Plant cell culture
a practical approach
Edited by R. A. Dixon
Department of Biochemistry,
Royal Holloway College, Egham Hill,
Egham, Surrey TW20 OEX, UK
G. P. Bolwell, J. V. Chapman, R. A. Dixon,
J. M. Dunwell, R; A. Gonzales,
S. A. Miller, P. Morris, J. B. Power,
A.	Scragg, N. Smart, A. Stafford,
B.	Tisserat, J. M. Widholm, L. A. Withers,
K. R. Wood
6
БИОТЕХНОЛОГИЯ
РАСТЕНИЙ:
культура клеток
Перевод с английского
доктора биологических наук В. И. Негрука
Под редакцией и с предисловием
члена-корреспондента АН СССР,
академика ВАСХНИЛ Р. Г. Бутенко
Москва ВО„Агропромиздат”
1989
УДК 631.527:573.6
Редактор к. б. н. Н. К. Смирнова
Биотехнология растений: культура клеток/Пер. с англ. В. И. Негру-
к а; С предисл. Р. Г. Бутенко. — М.: Агропромиздат, 1989. — 280 с.: ил.;
ISBN 5-10-001257-9.
В книге описаны методы получения и поддержания каллусной и суспензион-
ной культур. Подробно рассмотрены возможности использования культуры кле-
ток при изучении проблем дифференциации, роста, развития, селекции, фитопа-
тологии и генной инженерии. Дан анализ использования культуры клеток в каче-
стве источника ферментов для получения вторичных веществ. Уделено внимание
вопросам консервации и хранения генофонда.
Для научных работников в области биотехнологии, селекции, фитопатологии.
Иллюстраций 45, таблиц 51, список литературы — 328 названий.
к 3803010300-263 с
035 (01)-89
Г. П. Болвелл, К. Р. Вуд, Р. А. Гонзалес, Дж. М. Данвелл, Р. А. Диксон,
С А. Миллер, П. Моррис, Дж. Б. Лавер, А. X. Скрагг, Н. Дж. Смарт,
А. Стаффорд, Б. Тиссера, Дж. М. Увдхолм, Л. А. Уизерс, Дж. В. Чепмен
Биотехнология растений: культура клеток
Зав. редакцией В. Е. Машковский
Мл. редактору!. В. Жарков
Художественный редактор Н. Н. Кондратьева
Художник В. П. Трифонов
Технический редактор Т. В. Мындру
Корректор А. П. Шахрова
ИБ № 5860
Сдано в набор 20. 12.88. Подписано в печать 15.03.89. Формат 60 X 88/16. Бумага
кн.-журн. импортная. Гарнитура Пресс-Роман. Печать офсетная. Усл. п. л. 17,15.
Усл. кр.-отт. 17,15. Уч.-изд. л. 20,27. Тираж 2800 экз. Изд. № 055. Заказ № 1021.
Цена 4 р. 40 к.
Ордена Трудового Красного Знамени ВО „Агропромиздат”. 107807, ГСП-6,
Москва, Б-78,ул. Садовая-Спасская, 18.
Московская типография № 8 Государственного комитета СССР
по делам издательств, полиграфии и книжной торговли
101898, Москва, Центр, Хохловский пер., 7
ISBN 0-947946-22-5 (Англия)
ISBN 5 -10-001257-9 (СССР)
© 1985 IRL Press Limited
© Перевод на русский язык
ВО „Агропромиздат”, 1989
ПРЕДИСЛОВИЕ К РУССКОМУ ИЗДАНИЮ
В настоящее время значительно возрос интерес к методам культуры
тканей и клеток растений. Это связано как с увеличением роли клеточ-
ных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физио-
логии, молекулярной биологии и цитологии растений, так и возможно-
стями практического применения клеточных технологий в сельском
хозяйстве и промышленности.
В нашей стране актуальны и фундаментальные, и прикладные ас-
пекты использования культивируемых клеток растений. В фундамен-
тальных исследованиях клетки и ткани in vitro являются основой, кото-
рая позволяет объединить разные уровни исследования, начиная с мо-
лекулярно-генетического и кончая популяционным, что очень важно
для изучения различных проблем биологии растений. Прикладные ас-
пекты приобрели большое значение в связи с увеличением объема работ
по биотехнологии растений, созданием многочисленных региональных
биотехнологических центров и кафедр биотехнологии в вузах.
Читательская аудитория, заинтересованная в поступлении новой
информации в области теории и практики культивирования клеток и
тканей растений, в нашей стране значительно расширилась, но, к сожа-
лению, ее запросы удовлетворяются далеко не полностью. Тиражи
сборников докладов Всесоюзных конференций по культуре тканей и
клеток растений, издающихся раз в четыре года, очень малы, методи-
ческие рекомендации по разным технологиям на основе клеточных
культур, созданные в стране, малодоступны, а специальные методиче-
ские сборники, включающие описание техники для культивирования
и изучения систем in vitro, вообще отсутствуют. В сложившейся ситуа-
ции издание данной книги на русском языке — очень своевременный
шаг.
Основной задачей этой книги, написанной ведущими английскими
и американскими учеными, является ознакомление работающих в
этой области исследователей и биотехнологов с многочисленными совре-
менными методами и техническими приемами, которые применяются
для выращивания тканевых и клеточных культур, оценки их состояния
и использования в решении разных научных и прикладных проблем,
таких, как получение экономически важных продуктов промышленным
способом, облегчение селекционного процесса с помощью получения
гаплоидов, создание генетического разнообразия методами слияния
и манипуляций с протопластами, клеточной селекции и получением
сомаклональных вариантов. Особый интерес представляют главы,
посвященные использованию методов культуры клеток для изуче-
ния взаимодействия патогенов — вирусов и грибов — с клетками
растений.
5
Авторы неоднократно напоминают, что приведенные прописи пред-
ставляют основную схему, которую можно, а часто необходимо коррек-
тировать в зависимости от объекта и целей исследования.
Конечно, со времени опубликования оригинала книги в столь дина-
мичном направлении, которым является манипулирование с культиви-
руемыми клетками растений, появились и появляются более совершен-
ные методы. Это необходимо учитывать при ознакомлении с методами,
например, электрослияния протопластов при гибридизации и цибриди-
зации соматических клеток растений, описании типов биореакторов,
перспективных для крупномасштабного выращивания клеток, слишком
упрощенными схемами методов депонирования и криосохранения
генофонда растений.
Вероятно, следует отметить, что в литературных ссылках указаны
не всегда лучшие и основополагающие работы. В частности, нет ссылок
на наши отечественные исследования, даже тогда, когда они были при-
оритетными в создании методов и направлений.
Р. Г. Бутенко
ПРЕДИСЛОВИЕ К АНГЛИЙСКОМУ ИЗДАНИЮ
Методы культивирования изолированных органов, тканей и клеток
растений появились более полувека назад и с тех пор постоянно совер-
шенствуются. Работа в этом направлении привела к некоторым прин-
ципиальным достижениям в понимании процесса развития растения.
Однако лишь недавно, в связи с возросшим интересом к вопросам,
связанным с биотехнологией растений, методы клеточных культур
стали широко применять в лабораториях, занимающихся изучением
растений. Культуры клеток растений используются не только для генети-
ческих манипуляций с растениями, но и в качестве источников фер-
ментов и продуктов вторичного метаболизма, а также как модельные
системы для изучения дифференциальной экспрессии генов.
Несмотря на то что многие методы, используемые при манипуля-
циях с культурами клеток растений и для их получения, сами по себе
довольно просты, изложение их в одной небольшой книге представляет
довольно сложную задачу, поскольку различные виды растений по-
разному реагируют на сходные химические и физические условия куль-
тивирования. Подобная изменчивость неизбежно приводит к необходи-
мости использовать эмпирические подходы к подбору соответствую-
щих условий культивирования для видов растений, исследуемых в
этом плане впервые. Поэтому наряду с описанием методов получения
и манипулирования с хорошо охарактеризованными культурами клеток
в некоторых главах этой книги даны короткие обзоры по подбору
условий культивирования различных важных в практическом отношении
культур. Надеюсь, что всем исследователям, желающим использовать
методы культуры клеток при работе с видами растений, для которых
детальные методики отсутствуют, такой подход окажется полезным.
Р. А. Диксон
1.	ИЗОЛИРОВАНИЕ И ПОДДЕРЖАНИЕ КАЛЛУСНЫХ И
СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК
Р. А. ДИКСОН
1.1.	ВВЕДЕНИЕ
Во многих методиках, описанных в данной книге, в качестве исход-
ного материала используют каллусные или суспензионные культуры
клеток растений. В этой главе изложены основные способы получения
и поддержания таких культур. Таким образом, эта глава в какой-то
степени предназначена новичку, который впервые сталкивается с си-
стемами культуры тканей. Суспензионные культуры клеток обычно
получают из каллусных; кроме того, последние представляют собой
удобную форму поддержания линий и часто являются тем типом куль-
туры, из которого проводят регенерацию растений. В связи с тем что
суспензионные культуры в основном состоят из относительно гомо-
генной популяции клеток, которые можно быстро и сходным образом
обрабатывать с помощью добавляемых извне химических веществ,
они очень удобны для биохимических экспериментов, проводимых
при исследовании индукции ферментов, экспрессии генов, метаболизма
добавляемых веществ, а также для выделения и характеристики мутан-
тов. Кроме того, необходимо принимать во внимание, что общие на-
выки работы в стерильных условиях, основные практические аспекты
получения культуры и ее поддержания группируются вокруг проблемы
подбора подходящей среды для культивирования. Ниже подробно
описаны среды, используемые в лаборатории автора. Более детальные
сведения по подбору сред можно найти в специализированных руко-
водствах по культуре клеток растений [1—5].
1.2.	ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ЛАБОРАТОРИИ
В основном для работы с культурой тканей растений необходимо
следующее:
1)	место для приготовления сред;
2)	стерильная комната или ламинар-бокс для стерильной пересадки;
3)	комната с постоянной температурой или термостат для выра-
щивания каллусных культур;
4)	качалки для суспензионных культур клеток.
Некоторые исследователи считают, что для приготовления сред
желательно иметь отдельную комнату. В случае, если это невозможно,
необходимо соблюдать чистоту при хранении стеклянных сосудов для
культур, а также следить за тем, чтобы в среды не попадали следовые
8
количества химических реактивов, например, с грязных чаш весов или
с электродов pH-метра. Как показала практика, небрежность, допущен-
ная при проведении эксперимента, даже при хорошей оснащенности
рабочего места, сводит к нулю все затраченные усилия, поэтому чистота
гораздо важнее, чем изысканное специальное оборудование.
Ламинар-бокс в настоящее время вполне доступен и широко исполь-
зуется для стерильных пересадок при работе с культурой тканей. Не-
которые ламинар-боксы оснащены ультрафиолетовыми лампами, кото-
рые можно оставлять на ночь для стерилизации внутренней поверхно-
сти. Однако даже после этого рабочую поверхность перед использова-
нием желательно протереть этанолом или 20% водным раствором фенола
(обязательно в перчатках!). При отсутствии ламинар-бокса для стериль-
ных работ можно использовать небольшую изолированную комнату.
В этом случае для работы необходимо иметь поверхность, которую
можно легко простерилизовать спиртом или 20% фенолом. Кроме
того, до начала работы и во время нее на каждом конце рабочей поверх-
ности должны быть зажжены две горелки Бунзена. Дополнительной
мерой предосторожности служат ультрафиолетовые лампы, которыми
в нерабочее время проводят стерилизацию поверхности. Такая стериль-
ная комната, конечно, уступает ламинар-боксу, тем не менее и такое
оснащение позволяет успешно работать.
Основным физическим требованием для выращивания и поддержа-
ния культур клеток растений является постоянная температура. Для
небольшого числа каллусных культур вполне пригоден стандартный
микробиологический термостат, работающий в режиме 25 ± 2 С. Мно-
гие исследователи выращивают культуры каллусов в темноте, однако
при необходимости в помещении может быть и свет. Для больших
коллекций каллусных культур необходима термостатируемая комната
с температурой 25 ° С. Для культивирования наиболее гибкой и удобной
является система полок с трубчатыми люминесцентными лампами
над ними (лампы можно прикрепить с нижней стороны верхней полки).
Такая система пригодна для выращивания культур в любом световом
режиме. Культуры с требованиями к темноте выращивают в той же
комнате, но в темном шкафу.
Для перемешивания и аэрации суспензионных культур самой деше-
вой системой являются качалки с круговым вращением, имеющие
открытую платформу, например, выпускаемые в Великобритании фир-
мой L. Н. Engineering Ltd. Такие качалки с платформами, которые можно
приспособить для колб разного диаметра, помещают в термостатируе-
мую комнату с необходимым световым режимом. Лучший контроль
за условиями выращивания (при больших денежных затратах) достига-
ется в закрытых термостатах с круговым вращением, например, выпу-
скаемых фирмой Gallenkamp (каталожный номер INR-401-010W) или
L. Н. Engineering (Mk. 10), Такие качалки снабжены лампами дневного
света, вмонтированными в крышку, и ручками управления, позволяю-
9
щими устанавливать различную продолжительность светового дня.
При работе с культурой клеток растений важно снабдить качалку
цельной системой охлаждения, поскольку нагрев мотора может
привести к значительному повышению температуры внутри ка-
меры.
Каллусные культуры выращивают в пластиковых чашках Петри,
в стеклянных пробирках для культуры тканей или в пластмассовых
баночках с завинчивающейся крышкой. Суспензионные культуры обыч-
но выращивают в стеклянных конических колбах. Описание более
сложной аппаратуры для выращивания суспензионных культур в аэри-
руемых ферментерах в данной главе не приводится (см. [1], а также
гл. 7 этой книги).
13. СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
В этом разделе описаны состав и приготовление основных сред
для индукции и выращивания каллусных и суспензионных культур
клеток. Более специализированные среды изложены в других разде-
лах книги.
1.3.1.	СОСТАВ
Компоненты среды для выращивания каллусных и суспензионных
культур растений можно разделить на шесть групп, что обычно отражает
порядок приготовления и хранения концентрированных исходных
растворов. Это следующие группы:
1)	основные неорганические питательные вещества (макроэле-
менты) ;
2)	микроэлементы;
3)	источник железа;
4)	органические добавки (витамины);
5)	источники углерода;
6)	органические добавки (регуляторы роста растений).
Состав некоторых сред приведен в таблицах 1.1—1.3. В связи с тем
что содержание регуляторов роста обычно является определяющим
фактором для успешного дедифференцированного роста культур клеток
растений, а также поскольку оптимум концентраций ауксинов и
цитокининов, необходимых для такого роста, у разных видов мо-
жет варьировать, содержание этих компонентов в таблицах 1.1—1.3
не указано.
Регуляторы роста, обычно применяемые в средах для культивиро-
вания клеток растений, приведены в таблице 1.4, а подбор соответ-
ствующих концентраций регуляторов роста для определенного вида
растения обсуждается в разделе 1.3.3.
10
1.1. Среда Мурасиге—Скуга. Состав и приготовление
Компоненты	Молярность в среде	Концентра- ция исход- ного раствора, мг/л	Объем ис- Те мп ер ату-	
			ходного раствора на 1 л среды, мл	ра хране- ния исход- ного раст- вора, С
— —				
Основные неорганические питательные вещества nh4no3	2,06 • 1О'а	33000		
KNO3	1,88 - IO’2	38000		
CaCia • 2НаО	3,00 • 10 ~3	8800	50	+ 4
MgSO4-7НаО	1,50 • 10-3	7400		
KHaPO4	1,25 - 10-3	3400		
Источники микроэлементов KI	5,00 • IO”6	166		
н3во3	1,00 • Ю-*	1240		
MnSO4• 4HaO	9,99 • 10 ~5	4460		
ZnSO4 -7HaO	2,99 • 10 s	1720	5	+4
NaaMoO„ • 2HaO	1,00 • 10	50		
CuSO4•5HaO	1,00 • ю-’	5		
CoCla • 6HaO Источник железа	1,00 • ю-7	5		
FeS04 • 7HaO	1,00  ю-*	5560		
Ь'ааЭДТА • 2HaO Органические вещества	1,00 • io-4	7460	5	+4
Мезоинозит	4,90 • 10~4	20000		
Никотиновая кислота	4,66 • 10-*	100		
Пиридоксин-НС1	2,40 • IO"6	100	5	-20 (по 5 мл)
Тиамин-НС1	3,00 - io-7	100		
Глицин Источник углерода	3,00 • ю-5	400		
Сахароза	8,80  10 -г		Добавлять в виде по- рошка (30 г/л)	
U. Модифицированная среда готовпение	Шейка—Хильдебрандта (pH 6,7). Состав и при-
Компоненты	Концен-	Объем Температу- трация исходного ра хране- Молярность	исходного раствора ния исход- в среде	раствора, на 1 л ного раст- мг/л	среды, мл вора, °C
Основные неорганические питательные вещества KN()3 MgSO4•7НаО	2,5 • 10 2	1 01000	25	+4 1,5 • 30-3	24640	15	+4
11
Окончание табл. 1.2
		Концен-	Объем	Температу-
		трация	исходного	ра хране-
Компоненты	Молярность	исходного	раствора	ния исход-
	в среде	раствора,	на 1 л	ио го раст-
		мг/л	среды, мл	вора, С
NH4H21’O4	2,5 • 10-3	11500	25	+4
СаС12 • 2Н2О Ми кроэлементы	1,5 - 10“3	14680	15	+4
Мп SO. - 4Н2О	5,9  10"5	1320		
Н3ВО3	1,3 • 10’4	500		
ZnSO4 • 7Н2О	3,5 • IO’6	100		
KI	6,0 • ю -*	100	10	+4
CuSO45Н2О	8,0 • 10	20		
Na2 МоО4	4,1 • 10'7	10		
СоС12 • 6Н2О Источник железа	4,2 • 10	10		
FeSO4  7Н2О	5,4 • 1O'S	1500	10	+4
№2ЭДТА	5,4 • IO’5	2000		
Органи чески е в ещества Тиамин-НС1	1,5 • 10'5	500		
Никотиновая кислота	4,1 • 10 s	500		-20
Пиридоксин-НС1	2,4 • 10~6	50	10	(по 10 мл)
Мезо инозит	5,6 • 10'3		Добавлять в виде по- рошка (1 г/л)	
Источник углерода Сахароза	8,8 • 10'я	-	Добавлять в виде по-	
			рошка (30 г/л)	
1.3.	Составы других широко используемых сред для культивирования
клеток растений*
Концентрация в среде для культивирования, мг/л
Компоненты	Среда Уайта	Среда Шенка- Хильде- брандта	Среда В5	Среда Хеллера	Среда Лисмайе- ра—Скуга
Ca(NO3)2	142	—	—	—	—
KNO3	81	2500	3000	—	1900
NaNO3	—	—	—	600	—
NH4NO3	—	—	—	—	1650
nh4h2po4	—	300	—	—	—
(NH4)2SO4	—	—	134	—	—
MgSO4•7H2O	74	400	500	250	370
CaCl2 • 2H2O	—	200	150	75	440
12
Продолжение табл. 1.3
Концентрация в среде для культивирования, мг/п
Компоненты	Среда Уайта	Среда Шенка- Хильде- брандта	Среда В5	Среда Хеллера	Среда Ли Смайе- ра—Скуга
КС1	65	—	—	750	—
КН2РО4	12	—	—	—	170
NaH2PO4 -Н2О	—	-	150	125	—
MnSO4 н2о	—	10	10	—	—
MnSO4-4Н2О	—	—	—	0,1	22,3
Ю	—	1	0,75	0,01	0,83
Н3ВО3	—	5	3	1	6,2
ZnSO4 7Н2О	—	1	2	1	8,6
CuSO4	—	0,2	0,025	—	—
CuSO4-5НаО	—	—	—	0,03	0,025
Naa МоО4  2НаО	—	0,1	0,25	—	0,25
СоС12 - 6Н2О	—	0,1	0,025	—	0,025
А1С13	—	—	—	0,03	—
NiCl2 6Н2О	—	—	—	0,03	—
FeCl3 • 6Н2О	—		—	1	—
FeSO„ -7Н2О	—	15	—	—	27,86
Fe2(SO4)3	2,46	—	—	—	—
Сиквестрен 330 Fe	—	—	28	—	—
Na/ЭДТА	—	20	—	—	37,26
Мезоинозит	—	1000	100	—	100
Тиамин-НС1	—	5	10	—	0,4
Никотиновая кислота	—	5	1	—	—
Пиридоксин-НС1	—	0,5	1	—	—
Дрожжевой экстракт	100	—	—	—	—
Сахароза	20000	30000	20000	-	30000
рн		5,9	5,5		5,8
* Сложные добавки (например, кокосовое молоко) и регуляторы роста,
используемые с этими средами, не приведены. Составы сред соответствуют ори-
гинальным. При приготовлении среды Хеллера сахарозу (20—30 г/л) следует
Добавлять к раствору солей.
Среды Мурасиге—Скуга (МС, табл. 1.1) и Шенка—Хильдебрандта
(ШХ, табл. 1.2, 1.3) относятся к наиболее употребляемым в работе с
культурами клеток растений и оказались эффективными для роста
13
§
s
х
а
Е
х
к
а>
R
0
О
2
о
S
о
д
X
а
Е
X
я
40
8
is

к
Я
О
X
§
&
Е
а
к
5
§
в
н
£
g
(D
R
6
я
5
§

я
S
d
X
5
2
§
§
а
я
я
§
X
R
Я
d
Ю
о
а.
я
п
£
я
я
§
я
&
х
«
х
Я
X
d
0
2
О
Й
GJ
Я
б
Я
§
я
8
X
° к
8-<2
я Z
!§
d
К
о
S
К
Я
я
в
§
2
t
о
s
о
я
я
9
§
Я
S
§
я
9
§
к
X
й
В
1
3
я
S
о
£
й
о
Я
я
о

9
В!
а
5
я
я
гэ
Bi
я
2
я
я
§
к
о
d
Z
Я
0
S
©
я
я
и
о
я
В о
а ЕС
о д
Е R
и 2
ZZT Г . V»
Я £ о
Бй В
1.4. Регуляторы роста, используемые при культивировании клеток растений
X
X
р>
ss
О)
э
о
X
§
R
о
S
X
s
I
a
x
о
к
§
к
S
е
><
St

и

S
S
я
к
<
W
С
Я

а
я
g
&
я
Б
я
g
£
S
о
5
§
я
5
х
X
§
X
о
я
о
е
й
а
5
Я
X
й
S
&
я
м § g
i § о
5 « 5
&S §
X
d
g
5
d
s
§
R
О
a
d
Я
&
X
я
X
d
S
&
я
S
я
5
§
я
я
х
•&
d
X
о
5
§
Я
я
а
&
о
я
я
d
R
Я
го
Я
о
W
я
d
§
я
(D
Ё
GJ
Я
я
я
а
&
о
я
d
§
й
я
я
S
Z
я
о. ®
•	J
к
Я

£
ю
я
б
о
5
Я
X
я
I
§
а
Я
я
я
я
а
GJ
10
\о
я
* Для инициации или поддержания суспензионных и каллусных культур используется редко; иногда необходима для реге-
нерации растений.
14
различных одно- и двудольных растений. Их считают средами с высоким
содержанием солей (по сравнению с низкосолевой средой Уайта). Среда
ШХ от других сред отличается очень высоким, десятикратным содержа-
нием мезоинозита. Среды МС и ШХ содержат железо в хелатированной
форме в комплексе с ЭДТА. Это обеспечивает его доступность при
pH до 8,0 в течение всего периода роста культуры, тогда как в отсутст-
вие хелатирующего агента недостаток железа может возникнуть очень
быстро.
Наилучшие результаты получают при использовании сред опреде-
ленного состава (см. табл. 1.1—1.3), хотя некоторые культуры клеток,
по-видимому, лучше растут при добавлении определенных питательных
веществ (например, гидролизата казеина, дрожжевого экстракта или
кокосового молока) и (или) регуляторов роста. Однако в настоящее
время таких добавок стараются избегать в связи с трудностями вос-
произведения результатов и наличия в них неизвестных факторов роста.
Как мы увидим далее в старых прописях, например в среде Уайта,
100 мг/л дрожжевого экстракта заменяет микроэлементы и витамины.
Дрожжевой экстракт и гидролизат казеина можно приобрести у фирм,
выпускающих продукты для микробиологических целей (например,
Oxoid Ltd., UK). Кокосовое молоко (во избежание получения разнород-
ного материала) лучше готовить в больших количествах. Для этого
молоко, извлеченное из нескольких кокосовых орехов, депротеини-
зируют кипячением, фильтруют через фильтровальную бумагу Ватман
№ 1, разливают раствор небольшими порциями, автоклавируют и хранят
при —20 °C. Обычно кокосовое молоко добавляют к среде до 10%
(объем к объему).
Для приготовления агаризованных сред добавляют агар до конечной
концентрации 6—10 г/л. При работе с культурами клеток растений
важно использовать агар хорошего качества, пригодный для бактерио-
логических работ. В большинстве случаев наилучшим является агар
из Новой Зеландии (фирмы BDH Chemicals Ltd., UK). Величину pH
среды обычно перед автоклавированием доводят до 5,5—6,0. Однако
в дальнейшем она слегка снижается в результате образования в ходе
автоклавирования сахарных кислот.
1.3.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СРЕД
В настоящее время выпускают несколько типов готовых сред (Уай-
та, МС, Хеллера) в виде сухих порошков, содержащих все необходимые
компоненты, за исключением регуляторов роста, сахарозы и агара
(фирмы Flow Laboratories, Irvine, Ayshire, UK и Gibco, Grand Island, New
York, USA). Готовые среды чрезвычайно удобны для обычного культи-
вирования. Однако у них есть ряд недостатков: они дороги, а их приме-
нение ограничено для исследований, в которых необходимо варьирова-
ние компонентов сред.
15
Обычное приготовление сред для культивирования из отдельных
соединений довольно просто. Большинство сред готовят так же, как,
например, модифицированную среду ШХ (см. табл. 1.2).
1.	Готовят исходные растворы основных неорганических солей,
микроэлементов, витаминов и регуляторов роста растений (см.
табл. 1.2).
2.	Для приготовления 1 л жидкой среды в стакан объемом 1 л,
стоящий на магнитной мешалке, пипеткой переносят необходи-
мый объем каждого из исходных растворов.
3.	Добавляют сухие мезоинозит и сахарозу; полностью растворяют
их, добавляя при необходимости немного воды.
4.	Дистиллированной водой доводят объем до 950 мл.
5.	Доводят pH до 5,8—5,9 с помощью 5 М NaOH.
6.	Переносят среду в мерный цилиндр или колбу объемом 1 л и
доводят объем до метки дистиллированной водой.
7.	Переносят среду обратно в колбу и перемешивают на мешалке
до полного растворения.
8.	Разливают среду порциями (75—100 мл) в чистые конические
колбы объемом 250 мл. закупоривают ватными пробками, на-
крывают сверху алюминиевой фольгой и автоклавируют в
течение 15 мин при 120 °C (1,06 кг/см2) .
Необходимо помнить, что растворы неорганических веществ могут
храниться в течение 1 месяца при +4 °C, тогда как витамины следует
разлить порциями по 10 мл и хранить в замороженном состоянии при
—20 °C. Приготовление исходных растворов регуляторов роста приве-
дено в таблице 1.4. Эти растворы рекомендуется готовить небольшими
объемами перед употреблением. Все растворы должны быть приготов-
лены из реактивов марки не ниже ХЧ на бидистилляте.
Минимальное время, необходимое для стерилизации среды спосо-
бом автоклавирования, зависит от объема среды в колбе. Например,
для объемов 250—500 мл автоклавирование проводят в течение 25 мин
при 120 °C. Некоторые регуляторы роста растений термолабильны (см.
табл. 1.4), поэтому их нельзя автоклавировать. В этом случае готовят
среду, как описано выше, но без добавления этих веществ. После того
как колба остынет (для агаризованных сред достаточно 40 С), в лами-
нар-боксе добавляют раствор термолабильного компонента, доведенный
до требуемого pH, предварительно профильтровав его через мембранный
фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Такие фильтры можно использовать
с автоклавируемыми адаптерами, которые вставляют в шприц или
в специальное фильтровальное устройство (например, фирмы Millipore
Ltd.). Перед стерилизацией необходимо осветлить раствор, пропустив
его через фильтр из пористого стекла № 3, что предупреждает засорение
мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.
Для приготовления полутвердых сред агар в готовую среду вносят
перед автоклавированием. Это делают в тех случаях, когда большие
16
объемы одной и той же среды (0,5—1 л) автоклавируют в 1—2,5-литро-
вых колбах, а затем, охладив примерно до 40 °C, в ламинар-боксе разли-
вают по стерильным сосудам. Если для эксперимента необходимы
несколько сред в меньших объемах или если сосуды (например, стек-
лянные культуральные пробирки) необходимо стерилизовать одновре-
менно со средой, то удобнее во избежание многократного взвешивания
агара растворить его в воде (с подогревом) до внесения остальных ком-
понентов среды. В этом случае среду не надо сильно охлаждать, чтобы
агар не застыл до переноса в культуральные колбы.
Агаризованную или жидкую готовую среду нельзя хранить долго.
(Чтобы убедиться в отсутствии в среде бактериального заражения,
ее оставляют примерно на 4 дня при 25 °C.) Однако если это необходи-
мо, то ее хранят при 4 °C.
1.3.3.	ВЫБОР СРЕДЫ
В настоящее время описано много различных составов сред (см.,
например, [4, 5]). Если в литературе не содержится необходимой инфор-
мации, начинают с использования широко распространенных стандарт-
ных сред, таких, как МС, ШХ или Гамберга В5, а затем подбирают кон-
центрации регуляторов роста растений. В большинстве случаев это сво-
дится к подбору концентраций ауксина и цитокинина. Рекомендуют
[4] испробовать пять концентраций ауксина и пять — цитокинина, что
в общей сложности дает 25 различных комбинаций (см. ниже). Затем
выбирают концентрации, при которых обеспечивается наилучший рост, и
далее в пределах этих концентраций исследуют действие разных концен-
траций ауксина и цитокинина вновь, возможно, слегка меняя содержание
неорганических веществ и витаминов (например, уменьшая вдвое содер-
жание основных солей)*.
Экспериментальный подход к подбору среды для культивирования
(по [4] с изменениями) :
1.	Отобрать одну или более основных сред, например МС, ШХ или В5, не
добавляя регуляторов роста.
2.	Поставить эксперименты с использованием различных комбинаций пяти
концентраций ауксина и цитокинина, как показано ниже.
2,4-Д, мкМ	0	Кинетин, мкМ		5	10
		0,5	2,5		
0	1	2	3	4	5
0,5	6	7	8	9	10
2,5	11	12	13	14	15
5	16	17	18	19	20
10	21	22	23	24	25
* В некоторых лабораториях по культуре клеток растений в СССР использу-
ется математический метод планирования экспериментов для выбора бптимйльного-
состава компонентов питательной среды, что уск»ряб¥*Ттот про есс.гр Прим) ед.
3.	Выбрать условия, в которых происходит наилучший рост, и исследовать
действие различных концентраций ауксина и цитокинина в пределах этих условий.
В таблице 1.5 представлены индексы роста каллусных культур
нескольких видов растений на среде ШХ с добавлением регуляторов
роста — и-хлорфеноксиуксусной кислоты (н-ХФУК) (10~5М), 2,4-
дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) (2 • 10-6М) и кинетина
(5 • 10-7). В связи с тем что такая стандартная среда обеспечивает
удовлетворительный рост как двудольных, так и однодольных расте-
ний, вышеописанный экспериментальный подход к определению соста-
ва среды лучше предпринимать лишь после неудачи при использовании
стандартной среды.
1.5. Скорости роста каллусных культур растений на среде ШХ, содержащей
д-ХФУК (IO'5 М), 2,4-Д (2 - IO"6 М) и кинетин (5 • 10’7 М) (по [6] с
дополнительной информацией из лаборатории автора)
Вид	Сорт	Индекс скорости роста*	
		в темноте	на свету
Табак (Nicotiana tabacum)	Wisconsin 38	30	30
Хлопчатник (Gossypium hirsutum)	Auburn 56		30
Сои (Glycine max)	Hood		30
Соя (Glycine max)	Harosoy 63	15	
Арахис (Arachis hypogaea)	Dixie Spanish	15	30
Томат (Lycopersicon esculentum)	Homestead 24		30
Haplopappus gracilis			2
Фитолакка американская, (Phytolacca americana)		15	30
Виноград (Vitis vinifera)			15
Капуста (Brassica oleracea)	Wisconsin Ballhead		4
Горох (Pisutn sativum)		4	4
Клевер (Trifolium repens)		4	
Фасоль карликовая,	Canadian Wonder	15	15
(Phaseolus vulgaris)	Red Kidney	15	
	The Prince	15	
	Immuna	30	
Бобы (Vida faba)	Aquadulce longpod		4
Люцерна (Medicago sativa)	Europe	15	15
Горох турецкий (Cicer arietinum)		8	
Груша (Pyrus communis) Авокадо (Persea americana)	Duke 7	30	15
Opuntia subulata		8	8
Петрушка (Petroselinum hortense)			8
Морковь (Daucus carota)			30
18
Продолжение табл. 1.5
Индекс скорости роста*
Вид	Сорт	в темноте	на свету
Клен белый (Acer pseudoplatan us) Ячмень (Hordeum vulgare)	Himalaya	15	15
Тимофеевка (Phleum pratense)	Old Gold	30	
Пшеница (Triticum spj	Vernal, Gaines	8	
Овес (Avena sativa)	Тетраплоид C.l .7232	8	
Рис (Oryza sativa)	TaiN.l.,IR-8	4	
Сорго (Sorghum sp.)	Pioneer Hibrid 7480	8	
Рожь (Secale cereale)	Tetropetkus, Gator	4	
Кукуруза (Zea mays)	SC313 (инбредный сорт)	2	
* Примерное увеличение (число раз) поверхности каллуса через 3 недели
посадки исходного материала размером около 20 мм’.
1.6. Среды, используемые для получения и роста каллусных культур злаков [9]*
Вид	Основ- ная _ среда	Концентрация регуляторов роста, мкМ						
		ИУК	2,4-Д	НУК	И-ХФУК	к	2 иП	Зеа
Кукуруза	мс	—	2,3-67,8	21,5* **	—	—	0,24**	—
(Zea mays) Пшеница	MC, В5	—	4,5-9,0	—	—	—	—	—
(Triticum aesti- vutn) Рис (Oryza sativa)	МС	-	9,0-45,2	-	-	-	-	-
Райграс (Loliurn multiflorum X	мс	31,7	6,8	—	—	1,0	—	—
X L. perenne) Овес (A vena	В5	—	2,3-13,6	—	—	—	—	—
sativa)	ШХ	—	9,1	—	10,7	—	—	—
	мс	—	22,0	—	—	—	—	—
Ячмень (Horde-	В5	—	4,5	—	—	—	—	—
urn vulgare)	МС	10,0	1,5	—	—	—	1,5	—
Просо (Panicum miliaceum)	МС	—	9,0	—	—	—	—	—
Сорго (Sorghum	мс	—	22,6-67,8	—	—	—	—	—
tricolor)	мс	—	5,0	—	—	—	—	10
* Эта ссылка содержит также детальные характеристики использовавшихся
эксплантов.
** При добавлении к 4,5 мкМ 2,4-Д.
19
Раньше считали, что злаки выращивать в культуре трудно, что нашло
свое отражение в данных таблицы 1.5. Однако в настоящее время боль-
шинство видов злаков успешно выращивают в культуре, хотя не для
всех видов удалось добиться регенерации растений из неорганизованного
каллуса ([8, 9], гл. 5 данной книги). В таблице 1.6 перечислены некото-
рые среды, используемые для культур злаков.
1.4.	КАЛЛУСНЫЕ КУЛЬТУРЫ
1.4.1.	ВЫБОР ЭКСПЛАНТА
Культуры каллусов могут быть получены из многих органов расте-
ний (например, корней, побегов, листьев) или из определенных типов
клеток (например, эндосперма, пыльцы). В данной главе рассматрива-
ется получение каллусов из органов растений и эндосперма. Более
специальная тема — получение гаплоидов из культур пыльцы и пыльни-
ков — обсуждается в гл. 2. Выбор экспланта в значительной степени
определяется задачами исследования. Для общих биохимических иссле-
дований первичного или вторичного метаболизма можно посоветовать
получать культуры более чем из одного источника и сравнивать их
характеристики по изучаемым параметрам.
1.4.2.	ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ЭКСПЛАНТОВ
После выбора экспланта и подбора питательной среды можно при-
ступать к получению каллусных культур. Прежде всего следует убе-
диться, что выбранный вами зксплант находится в подходящем „био-
логическом состоянии”, необходимом для получения каллусных куль-
тур. Молодые ткани более пригодны для этой цели, чем зрелые. Это
особенно заметно на листьях. Проращивание простерилизованных семян
в асептических условиях часто дает материал корней, побегов и листь-
ев, пригодный для получения каллуса. Активность роста каллуса спе-
циализированных тканей (например, эндосперма) в значительной степе-
ни зависит от времени его получения. Так, из эксплантов эндосперма
Zea mays, полученных позднее чем через 8—11 дней после опыления,
каллус не образуется [10].
Кусочки стебля древесных пород часто служат плохим материалом.
Мы успешно получили каллусы авокадо Persea americana из стеблей про-
ростков, предварительно удалив боковые побеги, а затем позволив
сформироваться раневому каллусу. Поверхность полученного каллуса
затем простерилизовали и использовали в качестве экспланта.
Семена представляют собой хороший исходный материал в следую-
щих случаях:
1)	для получения каллуса путем посадки целых семян на агаризо-
ванную среду, содержащую регуляторы роста;
20
2)	для получения из прорастающих семян, помещенных на агари-
зованную среду без регуляторов роста, стерильных корней, побегов и
листьев, которые затем используются как экспланты;
3)	для изолирования тканей зародышевого корня и зародышевой
почки непосредственно из семян и дальнейшего их использования в
качестве эксплантов.
Каллусные культуры, полученные из отрезков органов, таких,
как корни и стебли, могут возникать из разных типов клеток, присут-
ствующих в исходной ткани.
Размер и форма исходного экспланта до определенных пределов
не оказывают влияния на пролиферацию каллуса, хотя существует
минимальный критический размер, уменьшив который, нельзя вызвать
рост экспланта. Экспланты из флоэмы корней моркови массой всего
3,8 мг вполне жизнеспособны для активного роста каллуса, тогда как
масса аналогичного размера эксплантов клубней земляной груши слиш-
ком мала [11]. Это зависит, очевидно, от размеров и, следовательно,
числа клеток у этих двух типов эксплантов. У моркови клетки мельче и
поэтому при изолировании экспланта повреждается меньший процент.
Методы, используемые обычно для стерилизации эксплантов, при-
ведены в таблице 1.7. Наиболее часто применяют гипохлорит натрия.
Обычно его производят в виде концентрированных растворов (10—14%
в расчете на активный хлор), которые перед использованием разводят
водой в 10 раз. При работе с тканями или семенами с шероховатой
поверхностью к раствору гипохлорита можно добавить смачивающее
вещество (0,05% раствора детергента типа „типол”), способствующее
лучшему распределению стерилизатора по поверхности ткани и, следо-
вательно, предотвращению выживания микроорганизмов. Это особен-
но необходимо, если в качестве источника экспланта предполагают
использовать листья.
Ниже приведена методика получения каллуса фасоли из изолиро-
ванных кончиков корешков. Мы считаем, что этот метод удобен
при получении каллусных культур для большого круга зернобо-
бовых.
Метод получения каллусных культур из кончиков корешков фасоли (Pha-
seolus vulgaris) *:
1.	Помещают семена в чашки Петри диаметром 8,5 см (15 шт. на чашку).
2.	Заливают чашку раствором гипохлорита натрия (1—1,4% активного хлора;
это 10-кратное разведение продажного концентрированного раствора)
так, чтобы полностью покрыть семена. Оставляют раствор на 20 мин.
3.	Промывают семена в чашке Петрн трижды стерильной дистиллированной
водой (по 20 мл).
4.	Оставляют семена в чашке Петри в стерильной дистиллированной воде
на ночь для набухания.
5.	Удаляют все семена с разрушенной кожурой (используя стерильный пинцет).
6.	Повторно стерилизуют в гипохлорите натрия в течение 20 мин.
* Все операции выполняют в ламинар-боксе-
21
rt
о

я
i
о
я
§
Й
X
5
в
&
S
s
X
и
о
X
о
О
S
х
S
X
CD
ё
к
о
Р га
я
Я
га
й
с
к
§
я
ё
О
Е
К
§
X
§
к
§
к
§
с
й S
я
я
я
я
5
S
8
(D
Я
*
Я
О
Ж
х
О
S
Я
а
с
я
я
я
8
я
5
X
я
5
я
я
в
я
й
к ЗЯ
я о	о S cu
Р1 н m	й х 5ГСГ
«
и
зя
о
зЯ
®	О	«	О	О
О	&	О	Ж
Я	д	Я	3	«
5		Я	5	°
га	Л	R	Я	*
я
CD
я
8
о
с

Я н
о -
СП
ё.
Е
в
о
ё
&
о
Ж
э
о
я
§
В
е?
о
2
«5
о
я
я
S
CD
„ S
g <S
2
я
g g 5
5 Р< Я
*5 д о
2 ft р*
О' Ь X
К и х
й
г!
Ё
к
О
я
О
S
8
i
Z
я
я
b 3 «
О.» Я
‘ а?
О О 5
8. Н и о.
я
к
я
ЗЯ
О
S
I
я
я
я
я
я
в
в:
§
ь
s
R
o-S
я £
|°1
к у
В £ &В
к
h°S^
Б ё
и!
5
та
Я >4 С -—'
Ч- А. ‘Я	О
я
s в
ф
к
О
X
я
§
о
я
я
Я
о
я
х °
i s
S я
я л . w
1Ш
о
£
i
ё
2
 X
л
я
с
X
8
х
я
Я
Рч О
S §3
«, о
'-'ю
Ё 8
е °
го л с;
я о Ж
6 ®
X в
£ ё
° 2
Я "
я
go
я я
1=1 Й
h
Я й
Я
X
ё
Я
о
X
ё
8
зя
га _
» §
х
s 8
Й ё
"' га
X
§
Я
X
8 5
g §
” и
и
я
С
as
-* я
CD
Я
В
п
8.
я
Й
Й
я
я
я
X
а
- к
ср 0)
Рч Я
га
я
о
X
&
CD
Э 2
° ft
ё °
о м<
о
Я Я
gg
 ЙЧ 
§ § в
я
.» я
ё §
&
0)
я
S18
оВк
£
0>
&
S
а 8
I&
я
га
S
я
S
s
К
ж
CD
5
5
5
и
g&BS
I® н
«ЙВ&
S Й
х ° «•&
Б
я
5
£
О
я
Э * s
га й о
Я 2 Я
X °
X .W
” 1О
а
к
Я ,_, г-ч
3 5 х
ей ®
° X 
X
о
S
S
Я
а
я
я
с
2 пп
« и
S «
X и
я
я
«
3S
5
g
е
я
га
S
л
я
й
д
S
Е
rt
2
>&К
«<5
2 ® S
•° S S
E*g.3
га S ~
Э X Р<
•>. н о
й В
о
га
Z
w =
Й S .
х Ь . “
£. a 3 §
&tR I g
оЧо Е
С rU
я
Z
и
Н г>
ж
о
К
к
S
° X
7?
о
си
я
я
я
я
в
« й
о о
S в
R ~
X
Б
я
я
S
е
о
я
g
эЯ
о
я
5
Я
Я
X
_h
Я Я га
и
о
га
Я
я
я
я
я
я
ЗЯ
g
® § .
° ; s
эЯ
О
§&
с 5
В 8.
ё §
«
о
S
§
5 X
Ё I S£ g
п
§1 8.
§ О °
— R У0
£s82 е
c’SSz §ё
Й
к
CJ
2
о
ЗЯ
я х
и
зЯ
О
8
щ « И
я
g
S
W4
и
я S
В S £т*
ё В
1 и
X
я
я
S
я
8.
Я
X
Е
и и
8. S
X 8
ё =
я X „ „
8 § 8. §
Й
Я
га
X О
3 я
*ei
|с°1
5 s
О «
я о
я
ЗЯ
I
5
Ё
CD
в
я
я
я
я
в
я
8
я
&
я
8
ь «=
5 в
я
Си
(D К
§1
и
я
х §
Я О
5 §
я
ё
Си
О
X
я
м< а го рц
о 2 х га
22
7.	Промывают семена трижды дистиллированной стерильной водой (по
20 мл).
8.	Переносят их в новые стерильные чашки Петри (5 шг. на чашку).
9.	Держа стерильным пинцетом семя, с помощью стерильного скальпеля
делают два надреза таким образом, чтобы отслоилась оболочка и можно
было увидеть корешок.
10.	Изолируют кончики корешков (2—3 мм) и переносят их в чашки Петри
со стерильной дистиллированной водой (15 кончиков на чашку).
И. Переносят кончики корешков на среду для индукции каллусов (среда
ШХ с 10~s мкМ и-ХФУК, 2 - 10~6 2,4-Д, и 10~7 мкМ кинетина) (5 кон-
чиков на чашку). Запечатывают чашки парафилмом и переносят в темную
комнату на 25°C.
1.4.3. ИНДУКЦИЯ, СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ПОДДЕРЖАНИЕ КАЛЛУСА
В разделе 13 перечислены среды и способы подбора сред, пригод-
ных для получения и поддержания каллусных культур из тканевых
эксплантов большинства видов растений. Среды для получения каллу-
сов из более специализированных эксплантов (например, пыльцы,
эндосперма) могут потребовать специальных модификаций (см. гл. 2).
Так, в первых работах с культурой эндосперма кукурузы была обна-
ружена потребность в неизвестных компонентах, которых, как оказа-
лось, больше всего содержалось в томатном соке. В настоящее время
во многие среды для культивирования эндосперма вместо томатного
сока добавляют дрожжевой экстракт (табл. 1.8).
1.8. Модифицированная среда Уайта для выращивания культур эндосперма
Lohum multiflorum [12]
Компоненты	Молярность	Компоненты	Молярность
Основные неорганические питательные вещества		Микроэлементы	
Ca(NO3\  4Н2О	1,23 • 10 3	MnSO4-4Н2О	1,78 - 10's
KNO3	7,9 • 10 4	Н3ВО3	8,08 -10-6
MgSO4-7Н2О	2,96 • 10-3	ZnSO,-7Н2О	1,74 -10"6
ка	9,40 • 10-4	CuSO,-5Н2О	1,00 - ю-7
NaH2PO4 Na2 SO„ Органические вещества Никотиновая кислота Пиридоксин	1,16 • ю-2 1,42 • IO'3 1,00 • io-8 1,21 • IO"6	СоС12 -6Н2О Источник железа Цитрат железа Источник углерода	1,10- io-’ 4,07 • IO’5
Тиамин-НС1 Пантотенат кальция	7,10 • 10-' 5,30 • 10-7	Сахароза Регуляторы роста	1,17  10“*
Дрожжевой экстракт „Дифко”	0,5% (м/о)	ИУК	5,7 • 10-‘
Для получения каллуса в асептических условиях экспланты пере-
носят на агаризованную среду и слегка вдавливают их в агар для обес-
печения хорошего контакта со средой. Кончики корней легко образуют
каллус, если они помещены на агар горизонтально, тогда как сегменты
стебля лучше образуют каллус, если их поместить вертикально, одним
23
из концов погрузив в агар. Чашки Петри запечатывают с помощью
клингфилма, парафилма или полимерной клеящейся ленты, чтобы
предотвратить высыхание. Мы для индукции каллуса обычно инкуби-
руем экспланты в темноте при 25 °C, хотя можно проверить влияние
на рост слабого освещения.
При оптимально подобранной среде большая часть эксплантов
за 3—8 недель образует каллусы в количестве, достаточном для пере-
садки. Стерильным скальпелем срезают вновь образованный каллус
с исходного экспланта. Следует обратить внимание на размеры кусоч-
ков каллуса, переносимых на свежую агаризованную среду: если они
слишком малы, может быть угнетен дальнейший рост каллуса. Удачно
полученные линии каллусных культур потребуют регулярной пересадки,
примерно через каждые 4 недели. В качестве ориентира, например,
приведем каллус фасоли площадью около 4 см2, который при пересад-
ке можно разделить на 8—10 кусочков, что обеспечит в дальнейшем
успешный рост каллуса. Однако и здесь следует помнить, что оптималь-
ный размер пересаживаемого каллуса варьирует от вида к виду.
15. СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ
Суспензионные культуры клеток растений предоставляют био-
химику относительно гомогенную популяцию клеток, которые легко
подвергнуть воздействию химических веществ. Кроме того, эти клетки
растут при определенных, стерильных, условиях. Суспензионные куль-
туры клеток широко используются в качестве модельных систем для
изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экс-
прессии генов, деградации чужеродных соединений, а также как исход-
ный материал для очистки ферментов. Важным их преимуществом
при выделении ферментов или продуктов вторичного метаболизма
является отсутствие у большинства суспензионных культур хлорофилла
и каротиноидных пигментов. Для некоторых исследований предпочти-
тельнее использовать суспензии изолированных клеток мезофилла
листьев, поскольку они представляют собой лучший пример дифферен-
цированной ткани, чем клетки, полученные из каллуса [13]. Однако
такие суспензии невозможно поддерживать в течение длительного пе-
риода времени, и поэтому их обычно готовят для каждого эксперимента.
1.5.1. ПОЛУЧЕНИЕ СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬ ТУР ИЗ КАЛЛУСА
Большинство суспензионных культур можно получить путем пере-
носа кусочков рыхлого каллуса в перемешиваемую жидкую среду того
же состава, что и среда, на которой выращивался каллус. Желательно
переносить относительно крупные кусочки, поскольку это обеспечит
достаточно большое число отдельных клеток и (или) маленьких кусоч-
ков каллусной ткани в среде, необходимых для последующего роста
24
(см. ниже). Скорости вращения круговой качалки должны быть в
пределах 30—150 об/мин с амплитудой вращения 2—4 см. При первом
переносе на свежую среду удаляют крупные кусочки исходного каллуса
и крупные агрегаты клеток, пропуская материал через пипетку или
шприц с соответствующим отверстием. Можно также дать культуре
отстояться в течение короткого промежутка времени, а затем перенес-
ти клетки из верхнего слоя культуры. Определенные линии каллусных
культур растут в виде плотных комочков (например, у Vicia faba)
и их нелегко диссоциировать для получения суспензии. Однако в неко-
торых случаях после ряда пересадок каллус становится более рыхлым.
Для каждой линии культуры клеток существует минимальный
размер инокулума (числа пересеваемых клеток), при меньшем раз-
мере которого культура не растет. С уменьшением размера инокулума
увеличивается длина лаг-фазы. Однако часто рост суспензионной куль-
туры с низкой плотностью можно вызвать добавлением „кондициони-
рованной” среды. Такая среда, содержащая, по-видимому, необходимые
для роста метаболиты, выделяемые растущими клетками, может быть
приготовлена следующим образом:
1.	Переносят стерильно определенный объем быстрорастущей куль-
туры в диализную трубку, соединенную с концом стеклянной трубки
равного диаметра. Верх стеклянной трубки должен быть закрыт ватным
тампоном.
2.	Помещают диализную трубку в коническую колбу, содержащую
свежую питательную среду, таким образом, чтобы дно стеклянной
трубки находилось на уровне поверхности свежей среды, а диализная
трубка была бы полностью погружена в среду. Верх стеклянной трубки
должен находиться в горлышке конической колбы с ватной пробкой.
3.	Инкубируют на круговой качалке. Степень кондиционирования
свежей среды будет зависеть от: а) плотности активно растущей сус-
пензии; б) соотношения объемов суспензии и свежей среды; в) време-
ни инкубации.
1.5.2.	ПОЛУЧЕНИЕ СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР ИЗ КЛЕТОК МЕЗОФИЛЛА
ЛИСТА
Ниже приведен метод получения мезофилльных клеток из листьев
томата [13].
1.	Удаляют из молодых листьев жилки.
2.	Поверхность листьев стерилизуют в течение 10 мин, погружая их в 0,1%
раствор гипохлорита натрия, содержащего 0,05% (объем на объем) ти-
пола.
3.	Ополаскивают три раза в стерильной дистиллированной воде.
4.	Разрезают листья на полоски шириной 1 мм и обрабатывают под вакуумом
средой для мацерации (с) в течение 30 сек.
5.	Удаляют старую среду, затем добавляют свежую среду для мацерации и
инкубируют ткань при мягком перемешивании на магнитной мешалке в
течение 20 мин при 20 °C
25
6. Фильтруют через муслин для удаления не мацерированных кусочков ткани,
а изолированные клетки собирают на нейлоновом сите с размером пор
40 мкм.
7. Промывают и ресуспендируют клетки в среде для суспензионной куль-
туры (б)
(а) Среда для мацерации:
Компонент	Концентра-
ция, г/л
2 (N-Морфолино)этансульфоновая кислота (МЭС)	19,52
Сорбит	100,00
Поливинилпирролидон (мол. масса 40000)	20,00
K2SO4	2,20
Маце раза (полигалактуроназа Rhisopus)	10—30
pH 6,0 доводят pH МЭС с помощью КОН, добав-
ляют остальные компоненты и повторно проверя-
ют pH
(б) Среда для суспензионной культуры:
Компонент	Концентра-
ция, г/л
N-Трис (гидроксиметил)мстилглицин (трицин)	17,92
KNO3	0,50
Ca(NO)2	0,50
MgCl2	0,20
Сорбит	54-100
pH 8,4 — доводят pH трицина с помощью НС1,
добавляют остальные компоненты и повторно
проверяют pH
Подобные методы используют для получения клеток мезофилла
листьев табака [14]. При этом отмечалось, что добавление в среду для
мацерации 1% (масса к объему) декстрана сульфата калия (молеку-
лярная масса исходного декстрана 560, содержание серы 17,3%, произ-
водится фирмой Meito Sangyo Со., Ltd., Japan) увеличивает выход сво-
бодных клеток. Отбирая клетки, высвобождаемые из листьев табака
через разные промежутки времени, можно сначала приготовить фракции,
содержащие главным образом клетки губчатой паренхимы, а позднее —
клетки палисады [15].
1.5.3. СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА
Суспензионные культуры клеток обычно требуют регулярного и
более частого субкультивирования, чем каллусные культуры, из кото-
рых они получены. Субкультивирование включает в себя перенос в
стерильных условиях инокулята необходимого объема (см. выше)
на свежую среду с помощью: а) пипеток; б) проавтоклавированных
металлических шприцев (например, фирмы A. R. Howell Ltd., UK) или
в) просто переноса части культуры в новый сосуд с градуировкой объе-
ма до определенной отметки так, чтобы объем инокулята оставался
примерно одинаковым. Последний способ оказался единственно при-
емлемым для культур, содержащих крупные агрегаты клеток.
26
Рост суспензионных культур клеток можно оценивать по одному
или нескольким следующим параметрам:
1.	Объем осажденных клеток.
2.	Число клеток. .
3.	Сырая и сухая масса.
4.	Содержание белка и (или) ДНК.
5.	Проводимость среды.
6.	Жизнеспособность клеток.
1.5.3.1.	Объем осажденных клеток (ООК)
Переносят определенный объем суспензионной культуры в мерную
пластмассовую или стеклянную центрифужную пробирку объемом
15 мл. Лучше использовать конические пробирки. Центрифугируют
в бакет-роторе в течение 5 мин при 200 g. ООК — это величина, кото-
рую составляет объем осадка от объема суспензии; обычно выража-
ется в процентах.
1.5.3.2.	Число клеток
Число клеток в хорошо делящейся культуре может быть подсчита-
но прямо в камере Фукса—Розенталя. Однако большинство культур
обычно содержат агрегаты достаточно большого размера, и поэтому
подсчет клеток в каждом таком агрегате затруднителен. В таких случаях
добавляют к одному объему культуры два объема 8% (масса к объему)
водного раствора оксида хрома (III) и нагревают до 70 °C в течение
некоторого промежутка времени (обычно 2—15 мин), предварительно
подобранного экспериментально для каждой линии клеток. После
охлаждения культуру сильно встряхивают, чтобы распались комочки,
и далее считают число клеток по способу, описанному выше. В
некоторых случаях для разрушения комков клеток перед подсчетом
можно использовать 0,25% (объем к объему) пектиназу (Sigma
Chemical Со.).
.1.5.3.3. Сырая и сухая масса
Фильтруют суспензию клеток через предварительно смоченную
и взвешенную нейлоновую ткань или фильтровальную бумагу № 1 фир-
мы Ватман, вложенную в воронку Бюхнера, под слабым вакуумом.
Клетки промывают в дистиллированной воде, оттягивают воду под
вакуумом и вновь взвешивают клетки вместе с фильтром. Опре-
деление сухой массы проводят так же, только предварительно
взвешивают сухие фильтры; а затем клетки с сухим фильтром
высушивают в термостате при 60 °C до тех пор, пока их масса не станет
постоянной.
27
1.5.3.4.	Содержание белка и ДНК
Для определения содержания общего белка собирают клетки на
фильтре из стекловолокна фирмы Ватман и дважды промывают кипя-
щим 70% водным раствором этанола. Высушивают растительный мате-
риал ацетоном и затем переносят фильтр в раствор 1 М NaOH и нагре-
вают при 85 °C в течение 1,5 ч Фильтруют и определяют в фильтрате
гидролизованный белок по Лоури [16]. Концентрация белка в фильтра-
те не должна превышать 1 мг/мл.
Для определения содержания ДНК и РНК в культурах клеток
растений описано много методов. Они варьируют от простой экстракции
с помощью хлорной кислоты [17] до более сложных методов [18—20].
Культивируемые клетки растений содержат вещества (например, пекти-
ны) , которые сильно мешают спектрофотометрическому определению
содержания ДНК при использовании дифениламинового реагента. Метод,
описанный ниже [18], хотя он сложнее других, может оказаться удов-
летворительным для большинства клеточных культур, поскольку позво-
ляет одновременно анализировать несколько образцов. Описано приспо-
собление [21], которое позволяет проводить экстракцию сразу из мно-
гих образцов вплоть до стадии 7 (см. ниже). При использовании данного
метода рекомендуется работать с объемом, содержащим около 250 мг
исходного сухого вещества клеток.
1.	Собирают клетки, удалив среду с помощью фильтра из стекло-
волокна.
2.	Гомогенизируют клетки в 85% (объем к объему) метаноле
при 0—2 °C. Гомогенат центрифугируют или фильтруют.
3.	Остаток экстрагируют трижды порциями по 5 мл 10% (масса
к объему) трихлоруксусной кислотой при 2 С. Осадок сохра-
няют.
4.	Осадок дважды экстрагируют 90% (объем к объему) этанолом,
насыщенным безводным ацетатом натрия, при 2 °C.
5.	Затем экстрагируют 95% этанолом при 2 °C.
6.	Дважды экстрагируют в 7 мл смеси этанол : хлороформ (3:1)
при комнатной температуре.
7.	Дважды экстрагируют в 7 мл смеси этанол: эфир (11), затем
промывают эфиром и высушивают на воздухе. Сухой остаток
можно хранить при —20 °C для дальнейшего анализа.
8.	Экстрагируют осадок в 10 мл 0,3 М КОН при 37 °C в течение
16 ч. Осадок трижды промывают в 2 мл 0,5 М КОН. Сохраняют
надосадочную жидкость и смывы
9.	Охлаждают надосадочную жидкость и смывы до 0 С. pH до-
водят до 1,0 с помощью хлорной кислоты, затем добавляют
2 объема 95% (объем к объему) этанола. Оставляют на 2 ч при
0 °C.
28
10.	Надосадочная жидкость, полученная на предыдущей стадии,
представляет собой грубую фракцию РНК и после очистки [18]
может быть использована для спектрофотометрического опре-
деления РНК при 260 нм Осадок трижды экстрагируют в 5 мл
0,5 М хлорной кислоты в течение 20 мин при 70 °C. Определяют
содержание ДНК в этом экстракте, используя метод Бартона
с применением дифениламина [22].
1.5.3.5.	Проводимость среды
Для некоторых клеточных суспензионных культур (например,
петрушки и сои) проводимость среды обратно пропорциональна све-
жей массе клеток [23] (рис. 1.1). Такое изменение проводимости, по-
видимому, в основном происходит из-за потребления нитратов. Изме-
рения проводимости, которые могут быть проведены на различных
кондуктометрах, вероятно, можно шире применять для стандартного
определения отдельных стадий роста культур (например, в связи с
изменением активности ферментов или потенциала индукции фермен-
тов) после предварительных экспериментов, которые определили бы,
через какие промежутки времени происходят изменения в проводимо-
сти при исследуемых параметрах.
1.5.З.6.	Жизнеспособность клеток
Кроме изучения движения протоплазмы под микроскопом, так же
как и наличия интактного ядра, жизнеспособность клеток можно оце-
нивать и с помощью прижизненных красителей. Это могут быть веще-
ства, которые включаются интактными живыми клетками (например,
синий Эванса, 0,025% масса к объему), или вещества, участвующие в
метаболизме и способные или к флуоресценции (флуоресцеиндиацетат),
или к окрашиванию (соли тетразолия). Для количественного или полу-
количественного определения жизнеспособности клеток нельзя пола-
гаться на какой-нибудь один метод, поскольку разные методы позво-
ляют измерить различные парамет-
ры (например, в случае флуорес-
цеиндиацетата — активность эсте-
разы, а в случае солей тетразолия —
эффективность дыхания).
Рис. 1.1. Взаимосвязь между увеличе-
нием объема осажденных клеток (1)
и изменением проводимости (2) и кон-
центрации нитратов (J) в среде для
суспензии клеток сои [23].
29
Рис. 1.2. Определение переменных параметров для оценки жизнеспособности
клеток в суспензионных культурах Phaseolus vulgaris с использованием трифенил-
тетразолия хлорида (ТТХ) (описание метода приведено в тексте): А — время
инкубации; Б — pH; В - концентрация ТТХ (изменения каждого из параметров
показаны при оптимальных значениях двух других); Г - калибровочная кривая
для смеси живых и убитых нагреванием клеток; все точки представлены сред-
ними значениями из двух параллельных проб. М. А. М. S. Hamdan (неопублико-
ванные данные).
Добавляют флуоресцеиндиацетат к суспензиям клеток до конечной
концентрации 0,01%. Исходный раствор (0,5% масса к объему) можно
приготовить на ацетоне и хранить при +4 °C. Примерно после пятиминут-
ной инкубации клетки просматривают под флуоресцентным микроско-
пом. При освещении ультрафиолетовым светом флуоресцирующие
продукты живых клеток образуют зеленое свечение.
Для оценки жизнедеятельности клеток может применяться следую-
щий метод, который требует использования 2,3,5-трифенилтетразолия
хлорида (ТТХ).
1.	Готовят одинаковые образцы, содержащие равные объемы осаж-
денных клеток, соответствующие 1—1,5 г свежей массы клеток
суспензионной культуры, как описано выше. Для более точного
определения количества клеток их можно профильтровать и
30
для повторных опытов использовать одинаковые навески. Если
для оценки количества клеток используют ООК, среду для куль-
тивирования следует слить.
2.	Добавляют 8 мл 0,05 М КН2РО4 при оптимальном pH и опти-
мальной концентрации ТТХ (см. ниже). Инкубируют без встря-
хивания на водяной бане в темноте при 20 °C в течение определен-
ного промежутка времени (см. ниже).
3.	Образцы клеток центрифугируют в центрифуге с бакет-ротором
при 2000 g. Удаляют пастеровской пипеткой надосадочную жид-
кость.
4.	Экстрагируют водонерастворимый красный формазан путем
нагревания в течение 5—15 мин при 60 °C с 3 мл 95% этанола.
Охлаждают в течение 15 мин.
5.	Центрифугируют образцы в течение 1 мин при 5000 g. Измеряют
поглощение надосадочной жидкости при длине волны 485 нм.
Прежде чем использовать этот метод для анализа какой-либо линии
клеточной суспензионной культуры, подбирают pH инкубационного
буфера, концентрацию ТТХ и время инкубации. Затем проверяют
воспроизводимость путем построения калибровочной кривой для смеси
живых и убитых нагреванием клеток. Результаты таких предваритель-
ных экспериментов для суспензионных культур фасоли Phaseolus vul-
garis представлены на рисунке 1.2.
ЛИТЕРАТУРА
1.	Street, Н. Е., ed. (1973) Plant Tissue and Cell Culture, published by Blackwell,
Oxford.
2.	De Fossard, R. A. (1976) Tissue Culture for Plant Propagators, published by
University New England, Armidale, Australia.
3.	Biondi, S. and Thorpe, T. A. (1981) inPlant Tissue Culture: Methods and Appli-
cations in Agriculture, Thorpe, T. A. (ed.), Academic Press, New York, p. 1.
4.	Bhojwani, S. S. and Razdan, M. K. (1983) Plant Tissue Culture, Theory and
Practice, published by Elsevier, Amsterdam.
5.	Evans, D. A., Sharp, W. R., Ammirato, P. V. and Yamada, Y., eds. (1983) Hand-
book of Plant Cell Culture, Volume I, published by Macmillan, New York.
6.	Schenk, R. U. and Hildebrandt, A. C. (1972) Can. J. Bot., 50,199.
7.	Dixon, R. A. and Fuller, K. W. (1976) Physiol. Plant Pathol., 9, 299.
8.	Thomas, E., Brettell, R., Potrykus, I. and Wernicke, W. (1980) in Tissue Culture
Methods for Plant Pathologists, Ingram, D. S. and Helgeson, J. P. (eds.), Blackwell,
Oxford, p. 41.
9.	Flick, С. E., Evans, D. A. and Sharp, W. R. (1983) in Handbook of Plant Cell
Culture, Volume I, Evans, D. A., Sharp, W. R., Ammirato, P. V. and Yamada, Y. (eds.),
Macmillan, New York, p. 13.
10.	Tamaoki, T. and Ullstrup, A. J. (1958) Bull. Torrey Bot. Club, 85,260.
11.	Yeoman, M. M. (1973) in Plant Tissue and Cell Culture, Street, H. E. (ed.),
Blackwell, Oxford, p. 31.
12.	Smith, M. M. and Stone, B. A. (1973) Aust. J. Biol. Sei., 26,123.
31
13.	Callow, J. A. and Dow, J. M. (1980) in Tissue Culture Methods for Plant Patho-
logists, Ingram, D. S. and Helgeson, J. P. (eds.), Blackwell, Oxford, p. 197.
14.	Evans, P. K. and Cocking, E. C. (1975) in New Techniques in Biophysics and
Cell Biology, Vol. 2, Pain, R. H. and Smith, B. J. (eds.), John Wiley, London, p. 127.
15.	Takebe, I., Otsuki, Y. and Aoki, S. (1968) Plant Cell Physiol., 9,115.
16.	Lowry, О. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J. (1951) J. Biol.
Chem., 193, 265.
17.	Grant, M. E. and Fuller, K. W. (1971) J. Exp. Bot., 22,49.
18.	Holdgate, D. P. and Goodwin, T. W. (1965) Phytochemistry, 4, 831.
19.	Short, К. C., Brown, E. G. and Street, H. E. (1969) J. Exp. Bot., 20, 579.
20.	Yeoman, M. M. and Mitchell, J. P. (1970) Ann. Bot., 34,799.
21.	Davies, M. E. (1971) Plant Physiol., 47,38.
22.	Burton, K. (1955) Biochem. J., 62, 315.
23.	Hahlbrock, K., Ebel, J., Oaks, A., Auden, J. and Liersch, M. (1974) Planta,
118,75.
1. КУЛЬТУРЫ ГАПЛОИДНЫХ КЛЕТОК
ДЖ. М. ДАНВЕЛЛ
2.1.	ВВЕДЕНИЕ
Гаплоиды — это растения, в клетках которых содержится половин-
ный (как в гаметах), а не соматический набор хромосом. Получают
их различными способами, многие из них основаны на аномальном
развитии зародыша, приводящем к появлению „близнецов” — явлению,
называемому семигамией, или двойным проростком. В данной главе
спонтанные методы образования гаплоидов не рассматриваются. Основ-
ное внимание уделено методам культивирования незрелой пыльцы
(микроспор). Получение гаплоидных растений из женского гамето-
фита — культивируемые завязи и семяпочки — описано в других об-
зорах [1,2].
2.1.1.	СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИЙ
Основной интерес к гаплоидам связан с возможностью их исполь-
зования в качестве посредников для получения гомозиготных растений,
образуемых удвоением числа хромосом. Такой быстрый путь достиже-
ния гомозиготности предоставляет большие возможности для селекции
растений по сравнению с альтернативным путем, состоящим в повтор-
ных циклах инбредных скрещиваний самоопыляемых культур. У пере-
крестноопыляемых видов дигаплоиды скорее всего могут применяться
в качестве родителей для получения гибридов в результате простых
или двойных скрещиваний [3,4].
2J.2. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Гаплоидия может широко применяться при количественном гене-
тическом анализе сельскохозяйственных растений. Такой анализ вклю-
чает изучение взаимодействия генов и генетической изменчивости,
определение групп сцепления, установление числа генов, действующих
на количественные признаки, а также локализации полигенов [5].
2.1.3.	ИССЛЕДОВАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК И СМЕНА ПОКОЛЕНИЙ
У определенных видов растений, в частности у многих злаков,
микроспора представляет собой единственную легко доступную инди-
видуальную тотипотентную клетку. Эта гаплоидная клетка дает уни-
кальные преимущества при изучении деления и дифференцировки кле-
ток [6].
2 - 1021
33
Отклонение незрелого гаметофита от нормального пути развития
и переход к спорофитному типу развития в условиях in vitro позволяет
наблюдать смену поколений и изучать дифференциальную экспрессию
и регуляцию генов в течение двух фаз жизненного цикла.
2.2.	МЕТОД КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЫЛЬНИКОВ И ПЫЛЬЦЫ
Более чем у 200 видов растений из микроспор удалось получить
целые растения или линии клеток, в частности у представителей семейств
Gramineae и Solanaceae [1,7—10]. Иногда считают, что такие растения-
регенеранты или линии клеток всегда гаплоидны, однако это не сов-
сем правильно, поскольку на ранних стадиях культивирования может
произойти мультипликация генома (см. разд. 2.2.3). Методы, с помощью
которых индуцируют деление и регенерацию незрелой пыльцы, можно
разделить на методы культуры пыльников, при которых пыльца содер-
жится внутри соматических тканей пыльника, и методы культуры пыль-
цы, при которых эти соматические ткани удаляются.
2.2.1.	КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ
При использовании этого наиболее важного и распространенного
метода у растений изолируют пыльники, содержащие пыльцу, и перено-
сят их на среду для культивирования. У некоторых пыльников часть
микроспор выживает и развивается. При оценке относительной при-
годности методик и результатов экспериментов необходимо применять
один и тот же обсчет конечных результатов. В каждом эксперименте
измеряют несколько параметров, хотя не все они оцениваются. Основ-
ные параметры — число пыльников/бутонов (флоральных почек), из
которых образуются возникающие иэ микроспор каллусы, зародыши
или растения. Пыльники, не образующие подобных структур, следует
исследовать микроскопически, чтобы выявить в микроспорах первые
клеточные деления, и при их наличии оценить, какая часть микроспор
начала делиться (рис. 2.1, А). Этот процесс начального деления клеток
обычно называется „индукцией” в отличие от „продукции” — процесса
формирования из пыльников растений или зародышей (рис 2.1, Б).
В дальнейшем мы увидим, что отдельные компоненты, определяющие
конечный выход растений, подвергаются различным воздействиям
и по-разному реагируют на многочисленные приемы культивирования.
Будут рассмотрены и основные факторы, определяющие конечный
выход растений.
2.2.1.1.	Условия выращивания донорных растений
Условия выращивания растений-доноров, из которых получают
культивируемые пыльники, оказывают сильное влияние на выход про-
34
Рис. 2.1. Культура пыльников рапса. Л. Микроспоры, окрашенные ацетокармином;
видно большое число делений, индуцированных в культуре. Б. Культура (3 мл
жидкой среды в чашке Петри диаметром 30 мм) шести пыльников из одного
бутона; общий выход из этого бутона составил примерно 1000 зародышей.
2.1. Влияние температуры выращивания и продолжительности инкубации иа
выход зародышей из микроспор Brassica napus ssp. oleifera
Число зародышей
Генотип	Температура выращи- вания растений, °C		Длительность инкубации (t = 35 °C), дни				
	15	20	0	1	2	3	Всего
1А	48	33	0	5	35	41	81
1В	298	43	0	9	299	33	341
1С	87	37	0	17	9	98	124
1D	225	69	0	108	144	42	294
2А	94	35	0	1	101	27	129
2В	44	24	0	13	47	8	68
2С	112	74	0	49	96	41	186
2D	124	7	0	38	65	28	131
ЗА	212	96	0	9	112	187	308
ЗВ	124	2	0	11	79	36	126
ЗЕ	174	8	0	6	112	64	182
Всего	1542	428	0	266	1099	605	1970
дуктов аномального развития микроспор [1, 2], и, следовательно, вос-
производимые результаты могут быть получены лишь при выращива-
нии растений в контролируемых условиях окружающей среды: темпе-
ратуре, фотопериодичности и интенсивности света. Соблюдение этого
правила позволит исключить разбросы результатов, обусловленные
этим фактором. Для каждого вида оптимальные требования различа-
ются, и поэтому не существует единых общих рекомендаций. Наиболее
детальные исследования условий выращивания были проведены на
табаке Nicotiana tabacum [11] и выявлены оптимальные требования:
короткий день (8 ч) и высокая интенсивность света (11000 лк). Для
ячменя Hordeum vulgare [12, 13] рекомендуют пониженные температуры
(12°C) и высокую интенсивность света (20000 лк). Для представите-
лей рода Brassica, который также хорошо изучен [14, 15], рекомендуют
использовать свет высокой интенсивности, температурный режим зави-
сит от вида. Данные, полученные для гибридов озимого рапса с высо-
ким содержанием масла в семенах Brassica napus ssp. oleifera (табл. 2.1),
показывают, что наибольший выход зародышей из микроспор в куль-
туре пыльников получается при выращивании растений при 15 °C, но
не 20 °C. Метод [16], обеспечивающий получение стандартизованного
материала из ржи Secale cereale, приведен ниже.
Стандартизация донорного материала Secale cereale для получения стериль-
ных пыльников для культивирования in vitro [16].
1.	После яровизации растения выращивают до цветения при 20°С и 16 ч
освещения (6000 лк) и 8 чтемиотыпри 18°С.
2.	Колосья собирают в период, когда они еще закрыты флаговыми листьями.
3. Стерилизуют поверхность ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле.
36
рис- 2-2- Схемы развития пыльцы у
fficotiana tabacum и Hordeum vulgare.
Диаграммы показывают последователь-
ность высвобождения четырех микро-
спор из тетрады, увеличение микро-
©©
©©
NICOTIAN A TABACUM	1 -й МПЗ
споры за счет вакуолизации, вызы-
вающее миграцию ядра к стенке пыльцы
(у Н. vulgare это место находится на
стороне клетки, противоположной поре,
которая при развитии остается при-
клепленной к тапетуму). Затем про-
исходит неравный первый митоз пыль-
цевого зерна, в результате обособляется
маленькая генеративная клетка за
счет образования полукруглой клеточ-
ной стенки, отделяющей ее от большой
вегетативной клетки, содержащей боль-
шую часть цитоплазмы микроспоры.
При созревании пыльцевого зерна гене-
ративная клетка отделяется от стенки
пыльцы и занимает определенное по-
ложение внутри вегетативной клетки,
перемещаясь внутрь цитоплазмы За
это время цитоплазма теряет свои
вакуоли и активно синтезирует белок
и РНК. Пыльца N. tabacum высыпается
на этой стадии двух клеток, а второй
митоз пыльцевого зерна (второй МПЗ)
уже происходит в пыльцевой трубке
после прорастания зерна. В отличие
от этого у Н. vulgare второй МПЗ происходит до окончательного созревания пыль-
цы и в результате пальца высыпается тогда, когда содержит два спермия вместе
с вегетативным ядром.
4.	Погружают отрезанный конец колоса в жидкую среду Нича и Ничв колбы
на 100 мл или 250 мл.
5.	Колос, а также горлышко колбы закрывают стерильными пластиковыми
пакетами.
6.	Плотно запечатывают липкой лентой.
7.	Инкубируют при 26 °C и 12-часовом дне (7000 лк).
8.	Развитие пыльцы контролируют на давленых препаратах одиночных пыль-
ников из отдельного цветка, окрашенных в ацетокармине.
9.	Когда пыльца окажется на стадии первого МПЗ, колбы с погруженными
в питательную среду колосьями переносят в темный холодильник (6 °C)
на 6-10 дней.
10.	Культивируют пыльники на питательной среде для картофеля (см.
табл. 2.3), содержащей 2,4-Д (1-2 мг/л).
2,2.1.2.	Возраст растений-доноров
Рекомендуется изолировать бутоны с растений, находящихся в
начале периода цветения. Если необходимо продолжать эксперименты
в течение длительного периода, то неиспользованные бутоны должны
быть удалены с растения и помещены в условия, замедляющие созре-
вание пыльцы.
37
2.2.1.3. Стадия развития пыльцы
Крайне важно подобрать оптимальную стадию развития пыльцы
к моменту изолирования бутона. Эта стадия для раэных:видов отлича-
ется. У табака [17—19] наилучшие результаты получаются, когда пыльца
находится на стадии первого митоза пыльцевого зерна (МПЗ), а у злаков
[1, 20] и различных видов Brassica оптимальной является ранняя одно-
ядерная стадия развития пыльцы (рис. 2.2). В таблице 2.2 представлены
данные для пыльников рапса, изолированных на четырех стадиях раз-
вития пыльцы от ранней одноядерной стадии до первого МПЗ.
2.2. Влияние степени созревания пыльцы на индукцию и рост зародышей
Brassica napus ssp. oleifera, полученных из микроспор
	X 2	X 2	а
	2* ф	2 ф	1
S		СХ	В
S	S Й	S В	а
и ф	S	S	S
р. m о	л К	Р. g	
о К § се	2	*	£ S-	О ?	°	к Б	5	2	О S	h £ s 5 е
^4	Л	S >.	S л	
о	К	55м Ю	ЕГ К	►г о
2 £		2		X 2			св а	’S л S	
св в О сх		№ в S >		а §		>s ф Б й	ф а а	ф сх S в S	
	Я	Й		И	в	о	о		
й	о	о	О-	о	о	СХ		л	—
S	X	о.		сх		св	rt"	К	
S о	S к	С О	В О S	к о	S к	М О	М О	к	1
Е о S	л Б л	5 S	о н	к ф S	л Б л	К и а	5 S	а §	5 л
	с	ЕГ	о	tr	к	0м	ЕГ	о	с
Ранняя одноядерная	26	130	73,1	48,5	26,9	13,1	421	3,24
Средняя одноядер- ная	31	155	83,9	42,6	19,4	9,0	405	2,61
Поздняя одноядер- ная	86	430	72,1	43,0	9,3	4,9	100	0,23
1-й МПЗ	15	75	53,3	29,3	6,7	1,3	2	0,03
Методы окрашивания. Для постоянно высокого выхода
крайне важно определять оптимальную для культивирования стадию
развития пыльцы. Для анализа стадий развития пыльцы существует
несколько методов окрашивания. Наиболее часто используют ацето-
кармин (4%, масса к объему, кармина в 50%, объем к объему, ледяной
уксусной кислоте залить на 8 ч, профильтровать и хранить в темной
бутылке). Жизнеспособность пыльцы можно определить после окраши-
вания флуоресцеиндиацетатом [21], а также другими способами (см.
ниже).
Оценка жизнеспособности пыльцы с помощью флуоресцеиндиацетата [21]
1. Готовят исходный раствор, растворив 2 мг флуоресцеиндиацетата в 1 мл
ацетона. Этот раствор необходимо хранить в темноте в холодильнике.
2. Готовят водный раствор, добавляя по каплям исходный раствор к раст-
вору сахарозы определенной концентрации (подобранной заранее, чтобы
свести к минимуму возможность осмотического разрушения пыльцы)
38
до появления устойчивой мути. Этот водный раствор всегда должен быть
свежеприготовленным.
3. Помещают пыльцу в этот раствор, оставляют на некоторое время для
окрашивания и исследуют под флуоресцентным микроскопом.
Изучение фертильности пыльцы с помощью железного кармина в гли-
церине [22]
1.	Готовят исходный раствор, добавив 0,25 г порошка кармина к 50 мл
подогретого глицерина. Тщательно перемешивают, чтобы получить гомо-
генную суспензию, после того как глицерин остынет.
2.	Добавляют 40 мл 45% уксусной кислоты к 20 мл подогретого исходного
раствора.
3.	Помещают на кипящую водяную баню и оставляют в ней до тех пор, пока
раствор не станет прозрачным и кармин не растворится полностью (про-
веряют под микроскопом).
4.	Добавляют 4 мл насыщенного раствора ацетата железа в 45% уксусной
кислоте.
5.	Мацерируют пыльник в капле среды, удаляют остатки стенки пыльника
и покачивают каплю, чтобы равномерно распределить пыльцу.
6.	Накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом.
Проведение дифференциальной окраски стерильной и фертильной пыльцы [23]
1. Смешивают следующие ингредиенты в указанном порядке.
Этанол (95%)
Малахитовый зеленый
Дистиллированная вода
Глицерин
Фенол
Хлоральгидрат
Кислый фуксин
10 мл
10 мл (1 мл 1% масса/обьем раствора
в 95 % этаноле)
50 мл
25 мл
5 г
5 г
50 мг (5 мг 1 %, масса к объему, раствора
в воде)
5 мг (0,5 мл 1%, масса к объему, раст-
вора в воде)
1—4 мл (объем возрастает с увеличением
толщины стенок пыльцы)
Оранж G
Ледяная уксусная кислота
2.
3.
4.
5.
красителя, накрывают покровным стеклом.
Хранят в темной бутыли
Помещают пыльцу в каплю
Подогревают над небольшим пламенем.
Стерильная пыльца окрашивается в зеленый цвет, а фертильная - от крас-
ного до интенсивно-красного, в зависимости от количества уксусной
кислоты в смеси.
Определение жизнеспособности пыльцы по содержанию пролина [24]
1.	К 20 мл ацетона добавляют 0,2 мл ледяной уксусной кислоты и 0,2 г
изатина.
2.	На предметном стекле смешивают пылщу с тремя каплями этого реактива.
3.	После 5-минутного окрашивания препарат прогревают в течение 10 мин
при 90 ° С.
4.	С помощью влажной ваты удаляют излишки красителя с высохшей капли-
5.	Тщательно перемешивают пыльцу на предметном стекле в капле глицерина
с помощью стеклянной палочки.
6.	Накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом; фертиль-
ная пыльца реагирует с изатином и окрашивается в интенсивно-темно-
синий цвет.
39
2.2.1.4.	Методы стерилизации
Перед культивированием изолированных пыльников после сте-
рилизации наружной поверхности бутона удаляют окружающие ткани
цветка, а где необходимо, и листья. У злаков необходимо протереть
90% этанолом флаговый лист. Дня большинства видов стерилизацию
проводят в растворе гипохлорита (1% активного хлора), содержащем
смачивающее вещество, в течение 10 мин. Можно использовать 5%
раствор препарата „доместос” (Lever Bros.). Для стерилизации пыль-
ников злаков, у которых пыльца достигает оптимальной стадии раз-
вития после появления цветков, можно использовать описанный ранее
метод (см. стр. 36).
2.2.1.5.	Предварительная обработка бутонов или пыльников
Для многих видов максимальный выход образующегося из микро-
спор материала был получен из пыльников, которые перед культивиро-
ванием выдерживались при определенной температуре. Для ячменя,
например, предварительное выдерживание составляло 28 дней при
4 °C или 14 дней при 7 °C [25]. Такая предварительная обработка может
быть применима к колосьям, колоскам или даже к изолированным
пыльникам. Необходимо следить за тем, чтобы в течение предваритель-
ной обработки на них не попадала вода. Рекомендуется поместить целый,
с удаленной осью, колос в одну из половин перегороженной чашки
Петри (Sterilin 502), в другую половину чашки налить 5 мл воды для
поддержания высокой влажности. Чашку запечатывают пленкой (Nesco-
film, Fisons) и хранят в темноте в холодильнике.
Высокого выхода материала, как показано на некоторых видах,
можно достичь, если пыльники после помещения их на среду для куль-
тивирования обработать холодом. В ряде случаев такой подход, по-
видимому, удобнее и быстрее, поскольку отпадает необходимость
предварительной инкубации. К сожалению, не существует стандартной
предварительной обработки, которую можно было бы рекомендовать;
для каждого вида необходимо определить оптимальную точную темпе-
ратуру и время инкубации. Эти переменные величины зависят также
от стадии развития пыльцы и времени ее сбора, причем для пыльцы,
находящейся на более поздних стадиях развития, обычно используют
более короткое время предынкубации.
2.2.1.6.	Методы препарирования
Пыльники большинства видов растений обладают достаточным
размером и поэтому относительно легко могут быть извлечены из цвет-
ков. Однако у некоторых видов, например у тропических злаков, при-
надлежащих к родам Panicum, Pennisetum, Setaria, препарирование слож-
40
ных соцветий для удаления крошечных пыльников представляет собой
утомительную и длительную процедуру. В таком случае рекомендуется
культивировать соцветия полностью. Для большей эффективности
желательно медленно покачивать их в жидкой среде (см. след, разд.,
а также [1]).
2.2.1.7.	Среда для культивирования
Хотя среду часто считают наиболее важным фактором при культи-
вировании, ее состав зависит в первую очередь от разнообразных усло-
вий выращивания и стадии развития пыльцы. Ниже рассмотрены раз-
личные компоненты среды.
Твердая или жидкая. Уже давно известно, что большинство
типов агара, используемого для твердых сред, содержит вещества,
оказывающие вредное действие на выживаемость пыльцы. Поэтому
для достижения максимального выхода следует избегать применения
агара или, по крайней мере, тщательно промывать его дистиллированной
водой. В качестве альтернативы можно использовать агарозу. Например,
для ячменя [13] наиболее эффективна агароза Sea Plaque (FMC). Кроме
того, можно использовать жидкую среду. Однако, хотя на жидкой
среде довольно высокий выход каллусов из микроспор, эффективность
регенерации часто гораздо ниже, что является определенным недостат-
ком. Предполагают, что это связано с условиями анаэробиоза, подав-
ляющего рост каллусов, погруженных в жидкость. При работе с ячме-
нем для повышения плавучести каллусов было рекомендовано добав-
лять фиколл (200 г/л) [26], однако это нуждается в дальнейших
исследованиях.
Для некоторых видов, например Nicotiana, Anemone, Clematis и
Papaver, применялась двухфазная система [27]. При этом методе пыль-
ники флотировали в 4 мл жидкой среды, наслоенной на 5 мл агаризо-
ванной среды, содержавшей активированный уголь (5%), в чашке
Петри (диаметром 50 мм) (см. разд. 2.2.1.7, а также [7]).
Осмотическое давление. До сих пор, хотя это одна из 
наиболее важных переменных в составе среды, существует весьма огра-
ниченная информация, на которой можно основываться, меняя рекомен-
дуемую среду. В результате многочисленных исследований по культи-
вированию пыльников растения были разделены на две группы: первая —
с оптимальным выходом при росте на низких концентрациях сахарозы
(2—4%) и вторая — с лучшими результатами при более высоких ее кон-
центрациях (8.-12%). Такое подразделение, по-видимому, связано с изве-
стным делением зрелой пыльцы на двухклеточную (у Soloanaceae, Lilia-
сеае) и трехклеточную (у Gramineae, Cruciferae). Первая группа требует
условий с низким осмотическим давлением, а вторая — с высоким.
Неорганические соли. Систематизированные данные о
влиянии этих компонентов на эффективность среды для культивиро-
41
вания малочисленны Обычно среду составляют по прописи Мурасиге
и Скуга (см. гл. 1, табл. 1.1), хотя для культивирования пыльников
злаков были разработаны среды N6 [28] и среда с экстрактом карто-
феля [29] (табл. 2.3). * ***
2.3. Среды для культивирования пыльников и пыльцы*
Соединение	N6 [28]	Карто- фельная среда 129 J	Модифи- цирован- ная среда МС для ячменя (20]	Solana- сеае [18]	Brassica [15]
KNO3	2830	1000	1900	950	2500
NH4NO3	—	—	165	825	—
MgSO4-7Н2О	185	125	370	185	250
СаС12 • 2H3O	166	—	440	220	750
KC1	—	35	—	—	—
KH2PO4	400	200	170	85	—
NaH2PO4 H2O	—	—	—	—	150
(NH4)2SO„	463	100	—	—	134
Ca(NO3)3 -4H2O	—	100	—	—	—
MnSO4 • H2O	—	—	22,3	11,2	10
H3BO3	—	—	6,2	3,1	3
ZnSO4 - 7H2O	—	—	8,6	4,3	2
Na3 MoO4 - 2H2O	—	—	0,25	0,13	0,35
CuSO„ -5H2O	—	—	0,025	0,013	0,025
CoCl2 -6H2O	—	—	—	0,013	0,025
KI	0,8	—	0,83	0,4	0,8
Никотиновая кислота	0,5	—	—	0,25	1,0
Тиамин-HCl	1,0	1,0	0,4	0,05	10
Пиридоксин	0,5	—	—	0,25	1,0
Мезоинозит	—	—	100	5000***	100
Глиции	2,0	—	—	1,0	—
НаТеЭДТА	37	37	40	40	40
L-Глутамин	—	—	—	800***	800
L-Серин	—	—	—	100***	100
НУК	—	—	—	—	0,1
2,4-Д	1Л	1,5	—	—	0,1
НУК	—	—	1,0	—	—
БАП	—	—	1,0	—	—
Кинетин	0,5	0,5	—	—	—
Сахароза, г/л	100	100	60	20	100
КЗ**	—	10%	—	—	—
* Концентрации даны в мг/л, за исключением оговоренных особо.
** Картофельный экстракт (100 г ткани клубня прокипячено в воде, от-
фильтровано и охлаждено).
*** Рекомендуется включать в среду для культивирования пыльцы.
Витамины. В данном случае также используют обычные смеси
по прописи среды Мурасиге и Скуга. Доказательства того, что эти ве-
42
щества действительно необходимы для индукции и роста каллуса из
микроспор и зародышей, отсутствуют.
Гормоны. Все виды растений подразделяют на требующие до-
бавок гормонов в среду для культивирования пыльников (Gramineae,
Cruciferae) и, по-видимому, гормон-независимые (Solanaceae). Однако
при оптимальных условиях на среде без гормонов могут развиваться
пыльники первой группы, по крайней мере,’ на первых стадиях культи-
вирования. Возможно, более детальные исследования покажут, что
срок обработки пыльников гормонами следует сократить. Для гормон-
зависимых видов специфические концентрации и комбинации гормонов
в среде, по-видимому, не важны. Например, для ячменя хорошие резуль-
таты получаются при использовании либо сочетания кинетина (0,5 мг/л)
с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (1,5 мг/л) [25], либо 6-бензи-
ламинопурина (1,0 мг/л) с индолилуксусной кислотой (1 мг/л) [20].
Невозможно дать какие-либо четкие рекомендации по потребностям
других видов.
Органические вещества и другие источники
азота. Добавление питательных веществ неопределенного состава,
таких, как экстракт клубней картофеля, или определенных амино-
кислотных добавок, особенно глутамина, благоприятно сказывается
на культивировании пыльников некоторых видов. Особенно широко
для пыльников злаков использовали картофельную среду [29]. При
работе с ячменем было показано, что, хотя такая среда и может спо-
собствовать индукции большого числа каллусов из микроспор, их
длительное развитие происходит лучше на смесях солей с повышенной
концентрацией [13]. Более того, желательно избегать использования
сред неизвестного состава, если в эксперименте необходимы воспро-
изводимые результаты. Например, известно, что на эффективность
такой среды значительно влияют сорт, источник и возраст клубней,
используемых для получения картофельной среды [30].
Другие соединения. Другим макрокомпонентом, который
часто рекомендуется для культур пыльников, является активированный
уголь. Это вещество значительно меняет среду для культивирования:
адсорбирует гормоны, витамины и железо, а также фенолы, часто выде-
ляемые стареющими тканями в культуру. Таким образом, точно его
эффект изучить невозможно. К видам, для которых рекомендуется
добавка активированного угля, относятся картофель (добавляют 0,5%
к среде МС, содержащей 6% сахарозу и 1 мг/л БАП) [30] и Lolium
(0,2%). Активированный уголь добавляется также в нижний агар-
содержащий слой, если используется двухфазная система, описанная
выше (разд. 2.2.1.7, [1]).
2.2.1.8.	Условия инкубирования
Т е мпература. Это один из наиболее важных параметров при
культивировании. Пыльники большинства видов растений, включая
43
представителей Solanaceae, дают адекватный ответ при температуре
культивирования 25 С. Однако некоторые виды, особенно принадле-
жащие к роду Brassica, требуют более специфических температур, и
большая часть из них хорошо реагирует на кратковременное выдержи-
вание при 35 °C или даже при более высоких температурах. В таблице
2.1 показана реакция пыльников нескольких гибридов первого поко-
ления озимого рапса, который необходимо инкубировать, по крайней
мере, в течение одного дня при 35 °C. Пыльники перца {Capsicum ап-
пиит) также требуют такой высокой температурной обработки.
Свет. Достоверных доказательств действия света на культуру
пыльников почти нет. Обычно рекомендуется выращивать их в темноте
до появления из микроспор зародышей или каллусов.
Сосуд для культивирования. Единственное системати-
ческое исследование этого параметра было проведено на пыльниках
табака [31]. Наилучшие результаты были получены при культивирова-
нии в сосудах, содержавших 5 мл воздуха на 1 пыльник (рис. 2.3).
При культивировании в сосудах большего и особенно меньшего раз-
мера результат был значительно хуже.
Ориентация экспланта. Ориентацию пыльника к поверх-
ности среды обычно не контролируют и не описывают в исследованиях.
Однако для табака и Datura показано, что наилучших результатов дости-
Рис. 2.3. Число индуцированных пыльников, пыльников с регенерантами, общее
число полученных растений и среднее число растений-регенерантов, образующихся
из одного пыльника, у табака White Burley и Wisconsin 38 в зависимости от объема
сосуда для культивирования.
44
гают при размещении пыльника на поверхности среды плашмя. Для
пыльников Brassica рекомендуют, чтобы „наружняя плоская часть”
соприкасалась со средой [15].
Плотность посадки пыльников. Сведения о том, что
это важный параметр, определяющий реакцию культуры, опубликованы
только для ячменя. Рекомендуют при использовании жидкой среды
в каждый миллилитр помещать, по крайней мере, 60 пыльников. С
другой стороны, среду для пыльников можно подготовить, предвари-
тельно проинкубировав в ней другую ткань ячменя. Наиболее пригод-
ным в этом отношений объектом, судя по эффективности на единицу
сырой массы, являются семяпочки. После их инкубирования число
пыльников в расчете на 1 мл среды может быть существенно снижено.
2.2.1.9.	Пересадка каллусов или зародышей, полученных из микроспор
У большинства видов пасленовых микроспоры, в которых прохо-
дит деление клеток, образуют эмбриоиды, формирующиеся на поверх-
ности пыльников, и поэтому для развития корней и побегов их следует
лишь перенести на среду с пониженным содержанием сахарозы (1%).
Растения-регенеранты затем можно пересадить на компост, тщательно
отмыв корни от налипшего агара. У злаков обычно развитие происходит
через образование каллуса. Маленькие каллусы (1—2 мм диаметром)
для индукции роста побегов и корней необходимо перенести на среду
с пониженным содержанием сахарозы (2—3%) и гормонов (ИУК
0,4 мг/л, БАП 0,4 мг/л). Хотя у видов рода Brassica изначальное развитие
происходит через образование зародышей, большинство из них не способ-
ны развиваться нормально после переноса на свежую среду (МС с 0,02 мг/л
ПУК, ] мг/л БАП) и вместо этого формируют вторичные зародыши из
гипокотиля. Эти вторичные зародыши и следует пересаживать, посколь-
ку именно из них в конечном счете и разовьются нормальные растения.
2.2.2.	КУЛЬТУРА ПЫЛЬЦЫ
Несмотря на теоретическую привлекательность возможности уда-
лять соматические ткани пыльника и культивировать отдельные микро-
споры, такой метод применитсяен лишь для отдельных видов растений,
таких, как Datura, Petunia, Nicotiana, Brassica.
Однако даже у них конечный выход растений-регенерантов на один
пыльник обычно ниже, чем из микроспор, развивающихся внутри пыль-
ника. У остальных видов, особенно у злаков, микроспоры невозможно
отделить от других тканей пыльника без того, чтобы резко не снизить
их жизнеспособность, а следовательно, выживаемость и развитие в
культуре.
Разработаны различные методы отделения пыльцы от соматических
тканей.
45
2.2.2.1.	Спонтанное высвобождение
У многих видов, если применяют правильно подобранное сочетание
стадии развития пыльцы, предварительной обработки и условий инку-
бирования, пыльники при культивировании раскрываются, и при исполь-
зовании жидкой среды пыльца, свободная от соматической ткани, всплы-
вает. Такое пассивное образование „культуры пыльцы” удавалось полу-
чать у многих видов Solanaceae [18, 19], Brassica и у нескольких видов
злаков [1].
2.2.2.2.	Гомогенизация и фильтрация
Этот метод с успехом применяют лишь для пасленовых, рапса и,
по предварительным данным, для дикого родственника сахарного трост-
ника (Saccharum spontaneurri) . Например у табака для получения суспен-
зии, содержащей примерно 5 • 104 зерен в 1 мл (1 пыльник в мл),
предварительно обработанные пыльники, культивируемые в течение
3—4 дней, необходимо осторожно разрушить в жидкой среде (см.
табл. 2.3). Затем суспензию фильтруют (размер пор 50—100 мкм меш)
и центрифугируют (100 g в течение 5 мин). Удаляют надосадочную
жидкость, промывают не менее одного раза пыльцу и суспендируют
ее в жидкой среде в чашке Петри с изначальной плотностью (5 • 104 в
1 мл). Затем инкубируют, как и ранее.
2.2.2.3.	Метод разрезания
При использовании этого метода необходимо разрезать стенку
пыльника так, чтобы дать выход каллусам или зародышам, образован-
ным из микроспор, не полагаясь на естественное растрескивание пыль-
ника. Этот метод сначала был опробован на табаке, а затем успешно
применен на Pennisetum typhoides (см. ниже). Ясно, что это требует
много времени, и поэтому лучше попытаться вызвать искусственное
растрескивание пыльника.
Метод, используемый для получения регенерированных из микроспор растений
1. Выращивают растения в контролируемых условиях: 28 °C, 16-часовой
деньи 24°С, 8-часовая ночь.
2.	Отделяют колосья сразу после их появления у основания флагового листа;
микроспоры еще не содержат ядро и не вакуолизированы.
3.	Стерилизуют колосья в растворе гипохлорита кальция (7%) в течение
8-10 мин и ополаскивают их в дистиллированной воде.
4.	Отделяют колоски от оси и помещают стебельками в агаризованную среду
(МС с БАП 0,3 мг/л и активированным углем 2 г/л в чашках Петри диа-
метром 60 мм).
5.	Запечатывают чашки Петри и помещают их в более крупный сосуд из
стекла.
6.	Помещают культуры в 300 мм (снизу) от источника красного света при
27 °C.
46
7.	Через 12 ч собирают пыльники и помещают их в жидкую среду (МС с
БАЛ 0,1 мг/п, НУК 0,5 мг/п и 2,4-Д 0,1 мг/п). Рассекают пыльники, чтобы
высвободить микроспоры в жидкость.
8.	Возвращают культуры под красный свет при 27 °C.
9-	Через 14—21 день переносят колонии диаметром 1—2 мм на агаризован-
ную среду (МС с НУК 1 мг/л и 2,4-Д 0,25 мг/л) и держат под белым све-
том (4000—5000 лк) при 27 °C.
10.	Через 5—8 дней переносят колонии на агаризованную среду (МС с зеатином
0,05 мг/л и НУК 1 мг/л) и держат до тех пор, пока не появятся растения-
регенеранты.
11.	Переносят растения-регенеранты на агаризованную среду (МС с НУК
0,2 мг/л) для индукции корнеобразования.
2.2.3.	РЕЗУЛЬТАТЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
2.2.З.1.	Плоидность
Нельзя считать, что регенеранты, образовавшиеся непосредственно
из зародышей или вследствие дифференцировки каллуса, являются
гаплоидами. Для многих видов гаплоидные растения составляют исклю-
чение, а чаще встречаются полиплоиды, иногда гексаплоиды. Однако
большинство этих растений образуется из одиночных гаплоидных микро-
спор, в которых произошла серия хромосомных удвоений, часто на
самых ранних стадиях культивирования. В таких случаях они, естест-
венно, гомозиготны и, если фертильны и самосовместимы, способны
к нормальному воспроизведению. К сожалению, у некоторых видов
негаплоидная пыльца образуется во всех пыльниках при нормальных
условиях с низкой частотой, и если индуцировать деление такой пыльцы
в культуре, а затем получить растения, то они, вероятно, будут гете-
розиготны [1,2]. Эти растения не представляют интереса для тех селек-
ционеров, которым необходима абсолютная гомозиготность. Зрелые
аплоидные растения легко идентифицируют по морфологическим
признакам (рис. 2.4), а также применяя цитологические методы.
Цитологические методы. Это методы, позволяющие
оценить плоидность растений-регенерантов. Для селекционных целей
очень важно как можно раньше определить плоидность, а следовательно,
и отделить или отобрать гаплоиды для удвоения числа хромосом. Для
быстрорастущих растений обычно применяют метод подсчета хромосом
в кончиках корешков или листьях. Можно также отделить эпидермис
из первого полностью развернувшегося листа и исследовать устьица.
Число хлоропластов в одной замыкающей клетке устьица, которое
определяют после окрашивания раствором I—KI, прямо пропорциональ-
но плоидности (например, у картофеля моногаплоиды содержат 5—8,
дигаплоиды 10—15, а тетраплоиды — 18—24 хлоропласта на одну замы-
кающую клетку устьица) [30]. Кроме того, простые измерения длины
устьица помогают отличить гаплоиды от диплоидов. Однако следует
иметь в виду, что некоторые растения могут оказаться химерами и
содержать участки с разной плоидностыо.
47
Рис. 2.4. Растения-регенеранты рапса, полученные из микроспор. Стерильный гапло-
ид (слева) и спонтанно удвоившийся фертильный диплоид (справа). Цветки этих
растений показаны ниже.
2.2.3.2.	Генетическая изменчивость
Дигаплоиды, полученные из отдельных гаплоидных микроспор,
как отмечалось выше, считаются гомозиготными. Однако в настоящее
время получены данные, что зто не всегда так, и у таких диплоидов в
потомстве происходит расщепление. Имеются данные, что растения-
регенеранты из микроспор от инбредного или гомозиготного донора
неоднородны [1, 2]. Оба эти факта имеют очень важное значение и позво-
ляют предположить, что мутации происходят при развитии той части
незрелого гаметофита (т. е. вегетативной клетки), из которой образу-
ется зародыш и (или) в ходе самого процесса культивирования.
Данные полевых испытаний. Если предполагается
использовать продукты культивирования пыльников или пыльцы в
селекционных программах или для изоляции мутантов, в этом случае
следует оценить фоновые изменения, свойственные этому процессу.
Для этого необходимо провести широкомасштабные испытания потом-
ства растений-регенерантов; простого анализа регенерантов недостаточ-
но, поскольку часто возникают сопутствующие культивированию эф-
фекты. Полевые испытания некоторых видов, включая ячмень, рис,
пшеницу и табак, показали, что на отдельных стадиях этого процесса
действительно происходят мутации.
2.2.3.3.	Возможности применения в селекции растений
Данные полевых испытаний следует получить до того, как широко
рекомендовать продукты микроспорогенеза в селекции растений. Нали-
чие мутаций, а также высокая частота образования среди растений-
регенерантов альбиносов, наблюдавшиеся у злаков [1, 2], остаются
основными трудностями, которые необходимо преодолеть.
2.2.4.	ОТБОР МУТАНТОВ IN VITRO
Теоретически линии гаплоидных клеток имеют больше преимуществ
для работ по отбору мутантов in vitro. Однако существует мало убеди-
тельных сообщений об успешном отборе мутантов непосредственно
из культивируемых микроспор, хотя мутанты и выделяли из культур.
Культуры были получены из протопластов мезофилла листьев гапло-
идных растений.
2.3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Подводя итог, можно утверждать, что разработан метод получения
гаплоидных или гомозиготных клеток и растений для некоторых видов,
особенно у Solanaceae и Gramineae. К сожалению, эти методы были
разработаны скорее в результате эмпирических исследований, а не
49
основаны на детальном знании физиологии и биохимии пыльцы. Мето-
дики, описанные выше, таким образом, имеют относительно мало обще-
го, за исключеним того, что для получения воспроизводимых резуль-
татов необходимо-уделять серьезное внимание мелочам.
ЛИТЕРАТУРА
1.	Dunwell, J. М. (1985) in Cereal Tissue and Cell Culture, Bright, S. W. J. and
Jones, M. J. K. (eds.), Martinus Nijhoff, The Hague, in press.
2.	Dunwell, J. M. (1985) in Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications,
Alderson, P. G. and Withers L. A. (eds.), Butterworths, London, in press.
3.	Hermsen, J. G. T. and Ramanna, M. S. (1981) Phil. Trans. R. soc. Land. B, 292,
499.
4.	Snape, J. W. (1982) Induced Variability in Plant Breeding, published by Pudoc,
Wageningen, p. 52.
5.	Choo, T. M., Reinbergs, E. and Kasha, K. J. (1985) Plant Breeding Rev., 3, in
press.
6.	Dunwell, J. M. (1978) Frontiers of Plant Tissue Culture 1978, Thorpe, T. A,
(ed.), University of Calgary, p. 103.
7.	Sunderland, N. and Dunwell, J. M. (1977) in Plant Tissue and Cell Culture, Stre-
et, H. E. (ed.), Blackwell, Oxford, p. 223.
8.	Vasil, I. K. (1980) Int. Rev. Cytol., Suppl. 11A, 195.
9.	Collins, G. B. and Genovesi, A. D. (1982) in Application of Plant Cell and Tissue
Culture to Agriculture and Industry, Tomes, D. T.,Ellis, В. E., Harvey, P. M., Kasha, K. J.
and Peterson, R. L. (eds.), University of Guelph, Ontario, p. 1.
10.	Baenziger, P. S. and Schaeffer, G. W. (1983) in Genetic Engineering: Applica-
tions to Agriculture, Owens, L. D. (ed.), Granada, London, p. 269.
11.	Dunwell, J. M. (1976) Environ. Exp. Bot., 16,109.
12.	Foroughi-Wehr, B. and Mix, G. (1,979) Environ. Exp. Bot., 19,303.
13.	Lyne, R. L., Bennett, R. I. and Hunter, С. P. (1985) in Plant Tissue Culture
and its Agricultural Applications, Alderson, P. G. and Withers, L. A. (eds.), Butterworths,
London, in press.
14.	Keller, W. A., Armstrong, К. C. and De La Roche, A, I. (1983) in Plant Cell
Culture in Crop Improvement, Sen, S. K. and Giles, K. L. (eds.), Plenum Press, New York,
p. 169.
15.	Keller, W. A. (1984) in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol 1,
Vasil, I. K. (ed.), Academic Press, New York, p. 302.
16.	Thomas, E., Brettell, R., Potrykus, I. and Wernicke, W. (1980) in Tissue Culture
Methods for Plant Pathologists, Ingram, D. S. and Helgeson, J. P. (eds.), Blackwell, Oxford,
p. 41.
17.	Sunderland, N. (1978) in Proceedings of Sumposium on Plant Tissue Culture,
Science Press, Peking, p. 65.
18.	Sunderland, N. (1980) in Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, Ing-
ram, D. S. and Helgeson, J. P. (eds.), Blackwell, Oxford, p. 33.
19.	Sunderland, N. (1984) in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,
Vol. 1, Vasil, I. K. (ed.), Academic Press, New York, p. 283.
20.	Wenzel, G. and Foroughi-Wehr, B. (1984) m Cell Culture and Somatic Cell
Genetics of Plants, VoL 1, Vasil, I. K. (ed.), Academic Press, New York, p. 311.
21.	Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y. and Shivanna, K. R. (1984) Theor.
Appl. Genet., 67, 367.
22.	Marks, G. E. (1954) Stain Technol., 29,277.
23.	Alexander, M. P. (1969) Stain Technol., 44,117.
50
24.	Palfi, G. and Koves, E. (1984) Biochem. Physiol. Pflanz. BPP, 179, 237.
25.	Huang, B. and Sunderland, N. (1982) Ann. Bot., 49, 77.
26.	Kao, K. N. (1987) Z. Pflanzenphysiol., 103, 437.
27.	Johansson, L., Andersson, B. and Eriksson, T. (1982) Physiol. Plant., 54, 24.
28.	Chu, C-C. (1978) in Proceedings of Symposium on Plant Tissue Culture, Science
Press, Peking, p. 43.
29.	Chuang, C-C., Ouyang, T-W., Chia, H., Chou, S-M. and Ching, C-K. (1978) in
Proceedings of Symposium on Plant Tissue Culture, Science Press, Peking, p. 51.
30.	Wenzel, G. and Foroughi-Wehr, B. (1984) in Cell Culture and Somatic Cell
Genetics of Plants, Vol. 1, Vasil, I. K. (ed.), Academic Press, New York, p. 293.
31.	Dunwell, J. M. (1979) J. Exp. Bot., 30,419.
32.	Bui Dang Ha, D. and Pernes, J. (1982) Z. Pflanzenphysiol., 108, 317.
3.	ИЗОЛИРОВАНИЕ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАНИПУЛЯЦИИ
С ПРОТОПЛАСТАМИ РАСТЕНИЙ
ДЖ. Б. ПАВЕР, ДЖ. В. ЧЕПМЕН
3.1.	ВВЕДЕНИЕ
Протопласты растений представляют собой отправную точку мно-
гих методик, используемых для генетической модификации целых рас-
тений и их клеток. Изолированный протопласт — клетку, лишенную
стенки, — можно заставить слиться с протопластами других видов рас-
тений и получить таким образом новые гибридные растения (сомати-
ческая гибридизация) [1]. Кроме того, протопласт является идеальным
реципиентом для чужеродной ДНК, которая часто представляет собой
плазмиды. Такая трансформация, обеспечивая проникновение и после-
дующую экспрессию этой ДНК, может приводить к образованию генети-
чески модифицированных растений [2]. Протопласты могут также вклю-
чать частицы большего размера (органеллы), обеспечивая таким образом
обмен внеядерными генетическими элементами (перенос органелл). Та-
кие методики описаны в главе 5, посвященной регенерации растений.
3.2.	ТРЕБОВАНИЯ К РАСТЕНИЯМ И КЛЕТКАМ
ПРИ ВЫДЕЛЕНИИ ПРОТОПЛАСТОВ
3.2.1.	ВЫРАЩИВАНИЕ РАСТЕНИЙ
Возраст и физиологическое состояние растений, выращиваемых
в теплице, влияют на конечный выходи жизнеспособность протопластов.
Условия содержания в теплице петунии, взятой в качестве примера,
приводятся ниже.
1.	Проращивают семена петунии на свету на компосте Левингтона
(не содержащем почвы) при 20 — 23°С.
2.	Проростки выращивают в теплице при 20 —25°С и освещении
10 000 лк (люминесцентные лампы дневного света) при 16-ча-
совом световом дне.
3.	Переносят проростки в растильни и выращивают в течение после-
дующих 5 — 6 недель при тех же условиях.
Растения высотой 8 — 10 см с 7 — 10 полностью развернутыми листь-
ями используют в качестве источника протопластов. Необходимо запом-
нить, что растения с бутонами для работы с протопластами непригодны.
3.2.2.	БОРЬБА С ВРЕДИТЕЛЯМИ
Белокрылка и паутинный клещ являются двумя основными ви-
новниками бактериального заражения, возникающего в результате
52
повреждения ими листьев. С вредителями борются, последовательно
обрабатывая растения фумигантами, включая ДДТ/линдан (Murphy
Chemicals Ltd.), пропоксур и никотин.
Растения в той же теплице, не предназначенные для получения про-
топластов, можно эффективно систематически обрабатывать препара-
том видат (Nursery Supplied, Boeirne, Lincolnshire).
3.2.3.	РОСТ КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ
Суспензии клеток, предназначенные для выделения протопластов,
должны находиться в фазе экспоненциального роста. На этой стадии
роста суспензии клеточные стенки относительно тонкие и состоят из
целлюлозы, и для них требуется минимальная инкубация в смесях
целлюлаза/пектиназа. Для выделения протопластов из каллусов исполь-
зуют тот же метод.
3.2.4.	ПОЛУЧЕНИЕ ПРОРОСТКОВ
1.	Стерилизуют поверхность семян в 0,1% растворе хлорида ртути
в 0,1% лаурилсульфате натрия в течение 10 мин или в 10% до-
местосе в течение 30 мин.
2.	Тщательно промывают простерилизованной водой (пять
раз).
3.	Стерильно переносят семена в круглые сосуды объемом около
200 мл (или в чашки Петри), содержащие среду Мурасиге и
Скуга (МС) (см. гл. 1, табл. 1.1) без фитогормонов, но с добав-
лением 0,6% агара (Sigma) и 0,2% сахарозы.
4.	Проращивают семена в темноте или на свету (2000 лк) при
25°С.
3.3.	МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ
Успешное выделение протопластов зависит от многих факторов,
например типа ткани (лист, клеточная суспензия, семядоля, корень),
вида растения и сорта, смеси ферментов и физиологического состояния
растения. Однако проблема жизнеспособности протопластов возни-
кает не только после их выделения, но и после различных манипуля-
ций с ними. Описанные ниже методики составлены с учетом этого вопро-
са и поэтому применимы для многих видов растений и систем прото-
пластов.
3.3.1.	ПРОТОПЛАСТЫ ИЗ ЛИСТЬЕВ (НА ПРИМЕРЕ PETUNIA PARODII)
1.	Отбирают с растений полностью развернувшиеся листья с череш-
ками (около 30 шт.).
53
1.. Помещают листья, а также четыре резиновые перчатки в посуду
с 7,5 % (объем к объему) раствором доместоса. Оставляют на
30 мин.
3.	Используя стерильную перчатку, переносят листья в кювету и
промывают простерилизованной водой (шесть раз).
4.	Сливают воду, удаляют нижний эпидермис, очистив от него лист,
и переносят кусочки листа (только очищенные его участки)
в чашку Петри диаметром 14 см на поверхность среды (пример-
но 30 мл) для промывки протопластов (СПП) с 13% маннитом
(СПП13М, см. стр. 55). Полностью покрывают поверхность
жидкости очищенными кусочками листьев.
5.	Когда чашка заполнится, пипеткой удаляют раствор СПП13М
из-под кусочков листьев и вместо него вносят примерно 25 мл
раствора фермента (табл. 3.1, стр. 56).
6.	Инкубируют в течение ночи в темноте при 27 °C без перемеши-
вания.
7.	Не трогая обработанные ферментом кусочки листьев, удаляют
раствор фермента и затем их отжимают примерно в 25 мл раст-
вора СПП21С (см. стр. 56), чтобы высвободить протопласты.
8.	Переносят суспензию протопластов в центрифужные пробирки
и центрифугируют (100 g, 10 мин). Протопласты всплывают
на поверхность.
9.	Переносят протопласты в пробирки с промеренным объемом
среды СПП13М и подсчитывают (см. разд. 3.4.1). Работать удоб-
нее с объемом 10 мл.
3.1.	Смеси ферментов, используемые для изолирования протопластов
Смесь ферментов	Вид растения, ткань	Примечание
Мейцелаза, 1,5 %	Листья петунии, табака	Механически удаляют
Мацерозим R10, 0,05 % Среда СПП13М Антибиотики pH 5,8	и большинства других видов	нижний эпидермис
То же, что и перечислено	Р. parviflora (листья с	Предварительно обраба-
выше, но со средой СПП21С	неотделяемым эпидер- мисом) Листья растений-альбино- сов Р. inflate, листья Solanum melongema	тывают в 1 % растворе рогамента Р., в среде СПП13М
Розим HP 150, 2% Мейцелаза, 2% Мацерозим R10, 0,03 %	Корни	Например, Brassica, кор- мовые бобовые куль- туры
Среда СПП13М	Суспензии клеток боль-	Например, Lactuca, Си-
pH 5,8	шинства альбиносных растений. Каллусные тка- ни и суспензии клеток большинства видов растений.	cumis, Petunia, Nicotiana, Browallia, Capsicum, Saint- paulia
54
Продолжение табл. 3.1
Смесь ферментов	Вид растения, ткань	Примечание
	Корневые клубеньки, семядоли	Для большинства видов растений
Мейцелаза, 2 %	Листья альбиносных рас-	Отделяют нижний эпи-
Мацерозим R10,0,04 %	тений Nicotiana, Petunia	дермис. Протопласты
Дрейселаза, 0,2 %	и большинства альбинос-	флотируют в растворе
Среда СПП21С Антибиотики pH 5,8	ных мутантов	фермента
Мейцелаза, 3 %	Листья пшеницы или	Листья нарезают на по-
Мацерозим R10, 0,08 %	ячменя, а также орхид-	лоски, инкубируют в те-
Декстран сульфата калия, 0,75% Маннит, 14 % Антибиотики pH 5,6	ных	чение ночи
Дрейселаза, 2 %	Проросшая пыльца бере-	Перед проращиванием
Среда СПП13М Дрейселаза, 2 % Среда СПП9М	зы и большинства видов растений Тетрады пыльцы N. tabacum и большинства видов рас- тений	пыльцу хранят при 4 °C
Целлюлизин, 2 %	Листья злаков с удален-	Инкубируют 1 —2 ч в
Мацерозим R10,0,2 % Гемицеллюлаза, 0,5 % Декстран сульфата калия, 1% Маннит, 11% pH 5,8 (трис-малатный буфер)	ным нижним эпидерми- сом	темноте при 30 °C
Целлюлизин, 1 %	Гипокотиль, стебель и	Инкубируют в течение
Мацерозим R10, 0,1 %	черешок листа предста-	ночи в темноте нарезан-
Среда СПП13М pH 5,6	вителей рода Brassica и большинства других ви- дов растений	ними на кусочки
Пектолиаза Y23 (0,1 %) вместе с целлюлазой (как в смесях, представленных
в таблице) эффективна для получения протопластов из определенных тканей,
например листьев или семядолей Glycine spp. н вторичных листьев кормовых
бобовых культур — Medicago spp. Для ферментных смесей другого состава см.
источники литературы, приведенные в таблице 3.3. Все растворы ферментов сте-
рилизуют фильтрованием.
Ниже приведены составы сред, используемых для промывки прото-
пластов
СолиСПП:	КН2РО4	-27,2 мг/л
KNO3	— 101,0 мг/л
СаС12 X 2 Н2 О	- 1480,0 мг/л
MgSO„ X 7 Н2 О	- 246,0 мг/л
KI	— 0,16 мг/л
CuSO4 X 5 Н2О	— 0,025 мг/л
pH	- 5,8
55
Среда СПП13М - соли СПП с 13 % маннита
Среда СПП9М — соли СПП с 9 % маннита
Среда СПП21С — соли СПП с 21 % сахарозы
Среда СППОМ - раствор солей СПП
Во всех случаях pH 5,8
Для ферментных смесей антибиотики добавляют в концентрациях: ампициллин
400 мг/л, гентамицин 10 мг/л и тетрациклин 10 мг/л.
Ферменты, используемые для изолирования протопластов, произ-
водят следующие фирмы:
Фермент
Целлюлаза
Целлюлаза
Целлюлаза
Целлюлаза
Целлюлаза R10
Целлюлаза RS
Целлю лизин
Дрейселаза
Геликаза
Гемицеилю лаза
Мейцелаза
Мацерозим R10
РАТЕ
Пектолиаза Y23
Розим НР150
Рогамент Р
Производитель/Посгавщик
Calbiochem, La Jolla, California, USA
Mayvill Chemicals Ltd., Sandbach, Cheshire, UK
Serva Feinbiochemica, Heidelberg, FRG
Sigma London Chemical Co., Poole, Dorset, UK
Yakult Honsha Co., Nishinomiya, Japan
Yakult Honsha Co., Nishinomiya, Japan
Calbiochem, La Jolla, California, USA
Kyowa Hakko Kogya, Tokyo, Japan
Reactifs IBF._ Villeneuve-La-Garenne, France
Sigma London Chemical Co., Pool, Dorset, UK
Meiji Seika Kaisha, Tokyo, Japan
Kinki Yakult, Nishinomiya, Japan
Farbwerke-Hoechst AG, Frankfurt, FRG
Seishim Pharmaceutical, Tokyo, Japan
Rohm and Haas, Philadelphia, USA
Rohm GmbH Chemische Fabrik, Darmstadt, FRG
3.3.2.	КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ПРОТОПЛАСТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ КЛЕТОК
(НА ПРИМЕРЕ АЛЬБИНОСНОГО РАСТЕНИЯ PETUNIA HYBRIDA)
1.	Следует подождать, пока клетки в среде осядут.
2.	Сливают большую часть среды и переносят (переливая суспен-
зию) клетки в колбу объемом 250 мл. С помощью пастеровской
пипетки удаляют среду для культивирования. Легче всего это
сделать, отсасывая среду из-под слоя клеток.
3.	Добавляют примерно 30 мл раствора ферментов (см. табл. 3.1)
и инкубируют в течение ночи при медленном покачивании.
4.	Переливают обработанные ферментами клетки в центрифужные
пробирки. При необходимости раствор в пробирках доливают
средой СПП13М. Центрифугируют при 80 g в течение 5—10 мин,
чтобы осадить протопласты. Надосадочную жидкость удаляют с
помощью пипетки.
5.	Ресуспендируют протопласты примерно в 5 мл раствора СПП21С
в расчете на каждую пробирку.
6.	Сливают содержимое двух-трех пробирок на сито с размером
пор 64 мкм и, покачивая и промывая небольшими объемами
раствора СПП21С, собирают фильтрат в чашку Петри диаметром
9 см.
7.	Переносят фильтрат в центрифужные пробирки (доливая при
56
необходимости раствором СПП21С) и центрифугируют при
100 g в течение 10 мин. Протопласты всплывают к поверх-
ности.
8.	Переносят суспензию протопластов в отмеренный объем среды
М/СЩ9М (табл. 3.2) и подсчитывают их число.
3.2.	Среды, используемые для культивирования протопластов
и для регенерации растений
Основные компоненты	Регуляторы роста, мг/л	Назначение	Сокращение
МС* + 3 % сахарозы	2,0 НУК, 0,5 БАП	Инициация побегов	М/СП, ОМ
МС + 3 % сахарозы + + 9 % маннита	2,0 НУК, 0,5 БАП	Культивирование протопластов	М/СП,9М
МС + 3 % сахарозы (0,5 % агара)	0,1 НУК	Корнеобразование .у регенерированных побегов	М/СП2
МС + 3 % сахарозы	2,0 ИУК, 1,0 БАП	Инициация побегов	М/СДа
МС + 3 % сахарозы	1,0 зеатина	Инициация побегов	М/СЗ
МС + 3 % сахарозы + + 0,001 мг/п фолие- вой кислоты	0,009 ИУК, 0,03 кине- тина	Культивирование аксеничных расте- ний	БГС
МС + 3 % сахарозы + + 9,9 мг/л тиамин- НС1 + 4,5 мг/л нико- тиновой кислоты + + 9,5 мг/л пиридоксин- НС1 + 2,0 г/л гидроли- зата казеина	2,0 2,4-Д, 0,25 кине- тина	Культивирование клеточных суспен- зий	УМ
МС +, 30 % сахарозы	Нет	Отбор трансфор- мантов Во всех случаях pH 5,8		м/со
♦Состав среды Мурасиге и Скуга (см. гл. 1, табл. 1.1).
3.3.3.	ПРОТОПЛАСТЫ ИЗ СЕМЯДОЛЕЙ (НА ПРИМЕРЕ MEDICAGO SATIVA)
1.	Срезают проростки (3 — 6-дневные) на уровне подсемядольного
колена.
2.	Еще раз стерилизуют в 5% доместосе (в течение 10 мин) и про-
мывают простерилизованной водой.
3.	Нарезают семядоли на полоски шириной 1 мм и проводят плаз-
молиз в течение 1 ч в СПП13М.
4.	Переносят в раствор ферментов (см. табл. 3.1) и инкубируют
на круговой качалке (30 об/мин) в течение 16—17 ч при 25°C.
5.	Сливают инкубационную смесь на сито с размером пор 64 мкм
и высвобождают протопласты, сжимая обработанные полоски
семядолей.
57
6.	Осаждают протопласты центрифугированием (120 g в течение
10 мин), после чего трижды промывают в среде СПП13М.
3.3.4.	ПРОТОПЛАСТЫ ИЗ КОРНЕЙ (НА ПРИМЕРЕ
TRIGONELLA FOENUM-GRAECUM)
1.	Отрезают кончики корней размером 1,0 см и поперечно делят
на сегменты размером 1 мм (100 корней).
2.	Проводят плазмолиз в среде СПП13М в течение 1 ч.
3.	Переносят в 4 мл смеси ферментов (см. табл. 3.1) и инкуби-
руют, как описано выше (разд. 3.3.3.4).
4.	Выделяют протопласты способом, описанным выше (для семя-
долей) , и центрифугируют при 120 g в течение 10 мин.
5.	Ресуспендируют осадок протопластов в среде СПП21С и центри-
фугируют при 100 g в течение 15 мин.
6.	Промывают всплывшие протопласты в среде СПП13М путем
ресуспендирования и центрифугирования (100 g в течение
10 мин).
3.3.5.	ПРОТОПЛАСТЫ ИЗ ГИПОКОТИЛЯ, СТЕБЛЯ И ЧЕРЕШКОВ
(НА ПРИМЕРЕ BRASSICA NAPUS)
1.	Для выделения протопластов из гипокотиля предварительно
проращивают простерилиэованные семена (см. разд. 3.2.4);
получают из гипокотиля (4 — 5-дневных растений) поперечные
срезы толщиной 0,5 —1,0 мм. Стебель или ткань черешка раз-
резают аналогичным образом.
2.	Переносят в среду СПП13М на 1 ч, а затем в раствор фермен-
тов (см. табл. 3.1). Инкубируют в темноте при 22 °C в течение
16—18 ч при медленном покачивании (круговая качалка,
20 об/мин).
3.	Пропускают инкубационную смесь через нейлоновое сито с раз-
мером пор 50 мкм, промывая обработанные ферментом ку-
сочки ткани небольшими объемами среды СПП13М. Для осаж-
дения протопластов центрифугируют при 100 g в течение 10 мин.
4.	Удаляют надосадочную жидкость, ресуспендируют протопласты
в среде СПП21С и центрифугируют при 120 g 10 мин. Прото-
пласты всплывают к поверхности.
5.	Собирают протопласты, переносят их на соответствующую среду
и подсчитывают.
3.3.6.	ПРОТОПЛАСТЫ ИЗ ЛЕПЕСТКОВ (НА ПРИМЕРЕ NICOTIANA AFFINIS)
1.	Собирают лепестки со зрелого цветущего растения, проводят
их поверхностную стерилизацию (5% доместос, 10 мин), а затем
промывают простерилизов энной водой.
58
2.	Дают лепесткам подсохнуть и снимают слой нижнего эпидер-
миса.
3.	Переносят очищенные от эпидермиса лепестки на поверхность
смеси ферментов, применяемой для выделения протопластов из
листьев (см. табл. 3.1). Протопласты выделяют, как иэ листьев,
в результате инкубации в темноте при 30 °C в течение 6 ч, фло-
тируют в среде С1Ш21С и далее проводят их подсчет.
Для некоторых видов (например, для Pelargonium) смесь фермен-
тов должна содержать 0,5% целлюлазы R10, 0,25% мацерозима R10,
0,25 % дрейселазы, среду СПП13М, pH 5,8.
3.3.7.	ПРОТОПЛАСТЫ ИЗ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН И ТЕТРАД
. 3.3,7.1. Пыльцевые зерна (на примере Betula pendula)
1.	Свежую пыльцу (или пыльцу, хранившуюся при 4 °C) помещают
в небольшой объем (4 — 8 мл) 20% сахарозы в чашку Петри
диаметром 5 см, содержащую Н3ВО3 (100 мг/л), Ca(NO3)2 X
X 4Н2 О (300 мг/л), MgSO4 • 7Н2 О (200 мг/л) и KNO3 (100 мг/л),
pH 7,3.
2.	Проращивают пыльцу в течение ночи на круговой качалке
(80 об/мин) при 23 °C. Прорастание должно составлять 80 — 90 %.
3.	Собирают проросшую пыльцу путем центрифугирования или
просто удалив среду.
4.	Переносят пыльцу в 10 мл смеси ферментов (см. табл. 3.1)
и инкубируют в темноте в течение 2 ч без покачивания.
5.	Собирают протопласты, пропуская их через нейлоновое сито с
размером пор 64 мкм.
6.	Промывают их, а затем подсчитывают в среде СПП13М.
3.3.7.2.	Тетрады пыльцы (на примере Nicotiana tabacum сорта White
Burley)
1.	Берут 25 незрелых цветочных почек и отбирают только те, в
которых пыльца находится на стадии тетрад (обычно 5 — 10 на
25 почек). В одном пыльнике содержится примерно 1 • 104 те-
трад (= 4 • 10 4 потенциальных протопластов из тетрад).
2.	Переносят тетрады (сдавливая пыльники) сразу в 5 мл смеси
ферментов (см. табл. 3.1). Инкубируют в темноте в течение 1 ч
при 27 °C без перемешивания.
3.	После инкубирования смесь пропускают через нейлоновое сито с
размером пор 64 мкм, промывая средой М/СП! 9М(см. табл. 3.2).
4.	Собирают протопласты путем центрифугирования (80 g, 10 мин).
3.3.8.	ПРОТОПЛАСТЫ ИЗ ЗЕЛЕНЫХ И БЕЛЫХ ЛИСТЬЕВ АКСЕНИЧНЫХ
КУЛЬТУР (НА ПРИМЕРЕ PETUNIA INFLATA)
I.	Растения в аксеничных культурах обычно поддерживают на со-
левых средах, содержащих низкие концентрации источника
59
углерода, ауксинов и цитокининов (например, среда МС с
0,03 мг/л кинетина, 0,009 мг/л ИУК, 0,001 мг/л фолиевой кисло-
ты и 3 % сахарозы).
2.	Отделяют листья и скальпелем измельчают их. Инкубируют ку-
сочки листьев на сите, погруженном в среду СПП13М, в течение
1 ч.
3.	Переносят кусочки листьев в маленькую чашку Петри (диамет-
ром 5 см), содержащую смесь ферментов (см. табл. 3.1). Инку-
бируют в течение ночи при 27 °C.
4.	Переносят обработанные ферментами кусочки листьев вместе
со средой для инкубации на нейлоновое сито (размер пор
64 мкм) и промывают небольшими объемами среды СПП21С.
Собирают протопласты путем флотации, происходящей при
центрифугировании (120 g в течение 10 мин).
3.3.9.	ПРОТОПЛАСТЫ ИЗ ЛИСТЬЕВ С НЕОТДЕЛЯЕМЫМ ЭПИДЕРМИСОМ
(НА ПРИМЕРЕ PETUNIA PARVIFLORA)
1.	Стерилизуют поверхность листьев и скальпелем измельчают
на кусочки. Кладут кусочки листьев на сито с крупными отвер-
стиями (100 — 200 мкм) и погружают на 30 мин в среду СПП9М,
а затем переносят в среду СПП13М еще на 30 мин. Такая обработ-
ка обеспечивает постепенный плазмолиз по мере удаления остат-
ков поврежденных клеток.
2.	Переносят кусочки листьев в колбу объемом 100 мл, содер-
жащую примерно 20 мл (на 5 — 10 г сырой массы листьев) раст-
вора ферментов, простерилиэованного путем фильтрации (1 %
рогамент в среде СПП13М, pH 5,8), и инкубируют при 27°C
в течение 1 ч в качалке с термостатируемой водяной баней
(80 об/мин).
3.	Собирают кусочки листьев на грубое сито и переносят в чашку
Петри, содержащую основную ферментную смесь (см. стадию
3 выделения протопластов из листьев Р. inflata). Центрифуги-
руют фильтрат, содержащий много одиночных клеток, чтобы
удалить раствор ферментов. Ресуспендируют клетки в 2 — 3 мл
основного раствора ферментов и объединяют их затем с кусоч-
ками листьев.
4.	Далее выделение проводят способом, описанным для прото-
пластов из листьев Р. inflata.
В качестве альтернативы измельчению листьев скальпелем можно
предложить натирание листьев жесткой нейлоновой щеткой, или же
в некоторых случаях эпидермис частично удаляют с помощью напыле-
ния и натирания листьев абразивом типа карборунда.
60
3.4.	КУЛЬТУРА ПРОТОПЛАСТОВ
Протопласты можно успешно культивировать различными спо-
собами, и применение того или иного метода культивирования зави-
сит от цели эксперимента. Перед пересадкой протопласты промывают,
суспендируют в определенном объеме среды для культивирования и
подсчитывают количество клеток в образце с использованием камеры
Фукса — Розенталя. Затем плотность протопластов доводят до требуе-
мой, хотя оптимальная плотность в каждом случае определяется экспе-
риментально. В качестве примера приведены протопласты из листьев
Petunia parodii. Те же принципы применимы и для экспериментов по со-
матической гибридизации и трансформации.
3.4.1.	ПОДСЧЕТ ПРОТОПЛАСТОВ
Для всех последующих манипуляций типа слияния, трансформации
и регенерации растений необходимо определить начальный выход про-
топластов, чтобы контролировать при культивировании их плотность.
1.	Переносят суспензию протопластов в заранее определенный
(например, 10 мл) объем среды СПП13М и подсчитывают в ка-
мере Фукса — Розенталя.
2.	Подсчитывают число протопластов в одном квадрате (= и).
3.	Общий выход равен и X 5 X 10 3 X 10 (объем в мл) = 5nX 104.
4.	Чтобы определить объем (мл), который необходимо добавить
(или в случае низкого выхода — отлить) к исходным 10 мл,
полученное число делят на 2Х105 (если требуемая плотность
2Х 10s ит.д.),
5иХ104
т. е. ------- = объем, мл, при котором плотность равна 2 X
2Х105
X 10 5 клеток/мл.
5. В случае необходимости доводят объем суспензии протопластов
до требуемого.
3.4.2.	ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ПРОТОПЛАСТОВ (ОКРАШИВАНИЕ ФДА)
Флуоресцеиндиацетат (ФДА) — это нефлуоресцирующее соединение,
используемое для определения жизнеспособности протопластов. Мо-
лекулы ФДА легко проходят через плазматическую мембрану прото-
пластов/клеток, но только в живых протопластах расщепляются эсте-
разами [3]. Расщепление приводит к высвобождению флуоресцеина,
который задерживается лишь внутри протопластов с интактными мемб-
ранами. Метаболически активные (жизнеспособные) протопласты по
зеленому свечению становятся визуально различимыми, благодаря воз-
буждению накопленного флуоресцеина, в ультрафиолетовом свете.
61
1.	Готовят исходный раствор ФДА (1—5 мг/мл ацетона) и хра-
нят его при О °C в темноте.
2.	Добавляют 1 каплю исходного раствора к 10 мл среды СПП13М.
3.	Смешивают равные объемы раствора ФДА и густой суспензии
протопластов в среде для культивирования.
4.	Через 5 мин анализируют под флуоресцентным микроскопом.
% жизнеспособности протопластов =
__ число флуоресцирующих протопластов * юд
общее число протопластов
3.4.3.	ПЛАНИРОВАНИЕ В АГАРЕ
1.	Суспендируют протопласты в среде с плотностью 5Х 104 кле-
ток/мл.
2.	Расплавляют среду, содержащую 1,2% агара, и хранят при 45 °C
до употребления.
3.	В чашку Петри диаметром 9 см добавляют 4 мл суспензии про-
топластов (стерильной пипеткой с ватной пробкой), а затем
4 мл расплавленной среды с агаром.
4.	Тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин для застывания
агара. Теперь протопласты находятся в среде с плотностью 2,5 X
X 104 клеток/мл. Запечатывают чашки Петри парафилмом и
хранят перевернутыми в термостатируемой комнате для куль-
тивирования.
3.4.4.	КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В ВИСЯЧЕЙ/СИДЯЧЕЙ КАПЛЕ
1.	Суспендируют протопласты с плотностью 2,5 ХЮ4 клеток/мл
среды.
2.	С помощью автоматической пипетки распределяют протопласты
по маленьким каплям (обычно в пределах 20 — 40 мкл) на крыш-
ке или на дне чашки Петри.
3.	Чашки запечатывают парафилмом и хранят при высокой влаж-
ности. Для культуры в висячей капле обычно в чашку Петри
наливают небольшой объем среды для культивирования.
3.4.5.	КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В ЖИДКОЙ СРЕДЕ НА АГАРЕ
1.	Готовят чашки, добавляя соответствующий объем агаризован-
ной среды (8 мл на чашку диаметром 9 см и 4 мл на чашку диа-
метром 5 см) и позволяя этой среде растечься по чашке тонким
слоем.
2.	Наслаивают суспензии протопластов в соответствующей среде
для культивирования при концентрации, в два раза большей,
62
чем оптимальная плотность, на поверхность агаризованной среды
так, чтобы общая плотность протопластов уменьшилась вдвое.
3.	Запечатывают чашки парафилмом и хранят в комнате для куль-
тивирования. Протопласты в тонком слое жидкой среды мож-
но поддерживать в самых разных сосудах, например в колбах,
чашках Петри, пробирках, матрацах (медицинских) и т. д. В те-
чение первых 2 — 3 дней сосуды обычно хранят неподвижно.
Показано [4], что деление клеток (эффективность платирования)
можно увеличить, если вместо агара в среде для культивирования ис-
пользовать агарозу. Этот подход (см. разд. 3.4.6), видимо, стоит исполь-
зовать особенно для систем протопластов, рост которых замедлен или
невоспроизводим. Его можно также использовать для пересадки изо-
лированных гетерокарионов (см. разд. 3.7.4).
3.4.6.	КУЛЬТИВИРОВАНИЕ НА АГАРОЗНОЙ СРЕДЕ
1.	Готовят 4,5% суспензию агарозы в дистиллированной воде (Sea
Plaque, FMC Corporation, Marine Colloids Div., Rockland, MDO
4841, USA). Автоклавируют и хранят в расплавленном виде до
употребления.
2.	Разводят 1:1 используемой для протопластов средой в двой-
ной концентрации.
3.	Смешивают разбавленную 1 : 1 агарозную суспензию с протопла-
стами в обычной среде для культивирования с двойной плот-
ностью. Конечный объем, составляющий 4 мл, наливают в чашку
Петри диаметром 5 см. Дают смеси застыть.
4.	В случае необходимости разрезают слой агарозы (содержащий
протопласты) на четыре одинаковых сектора. Два сектора можно
перенести в среду для культивирования протопластов объемом
8 мл в чашку Петри диаметром 9 см для дальнейшего культи-
вирования (культивирование на агарозной подложке). В не-
которых случаях в таком переносе нет необходимости или его
можно отложить на срок до 7 дней.
5.	Варьирование сред и способов культивирования можно про-
водить последовательно. Например, блоки агарозы, погружен-
ные в жидкую среду, можно покачивать на круговой качалке
(5 —10 об/мин).
3.5.	ПОДДЕРЖАНИЕ КУЛЬТУР ПРОТОПЛАСТОВ И РЕГЕНЕРАЦИЯ
РАСТЕНИЙ
Очевидно, что оптимальные условия зависят от вида, а иногда и от
сорта растения. Большинство систем протопластов для инициации деле-
ния не требует света, однако некоторые из них обладают чувствитель-
ностью к свету. Температуру обычно меняют от 25 до 30 °C, а чашки
63
можно освещать непрерывно, используя люминесцентные лампы днев-
ного света интенсивностью до 1000 лк.
3.5.1.	ДЕЛЕНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ
Первые деления можно ожидать через 24 — 36 ч после пересадки
(для протопластов из культивируемых клеток) с завершением обра-
зования колоний через 21 день. В процессе культивирования можно
снизить осмотическое давление в культуральной среде для того, чтобы
увеличить скорость (но не уровень) деления. Для протопластов, нахо-
дящихся в агаре или агарозе, маленькие блоки среды, содержащие
делящиеся протопласты, переносят на поверхность среды (обычно
той же), содержащей меньшие количества плазмолитиков. Тот же блок,
если это нужно, можно пересаживать и дальше. Для культур в жидких
средах также можно добавлять определенные количества среды с пони-
женным осмотическим давлением. Культуры протопластов, способных
к регенерации, обычно разводят не более чем на 25 % по отношению к
объему среды на первых этапах роста.
Ниже приведена типичная схема.
Протопласты (в 8 мл среды) (9 %, масса к объему, маннита, начало инкубации)
I 2 недели
Добавление 2 мл среды, содержащей 6 % маннита
I 2 недели
Добавление 2 мл среды, содержащей 3 % маннита
I 2 недели или иное необходимое время
Добавление 2 мл среды без маннита
3.5.2.	РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ
Начиная с четвертой недели колонии можно пересаживать. Исполь-
зуя кончик скальпеля, их переносят на поверхность агаризованной сре-
ды для регенерации (см. табл. 3.2).
На этой стадии колонии или каллусы можно выращивать в чашках
Петри или в баночках. Обычно они требуют регулярной пересадки для
образования побегов. Побеги формируют корни при пересадке на среду,
с низкой концентрацией фитогормонов или без них (см. табл. 3.2 и
гл. 5).
3.5.3.	ВЫБОР СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И РЕГЕНЕРАЦИИ
ПРОТОПЛАСТОВ
Среда для культивирования, конечно, определяется видом и сортом
экспериментальных растений. Для культивирования протопластов и
регенерации растений разработано и изучено несколько сред.
64
3.5.3.1.	Среды на основе компонентов среды Мурасиге и Скуга [6]
Основную среду выпускают в сухом виде (Flow Laboratories, Irvine,
Ayshire, UK) в количествах, достаточных для приготовления от 1 до
100 л раствора. Порошок растворяют в 80% требуемого объема дистил-
лированной деионизированной воды или бидистиллированной воды и
вводят необходимые добавки. Доводят pH среды и конечный объем.
На этом этапе добавляют весь требуемый агар, среду стерилизуют в
автоклаве горячим паром и горячую разливают в соответствующую
посуду.
В таблице 3.2 перечислены среды, наиболее удобные для культи-
вирования протопластов и регенерации растений.
3.5.3.2.	Среды на основе прописи Као и Михайлюка (КМ) [7]
При успешном культивировании протопластов и в особенности
изолированных гетерокарионов (см. выбор методик) для деления про-
топластов и клеток при низкой плотности часто необходимо исполь-
зовать обогащенные среды. Был подобран ряд сред для культивирова-
ния клеток и протопластов. Сначала протопласты помещают в среду
КМ8р [7] или КР8 [8], а затем разбавляют среды соответственно КМ8
[7] или К8 [8] (с пониженным осмотическим давлением).
3.5.4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ
Для успешного получения соматических гибридов во многих слу-
чаях необходимо разработать среду для культивирования, которая бу-
дет способствовать делению протопластов или направленно ингиби-
ровать его (т. е. рост замедлен у. одной из родительских форм, тогда
как у другой останется неизменным). В этом случае может быть облег-
чен активный рост соматического гибрида. Существует простой спо-
соб изучения большого числа различных вариантов сред. Этот принцип
с использованием нескольких одинаковых чашек размером 5 X 5 см
может быть применен и при изучении морфогенетического ответа кал-
луса, полученного из протопластов.
З.5.4.1.	Метод нескольких микрокапель (МНМ)
Метод, описанный ниже, представляет собой упрощенный вариант ме-
тода микрокапель [9]. Этот вариант предназначен для изучения реакции
протопластов на сочетание двух факторов, каждый из которых испы-
тывают в трех концентрациях. В данном случае такими факторами яв-
ляются: НУК (4,0; 2,0 и 1,0 мкг/мл) и БАП (2,0; 1,0 и 0,5 мкг/мл).
1.	Выделяют протопласты обычным методом и суспендируют при
плотности, превышающей нормальную в три раза (в данном
3 - 1021
65
случае 1,5X 10s клеток/мл при конечной плотности 5Х 104 кле-
ток/мл), в среде МС без гормонов, но содержащей 9% (масса к
объему) маннита.
2.	Готовят исходные растворы НУК и БАП, концентрация которых
в три раза превышает их конечную концентрацию в среде МС.
Каждый исходный раствор обозначен:
для НУК: 1 = 12 мкг/мл; 2 = 6,0 мкг/мл; 3 = 3,0 мкг/мл;
для БАП: А = 6,0 мкг/мл; Б = 3,0 мкг/мл; В = 1,5 мкг/мл.
Каждую комбинацию концентраций НУК и БАП смешивают
вместе с протопластами в отдельной лунке на чашке для микро-
анализа. Кодируют каждую лунку по ее сочетанию:
3.	С помощью микропипетки наливают по 100 мкл суспензии про-
топластов в каждую лунку, затем добавляют по 100 мкл соот-
ветствующего исходного раствора НУК и по 100 мкл соответ-
ствующего исходного раствора БАП.
4.	Смешивают протопласты и среды, мягко постукивая по краю
чашки.
5.	Для каждой чашки-реплики размечают сетку на крышке:
1 г з
На одну обработку необходимо
пить чашек Петри (диаметром 5 см)
Снимают крышку с каждой чашки и кладут в перевернутом виде.
6.	С помощью микропипетки переносят каплю объемом 20 мкл
смеси А1 на поверхность, которая на каждой крышке-реплике
обозначена также А1. Используя свежий наконечник для каж-
дой новой смеси, переносят таким же образом по 20 мкл смесей
А2, АЗ, Б1 и т. д.
7.	Осторожно накрывают крышками чашки Петри. При этом про-
топласты инкубируются в виде висячих капель. Для поддержа-
ния высокой влажности помещают чашки Петри (диаметром
5 см) в более крупные чашки диаметром 14 см, содержащие
мокрую фильтровальную бумагу.
Этот подход можно использовать более широко, включая третий
фактор, например, добавляя три различных концентрации 2,4-Д. По-
скольку в висячие капли добавляется третий фактор, для сохранения
конечной концентрации исходная концентрация протопластов и содер-
жание первых двух факторов должны быть шестикратными. Исходный
раствор третьего фактора должен быть двукратным.
Готовят висячие капли так, как описано на стадиях 1—4, однако
число чашек-реплик должно быть больше. Ко всем каплям на первой
чашке добавляют по 20 мкл 2,4-Д в первой концентрации. Ко всем
каплям на второй чашке добавляют по 20 мкл 2,4-Д во второй концент-
рации. К каплям третьей чашки добавляют третью концентрацию. По-
вторяют все это на чашках-репликах.
Основываясь на вышеизложенной схеме, можно варьировать и до-
полнительными факторами, например светом и температурой. Для
большинства видов растений обычные колебания света составляют
0 — 2000 лк, а температуры — от 15 до 30 С.
3.6.	СОМАТИЧЕСКАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ РАСТЕНИЙ
3.6.1.	ВВЕДЕНИЕ
Соматическая гибридизация растений включает четыре отдельных
этапа:
а)	выделение протопластов,
б)	слияние;
в)	отбор и регенерацию растений,
г)	анализ растений-регенерантов.
Соматическая гибридизация представляет собой единственный
метод, позволяющий обойти проблему половой несовместимости у
растений. Поскольку для слияния протопластов не существует барь-
еров, на уровне протопластов могут быть объединены несовместимые
и поэтому изолированные друг от друга при половом размножении
виды растений. После слияния гетерокарионы, содержащие ядра двух
видов в общей цитоплазме, регенерируют новую клеточную стенку,
делятся, а слияние ядер приводит к образованию клетки соматического
гибрида. Клетка соматического гибрида, как и нормальная клетка
растения, тотипотентна и поэтому способна развиваться в целые (гиб-
ридные) растения через эмбриогенез или органогенез. Таким образом,
67
соматическая гибридизация обеспечивает не только путь для получения
новых гибридов между несовместимыми при половом скрещивании ком-
бинациями видов, но и путь для генетической модификации вегета-
тивно размножаемых сельскохозяйственных культур стерильных или
слабофертильных видов, а также видов с длительным жизненным цик-
лом. Слияние протопластов и регенерация растения облегчают также и
перенос между растениями, принадлежащими к разным видам или
родам, внеядерных генетических элементов, таких, как митохондриаль-
ная ДНК (цитоплазматическая мужская стерильность), а также генов,
локализованных в хлоропластах и в цитоплазме. Следовательно, этот
подход в целом необычайно ценен для селекции и улучшения растений
[1, Ю].
Основное оборудование, необходимое для соматической гибриди-
зации растений, приведено на стр. 77. Для индукции процесса слияния
протопластов существует много различных методов. Главным обра-
зом они отличаются по составу агента, вызывающего слияние. Ниже
приведены стандартный метод и схема эксперимента, успешно исполь-
зуемые для получения соматических гибридов. Чтобы как-то иденти-
фицировать слияние, применяют визуальные маркеры, например зе-
леные протопласты из мезофилла листа одного родительского вида
растения комбинируют с бесцветными (культивируемые клетки/корень/
семядоля/растение-альбинос) протопластами другого. При этом гете-
рокарионы идентифицируют, как протопласты, содержащие хлоро-
пласты (из мезофилла растения-родителя) в обширном пространстве
цитоплазмы (от бесцветных клеток другого растения-партнера).
В качестве примера ниже описан метод слияния протопластов из
мезофилла листа Petunia parodii (см. разд. 3.3.1) с протопластами из
суспензии клеток альбиносной формы Р. hybrida (см. разд. 3.3.2). При-
веден и другой способ обработки, индуцирующей слияние протопла-
стов.
3.6.2.	СЛИЯНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ: ОСНОВНОЙ МЕТОД
1.	Доводят плотность суспензии протопластов Р. parodii и альби-
носной формы Р. hybrida до 2 X 10 s клеток/мл в среде M/СП, 9М.
2.	Отмечают на каждой центрифужной пробирке объемы 4 и 8 мл
(на один эксперимент по слиянию требуется семь пробирок).
3.	Разливают протопласты следующим образом:
1 пробирка
1 пробирка
1 пробирка
1 пробирка
3 пробирки
4 мл Р. parodii
4 мл Р. hybrida
8 мл Р. parodii
8 мл Р. hybrida
4 мл Р. parodii плюс
4 мл Р. hybrida
Надписывают: Р. par.; жиз-
неспособность
Р. hyb.; жизнеспособность
Р. par.; самогибридизация
Р. hyb.; самогибридизация
Надписывают: Слияние
68
4.	Центрифугируют пробирки, за исключением двух контроль-
ных на жизнеспособность, для осаждения протопластов.
5.	Удаляют среду (некоторые протопласты Р. parodii могут всплыть,
поэтому среду следует удалять между двумя слоями), чтобы
протопласты оставались в виде суспензии в объеме, не превы-
шающем 0,5 мл.
6.	Добавляют вещество, индуцирующее слияние (см. методику
в разд. 3.6.3 — 3.6.6).
7.	Промывают протопласты, чтобы очистить их от вещества, инду-
цирующего слияние (см. соответствующую методику).
8.	Суспендируют протопласты, обработанные индуктором сли-
яния, в 16 мл (одна полная пробирка) среды М/СП! 9М.-
9.	Готовят 12 чашек Петри диаметром 9 см, в каждой из которых
содержится 8 мл агаризованной среды М/СП19М.
10.	Доводят объем среды М/СП19М в двух пробирках (контроль
на жизнеспособность) до 8 мл.
11.	Распределяют протопласты следующим образом:
а.	Р. parodii; жизнеспособность — 8 мл на чашку: 1 чашка.
б.	Альбиносная форма Р. hybrida; жизнеспособность — 8 мл на
чашку: 1 чашка.
в.	Три пробирки с протопластами, обработанными для слияния,
каждую пробирку в две чашки — 8 мл на чашку: 6 чашек.
г.	Р. parodii самогибрид — 8 мл в одну чашку.
д.	Альбиносная форма Р. hybrida; самогибрид — 8 мл в одну чашку,
е. Оставшиеся две пробы самогибридов по 8 мл смешивают
и распределяют по двум чашкам — по 8 мл на чашку: две чашки
(контрольная смесь на действие самого процесса слияния).
ж.	Запечатывают все чашки парафилмом и инкубируют при
25 °C с постоянным освещением лампами дневного света
700 лк.
3.6.3.	ОБРАБОТКА ДЛЯ СЛИЯНИЯ: ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ (ПЭГ)
1.	Выполняют операции I — 5 из прописи основного метода.
2.	Добавляют по 2 мл ПЭГ (см. стр. 70) в каждую пробирку (за
исключением контрольных на жизнеспособность) и оставляют
на 10 мин.
3.	Разводят ПЭГ через каждые пять минут, добавляя следующие
объемы среды М/СЩ9М: 0,5; 1,0; 2,0; 2,0; 3,0; 4,0 мл на про-
бирку. После каждого разведения протопласты суспендируют.
4.	Проводят центрифугирование (100 g, 10 мин), чтобы осадить
протопласты и удалить надосад очную жидкость. (Протопласты
Р. parodii могут всплывать, и поэтому среду следует отбирать
между двумя слоями протопластов.)
69
5.	Промывают протопласты один раз в среде М/СП|9М, ресуспен-
дируя и центрифугируя их.
6.	Далее выполняют операции 8—11 из прописи основного ме-
тода.
3.6.4.	ОБРАБОТКА ДЛЯ СЛИЯНИЯ: СЛИЯНИЕ ПРИ ВЫСОКОМ pH
И НАЛИЧИИ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ
1.	Выполняют операции 1 — 5 из прописи основного метода.
2.	Добавляют по 4 мл на каждую пробирку раствора для слияния
с высоким pH и наличием ионов кальция (см. ниже) (кроме
контрольных на жизнеспособность). Инкубируют пробирки
на водяной бане при 30 °C в течение 10 мин.
3.	Центрифугируют (50 g, 3 — 4 мин), удаляют надосадочную жид-
кость.
4.	Протопласты дважды промывают раствором СПП13М/Са2+,
ресуспендируя и центрифугируя их.
5.	Далее выполняют операции 8 — 11 из прописи основного ме-
тода.
Состав растворов для слияния и промывки протопластов
Растворы для слияния ПЭГ	30% (масса к объему) полиэтиленгликоля, мол. масса 6000 4 % сахарозы 0,01МСаС12 -2Н2О
Высокий рН/Са2+	(автоклавируют и хранят в темноте при 4 °C) 0,05 М глицин-NaOH буфер 1,1 % (масса к объему) СаС12 • 6Н2О 9 % (масса к объему) маннита pH 10,4 (стерилизуют путем фильтрования; исполь-
Высокий рН/Са2+	зуют свежеприготовленный раствор) (Также используется для слияния при высоком pH) То же, что и выше, но с 10% (масса к объему) маннита
Раствор для промывки СПП13М/Са	То же, что и среда СПП13М (стр. 56), но с до- бавлением 0,74 г/мл СаС1г • 2Н2О
Растворы для слияния и промывки при работе снебол
ш и м и объемами
Раствор для слияния ПЭГ	22,5 % (масса к объему) полиэтиленгликоля, мол. масса 6000 1,8% (масса к объему) сахарозы 154 мг/100 мл СаС12 • 2Н2 О 9,52 мг/100 мл КН2РО4 pH 5,8 (доводят 1М КОН или НС1)
Раствор для промывки	740 мг/100 мл СаС12 - 2Hj О 375 мг/100 мл глицина 11 % (масса к объему) сахарозы pH 5,8
70
3.641.	Модификация: слияние в условиях обработки ПЭ Г привысокомрН
1.	Выполняют операции 1 — 5 из прописи основного метода и опе-
рацию 2 метода слияния в присутствии ПЭГ.
2.	Через 10 мин инкубации с ПЭГ в каждую пробирку добавляют
по 8 мл раствора с высоким рН/Са+2 и оставляют на 10 мин.
3.	Выполняют стадии 3 и 4 метода слияния при высоком рН/Са+2.
4.	Выполняют стадии 8 — 11 основного метода.
3.6.4.2.	Модификация: слияние в воде при высоком pH
1.	Выполняют операции 1 — 5 из прописи основного метода.
2.	Добавляют 8 мл раствора для слияния с высоким рН/Са+2 (см.
стр.70).
3.	Осторожно центрифугируют (60 g, 2 —3 мин). Пробирки поме-
щают на водяную баню при 30 °C.
4.	Через 12—17 мин добавляют 2 мл стерилизованной воды, осто-
рожно смешивают с раствором с высоким pH, стараясь не взбол-
тать осадок протопластов.
5.	Инкубируют в течение 10 мин на водяной бане.
6.	Удаляют надосадочную жидкость.
7.	Промывают один раз протопласты раствором СПП13М/Са+2 с
помощью ресуспендирования и центрифугирования.
8.	Выполняют стадии 8 — 11 основного метода.
3.6.5.	СЛИЯНИЕ В НЕБОЛЬШИХ ОБЪЕМАХ
Представляемую методику можно использовать для различных
комбинаций видов растений, включая и „идентификацию гетерокарио-
нов”, и изучение слияния протопластов, полученных из зеленых листьев
(мезофилльных) и культивируемых клеток (белых). Этот метод идеа-
лен для небольших количеств протопластов.
1.	Суспендируют протопласты двух типов (видов) в среде СПП13М
с плотностью 2,5X10s протопластов/мл. Затем смешивают их
для удобства в центрифужных пробирках с завинчивающимися
крышками в соотношении 1:1. Минимальный объем каждого
типа суспензии составляет 2 мл.
2.	Используя пастеровскую пипетку, помещают маленькую ка-
плю смеси протопластов на стерильное покровное стекло в чаш-
ке Петри диаметром 5 см и дают протопластам осесть в течение
10—15 мин.
3.	Добавляют две таких же капли раствора для слияния (см.
стр. 70) по обеим сторонам первой капли таким образом, чтобы
три капли постепенно слились.
4.	Протопласты не трогают в течение 20 —25 мин, оставив их при
комнатной температуре, а затем медленно добавляют одну каплю
71
раствора для промывки (см. стр. 70) , отбирая одновременно из
слившихся капель часть раствора для слияния. Повторяют эту
процедуру в течение 20 мин с пятиминутным интервалом. В хо-
де этих манипуляций важно как можно меньше задевать прото-
пласты.
5.	После удаления раствора для слияния, содержащего ПЭГ, за-
меняют раствор для промывки культуральной средой (например,
средой П/СП19М). После этого необходимо промыть прото-
пласты средой для культивирования, по крайней мере, еще три
раза.
6.	Для культивирования протопластов заливают покровное стекло
средой для культивирования и, прежде чем заклеивать чашку
Петри парафилмом, вносят несколько капель среды.
3.6.6.	МЕТОД ЭЛЕКТРОСЛИЯНИЯ
В последнее время был разработан метод, отличный от химической
индукции слияния, — метод электрослияния. Однако этот подход, обыч-
но не нужный для успешного слияния протопластов и для соматической
гибридизации, высокоспецифичен и требует дорогостоящего обору-
дования. С деталями, касающимися оборудования и методов, можно
ознакомиться в работе [11].
Вышеупомянутые методики, конечно, могут быть модифициро-
ваны с тем, чтобы они были удобны и соответствовали системам про-
топластов, объектам и целям работы. В целом необходимо отметить
следующее.
1.	Слияние — это случайный процесс.
2.	Протопласты мезофилла (или содержащие пластиды) часто
повреждаются при любом методе с применением высокого pH, поэтому
лучше использовать ПЭГ, особенно если проводят слияние двух мезо-
филльных клеток.
3.	После слияния при высоком pH протопластов культивируемых
клеток и клеток дикого типа (соответственно белых и зеленых, из
мезофилла листа) образуются стабильные гетерокарионы. Тот факт,
что протопласты из мезофилла листа (неслившиеся и гомокарионы) по-
вреждаются и обычно разрываются, облегчает визуальную идентифи-
кацию гетерокарионов.
4.	Соотношение протопластов, готовящихся к слиянию, не обя-
зательно должно составлять 1:1. Например, при индукции к слиянию
протопластов мезофилла соотношение 1 :9 более или менее Гаранти-
рует большую вероятность образования гетерокариона, чем гомока-
риона.
72
3.7.	ОТБОР СОМАТИЧЕСКИХ ГИБРИДОВ
3.7.1.	ВВЕДЕНИЕ
На способность протопластов к слиянию действует много факто-
ров. Реакция протопластов на разные индукторы слияния неоднознач-
на, и поэтому необходимо установить равновесие между уровнем инду-
цируемого слияния и жизнеспособностью протопластов после слия-
ния. Во многих случаях было показано, что протопласты однодольных
легче индуцировать к слиянию, чем протопласты двудольных. Конеч-
ная цель большинства экспериментов по слиянию протопластов — по-
лучение гибридных растений, поэтому низкий уровень слияний при мак-
симальной жизнеспособности требует разработки определенных мето-
дов отбора, обеспечивающих преимущественный рост (или выживание)
предполагаемых соматических гибридов (см. табл. 3.3) ."В этом отно-
шении мутанты-альбиносы — наиболее распространенные и легко узна-
ваемые и поэтому чаще используемые. По-видимому, самые успеш-
ные комбинации наблюдали в тех экспериментах, где использовали
слияние протопластов дикого типа с ограниченным ростом (Р. parodii)
с альбиносными растениями (Р. hybrida) или использовали оба парт-
нера-альбиноса (например, Р. parodii/P. hybrida, Р. parodii/P. inflata
[12]).
3.7.2.	ПОЛУЧЕНИЕ И ВЫРАЩИВАНИЕ ЯДЕРНЫХ МУТАНТОВ-АЛЬБИНОСОВ
3.7.2.1.	Облучение семян
Ядерные мутанты-альбиносы Р. parodii и Р. parviflora можно полу-
чить, облучая семена нормальных диплоидных растений дозами 13,4
и 13,8 крад (в качестве источника 7-излучения можно использовать
Со60).
1.	Помещают семена на поверхность увлажненного беспочвенного
компоста Левингтона и ставят в холодильник на две недели при
при 4 °C.
2.	Проращивают семена на свету и получают в теплице проростки
(см. описание выращивания растений для получения протопла-
стов). Дозы облучения должны быть таковы, чтобы погибло
примерно 50% семян по сравнению с контрольными необлучен-
ными семенами (90 — 100 % прорастания).
3.	Самоопыляют растения и яровизируют выборочно собранные
из растений семена при 4 °C в течение 2 недель, а затем поме-
щают их на влажную фильтровальную бумагу. Таким образом
можно идентифицировать гетерозиготные растения, в потом-
стве которых происходит расщепление зеленых к белым как
3 : 1 для рецессивных моногенных мутаций типа альбина.
73
3.7,2.2.	Получение суспензионной культуры альбиносов
1.	Стерилизуют поверхность гетерозиготных растений (30 мин в
10%, объем к объему, растворе доместоса, после чего промы-
вают несколько раз простерилизованной водой) и высаживают
на среду Б ГС (см. табл. 3.2) в чашки Петри диаметром 9 см
(150 семян на чашку). Для некоторых видов семена до выращи-
вания при 27 С и на свету необходимо яровизировать при 4 °C
в течение 2 недель.
2.	Отбирают белые проростки, обычно через 3—4 недели после
прорастания и делают надрезы на листьях перед тем, как помес-
тить их на поверхность среды УМ (см. табл. 3.2) в круглые баноч-
ки с завинчивающимися крышками.
3.	Переносят полученные таким образом каллусы на среду УМ
(200 мл в колбы объемом 500 мл) и получают из них суспен-
зию клеток (см. гл. 1, разд. 1.5), которая должна пересажи-
ваться каждую неделю. Для получения протопластов из альби-
носных клеток в большинстве случаев суспензия клеток явля-
ется лучшим исходным материалом (см. разделы по методам
выделения протопластов).
3.7.3.	СПОНТАННЫЕ МУТАНТЫ-АЛЬБИНОСЫ
Случайные спонтанные мутации (почти всегда цитоплазматиче-
ские) можно обнаружить как в регенерантах, так и в тепличных расте-
ниях. Поверхность белых побегов необходимо простерилизовать и
перенести на среду УМ. Кроме того, растения-альбиносы можно полу-
чить из семян через самоопыление цветков, появляющихся на абсо-
лютно белых побегах пестролистных растений. С таким материалом
следует обращаться, как и с мутантными растениями, полученными
после облучения.
Ряд соматических гибридов удалось получить, используя мутан-
ты-альбиносы; в таблице 3.3 суммированы состав раствора, использо-
вавшегося для слияния протопластов, способ отбора и природа половой
несовместимости. Необходимо подчеркнуть, что для данного сочетания
видов оптимальные условия для эффективного слияния следует под-
бирать экспериментальным путем (по этому вопросу см. [1, 10], а так-
же ссылки в табл. 3.3).
3.7.4.	ВЫДЕЛЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ГЕТЕРОКАРИОНОВ
Кроме биохимических методов отбора, существуют и физические
приемы изолирования отдельных гетерокарионов. Для этого прежде
всего необходимо выделить признак, по которому гетерокарионы по-
сле слияния можно было бы легко идентифицировать. Если существу-
74
ют визуальные маркеры (например, протопласты мезофилла и куль-
тивируемых клеток), то гетерокарионы изолируют, используя инвер-
тированный микроскоп и микроманипулятор [13]. При отсутствии
природных визуальных маркеров протопласты метят до слияния ка-
ким-нибудь флуоресцирующим красителем (см. [14]) и вручную изо-
лируют или отбирают, используя проточный флуориметр с сортером
[15].
3.3.	Некоторые растворы для слияния, используемые
для получения соматических гибридов
Комбинация видов	Раствор для слияния	Литера- турный источник
Datura innoxia (М, Р),	। хлорофилл-дефектное X	J X Datura Candida (М, р) *,	]	r O,2MCa(NO3)2 0,05 М глицин NaOH pH 9,0	[22]
дикий тип	 Datura innoxia (М, Р),	10% 45 %-ного раствора ПЭГ 6000 (23]	
хлорофилл-дефектное X X Atropa belladonna (М, Р) ***		
Nicotiana glauca (М, р),	0,25 MNaNO3	[24]
дикий тип У. Nicotiana langsdorfii (М, р) *, дикий тип		
Nicotiana tabacum (С, Р), альбиносное X Nico-	J tiana knightiana	]	40 % ПЭГ 6000 0,1 М СаС12 0,3 М глюкоза	[25]
(М, р) *, дикий тип	с pH 5,6 + 0,05 М CaClj • 2Н2 О • 2Н2 О 0,4 М маннит 0,05 М глицин/NaOH pH 10,5	к
Nicotiana tabacum (С, р), устойчивый к 5-ме- тилтриптофану X Nicotiana glutinosa (М, р) **, дикий тип	15 % декстран (мол. масса 500 000) 5%NaCl	, + 0,1 М NaOH 1 8 % NaCl	)	[26]
Nicotiana tabacum (М, р) ЦИС, устойчивое к стрептомицину X Nicotiana plumbaginifolia (М, р) *, дикий тип	40% ПЭГ 6000 । 0,3 М глюкоза (66 мМ СаС12 pH 6,0 + 0,4 М глюкоза 66 мМ СаС12 10%ДМСО 0,03 М глицин/NaOH pH 10,5 _	[27]
Nicotiana tabacum (С, Р), серный мутант X X Nicotiana otophora (М, р) *, дикий тип	f 50 % ПЭГ 1540 10,5 мМ СаС12 • 2Н2О 1о,7мМКН2Р04 ’	ч + 50 мМ СаС12 0,3 М глюкозы 0,05 И глицин/NaOH pH 10,5	[28]
75
Окончание табл. 3.3
Литера-
Комбинация видов	Раствор для слияния	туриый
источник
Petunia parodii	(	15 % ПЭГ 6000	[29]
(М, р), дикий тип X	< X Petunia hybrida	( (М, р) *, дикий тип	4 % сахароза 0,01 И СаС12	
Petunia parodii (И, р), дикий тип X X Petunia parviflora (К, Р)***,альбинос	' 0,05 М СаС12 • 2Н2 О 0,4 М маннит „ 0,05 М глицин/NaOH pH 10,5	[30]
Daucus carota (С, Р),альбинос X X Daucus capillifolius (С, Р) *, дикий тип Daucus carota	] (С,Р),альбинос X Petroselenium hortense (М, р) ***, дикий тип	' 50 % ПЭГ 1540 0,1 М глюкоза 10,5 мМ СаС12 0,7 мМ КН2РО„	[31] [32]
Brassica oleracea (М, р), дикий тип X X Brassica campestris (М, р) *, дикий тип	Г 30 % ПЭГ 6000 1 0,4 М глюкоза 1 30мМСаС12 1 pH 9,5	[33]
Arabidopsis thaliana (К, р), дикий тип X X Brassica campestris (М, р) ***, дикий тип	50 % ПЭГ 6000 0,1 М глюкоза 10,5 мМ СаС12 .0,7 мМ КН2РО„ +	[34]
+ 50 мМ СаС12
0,03 М глюкоза
0,05 Мглицин/NaOH pH 10,5
Обозначения. Источник протопластов: М — мезофилл, К — каллус, С — клетки
суспензионной культуры. Способность к регенерации: Р — способный к морфо-
генезу, р — неспособный к морфогенезу в данных условиях.
Половая совместимость/несовместимость:* растения с прловой совместимостью,
** с односторонней несовместимостью,*** с половой несовместимостью; ЦИС -
цитоплазматическая мужская стерильность.
+ Вещества добавляются последовательно (вторая колонка).
3.7.5.	АНАЛИЗ РАСТЕНИЙ, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ СОМАТИЧЕСКОЙ
ГИБРИДИЗАЦИИ
После получения соматических гибридов необходимо провести био-
химический и цитологический анализ, т. е. сравнительный анализ роди-
тельских видов, гибридов первого поколения (где это возможно) и
растений-регенерантов. Обычно используют несколько стандартных
экспериментальных подходов, практические детали которых можно
найти в следующих публикациях: 1) анализ белка фракции 1 [16];
2) число хромосом и кариотип [17]; 3) изоферменты [18]; 4) мито-
76
хондриальная ДНК [19]; 5) хлоропластная ДНК [20]; 6) общая мор-
фология [21].
5.7.6.	ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ЭКСПЕРИМЕНТАМ ПО СЛИЯНИЮ
Ниже приведено общее и специальное оборудование, необходимое
для исследований по слиянию и отбору.
Перечень оборудования для экспериментов по слия-
нию
Оборудование, необходимое для стандартных экспериментов по слиянию
протопластов мезофилла и альбиносного растения
Чашки Петри диаметром 5,9 см и 14 см
Колба объемом 250 мл (для инкубирования клеток суспензионной культуры с
ферментами)
Две кафельных плитки (используемые в качестве рабочей поверхности при сня-
тии с листьев нижнего эпидермиса)
Пинцет, скальпель
Перчатки резиновые или разового пользования
Матрацы объемом 100 мл (не менее 2)
Нейлоновые сита диаметром 64 мкм (не менее 2)
Одноразовые пастеровские пипетки с ватными пробками и маленькими резино-
выми грушами
Металлические чашки (2)
Центрифужные пробирки с завинчивающимися крышками (20)
Градуированные пробирки (с градуировкой по 1 мл, максимальный объем 16 мл)
Основное оборудование
Ламинар-бокс
Простерилизованная вода (6 X 500 мл)
Прибор для плавления агара
Водяная баня на 30 °C
Круговая качалка (20 — 80 об/мин)
Доместос (или эквивалентный раствор гипохлорита)
Камера Фукса - Розенталя
Среда для культивирования и соответствующие растворы для промывки
Микроскоп (обычный и инвертированный)
Центрифуга с бакет-ротором (работающая в режиме 50 — 200 g)
3.8.	ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМ
ПРОТОПЛАСТОВ
3.8.1.	ВВЕДЕНИЕ
Трансформацию растений в отличие от соматической гибридизации
рассматривают как способ получения более ограниченных (и специфи-
ческих) генетических изменений. Во многих случаях отдельный важ-
ный в сельскохозяйственном отношении признак, в идеале контроли-
руемый одним или небольшим числом генов, может быть изменен путем
трансформации, при этом большая часть генома растения остается без
изменений. В настоящее время разрабатывается много подходов к про-
блеме трансформации растений [2], однако с практической точки зре-
ния относительно простой и воспроизводимый метод (для двудоль-
ных растений) основан на использовании Agrobacterium tumefaciens
или Ti-плазмиды и их взаимодействии с протопластами или системами
77
регенерирующих протопластов. При таком подходе в качестве селек-
тивного маркера используют индуцированную автотрофность по аук-
сину. Ниже описаны методики применения.
3.8.2.	ТРАНСФОРМАЦИЯ ИЗОЛИРОВАННЫМИ Ti-ПЛАЗМИДАМИ
(НА ПРИМЕРЕ PETUNIA HYBRIDA)
1.	Выделяют из суспензионной культуры протопласты (см. разд.
3.3.2). Подсчитывают и ресуспендируют в среде СПП9М (см.
стр. 56).
2.	Переносят 4 X 106 протопластов в центрифужную пробирку
размером 12 X 100 мм. Центрифугируют (90 g, 2 мин) и удаляют
надосадочную жидкость.
3.	Ресуспендируют протопласты в 1,0 мл буфера трис-ЭДТА (0,05 М
трис-НС1, pH 8,5 и 0,02 М Na2 ЭДТА), содержащего 9% (масса
к объему) маннита, 10 мкг Ti-плазмиды (приготовление см.
[35]) и 2 мкг поли-Ь-орнитина (мол. масса 166000, Sigma Chemi-
cals Со). Оставляют на 1 ч при 27 °C.
4.	После инкубации трижды промывают протопласты в 8 мл бу-
фера трис-ЭДТА (см. 3), содержащего 9% маннита.
5.	Пересаживают протопласты с плотностью 2Х 10 s клеток/мл
в жидкую среду М/СП19М (см. табл. 3.2) (4 мл на каждую
чашку Петри диаметром 5 см). Запечатывают чашки парафил-
мом и инкубируют при 25 °C и постоянном освещении 700 лк.
3.8.2.1.	Отбор трансформированных колоний
1.	Через две недели осторожно отделяют регенерированные клетки
и распределяют их на поверхности среды МС, содержащей 0,6%
агар Sigma, пониженные концентрации фитогормонов (0,44 мг/л
НУК, 0,11 мг/л БАП) и сначала 9,0% маннита (pH 5,8).
2.	Переносят клетки/колонии в ту же среду, но с постепенным сни-
жением осмотического давления (т. е. через неделю снижают
концентрацию маннита до 7 %, через две — до 4,5 %, через четыре —
до 3,0%, а через шесть недель — до 0,0%).
3.	Наконец, переносят выжившие колонии клеток в среду М/СО
(см. табл. 3.2), не содержащую фитогормоны. Регулярная пере-
садка на этой среде обеспечивает постоянное давление отбора
на трансформированные (ауксин-автотрофные) клетки.
3.8.3.	ТРАНСФОРМАЦИЯ РЕГЕНЕРИРУЮЩИХ ПРОТОПЛАСТОВ
AGROBACTERIUM (НА ПРИМЕРЕ NICOTIANA TABACUM)
1.	Получают протопласты из листьев (см. разд. 3.3.1, табл. 3.1).
2.	Культивируют их (при плотности 2,0 X 10 s клеток/мл) в 3,0 мл
жидкой среды М/СП19М (см. табл. 3.2), нанесенной на агари-
78
зованную среду М/СП19М (см. разд. 3.4.5), в чашках Петри
диаметром 9 см. Чашки инкубируют при 25 °C и освещении
700 лк.
3.	Через 7 дней переносят регенерирующие клетки на среду
М/СП17М (7% маннита) и на четырнадцатый день после полу-
чения протопластов инфицируют 0,4 мл суточной культуры
A. tumefaciens, выращенной на пептонной среде (приготовление
см. [35]). Чтобы трансформация была эффективной, конечная
смесь должна содержать 5,0X 10 7 бактерий/мл и 0,8 X 10 2 бак-
терий на регенерирующую клетку табака. Инкубируют 36 ч при
25 °C в темноте.
3.8.3.1.	Отбор трансформированных колоний
1.	Переносят клетки на свежую среду М/СП17М (жидкую среду,
нанесенную на агаризованную, см. разд. 3.4.5), к которой добав-
лен карбеницилин в концентрации 1,0 мг/мл.
2.	Путем последовательных переносов снижают осмотическое дав-
ление до 3,5 % маннита и, наконец, через 4 недели — до 0% ман-
нита или инкубируют в среде М/СП; ОМ, также в присутствии
карбеницилина.
3.	Переносят клетки на агаризованную среду М/СП;0М (см. табл.
3.2)	с антибиотиком. Через 4 — 6 недель с помощью скальпеля
переносят индивидуальные колонии (> 1000) на агаризованную
среду М/СО (см. табл. 3.2) и субкультивируют каждые 4 неде-
ли. Выжившие (ауксин-автотрофные) колонии представляют
собой трансформанты.
Две описанные методики можно модифицировать для других (де-
лящихся) систем протопластов двудольных.
3.8.4.	ПРОВЕРКА ТРАНСФОРМАЦИИ И СПОСОБНОСТИ К ОБРАЗОВАНИЮ
ОПУХОЛИ
Трансформанты, полученные из протопластов и регенерировавших
клеток, необходимо детально проанализировать биохимически на при-
сутствие в них опиновых аминокислот. Наличие этих опинов, сопря-
женное с автотрофностью по ауксину, подтверждает факт трансфор-
мации Agrobacterium и (или) Ti-плазмидой [36]. Простой тест, подтверж-
дающий отличие опухолевого состояния от обычного, — это прививка
отобранных (трансформированных) каллусов.
З.8.4.1.	Определение способности образовывать опухоль
с помощью прививки
1.	Берут молодые побеги растений, выращенных в теплице (Petunia,
Nicotiana или соответствующий вид растения, используемый
79
для получения протопластов), и проводят поверхностную сте-
рилизацию.
2.	Срезают верхнюю часть побегов длиной 5 см и помещают иссле-
дуемые (трансформированные) ткани в разрез длиной 0,5 см,
сделанный на каждом зкспланте стебля.
3.	Закрывают трансплантат стерильной (автоклавированной) мик-
ропористой лентой длиной 3 см (3 М Medical Products),.
4.	Помещают основание стебля в агаризованную среду с 0J мг/л
НУК в стеклянные банки с завинчивающейся крышкой объ-
емом 180 мл.
На месте прививки образуются трансформированные (опухоле-
вые) ткани.
3.9.	ВВЕДЕНИЕ ОРГАНЕЛЛ В ПРОТОПЛАСТЫ
3.9.1.	ВВЕДЕНИЕ
При слиянии протопластов разных видов вне зависимости от судьбы
ядер неизбежно происходит перенос органелл. Перенос (или обмен)
цитоплазмы и органелл в некоторых случаях может происходить вплоть
до образования растений-регенерантов. Это видно из экспериментов по
введению признака цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС),
контролируемого митохондриальной ДНК и описанного для многих
систем [37]. Во многих случаях протопласт (часто облученный для
инактивации ядра) [38] является наиболее эффективной системой
переноса органелл через слияние. Однако существуют методы введения
изолированных органелл (например, хлоропластов), микроорганизмов
(например, дрожжей) и более крупных частиц (например, цианобакте-
рий) [39]. Все эти методы осуществляются по общему принципу, осно-
ванному на условиях, применяемых для слияния протопластов. Чтобы
продемонстрировать проникновение, лучше использовать протопласты
из суспензии клеток (содержащих цитоплазму и лишенных пластид).
3.9.2.	ВВЕДЕНИЕ В ПРОТОПЛАСТЫ ВОДОРОСЛЕЙ, ХЛОРОПЛАСТОВ
И МИКРООРГАНИЗМОВ (НА ПРИМЕРЕ Р. HYBRIDA)
1.	Выделяют протопласты (см. разд. 3.3.1, 3.3.2).
2.	Суспендируют протопласты с плотностью 1X 106 клеток/мл
в среде СПП13М.
3.	Смешивают 1 мл суспензии протопластов с равным объемом
суспензии соответствующих органелл или микроорганизмов.
Для цианобактерий (например, Anacystis nidulans), микроорганиз-
мов (например, клеток или протопластов Saccharomyces сеге-
visiae) и хлоропластов (из любых видов) суспендируют их до
плотности 1 X 10 7 частиц/млв среде СПП13М [39].
80
4.	Добавляют к смеси 2 мл водного 40% раствора ПЭГ (мол. масса
6000), тщательно перемешивают и инкубируют при 37 °C в те-
чение 20 мин.
5.	Постепенно разводят смесь, добавляя через каждые пять минут
0,5 мл; 1,0; 2,0; 3,0 и 4,0 мл среды СПП13М. После каждого
добавления смесь тщательно перемешивают.
6.	Дают протопластам осесть, ресуспендируют их в свежей среде
СПП13М и инкубируют при 22 °C и освещении 100 лк.
7.	В течение последующих 3 ч отбирают образцы и фиксируют их
для электронной микроскопии [40].
ЛИТЕРАТУРА
1.	Evans, D. А. (1983) Bio/Technology, 1,253.
2.	Bevan, М. W. and Chilton, M. D. (1982) Annu. Rev. Genet., 16, 357.
3.	Lar kip, P. J. (1976) Planta, 128, 213.
4.	Lorz H., Larkin, P. J., Thomson, J. and Scowcroft, W. R. (1983) Plant Cell
Tissue Organ Culture, 2,217.
5.	Shillito, R. D., Paszkowski, J. and Potrykus, I. (1983) Plant Cell Rep., 2, 244.
6.	Murashige, T. and Skoog, F. (1962) Physiol. Plant., 15, 473.
7.	Kao, K. N. and Michayluk, M. R. (1975) Planta, 126, 105.
8.	Kao, K. N. (1977) Mol. Gen. Genet., 150, 225.
9.	Potrykus, I., Harms, С. T. and Lorz, H. (1979) Plant Sci. Lett., 14,231
10.	Harms, С. T. (1983) in Lecture Proceedings, 6th International Protoplast Sym-
posium, Basel, Switzerland. August 12 to 16, 1983, Potrykus, I., Harms, С. T., Hin-
nien, A., Hutter, R., King, P. J. and Shillito, R. D. (eds.), Experientia, Suppl. Vol 46,
p. 69.
11.	Watts, J. W. and King, J. M. (1984) Biosci. Rep., 4, 335.
12.	Power, J. B., Berry, S. F., Chapman, J. V., Sink, К. C. and Cocking, E. C. (1979)
Theor. Appl. Genet, 55, 97.
13.	Patnaik, G., Cocking, E. C., Hamill, J. and Pental, D. (1982) Plant Sci. Lett.,
24, 105.
14.	Galbraith, D. W. and Mauch, T. J. (1980) Z. Pflanzenphysiol., 98, 129.
15.	Galbraith, D. W. and Galbraith, J. E. C. (1979) Z. Pflanzenphysiol., 93, 149.
16.	Kumar, A., Wilson, D. and Cocking, E. C. Biochem. Genet., 19, 255.
17.	Gleba, Y. Y. and Hoffmann, F. (1978) Mol. Gen. Genet., 165, 257.
18.	Kameya, T., Horn, M. E. and Widholm, J. M. (1981) Z. Pflanzenphysiol., 104,
459.
19.	Galun, E., Arzec-Gonen, P., Fluhr, R., Edelman, M. and Aviv, D. (1982) Mol.
Gen. Genet., 186, 50.
20.	Gressel, J., Cohen, N. and Binding, H. (1984) Theor. Appl. Genet., 67,131.
21.	Evans, D. A., Flick, С. E., Kut, S. A. and Reed, S. M. (1982) Theor. Appl. Genet.,
62, 193.
22.	Schieder, O. (1980) Z. Pflanzenphysiol., 98, 119.
23.	Krumbiegcl, G. and Schieder, O. (1979) Planta, 145, 371.
24.	Carlson, P. S-, Smith, H. H. and Dearing, R. D. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 69, 2292.
25.	Maliga, P., Kiss, Z. R., Nagy, A. H. and Lazar, G. (1978) Mol. Gen. Genet.,
163, 145.
26.	Horn, M. E., Kameya, T., Brotherton, J. E. and Widholm, J. M. (1983) Mol.
Gen. Genet., 192, 235.
27.	Menczel, L., Nagy, F., Lazar, G. and Maliga, P, (1983) Mol. Gen. Genet., 189,365.
81
28.	Evans, D. A., Bravo, J. E., Kut, S. A. and Flick, С. E. (1983) Theor. Appl. Genet.,
65, 93.
29.	Power, J. B., Frcarson, E. M., Hayward, C., George, D., Evans, P. K., Berry,
S. F. and Cocking, E. C. (1976) Nature, 263, 500.
30.	Power, J. B., Berry, S. F., Chapman, J. V. and Cocking, E. C. (1980) Theor.
Appl. Genet., 57, 1.
'31	. Dudits, D., Hadlaczky, G-, Levi, E., Fever, O., Haydu, Z. and Lazar, G. (1977)
Theor. Appl. Genet., 51, 127.
32.	Dudits, D, Fejer, O. Hadlaczky, G., Koncz, C, Lazar, G. and Horath, G. (1980)
Mol. Gen. Genet., 179, 283.
33.	Schenck, H. R. and Robbclen, G. (1982) Z. Planzenziichtg., 89, 278.
34.	Gleba, Y. Y. and Hoffmann, F. (1980) Planta, 149,112.
35.	Davey, M. R., Freeman, J. P., Draper, J. and Cocking, E. C. (1980) Tissue Culture
Methods for Plant Pathologists, Ingram, D. S. and Helgeson, J. P. (eds.), Blackwell Scienti-
fic Publications, p. 209.
36.	Otten, L. А. В. M. and Schilperoort, R. A. (1978) Biochitn. Biophys. Acta, 527,
497.
37.	Izhar, S., Schlicter, M. and Swartzberg, D. (1983) Mol. Gen. Genet., 190, 468.
38.	Menczel, L., Galiba, G., Nagy, F. and Maliga, P. (1982) Genetics, 100, 487.
39.	Davey, M. R. and Power, J. В. (19T 5) Plant Sci. Lett., 5, 269.
40.	Fowke, L. C. (1975) Plant Tissue Culture Methods, Gamborg, O. L. and Wetter,
L. R. (eds.), Prairie Regional Lab., Saskatoon, Canada, p. 72.
4. ОТБОР КЛЕТОК РАСТЕНИЙ ПО ТРЕБУЕМЫМ ПРИЗНАКАМ:
УСТОЙЧИВОСТЬ К ИНГИБИТОРАМ
Р. А. ГОНЗАЛЕС, ДЖ, М, УИДХОЛМ
4.1.	ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время -в экспериментах по отбору культивируемых
клеток или протопластов получено большое число мутантов [1, 2]. От-
бор по устойчивости — это наиболее простой метод отбора мутантов,
поскольку резистентные клетки могут быть отобраны в большом ко-
личестве по их способности расти в присутствии ингибитора, в то время
как чувствительные клетки гибнут. Это очень продуктивный метод,
позволяющий достаточно легко проверить миллионы клеток.
Нам удалось отобрать много клеточных линий, устойчивых к ами-
нокислотным аналогам и гербицидам, влияющим на биосинтез амино-
кислот. Таким образом было получено множество мутантов, имеющих
изменения в регуляции биосинтеза ряда аминокислот, что обычно при-
водило к избыточному синтезу аминокислот.
В большинстве исследований по отбору были использованы сус-
пензионные культуры, суспензионные культуры, перенесенные на ага-
ризованную среду, протопласты или кусочки каллуса. Ниже приведены
примеры использования методик на различных культурах.
4.2.	ОТБОР ИЗ СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР
Главным преимуществом при использовании суспензионных куль-
тур клеток растений является возможность применения стандартных
микробиологических методов. Небольшой размер клеточных агрегатов
и относительная физиологическая гомогенность культуры позволяют
влиять с помощью селективного агента сразу на большое число клеток.
В результате в литре или еще в меньшем объеме среды для культивиро-
вания можно легко проверить несколько миллионов клеток.
4.2.1.	ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК
1.	Выращивают две культуры объемом 50 мл до начальной фазы
или до середины фазы логарифмического роста.
2.	Фильтруют клетки, используя марлю или сито с большими по-
рами (нейлоновое или из нержавеющей стали), для удаления
крупных агрегатов клеток.
3.	Отбирают пробу объемом 5 мл и фильтруют под вакуумом через
воронку Бюхнера с капроновым фильтром; взвешивают клет-
ки и рассчитывают их сырую массу в 1 мл.
83
Рис. 4.1. Системы фильтров, разработанные для удаления больших агрегатов кле-
ток из суспензионных культур растений. А. Экран из нержавеющей стальной про-
волоки с большим размером пор (> 1000 мкм). Б. Пластмассовый фильтр, из-
готовленный из шприца (см. рис. 4.2). В. Отдельный цилиндр с закрытым тор-
цом из стальной нержавеющей проволочной сетки, сделанной по форме шприца.
Эти приспособления помещают в колбу объемом 250 мл, оборачивают алюминие-
вой фольгой и автоклавируют.
Рис. 4.2. Изготовление фильтра из пластмассового шприца. А. Обрезают острый
кончик пластмассового шприца. Б. Обрезанный конец обжигают над пламенем
горелки. В. Шприц подплавленным над пламенем концом прижимают к капро-
новой сетке или сетке из нержавеющей стали. Для фильтрования клеточных куль-
тур наиболее пригодны сетки с большим размером пор (> 1000 мкм) .
Для проведения исследований по отбору и других экспериментов,
связанных с выращиванием клеток, стандартизуют инокулум до 0,25 г
сырой массы клеток, которые затем добавляют к 50 мл среды для
культивирования. Можно использовать и инокулумы других размеров,
однако для получения воспроизводимых результатов их величина долж-
на быть одинакова.
84
Фильтрацию культуры проводят так, чтобы достичь минимального
размера способных к росту агрегатов клеток. Это позволяет осущест-
влять максимальный контакт селективного агента со всеми клетками
агрегата. Типичный комплект для фильтрования — это пластмассовые
воронки со вложенными внутрь марлей или сеткой из нержавеющей
стали (рис. 4.1, Л), а также самодельные пластмассовые фильтры (рис.
4.1, Б), которые легко сделать, отрезав острый конец пластмассового
шприца объемом 50 мл. Отрезанный кончик нагревают и прижимают
к сетке из нержавеющей стали или нейлона (рис. 4.2). Еще лучше из
сетки из нержавеющей стали сделать цилиндр того же размера, как пласт-
массовый из шприца (рис. 4.1, В). Фильтры необходимо поместить в
широкогорлую колбу объемом 250 мл, обернуть фольгой и перед
использованием проавтоклавировать.
4.2.2.	КОНЦЕНТРАЦИЯ ИНГИБИТОРА
Концентрация ингибитора, применяемого при отборе, очевидно,
зависит от чувствительности данной линии клеток растений. Поэтому
для каждого селективного агента, используемого в экспериментах,
необходимо построить кривую роста в зависимости от концентрации
ингибитора. Для клеток растений — это обычно определение максималь-
ной концентрации вещества, при которой останавливается рост. Диапа-
зон концентраций ингибитора может определяться и другими особен-
ностями, например его растворимостью и т. д., поэтому лучше взять
как можно более широкий диапазон концентраций. Для аналогов ами-
нокислот типичные диапазоны варьируют логарифмически от 1 мкМ
до 10 мМ [3, 4]. Рисунок 4.3 схематично иллюстрирует два последова-
тельных разведения, используемых для приготовления градиентов
концентраций в этом диапазоне. Разведения выбраны произвольно для
большей графической наглядности конечных результатов. На рисунке
4.4 приведен пример дозовых кривых для клеток табака дикого типа
и клеточной линии, отобранной на устойчивость к этионину.
	3»	лМ	10 мМ 1			
1 1 мМ I			Г 1 мМ		1 ЗмМ
1 о,1 1	0	3	0,1 I		1 0,3 1
♦ 0,01 I	0,	03	т 0,01		1 0,03 !
1 0.001	♦ 0,003 А		0,001	Б	♦ 0,003
Рис. 4.3. Схема последовательного
разведения, проводимого для опре-
деления логарифмической кривой до-
зовой зависимости (А) от 1 мкМ
до 3 мМ и (Б) от 1 мкМ до 10 мМ.
Ступенчатые градиенты концентраций
выбраны произвольно для наглядно-
го графического изображения (см.
рис. 4.4). Технические детали приве-
дены в тексте.
85
Рис. 4.4. Кривая дозовой зависимости
на примере действия этионина на чув-
ствительные (2) и устойчивые (2)
культуры клеток табака. Клетки соби-
рали через 10 дней после введения в
50 мл свежей питательной среды, со-
держащей этионин, 0,25 г сырой массы
клеток [4].
4.2.2.1.	Подготовка к построению дозовой кривой
1.	Исходный раствор А. В среде для культивирования (160 мл)
готовят максимальную концентрацию ингибитора, используе-
мую в эксперименте.
2.	Исходный раствор Б. Разводят 40 мл раствора Л 80 мл свежей
среды для культивирования (разведение 1:3).
3.	Последовательно разводят раствор А и раствор Б на каждом
этапе в 10 раз (12 мл раствора с ингибитором плюс 108 мл све-
жей среды для культивирования) до предполагаемой минималь-
ной концентрации (см. рис. 4.3).
4.	Переносят две порции по 50 мл оставшегося на каждой стадии
раствора в колбы для культивирования объемом 125 мл.
5.	Готовят такие же колбы со средой для культивирования, но без
ингибитора (контроль).
4.2.2.2.	Дозовая кривая
1.	Вносят в каждую колбу по 0,25 г сырой массы клеток.
2.	Инкубируют на качалке в течение 10 дней или до тех пор, пока
контрольные культуры (без ингибитора) не достигнут фазы
стационарного роста (см. рис. 4.5).
3.	Собирают клетки из каждой колбы с помощью фильтрации-
под вакуумом на капроновую сетку и определяют их сырую
массу.
Для определения роста в присутствии ингибитора используют сред-
нее для нескольких параллельно культивировавшихся колб. Делают
поправку, вычитая 0,25 г сырой массы клеток, внесенных вначале.
Делят этот результат на данные, полученные для контрольных колб
без антибиотика, для определения относительного увеличения сырой
массы, которое вычисляют по формуле
хя~хо
X 100,
86
Рис. 4.5. Кривые роста культур клеток растений в зависи-
мости от действия различных типов ингибиторов метабо-
лизма. А. Задержка скорости роста в зависимости от инги-
бирования активности фермента метаболизма; скорость
роста снижается, хотя конечный выход клеток остается
постоянным. Б. Ингибирование механизма преобразова-
ния энергии; начальная скорость роста остается постоян-
ной, но конечный выход клеток снижается. В, Эпигенети-
ческая адаптация к присутствующему ингибитору; ско-
рость роста и конечный выход клеток постоянны, однако
перед началом роста появляется определенный период
запаздывания, адаптация может возникать в результате
индукции ферментов альтернативных путей метаболизма
или инактивации ингибитора.
Время
где Хи — средняя масса клеток при концентрации ингибитора л; X*. — средняя
масса клеток в контрольных колбах; XQ — масса клеток в исходном инокупуме.
Наносят эти цифры на полулогарифмическую миллиметровую
бумагу для определения ЛД50 (концентрация, при которой происхо-
дит подавление роста на 50%) и/или МКИ (минимальная концентрация
ингибитора, при которой происходит подавление роста на 100%; см.
рис. 4.4). При необходимости могут быть также включены и дополни-
тельные параллельные колбы. В этом случае требуется более сложная
математическая обработка.
Возможные кривые роста, получаемые в экспериментах по инги-
бированию (рис. 4.5), демонстрируют, что измерения необходимо про-
водить в один промежуток времени. Однако, как правило, хотелось бы
определять лишь те концентрации ингибиторов, при которых происхо-
дит полное или почти полное подавление роста, и следовательно, возни-
кает меньше затруднений в связи с кинетикой роста. Тем не менее надо
стараться избегать и их.
4.2.3.	МУТАГЕНЕЗ
1.	Добавляют к 40 мл клеточной суспензии 2 мл (или менее) раст-
вора мутагена в среде для культивирования, стерилизованного
с помощью фильтрования. При работе с химическими мутаге-
нами необходимо соблюдать осторожность.
2.	Через 24 ч клетки промывают свежей средой для культивиро-
вания и ресуспендируют их в 60 мл свежей среды.
87
3.	Инкубируют клетки в течение 4 — 7 дней, чтобы они подросли,
а затем промывают в свежей среде для культивирования и ресус-
пендируют до требуемой плотности.
Чтобы следить за ходом мутагенеза, на каждой стадии определяют
жизнеспособность клеток [5]. Таким образом можно определить эф-
фективную концентрацию мутагена, при которой культура выживает
наряду с высокой частотой появления устойчивых клеток.
Обычно мы не обрабатывали клетки мутагенами при отборе на
устойчивость, хотя в некоторых исследованиях было показано, что му-
тагены могут увеличить частоту устойчивости (см., например, [6]). По-
скольку мутагены вызывают случайные мутации, их использование
может повысить частоту появления желаемого признака, однако при
этом они могут вызвать и дополнительные вредные мутации. Желае-
мая мутация может быть получена, если при частоте спонтанных му-
таций около 10"6 — 10-7 анализируется несколько миллионов клеток.
В наших экспериментах суспензионные культуры табака содержали
около ЗХ 106 клеток на 1 г сырой массы. В экспериментах по отбору
на устойчивость к этионину клеток суспензионной культуры табака
[4] в колбы со 100 мл селективной среды вносили по 1 г сырой массы
клеток. При этом рост был отмечен в 2 из 12- колб, инкубировавшихся
в течение 10 недель. Поскольку рост происходил только в двух кол-
бах, можно предположить, что в каждой из них появлялась лишь одна
устойчивая клетка, что составляло частоту 2 на 3,6 X 10 7 клеток. В дан-
ном случае селективная среда содержала 0,2 мМ этионина, что превы-
шает концентрацию, приводившую к полному подавлению роста кле-
ток дикого типа (рис. 4.4).
4.2.4.	ОДНОСТУПЕНЧАТЫЙ ОТБОР
1.	Определяют МКИ для данной линии клеток в комбинации с ин-
гибитором, который будет использоваться (см. разд. 4.2.2).
2.	Готовят 1 л среды для культивирования, содержащей ингиби-
тор в концентрации, в 2 — 3 раза большей, чем МКИ.
3.	Разливают среду по 50 мл в двадцать колб для культивирования
объемом по 125 мл каждая и автоклавируют (при наличии термо-
чувствительных ингибиторов стерилизуют с помощью фильт-
рования) .
4.	Вносят в каждую колбу по 0,25 г сырой массы клеток и инкуби-
руют до 8 недель на круговой качалке.
5.	Из любой колбы, в которой происходит рост клеток, отбирают
материал и переносят на свежую питательную среду, содержащую
ингибитор (см. разд. 4.5).
В нашей лаборатории таким образом было получено много клеточ-
ных линий растений, устойчивых к аналогам аминокислот [4, 7]. Как
показано на рисунке 4.4, при зтом в одной из таких линий (табака,
88
устойчивого к этионину) удалось увеличить устойчивость в 30 раз по
сравнению с диким типом.
Однако в некоторых случаях подобный одноступенчатый метод
неудобен и нежелателен. Например, данная линия клеток растений
может оказаться неподверженной давлению отбора избыточных кон-
центраций МКИ в результате одновременной гибели всех клеток или
неспособности одиночных клеток к выживанию. С другой стороны,
может оказаться необходимым проводить поиск мутантов различной
природы.
4.2.5.	МНОГОСТУПЕНЧАТЫЙ ОТБОР
1.	Готовят среду для культивирования, содержащую сублеталь-
ные концентрации ингибитора (МКИ > [И] > ЛД50), как опи-
сано в разделе 4.2.2.
2.	Вносят в каждую колбу по 0,25 г сырой массы клеток на 50 мл
среды и инкубируют на качалке.
3.	По мере роста культуры ее пересаживают на свежую среду, содер-
жащую более высокие концентрации ингибитора (см. разд. 4.5).
При этих условиях растущие быстрее устойчивые клетки должны
начать обгонять по скорости роста клетки дикого типа. Затем, посте-
пенно увеличивая концентрацию ингибитора и доводя ее до сублеталь-
ной, можно получить культуры, интенсивно растущие при концентра-
циях ингибитора, значительно превышающих МКИ, установленную для
исходной культуры, не подвергавшейся отбору.
Стабильность устойчивых культур, растущих в отсутствие ингиби-
тора, обычно представляет собой проблему, если отбор проводился в
несколько этапов при концентрациях ингибитора вплоть до сублеталь-
ных. Потеря признака устойчивости может происходить по несколь-
ким причинам, включая и снижение кратковременной генетической
или эпигенетической адаптации. Однако при многоступенчатом отборе
устойчивость к высоким концентрациям ингибитора часто может быть
достигнута и таким образом, что признак устойчивости в конечном
счете остается стабильным [8].
В качестве примера многоступенчатого отбора, проведенного в
лаборатории авторов, может служить отбор суспензионных культур
клеток моркови, устойчивых к глифосату (гербициду, Ы-[фосфоно-
метил] глицину) [9]. В этом случае клетки культур последовательно
пересевались на среды, содержащие все возрастающие концентрации
гербицида до тех пор, пока не была достигнута 52-кратная устойчи-
вость. Сначала клетки вносили в среду, содержащую 0,25 мМ глифо-
сата, что почти полностью подавляло их рост. Примерно через год, в те-
чение которого проводили последовательные пересевы на свежие пи-
тательные среды со все более высокими концентрациями гербицида,
клетки медленно росли при концентрации 25 мМ. После трехлетнего
89
г
1
Рис. 4.6. Методы высева суспензионных клеточных культур или культур прото-
пластов на чашки с агаризованной средой. А. Метод распределения по поверхности.
Б. Метод смешивания с агаром (подробнее см. текст).
выращивания клеток в отсутствие этого соединения признак устойчи-
вости стабильно сохранялся.
4.2.6.	ОТБОР НА (В) АГАРИЗОВАННОЙ СРЕДЕ
Помимо отбора в жидких питательных средах [6, 10, И], также
успешно применяют и пересев суспензионной культуры на (в) агаризо-
ванную селективную среду. Эти методы имеют важное дополнитель-
ное преимущество, состоящее в том, что любые колонии клеток, вы-
росшие на среде с ингибитором, с большой вероятностью могут ока-
заться клонами.
4.2.6.1.	Метод распределения по поверхности (рис. 4.6,Л)
1.	Наносят на чашки с агаризованной средой, содержащие ингиби-
тор (> МКИ), с помощью пипетки 1 — 2 мл суспензионной куль-
туры и распределяют ее по всей поверхности.
2.	Оставляют чашки на 30 мин и в случае необходимости убирают
избыточную жидкость.
3.	Запечатывают чашки парафилмом и ставят на инкубацию; каж-
дую неделю проверяют рост клеточных колоний.
4.	Примерно через 8 недель отбирают выросшие колонии и перено-
сят их в свежую питательную среду с ингибитором (см. разд.
4.5)	.
90
4.1.6.2.	Метод смешивания с агаром (рис. 4.6, Ь)
1.	Готовят среду для культивирования с двойной концентрацией
ингибитора и агара.
2.	После автоклавирования охлаждают среду примерно до 45 С
(немного выше температуры застывания агара); смешивают
с суспензионной культурой клеток в отношении 1 : 1 (см. разд.
4.2.1) и сразу же переливают в стерильную чашку Петри или
смешивают агаризованную среду с суспензионной культурой
клеток, уже налитой в чашку, в соотношении 1:1.
3.	После того как агар в чашках застынет, их запечатывают пара-
филмом и оставляют на инкубацию, проверяя еженедельно рост
колоний.
4.	Отбирают колонии, выросшие примерно через 8 недель, и пере-
носят их на свежую питательную среду, содержащую ингиби-
тор (см. разд. 4.5).
4.3.	ОТБОР ИЗ КУЛЬТУР ПРОТОПЛАСТОВ
Отбор устойчивых линий клеток растений из препаратов протоплас-
тов обладает определенными преимуществами. Протопласты можно
получать не только из суспензионных культур и каллусов, но и непо-
средственно из ткани целого растения. Следовательно, начальный этап
получения культуры можно исключить. Кроме того, что гораздо важ-
нее, можно быть более уверенным в клональном происхождении кле-
точных линий, получаемых с использованием протопластов, поскольку
обработка клеточной стенки ферментами высвобождает и отделяет
индивидуальные клетки растений. В результате регенерации клеточ-
ной стенки и последующих делений образуются агрегаты клеток кло-
нального происхождения. Так как отбор на устойчивость производят
с помощью методов распределения по поверхности или смешивания,
зти агрегаты можно разделить ([12] см. разд. 4.2.6.1 и 4.2.6.2). Однако
преимущества этого метода несколько снижаются, если учитывать
сложные технические требования, необходимые для получения жизне-
способных протопластов, поскольку эту методику необходимо разра-
батывать для каждого вида растения или ткани.
1.	Протопласты выделяют из ткани растения, суспензионной кле-
точной культуры или каллуса, используя стандартные методы,
разработанные для данного вида растения (см. гл. 3).
2.	Протопластам необходимо регенерировать клеточные стенки и
пройти несколько циклов деления (до 3 — 10 клеток в агре-
гате) .
3.	Вводят селективный агент непосредственно в суспензионную
культуру или используя методы распределения по поверхно-
сти агара (разд. 4.2.3.1), или смешивания с ним (разд.
4.2.3.2).
91
4.	Переносят выросшие суспензионные культуры или колонии
на свежую питательную среду, содержащую ингибитор (см. разд.
4.5).
4.4.	ОТБОР ИЗ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР
Отбор из каллусов растений, устойчивых к ингибитору, по-види-
мому, один из наименее сложных методов. Можно использовать как
одноступенчатый отбор, с помощью которого Малигой и др. [13] были
отобраны клетки, устойчивые к стрептомицину, так и многоступен-
чатый отбор, позволивший Генгенбаху и Грину [14] получить линии
клеток кукурузы, устойчивые к токсину, вызывающему гниль. Можно
просто переносить одинаковые маленькие кусочки каллуса (~ 25 —
250 мг сырой массы) прямо на свежую агаризованную среду, содержа-
щую летальные, сублетальные или окололетальные концентрации инги-
битора. В процессе инкубации устойчивые клетки обычно выделяются
как зоны интенсивного роста. Преимущество каллусной культуры
состоит в возможности использовать альтернативные критерии отбора'
мутантов, отличные от роста в селективных условиях. Однако, конечно
же, зти критерии связаны со специфическим типом действия ингиби-
торов. Примером может служить отбор линий клеток табака, способ-
ных образовывать хлорофилл и регенерировать побеги в присутствии
окололетальных концентраций стрептомицина [13]. Очевидно, что к
методу каллусного отбора можно легко приспособить и другие анти-
биотики или гербициды, влияющие на образование пигмента. Поскольку
отобранные устойчивые линии потенциально могли появиться в резуль-
тате образования смешанных культур или эпигенетической адаптации,
их следует выращивать на среде с ингибитором до того, как стабиль-
ность зтих линий будет определена, или до проведения субклонирования
(см. разд. 4.5).
Хотя этот метод отбора и нетрадиционен, использование каллус-
ной селекции для оценки отличных от пигментации изменений может
оказаться на самом деле единственным работающим методом, осо-
бенно если для данного вида растения невозможно получить хорошую
суспензионную культуру или протопласты. Кроме того, этот подход
может оказаться необходимым в тех случаях, когда ингибиторы пло-
хо растворяются в воде.
1.	Раствор ингибитора в органическом растворителе может быть
равномерно распределен в чашке по поверхности агара, а затем
перед внесением клеток выпарен.
2.	Ингибитор может быть добавлен к расплавленной агаризованной
среде и в дальнейшем поддерживаться в виде коллоидной сус-
пензии в основе агарозного геля.
Хотя, используя каллус, можно проводить отбор клеток, в прак-
тическом применении этого метода существуют некоторые проблемы.
92
Неодинаковый контакт клеток с ингибитором в агаризованной среде
приводит к тому, что нижние клетки каллуса получают более высокие
дозы ингибитора, чем верхние. Время удвоения числа клеток для кал-
луса обычно значительно больше, чем для суспензионных культур. В
связи с тем что клетки каллуса тесно контактируют друг с другом,
клонирование представляется особенно важным этапом при работе с
отобранными из каллуса линиями.
4.5.	СТАБИЛЬНОСТЬ И КЛОНИРОВАНИЕ ЛИНИЙ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ,
УСТОЙЧИВЫХ К ИНГИБИТОРУ
Основная сложность, часто возникающая при работе с линиями
клеток растений, отобранных по признаку устойчивости к ингибиторам
роста, — нестабильность этого признака, которая проявляется после
того, как снимается давление отбора. Выделяют несколько причин
такой нестабильности. Возникающее в ответ повреждение генома может
обладать высокой частотой реверсий или данное изменение просто
может представлять собой кратковременную генетическую или эпиге-
нетическую адаптацию. Однако, по-видимому, наиболее часто нестабиль-
ность объясняется наличием в популяции клеток дикого типа. В несе-
лективных условиях выращивания эти клетки могут начать быстро
размножаться, замещая в конце концов всю популяцию. Поэтому вновь
отобранные линии следует выращивать в селективных условиях до тех
пор, пока не установится стабильность или линии не будут расклони-
рованы.
4.5.1.	СТАБИЛЬНОСТЬ ПРИЗНАКА УСТОЙЧИВОСТИ
Чтобы проверить стабильность признака устойчивости, необходимо
получить, по крайней мере, две культуры для каждой из отобранных
линий; обычно одна из них пассируется в присутствии, а другая — в от-
сутствие селективных условий. Для этих линий в течение нескольких,
месяцев через различные промежутки времени необходимо строить
кривые дозовой зависимости (разд. 4.2.2). Если в культуре, выращи-
вающейся в неселективных условиях, наблюдается очевидное снижение
устойчивости, то рекомендуется вновь расклонировать культуру, выра-
щиваемую в селективных условиях. Если же этот подход не использу-
ется как основная часть метода отбора, то устойчивые линии необхо-
димо расклонировать сразу же после отбора, поскольку ясно, что это
единственный путь получения заведомо гомогенных культур.
4.5.2.	КЛОНИРОВАНИЕ ПУТЕМ ПЛАТИРОВАНИЯ АГРЕГАТОВ КЛЕТОК
Платирование бактериальных клеток на агаризованную среду пред-
ставляет собой уже хорошо разработанный способ клонирования. Вырос-
93
шие колонии состоят из дочерних клеток, развившихся из одной един-
ственной материнской клетки. Однако при использовании суспензион-
ной культуры клеток надежность этого метода снижается, поскольку-
образуются агрегаты клеток. Размеры агрегатов могут варьировать
от нескольких клеток до нескольких сотен клеток. Однако, даже с
учетом этого, следует отметить, что метод платирова^ия агрегатов
клеток на агаризованную среду является полезным методом клони-
рования. Портной и Мэрфи [15] разработали теоретическую модель,
описывающую распределение мутантов в агрегатах культивируемых
клеток. Из этой модели следует, что мелкие агрегаты со временем
могут стать гомогенными и приобрести одинаковую скорость деления
клеток, а также могут распадаться и больше не склеиваться. Таким об-
разом, можно вычислить число поколений, требующихся для того, что-
бы получить с высокой вероятностью ситуацию, при которой все клетки
внутри данного агрегата окажутся потомками одной единственной
клетки. На практике для достижения подобной ситуации в агрегате,
состоящем из 13 клеток или менее, необходимо получить 75 поколе-
ний [7].
Стандартное клонирование, используемое в нашей лаборатории,
проводится следующим образом.
1.	Поддерживают вновь отобранную линию клеток в селективных
условиях в течение 50 — 75 поколений.
2.	Отбирают небольшую порцию суспензионной культуры и филь-
труют через нержавеющие фильтры с размером пор 690 и
202 мкм. Получаемые в результате агрегаты обычно содержат
не более 13 клеток [7].
3.	Платируют агрегаты непосредственно на агаризованную среду
или на чашки с „кормящим” слоем.
4.	Собирают появившиеся колонии и переносят их на свежую
среду.
5.	Подросшие клоны вводят в суспензионные культуры и по-
вторно строят для них дозовые кривые (см. разд. 4.2.2).
4.5.3.	КЛОНИРОВАНИЕ ЧЕРЕЗ КУЛЬТУРУ ПРОТОПЛАСТОВ
Культура протопластов — это, пожалуй, наиболее эффективный
метод клонирования для клеточных линий растений. В результате об-
работки клеточной стенки определенными ферментами происходит
высвобождение клеток из многоклеточных агрегатов или из раститель-
ной ткани. Последующая регенерация стенки и деление приводят к
появлению нового агрегата клеток, являющегося по происхождению
клоном. Важным преимуществом этого метода является то, что прото-
пласты можно приготовить сразу же после того, как получены устой-
чивые линии, или же зту процедуру можно прямо включить в схему
отбора устойчивых линий (разд. 4.3).
94
1.	Протопласты получают из растительной ткани, каллуса или сус-
пензии клеток с помощью обычных приемов, разработанных
для используемого вида растения.
2.	Дают протопластам возможность регенерировать клеточные стен-
ки и осуществить несколько делений (примерно 3 — 10 клеток
на один агрегат), оставив их в жидкой культуре.
3.	Очень аккуратно переносят небольшие порции суспензионной
культуры на свежую агаризованную среду, содержащую ингиби-
тор, и ставят на инкубацию.
4.	Отбирают выросшие колонии и переносят их на свежую среду.
В случае необходимости подращивают клоны на агаризованной
среде, следя за тем, чтобы они не соприкасались. Агрегаты клеток мож-
но перенести пипеткой на поверхность агара, на диски бумажных фильт-
ров, лежащие на агаре [16], или на чашки с кормящим слоем [17, 18].
Хотя это и более сложно, использование чашек с кормящим слоем
позволяет высевать клетки с меньшей плотностью, повышая таким об-
разом эффективность высева. Высев необходимо проводить при низ-
кой плотности клеток, чтобы гарантировать хорошее разделение расту-
щих колоний.
4.5.4.	КЛОНИРОВАНИЕ ПУТЕМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК
Единственный абсолютно надежный способ обеспечения клональ-
ного происхождения клеточных линий растений — это изолирование
отдельных клетрк. Отдельные клетки (или протопласты) можно от-
делить физически и затем проводить культивирование, используя ме-
тоды микроманипулирования и проточной цитометрии. Отдельные
клетки моркови индивидуально отбирали с помощью микропипетки
из суспензионной культуры и наносили на квадратики из фильтроваль-
ной бумаги, помещенные на поверхность каллусной ткани моркови
[3]. Таким образом из отобранной суспензии было выделено 14 кло-
нов, обладавших стабильной устойчивостью к и-фторфенилаланину.
Однако сложность методики и связанные с ней трудности не очень
привлекают исследователей и существенно сужают сферу ее приме-
нения.
При использовании метода клонирования с истощающим разве-
дением клеточной суспензии возникают серьезные проблемы, связан-
ные с ростом клеток растений при низких плотностях клеточных куль-
тур. Однако этот стандартный микробиологический метод может ока-
заться полезным в сочетании с методами, в которых используются
каллусы-„няньки” [17, 18]. Суспензионную культуру можно пригото-
вить для разбавления с помощью различных методов: а) путем отбора
1 — 2 мл верхнего слоя после оседания суспензионной культуры; б) пу-
тем последовательного фильтрования через сита с постепенно уменьшаю-
щимися размерами пор; в) через получение культуры протопластов.
95
1.	Последовательно разводят небольшую часть культуры свежей
или кондиционированной* средой. При этом использование
плат для микротитрования позволяет контролировать процесс
разведения с помощью микроскопии.
2.	Переносят содержимое последней лунки для разведения на чаш-
ку с кормящим слоем. Так как использование чашки с кормя-
щим слоем само по себе будет определять разделение клеток
и агрегатов, не обязательно, чтобы разведение проводилось до
стадии отдельной клетки или агрегата. Считают, что агрегаты
образуются из одной клетки, если они получены из культуры
протопластов (разд. 4.5.2) или динамических популяций (разд.
4.5.1).
ЛИТЕРАТУРА
1.	Maliga, Р. (1984) Аппи. Rev. Plant Physiol., 35, 519.
2.	Widholm, J. M. (1984) Selection of Mutant Plant Cells in Plant Genetic Engine-
ering, Cress, D. E. (ed.), Marcel Dekker Inc., New York, in press.
3.	Palmer, J. E. and Widholm, J. (1975) Plant Physiol., 56,233.
4.	Gonzales, R. A., Das, P. K. and Widholm, J. M. (1984) Plant Physiol., 74, 640.
5.	Widholm, J. M. (1972) Stain Technol., 47,189.
6.	Ranch, J. P., Rick, S., Brotherton, J. E. and Widholm, J. M. (1983) Plant Physiol.,
71, 136.
7.	Hauptman, R. M. and Widholm, J. M. (1982) Plant Physiol., 70, 30.
8.	Schimke, R. T. (1984) Cell, 37, 705.
9.	Nafziger, E. D., Widholm, J. M., Steinrucken, H. C. and Kilhner, J. L. (1984)
Plant Physiol., 76, 571.
10.	Miller, О. K. and Hughes, K. W. (1980) In Vitro, 16, 1085.
,11. Chaleff, R. S., and Parsons, M. F. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5104.
12.	Bourgin, J.-P. (1978) Mol. Gen. Genet., 161, 225.
13.	Maliga, P., Sz.-Breznovits, A. and Marton, L. (1973) Nature New Biol., 244, 29.
•14. Gengenbach, B. G. and Green, С. E. (1975) Crop Sci., 15, 645.
15.	Portnoy, S. and Murphy, T. M. (1983) Theor. Popul. Biol., 23,136.
16.	Horsch, R. B., King,'J. and Jones, G. E. (1980) Can. J. Bot., 58, 2402.
17.	Weber, G. and Lark, K. G. (1979) Theor. Appl. Genet., 55, 81.
18.	Shneyour, Y., Zelccr, A., Izhar, S. and Beckmann, J. S. (1984) Plant Sci. Lett.,
33, 293.
* Среда, полученная в результате фильтрации или центрифугирования куль-
тивировавшихся в течение нескольких дней клеток суспензионной культуры
той же линии. — Прим. пер.
5. ЭМБРИОГЕНЕЗ, ОРГАНОГЕНЕЗ И РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ
Б. ТИССЕРА
5.1.	ВВЕДЕНИЕ
Методы культивирования клеток растений к настоящему времени
разработаны до такой степени, что любой вид растения при использова-
нии определенных методических подходов может быть регенерирован
из каллусной ткани. Скорость регенерации растений в культуре тканей
в зависимости от вида сильно варьирует [1—5]. Для регенерации до
целого растения можно успешно культивировать различные клетки,
ткани и органы этого растения [1—15]. Для каждого вида растения
могут быть разработаны несколько методов регенерации, однако, как
правило, лишь один оказывается наиболее эффективным [4, 5]. Методы
регенерации растений разрабатывались на основании множества неза-
висимых исследований, опубликованных в виде огромного количества
статей [6, 8, 10, 15—23]. Задачей этой главы является создание воспро-
изводимого практического руководства по размножению с помощью
культуры тканей растений. При этом нет необходимости в исчерпываю-
щем обзоре, поскольку: а) наиболее ранние сообщения довольно мно-
гочисленны и иногда противоречивы; б) теоретические знания и знания
методов регенерации растений, как и в любой другой области культуры
тканей, постоянно пополняются, в связи с чем часто отпадает необходи-
мость обращаться к более ранним работам.
Регенерация растений — зто краеугольный камень всей методологии
культуры тканей. Без регенерации становятся бесполезными исследо-
вания по гибридизации протопластов, росту и дифференцировке, по-
лучению генетически изменчивых растений, культуре пыльников, про-
мышленному клонированию с целью быстрого размножения необходи-
мых или трудноразмножаемых видов растений, получению незаряжен-
ных растений с помощью культур меристем, а также исследования по
многочисленным регуляторам роста. Благодаря знаниям в области реге-
нерации растений, подобные исследования превратились в мощные
инструменты, применяемые в сельском хозяйстве и садоводстве.
В этой главе описаны приемы, составляющие современные методы
размножения растений в стерильной культуре. Необходимо отметить,
что эти методы соответствуют поставленным задачам, хотя и не всегда
представляют собой оптимальные или наиболее эффективные приемы.
По мере совершенствования наших знаний по этому предмету методы
размножения растений меняются. Представленные методы обеспечат
получение быстрых и надежных результатов по размножению боль-
шинства видов растений in vitro. Для некоторых видов растений потре-
4 - 1021
97
буются определенные изменения и в методиках, и в составах сред (см.
табл. 5.4). В последние годы по проблеме регенерации растений было
опубликовано много обзоров [1—6, 8—13, 15, 17—19, 23—25]. Они ока-
жут помощь тем исследователям, которых глубоко заинтересует зта
проблема, и предоставят более широкие сведения о предмете. Кроме
того, обзоры будут полезны всем, кому необходима исходная инфор-
мация об определенных видах растений как основа для проведения
более интенсивных исследований.
5.1.1.	СПОСОБЫ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ
Термин „культура тканей растений” превратился в чрезвычайно
широкое и удобное понятие, описывающее все типы работ с культурами
растений в стерильных условиях, имеющих отношение к выращиванию
протопластов растений, клеток, тканей, органов, зародышей и расте-
ний-регенерантов. Регенерация растений через культуру тканей будет
использоваться здесь для описания формирования растений-регенеран-
тов в стерильной культуре. Термин „in vitro” использован для описания
стерильной искусственной окружающей среды; соответственно термин
„in vivo” имеет отношение к естественным, нестерильным условиям.
Термин „регенерант” применен для обозначения стерильного растения
с развитой системой корней и побегов, сформировавшихся in vitro.
Регенерацию растений из культуры тканей можно достичь, исполь-
зуя один из трех методов: культуру зародышей, соматический эмбрио-
генез и органогенез. Культура зародышей представляет собой стериль-
ную культуру зиготических зародышей. Зародыш изолируют из
семени или семяпочки и помещают в искусственные условия, заменя-
ющие эндосперм (т. е. питательную среду). Последующее развитие и
прорастание зародыша происходят так же, как зто было бы и в семени.
Такой тип регенерации растений в данной главе не обсуждается, хотя
многие применяемые принципы и методы в данном случае перекры-
ваются с другими методами регенерации растений. Соматический, или
неполовой, эмбриогенез представляет собой процесс формирования
зародышеподобных структур из соматических клеток. Соматический
зародыш — зто независимая двухполюсная структура, физически не
прикрепленная к ткани, из которой происходит. Такие зародыши в
дальнейшем могут развиваться и прорастать в регенеранты через стадии,
соответствующие тем, что встречаются при развитиии зиготы [15]. По-
добное явление можно встретить у многих видов растений в условиях
in vitro при работе с культурами различных типов клеток, тканей и
органов, тогда как в природе такие процессы происходят внутри семя-
почки [15]. Формирование растений путем органогенеза состоит в появ-
лении и росте побегов из каллусов или в инициации и росте побегов
из пазушных почек, развившихся на культивируемых верхушках по-
бегов и образовавших впоследствии адвентивные корни. Побег — это
98
рис. 5.1. Морфогенетические способности
финиковой пальмы in vitro. 1. В природе фи-
никовые пальмы размножаются семенами
или укореняющимися отводками (8). 2.
Различные экспланты, например боковые
почки (2А), изолированные зародыши (2Б)
и верхушки побегов (2В) можно культиви-
ровать и использовать для получения расте-
ний-регенерантов. Можно использовать не-
сколько методов регенерации, например:
культивирование зародышей (б), органоге-
нез через образование пазушных почек (5)
или соматический эмбриогенез (5, 4); эти
методы можно совмещать. 3. Экспланты, вы-
саженные на среду, содержащую 0,45 мкМ
2,4-Д, образуют узловатый каллус и сомати-
ческие зародыши через 2—6 месяцев культи-
вирования. 4. Перенос каллуса на среду, ли-
шенную 2,4-Д, приводит к образованию
крупных зародышей и их прорастанию. 5.
Растения-регенеранты и побеги, полученные
из зиготических и соматических зародышей,
боковых почек и верхушек побегов, куль-
тивируемых на среде, содержащей 0,54 мкМ НУК и 44,4 мкМ БА, образуют пазуш-
ные почки. 6. Укоренение боковых почек, верхушек побегов и растений-регенеран-
тов на среде, содержащей 0,54 мкМ НУК. 7. Свободноживущие пальмы,
полученные через культуру тканей.
однополюсная структура, физически связанная с тканью, из которой
происходит. Иногда побегам могут дать начало корни. Для размно-
жения некоторых видов растений можно использовать несколько ме-
тодов регенерации (рис. 5.1).
К сожалению, экспериментальные подходы, описанные в литера-
туре, ле всегда можно воспроизвести. Опубликованные эксперимен-
тальные прописи могут оказаться лишь предварительными или фраг-
ментарными. Отсутствие стандартизованных методов среди исследо-
вателей часто способствует появлению противоречивых и невоспроиз-
водимых результатов. Для проведения успешных исследований по
размножению растений необходимо учитывать следующие факторы:
лабораторное оснащение, состав среды, условия культивирования,
техническую квалификацию и отбор эксплантов.
5.7.2. ЗНАЧЕНИЕ ЗКСПЛАНТА
Термин „зксплант” применяют для описания исходного кусочка
растения, введенного в культуру in vitro. Для успеха работ по регенера-
ции растений отбор зкспланта играет первостепенную роль. Лучше всего
отбирать экспланты из здоровых, сильных растений. Условия предва-
рительного выращивания растений также могут существенно влиять
на последующий рост зкспланта в культуре (например, режим добавки
99
и качество искусственных удобрений, время года и условия окружаю-
щей среды, при которых выращиваются растения). Практически любую
часть растения можно успешно культивировать in vitro и получить реге-
неранты, если зксплант отобран на соответствующей стадии развития.
Незрелые ткани и органы всегда более пластичны с точки зрения спо-
собности к морфогенезу in vitro, чем зрелые ткани и органы. Более того,
при выборе материала следует отдавать предпочтение меристематически
активным тканям и органам, поскольку они удобнее при клонировании,
легче выживают в культуре, обладают большей скоростью роста и тоти-
потентностью (табл. 5.1). Меристемы, верхушки побегов, пазушные
почки и незрелые, быстро растущие ткани особенно удобны в качестве
эксплантов. Зрелые листья, корни, стебли, черешки и части цветка тра-
вянистых растений также можно успешно культивировать, и из них обра-
зуются растения-регенеранты путем органогенеза или соматического эм-
бриогенеза [1—3,6,10,17—19,23]. Пластичность эксплантов из однолетних
растений заметно контрастирует с ростом тех же типов эксплантов, по-
лученных из многолетних растений и некоторых хлебных злаков.
5.1. Источники эксплантов покрытосеменных растений и их
относительный морфогенетический потенциал
Морфогенетический потенциал*/число эксплантов **
Тип экспланта ______________________________________________________
Двудольные	Однодольные
	однолетние	многолетние	травянистые	многолетние
Верхушки побегов	Высокий	Высокий	Высокий	Высокий
	Большое	Большое	Большое	Один
	Высокий	Различный	Высокий	Различный
	Большое	Большое	Большое	Небольшое
Соцветие	Высокий	Различный	Высокий	Различный
	Большое	Большое	Большое	Большое
Ось сложного	Высокий	Низкий	Различный	Низкий
колоса	Большое	Большое	Большое	Большое
Зрелый лист	Высокий	Низкий	Различный	Низкий
Большое Большое Большое Большое
Молодой лист	Высокий	Различный	Различный	Различный
	Большое	Большое	Большое	Большое
Черешок листа	Высокий	Низкий	Высокий	Низкий
	Большое	Большое	Большое	Большое
Корень	Высокий	Низкий	Высокий	Низкий
	Большое	Большое	Большое	Большое
* Морфогенетический потенциал используется			для описания	способной
экспланта регенерировать растения in vitro.
** Число эксплантов — относительное число эксплантов, получаемых из одно-
го растения.
100
5.2. Методы дезинфекции, предназначенные для поверхностной
стерилизации эксплантов
Тип экспланта
Дезинфектант *,
(концентрация)
Пропись
Листья, цветки,	NaOCl	Вымыть ткань водным раствором мяг-
стебли	(0,26-2,6%)	кого детергента; проинкубировать 10— 20 мин в 1,3% NaOCl, раствор слить; промыть три раза стерильной водой. Эта методика пригодна для поверхност- ной стерилизации большинства эксплан- тов
Листья	NaOCl	Например, табака. Вымыть ткань вод-
	(0,25%)	ным раствором мягкого детергента; промыть 70% этанолом; раствор слить; инкубировать в NaOCl 20 мин; слить; промыть три раза стерильной водой
Корни	NaOCl	Например, финиковой пальмы. Инкуби-
	(2,6%)	ровать в NaOCl 30 мин; промывать стерильной водой не надо
Главный корень	HgCl2	Например, моркови. Разрезать корень
	(0,1%)	на кусочки длиной 50 мм и проинкуби- ровать в HgCl2 30 мин; раствор слить; промыть три раза стерильной дистилли- рованной водой
Семена	NaOCl	Например, томата. Проинкубировать се-
	(0,25-2,6%)	мена 1 мин в 80% этаноле; слить этанол; замочить их в 1,6% NaOCl на 10 мин; слить раствор; промыть три раза сте- рильной дистиллированной водой Например, табака. Проинкубировать се- мена в 0,25% растворе NaOCl в течение 10 мин; раствор слить; промыть три ра- за стерильной дистиллированной водой
	Иод (3%)	Например, финиковой пальмы. Проин-
	HgCl2 (0,5%)	кубировать семена в дезинфектанте в те-
	HgBr2 (0,5%)	чение 30 мин; раствор слить; промывать
	или Hgl2 (0,5%)	стерильной водой не надо
* Все растворы должны быть водными, за исключением иода, который раство-
ряется в 95% этаноле. Ко всем растворам NaOCl добавляют эмульгатор (1 каплю
на 100 мл раствора). Растворы дезинфектантов необходимо периодически встряхи-
вать или постоянно качать на круговой качалке (25 —50 об/мин) в ходе всей ин-
кубации.
После отбора экспланта следует обратить особое внимание на дезин-
фекционную обработку растения (табл. 5.2). Дезинфекция тканей необ-
ходима для удаления микроорганизмов, находящихся на поверхности
растения. Наличие любого загрязнения влияет на рост зксплантов или
культур. Загрязнение культур растений грибами и бактериями обычно
выявляется через 1—14 дней после посадки в культуру. Загрязненные
культуры необходимо тотчас же удалить, так как их присутствие при-
101
водит к дальнейшему заражению воздуха в комнате, где поддерживают-
ся культуры. Споры микроорганизмов, находящиеся в состоянии покоя
на поверхности экспланта, устойчивы к большинству дезинфектантов.
Некоторые исследователи рекомендуют вводить антибиотики в пита-
тельную среду или промывать экспланты в растворе антибиотика. Одна-
ко этот подход обычно ненадежен и утомителен и поэтому не рекомен-
дуется. Наличие загрязнений свидетельствует о неэффективности при-
меняемого метода поверхностной стерилизации. Выживание микроор-
ганизмов после поверхностной стерилизации зависит от типа исполь-
зуемого экспланта, типа дезинфектанта и (или) времени обработки.
Перед тем как вымыть эксплант мылом и водой или погрузить его в
этанол, рекомендуется обеспечить необходимую смачиваемость и некую
первичную очистку.,Чаще всего в качестве дезинфектанта используют
разбавленный раствор гипохлорита натрия (0,25—2,63%). К нему до-
бавляют эмульгатор типа Твина-20 (полиоксиэтиленсорбитанмонолау-
рат) в соотношении 1 капля на 100 мл раствора. Вегетативные экс-
планты обычно стерилизуют в течение 10—20 мин и затем промывают
в стерильной воде для удаления остатков дезинфектанта. Иногда по-
лезно применять механическое помешивание на мешалке и (или) ва-
куум для удаления пузырьков воздуха и облегчения распределения
дезинфектанта по всему эк сил анту. Если для стерилизации экспланта
не подходит один тип дезинфектанта, можно попробовать другие.
Все большее число данных свидетельствует о том, что внутри экс-
плантов и полученных из них культур могут проявиться инфекцион-
ные примеси, находившиеся внутри растения. В некоторых случаях
бактериальные культуры (например, Pseudomonas у капусты брокколли)
могут сосуществовать с культурами растений и не выявляться в течение
нескольких пересадок. При этом значительно снижается частота делений
клеток и другие параметры роста культуры [7]. Некоторые микроорга-
низмы (например, бактерии на стадии спор) могут оставаться неактив-
ными в течение нескольких пересадок культуры и лишь затем начинают
размножаться. Связь между таким скрытым заражением и нормальным
ростом, если она имеется, неясна.
5.1.3. ФАКТОРЫ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
Состав питательной среды представляет собой следующий важный
параметр, который необходимо оптимизировать для получения успеш-
ной регенерации растений [18]. Среда, разработанная Мурасиге и Ску-
гом (МС) в 1962 г., — это наиболее распространенная среда, исполь-
зуемая при работе с культурами тканей растений (табл. 5.3). В табли-
це 5.4 приведены примеры растений, которые можно регенерировать
на этой основной среде при различных концентрациях регуляторов
роста. Вредные для эксплантов химические выделения, часто прояв-
ляющиеся в виде коричневой окраски, можно удалять с помощью частых
102
5.3. Состав среды Мурасиге и Скуга и источников витаминов
Компоненты среды	Концен- трация, мкМ*	Компоненты среды	Концен- трация, мкМ*
Неорганические соли Макросоли:		Источники витаминов Дигидрат мезоинозита	0,46
nh4no3	20 600	Тиамин-НС1	1,2
KNO3	18 800	или витамины в модификации	
СаС12 г2Н,0	3000	Уайта	
MgSO4-7H2O	1500	Тиамин-НС1	0,59
КН2РО4	1250	Пиридоксин-НС1	4,9
Микросоли		Никотиновая кислота	8,1
KJ	5,0	Глицин	53,28
н3во3	100	или витамины в модификации	
MnS04 -4Н2О	100	ИичаиНич	
ZnSO4 -7Н2О	30	Тиамин-НС1	1,48
Na2Mo04-2H20	1,0	Пиридоксин-НС1	0,24
CuS04 -5H2O	0,1	Никотиновая кислота	40,61
Na3 ЭДТА	100	Глицин	26,64
FcSO4-7H2O	100	Фолиевая кислота	1,13
Источник углеводов		Биотин	0,2
Сахароза		Сложная добавка Агар (%)	0,8
* По концентрациям исходных растворов и проч. см. гл. 1, табл. 1.1.
5.4. Требования к среде для культивирования, необходимые
для регенерации целых растений in vitro
Концентрация регуляторов роста,
мкМ**
Вид	Эксплант	Тип регене- рации*	Каллус или Формирова-		Формирова- ние корней
			введение в культуру	ние побегов или эмбрио- генез	
Атасеае Anthurium andraeanum	Лист	о-к	0,4 2,4-Д,	3,2 ТГП	0,054 НУК
[2]*** Arecaceae Phoenix dactylifera [6]	Пазушная	сэ-к	3,2 ТГП 135 2,4-Д,		или — 0,54 НУК
Aquifoliaceae Ilex aqu [folium [6]	почка Зародыш	СЭ-П	13,9 2 иП, 0,03% древесный уголь		
Araliaceae Hedera helix (2]	Стебель	о-к	21,8 НУК,	5,4 НУК,	0,054 НУК
			9,3 К	2,3 К,	
200 мг/л
КГ
103
Продолжение табл. 5.4
Концентрация регуляторов роста,
мкМ**
Вид
Эксплант Тип
регене-
рации *
Каллус или Формирова- Формирова-
введение в ние побегов ние корней
культуру или эмбрио-
генез
Begoniaceae					
Begonia X hiemalis [21]	Лист	О-П	—	0,17 БА,	0,54 НУК
Brassicaceae Brassica campestris [16]	Узел стебля	ПП	4,4 БА	0,54 НУК 4,4 БА	0,44 БА,
Bromeliaceae Ananas sativus [1 ]	Пазушная	О-П		9,7 НУК,	5,4 НУК 0,054 НУК
A. sativus [2]	почка Пазушная	О-К	28,1 НУК,	9,8 ИМК, 9,8 К 9,7 НУК,	или — 0,054 НУК
Betulaccae Betulaalleghaniensis [16]	почка Кончик по-	ПП	29,7 ИМК, 9,8 К 22 3	9,8 ИМК, 9,8 К 22 3	или — 4,9 ИМК
Cactaceae Mammillaria woodsii	бега Стебель	О-П		9,8 ИМК,	0,054 НУК
[2] Caricaceae Carica stipulate [6]	Цветонож-	сэ-п	1 НУК,	9,3 К 1 НУК,	0,054 НУК
Caryophyllaccae Dianthus caryophyllus	ка Кончик по-	ПП	2 БА 4,4 БА,	2 БА, 1% древесный уголь 4,4 БА,	0,57 НУК
[10] Compositae Chrysanthemum mori-	бега Кончики	О-К	0,057 ИУК 46,5 К,	0,057 ИУК 9,3 К,	0,054 НУК
folium [2]	побегов, ле-		5,4 НУК	0,11 НУК,	или —
C. morifolium [16]	пестки Кончики	ПП	9,3 К,	29 ГК 9,3 К,	—
Cichorium endiva [2]	побегов Зародыш	О-К	0,11 НУК 27 2,4-Д	0,11 НУК 0,19 К	0,054 НУК
Stevia rebaudiana [2]	Семена, мо-	О-К	53,7 2,4-Д	4,4-	—
S. rebaudiana [2]	лодые лис- тья Сегменты	ПП	9,3 К 8,9 БА	8,8 ИУК 8,9 БА	54 НУК
Crassulaceae Crassula argentea [2]	узлов стеб- ля Лист	О-К	100 2 иП	0,1 БА	0,054 НУК
104
Продолжение табл. 5.4
Вид
Концентрация регуляторов роста,
мкМ**
Эксплант Тип ______________________________________
регене- Каллус или Формирова- Формирова-
рации* введение в ние побегов ние корней
культуру или эмбрио-
генез
Cruciferae
Arabidopsis thaliana	Лист, сте-	О-К	4,5 2,4-Д,	0,2 ИУК,	
12]	бель, семе- на, пыль- ник		4,7 К	4,7 К	
Brassica oleracea [2]	Лист	О-К	11,4 ИУК, 2,3 К	—	—
Cucurbita pepo [6]	Семядоли, гипокотиль	сэ-к	4,5 2,4-Д	0,5 2,4-Д	—
Sinapis alba [2] Dioscoreaceae	Семядоли, гипокотиль, стебель, и корень	О-К	4,5 2,4-Д	0,9 2,4-Д, 9,3 К	
Dioscorea deltoidea [2]	Клубень	О-К	4,5 2,4-Д, 10% КМ	10% КМ	0,054 НУК или —
D. floribunda [6] Fuphorbiaceae	Зародыш	сэ-к	4,5 2,4-Д	—	0,054 НУК или —
Euphorbia pulcherrima [2] Gramineae	Междоуз- лие, чере- шок листа	О-К	20 НУК, 2 К	10-50 2 иП, 0,054 НУК 0,5 НУК	
Eestuca arundinaceae t2]	Зародыш	О-К	40,7 2,4-Д	2,3 2,4-Д	0,054 НУК или —
F. a. spp. [16]	Меристем- ная ткань	ПП	0,93 К, 0,045 2,4-Д	0,93 К, 0,045 2,4-Д	0,93 К, 0,045 2,4-Д
Hordeum vulgare [2]	Меристем- ная ткань	О-К	10 ИУК, 1,5 2,4-Д, 1,5 К	—	0,054 НУК или -
Oryza sativa [2]	Корень	О-К	10 2,4-Д	—	0,054 НУК или —
O. sativa [6]	Лист	сэ-к	4,7 2,4-Д	—	0,054 НУК или -
Panicum maximum [2]	Соцветие	О-К	9,0 2,4-Д	—	0,054 НУК или —
Pennisetum americanum 16]	Соцветие	сэ-к	11,3 2,4-Д	—	0,054 НУК или —
Saccharum spp. [2]	Лист, соцве- тие	О-К	13,6 2,4-Д	0 или 26,9 НУК	0,054 НУК или -
Triticum aestivum [2]	Ось колоса, О-К зародыш, семена		4,5-9 2,4-Д	4,6 3, 5,7 ИУК	0,054 НУК или -
Zea mays [2]	Me зо ко- тиль	О-К	67,8 2,4-Д	—	0,054 НУК или —
105
Продолжение табл. 5.4
Вид	Эксплант	Тип регене- рации*	Концентрация регуляторов роста, мкМ** Каллус или Формирова- Формирова- введение в ние побегов ние корней		
			культуру	или эмбрио- генез	
Labiatae Perilla frutescens [2]	Лист	о-к	0,45 2,4-Д	4,4 БА,	0,054 НУК
Leguminosae Acacia koa [2]	Корень,	о-к	1%КМ,	0,54 НУК 22 БА	1 ИМК
Medicago saliva [16]	кончик кор- невого по- бега Про то пл а- СЭ-К		11,3 2,4-Д 9 2,4-Д,	0,3 НУК,	0,054 НУК
M. sativa [6]	сты листа Кончики	СЭ-К	1,2 К 4,5 2,4-Д,	2,3 БА 0,5-4,5	0,054 НУК
Pisum sativum [2]	побегов Эпикотиль	о-к	0,5 3 10,7 НУК,	2,4-Д 22,2 БА,	
Liliaceae Allium sativum [2]	Лист	о-к	4,7 БА 0,5 2,4-Д,	1,1 ИУК 11,4 ИУК,	0,054 НУК
A. sativum [16]	Меристем-	пп	11,7 ИУК, 9,3 К	9,3 К	или — 0,54 НУК
Asparagus officinalis	пая ткань Побег	СЭ-К	5,4 НУК,	0,5—5,7ИУК, 0,054 НУК	
[6] Hyacinthus orientalis	Цветок	о-к	4,7 К 0,44-13 БА	0,44-17,7 БА 13 БА,	0,054 НУК
12] Scilla sibirica [2]	Луковица,	о-к	0,54-1,6 НУК 0,69-43	1,6 НУК <11,4 ИУК	ИЛИ — 0,054 НУК
Malvaceae Gossypium klotzschia-	лист, соцве- тие, стебель, завязь Гипокотиль СЭ-К		НУК 0,54-9,1 2,4-Д 0,5 2,4-Д	<0,64 НУК 11,4 ИУК,	или — 0,054 НУК
num [1] Passifloraceae Passiflora suberosa	Лист	о-к	4,4 БА,	4,7 К 4,4 БА,	0,054 НУК
[9] Portulacaceae Mesembryanthemum	Корень, сте-	о-к	5,4 НУК 11,4 ИУК,	5,4 НУК	0,054 НУК
floribundum [2] Ranunculaceae Coptis japonica [2]	бель, гипо- котиль Черешок	о-к	20% КМ 4,5 2,4-Д,		0,054 НУК
Ranunculus sceleratus	листа Прото плас-	СЭ-К	0,5 К 5,7 НУК,	5,7 НУК,	0,054 НУК
16]	ты мезо- филла		10% КМ	10% КМ	
106
Продолжение табл. 5.4
Вид	Эксплант	Тип регене- рации*	Концентрация регуляторов роста, мкМ**		
			Каллус или Формирова- Формирова- введение в ние побегов ние корней		
			культуру	или эмбрио- генез	
Rosaceae Prunus amygdalis [2]	Лист, соцве-	о-к	26,9 НУК,	26,9 НУК,	0,054 НУК
	тие, заро- дыш		10% КМ	2,3-4,7 К	
Rubus spp. 121	Кончик по-	о-п	—	0,4 БА,	0,054 НУК
	бега			0,3 ГК, 4,9 ИМК	
Rubiaceae Coffea arabica [1]	Лист	СЭ-К	2 К,	2,5 К,	0,054 НУК
			2 2,4-Д	0,5 НУК	
Rutaceae Citrus limettoides [2]	Стебель	о-к	1,1 2,4-Д	2,2 БА, 1,2 К, 1,0 ИУК 500 мг/л ЭС	0,054 НУК
C. sinensis [1] Scrophulariaceae	Нуцеллус	сэ-п	—	—	—
Digitalis purpurea [2]	Проросток	о-к	4,5 2,4-Д, 0,5 К	0,6 ИУК, 4,7 К	0,054 НУК
Solanaceae					
Atropa belladonna [6]	Прото пла-	СЭ-К	18,5 К,	0,5-0,9 К	—
	сты листа		5,4 и-ХФУК		
Datura innoxia [2]	Стебель	о-к	1 2,4-Д	1 БА	—
Lycopersicon esculen-	Лист	о-к	0,5-34,3	10 БА,	10,7 НУК
turn [2]			ИУК, 1-20	0,5 НУК	или 11,8
			БА или 9,3-18,6 К		ИУК
					
L. esculentum [1]	Лист	о-п	—	22,8 ИУК,	10,7 НУК
				18,6 К	или 11,8 ИУК
					
Nicotiana acuminata	Стебель	о-к	0,45 2,4-Д	10 2 иП,	—
12]				1 ИУК	
N. alata [2]	Цветоносы	о-к	0,45 2,4-Д	5 БА	—
N. rustica [2]	Побег	о-к	0,45 2,4-Д	45,7 ИУК, 11,9 К	—
N. sylvestris [2]	Лист	о-к	0,45 2,4-Д	17,1 ИУК, 0,9 К	—
N. tabacum [2]	Стебель,	о-к	0,45 2,4-Д	1 ИУК, 5 К	—
	ЛИСТ				
N. tabacum [1]	Лист	о-п	—	1ИУК	—
N. tabacum fl]	Прото плас-	СЭ-К	6 п-ХФУК,	0,02 К	—
	ты листа		2,5 К		
Solanum nigrum [2]	Лист	о-к	10 ИУК,	10 ИУК,	—
			1-10 БА	10 БА	
107
Окончание табл. 5.4
Вид	Эксплант	Тип регене- рации*	Концентрация регуляторов роста, мкМ** *** Каллус или Формирова- Формирова- введение в ние побегов ние корней	
			культуру	или эмбрио- генез
S. tuberosum [2]	Побег, сте- бель	о-к	9,05 2,4-Д	4,7-46,5 К
S. tuberosum [6]	Меристем- нал ткань	ПП	0,05 НУК	0,05 НУК -
Petunia hybrida [2]	Корень	о-к	0-107,4 НУК, 0,4— 35,2 БА	0,3-2,7 НУК, 1,1- 8,9 БА
P. hybrida 16]	Стебель, лист	СЭ-К	4,5 2,4-Д, 0,9 БА	0,5 3
Umbelliferae				
Ammi major [6]	Гипоко- тиль	сэ-к	28,5 ИУК	11,4 ИУК -
Anethum graveolens	Зародыш	сэ-к	10,7 НУК	_ —
[6]				
Carum carvi [6]	Черешок листа	сэ-к	10,7 НУК	— —
Daucus carota ]15]	Корень, стебель, со- цветие, чере шок листа, зиготиче- ский заро- дыш	сэ-к	0,45 2,4-Д	
Vitaceae				
Vitis spp. [6]	Цветок, лист	сэ-к	4,5 2,4-Д, 0,4 БА	10,7 НУК, 0.054 НУК 0,4 БА
* Типы регенерации растений обозначены: О-К — органогенез из каллуса;
0-П — органогенез прямо из экспланта; ПП — образование пазушных побегов;
СЭ-К — соматический эмбриогенез из каллуса; СЭ-П — прямой соматический
эмбриогенез.
** Во всех случаях использована основная питательная среда Мурасиге и
Скуга. В таблице приняты сокращения: БЛ — 6-бензиладенин; КГ — гидролизат
казеина; КМ — кокосовое молоко; л-ХФУК - и-хлорфеноксиуксусная кислота;
2,4-Д — 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота; ГК — гибберелловая кислота; ИУК —
индолилуксусная кислота; ИМК — индолилмасляная кислота; 2иП - изопенте-
ниладенин; К — кинетин; ЭС — экстракт солода; НУК — нафтилуксусная кис-
лота; ” — регуляторы роста не добавляли; ТГП — тетрагидропиранил; 3 —
зеатин.
*** В квадратных скобках — литературный источник.
108
пересадок или путем включения в состав питательных сред таких ад-
сорбентов, как активированный уголь или поливинилпирролидон.
При использовании адсорбентов концентрации других компонентов
(например, регуляторов роста) существенно меняются.
Используя однотипную среду для культивирования (например,
среду МС) и варьируя концентрациями и типами регуляторов роста,
часто можно довольно успешно определять путь морфогенеза in vitro.
Обычно среды, содержащие высокие концентрации ауксина, способству-
ют формированию каллуса. Введение цитокининов в сочетании с аукси-
нами для некоторых видов растений также способствует формирова-
нию каллуса. Снижение концентрации ауксинов и повышение содержа-
ния цитокининов обычно используют для индукции образования побе-
гов из каллуса.
Соотношение ауксинов и цитокининов также важно для прямой ин-
дукции образования побегов из культивируемых эксплантов (например,
у табака) (см. рис. 5.4). При соматическом эмбриогенезе переноса кал-
луса в среду без регуляторов роста обычно бывает достаточно для сти-
муляции более поздних стадий развития зародыша и его последующего
прорастания. Меристемные ткани, кончики побегов и срезы узлов стеб-
ля для индукции роста пазушных почек культивируют на среде, содер-
жащей низкие концентрации ауксинов и цитокининов в различных соот-
ношениях. Добавление других регуляторов роста, как, например, абс-
цизовой или гибберелловой кислоты, в среду для культивирования
обычно не практикуется, однако в некоторых случаях это может ока-
заться полезным для индукции образования корней (например, у цит-
русовых) или развития растений-регенерантов (например, у моркови)
[6,8].
5.1.4. УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
В зависимости от условий культивирования культуры тканей рас-
тений растут по-разному. Интенсивность, тип и продолжительность
освещения, температуры, соотношение кислорода и углекислого газа,
а также других газов, как и физический состав среды, — все важно в
процессе морфогенеза культуры тканей растений. Обычно каллус растет
в темноте, поскольку свет вызывает эмбриогенез, формирование по-
бегов и зеленение каллуса. Экспланты часто культивируют при интен-
сивности освещения 500—1000 лк и длине светового дня 16 ч. Растения
освещаются обычно холодным белым светом или с помощью специаль-
ных люминесцентных ламп, предназначенных для выращивания расте-
ний. На более поздних стадиях морфогенеза развитие регенерантов акти-
вируется под действием более интенсивного освещения — 5000-
10000 лк, необходимого для ускорения развития фотосинтезирующих
листьев и помогающего привыканию растения при переходе к условиям
109
роста in vivo. Температура в комнате для культивирования обычно под-
держивается около 25 °C. Некоторым видам растений для наилучшего
роста может потребоваться другая температура. Субтропические рас-
тения, например пальмы, лучше растут при температуре 29 °C.
5.2. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ
Образование соматических зародышей из культур клеток, тканей и
органов может происходить прямым или непрямым путем. Прямой
соматический эмбриогенез заключается в формировании вегетативного
зародыша из одной или нескольких клеток ткани зкспланта без стадии
образования промежуточного каллуса. Такое явление наблюдается у
цитрусовых, где ткани нуцеллуса дают начало нуцеллярным зародышам
(как in vivo, так и in vitro), а также в других случаях, когда культиви-
руемые незрелые зародыши начинают почковаться [15]. Кроме того,
известно, что у таких видов, как Лех aquifolium и Ranunculus sceleratus,
эпидермальные клетки стебля дают начало дополнительным зародышам
[15]. Есть сообщения о прямом эмбриогенезе в некоторых культурах
пыльников и протопластов. Однако по сравнению со случаями непря-
мого эмбриогенеза эти примеры редки.
Непрямой эмбриогенез состоит из нескольких этапов: помещения
зкспланта в культуру, последующей стимуляции роста каллуса и фор-
мирования предзародышей (обычно на среде, содержащей высокие
концентрации ауксина, например 0,45—452 мкМ 2,4-Д) и переноса
каллуса на питательную среду без факторов роста, для того чтобы ин-
дуцировать формирование биполярных зародышей из предзародышей.
При подходящих условиях эти зародышы прорастают и образуют расте-
ния-регенеранты. Обычно в образовании каллуса участвует лишь не-
большое число клеток зкспланта. Эти клетки располагаются, как пра-
вило, в поверхностных слоях каллуса или находятся в физическом
контакте с питательной средой [1]. Каллус по своей природе гетерогенен
и может состоять из клеток многих типов, включая и инициали пред-
зародышей. Инициали предзародышей могут состоять из одной клетки
или представлять собой многоклеточные образования. Когда каллус пе-
реносят на среду с низким содержанием ауксина, происходит процесс
дальнейшего эмбриогенеза, при котором образуется большее число
предзародышей, а ранее сформировавшиеся инициали предзародышей
развиваются в биполярные зародыши. Развитие зародышей происходит
асинхронно.
В своих первых работах исследователи использовали морковь и
другие растения семейства Umbelliferae, в результате возникло мнение,
что явление соматического эмбриогенеза присуще лишь этому семей-
ству. В настоящее время известно, что это общее явление, которое
встречается, видимо, у растений любого семейства. Формирование сома-
тических зародышей может быть достигнуто путем использования
110
Рис. 5.2. Метод соматического эмбрио-
генеза на примере моркови. От зрелых
растений моркови (2) получают семена
или экспланты черешков. Сегменты зре-
лых черешков подвергают поверхност-
ной стерилизации и высаживают на сре-
ду, содержащую 0,45 мкМ 2,4-Д. Про-
сгерилизованныс семена прорастают (2)
на среде, лишенной регуляторов роста.
Кусочки черешков затем можно отде-
лить от стерильных проростков и вы-
садить на среду, содержащую 2,4-Д (5).
Через 4 недели из эксплантов черешков
образуются каллусы (4). Из таких
каллусов можно получить суспензион-
ные культуры (7) при культивировании в жидкой среде, содержащей 2,4-Д,
которые поддерживаются с помощью регулярных пересадок. Перенос на
жидкую среду без 2,4-Д приводит к развитию более поздних стадий сома-
тического эмбриогенеза (5). С другой стороны, каллус, развивавшийся на
агаризованной среде, содержавшей 2,4-Д, после пересадки на среду без 2,4-Д
будет также образовывать соматические зародыши (5). Регенеранты пере-
носят с жидкой или агаризованной питательной среды на среду для укоре-
нения (б).
соответствующей питательной среды, условий культивирования и отбора
зкспланта. В ранних обзорах приводились многочисленные примеры
соматического эмбриогенеза для разных семейств, родов- и видов рас-
тений [6,15]. К сожалению, многие из этих примеров представляли собой
лишь предварительные наблюдения, описывавшие самые ранние этапы
эмбриогенеза. Формирование растений-регенерантов, возникших в ре-
зультате эмбриогенеза, описывалось гораздо реже [6, 15]. Трудности
культивирования часто мешали развитию этих инициалей предзароды-
шей в растения-регенеранты. В настоящее время регенерация растений
из соматических зародышей в производстве не используется (за исклю-
чением пальм). В этих случаях вызывает сомнения генетическая ста-
бильность растений-регенерантов, полученных с помощью соматического
эмбриогенеза. Кроме того, для клонального размножения часто сущест-
вуют более падежные методы регенерации растений через развитие
пазушных почек.
5.2.2. НЕПРЯМОЙ СОМА ТИЧЕСКИЙ
ЭМБРИОГЕНЕЗ
Соматический эмбриогенез моркови представляет собой классиче-
ский пример подобного типа регенерации растений (рис. 5.2). У моркови
практически любая часть растения — корень, черешок листа, цветонож-
ка, лист, стебель или зиготический зародыш — продуцирует эмбриоген-
ный каллус.
111
5.2.1.1.	Процедура получения эмбриогенного каллуса'
1.	Берут обычные семена сортовой моркови. Заворачивают 50—
100 семян в два слоя марли (5 см2) и переносят на дно стеклян-
ной пробирки размером 25X150 мм. Марля препятствует по-
терям семян, возможным при переносах во время поверхност-
ной стерилизации.
2.	Готовят дезинфицирующий 2,6% раствор гипохлорита натрия.
Можно использовать и раствор отбеливателя, имеющегося в
продаже, содержащего 5,2% гипохлорита натрия. Растворяют
50 мл отбеливающего раствора в 50 мл водопроводной воды,
добавляют 1 каплю Твина-20 и слегка перемешивают, избегая
ценообразования. Для максимального антисептического действия
используют дезинфицирующий раствор сразу же после приготов-
ления. Наливают раствор в пробирку. Добавляя дезинфицирую-
щий раствор, медленно поворачивают пробирку так, чтобы в
итоге совершить оборот на 360° и облегчить тем самым кон-
такт дезинфектанта с поверхностью стекла. Закрывают пробирку
полипропиленовой крышкой и осторожно покачивают каждую
минуту (в течение нескольких секунд), чтобы удалить при-
клеившиеся пузырьки воздуха и обеспечить таким образом
максимальный контакт дезинфектанта с эксплантом. Все после-
дующие операции необходимо проводить в стерильных условиях
в ламинар-боксе.
3.	Через 15 мин поверхностной стерилизации снимают крышку и
сливают раствор, также медленно повернув пробирку вокруг
своей оси на 360 . Используя пинцет с острыми концами длиной
19 см, переносят марлевый мешочек на стерильную чашку Петри
и с помощью двух пинцетов открывают его.
4.	Помещают семена на агаризованную поверхность среды МС по
1—3 семени на пробирку.
5.	Инкубируют семена в термостатной комнате при 25—29 °C и
16-часовом световом дне (1000 лк) до тех пор, пока семена не
прорастут (примерно 2—5 недель). Каждый день культуры про-
веряют на наличие заражения и инфицированную культуру удаля-
ют. Следует обратить внимание, что на этой среде некоторые
проростки начинают образовывать каллус и вегетативные заро-
дыши. Такие пробирки необходимо исключить.
6.	С помощью пинцета переносят проростки (длиной примерно 3—
6 см) в стерильную чашку Петри и, используя хирургический скаль-
пель с лезвием № 11, изолируют черешки листьев. Эти черешки
режут кусочками длиной 1 см и помещают их по 1—3 кусочка в
чашку па поверхность среды МС, содержащей 0,45 мкМ 2,4-Д.
7.	Инкубируют культуры в полной темноте в течение 4—8 недель
при 25-29 °C.
112
8.	Образовавшийся каллус поддерживают на агаризованной среде,
пересаживая кусочки каллуса размером 0,5—1 см2 на свежую
среду каждые 8 недель.
В конце этих манипуляций каллус будет содержать эмбриогенные
клетки-предшественники (инициали проэмбрио), а также множество
крошечных микроскопически различимых зародышей, находящихся
на ранних стадиях развития. Изредка некоторые соматические заро-
дыши, образовавшиеся из такого каллуса, образуют на той же среде
растения-регенеранты.
5.2.1.2.	Процедура получения свободноживущих растений-регенерантов
из каллуса на агаризованной среде
1.	Инициируют образование растений-регенерантов через соматиче-
ский эмбриогенез путем пересадки кусочков каллуса размером
0,5—1 см2 на поверхность агаризованной среды МС.
2.	Инкубируют культуры при 25—29 °C и 16-часовом световом дне
(1000 лк). Через 2 недели в культурах начнется формирование
визуально различимых зародышей и зеленых растений-регене-
рантов.
3.	Через 4—8 недель проростки или их группы можно отделить от
остальной массы, содержащей каллус, зародыши и растения-ре-
генеранты, и высадить на разбавленную вдвое агаризованную
среду МС.
4.	Культуры инкубируют при освещении 5000 лк и 16-часовом свето-
вом дне при 25—29 °C. Через 4—8 недель культуры значительно
подрастут и станут все более походить на проростки моркови.
5.	Их продолжают пересаживать каждые 4—8 недель до тех пор,
пока проростки моркови не достигнут размеров, достаточных
для высадки в почву (примерно 10—15 см в длину). Для полу-
чения растений, способных к самостоятельному существованию,
важно отобрать хорошо развитые растения-регенеранты с функ-
ционирующими побегами и корнями. Для переноса в почву
могут быть отобраны только здоровые, крепкие растения-регене-
ранты.
6.	Интактные проростки переносят в дистиллированную воду на
10—15 мин, чтобы избежать дегидратации и удалить остатки
питательной среды. Трижды промывают дистиллированной водой,
опрыскивают 0,5% (масса к объему) раствором фунгицида бе-
нолата (Du Pont, Wilmington, Delaware) и переносят в пластмас-
совые горшочки диаметром 7,6 см2 или в торфяные горшочки,
содержащие стерильный моховой торф и вермикулит в соотно-
шении 1 : 1 (объем к объему). Проростки и контейнер заклю-
чают в два смыкающихся прозрачных пластмассовых полисти-
роловых покрытия для поддержания высокой влажности.
113
7.	Каждую неделю листья обязательно опрыскивают 0,5% бенола-
том, чтобы свести к минимуму рост грибов. В течение 1—2 ме-
сяцев растения поливают через день дистиллированной водой и
один раз в неделю разбавленным в четыре раза раствором Хог-
лэнда. Сначала (в течение 2 недель) проростки инкубируют при
освещенности 8000 лк, длине светового дня 16 ч и температуре
25—29 °C, затем их переносят в затененную теплицу. Пробивая
отверстия в пластмассовой крышке, постепенно приучают расте-
ния к условиям влажности в теплице. Через 2 месяца крышки
можно снять, а с растениями обращаться как с обычными про-
ростками.
5.2.1.3.	Процедура получения свободноживущих растений
из суспензионных культур [1,6]
1.	Пересаживают 2—4 г эмбриогенного каллуса в колбу Эрленмей-
ера объемом 250 мл на 25 мл жидкой среды МС, содержащей
0,45 мкМ 2,4-Д. Помещают колбы на круговую качалку при
50 об/мин.
2.	Инкубируют при освещении 1000 лк при 25—29 °C и 16-часовом
световом дне.
3.	Сначала пересаживают культуру, разведя ее вдвое путем отбора
пипеткой половины объема суспензии и добавления к ней рав-
ного объема питательной среды. Разведение проводят через 2 не-
дели.
4.	Затем пересаживают, разведя ее в четыре раза. Разведение можно
проводить, добавляя каждые 10—18 дней 5 мл суспензии к 20 мл
свежей питательной среды. Обычно быстрорастущие культуры
пересаживают каждые 10 дней. Культуры можно поддерживать
таким образом в течение нескольких лет.
5.	Удаляют в стерильных условиях среду, содержащую 2,4-Д, и
переносят каллусную ткань в жидкую среду МС для индукции
более поздних стадий вегетативного эмбриогенеза. Однотипную
популяцию зародышей можно получить, просеивая каллусную
суспензию через стальную нержавеющую сетку с размером пор
43—200 мкм и культивируя ее затем на жидкой среде МС.
6.	Далее следуют процедуре получения свободноживущих растений
(см. разд. 5.2.1.2).
5.2.2. ПРЯМОЙ НЕПОЛОВОЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ
Соматические зародыши могут образовываться из культивируемых
клеток без промежуточной стадии каллусообразования. Это часто про-
исходит в полиэмбрионных культурах нуцеллуса у Citrus [8, 15].
У этих видов клетки нуцеллуса незрелых семяпочек проявляют при
114
Рис. 5.3. Метод культивирования нуцел-
луса Citrus. 1. Целую семяпочку изолиру-
ют из 120-дневного плода Citrus limon
(L.) Burm. f., содержащего сердечковид-
ный зародыш. Круглый конец называется
халазальным, а острый - микропиляр-
ным. 2. Поддерживая семяпочку пинце-
том у халазального конца, делают неглу-
бокий (1 мм) продольный разрез через
оболочку семяпочки, используя хирурги-
ческий скальпель с лезвием № 11. 3, 4.
Освобождают нуцеллус от интегументов,
обнажая зеленый сердечковидный заро-
дыш, видимый через прозрачную стенку
нуцеллуса. 5. Удаляют (выталкивают) этот зародыш через терминальный разрез
у микропилярного конца, сделанный перпендикулярно к продольной оси нуцеллу-
са, надавив на семяпочку пинцетом. 6. Затем нуцеллус высаживают на агаризован-
ную среду таким образом, чтобы халазальный конец был погружен в агар, а мик-
ропилярный остался наверху.
делении свойственную им тотипотентность, в результате чего появляются
дополнительные зародыши. Такой тип эмбриогенеза in vitro типичен
лишь для представителей семейства Rutaceae. Кроме того, общее число
появившихся зародышей регулируется изначальным числом зародышей,
предопределенным для нуцеллуса данного вида. Например, полиэмбрио-
нальные виды Citrus постоянно образуют большее число соматических
зародышей, чем моноэмбриональные виды того же рода Citrus [8, 15].
Появлялись сообщения о размножении зародышей прямо из зксплан-
тов стебля и зародыша, а также из целых растений-регенерантов, однако
в этих исследованиях была недостаточно разработана методика. Очевид-
но, что для создания подобного метода, воспроизводимого при широ-
ком использовании, требуется дальнейшая работа. Процедура изолиро-
вания нуцеллуса у представителей рода Citrus приведена на рисунке 5.3.
5.2.2.1.	Процедура культивирования нуцеллуса у Citrus
1.	Собирают незрелые зеленые плоды диаметром 2,5—3,0 см с де-
ревьев через 100—120 дней после опыления. Плоды можно хра-
нить при 0 °C в течение 20—30 дней без каких-либо последствий.
2.	Плоды моют мылом и водопроводной водой в течение несколь-
ких минут. Скальпелем отсекают нижнюю часть завязи и конец
черешка. Поверхность плодов стерилизуют. Для этого несколько
плодов помещают в литровую банку и заливают 2,63% раство-
ром гипохлорита натрия (приготовленным, как описывалось
выше) на 15—30 мин. Сливают дезинфицирующий раствор. Про-
мывать стерильной водой необязательно.
3.	Все последующие операции необходимо проводить в стерильных
условиях в ламинар-боксе. Берут один плод пинцетом с острыми
115
концами и, не споласкивая, переносят его в чашку Петри. Надев
стерильные перчатки, смоченные этанолом, придерживают плод
большим и указательным пальцами и делают неглубокий попе-
речный надрез вокруг всего плода. Аккуратно поворачивают
плод примерно на 90°, разделив его таким образом на две по-
ловинки.
4.	Используя хирургический скальпель с лезвием № 11, отделяют
семяпочки, стараясь не повредить их, от соковых мешочков. Воз-
можно, что возникает необходимость разделить плод на сегменты,
сделав скальпелем перпендикулярные надрезы. Осторожно пере-
носят неповрежденные семяпочки в отдельную чашку Петри.
5.	Используя препаровальную лупу с увеличением в 10—60 раз,
тонкий пинцет и скальпель с лезвием № 11, осторожно делают
неглубокий, продольный надрез по всей длине семяпочки. При
этом необходимо соблюдать осторожность и не повредить семя-
почку. Аккуратно отделяют нуцеллус от интегументов.
6.	Концом скальпеля делают прокол верхушки нуцеллуса в том
месте, где располагается микропиле, и, сдавливая семяпочку,
извлекают зиготический зародыш.
7.	Помещают целый нуцеллус на поверхность агаризованной сре-
ды МС, содержащей 100 мг/л экстракта солода и модифицирован-
ную добавку витаминов Уайта (см. табл. 5.3), таким образом,
чтобы микропилярный конец находился на воздухе, а халазаль-
ный конец был погружен в среду.
8.	Культуры инкубируют при 25—29 °C, освещении 1000 лк и 16-ча-
совом световом дне.
9.	Зеленые, визуально различимые зародыши сформируются через
2—6 недель. Число .образовавшихся зародышей зависит от ис-
пользуемого типа плода Citrus.
10.	Растения переносят в почву описанным выше способом.
5.3. ОРГАНОГЕНЕЗ
Формирование придаточных побегов in vitro происходит чаще и
лучше поддается контролю, чем развитие соматических зародышей из
культивируемых эксплантов. Получение растений через органогенез
можно осуществить тремя способами:
1.	Путем формирования придаточных органов на каллусе, полу-
ченном из экспланта (например, у табака).
2.	Путем формирования придаточных органов прямо из экспланта
без промежуточной фазы каллусообразования.
3.	Путем формирования растений-регенерантов из побегов, обра-
зовавшихся из пазушных почек [4,21].
Табак представляет собой модельную систему регенерации расте-
ний через органогенез. Варьируя концентрациями регуляторов роста
116
Рис. 5.4. Способы регенерации рас-
тений на примере табака. Источником
листовых эксплантов служит расте-
ние табака, выращенное в теплице
(7). 2. Кусочки эксплантов из листа
высаживают на агаризованную среду,
содержащую 4,5 мкМ 2,4-Д; каллус
образуется примерно через 2—3 неде-
ли (4). Переносят каллус на среду,
содержащую БА без 2,4-Д, что при-
водит к образованию побегов (5).
Если экспланты культивировать на
среде, содержащей 1 мкМ БА, то че-
рез 2—3 недели прямо из клеток
эпидермиса образуются побеги (5).
Побеги, полученные любым из этих
методов, укореняют, помещая на
агаризованную среду без регулято-
ров роста (6).
в питательной среде, можно выращивать побеги прямо из экспланта
или через промежуточный каллусогенез (рис. 5.4.). Получить прида-
точные корни из каллуса или из регенерировавшего побега обычно не
составляет труда. Для этого, как правило, подходит среда, содержащая
низкие концентрации ауксинов, или без них.
5.3.1.	ОБРАЗОВАНИЕ ПОБЕГОВ КАЛЛУСАМИ
Для образования каллуса, который, в свою очередь, может диффе-
ренцироваться с образованием побегов и затем регенерантов, исполь-
зуют разнообразные экспланты. У травянистых растений экспланты
можно получать из стеблей, листьев, черешков листьев и лепестков
цветков [1, 5]. Для получения морфогенного каллуса из многолетних
растений часто следует брать органы, в которых клетки митотически
активны, папример верхушки побегов или выделенные из них участки
меристемной ткани. Как и в эмбриогепном каллусе, в данном случае
лишь небольшой процент эксплантов в результате клеточного деления
образует органогенный каллус. И снова большинство таких клеток
находится на поверхности экспланта или же в контакте с питательной
средой [1]. Высокие концентрации ауксинов и низкие — цитокининов
вызывают каллусообразование. Формирование каллуса на агаризован-
ной среде также можно индуцировать, добавляя только ауксин, напри-
мер 0,45 мкМ 2,4-Д. Однако добавление в среду цитокининов всегда
облегчает рост каллуса. Как правило, каллус гетерогенен и состоит из
разнообразных типов и групп клеток, различающихся по размерам
[1]. Редко бывает так, чтобы полученный каллус состоял из одинако-
вых по размеру клеток паренхимного типа [5]. Часто со старением
каллуса развиваются секреторные, одревесневшие, содержащие танин
117
клетки. Для органогенного каллуса достаточно характерно появление
меристематически активных отдельных клеток или групп клеток. Эти
клетки представляют собой предшественники корней и побегов. Плоид-
ность каллусных клеток может значительно варьировать [5]. После об-
разования каллуса, что обычно требует от 4 до 16 недель, его можно
расчленить и размножить на той же среде. Органогенез обычно стимули-
руется изменением соотношения концентраций цитокининов и аукси-
нов, необходимых для формирования каллуса. Обычно, если для раз-
вития каллуса в среду вводился лишь ауксин, его концентрацию сни-
жают и в среду добавляют цитокинин (см. табл. 5.4). Изменение
концентраций регуляторов роста в среде сопровождается появлением
и ростом побегов [5].
5.3.1.1.	Процедура получения побегов из каллуса [1]
1.	Выращивают растения в теплице и получают экспланты из листьев
до цветения растений. Листья отбирают или через 1—2 ч после
восхода солнца, или с растений, до этого находящихся в тем-
ноте.
2.	Промывают листья водой с мылом, ополаскивают 70% этанолом
и затем дистиллированной водой.
3.	Стерилизуют поверхность листьев в 1,1% растворе гипохлорита
натрия путем 20-минутного покачивания па круговой качалке.
Ополаскивают листья три раза стерильной дистиллированной
водой. Необходимо отметить, что экспланты можно также полу-
чить и из выросших в стерильных условиях растений.
4.	Разрезают листья с помощью скальпеля и пинцета на кусочки
размером 1 см2 и переносят на среду МС, содержащую 4,5 мкМ
2,4-Д.
5.	Инкубируют их при 25—29 °C и 16-часовом световом дне
(освещенность 1000 лк). Каллус формируется через 3—4 не-
дели.
6.	Пересаживают кусочки каллуса (0,5 см2) на агаризованную сре-
ду МС, содержащую 1 мкМ 6-бензиладенина, необходимого для
образования побегов.
7.	Инкубируют их при 25—29 °C и 16-часовом световом дне при
освещенности примерно 1000 лк. Побеги формируются через
3—5 недель.
8.	Пересаживают побеги па агаризованную среду МС (полную или
разведенную в два раза), не содержащую регуляторов роста. Этот
этап необходим для образования корней.
9.	Инкубируют культуры при 25-29 °C, освещенности 5000 лк и
16-часовом световом дне.
10.	Через 8 недель укоренившиеся растения можно пересадить в
почву, как это описывалось выше.
118
5.3.2.	РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ НЕПОСРЕДСТВЕННО
ИЗ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ЭКСПЛАНТОВ
Этот метод регенерации растений особенно пригоден для травяни-
стых растений при использовании листьев, луковиц, клубнелуковиц,
стеблей, корневищ и клубней. Эксплант помещают на питательную
среду, содержащую небольшие количества ауксинов и цитокининов
(чтобы избежать формирования каллуса), после чего из него образу-
ются побеги. Размножение осуществляется путем расщепления пучка
побегов и высаживания отдельных побегов в сосуды. Этот метод нельзя
использовать для клонирования неоднородных (химерных) растений,
поскольку образовавшиеся в результате растения-потомки или будут
изменены, или полностью утратят неоднородность [5].
5.3.2.1.	Процедура регенерации растений путем прямого
органогенеза у Версий [15]
1.	Срезают молодые, полностью развернувшиеся листья с череш-
ками с растений Begonia, выращенных в теплице.
2.	Дезинфицируют их, обработав 5,25% раствором гипохлорита
натрия, содержащего 0,5% Твин-20, в течение 10 мин. Ополаски-
вают трижды в стерильной дистиллированной воде.
3.	Разрезают листья на кусочки длиной 5 мм и помещают их про-
ксимальной стороной вниз на поверхность агаризованной среды
МС, содержащей добавки витаминов Нича и Нич (см. табл. 5.3),
1,8 мкМ БА и 0,54 мкМ НУК.
4.	Инкубируют при 25—29 °C, 16-часовом световом дне и освещен-
ности 1000 лк. Придаточные побеги образуются прямо из экс-
планта через 4 недели.
5.	Делят каждую культуру и через 4 недели переносят на ту же
среду. Эту процедуру продолжают до получения необходимого
числа растений.
6.	Укореняют побеги, перенеся их на агаризованную среду МС, со-
держащую 0,54 мкМ НУК.
7.	Укоренившиеся побеги пересаживают в почву, используя описан-
ный ранее метод.
5.3.3.	УСИЛЕНИЕ ОБРА ЗОВАНИЯ ПАЗУШНЫХ ПОБЕГОВ IN VITRO
Все растения растут благодаря активности их верхушечных мери-
стем. Апикальная меристемная ткань представляет собой активно де-
лящиеся клетки, образующие ткань купола, расположенного на самой
верхушке побега и имеющего обычно диаметр 0,1 мм и около 0,25—
0,3 мм в длину. Тотипотентность, свойственная этой верхушечной ме-
ристемной ткани и примыкающему к ней участку кончика побега,
119
Рис. 5.5. Культивирование меристемной ткани картофеля и прорастание пазушных
почек in vitro. Клубни картофеля получают из растений, выращенных в полевых
условиях (1, 2). Клубень режут на кусочки размером 2,5 см, обрабатывают ГК и
инкубируют для стимуляции образования побегов на сыром вермикулите (3). Ме-
ристемные ткани изолируют и пересаживают на среду без регуляторов роста (4).
В течение месяца побеги увеличиваются в размерах и развивают придаточные
корни (5). Перенос побегов на среду, содержащую 0,05 мкМ НУК, приводит к
развитию пазушных почек (б). Растения-регенеранты с хорошо развитыми побегами
и корнями можно переносить в почву (7) или, перенося на среду, содержащую
22—44 мкМ БА, вызывать образование миниатюрных клубней (7).
явилась основой для промышленного клонального размножения многих
видов растений. Культивируемые меристемные ткани могут регенери-
ровать растения через развитие побегов из пазушных почек (рис. 5.5).
Растения, полученные таким способом, часто сохраняют генотип мате-
ринского растения. В зависимости от размера начального экспланта с
помощью этого метода можно получать растения, свободные от пато-
генов. Пазушные почки могут также развиваться из культивируемых
верхушек или сегментов узла. Обычно эксплант помещают на среду,
содержащую ауксины и цитокинины в низких концентрациях. Делается
это для того, чтобы стимулировать рост и образование побегов из па-
зушных почек и помешать формированию каллуса. Как правило, цито-
кинин добавляется к питательной среде, чтобы преодолеть апикальное
доминирование при формировании побегов и облегчить ветвление из
боковых почек, расположенных в пазухах листьев. Дополнительные
побеги отсаживаются на ту же питательную среду для дальнейшего
120
образования побегов из пазушных почек. Подобный процесс можно
продолжать и получать с его помощью огромные количества расте-
ний-регенерантов [4]. Размножение с использованием такого типа ре-
генерации растений считается самым медленным путем из всех
известных типов органогенеза [4]. Тем не менее предлагали проекты
с использованием этого метода по размножению Gerbera, в которых
за один год планировалось получить из одного побега миллион но-
вых [4].
Размер экспланта определяет степень выживания; более крупный
эксплант верхушки побега всегда выживает лучше, чем меристемные
ткани в культуре Это определяется как методическим мастерством,
так и питательной средой. Почки и узлы стебля, отобранные из активно
растущих участков, обычно в культуре растут лучше, чем экспланты,
выделенные из основания растения. Время года при отборе эксплантов
также часто имеет решающее значение, особенно для многолетних рас-
тений [11].
5.3.3.1.	Процедура получения стерильных клубней и регенерантов
из клубней картофеля {Solatium tuberosum) с использованием
культивируемых меристемных тканей [11]
1.	Нарезают клубни картофеля на 20 кусочков размером около
2 см2. Замачивают экспланты клубней в 0,003 М ГК на 1 ч, чтобы
разбудить спящие почки. Высаживают их на поверхность сте-
рильного, влажного вермикулита в термостатируемой камере и
изолируют кончики побегов после того, как они достигнут 3—
5 см в длину. При этом поверхностную стерилизацию проводить
не обязательно.
2.	Из кончиков побегов, используя препаровальную лупу с увели-
чением в 10—25 раз, помещенную в ламинар-бокс, изолируют
верхушечные купола меристемной ткани с одним примыкающим
примордием (примерно 75 мкм). Эксплант культивируют в про-
бирке для культивирования на поверхности агаризованпой среды
МС, содержащей 1 г/л бакто-триптона.
3.	Инкубацию проводят при 25 °C, освещенности 1500 лк и свето-
вом дне 12 ч в течение 30 суток, а затем переносят в камеру с
освещенностью 500 лк еще на 30 суток. В конце этого периода
времени побеги достигнут длины около 3 см
4.	Переносят побеги на поверхность агаризованной среды МС, со-
держащей 0,05 мкМ НУК, в колбу объемом 250 мл. Через 20 дней
из них разовьются от двух до трех пазушных побегов с прида-
точными корнями.
5.	Для стимуляции дополнительного образования пазушных по-
бегов эти побеги кладут горизонтально на поверхность агаризо-
ванной среды.
121
6.	Для размножения побегов повторяют такой перенос каждые
20 дней. Для получения большего числа новых культур на све-
жую агаризованную среду переносят срезанные верхушки по-
бегов.
7.	Когда побеги достигнут длины 10 см, их пересаживают (с при-
даточными корнями) в почву, используя ранее описанные при-
емы.
8.	Пазушные побеги переносят на агаризованную среду МС, со-
держащую 22—44 мкМ БА и 0,23 М сахарозы, в колбы объемом
500 мл.
9.	Инкубируют при 18—30 С, продолжительности светового дня
8 ч и освещенности 1000—5000 лк.
10.	Через 4 месяца из каждой колбы объемом 500 мл можно ото-
брать от 30 до 50 спящих миниатюрных клубней. Отобранные
клубни необходимо хранить в стерильных условиях. В свою оче-
редь, они могут служить источниками других исходных верху-
шек побегов.
5.4.	Регенерация растений из протопластов
Соматическая гибридизация с использованием протопластов предо-
ставляет потенциальную возможность получения гибридов между близ-
кородственными и отдаленными видами растений. Такой подход может
применяться в тех случаях, когда для данных растений обычное раз-
множение невозможно [19]. Получение протопластов (клеток без кле-
точной стенки), их гибридизация и последующее культивирование
представляют собой самые последние из современных методов регене-
рации растений (см. гл. 3). Прежде всего этот метод включает обработ-
ку тканей смесью ферментов, разрушающих клеточную стенку в осмо-
тически стабильном растворе. Образование протопластов зависит от
типа экспланта, смеси ферментов и применяемого метода. Обычно
выделение протопластов растений не представляет трудностей, посколь-
ку к настоящему времени уже разработаны соответствующие среды и
методы (см. гл. 3, [14, 23]). Однако регенерация растений — это более
трудная процедура, которая гораздо реже завершается успешно. Пере-
числим некоторые растения, у которых была осуществлена регенерация
из протопластов. Это морковь, табак, костер, рапс, спаржа, апельсин,
просо, картофель и томат. Путь формирования растений-регенерантов
из протопластов не обязательно соответствует тому типу морфогенеза,
по которому полученный из того же растения эксплант обычно развива-
ется на той же среде для регенерации (например, каллус моркови обра-
зует растения-регенеранты из соматических зародышей, а табак обра-
зует растения-регенеранты из побегов и соматических зародышей)
[19,24].
122
5.4.1.	ПРОЦЕДУРА ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ ТАБАКА
И РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ [24]
1.	Готовят суспензию клеток табака, перенося 1 г каллуса, полу-
ченного из листьев, помещенных на агаризованную среду МС,
содержащую 4,5 мкМ 2,4-Д, в жидкую среду МС, содержащую
4,5 мкМ 2,4-Д. Клеточные линии пересаживают каждые 3—
7 дней.
2.	Добавляют 2,0 мл суспензии клеток, находящихся в фазе лога-
рифмического роста, к 2 мл смеси ферментов (например, 2,0%
целлюлазы, 2,0% мацеразы, 1,0% дрейселазы, 0,7 М глюкозы,
3,0 мМ 2-[М-морфолино] этансульфоновой кислоты [МЭС], 6,0 мМ
СаС12- 2Н2О и 0,7 мМ NaH2PO4 -Н2О, pH 5,6—5,8) в стерильную-
чашку Петри размером 15 X 60 мм.
3.	Раствор инкубируют в течение 5 ч при 25 °C в темноте на круго-
вой качалке при 30—50 об/мин.
4.	Фильтруют раствор через сито из нержавеющей стали с раз-
мером пор 60—80 мкм и собирают фильтрат, содержащий
протопласты.
5.	Протопласты осаждают центрифугированием в течение 2 мин
при 40—50 g в стерильной центрифужной пробирке.
6.	Надосадочную жидкость отбирают стерильной пипеткой. Про-
топласты осторожно ресуспендируют в 4,0 мл среды, содержа-
щей 6 мМ СаС12  2Н2О, 0,7 мкМ КН2РО4 • 2Н2О и 0,5 М глюкозы,
pH доводят до 5,6—5,8. Переосаждают протопласты с помощью
центрифугирования.
7.	Промытые протопласты (примерно 0,5 мл) ресуспендируют в
2 мл среды (использовавшейся на стадии 6).
8.	Ресуспендированные протопласты помещают маленькими ка-
пельками в стерильную чашку Петри размером 60Х 15 мм. В одну
чашку добавляют 5—10 капель. Заклеивают чашки парафилмом
и хранят в полупрозрачной пластмассовой коробке, влажность
в которой поддерживается с помощью полотенца, смоченного в
1 % растворе CuSO4. Инкубируют при 25 °C, освещенности 1000 лк
и 16-часовом световом дне.
9.	К капелькам каждую неделю добавляют свежую среду до тех
пор, пока не появится растущий каллус.
10.	Побеги из каллуса формируются при добавлении жидкой среды
МС, содержащей 0,5 мкМ БА, каждые 2 недели. Побеги должны
регенерировать через 6 недель.
11.	Регенерировавшие проростки укореняют, перенося их на ага-
ризованную среду МС, разведенную вдвое и содержащую
0,11 мкМ 3-аминопиридина.
12.	Укоренившиеся проростки переносят в почву, используя опи-
санные ранее приемы.
123
5.5.	РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ: СОСТОЯНИЕ, ПРОБЛЕМЫ
И ВОЗМОЖНОСТИ
Образования придаточных корней можно добиться разными спосо-
бами. Некоторые виды растений (например, пальмы) требуют наличия
хорошо развитой системы побегов и корней еще до высадки их в поч-
ву. В данном случае получить из культуры тканей свободноживущие
растения можно только таким образом. Обычно придаточные корни
легко образуются из культивируемых побегов или растений-регене-
рантов после введения небольших количеств ауксина (например,
0,54 мкМ НУК) в питательную среду. Некоторые исследователи обна-
ружили, что при разбавлении среды МС в два раза и удалении регулято-
ров роста у некоторых видов растений облегчается формирование при-
даточных корней [1,2, 6]. Иногда образование корней подавляет высо-
кая интенсивность света, стимулирующая развитие фотосинтезирующих
листьев. Такое противоположное действие можно преодолеть, обора-
чивая нижнюю часть пробирок фольгой или добавляя в питательную
среду активированный уголь [10]. Укоренение можно также индуциро-
вать, поместив проросток в нестерильные условия грунта [10, 11, 16].
Для некоторых видов растений укоренение проростков стимулируют
с помощью высокой влажности и регулярного опрыскивания при 25—
35 С [16]. Для других видов растений укоренению способствует обра-
ботка побегов синтетическим ауксином [16].
Как отмечал Мурасиге [4, 7], клональное размножение растений в
промышленных масштабах с помощью методов культуры тканей про-
исходит в три или более этапов. Эти этапы включают: 1 этап — введение
зкспланта в культуру; 2 этап — размножение побега в культуре;
3 этап — получение растений с корнями и их предварительная аккли-
матизация для выращивания в условиях открытого грунта; 4 этап —
высаживание растений в грунт. В таблице 5.5 приведены области приме-
нения каждого типа регенерации растений. Из различных методов един-
ственно надежными для получения клонированного материала являются
методы размножения пазушными и адвентивными почками, хотя прямой
органогенез из эксплантов также широко используется для крупно-
масштабного клонирования растений. Правда, иногда при использова-
нии последнего образуются генетически нестабильные растения [4, 5].
Размножение пазушными побегами представляет собой самый медлен-
ный метод размножения растений. Соматический эмбриогенез обладает
самыми- большими возможностями для формирования наибольшего
числа растений в расчете на одну культуру. Получение растений-регене-
рантов из соматических зародышей из-за неопределенности генетической
природы этих растений не использовался как метод клонального раз-
множения. По той же причине не использовались и растения-регенеран-
ты, полученные из побегов, развившихся, в свою очередь, из каллус-
ной ткани. Получение каллуса, способного к морфогенезу, возможно
124
5.5- Методы регенерации растений, применяемые
в сельском хозяйстве и цветоводстве
Цель использования
Метод размножения
Клональное размножение
Получение растений, свобод-
ных от патогенов
Сохранение генотипа
Исследования по проблеме
морфогенеза
Получение генетически раз-
нообразных растений
Размножение пазушными почками из верхушек
побегов, меристемных тканей узлов, а также орга-
ногенез через прямое образование побегов из раз-
личных типов эксплантов
Размножение пазушными почками с использова-
нием меристемных тканей
Размножение пазушными почками с использовани
ем верхушек побегов и меристемных тканей, а
также органогенез через побеги, сформированные
из каллуса
Размножение пазушными почками, органогенез че-
рез побеги, сформированные из каллуса, и через
прямое образование побегов, соматический эмбрио-
генез
Органогенез через побеги, сформированные из кал-
луса, соматический эмбриогенез, а также получение
растений-регенерантов из протопластов
почти для всех видов растений, если правильно подобраны эксплант и
питательная среда. Неопределенность генетической природы растений,
полученных из каллуса, мешает использованию такого метода размно-
жения растений в качестве надежного способа клонального размножения.
Повышенная частота образования анеуплоидных клеток наряду со ста-
рением приводят к явной потере морфогенетической способности кал-
лусных культур [1, 2]. Однако этот метод регенерации растений можно
использовать для получения генетически разнообразных растений. Дру-
гими подходами при получении необходимого генетического разнооб-
разия являются обработка химическими мутагенами и ионизирующей
радиацией [12]. Наконец, подходом, вызывающим генетическое раз-
нообразие растений, является получение растений-регенерантов из гиб-
ридных протопластов, полученных, в свою очередь, в результате слия-
ния протопластов отдаленных видов растений, а также трансформация
клеток путем введения чужеродной ДНК (гл. 3).
5.6.	ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В этой главе основное внимание было уделено описанию методиче-
ских приемов на примере определенных видов растений для знаком-
ства с методами регенерации растений in vitro. Необходимо отметить,
что приведенные прописи составляют лишь основу, необходимую иссле-
дователям, начинающим работать в этой области. Для культивирования
других растений приведенные методики придется модифицировать. Как
уже упоминалось, исследователь должен: а) изучить литературу по ин-
125
тересующему его виду растения для выбора правильного метода (это
сэкономит массу времени, затраченного на бесплодные разработки);
б) тщательно отобрать нужный эксплант, чтобы начать исследования;
в) использовать для получения культур соответствующие методы дез-
инфекции и подходящую питательную среду.
ЛИТЕРАТУРА
1.	Evans, D. A., Sharp, W. R. and Flick, С. Е. (1981) in Plant Tissue Culture -
Methods and Applications in Agriculture, Thorpe, T. A. (ed.), Academic Press, New
York, p. 45.
2.	Flick, С. E., Evans, D. A. and Sharp, W. R. (1983) in Handbook of Plant Cell
Culture, VoL 1, Evans, D. A., Sharp, W. R., Ammirato, P. V. and Yamada, Y. (eds.),
Macmillan Publishing Co., New York, p. 13.
3.	Holdgate, D. P. (1975) in Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell,
Tissue, and Organ Culture, Reinert, J. and Bajaj, Y. P. S. (eds.), Springer-Verlag, Berlin,
Heidelberg and New York, p. 18.
4.	Murashige, T. (1974) Annu. Rev. Plant Physiol., 25, 135.
5.	Myrashige, T. (1977) in Plant Tissue Culture and its Bio-technological Appli-
cations, Barz, W., Reinhard, E. and Zenk, M. H. (eds.), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg
and New York, p. 392.
6.	Ammirato, P. V. (1983) in Handbook of Plant Cell Culture, Evans, D. A.,
Sharp, W. R., Ammirato, P. V. and Yamada, Y. (eds.), Macmillan Publishing Co., New
York, p. 82.
7.	Anderson, W. C. (1980) in Proceedings of the Conference on Nursery Produc-
tion of Fruit Plants through Tissue Culture — Applications and Feasibility, Zimmerman,
R. H. (ed.), USDA, SEA, AR, Beltsville, p. 1.
8.	Button, J. and Kochba, J. (1975) in Applied and Fundamental Aspects of Plant
Cell, Tissue, and Organ Culture, Reinert, J. and Bajaj, Y. P. S. (eds.), Springer-Verlag, Ber-
lin, Heidelberg and New York, p. 70.
9.	De Fossard, R. A. (1976) Tissue Culture for Plant Propagators, published by
the Department of Continuing Education, University of New England, Armidale.
10.	Hu, C. Y. and Wang, P. J. (1983) in Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1,
Evans, D. A., Sharp, W. R., Ammirato, P. V. and Yamada, Y. (eds.), Macmillan Pub-
lishing Co., New York, p. 177.
ll.	Kartha, К. K. (1981) in Plant Tissue Culture — Methods and Applications in
Agriculture, Thorpe, T. A. (ed.), Academic Press, New York, p. 181.
12.	Narayanaswamy, S. (1977) in Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell,
Tissue, and Organ Culture, Reinert, J. and Bajaj, Y. P. S. (eds.), Springer-Verlag, Berlin,
Heidelberg and New York, p. 179.
13.	Pierik, R. L M. (1975) Acta Hortic., 54, 71.
14.	Thomas, E. and Davey, M. R. (1975) From Single Cells to Plants, published
by Wykeham Publications (London) Ltd., London and Winchester.
15.	Tisserat, B., Esan, E. B. and Murashige, T. (1977) Hortic. Rev., 1, 1.
16.	Debergh, P. C. and Maene, L. J. (1981) Sei. Hortic., 14, 335.
17.	Durbin, R. D., ed. (1979) Nicotiana — Procedures for Experimental Use, pub-
lished by USDA, SEA, Technical Bulletin No. 1586.
18.	Gamborg, O. L. and Shyluk, J. P. (1981) in Plant Tissue Culture — Methods
and Applications in Agriculture, Thorpe, T. A. (ed.), Academic Press, New York,
p. 21.
19.	Gamborg, O. L., Shyluk, J. P. and Shahin, E. A. (1981) in Plant Tissue Cul-
ture - Methods and Applications in Agriculture, Thorpe, T. A. (ed.), Academic Press,
New York, p. 115.
126
20.	Kartha, К. К. (1915) in Plant Tissue Culture Methods, National Research Co-
uncil of Canada, Prairie Regional Laboratory, Saskatoon, Saskatchewan, p. 44.
21.	Mikkelsen, E. P. and Sink, К. C., Jr. (1978) Hortic. Sei., 13, 242.
22.	Tran Thanh Van, K. (1980) Adv. Biochem. Eng., 18, 151.
23.	Wang, P. J. and Hu, C. Y. (1980) Adv. Biochem. Eng., 18, 61.
24.	Evans, D. A. and Bravo, J. E. (1983) in Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1,
Evans, D. A., Sharp, W. R., Ammirato, P. V. and Yamada, Y. (eds.), . Macmillan Publi-
shing Co., New York, p. 124.
25.	Sharp, W. R., Sondahl, M. R., Caldas, L. S. and Maraffa, S. B. (1980) Hortic.
Rev., 2, 268.
6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУР ТКАНЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ
ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ СОСУДОВ
Г. П. БОЛВЕЛЛ
6.1.	ВВЕДЕНИЕ
Главная цель современной биологии — выяснение молекулярных
событий, вовлеченных в дифференцировку специализированных кле-
ток. В данной главе мы попытаемся оценить возможность использова-
ния экспериментальной индукции дифференциации в культурах клеток
растений как ключа для понимания процессов, происходящих в интакт-
ном растении. Относительные простота и гомогенность системы культу-
ры тканей дают возможность изучать как механизмы, так и контроль
экспрессии и последующей модуляции тех генов, которые могут регу-
лироваться экзогенным введением гормонов растений; такие процессы
включают начальное взаимодействие сигнала с рецептором через генную
экспрессию, необходимую для модуляции синтеза продуктов, закоди-
рованных в генах. Не исключено, что использование систем культуры
тканей позволит: а) выявить сигналы, необходимые для морфогенеза,
главным образом эмпирически подобрать оптимум потребности
в питательных веществах, а также регуляторах роста; б) понять
механизмы модуляции сигналов и их действие на синтез макро-
молекул.
Исследование перечисленных выше явлений требует многосторон-
него подхода, включая методы биохимии, а также клеточной и моле-
кулярной биологии. Очевидно, методические разработки последних
лет обладают большими возможностями. Несмотря на то что мы еще
далеки от полного понимания сложных взаимодействующих систем,
регулирующих развитие растения, имеет смысл изучать образование
специализированных типов клеток в культуре тканей, поскольку эти
клетки являются начальным звеном органогенеза и регенерации растений
(см. гл. 5). Распространение этих исследований на проблему клеточного
морфогенеза в интактном растении более спорно и требует осторожного
подхода с постоянным сравнением данных, полученных в культуре
тканей и на интактном растении. Однако тщательный выбор систем
может помочь преодолеть некоторые из таких естественных трудностей.
Поэтому в настоящей главе описаны системы культур клеток, которые
с хорошей воспроизводимостью продуцируют высокую степень спе-
циализированных клеток и которые еще не полностью используются.
На основании цитологического анализа дана количественная оценка
дифференциации. Кроме того, для понимания механизмов экспрессии
генов проводят исследования биохимических маркеров.
128
В данной главе мы попытаемся проиллюстрировать некоторые
концепции и подходы по этой проблеме.
6.2.	ОБЩИЕ КОММЕНТАРИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ КУЛЬТУР ТКАНЕЙ
Способность индуцировать дифференцировку в культуре тканей
имеет большое значение для изучения процесса морфогенеза. В идеаль-
ном случае культура должна состоять из популяции физиологически
и биохимически однородных клеток. Более того, если бы в ней уда-
лось синхронизировать процессы деления, роста и дифференцировки
клеток, то была бы получена совершенная экспериментальная система,
с которой было бы гораздо легче манипулировать и анализировать
результаты, чем в интактном растении.
В действительности эта идеальная модель далека от достижения,
а степень приближенности к ней зависит от имеющейся у исследователя
системы.
Получению однородной, недифференцированной системы, которую
можно было бы индуцировать к дифференцировке, препятствует не-
сколько факторов. Агрегация приводит к неоднородности размеров
клеток, их формы и метаболического состояния. Часто в клетках наблю-
даются полиплоидия и другие хромосомные изменения. Гетерогенность
культуры клеток отчасти обусловлена межклеточными взаимодейст-
виями: образованием сосудистоподобных элементов. Кроме того, не-
возможно достичь полной синхронности деления и дифференцировки
клеток. Все это рождает трудности в интерпретации результатов по
регуляции биохимических маркеров, поскольку не вызывает сомнения,
что наблюдаемые при дифференцировке изменения обусловлены типами
клеток, встречающихся в культуре. В тех случаях, где морфогенезу
подвергается особенно малое число клеток, подобная гетерогенность
приводит к трудностям, связанным с возникновением флуктуаций,
даже если известно, что маркер весьма сильный. Еще одна существен-
ная проблема — потеря морфогенетических потенций и привыкание
к регулярным пересадкам исходного изолята. На первый взгляд, все
эти перечисленные факторы свидетельствуют против использования
культур тканей для изучения дифференциации клеток.
Однако, с другой стороны, использование культур клеток позво-
ляет применять различные воздействия извне, неприемлемые для целых
растений, и которые, по крайней мере, в суспензионных культурах
близки к унификации. Следовательно, потенциально можно получить
большое количество клеток, содержащихся в одинаковых условиях
и удобных для отбора. Все еще остается проблема несинхронного роста,
хотя в некоторых культурах получена частичная синхронизация клеточ-
ных делений. Существует ряд методов синхронизации, а управление
ростом культуры может в какой-то степени предотвратить накапливаю-
щиеся хромосомные перестройки. Таким образом, перед началом био-
5 - 1021
129
химического анализа необходимо разработать четкую стратегию, учиты-
вающую максимум параметров системы. Экспериментальную систему
всегда следует соотносить с реальной ситуацией в интактном растении.
У многих растений можно изолировать определенные типы дифференци-
рованных клеток (часто это весьма трудоемкая процедура) для установ-
ления тканеспецифических маркеров и в дальнейшем использовать их
для сравнительного анализа в культуре клеток.
6.3.	СТРАТЕГИИ
Большую часть описанных выше ограничений позволяет преодолеть
удачно подобранный экспериментальный материал. Определенным
преимуществом обладают исследователи, знающие особенности роста
и дифференцировки специализированных типов клеток внутри данного
растения. Важное значение имеет возможность получения регенерации
или органогенеза для данных видов или сортов растений в культуре.
В данной главе описаны системы, в которых удалось получить высокий
уровень дифференцировки определенного типа клеток в культуре.
Эти системы различаются продолжительностью времени отделения от
исходного материала. Кроме того, в главе рассматриваются изолирован-
ные клетки, экспланты, каллусы и суспензионные культуры.
Перед получением системы необходимо рассмотреть ряд переменных
параметров, большинство из них приходится подбирать опытным пу-
тем. Стадия развития и физиологическое состояние растения, от которо-
го берется эксплант для культивирования, влияют на способность инду-
цировать органогенез, а следовательно, и на эффективность этой системы
для изучения процесса дифференцировки. Это относится и к источнику
экспланта. Нет готового рецепта среды, необходимой для культивирова-
ния, ее обычно подбирают опытным путем (см. гл. 1). По мнению
одних исследователей, морфогенезу способствует среда, богатая азотом,
другие, которых большинство, используют среды „гибридного” со-
става.
Другие специфические переменные имеют отношение к изучению
каллусных и суспензионных культур. Здесь прежде всего необходимо
подобрать среду для инициации каллуса, как описывалось в главе 1.
После того как каллус получен или переведен в суспензию, наиболее
важными факторами для изучения дифференциации являются условия
культивирования. Многие детальные исследования показали, что для
сохранения морфогенетического потенциала метод культивирования
является решающим. Наиболее важным фактором, выявляемым цито-
логически, служит стабильность хромосом. На нее может влиять частота
пересадок, и культуры должны субкультивироваться перед вступлением
в стационарную фазу роста. Отдельные культуры, особенно когда они
получены недавно, различаются скоростью роста, поэтому за ней необ-
ходимо тщательно следить и пересаживать клетки, когда они находятся
130
р конце фазы экспоненциального роста. Это позволяет избежать накоп-
ления в культуре анеуплоидных клеток [1]. Однако даже в этом случае,
при длительном культивировании, вероятно, имеет смысл получать
примерно через каждые 3 месяца новые изоляты, поскольку наблюдает-
ся значительное снижение морфогенетического потенциала. Параметры
роста должны быть определены, по крайней мере, для поддержания
культур и» если это возможно, для определения деталей установившего-
ся клеточного цикла.
Условия дифференцировки также определяются эмпирически.
Клональная изменчивость оценивается анализом максимально возмож-
ного числа отдельных культур по определенному цитологическому или
биохимическому маркеру, характерному для данного типа изучаемых
клеток. Отбираются клетки, обладающие большой скоростью роста
и самым большим морфогенетическим потенциалом. На этой стадии,
изменяя среды для культивирования, можно иногда противостоять
быстрой потере морфогенетических потенций при регулярных пере-
садках культуры. Схема экспериментов для изолированных клеток
и эксплантов, в которых каждый изолят включается в отдельный экс-
перимент, отличается от таковой для каллусов и суспензионных куль-
тур, представляющих собой длительно пересаживаемые культуры, в
том смысле, что клетки могут быть пересажены в среду для индукции
морфогенеза при каждом эксперименте, в то время как культура регу-
лярно пересаживается и сохраняется в поддерживающей ее питательной
среде.
6.4.	СИСТЕМЫ
Выбор системы, естественно, определяется дифференциацией опре-
деленного изучаемого типа клеток. Образование продуктов вторичного
метаболизма обсуждается в 7 главе этой книги. В этом разделе индук-
ция образования сосудистой ткани со специализированной структурой
стенки описана для систем, в которых с хорошей воспроизводимостью
достигается высокий уровень клеточной дифференциации. Исследовали
биохимические изменения, в частности лигнификацию, связанные с
развитием трахеид и других сосудов на некоторых из таких систем.
Все еще неизвестно, какие ферменты действительно являются биохими-
ческими маркерами, особенно для многоклеточных систем, в которых
Дифференциация происходит асинхронно.
Проблемы ксилемогенеза обсуждали в монографиях по дифферен-
циации клеток растений [2—4]. Условия оптимизации индукции сосу-
дистой дифференциации в культурах, выращиваемых в стандартной
среде с различными концентрациями ауксина и цитокинина (диффе-
ренцировка оценивалась с использованием цитологических методов),
приведены в таблице 6.1.
131
6.1. Определение образования сосудистых элементов
А. Определение лигнифицированных сосудистых узлов
1. Мягко мацерируют 1 г клеток в насыщенном растворе флуороглюцина
в 6 М НС1.
2. Используя бинокулярный микроскоп, подсчитывают число окрашенных
в красный цвет узлов на 1 г клеток.
Б. Гистологическое определение сосудистой ткани
Ксилема
1.	Инкубируют образец в 2 мл 4% (масса к объему) NaOH в течение ночи
при 50°С для размягчения ткани.
2.	Удаляют NaOH и добавляют 2 мл водного раствора сафранина О (0,04%
масса к объему).
3.	Инкубируют ткань в красителе в течение 30 мин при 50°С.
4.	Удаляют красящий раствор и помещают образец на отмывку в 1 М НС1
на 1 ч при 50°C.
5.	Образец ополаскивают и повторяют процедуру отмывки.
6.	Изучают окрашенную ксилему на давленых препаратах при 100-кратном
увеличении.
Флоэма
1.	Предыдущий материал (окрашенный сафранином) еще раз окрашивают
пикриновой кислотой с анилиновым голубым (0,005 % в 0,15 М К2НРО4,
pH 9) в течение 10 мин.
2.	Удаляют краситель и наносят на препарат 0,15 М КН2РО4, 0,1 М сахарозу,
pH 8,2.
3.	Готовят давленый препарат и определяют зоны утолщений в ксилеме
с окаймленными порами.
4.	Элементы флоэмы выявляют с помощью ультрафиолетовой флуорес-
центной микроскопии.
В. Определение числа трахеид
1.	Мацерируют образцы в 10 мл 5 % (масса к объему) ашидрида хрома и 5%
(масса к объему) НС1 при комнатной температуре в течение 24 ч.
2.	Удаляют смесь хромовых кислот, не взмучивая образец, и добавляют
1 мл дистиллированной воды.
3.	Образец разрушают кончиком надетой на шприц иглы № 22 и гомогенизи-
руют, пропустив гомогенат через шприц.
4.	Разводят в 2 мл и, используя гемоцитометр, определяют число трахеид.
6.4.1. ИЗОЛИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ
Наиболее ярким примером такой системы является индукция
ксилемогенеза в изолированных клетках мезофилла из листьев Zinnia
elegans в суспензионной культуре [5]. После периода увеличения собст-
венных размеров клетки прямо и относительно синхронно дифференци-
руются в трахеидоподобные элементы в условиях, описанных в табли-
цах 6.2 и 6.3. Дифференцируется примерно 40—60% клеток. В течение
96 ч это один из наиболее высоких показателей, зафиксированных
в культуре. Система оказалась особенно удобной для изучения таких
аспектов дифференциации трахеид, как клеточный цикл и синтез ДНК
[6, 7]. Было показано также, что деление не обязательно происходит
132
5.2.	Индукция ксилемогеиеза в изолированных клетках мезофилла Zinnia elegans
1.	Проращивают семена Zinnia elegans в увлажненном вермикулите при 27 ° С на
непрерывном освещении (люминесцентный свет 4 лк) в течение 1 недели.
2.	Переносят на режим 12-часового дня (люминесцентный свет 10 лк) при
27 °C на 1-2 недели.
3.	Срезают первые или вторые листья и (примерно 2 г) проводят поверх-
ностную стерилизацию в растворе NaOCl (0,05% в расчете на активный
хлор) в течение 10 мин.
4.	Ополаскивают 3 раза в стерильной деионизированной воде и разрезают
на кусочки (примерно 5X5 мм).
5.	Мацерируют в 5 мл 0,2 М маннита, используя стерильные ступку и пестик.
6.	Фильтруют через нейлоновую сетку с размером пор 50 мкм и собирают
клетки центрифугированием при 150 g в течение 2 мин.
7.	Ресуспендируют клетки в 150 мл каждой среды (табл. 6.3).
8,	Инкубируют клетки в темноте при 27 °C в небольших колбах на круговой
качалке или в пробирках на вращающемся барабане.
6,3.	Состав среды для культивирования изолированных мезофилльных клеток
Zinnia
Макросоли, мг/л	Микросоли, мг/л		
KNO3	2020	MnSO4  4Н2О	25
NH„C1	54	Н3ВО3	10
MgSO4 - 7Н2О	247	ZnSO4•7Н2О	10
СаС1г  2Н2О	147	Na2MoO4 • 2Н2О	0,25
KH2PO4	68	CuSO4  5Н2О	0,025
		Na2 ЭДТА	37
		FeSO4 • 7Н2О	28
Витамины, мг/л		Регуляторы роста, мг/л	
Глицин	2	НУК	0,1
Мезоинозит	100	БА	1,0 (в кон- трольной культу- ре 0,001)
Никотиновая кислота	5	Сахароза	10000
11иридо ксин-НС!	0,5	Маннит	36000
Тиамин	0,5	pH 5,5	
Фолиевая кислота	0,05		
Биотин	0,05		
во всей популяции клеток [8]. Около 50% клеток делятся, и некоторые
трахеиды образуются из клеток со все еще интактными клеточными
пластинками. Однако у большинства клеток наблюдается развитие
нормальной многослойной клеточной стенки. Для деления клеток и
для образования трахеидных элементов требуется 6-бензиладенин (БА)
в присутствии нафтилуксусной кислоты (НУК). Активности L-фенил-
аланинаммонийлиазы (ФАЛ) и связанных с клеточной стенкой изофер-
ментов пероксидазы — биохимические маркеры, указывающие на синтез
лигнина, — достигают максимума через 72 ч и таким образом четко
133
коррелируют с началом лигнификации [9]. Однако по этой потенциально
очень удобной системе до сих пор не было опубликовано данных мо-
лекулярно-биологических исследований.
6.4.2.	ЭКСПЛАНТЫ
Индукция ксилемогенеза в однородной паренхиматозной ткани,
выделенной из некоторых растений, оказалась весьма популярной экс-
периментальной системой. От системы отдельно изолированных клеток
ее отличает отсутствие разъединенности клеток, которые подвергаются
различным обработкам, находясь на твердой среде, а от каллусной
системы — изначально более однородные клетки, а также возможность
для каждого экспланта (который не подвергается пересадкам) про-
вести лишь один эксперимент. Определенная работа была проведена
на эксплантах клубня земляной груши, коровой ткани корня гороха,
сердцевины стебля салата и некоторых пораненных тканей, в частности
Coleus (табл. 6.4). В этих системах дифференцировка клеток проис-
ходит с относительно высокой и предсказуемой скоростью. Вновь сфор-
мированные клетки ксилемы, выявляемые под световым микроскопом
по специфическим вторичным утолщениям клеточной стенки, сначала
появляются в эксплантах земляной груши через 48 ч, в клетках серд-
цевины салата через 96 ч, а в эксплантах корня гороха через 120 ч.
6.4.	Индукция ксилемогенеза в эксплантах паренхимной ткани
Паренхиматозную ткань можно легко приготовить из салата, земляной груши
и коровий ткани корня гороха.
1.	Для салата. Удаляют листья с кочана рыхлокочанного салата до тех пор,
пор, пока не обнаружится мягкий и тонкий базальный конец. Срезают примерно
20 мм верхушки и тщательно моют под краном. Поверхность сердцевины стери-
лизуют в NaOCl (1,2% в расчете на активный хлор) в течение 20 мин, а затем
промывают, по крайней мере, 3 раза в стерильной бидистиллированной воде.
Из паренхимной ткани с помощью пробочного сверла диаметром около 4 мм
высверливают 4-5 цилиндров. Разрезают цилиндры на экспланты толщиной 1 мм.
Для земляной груши. Моют клубни щеткой под краном и замачивают в NaOCl
(1,2% в расчете на активный хлор) на 20 мин, после чего моют стерильной биди-
стиллированной водой. Разрезают клубни на расстоянии 20 см от верхнего и ниж-
него концов. Из паренхимной ткани каждого клубня с помощью пробочного
сверла диаметром около 4 мм высверливают по одному цилиндру. Разрезают
цилиндры на экспланты толщиной 1 мм.
Для гороха. Проводят поверхностную стерилизацию семян в NaOCl (0,6%
в расчете на активный хлор) в течение 15 мин, ополаскивают в стерильной дистил-
лированной воде и оставляют набухать в стерильной бидистиллированной воде
на 6-8 ч. Семена проращивают в чашках с водой, содержащей 0,7% (масса к объ-
ему) агара, в темноте при 20 °C в течение 60-65 ч. В стерильных условиях наре-
зают сегменты толщиной 1 мм, начиная с расстояния 10—11 мм от кончика корня.
Выбирают центральный цилиндр, используя установленную вертикально стериль-
ную металлическую палочку диаметром 0,74 мм.
2.	Экспланты культивируют на полужидкой среде в предварительно стери-
лизованных чашках Петри или вегетационных сосудах в темноте при 25 °C.
134
3. Условия	культивирования для этих трех типов		эксплантов	следующие
Растение	Среда	Регуляторы роста	Формирова- ние трахеид	Литера- турный ис- точник
Салат	МС	10 мг/п ИУК, 0,1 мг/л кинетина, 2% глюкозы	18%	[11]
Земляная груша	МС с повы- шенным источником азота	1 мг/л 2,4-Д, 5 мг/л БА, 2% сахарозы	18%	112]
Горох	С2М	0,175 мг/л ИУК,	29%	[13,14]
1,1 мг/л 2,4-Д,
0,2 мг/л кинетина
Использование этих экспериментальных систем позволило пролить
свет на ряд важных проблем. Выяснено, что минимальные требования
для ксилемогенеза — это наличие ауксина, цитокинина и сахара, обычно
сахарозы в концентрациях 2—3% (масса к объему). Правда, дифферен-
цировка в эксплантах земляной груши может быть получена под дейст-
вием одной индолилуксусной кислоты (ИУК) и сахарозы, что, возмож-
но, указывает на некоторую автотрофность по цитокинину. Дифферен-
цировка в этой системе активировалась также после добавления гиббе-
релловой кислоты (ГК) [10]. Работы с эксплантами салата показали, что
дифференцировку можно усилить внесением предшественников этилена,
следовательно, ответ на подобное воздействие, вероятно, связан с ролью
этилена в жизнедеятельности клетки [11].
Системы эксплантов были также чрезвычайно полезны при изуче-
нии действия различных факторов на клеточный цикл перед дифферен-
цировкой. В культивируемых эксплантах как земляной груши [12],
так и корня гороха [13, 14] синтез ДНК предшествует ксилемогенезу,
и в экспериментах с использованием ингибиторов синтеза ДНК (см.
табл. 6.9) было высказано предположение о предварительном синтезе
ДНК [15]. Как у земляной груши, так и у эксплантов гороха дифферен-
цировке предшествуют, по крайней мере, два цикла деления, однако
пока не ясно, требуется ли для этого цитокинин.
Исследования дифференцировки эксплантов с использованием
биохимических маркеров проводятся не очень активно. Однако у земля-
ной груши была найдена слабая корреляция между изменениями в
активности ФАЛ, связанной с клеточной стенкой пероксидазой, числом
трахеид и лигнификацисй [16].
6.4.3.	КУЛЬТУРЫ КАЛЛУСОВ
Каллус можно с высокой эффективностью индуцировать к диффе-
ренцировке, однако перед использованием его в экспериментальной
135
работе необходимо принять во внимание ряд соображений; в еще боль-
шей степени это относится к суспензионным культурам. Некоторые
ограничения и источники изменчивости уже были описаны в разделе
6.3. Самая большая трудность, и это также относится к регенерации,
состоит в потере старыми культурами способности к дифференцировке.
Наиболее важным препятствующим фактором, видимо, здесь служит
анеуплоидия. Ослабление морфогенетического потенциала можно сдер-
жать путем тщательного исследования и подбора концентраций гормонов
роста. Обычно высокие концентрации только ауксина, как правило,
2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), приводят к интенсивно-
му делению клеток. Хотя на ранних пересадках иногда наблюдается
спонтанное образование корней, после длительного культивирования
при регулярных пересадках происходит постепенная потеря морфоге-
нетического потенциала, даже если клетки, субкультивируются, не всту-
пая в стационарную фазу роста. Часто это можно преодолеть, внося в
питательную среду низкую концентрацию цитокинина (недостаточную
для дифференцировки) или натуральный экстракт типа кокосового
молока до 20% (объем к объему). При тех же условиях, по-видимому,
поддерживается низкая плоидность, сохраняя таким образом морфоге-
нетический потенциал. В подобном случае индукцию ксилемогенеза
можно вызвать путем пересаживания небольшого кусочка рыхлого
каллуса (до 1 г сырой массы) на 30 мл агаризованной индуцирующей
среды в предварительно простерилизованные пластмассовые сосуды
для отбора проб объемом 60 мл.
Индукция образования специализированных типов клеток достиг-
нута при работе с каллусами множества различных видов растений.
Ксилемогенез детально исследован у фасоли, платана' и сои (табл. 6.5
и 6.6), тогда как для многих других видов растений удавалось индуци-
ровать синтез продуктов вторичного метаболизма, особенно пигментов.
К сожалению, для изучения клеточного цикла каллусные культуры
оказались недостаточно удобными из-за трудностей, связанных с отбо-
ром проб, хотя и были проведены некоторые исследования с использо-
ванием биохимических маркеров. В результате в каллусных культурах
фасоли (Phaseolus vulgaris) выявлена корреляция между изменениями
арабинансинтетазы (фермента, вовлеченного в синтез пектинов) и
образованием первичной клеточной стенки в ходе деления и роста кле-
ток, а также более поздними изменениями ФАЛ и ксилансинтетазы
(ассоциированных соответственно с лигнификацией и увеличением
отложения гемицеллюлоз) и образованием в процессе ксилемогенеза
вторичной клеточной стенки [17]. Эти изменения коррелировали также
с возросшим включением предшественников в ксилан и арабинан,
с увеличенными соотношениями ксилозы к арабинозе в полимерах
клеточной стенки в ходе ксилемогенеза [18], а также с изменениями
некоторых более поздних ферментов лигнификации [19].
136
6.5.	Индукция ксилемогенеза в каллусах и суспензионных культурах
1.	Основные методы изолирования каллусов, получения и поддержания
суспензионных культур описаны в гл- 1. Составы питательных сред приведены в
разделе 1.4.3.
2.	Каллусный материал культивируют, как обычно, на 30 мл агаризованной
среды в предварительно простерилизованных пластмассовых сосудах. Ксилсмоге-
нез индуцируют путем переноса нескольких порций рыхлого каллуса массой
около 1 г на среду для индукции, каждый кусочек каллуса в отдельный сосуд.
Каждые 3 дня отбирают для анализа образцы в виде трех параллельных проб
(табл. 6.8—6.12).
3.	Суспензионные культуры выращивают, как обычно, в 150 мл питательной
среды. Ксилемогенез индуцируют путем переноса известного, предварительно про-
анализированного инокулума из культуры, растущей в обычных условиях, в
среду для индукции. Используя иглу и шприц, отбирают для анализа роста и био-
химических маркеров каждые 10 дней небольшие порции суспензии объемом
по 10 мл (табл. 6.7-6.12).
Поскольку обычная (контрольная) и ксилемогенная (индукционная)
среды одинаковы для каллусных и суспензионных культур, они описаны
вместе в таблице 6.6.
6.6. Условия ксилемогенеза в каллусных и суспензионных культурах
Растение	Эксплант	Система*	Среда	Регуляторы роста		Литера- турный источник
				Обычные условия	Условия индукции	
Фасоль	Этиолиро- ванный ги- покотиль	к, с	В5	2 мг/л 2,4-Д, 10% кокосо- вого молока, 2% сахарозы	1 мг/л НУК, 0,5 мг/л кине- тина, 3 % са- харозы	[17-21]
Табак		с	ЛС	0,22 мг/л 2,4-Д, 3 % сахарозы	0,23 мг/л БА, 3% сахарозы	[22]
Платан	Камбий	к, с	PRL4	1 мг/л НУК, 2% сахарозы	0,5 мг/л НУК, 2 мг/л кине- тина, 2% са- харозы	
Соя		к, с	В5	2 мг/л 2,4-Д, 2% сахарозы	2 мг/л НУК, 0,5 мг/л кине- тина, 3% са- харозы	
Петуния		к	МС	1 мг/л 2,4-Д, 0,2 мг/л БА, 2% сахарозы	1 мг/л БА, 2% сахарозы	[48]
♦К — каллус, С — суспензионная культура.
137
6.4.4.	СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ
Суспензионные культуры получают путем пересаживания недиф-
ференцированного рыхлого каллуса в жидкую среду, которая после
пересадки взбалтывается (см. пт. 1). (В этой же главе приведены ре-
комендации по поддержанию культур и предупреждению потери каллу-
сом морфогенетического потенциала.) Суспензионные культуры обла-
дают явным преимуществом по сравнению с каллусными: с ними легче
проводить отбор образцов и цитологические исследования, экзогенная
обработка приводит к одинаковому воздействию на все клетки, а веро-
ятность присутствия смешанной популяции клеток значительно ниже.
В культурах также легче создать синхронность. Однако отчасти из-за
наличия агрегатов меньшего размера степень дифференцированности
суспензионных культур часто ниже, чем каллусных. В общем пока су-
ществует незначительное число культур, обладающих высоким выходом
дифференцированных структур.
Соотношение арабинан-, ксилансинтетазы и активности ФАЛ к
первичному и вторичному образованию клеточной стенки и лигнифика-
ции в процессе клеточного деления, роста и дифференцировки, напри-
мер, для суспензионных культур фасоли [20] сходное с выявленным
у каллусов. Результаты предварительных экспериментов дают основание
предполагать, что эти изменения могут происходить благодаря синтезу
ферментов de novo и поэтому, возможно, отражать экспрессию генов
de novo [20, 21], однако строгих молекулярно-биологических экспери-
ментов до сих пор не проведено. Аналогичные исследования на табаке
[22] показали, что увеличение активности метаболизма шикимовой
кислоты в лигнин коррелировало с дифференцировкой трахеидных
элементов. Эта реакция усиливалась в более крупных агрегатах
клеток.
Результаты всех исследований, проведенных на суспензионных
культурах, как и на каллусных, следует интерпретировать весьма осто-
рожно. Необходимо параллельно проводить неиндуцированные кон-
трольные эксперименты путем пересева того же исходного материала
на обычную питательную среду. Дополнительные контрольные культуры,
потерявшие способность к морфогенезу на индуцирующей среде, также
полезны. Ьфоме того, если это возможно, желательно проводить парал-
лельные эксперименты на интактном растении. Так, у фасоли временное
появление активностей арабинан-, ксилансинтетазы и ФАЛ в развиваю-
щихся стеблях, выделенных из гипокотилей, происходило в том же
порядке, что и в дифференцирующихся культивируемых клетках
[17, 20]. Таким образом, если индуцируемые изменения в культурах
и в развивающихся тканях происходят в аналогичной временной
последовательности и с такой же активностью, то нет оснований
полагать, что основные регуляторные механизмы в этих системах раз-
личаются.
138
6.5. ДЕЙСТВИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА РАСТЕНИЙ И СИНТЕЗ МАКРОМОЛЕКУЛ
Хотя соотношение регуляторов роста растений, используемых
для индукции дифференцировки, подбирается эмпирически, тем не
менее культуры тканей потенциально полезны для изучения действия
регуляторов роста на молекулярном уровне. Как правило, дифференциа-
цию можно вызвать путем выведения из среды ауксина. При этом часто
в среду добавляют большее количество экзогенного цитокинина. 2,4-Д —
это ауксин, который наиболее часто используется для индукции „мери-
стематической” активности. Он усваивается медленней, чем ИУК или
НУК, и поэтому является более активным при поддержании недиффе-
ренцированного состояния. Истощение 2,4-Д при переносе культуры
на среду, лишенную этого вещества, является, по-видимому, предвари-
тельным условием для морфогенеза, который в присутствии этого
регулятора роста подавляется. В длительно пересаживаемых культурах
действие цитокинина также модифицируется, поскольку культуры
могут привыкать к нему [23], что приводит к потере морфогенетиче-
ского потенциала [24]. Природа этих процессов еще не ясна, однако
важность ее не вызывает сомнений, так как эти процессы являются
инструментом для молекулярных исследований, особенно в тех случаях,
где их действие обратимо. Более глубокое понимание этих явлений
требует более широкого применения иммунохимических методов,
необходимых для точного измерения содержания эндогенных регуля-
торов роста [25].
При работе с системами клеточных культур внимание исследова-
телей привлекли значительные биохимические изменения, возникавшие
вскоре после воздействия регуляторов роста. Такие исследования сфо-
кусированы на проблеме синтеза макромолекул в связи с клеточным
циклом, ростом и дифференцировкой, в том числе измерении большого
числа биологических параметров, многие из которых приведены в
таблицах 6.9—6.12. Для полной интерпретации этих результатов необ-
ходимы контрольные культуры, в которых не происходит дифференци-
ровка.
Рассматривая ценность исследования клеточного цикла культиви-
руемых клеток, отличающихся от меристематических сильной вакуоли-
зированностью и цитологической гетерогенностью, необходимо иметь
в виду, что основная информация о работе клеточного цикла получена
при изучении апикальной меристемы корня, хотя в растении меристем-
ная структура тканей варьирует. Ценность подобных исследований
зависит от того, насколько хорошо синхронизирована культура. Неко-
торые культуры тканей обладают природной высокой степенью синхрон-
ности, тогда как другие удается синхронизировать лишь в результате
определенных манипуляций (табл. 6.7). Однако манипуляции, при
которых применяется блокирование клеточного цикла и затем высво-
бождение блокирующего агента, по-видимому, непригодны для таких
139
6Л. Методы синхронизации суспензионных культур клеток растений
А. Кинетиновый импульс
1.	Отбирают наиболее быстро растущую линию клеток и пересаживают ее
каждые 3 дня, чтобы отобрать быстроделящисся клетки.
2.	Проводят три пересадки на обычной среде.
3.	Пересаживают клетки на обычную среду без цитокинина. Через 3 дня их
пересаживают на ту же среду и выращивают еще 48 ч.
4.	В стерильных условиях вносят 6-бензиладснин (конечная концентрация
1,27 мг/л) и культивируют 24 ч.
5.	Переводят клетки в обычные условия культивирования.
Б. Блокирование и разблокирование
1.	На следующий день после пересадки добавляют к суспензионным культу-
рам фтордезоксиуридин (ФДУ, простерилизованный путем фильтрации
и разведенный в среде для культивирования) до конечной концентрации
1 мкг/мл, а также 0,5 мкг/мл уридина.
2.	Культуры инкубируют в течение 24 ч.
3.	Снимают блок, промывая клетки свежей простерилизованной средой,
содержащей 2 мкг/мл тимидина.
Необходимо отмстить, что ФДУ представляет собой сильнодействующий
ингибитор цитодифференцировки, однако его действие обратимо. При
этом большое значение имеет длительность обработки. Таким образом,
в исследованиях по дифференцировке этот метод далжен использоваться
с осторожностью.
исследований, поскольку могут приводить к возникновению хромосом-
ных аберраций.
Для изучения ранних биохимических изменений в ответ на действие
регуляторов роста должны быть полностью установлены параметры
роста, как это описано в гл. 1. Как правило, культуры, индуцированные
к дифференцировке, характеризуются заметным снижением скорости
роста по сравнению с культурами, растущими на обычной среде. Однако
обычно клетки не сразу входят в состояние дифференцировки. Актив-
ность вхождения клеток в очередной цикл деления перед началом диф-
ференцировки выявляют измерением синтеза ДНК и деления клеток
(митотического индекса). Способы измерения параметров клеточного
цикла приведены в таблице 6.8.
В некоторых работах основное внимание сконцентрировано на изу-
чении синтеза специфической РНК и белков, ассоциированных с диф-
ференцировкой. Однако у большинства изученных систем после пере-
садки на обычную среду не было обнаружено заметных количествен-
ных изменений в синтезе в сравнении со средой для индукции. Не уда-
лось выявить и заметных качественных различий при электрофорезе
в полиакриламидном геле (ПААГ), содержавшем додецилсульфат
натрия, ни в активности мРНК, анализировавшейся методом трансляции
in vitro, ни в синтезе белков, измеренном путем мечения in vivo
(табл. 6.9). Появление небольшого числа специфических белков в
140
6.8.	Измерение параметров клеточного цикла
А. Приготовление образцов
Там, где требуется провести большое число измерений, образцы могут быть
зафиксированы для хранения.
1.	Определяют сырую массу образца.
2.	Проводят фиксацию в течение 24 ч в смеси этанол : ледяная уксусная
кислота (3:1, объем к объему) .
3.	Такие образцы можно хранить в 70% этаноле в течение 1 недели.
Б. Определение числа клеток
Это делается в соответствии с методом, приведенным в гл. 1, разд. 1.5.3.2.
В. Митотический индекс
I.	Готовят ацетоорсеин, добавив 5% (масса к объему) орсеина к 50% (объем
к объему) уксусной кислоте, и оставляют на 30 мин.
2.	Смесь фильтруют.
3.	Периодически проверяют краситель на наличие кристаллов и, обнаружив
их, удаляют фильтрованием.
4.	Образцы, фиксированные в смеси этанол : уксусная кислота (3 :1), поме-
щают на предметное стекло.
5.	Добавляют равное количество ацетоорсеина и оставляют примерно на
5 мин.
6.	Накрывают образец покровным стеклом и сдавливают, используя фильтро-
вальную бумагу.
7-	Под микроскопом анализируют 500-1000 ядер, отмечая стадии деления
ядер, находящихся в состоянии митоза.
8.	Обозначают митотический индекс (МИ) как процент ядер, находящихся
в состоянии митоза в данный момент времени.
9.	Кроме того, что определения степени синхронизации клеточного деления
определяют соотношение числа делящихся клеток к общему числу
клеток.
Г. Содержание ДНК и наличие трахеидных элементов
1.	Отбирают образцы, находящиеся в 70% этаноле, и последовательно про-
водят их через 50% и 30% этанол и через воду.
2.	Ткань гидролизуют в 5М НС1 в течение 1 ч при комнатной температуре.
3.	Окрашивают в реактиве Шиффа (реакция Фельгена) в течение 4 ч.
4.	Промывают материал в 1% растворе (масса к объему) метабисульфита
натрия в воде, проводя несколько частых смен раствора. С помощью
микроденситометрии в давленых препаратах определяют плоидноегь
клеток.
5.	На этом этапе некоторые образцы можно обработать 0,05М ЭДТА, pH 9,0,
в течение 15 мин, клетки переносят в виде капель иа покрытые желатином
предметные стекла, высушивают и полученные препараты используют
для: а) определения митотического индекса (как описывалось выше)
и б) выявления трахеидных элементов (видны в поляризованном свете
окаймленные поры вторичной стенки).
6.	Для определения ДНК прогревают образцы, полученные на стадии 4,
в 0,1 М NaOH в течение 8 мин при 98 °C. Этот этап необходим для удаления
красителя.
7.	Разводят краситель в амиловом спирте, по крайней мере, в два раза и
объединяют спиртовые экстракты.
8.	Дабавляют 2 капли 0,1 М НС1 и резко встряхивают до появления розовой
окраски.
9.	Удаляют помутнение, добавив 250 мкл 96% этилового спирта.
10.	Каждый образец спектофотометрируют при 554 нм.
141
11 .Содержание ДНК обозначают через ESM в расчете на эксплант или на 1 г
сырой массы.
6.9. Определение скоростей синтеза белка и нуклеиновых кислот
Скорости синтеза нуклеиновых кислот и белка можно исследовать с приме-
нением пульс-мечения in vivo. Эти эксперименты легче проводить, используя куль-
туры, растущие в жидкой среде.
А.	Основной метод
1.	Пересаживают клетки в среду для индукции.
2.	Распределяют суспензионные культуры по небольшим порциям объемом
10 мл в предварительно стерилизованные пластмассовые сосуды объемом
60 мл и культивируют, как обычно.
3.	В стерильных условиях добавляют радиоактивную метку (см. ниже) на
требуемое время, необходимое для начала пульса, и инкубируют на ка-
чалке.
4.	После окончания пульса (время известно заранее) собирают клетки путем
фильтрации и замораживают в жццком азоте перед анализом.
5.	Для оценки внеклеточной радиоактивности отбирают 200 мкл использо-
вавшейся ддя культивирования среды.
6.	Клетки ресуспендируют в стерильном растворе, содержащем 100 мМ
трис-HCl, pH 7,7 (соотношение клеток и буфера 1:1), и оттаивают при
комнатной температуре.
7-	Клетки полностью разрушают, обрабатывая ультразвуком (во льду)
при мощности 65 Вт двумя импульсами по 15 сек и промежутком между
ними в 15 сек, необходимым для охлаждения гомогената. Эффективность
разрушения клеток и ядер проверяют микроскопически.
8.	Центрифугируют в течение 5 мин при 10000 g и анализируют надосадочную
жидкость.
9.	Образец (100 мкл) капаютна диск из стекловолокна (фирмы Ватман GF/C)
для оценки общей радиоактивности.
10.	Отбирают образец (5—10 мкл) для определения белка-
11.	Отбирают образец (400 мкл), добавляют трихлоруксусную кислоту (ТХУ)
до конечной концентрации 10% и оставляют смесь во льду на 30 мин для
осаждениия белков и нуклеиновых кислот. Собирают осадок на диски
из стекловолокна и промывают 10% ТХУ.
12.	Отбирают образец (400 мкл), добавляют к нему натриевую соль ЭДТА
до конечной концентрации 1 мМ, а также ДНКазу или РНКазу и инкубиру-
ют при 38°C в течение 30 мин. Добавляют ТХУ до конечной концентрации
10% и оставляют во льду на 30 мин. Собирают осадки на диски из стекло-
волокна (см. стадию 11). Эти обработки представляют контроль при
определении эффективности мечения нуклеиновых кислот.
13.	Для получения контроля на белок отбирают образец (400 мкл) и добав-
ляют NaOH до конечной концентрации 0,5 М, а также 1 мг/мл аминокисло-
ты, используемой при мечении (в данном случае немеченой). К гидроли-
затам в качестве носителя добавляется тРНК и 20% ТХУ до конечной
концентрации не менее 10%. Осаждение и сбор на дисках из стекловолок-
на - см. стадию 11.
14.	Просчитывают на сцинтилляционном счетчике образцы, полученные на
стадиях 5, 9, 11, 12 — для нуклеиновых кислот, а на стадиях 5, 9,11, 13 —
для белков.
142
I
Б. Синтез ДНК
1.	Для пульс-мечения используют 1 —2 мкКи/мл 3 Н-тимидина.
2.	Анализ содержания ДНК можно провести после экстракции ДНК с по-
мощью методов, описанных в гл. 1.
3.	Ингибирование синтеза ДНК может быть достигнуто в присутствии 1 мкМ
5-бромдезоксиуридина или 5-фтор дезоксиуридина.
В.	Синтез РНК
В этой главе детальный анализ синтеза РНК явно ограничен, поэтому мы
рекомендуем читателю обратиться к сборникам [26, 27[-
1.	Для пульс-мечения используют 1—2 мкКи/мл 5,6-3Н-уридин или 5-3Н-
уридин.
2.	Общую РНК можно определить методом, описанным в гл. 1.
3.	Экстракция, очистка и трансляция мРНК in vitro описаны в сборниках
[28, 29J.
4.	Гель-электрофорез РНКтакже описан [30].
5.	Ингибирования синтеза РНК можно достигнуть, добавляя 20 мкг/мл акти-
номицина Д. Обработку нельзя проводить более 6 ч, так как при длитель-
ной обработке снижается жизнеспособность клеток.
Г. Синтез белка
1.	Общий белок можно определить по методу Лоури (см. гл. 1) или с приме-
нением кумасси голубого, приведенным ниже. Растворяют 100 мг ку-
масси голубого G в 5 мл 96% этанола. Добавляют 10 мл 85% (объем к
объему) фосфорной кислоты. Затем осторожно вливают, энергично пере-
мешивая раствор, 85 мл дистиллированной воды, стараясь избежать при
этом выпадения осадка голубой краски. Образовавшийся осадок фильт-
руют. Смешивают 5-50 мкл образцов (содержащих до 20 мкг белка)
с 50 мкл дистиллированной воды. Добавляют 950 мкл реактива кумасси.
Через 5 мин образовавшийся голубой раствор можно спсктрометрировать
при 595 нм.
2.	Для мечения белка in vivo используют 0,1-2,0 мкКи/мл 358-метиоиина
(с удельной радиоактивностью примерно 1000 Ки/мМ) или ,4С-лейцина
(с удельной радиоактивностью около 25 млКи/мМ). При трансляции
in virto может быть использовано до 2,5 мкКи/мкл 35 S-метионина или
20 мкКи/мкл 14 С-лсйцина. -
3.	Белки анализируют с помощью одномерного или двумерного электрофо-
реза в ПААГ [32].
4.	Ингибирование белкового синтеза обычно достигается добавлением до
400 мкг/мл циклогексимида.
зависимости от обработки регуляторами роста растений выявлено при
электрофорезе в двумерном ПААГ [33, 34]. Такие исследования, воз-
можно, иллюстрируют крайнюю тонкость процессов дифференцировки
или демонстрируют существование типов контроля, отличных от изме-
нений в экспресии генов. С другой стороны, незначительные различия
могут отражать и известные проблемы выявления флуктуаций, возни-
кающих среди небольшого числа клеток в популяции. По-видимому,
проблемы избирательной экспрессии генов лучше исследовать, ориен-
тируясь на специфические маркеры (см. разд. 6.6). Такой подход тре-
бует: а) проверки значимости маркера, т. е. наличия коррелятивных
изменений маркера и процесса развития и б) разработки специальных
143
проб (антител и комплементарной ДНК) для молекулярно-биологи-
ческих исследований. В настоящее время число методик, разработанных
для анализа биохимических маркеров, имеющих отношение к диффе-
ренциации растений, ограничено.
6. 6. БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ПРОЦЕССА ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ СОСУДОВ
В процессе дифференциации происходит регуляция синтеза специ-
фических продуктов генной экспрессии. Они могут:
а)	индуцироваться в процессе развития и, таким образом, являются
позитивными маркерами;
б)	включаться, становясь негативными маркерами;
в)	проявлять ткане- или органоспецифичность.
В данном разделе основное внимание уделено маркерам, вовлечен-
ным в формирование вторичной стенки. Необходимо отметить, что
изменения, выявленные по этим маркерам в интактном растении, не
всегда легко изучить в культуре тканей, поскольку внутри клеточной
популяции существует определенная асинхронность и (или) низкая
частота индукции.
6.6.1. ОБРАЗОВАНИЕ ВТОРИЧНОЙ СТЕНКИ
Клеточные стенки легко фракционировать на достаточно грубо
очищенные фракции пектинов, гемицеллюлоз, целлюлоз и белков
(табл. 6.10). В ходе ксилемогенеза соотношение этих фракций меняется,
что определяется остановкой синтеза пектинов и увеличением синтеза
гемицеллюлоз [35]. В более ранних работах было показано, что в куль-
турах тканей при ксилемогенезе увеличивается отношение ксилозы
к арабинозе [18]. Этот параметр можно использовать при первоначаль-
ном поиске изменений в полисахаридах клеточной стенки. И хотя во-
прос о том, каким образом синтезируются сложные полисахариды,
остается спорным, в понимании процессов синтеза менее сложных по-
лисахаридных составляющих пектиназной и гемицеллюлозной основы
достигнут определенный прогресс. Правда, еще плохо охарактеризованы
участвующие в этих синтезах ферменты. Тем не менее уже описаны
связанные с мембранами полисахаридсинтазы (табл. 6.11). Показано,
что синтез полисахаридов регулируется на уровне этих ферментов.
Пока неизвестно, как осуществляется контроль за синтезом целлюлозы
в процессе дифференциации, и адекватная система in vitro была опи-
сана лишь недавно [36]. В противоположность этому ферменты синтеза
лигнина (табл. 6.12) охарактеризованы гораздо лучше, поскольку
содержат некоторые характерные белки, связанные с клеточной
стенкой.
144
6.	10. Биохимические маркеры для дифференциации клеточной стенки:
полимеры клеточной стенки
А.	Анализ клеточных стенок
Относительно быстрые способы определения соотношений фракций полиса-
харидов и определенных специфических мономеров могут свидетельствовать
о степени дифференциации вторичной клеточной стенки.
1.	Берут известную сырую массу клеток и добавляют охлажденную во льду
смесь хлороформ: метанол (1:1, объем к объему), получив таким обра-
зом смесь состава хлороформ: метанол : вода 10:10:3. При этом пред-
полагается, что сырая масса клеток представлена лишь водой.
2.	Интенсивно встряхивают в стеклянной пробирке в течение 30 мин при
4 °C.
3.	Центрифугируют и затем экстрагируют осадок в 80% этаноле в течение
30 мин при 85 °C.
4.	Центрифу тируют и экстратируют еще два раза в 80% этаноле (с псреосаж-
дением).
5.	Берут конечный осадок и экстрагируют смесью фенол:уксусная кислота:
вода (2:1:1, масса/объем/объем), перемешивая в течение 16 ч при 30 °C.
6.	Центрифугируют, промывают нерастворимый полисахаридный материал
ацетоном и высушивают.
7.	Используют эту фракцию клеточной стенки для анализа моносахаридов,
полисахаридов и лигнина (как описано ниже).
Б. Анализ моносахаридов
Увеличение в соотношении ксилоза: арабиноза среди полисахаридов клеточ-
ных стенок может дать примерное указание на то, что дифференциация имела
место. Эти моносахариды определяют после общего кислотного гидролиза.
1.	Берут экстракт клеточной стенки и растворяют в минимальном объеме
72% (масса к массе) H2SO4. Разбавляют до 3% (масса к массе) H2SO4.
2.	Автоклавируют в течение 1 ч при 120 °C.
3.	Нейтрализуют с помощью ВаСО3 и после центрифугирования удаляют
ионы Ва2+ из надосадочной жидкости, пропуская через маленькую катио-
нообменную колонку (Н+-форма).
4.	Выпаривают досуха под вакуумом при температуре ниже 60 °C.
5.	Перерастворяют моносахариды в пиридине-
6.	Разделяют моносахариды с помощью нисходящей бумажной хроматогра-
фии, проводимой 16—24 ч, или с помощью тонкослойной хроматографии
в смеси этилацетат:пиридин:вода (8:2:1, объем к объему) с сахарами
в качестве маркеров.
7.	Идентифицируют с помощью реагента бифталата анилина. Готовят его,
растворив анилин (9,2 мл) и фталиевую кислоту (16 г) в бутаноле
(490 мл), диэтиловом эфире (490 мл) и воде (20 мл). Окраска разви-
вается в течение 5 мин при 105 °C.
8.	Элюируют пятна ксилозы и арабинозы с помощью метанола, содержащего
1 % хлорид олова. Измеряют поглощение при 375 нм.
В.	Анализ полисахаридов
Грубая фракция основных полисахаридов может в некоторой степени свиде-
тельствовать о дифференциации сосудов по увеличению количества гемицеллю-
лоз по отношению к пектину [35].
1.	Отбирают фракцию клеточной стенки (см. раздел А, стадия 6) и экстра-
гируют в кипящей воде в течение 30 мин.
2.	Центрифугируют и дважды повторяют экстракцию. Осаждают нейтральный
пектин, добавив этанол до конечной концентрации 95% (объем к объ-
ему).
145
3.	Осадок экстрагируют 0,5 % (масса к объему) оксалатом аммония в течение
30 мин при 100°C. Центрифугируют и дважды повторяют экстракцию.
Осаждают кислые пектины, добавив этанол до конечной концентрации
70% (объем к объему).
4.	Осадок промывают водой и экстрагируют фракцию гемицеллюлоз дегази-
рованным 17% NaOH (масса к объему), содержащим 4% (масса к объему)
Н3ВО3, в течение 16 ч при 20 °C под вакуумом. Центрифугируют, нейтра-
лизуют и диализуют надосадочную жидкость. Фракцию гемицеллюлоз
выделяют осаждением в 80% этаноле (конечная концентрация).
5.	Конечный осадок промывают водой. Он и представляет собой фракцию
гемицеллюлоз.
6.	Каждую фракцию лиофилизируют и взвешивают.
7.	Проводят анализ моносахаридов в каждой фракции после общего кислот-
ного гидролиза (см. раздел Б).
Г. Анализ лигнина
1.	Отбирают материал клеточной стенки (получение см. раздел Л, стадия 6).
2.	Экстрагируют около 30 мг материала в 1 мл 8% (масса к объему) NaOH,
содержащего 60 мкл нитробензола. Прогревают под давлением при 160±
± 5 °C в течение 2,5 ч в специальном сосуде из нержавеющей стали, приспо-
собленном к работам под давлением.
3.	Разделяют образующиеся в результате ванилин, сиреневый альдегид и
n-оксибензальдегид с помощью нисходящей бумажной хроматографии
в течение 22 ч или путем тонкослойной хроматографии в целлюлозе, ис-
пользуя смесь бутанол:аммиак (относительная плотность 0,88) ;Н2О
(4:1:5, объем к объему).
4.	Разделенные пятна и маркеры выявляются с помощью 2% (масса к объе-
му) 2,6-дихлорхинонхлоримвда, растворенного в хлороформе с последую-
щей экспозицией хроматограммы в парах аммония над 2 М NH4OH.
5.	Пятна элюируют с помощью 0,2% КОН в этаноле и измеряют поглощение
при 298 нм.
6.11. Биохимические маркеры для дифференциации клеток растений:
ферменты синтеза полисахарццов
А.	Приготовление грубых осадков мембран
1.	Гомогенизируют клетки (5 г) в 5 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера,
pH 7,2, содержащего 1 мМ дигиотреитола, 10 мМ MgCl2 и 0,4 М сахарозы,
при 4 ° С.
2.	Центрифугируют в течение 20 мин прн 1000 g. Осадок отбрасывают.
3.	Центрифугируют в течение 1 ч прн 200000 g.
4.	Осадок ресуспендируют в буфере для гомогенизации (для некоторых фер-
ментов это может потребовать добавления еще 10 мМ МпС12 — см. соответ-
ствующую литературу). Концентрация белка должна быть примерно
5 мг/мл.
Б. Ферментные инкубационные смеси
Перечисленные ниже ферменты могут быть испытаны при 26 °C путем инку-
бации 25 мкл грубой фракции мембран с соответствующим субстратом в конеч-
ном объеме 30 мкл.
1.	Арабинансинтаза [17, 20, 40]. Субстрат: УДФ-Ь-’4С-арабиноза (100000
распадов в минуту) * плюс около 5 нМ нерадиоактивной УДФ-арабинозы**.
2.	Полигалактуронансинтаза [37]. Субстрат: УДФ-D-L-3Н-галактуроновая
кислота*3 (440000 распадов в минуту) плюс 5 нМ нсрадиоактивной УДФ-
галактуроновой кислоты*4.
146
3.	Ксилоглюкансинтаза [39]. Субстраты: УДФ-D-14 С-ксилоза * ** (17600 рас-
падов в минуту) с добавлением или без добавления 10 нМ нсрадиоактив-
ной УДФ-глюкозы*4. Синтез ксилоглюкана служит количественной оцен-
кой включения, стимулируемого в присутствии УДФ-глюкозы.
4.	Ксилансинтаза [17, 20, 40]. Субстрат: УДФ-D-14С-ксилоза* (100000 рас-
падов в минуту) плюс около 10 нМ УДФ-П-14С-ксилозы*4.
5.	/3--Глюкансинтаза [19[. Субстрат: УДФ-D-(У-14С)-глюкоза*5 (100000
распадов в минуту) плюс около 40 нМ УДФ-глюкозы.
В.	Остановка реакции
1.	После инкубации (в течение 10—30 мин) останавливают реакции, добав-
ляя 200 мкл смеси хлороформ:метанол (1:1, объем к объему) и оставляют
на 1 ч при 4 °C для экстракции меченых липидов.
2.	Смесь центрифугируют, осадок промывают или а) 85% этанолом (объем
к объему) для арабинана, или б) 70% этанолом для гемицеллюлозы и
/?-(1->3)-глюкана, или в) 50% этанолом для полигалактуроновой кислоты,
до полной отмывки свободной радиоактивности.
3.	Определяют включение радиоактивности в осадок с помощью сцинтилля-
ционного рчстчнка.
Г. Характеристика продуктов
Должна быть выполнена определенная предварительная характеристика про-
дуктов. Детали в этой главе не приведены, однако полезно отмстить следующее.
1.	Чтобы показать, что радиоактивность включена в полимерный материал,
ресуспендированный осадок диализуют.
2.	Проводят общий кислотный гидролиз и анализируют радиоактивные
моносахариды (см. табл. 10, Б), чтобы убедиться в отсутствии возможной
эпимеризации. Это важно для учета возможных взаимопревращений ара-
бинозы в ксилозу [171 и галактуроновой кислоты в глюкуроновую [37].
Данные радиоактивного включения могут понадобиться для того, чтобы
количественно просчитать подобные взаимопревращения.
3.	Включение радиоактивной глюкозы в (1-»4)- и в (1-»3)-глюкан можно
различить с помощью перйодатного окисления. Отбирают радиоактивные
полимеры, смешивают с 1 мл 0,05 М йодата натрия и проводят реакцию
в течение примерно 6 дней. Удаляют излишки йодата, добавив 100 мкл
этиленгликоля, и проводят восстановление образцов, добавив сухой
NaBH4. К образцам добавляют 72% H,SO„ (масса к массе) До конечной
концентрации 3% (масса к массе) и проводят гидролиз. Анализ осуществ-
ляется, как в таблице 10, Б, с использованием в качестве маркеров «лю-
козы и эритриол /3-(1->-4)-глюкана. Проверяют, не переходит ли больше
радиоактивность во фракцию эритриола при более длительной инкубации.
* Получена от фирмы NEN, ФРГ.
** Приготовлена в лаборатории с использованием ферментов, выделенных
из золотистой фасоли [17].
*3 Радиоактивный сахар получен от фирмы Amersham International, Англия.
Субстрат приготовлен в лаборатории с использованием ферментов, выделенных
из золотистой фасоли [17].
*4 Получено от фирмы Sigma, Poole, Англия.
*5 Получено от фирмКЕК и Amersham International.
6.12. Биохимические маркеры для дифференциации клеток растений:
ферменты синтеза лигнина
1. Гомогенизируют клетки в 0,1 М трис-буфере, pH 7,8, содержащем 1 мМ
2-меркаптоэтанол (1 г клеток/мл), и центрифугируют в течение 10 мин
147
при 10000 g. В таких грубых экстрактах могут быть испытаны следующие
ферменты.
2.	Фенилаланинаммонийлиаза (ФАЛ). Инкубируют 50 мкл экстракта с
а) 950 мкл L-фенилаланина в концентрации 10 мМ и б) 950 мкл D-фенил-
аланина в концентрации 10 мМ, в обоих случаях в 0,1 М трис-НС1, pH 8,8.
Используя пробирку с D-фенилаланином в качестве контроля, измеряют
поглощение при 290 нм в пробирке с L-фенилаланином через 5 мин после
начала реакции. Затем через 35 и 65 мин после инкубации при 40 ° С по-
вторно измеряют поглощение. Коэффициент молярного поглощения
коричной кислоты составляет 10000 при 290 нм.
3.	КоА-лигаза 4-оксикоричной кислоты. Инкубируют 0,5 мл экстракта с
30% глицерином (объем к объему), 0,5 мМ 4-оксикоричной кислоты,
1,5 мМ АТФ, 3,5 мМ MgCl2, 1,5 мг бычьего сывороточного альбумина и
0,15 мМ коэнзима А (конечный объем 1 мл). Образование сложного
эфира определяют по увеличению поглощения при 333 нм. Коэффициент
молярного поглощения продукта (4-кумароил КоА) составляет 21000
при этой длине волны.
4.	О-Метилтрансфераза кофеиновой кислоты. Инкубируют 200 мкл фермента
с 0,3 мкМ кофеиновой кислоты, 0,2 мкМ MgCl2, 30 мкМ аскорбиновой
кислотыи S-аденозил-(метил-14С)-метионином*(0,1 мкМ, 110000распадов
в минуту). Общий объем смеси составляет 300 мкл, а режим инкубации -
30 мин при 30°C. Реакцию останавливают с помощью 30 мкл 4 М HCL
Реакционную смесь распределяют на две части с помощью 500 мкл этилапе-
тата. Объединяют органические экстракты и разделяют меченый продукт
(феруловая кислота) с помощью тонкослойной хроматографии в сили-
кагеле G, нанесенном на у. ф. 254 тонкослойные пластины (фирма Camlab),
в смеси толуол:этиловый эфир муравьиной кислоты:муравьиная кислота
(7:2:1). Измеряют включение радиоактивной метки в ферулат.
5-	Пероксидаза. Инкубируют примерно 0,5 мл фермента с 13 мМ гваякола,
5 мМ Н2О2 и 40 мМ трис-малеатного буфера, pH 7,0. Общий объем смеси
3 мл. После добавления Н2О2 измеряют изменение поглощения при
470 нм.
* Производитель - фирма Amersham International, Англия.
6.6.1.1. Ферменты синтеза полисахаридов
1. Синтазы, участвующие в формировании пектина. Синтез пектина
возрастает во время деления и роста клеток и прекращается в начале
процесса дифференциации и поэтому может служить негативным марке-
ром. Препараты мембран, выделенных из клеток платана и золотистой
фасоли, могут включать галактуроновую кислоту из радиоактивно
меченной УДФ-галактуроновой кислоты в связанную в а- (1 ->4) -поло-
жениях полигалактуроновую кислоту. В одной из работ показано, что
при ксилемогенезе камбия платана теряется активность этого фермента
[37]. Исследовался также синтез арабинана в культуре тканей. При
этом также было отмечено исчезновение ферментативной активности
в начале процесса дифференциации [38].
2. Синтазы, участвующие в образовании гемицеллюлоз. Для некото-
рых двудольных растений ксилоглюкан является основным типом
гемицеллюлоз первичной клеточной стенки, Тогда как ксилан и глюку-
148
роноксилан откладываются во время вторичного утолщения. Показано,
что синтез ксилоглюкана осуществляется в препаратах мембран гороха
[39], однако в клеточных культурах детальный анализ регуляции этого
предполагаемого негативного маркера не был выполнен.
Для кукурузы, платана и фасоли были получены препараты мем-
бран, способные включать ксилозу из радиоактивно меченной УДФ-
глюкозы в 4)-ксилан. Регуляцию этого процесса исследовали доста-
точно детально на уровне ферментативной активности, однако сам
положительный маркер очищен не был [17, 40]. Недавно появилось
сообщение о выделении из гороха очищенного препарата, способного
синтезировать глюкуроноксилан, что, возможно, окажется маркером
для культур тканей [41].
6.6.1.2.	Белки клеточной стенки
1.	Связанные со стенкой пероксидазы. Пероксидазы принимают
участие в полимеризации предшественников лигнина. Общая активность
пероксидазы часто не коррелирует с процессом лигнификации в ходе
ксилемогенеза, однако в некоторых случаях отдельные изоферменты,
связанные с клеточной стенкой, проявляют высокую степень корреля-
ции [9, 42], что необходимо исследовать в дальнейшем.
2.	Белки, обогащенные оксипролином. Эти белки, также связанные
с клеточной стенкой, представляют определенный интерес для детально-
го исследования. До сих пор не обнаружено определенной корреляции
между их синтезом и дифференцировкой, хотя выявлено заметное
накопление белков клеточной стенки этой группы в ответ на старение,
нанесение раны или инфекцию.
6.6.1.3.	Ферменты, необходимые для синтеза лигнина
Синтез лигнина — это, по-видимому, в настоящее время наиболее
часто используемый биохимический маркер дифференциации, поскольку
лигнин относительно легко обнаруживается, а большинство ферментов,
участвующих в синтезе его предшественников, хорошо охарактеризо-
ваны на белковом уровне. Для части таких ферментов получены антите-
ла и пробы кДНК. Недавно они были использованы для анализа кратко-
временного увеличения транскрипционной и трансляционной актив-
ностей, вызванного различными стимулами. Однако до сих пор среди
этих стимулов не использованы регуляторы роста растений.
1.	Фенилаланинаммонийлиаза. Это первый фермент на пути мета-
болизма фенилпропаноидов, ведущего к синтезу лигнина и видоспеци-
фических флавоноидов и изофлавоноидов. Это наиболее изученный
фермент вторичного метаболизма, которому было посвящено много
обзоров (например, [43]). ФАЛ можно легко анализировать (см.
149
табл. 6.12) и индуцировать в культивируемых клетках путем изменения
концентраций регуляторов роста в питательной среде [17, 19-22, 24].
Сообщение о выделении и характеристике клонов к ДНК ФАЛ [44], ве-
роятно, открывает возможности изучения механизма его экспрессии,
роли в процессе дифференциации. Не исключено, что это может оказать-
ся семейство, состоящее из нескольких генов.
2.	4-Кумарат-КоА-лигаза. 4-Кумарат, ферулат и синапат до восста-
новления их спиртовых производных и включения в лигнин превраща-
ются в соответствующие им КоА-тиоловые сложные эфиры. В резуль-
тате исследования 4-кумарат-КоА-лигазы было показано, что, по крайней
мере, одна из нескольких форм этого фермента может, видимо, оказать-
ся специфичной для синтеза лигнина [45]. Получен клон к ДНК и изучена
Экспрессия соответствующего гена, но не в ответ на факторы, стимули-
рующие дифференциацию. У некоторых видов при замораживании
фермент терял стабильность.
3.	КуМарат-3-гидроксилаза. Этот фермент обычно исследуют как
фенолазу низкой специфичности. Возникают сомнения относительно
функции фермента in vivo [46].
4.	О-Метилтрансфераза кофеиновой кислоты. Изменения активности
этого фермента коррелировали с ксилемогенезом у фасоли [19] и табака
[22], но не у Zinnia [9]. В препаратах частично очищенного фермента
активность охарактеризована хорошо, однако его молекулярно-био-
логический анализ еще не разработан.
5.	Циннамоил-КоА: НАДФН-оксидоредуктаза и циннамиловый
спирт: НАДФН-оксидоредуктаза. Для культур тканей сои было показано,
что изменения активностей этих ферментов коррелировали с синтезом
лигнина [45].
6.6.1.4.	Ферменты/белки, характерные для процесса формирования
флоэмы
Флоэма частично может быть сформирована в среде для ксилемо-
генеза, однако усиленному ее образованию способствует более высокая
концентрация сахарозы. Можно использовать некоторые маркеры,
описанные в разделе 6.6.1.1, хотя существуют дополнительные маркеры,
специфичные для флоэмы.
1.	&-(1-*3)-Глюкансинтаза. Каллоза — это составная часть ситовид-
ных пластинок сосудов флоэмы Было показано, что активность кал-
лоэосинтазы коррелировала в каллусной ткани фасоли с образованием
сосудов флоэмы [19], хотя возникают сомнения в том, можно ли изоли-
ровать эту ферментную систему саму по себе или она представляет
собой модифицированную или перестроенную активность /3-(1~>4)-
глюк ансинтазы.
2.	Ф-Белок. Флоэмоспецифичные, или Ф-белки, интенсивно исследо-
вали у представителей семейства тыквенных, где они скапливаются в
больших количествах в выделениях, образующихся на местах пора-
150
нения. Обнаружено два основных белка, легко агрегирующих при окис-
лительном поперечном сшивании. Обработка иодацетамидом препятст-
вует этому и позволяет отделить нитевидный белок молекулярной
массой 80000 Да от N-ацетилглюкозаминспецифичного лектина моле-
кулярной массой 26000 Да [47]. Получены антитела, специфичные к
этим белкам, и поскольку огурцы можно культивировать и регенери-
ровать из каллусной ткани в целые растения, мы имеем систему, полез-
ную для исследования регуляции синтеза Ф-белков.
6.7.	ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Цель данной главы заключалась в суммировании типов систем
и основных методов, используемых для изучения различных аспектов
дифференциации сосудов в культурах тканей. Синтез продуктов вто-
ричного метаболизма растений также можно рассматривать как состав-
ную вдеть процесса дифференциации. Например, система Petunia (ко-
торая обладает хорошо охарактеризованными мутантами) [48] может
быть использована для исследования включения процесса метаболизма
фенилпропаноидов, начиная от синтеза хромогенных продуктов в
питательной среде и кончая синтезом лигнина в среде для индукции.
В тех случаях, где синтезируются особые тканеспецифические продукты,
например при синтезе жиров в культурах тканей пальмы или винограда
или при синтезе продуктов вторичного метаболизма в культурах тка-
ней нескольких видов растений (см. гл. 7), в качестве предварительного
условия может потребоваться клеточная дифференциация.
Для изучения морфогенеза в последнее время все чаще применяются
иммунохимические и молекулярно-биологические методы. Для не-
скольких белков, индуцируемых в процессе дифференциации, получены
поликлональные антитела, а для связанных с мембранами белков [38]
и рецепторов [49], не вьщеляемых обычными методами, получены
моноклональные антитела. Можно также получить и специфические
кДНК, которые обеспечивают адекватную проверку различных стадий
процесса дифференциации и с помощью которых можно изучать самые
ранние события в экспрессии генов, а также идентифицировать регуля-
торные последовательности и последовательности, кодирующие белки.
Для некоторых белков, например для фенилаланинаммонийлиазы,
подобные исследования уже проводятся. В дальнейшем предполагается,
что большая часть информации об экспрессии генов в процессе морфо-
генеза будет получена с помощью экспериментов по трансформации
чужеродных генов, встроенных в соответствующие векторы.
ЛИТЕРАТУРА
1.	Evans, D. A. and Gamborg, О. L. (1982) Plant Cell Rep., 1,104.
2.	Roberts, L. W. (1976) Cytodifferentiation in plants. Xylogenesis as a Model
System, published by Cambridge University Press, Cambridge, New York and Melbourne.
151
3.	Phillips, R. (1980) in Perspectives in Plant Tissue Culture, Vasil, I. K. and Mur-
phy, D. G. (eds.). In Rev. Cytol., Academic Press, New York.
4.	Dodds, J. H. and Roberts, L. W. (1982) Experiments in Plant Tissue Culture,
published by Cambridge University Press, Cambridge, New York and Melbourne.
5.	Fukuda, H. and Komamine, A. (1980) Plant Physiol., 65, 57.
6.	Dodds, J. H. (1980) Z. Pflanzenphysiol., 99, 283.
7.	Fukuda, H. and Komamine, A. (1981) Plant Cell Physiol., 22, 41.
8.	Fukuda, H. and Komamine, A. (1980) Plant Physiol., 65, 61.
9.	Fukuda, H. and Komamine, A. (1982) Planta, 155, 423.
10.	Dalessandro, G. and Northcote, D. H. (1977) Phytochemistry, 16, 853.
11.	Miller, A. R. and Roberts, L. W. (1984)2. Exp. Bot., 154, 691.
12.	Phillips, R. and Dodds, J. H. (1977) Planta, 135, 207.
13.	Simpson, S. F. and Torrey, J. G. (1977) Plant Physiol, 59,4.
14.	Phillips, R. and Torrey, J. G. (1973) Dev. Biol., 31, 336.
15.	Shininger, T. L. (1975) Dev. Biol, 45,137.
16.	Minocha, S. C. and Halperin, W. (1976) Can. J. Bot., 54, 79.
17.	Bolwell, G. P. and Northcote, D. H. (1981)Planta, 152, 225.
18.	Jeffs, R. A. and Northcote, D. H. (1966) Biochem. J., 101, 146.
19.	Haddon, L. E. and Northcote, D. H. (1975)7. Cell. Sci., 17, 11.
20..	Bolwell, G. P. and Northcote, D. H. (1983) Biochem J., 210,509.
21.	Jones, D. H. and Northcote, D. H. (1981) Eur. J. Biochem., 116, 117.
22.	Kuboi, T. and Yamada, Y. (1978) Biochim. Biophys. Acta, 542, 181.
23.	Meins, F. (1982) Molecular Biology of Plant Tumors, Kahl, G. and Schell, J. S.
(eds.), Academic Press, New York, p. 3.
24.	Bevan, M. W. and Northcote, D. H. (1979)7. Cell. Sci., 39, 339.
25.	Hanke, D. (1984) Nature, 310,272.
26.	Hames, B. D. and Higgins, S. J., eds. (1984) Transcription and Translation
A Practical Approach, published by IRL Press, Oxford and Washington, D. C.
27.	Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. (1982) Gel Electrophoresis of Nucleic
Acids — A Practical Approach, published by IRL Press, Oxford and Washington, D. C.
28.	Clemens, M. J. (1984) in Transcription and Translation — A Practical Approach,
Hames, B. D. and Higgins. S. J. (eds), IRL Press, Oxford and Washington, D. C. p. 211.
29.	Clemens, M. J. (1984) in Transcription and Translation — A Practical Approach,
Hames, B. D. and Higgins, S. J. (eds.), IRL Press, Oxford and Washington, D. C. p. 231.
30.	Grierson, D. (1982) in Gel Electrophoresis of Nucleic Acids - A Practical
Approach, Rickwood, D. and Hames, B. D. (eds.), IRL Press, Oxford and Washing-
ton, D. C. p. 1.
31.	Hames, B. D. (1981) in Gel Electrophoresis of Proteins — A Practical Approach,
Hames, B. D. and Rickwood, R. (eds.), IRL Press, Oxford and Washington, D. C., p. 1.
32.	Sinclair, J. and Rickwood, D. (1981) in Gel Electrophoresis of Proteins — A
Practical Approach, Hames, B. D. and Rickwood, R. (eds.), IRL Press, Oxford and Wa-
shington, D. C., p. 189.
33.	Bevan, M. W. and Northcote, D. H. (1981) Planta, 152, 32.
34.	Sung, Z. R. and Okimoto, R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3683.
35.	Northcote, D. H. (1972) Annu. Rev. Plant Physiol., 23,113.
36.	Callaghan, T. and Benziman, M. (1984) Nature, 311, 165.
37.	Bolwell, G. P., Dalessandro, G. and Northcote, D. H. (1984) Phytochemistry,
in press.
38.	Bolwell, G. P. and Northcote, D. H. (1984) Planta, 162, 139.
39.	Ray, P. M. (1980) Biochim. Biophys. Acta, 629,431.
40.	Bolwell, G. P. and Northcote, D. H. (1983) Biochem. J., 210, 497.
41.	Waldron, K. W. and Brett, С. T. (1984) Reported in Abstracts of the 6th John
Innes Symposium, Norwich, UK.
42.	Imberty, A., Goldberg, R. and Catesson, A. M. (1984) Plant Sci. Lett., in press.
4 3. Jones, D. H. (1984) Phytochemistry, 23, 1349.
152
44.	Edwards, К., Schuch, W., Bolwell, G. P., Dixon, R. A. Cramer, C. L. and
Lamb, C. J. (1984) Reported in Abstracts of the 22nd Harden Conference of the Bio-
chemical Society, Wye, UK.
45.	Ebel, J., Hahlbrock, K. and Grisebach, H. (1979) Annu. Rev. Plant Physiol.,
30, 105.
46.	Bolwell, G. P. and Butt, V S (1983) Phytochemistry, 22, 37.
47.	Read, S. M. and Northcote, D. H. (1983) Fur. J. Biochem., 134,561.
48.	Ranjeva, F., Boudet, A. M., Harada, H. and Marigo,G. (1975) Biochim. Biophys.
Acta, 399, 23.
49.	Jacobs, M. and Gilbert, S. F. (1983) Science (Wash), 220,1297.
7.	ОБРАЗОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА
В СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК
П. МОРРИС. А. X. СКРАГГ, Н. ДЖ. СМАРТ, А СТАФФОРД
7.1.	ВВЕДЕНИЕ
Растения с давних времен использовали не только в качестве источ-
ника питания, но и как поставщиков широкого набора химических
соединений, включая лекарственные препараты, инсектициды, пище-
вые добавки, отдушки и красители. Даже в настоящее время при успеш-
ном развитии микробиологических и химических способов производства
растения еще остаются источником тех соединений, производство ко-
торых или слишком сложно, или дорого. Чаще всего основной интерес
представляют продукты вторичного метаболизма растений. За послед-
ние тридцать лет на химически стандартных средах культивировали
множество различных видов растений, и в этих культурах обнаружены
многие продукты вторичного метаболизма, представляющие практи-
ческий интерес [1,2].
Развитию культуры клеток растений в качестве альтернативного
источника продуктов вторичного метаболизма способствовали опре-
деленные преимущества этого способа, включая независимость от се-
зонных условий, болезней и их переносчиков, и возможность получать
требуемый продукт, обладающий стандартными качественными харак-
теристиками, в необходимых количествах, вне зависимости от поли-
тических ограничений. Килограмм такого продукта оценивается в 250 —
1500 долларов, и поэтому ясно, что для рентабельности процесса куль-
тивирования клеток растений выход продукта должен быть высоким.
Культуры клеток растений продуцируют вторичные метаболиты в вы-
соких концентрациях [3], однако до сих пор эти вещества обладали
лишь ограниченной практической ценностью.
Для синтеза продуктов вторичного метаболизма используют два
основных подхода: во-первых, быстрый рост суспензионных культур
в больших объемах, из которых в результате дальнейшего культиви-
рования получают вторичные метаболиты, и, во-вторых, выращива-
ние предварительно иммобилизованных клеток и длительное их исполь-
зование для синтеза продуктов вторичного метаболизма. В данной главе
мы попытаемся осветить эти подходы и стратегии, используемые для
их реализации.
7.2.	СТРАТЕГИЯ ПОДДЕРЖАНИЯ СИНТЕЗА ПРОДУКТОВ ВТОРИЧНОГО
МЕТАБОЛИЗМА
Быстрорастущие суспензионные культуры клеток растений, под-
держиваемые с помощью регулярных пересадок на той же среде, в ре-
154
зультате неосознанного, но постоянного отбора сохраняют такие клетки
из первоначально гетерогенной популяции, которые обладают более
высокой скоростью роста.
Эти культуры, как показало микроскопическое изучение, на пер-
вых стадиях культурального цикла в основном состоят из мелких
клеток меристемного типа. В культурах Cataranthus roseus такие клетки
обладают яйцевидной формой, густой цитоплазмой и содержат большое
число мелких зерен крахмала. При окрашивании ядер видно, что в
культурах содержится много митотически активных клеток.
По некоторым данным, в быстрорастущих недифференцированных
клеточных культурах во многих случаях не происходит синтез про-
дуктов вторичного метаболизма, типичный для интактного растения,
и для его осуществления требуется определенная морфологическая
или биохимическая дифференциация и последующий медленный рост.
С подобным предположением можно согласиться, если учесть, что в
некоторых растениях существуют высокоспециализированные участки,
используемые для накопления продуктов вторичного метаболизма
(например, млечники у Papaver somniferum, нектарники у Mentha pipe-
rita), однако его нельзя принимать за общее правило, поскольку упо-
мянутые специализированные участки могут служить лишь местом на-
копления, а не синтеза продуктов.
Уделяя серьезное внимание проблеме влияния состава среды и
внешних условий культивирования на эффективность синтеза вторич-
ных метаболитов, можно подобрать среду, которая обеспечит как рост
культуры, так и образование продуктов вторичного метаболизма. Успех
в достижении этой цели скорее всего зависит от разумного анализа
опубликованных сведений, упорного труда и некоторого везения.
Однако в качестве первого шага было бы легче подобрать среду,
обеспечивающую синтез вторичных метаболитов при плохом росте
культуры. В этом случае можно разработать двухзтапный режим куль-
тивирования, при котором на первом этапе клетки, предназначенные
для пересадки, выращивают при большой плотности на стандартной
среде для культивирования, а на втором — их пересаживают на „про-
дуцирующую” среду, после чего метаболизм клеток сдвигается в сто-
рону синтеза продуктов вторичного метаболизма. После соответствую-
щего времени культивирования в такой среде клетки и, если это необ-
ходимо, используемую среду собирают, экстрагируют и анализируют
на наличие вторичных метаболитов.
Ниже описаны двухстадийная и одностадийная системы культи-
вирования, используемые для индукции синтеза серпентина у С. roseus
(см. разд. 7.2.3, 7.2.4). Серпентин и неродственные ему алкалоиды,
образующиеся в различных видах растений, часто оказываются отно-
сительно стабильными продуктами, не испаряющимися при комнат-
ной температуре. Однако изучаемые вторичные метаболиты не всегда
удобны для исследовательской работы, и поэтому при разработке со-
155
ответствуюгцей системы культивирования необходимо предусмотреть
возможные химические свойства этих метаболитов. Например, эфир-
ные масла (монотерпеноиды) часто оказываются высоколетучими.
Другие продукты подвержены быстрому окислению и поэтому их мож-
но потерять, если при отборе не создать специальные условия, препят-
ствующие окислению. Использование двухфазных систем для отбора
липофильных продуктов вторичного метаболизма см. [4].
7.2.1.	ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, ПОДДЕРЖИВАЮЩИЕ СИНТЕЗ ПРОДУКТОВ
ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА
Для определения состава среды для культивирования, способствую-
щей синтезу вторичных метаболитов, нет общих правил. Составы сред,
„индуцирующих” метаболиты у двух разных видов растений, приведе-
ны в таблице 7.1. По-видимому, состав сред можно улучшить, изменяя
гормональные и минеральные компоненты.
Решающим фактором для индукции синтеза серпентина является
состав фитогормонов, где 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д)
замещается индолилуксусной кислотой (ИУК). Образование шиконина
увеличивается при повышении концентрации нитрата кальция и суль-
фата натрия и удалении органических добавок и кинетина, т. е. при бо-
лее сложном перестраивании метаболизма, зависящем от наличия пита-
тельных веществ.
7.1. Среды для выращивания и продуцирующая среда, необходимые для
синтеза продуктов вторичного метаболизма
А. Синтез серпентина в суспензионных культурах Catharanthus roseus [7]
Среда для выращивания
сухая масса серпентина, % = О
Гамборга В5*
Сахароза 2 %
2,4-Д 1 мг/л
Кинетин 0,1 мг/л
Продуцирующая среда
сухая масса серпентина, % = 0,33
МС*
Сахароза 5 %
ИУК 1 мг/л
БАП 0,1 мг/л
Б. Синтез шиконина у Lithospermum erythrorhison [9]
Среда для выращивания	Продуцирующая среда
сухая масса шиконина, % = 2,1	сухая масса шиконина, % = 12,1
мг/л		мг/л
Ca(NO3)2 -4Н2О	300	694
KNO3	80	80
NaH2PO4  2Н3О	21	19
КС1	65	65
MgSO„ • 7H3O	750	750
Na2 SO4	200	1480
MnSO„ • 2H3O	5	—
156
Продолжение табл. 7.1
И. Синтез шиконина у Lithospermum erythrorhison [9]
ZnSO4 -7Н2О	3	3
Fe2(SO„)3	2,5	—
NaFe-ЭДТА	—	1,8
Н3ВО3	1,5	4,5
KI	0,75	—
CuSO„-5Н2О	0,01	0,3
МоО3	0,001	—
Сахароза	20000	30000
Глицин	3	—
Никотиновая кислота	0,5	—
Тиамин-НС1	0,1	—
Пиридоксин-НС1	0,1	—
ИУК	1,75	1,75
Кинетин	2,15	—
* См. гл. 1, табл. 1.3.
Эффективность новой среды для повышения синтеза продукта
достаточно легко оценить, используя метод, описанный для двухста-
дийного процесса в разделе 7.2.3. Состав среды для синтеза вторичных
метаболитов потребует изменения многих компонентов среды для
выращивания, которые для удобства условно подразделяют на мине-
ральные, органические, гормональные и источники углеводов. Значи-
мость этих компонентов кратко описана ниже. Для более детального
описания пользуйтесь обзором [5].
7.2.1.1.	Гормоны
Тип и концентрация гормонов, используемых для культивирова-
ния клеток, видимо, наиболее важный фактор, действующий на спо-
собность синтезировать продукты вторичного метаболизма. Например,
2,4-Д — зто синтетический ауксин, включаемый в состав многих сред
для культивирования тканей растений. Во многих системах он спосо-
бен стимулировать как деление, так и растяжение клеток. Однако он
также может вызывать резкое подавление синтеза продуктов вторич-
ного метаболизма [6, 7]. Одним из основных факторов, вызывавших
примерно до 1970 г. низкий выход продуктов в клеточных культурах,
видимо, было повсеместное использование 2,4-Д.
Классически в качестве ростовых веществ для клеток растений
в культуре обычно используют два типа соединений: ауксины и ци-
токинины. Для оптимального действия на синтез продуктов вторич-
ного метаболизма необходимо проверить различные вариации концент-
раций и соотношений гормонов.
157
7.2.1.2.	Минеральный состав
В минеральном составе сред для культивирования, обычно состоя-
щем из 15 различных типов солей, по степени влияния на синтез вторич-
ных метаболитов наибольшего внимания заслуживают источник азота
и его концентрация, а также содержание фосфатов. Азот вводят в
форме нитратов, солей аммония или как органический компонент типа
мочевины, аминокислот гидролизата казеина. Ограничение в содержа-
нии азота или фосфата в среде для культивирования приводит к подав-
лению роста, а в некоторых системах — к увеличению синтеза продук-
тов вторичного метаболизма.
7.2.1.3.	Другие факторы
В качестве источника углерода во многих системах глюкоза и са-
хароза усваиваются одинаково хорошо. Увеличение концентрации са-
хара с 1 — 2%, обычно используемых в среде для выращивания, до 5 —
10% может вызвать повышение выхода продуктов вторичного мета-
болизма, например накопление индоловых алкалоидов у С. roseus [7].
Другим фактором, на который часто не обращают внимание, яв-
ляется стресс, например изменения осмотического давления, темпе-
ратуры, величины pH, а также действие токсинов и вирусных инфек-
ций. Все эти факторы меняют спектры белков клеток.
Органические добавки, по видимому, не играют важной регулятор-
ной роли, хотя действие различных индивидуальных компонентов, та-
ких, как никотиновая кислота или мезоинозит, необходимо учитывать
при „тонком доведении” продуцирующей среды.
Буферная емкость сред очень низкая, поэтому величина исход-
ного pH 5 — 6 при культивировании может сдвигаться на несколько
единиц, если не добавлять биологические буферы типа N-2-оксиэтилпи-
перазин-N*-2-этансульфоновой кислоты (гепес) или 2-(N-морфолино) -
этансульфоновой кислоты (МЕС) (примерно около 100 мМ). Добавки
неопределенного состава, такие, как гидролизат казеина и кокосовое
молоко, также могут оказывать буферное действие. На биосинтетиче-
ские свойства и способность к накоплению продукта в культивируемых
клетках, по-видимому, оказывают сильное влияние значительные изме-
нения во внешнем pH, поэтому необходимо эффективно использовать
агенты, оказывающие буферное действие, и добавлять их в продуцирую-
щие среды. Влияние pH на синтез продуктов вторичного метаболизма и
их выход в среду для культивирования изучено недостаточно.
7.2.2.	УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
После того как вам удалось подобрать среду для культивирования,
способствующую синтезу продуктов вторичного метаболизма, можно
158
попытаться еще повысить выход продуктов, манипулируя внешними
условиями культивирования. Для многих систем важны как интен-
сивность света, так и длина волны. Например, биосинтезу флавонои-
дов и антоцианов способствует интенсивное продолжительное осве-
щение, в других случаях более эффективно выращивание культур в
темноте. Увеличив способность к фотосинтезу или степень позеленения
культуры, также можно повысить в культивируемых клетках синтез
продуктов или их разнообразие.
На образование продуктов могут влиять скорость качания колб
и состав газов. Газовый состав в колбах объемом 250 мл в определен-
ной степени регулируют, заменяя пробки сосуда, например вместо
крышки из алюминиевой фольги используют неадсорбирующую вату
или резиновую пробку. Кроме того, колбы можно инкубировать в кли-
матических камерах с различными составами газов.
Наконец, на скорость роста и накопление продуктов могут влиять
изменения температуры в пределах от 15 до 35 °C. Для этих двух па-
раметров температурный оптимум не всегда одинаков. Факторы внеш-
ней среды в некоторых случаях способны приводить к индукции син-
теза продуктов вторичного метаболизма, а не просто к повышению
их выхода. Таким образом, максимальный выход продукта в соответ-
ствующих культурах клеток достигается правильным сочетанием соста-
ва среды и внешних условий.
7.2.3.	ДВУХСТАДИЙНАЯ СИСТЕМА ПОЛУЧЕНИЯ СЕРПЕНТИНА
В СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУРАХ С. ROSEUS
Культуры, описанные в этом и последующем разделах (7.2.3 и
7.2.4), инкубированы при 25 °C, на круговой качалке 150 об/мин с оп-
тимальной интенсивностью света 5 Вт • м3, достигаемой с помощью
люминесцентных ламп типа „Холодный белый” или „Теплый белый”
(поставляемых фирмой Thom Electric). Все культуры содержатся в виде
100— 120 мл суспензии в конических колбах объемом 250 мл, закры-
тых крышкой из алюминиевой фольги.
Все манипуляции с культурами проводят в стерильных условиях
в ламинар-боксе.
7.2.3.1.	Инокулум
Культуру, из которой отбирают инокулум, характеризуют по сле-
дующим параметрам: возраст, выход биомассы, морфология и жизне-
способность клеток (например, можно использовать в качестве при-
жизненного красителя флуоресцеиндиацетат, см. гл. 1), митотическая
активность и количество синтезируемого продукта. Определяют также
оптимальную длину клеточного цикла и минимальную плотность ино-
кулума. Возраст инокулума, его плотность и условия содержания куль-
159
туры — это важные факторы, определяющие последующую скорость
накопления биомассы и продукта.
7.2.3.2.	Сбор клеток для инокуляции
При сборе клеток происходит их перенос на среду с другим питатель-
ным и гормональным составом, поэтому это очень важный момент.
1.	Выращивают культуру клеток С. roseus, поддерживая 14-днев-
ный цикл путем введения 20 мл культуры в 100 мл свежей среды
Гамборга В5 (см. гл. 1, табл. 1.3). Хороший рост культуры
и высокий выход алкалоидов происходят при переносе клеток
на продуцирующую среду 4 — 7-дневных культур (условия вы-
ращивания см. разд. 7.2.3).
2.	Фильтруют 100 мл клеточной суспензии с постоянной скоростью,
используя для этого состоящую из трех частей стерильную ворон-
ку Хартли, снабженную нейлоновым фильтром с размером пор
100 мкм.
3.	Промывают клетки 100 мл продуцирующей среды и удаляют
на воронке излишки влаги.
7.2.3.3.	Перенос клеток на продуцирующую среду
Скорость переноса является важным фактором, поэтому клетки
на воронке Хартли не должны находиться более нескольких минут.
Взвешивают 5 г влажных отфильтрованных клеток с помощью стериль-
ного шпателя и переносят их в 100 мл продуцирующей среды Ценка
(см. табл. 7.1) в колбу объемом 250 мл. Клетки одной культуры
С. roseus, растущей в течение 7 дней на среде В5, объемом 100 мл обес-
печивают количество инокулума, достаточное, по крайней мере, для
3 других колб. Условия инкубирования описаны в разделе 7.2.3.
7.2.3.4.	Контроль за синтезом продукта в культуре
Одной колбы, содержащей 100— 120 мл клеточной суспензии, до-
статочно для получения 4 образцов по 20 мл, которые можно исполь-
зовать для контроля над жизнеспособностью и ростом клеток, а также
накоплением алкалоидов в клетках и среде, например, сразу же после
отбора, через 7, 14 и 21 день после пересадки. Отбор образцов одновре-
менно из трех колб дает статистически достоверную оценку каждого
параметра.
Если накопление алкалоидов в клетках, растущих на продуцирую-
щей среде, собираются определять, отбирая образцы с интервалом в од-
ну неделю, то в этом случае явно необходимо более трех колб.
Типичные кривые роста культуры и накопления продукта пред-
ставлены на рисунке 7.1. Каждая точка представляет среднее из трех
160
рис. 7.1. Рост и накопление серпентина
в клетках суспензионных культур С. ro-
seus, субкультивируемых в продуцирую-
щей среде (см. табл. 7.1).
значений, полученных для культур
отдельных колб. Методы оценки
жизнеспособности клеток и био-
массы культуры приведены в гла-
ве 1 - Чтобы выразить данные по
содержанию алкалоидов в мг/мл
культуры, важно определить био-
массу культуры. Общее накопле-
ние алкалоидов в расчете на колбу
оценивают, суммируя количество
алкалоидов, экстрагируемых из
клеток и из среды для культивиро-
вания в этой же колбе.
Сбор и экстракция алкалоидов
из культивируемых клеток и из
среды обсуждаются ниже.
Время, дни
7.2.4.	ОДНОСТАДИЙНАЯ СИСТЕМА ПОЛУЧЕНИЯ СЕРПЕНТИНА
В СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУРАХ С. ROSEUS
Разработана среда, обеспечивающая рост и накопление продуктов
вторичного метаболизма в ходе регулярных пересадок суспензионных
культур С. roseus [8]
Анализ роста культуры и синтезируемых продуктов можно про-
водить, используя метод, описанный в разделе 7.2.3.4. В этом случае
контрольные колбы получают путем простого переноса 30 мл 7-днев-
ной суспензии на 100 мл свежей среды. С другой стороны, если при
переносе клеток необходимо избегать внесения старой, использован-
ной среды, инокулум можно профильтровать, промыть и ввести в 100 мл
свежей среды, как описано в разделе 7.2.3.3.
Типичные кривые роста и накопления продукта в одностадийной
системе приведены на рисунке 7.2.
7.2.5.	НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ВЫХОДА ПРОДУКТА ПРИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫХ
ПЕРЕСАДКАХ
Как свидетельствует анализ трех параллельных образцов, показа-
тели роста суспензионной культуры и накопление в клетках продукта
вторичного метаболизма совпадают, а выход продукта при последова-
тельных пересадках может существенно варьировать. Поэтому при
оценке эффективности новой среды, подобранной для повышения
6 - 1021
161
Рис. 7.2. Рост и накопление серпентина
в клетках суспензионных культур
С. roseus, выращенных в одностадий-
ной системе. Питательная среда (вклю-
чая витамины) Мурасиге и Скуга, 5 %
сахароза, 1 мг/п НУК и 0,1 мг/л кине-
тина |8].
синтеза продуктов вторичного метаболизма, необходимо определять
выход продукта в нескольких пассажах. Это особенно важно для одно-
стадийных систем, поскольку культуры могут иногда привыкать к но-
вым условиям, в результате способность синтезировать и (или) на-
капливать продукт в клеточной популяции подавляется.
7.3. АНАЛИЗ ПРОДУКТА
При экстракции и анализе специфических продуктов вторичного
метаболизма из культивируемых клеток сталкиваешься с теми же
трудностями, которые встречаются при выделении минорных вторич-
ных продуктов из тканей целых растений из-за низких концентраций
таких веществ по сравнению с другими компонентами клеток. Однако
информация о вторичных метаболитах, которые накапливаются в куль-
тивируемых клетках, весьма ограничена. Часто возникает необходи-
мость в определении класса продуктов, накапливаемых в клетках,
чтобы затем выяснить вопрос о том, какие метаболические пути функ-
ционируют в клетках, а также разделить, идентифицировать и выявить
количественные соотношения различных классов химических соеди-
нений. Многие из методов экстракции какого-то одного основного
соединения или даже класса соединений, применяемые при работе с
тканями целых растений, не всегда можно эффективно использовать
в экспериментах с культивируемыми клетками.
С учетом этого ниже приведены основные принципы экстракции,
разделения и определения количества продуктов вторичного метабо-
лизма из культивируемых клеток растений, а также методы выделения
некоторых веществ.
162
7.3.1.	ЭКСТРАКЦИЯ ОБРАЗЦА
В идеальном случае для экстракции следует использовать свежую
ткань. Если это неудобно из-за того, что образцы накапливаются в те-
чение всего периода роста, а экстрагируются одновременно, их можно
лиофилизировать и хранить в виде порошка.
7.3.1.1.	Методика приготовления образца
1.	Суспензионные культуры фильтруют через капроновую ткань,
помещенную в воронку Хартли, под вакуумом, создаваемым
водоструйным насосом. Промывают клетки дистиллированной
водой, которую затем удаляют под вакуумом.
2.	Сразу же клетки экстрагируют или лиофилизируют (сушка
клеток на воздухе не рекомендуется, поскольку приводит к пор-
че образцов).
3.	Для лиофилизации образец свежих клеток (примерно 10 г) по-
мещают в круглодонную колбу объемом 250 мл и добавляют
дистиллированную воду, чтобы получить жидкую суспензию
(колбу клеточной суспензией заполняют не более чем на треть).
4.	Замораживают образец в жидком азоте при постоянном вра-
щении колбы до тех пор, пока образец не станет твердым. Не сле-
дует допускать слишком сильного промораживания, это сни-
жает начальную скорость сублимации.
5.	Лиофильную сушку проводят под вакуумом менее 1,33 Па в те-
чение 24 — 48 ч в зависимости от размера образца.
6.	Высушенный образец извлекают из колбы, измельчают в ступ-
ке и хранят в закрытых сосудах с силикагелем при температу-
ре 4 °C или ниже.
7.3.1.2,	Экстракция
Конкретный способ экстракции зависит от ткани и содержания воды
в образце, а также от того, какое вещество выделяется. Во всех слу-
чаях желательно прежде всего „убить” живую ткань, чтобы воспре-
пятствовать ферментативному распаду до экстракции. Это можно сде-
лать, обработав образец кипящим этанолом, который, кроме того,
является хорошим универсальным растворителем для предваритель-
ной экстракции. Большие объемы свежих клеток (от 10 до 500 г)
можно разрушить в гомогенизаторе или с помощью ультразвука. Мень-
шие количества (0,1— 10 г) разрушают также ультразвуком или в
ступке. Классический способ экстракции органических компонентов
из высушенных и измельченных в порошок клеток состоит в последо-
вательной экстракции с помощью целого набора растворителей, начи-
ная с полярных растворителей типа гексана, эфира или бензина (для
163

экстракции липидов и терпеноидов), затем хлороформа или этилаце-
тата (для извлечения пигментов), после чего проводят экстракцию
спиртами (удаляя более полярные соединения) и, наконец, водой.
Однако редко удается достичь полного разделения, и многие соедине-
ния извлекаются в нескольких фракциях. Более того, такая экстрак-
ция годится лишь тогда, когда известно, что при этом не меняется хи-
мическая природа изучаемых соединений. Лиофипьно высушенные
клетки необходимо экстрагировать холодными растворителями, исполь-
зуя повторные обработки ультразвуком.
Выбор растворителей особенно важен вне зависимости от того,
какой метод экстракции применяется. В результате общей экстрак-
ции с помощью водных растворителей можно получить много соеди-
нений, трудно отделяемых от изучаемых или мешающих при последую-
щих операциях. При этом неполярные соединения иногда не экстраги-
руются. Более того, при низкотемпературной экстракции трудно уда-
лять воду. Неполярные растворители типа гексана, часто используемые
для удаления липидов и пигментов из тканей растений, для клеточных
культур применяют редко, если только последние не содержат боль-
ших количеств пигментов или липидов.
Таким образом, в целом растворители типа хлороформа, этилаце-
тата и низкомолекулярных спиртов, таких, как метанол и этанол или
их смеси, используют для экстракции алкалоидов, фенолов, терпенои-
дов и стероидов из культур клеток растений. При наличии в культи-
вируемых клетках связанных форм веществ можно применить мяг-
кий щелочной (1 М NH4C1, 1 ч, 100°C), затем кислотный гидролиз
(2 М НС1, 1 ч, 100 С) остаток клеток после предварительной экстрак-
ции растворителем. Необходимо следить за тем, чтобы в результате
обработок не происходило деградации продукта.
7.3.1.3.	Выделение алкалоидов из свежих клеток С. roseus с помощью
обработки ультразвуком
1.	Помещают 100—200 мг свежей массы клеток в стеклянную
центрифужную пробирку объемом 30 мл (2,5 X 10 см).
2.	Добавляют 10 мл перегнанного метанола.
3.	Обрабатывают ультразвуком на водяной бане в течение 30 мин.
4.	Центрифугируют клетки в течение 3 мин при 2000 g.
5.	Удаляют с помощью пипетки метанол.
6.	Повторяют три раза стадию 2.
7.	Собирают метанольные экстракты и фильтруют.
Чтобы добиться максимального разрушения, а следовательно, и
эффективной и воспроизводимой экстракции, необходимо подо-
брать соотношение массы клеток и объема растворителя, а также
геометрию системы и в дальнейшем придерживаться только этих па-
раметров.
164
Описанный метод оказался также пригоден для экстракции алка-
лоидов из свежих клеток Nicotiana tabacum, Papavcr somniferum, Cinchona
ledgcriana.
7.3.1.4.	Выделение алкалоидов из лиофильно высушенных клеток
С roseus по методу Сокслета
1.	Помещают 50—150 мг сухой массы лиофильно высушенных
измельченных клеток в капсулу Сокслета (12 X 50 мм), которую
неплотно закрывают ватой.
2.	Наливают 50 мл перегнанного метанола в круглодонную колбу
объемом 100 мл.
3.	Проводят экстракцию образца в аппарате Сокслета объемом
20 мл в течение 2 ч.
4.	Регулируют температуру водяной бани путем 8—10 прокачива-
ний через сифон в час.
7.3.2.	ОБРАБОТКА ОБРАЗЦОВ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ
Первичный экстракт следует отфильтровать и сконцентрировать.
Необходимо следить за тем, чтобы в ходе концентрации экстрактов
не происходило распада соединений, особенно если в используемом
для экстракции растворителе содержатся кислоты. В таком случае
большие объемы экстрактов (10— 100 мл) выпаривают в роторном
испарителе, а маленькие (1 — 10 мл) выпаривают, встряхивая, при
низких температурах в атмосфере N2 или под вакуумом. На этом этапе
работа с экстрактами, содержащими летучие компоненты, требует
особых предосторожностей. Сконцентрированные экстракты хранят
(если это совершенно необходимо) в атмосфере N2 при низкой тем-
пературе.
Грубые экстракты можно использовать для предварительной хро-
матографии на бумаге, тонкослойной хроматографии или даже жид-
костной хроматографии под давлением, хотя перед хроматографическим
разделением возникает необходимость в их частичной очистке.
Фракции, обогащенные пигментами, липидами и терпеноидами,
получают из грубых экстрактов, извлекая хлороформом или этилаце-
татом, после ресуспендирования осадка в водном растворе НС1 (pH 2).
Затем извлекают грубую фракцию алкалоидов, если экстракцию остав-
шейся водной фазы, содержащей НС1, проводят хлороформом при pH
на 1,5 единицы выше, чем рКа выделяемого соединения (обычно больше
pH 9,5, доводимого с помощью NH40H). При этом вторая оставшаяся
водная фаза обогащена фенолами.
Колонки для минихроматографии (типа Sep-Pak фирмы Waters
Associates, Ltd.) все чаще используют для предварительного фракциони-
рования и очистки клеточных экстрактов. Такие колонки выпускают
165
в нескольких вариантах, и с их помощью можно получать грубые фрак-
ции алкалоидов, фенольных соединений или пигментов, используя
методы жидкостной хроматографии под давлением с небольшими мо-
дификациями.
7.3.2.1.	Экстракция алкалоидов из грубых метанольных
экстрактов культур С. roseus, проводимая с применением
растворителей
1.	Высушивают грубый метанольный экстракт на роторном испа-
рителе при 60 С под вакуумом в круглодонной колбе.
2.	Ресуспендируют в смеси хлороформ : вода (1:1), трижды про-
мывают смесью по 10 мл. Материал из колбы удаляют (в слу-
чае необходимости обрабатывают ультразвуком).
3.	pH водной фазы доводят до значений выше 10 с помощью NH40H
(для проверки pH используют индикаторную бумажку).
4.	Добавляют 60 мл хлороформа, встряхивают примерно 5 мин
и, используя делительную воронку, фазы разделяют.
5.	Удаляют нижнюю фазу с хлороформом и дважды повторяют
стадию 4.
6.	Еще раз промывают отобранную фазу с хлороформом с помощью
60 мл водного раствора NH4OH (pH 10).
7.	Высушивают фазу с хлороформом над безводным Na2S04.
8.	Упаривают хлороформ досуха и осадок ресуспендируют в мини-
мальном объеме метанола.
7.3.2.2.	Разделение алкалоидов из грубых метанольных
экстрактов культур С. roseus с помощью колонок
типа Сэп-Пэк (Sep-Pak)
1.	Разводят грубый метанольный экстракт 0,05 М водным раство-
ром n-гептансульфоната (ГС) до 25 % (объем к объему) раство-
ра в метаноле.
2.	Активируют колонку Sep-Pak Cl 8 с помощью 4 мл ацетонитри-
ла, затем 4 мл 95 % метанола, содержащего 0,05 М ГС, и, наконец,
4 мл водного раствора 0,05 М ГС.
3.	Наносят образец на колонку с помощью шприца, элюируют по
* каплям, элюат собирают (это фракция, обогащенная фенольными
соединениями).
4.	Промывают колонку 4 мл 25 % метанола в 0,05 М ГС.
5.	Проводят элюацию с колонки с помощью 95% метанола в 0,05 М
ГС (по каплям) и проэлюированную фракцию собирают (это
фракция, обогащенная алкалоидами).
6.	Промывают колонку 4 мл хлороформа и проэлюированную
фракцию собирают (это фракция пигментов w липидов).
166
7.	Реактивируют колонку с помощью 4 мл 95% метанола,
содержащего 0,05 М ГС, а затем 4 мл водного раствора
0,05 М ГС.
Следует помнить, что между каждым добавлением раствори-
теля необходимо продуть колонку воздухом, чтобы удалить
остатки предыдущего растворителя.
8.	Удаляют метанол на роторном испарителе при 60 С под ваку-
умом и выделяют алкалоиды, свободные от ГС, экстракцией
хлороформом при pH 10 (NH4OH), если образцы далее анали-
зируют с помощью тонкослойной хроматографии. Образцы,
предназначенные для жидкостной хроматографии под давлением
с применением хроматографии двойных ионов, не требуют осво-
бождения от ГС.
7.3.3.	РАЗДЕЛЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА
На этой стадии обычно проводят предварительную проверку экст-
рактов путем хроматографии в топком слое или бумажной хроматогра-
фии. В таблице 7.2 приведены некоторые системы растворителей и ме-
тоды идентификации, обычно используемые для различных классов
продуктов вторичного метаболизма. В связи с широким разнообразием
химических свойств и большого числа соединений, найденных в расте-
ниях, нельзя полагаться лишь на хроматографию. Однако предвари-
тельные сведения о типах соединений, которые можно обнаружить
в клетках, значительно облегчают выбор' методов выделения и очистки.
Методы предварительной очистки некоторых соединений с помощью
тонкослойной хроматографии и хроматографии на бумаге подробнее
описаны в обзорах [10].
Разделение и очистку продуктов вторичного метаболизма обыч-
но проводят с использованием различных хроматографических ме-
тодов: хроматография на бумаге, хроматография в тонком слое, га-
зожидкостная хроматография или жидкостная хроматография (как
открытая колоночная, так и жидкостная хроматография под высо-
ким давлением), часто используют сочетание этих методов, выбор
методики частично зависит от полярности, растворимости и летучести
соединений, которые надо разделить, и частично от условий разделе-
ния. Хроматографию на бумаге и в тонком слое обычно используют
для предварительного разделения и проверки на чистоту образцов,
полученных после препаративного выделения. Хроматография на бумаге
особенно удобна при работе с водорастворимыми веществами,
такими, как органические кислоты и фенолы; хроматография в тон-
ком слое удобнее для разделения водонерастворимых соединений (ли-
пидов, стероидов, хинонов) и более предпочтительна для разделения
алкалоидов. Газожидкостная хроматография применяется для разде-
ления летучих соединений типа жирных кислот, стероидов и терпенои-
167
7.2. Предварительный анализ клеточных экстрактов на различные классы продуктов
вторичного метаболизма
Класс	Система	Система	Метод	Цветная	
соедине-	хромато-	раствори-	обнару-	реакция	Метаболит
НИИ	график	телей	женил		
1. Феноль- ные соеди- нения а. Простые	ТСХ, сили-	СНС13 :	Реактив	Голубая	Орцинол, ка-
фенолы и фе-	кагель G	СН3ООН	Фолина		техол, ванили-
нольные кислоты		(9:1)			новая кислота
	ТСХ, целлю-	6%	Ванилин/	Розовая	
	лоза	снэсоон	НС1		
			FeCl3/ K3Fe(CN)6	Голубая	
б. Окси-	ТСХ, целлю-	n-Бутанол:	УФ ± пары	Голубая,	п-Кумаровая,
коричные	лоза	СН3СООН:	NH_	зеленая,	кофейная и
кислоты и	—	_Н2О(БУВ)	Обычно	желтая	феруловая
оксикума-	Бумажная	(4:1:5)	опрыски-	флоурес-	кислоты
рины	хроматог-		вание фе-	ценция	
	рафия Ватман № 1		нолями		
в. Фенил-	ТСХ, сили-	n-Гек-	Ванилин/	Красная/	Тимол, эв-
пропены	кагель G	сан :	НС1 (конц.)	розовая	генол
		СНС13			
		(3:2)			
г. Флаваны	ТСХ, цел-	БУВ	Ванилин/	Розовая	Катехин,
	люлоза		НС1 (конц.)		эпикатехин
д. Флаво-	ТСХ, цел-	БУВ	У Ф ± пары	Желтая	Мирицетин,
нолы и фла-	люлоза		NH„	флуорео	кверцетин,
ВОНЫ				ценция	кемпферол, . апигенин
	Бумажная	НС1:	А1С13	Желтая	
	хроматогра-	СН3СООН:		флуорес-	
	фия	Н2О		ценция	
	Ватман № 1	(3 : 30 :10) Форестал	Ацетат	Желтая	
			свинца	флуорес- ценция	
			Ванилин/НС1	Красная/ пурпурная	
е. Антоциа-	ТСХ, цел-	Форестал	Белый	Красная,	Цианидин,
ны	люлоза		свет,	голубая,	петунидин
	—		А1С13	пурпурная	
	Бумажная хромато- графия Ватман № 1	БУВ			
ж. Антрахи-	ТСХ, сили-	СНС13 :	Белый	Желтая/	Юглон, эмо-
НОНЫ	кагель G	СН3СООН	свет	оранжевая	дин, хризо-
168
Продолжение табл. 7.2
Класс соедине- ний	Система хромато- графии	Система раствори- телей	Метод обнару- жения	Цветная реакция	Метаболит
	+ 4% вин- ная кис- лота	(9:1) Толуол : метанол (9:1) Бензол : этилацетат: СН3СООН (75 :24:1) Бензол : СНС13 (1:1) СНС13 : метанол (99 :1) СНЯ3 : метанол (99 :1)	УФ ± пары NH„	Оранжевая/ красная	фанол
			10 % мета- нол/КОН	Красная, фиолетовая	
2 Терпеноиды а.	Монотер-	ТСХ, сили- пены	кагель G б.	Сесквитер-	ТСХ, сили- пены	кагель G			лейкоме- тиленовый, голубой КМпО„, хлорид сурьмы, ванилин/ H2SO„ Иод	Зеленая, голубая Окраска различная Желтая/ коричневая	Лимонен, ментол, а-пинен, л о ганин Фарнезол, абсцизовая _ кислота
в. Тритерпе- ноиды: тритерпены	ТСХ, сили- кагель ± AgNO3		H2SO4 Хлорид сурьмы (20%) в сна3	Зеленая, коричневая, красная, голубая Желтая/ зеленая флуорес- ценция	Амирин, холестен
стероиды		СНС1Э	Уксусный ангидрид/ H2SO„	Окраска различная	Ситостерол, стигмастерол
сапогенины		СНС13 : ацетон (4 : 1)	Хлорид сурьмы (20%) в СНСЦ	Розовая/ пурпурная	Диосгенин, ямогенин
карденолиды 3. Амины а. Алифатиче- ские б. Арома- тические	ТСХ, цел- люлоза ТСХ, цел- люлоза	Этил аце- тат : мета- нол : Н2 О (16:1:1) БУВ БУВ	Хлорамин Т/трихлор- уксусная кислота Нингидрин Нингидрин	Желтая/ зеленая флуорес- ценция Розовая, голубая, пурпурная Голубая, пурпурная	Дигоксин, дигитоксин Путресцин, спермидин Триптамин, мескалин
169
Окончание табл. 7.2
Класс	Система	Система	Метод	Цветная	
со един е-	хромато-	раствори-	обнару-	реакция	Метаболи-i
НИЙ	графин	тел ей	женин		
	ТСХ, сили-	сна, :	Реактив	Розовая	
	кагель G	этил аце- тат :	Эрлиха		
		сн,соон			
4. Алкалоиды		(6:3:1)			
а. Рауволь-	ТСХ, сили-	Этилаце-	Сульфат	Окраска	Аймалицин,
фия Rauwol-	кагель G	тат: эта-	церия и	различная	резерпин,
fia		нол (3:1)	аммония		серпентин
		сна, : NH„OH (9:1)	Реактив	Оранжевая/	
			Драгендор- фа	коричневая	
б. Катарам-	ТСХ, сили-	Этилаце-	Сульфат	Окраска	Виндолин,
тус	кагель G	тат :эта-	церия и	различ-	катарантин,
Catharan-		нол (3:1)	аммония	ная	винбластин
thus		СНС1, :			
		ацетон: диэтил- амин			
		(50:40:10)			
в. Опиум	ТСХ, сили-	СНО, :	Недоплати-	Пурпурная/	Морфин,
	кагель G	этанол	натный	коричневая	кодеин,
		(4:1)	реактив		тебаин, папаверин
		Ксилен:	Реактив	Оранжевая/	
		бутанол:	Драген-	коричневая	
		метанол: диэтил- амин	дорфа		
		(40:40:6:2)			
г. Табак	ТСХ, сили-	СНО, :	Ио доп ла-	Пурпурная,	Никотин,
	кагель G	метанол:	тинатный	голубая,	анабазин
		NH„OH (60:10:1)	реактив	розовая	
д. Хинное	ТСХ, сили-	СНО, :	Реактив	Оранжевая	Хинин,
дерево	кагель G	этилаце-	Драген-		хинидин.
Cinchona		тат : изо-	дорфа		цинхонин
		пропанол:			
		диэтиламин	Иодо-	Голубая/	
		(20:70:4:6)	платинат	фиолетовая	
			Муравьиная	Голубая	
			кислота	флуорес- ценция	
е. Трепан	ТСХ, сили-	Этанол	Реактив	Оранжевая	Атропин,
	кагель G ±	70%:	Драген-		скополамин
	±0,5 ИКОН	NH„OH 25% (99:1)	дорфа		
170
дов. Триметилсилилэфирные производные алкалоидов также исполь-
зуют для разделения с помощью газожидкостной хроматографии, осо-
бенно когда это автоматически связано с масс-спектрометрией. Жид-
костная хроматография под высоким давлением в настоящее время
чрезвычайно широко применяется для анализа продуктов вторичного
метаболизма и становится наиболее используемым методом разделения
л количественного определения веществ растительного происхожде-
ния.
Подробное обсуждение методов хроматографического разделе-
ния выходит за пределы данной книги: основы методов приведены
в работах [11 — 17].
Обладающая высоким разрешением жидкостная хроматография,
называемая иногда жидкостной хроматографией под высоким давле-
нием, является одной из наиболее важных методических разработок
в этой области за последние десять лет, и ее потенциал еще не исполь-
зован. В общем это форма колоночной хроматографии, где использу-
ется колонка небольшого размера с равномерно упакованным в ней
материалом, имеющим мелкую зернистость, в связи с чем для поддер-
жания протока через колонку растворителя необходимо оказывать
на нее высокое давление. Метод позволяет проводить количественный
анализ смесей соединений, обладает высокой разрешающей способ-
ностью и чувствительностью. Количественный анализ осуществляется
путем автоматического измерения выходящего иэ колонки элюата с
помощью соответствующего детектора. В настоящее время описаны
методы разделения большинства наиболее распространенных, получае-
мых из растений алкалоидов, фенольных соединений, терпеноидов,
стероидных веществ и т. д. В этих методах использованы различные
сочетания носителей и растворителей, однако наиболее распростране-
ны колонки многократного использования типа Bondapak Cl8 (фирма
Waters assotiates), для анализа липидов, сахаров, аминокислот и пепти-
дов чаще применяют специальные колонки и системы измерения. Мето-
дические разработки в области систем жидкостной хроматографии
высокого давления в сочетании с масс-спектроскопией могут сделать
эти подходы столь же мощными, как и системы, использующие ком-
бинации газовой хроматографии и масс-спектроскопии, широко приме-
няемые сегодня.
7.3.3.1.	Разделение алкалоидов катарантуса с помощью
хроматографии в тонком слое
1.	Ресуспендируют фракцию алкалоидов в минимальном объеме
метанола и наносят на пластины для тонкослойной хроматогра-
фии, покрытые силикагелем G, содержащим флуоресцентный
индикатор (Merck 5714), 3 пятна по 5 мкл на расстоянии 6 см
друг от друга (расстояние от нижнего края и от бокового края
171
пластины размером 20 X 20 см не менее 2 см). Образец наносят
5 мкл микрокапилляром, стараясь, чтобы диаметр пятна не пре-
вышал 2 мм.
2.	Между исследуемыми образцами с интервалом 2 см в концент-
рации 1 мг/мл наносят пятна (по 5 мкл каждое) стандартных
образцов алкалоидов (растворенных в метаноле до концентра-
ции 1 мг/мл): однозамещенного виннокислого серпентина,
аймалицина (Koch light), сульфата винбластина (Sigma), вин-
долина и катарантина. Наносят также пятно (5 мкл) из смеси
всех этих алкалоидов.
3.	После того как пятна подсохнут, помещают одну пластину в
систему растворителей S1, а другую пластину — в систему раст-
ворителей S2. Оставляют пластины в сосуде, насыщенном па-
рами, внутренняя поверхность стен которого устлана фильтро-
вальной бумагой, содержащей 100 мл растворителя, до тех пор,
пока граница жидкой фазы не пройдет расстояние 15 см от
старта.
S1 — этилацетат : этанол (абсолютный), 3:1;
S2 — хлороформ : ацетон : аммиак, 50:40:10.
4.	После проведения хроматографического разделения (45 —
60 мин) пластины вынимают, отмечают положения фронтов раст-
ворителей и высушивают на воздухе.
5.	Осматривают пластины при дневном свете, а также при длинно-
волновом и коротковолновом УФ-свете (соответственно 366 и
254 нм). Отмечают окрашенные, флуоресцирующие и гасящие
флуоресценцию пятна.
6.	Опрыскивают пластины одним из следующих реактивов:
а.	Сульфат церия и аммония (1 г в 100 мл 80 % фосфорной кисло-
ты). Отмечают окраску пятен сразу же после опрыскивания,
через 5 и 30 мин. Вновь осматривают пластины через 24 ч, отме-
чая изменения окраски, а затем повторно изучают при УФ-
свете.
б.	Реагент Драгендорфа (состав № 39b (75J). Отмечают пятна,
содержащие алкалоиды, и затем опрыскивают 10 % водным раст-
вором нитрита натрия.
Если отсутствуют стандартные виндолин и катарантин, их можно
приготовить из фракций алкалоидов ткани листьев С. roseus, в которых
они являются двумя основными алкалоидами и составляют примерно
0,2 % сухой массы.
Некоторые хроматографические особенности маркерных алкало-
идов приведены в таблице 7.3.
Т.З. Особенности поведения некоторых распространенных
алкалоидов катарантуса при тонкослойной хроматографии
Алкалоид	Rf (X 100) в системе растворителей		Окраска в УФ-свете (366 нм)	Окраска после обра- ботки	
	S1* *	S2**		сульфатом церия и аммония*3	реагентом Драген- дорфа*4
Серпентин	2-5	31-33	Интенсивно- голубая	Отсутствует	Оранжевая
Аймалицин	80-81	68-70	Зеленого яблока	Желтая или зеленая	Оранжевая
Катарантин	70-71	44-46	Зеленая	Желтая или голубая	Оранжевая
Виндопин	72-73	67-71	Отсутствует (гасит УФ- свет при 254 нм)	Пурпурная	Оранжевая
Винбластин	38-39	65-66	Отсутствует (гасит УФ- свет при 254 нм)	Лавандовая	Оранжевая
* S1 — этилацетат : этанол (абсолютный) ,3:1.
** S2 — хлороформ: ацетон: аммиак, 50 : 40 : 10.
*3 Сульфат церия и аммония — цветная реакция алкалоидов часто зависит от
концентрации [27]; предел чувствительности равен 0,5—1,0 мкг.
** Реагент Драгендорфа — оранжевые пятна на желтом фоне; повторное
опрыскивание нитритом натрия вызывает образование оранжевых или коричне-
вых пятен на белом фоне; предел чувствительности равен 0,1—0,5 мкг.
7.3.3.2. Разделение алкалоидов С. roseus методом жидкостной
хроматографии под высоким давлением
Оборудование:
насосы (фирма Waters6000A);
инъектор (фирма Waters UK6);
программное устройство для формирования градиентов (Waters 660);
детектор в ультрафиолетовой области (Waters, модель 440);
колонка (Bondapak Cl 8,0,8 X 10 см);
радиальная компрессорная система или стальная колонка размером
3,9 X 30 см;
самописец (полная шкала 10 мВ).
Методика.
1. Активируют колонку, обработав 500 мл 95% метанол/н-гептан-
сульфоната (0,05 М).
2. Готовят, фильтруют и дегазируют системы растворителей А и
Б (см. подпись к рис. 7.3), используя спектроскопически чистый
метанол и деионизированную воду.
173
Рис. 7.3. Разделение с помощью
жидкостной хроматографии под
давлением пяти типичных для Catha-
ranthus алкалоидов. К-катарантин,
Л -аймалицин, В-виндолин, С—сер-
пентин, Вб—винбластин. Система
растворителей: метанол, вода, п-геп-
тансульфонат (пГС). Растворитель
А‘. вода с 0,05 М пГС (насос Л).
Растворитель Б: 95 % метанол с
0,05 М пГС (насос Б). Ступенча-
тый градиент: первая ступень гра-
диента — 50% растворителя Б
(14 мин), вторая — линейное уве-
личение растворителя Б до 60%
(6 мин), третья — линейное уве-
личение растворителя Б до 75 %
(6 мин), четвертая ступень — 75 %
растворителя Б (4 мин). Изме-
рение проводят при" 254 нм, ско-
рость тока растворителя —
1,5 мл/мин, скорость бумаги на
регистрирующем самописце —
0,5 см/мин.
3.	Подбирают условия хроматографирования, как описано в под-
писи к рисунку 7.3. Устанавливают базовую линию и нулевую
точку отсчета.
4.	Вводят 15 мкл стандартной смеси алкалоидов, используемых
при хроматографии в тонком слое.
5.	После завершения хроматографического разделения вновь воз-
вращаются к начальным условиям, при которых самописец
выходит на базовую линию, вводят 15 мкл отфильтрованного
(на фильтрах с размером пор 0,45 мкм) экстракта алкалоидов
клеток растений.
Следы органических примесей, присутствующих в деионизирован-
ной воде, можно элюировать 70% метанолом. В этих целях можно
использовать специальную колонку размером 0,4 X 10 см, упакован-
ную порасилом Б С18 (Porasil В фирмы Watefs), поместив ее между
выходом насоса А и входом насоса Б.
На рисунке 7.3 изображена хроматограмма алкалоидов С. roseus,
разделение которых происходило в описанных выше условиях.
7.3.4.	ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
7.3.4.1.	Основные принципы
В иммунных методах используется конкуренция меченого инди-
каторного антигена (Аг*) и немеченого антигена (Аг), присутствую-
174
щего в образце, который необходимо исследовать на наличие опреде-
ленного числа специфических участков, связывающих антитело (Ат)
с антигеном. Если концентрации Ат и Аг* поддерживаются постоян-
ными, то распределение метки, обнаруживаемой в свободном состоя-
нии и связанной с антителами, зависит от концентрации присутствую-
щего в образце Аг. Чувствительный и избирательный анализ осуще-
ствляется благодаря высокому сродству антител (которые можно
довольно легко получить при соответствующем выборе иммуногенной
структуры) и очень высокой специфической активности меченых ин-
дикаторных антигенов. Подобные подходы позволяют обнаружить
антигены в концентрациях 0,1 — 1,0 пмоль.
7.3.4.2.	Применение методов
Методы анализа просты и не требуют специального оборудования.
Иммунные методы могут быть двух типов: радиоиммунный анализ
(РИА) и иммунный анализ со связанными ферментами ELISA (от анг-
лийского enzyme-linked immunosorbent assay). Типичная методика ELISA
приведена в главе 9. Некоторые из ее этапов могут быть автоматизи-
рованы. Этим методом при компьютерном обеспечении за день можно
проанализировать 500—1000 образцов, а методом РИА — до 200 образ-
цов. Метод ELISA имеет ряд преимуществ перед РИА: он обладает
большей чувствительностью, не требует радиоактивно меченных анти-
генов, его результаты можно анализировать полуколичественно. С
другой стороны, метод РИА более точный.
7.3.4.3.	Области использования
Иммунные методы могут быть использованы для количественного
определения какого-либо соединения или группы соединений (при
использовании группоспецифической антисыворотки) в грубых или
частично очищенных экстрактах клеток растений, где они содержатся
в концентрациях около 1 нг в 1 мл экстракта. Это означает, что анализ
продуктов вторичного метаболизма можно проводить в крайне неболь-
ших образцах ткани (примерно 1 — 2 мг сырой массы) или в тех тканях,
где они присутствуют в чрезвычайно низких концентрациях.
В связи с этим методы иммунного анализа оказались особенно важ-
ны для отбора и сортировки растений и культур клеток растений с
повышенным содержанием определенных продуктов вторичного мета-
болизма.
Более полное описание иммунных методов анализа продуктов
растительного происхождения приведено в работе [18].
7.3.5.	ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРОДУКТОВ
Конечным этапом анализа продуктов, выделенных и очищенных
описанными выше методами, является его идентификация. Здесь, во-пер-
175
вых, необходимо определить химический состав и степень очистки.
Обычно это становится ясным по окраске, растворимости, значениям
Rf в разных системах растворителей и по характеристикам, полученным
при освещении УФ-светом.
Для полной идентификации необходимо знать и другие парамет-
ры, а затем сравнить их с опубликованными данными или со стандарт-
ными маркерными веществами. Это такие параметры, как точки плав-
ления, оптическое вращение и спектральные характеристики. Анализ
с помощью УФ-света, инфракрасного излучения, ядерного магнитного
резонанса и масс-спектрометрии обычно используют для идентифика-
ции индивидуальных соединений. Описание этих методов и интерпре-
тация полученных с их помощью спектров выходят за рамки данной
главы. Подробное описание спектроскопических методов и их исполь-
зование для определения продуктов вторичного метаболизма расте-
ний приведены в обзорах [19 — 26].
7.4.	КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В БОЛЬШИХ ОБЪЕМАХ
Культивирование клеток растений в больших объемах было раз-
работано для изучения проблем, связанных с масштабированием или
возникающих при создании промышленных технологий получения
биомассы или продуктов вторичного метаболизма. Выращивание кле-
ток растений в биореакторах позволяет также изучать действие раз-
личных условий, таких, как аэрация, содержание кислорода и углекис-
лого газа, на образование вторичных продуктов. Подобные исследова-
ния невозможно провести в небольших колбах.
Суспензионные культуры клеток растений, выращиваемые в кол-
бах на качалках, можно рассматривать как „бактериальные”, однако
при выращивании их в биореакторах практическая разница между
суспензионными культурами клеток растений и микробными культу-
рами становится очевидной (табл. 7.4).
ТА. Различия между бактериальными и суспензионными культурами
Параметр	Бактериальные клетки	Клетки растений
Плотность инокуляции	Небольшая	Большая
Скорость роста	Высокая (часы)	Низкая (дни)
Чувствительность к пщро динамическим стрессам	Устойчивы	Чувствительны
Морфологические ха-	Одиночные клетки,	Обычно в виде агрегатов,
рактеристики расту-	мицелии грибов об-	содержащих от 5 до 1000
щей культуры	разуют высокую вяз- кость суспензии	клеток, но могут образо- вывать и более крупные агрегаты, из-за которых сни- жается эффективность пере- мешивания и отбора проб
Требования к аэрации	Высокие	Невысокие
176
7.4.1.	ТРУДНОСТИ. СВЯЗАННЫЕ С КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ
В БОЛЬШИХ ОБЪЕМАХ
7.4.1.1.	Плотность инокуляции
Отличительная особенность суспензионных культур клеток рас-
тений — потребность в высокой плотности инокулята, необходимой
для их роста. Это вызвано тем, что клеткам растений в культуре не-
обходим один или несколько факторов, выделяемых в окружающую
среду самими клетками [28]. Поэтому клетки должны иметь плотность,
равную или выше минимальной, необходимой для их роста в новой
среде. Минимум составляет 10 — 30% общего объема ферментера, на-
пример 1—3 л для биореактора объемом 10 л. Таким образом, при
работе с большими объемами необходимы крупные емкости для на-
копления биомассы, а также тщательный расчет соотношений объемов
инокулума и биореактора.
7.4.1.2.	Скорости роста
Клетки растений растут в суспензионной культуре медленно. Ско-
рость роста измеряется днями, а не часами. Удваивание количества
биомассы происходит через 1 — 3 дня. Фактор медленного роста клеток
растений оказывает значительное влияние на культивирование в боль-
ших объемах. Для выращивания инокулума требуется значительное
время: эксперименты длятся от 1 до 4 недель, причем постоянно воз-
никают проблемы отбора проб и поддержания стерильности культуры.
Вторым, часто недооцениваемым фактором является ограниченность
числа экспериментов (поскольку они все длительные) на одном био-
реакторе, поэтому число ферментеров имеет важное значение.
7.4.1.3.	Чувствительность к гидродинамическим стрессам
Большой размер культивируемых клеток растений, а также нали-
чие жесткой клеточной стенки и крупной вакуоли делают эти клетки
чувствительными к гидродинамическим стрессам. Обычные бактериаль-
ные биореакторы имеют турбинные мешалки не только для переме-
шивания, но и для разрушения пузырьков воздуха, необходимого для
достижения высоких уровней аэрации. Такие типы мешалок создают
область с высокими гидродинамическими ударами на конце ротора,
где, как было показано, разрушаются клетки суспензионной культуры
растений. Культуры клеток растений выращивали в крупных биореак-
торах при низкоскоростном перемешивании с использованием мешалок
винтового типа. Таким путем довольно успешно выращивали в боль-
ших объемах культуры клеток табака, и недавно Кертин [29] сообщил,
что компания Mitsui разработала технологию производства шиконина
в больших биореакторах с перемешиванием. Однако, даже если проб-
177
леме гидродинамических сдвигов уделять особое внимание, невозможно
предсказать, будет ли определенная культура чувствительна к гидроди-
намическим стрессам или нет. Недавно было показано, что идеальным
для культивирования клеток растений, благодаря низким характеристи-
кам гидродинамических ударов, может служить альтернативный вариант
крупного сосуда с перемешиванием, называемый биореактором аэрлифт-
ного типа. В продажу такие типы биореакторов пока не поступили.
7.4.1.4.	Морфологические характеристики растущей культуры
Клетки растений в суспензионной культуре редко встречаются в
виде одиночных клеток одинакового размера. Чаще образуются агре-
гаты клеток, которые могут достигать 5 мм в диаметре. Кроме того,
в культуре размер и форма клеток существенно варьируют. Эта особен-
ность может вызвать сложности в перемешивании, отборе проб и аэра-
ции. Поэтому в биореакторе любого типа важно избегать мертвых эон,
а также свести к минимуму введение в суспензионную культуру ка-
ких-либо добавок и отбор проб. Образования комков агрегатов иногда
можно избежать, изменяя состав компонентов питательной среды,
например содержание ауксина или кальция. Еще одна проблема, возни-
кающая при выращивании клеток растений в биореакторах, — это об-
разование толстой корки внеклеточного материала, содержащей клет-
ки, и плавающей на поверхности культуры, которая называется „безе”.
Этот слой может достигать толщины 5 см и в некоторых случаях оста-
навливать поток воздуха в аэрлифтных биореакторах. Подобное проис-
ходит лишь в некоторых культурах и, видимо, связано со способностью
клеток растений образовывать внеклеточные полисахариды [30].
7.4.1.5.	Аэрация
Положительной особенностью медленного роста суспензий клеток
растений является их низкая потребность в кислороде (1,8 ммоль
О2/л/ч), поэтому перемешивание культуры становится столь же важ-
ным, как и аэрация. На рост суспензий клеток растений кроме кисло-
рода могут влиять и другие газы, например углекислый газ может
существенно влиять на длину лаг-фазы. Таким образом, высокая сте-
пень аэрации может оказывать негативное действие на рост и синтез
продуктов вторичного метаболизма, поскольку удаляются углекис-
лый газ и летучие соединения.
7.4.1.6.	Циркуляция газа
Путем повторного использования газа можно достичь высокой
скорости подачи газа, необходимой для достаточного перемешивания
и снижения потерь газа. Подробно система рециркуляции газа описана
178
Рис, 7.4. Система рециркуляции газа в
культуре клеток растений.
Обозначения: 1 — ротометр, 2 — кла-
пан соленоида, контролируемый анали-
затором количества растворенного кис-
лорода, 3 — воздушный насос, 4 —
воздушный фильтр (0,2 мкм), 5 —
биореактор, 6 — зонд для измерения
количества растворенного кислорода,
7 — холодильник, 8 — анализатор раст-
воренного кислорода.
[31], и была доказана способность поддержания в такой системе роста
клеток Tripfergium wildordii. В этой системе биореактор объемом 10 л
продувается со скоростью 1 л в минуту свежим воздухом, который по-
стоянно вводится в биореактор со скоростью лишь 100 мл в минуту. В
системе, используемой в институте Вольфсона, количество свежего воз-
духа, вводимого в систему циркуляции, зависит от концентрации раство-
ренного кислорода, которая может быть установлена на любом уровне
(рис. 7.4). Эта система хорошо работает, и при ее использовании получен
хороший рост клеток суспензионной культуры С. roseus. Этот метод хотя
и контролирует доступ кислорода, однако не позволяет учитывать содер-
жание углекислого газа или таких летучих соединений, как этилен.
Следовательно, экспериментатор сталкивается с проблемой выбора:
модифицировать существующие, сконструировать новые или приобрести
особые биореакторы. Выбор зависит главным образом от поставленных
задач, оснащенности мастерских, требуемых масштабов производства
и, что наиболее существенно, от размера финансирования.
7.4.2.	МОДИФИКАЦИЯ СУЩЕСТВУЮЩИХ БИОРЕАКТОРОВ
Существующие биореакторы почти всегда относятся к типу емко-
стей с перемешиванием, и ниже описаны модификации, которые можно
внести на биореакторе фирмы КВ [32]. Биореактор с перемешиванием
L. Н. Engineering серии 1/1000 можно перестроить, внеся следующие
модификации.
1.	Заменить турбинную мешалку на винтовую и запускать ее при
скорости около 100 об/мин.
2.	Удалить датчики pH.
3.	Заменить отверстие для отбора проб на широкую расточенную
трубку диаметром 1 см с зажимом (рис. 7.5).
4.	Поместить газоохладитель на линию выхода газа. Хотя исполь-
зуемая температура всего лишь 25°С, через 2—4 недели потери
воды будут значительными.
5.	Использовать колбу, заполненную доверху стерильной водой,
для стабилизации в случае резких потерь воды.
6.	Увеличить диаметр отверстия для инокуляции до 1 см.
179
Рис. 7.5. Деталь устройства отверстия
для отбора проб.
Обозначения: 1 - нижняя пластина из
нержавеющей стали, 2 — отверстие
(внутренний диаметр 1 см), высвер-
ленное в нижней пластине, 3 — сили-
коновая прокладка с внутренним диа-
метром 0,7 см и наружным диаметром
1,5 см, 4 — герметически завинчиваю-
щаяся крышка, 5 — трубка для отбора
проб с внутренним диаметром 0,7 см,
6 — стеклянный тройник, 7 — силико-
новая трубка, 8 — зажим.
Биореактор запускают при температуре 25 °C со скоростью продува
воздуха около 1—6 л в минуту и вносят 1—3 л инокулума. Каждые
2 — 3 дня в течение 30 дней отбирают пробы по 50 мл.
7.4.3.	КОНСТРУКЦИИ БИОРЕАКТОРОВ
7.4.3.1.	Биореактор, диаметр которого почти равен высоте
Конструкция такого типа биореактора представлена на рисунке
7.6.	Его рабочий объем 7 л, соотношение диаметра и высоты 1 :1,66.
27 см
Рис. 7.6. Аэрлифтный биореактор с ма-
лым соотношением сторон.
Обозначения: 1 — верхняя и 2 — ниж-
няя пластины из нержавеющей стали,
на обеих отмечены положения различ-
ных отверстий, 3 — воздушный
фильтр (фирма Sartorius), 4 — кресто-
образный распылитель с боковыми
отводами длиной 4,5 см и четырьмя
отверстиями диаметром 1,0 мм в рас-
чете на один отвод, 5 — отверстие для
отбора проб, предназначенное для
трубок диаметром 0,7 см, 6 — три от-
вода дренажной трубки, 7 — три цент-
рализованных отвода дренажной
трубки, 8 — дренажная трубка из
нержавеющей стали высотой 17 см и
диаметром 12,8 см, 9 — герметизиро-
ванная трубка, содержащая термо-
пару, 10 — отверстие для выхода газа,
подсоединенное к холодильнику, а
также к ловушке или фильтру, 11 —
резиновая прокладка между стеклян-
ной пластиной и пластиной из нержа-
веющей стали, 12 — фиксирующие
штыри, всего шесть штук, 13 — три
ножки по 10 см длиной, прикреплен-
ные к нижней пластине, 14 — стеклян-
ная отводная трубка длиной 30 см
и диаметром 19 см.
180
Стеклянная муфта диаметром 190 мм и высотой 300 мм изготовлена
из боросиликата и выпускается фирмой Hampshire R & D Glass, South-
hampton. Замыкающие пластины изготовлены из нержавеющей стали.
Их диаметр 27 см и толщина 1 см. На каждом конце стеклянной муфты
между муфтой и пластинами из нержавеющей стали расположены две
резиновые прокладки. Пластины из нержавеющей стали фиксируются
с помощью шести штырей.
Верхняя пластина имеет отверстие диаметром 1 см (рис. 7.6), ко-
торое используется для:
1)	газоохладителя, прикрытого сверху фильтром или ловушкой
с ватной пробкой;
2)	дополнительного вала;
3)	датчика растворенного кислорода;
4)	размещения температурного датчика;
5)	долива жидкости.
Нижняя пластина (рис. 7.6) имеет отверстия для крестообразного
разбрызгивателя, питаемого через поликарбонатный встроенный фильтр
(с размером пор 0,2 мкм), и для отбора проб. Трубка для стока жид-
кости диаметром 12,8 см и высотой 17 см изготовлена из нержавеющей
стали и установлена на 2,5 см выше основания ножек, также изготов-
ленных из нержавеющей стали.
Работа на ферментере. Стерилизуют ферментер (+ 100 мл
воды) в автоклаве в течение 40 мин при 120 С и заполняют средой,
простерилизованной с помощью фильтрования. В патрон, где располо-
жен термистор, наливают глицерин, обеспечивающий хороший темпе-
ратурный контакт, и подсоединяют миниатюрный термистор в виде
стеклянного шарика (фирмы R. S. Components Ltd.). Термистор исполь-
зуют для контроля температуры в суспензионной культуре, осуществля-
емого с помощью нагревательной ленты (фирмы Hotfoil Ltd., типа GW
200 Вт, длиной 2,7 м), обернутой вокруг стеклянной части прибора.
Аэрация контролируется с помощью ротаметра (фирмы G. A. Platon
Ltd., Flow Control), установленного между скоростями аэрации 1 и 6 л
в минуту. Давление растворенного кислорода контролируется с по-
мощью кислородного электрода Юнипроб (серия типа 50) и связанного
с Юнипроб измерителя растворенного кислорода серии 401. Инокуля-
цию 1 — 2 л суспензии клеток производят через дополнительный ввод.
Каждые 2 — 3 дня отбирают пробы по 50 мл.
7.4.3.2.	Рост С. roseus в биореакторе объемом 7 литров
Последовательность операций изображена на рисунке 7.7.
1.	Получают исходную культуру (100 мл культуры в колбах объ-
емом 250 мл) на среде В5 (см. гл. 1, табл. 1.3) из инокулума
объемом 10 мл. Инкубируют при 26°С в течение 14 дней при
150 об/мин на качалке (тип G-10 фирмы New Brunswick).
181
Среда
Проверка на зараженность
20-30 дней
14 дней
| Проба
Рис. 7.7. Последовательность манипуляций с 7-литровым биореактором с малым
соотношением сторон.
2.	Вводят в 1000 мл среды В5 исходную культуру (в колбе объ-
емом 3 л) и инкубируют еще в течение 14 дней.
3.	Через 14 дней проверяют инокулум под микроскопом на нали-
чие инфекции и жизнеспособность клеток, окрашивая суспен-
зионную культуру флуоресцеиндиацетатом (ФДА) и высевая
аликвоту на чашки с агаризованной питательной средой.
4.	За 3 — 4 дня до этого собирают и стерилизуют биореактор.
а.	Заполняют биореактор простерилизованной фильтрованием
средой (6 л) и проводят азрацию со скоростью 2 л в минуту,
б. Помещают термистор в предназначенный для него патрон и
заливают глицерином для обеспечения хорошего контакта.
в.	Распределяют нагревательную ленту по внутренней поверх-
ности биореактора, фиксируя ее с помощью автоклавной лен-
ты, и доводят температуру до 26 °C.
г.	Устанавливают прибор для измерения концентрации кисло-
рода, растворенного в среде, на 100%.
182
д.	До инокуляции среду инкубируют в течение 2 — 3 дней, чтобы
выявить возможность заражения. Непосредственно перед ино-
куляцией отбирают образец питательной среды и для дальней-
шей проверки на инфицированность высевают его на агаризо-
ванную питательную среду.
5.	Вводят в биореактор 1 л 14-дневной культуры, перелив ее в сте-
рильную пятилитровую коническую колбу с отводом и сили-
коновой трубкой, присоединенной к этому отводу. Вводят ино-
кулум через специальное отверстие, или отвод, герметизируют
биореактор.
6.	Каждые 3 дня отбирают по 50 мл пробы для определения сырой
и сухой массы синтезируемого продукта и содержания в среде
сахарозы, азота и фосфатов.
7.4.3.3.	Биореактор, высота которого существенно превышает диаметр
Конструкция сосуда (рис. 7.8) основана на предыдущих и требует
наличия стеклодувной мастерской. Биореактор состоит из трубки из
специального стекла (фирмы Pyrex) диаметром 11 см, длиной 90 см
и трубки для рециркуляции диаметром 4 см и длиной 54 см, что состав-
ляет рабочий объем 5 л. К описанной конструкции приделаны также
несколько шлифов 24 размера [33]. Верхний конец сосуда содержит
шлиф размера 55/44. Разбрызгиватель представляет собой стеклянную
трубку диаметром 8 мм с двенадцатью отверстиями диаметром 0,5 мм
также со шлифаьш. Как и у других биореакторов, потери при испаре-
нии снижаются с помощью холодильника, расположенного в верхней
Рис. 7.8. Аэрлифтный биореактор с большим
соотношением сторон.
Обозначения: 1 — распылитель, 2 — отверстие
для термопары, 3 — отверстие для отбора проб
(аналогично описанному на рис. 7.5), 4 —
водяная рубашка, 5 — дополнительное отвер-
стие, 6 — выход воздуха с холодильником, а
также с фильтром или ловушкой, 7 — состы-
ковка биореактора и головки с выводными
отверстиями на шлифах, 8 — отверстие для
заливки жидкости.
183
части сосуда вместе с резервуаром для заливки жидкости. Температура
в культуре поддерживается с помощью нагревательной ленты. Кроме
того, в сосуде содержится'электрод для измерения содержания кисло-
рода. Температурный контроль можно осуществлять и другим спосо-
бом, приспособив к сосуду водяную рубашку с циркулирующей и тер-
мостатируемой водой. Описана несколько иная и более крупная мо-
дель [33].
Работа на биореакторе. Этот биореактор также стери-
лизуется в автоклаве и затем заполняется стерильной средой. Скорость
аэрации (1—3 л/мин) также контролируется ротаметром (фирма G. А.
Platon Ltd.). Контроль температуры осуществляется аналогичным обра-
зом (см. разд. 7.4.3.2).
Т.4.4. БИОРЕАКТОРЫ ПРОМЫШЛЕННОГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ
В настоящее время существует много типов биореакторов с пере-
мешиванием. Конфигурация аэрлифтного типа, видимо, удовлетворяет
большинству требований, необходимых для выращивания культур кле-
ток растений. Вначале единственным выпускаемым биореактором был
аппарат объемом 30 л фирмы L. Н. Engineering. Сейчас можно приобрести
модели объемом 2 л и 100 л. Другие биореакторы промышленного из-
готовления в основном представляют собой модифицированные вариан-
ты существующих крупных биореакторов с перемешиванием, но со-
держащих трубку для продувки воздуха.
7.4.5.	СИНТЕЗ ПРОДУКТОВ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА В КУЛЬТУРАХ
БОЛЬШОГО ОБЪЕМА
Культивирование больших объемов клеток растений сконцентри-
ровалось в основном на выращивании клеток, а не на синтезе продук-
тов вторичного метаболизма. Как уже отмечалось, синтез продуктов
может осуществляться самыми различными способами и быть связан-
ным и несвязанным с ростом. В принципе нет оснований сомневать-
ся в том, что условия синтеза продуктов вторичного метаболизма,
используемые в колбах на качалках, подходят и для биореакторов,
как, например, при синтезе шиконина [29]. Однако такие факторы,
как содержание кислорода и углекислого газа, а также летучих веществ
типа этилена в биореакторах и в колбах на качалках, могут существен-
но различаться. Эти различия условий культивирования, как было
показано, влияют на рост клеток. Данные об их влиянии на синтез
продуктов вторичного метаболизма недостаточны, хотя предполагают,
что условия культивирования могут играть важную роль в этом про-
цессе.
184
7.4.6.	НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
Попытки выращивать клетки растений в условиях непрерывного
культивирования известны уже давно [34]. Культуры клеток растений
с такими характерными для них особенностями, как низкая скорость
роста (например, требуется 1 месяц для достижения устойчивого состоя-
ния) , нарастание биомассы на стенках сосуда, плохая перемешиваемость,
слипание в комки и образование в биореакторе гетерогенных зон, пред-
ставляют большие трудности для выращивания. Эти проблемы, а также
проблемы, связанные со стимуляцией синтеза продуктов вторичного
метаболизма вне зависимости от роста, свидетельствуют о том,
что к настоящему времени непрерывная культура не является пред-
почтительной системой для изучения синтеза продуктов вторичного
метаболизма.
7.5.	ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ КЛЕТКИ
Преимущество, использования культуры клеток, а не целых расте-
ний при получении продуктов растительного происхождения обсужда-
лось ранее. Для синтеза продуктов вторичного метаболизма гораздо
эффективнее применять иммобилизованные клетки растений, а
не суспензионные культуры больших объемов по следующим при-
чинам:
а)	можно многократно использовать биомассу (получение кото-
рой — дорогостоящая процедура) путем сохранения клеток в фермен-
тере и выделения продукта из среды;
б)	можно физически отделить клетки от среды и, следовательно,
от продуктов вторичного метаболизма;
в)	возможности эффективного использования дорогих фермен-
теров: культивирование большого количества биомассы в сосудах
небольшого объема;
г)	возможности использования процесса продолжительного куль-
тивирования.
Этапы получения иммобилизованных систем клеток растений при-
ведены ниже.
1.	Получение культуры клеток с определенными заданными свой-
ствами, например линии клеток с высоким выходом продукта
и низкой скоростью роста.
2.	Подбор соответствующего метода иммобилизации и геометрии
сосуда с иммобилизованными клетками, при которых поддержи-
вались бы жизнеспособность клеток и биосинтез продукта.
3.	Достижение процесса высвобождения продукта из клеток
в среду для культивирования при сохранении выживаемости
культуры, если продукт не высвобождается в естественных
условиях.
185
4.	Разработка соответствующего сосуда для культивирования
иммобилизованных клеток и условий культивирования, при ко-
торых клетки сохраняли бы свои свойства.
При промышленной иммобилизации следует отметить шесть важ-
ных моментов.
1.	Система должна быть безопасна для производителей и потреби-
телей продукта.
2.	Система должна быть простой и надежной при длительной работе
в стерильных условиях.
3.	Система должна быть щадящей для клеток, чтобы сохранить их
жизнеспособность.
4.	Система должна быть стабильной и надежной в работе.
5.	Система должна быть высокоактивной и специфичной.
6.	Система должна быть дешевой.
Кроме того, должна существовать возможность дешевого полу-
чения химически неизмененного продукта из среды. При этом иммоби-
лизованные клетки лишь тогда будут использоваться в промышлен-
ных условиях, когда они будут обладать дополнительными преимуще-
ствами перед клетками, культивируемыми альтернативными путями,
например с помощью обычного культивирования в большом объеме,
а также перед использованием изолированных ферментов или хими-
ческого синтеза. Эти ограничения значительно сужают выбор продук-
тов и методов иммобилизации.
Методы получения культур клеток, синтезирующих требуемые
продукты или способных к специфической биотрансформации, путем
применения индукции и селекции описаны в литературе. Другие этапы
разработки системы иммобилизации подробно обсуждаются в последую-
щих разделах.
7.5.1.	МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ, ПРИМЕНИМЫЕ К КЛЕТКАМ
РАСТЕНИЙ
Чувствительность клеток растений к механическому, осмотическо-
му и трофическому стрессам, а также к температуре, pH, давлению О2
и к химически активным веществам существенно ограничивает выбор
методов иммобилизации. Дальнейшие ограничения появляются при
подборе типа клеток, предназначенных для иммобилизации. В прин-
ципе можно иммобилизовать большие агрегаты клеток или даже кал-
лусные культуры, однако наиболее пригодны для этого мелкодисперс-
ные, гомогенные суспензии клеток, хотя культуры, содержащие агре-
гаты из 5 — 10 клеток, обычно могут быть иммобилизованы без ка-
ких-либо модификаций методов.
Клетки растений были успешно иммобилизованы в целый ряд
различных носителей путем обволакивания полимерной пленкой или
186
врастания в готовые структуры. Прикрепление к твердым носителям
вследствие абсорбции или ковалентного связывания оказалось непри-
годным для клеток растений. Использование методик, применяемых
для иммобилизации бактерий и ферментов, таких, как встраивание в
полиакриламид, в белки, сшитые поперечными сшивками с помощью
глютарового альдегида, и встраивание в полимеры на основе винила
или уретана, для клеток растений оказалось и вредным, и менее эффек-
тивным. В настоящее время клетки обычно иммобилизуют путем встраи-
вания в альгинат кальция, каррагинан калия или в агарозные шарики
[35—37]. Другой подход состоит во внедрении клеток в пространства
заранее подготовленной трехмерной сетчатой структуры, изготовлен-
ной из нейлона, полиуретана или металла. Клетки суспензионной куль-
туры после перемешивания с этим материалом (который обычно имеет
форму сфер или кубиков до 1 см в поперечнике) быстро проникают в
трехмерную структуру, затем растут в ее полостях и вследствие увели-
чившегося размера или связывания с материалом структуры застре-
вают в них. Такой подход оказался довольно успешным, хотя диф-
фузионные характеристики систем, полностью загруженных клет-
ками, не изучали. Описанные методы иммобилизации обладают
определенными преимуществами: они просты, дешевы, щадящи и
быстры. Кроме того, они позволяют поддерживать работу клеток
(табл. 7.5).
Модификации методов, приведенных в таблице 7.5, включают
использование смесей гелей альгината и желатина, агарозы и желатина,
полиакриламида 'и ксантановой смолы, полиакриламида и альгината.
Можно также получать однородные шарики разных размеров путем
диспергирования смеси полимера и клеточной суспензии в гидрофоб-
ной фазе, не повреждающей клетки (например, парафиновое масло),
перед упаковкой в гель. Это особенно полезно для иммобилизации
больших объемов клеток в гели из агарозы, агара и каррагинана. Клет-
ки могут быть также иммобилизованы в альгинатные или каррагина-
новые гели на нейлоновой или металлической подложке, хотя в этом
случае при превышении длины диффузного пробега возникают проб-
лемы, связанные с диффузией. Третий подход состоит в использовании
маленьких (20 — 50 мл) реакторов с полыми фибриллами и с клетка-
ми растений, погруженными (но не иммобилизованными) в полости
таких структур [38]. Этот подход может быть использован и в более
крупных ферментерах (5 — 10 л), содержащих трубки из полупроница-
емых синтетических мембран (например, диализные трубки), запол-
ненных клетками суспензионной культуры. В обеих описанных систе-
мах среда постоянно омывает мембраны, поставляя как питательные
вещества, так и необходимый для аэрации воздух, а также удаляя про-
дукты вторичного метаболизма, которые попадают в проходящий поток
питательной среды.
187
7.5. Методы, используемые для иммобилизации клеток растений
Основа для иммо- билизации	Метод иммобили- зации	Выживание* клеток				Иммо били- зов энные культуры	Исполь- зование	Метод культи- вирова- ния**
		А	Б	В	г			
1. Гели а. Шарики	2—3 % охлаж-	+	4-	+	/	Catharanthus	Выживание	1
агара	ценный агар					roseus	и рост кле-	
	(60-20 °C)						ток	
б. Шарики	2—5 % охлаж-	+	+	+	/	Catharanthus	Синтез	1
агарозы	денная ага-					roseus	аймалицина	
	роза (40— 20 °C)						de novo	
в. Шарики	10 % желатин,	+	—	—	/	Catharanthus	Выживание	1
желатина	поперечные					roseus	и рост	
	сшивки с по- мощью глу- таральдегида						клеток	
г. Шарики	1— 2%К-кар-	+	+	+	+	Catharanthus	Выживание	1
карра ги-	рагинан,					roseus	и рост	
нана	ионное по- перечное связывание (300 мМ К+)						клеток	
д. Шарики	2—4 % альги-	+	+	+	+	Daucus ca-	Биотранс-	6,7
альгината	нат натрия,					rota	формация	
	ионное попе-						стероидов	
	речное свя-					Morinda cit-	Синтез ан-	1,6
	зывание					rifolia	трахинонов	
	(100 мМ,						de novo	
	Са2+)					Catharanthus	Синтез алка-	1,5,
						roseus	ЛОЙДОВ de novo	6,7
						Digitalis	Биотрансфор-	1,6
						lanata	мадия дигитоксина	
						Nicotiana	Синтез нико-	1,6
						tabacum	тина	
						Cannabis	Выживание и	1
						sativa	рост клеток	
						Ipomoea sp.	Выживание и рост клеток	1
						Papaver som-	Биотрансфор-	1,4
						niferum	мадия морфиновых	
е. Полиакрил-15 % бисак-		—	—	—	—	Catharanthus	алкалоидов	1
амидные ша-	риламид;					roseus	и рост кле-	
рики	окислитель- но-восста- новительная полимериза- ция						ток	
188
Продолжение табл. 7.5
Основа для иммо- билизации	Метод иммобили- зации	Выживание* клеток				Иммобили- зованные культуры	Исполь- зование	Метод культи- вирова- ния**
		А	Б	В	г			
листы 2, Нераство- римые под- ложки	5 % бисак- риламид + ксантановая смола; окис- лительно-вос- становитель- ная полиме- ризация	/				Daucus carota Catharan- thus roseus Nicotiana tabacum	Выживание и рост кле- ток Синтез сер- пентина Синтез ал- калоидов	1,5 1,5 4,5
а. Нейлоно- вое сито	Выращива- ние клеток внутри пред- варительно сформирован- ного матрик- са с варьи- рующими размерами и геометрией пор	/	/			Beta vulgaris Humulus lu- pulus	Синтез бета- цианина Рост клеток	1 1
б. Пенопо- лиуретан	Выращивание клеток вну- три предва- рительно сформиро- ванного ма- трикса с варьирующи- ми размера- ми и геомет- рией пор	/	/	+		Capsicum frutescens Daucus carota	Синтез кап- саицина Рост клеток	1 1
в. Полые волокна	Проникно- вение в по- лости между полупрони- цаемыми мембранами	/	/	/	/	Glycine max Daucus carota Petunia hybrida	Синтез фе- нольных сое- динений Синтез фе- нольных сое- динений Выживание клеток	8 8 8
г. Оксид по- лифенилена	Формирова- ние попе- речных сши- вок в час- тицах, пред- варитель-	/	/	/	/	Nicotiana tabacum Solanum avi- culare	Выживание клеток Синтез гли- коалкалоидов	9 6
но активи-
189
Окончание табл. 7.5
Основа	Метод	Выживание*	Иммобили-		Метод
для иммо-	иммо били-	клеток	зов энные	Исполь-	культи-
билизации	зации		культуры	зование	вирова-
		А Б В Г			НИЯ**
рованных					
глутараль-
дегидом
* Методы оценки выживаемости клеток: А — плазмолиз, Б — дыхание, В —
рост клеток, Г гидролиз флуоресцеиндиацетатом; (+) положительно, (-) отри-
цательно, (/) не определяли.
** См. рис. 7.9.
7.5.1.1. Методика иммобилизации клеток растений на шарики
альгината кальция
При использовании данного метода можно получать 200 мл шари-
ков диаметром 2 — 3 мм, содержащих 0,2—0,3 г сырой массы клеток
в расчете на 1 мл шариков. Меньшие количества получают, медленно
капая пипеткой смесь альгината и клеток в СаС12 •
1. Фильтруют 200 мл суспензии клеток, находящихся в фазе лога-
рифмического роста (5 — 10-дневная культура), через нейлоно-
вую сетку с размером пор 100 мкм под небольшим вакуумом.
2. Отвешивают 60 г сырой массы клеток и помещают их в колбу.
Добавляют 40 мл среды для культивирования. Тщательно пере-
мешивают.
3. Эту суспензию клеток смешивают со 100 мл 4% (масса к объ-
ему) альгината натрия (фирма BDH Ltd.), растворенного в среде
для культивирования и простсрилизованного при 121 С в те-
чение 15 мин.
4. Перекачивают смесь с помощью перистальтического насоса через
стеклянную трубочку диаметром 2 мм, по каплям добавляя к
500 мл перемешиваемой среды для культивирования, содержа-
щей 100 мМ СаС12. Шарики должны образовываться сразу же
при контакте с раствором СаС12.
Если трубочка забьется клетками, насос на несколько се-
кунд пускают в обратном направлении. Не допускают контакта
стеклянной трубочки с раствором СаС12.
5. В конце процесса иммобилизации встряхивают шарики в те-
чение 2 ч при 150 об/мин для обеспечения полной фиксации.
6. Смесь шариков со средой пропускают через нейлоновую сетку
с диаметром отверстий 1 мм. Удаляют разрушившиеся шарики
и шарики, содержащие пузырьки воздуха, дважды промывают
250 мл среды для культивирования, покачивая смесь в течение
15 мин при 150 об/мин.
7. Удаляют среду для промывания. Ресуспендируют в свежей среде
для культивирования и далее культивируют как обычно.
190
7.5.2.	ОСОБЕННОСТИ И ПРОБЛЕМЫ СИСТЕМ ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК
7.5.2.1.	Ограничения, вызванные разделением фаз и диффузией
Так как иммобилизованные клетки существуют в гетерогенной
двухфазной системе, их свойства могут отличаться от свойств свобод-
ноживущих клеток суспензионных культур, если физико-химические
особенности новой фазы не эквивалентны свойствам основного раствора.
Разделение субстратов, газов, ионов, ингибиторов и продуктов между
иммобилизованной и водной фазами значительно влияет на свойства кле-
ток, даже если последние не изменены в результате иммобилизации.
Транспорт субстратов становится зависимым от диффузионного
сопротивления двух типов. Во-первых, появляются ограничения извне,
поскольку передвижение веществ из основного раствора к поверх-
ности иммобилизованных клеток осуществляется через пограничный
слой воды. Во-вторых, возникают ограничения изнутри относительно
диффузии внутрь иммобилизованной частицы. Наличие этих диффу-
зионных ограничений снижает эффективность системы и может менять
свойства клеток путем создания микроусловий внутри иммобилиза-
ционного матрикса, отличающихся от условий в основном растворе.
Для поддержания физиологического состояния клеток, аналогичного
состоянию свободных клеток суспензионной культуры, необходимо
свести к минимуму описанные диффузионные ограничения и микро-
условия. Этого можно достичь уменьшением размеров частиц и опти-
мизацией их формы (чтобы сократить длину диффузионного пробега),
повышением концентрации субстрата в основном растворе, увеличением
перемешивания среды (для повышения скорости переноса), а также
увеличением пористости и оптимизацией распределения биомассы внутри
частиц (для снижения диффузионного сопротивления).
Однако создание микросреды внутри матрикса может оказаться
и желательным, если новые условия приведут к повышению синтеза
или выхода продукта.
Кроме возможной потери активности клеток в результате иммо-
билизации и последующего культивирования, может возникнуть еще
одна проблема в результате отрыва клеток от матрикса. Биомассу
клеток обычно получают до иммобилизации, наращивая в отдельных
сосудах. Помимо этого клетки можно выращивать в уже приготов-
ленном матриксе, что в итоге также приведет к иммобилизации. При
любом подходе рост клеток после иммобилизации необходимо конт-
ролировать, поскольку неограниченный рост приводит к повышению
диффузионного сопротивления и, по-видимому, к появлению клеток
в омывающей питательной среде.
7.5.2.2,	Измерение параметров клеток после иммобилизации
При определении свойств иммобилизованных клеток возникает
ряд проблем, так как после погружения в нерастворимую подложку
191
клетки невозможно прямо отобрать для анализа. Таким образом, изме-
рение основных показателей роста клеток, таких, как увеличение сы-
рой и сухой массы, числа клеток и митотического индекса, а также
определение интенсивности дыхания и их жизнеспособности вызывают
определенные трудности. Жизнеспособность, интенсивность дыхания
и митотический индекс клеток можно определить на тонких срезах
иммобилизованного материала. Снижение концентрации питательных
веществ в среде, информируя в некоторой степени об общем состоя-
нии системы, мало что говорит о скорости роста или о физиологическом
состоянии клеток. Более того, наличие в среде продукта вторичного
метаболизма может свидетельствовать как о повышении способности
клеток к высвобождению продукта в окружающую среду, так и об
избирательной гибели клеток.
Рост клеток в процессе культивирования определяют измерением
сырой или сухой массы образца иммобилизованных клеток определен-
ных размеров после растворения матрикса, проводимого для подсче-
та числа клеток. Однако для некоторых систем зто оказывается не-
возможным. Сходные проблемы встречаются и при определении со-
держания вторичных продуктов, накопленных иммобилизованными
клетками.
Другой проблемой является изучение среды внутри матрикса по
таким параметрам, как pH, давление О2 и СО2, содержание питатель-
ных веществ в различных системах иммобилизации при разной плот-
ности биомассы и в различных условиях культивирования.
Сначала необходимо получить данные об окружении клеток и о
реакции клеток, культивируемых в данном окружении, и лишь затем
сравнивать с клетками в свободной суспензионной культуре. Особен-
но важно определить жизнеспособность клеток, так как это необходимо
для поддержания их биосинтетической активности. Этот показатель
указывает на пригодность данного метода иммобилизации и режима
культивирования. Жизнеспособность клеток оценивают следующим
образом:
1)	по способности клеток подвергаться плазмолизу в гипотони-
ческой среде (например, 0,4 — 0,6 М манните);
2)	по включению и гидролизу ФДА или по выходу Эванса голу-
бого (см. гл. 1);
3)	по интенсивности дыхания клеток, измеряемой в обычном кисло-
родном электроде типа Кларка;
4)	по митотическому индексу.
Если методы 1 и 2 позволяют оценить соотношение жизнеспособ-
ных клеток в культуре и могут с легкостью использоваться для изу-
чения дифференциальной жизнеспособности клеток внутри матрикса,
то методы 3 и 4 дают среднюю оценку жизнеспособности клеток и ме-
нее ценны, поскольку и интенсивность дыхания клеток, и частота мито-
зов при культивировании варьируют.
192
75.2.3	. Выход продукта в питательную среду и его извлечение
Выход продукта в питательную среду. При ра-
боте с системой иммобилизованных клеток необходимо, чтобы, по край-
ней мере, некоторые продукты высвобождались из клеток в окружаю-
щую среду, откуда их можно изолировать, не теряя клеточной биомас-
сы. Однако естественное выделение продуктов вторичного метаболизма
культивируемыми клетками растений встречается крайне редко. Глав-
ным образом такие продукты накапливаются в вакуоли. Поэтому основ-
ной проблемой является высвобождение продуктов из клеток. В систе-
мах, которые естественным образом не секретируют продукты, исполь-
зуются двухстадийные методы культивирования, состоящие в повтор-
ных накоплении и извлечении продукта. Однако если необходимо вновь
использовать иммобилизованную биомассу, то при обработке, приме-
няемой в процессе извлечения продукта, следует сохранять целостность
мембран или, по крайней мере, должно обеспечиваться быстрое вос-
становление их функции.
Извлечение продукта. Извлечение продуктов, раство-
ренных в омывающем клетки растворе, становится важной проблемой
при экономической оценке производства продукта с использованием
систем иммобилизации. Классические методы извлечения продуктов
вторичного метаболизма с использованием растворителей оказывают-
ся дорогостоящими. Однако проводятся новые биотехнологические
разработки, как, например, использование иммобилизованных антител
для удаления из среды специфических продуктов.
7.5.3.	РЕАКТОРЫ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ
Если иммобилизованные клетки предназначены для промышлен-
ного использования, необходимо обратить самое серьезное- внимание
на выбор сосуда, в котором они будут культивироваться. До сих пор
этому уделяли мало внимания [38]. В связи со сложностью и разно-
образием иммобилизованных систем, однако, маловероятно существо-
вание единственного типа конструкции реактора, пригодного для всех
систем иммобилизованных клеток растений. Учитывая перечисленные
ранее ограничения, можно сказать, что, по-видимому, проточные систе-
мы реакторов, в которых реализуется кинетика задержки потока пита-
тельной среды, не подойдут для клеток растений из-за длительного
периода роста. Однако некоторые типы реакторов с повторным цирку-
лированием, напротив, могут оказаться более эффективными. Наиболь-
шее распространение получили два типа подложек для иммобилизован-
ных клеток (подложки, состоящие из множества мелких частиц или
из плоских листов), которые и определили конструкцию реакторов,
хотя иногда для обеих систем могут быть использованы сходные типы
аппаратов (рис. 7.9).
7 - 1021
193
3
воздух
воздух
Рис. 7.9. Формы реакторов, пред-
назначенных для иммобилизованных
клеток растений.
Обозначения: 1 — качаемая колба,
2 — перемешиваемый сосуд, 3 — про-
дувка воздуха снизу, 4 — колонка,
5 — заполненная колонка, 6 — запол-
ненная колонка с повторным прока-
чиванием среды, 7 — сжиженная осно-
ва, 8 — клетки в просветах пустых
трубочек, 9 — клетки пропускают
между полыми фибриллами.
В настоящее время конструк-
ции реакторов с подложкой, со-
стоящей из множества мелких
частиц, представляют собой разно-
образные варианты существую-
щих аппаратов, используемых для
непрерывно культивируемых сус-
пензионных культур клеток расте-
ний. Те из них, которые представляют собой сосуды большого объема
с мешалкой, разновидности аэрируемых башен, перевернутых кони-
ческих колб и модифицированных аэрлифтных ферментеров, для им-
мобилизованных клеток часто неэффективны. Во всех этих системах
на частицы в течение короткого промежутка времени действуют меняю-
щиеся условия перемешивания и аэрации, вызываемые бурлением пу-
зырьков воздуха — фактором, который также существенно снижает
загрузку сосуда для культивирования биомассой. Кроме того, переме-
шиваемые реакторы всех типов вызывают повреждение частиц вслед-
ствие механического трения и постоянного их соприкосновения. В
работе используют и реакторы, в которых частицы упакованы в колон-
ку, реакторы с рециркуляцией или реакторы, в которых частицы упа-
кованы в виде спирали [35]. Эти типы реакторов могут работать при
более высоких загрузках биомассы, однако здесь могут встретиться
серьезные проблемы, связанные с переносом больших масс питатель-
ной среды при низких скоростях протока в этих системах.
По-видимому, наиболее удачным типом реактора с подложкой,
состоящей из множества частиц, является реактор с растягивающейся
разжиженной основой. В подобных системах можно работать при по-
вышенной загрузке биомассы, высоких скоростях протекающей пи-
тательной среды и пониженным повреждением частиц за счет трения.
При этом снижаются также диффузионные и массообменные ограни-
194
чения. Единственной существенной проблемой при крупномасштабном
культивировании может быть повышенное потребление энергии, требуе-
мой для сохранения подложки в подобном состоянии. В отличие от
системы, состоящей из множества мелких частиц, системы с подлож-
кой в виде поверхности, свернутой в „рулет”, и содержащие крупные
сосуды с перегородками или модифицированными, уложенными стоп-
кой круглыми пластинами, или квадратными рамами, интересны в прин-
ципиальном отношении и могут быть использованы для разработок
альтернативных систем культивирования [35].
До сих пор исследования с иммобилизованными клетками рас-
тений проводили в объемах 1 — 2 л и поэтому не возникали те проблемы,
с которыми приходится сталкиваться при иммобилизации и культи-
вировании клеток в условиях крупнотоннажного _ промышленного
производства. Вероятно, главным фактором при решении вопроса о
том, смогут ли иммобилизованные клетки растений проявить свой
потенциал в качестве альтернативной системы синтеза биохимических
соединений в промышленных условиях, окажется новаторское мастер-
ство инженера-биохимика.
7.6.	БИОТРАНСФОРМАЦИЯ
Биотрансформация представляет собой метод, использующий фер-
менты, локализованные в клетке растения и способные менять функ-
циональные группы добавленных извне химических соединений. Этот
метод часто используют для повышения биологической активности
данной химической структуры и осуществления серии специфических
химических реакций за счет включения одного или нескольких после-
довательно связанных ферментов.
В таких системах первичный метаболизм клеток растений направлен
на регенерацию соответствующих коферментов/кофакторов, необходи-
мых для поддержания катализа.
Биотрансформация с помощью компонентов растительной клетки
может происходить в двух формах: а) с использованием целых клеток
как в виде совершенно свободной суспензии, так и иммобилизован-
ных путем закрепления на внешней подложке, б) с использованием
препаратов иммобилизованных компонентов клеток, где необходимые
специфические ферменты выделены, очищены и иммобилизованы на
внешнюю подложку.
Огромный биохимический потенциал клеток растений, позволя-
ющий осуществлять специфическую биотрансформацию определенных
природных или синтетических субстратов, необходимую для получе-
ния более ценных веществ, может использоваться чрезвычайно широ-
ко. Синтетические соединения, аналоги промежуточных продуктов
или продукты, не встречающиеся обычно в растении, могут быть исполь-
195
7.6. Различные типы структур, подвергающихся реакции биотрансформации
Субстрат	Продукт	Культура клеток
А. Терпеноиды а-Терпинеол	7-Окси-а-терпинеол	Nicotiana tabacum
транс-ft-	/ранс-6-Окси-а-терпинеол цис-6-Окси-а-терпинеол 1О-Окси-трянс-р-терпинеол	N. tabacum N. tabacum N. tabacum
Терпинеол	4-Окси-трснс-р-терпинеол	N. tabacum
Линалоол	8-Оксилиналоол	N. tabacum
Ацетат лина-	8-Оксилиналилацетат	N. tabacum
лила	8-Оксилиналоол	N. tabacum
Дигидроли-	8-Оксидигидролиналоол	N. tabacum
налоол Дигидроли-	8-Оксидигид ролиналил-ацетат	N. tabacum
налилацетат Гераниол	Цитраль а + Ь, нерол	Cannabis sativa
Нерол	Цитраль а + Ь. гераниол	Cannabis sativa
Ментол	(+) -Неоментол	Mentha sp.
Пулегон	(+) -Изо ментол	Mentha sp.
2-Изопропилидин-	2-Изопропилциклогексанон	Mentha sp.
циклогексанон Стевиол	Стевиолбиозид, стевиозид	Stevia rebaudiana
Панаксатриол	Панаксатриол-З/З и 6/3-глю-	Digitalis purpurea
Б. Ароматические соединения Гидрохинон	козиды Арбутин	Panax ginseng Agrostemma githago
2-Метилкорич-	3- (4,5-Диокси-	Datura innoxia Digitalis purpurea N. tabacum
пая кислота Б. Кумарины Кумарин	2-метилциннамоил) и 3- (4-ОКСИ-2-МЯИЛ- циннамоил) -хинная кислоты 7-Оксикумарин	Catharanthus roseus
7-Оксикума-	Герниарин, мармезин,	Ruta sp.
рин Г. Алкалоиды (К8)-Ретикулин	псорален (+) - (s) -Ретикулин	Papaver somniferum
(-)-Кодеинов	( -) - (s)-Ci<y лерин (_) _ (s) -Хейла! пифолин (-)-Кодеин	P. somniferum P somniferum P. somniferum
Тебаин	Неопин	P. somniferum
4-Окси-2-хинолон	Диктамин, 8-метоксидик-	Ruta sp.
Триптофан	тамин Гарман, норгарман	Phaseolus vulgaris
Виндолин	Дезацетилвиндолин,	Catharanthus roseus
Ангидровин- бластин	дигидровиндолин Винбластин	Catharanthus roseus
Д. Стероиды Дигитоксигенин	Дигитоксиге! юн	Digitalis purpurea
Digitalis lanata
Thevetia neriifolia
196
Окончание табл. 7.6
Субстрат	Продукт	Культура клеток
	7 /З-Оксидигито ксигенин	D. purpurea
	Дигоксигенин	D. lanata
Дигитоксигенин диэтил аминоацетат	Дигоксигенин	D. lanata
Гитоксигенин	5/3-Оксигитоксигенин	Daucus carota
Узаригенин	Узаригенон	Thevetia neriifolia
Дигитоксин	Дигоксин	D. lanata
Дигитоксин	Гитоксин	D. lanata
Прогестерон	4-Прегнен-20а-ол-3-один	Capsicum frutescens
Прегненолон	Прогестерон	Digitalis lutea
Тестостерон	Андростан-3,17-дион, 5 а-андростан-3 /Зол-17-один	N. tabacum
Холестерол	4-Холестерин 3-один	Cheiranthus cheiri
7.7.	Процессы биотрансформации, осуществленные с помощью
иммобилизованных клеток растений
Вид растений, клетки которого были иммобили- зованы	Метод им- мобили- зации	Субстрат	Реакция био- трансформации	, Продукт
Digitalis lanata	Альгинатный	Дигитоксин	12-0-Гидро- ксилирование	Дигоксин
Digitalis lanata	Альгинатный	0-Метилди- гитоксин	12-0-Гидро- ксилирование	0-Метилди- гоксин
Digitalis lanata	Альгинатный	Дигитоксин	Гликозилиро- вание	Пурпуреагли- козид А
Daucus carota	Альгинатный	Дигитокси- генин	5-0-Гидро- ксилирование	5-0-Оксидиги- токсигенин
Daucus carota	Альгинатный	Гитокси- генин	5-0-Гидрокси- лирование	5-0-Оксигито- ксигенин
Catharanthus roseus	Агарозный	Катена мин	Восстановле- ние двойной связи	Изомеры аймалицина
зованы в качестве субстратов для получения новых вешеств, обладаю-
щих уникальной биологической активностью. Природные промежуточ-
ные соединения растительного происхождения используют для полу-
чения в аппаратах соединений с той же активностью, как и соединения,
извлекаемые из целых растений, растущих в естественных условиях.
Реакции биотрансформации обычно стереоспецифичны и включа-
ют такие процессы, как окисление, восстановление, гидроксилирование,
метилирование, диметилирование, гликозилирование, этерификация,
эпоксидация, изомеризация и сапонификация. Химические структуры,
подвергающиеся биотрансформации, также весьма разнообразны и,
как было показано, включают ароматические соединения, стероиды,
кумарины, терпеноиды и алкалоиды. Некоторые из этих соединений
приведены в таблице 7.6.
7* - 1021
197
В работе по биотрансформации использовались несколько основ-
ных сред, включая среды Мурасиге и Скуга, Линсмайера и Скуга, Гам-
борга и др., Нича и Нич (см. гл. 1). В. большинстве случаев эти среды
обеспечивают клетки питательными веществами до их использования
в реакциях химической модификации, хотя, за исключением превра-
щения дигитоксина в дигоксин клетками Digitalis lanata, они не оказы-
вают влияния на кинетику реакций биотрансформации.
При использовании препаратов целых иммобилизованных клеток
во всех реакциях биотрансформации (кроме одной) в качестве поддер-
живающей подложки использовали альгинатные гели. Исключением
была реакция превращения катенамина в аймалицин клетками С. roseus,
погруженными в агарозу. Некоторые из упомянутых реакций приве-
дены в таблице 7.7.
Иногда для увеличения периода полезного катализа необходимы
некоторые модификации. Это было сделано в случае упакованных в
альгинат клеток Daucus carota, которые использовали для изучения про-
цесса 5-/3-гидроксилирования агликонов дигитоксигенина и гитоксиге-
нина. В данном случае специальным образом подобранная среда была
использована для предотвращения разрушения клеток внутри матрик-
са, происходящего из-за клеточного роста.
7.6.1.	БИОТРАНСФОРМАЦИЯ СТЕРОИДНЫХ ГЛИКОЗИДОВ ДИГИТАЛИСА
7.6.1.1.	Введение
Хорошо изученной системой, на примере которой можно проил-
люстрировать способность процесса биотрансформации повысить актив-
ность вещества, является превращение дигитоксина в дигоксин клет-
ками Digitalis lanata. Этот процесс в последние десять лет привлек боль-
шое внимание благодаря своему биотехнологическому потенциалу.
Дигитоксин и дигоксин принадлежит к группе стероидов, извест-
ных как „карденолиды”, применяемых в медицине для лечения хро-
нической болезни сердца. В настоящее время соединения стоят на ше-
стом и восьмом местах в списке наиболее используемых препаратов
в США, чем объясняется интерес к возможности их химической мо-
дификации. Оба эти соединения обычно экстрагируют из растений,
хотя при этом в основном выделяется дигитоксин. Такая ситуация
привела к сокращению выпуска дигоксина, соединения, обладающего
лучшим фармакологическим эффектом, и к увеличению производства
таблеток более токсичного дигитоксина. Биотрансформация дигито-
ксина в дигоксин за счет реакции /3-12-гидроксилирования, катализируе-
мой ферментом, содержащимся в клетках D. lanata, впервые была
проведена Альферманном и Райнхардтом в ФРГ и включала манипу-
ляции с использованием свободных суспензионных культур [39] и
198
целых иммобилизованных клеток [40]. Ниже приведены оба подхода,
чтобы проиллюстрировать возможность достижения одной цели различ-
ными способами.
7.6.1.2.	Биотрансформация в суспензионных культурах
В предварительных экспериментах были использованы колбы Эрлен-
мейера объемом 250 мл, а в основной части проделанной работы при-
менялись трубчатые аэрлифтные реакторы с рабочим объемом 20 л.
Как отмечалось в предыдущих разделах, эти системы позволяют мягко
перемешивать чувствительные клетки суспензионных культур расте-
ний, не причиняя им серьезных повреждений за счет физического
стресса.
На практике в качестве субстрата для этого процесса использу-
ется производное дигитоксина, известное как (З-метилдигитоксин. Было
показано, что в результате стереоспецифической трансформации этого
соединения образуется /3-метилдигоксин и небольшое число побочных
продуктов. Схема реакции приведена на рисунке 7.10. Кроме того,
особенности растворимости молекул этого соединения в процессе био-
трансформации позволяют использовать концентрации субстрата, на-
много превышающие те, которые возможны при использовании при-
родного производства. Это делает процесс более эффективным. Ниже
приведена методика, основанная на экспериментах Альферманна и др.
[39].
1.	Клетки D. lanata выращивают в течение 5 дней на обычной среде
Мурасиге и Скуга (МС) (с 2%, масса к объему, глюкозы в ка-
честве основного источника углерода) в 20-литровом азрлифт-
ном ферментере при температуре 24 °C. Вводят инокулят с конеч-
ной плотностью клеток 0,8 г сухой массы в 1 л среды и доводят
скорость аэрации до 350 л воздуха в час. Подготавливают фер-
ментер к работе в соответствии с рекомендациями, описанными
в разделе 7.4.3.2. (Размеры ферментера см. рис. 7.7.) В ходе
эксперимента рн среды не регулируется и обычно колеблется
между 5,0 и 6,0. Наибольшая биомасса, получаемая в резуль-
тате эксперимента, обычно составляет 10 г сухой массы на 1 л
среды.
2.	Через 5 дней готовят растворы (3-метилдигитоксина в метаноле
(10 мл, 40 мг/мл) и вводят их в реакционную смесь. Процеду-
ру повторяют каждые два дня. При этих условиях (3-метилди-
гоксин должен продуцироваться клетками за 14 дней инкуба-
ции до концентрации около 475 мг/л. В качестве загрязняю-
щих побочных продуктов образуются небольшие количества
пурпуреагликозида А и диацетилланатозида С.
3.	Перед анализом с помощью жидкостной хроматографии под
высоким давлением отделяют соединения от компонентов
культуры, в которой происходила ферментация, путем повтор-
199
—н	~н	-сн3	-н	р -метилдигитоксин
-он	-н	-сн3	-н	/з-метилдигоксин
-н	-н	-глюкоза	-н	пурпуреагликозид А
-он	-н-глюкоза-н	диацетилланатозидС
Рис. 7.10. /^Метилдигитоксин и связанные с ним продукты биотрансформации.
ной экстракции клеток и питательной среды ацетонитри-
лом.
При использовании этой системы внутри культивируемых клеток
содержалось лишь 10% соединений, в то время как более 90% было
обнаружено в питательной среде.
7.6.1.3.	Биотрансформация в иммобилизованных клетках
Реакции биотрансформации можно проводить также с использо-
ванием клеток D. lanata, упакованных в полимерный матрикс геля
альгината кальция. Возможность использовать клетки таким образом
кажется весьма привлекательной, поскольку это повышает вероят-
ность использования клеток в качестве биокатализаторов повторного
действия. Нижеприведенная методика описывает использование иммо-
билизованных клеток для (3-12-гидроксилирования (З-метилдигито-
ксина.
1.	Выращивают клетки D. lanata линии 287Т в среде МС с добав-
лением аминокислотной смеси гидролизата казеина в концент-
рации 1 г/л, 1 мг/л ИУК, 2 мг/л кинетина и 22 г/л глюкозы. Перед
стерилизацией доводят pH среды до 5,5.
2.	Переносят 30 г клеток (сырая масса) в свежую-Среду аналогич-
ного состава для культивирования в течение недели (30Q мл
в литровую колбу Эрленмейера) и инкубируют при 24 °C на
круговой качалке при 120 об/мин под расссянным светом.
3.	Готовят иммобилизованные клетки в соответствии с методами,
описанными в разделе 7.5.1. Инкубируют порции по 25 шариков
в 25 мл среды в колбах Эрленмейера объемом-100 мл при тех
же условиях, что и на стадии 2.
4.	Растворяют сердечные гликозиды (/3-метилдигитоксин) в 50%
метаноле до концентрации 1 мг/мл и добавляют в каждую кол-
бу 1 мг иммобилизованных клеток после стерилизации фильт-
рованием.
200
Рис. 7.11. Биотрансформация ^-метилдигитоксина
иммобилизованными клетками D. lanata, выросши-
ми на свету: 1 — /3-метилдигитоксин нетрансфор-
мированный, 2 /3-метилдигитоксин, 3 — /З-метил-
дигоксин [40].
5.	На третий день инкубации добавляют
в каждую, колбу еще по 0,5 мг гли-
козидов.
6.	На шестой день переносят шарики в
свежую среду, содержащую /3-мстил-
дигитоксин в конечной концентрации
40 мг/л.
7.	Повторяют эту процедуру через три
дня, а затем еще через день.
8. Анализируют среду
на наличие продуктов биотрансформации,
аналогичные описанным для свободножи-
используя методы,
вущих суспензионных культур клеток.
На рисунке 7.11 изображена кривая кинетики образования /З-мстил-
дигоксина из /3-мстилдигитоксина иммобилизованными клетками D. 1а
nata, выросшими на свету, в течение 61 дня. Из рисунка видно, что в
продолжение всего эксперимента снижения общей способности клеток
к гидроксилированию не наблюдается. Окончание эксперимента, оче-
видно, определялось распадом альгинатного геля. Из общего количе-
ства добавленного метилдигитоксина, равного 1160 мг, около 409 мг
остались нетрансформированными. Из оставшихся 751 мг образова-
лось 532 мг метилдигоксина и 10 мг пурпуреагликозида А. Однако,
поскольку используются лишь соединения, содержащиеся в среде, ве-
ществами, локализованными внутри клетки, можно пренебречь. В
данном случае 398 мг нетрансформированного . метилдигитоксина,
оставшегося в среде, можно вновь использовать во второй системе
биотрансформации. Так как пурпуреагликозид А не представляет ни-
какой ценности с медицинской точки зрения, можно считать, что общий
выход составляет примерно 67%, учитывая молекулярные массы со-
ответственно субстрата и продукта.
В заключение, сравнивая относительные свойства описанных систем,
необходимо отметить, что, видимо, иммобилизованные клетки D. lanata
могут трансформировать /3-метилдигитоксин в тот же продукт, что и
свободные клетки суспензионной культуры, и, кроме того, способны
к более длительной биокаталитической активности. Однако, с другой
стороны, биологическая активность этой системы вдвое ниже, чем
системы свободно культивируемых клеток суспензионной культуры
при сходных условиях культивирования.
201
ЛИТЕРАТУРА
1.	Staba, Е. J. (1982) in Plant Tissue Culture, Proceedings of the 5th International
Congress on Plant Tissue and Organ Culture, Fujiwara, A. (ed.), Maruzen Co. Ltd., Tokyo,
p. 25.
2.	Dougall, D. K. (1979) in Plant Cell and Tissue Culture - Principles and Applica-
tions, Sharp, W. R., Larsen, P. D., Paddock, E. F. and Raghaven, V. (eds.), Ohio State
University Press, p. 727.
3.	Berlin, J. (1984) Endeavour, 8, 5.
4.	Bisson, W., Beiderbeck, R. and Reichling, J. (1983) Plant. Med., 47,164.
5.	Mantell, S. H. and Smith, H. (1983) in Plant Biotechnology, SEB Biology Semi-
nar Series 18, Mantell, S. H. and Smith, H. (eds.), Cambridge University Press, p. 75.
6.	Zenk, M. H., El-Shagi, H. and Schulte, U. (1975) Plant. Med., Suppl., 79.
7.	Zenk, M. H„ El-Shagi, H., Arens, H., Stockigt, J., Weiler, E. W. and Deus, B.
(1977) in Plant Tissue Culture and its Biotechnological Applications, Barz, W., Reinhard,
E. and Zenk, M. H. (eds.), Springer-Verlag, Berlin, p. 27.
8.	Smart, N. L, Morris, P. and Fowler, M. W. (1982) in Plant Tissue Culture, Proce-
edings of the 5th International Congress on Plant Tissue and Organ Culture, Fujiwara,
A. (ed.), Maruzen Co. Ltd., Tokyo, p. 397.
9.	Fujita, Y., Hara, Y., Suga, C. and Morimoto, T. (1981) Plant Cell Rep., 1, 61.
10.	Harbourne, J. B. (1983) Phytochemical Methods, published by Chapman &
Hall, London.
11.	Slierma, J. and Zweig, G. (1971) Paper Chromatography, published by Aca-
demic Press, New York.
12.	Stahl, E., ed. (1979) Thin layer chromatography, published by George Allan
& Unwin, London.
13.	Baerheim-Suendsen, A. and Verpoorte, R. (1983) Chromatography of Alka-
loids Part A. TLC, published by Elsevier, Amsterdam.
14.	Court, W. E. (1963) in Shellard, E. J. (ed.), Quantitative Paper and Thin Layer
Chromatography, Academic Press, London, p. 29.
15.	Fried, B. and Sherma, J. (1982) TLC: Techniques and Applications. Chromato-
graphic Science Series Vol. 17, published by Marcel Dekker, New York.
16.	Simpson, C. (1970) Gas Chromatography, published by Kogan Page, London.
17.	Pryde, A. and Gilbert, M. T. (1979) Applications of HPLC, published by Chap-
man & Hall, London.
18.	Weiler, E. W. (1983) Biochem. Soc. Trans., 11,485.
19.	Scott, A. I. (1964) Interpretation of the UV Spectra of Natural Products, pub-
lished by Pergamon Press, Oxford.
20.	Williams; D. H. and Fleming, I. (1980) Spectroscopic Methods in Organic Che-
mistry, 3rd ed., published by McGraw Hill.
21.	Cross, A D. and Jones, R. A. (1969) An Introduction to Practical IR Spect-
roscopy, 3rd ed., published by Butterworths, London.
22.	Waller, G. R. (1972) Biochemical Applications of Mass Spectrometry, published
by Wiley Interscience, New York.
23.	Gabetta, B. and Mustich, M. (1975) Spectral Data of Indole Alkaloids, published
by Invern: Della Beffa, Milan, Italy.
24.	Mabry, T. J., Markham, K. R. and Thomas, M. B. (1970) The Systematic
Identification of Flavonoids, published by Springer-Verlag, Berlin.
25.	Thompson, R. H. (1971) Naturally Occurring Quinones, published by Academic
Press, London.
26.	Yamaguchi, K. (1970) Spectral Data of Natural Products, published by Elsevier,
Amsterdam.
27.	Farnsworth, N. R., Blomster, R. N., Damratoski, D., Meer, W. A. and Canmarato,
L. V. (1964) Lloydia, 27, 302.
202
28.	Street, H. E. (1977) in Plant Tissue and Cell Culture, Street, H. E. (ed.), Black-
well Scientific Publications, Oxford, p. 61.
29.	Curtin, M. E. (1983) Biotechnology, 1, 649.
30.	Aspinall, G. D., Molloy, J. A. and Craig, J.W.T. (1979) Can. J. Biochem., 47
1063.
31.	Townsley, P. M., Webster, F., Kutney, J. P., Salisbury, P., Hewitt, G., Kawawura,
N., Choi, L. and Kurihara, T. (1983) Biotechnol. Lett., 5,13.
32.	Fowler, M. W. (1976) LKB Application Note, 252.
33.	Smart, N. J. and Fowler, M. W. (1984) J. Exp. Bot., 35, 531.
34.	Wilson, G. (1980) in Advances in Biochemical Engineering, vol. 16, Fiechter,
A. (ed.), Springer-Verlag, Berlin, p. 1.
35.	Rosevear, A. and Lambe, C. (1983) Top. Enzyme Ferment. Biotechnol., 7, 13.
36.	Mattiasson, B. (1982) Immobilized Cells and Organelles, Vol. II, published by
CRC Press Inc., Florida.
37.	Brodelius, P. and Mosbach, K. (1982) J. Chem. Technol. Biotechnol., 32, 330.
38.	Prenosil, J. E. and Pederson, H. (1983) Enzyme Microb. Technol., 5, 323.
39.	Alfermann, A. W., Boy, H. M., Doller, P. C., Hagedorn, W., Heins, M., Wald,
J. and Reinhard, E. (1977) in Plant Tissue Culture and Its Biotechnological Application,
Barz, W., Reinhard, E. and Zenk, M. H. (eds.), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg and
New York, p. 125.
40.	Alfermann, A. W., Schuller, I. and Reinhard, E. (1980) Plant. Med., 40, 218.
8. КРИОСОХРАНЕНИЕ И ХРАНЕНИЕ ГЕНОФОНДА
Л. А. УИЗЕРС
8.1.	ВВЕДЕНИЕ
Одним из основных требований в селекции растений является обес-
печенность источниками генов [1,2]. Поскольку в работе по улучшению
признаков сельскохозяйственных растений методы in vitro приобретают
все более важное значение благодаря применению генетики соматиче-
ских клеток, генетические источники становятся более вариабельными
в разных вариантах, начиная от протопластов и кончая регенерантами
(см. другие главы этой книги). Несмотря на то что семена в качестве
единицы хранения удовлетворяют основным требованиям, предъявляе-
мым к обычным генетическим источникам, часть материала, получае-
мого in vitro, необходимо хранить в культуре. Хранение в условиях
in vitro, очевидно, является оптимальным выходом из положения для
тех видов растений, семена которых не могут храниться в обычных
условиях. К таким растениям относятся культуры, образующие плохо
прорастающие („короткоживущие”) семена, а также вегетативно раз-
множаемые виды [3] .
Не вся работа in vitro нацелена на получение растений, способных
далее расти в условиях грунта. Например, создаются линии клеток и
каллусов, синтезирующие ценные продукты вторичного метаболизма
в культурах, растущих в больших объемах. Более того, для исследова-
ния физиологических и биохимических процессов, происходящих в
культурах тканей, несомненно, понадобятся стандартные исходные
культуры, а в связи с этим и необходимость сохранять материал в
течение определенного промежутка времени в ходе серийных экспери-
ментов. Таким образом, как в сельском хозяйстве, так и в биотехноло-
гии существует потребность в надежных методах хранения культур.
8.2.	ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ХРАНЕНИЯ
В течение многих лет для поддержания исходных культур использо-
валось постоянное выращивание растений при более или менее оптималь-
ных условиях. Такой подход хотя и позволяет наблюдать за здоровым
растущим материалом, однако ему присущи серьезные недостатки,
связанные с генетической нестабильностью (например, риск возник-
новения сомаклональной изменчивости [4]), высокой стоимостью,
опасностью загрязнения чужеродным генетическим материалом и слу-
чайной утерей собственного генетического материала. Для поддержа-
204
ния культуры тканей обычно требуются регулярные пересадки на све-
жую питательную среду через каждую неделю, две недели или месяц,
что оказывается довольно трудоемким процессом при наличии несколь-
ких культур. Поэтому как в практическом, так и в научном отношении
необходимо найти альтернативные методы хранения, требующие мень-
ше времени и финансовых затрат.
Иными словами, задача состоит в том, чтобы изменить кинетику
роста культуры и увеличить временной интервал между пересадками.
В одних случаях это позволило бы пересаживать культуру раз в квартал
или в год, в других — сроки можно было бы увеличить до нескольких
лет, десятилетий или даже столетий. В обычном понимании сохранение
генофонда растений можно представить себе как активную и базовую
коллекции [5], причем последняя могла бы поддерживаться в безопас-
ности в течение длительного времени, не истощаясь из-за передачи части
материала потребителям. Эти два типа банков генов индентичны двум
основным подходам к хранению культур, развиваемым в настоящее
время: путем замедленного роста и криосохранения (хранения в за-
мороженном состоянии).
8.2.1.	МЕДЛЕННЫЙ РОСТ
Медленный рост в течение всего периода выращивания при оптималь-
ных условиях культивирования характерен для небольшого числа куль-
тур. Такие культуры не требуют специальной обработки, необходимой
для увеличения времени между пересадками и обеспечения соответст-
вующих условий хранения „активной коллекции”. Однако для большин-
ства культур необходимы факторы, ограничивающие рост.
Наиболее очевидный путь замедления роста состоит в снижении
температуры культивирования. Другой способ, часто в сочетании с
первым, заключается в использовании гормональных или осмотических
ингибиторов. Яркие примеры подавления роста за счет удаления или
сокращения количества необходимых питательных веществ найти чрез-
вычайно трудно. В крайне редких случаях для замедления роста исполь-
зовали снижение уровня кислородного питания [6]. Этот подход нужда-
ется в дополнительном исследовании.
8.2.2.	КРИОСОХРАНЕНИЕ
Хотя большинство культур обладают низкой скоростью роста и
удалось значительно увеличить время между пересадками, оказалось
невозможным, что неудивительно, сократить скорость роста до нуля.
Таким образом, современные знания не позволяют перевести культуры
в состояние покоя, наблюдаемое в обычных семенах. Пока еще для
полного прекращения роста тканей высших растений доступно лишь
205
одно средство — замораживание при сверхнизких температурах, на.
пример при температуре жидкого азота —196 °C.
Чрезвычайно незначительное число культур, если они вообще су.
ществуют, обладают естественной устойчивостью к замораживанию.
Поэтому необходимо соблюдать особые условия при подготовке мате-
риала к замораживанию, в процессе замораживания и оттаивания, а так-
же в ходе возобновления роста. Эти стадии суммированы и разобраны
более детально в разделе 8.4 (см. также [6—8]).
8.2.2.1.	Предварительное выращивание
В течение нескольких дней или, по крайней мере, нескольких часов
перед началом замораживания большинство культур требует специаль-
ной подготовки и (или) условий культивирования для выработки
максимальной устойчивости к пониженным температурам. Для различ-
ных систем культивирования и для разных видов растений эти требо-
вания неодинаковы*.
8.2.2.2.	Криопротекторы
Воздействие на культуру определенными веществами примерно
за 1 ч до замораживания приводит к изменениям проницаемости кле-
ток, точки замерзания и реакции клеток на стрессы, вызванные замо-
раживанием и оттаиванием, необходимыми для выживания этих клеток.
Наиболее часто в этих целях используют диметилсульфоксид (ДМСО)
и глицерин. ДМСО иногда применяют один, тогда как глицерин главным
образом эффективен в сочетании с ДМСО или другими соединениями
типа сорбита, маннита, сахарозы, пролина или полиэтиленгликоля.
Криопротекторы обычно готовят в двойной концентрации на среде
для культивирования (что повышает эффективность обработки) и перед
внесением разводят, pH доводят до стандартного и среду стерилизуют
фильтрованием**, чтобы избежать возможной карамелизации сахаров
или других процессов разрушения компонентов среды, возможных
при автоклавировании. Добавление криопротектора может быть по-
степенным или одноразовым при пониженной температуре (например,
* Требования к подготовке часто оказываются различными не только для
разных видов и культуральных систем, но и для разных штаммов клеток
(Chen Т. Н. Н., Kartha К. К. et al., Plant Physiol. 1984, 75, 726-731; Попов А. С.,
Волкова Л. А., Черняк Н. Д. - В кн.: Культура клеток растений и биотехнология.
М., 1986, с. 219-222). — Прим. ред.
** Вполне допустимо автоклавирование приготовленных на среде растворов
криопротекторов, но в мягком режиме (0,7—0,9 кг/см2, 15 + 15 мин). Однако
автоклавирование гибберелловой кислоты и некоторых аминокислот не рекомен-
дуется (Дж. Пол. Культура клеток и тканей. М.: Медгиз, 1963). Удаление ДМСО
после оттаивания обязательно для возобновления культуры (Попов А. С., Чер-
няк Н. Д., Пауков В. Н. — Физиол. расг., 1984, с. 602—605). - Прим. ред.
206
во льду) или при комнатной. В работе стоит попробовать все варианты,
что не всегда, однако, может оказаться эффективным.
Считают, что криопротекторы обладают определенной токсичностью,
поэтому их применяют с осторожностью. Чаще всего их стараются быст-
ро удалить после оттаивания, однако, как мы увидим в дальнейшем,
это может вызвать некоторые осложнения.
8.2.2.3.	Замораживание
При замораживании в промежутке между первыми отрицательными
температурами и примерно —100 °C происходят такие важные измене-
ния, как образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих
изменений часто зависит от изучаемого образца и от обработки крио-
протекторами, но главным образом — от скорости охлаждения. При
медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда,
приводящее к обезвоживанию клеток до того, как будет достигнута
температура замерзания цитоплазмы. Быстрое охлаждение вызывает
более раннее замораживание клеток изнутри и меньшее обезвоживание.
При быстром охлаждении образующиеся кристаллы льда вызывают
повреждения клеток. С другой стороны, в результате излишнего обез-
воживания происходят повреждения иного типа, но столь же губитель-
ные для клеток. Таким образом, выживание клеток зависит от равно-
весия двух противодействующих повреждающих сил. И в этом случае
оптимальные условия замораживания зависят от вида растений.
8.2.2.4.	Хранение
Во избежание эффектов повреждения, в том числе повторного
образования кристаллов льда, замороженные культуры необходимо
хранить при низкой температуре, по крайней мере, при —100 С. На
практике для этого удобнее всего использовать жидкий азот (—196 С)
или его пары (—150 °C).
8.2.2.S.	Оттаивание
При слишком медленном оттаивании клеток в них происходит
повторное образование льда, оказывающее повреждающее действие.
Степень повреждения пропорциональна количеству внутриклеточного
льда. В этом случае основная мера предосторожности — быстрое оттаи-
вание. Легче всего его провести, капая на замороженные образцы теплую
воду или среду для культивирования. Однако в исключительных слу-
чаях более целесообразным оказывается медленное оттаивание.
8.2.2.6.	Возобновление роста
Основная часть биофизических изменений в клетках происходит
при замораживании и оттаивании, однако только что оттаявшие клетки
207
сильно предрасположены к дальнейшим повреждениям и поэтому тре-
буют соответствующего „выхаживания”. Часто это начинается с прямого
пересаживания клеток на восстанавливающую среду без промывки
для сохранения в клетках криопротекторов, хотя могут быть созданы
специальные условия отмывки. Для исследуемых образцов можно
подобрать стандартные или модифицированные среды для культивиро-
вания, однако, за редким исключением, агаризованные среды предпоч-
тительнее жидких.
8.2.3.	СТРАТЕГИИ ХРАНЕНИЯ
В отсутствие других определяющих факторов желательно применять
такие методы хранения и стандартные методики, которые удовлетворяют
временным масштабам, возможностям контроля или прекращения роста
суспензионных культур, а также возможностям лабораторного оборудо-
вания. Однако в настоящее%время это едва ли возможно. Главными
препятствиями для этого являются отсутствие удобных методик
для каждой культуры, проблемы генетической нестабильности и
межгеномные изменения, проявляющиеся как реакция на процесс
хранения.
Таким образом, пока мы ни в коем случае не должны отступать
от рекомендованных методов хранения, которые оказались эффектив-
ными для определенных видов растений и которые остаются до сих
пор лучшими из тех, что мы имеем. Более того, практическая возмож-
ность выбора между медленным выращиванием и криосохранением
существует лишь для культур побегов. Для каллусных культур в техни-
ческом отношении оба подхода достижимы, однако при медленном
росте существует опасность возникновения генетической нестабильно-
сти. Для всех остальных систем в настоящее время реально лишь крио-
сохранение, хотя и оно в техническом отношении еще несовершенно.
До сих пор недостаточно разработаны подходы к высокоэффективному
восстановлению хранившегося материала и к сохранению его генетиче-
ской стабильности. Правда, в последней проблеме достигнут опреде-
ленный прогресс с тех пор, как оценке восстановленного материала
уделяют все большее внимание.
8.3.	ОБОРУДОВАНИЕ
Требования к поддержанию культур до и после хранения включены
в стандартную процедуру культивирования. Необходимость оценки
восстановленного материала требует соответствующего микроскопи-
ческого и биохимического оборудования (см. разд. 8.6).
208
8.	3.1. МЕДЛЕННЫЙ РОСТ
Все медленнорастущие культуры статичны и поэтому требуют лишь
места на полке и соответствующих условий хранения. Обычно сосуды
для хранения культур представляют собой пробирки (в штативах),
бутыли или колбы с соответствующими крышками. Было высказано
предположение в исследовании по поддержанию культур побегов
Chrysanthemum morifolium, что тип крышки влияет на состояние культу-
ры. Слишком герметичная крышка служит причиной образования непод-
ходящей газовой среды внутри сосуда. Этого можно избежать, помещая
между крышкой и горлышком сосуда бумажную или целлюлозную
прокладку[9].
Во многих случаях, если задержка роста вызвана изменениями
состава среды, для хранения используют обычную комнату для куль-
тивирования. Иногда эффективным оказывается и снижение уровня
освещенности. Для роста культур, у которых в качестве ограничиваю-
щего фактора использована пониженная температура/ вполне пригод-
на небольшая комната, смежная с основной комнатой для культиви-
рования, но с более низкой температурой.
8.	3.2. КРИОСОХРАНЕНИЕ
Специальные приборы используются на двух стадиях криосохране-
ния: в период подготовки к хранению и при самом хранении. Подго-
товка к хранению, т. е. перенос образцов из нормальной для культиви-
рования температуры в сверхнизкую температуру жидкого азота, тре-
бует наличия прибора для замораживания более или менее сложной
конструкции. В серийных экспериментах по изучению скоростей замо-
раживания рекомендуется замораживатель с программным управлением
(типа выпускаемых фирмой L Air Liquide, Cryo-Med, Planer и др.)*.
В их устройство входит рабочая камера, охлаждаемая с запрограммиро-
ванной скоростью (скоростями) введением паров жидкого азота.
В другом типе замораживателей, менее дорогостоящих, но и менее
мобильных, образцы охлаждаются путем погружения в камеру, запол-
ненную жидкостью с низкой температурой плавления; которая охлаж-
дается с помощью электрической холодильной установки. Установка
может быть термостатирована на определенную конечную температуру,
достижение которой происходит со скоростью, зависящей от объема
камеры, заполненной жидкостью. Кроме того, температура может регу-
лироваться с помощью программного устройства, обеспечивающего
* Программные замораживатели выпускает СКТБ с ОП Института проблем
криобиологии и криомедицины АН УССР (310093, Харьков, ул. Скорохода, 4). -
Прим. ред.
209
Рис. 8.1. Простой прибор для замораживания, использованный Уизерсом и Кингом
[Ю].
Обозначения: 1 — термостатированная холодильная камера, 2 - установка для
глубокого замораживания, 3 — отдельная спиртовая баня, 4 — неискрящая мешал-
ка, 5 — пробирка с образцом (в поплавке из пенопласта, см. рис. 8.2, Г) , б — циф-
ровой термометр, 7 — полиэтиленовый пакет с изолирующей крошкой из пено-
пласта.
любой желаемый профиль охлаждения. Это устройство было использо-
вано Уизерсом и Кингом [10] в простой камере для замораживания
(рис. 8.1).
Еще проще устроены аппараты, в которых используются изолирую-
щие свойства контейнеров типа сосуда Дьюара или коробки из пено-
пласта (рис. 8.2, А, Б; [11, 12]), применяемые для постепенного сни-
жения температуры образцов до уровня, при котором их можно пере-
вести на постоянное хранение. Суспендирование образцов в парах жид-
кого азота или погружение в охлаждающую баню, проводимые при
определенной (одной) отрицательной температуре, представляют собой
еще два упрощенных варианта охлаждения (рис. 8.2, В, Г) . Окончатель-
ное охлаждение медленно охлаждавшегося материала до температуры
210
Рис. 8.2. Импровизированные замора-
живающие аппараты: А — ампулы
помещают в сосуд Дьюара, который,
в свою очередь, помещают в холо-
дильник с температурой -70... -80 °C
[11]; Б - ампулы хранят в пенопла-
стовом ящике со специально проделан-
ными для них отверстиями, который
помещают в холодильник на -70...
-80°C; В - ампулы связывают вместе
и подвешивают на стеклянной палоч-
ке, лежащей поперек сосуда Дьюара,
заполненного жидким азотом и по-
крытого изолирующей крышкой из
пенопласта; Г — ампулы помещают
на плотик из пенопласта, плавающий
на поверхности холодного спирта. А
и Б — скорость охлаждения зависит
от изоляционных свойств сосуда Дьюа-
ра или коробки, В — от расстояния
между ампулами и поверхностью жид-
кого азота, Г - ампулы хранятся при
постоянной температуре.
хранения, а также быстрое охлаждение, проводимые в зависимости
от образцов, потребуют небольших широкогорлых сосудов Дьюара.
Лабораторные морозильники (около —20 °C) и камеры с сухим
льдом (около —78 °C) для хранения материала непригодны, особенно
морозильники, в которых невозможно контролировать внутрсклеточ-
ное замораживание. Морозильные установки, работающие от электро-
сети, с температурным минимумом примерно —100 °C могут быть ис-
пользованы для довольно продолжительного хранения. Однако, по-
скольку при этом требуется определенный запас жидкого азота,
необходимый в случае неисправностей в электроснабжении, проще
использовать морозильники, охлаждаемые жидким азотом. В них под-
держивается температура —196 °C в жидкой фазе и около —150 °C в
парах жидкого азота (рис. 8.3). При этом более предпочтительно хра-
нение материала в многоярусных выдвижных полках, чем в коробках
или „жестянках”.
Для оттаивания желательно иметь водяную баню, внутри которой,
чтобы снизить риск заражения, помещают контейнер со стерильной
водой.
На разных этапах процесса криосохранения требуются определенные
инструменты и приспособления.
Отбор образцов (например, кончиков побегов): пинцеты, скаль-
пели, препаровальные иглы, иглы для подкожных инъекций.
2.	Криосохранение: стерильные пастеровские пипетки, мембранные
фильтры (размер пор 0,22 мкм), шприцы, стерильные чашки Петри.
211
Рис. 8.3. Холодильник, охлаждаемый жидким азотом; ампулы с образцами хранят
в выдвижных ящиках.
3.	Замораживание: стерильные пропиленовые ампулы с завинчиваю-
щейся крышкой и местом для подписей (предпочтительнее, чем стеклян-
ные, см. разд. 8.5.1), пакеты из фольги, пакеты из полиэтиленовой
пленки (запаянные нагреванием).
4.	Оттаивание, стерильные пастеровские пипетки, пинцеты.
212
8.4.	СПОСОБЫ ХРАНЕНИЯ: МЕДЛЕННЫЙ РОСТ
В настоящее время замедление роста достигнуто лишь для куль-
тур побегов и растений-регенерантов. Для каллусных культур подобный
подход имеет ряд ограничений. Методы, описанные ниже, озаглавлены
в соответствии с модификациями, проведенными для создания нормаль-
ных условий культивирования. При отсутствии аналогичных экспери-
ментов, проведенных на большом числе различных видов растений,
предполагается, что вначале необходимо сравнить эффективность сниже-
ния температуры выращивания с данными по применению в качестве
осмотического ингибитора маннита. Сочетание этих двух подходов
и включение „гормональных” ингибиторов лежат в основе дальней-
ших исследований.
8.4.1.	ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Для культивирования в искусственных условиях в течение дли-
тельного промежутка времени характерны особенности, не встречающие-
ся при нормальном росте. Например, сосуды для культивирования
должны быть прочными и иметь крышки, не портящиеся во время
культивирования. Пленки из парафилма, по-видимому, необходимо
периодически менять. Во избежание истощения питательных веществ
и обезвоживания, вызывающего осмотический стресс, полезно увели-
чить объем агаризованной среды. Жидкая питательная среда, вероятно,
менее удобна, поскольку активнее испаряется (см. ниже). Необходимо
отметить, что реакция культуры зависит от типа используемой среды,
особенно при осмотическом стрессе. Как правило, он сильнее в жид-
кой среде.
8.4.2.	ВЫРАЩИВАНИЕ ПРИ ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ
(Рекомендуется для каллусов и культур побегов)
1.	Готовят сосуды для культивирования и стандартную среду (см.
разд. 8.3).
2.	Помещают в них экспланты из полученной ранее культуры, рас-
тущей при обычной температуре.
3.	Для возобновления роста переносят экспланты в стандартные усло-
вия культивирования (примерно на 4 недели).
4.	Переносят экспланты в условия с более низкой температурой:
4- 10 °C для культур, нормально растущих при 20—25 °C; 15—20 °C
для культур, обычно растущих при температуре около 30 °C (см.
[6, 13—15]). Наиболее предпочтителен 16-часовой фотопериод при
пониженном освещении (до 50 лк [9]); полное затемнение может
привести к разрушению хлорофилла в культурах побегов.
213
5,	Культуры периодически проверяют, например раз в месяц, на нали-
чие бактериального заражения, разрушения крышек или пробок,
на плохое состояние растительного материала или его чрезмерный
рост.
6.	Переносят культуры на свежую питательную среду и повторяют
операции начиная со стадии 3 (см. также ниже).
Проблемам продолжительного хранения материала после первого
периода ограниченного роста (обычно 1 год, возможно, 2 года и более)
посвящено незначительное число исследований. Поэтому процесс воз-
обновления культур характеризуется значительной неопределенностью.
Физиологическое состояние материала при каждом переносе, а следо-
вательно, и реакция на условия выращивания при замедленном росте
все время будут варьировать. При этом может помочь еще одно
независимое получение материала (см. выше стадию 3). Кроме того,
Старицкий [13] обнаружил, что периодическая кратковременная экспо-
зиция (без переноса на свежую среду) материала при нормальной
температуре культивирования способствует увеличению устойчивости
культивируемых образцов к продолжительному выращиванию при
пониженной температуре. Жидкая питательная среда по сравнению
с другими типами обладает следующим преимуществом: ее можно
просто доливать небольшими порциями к хранящейся культуре
через определенные промежутки времени.
8.4.3.	ВЫРАЩИВАНИЕ В ПРИСУТСТВИИ ОСМОТИЧЕСКИХ ИНГИБИТОРОВ
(Рекомендуется для культур побегов)
1.	Готовят сосуды для культивирования и среду, например, стандарт-
ную среду с добавлением маннита в концентрации 3—6% (масса
к объему).
2.	Вносят зкеплант, полученный из стабилизированной культуры,
растущей на стандартной среде.
3.	Помещают экспланты в стандартные условия культивирования
или в условия ослабленного освещения (см. разд. 8.2, стадия 4).
4.	Периодически проверяют материал на инфицированность (см.
разд. 4.2, стадия 5) .
5.	Переносят культуры на свежую среду и переводят в условия куль-
тивирования, описанные выше.
8.4.4.	КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В ПРИСУТСТВИИ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА
(Рекомендуется для культур побегов)
Метод поддержания культур сходен с представленным в разде-
ле 8.4.3, за исключением ингибиторов роста. В питательную среду можно
добавлять ССС (цикоцель) в концентрации 2 г/л, Б-девять (и-диметил-
214
Рис. 8.4. Методы криосохранения: тип I — медленное постепенное замораживание,
тип II - сухое замораживание, тип III — быстрое замораживание, тип IV — сверх-
быстрое замораживание. После предварительного выращивания и обработки крио-
протекторами (во всех случаях на льду или при комнатной температуре, причем
для типов I и II предпочтительнее первое, а для типов III и IV - последнее) образцы
распределяют по ампулам (исключение - тип IV), причем для типов I и III крио-
протекторы остаются в среде. Для типов I и II охлаждение проводят с постоянной
скоростью (___________ ) до температуры ниже О °C, перед тем как перенести
ампулы в жидкий азот; с постоянной скоростью до окончательной отрицательной
температуры ( . _____________. ___) до переноса в жидкий азот; путем прямот е
переноса ампул в условия постоянной отрицательной температуры (----. — . -)
и последующим переносом в жидкий азот. (Варианты приведены для типа I, а
первый для типа II.) Для типа III охлаждение быстрое за счет прямого погружения
ампулы в жидкий азот. Для типа IV охлаждение происходит сверхбыстро: образец
фиксируют, например, на игле для подкожных инъекций и опускают в жидкий азот.
Во всех методах образцы хранят — в или над жидким азотом и в основном оттаивание
происходит быстро. В исключительных случах (для типа II показано -.-.-) мед-
ленное оттаивание может оказаться предпочтительнее. Во всех методах оттаявший
образец переносят в чашку с питательной средой, обычно без промывки.
сукцинаминовая кислота) в концентрации около 50 мг/л или АБК
(абсцизовая кислота) в концентрации 5—10 мг/л (см. [6, 14, 16]).
8.4.5.	СОЧЕТАНИЕ ОГРАНИЧИВАЮЩИХ ФАКТОРОВ
Этой стороне проблемы уделялось недостаточное внимание, особен-
но при изучении устойчивости культур к потенциально аддитивным
215
эффектам. В тех случаях, когда культуры испытывают вредное влияние
стрессовых воздействий, может оказаться полезной комбинация двух
факторов, каждый из которых применяется в умеренных дозах. Перс-
пективность подобного подхода можно проиллюстрировать на примере
культур побегов картофеля, рост которых происходил в присутствии
АБК и при постепенном снижении температуры культивирования от
22 до 6 °C [16] и которые успешно хранились при 10 С под ингибирую-
щим действием Б-девять [14].
8.5.	СПОСОБЫ ХРАНЕНИЯ: КРИОСОХРАНЕНИЕ
Методы, в которых применяется замораживание до температуры
жидкого азота, разработаны лишь для суспензионных культур. Для
остальных систем культивирования описанные ниже методы можно
предложить лишь как лучший на сегодня вариант, нуждающийся в
доработке. Наиболее детально описана методика для клеточных сус-
пензий. Приводимые ниже методы схематично представлены на рисун-
ке 8.4.
8.5.1.	СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК
Метод, подробно изложенный ниже, относится к типу 1 (см. рис. 8.4.)
и основан на рекомендациях Уизерса и Кинга [10]. Он обеспечивает
высокую вероятность успеха для любого * вида растения. Для улуч-
шения состояния материала, трудно поддающегося замораживанию,
предложены и другие возможные типы обработки на различных этапах
процесса. В принципе можно выявить характеристики образцов, затруд-
няющих процесс замораживания. Большие вакуолизированные клетки
менее устойчивы к замораживанию, чем мелкие клетки с большим
количеством цитоплазмы. То же можно сказать и о больших массах
плотных клеток по сравнению с мелкодисперсными суспензионными
культурами рыхлых агрегатов клеток. Тропические виды растений
могут оказаться менее устойчивы, чем растения умеренной зоны. Могут
также возникать проблемы с полуорганизованным материалом,
например с тканями, содержащими зачатки корней.
1.	Вносят клетки с довольно высокой относительной плотностью в
исходной суспензии в стандартную среду для культивирования
с добавлением маннита в концентрации 6% (масса к объему). Куль-
* Данную фразу не следует понимать буквально. И осмотик (маннит или
сорбит), и его концентрацию, и время предварительного культивирования с ним
необходимо оптимизировать для данных клеток. — Ирим. ред.
216
тивируют в стандартных условиях (предварительное подращива-
ние) .
2.	Через 4 дня клетки собирают. Концентрируют их примерно в 3 раза
(в зависимости от вида).
3.	Охлаждают клетки на льду.
4.	Готовят раствор криопротекторов: 1 М ДМСО+1 М глицерина+
2 М сахарозы в среде для культивирования (в двойной концен-
трации, см. разд. 8.2.2.2)*. Охлаждают на льду.
5.	Постепенно добавляют равный объем раствора криопротекторов
к суспензии клеток и хорошо перемешивают. (Раствор криопро-
текторов очень плотный и вязкий. Удобно и эффективно проводить
смешивание на магнитной мешалке или небольшой плоской качалке,
помещенной в холодную комнату.)
6.	Инкубируют на льду в течение 1 ч.
7.	Разливают порциями по 1 мл в стерильные полипропиленовые
пробирки объемом 2 мл. Их закрывают и помечают. (Если далее
для охлаждения используется спиртовая баня, пользуются устойчи-
выми к растворителю чернилами либо процарапывают метку на
пробирке раскаленной иглой.)
8.	Охлаждают пробирку со скоростью примерно 1 °С**/мин до
—35 °C, а затем оставляют на 40 мин при —35 °C. После этого быстро
переносят пробирки для охлаждения в жидкий азот.
9.	Хранят в жидком азоте или его парах.
10.	Для оттаивания пробирку помещают в стерильную воду при +40 °C.
С достаточной эффективностью можно проводить оттаивание одно-
временно четырех пробирок примерно в 150 мл воды. Использова-
ние стеклянной банки с крышкой облегчает эффективное переме-
шивание и предохраняет работающего сотрудника от внезапных
взрывов и выбросов содержимого из пробирки. По этой причине
не рекомендуется работать со стеклянными пробирками, поскольку
при взрыве они могут служить источником травм. Перемеши-
вание проводят только до того момента, когда в пробирке
* Подбор криопротекторов, их концентраций и смесей необходимо начинать
в более широком диапазоне. - Прим. ред.
** Целесообразна еще меньшая скорость охлаждения: 0,5 и даже
0,25° С/мин, по крайней мере, до —30 °C, а затем ее можно увеличить до
10°С/мин. Очень важно инициировать кристаллизацию раствора при температуре
не более чем на 1 -2 ° С ниже точки его замерзания с последующей инкубацией
при этой же температуре (Самыгин Г. А. Причины вымерзания растений. М.: Наука,
1974; Бутенко Р. Г., Попов А. С. и др. Цитология, 1983, 25, с. 1191-1196;
Keefe Р. D., Henshaw G. G., Cryo-Letters, 1984, 5, р. 71-78). В Харькове с 1989 г.
появятся программные замораживатели, имеющие устройство для инициа-
ции кристаллизации раствора в ампулах и контейнерах с биообъектами.
Прим. ред.
8 - 1021
217
останется лишь маленькая ледяная пробочка. Переносят пробирку
в штатив.
11.	Переносят клетки из суспензии на поверхность чашки со стандартной
агаризованной средой. Материал из одной пробирки распределяют
по трем чашкам*.
12.	Клетки инкубируют в стандартных условиях. Примерно через 2 дня
удаляют оставшуюся жидкость, в которой были суспендированы
клетки**.
13.	После образования „газона” из клеток вводят его в суспензионную
культуру с соответствующей, относительно высокой плотностью
клеток.
Для предварительного подращивания можно использовать и стан-
дартную немодифицированную среду для культивирования или среду,
содержащую 1 М пролина, 1 М сорбита или какую-либо иную из возмож-
ных добавок в более низкой концентрации***. При применении 1 М
сорбита срок инкубирования необходимо сократить до 20 ч или менее
[17]. Пролин в концентрации 1 М в смеси криопротекторов можно
заменить сахарозой. Другие составы криопротекторов приведены
в таблице 8.1.
Нет необходимости проводить медленное охлаждение ниже при-
мерно —40 °C. В этом случае, минуя стадию выдерживания, пробирки
переносят прямо в жидкий азот сразу же после того, как будет достиг-
нута конечная температура при медленном охлаждении. Медленное
оттаивание оказывается эффективным в исключительных случаях
[6, 8], чаще оно вызывает летальный исход.
Возобновление роста можно попытаться провести в жидкой пита-
тельной среде (с промывкой или без нее), однако это приемлемо, види-
мо, лишь при использовании очень токсичного криопротектора. При
культивировании в жидкой питательной среде в колбах на круговой
качалке или в стационарных условиях в небольшом объеме в чашке
Петри необходимо учитывать влияние плотности клеток на эффектив-
ность роста, которое нивелируется добавлением среды (постепенно
разбавляемой, того же состава, что использовалась во время предвари-
тельного подращивания). И все же предпочтительной остается культура
на агаризованной среде, а трудно возобновляющие рост образцы можно
* Иногда приходится поступать наоборот: суспензию из 2-3 ампул высе-
вать на одну чашку. Это зависит от выживаемости клеток и их исходной кон-
центрации. - Прим. ред.
** Жидкость желательно удалить сразу после полного осаждения клеток,
чтобы улучшить их аэрацию. - Прим. ред.
*** Например, аспарагин, аланин, глицин, бетаин, серин Предварительное
культивирование с одним из них в течение 7—8 дней и более даже в концентрациях
0,01-0,05 М может оказаться субгоксичным, но благоприятным для крио-
сохранения (Волкова Л. А. и др. Физиол. раст., 1984, 31, с. 632-638). -
Прим. ред.
218
8.1.	Препараты криопротекторов, используемые при криосохранении
суспензионных клеточных культур *
ДМСО	Глицерин	Пролин	Сахароза	Глюкоза	Этилен- гликоль	Полиэти- ленгли- коль 6000
3,5**	—	—	—	—	—	—
5	—	—	—	—	—	—
7	—	—	—	—	—	—
10	5		—		—	—
	10	—	—	—	—	—
—	15	—	—	—	—	—
—	—	10	—	—	—	—
2,5	2,5	—	—	—	—	—
5	1	—		—	—	—
5	5	—	—	—	—	—
(0,5 М)	(0,5 М)	—	—	—	—	—
5	10	—	—	—	—	—
10	10	—	—	—	—	—
12	—	—	—	5	—	—
(0,5 М)	(0,5 М)	(1 М)	—	—	—	—
(0,5 М)	(0,5 М)	—	(1М)	—	—	—
3	—	—	—	4	2,5	—
10	—	—	—	8	—	—
10		—	—	8	—	10
*	Подробнее см. [8].
*	* Приведены конечные концентрации, выраженные в процентах.
перенести на чашки с кормящим слоем [18] или, если клетки нанесены
на фильтровальную бумагу, через 2—3 ч на чашку со свежей питательной
средой [17] *.
8.5.2.	ПРОТОПЛАСТЫ
В некоторых случаях [19, 8] протопласты удалось хранить при
низких отрицательных температурах (см. метод типа I, рис. 8.4).
1.	Готовят протопласты из культивируемых клеток или тканей, про-
мывают и концентрируют в несколько раз до нормальной плотности
инокуляции. Охлаждают на льду.
2.	Готовят раствор криопротекторов: 10% (объем к объему) ДМСО +
+ 20% (масса к объему) глюкозы (в двойной концентрации) в среде
для культивирования протопластов, включая и осмотический стаби-
лизатор. Охлаждают на льду.
* Можно использовать кондиционированную среду, взятую из той же или
другой, но биологически совместимой культуры, находившейся в экспоненциаль-
ной фазе роста, отфильтровав ее от клеток. — Прим. ред.
219
3.	К суспензии протопластов медленно добавляют равный объем
раствора криопротекторов и тщательно перемешивают.
4.	Инкубируют в течение 1 ч на льду.
5.	Распределяют по пробиркам, как было описано ранее. Заморажи-
вают со скоростью 1—2°С/мин до —30 или - 40 °C, а затем переносят
в жидкий азот. Оставляют на хранение.
6.	Оттаивание проводят быстро в воде температурой +40°C.
7.	Промывают в свежей среде для протопластов и вносят в чашку
с жидкой или агаризованной средой.
8.5.3.	КАЛЛУС
Для работы с каллусами используют два подхода (оба по типу I,
рис. 8.4). Во-первых, с ними можно обращаться, как и с суспензионной
культурой, дробя каллусную массу на маленькие кусочки и далее по-
ступая, как описано в разделе 8.5.1 [20, 21]. Во-вторых, каллусные мас-
сы можно обрабатывать в интактном состоянии, однако в этом случае,
возможно, кусочек ткани, если его размер слишком велик, будет обра-
ботан не полностью. Большая часть успешных экспериментов с исполь-
зованием последнего подхода была выполнена Финклом и др. [22] *
по следующей методике.
1.	Готовят раствор криопротекторов: 20% (объем к объему) ДМСО+
+20% (объем к объему) полизтиленгликоля +16% (масса к объему)
глюкозы в среде для культивирования ( = двойной концентрации).
Охлаждают на льду.
2.	Погружают кусочки каллуса в среду для культивирования. Охлаж-
дают на льду. Добавляют равный объем охлажденного раствора
криопротекторов.
3.	Инкубируют на льду в течение часа.
4.	Разливают по пробиркам.
5.	Замораживание проводят со скоростью 1 °С/мин до —40 °C. Перено-
сят в жидкий азот. Оставляют на хранение.
6.	Оттаивание проводят быстро в воде при +40 °C.
7.	Промывают свежей средой для культивирования приблизительно
при +22 °C.
8.	Помещают на стандартную агаризованную среду.
8.5.4.	ЗАРОДЫШИ
К этой категории относятся два типа образцов: зиготические и
соматические зародыши. Зародыши внутри обычных семян без труда
* В этих опытах каллусы содержали много эмбриоидогенных клеточных
масс с мелкими клетками. - Прим. ред.
220
выдерживают замораживание. Незрелые зародыши с большим содер-
жанием воды также могут быть заморожены (см. методику в
разд. 8.5.3 или приведенную ниже для соматических зародышей; про-
цедура типа II, рис. 8.4). Зародыши с высоким содержанием воды внут-
ри замоченных зрелых семян гораздо труднее поддаются криосохране-
нию [23]; в этом редко возникает необходимость, за исключением
модельных экспериментов, связанных с изучением плохо прорастаю-
щих семян. Однако в последнее время были предприняты попытки
разработать методы их криосохранения. Совсем недавно Граут и др.
[24, 25] сообщили об успешных экспериментах, в которых использова-
лись обезвоживание, замораживание и последующая регенерация куль-
туры зародышей, полученных из семян масличной пальмы (Elaeis
guinensis). Методика, основанная на схеме типа III (рис. 8.4), приведена
ниже.
1.	Удаляют зиготический зародыш.
2.	Подсушивают зародыш на воздухе до содержания воды около 10%.
Помещают зародыш в пробирку или пакет из фольги *.
3.	Быстро замораживают в жидком азоте. Оставляют на хранение.
4. Проводят быстрое оттаивание в воде при +40 °C.
5. Вносят на соответствующую агаризованную среду.
Соматическим зародышам также уделяли недостаточно внимания,
хотя они представляют удобную возможность для описания методики
криосохранения по типу „сухое замораживание” (тип II, рис. 8. 4),
которую можно применять для других объектов, в том числе и для
незрелых зиготических зародышей. Метод был разработан Уизерсом
[26] для работы с соматическими зародышами моркови, для которых
неприемлемы методы криосохранения клеточных суспензий, из кото-
рых эти зародыши были получены. Подробности сухого замораживания
приведены ниже. (Один или два случая сохранения каллусов, возможно,
связаны с ранними стадиями развития в них соматических зародышей,
например у масличной пальмы [27], и соответствуют процедурам, опи-
санным в разделах 8.5.2 или 8.5.3.)
1.	Готовят раствор криопротекторов: 20% (объем к объему) ДМСО
в среде для культивирования ( = двойной концентрации).
2.	Погружают зародыши в среду для культивирования. Охлаждают.
Добавляют равный объем раствора криопротектора. Инкубируют
на льду в течение 1 ч.
3.	Отделяют зародыши от раствора криопротектора фильтрацией или
с помощью пинцета, подсушивают на фильтровальной бумаге.
* И в пробирках, и в фольге прослойка воздуха нарушает теплопередачу.
В пакет из фольги, кроме того, возможно проникновение жидкого азота. При
влажности около 10% медленное оттаивание предпочтительнее, поскольку оно
уменьшает морфологические повреждения крупных организованных структур
при быстром вскипании жидкого азота. — Прим. ред.
221
7.	Удаляют эфир на роторном испарителе при пониженном давлении
и хранят получившиеся липосомы (ПИОФ) в атмосфере азота.
8.	Переносят около 1 X 106 протопластов в стеклянную центрифуж-
ную пробирку объемом 50 мл и осаждают в течение 5 мин при
ЮО g.
9.	Дважды промывают 5 мМ трис-НС1 (pH 7,6), содержащим 5 мМ
СаС12 и 0,5 М маннита (среда для слияния), ресуспендируя конеч-
ный осадок в среде для слияния до конечного объема 0,5 мл.
10.	Осторожно смешивают протопласты с препаратом липосом и остав-
ляют на 30 сек.
11.	Добавляют 5 мл 20% (масса к объему) ПЭГ 6000 к среде для слия-
ния и перемешивают.
12.	Инкубируют в течение 15 мин при 25 °C.
13.	Добавляют 20 мл среды для слияния, переливают смесь в стеклян-
ную центрифужную пробирку объемом 50 мл и осаждают протопла-
сты в течение 5 мин при 100 g.
14.	Дважды промывают протопласты в среде для слияния.
15.	Ресуспендируют осадок в 10 мл инкубационной смеси (табл. 9.5),
переносят в коническую колбу объемом 100 мл или чашку Петри
и инкубируют в темноте при 28 °C.
Таким способом можно инфицировать до 70% популяции протопла-
стов мезофилла табака. При оптимальных условиях, которые в деталях
могут отличаться от описанных, можно добиться сходного эффекта и
при инфицировании протопластов других видов растений другими
видами вирусов.
9.2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАКОПЛЕНИЯ ВИРУСА, ВИРУСНОГО АНТИГЕНА
И ВИРУСНОЙ НУКЛЕИНОВОЙ кислоты
Развитие инфекции при инкубации инфицированных протопластов
можно изучать различными способами в зависимости от требований
эксперимента. Обычно относительное количество инфицированных про-
топластов определяют по накоплению вирусных антигенов в клетке,
используя антивирусную сыворотку. Кроме того, стало общепринятым
оценивать накопление инфекционного вируса путем выделения нуклео-
протеида или вирусной нуклеиновой кислоты и заражения клеточным
экстрактом соответствующего растения-хозяина, дающего некротиче-
скую реакцию. Реже, хотя она и достаточно целесообразна, используется
оценка общего накопления вирусных частиц. Для определения накопле-
ния вирусного антигена и нуклеиновой кислоты существуют чувстви-
тельные методы фермент-связанного иммуносорбентного анализа
(ELISA) и точечной молекулярной гибридизации соответственно.
При изучении новой комбинации вирус — хозяин рекомендуется
проследить за развитием заражения в небольших порциях инфициро-
ванной суспензии через короткие промежутки времени в течение первых
244
72 ч. Некоторые вирусы накапливаются до максимальных количеств
и за более короткое время. Например, вирус мозаики табака достигает
максимальной концентрации в протопластах табака за 24 ч. Для других
вирусов может понадобиться более длительное время — до 60 или 72 ч.
9.2.4.1.	Определение относительного количества инфицированных прото-
пластов с помощью окрашивания флоуресцирующими антителами
Протекание процесса заражения можно успешно оценивать путем
определения числа инфицированных клеток косвенным методом с
использованием флуоресцирующих антител, где вирусный антиген в
фиксированном препарате клеток сначала взаимодействует с антивирус-
ной сывороткой, полученной из крови кролика. (Для некоторых сыво-
роток может потребоваться абсорбция белками здорового растения.)
Наличие антивирусной сыворотки кролика определяется затем по реак-
ции антисыворотки, полученной из крови барана, против антисыворотки
кролика к вирусу. При этом флуоресцеином метится антисыворотка
барана.
1.	Наливают протопласты (2 X 106) в коническую центрифужную
пробирку объемом 10 мл, промывают один раз 0,7 М маннитом и
ресуспендируют в 5 мл 0,7 М маннита.
2.	Каплю суспензии отмытых протопластов размазывают по поверх-
ности предметного стекла и быстро подсушивают теплым воздухом.
3.	Фиксируют мазок в ацетоне, высушенном над СаС12, в течение
30—45 мин.
4.	Осторожно промывают в дистиллированной воде примерно 10 мин
для удаления маннита.
5.	Уравновешивают фосфатным буфером (5 мМ, pH 7,1) с 0,145 М
NaCl (ФБН), выдержав в этой смеси 15 мин.
6.	Наливают на мазок антивирусную сыворотку, разбавленную соот-
ветствующим образом, и оставляют для взаимодействия с фикси-
рованными клетками во влажной камере на 24 ч при 20 С.
Рис. 9.1. Микрофотография прото-
пласта Chenopodium quinoa, инфици-
рованного вирусом кольцевой пятни-
стости Cymbidium; вирусные частицы
выявлены методом непрямых флуо-
ресцирующих антител [16].
245
4.	Заворачивают зародыши в стерильный пакет из фольги или поме-
щают в пробирку (не добавляя раствора криопротектора).
5.	Охлаждают со скоростью 1 °С/мин до —40 °C. Переносят в жидкий
азот. Оставляют на хранение.
6.	Проводят медленное оттаивание, поместив контейнер с образцами
на воздух при комнатной температуре.
7.	Переносят зародыши на агаризованную среду стандартного состава
или с содержанием 1% активированного угля.
8.5.5.	ЗАРОДЫШИ ИЗ ПЫЛЬНИКОВ И ПЫЛЬЦЫ
Этим объектам уделяли так мало внимания, что трудно дать даже
краткие рекомендации. Можно попробовать применить любой из мето-
дов, описанных в разделах 8.5.1 — 8.5.4 и 8.5.6.
8.5.6.	КОНЧИКИ ПОБЕГОВ
Для криосохранения кончиков побегов, обладающих большим
набором разных структур в отличие от протопластов и клеточных сус-
пензий, необходимы совершенно другие требования. В последние годы
в развитии методов замораживания был достигнут значительный успех,
хотя все еще приходится сталкиваться со многими проблемами, включая
совершенно разные потребности и реакции на замораживание*. В мето-
дах хранения, описанных ниже, изложены совершенно различные под-
ходы. Приспосабливая зти методы к определенным видам, необходимо
уделять внимание оптимизации таких параметров, как состав среды
(соответствующей условиям предварительного выращивания и варьи-
рующей в зависимости от продолжительности выращивания), концент-
рация криопротекторов, скорость охлаждения и температура переноса.
8,5.6.1.	Быстрое замораживание
Метод относится к типу III и IV (см. рис. 8.4) [28-31].
1.	Изолируют кончики побегов. Помещают их в чашку Петри на фильт-
ровальную бумагу, смоченную в стандартной среде для культиви-
рования или в среде, в которую добавлено 5% (объем к объему)
ДМСО. Инкубируют в течение 48 ч.
2.	Готовят раствор криопротектора: 10% (объем к объему) ДМСО
в среде для культивирования.
3.	Удаляют избыток среды для культивирования из чашки Петри,
в которой подращивались кончики побегов, и пипеткой добавляют
* Важнейшее значение при формировании нового примордия имеет физиоло-
гическое состояние верхушки побега, которого он достигает к началу заморажива-
ния, в частности расширение пластохрона и детерминирование некоторых клеток. -
Прим. ред.
222
раствор криопротектора, который за счет капиллярных сил пропиты-
вает фильтровальную бумагу и достигает кончиков побегов. Инку-
бируют в течение 1 ч.
4.	Далее выбирают один из следующих путей:
а.	Переносят кончики побегов и 1 мл раствора криопротектора
в пробирку, закрывают ее и помечают. Замораживание проводят
со скоростью 1 С*/мин до —40 °C. Помещают в жидкий азот,
оставляют на хранение (далее см. стадию 5).
б.	Собирают кончики побегов на покровное стекло или отбирают
в иглу для подкожных инъекций. Помещают их в жидкий азот,
оставляют на хранение (далее см. стадию 6).
5.	Проводят оттаивание, поместив пробирку в стерильную теплую
воду при +40 °C (далее см. стадию 7).
6.	Проводят оттаивание, поместив покровное стекло или иглу в жид-
кую среду для культивирования при температуре +25 С (далее
см. стадию 7).
7.	Помещают кончики побегов на стандартную полужидкую среду
или среду, содержащую гормоны [например, нафтилуксусную кисло-
ту, гибберелловую кислоту и (или) цитокинин].
8.5.6.2.	Медленное замораживание
Этот метод относится к типу I (см. рис. 8.4) [32—34].
1.	Изолируют кончики побегов и подращивают (см. разд. 8.5.6.1,
стадия 1).
2.	Готовят и вносят криопротектор (см. тот же раздел, стадии 2 и 3).
3. Распределяют по пробиркам (см. тот же раздел, стадия 4а).
4.	Замораживание проводят со скоростью около 0,5 С/мин до —40 С.
Погружают в жидкий азот. Оставляют на хранение.
5.	Оттаивают (см. раздел 8.5.6.1, стадия 5).
6.	Возобновляют рост (см. тот же раздел, стадия 7).
Недавно опубликованы варианты этой методики [35], в которых
использовалось распределение кончиков побегов по каплям размером
2—3 мкл в чашке Петри на подложке из фольги. Подложка погружена
в теплую среду для культивирования, необходимую для оттаивания
кончиков побегов.
8.6.	УСЛОВИЯ ДЛЯ УСПЕШНОГО ХРАНЕНИЯ
8.6.1.	МАТЕРИАЛ С ЗАМЕДЛЕННЫМ РОСТОМ
Преимуществом хранения медленнорастущих культур является
их наглядная реакция на выживаемость. Это, конечно, не означает,
♦Замораживание со скоростью 1°С/мин никак нельзя считать быстрым. С
другой стороны, замораживание по п. 46 следует считать сверхбыстрым, и эта тер-
минологическая разница отражает различные скорости процесса. — Прим. ред.
223
что выживаемость, определенную качественным показателем, можно
считать удовлетворительным критерием. Для проверки степени выжи-
ваемости требуются физиологические исследования, оценка морфоло-
гического и биохимического состояния и генетический анализ потомства
(для фертильного материала).
Культуры целых организованных побегов, по-видимому, необратимо
не повреждаются при замедленном выращивании. Однако, если попу-
ляция гетерогенна, может происходить некоторый отбор. Более того,
если происходит каллусообразование и образуются адвентивные побеги,
эти процессы могут стать источником генетической изменчивости, чувст-
вительной к давлению отбора.
Каллусные культуры, обладающие способностью синтезировать
нужные вторичные метаболиты, теряют активность и проявляют ва-
риабельность синтеза после хранения в течение 10 месяцев при темпера-
туре около 4 °C [36]. В связи с этим замедленный рост при пониженных
температурах не может быть рекомендован в качестве метода хранения
каллусных культур. Весь материал, находящийся в состоянии замедлен-
ного роста, вероятно, следует оценивать по критериям, важным для
данного материала, с интервалом, например, раз в 3 месяца.
8.6.2.	МА ТЕРИАЛ. ПОДВЕРГШИЙСЯ КРИОСОХРАНЕНИЮ
Когда материал находится на крио сохранении, состояние культур
оценить невозможно. К счастью, при хранении нет необходимости в
периодическом исследовании материала, и поэтому оценка проводится
лишь после оттаивания и нужна для использования культур.
Определенным тестом на выживание, его количественной оценкой,
является рост после восстановления, хотя для быстрой оценки пригод-
нее тест на жизнеспособность. Качественные оценки требуют соответ-
ствующих анализов.
8.6.2.1.	Тесты на жизнеспособность
Ниже приведены три теста определения жизнеспособности. Первые
два используют для образцов, видимых под микроскопом в проходящем
свете, т. е. клеточных суспензий, протопластов, небольших каллусных
и организованных структур. Третий, ТТХ-тест, удобен для клеток,
каллусов и плотных, относительно крупных организованных структур,
однако он не достаточно эффективен на зеленом материале.
В первые несколько минут результаты тестов могут быть нечеткими,
иногда этот период растягивается на несколько часов после оттаивания.
Поэтому тесты лучше всего проводить через определенный промежуток
времени, желательно на следующий день. Тесты можно проводить пе-
риодически в процессе возобновления роста для контроля за увеличе-
нием содержания жизнеспособных клеток или живой ткани.
224
Окрашивание флуоресцеиндиацетатом (ФДА-тест)
1.	Готовят исходный раствор красителя: 0,5% (масса к объему) ФДА
в ацетоне. Хранят в холодильнике.
2.	Готовят разбавленный раствор красителя: 0,1 мл исходного раст-
вора в 5 мл среды для культивирования. Хранят на льду и исполь-
зуют в течение 1 ч.
3.	Смешивают одну каплю разведенного красителя с одной каплей
клеточной суспензии (или среды, в которую погружены дру-
гие образцы) на предметном стекле и накрывают покровным
стеклом.
4.	Через 2—5 мин смотрят под световым микроскопом на светлом
поле клетки и различные включения, а затем под ультрафиолето-
вым светом, выявляя ярко флуоресцирующие „живые” клетки
(см. рис. 8.5,Л).
5.	Для количественной оценки образцов, в которых можно различить
отдельные клетки, подсчитывают общее число клеток, видимых
в обычном свете и при ультрафиолетовом освещении, используя
ручной счетчик.
Примечание. Цветная реакция со временем становится менее
четкой и теряет специфичность. Флуоресценция, диффундируя, может
появиться в большинстве клеток и в среде для культивирования.
Тесты на отсутствие окрашиваемости. Для замороженного материала
в основном используют два: окрашиванием синим Эванса и феносафра-
нипом.
Рис. 8.5. Клетки суспензионной культуры, окрашенные флуоресцеиндиацетатом
и синим Эванса: А - флуоресцирующие живые клетки в УФ-свете, Б - сильно-
окрашенные погибшие клетки на белом поле.
225
1.	Готовят растворы красителей: синий Эванса — 0,025% (масса к объе-
му), феносафранин — 0,1% (масса к объему), оба в среде для куль-
тивирования.
2.	Смешивают каплю краски с каплей клеточной суспензии на пред-
метном стекле и накрывают покровным стеклом.
3.	Через 5 мин дважды промывают свежей средой для культивирова-
ния. Наблюдают под световым микроскопом при дневном свете.
„Живые” клетки останутся неокрашенными, а „мертвые” накопят
краску. Эта реакция противоположна реакции на окрашивание
флуоресцеиндиацетатом (ФДА) (см. рис. 8.5, Л, Б) .
Для идентификации выживших клеток и их окрашенных ядер
окраска синим Эванса сочетается с окраской по Фельгену [37]. Для
сохранения синего окрашивания мертвых клеток необходимо поддержи-
вать водную среду.
1.	Проводят окрашивание синим Эванса, как описано выше.
2.	Фиксируют образец не более 3 ч в 50% муравьиной кислоте.
3.	Проводят гидролиз 1 М НС1 в течение 5 мин при 60 °C. (Время
гидролиза зависит от размера образца.)
4.	Окрашивают по Фельгену, реактивом Шиффа, при комнатной темпе-
ратуре примерно 45 мин.
5.	Промывают три раза по 5 мин водой, насыщенной SO2, и один раз
дистиллированной водой.
6.	Делают давленые препараты и заключают в хлораль камеди (водный
раствор 80% гуммиарабика и 50% хлораль гидрата). Стекла хранят
в холодильнике (в течение 2 4 дней).
7.	Анализируют под световым микроскопом с помощью микроден-
ситометра (для количественного определения ДНК).
Восстановление 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида (ТТХ-тест). Этот тест
описан в главе 1, разделе 1.5.3.6.
8.6.2.2.	Изучение роста
1.	Суспензионные культуры клеток. Можно использовать все стандарт-
ные методы измерения роста, включая прирост сырой и сухой
массы, объем осевших клеток, объем упакованных клеток и опти-
ческую плотность (в культурах с большими объемами). Эти пара-
метры лучше всего измерять одновременно с определением жизне-
способности, по крайней мере, на ранних этапах возобновления
роста. Метод возобновления роста [17] (см. разд. 8.5.1) облегчает
определение прироста сырой массы, поскольку позволяет через
определенные промежутки времени из чашки Петри отбирать ку-
сочки фильтровальной бумаги с сидящими на ней клетками.
2.	Протопласты. В данном случае при восстановлении роста сначала
регенерирует клеточная стенка. За этим процессом можно наблю-
226
дать с помощью микроскопии в ультрафиолетовом свете после
окрашивания клеток 1% раствором „Calcofluor white”. Последую-
щие оценки лучше проводить, используя прямое микроскопическое
наблюдение отдельных протопластов и продуктов деления образо-
ванных из них клеток (в культуре на агаризованной среде и, на-
сколько зто возможно, в жидкой среде). После полного восстанов-
ления с культурой можно обращаться, как с обычной суспензион-
ной или каллусной культурой.
3.	Каллус. Лучше всего использовать прямое микроскопическое наблю-
дение, а также измерять прирост каллусной массы по величине
сырой и сухой массы.
4.	Зародыши. С ними обращаются, как с каллусом, а также следят
за появлением признаков организованного роста и каллусообразо-
вания.
5.	Зародыши из пыльников и пыльцы. С ними следует обращаться,
как отмечалось в пункте 4.
6.	Кончики побегов. Пригодны те же методы оценки, что и в предыду-
щих случаях.
8.6.2.3.	Световая и электронная микроскопия
Световая микроскопия материала, заключенного в воск или смолу,
дает возможность оценить степень повреждений и восстановительных
процессов, происходящих в тканях. Кроме того, стандартные цитоло-
гические методы позволяют получить информацию о кариотипе образца
(см. выше метод окрашивания по Фельгену, разд. 8.6.2.1). Однако
более точные данные можно получить лишь при исследовании ультра-
структуры. Для замороженных образцов используют два метода: замо-
раживание-замещение и замораживание-травление. Для незаморожен-
ных, оттаявших и восстановленных образцов используют обычные ме-
тоды электронно-микроскопического анализа ультратонких срезов.
Ниже описаны методы, успешно применяемые нами [38, 39], хотя,
конечно, можно использовать любой стандартный метод электронной
микроскопии. На рисунке 8.6 приведены электронно-микроскопические
фотографии типичных образцов, полученные с помощью описанных
ниже методов.
Замораживание-скалывание.
1.	Замораживают образец на срезе.
2.	Готовят сколы, протравливают и напыляют платину.
3.	Промывают реплику в растворе гипохлорита натрия (10—14%
активного хлора) в течение 16 ч, а затем обрабатывают в течение
24 ч 70% серной кислотой.
4.	Помешают реплику на сетку и наблюдают под электронным ми-
кроскопом.
227
Рис. 8-6. Микроскопическое исследование повреждений, причиненных заморажи-
ванием: А — электронная микроскопия, реплика, полученная методом скола,
видны ядро (Я), цитоплазма (If) и везикулы (В) ; Б - электронная микроскопия,
ультратонкий срез, полученный методом замораживания-замещения, видны орга-
неллы (М — митохондрии; Д диктиосома, которая выглядит светлой на фоне
электронно-плотной цитоплазмы), полость льда (Л) и мембрана тонопласта (7);
В — световая микроскопия агрегата клеток, приготовленных для электронной
микроскопии, но срезанных толще; Г электронная микроскопия, ультратонкий
срез оттаявшей клетки, видны повреждения, вызванные замораживанием, про-
являющиеся в набухании митохондрий (М) и прикреплении эндоплазматического
ретикулума (ЭР) к ядру (Я).
Замораживание-замещение.
1	Помещают образец в ампулу, у которой дно сделано из парафилма.
Замораживают и оставляют в жидком азоте.
2.	Готовят фиксирующий раствор: 2% (масса к объему) тетраоксида
осмия в ацетоне. Разливают в полипропиленовые пробирки объе-
мом 5 мл. Охлаждают в смеси спирт/сухой лед до -78 С.
3.	Не вынимая из жидкого азота, удаляют у ампулы дно из нарафилма.
Быстро переносят ампулу в пробирку с фиксирующим раствором.
4.	Оставляют пробирку с фиксирующим раствором при —78 С на
3 недели. За это время образец освободится от льда и осядет в
фиксатор. Удаляют ампулу, в которой находился образец.
5.	Переносят пробирку с фиксирующим раствором в смесь спирт/су-
хой лед и оставляют на ночь, чтобы смесь постепенно нагрелась
до комнатной температуры.
6.	Промывают образец ацетоном, смесью ацетон/этанол и дважды
этанолом, пи 15 мин — 1 ч в зависимости от размера.
7.	Заливают стиролметакрилатом.
8.	Делают ультратонкие срезы, окрашивают цитратом свинца и анали-
зируют под электронным микроскопом.
Стандартная фиксация и заливка. Образцы, приготовленные описан-
ным выше способом, можно нарезать на кусочки толщиной 1—5 мкм,
срезы собрать и поместить на предметное стекло, окрасив 0,5% (масса
к объему) толуидиновым синим в 1% (объем к объему) уксусной
кислоте. Окрашенные препараты пригодны для исследования под свето-
вым микроскопом. Для контроля за восстановлением организованных
структур может оказаться полезным параллельное изучение серийных
срезов под световым и электронным микроскопами.
1.	Фиксируют 6% глутаральдегидом в 0,1 М фосфатном буфере (pH
7,0) в течение 3—16 ч (в зависимости от размера образца) .
2.	Промывают трижды буфером в течение 10—30 мин.
3.	Проводят постфиксацию 1% тетраоксидом осмия в фосфатном бу-
фере в течение 0,5—2 ч.
4.	Обезвоживают образцы, проводя через растворы 30, 50, 70, 90
и 100% этанола, по 10—30 мин на каждом этапе.
5.	Окрашивают в течение 0,5—1 ч 1% спиртовым раствором уранил-
ацетата.
6.	Промывают 100% этанолом, смесью этанола и стиролметакрилата,
а затем дважды стиролметакрилатом, каждый раз по 0,5—1 ч.
7.	Заливают стиролметакрилатом.
8.	Готовят ультратонкие срезы, окрашивают цитратом свинца и анали-
зируют под электронным микроскопом.
8.6.2.4. Физиологическая и биохимическая оценка
В связи с огромным разнообразием растений, используемых для
криосохранения, мы можем предложить лишь возможные подходы
к решению этих задач.
229
1.	Измерение интенсивности дыхания. Только что оттаявшие образцы,
видимо, обладают ослабленным потреблением кислорода и дыха-
нием (хотя в некоторых системах можно наблюдать кратковремен-
ное увеличение интенсивности дыхания как сигнала серьезных
повреждений). Дыхательную активность определяют с помощью
ТТХ-теста (см. разд. 8.6.2.1, 1.5.3.6). Можно использовать также
кислородный электрод. Добавление 2,4-динитрофенола вызовет
разобщение дыхания. Поврежденные клетки, видимо, по-иному
реагируют как на сопряженное, так и па разобщенное потребление
кислорода по сравнению с нормальными клетками [И]. Хорошей
коррелирующей оценкой является измерение потребления 3-0-метил-
Л-глюкозы [11].
2.	Тесты на целостность мембран, измерение потерь электролита и
истощение внутриклеточных пулов метаболитов. Отток ионов
из образцов можно определить непосредственно по увеличению
проводимости окружающей среды* или косвенно, измеряя оста-
точные концентрации ионов с помощью атомной абсорбционной
спектрофотометрии [И]. Для обнаружения изменений в пулах
АТФ, глюкозо-6-фосфата, пирувата и других соединений мож-
но использовать ферментативные методы [11]- ФДА-тест (см.
разд. 8.6.2.1) позволяет определить как активность ферментов
(эстеразы), так и целостность мембран (способность задерживать
флуоресцеин).
3	Синтез вторичных продуктов. В данном случае можно использовать
стандартные подходы в расчете на плотность жизнеспособных кле-
ток. Детальный анализ состояния восстановленного материала
описан [40] для клеток суспензионной культуры Digitalis lanata,
способных к биотрансформации дигитоксина в дигоксин (см. также
гл. 7).
4.	Электрофорез изоферментов. Этот метод применяется для иденти-
фикации генотипов различных организмов. Он был применен и для
анализа подвергшихся криосохранению каллусных культур [22].
8.	7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ: ГЕНОФОНД РАСТЕНИЙ IN VITRO - ЦЕННЫЙ ИСТОЧНИК
ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
Культуры растений in vitro получают все большее признание в селек-
ции растений, промышленном производстве и фундаментальных иссле-
дованиях. Они оцениваются по их уникальной генетической идентично-
сти, а также усилиям, затраченным на изолирование и культивирование,
уход за культурами, их безопасное хранение, подробное описание данных
и распространение среди потребителей. В данной главе рассмотрены
* См. также: Самыгин Г. А. и др. Физиол. раст., 1985, 32, с. 813-818. —
Прим. ред.
230
различные аспекты хранения растительного материала; в последующих
разделах изложены положения, связанные в этой проблемой и требую-
щие серьезного внимания.
8.7.1.	РАСПРОСТРАНЕНИЕ КУЛЬТУР
Культуры побегов распространялись по всему миру из различных
активных коллекций in vitro, имеющихся в международных центрах
(например, МЦК — Международный центр картофеля, МЦТЗ — Между-
народный центр тропического земледелия, МИТСХ — Международный
институт тропического сельского хозяйства); при этом уделялось
внимание подготовке, упаковке и заботе о растениях в соответствии
с необходимыми требованиями [41].
Так как при обмене необходимо распространять материал, свобод-
ный от инфекций, всем партнерам следует соблюдать меры предосто-
рожности во избежание возможности случайного переноса скрытых
патогенов.
Внимание методам in vitro для коллекционирования генофонда
культивируемых растений стали уделять совсем недавно [42]. Надеемся,
что методы отбора и размножения наиболее распространенных сель-
скохозяйственных культур вскоре станут традиционными.
Все вышеупомянутые соображения применимы к культурам, под-
держиваемым на агаризованых средах. Однако для очень кратковремен-
ных переездов можно использовать и культуры в жидких средах, поме-
щая их в небольшие пузырьки. Распространение замороженных культур
еще только начинается.
8.7.2.	ХАРАКТЕРИСТИКА И ОЦЕНКА
Все типы источников генов растений необходимо описывать как
можно более полно. Этого же принципа следует твердо придерживаться
в работе по их сохранению. Материал в культуре in vitro отличается
от исходного в том смысле, что морфологические особенности, позво-
ляющие определить исследуемое целое растение, в культуре скорее
всего отсутствуют либо модифицированы. В связи с этим возрастает
важность альтернативных методов оценки: цитологии ядра, анализа
изоферментов, изучение синтеза вторичных метаболитов, а в перспек-
тиве использование методов молекулярной биологии.
8.7.3.	ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
Ценность научно-исследовательской работы невелика, если ее конеч-
ные результаты недоступны другим ученым. Это относится и к исследо-
ваниям по размножению in vitro, и генетическому сохранению важных
231
сельскохозяйственных культур. Учитывая это, Международный совет
по генетическим ресурсам растений разработал проект обмена информа-
цией (включая сбор, проверку и ее распространение [43]), согласно
которому все исследователи могут получить современную информацию
о развитии и применении методов хранения in vitro.
ЛИТЕРАТУРА
1.	Holden, J. Н. W. and Williams, J. T., eds. (1984) Crop Genetic Resources: Conser-
vation and Evaluation, published by Allen and Unwin, London.
2.	Wilkes, G. (1983) CRC Crit. Rev., 1,131.
3.	Withers, L. A. and Williams, J. T. (1982) Crop Genetic Resources: The Conserva-
tion of Difficult Material, published by IUBS/IBPGR, Paris, IUBS Series B42.
4.	Scowcroft, W. R., Ryan, S. A., Brettell, R. I. S. and Larkin, P. J. (1985) in
Biotechnology in International Agricultural Research. IRRI Press, Manila, p. 99.
5.	IBPGR (1983) IBPGR Adyisory Committee on In Vitro Storage — Report of the
first meeting, IBPGR Publication AGP:IBPGR/82/84, International Board for Plant
Genetic Resources, Rome.
6.	Withers, L. A. (1984) in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, 2:
Cell Growth, Nutrition, Differentiation and Preservation, Vasil, 1. K. (ed.), Academic
Press, Orlando, Florida, in press.
7.	Kartha, К. K. ed. (1985) Cryopreservation of Plant Cells and Organs, published
by CRC Press, Boca Raton, in press.
8.	Withers, L. A. (1985) in Cryopreservation of Plant Cellsand Organs- Kartha, К. K.
(ed.), CRC Press, Boca Raton, in press.
9.	Preil, W. and Hoffmann. M. (1985) in Proceedings: EEC Symposium on In Vitro
Techniques — Propagation and Long-Term Storage, in press.
10.	Withers, L. A. and King, P. J. (1980) Cryo-Lett., 1, 213.
11.	Celia, R., Colombo, R., Galli, M. G., Nielsen, E., Rollo, F. and Sala, F. (1982)
Physiol. Plant., 55, 279.
12.	Maddox, A., Gonsalves, F. and Shields, R. (1983)Plant Sci. Lett., 28,157.
13.	Staritsky, G. (1985) in Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications,
Withers, L. A. and Alderson, P. G. (eds.), Butterworths, London, in press.
14.	Mix, G. (1984) in Efficiency in Plant Breeding, Lange, W., Zeven, A. C. and
Hogenboom, N. G. (eds.), Pudoc, Wageningen, p. 194.
15.	Westcott, R. J. (1981)Potefo Res., 24, 331.
16.	Westcott, R. J. (1981) Potato Res., 24, 343.
17.	Chen, T. H. H., Kartha, К. K., Leung, N. L., Kurz, W. G. W., Chatson, К. B. and
Constabel, F. Plant Physiol., 75, 726.
18.	Hauptmann, R.M. and Widholm, J. M. (1982) Plant Physiol., 70, 30.
19.	Takeuchi, M., Matsushima, H. and Sugawara, Y. (1982) in Plant Tissue Culture,
1982, Fujiwara, A. (ed.), Japanese Association for Plant Tissue Culture, Tokyo,
p. 797.
20.	Watanabe, K., Mutsuda, H. and Yamada. Y. (1983) Plant Cell Physiol., 24. 119.
21.	Ziebolz, K. and Forche, E. (1985) in Proceedings: EEC Symposium on In Vitro
Techniques — Propagation and Long-Term Storage, in press.
22.	Finkle, B. J., Ulrich, J. M., Schaeffer, G. W. and Sharpe, F. (1983) in Cell and
Tissue Culture Techniques for Cereal Crop Improvement, Academic Sinica/International
Rice Research Institute, Science Press, Beijing, p. 343.
23.	Grout, B. W. W. (1979) Cryo-Lett., 7, 71.
24.	Grout, B. W. W. (1985) in Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications,
Withers, L. A. and Alderson, P. G. (eds.), Butterworths, London, in press.
232
25.	Grout, В. W. W., Shelton, K. and Pritchard, H. W. (1983) Ann. Bot., 52, 381.
26.	Withers, L. A. (1979) Plant Physiol., 63, 460.
27.	Tisserat, B., Ulrich, J. M. and Finkle, B. J. (1981) Hort. Set. 16, 47.
28.	Grout, B. W. W. and Henshaw, G. G. (1978) Ann. Bot., 42, 1227.
29.	Seibert, M. and Wetherbee, P. M. (1977) Plant Physiol., 59,1043.
30.	Uemura, M. and Sakai, A. (1980) Plant Cell Physiol., 21, 85.
31.	Withers, L. A. (1982) in Plant Tissue Culture, 1982, Fujiwara, A. (ed.), Japanese
Association for Plant Tissue Culture, Tokyo, p. 793.
32.	Kartha, К. K., Leung, N. L. and Gamborg, O. L. (1979) Plant Sei. Lett., 15, 7.
33.	Kartha, К. K., Leung, N. L. and Mroginski, L. A. (1982) Z. Pflanzenphysiol.,
107, 133.
34.	Towill, L. E. (1983) Cryobiology, 20, 567.
35.	Kartha, К. K., Leung N. L. and Pahl, K. (1980) J. Am. Soc. Hort. Sci., 105, 481.
36.	Hiraoka, N. and Kodarna, T. (1982) in Plant Tissue Culture, 1982, Fujiwara, A.
(ed.), Japanese Association for Plant Tissue Culture, Tokyo, p. 359.
37.	Withers, L. A. (1978) Cryobiology, 15, 87.
38.	Withers, L. A. (1978) Protoplasma, 94,235.
39.	Withers, L. A. and Davey, M. R. (1978) Protoplasma, 94,207.
40.	Seitz, U., Alfermann, A. W. and Reinbard, E. (1983)Plant Cell Rep., 2, 273.
41.	Roca, W. M., Rodriguez, J. A., Mafia, G. and Roa, J. (1984) Procedures for
Recovering Cassava Clones Distributed In Vitro., CIAT, Colombia.
42.	IBPGR (1984) The Potential for Using in vitro Techniques for Germplasm
Collection, IBPGR Publication AGP:IBPGR/83/108, International Board for Plant Genetic
Resources, Rome.
43.	Whcclans, S. K. and Withers, L. A. (1984) FAO/IBPGR Plant Genetic Resources
Newsletter, 60,33.
9.	МЕТОДЫ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ В ФИТОПАТОЛОГИИ: ВИРУСЫ
К. Р. ВУД
9.1.	ВВЕДЕНИЕ
Изучение роста вирусов в культурах клеток растений — ценный
научный подход не только к проблеме репликации вирусов и функцио-
нирования их генома, но и к проблеме взаимодействия вирусов и кле-
ток, а также двух типов вирусов, инфицировавших одну и ту же клетку.
В этих работах, однако, используют почти всегда протопласты, выделен-
ные либо из тканей листа, либо относительно недавно — из суспензион-
ных культур, инфицированные in vitro. Таким образом, данная глава
почти полностью посвящена именно использованию протопластов.
Причина такого широкого использования протопластов заключается
в относительной легкости, с которой они могут быть инфицированы.
Без специальной помощи вирусы не могут проникнуть через клеточную
стенку, поэтому инфицирование клеток суспензионных культур, хотя
его и проводят, представляет собой гораздо менее предсказуемый про-
цесс. Протопласты можно заражать in vitro с помощью различных мето-
дов и получить в результате популяцию клеток, большая часть которых
(иногда до 95%) оказывается инфицированной. В этих клетках зараже-
ние значительно более синхронизированно, чем в инфицированном
листе. В тех экспериментах, где синхронность является очень важным
фактором, обычно предпочитают использовать протопласты, зараженные
in vitro, а не выделенные из инфицированных растений.
Ниже описаны методы инфицирования в условиях in vitro и оценки
его эффективности и других характеристик. Однако необходимо под-
черкнуть, что зти методы, хотя и нашли широкое применение, для по-
лучения оптимальных результатов нуждаются в модификации.
9.2.	РАЗМНОЖЕНИЕ ВИРУСОВ В ПРОТОПЛАСТАХ
В течение примерно 15 лет, прошедших после разработки метода
инфицирования [1], он стал традиционным для суспензии протопластов,
выделенных из ткани листа; протопласты целого ряда растений были
заражены большинством основных групп вирусов растений. Целью
многих экспериментов было исследование различных аспектов реплика-
ции вирусов. В результате выбор клеток растения-хозяина определялся
главным образом наличием доступного метода выделения популяции
протопластов, которые можно было бы инфицировать и в которых
происходило бы размножение вирусов. Поэтому круг используемых
видов растений был гораздо более ограниченным, чем круг изучавшихся
вирусов. Однако с расширением тематики исследований, включающей
234
уже, например, изучение механизмов устойчивости и круга хозяев,
по-видимому, возрастет число видов используемых растений. Развитию
этих тенденций, вероятно, будут способствовать методы получения и
инфицирования протопластов, выделенных из суспензионных культур.
В исследованиях чаще всего используют метод заражения соответ-
ствующей суспензии протопластов очищенным препаратом целого виру-
са, хотя в некоторых случаях оказывается необходимым и даже полез-
ным приемом введение в протопласты нуклеиновой кислоты вируса.
Это может использоваться, например, при исследовании функциональной
роли отдельных видов РНК некоторых вирусов с фрагментированными
геномами. Разработаны методы заражения как вирусными нуклеопро-
теидами , так и нуклеиновыми кислотами вирусов (эти методы рассмот-
рены ниже). Для более широкого ознакомления с достижениями по
применению методов инфицирования протопластов in vitro, а также
с возможностями такого подхода см. [2 4].
9.2.1.	ПОЛУЧЕНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ
Большая часть препаратов протопластов, используемых в работе
с вирусами, была получена из ткани листа, главным образом из клеток
мезофилла (см. гл. 3). Следует помнить основные правила при получе-
нии протопластов, которые в дальнейшем используются для заражения
вирусами или нуклеиновыми кислотами. По причинам, еще недостаточно
понятным, восприимчивость протопластов к инфицированию может
существенно варьировать. Поэтому, во-первых, важно оптимизировать
условия выращивания растений, протопласты которых подлежат инфи-
цированию. Их подбирают эмпирически, однако в целом наиболее при-
годны растения, растущие постоянно и активно. После того как условия
подобраны, их следует неукоснительно соблюдать. Для этого чрезвы-
чайно желательно выращивать растения в специальной климатической
камере. Во-вторых, лучше всего использовать зрелые листья без симпто-
мов старения. При выборе листьев с растения также полагаются на
метод проб и ошибок и опытность исследователя. Для инфицирова-
ния вирусами более пригодны протопласты, полученные из листьев
после относительно короткого срока обработки ферментами, чем
подверженные обработке в течение ночи. Возможно также, что для
этих целей не всегда пригодны протопласты, полученные с помощью
методов, используемых в исследованиях по регенерации растений.
Если возникли сомнения в пригодности протопластов для инфицирова-
ния, следует просмотреть методы выделения, описанные в литературе,
посвященной вирусам и приведенной в разделе 9.2.5.
По-видимому, именно эти трудности в получении потенциально
инфицируемых популяций клеток из восприимчивых к вирусу растений
и ограничивают круг используемых видов. В качестве альтернативы
исследователей привлекала возможность использовать суспензионные
235
культуры. Суспензионная культура недифференцированных клеток
находящаяся на стадии логарифмического роста, поддерживаемая в
постоянных условиях и пересаживаемая в определенном режиме, пред-
ставляет собой воспроизводимый исходный материал для получения
протопластов. Подобная культура позволяет обойти многие варьирую-
щие особенности, возникающие при использовании ткани листа. Наличие
более эффективных ферментов, разрушающих клеточную стенку (на-
пример, пектолиаза U23 и целлюлаза RS), сделало использование сус-
пензионных культур гораздо более привлекательным подходом. Очевид-
но, суспензионные культуры все чаше будут применять в качестве источ-
ника протопластов в исследованиях по инфицированию вирусами.
На данном этапе необходимо подчеркнуть, что протопласты доволь-
но хрупки, и поэтому если их и можно набирать пипеткой, то у этой
пипетки должен быть широкий кончик. Лучше же их просто переливать.
9.2.2.	ИНФИЦИРОВАНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ ВИРУСАМИ
Для этого необходимы два основных условия: наличие концентри-
рованной суспензии вирусов с высокой удельной инфекционностью и
свежеприготовленная суспензия активно метаболизирующих прото-
пластов. Для облегчения инфицирования вирусы и клетки следует
привести в тесный контакт, что осуществляется двумя способами.
Первый, чаще используемый, основан на применении поликатионов
типа поли-Ь-орнитина [1]. Большинство исследователей обычно строго
придерживается этого исходного метода с незначительными модифика-
циями в зависимости от конкретного вируса и типа клеток. Недавно
разработан метод с использованием полиэтиленгликоля, который также
облегчает слияние клеток, но за счет других механизмов.
9.2.2.1.	Метод с использованием поли-Ь-орнитина
При pH, используемых при большинстве заражений, большая часть
вирусов, как и поверхность протопластов, несет суммарный отрица-
тельный заряд. Для облегчения взаимодействия вируса и клетки вирус-
ную суспензию сначала смешивают с поликатионом поли-Ь-орнитином
(PLO, мол. масса примерно 120000; Sigma Chemical Со.). Считают, что
это способствует образованию положительно заряженных агрегатов
вирусов, содержащих PLO, т. е. облегчает их сближение с мембраной
протопласта. Кроме PLO, можно использовать такие поликатионы,
как поли-Ь-аргинин, поли-Ь-лизин, поли-П-лизин или недавно предложен-
ный полиэтиленимин (полимин Р, мол. масса 30000—40000, фирма
BRL) [5]. В отсутствие поликатиона инфицирование может произойти,
однако оно будет неэффективным.
Затем агрегаты вирусов должны проникнуть через мембрану. В
этом процессе PLO может играть дополнительную роль, вызывая изме-
236
нения в мембране, обеспечивающие проникновение вирусов в цитоплаз-
му. С другой точки зрения, агрегаты могут проникать в протопласт
путем эндоцитоза. Для вирусов с суммарным положительным зарядом
при pH, используемых для инфицирования, а также для протопластов
некоторых видов растений добавление PLO не обязательно, хотя и не-
сколько улучшает результаты экспериментов.
Ниже приведена достаточно стандартная методика инфицирования
в присутствии PLO протопластов мезофилла листа ряда видов растений.
В эксперименте, цель которого состоит в изучении взаимодействия
двух вирусов, заразивших одну и ту же клетку, инфицирование можно
проводить различными вирусами либо одновременно, либо последова-
тельно. Кроме того, клетки можно инфицировать отдельными вирус-
ными частицами для вирусов, геном которых распределен между двумя
или более частицами.
1.	Суспендируют вирус (20 мкг) в 5 мл 0,02 М калий-цитратного буфе-
ра (pH 5,2), содержащего 0,7 М маннита.
2.	Растворяют PLO (мол. масса около 120000, 20 мкг) в 5 мл того
же буфера.
3.	Смешивают суспензию вируса и раствор PLO и инкубируют в тече-
ние 10 мин при 25 °C.
4.	Осаждают примерно 1 X 107 свежеприготовленных протопластов
(100 g, 5 мин) в стеклянной центрифужной пробирке объемом
50 мл и ресуспендируют в общем объеме около 10 мл 0,7 М ман-
нита.
5.	Добавляют смесь вируса и PLO к суспензии протопластов, осторож-
но перемешивают и инкубируют в течение 10 мицпри 25 С, время
от времени осторожно перемешивая.
6.	Осаждают протопласты и сливают среду, используемую для инфи-
цирования.
7.	Добавляют 30 мл 0,7 М маннита, содержащего 0,1 М СаС12, осторож-
но перемешивают и вновь осаждают протопласты.
8.	Повторяют промывку еще два раза и ресуспендируют конечный
осадок протопластов в среде для инкубирования, содержащей
антибиотики (см. ниже), до конечной концентрации протопластов
2Х105/мл.
9.	Разливают по 10 мл суспензии в конические колбы объемом 100 мл
или в пластмассовые чашки Петри и инкубируют до 72 ч при 25 С
и постоянном рассеяном свете (около 2000 лк) .
Некоторые пункты этой методики требуют комментариев. Важное
значение имеет молекулярная масса используемого в работе PLO. Боль-
шая часть предлагаемых препаратов гетерогенна и варьирует в различных
фасовках. Наилучшие результаты получают с препаратами с номинальной
молекулярной массой 120000—130000 или выше. Для инфицирования
чаще используют цитратный буфер с pH 5 и 6, хотя в некоторых случаях
предпочтительнее фосфатный буфер. Оптимальная концентрация ман-
237
нита также может отличаться от предлагаемой (0,7 М). Наиболее часто
для инкубирования используют, иногда с небольшими изменениями,
среду, предложенную Такебе [6] и хорошо себя зарекомендовавшую.
В среде, рекомендуемой в этой главе (табл. 9.1—9.2), по сравнению со
средой Такебе отсутствуют 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота и
6-бензиладенин, и в нее добавлена сахароза. В качестве антибиотиков
рекомендуется использовать карбенициллин и микостатин.
9.1.	Среда для инкубации протопластов
КН2РО„
KNO3
MgSO4
СаС12
KI
CuSO„
D-Маннит
Сахароза
pH 5,4
0,2 мМ
1 мМ
1 мМ
10 мМ
1 mkM
10 hM
0,7 M
1%
9.2.	Антибиотики для инкубационной среды
Цефалоридин
Римоцидин
Карбенициллин
Микостатин
Гентамицин
300 мкг/мл
10 мкг/мл
500 мкг/мл
6 мкг/мл
2 мкг/мл
Возможно, что при получении протопластов из суспензионных
культур предпочтительнее окажется среда более сложного состава,
хотя имеющаяся к настоящему времени информация не позволяет
зто утверждать (см. разд. 9.2.2.2). Рекомендуется инкубация при 25 °C
и низкой интенсивности рассеянного света (около 2000 лк). Однако
для получения оптимальных условий заражения при различных ком-
бинациях в системе хозяин — вирус это положение, как и другие, может
быть изменено. Варианты основного метода для вирусов, принадлежа-
щих к главным группам, представлены в таблице 9.3. Это не означает,
что те же самые условия обязательно подойдут ко всем вирусам дан-
ной группы.
Метод, очень близкий к вышеописанному, пригоден также для
работы с протопластами, выделенными из клеток суспензионных
культур [5], но пока еще рано утверждать, что он может быть применим
без каких-либо модификаций к широкому кругу комбинаций хозяина
и вируса. В таблице 9.4 сравниваются условия, применявшиеся для
238
о
§
Я
о
Е
О
S
S
<й>
S
я
я
о
н
О
&
ф
Я
в
•&
S
Я Q ф ©
§•&!» О
-*•!&
га

§
ЕТ
га
Ё
Ф
а
х
S
е»&§
g£oc
&о П
я о
R
0-1
- Е
h
S
S
Я
я
га
2
I
§§
«к
CUE
ф >>
•&Х
>> °
м§
й
S
©
X
Я
с °
Е “
га
га
о
s
£
s§£§S§s§s§®§§§s§s§s§S§S§lg®B^is
S gs g? 2s gs 5^ gS £S 5S 5S ss ss S?Ss^
Л A *; Л Jg Л Д Д Д Д Ig Д Д g Д Д g
о. °- С Er °- Er
g§Ss§5§B§S§B§S
и§яд»й»й“
Б s
8 ST
-я -
О ~ О й
£§§§
5? raS ffl
а
га
О
о
X
S
ё
я
га
о
S
©
S
о
CU
и
X
с
0)
Я
*я
о
е
ф
э
S
’§
§ X К
5 9.5
я
о
о
X «
- х
3 5 °
£
о
X
Яш
§2
я S
га я
о н о и ф <-• ф
^asgsss
о
Я
о
С гага
_ © © О
&
О
О
я
§
га
га
о
S
Е
О
к
ф
5
Р1
tx
*

*
и
и
"с
я
о
я
. я
2 =-sf 3
>s § о Г s
° О и «
о Я. n s -
О у S я Я
Я й сига «
СО га я S й
R
S
и
о»
Е’&
Д га
§м
§fgs
S H’S 2
й Я га ®
>>й л 2
о Щ
d^Sxeoe^S

и
я Б
И й
>, >я *
Си ° м
>я
о
я
*
S
я
и
2 °
g
oq
я
§
га
га
©
S я
>Я М
я о К
ч/ Ч ф
Я
н
о
га
о
Я
S
я с « S
е-^йя
га О^-1 Ф °*
s-&cg«&
о
я
о
©
Си
W
с
3
s
е
се
*
о
2
о
X
о
S

о
2
И
£
Я
g
I	“•	"
Лов
Ч	X	S
Я
ф
и
©
к
Я
S S S о
Й X E К
о
«
©
5
о
о
S
Я
«
ю
©
ф
X
239
9.4. Инфицирование протопластов, выделенных из клеток мезофилла табака и
суспензионной культуры, вирусом табачной мозаики
Источник протопластов	Буфер Для иноку- ляции	pH	Концентрация				Инфици- рованные прото- пласты, %
			ман- нит, М	вирус, мкг/мл	поли- катион, мкг/мл	протопла- стов, чис- ло прото- плас- стов/мл X X 1О~5	
Мезофилл	0,01 м цитрат калия	5,2	0,7	1	PLO:1	2-5	90+
Суспензион- ная культура клеток	0,01 М цитрат калия	5,2	0,4	0,3	Полимин Р: 0.8	2	50 70
9.5. Инкубационная среда для протопластов, выделенных из
клеток суспензионной культуры
Компоненты	Концентрация
Компоненты среды Линсмайера и Скуга [7]:	
КН2РО4	370 мг/л
тиамин-НС1	1 мг/л
сахароза	1%
2,4-Д	0,2 мг/л
D-маннит	0,4 М
работы с протопластами, выделенными из двух источников. Инфициро-
ванные протопласты, выделенные из клеток суспензионных культур,
кроме того, необходимо инкубировать в более сложной среде по срав-
нению со средой, обычно используемой для выделения протопластов
из мезофилла листа. Для подобных целей подходит среда, описанная в
таблице 9.5.
9.2.2.2.	Метод с использованием полиэтиленгликоля
Полиэтиленгликоль (ПЭГ), особенно эффективный для повышения
инфекционности вирусных нуклеиновых кислот (разд. 9.2.3), наряду
с PLO оказывается полезным при инфицировании нуклеопротеинами
вирусов. По существу вирусы и протопласты смешивают в концентри-
рованном растворе ПЭГ и быстро разбавляют раствором маннита, со-
держащим ионы кальция. Хотя ПЭГ способствует слиянию мембран,
его роль в заражении вирусами протопластов все еще неясна. Возможно,
что он способствует инфицированию путем повреждения мембран
протопластов. Однако использование ПЭГ оказалось весьма успешным
240
для заражения различными вирусами растений, а описываемая ниже
методика инфицирования протопластов из нескольких видов рода
Brassica ДНК вируса мозаики цветной капусты оказалась более эффек-
тивной, чем метод с использованием PLO [8].
1.	Промывают примерно 2 X 106 протопластов 0,4 М маннитом и
ресуспендируют их в минимальном объеме 0,4 М маннита при ком-
натной температуре.
2.	Добавляют 10 мкг вируса.
3.	Сразу же добавляют 0,5 мл 30% (масса к объему) ПЭГ 6000 в
0,4 М манните, содержащем 3 мМ СаС12, до конечного объема
0,65 мл.
4.	Дают постоять 10—20 сек и, осторожно встряхивая, разводят 5 мл
0,4 М маннита, содержащего 1 мМ СаС12.
5.	Оставляют при комнатной температуре примерно на 5 мин, а затем
осаждают инфицированные протопласты.
6.	Трижды промывают 0,4 М маннитом, содержащим 1 мМ СаС12.
7. Ресуспендируют в среде Км8р [9] без кокосового молока, содержа-
щей 500 мкг/мл карбенициллина и 6 мкг/мл микостатина. Плотность
протопластов должна составлять 0,5—1,0 XI О6 протопластов в
1 мл.
8.	Инкубируют в условиях рассеянного света (около 2500 лк) при
21 °C.
Многие дополнения в разделе 9.2.2.1 применимы и к этому методу.
Для различных комбинаций вируса и растения-хозяина оптимальные
условия могут немного отличаться. Инкубация протопластов Brassica,
инфицированных вирусом мозаики цветной капусты в сложной среде
Км8р, давала более воспроизводимые результаты, чем в обычной соле-
вой среде. Однако так бывает не всегда, и в большинстве случаев можно
получить вполне удовлетворительные результаты, используя инкуба-
ционную среду, состав которой приведен в таблице 9.1.
9.2.3.	ИНФИЦИРОВАНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ
НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ ВИРУСОВ
Для инфицирования нуклеиновой кислотой вирусов существует
ряд методов, при использовании каждого из которых требуется иноку-
лум с высокой удельной инфекционностью. Подходы, основанные
на методе с использованием PLO, описанном для инфицирования про-
топластов нуклеопротеином вируса, с модификациями для защиты
нуклеиновой кислоты вируса от разрушающего действия ферментов,
оказались менее эффективными, чем с использованием ПЭГ [2]. Ниже
описаны метод с применением ПЭГ, а также недавно разработанная
методика использования липосом, формирующих защитную оболочку
вокруг молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, липосомы облег-
чают проникновение нуклеиновой кислоты через мембрану протопласта.
241
9.2.3.1.	Инфицирование протопластов вирусной РНК с использованием
ПЭГ
Наиболее эффективный метод заражения нуклеиновой кислотой
вируса, обеспечивающий высокий процент инфицированных протопла-
стов с наименьшими затратами нуклеиновых кислот, включает исполь-
зование ПЭГ 6000 [10, 11]. Он весьма сходен с методом, предназначен-
ным для инфицирования протопластов нуклепротеином вируса. Хотя
чаще всего инфицирование нуклеиновыми кислотами менее эффективно,
чем вирусными частицами; при заражении протопластов огурца вирусом
мозаики огурца было обнаружено обратное действие. Ниже описывается
модифицированная версия (М. J. Boulton, личное сообщение) метода,
разработанного для данной комбинации вируса и растения-хозяина [10].
Однако этот метод (с небольшими модификациями) оказался вполне
удовлетворительным и для других вирусов и протопластов. Его также
можно использовать для инфицирования протопластов индивидуальными
РНК вирусов с фрагментированнымгеномомилидлязараженияпсевдоре-
комбинантами, сконструированными из РНК различных штаммов вируса.
1. Осаждают 0,5—1,5 XIО7 свежевыделенных протопластов (100 g,
5 мин) в центрифужной пробирке объемом 50 мл.
2.	Промывают протопласты, ресуспенднруя их в 20 мл 0,55 М ман-
нита, осторожно перемешивая, и снова осаждают при 100 g в те-
чение 5 мин.
3.	Повторяют 2-ю операцию.
4.	Ресуспендируют осадок промытых протопластов примерно в 0,2 мл
0,55 М маннита.
5.	Добавляют раствор вирусной РНК (100 мкг, 0,2 мл) и затем сразу
же — 2 мл 40% (масса к объему) ПЭГ (мол. масса 6000) в 3 мМ
СаС12 - Осторожно перемешивают.
6.	Примерно через 10 сек разбавляют суспензию 20 мл 0,55 М манни-
та, 0,1 мМ СаС12 и осторожно встряхивают.
7.	Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, время
от времени осторожно перемешивая содержимое пробирки.
8.	Трижды промывают протопласты 0,55 М маннитом, 0,1 мМ СаС12
и ресуспендируют в 20 мл инкубационной среды (табл. 9.1.).
9.	Разливают по 10 мл в конические колбы объемом 100 мл или в чаш-
ки Петри и инкубируют при 22 °C под постоягшым рассеянным
светом (2000 лк) до 72 ч.
9.2.3.2.	Инфицирование протопластов нуклеиновой кислотой
вирусов с использованием липосом
Совсем недавно разработанная методика для введения чужерод-
ных нуклеиновых кислот, особенно вирусных, в протопласты растений
основана на использовании фосфолипидных пузырьков, или липосом,
242
широко применяемых для введения чужеродного материала в клетки
животных. Эта методика заключается в следующем: липосома обво-
лакивает водный раствор нуклеиновой кислоты вируса, взаимодейству-
ет с мембраной протопласта в присутствии вещества, способствующего
слиянию, а далее происходит перенос нуклеиновой кислоты в цитоплаз-
му протопласта, где может начаться процесс заражения.
Используют два типа липосом: крупные однослойные пузырьки
(КОП) д пузырьки, полученные в результате испарения обратной фазы
(ПИОФ). В первом случае образуются фосфолипидные структуры
вытянутой формы, а нуклеиновая кислота, упакованная в виде ци-
линдра, входит в их состав [12]. Во втором случае раствор нуклеино-
вой кислоты в органическом растворителе смешивается с фосфолипи-
дами, и нуклеиновая кислота обволакивается фосфолипидами по мере
удаления органического растворителя [13—15]. Метод, описываемый
ниже, с некоторыми модификациями [15] основывается на методике
получения ПИОФ, разработанной Фрэйли [13] для инфицирования про-
топластов, выделенных из клеток суспензионных культур. До сих пор
этот метод использовался главным образом для переноса РНК вируса
табачной мозаики; по крайней мере, в этом случае он обеспечивает
заражение с использованием меньших количеств вирусной РНК, чем
необходимо для других методов. Однако это не всегда так. Показано,
что оптимальную эффективность заражения протопластов мезофилла
обеспечивает использование отрицательно заряженных липосом, при-
готовленных только из фосфатидилсерина, хотя в некоторых случаях
используется также холестерин. При этом необходимо использовать
ПЭГ или поливиниловый спирт (ПВС) вместе с Са2 +. На данном этапе
не совсем ясно, как переносится нуклеиновая кислота, хотя ультра-
структурное изучение взаимодействия КОП с протопластами, получен-
ными из суспензионных культур Vinca rosea, показывает, что это процесс
эндоцитоза, а нуклеиновая кислота внутри клетки освобождается по
мере разрушения пузырька.
1.	Переносят 5 мкМ фосфатидилсерина (фирма Sigma, хранят в ат-
мосфере аргона или азота при —70 °C) в круглодонную колбу объе-
мом 50 мл и удаляют растворитель на роторном испарителе.
2.	Пропускают через колбу азот.
3.	Растворяют липид в 0,8 мл диэтилового эфира (пероксид предва-
рительно удаляют путем дистилляции над бисульфитом натрия).
4.	Растворяют вирусную РНК в концентрации 1 мг/мл в 5 мМ трис-
НС1 (pH 7,6), содержащем 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 0,44 М ман-
нита.
5.	Добавляют 200 мкл раствора вирусной РНК к липиду и смешивают
в атмосфере азота.
6.	Обрабатывают в течение 30 сек на ультразвуковой установке с
водяным охлаждением, пока смесь не станет прозрачной, одно-
фазной.
243
8.4.5.	Сочетание ограничивающих факторов	215
8.5.	Способы хранения: криосохранение . ..........................   216
8.5.1.	Суспензии клеток . .	. . . .	........... 216
8.5.2.	Протопласты........ . .	.	. . . ......	219
8.5.3.	Каллус....................................................   220
8.5.4.	Зародыши .................................................   220
8.5.5.	Зародыши из пыльников и пыльцы	222
8.5.6.	Кончики побегов...........................................   222
8.6.	Условия для успешного хранения .	...... .................. 223
8.6.1.	Материал с замедленным ростом .............................. 223
8.6.2.	Материал, подвергшийся криосохранению....................... 224
8.7.	Заключение: генофонд растений in vitro ценный источник для
научных исследований и сельского хозяйства .....................  230
8.7.1.	Распространение культур	....	. . .  .................... 231
8.7.2.	Характеристика и оценка	......	231
8.7.3.	Источники информации.....	231
Литература ....	......	........	232
9.	Методы культуры тканей в фитопатологии: вирусы. К. Р. Вуд	234
9.1.	Введение............................................... ...	234
9.2.	Размножение вирусов в протопластах . . . .	. .	....... 234
9.2.1.	Получение протопластов...................................    235
9.2.2.	Инфицирование протопластов вирусами......................... 236
9.2.3.	Инфицирование протопластов нуклеиновой кислотой вирусов . .	241
9.2.4.	Определение накопления вируса, вирусного антигена и вирус-
ной нуклеиновой кислоты . . .	.............. 244
9.2.5.	Применение метода при изучении устойчивости ........ ...	254
9.3.	Использование культур, полученных из каллусов......	.... 256
Литература . . ....................... ....	257
10.	Методы культуры тканей в фитопатологии: грибы. С. А. Миллер . .	259
10.1.	Введение................... ....	............... 259
10.2.	Получение двойных культур с иекротрофными патогенами ...	259
10.2.1.	Система nK>v,QpHalPhytophthora megasperma ................. 260
10.2.2.	Система ia&aKlPhytophthora parasitica var. nicotianae . . . 266
10.3.	Получение двойных культур: облигатно биотрофные патогены . .	269
10.3.1.	Система сахарный тростнмк/Sclerospora	sacchari .	271
10.3.2.	Система табак/Регоиохрога tabacina	  272
„	274
Литература............ .........................................

100
Рис. 9.2. Увеличение относительного содержания жизнеспособных протопластов
из листьев ячменя, инфицированных вирусом мозаики костра, окрашенных флуо-
ресцирующими антителами (7), и соотношения числа вирусов и протопластов
(2) в зависимости от времени. Число вирусов определяли методом проверки на
инфекционность С. hybridum и сравнением инфекционности в образцах гомогената
стандартными препаратами вируса. Через 38 ч после заражения среднее содержание
вируса в расчете иа протопласт составляло 33 пг, или 4,1 X 106 частиц [17].
Б0
Рис. 9.3. Увеличение относительного содержания протопластов, выделенных из
суспензионных культур табака, инфицированных вирусом табачной мозаики,
выявленных антителами, меченными флуоресцеином [5].
7.	Промывают предметное стекло в течение 30 мин ФБН, высушивают
и добавляют меченный флуоресцеином бараний антикроличий имму-
ноглобулин (фирма Wellcome Reagents Ltd), разведенный ФБН
в 16 раз.
8.	Оставляют на 30 мин.
9.	Тщательно промывают ФБН, наносят 10 мМ натрий-карбонатный
буфер в 90% глицерине (pH 8—9) и просматривают под флуорес-
центным микроскопом с отсекающим фильтром КР500 и задер-
живающими фильтрами LP520 и LP540.
На рисунке 9.1 [16] представлена микрофотография протопласта
Chenopodium guinoa, инфицированного вирусом кольцевой пятнистости
Cymbidium и прореагировавшего с антителами, меченными флуорес-
цеином.
Развитие инфекции в протопластах из листьев ячменя, выявленное
таким способом, наглядно показано на рисунке 9.2 [17]. Увеличение
наблюдаемого числа инфицированных протопластов в течение 10 ч
после инфицирования свидетельствует о том, что, хотя все протопласты
246
были заражены одновременно, последующее накопление вирусного
антигена, а также, по-видимому, другие этапы цикла репликации не
являются совершенно синхронными процессами. Для сравнения на
рисунке 9.3 [5] можно видеть увеличение числа протопластов, получен-
ных из суспензионной культуры и демонстрирующих положительную
реакцию после инфицирования вирусом табачной мозаики.
9.2.4.2.	Оценка инфекционности по содержанию вирусного нуклепротеида
Первым требованием при определении развития инфекционности
является наличие соответствующего некротического хозяина. Если
такового нет, можно использовать растение, являющееся системным
хозяином, заражая его вирусом в различных разведениях и определяя
конечное разведение, при котором вирус или растительный экстракт,
содержащий вирус, сохраняет инфекционность. Ясно, что это менее
точный метод и по возможности его следует избегать. Наиболее прямой
путь состоит в выделении вируса из протопластов с помощью гомоге-
низации и заражении очищенным экстрактом, разбавленным соответ-
ствующим образом. Однако необходимо помнить, что оценка инфек-
ционности подобным образом представляет собой нечувствительный
метод, а число некрозов на инфицированных листьях непропорционально
числу потенциально инфекционных частиц в инокулуме.
1.	Осаждают суспензию протопластов (100 g, 5 мин) и промывают
осадок 0,7 М маннитом, содержащим 1 мМ СаС12.
2.	Осадок ресуспендируют примерно в 0,5 мл среды для инкубации
(табл. 9.1) и гомогенизируют в гомогенизаторе Поттера или Да-
унса.
3.	Разводят гомогенат соответственно в 10 или 100 раз в 50 мМ натрии-
фосфатном буфере (pH 7,5) и определяют инфекционность, заразив
листья, опыленные карборундом и натертые муслиновым тампо-
ном, смоченным вирусной суспензией (листья некротического
хозяина) В качестве контроля используют препараты вирусов с
известной инфекционностью.
9.2.4.3.	Оценка инфекционности по нуклеиновой кислоте вируса
Может оказаться, что для более лабильных вирусов нуклеиновая
кислота этих вирусов, выделенная из клеток с помощью метода феноль-
ной депротеинизации, будет обладать более высокой инфекционностью,
чем выделенный нуклепротеид вируса. Ясно, что при использовании
этого метода нельзя различить нуклеиновую кислоту, упакованную в
вирусные частицы in vivo, и свободную.
1.	Переливают протопласты, предназначенные для экстракции, в кони-
ческую центрифужную пробирку объемом 10 мл и промывают
один раз 0,55 М маннитом
247
1. Осадок ресуспендируют в 0,6 мл раствора маннита.
3.	Добавляют к суспензии 0,4 мл раствора, содержащего 3,2% доде-
цилсульфата натрия (ДДСН) и 1,3% (масса к объему) бентонита
в 0,18 М натрий-фосфатном буфере (pH 7,4), а затем добавляют
1 мл водонасыщенного фенола, содержащего 0,1% 8-гидроксихи-
нолина и 15%л«-крезола, при 0 °C.
4.	Энергично встряхивают в течение 10 мин при 4 °C.
5.	Центрифугируют в течение 10 мин при 4500 g.
6.	Водную фазу переносят в сосуд с завинчивающейся крышкой объ-
емом 5 мл и удаляют фенол путем 10-кратного встряхивания с
водонасыщенным эфиром. В конце следы эфира удаляют с по-
мощью продувки воздухом.
7.	Определяют инфекционность раствора РНК, не разводя его или
разведя в 10 или даже 100 раз в 0,05 М натрий-фосфатном буфере
.(pH 7,5) и заражая листья растения — некротического хозяина, посы-
панные карборундом, с помощью муслинового тампона, смоченного
в растворе РНК.
9.2.4.4.	Оценка накопления вирусных частиц с помощью
центрифугирования в градиенте сахарозы
Если требуется оценка общего накопления вирусных частиц, а
не возрастания инфекционности или количества вирусного антигена,
то частицы можно отделить от остального клеточного материала путем
центрифугирования в градиенте концентраций сахарозы, а количество
вируса можно определить, измеряя оптическое поглощение вируса в
полученной зоне при 260 нм [18].
1.	Переносят протопласты в коническую центрифужную пробирку
, объемом 10 мл и осаждают в течение 5 мин при 100 g.
2.	Осадок ресуспендируют в 1 мл 0,1 М ацетата натрия, pH 4,7.
3.	Тщательно гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с те-
флоновым пестиком, соединенным с мотором.
4.	Гомогенат центрифугируют в течение 5 мин при 3000 g для удаления
остатков клеток.
5.	Наслаивают пробу надосадочной жидкости (0,1—0,5 мл) на 4,5 мл
линейного градиента концентраций сахарозы 10—40%, приготовлен-
ного в 0,1 М ацетате натрия, pH 4,7.
6.	Центрифугируют в течение 2,25 ч при 100000 g на центрифуге фирмы
Beckman в бакет-роторе SW50.1 (или аналогичном ему роторе).
7.	Фракционируют градиент, используя прибор для фракционирова-
ния градиентов фирмы Isco (или аналогичный ему) с проточной
кварцевой кюветой, вмонтированной в прибор, измеряющей погло-
щение при длине световой волны 260 нм.
8.	Вычисляют выход вируса в градиенте, исходя из измерения площади
пика поглощения, используя в качестве стандарта градиент с извест-
ным количеством вируса.
248
9.2.4.5.	Оценка накопления вирусной ДНК
Метод точечной молекулярной гибридизации представляет собой
чувствительный тест для оценки накопления вирусной нуклеиновой
кислоты. В данном случае подготовленные соответствующим образом
пробы капают на нитроцеллюлозные фильтры, а нуклеиновую кислоту
вируса определяют по гибридизации с меченой комплементарной про-
бой. Описанный здесь метод был разработан Маулом и др. [19] и при-
менен ими для обнаружения и количественного определения ДНК вируса
мозаики цветной капусты. Пробы, приготовленные методом ник-транс-
ляции вирусной ДНК, обычно имеют активность 1—2 • 107имп/мин/мкг
ДНК.
1	Осаждают пробу протопластов в течение 5 мин при 100 g.
2.	Добавляют равный объем 1 М NaOH и инкубируют в течение 10 мин
при комнатной температуре.
3.	Последовательно разводят несколько раз пробу 0,5 М NaOH
и капают по 5 мкл каждого разведения на нитроцеллюлозные
фильтры.
4.	Нейтрализуют, поместив нитроцеллюлозный фильтр с помощью
пинцета стороной, на которую нанесены капли, вверх на фильтро-
вальную бумагу Ватман ЗММ, насыщенную 0,6 М NaCl в 1 М трис-
НС1, pH 6,8.
5.	Оставляют на 1 мин, а затем повторяют операцию № 4.
6.	Переносят на бумагу Ватман ЗММ, смоченную в 1,5 М NaCl в 0,5 М
трис-НС1, pH 7,4.
7.	Оставляют на 5 мин, затем подсушивают на воздухе в течение 20 мин.
8.	Дважды промывают фильтр в хлороформе и подсушивают, оставив
на 15 мин.
9.	Выдерживают при 80 °C под вакуумом не менее 2 ч.
10.	Инкубируют фильтр с нанесенными каплями пробы в запаянном
полиэтиленовом пакете в течение 2—5 ч при 65 °C в 3 X SSC (1 X
X SSC равен 0,15 М NaCl, 0,15 М цитрата натрия), 4-кратном раство-
ре Денхардта [1-кратный раствор Денхардта содержит 0,02% бычьего
сывороточного альбумина, 0,02% фиколла 400 и 0,02% поливинил-
пирролидона (ПВП)], а также 250 мкг/мл обработанной ультразву-
ком и денатурированной ДНК из спермы лосося.
11.	Гибридизуют в течение 18—24 чпри 65 °C, используя 150 мкл смеси,
содержащей 3 X SSC и 4-кратный раствор Денхардта, в расчете
на 1 см2 фильтра, а также 1—2 • 10s имп/мин пробы, меченной
Р32 (1—2 • 107 имп/мин на 1 мкг ДНК) в 1 мл.
12.	Тщательно промывают фильтр в 2 X SSC, 0, 1% ДДСН при 65 °C.
13. Помещают фильтры на экспозицию с рентгеновской пленкой при-
мерно на 48 ч, используя усиливающий экран. (Оптимальное время
экспозиции будет зависеть от уровня радиоактивности пробы и
степени связывания пробы с фильтром.)
9 - 1021
249
Рис. 9.4
20	40	60	80
Время г оспе инфицирования, ч
Рис. 9.5
н
Рис. 9.4. Точечная гибридизация ДНК вируса мозаики цветной капусты, выявляю-
щая изменения концентрации вирусной ДНК в зависимости от времени после
заражения протопластов, выделенных из нескольких видов рода Brassica, вирусом
(I) или лишь буфером (Н). Образцы наносили пятнами по 5 мкл с 5 X 103 про-
топластов в одном пятне [8].
Рис. 9.5. Графическое изображение данных, представленных на рисунке 9.4: 1 -
турнепс, 2 - рапс, 3 - китайская капуста, 4 — горчица.
14. Определяют количество метки, связавшейся с фильтром, вырезая
каждое пятно с радиоактивностью и считая его в сцинтилляционном
счетчике. В качестве контроля используют известные количества
вируса, проведенные через ту же процедуру.
На рисунке 9.4 приведен пример результатов, получающихся при
использовании описанной процедуры в случае точечной гибридизации
ДНК вируса мозаики цветной капусты с ДНК на фильтре, выделенной
из протопластов нескольких видов рода Brassica. Количественная оценка
радиоактивности в некоторых пятнах (см. рис. 9.4) выражена графи-
чески на рисунке 9.5.
250
9.2.4.6.	Оценка накопления вирусной РНК
Метод в принципе аналогичен приведенному для определения ДНК,
но с некоторыми модификациями, описанными ниже. Пробы, исполь-
зуемые для обнаружения вирусной РНК и приготовленные с помощью
метода обратной транскрипции, обычно имеют активность около 0,5—
2 • 106 имп/мин/мкгРНК [19].
1.	Смачивают нитроцеллюлозный фильтр в 20 X SSC и высушивают
его на воздухе.
2.	Осаждают пробу протопластов в течение 5 мин при 100 g.
3.	Добавляют равный объем 50 мМ натрий-фосфатного буфера (pH 7,5)
и гомогенизируют в гомогенизаторе Поттера или Даунса.
4.	Последовательно разводят гомогенат 50 мМ натрий-фосфатным
буфером (pH 7,5) и капают по 5 мкл на предварительно обработан-
ный фильтр.
5.	Высушивают на воздухе и выдерживают в вакууме при 80 °C в
течение 2 ч.
6.	Далее повторяют операции 10—14, описанные в разделе 9.2.4.5.
9.2.4.7.	Оценка вирусных антигенов с помощью метода ELISA
Промывка
|у У У.	
vQj	—
1 ф ф 1 фV'" 1 у У-Г-	—
ELISA — чувствительный метод определения вирусного антигена
в популяции протопластов. Существует несколько вариантов этого
метода. Здесь приводится метод
двойных антител, принцип которо-
го описан на рисунке 9.6. Он отно-
сительно прост и пригоден для
нескольких изученных в этом отно-
шении вирусов растений.
Определение проводится в
лунках специальных плат для мик-
ротитрования (например, микро-
плата EIA, фирма Flow Laborato-
ries), которые сначала покрываются
антивирусными антителами. В зти.
выстланные антителами лунки до-
бавляются исследуемые образцы.
Вирусные частицы, присутствующие
в образце, взаимодействуют с ви-
рус-специфическими антителами и
обнаруживаются при последующем
добавлении антител, меченных, в
свою очередь, пероксидазой. Ме-
ченые антитела, присутствующие
Промывка
Промывка
2. Внесение исследуемого
образца, содержащего вирус
1. Специфические антитела,
адсорбированные на дне лунки
3. Внесение специфичес-
ких антител, меченных
ферментом
4. Внесение ферментного
субстрата
Интенсивность окраски пропорциональна
концентрации вируса
Рис. 9.6. Принцип метода ELISA.
251
Концентрация выстилающего у-глобулина, мгк/мл
10 1,0	0,1
Исследуемый,
образец
Контрольный
образец
Разведение конъюгата,
содержащего меченый фермент
Рис. 9.7. Схема определения оптимальных концентраций выстилающих и меченных
ферментом антител для ELISA.
только в лунках с вирусом, затем обнаруживаются при добавлении
соответствующего субстрата, меняющего цвет под действием перок-
сидазы. В соответствующих условиях и в пределах определенных границ
интенсивность развивающегося окрашивания пропорциональна количе-
ству связанных с ферментом антител и, следовательно, количеству
вируса. Успех этого метода, однако, зависит от многих факторов, вклю-
чая тип использовавшейся платы для микротитрования, температуры
инкубации и т. д. Для оценки альтернативных экспериментальных под-
ходов, возможных изменений в системе, а также метода приготовления
антител необходимо обратиться к более специализированной литера-
туре [20]. Рекомендуется использовать вирус-спепифическую антисы-
воротку с титром не менее 1 : 500 для приготовления иммуноглобули-
нов. Предлагаемый ниже метод, основанный на методике, описанной
Кларком и Адамсом [21], включает разведение выстилающих антител
и антител, меченных ферментом, с применением очищенных вирусных
контрольных образцов (рис. 9.7).
1.	Осаждают пробу протопластов (около 1 мл) в течение 5 мин при
100 g и ресуспендируют в 0,1 мл натрий-фосфатного буфера с Тви-
ном (табл. 9.6), содержащим 2% ПВП (мол. масса 44000, фирма
BDH Chemicals).
2.	Разрушают клетки трехкратным замораживанием и оттаиванием
и удаляют остатки клеток с помощью центрифугирования (3000 g,
10 мин).
252
9.6. НФБТ для метода ELISA
	Компоненты	Концент- рация, г/л	Компоненты	Концент- рация, г/л
NaCl		8,0	NaNO3	0,2
КН2РО4		0,2	Твин-20	0,5 мл
Na2HPO4	• 12НаО	2,9	Довести pH до 7,4	
КС1		0,2		
9.7. Субстрат для метода ELISA
А. 1 М ацетат натрия, довести до pH 5,8 уксусной кислотой	10 мл
Б. 3, 3', 5,5*-тетраметилбензидин, 10 мг/мл в диметилсуль-
фоксиде	1мл
В. 6%Н2О2	0,1мл
Перед использованием смешать Л, Б, В и довести раствор до 100 мл.
3.	Добавляют 200 мкл очищенных вирус-специфических антител в
50 мМ карбонате натрия (pH 9,6), содержащем 0,02% (масса к
объему) азида натрия, в каждую лунку платы для микротитро-
вания.
4.	Инкубируют 2—4 ч при 30 °C.
5.	Промывают, заливая лунки натрий-фосфатным буфером с Твином
(НФБТ), оставляют не менее чем на 30 мин.
6.	Удаляют НФБТ и промывают еще три раза. Выливают все из платы.
7.	Добавляют 200 мкл исследуемых проб и контрольных очищенных
вирусов в 2—3 параллельных лунки и оставляют на ночь при 6 С
или на 4—6 ч при 30 °C.
8.	Трижды промывают плату НФБТ.
9.	Добавляют в каждую лунку по 200 мкл вирус-специфических анти-
тел с пероксидазой, растворенных в НФБТ, содержащем 2% ПВП
и 0,2% овальбумин.
10.	Инкубируют в течение 3—6 ч при 30 °C.
11.	Трижды промывают плату НФБТ.
12.	Добавляют 200 мкл свежеприготовленного субстрата (табл. 9.7)
в каждую лунку и инкубируют примерно 1 ч при комнатной темпе-
ратуре, после чего смеси в лунках с положительной реакцией окра-
сятся в синий цвет.
13.	Останавливают реакцию, добавив 50 мкл 3 М H2SO4 в каждую
лунку, после чего смеси в лунках с положительной реакцией при-
обретают желтую окраску.
14.	Измеряют поглощение при 450 нм.
15.	Вычисляют концентрацию вируса в исследуемых пробах, используя
стандартные кривые, полученные с применением очищенного вируса.
253
9.2.5. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПРИ ИЗУЧЕНИИ УСТОЙЧИВОСТИ
Существует множество примеров успешного инфицирования про-
топластов из растений-хозяев, чувствительных к данному вирусу;
главной целью этих экспериментов было изучение разных сторон репли-
кации вируса. Однако относительно небольшое число сообщений сви-
детельствует об инфицировании протопластов, выделенных из растений,
которые не были явно чувствительны к данному вирусу. Несмотря
на это, имеется достаточно данных для предположения о том, что инфи-
цирование протопластов из таких растений может дать ценную инфор-
мацию о природе устойчивости.
Обычно инфицируют протопласты мезофилла листа как чувствитель-
ных, так и устойчивых растений при оптимальных условиях и сравни-
вают последующее развитие инфекции и процент инфицированных
клеток в этих двух популяциях с помошью уже описанного метода.
Эти начальные наблюдения можно затем дополнить сравнительным
исследованием биосинтеза белков и нуклеиновых кислот вируса, а
также некоторых других процессов, связанных с проблемой взаимодей-
ствия вируса и клетки. Подобные примеры описываются в последующих
разделах, а также в работе Харрисона и Майо [2].
Устойчивые растения для удобства можно разделить на два типа.
Растения, в которых размножение вируса явно не идет, и поэтому обо-
значенные термином „нехозяева”, считаются иммунными. В устойчи-
вых растениях поддерживается ограниченное размножение вируса.
В редких случаях протопласты, полученные из явно иммунных растений,
также могут оказаться неспособными поддерживать репликацию виру-
са. Во многих случаях, однако, по крайней мере, некоторые протопласты
популяции могут быть заражены и действительно поддерживают раз-
множение вируса. Если поведение протопластов, инфицированных
in vitro, отражает восприимчивость или устойчивость, характерные для
той же клетки in vivo, то на этом основании можно предположить, что
после механического инфицирования многих „иммунных” растений
вирус может размножаться в небольшом числе изначально инфициро-
ванных клеток, однако дальше этот процесс не идет. Растение не при-
обретает симптомов болезни, а небольшие количества синтезируемого
вируса при поверхностной проверке обнаружить невозможно. Растения
японской редьки обычно невосприимчивы к вирусу мозаики костра,
однако после заражения in vitro многие протопласты из различных
видов редьки заражались, как и протопласты из ячменя (табл. 9.8)
[22], хотя выход вируса при этом был ниже, чем из протопластов ячме-
ня. Кроме того, выход вируса из протопластов редьки удавалось повы-
шать путем добавления в среду для инкубации протопластов актиноми-
цина Д (20 мкг/мл). Поэтому было сделано предположение, что
в клетках редьки образуются соединения, подавляющие размножение
254
9.8. Действие актиномицина Д на размножение вируса мозаики костра
в протопластах ячменя и японской редьки [22]
Время добавления актиноми- цина Д после инфицирования, ч	Степень инфицирования, %		Число локальных поражений	
	ячмень	редька	ячмень	редька
Без актиномицина Д	57	67	110±46	6±3
0	57	67	46±11	55 + 8
3	57	73	79 ±14	38+17
6	55	70	137±27	42+19
вирусов, и что синтез вируса оказывается чувствительным к актиноми-
цину Д. Таким образом, в некоторых случаях применение ингибито-
ров клеточного метаболизма может обеспечить полезную инфор-
мацию.
Грубо мы можем разделить устойчивые растения на две группы:
группу, в которой вирус располагается недалеко от очага заражения
и в результате образуются повреждения, являющиеся обычно хлрро-
тическими или некротическими, и группу, в которой вирус распростра-
няется неограниченно, однако накапливается в количествах, более
низких, чем в чувствительных растениях. Протопласты из растений
первого типа почти всегда оказываются чувствительными. Например,
протопласты из растений томата, содержащих ген Тт-22 [ 23], после
инфицирования вирусом табачной мозаики производят столько же
вируса, сколько и протопласты чувствительных растений, хотя размно-
жение этого вируса в растении ограничено. Реакция протопластов из
растений второй группы менее предсказуема. Репликация в них может
поддерживаться на том же уровне, что и в протопластах чувствительных
растений. С другой стороны, репликация вируса может быть замедле-
на или, как, например, в случае с протопластами коровьего гороха
сорта Arlington, инфицированными вирусом мозаики коровьего гороха,
репликация вируса может быть ограничена [24].
Наконец, протопласты можно использовать для получения инфор-
мации о тканевой специфичности. К примеру, было обнаружено, что
вирусы, которые обычно механически не переносятся, а после вектор-
ного переноса их размножение ограничивается лишь тканью флоэмы,
после заражения протопластов мезофилла in vitro нормально размножа-
ются. Другой пример: вирус скручивания листьев картофеля механи-
чески нельзя перенести на табак или картофель, однако он размножается
в протопластах мезофилла из обоих растений-хозяев [25, 26].
Эти немногочисленные примеры могут указывать на значительную
потенциальную роль протопластов в проведении дополнительных ис-
следований механизмов устойчивости в интактных растениях.
255
9.3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУР, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ КАЛЛУСОВ
Несмотря на то что каллусы, полученные из тканей инфицированных
растений, в соответствующих условиях продолжают продуцировать
вирус, целью подобных экспериментов обычно является не поддержи-
вание размножения вируса в ткани, а избавление от него. Клетки, инфи-
цированные in vitro, потенциально более полезны. Однако инфицирова-
ние in vitro полученных из каллусов суспензионных культур сопряжено
с трудностями, не встречающимися при работе с протопластами. Вирус-
ные частицы не могут проникнуть через клеточную стенку. Поэтому,
для того чтобы вирус проник в клетку, метод инокуляции должен
включать стадию, на которой повреждается клеточная стенка. Обычно
этого можно добиться путем энергичного встряхивания смеси вируса
и клетки. Такому пути инфицирования клеток, по-видимому, свойст-
венна некоторая неопределенность, что ограничивает использование
получаемых из каллусов клеток очень небольшими сочетаниями виру-
сов и клеток растений-хозяев. В самом деле, в зависимости от целей
эксперимента и доступности соответствующей клеточной системы этот
метод может оказаться предпочтительнее, чем приготовление из клеток
суспензии протопластов и инфицирование этих протопластов.
Однако инфицирование суспензионной культуры клеток in vitro
возможно. Ниже приводится метод, использовавшийся By и Муракиси
[27] для инфицирования клеток сои вирусом мозаики южной фасоли.
Для описываемого метода каллус сои (Glycine max, сорт Harosoy 63)
поддерживался в жидкой среде (табл. 9.9) в колбах Эрленмейера,
которые покачивали на круговой качалке при 120 об/мин под лампами
дневного света (861 лк) и температуре 24 °C.
9.9. Жидкая среда для поддержания каллусных культур сои
Компоненты
Компоненты
Концен-
трация,
мг/л
Концен-
трация,
мг/л
Неорганические соединения по Линсмайеру и Скугу [7]
Сахароза	30 г	Индолилуксусная кислота	5,0
Пиридоксин	0,5	Кинетин	0,3
Никотиновая кислота	0,5	2,4-Ди хлорфенок сиу к су сная	
Тиамин-НС1	0,5	кислота Довести pH до 5,8 NaOH	0,5
1.	Переносят примерно 1 г клеток в пробирку объемом 50 мл. Добав-
ляют 3 мл среды (табл. 9.9) и 180 мкг/мл очищенного вируса.
2.	Пробирку резко встряхивают на специальном встряхивателе при
8000 об/мин в течение 20 сек.
256
Рис. 9.8. Накопление инфекционного ви-
руса мозаики южной фасоли в клетках
суспензионной культуры сои. Образцы
гомогенизировали в 0,5 М фосфатном
буфере (pH 7,5), разводили в 10 раз
в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,1)
и исследовали на наличие некрозов
на растении-хозяине фасоли Пинто
[27].
Время после инфицирования, дни
3.	Клетки собирают в воронку, проложенную капроном.
4.	Трижды промывают примерно 15 мл среды, осторожно перемеши-
вая смесь.
5.	Переносят инфицированные клетки в жидкую среду и инкубируют,
как это было описано выше для неинфицированного каллуса.
6.	Для поддержания активного роста периодически обновляют среду.
За накоплением вируса можно наблюдать через определенные проме-
жутки времени с помощью методов, описанных в соответствующем
разделе для протопластов. В процессе накопления вируса мозаики
южной фасоли в инфицированных культурах сои (рис. 9.8) [27] на-
блюдается лаг-фаза, составляющая около 2 дней с максимумом накоп-
ления инфекционного вируса через 5 -6 дней. В заключение необходимо
подчеркнуть, что этот метод до сих пор используется не очень широко.
Для различных линий клеточных культур требуются, по-видимому,
некоторые модификации среды, наиболее соответствующей условиям
инкубации клеток, а также знание других тонкостей методики.
ЛИТЕРАТУРА
1.	Takebe, I. and Otsuki, Y. (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 64, 843.
2.	Harrison, B. D. and Mayo, M. A. (1983) in Use of Tissue Culture and Proto-
plasts in Plant Pathology, Helgeson, J. P. and Deverall, B. J. (eds.)., Academic Press,
Australia, p. 69.
3.	Muhlbach, H. P. (1983)Experientia, Suppl. 46, 111.
4.	Takebe, I. (1980) in Advances in Protoplast Research; Ferenczy, L. and Far-
kas, G. L. (eds.), Pergamon Press, Oxford, p. 431.
5.	Kikkawa, H., Nagata, T., Matsui, C. and Takebe, I. (1982) J. Gen. Virol., 63,
451.
257
6.	Takebe, I. (1977) in Comprehensive Virology, Vol. II, Fraenkel-Conrat, H.
and Wagner, R. R. (eds.), Plenum Press, New York, p. 237.
7.	Linsmaier, E. M. and Skoog, F. (1965) Physiol. Plant, 18, 100.
8.	Maule, A. J. (1983) J. Gen. Virol., 64, 2655.
9.	Kao, K. and Michayluk, M. R. (1975) Planta, 126,105.
10.	Maule, A. J., Boulton, M. I., Edmunds, C. and Wood, K. R.(1980) J. Gen. Virol.,
47, 199.
11.	Dawson, J. R. O., Dickerson, P. E., King, J. M., Sakai, F., Trim, A. R. H. and
Watts, J. W. (1978) Z. Natwforsch., 33c, 548.
12.	Fukunaga, Y., Nagata, T. and Takebe, I. (1981) Virology, 113,752.
13.	Fraley, R. T. (1983) Plant Mol. Biol., 2, 5.
14.	Nagata, T., Okada, K., Takebe, I. and Matsui, C. (1981) Mol. Gen. Genet., 184,
161.
15.	Rouze, P., Deshayes, A. and Caboche, M. (1983) Plant Sci. Lett., 31,55.
16.	de Varennes, A., Russo, M. and Maule, A. J. (1984) J. Gen. Virol., 65, 1851.
17.	Loesch-Fries, L. S. and Hall, T. C. (1980) J. Gen. Virol., 47, 323.
18.	Motoyoshi, F., Bancroft, J. B. and Watts, J. W., (1974) J Gen. Virol., 25, 31.
19.	Maule, A. J., Hull, R. and Donson, J. (1983) J. Virol. Methods, 6, 215.
20.	Maggio, E. T., ed. (1980) Enzyme Immunoassay, published by CRC Press Inc.,
Florida.
21.	Clark, M. F. and Adams, A. N. (1977) J. Geng. Virol. 34, 475.
22.	Maeckawa, K., Furusawa, I. and Okuno, T. (1981) J. Gen. Virol., 53, 353.
23.	Motoyoshi, F. and Oshima, N. (1975) J. Gen. Virol., 29, 81.
24.	Beier, H., Bruening, G., Russell, M. L. and Tucker, C. L. (1979) Virology, 95,
165.
25.	Barker, H. and Harrison, B. D. (] 98.2) Plant Cell Rep., 1,247.
26.	Takanami, Y. and Kubo, S. (1979)7. Gen. Virol., 44,153.
27.	Wu, F. and Murakishi, H. H. (1978) Phytopathology, 68,1389.
10. МЕТОДЫ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ В ФИТОПАТОЛОГИИ: ГРИБЫ
С А. МИЛЛЕР
10.1. ВВЕДЕНИЕ
Разработка методов культуры тканей для многих видов растений
позволила использовать новые подходы в изучении различных аспектов
взаимодействия хозяина и патогена. Целый ряд облигатно биотрофных
грибов (грибы, паразитирующие на живых клетках хозяина) и большин-
ство некротрофных грибов (грибы, получающие питательные вещества
из погибших клеток хозяина) можно культивировать совместно с
каллусной тканью, полученной из растения-хозяина. Хотя методы полу-
чения двойных культур тканей растений и патогенных грибов не всегда
просты и варьируют от системы к системе, в этой области достигнут
заметный успех. В данной главе описаны методы получения двойных
культур, состоящих, с одной стороны, из тканей растений, а с другой —
из биотрофных и некротрофных патогенных грибов. Обсуждение
ограничено использованием каллусных культур, хотя в случае некро-
тических патогенов исследовались также и другие типы клеточных
и тканевых культур.
10.2. ПОЛУЧЕНИЕ ДВОЙНЫХ КУЛЬТУР С НЕКРОТРОФНЫМИ ПАТОГЕНАМИ
Двойные культуры некротрофных грибов и тканей растений могут
служить моделью, как для фундаментальных, так и для прикладных
исследований процесса взаимодействия растения-хозяина и патогена.
Двойные культуры удобны при изучении механизмов устойчивости к
болезням, так как позволяют использовать упрощенную систему (в
отношении типа клеток растения-хозяина), в которой можно строго
контролировать факторы питания и условия культивирования. Раз-
работан ряд систем, в которых устойчивость или чувствительность
к данной болезни, свойственная интактному растению, проявляется
также и в полученных из него каллусных культурах [1]. Однако из
этих работ становится очевидным, что заложенная в геноме экспрессия
признака устойчивости или чувствительности in vitro зависит от целого
ряда параметров, включая температуру, концентрацию материала для
инфицирования, морфологию каллуса, а также тип и концентрацию
фитогормонов в среде для культивирования [2, 3]. В то время как при
реакции устойчивости в целых растениях и каллусных тканях, инфи-
цированных одним и тем же патогеном, наблюдалось удивительное
сходство ультраструктурных особенностей [4], все еще остается от-
крытым вопрос: одинаковы ли механизмы устойчивости, экспресси-
259
10.1. Модифицированная среда Шенка и Хильдебрандта [11] для выращивания
культур каллусных тканей люцерны
Компоненты среды	Концен- трация, мг/л	Исходный раствор	Количество, мл исходного раствора в 1 л среды
KNO3	2500	50 г/л	50
MgSO4 • 7Н2О	400	8 г/л	50
nh4h2po4	300	бг/л	50
СаС12 • 2Н2О	200	8 г/л	25
MnSO4 - H2O	10	200 мг/100 мл	5
H3BO3	5	100 мг/100 мл	5
ZnSO4 • 7H2O	1	100 мг/100 мл	1
KI	2	20 мг/100 мл	5
CuSO4 5H2O	0,2	5 мг/100 мл	4
Na2MoO4  2H2O	0,1	5 мг/100 мл	2
CoCl2 • 6H2O	0,1	5 мг/100 мл	2
FeSO4 • 7H2O	15	5,6 г/л	2,7
Na/ЭДТА	20	7,5 г/л	2,7
Тиамин-HCl	5	100 мг/100 мл	5
Никотиновая кислота	5	100 мг/100 мл	5
Пиридоксин-HCl	0,5	10 мг/100 мл	5
2,4-Д	2	50 мг/100 мл	4
Кинетин	2	25 мг/100 мл	8
НУК	2	50 мг/100 мл	4
Инозит	1000		—
Сахароза	30000	—	—
Агар	10000	—	—
pH 5,9
для получения и выращивания каллуса [9, 12]. Для неорганических соеди-
нений и витаминов можно готовить концентрированные исходные раство-
ры, фитогормоны следует разводить перед употреблением. В качестве
эксплантов используют незрелые завязи, выделенные из здоровых, креп-
ких растений. Необходимо отметить, что патогеном инфицируются отно-
сительно молодые каллусные культуры. Каллусы перед инфицированием
Pmm или Pmg пересаживают лишь один раз. Способность формировать
хороший каллус зависит от генотипа и поэтому может оказаться необхо-
димым проверить ряд растений на их способность расти в культуре. Дан-
ный метод представлен схематично на рисунке 10.2.
1. Готовят модифицированную среду Шенка и Хильдебрандта (ШХ)
в соответствии с данными, приведенными в таблице 10.1. После
смешивания в соответствующих количествах концентрированных
растворов неорганических соединений и витаминов добавляют фито-
гормоны, инозит и сахарозу. Доводят дистиллированной водой до
конечного объема и доводят pH до 5,9 1 М NaOH. Добавляют агар
и подогревают среду до тех пор, пока агар не растворится. Разливают
по 40 мл расплавленной среды в медицинские матрацы объемом
260
Рис. 10.1. Взаимодействие каллусов люцерны с Phytophthora megasperma f. sp. medica-
ginis (Pmm) и P. megasperma f. sp. glycinea (Pmg) через 3 дня после инфицирования.
Верхний ряд: каллусы, полученные из растения, чувствительного к Pmm. Нижний
ряд: каллусы, полученные из растения, устойчивого к Pmm. Левая колонка: неинфи-
цированные каллусы. Средняя колонка: каллусы, инфицированные Pmm. Правая
колонка: каллусы, инфицированные Pmg.
sperma var. medicaginis (Pmm) вызывает корневую гниль люцерны. Патоген
может быть легко выращен в культуре на любых сложных средах, и в
условиях in vitro можно индуцировать образование как вегетативных,
так и генеративных структур. Устойчивость люцерны к Pmm определяется
двумя комплементарными генами с неполным доминированием, для
экспрессии которых требуется, по крайней мере, дуплекс в одном локусе
и симплекс — в другом [10]. Устойчивость к Pmm проявляется в каллус-
ных культурах люцерны, полученных из устойчивых, но не из чувствитель-
ных к Pmm растений [1, 2]. Каллусы, полученные как из устойчивых,
так и из чувствительных растений, устойчивы к Р. megasperma f. sp.glucinea
(Pmg), патогену, инфицирующему сою, но не инфицирующему люцерну.
В устойчивых линиях в сравнении с чувствительными снижаются скорость
и степень инфицирования клеток при действии Pmm или Pmg. Каллусная
ткань, полученная из чувствительных растений, полностью поражается
грибом уже через 3 дня после инокуляции (рис. 10.1) .
10.2.1.1. Получение каллусных культур люцерны
Культуры каллусов выращивают на модифицированной среде Шенка
и Хильдебрандта [11] (табл. 10.1), хотя другие среды также пригодны
261
руемые in vitro и in vivo? Тем не менее Хелгесон и др. [5] показали,
что ген устойчивости к расе 0 Phytophthora parasitica var. nicotianae, экспрес-
сируемый в растениях табака, проявляется также и в каллусах.
Двойные культуры могут быть также полезны при выведении новых
сортов сельскохозяйственных растений с повышенной устойчивостью к
болезням. Для болезней, при которых экспрессия устойчивости в целых
растениях может варьировать или плохоразличима, отбор селекционного
материала in vitro может оказаться более эффективным и удобным подхо-
дом. Этот метод позволяет также проводить оценку устойчивости растения
к определенному патогену, не приводящую к разрушению растения. Дитон
и др. [6] успешно отобрали in vitro ряд селекционных линий табака на
полигенную устойчивость к Phytophthora parasitica var. nicotianae, т. e. на
признак, трудно определяемый в интактных растениях. Полученные ими
результаты дают основание предполагать, что система отбора in vitro снижа-
ла общее число взаимодействий генотипа с окружающей средой и позво-
ляла таким образом выявить небольшие генетические различия между
линиями.
Существует один фактор, которому необходимо уделять большое
внимание при разработке систем двойного культивирования для изучения
устойчивости к болезням и отбора больных растений. Это возможность
генетических изменений в культурах каллусов растения-хозяина и в пато-
генных грибах. Показано, что в каллусных культурах происходят генети-
ческие изменения, включающие изменения числа хромосом (полиплоидия,
анеуплоидия), их структуру (транслокации, делеции, инверсии), а также
точечные мутации [7, 8], число которых увеличивается с возрастом куль-
туры. В результате реакция отдельной каллусной линии на патоген может
и не отражать возможности генотипа донорного растения. Нестабильность
хромосом в каллусных культурах может быть снижена путем подбора
соответствующей среды для культивирования и использования молодых
или часто пересаживаемых каллусов [7]. Кроме того, во избежание непра-
вильных выводов, сделанных в результате использования генетически
дефектных каллусов, необходимы тщательный контроль за развитием
болезни в двойной культуре и использование многочисленных параллель-
ных проб. Перед получением двойной культуры необходимо также прове-
рить патогенность гриба с помощью обычного инфицирования (с исполь-
зованием целых растений), так как известно, что в процессе культивиро-
вания патогенность грибов снижается или полностью утрачивается.
10.2.1. СИСТЕМА ЛЮЦЕРНА/PHYTOPHTHORA MEGASPERMA
Люцерна (Medicago sativa) — это одно из бобовых с мелкими семенами,
которые можно выращивать in vitro, получая на среде для каллусообразо-
вания обильный каллус. Растения-регенеранты могут быть получены из
культур тканей и клеток люцерны через соматический эмбриогенез, хотя
эффективность генерации зависит от генотипа [9]. Phytophthora mega-
202
^0
тделение
незрелых завязей
Культивирование почек
на модифицированной
среде Шенка-Хильдебрандта
Каллусообразование
~7\(4-6 недель)
J
Пересадка (4-6 недель)
Рис. 1012. Схема получения культуры ткани люцерны, инфицированной Phytophthora
megasperma f. sp. medicaginis. Каллусные культуры можно выращивать в глубоких
(100 X 20 мм) чашках Петри (слева) или во флаконах (справа).
150 мл, закрывают их, стерилизуют среду при 121 °C в течение 20 мин.
После стерилизации среды кладут матрацы горизонтально и дают им
остыть в ламинар-боксе для предотвращения заражения. Можно также
прбстерилизовать среду в больших колбах и разлить в пластмассовые
чаШки Петри размером 100 X 20 мм после того, как среда немного
остынет.
2.	Удаляют бутоны длиной 2—4 мм с растений люцерны и стерили-
зует их поверхностно, вымачивая в течение 3 мин в 95% этаноле,
263

I
затем 3 мин в 1,1% растворе гипохлорита натрия (разбавленном
в 5 раз в готовом растворе отбеливателя). Дважды промывают
бутоны в стерильной дистиллированной воде и помещают в закры-
тую чашку Петри.
3.	В стерильных условиях разрезают бутоны и изолируют завязи (дли-
ной 1—2 мм). Помещают завязи на приготовленную среду для
культивирования (три завязи на матрац или четыре завязи на чаш-
ку) и инкубируют в темноте при 21 ±1 °C в течение 4—6 недель.
4.	Делят каллусы на кусочки примерно 3—5 мм в диаметре и пере-
носят их на свежую модифицированную среду ШХ. Инкубируют
культуры в описанных выше условиях еще в течение 4—6 недель
до тех пор, пока каллусы не достигнут 2 см в диаметре.
10.2.1.2.	Приготовление патогенных грибов
Как и многие другие факультативные паразиты, различные виды
Phytophthora могут становиться менее агрессивными после длительного
выращивания на среде для культивирования. Перед получением двойных
культур необходимо проверить агрессивность изучаемых изолягов,
инфицировав целые растения (13]. Путем повторного выделения пато-
гена из инфицированной ткани агрессивность может быть восстановлена.
При этом может потребоваться несколько циклов инфицирования
и повторного выделения. Как Pmm, так и Pmg можно хранить при 4—6 °C
под стерилизованным минеральным маслом без пересева в течение
6—12 месяцев.
Культуры Pmm и Pmg можно поддерживать следующим образом.
1. Готовят агаризованную среду V-8 с соком [14] в соответствии
с составом, приведенным в таблице 10.2. Для растворения агара
раствор прогревают, а затем разливают по 10 мл среды в пробирки
размером 18 X 150 мм и закрывают их. Пробирки стерилизуют
путем автоклавирования при 121 °C в течение 15 мин. Дают среде
остыть, наклонив слегка пробирки, чтобы получился косой агар.
10.2. Агаризованная среда с добавлением сока V-8 [14]
Компонент	Количество вещества	> 1 г I,	Компонент	Количество вещества
Сок V-8*	200 мл		Вода	800 мл
СаСО3	Зг		Агар	15 Г
I
* Продукт производится фирмой Campbell Soup Company, содержит сок тома-
та, моркови, сельдерея, свеклы, петрушки, салата, шпината и горчицы полевой.
2.	Стерилизуют медицинское очищенное минеральное масло, разлитое
порциями по 125 мл, при 121°С в течение 45 мин.
264
3.	Переносят на косой агар чистые культуры Pmm и Pmg и дают им
как следует вырасти — до тех пор, пока колония не покроет почти
всю поверхность косого агара.
4.	Заливают колонию стерилизованным минеральным маслом на
высоту 1 см над самой высокой точкой косого агара, стараясь
не пролить его на горлышко пробирки, крышку или пробку.
5.	Культуры хранят в темноте при 4—6 °C.
6.	Для приготовления культуры патогена к инфицированию в сте-
рильных условиях удаляют кусочки мицелия из пробирки для
культивирования, с помощью стерильной фильтровальной бумаги
удаляют избыток минерального масла и помещают их на агаризо-
ванную среду в чашках Петри. Культуры инкубируют при 22 ±
± 1 °C и обычном освещении в течение 4—6 дней.
10.2.1.3.	Методы инфицирования
1.	Отрезают кусочки инокулума (1 мм2) от края колоний Pmm или
Pmg и удаляют избыток агара.
2.	Используя препаровальную иглу с длинной ручкой, помещают по
кусочку инокулума на верхушку каждого кусочка каллуса.
3.	Культуры инкубируют в темноте при 21 ± 1 °C.
10.2.1.4.	Система подсчета целых инфицированных каллусов
Оценку процесса инфицирования отдельных каллусов проводят
ежедневно по следующей системе:
0 — нет видимых воздушных гифов;
1	воздушные гифы занимают 25% поверхности каллуса;
2	- воздушные гифы занимают 50% поверхности каллуса;
3	— воздушные гифы занимают 75% поверхности каллуса;
4	— воздушные гифы занимают всю поверхность каллуса.
Результаты характерного эксперимента такого типа приведены
в таблице 10.3.
10.3. Развитие воздушных гифов на каллусных культурах люцериы после
инфицирования Phytophtora megasperma f. sp. medicaginis (Pmm) и
P. megasperma f. sp. glycinea (Pmg)
Обработка *	Развитие воздушных гифов** 1-й день	2-й день	3-й день
M269/Pmm M194/Pmm	0,0	1,6	2,7 0,0	0,3	0,3
265
Окончание табл. 10.3
Обработка*	Развитие воздушных гифов**		
	1-й день	2-й день	3-й день
M269/Pmg	0,0	0,3	0,3
M194/Pmg	0,0	0,0	0,0
М269-Ь!оитроль	0,0	0,0	0,0
Ml 94-контроль	0,0	0,0	0,0
* Селекционная линия люцерны М269, чувствительная к Pmm; линия Ml 94
устойчива. Обе не являются хозяевами Pmg.
** Развитие воздушных гифов оценивалось по шкале 0-4 (разд. 10.2.1.4);
измерения проводились на трех параллельных пробах.
10.2,1.5. Определение степени развития гифов внутри каллусов
1. Выращивают каллусы до размеров 1 см* 1 2 3, затем каждый кусочек
каллуса разрезают горизонтально на четыре равных кусочка.
2. Кладут эти кусочки на предметное стекло и окрашивают красителем
для хлопчатобумажных тканей лактофеноловым голубым (10 г
фенола, 10 мл глицерина, 10 мл молочной кислоты, 0,02 г анили-
нового синего и 10 мл дистиллированной воды). Накрывают окра-
шенную ткань покровным стеклом.
3. Изучают^срезы под микроскопом (при 20-кратном увеличении),
после чего оценивают скорость инфицирования.
10.2.2. СИСТЕМА TAEAK/PHYTOPHTHORA PARASITICA VAR. NICOTIANAE
Двойные культуры каллусной ткани табака (Nicotiana tabacum L.)
и Phytophthora parasitica var. nicotianae (Ppn) были получены в несколь-
ких лабораториях [6, 15, 16] для изучения физиологии устойчивости
и отбора на устойчивость к болезням. Эта система прекрасно подходит
для решения подобных задач в связи с относительной простотой обра-
щения с культурами и табака, и Ррп. Кроме того, как расоспецифич-
ность, так и общая устойчивость к Ррп для табака характерны и экспрес-
сируются в каллусных культурах [5,6].
10.2.2.1. Получение каллусных культур табака
Табак относится к растениям, наиболее легко поддающимся куль-
тивированию in vitro. Формирование каллуса и регенерация растений
происходят практически из любого типа зкспланта. Каллусную ткань
можно выращивать на многих средах для культивирования, однако
наиболее часто используется среда Мурасиге и Скуга (МС) [17]. Недавно
266
был опубликован обзор методов культивирования табака и других
видов рода Nicotiana [18]. На основании работ Дитона и др. [6], а также
Хелгесона и др. [15] приводится следующая методика.
1. Готовят среду МС, модифицированную по Каспербауэру и Коллин-
зу [19] и Дитону и др. [6] (табл. 10.4).
lff.4. Модифицированная среда Мурасиге и Скуга [ 17 J для выращивания
каллусных культур тканей табака [19]
Концен-	Исходный	Количество,
трация,	раствор,	мл исходного
мг/л	г/л	раствора в
		1 л среды
Компоненты
nh4no3	1650	82,5 1	20
KNO3	1900	95,0 J	
MgSO4  7Н2О	370,0	74,0	
MnSO 4  Н2О	22,3	4,46'	5
ZnSO4 • 7Н2О	8,6	1,72	
CuSO4 • 5H2O	0,025	0,005	
CaCl2 • 2H2O	440,0	88,0	5
H3BO3	6,2	1,24 '	
KH2PO4	170,0	34,0	
KI	0,83	0,166	5
Na2MoO4 • 2H2O	0,25	0,050	
CoCl2 • 6H2O	0,025	0,005	
Na2 ЭДТА	22,4	0,8 '	►	28
f'e2(SO4)3	10,6	0,38	)
Тиамин-HCl	0,1	0,02	
Никотиновая кислота	0,5	0,10		5
Пиридок син-HCl	0,5	0,10	
Глицин	2,0	0,40	
НУК	0,1	0,10	I
Кинетин	0,2	0,10	0,5
Сахароза	20000		—
Агар	6000		—
Мезоинозит	100	—	—
pH 5,7			
2. Стерилизуют семядоли проростков табака, погружая их на 2 мин
в 70% этанол, затем на 6 мин в 0,8% гипохлорит натрия. Ткань
трижды ополаскивают в дистиллированной воде.
3. Режут семядоли на кусочки размером 1 см2 3 4 5 и помещают их на среду
для культивирования. Культуру инкубируют при 26 ± 1 °C и непре-
рывном освещении в течение 28 дней.
4. Каллусы пересаживают и инкубируют в течение 21 дня в таких же
условиях, как в позиции 3.
5. Перед инфицированием переносят отдельные кусочки каллуса
массой около 200 мг из среды для культивирования в стериль-
ные чашки для культивирования размером 60 X 20 мм, содержащие
несколько капель стерильной дистиллированной воды.
267
10.2.2.2.	Приготовление и выращивание патогена
Phytophthora parasitica var. nicotianae (Ppn) можно хранить до 6—12
месяцев при 4—6 °C на косом агаре картофельной декстрозы (АКГ,
фирма Difco) под наслоенным на него стерилизованным минеральным
маслом, как это описано для Pmm. Однако для получения инокулума
патоген необходимо выращивать на агаре с овсяной мукой (см. ниже
позицию 1). В зависимости от требуемого количества инокулум может
состоять из частей мицелия или зооспор. Как и для Pmm, патогенность
Ррп необходимо регулярно проверять путем инфицирования интактных
растений.
1.	Готовят агаризованную среду с овсяной мукой следующим обра-
зом. На каждый литр среды гомогенизируют в мощном гомогени-
заторе 75 г овсяной муки в 600 мл дистиллированной воды. Смесь
стерилизуют в автоклаве при 100 °C в течение 30 мин. Тем временем
растворяют с подогревом 20 г агара в 400 мл дистиллированной
воды. Смешивают два раствора и дают им полностью остыть, а
затем автоклавируют в течение 20 мин при 121 °C. Разливают по
10—15 мл в стерильные чашки Петри диаметром 9,5 см.
2.	На середину агаризованной среды с овсяной мукой кладут кусочек
ткани мицелия Ррп. Инкубируют культуры в темноте при 22 + 2° С в те-
чение 12 — 16 дней. Гриб формирует толстый покров белого мицелия.
3.	Для получения мицелиального инокулума отделяют кусочек (около
2 см2) с покрова мицелиальной культуры. Помещают кусочек в
стерильный сосуд с завинчивающейся крышкой, содержащий 10 мл
стерильной дистиллированной воды. Сосуд сильно встряхивают,
чтобы разрушить кусочек мицелия.
4.	Для получения инокулума зооспор выращивают Ррп на агаризован-
ной среде с овсяной мукой в течение недели, как было описано
выше. Отделяют от каждой культуры по кусочку мицелия и по-
мещают их в чашки Петри, содержащие 15—20 мл стерильной дистил-
лированной воды. Культуры инкубируют в темноте при 22 ± 2 °C
в течение 2 недель, меняя за время инкубации несколько раз дистил-
лированную воду. Воду сливают и добавляют 10 мл свежей стериль-
ной дистиллированной воды. Охлаждают культуры в течение 25 мин
до 8 °C. Затем опять переносят их в условия с комнатной темпера-
турой. Зооспоры будут высвобождаться примерно через 15 мин.
Подсчитывают в образце зооспоры, используя гемоцитометр и
доводят их до требуемой концентрации.
10.2.2.3.	Методы инфицирования
1.	Для мицелиального инокулума помещают одну каплю (около
50 мкл) на верхушку каждого кусочка каллуса. В качестве кон-
троля на верхушку каждого кусочка каллуса добавляют каплю
стерильной дистиллированной воды.
268
I
2.	Для инокулума зооспор доводят их концентрацию примерно до
200—300 зооспор/мл. На верхушку каждого кусочка каллуса по-
мещают кольцо (внутренний диаметр 5 мм, высота 2 мм) из сте-
рильной тигоновой трубки. Внутрь каждого кольца капают одну
каплю (около 50 мкл) инокулума. В качестве контроля на вер-
хушку каждого кусочка каллуса добавляют каплю дистиллирован-
ной воды.
3.	Инкубируют инфицированные каллусные культуры в темноте при
20°C. Ежедневно проверяют развитие гифов.
10.2.2.4.	Система оценки скорости роста
Система оценки скорости роста (см. разд. 10.2.1.4) для люцерны,
инфицированной Р. megasperma, может быть применена и для опреде-
ления распространения Ррп по каллусу табака. Дитон и др. [6] исполь-
зовали следующие критерии:
0 — мицелий не виден;
1	— очень слабый рост воздушных гифов;
2	— ограниченный рост гифов;
3	— умеренное инфицирование;
4	— интенсивное инфицирование;
5	— каллус покрыт слоем мицелия.
10.3. ПОЛУЧЕНИЕ ДВОЙНЫХ КУЛЬТУР: ОБЛИГАТНО
БИОТРОФНЫЕ ПАТОГЕНЫ
После пионерской работы Мореля [20] целью многих исследова-
телей стало получение двойных культур облигатно биотрофных пато-
генов и их хозяев. Для ложной мучнистой росы (Peronosporaceae), белой
ржавчины (Albuginaceae), настоящей мучнистой росы (Erysiphales),
ржавчинных грибов (Uredinales) и Plasmodiophorales двойные культуры
потенциально позволили бы проклонировать изоляты патогена, получить
аксеничные культуры, асептический инокулум, а- также системы для
изучения взаимодействий растения-хозяина и патогена. В то время
как двойные культуры получили для многих упомянутых патогенов
и их хозяев [21, 22], использование других систем было связано с техни-
ческими трудностями. В идеале двойные культуры облигатных биотро-
фов и их хозяев следует разрабатывать путем культивирования подвер-
женного этому заболеванию растительного материала или путем инфи-
цирования культивируемых тканей, как это показано на рисунке 10.3.
В удачно разработанной двойной культуре патоген заражает хозяина и
между скоростью роста тканей растения-хозяина и патогена устанавли-
вается равновесие. При пересадках как каллус, так и гифы должны
продолжать расти без сдвига равновесия. В двойной культуре сахарной
269
Стерильный инокулум
Международный обмен изолятами
Клонирование патогенов
Изучение взаимодействия растение-хозяин и патоген
Аксеничная культура
Рис. 10.3. Схема получения двойных культур облигатно биотрофных патогенов
растений из здорового экспланта, который затем инфицируется, или из инфици-
рованных эксплантов.
свеклы (Beta vulgaris) и возбудителя ложной мучнистой росы Peronospora
barinosa f. sp. betae удалось добиться такого равновесия. Подробная
методика получения этой системы, а также список двойных культур
для других разновидностей ложной мучнистой росы и их растений-
хозяев опубликованы в работе Ингрэма [23]. К сожалению, во многих
случаях, особенно у настоящей мучнистой росы [24] и ржавчинных
грибов [21,25], инфицирование каллусов может оказаться безуспешным
или, если оно и происходит, рост гриба не поддерживается. Было вы-
сказано предположение, что причинами неудач в получении двойных
культур в данных системах являются отсутствие эпидермиса и кути-
кулы в каллусах, а также наличие в них ингибиторов роста грибов
[21, 22]. Кроме того, в успешно полученных двойных культурах ге-
270
нотипическая устойчивость к патогену в каллусах, полученных из устой-
чивых растений, может не проявляться [26]. С другой стороны, каллус
из чувствительных растений может и не поддерживать хороший рост
исследуемого облигатного биотрофа. Эту трудность в некоторых слу-
чаях можно обойти, изменив состав питательной среды для культи-
вируемого каллуса [26] или другие параметры, например температуру
инкубации или световой режим [27]. Для каждой системы растение-
хозяин/облигатный биотроф необходимо подбирать соответствующую
среду и параметры культивирования. Ниже приводятся методики полу-
чения двойных культур двух разновидностей ложной мучнистой росы
и их хозяев.
10.3.1 СИСТЕМА САХАРНЫЙ ТРОСТНИК/SCLEROSPORA SACCHARI
Двойные культуры сахарного тростника и возбудителя ложной
мучнистой росы Sclerospora sacchari были получены при использовании
инфицированных естественным путем верхушек побегов и листьев
[27]. В двойных культурах устойчивость S. sacchari не проявлялась.
Каллус, полученный из устойчивых растений, как правило, был под-
вержен инфицированию, как и каллус из чувствительных растений.
Двойные культуры невозможно было поддерживать в течение длитель-
ного времени путем регулярного пересаживания, так как скорость
роста каллуса обычно превышала скорость размножения гриба. Однако
культуры можно было поддерживать путем переноса кусочков инфици-
рованной каллусной ткани в культуры здорового каллуса, который
после этого также подвергался инфицированию.
10.3.1.1.	Получение двойной культуры
Для сахарного тростника метод культуры тканей широко исполь-
зуется с конца 60-х годов, когда, наконец, удалось получить каллусные
культуры и регенерированные побеги [28]. Недавно был опубликован
обзор по культуре тканей сахарного тростника, в который включены
способы индуцирования каллусообразования и регенерации побегов
[29]. Представленная здесь методика заимствована из опубликован-
ных работ Чена с соавторами [27] и Лью [29].
1.	Готовят модифицированную среду МС (табл. 10.5). Доводят pH
до 5,7 1 М NaOH.
2.	Готовят экспланты из больных растений (с выраженными симпто-
мами) или из здорового материала. Срезают наружные листья при-
мерно до десятого узла (от верхушки). Осторожно удаляют остав-
шиеся листья, обнажив конус апикальной меристемы и второй
внутренний молодой лист. Срезают их по отдельности и переносят
на модифицированную среду МС (табл. 10.5). Если работа с мате-
риалами проводилась в стерильных условиях, поверхностная сте-
рилизация не требуется.
271
10.5. Модифицированная среда Мурасиге и Скуга [17] для получения
каллуса из сахарного тростника [29]
Компоненты	Концен- трация, мг/л	Исходньн раствор, г/л	Количество, мл исходного раствора в 1 л среды
NH4NO3	1650	82,5 3	20
KNO3	1900	95,0 J	
MgSO47Н2О	370	74,0 '	
MnSO4•4H2O	22,3	4,46	5
ZnSO47H2O	8,6	1,72	
CuSO4•5H2O	0,025	0,005 J	
CaCl2 • 2H2O	440	88,0	5
H3BO3	6,2	1,24 "	
KH2PO4	170	34,0	
KI	0,83	0,166	5
Na2MoO4  2H2O	0,25	0,050	
Cod2 • 6H2O	0,02	0,005	
Na2 ЭДТЛ	37,23	1,3 .	L	28
FeSO„ • 7H2O	27,95	0,98	
Тиамин-HCl	1,0	—	—
Мезоинозит	100	—	—
Кокосовое молоко	10%	—	—
Сахароза	2000	—	—
2,4-Д	3,0	—	—
Лгар	9000	—	—
pH 5,7			
3. Экспланты инкубируют при	26 + 1 °C и	12-часовом режиме осве-	
щения (4000 лк).
4. Для пересадки помещают кусочек инфицированного каллуса таким
образом, чтобы был контакт со здоровой каллусной тканью, расту-
щей на модифицированной среде МС.
10.3.2. СИСТЕМА ТАБАК/PERONOSPORA TABACINA
Получение двойной культуры табака (Nicotiana tabacum) и возбу-
дителя пероноспороза табака, Peronospora tabacina, впервые было про-
ведено Изардом и др. в начале 60-х годов [30]. Оказалось, что каллусная
ткань табака поддерживает рост и споруляцию Р. tabacina, тогда как
каллус N. debneyi (вид, устойчивый к пероноспорозу) очень слабо
поддерживал рост Р. tabacina. Тригиано и др. [31] с помощью методов
световой и электронной микроскопии изучали взаимодействие каллусов
табака и Р. tabacina в двойной культуре. При этом были выявлены
различия во взаимодействии культуры ткани и интактного растения —
с одной стороны и патогена — с другой, особенно в процессе инфициро-
вания, хотя ультраструктурные характеристики при взаимодействии
гриба и клетки растения-хозяина были сходны. К сожалению, не уда-
272
лось добиться сбалансированного роста Р. tabacina и каллусной ткани
табака. Со временем рост гриба снижался и спорангии не образовыва-
лись. Методики, использовавшиеся в этой работе [31], представлены
ниже. Для улучшения роста гриба в двойной культуре, возможно, по-
требуются изменения состава среды, условий культивирования и (или)
используемых сортов растений.
10.3.2.1.	Получение каллусных культур табака
Каллусы получают из тканей сердцевины стебля, культивируемых в
среде МС [17]. Среду готовят по прописи, указанной в таблице 10.4, со сле-
дующей модификацией; вместо Ыа2ЭДТА в концентрации 37,23 мг/л и
10.6. Среда Ml для выращивания каллусных культур табака,
инфицированных Peronospora tabacina *
Компоненты	Концен- трация, мг/л	Исходный	Количество,	
		раствор г/л	мл исходного раствора в 1 л среды
Ca(NCL), • 4Н2О	133,3	0,8 Л	
KNO,	33,3	0,2	166
КН2РО4	33,3	0,2 )	
K.I	0,83	0,1661	
Н2ВО3	6,2	1,24	
Na2MoO4 • 2Н2О	0,25	0,050	5
СоС12 -6Н2О	0,025	0,005	
ZnSO4 7Н2О	8,6	1,72 1	
MnSO4 - 4Н2О	22,3	4,46	5
CuSO,  5Н2О	0,025	0, 005.	
Ыа2ЭДТА	37,23	12,4	з
f’eSO4  7Н2О	27,95	9,3	
Никотиновая кислота	0,5	0,10	
Пиридоксин-НС1	0,5	0,10	5
Тиамин-НС1	0,1	0,02	
Мезоинозит	100	—	—
Глюкоза	5000		—
ИУК	0,088	—	—
Кинетин	0,11	—	
pH 5,7
* Среда была составлена Изардом и др. [301, а затем модифицирована Три-
гиано и др. [31].
FeS04 • 7Н2О в концентрации 27,65 мг/л добавляют 22,4 мг/л Na2 ЭДТА
и 10,6 мг/л FeS04 -7Н2О. Концентрация сахарозы равна 30 г/л, кине-
тина — 0,22 мг/л, а вместо НУК добавляют 2,0 мг/л ИУК.
273
1.	Готовят среду МС, как описано выше. ИУК и кинетин стерилизуют
фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм, а затем
добавляют к автоклавированной среде.
2.	Проводят поверхностную стерилизацию срезов стебля табака раз-
мером 4—6 см, затем в асептических условиях удаляют ткани серд-
цевины, измельчают (кусочки 0,4—0,6 см в диаметре) и помещают
в среду МС.
3.	Культуры инкубируют в темноте при 25 °C. Исходные куль-
туры необходимо поддерживать, пересаживая через каждые
2 недели.
4.	За пять дней до инфицированния каллус переносят в чашки Петри
размером 100Х 25 мм, содержащие среду Ml (табл. 10.6). Инку-
бируют культуру в темноте при 25 °C.
10.3,2.2.	Получение инокулума
1.	Инфицируют листья растений табака, чувствительных к пероноспо-
розу,Р. tdbacina в концентрации 2 X 104 спорангиев в 1 мл.
2.	Инкубируют растения в теплице при 22 °C в течение 7 дней
до появления хлоротических пятен. Переносят растения в темно-
ту на 2—4 ч, затем протирают поверхность хлоротических пятен
70% спиртом. Инкубируют растения в течение ночи при 100%
относительной влажности для индуцирования спороношения Р. taba-
cina.
3.	Определяют среднее число спорангиев на 1 см2 поврежденной ткани,
смыв их с трех пятен водой и подсчитав на гемоцитометре. Опре-
деляют степень повреждения, используя прибор для измерения
площади поверхности. Тригиано и др. [31] сообщали о наличии
на 1 см2 поврежденной ткани в среднем 5 X 104 спорангиев.
10.3.2.3.	Инфицирование
1.	Используя 1% водный раствор агара, кусочек ткани листа, инфи-
цированный Р. tabacina, прикрепляют спорангиофорами вниз на
внутреннюю поверхность крышки чашки Петри, содержащей кал-
лусы табака. Спорангиофоры раскроются после того, как культуры
слегка подсохнут.
2.	Примерно через 18ч после инфицирования заклеивают чашки Петри
парафилмом и инкубируют культуры в темноте при 25 °C.
ЛИТЕРАТУРА
1.	Miller, S. A. and Maxwell, D. Р. (1983) in Handbook of Plant Cell Culture, Vol.
1, Evans, D. A., Sharp, W. R., Ammirato, P. V. and Yamada, Y. (eds.), Macmillan Pub-
lishing Co., New York, p. 853.
2.	Miller, S. A., Davidse, L. C. and Maxwell, D P (1984) Phytopathology, 74,
345.
274
3.	Haberlach, G. T., Budde, A. D., Sequeira, L. and Helgeson, J. P. (1978) Plant
Physiol., 62,522.
4.	deZoeten, G. A., Gaard, G., Haberlach, G. T., and Helgeson, J. P. (1982)Phyto-
pathology, 72, 743.
5.	Helgeson, J. P., Haberlach, G. T. and Upper, C. D.	Phytopathology, 66, 91.
6.	Deaton, W. R., Keyes, G. J. and Collisn, G. B. (1982) Theor. Appl. Genet., 63, 65.
7.	Evans, D. A., Sharp, W. R. and Medma-Filho, H. P. (1984)Am. J. Bot., 71, 759.
8.	D’Amato, F. (1978) in Frontiers of Plant Tissue Culture, Thorpe, T. A. (ed.).,
lAPTC/University of Calgary, Calgary, p. 287.
9.	Saunders, J. W. and Bingham, E. T. (1972) Crop Sei., 12, 804.
10.	Irwin, J. A. G., Maxwell, D. P. and Bingham, E. T. (1981) Crop Sei., 21, 277.
11.	Schenk, R. U. and Hildebrandt, A. C. (1972) Can. J. Bot., 50, 199.
12.	Lupotto, E. (1983) Z. Pflanzenphysiol., 111. S., 95.
13.	Irwin, J. A. G., Miller, S. A. and Maxwell, D. P. (1979) Phytopathology, 69,
1051.
14.	Diener, U. L. (1955) Phytopathology, 45, 141.
15.	Helgeson, J. P., Kemp, J. D., Haberlach, G. T. and Maxwell, D. P. (1972)Phyto-
pathology, 62,1439.
16.	Maronek, D. M. and Hendrix, J. W. (1978) Phytopathology, 68, 233.
17.	Murashige, T. and Skoog, F. (1962)Physiol. Plant, 15, 473.
18.	Flick, С. E. and Evans, D. A. (1984) in Handbook of Plant Cell Culture, VoL 2,
Sharp, W. R., Evans, D. A., Ammirato, P. V. and Yamada, Y. (eds.), Macmillan Publis-
hing Co., New York, p. 606.
19.	Kasperbauer, M. J. and Collins, G. B. (1972) Crop. Sei., 12, 98.
20.	Morel, G. (1944) C. R. Hebd. Seances. Acad. Sei., Paris., 218, 50.
21.	Amerson, H. V. and Mott, R. L. (1982) in Tissue Culture in Forestry, Bonga, J. M.
and Durzan, D. J. (eds.), Martinus Nijhoff/Dr. W. Junk Publishers, The Hague, Boston
and London, p. 208.
22.	Ingram, D. S. (1977) in Plant Tissue and Cell Culture, Botanical Monographs,
VoL II, Street, H. E., (ed.), University of California Press, Los Angeles, p. 463.
23.	Ingram, D. S. (1980) in Tissue Culture Methods for Plant Pathologusts,
Ingram, D. S. and Helgeson, J. P. (eds.), Blackwell Scientific Publications, Oxford, Lon-
don, Edinburgh, Boston and Melbourne, p. 139.
24.	Webb, K. J. and Gay, J. L. (1980) in Tissue Culture Methods for Plant Patholo-
gists, Ingram, D. S. and Helgeson, J. P. (eds.), Blackwell Scientific Publications, Oxford,
London, Edinburgh, Boston, and Melbourne, p. 151.
25.	Jacobi, W. R. (1982) Phytopathology, 72,143.
26.	Ingram, D. S. and Tommerup, I. C. (1973) in Fungal Pathogenicity and the
Plant’s Response, Byrde, R. J. W. and Cutting, С. V. (eds.), Academic Press, London
and New York, p. 121.
27.	Chen, W.-IL, Liu, M.-C. and Chao, C.-Y. (1979) Can. J. Bot., 57,528.
28.	Heinz, D. J. and Mee, G. W. P. (1969) Crop Sci., 9, 346.
29.	Liu, M.-C. (1984) in Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 2, Sharp. W. R.,.
Evans, D. A., Ammirato, P. V. and Yamada, Y. (eds.), Macmillan Publishing Co. New
York, p. 572.
30.	Izard, C., Lacharpagne, J. and Schiltz, P. (1964) SEPTA (Serv. Exploit. Ind.
Tab. Alumettes), Ann. Dir. Etud. Equip., Sect. Deux, 95.
31.	Trigiano, R. N., Van Dyke, C. G„ Spun, H. W. Jr. and Gray, D. J. (1984)
Phytopathology, 74, 280.
275
СОДЕРЖАНИЕ
Предисловие к русскому изданию ...	. .	......... ............. 5
Предисловие к английскому изданию	....	...	7
1.	Изолирование и поддержание каллусных и суспензионных культур
клеток. Р. А. Диксон................................................ 8
1.1.	Введение ........................................... ...	8
1.2.	Основные требования к лаборатории ........................ 8
1.3.	Среда для культивирования ....	    .	10
1.3.1.	Состав...............................................  10
1.3.2.	Приготовление сред ................................... 15
1.3.3.	Выбор среды........................................... 17
1.4.	Каллусные культуры . . ............................ ....	20
1.4.1.	Выбор экспланта ... .................................. 20
1.4.2.	Приготовление и стерилизация эксплантов............... 20
1.4.3.	Индукция, субкультивирование и поддержание каллуса ... 23
1.5.	Суспензионные культуры................................... 24
1.5.1.	Получение суспензионных культур из каллуса............ 24
1.5.2.	Получение суспензионных культур из клеток мезофилла
листа......................................................   25
1.5.3.	Субкультивирование и измерение роста.................. 26
Литература........................................................	31
2.	Культуры гаплоидных клеток. Дж. М. Данвелл..................... 33
2.1.	Введение ........................................'.	... .	33
2.1.1.	Селекция растений.....	.	. .	............... .	33
2.1.2.	Количественные генетические исследования ............. 33
2.1.3.	Исследование дифференцировки клеток и смена поколений . .	33
2.2.	Метод культивирования пыльников и пыльцы................. 34
2.2.1.	Культура пыльников.................................... 34
2.2.2.	Культура пыльцы .	   45
2.2.3.	Результаты культивирования............................ 47
2.2.4.	Отбор мутантов........................................ 49
2.3.	Заключение .............................................. 49
Литература . .	............... ............................  50
3.	Изолирование, культивирование и генетические манипуляции с прото-
пластами растений. Дж. Б. Павер, Дж. В. Чепмен..................... 52
3.1.	Введение ................................................ 52
3.2.	Требования к растениям и кликам при выделении протопластов ..	52
3.2.1.	Выращивание растений.................................. 52
3.2.2.	Борьба с вредителями.................................. 52
3.2.3.	Рост клеточных суспензий.............................. 53
3.2.4.	Получение проростков.................................. 53
3.3.	Методы выделения протопластов ........................... 53
3.3.1.	Протопласты из листьев (на примере Petunia parodii)... 53
3.3.2.	Культивируемые протопласты, полученные из клеток (на
примере альбиносного растения Petunia hybrida)............... 56
3.3.3.	Протопласты из семядолей (на примере Medicago sativa).	57
3.3.4.	Протопласты из корней (на примере Trigonella foenum-grae-
cum) ....	............	.......... 58
276
3.3.5.	Протопласты из гипокотиля, стебля и черешков (на примере
Brassica napus)................................................ 58
3.3	6. Протопласты из лепестков (на примереNicotiana afflnis) ....	58
3.3.7	-Протопласты из пыльцевых зерен и тетрад................. 59
3.3.8.	Протопласты из зеленых и белых листьев аксеничных куль-
тур (на примере Petunia inflata') ............................. 59
3.3.9.	Протопласты из листьев с неотделяемым эпидермисом (на
примере Petunia parviflora) .................................   60
3.4.	Культура протопластов ....	...................... 61
3.4.1.	Подсчет протопластов .	......... ...	61
3.4.2.	Жизнеспособность протопластов (окрашивание ФДА) .	61
3.4.3.	Платирование в агаре................. ...	62
3.4.4.	Культивирование в висячей/сидячей капле	. .	62
3.4.5.	Культивирование в жидкой среде на агаре . ...	........ 62
3.4.6.	Культивирование на агарозной среде...................... 63
3.5.	Поддержание культур протопластов и регенерация растений .... 63
3.5.1.	Деление протопластов .	..... ......................... 64
3.5.2.	Регенерация растений..................................   64
3.5.3.	Выбор сред для культивирования и регенерации протопластов 64
3.5.4.	Определение условий культивирования протопластов...	65
3.6.	Соматическая гибридизация растений.	. .	................. 67
3.6.1.	Введение..............................................   67
3.6.2.	Слияние протопластов: основной метод.................... 68
3.6.3.	Обработка для слияния: полиэтиленгликоль (ПЭГ) ....	69
3.6.4.	Обработка для слияния: слияние при высоком pH и наличии
ионов кальция................................................   70
3.6.5.	Слияние в небольших объемах . .	.......	71
3.6.6.	Метод электроспияния ...	.72
3.7.	Отбор соматических габридов	  73
3.7.1	Введение	  73
3.7.2.	Получение и выращивание ядерных мутантов-альбиносов ....	73
3.7.3.	Спонтанные мутанты-альбиносы........  .	74
3.7.4.	Выделение отдельных гетерокарионов.................. 74
3.7.5.	Анализ растений, полученных при соматической гибридизации . .	76
3.7.6.	Общие требования к экспериментам по слиянию ............ 77
3.8.	Трансформация растений с использованием систем протопластов 77
3.8.1.	Введение . .	......... . .	77
3.8.2.	Трансформация изолированными '/'/'-плазмидами (на примере
Petunia hybrida)............................................... IS
3.8.3.	Трансформация регенерирующих протопластов Agrobacterium
(на примере Nicotiana tabacum) ...................	78
3.8.4.	Проверка трансформации и способности к образованию опу-
холи .......................................................... 79
3.9.	Введение органелл в протопласты	. .	80
3.9.1.	Введение................................................ 80
3.9.2.	Введение в протопласты водорослей, хлоропластов и микро
организмов (на примере Р. hybrida)	80
Литература	. .	........ ...................... 81
4.	Отбор клеток растений по требуемым признакам: устойчивость к инги-
биторам. Р. А. Гонзалес, Дж. М. Уидхолм	...	83
4.1.	Введение . .	83
4.2.	Отбор из суспензионных культур	83
277
4.2.1.	Приготовление суспензии клеток .	..... ........... 83
4.2.2.	Концентрация ингибитора ....	. -	....... 85
4.2.3.	Мутагенез............................ .	.	...	87
4.2.4.	Одноступенчатый отбор ...	88
4.2.5.	Многоступенчатый отбор......	89
4.2.6.	Отбор на (в) агаризованной среде .	..... .	90
4.3.	Отбор из культур протопластов	....	....... 91
4.4.	Отбор из каллусных культур.............. .	. . . ........ 92
4.5.	Стабильность и клонирование линий клеток растений, устойчи-
вых к ингибитору ........	- .	......... 93
4.5.1.	Стабильность признака устойчивости.. . .	. .	93
4.5.2.	Клонирование путем платирования агрегатов клеток ....... 93
4.5.3.	Клонирование через культуру протопластов ............... 94
4.5.4.	Клонирование путем культивирования одиночных клеток ...	95
Литература ...	.......... ....	....	...	96
5.	Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений. Б. Тиссера...... 97
5.1.	Введение.................................................   97
5.1.1.	Способы регенерации растений .	................... 98
5.1.2.	Значение зкспланта....... .	....	....... 99
5.1.3.	Факторы питательной среды ....	....	....... 102
5.1.4.	Условия культивирования	...	....... 109
5.2.	Соматический эмбриогенез ...	..... ........... 110
5.2.1.	Непрямой соматический эмбриогенез ....................  111
5.2.2.	Прямой неполовой эмбриогенез . .	................. 114
5.3.	Органогенез ................ .	.	..... . -	• •	116
5.3.1.	Образование побегов каллусами.......................... 117
5.3.2.	Регенерация растений непосредственно из культивируемых
эксплантов.................................................... 119
5.3.3.	Усиление образования пазушных побегов in vitro	119
5.4.	Регенерация растений из протопластов...................... 122
5.4.1.	Процедура выделения протопластов табака и регенерации
растений...................................................... 123
5.5.	Регенерация растений: состояние, проблемы и возможности... 124
5.6.	Заключение............... ....	............ 125
Литература .	............	................... 126
6.	Использование культур тканей для изучения дифференциации сосудов.
Г. П. Болвелл..............................  ....	. .	- -	128
6.1.	Введение................................................   128
6.2.	Общие комментарии по использованию культур тканей......... 129
6.3.	Стратегии .........................................   -	•	130
6.4.	Системы................................................... 131
6.4.1.	Изолированные клетки .................................. 132
6.4.2.	Экспланты................................   ........	1 34
6.4.3.	Культуры каллусов...................................... 135
6.4.4.	Суспензионные культуры...............................   138
6.5.	Действие регуляторов роста растений и синтез макромолекул ...	139
6.6.	Биохимические маркеры процесса дифференциации сосудов ....	144
6.6.1.	Образование вторичной стенки.......... . .	144
6.7.	Заключение..............................................   151
Литература........	..................... . .	....	151
278
7.	Образование продуктов вторичного метаболизма в суспензионных куль-
турах клеток. П. Моррис, Л. X. Скрагг, Н. Дж. Смарт, А. Стаффорд.	154
7-1. Введение ...................................................... 154
7.2.	Стратегия поддержания синтеза продуктов вторичного метабо-
лизма ........................................................ 154
7.2.1.	Питательные среды, поддерживающие синтез продуктов вто-
ричного метаболизма.......................................... 156
7.2.2.	Условия культивирования ................................... 158
7.2.3.	Двухстадийная система получения серпентина в суспензион-
ных культурах С. roseus...................................... 159
7.2.4.	Одностадийная система получения серпентина в суспензион-
ных культурах С. roseus...................................... 161
7.2.5.	Нестабильность выхода продукта при последовательных пе-
ресадках .................................................... 161
7.3.	Анализ продукта .............................................. 162
7.3.1.	Экстракция образца......................................... 163
7.3.2.	Обработка образцов и предварительное фракционирование ....	165
7.3.3.	Разделение и количественная оценка......................... 167
7.3.4.	Иммунологические методы исследования....................... 174
7.3.5.	Идентификация продукта...................................   175
7.4.	Культивирование в больших объемах............................. 176
7.4.1.	Трудности, связанные с культивированием в больших объемах .	177
7.4.2.	Модификация существующих биореакторов...................... 179
7.4.3.	Конструкции биореакторов................................... 180
7.4.4.	Биореакторы промышленного изготовления..................... 184
7.4.5.	Синтез продуктов вторичного метаболизма в культурах боль-
шого объема.................................................. 184
7.4.6.	Непрерывное культивирование ............................... 185
7.5.	Иммобилизованные клетки....................................... 185
7.5.1.	Методы иммобилизации, применимые к клеткам растений ....	186
7.5.2.	Особенности и проблемы систем иммобилизации клеток...	191
7.5.3.	Реакторы с иммобилизованными клетками.....................  193
7.6.	Биотрансформация.............................................. 195
7.6.1.	Биотрансформация стероидных гликозидов дигиталиса ......... 198
Литература.............................................................. 202
8.	Криосохранение и хранение генофонда. Л. А. Уизерс .................. 204
8.1.	Введение ..................................................... 204
8.2.	Основные методы хранения...................................... 204
8.2.1.	Медленный рост............................................  205
8.2.2.	Криосохранение............................................. 205
8.2.3.	Стратегии хранения......................................... 208
8.3.	Оборудование.................................................. 208
8.3.1.	Медленный рост............................................. 209
8.3.2.	Криосохранение............................................. 209
8.4.	Способы хранения: медленный рост.............................. 213
8.4.1.	Общие замечания............................................ 213
8.4.2.	Выращивание при пониженной температуре .....................213
8.4.3.	Выращивание в присутствии осмотических ингибиторов... 214
8.4.4.	Культивирование в присутствии регуляторов роста ......	214
279