/
Автор: Фрешни Р.Я.
Теги: биологическая техника, экспериментальные методы и оборудование в целом общая биология биология биотехнологии
ISBN: 978-5-9963-1342-6
Год: 2012
Текст
КУЛЬТУРА
ЖИВОТНЫХ
КЛЕТОК
КУЛЬТУРА
ЖИВОТНЫХ
КЛЕТОК
R. Jan Freshney
CULTURE
OF ANIMAL CELLS
A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE
Fifth Edition
R. Jan Freshney
Cancer Research UK Centre for Oncology and Applied Pharmacology
Cancer Research UK Beatson Laboratories
University of Glasgow
WILEY-LISS
A JOHN WILEY & SONS, INC., PUBLICATION
МЕТОДЫ
В
БИОЛОГИИ
Р. Я.Фрешни
КУЛЬТУРА
ЖИВОТНЫХ
КЛЕТОК
ПРАКТИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО
2-е издание (электронное)
Перевод с 5-го английского издания
д-ра биол. наук Ю. Н. Хомякова,
канд. мед. наукТ. И. Хомяковой
Москва
JL БИНОМ. Лаборатория знаний
2012
УДК 57.08
ББК 28.03
Ф87
Фрешни Р. Я.
Ф87 Культура животных клеток [Электронный ресурс] : практи-
ческое руководство / Р. Я. Фрешни ; пер. 5-го англ. изд. 2-е изд.
(эл.). — М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012. 691с. : ил.,
[24] с. цв вкл.
ISBN 978-5-9963-1342-6
Учебное издание, написанное ведущим специалистом в данной области,
содержит наиболее полное описание теоретических основ и практических
приемов работы с культурами животных клеток, а также необходимого
оборудования, включая лабораторный дизайн В достаточном объеме осве-
щены вопросы техники безопасности Подробно обсуждаются методика
подготовки сред, приемы работы с первичной культурой и клеточными
линиями. Описано специальное оборудование, в том числе для маникуляций
с культурами животных клеток. Книга прекрасно иллюстрирована и удобна
для использования как практическое руководство в лаборатории
Для студентов-биологов, биотсхнологов, медиков, а также исследова-
телей, специалистов биофармацсвтичсскнх центров и сотрудников диагно-
стических лабораторий.
УДК 57.08
ЬЬК 28.03
По вопросам приобретения обращаться:
«БИНОМ. Лаборатория знаний»
Телефон: (499)157-5272
e-mail: binnmtaLbz.ru, http://www.Lbz.ni
Copyright ©
©
ISBN 978-5-9963-1342-6
2005 by John Wiley & Sons Inc.
Все права защищены Перевод
с английского языка по договору.
ВИНОМ Лаборатория знаний,
2010
Оглавление
Список рисунков ... 15
Список цветных вкладок .. 18
Предисловие .................................. 19
Список сокращений 21
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ .............................25
1.1. История вопроса 25
1.2. Преимущества метода культуры ткани . 30
12.1 Контроль окружения .............. 30
1.2.2 Характеристика и однородность
образца........................ 31
1.2.3 Экономичность, эффективность
и автоматизация процесса ...... 31
1.2.4 Моделирование tn vitro условий
tn two......................... 31
1.3. Ограничения метода культуры ткани 31
1 3.1 Наличие специальных навыков .... 31
1.3.2 Затраты......................... 32
1 3.3 Дифференцировка и селекция.. 32
1 3.4 Происхождение клеток 32
13.5 Нестабильность.. 32
1.4. Основные отличия культуры in vitro . 32
1.5. Типы культуры ткани 33
ГЛАВА 2. ТРЕНИРОВОЧНЫЕ
ПРОГРАММЫ ... 36
2.1. Цели и задачи главы .36
2.2. Упражнения для начинающих
(основной курс) ......................... 36
Упражнение 1 Асептический метод 1:
Пикетирование и перенос жидкостей . 38
Упражнение.................................. 38
Упражнение 2 Введение в технику ведения
культуры ткани . 39
Упражнение ........................ 39
Упражнение 3 Асептический метод 11-
Приготовление питательной среды.. 40
Упражнение ............................. . 41
Упражнение 4 Смена среды в монос зойной
культуре......... ........... 41
Упражнение .................... . 41
Упражнение 5 Мытье и стерилизация
стекзянной посуды. .. .... 42
Упражнение ................................. 42
Упражнение 6 Подготовка и стерилизация воды.... 42
Упражнение.................................. 42
Упражнение 7 Подготовка и стери шзация
фосфатно-буферного раствора для среды
Дюльбекко (D-PBS) без Саг~и М^‘........... 43
Упражнение ................................. 43
Упражнение 8 Приготав зение стандартных
растворов для контроля pH..............43
Упражнение............................. 13
Упражнение 9 Приготовзение основной
питательной среды из порошка
и стерилизация методом фильтрования........ 14
Упражнение ............................ 14
Упражнение 10 Приготов зение по зной среды
из концентрата 10х . . 14
Упражнение . ............................ 15
Упражнение 11 Приготов зение полной среды
из порошка ......................... 15
Упражнение 12 Помнет клеток в ге иоцитометре
и э /ектронном счетчике .. 15
Упражнение ................................... 16
Упражнение 13 Рост субкузьтуры клеток
в суспензии .. .......... 16
Упражнение............................. ... 17
Упражнение 14. Рост субкузьтуры постоянной
клеточной линии в монослое .... 17
Упражнение ................................... 18
Упражнение 15 Окрашивание монослойной
клеточной кузыпуры по Гимза................ 19
Упражнение . .. 50
Упражнение 16 Построение и анализ
кривой роста................ 50
Упражнение. .... 50
2.3. Упражнения повышенной сложности 51
Упражнение 17 Криоконсервация
культивируемых клеток....................... 51
Упражнение ................................... 52
Упражнение 18 Обнаружениемикопзази. . 52
Упражнение .......................... 54
Упражнение 19 Характеристика клеточных
линий.... .... 54
Упражнение.............. 55
Упражнение 20 Первичная культура...... 55
Упражнение............................ 56
Упражнение 21 Клонирование в монослое. 56
Упражнение....................... 57
2.4. Специализированные упражнения 57
ГЛАВА 3. БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
КЛЕТОК .58
3.1. Влияние окружающей среды
на культуру клеток 58
3.2. Клеточная адгезия................ 58
3.2.1 Молекулы клеточной адгезии. 58
3.2.2 Межклеточные контакты ... 59
3.2.3 Внеклеточный матрикс....... 60
3.2.4 Цитоскелет................. 61
3.2.5 Клеточная подвижность 61
3.3. Клеточная пролиферация.. 62
3.3.1 Клеточный цикл............. 62
3.3.2 Кин ipo.ib клеючной пролиферации ... 62
3.4. Дифференцировка...................63
Оглавление
341 Поддержание и индукция
дифференцировки...........
3.4 2 Дедифференцировка..
3.5. Передача клеточных сигналов.
3.6. Энергетический метаболизм
3.7. Получение первичной культуры
3.8. Эволюция клеточных линий
381 Старение ...
3.9. Возникновение постоянных
клеточных линий . .
3.10. Происхождение культивируемых клеток.
ГЛАВА 4. СТРУКТУРА И ПЛАНИРОВАНИЕ
ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ
4.1. Планирование
4.2. Обслуживающие системы
и вспомогательные службы
4.3. Планирование асептических комнат
или блоков....................
431 Помещение для стерильных
манипуляции...............
4 3.2. Ламинарное оборудование
4 3.3 Карантин и изоляция.........
4 3 4. Помещения для сервисных служб..
4.4. Инкубация......
441 Инкубаторы ....
4.4 2. Термальная комната..
4.5. Помещения для подготовительных работ
451 Приготовление сред............
45 2 Помещение для мытья посуды
4.5.3. Хранение...............
ГЛАВА 5. ОБОРУДОВАНИЕ
5.1. Потребности лаборатории культур тканей
5.2. Асептическая зона....
5.2 1. Ламинарные шкафы....
5.2 2. Цилиндры для пипеток .
5.2.3. Аспирационный насос........
5 24. Сервисные тележки...........
5.2 5. Инвертированный микроскоп .
5 26 Центрифуга...................
5.2 7. Манипуляции с жидкостями
в стерильных условиях
ииистированис и дозирование
5.2.8. Счетчик клеток......
5.2 9. CCD-камсра и монитор
5 2 10 Препаровальная луна.
5.3. Инкубация.................
5.3 1 Инкубатор............
5.3 2 Влажный СО2-инкубатор ..
5.3.3 Pci ист ратор температуры..
53.4. Роллерные штативы ..
5 3 5. Магнитная мешалка ..
5.4. Подготовительные работы
и стерилизация.....
541 Мы гьс посуды
5 4 2. Очиститель воды ...........
5.4.3. Стерилизация и сушильные шкафы ..
544 Паровой стерилизатор (автоклав)....
5 4 5. Весы........ ..............
5.46. рН-Метр.....................
54 7 Mai нитная мешалка с подогревом
5 4.8. Автоматический диспенсер .
5.4 9 Измеритель электропроводности
(кондуктометр) ............
63
64
66
67
67
68
68
68
70
72
72
76
76
77
77
78
78
78
78
78
81
81
81
82
85
85
85
85
87
87
88
88
89
89
92
93
93
94
94
94
95
96
96
96
96
96
97
98
98
99
99
100
100
5410 Осмометр. ... 100
5411. Моечная машина для стеклянной
посуды ............................ 100
5.5. Хранение.............................. 101
5 5 1. Хилидильники морозильники . . 101
5 5 2. Контейнеры для криоконссрвавии 102
5 5 3. Морозильники с управляемым
процессом замораживания.......... 102
5.6. Лабораторные приборы . 102
56.1 Компьютеры и сети. 102
5 6.2 Прямой микроскоп . 102
563 Низкотемпературный морозильник . 102
56.4. Конфокальный микроскоп..... 103
5£.5. Термоциклер.. .103
5.7. Специальное оборудование . ... .103
5.7.1. Установка для микроинъекций 103
5 7.2. Счетчик колоний................. 103
5.7 3. Цсшрпфужный элютрнатор...........104
5 7 4 Проточный цитометр 104
5.8. Расходные материалы 104
5.8 1 Пиноли. 104
5.8.2. Гсмоцитомстр.................... 104
5.8.3. Культу|>а.1ьные сосуды 105
5.8.4. Стерильные контейнеры.... 105
5.8.5. Шприцы и иглы................... 105
5.8.6. Стерилизационные фильтры......... 105
5.8.7. Бумажные полотенца м салфетки . 105
5.8.8. Дезинфектанты................... 105
ГЛАВА 6. МЕТОДЫ АСЕПТИКИ 106
6.1. Цели асептики 106
611 Поддержание стерильности. 106
6.2. Объекты асептического окружения .. 106
62.1. Стерильная зона................. 106
62.2. Рабочая поверхность 107
6.2.3 . Личная гигиена. .108
6.2.4 . Реагенты и среды.. 109
62.5 Культуры ....................... 109
6.3. Стерилизующие манипуляции . . 109
6.3 1 Протирание поверхностей . 109
6.3 2 Закрывание емкостей .110
6.3 3. Работа с горелкой................ ПО
6.3 4. Манипуляции с бутылками
и колбами........... 110
6.3 5. Пнист ированис . .110
6.3 6. Переливание . 112
6.4. Ламинарный поток. . . 112
6.5. Стандартная процедура . 113
65.1. Чашки Петри и многолуночныс
планшеты........................... ИЗ
6.6. Приборы и оборудование 114
661 Инкубаторы......................... 114
Протоки 16.1 Асептические методы работы
в вертикальном ламинарном потоке......... 115
Протока 16.2 Работа на открытой поверхности . 116
Протоки 163 Манипуляции с чашками
и планшетами........................ 118
66.2. Коробки для влажного инкубатора . 119
6.6.3. Культивирование в атмосфере СО2 119
ГЛАВА 7. БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА
И ВАЛИДАЦИЯ 120
7.1. Лабораторная безопасность ............120
7.2. Оценка риска......................... 120
Оглавление
120
120
122
122
122
123
124
125
126
126
126
126
127
127
127
127
129
129
129
131
135
136
136
136
136
136
137
138
138
138
139
139
139
139
139
140
142
143
143
144
144
145
145
145
145
146
146
147
148
148
149
149
149
149
7.3. Стандартные операционные процедуры .
7.4. Контроль безопасности
7.5. Общая безопасность
7.5.1 Оператор.
7.5.2 Оборудование...................
7.5.3 С1 ек.1»нныс и острые предметы.
7.5.4 Химическая токсичность
7.5.5 Газы.............
7.5.6 Жидким азот
7.5.7 Ожоги..........................
7.6. Пожар......
7.7. Ионизирующее излучение ... ...
7 .7.1. Попадание в организм.........
7 7.2 Утилизация радиоактивных отходов .
7.7.3 Излучение от меченых реагентов. .
7.7.4 Излучение от высокоэнергстичных
net очников ........
7.8. Биологическая опасность.........
7.8.1 Уровни биоло! ичсской защиты ..
7.8.2. Ламинарные шкафы
мик|юбиолО|ИчсскоГ| защиты..........
7.8.3 Человеческим бцоисцинын материал .
7.8.4 Манипуляции с генетическим
материалом............... ......
7.8.5 Уничтожение биологически
опасных отходов..............
7.8.6 Дезинфекция окуриванием ..
7.9. Биоэтика..............
7.9 .1 Ткани животных..
79.2 Ткани человека...
7.10. Валидация..........................
7 10 1. Подтверждение аутентичности ...
7 102 Происхождение.
7 10 3 Контаминация..
ГЛАВА 8. ПОСУДА И СУБСТРАТЫ
ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
8.1. Субстрат.....................
8 1.1 Прикрепление и рост клеток.
8.1.2 Материалы ..............
8.2. Выбор сосудов для культивирования
клеток ..............................
8.2.1 Клеточный выход в культуральном
сосуде......................
8.2.2 Суспензионная культура.........
8.2.3 Вентилирование...
8.2.4 Отбор и анализ проб....
8.2.5 Неравномерный рост
8.2.6 Сюимость.
8.3. Специализированные системы
8.3.1 Проницаемые подложки
8.4. Обработка поверхности. ..
8.4.1 Покрытие матриксом
Протокол 8 1 Приготовление ВКМ
8.4.2. Фидерные слои...
8.4.3. Трехмерные матриксы
84.4. Металлические субстраты.
8.4.5. Неадгсзивныс субстраты........
ГЛАВА 9. СРЕДЫ ОПРЕДЕЛЕННОГО
ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА
И ДОБАВКИ К СРЕДАМ
9.1. Составление сред .....
9.2. Физико-химические свойства .........
9.2.1. pH............................
Протокол 9 1. Приготовление стандартов PH . 150
9.2.2 СО2и бикарбонат натрия..........150
9.2.3 Буферизация ....................151
9.2.4 Кислород..................... ... 152
9.2.5 Осмотическое давление. ........ 152
9.2.6 Температура. 153
9.2.7 Вязкость....................... . 154
9.2.8 Поверхностное натяжение
и ценообразование.. 154
9.3. Сбалансированные солевые растворы 154
9.4. Полные питательные среды 154
9.4.1 Аминокислоты .
9.4.2 Витамины. .
9.4.3 Соли......
9.4.4 Глюкоза......
9.4.5 Opiаническнсдобавки.. 158
9.4.6 Гормоны и факторы роста . 158
9.4.7 Аншбнотики......................... 158
9.5. Сыворотка 159
9.5.1 Белки .... 159
9.5.2 Факторы роста 160
9.5.4 Питательные вещества и метаболиты.. 160
9.5.5 Липиды ............................ 160
9.5.6 Неорганические элементы . 160
9.5.7 И hi ибиторы....................... 160
9.6. Выбор среды и сыворотки................. 160
9.6.1 Резервирование партии сыворотки . 161
9.6.2 Тестирование сыворотки............. 162
9.6.3 Тепловая инактивация . .... 163
9.7. Другие добавки 163
9.7.1 Гидролизат аминокислот..............163
9.7.2 Эмбриональный экс факт... 163
9.7.3 Кондиционированная среда... 163
ГЛАВА IV- БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ 164
10.1. Недостатки сыворотки . . 164
10.2. Преимущества бессывороточных сред ... 168
102.1. Селективные среды . ... 168
10 2.2. Регуляция пролиферации
U дифференцировки. . 168
10.3. Недостатки бессывороточных сред .. 168
10.4. Замена сыворотки........................ 170
10 4 1. Компоненты для бсесывороточного
культивирования........ 170
10.4 2 Гормоны......... 170
104.3. Факторы роста..................... 171
104.4. П1иа1сльныс вещества сыворотки. 171
104.5. Белки и полиамины. 171
10.4.6 . Матрикс. 171
10.5. Выбор бессывороточной среды 171
Ю_5_1. Имеющиеся в продаже
бсссывороточные среды... 176
1 05.2. Замени гс эн сыворотки 176
10 5.3. Адаптация клеток
к бессывороточной среде.. 176
10.6. Разработка бессывороточной среды . .. 178
10.7. Приготовление бессывороточной среды.. 179
10.8. Среды, не содержащие белков 179
10.9. Заключение .... 179
ГЛАВА 11- ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ
РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ 180
11.1. Приготовление реактивов
и материалов. ... ...........180
Оглавление
11-2. Стерилизация оборудования
и жидкостей 180
11.3. Оборудование......... 180
11.3 1 Стеклянная посуда............ 180
Протекая 11-1. Подготовка и стерилизация
изде шй из стекла......................... 182
11.3.2. Стеклянные пипетки.......... 183
11.33. Завинчивающиеся крышки. . 183
11.3 4 Выбор детергента.... 184
11.3>5. Прочее оборудование ........ 186
Протокол 11.2. Подготовка и стерилизация
стеклянных пипеток........................ 187
Протока/ 113. Подготовка и стерилизация
завинчивающихся крышек.................. 188
11.3.6. Стерилизационные фильтры
многократного использования 190
Протока/ 11.4. Стерилизация комплекта
фильтров.................................. 190
11.4. Реагенты и среды . 191
11.4 1 Вода ........................ 191
Протокол 11.5. Приготовченив и стерилизация
сверхчистой воды (UPW).................... 192
11.4 2. Сбалансированный солевой
раствор (BSS)....................... 193
Протока./ 11.6. Приготовление и стерилизация
D-PBSA.................................... 193
11.4 3. Приготовление и стерилизация
среды............................... 194
Протока? 11.7. Приготовчениесреды
из концентрата с кратностью 1 х.. 194
Протокол 11.8. Приготов /ение среды
из концентрата с кратностью 10 х. , 196
11.4 4 Порошкообразные среды . 197
11.4 5 Специализированная среда. . . . 198
Протокол 11.9. Приготов /ение среды из порошка . 198
11.5. Стерилизация среды.................. 199
11.5 1 Автоклавируемые среды....... 199
115 2 Стерилизация мешдим фильтрации 199
Протока? 11.10. Приготовление
специализированной среды .................. 199
Протокол 11.11. Стерилизация с испочьзованием
фильтрующих насадок на шприцы............. 200
Протокол 11.12. Стерилизация с использованием
фильтрующей вакуумной насадки на колбу . .. 202
Протока? 11.13. Стерилизация с использованием
ма юго встроенного фильтра ... 202
11.53 Сыворотка..................... 203
Протокол 11.14. Стерилизация с использованием
большого встроенного фильтра.............. 205
Протокол 11.15. Сбор и стерилизация сывороток.. 206
Протокол 11.16 Диализ сыворотки......... 207
11.5 4 Приготовление и с |ерилизация
дру । их реагентов.. 208
11.6. Контроль, проверка качества
и хранение сред. 208
11.6 1. Контроль качества 208
11.6 2 Проверка стерильности........ 209
11.63. Проверка культуральных свойств ... 209
11.64 Хранение.......................210
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА ......... 211
12.1. Тилы первичных культур клеток. 211
12.2. Выделение образцов ткани..... 211
Протока/ 12 1. Выдесение мышиного эмбриона . 212
12.2 1. Мышиный эмбрион....... 212
12.22 Куриный эмбрион ................ 215
Протока? 12.2. Извлечение куриных эмбрионов..... 216
12.2 3 Биопсийный материал че ювека.... 216
12.3. Первичная культура 217
Протока? 123. Биопсийный материал человека.. . 218
12.31 Первичный эксплантат .......... 218
12.32 Ферментативная дезагрегация... 219
Протокол 12.4. Первичные эксплантаты.. 220
12.33 . Теплый трипсин.............. 221
12.3 4 Триисинизация с прсинкубациеи
нахолиду........................... 221
Протока/12.5. Дезагрегация ткани теплым
трипсином .................... 222
12.3.5. Рудиментарные органы куриного
эмбриона............................224
12.3 6. Дезагрегация с использованием
дру I их ферментов..................224
Протока? 12.6. Дезагрегации ткани хочодным
трипсином ................ 225
Протока? 12.7. Рудиментарные органы
куриного эмбриона ........... .. 226
12.3 7 Коллагеназа.... .... 226
12.3.8. Механическая дезагрегация. 227
Протокол 12.8. Дезагрегация ткани
с помощью кол сагеназы........... 230
12.39 Разделение жизнеспособных
и нежизнеспособных клеток .. 230
12.3 10 Первичная культура, краткие
выводы...............................231
123 11 Первичная документация 231
Протока? 12.9. Механическая дезагрегация
путем просеивания.........................233
Протокол 12.10. Обогащение жизнеспособных
клеток ................................ . 234
ГЛАВА 13. СУБКУЛЬТУРА
И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ .235
13.1. Субкультивирование 235
13.2. Тсрминолошя. .. 235
13.3. Возраст культуры .. 235
13.4. Маркировка клеточной культуры .... 240
13.5. Выбор клеточной линии . 240
13.6. Обычный порядок поддержания
культуры.................................241
13.6 1. Необходимость исследования
клеточной морфоло! ин 241
13 6 2 Замена среды .. 242
13.7. Субкультура....................... 243
Протоки/13.1. Сиена среды вмоносчойной
культуре........................... ..... 243
13.7 1. Критерии субкультивирования .. . 244
Протоки /13.2. Субкультивирование монос миной
культуры клеток ....................... 246
13 7 2. Цикл роста и индекс разведения.... 248
13.7.3. Концентрация клеток в субкультуре. 249
13.7 4 Культивирование в суспензии. . 250
13.7 5. Субкультура клеток, растущих
в суспензии........................ 250
Протока? 133. Субкультивирование суспензионной
культуры клеток.................... 251
13 7 6. Стандартизация условии
культивирования................. .. 252
13.7 7 Использование антибиотиков . . 252
13 7 8 Ведение документации ........253
Оглавление
ГЛАВА 14. КЛОНИРОВАНИЕ
И СЕЛЕКЦИЯ 255
14.1. Клонирование клеток ............... 255
Протоко 114 1 Клонирование с разведением ... . 256
14.2. Стимуляция эффективности посева . . 257
14 2 1 Условия, которые улучшают
клональный рост....................258
Протоко 114 2 Приготовление кондиционированной
среды ................ ............ 260
Протоко 114.3 Приготовление фидерных с юев .. . 260
14 2 2 Кондиционированные среды . . 260
14 2 3 Фидерные слои...............261
14.3. Суспензионное клонирование 261
Протокол 14 4 Кчонированиевагаре............ 262
Протоко 114 5 Клонирование в метилце 1люлозе . . 264
14.4. Выделение клонов .... . 265
Протокол 14 6 Выделение клонов
с использованием колец для клонирования .. . 266
Протокол 14 7 Выде /ение клеточных колоний
пишем облучения .................. 266
14 4 1. Другие методы выделения
монослойных клонов.................267
Протокол 14 8. Выде 1ение суспензионных клонов.... 268
14 4 2 Суспензионные клоны . 268
14.5. Получение репликативных колоний .. . 268
14.6. Селективные ингибиторы...............268
Протоко 114 9 Метотрексат-резистентность
и DHFR-а.мплификация . . 270
14.7. Выделение генетических вариантов . . 270
14.8. Взаимодействие с субстратом 272
14.8 .1. Се чсктивная адгезия. . 272
14.8 2 Селективное открепление....272
14.8..........................3. Природа субстрата..... . 272
14.84 Селективные фидерные слои... . 273
14.85. Селекция на полужидкой среде. . 273
ГЛАВА 15. РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК . 274
15.1. Плотность клеток и изопикническая
седиментация . ... ... . 274
Варианты........ .... .... 274
15.2. Размер клеток и скорость седиментации . 275
15 2 1 Седиментация в поле
силы тяжести.... . 275
15 2.2 Элюатриацпоннос
центрифуг ированис 276
Протокол 15 1 Разде гение клеток
центрифугированием в градиенте плотности . . 276
15.3. Методы, основанные на применении
антител............................ ... 277
15.3 1 Иммунный пзннинг 278
15.3 2 Магнитный сорт инг.........278
Протокол 15 2 Магнитно-активированный
клеточный сортинг (MACS) .. . 279
15.4. Флюоресцентно-активируемый
клеточный сортинг ................. ... 281
15.5. Другие методы .... 283
15.6. Советы начинающему ... . 283
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК 285
16.1. Необходимость характеристики.....285
16.2. Ведение документации
и происхождение клеток . 285
16.3. Подтверждение аутентичности......285
16.3 1 Видовая идентификация....286
16.3.2. Маркеры дифференцировки
или маркеры ткани......... . 286
16.3.3. Уникальные маркеры . ... 288
16.3.4 Трансформация. .. . 288
16.4. Морфология клеток........ 288
164 1. Микроскопия..................... 289
Протокол 16 1. Использование инвертированного
микр оскопа .......... ................... 289
Протоко 116.2 Окрашивание по Ги изо .. . 290
16 4 2. Окрашивание................... 290
164 3. Куль 1 уральные сосуды
для цитологии: монослойныс
культуры............................291
Протокол 163 Окрашивание кристачлвиолетом . . 291
Протоко । 16 4. Подготовка суспензионной
культуры клеток д /я цитологических
исс чедований методом
цитоцентрифунгирования................. . 292
16.4 .4. Приготовление суспензионной
культуры для цитологии..............292
Протокол 16 5 Фильтрование суспензии клеток
для цитологического исследования ... . 298
164.5. Микрофотография... . 298
Протокол 16.6 Цифровая фотография
на микроскопе ............. . 300
16.5. Хромосомный состав.................... 300
Протоко! 16 7 Приготов/ение хромосомного
препарата .................. ... 301
Варианты.....................................302
163.1. Дифференциальное окрашивание
хромосом............................302
16 5.2. Хромосомный анализ..............303
165 3. Окрашивание хромосом . .. 304
16.6. Содержание ДНК........................ 305
1661. Гибридизация ДНК ................305
Протоко I 16.8 Мультияокусный фингерпринтинг
ДНК к четочных линий......................306
1662. ФингерпринтингДНК .... 306
Протокол 16.9 STR-анализ профиля ДНК
клеточных линий......................310
16 6 3. Анализ профиля ДНК. 310
16.7. РНК и экспрессия белка .. 312
16.8. Активность ферментов. 313
16.8.1. Изоферменты.....................313
16.8.2. Изофермент ный электрофорез
при помощи Authcntikit ... 314
16.9. Антигенные маркеры.................... 315
ПротокоI 16 10 Изоферментныйаначиз 316
Протоко/16 11 Непрямая им мунофлюорещенция . 318
169.1. Иммунное окрашивание.......318
Варианты................................... .318
169.2. Иммунный анализ .. . 320
16.10. Дифференцировка 320
ГЛАВА 17. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА .... 321
17.1. Экспрессия фенотипа in vivo.. 321
17 1.1. Дедцффсрснцировка . .. 321
17 1.2. Линейная селекция 321
17.2. Стадии дифференцировки .... 321
17.3. Пролиферация и дифференцировка .. 322
17.4. Коммитирование и линии
дифференцировки 322
17.5. Пластичность стволовых клеток. 324
17.6. Маркеры дифференцировки 324
17.7. Индукция дифференцировки........325
10
Оглавление
17.7 1 Межклеточные взаимодействия .. . 325
Паракринные факторы роста ............. 326
17.7 .2 Системные или экзогенные факторы. 327
17.73 . Взаимодействия клетки с матриксом. 327
17.74 Полярное |Ы1 форма клетки....329
17.75 . Давление кислорода........ 329
17.8. Дифференцировка и злокачественность 330
17.9. Практические аспекты 330
ГЛАВА 18. ТРАНСФОРМАЦИЯ
И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ . . . . 332
18.1. Роль в характеристике клеточных
линий 332
18.2. Что такое трансформация?.. 332
18.3. Генетическая нестабильность .. .. 332
18.3 1. Хромосомные аберрации ... . 334
18.3 2. Изменение содержания ДНК. ... 335
18.4. Иммортализация....................... 335
18.4 1 Контроль физиологического
старения........................... 336
18.4 2 Иммортализация с использованием
вирусных генов..................... 336
18.4 3 Иммортализация человеческих
фибробластов........................337
Протокол 18.1. Иммортализация фиброб частое .. 338
18.4.4. Тсломсраза-индуцированная
иммортализация..................... 340
18.4.5 Трансгенные мыши . 341
Протокол 18.2. Иммортализация мезенхи мольных
ствочовых клеток человека с помощью
теломеразы ... 341
18.5. Аберрантный контроль роста............343
18.5.1 Независимость от прикрепления
к субстрату....................... . 343
18.5.2 Контактное торможение.. . 344
Протокол 183. Ограничение клеточной
пролиферации в зависимости от плотности
культуры ................................. 344
18.5.3 Зависимость от сыворотки.....345
18.5.4. Онкогены.................. . 346
18.6. Туморогенность............ .... 346
18.6.1. Малитнизания........... 346
18.6.2 Опухолевая трансплантация . .. 347
18.6.3 Инваэивность .. ... . 347
18.6.4 Ант иогенез . . ... 348
18.6.5 Активаторы плазминогена. . 349
ГЛАВА 19. КОНТАМИНАЦИЯ ................... 350
19.1. Источники контаминации ......... 350
19.11. Основные приемы стерильной
работы.............................350
19.12. Состояние внешней среды... 350
19.1.3 . Использование и поддержание
в рабочем состоянии ламинарного
шкафа............................. 350
19.14. Инкубаторы с увла-кнением .353
Протокол 19.1. Обработка инкубаторов... 353
19.15. Холодильные камеры ... ... 354
19.16. Стерильные материалы... 354
19.17 Привезенные клеточные линии
и биопсийные образцы.. ... 354
19.18 Карантин................... 354
19.2. Виды микробной контаминации . . 354
19.3. Контроль контаминации............ 355
19.3 1. Визуально определяемая
микробная контаминация . . 355
19.3 2. Микоплазма................... 357
Протокол 19.2. Выявление микоплазмы методом
флюоресценции .............................357
19.3 3 Окрашивание микоплазмы
флюоресцентными красителями. .. 358
19.3 4 Использование ПЦР для детекции
микоплазм........................... 358
Протокол 193. Выявление микоплазмы
с помощью ПЦР ........ 359
Интерпретация результатов ... .............. 360
19.3 5 Альтернативные методы детекции
микоплазмы.......................... 361
19.36 Вирусная контаминация . 361
19.4 Устранение контаминации 361
19.41 Бактерии, грибы и дрожжи... 361
19.42 Устранение микоплазмы ....... 362
19.43 . Устранение вирусной контаминации. 362
19.4 4. Персистирующая контаминация.. . 362
Протока t19.4. Ликвидация микробной
контаминации.. ... 362
19.5. Перекрестная контаминация ......... 363
19.6. Заключение 363
ГЛАВА 20. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ 365
20.1. Предпосылки метода замораживании . 365
20.2. Получение клеточных линий
для криоконсервации . 365
20.3. Принципы криоконсервации ...... 365
203 1. Теоретическое обоснованно
замораживания клеток . 365
20 3 2. Концентрация клеток .. 366
20 3 3. Среда для замораживания. 366
20 3 4. Скорость охлаждения. 367
2035. Морозильные камеры 369
Протока t20.1. Замораживание клеток... 372
20 3 6. Протоколирование работы
морозильника...................... 373
Протока t М/.2. Размораживание замороженных
клеток ................... .......... 374
20 3 7. Размораживание хранившихся
ампул......................... ... 374
20.4. Планирование и контроль
замораживания культур клеток.......... 377
20 4 1. Контроль за состоянием запасов
клеток в морозильнике........... 377
20 4 2 Периодическая замена
культ ивируемых клеток.......... 377
20.5. Банки клеток...................... 378
20.6. Транспортировка клеточных культур 379
20.6 1 Замороженная ампула 379
20.6 2. Живые культуры... 379
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ 380
21.1. Подсчет клеток ................... 380
2111. Гемоцитомстр................. 380
Протока? 21.1. Подсчет клеток при помощи
гемоцитаметра ....................... 380
2112 Электронный подсчет клеток.... 383
Протока? 21.2. Электронный подсчет клеток
на основании электрического сопротив гения . . 384
211.3 Окрашенные монослои 386
21.2. Вес клеток.........................386
Оглавление
11
21.3. Содержание ДНК . 386
21.4. Белок..................... . 386
214 1 Солюбилизация образца . . 387
21.5. Скорость синтеза 387
2 1.51 Синтез ДНК.................387
Протокол 213 Оценка содержания ДНК
с использованием красителя HOECHST33258 . 387
Протоко 1214. Оценка содержания бечка
методом Брэдфорда...................... . 387
Протокол 215 Оценка уровня синтеза ДНК
методом включения И3-тимидиновой метки . . 388
215 2. Син юз белка.... ..........389
Протокол 21.6 Синтез бечка .. ......... 389
21.6. Приготовление образцов
для ферментного и иммуноферментного
анализа . 390
21.7. Цитометрия. 390
217 1 Мечение in situ......... 390
21 7 2 Проточная цитометрия . 390
21.8. Увеличение количества ооразцов
для статистического анализа . 390
21.81 . Получение данных.. . 391
21.82 Анализ данных . 391
21.9. Клеточная пролиферация. ..... . 391
219 1 Планирование зкспсримснта . .391
2192. Цикл роста..................392
Протоко 121 7 Кривая роста монос юя
еоф.чаконал ................ . 393
Протокол 218. Кривая роста монос юя
в многолуночном планшете..................394
219.3 Анализ кривой роста монослоя... . 395
2194. Объем среды, концентрация
и плотность клеток..... . 396
2195 Суспензионные культуры .. . 396
2196 Фазы цикла роста...... . 397
Протокол 219 Кривая роста суспензионной
культуры..................................397
219 7 Данные, получаемые при исследовании
кривой роста.. . 399
21.10. Эффективность культивирования .. .. 399
Протокол 2110 Определение эффективности
посева на чашках Петри................. 400
21.10.1. Анализ формирования колоний .. 401
21.10.2. Автоматический счетчик колоний . 402
Протокол 2111 Индекс мечения И3-тимидином . . 402
21.11. Индекс мечения......................403
21.11.1. Фракция прол1|фсрируюшнх
клеток..............................404
21.112. Митотический индекс .... . 404
21.11.3. Индекс пролиферации - . 404
Протокол 2112 Опрсдеicuue фракции
пролиферирующих клеток........ . 404
21.12. Время клеточного цикла . 405
21.13. Клеточная миграция . 405
ГЛАВА 22. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ 406
22.1. Жизнеспособность, токсичность
и выживаемость . 406
22.2. Ограничения in vitro. . 407
22.3. Природа исследований.... . 407
22.3 1 Жизнеспособность....... . 407
Протокол 22 1 Оценка жизнеспособности
методом отторжения красителя. . . 408
Протоко 122 2. Оценка жизнеспособности
методом поглощения красите гя ............... 408
22.3 2 Выживаемое 1Ь...............409
Протокол 223 Клоногенный анализ
прикрепившихся клеток ................ 410
22 3.3. Анализ, основанный на клеточной
пролиферации ................... .. .413
22 3.4. Метаболический анализ
цито 1 оксичности.......... 413
22 3.5. Микротитрацнонный анализ ...... 413
Протокол 22 4 Оценка цитотоксичности
при помощи МТТ-теста............... .. .414
22 3.6. Сравнительная оценка
микротш рационного и клоногенного
анализа выживания....................417
22 3.7. Взаимодействие лекарственных
препаратов.. ....417
22.4. Применение исследования
цитотоксичности 418
22 4.1. Скрининг противораковых
препаратов...........................418
22 4.2. Прогностические исследования
противоопухолевых препаратов .... 418
22 4.3. Фармацевтическое тестирование 419
22.5. Трансформация и мутагенез 419
22 5.1. Анализ мутагенеза меюдом обмена
сестринских хроматид.................419
Протокол 225 Обмен сестринских хроматид ... 419
22 5.2. Канцерогенность................ 421
22.6. Воспаление .. 422
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ
ТИПОВ КЛЕТОК .... 423
23.1. Клеточные культуры
специализированных
клеток 423
23.2. Эпителиальные клетки .. 423
232.1. Эпидермис..................... 424
Протокол 23 1 Эпидермальные кератиноциты..425
23 2.2. Роговица .................... 428
Протокол 23.2 Эпите чиа явные клетки роговицы.... 429
Протокол 233 Эпителий молочной мечезы.. . 430
23 2.3. Молочная железа...............430
23 2.4. Шейка матки................. 431
Протокол 23 4 Цервикальный эпителий.. .431
23 2.5. Желудочно-кишечный тракт ... . 433
Протоко 1235 Выделение и культивирование
клеток крипт толстого кишечника ...... 434
23.2.6. Печень........................435
Протокол 23 6 Выдеюние гепатоцитов крысы .. 436
23.2.7. Поджелудочная же чеза.........437
Протоко 123 7 Поджелудочный эпителий......437
23 2.8. Почка........ 438
Протокол 23.8 Эпите чий почки.................. 439
Протокол 23.9 Бронхиальный и трахеальный
эпителий................................. 440
23 2.9. Бронхиальный и трахеальный
эпителий....................... 440
23.2.10. Эпителий ротовой полости . ... 441
Протокол 23 10 Кератиноциты ротовой
полости ....................... .441
Протоко 123 11 Эпителий простаты .. 442
23.2.11 Простата 442
23.3. Мезенхимные клетки .................. 444
23.3.1. Соединительная ткань ... .. 444
23.3.2. Жировая ткань .......... . . 444
Протоко 123 12 Первичная культура
адипоцитов 445
12
Оглавление
Протокол 23.13. Выдс /ение и культивирование
гладкомышечных клеток ...
23.33 Мышцы...............
Протокол 23.14. Культура миобластов
взрослой мышцы взрос юго человека ..
Протокол 23.15. Культура отде /ьныл
мышечных волокон скелетных мышц... .
Протокол 23.16. Хондроциты на альгинатных
бусинах .............
‘ 23.34 Хрящ .
23.35 Кость...
Протокол 23.17. Остеобласты ....
23.3 6 Эндотелий...................
Протокол 23.18 Выделение и культивирование
клеток сосудистого эндотелия ..........
23.4. Нейроэктодермальные клетки.
23.4 1 Нейроны.....................
Протокол 23.19 Гранулярные к /етки мозжечка .
23.4 2 Глиальные клетки...
Протокол 23.20. Ольфакторные капсульные
к/етки (ОЕС)
23.43. Эндокринные клетки.
23.4 4 Меланоциты.........
Протокол 23.21. Меланоциты...............
23.4 5 Подтверждение идентичности
ме ганоцитов.. . ........
23.5. Гематопоэтические клетки..........
23.5 1 Долгоживущие культуры клеток
костного мозга.................
Протокол 23.22. Долгоживущая культура
гематопоэтических клеток костного мозга..
Протокол 23.23. Анализ ко юниеобразования
культуры ге чатопоэтических клеток..
23.5 2 Анализ колониеобразования
культуры гематопоэтических клеток.
23.6. Гонады
23.7. Стволовые клетки..................
23.7 1 Эмбриональные стволовые клетки .
23.7 2 Мультииотентныс стволовые
клетки взрослого организма..........
23.7.3 Исючники стволовых клегок
и работа с ними................
ГЛАВА 24. КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ
КЛЕТОК........................
24.1. Проблемы культивирования
опухолевых клеток.
24.2. Взятие образцов
24.3. Дезагрегация ________
24.4. Первичная культура
24.5. Характеристика.
24.6. Размножение клеточных линий . .
24.61 Постоянные клеточные линии
24.7. Селективная культура опухолевых
клеток .
24.71. Селективные среды.......
24.7 2 Конфлюэнтные фидерные слои . ..
Протокол 24.1. Выращивание клеток
на конфлюэнтном фидерном с юе.......
24.7.3. Суспензионное клонирование
24.7 4 Гистотипцчсская культура....
24.7.5. Ксенотрансплантат .........
24.7 6 Характеризация культур
опухолевых клеток ..................
24.7.7 Сохранение тканей замораживанием
446
446
447
449
450
450
453
453
454
455
458
458
459
460
461
463
463
464
465
465
467
467
468
468
469
470
470
470
471
472
472
473
473
474
474
475
476
476
476
476
477
478
478
479
479
479
Протокол 24.2 Замораживание биопсии .. .. 479
24.8. Специфические опухолевые культуры . 480
24 8 1. Молочная железа .. 480
24 8 2. Легкое..................... 480
2483 Желудок....................... 481
2484 Толе 1ыи кишечник.. 481
Протокоз 243 Культура колоректальных
опухолей................................ 482
24 8 5 Поджелудочная железа.. 483
2486 Яичники.................... 484
24 8 7 Простата... 484
24 8 8. Мочевой пузырь 484
2489 Кожа . '................... 484
248 10. Шейка матки .... 485
24 8 11 Глиома ..................... 485
24 8 12 Нейробластома .. 485
24 8 13 Спсрматоцитома... 486
24 8 14. Лимфома и лейкемия 486
ГЛАВА 25. ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ
КУЛЬТУРА 487
25.1. Межклеточное взаимодействие
и фенотипическая экспрессия 487
25.11. Роль клеточной плотности... 487
25.12 Реципрокные взаимодействия. . 487
25.1.3 Выбор модели . 488
25.2. Органная культура................. 490
25.2.1. Обмен питательных веществ
и газов........................... 490
25.22. Структурное единство ....... 490
25.2 3 Рост и дифференцировка ... 490
25.2 4. Ограничения мс i ода органной
кучьтуры 491
25.2 5. Типы органных культур... 491
Протока з 25.1. Органная культура. 491
25.3. Гиетотипическая культура 492
25.3 1 Метод геля и губки 492
25.32 Пустотелые волокна 493
25.3 3 Сфероиды....... 493
Протокол 25.2. Сфероиды................. 494
25.3 4 Вращающиеся камерные системы 496
25.3 5 Иммобилизация живых клеток
в альгинате.................. 496
Проток» 1253. Альгинатное капсуяировиние . . 497
Протокол 25.4. Вк игдыши д /я филыпраиионных
лунок....................... ............ 498
25.3 6. Вкладыши для фильтрационных
лунок........................... 498
25.3 7. Культуры нейрональных агрегатов . 500
25.3 8. Тканевой эквивалент тканевая
инженерия......................... 501
Протока з 253. Нейрона /ьные агрегаты.. 501
25.4. Создание трехмерных изображений
клеток (З-П-реконсгрукция) 504
ГЛАВА 26. КРУПНОМАСШТАБНОЕ
ПРОИЗВОДСТВО КЛЕТОК.........................505
26.1. Крупномасштабное производство
суспензионных культур................... 505
Протокол 26.1. Перемешивание 4-литровой
емкости с суспензионной культурой .. . 506
261.1. Постоянная культура . ... 507
26 12 Масштаб и комплексность...... 508
2613. Перемешивание и аэрация...... 508
Оглавление
13
26.2. Крупномасштабное производство
монослойных культур ... ...........510
26 2 1 Многослойные пропагаторы
(культиваторы)......................510
Протокол 26 2 Система NUNC CELL FACTORY. .511
26 2 2 М ногоцслевыс диски. спирал и
и пробирки........................ .512
26 2 3 Роллерные культуры...........512
Протокол 263 Роллерная бутылочная культура ... 514
26 2 4. Мнкроноснтечи...............514
Протокол26 4 Микроносители .. 516
26 2 5. Макроноситсдц...............516
26 2 6 Перфузионные моное юйныс
культуры............ .516
26.3. Контроль процесса . 518
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ 520
27.1. Методы выде тения и исследования
лимфоцитов........................ . 520
Протокол 271 Приготов teuue лимфоцитов. . 520
27 1.1. E.iaci |рансформацця 521
27.2. Авторадиография....... ......521
Протоко1272 ФГА-стимуляция лимфоцитов .. .521
Протокол 273 Микрорадиография ....... . 522
27.3. Съемка в режиме замедленного
времени. 526
Протоко 127.4. Видеозапись в замедленном
режиме времени.......................... . 526
27.4. Конфокальная микроскопия .. . 528
27.5. Синхронизация клеток.... . 528
27 5 1. Разделение клеток . ...........528
27 5 2 Блокирование клеточного цикла.. . 529
27.6. Культура амниоцитов...................529
Протокол 27 5. Культура амниоцитов. - - 529
27.7. Культуры клеток нойкилотермных
животных.............................534
27 7 1. Клетки рыб...................535
Протоко t27.6 Культуры клеток эмбриона
полосатого данио .............. .. . 536
27 7 2. Клетки насекомых.............538
Протокол 277 Культуры клеток насекомых . 538
27.8. Молекулярная гибридизация in situ . 539
27.8 1 Анализ экспрессии генов РНК
Meiодом гибридизации in situ... . 539
Протокол 27.8 Авторадиографическая
гибридизация tn situ ..................... 539
27.8.2 . Флюоресцентная гибридизация
tn situ (FISH) при анализе генов
и хромосом ...................543
Протокол 279 FISH с использованием
однокопииных геномных зондов
и хромосомных красителей........ . 543
27.9. Слияние соматических клеток. 545
Протоко 12710 Гибридизация клеток. .. . 545
27 9 1. Ядсрныи перенос..............547
27.10. Продукция моноклональных антител. . 547
Протока ! 27 11 Продукция моноклональных
антител .148
27.11. Перенос ДНК...........................551
27.11.1. Копрсциии гация с фосфатом
кальцит!........................... 551
27.11.2. Лииофскция..... 551
Протокол 2712 Транзиторная трансфекция
методам липофекции ....... ........... 552
27.11.3. Электропорация..............553
Протокол 27 13 Устойчивая трансфекция
методом электропорации ......................553
27.11.4. Другие методы переноса ДНК. ... 554
27.11.5. Рсиортсрныс гены....... . 555
Протокол 2714 Окраска in situ
на ^-галактозидазу.......................... 555
Протокол 27 15 Определение активности
г юра мфенико {ацетилтрансферазы
(CATASSAY) . 556
ГЛАВА 28. РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ 557
28.1. Медленный рост клеток 557
2811. Проблемы, ограниченные
вашими собственными
исходными культурами .................557
28 1.2. Более общие проблемы,
возникающие и у других
сотрудников ..........................557
28 1.3. Нс было ли у вас в лаборатории
каких-либо изменений?.................558
28.2. Среда .. 558
282.1. Выбор среды............ . 559
282.2. Нес дебильные реактивы. . 559
28.3. Чистота составляющих частей............ 560
28 3.1. Правильно ли работает система
очистки воды? 560
28 3.2. Бикарбонат .. 560
283.3. Антибиотики . 560
28.3.4 . Сыворотка... .... 560
28.4. Пластиковая посуда 560
28.5. Стеклянная посуда....................561
2851. Мытье посуды 561
28.6. Микробиологическая контаминация .. 561
28.6.1. Контами нация, ограниченная
одним псе |сдователем.................561
28 6 2. Распространенная контаминация.... 562
2863. Иденшфикация контаминации... . 563
28 6 4. Деконтаминация.................. 563
28.7. Химическая контаминация. . 563
287.1 Стеклянная посуда.. 563
287.2. Пинетки...........................563
28 7.3. Очистка воды..... 564
28 7.4. Дру! нс реактивы.... 564
28.7.5 . Порошки и аэрозоли.. 564
28.8. Первичная культура....... 564
28.8.1. Низкий выход клеток
в первичной культуре..................564
28.8.2. Неверно выбраны клетки. 565
28.8.3. Коп гаминация.. . 565
28.9. Дифференцировка 565
2891. Клетки нс дифференцированы ... . 565
28 9.2. Снижение образования продукта. . 565
28.10. Смена среды 565
2810.1 Обычные монослои.. ...565
28102. Клоны..................... .. .565
28.11. Субкультура. ... 566
28 11 1 Фазы клеточного цикла
при субкультуре . . 566
28.11.2. Старение. ..................... 566
28.113. Среда.......................... 566
28.11.4. Неравномерный рост. 566
28.12. Клонирование......................... 566
28.1 2.1. Низкая эффективность посева.566
2812.2. Диффузные колонии.. . ... 567
28 12.3. Слишком mhoio колонии на чашку . 567
Оглавление
28124 Неслучанное распределение. 567
28 12 5 Неирикрсиляющисся клетки 567
28.13. Прекрестная контаминация......... 567
28 13.1 Симптомы перекрестной
контаминации ........................ 567
28 13 2 Предупреждение перекрестной
контаминации ........................ 568
28 13 3 Элиминация перекрестной
контаминации......................... 568
28.14. Криоконсервация...................... 568
28 14 1 Плохое восстановление . .... 568
28 14.2. Изменение внешнего вида культуры
noc.ic криоконссрвацни.........568
28 14 3 Контаминация................. 569
28 14 4 Утрата рабочей культуры ... 569
28.15. Грануляция клеток. 569
28.16. Подсчет клеток........ 569
28 16 1. Гсмоцитометр. ............. 569
28 16 2 Электронным счетчик клеток
посредством измерения
сопротивления при пропускании
через дроссель ... ............ 569
28.17. Жизнеспособность.................... 570
28 17 1 Морфологические признаки. . .. 570
28 17 2 Определение жизнеспособности... 570
28 17 3 Цитотоксичность 570
ГЛАВА 29. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 571
Приложение I. ПРИГОТОВЛЕНИЕ
РЕАКТИВОВ 572
Приложение II. ИСТОЧНИКИ
ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ ..... 579
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ
ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ . 601
Приложение IV. СЛОВАРЬ
УПОТРЕБЛЯЕМЫХ ТЕРМИНОВ
[но Schaeffer, 1990] . 633
Приложение V. ОСНОВНАЯ ЛИТЕРАТУРА 640
Список литературы 641
Предметный указатель... . .. . . . 689
Список рисунков
1.1. Рост количества публикаций ио культуре тканей
1.2. Области применения культуры тканей
1.3. Типы клеточных культур
2.1 У пражнение по заморажи ванию
3.1. Клеточная адгезия
3.2. Межклеточные контакты
3.3. Рост клеток А549 на матригеле
3.4. Клеточный цикл
3.5. Рефляции клеточного цикла
3.6. Дифференцировка из стволовых клеток
3.7. Клеточное взаимодействие и передача ст нала
3.8. Развитие клеточной линии
3.9 Количество хромосом в клетках конечной и пос-
тоянной клеточных линий
4.1. Небольшая лаборатория культивирования тканей
4.2. Лаборатория культивирования тканей средних
размеров
4.3. Лаборатория культивирования тканей с приле-
жащими препаративными комнатами
4.4. Большая лаборатория культивирования тканей
4.5. Термальная комната
4.6. Раковина для мойкм и моечная машина для пи-
петок
4.7. Хранилище для жидкого азота и морозильное
оборудование
5.1. Ламинарный шкаф
5.2. Удаление среды с помощью насоса
5.3. Вакуумный насос Integra
5.4 Инвертированный микроскоп
5.5. Пп ветирующее устройство
5.6. Автоматическая пипетка (пипеттор)
5.7. Градуированный бутылочный диспенсер
5.8. Пипетка с многократно дозируемым объемом
5.9. Автоматический диспенсер
5.10 Многоканальная пипетка
5.11 Автоматическое запол няющее устройство
5.12. Планшетный сканер
5.13. Устройство для переноса
5.14. Замкнутая телевизионная система
5.15. СО,-мнкубатор
5.16 Устройство СО2-инкубатора
5.17. Очиститель воды
5.18. Настольный автоклав
5.19 Напольный автоклав
5.20 Диспенсер, соединяющийся с бутылкой
5.21. Моечная машина для стекла
5.22. Микроманипуляторы и подогреваемый столик
6.1 Возможность заражения
6.2 Возможное расположение оборудования в рабо-
чей зоне ламинарного шкафа
6.3 Плохо opi авизованное расположение предметов
в рабочей зоне
6.4 . Планировка рабочей зоны в ламинарном шкафу
с горизонтальным воздушным потоком
6.5 . Планировка рабочей зоны на открытом поле
6.6 Способ удерживания । руши и крышки от фла-
кона в руке
6.7 Воздушные потоки в ламинарном шкафу
6.8 . Стакан для слива
6.9 Правильное введение пипетки в ппиетярующее
устройство
6.10 . Чашки Петри в коробке
6.11 . Заполнение флакона азом
7.1 Переполненные цилиндры для использованных
пипеток
7.2 Правильное введение пипетки в пииетирующее
устройство
7.3 . Хомут для баллона
7.4 . Колба для спиртовой стерилизации инструментов
7.5 Ламинарный шкаф биоло! п ческой безопасности
8.1 Количество клеток и площадь поверхности
8.2 Многолуночные плашки
8.3. Чашки Петри
8.4. Пластиковые флаконы
8.5 Многопластинчатый флакон
8.6 Маленькие флаконы с перемешиванием
8.7. Вентилируемые чашки Петри
8.8. Вентилируемые флаконы
8.9 Пузырьки и флаконы с закручивающимися
крышками
8.10. Случайный рост
8.11. Культивирование на полых волокнах
8.12. Морфоло! ия фидерных слоев
9.1 Осмометр
11.1. Мытье и стерилизация лабораторно! о стекла
11.2. Механические щетки для мытья бутылок
11.3. Стерн л изованные буты л ки
11.4. Сифонное моющее устройство для пипеток
11.5. Мытье и стерилизация пипеток
11.6. Полуавтоматическое устройство для затыкания
пипеток ватными пробками (Belleо)
11.7. Стерилизационный шкаф
11.8. У паковка закручивающихся крышек для стери-
лизации
16
Список рисунков
11.9. Отношения между давлением и температурой
11.10. Очистка ноды
11.11. Стерилизация фильтрацией
11.12. Одноразовые стерилизационные фильтры
11.13. Фильтрационная установка большой мощности
11.14. Фильтрация при помощи перистальтического
насоса
11.15. Крупномасштабная стерилизация фильтрацией
с использованием большого встроенного комп-
лекта фильтров
11.16. Фильтры многократного использования
11.17. Предварительный фильтр
12.1. Общий вес и выход клеток мышиного эмбриона
12.2. Мышиные эмбрионы
12.3. Препарирование мыши
12.4. Извлечение куриного эмбриона из янна
12.5. Варианты первичной культуры
12.6. Культура первичного эксплантата
12.7. Дезагрег ация с помощью тепло! о трипсина
12.8. Клеточное сито
12.9. Дезагрегация в холодном трписине
12.10. Теплая и холодная триисинизация
12.11. Препарирование куриного эмбриона
12.12. Дезагре! ация ткани с помощью коллагеназы
12.13. Механическая дезагре!ация
13.1. Плохое состояние культуры
13.2. Кривая роста и поддержание культуры
13.3. Субкультивирование монослоя
13.4. Серийное субкультивирование
13.5. Перемешиваемая культура
13.6. Параллельные культуры и антибиотики
14.1. Изменение числа клеток при клонировании
14.2. Клонирование с разведением
14.3. Клонирование в планшетах для микротитрации
14.4. Фидерные слои
14.5. Клонирование в суспензии
14.6. Клонирование в метилцеллюлозе
14.7. Кольца для клонирования
14.8. Выделение монослойного клона
14.9. Выделение суспензионных клонов
14.10. Селективные фидерные слои
14.11. Рост клеток меланомы, фибробластов и глии в
суспензии
14.12. Рост клеток в смешанной культуре
15.1. Разделен ие клеток ио их плотности
15.2. Устройство для создания градиента
15.3. Градиент, полученный с помощью центрифуги-
рования
15.4. Центрифужный элютриагорный ротор (Вескшап)
15.5. Разделительная камера элюатриаторнного ротора
15.6. Магнитный сортин!
15.7. Магнитный соргинг клеток (MACS® Technology)
15.8. Флюоресцентно-активируемый сортер клеток
(FACS)
15.9. Проточная цитометрия
15.10. Распечатка, полученная после измерения на
FACS II
16.1. Куполообразные образования
16.2. Примеры морфологии клеток в культуре
16.3. Культуральные сосуды для цитологии
16.4. Цитоцентрифу! а
16.5. Ци голо! ический фильтр
16.6. П pin отопление препарата хромосом
16.7. Окрашивание хромосом
16.8. Препарат кариотип
16.9. ДНК-фингерцринтин!
16.10. Сиквенирование ДНК
16.11. Изучение профиля ДНК
16.12. Изоферментныи электрофорез
16.13. Прибор для иммуноанализа Agilent
17.1. Регуляция дифференцировки
17.2. Реципрокное паракринное взаимодействие
18.1. Клональные вариации
18.2. Хромосомные аберрации
18.3. Фок¥Сы трансформации
18.4. Совокупное количество периодов удвоения
популяции (PD) иммортализованных клеток
11TERT ио сравнению со стареющими контроль-
ными клетками
18.5. Oi раничен ие клеточной пролиферации
18.6. Эксперимент с использованием сердца цыпленка
18.7. Инвазия в фильтрующей лунке
18.8. Активатор плазминогена (РА)
19.1. Типы контаминации
19.2. Детекция микоплазмы с помощью ПЦР
20.1. Кривая замораживания
20.2. Ампулы на стержне
20.3. Пробка для узкогорлого морозильника
20.4. Охлаждающее устройство Nalge Nunc Cooler
20.5. Программируемый морозильник
20.6. Морозильники с жидким азотом
20.7. Конструкция плотного морозильника
20.8. Замораживание клеток
20.9. Размораживание клеток
20.10. Серийное возобновление культуры
20.11. Контейнер для транспортировки клеток
21.1. Использование гемоцитометра
21.2. Электронный счетчик клеток С ASY
21.3. Схема работы счетчика клеток CASY
21.4. Аналоговая распечатка результатов подсчета
клеток на электронном счетчике CASY
21.5. Электронный счетчик клеток Beckman Coulter
Vi-CELL
21.6. Кривая роста
21.7. Внешний вид многолуночных планшетов
21.8. Интерпретация кривой роста
21.10. Разведение клеток для клонирования
21.11. Линейность эффективности посева
21.12. Автоматический счетчик колоний
21.13. Индекс мечения
21.14. Направление сканирования препаратов или
чашек
21.15. Фракции роста
22.1. Клопогонные исследования монослойных клеток
22.2. Кривая выживания
22.3. Интерпретация кривых выживания
22.4. Влияние фидерного слоя на долю выживания
клеток
Список рисунков
22.5. Микротитрационное исследование
22.6 Кривая ин1 ибирования
22.7 Продолжительность исследования
22.8. Кривая падения IC50
22.9 Корреляция между микротитрационным и кло-
ногенным методами исследования выживания
22.10. Ор1анотипическое исследование
23.1. Вид кровеносных сосудов в пупочном канатике
человека
23.2. Клетки сосудистого эндотелия в культуре
23.3. Иссечение обонятельной луковицы
23.4 Культура меланоцитов
24.1. Конфлюэнтные фидерные слои
24.2 Клеточные линии карциномы желудка
24.3. Клеточные линии рака поджелудочной железы
24.4. Культуры 1лиомы человека
25.1. Влияние клеточной плотности на экспрессию
GFAP в клетках С 6
25.2. Гистотииическая и ор1анотииическая культура
25.3. Ор>анная культура
25.4 Разделение клеток в сфероидах
25.5. Вращающаяся камерная система
25.6 Вращающаяся система для культуры клеток
Synlhecon Rotatory Cell Culture System
25.7. Вкладыши в фильтровальный колодец
25.8. Вкладыши Transwells
25.9. Каркасы и матрицы
25.10. MRI-мониторин! клеток в 3D конструктах
25.11 MRI конструкта хряща
26.1. Большой сосуд для перемешивания
26.2. Перемешиваемая культура
263. Биостат
26.4. Ферментер с барботированием
26.5. Аэрагор культуры Bello Cell
26.6. Перфузия на полых волокнах
26.7. Система Metnbroferm
26.8. Система Nunc Cell Factory для культуры кле-
26.9. Заполнение системы Nunc Cell Factory
26.10. Система для культуры клеток Corning Cell-
Cube
26.11. Бутыли для ролерных культур на стеллажах
26.12. Схема работы роллерной системы культуры
26.13. Примеры бутылей для роллерных культур
26.14. Барабанный роллерный аппарат
26.15. Реакторы с неподвижным слоем
26.16. Реакторы с псевдоожиженным слоем
26.17. Системы контроля биореактора
26.18. ЯМР-анализ клеток
27.1. Микроавторадиография
272. Микроавторадиографы
273. Гибридизация соматических клеток
27.4. Получение шбридом
275. Перенос ДНК
Список цветных вкладок
1. Первичная культура, человеческая
2. Первичная культура, эксплантат, холодная трии-
синизация и коллагеназа
3. Первичная культура, эмбрион цыпленка
4. Фазы ростового цикла
5. Субкультивирование методом трннсинизации
6. Клонирование клеток
7. Клонирование клеток. Морфолотческое разно-
образие
8. Конечные клеточные линии
9. Постоянные клеточные линии из опухоли человека
10. Постоянные клеточные линии из нормальных
тканей животных
11. Иммунное окрашивание
12. Морфологическая дифференцировка эпителиаль-
ных клеток
13. Дифференцировка клеток Friend и 1лиальных
клеток человека
14. Трансформация
15. Свойства трансформированных клеток
16. Примеры контаминации
17. Жизнеспособность и цитотоксичность
18. Сфероиды, инкапсуляция и микроносители
19. Органотииическая культура в фильтрующей лунке
20. Ор1анотиническая культура кожи
21. Токсичность в органотииической модели in vitro
22. Приготовление среды, культуральные системы и
флаконы для криоконсервации
23. Mai нитноактивированный клеточный сортиш
24. Мнкроматричный анализ экспрессии генов (Af-
fymetrix UK)
Благодарю за помощь и поддержку на протяжении
многих легп моих друзей и кол tex. Без них не было бы
этой книги.
Предисловие
Настоящее издание книш «Культура животных кле-
ток» но структуре сходно с предыдущим изданием, но
содержит некоторые значительные изменения. Введена
новая слана «Тренировочные программы», которая но
своему построению, так же как сноски и ссылки, должна
обле! чпть использование этой кнш и преподавателями
в качестве учебного пособия. Содержание данной t ла-
вы предполагает овладение новыми практическими
навыками учащимися или техническим персоналом,
поэтому включает в некоторых протоколах как экс-
периментальные, так и расчетные элементы. Все это
сделает процесс обучения интереснее, информативнее
и несколько разнообразнее.
Приведенные в книге ссылки тщательно выверены
и усовершенствованы. Отдельные разделы теперь
имени нумерацию, соответствующую нумерации главы.
Биномиальная ссылка, например 4.1, означает i л. 4, раз-
дел 1. Триномиальная ссылка 14.6.2 отсылает к гл. 14,
разделу 6, подразделу 2. Полому первая цифра ссылки,
независимо от того, относится она к тексту, таблице или
иллюстрации, будет ucei да означать соответствующую
главу. Такая структура кнш и, в частности, вызвана
необходимостью обле! чить создание гиперссылок в
будущей электронной версии кнш и, которая должна
появиться на веб-сайте издательства Wiley (wwvv.vviley.
com) вскоре после выхода печатного издания.
Количество цветных вкладок увеличено вдвое. На
рис. 16.2 представлены изображения примерно сорока
различных клеточных линий, а также первичных куль-
тур, оборудования и стадий рабочего процесса. Я t лу бо-
ко 6.iat одарен Ивонне Рейд и Гр?лу Сайкису из АТСС,
Питеру Трэвису из ЕСАСС и mhoi им apyi нм за любез-
но предоставленные новые иллюстрации. Надеюсь, что
это воодушевит читателей, позволит им взглянуть на
клетки, с которыми они работают, более внимательно и
разовьет чуткость к любым изменениям, которые moi ут
возникнуть в ходе повседневной работы.
Б целом я сохранил акцент, который был в иредыду
щих редакциях, и сосредоточил внимание на основных
методах работы с культурами животных клеток, опи-
сав особые приемы работы со специализированными
культурами.
Эти методы приведены подробно, с использованием
пошаговых протоколов, которые должны дать полную
информацию о порядке проведения всей процедуры
без обращения к друi им литературным источникам.
Каждому протоколу в кнше предшествует вводный
материал, который дает теоретическое обоснование и
дополнительную информацию для проведения альтер-
нативных процедур и применения данного протокола.
Некоторые основные понятия биоло! ни объясняются
в тексте, но подразумевается, что читатель обладает
начальными знаниями в анатомии, гистолоши, био-
химии. клеточной и молекулярной бполслин. Кнша
предназначена для тех. кто не имеет навыков или имеет
незначительный опыт в работе с культурами тканей,
включая лаборантов-исследователей, студентов стар-
ших курсов, дипломников, аспирантов и клиницистов,
имеющих интерес к научно-исследовательской работе.
Кажется нелшичным особо выделять молекулярные
методы, тем более что точной границы между молеку-
лярными и клеточными методами не существует.
Молекулярные методы, описанные в кнше. имеют
прямое отношение к культурам клеток. Не было даже
попытки представить их все. поскольку такие методы
доступно изложены в друtux работах [Satnrook el al.,
1989. Ausubel el al., 2002 и др-J. Тема повышения выхода
клеточной массы близка <хмастибиотехноло1ии, и глава,
посвященная этой проблеме, дает описание некоторых
приемов и техник повышения количества получаемых
клеток. Однако эга 1.чава не рассматривает процессы
производства бпофармацевтической продукции.
Список оборудования и оснащения обновлен и ко
времени публикации кнш и, надеюсь, еще будет соот-
ветствовать современному уровню. Однако меняются
названия компаний, происходит слияние фирм, исчеза-
ют некоторые виды оборудования, поэтому достаточно
трудно сохранять постоянство в этом отношении. Тем
не менее я надеюсь, что в будущем этот аспект будет
учитываться более эффективно на веб-сайте.
В тексте используются сокращения, которые при-
водятся отдельным списком после предисловия. Об-
щеприняты такие условные обозначения, как D-PBSA
(фосфатно-солевой буфер Дюльбекко без Са-1 и Mg*’),
UPW (сверхчистая вода, независимо от способа ее
получения). Там. iae это возможно, используются
молярные концентрации. Реальным весом (в граммах)
обычно цренебрегоют, используя в списке питатель-
ных сред молярность, поскольку предполагается, что
очень небольшое число людей попытается составлять
собственные питательные среды из отдельных компо-
нентов. Но возможно, что при необходимости сравнить
компоненты будет полезным использовать молярные
эквиваленты.
20
Предисловие
Протоколы выделены в тексте рамкой и особым фо-
ном. Реагенты, специфические для данною отдельною
протокола, указаны в материалах соответствующего
протоколу раздела, прописи для общеупотребительных
реагентов, таких как буферный раствор Хэнкса или
трипсин, приводятся в Приложении II. Приложения
также содержат подробные описания компаний, произ-
водящих реагенты, оборудование u apyi ие ресурсы.
Как обычно, я должен выразить свою благодарность
авторам, которые участвовали в разработке протоко-
лов, а также иомот али мне советами в тех областях, в
которых мои знания несовершенны. Это Роберт Ау-
эрбах, Боб Браун, Кеннет Кельман, Ричард Хэм, Роб
Хэй, Стан Кей, Николь Кейт, Уолли Мак Киан, Рона
Мак Каи, Стефан Мерри, Джейн Плам, Питер Вот там,
Поль Уокман. Роландж Графе трем и Джон Поль. Я
был с частлив работать вместе с клиницистами Дэви-
дом И. Грэмом и Дэввдом Дж. Т. Томасом и Джоном
Максвеллом Андерсеном.
На ранних этапах работы над книгой я получил
большую пользу от бесед с Доном Дутласом, Питером
дель Веккьо, Сергеем Федоровым и Майком Гэбрид-
жем, Дженом Лувдпном, Джоном Райаном, Джимом
Смитом и Чэрпти Уэймаут. Я бесконечно благодарен
Полю Чэтшелю, который первым убедил меня в необ-
ходимое ги написать руководство по основным мето-
дам работы с культурами тканей и который недавно
предложил перевести этот текст в мультимедийный
формат и опубликовать в издательстве Wiley-Liss
Mhoi ие из иллюстраций этой кнш и были выполнены
Джейн Джиллис и Мариной ла Дюк, хотя часть из них
была заменена в связи с требованиями электронной
публикации. Я очень признателен руководству Бри-
танских лабораторий Битсона ко исследованию рака
за разрешение фотш рафировать их оборудование
и использовать фото!рафии для иллюстрирования
этой кнш и. Некоторые из данных, представленных
в книге, были получены теми, кто работал со мной в
течение mhoi их лет, это: Шейла Браун, Ян Канншэм,
Лин Эванс, Маргарет Фрэйм, Элайн Харт, Кэрол Мак
Кормик, Джон МакЛин, Элпстар МакНэб, Диана Мор-
ан, Элисон Мюррей. Элисон Мэкки, Ирэн Оспрей,
Мохаммед Зарин Хан и Наташа Евдокимова.
Мне посчастливилось получить отличные сове-
ты и поддержку от сотрудников издательства John
Wiley&Sons. С искренней благодарностью я бы хотел
упомянуть и всех тех, кто побеспокоился и прислал нам
письма с своими советами и конструктивной критикой
по поводу предыдущих редакций издания. Приятно и
радостно слышать высказывания о том. что наша книга
полезна, но еще более важно услышать от читателей
критику ио поводу недостатков кнш и, которые я попы-
таюсь учесть в дальнейшем. Можно лишь надеяться, что
те из вас, кто использует кнш у в работе, сохранят в душе
то же волнение, которое я ощущал, размышляя о буду-
щих иерсиективах, открывающихся в этой области.
Я бы хотел поблагодарить мою дочь Джнлиан и
сына Норманна за помощь, которую они много лет
назад оказывали мне в подготовке первого издания,
за их постоянные советы и поддержку. Кроме того, я
благодарен моей жене Мэри за те часы, которые она
провела за составлением, правкой и другой работой. Без
ее помощи и поддержки первоначальный текст hukoi да
не был бы написан, и я не завершил бы подготовку это-
го переиздания к оговоренным срокам и не достш бы
необходимого уровня технической точности, которая
является основным цюбованием хорошего руководства
но культурам тканей.
Ян Фреш ни
Список сокращений
AFP
Arg VP
AST
ATCC
BMP
bp
BPE
bGH
BrdU
BSA
BSL
BSS
BudR
CAM
cAMP
CAMs
CCD
CCTV
CE
CEA
CMF
CMRL
CPM
DAG
D-BPSB
DDAB
DEPC
DHFR
DIC
DM EM
DMSO
DOSPA
DOPE
DOTMA
D-PBS
DPDE
DT
DTT
EBSS
Альфа-фетопротеин
Apt инин-вааопрессин
Аспартатампнотрансфераза
Американская коллекция культур клеток
Костный морфогенетический белок
Нуклеотидная пара (ни)
Экстракт । ипофпза быка
Гормон роста быка
Бромдезоксиуридин
Бычий сывороточный альбумин
Уровень биобезопасности
Сбалансированный солевой раствор
Брпмдеоксиуридин
Хориоаллантоисная мембрана
Циклический аденозинмонофосфат
Молекулы межклеточной адгезии
Устройство с зарядовой связью
Встроенное телевизионное устройство
Эффективность клонирования
Карииноэмбриональный анти ген
Солевой раствор без кальция и машия
Лаборатория Медицинских исследований
Коннаута
Число импульсов в минуту
Д нация । л ицерин
Раствор Са2* и М§'+для добавления в
D-PBSA
Диметилдиоктадеццламмония бромид
Дизтилпирокарбонат
Ди । пдрофолатредуктаза
Дифференциальный интерференционный
контраст
Модификация Дюльбекко среды Игла
Диметилсульфоксид
2,3-диоленлокси-ЬЦ2(спермцнкарбокса-
мид)зти л] -N.N-диметил-1 - пропанам ин
трифторацетат
Д иолеил фосфа гидилэтаноламин
N-[ 1-( 2,3д иол еил оке и )-пропил |-N.N.N-
триметиламмония хлорид
Фосфатно-буферный солевой раствор
Дюльбекко
Дифосфодиэфпры
Время удвоения популяции
Дитиотреитол
Сбалансированный солевой раствор
Эрла
a-fetoprotein
Arginin-Vasopressin
Aspartate aminotransferase
American Type Culture Collection
Bone morphogenetic protein
Base pairs
Bovine pituitare extract
Bovine growth hormone
Bromodeoxy urid in
Bovine Serum Album ine
BioSafety Level
Balanced salt solution
Bromodeoxyurid ine
Chorioallantoic membrane
С у cl ic adenosinmonophosphate
Cell adhesion molecules
Charge-coupled device
Closet-circuit television
Cloning efficiency
Carcinoeinbrvonic antigen
Calciun- and magnesium —free saline
Connaught Medical Research Laboratory
Counts per minute
Diacylglicerol
Dimethyl diocladecy (ammonium bromide
Diethyl pyrocarbonate
Di hydrofolate reductase
Differential interference contrast
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium
Di met ilsulphoxid
2,3-dioleyloxy-N[2(sperminecarboxamido)
ethyl] -N.N-d itnelh vl- 1-lrifluoroacelate
Dioleoylphosphalidylelhanolamine
N-11 -( 2,3 dioley (oxy)-propyl J -N ,N ,N -1 r i-
methylammonium chloride
Dulbecco’s phosphate-buffered saline
Diphosphod ieslers
Doubling lime population
Dithiothreilol
Earle’s balanced salt solution
22
Список сокращений
EBV
ЕСАСС
ECGF
ЕСМ
EDTA
EGF
EGTA
ЕМ
ЕМА
FBS
FCS
FGF
G6PD
Gal - С
GFAP
GLP
GMP
GPDH
GRP
Н&Е
HAT
HBGF
HBS
HBSS
НС
hCG,
НЕРА
HES
HGPRT
Hgh
HITES
Hmfg
HPV
Hspgs
HL
ICAM
ISO
Its
lUdr
Kbin
Kdm
Kgm
LI
M199
Maa
MAGs
MACS
Вирус Эпштейна-Барра
Европейская коллекция живитных куль-
тур клеток
Фактор роста эндотелиальных клеток
Внеклеточный матрикс
Этилендиаминтетрауксусная кислота
Эпидермальный фактор роста
Этиленгл иколь-бис-( р-ами ноэтилэфир)-
4п-тетрауксусная кислота
Электронный микроскоп
Эпителиальный мембранный антиген
Эмбриональная бычья сыворотка
Эмбриональная сыворотка теленка
Фактор роста фибробластов
Гл юкоза-6-фосфа r-aei пдрогеназа
Галактоцереброзид
Глиальный фибриллярный кислый белок
Хорошая лабораторная практика
Хорошая производственная практика
Глиальный фибриллярный кислотный
протеин
Гастрин-высвобоасдаюший пептид
Гематоксилпн/эозин
Гипоксантин, аминоптерин, тимидин
Геиарин-связывающий фактор роста
Hepes-забуференный солевой раствор
Сбалансированный солевой раствор
Хэнкса
Г пдрокортпзон
Человеческий хориональный гонадотропин
Высокоэффективный дисперсный воз-
душный поток
Г идроксилэтиловый крахмал
Гипоксантин [уанозин фосфорибозил
трансфераза
Человеческий гормон роста
Гидрокортизон, инсулин, трансферрин,
эс градиоии селен
Глобулярный белок молока человека
Вирус папилломы человека
Гепарансульфатиротеогликаны
Г ииоксантин / тимиди н
Межклеточная молекула адгезии клеток
Международная организация стандар-
тизации
Инсулин, трансферрин, селен
Иод-дезоксиуридпн
Основная среда для кератиноцитов
Селективная среда для выделения кера-
тиноцитов
Среда ajtH роста кератиноцитов
Индекс мечения
Среда 199
Микрома грич ный анализ
Искусственные хромосомы млекопита-
ющих
Mai нитно-актпвируемый клеточный
СОрТИН!
Epstein—Barr virus
European collection of Animal cell cultures
Endothelial cell growth factor
Extracellular matrix
Elylend iaminletraacelat
Diaininoethane telraacetic acid
Epidermal groulh factor
Ethylene glycol-bis(P-aminoethylelher)-
N,n,n,n-telraacetic acid
Eleclrone microscope
Epithelial membrane antigene
Fetal bovine serum
Fetal calf serum
Fibroblasts grouth factor
Glucose-6-phosphale dehydrogenase
Galactocerebroside
Glial fibrillary acidic protein
Good laboratory practice
Good manufacturing practice
Glial fibrillar у acidic
Protein
Gastrin-releasing peptide
Hematoxlin&eosin
Hypoxantine, aminopterin, thymidine
Heparin binding groulh factor
Hepes- buffered saline
Hanks’ balansed sail solution
Hydrocortisone
Human chorionic gonadotropin
High-efficiencv particulate air
Hydroxyelhylslarch
Hypoxanlinguanosine phosphoribosyl trans-
ferase
Human growth hormone
Hydrocortisone, insuline, transferrin, estra-
diol and selenium
Human milk fat globule protein
Human papilloma virus
Heparan sulfate proteoglycans
Hypoxant ine. timid ine
Intercellular cell adhesion molecule
International standardization organization
Insulin, transferrin, selen
lododeoxiurid in
Keratinocyle basal medium
Keratinocy le-defined med him
Keratinocyte growth medium
Labeling index
Medium 199
Microarray analysis,
Mammalian artificial chromosomes
Magnetic-activated cell sorting
Список сокращений
23
Md
МЕМ
MPI
MSC
NBCS
NCI
NP
NSE
O.D.
РА
PBS
PBSA
PBSB
РСА
PCR
PCR
PDE
PDGF
PDT
Ре
РЕ
PEG
Pep b
PGA
Pla
Pma
Pine
Ptfe
Pvp
РИА
PWM
Rt-pcr
Sees
Scid
Sclc
Sd
SDS
Se
Sit
Skdrn
Sis
Ssc
Sv40
Sv401l
Teb
Teer
Tgf
Tk
Toe
UPW
VEGF
Vntrs
Yacs
Малатде! идрогеназа
Минимальная питательная среда шла
Манно. «а-6-фосфат-изомераза
Микробиоло! ические боксы биоло! ичес-
кой безопасности
Сыворотка новорожденного теленка
Государственный институт рака
Нуклеозидфосфорилаза
Нейрон -специфическая энолаза
Оптическая плотность
Активатор плазминогена
Фосфатно-буферный раствор
Фосфатно-буферный раствор а
Фосфатно-буферный раствор в
Перхлорная кислота
Полимеразная цепная реакция
Фосфокреатин
Фосфодилфиры
Тромбоцитарный фактор роста
Время удвоения популяции
Эффективность культивирования
Фосфатно-буферный раствор - а/эдта
Полиэтилен!ликоль
Пептидаза Ь
Полигликолевая кислота
Полимолочная кислота
Форбол-миристиновокислая соль уксус-
ной кислоты
Фосфомоноэфиры
Политетрафторэтилен
Полнвинилпирролидон
Фптогема! глютинпн
Митоген лаконоса
ПЦР, основанная на использовании обрат-
ной транскриптазы
Обмен сестринских хроматид
Тяжелый комбинированный иммуноде-
фицит
Мелкоклеточная карцинома ле! ких
Плотность насыщения
Додецилсульфат натрия
Эффективность посева
Селен, инсулин, трансферрин
Селективная среда с добавками для выде-
ления кератиноцитов
Лаурилсульфат натрия
Цитрат натрия,'хлорид натрия
Вирус обезьяны 40
Ген sv40 для большого т-антигена
Буфер трис, эдта
Трансэпителиальное электрическое со-
противление
Трансформирующий фактор роста
Тимидинкиназа
Общий ор1анический vi лерод
Сверхчистая вода
Фактор роста сосудистого эндотелия
Вариабельное число тандемных повторов
Искусственные хромосомы дрожжей
Malate dehydrogenase
Eagle’s minimal essential medium
Mannose-6-phospliate isomerase
Microbiological safely cabinet
Newborn calf serum
National cancer institute
Nucleoside phosphorylase
Neuron-specific enolase
Optical density
Plasminogen activator
Pliosphate-buffered saline
Pliosphate-buffered saline-a
Pliosphate-buffered saline-b
Perchloric acid
Polvmerase chain reaction
Phosphocreatine
Pliosphodieslers
Platelet-derived growth factor
Population doubling time
Plate efficiency
Pbsa edta
Polyethyleneglycol
Peptidase b
Polyglycolic acid
Polylaclic acid
Pliorbol myristate acetate
Phosphomonoesters
Polytetrafluorethylene
Polyvinylpyrrolidone
Phylohemagglulinin
Pokeweed mitogen
Reverse transcriptase per
Sister chromatide exchange
Severe combine iminunodeficite syndrome
Small cell lung mincer
Saturation density
Sodium dodecyl sulfate
Seeding efficiency
Selen, insulin, transferrin
Supplemented kdm
Sodium lauryl sulfate
Sodium citrate/ sodium chloride
Simian virus 40
Sv40 gene for large t-antigeue
Tris edta buffer
Transepithelial electrical resistance
Transforming growth factor
Thymidine kinase
Total organic carbone
Ultra pure water
Vascular endotelial growth factor
Variable number tandem repeats
Yeast artificial chromosomes
Список сокращений
СОП Стандартная операционная процедура
МЦ Метилцеллюлоза
ТХУ Трихлоруксусная кислота
Ф ГА Ф1 погема 11 лютинин
Pi Внеклеточный неор|анический фосфор
УФ Ультрафиолет
Птфэ Политетрафторэтилен
ССР Сбалансированный соленой растнор
мкм Микрометр
мл Миллилитр
мм Миллиметр
Kip Килогрэй
кПа Килопаскаль
Глава 1
ВВЕДЕНИЕ
1.1. ИСТОРИЯ ВОПРОСА
Техника культуры ткани была впервые задумана
и разработана в начале двадцатою века | Harrison.
1907; Carel, 1912] (табл. 1.1) для изучения свойств
животных клеток, свободных от системных влияний,
возникающих in vivo как при нормальном гомеостазе,
так и в условиях стресса, вызванного экспериментом.
Как видно из названия, эта технолси ия первоначально
разрабатывалась для недезагре! ированных фрагментов
тканей; рост культуры был ограничен возможностью
миграции клеток из кусочка ткани и нере|улярностью
митозов в первичном разрастании. Культивирование
клеток из такою первично! о эксплантата тканей доми-
нировало в данной област и более 50 лег [Fischer, 1925;
Parker, 1961 ]. Поэтому неудивительно, что исходный
термин «культура ткани» продолжает использоваться,
несмотря на то что бурное развитие в этой области в
течение второй половины XX в. (рис. 1.1) было связа-
но с возможностью использования диспергированных
клеточных культур
Впервые возможность деза|регации клеток экс-
плантата с последующим выращиванием на чашках
днеitepi ированных клеток была показана Роусом [Rous
and Jones, 1916], хотя в то время чаще всего пересев
культуры для создания клеточного штамма осущест-
вляли путем оперативного отделения ее фра! мента.
Первым клонированным клеточным штаммом был
L929, выделенный из мышиных L-клеток методом
капиллярною клонирования [Sanford el al., 1948].
В 1950-х гидах зля анализа вирусных бляшек на
монослое клеточных культур Дюльбекко [Dulbecco,
1952] описал метод получения монослойных культур с
использованием трипсина, который стал затем широко
применяться в практике культивирования. Возмож-
ность создания клеточной суспензии из единичной
клетки, полученной путем предварительной трипси-
низацип эксплантата, способствовала дальнейшему
развитию клонирования клеточных линий. Первая по-
стоянно пересеваемая клеточная линия человеческого
происхождения HeLa была получена Геем [Gey al al.,
1952]. Впоследствии она была клонирована Паком
[Puck and Marcus, 1955] с использованием облученно-
го ренп еном фидерного слоя клеток. Культура тканей
стала в то время шире использоваться благодаря появ-
лению антибиотиков, которые позволили разработать
долгоживущие клеточные линии. Тоща же появились
первые предупреждения о риске существования скры-
той иJiu антибиотико-резистентной контаминации
долгоживущей культуры [Parker, 1961]. Пятидесятые
годы были также годами разработки и создания mhoi их
питательных сред с определенным составом [Morgan
el al., 1950; Parker et al., 1954; Eagle, 1955, 1959; Way-
mouth, 1959), которые в конечном итоге легли в основу
разработки бессывороточных сред [Наш, 1963, 1965]
(см. разд. 10.6).
В тексте .л ой кнгп и термин культура ткани исполь-
зуется как обобщенный термин, обозначающий как
органные, так и клеточные культуры. Термин органная
культура подразумевает трехмерную культуру неде-
загре! ированной ткани, сохраняющей полностью или
частично все i истологические особенности этой ткани
in vivo. Термин к/еточная культура имеет отношение
к культуре, полученной от диспергированной исход-
ной ткани из первичной культуры из клеточного
штамма путем ферментативной, механической или
химической деза! pei ации. Термин гистотипическая
культура подразумевает, что клетки peai pei провали
или на|хк*ли с формированием трехмерной структуры,
соответствующей таковой в ткани. Гистотипическая
культура формируется путем культивирования при вы-
сокой плотности клеток в ячейке фильтра, вторичном
росте монослоя во флаконе или на чашке, в суспензии
в агаре, в условиях реального или смоделированного
Рис. 1.1. Рост количества публикаций по культуре ткани.
Количество сообщений в PuhMed начиная с 1965 i. Коли-
чество публикаций до 1960 i приводи ic>i по библиографии
Fisher 11925]
26
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
Таблица 1.1. Ключевые события в развитии методов ку яьтивирования тканей и клеток
Год/годы Событие
1907 Рост in vitro нервного волокна эмбриона лягушки
1912 Эксплантаты соединительной ткани цыпленка, сокращение cq>ac4-
ной мышцы в течение 2-3 месяцев
1916 Трипсинизация и субкультура эксплантата
1920-30-с Субкультуры клеточных линии фибробласгов
1925 26 Дифференцировка в органной культуре* in vitro
1940-е Внедрение использования антибиотиков в культуре ткани
1943 Создание линии L-кле гок мышиных фибробластов,
первая постоянная клеточная линия
1948 Клонирование L-клс гок
1949 Выращивание вирусов в клегочной культуре
1952 Использование трипсина для воспроизведения культуры; метод
вирусных бляшек
1952 1955 Создание первой линии клеток человека HeLa из цервикальной
карциномы
1952 Трансплантация ядра
1954 Контактное торможение клеточной подвижности в культуре
фибриблас гов
Противоиолиомислитная вакцина Солка, полученная в культуре
клеток иочек обезьян
1955 Клонирование клеток HcLa на гомологичном фидерном с юс
Разработка питательных сред Необходимость сыворп очных фак-
торов роста в питательных средах
Конец Понимание важности инфицирования микоплазмами (PPLO)
1950-х
1961 Объяснение конечности времени жизни нормальных клеток челове-
ка. Клеточное слияние тбрпдизация соматических клеток
1962 Создание и трансформация линии ВНК21 Поддержание диффе-
ренцировки (опухоли гипофиза и надпочечника)
Ссылка
Harrison. 1907
Carrel. 1912, Burrows, 1912
Rous & Jones, 1916
Carrel & Ebeling, 1923
Strangeways & Fell, 1925,1926
Kotlova, 1948, Cruikshank & Lowbury, 1952
Earle ct aL, 1943
Sanford ct al.. 1948
Enders ct al, 1949
Dulbecco, 1952
Dulbecco, 1952
Gey ct al.. 1952
Cm. Briggs & King. 1960
Abercrombie & Hcaystnan, 1954
cm. Griffiths. 1991
1963
1964
1964 1969
1965
1966
1967
1968
1969
1970-е
1973
1975
1976
ЗТЗ клетки и спонтанная трансформация
Плюрипотентность эмбриональных клеток
Селекция трансформированных клеток в агаре
Бешенство. Противокраснушная вакцина в культуре фибробластов
легкого человека WI-38
Клонирование клеток китайского хомяка в бсесывороточной
среде
Гсгсрокарион-i ибрид чеювек-мышь
Фак юр роста нервов
Дифференцировка гепатомы крысы
Эпидермальный фак юр роста
Перекрестная контаминация клетками HcLa
Ограничение клеточной пролиферации суспензии плотности
Клетки линии лимфоблаетомы
Поддержание уровня дифференцировки в культуре нормаль-
ных миобластов. Клеточная пролиферация, независимая от
подложки
Формирование колоний гематопоэтических клеток
Изобретение ламинарных шкафов
Puck & Marcus, 1955. Eagle. 1955,1959. San-
ford ct al „ 1955
Harris, 1959, Coricll et al, 1958. Rothblat &
Morton. 1959, Nelson, 1960
Hay flick & Moorhead, 1961, Soricul &
Ephrussi, 1961
Macpherson & Stoker, 1962; Buonassisi ct al.,
1962. Yasamura ct al., 1966. Sato & Yas-
umura, 1966
Todaro & Green, 1963
Klctnsmith & Pierce, 1964, Macpherson &
Montagnier, 1964
Wiktorct al, 1964. Andzapartdze. 1968
Ham, 1965, Harris & Watkins, 1965
Перенос ДНК, фосфат кальция
Фактор роста фибробластов. Гибридомы. Моноклональные антц-
Тотипотентные эмбриональные стволовые клетки. Добавление
фак торов роста к бсесывороточной питательной среде
Lcvi-Montalctui, 1966, Thompson ct al.,
1966
Hoobcr & Cohen, 1967, Gartlcr. 1967, Stoker
& Rubin, 1967, Moore ct al, 1967,Gcrperct
al., 1969, Miller ct al., 1971
Yaflc, 1968. Stoker ct al., 1968
Metcalf, 1969; see alsoMctcalf, 1990
see Kruse ct al, 1991, Coiltns & Kennedy,
1999
Graham & Van det Eb. 1973
Gospodarowtez ct al. 1975
Kohler & Milstctn, 1975. Illmensee & Mintz,
1976. Hayashi & Sato, 1976
1.1. История вопроса
27
Таблица 1.1. Ключевые события в развитии методов культивирования тканей и клеток (окончание)
Год/годы Событие
Ссылка
1977 Подтверждение перекрестной контаминации многих линии клеток
клетками HcLa
ЗТЗ фидерный слой и культура клеток кижи
1978 MCDB-сслсктивная бсесыворотичная среда
Взаимодействие с матриксом
Форма клетки и конгроль роста
1980-е Регуляция экспрессии генов Онкогенез, злокачественность и
трансформация
1980 Матрикс саркомы EHS (Позже Matngcl™)
1983 Регуляция клеточного цикла Иммортализация культуры с исполь-
зованием SV40
1980 1987 Разработка mhoi их специализированных клеточных линий
1983 Реконструированная культура клеток кижи
1984 Продукция рекомбинантного тканстикичного активатора илазми-
ногена в клетках млекопитающих
1990-е Культура трансфицированных клеток в промышленном масштабе
для нужд бкофарамацсвтики
1991 Культура мезенхимальных стволовых клеток взрослого человека
Nelson-Rees & Flandcrmcycr, 1977, Rhcimvald
& Green. 1975
Ham & McKcchan, 1978, Gospodarowicz et
al., 1978b, Retd & Rojkind, 1979, Folkman
& Moscona, 1978
c.g., Darnell, 1982, cm. Weinberg, 1989
Hassell et al, 1980
Evans et aL, 1983; см.такжс Nurse, 1990,
Huschtscha & Holliday, 1983
Pcehl & Ham, 1980, Hammond et al, 1984,
Kncdlcr & Ham, 1987
BellctaL, 1983
Collcn et aL, 1984
Butler, 1991
Caplan, 1991
1998 Выращенный в культуре хрящ
1998 Культура эмбриональных стволивых клщпк человека
Aigner et al. 1998
Thomson et al, 1998
отсутствия силы тяжести либо инфильтрации трех-
мерного матрикса, такого как коллагеновый дель.
Органотипическая культура подразумевает такую же
процедуру, но с соединением клеток различных .линий,
например эпидермальных кератиноцитов в комбини-
рованной культуре с фибробластами кожи, в попытке
создать тканевой эквивалент.
В свое время Харрисон [Harrison, 1907] выбрал
ли (ушку как источник ткани манным образом по-
тому, что она является холоднокровным животным,
и соответственно, культивирование не требовало
инкубации. Кроме тоги, поскольку регенерация тка-
ней более распространена у низших позвоночных,
он, возможно, предположил, что рост выделенной!)
образца будет более успешным, чем для ткани мле-
копитающих. Хотя ею метод вызвал новую волну
интереса к культивированию тканей гл vitro, лишь
некоторые ученые последовали примеру Харрисона
в выборе вида организма. Влияние медицины обусло-
вило развитие интереса к теплокровным животным, у
которых как нормальное развитие, так и патологиче-
ские процессы аналои1чны процессам, протекающим
в организме человека. Доступность различных тканей,
многие из которых хорошо росли в культуре, сделала
излюбленным объектом для исследования эмбрион из
куриного яйца; однако развитие экспериментального
животноводства, в том числе создание инбредных
линии грызунов, вывели млекопитающих на передний
край. Хотя куриные эмбриональные ткани moi ли обес-
печить разнообразные клеточные линии в первичной
культуре, ткани грызунов имели ряд преимуществ
при создании постоянных клеточных линий [Earle
et al., 1943J, а также предоставили широкий спектр
перевиваемых опухолей. Создание техноло( и и транс-
генных мышей [Beddingion. 1992: Peal et al.. 1992]
при наличии хорошо изученною генома мыши дало
новый импульс выбору этого животного в качестве
излюбленной модели для исследований в области
культуры тканей.
Ко(да было продемонстрировано, что клетки че-
ловеческих опухолей, такие как HeLa, также могут
давать начало постоянным клеточным линиям [Gey el
al., 1952], интерес к человеческим тканям значительно
возрос. Этому интересу позже способствовали работы
Леонарда Хейфлнка по исследованию клеточною
цикла [Hayflick & Moorhead, 1961] и потребности
вирусологов и молеку.>(ярных генетиков, работающих
с человеческими клетками и тканями. Культивиро-
вание человеческих клеток получило дальнейший
стимул то(да, когда был разработан ряд различных
бессывороточных селективных сред для Специфичных
типов клеток, таких как эпидермальные кератиноциты,
клетки бронхиального эпителия, а также сосудистого
эндотелия (см. разд. 10.2.1.). Эти среды в настоящее
время доступны, хотя стоимость их остается еще доста-
точно высокой по сравнению со стоимостью обычной
питательной среды.
В течение многих лет низшие позвоночные и
беспозвоночные не рассматривались в качестве объ-
ектов для культивирования тканей, хотя уникальные
аспекты их развития (высокая способность к регене-
рации амфибий, метаморфозу насекомых) сделали их
28
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
привлекательными для исследований молекулярных
основ развития организма. Относительно недавно по-
требности сельского хозяйства в области контроля над
насекомыми-вреди гелями простимулировали развитие
токсиколо! ических и вирусоло! ических исследований
на насекомых. Разработка генных техноло! ии позволи-
ла предположить, что создание клеточных линий насе-
комых с бакуловирусами и Apyi ими векторами может
стать полезным для создания клеток-продуцентов в
связи со способностью включения крупных геномных
последовательностей в вирусную ДНК и снижением
риска распространения патогенных вирусов человека.
Кроме того, экономическая важность рыбоводства
и затрязнение морей и пресноводных источников
стимулировали изучение клеток и тканей рыб при
нормальном их развитии и иатоло! ических процессах.
Методы работы и приемы манипуляций с клетками не
млекопитающих ортанизмов являются продолжением
развития методов работы, разработанных для культур
клеток млекопитающих. Кроме того, для работы с
клетками рыб и насекомых разработано ограниченное
число доступных специальных коммерческих сред (см
разд. 27.7.1 и 27.7.2).
Типы исследований, в которых могут быть исполь-
зованы культуры тканей, представлены на рис. 1.2;
1) исследование внутриклеточных процессов, на-
пример репликации и транскрипции дезоксири-
бонуклеиновой кислоты (ДНК), синтеза белка,
энергетического метаболизма, а также метаболизма
лекарственных веществ;
2) внутриклеточные потоки веществ, например РНК,
перемещение юрмональных рецепторных комплек-
сов и возникающие в результате процессы передачи
ст нала, а также мембранный транспорт;
3) взаимодействие с окружающей средой, например
питание, инфицирование, цитотоксичность, кан-
церогенез, действие лекарственных препаратов и
ли1 анд-рецепторное взаимодействие;
4) межклеточное взаимодействие, например морфо-
генез, паракринный контроль, кинетика клеточной
пролиферации, метаболическая кооперация, клеточ-
ная адгезия и подвижность, взаимодействие с мат-
риксом и opi анотипические модели для медицин-
ского протезирования и процессов приживления;
5) генетика, включая геномный анализ в норме и иато-
ло1 ии, генетические манипуляции, трансформация
п иммортализация;
б) образование и секреция клеточных продуктов,
биотехнология, создание биореакторов, получение
конечного продукта, технологов производства и
выделения целевого продукта.
Процесс разработки клеточных культур многом
обязан двум основным отраслям медицинских иссле-
дований: производству противовирусных вакцин и
исследованию механизмов новообразований. Стан-
дартизация условий исследовании и клеточных линий
для произволе гва вакцин и исследования механизмов
действия вирусов, без сомнения, обеспечили стреми-
тельное развитие современной техноло! ии получения
культуры тканей, в частности оборудования, обес-
печивающего выход большого количества клеток,
пригодных для биохимических исследований. Все эти
технические усовершенствования стали возможными
блй1 одаря коммерческому производству подходящих
сред, сывороток и повышению контроля загрязнения,
путем добавки антибиотиков в среду и создания сво-
бодно! о от микроор! анизмов оборудования с ламинар-
ными потоками воздуха. Эти успехи техноло! ического
npoipecca позволили внедрить культуру тканей в
разные области научных интересов
Дополнительный вес исследованиям на культурах
тканей придают протесты различных обществ защиты
прав животных, выступающих против необоснован-
ного использования большого количества животных
для проведения экспериментов. Общепринята идея
о необходимости использования животных в ходе
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОЦЕССЫ
транскрипция ДНК, синтез белка,
энергетический метаболизм, метаболизм
лекарств, клеточный цикл, дифференцировка,
апоптоз
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПОТОКИ, процессинг
РНЦ, рецепторы гормонов, потоки
метаболитов, обмен кальция, передача
сигнала, мембранный транспорт
ФАРМАКОЛОГИЯ действие лекарствен**!*
препаратов, лиганд-рецепторное
взаимодействие, метаболизм лекарств,
лекарственная устойчивость
КЛЕТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ протеомика,
секреция, биотехнология, конструирование
биореактора, получение конечного продукта,
направленный процессинг
МЕЖКЛЕТОЧНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ,
морфогенез, паракринный контроль,
кинетика клеточной пролиферации,
метаболическая кооперация, клеточная
адгезия и подвижность, взаимодействие с
матриксом,инвазия
ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ реконструкция
тканей, матрицы и структурные каркасы,
источники стволовых клеток, разрастание
тканей, дифференцировка
ГЕНОМИКА, генетический анализ,
трансфекция, инфекция, трансформация,
иммортализация, старение
ИММУНОЛОГИЯ эпитопы клеточных
поверхностей, гибридомы, цитокк*) и
передача сигнала, воспаление
ТОКСИКОЛОГИЯ, инфекция,
цитотоксичность, мутагенез, карциногенез,
раздражение, воспаление
Рис. 1.2. Области применения культуры ткани
1.1. История вопроса
29
доклинических испытаний новых фармаколог иче-
ских препаратов, однако нет моральною оправдании
применению большою их количества в исследованиях
косметических препаратов и друг их подобных экспе-
риментах. Таким образом, сформировано и возрастает
сообщество, в котором доминирует вдея проведении
наибольшею количества исследований in vitro, хоти
эта идея связана с дополнительным подтверждением
достоверности результатов и адекватностью модели in
vitro процессам, протекающим в организме in vivo. Еще
несколько лет назад перспектива перехода большинства
исследований на модели in vitro казалась весьма отда-
ленной. Тем не менее появление более чувствительных
методов анализа одновременно с совершенствованием
технолог ий и оборудовании сделали работу с культура-
ми тканей доступной широкому круг у исследователей.
Возможность исследования процессов воспаления in
vitro обеспечила беспрецедентное расширение области
применения культур тканей (см. разд. 22.4)
Помимо вирусолог ии и онколо! ии, от развития ме-
тодов культуры тканей сильно зависят дру< не области
исследования. Введение в методы клеточного слиянии
(1 ибрпдизапии клеток, см. разд. 27.9.) и генетические
манипуляции |Maniatisetal., 1978;Sambrookelal., 1989,
Ausubel el al., 1996J определили генетический состав
соматических клеток как основной компонент i енети-
ческо! о анализа высших животных, включая человека.
Широкий Kpyi методов, используемых для генетичес-
кой рекомбинации, в настоящее время включает пере-
нос ДНК [Ravid & Freshney, 1998], монохромосомный
перенос [Newbol & Cuthbert, 1998] и ядерный перенос
[Коно. 1997]. который дополнил метод соматической
1 ибридизации как инструмент генетического анализа и
генной манипуляции. Перенос ДНК сам ио себе поро-
дил много различных вариаций внесения ДНК в куль-
туру клеток, включая использование фосфатно-кальцие-
вой копреципитации, липофекции, электроиорации и
ретровирусное инфицирование (см. разд. 27.11).
Особенно бурное развитие генетика человека
поручила при реализации проекта Геном Человека
(Baltimore, 2001] Данные, полученные в ходе этих
исследований, обусловили развитие методов анализа
экспрессии множественных генов [Iyer et al., 1999].
После появления моноклональных антител метод
культуры тканей внес значительный вклад в иммуно-
лшические исследования и связанные с культивиро-
ванием клеток методы получения и анализа гематопо-
этических клеточных линии. Глубокое проникновение
в механизм действия антител и возможность исследо-
вания структуры эпитопа методом моноклональных
антител [Kohler & Mislein, 1975] явились, как и в
случае метода слияния соматических клеток, проло-
гом к развитию целой новой области генетических
исследований. Возникновение этой области было
обусловлено большим количеством основоиола! аю-
щпх знаний о контроле транскрипции генов и новыми
техноло! иямн. В результате из возможности внедрять
желаемый ген в прокариотическую и эукариотическую
клетку выросла отрасль промышленное ги с много-
миллиардными бюджетами. Клеточные продукты,
производимые клетками с внесенным геном, такие как
гормон роста человека, инсулин, интерферон и др., в
настоящее время стали повседневным явлением. Вмес-
те с тем отсутствие у бактерий цосттранскрииционных
модификаций, таких как i ликозилирование, позволяет
предположить, что клетки млекопитающих могут
обеспечить более качественный конечный продукт
[Grainpp et al., 1992], особенно в свете развития тех-
ноло! ии получения иммортализованных клеточных
линий (см. разд. 18.4).
Другие области, связанные с развитием культуры
тканей, включают в себя изучение межклеточного
взаимодействия, внутриклеточных механизмов конт-
роля дифференцировки и развития [Jesselland Mellon,
1992; Obmiclii el al.. 1998; Balkovelz & Lipschulz.
19991 и функций нейронов [Richard el al., 1998; Dunn
et al., 1998; Haynes, 19991. Успехи неврологических
исследований еще не мо1ут считаться значительны-
ми, поскольку работа с пересеваемыми клеточными
линиями, полученными из нормальных клеток MO3ia
или нервной ткани, пересев нейронов in vitro до на-
стоящего времени еще невозможны без использования
клеточной трансформации (см. разд. 18.4) Тем не
менее успехи работы с эмбриональными стволовыми
клегками [Thomson el al., 1998; Ralhejen et al., 1998;
Wolf el al., 1998; Webber & Minger, 20041 позволяют
предположить, что этот подход может способствовать
репликации культур, которые в последующем способ-
ны дифференцироваться в нейроны.
Технология культуры тканей также была при-
менена во mhoiux привычных областях медицины
и промышленности. Хромосомный анализ клеток,
полученных из амниотической жидкости пункцией
плодно!о пузыря беременных (см. разд. 27.6), помо-
гает обнаружить генетические нарушения у плода.
Определение качества питьевой воды и токсического
действия фармацевтических компонентов и веществ,
загрязняющих окружающую среду, moi ут быть прове-
дены на основе колониеобразующих u друз их методов
анализа in vitro (см. разд. 22.3.1,22.3.2,22.4). Дальней-
шие возможные приложения технологии культуры
тканей к решению медицинских проблем связаны с
обнаруженной у культуры эпидермальных клеток
способностью формировать функционально активный
клеточный пласт [Green et al., 1979], а у клеток сосудис-
того эндотелия — образовыватькапилляры [Folkman &
Haudenschild. 1980]. Такие способности открыли новые
возможности в гомот рансплан гации и восстановитель-
ной хирург ии с использованием собственных клеток
[Tuszynski etal., 1996; Gustafson etal., 1997; Liinalel al.,
1996], особенно в случае обширных ожогов [(iobet el
al., 1997; Wright et al., 1998; Vunjak-Novakovic & Fresh-
ney, 20051 (см. также разд. 25.3.8). Вместе с внесением
«нормальных* генов в генетически дефицитные клетки
стало возможным возвращат ь такие «исправленные»
клетки обратно в организм пациента. Показано, что
трансфецированные клетки культуры бронхиального
эпителия крыс, несущие репортерный ген £-ga/, спо-
30
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
собны инкорпорироваться в бронхиальную выстилку
при аэрозольном введении их в дыхательный тракт
животных [Rosenfeld et al., 1992]. Показано также, что
культивированные сателлитные клетки внедряются
в поврежденную скелетную мышцу крыс, при этом
клетки с ядром от «пересаженных» клеток обнаружи-
ваются в зрелых синцитиальных мышечных трубочках
[Morgan el al., 1992].
Перспективные возможности имплантации нор-
мальных клеток от здорово! о человека-до нора или
подходящих фетальных клеток больному, а также
пересадка генетически измененных клеток от само! о
пациента привели к созданию целой ветви метода
культуры тканей, которая получила название тканевая
инженерия [Alala and Lanza, 2002; Vunjak-Novakovic
and Freshney. 2005]. Тканевая инженерия включает в
себя выращивание тканевых эквивалентов с формиро-
ванием ор!анотнпической культуры (см. разд. 25.3.8),
выделение и дифференцировку человеческих эмбри-
ональных стволовых (ES) клеток и тотипотентных
стволовых клеток взросло!о человека, таких как
мезенхимальные стволовые клетки (MSCs), перенос
гена, материаловедение, утилизацию продуктов био-
производства и техноло! ик> т ранс плантации. Техниче-
ские барьеры постоянно преодолеваются, выдвигая на
передний план вопросы биоэтики. Стало возможным
имплантирование нормальных нейронов плода паци-
ентам с болезнью Паркинсона, но общество должно
определить законность использования фетальных ор-
ганов и тканей для этих ццдей. Это касается также тех
случаев, когда культивированные собственные клетки
больного подвер! аются i енетической реконструкции
путем трансфекции «нормального» !ена, например
внесение нормального 1ена продукции инсулина в
культивируемые Р-клетки островков поджелудочной
железы больных диабетом. Существуют проблемы при
трансфекции клеток дру гсл о типа, например введение
клеток-предшесгвенников скелетных мышц [Morgan
et al., 1992], что позволяет клеткам инкорпорировать
в медленно делящиеся ткани и потенциально обеспе-
чивать пролонгированный физиолог и чес кий эффект.
Хотя этические проблемы такого типа исследований
стволовых клеток менее спорны, пока очевидны тех-
нические oi раничения этого метода.
Оплодотворение in vitro (IVF) (экстракорпораль-
ное оплодотворение) начали разрабатывать начиная
с первых экспериментов на эмбриональной культуре
[см. Edwards. 1996]. и в настоящее время оно юриди-
чески и этически принято п широко используется во
mhoi их странах [см. Gardner and Lane, 2003]. Однако
вызывает бурные этические дебаты формирование
in vitro гамет из герминативных стволовых клеток,
выделенных из семенников и яичников [Dennis, 2003]
или из ES-клеток. Имплантация ооцитов, полученных
культивированием клеток яичника мышиного эмбри-
она, привела к рождению нормальных мышей [Eppig,
1996, Obata el al., 2002]. Сперматиды, выделенные из
семенников новорожденных бычков и культивиро-
ванные вместе с клетками Сертоли [Lee et al., 2001],
так же как и сперматиды, выделенные из семенников
мышей, способны были оплодотворять яйцеклетку
с последующим рождением здоровых, фертильных
особей [Marh el al., 2003]
1.2. ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА
КУЛЬТУРЫ ТКАНИ
1.2.1. Контроль окружения
Два основных преимущества техники культуры ткани
(табл. 1.2) заключаются в возможности очень точного
контроля физико-химических свойств окружения
(pH, температуры, осмотического давления, парци-
ального давления О, и СОД и физиолошческих ус-
ловий, которые могут поддерживаться относительно
неизменными, но не все!да Moiyr быть определены.
Большинство клеточных линий еще пока требуют для
своего роста добавок в среду сыворотки или дру! их
недостаточно изученных компонентов. Эти добавки
варьируют и содержат неопределенное количество
Таблица 1.2. Преимущества метода культуры ткани
Категория Преимущества
Физико-химические Контроль pH, температуры, ос-
свойства окружения мотичсского давления, парци- ального давления растворенных газов
Физиологическое со- Контроль гормонов и концентра-
стояние цпй питательных веществ
Микроокружение Регуляция матрикса, межклеточ- ных взаимодействий, газовой диффузии
Однородность клсточ- Доступность селективных сред.
вых линии клонирование
Характеристика Цитолшия и иммунное окрашива- ние легко осуществимо
Сохранение Может храниться в жидком азоте
Сертификация иаккрс- Происхо-кдснпс. история и чистота
дптацня культуры могут быть проверены на аутентичность и документи- рованы
Повторяемость и вое- Количественный анализ легко
приизводимость ро- зу тьтатов осуществим
Экономия реагентов Использование мснывих объемов реагент ов, прямое воздействие на клетки, снижение стоимости
Контроль концентра- Возможность определять п конт-
цив и времени (СхТ) ролировать дозу, концентрацию и время действия.
Механизация Возможность микро 1ИТрОВаН!!Я м робгн изацни
Снижение количества Исследование циютоксичности.
использованных жи- скрининговых исследований в
вотных фармацевтике, косметологии
1.2. Преимущества метода культуры ткани
31
элементов, таких как гормоны и другие ретуляторные
вещества. Идентификация некоторых существенных
для клеточного роста компонентов сыворотки вместе
с более глубоким пониманием механизмов действия
факторов, ретулирующнх клеточную пролиферацию
(см. таил. 10.3), сделали возможным замену сыворотки
определенным набором компонентов (см. разд. 10.4).
Поскольку исследователи стремятся воспроизвести
нормальные фенотипические свойства тканей гп vitro,
роль внеклеточною матрикса все более возрастает.
В настоящее время эта роль соответствует роли сы-
воротки: матрикс часто необходим, но не все1да точно
определен, его состав может быть изменен и, со време-
нем, koi да будет доступна биохимическая идентичность
всех компонентов матрикса, состав его будет полностью
охарактеризован.
1.2.2. Характеристика
и однородность образца
Образцы тканей все1да разнородны. Повторно взятые
образцы даже из одной и той же ткани различны ио
клеточному составу. Предцолатается, что после одно-
го-двух пересевов культивируемые клеточные линии
однородны (или, ио крайней мере, единообразны) ио
составу, поскольку клетки беспорядочно перемеши-
ваются при каждом переносе и селективное давление
условий культивирования приводит к формированию
Таблица 1.3. Ограничения метода культуры ткани
Категория Примеры
Необходимость нали- Стерильность манипуляций
чпя специальных Химические загрязнения
навыков Микробное загрязнение Перекрестное загрязнение
Контроль окружаю- Рабочее место
щей среды Культивирование, контроль pH Предотвращение биозат рязнсния окружающей среды и утилизация отходов
Объем расходов и Основное оборудование для лромз-
мнимость водства в больших масштабах Среды, сыворотка Одноразовое пластиковое обору- дование
Генетическая неста- бильное гь Разнородность, изменчивость
Фенотипическая Обратная дифференцировка
нестабильность Адаптация Избирательный чрезмерный рост
Идентификация ти- Маркеры нс всегда экспрссеиро-
ИОВ клегок ваны Сложно восстановить гистологи- ческую принадлежность, антич- ность клеток Геометрия пространства и микроок- ружение изменяют ЦИТОЛОГИЮ
гомогенной культуры наиболее устойчивых типов кле-
ток. Следовательно, в каждой субкультуре репликатив-
ные образцы идентичны друт друт у, и характеристика
клеточных линий может сохраняться в нескольких
поколениях и быть неизменной при замораживании
и хранении в жидком азоте. Поскольку эксперимен-
тальные самовоспронзводящиеся клетки фактически
идентичны, необходимость вариационною статисти-
ческою анализа уменьшается.
Возможность использования с грот их тестов иденти-
фикации клеточных линий (гл. 15) и их загрязненности
(гл. 18) означает, что сохраненные первичные культуры
и клеточные линии могут быть пригодны для будущих
исследований и коммерческою использования.
1.2.3. Экономичность, эффективность
и автоматизация процесса
В культурах тканей можно осуществить непосред-
ственное воздействие на клетки определенных низких
концентраций реагентов. Следовательно, для достиже-
ния аналО( U4HO1 о эффекта требуется использование
меньших концентраций реагентов, чем in vivo, где до
9<)°о действующею вещества теряется при выведении и
распределении ио другим тканям, которые не изучают-
ся в данном эксперименте. Проведение скрининговых
исследований с большим количеством параметров
и использованием самовоспроизводящихся клеток
дешевле, при этом исчезает необходимость решения
юридических, моральных и этических вопросов, свя-
занных с экспериментами на животных. Разработка
новых мноюлуночных планшетов и роботизация про-
цесса также вносит значительный вклад в экономию
времени и объема работы.
1.2.4. Моделирование m vitro условий
in vivo
Перфузионные методы позволяют доставлять в
ходе эксперимента специфические компоненты, кон-
центрация которых в ходе процесса и при различном
состоянии метаболизма клеток может ре1улировагься
(см. табл. 1.2). Разработка юстотицических и ортано-
тшшческих моделей также повышает точность моде-
лирования процессов in vivo.
1.3. ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
КУЛЬТУРЫ ТКАНИ
1.3.1. Наличие специальных навыков
Техника культивирования клеток должна проводиться
в строго асептических условиях, поскольку животные
клетки растут намного медленнее, чем большинство
наиболее распространенных коитаминантов, таких
как бактерии, плесневые грибы и дрожжи. Более тою.
32
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
в отличие от MUKpoopt анизмов клетки многоклеточ-
ных животных в норме изолированно не существуют
и, следовательно, не способны к жизнедеятельности
без обязательного добавления в среду компонентов,
воссоздающих условия плазмы крови или межкле-
точной жидкости Воспроизведение таких условий
предполагает наличие определенного уровня подготов-
ки персонала для точного определения необходимых
условий культивирования, своевременной диа> ностики
возможных ошибок (табл. 1.3, см. также >л. 28) и пре-
дотвращения перекрестной контаминации культур.
Таким образом, культура тканей не может использо-
ваться от случая к случаю для проведения одного-двух
экспериментов.
1.3.2. Затраты
Основным oi раничением культивирования тканей с
экономической точки зрения является большой объем
работы и материалов, которые необходимы для полу-
чения относительно небольшого количества конечного
продукта. Реально максимальная партия, которую
мотут нарастить небольшие лаборатории (два-три
сотрудника, занимающихся культивированием), со-
ставляет 1-101 клеток. Крупные лаборатории с боль-
шими возможностями способны получить 10 1001,'
опытно-промышленные установки дают свыше 1001
клеток в одной партии. Этот уровень превышает выход
клеток даже в крупных лабораториях, однако далек от
промышленного уровня производства, при котором
специальное оборудование позволяет получать кило-
граммы клеток.
Стоимостьироизводимых клеток примерно в 10 раз
выше, чем стоимость использования животных тканей
Следовательно, если требуется большое количество
ткани (больше 101), причина, вынуждающая исполь-
зовать культуру тканей, должна быть очень весома.
Для небольшого количества тканей (около 10 г) сто-
имость получения культуры покрывается обычными
расходами, однако цена учитывает возможность
снижения стоимости анализа или подготовительных
процедур. Полумикро- или микрометоды часто можно
проводить быстрее, поскольку они требуют меньшего
общего времени работы, объема проб, времени цент-
рифугирования и т.д. Кроме того, многие процессы
автоматизированы.
1.3.3. Дифференцировка и селекция
Когда в 1950-х годах были достшнуты первые ос-
новные успехи воспроизводства клеточных линий,
многое исследователи отмечали утрату фенотипиче-
ских характеристик, характерных для тех тканей, из
которых были изолированы клетки. В этом явлении
первоначально обвинили де^иффрренцировку - про-
цесс, который, как предиола! ал и, противоположен
дифференцировке. Однако позже было показано, что
такая утрата 1 истологических характеристик связана
с чрезмерно быстрым ростом недифференцированных
клеток того же или другого происхождения. Разработка
бессывороточных селективных сред (см. разд. 10.2.1)
позволила выделять клетки, имеющие особое проис-
хождение, и теперь можно видеть, что при правильно
подобранных условиях mhoi не из утраченных свойств
таких дедифференцированных клеток восстанавлива-
ются (см. разд. 17.7)
1.3.4. Происхождение клеток
Если свойства дифференцированных клеток были
утрачены по какой-либо причине, трудно обнару-
жить сродство клеток с функционально активными
клетками тканей, из которых они были получены.
Поэтому для характеристики и идентификации
происхождения клеток требуются их постоянные
маркеры (см. разд. 16.1). Кроме toi о, для экспрессии
этих маркеров moi у т потребоваться совершенствова-
ние и модификация условий культивирования (см.
разд. 3.4.1. 17.7).
1.3.5. Нестабильность
Нестабильность является главной проблемой мши их
постоянных цветочных линий, что связано с нестабиль-
ностью анеуидоидно! о набора хромосом в животных
клетках. Даже в короткоживущих культурах нетран-
сформированных клеток отмечается 1етеро1енность
интенсивности и способности к дифференцировке,
которые мо1ут привести к вариабельности результатов
от одного пассажа к другому (см. разд. 18.3)
1.4. ОСНОВНЫЕ ОТЛИЧИЯ КУЛЬТУРЫ
IN VITRO
М hoi не различия между поведением клеток в культуре
и исходной ткани in vivo проистекают из диссоциации
клеток, в свою очередь, связанной с трехмерной ieo-
метрмей ткани in vivo и двухмерным распространением
клеток на субстрате in vitro. Специфические межкле-
точные взаимодействия, характерные для i истоло! ии
данной ткани, утрачиваются, клетки растяговаются
по площади, становясь подвижными, и во mhoi их
случаях начинают делиться с увеличением концент-
рации факторов роста в клеточной популяции. При
формировании клеточная линия может быть пред-
ставлена только одним-двумя типами клеток и многое
разнообразные формы межклеточных взаимодействий
утрачиваются.
Среда культивирования также испытывает недоста-
ток ряда системных компонентов, участвующих в peiy-
ляцин । омеостаза in vivo, в том числе наиболее важных,
относящихся к нейро-гуморальной системе. Без этого
контроля клеточный метаболизм может* быть более
1.5. Типы культуры ткани
33
постоянным in vitro, чем in vivo, но не может считаться
реально представляющим ткани, их которых эти клет-
ки были получены. Анализ данного фактора привел к
пониманию необходимости введения в культуральную
среду различных гормонов (см. разд. 10.4.2), и, видимо,
эта тенденция будет развиваться.
Энергетический метаболизм in vitro представлен в
ОСНОВНОМ ГЛИКОЛИЗОМ, и, хотя цикл лимонной кислоты
также функционирует, он играет меньшую роль.
Нетрудно обнаружить другие различия между
условиями окружения клеток in vitro и in viva (см.
разд. 22.2), и это несовпадение нередко приводит к
тому, что работы на культуре клеток часто рассматри-
ваются скептически. Однако, хотя существование таких
различий нельзя отрицать, многие специфические
функции тканей и клеток можно воспроизводить в
культуре. Поэтому в той степени, в какой все оиисаниые
or раничения позволяют рассматривать их как адекват-
ную модель, культуры клеток являются очень ценным
инструментом для исследований.
1.5. ТИПЫ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ
Существуют три основных метода формирования
культур [Schaeffer, 1990J (см. Приложение IV, рис. 1.3
и табл. 1.4).
1) Термин органная культура подразумевает, что в
культуре сохранены, ио крайней мере частично,
структурно-функциональные характеристики
Ткань на границе
раздела сред
жидкость-газ,
гистологическая
структура сохранена
ЭКСПЛАНТАТНАЯ ДИССОЦИИРОВАННАЯ ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ
КУЛЬТУРА КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА КУЛЬТУРА
Ткань на границе
раздела жидкость/
плотная среда,
клетки мигрируют из
эксплантата
Разрушенные ткани,
клетки формируют
моноспой на границе
раздела жидкость/
плотная среда
Различные клетки
совместно культивируются
на подложке или без
нее, органотипическая
структура восстановлена
Рис. 1.3. Тилы клеточных культур
Таблица 1.4. Свойства различных типов культур
Категория Органная культура Эксплантат Клеточная культура
Источник Эмбриональныеорганы.фраг- менты взрослых тканей Фраг менты тканей Измельченные ткани, первич- ная культура, пересеянная клеточная линия
Трудозатраты Высокие Умеренные Низкие
Исследуемые характерце- Гистология Ци । ологпя и маркеры Биохимические, молекулярные, иммунологические и цитоло- гические исследования
Гистология И нформативна Затруднена Невозможна
Биохимическая дифферен- циация Возможна Гстсрогенна У грачсна, но возможно восста- новление
Пересев Невозможен Возможна из матричного нароста Стандартная процедура
Повторный отбор проб. Высокая вариабельность. низ- Высокая вариабельность Низкая вариабельность, выси-
воспроизводимость, гомогенность кая воспроизводимость низкая воспроизводи- мость кая воспроизводимость
Количественный анализ Затруднен Затруднен Простой, много доступных тех- нических средств
34
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
ткани in vivo. Для этого кусочки ткани культиви-
руются на границе раздела сред жидкость—газ (на
плотике, решетке пли гелевой подложке), которые
предпочтительны для фиксации сферической или
трехмерной структуры.
2) В перчично эксплантируемой культуре фра1мент
ткани (эксплантат) помещается на стекло (или
пластик) в жидкую среду, где после прикрепления
активизируется мт рация клеток ио поверхности
плотною субстрата (см. разд. 12.3.1).
3) Термин клеточная культура предполагает, что
фра1мент ткани или полученная из первичною
эксплантата культура измельчается (механически
или ферментативно) до клеточной суспензии, ко-
торая затем культивируется как адгезированный
монослой на плотном субстрате или как суспензия в
культуральной жидкой среде (см. разд. 12.3,13.7).
В результате сохранения клеточных взаимодей-
ствии, изначально существовавших в ткани, которая
была использована для культивирования, opi энные
культуры сохраняют специфические свойства этой
ткани. Они растут не очень быстро (клеточная про-
лиферация ограничена и снижена на периферии
эксплантата) и используются, главным образом, для
эмбриональных тканей и, следовательно, не могут
быть пересеяны. Каждый эксперимент на opiэнной
культуре требует использования свеже! о эксплантата,
что требует больших трудозатрат и снижает воспро-
изводимость результатов ио сравнению с клеточной
культурой. Таким образом, количественный анализ
более сложен, и количество материала, которое может
быть выращено, ограничено размерами эксплантата
(около 1 мм1) и объемом работ, требуемых JjIH отде-
ления и пересадки культуры. Тем не менее органные
культуры сохраняют специфические i ucttuioi ические
межклеточные взаимодействия, без которых сложно
воспроизвести характерные свойства тканей.
Из первичною эксплантата или дисиер! ированной
клеточной суспензии можно получить клеточные
Таблица 1.5. Субкультура
Преимущества Недостатки
Воспроизводство Повреждение при ферментативной или механической дезагрегации
Большое количество Селекция клеток, приспособленных
клеток к росту в культуре
Возможность клони- Чрезмерно быстрый рост нсспеци-
рования ализированных или стромальных клеток
Повышение однород- Генетическая нестабильность
Характсрпст ика реп- Vipaia дифференцировки и свя-
ликативных образ- занных г нею свойств (возможно
цов индуцированная)
Хранение в заморо- Возрастание риска неправильной
женном состоянии идентификации или перекрестного зара-кения культур
культуры. Поскольку в таких культурах часто отме-
чается клеточная пролиферация, задача формирова-
ния постоянных клеточных культур представляется
выполнимой. Монослой или клеточная суспензия
со значительной фракцией растущих клеток (см.
разд. 21.11.1) может быть отделен путем фермента-
тивного воздействия или простым разведением и пе-
ресевом (субкультпвированием) во флакон со свежей
питательной средой (табл. 1.5; см также разд. 13.1,
13.7). Эта процедура называется пассажем, а дочерняя
культура, сформированная таким образом, представ-
ляет собой начало клеточной линии.
Формирование клеточной линии из первичной
культуры подразумевает (1) увеличение общею коли-
чества клеток после нескольких генераций и (2) конеч-
ное преобладание клеток или линий дифференцировки,
обладающих способностью к высокому темпу роста,
что приводит к (3) высокой степени однородности
клеточной популяции (см. табл. 1.5). Клеточную ли-
нию можно охарактеризовать, и такие характеристики
применимы к большинству их жизненных циклов.
Получение постоянных (или «установившихся») кле-
точных линий обычно подразумевает фенотипическое
изменение или трансформацию (см. разд. 3.8,18.2).
Сублиния, полученная при отборе клеток из куль-
туры путем клонирования или какими-то дру ими
методами, называется клеточным штаммом. Подра-
зумевается, что клеточный штамм имеет подробную
характеристику. Клеточные линии или клеточные
штаммы мо1ут делиться и развиваться в адгезирую-
щем монослое или суспензии. Монос.юйная культура
означает, что при наличии необходимых условий
клетки будут прикрепляться к субстрату и в норме
будут делиться и распространяться таким способом.
Зависимость от подложки означает, что прикрепле-
ние (и обычно степень расиластанности) к субстрату
является необходимой предпосылкой для клеточной
пролиферации. Монослойная культура является ме-
тодом культивирования, общепринятым и наиболее
распространенным для большинства нормальных
клеток, за исключением гематопоэтических. Суспензи-
онную культуру обычно получают из клеток, которые
способны выжить и делиться без прикрепления к
субстрату (независимость от подложки)', этой способ-
ней? ью обладают гематопоэз ические клетки, трансфор-
мированные клеточные линии и клетки, выделенные
из злокачественных опухолей. Можно показать, что
некоторая доля клеток, способных к делению в суспен-
зии, присутствует во mhoi их нормальных тканях (см.
разд. 18.5.1). Принадлежность этих клеток к какому-то
типу остается неясной, но в настоящее время посту-
лируется их сродство со стволовыми клетками или
некоммитированн ыми предшественниками. Подра-
зумевается, что некоторые из культивируемых клеток
представляют собой пул клеток-предшественников
из исходной ткани (см. разд. 3.10). Культивируемые
клеточные линии напоминают недифференцирован-
ные клетки-иредшественники in vivo больше, чем
полностью дифференцированные клетки, поскольку
1.5. Типы культуры ткани
нормальные дифференцированные клетки тканей, как
правило, не способны к делению.
Поскольку они moi ут размножаться как однород-
ная клеточная суспензия или монослой, клеточные
линии имеют много преимуществ, проявляющихся
в возможности количественною анализа, точной ха-
рактеризации и точной репликации образцов. К недо-
статкам клеточных линий можно отнести отсутствие
или недостаточность межклеточных и клеточно-мат-
риксных взаимодействий, имеющихся у ор1анных
культур. По этой причине многие исследователи пы-
тались воссоздать трехмерную клеточную структуру
путем использования arpeiaTOB в клеточной суспензии
(см. разд. 25.3.2). Такие подходы потребовали вве-
дения новых терминов или, ко крайней мере, нового
истолкования некоторых старых понятий. Термин
гистпотипическая культура или гистокультура (нами
используется термин гистотипическая культура) стал
означать культуру высокой плотности, «гканеобраз-
ную», полученную из одной клетки, в то время как ор-
ганотипическая культура подразумевает присутствие
более чем одного типа клеток, взаимодействующих так,
как они moi ли бы это делать в ор1анах, из которых они
ведут свое происхождение (либо имитируют это взаи-
модействие). Ор1анотииическая культура открывает
новые перспективы для изучения клеточного взаимо-
действия внутри отдельной определенной популяции
однородных и, предположительно, сенетически и
фенотипически определенных клеток.
Во mhoi их отношениях некоторые из наиболее
многообещающих подходов к работе с культурой
ткани возникли и развились благодаря пониманию
необходимости учета межклеточного взаимодействия
в гомогенной и гетерогенной клеточной популяции в
культуре. Это понимание отмечает начало перехода от
эры фундаментальной молекулярной биоло! ии, koi да
мно< ие pei уляторные процессы были исследованы на
клеточном уровне, к эпохе клеточной пли тканевой
биоло! ии, в которой это приобретенное знание приме-
няется к составляющей единое целое клеточной попу-
ляции клеток и к более ясному пониманию механизмов
передачи сш налов между клетками.
Глава 2
ТРЕНИРОВОЧНЫЕ
ПРОГРАММЫ
2.1. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ГЛАВЫ
Эта книга первоначально была создана как источник
информации о методах и приемах работы с культурами
тканей, предоставляющий также некоторое количество
теоретического материала и практические протоколы,
размещенные в тексте киш и и разумно объясняющие
некоторые из правил проведения этих процедур.
Так пли иначе, существует необходимость облег-
чить первоначальный этап понимания и усвоения мате-
риала начинающими работниками, а также тренировки
тех, кто уже имеет некоторые минимальные знания и
навыки работы с культурой ткани. Самостоятельный и
опытный исследователь может изучить только те части
руководства, которые имеют отношение к области его
интересов. В то же время студенту или лаборанту с
ограниченными навыками работы и знаниями рекомен-
дуется проработать раздел тренировочных tipot рамм,
основанных на его предыдущем опыте и соответ-
ствующий требованиям его руководителя. Эта глава
имеет целью обеспечить читателей тренировочными
программами как на начальном, так и на более высоком
уровне, и может бы гь использована руководителями
с возможностью модификации этих про t рам м при
подготовке нового персонала.
Настоящие ирО1раммы представлены как серия
упражнений в стандартном формате с перекрестными
ссылками на соответствующие протоколы и сноски.
Инструкции стандартных протоколов не повторяются
в упражнениях, поскольку они иод]хюно описывают-
ся в соответствующих t лавах. Однако специальные
указания позволяют модифицировать стандартные
протоколы, чтобы сделать каждое упражнение более
интересным, а полученные данные учащийся может
затем обработать и проанализировать. Большинство
упражнений иредла1ает использовать минимальное
количество образцов, для того чтобы сэкономить время
обучения и снизить сложность, поэтому учащийся дол-
жен осознавать важность большего количества повто-
рений стандартных оиераций и манипуляций в ходе по-
вседневной экспериментальной практики. У пражнения
расположены в порядке усложнения с точки зрения ме-
тодических приемов и использования оборудования: от
элементарных до более сложных. Все они представлены
в табл. 2.1. У иражнения, обязательные для выполнения,
выделены жирным шрифтом. Предиола1ается, что как
элементарные, так и более сложные задания послужат
хорошей основой для работы и усвоения материала,
хотя как технические возможности обучающегося, так и
время, имеющееся у него в распоряжении, могут влиять
на выбор изучаемого материала.
В тех случаях, кемда выполнение упражнения тре-
бует применения более чем одного протокола, номера
протоколов приводятся через точку с занятой. Там,
1де возможен выбор, номера разделяются «или» и
инструктор (преподаватель) может решить, какой из
протоколов более уместен или лучше подходит к работе
конкретной лаборатории. Рекомендуется постараться
освоить все основные методы, описанные в упражнени-
ях, приведенных в табл. 2.1, уделив большее внимание
наиболее существенным, выделенным жирным шриф-
том. За инструктором остается свобода выбора заданий
в специальных разделах.
В каждом упражнении приведены дополнительные
разделы и протоколы. Они не являются необходимой
частью упражнения, но MOtyT быть в него включены,
если это отвечает целям и интересам лаборатории или
обу чающ егося.
2.2. УПРАЖНЕНИЯ ДЛЯ НАЧИНАЮЩИХ
(основной курс)
Ниже приводятся упражнения, которые преподавателю
или учащемуся следует выполнить прежде всего. Боль-
шинство из них просты и доступны для выполнения.
Протоколы и варианты этих протоколов построены так,
чтобы выполнение их становилось интересным экспе-
риментом, и представлены подробно в текстах, на кото-
рые есть указания в перекрестных ссылках. Количества
реагентов, указанные в разделах Материалы каждого
протокола, соответствуют описываемому методу, но
при необходимости мен ут быть сокращены или допол-
нены. Упражнения, выделенные в табл. 2.1 жирным
шрифтом, представляются наиболее важными.
Обратите внимание на список необходимых мате-
риалов и оборудования, приведенный в начале упраж-
нений. Это позволит руководителю оценить имеющееся
у него оборудование, определить его роль и возможнос-
ти использования, а также понять уровень подготовки
и технического обеспечения, необходимый для работы
с культурами тканей. Принципы хранения также долж-
ны быть объяснены с тем, чтобы привлечь внимание
к особенностям упаковки и хранения образцов с раз-
2.2. Упражнения для начинающих
37
Таблица 2.1. Тренировочные программы
Ns упраж- Процедура нения Навыки, которыми следует овладеть № протокола
Основной кур/
1 Пилотирование и перенос жидкостей Знакомство с техникой. Точность и аккуратность мани- пуляций В упражнении
2 Введение в технику ведения культуры ткани Использование инвертированного микроскопа Оценка различий в морфплоши клеток внутри одной линии и мсжлинсиныс. Использование фотоаппарата и из- готовление рсфсрснс-фо гографий 16.1; 166
3 Асептический метод. приготовление питан-льной среды Асептические манипуляции Навыки в работе со сте- рильными веществами и флаконами без заражения. Внесение добавок в питательную среду 6.1.117
4 Смена среды в монослойной куль- туре Обследование культуры. Замена питательной среды 13.1
5 Мытье и стерилизация стеклянной посуды Знакомство со вспомогательными службами. Уяснение необходимости чистоты и нстоксичностистеклянных контейнеров И 1
В Подготовка и стерилизация воды Понимание значения чисготы и стерильности Приме- нение и ограничения. Стерилизация автоклавирова- 115
7 Приготовление и стерилизация фос- фатно-буферного раствора (PBS) Состав солевого раствора. Осмолярность. Забуфсрива- нис и контроль pH. Стерилизация термостабильных растворов автоклавированием 116
В При । о говлснис с 1 андарт ных растворов ДЛЯ КОНтрОЛЯ pH Знакомство с фенолом красным как индикатором pH 9 1
9 Приготовление основной питатель- ной среды и стерилизация методом фллыровання Техника фильтрации и сравнение различных методов И 11,11.12. 11.13; И 14
10 Приготовление полной среды или концентрата основной среды 10 х Асептические .манипуляции Состав среды. Контроль рн 11.8; 11.9
И Подсчет клеток в гемоцитометре и электронном счетчике Количественные навыки. Подсчет клеток и оценка жиз- неспособности. Сравнительная опенка достоинств двух методов 21.1; 21.2
12 Рост субкультуры клеток в суспензии Оценка ку 'тьтуры. Асептические манипуляции. Подсчет клеток и оценка жизнеспособности. Выбор концентра- ции для пересева 13.3
13 Рост субкультуры постоянной клеточ- ной линии в монослое Оценка культуры. Асептические манипуляции Методы дезагрегации клеток, в т.ч. метод тртшеинизации 13.2
14 Окрашивание монослойной клеточной культуры по Гимза Цитология клеток Фазово-контрастная микроскопия. Фиксация и окрашивание. Фотографирование 16 2,16.6
15 Построение и анализ кривой роста Репликативные культуры в многолуночных планшетах. Подсчет клеток. Выбор концентрации для пересева Упражнения повышенной с го ясности 21.8; 21.1,21.2
16 Характеристика клеточных линий Подтверждение идентичности клеточных линий 16.7 или 16.8 или 16.9 или 16.10
17 Обнаружение микоплазм Осознание важности скрининг а культур на присутствие микоп.<азм Опыт применения флюоресцентного ме- тода или ПЦР для постоянного скрининга клеточных линий на предмет микоплазматичсского заражения 19.2 или 19.3
18 К риоконс ервация к ультивируемых клеток Практика замораживания клеток, подготовка клеточных линий, ведение записей по использованию морозиль- ников, контроль состояния хранящихся культур 20 1;20.2
19 Первичная культура Происхождение и разнообразие клс точных культур. Ва- рианты мстодоло! ии получения первичной культуры 12.2; 12.6 или 12.7
20 Клонирование в монослос Техника клонирования методом серийных разведений. Определение эффективности посева. Клональное выделение 14 1.21.10, 14 6
38
ГЛАВА 2. ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ
Окончание табл. 2.1
Ns упраж- нения Процедура Навыки, которыми следует овладеть Ns протокола
21 22 23 24 25 26 27 Специализированные упражнения Клонирование в суспензии Техника клонирования методом серийных разведений суспензионной культуры. Виде ichiic суспензионных клонов Селективная среда Демонстрация селективного роста специфических кле- точных тиков Раздс. юние клеток Выделение клеточного типа с желаемым фенотипом одним из нескольких сепаративных методов Приготовление фидерных слоев Способы повышения эффективности культивирования. Селективный эффект фидерных слоев Гистотипичсская культура в фнльтро- Знакомство е культурами с высокой плотностью Изу- вальном колодце с вкладышами чснис возможностей дифференцировки, транспорта питательных веществ п инвазивных свойств Пес дсдовання цитотоксичности Знакомство с высокопроизводительными мс годами скри- нинга. Положительное и отрицательное действие Исследование выживаемости (может Использование клонального роста для обнаружения проводиться как компонент упраж- положительного и отрицательного действия на выжи- нения 20 или как отдельное упраж- васмость и пролиферативную активность клеток ненце) 14.4 или 14.5 14.8 23.1 или 23.2 15.1 или 15.2 14.3 25.4 22.4 22.3
делением на стерильные и нестерильные культуры
ткани. Описываются также необходимое пластиковое
оборудование, используемые реактивы с условиями
их хранения, в том числе ири комнатной температуре
либо в интервале от 4 °C до 20 °C. Инструктор должен
знать положение всех образцов: предельные сроки их
хранения, какие замены производятся, кою следует
информировать при истечении сроков хранения и как
производить перемещение образцов с тем, чтобы наи-
более старые использовались первыми.
Упражнение 1.
Асептический метод I:
Пипетирование и перенос жидкостей
Цель процедуры
Перенести жидкость быстро и аккуратно из одной
емкости в другую.
Навыки, которыми
следует овладеть
Навыки ручного пииетирования; повышение скорости,
точности и воспроизводимости пииетирования
Инструктирование и руководство: на первом эта-
не постоянные, затем оставить обучающегося пов-
торять упражнение с подробными записями.
Время: 30 мин— 1 ч.
Сведения общего характера
Манипуляции со стерильными жидкостями (см.
разд. 5.2.7); манипуляции с флаконами и бутылками
(см. разд. 6.3.4); пипетирование (см. разд. 6.3.5).
Демонстрационный материал или действия: инс-
труктор должен показать приемы ручного нипетиро-
вания, включая набирание жидкости в пипетку и пе-
ренос жидкости, сопровождать процесс замечаниями,
указывающими на необходимость компромисса между
скоростью работы и аккуратностью пииетирования.
Инструктор также должен продемонстрировать уда-
ление жидкости при помощи вакуумного насоса (если
он используется в лаборатории) и объяснить механизм
его действия и ограничения. накладываемые сообра-
жениями безопасности
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Перенести жидкость пинеткой из одного сосуда в
другой.
Стандартный протокол
Асептический метод пииетирования включает в себя
работу в вертикальном ламинарном потоке (см. про-
токол 6.1) или работу на открытом рабочем столе (см.
протокол 6.2). До начала выполнения полного прото-
кола полезно потренироваться в простых нестерильных
манипуляциях с пипеткой, включая перенос воды из
одной емкости в другую. Это позволит более близко
познакомиться с данной задачей до начала работы в
асептических условиях.
Экспериментальные варианты
процедуры
Цель упражнения повысить сноровку и качество
проведения манипуляции с пинетками и емкостями в
асептических условиях. Следующие дополнительные
шаш могут повысить интерес к работе и наблюдать за
гем, как обучащийся умеет.
2.2. Упражнения для начинающих
39
1. Предварительно взвесить флаконы, используемые
для приема жидкости:
а) добавить 5 мл в каждый из5 флаконов;
б) использовать 5-мл пипетку.
2. Использовать 25-мл пипетку.
3. Записать время, которое потребовалось для завер-
шения шшетирования.
4. Взвесить флаконы снова.
5 Инкубировать флаконы, с тем чтобы убедиться
в стерильности манипуляции и отсутствии зара-
жения.
Данные
1. Подсчитайте средний вес жидкости во флаконе.
2. Запишите распределение данных:
а) подсчитайте процент разброса величины объема
б) подсчитайте величину среднего и стандартного
отклонения:
— внесите значения в таблицу в Excel в сголбик;
поместите курсор в клетку ниже столбика
цифр;
нажмите стрелку справа от кнопки Е на
стандартной панели инструментов, выберите
опцию «средняя величина»;
— выделите столбик цифр, если он еще не
выделен, нажмите Enter. Это даст значение
средней величины ваших данных;
— поместите курсор в следующую клетку;
— нажмите стрелку справа от кнопки Е на
стандартной панели инструментов, выберите
«друг ие функции» и затем выберите опцию
«стандартное отклонен ие»;
выделите столбик цифр, если он еще не вы-
делен, нажмите Enter.
Вы получите значение стандартного отклонения
ваших данных, которое вы затем сможете посчитать
как процент значений, чтобы оценить точность прове-
денного пипетирования.
Анвлиз данных
1. Сравните результаты, полученные ори помощи
разных пипеток и объясните разницу:
а) в точности,
6) во времени работы.
2. Ког да будет уместнее использовать каждую из пи-
петок?
3. Что можно принять за приемлемый уровень ошибки
в точности пипетирования?
4. Что важнее: абсолютная точность или единооб-
разие?
Упражнение 2.
Введение в технику ведения
культуры ткани
Цель процедуры
Критический осмотр клеточных культур.
Области применения
Проверка консистенции клеточной культуры в ходе
стандартной процедуры хранения; оценка состояния
культуры до введения питательных веществ, выделения
субкультур или криоконсервации; анализ и оценка от-
вета культуры на создание новых или эксперименталь-
ных условий: определение явного заражения.
Навыки, которыми
следует овладеть
Более близкое знакомство с внешним видом культур
клеток разных видов и различной плотности; исполь-
зование цифровой или пленочной фотокамеры; выяв-
ление стерильной и зараженной, здоровой и нездоровой
культур; оценка фазы роста культуры.
Инструктирование и контроль: постоянные во
время наблюдения, периодические при работе с фото-
графиями.
Время: 30 мин.
Сведения общего характера
Морфология, фотографирование (см. разд. 16.4.5).
Демонстрационный материал и ш действия: фото-
графии, представляющие мо]х)мыогию различных типов
клеток, фазово-контрастная микроскопия, фиксирован-
ные и окрашенные клетки, иммуноокрашивание; типы
культуральных сосудов, пригодных для морфолог иче-
ских исследований, например чашки Петри (см.
рис. 8.3), пробирки с покровными стеклами, флаконы с
предметными стеклами и т.д. (см. рис. 16.3); цитоцент-
рифуга для суспензионной культуры (см. рис. 16.4).
Безопасность: нет специальных требований к бе-
зопасности.
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Исследовать и фотографировать разнообразные кле-
точные линии при различной плотности клеток.
Материвлы и оборудование
• Набор плашек или чашек Петри с культурами
клеток различной плотности, предпочтительно
нормальные и трансформированные варианты од-
ной клеточной линии (например, ЗТЗ и SV3T3 или
ВНК21-С13и BHK21-PyY) на разных фазах роста,
включая середину log-фазы (~50°п-й сливной рост с
явлениями митоза) и фазу сливного роста по всей
чашке (клетки образовали многослойную структуру
и образовали скопления, если они трансформирова-
ны). Если возможно, исследуется также суспензи-
онная культура с низкой и высокой концентрацией
клеток.
• Если возможно, включите в набор образцов конта-
минированные культуры (предпочтительно не на
чашках Петри во избежание риска расп|хгстраненпя
заражения) и нездоровые культуры, например слиш-
ком долго находящиеся без питательных веществ.
40
ГЛАВА 2. ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ
• Инвертированный микроскоп с фалово-контраст-
ными объективами 4х, 10х и 20х и конденсором.
• Автоматический фотоаппарат, предпочтительно
цифровой с монитором или пленочный фотоаппарат
с фот<юкуляром.
Стандартный протокол
1. Установите микроскоп и oTpetyniipytrre освещение
(см. протокол 16.1).
2. Принесите культуры из инкубатора. Лучше всего
за один раз брать небольшое число планшетов, чем
сразу вынимать из инкубатора на продолжительное
врем слишком много планшетов или чашек. Выбе-
рите пару, например одни и те же клетки с низкой и
высокой плотностью или нормальные и трансформи-
рованные варианты одного и того же вида клеток.
3. Исследуйте каждую культуру визуально, пытаясь
обнаружить мутность среды, падение pH или отде-
лившиеся от субстрата клетки. Также постирай гесь
выявить отклонения от монослой ной структуры с
формированием рельефа.
4. Исследуйте культуры при малом увеличении (объ-
ектив 4х) инвертированно! о микроскопа (фазовый
контраст), обращая внимание на степень клеточной
плотности и любые признаки межклеточного взаи-
модействия.
5. Исследуйте культуры при среднем (объектив 10х)
и большом (20х) увеличении, обращая внимание
на признаки здорового состояние культуры (см.
рис. 13.1), признаки скопления клеток в одном месте,
складкн монослоя или отслоение его от субстрата.
6 Отметьте признаки контаминации культуры.
7. Поищите митотические клетки и оцените прибли-
зительно частоту их встречаемости.
8. Сфотографируйте (см. протокол 16.6) и сделайте
записи для каждой культуры (клеточный тип, дата
последнего пассажа) и плотности клеток, а также
обо всем, что покажется вам интересным.
9. Верните культуры в инкубатор и повторите стан-
дартную процедуру с новыми планшетами.
Служебные протоколы: окрашивание (см. про-
токол 16.2, 16.3); цитоцентрифуt ирование (см. про-
токол 16.4); непрямая иммунофлюоресценция (см.
протокол 16.11).
Экспериментальные варианты процедуры
1. Определите различия в стадии роста, клеточной
плотности и морфошм ии культур
2. Оцените состояние здоровья культур.
3. Отметьте признаки контаминации.
4 Определи те готовность клеток к смене культ урильной
среды (см. разд. 13.6.2) или пересеву (см. разд. 13.7.1).
5. Выполните численную оценку клеточной плотности
путем вычисления площади, находящейся в поле
зрения при объективе 20х и подсчета количества
клеток в .ном ноле зрения. Следует использовать
самую простую цифровую камеру и монитор, в ко-
тором экран может быть покрыт чистой пленкой и
каждую клетку можно отметить точкой маркера.
6. Попытайтесь обнаруЖ!ггь и сосчитать клетки в ста-
дии митоза при этом большом увеличении.
Данные
Качественные
1. Запишите ваши наблюдения, касающиеся морфо-
логии, формы и структурирования всех культур
клеток
2. Отметьте все случаи заражения.
3. Подтвердите состояние здоровья культур и прочие
качественные признаки
Количественные
1. Запишите плотность клеток (кл./см1) для каждой
культуры.
2. Запишите значение митотического индекса для
каждой культуры.
Анализ
1. Оцените различия клеточной плотности.
2. Оцените различия митотических индексов.
3. Сравните характеристики нормальных клеток и
трансформированных культур при высокой и низ-
кой плотности культуры, попробуйте объяснить
различия.
Упражнение 3. Асептический метод II:
Приготовление питательной среды
Цель процедуры
Сохранить стерильность растворов в ходе манипуляций
с ними.
Навыки, которыми следует овладеть
Асептические маиинуляшш: тренировка навыков в ни-
велировании и других манипуляциях со стерильными
растворами
Инструктирование а контроль: постоянные.
Сведения общего характера
Тренировочные объекты (см. разд. 6.1); компоненты
асептического окружения (см. разд. 6.2); манипуляции
со стерильными объектами (см. разд. 6.3); работа в
ламинарном шкафу (см. разд. 6.4); визуально опреде-
ляемое микробное заражение (см. разд. 19.3.1).
Демонстрационные материалы или действия: не-
обходимо показать, как нужно обрабатывать рабочие
поверхности и предметы, вносимые в ламинарный
шкаф. Объяснить принципы ламинарного потока и
фильтрации воздушных частиц. Показать учащимся,
как открывать и закрывать пробки флаконов и бутылок
и как размещать пробку на рабочей поверхности. Про-
демонстрировать способы манипуляции с пинеткой,
включая удерживание ее в руке, забор жидкости без
соприкосновения пинетки с нестерильными объекта-
ми, способными за!рязнить переносимую жидкость,
асептический перенос пинетки в Apytyxi емкость и
2.2. Упражнения для начинающих
41
выпускание жидкости в бутыли и флаконы. Следуе!
сделать акцент на обработке ламинарною бокса и
уборке места под рабочей поверхностью.
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Внес гц необходимые добавки и питательные элементы
к основной среде (1х).
Стандартный протокол
Приготовление питательной среды для культивпрова
ния из основной среды (1х) (см. протокол 11.7).
Экспериментальные варианты
стандартного протокола
1. Разлить 50 мл среды в две стерильные бутылки.
2. Поместить одну из них при 4 °C.
3. Инкубировать другую бутылку в течение 1 недели
и проверить наличие признаков заражения (см.
разд. 19.3.1).
4. Использовать обе бутылки в упражнении 4.
Упражнение 4. Смена среды
в монослойной культуре
Цель процедуры
Заменить истощенную среду в монослойной культуре
на свежую.
Области применения
Используется для восполнения объема питательной
среды между пересадкой в быстро растущих культурах
или при замене одною вида среды на другой.
Навыки, которыми следует овладеть
Укрепление навыков асептических манипуляций.
Введение одною из основных принципов поддержания
культур клеток, заключающегося в замене и попол-
нении питательной среды в ходе цикла размножения
культуры. Обучить студентов обследовать культуру,
обнаруживать признаки истощения питательной сре-
ды, такие как клеточная плотность и или падение pH, а
также признаки заражения. Выявление опасности пере-
крестною заражения культур. Сравнение питательных
сред, предварительно инкубированных при комнатной
температуре и хранившихся в холодильнике.
Инструктирование и контроль: учащимся потребу-
ется совет при интерпретации признаков истощения
питательной среды и показ приемов удаления и заме-
щения питательной среды.
Время: 30 мин.
Сведения общего характера
Замещение питательной среды (см. разд. 13.6.2); мо-
ниторит заражения (см. разд. 19.4); перекрестное
заражение (см. разд. 19.5).
Демонстрационный материал или действия: уп-
ражнение требует- по крайней мере трех флаконов
постоянных клеточных линий т ипа HeLa или Vero,
доспи ших иолусливною роста, с указанием даты и
посевной дозы клеток. Учащимся следует показать,
как приносить среду из холодильника, при этом сле-
дует подчеркнуть, что для каждой клеточной линии
требуется специфическая среда (ее не следует делить
между учащимися или между клеточными линиями).
Продемонстрируйте также уборку и обработку рабо-
чей поверхности, ламинарною шкафа, использование
инкубатора, вынимание культуры из инкубатора и
возвращение ее на прежнее место, оценку состояния
культуры «на рлазок» и под микроскопом (свободу от
заражения, потребность в питательных веществах, со-
стояние здоровья культуры). Потребуется аспиратор с
насосом для удаления питательной среды или емкость
для слива истощенной питательной среды. Необходимо
показать приемы удаления старой питательной среды
и замещения ее свежей, включая использование атмос-
феры, содержащей 5?о-й СО,.
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Истощенная среда должна быть отобрана из клеточной
культуры, отправлена в емкость для слива и замещена
свежей средой.
Стандартный протокол
Смена среды в монослойной культуре (см. прото-
кол 13.1).
Дополнительные протоколы: itpiu отопление полной
питательной среды (см. протоколы 11.7, 11.8 пли 11.9
и упражнение 3); приготовление стандартов pH (см.
протокол 9.1); манипуляции с чашками и флаконами
(см. протокол 6.3)
Экспериментальные варианты процедуры
Флаконы с культурами, которые будут заполнены
охлажденной и предварительно инкубированной
питательными средами при выполнении этою упраж-
нения, следует использовать позже при демонстрации
подсчета клеток (см. упражнение 12), дру! не такие же
флаконы с культурами должны храниться без смены
среды. Трипсинизацию всех флаконов проводят од-
новременно.
Сведения общего характера
Полная среда (см. разд. 9.5); замещение питательной
среды (см. разд. 13.6.2).
Данные
Сравнить внешний вид и выход культуры (подсчет
клеток см. упражнение 12) из флаконов, которые полу-
чили питательную среду, хранившуюся в холодильнике
или инкубированную при комнатной температуре, и из
флаконов, в которых не заменяли питательную среду.
42
ГЛАВА 2. ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ
Стандартные действия должны записываться в
стандартные бланки для закисей (см. табл. 12.5); экс-
периментальные данные сводятся в таблицу в упраж-
нении 12.
Упражнение 5. Мытье и стерилизация
стеклянной посуды
Цель процедуры
Вымыть и иростерилизовать i ризную стеклянную
посуду.
Навыки, которыми следует овладеть
Совершенствование препаративных навыков; контроль
качества обработки проводимой вне асептической
Инструктирование и контроль: назначенный
сотрудник из штата персонала (препараторов н лабо-
рантов) должен продемонстрировать учащимся после-
довательность стандартных процедур.
Время: 20—30 мин следует уделять каждому этапу
занятия, однако в целом время, посвященное этому
упражнению, должно соответствовать степени участия
учащихся в процедуре мытья и стерилизации, что оп-
ределяется ею ее основным родом занятий и свободно
устанавливается преподавателем
Сведения общего характера
Моечная зона (см. разд. 4.5.2); мытье (см. разд. 5.4.1);
посудомоечная машина (см. разд. 5.4.11, рис. 5.21);
стерилизатор (см. разд. 5.4.4; рис. 5.18.18); мытье и
стерилизация оборудования (см. разд. 11.3).
Демонстрационный материал или действия: уча-
щимся следует показать все стадии приготовления,
мытья и стерилизации посуды и ио возможности при-
нять в них участие. Несколько раз посетите моечное
помещение, чтобы понаблюдать за всеми этапами.
Учащиеся должны увидеть в действии все работающее
необходимое оборудование, включая складывание в
моечную машину, контроль качества (QC) и соблю-
дение требований техники безопасности, а также не-
работающее оборудование, если будущие обязанности
будут включать мытье и стерилизацию.
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Сбор, ополаскивание, замачивание, мытье и стерили-
зация стеклянной иосуды и иниеток
Материалы и оборудование
Стандартные материалы и оборудование препаратив-
ной зоны (см. протокол 11.1 -11.3).
Стандартный протокол
1. Подготовка и стерилизация стеклянной иосуды (см.
протокол 11.1).
2. Подютовка и стерилизация иииеток (см. прото-
кол 11.2).
3. Подютовка и стерилизация заворачивающихся
крышек (см. протокол 11.23)
Дополните /ьные протоколы:стерилизация сложных
фильтров (см. протокол 11.4).
Данные
Учащиеся должны ближе ознакомиться с ведением
записей и пометок, таких как цифровые и графические
отметки на ретистрирующем выходном устройстве
печей и автоклавов.
Упражнение 6. Подготовка
и стерилизация воды
Цель процедуры
Обеспечение постоянною снабжения чистой стериль-
ной водой
Навыки, которыми следует овладеть
Совершенствование и развитие препаративных навы-
ков работы вне асептической зоны. Получение знаний
о значении обеспечения чистой стерильной водой и
знакомство с процессом ее получения.
Инструктирование и контроль: периодически.
Время: 30 мин.
Сведения общего характера
Приют овление и стерилизация сверхчистой воды
(UPW см. разд. 11.1.4; рис. 5.17: 11.10).
Демонстрационный материал или действия: под-
готовленный специалист должен изложить принципы
работы оборудования для получения сверхчистой воды
и продемонстрировать процедуру получения UPW,
сбора, бутилирования, стерилизации u QC. Участие
учащихся определяется свободным решением этою
специалиста или преподавателя
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Очистить воду, разлить ио бутылям и стерилизовать
автоклавированием.
Стандартный протокол
Прш отопление и стерилизация сверхчистой воды (см.
протокол 11.5).
Дополнительные протоколы: приготовление стек-
лянной иосуды (см. протокол 11.1).
Данные
Получение данных
Измеритель сопротивления или проводимости на
дистилляторе, датчик общею ортаническою углерода
(ТОС). Автоматический вывод данных из автоклава
2.2. Упражнения для начинающих
43
на печатающее устройство. Отметка о стерильности
на бутыли. Индикатор стерильности в центральной
бутыли.
Записи данных
Ознакомиться, научиться читать и делать записи в
pei истрашюнном журнале оборудования.
Анализ данных
Обзор pei истрационного журнала за периоды 1 неделя,
1 месяц и 3 месяца для определения общих тенденций
или различий в качестве воды или достижении сте-
рильности.
Упражнение 7.
Подготовка и стерилизация
фосфатно-буферного раствора для среды
Дюльбекко (D-PBS) без Са2+и Мд2*
Цель процедуры
Прш отовление изотонического солевого раствора для
использования в нормальных атмосферных условиях.
Области применения
Раствор для разведения концентратов, таких как
2,5%-й трипсин, предварительное ополаскивание при
триисинизации, отмывающий раствор при сборе кле-
точной массы или смене реагентов. Поскольку он не
содержит кальция, машия, бикарбоната натрия или
глюкозы, раствор не пригоден для продолжительной
инкубации клеток.
Навыки, которыми следует овладеть
Составление простого раствора солей, осмоляль-
ность. Буферные свойства раствора и доведение pH.
Стерилизация термостабильных растворов автокла-
вированием.
Инструктирование и контроль: в ходе приготовле-
ния раствора - постоянно; на этапе QC периодичес-
ки. В начале и завершении процедуры стерилизации и
интерпретации данных QC постоянно.
Вренн: 2 ч.
Вспомогательная информация
Сбалансированный солевой раствор (см. разд. 9.3;
табл. 9.2); использование буферных растворов (см.
разд. 9.2.3)
Демонстрируемые материалы и действия: ис-
пользование осмометра или прибора, измеряющего
проводимость растворов. Использование ав гоклава
или настольного стерилизатора под наблюдением
руководителя.
Вопросы безопасности:стерилизация паром связана
с риском ожо>а и риском взрыва (см. разд. 7.5.2; 7.5.7).
Простые настольные стерилизаторы мО|ут взрываться
при отсутствии пара, в связи с чем при отсутствии
автоматически о тем церату рно i о пред охран и тел я
существует пожароопасность.
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Растворение предварительно перемешанного порош-
ка или таблетки в U PW и стерилизация автоклави-
рованием.
Стандартный протокол
Приготовление D-PBSA (см. протокол 11.6).
Данные контроля качества
Получение данных
Измерение осмоляльности или проводимости и pH
после растворения компонентов.
Запись
Сделать подробную запись в регистрационный
журнал с указанием даты и номера серии.
Упражнение 8. Приготовление стандартных
растворов для контроля pH
Цель процедуры
Приготовить серию флаконов, аналошчных ис-
пользуемым в текущем исследовании лаборатории,
содержащих простую среду или солевые растворы с
феноловым красным. Отрегулировать pH до значений,
соответствующих диапазону pH, в норме имеющемуся
в культуре.
Области применения
Оценка pH в ходе приготовления среды и до смены
питательной среды или пересадки клеток.
Навыки, которыми следует овладеть
Более близкое знакомство с использованием феноло-
вого красного как индикатора pH. Стерилизация при
помощи шприцевого фильтра.
Инструктирование и контроль: в начале выполне-
ния операций — постоянно, позже - минимально.
Время: 2 ч.
Сведения общего характера
Физико-химические свойства, pH (см. разд. 9.2).
Демонстрационный материал и т действия: исполь-
зование рН-метра. Принцип действия, использование
и диапазон использования шприцевых фильтров (см.
рис. 11.12а, в).
Вопросы безопасности: до тех пор, пока для выпуск-
ного отверстия шприца не используются иглы, проблем
безопасности нет.
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Приготовление ряда сред с различными значениями pH.
44
ГЛАВА 2. ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ
Стандартный протокол
Приготовление стандартных растворов для контроля
pH (см. протокол 9.1 и цв. вкладку 226) с использо-
ванием 25-см2 флаконов. Стерилизация фильтрацией
с использованием шприцевых насадочных фильтров
(см. протокол 11.11).
Упражнение 9. Приготовление основной
питательной среды из порошка
и стерилизация методом фильтрования
Цель процедуры
Приготовить сложные растворы и стерилизовать тер-
молабильные реагенты и среды.
Навыки, которыми следует овладеть
Метод фильтрации и оценка диапазона возможностей
его использования. Сравнение способов фильтрации
под действием положительного и отрицательною
давления
Инструктирование и контроль: инструктирование
в ходе приготовления среды. Постоянно — при насадке
фильтра п при контроле качества фильтрации, перио-
дически - в процессе фильтрации.
Время: 2 ч.
Сведения общего характера
Приготовление среды из порошка (см. протокол 11.9);
стерилизация фильтрованием (см. разд. 11.5.2; про-
токол 11.12); альтернативные процедуры (см. прото-
кол 11.11.11.13.11.14).
Демонстрационный материал или действия: набор
имеющихся в распоряжении одиночных и сборных
фильтров, при отсутствии набора для ознакомления
можно использовать фото! рафии. Сделать акцент на
размерах фильтров (площадь поверхности) и фильтру-
емых объемах. Принципы действия и преимущества
недостатки фильтрации под действием положительно-
го и отрицательного давления (см. разд. 11.5.2). Проде-
монстрировать технические приемы при манипуляции
с фильтрами, фильтрации, сборе профильтрованных
образцов и QC.
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Растворение порошка в UPW, стерилизация филь-
трованием, фасовка и отбор пробы для QC-стериль-
ности
Стандартный протокол
1. Приготовление среды из порошка (см. прото-
кол 11.9).
2. Стерилизация 450 мл вакуумной фильтрацией (см.
протокол 11.12).
3. Стерилизация 550 мл фильтрацией при положи-
тельном давлении (см. протокол 11.13).
Дополнительные протоколы: ирш отопление ком-
мерческой среды (см. протокол 11.10); автоклавируе-
мые среды (см. разд. 11.5.1); стерилизационные фильт-
ры mhoi ократного использования (см. разд. 11.3.6);
стерилизация фильтрованием при помощи насадочных
шприцевых фильтров (см. протокол 11.11); стерилиза-
ция фильтрованием при помощи больших последова-
тельно расположенных фильтров (см. протокол 11.14);
сыворотка (см. разд. 11.5.3; протокол 11.15).
Экспериментальные варианты
процедуры
Разделите растворенную среду на две части, проста-
рилизуйте 550 мл фильтрацией при положительном
давлении (см. протокол 11.13) и 450 мл фильтрацией
при отрицательном давлении (см. протокол 11.12).
Сведения общего характера
СО, и бикарбонат (см. разд. 9.2.2); использование
буферных растворов (см. разд. 9.2.3); стандартные
протоколы стерилизации (см. разд. 11.5).
Данные
1. Определите и запишите значение pH до и сразу
после фильтрации.
2. Инкубируйте универсальные контейнеры или буты-
ли со средой при 37 °C в течение недели и проверьте
наличие загрязнения.
Анализ
1. Объясните различия в значениях pH между среда-
ми. профильтрованными с использованием поло-
жительного и отрицательного давления.
2. Определите, восстанавливается или сохраняется
измененным значение pH.
3. В каких случаях следует предпочитать тот или иной
тип фильтрации?
4. Какие фильтры вы используете:
а) для 5 мл чистого раствора?
б) для 10 л среды?
в) для 1 л сыворотки?
Упражнение 10. Приготовпение
полной среды
из концентрата 10х
Цель процедуры
Добавить нестабильные компоненты и добавки к ос-
новной среде для получения сложной среды, необхо-
димой для решения специфической задачи.
Области применения
Получение питательной ростовой среды, обеспечива-
ющей пролиферацию клеток растущей культуры; под-
держивающей среды, необходимой для поддержания
жизнеспособности клеток; или дифференциальной
среды в присутствии соответствующих индуцирующих
факторов.
2.2. Упражнения для начинающих
45
Навыки, которыми
следует овладеть
Дальнейшее приобретение опыта в асептических ма-
нипуляциях. Улучшение понимания роли питательной
среды и добавок. Стабильность компонентов. Контроль
pH при помощи бикарбоната натрия
Инструктирование и контроль: учащиеся, выпол-
нившие упражнение 6, нуждаются в минимальном
руководстве, но до выполнения упражнения нм требу-
ется разъяснение необходимости некоторых добавок и
компонентов среды.
Время: 30 мин.
Сведения общего характера
Среда (см. разд. 11.4.3; 11.4.4).
Демонстрационный материал или действия: набор
стандартов pH (см протокол 9.1). Набор емкостей,
пригодных для приготовления среды.
Безопасность:нет специальных проблем, связанных
с безопасностью, если только в среду не добавляются
токсичные вещества (например, холерный токсин
или цитотоксические препараты) или радиоактивные
компоненты.
Упражнение
Краткое изложение
процедуры
Стерильные компоненты или добавки вводятся в
предварительно стерилизованную основную среду,
чтобы приготовить полную среду, готовую к исполь-
зованию.
Стандартный протокол
Приготовление полной среды из концентрата 10х (см.
протокол 11.8). Преподавателем могут быть выбраны
один или все пункты протокола 11.8.
Дополнительные протоколы: коммерческие среды
(см. протокол 11.1(1); приготовление основной среды
из порошка и стерилизация методом фильтрации (см
протокол 11.9); приготовление стандартных растворов
для контроля pH (см. протокол 9.1).
Экспериментальные варианты
процедуры
Вентилируемые флаконы
1. Приготовьте среды в соответствии с протоко-
лом 11.8. А без HEPES.
2. Внесите иииеткои 10 мл среды в каждый из четырех
25-см2 флаконов.
3. Добавьте 20 мкл 1М HEPES в каждый из двух фла-
конов
4. Герметизируйте два флакона: один - содержащий
HEPES, один - нет. Ослабьте крышки на двух
дру| их.
5. Инкубируйте при 37 °C в течение ночи без С О,-ат-
мосферы.
Данные
Запишите значения pH и внесите в таблицу условия
инкубации.
Анвлиз
1. Определите pH и оцените различия.
2. Какие условия подходят для низкоу|леродной пи-
тательной среды?
3 Какое действие оказывает HEPES на стабильность
pH?
4. Ко । да вентиляция флакона может быть предпочти-
тельна?
Роль концентрации бикарбоната (см. разд. 9.2.2)
1 Исключите бикарбонат из стандартном процедуры
протокола 11.86 и добавьте различное количество
бикарбоната натрия следующим образом:
а) приготовьте и пометьте 5 аликвот 10 мл безби-
карбонатной среды в 25-см2 флаконах,
б) добавьте в различные флаконы 200 мкл, 250 мкл,
300 мкл, 350 мкл, 400 мкл 7,5%-го NaHCO.,.
2. Оставьте крышки слабозаверн у тыми (только caei ка
надетыми на резьбу) или используйте фильтрующие
крышки, поместите на 37 °C в С02-инкубатор.
3 Инкубируйте в течение ночи и сравните значение
pH со стандартом (см. протокол 9.1).
Данные
Запишите значения pH и внесите в таблицу в соответ-
ствии с объемом внесенного NaHCO ,.
Анализ
1) Объясните, что является причиной изменения
pH?
2) Подсчитайте конечную концентрацию бикарбоната
в каждом случае u определите оптимальное для
использования количество NaHCO3
3) Если ни одно из значений не оптимально, что сле-
дует сделать для достижения правильного pH?
Упражнение 11. Приготовление
полной среды из порошка
См. протокол 11.9.
Упражнение 12. Подсчет клеток
в гемоцитометре и электронном счетчике
Данное упражнение можно использовать ио-разному:
для работы как на гемоцитометре, так и на электрон-
ном счетчике. Кроме того, можно использовать его
для сравнительного изучения двух методов подсчета
клеток и оценки их эффективности. Для экономии
времени учащихся возможна комбинация с упраж-
нением 11. Так или иначе, поскольку приобретение
первоначальных навыков в подсчете клеток происходит
достаточно медленно, рекомендуется провести подсчет
46
ГЛАВА 2. ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ
клеток как отдельное самостоятельное упражнение с
использованием культур, выросших в ходе выполнения
предыдущих уи|>ажнений (например, упражнение 9),
и не использовать его как предварительный этап для
последующего упражнения. Комбинированное исполь-
зование обоих методов подсчета будет описано ниже.
Цель процедуры
Оценить концентрацию клеток в суспензии
Области применения
Стандартизация клеточной концен грации в повседнев-
но используемой субкультуре; анализ количественного
роста в эксперименте и клеточной продукции в ходе
анализа кривой роста и выхода клеток.
Навыки, которыми следует овладеть
Навыки количественной оценки культуры. Подсчет кле-
ток и оценка жизнеспособности. Оценка роде гвенных ха-
рактеристик гемоцитометра и электронного счетчика.
Инструктирование и контроль: требуются в ходе
подготовки и исследования образцов, а также подготов-
ке к работе обоих устройств. Подсчет клеток в образцах
может' производиться учащимися самостоятельно,
хотя им может потребоваться помощь при анализе
результатов.
Время: 45 мин.
Сведения общего характера
Подсчет клеток, гемоцитометр (см. разд. 21.1.1); элек-
тронный счетчик (см. разд. 21.1.2).
Демонстрационный материал или действия: кле-
точные культуры, используемые для подсчета, могут
быть получены в результате выполнения упражнения
9. Использование гемоцитометра и электронного
счетчика потребует демонстрации их работы с соот-
ветствующей инструкцией ио выполнению подсчетов
в конце работы. Следует также объяснить принципы
работы электронного счетчика.
Безопасность: при использовании человеческих
клеток манипуляции должны производиться в помеще-
ниях II класса микробиоло! ической биобезопасности.
Все пластиковое и стеклянное оборудование, включая
пластинки 1 емоцитометра и покровные стекла, после
использования необходимо поместить в дезинфициру-
ющий раствор. Ячейки для подсчета клеток и жидкости
при подсчете на электронном счетчике также следует
обработать дезинфектантом (см. разд. 7.8.5).
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Клеточный рост в суспензионной культуре или отде-
ленной от монослоя трипсином суспензии подсчиты-
вается непосредственно в оптической камере или после
разведения в D-PBSA на электронном счетчике. До под-
счета в гемоцитометре клетки можно предварительно
окрасить для определения жизнеспособности.
Стандартный протокол
Упражнение выполняют сначала на разведенной
клеточной суспензии с использованием электронного
счетчика (см. протокол 21.2), а затем подсчет ведут на
концентрированной клеточной суспензии с помощью
гемоци гометра (см. протокол 21.1), и, используя ту же
концентрированную клеточную суспензию, проводят
оценку жизнеспособности методом исключения noi иб-
ших клеток (см. протокол 22.1).
Дополнительные протоколы: окрашивание крис-
талл -виолетом (см. протокол 16.3); содержание ДНК
(см. разд. 16.6); микротитрационное исследование (см.
разд. 22.3.5).
Экспериментальные варианты процедуры
1. Повторите подсчет 5—10 раз с использованием ге-
моцитометра и электронного счетчика. Подсчитайте
среднее значение и стандартное отклонение (см.
уи|>ажнение 1).
2. Сравните культуры, получившие и не получившие
питание из упражнения 9.
Данные
Подсчет клеток, включая оценку жизнеспособности,
в пересчете на флакон, двумя методами.
Все детали ежедневного ведения культуры, включая
учет посевной дозы клеток на каждый флакон, должны
вноситься в pei истрационный журнал (см. табл. 13.7),
экспериментальные данные заносятся в отдельную
таблицу (табл. 2.2).
Анвлиз
1) Подсчитайте выход жизнеспособных клеток как от-
ношение количества клеток во флаконе к посевной
2) Оказывает ли среда влияние на выход клеток?
Упражнение 13. Рост субкультуры
клеток в суспензии
Цель процедуры
Уменьшить концентрацию клеточной культуры про-
порционально скорости роста, что позволит клеткам
пребывать в экспоненциальной фазе роста.
Области применения
Повседневная практика ведения культур, в т. ч. пере-
сев неприкрепленных клеток, таких как миеломл или
асцитные культуры; распространение культуры для
повышения производства клеток; отделение реплици-
рованной культуры для экспериментальных целей
Навыки, которыми следует овладеть
Знакомство с режимом роста клеточной культуры,
подсчет клеток и оценка жизнеспособности.
Инструктирование и контроль: требуется перво-
начальное руководство и объяснение принципов ра-
боты. Дальнейшие манипуляции просты и, поскольку
2.2. Упражнения для начинающих
47
Таблица 2.2. Запись результатов, полученных при выполнении упражнения 12 Подсчет клеток
Посевная доза клеток (кл./флакон) Гемоцитометрический или электронный подсчет ко- личества выросших клеток Разведение или выбороч- ная доля* Концентрация трипсини- зированной культуры или суспензии (кл_/мл ) Количество клеток в одном флаконе Выход клеток: Количество вы- росших клеток/ посевная доза
* Электронным счетчик разведение 50Х (например, 0,4 мл клеточной суспензии в 20 мл жидкости для разведения), для под-
счета используется 0,5 мл, для получения значения концентрации следует умножать на фактор 100. Объем образца для камеры
гсмоцигометра (усовершенствованный гсмоцигометр Neubauer) обычно составляет 1 мм3, поэтому умножение на фактор 1x10*
даст концентрацию кл мл.
в результате выполнения упражнения 10 учащиеся
освоили, но крайней мере, один из методов подсчета
клеток, дальнейшее руководство не иредно-патается.
за исключением периодического контроля за соблюде-
нием правил асептики.
Время: 30 мин.
Сведения общего характера
Размножение клеток в суспензии, субкультура суспен-
зионной культуры (см. разд. 13.7.4); жизнеспособность
(см. разд. 22.3.1).
Демонстрационный материал или действия: уча-
щимся потребуется две суспензионные культуры
разной фазы роста: одна на поздней log-фазе и одна
на плато, с указанием даты пересева и клеточной
концентрации. Следует показать, как определяют
жизнеспособность в гемоцитометре (см. разд. 21.1.1;
22.3. Г. протокол 22.1). Если руководитель предпочитает
работать с перемешиваемой а не статической культу-
рой. до начала выполнения упражнения ознакомьте
учащихся с работой мешалки и подготовкой флаконов
с перемешиваемой культурой.
Безопасность: при использовании человеческих
клеток производите манипуляции в боксах II класса
микробиоло1 ической биобезопасности. Все пластико-
вое и стеклянное оборудование после использования
необходимо помещать в дезинфицирующий раствор.
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Обратен клеточной суспензии отбирается из культуры,
подсчитывается количество клеток с использованием
гемоцитометра юти электронного счетчика, культура
разводится в питательной среде и пересевается.
Стандартный протокол
Субкультура в суспензии (см. протокол 13.3); жизне-
способность (см. протокол 22.1).
Дополнительные протоколы-, пропорциональное
увеличение клеток в суспензии (см. протокол 26.1).
Экспериментальные варианты процедуры
Сравнительное исследование субкультур, находящихся
на log-фазе и фазе ила го клеточного роста.
Теоретические предпосылки: концентрация клеток
в субкультуре (см. разд. 13.7.3).
Данные
Определите концентрацию клеток и жизнеспособность
в субкультурах, пересеянных с log фазы и фазы плато
клеточно! о роста через 72 ч после пересева. Форма
записи лучше все| о представлена в табл. 2.3 и может
быть переведена в электронный вид.
Анализ
1 Подсчитайте выход клеток, как описано в табл. 2.4.
2. Сравните выход из клеток, пересеянных из культур,
находящихся в разных фагах роста.
Упражнение 14. Рост субкультуры
постоянной клеточной пинии в моноспое
Цель процедуры
Размножение культуры путем переноса клеток в новый
культуральный сосуд. Упражнение может включать
разведение для пересева в сосуд такого же объема или
в больший сосуд, если иредиола|ается расширение
культуры.
Навыки, которыми следует овладеть
Оценка культуры: Это упражнение требует от учащихся
умения исследовать и оценивать состояние культуры.
Следует отметить общие признаки здоровья культуры,
наличие заражения, pH среды, плотность клеток
Асептические манипуляции: совершенствование
навыков, полученных при выполнении упражнений 5,
7 и «.
Субкультура или пересев: это упражнение знакомит
с принципом переноса культуры из одного флакона в
другой с разведением, соответствующим иредиола|ае-
мой скорости роста. Следует показать учащимся техни-
ку дезагрв! ирования клеточного моносзоя с использо-
ванием трипсина. Они должны знать приемы подсчета
клеток и оценки жизнеспособности, в ходе выполнения
упражнения от учащихся требуется умение определять
концентрации клеток и выбирать правильную концент-
рацию дли пересева с учетом представлений означении
плотности клеток в культуре. Предиола|ается совер-
шенствование навыков математических расчетов.
48
ГЛАВА 2. ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ
Таблица 2.3. Запись результатов, полученных при выполнении упражнения 13 Рост субкультуры клеток в суспензии
Образец Объем клеточ- ной сус- пензии во флаконе Под- клеток Разведе- ние или выбороч- ная доля* Концентрация во флаконе клеток/мл Жизнеспо- собность (отноше- ние кол-ва неокра- шенных клеток к общему) Коэффици- ент разве- дения для окраски на жизнеспо- собность Жизнеспо- собность клеток/мл Клеток/фла-
V с D CxD R F CxDxRxF CxDxRxFxV
Например, подсчет на элек ipOHHOM счет- чике без окраски на жизнеспособность 20 15 321 100 1 532 100 1 1 1 532 100 30642 000
Например, подсчет на гемоинтометрс с окраской на жиз- неспособность 20 76 10000 760 000 0,85 2 1 292 000 25 840 000
Инструктирование и контроль: поскольку учащи-
еся обладают достаточными навыками и асептических
техниках, постоянное руководство не требуется, однако
руководитель должен быть в ноле зрения учащихся,
чтобы они могли получить ответы на возникающие
вопросы.
Сведения общего характера
Стандартный протокол
Субкультура, критерии субкультуры (см. разд. 13.7.1:
рис. 13.2; 13.3; 13.4); кинетика роста и индекс разведе-
ния (см. разд. 13.7.2); концентрация клеток в субкуль-
туре (см. разд. 13.7.3; рис. 13.4); выбор культуральных
сосудов (см. разд. 13.7.3); СО, и бикарбонат (см.
разд. 9.2.2, табл. 9.1).
Экспериментальные варианты процедуры
1. Концентрация клеток в субкультуре (см.
разд. 13.7.3).
2. Кинетика роста (см. разд. 21.9.2).
3. Действие клеточной плотности (см. разд. 25.1.1).
Таблица 2.4. Анализ упражнения 13
Образец Посевная концент- рация (клеток/ флакон) Клеток/фла- кон в следую- щей субкуль- туре Выход: коли- чество выросших клеток/посевная доза
N CxDxVxRxF CxDxVxRxF N
Пример 200.000 30642 000 153.21
log-фазы
Клетки с фазы плато
Демонстрационные материалы
и операции
Покажите учащимся различные типы культуральных
сосудов (см. табл. 8.1; рис. 8.1 —8.8) и фотец рафии кле-
ток, здоровых (см. рис. 16.2, цв. вкладку 5.6), нездоровых
(см. рис. 13.1), зараженных (см. рис. 19 а—в) и имеющих
различную плотность (см. рис. 16.2; цв. вкладку 5.6).
Дайте подробные инструкции ио фазово-контрастной
микроскопии клеток. Требуется также демонстрация
приемов триисинизации (см. протокол 13.2).
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Клеточный МОНОС.ЮЙ разрушается действием трипсина,
разводится и пересевается.
Материалы и оборудование
См. материалы для стандартной субкультуры (см.
протокол 13.2).
Стандартный протокол
Субкультура монослоя (см. протокол 13.2).
Экспериментальные варианты
процедуры
В и. 11 протокола 13.2. возможны дополнения,
а) засейте шесть флаконов, посевная до.й 2х10’кл./ мл;
б) замените питательную среду в трех флаконах через
4 дня;
в) определите количество клеток через 7 дней в двух
флаконах, которые получили питание, и в двух, не
получивших свежей среды:
— удалите питательную среду,-
— отмойте клетки дважды 2 мл D-PBSA, полно-
стью удаляя его после отмывки;
— добавьте 1 мл трипсина в каждый флакон;
2.2. Упражнения для начинающих
49
Таблица 2.5. Запись данных упражнения 14
Образец Объем трипемната Результат подсчета клеток на гемоцитометре или электронном счетчике Разведение или выборочная доля Клеток/мл в трипсинате Клеток/флакон
Т С D CxD CxDxT
— инкубируйте 10 мин;
— добавьте 1 мл среды к трипсину и размешайте
клетки энер| ичным пипетированием;
— произведите подсчет клеток на гемонитометре
или на электронном счетчике;
— подсчитайте количество клеток в каждом фла-
коне, концентрацию кл. мл среды и кл..см2 во
время тринсинизации;
г) зафиксируйте и окрасьте клетки в остальных фла-
конах (см. протокол 16.2).
Замечание: пинетки следует использовать при
подсчете клеток из изолированных образцов, а не для
выделения клеток для субкультуры, если только не
используются специальные наконечники
Дополнительные протоколы: использование инвер-
тированного микроскопа (см. протокол 16.1); подсчет
клеток (см. протокол ы 21.1,21.2); при готовление среды
(см. протокол 11.7; 10.8; 10.9): окрашивание ио Гимза
(см. протокол 16.2)
Данные
1. Подсчет клеток в начале и в одном наборе флаконов
через 1 неделю.
2. Обследование и фотт рафирование окрашенных
флаконов культуры, полученной при выполнении
упражнения 13. Наилучший результат можно по-
лучить при исследовании клеточного слоя до его
высыхания.
Анализ
1 Подсчитай те кратность выхода (количество получен-
ных клеток .-количество посеянных клеток,табл. 2.6)
и объясните различия (см. разд. 18.5.2,21.9.3)
2. Требовалось ли для этих клеток промежуточное
питание?
3. Прокомментируйте различия в морфолО! ии клеток,
получивших и не получивших питание в ходе вы-
полнения упражнения 13.
Упражнение 15. Окрашивание
монослойной клеточной культуры
по Гимза
Цель процедуры
Окрашивание полихроматическим красителем тина
крас и тел я Гимза, выявляющим морфоло и ческие
характеристики фиксированных клеток и позволя-
ющий анализировать состояние и происхождение
клеток.
Области применения
Мониторин! морфоло! ии клеток, обычно в совокуп-
ности с фазово-контрастным исследованием, в ходе
стандартной процедуры пересева культур или в усло-
виях эксперимента. Изготовление препаратов клеток
длительно! о хранения для сравнительного анализа
их морфоло! ии. Идентификация клеточных типов,
присутствующих в первичной культуре.
Навыки, которыми следует овладеть
Следует подчеркнуть необходимость исследования
морфоло! ии клеток в ходе ведения культуры и при-
влечь внимание учащихся к морфоло! ии клетки.
Таблица 2.6. Анализ данных, полученных
в упражнении 14
Образец Посев- ная доза (клетки/ флакон) Количество полученных клеток/фла- Выход клеток полученные клетки /посев- ная доза
N CxDxT (см. последний столбик табл 2.5) CxDxT
Нс получившие питания 100 000
100 000
Получившие питание 100 000
100000
1 При тринсинизации жизнеспособность нс учитывается,
однако при отмывке культуры до грипсинизации следует
позаботиться о том, чтобы удалить большую часть не-
жизнеспособных клеток при манипуляциях с постоянной
клеточной линией. Тем нс менее необходимость отделения
нежизнеспособных клеток нс так велика, как в случае раннего
пересева или первичной культуры, когда жизнеспособность
необходимо брать в расчет (см pci истрационный лист, уп-
ражнение 20).
50
ГЛАВА 2. ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ
Инструктирование и контроль: минимальное.
Время: 30 мин.
Сведения общего характера
Морфолотя (см. разд. 16.4), окрашивание (см.
разд. 16.4.2).
Демонстрационный материал или действия: проде-
монстрируйте приготовление красителя и процедуру
окрашивания. В качестве Кримеров используйте пред-
варительно окрашенные препараты.
Безопасность: меры предосторожности при работе
с клетками человека аналот ичны мерам, описанным в
предыдущих упражнениях.
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Удаление среды, промывание клеточного монослоя
PBSA, фиксирование в этаноле, окрашивание краси-
телем Гимза.
Стандартный протокол
Окрашивание красителем Гимза (см. протокол 16.2).
Дополнительные протоколы: окрашивание крис-
талл-виоллетом (см. протокол 16.3); использование
инвертированного микроскопа (см. протокол 16.1);
цифровая фотш рафия микроскопируемого объекта
(см. протокол 16.6).
Экспериментальные варианты процедуры
1 Используйте флаконы с культурой, полученные
при выполнении упражнения 12, и сравните мор-
фоло! ню клеток из культур со сменой и без смены
среды.
2 . Сфотографируйте культуру до (фазово-контрастная
микроскопия) н после (нормальная микроскопия в
светлом поле) окрашивания.
Упражнение 16. Построение
и анализ кривой роста
Цель процедуры
Познакомиться с образцом возобновляемого роста
субкультуры; продемонстрировать кинетику роста на
стандартно используемой субкультуре и в качестве
аналитическою средства
Области применения
Кривые роста. Исследования клеточной пролифера-
ции; анализ цитотоксичности; исследования стимуля-
ции роста; испытание свойств сред и сывороток.
Навыки, которыми следует овладеть
Выделение экспериментальных репликативных куль-
тур. Подсчет клеток и жизнеспособность. Построение
и анализ кривой роста. Представление о различиях
между временем удвоения и достижением макси-
мальной плотности популяции. Выбор пересеваемой
концентрации.
Инструктирование и контроль: если учащиеся
успешно прошли упражнение 12, триисинизация куль-
туры и подсчет клеток не требуют инструктирования,
но при дальнейшей работе с пересевом на чашки необ-
ходимо некоторое руководство.
Время: 1 ч в день 0; 30 мин в день с 1 по 10 дни.
Сведения общего характера
Выбор культуральною сосуда (см. разд. 8.2); мани-
пуляции с кюветами и чашками (см. протокол 6.3);
репликация образцов (см. разд. 21.8); цикл роста
(см. разд. 21.9.2); микротитрационный анализ (см.
разд. 22.3.5).
Демонстрационный материал или действия: уча-
щимся следует показать разнообразные многолуноч-
ные планшеты (см. табл. 8.1 и рис. 8.2) и дать представ-
ление об их применении. Продемонстрируйте приемы
пересева культур на чашки с применением мер, предуп-
реждающих заражение культуры (см. разд. 6.5.1).
Безопасность: соблюдать меры предосторожности
при работе с человеческими клетками (см. упражне-
ние 10 и разд. 7.8), особенно при работе с открытыми
чашками и кюветами в связи с повышенным риском
разбрыз! ивания (см. разд. 6.6.2 и рис. 6.10).
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Существует два варианта выполнения этого упражне-
ния: построить простую кривую роста одной клеточной
линии с использованием флаконов, как при обычной
работе с субкультурой, и использовать многолуночные
планшеты для анализа различий в росте двух клеточных
линий при различной плотности клеток или каких-либо
иных различиях в условиях культивирования. Кле-
точный монослой трицсинизируется, подсчитывается
количество клеток, культура разводится в различных
средах и пересевается на необходимое количество куль-
туральных флаконов или многолуночных планшетов.
Стандартный протокол
Кривая роста (см. протокол 21.7 для построения кривой
роста во флаконах и определения условий стандартной
процедуры поддержания культуры и протокол 21.8
для работы с многолуночным планшетом при анализе
кинетики роста культур различной плотности и/или
сравнения двух различных клеточных линий).
Дополнительные протоколы: манипуляции с чаш-
ками или кюветами (см. протокол 6.3); МТТ-тест
цитотоксичности (см. протокол 22.4).
Экспериментальные варианты процедуры
Концентрация клеток при посеве
1. Посейте во флаконы постоянную клеточную линию:
быстрорастущую в дозе 2x10* кл. мл или медленно-
2.3. Упражнения повышенной сложности
51
растущую в дозе 1x10s кл./мл. Повторите посев для
оптимизации посевной концентрации.
2. Для удобства выполнения упражнения одна кле-
точная линия может быть посеяна в трех различных
концентрациях клеток в 12-луночный планшет
(каждая концентрация в трех рядах), одна лунка
в ряду используется для окрашивания клеток (см.
рис. 21.7а). Для исследовании фазы роста для
каждого из 10 дней следует косеять отдельные
планшеты.
Различия между нормальными и трансформирован-
ии чи к неточными линиями: в этом случае используйте
24-луночный планшет и посейте две клеточных линии
на каждый планшет (см. рис. 21.76).
Сведения общего характера
Цикл роста (см. разд. 21.9.2); объем, 1лубинд и площадь
поверхности (см. разд. 13.6.2); концентрация клеток в
субкультуре (см. разд. 13.7.3); фазы роста клеток (см.
разд. 21.9.6); продукты, образующиеся в цикле роста
(см. разд. 21.9.7); контактное ингибирование (см.
разд. 18.5.2); О1раничение роста клеточной популяции
плотностью клеток (см. протокол 18.3).
Данные
Подсчет клеток в ячейках каждый день.
Анализ
1 На основании количества клеток в лунке рассчитай-
те концентрацию клеток в лунках (кл./мл и кл ./см2)
и найдите для каждою дня исследования среднее
Значение и величину стандартной ошибки (стандарт-
ное отклонение, деленное на квадратный корень от
количества образцов). Постройте в логарифмичес-
кой шкале график зависимости количества клеток
от дня после посева культуры (см. рис. 21.6).
2. Определите время lag <]йс!ы, время удвоения массы
культуры и время достижения максимальной плот-
ности.
3. Какая концентрация клеток оптимальна для пере-
сева постоянно используемой субкультуры?
4. Оцените различия между нормальной и трансфор-
мированной клеточными линиями.
2. 3. УПРАЖНЕНИЯ ПОВЫШЕННОЙ
СЛОЖНОСТИ
Данные упражнения зависят от успеха в выполнении
упражнений основного курса, и не следует пытаться
выполнить их до того, как этот успех будет достшнут.
Несмотря на то что упражнения повышенной сложнос-
ти не входят в основной курс, навыки, отрабатываемые
в ходе их выполнения, имеют широкое приложение
и потребуются каждому, кто предполагает достичь
профессионализма в работе с клеточными культура-
ми. Однако, если время обучения ограничено, можно
отложить выполнение этих упражнении при условии,
что другие сотрудники лаборатории имеют опыт в
таких манипуляциях и вновь обученный сотрудник не
должен будет их выполнять. При этом следует учиты-
вать, что обучение не может считаться завершенным
и соответствующим общепринятым стандартам, если
учащийся не приобрел навыки, изучаемые в упражне-
ниях повышенной сложности.
Поскольку некоторые основные знания уже сумми-
рованы и обобщены в ходе выполнения упражнений
основного курса, вариации стандартных протоколов
этой части не будут представлены так же детально, как
прежде. Допускается большая степень собственного
планирования эксперимента, что будет полезной и
важной частью процесса обучения.
Упражнения основного курса представлены в той
последовательности, в которой они должны выпол-
няться, упражнения данного раздела не имеют такого
расположения и мотут быть выполнены учащимися
по очереди.
Упражнение 17. Криоконсервация
культивируемых клеток
Цель процедуры
Обеспечить сохранность клеточной линии, защищен-
ной от случайной i ибели, генетической или фенотипи-
ческой нестабильности.
Области применения
Хранение новых и постоянно пересеваемых клеточных
линий: создание и поддержание клеточного банка для
архивирования и распределения клеточных линий;
снабжение работающего клеточного банка в ходе реали-
зации научного проекта или программы исследований;
хранение и распространение митомицин С-обработан-
ных фидерных клеток.
Навыки, которыми следует овладеть
Знакомство с процедурой замораживания и размора-
живания клеток. Указания к возможным вариантам
улучшения процедуры для сложных клеточных ли-
ний. Сравнение оценки жизнеспособности клеток ко
высвобождению красителя с реальным выживанием
клеток.
Инструктирование и контроль: основные процеду-
ры, такие как триисинизация, подсчет клеток, добавка
криоконсерванта и заполнение ампул, не требуют ру-
ководства. Оно понадобится при определении расхода
жидкого азота в системе контроля расхода материаль-
н ых средств, при замораживании и переносе амиул и
помещении их в азот, а также при размораживании и
восстановлении клеток.
Время: 1 ч в 1-й день; 15 мин во 2-й день, 30 мин в
3-й день. 1 ч в 4-й день.
Сведения общего характера
Теоретическое обоснование замораживания (см.
разд. 20.1); скорость охлаждения, аппараты для за-
S2
ГЛАВА 2. ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ
мораживания, ведение записей при замораживании
(см. разд. 20.3.6.); генетическая нестабильность (см.
разд. 18.3); эволюция клеточных линий (см. разд. 3.8);
контроль физиолог ического старения (см. разд. 18.4.1);
периодическое замещение (см. разд. 20.4.2); банк кле-
точных линий (см. разд. 20.5).
Демонстрационный материал или действия: уча-
щимся следует показать тины ампул в процессе их
использования, оборудование для замораживания
(см. рис. 20.3; 20.4; 20.5) tt типы морозильников (см.
разд. 20.7). Учащиеся должны ознакомиться с исполь-
зованием и обслуживанием контрольных систем и
ведением записей ио учету клеточных линий.
Безопасность: меры безопасности при работе с
человеческими клетками те же. Существует риск
отморожения, асфиксии и взрыва при погружении
ампул в жидкий азот (см. разд. 7.5.6). Настоятельно
рекомендуется, в соответствии с целью этого упраж-
нения, не погружать ампулы в жидкий азот, а хранить
их в парах азота.
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Клетки при высокой концентрации в среде с криокон-
сервантом медленно охлаждаются, медленно заморажи-
ваются и помещаются в холодильник с жидким азотом
Затем им дают быстро оттаять и пересевают.
Сведения общего характера:
Стандартные протоком: замораживание клеток (см.
протокол 20.1); оттаивание замороженных клеток (см.
протокол 20.2).
Дополнительные протоколы: субкультура в монос-
лое (см. протокол 13.2); субкультура в суспензии (см.
протокол 13.3); подсчет клеток при помощи гемоцито-
метра (см. протокол 21.1); электронный счетчик клеток
(см. протокол 20.2); оценка жизнеспособности но тесту
высвобождения красителя (см. протокол 22.1).
Экспериментальные варианты процедуры
Имеется несколько вариантов эксперимента, которые
можно использовать при выполнении упражнения:
1. Сравните свойства ДМСО и глицерина как крио-
консервантов.
2. Сравните различные скорости замораживания.
3 Храните при комнатной температуре или при 4 °C
до замораживания.
4. Удалите криоконсервант методом замещения пи-
тательной среды на следующий день пли путем
центрифугирования после разморживания. При
выборе этого варианта процедуры затем следует
сравнить клетки суспензионной культуры (на-
пример, лимфомы L5178Y, гибридомы или HL60)
и монослойной культуры (например, HeLa, А549,
Vero или NRK).
5. Быстро или медленно разведите в растворе после
размораживания.
Приводимая схема включает сравнение свойств
ДМСО и 1 лицерина (1-й вариант) и сравнение резуль-
татов хранения при комнатной температуре или при
4 °C (3-й вариант) до замораживания (рис. 2.1).
Теоретические предпосылки: криопротекторы (см.
разд. 20.3.3).
Данные
1. Ежедневные записи ведите в соответствии со стан -
дартом регистрационных записей при заморажива-
нии материала (см. табл. 20.2; 20.3).
2. Оцените жизнеспособность клеток в осадке в каж-
дой ампуле после оттаивания.
3. Размороженную культуру необходимо триисини-
зировать и провести подсчет клеток в ней в тот же
день (только в ходе упражнения; эту процедуру не
производите в ходе повседневной работы).
4. Результаты занесите в таблицу, как при выполнении
упражнения 13 и 14. Посчет жизнеспособности кле-
ток проведите в день оттаивания для суспензионных
культур и на следующий день для монослойных
культур.
Анализ
1. Какой криоконсервант луч ше для культуры, исполь-
зованной при выполнении упражнения?
2. Cot ласуются ли результа гы сравнения оценки жиз-
неспособности клеток ио высвобождению красителя
с реальным выживанием клеток через 24 ч?
3. Является ли повреждающим фактором промедле-
ние при замораживании? Помогает ли выживанию
клеток охлаждение после добавление криоконсер-
ванта?
Упражнение 18. Обнаружение микоплазм
Цель процедуры
Подтвердить, что культура свободна от микоилазмати-
ческого заражения.
Области применения
Рутинное ведение клеточных линий; контроль качества
клеточных линий перед замораживанием; проверка
поступивших на исследование клеточных линий, тка-
ней и биопсийных образцов в ходе карантинных мер.
Навыки, которыми следует овладеть
Понимание важности отсутствия в культуре мнко-
плазматического загрязнения. Приобретение опыта в
скрининге клеточных линий на предмет' микоплазма-
тического заражения флюоресцентным методом или
ПЦР.
Инструктирование и контроль: пересев культуры
и инфицирование фидерною слоя не требуют руко-
водства, нет необходимости производить настоящее
заражение культуры микоплазмами, поскольку в этом
случае все процедуры должны проводиться в условиях
строгого инструктирования и постоянного контроля
2.3. Упражнения повышенной сложности
53
Рис. 2.1. Упражнение по замораживанию. Протокол эксперимента по сравнению криопротекторного действия DMSO и
ьтицерина с предварительным охлаждением при 4 °C и нос ie выдерживания при комнатной температуре
S4
ГЛАВА 2. ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ
с соблюдением карантинных мер. Периодическое
наблюдение и руководство потребуются при окра-
шивании образцов на микоплазмы и при экстракции
ДНК н проведении ПЦР,степеньруководсгвазависит
от опыта учащихся в проведении этих манипуляций.
Постоянное руководство необходимо при анализе по-
лученных результатов.
Время: 30 мин в течение 5 дней до пересева иссле-
дуемой культуры или замены питательной среды; 1 ч в
день пересева индикаторной культуры (день 0), 30 мин
в 1 -й день перенос среды из испытываемой культуры;
2 4 ч в 5-й день для окрашивания культуры на при-
сутствие микоплазмы или проведение ПЦР и 30 мин
в дальнейшем для оценки результатов.
Вспомогательная информация
Микоплазмы (см. разд. 19.3.2); валидация (проверка)
(см. разд. 7.10).
Сведения общего характера
Карантинные меры (см. разд. 19.1.8); использование
флюоресцентного микроскопа или ПЦР-исследова-
ние; предоставление фиксированной положительной
тест-культуры.
Безопасность: нет специальных требований к безо-
пасности, отличных от прежде описанных для работы
с человеческими клетками (см. разд. 7.8.3). Учащиеся
должны быть предупреждены о риске для здоровья
при рабочее источником УФ-света и риске, связанном
с извлечением источника света из флюоресцентною
микроскопа.
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Исследуемая культура получает питание на среде, не
содержащей антибиотик, в течение 5 дней, образец
культуры переносится в индикаторную клеточную
линию, в которой заведомо присутствуют микоплазмы.
Присутствие микоплазм регистрируется методом ПЦР
или флюоресцентной микроскопии.
Сведения общего характера
Стандартный протокол: выявление микоплазмы
методом флюоресценции (см. протокол 19.2) или оп-
ределение микоплазматического заражения методом
ПЦР (см. протокол 19.3).
Дополнительные протоколы: цифровая фотография
(см. разд. 16.4.5).
Экспериментальные варианты процедуры
Трудно дополнить это упражнение экспериментальны-
ми элементами, кроме варианта выявления потенциаль-
ного пути заражения инфицированной культуры. Ма-
ловероятно, что в какой-либо лаборатории возникнет
желание цодвер1аться опасности заражения микоплаз-
мами, если только не преследуются какие-либо особые
цели исследовании, оправдывающие этот риск.
Данные
1. Результаты оцените как положительные или отри-
цательные ко сравнению с фиксированным поло-
жительным контролем (флюоресценция) или ДНК
микоплазм (ПЦР).
2. Результаты всех исследований запишите в ре-
гистрационный журнал или в журнал ведения
культур.
Анализ
1. В микоилазма-положительных образцах при ок-
рашивании обнаруживаются точечные или ните-
видные образования в цитоплазме и на периферии
клетки.
2. Электрофорет ическая миграция ДНК при ПЦР мо-
жет быть исследована в сравнении с контрольными
образцами ДНК (см. рис. 19.2)
Упражнение 19. Характеристика
клеточных пиний
Наряду с детекцией микоплазматического заражения
(см. упражнение 18), умение провести характеристику
клеточной линии является одним из наиболее важных
навыков специалиста в области культивирования
клеток. Некоторые формы характеристики важны для
подтверждения идентичности используемой клеточ-
ной линии, однако выбираемые методы характерис-
тики определяются методоло! иен, принятой в данной
лаборатории. При использовании в лаборатории
ДНК-фингерцрннтин1а или исследования профиля
ДНК эти методы могут применяться и для описания
клеточной линии, если прежде было показано, что ис-
следуемый параметр служит характеристикой данной
линии. В противном случае для характеристики линии
потребуется более одного метода. Клеточные линии,
постоянно используемые в работе, мо1ут иметь специ-
фические мониторинговые характеристики, например
экспрессия отдельных рецепторов, экспрессия специ-
фических продуктов, устойчивость к лекарственному
препарату. Возможно, для характеристики потребуется
добавить еще один параметр, например хромосомный
или изоферментный анализ. Если ДНК-фингеририн-
тин1 или исследование профиля не используется в
лаборатории, то маловероятно, что кто-либо начнет раз-
вивать эти методы только для приобретения навыков
учащимися. Скорее всего, клетки будут посланы для
идентификации в коммерческую лабораторию, име-
ющую широкие возможности для проведения допол-
нительных исследований, в том числе для сравнения с
референс -материалом. Однако, исходя из соображений
целесообразности, в тренировочную пршрамму вклю-
чено упражнение по характеристике клеточной линии,
для того чтобы убедить учащихся в важности прове-
дения аутентификации клеточных линий, имея в виду
широкую распространенность неверно идентифициро-
ванных клеточных линий и возможные последствия,
связанные с этим (см. разд. 16.3; 19.5; 20.2).
2.3. Упражнения повышенной сложности
55
Для проведения эксперимента и данном упраж-
нении иредла! ается использовать изоферментный
электрофорез, который ла ко осуществим при помощи
коммерческих наборов и достаточно дешев.
Цель процедуры
Подтвердить идентичность клеточной линии.
Области применения
Проверка наличия случайною перекрестною зараже-
ния клеточных линий; контроль качества клеточных
линий до замораживания и/нли до начала реализации
проекта или программы исследований; подтверждение
идентичности поступивших Клеточных линий.
Навыки, которыми следует овладеть
Подтверждение идентичности клеточной линии. Раз-
витие понимания роли избыточною роста культуры,
неправильной идентификации и перекрестной конта-
минации.
Инструктирование и контроль: прш отопление об-
разцов и проведение электрофореза потребуют наблю-
дения и помощи со стороны руководителя, возможно
не постоянною.
Время: 2 ч.
Сведения общего характера
Необходимость характеристики клеточных линий
(см. разд. 16.1); морфология (см. разд. 16.4); и.юфер
менты (см. разд. 16.8.1); хромосомный состав (см.
разд. 16.5); ДНК-фин1ерпринтин1 и исследование
профиля (см. разд. 16.6.2; 16.6.3); антигенные маркеры
(см. разд. 16.9); аутентификация (см. разд. 16.3).
Демонстрационный материал или действия: ис-
пользование аппарата для электрофореза Autlieniikil™
(см. рис. 16.12); примеры ДНК-фингерпринтпша
и или исследования профиля (см. рис. 16.9; 16.11);
примеры кариотипов (см. рис. 16.6; 16.8).
Безопасность: нет дополнительных требований
к мерам безопасности, помимо описанных выше для
работы с человеческими клетками. При использовании
ДНК-фингериринтиша требуется соблюдение мер
осторожности при работе с радиоактивно меченными
материалами (см. разд. 7.7).
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Подютовка экстракта клеток, проведение электро-
фореза на а1арозном геле; проведение окрашивания
хромогенными субстратами.
Стандартный протокол
Изоферментный анализ (см. протокол 16.10)
Вспомогательные протоколы: приготовление пре-
парата хромосом (см. протокол 16.7); мультилокусный
ДНК-фингерпринтинг (см. протокол 16.8); исследо-
вания профиля ДНК (см. протокол 16.9); непрямая
иммунофлюоресценцня (см. протокол 16.11).
Экспериментальные варианты процедуры
Исследуйте шесть различных клеточных линий, вы-
бранных из доступною лаборатории набора или из
следующею списка: HeLa; КВ или Hep-2; Veto; L929;
ЗТЗили ЗТ6; ВНК-21-С13; СНО-К1. Большинство
клеточных линий из различных источников можно
определить с помощью четырех изоферментов: нуклео-
зидфосфорилазы, i люкозо-6-фосфат-де« идрогеназы,
лактатдегидрогеназы и малатде! идрогеназы.
Сведения общего характера
Изоферменты (см. разд. 16.8.1,16.8.2 и обзоры [Hay el
al.. 2000: Slube et al.. 1995])
Данные
После окрашивания геля хромогенными субстратами
проведите фотографирование или сканирование. Гели
можно сохранить.
Анализ
1. Сравните результаты, полученные с использова-
нием каждою фермента для разных клеточных
линий
2. Объясните значение того, что в культурах КВ или
Нер-2 имеется тот же изофермент (глюкозо-6-фос-
фат-де1 идрогеназа), что и в HeLa.
3. Как повысить разрешение между клеточными ли-
ниями?
Упражнение 20. Первичнвя культура
Цель процедуры
Выделить клетки из тканей ор1анизма для создания
клеточной культуры.
Области применения
Создание клеточной культуры для производства вак-
цин; выделение специализированных клеточных типов
для исследований; хромосомный анализ; разработка
селективных сред; создание короткоживущих клеточ-
ных линий для тканевой инженерии.
Навыки, которыми следует овладеть
Понимание происхождения и разнообразия культи-
вируемых клеток. Оценка различий в методолоти
получения первичных культур.
Инструктирование и контроль: периодическое.
Время: 2 4 ч в день 0; 1 ч в день 1; 2 ч в день 3
Сведения общего характера
Первичная культура (см. гл. 12)
Демонстрационный материал или действия: ткани
куриного эмбриона (или альтернативные источники
тканей).
56
ГЛАВА 2. ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ
Беляааюапк при использовании тканей куриного
эмбриона минимальные требования к мерам безопас-
ности.
Упражнение
Куриный эмбрион выбран для этого упражнения но
ряду причин. Его ткани практически готовы к куль-
тивированию с минимальной предварительной подго-
товкой животного. Эмбрион может быть препарирован
без каких-либо ограничений, если он находится на
половинном сроке эмбрионального развития. Полный
срок составляет 21 день, потому 10-дневный эмбрион
пригоден для использования, если он достаточно мал
ио размеру. Куриный эмбрион крупнее, чем мышиный,
на згой стадии развития, поэтому можно получить
больший выход клеток из целого измельченного эмб-
риона или его изолированных органов.
Краткое изложение процедуры
Эмбрионы извлекаются из яйца и иссекаются с полу-
чением первичного эксплантата. Выделяются дезагре-
ированные клеточные культуры
Стандартный протокол
1. Выделите эмбрионы из оплодотворенных яиц (см.
протокол 12.2).
2. Размельчите один эмбрион в теплом растворе трип-
сина (см. протокол 12.5).
3 Размельчите один эмбрион таких же размеров в
холодном растворе трипсина (см. протокол 12.6)
4. Иссеките третий эмбрион и выделите отдельные
органы, например мозг, печень, сердце, кишечник,
мышечное волокно. Размельчите каждый орган
отдельно методом холодной тринсинизации (см.
протокол 12.7).
5. Соберите некоторые из оставшихся после выпол-
нения 4-(Оша|а тканей и получите первичные
эксплантаты (см. протокол 12.4).
Вспимогате.пмые протоколы: дезатрегация в раст-
воре коллагеназы (см. протокол 12.8); механическое
измельчение на ситах (см. протокол 12.9); обогащение
жизнеспособных клеток (см. протокол 12.10)
Экспериментальные варианты процедуры
1 Клетки, изолированные из различных тканей
2 . Восстановление после теплой и холодной трииси-
низаиии.
Сведения общего характера
Ферментативная дезагре! ация (см. разд. 12.3.2); трии-
синизация после предварительной экспозиции на
холоде (см. разд. 12.3.4).
Данные
1. Исследуйте культуры, полученные из остатков
органов, через 3—5 дней роста и отметьте морфоло-
гические особенности и признаки сократительной
способности в клетках сердечной мышцы.
2. Подсчитайте количество клеток, полученных мето-
дом холодной и теплой тринсинизации, и оцените
их жизнеспособность методом окрашивания
3. Три исинизируй ге и изучите культуры, полученные
методом холодной и теплой тринсинизации. через
3 дня после посева.
4. Запишите полученные данные в решстрацион-
ный журнал, как для первичной культуры (см.
табл. 12.2).
Анализ
1. Постарайтесь идентифицировать различные кле-
точные типы, представленные в первичных куль-
турах. полученных из остатков органов.
2. Как бы вы размножили эти культуры, чтобы сохра-
нить специфические клеточные типы?
3. Произведите расчеты и занесите в таблицу общее
количество клеток на один эмбрион и на грамм, ко-
личество жизнеспособных клеток на один эмбрион
и на один грамм.
4. Исходя из количества клеток, полученных в первой
субкультуре (3 дня после посева), высчитайте выход
клеток на эмбрион, а также в отношении к общему
количеству посеянных клеток и количеству жизне-
способных посеянных клеток.
5. Является ли оценка жизнеспособности методом
высвобождения красителя надежным upoi ности-
ческим признаком восстановления культуры?
Упражнение 21. Клонирование
в монослое
Цель процедуры
Развести клетки так, чтобы они росли как изолирован-
ные колонии, полученные из единичных клеток.
Области применения
Выделение генотипических или фенотипических ва-
риантов; исследование выживаемости; исследования
роста.
Навыки, которыми следует овладеть
Введение в технику Клонирования клеток методом
разведения. Определение эффективности посева как
параметра роста или выживаемости клеток. Клональ-
ное выделение определенных клеточных типов.
Инструктирование и контроль: первичное руковод-
ство только в день 0, в последующие дни (с 10-го но
14-и) только помощь в идентификации клонов.
Время: 1 ч.
Сведения общего характера
Клонирование (см. протокол 14.1-14.4); определение
эффективности посева (см. разд. 21.10).
Демонстрационный материал или действия: пре-
дыдущее клонирование и окрашенные культуры; ва-
2.4. Специализированные упражнения
57
рианты клонирования, например, в чашках Петри или
на микроти грационных планшетах.
Безопасность: минимальные меры безопасности
при использовании нечеловеческих клеточных линий,
таких как СНО-К1. Использование тормозящего рост
фидерною слоя потребует привлечения внимания
учащихся к токсичности митомицина С или риска
радиоактивного излучения, в зависимости от вида
фидерных клеток
Упражнение
Краткое изложение процедуры
Монослойная культура тринсинизируется в середине
поздней логарифмической фазы, клетки проходят
серийное разведение. Посев производится в низких
концентрациях на чашки Петри или на микротитра-
ционные планшеты.
Стандартный протокол
Для выполнения простого упражнения на клеточной
линии: использование клонирования методом разве-
дения (см. протокол 14.1). Для усложненного вари-
анта упражнения: использование клеточной линии с
неизвестной эффективностью посева. Определение
эффективности посева (см. протокол 21.10).
Дополнительные протоколы: приготовление конди-
ционированной среды (см. протокол 14.2); приготовле-
ние фидерного слоя (см. протокол 14.3); клонирование
в aiape (см. протокол 14.4); клонирование в метилцел-
люлозе (см. протокол 14.5): клоногенное исследование
(см. протокол 22.3)
Экспериментальные варианты процедуры
1. Посевные концентрации: иосев 10, 20, 50, 100,
200 кл./мл (см. протокол 21.10)
2. Концентрация сыворотки: посев в различной
концентрации сыворотки от 0 до 20*о. Это также
хороший способ проверки качества сыворотки (см.
протокол 14.10. Разведите клетки в бессывороточ-
ной среде до концент рации 1000 кл. мл и разведите
200 мкл до 20 мл (1:100), что дает концентрацию
10 кл. мл в отдельном объеме, содержащем соответ-
ствующую концентрацию сыворотки (например, 0,
0,5,0,2,1,0,2,0,5,10,20,50 мкт мл).
3. Цитотоксичность: простое дополнение к упражне-
нию состоит в добавлении цитотоксического вещества
к клеткам на 24 ч до начала клонирования (см. прото-
кол 22.3). При использовании митомицина С полезно
предварительно подготовить фидерный слой (см.
протокол 14.3). Можно использовать экспоненци-
альный диапазон концен граций между 1 и 50 мю мл,
например 0,0,1,0,2,0,5,1,0,2,0,5,10,20,50 мкс/мл.
4. Фидерный слой, повторите п. 1) в присутствии и без
фидерного слоя (см. протокол 14.3).
5. Выделение клонов клеток: выделите и сравните мор-
фоло| ию клонированных штаммов.
Сведения общего характера
Клонирование клеток (см. разд. 14.1); выделение кло-
нов (см. разд. 14.6, 14.7,14.8); эффект ивность посева
(см. разд. 21.10); выживаемость (см. разд. 22.3.2).
Данные
1. После того как колонии на чашках станут видны
невооруженным глазом, окрасьте их кристалл-вио-
летом (см. протокол 16.3).
2. Подсчитайте количество колоний на чашках.
Анализ
1 Подсчитайте эффективность посева (отношение
количества образовавшихся колоний к количеству
посеянных клеток X100) (см. протокол 21.10).
2. Если концентрация клеток варьирует', построите
рафик зависимости количества колоний на чашке
от количества посеянных клеток (см. протокол
21.10). Должна быть линейная зависимость.
3. Если варьирует концентрация сыворотки, построй-
те трафик зависимости эффективности посева от
концентрации сыворотки (см. разд. 11.6.3).
а) Почему это хороший тест для проверки качества
сыворотки?
б) Как бы вы mdi.'iii сравнить различные партии
сыворотки?
4. Если использовалось цитотоксическое вещество,
вычислите отношение количества колоний на
чашку при каждой концентрации препарата к ко-
личеству колоний на чашке в контроле. Это даст
показатель выживания, который следует построить
в ло1 арифмических координатах против логарифма
концентрации препарата. Можно построить также в
линейных координатах при более узком диапазоне
размаха концентрации.
2.4. СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ
УПРАЖНЕНИЯ
Допускается, что успешное выполнение специализи-
рованных упражнений (21-27) приведет к формирова-
нию специфических навыков и представлений и будут
выбраны соответствующие протоколы. Параметры
вариабельности определяются в соответствии с целями
обучения, поэтому эти упражнения не детализированы.
Подразумевается также, что студент/обучающийся
приобретает достаточно навыков, чтобы спланировать
и провести свой собственный эксперимент. Они вклю-
чены в табл. 2.1, однако предполагается, что учащиеся
имеют достаточно большой интерес к работе, чтобы
расширить программу обучения и достичь более вы-
сокого профессионального уровня.
Глава 3
БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК
3.1. ВЛИЯНИЕ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
НА КУЛЬТУРУ КЛЕТОК
Достоверность и приемлемость использования культи-
вируемых клеток в качестве модеди для исследования
физиоло! ических функций in vivo постоянно крити-
куется. Часто клетки в культуре не проявляют топ»
фенотипа, который они имеют in vivo, поскольку их
микроокружение изменено. В результате недостатка
клеточной гетерогенности и трехмерной архитектуры
тканей, характерной для клеток in vivo, в культуре
редуцированы межклеточные и клеточно-матрикс-
ные взаимодействия. Отсутствуют mhoiне гормо-
нальные п питательные стимулы. Все это создает то
окружение, которое в большей степени благоприятно
для распространения, мш рации и пролиферации
неспециализированных клеток-цредшественн цков,
чем для проявления функциональных свойств диф-
ференцированных клеток. Влияние окружения на
культуру осуществляется но четырем направлениям:
1) природа субстрата, на котором или в котором про-
исходит рост культуры, плотная, такая как пластик
или иная жесткая структура, полужидкая, например
гель (коллаген или агар), или жидкая, как в случае сус-
пензионной культуры; 2) степень контакта с дру< ими
клетками; 3) физико-химический и физиоло! ический
состав среды; 4) состав гезовой фазы ц 5) температура
инкубации. Обеспечение соответствующего окру-
жения, включая адгезию к субстрату, концентрация
питательных веществ, i ормонов или факторов роста,
а также межклеточное взаимодействие являются
основонолатающнмц условиями проявления специа-
лизированных функций клеток (см. разд. 17.1, 17.7 и
Alberts et al., 2002).
3.2. КЛЕТОЧНАЯ АДГЕЗИЯ
Большинство клеток из плотных тканей растут как
прикрепленный монослой, если только не происходит
трансформации, в результате которой они мотут при-
обрести независимость от субстрата (см. разд. 18.5.1);
после дезасрегеции тканей или субкультуры они нуж-
даются в том, чтобы прикрепиться и распластаться по
субстрату до начала деления (см. разд. 13.7, 21.9.2).
Первоначально было обнаружено, что клеткам необ-
ходимо прикрепиться и распластаться на стекле, име-
ющем небольшой отрицательный заряд. Впоследствии
было показано, что клетки мо»ут прикрепляться также
к пластику, такому как полистирол, предварительно
обработанному антистатиком или высокоэнергети-
ческой ионизирующей радиацией. Теперь мы знаем,
что клеточная адгезия опосредована специфическими
поверхностно-клеточными рецепторами для молекул
во внеклеточном матриксе (см. также разд. 8.4,17.7.3),
и, ио-видимому, распластыванию клетки но субстрату
предшествует секреция клетками матрикса внеклеточ-
ных белков н иротео1ликанов. Матрикс адгезирует на
заряженном субстрате, и затем клетки связываются с
матриксом с использованием специфических рецеп-
торов. Следовательно, пластик или стекло, которые
использовались для культивирования клеток, mo-
ot обеспечивать лучшую поверхностную адгезию.
Предварительная обработка субстрата веществами,
входящими в состав клеточного матрикса, такими как
фибронектин или коллаген, либо производными, та-
кими как желатин, может способствовать росту более
требовательных клеточных культур.
Использование фибробластиодобных клеток явля-
ется 1 данным требованием прикрепления к субстрату и
распластывания, а также миграции отдельных клеток
при низкой плотности суспензии. Для адгезии, выжи-
вания и роста культуры эпителиальных клеток может
также потребоваться наличие межклеточных контак-
тов, поэтому они склонны формировать островки.
3.2.1. Молекулы клеточной адгезии
Показано, что в процессах межклеточной п клеточно-
матриксной адгезии участвуют три iданных класса
трансмембранных белков (рис. 3.1). Са2*-Независи-
мые молекулы межклеточной адгезии (cell adhesion
molecules, САМ) н Са2*-.1ависимые кадгерины пре-
имущественно вовлечены во взаимодействие между
гомологичными клетками. Две идентичные моле-
кулы такого белка взаимодействуют дру1 с другом;
в результате этого взаимодействуют дру1 с другом
1 омоло! очные молекулы располагающихся напротив
дру1 друге клеток [Rosenman & Calat in, 1991; Alberts
et al., 2002J, вследствие чего происходит межкк-
точное распознавание, играющее стнальную роль
в поведении клеток [Cavallaro & Christofori, 2004J.
Клеточно-субстратное взаи содействие опосредовано
3.2. Клеточная адгезия
59
CAMS
сигнальным доменом и вариабельным рецепторы без сигнального домена,
внеклеточным доменом, связывающим связывающие протеогликаны матрикса,
фибронектин, витронктин, ламинин, коллаген и факторы роста
коллаген
Рис. 3.1. Клеточная адгезия. Схематическое изображение е чосв эпителиальных клеток над соединительной тканью, содержащей
фиброцшы и отделенной базальной мембраной. Молекулы клеточной адгезии (CAMs) и кадгерины изображены между одина-
ковыми клетками, мнтегрмны и протеогликаны между слоем эпителиальных клеток и матриксом базальной пластинки
преимущественно интегринами рецепторами для
молекул матрикса, таких как фибронектин, энтактин,
ламинин и коллаген. Интегрины связываются с ними
через специфические повторы аминокислот, обычно
содержащие последовательность аргинин-1лицин-
acnapai иновая кислота (RGD) [ Yamada & Geiger,
1997]. Каждый интегрин включает в себя одну а- и
одну Р-субъединицу, внеклеточные домены которых
обладают высокой степенью полиморфизма, что обус-
ловливает значительное разнообразие инте| ринов.
Как интегрины, так и кадгерины взаимодействуют с
винкулином, что является звеном передачи сигнала в
клеточное ядро [Baculitsa et al., 2004].
Третью группу молекул клеточной адгезии со-
ставляют трансмембранные протеог-шканы, также
взаимодействукщдее с компонентами матрикса, такими
как дру| ие нротео|ликаны и коллаген, но не взаимо-
действующие с RGD-иовторами. Некоторые трансмем-
бранные и растворимые протеогликаны действуют как
низкоаффинные рецепторы факторов роста [Subrama-
nian el al., 1977; Yevdokimova & Freshney, 1997] и moi уч
стабилизировать, активировать и или перемещать фак-
торы роста к высокоаффинным рецепторам, участвуя
в их димеризации [Schlessinger el al., 1995].
Дезагре! ация ткани или отделение от субстрата мо-
нослойной культуры иод действием протеазы приведет
к расщеплению некоторых компонентов внеклеточного
матрикса и может даже способствовать де|радации
некоторых внеклеточных доменов трансмембранных
белков, приводя к разобщению клеток. Эпителиальные
клетки в целом более устойчивы к дезагрегации, по-
скольку пни сююнны к образованию плотных межкле-
точных соединений (десмосом, ал езивных соединений
и плитных контактов), удерживающих их вместе, в то
время как мезенхимальные клетки больше нуждаются
в клеточно-матриксных взаимодействиях для осущест-
вления межклеточного связывания, а поэтому ле| че
разобщаются. Эндотелиальные клетки могут образо-
вывать плотные соединения в культуре, особенно при
культивировании на иреформированном матриксе в
течение продолжительною времени, и диссоциация
клеток затруднена.
В любом случае, до того как начнется ipuKpei гление
и распластывание клеток, они должны синтезировать
матричные белки либо должны иметь возможность
использования субстрата, покрытого матриксом.
3.2.2. Межклеточные контакты
В то время как некоторые молекулы клеточной aai езии
диффузно распределены на плазматической мембране,
дру। ие организованы в межклеточные контакты. Роль
контактов различна. Механическую роль hi рают такие
контакты, как десмосомы и адгезивные соединения,
удерживающие вместе эпителиальные клетки, а так-
же плитные контакты, заполняющие пространство,
например между клетками ацинуса или притока либо
между эндотелиальными клетками сосудов. Плотные
контакты позволяют ионам, питательным веществам и
небольшим сш нальным молекулам (таким как моле-
кулы циклического АМФ. цАМФ) [см. Alberts el al.,
2002] проникать в клетки. Хотя десмосомы moi ут быть
распределены но всей области цитоплазматической
мембраны, имеющей контакты с дру ими клетками
(рис. 3.2а), они части ассоциированы с плотными кон-
тактами и адгезивными соединениями на апикальном
конце латеральных клеточных контактов (рис. 3.26).
so
ГЛАВА 3. БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК
Рис. 3.2. Межклеточные контакты. Электронная микрофотография культивируемых Ca-KD-клеток (ранний пассаж).
Клетки получены из вторичной аденокарциномы мозга (первичный источник неизвестен) Клетки выращены в чашке Петри
(Vivascicnee). (л) Дссмосомы (Д) между двумя контактирующими клетками, увеличение 28.000х. (б) Плотные контакты (Т)
и комплексы контактов (JC) в области канальца, увеличение 13.500х (любезно предоставлено Каролин МакДональд)
Поскольку эпителиальные клетки дифференци-
руются в культурах, имеющих сливной рост, они
способны формировать увеличивающееся количество
десмогом и при наличии некоторой морфолог ггческой
организации могут образовывать полные контактные
структуры. Это одна из причин, iro которым эпите-
лиальные клетки, находящиеся на стадии сливного
роста в течение слишком длительного времени, трудно
поддаются дезаг регацгги. Поскольку мног гге молекулы
адгезии в таких соединениях являются Са2+-зави-
еггмымгг. до дезагрегации или в ее процессе вместе с
трипсином часто используются хелатирующие агенты,
такие как ЭДТА
3.2.3. Внеклеточный матрикс
Межклеточное пространство в тканях заполнено вне-
клеточным матриксом (extracellular matrix, ЕСМ), со-
став которого определяется типом клеток. Фиброциты
секретируют в матрикс коллаген I типа и фибронек-
тин; эпителиальные клетки продуцируют ламин пн.
Если контактирующие клеткгг относятся к различным
типам, например на границе дермы (фиброциты) и
эпидермального слоя (эпителиальные кератггноци-
ты), оба клеточных типа вносят свой вклад в состав
ЕСМ, часто образуя бомлъную пластинку. Состав
ЕСМ является фактором, во многом определяющим
фенотипические проявления клеток, прилегающих
к нему, поэтому существует дггнамггческое равнове-
сие, при котором ггргглегающие к матриксу клетки
контролируют состав ЕСМ, и, в свою очередь, состав
ЕСМ регулирует фенотип этих клеток [Kleinman el al.,
2003; Zoubiane el al., 2003; Fata et al., 2004J. В связи с
этггм для пролиферации мигрирующих фибробластов
необходим иной ЕСМ, чем для дифференцирующихся
эпителиальных клеток или нейронов. Культивируе-
мые клеточные линии сами способны ироду пировать
компоненты ЕСМ, однако первичная культура и
размножение некоторых специализированных кле-
ток, а также индукция их дифференцировки могут
потребовать специальных экзогенных продуктов в
составе ЕСМ.
Внеклеточный матрикс может иметь в составе кол-
лаген, ламинин, фибронектин, гиалуроновую кислоту,
протеогликаны и связывать факторы [хюга и цитокггны
[Alberts et al., 1997,2002].
Он может быть изготовлен механическим смеши-
вай ггем чистых компонентов, таких как коллаген и
фибронектин. Для продукции ЕСМ используют клет-
ки, продуцирующие ЕСМ, с последующей отмывкой
клеток-продуцентов до начала посева исследуемых
клеток (см. протокол 8.1). В культивировании часто
используется ггреформированный матрикс, продуци-
рованный культурой мышиной саркомы Ehgelberth-
Hobn-Swarm (ЕНС), коммерчески производимый
как матригель (Matrigel) (см. разд. 8.4.1). Матригель
часто применяется для ускорения дифференцировки
и морфогенеза в культуре, так как формирует ре-
шеткообразную сеть с эпителиальными (см. рис. 3.3,
цв. вкладку 12») и эндотелиальными клетками.
Во взаимодействии клеток с субстратом можно
выделить, гго крайней мере, два этапа: 1) адгезию,
позволяющую осуществить прикрепление и расплас-
тывание клеток по субстрату, необходимые для начала
клеточной пролиферации [Folkinan &Moscona, 1978J,
и 2) специфические взаимодействия, напоминающие
взаимодействие эпителиальной клетки с базальной
мембраной, другими компонентами ЕСМ или клет-
ками прилегающих тканей. Эти специфические взаи-
модействия необходимы для проявления некоторых
специфических функций клеток (см. разд. 3.4.1 и
17.7.3). Rojkind [1980], Vlodavsky et al [1980] гг другие
исследователи изучали рост клеток на естественных
субстратах, аналогичных базальной мембране. В на-
стоящее время в коммерческом варианте доступны как
3.2. Клеточная адгезия
61
Рис. 3.3. Рост клеток Л549 на матригеле. Культуры клсчпк
аденокарциномы А549, растущие на матригеле (с) Фо
тосъсмка при малом увеличении, формирование решетки
через 24 ч после посева клеток в концешрации 1x10*кл мл,
(б) фотосъемка при большом увеличении через 3 дня после
посева клеток в концентрации 1x10s кл.. мл С 1рслка указы-
вает возможные канальцевые образования (фото Jane Sinclair,
см также цв. вкладку 12в)
естественные матрицы, так и стандартные матрицы
с определенным набором макромолекул, такие как
Malrigel, Nat rig el, коллаген, ламинин и витронектин
(В-D Biosciences, Invitrogen). Эти матрицы можно
использовать для контролируемых исследований
взаимодействия с матриксом.
Использование компонентов ЕСМ может быть
чрезвычайно полезно для улучшения клеточного вы-
живания, пролиферации, дифференцировки, однако,
если не используются рекомбинантные молекулы [см.
например, Ido et al., 2004], существует значительный
риск внедрения случайных факторов из иницииру-
ющих животных (см. разд. 10.1). В настоящее время
доступны коммерческие препараты, представляющие
собой фр;и менты фибронекти на и лами ни на (см При-
ложение II).
3.2.4. Цитоскелет
Молекулы клеточной адгезии соединяются с элемента-
ми цитоскелета. Реципрокная передача ст нала между
поверхностью клетки и ядром обусловлена присоедине-
нием интегринов к актиновым микрофиламентам через
связывающие белки [Fala el al., 2004]. Кадгерины также
связываются с актиновым цитоскелетом в адгезивных
соединениях, опосредуя изменения формы клеток.
Десмосомы, которые также задействуют кад| ерины,
связываются с промежуточными филоментами, в дан-
ном случае (в эпителии) с кератинами, через межкле-
точ ные диски, однако еще не до конца ясно, является
эта связь чисто структурной особенностью или также
играет сш нальную роль. Промежуточные филоменты
специфичны для каждой линии клеток и moi ут быть ис-
пользованы для характеристики линии (см. разд. 16.3.2;
цв. вкладку 11а в). Третьим компонентом цитоскелета
являются микротрубочки; их роль проявляется глав-
ным образом в обеспечении клеточной подвижности и
внутриклеточном транспорте органелл, таких как ми-
тохондрии и хроматиды. Кроме того, они обеспечивают
расхождение хроматид при делении клетки.
3.2.5. Клеточная подвижность
Замедленная видеозапись (см. разд. 27.3) показывает,
что культивируемые клетки способны к перемеще-
нию по субстрату. Наибольшей подвижностью обла-
дают фибробласты при низкой плотности культуры
(когоа между клетками нет контактов), наименьшая
подвижность характерна для плотного монослоя
эпителиальных клеток. Фибробласты мигрируют как
индивидуальные клетки с видимой полярностью дви-
жения. Ламел л инод ии, образуемые за счет полимери-
зации актина [Pollard &Borisy, 2003J, вытя! иваются в
направлении движения и прикрепляются к субстрату,
плазматическая мембрана на противоположной сторо-
не клетки сокращается, заставляя клетку направленно
двигаться. Если клетка встречает друт ую клетку, поляр-
ность меняется и миграция осуществляется в противо-
положном направлении. Как показано в исследовании
с применением коллоидного золота [Scott et al., 2000],
миграция фибробластов возобновляется в случайных
направлениях до тех пор, пока клеточная плотность
культуры не достшнет фазы сливного роста. После
этого направленная миграция фибробластов прекраща-
ется. Явление прекращения движения клеток на фазе
сливного роста культур, сопровождающееся снижением
образований морщин и складок в мембране, известно
как контактное ингибирование (см. разд. 18.5.2) и ведет,
в конечном счете, к выходу клетки из клеточного цик-
ла. Миобласты и эндотелиальные клетки мигрируют
аналО| ичным образом и, как и фибробласты, способны
дифференцироваться, koi да достш ают сливно! о роста
в зависимости от микроокружения
Эпителиальные клетки, не подвергавшиеся транс-
формации, не совершают беспорядочно! о движения.
62
ГЛАВА 3. БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК
При посеве в пилкой концентрации клетки переме-
щаются до осуществления контакта с другой клеткой,
после чего миграция прекращается. В конечном счете,
клетки накапливаются в клеточных островках, и затем
весь островок может проявлять признаки координиро-
ванного движения |Casanova, 2002].
3-3- КЛЕТОЧНАЯ ПРОЛИФЕРАЦИЯ
3.3.1. Клеточный цикл
Клеточный цикл состоит из четырех фаз (рис. 3.4).
В М-фаае (Mitosis), хроматин конденсируется и обра-
зуются хромосомы; две отдельные хроматиды, состав-
ляющие хромосому, разделяются для тою. чтобы пе-
рейти в дочерние клетки. В Gj-фазе (Gapl) происходит
либо подготовка к синтезу ДНК и следующему циклу
клеточное» деления, либо обратимый выход клетки их
клеточно! о цикла (выход в С0-фазу). Возможен также
необратимый переход в стадию дифференцировки.
В ходе Gj-фазы клетка частично способна контроли-
ровать прохождение клеточного цикла в ряде точек
рестрикции, которые определяют, войдет ли клетка в
пролиферативный цикл, выйдет ли из него временно,
либо покинет его, перейдя к дифференцировке. Вслед
за G,-фазой следует S-фаза (Synthesis ДНК), в кото-
рой происходит репликация ДНК и которая, в свою
очередь, сменяется Gj-фазой (Gap2). В ходе Gj-фазы
клетка отовится вновь перейти в стадию митоза. Кон-
трольные точки в начале фазы синтеза ДН К и Gj-фазы
определяют цельность и аутентичность ДНК и могут
приостановить клеточный цикл с тем, чтобы клетка
MOi.'ia репарировать повреждения ДНК или включить
механизм опоптотической ибели, если репарация не-
возможна. Апоптоз, или программируемая клеточная
Рис. 3.4. Клеточным цикл. Клсчочный цикл делится на
четыре фазы Gl, S, G2 и М Продвижение но циклу регули-
руется взаимодействием цикл инов с CDC-кинаэами и сти-
мулируется ядерными онкогенами и цитоплазматическими
сигналами, инициируемыми взаимодействием рецепторных
киназ с лигандами Клеточным цикл останавливается в точ-
ках рестрикции интнбиторами клс [Очного цикла, такими
как R1; и р53
смерть |al-Rubeai& Singh, 1998],являетсяфизполощ-
ческим процессом, в соответствии с которым клетка
может быть выведена из популяции. Фра[ментацпя
ДНК, фра[ментация ядра, уменьшение клеток в разме-
ре и изменение их очертаний являются визуальными
признаками апоптотическою изменения клеток (см. цв.
вкладку 17 », г). Апоптоз можно обнаружить также по
наличию ферментов-маркеров, д.ля детекции которых
используются наборы реактивов, такие как Apotag (Оп-
сог) или COMET-анализ |Maskell&Green, 1995].
3.3.2. Контроль клеточной пролиферации
Вход в клеточный цикл регулируется сшналами из
окружающей среды. Низкая плотное гь клеток приво-
дит к тому, что клетка, не имея контактов с друi ими
клетками, переходит в активное состояние, способна
к размножению и поэтому входит в клеточный цикл
в присутствии мпто1енных факторов роста, таких
как эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоци-
тарный фактор роста (PDGF) (см. разд. 9.5.2, 10.4.3.
и табл. 10.3), взаимодействующих с рецепторами
клеточной поверхности. Высокая плотность клеток
шпибпрует пролиферацию нормальных клеток (п не
ин! ибируетделение трансформированных кле гок) (см.
разд. 18.5.2). Ин|ибпрование пролиферации иниции-
руется клеточными контактами и усугубляется скопле-
нием клеток и возникшими в результате изменениями
формы клеток, а также ограничением возможности
рас пространения.
Внутриклеточный контроль опосредован поло-
жительно действующими факторами, такими как
циклины [Planas-Sliva & Weinberg, 1997; Reed, 2003]
(см. рис. 3.2), на которые влияют щипальные каскады,
активированных фосфорилирован пем внутриклеточ-
ных доменов рецепторов при их связывании с факто-
рами роста. Негативно действующие факторы, такие
как белки рЗЗ1 Sager, 1992; Mell wrath el al., 1994], р16
(Russo el al., 1998] или продукты .жспрессии Rb-гена
(Sager, 1992J, останавливают прохожден пекл елоч-
ною цикла в точках рестрикции или контрольных
точках цикла (рис. 3.5). Связь между внеклеточными
элементами контроля клеточного цикла (как положи-
тельными, например PDGF, так и отрицательными,
например TGF-0) и внутриклеточными эффекторами
осуществляется посредством рецепторов клеточной
мембраны и путями передачи биохимических сшна-
лов, часто включающими фосфорилирование белка и
участие вторичных мессенджеров, таких как цАМФ,
Са2* и диацилглицерин (Alberts el al., 2002]. Имеется
множество доказательств существования этих стадий
в контроле клеточной пролиферации, полученных при
изучении онкогенов и супрессоров генной экспрессии
в опухолевых клетках. Эти исследования были пред-
приняты с целью создания терапевтических подходов
регуляции неконтролируемою клеточною деления
при раковых заболеваниях. В ходе исследований
были получены промежуточные данные, у|лубившие
3.4. Дифференцировка
63
Рис. 3.5. Регуляция клеточного цикла и продвижение по
клеточному циклу. Клеточный цикл останавливается в
точках рестрикции или контрольных пунктах иод действием
Rh, рэЗ и других ингибиторов клеточного цикла (а). При их
активации (обычно путем фосфорилирования) клеточный
цикл возобновляется (б)
нанимание механизмов рефляции, происходящих в
клеточной культуре, а также природы факторов pei у ли-
нии [Jenkins, 1992]. Кроме того, в ходе .них работ были
идентифицированы 1ены, улучшающие клеточное
деление, некоторые из которых можно использовать
для иммортализации конечных клеточных линий (см
разд. 18.4).
3.4. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
Как упоминалось ранее (см. разд. 1.3.3), выражение
особенностей дифференцировки клеточной культуры
часто ограничено продвижением клеток но клеточному
циклу, необходимому для размножения клеток и расши-
рения ростковой культуры. Условиями, необходимыми
для индукции дифференцировки, являются высокая
плотность клеток, усиление межклеточных и клеточно-
матриксных взаимодействий и присутствие различных
факторов дифференцировки (см. разд. 17.1.1; 17.7).
которые moi ут быть анта> онистами факторов клеточ-
ной пролиферации и наоборот. Поэтому, если есть
необходимость дифференцировки культуры, следует
различать две группы условий — одну, оптимизирую-
щую клеточное деление, и другую, оптимизирующую
клеточную дифференцировку
3.4.1. Поддержание и индукция
дифференцировки
Много лег назад было обнаружено, что специфические
функции клеток сохраняются дольше, koi да сохранена
трехмерная структура первичной ткани, как в случае
opiанной культуры (см. разд. 25.2). К сожалению,
органная культура не может поддерживаться и переви-
ваться. поэтому для каждого следующего эксперимента
требуется при1 отопление органной культуры de novo,
что приводит к сложностям при стандартизации и
количественном анализе данных. Восстановление трех-
мерности пространственной структуры возможно пер-
фузией монослойной культуры (см. разд. 25.3; 26.2.6)
или культивированием клеток на или в специальных
матрицах, таких как коллагеновый гель, целлюлоза,
желатиновая губка и др. (см. разд. 3.2.3; 8.4.1; 8.4.3;
17.7.3), в зависимости от конкретных потребностей
исследователя. Ряд коммерческих продуктов, наиболее
известным из которых является Matrigel (BD Biosci-
ences), воспроизводит характеристики внеклеточного
матрикса, которые не определены с необходимой
точностью. Однако имеются варианты коммерчес-
ких препаратов, из которых удалены факторы роста
(GFR-Matrigel). Эта технологов имеет определенные
ограничения, но предоставляет возможность для иссле-
дований межклеточных и клеточно-матриксных взаи-
модействий как гомотииической, так и гетеротипиче-
ской культуры. В перспективе она также пред пол тает
возможность изучения тканесиецифических функций,
особенно когда взаимодействие клеток в культуре свя-
зано с ростом культуры в фильтрационной лунке (см.
разд. 25.3.6). Для проявления фенотипических свойств
дифференцированной культуры может потребоваться
использование соответствующих селективных сред
(см. разд. 10.2.1) с соответствующими растворимыми
индукторами. Такими индукторами могут быть шд-
рокоргизон, ретиноиды или двухмерные полярные
соединения (см. разд. 17.7.1; 17.7.2). При этом обычно
не требуется добавления сыворотки.
Развитие методов моделирования нормальных
«функций тканей в культуре может способствовать
исследованиям иатоло! ических изменений, таких как
демиелинизация и злокачественная инвазия. Однако с
точки зрения фундаментальных исследований клетки,
изучаемые in vitro, должны обладать всеми функциями,
характерными для исходной ткани. Проявление диф-
ференцированного фенотипа клеток не должно быть
завершенным, поскольку появление единичного ти-
носиецифическо! о поверхностного антигена бывает
достаточным для того, чтобы придать клетке правиль-
ное направление дифференцировки. Более полная
экспрессия антш енов может потребоваться для того,
чтобы поместить клетку в правильное положение в
линиях клеточной дифференцировки и использовать
64
ГЛАВА 3. БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК
ее как достоверную модель для исследования свойств
клеток in vivo.
3.4.2. Дедифференцировка
Исторически в неспособности клеточных линий
проявлять фенотипические признаки, которыми они
обладают in vivo, обвиняли явление дедифференциров-
ки. Согласно .пой концепции, дифференцированные
клетки при их культивировании in vitro теряют свои
характерные свойства. Однако часто остается неясным,
что вызвало адаптивную и потенциально обратимую
утрату характерных для дифференцированных клеток
свойств: 1) ошибки в выделении линии клеток; 2) выде-
ление недифференцированных клеток желаемой линии
дающих избыточный рост но сравнению с полностью
дифференцированными клетками, обладающими по-
ниженной способностью к делению или 3) отсутствие
соответствующих индукторов дифференцировки (гор-
монов или цитокинов межклеточного или клеточно-
матриксного взаимодействия). В реальной практике
все ли элементы могут вносить определенный вклад
в дедифференцировку клеток. Даже при соблюдении
адекватных условий культивирования и тщательной
селекции клеток продолжительная пролиферация со-
здает благ окриятные условия для развития и деления
недифференцированных кле ток-предшественников,
которые в отсутствие соответствующего окружения не
переходят в стадию дифференцировки
Следует различать дедифференцировку, деаданта-
цию и селекцию. Понятие «дедиф<|>еренц11ровка>> под-
разумевает. что свойства специализированных клеток
утрачены в результате конверсии до более нримитив-
Рис. 3.6. Дифференцировка из стволовых клеток, (л) In vivo Небольшое количество стволовых клеток дает начало пулу проли-
ферирующих клеюк-предшсствснников (б) In vitro дифференцировка ограничена необходимостью пролиферации. Популяция
состоит иреимущсствснно из клеток-предшественников, хотя в иоиуляции могут быть гакже представлены стволовые клетки.
Плюрипшснтныс стволовые клетки (крайние слева) также могут быть выделены из некоторых тканен н культивированы, од-
нако их отношения е тканевыми стволовыми клетками еще нс ясны. Условия культивирования главным об|мзом. определяют
селекцию пролиферирующих к.ге (<|К-ирсдшсствснников данной т канн или индуцируют деление час гично дифференцированных
клеток, с последующим их преобразованием до состояния предшественников
3.4. Дифференцировка
65
। io ix) фенотипа. Например, гепатоциты утратили бы
характерные ферменты (артназа, аминотрансферазы
и т.д.) и не меняй бы накапливать пшкоген или секре-
тировать сывороточные белки в результате возвращении
к состоянию клеток-предшественников [Kondo & Raff,
2004]. Деадаптация, в свою очередь, предполагает, что
синтез специфических продуктов или иные аспекты
специализированных функций клеток находятся мод
ретуляторным контролем гормонов, влияния межкле-
точного и клеточно-матриксного взаимодействия и т.д.,
и может быть вновь индуцирован наличием соответству-
ющих условий. Например, присутствие матрикса в виде
плавающего коллагенового плотика [Michalopoulos &
Pitil, 1975], Malrigel [Bissell etall., 1987] или диметил-
сульфоксида (DMSO) [Cable & Isom, 1997] позволяет
сохранить дифференцированные свойства гепатоцитов.
В настоящее время считается доказанным, что при на-
личии специальных условий культивирования диффе-
ренцированные фенотипические свойства клеток могут
восстанавливаться (табл. 3.1, см. также разд. 17.5).
Таблица 3.1. Клеточные линии е дифференцированными свойствами
Тип клеток Происхождение Клеточная линия N* Вид Маркер Ссылка
Эндокринные Кора надпочечни- ¥-1 Т Мышь Адреналовые стероиды Yasamura ct al, 1966
Эндокринные Опухоль гипофиза GH3 Т Крыса Гормон роста Buonassisi ct al, 1962
Эндокринные Гипоталамус С7 N Мышь НсЙрофизин. вазопрессин De Vitry ct al., 1974
Эндотелий Дерма HDMEC Человек Фактор V111, С D36 Gupta etal., 1997
Эндотелий Легочная артерия С РАЕ с Корова Фактор V III. ангиотензин II-конвертирующий ко- фермент Del Vecchio & Smith 1981
Эндотелий Гсиатома SK НЕР-1 т Человек Фактор VIII Hcffeifinger etal, 1992
ЭишелнЙ Простата РРЕС N Человек PSA Robertson & Robertson. 1995
Эпителий Почка MDCK с Собака Куполообразность. Транс- Gausb ct al. 1966, Rindlcr etal., 1979
Эпителии Почка LLC-PK1 < Свинья Na4 -зависимый захват глю- Hull ct al., 1976. Saicr, 1981
Эпителии Молочная же юза MCF-7 т Человек Куполообразность, а-лактальбумин Soule etal., 1973
Глия Глиома MOG-G-CCM т Человек Енотам илсинтстаза Balmforth ct al.. 1986
Глия Глиома С6 т Крыса Фибриллярный кислотный протеин глии Benda etal. 1968
Гепатоциты Гепатома Н4-11-Е-СЗ т Крыса Тирозин Pitot ct al.. 1964
Гепатоциты Печень т Мышь Аминогранефсраза Ycohctal.. 1990
Ксратпноциты Эпидермис HaCat т Человек Ксратинизация Boukamp ct al, 1988
Лейкемия Селезенка Friend т Мышь Гемоглобин Scher etal., 1971
Меланоциты Меланома В16 т Мышь Меланин Nilos & Makarski, 1978
Мцелопд Лейкемия К562 т Человек Гемоглобин Andersson ct al.. 1979 a,b
Мпслонд Миелома Various т Мышь Иммуноглобулин Honbata & Harris. 1970
Миелоид Костный мозг WEHl-ЗВ D+ т Мышь Морфология Nicola. 1987
Мислоид Лейкемия HL60 т Человек Фагоцитоз, восстановление нсотстразолия голубого Olsson & Ologsson, 1981
Миоциты Ске четные мышцы С2 L6 с Мышь Крыса Мышечные трубочки Мышечные трубочки Morgan ct al. 1992, Rtchler & Yaffc. 1970
Нсороэндокрин- ныс клетки Хромафннная опу- РС12 т Крыса Катсхо.1амины, допамин.норз1и1нсфрин Greene & Tischlcr. 1976
Нейроны Нейробластома С1300 т Крыса Нейриты Lieberman & Sachs, 1978
Пнсвмоциты Карцинома легких А549 т Человек Сурфактант Giard ct al, 1972
клеток Клара NCI-H441 т Человек Сурфактант Brower etal., 1986
II tuna
Пневмициты II Карцинома лп ких Мышь Сурфак1ант Wilkcnhciserctal.. 1991
1 III ы
Различные Эмбриональная тс- ратокарцинома F9 т Мышь Активатор плазминогена, ла- минин, коллаген IV' типа Bcrnstine et al, 1973
* N нормальные. С — постоянные. I — иммортализованныс, Т — трансформированные.
66
ГЛАВА 3. БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК
Для того чтобы такая индукция имела место, необ-
ходимо, чтобы в культуре имелись соответствующие
клетки. Первые попытки восстановления функции в
культурах клеток печени были неудачны, частично
в связи с избыточным ростом фибробластов соеди-
нительной ткани или эндотелиоцитов синусоидных
кровеносных сосудов. При соблюдении правильной
техники дезагре1ации ткани и правильных условий
культивирования [Guguen-Guillozo, 2002] (см. также
протокол 2.3.6) можно осуществить преимущественную
селекцию гепат оцитов. Таким же образом с использо-
ванием сливного фидерного слоя [Rheinwald & Green,
1975] или селективной питательной среды [РееЫ &
Ham, 1980; Tsao el al., 1982] (см. протокол 23.1) могут
быть выделены и выращены эпидермальные клетки.
Селективная среда используется также для выделения
мно< их других типов эпителиальных клеток [Freshney,
2002]. Эти и другое примеры [например, селектив-
ные фидерные слои (см. протоколы 23.1, 23.4, 24.1),
использование D-валина для выделения почечного
эпителия и применение цитотоксических антител (см.
разд. 14.6) ясно доказывают, что селективное культи-
вирование дифференцированных клеток возможно и
достижимо. Многое селективные среды были созданы,
1 данным образом, на основании дополненной среды
Хэма F12:DMEM или ее модификаций серии MCDB
(см.ращ. 10.2.1) [Cartwright & Shah, 1994; Mather 1998],
и теперь коммерчески доступны (см. Приложение II)
часто вместе со специализированной культурой.
3-5. ПЕРЕДАЧА КЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛОВ
Клеточное деление, мшрация, дифференцировка
и апоптоз in vivo, как это обсуждалось выше (см.
разд. 3.4.1), регулируются за счет межклеточного и
клеточно-матрикс ного взаимодействия, гормональ-
ных сигналов и питательных веществ. Некоторые
сшнальные цепи опосредованы молекулами клеточ-
ной адгезии (см. разд. 3.2). Однако передача сигнала
может осуществляться также за счет растворимых
факторов, способных к диффузии. Сш нальные мо-
лекулы, досгшающие клеток из соседних тканей по
сосудистой системе, называются эндокринными; те
сшнальные молекулы (оиналы), которые диффун-
дируют из криле! ающих тканей без участия потока
крови, называются паракринными. Следует знать, что
одни и те же сигнальные молекулы синтезируются в
таких же клетках, на которые они оказывают действие.
Позже будет рассказано о гимотипической паракрин-
ной, или гомокринной, передаче стнала (рис. 3.7).
Сшнальные молекулы, появляющиеся в клеточном
тике, отличном от peai ирующих клеток, относятся к ге-
теротипической паракринной системе и в дальнейшем
будут называться просто паракринными. Клетки могут
также продуцировать свои собственные сшнальные
факторы, которые связываются с их собственными
рецепторами и это явление называется аутокринной
сигнальной системой.
Рис. 3.7. Клеточное взаимодействие и передача сигнала.
Пути взаимодействия между клетками, (о) Факторы, влия-
ющие на поведение клеток, включая эндокринные гормоны,
поступающие № сосудистой системы, паракринные фак горы
с громы, гомокринныс фак горы соседних подобных клеток и
аутокринные факторы самой клетки. Матричный, рашворн-
мый fi ассоциированный с к.(С1камг! сульфат гепарина (HS)
может участвовать в активации, с <абплизаиии и перемещении
паракринных факторов, (б) Единообразие ответа тканеи-ми-
шеней усиливается взаимодействием через щелевые контак-
ты. передачу сигнала и, возможно, гомокринными факторами
стимулированных клеток
Хотя in vivo все эти формы сш налов имеют место,
in vitro мри нормальных условиях на основной пита-
тельной среде реализуются только аутокринная и гомо-
кринная передачи стнала. Неудачи в попытках пере-
нести на чашку Петри некоторые из клеточных культур
либо низкая эффективность культивирования MOiyr
объясняться, в частности, снижением концентрации
одного или нескольких аутокринных и гомокринных
факторов. Необходимость присутствия сш нальных
молекул является одним из разумных объяснений
3.7. Получение первичной культуры
67
использования кондиционированных сред (см. про-
токол 14.2) или фидерных слоев (см. протокол 14.3)
для повышения эффективности посева. Поскольку
интенсивность пролиферации и поддержание специ-
ализированных клеточных линий, а также индукция
их дифференцировки мел ут зависеть от паракринных
и эндокринных факторов, эти факторы должны быть
идентифицированы и добавлены в дифференцирую-
щую питательную среду (см. разд. 17.7.1, 17.7.2). Их
действие может быть достаточно сложным, и, возмож-
но, для реализации сш нала потребуется сцнэр! ическое
действие двух или более факторов [см., например,
McCormick & Freshney, 2000]. В попытке стимулиро-
вать межклеточное взаимодействие добавлением экзо-
генных паракринных факторов необходимо принять во
внимание, что фенотип взаимодействующих клеток. и.
следовательно, тик ст нальных факторов, которые они
могут продуцировать, а также временные рамки, в ко-
торые эти факторы продуцируются, изменяются в ре-
зультате этого самого межклеточною взаимодействия.
Возможно, гетеротипическая комбинация клеток, но
крайней мере первоначально, является более простым
путем обеспечения набора ст нальных молекул в
правильном матрикс ном микроокружении, и анализ
этою взаимодействия может затем быть блокирован
добавлением антител либо антисенсорных РНК.
3.6. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ
Большинство культуральных сред содержит 4—20 м М
глюкозы, которая, t лавным образом, используется как
источник углеводов для гликолиза с образованием
молочной кислоты как конечною продукта метабо-
лизма. При нормальных условиях культивирования
(атмосферный кислород и ши ружейная в питатель-
ную среду культура) имеется относительный дефицит
кислорода. В отсутствие соответствующих носителей,
таких как гемоглобин, повышение парциальною дав-
ления кислорода в атмосфере, приводит к образованию
свободных радикалов, токсичных для клеток, поэтому
концентрацию О,обычно поддерживают на уровне
атмосферной. В результате возникают анаэробные ус-
ловия, при которых для обеспечения энергетическою
метаболизма используется гликолиз. Тем не менее
цикл лимонной кислоты (цикл Кребса) также играет
важную роль. Очевидно, ряд аминокислот, в частности
глутамин, MOtyT быть утилизированы как источник
углевода путем окисления до 1лутамата при помощи
глутаминазы и поступают в цикл лимонной кислоты
через трансаминирование до 2-оксо1лутарата [Reitzer
et al., 1979; Butler & Christie, 1994]. Дезаминирование
глутамина ведет к образованию аммиака, токсичною
для клеток и ограничивающею их рост. Однако при
использовании ди пептидов, таких как 1лутамил-ала-
нцн или ытутамил-!лицин, отмечалось минимальное
образование аммиака и более высокая стабильность
культуры, что является дополнительным преимущест-
вом (например, Glutamax, Invilrogen).
3.7. ПОЛУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ
КУЛЬТУРЫ
Методы получения первичной культуры подробно
будут описаны ниже (см. гл. 12). Вкратце, первичной
называется культура, полученная за счет активною рос-
та мигрирующих клеток из фра! мента ткани или путем
ферментативной или механической деза! регации тка-
ней. Независимо от применяемого метода, получение
первичной культуры является первым этапом в ряде
селективных процессов (табл. 3.2) и может в конечном
ит01 е привести к формированию относительно едино-
образных клеточных линий. В первичном эксплантате
(см. разд. 12.3.1) селекция осуществляется за счет
преимущественной способности клеток к миграции из
фра! мента ткани, в то время как средн дисиер! ирован-
ных клеток основу для формирования первичной куль-
туры способны составить только те клетки, которые
способны как к выживанию после дезагре! ации, так и
к адгезии к субстрату либо выживанию в суспензион-
ной культуре. Если первичная культура сохраняется
несколько часов, можно переходить к следующему
uiaiy селекции. Количество клеток, способных к про-
лиферации, будет увеличиваться, некоторые типы
клеток могут выживать без деления и увеличения
числа клеток, а прочие moi ут оказаться неспособными
к выживанию в данных условиях культивирования.
Таблица 3.2. Селекция в развитии клеточной линии
Стадия
Факторы, определяющие селекцию
Выделение
Первичная культура
Первая субкультура
Поддержание клеточной
линии, пассаж
Старение, трансформация
Первичный эксплантат Ферментативная дезагрегация
Механическое повреждение Ферментативное повреждение
Адгезия эксплантата, избыточный рост и митра- Кле (очная адгезия и распластывание, клс-
ция. клеточная пролиферация точное деление
Чувстви (сльность к трипсину, потребности в питательных веществах, гормональные и суб-
стратные ограничения, пролиферативная способность
Относительная скорость роста различных клеток, селективный избыточный рост одной линии
дифференцировки. Питательные, гормональные и субстратные ограничения
Нормальные к.(сточные линии погибают, трансформированные клетки продолжают деление
(избыточный рост)
£8
ГЛАВА 3. БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК
Следовательно, относительное соотношение клеточных
типов в культуре будет постоянно изменяться. Для
монослойной культуры этот динамический процесс
будет продолжаться до тех пор, иока не будет заполнена
вся площадь субстрата. Следует понять, что первичная
культура, вполне пригодная для проведения цитогене-
тического анализа и некоторых друт их целей, может не
походить для дру1 их видов исследований в результате
ее нестабильности. Как изменчивость клеточной по-
пуляции, так и адаптивные модификации отдельных
типов клеток постоянно имеют место в ходе развития
культуры, затрудняя определение периода, в котором
культура может расцениваться как гомогенная или
стабильная.
Состояние, котда все доступные для роста области
заняты и клетки находятся в плотном контакте друг с
другом, называется стадией слионохо роста, а культуру
называют конфлюэнтной. В конфлюэнтной культуре
клетки, рост которых чувствителен к контактному
ин1 ибированию, а клеточная плотность ограничивает
клеточную пролиферацию (см. разд. 18.5.2), прекраща-
ют деление, в то время каклюбыетрасформированные
клетки, нечувствительные к плотности популяции,
будут продолжать избыточный рост. Поддержание
постоянно низкой плотности популяции (например,
частым субкультивированием) iiOMOiaer сохранить
нормальный фенотип клеток в культуре, имеющей при
повышении плотности клеточной популяции склон-
ность к спонтанной транс формации и избыточному
росту, например культуры мышиных фибробластов
[Todaro & Green,1963J.
Некоторые аспекты специализированных функций
выражены сильнее в первичной культуре, в частности
в конфлюэнтной культуре. На этой стадии культура
обнаруживает наибольшее морфологическое сходство
с родительской тканью и сохраняет некоторое разно-
образие клеточных типов.
3.8. ЭВОЛЮЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ
После первого субкультивирования (или пассажа)
(рис. 3.8) первичная культура начинает именоваться
клеточной линией и может поддерживаться, размно-
жаться и пассироваться несколько раз. При каждом
успешном пассаже составляющая популяции с наи-
более высокой скоростью пролиферации начинает
доминировать и постепенно вытесняет другие ком-
поненты популяции, обладающие меньшей пролифе-
ративной активностью. Это особенно заметно после
первого субкультпвирования, при котором различия
к возможности пролиферации усиливаются различной
устойчивостью клеток к механическому воздействию
либо трипсинизации, а также переносу в друi ue условия
культивирования (см. разд. 13.1).
Хотя некоторые селективные и фенотипические
изменения будут продолжаться в ходе субкультивиро-
вания после третьего пассажа клеточная линия стано-
вится более стабильной и определяется устойчивыми к
внешним воздействиям, быстро делящимися клетками.
В присутствии сыворотки и без специфических селек-
тивных условий часто отмечается избыточный рост
мезенхимальных клеток, имеющих в основе своего
происхождения фиб|х)бласты соединительной ткани
либо сосудистые элементы. Это явление способство-
вало появлению очень полезных для некоторых целей
клеточных линий: легочные фибробласты человече-
ского эмбриона WI-38 [Hayflick and Moorhead, 1961 J,
почечные фибробласты детенышей хомяков ВНК21
[Macpherson and Stoker, 1962J, клетки COS [Gluzman,
1981], клетки CH О [Puck el al., 1958] (см. табл. 13.1),
и наиболее известные L-клетки, мышиные подкожные
фибробласты, обработанные метилхолантреном [Earle
et al., 1943, Sanford el al., 1948]. Однако в целом избы-
точный рост является одной из сложнейших и|х>блем
культивирования тканей, а именно: как предупре-
дить избыточный рост при культивировании более
нежных и медленно растущих специализированных
клеток, таких как клетки печеночной паренхимы или
эпидермальные кератиноциты. Чаще всего причину
избыточного роста видят в неадекватности условий
культивирования. В области подбора селективных
сред и субстратов для поддержания мнших клеточ-
ных линий достшнуты значительные успехи (см.
разд. 10.2.1, гл. 23).
3.8.1. Старение
Нормальные клетки могут делиться ограниченное чис-
ло раз: следовательно, клеточные линии, полученные
из нормальной ткани, погибнут после фиксирован-
ного количества периодов удвоения популяции. Это
тенетически детерминированное событие включает
участие нескольких различных гонов и известно как
старение культуры. Считается, что оно определяется,
в частности, неспособностью терминальной последо-
вательности ДНК в теломерах реплицироваться при
каждом делении клетки. В результате происходит
iipoi рессирующее укорочение теломеров, и в конце
концов клетка становится неспособной к дальнейшему
делению [Bodnar et al., 1998]. Исключениями из этого
правила являются половые клетки, стволовые клетки
и трансформированные клетки, которые часто экспрес-
сируют фермент теломеразу, способный к репликации
терминальных последовательностей ДНК в теломере и
удлиняющий время жизни клеточной популяции инО1 -
да бесконечно, — в случае половых клеток и некоторых
опухолевых клеток (см. также разд. 18.4.1).
3.9. ВОЗНИКНОВЕНИЕ ПОСТОЯННЫХ
КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ
Некоторые клеточные линии мотут давать начало
постоянным клеточным линиям (см. рис. 3.7). Способ-
ность клеточной линии к ш>с гоянному росту, возможно,
отражает ее способность к генетической вариабельное-
3.9. Возникновение постоянных клеточных линий
69
Эксплантат Недели культивирования
Рис. 3.8. Развитие клеточной линии. Вертикальная ось (Y) представляет общий рост числа клеток в гипотетической клеточ-
ной культуре (ирсдло.1а1астся, что при пересадке уменьшении количества клеток нс происходит). Общее количество клепок
(клеточный выход) представлен на этой оси в логарифмической шкале. Время культ ивировании показано на оси X в линей-
ной шкале Хотя постоянная клеточная линия изображена развивающейся в течение 14 недель, для различных клеточных
линий это время подъема различно Соответственно, старение может начаться в разное время, для че ловеческих диплоидных
фибробластов старение происходит между 30-м и 60-м исриодами удвоения количества клеток, или между 10-й и 20-й нсде-
лямн, в зависимости от времени удвоения. Используемые термины и определения даны в словаре употребляемых терминов
(по Hayflick & Moorhead [ 19611)
ти, позволяющей осуществиться дальнейшей селекции.
Генетическая вариабельность часто связана с делецией
гена р53, который в норме останавливает' прохождение
клеточного цикла в случае мутации ДНК, а также со
сверхаксцрессией тена теломеразы. Фибробласты
человека остаются преимущественно эуплоидными в
ходе жизненно! о цикла в культуре и никшда не дают
начало постоянным клеточным линиям [Hayflick and
Moorhead, 1961), в то время как мышиные фибро-
бласты и клеточные культуры из ряда человеческих
и животных опухолей нередко в культуре становятся
анеуилоидными и дают начало постоянным клеточным
линиям. Возможно, необходимым условием является
наследственная предрасположенность большинства
из этих линии к генетической изменчивости, поэтому
неудивительно, что в них обнаруживается генетическая
нестабильность, сохраняющаяся затем в постоянных
клеточных линиях. Общим свойством mhoi их постоян-
ных клеточных линий человека является формирова-
ние субтетрацлоидниго набора хромосом (рис. 3.9).
Изменение в культуре, которое приводит к развитию
постоянной клеточной линии, обычно называется
трансформацией in vitro (см. i л. 18) и может возникать
спонтанно или быть индуцировано химически или
вирусом (см. разд. 18.2,18.4). Термин трансформация
используется скорее приблизительно и может иметь
различный смысл при употреблении разными людьми.
В этом руководствеимморта шзоцижмначает приобре-
тение клеточной линией способности к возникновению
неопределенного числа клеточных циклов, а трансфор-
мация подразумевает дополнительные перестройки в
характеристиках роста (независимость от прикреиле-
70
ГЛАВА 3. БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК
Рис, 3.9. Количество хромосом в клетках конечной и пос-
тоянной клеточных линий, (а) Клеточная линия нормальных
шпальных клеток человека, (б) Пост оянная клеточная линия
метастазирующей меланомы человека
имя к субстрату, утрату контактней о uhi ибирования и
отсутствие чувствительности к плотности популяции),
которые часто, хотя и не все1да, коррелируют с онко-
генностью.
Постоянные клеточные линии обычно теупмидны
и часто имеют хромосомный набор между диплоидным
и тетраплоидным (см. рис. 3.9). Имеются также зна-
чительные вариации в хромосомном наборе и составе
между клетками одной популяции (гетероплоидия)
(см. также разд. 18.3). Еще не ясно, присутствуют
клетки, кепорые затем дают начало постоянным клеточ-
ным линиям, исходно в эксплантате в незначительном
количестве, либо они образуются позже как результат
трансформации одной или более клеток. На основании
анализа кинетики клеточною роста второй вариант
кажется более вероятным, поскольку постоянные
клеточные линии мо!ут появляться достаточно позд-
но в истории жизни клеточной культуры, нам ною
позже, чем они мо1ли бы развиться при наличии и
избыточном росте предварительно существовавших
в тканях клеток. Однако остается возможность тою.
что в тканевых культурах существует субиопуляция,
предрасположенная к трансформации, которая не
смешивается с остальными клетками.
Термин трансформация относится к процессу
формирования постоянной клеточной линии, в част-
ности, в результате морфоло! ических и кинетических
изменений клеток, но также в связи с тем, что форми-
рование постоянной клеточной линии часто сопро-
вождается возрастанием онкогенности. Ряд свойств
постоянных клеточных линий, таких как снижение
потребности в сыворотке, уменьшение ограничения
роста клеточной плотностью, рост на полужидкой
среде, анэуплоидия клеток (см. также табл. 18.1 и цв.
вкладку 14) и друтие, связаны с малигмизационной
трансформацией (см. разд. 18.6). Похожие морфо-
лотические и функциональные изменения могут
наблюдаться в клетках, подвертшихся вирусному
или химическому воздействию. Мноте нормальные
клетки (если не большинство) не moi ут давать начало
постоянным клеточным линиям. Классическим при-
мером является формирование культуры фиб(х>б.тас-
тов, которые сохраняют нормальный набор хромосом
в течение жизненно! о цикла и затем (примерно после
50 поколений) прекращают- деление, хотя остаются
жизнеспособными еще до 18 месяцев. Аналошчны-
ми свойствами обладают 1лиальные клетки человека
[Ponten & Wester mar к, 1980J и фибробласты цыпленка
[Нау & Strehler, 1967J. С другой стороны, эпидермаль-
ные клетки обнаруживают постепенное удлинение
клеточных циклов при усовершенствовании техники
культивирования [Rheinwald & Green, 1977; Green el
al., 1979J и, возможно, способны к формированию по-
стоянной культуры. Постоянный рост культуры может
иметь отношение к способности тканей к pei енерации
и самообновлению in vivo и успешности распростра-
нения in vitro ее стволовых клеток (см. разд. 3.10).
Возможно образование постоянной культуры лим-
фобластов при ее трансформации с использованием
вируса Эпштейна—Барра [Gjerset etal., 19901
3.10. ПРОИСХОЖДЕНИЕ
КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК
Поскольку большинство исследователей работают со
стандартными условиями культивирования конечных
или постоянных пролиферирующих клеточных ли-
нии, очень важно знать клеточный состав культуры.
Способность экспрессировать различные клеточные
маркеры иод влиянием индуцирующих факторов
может означать либо то, что клетки, существующие
в данной культуре, находятся в состоянии зрелости и
требуется лишь индукция для продолжения синтеза
специализированных белков; либо то, что культура
состоит из предшественников или стволовых клеток,
которые способны к пролиферации, но остаются не-
дифференцированными до тех пор, пока не возникнут
необходимые условия, вследствие чего все клетки или
их некоторая часть станут- зрелыми и дифференци-
руются. Полезно рассматривать клеточную культуру
как систему, находящуюся в состоянии равновесия
между мульти потентными стволовыми клетками,
недифференцированными, но уже детерминирован-
ными клетками-предшественниками и зрелыми диф-
ференцированными клетками (см. рис. 3.6), причем
это равновесие может быть сдвинуто в соответствии
с условиями окружения. Стандартный серийный пас-
саж при относительно низкой клеточной плотности
стимулирует клеточную пролиферацию и сдерживает
дифференцировку, в то время как высокая концепт-
3.10. Происхождение культивируемых клеток
рання клеток, недостаток сыворотки и действие соот-
ветствующих гормонов ингибируют пролиферацию и
стимулируют дифференцировку
Источник культуры определяет наличие клеточных
компонентов, представленных в культуре. Следова-
тельно, клеточные линии, полученные из эмбрио-
нальных тканей, moi ут содержать большее количество
стволовых клеток и клеток-иредшественников, а также
обладать большой способностью к самообновлению,
чем культуры, выделенные из взрослых тканей. Культу-
ры, которые имеют высокую скорость самообновления
и регенерации in vivo (эпидермис, эни гелий кишечника,
гематопоэтические клетки), могут содержать большое
число стволовых клеток, которые при соответ ву ющих
условиях будут иметь продолжительное время жизни.
В то же время в культурах, которые обновляются ис-
ключительно иод действием стресса (фибробласты,
мышечные и глиальные клетки), могут обнаруживаться
только детерминированные клетки-предшественники
с ограниченным временем жизни.
Таким образом, идентификация культуры клеток
проводится не только ко источнику in vivo (гематопо-
этические или глиальные клетки, гепатоциты ит.и.).
но также но их положению в линии дифференциров-
ки (стволовые клетки, предшественники или зрелые
дифференцированные клетки). Хотя предполагается,
что развитие по пути дифференцировки является
необратимым, данная концепция детерминации в
настоящее время подверг аегся сомнению [Kondo &
Raff, 2004; LeDouarin et al., 2004J. Возможно, некото-
рые клетки-цредшественники могут быть способны к
конверсии и реверсии до состояния стволовых клеток
и дедифференцироваться ио той же или иной линии
дифференцировки
Клеткам, происходящим из опухолевых, не требу-
ется адгезия для пролиферации и дифференцировки.
Таким образом, клетки крысиной гепатомы могут
пролиферировать in vitro, обладая некоторыми харак-
терными особенностями дифференцировки, однако,
чем ближе их фенотип к нормальному, тем в большей
степени индукция дифференцировки может инг ибиро-
вать пролиферацию. Отношение между положением в
линии дифференцировки и клеточной пролиферацией
может ослабляться: клетки меланомы В16 способны к
продукции большего количества пигмента при более
высокой плотности клеток и низкой скорости проли-
ферации ко сравнению с низкой плотностью и высоким
уровнем пролиферации. Несмотря на это, возможность
перехода между линиями дифференцировки еще не
установлена (см. разд. 17.4).
Глава 4
СТРУКТУРА И ПЛАНИРОВАНИЕ
ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ
4.1. ПЛАНИРОВАНИЕ
Главным требованием, которое характеризует культи-
вирование клеток в отличие от друтх лабораторных
методов, является необходимость поддержания асепти-
ческих условий. Хотя обычно экономически невыгодно
создание и поддержание большой асептической зоны,
важно, чтобы все помещения лаборатории, в которой
проводятся работы с культурами тканей, были чистыми
и не имели сквозного прохода. Появление и внедрение
ламинарных боксов (шкафов) значительно облепило
решение этой проблемы и позволило работать с культу-
рами клеток в неспециализированных лабораториях при
условии, что размещение оборудования соответствует
имеющимся требованиям (см. разд. 4.3.2,5.2.6,6.4).
При планировании новых помещений и приоб-
ретении оборудования следует учитывать несколько
моментов. Будет ли строиться новое здание или уже
имеющееся помещение будет переделываться в соот-
ветствии с новыми требованиями? В последнем случае
вы будете шраничены структурой уже имеющихся
помещений, переделывание воздуховодов и венти-
ляционных систем может оказаться очень дорогим,
изменение структуры помещений может быть связано
с удалением несущей нагрузку стены и стать дорого-
стоящим и сложным мероприятием. При строитель-
стве нового здания имеется больше возможностей для
осуществления необходимой планировки и разработки
Структуры лабораторных помещений, оборудование
может быть размещено более эргономично и энерго-
сберегающе, чем при необходимости распределять его
в соответствии со структурой помещений. Необходимо
учитывать следующие параметры:
1) Вентиляция
а) Равновесие давления. В идеале культуральные по-
мещения лаборатории должны иметь повышенное
атмосферное давление относительно друi их зон, для
того чтобы избежать заноса зараженного воздуха
извне. Однако использование материала, выделен-
ного из человеческих тканей, требует соблюдения
наиболее строгих требований безопасности, которые
относят лаборатории, в которых проводятся работы
ио культуре тканей, к категории I (см. разд. 7.8.1).
Соответствующие требования связаны с необходи-
мостью создания отрицательного давления в лабо-
раторных помещениях относительно других зон.
Для того чтобы удовлетворить обоим требованиям,
предпочтительным является создание буферной
зоны с положительным давлением вне культураль-
ных помещений, таких как подготовительная зона
или микроскопическая комната (см. рис. 4.3) или
коридор (см. рис. 4.4).
б) Ламинарные шкафы. Внимат ельно отнеситесь к раз-
мещению впускных и выходных систем воздуховода.
Предпочтительно раскола! ать ламинарный шкаф
так, чтобы поток выходящего воздуха направлялся
наружу, обеспечивая лучшую циркуляцию и уда-
ление тепла из помещения (300—500 Вт на каждый
ламинарный шкаф). Такое расположение облегчит
проведение обеззараживания формальдешдом, если
это потребуется. Вентиляционные колпаки, обра-
щенные во внешнюю сторону, с moi у т обеспечить
наилучший поток воздуха, требуемый для работы, и
необходимо лишь удостовериться, что приходящий
воздух из центральной вентиляционной системы
или локальных кондиционеров воздуха не смеши-
вается с чистым потоком воздуха из-под колпака
ламинарный шкафа. Предпочтительно оставлять
ламинарный шкаф постоянно работающим; в слу-
чае, если его включают только при работе, следует
выждать некоторое время д ля прохождения воздуха
через вентиляционный колпак
2) Размещение
а) Количество оборудования. Количество оборудо-
вания в помещениях культуральной лаборатории
зависит от количества работающих людей, от того,
сколько времени они будут работать еженедельно
и какой тип культуры они будут вести? С учетом
этих вопросов следует решать, сколько ламинарных
шкафов потребуется (с учетом того, CMOiyr ли ра-
ботники использовать бокс совместно или каждый
из них занимает ламинарный шкаф в течение всего
рабочего дня), и необходимо ли обеспечить большое
пространство для манипуляций с биореактором,
работой с животными тканями и большим количест-
вом различных линий клеток.
Ориентировочно, при работе лаборатории, состо-
ящей из 50 человек, выполняющих различную
работу, требуется 12 ламинарных шкафов (при их
совместном использовании).
6) Пространство. Сколько места требуется для обору-
дования и всей лаборатории?
4.1. Планирование
73
Самая большая площадь выделяется для манипу-
ляций с культурами, мде должны быть размещены
ламинарные боксы, счетчики клеток, центрифум и,
инкубаторы, микроскопы и некоторые основные
реагенты, среды, стеклянная и пластиковая посу-
да. Вторую ио величине площадь следует отдать
помещению для мытья, препаративных работ и
стерилизации. Третью комнате для хранения и
четвертую — для инкубации. Приблизительное со-
отношение площади в этих помещениях составляем
соответственно 4:2:1:1.
в) Асептическая зона. Если при работе сотрудников
лаборатории будет необходимость постоянной
работы в зоне содержания животных, следуем
обеспечить удобный доступ как к помещениям для
культивирования тканей, так и для комнат, в кото-
рых осуществляются манипуляции с животными,
однако так, чтобы при этом помещения не соприка-
сались. Окна в помещениях для культивирования
могут причинять неудобства, приводя к колебаниям
температуры в помещении, становясь причиной
ультрафиолетовой денатурации сред и инфици-
рованию микроорганизмами, если помещения не
обеззараживаются соответствующим образом.
г) Ламинарные шкафы. Пространство между лами-
нарными шкафами должно составлять не менее
500 мм для обеспечения свободном о доступа к ним
и снижения до минимума возможности интерфе-
ренции воздушных потоков. В это пространство
можно поместить передвижную тележку или сто-
лик на колесиках, на которых могут располагаться
бутыли, флаконы, реактивы, а также лабораторные
журналы
д) Инкубирование. В зависимости от того, какой тип
инкубирования используется в работе, выбираются
размеры, температура, мазовая фаза и расстояние
от места расположения инкубатора до рабочею
места. Используется ли обычное инкубирование в
термостате или термальной комнате без специаль-
ном'! мазовой среды либо требуется СО2-атмосфера
с повышенным уровнем влажности? Обычно боль-
шое количество флаконов или флаконы большому)
объема после мерметизацимм наилучшим образом
инкубируются в термальной комнате, в то время кам<
открытые чашки и иланшеты лучше хранить в СО, -
инкубаторе с повышенным уровнем влажности.
е) Подготовите юная мна. Оборудование для мытья и
стерилизации должны быть расположены: 1) близко
к асептической зоне, которую онмм обслуживают', мм
2) вммлотную к стене, выходящей наружу, для того
чтобы обеспечить лучшее удаление тепла из ммечей
и потоков пара из ммаровых вентилей автоклавов.
Обеспечьте хорошим: обзор и приемлемое простран-
ство, приятное для взгляда персоммалу, работающему
настерммлизационном, моющем мм подмугговительном
оборудовании. Обычно ohmi выполняют свою работу
ммериодически, в то время как научные сотрудникмм
постоянно смотрят в ламинарный шкаф и не нуж-
даются в приятной обстановке.
ж) Обслуживание асептической .юны. Выясните, бу-
дет ли нужен лифт ил мм достаточно эстакады мглмм
пандуса? В последнем случае важно знать, каков
необходимый угол наклона и максимальный груз,
который можно перевозить вверх ио наклону без
ммсммользованмя механммческих устройств?
з) Хранение. Каковы масштабы иредцоламаемого
хранения, и каких размеров пространство может по-
требоваться для хранения одноразовой пластиковой
посуды? Каков ммредммоламаемый объем работе кле-
точными линиями, обусловливающий требования
к помещению для сосудов с жидким азотом?
3) Реконструирование. Если ммредммолагается пере-
оборудование существовавшммх прежде помещений,
учитывайте оммределенные структурные ограни-
чения mi тщательно выбммрайте местоположение,
избемая тесноты mi трудновыполнимых ммроектов
ммспользования комнат, в которых маневренность
ограничена.
4) Доступ. Удостоверьтесь, что обе створки дверей
открываются достаточно широко, что высота дверей
и потолков достаточна для обееммеченммя установки
такому» оборудования, кам< инкубаторы, автоклавы.
При этом помните, что ламинарным'! шкаф требует
доммолнммтельного пространства над верхнем'! ммоверх-
ностыо для установки воздухомзода. Удостоверьтесь,
что дверном*! ммроход и ммространство между оборудо-
ванммем обеспечивает достумм для ему» техническому)
обслуживания.
5) Карантин. Какой карантин требуется для вашей
лаборатории? Вновь поступившие клеточные линии
и биоммсийн ые образцы должны быть исследованы на
предмет контамммнацмми микоплазмами до того, как
онм: будут переданы в те комнаты, мде проводятся
работы с основными линиями. Некоторые линимм
клеток человека и приматов, а также клеточные
линии, ммотенциально представляющие собой
бммоломическую опасность, требуют изоляции (см.
разд. 7.8.1).
Изучение этих воммросов позволит вам решить, каких
размеров мюмещения вам требуются. Каков предполама-
емый тимм устройства лаборатории: одна ммлмм две малень-
ких комнаты (рис. 4.1,4.2) либо комммлекс ммомещений,
включаюмщмй моечную, стерилммзамхионнумо, одну или две
асептических зоны, инкубационную комнату, темную
комнату для флюоресцентной микроскоммим! mi микрофо-
тографпи.холодпльную комнату мм хранилище (рис. 4.3)?
Прмм сравнении с традиционно расмюложенными в ряд
комнатами мм единственным ламинарный шкам)>ом в изо-
лированном': комнате лучшммм вариантом является одно
специально спланированное для культуральных работ
иомещенм:е со смежной подготовительной зоной и ря-
дом меньших комнат с общем*! цодму»товительной зоной.
Отдельное ммомещение обеспечивает лучшую защммту
от заражения, ммозвиляет хранить клеточные ростковые
ЛИНМ1М! отдельно от реактивов и стеклянном': посуды м: в
любом случае потребуется при работе с клетками чело-
века или приматов (см. разд. 7.8.1).
74
ГЛАВА 4. СТРУКТУРА И ПЛАНИРОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ
Обычный инкубатор
Влажный СОг-инкубатор
Баллоны с жидким
СОгс автоматическим
реле переключения
Подводка СО
Холодильник
Морозит
Рабочий стол с
полками над ним
Поступление воздуха или
расположение кондиционера воздуха
Сервисная тележка
Стеллаж для хранения
Центри-
/"~л Цент;
Фуга
-----Стерилизационная печь
-Автоклав
/ ВОДЫ
Ljj
Водяная
Аппарат
для -
очистки
воды
Подводка
деионизированной
воды ,
Счетчик
клеток
Инвертированный
микроскоп
Стол для
.подгото-
вительных
работ
Ламинарный шкаф (II класса
биологической защиты) с
полной очисткой воздуха
Удаление воздуха
Главный вход, двойные
асимметричные двери-
Двухуровневая сушильная печь
(с высоким и низким уровнями
температуры)
Раковины для замачивания Раковины для мытья
Рис. 4.1. Небольшая лаборатория культивирования тканей. Возможная планировка простой автономной лаборатории куль-
тивирования тканей для 2-3 сотрудников Темным цветом выделены области, занимаемые перемещаемым оборудованием.
Области светлого цвета закрепленная или перемещаемая мебель. Масштаб 1.100
Ламинарный шкаф (II класса биологической
защиты) с полной очисткой воздуха
I I I
Инвертированный Счетчик
микроскоп теток
— Сераисная тележка
Полки для реактивов
(стерильные жидкости)
Двухуровневый
обычный инкубатор
Двухуровневый влажный
СОг-инкубатор
Подводка СО2 --------
Баллоны с жидким СО2с
автоматическим реле
переключения
Главный вход двойные
асимметричные двери
Сервисная тележка----
Поступление воздуха
— или расположение
кондиционера воздуха
—Холодильник
— Морозильник
Я хранения
7 Сборный Раковины для
поток Раковина замачивания
^-4 А ; ы
— Центрифуга
Удаление воздуха
Рис. 4.2. Лаборатории культивировании тканей средних размеров. Планировка лабаратщннт для 5—6 сотрудников, с моечной
и подготовительной зоной, расположенными в другом помещении. Темным цветом выделены области, занимаемые перемеща-
емым оборудованием Области светлого цвета - закрепленная или перемещаемая мебель. Масштаб 1:100
4.1. Планирование
7S
Рис. 4.3. Лаборатория культивирования тканей с прилежащими препаративными комнатами. Возможная планировка лабора-
тории культивирования тканей средних размеров (см. рис. 4 2). нос при лежащими подготовительной зоной, микроскопической
комнатой и термостатируемой комнатой на 37 °C. Масштаб 1.100
Рис. 4.4. Большая лаборатория культивирования тканей. Продли! асмая планировка подходит для 20—30 сотрудников Рядом
рашюложены моечная, счерилизационная и препаративная зоны 37 °C. Темным цветом выделены области. занимаемые обору-
дованием. Области светлого цвета - закрепленная или 1|срсмсщасмая мебель. Масштаб 1.200
76
ГЛАВА 4. СТРУКТУРА И ПЛАНИРОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ
4.2. ОБСЛУЖИВАЮЩИЕ СИСТЕМЫ
И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ СЛУЖБЫ
Комнаты должны быть оборудованы системой фильт-
рации воздуха. Если лаборатория культивирования
тканей будет относиться к I категории безопасности
(см. разд. 7.8.1), следует* обеспечить отрицательное
относительно дру! их помещений давление воздуха.
В этом случае смежные помещения, которые ведут в
асептическую зону, необходимо рассматривать как бу-
ферную зону и также установить систему фильтрации
воздуха, но с положительным давлением
Оборудование в комнатах должно располагаться так,
чтобы не затруднять уборку помещений. Мебель долж-
на прочно прикрепляться к полу или располагаться на
подставке или на ножках с тем. чтобы пространство
под ней было достаточным для уборки. Пол должен
иметь виниловое или иное пылезащитное покрытие, а
также небольшое понижение уровня ио направлению
к стоку в иолу, расположенному за дверью комнаты
(за пределами стерильной зоны). Это обеспечит более
свободное обращение с водой при мытье полов и, что
более важно, защитит оборудование от повреждения
при переполнении раковины или автоклава.
При возможности желательно отделить комна-
ты, непосредственно предназначенные для работы
с культурами тканей, от препараторских, моечных
и стерилизационных помещений (см. рис. 4.3, 4.4).
Следует обеспечить необходимый водоток из ирепа-
ративной/моечной зоны с небольшим наклоном иола
со стороны культуральной зоны но направлению
к моечной. Если у вас есть большая лаборатория с
отдельными помещениями для моечной и стерилиза-
ционной, удобно разместить их на том же уровне пола,
чтобы не создавалось неудобства при перемещении
тяжестей при помощи тележки. Размещение напротип
через коридор является идеальным (см. рис. 4.4, см.
также разд. 4.3).
Постарайтесь представить себе потоки движения
людей, реактивов, тележек и т. д. и расположите обору-
дование так, чтобы обеспечить минимум конфликтов,
ле! кий и близкий доступ к хранилищу, хороший доступ
к пополняемым запасам без нарушения стерильности в
асептической зоне, а также лет кое удалении и уничто-
жение испорченных и загрязненных объектов.
Требуемое обслуживание включает подключение
к источникам питания, горючим 1азам (бытовой ме-
тан. пропан и т. д.). сжатому воздуху и СО,и создание
вакуума. Обычно электрическое питание обеспечива-
ется недостаточно — как в количестве электрических
розеток, так и в напряжении в сети. Определите коли-
чество оборудования, которое должно обеспечивать-
ся бесперебойным электроснабжением; учтите, что
число электроприборов и энергопотребление, которое
потребуется в будущем, втрое увеличится и поста-
райтесь обеспечить необходимое электроснабжение.
Предпочтительно располагать каждый электрический
прибор рядом с розеткой или, по крайней мере, рядом
с 1лавным распределительным щитом.
Гораздо сложнее оценить потребности в газе, по-
скольку в данном случае необходима информация о
конкретных возможностях iазоснабжения в вашем
pei ионе. Электричество представляет собой более чис-
тый и ле! коуправляемый источник энергии, однако газ
может быть дешевле и надежнее. Обычно потребность
в горючем газе определяют местные условия.
Если есть возможность, лучше обеспечить подводку
СО2 в лабораторные помещения но трубам. Установка
такой подводки надежнее обеспечит инкубаторы и
окупит себя за счет стоимости баллонов с yi лекислотой
для СО,-пнкубируемых культур (см. разд. 5.3.2). Для
обеспечения необходимой газовой смеси (см. Прило-
жение II) на рабочих местах могут быть установлены
счетчики газа и краны-смесители.
Сжатый воздух обычно не требуется, поскольку в
СО2-инкуба горах состав газовой смеси ре1улируется
за счет поступления чистого СО2. Однако при необ-
ходимости должна иметься возможность получения
смеси газов на каждом рабочем месте. Сжатый воздух
также используется для удаления ватных пробок из
стеклянных пипеток до их мытья и может потребовать-
ся для некоторых видов моечных машин (например,
Scienlek 3000).
Вакуумная установка очень полезна для опорожне-
ния культуральных флаконов, при этом для успешной
работы следует соблюдать некоторые меры предосто-
рожности. Коллекторные сосуды должны быть обору-
дованы промежуточными сосудами с шдрофобными
фильтрами для обеспечения защиты от попадания
жидкостей, паров или дру! их загрязнений в систему.
Вакуумный насос также должен быть защищен от
небрежного оставления во включенном состоянии.
Обычно это достигается использованием ножной пе-
дали, которая включает систему вакуумного отсоса и
выключается при убирании hoi и с педали. Во многих
отношениях, лучше обеспечить каждое рабочее место
индивидуальным перистальтическим насосом (см.
рис. 5.1—5.3) или установить один насос на два рабочих
места (например, Integra Vacusafe, см. рис. 5.3).
4.3. ПЛАНИРОВАНИЕ АСЕПТИЧЕСКИХ
КОМНАТ ИЛИ БЛОКОВ
В .лаборатории необходимо обеспечить проведение
шести необходимых процессов.* стерильных манипуля-
ций. инкубирования, препаративных работ, мытья, сте-
рилизации и хранения (табл. 4.1). Если используется
одна комната, го следует создать «градиент стерильнос-
ти s>; чистая зона для стерильных манипуляций должна
быть расположена на одном конце комнаты, наиболее
удаленном от дверей, а оборудование для мытья и сте-
рилизации должно быть расположено на другом конце,
отделенное подготовительной зоной, инкубационной
зоной и хранилищем. Под! отопительная зона должна
находиться рядом с моечной и стерилизационной зона-
ми, хранилище и инкубаторы должны быть доступны
из стерильной зоны (см. рис. 4.1—4.4).
4.3. Планирование асептических комнат или блоков
77
Таблица 4.1. Помещения культуральной лаборатории
Минимальные требования
Стерильная зона, чистота, тишина, минимум не
ремещенпя люден, нет сквозного прохода
Отдельно от помещений, в которых содержатся
животные или ведутся микробиологические
работы
Подготовительная зона
Моечная зона (не обязательно на площади куль-
туральной лаборатории, но, по крайней мере,
по соседе 1ву с ней)
Пространство для инкубаторов
Хранилище:
Жидкости, атмосферный воздух, 4 °C, -20 “С
Стеклянная посуда(полки)
Одноразовый пластик (полки)
Небольшие предметы (ящики)
Специальное оборудование (шкафы с плавным
наворотом, стенные шкафы)
Химические реактивы (атмосферный воздух,
4 °C, -20 °C, moi ут располагаться рядом с
жидкостями при соблюдении условия хра-
нения в герме! йчных сосудах, предупрежда-
ющих обезвоживание)
Баллоны СОг
Хранилище для жидкого азота
Морозильное оборудование
Водосток
Желательное оборудование
Фильтрованный воздух (конди
пионер)
Система обслуживания по сосед-
ству с культуральной зоной
Отдельная препараторская ком
Горячая комната с регистрирующим
оборудованием
Отдельная стерилизационная
комната
Отдельное хранилище для
баллонов
Рекомендуемое дополнительное
оборудование
Подводимый по трубам СО?
Сжатый воздух
Хранилище для запасов пластика
Карантинное помещение
Изолятор (может использоваться как
карантинное помещение)
Хранилище X. (емкость около 500л)
и отдельное хранилище для мо[ю-
зильного оборудования
Микроскопическая комната
Темная комната
Вакуумная система
4.3.1. Помещение для стерильных
манипуляций
Стерильные процедуры следует проводить в спокой-
ной части культуральной лаборатории, специально
выделенной для этих целей (не следует, например,
здесь также работать с химическими реактивами или
с дру! ими opi анизмами, например бактериями либо
дрожжами). Через культуральную зону не должно быть
сквозило прохода пли каких-либо иных действий,
связанных с запылением или движением воздуха. Если
нет возможности использовать ламинарный шкаф,
используйте отдельную комнату или отгороженное
пространство для стерильных манипуляций. Рабочая
зона в самом простом виде представляет собой по-
верхность. покрытую ламинатом, преимущественно
белую или нейтрально-серую для обеспечения лучшего
исследования культур, проведения анатомирования и
т. д. Такое покрытие позволяет также точнее определить
pH с помощью фенолового красного в качестве индика-
тора. Не следует ниче| о хранить на поверхности этого
стола, и все полки над ним должны использоваться
только для предметов, связанных со стерильной рабо-
той (например, для хранения стерильных пипеток и
инструментов). Рабочий стол также должен свободно
стоять (отстоять от стены) либо закрепляться у стены
уплотнительной полосой или замазкой
4.3.2. Ламинарное оборудование
Появление и введение в практику ламинарный шка-
фов и боксов со стерильным воздухом, поступающим
на рабочую поверхность (см. разд. 5.2.1 и рис. 5.1, 6.2)
обеспечивают больший контроль стерильности при
более низкой себестоимости, чем оборудование и
поддержание стерильной комнаты. Индивидуальные
отдельно стоящие ламп парные боксы наиболее пред-
иочтительны, поскольку они разделяют операторов и
их удобно обойти, однако можно использовать стенные
и потолочные ламинарные колпаки, объединенные и
батареи. При индивидуальных рабочих местах в сте-
рильную область попадают только руки оператора, в то
время как повтором случае отсутствуют боксы и опера-
торы являются частью рабочего просгранства. При этом
имеется большая свобода передвижения, в том числе
с большими передвижными аппаратами (такими как
роллерные тележки с бутылями, биореакторы и г.д.),
требуется большее усилие со стороны операторов для
того, чтобы не разрушать ламинарного потока. Кроме
того, необходимо носить стерильные шапочки и накид-
ки. чтобы избежать заражения культур.
Выбрав ламп парное оборудование, соответствующее
вашим задачам и возможностям, - свободностоящее
или настольное, — обеспечьте достаточное место для
помещения ног под ним вместе с насосами, аспиратора-
78
ГЛАВА 4. СТРУКТУРА И ПЛАНИРОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ
ми и т.д. Свободностоящие боксы д<ыжны растима! ать-
ся на блокируемых роликах, так чтобы их можно было
перемещать при необходимости. Стулья должны быть
подходящего веса, с изменяемыми высотой сиденья и
yi лом наклона спинки. Их конфигурация должна поз-
волять оператору придвинуться вплотную к переднему
краю ламинарного стола для удобной работы в боксе.
Небольшая тележка, либо перемещаемый столик или
складной откидной столик (не больше 300—500 мм)
должен находиться рядом с каждым ламинарным бок-
сом для материалов, которые MOiyr потребоваться, но
постоянно не используются.
Расстояние между рядом стоящими боксами долж-
но быть не менее 500 мм, а при противоположном
стоянии - 2000 мм между передними поверхностями.
Ламинарные боксы следует рассматривать как час гь
конструкции здания, поскольку они будут оказывать
влияние на систему вентиляции.
4.3.3. Карантин и изоляция
Если позволяет структура помещения лаборатории,
очень ценным будет выделить отдельную комнату для
карантина н/или изоляции (см. рис. 4.4). Это отде-
льная асептическая комната с отдельным ламинарным
колпаком (микробиолО1 ический кабинет II класса
безопасности), инкубаторами, морозильником, холо-
дильником, центрифугами, электрической подводкой
и другими устройствами. Такая комната должна быть
отделена от остальных помещений дверью или воздуш-
ной шлюзовой камерой и иметь отрицательное давле-
ние относительно остальной асептической зоны. Все
манипуляции с вновь доставленными в лабораторию
клеточными линиями или биопсийным материалом
проводятся только в этом помещении, пока не будет ус-
тановлено, что они свободны от заражения, в частности,
микоплазмами (см. разд. 19.3.2 и протоколы 19.2,19.3),
а также друшми возбудителями, такими как HIV или
вирус гепатита В. Если позволяют существующие пра-
вила внутреннего распорядка, эта же комната в другое
время может быть использована как изолятор II уровня
защиты. При использовании для более высокого уровня
защиты потребуется соответствующий кабинет, обору-
дованный в соответствии с требованиями биологичес-
кой опасности, либо ламинарный шкаф с отдельным
воздуховодом для выведения воздуха, оборудованным
ловушкой для возбудителей (см. разд. 7.8.2).
4.3.4. Помещения для сервисных служб
Очень удобно иметь tpytiuy помещений, в которых
будут раскола! аться счетчик клеток, микроскопы и т.д.
поблизости от зоны стерильных манипуляций, а так-
же разделяющих пространство или отделяющих одну
часть комнаты от другой (см. рис. 4.1 1.4). Сервисные
помещения также включают в себя хранилища для
стерильной стеклянной посуды, одноразового пластика.
пинеток, колпачков и крышек, шприцов и т.д. в закры-
тых ящиках внизу и открытых полках над ними. Эти
помещения moi ут также использоваться для другого
дополнительного оборудования, такого как маленькие
центрифути, и следует обеспечить доступность eto
использования при необходимости.
4.4. ИНКУБАЦИЯ
Требования к чистоте в зоне инкубации не такие стро-
гое, как для зоны, в которой проводятся стерильные
манипуляции, но чистый воздух, низкий уровень фи-
зических помех и минимальные перемещения в этой
зоне обеспечат более успешное избщание загрязнения
пылью и спорами, кроме того, здесь меньше потоки
воздуха, способные переносить их.
4.4.1. Инкубаторы
Инкубацию можно проводить в отдельных инкуба-
торах или в термостатируемой (термальной) комнате
(рис. 4.5). Если требуется только один пли два инкуба-
тора, это экономически оправданно и выгодно г точки
зрения занимаемой площади; однако как только вам
понадобится более чем два инкубатора, их общая стои-
мость начинает превышать стоимость оборудования
термальной комнаты, а их использование менее удобно.
Кроме того, инкубаторы теряют большое количество
тепла при открывании и медленнее восстанавливают
температуру, чем термальная комната. По приблизи-
тельной оценке, на каждого работника потребуется
0,2 мч(200 л) инкубируемого пространства при площа-
ди полки 0,5 м2. Может понадобиться дополнительное
пространство для одного или более инкубаторов с конт-
ролируемым уровнем СО2 и повышенной влажностью
в атмосфере.
4.4.2. Термальная комната
Если у вас есть площадь в лабораторной зоне или
имеется смежная комната либо оборудованная и при-
способленная для хранения холодильная камера, их
можно переоборудовать в термальную комнату (см.
рис. 4.5). Эта зона не должна иметь каких-то особых
конструктивных приспособлений, кроме теилоизоля-
ции, предотвращающей появление холодных участков
на стенах. Для теплоизоляции поверхности обшивают
пластиковыми панелями, покрытыми ламинатом, от-
деленными от стен слоем стекловолокна, стекловаты
или огнеупорной ценой толщиной слоя около 5 см.
Отметьте расположение крепежных элементов пане-
лей, с тем чтобы укрепить здесь стеллажи, если они
будут использоваться. Используйте разборные полки.
Пространство между полками должно иметь высоту не
более 500—600 мм, чтобы опоры не позволяли полкам
прогибаться. Предпочтительно использование пере-
4.4. Инкубация
79
ДВПЖНЫХ полок, поскольку они позволяют произво-
дить уборку стеллажей и комнаты. Расстояние между
полками должно составлять 200—300 мм, используйте
более широкие полки (450 мм) внизу и более узкие
(250—300 мм) выше уровня глаз. Перфорированные
полки устанавливаются на кронштейны, ретулируемые
ио высоте крепления. Полки должны быть плоскими и
абсолютно горизонтальными, что исключает падение
Не стоит недооценивать пространство, которое
вам потребуется в течение всею времени существо-
вания термальной комнаты. Оборудование несколько
большей комнаты незначительно повышает стоимость
работ. Подсчитайте стоимость работы на основе коли-
чества полок, которое вам требуется, если вы только
начинаете работу, умножьте это количество на 5 или
10: если вы уже работаете в течение какого-то времени,
умножьте на 2 или 4.
Следует, насколько возможно, избегать деревянной
мебели, поскольку дерево может коробиться при дей-
ствии тепла и быть источником вредителей.
В определенной части термальной комнаты должны
быть оборудованы небольшие столы и полки пред-
почтительно из нержавеющей стали или твердого
пластика. Приспособьте эти столы для установки
инвертированного микроскопа, обследуемых фла-
конов и тетради. Если вы предпола1аете выполнять
эксперименты по синхронизации клеток или некие
стерильные манипуляции при 37 °C, также следуеч
обеспечить пространство для небольшого вытяжного
колпака с размерами фильтра 300*300 или 450x450 мм,
прикреплении! о к стене или к подставке, расположен-
ной выше рабочей поверхности. В этой же комнате,
помимо того, может располадеться небольшой лами-
нарный шкаф (ширина не более 1000 мм). Двшатель
вентилятора должен быть специально приспособлен
для работы в тропических условиях и не должен по-
стоянно работать. При постоянной работе он будет
производить тепло, и в условиях термальной комнаты
мотор перегреется и uepei орпт.
Как только будет оборудована термальная комната,
сотрудники дру> их лабораторий захотят использовать
ее пространство для целей, не относящихся к куль-
тивированию тканей, поэтому пространство рабочих
поверхностей и полок следует рассчитывать так,
чтобы обеспечить возможность инкубации пробирок,
установки шейкеров пт.д. Однако категорически
препятствуйте использованию термальной комнаты
для работы с микроорганизмами. такими как 6ак1ерип
или дрожжи.
Следует отдавать предпочтение лампам нака-
ливания, поскольку флюоресцентные лампы мшут
вызывать разрушение среды. Кроме того, некоторые
флюоресцентные трубки включаются в условиях тер-
мальной комнаты.
Температуру в горячей комнате контролируют с
точностью до ±0,5 °C в любой момент времени, что
зависит от точности и чувствительности контроль-
ной аппаратуры, расположения сенсоров термостата,
циркуляции воздуха в комнате, типа теплоизоляции
и выделения тепла при работе другого оборудования,
находяще! оси в комнате.
Нагреватели. Обогрев наи лучшим образом обеспе-
чивается путем использования теплодувных вентиля-
торов бытового или промышленного предназначения,
в зависимости (п объемов комнаты. На 20 м3 объема
комнаты потребуется на1реватель приблизительно
2—3 кВт мощности (можно использовать два на!рева-
теля каждый мощностью 1,0—1,5 кВт), в зависимости
от типа изоляции. Вентиляторы при нагреве должны
работать постоянно, и мощность на1ревательного
элемента должна ре1улироваться контролирующими
аппаратами
Циркуляция воздуха. Второй вентилятор, рас-
положенный в противоположной стороне комнаты,
должен осуществлять движение воздушного потока,
обеспечивая максимальную циркуляцию. Если комната
но размерам превышает 2x2 м, может потребоваться
специальное оборудование для распределения потоков
воздуха. О1разсдение у1лов (см. рис. 4.5а) часто пред-
ставляет собой наиболее простой и экономичный спо-
соб обеспечения равномерного распределения потоков
по пространству комнаты. В длинной прямоугольной
комнате можно построить перегородки, однако поза-
ботьтесь о том, чтобы они были теплоизолированы и
достаточны крепки, чтобы выдержать крепление на
них полок.
Термостаты. Термостаты должны быть типа «про-
порциональный автоматический pei улятор», действо-
вать через реле, обеспечивающее поступление тепла
со скоростью, пропорциональной различию между
комнатной температурой и установленным режимом.
Koi да двери открыты и температура в комнате надает,
восстановление ее должно быть быстрым; с другой
стороны, температура не должна превышать некото-
рой установленной отметки, и чем ближе температура
комнаты к этой точки, тем меньше должно поступать
В идеале, необходимы два отдельных нагревателя
(Н1 и Н2). каждый со своим собственным термостатом
(НТ1 и НТ2). Термостат (НТ1), установленный на
37 °C, располагают позади вентшштора (F1) напротив
нагревателя (Н1) по диагонали комнаты. Другой
термостат (НТ2) распола1ается напротив нагревателя
Н2 и за вентилятором F2 и должен быть установлен на
36 °C. (см. рис. 4.5а). Два корректирующих термостата
(ST 1 и ST2) обеспечивают безопасность и работают как
предохранители один последовательно соединен с
НТ1 и установлен на 38 °C, другой находится в соеди-
нении с основным блоком пит ания обоих нагревателей.
Если первый на: рева гель задержится на температуре,
превышающей установленную, ST1 сработ ает' как пре-
дохранитель и прервет сеть и второй нагреватель (Н2)
будет обеспечивать температуру с участием регулиру-
ющего термостата НТ2. Если второй нагреватель также
перегреется, ST2 выключит работу всей нагревающей
системы (табл. 4.2). Следуетустановптьиндикаторные
сш нальные лампы, показывающие включение ST 1 и
ST2. Термостатные сенсоры для обеспечения большей
80
ГЛАВА 4. СТРУКТУРА И ПЛАНИРОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ
Рис. 4.5. Термальная комната. Комбинированная система топления и предохранительное термпрслс {а) план, вид сверху,
(6) диагональное сечение Стре чки показывают циркуляцию воздуха. Планировка и дизайн помещения разрабт аны в сотрудниче-
стве с М McLean (архитектурный дизайн, Boswcl & Johnson) и Lindsay (инженерное решение. Kenneth Munro & Associates)
Таблица 4.2. Термостаты термальной комнаты
Термостат 37 °C <37 °C «37 °C >37 С <38 "С >37 °C >38 “С >37 С >39 С
НТ1 О 1 1 О О О
ST1 ] ] ] ] О О
НТ2 О О ] О о О
ST2 ] ] ] ] О
Аварийная лампа ST1 ♦ ♦
Аварийная лампа ST2 ♦
I = включен, О = выключен, ♦= сшнальная лампа светится.
НТ1 регулирующий термостат для на1рева|еля Hl, НТ2 регулирующий термостат для нагревателя Н2. ST1 автомати-
ческий блокирующий термостат-предохранитель для Н1, ST2 — автоматический блокирующий термостат-предохранитель д.ш
единого источника питания Hl и Н2.
4.S. Помещения для подготовительных работ
81
чувствительности должны располагаться в области
быстрых потоков воздуха, поблизости от места выхода
воздуха из второго вентилятора, обеспечивающего цир-
куляцию. Предпочтительно использовать термисторы
или термопары, имеющие более высокую чувствитель-
ность и высокую температурную проводимость по
сравнению с другими типами датчиков.
Перегрев. Большое внимание обычно уделяется
обеспечению достаточного количества тепла и умень-
шению потерь анергии, при этом часто забывают о
проблеме нежелательно! о избы точного поступления
тепла. Оно может быть результатом: 1) возрастания
температуры в окружающей среде в лаборатории в
жаркую погоду или 2) увеличения количества тепла,
производимого работающим в горячей комнате обору-
дованием. таким как мешалки, роллерные установки,
ламинарные мини-боксы и т.д. Постарайтесь избе1ать
установки теилоироизводящею оборудования в тер-
мальной. Магнитные мешалки, работающие по прин-
ципу магнитной индукции, производят меньше тепла,
чем механически вращаемые машиты, а двигатели,
обеспечивающие работу роллерных установок, могуч
располагаться вне термальной комнаты. В тропиче-
ских регионах или других зонах, где перегрев может
быть частой проблемой, возможно, потребуется обо-
рудовать охлаждающие теплообменники для отвода
избытка тепла.
Доступ. При наличии необходимого указанного
выше оборудования, хорошей циркуляции воздуха и
адекватного наг рева воздушный запор не требуется.
Двери должны быть теплоизолированы (пенопластом
или стекловолокном), лег кпми и без труда закрываться.
Предпочтительны замозакрывающиеся двери. Полезно
также иметь шлюзную камеру, ведущую в зону культи-
вирования тканей, с полками на обеих сторонах, чтобы
культуры могли ле! ко передаваться в комнату. Дверь
шлюзной камеры также должна иметь изоляционное
покрытие. Расположение шлюзовой камеры над столом
позволит избежать риска появления «холодных пятен»
на полках.
Термометр. Самописец, регистрирующий колеба-
ния температуры, необходимо установить в термальной,
чтобы регистрационная кривая была видна сотрудни-
кам, работающим в культуральной комнате. Диаграммы
должны еженедельно сниматься с самописца. При воз-
можности следует установить две предупреждающих
лампы: одну высокотемпературную и одну низкотемпе-
ратурную. Лампы располагают позади самописца либо
в другом месте, доступном для наблюдения.
4.5. ПОМЕЩЕНИЯ ДЛЯ
ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫХ РАБОТ
4.5.1. Приготовление сред
В маленькой лаборатории можно избежать потребности
в постоянном прш отоплении питательных сред, если
существует испытанный источник подходящих ком-
мерческих культуральных сред. Однако в большом
учреждении (примерно 50 человек, работающих в куль-
тивировании тканей) может обнаружиться, что более
экономично приготовление сред непосредственно в ла-
боратории. Меньшие лаборатории могут предпочитать
закупку готовых сред. Этим лабораториям не нужно
г отопит реагенты, такие как солевые растворы, раствор
этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), бутилировать их
и воду, упаковывать п герметизировать, подготавли-
вать к стерилизации. В этом случае препаративная
зона должна быть чистой и тихой, но стерильность
не нужна, поскольку все покупаемые продукты будут
стерильны.
Если трудно получить приемлемые коммерческие
среды, то препаративная зона лаборатории должна
быть достаточно большой для того, чтобы расположить
там грубые и точные весы, pH-метр и, если возможно,
осмометр. Пространство рабочего стола должно быть
достаточным для разведения и перемешивания раство-
ров, бутилирования и упаковки различных материалов.
Иногда требуются дополнительное оборудование и
полки в холодильниках. Если возможно, установите в
стерильной зоне дополнительный ламинарный шкаф
с горизонтальным потоком для фильтрации и бутили-
рования жидкостей, а в инкубаторе обеспечьте место
для проведения контроля стерильности (например,
инкубация образцов среды в бульоне и при посеве на
чашки).
Термостабильные растворы и оборудование можно
автоклавировать или стерилизовать сухим жаром в
нестерильной части препаративной зоны Оба пото-
ка реагентов затем встречаются в зоне хранения (см.
рис. 4.3).
4.5.2. Помещение для мытья посуды
Лучше располагать моечное и стерилизационное поме-
щения вне культуральной лаборатории, поскольку рас-
пространение образующихся влажности и тепла может
быть затруднительным без превышения допустимого
уровня движения воздушных потоков. Автоклавы, печи,
дистилляторы при возможности располагают в отдель-
ной комнате (см. рис. 4.3,4.4), с мощной системой вен-
тиляции. Моечная зона требует много пространства для
замачивания стеклянной посуды, для расположения
моечных машин, ес.ш они вам потребуются. На рабочих
столах должно быть достаточно места для манипуля-
ций с контейнерами с посудой, сортировки пипеток,
упаковки и герметизации оборудования, готового к
стерилизации. Кроме того, вам нужно место для мытья
и сушки пипеток. Если оборудование для стерилизации
должно располагаться на те|>ритории культуральной
лаборатории, поместите его рядом с вытяжным боксом
и подальше от стерильной зоны.
Вид моечною оборудования зависит от целей, ко-
торые ставят перед лабораторией. Наилучшими явля-
ются нержавеющие или полипропиленовые раковины.
Первые предпочтительнее, если вы планируете работу
82
ГЛАВА 4. СТРУКТУРА И ПЛАНИРОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ
Блок для ионизации
воды или установка для *
обратноосмотической
очистки (RO)
Рис. 4.6. Раковина для мойки и моечная машина для пипеток. Предполагаемый план оборудования для замачивания и мытья
с горячей, холодной и деионизированной водой Масштаб 1.16
с изотопами, последние устойчивее к действию дезин-
фектантов, в частности i ииохлорида
Раковины должны быть достаточно глубокими
(450 мм) для того, чтобы обеспечить работу моечной
машины и споласкивание больших предметов, и рас-
ползаться так. чтобы не приходилось сутулиться при
работе. Ободок раковины должен находиться на высоте
около 900 мм от пола (рис. 4.6). Лучше разместить
слишком высоко, чем слишком низко, низкорослые
работники moivt всегда встать на подставку, чтобы
достать слишком высоко расположенную раковину,
но высокие люди BCeiaa вынуждены будут наклонять-
ся над слишком низко расположенной раковиной.
Приподнятые края раковины позволят предупредить
ралбрыЗ! ивание и предохранить оператора от загрязне-
ний и обливания, которые неизбежны при наклоне над
раковиной. Поднятые края должны проходить вокру|
раковины за кранами.
Каждая раковина, предназначенная для мытья посу-
ды, требует четырех кранов: отдельный кран холодной
воды, смеситель с кранами горячей и холодной воды,
кран холодной воды для отводного шланга для соедине-
ния с оборудованием AjIh ополаскивания, а также неме-
таллический или нержавеющий кран для деионизиро-
ванной воды из резервуара над раковиной (см. рис. 4.6).
Избегайте централизованного обеспечения деионизиро-
ванной водой, поскольку трубы быстро загрязняются,
зарастают водорослями и трудно очищаются.
Тележки или перемещаемые столики часто ис-
пользуются для сбора |рязной стеклянной посуды
и перераспределения свежестерилизованного обо-
рудования и материалов. Спланируйте место для их
размещения.
4.5.3. Хранение
Обеспечьте отдельное хранение стерильных и несте-
рильных объектов, которые должны быть снабжены
четкой маркировкой. Необходимо спланировать хра-
нение следующих объектов:
1) Стерильные жидкости, цри комнатной температу-
ре (растворы солей, вода и т. д.), при 4 °C (среды)
и при 20 "С или —70 °C (сыворотки, трипсин,
глютами н и т. д_).
2) Стерильная и нестерильная стеклянная посуда,
включая бутылки для среды и ни пе ч ки
3) Стерильный одноразовый пластик (например, куль-
туральные плашки, чашки Петри, центрифужные
ц|хюирки и флаконы, шприцы и т.д.)
4.5. Помещения для подготовительных работ
83
Рис. 4.7. Хранилище для жидкого азота и морозильное оборудование. Хранилище для жидкого азота лучше располагать рядом
с наружной стеной в помещении, оборудованном вентиляцией из здания наружу, а также дверью, обеспечивающей легкий доступ
для получения доставленного азота Если морозильное оборудование располагав ich ио соседе гну, морозильные установки могут
заполняться непосредственно путем поступления газа через гибкий шланг В процессе заполнения двери должны оставаться
открытыми для лучшей вентиляции, настенный измеритель уровня кислорода с сигналом тревоги, детектор которого распола-
гает ея на у|ювне пола, при обнаружении падения уровня кислорода в воздухе ниже безопасного должен подать сш нал
4) Навинчивающиеся крышки, пробки и т. д., стериль-
ные и нестерильные.
5) Фильтры и подобные аппараты, стерильные и не-
стерильные
6) Перчатки, упаковочные мешки и т.д.
7) Жидкий азот для пополнения морозильных уст-
ройств; жидкий азот может храниться двумя спо-
собами:
а) в сосудах Дьюара (25 50 л) под рабочими сто-
лами ИЛИ
б) в больших емкостях для хранения (100—150л)
на тележках или в хранилищах (500—1000 л),
постоянно распола|ающихся в комнате с соб-
ственной вентиляционной системой пли, что
иредиичтительно, в отдельном охраняемом,
укрытом от непогоды строении (рис. 4.7).
Замечание. Сосуды с жидким азотом мщут на-
капливать загрязнения, поэтому следует хранить их в
чистой зоне.
• Требование безопасности. В комнате, где
хранится и разливается жидкий азот, должна быть обес-
печена соответствующая вентиляция, предпочтительно
с сш нализатором падения содержания кислорода в
воздухе ниже допустимого уровня. Причиной этого
требования является возможность испарения азота
при манипуляциях с ним, при этим азот может заме-
щать кислород в воздухе (1л жидкого азота —> 700 л
газообразного N,).
8) Хранение баллонов с двуокисью азота в отдельных
баллонах, при необходимости перемещаемых в по-
мещение лаборатории
• Требование безопасности. Баллоны должны
быть прикреплены к стене или рабочей поверхности на
стеллаже (см. рис. 7.2).
9) В культуральной лаборатории возможно центра-
лизованное обеспечение СО,с использованием
трубопровода либо из собственного резервуара,
периодически пополняемого, из которого газ рас-
пределяется по трубам ио помещениям лаборатории.
Способ, который вы изберете, зависит от ваших
ГЛАВА 4. СТРУКТУРА И ПЛАНИРОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ
планов, спектра ваших задач и стоимости затрат.
При грубой оценке, работа 2—3 человек потребует
нескольких баллонов; при количестве сотрудников
10-15 человек, экономически выгоднее иметь тру-
бопровод, соединенный со стационарно pacuo.iaia-
ющимися баллонами; при количестве сотрудников
более 15 необходимо использовать систему труб,
связывающую помещения и большую емкость для
хранения СО2.
Зона хранения 1—6 должна располагаться в стериль-
ной рабочей зоне и быть ле| кодостуина. Холодильники
и морозильники установите так, чтобы они были обра-
щены к нестерильной части лаборатории, поскольку
двери п компрессорные вентю1яторы создают пыль и
сквозняки и MOiyr разносить споры грибов. Кроме того,
холодильники и морозильники требуют ухода и перио-
дического размораживания, которые лучше проводить
отдельно от стерильной рабочей зоны.
В идеале, зона хранения должна расиола|аться так,
чтобы быть доступной как для изъятия, так и для заме-
ны объектов хранения. Полезно использовать двусто-
ронние блоки, поскольку хранящиеся предметы можно
использовать для изъятия и замены с одной стороны и
для использования в работе с дру< ой
• Требование безопасности. Очень важно
иметь выступающую кромку на краю с обеих сторон
полок, если они находятся на.значи гельной высоте и на
них хранятся стеклянная посуда и реактивы. Это пре-
дупреждает случайное выпадение предметов с полки
при их использовании и замещении.
Помните о необходимости иметь достаточно места
для хранения, поскольку это позволит вам производить
закупки большего объема, таким образом, экономя
средства, и в то же время уменьшит риск истощения
ценных запасов в тот момент, когда они не moivt быть
восполнены. По грубой оценке, на каждого сотрудника
культуральной лаборатории потребуется 200 л объема
хранения при 4 "С и 100 л при -20 °C. Необходимый
объем возрастает при уменьшении количества людей.
Например, одному человеку может потребоваться
250-литровый холодильник и 150-литровый морозиль-
ник. Конечно, эти цифры, требуемые для хранения,
приблизительны и следует сделать скидку на наличие
пространства в холодных комнатах и комнатах глубо-
кого замораживания.
Б целом, отдельные холодильники на —20 °C лучше,
чем холодильное помещение на —20 °C. Холодильни-
ки леоте мыть и эксплуатировать, они обеспечивают
лучший резерв при недостатке какой-либо единицы
хранения Вы сами должны оценить достоинства
и недостатки холодной комнаты но сравнению с
холодильниками. Без сомнения, холодная комната
предоставляет больший объем для хранения в кубо-
метрах, однако очень важен вопрос использования
этО| о пространства — насколько ле| ко осуществлять
эксплуатацию и уборку помещения, насколько хорошо
это пространство может быть использовано индивиду-
альными пользователями? Несколько независимых
холодильников займут больше места, чем холодная
комната эквивалентно!о объема, однако они MOiyr
быть удобнее в эксплуатации и поддержании, а также
в случае поломки оборудования.
При планировании расходов стоит учитывать не-
обходимость в дополнительном количестве морозиль-
ников и холодильников, предоставляющих больше
возможностей как в повседневных, так и в непредска-
зуемых обстоятельствах.
Глава 5
ОБОРУДОВАНИЕ
5.1. ПОТРЕБНОСТИ ЛАБОРАТОРИИ
КУЛЬТУР ТКАНЕЙ
В случае ограниченного финансирования необходимо
определить приоритетные специфические потребности
лаборатории культивирования тканей:
1) основные — оборудование, без которого вы не смо-
жете выполнить работу с достаточной точностью и
надежностью;
2) желательные — оборудование, позволяющее осу-
ществлять культивирование лучше, эффективнее,
быстрее или с меньшими затратами труда,-
3) полезные элементы оборудования, которые
улучшают условия работы, уменьшают- усталость,
обеспечивают проведение более сложного анализа
данных или в целом делают рабочие помещения
более привлекательными (табл. 5.1). В следующих
разделах ио отдельным подразделам, соответству-
ющим предметному указателю, представлено обо-
рудование в порядке первоочередности, как оно
видится автором, но ясно, что читатель может иметь
свое мнение о приоритетах.
Потребности в отдельных элементах оборудования
часто очень субъективны и являются результатом
личных устремлении, наличия в продаже, технических
инноваций и давления со стороны колле!. Реальные
потребности сформулировать сложнее, но они опреде-
ляются объективно типом работы, экономией времени,
которое предоставляет это оборудование, более высо-
ким уровнем техники в области асептики, качеством
данных, аналитических возможностей и требований к
образцам, экономией времени ияи трудозатрат, коли-
чеством людей, которую будут использовать это обо-
рудование, приемлемостью сметы расходов и размеров
потенциальной прибыли, а также специальными требо-
ваниями, предъявляемыми вашими методиками
5.2. АСЕПТИЧЕСКАЯ ЗОНА
5.2.1. Ламинарные шкафы
Если помещение соответствующим образом изоли-
ровано и размещено в чистой лоне с ограниченным
доступом, то возможно выполнение асептических
работ без ламинарного потока. Однако понятно, что
для большинства лабораторий, обычно переполненных
и оживленных, использование ламинарных шкафов
является наиболее простым способом обеспечения
асептических условий (см. разд. 6.4). Обычно один
шкаф используется двумя-тремя людьми. Шкафы
с горизонтальным ламинарным потоком дешевле и
обеспечивают наилучшую защиту стерильности куль-
туры, но в действительности они подходят только для
приготовления сред и дру| их стерильных реагентов, а
также для культивирования клеток неприматов. Они
частично при! одны для иссечения материала неирпма-
тов при получении первичной культуры. При работе с
потенциально опасными биолш ическими материалами
(любые клеточные линии приматов, включая человека,
вируспродуцирующие культуры, радиоизотопы, канце-
рогенные или токсические препараты) необходимы спе-
циальные микробполш ические шкафы II или III класса
защиты (рис. 5.1, см. также рис. 7.4). На практике
большинство лабораторий используют стандартные
микрпбиоло! ические шкафы II класса защиты.
• Требование безопасности. Важно ознако-
миться с местными и государственными требованиями
и правилами биоло! нческой опасности до установки
оборудования, поскольку требования законодательства
и рекомендации в различных pei ионах различаются
(см. разд. 7.8.1).
Выберите ламинарный шкаф, который: 1) достаточ-
но большой [минимум рабочей поверхности 1200 мм
ширины х 600 мм । лубины]; 2) тихий, поскольку
производящие шум ламинарные шкафы утомляют;
3) jiei ко моется как внутри рабочей зоны, так и под
рабочей поверхностью в случае разлития жидкостей и
4) удобный для сидения рядом с ним во время работы.
Некоторые шкафы имеют неудобную систему воздухо-
водов под рабочей поверхностью, которая не оставляет
места для колен. В друт их шкафах освещение или иные
приспособления над рабочей поверхностью задевают
голову, либо имеется экран, который затрудняет об-
зор. Передний экран должен подниматься, опускаться
или полностью удаляться для обеспечения уборки и
манипуляции с громоздким оборудованием для культи-
вирования. Помните, однако, что микробиолш ические
шкафы определенного уровня биозащиты не обеспе-
чат вам как оператору необходимой защиты, если вы
удалите передний экран, кроме того, вы потеряете в
эффективности обеспечения стерильности в шкафу.
86
ГЛАВА 5. ОБОРУДОВАНИЕ
Таблица 5.1. Оборудование лаборатории культивирования тканей
Основное оборудование Не существенное, но желательное Полезные дополнительные приспособления
Ламинарный шкаф (с биозашитой для клеток человека) Инкубатор (влажный С02-инкубатор, если используются открытые чашки пли флаконы) цилиндр 5%-го СО2 для создания газовой атмосферы культивирования баллоны с жидким СО, без сифона (для С02-ггнкубдтора) Стерилизатор (автоклав. термобарока- мсра) Холодильник Морозильник (для хранения при -20 °C) Инвертированный микроскоп Ванна или раковина для замачивания Глубокая раковина для мытья ЦиЛИНДрЫ ДЛЯ 11ИПСТОК Моечная машина для пипеток Дистиллятор пли водоочистительная установка Настольная центрифуга Морозильное оборудование, содержащее жидкий N,(-35 л, 1500-3000 ампул) Сосуд Дьюара г жидким N, (-25 л) Аппараты для медленного заморажива- ния клеток (см разд. 20.3 4) Магнитная мешалка для суспензионных культур гемоцитомстр Счетчик клеток Пернет альтический насос Дозаторы pH-метр Стерилизационнып шкаф Теплая комната (37 °C) Самописцы для решетрации тем- пературы в с 1срнлизаторе, авто- клаве и горячен комнате Фазово-контрастный, флюорес- центный микроскоп Пломбировщик пипеток Сушка для пинеток Автоматический диспенсер Тележки или перемещаемые сто- Высоко- и низкотемпературные сушильные шкафы Роллерные штативы для культур в рпллср-сосудах Трубопровод для поступления СО2из хранилища Ав соматический переключатель баллонов СО, Мисчная машина для стеклянной посуды Низкотемпературный морозильник (<-70 °C) Измеритель проводимости (кондуктометр) Осмс-мс1 j. Заваривающее устройство для полиэтиленовых пакетов (для упаковки стерильного оборудо- вания для долговременного хранения) Компьютер для ведения рс|пстрационных записей эксплуатации морозильника и база данных по клеточным линиям Счет чик колоний Центрифуг а большого объема (6x1 л) Цифровая камера и монитор для инвертиро- ванного микроскопа Впдетюбпрудованиедля съемок в замедленном режиме Измеритель размеров клеток (например, Scharfc. Coulter) Портативный прибор для записей температу- ры для проверки температурного режима в горячей комнате или инкубаторе) Дезинтегратор/ стерилизатор пластика Аппарат- для медленного контролируемого охлаждения клеток (для замораживания клеток) Клс точный сортер, активирующий флюорес- ценцию Конфокальный микроскоп Сцинтилляционный счетчик для микротитра- ционных планшет Элютриатор
Оператор, который будет работать в данном ламинар-
ном шкафу, должен ди его приобретения попробовать
посидеть на рабочем месте, воспроизводя обычную дея-
тельность. Обратите внимание на следующие вопросы.
1) Можете ли вы поместить колени иод рабочую по-
верхность ламинарного шкафа, удобно ли вы при
этом сидите? Достаточно ли близко к рабочему
пространству? Располагаются ли руки, по крайней
мере наполовину, внутри ламинарного шкафа?
2) На правильном ли месте располагается подножка?
3) Можете ли вы видеть, что вы делаете, не напрягая
шею?
4 ) Перфорирована ли рабочая поверхность и, если да,
создаст ли это затруднения при иииетировании и
дисиенсировании жидкостей (предпочтительна
сплошная рабочая поверхность с отверстиями для
вентиляции в передней и задней частях).
5) Легко ли удаляется рабочая поверхность при
уборке?
6) Если рабочая поверхность поднимается, острые
или закругленные у нее края? Нет ли опасности
порезаться при уборке?
7) Нет ли трещин на рабочей поверхности, которые
мо1ут накапливать споры и другие загрязнения?
Некоторые шкафы имеют разделенную на секции
рабочую поверхность, что обле! чает уборку, но со-
здает капиллярные щели при нормальном рабочем
расположении секций.
8) Достаточно ли и правильно расположено освещение?
9) Разместится ли этот шкаф в лаборатории?
10) Размещенный на постоянном месте, будет ли шкаф
удобен для работы и обслуживания? (Спросите об
этом обслуживающий персона.'!, а не продавца!)
Между боковыми стенками шкафов должно быть
как минимум 500 мм.
11) Будет ли достаточно места над шкафом для венти-
ляции в комнате или установления воздуховода с
выводом воздуха наружу?
12 ) Не будут ли возду ш ные потоки из дру i их ш кафов.
комнатной вентиляции, независимой системы
кондиционирования воздуха перемешиваться с
воздушными массами рабочего места данною ла-
минарною шкафа? Не будет ли выхода воздуха или
аэрозолирования воздуха за счет турбулентных
потоков? Чтобы избежать такого явления, располо-
жите передние поверхности противоположно сто-
ящих шкафов как минимум на расстоянии 2000 мм
пли, что предпочтительнее, 301)0 мм и проведите
испытания с участием инженера с опытом работы
с микробиологическими ламинарными шкафами.
5.2. Асептическая зона
87
Рис. 5.1. Ламинарный шкаф. В правой части шкафа, под рабочей поверхностью показан перистальтический насос, соединенный
е принимающим сосудом и включающийся при помощи ножной педали
5.2.2. Цилиндры для пипеток
Цилиндры для пинеток (иногда они известны как
лотки для пипеток) должны быть сделаны из поли-
пропилена и равномерно свободно стоять ио лабора-
тории, по одному на рабочем месте плюс некоторое
дополнительное количество, с тем чтобы заполненные
цилиндры с дезинфектантом могли стоять 2 ч до мытья
(см. разд. 7.8.5).
5.2.3. Аспирационный насос
Для удаления лишней среды пли друих реа|ентов из
культуральных флаконов используют перистальти-
ческий насос (рис. 5.2а), удаляемую жидкость можно
перемещать прямо в дезинфектант (см. разд. 7.8.5),
содержащийся в контейнере с отверстием (рис. 5.26).
Для tOio чтобы минимизировать риск образования
аэрозоля в атмосфере, следует использовать ватную
пробку или микроиоровый фильтр. Всасывающее от-
верстие должно находиться, по крайней мере, на 5 см
дальше от запирающего устройства, чем выпускное, так
чтобы удаляемая жидкость не заплескивалась назад в
отверстие. Все соединения трубок и насоса должны
регулярно проверяться; насос должен включаться
действием ножной педали.
Вакуумный насос, подобно устройству, которое
используется для стерилизации фильтрацией, может
использоваться вместо перистальтического насоса.
При необходимости один и тот же насос может слу-
жить обеим целям; так или иначе, для избежания риска
за|рязнения самы о насоса требуется использовать
3ai лушку. Удаляемая жидкость должна собираться
в емкости (см. рис. 5.26, 5.3), куда но завершении
работы добавляется дезинфектант типа ипохлорида
(см. разд. 7.8.5) и оставляется но крайней мере на 2 ч
до опустошения резервуара. Гидрофобный мнкро-
цоровый фильтр (например. Pall Gelman) и вторую
заглушку можно поместить в тдролинию с насосом,
чтобы предупредить вытекание жидкости или аэрозо-
лирование. Не пропускайте воздух, содержащийся в
резервуаре с тдрохлоридом, через перистальтический
насос, поскольку свободный хлор приводит к коррозии
деталей насоса и может быть токсичным. Также избе-
гайте попадания жидкости в вакуумные системы. При
.загрязнении жидкостью их очень трудно очистить.
Чтобы предупредить возврат удаляемой жидкости
обратно во флакон, всез да включайте насос прежде, чем
вставите пипетку в трубку (см. разд. 6.5).
88
ГЛАВА 5. ОБОРУДОВАНИЕ
Рис. Б.З. Вакуумный насос Integra. Всасывающий насос и
принимающая емкость для удаления жидкости из флаконов,
предоставляется компанией Integra. (Фото любезно предо-
ставлено Norbert Fesunig, Deutches Krebsibrschuugzcntnnn,
Гсйдс.г ьбср|.)
Рис. Б.2. Удаление среды с помощью насоса, (а) Пинетка,
соединенная трубкой с перистальтическим насосом, иегюль-
зус гея для удаления среды из флакона, (6) перистальтический
насос во всасывающей гндролцнпи из ламинарного шкафа к
сосуду-приемнику для слива
5.2.4. Сервисные тележки
Различные предметы, необходимые для работы в лами-
нарном шкафу, удобно располагать на перемещаемых
тележках. Эти тележки удобно заполняют нижнее про-
странство между соседними шкафами и легко переме-
щаются при обслуживании помещения и шкафов. Они
могут быть использованы обслуживающим персоналом
для перевозки материалов к шкафам и от них, а также к
другому основному оборудованию лаборатории. Боль-
шие тележки полезны для перемещения загрязненной
стеклянной посуды и использованного оборудования
из асептической зоны в моечную. Они могут быть при-
паркованы в удобном месте (см. рис. 4.3,4.4,5.1).
5.2.5. Инвертированный микроскоп
Будет не лишним подчеркнуть, что, несмотря на
значительный прогресс в области количественного
анализа культивированных клеток гг молекулярных
зондов, остается актуальным регулярное визуальное
наблюдение за культурами клеток. Морфолог ические
изменения часто являются первым признаком истоще-
ния истарения культуры (см. разд. 13.6.1 ирис. 13.1), а
характерные черты микробиолог ического загрязнения
лег ко распознаются.
К оборудовании!, необходимому для культуральной
лаборатории, относится простой инвертированный
микроскоп (рис. 5.4). Удостоверьтесь, что платфор-
ма микроскопа достаточно велика, чтобы поместить
большой роллер-флакон между платформой и конден-
сором (см. разд. 26.2.3) в случае, ec.ru вам потребуется
исследовать такие флаконы. На рынке доступно много
простых и недорогих инвертированных микроскопов,
особенно ценно приобрести микроскоп г фототрубкой
для цифровою фотографирования или киносъемки.
Если вы заранее знаете, что будете фотографировать
живые культуры, вам следует вложить в микроскоп
значительные средства и приобрести прибор с высоко-
качественной оптикой и фазово-контрастным конден-
сором и объективами с длиннофокусным расстоянием,
а также со всем необходимым для CCD-камеры и
монитора (см. рис. 5.14). Возрастающее использование
зеленою флюоресцентного белка (GFP) для мечения
живых клеток означает, что флюоресцентная оптика
также может понадобиться.
Полезной приставкой к инвертированному мик-
роскопу может быть кольцо с маркировкой компании
Nikon. Это устройство вставляется в револьверную
головку микроскопа на место объектива и может быть
использовано для того, чтобы отмечать нижнюю часть
чашки Петри, в которой расположены интересующие
колонии или группы клеток. Затем эти колонии могут
5.2. Асептическая зона
89
Рис. 5.4. Инвертированный микроскоп. Инвертированный
микроскоп Olympus СКХ41 оборудован фазово-контрастной
ОнТИКОН и трннокулирной головкойс портом для присоеди-
нения цифровой фотокамеры. (Фото любезно предоставлено
фирмой Olympus, UK, Ltd )
быть отсняты (см. разд. 14.4 и рис. 14.8,14.9) или в по-
следующем интересующий вас участок культуры може-1
подвергаться пристальному изучению.
5.2.6. Центрифуга
Периодически клеточные суспензии требуют центри-
фугирования для повышения концентрации клеток
или отмывки реагентов. Для большинства таких целей
подходит маленькая настольная центрифута, предпоч-
тительно с пропорционально контролируемым тор-
можением. Клетки хорошо осаждаются при 80 100 g;
более высокие значения moivt вызвать повреждение
клеток и инициировать атглютинаиию сгустков тканей.
При крупномасштабном культивировании суспен-
зионных культур ишида потребуются охлаждаемые
центрифути большого объема, например, 4x1 л или
6x1 л (см. разд. 26.1).
5.2.7. Манипуляции с жидкостями
в стерильных условиях —
пипетирование и дозирование
Удаление жидкостей. Жидкости удаляют простой
пинеткой, но процесс будет значительно облетчен
и ускорен, если использовать пипетку с широким
отверстием, присоединенную к вакуумному насосу
или вакуумной линии. Требуется также подходящая
емкость для слива и предупреждения загрязнения
насоса. Можно использовать и простой перистальти-
ческий насос, перекачивающий жидкость в резервуар
с дезинфектантом (см. разд. 5.2.3)
Пикетирующие устройства. Простое пикетирова-
ние является одной из наиболее частых повседневных
манипуляций с культурами. Хотя резиновая груша или
друt ие простые приспособления для пииетирования
дешевы и просты в использовании, скорое гь, точность
и воспроизводимость результатов значительно повы-
шаю гея при использовании автоматического иинетттру-
ющего устройства (дозатора) (рис. 5.5), которые мотут
быть со встроенным или отдельным насосом, иметь
питание от Сети или от зарядного устройства (см. При-
ложение II). При выборе тишетирующего устройства
обратите внимание на вес и удобство в использовании
в течение долгого времени и лучше всего опробуйте
одно из устройств прежде, чем приобретать eto. Пи-
кетирующие устройства обычно снабжены фильтром
во вкладыше для минимизации переноса загрязнений.
Некоторые фильтры одноразовые, некоторые мож-
Рис. 5.5. Пипетирующее устройство. Мокцлиованнос
гишетпрующее устройство для использования обычной тра-
дуттрованной пинетки
90
ГЛАВА 5. ОБОРУДОВАНИЕ
но использовать повторно после стерилизации (см.
рис. 7.2 для изучения правильного метода вставления
пинеток в пикетирующее устройство).
Автоматические пипетки. Эти устройства по-
лучили свое начало от микропииеток компании Ер-
pendorf и использовались для дозирования объемов
10—200 мкл. К настоящему времени рабочие объемы
возросли до 5 мл, поэтому термин «микроиипет'ки»
не веет да соответствует реальности, и это устройство
называется по-разному: дозатор, автоматическая
пинетка, пинетман и т.н. (рис. 5.6). Только наконеч-
ники этих пипеток нуждаются в стерилизации, среди
отраничений в использовании автоматических пи-
петок длина наконечников, определяющая выбор
используемых сосудов. Если стерильная жидкость
забирается из контейнера с помощью автоматической
пинетки, ее нестерильный корпус не должен касаться
сторон контейнера. Реагенты объемом 10—20 мл могут
бы гь дозированы на объемы от 5 мкл до 1 мл из уни-
версального контейнера или на объемы 1 —200 мкл из
миниатюрного флакона. Для дозирования на объемы
100 мкл—1 мл можно исиользоватьиробирки типа Ер-
pendorf, но они требуют стерилизации.
Предиолагоется, что внутри автоматическая пи-
нетка стерильна либо не производит перемещения
воздуха, достаточного для заражения наконечников.
Однако в некоторых ситуациях даже минимальная
возможность заражения имеет значение. Например,
если вы осуществляете серийное субкультивнрованне
ростковой клеточной линии (в противоположность
кратковременному эксперименту с клетками, которые в
конечном счете будут взяты на анализ либо уничтоже-
ны, но не иреддолатают их размножение), безопасность
и чистота клеточной линии становятся первостепенны-
ми, поэтому вы должны использовать либо обычные
стеклянные пипетки с ватным фильтром, либо однора-
зовые пипетки, которые стерильны ио всей длине, что
является существенным при необходимости достичь
необходимой точки в сосуде, из которой отбираются
пробы. Если вы используете достаточно маленькие
контейнеры, то можно избежать прикосновения не-
стерильных частей корпуса автоматической пипетки,
поэтому ее использование допустимо при условии.
что наконечник снабжен фильтром, препятствующим
перекрестному заражению и минимизирующим микро-
бную контаминацию. В противном случае вы рискуете
получить микробное загрязнение от нестерильных
частей автоматической пипетки или, что более значи-
мо, перекрестное заражение из аэрозоля и жидкости.
Заброшенных в ствол этой пипетки.
Обычное суб культивирование, которое должно
проводиться быстро и точно, с высокой степенью за-
щиты от загрязнения и перекрестной контаминации,
следует проводить с использованием стеклянных или
одноразовых пластиковых пипеток. Эксперименталь-
ная работа, которая должна быть точной, но не требует
длительного размножения используемых клеток, поз-
воляет использовать автоматические пинетки.
Наконечники можно покупать россыпью в больших
упаковках, с тем чтобы упаковывать и стерилизовать
их в условиях лаборатории. Их можно также поку-
пать уже стерильными и готовыми к использованию.
Предварительно упакованные наконечники намного
удобнее, но значительно дороже. Некоторые держатели
для наконечников могут повторно стерилизоваться, что
представляет собой определенный компромисс.
Диспенсеры больших объемов. Koi да объем среды в
культуральных сосудах превышает 100 мл, для разлива
жидкостей можно использовать дру ие приспособле-
ния. Если используется небольшое количество сосудов,
удобно применять пипетки объемом 100 мл (BD Bio-
scences) либо градуированные бутыли (рис. 5.7) или
Градуированная
бутыль
Витая пробка
Липкая пента
Линия
аспирационного
воздуховода
Силиконовые
Рис. 5.6. Автоматическая пипетка (пипеттор). Пипети-
рующсс устройство с изменяемым объемом. Существуют
также пипетки с фиксированным объемом Сами пипетки
нс стерилизуют’, пластиковые наконечники подпер]ают
стерилизации
Рис. 5.7. Градуированный бутылочный диспенсер. Прпбка
с двумя отверстиями вставлена в горлышко градуированной
бутыли, от одного отверстия отведен ш.1анг, соединенный с
диспснсируюпшм колоколом, защищающий принимающий
жидкость сосуд. На шланге имеется металлический пружин-
ный зажим. имеется также отводящая линия для равновесия
воздуха. Пробка может стерилизоваться отдельно от бутылки,
подходи! к любой стандартной бутылке со средой (Opmii-
нальнос изобретение John Paul )
5.2. Асептическая зона
91
пакеты (Sigma). Если объемы очень большие (около
500 мл) либо требуется очень большое количество
повторного отмеривания больших объемов, может
понадобиться перистальтический насос. Простой пере-
нос большою объема жидкости (10—10 000 л) обычно
осуществляется приготовлением среды в закупоренном
под давлением сосуде и дальнейшим перемещением
ее в культуральные сосуды под действием положи-
тельною давления (Alfa Laval). Можно разливать
большие объемы путем простого переливания через
горлышко сосуда, однако такого рода манипуляции
oi раничпваются однократным действием с предвари-
тельным измерением объема переливаемой жидкости
(см. разд. 6.3.6).
Многократное диспенсирование. Традиционно
диспенсер для мноюкратною повторяющегося дис-
пенсирования представляет собой тип оборудования,
известный как шприц Корнуэла, в котором жидкость
набирается через одно отверстие, а выпускается через
другое, при этом используется простой двухходовой
клапан. Пружинный поршень шприца делает процеду-
ру полуавтоматической и многократной. Существуем
неисчислимое количество вариантов такого типа дис-
пенсеров, мнО| не из которых применяются в настоящее
время. Основные проблемы при их использовании
возникают из-за залипания поршня, но его можно
минимизировать, если избегать этапа сушки после
автоклавирования и прокаливания шприца со средой
или со.гевым раствором до и после использования.
Многократное диспенсирование небольших объемов
осуществляют пошаговым движением поршня в шпри-
це (рис. 5.8).
Перистальтический насос также может исполь-
зоваться для диспенспрования серийных емкостей и
имеет определенные преимущества, так как наличие у
него ножной педали позволяет остав.лятьруки свобод-
ными (рис. 5.5). Использование такого оборудования
требует особенно тщательной заботы о чистоте дпспен-
сирования и предупреждения зафязненпй трубок на
приемном и выпускном концах. В общем, применение
такого оборудования целесообразно, если требуется
разлить очень большое число флаконов. Автомати-
ческое пипетирование, обеспечиваемое перистальти-
ческим насосом, может быть контролируемо в малых
приращениях. Кроме того, необходимо автоклавиро-
вать только приносящие трубки. При разливе объемов
Рис. 5.8. Пипетка с многократно дозируемым объемом. По-
шаговый диспенсер действует' на основе движения помпового
механизма в шприце, когорып приводится в движение кноп-
кой, на которую нажимают большим пальцем (Jencotis)
Рис. 5.9. Автоматический диспенсер. Диспенсер Peninatic
Premier, пригодный для многократного диспенсирования и
разлива в диапазоне 1-1000 мл. Если оборудование исполь-
зуется для стерильных операций, следует автоклавировать
только доставляющие трубки
от 10 до 100 мл точность и воспроизводимость мслут
находиться на достаточно высоком уровне. Некото-
рые виды приводящих трубок можно стерилизовать и
хранить в инвентаре, что позволяет быстро заменить
их при случайном загрязнении или смене клеточного
типа или разливаемого реагента.
Автоматизация. В культивировании тканей было
много попыток автоматизировать процесс разлива жид-
костей, но только некоторые системы нашли широкое
практическое применение. При стандартной системе
производства может использоваться автоматическое
снабжение растворами, однако большие затраты вре-
мени на настройку соответствующей программы и вне-
сение модификаций, которыемогут потребоваться при
изменении системы, а также чрезвычайная важность
соблюдения стерильности удерживают большинство
лабораторий от инвестирования средств и времени во
внедрение таких систем. Появление и широкое при-
менение планшета для микротптрации (см. рис. 8.2)
принесло с собой автоматизацию разлива по ячейкам,
учета результатов и т.д. (рис. 5.10, 5.11, 5.12). Переда-
точные устройства, использующие перфорированные
лотки, или многоканальные пипетки обле|чают пе-
ресев из одной плашки в другую. Существуют также
миксеры для планшетов и держатели для центрифу-
гирования плашек. Ассортимент оборудования столь
широк, что не может быть приведен здесь, рекомендуем
ознакомиться с соответствующими торговыми ката-
логамп (см. Приложение II). Два вида оборудования
заслуживают особого внимания: иро!раммируемая
одноканальная или мультиканальная автоматическая
92
ГЛАВА 5. ОБОРУДОВАНИЕ
Рис. S.10. Многоканальная пинетка. Пипс пса с большим
количеством каналов может одновременно использовать
8 пластиковых наконечников. Существуют также 4- и 12-
канальные пипетки
Рис. 5.11. Автоматическое заполняющее устройство для
загрузки многолу ночных планшетов. На фото показано за-
полнение платы в нестерильных условьях, но оборудование
может быть использовано для стерильных манипуляции
(Фото любезно предоставлено Центром исследований
для OHKo.ioiiiH и прикладной фармакологии. Университет
Глазго.)
пинетка Rainin и оборудование для переноса среды
и реплинирования плашек Corning Cosier Translar
(см. рис. 5.13). Б технику исследований при помощи
культивирования тканей сейчас вводятся роботизи-
рованные системы (такие как Packard), что является
естественным продолжением микротитрационных
систем. Роботы полностью автоматизируют процессы,
хотя требуют перепрограммирования при изменении
условий аналитических исследований
Выбор системы. Выбор между оборудованием с
ручным управлением и сложной автоматизированной
системой определяют пять критериев:
Рис. 5.12. Планшетный сканер. Денситометр для измерения
он 1 ичсского поглощения в каждой ячейки, нек<1 шрые модели
измеряют также флюоресценцию (Фо ю любезно предостав-
лено Центром исследований для онкологии и прикладной
фармаколо! ни. Университет Глазго.)
1) Jlei кость использования и эргономическая эффек-
тивность.
2) Стоимость в соотношении с экономией времени и
возрастанием эффективности.
3) Точность и воспроизводимость в серийных и парал-
лельных партиях
4) Jlei кость стерилизации и действие ее на точность и
воспроизводимость.
5) Механическая, электрическая, химическая, биоло-
гическая и радиологическая безопасность.
• Требование безопасности. Большинство । и i -
позирующих устройств склонны вы пускать жидкость с
более высокой скоростью, чем при нормальных ручных
манипуляциях, и, следовательно, больше способствуют
созданию аэрозолей. Это следует иметь в виду при
использовании потенциально опасных биоло| ических
веществ.
5.2.8. Счетчик клеток
Счетчик клеток (см. рис. 21.2) имеет много преиму-
ществ при одновременном ведении двух или трех
линий клеток, а также при необходимости точной
количественной оценки кинетики роста. Несколько
компаний представили на рынке различные но слож-
5.2. Асептическая зона
93
Рис. 5.13. Устройство для переноса. Transtar (Corning)
для посева культуры, переноса среды, воспроизведения
пости модели от простых счетчиков количества частиц
до автоматизированных приборов, подсчитывающих
количество клеток и анализирующих их размеры. Для
рутинных исследований подходят представленные на
рынке счетчики Beckman Coulter и Sch rfe (см. также
разд. 21.1.2). При необходимости количественной
оценки нестерильных жидкостей для их доставки
полезны автоматические системы разлива (См. также
разд. 5.2.7). При использовании для подсчета клеток
диспенсеров, наворачивающихся на горлышко буты-
лей, следует подождать, чтобы жидкость успокоилась
до начала подсчета, поскольку маленькие пузырьки,
появляющиеся при быстром дискенсировании, мо>ут
учитываться счетчиком как клетки
Анализатор размера клеток. Большинство при-
боров для оценки размеров клеток среднего или высо-
К01 о качества (Scharfe, Beckman Coulter) (см. рис. 21.2)
обеспечивают анализ размера клеток и возможность
загрузки данных в персональный компьютер, прямо
или через компьютерную сеть
5.2.9. CCD-камера и монитор
планшетов. и друшх аналошчных манипуляций с мпкро-
титрационными планшетами, (рсбукицих одновременных и
одинаковых действий со всеми 96 лунками. (Воспроизводит-
ся с разрешения Corning.)
Рис. 5.14. Замкнутая телевизионная система. CCD-кэмсра
присоединена к инвертированному микроскопу Zeiss Axiovcrt
и может использоваться для прямого распечатывания или
записи в замедленном времени при использовании впдео-
заиисывающсго оборудования (см разд. 27.3) Справа порт
для мнкропн-ьскций
С момента появления микросхем, телевизионные
камеры и мониторы стали ценным помощником при
обсуждении культур и обучении студентов (рис. 5.14).
Выбирайте камеры с высоким разрешением и невысо-
кой чувс гвительностью, поскольку чувствительность
стандартного фотоаппарата достаточно высока и
может вызвать эффект сверхсвечения. Черно-белые
камеры обычно дают лучшее разрешение и адекватны
нрн фазово-контрастной микроскопии живых куль-
тур. Цветные камеры предпочтительны ори изучении
фиксированных и окрашенных образцов. Если вы
иредиола! аете обсуждать культуры с двумя или более
ассистентами или коллегами, достаточно будет ис-
пользовать монитор 300- или 400-мм (12 15 дюймов),
дающий хорошее разрешение, но если вы предпола-
гаете обучать 1 руину из 10 и более студентов, следует
приобрести 500- или 550-мм (19- или 21-дюймовый)
монитор.
CCD-видеокамера (CCD или ПСЗ - прибор с за-
рядовой связью) с высоким разрешением может быть
полезна при записи и оцифровке изображений для по-
следующего анализа и публикации данных, приставки
к видеооборудованию позволят снимать как в режиме
нормального времени, так и в замедленном режиме
(см. разд. 27.3).
5.2.10. Препаровальная лупа
Иссечение маленьких кусочков тканей (например,
эмбриональных органов или тканей мелких беспоз-
воночных) потребует использования препаровальной
лупы (Nikon, Olympus, Leica), которая будет полезна
также при подсчете колоний в монослойной культуре,
94
ГЛАВА 5. ОБОРУДОВАНИЕ
а также подсчете и выборе маленьких колонии, расту-
щих на aiape.
5.3. ИНКУБАЦИЯ
5.3.1. Инкубатор
Если нет возможности организовать термальную
комнату (см. разд. 4.4.2), может возникнуть необ-
ходимость приобретения эквивалентною сухого
инкубатора. Даже при наличии термальной комнаты
ино1да удобнее иметь дополнительный инкубатор
для трииси низании культуры поблизости от лами-
нарного шкафа (приблизительно 50 200 л на одною
сотрудника) с принудительной вентиляцией, темпе-
ратурным контролем с точностью до —0,2 °C и термо-
статом безопасности, который прекратит uai ревание,
выключив инкубатор, если температура превысит
необходимую, или, что лучше, примет на себя функ-
цию регуляции работы инкубатора, если основной тер-
мостат сломается. Инкубатор должен быть устойчив
к коррозии (например, из нержавеющей стали, хотя
анодированный алюминии тоже подходит для сухо-
го инкубатора) и ле> ок для уборки. Двойная камера
или два инкубатора, поставленные один на другой и
независимо pei у.тируемые, предпочтительнее, чем
один большой инкубатор, поскольку в первом случае
обеспечивается лучший температурный контроль для
большего количества культур, к тому же, если один из
инкубаторов сломается или потребует уборки, может
быть использован второй.
Многое инкубаторы имеют водяную рубашку для
равномерного распределения тепла во внутреннем
врос (ранстве, что позволяет избежать холодовых пятен.
Эти инкубаторы дольше держат температуру при по-
ломке нагревательной системы или выключении элект-
роснабжения. Тем не менее новые высокоэффективные
изолирующие материалы и диффузная поверхность
нагревательных элементов дают те же преимущества,
но позволяют обойтись без водяной рубашки и делают
перемещение инкубатора более лы ким (при необходи-
мости перемещения инкубатора с водяной рубашкой
необходимо слить воду).
Полки инкубатора обычно перфорированы для
улучшения циркуляции воздуха. Однако перфорация
может привести к неравномерности распределения
клеток в монослоиных культурах и различию в кле-
точной плотности в образцах, расиоллаклцихся на
разных полках. Такие различия могут возникнуть и
в результате конвекционных потоков, возникающих
над точками контактов чашек с полками ио сравнению
с дырками в полках, либо MOiyr иметь отношение к
областям местного охлаждения, возникающим цри от-
крывании дверей. Хотя при рутинных манипуляциях
обычно такие проблемы не возникают, цри выполне-
нии экспериментов, в которых однородная плотность
культуры важна, следует помещать флаконы и чашки
на изолирующий кафель или металлический поддон.
5.3.2. Влажный СО2-инкубатор
Хотя культуры могут инкубироваться в закрытых
флаконах в обычном сухом инкубаторе или термальной
комнате, некоторые сосуды, например чашки Петри
или многолуночные планшеты, требуют контроли-
руемого состава атмосферы с высокой влажностью и
более высоким уровнем СО2. Самым дешевым путем
контроля 1азовой фазы является помещение культуры
в цластиковую коробку или камеру (Bellco, MP Bio-
medicals), заполнение контейнера газом с необходимой
концентрацией С О, и герметизация ее. Если контейнер
не полностью заполнен чашками, поместите в него
открытые чашки Петри с водой с тем, чтобы повысить
влажность в камере.
С О 2-Инкубаторы (рис. 5.15) более дорою, но
простота их использования и постоянный контроль
давления СО2 и температуры (анаэробные сосуды
и поглотители влаги удлиняют время на(ревания)
компенсируют расходы. Контроль влажности до-
стшается использованием увлажняющих поддонов
(рис. 5.16), а контроль давления СО,— при помощи
СО2-регул(1рующе1 о оборудования, которое всасывает
воздух из инкубатора в отдельную камеру, 1де опре-
деляется концентрация СО,, а также вводит чистый
СО, в инкубатор для пополнения дефицита. Воздух
циркулирует вокруг инкубатора путем естественной
Рис. 5.15. СОг-инкубатор. С02-ннкубатор (Forma) с откры-
тое дверью, позволяющей увидеть флаконы, многолуночныс
планшеты и чашки Петри, помешенные в коробки (см также
рис. 5 16)
5.3. Инкубация
95
Рис. 5.16. Устройство СОг-инку'батора. Вид спереди контрольной панели и секции внутренней камеры двух стилизованных
влажных СО3-инкубаторов. (о) Инкубатор с водяной рубашкой п циркуляцией воздуха за счет вентилятора, (/)) Сухое енный
инкубатор без циркуляторного вентилятора (общая схема, нс относящаяся к конкретным компаниям-производителям)
конвекции или в результате использования вентиля-
тора, который поддерживает как уровень СО2, так и
температурный режим. Существует мнение, что инку-
баторы. снабженные вентилятором, восстанавливают
уровень СО, и температуры после открывания двери
инкубатора быстрее, хотя инкубаторы с естественной
циркуляцией также могут восстанавливать режим до-
статочно быстро, при этом ниже риск контаминации.
Кроме то]о, сухие, подсмретые стенки инкубатора
обеспечивают меньшее заражение стенок грибами,
поскольку остаются сухими даже при относительно
высокой влажности. Некоторые типы контролирую-
щее о уровень СО2 оборудования нуждаются в перио-
дической калибровке каждые несколько месяцев, но
использование золотой проволоки или инфракрасной)
детектора минимизирует дрейф нуля и mhoi ие модели
автоматически переустанавливают нулевое значение
детектора СО,
Размеры инкубатора определяются потребностями
лаборатории - как количеством сотрудников, пользу-
ющихся им, так и типами культур, с которыми они ра-
ботают. Пять человек, пользующихся только плашками
для микротитрации, MOiyr использовать 1000 плашек
(приблизительно 100 000 индивидуальных культур)
или проводить 10 экспериментов, каждый из которых
может' потребовать инкубатор небольших размеров,
в то время как один человек, ведущий клонирование
клеток, может заполнить одну полку за один или два
эксперимента. Экономически невыгодно инкубировать
в СО2-инкубаторах флаконы, особенно больших раз-
меров. Для этих целей лучше использовать обычные
инкубаторы или термальные комнаты. Если требуется
СО2, то флаконы должны быть заполнены |азом из
баллонов или СО2-газопровода.
Частая уборка инкубатора. в частности влажного, —
важный элемент его эксплуатации (см. разд. 19.1.4),
поэтому внутреннее пространство должно ле] ко раз-
бираться, не оставляя недоступных для мытья частей
и углов. Вынутые из инкубатора флаконы или чашки
либо коробки, содержащие их, при переносе в лами-
нарный шкаф и дальнейшем использовании должны
быть обработаны тампоном с этанолом до открывания
(см. разд. 6.3.1).
5.3.3. Регистратор температуры
Pei истрпрующий термометр с диапазоном измере-
ния от -50 °C и ниже до +200 °C позволит вам вести
мониториш условий хранения в морозильной каме-
ре. замораживания клеток, состояния инкубаторов
и стерилизационных шкафов и представляет собой
инструмент с долгосрочными проводами, покрытыми
тефлоном, и снабженный термистором или термопарой.
Печи, инкубаторы и термальные комнаты требуют по-
стоянного контроля для осуществления стабильности
температурного режима. Pei истрирующие термометры
должны беспрерывно закрепляться в термальной ком-
нате, стерилизационных шкафах, автоклаве, а их записи
должны регулярно просматриваться для обнаружения
отклонений в работе приборов, в частности в случае
возникающих сбоев.
96
ГЛАВА 5. ОБОРУДОВАНИЕ
5.3.4. Роллерные штативы
Роллерные штативы используются и произволе rue
монослойных культур в расширенном масштабе (см.
разд. 26.2.3). Выбор аппарата определяется масштабом
культивирования (например, размером и количеством
роллер-бутылей). Этот масштаб может быть определен
исходя из количества клеток, которые планируется
нарастить, максимально доступной клеточной плот-
ности, и площади рабочей поверхности бутылей (см.
табл. 8.1). Большое количество маленьких бутылей
дает наибольшую площадь поверхности, но повышает
затраты труда и интенсивность ручных манипуля-
ций, поэтому обычно принимается компромиссное
решение используются бутыли диаметром 125 мм
(5 дюймов) и длиной от 150—500 мм (6 20 дюймов).
Длина бутыли обусловливает конечный иыход про-
дукта, но or раничивается размерами штатива; высота
штатива будет определять количество креплений (т.е.
рядов) бутылей. Хотя дешевле купить один большой
штатив, чем несколько маленьких, последний вариант
предпочтителен, поскольку:
1) позволит установить штативы ступенчато (убеди-
тесь, что система работает);
2) упростит расположение штативов в термальной
комнате;
3) позволит при необходимое! и включать изолирован-
но один штатив.
Настольные модели Bellco или Thermo Electron
могут полностью удовлетворить запросы культи-
вирования небольших масштабов, Belco, Integro
и New Brunswick Scientific подходят для больших
масштабов.
5.3.5. Магнитная мешалка
Культивирование тканей предъявляет определенные
специфические требования к магнитным мешалкам.
Быстрое перемешивание для растворения химических
реактивов может проводиться на любых мешалках.
При перемешивании, которое сопровождает <)ж±рмен-
тативное расщепление тканей (см. разд. 12.3.3) или
рост суспензионной культуры (см. разд. 13.7.1,13.7.5),
должны соблюдаться некоторые условия:
1) мотор не должен нагревать культуру (используйте
вращающийся индуктор или ременную передачу от
двигателя, находящегося вне мешалки);
2) скорость вращения должна контролироваться и
понижаться до 50 об./мин;
3) вращающий момент при низких оборот ах должен
обеспечивать перемешивание объема до 10 л
жидкости;
4) оборудование должно обеспечивать поддержание
нескольких культур одновременно;
5) каждое положение мешалки должно индивидуально
контролироваться;
6) считывание данных но частоте вращения должно
осуществляться для каждого держателя. Предпоч-
тительно иметь специально предназначенную для
культивирования мешалку (Techno или Bellco)
5.4. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ
И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
5.4.1. Мытье посуды
Ванны и раковины для замачивания Ванны и ракови-
ны для замачивания должны бытьглубокими настоль-
ко, чтобы все ваше лабораторное стекло (кроме пинеток
и самых больших бутылей) погружалось в раствор де-
терт ента при замачивании, но не настолько глубокими,
чтобы иод весом стекла разрушались мелкие предметы
на дне раковины. Примерные размеры раковины состав-
ляют 400 мм (15 дюймов) в ширину,600 мм (24 дюйма)
в длину и 300 мм в глубину (см. рис 4.6).
Моечная машина для пипеток. С геклянные пи-
петки, пригодные для повторного употребления, лег ко
моются в стандартных моечных машинах сифонног о
типа (см. разд. 11.3.2 и рис. 11.5). Лучше разместить
моечную машину на уровне пола, а не на уровне стола,
для тою чтобы избежать неудобств при вынимании
пинеток, и соединить с оборудованием, деионизиру-
ющим воду, и с подводкой холодной воды так, чтобы
последние несколько полосканий можно было прово-
дить деионизованной водой. Если возможно, следует
встроить простой клапан-переключатель в систему
подводки деионизованной воды (см. рис. 4.6).
Сушка пипеток. Если в моечной машине для пи-
петок используется корзина из нержавеющей стали,
пинетки можно прямо перенести в электрическую су-
шилку. В другом варианте их высушивают на штативе
или в обычном сушильном шкафу.
5.4.2. Очиститель воды
Очищенная вода требуется для прополаскивания стек-
лянной посуды, растворения порошкообразной среды
и разведения концентратов. Для первой цели обычно
достаточно деионизованной или обратноосмотически
обессоленной воды. Вторая и третья задачи требуют
сверхчистой воды (UPW), полученной в результате
трех- или четырехстуненчатого процесса (рис. 5.17; см.
также рис. 11.10). Важным принципом такого процесса
является качественное отличие каждой стадии от дру-
1 их. Обратный осмос может следовать за фильтрацией
через активированный уголь, деионизацией и микро-
поровой фильтрацией (т.е. через стерилизационный
фильтр, см. рис. 11.11). Первая стадия может быть
заменена дистилляцией (с использованием элемента
в кремниевой оболочке). Обратный осмос дешевле,
если вы платите за топливо, если нет, то дистилляция
лучше и более приемлема для получения стерильного
продукта. При использовании обратного осмоса нуж-
но выбрать такой тип картриджа, который обеспечит
необходимое значение pH; некоторые мембраны могут
5.4. Подготовительные работы и стерилизация
97
Рис. 5.17. Очиститель воды. Водопроводная вода сначала проходит через реверсивно-осмотический блок справа и затем в
емкость-хранилище слева. Затем она очищается на уыеродном фильтре и проходит через деионизатор (центральный блок) и
микроиоровый фильтр (Milliporc Milli-Q) накапливаясь в коллекторе. (Фото любезно предоставлено Beatsoil Institute )
прорываться при крайних значениях pH (уточните у
поставщика).
Деионизатор должен иметь измеритель проводи-
мости (кондуктометр), контролирующий сточный по-
ток, для обнаружения необходимости замены картрид-
жа. На дру| их картриджах необходимо помечать дату
установки и заменять в соответствии с инструкцией
производителя. Для контроля коллоидного состояния
можно использовать измеритель общего органического
углерода (TOC) (Millipore).
Очищенная вода не должна храниться, ее следуй
отправлять на повторную очистку, чтобы миними-
зировать инфицирование водорослями или друi ими
микро1)р|анизмамн. Все трубки и резервуары в системе
должны регулярно проверяться (каждые три месяца
или около того) на наличие водорослей, промываться
гииохлоридом и детергентом (например, Clorox или
Chloros), тщательно промываться проточной водой и
ополаскиваться дистиллированной водой перед ис-
пользованием.
Вода является самым простым, но, возможно, наи-
более критичным составляющим элементом всех сред
и реагентов, в частности бессывороточных сред (см
гл. 10). Хороший контроль качества воды состоит в
исследовании эффективности посева чувствительной
клеточной линии в среде, сделанной на основе этой
воды (см. разд. 11.6.3 и протокол 21.10) через равно-
мерные промежутки времени.
5.4.3. Стерилизация и сушильные шкафы
Хотя вся стерилизация должна проводиться в ав-
токлаве, пинетки и другое стекло предпочтительно
стерилизовать сухим жаром, что позволяет избеготь
возможности как химического загрязнения от парового
конденсата, так и коррозии пеналов для пинеток. Такая
стерилизация, однако, требует высокой температуры
(160—180 °C) и принудительно вентилируемых печей,
чтобы обеспечить прогревание всей массы за| ружей-
ных материалов. Так же как в отношении автоклава,
при покупке стерилизационных шкафов не выбирайте
один большой, который может быть слишком велик
для размеров и количества используемой стеклянной
посуды. Лучше приобрести два маленьких шкафа; про-
гревание их легче, быстрее и равномернее, кроме toi о,
экономичнее использовать один маленький шкаф при
небольшом количестве стеклянной посуды, которую
нужно иростерилизовать. Вы также в большей степени
защищены от поломок.
98
ГЛАВА 5. ОБОРУДОВАНИЕ
5.4.4. Паровой стерилизатор (автоклав)
Самый простой и дешевый способ стерилизации бы-
товой автоклав, который создает давление 100 кПа
(1 атм) выше атмосферною. Друюй вариант — на-
стольный автоклав (рис. 5.18), имеющий автома-
тическое прсираммирование и запор безопасности.
Напольная мидель больших размеров с программиру-
емым таймером, выбором режима вакуумирования до
и после стерилизации и температурным pet истратором
(рис. 5.19) имеет большие возможности, обеспечивает
большую вариабельность режима, и дает перспективы
для соблюдения требования GLP (good laboratory prac-
tice, надлежащая лабораторная практика).
«Влажный» цикл (вода, солевые растворы и т.д.)
осуществляется без удаления воздуха из камеры до
или после стерилизации. Сухие предметы (инструмен-
ты, щетки, закручивающиеся пробки и т.д.) требуют
вакуумирования до начала стерилизации либо воздух
должен быть вытеснен в ходе стерилизации для эф-
фективного распространения горячих потоков. Камера
должна быть также вакуумирована пос де стерилизации,
для удаления пара и обеспечения последующей сушки:
в противном случае все предметы останутся влажны-
ми, появится опасность заражения из конденсата при
сушке. Для минимизации риска заражения, если у вас
нет возможности «цоствакцинального» цикла, все1да
используйте деионизованную или обратноосмотически
обработанную воду для иодачи в автоклав. Если вам
требуется автоклавировать большие объемы (>300 л),
предпочтительнее купить два автоклава средних раз-
меров, поскольку в ходе рутинных манипуляций и
случайных поломок одною вы сохраните другой в ра-
ботающем состоянии. Кроме того, оборудование сред-
них размеров будет на1реваться и остывать быстрее и
использоваться более экономично д>1я небольших объ-
емов автоклавируемого материала. Оставляйте допол-
нительное пространство вокруi автоклава для уборки
и вентиляции, обеспечивая необходимую экстракцию
воздуха для выведения тепла и пара, удостоверьтесь,
что имеется возможность вытекания конденсата.
Большинство маленьких автоклавов имеют соб-
ственный парогенератор (калорифер); большие маши-
ны также могут быть снабжены собственным парогене-
ратором либо использовать подводящую пар линию.
Если в вашем распоряжении имеется паровая линия
высокого давления, то подключение к ней будет самым
простым и дешевым методом подогрева и повышения
давления в автоклаве: если нет. то лучше всею закупать
автоклав в комплекте с собственным парогенератором.
Такой автоклав будет дешевле устанавливать и ле>че
передни! ать. При покупке больших автоклавов выбор,
вероятно, будет отсутствовать, поскольку чаще всего
предлатаются модели с отдельным 1енератором. Б этом
случае следует планировать площадь код размещение
автоклава и генератора.
5.4.5. Весы
Хотя большинство лабораторий получают уже i отовые
среды для культивирования, иншда дешевле ютовить
некоторые реагенты на месте. В этом случае вам по-
требуются весы (электронные весы с автоматическим
тарированием наилучшие), способные взвешивать
от 10 mi до 1001 или даже до 1 ki, в зависимости от
Рис. 5.18. Настольный автоклав. Простой автоклав (Prestige Medical), слева с закрытой крышкой, справа - крышка снюа.
(Фото любезно прсдошавлено Beatson Institute.)
5.4. Подготовительные работы и стерилизация
99
Рис. 5.19. Напольный автоклав. Лабораторный автоклав средних размеров (300 л, 10 фугпв'<) с квадратной камерой для мак-
симальной загрузки. Самописец на верхней консоли связан с датчиком в бутылке, располагающейся в центре .загруженной
камеры. (Фот о любезно предоставлено Bcatson Institute )
масштабов работы. Если вы являетесь поставщиком
услуг, то требуется готовить большое количество ре-
агента, иногда в концентрации 10х, поэтому вес взве-
шиваемого вещества может быть достаточно большим.
Хорошо зарекомендовало себя использование пары
весов грубых и точных, в этом случае расходы прак-
тически одинаковы, а точность и удобство пользования
возрастают.
5.4.6. рН-Метр
Простой pH-метр является полезным дополнением
к лабораторному оборудованию для приготовления
питательных сред и реагентов при культивировании
тканей. Хотя для мониторинга кислотности большинс-
тва растворов достаточно фенолового красного индика-
тора, бывают случаи, когда феноловый красный нельзя
применить (например, в приготовлении культур для
флюоресцентного анализа и в приготовлении основных
растворов), в этом случае потребуется рН-метр
5.4.7. Магнитная мешалка с подогревом
Б дополнение к магнитной мешалке, работающей при
комнатной температуре и используемой при трип-
синилации культур и росте суспензионных культур,
желательно иметь магнитную мешалку с подогревом
для ускорения растворения некоторых реагентов.
Можно поместить обычную мешалку в термальной
комнате, однако при длительном нахождении солево-
100
ГЛАВА 5. ОБОРУДОВАНИЕ
го раствора при температуре 37 °C может развиться
микробный рост, поэтому термостабильные реагенты
лучше растворять при более высокой температуре за
более короткое время.
5.4.8. Автоматический диспенсер
Для разлива объемов до 50 мл можно использовать
диспенсеры, накручивающиеся на горлышко бутыли
(см. рис. 5.20). Для больших объемов, если точность
измерения объема не критична для работы, лучше
использовать диспенсер, работающий иод действием
силы тяжести. Жидкость вытекает по трубке из ре-
зервуара, например из градуированной бутыли (см.
рис. 5.7) или пластикового пакета. Если отмеряемый
объем должен быть точным, предпочтительно исполь-
зование перистальтического насоса (см. рис. 5.9). Точ-
ность и объем разливаемой жидкости определяются
продолжительностью диспенсирования и диаметром
Рис. 5.20. Диспенсер, соединяющийся с бутылкой. Пру-
жинный поршень, связанным с двусторонним клапаном, по-
очередно <и начинающим определенный объем из резервуара
и направляющим жидкость по отводной трубке в сосуд сбоку
Устройство используется для разливании пов1оряющеп1Ся
объема Hccicpii.ibHoii жидкости
трубок Длинный цикл и тонкие подводящие трубки
мшут давать большую точность, широкие трубки уско-
ряют процесс.
5.4.9. Измеритель электропроводности
(кондуктометр)
При изготовлении растворов peai ентов в лаборатории
их качество повышается (см. разд. 11.6.1). Простая
проверка концентрации ионов может проводиться
при помощи кондуктометра против известного стан-
дарта. такого как обычный раствор поваренной соли
(0,15 М).
5.4.10. Осмометр
Одним из наиболее важных физических свойств
культуральной среды, которое к тому же трудно пред-
сказать, является осмолярность. Проводимость опре-
деляется концентрацией ионизированных молекул, но
в осмолярность могут также вносить вклад неионизи-
рованные молекулы. Поэтому осмометр (см. рис. 9.1)
полезен для проверки приготовленных растворов,
ре1улировки новых композиций питательных веществ
или для компенсации осмолярности при добавлении в
среду каких-то реагентов. Осмометры обычно работа-
ют за счет понижения точки замерзания раствора или
среды или повышения давления пара. При покупке вы-
бирайте прибор с маленьким объемом анализируемого
образца (<1 мл), поскольку вам может* потребоваться
измерить осмолярность ценного реагента и точность
измерения (± 10 мосмол кг) будет менее важна, чем
ценность реагента
5.4.11. Моечная машина
для стеклянной посуды
Возможно, наилучшим способом получения чистой
стеклянной посуды является наличие лаборанта, ко-
торому вы доверяете, однако при слишком большом
количестве иосуды может быть ценным приобретение
автоматической моющей машины (рис. 5.21). Некото-
рые из тех, которые представлены на рынке, достаточно
удовлетворительны ио качеству. Обратите внимание на
следующие моменты:
1) Внимательно выбирайте штативы и держатели с
индивидуальными втулками, над которыми вы мо-
жете разместить бутыли, флаконы и т. д. Открытые
сосуды, такие как чашки Петри и химические ста-
каны, moi ут быть вымыты достаточно хорошо при
помощи разбрызтвания и вращающейся формы,
но узкогорлые сосуды требуют индивидуально! о
высокоскоростного потока. Форсунки для потока
должны иметь прокладки или коврики в осно-
вании для предохранения горлышка бутылки от
скалывания.
5.5. Хранение
101
Рис. 5.21. Моечная машина для стекла. Стеклянная посуда
и другие изделия помещаются на индивидуальные патрубки.
которые обеспечивают тщательное мытье и ополаскивание
(Bcttcrbudt). (Фото любезно предоставлено Beatson Insti-
tute)
2) Насос, который накачивает воду через форсунки,
должен обеспечивать достаточно высокое давление,
около 2—51 Па, в зависимости от размеров машины
3) Вода для мытья должна быть tioaot рета, по крайней
мере, до 80 °C.
4) Должно иметься приспособление для ополаски-
вания деионизованной водой в конце цикла. Вода
должна быть подогрета до 50—60 °C; в противном
случае стекло может треснуть от резкого перепада
температуры. Вода для полоскания должна пода-
ваться как проточная струя с удалением без повтор-
ного использования. Если иовторное использование
неизбежно, то иотребуется. ио меньшей мере, трое-
кратное прополаскивание в деионизованной воде.
5) Предпочтительно удалять воду, оставшуюся от
последнего полоскания одной партии посуды, и не
оставлять ее для предварительного ополаскивания
следующей партии. Слив воды после полоскания
уменьшает риск химического загрязнения, особенно
кот да машина используется для мытья химической
и радиоизотопной посуды.
6) Машина должна быть облицована нержавеющей
сталью и соединена с нержавеющими или нейло-
новыми трубами.
7) При возможности, следует выбрать такую машину
для сушки стекла, в которой можно использовать те
же поддоны и держатели, что н в моечной машине
(см. рис. 5.21), чтобы можно было прямо перемещать
посуду, не снимая ее с держателей, с использовани-
ем подходящих тележек или роликов.
5.5. ХРАНЕНИЕ
5.5.1. Холодильники и морозильники
Обычно бытовые холодильники и морозильники
достаточно эффективны и дешевле, чем специальное
оборудование. Существуют бытовые холодильники
без морозильной камеры («большие холодильники»)
с большим пространством и реже возникающей необ-
ходимостью размораживания. Однако, если вам требу-
ется хранить объем 400 л или больше (см. ращ. 4.5.3),
большой больничный банк для хранения крови или
промышленный холодильник для продуктов может
оказаться лучше
Если площадь помещения достаточно велика, а ко-
личество людей, использующих культуру тканей, более
трех или четырех, лучше подумать о холодной комна-
те, содержание которой но сравнению с несколькими
отдельными холодильниками экономически более
выгодно из-за большего пространства, а также легче
для доступа. Стены холодной комнаты должны быть
гладкими и ле! ко мыться, стеллажи должны бы гь снаб-
жены колесиками, чтобы можно было их перемещать
при уборке помещения. Холодная комната должна уби-
раться регулярно, с удалением старых запасов; стены и
полки следует мыть с антисептиками для минимизации
заражения грибами.
Подобное оборудование можно использовать для
замораживания - несколько недоро! их бытовых моро-
зильников будут дешевле и эффективнее, нежели спе-
циальный лабораторный морозильник. Большинство
реагентов для культивирования тканей хранятся при
температуре —20 °C, поэтому сверх! лубокое заморажи-
вание не требуется. Создание комнаты для i лубокого
замораживания не рекомендуется - ее очень трудно и
неприятно убирать; возникает мною проблем, связан-
ных с перемещением ее содержимого при тщательной
уборке.
Хотя использование саморазмораживающихеся
морозильников нежелательно д.>1я некоторых реакти-
вов (ферментов, антибиотиков и пр.), они достаточно
полезны для хранения большинства запасов, необходи-
мых для культуры тканей, структура которых позволяет
выдержать колебания температуры, а природа менее
чувствительна к острому криогенному повреждению.
Теоретически сыворотки moivt испортиться при ко-
лебаниях температуры в саморазмораживающихся
морозильниках, но на практике этого не происходит.
Мнение важные составляющие сыворотки - малые
протеины, полипептиды и простые ор1анические и
неор1анические компоненты — moivt быть нечуветви-
102
ГЛАВА 5. ОБОРУДОВАНИЕ
тельны к криогенному повреждению, в частности, если
растворы хранятся в объемах >100 мл.
5.5.2. Контейнеры для криоконсервации
Подробное описание контейнеров для криоконсерва-
ции и советы но выбору этого оборудования приводятся
в гл. 20 (см. разд. 20.3.5). Коротко говоря, выбор зависит
от размеров и типа системы, которые требуются для
ваших нужд. Для маленькой лаборатории подойдет35-л
сосуд с узким горлышком. Использование емкостей и
канистр (см. рис. 20.6а, 20.7а) или ящиков в системе
стеллажей (см. рис. 20.6/, 20.7») должно обеспечить
хранение примерно 500 1000 ампул с культурами (см.
Приложение II). Морозильное оборудование большего
объема, которое вмещает >10 000 ампул и включает мо-
дели со стенами, обрызтанными жидким азотом, помо-
жет снизить расходы азота и обеспечит более надежное
хранение образцов без хранения собственно жидкот о
азота. При выборе хранилища с разбрызшванием азота
по стенам важно обеспечить необходимые меры предо-
сторожности от попадания некоторых материалов, воды
и водяных паров в перфузионную систему, поскольку
засор системы трудно, порой невозможно удалить.
Следует приобрести соответствующие сосуды для
хранения, которые позволят иметь резерв жидкого азота.
Размеры сосудов зависят от 1) размеров морозильного
оборудования; 2) частоты и возможности приобретения
жидкого азота; 3) скорости испарения жидкого азота;
для 35-л узкогорлого морозильника, использующего
5 10 л в неделю потребуется только 25-л сосуд Дюара
при доступности ре1улярного его заполнения. Большие
морозильники лучше заполнять азотом по системе труб
из постоянного хранилища (например, 160-л сосуд
для хранения, соединенный с 320-л морозильником со
встроенной системой заполнения и аварийной сш нали-
заииеи, либо 500-л цистерна для большего морозильни-
ка пли нескольких меньших морозильников).
5.5.3. Морозильники с управляемым
процессом замораживания
Хотя клетки можно заморозить непосредственно поме-
щением в изолированный шкаф при —70 °C, некоторые
клетки требуют различных скоростей охлаждения или
сложно! о upoi раммирования скорости охлаждения
(см. разд. 20.3.4). Программируемый морозильник
(например. Cryomed, Planer) обеспечивает управление
процессом замораживания с возможностью измене-
ния параметров замораживания путем впрыскивания
жидкого азота в морозильную камеру под контролем
заранее установленной программы (см. рис. 20.5). Бо-
лее дешевый вариант контроля охлаждения клеток с
помощью систем Taylor Wharton, специальных замора-
живающих шкафов (Nalge Nunc), а также контейнеров
из простой полистиреновой пены или пеноизоляиии
труб водоотвода (см. рис. 20.2-20.4).
5.6. ЛАБОРАТОРНЫЕ ПРИБОРЫ
5.6.1. Компьютеры и сети
Большинство лаборат ории оборудовано одним или бо-
лее компьютером, которые могут быть соединены в сеть.
В зависимости от того, располатается ли компьютер или
термина.'! в помещении лаборатории культуры тканей,
занесение в базу данных записей пл ведению клеточ-
ных линий (см. разд. 13.7.8) первичных культур (см.
разд. 12.3.11) и протоколы экспериментов значительно
обле1 чают последующий поиск этой информации и ее
анализ. Данные ио ведению клеточных линий лучше со-
хранять в базе данных компьютера, что может служить
для учетного контроля замороженных в азоте культур
(см. разд. 20.4.1). В больших лабораториях контроль
запасов пластика, стекла, реактивов и питательных сред
также можно упростить использованием компьютера.
У внутренних сетей есть определенные преимущества:
поскольку индивидуальные компьютеры могут быть
дублированы централизованно на основе стандартного
программного обеспечения, постольку информация,
внесенная на любом пункте, может быть доступна всем
пользователям. Например, фотографии, сделанные
в лаборатории культивирования тканей, мотут быть
сохранены на центральном сервере и извлечены из
центрального офиса или зоны ведения документации.
5.6.2. Прямой микроскоп
Наряду с инвертированным микроскопом, применяе-
мым для хромосомного анализа, определения контами-
нации микоплазмами и ав i орадиографии в лаборатории
может потребоваться прямой микроскоп. На самом деле,
инвертированный микроскоп применяется также для
оценки состояния культуры, контаминации бактериями
и грибами. Препараты авторадиографии и хромосомные
препараты можно смотреть и на прямом микроскопе. Вы-
бирайте микроскоп с высоким разрешением (Leica, Zeiss
или Nikon), со светлою (льной оптикой и увеличением
о&ьектива до х1()0, фазово-контрастным объективом,
по крайней мере, х40, но предпочтительно х100 и флю-
оресцентной оптикой с подсветкой и объективами х40
и х10(). Флюоресцентная оптика будет использоваться
для обнаружения микоплазм (см. протокол 19.2) и иссле-
дования флюоресцентных антител. Leica предоставляет
вводно-иммерсионные объективы с увеличением 50х.
которые, в частности, полезны для изучения стандарт-
ных препаратов микоплазм, окрашенных ио Hoechst.
Автоматическая цифровая камера или CCD- обору-
дование также полезны для фотографической формы
регистрации данных или постоянных препаратов.
5.6.3. Низкотемпературный морозильник
Большинство реактивов для ведения культивирования
могут храниться при температуре 4 °C или —20 °C, од-
5.7. Специальное оборудование
103
нако некоторые препараты или продукты, выделенные
из культур, MOiyT потребовать хранения при 70 °C
или —90 °C. При этой температуре замерзает* лея вода
и скорость протекания большинства химических и
радиолитических реакции резко О|раничивается.
Низкотемпературный морозильник -70 °C или 90 °C
также используется для замораживания клеток в
теплоизолирующем контейнере (см. протокол 20.1).
Тип морозильной камеры, расиола|ающейся на уров-
не । руди, более экономичен и приводит к меньшему
расходу энерши, но вертикальный шкаф с выдвиж-
ными ящиками, стоящий на иолу, выглядит менее
экстрава|антно и обеспечивает более леи<ий доступ к
хранящемуся содержимому. Если вы сделали выбор в
пользу вертикального морозильника, удостоверьтесь,
что в нем имеются 6—8 индивидуальных отделений на
объем 400 л с отдельными плотно закрывающимися
дверцами, и ожидайте, что вам придется заплатить за
него, по крайней мере, на 20°о больше, чем за моро-
зильную камеру.
Н изкотем иературны и морозильник производи!
большое количество тепла, которое должно отводиться
д.>1я эффективной работы (или вообще работы). Такие
морозильники должны располагаться в хорошо вен-
тилируемой или снабженной кондиционером воздуха
комнате, чтобы постоянная комнатная температура не
превышала 23 °C. Если это невозможно, вложите сред-
ства в морозильник, приспособленный для тропических
условий, в противном случае перед вами постоянно
будет стоять проблема эксплуатации, размораживания
и более короткого срока службы со всеми соответ-
ствующими осложнениями но перемещению ценных
запасов. Одна или две поломки вызовут расходы на
очинку ($ 1000 и более) и потерю ценных материалов,
что вскоре сведет на нет все преимущество, которое вы
получите, покупая более дешевый морозильник.
например для обнаружения микоплазм (см. прото-
кол 19.3) и определения профиля ДНК (см. прото-
кол 16.9), работа которого основана на амплификации
и обнаружении специфической последовательности
ДНК. Если вы планируете применять этот метод в
вашей лаборатории, помните, что в нем используется
полимеразная ценная реакция (ПЦР) и требуется ам-
илификатор.
5.7. СПЕЦИАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
5.7.1. Установка для микроинъекций
Для введения чего-то непосредственно в клетку, напри-
мер для ядерной трансплантации или инъекции краси-
теля, используют микроманииуляторы (рис. 5.22).
5.7.2. Счетчик колоний
Монослойные колонии можно ле|КО подсчитать на
глаз или при помощи препаровальной луны и фломас-
тера, которым отмечают колонии, но при необходи-
мости обсчитать большое количество колоний может
помочь автоматический счетчик колоний. Самый
простой прибор включает разметочный карандаш с
электродом на конце, прикосновение которым к по-
верхности чашки включает счетчик. Часто счетчики
снабжены мощной линзой, позволяющей помочь визу-
ализации колоний. Дальнейшее усложнение прибора
с возрастанием стоимости приводит к электронному
счетчику с предварительно установленной програм-
мой, которая позволяет подсчитывать колонии, ис-
пользуя программы анализа изображения (Optomax,
5.6.4. Конфокальный микроскоп
Цитологи четкие исследования флюоресценции ме-
ченых клеток при высоком разрешении часто более
успешны, если проводятся при помощи конфокального
микроскопа. Эта техника позволяет микроскопу прово-
дить «оптическое сечение» через образец, предоставляя
изображение в одной фокальной плоскости и избе|ая
интерференции, вызванной соседними клетками, рас-
положенными в другой фокальной плоскости. Данные
накапливаются, хранятся в цифровом виде и moi уч
быть представлены различными способами, включая
создание образа вертикального сечения образца (т. н.
Z-сечение), что, в частности, полезно при осмотре
трехмерной культуры.
5.6.5. Термоциклер
При сертификации Клеточной линии используется
большое количество дополнительного оборудования,
Рис. 5.22. Микроманипуляторы и подогреваемый столик.
Столик с контролируемой температурой поверхности (Pel-
tier) для видеосъемки в замедленном режиме или микрои-
нъекций, с возможностью перфузии н о i бора проб. (Фото
любезно iipe-доставлсно Beatsun Institute.)
104
ГЛАВА 5. ОБОРУДОВАНИЕ
Symbiosis). Эти счетчики очень высокоскоростные и
позволяют учитывать колонии различного диаметра,
а также различать соседние слившиеся колонии (см.
разд. 21.10.2)
5.7.3. Центрифужный элютриатор
Центрифужный элютриатор представляет собой спе-
циально адаптированную центрифугу, подходящую
для разделения клеток по размерам (см. разд. 15.2.2).
Это оборудование дорО| остоящее, но эффективное, в
частности для получения большого выхода клеток.
5.7.4. Проточный цитометр
Этот прибор может анализировать клеточные копуля-
ции в соответствии с широким диапазоном параметров,
включая светорассеяние, ши лощение света и флюорес-
ценцию (см. разд. 15.4, 21.7). Многопараметрический
анализ представлен в двух- или трехмерном формате.
По типу анализа эти приборы обычно известны как
проточные цитометры (см. разд. 21.7.2, например
BD Bioscences Су tester), но сигналы, которые они
порождают, также используют в клеточном сортере
с активированной флюоресценцией для выделения
индивидуальных клеточных копуляций с высокой
степенью разрешения (например, BD Bioscences
FACStar). Стоимость проточно!о цитометра высока
($100 000 200 000), и наилучшие результаты мтут
быть получены при помоши квалифицированного
оператора, имеющего специальные навыки
5.8. РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Эта категория материалов включает основные пред-
меты, такие как пипетки и контейнеры для пипеток,
культуральные флаконы, ампулы для замораживания,
центрифужные пробирки и стаканы (10 - 15 мл, 50 мл,
250 мл Sterlin, Nalge Nunc), одноразовые шприцы и
иглы (21—23 G для удаления жидкости из пузырька
или ампулы, 19 G для измельчения клеток), фильтры
различных размеров (см. разд. 11.5.2) для стерилиза-
ции жидкостей, хирур! ические перчатки и бумажные
полотенца.
5.8.1. Пипетки
Пипетки должны быть продуваемого типа, с широким
отверстием в носике для быстрого удаления жидкости
и градуированные до носика с максимальным делением
шкалы на другом конце пипетки. Можно использовать
одноразовые пипетки, но они доро< и и лучше сохранить
их в качестве запасных на период выходных дней, koi да
не работает технический персонал либо на случай по-
ломки моечной машины или стерилизатора. Пипетки
многократного использования после употребления
собираются в контейнеры для пипеток или лотки, по
одному на рабочее место. В отношении пастеровских
пинеток наилучшим образам зарекомендовали себя
одноразовые пипетки, использованные пастеровские
пипетки не следует помещать в общие цилиндры для
пипеток, используйте для этою безопасную емкость
для стеклянных отходов. Кроме того, можно пользо-
ваться одноразовыми пластиковыми пастеровскими
пипетками (Pastettes).
Контейнеры Оля пипеток. Стеклянные пинетки
обычно стерилизуют в алюминиевых или никелиро-
ванных стальных контейнерах. Квадратные в сечении
контейнеры предпочтительнее кру|лых, поскольку
они удобнее складируются и не покатятся по по-
верхности рабочего стола. Существуют различные
варианты контейнеров с обложенными силиконовой
резиной крышкой и дном во избежание скола или
разбивания пипеток при манипуляциях (Thermo
Electron, Bellco)
Пластиковые либо стеклянные пипетки. Во
mhoi их лабораториях привыкли к использованию
пластиковых пипеток, имеющих ряд преимуществ
перед стеклянными: они поступают предварительно
стерилизованными, упакованными, и не вызывают
опасности, связанной со сколом или разбиванием
стеклянных пипеток. Кроме того, их не требуется
мыть, что достаточно затруднительно, или затыкать
ватными фильтрами, что утомительно. С другой сто-
роны. они значительно дороже, и. если они упакованы
индивидуально, их дольше вынимать из упаковки при
употреблении. Если же такие пипетки упакованы пар-
тией, повышается риск загрязнения в случаях, koi да
упаковка не подразделена на секции (см. разд. 6.3.5).
Пластиковые пипетки также увеличивают косвенные
расходы, особенно если их необходимо дезинфициро-
вать до утилизации.
При грубой прикидке, расходы на пластиковые пи-
петки на одного человека ежегодно составляют около
$2000. Количество людей, таким образом, определяет
выбор между стоимостью приобретения пластиковых
пипеток или оплатой труда лаборанта, моющего и
стерилизующего стеклянные пипетки. (При расчетах
помните, что на стеклянные пипетки ежегодно расхо-
дуется $200 на человека, кроме того, требуется расход
лнер] ии на мойку и стерилизацию.)
5.8.2. Гемоцитометр
При работе с клетками полезно иметь несколько
методов, позволяющих оценивать их количество.
Гемоцитометрические камеры наиболее дешевы и
будут полезным дополнением при оценке жизнеспо-
собности клеток методом освобождения красителя,
(см. разд. 21.1.1, 22.3.1, рис. 21.1., цв. вкладку 17а и
протоколы 21.1,22.1).
5.8. Расходные материалы
105
5.8.3. Культуральные сосуды
Выбор культуральных сосудов определяется: 1) требуе-
мым выходом клеток (см. табл. 8.1); 2) типом культуры:
монослойная или суспензионная; и 3) режимом куль-
тивирования (например, будут ли образцы отбираться
одновременно или через определенные промежутки
времени) (см. разд. 21.8). Покупая «все подряд», вы
можете выиграть в цене, но не поддавайтесь соблазну
менять продукты слишком часто, и Bcei да испытывайте
новые образцы культуральных сосудов, прежде чем
приобретать их партией (см. разд. 11.6.3).
Обратите особое внимание на этикетки: стерильно
или нестерильно, для культуры тканей или не для
работы с культурами тканей, качество пластика, — все
эти категории хранятся отдельно. Стеклянные бутылки
с плоской стороной (матрасы) мозут использоваться
вместо пластиковых при возможности их обработки:
мытья и стерилизации. Так или иначе, более низкая цена
стеклянной посуды компенсируется превосходством
оптических характеристик, стерильностью, гарантией
качества и общим удобством использования пласти-
ковых флаконов. Однако одноразовый пластик сейчас
составляет примерно 60% от бюдже га культуральных ла-
бораторий — даже больше, чем стоимость сывороток
Чашки Петри менеедороз и, чем флаконы, однако их
содержимое более подвержено заражению и чаще раз-
ливается. Б зависимости от вида работ и стерильности
окружения, использование чашек Петри может быть
достаточно удобно, например, при использовании в экс-
перименте, не связанном с ведением культуры. Чашки
Петри также полезны для исследования колониеобра-
зования, козда в конце эксперимента колонии должны
быть окрашены и подсчитаны или изолированы.
5.8.4. Стерильные контейнеры
Для иссечения тканей потребуются чашки Петри
(9 см), маленькие бутылочки (5 мл), 30-мл универ-
сальные контейнеры или 50-мл баночки для хранения,
15- и 50-мл пробирки для центрифуз ирования и 1-, 2-мл
пластиковые пузырьки для консервирования (Nalge
Nunc) при замораживании в жидком азоте (см. прото-
кол 20.1). Удобно использование пузырьков с цветовой
маркировкой (Alpha Laboratories; см. цв. вкладку 22).
5.8.5. Шприцы и игпы
Несмотря на то что при стандартных манипуляциях
частое использование И1 л и шприцов не рекомендуется
(в связи с опасностью травматизации, требованиями
стерильности и проблемами стресса клетки деформа-
цией сдвига), при фильтрации в соединении с фильтру-
ющими насадками шприцы необходимы, а излы мозут
потребоваться для экстракции реагентов (лекарствен-
ных ззреззаратов, антибиотиков или радззозззотзизов) ззз
закуззоренных ззузырьков.
5.8.6. Стерилизационные фипьтры
Хотя обычно в лаборатории культивирования тка-
ней доступ нз> стерззлизузощее оборудование, в боль-
шинстве лабораторззй исззользуются стерззлзззузощие
фззльтры. Целесообразно иметь в запасе несколько
«фильтрующих насадок различнозх* размера, например
25-мм насадку для шприца (Pall Gelman, Millipore) и
47-мм насадку для бутылок или колбу для фильтро-
вания (Falcon, Nalge Nunc). Хорошо иметь ззод рукой
небольшой набор фильтров еще больших размеров
(см. разд. 11.5.2).
5.8.7. Бумажные полотенца и сапфетки
Возле каждоз о рабочезх* места или ламинарнозо шкафа
следует обесззечить расположение бумажных полотенец
зз салфеток.
5.8.8. Дезинфектанты
Все биолоз ические материалы ззосле работы предпоч-
тительно отззравлять в дезинфицирующий раствор
для предупреждения роста в емкостях для утилзззацизз
микроорз анизмов, потенциально сззособных привести к
зараженззю культур. При исззользованизз тканей чело-
века и друз их ззриматов ззбязательно помезцать все био-
лоз ззческие материалы в дезинфектант (см. разд. 7.8.5).
Чазце всего используются дезинфектанты на основе
хлора, которые поставляются на рынозс в виде концен-
трата (Clorox. Cliloros) или таблеток (Precept).
Глава 6
МЕТОДЫ АСЕПТИКИ
6.1. ЦЕЛИ АСЕПТИКИ
Заражение микроорганизмами остается главной про-
блемой культивирования тканей. Бактерии, микоп-
лазмы, дрожжи и споры грибов попадают в кулыуру
через оператора, из воздуха, с рабочей поверхности, из
растворов и мно1 их дру* их источников (см. разд. 19.1 и
табл. 19.1). Асептические методы работы имеют целью
исключить заражение путем установления жестких
норм, правил и гарантий того, что каждый сотрудник,
использующий оборудование, придерживается их.
Заражение может быть незначительным и ограни-
чиваться одной—двумя культурами, может распростра-
ниться на несколько культур и ио* убить весь экспери-
мент, либо окажет ся обширным и унич гожпт все ваши
(и даже всей лаборатории) культуры. Катастрофу мож-
но минимизировать, если: 1) при каждой манипуляции
с культурами тщательно проверять их визуально, при
помощи микроскопа, желательно фазово-контрастного;
2) культуры ведутся без использования антибиоти-
ков, предпочтительно все время, но, ко крайней мере,
часть времени, для установления скрытого заражения;
3) реактивы проверяются на стерильность (вами или
поставщиком) до начала их использования; 4) буты-
ли со средой и дру* ими реа*ентами не используются
несколькими людьми или для различных клеточных
линий; 5) постоянно выполняются стандартные мето-
ды стерилизации, уровень стандартов поддерживается
на высоком уровне.
Одну из наиболее сложных проблем представ-
ляет собой микоплазменная инфекция, невидимая
при обычной микроскопии. Если ее не обнаружить,
она может распространиться на другие культуры
по всей лаборатории. Такими образом, очень важно
дублировать визуальный контроль контаминации
проведением теста на заражение микоплазмами, осо-
бенно если растущая культура вьилядит необычно
(см. разд. 19.3.2).
6.1.1. Поддержание стерильности
Соблюдение правил и методов асептики обеспечивает
барьер между микроор*анизмами окружающей среды
вне культуры и чистой, незараженной культурой во
флаконе или в чашке. Следовательно, все материалы,
которые входят в непосредственный контакте культу-
рой, должны быть стерильны, а все манипуляции долж-
ны проводиться так, чтобы не было прямого контакта
между культурой и нестерильным окружением.
Установлено, что барьер стерильности не может
быть абсолютным без создания условий, которые
значительно затрудняют стандартные манипуляции.
Поскольку проверка соблюдения индивидуальных
мер предосторожности - очень обширное и затруд-
нительное исследование, все операции адаптируются
на основе опыта и здравого смысла исследователя.
Асептические методы представляют собой комбинацию
действий, призванных снизить возможность иниции-
рования. Корреляция между невыполнением какого-
то ша*а и случаями заражения не все* да абсолютна.
Оператор может отказаться от выполнения нескольких
действий, прежде чем вероятность заражения возрас-
тет так резко, что станет почти неизбежной (рис. 6.1).
К тому же, причина заражения обычно мно* офакторна,
и, следовательно, не существует очевидного простого
решения проблемы. Если однажды установленные
меры предосторожности постоянно соблюдаются, то
случаи заражения имеют место значительно реже и
ле* че обнаруживаются.
Хотя лабораторные условия в настоящее время в
большой мере обле*чают соблюдение асептики (кон-
диционирование и фильтрация воздуха, ламинарные
шкафы и т.д.), современные лаборатории нередко
переполнены персоналом, и оборудование часто ис-
пользуется несколькими людьми. Тем не менее при
жестком соблюдении мер предосторожности не трудно
соблюдать стерильность.
6.2. ОБЪЕКТЫ АСЕПТИЧЕСКОГО
ОКРУЖЕНИЯ
6.2.1. Стерильная зона
В отсутствие ламинарного шкафа для стерильных
работ следует использовать специальную стерильную
комнату. Если это невозможно, выделите тихий угол в
лаборатории, с минимальным перемещением людей и
отсутствием выполнения рядом какой-либо другой ра-
боты (см. разд, 4.3.1). При наличии ламинарного шкафа
для расположения стерильной зоны следует выбрать
место, удаленное от иотоков воздуха из дверей, окон и
т. д_, в этой зоне не должно быть активных перемещений.
6.2. Объекты асептического окружения
107
0 10 20 30 40 50 60
Недели
Рис. 6.1. Возможность заражения. Сплошная линия в верхней части графика представляет колебания в методике относительно
100% идеальная асептическая техника. Сплошная линия в нижнеп части графика представляет собой колебания в уровне
заражения в окружающей среде, за 0 принимается идеальная асептика. Максимум первой кривой связан с нарушениями асеп-
тической техники (нс иршсртая по забывчивости поверхность, прикосновение пальцев к пинеткам в средней и нижней частях,
контакт кончика иипсткн с нестерильной поверхностью ит д.) Пики другой кривой связаны с повышением зараженности
окружающей обстановки (споровое заражение, зараженный инкубатор, зараженные реактивы и т.д ). Пока эти отклоненья
или пики минимальны по силе и продолжи гс тьностн, два графика нс перекрываются Когда резкие колебания в асептическое
методике (точечная линия наверху) совпадают с резкими отклонениями в степени зараженности окружения (пунктирная линия
внизу), например как в левой части графика, где точечная и пунктирная линии пересекаются, возможность инфицирования
возрастает Если нарушения в соблюдении методов асептики продолжаются и нарастают (регрессия точечной линии в пра-
вой части графика), а зараженность окружения также повышается (повышение пунктирной кривой в правой части графика),
после пересечения двух кривых вероятность инфицировании резко возрастает и приводит к частым мультиспсцифичным и
мультифактирным случаям заражения
а также оборудования, которое создает шттоки вгхгдуха
(центрифуги, холодильники и морозильники ит.д.),
кондиционеры должны располагаться так, чтобы по-
токи воздуха не нарушали работу ламинарного шкафа
(см. разд. 4.3). Работа в боксе должна быть ограничена
работой с культурами тканей, все микробиолог ические
процедуры, так же как и манипуляции с животными,
необходимо исключать из асептической зоны. Зона
должна содержаться в чистоте и быть свободной от
ныли, а также от оборудования, которое не связано с
культивированием тканей. Нестерильные манипуля-
ции. такие как отбор проб, окрашивание ггли экстрак-
ция, должны производиться где-то в другом месте.
6.2.2. Рабочая поверхность
Очень важно содержать рабочую поверхность свобод-
ной и чистой. Следует соблюдать следующие правила:
1) начинайте работу только на совершении чистой
поверхности;
2) притрите поверхность тампоном, обильно смочен-
ным 70%-м раствором этанола;
3) принесите только те предметы, которые вам потре-
буются для планируемой работы;
4) убирайте все, что вам не нужно, протирая поверх-
ность между манггггуляциями;
5) организуйте ваше рабочее место так, чтобы вы:
а) имели свободный доступ ко всем предметам гг не
тянулись через однгг, чтобы достать другие;
б) имел и для работы больш ое свободное простран-
ство в центре стола (не только в передней его
части) (рггс. 62). Если вокруг вас будет слишком
много оборудования и материалов, возрастет
риск контакта наконечника или кончика сте-
рильной пипетки с нестерггльной поверхно-
стью. Более того, ламинарный поток в боксе,
заставленном посудой гг оборудованием, резко
нарушается (рис. 6.3);
6) горизонтальный ламинарный поток более устойчив к
загромождению разными предметами, но вы и в этом
случае должны работать на чггскгй поверхности, не
имеющей препятствий для воздуха между централь-
ной рабочей зоной гг НЕРА-фильтром (рис 6.4);
7) организуйте работу так, чтобы все необходимые
вам предметы (пггпетки, груши для пииетирования,
108
ГЛАВА 6. МЕТОДЫ АСЕПТИКИ
Рис. 6.2. Возможное расположение оборудования в рабочей зоне ламинарного шкафа. Правильное расположение предметов
на рабочей поверхности Для операторов-левшей расположение может быть зеркальным
Рис. 6.3. Плохо организованное расположение предметов в рабочей зоне. Ламинарный шкаф используется неправильно.
Слишком много предметов, нарушающих движение воздушных потоков, в т ч. в передней части рабочей зоны. Нарушаются
как сюрильность. так и защита опера юра от биологической опасное и
наконечники для автоматических пинеток н др.)
находились в иоле вашего зрения и не закрывались
вашими руками при манипуляции;
8) немедленно удаляйте любые загрязнения, иротирая
затем поверхность 70%-м этанолом;
9) ио окончании работы уберите все, еще раз вымойте
и протрите этанолом поверхность.
6.2.3. Личная гигиена
Существуют различные мнения но поводу того, повы-
шает или увеличивает количество микроорганизмов
на коже рук частое мытье. Независимо от результатов
этой дискуссии, мытье очищает руки и удаляет сухие
клетки кожи, которые, в противном случае, могли
6.3. Стерилизующие манируляции
109
Рис. 6.4. Планировка рабочей зоны в ламинарный шкафе с горизонтальным воздушным потоком. Для операторов-левшей
расположение может- быть зеркальным
бы попасть в культуру. Мытье рук также снизит за-
раженность слабо прикрепленными микроор|аниз-
мами, которые представляют наибольший риск для
культуры. Можно надевать хирургические перчатки
и периодически протирать их спиртом, но предпочти-
тельной может оказаться работа без перчаток ( гам, । де
применение перчаток не обязательно по требованиям
биобезопасности), поскольку это позволяет сохра-
нить большую чувствительность пальцев и точность
манинуляцп й.
По требованиям GMP (Good Manufacturing Prac-
tice), персоналу требуются шапочки, ххчаты, накидки
и xiipypi ические маски [Food and Drug Administration,
1992, Rules and Guidance for the Pharmaceutical Manu-
facturers and Distribiitir.s, 1997J, но в них нет особой
необходимости в обычных условиях, в частности при
работе в ламинарном шкафу. Если у вас длинные во-
лосы, завяжите их сзади. При работе в асептической
зоне на открытом столе не разговаривайте. Pa3i опоры
допустимы при работе в ламинарном шкафу с верти-
кальным потоком, при наличии стеклянной перегород-
ки между вами и культурой, но и в этом случае следует
свести их до минимума. Если у вас простуда, наденьте
маску, или, еще лучше, — не проводите никаких работ
с культурами тканей, хотя бы в период выраженного
инфекционного процесса.
6.2.4. Реагенты и среды
Реактивы и среды, полученные от промышленного
производителя, должны до продажи предварительно
подвер!аться строгому контролю на стерильность,
однако наружная поверхность бутылей и флаконов,
в которых они содержатся, не стерильна. Некоторые
производители обтяшвают бутыли полиэтиленовой
пленкой, которая защищает от грязи и позволяет по-
мещать их в водяную баню для размораживания или
согревания. Эту пленку следует удалить с бутыли вне
ламинарного шкафа. Бутыли после водяной бани или
холодильника, освобожденные от упаковки, должны
быть обработаны 70?о-м этанолом
6.2.5. Культуры
Культуры, полученные из других лабораторий, несут
высоки ii риск, поскольку они могут быть заражены как
исходно, так и при транспортировке. Импортирован-
ные клеточные линии необходимо всегда подвергать
карантину (см. разд. 4.3.3; 19.1.8), т.е. все работы с
ними производить в отдельном от выращивания Apyi их
основных культур помещении, а также хранить без ис-
пользования антибиотиков, пока небудет показано, что
поступившие культуры свободны от заражения. Затем
их можно присоединить к остальным культурам. Не
стоит постоянно использовать антибиотики, поскольку
они moi ут подавлять, но не уничтожать микроор! аниз-
мы, заразившие культуры (см. разд. 9.4.7).
6.3. СТЕРИЛИЗУЮЩИЕ МАНИПУЛЯЦИИ
6.3.1. Протирание поверхностей
Протирайте все рабочие поверхности 70“о-м этиловым
спиртом до и в процессе работы, в частности после лю-
бим о разливания, а также по завершении всей работы.
Протирайте до начала работы бутылки, особенно те,
которые поступают из хранения на холоде или после
водяной бани, а также флаконы или боксы, вынутые из
инкубатора. Протирание и hoi да приводит к смыванию
надписей, поэтому используйте этанол-устойчивый
маркер.
110
ГЛАВА 6. МЕТОДЫ АСЕПТИКИ
6.3.2. Закрывание емкостей
Глубокие закручивающиеся крышечки предпочти гель-
нее пробок, хотя требуется больше внимания хорошему
отмыванию детерюнта из внутреннем поверхности
резиновых прокладок- При возможности следует ис-
пользовать полипропиленовые крышки без прокладок.
Закручивающиеся колпачки должны быть обернуты
фолы ой для предохранения юрлышка бутылки от
отложения ныли, хотя использование । лубоких колпач-
ков (например, Duran) делает оборачивание фольгой
менее необходимым.
6.3.3. Работа с горелкой
При работе на открытом столе (рис. 6.5) производится
обжигание стеклянных пипеток, горлышек бутылей,
а также пробок до и после открывания емкостей; вся
работа проводится вблизи пламени, в потоках восхо-
дящего воздуха, возникающего за счет конвекции. Не
оставляйте открытыми бутыли, если вы работаете не в
ламинарном шкафу, даже рядом с пламенем. Крышки
следует класть на чистую поверхность внутренней сто-
роной наверх и обжигать до тою, как ими снова закроют
бутыли. Колпачки можно держать в руке (рис. 6.6) во
время пипетирования, при этом отпадает необходи-
мость класть их на стол н обжигать.
Обжи|ание в пламени не целесообразно, koi да
вы работаете в ламинарном шкафу, поскольку это
нарушает ламинарный поток, что, в свою очередь,
нарушает стерильность культур и предохранение от
биол<м ической опасности. Открытое пламя несет в себе
опасность пожара и может повредить НЕРА-фильтры
(high-efficiency par lieu late air высокоэффективный
распыленный воздух) или расплавить некоторые внут-
ренние пластиковые детали.
6.3.4. Манипуляции с бутылками и колбами
При работе на открытом рабочем столе не следует де-
ржать открытые бутыли вертикально, наклоняйте их
насколько возможно без риска разливания. Штатив для
бутылей (MP Biomedical) позволяет удерживать буты-
ли или флаконы под углом. Культуральные флаконы
должны лежать горизонтально, koi да их открывают, и
затем при манипуляциях следует держать их под ут лом.
Когда вы работаете в ламинарном шкафу, бутыли мо-
ут стоять вертикально открытыми, но не допускайте,
чтобы ваши руки или другие предметы двш злись мимо
открытых сосудов или стерильных пипеток, а также
воздушных Н ЕРА-фильтров.
6.3.5. Пипетирование
Стандартные стеклянные или пластиковые пипетки
до сих пор остаются самым простым приспособлением
для манипуляций с жидкостями. ИнО|да используются
шприцы, но их употребление ограничено, поскольку
стандартные шлы слишком коротки для большинс-
тва сосудов. Работа со шприцом может также создать
напряжение сдиша, повреждающее клетки, ко|да вы
разливаете суспензию клеток, кроме тою, возрастает
риск укалывания и введения себе биоло| и ческою ма-
териала. Канюли с широким просветом имеют преиму-
щества перед стандартными ш нами, но их использо-
вание замедляет процесс, за исключением применения
многоступенчатого диспенсера (см. рис. 5.8).
Можно выбрать пипетки удобного размера, набор
пипеток объемом 1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл, и 25 мл удов-
летворит все ваши потребности, хотя существуют и
100-мл пинетки (BD Biosciences), которые удобны при
приготовлении и разливании среды. Использование
пипеток с быстрым сливом снижает точность и акку-
Рис. 6.5. Планировка рабочей зоны на открытом столе. Предметы расставлены в форме полумесяца вокрут чистой рабочей
поверх носит в центре стола. Бунасновская горелка расположена в центре, чтобы обеспечить обжи танце предметов и создать
восходящий воздушный поток над рабочей зоной
6.3. Стерилизующие манируляции
111
Рис. 6.6. Способ удерживания груши и крышки отфлакона
в руке. Крышка может быть откручена и удерживаема мизин-
цем руки. прижимающим ее к ладони При этом три пальца
держат грушу для пииетирования
раз ность работы, но дает значительным выш рыт в ско-
рости. Если вы используете стекля иные пипетки и вам
требуется только несколько пипеток каждого объема,
при упаковке пипеток в контейнер для стерилизации
используйте смешанный набор. Одноразовые пластико-
вые пипетки должны иметь двойную оболочку, верхняя
из которых удаляется до помещения в ламинарный
шкаф. Неиспользованные пипетки должны храниться
в бес пылевом контейнере.
Пипетирование ртом должно быть исключено,
поскольку оно является дополнительным фактором
микоплазматического заражения п может представлять
биоло! пческую опасность для оператора (например,
при работе с вирус инфицированными клеточными
линиями, биопсийным или аутопсийным материалом
от человека, или другими объектами, обладающи-
ми потенциальной биоло! и ческой опасностью (см.
разд. 7.1.7)). Производителями предлагаются недоро-
ие груши (рис. 6.6) и электрические пипетирующие
устройства (см. рис. 5.5); постарайтесь выбрать из этого
оборудования то, что подходит вам. Инструмент, кото-
рый вы выберете, должен подходить к пипеткам всех
используемых размеров без применения каких-либо
усилий для вставления и удаления пипеток. Pei уля-
ция потока жидкости должна быть ле! кой и быстрой.
Устройство должно позволять многократно засасы-
вать и выливать из пипетки жидкость (например, при
суспендировании) без разбрызтвания, быть леисим
и удобно располагаться в руке так, чтобы длительная
работа не вызывала утомления.
Автоматическая пипетки (см. рис. 5.6), в част-
ности, удобны для малых объемов (1 мл и меньше),
хотя большинство производителей предлагает авто-
матические пипетки объемом до 5 мл. Поскольку за-
труднительно достать до дна сосуда большого объема
носиком наконечника, не касаясь при .игом внутренней
части его горлышка нестерильными частями корпу-
са, автоматические пипетки следует использовать
только при работе с маленькими флаконами или с
применением промежуточных соединений с другими
емкостями, такими как универсальный контейнер.
Кроме того, при работе с большими объемами следует
использовать удлиненные наконечники. В частности,
автоматические пипетки полезны при микротитра-
ционном анализе и других манипуляциях с много-
луночными планшетами, но не следует использовать
их при серийном ведении культуры, если только не
используются специальные наконечники с фильтра-
ми. Многоканальные автоматические пипетки (с 4,8
или 12 каналами) удобны для работы на микротитра-
ционных планшетах (см. рис. 5.10).
Пипетирование в культуре тканей часто представ-
ляет' собой компромисс между точностью и скоростью
выполнения работы; скорость требуется для того,
чтобы свести к минимуму повреждение клеток при
манипуляциях с ними, в т. ч. субкультивировании, а
аккуратность и точность — для воспроизводимости
результатов при стандартных условиях культиви-
рования. Тем не менее приемлемая ошибка обычно
составляет ±5«, кроме таких условий эксперимента,
koi да может потребоваться большая точность. В целом,
использование пппеток меньшего объема согласуется
с возможностью большей точности, требуемой для
получения количественных данных.
Необходимо вставлять ватную пробку в верхнюю
часть стеклянной пипетки до стерилизации, для того
чтобы сохранить стерильность пипетки входе исполь-
зования. Пробка предохраняет загрязнение из груши
или пи легирующего устройства и уменьшает риск
перекрестной контаминации из содержимо! о пипетки.
Если ватная пробка становится влажной, замените
пипетку, поместив использованную в дезинфектант,
с последующим мытьем. Затыкание пипеток ватными
пробками перед стерилизацией- достаточно утоми-
тельная работа, так же как удаление этих пробок перед
мытьем. Производители предлагают автоматические
устройства д;1я затыкания пипеток ватными пробками
(см. рис. 11.6); они ускоряют п обяегоают процесс.
Пластиковые пипетки поступают уже с пробками.
Однако работа с ними идет медленнее, поскольку
каждая пипетка имеет индивидуальную обертку, ко-
торая требует удаления перед использованием и неэ-
кономична, если несколько пипеток обернуто вместе
(часть неиспользованных пипеток всегда теряется,
поскольку нецелесообразно хранить и в следующий раз
использовать однажды открытую упаковку), а также
связана с относительно высоким риском контаминации,
поскольку процедура вынимания пипетки из обертки
более подвержена риску контаминации, чем изъятие
из контейнера. Тем не менее к достоинствам пласти-
ковых пипеток относится то, что они более свободны
от бактериальных и химических загрязнений, чем
стеклянные, и при этом не требуют времени на мытье
и стерилизацию.
Автоматические пипетирующие устройства и
диспенсеры подробно описаны в гл. 5 (см. разд. 5.2.7).
Следует уделять большое внимание риску загрязнений
при работе с ними, но возрастание скорости работы
112
ГЛАВА 6. МЕТОДЫ АСЕПТИКИ
поможет снизить усталость и сократить время, при
котором культуральные сосуды открыты и подвержены
риску контаминации.
6.3.6. Переливание
Не переливайте жидкости из одной стерильной емкос-
ти в дру тую. Переливание через горлышко допустимо,
если та бутыль, из которой выливают, используется
однократно, только чтобы перелить все ее содержи-
мое, предварительно измерив объем, в одно приемное
устройство или сосуд. Главный риск при переливании
через горлышко заключается в появлении жидкостного
мостика между внешней стороной бутылки и внут-
ренней ее стороной, позволяющей микроорганизмам
проникнуть внутрь бутылки в ходе хранения или
инкубации
6.4. Ламинарный поток
Главным преимуществом работы в ламинарном шкафу
является то, что рабочая поверхность защищена от
пыли и микробнот о заражения постоянным стабиль-
ным потоком фильтрованного воздуха, проходящего
над ней (рис. 6.7). Существуют два тина ламинарных
потоков: 1) горизонтальный, при котором поток воз-
духа дует со стороны, противоположной оператору,
параллельно рабочей поверхности, и не рециркулирует
(см. рис. 6.7а); и 2) вертикальный, нри котором поток
воздуха направляется сверху вниз на рабочую по-
верхность и либо удаляется, либо рециркулирует (см.
рис. 6.76). В большинстве ламинарных шкафов 20%
воздуха удаляется, и восполняется захватом воздуха
перед поверхностью рабочего стола. Такая конфитура-
ция создана для минимизации выхода избытка воздуха
с поверхности рабочей зоны. Горизонтальный тип
создает более стабильный поток воздуха и лучшую за-
щиту стерильности культур и реагентов; вертикальный
тип обеспечивает лучшую защиту для оператора.
Для работы с объектами, имеющими потенциаль-
ную био лот и чес кую опасность (культуры клеток,
выделенных из человека или приматов, вирусинфп-
цированные культуры и т.д.), следует использовать
М SC-боксы II класса биолот и ческой безопасности
(Microbiological Safely Cabinet) с вертикальным
ламинарным потоком (см. разд. 7.1.7 и рис. 7.5а). На-
илучшую защиту от химической и радиохимической
опасности обеспечивает специальный шкаф для работ
по определению цитотоксичности, оборудованный
угольным фильтром, очищающим рециркулирующий
воздух, либо ламинарный шкаф с выведением всего
потока воздуха наружу из здания через систему вен-
тиляции (см. разд. 7.5.4). Если оператор имеет дело с
известными возбудителями человека, приемлем бокс
для работы с возбудителями III i руины патогенности
(см. разд. 7.8.2, рис 7.5»).
Эффективность работы ламинарного шкафа зави-
сит от минимального перепада давления, нри котором
воздух проходит через фильтр. При возрастании
сопротивления церецад давления увеличивается и
поток воздуха через бокс снижается. Ниже 0,4 м с
(80 футов/мин) стабильность потока исчезает и сте-
рильность не может поддерживаться. Перепад давле-
ния контролируется манометром, встроенным в бокс.
а ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ЛАМИНАРНЫЙ ПОТОК б ВЕРТИКАЛЬНЫЙ ЛАМИНАРНЫЙ ПОТОК
Рис. 6.7. Воздушные потоки в ламинарном шкафу. Стрелки указывают направление потоков, (а) Горизонтальный типик,
(б) Вертикальный лоток
6.5. Стандартная процедура
113
но прямое измерение потока воздуха анемометром
предпочтительнее.
При повседневной работе проверять качество
фильтров необходимо примерно каждые 3 6 меся-
цев. Первичный фильтр для ламинарной) шкафа с
горизонтальным потоком можно снять (посче выклю-
чения вентилятора) и вымыть при помощи мыла и
воды. Встроенные первичные фильтры в ламинарных
шкафах II класса биоло| ической опасности и боксах с
вертикальным потоком мщут быть заменены только
инженером. Эти фильтры необходимо сжечь или ав-
токлавировать и заменить на новые.
Каждые 6 месяцев НЕРА-фильтр над рабочей
поверхностью должен проверяться на предмет ста-
бильности и однородности воздушного потока, а также
дефектов и прорывов, которые определяются но мест-
ному возрастанию воздушною потока и увеличению
подсчитанных частиц. Мониторинг, как правило,
проводят инженеры-профессионалы на контрактной
основе. В ламинарных шкафах II класса биоло| ической
опасности также необходимо производить периодичес-
кую замену НЕРА-фильтра при снижении качества
очищаемою воздуха. Это также должно производиться
профессиональным инженером, с соответствующей
подготовкой, включающей навыки упаковки и утили-
зации отработанных фильтров, замены и установки
новых. Если ламинарный шкаф предназначен для
работы с объектами, имеющими потенциальную биоло-
гическую опасность, до замены фильтра боксы должны
быть закрыт ы и обработаны дезинфектантом
Регулярная проверка рабочей поверхности должна
проводиться еженедельно при любом разбрыЗ|ивании
и разливании сред и реагентов, рабочая зона немед-
ленно вытирается и стерилизуется 5%-м феноловым
дезинфектантом или 70%-м этанолом. ИнО|да разлив
или разбрьк'я ивание остаются незамеченными, поэтому
необходимо периодически проверять чистоту рабочей
поверхности. Тампоны, щетки, тканевые салфетки, пер-
чатки, попавшие под рабочую поверхность, при уборке
могут попасть на первичный фильтр и нарушить поток
воздуха, поэтому будьте внимательны и периодически
проверяйте первичный фильтр.
Предпочтительна непрерывная работа ламинар-
ною шкафа, поскольку она позволяет сохранять
рабочую зону чистой: любое разливание на фильтре
или на рабочей поверхности быстро высыхает в сте-
рильном воздухе и снижается возможность роста
микроор । анизмов.
Ультрафиолетовый свет также используется для
стерилизации воздуха и обработки рабочей поверх-
ности в перерывах между работами. Эффективность
ультрафиолетовой обработки несомненна, поскольку
свет проникает в щели, куда не может- проникнуть
этанол или дру| ие дезинфицирующие агенты. Ульт-
рафиолетовая обработка несет в себе радиационную
Опасность, в частности для глаз. а также может при-
вести к образованию трещин на пластиковых панелях
(например, Perspex) через 6 месяцев — 1 год при одно-
временном использовании этанола.
• Требование безопасности. Если попользу-
ется ультрафиолет, следует надевать защитные очки
и закрывать все участки кожи, подвер|ающиеся ею
воздействию.
6.5. СТАНДАРТНАЯ ПРОЦЕДУРА
Суть правил соблюдения стерильности во многом ос-
новывается на принципах стандартной лабораторной
практики (GLP) (см. табл. 6.1). Поверхность рабочего
места должна быть ровной и чистой, на ней должны на-
ходиться лишь те предметы, которые вам необходимы
для работы в настоящее время. Приготовьте заранее
то, что вам может понадобиться, так чтобы культуры
вынимались из инкубатора на менее продолжительный
срок, все манипуляции должны производиться так
быстро, как это возможно, без препятствий и помех.
Предмет ы на столе должны pacuojiaia-гься в зоне пря-
мой видимости. Избегайте случайного контакта сте-
рильных и нестерильных поверхностей. После работы
остав,1яйте рабочее место чистым.
В двух протоколах, которые следуют ниже, сделан
акцент на асептических методах Приготовление среды и
другое манипуляции обсуждаются более подробно в со-
ответствующих иодразде.|ах(см.разд. И.4). Данный про-
токол создан для использования вуиражнении 1 (см. 1Л. 2,
упражнение 1), но применимым и к другим случаям.
6.5.1. Чашки Петри и многолуночные
планшеты
Возможность контаминации чашек Петри и многолу-
ночных планшетов повышается в связи со следующими
фак горами, такими как:
1) наличие большой площади поверхности. ко|да ем-
кости открыта;
2) возникновение риска прикосновения к краю чашки
при манипуляциях с открытой чашкой;
3) риск переноса заражения с рабочей поверхности
на чашку через крышку, если крышку кладут вниз
краем;
4) среда, заполняющая промежуток между крышкой
и чашкой в связи с явлением капиллярности, если
чашку наклоняли или встряхнули при переноске в
инкубатор;
5) влажная атмосфера СО, инкуба гора повышает риск
заражения.
Соблюдение следующих правил минимизирует
риск заражения:
1) Не оставляйте чашки открытыми на продолжи-
тельный период, тщательно следите за открытыми
чашками и крышками
2) При передвижении чашек но рабочей поверхности и
перемещении их в инкубатор или из него старайтесь
не наклонять и не трясти чашки, чтобы избежать
попадания среды на края чашки пли крышки и
предотвращения заполнения промежутка между
114
ГЛАВА 6. МЕТОДЫ АСЕПТИКИ
Таблица 6.1. Основные приемы асептической техники
Объект Правильно Неправильно
Ламинарный шкаф Протирать до и после работы Использовать минимум приборов. оборудова- ния и материалов на рабочей поверхности Располагать материалы и оборудование по линии прямой видимости Засорять ламинарный шкаф Оставлять ламинарный шкаф в беспорядке
Заражение Рабо 1 ать без антибиотиков Pci улярно проверять культуру, визуально невооруженным глазом и с помощью мик- роскопа Упаковывать чашки Петри u mhoi олуночныс планшеты в прозрачные коробки Открывать зараженные флаконы в зоне работ с культурами Пересевать инфицированные клетки Оставлять заражение без внимания
Микоплазмы Исследовать клетки ио стандартной методике Пересевать зараженные клетки П ы 1 аться дскон аминировать ( « вылечить») культуры
Импорт новых клеточных Получать из проверенных, заслуживающих Получать из источника, отдаленного от перво-
линий доверие источников Выдерживать карантин для новых линий Проверить на микоплазмы Подтвердить происхождение клеток Вести записи начального производителя культуры
Экспорт клеточных линий Проверить на микоплазмы Подтвердить происхождение Послать сопроводительные документы Тройная упаковка Посылать зараженные клеточные линии
Стеклянная посуда Храни 1Ь запасы отдельно Использовать ту же посуду для процедур, нс связанных с культивированием т каней
Флаконы Наклонять флаконы при иицетировании Заполнять газом при необходимости СО2-ин- кубированця Быст[м» провентилировать при необходимости штабелирования От крывать слишком много флаконов одновре- менно Инкубировать в СО2-инкубаторе, если нет га- зопроницаемой крышки Укладывать в с тишком высокие штабели
Среды и реагенты Протирать бутылки до помещения их в ламп нарный шкаф Открывать только в боксе Использовать для нескольких клеточных ли- Дсли 1ь с другими сотрудниками Переливать через край
Пилотирование Использовать пипетки с ватными пробками Менять пниетку, если она грязная или ватная пробка стала влажной Использовать пластик для aiapa Выливать жидкости в стакан для отходов при помощи воронки (рис. 6.8) Использовать одну и ту же пипетку для разных клеточных линий Дслшь С Дру! ими людьми Создавать аэрозоль Слишком сильно заполнять цилиндры с обезв- реживающим раствором
крышкой и чашкой, ведущею к контаминации
вследствие явления капиллярности. Кроме тел о,
а) используйте вентилируемые чашки (см. рис. 8.7);
б) если среда попала в это пространство, снимите
крышку, тща гельно удалите среду на наружной
поверхности края ватным тампоном, смоченным
70%-м этанолом, замените крышку на новую.
(Убедитесь, что маркировка располагается на
дне чашки!)
3) При инкубации помещайте чашки и крышки в про-
зрачную пластиковую коробку, протрите коробку
этанолом когда вынимаете из инкубатора (см.
рис. 6.10 и разд. 6.7.1).
Для манипуляций с чашками Петр и или мн то-
лу ночными планшетами рекомендуется следующий
порядок действии (протокол 6.3).
6.6. ПРИБОРЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
Все приборы, используемые в технике культуры ткани,
необходимо peryjiupHO очищать для избежания накап-
ливания пыли и предупреждения микробного роста
при случайном разбрыгиивании. Заменяемые части,
такие как газовые баллоны, должны также протираться
перед внесением их в зону работы с культурами тканей.
Во время работы следует избе! ать перемещения при-
боров и оборудования но асептической зоне.
6.6.1. Инкубаторы
Влажные инкубаторы являются основным источником
заражения (см. ралд. 19.1.4). Их след ует регулярно мыть
6.6. Приборы и оборудование
115
ПРОТОКОЛ 6.1. Асептические методы
работы в вертикальном ламинарном
потоке
Схема
Очистите и протрите рабочую зону, принесите
бутылки, пинетки и т.д. Сначала выполните подго-
товительные действия (приготовление среды и реак-
тивов), затем культуральную часть работы. В конце
работы очистите и вытрите рабочую поверхность
70%-м этанолом.
Материалы
Стерильные.
• Среда Игла 1х МЕМ с солями Хэнкса и НСО3,
без антибиотиков.....................100 мл
• Пинетки, градуированные и заткнутые ватной
пробкой. Если используются стеклянные, то раз-
личных размеров: 1 мл, 5 мл, 10 мл, 25 мл, в квад-
ратном пенале. Если используется пластик, - в
индивидуальной упаковке, рассортированные ио
размерам в штативе.
• Культуральные флаконы (для Упражнения 1
предварительно взвешенные), 25 см~......10
Нестерильные:
• Пззиетззрующее устройство или груша (см.
рис. 5.5,6.6)
• 70%-й этанол в пульверизаторе
• Не оставляющие ворса салфетки или щетки
• Абсорбирующие бумажные салфетки
* Цилиндр для пинеток, содержащий воду и дезин-
фицирующее вещество (см. разд. 7.8.5)
• Ножницы
• Маркер с этанол-устойчивымзз чернилами
• Ручка, тетрадь, протоколы и т.д.
Протокол
1 Прэтрите рабочую зкшерхность и все другие поверх-
ности вну зри ламинар-бокса, включая внутреннюю
часть иереднего экрана 70%-м этанолом при помо-
щи не оставляющих ворса салфеток или щетки
2. Принесите среду и т.д. из холодного хранилища,
на водяной бане или иным способом разморозьте
принесенные из морозильника реактивы, про-
трите бутылки спиртом, разместите те, что вам
истребуются с начала, в ламинарном шкафу.
3. Соберите иииетки и разместите с одной стороны
задней части рабочего места в доступном месте
(рис. 6.2).
а) Если используются стеклянные пипетки,
откройте пеналы с пипетками и поместите
крышки рядом, внутренней стороной наверх.
б) С пластиковых пииеток удалите упаковку,
рассортируйте ио размерам в штативе или в
металлических банках.
4 Соберите друз у ю стеклянную и пластиковую по-
суду, инструменты и т.д. и поместите поблизости
(на тележке или соседнем столе).
5. Ослабьте, но не снимайте крышки всех бутылок, |
которые будут использованы.
6. Снимите крышку с тех бутылок, куда вы будете
наливать жидкость, откуда будете переносить ее
пипеткой. Поместите крышки от бутылок откры-
той стороной на самом высоком месте рабочей
поверхности в дальней части ламинар-бокса за
бутылками, так чтобы ваша рука не проходила
над нем во время манипуляций. Если вы одно- I
моментно используете только одну бутыль и
открываете только одну крышку, вы можете после
открывания бутыли удерживать крышку в руке
между мизинцем и ладонью (см. рис. 6.6) и после
пикетирования снова надевать ее на бутыль.
7. Возьмите ззззпетку.
а) Если иииетки стеклянные:
з) возьмите пипетку из пенала, вынимая ее
параллельно друз им иииеткам в пенале и
прикасаясь к ним так мало, как это возмож-
но, в том числе к верхним их частям (если
пипетка, которую вы достаете, коснулась
носиком верхних частей друз их пииеток.
еще находящихся в пенале, сбросьте ее в I
цилиндр для использованных ззззпеток); ।
ii) вставьте верхний конец пмиегки в пине
тирующее устройство, держа иииетку в
направлении от вас и закрепите ее над
градуировкой, так чтобы часть пипетки,
входящая в бутыль, не была загрязнена
(рис. 6.9).
• Требование безопасности. Если вы встав-
ляете иииетку в грушу или пикетирующее устрой- |
ство, обратите внимание на то, чтобы не прила1ать
с л и ш ком больших усилий, пипетка может сломаться |
при давлении (см. разд. 7.5.3 и рис 7.2).
б) Если иииетки пластиковые:
i) откройте упаковку в верхней части иипеток; I
ii) расслоите концы упаковки, поворачивая
их снаружи внутрь;
iii) вставьте конец иииетки в грушу или зизззе-
тирующее устройство;
iv) извлеките иииетку из упаковки, не каса- I
ясь дру> их иипеток или упаковки, а также
любых нестерильных поверхностей (см. I
рис. 6.9);
у) Выбросьте обертку в мусорную корзину.
8 Пипетка в пикетирующем устройстве или груше
должна располагаться в правильном направлении
и под правильным узлом в вашей руке. Просле-
дите, чтобы кончик иииетки не касался внешней
стороны бутылки или внутренней поверхности
ламинарного бокса (см. обозначенные кружком
зоны на рис. 6.9). Всезда следите, зде находится
пипетка. Выззолнение этой процедуры нелезко, ।
коз да вы овладеваете методами асептззки, но это I
важное требование для усззешной работы и со |
временем вы приобретете опыт. ।
116
ГЛАВА 6. МЕТОДЫ АСЕПТИКИ
9. Наклоните бутыль со средой но направлению к
пинетке так, чтобы наша рука не проходила над
открытым 1Х)рлышком и, используя 5-мл пипет-
ку, отберите 5 мл среды и перенесите ее н 25-см'* *
флакон, также наклоненный.
10. Повторите еще 4 раза, заполнив 4 флакона Когда
разливаете жидкость в несколько бутылей или
флаконов, их можно положить t оризонтально
на бок. Убедитесь, что флаконы лежат надежно и
ваша рука не проходит над открытыми <орлыш-
ками (при выполнении Упражнения 1 запишите
время, которое вам потребовалось для добавления
среды в 5 флаконов).
11. Сбросьте стеклянные пипетки в цилиндр для
использованных пипеток, содержащий дезинфи-
цирующий раствор. Пластиковые пинетки должны
быть сброшены в мешок для автоклавирования по-
тенциально биоло! ически опасных материалов.
12. Заверните крышки на флаконы.
13. Повторите процедуру, используя 25-мл пипетку
для переноса 5 мл в каждый из 5 флаконов (при
выполнении Упражнения 1 запишите время, ко-
торое вам понадобилось для добавления среды в
5 флаконов).
14. Закройте крышки на бутылках со средой и фла-
конах Бутылки мот ут быть открыты, кока вы ра-
ботаете, но веет да должны быть закрыты прежде,
чем вы покинете место у ламинарною бокса по
какой-то причине.
Замечание'. В ламинарном шкафу с вертикальным
потоком не работайте непосредственно над откры-
тым сосудом. При горизонтальном потоке не рабо-
тайте за открыт ым сосудом.
15. По завершении операции плотно заверните все
крышки, уберите все растворы и материалы,
которые больше не требуются, с рабочей иоверх-
16. При выполнении Упражнения 1 взвесьте фла-
коны, чтобы проверить точность разлива сред,
и инкубируйте при 37 °C в течение 1 недели для
проверки на возможное заражение.
Рис. 6.8. Стакан для слива. Фильтровальная воронка пре-
дупреждаем разоры я ивание содержимого из лабпраюрного
стакана
Рис. 6.9. Правильное введение пипетки в иииетирующее
устройство. Пипетка при правильном введении захваты-
вается как можно выше над (радуировкоя. конец пинетки
направлен от оператора Обведенные зоны отмечают по-
тенциальный риск, например случайное соприкосновение
кончика или середины пипетки с нестерильной поверхностью
бутылки или стенки шкафа
ПРОТОКОЛ 6.2. Работа на открытой
поверхности
Схема
Очистите и протрите рабочую зону, принесите
бутылки, пипетки и т.д. (см. рис. 6.5). Сначала вы-
полните под!отопительные действия. Обожште в
пламени, если необходимо, используемые предметы,
сохраняйте рабочую поверхность свободной и чис-
той. В конце работы очистите и вытрите рабочую
поверхность 70%-м этанолом.
Материалы
Стерильные:
* Среда Hi ла IxMEM с солями Хэнкса и НСО„ без
антибиотиков...................... 100 мл
* Пинетки, радуированные и заткнутые ватной
пробкой. Если используются стеклянные,то раз-
личных размеров: 1 мл, 5 мл, 10 мл, 25 мл, в квад-
ратном пенале. Если используется пластик, в
индивидуальной упаковке, рассортированные ио
размерам в штативе.
• Культуральные флаконы
(для Упражнения 1 предварительно взвешен-
ные)...........25см'............. 10
Нестерильные.
* Пикетирующее устройство или «руша (см.
рис. 5.5,6.6)
• 70ио-й этанол в пульверизаторе
• Не оставляющие ворса салфетки или щетки
• Абсорбирующие бумажные салфетки
• Цилиндр для пинеток, содержащий воду и дезин-
фицирующее вещество (см. разд. 7.8.5)
• Бунзеновская iпредка (или ее эквивалент) и
зажигалка
6.6. Приборы и оборудование
117
• Ножницы
• Маркер с .и анол уст ойчиными чернилами
• Ручка, тетраль, протоколы и т.д
Протокол
1. Протрите рабочую поверхность стола 70%-м эта-
нолом
2. Принесите среду и т.д. из холодного хранилища,
на водяной бане или иным способом разморозьте
принесенные из морозильника реактивы, про-
трите бутылки спиртом, разместите то, что вам
потребуется сначала, на рабочем столе, оставив
остальное поблизости в стороне.
3. Соберите пипетки и разместите с одной стороны
задней части рабочего места в доступном месте
(см. рис. 6.5).
а) Если используются стеклянные иииетки,
откройте пеналы с пипетками и поместите
крышки рядом, внутренней стороной наверх.
б) С пластиковых пипеток удалите внешнюю
упаковку, рассортируйте индивидуально упа-
кованные пипетки цо размерам в штативе или
в металлических банках.
4. Соберите другую стеклянную и пластиковую посу-
ду, инструменты и т.д. и поместите поблизости.
5. Обожште горлышки бутылок, быстрым движе-
нием повернув их в пламени горелки и ослабьте
крышки.
6. Выберите пипетку.
а) Если пипетки стеклянные:
i) возьмите шшетку из пенала, поднимая ее
параллельно другим шшеткам в пенале и
прикасаясь к ним так мало, как это возмож-
но, в частности к верхним их частям (если
шшетка, которую вы достаете, коснулась
носиком верхних частей любой из дру-
1их пипеток, еще находящихся в пенале,
сбросьте ее);
и) вставьте верхний конец пипетки в пике-
тирующее устройство, держа пипетку в
направлении от вас и закрепите ее над
(радуировкой, так чтобы часть пииетки,
входящая в бутыль, не была загрязнена
(рис. 6.9).
б) Если пипетки пластиковые:
i) откроите упаковку в верхней части пи-
неток;
и) расслоите концы упаковки пипеток, пово-
рачивая их снаружи внутрь;
iii) вставьте конец иииетки в грушу или пиие-
тирующее устройство;
ту) извлеките пипетку из упаковки, не каса-
ясь друг их пипеток или упаковки, а также
любых нестерильных поверхностей (см.
рис. 6.9);
у) выбросьте обертку в мусорную Корзину.
7 Обожште пинетку (только стеклянную!) в пла-
мени горелки, проводя ее по длине через пламя и
одновременно поворачивая на 180°. Это должно
занять 2—3 с, иначе пипетка станет слишком го-
рячей. Не стремитесь простерилизовать пинетку
таким образом; вы просто стараетесь сжечь пыль,
которая мот ла осесть на пипетку. Если вы прикос-
нулись кончиком пипетки к нестерильной поверх- I
нести или мотли контаминировать ее каким-то
иным образом, сбросьте ее в дезинфицирующий I
раствор для повторного мытья, не пытайтесь ।
вновь сделать ее стерильной в пламени горелки.
8. Вставьте шшетку в пикетирующее устройство |
или грушу, направляя ее от вас и закрепив ее
над градуировкой так, чтобы кончик пииетки, |
который будет входить в бутылку или флакон,
не загрязнялся.
• Требование безопасности. Если вы встав-
ляете шшетку в грушу или пикетирующее устрой- |
ст во, обратите внимание на то, чтобы не црила1ать
слишком больших усилий, пинетка может сломаться |
при давлении (см. разд. 7.5.3 и рис 7.2).
Не обжшайте в пламени пластиковые иииетки.
9. Пинетка в пикетирующем устройстве или груше
должна располагаться в правильном направлении
и иод правильным уыом в вашей руке. Проследите,
чтобы кончик иииетки не касался внешней сюроны
бутылки или пенала с пипетками. Все1да осозна-
вайте, 1де находится нииетка. Выполнение этой I
процедуры нелег ко, koi да вы овладеваете методами
асеп тики, но это важное требование для успешной I
работы и со временем вы приобретете опыт.
10. У держивая пипетку в направлении от вас, удалите
крышку с первой бутылки, зажав ее между мизин-
цем и ладонью (см. рис. 6.6). Если вы разливаете
жидкость в несколько бутылей или флаконов, их
можно положить горизонтально на бок. Работая
с бутылками, наклоните их так, чтобы ваша рука
не проходила над открытым горлышком. Если у
вас будут трудности с удерживанием крышки при
шшетировании, разместите ее на столе рядом с
(ореткой открытой стороной вниз. Если бутылки
должны оставаться в открытом положении, их
следует наклонить так близко к горизонтальному
положению, как это возможно, на столе или опоре
для бутылок.
11. Обож! ите горлышко бутылки.
Замечание. При обжигании бутылей Duran не I
используйте бутыли с кольцами для разлива.
12. Наклоните бутыль со средой ио направлению к I
пипетке так, чтобы ваша рука не проходила над
открытым горлышком.
13. Отберите необходимое количество жидкости и |
удерживайте ее в пипетке.
14. Обожт ите горлышки бутылки и закройте крышку.
15. Снимите крышку с оставшейся бутылки, обож- I
гите горлышко, внесите жидкость, обожште
горлышко, закройте крышку. ,
118
ГЛАВА 6. МЕТОДЫ АСЕПТИКИ
16. Плотно заверните все крышки пи окончании
работы.
17. По завершении операции уберите с рабочей по-
верхности основные растворы, оставив только те
бутыли, которые потребуются.
ПРОТОКОЛ 6.3. Манипуляции с чашками
и планшетами
Материалы
Такие же, как в протоколах 6.1. и 6.2., ио обстоя-
тельствам.
Протокол
Удалите среду из чашек:
1 Сложите в штабель чашки или планшеты на од-
ной стороне рабочей зоны.
2 Включите аспирационный насос.
3 Выберите пипетку без ватной пробки, вставьте в
аспирационную линию.
4 Поместите первую чашку или планшет в центр
рабочей зоны.
5 Удалите крышку и поместите за чашкой открытой
стороной вверх.
6 Зажмите чашку в ладони так близко к основанию,
как можно, стараясь не касаться края чашки,
и следите за тем, чтобы рука не проходила над
открытой чашкой пли крышкой. При наличии
некоторой практики, возможно вы сможете уда-
лять жидкость из чашки, не открывая крышку
полностью. Этот метод быстрее и безопаснее, чем
описанный выше.
7 Наклоните чашку и удалите среду. Если нет ас-
пирационною насоса, перенесите среду пипеткой
и слейте в стакан с отходами через воронку (см.
рис. 6.8).
8 Закройте крышку.
9 Поставы е чашку на другую сторону рабочей зоны
отдельно от необработанных чашек, формируя
новый штабель
10 . Повторите процедуру с остальными чашками или
планшетами.
11 . Сбросьте пинетку в цилиндр и выключите насос.
Добавьте среду или клетки-
1 Установите в необходимом месте нужные бутыли
и ослабьте крышку на той, которую будут исполь-
зовать.
2 Поставьте первую чашку в центр рабочей зоны.
3. Снимите крышку с бутыли и заполнить пипетку.
4. Снимите крышку с чашки и поместите за чашкой.
5 Добавьте среду в чашку, направляя поток как
можно ближе к основанию вдоль ио боковой
стороне чашки.
6 Закройте крышку.
7 Переместите чашку в ту сторону, 1 де чашки стоя-
ли первоначально, внимательно следя за тем,
чтобы среда не попадала на край и не заполняла
пространство между краем чашки и крышкой.
8. Повторите манипуляцию со второй чашкой и
9. Сбросы е иииетку.
При определенной практике вы, возможно, научи-
тесь поднимать крышку чашки и добавлять среду, не
открывая крышку полностью
Замечание: Если вы добавляете среду в чашку
или планшет с клетками, бутылка со средой должна
быть подписана маркировкой используемой клеточ-
ной линии и не использоваться ajin друiих линий.
Предпочтительно отлить среду в отдельную бутыль
и использовать только для этой процедуры.
через определенные промежутки времени (еженедельно
или ежемесячно, в зависимости от уровня зараженнос-
ти атмосферы и частоты использования) с удалением
всею содержимого, включая подносы и полки, мытьем
внутренней поверхности с нетоксичным детергентом
(Decon или Roccall). Следы детергента удаляют 70%-м
этанолом, которому затем надо дать полностью испа-
риться до установки полок и подносов.
Для предотвращения роста грибов фунгицидный
раствор (2% Roccall или 1 % сульфат меди) можно по-
местить в увлажняющий лоток на дно инкубатора, но
эффективность фунгицидного действия ограничена
поверхностями, с которыми осуществляется контакт и
такая процедура не может заменить регучгярной уборки.
Некоторые инкубаторы снабжены высокотемператур-
ным стерилизационным циклом, однако они редко
создают надолго необходимый уровень температуры.
Кроме того, такая обработка длительна, что неудобно,
поскольку на это время инкубатор не используется для
культивирования. Некоторые инкубаторы имеют мик-
ропоровый фильтр и ламинарный поток воз^'ха для
Рис. 6.10. Чашки Петри н коробке. Прозрачная коробка,
такая как коробка для сэндвичей или пирожных, помогает
защитить нсгермстнчно .закрытые чашки или планшеты, а
также флаконы с ослабленными крышками, от заражения
во влажном инкубаторе Этт тип контейнера может так-
же использоваться при работе с материалом, обладающим
потенциальной биологической опасностью. для того чтобы
предупредить разлив или разбрызгивание при аварии
6.6. Приборы и оборудование
119
ин1 ибирования циркуляции микроорганизмов (Forma,
Jencons), однако иногда лучше предпочесть небольшое
увеличение времени восстановления, отсутствие вен-
тилятора и полаяться на конвекционную циркуляцию
воздуха (см. разд. 5.3.2).
6.6.2. Коробки для влажного инкубатора
Koi да проблемы заражения во влажном инкубаторе воз-
никают часто, можно помещать чашки Петри, планшеты
и флаконы с ос чабленными крышками в пластиковые
коробки для сэндвичей (рис. 6.10). Коробки следует про-
тереть до использования, внутри и снаружи, и высушить
в стерильном воздухе. Koi да коробки будут вынуты из
инкубатора, их также обрабатывают 70%-м этанолом
до того как открыть или внести в рабочую зону. Затем
чашки аккуратно вынимают, внутренность коробки
обрабатывают перед повторным использованием.
6.6.3. Культивирование в атмосфере СО2
Общепринятой практикой является ослабление кры-
шек на флаконах при помещении их в <1О2-инкубатор
для проникновения газа внутрь (^чакона и достижения
газовою равновесия, однако этот прием повышает риск
контаминации. Некоторые производители предлагают
Рис. 6.11. Заполнение флакона газом. Пине пса, вводи-
мая во флакон, присоединена к шлангу с линией СО,. Для
вытеснения воздуха из флакона используется 5°> СО2 без
пробулькиванпя среды Буква F обозначает микропоровын
фильтр, встроенный в СО2-линию
флаконы с газопроницаемыми крышечками, обеспе-
чивающими быстрое достижение 1азового равновесия
в атмосфере СО2без риска контаминации. Альтер-
нативным выходом является заполнение флаконов
стерильной смесью 1азов (рис. 6.11) и герметичное
закрывание их. Это позволяет избежать использования
газовых инкубаторов для флаконов и обеспечивает
единообразие и быстрое достижение нужною состава
газовой среды.
Глава 7
БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА
И ВАЛИДАЦИЯ
7.1. ЛАБОРАТОРНАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ
В дополнение к ежедневным требованиям к безопаснос-
ти работы, ибшим для всех рабочих мест, лаборатория
клеточных культур характеризуется рядом специфи-
ческих рисков, связанных с культуральной работой.
Несмотря на образование и опыт большинства людей,
работающих в этих условиях, происходят различные
аварии, поскольку постоянная работа связана с обыч-
ной, биоло| пческой и радиоло! ической опасностью. Бо-
лее того, отдельные лица, которые работают в подi ото-
пительной зоне, часто не имеют высшего образования,
и ответственность за их действия в лаборатории лежит
на руководителях. Важно определять потенциальную
опасность, но в то же время не преувеличивать риск.
Если нет реальной угрозы, объем предупреждающих
мер может быть сокращен, и в целом код безопасности
может быть поставлен под сомнение.
7.2. ОЦЕНКА РИСКА
Оценка риска важный принцип, который введен
в большинство современных законов, связанных с
безопасностью. Определение природы и размеров
потенциальной опасности является только частью
процесса; способ, которым используются материалы
и оборудование, лицо, использующее их, частота ис-
пользования, общие условия работы — все одинаково
важны при определении риска (табл. 7.1). Необхо-
димо учитывать количество отдельных материалов,
степень и частоту контактов с опасным материалом,
процедуру манипуляций с ним, тип защитной одежды,
дополнительные опасности — такие как манипуляции
с горячими предметами, холодом, электричеством, а
также тип предварительною обучения и опыт работы
оператора - все эти элементы оказывают влияние на
риск, возникающий при проведении определенных
процедур, хотя природа опасности сама по себе остается
постоянной.
Основная проблема, постоянно выходящая на пер-
вый план при установлении мер безопасной практики
в биомедицинских лабораториях, непропорцио-
нальность между чрезмерным вниманием к неясно
понимаемым, эзотерическим проблемам, связанным,
например, с генетическими манипуляциями, и недо-
статком внимания к Опасности работы с токсическими
и повреждающими химическими веществами, рас-
творителями, потенциальными источниками пожара,
ионизирующим излучением, ударом электрическим
током и разбитой посудой. Важно, что бполш ическая
опасность четко подразделена на категории [Постанов-
ление министерства здравоохранения и социального
обеспечения No. (С DC) 93 8395,3-е издание (1993);
Комиссия по здоровью и безопасности, 1991а, 1991b,
1992, 1999а, 1999b, Caputo, 1996], при этом биологи-
ческая опасность не переоценивается и не недооцени-
вается. Соблюдение мер предосторожности не должно
замещать видение ежедневных проблем, связанных с
обеспечением безопасности всех видов.
7.3. СТАНДАРТНЫЕ ОПЕРАЦИОННЫЕ
ПРОЦЕДУРЫ
Опасные вещества, оборудование и условия не должны
рассматриваться отдельно от остальных составляю-
щих элементов, следует представлять всю систему в
совокупности. Если подразумевается, что процедура
связана с неким значительным риском помимо обычно-
го, необходимо составить стандартную операционную
процедуру (СОП), и весь персонал, работающий с
этим материалом, оборудованием и т.д. должен быть
ознакомлен с данным документом Должны быть
определены различные этапы - покупка, хранение,
манипуляции и уничтожение, следует принять во вни-
мание, что наличие одной или более опасностей в ходе
манипуляций умножает риск или, точнее, сложность
необходимых мер предосторожности (как, например,
проводить удаление осколков разбитой емкости, со-
державшей линию человеческих клеток, меченных
радиоизотопом).
7.4. КОНТРОЛЬ БЕЗОПАСНОСТИ
Дальнейшие рекомендации не должны рассматривать-
ся как практические инструкции по определению кода
безопасности, но, скорее, как советы, которые могут
вам помочь в составлении требований по мерам безо-
пасности. Данная информация призвана предоставить
читателю некоторые источники и законодательные
акты, а также руководства, при помощи которых он
может составить частные нормы и правила работы в
7.4. Контроль безопасности
121
Таблица 7.1. Составляющие оценки степени риска
Категория Элемент, влияющий на степень риска
Оператор
Опыт исслсдова- Уровень
НИИ Соответствие роду работы Предварительная подготовка и опыт работы
Тренировка Предварительная Соответствующая новым потребностям
Защитная Адекватная
спецодежда Оборудование Правильно надетая (застегивание на пу- говицы лабораторного халата) Регулярная стирка При повреждениях ремонт или замена спецодежды
Возраст Сохранность Соответствие законодательству
CooTBCfi'iBiie Приемлемость, объем пробы, гермстиза-
задаче ция или изоляция
Механическая Погрузка
надежность Крепеж Балансировка
Электрическая
безопасность
Защитные
оболочки
Тепло
Уход
Захоронение
отходов
Электрической
Огонь
Соединения
Заземление
Эффект близости к воде
Аэрозоли
Создание
Утечка из-под кожуха
Выход из рабочей зоны
Токсичные нары
О гводящая канализация
Встроенность
Участок стока и риск с подветренной
стороны
Образование
Рассеяние
Частый
Требус|Ся обеззараживание?
Стандартный
Требуе|Ся обеззараживание?
Физические риски
Интенсивный Обмораживание
холод Онемение
По тери сознания
Остановка сердца
Общие меры иредос юрожности
Монтаж электропроводки, установка
оборудования, уход за ним
Просачивание воды вблизи элсюрштбо-
рудования
Пожарные учения, процедуры и трени-
ровки поведения при пожаре
Использование и хранение раствори-
телей (например, нс хранить в холо-
дильниках)
Вос11.|амсняющнсся смеси
Маркировка биологически и радиохими-
чески опасных объекта
Продолжение табл. 7.1
Категория Элемент, влияющий на степень риска
Химические
(включая газы
и летучие жид-
кости)
Степень ипас- Используемое количество
ности
Токсичность Ядовитость Канцерогенность Тсрат огснность Мутагенность Коррозионность Раэдра-каюшие свойства Аллерт ичность Асфиксичност ь
Реакция с водой Теплообразование Закипание
Реакция с раство-
рит чя.ми
Летучесть
Образование
пыли и аэро-
Теилоибразованис
Закипание
Образование взрывчатой смеси
Отравление
Асфиксичност ь
Рассеивание и разбрызгивание
Импорт, экспорт Поломки и утечки
и транспорти-
ровка
Условия место- Доступность для необученного персо-
положения и нала
хранения Незаконный ввоз
Погодные условия, протечка воды
Надежность, устойчивость к сжатию,
поломки, утечки
Биологические опасности
Патогенность
Вирулентность
Генетические
манипуляции
Метод изоляции
Радиоизотопы
Излучение
Изменяемость
Локализация при
приеме внутрь
Размещение
и учет
Степень
Инфекционноеть
Специфичность по отношению к хо-
зяину
Заражающая доза (количество клеток)
Количество ДНК
Сисцифичност ь по отношению к хозяину
Внедрение вектора
Потеря трудоспособности
Комната
Методы работы
Тип
Уровень энергии
Проникающая способность, защита
Взаимодействие, ионизирующее дей-
ствие
Время полураспада
Парообразование
Распыление
Предшественники ДНК, такие как |‘Н-
тимидин]
Жидкие, твердые, газообразные
Стандартные
Законодательные ограничения
122
ГЛАВА 7. БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И ВАПИДАЦИЯ
Окончание табл. 7.1
Элемент, влияющий на степень риска
Категория
Особые обстоятельства
Беременность
Иммуносупрес-
сивные нрспа-
Раны и ссадины
Аллергия
Сложность
Продолжи 1 ель-
ность
Количество лиц,
вовлеченных в
процесс
Местоположение
Иммунодефицит
Риск дли плода. тератогенность
Иммунодефицит
Иммунодефицит
Возрастание риска попадания в орга-
Порошки (например, детергенты)
Аэрозоли
Контактная (например, резиновые пер-
Элементы процедур
Масштаб, размах
действий
Количество используемого материала
Размеры оборудования и материалов
Количество персонала, необходимого
для работы
Количество этапов и стадий
Количество вариантов процедур
Взаимодсиствце систем и процедур
Время (ир|>до.1жительн1кть) собственно
процедуры
Время инкубации
Время хранения
Возрастание рисков?
Сскрс1 ность и доступ ность
конкретной лаборатории. Эти нормы и правила долж-
ны находиться в соответствии с региональным и госу-
дарственным законодательством и составляться при
консультации с местным комитетом по охране труда.
Настоящие рекомендации не имеют законодательной
силы и не должны рассматриваться как таковые.
Общие предписания ио соблюдению мер безопас-
ности должны быть получены из бюро безопасности
института или компании, в которой вы работаете. В до-
полнение к ним, следует использовать рекомендации
Администрации профессиональной безопасности и
здоровья США (OSHA) [wuiestsha-ficcupationtd-hetdlh-
and-safety.com/']. В Европе, включая Великобританию,
действует новый свод требований [в Великобритании
основанный на Руководстве по здравоохранению и
Безопасности при работе. 1999]; teww.hmso^ov.uk.'
si.'si1999/19993242.htm (табл. 7.2). Эти требования
включают в себя все объекты общей безопасности.
Соответствующие требования и рекомендации но
биологической безопасности для США содержатся в
Руководстве * Биобезопасность в микробиолог ических
и биомедицинских лабораториях t> [Министерства
.здравоохранения и социального обеспечения США,
199.3; www.orcbs.nisu.edu biological BMBL/BMBL
1 him], объединенном документе, подготовленном
Центром но предупреждению и контролю болезней
в Атланте, шт. Джорджия, и Национальными инсти-
тутами здоровья в Бетезде, шт. Мэрнлонд. На тер-
ритории Великобритании опубликован двухтомный
сборник Информационного сообщения Комиссии
ио здравоохранению и социальному обеспечению:
Безопасность работ п предупреждение инфицирова-
ния в клинических лабораториях [Комиссия но здо-
ровью и безопасности, 1991а] и Безопасность работ
и предупреждение инфицирования в клинических
лабораториях типовые правила для персонала и
посетителей [Комиссия ио здоровью и безопасности.
1991Ь]. Работа с генетически модифицированными
клетками проводится в соответствии с Руководством
по работе с генетически измененными микроорганиз-
мами (ограниченного использования) (HSE, 1996), а
также распоряжениями Канцелярии Ее Высочества.
Некоторые руководства Великобритании доступны
для ознакомления ио адресу www.hse.gov.iik/hthdn
nofratnes.'hioldex.htm/. Советы, данные в этом разделе,
носят общий характер и не должны толковаться как
удовлетворяющие законодательству.
7.5. ОБЩАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ
В табл. 7.3 делается акцент на тех аспектах общей безо-
пасности, которые, в частности, важны для лабораторий
культивирования тканей и должны использоваться
в совокупности с национальными и региональными
правилами и нормами безопасности.
7.5.1. Оператор
В сферу ответственности учреждения входит подго-
товка и переподготовка работников, либо определе-
ние степени подг отивленности работника той работе,
которую ему поручают, в т. ч. знание соответствующих
лабораторных процедур. Руководитель лаборатории
должен убедиться, что новые или уже работающие со-
трудники близко знакомы с правилами и нормами тех-
ники безопасности. В обязанности непосредственного
руководителя каждого нижестоящего по должности
сотрудника входит проверка знаний и правильного
выполнения всех действий, а также применения ин-
дивидуальных способов защиты, в т. ч. спец, одежды в
соответствующее время
7.5.2. Оборудование
Руководитель подразделения должен назначить ответ-
ственного за состояние оборудования, электрическую
безопасность и техническую надежность. Начальник
лаборатории должен быть уверен, что все оборудование
работает в соответствии со спецификацией и отвечает
требованиям техники безопасности п что все сотрудни-
ки прошли обучение для работы с этим оборудованием.
Отдельные риски, связанные с токсичностью паров или
аэрозолированием при центрифугировании и гомоге-
7.5. Общая безопасность
123
Таблица 7.2. Руководства и нормы безопасности
Тема США Великобритания Европа
Общие Администрация профессиональной Руководстве по здравоохранс- Документы управления здравоохра-
безопасности и здоровья США нию и безопасности при рабо- нения и безопасности при работе
(OSHA.)[w!£'w.osha-occupational- heulth-and -safety сот/]. тс, 1999 [www hmsogov.uk/st/ st1999'19993242.him ] 89 391 EEC
Оборудова- (OSHA) [wicw osha-occupattonal- Руководство ио обеспечению и ис- Директива гго обеспечению и исполь-
ние health-and -safety com/] пользованию рабочею оборудо- вания (PUWER), 1998, Уровень безопасности, 1998, No 2306 зованггю рабочего оборудования 98 355 EEC и 95/63/ЕС
Химическая (OSHA) [wzeze osha-occupattonal- Контроль .за безопасностью ве- Директива совета 98 24 ЕС от 7 ал-
безопас- health-and -safety com/] щсств для здоровья [Комиссия реля 1998 г. «О защите здоровья и
ность Национальный институт здоровья по здоровью и безопасности. безопасности работников от рис-
|kw tttehs.nihgov odhsb/]. HSC, iS99fiicw.hsegov.uk/ioshh ков, связанных при работе с хими-
Национальный институт техни- ки безопасности и здоровья (NIOSH), www cde gov‘'mosh/ homepage.html index/htm\ чсскцм агентами» (14-я индивиду- альная директива в ра «де че Статьи 16(1) Директивы 89, 391 EEC) Offrcional Journal, п" L131? 05 05,1998, р. И
Биологиче- «Биобезопасность в мцкробио- Безопасность работ и предуиреж- Директива ЕС ио защите работников
екая безо- логических и биомедицинских дсние инфицирования в клини- от рисков, связанных при работе
паеность лабораториях» чсских лабораториях [Комиссия с контактами с биологическими
Министерства здравоохранения и социального обеспечения США 1999, [tctctcjcdcgov 'od/ohs/bios fry • bmbl4/bmbl4toc/httn / по здоровью и безопасности, 1991а|, а также Безопасность работ и предупреж- дение инфицирования в клини- ческих лабораториях тшювые правила для персонала и посети- гелей [Комиссия по здоровью и безопасности, 1991b] Руководство по работе с гене- тически измененными микро- орг анцзмами (ограниченного использования) [HSE, 1996. iL’Ww.hsegov.uk.'biosafety/]. агентами (90,679/ЕЕС)
Радиологи- Регуляторная комиссия по ядерной Руководство по работе с источни-
ческая бе- энергии. Медицинское, про- ками ионизирующей радиации.
зопасность мышленное и научное исполь- зование ядерных материалов ptmt! nregov 'tnatertals/medical html] 1999
нпзировании, должны быть снижены за счет дизайна
оборудования или путем установки оборудования в
изолирующие контейнеры.
Электрическая безопасность оборудования опира
ется в США на документы Администрации профес-
сиональной безопасности и здоровья США (OSHA)
[ww.mha-occupational-health -and—safety .сот /J, в
Великобритании на Руководство но обеспечению и
использованию рабочей» оборудования [ 1998. www.hse.
gov.uk/puhns/indg291.pdf], в с гранах Европейского Со-
юза на Директивы ио обеспечению и использованию
рабочего оборудования [1995|.
7.5.3. Стеклянные и острые предметы
Наиболее частыми повреждениями при проведении
работ ио культуре тканей являются случайные ранения
при манипуляциях с разбитым стеклом и шприцевы-
ми шлами. В частности, опасны разбитые иииетки в
моечных цилиндрах. Разбивание и скалывание пи-
неток происходят при вставлении с силой пииеток в
цилиндр с друг ими иипеткамц (см. рис. 7.1). Стеклян-
ные пастеровские иииетки не должны сбрасываться в
цилиндр с обычными пинетками (см. ниже). Большую
опасность также представляют иглы, выброшенные
без соблюдения соответствующих правил вместе с
обычным мусором либо проткнувшие стенку жесткого
контейнера. Случайный укол использованной иглой,
гговреждение осколком разбившегося сосуда, либо
повреждение кожи в ходе стандартных манипуляций
остаются наиболее частыми видами травм, связанных
с манипуляциями с потенциально биолог ически опас-
ным материалом. Этим обусловлен также риск транс-
плантации опухоли ири уколе иглой, использованной
для работы с человеческими опухолями [Soulham,
124
ГЛАВА 7. БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И ВАПИДАЦИЯ
Рис. 7.1. Перепилненныъ цилиндры для исполосованных
пипеток. В результате всовывания с усилием цнисток в уже
наполненный цилиндр, они торчат наружу, эти торчащие
пипетки нс замачиваются и нс дезинфицируются, а также
могут разбиться (если они стеклянные) при добавлении
новых пипеток
1958; Scanlon el al.. 1965: Gugel & Sanders, 1986|, хотя
сообщения о таких случаях крайне редки.
Пастеровские пинетки должны выбрасываться в
специальную корзину для острых и колющих предме-
тов (см. приложение II и www.cdc.gov/niosh /sharps 1.
hlttil), а не в общую мусорную корзину, поскольку
они лег ко разбиваются и осколки крайне опасны. При
повторном использовании их необходимо складывать
отдельно с большой аккуратностью. Производители
предлагают одноразовые пластиковые пастеровские
пинетки Kimble-Kontes; Alpha Laboratories-PastelleS,
однако они имеют более толстый кончик, чем стек-
лянные. Избегайте использования шприцов и игл,
если только они не требуются для наполнения ампул
(используйте тупоконечные канюли) или отбора жид-
кости из запаянных пузырьков. Пользуйтесь жесткими
пластиковыми или металлическими контейнерами
для использованных одноразовых игл. Не старайтесь
соснуть, вставить иеггользованную иглу обратно в
упаковку или как-то иначе с ней манипулировать.
Обесиечьте отдельный ящик с жесткими ст енками для
сбора отработавших колющих предметов и разбитого
стекла и не используйте его для общего мусора.
Будьте внимательны при установке ггггггетки в гггиге-
тирующее устройство или грушу. Выбирайте правиль-
ный размер груши, чтобы избежать риска разбивания
пиггетки и повреждения руки. Проверьте, чтобы носик
груши издавал звук, удерживайте пипетку так близко
к концу, как возможно, и, мяг ко надавливая, наденьте
носик, удерживая пипетку так, чтобы, случайно сло-
мавшись, она не иовредила суставов руки (рис. 7.2).
Хотя использование стеклянных пинеток в этом слу-
чае связано с большим риском, пластиковые ициетки
гоже могут быть повреждены и сломаться, поэтому
всегда проверяйте верхнюю часть каждой пипетки до
ис пользования.
7.5.4. Химическая
токсичность
При культивировании тканей используется отно-
сительно мало химически оиасных соединений, но
их использование должно быть согласовано с обще-
принятыми мерами иредосторожности. Обращайте
особое внимание на образование пылгг и аэрозоля в
ламинарном шкафу (см. разд. 7.8.2). Детергенты, в
частности те, которые используются в моечных ма-
шинах, обычно представляют собой каустик и мог ут
раздражать кожу, глаза и легкие. По возможности,
исиользуйте жидкие детергенты в дисиенсирующих
устройствах, надевайте перчатки, избегайте процедур,
сопровождающихся распылением детергента. Жидкие
детергенты в виде концентрата иредпочтительны,
поскольку с ними легко обращаться и дозировать, но
они дороже. Химические дезинфектанты, такие как
гииохлорит, должны использоваться с соблюдением
всех мер иредосторожности, при этом ггреггочтггтельны
таблетированные формы или жидкие концентраты в
емкостях с диспенсерами. Гипохлорит-содержащие
дезинфектанты обесцвечивают одежду, вызывают
раздражение кожи, могут вызвать коррозию в местах
сварки нержавеющей стали.
При культивировании тканей используются спе-
цифические химикаты, которые требуют особого
внимания: 1) диметилсульфоксид (Д МСО), является
мощным растворителем и проникает через кожу, ио-
этому может перенести мног ие вещества через кожные
покровы [Horrta and Weber, 1964J и даже через неко-
торые защитные перчатки (например, через латексную
или силиконовую резину, в меньшей степени через
нптрильную) и 2) мутагенные, канцерогенные и ци-
тотоксические вещества, работа с которыми должна
проводиться в специальных боксах. Ламинарный
шкаф II класса защиты подойдет для периодической
работы с этими веществами, но для постоянного ис-
пользования этих соединений может потребоваться
специально разработанный бокс. Мутагены, канцеро-
гены и другие токсичные вещества часто растворяют
в ДМСО, что повышает риск их проникновения через
кожу. Нитрильные перчатки обеспечивают лучшую
защиту, но для отдельных реагентов следует ировести
7.5. Общая безопасность
125
Рис. 7.2. Правильное введение пипетки в пипетирующее устройство. («) Неправильное положение рук Левая рука слишком
низко удерживает пипетку, прикладывая слишком большое усилие, при котором пипетка может разбиться. Правая рука слиш-
ком далеко захватывает устройство сверху, касаясь верхней части пинетки. Осколки при разбивании штие-тки при слишком
большом усилии могут поранить суставы пальцев (б) Правильное положение рук. левая рука в верхней части пипетки, легкий
захват, верхний конец пииетки ясно виден
испытания [см. также w&wyaciJica.cotn/NitrileGlfwe-
sChemicalResistcince-BarrierGuide.pdf\.
Работа с химическими реактивами ретулируется
документами OSHA [tt'arp.osfte-got'.J, а также в Вели-
кобритании Руководством ио кон гролю за безопас-
ностью веществ для здоровья [Комиссия но здоровью
и безопасности, HSC, 1999а;1999b J. По адресам wow.
mehn.nih^’uv/udhsb.'niDWW.cde.flftv/mosh/homejMtSfi.html
доступна информация из Национального института
техники безопасности и здоровья (NIOSH) и Нацио-
нального института здоровья (США)
7.5.5. Газы
Большинство газов, используемых в культуре тка-
ней (СО,, О2, N2) в малых количествах не оказываю?
повреждающею действия, но, тем не менее, могу?
быть опасны при ненадлежащем использовании. Они
должны быть заключены в баллоны иод давлением,
которые затем должны соответствующим образом
храниться (рис. 7.3). Если произойдет значительная
утечка газа,то существует риск асфиксии (СО2, N,) или
пожара (О2). В каждом случае необходимы эвакуация
и максимальная вентиляция, при интенсивной утечке
кислорода вызовите пожарных. В комнате, в которой
хранятся запасы (СО,, N,), или в комнатах, в которые
газы поступают ио системе трубопровода, на уровне
г гола должен быть установлен показатель содержания
кислорода.
Если используются стеклянные ампулы, они запаива-
ются на ог не газовой горелки. Наибольшая исюрожность
Рис. 7.3. Хомут для баллона. Хому, прпкрспляегся к краю
стола или жестко закрепленной полки, предохраняя газовый
баллон при помощи ткансво! о ремня Подходит к баллонам
разных размеров, может быть перемещен в другое положение
при необходимости, предлагается большинством поставщи-
ков лабораторного оборудования
126
ГЛАВА 7. БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И ВАПИДАЦИЯ
требуется как для работы с пламенем, так и для предуп-
реждения неи|>едумы11ыенного смешивания бытового
аза и кислорода. В систему |азоировода должен быть
вмонтирован однонаправленный клапан, не позволяю-
щий кислороду проникать в газопроводные трубы.
7.5.6. Жидкий азот
С жидким азотом связаны три основных риска: об-
морожение, асфиксия и взрыв (см. протокол 20.1).
Поскольку температура жидкою азота составляет
—196 °C, прямой контакт с жидкостью (при расплес-
кивании и т.д.) или с чем-то дру|им, особенно метал-
лическим, перед этим подверженным воздействию
азота, представляет собой серьезную опасность.
Следует надевать перчатки, достаточно толстые для
обеспечения изоляции, но достаточно мягкие и ,иб-
кие, чтобы не затруднять работы с ампулами. Ко|да
азот выкипает из морозильного оборудования при
рутинных манипуляциях, для удаления паров азота
достаточно работы обычной системы вентиляции,'
но ко|да азот переливают или большое количество
образцов ставится в морозильник на замораживание,
необходимо включать дополнительную вентиляцию.
Помните, что 1 л жидкою азота образует около 700 л
аза. Датчик кислорода и сш нал трево! и должны быть
встроены (см. рис. 4.7) в вентиляционную систему, так
чтобы при изменяющемся составе воздуха и снижении
уровня кислорода звуча.'! аварийный ст нал и вклю-
чалась дополнительная вентиляция.
7.5.7. Ожоги
Существует три основных источника ожогов: 1) авто-
клавы, стерилизационные печи и горячие поверхности;
2) манипуляции с предметами, только что вынутыми
из автоклавов, печен и горячих плиток и 3) открытое
пламя бунзеновскои горелки при обжигании предметов
(см. табл. 7.3). Рядом со всем нагревающимся оборудо-
ванием, в том числе горелкой, должны быть помещены
предупреждающие надписи; после автоклавирования
и стерилизации все предметы необходимо охлаждать.
Для манипуляций с горячими предметами следует
использовать теплоизолирующие перчатки
7.6. ПОЖАР
Возникновение повышенной пожароопасности при
культивировании тканей связано с использованием
горелки для обжшания предметов и этилового спир-
та для стерилизации поверхностей и инструментов.
Храните спирт в удалении от источников оюя; всег-
да следите за тем, чтобы спирт для стерилизации
инструментов содержался в минимальном объеме в
узкогорлой бутыли или колбе, которая не опрокидыва-
ется (рис. 7.4). Спирт для дезинфекции поверхностей
Таблица 7.3. Общие мероприятия
Категория Действие
Расиоряди гель- Взаимодействие с государственными и
ный орган pci повальными инспск пирующими органами
Местный комитет Назначенный представитель
по технике бе- Ор<ан1!зация встреч и дискуссий
зопасности
Руководства Местные и государе ibc-нныс Составление местной действующей инс- трукции, если таковой нс имеется
Стандартные дев- Определить и еде тать доступными для
ствующис пра- персонала
вила (SOPs)
Защитная одежда Обеспечение, стирка, правила ношения
Контейнеры Специфические нормы и правила (на- пример, хранение и упаковка)
Уровень бсзолас- Оиреде шть уровень химической, бноло-
ности ической, радиологической защиты
Тренировка Организация семинаров, руководство
Мониторинг Авт оматический дотек пр дыма, измери- те зь уровня кислорода
Проверки П|юверка оборудования, порядка дей- ствий специально обученными сотруд- никами, назначенными для выполне- ния этой обязанное in
Ведение записей Инструктор ио технике безопасности и сотрудники регулярно ведут записи
Импорт и экспорт Согласно установленному распорядку, ведение регистрационных записей
Сортировка Определить порядок утилизации ко-
мусора люще-режущего, радиоактивною (твердые и жидкие отходы), биоло- гически опасного, коррозирующего, оксичного видов мусора, а также растворителей
Допуск Ограничить обученным персоналом и посетителями. Исключить при- сутствие детей, за исключением зон общего пользования
должен храниться в пластиковой бутыли с распыли-
телем и не использоваться в присутствии открытою
пламени. При стерилизации инструментов в спирте с
последующим обжиганием их в пламени не возвращай-
те инструменты обратно в спирт, пока они охвачены
oi нем. Если вы используете этот метод стерилизации
инструментов, держите под рукой влажную ткань для
сбивания пламени, если спирт загорится
7.7. ИОНИЗИРУЮЩЕЕ ИЗЛУЧЕНИЕ
С культивированием тканей связаны три основных
типа радиационной опасности: попадание внутрь орга-
низма, излучение от меченых реагентов и излучение от
высокоэнергетичных источников. За руководством ио
радиационной защите в С Ш А можно обратиться в У •-
равление но регуляции исследований ядернон энер| ии
(ядерная рщуляторная комиссия США, Вашингтон,
7.7. Ионизирующее излучение
127
DC 20555). В Великобритании работа с радиоактивны-
ми источниками ршулируется документом «Работа с
ионизирующим излучением. Регуляция деятельности,
связанной с ионизирующим излучением |1999]».
7.7.1. Попадание в организм
Растворимые радиоактивно меченные компоненты
мшут попасть в ор1анизм оператора через кожу рук
или путем аэрозол ирования при ии дотировании, а
также при использовании шприца. Меченные три-
тием нуклеотиды при случайном попадании внутрь
внедряются в ДНК и мгпут вызвать радиоактивное
разложение ДНК из-за кратчайшею расстояния
воздействия низкоэнергетичного ^-излучения oi
3Н-метки. Радиоактивные изотопы йода будут кон-
центрироваться в щитовидной железе и moi ут также
вызвать местное повреждение.
С изотопами работайте в боксе II класса защиты,
предохраняющею от аэрозолей, и надевайте резино-
вые перчатки. Все предметы, с которыми вы работа-
ете, должны расиола1аться на не!лубоких поддонах,
выстланных фильтровальной бумагой или тканью
Benchote, впитывающими возникающие загрязнения.
Используйте наименьшее количество оборудования
(например, дозатор с одноразовыми пластиковыми
наконечниками, маленькие пробирки для образцов
и т.д.), совместимое с процедурой, для обеспечения
минимального объема ири утилизации радиоактивных
отходов. Тщательно мойте руки после завершения
работы, ршулярно обследуйте рабочую зону контроли-
рующими датчиками для обнаружения радиоактивного
загрязнения.
7.7.2. Утилизация радиоактивных отходов
Процедура утилизации радиоактивных отходов опре-
деляется местными правилами, принятыми в лабора-
тории; совет ио внедрению этих правил можно полу-
чить из источников, приведенных выше. В целом, за
определенный период времени можно утилизировать
О1раниченное количество радиоактивных отходов.
Утилизация может проводиться в особо обозначенных
устройствах. Количество выбрасываемого материала
должно быть занесено в кишу ведения радиоактив-
ных материалов в графе «утилизация». Емкости,
используемые для утилизации, должны быть обрабо-
таны специальными детергентами (vvvvvv.oshasafely.
com/HazardLab.htm). смывные воды также должны
утилизоваться как радиоактивные отходы. Утилиза-
ция может потребовать принятия определенных мер,
снижающих риск радиационного поражения, поэтому
те предметы, которые будут повторно использовать-
ся. должны быть предварительно обработаны против
биоло! ическо! о за1рязнения ишохлоритом. а затем
против радиоактивного 3ai рязнения детергентом De-
con или аналО( ичным ему. Оба раствора необходимо
затем уничтожать как радиоактивные отходы.
7.7.3. Излучение от меченых реагентов
Второй тип риска связан с радиоактивным излучением
от высокоэнергетичных 0-и у-источников, таких как
З2р, i2->£, 1.Иj ‘>>сг_ Защита обеспечивается работой за
2-мм свинцовым экраном и хранением источников в
свинцовом контейнере. При кратковременной работе
с низкими концентрациями 32Р можно использовать
экран Perspex (толщина 5 мм). Работайте на поддонах
в боксах II класса зашиты (см. разд. 7.7.1).
7.7.4. Излучение от высокознвргетичных
источников
Третий тип радиоактивной опасности связан с прибо-
рами, использующими рентгеновское излучение, и вы-
сокоэнергетичным источником “’Со. Особой осторож-
ности требуют также источники ультрафиолетового
излучения, которые применяются в стерилизационных
аппаратах или оборудовании для pei уляции клеточной
128
ГЛАВА 7. БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И ВАПИДАЦИЯ
Таблица 7.4. Опасные производственные факторы в лаборатории культивирования тканей
Категория Объект Риск Меры предосторожности
Общие Разбитое стекло Раны, инфекция Осторожное размещение в специальной корзине для мусора
Пипетки Раны, инфекция Проверка пипеток. Замена поврежденных. Исполь- зование пластиковых пипеток
Острые инструменты Раны, инфекция Аккуратное использование, утилизация в корзине для острых и колющих иредмектв
Стеклянные Пастеровские пипетки Раны, инфекция Аккуратное исцользованис, нс используйте для потенциально биоло! ичсски опасных материалов, использование пластика
И| лы для шприцов Раны, инфскиия Минимизировать употребление, при возможности отказаться от использования. Утилизация в кор- зине для острых и колющих предметов
Электрические кабели Пожар, удар током, пре- ткновение, падение Проверка надежности соединений, соединение зажи- мом нескольких кабелей вместе и расположение их в безопасном месте
Прокладка труб Утечка, затор, падение Проверка и регулярная замена устаревших труб Закрепление на месте расположения, расположение нс на пути прохода персонала
Газовые баллоны Неустойчивость, утечка Прикрепление к столу или стене, регулярная про- верка на предмет утечки
Жидкий азот Обморожение, асфик- сия, взрыв Ношение маски, лабораторного халата и перчаток; не хранить ампулы в жидкой фазе, либо помещать в оболочку при оттаивании
Ожоги Автоклавы, стсрилизаци- Контакт с оборудова- Предупреди тельные .знаки, использование теплоизо-
онные печи, горячие по- верхности нием, манипуляции с только что стерилизо- ванным материалом лирующих перчаток
Пожар Бунзсновская горелка. Пожар, повреждение Держать вне ламинарных шкафов, нс помещать под
открытое пламя, в част- расплавленным мате- шкафы и полки, нс возвращать охваченные огнем
ности в совокупности с риалом, риск ожога инструменты в спирт
парами спирта; При отсутствии воды Устанавливать таймер и термостатический прсдох-
Ручные автоклавы может загореться со- держимое ранитслы Удостовериться, что предохранительный клапан в наличии и рабочем состоянии
Радиоле»- Радиоизотопы в стериль- Излучение, ра тлнванис. Работать на абсорбирующем поддоне в боксе II клас-
гическая ном боксе аэрозолированис. са химической защиты, минимизировать аэро-
опасность Излучение в культуре Летучесть Доза радиации золированис Использовать монитор дозы радиации. Носить персональный монитор и регулярно производить проверки
Биологиче- Ввоз клеточных линий и Инфекции Нс ввозить из зон повышенного риска, скрин и hi
екая биопсийного материала Генетические манипу ляции культур на присутствие возбудителей Следование руководствам по генетическим мани- пуляциям
Распространение вирусов Инфекции, перенос Соблюдать 1рсбования CDC пли ACDP
Расположение и эксплуа- ДНК Работать на необходимом уровне безопасности, ми-
тация ламинарных шкафов Инфекции Нарушение юрмстич- нимизнровать аэрозолированис Регулярная проверка потоков в ламинарный шкафах, перепада давления через фильтры, а также утечку воздуха из боксов
пролиферации и фидерных с.юях (см. разд. 14.2.3. и
протокол 23.1,23.4). По причине выделения высокого
уровня знер! и и, в частности ренп еновскмх лучей или
“Со, эти источники часто распола! аются в специально
оборудованных строго контролируемых приспособле-
ниях. УФ-источники могут стать причиной поврежде-
ния кожи или ита.т, они должны экранироваться для
предупреждения прямого воздействия на оператора.
Кроме того, работающему с УФ-излучением оператору
необходимо надевать специальные очки с барьерным
фильтром
Проконсультируйтесь с местным государственным
служащим, узнайте нормы и правила работы до toi о,
как приступать к экспериментам с радиоизотопами.
7.8. Биологическая опасность
129
Местные правила MOiyr иметь какие-то особен-
ности, но большинство требует жесткою контроля
количества изотопов, которое можно использовать,
хранить и утилизовать. Эти требования следует
учитывать при планировании обще! о медицинского
обследования, включая планирование хранения об-
разцов крови.
7.8. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОПАСНОСТЬ
Аналошчно требованиям безопасности при исполь-
зовании радиоизотопов, до начала проведения био-
медицинских исследований требуется учесть правила
работы с биологически опасным материалом, включая
хранение образцов крови. Необходимость биологи-
ческой защиты [см Caputo, 1996) определяется как
источником материала, так и характером действий,
производимых над ним. Степень биоло!ической
опасности связана также с условиями, при которых
проводится культивирование тканей. Стандартные
микробиоло! и ческие приемы работы на открытой
поверхности имеют то преимущество, что эти методы
являются результатом накопления многолетнего опы-
та работы. Проблемы появляются при введении в прак-
тику новых методов или при увеличении количества
людей, работающих на одной площади. Использование
ламинарного шкафа с горизонтальным потоком обус-
ловливает более высокую защиту стерильности куль-
туры, но вероятность воздействия аэрозолированною
материала на оператора повышается. Это привело к
разработке ламинарных шкафов с вертикальным воз-
душным экраном в передней части (см. разд. 5.2.1. п
6.4) для минимизации выхода зараженного воздуха из
объема шкафа. Такой тип ламинарно! о шкафа опреде-
ляется как II класс микробиоло! ической безопасности
(см. разд. 7.8.2).
7.8.1. Уровни биологической защиты
Национальным институтом здоровья (NIH) и Центром
по контролю и предупреждению болезней (CDC) США
выделяется четыре уровня биоло!ической защиты
[Материалы HHS.No (CDC) 93-8395] (табл. 7.5). Они
определяют требуемые методы работы, оборудование и
меры безопасности. Европейские законы в этой области
еще окончательно не приняты, но похожи на существу-
ющие в Великобритании Руководства, которые также
выделяют четыре уровня биоло! ической защиты, хотя
с небольшими отличиями от классификации США
(табл. 7.6). В таблицах представлено только краткое
содержание, поэтому читатель, который иредпола1а-
ет работать с потен циально биоло! и чески опасными
объектами, должен обратиться к соответствующим
электронным источникам [USA: www.orcbs.msu.edu/
biological ВМBL BMBL-l.hlui;UK.* www.lise.gov.uk/
biosafety ]. Руководства Европейского Союза находят-
ся на стадии подготовки.
7.8.2. Ламинарные шкафы
микробиологической защиты
В пределах каждою уровня биологической защиты
можно выделить три уровня манипуляций, определя-
емых типом используемого ламинарного шкафа:
1) Максимальная защита от известного возбуди-
теля. Изолированный бокс с фильтрацией воз-
духа, входящего и выходящею через встроенные
фильтры-ловушки для возбудителей (бокс биоло-
1 ической защиты или микробиоло! ический бокс
III класса безопасности, рис. 7.4б). Бокс обычно
установлен в отдельной комнате с траниченным
допуском, дезинфекцией выносимою оборудо-
вания, твердых и жидких отходов (см. BSL4 в
табл. 7.5 и Уровень 4 в табл. 7.6), в зависимости от
природы риска.
2) Промежуточный уровень защиты от потенци-
ального возбудителя. Вертикальный ламинарный
шкаф с передней защитой в форме воздушной
завесы и фильтрацией выходящего воздуха (бокс
биоло: ической защиты или микробиоло: ический
бокс II класса безопасности, рис. 7.4а) [National
Sanitation Foundation Standard 49, 198.3,- British
Slandarlisation, 1999]. Если определено наличие
возбудителя в материале, то работа должна вестись
в ламинарном шкафу, находящемся в отдельном
помещении, в соответствии со II, III или IV уровнем
защиты в зависимости от вида во.1будителя. Если нет
причины предполагать инфицирование материала,
помимо случайною, то ламинарный шкаф, который
можно отнести ко II уровню защиты, допустимо
распила: ать в общем помещении лаборатории куль-
тивирования тканей. При этом следует oi раничпть
доступ к материалу, с которым ведется работа, кон-
тролировать утилизацию мусора, использование
защитной одежды, а также запретить употребление
пищи и напитков на территории рабочей зоны (см.
табл. 7.4; 7.5). Все боксы биологической защиты
должны быть объектом строгою контроля [Osborne
el al., 1999], с проверкой фильтров через определен-
ные интервалы времени, соответствующей схемой
мероприятий фумигацией боксов, заменой фильт-
ров, безопасным уничтожением старых фильтров с
упаковкой их в двойную оболочку и последующим
сжиганием.
3) Минимальная защита. Открытая поверхность,
выполнение правил ведения микробиоло! ических
работ. Обычно эти работы достаточно проводить в
специально выделенной части помещения, которая
может быть названа «лабораторией культивирова-
ния тканей», но 1де будут соблюдаться все меры
предосторожности для работы на I уровне безо-
пасности.
В табл. 7.7 приводится список основных мероприя-
тий, соответствующих каждому уровню биоло: ической
защиты. Кроме тою, при организации лаборатории
следует обратиться в государственный и местный коми-
теты по технике безопасности и использовать соответ-
130
ГЛАВА 7. БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И ВАПИДАЦИЯ
Таблица 7.5. Уровни безопасности (BSL) в США (требуются замечания переводчика!)
BSL 1 (SMP’) BSL 2 (SR2) BSL 3 (SP) BSL 4 (SP)
Допуск Допуск ограничен, ко1да ведется работа Контроль против зара- жения насекомыми и грызунами Доступ ограничен по- егоянно Оценка предраспо- ложенности, имму- низация изучение фоновых харак- теристик, может потребоваться пе- риодическое иссле- дование проб сыво- Анало! ично BSL 2, + отдельное лабораторное помещение на два места с само захлопывающимися дверьми Когда ведется работа, двери закрыты Иммунизация или проверка иммунного статуса, изуче- ние фоновых характерис- тик, периодическое иссле- дование проб сыворотки Анало! нчно BSL 3 + только определенные сотруд- Охранясмыс запирающиеся двери Раздевалка и душ Двери с внутренними замками. Оборудование и материалы вносятся через шлюзовую камеру с двумя дверьми (авток.1ав или фумигатор) Нс вносятся никакие ма- териалы помимо тех, что непосредственно необхо- димы для работы
Уборка Jlei кость уборки, доста- точно пространства между боксами, обо- рудованием и т.д. водо- упорная поверхность рабочих с голов Аналогично BSL 1 + рсгулярное обезза- раживание рабочих поверхностей и обо- рудования Аналогично BSL 2 + Рекомендуется работа на абсорбирующей бумаге с пластиковой основой. Все поверхности в комнатах покрыты моющимся защит ным слоем Анало! нчно BSL 3+ гсрмстичныс соединения, дезинфицирующие ло- вушки на сливных отвер- стиях, НЕРА-фи льтры на выпускных отверстиях Минимальная площадь поверхности для ПЫЛИ
Личная Ношение лабораторных Аналогично BSL 1 + Анало! ич но BSL 2+ защи гныс Аналошчно BSL 3+
гигиена халатов. нс принимать СДУ »111НТЬС И ТЛ, НС Ш1- петировать ртом Но- сить перчатки и защит- ный козырек (особенно при наличии контак- тных линз) Раковина для мытья рук Снимать перчатки и мыть руки, покидая поме- щение Обеспечение обезза- раживания и стирки в помещении лабо- ратории Оборудование для промывки |лаз очки и маска или экран для лица кроме BSC Защита органов дыхания, если образование азрозоля нс можс! быть контролируемо. Одежда со сплошной пере- дней частью, снимаемая при выходе из лаборатории Автоматический или откры- ваемый локтем кран на раковине Перемена одежды, одежда авток.1авирустся Душ перед уходом из лабо- ратории
Потоки возду- ха и венти- ляция Без особенностей. 01 крываемыеокна долж- ны иметь экран Ана.ю! ич но BSL 1 + Окна закрыты и герметизи- рованы Отрицательное давление, полная экстракция воздуха, выхлоп воздуха наружу из рабочей зоны или захват воздуха Система вентиляции, спе- циально предназначен- ная для этого уровня, снабженная системой аварийной ситализа- ции, без рециркуляции воздуха
Оборудова- Без особенностей Обычное, обеззаражи- вание, в частности до внесения в поме- щение лаборатории или выноса его Аналогично BSL 2+ физиче- ские методы сдерживания, например дополни 1ельные изолирующие колпаки для центрифу! и роторов Очищающие НЕРА- фильтры Вакуумные линии защище- ны дезинфицирующими ловушками и НЕРА-филь- грамц Оборудование, предупрежда- ющее обратный поток Аналогично BSL 3
Осколки Без особенное icii Применение стекла ограничено неиз- бежным использова- нием Использован- ные или разбитые предметы помеща- ются в контейнер, обеззараживаю гея до утилизации Авалей нчно BSL 2 Аналошчни BSL 2
7.8. Биологическая опасность
131
Окончание табл. 7.5
BSL 1 (SMP') BSL 2 (SP1 2) BSL 3 (SP) BSL 4 (SP)
Блок микро- биологичес- кой защиты Нс требуется, миними- зировать возможность аэрозолирования Класс II Класс II пли III. выхлоп через НЕРА фильтр, для II K.iacca возможна рециркуляция воздуха Класс II или III, инди- видуальный костюм с системой жизнеобеспе- чения II ПОЛОЖИ It 1ЬНЫМ давлением воздуха
Дезинфекция Любые дезинфектанты Обеззараживание по- верхностей ио крайней мерс один раз в день Аналогично BSL Н Специфические про- цедуры. автокла пирование нсиода- Аналогично BSL 2 + Разлив удаляется специально подготовленными специа- листами Аналогично BSL 3+ Требуется двухсторонний входной автоклав, пред- почтительно из бокса III класса защиты
Хранение и пе- редача мате- риала Без особенностей Герметичный контей - нср Аналогично BSL 2 Устойчивые к воздейс твию материалы передаются в двойной упаковке в небьющихся контейне- рах после замачивания в дез. растворе или фу- мигации
Утилизация После дезинфицирова- ния или обеззаражи- вания автоклавирова- нием в соседнем поме- щении Аналтично BSL 1 + определенные меры обеззараживания Аналогично BSL 2 + обезза- раживание в помещении лаборатории Аналогично BSL 3+ обез- зараживание всех слив- ных вод, включая душ и туалет, а также обеззара- живание дру| их материа- лов через двусторонний автоклав
Руководство по биобезо- пасности и тренинг Без особенностей Т рсбуется подготови- с-льный тренинг Аналогично BSL 2 Аналогично BSL 3+ вы- сокая квалификация в SMP
Аварии и раз- ливания Без особенностей Подписанная доклад- ная. Возможно, пот- ребуется медицин- ское заключение Аналогично BSL 2 + Разлив удаляется специально подготовленными специа- листами Аналогично BSL З4- Мониторин! отсутствия исрсонала, забот а о забо- левших, карантин
Валидация оборудова- Без особенностей Без особенностей Без особенностей Безопасность всех сливных жидкостей и выхлопов
1SMP Standard Microbiological Practices, Стандартная мик|юбиологичсская практика
2SP Special Practice», специальная практика. Манипуляции с агентами обладающими умеренной потенциальной опасностью.
ствующие руководства (см. ра.щ. 7.2) для ознакомления
с требованиями действующего законодательства.
7.8.3. Человеческий биопсийный материал
Требования биологический безопасности являются
наиболее ясными, когда используется известный,
изученный возбудитель, поскольку нормы и правила
работы с каждой группой возбудителей установлены
как в США [Министерство здравоохранения и социаль-
ного обеспечения США, 1993], так и в Великобритании
[Консультативный комитет ио опасным возбудителям
(ACPD), 1995а, 1*[. Однако в двух <ю.-1астях иссдедований
существует наибольший риск, связанный с определени-
ем природы материала. Одна из этих областей касается
новых потенциально патогенных гонов и находится в
стадии развития, поскольку связана с рекомбинантными
техниками — такими как трансфекция, ретровирусное
инфицирование и межвидовая клеточная |ибридиза-
ция. Манипуляции с такими культурами в ламинарных
шкафах связаны с иреднола|аемым риском, который не
имеетэиидем11олО|ическо|о обоснования для правиль-
ной его оценки. Трансформация вирусов, амфитропные
вирусы. |рансформированные неточные линии челове-
ка, । ибриды клеток человека и мыши, а также, например,
клеточные линии, полученные при ксенотрансплантации
у иммунодефицитных мышей, должны быть объектами,
работа с которыми ведется с большой предосторожнос-
тью до тех пор, пока не получено достаточно данных,
подтверждающих отсутствие риска.
Другой областью риска является включение слу-
чайных иозбудителей в клеточные линии, либ» в био-
псийные или аутопсий ные образцы от человека или
приматов [Grizzle & Poll, 1988; Wellset al., 1989; Tedder
etal., 1995J, либо в продукты животного происхождения,
132
ГЛАВА 7. БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И В А ПИД АЦИЯ
Таблица 7.6. Уровни биологической защиты в Великобритании
Уровень! Уровень 2 Уровень 3 Уровень 4
Допуск При проведении работы двери закрыты Ограничен Аналогично 2 + Отдельная лаборато- рия с обсервацион- ным окном. Koi да лаборатория нс работает, двери заперты Аналогично 3 + Контроль зараженности насеко- мыми и грызунами Раздевалка и душ Внутренние запоры на дверях. Вентили- руемый воздушный шлюз для оборудования Телефон или интерком
Площадь Без особенностей 24 м3 на человека Анало| ично 2 Аналогично 2
Уборка Лег кость уборки, водо- упорная поверхность рабочих столов Анало! нчно 1 + Обычное обеззара- живание рабочих поверхностей Аналогично 2 Анало! ично 2
Личная гигиена Носить лабораторные Аналогично 1 + см- Аналогично 2 + ноше- Аналогично 3 + смена одежды.
халаты (застегивают- кость для обез- нис перчаток, сни- автоклавирование одежды.
ся на боку или на спи- не). хранить, стирать после изнашивания правильно заменять Нс принимать еду н пи- тье и т.д, нс пипсти- ровать ртом заражнвания рук рядом с выходом магь которые при пользовании общи- ми предметами, на- пример телефоном Душ перед уходом
Потоки воздуха Предпочтите гьно отри- цагсльное давление Требуется отрнца- ic.ibHoc давление Аналогично 2 Отрицательное давление >70 Па (7 мм Н,О), воздух выпуска- ется через серию НЕРА-филь- тров. Подача и экстракция взаимосвязаны
Оборудование Без особенное гей Без особенностей Следует иметь все не- обходимое оборудо- вание Необходимо иметь все необхо- димое оборудование
Блок микробио- Нс требуется, манимы- Требуется MSC или K.iacc I или III Класс III
логической за- щиты (MSC) зировать возможность аэрозолировання изолятор (BS5725), класс II (BS5726) Выхлоп через НЕРА фильтр наружу
Дезинфекция Любые дезинфектанты Специфические процедуры, ав- токлавирован нс неподалеку Аналогично 2 + Герметизация лабо- ратории для обез- зараживания, ав- токлавирование предпочтительно в .|абораторни Аналогично 3 Требуется двухсторонний вход- ной автоклав, предпочти- тельно из бокса III класса зашиты
Хранение Без особенностей Требования безо- пасности при хра- нении биологи- ческих объектов Аналогично 2
Утилизация В дезинфектант до ути- лизации Аналогично 1 + Мсгка на мусоре, безопасный сбор и утилизация Аналогично 2 Аналогично 3-*- дезинфекция всех жидких oixoaob, включая воду от душа. Двусторонний бак для .замачивания мусора, который немо'кет автоклави- роваться
Аварии Докладная Аналогично 1 Аналогично 2 Аналогично 3+ второй сотруд- ник помогает в случае необ- ходимости
Валидация оборудования Без особенностей Без особенностей Без особенностей Требуется
7.8. Биологическая опасность
133
Герыети-№1й воздуховод
под отрицательным
давлением
загрязнения при
а ЛАМИНАРНЫЙ ШКАФ II КЛАССА БЕЗОПАСНОСТИ б ЛАМИНАРНЫЙ ШКАФ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ
в ЛАМИНАРНЫЙ ШКАФ III КЛАССА БЕЗОПАСНОСТИ, ВИД СПЕРЕДИ Г ЛАМИНАРНЫЙ ШКАФ III КЛАССА БЕЗОПАСНОСТИ, ВИД СБОКУ
Рис. 7.5. Ламинарный шкаф биологической безопасности, (й) Ламинарный шкаф с вертикальным потоком II класса заштпы
с рециркуляцией 80% воздуха и удалением 20% наружу через фильтр и воздуховод для захвата потенциальных возбудителен
из воздуха. Для восстановления объема рециркулирующего воздуха, он захватывается из передней части шкафа, что повышает
защиту от распространения биологически опасных частиц из рабочей зоны, (б) ламинарный шкаф с вертикальным потоком
II класса химической защиты с угольным фильтром на выходе, и рециркуляцией воздуха, (в) ламинарный шкаф III класса
защиты без рециркуляции воздуха, шкаф снабжен резиновыми карманами, работа ведется при отрицательном давлении, с
воздушной разделительной камерой для доставки оборудования и прямым доступом к автоклаву, соединенному или располо-
женному рядом, (z) ламинарныц шкаф III класса, вид ебоку
134
ГЛАВА 7. БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И ВАПИДАЦИЯ
Таблица 7.7. Биологические процедуры н предлагаемый уровень защиты*
Процедура Уровень защиты Рабочее пространство
Приготовление сред GLP Открытый стол со стандартной микробиологической практикой либо горизонтальный или вертикальный ламинарный шкаф
Первичные культуры или клеточные линии, нс от человека или других приматов 1 Открытый стол со стандартной микробиологической практикой либо горизонтальный или вер шкальный ламинарный шкаф
Первичные культуры или клеточные линии, нс от человека или других приматов, инфицированные или трансфицированные 1 Ламинарный шкаф II класса защиты
Первичные культуры или серийный пассаж клеток человека или других приматов 2 Ламинарный шкаф II класса защиты
Межвидовые гнбридомы или дру| ис рекомбинантные клетки, трансфицированные клетки, человеческие клетки, и опухолевые клетки животных 2 Ламинарный шкаф II класса защиты
Человеческие клетки, инфицированные ретровирус- ными конструктами 3 Ламинарный шкаф II класса защиты
Вирус-иродуцирующис человеческие клеточные линии, клеточные линии, инфицированные амфит- ропными вирусами 3 Ламинарный шкаф II класса защиты
Образцы тканей и культуры, несущие известные человеческие возбудители 4 Ламинарный шкаф III класса микробиологической защиты с перчаточными карманами, фильтрованием воздуха и ловушкой для пат огенов в системе вентиляции воздуха
* Предлагаемый уровень защиты не является законодательным основой. Ознакомьтесь с принятыми на вашей
территорией нормами и правилами техники безопасности, а также с регулирующим законодательством прежде,
чем формулировать действующее у вас Руководство.
такие как сыворотка, в частности при получении их из
тех частей света, в которых имеется высокий эпидеми-
ческий уровень инфекционных болезней. Koi да наличие
инфекции подтверждено, вид микроорганизма опреде-
лит необходимый уровень защиты и соответствующие
меры иредос горожности, но koi да инфекционный агент
еще не определен, остается вероятность присутствия
в образцах возбудителей гепатита В, ВИЧ-инфекции,
туберкулеза и друi их еще не диа1 ностированных ин-
фекционных а|ентов. Требования конфиденциальнос-
ти часто запрещают проводить исследования на ВИЧ
без согласия пациента, и для большинства случайных
инфекций соответствующая информация может быть
недоступна. Если возможно, то биопсийный материал
должен исследоваться на присутствие возбуди гелей до
начала манипуляций с ним. Полномочия на проведение
таких работ необходимо подтвердить в соответствующей
форме, подписанной работником, занимающимся куль-
тивированием тканей (см., например,табл. 7.8). Однако
потребность получать образцы для работы как можно
быстрее приводит к тому, что культивирование начи-
нается без предварительного тестирования на наличие
возбудителей. С такими образцами следует обращаться
со всеми необходимыми мерами предосторожности:
1. Транспортируйте образцы в двойном контейнере
(им может быть универсальный контейнер или пу-
зырек с закручивающейся крышкой, находящийся
внутри второго сосуда с закручивающейся крышкой,
например в полипропиленовой банке). Контейнер, в
свою очередь, должен быть упакован в непрозрачный
пластиковый или водонепроницаемый бумажный
пакет, заполненный абсорбирующим материалом для
удержания внутри любых возможных протеканий.
В таком виде образец транспортируется в лаборато-
рию специальным курьером.
2. Заносите все образцы в инвентарную книгу в графу
«поступления» и распола|айте в специальном хо-
лодильнике. с нанесенным знаком «биолошческая
опасность».
3. Выполняйте иссечение и субкультивирование та-
ких тканей и культур в ламинарном шкафу II класса
защиты, предпочтительно расположенном в комна-
те, отдельной от общей площади .>|аборатории куль-
тивирования тканей. Такие меры минимизируют
риск распространения заражения друiих культур,
например, микоплазмами, а также ограничат круг
лиц, контактировавших с образцом, если будет
обнаружена его инфицированность.
4. При работе с такими образцами избегайте исполь-
зования острых и режущих инструментов (напри-
мер, шприцов, скальпелей, стеклянных Пастеров-
ских пинеток).
5. Помещайте все культуры в пластиковые коробки
с надписью или этикеткой, идентифицирующей
культуры как биологически опасные, с именем от-
ветственного лица и датой.
6. Сбрасывайте все стеклянные предметы, пииетки,
инструменты и т.д. в дезинфицирующий раствор
7.8. Биологическая опасность
135
Таблица 7.8. Форма информированного согласия донора
СОГЛАСИЕ НА ИЗЪЯТИЕ ТКАНЕЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ИССЛЕДОВАНИЯ
--------------------------------------------------------------------------------------------1
Данная форма требует вашего разрешения на получение образца вишен крови или одног о и более маленьких I
кусочков тканей для того, чтобы использовать их в медицинских исследованиях. Этот образец, или клеточная
линия, или продукты, полученные из них, могут быть использованы рядом различных исследовательских op- I
ганизаций, или они могут храниться в течение длительного периода, ожидая использовании. Возможно также, i
что образцы будут использованы какой-то коммерческой организацией для разработки новых лекарственных
греггаратов. Мы бы хотели, чтобы вы были осведомленны об этом и подтвердили факт осведомленности личной
ггодггггсью. Вы также должны быть осведомлены о возможном исследовании ваших тканей на присутствие ин- ।
фекцггонных агентов, таких как вирус СПИД или гепатит, на что вы подтверждаете согласие личной подписью |
данной формы.
Я готов предоставить ткани для использования в медицинских исследованиях и разработках. Я прочел гг понял
но мере своих способностей предоставленную мне информацию (если донор в слишком плохом состоянии здо-
ровья для того, чтобы поставить подпись, форму должны подписать его близкие родственники с соблюдением |
его интересов)
ФИО донора.........................ФИО родственника..............
Подпись............................................
Дата.......................................
Данный материал получит код, что гарантирует полную конфиденциальность. Ваше имя не будет известно
никому, кроме лггца, непосредственно берущего образец.
Хотите ли вы получать любую информацию об атом материале, касающуюся вашего здоровья? Да
Нет
Подпись............................Дата................................
Хотите или предпочитаете ли вы, чтобы эту информацию предоставили вашему врачу? Да
Нет
Если <Да» то имя врача.....................
Адрес врача.....................................................
илгг мешки для автоклавированггя биологически
опасных объектов.
Если соответствующие клинические дггаг ностичес-
кие тесты показывают, что материал не инфицирован,
стерилен и не содержит микоплазмы, он может куль-
тивироваться, как остальные культуры. Однако если
ггредполагается получить более чем 1x10®клеток пли
чистую ДНК, то следует посоветоваться с местным
комитетом по технике безопасности.
При обнаружении образца инфицирования он
должен быть уничтожен. Для этого его помещают в
двойной мешок для автоклавированггя биологически
опасных объектов вместе со всеми реактивами, которые
использовались при работес ним, с последующим авто-
клавированием или сжиганием. Инструменты и другие
твердые предметы помещают в контейнер с дезинфек-
тантом, замачивают, по крайней мере, на 2 ч и затем
автоклавируют. Если есть необходимость продолжать
работу с материалом, уровень защиты должен возрасти
соответственно категории возбудителя [Отдел CDC
гго здоровью и безопасности. 199$), (wu-w.cdc.gov/od;
ohs/biosafeiy/bmbl4/bmbl4loc.htm); Консультативная
комиссия гго Опасным Возбудителям, 2003, wzew.hse.
gov.uk/aboutus/meetings/acdp;].
7.8.4. Манипуляции с генетическим
материалом
На любые действия, связанные с изменением генети-
ческого состава клеток илгг клеточной линии, с которой
вы работаете, путем переноса нуклеиновой кислоты,
136
ГЛАВА 7. БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И ВАПИДАЦИЯ
должно быть получено разрешение местног о комите-
та но биоло! ической безопасности. Текущие нормы
и правила могут быть получены в США из подразде-
ления, занимающегося охраной окружающей среды
(NCI, NIH. Bldg 13, Room2W64, Bethesda, MD 20892)
(информация доступна также на сайте www.nci.nih.
gov/inira/resoutce.'biosafe.htm, а и Великобритании — от
Комиссии по охране здоровья и безопасности (www.hse.
gov.uk /hatsafety. gmo/index/htm).
7.8.5. Уничтожение биологически
опасных отходов
Материалы, потенциально биоло! цчески опасные,
должны подвергаться стерилизации до утилизации
(Национальный исследовательский совет, 1989; Кон-
сультативный комитет но здравоохранению, 1992]. Их
можно поместить в негерметпчно закрытые контейнеры
и поместить в автоклав либо залить стерилизующим
веществом, например i ипохлоритом. Существуют
различные дезинфицирующие растворы в виде жидких
концентратов (такие как Clorox u Chloros) или таблеток
(Precept Tablets) (см. приложение II). Рекомендуемые
концентрации зависят от местных норм и правил, но
приблизительные рекомендации обычно можно по-
лучить из инструкции пользователя, прилагаемой к
продукту производителем препарата. Гипохлорит часто
используют в количестве 300 ppm (частей на миллион)
активного хлора, но некоторые руководства требуют
2500 ppm активного хлора (разведение Chloros 1:20),
как рекомендовано в Howie Report (1978]. Гипохло-
рит эффективно действует и легко отмывается с тех
предметов, которые будут повторно использоваться,
но обладает высокой коррозийностью, в частности в
щелочных растворах. Он обесцвечивает одежду и даже
вызывает коррозию нержавеющей стали, поэтому при
работе с ним следует надевать перчатки и лаборатор-
ные халаты или фартуки. Емкости для замачивания и
цилиндры должны быть сделаны из полипропилена.
7.8.6. Дезинфекция окуриванием
Некоторые виды деятельности требуют, чтобы микро-
биолог ической бокс был полностью обработан после
использования. К таким видам относится работа с вы-
сокопагогеннымн микроорганизмами либо обработка
бокса перед сервисным обслуживанием. Дезинфекция
окуриванием или фумиг ация проводится с использо-
ванием паров формальдег нда. При этом бокс должен
быть отключен от электрической сети и закрыт до
начала фумигации, которую проводят при помощи
электроподогреваемого генератора. Ламинарный шкаф
включается на короткий период для циркуляции газа
и затем оставляется на 1 ч. После этого ламинарный
шкаф включают для продувания паров на ночь, затем
открывают переднюю панель на 10 мин. Фумигация
бокса может проводиться также при помощи перекиси
водорода (Bioquell), который легче рассеивается по
завершении обработки.
7.9. БИОЭТИКА
Кроме потенциальной биологической опасности работа
с тканями человека и животных связана с рядом эти-
ческих проблем, включая приобретение, последующие
манипуляции, а также отдаленные способы использо-
вания материала.
7. 9.1. Ткани животных
В большинстве стран, ведущих биомедицинские иссле-
дования, вводятся в действие или будут вскоре введены
законы, регулирующие использование эксперимен-
тальных или дру । их животных-доноров для получения
тканей. В основном эти нормы и правила относятся к
высшим животным, поскольку предполагается, что
они имеют достаточно высокоорганизованный мозг,
чтобы чувствовать боль и дистресс, и обычно не приме-
няются к низшим позвоночным, таким как рыбы, или
к беспозвоночным Считается, что высшие животные
становятся разумными со второй половины эмбрио-
нального развития, поэтому or раничения, связанные
с биоэтикой, накладываются на методы забоя или
методы обездвиживания и оперативного воздействия
в случаях, когда животное остается живым. Основные
требования направлены на минимизацию страданий
от боли и дискомфорта, причиняемых животным.
Существуют также ограничения, касающиеся содер-
жания животных и ухода за ними как в питомнике
и виварии в условиях эксперимента, так н в ветери-
нарной клинике в клиническом состоянии. В каждом
случае контроль осуществляется на местном уровне
комитетом по биоэтике и на уровне правительства
официально назначенным лицом. У каждой страны
свое законодательство, но при получении лицензии
для работы в любой стране первым шагом является
обращение в местный комитет ио защите животных и
биоэтике (АЕС) (US: www.biu.tcience.otg/guides/amm-
care/htm; UK: www.ebra.org. ‘tegulat/uk.html; www.mrc.
ac.uk/index/sitemap.htm: Использование животных в
научных исследованиях]
7. 9.2. Ткани человека
Требования при работе с человеческим материалом
отличаются от правил работы с тканями животных и
более сложны. Ткани должны быть получены в усло-
виях клиники опытным практикующим врачом, на-
ибольшую проблему представляет юридический аспект
забора тканей и выбор целей, для которых они будут
использованы. В этом случае до начала планирования
экспериментальных работ с тканями человека также
следует прежде всего обратиться в местную комис-
7.10. Валидация
137
сию но медицинской этике (НЕС), которая должна
решить, имеется ли достаточно причин и оправданны
ли расходы возможной прибылью. Взаимодействие с
НЕС следует осуществить на стадии планирования, по-
скольку большинство грант-образующих организации
до начала финансирования требуют предоставления
свидетельства этической комиссии о разрешении на
работу. Кроме того, существует вопрос собственности
на ткани и их производные ДНК, любые клеточные
линии, полученные из них, и любые продукты или
годные для продажи технологии, которые могут быть
в конечном итоге разработаны и проданы с получением
прибыли. В связи с этим необходимо:
1) до забора тканей для исследовательских целей сверх
клинически необходимых получить информирован-
ное согласие пациента или его родственников:
2) заполнить соответствующую письменную форму
(например, табл. 7.8), при составлении которой до-
нор или пациент- должен ясно понимать, для каких
целей будут исиользованы их ткани, такое согласие
должно быть письменно заверено;
3 ) разрешение родственников, если пациент находится
в слишком плохом состоянии, для тог о чтобы при-
нимать разумное решение,
4) подготовить краткое резюме, объясняющее в тер-
минах закона цели и задачи исследования, ход
эксперимента, ожидаемые результаты и прибыль, в
частности если они будут использованы для улуч-
шения качества медицинской помощи;
5) гарантировать конфиденциальность происхожде-
ния образца ткани;
6) определить собственника клеточной линии и ее
производных;
7 ) получить разрешение для проведения генетических
модификаций клеточных линий;
8) установить права пациента при взаимодействии с
любыми коммерческими лабораториями;
9) предоставить донору возможность оиределить,
должна ли генетическая информация ио образцу
тканей быть передана пациенту и/или врачу;
10) согласие донора на скрининг тканей на иредмет
присутствия возбудителей.
Самым иростым решением будет попросить донора
или его родственников подписать отказ от права соб-
ственности на ткани до того, как они будут извлечены;
в противном случае становится чрезвычайно затруд-
нительным юридический аспект собственности на
клеточные линии, которые в дальнейшем мог ут быть
иолучены, как и на любые дальнейшие бпофармацевти-
ческие аспекты использования этих клеточных линий,
их генов, и их продуктов. Предоставление генетичес-
кой информации, а также свидетельства о возможной
патологической инфекции, такой как ВИЧ. является
более сложной проблемой; в случае если иациенз
находится в больнице, эти данные рассматриваются
как часть диагностических исследований и предо-
ставляются на паритетных началах лечащему врачу. В
случае когда донор не госииталггзирован, вы должны
спросить его, заинтересован ли он она ознакомиться
с данными, которые будут вами получены, а также в
соавторстве при дальнейшем их использовании. Луч-
ше предоставить это врачу общей пракгики, который
лечит донора, путем подписания согласия в стандарт-
ной форме. Такая форма может быть предоставлена
местным комитетом ио биомедицинской этике, либо
составляется (см. табл. 7.8) в сотрудничестве с Н ЕС
и другими заинтересованными организациями, таки-
ми как клинические лаборатории, группа иоддержки
пациента, и организации, иредоставляющие финанси-
рование работ. Дальнейшая информация может быть
иолучена в рубрике Научно-исследовательская этика
на сайте www.bioelhics.gov/topics/oiher_index.htnil, а
также в рубрике Человеческие ткани: Этические и
юридические вопросы на сайте incw.niiffieldhioelhics.
org. 'home.'. Кроме того, следует обращаться в Совет ио
медицинским исследованиям Великобритании и Все-
мирную организациюздравоохранения [Рекомендации
ио работе для этических комитетов, которые курируют
биомедицинские исследования!. В Великобритании
при формировании нового комитета ио биомедицинс-
кой этике либо у существующего комитета возникает
необходимость в совете и консультации, следует об-
ращаться в Центральный офис исследовательского
этического комитета (COR ЕС) www.corec.org.uk/
Наиболее противоречивым аспектом процедуры
получения информированного согласия может ока-
заться предоставление информации для донора, про-
изводимое для того, чтобы он знал, с какой целью и как
будут использованы его ткани. Для этого требуется в
кратком виде в юридических терминах предоставить
содержание работы так. чтобы не смутить и не привести
в замешательство. Трансплантация тканей имеет ясные
цели, поэтому достаточно небольшого объяснения, но
некоторые методы и вопросы, такие как исследование
нарушений передачи клеточного сигнала в трансфор-
мированной клетке, потребуют некоторог о обобщения
и упрощения общей концепции. Часто объяснение в
простых терминах, данное устно, воспринимается легче,
чем подробное описание. Однако устное представление
тоже должно прозвучать с использованием юридичес-
ких терминов, с акцентом на потенциальный выигрыш,
указанием этических аспектов, таких как иолучение
генетической информации, трансплантация клеток
другому лицу после тканевой инженерии.
7.10. ВАЛИДАЦИЯ
Правильное использование клеточных линий, в ком-
мерческих или исследовательских целях, требует
подтверждения истинности (валидации). В промыш-
ленных условиях в юридические обязанности произво-
дителя входит то, что окончательный продукт должен
быть принят Федеральным управлением ио контролю
качества продуктов и лекарственных средств (FDA) в
США либо Национальным институтом качества кли-
нических исследований (NICE) в Великобритании. Од-
нако в академических исследовательских лабораториях
138
ГЛАВА 7. БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И В А ПИД АЦИЯ
требования могут быть менее жесткими и обязательства
по использованию клеточных линий ложатся на со-
весть исследователя. Несмотря на это, использование
клеточных линий, не прошедших валидацию, снижает
ценность результатов и возможность повторения их
друг ими исследователями
Существует три основных этапа валидации:
1) Подтверждение аутентичности: является ли клеточ-
ная линии тем, чем она заявлена?
2 ) Происхождение: что произошло с клеточной линией с
тех пор, как она была выделена из первоисточника?
3) Исследование на зараженность: свободна ли клеточ-
ная линия от заражения всеми известными формами
бактериальных возбуди гелей?
торая будет дополняться по мере ведения этой линии.
Это означает, что при работе необходимо регулярно
вести в правильной форме соответствующие записи
(см. разд. 12.3.11, 13.7.8, 20.3.6), в которых подробно
описаны рутинные манипуляции, важные экспери-
ментальные наблюдения, замораживание и хранение.
Это не должно быть очень трудоемким процессом,
поскольку использование крупноформатных таблиц
и компьютерных баз данных позволяет вводить новые
данные (вновь полученные или изменившиеся) без пов-
торного набора информации на клавиатуре. Клеточная
линия с хорошим подробным описанием происхожде-
ния приобретает такую же ценность, как антикварная
мебель или произведение искусства.
7.10.1. Подтверждение аутентичности
Для определения специфического профиля клеточной
линии имеется несколько методов (см. разд. 16.6).
Наилучшие из них включают ДНК-фингерпринтинг
и изучение ирофгыя ДНК, однако при этом требуется,
чтобы, во-первых, донор предоставил свою ДНК в ка-
честве стандарта либо, во-вторых, чтобы сохранилась
ДНК ранних стадий ведения этой линии, когда ее аутен-
тичность была несомненна. Иначе ириисхождение (вид
животного, тип ткани; см. разд. 16.3) ггри отсутствии
обоснованного сомнения может приводиться на основе
компиляции нескольких характеристик. Следует пом-
нить, что один гоги более используемых критериев мо-
г ут подходить гг быть специфичными для лаборатории,
в которой эта куль гура ведется, но недостаточными для
другой лаборатории, если происходит экспорт клеточ-
ной линии. Важным аспектом является то, что до того,
как будут израсходованы силы, время гг средства на
экспериментальную работу, должны быть предприняты
некоторые шаг и для подтверждения аутентичности кле-
точной линии, на которой предполагается проведение
экспериментов.
7.10.2. Происхождение
Частью ироцесса валидации является ведение под-
робных записей, свидетельствующих о том, откуда
была выделена клеточная линия, что с ней произошло
с момента выделения, каковы условия ее культивиро-
вания и пассирования, когда проводились проверки
на зараженность, если имели место попытки декон-
таминации, то какие и когда, какие свойства линии
были обнаружены, какие генетические модификации
проводились, какие произошли спонтанные изменения
и т.д. Некоторые сведения о происхождении клеточной
линии, полученные из литературы илгг устно со слов
коллег, обусловливают выбор данной линии, однако
должна существовать независимая документация, ко-
7.10.3. Контаминация
Как бы иодробно вы ни вели записи, как бы четко ни
соблюдали методику, ценность ваших данных будет ут-
рачена или, гго крайней мере, значительно снижена, если
обнаружится, что линия заражена одним или несколь-
кими возбудителями. В случаях, когда контаминация
налицо, клеточная линия уничтожается. Однако иногда
воирос о чистоте линии остается неясным, если:
1) клеточные линии ведутся с использованием анти-
биотиков (см. разд. 19.3);
2) не проводились стандартные исследования на пред-
мет заражения микоплазмами;
3) нет стандартных методов, позволяющих обнаружить
заражение, например, некоторыми вирусами или
прионами (см. разд. 19.3.6).
Заражения можно избежать:
1) путем сгкьтюдения правильной асептической техни-
ки (см. гл. 6);
2) гголученггем клеточных линий из достоверных ис-
точников, например из банка клеток;
3) культивированием клеток в отсутствие антибио-
тиков, хотя бы не постоянно, а лишь часть времени
(см. разд. 13.7.7);
4 ) регулярным скринингом на м икоплазмы (окраска гго
Hoechst 33258 обнаружит любые ДНК-содержагцие
организмы, достаточно большие для того, чтобы
быть обнаруженными при помощи флюоресцент-
ного микроскопа) (см. протокол 19.2); или
5) путем скрининга на большинство общеизвестных
вггрусов с использованием ПЦР или коммерческих
контрактов с друг ими организациями
Клеточные линии, которые ирошли соответству-
ющую валидацию, должны храниться в жидком азоте
и выдаваться конечному потреби гелю гго требованию.
Конечный потребитель может хранить свои запасы в
ходе выполнения ироекта, но, поскольку его основные
линии не прошли валидации, они не должны пере-
даваться гг новые потребители должны обращаться к
источнику, имеющему валидированные линии.
Глава 8
ПОСУДА И СУБСТРАТЫ
ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
8.1. СУБСТРАТ
8.1.1. Прикрепление и рост клеток
Большинство клеток позвоночных, культивируемых
in vitro, растут в виде mdhdCjkih на искусственном
субстрате. Следовательно, субстрат должен иметь
правильный заряд, чтобы позволить прикрепиться
клеткам или, ио крайней мере, сорбировать факторы
клеточной адгезии, которые, в свою очередь, даду?
возможность клеткам прикрепиться и распластаться.
Несмотря на то что спонтанный рост в суспензии
ограничен ли ниями гемопоэтических клеток, асцит-
ных опухолей 1рызунов и небольшим количеством
некоторых других выведенных линий, как, например,
мелкоклеточного рака ле| кого человека [Carney et al.,
1981 J, mhoi ие трансформированные клеточные линии
можно заставить расти в суспензии и не испытывать
зависимости от поверхностного заряда субстрата. Одна-
ко большинству нормальных клеток для размножения
требуется распластывание на субстрате [Folkinan &
Moscona, 1978; Ireland et al., 1989; Danen & Yamada,
2001J, а неполноценное распластывание из-за слабой
адгезии или высокой плотности посева ишибирует
пролиферацию. Клетки, которым требуется прикреп-
ление для дальнейшего роста, называются субстрат-
зависимыми; клетки, которые подвер|аются процессу
трансформации, быстро становятся субстрат-незави-
симыми (см. разд. 18.5.1) и приобретают способность
расти в суспензии (см. разд. 13.7.4) в жидкой среде при
перемешивании или поддерживать суспензионный рос?
в полутвердой среде, такой как агар.
8.1.2. Материалы
Стекли. Стекло было первым субстратом благодаря
своим оптическим свойствам и поверхностному за-
ряду. Однако в настоящее время стекло заменено в
большинстве лабораторий на синтетический пластик
(обычно иолистерол), который обладает большей плот-
ностью и лучшими оптическими характеристиками.
Сейчас стекло используется редко, хотя оно является
дешевым, ле1Ко моется, не утрачивая при этом под-
держивающих клеточный рост свойств. Обработка
сильными щелочными растворами (NaOH или едкими
детергентами) делает стекло непригодным для культи-
вирования до тех пор, пока поверхность его не будет
нейтрализована кислотой (см. разд. 11.3.1).
Одноразовый пластик. Одноразовые стерильные
флаконы из полистирола представляют собой простой,
воспроизводимый субстрат для культивирования. Они
обычно обладают хорошими оптическими свойства-
ми, а поверхность является достаточно плоской для
перевиваемых монослой ных культур с равномерным
ростом. Промышленно произведенный полистирол
является i идроф<юным субстратом, к которому клетки
не способны прикрепиться, поэтому культуральный
пластик обрабатывают коронным разрядом, гозораз-
ряднпй плазмой, у-радиацией или же химическими
стентами для формирования заряженной смачиваемой
поверхности. Так как качество конечной) продукта мо-
жет зависеть от производителя, образцы, полученные
из нескольких источников, необходимо тестировать
для определения скорости роста и эффективности
раиластывания клеток (см. протоколы 21.7—21.10) в
соответствующей среде, содержащей оптимальные и
иолуоитимальные концентрации сыворотки или на
бессывороточной среде. (Высокие концентрации сы-
воротки могут маскировать дефекты пластика.)
Несмотря на то что полистирол является наиболее
широко используемым и дешевым пластмассовым
субстратом, клетки также могут расти на поливинилхло-
риде (PVC), поликарбонате, поянтетрафторретилене
(PTFE; Teflon), Melinex, Thermanox (ТРХ) и на ряде
дру। их пластмасс. Для тестирования нового субстрата
необходимо вырастить на нем клетки в виде равно-
мерного монослоя при Ha.'iu4iiu и отсутствии предва-
рительной обработки поверхности (см. разд. 8.4.1), а
затем клонировать их (см. протокол 21.10). РТЕЕ может
использоваться как в заряженной (i идрофильной), так
и в незаряженной (i идрофобной) формах [Janssen et al.,
2003: Lehle et al.. 20031, заряженная форма может быть
использована для обычных монослойных и органотиии-
ческих культур (Biopore, Millipore; Transwell, Corning),а
незаряженная — для мак|юфагов [von Briesen et al., 1990]
u некоторых трансформированных клеточных линий.
8.2. ВЫБОР СОСУДОВ ДЛЯ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
Некоторые типичные сосуды для культивирования
приведены в табл. 8.1. Предполагаемое максимальное
140
ГЛАВА 8. ПОСУДА И СУБСТРАТЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
Таблица 8.1. Характеристики культуральных сосудов
Культуральный сосуд Количество Рабочий объем, мл Площадь поверхности, смг Приблизительное количество клеток (HeLa)
Мною луночные планшеты
Микротптровальныс 96 0,1 0,3 1x10’
Микротитровальныс 144 0,1 0,3 1x10’
4-луночныс 4 2 2 5x10’
6-луночныс 6 2 10 2х106
12-луночныс 12 1 3 7,5x10’
24-луночныс 24 1 2 5x10’
Чашки Петри
3,5 см в диаметре 1 2 8 2x10е
5 см в диаметре 1 ' 17,5 4x10е
6 см в диаметре 1 5 21 5xl0R
9 см в диаметре 1 10 49 lxl0R
Флаконы
10 см2 (Т10) 2 10 2xl0R
25см2(Т25) 1 5 25 5x10R
75 см2 (175) 1 25 75 2x107
175 см2 (Т175) 1 75 175 5x107
225см*(Т225) i 100 225 6х107
Роллерные бутыли 1 200 850 2,5x10”
Бутыли с перемешиванием
500 мл (без ирпбулькпвання) 1 50 5хЮ7
5000 мл (с цробулькпванцем) 1 4000 4x103
количество клеток линии HeLa рассчитывается для
каждого типа сосуда: количество полученных клеток
ограниченной клеточной линии (например, диплоидных
фибробластов) будет составлять около одной пятой
от количества HeLa. Определяющими факторами при
выборе культуральной посуды являются: 1) требуемое
количество клеток; 2) характер роста культуры — суспен-
зионный или прикрепленный; 3) необходимость в аэра-
ции или герметизация культуры; 4) порядок забора об-
разцов; 5) характер анализа культуры и 6) стоимость.
8.2.1. Клеточный выход
в культуральном сосуде
Для монослонных культур количество клеток пропорци-
онально площади поверхности флакона (рис. 8.1). Для
малых объемов и выращивания культуры для парал-
лельных исследований (опытов) наилучшим образом
подходят мноюлу ночные планшеты (рис. 8.2), которые
метут иметь большое количество маленьких лунок (как,
например, многолуночные планшеты для микротитра-
ции на 96 и 144 лунки, 0,1 0,2 мл среды и площадью
ростовой поверхности — 0,25 см- или 24-л у ночные
«кластерные чашкит* с рабочим объемом среды 1—2 мл
на каждую лунку и поверхностью для роста — 1,75 см2)
вплоть до 4-лу ночных плашек с диаметром в 5 см2 и объ-
емом культуральной среды 5 мл (см. табл. 8.1). Обычно
используют как чашки Петри, так и флаконы в диапа-
зоне размеров от 10 см2до 225 см2 (рис. 8.4). Флаконы,
как правило, маркируют соишсно площади рабочей
поверхности (например, 25 см2или 175 см2, а инет да Т25
или Т175 соответственно), в то время как чашки Петри
обозначают но их диаметру (т.е. 3,5 см или 9 см).
Размеры стеклянных бутылей более разнообразны,
так как их производят и для фармацевтических целей.
Стеклянные бутыли должны иметь: 1) одну достаточно
плоскую поверхность; 2) высокую плотно завинчиваю-
щуюся крышку с нетоксичной прокладкой; 3) сражен-
ные плечи ребра для удобства сбора клеток монослия
после триисинизации и улучшения качества отмывки.
Если вам требуется получить большое количество
клеток (например, ~ 1x10sклеток HeLa карциномы
цервикального канала пли 2xlOKMCR-5 диплоидных
фибробластов человека), то увеличение размера и
количества обычных бутылей становится неудобным
и требуются специальные сосуды. Флаконы с |офриро-
ванной поверхностью (Corning, Becton Dickinson) или
многослойные флаконы (Corning, Nagle Nunc) позволя-
ют увеличить площадь поверхности для наращивания
клеток (рис. 8.5). При необходимости еще большего на-
ращивания культур используют мультниоверхностные
пропагаторы или роллерные бутыли на специальных
держателях (см. разд. 26.2.3). Повышение количес гва
клеток, растущих в суспензии, требует только увели-
чения объема среды при условии, что культура будет
аффективно перемешиваться и аэрироваться во всей
голще объема (см. разд. 26.1).
8.2. Выбор сосудов для культивирования клеток
141
Рис. 8.1. Количество клеток и площадь поверхности. Зависимость объема среды и конечною количества клеток от площади
поверхности культурального сосуда. График построен на основе объема среды для каждого размера сосуда и нс является ли-
нейным, так как существует тенденция к уменьшению пропорции рабочею объема среды по мерс увеличения объема сосуда.
Количество клеток рассчитано по объему среды и является приблизительным
Рис. 8.2. Многолуночные планшеты. 6-луночные, 24-луночные и 96-луночные (микротитровальныс) планшеты. Произво-
дятся планшеты с разным количеством лунок от 4 до 144 (размеры и объемы см. в табл. 8.1)
142
ГЛАВА 8. ПОСУДА И СУБСТРАТЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
Рис. 8.3. Чашки Петри. Демонстрируемые чашки имеют
диамшры 3,5 см, 5 см и 9 см. Также выпускаются квадратные
чашки Петри с размерами 9x9 см. Нанесенная на дно сетка
может облегчить сканирование чашки, например, при под-
счете колонии, однако стать помехой при автоматическом
подсчете
Рис. 8.5. Многопластинчатый флакон. Nunc Triple-Flask
с тремя рабочими поверхностями по 80 см2, которые засеи-
ваются одновременно. Несмотря на то что общая площадь
ростовой повсрхноск! 240 см2, пространство между плас-
тинами эквивалентно обычному флакону в 80 см2. Так как
объем газовой фазы уменьшен, такой флакон лучше всего
использовать с вентилируемой крышкой в С02-пнкубаторе.
(Фотография представлена с любезною разрешения Nagle
Nunc International)
Рис. 8.4. Пластиковые флаконы. Иллюстрируемые разме-
ры 10 и 25 см2 (Falcon, D-D Bioscicnccs), 75 см2 (Corning)
и 185 см2 (Nagle Nunc) (см табл. 8.1. для представления
размеров и объемов)
8.2.2. Суспензионная культура
Клетки, растущие и суспензии, moi ут культивироваться
в стерильных флаконах любого вида, в плашках или
чашках Петри, которые не требуют дополнительной
обработки дли обеспечения клеточной адгезии. Враща-
тельные бутыли используются в тех случаях, koi дадля
поддержания клеток в суспензии требуется постоян-
ная циркуляция среды. Такие сосуды имеют разные
размеры и изготавливаются обычно из стекла (Bellco,
Tec line). Перемешивание,как правило,осуществляется
Mai нцтным стержнем, приводимым в движение внеш-
ней Mai нитной мешалкой (рис. 8.6; см. также рис. 12.7
и 25.1). Скорость вращения должна поддерживаться
низкой, -60 об. /мин, во избежание действия на клетки
повреждающих центробежных сил. Обычно для мини-
Рис. 8.6. Маленькие флаконы е перемешиванием. Четыре
маленьких флакона с перемешиванием (Techno), вмсстимос ь
250 мл при объеме ростовой среды 50—100 мл на 4-мсстной
подставке для мешалок (Tcclinc) Также поставляются бу-
тыли большею объема вплоть до 10 л (см. так-ке рис 135.
26.1.262)
мизации центробежной силы определяющее значение
имеет форма ротора. Для постановки параллельных
опытов суспензионные культуры могут культиви-
роваться в отдельных сосудах, либо отбор образцов
производится повторно в разное время через боковой
рукав одного и топ» же сосуда. Подобные сосуды могут
также применяться для поддержания долге живущей
культуры путем последовательно! о обновления среды
(разд. 26.1.1).
8.2. Выбор сосудов для культивирования клеток
143
8.2.3. Вентилирование
Многолуночные планшеты и чашки Петре, приме-
няемые для выращивания образцов при проведении
параллельных опытов или клонировании, имени неза-
винчивающуюся свободную крышку для обеспечения
удобною доступа внутрь чашки. Следовательно, они
не герметичны и нуждаются в поступлении влажною
атмосферно! п воздуха с контролируемой концентра-
цией СО, (см. разд. 9.2.2). Так как ио окружности внут-
ренней поверхности крышки может формироваться
тонкая пленка жидкости, герметизирующая некоторые
чашки, то необходимо использовать вентилируемые
крышки со специальными опорными элементами
из формованною пластика (рис. 8.7). Б случае если
требуется полная герметизация, некоторые виды мно-
голуночных чашек можно оборачивать тонкой поли-
этиленовой пленкой (см. Плашечные герметизаторы.
Приложение II).
Флаконы могут вентилироваться за счет ослабления
закручивания крышки на один оборот для доступа СО2
в СО2-инкубаторе или, наоборот, для выхода избытка
СО, при выращивании клеточных линий, сильно за-
Рис. 8.7. Вентилируемые чашки Петри. Вентилируемая
чашка. Маленькие ребрышки, отдаленные друг от друга на
120°, приподнимают крышку над основанием и предотвра-
щают образование тонкой пленки жидкости, например от
конденсата в результате плотного закрытии крышкой, что
затрудняет газообмен
Рис. 8.8. Вентилируемые флаконы. Газопроницаемая крыш-
ка на флаконе 10 см2 (Falcon, В-D Bioseienccs)
кисляющих среду. Однако, для поддержания правиль-
но! о газообмена предпочтительнее все! о использовать
крышки с проницаемыми фильтрами (рис. 8.8) (не-
смотря на большую стоимость), так как они допускают
диффузию СО2 без риска контаминации.
8.2.4. Отбор и анализ проб
Мниюлуночные планшеты являются идеальной посу-
дой для рассева культуры для параллельных опытах,
koi да предпола! ается одновременный п однотипный
анализ всех образцов. Если, с другой стороны, есть
необходимость забора образцов в разное время, то
предпочтительнее использовать различные сосуды
(см. также разд. 21.8 и рис. 8.9). Отдельные лунки в
микротитровальных планшетах можно отбирать на
анализ путем вырезания и удаления только интересу-
ющею исследователя участка планшета вместе с ад-
гезивной крышкой, покрывающей выбранные лунки.
Альтернативой в этом случае являются выпускаемые
планшеты с удаляемыми вставными лунками для ин-
дивидуальною анализа (Nagle Nunc), при этом необхо-
димо убедиться, что рабочая поверхность этих лунок
обработана для обеспечения клеточной адгезии, если
вы работаете с субстрат-зависимыми культурами.
Микроскопическое исследование при малом уве-
личении ле! коосуществимо для культур, растущих во
флаконах, на чашках Петри и мноюлуночных планше-
тах при использовании инвертированною микроскопа.
Однако с применением фазового контраста moivt
возникнуть трудности при просмотре МНО1 ОЛУНОЧНЫХ
планшетов из-за малою размера мениска; даже при
просмотре 24-луночных планшетов удовлетворитель-
ный обзор на фазовом контрасте достш ается только
в центральной части лунки. Если микроскопический
анализ необходим при вашей работе с культурой, то
полезно использовать предметные стекла с ячейками
для культур (см. разд. 16.4.3 и рис. 16.3). Большие
роллерные бутыли проблематично просматривать на
некоторых микроскопах; как правило, необходимо
удалить конденсор, при этом настройка фазовою кон-
траста оказывается невыполнимой.
Если обработка образца предусматривает экстра-
кцию в ацетоне, толуоле, этилацетате или некоторых
apyi их органических растворителях, то возникает про-
блема растворения полистирола. Так как применение
органических растворителей часто связано с । истоло-
। и чески ми процедурами. Lux (Bayer, MP Bioniedicals)
поставляет устойчивые к действию растворителей
пластиковые покровные стекла Thermanox (ТРХ), ко-
торые пригодны для 1 истоло! ии и подходят по размеру
под ячейки стандартных мноюлуночных планшетов
(при этом совсем нет необходимости, чтобы сами
планшеты подходили для культивирования). Однако
данные стекла не обладают хорошими оптическими
свойствами и их следует монтировать на предметные
стекла клетками вверх, а затем покрывать стандартным
покровным стеклом.
144
ГЛАВА 8. ПОСУДА И СУБСТРАТЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
Рис. 8.9. Пузырьки и флаконы с закручивающимися крышками, (л) Стеклянные флаконы хорошо подходят для рассева
культуры для параллельных опытов или хранения образцов, особенно если пластик может нс выдержать последующего про-
цесса обработки образца. Закручивающиеся крышки предпочтиц-льнсс пробок из-за более низкой вероятности протекания и
лучшей защиты горлышка флакона ог контаминации (б) Сцинтилляционные пузырьки особенно необходимы для исследо-
вания включения радиоакт ивных изотопов, однако их нельзя снова использовать для культивирования после того, как в них
побывала сцинтилляционная жидкость
Для таких процедур, как горячая экстракция ДНК
хлорной кислотой, требуются стеклянные сосуды.
Прямосторонние пузырьки или колбы Эрленмейера
(без краевой кромки), используемые в сочетании с
i ермети^ирующей лентой или крышкой Oxoid, удоб-
ны в использовании и хорошо поддерживают влаж-
ную атмосферу с СО2. Традиционные стеклянные
сцинтилляционные флаконы, или «минифлаконы»,
также являются хорошими культуральными сосу-
дами благодаря плоскому дну. Однако даже после
однократного использования сцинтилляционной
жидкости такие флаконы становятся непригодными
для культивирования.
8.2.5. Неравномерный рост
Инотда бывает, что клетки спонтанным образом
неравномерно распределяются ио рабочей поверх-
ности сосуда. Вибрация, создаваемая открыванием
и закрыванием инкубатора, несовершенной работой
мотора или вибрацией оборудования, может вызвать
пертурбации культуральной среды, в результате че| о
возникает резонанс пли стоячие волны, которые, в
свою очередь, приводят к волнообразному характеру
монослоя (рис. 8.10) из-за неравномерной плотности
роста клеток. Исключение вибрации и минимизация
вторжения в инкубатор иомслут избежать неправиль-
ного роста. Помещение тяжелого груза на поддон или
бокс с платами и установка планшетов на пенопласт
может также облегчить решение данной проблемы
[Nielsen, 1989J. однако в большую проблему может пре-
вратиться мытье и стерилизация таких пенопластовых
прокладок, так как они имеют склонность к постоянной
контаминации.
Рис. 8.10. Случайный рост. Примеры гребневидного ха-
рактера роста, видимого в монослойных культурах в чашках
н флаконах, который, возможно, возникает в результате
разницы резонанса oi работы митра инкубатора или из-за
открывания и закрывания дверцы инкубатора. ГС любезного
разрешения Nagle Nunc )
8.2.6. Стоимость
Стоимость все|да нужно соотносить с прочими пре-
имуществами,* например, чашки Петри дешевле, чем
флаконы с эквивалентной площадью ростовой по-
верхности, однако требуют поддержания влажности
и контролируемого поддува СО2 и более подвержены
заражению. При этом они очень удобны для исследова-
ния и обработки. Дешевые бутыли из Na-силнкатного
стекла, хотя и не все|да обладают хорошими оптичес-
кими свойствами, часто оказываются лучше, чем стек-
ло высокого класса типа Pyrex или оптически чистое
стекло, которое обычно содержит свинец. Наибольший
недостаток использования стекла заключается в тру-
доемкости процесса подготовки к культивированию,
так как стеклянная посуда должна тщательно мыться
и заново стерилизоваться перед очередным исполь-
зованием. В большинстве лабораторий в настоящее
8.4. Обработка поверхности
145
время используется пластик благодаря его удобству,
оптической чистоте и качеству.
8.3. СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ
СИСТЕМЫ
8.3.1. Проницаемые подложки
Полупроницаемые мембраны применяются как газо-
проницаемые субстраты, а гакже дают возможность про-
никать воде и малым молекулам (<500—1000 Да). Это
свойство используется в некоторых крупномасштабных
биореакторах (см. разд. 25.3.2 и 26.2.6). Рост клеток на
водопроницаемом субстрате сиособст вует повышенной
диффузии кислорода. СО,и питательных веществ. При-
крепление клеток к естественному субстрату, такому
как коллаген, активирует регуляцию фенотипической
экспрессии благодаря взаимодействию интегриновых
рецепторов на поверхности клеток со специфическими
сайтами внеклеточного матрикса (см. разд. 3.2.1,3.2.3 и
17.7.3). Широкое использование приобрели натураль-
ные гели, такие как коллаген. Культивирование клеток
на коллагеновых плотиках [Michalopoulos и Pitot, 1975,
Lillie el al., 1980] использовалось для улучшения выжи-
ваемости эпителиальных клеток и стимуляции терми-
нальной дифференцировки (см. разд. 17.7.3 и 25.3.8).
Вставные филыпры. Проницаемость поверхности,
к которой прикрепляются клетки, может индуциро-
вать полярность клеток за счет симуляции базальной
мембраны. Такая полярность может оказаться жиз-
ненно необходимой для проявления функциональных
свойств секреторного Эпителия и mhoi их дру| их типов
клеток [Guinbiner & Simons, 1986; Chanibard el al.,
1987; Artursson & Magnusson, 1990; Mullin et al., 1997J.
Некоторые производители в настоящее время иос-
тав.>1яют проницаемые подложки в форме отдельных
фильтров, свободно вставляемых в лунки планшеты,
разных размеров, из разных материалов и с различным
диаметром пор (Costar, В-D Bioscoences, Millipore,
Nunc). Также производятся подложки, покрытые
коллагеном, ламинином или друi ими матрикснымн
материалами (например, Матрипель, В-D Biosciences).
Все перечисленные виды подложек широко исиользу -
ются для изучения межклеточных взаимодействий и
взаимодействии с матриксом клеток, для исследования
дифференцировки и полярности, а также трансэиите-
лиальной проницаемости (см. разд. 25.3.6).
Полые волокна. Knazek el al. [1972J разработал
технику выращивания клеток на внешней поверх-
ности пучков пластиковых капилляров (рис. 8.11;
разд. 23.3.2). Пористый пластик дает возможность диф-
фундировать ни гательным веществам и растворенным
газам из среды, перфузируемой через просвет капилля-
ра. Находясь на внешней стороне капиллярных трубок,
клетки растут как бы на разных уровнях но отношению
дру । к другу, имитируя тканевую целостность. Полые
Рис. 8.11 Культивирование на полых волокнах. Пучок по-
лых волокон т проницаемого пластика заключен в прозрач-
ную пластмассовую внешнюю камеру с обеспечением доступа
к клеткам через один из двух боковых рукавов. В ходе куль-
тивирования камера перфузируется вплоть до центра полых
капилляров через соединения, ирп крепленные к обоим концам
камеры (CellMax, Spectrum Labs; см также рис. 26 6)
волокна также используются в крупномасштабных
биореакторах (см. разд. 26.2.6).
8.4. ОБРАБОТКА ПОВЕРХНОСТИ
8.4.1. Покрытие матриксом
Кондиционирование. Клеточную адгезию и рост можно
усилить путем предварительной обработки субстрата
[Barnes el al., 1984аJ. Любому профессионалу в области
культуры ткани известен тот факт, что однажды исполь-
зованная для культуры стеюшнная посуда лучше обеспе-
чивает рос г клеток, чем новая. Если это так, то, возможно,
это происходит за счет травления поверхности или
присутствия следовых остатков веществ после куль-
тивирования. Выращивание клеток во флаконах также
улучшает поверхность для повторного посева, и конди-
ционирование такого типа, ио-видимому, происходит за
счет коллагена, фибронектина или дрхт их компонентов
матрикса [Crouch et al., 1987J, продуцируемых клетками.
Субстрат также может быть кондиционирован путем
его обработки уже использованной средой от другой
культуры [Stamper el al.. 19801,сывороткой, очищенным
фибронектином или коллагеном (см. протокол 23.9).
Полилизин. McKeehan и Наш [ 1976а[ предложили
покрывать поверхность пластиковых чашек поли-
D-jih3uhom в концентрации 1 mi мл перед клониро-
ванием в отсутствие сыворотки (см. разд. 14.2.1), так
что некоторые эффекты кондиционирования ростовой
поверхности могут быть связаны с ее зарядом.
Коллаген и желатин. Обработка денатурирован-
ным коллагеном улучшает прикрепление mhoi их типов
146
ГЛАВА 8. ПОСУДА И СУБСТРАТЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
клеток, таких как эпителиальные, а неденатурирован-
ный гель может быть необходим для поддержания
дифференцированного фенотипа (см. разд. 3.2.3,17.7.3,
23.2.1). Покрытие желатином оказалосыюлезным при
культивировании мышечных [Richlerand Yaffe, 1970]
и эндотелиальных клеток [Folkman et al., 1979] (см.
разд. 23.3.6) и необходимым для некоторых мышиных
тератом. Для создания покрытия денатурированным
коллагеном используют коллаген из сухожилий крыси-
ных хвостов или коммерчески поставляемых аналогов
(например, Vitrogen). Раствор коллагена наливают на
поверхность планшета, удаляют его избыток и высу-
шивают. Так как описанная процедура иногда при-
водит к откреплению коллагенового слоя в процессе
культивирования, то Macklis el al. [1985] разработали
протокол, гарантирующий крепкое связывание колла-
гена с субстратом за счет поперечного сшивания его с
пластиком с помощью карбодиимида Коллаген также
может использоваться в сочетании с фибронектином
(см. протокол 23.9).
Коллаген можно применять и в форме неденатури-
рованного 1 еля (см. разд. 17.7.3). Такой тип субстрата,
как было показано, поддерживает рост аксонов спи-
нальных! англиев цыпленка [Ebendal, 1976], морфоло-
1 ическую дифференцировку клеток молочной железы
[Nicosia and Ottinelli, 1990; Berdichevsky et al., 1992]
и гепатоцитов [Sattler et al., 1978; Fiorino el al., 1998],
а также стимулирует проявление тканеспецифичных
свойств ряда друшх клеток in vitro [ Maas-Szabo wski
et al., 2002] (см. разд. 23.1.1). Разведение концентри-
рованного коллагена 1:10 культуральной средой и
нейтрализация до pH 7.4 превращают коллаген в гель
так что разведение и распределение такого раствора
должны происходить быстро. Лучше всего добавить
ростовую среду к гелю еще на 4—24 ч, чтобы достичь
равновесного состояния геля со средой перед внесени-
ем клеток. На этой стадии также мшут быть добавлены
в среду фибронектин (25—50 mki/мл) или ламинин
(1—5 мК1 мл) или их сочетание
Матригель. Коммерчески производимые вне-
клеточные матриксы, такие как Матригель (Becton
Dickinson) из саркомы Engelbrelh-Holin-Swann (EHS),
содержат ламинин, фибронектин и протеогликаны с
превалированием ламинина (см. также разд. 17.7.3).
Дру 1 ие варианты коммерческих продуктов включают
Proneclin F (Protein Polymer Technologies), лами-
нин фибронектин, витронектин (В-D Biosciences,
Biosource International), энтактин (US Biological),
гепаран сульфат, EHS Natrix (В-D Biosciences), ECL
(US Biological), Cell-tak (В-D Biosciences). Некоторые
из этих продуктов очищены, если не полностью хи-
мически определены; другое же представляют собой
смесь компонентов внеклеточного матрикса, слабо
охарактеризованных и, возможно, содержащих свя-
занные факторы роста. Если адгезия клеток является
необходимым условием их выживания, а некоторые
из субстратов неполноценны, то использование таких
матриксов приемлемо, но если проводятся механис-
тические исследования, то матригель может быть
использован только как промежуточный этап на пути
к полностью детерминированному субстрату.
Внеклеточный матрикс. Несмотря на то что
инертное покрытие поверхности может быть вполне
достаточным, все же ино1да оказывается необходимым
использование монослоя подходящего типа клеток
для формирования приемлемого матрикса с целью
поддержания некоторых специализированных клеток.
Gospodarowicz с соавторами [1980] сумели вырастить
эндотелий на внеклеточном матриксе (ВКМ) из-под
конфлюентного монослоя клеток линии ЗТЗ, удален-
ных тритоном Х-100. Этот остаточный ВКМ также
был использован для стимуляции дифференцировки
ранулезных клеток яичника [Gospodarowicz et al..
1980] и для исследования поведения опухолевых кле-
ток [Vlodavsky etal., 1980].
ПРОТОКОЛ 8.1. Приготовление ВКМ
Схема
Удалить детергентом конфлюентный монослой кле-
ток, продуцирующих матрикс, отмыть флакон или
чашку и посадить требуемые клетки на остаточный
матрикс.
Материалы
Мышиные фибробласты, например ЗТЗ, фибро-
бласты MCR-5 человека или эндотелиальные
клетки легочной артерии теленка (или другея
подходящая клеточная линия, известная своей
способностью к наращиванию внеклеточного
матрикса)
• Стерильная вода высокой ст епени очистки (ВСО)
(см. часть 11.4.1)
• Тритон Х-100.1% раствор в ВСО
Протокол
1. Посади те культуру, продуцирующую матрикс, и
выращивайте ее до конфлюентного монослоя.
2. Через 3—5 дней на стадии смыкания монослоя
удалите среду и внесите в культуру равный объем
стерильного раствора Тритона Х-100 в ВСО.
3. Инкубируйте 30 мин при 37 °C.
4. Удалите раствор Тритона Х-100 и трижды
промойте остатки матрикса таким же объемом
стерильной ВСО.
5 Флаконы или чашки можно использовать сразу пос-
ле отмывки или же хранить при 4 °C до 3 недель.
8.4.2. Фидерные слои
Несмотря на то что покрытие матриксом может
способствовать прикреплению, росту и дифферен-
8.4. Обработка поверхности
147
цировке, некоторые культуры более прихотливых
клеток, особенно растущие в низкой плотности, тре-
буют поддержки живых клеток (например, мышиных
эмбриональных фибробластов; см. протокол 13.3).
Необходимость такого воздействия обусловлена,
в частности, необходимостью обогащения среды и
удаления продуктов метаболизма, а также секрецией
факторов роста фибробластами, но также может быть
вызвана кондиционированием субстрата клеточными
продуктами. Фидерные слои, выросшие в виде кон-
флюентного монослоя, мсиут сделать поверхность
подходящей и даже селективной для прикрепления
дру1 их клеток (см. разд. 14.2.3,24.7.2 и протоколы 23.1,
23.4). Жизнеспособность и рост аксонов центральных
и периферических нейронов можно повысить за счет
культивирования нейронов на монослое 1лиальных
клеток, хотя в этом случае эффект скорее обусловлен
результатом действия растворимых факторов, чем
непосредственных клеточных контактов [Seifert &
Muller, 1984].
После достижения конфлюентною монослоя
дальнейшая пролиферация заставляет клетки от-
крепляться от искусственного субстрата и мигриро-
вать над поверхностью монослоя (рис. 8.12). Может
поменяться морфолоюя клеток: клетки становятся
менее распластанными, более высокодифференци-
рованными и интенсивнее окрашиваются. Очевидно,
и не слишком удивительно то, что взаимодействие
клеток с клеточной подложкой от личается от гакового
с синтетическим субстратом. Первое может изменять
морфолошю клеток и уменьшать их пролифератив-
ный потенциал.
8.4.3. Трехмерные матриксы
Очевидно, что мшиие функциональные и морфоло1и-
ческие характеристики исчезают в ходе субкультиви-
рования в результате утраты тканевой архитектоники
и межклеточных контактов (см. разд. 3.4.2). Эти недо-
статки явились стимулом к апробированию трехмер-
ных матриксов, таких как кодлагеновый гель [Douglas
et al., 1980], целлюлозный сионж (как таковой или с
колла! еновым покрытием) [Leighton el al., 1968| или
пенный гель Gelfoain (см. разд. 25.3.1). Фибриновый
С1усток служил одной из первых сред, использованных
для первичной культуры, и до сих пор используется
либо в виде необработанных сгустков плазмы, либо в
виде очищенного фибриногена в смеси с тромбином.
Обе системы формируют трехмерный гель, в котором
Рис. 8.12. Морфология фидерных слоев. Морфо jot ические изменения клеток, растущих на фидерных слоях Фибробласты
рака молочной железы че ювека (а), растущие на пластике и (б) растущие на конфлюентном фидерном слое человеческих
эмбриональных интерстициальных клеток Эпителиальные клетки рака молочной железы человека, растущие (в) на плащике
н (г) на том же самом конфлюентном фидерном слое, как в (б)
148
ГЛАВА 8. ПОСУДА И СУБСТРАТЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
клетки могут мигрировать и расти на ранице твердой
поверхности и геля или непосредственно внутри геля
[Leighton, 1991].
Трехмерные ма гр иксы широко используются в
тканевой инженерии и могут быть неорганическими,
как фосфат кальция или же органическими, как Gel-
foam (см. разд. 25.3.8). Помимо индукции клеточной
адгезии, пролиферации и дифференцировки, такие
матриксы, или каркасы, также должны быть дегради-
руемыми in vivo с последующим замещением эндоген-
ным матриксом.
Микроносители, произведенные из полистирола
(Nugle Nunc), сефадекса, полиакриламида и коллагена
или желатина, поставляются в форме бусин и предна-
значены д;1я размножения субстрат зависимых клеток в
суспензии (см. разд. 26.2.4 и Приложение II). Несмотря
на трехмерность самих микроносителей, функцио-
нально культура клеток на них представляет собой
двухмерный монослой, модифицированный радиусом
кривизны бусины. Однако некоторые микроносители
являются пористыми (см. разд. 26.2.4), в биореакто-
рах также используются пористые микробусины (см.
разд. 26.2.5). Клетки растут в промежутках толщи мат-
рикса в обоих типах бусин. Трехмерный рост в бусинах
из алыината происходит скорее путем инкапсуляции,
чем иенетрации матрикса (см. разд. 25.3.5), давая воз-
можность тесному развитию межклеточного взаимо-
действия и облегчая дифференцировку у хондроцитов
(см. протокол 23.16) и нейронов (см. протокол 25.3),
и используется для увеличения выработки антител
|ибрндомами [Zimmerman el al., 2003].
8.4.4. Металлические субстраты
Клетки способны расти на дисках из нержавеющей ста-
ли [Birnie & Simons. 1967] или друшх металлических
поверхностях [Lilwin, 1973]. Визуальный контроль
клеток, растущих на светонепроницаемом субстрате,
требует поверхностной интерференционной микро-
скопии, за исключением случаев использования очень
тонких металлических пленок. Westermark [1978]
разработал метод выращивания фибробластов и глии
на палладии. Применив электронномикросконическое
оборудование, используемое для напыления металлов
на образцы для создания реплик, он сформировал ос-
тровки палладия на агарозе, которая не дает клеткам
прикрепляться в жидкой среде. Размер и форма остров-
ков определялись рельефными участками, созданными
фототравлением, а палладий напылялся в вакуумной
камере, как это осуществ.>1яется в электронной микро-
скопии. Так как слой палладия под клетками был очень
тонким, он оставался прозрачным и не препятствовал
визуализации.
8.4.5. Неадгезивные субстраты
ИнО| да прикрепление клеток является нежелательным.
Отбор колоний клеток, трансформированных вирусом,
независимых от прикрепления, может быть достш нут
путем культивирования клеток в агаре [Macpherson
& Monlagnier, 1964], гак как нетрансформированные
клетки спонтанно не формируют колоний в таком
матриксе. Существуют два принципа, соблюдаемых
в такой системе: 1) предотвращение прикрепления
к поверхности флакона, где должно происходить
распластывание и зависимый от прикрепления рост,
и 2) иммобилизация клеток таким образом, чтобы
дочерние клетки оставались связанными с колонией,
даже если они являются субстрат независимыми. Наи-
более часто используются агар, агароза или Methocel
(метилиеллюлоза с вязкостью 4000 cP) (см. разд. 14.3).
Первые два представляют собой гели, а третий — золь
с высокой вязкостью. Так как Methocel является зо-
лем, то клетки постепенно будут осаждаться в нем. По
этой причине он обычно используется с подложкой из
aiapa(c-M. протокол 14.5). Посуда, не предназначенная
для клеточных культур, может быть использована
без агара, однако и в этом случае может происходить
прикрепление и распластывание незначительно!о
количества клеток
Глава 9
СРЕДЫ ОПРЕДЕЛЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО
СОСТАВА И ДОБАВКИ К СРЕДАМ
9.1. СОСТАВЛЕНИЕ СРЕД
В ранних исследованиях для культивирования клеток
использовали природные среды на основе тканевых
экстрактов и естественных жидкостей оргонизма,
таких как экстракт куриною эмбриона, сыворотка,
лимфа и т.д. С распространением клеточных линий
потребность в большем количестве сред стандартного
однородного качества привела к внедрению сред с
химически точным определенным составом, основан-
ным на анализе естественных жидкостей opi анизма и
биохимии питательных веществ. Базовая среда Игла
[Eagle, 1955] и впоследствии минимальная среда Илла
(MEM) [Eagle, 1959] получили широкое распростране-
ние, с различными вариантами добавления сывороток
теленка, лошади или человека, белковых i идролнзатов
и эмбриональных экстрактов. Так как к тому времени
уже было получено большее количество постоянных
клеточных линий (L929, HeLa и др.), стало очевидно,
что эти среды хорошо подходят для большинства кле-
точных линий, и целью mhoi их успешных исследова-
ний были попытки замены сыворотки (см. разд. 10.2),
оптимизация сред для различных типов клеток (на-
пример, для лимфобластондных линий клеток была
разработана среда RPMI 1640), или модификация
сред для специфических условий культивирования
(например, среда Лейбовица L15 была разработана для
культивирования клеток в отсутствие СО, и NaHCO,)
[Leibovitz, 1963].
Для выделения и наращивания клеток специфичес-
кого происхождения может потребоваться селективная
бессывороточная среда (см. разд. 10.2.1), в то время как
для наращивания клеток для заражения их впослед-
ствии вирусами или для молекулярных исследований,
независящих от специфичности клеток, подходят среда
И1ла MEM [Eagle, 19591, среда Hi ла в модификации
Дюльбекко DMEM [Dulbecco & Freeman, 1959] или,
все чаще, RPMI 1640 [Moore et al., 1967], в которые
добавляется сыворотка. Однако сейчас многое про-
мышленные технолш ии используют бессывороточные
среды для того, чтобы упростить процесс и снизить
риск контаминации случайными инфекционными
агонтами (см. разд. 10.1). Популярным компромиссом
для mhoiих лабораторий стала смесь сложных сред,
таких как среда Хэма Ham’s F12 [Ham, 1965] с одной
из сред, содержащей повышенные концентрации ами-
нокислот и витаминов, таких как DMEM. Этот вариант
может шокировать сторонников использования сред с
постоянным составом, но он позволил создать полезные
многоцелевые среды, пригодные как для первичных
культур, так и для поддержания клеточных линий.
Эта 1лава посвящена основным принципам состав-
ления сред. Б качестве примера используются широко
применяемые среды, требующие добавления сыворот-
ки. Глава 10 посвящена разработке и использованию
бессывороточных сред.
9.2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
9.2.1. pH
Большинство клеток хорошо растут при pH 7,4. Хотя
оптимальные значения pH варьируют в относительно
небольшом диапазоне для разных клеточных линий,
некоторые нормальные фибробласты лучше растут при
pH 74 7 7. в то время как для трансформированных
клеток оптимальное значение pH находится в диапа-
зоне 7,0—7,4 [Eagle, 1973]. По некоторым данным, эпи-
дермальные клетки могут расти при значении pH 5,5
[Eisinger et al., 1979], однако эта точка зрения не являет-
ся общепринятой. В особых случаях для доказательства
полезно проведение кратковременных экспериментов
но исследованию эффективности роста (см. протоко-
лы 21.7 и 21.8), исследования эффективности посева
(см. разд. 21.10) или проведение специализированного
функционального анализа (например, см. разд. 17.7)
для определения оптимальных значений pH.
В качестве индикатора pH обычно используется фе-
ноловый красный. При pH 7,4 он красного цвета, при pH
7,0 становится оранжевым, при pH 6,5 — желтым и ли-
монно-желтым при более кислых значениях pH. При pH
7,6 цвет индикатора сдви! ается в розовую область, при
pH 7,8 становиться фиолетовым (см. цв. вкладку 226).
Так как оценка цветов во многом субъективна, полезно
приготовить набор стандартных растворов стерильного
сбалансированного солевого раствора, содержащего
феноловый красный в необходимой концентрации, в
такой же бутыли и с таким же объемом для воздуха,
которые обычно используются для приготовления сред.
В нижеследующем примере в качестве окончательного
резервуара будет использоваться культуральный фла-
кон площадью 25 см2, и этот пример можно использо-
вать в сочетании с упражнением 8.
150
ГЛАВА 9. СРЕДЫ ОПРЕДЕЛЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ДОБАВКИ К СРЕДАМ
ПРОТОКОЛ 9.1. Приготовление
стандартов PH
Материалы
Стерильные:
• Сбалансированный солевой раствор Хэнкса
(HBSS) или среда Игла МЕМ, 10х концентрат
без бикарбоната, без i люкозы, содержащий 20 мМ
HI.PI.S...........................IOm.i
• Вола высшей c i сигни очноки.......90 м.1
• 1нКа()Н...........................IOm.i
• У викерса. 11>ныг Контейнеры. 3(1 мл...7
• муральные флаконы. 25см *.............7
• Наконечники для ништок. 100 мкл.........
Нестерильные:
• рН-метр
• Автоматическая пипетка, 10—100 мкл
Протокол
1 Приготовьте раствор Хэнкса или среду с pH
6.5 или ниже и в каждый из семи подписанных
универсальных контейнеров поместите ио 10 мл
раствора.
2 . В течение 30 мин дайте уравновеситься воздухом.
3 С помощью 1 н NaOH доведит е pH растворов в
контейнерах до 6,5, 6,8, 7,0, 7.2, 7,4, 7,6 и 7,8, из-
меряя значения pH на рН-метре.
4 По 5 мл каждого раствора Хэнкса стерилизуйте
фильтрованием в отдельные подписанные флако-
ны (см. протокол 11.11). Первые 5 мл используй-
те для промывания фильтра перед сбором второй
порции в 5 мл во флакон.
5 Прочно закройте флаконы крышками.
9.2.2. СО2 и бикарбонат натрия
Углекислый газ из 1азовой фазы растворяется в среде,
достигает равновесия с ионами НС О, и понижает pH.
Так как растворенные СО,, НСО3 и pH взаимосвяза-
ны, трудно определить главный прямой эффект СО2.
Атмосферное парциальное давление С О, бу дет прямо
регулировать концентрацию растворенного СО2 как
функцию температуры. Эта регуляция, в свою очередь,
приводит к образованию Н ,СО который диссоциирует
в соответствии с реакцией
Н.О -г СО2 «> Н2СО3 «>Н+ -г НСО, (1)
НСО, имеет' довольно низкую константу диссо-
циации с большинством доступных катионов и, таким
образом, имеет тенденцию реассоциировать, закисляя
при этом среду. Конечный результат повышения кон-
чен грации атмосферного СО2 — снижение pH, и, таким
образом, эффект повышения парциального давления
СО, нейтрализуется повышением концентрации би-
карбоната.
NaHCO3«>Na + НСО:(
(2)
Повышенная концентрация НСО/ сдвигает урав-
нение 1) влево, цока не будет достиг нуто равновесие
при pH 7.4. Если вместо NaHCO3 использовать другую
щелочь (например, NaOH), окончательный результат
будет таким же:
NaOH + Н,СО3 «>NaHCO‘* + Н2О
«>Na+HCO.( + Н2О (3)
Эквивалентные концентрации NaHCO ,, обычно ис-
пользуемые при различном парциальном давлении СО2,
приведены в табл. 9.1,9.2 и 9.3. Могут использоваться
промежуточные значения СО, u НСО-, , при условии,
что концентрации обоих компонентов изменяются
пропорционально. Так как мног ие среды готовят в кис-
лых растворах и, кроме того, в их состав может входить
буфер, трудно предсказать, скодько бикарбоната нужно
использовать, когда друг ие щелочи могут дать такой же
эффект, как п бикарбонат (см. уравнение (3)). Когда
новую среду готовят в первый раз, добавляют указанное
количество бикарбоната и затем достат очное количество
1 н NaOH дл того, чтобы среда уравновесилась до желае-
мого pH после инкубации в чашке Петри при 37 °C при
соответствующей концентрации СО2. Если работают со
средой уже в рабочей концентрации, варьируют коли-
чество НСО/ для того, чтобы подобрать газовую фазу
(см. табл. 9.1), и оставляют среду на ночь уравновеши-
ваться при 37 °C. Д,гя каждой среды есть рекомендуемые
концентрации бикарбоната и парциального давления
СО2для достижения правильных значений pH и осмо-
тического давления, но мог ут быть небольшие вариации
в зависимости от метода приготовления среды.
С использованием буферов Гуда (например, HEPES,
Tricine) [Good el al., 1966] в культуре клеток, были
высказано предположение, что, так как СО2 больше
не является необходимым для стабилизации pH. его
можно удалить из состава среды.
Таблица 9.1. Бзаимпсвязь между бикарбонатам, у|лскис.|ым газом и HEPES
_ г. .. -и Низкая концентрация Вещество Срела МЕМ Игла с солями Хэнкса j. к НСО3 + буфер Среда МЕМ Игла с солями Эрла DMEM
NaHCO, 4мМ 10 мМ 26 мМ 44 мМ
СО2 Атмосферное и выделенное культурой 2% 5% 10%
HEPES* (если требуемся) 10мМ 20 мМ 50 мМ
9.2. Физике химические свойства
151
Это утверждение неверно [Ilagaki & Kimura, 1974],
по крайней мере для большинства типов клеток, особен-
но при низкой их концентрации. Хотя 20 мМ HEPES
может контролировать pH в физиолт ическом диапазо-
не, в отсутствие атмосферного СО2равновесие реакции
1) сдвшается влево, что в конечном irroie приводит к
элиминации растворенного СО,и, далее, НСО</ из сре-
ды. Эта цепь событий, ни-видимому, ограничивает рост
клеток, хотя что именно требуется клеткам растворен-
ный СО2, или HCOj" (или н то, и другое одновремен-
но) остается неясным. Рекомендуемые концентрации
СО». Н СО л и HEPES указаны в табл. 9.1.
Включение в состав среды пирувата позволяет
клеткам увеличить продукцию эндогенного СО2, де-
лая их независимыми как от экзогенною СО,, гак и
от NaHCOj. Среда Лейбовица L15 [Leibovitz. 19631
содержит пируват натрия в высокой концентрации
(550 mi , мл) и не содержит NaHCO.,11 не требует при-
сутствия СО2в газовой фазе. Буферизация достш а-
ется благодаря относительно высокой концентрации
аминокислот. Так как данная среда не требует СО»,
L15 иногда рекомендуют использовать для транспор-
тировки образцов тканей, p-глицерофосфат натрия
может также использоваться в качестве бу(]>ера для
автоклавируемых сред, в которых отсутствуют СО2 и
НСО/ [Waymoulh, 1979J, и фирма Invilrogen продает
среды для культивирования в отсутствие СО2. Если
отсутствие СО2 важно для снижения себестоимости,
из соображении удобства или но друiим причинам,
возможно, одна из этих сред заслуживает внимания, но
только после соответствующего тестирования.
Обобщая вышесказанное. клетки, культивируемые
во флаконах с доступом воздуха, необходимо инкубиро-
вать в атмосфере СО2, концентрация которою находит-
ся в равновесии с бикарбонатом натрия, содержавшимся
в среде (см. табл. 9.1, 9.2 и 9.3). Клетки в умеренно
высокой концентрации (>1х 10’ клеток/мл) и растущие
в закрытых флаконах не нуждаются в добавлении СО2
в газовую фазу при условии, что концентрация бикар-
боната поддерживается низкой (~4 мМ), особенно если
клетки сильно закисляют среду. Однако при низкой
концентрации клеток (например, при клонировании) и
для некоторых первичных культур необходимо добав-
лять СО2 в газовую фазу и при культивировании клеток
в закрытых флаконах. Когда требуется вентиляция
для достижения равновесия (либо для допуска СО,,
либо для удаления его избытка для сильно закисля-
ющих среду клеток), необходимо оставлять крышки
флаконов приоткрытыми или использовать крышки,
пропускающие СО, (см. рис. 8.8).
9.2.3. Буферизация
Культуральная среда должна быть забуферена в двух
случаях: 1) мри культивировании клеток в чашках Пет-
ри, 1де образование С О2 является причиной повыше-
ния pH (см. разд. 9.2.2), и 2) при i икеркродукции СО2
и молочной кислоты трансформированными клеточ-
ными линиями, растущими в высокой концентрации,
koi да pH падает. Буфер может' входить в состав среды
для стабилизации pH, но 1) экзогенный СО2 может,
однако, быть необходим для некоторых клеточных
линий, особенно для клеток, растущих в низкой кон-
центрации, для предотвращения полной потери рас-
творенною СО,и бикарбоната из среды. Несмотря на
низкую буферную емкость при физиолш ических pH.
бикарбонатныи буфер все еще используется намного
чаще, чем дру1 ие буферы, блаюдаря ею низкой токсич-
ности, дешевизне и питательной пользе для культуры.
Таблица 9.2. Сбалансированные солевые растворы (BSS)
Компоненты BSS Эрла PBS Дюльбекко BSS Хэнкса Соли Спиннера (как в S-MEM)
Без Са2* и Мд2* (D-PBSA) ССа2* и Мд2
Мол. вес. г/л мМ г/л мМ г/л мМ г/л мМ г/л мМ
Hcopi аннческие соли
СаС12 (безводный) 111 0,02 0.18 0,2 1.80 0,14 1.3
КС! 74.55 0,4 5,37 0,2 2.68 0,2 2.68 0,4 5,4 0,40 5,37
КН.РО, 136.1 0,2 1.47 0,2 1.47 0,06 0,4
MgCL - 6Н2О 203.3 0,1 0,5
MgSO, • 7Н2О 246.5 0,2 0.81 0,98 3.98 0,1 0,4 0,20 0.81
NaCl 58.44 6,68 114.3 8 136,9 8 136.9 8 136,9 6,80 116.4
NaHCO, 84.01 2,2 26.19 0.35 4,2 2,20 26.19
Na2HPOt • 7Н2О 268.1 2,2 8,06 2,16 806 0 09 0.3
NaH2POt • Н2О 138 0,14 1.01 1,40 10.14
Общее содержание солей 147,9 149,1 154.00 149,4 158,9
Друше компоненты
D-глюкоза 180.2 1 5.55 1 5.5 1,00 5.55
Феноловый красный 354,4 0,01 0.03 0,01 0.0 0,01 0,03
Газовая фаза 5% СО2 Воздух Воздух 5*0 СО2
152
ГЛАВА 9. СРЕДЫ ОПРЕДЕЛЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ДОБАВКИ К СРЕДАМ
HEPES является гораздо более сильным буфером в
диапазоне pH 7,2—7,6 и используется в концентрациях
10—20 мМ. Были обнаружено, что при использовании
HEPES вместе с экзогенным СО2, концентрация
HEPES должна быть выше концентрации бикарбо-
ната более чем вдвое для адекватной буферизации
(см. табл. 9.1). Вариант среды Хэма F12 (Ham’s F12),
содержащей 20 мМ HEPES, 10 мМ бикарбонат и 2%
С О2 успешно используется в лаборатории автора для
культивирования ряда различных клеточных линий.
Это делает возможным проведение микротитрования
и других манипуляции с многолуночными планшета-
ми вне инкубатора без значительного повышения pH
среды и минимизирует потребность в HEPES, который
не только токсичен, но и дорогой по цене.
9.2.4. Кислород
Дру1 им важным компонентом азовой фазы является
кислород. Несмотря на то что in vivo большинству
клеток требуется кислород для дыхания, жизнеде-
ятельность клеток в культуре часто в большей степени
зависит от гликолиза, полому mhoi ие клетки, например
трансформированные, являются анаэробами. Хотя были
попытки включать в состав среды носители О,, по ана-
лО1 и и с гемо! лобнном крови, эта практика не является
общепринятой. Клетки используют, i лавным образом,
растворенный О2, который, однако, может быть токси-
чен, так как он повышает уровень свободных радикалов.
Обеспечение правильного парциального давления О2,
таким образом. все| да является компромиссом между
потребностями дыхания и попыткой избежать токсич-
ности. Страте! ни, включающие как повышенный, так
и пониженный уровень О,, могут использоваться при
добавлении в культуральную среду соединений-лову-
шек для свободных радикалов, таких как i лутатион,
2-меркаптоэтанол ф-меркаптоэтанол) или дитиотре-
итол. В большинстве случаев условия подбираются
эмпирически
Потребности культур в кислороде различаются,
лавное различие лежит между ор|анными и клеточ-
ными культурами. Хотя атмосферное или пониженное
давление кислорода [Cooper el al., 1958; Balin el al.,
1976J для большинства клеточных культур является
предпочтительным, некоторые ор|анные культуры,
особенно полученные из эмбрионов на поздних стади-
ях развития, новорожденных или взрослых, требуют
содержания О, в i азовой фазе до 95% [Trowell, 1959; De
Ridder & Mareel, 1978J. Требование клеток к высокому
уровню содержания О,может являться проблемой при
его затрудненной диффузии, что, в свою очередь, свя-
занно с геометрической формой и проницаемостью для
азов органной культуры (см. разд. 25.2.1), но может
также отражать различие между дифференцированны-
ми и быстро пролиферирующими клетками. Наруше-
ние диффузии кислорода может также ограничивать
применение пористых микроносителей [Preissmann et
al., 1997J (см. также разд. 26.2.4).
Большинство дисперсных клеточных культур
предпочитают низкое парциальное давление кислоро-
да и для некоторых систем (например, для опухолевых
клеток человека в исследованиях по определению
клоногенной активности [Courtenay el al., 1978J и эм-
бриональных фибробластов ле! кого человека [ Balin el
al., 1976J), предпочтительней, чтобы парциальное дав-
ление кислорода было ниже атмосферного. McKeehan
et al. [1976] предположил, что необходимость в
добавлении селена в культуральную среду связана
с токсичностью кислорода, так как селен является
кофактором синтеза 1лутатиона. Кислородную толе-
рантность так же как и селен может обеспечить
сыворотка, таким образом контроль за парциальным
давлением О,, по-видимому, более важен для культи-
вирования в бессывороточной среде
Так как толщина слоя культуральной среды
может влиять на скорость диффузии кислорода в
клетки, в статической культуре рекомендуется под-
держивать толщину слоя среды в диапазоне 2—5 мм
(0.2-0.5 мл см2). Некоторые типы клеток, например
бронхиальный эпителий и кератиноциты, растущие
на фильтрах-вставках в лунках, по-видимому, лучше
дифференцируются на границе фаз жидкость-воздух
(см. разд. 25.3.6).
9.2.5. Осмотическое
давление
Большинство клеток в культуре проявляют довольно
широкую толерантность в отношении осмотического
давления [Waymoulh, 1970]. Так как осмотичес-
кое давление в плазме крови человека составляет
290 мосмоль/ Ki, резонно допустить, что этот уровень
является оптимальным для клеток человека in vitro,
хотя он может отличаться для дру! их видов (например,
для мышей это значение составляет 310 мосмоль.ю
[Waymoulh, 1970J). На практике, для большинства
клеток допустимо осмотическое давление в диапазоне
от 260 мосмоль. кг до 320 мосмоль/ki ; выбран hoi о
значения следует придерживаться, допуская разброс
±10 мосмоль/Ki. Слеша । ипотоническая среда может
использоваться при культивировании клеток в чашках
Петри или в открытых планшетах для компенсации
испарения во время инкубации.
Осмотическое давление обычно измеряют по
снижению температуры замерзания среды (рис. 9.1)
или по повышению давления насыщенного пара. Из-
мерение осмотического давления является полезным
этапом по контролю качества в том случае, если вы
готовите среду самостоятельно, так как это помошет
избежать ошибок при взвешивании, разбавлении
и т.д., особенно важно контролировать осмотическое
давление, если внесены изменения в состав среды.
Добавление HEPES и веществ, которые растворены
в сильных кислотах и основаниях, и их последующая
нейтрализация могут также значительно влиять на
осмотическое давление.
9.2. Физике химические свойства
153
Рис. 9.1. Осмометр. Показана передняя панель, пр,«бирка для
обра ща и пора’ для образца осмометра Роублинга (Camlab)
Эта модель может измерять образцы объемом 50 мкл
9.2.6. Температура
О итимальн ая температура для кул минирования
клеток зависит от 1) температуры тела животного, из
которого клетки были получены, 2) некоторых ана-
томических вариации (например, температура кожи
и тестикул может быть ниже температуры покояще-
гося тела) и 3) учета фактора безопасности, гак как
могут иметь место небольшие ошибки в ре1улировке
инкубатора. Таким образом, в целях безопасности,
для большинства клеточных линий человека и тепло-
кровных животных рекомендуется температура 37 'С,
которая немного ниже температуры тела, так как пе-
регревание является более серьезной проблемой, чем
переохлаждение.
Из-за высокой температуры тела птиц, клетки итиц
необходимо культивировать нри 38,5 °C для макси-
мального роста, но они могут вполне удовлетворитель-
но расти, хоть и несколько медленнее, при 37 °C
Культивируемые клетки млекопитающих устой-
чивы к значительному понижению температуры, они
выживают в течение нескольких дней при 4 °C и мог уз
быть заморожены и охлаждены до -196 °C (см. про-
токол 20.1), но не выдерживают нагрева выше нормы
более чем на 2 °C (39,5 °C) более чем на несколько
часов п очень быстро ног ибают при температуре 40 °C
Необходимо обратить внимание на соответствие
температуры (в пределах ±0,5 °C), чтобы i арантиро-
вать воспроизводимые результаты. Двери инкубатора
или термальной комнаты не должны оставаться откры-
тыми дольше, чем необходимо, и крупные предметы
или объемы жидкости, помещенные в термальную
комнату для согревания, не должны находиться рядом
с какими-либо культурами. Распределение темпера-
туры внутри инкубатора или термальной комнаты
должно быть также однородным (см. разд. 4.4 и 5.3);
не должно быть «холодных мест», воздух должен
свободно циркулировать. Это означает, что большое
количество флаконов не должно быть сложено стоп-
кой, кот да они в первый раз помещены в инкубатор или
термальную комнату; между флаконами должно быть
пространство, достаточное для циркуляции воздуха.
Так как тазовая фаза внутри флаконов расширяется
при 37 °C, флаконы, особенно сложенные стопкой,
должны вентилироваться путем кратковременного
ириоткрывания крышки (от 30 мин до 1 ч) после по-
мещения флаконов в инкубатор.
Пойкилотермные (холоднокровные животные, ко-
торые не способны рет улировать температуру крови в
узком диапазоне) переносят изменение температуры в
широком диапазоне, между 15 °C и 26 °C Для имита-
ции условий in vivo (например, для клеток рыб, живу-
щих в холодной воде) может потребоваться инкубатор,
который не только нагревает, но и охлаждает*, для тога
чтобы поддерживать температуру ниже температу-
ры окружающей среды. При необходимости клетки
иойкилотермных животных можно культивировать
при комнатной температуре, но колебания темпера-
туры окружающей среды в лабораториях делают это
нежелательным, и охлаждаемый инкубатор является
предпочтительным.
Были получены температурно-чувствительные
(Is) мутантные клеточные линии, в которых специ-
фические тены экспрессируются при температуре
ниже стандартной [Su et al., 1991, Foster & Martin,
1992; Wyllie el al., 1992). Эти мутанты необходимы
для проведения исследований клеточной регуляции.
Кроме того, особое Значение придается узкому темпе-
ратурному диапазону в котором можно работать, так
как две отраничивающие температуры различаются
обычно на 2—3 °C. Использование Is мутантов обычно
требует наличия инкубатора как с нагреванием, так и с
охлаждением для того, чтобы компенсировать нагрев
за счет окружающей среды.
Не считая прямого эффекта нарост клеток, темпера-
тура может также влиять на pH из-за повышения рас-
творимости СО? при низких температурах и, возможно,
из-за изменений степени ионизации u рКа буфера. pH
должен быть установлен для комнатной температуре на
0,2 единицы ниже, чем для 37 °C. При приготовлении
среды впервые лучшим вариантом было бы приготов-
ление полной среды и последующее инкубирование
образца среды в течение ночи ири 37 °C при правиль-
ном давлении 1 аза для того, чтобы проконтролировать
pH (см. разд. 9.2.2 и вкладку 226).
154
ГЛАВА 9. СРЕДЫ ОПРЕДЕЛЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ДОБАВКИ К СРЕДАМ
9.2.7. Вязкость
На вязкость культуральной среды влияет i данным об-
разом содержание сыворотки и, в большинстве случаев,
влияние вязкости на клеточный рост невелико. Вяз-
кость становится важна, однако, при перемешивании
клеточной суспензии или KOiaa клетки диссоциируют
после тринсинизации. Любые повреждения клеток,
которые происходят в этих условиях, могут быть
снижены при повышении вязкости среды с помощью
карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или поливинил пир-
ролидона (ПВП) [Cherry & Papoulsakis, 1990; смотри
также Приложение IJ. Это становится особенно важ-
ным при низкой концентрации сыворотки, в отсутствие
сыворотки и для клеток, культивируемых в биореак-
торах с перемешиванием (см. разд. 26.1). в которых
часто используется илюроник F68, хотя его эффект
ио-видимому, является многофакторным
9.2.8. Поверхностное натяжение
и пенообразование
Влияние ценообразования до сих пор не ясно, но при
ценообразовании может повышаться скорость денату-
рации белка, может возникнуть риск контаминации,
если иена достш нет горла культурального сосуда. Пе-
нообразование также ограничивает диффузию газов в
том случае, если пленка иены или пролившаяся часть
попадет в капиллярное пространство между крышкой
и флаконом или между крышкой и нижней частью
чашки Петри.
Пена может возникать в сус иензионных культурах в
сосудах с мешалкой или в биореакторах, koi да воздух с
5“о СО, пропускают через среду,содержащую сыворот-
ку. Добавление гасителя иены наосновесиликона(Оош
Chemical) или илюроника F68 (Sigma) в концентрации
0,01-0,1“п помогает предотвратить ценообразование в
данной ситуации, снижая поверхностное натяжение,
и может также защищать клетки от повреждающего
воздействия пузырьков. СО, не должен пропускаться
через среду при газации флакона, так как при этом
может образовываться цена и может также произойти
выброс аэрозоля из флакона.
9.3. СБАЛАНСИРОВАННЫЕ СОЛЕВЫЕ
РАСТВОРЫ
В состав сбалансированного солевого раствора (BSS)
входят Heopi анические соли. Кроме того, в его состав
может входить бикарбонат нагрия и в некоторых слу-
чаях |люкоза. Состав некоторых наиболее используе-
мых сбалансированных солевых растворов представлен
в табл. 9.2. Так же при необходимости, в эти растворы
может быть добавлен буфер HEPES (5-20 мМ). при
этом удаляется эквивалентное количество NaCl для
сохранения осмотического давления. На основе BSS
готовят mhoi ие полные среды и поставщики сред, кото-
рые продают среду Игла МЕМ на основе солей Хэнкса
[Hanks & Wallace, 1949J или Hi ла МЕМ на основе солей
Эрла [Earle el al., 1943J указывают, какого состава BSS
был использован при приготовлении среды. Соли Хэнк-
са применяют при культивировании клеток в закрытых
флаконах в атмосфере воддуха, в то время как соли
Эрла применяют при высокой концентрации в среде
бикарбоната в сочетании с 5% СО2 в азовой фазе.
BSS также используется для разбавления концен-
тратов аминокислот и витаминов при при готов.|ении
питательной среды, для изотонических промывок или
при препарировании и для кратковременной инкуба-
ции клеток (до 4 ч, обычно с добавлением глюкозы).
Состав BSS часто модифицируют — например, исклю-
чают |люкозу или феноловый красный из BSS Хэнкса
или исключают ионы Са2* и Mg2 из PBS Дюльбеко
[Dulhecco & VogL, 1954]. PBS без Са2" и Mg'2" известен
как раствор PBS А, и обозначение D-PBSA будет ис-
пользоваться в данной книге чтобы указать отсутствие
этих двухвалентных катионов. Необходимо всегда
указывать модификацию при покупке BSS, а также в
публикациях и отчетах.
Выбор BSS зависит как от парциального давления
СО, (см. разд. 9.2.2 и табл. 9.1 и 9.2), так и от целей
исследователя Если BSS используется в качестве
раствора для дезагре! аиии тканей или клеточного мо-
нослоя, то Са2’ и Mg2* обычно исключается, например,
как в солевом растворе Moscona без кальция и магния
[ 1952] (CMF) или в D-PBSA (см. табл. 9.2). Выбор BSS
также зависит от toi о, будет ли этот раствор исполь-
зован д,1я суспензионной культуры или монослойной
(прикрепленной) культуры клеток. S-MEM на основе
солевой» раствора И|ла в модификации Спиннера
представляет собой вариант минимальной питательной
среды И|.ча [1959] с пониженным содержанием Са-’
для снижения клеточной агрегации и прикрепления
клеток (см. таб.ь 9.2).
HBSS, EBSS и PBS как буферы на основе фосфата
имеют низкую буферную емкость при физиоло! ичес-
ких pH. Paul [ 1975] предложил BSS, забуференный
Tris, который более эффективен как буфер, но при
его применении для некоторых типов клеток требу-
ется адаптация. Наиболее эффективными буферами
в настоящее время считаются HEPES (10—20 мМ) в
диапазоне pH 7,2-7,8 и Трицин в диапазоне pH 7,4—8,0,
но использование этих буферов в в больших масштабах
значительно удорожает исследования.
9.4. ПОЛНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Термин полная питательная среда подразумевает сре-
ду, содержащую все компоненты и добавки и подходя-
щую для конкретного использования. Ее обычно i ото-
пят из компонентов среды определенного химического
состава, некоторые из составляющих которой, такие
как |лутамин, moi ут быть добавлены непосредственно
перед употреблением, и различных добавок, таких как
сыворотка, факторы роста или гормоны. Состав сред
9.4. Полные питательные среды
155
определенней о химического состава может быть как
относительно простым, как, например, среда Игла
MEM | Eagle, 1959], которая состоит из незаменимых
аминокислот, витаминов, солей, так и более сложным,
как в средах 199 (М199) (Morgan et al., 1950], CMRL
1066 (Parkeretal., 1957J, MB 752/1 (Waymoulh, 1959],
RPMI 1640 (Moore et al., 1967J, и F12 (Ham, 1965J
(Таблица 9.3). Кроме того, имеется большое количество
бессывороточных сред (см. табл. 10.1 и 10.2). Слож-
ные среды содержат большое количество различных
аминокислот, в том числе заменимых аминокислот,
дополнительные витамины и часто дополнительные
метаболиты (например, нуклеозиды, компоненты цик-
ла трикарбоновых кислот и липиды) и минеральные
компоненты. Концентрация питательных веществ,
в целом, относительно низкая в среде F12 (которая
была оптимизирована для клонирования) и высока в
среде МЕМ Игла в модификации Дюльбекко (DMEM)
(Dulbecco & Freeman, 1959; Morion, 1970],оптимизиро-
ванной для выращивания клеток в высокой плотности
для наращивания вирусов. Barnes and Sato 11980] сме-
шали бедную среду F12 с более богатой по питательным
веществам DMEM в соотношении 1:1 и использовали
эту смесь как основу для своих бессывороточных сред.
Хотя такой подход не всегда является целесообразным,
в данном случае эта комбинация, полученная эмпи-
рическим путем, позволила получить базовую среду,
которая, при обогащении специальными добавками,
подходит для различных типов клеток.
9.4.1. Аминокислоты
Для культивирования клеток требуются незаменимые
аминокислоты (т.е. те, которые не синтезируются в
организме), цистин и или цистеин, apt инин, i лутамнн
и тирозин. Потребность в индивидуальных аминокис-
лотах может различаться у клеток различных типов.
Другое заменимые аминокислоты часто добавляю?
для того, чтобы либо компенсировать неспособность
некоторых клеток синтезировать их, либо для компен-
сации их утечки в среду. Концентрация аминокисло?
обычно определяет максимальную плотность культуры
и при достижении равновесия влияет на выживаемость
клеток и скорость их роста. Для большинства клеток
требуется i лутамнн, хотя некоторые клеточные линии
могут использовать 1лутаминовую кислоту; есть дан-
ные. что 1лутамин используется культивируемыми
клетками в качестве источника энерши и у 1 лерода
[Butler & Christie, 1994; см. также разд. 3.6]. Глутамакс
(Glutamax, Invitrogen) представляет собой дицеитнд
аланин-i лутамнн, который более стабилен по сравне-
нию с глутамином.
В, холин, фолиевую кислоту, инозитол и никотинамид,
смотри табл. 9.3); остальные необходимые компонен-
ты клетки получают* из сыворотки. Биотин входит в
состав большинства более сложных сред, в том числе и
бессывороточных; u-аминобензойная кислота (РАВА)
входит в состав М199, CMRL1066 (модифицированная
М199) и RPMI 1640. Все жирорастворимые витамины
(A, D, Е и К) присутствуют только в М199, витамин А
входит в состав LHC-9, а витамин Е в MCDB 110 (см.
табл. 10.1). В бессывороточных средах некоторые вита-
мины (например, холин и никотинамид) содержатся в
повышенной концентрации. Ограничение по витами-
нам например, при выпадении в осадок фолиевой
кислоты из концентрированного раствора — снижает
выживаемость клеток и скорость роста, влияя на эти
параметры сильнее, чем на максимальную плотность
t^ieroK Аналог нчно тому, как это происходит с ами-
нокислотами, потребность в витаминах определяют
эмпирически, и часто это обусловлено со свойствами
клеточной линий, используемой в исследованиях;
например в среде Фишера (Fischer) высокая концент-
рация фолиевой кислоты потому, что клетки L5178Y,
использовавшиеся при разработке среды, являются
фолат-зависимыми [Fischer & Sartorelli, 1964].
9.4.3. Соли
Основные компоненты, обеспечивающие осмотиче-
ское давление среды, - это_ соли, такие как Na*, К*,
Mg’*, Са2’, СГ, SO42’, РО43 и НСО3. В большинстве
сред концентрация солей соответствует их концент-
рации в солевых растворах Эрла (высокая концентра-
ция бикарбоната, 5% СО,в газовой фазе) или Хэнкса
(низкая концентрация бикарбоната, 1азовая фаза
воздух). Са необходим для некоторых молекул
клеточной ад1езни, таких как кадгерины [Yamada &
Geiger, 1997]. Са’ гакже участвует как посредник в
передаче сигналов (Alberts et al., 2002], концентрация
С а’* в среде может влиять на процессы пролиферации
и дифференцировки (см. разд. 17.2.2,23.2.1). Na*, К*,
и СГ ре1улируют мембранный потенциал, в то вре-
мя как SO42 , РО4'* и НСО-, выступают в качестве
анионов, необходимых в качестве предшественников
макромолекул, а также регуляторов внутриклеточного
заряда.
Концентрация кальция снижена в средах для сус-
пензионных культур для того, чтобы минимизировать
клеточную агре1ацию и прикрепление (см. разд. 9.3).
Концентрацию бикарбоната определяет концентра-
ция СО? в газовой фазе (см. разд. 9.2.2); кроме того,
бикарбонат выступает в качестве не только буфера, но
и питательного компонента.
9.4.2. Витамины
Среда МЕМ Иыа содержит только водорастворимые
витамины, за исключением биотина (витамины группы
9.4.4. Глюкоза
Глюкоза входит в состав большинства сред в качестве
источника энерши. Метаболизм глюкозы происхо-
156
ГЛАВА 9. СРЕДЫ ОПРЕДЕЛЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ДОБАВКИ К СРЕДАМ
Таблица 9.3. Чае-io используемые среды
Компоненты MEM DMEM F12 DMEM/ F12 o.MEM CMRL 1066 RPMI 1640 Ml 99 L15 McCoy’s 5A Fischer MB 752/1
Аминокислоты
L-аланин I.OE-04 5.OE-O5 2.8E-04 2.8E-04 2.8E-04 2.5E-03 1.5E-O4
L-аргинин 6.0E-04 4.0E-04 1.0E-03 7.0E-04 6.OE-O4 З.ЗЕ-О4 1.1E-03 3.3E-04 2.9E-03 2.0E-04 7.1E-O5 3.6E-04
L-аспарагин I.OE-04 5.OE-O5 З.ЗЕ-О4 3.8E-04 1.7E-03 3.0E-04 7.6E-05
L-аспарагиновая I.OE-04 5.OE-O5 2.3E-04 2.3E-04 1.5E-04 2.3E-04 1.5E-O4 1.5E-U4
кислота
L-цистеин 2.0E-04 I.OE-04 5.7E-04 1.5E-O3 5.6E-07 99E-04 2.0E-04 5.0E-04
L-цистин I.OE-04 2.0E-04 1.0E-04 1.0E-04 8.3E-O5 2, IE-04 9.9E-05 9.9E-O5 6.3E-05
L-глутаминовая кис- I.OE-04 5.0E-05 5.1 E-04 5.1E-04 1.4E-04 1.5E-04 1.5E-O4 I.0E-03
лота
L-глутамин 2.0E-03 4.0E-03 1.0E-03 2.5E-O3 2.0E-03 6.8E-04 2.1E-03 6.8E-04 2, IE-03 1.5E-O3 1ЛЕ-ОЗ 2.4E-03
Глицин 4 0E-04 I.OE-04 2.5E-O4 6.7E-O4 6.7E-04 1.3E-04 6.7E-04 2.7E-O3 1.0E-04 6.7E-04
L-гистидпн 2.0E-04 2 0E-04 1.0E-04 1.5E-O4 2.0E-04 9.5E-05 9.7E-05 I.OE-04 1.6E-03 1.0E-04 3.9E-O4 8.3E-04
L-оксипролин 7.6E-05 1.5E-04 7.6E-05 1.5E-O4
L-изолейцпн i.OE-04 8.0E-04 3.0E-05 4JE-O4 4.0E-04 1.5E-O4 3.8E-04 I.5E-04 9.5E-04 3.0E-04 5.7E-O4 I.9E-04
L- лейцин i.OE-04 8.0E-04 1.0E-04 4.5E-O4 4.0E-04 4.6E-O4 3.8E-04 I.6E-04 9.5E-04 3.0E-04 23E-O4 ЗЛЕ-04
L- лизин НС1 i.OE-04 8.0E-04 2.0E-04 5.OE-O4 4.0E-04 3.8E-O4 2.2E-04 3.8E-04 5.1 E -04 2.0E-04 2.7E-O4 1.3E-03
L-метионин I.OE-04 2.0E-04 3.0E-05 1JE-O4 1.0E-04 1.0E-04 1.0E-04 1.0E-04 5.0E-04 1.0E-04 6.7E-04 3.4E-04
L-фенилаланин 2.0E-04 4.0E-04 3.0E-05 2.2E-O4 1.9E-O4 1.5E-O4 9.1E-05 1.5E-04 7.6E-04 1.0E-04 4.1E-04 .i.OE-04
L-пролин 3.0E-04 1.5E-O4 3.5E-04 3.5E-04 1.7E-04 3.5E-04 1.5E-O4 4.3E-04
L-серин 4.0E-04 I.OE-04 2.5E-O4 2.4E-O4 2.4E-04 2.9E-04 2.4E-04 19ЕЧ13 2.5E-O4 1AE-04
L-треонин i.OE-04 80E-04 I.OE-04 4.5E-O4 4.0E-04 2.5E-04 1.7E-04 2.5E-04 2.5E-03 1.5E-O4 3AE-O4 6.3E-04
L триптофан 1.9E-05 7.8E-05 1.0E-05 4.4E-05 4.9E-05 4ЛЕ-О5 2.5E-05 1.9E-05 9.8E-05 1.5E-O5 4.9E-O5 2.0E-04
L-тирозин 2.OE-O4 4.0E-04 3.0E-05 2.1E-O4 2.3E-04 2.2E-O4 1.1E-04 2.2E-04 1.7E-03 1.2E-04 З.ЗЕ-О4 2.2E-04
L-валин 1.0E-U4 8.0E-04 I.OE-04 4.5E-O4 3.9E-04 2.1E-04 1.7E-04 2, IE-04 8.5E-04 1.5E-O4 6.0E-04 5.6E-04
Витамины
р-аминобензойная 3.6E-07 7.3E-06 3.6E-07 7.3E-06
кислота
L-аскорбиновая кис- 2.5E-O4 2.8E-O4 2.8E-07 3.2E-O6 9.9E-05
Ьиотин 3.0E-08 1.5E-O8 4.IE 07 4.1E-O8 8.2E-07 1. IE-08 M.2I 07 4.1E-08 8.2E-08
кальциферол 2.5E-07
Холин хлорид 7.1E-06 2.9E-05 1.0E-04 ME-05 7.1E-O6 3.6E-06 2, IE-05 3.6E-06 7. IE-06 3.6E-O5 1.1E-05 I.8E-03
Фолиевая кислота 2.3E-06 9.1E-06 2.9E-06 b.OE-06 2.3E-O6 2.3E-O8 2.3E-06 2.3E-08 2.3E-06 2.3E-O5 23E-05 9.1E-07
Мио-инозитол LIE-05 4.0E-05 I.OE-04 7.OE-O5 1.1E-05 2.8E-07 1 9E-04 2.8E-07 1.1E-05 2.0E-04 83E-06 5.6E-06
Менадион (витамин 6.9E-08
ка)
Никотинамид 8.2E-00 33E-05 3.3E-07 1.7E-O5 82E-06 2.0E-07 82E-06 2 0E-07 «2Е-06 4.1E-O6 4.1E-O6 8.2E-06
Никотиновая кис-
2 0E-07
D-пантотенат Са 4.2E-08 1.7E-05 2.0E-06 9.4E-O6 4.2E-06 4.2E-O8 1, IE-06 1.2E-08 4.2E-06 8.4E-07 2.1E-06 4.2E-06
Пиридоксаль HCI i.9E-Of> 2.0E-05 3.0E-07 1.0E-05 4.9E-06 1.2E-O7 I.2E-07 2.5E-O6 2.5E-06
Пиридоксин НС1 3.0E-07 1.5E-O7 1.2E-07 4.9E-06 I.2E-07 2.4E-06 1.9E-06
Рибофлавин 2.7E-07 1, IE-00 1.0E-07 5ЛЕ-О7 2.7E-07 2.7E-08 5.3E-07 2.7E-08 1.9E-07 5.3E-07 13E-06 2.7E-06
Тиамин 3.0E-00 LZE-05 1.0E-06 6.4E-O6 3.0E-06 3.0E-08 3J)E-(№ 30E-08 2.4E-06 5.9E-O7 3.OE-O6 3.0E-05
Тиамин монофосфат
<х-тоютферол 2.3E-08
Ретинол ацетат 3.5E-07
Витамин В12 1.0E-06 5.OE-O7 1.0E-06 3.7E-09 I.5E-07
Антиоксиданты
1чутатион 3.0E-05 3.0E-06 I.5E-07 1.5E-06 I.5E-05
Неорганические
соли
СаС1_ I.8E-03 1.8E-03 3.0E-04 1.1E-O3 1.8E-O3 1.8E-O3 I.3E-03 1.3E-03 9.0E-04 6.2E-04 8.2E-04
КС1 5.3E-03 5.3E-03 3.0E-03 4.2E-O3 5.3E-04 5.3E-O3 5.3E-03 Э.ЗЕ-ОЗ 5.3E-O3 5.3E-O3 53E-03 2.0E-03
КН.РО, i 4E-04 4.4E-O4 5.9E-04
MgCl2 1.2E-01 I.2E-03
MgSO, 8.1 E-04 8.1E-04 4.OE-O4 8.1E-04 8.1E-04 4.0E-04 8.1E-04 1.6E-03 8.1E-04 49E-04 8.1E-04
NaCl I.2E-01 1.1E-01 1.3E-01 1.2E-01 l^E-01 1.0E-01 I.4E-01 1.4E-01 1.1E-01 ME-01 I.0E-01
NaHCOs 2.8E-02 4.4E-02 1.4E-02 2.9E-O2 2.6E-O2 2.6E-O2 4.2E-03 2.6E-02 1.3E-O2 2.7E-O2
9.4. Полные питательные среды
157
Окончание табл. 9.3
Компоненты МЕМ DMEM F12 DMEM/ F12 аМЕМ CMRL 1066 RPMI 1640 М199 L15 McCoy’s 5А Fischer МВ 752/1
КаН,РО, 1.0Е-03 НДЕ-04 4.5Е-04 1.0Е-03 4.2Е-03 5.7Е-04
Кл.НРО 1.0Е-03 5.0Е-04 5.6Е-03 4.0Е-04 1.ЙЕ-03 5 0Е-04 2 1Е-03
Микроэлементы
CuSO 5Н,О 1.6Е-08 7.8Е-09
Fc{NO,). 9Н2О 2.5Е-07 1.2Е-07
hcSOj 7Н2О .I.0E-06 1.5Е-06
ZnSO, 7Н2О 3.0Е-06 1.5Е-06
Основания, нуклеозиды и т д
Аденин SO4 5.4Е-05
Аденозин 3.7Е-05
АМФ 5.8Е 07
А ГФ L8E-05
Цитидин 4.1Е-05
Дезоксиаденозин 4.0Е-05 4.0Е-05
Дезоксицитиднн 4.2Е-05 3.8Е-05
Дезоксигунозин 3.7Е-05 3.7Е-05
2-дезоксирибоэа 3.7Е-06
НАД 9.5E-U6
ФАД 1ДЕ-06
I зюкоронат Na Ц9Е-О5
lyaHiiu 1.6Е-06
1уаиозин 3.5Е-05
I ипоксантин •1.0Е-05 1.5Е-05 2.2Е-06
5-метил дезокси цитозин 4.1Е-07
D-рибоза З.ЗЕ-06
Тимидин З.ОЕ-ОЬ 1.5Е-06 4.1Е-05 4.1Е-05
Тимин 2.4Е-06
Трпфосфопиридиндинуклео- 1,ЗЕ-06
гид
Урацил 2.7Е-06
Уридин 4.1Е-05
У ГФ 1.8Е-06
Ксантин 2.0Е-06
Компоненты энергетического
обмена
Кокарбоксилаза 2.2Е-06
Коэнзим А З.ЗЕ-06
D-галактоза 5.9Е-02
D-глюкоза 5.6Е-ОЗ 2.5Е-02 1.0Е-02 1.8Е02 5.6Е-03 5.6Е-03 LIE-02 5.НЕ-03 1.7Е-02 5.6Е-03 2ЛЕ-02
Ацетат натрия 6.1Е-04 4.5Е-04
Пируват натрия ЦОЕ-03 1.0Е-03 1.0Е-03 1.0Е-03 5.0Е-03
Липиды и предшественники
Холестерол 5ДЕ-07 5.2Е-07
Этанол (растворитель) 3.5Е-04
Линолевая кислота 3.0E-07 1.5E-II7 8.9Е-05
Липоевая кислота 1.0Е-06 5.1Е-П7 9.7Е-07
Твин 80 1.8Е-05 L8E-05
Другие компоненты
Пептон, мг/мл 0.6
Феноловый красный 2 7Е-05 4.0Е-05 3.2Е-05 3.6Е-05 2.9Е-05 5.3Е-05 1-3E-D5 4.5Е-05 27Е-О5 2.9Е-О5 1.3Е-05 2.7Е-05
IlvtpecuHU 1.0Е-06 5.0Е-07
1азовая фаза
СО2 59» 10% 24 7% 5% 54 5"» 5% Воздух 5% 2% 5%
Все концентрации молярные, использован компьютерный стиль обозначений (например. З.ОЕ-2 = 3,0x10 = 30 мМ). Для неко-
торых важных компонентов указан молекулярный вес, хотя в некоторых составах используются соли в гидратированной форме,
молярность остается прежней Синонимы и аббревиатуры. АМФ аденозинмонофосфат, АТФ — аденозинтрифосфат, биотин =
витамин Н, кальциферол = витамин D2, ФАД, флавинадениндинуклеотид, липоевая кислота = тиоктовая кислота, менадион = ви-
тамин Kj, мио-инозитол: = L-инозитол, никотинамид = ниацинамид, никотиновая кислота = ниацин, пиридоксин HCI = витамин
Вь. тиамин = витамин В,. а-токоферол = витамин Е, ретинол = витамин Аь УТФ. уридинтрифосфат, витамин В() = кобаламин.
Смотри ссылки в тексте.
158
ГЛАВА 9. СРЕДЫ ОПРЕДЕЛЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ДОБАВКИ К СРЕДАМ
дит 1 .чайным образом путем 1 дикол иза, из 1люкозы
образуется пируват, из которт о может образоваться
лактат или ацетоацетат. Пируват может окисляться в
цикле лимонной кислоты с образованием СО, и воды.
Накопление в среде молочной кислоты, особенно
характерное для эмбриональных и трансформиро-
ванных клеток, свидетельствует о нарушениях в фун-
кционировании цикла лимонной кислоты. Недавно
были получены данные, что большая часть углерода
в клетке образуется не из глюкозы, а из 1лутамина.
Это открытие может объяснить исключительно вы-
сокие требования некоторых культур к глутамину
или глутамату.
9.4.5. Органические добавки
В состав сложных питательных сред входят разнооб-
разные компоненты, такие как белки, пептиды, нук-
леозиды, промежуточные продукты цикла лимонной
кислоты, пируват и липиды. Было показано, что эти
компоненты необходимы для сред с пониженным
содержанием сыворотки, они помогают выжить клет-
кам при клонировании, а также при культивировании
определенных специализированных клеток, даже в
присутствии сыворотки.
9.4.6. Гормоны и факторы роста
Гормоны и факторы роста не указываются в составах
большинства стандартных сред, хотя их часто добав-
ляют в бессывороточные среды (см. разд. 9.5.2, 9.5.3,
10.4.2,10.4.3).
9.4.7. Антибиотики
Антибиотики исходно добавляли в культуральную
среду для того, чтобы снизить вероятность контами-
нации. Однако использование шкафов с ламинарным
потоком совместно с применением стро< их асептиче-
ских методик сделало использование антибиотиков
необязательным. Несомненно, антибиотики имеют ряд
недостатков:
1) Они способствуют селекции микроорганизмов,
устойчивых к антибиотикам.
2) Они маскируют присутствующих в небольшом ко-
личестве скрытых контаминантов, которые moi ут
активизироваться при удалении антибиотиков,
изменении условий культивирования или из них
moi ут развиться резистентные штаммы.
3) Они могут маскировать микоплазменную инфекцию.
4) При взаимодействии с клетками млекопитающих
они moivt действовать как антиметаболиты.
5) Они позволяют неаккуратно работать в плохих
асептических условиях.
Поэтому настоятельно рекомендуется рутинное
культивирование проводить в отсутствие антибиоти-
ков; применение антибиотиков ограничить первичны-
ми культурами или продолжительными дорогостоя-
щими лабораторными экспериментами. Если условия
требуют применения антибиотиков, они должны йотом
быть удалены так быстро, как только возможно. Если
антибиотики используются в течение продолжительно-
го времени, необходимо параллельно культивировать
клетки без антибиотиков (см. разд. 19.4)
Ряд антибиотиков, используемых в культуре клеток,
обладают умеренной эффективностью в отношении
бактериальных инфекций (табл. 9.4). Однако у mhoi их
Таблица 9.4. Антибиогики, используемые при культивировании клеток
Концентрация, мкг/мл
(если не указана другая)
Антибиотик Рабочая Цитотоксическая Активны в отношении.
Амфотерицин В (Фушичон) 2.5 30 Грибы, дрожжи
Ампнцн.ыпн 2,5 Грамположитсльные и грамотрнцатсльные бактерии
Ципрофлоксацин 100 Микоилазма
Эритромицин 50 300 Микоплазма
Гентамицин 50 >300 Грамположитсльные и грамофицатсльныс башерин, мико- плазма
Канамицин 100 10 mi /мл Грамиоложитс чьные и грамотрнцатсльные бактерии, мико- плазма
MRA(ICN) 0,5 Микоплазма
Неомицин 50 3,000 Грамположитсльные и грамофицатсльные бактерии
Нистатин 50 Грибы, дрожжи
Пенищылнн-G 100 U мл 10,000 и/мл Грамположитсльные бактерии
Полимиксин В 50 1 Ml 'мл Грамотрнцатсльные бактерии
С |рептом>шин сульфат 100 20 мг/мл Грамположитсльные и i рам -отрицательные бакт ерии
Тетрациклин 10 35 Грамположитсльные и i рам-отрицательные бактерии
Тилозин 10 300 Мнкоп дазма
По Paul, 1975,
9.5. Сыворотка
159
бактериальных штаммов развилась устойчивость к ан-
тибиотикам, как естественным путем, так и в результате
селекции Таким образом, контроль контаминации с
помощью антибиотиков hukoi да не будет абсолютным.
Особенно трудно контролировать контаминацию гри-
бами и дрожжами, размножение этих микроорганизмов
можно сдержать, но уничтожить их удается только в
редких случаях (см. разд. 19.4).
9.5. СЫВОРОТКА
В состав сыворотки входят факторы роста, которые
способствуют клеточной пролиферации, а также фак-
торы адгезии и вещества, обладающие антитриксиновой
активностью, способствующие прикреплению клеток.
Сыворотка также является источником минеральных
веществ, липидов и гормонов, mhoi ие из которых moi ут
быть связаны с белком (табл. 9.5). Для большинства
клеточных культур используются телячья сыворотка,
эмбриональная бычья сыворотка, сыворотка взрослых
лошадей и человеческая сыворотка. Телячья (CS) и
эмбриональная бычья (FBS) сыворотки используются
наиболее широко, в особенности последняя, которую
применяют для большинства требовательных линий
клеток и для клонирования. Человеческая сыворотка
инО| да используется для культивирования некоторых
линий клеток человека, но ее необходимо проверять
на вирусы, такие как ВИЧ и гепатит В. Для некоторых
исследований лошадиная сыворотка предпочтительнее
телячьей, так как она может быть получена из закрытого
донорского сердца и часто ее свойства меньше варьирует
от серии к серии. Лошадиная сыворотка также обладает
свойством меньше метаболизировать пол намины из-за
низкого уровня иолиаминоксидазы; полиамины явля-
ются митогенными факторами для некоторых типов
клеток | Ну vonen et al., 1988; Kainjnska et al., 19901.
9.5.1. Белки
Хотя белки являются основным компонентом сы-
воротки, функции мнО|их белков in vitro не ясны;
возможно, что некоторые белки являются не только
переносчиками минеральных содинений, жирных
кислот и гормонов, но и выполняют дру| не функции.
К белкам с известными функциями относятся аль-
бумин [Iscove & Melchers. 1978: Barnes & Sato. 1980J.
который является важным переносчиком липидов,
минералов; i лобулины [Tozer& Pirl, 1964 j; фибронек-
тин (нерастворимый на холоду |лобулин), который
способствует прикреплению клеток [Yamada & Geiger,
1997; Hynes, 1992J, хотя, возможно, не настолько
эффективно, как фибронектин, продуцируемый клет-
ками; и а,-макрО| лобулин ин| ибитор трипсина [de
Vonne & Mouray, 1978J. Фетуин из эмбриональной
сыворотки способствует прикреплению клеток [Fisher
el al., 1958], а трансферрин [Giiilberl & Iscove, 1976]
связывает железо, снижая его токсичность и делая
Таблица 9.5. Компоненты сыворотки
Компоненты Диапазон концентраций"
Белки и полипептиды 40-80 mi мл
Альбумин 20-50 mi /мл
Фетуин6 10-20 mi мл
Фибронектин 1 10 мкг/мл
Глобулины 1 15 мг/мл
Ингибитор протеаз, сц-anti- trypsin, a2-inacroglobulin 0,5-2,5 мг мл
Трансферрин 2-4 мг/мл
Факторы роста;
EGF. PDGF. IGF-I and -И.
FGF, IL-1. IL-6 1 IOUhi/мл
Аминекие юты 0,01-1,0 мкМ
Липиды 2-10 мг/мл
Холсстсрол 10 мкМ
Жирные кислоты 0,1-1,0мкМ
Линолевая кисэота 0.01-0,1 мкМ
Фосфолипиды 0,7-3,0 мг мл
Углеводы 1,0-2,0 мг/мл
1люкоза 0,6-1,2 мг/мл
Гексозами н“ 6-1,2 mi мл
Мо.ючная кислота* О,5-2,О мг/мл
Пировиноградная кислота 2-10мк1/мл
Полиамнны:
Путресцин, спермидин 0,1-1,0мкМ
Мочевина 170—300 мкг/мл
Неорганические соединения: 0,14-0,16 М
Кальций 4-7 мМ
Хлориды 100 мкМ
железо 10-50 мкМ
калин 5-15 мМ
Phosphate 2-5 мМ
Селен 0,01 мкМ
Натрий 135-155 мМ
Цинк 0,1-1,0мкМ
Гормоны. 0,1-200 нМ
Гидрокор|U3OH 10 200 нМ
Инсулин 1 100 hi/мл
Трийодтиронин 20 нМ
Тироксин 100 нМ
Витамины. 10 ш-10 мкг, мл
Вит амин А 10-100н| /мл
Фолат 5-20 нс/мл
“Диапазон концентрации дан приблизительно и предназначен
для того, чтобы только указать порядок величины Данные
приведены по Evans and Sanford [1978], и Cartwright and
Shah[1994]
'’Только в фс дельной сывпршке.
"Больше всего в сыворотке человека.
1 Больше всего в фетальной сыворотке
его биодоступным. Дру| ие белки, которые еще не оха-
рактеризованы, мсиут использоваться для клеточного
роста и прикрепления клеток.
160
ГЛАВА 9. СРЕДЫ ОПРЕДЕЛЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ДОБАВКИ К СРЕДАМ
Белки также повышают вязкость среды, снижая
стресс от повреждений при пипетирования и пере-
мешивании, и могут увеличивать буферную емкость
среды.
9.5.2. Факторы роста
Сыворотка, полученная естественным путем, т.е. соп-
ранная после образования сгустка, стимулирует проли-
ферацию клеток лучше, чем сыворотка, полученная при
физическом удалении клеток крови (например, путем
центрифут ирования). Возможно, это связано с тем, что
при образовании сгустка из тромбоцитов высвобожда-
ется тромбоцитарный фактор роста (PDGF). PDGF
[Antoniades et al.. 1979: Heklin el al.. 1979] один из
представителей семейства полипептидов, обл4дающих
митогенной активностью и, возможно,основной фактор
роста сыворотки. Содержащийся PDGF стимулирует
рост фибробластов и глии, но друше тромбоцитарные
факторы роста, такие как TGF-fS, могут ингибировать
рост или стимулировать дифференцировку эпители-
альных клеток [Lechner el al., 1981 J.
Друше факторы роста (см. табл. 10.3), такие как
факторы роста фибробластов (FGF) [Gospodarowicz,
1974], эпидермальный фактор роста (EGF) [Cohen,
1962; Carpenter & Cohen, 1977; Gospodarowicz el al.,
1978a], факторы роста эндотелия, такие как васкуляр-
ный эндотелиальный фактор роста (VEGF) и аш иоге-
нин [Hu el al., 1997; Folkinan & d’Atnore, 1996; Joukov
et al., 1997; Folkman et al., 1979; Maciag et al., 1979] и
инсулиноподобные факторы роста IGF-I и IGF-II [le
Roith & Raizada, 1989], которые были выделены из тка-
ней или секретированы в культуральную среду клетка-
ми, значительно различаются но своей специфичности
и, возможно, присутствуют в сыворотке в небольших
количествах [Gospodarowicz & Moran, 1974]. Mhoi не
факторы роста продаются как коммерческие препараты
(см. Приложение II) в виде рекомбинантных белков,
некоторые из них производятся в форме долгоживущих
анало! ов (Sigma), которые отличаются более высокой
митогенной активностью и стабильностью.
9.5.4. Питательные вещества и метаболиты
Сыворотка может также содержать аминокислоты,
। люкозу. оксо (кето) кислоты, нуклеозиды и ряд других
питательных компонентов и промежуточных метаболи-
тов. Эти соединения moiут быть важными для простых
сред, но не так значимыми для сложных сред, особенно
для сред с высоким содержанием аминокислот и дру шх
химически определенных добавок.
9.5.5. Липиды
Линолевая кислота, олеиновая кислота, этаноламин
и фосфоэтаноламин присутствуют в сыворотке в не-
больших количествах, обычно в связанном с белками
(такими, как альбумин) виде.
9.5.6. Неорганические элементы
Эксперименты с заменой сыворотки [ Ham & McKeehan.
1978] позволили предположить, что микроэлементы
железо, медь и цинк - могут связываться с белками
сыворотки. McKeehan et al. [1976] продемонстриро-
вали необходимость в селене, который, ио-видимому,
помогает нейтрализовать свободные радикалы, так как
является кофактором для |лутатионсинтазы.
9.5.7. Ингибиторы
Сыворотка может содержать вещества, ищ ибирующие
пролиферацию клеток | Harrington & Godinan, 1980;
Liu et al., 1992; Varga Weisz & Barnes, 1993]. Некото-
рые из них могут присутствовать в сыворотке из-за
ошибок при приготовлении (например, бактериальные
токсины, в случае, если сыворотка была контамини-
рована до фильтрации, или антитела, содержащиеся в
у-глобулиновой фракции, которые взаимодействуют
с эпитопами на поверхности клеток), но дру| не явля-
ются отрицательными ре|уляторами роста, такие как
TGF-p [Massague el al., 1992]. Тепловая инактивация
удаляет из сыворотки комлемент и снижает цитотокси-
ческое действие иммуношобулинов, не разрушая при
этом факторы роста, но может также разрушать более
лабильные компоненты сыворотки, поэтому инакти-
вированная сыворотка может быть менее активна ио
сравнению с необработанной сывороткой.
9.6. ВЫБОР СРЕДЫ И СЫВОРОТКИ
Все 12 сред, приведенных в табл. 9.3, были разработаны
для выращивания определенных клеточных линий в
определенных условиях. Mhoi не из них были разра-
ботаны для мышиных фибробластов L929 или клеток
карциномы шейки матки HeLa; среда Хэма F12 была
разработана для клеток яичника китайского хомячка
(СНО); однако сейчас все они имеют более широкое
применение и состав их считается классическим.
Производители свидетельствуют, что доля наиболее
популярных сред RPMI 1640. DMEM и МЕМ со-
ставляет 75% продаж. Доля сред другого состава редко
превышает 5% от общей суммы продаж, обычно 2—3%,
хотя доля смеси DMEM/F12 более 4%.
Минимальная питательная среда Иьча (МЕМ)
была разработана путем усовершенствования Базовой
среды И|.ча (ВМЕ) за счет увеличения количества
и концентрации компонентов. В течение mhoiих лет
среда И| ла МЕМ использовалась чаще всех сред. Среда
МЕМ в модификации До.тбекко (DMEM) была разра-
ботана для трансформации мышиных фибробластов
и исследований, связанных с наращиванием вируса.
9.6. Выбор среды и сыворотки
161
Концентрация аминокислот в ней в 2 раза выше, чем в
МЕМ, концентрация витаминов выше в 4 раза, и двой-
ная концентрация НСО-, (и,соответственно СО,) для
лучшей буферизации. В состав аМЕМ |S tanners et al.,
1971J входят не только дополнительные аминокисло-
ты и витамины, но и нуклеозиды и лииоевая кислота;
эта среда используется для mhoi их типов клеток,
включая гематопоэтические клетки. Среда Хэма F12
была разработана для клонирования клеток СНО при
низком содержании сыворотки, она также широко ис-
пользуется, особенно для исследования клоно| енной
активности (см. протокол 22.3.2) и первичных культур
(см. протокол 12.7).
Среды CMRL 1066, М199 и среда Вэймонта (Way-
tnoulh’s medium) были разработаны для культивирова-
ния клеток L929 без добавления сыворотки, однако они
используются д,1я mhoi их требовательных к условиям
культур либо в чистом виде, либо в сочетании с дру| и-
ми средами, такими как DMEM или F12. RPMI1640 и
среда Фишера (Fischer’s medium) были разработаны
для лимфоидных клеток: среда Фишера для лимфо-
мы L5178Y, требующей высокого содержания фолата.
RPMI 1640 особенно широко используется, часто для
прикрепляющихся клеток, хотя была исходно предна-
значена для суспензионных культур, поэтому в ней от-
сутствует кальции. Среда L15 была создана специально
для тоге, чтобы обеспечить буферизацию в отсутствие
НСО3 н СО,. По этой причине ее часто используют
для транспортировки клеток и в качестве среды для
первичных культур, но она используется меньше из-за
тоге, что в ее состав входит HEPES, что демонстрирует,
что НС ()•< и СО2часто необходимы для оптимального
роста клеток, невзирая на требования буферизации.
Информацию относительно выбора подходящей
среды для данного типа клеток обычно можно най-
ти в литературе - в статьях, 1де описано получение
клеточной линии или сходной культуры клеток. Ин-
формацию также можно получить от тоге, кто предо-
ставляет клеточную линию. Банки клеток, такие как
АТСС (Американская коллекция клеток) u ЕСАСС
(Европейская коллекция клеток), предоставляют
информацию о средах, которые используются для
доступных в настоящее время линий клеток, и эту
информацию можно просмотреть на их веб-сайтах (см.
Приложение III, см. также табл. 9.6). В случае если
информация отсутствует, приходится либо эмпири-
чески подбирать среду, либо провести сравнительное
тест ирование нескольких сред так же. как и при выборе
сыворотки (см. разд. 9.6.2).
Mhoi ие постоянные линии клеток (например, HeLa,
L929, ВНК21), первичные культуры клеток человека,
грызунов и фибробласты птиц, и линии клеток, произо-
шедшие от них, можно культивировать на относительно
простых средах, таких как среда И| ла МЕМ, с добавле-
нием телячьей сыворотки. Более сложные среды Moiyi
потребоваться для специализированных клеток (см.
раса. 17.7) или koi да клетки субку.вьтивируютс низкой
плотностью посева (<1х10!/мл), как при клонировании
(см. разд. 14.2). Зачастую для более требовательных
клеток, для которых необходима сложные среды,
требуется также эмбриональная бычья сыворотка, а
не телячья или лошадиная, несмотря на то что среда
исходнобыла разработана для культивирования клеток
в отсутствие сыворотки.
Некоторые предложения но выбору среды и не-
сколько примеров некоторых типов клеток и исполь-
зуемых для них сред приведены в табл. 9.6 (см. также
Mather, 1998). Если информация недоступна, за две
недели можно провести простые эксперименты ио ис-
следованию эффективности роста клеток на коммерчес-
ких доступных средах в многелуночных планшетах (см.
протоколы 21.7—21.9). Исследование эффективности
клонообразования (клоногенной активности) (см. про-
токол 21.10) и измерение проявления специфических
функций помогут дополнительно ограничить выбор.
Для вас может оказаться сюрпризом, если удастся
подобрать лучшие условия для культивирования
клеток, которые не сО|ласуюгся с литературными
данными; воспроизвести условия, созданные в другей
лаборатории, может быть сложно из-за вариаций в
Ирш отоплении сред или разных поставщиках, из-за
примесей, ирису гсзвующих в реакт ивах и воде, разницы
между сериями сыворотки. Остается надеяться, что при
снижении необходимости использования сыворотки и
повышении чистоты реактивов стандартизация среды
будет совершенствоваться.
В конце концов, вы можете найти компромисс, выби-
рая среду или сыворотку но их цене. Автоклавируемые
среды доступны у коммерческих производителей (см.
Приложение II). Их просто готовить из порошка, и они
подходят для многих постоянных клеточных линий.
В эти среды необходимо добавлять для большинства
клеток |лутамин и, обычно, сыворотку. Стоимость
сыворотки можно подсчитать, основываясь на объеме
среды, koi да количество клеток не имеет значения, но
в случае, кота целью является наращивание большого
количества клеток, можно подсчитать стоимость сыво-
ротки в расчете на клетку. Так, если культура растет до
плотности 1х10*‘ мл в среде с сывороткой А и 2х10*’/мл
в среде с сывороткой Б, сыворотка Б обойдется дешевле
в 2 раза. Если необходима эмбриональная сыворотка,
попробуйте смешать ее с телячьей. Это может помочь
вам снизить концентрацию более дорогой эмбриональ-
ной сыворотки. Если вы сможете, полностью избавьтесь
от сыворотки или снизьте ее концентрацию и исполь-
зуйте бессывороточные составы (см. разд. 10.5)
9.6.1. Резервирование партии сыворотки
Разные партии сыворотки MOiyr значительно разли-
чаться но своим свойствам. Эти различия обусловлены
разными методами приготовления и стерилизации,раз-
личным сроком и условиями хранения, а также зависят
от породы животных, у которых берут сыворотку, от ИХ
рациона, климата, в котором животных выращивают и
от дру । их условий окружающей среды. Важно выбрать
серию сыворотки и использовать ее как можно дольше
162
ГЛАВА 9. СРЕДЫ ОПРЕДЕЛЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ДОБАВКИ К СРЕДАМ
Таблица 9.6. Выбор подходящей среды
Клетки или линия клеток Среда Сыво-
Клетки ЗТЗ MEM. DMEM CS
Эмбриональные фнбро- Eagle’s МЕМ CS
бласты цыпленка Яичник кит айского хо- Eagle's МЕМ, CS
мячка (СНО) Ham's F12 Хондроциты Ham's F12 FB
Непрерывные клеточные Eagle’s MEM, DMEM CS
линии
Эндотелий DMEM. М199. МЕМ CS
Фибробласты Eagle's МЕМ CS
Глиальные клетки MEM, DMEM F12 FB
Глиома MEM, DMEM/F12 FB
Клетки HeLa Eagle’s MEM CS
Гематопоэтические клст- RPMI1640. Fischer's, FB
ки аМЕМ
Диплоидные фибро- Eagle's MEM CS
бласты человека
Лейкемия человека RPMI 1640 FB
Опухоли человека Llj, RPMI 1640, FB
DM ЕМ/Fl 2
Кератпноциты о.МЕМ FB
L клетки (L929. LS) Eagle’s М ЕМ CS
Лимфоблае Ю11ДНЫС RPMI 1640 FB
линии клеток (челове- ческие)
Эпителий молочной же- RPMI 1640. FB
лезы DMEM/F12
Эпителий почки собаки DMEM, DMEM F12 FB
MDCK
Меланоциты М199 FB
Меланома MEM, DMEM F12 FB
Эмбриональные фибро- Eagle's МЕМ CS
6.1ЭСТЫ мыши
Лейкемия мыши Fisher’s, RPMI 1640 FB, HoS
Эритролейкемия мыши DMEM F12. FB, HoS
RPMI 1640
Миелома мыши DMEM. RPMI 1640 FB
Нейробластома мыши DMEM. DMEM F12 FB
Нейроны DMEM FB
Фибробласты почки кры- MEM, DMEM CS
cbiNRK
Гепатома крысы с мини- Swim’s S77, FB
мальным отклонением DMEM F12 (HTC.MDH)
Скелетные мышцы DM ЕМ. F12 FB, HoS
Фибробласты сирийеко- MEM, GMEM. CS
го хомячка (например DM ЕМ ВНК21)
CS телячья сыворотка, FB эмбриональна бычья сыворот-
ка, HoS — лошадиная сыворотка. SF12 среда Хэма F12 плюс
незаменимые аминокислоты Игла и заменимые аминокис-
лоты как в DMEM (иродас1ся как 100-кра1Ныи концентрат,
смотри Приложение II). Дополнительные рекомендации по
выбору сред можно найти у McKechan |1977|, Barnes et al
|1984(a-d)]. и Mather 11998|
и заменить ее со временем на максимально сходную но
свойствам.
Стандартизировать сыворотку сложно, так как
партии moi ут значительно варьировать, и одна партия
может храниться от шести месяцев до года при —20 °C.
Выберите тип сыворотки, наиболее подходящей для
ваших целей, и запрашивайте картин для тестирования
у нескольких поставщиков. Большинство поставщиков
сыворотки резервируют партию, кока заказчик выберет
наиболее подходящий ему вариант (с условием, что вы-
бор не займет более трех недель или около того). Koi да
подходящая партия будет отобрана, поставщика просят
хранить необходимый объем до года и отправлять по
потребности. Дру| их поставщиков необходимо инфор-
мировать, что они могут вернуть зарезервированные
партии на склад.
9.6.2. Тестирование сыворотки
Качество данной сыворотки гарантируется постав-
щиком, однако, контроль качества фирмы проводят
на одной из ряда постоянных клеточных линий. Если
ваши требования более высокие, вы должны провести
собственное тестирование. Сыворотку тестируют по
четырем основным параметрам.
Эффективность посева. При клонировании клет-
ки растут в низкой плотности и из-за aroi о становятся
более чувствительными, поэтому это очень убеди-
тельный тест. Рассейте клетки с плотностью от 10 до
100 клеток/мл и проанализируйте образование коло-
нии в период от 10 дней до двух недель. Покрасьте и
посчитайте колонии (см. протокол 21.10) и определите
разницу в эффективности посева (отражает выживае-
мость) и в размере колоний (отражает пролиферацию
клеток). Каждую сыворотку необходимо тестировать в
диапазоне концентраций от 2% до 20%. Такой подход
выявит, если какая-либо из сывороток будет проявлять
равную активность в более низкой концентрации, и это
поможет сэкономить дены и и использовать партию в
течение более длительного времени. Кроме того, если
в сыворотке присутствует какая-либо токсичность, при
высокой концентрации она проявится.
Кривая роста. Необходимо построить график
кривой роста клеток при их выращивании на каждой
сыворотке (см. протоколы 21.7—21.9) и определить по
кривой lag-период, время удвоения и плотность насы-
щения (плотность клеток при выходе кривой на плато).
Длинный lag-период означает, что культура должна
адаптироваться к сыворотке; короткое время удвоения
предпочтительней, если вы хотите быстро нарастить
много клеток; высокая плотность насыщения позволит
вам вырастить больше клеток, используя данное коли-
чество сыворотки, и поможет сэкономить средства.
Сохранение свойств культуры клеток. Ясно,
что клетки должны и с новой сывороткой сохранять
свойства и выполнять те функции, которые от них
требуются, являются ли они клетками-хозяевами для
заданно! о вируса, продуцируют ли определенный
9.7. Другие добавки
163
клеточный продукт, должны ли дифференцироваться
или проявлять специфическую чувствительность к
данному веществу.
Стерильность Сыворотка от поставщиков с хо-
рошей репутацией будет протестирована, и будет ука-
зано, что в ней отсутствуют микроорганизмы. Однако
в редких случаях образцы контаминированной сыво-
ротки проходят контроль качества. Если сыворотка
контаминирована, это выявится при тестировании на
микоплазму (см. гл. 19.3.2)
9.6.3. Тепловая инактивация
Сыворотку инактивируют путем инкубации в течение
30 мин при 56 °C. Затем ее можно разлить на порции н
хранить при —20 °C. Исходно прогревание применялось
для инактивации комплемента для использования в
иммуноло! ических анализах, но, возможно, оно вызы-
вает и дру| ие эффекты, пока не описанные Часто сы-
воротку инактивируют потому, что это было указано в
одном из предыдущих протоколов, причем нет никаких
конкретных свидетельств, что инактивация иринесеч
какую-либо пользу. Утверждения, что тепловая ина-
ктивация элиминирует микоплазму по-видимому, не-
обоснованны, хотя тепловая обработка может снизить
титр некоторых видов микоплазмы.
9.7. ДРУГИЕ ДОБАВКИ
Кроме сыворотки ио традиции в качестве добавок к
куль гуральным С|>едам используют тканевые экс гранты
и гидролизаты.
9.7.1. Гидролизат аминокислот
Мн<н ие добавки этого типа ведут свое происхождение
из микробиоло! ии (автоклавируемые бульоны). Бакто-
иеитон, три птоза и идролизат лактальбумина (Difco-
B-D Biosciences) представляют собой протеолитические
гидролизаты бычьею сердца или лактальбумина и
содержат i лавным образом аминокислоты и малые пеп-
тиды. Бактоиентон и триитоза могут также содержать
нуклеозиды и дру| не термостабильные компоненты
тканей, такие как жирные кислоты и углеводы.
9.7.2. Эмбриональный экстракт
Эмбриональный экстракт представляет собой грубый
гомогенат 10-дневною эмбриона цыпленка, очищенный
центрифу! ированием (см. Приложение I). Coon и Cahn
[1966] фракционировали грубый экстракт и получили
фракции с высоким и низким молекулярным весом.
Низкомолекулярная фракция стимулировала проли-
ферацию клеток, в то время как высокомолекулярная
фракция индуцировала щцментацию и дифферен-
цировку в хрящ. Хотя Coon и Cahn не охарактеризо-
вали полностью эти фракции, более поздние данные
позволили предположить, что в низкомолекулярной
фракции, ио-видимому, содержатся белковые факторы
роста, а в высокомолекулярной фракции — протеогли-
каны и дру| ие компоненты матрикса
Эмбриональный экстракт исходно использовали в
качестве добавки к плазме (см. разд. 3.7,12.3.1) для сти-
муляции миграции клеток из эксплантата, и до сих пор
его используют в методиках выращивания некоторых
органных культур (см. разд. 25.2)
9.7.3. Кондиционированная
среда
Puck и Marcus [ 1955J обнаружили, что выживаемость
культуры клеток, растущих в низкой плотности, можно
повысить, выращивая клетки на фидерном слое (см.
разд. 14.2.3). Этот эффект, ио-видимому, является
комбинацией ряда событий, включающих кондици-
онирование субстрата и кондиционирование среды
посредством секреции в среду малых молекул мета-
болитов и факторов роста [Takahashi & Okada, 1970J.
Hauschka u Konigsberg [1966] показали, что кондици-
онирование культуральной среды, необходимое для
роста и дифференцировки миобластов, происходит
благодаря синтезу колла!ена фидерными клетками.
Использование фидерных слоев и кондиционирован-
ной эмбриональными фибробластами или друшми
клетками среды сохранилось до сих пор при культи-
вировании трудно растущих клеток (см., например,
Siampfer el al., 1980).
На основании экспериментов но выделению актив-
ных фракций из кондиционированной среды, были вы-
двинуты орт инальные i ииотезы, возможно, недалекие
от правильной интерпретации. Кондиционированная
среда содержит как компоненты, модифицирующие
субстрат, такие как коллаген, фибронектин и проте-
огликаны, так и факторы роста, такие как FGF, пнсу-
линоиодобные факторы роста (IGF-I u II), PDGF
и некоторые друше (см. табл. 10.3). а. кроме тою. как
иредиола! алось ранее, промежуточные метаболиты.
Однако, при использовании кондиционированной
среды, появляются неизвестные факторы, поэтому она
должна быть удалена после того, как будут определены
ее активные компоненты.
Глава 10
БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ
Хотя многое линии клеток все еще культивируют в
среде с добавлением сыворотки, есть много примеров
культивирования клеток в бессывороточных средах
(табл. 10.1.10.2). Необходимость 1) стандартизировать
среды для работы в разных лабораториях, 2) обеспе-
чить специализированные среды для специфических
типов клеток и 3) удалить природные соединения, ко-
личество и состав которых могут варьировать, привела
к разработке более сложных сред, таких как среда М199
[Morgan et al., 1950J, CMRL 1066 [Parker et al., 1957],
NCTC109 [Evans et al., 1956], MB 572. 1 [Waymoulh,
1959J.NCTC 135 [Evans & Bryant, 1965], [Birchand Pin,
1971] для культур фибробластов мыши L929, а также
среды F10 [Ham, 1963] u F12 [Ham, 1965] для клони-
рования клеток яичника китайскою хомячка (СНО).
Бессывороточные среды также были разработаны для
клеток карциномы шейки матки человека HeLa [Blaker
et al., 1971; Higuchi, 1977].
Для адаптации постоянных линий клеток к куль-
тивированию в отсутствие сыворотки может потребо-
ваться проведение селекции клеток. Тем не менее при-
менение сред Серни MCDB [Ham & McKeehan, 1978;
см. также табл. 10.1], среды на основе DMEM/F12 в
модификации Salo [Barnes & Sato, 1980] и apyi их сред
на основе RPMI 1640 [Carney el al., 1981; Brower el al.,
1986] (см. также табл. 10.2) показало, что сыворотка мо-
жет быть удалена из среды полностью или количество
ее может быть значительно снижено без видимой
селекции клеток в том случае, если в среду добавлены
необходимые питательные вещества и гормоны [Barnes
el al., 1984a-d; Cartwright & Shah, 1994, Mather, 1998].
Это также обеспечивает избирательные условия для
первичной культуры особых тиков клеток. Среды
сиециальнО|Х> состава (например, MCDB НО [Betlger
el al., 1981]) были разработаны для культивирования
фибробластов человека [Ham. 1984], многих нормаль-
ных и опухолевых клеток человека и мыши [Barnes &
Salo, 1980], л имфобластоидных линий клеток [Iscove &
Melchers, 1978], а также некоторых первичных культур
[Maiher & Salo, 1979а, b; Sundq vist el al., 1991; Gupia el
al., 1997; Keen & Rapson, 1995; Vonenetal., 1992] в отсут-
ствие сыворотки. В некоторых случаях в среду добавля-
ли необходимые белки [Tsao el al., 1982; Benders el al.,
1991]. Список типов клеток, которые выращивают на
бессывороточных средах, весьма велик, a mhoi не среды
можно купить у фирм-производителей (см. Приложе-
ние II). Кроме т01 о, при производстве биофармацев-
тических препаратов, при очистке целевого продукта
необходимо удалять белки животною происхождения.
Поэтому, в целях безопасности [Merten, 1999], были
разработаны среды для иос гоянных клеточных линий,
таких как СНО. и шбридом [Frond, 1999; Ikonoiuou et
al., 2003; Shah, 1999]
10.1. НЕДОСТАТКИ СЫВОРОТКИ
Использование сыворотки в среде имеет ряд недо-
статков.
Физиологоческая вариабельность. Известны ос-
новные компоненты сыворотки, такие как альбумин и
трансферрин, но сыворотка также содержит большое
количество минорных компонентов, которые могут
в значительной степени влиять на рост клеток (см.
табл. 9.5). Эти компоненты включают питательные
вещества (аминокислоты, нуклеозиды, сахара ит.д.),
белковые факторы роста, гормоны, неорганические со-
единения и линиды, концентрация и действие которых
полностью не определены.
Срок хранения и постоянство состава Состав сыво-
ротки варьирует от партии к партии, и, в лучшем случае,
качество партии сохраняется в течение года, причем
в течение этого срока возможно ухудшение качества.
Далее сыворотку следует заменить другой партией, при
этом выбирается наиболее сходная, но она никогда не
будет идентичной сыворотке из первой партии.
Контроль качества. При использовании сыворотки
из другой партии необходимо проведение всесторон-
него тестирования для того, чтобы убедиться, что ио
своим свойствам сыворотка из новой партии макси-
мально близка к ранее используемой. Тестирование
проводится на нескольких линиях клеток (исследуются
параметры роста, эффективность посева и специфиче-
ские свойства клеток; см. разд. 9.6.2).
Специфичность. Если в работе используются не-
сколько разных типов клеток, для каждого типа может
потребоваться отдельная партия сыворотки, таким
образом одновременно необходимо зарезервировать
несколько партий. При сокультивировании клеток
разных типов могут возникнуть большие проблемы.
Доступность. Время от времени поставки сыворот-
ки прекращаются из-за засух в областях, где разводят
крупный ро<атый скот, болезней животных, или ко эко-
номическим или политическим причинам. Такие про-
10.1. Недостатки сыворотки
16Б
Таблица 10.1. Примеры составивбессывороточныхсред
Тип клеток Среда MCDB 110 Фибро- бласты легкого века MCDB 131 Эндо- телий сосудов MCDB 170 Эпите- лий мо- лочной железы MCDB 202 Эмбрио- нальные фибро- бласты цыпленка MCDB 302 Клетки CHO MCDB 402 Клетки ЗТЗ WAJC 404 Эпителий предста- тельной железы1 MCDB 153 Iscove's Клетки лимфо- идного проис- LHC-9 хиаль-
Ссылки Bettger Knedler Ham- McKeehan Hamil- Shipley McK- Peehl Iscove & Lech-
et aL, & Ham, mond et & Ham, ton & & Ham, eehan et & Ham, Melchers, ner &
Bettger 1987; aL, 1984 1976b Ham, 1983 aL, 1984; 1980 1978 LaVeck,
et aL, Gupta et 1977 Chap- 1985
1961 al., 1997 roniere
& McK-
eehan.
1986
Компоненты Мол.
вес
Аминокислоты
L-аланин ев 1 OE-04 3 0E-05 1 OE-04 1 OE-04 1.OE-04 1 OE-04 2.8E-04 1 OE-04
L-аргиипн 211 1 OE-03 3 0E-04 3 0E-04 3 OE-04 1 OE-03 3 OE-04 1 PE-03 1.0E-03 4 OE-04 2 0E-03
L-аспарагин 132 1 OE-04 1 0E-04 1 0E-03 1-OE-03 1 IE-04 1 (IE-04 1 0E-04 1.OE-04 19E-04 1 OE-04
L-аспарагиновая кис 133 1 0E-04 1 0E-04 1 0E-04 1.OE-04 1 OE-04 1 OE-05 3 0E-05 3.0E-05 2.3E-04 3.0E-05
лота
L-цистеин 176 5 OE-05 2 0E-04 7 OE-05 2.0E-04 1 OE-04 2.4E-04 2 4E-04
L-цистин 240 2 0E-04 2 OE-04 4 OE-04 2/E-04 29E-04
L-глутаминовая кис 147 1 0E-04 3 OE-05 1 0E-04 1 OE-04 1 OE-04 1 OE-05 1 0E-04 1 OE-04 5 IE-04 1 0E-04
лота
Е-глутамин 146 2 5E-03 1 0E-02 2 0E-03 1.0E-03 3.0E-03 5.0E-03 6 0E-03 6.0E-03 40E-03 6.0E-03
1 11ШПН 75 3.0E-04 3 0E-05 1 0E-04 1.OE-04 1 OE-04 1.OE-04 1 OE-04 1 OE-04 4 OE-04 1 0E-04
L-гистидин 210 1 OE-04 2 0E-04 1 OE-04 1 OE-04 1 OE-04 20E-03 8 OE-05 8.0E-05 2 OE-04 1 6E-04
L-толеицин 131 3.0E-05 5 0E-04 1 OE-04 1 OE-04 3.0E-05 1 OE-03 1 5E-05 1 5E-05 8 OE-04 3.0E-05
L-лейцпн 131 10E-04 1 0E-03 3 0E-04 3 OE-04 1 OE-04 2 OE-03 5 OE-04 5 OE-04 8 OE-04 1 0E-03
L-лптин HCI 183 2 OE-04 1 0E-03 2 0E-04 2.0E-04 2 OE-04 8.0E-04 1 0E-04 1 OE-04 8 OE-04 10E-04
L-метиоиин 149 3.0E-05 1 0E-04 3 OE-05 30E-05 3.0E-05 2 OE-04 3.0E-05 3.0E-05 2 OE-04 6.0E-05
L -фенилаланин 165 3.0E-05 2 0E-04 3 0E-05 3.0E-05 3.0E-05 3.0E-04 3 PE-05 3.0E-05 4 OE-04 6.0E-05
L-пролин 115 3.0E-04 1 0E-04 5 0E-05 50E-05 3.0E-04 3 OE-04 3.0E-04 35E-04 3.0E-04
L-серпн 105 1 0E-04 3 OE-04 3 0E-04 3 OE-04 1 OE-04 1.OE-04 6 0E-04 6.0E-04 4 OE-04 1 2E-03
L -треонин 119 1 OE-04 1 OE-04 3 0E-04 3 OE-04 1 OE-04 5 OE-04 1 0E-04 1 (IE-04 8 OE-04 2 0E-04
Ь-триитофан 204 1 OE-05 2 0E-05 3 OE-05 3.0E-05 1 0E-05 1.0E-05 1 5E-05 1 5E-05 7.8E-05 3.0E-05
L-тирозин 181 3.5E-05 1 OE-04 5 OE-05 5.0E-05 4 4E-05 2.0E-04 1 5E-05 1 5E-05 46E-04 3.0E-05
L-валин 117 1 0E-04 1 0E-03 3 0E-04 3.0E-04 1 OE-04 20E-03 3 OE-04 3.0E-04 8 OE-04 6.0E-04
Витамины
Ьпотпн 244 3.0E-08 3 OE-08 .1DE-08 30E-08 3.0E-08 30E-U8 6 PE-08 6.0E-08 5.3E-08 6.0E-08
Холин хлорид 140 1 OE-04 1 0E-04 1.OE-04 1 OE-04 1 OE-04 1 0E-04 1 OE-04 2 OE-05 2 0E-04
Фолиевая кислота 441 1 0E-04 3.0E-06 1.8E-06 1 8E-06 9 IE-06 1 8E-06
Фолнновая кислота 512 1 0E-09 1 0E-06 1 0E-08 1 OE-08 1 0E-06
Мио-Инозитол 180 1 OE-04 4 0E-05 1 0E-04 1 OE-04 1 OE-04 4 0E-05 1 0E-04 1 OE-04 4 OE-05 1 0E-04
Никотинамид 122 5 OE-05 5 0E-05 5 0E-05 50E-05 3.0E-07 5 0E-05 3 0E-07 3.0E-07 3.3E-05 3.0E-07
Пантотенат 238 1 0E-06 5 0E-05 1 0E-06 1 0E 06 1 0E-06 5 OE-05 1 0E-06 1 0E-06 17E-05 1 0Е-06
Пиридоксаль HCI 204 2 OE-05
Пиридоксин НС1 206 3.0E-07 1 0E-05 3 0E-07 3.0E-07 3.0E-07 1.OE-04 3 PE-07 3.0E-07 3.0E-07
Рибофлавин 376 3.0E-07 1 OE-Oe 3 0E-07 3.0E-07 1 0E-07 1 0E-06 1 PE-07 1 0E-07 1 IE-06 1 0E-07
Тиамин НС1 337 1 0E-06 1 0E-05 1 0E-06 1 0E-06 1 0E-06 1 OE-04 1 PE-06 1 0E-06 1.2E-05 1 0E-06
а-токоферол 130 1 4E-07
Ретиноевая кислота 300 3.3E-07
Ретинол ацетат 329 4 2E-07
Витамин В,» 1355 1 OE-07 1 0E-08 1 0E-07 1 0E-07 1 0E-07 1 (IE-08 3 0E 07 3.0E-07 H6E-O9 3 0E-07
Антиоксиданты
Дитпотреитол 154 6.5E-06
1 чутатнон 307 6.5E-07
166
ГЛАВА 10. БЕССЫ ВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ
Продолжение табл. 10.1
MCDB MCDB MCDB MCDB MCDB MCDB WAJC MCDB
Среда 110 131 170 202 302 402 404 153 Iscove’s LHC-9
Тип клеток Фибро- Эндо- Элите- Эмбрио- Клетки Клетки Эпителий Kepa- Клетки Брон-
бласты тел ий ЛИЙ МО- нальные CHD зтз предста- ТИНО- лимфо- хиаль-
легкого сосудов лочной фибро- тельной циты идного ныи
чело- чело- железы бласты железы1 проис- элите-
века века цыпленка хожде- ЛИИ
НИЯ
Ссылки Bcttger Knedler Ham- McKeehan Hamil- Shipley МсК- Peehi Iscove & Lech-
et al.. & Ham, гл ond et & Ham, ton А & Ham, eehan et & Ham, Melchers, пег &
Bettger 1987; aL, 1984 1976b Ham, 1983 aL, 1984; 1980 1978 LaVeck,
et al.. Gupta et 1977 Chap- 1985
1981 aL, 1997 ronlere
& McK-
eehan.
198Б
Компоненты Мол.
вес
Неорганические соли
CaCI, 147 1ОЕ-ОЗ 1.6E-03 2.0E-03 2 ОЕ-ОЗ 6 0Е-04 1 ЬЕ-03 1.3E-04 3 OE-05 1 5Е-03 1 1Е-04
KCI 75 50E-O3 1.0Е-03 3.0E-03 3 ОЕ-ОЗ 3 ОЕ-ОЗ 1 ОЕ-ОЗ 1.5E-03 1 5E-03 4 4Е-03 1.5Е-ОЗ
KNQ, 160 7 5Е-07
МдС12 203 60E-04
MgSO, 247 1 ОЕ-ОЗ 1.0E-02 1 5Е-03 8 0Е-04 8.1Е-04
NaCI 58 1 IE 01 1 IE-01 1 2Е-01 1 2Е-01 1.2E-01 7 7Е-02
NaHCO:i 84 1.4E-02 1 4Е-02 1.4E-02 3.6Е-02
NAzHPO, 120 3OE-O3 59E-04 5 0Е-04 5 0Е-04 2.0E-03 1 ОЕ-ОЗ
Микроэлементы
CuSOt5H,O 160 10E-09 75E-09 1 0Е-09 5 0Е-09 1 0E-09
FeSO( 278 5OE-O6 1 0E-06 5 0Е-06 1 0Е-06 50E-06
MnSO, H2O 169 10E-09 1.2E-09 5 0Е-10 1 0Е-09 1 (IE-09
(NH4)0MOjO2i 1236 10E-09 30E-09 1 0Е-09 3 0Е-09 1 (IE-09
NiCI2 238 50E-10 1.2E-10 5 0Е-12 ЗОЕ-10 50E-10
H,SeQ( 129 3 OE-08 3 0Е-08 10Е-08 3 OE-08 1 0Е-07
Na,SiO, 122 5OE-O7 2.3E-05 5 0Е-07 1 0Е-05 50E-07
SnCI, 190 50E-10 5 0Е-12 5 (IE-10
NH,VO3 117 5OE-O9 5 IE-09 5 0Е-09 50Е-09 50E-09
ZnSO, 7H2O 288 50E-07 1 (IE-09 1 0Е-07 1 0Е-06 50E-07
Липиды и предшественники
Холестерол 387 76E-06
Этаноламин 61
.'нолевая кислота 280 2 0Е-07 3 ОЕ-07
Лшюевая кислота 206 1 OE-08 1 (IE-08 1 0Е-08 1 0Е-08 1 OE-Ob
Фосфоэтаиоламнн 141
Соевый лецитин. 6
мкг/мл
Соевый липид, 50
мкг/мл
Сфннгомне лпн, I
мкг/мл
Гормоны и факторы роста
ЕС|.нг/мл 30 25
Эпинефрин 183
Г цдрокортилиг 36> 50E-07 5.0E-07
Инсулин, мкг/мл 10
Пролактин, мкг/мл 1
PGE, 355 25E-O8
Трийодтиронип 673
Нуклеозиды и т.д.
Аденин SO, 184 10E-05 1 0E-06 1 0Е-06 1ОЕ-06 1.8E-04
1ипоксантип 136
10.1. Недостатки сыворотки
167
Окончание табл. 10.1
Тип клеток Среда MCDB 110 Фибро- бласты легкого века MCDB 131 Эндо- телий сосудов MCDB 170 Эпите- лий мо- лочной железы MCDB 202 Эмбрио- нальные фибро- бласты цыпленка MCDB 302 Клетки CHO MCDB 402 Клетки 3T3 WAJC 404 Эпителий предста- тельной железы1 MCDB 153 Iscove’s Клетки лимфо- идного проис- LHC-9 хиаль-
Ссылки Bettger Knedler Ham- McKeehan Hamil- Shipley McK- Peehl Iscove & Lech-
et aL, & Ham, mond et & Ham, ton & & Ham, eehan et & Ham, Melchers, ner &
Bettger 1987; aL, 1984 1978b Ham, 1983 aL, 1984; 1980 1978 LaVeck,
et aL, Gupta et 1977 Chap- 1985
1981 aL, 1997 roniere & McK- eehan,
1986
Компоненты Мол.
вес
Тимидин 242 3.0E-07 1 OE-07 3.0 E 07 1 0E-06 3 OE-Oti
Компоненты энергетического обмена
D-глюшма 180 4 0E-03 5 6E-03 «0Е-03 5.5E-03 6 0E-03 25E-02
Фосфоенолпируват 100 1 0E-05
Ацетат натрия ЗН.,О 136 10E 3.7E-03 3.7E-03
llnpyuai натрия по 1 OE-03 1 0E-03 5.0E-04 11E+02 50E-04
Другие компоненты Холерный токсин 2 OE-10
HEPES. натриевая S.0E-02 3.0E-02 2.8E-02
соль
Феноловый красный 3.3E00 3 3E-05 3 .IE-06 3..IE-06 3.3E-05 3 3E-05
Путресцин 2HCI Белковые добавки 1 0E-09 1 2E-09 1 0E-09 1 0E-06 1 0E-09 1 0E-06
ВРЕ, мкг бетка/мл’ BSA, мг/мл Диализованная FB3, 70 25
мкгР/ыл
Трансферрин, Ее*’ насыщенный. Газовая фаза СО, 2"i 2”.
1 С.мгцри latoKc полную PFMR-4A [Pcehl, 2002]
2 Можно использовать растворимые ана.101 и гидрокортизона, такие как дексаметазон
3 ВРЕ можно заменить овечьим пролактином. Концентрации в основном указаны молярные, использован компьютерный стиль
обозначении, например З.ОЕ-2 = 3.0x10 = 30 мМ Для основных компонентов указан молекулярный вес, хотя некоторые из
них присутствуют в виде солей или в гидратированной форме. Сокращения- ВРЕ экстракт ипофиза быка, BSA бычин
сывороточный альбумин, EGF эпидермальный фактор роста. FBS эмбриональная бычья сыворотка См ссылки в тексте.
блемы могут возникнуть в любое время, ограничивая
и количество сыворотки, и выбор среди разных партий
сыворотки. Особенно острой эта проблема становится в
условиях высокого спроса В настоящее время спрос на
сыворотку повышенный и будет возрастать до тех пор,
пока большинство покупателей сыворотки не начнут
использовать в своей работе бессыворт очные среды.
Хотя исследовательская лаборатория может резервиро-
вать в среднем 100—200 л сыворотки в год, коммерческая
биотехноло!ическая лаборатория может использовать
такое количество (или больше) за неделю
Последующая обработка продукта. Присутствие
сыворотки создает большие трудности при очистке
продукта и даже может препятствовать фармацевти-
ческому одобрению продукта.
Контаминация. Сыворотка часто контаминиро-
вана вирусами, мноте из которых хотя и не опасны
для культуры клеток, но являются дополнительным
неизвестным фактором, которые невозможно контро-
лировать (Merten, 1999J. К счастью, усовершенство-
вание методов стерилизации сыворотки практически
исключили риск за]>ажения мико|ыазмой из сыворотки
наиболее уважаемых поставщиков, но вирусная инфек-
ция остается проблемой, несмотря на утверждения, что
некоторые фильтры могут задерживать вирусы (Pall
Gelman). Из-за риска распространения бычьего iy6-
168
ГЛАВА 10. БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ
чатогоэнцефалита среди крупного рогатого скота, для
культур клеток и сыворотки, доставленной в Соеди-
ненные Штаты и Австралию, требуется информация
о стране происхождения и номере серии сыворотки.
Сыворотка крупного рогатого скота из Новой Зелан-
дии, ио-видимому, контаминирована эндогенными ви-
русами в значительно меньшей степени, так как многие
вирусы крупного рог атиго скота Европы и Северной
Америки в Новой Зеландии не обнаружены.
Стоимость. Стоимость часто называют одним из
недостатков применения сыворотки. Безусловно, сыво-
ротка является самой дорогой составляющей в бутыли
со средой (она более чем в 10 раз дороже всех остальных
химических компонентов), но при замене сыворотки
компонентами определенного химического состава стои-
мость среды может возрасти даже больше, чем в случае
применения сыворотки. Однако, так как потребность в
таких компонентах, как трансферрин, селен, инсулин
и т.д., возрастает, цена, по-видимому, будет снижаться
с увеличением рынка сбыта, и бессывороточные среды
станут относительно дешевле. Досгуи ность рекомбинан-
тных факторов роста вместе с увеличением рыночного
спроса может помочь снизить их стоимость.
Ингибиторы роста. Кроме стимуляторов роста сы-
воротка содержит uhi ибиторы роста, и хотя стимули-
рующий рост эффект сыворотки обычно преобладает,
конечный эффект сыворотки - это непредсказуемая
комбинация как иншбирования, так и стимуляции
роста. Хотя вещества, такие как PDGF, могут быть
митогенами для фибробластов, другие комионенты
сыворотки могут быть цитостатиками. Гидрокорти-
зон. который присутствует в фетальной сыворотке
в концентрации приблизительно 1х10-кМ, является
ци гостатиком для мног их типов клеток, таких как глия
[Guneretal., 1977] и легочный эпителий [McLean el al.,
1986], растущих в высокой илотности (хотя он может
быть митогеном для клеток в низкой плотности), и
TGF-p, продуцируемый тромбоцитами, является ци-
тостатиком для мног их эпителиальных клеток.
Стандартизация. Вариации в качестве сыворотки
от партии к партии затрудняют стандартизацию экспе-
риментальных и промышленных протоколов как в раз-
личное время, так и между разными лабораториями.
10.2. ПРЕИМУЩЕСТВА
БЕССЫВОРОТОЧНЫХ СРЕД
Все перечисленные выше п|х>6лемы могут быть разре-
шены путем удаления сыворотки и других продуктов
животного ироисхождения из сыворотки. Кроме того, бес-
сывороточные среды имеют два главных преимущества.
10.2.1. Селективные среды
Одно из главных преимуществ, которое дают бессыво-
роточные среды, — это возможность приготовления се-
лективных сред для индивидуальных типов клеток (см
табл. 10.1 и 10.2). Так рост фибробластов в культурах
клеток молочной железы и кожи можно инг ибировать,
используя среду MCDB 170 [Hammond el al., 1984J and
153 [Peehl and Ham, 19801, меланоциты можно культи-
вировать в отсутствие фибробластов и кератиноцитов
[Naeyaerl et al., 19911. Подобрав правильные факторы
роста пли группу факторов, можно выделить гематопо-
этические клетки определенного происхождения и даже
на одной стадии развития (см. разд. 23.4). Мног ие из
этих селективных сред сейчас коммерчески достуины
вместе с культурами клеток, для которых эти среды
подобраны (см. табл. 10.4).
10.2.2. Регуляция пролиферации
и дифференцировки
Бессывороточные среды позволяют не только создать
оптимальные условия для индивидуальных типов
клеток, но и дают возможность создавать условия как
для роста клеток, так и для их диффе|>енцировки путем
изменения концентрации и типов факторов роста и
других индукгоров роста и дифференцировки.
10.3. НЕДОСТАТКИ БЕССЫВОРОТОЧНЫХ
СРЕД
У бессывороточных сред имеются и недостатки:
1) Многообразие сред. Каждый тип клеток, ио-ви-
димому, требует среду определенного состава, и
культуры клеток, полученные из опухолей, могут
проявлять разные требования к составу среды,
даже если они были получены из опухолей одного
типа. Хотя эта степень специфичности может быть
преимуществом, г позволяющим выделять специфи-
ческие типы клеток, тем не менее в лабораториях
существует проблема при культивировании клеточ-
ных линий разного происхождения.
2) Селективность. К сожалению, переход к бессыво-
ротпчным средам, как бы это ни было желатель-
ным, не является таким простым, как это кажется.
Применение некоторых сред может приводить к
появлению сублиний, которые не являются типич-
ными для основной иоиуляции клеток. Даже для
иос гоянных клеточных линий может потребовать-
ся дополнительная селекция. Клетки на разных
стадиях развития (наиример. стволовые клетки и
коммитированные клетки-иредшественники) мог ут
нуждаться в средах разного состава, в особенности
факторов роста и цитокинов.
3) Чистота реагентов. Отсутствие в среде сыворотки
значительно повышает требования к чистоте реаген-
тов и воды, а также к чистоте аппаратуры, так как
сыворотка обладает защитным и ангитоксичным
действием за счет некоторых белков. Хотя исклю-
чение этого защитного действия, без сомнения,
желательно, но достичь его при использовании
сыворотки не всегда удается.
10.3. Недостатки бессывороточных сред
169
Таблица 10.2. Примеры бессывороточных сред; Дополненные основные среды
Среда HITES ACL-3 N3 G3 К-1 К-2
Ссылки Carney et Masui et al.. Masui et Botten- Michler- Taub, Taub, Chopra & Robert- Naey-
aL, 1981 1986 al., 1986b 1984 Stuke & Bot- tenstein, 1982 1984 1984 Xue-Hu, 1993 son & Robert- son,1995 al., 1991
Тип клеток Мелко- Немелко- Адено- Нейроб- Клетки МОСК LLC-PK Около- Предста- Мела-
клеточная клеточная карци- ластома глии (почка (почка ушная тельная ноциты
карцинома легкого человека карцинома легкого человека легкого человека LA-N-1 крысы собаки) свиньи) железа человека железа человека челове-
Основная среда RPMI 1640 RPMI 1640 DM ЕМ F12 DMEM/ F12 DM ЕМ DMEM F12 DMEM/ F12 MCDB 153 txMEM, F12 М199
Добавки
ArgVP, 10
мкЕд, мл
ВРЕ, мкг бел- 25 25
ка/мл
BS А. мкг/мл 5.0 03
EGF. нг/ мл 10 10 10 1
FGF-2 (основ-
нон FGF) 10
Hl M.I
Na,ScO3 ЗОЕ-08 25Е-08 2.5Е-08 3.0Е-08
Г шрокортизон 10Е-08 50Е-08 50Е-08 20Е-07 1.4Е-06 1 0Е-06 1 4Е-06
Глутамин (до- 2 ОЕ-ОЗ 2 ОЕ-ОЗ
полни ic-льно)
Глюкагон, 0.2
мкг. мл
Инсулин, 50 20 0 5.0 50 05 50 250 5.0 5.0 100
мкг. мл
Пируват Na (до- 50Е 04
полни гсльно)
Прогестерон 20Е-08 2 0Е-07
Пролактин
Проста| ландин 70Е 08
Е1
Пучрссцин 10Е-04 1.0Е-07
Тироксин 4.5Е-07
Трансферрин,
насыщенный Fc3 мкг'мл 100 10 50 100 5 10 5 10
Трийодзиронин 10Е-10 5.0Е-10 4.9Е-07 50Е-12 10Е-09 1.0Е-09
Фпсфоэ1анол- I 0Е-04
амин
Холерный 1.UE-09
1оксин
Холссгерол 1.0E-U8
Эпинефрин
Эстрадиол 10Е-08
Этанолакшн 50Е-07 1 ОЕ-ОЗ
Большинство концентрации молярные, использован компьютерный стиль обозначений, например З.ОЕ-2 = 30x10 = 30 мМ
Для основных компонентов указан молекулярный вес, хотя в некоторых составах используются соли в гидратированной форме,
молярность остается прежней Единицы размерност и указаны в колонке с наименованиями компонентов в тех случаях, i де не
используется молярная концентрация. Moi ут быть использованы растворимые аналоги гидрокортизона, такие как дексаметазон
Arg VP — аргинпн-вазоирессцн, ВРЕ экстракт гипофиза быка, BSA — бычий сывороточный альбумин, EGF — эпидермальный
фактор роста, FBS — эмбриональная бычья сыворотка, FGF — факюр роста фибробластов.
170
ГЛАВА 10. БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ
4) Пролиферация клеток. На бессывороточных средах
клетки часто растут медленнее, и перевиваемые
линии клеток дают меньше поколений.
5) Доступность. Несмотря на постоянное усовершен-
ствование, возможность использования бессыворо-
точные среды контролируемого должным образом
качества значительно ограничена, а стоят такие
среды значительно дороже традиционных сред.
10.4. ЗАМЕНА СЫВОРОТКИ
Необходимые факторы сыворотки уже были описаны
ранее (см. 1л. 9.6). К ним относятся: 1) факторы ад-
гезии, такие как фибронектин; 2) пептиды, такие как
инсулин. PDGF и TGF-0, которые регулируют рост
и дифференцировку; 3) необходимые питательные
компоненты, такие как неор1анические соединения,
витамины, жирные кислоты и их метаболиты и 4) гор-
моны, такие как инсулин, гидрокортизон, эстрогены
и трийодтиронин, которые регулируют мембранный
транспорт, фенотипический статус и строение клеточ-
ной поверхности. Некоторые из них входят в состав
бессывороточных сред, те же, которые не входят, инотда
требуется добавлять дополнительно (иногда требуется
оптимизация).
10.4.1. Компоненты для бессывороточного
культивирования
Факторы адгезии. В отсутствие сыворотки может
возникнуть необходимость обработать поверх-
ность пластика фибронектином (25 50 мкт/мл)
или ламинином (1 5 мкг/мл), которые добавляют
непосредственно в среду [Barnes el al., 1984а; см.
протокол 23.9]. Было показано, что предваритель-
ная обработка пластика цоли-Ь-лизином (1 мт мл)
повышает выживаемость диплоидных фибробластов
человека [McKeehan & Ham, 1976а; see also Section 8.4
and Barnes el al., 1984а].
Ингибиторы протеаз. После пересева клеток с
помощью трипсина добавление сыворотки uhi ибиру-
ет протеолитическую активность остатков трипсина.
Следовательно, при использовании бессывороточных
сред, необходимо добавлять ингибиторы протеаз,
такие как uhi ибитор трипсина из сои или аиротинин
(0 1 mi/мл. Sigma) при пересеве клеток. Кроме того,
неочищенный трипсин представляет собой сложную
смесь протеаз и для иш ибирования некоторых из этих
протеаз moivt потребоваться и другие ишибиторы.
Поэтому предпочтительней использовать очищенный
трипсин (например, Sigma Gr. Ill) и далее применять
иш ибитор трипсина. Альтернативой применения
иншбиторов может служить однократная промывка
клеток и осаждение их центрифу! ированием для уда-
ления трипсина.
Трипсин и другие протеазы. При триисинизации
клеток, растущих на бессывороточной среде, может
потребоваться особая тщательность, так как клетки
становятся более уязвимыми. Возможно, придется
использовать раствор кристаллически! о очищеннш о
трипсина и охладить его до 4 "С, чтобы уменьшить
повреждения клеток [McKeehan, 1977]. Для топ» чтобы
избежать контакта клеток с продуктами животною
происхождения, можно использовать альтернативные
источники протеаз. Очищенный свиной трипсин мож-
но заменить рекомбинантным трипсином (TrypLE™,
Invilrogen; TrypZean, Sigma). Также можно использо-
вать протеазы не животного происхождения (напри-
мер, Acculase™ or Ассшпах™, Sigma). Приказа, Дисцаза
и коллагеназа являются бактериальными протеазами,
и для их удаления требуется центрифугирование.
Возможно, цроназу можно инактивировать просто
разведением в бессывороточной среде без последую-
щей нейтрализации [McKeehan, личное сообщение].
Прона»а очень эффективна, но может проявлять ток-
сичность для некоторых клеток; дисцаза и колла! ена-
за не позволяют получить суспензию из одиночных
клеток при их использовании для рекультивирования
эпителиальных клеток.
10.4.2. Гормоны
К гормонам, используемым для замены сыворотки,
относят гормон роста (соматотропин) в концентрации
50 hi мл, инсулин 1 -10 Ед/мл, которые повышают
эффективность посева ряда клеток различных типов,
и 1 идрокортизон, который улучшает эффективность
клонирования глиальных клеток и фибробластов (см.
табл. 10.1 и 10.2 и разд. 14.2.1) и, как было показано,
необходим для культивирования эпидермальных
кератиноцитов и некоторых друшх эпителиальных
клеток (см. разд. 23.1.1). Barnes и Salo [1980] писали,
что для клеток MDCK (почка собаки) необходимой
добавкой является трийодтиронин (Т;|, 10 пМ). Также
он может применяться при культивировании легочного
эпителия [Lechner & LaVeck, 1985; Masuielal., 1986b],
Было показано, что для культивирования эпителия
молочной железы необходимы различные комбинации
эстрогенов, андрогенов или прогестерона с i идрокор-
гизоном и пролактином (концентрация около 10 нМ)
[Klevjer-Anderson & Buehring, 1980; Hammond el al.,
1984, Strange et al., 1991; Lee el al., 1996].
Было показано, ч го д ру i ие гормоны, действие ко-
торых обычно не связывают с клеточной активностью,
мшут быть эффективны в условиях отсутствия сыво-
ротки, например фолликулостимулирующий i ормон
(FSH) эффективен в отношении меланомы мыши В16
[Barnes and Sato, 1980]. Возможно, имеется гомолошя
определенных последовательностей между стимули-
рующими рост клеток полипептидами и хорошо изу-
ченными пептидными гормонами. Дру1 им возможным
вариантом может быть расщепление (или протеолиз)
некоторых больших белков или полипептидов с вы-
свобождением активных пептидов с совсем друтми
функциями.
10.5. Выбор бессывороточной среды
171
10.4.3. Факторы роста
Семейство полипептидов, которые, как было обнару-
жено, moivt проявлять митогенные свойства in vitro,
довольно обширно (табл. 10.3) и включает в себя гепа-
рин-связывающие факторы роста (включая семейство
FGF), EGF, PDGF [Barnes et al., 1984а, с], IGF-I и II
и интерлейкины [Thomson, 1991J, которые проявляют
активность в диапазоне концентраций 1-10 hi мл
Факторы роста и цитокины обладают широкой спе-
цифичностью, за исключением факторов, влияющих
на гематопоэтическую систему [Barnes et al.,1984d;
см. также разд. 23.4J. Фактор роста кератиноцитов
(KGF) [Aaronson et al., 1991J проявляет активность не
только в отношении эпидермальных кератиноцитов,
но также индуцирует пролиферацию и дифференци-
ровку эпителия предстательной железы [Planz el al.,
1998; Thomson et al., 1997J. Фактор роста гепатоцитов
(HGF) [Kenworthy el al., 1992J является mhtoi еном для
гепатоцитов, а также индуцирует морфогенез почечных
канальцев. [Furue & Saito, 1997; Montesano el al., 1997;
Balkovelz & Lipschulz, 1999J. Факторы роста и цито-
кины проявляют свою специфичность посредством
того, что их биосинтез локализован в определенных
клетках и тканях, и, таким образом, они имеют ojpa-
ниченную область распространения. Большинство из
них действуют как паракринные факторы (активные в
отношении соседних клеток) и не способны к систем-
ному распространению в крови.
Факторы роста могут действовать синершчно или
аддитивно Apyi с другом или с другими гормонами и
паракринными факторами, такими как проста] лаидин
F2a и । идрокортизон [Westennark & Wasleson, 1975;
Gospodarowicz, 1974J. Например, эффективность
действия интерлейкина 6(IL-6) и онкостатина М на
клетки А549 зависит от дексаметазона, синтетического
анало| а i идрокортизона [McCormick el al., 1995,2000J,
который индуцирует образование гепарин сульфа*]
протеогликана (HSPG) [Yevdokimova & Freshney.
19971. Необходимость в гепарине или HSPG впервые
была обнаружена для FGF (Klagsbrun & Baird. 1991|,
но, возможно, этот механизм является более общим.
Например, было показано, что bi лмкан учавствует в
клеточном ответе на TGF-£ [Lopez-Casillas el al., 1993 [.
Для активации некоторых факторов роста необходим
chi нал от дру] ого фактора роста [Phillips and Chrislo-
falo, 1988]; например, бомбезин не является сам по себе
mhtoi еном для нормальных клеток, для проявления его
митогенной активности требуется одновременное или
предварительное воздействие инсулина или одно] о из
IGF [Aaronson el al., 1991]
10.4.4. Питательные вещества сыворотки
Железо, медь и ряд неорганических соединений входя?
в состав бессывороточных сред, хотя данных о пот-
ребности в некоторых редких соединениях пока нет.
В большинство прописей сред входит селен (Na2SeO3) в
концентрации около 20 нМ. По-видимому, необходимо
включение в среды липидов или их предшественников,
таких как холин, линолевая кислота, этаноламин или
фосфоэганоламин
10.4.5. Белки и лолиамины
Включение в состав среды белков, таких как бычий сы-
вороточный альбумин (BSA) или тканевые экстракты,
часто способствует клеточному росту и выживаемости,
но добавляет неидентифицированные компоненты в
среду. Кроме того, при этом остается проблема случай-
но] о внесения инфекционных агентов.
К экстрактам тканей относят экстракт i ипофиза
быка, используемый для культивирования керати-
ноцитов в бессывороточной среде, но его, возможно,
можно заменить рекомбинантными факторами роста.
BS А. свободные жирные кислоты используются в кон-
центрациях 1 10 mi мл. Трансферрин в концентрации
около 10 нг мл требуется как переносчик железа и так-
же может выполнять функцию митогена Путресцин
используется в концентрации 100 нМ.
10.4.6. Матрикс
Одним из свойств сыворотки является обеспечение
клеток белками, такими как фибронектин, которые
покрывают пластик и делают его более адгезивным (см.
разд. 10.4.1, 8.4.1). В отсутствие сыворотки пластико-
вую подложку и hoi да бывает необходимо покрывать
фибронектином (см. протокол 23.9) или коли лизи-
ном [McKeehan & Ham, 1976а] (см. табл. 10.1 и 10.2 и
разд. 14.2.1).
10.5. ВЫБОР БЕССЫВОРОТОЧНОЙ
СРЕДЫ
Если причиной для использования бессывороточной
среды является задача стимулировать селективный рост
индивидуального типа клеток, то в этом случае именно
эта причина будет определять выбор среды (например,
MCDB 153 для эпидермальных кератиноцитов, LHC-9
для бронхиального эпителия, HITES для мелкокле-
точного рака ле] кого, MCDB 130 для эндотелия и т.д.;
см. табл. 10.1 и 10.2). Если причина состоит попросту
в стремлении избежать использования сыворотки при
культивировании постоянных клеточных линий, таких
как клетки СНО или гобридомы, для того чтобы сни-
зить вероятность контаминации продукта вирусными
или сывороточными белками, то в этом случае выбор
среды будет шире, и выбирать можно будет среды у
нескольких коммерческих производителей (табл. 10.4).
Если линия клеток получена от ее создателя или из
банка клеток с хорошей репутацией, поставщик обыч-
но рекомендует подходящую среду, и единственной
причиной не использовать рекомендованную среду
172
ГЛАВА 10. БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ
Таблица 10.3. Факторы роста и митогены
Название и синонимы Аббревиа- тура Молекулярная масса (кДа) Источник* Функция
Кислым фактор роста фиб|юбластов, aFGF, Гсоаринсвязыеающий фак- FGF-1 13 re Мозг быка, гипофиз Митоген для эндотелиальных клеток
тор роста 1. HBGF-1, фактор роста эндотелиальных клеток (ECGF), фактор роста миобластов (MGF)
Активин, семейство TGF-p Гонады Индуктор морфогенеза, стиму- лирует секрецию FSH
Ahi иогснин 16 Фибробласты, лимфо- циты, эпителиальные клетки кишечника Ангиогенный фактор, митоген для эндотелиальных клеток
Астроглиальный фактор 1, член се- мейства кислых FGF AGF-1 14 Мозг Митоген для астрся лиальных клеток
Астрот анальный фактор рос та 2, член семейства основных FGF AGF-2 14 Моз! Митоген для астроглиальных клеток
Основной фактор росса фиброблас- тов. bFGF. HBGF-2. прошатрииин FGF-2 13 re Мозг быка, гипофиз Мгноген для многих мезо- дермальных и нейроэкто- дермальных клеток; ин- дуктор дифференцировки адипоцитов и гранулезных клеток яичника
Нейротрофический фактор мозга BDNF 28 Моз! Выживаемость нейрональных клеток
Кахсктин TNF-ct 17 Моноциты Катаболическое действие; ка- хексия, шок
Холерный токсин Цилиарный нейротрофический фак- XT CNTF 80-90 Холерная палочка Митоген для некоторых нор- мальных эпителиальных клеток
тор. член Семенетва 1L-6
Фактор роста эндотелия, семейство ECGF гл Рекомбинантный М1ПОГСНСЗЭНД111С шя
кислого FGF
Добавки для роста эндотелия,- смесь ECGS Гипофиз быка Митогенез эндогелия
эндотелиальных митогенов
Эндотоксин Бактерии Стимулирует секрецию TNF
Эпидермальный фактор роста, уро- гастрон EGF 6 Подчелюстные слюн- ные жсчсэы мыши, моча человека, пред статсльная железа морской свинки Активный транспорт, синтез ДНК, РНК. белка, мито- ген для эпителиальных и фибробластоидных клеток, действует синсршчнос IGF- 1 u TGF-p
Эритропоэтин EPO 34-39 гл Околоклубочковые клетки почки Индукция пролиферации и дифференцировки эритро- идных предшественников
Фактор роста глаза 1; член семейства EDGF-1 14 Глаз
основного FGF
Фактор роста глаза 2; член семейства EDGF-2 14 Глаз
кислого FGF
Фактор роста фибробластов 3, про- дукт онкогена int-2 FGF-3 14 гс Опухоли молочной же- Митоген, индуктор морфоге- неза. ашиогенный фактор
int-2 oncogene
Фактор роста фибробластов 4. про- дукт онкогена list, KS3 FGF-4 14 гс Эмбрион.опухоли Митоген, индуктор морфоге- неза. ангиогенный фактор
oncogene
Фактор роста фибробластов 5 FGF-5 14 гс Фпб|х1блас гы, эпители- альные клетки, опу- холи F Митоген, индуктор морфоге- неза. аш иогенный фактор
Фактор роста фибробластов 6, про- дукт онкогена hst-2 FGF-6 14 гс Половые железы; сердце, мышцы Митоген для фибробластов, индуктор морфогенеза
10.5. Выбор бессывороточной среды
173
Продолжение табл. 10.3
Название и синонимы Аббревиа- тура Молекулярная масса (кДа) Источник' Функция
Фактор роста фибробластов 9 FGF-9 14 re Рекомбинантный
Фактор роста фибробластов 10 FGF-10 Инвазия трофобласта, сти- мулирует иРА и PAI-1. ми- тоген для альвеолярного эпителия
Гранулоцитарный колонггсстиму - лирующий фактор, плюрнпоэтин; CFS-P G-CSI 18 22 Стимулирует пролиферацию предшественников грану- лоцитов
Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; CSA. человеческий CSFct Гепаринсвязываюгций EGF-иодобный фактор factor GM-CSF HB-EGI 14 35 гл Рекомбинант ныи Стимулирует пролиферацию предшественников грануло- цитов/ макрофагов
Фактор роста гепатоцитов, HBGF-8; Фактор рассеивании HGI ГС Фибробласты Стимулирует морфогенез эпи- телия. пролиферацию гепа- тоцитов
Гсрсгулин. лиганд егЬВ2 HRG 70 Опухоли молочней! же- лезы, рекомбинант- Клетки молочной же тезы и дру- гие эпителиальные клетки
Фактор активации .макрофагов MAI 20 25 Активированные лим- фоциты Антивирусная активность,- активация макрофагов
Ингибин; член семейства TGF-0 31 гл Яичники Индукгор морфогенеза, инги- бирует секрецию FSH
Инсулин Инсулиноиодобный фактор роста 1; соматомедин-С. NSILA-1 Ids IGF-1 6 Клетки 0-см.тровков под- желудочной железы Захват глюкозы и окисление, захват аминокислот; глико- неогенез Опосредует денегвис гормона роста на сульфатирование хряща, инсулиноподобная активность
Инсулиноподобный фактор роста 2; MSA у крыс IGF-2 7 Среда, кондициони- рованная клС1кам« BRL-3A Опосредует эффект гормона роста на сульфатирование хряща, инсулиноподобная активность
Интерферон-al; лейкоцитарный интерфдюн IFN-«1 18 20 Макрофаги Антивирусная активность, индукгор дифференциров- ки, противоопухолевая ак- тивность
Интерферон-а2: лейкоцитарный интерферон IFN-a2 18 20 Макрофаш Антивирусная активность, индукгор дифференциров- ки, противоопухолевая ак- тивность
Интсрферон-p, фибробластный ин- терферон lFN-pi 22 27 гл Фибробласты Антивирусная активность, индукгор дифференциров- ки, противоопухолевая ак- тивность
Интсрфсрон-р2, фибробластный интерферон, IL-6. BSF-2 (смотри также IL-6) IFN-02 22 27 гл Ак1ивированныс Т-клетки. фибро- бласты, опухолевые клегки Индуктор дифференциров- ки кератиноцитов и PC 12 (смотри также IL-6)
Интерферон Y иммунный интерфе- IFN-y 20-25 Акт ивированныс лим- фоцигы Антивирусная активность, ак- тивация макрофагов, анти- нролиферативнос действие на трансформированные клетки
Ин1Срлейкин-1, фактор активации лимфоцитов (LAF), факгор акти- вации В-клсток (BAF): гематоио- IL-1 12-18 Активированные мак- рофаги Индуцирует секрецию IL-2
174
ГЛАВА 10. БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ
Продолжение табл. 10.3
Название и синонимы Аббревиа- тура Молекулярная масса (кДа) Источник* Функция
Интсрлсйкин-2, факгор |юста Т-клс- ток (TCGF) IL-2 15 CD4+vc лимфоциты (NK), мышиная LBRM-5A4 и челове- ческая Jurkat FHCRC линии клеюк Поддерживает рост активиро- ванных Т-клеюк, стимули- рует клетки LAK
И НТСрЛСЙК1|Н-3, Мул ЬТИиОТСНТИЫЙ колониестимулирующий фактор, фактор роста тучных клеток IL-3 14-28 гл Активированные T-K.ICTKH, мисломо- ноццтарная линия клс юк WEHI-ЗЬ Поддерживае т рост и диффе- ренцировку гранулоцитов/ макрофагов
Интсрлейкин-4, фактор роста В-клс- ток. BCGF-L BSF-1 IL-4 15-20 Активированные CD4+vc лимфоциты Фактор компетентности для зрелых В-клеток, способ- ствует созреванию тучных клеток (вместе с IL-3)
Интерлейкин-5, Т-клсточный заме- щающий фактор (TRF), фактор дифференцировки эозинофилов (EDF) BCGF-2 IL-5 12-18 гл 1 лимфоциты Фактор дифференцировки эозинофилов, фактор про- лиферации активированных В-клеток
Интерлсйкин-6, интерферон р-2, фак- тор стимуляции В-клеюк (BSF-2), фактор стимуляции гепатоцитов, фактор роста гибридом-плазма- IL-6 22-27 гл Активированные Т-клетки Индукция синтеза белков ост- рой фазы, дифференцировка В-клсток , кератиноцитов, РС12
циэом
И нтсрлсйкин-7; гсмат опоэтичсский фактор роста, лимфоиоэт ин 1 IL-7 15-17 гл Строма костною мозга Фактор |юста пре- и иро- В-клеток
Интерлейкин-8, моноцитарный фактор хемотаксиса нейтрофилов (MDNCF), фактор хемотаксиса Т- кле 1<>к. акт ивпрующий нейч рифилы белок (NAP-1) IL-8 8-10 гс Стимулированные Л ПС моноциты. Сти- мулированные ФГА лимфоциты, эндо- телиальные клетки. стимули|юванныс 1L- 1 и TNF фибробласты и ксратиноциты Фак । ор хсмо таксиса для нейтрофилов, базофилов и Т-клсток
Интерлейкин-9. Р-40 человека, фак- тор роста Т -хелперов мыши, фактор ак| пватш тучных клеюк (ME А) IL-9 30-40 CD4+vc Т-клетки, сти- мулированные анти- телами к CD4, ФГА или РМА Фактор роста Т-хелперов, мегакариоцитов, тучных клеток (вместе с IL-3)
Интерлейкин- Ю.факшр ишибирова- IL-10 20 Иммуносупрессор
ния синтеза цитокинов (CSIF)
Интерлейкин-11. IL-11 21 Стимулирует пролиферацию плазмацитомы и зависимое <>1 Т-клеток развитие Ig-ttpo- дуцирующих В-клсток
Интерлейкин-12, фактор созревания цитотоксических лимфоцитов IL-12 40,35 субъединицы Активирует рост Т-клсток и NK, индуцирует секрецию IFN-y
Фактор роста кератиноцитов, FGF-7 KGF Фибробласты Индукция пролиферации и дифференцировки ксратн- нощпов и эпителия прсдста- ельной железы
Лейкемический ингибиторный фак- тор, HILDA; член семейства IL-6 LIF 24 Клетки SCO cells Ингибирует дифференциров- ку эмбриональных стволо- вых клеток
Липополисахарид LPS 10 Г рамиоложнтельныс бак|срии Активация лимфоцитов
Лимфотоксин TNF-p 20-25 Лимфоциты Цитотоксичность для опухоле- вых клеток
Макрофа1альный белок восиалс- М|Р-1а 10 Макрофа! и Ин i ибнтор рос га гематопоэти- ческих стволовых клеток
10.5. Выбор бессы воротом ной среды
175
Окончание табл. 10.3
Название и синонимы Аббревиа- тура Молекулярная масса (кДа) Источник' Функция
Моноцигарно-макрофагальный ко- лон нести мул и р у ющи и фактор, CSF-1 M-CSF 47-74 В-и Т-клстки, моноци- ты, тучные клетки, фщбробласты Индукция пролиферации и дифференцщювки предшес- твенников макрофагов
Мюллеров иш ибирующин фактор MIF Тести кулы Ингибирование развития Мюллерова протока, инги- бирование пролиферации карциномы яичника
Фак юр роста нервов, р ₽NGF 27 11 од ч елюстные сл юн- ныс железы самцов мышей Трофический фактор, хемо- таксический фактор, фак- тор дифференцировки, спо- собствует росту нейритов нейронов периферической нервной системы
Онкостатин М, член семейства IL-6 OSM 28 Активированные Т-клстки и обрабо- танные РМА моно- Индуктор дифференциров- ки (совместно с глюкокор- тикоидами), митоген для фибробластов
Фитогемагглютинин ФГА 30 Красная фасоль (Phaseolus vulgaris) (Phascolusvulgaris) Активация лимфоцитов
Тромбоцитарны И эндотс.шал ьный фактор роста, сходный с глноста- тином PD-ECGF -70 Тромбоциты крови, фибробласты, глад- кая мускулатура С1имуляцня автогенеза,- ми- тоген для эндо । глиальных клеток, способствует выжи- ванию нейронов, ингибирует пролиферацию глии
Тромбоцитарный фактор роста PDGF 30 Тромбоциты крови Митоген для клеток мезо- дермального и нейроэкто- дермально! о происхожде- ния, способствует зажив- лению ран, действует в синергизме с EGF и IGF-1
Форбол миристаг ацпат, ТРА, фор- боловый эфир РМА 0 617 Масло кротона Опухолевый промогор, мнто- 1сн для некоторых эпите- лиальных клеток и мелано- цитов, фактор дифференци- ровки для HL-60 и плоского эпителия
Митоген лаконоса PWM Корень фитолакки аме- риканской Активация моноцитов
Фактор стволовых клеток, фактор роста тучных клеток, стволовой фактор, c-kit лиганд SCF 31 g Эндотелиальные клет- ки, фибробласты, КОСТНЫЙ мозг, клст ки Сертолли Способствует первому деле- нию плюрипотентных гема- топоэтических стволовых клеток
Трансферрин Tin 78 Печень Осуществляет транспорт же- леза, митоген
Транформирующий фактор роста а TGF-a 6 Индуцирует независимый от подложки рос клет ок и спо- собе вуст noiepe кле гок кон- тактного ингибирования
Транформирующий фактор роста |1 (шесть видов) TGF-pi-6 23-25 Тромбоциты крови И н гпбитор ц рол ифераци и эпителиальных клеток; ин- дуктор дифференцировки сквамозных клеток
* Под источниками подразумеваются некоторые типы тканей, из которых выделяют природные факторы Во многих случаях
природный белок заменен рекомбинантным, Koiopbiii имеется в продаже (смотри Приложение II) Сокращения (от личающиеся
от приведенных в колонке 2). 1Л гликозилированный, гс гспарннсвяэывающий, HBGF гецаринсвязывающпй фак юр
роста С разрешения из Barneset а]. [1984а], Langeetal [1991].Jenkins [1992],и Smithetal [1997]
176
ГЛАВА 10. БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ
является только невозможность ее приобретения или
ее несовместимость с друi ими исходными компонен-
тами. Если возможно, лучше всего придерживаться
рекомендаций создателя культуры, так как, возможно,
это является единственным способом гарантировать
сохранение специфических свойств данной линии кле-
ток. В табл. 10.4 суммированы данные ко пригодности
и выбору бессывороточных сред, перечисленных в
табл. 10.1 и 10.2 и добавлены несколько дополнитель-
ных советов. (См. также [Mather, 1998], [Barnes et al.,
1984a-d] n [Ham & McKeehan, 1979].)
10.5.1. Имеющиеся в продаже
бессывороточные среды
Ряд производителей (см. табл. 10.4 и Приложение И)
сейчас изготовляют бессывороточные среды. Состав
некоторых из них известен, таких как MCDB 131
(Sigma) - среда для эндотелиальных клеток, н LHC-9
(Biosource International) — для бронхиального эпите-
лия, в то время как состав друi их сред запатентован
(например, среда CHO-S-SFM для клеток СНО-К1 и
Opti-MЕМ для гематопоэтических клеток (Invilrogen)).
Мшлие среды разработаны для культур ибрндом, их
применяют в тех случаях, когда абсолютно необходимо
исключить присутствие в целевом продукте сывороточ-
ных белков, но есть п д рут ие среды, которые подходят
для друт их тиков клеток. Хотя в литературе имеются
данные по использованию запатентованных сред для
индивидуальных типов клеток (см. табл. 10.4), состав
таких сред часто является коммерческой тайной. и
вы можете только пола1аться на совет фирмы-произ-
водителя или, что лучше, проверить несколько сред,
пассируя несколько раз на этих средах свои клетки.
Последний вариант' может потребовать значительных
затрат, но будет вполне оправданным в том случае, если
вы планируете длительную работу с клетками.
Важно установить параметры контроля качества,
выполненного коммерческими производителями бес-
сывороточных сред. В идеальном варианте среда уже
протестирована на тех клетках, которые вы хотите
культивировать (например, среда для культивирова-
ния кератиноцитов должна быть протестирована на
кератиноцитах). Некоторые производители, такие как
СашЬгех, Cascade и PromoCell, поставляют соответству-
ющие клегки вместе со средой, прошедшей надлежащий
контроль качества, но другие поставщики могут про-
водить контроль качества на рутинных линиях клеток,
в этом случае вы должны перед покупкой среды сами
проверить ее качество.
10.5.2. Заменители сыворотки
Коммерческими производителями разработан ряд
продуктов для замены сыворотки целиком или час-
тично в традиционных средах. Вот некоторые из этих
продуктов: Ex-cyle( Bayer), Venlrex(JRH Biosc iences).
CPSR-1,2,3 (Sigma). Nu-seruni (Becton Dickinson), and
Biolain-MPS (Cambrex). Хотя состав этих заменителей
постоянен, что невозможно для обычной сыворотки,
однако все еще мтут проявляться различия между
разными партиями, и состав продуктов полностью
не идентифицирован. Использование заменителей
может быть полезным нри проведении специальных
экспериментов или в целях экономии, но не как заме-
на бессывороточных сред. К добавкам определенного
химического состава относятся Nulridoma (BCL), ITS
Premix, ТСМ, ТСН (ICN), SIT (Sigma), and Excell-900
(JRH Biosciences), с помощью которых можно полно-
стью или частично заменить сыворотку. Sigma продает
серию сред MegaCell среди которых MEM, DMEM,
RPMI 1640 и МЕМ или DMEM F12, обтащенные
факторами роста и дополнительными аминокислотами,
позволяющими снизить концентрацию сыворотки.
Выбор бессывороточной среды и заменителей сы-
воротки сейчас настолько велик и разнообразен, что
невозможно дать индивидуальные рекомендации для
каждой индивидуальной .задачи. Лучшим подходом
при выборе является изучение литературы, контакт с
производителями, получение наиболее подходящих (ио
литературным данным) для ваших задач образцов их
продукции и проверка продукции в ваших собственных
тестах (например, влияние на рост, выживаемость или
специальные функции).
Гидролизаты аминокислот (см. разд. 9.7.1) исполь-
зуются с целью снизить или полностью удалить сыво-
ротку при наращивании культур в крупном масштабе
для биотехноло! ического применения. Достоинство
1 идролизатов в том. что их можно стерилизовать авто-
клавированием, но состав их точно не определен.
10.5.3. Адаптация клеток
к бессывороточной среде
Многие постоянные линии клеток, такие как HeLa,
СНО-К1 или мышиные миеломы, можно адаптировать
к культивированию в отсутствие сыворотки. Процесс
адаптации включает в себя продолжительный период
отбора минорных компонентов клеточной популяции,
так как важно удостовериться, что свойства клеточной
линии не будут потеряны за время селекции.
Адаптация клеток к бессывороточной среде обычно
выполняется путем нескольких серин пассирования
с постепенным снижением концентрации сыворотки.
При достижении стабильной пролиферации клеток при
одной концентрации, клетки пассируют в среде с более
низкой концентрацией сыворотки до тех пор, пока не
восстановится стабильный рост клеток, и затем опять
понижают концентрацию сыворотки. В суспензионных
культурах контроль осуществляют путем подсчета
живых клеток и разбавляя соответственно клеточную
суспензию, нри этом возможно поддерживать мини-
мальную концентрацию клеток выше, чем при обычном
пассировании. Для монослоцных культур концентра-
цию сыворотки снижают за несколько дней до пересева
10.Б. Выбор бессы воротомной среды
177
Таблица 10.4. Выбор бессы воро точной среды
Клетки или линия клеток Бессывороточная среда (смотри табл. 10.1) Ссылки (смотри табл. 10.1 И 10.2) Коммерческие производители (специфических сред или их альтернативных вариантов)
Адипоциты Rodrigucz et al, 2004 PromoCcll
ВНК21 HyQ PF СНО, HyG PF CHOMPS. PC-1 Pardee et al., 1984 Cambrex
Бронхиальным эпителии LHC-9 См ироюкол 22.9 Btosourcc, Cambrex, PromoCcll
Куриные эмбриональные MCDB 201,202 McKechau & Ham, 1976b Sigma
фибробласты
Яичник китайского хомячка (С НО) MCDB 302; PC-1 Hamilton & Ha tri, 1977 Cambrex, Sigma. Invitrogcn. JRH Biosciences. ProinuCell
Хондроциты Обогащенная DMEM F12 Adolphe. 1984, смотри про- токол 23 13 PromoCcll
Постоянные клеточные линии Hua MEM, M199, MB752 1. CMRL1066, среда MCDB. DMEM F12 + добавки Wayinouth, 1984 Cambrex, Invitrogen.JRH Bio- scicnccs, ICN, Sigma
Эпителиальные клетки рого- MCDB 153 Смотри протокол 23 2 Cambrex, KGM. Cascade
вицы
COS-1,7 Doering et al.. 2002 Cambrex
Эндотелии MCDB 130,131 Kncdlcr & Hain, 1987, Gup- ta et aL, 1997 Hoheisel et al.. 1998 Cauibrex, Cascade, PromoCcll, Sigma
Фибробласты MCDB 110,202,402 Bettger et al.. 1981, Shipley & Ham, 1983 Cambrex, Cascade, PromoCcll,
Клетки глии Michlcr-Stukc Michler-Stukc & Bottenstcin, 1982 Cambrex, Invitrogcn
Глиома SF12 (среда Hain’s F12 c экстра незаменимыми u заменимыми аминокис- лотами) Frame et al, 1980, Freshney, 1980 Cambrex, Invitrogcn
Клетки HcLa BlakcrctaL, 1971, Berthcussen. 1993 Cambrex
Гематопоэтические клетки aMEM. Iscovc’s Stauners et al, 1971. Iscove & Melchers, 1978 Sigma, Roche
HL-60 Li et al.. 1997 Cambrex
НТ-29 Oh et al, 2001 Cauibrex
Ди илоидные фибробласты человека MCDB 110,202. PC-1 Bettger et al.. 1981, Ham, 1984 Cascade, Cambrex, PromoCcll
Лейкоз человека и нормальные лейкоциты Iscovc’s Brcitman ctal, 1984 Cambrex, Hyclone, MP Bio- medicals Invitrogen.JRH Biosciences. Sigma
Опухоли человека Brower. HITES, Masui, Bottenstcin N3 Brower et al.. 1986, Carney et al.. 1981, Masui et al.. 1986b, Bottenstcin. 1984. Chopra et al, 1996
Гепатоциты, эпителий печени Williams E. L15 Williams & Gunn. 1974, Mi- takactaL, 1993) Cambrex, Sigma
Гибридомы Iscove's Iscove & Melchers, 1978. Murakami, 1984 Sigma, Invitrogcn, Cambrex. JRH Biosciences. MP Bio- mcdicals, Roche, Irvine Sci- entific. Mctachcm. PromoCcll
Клетки насекомых Ikonomou et al, 2003 JRH Biosciences; Cell Gro
Кератиноциты MCDB 153 Poehl & Ham, 1980. Tsao et al. 1982. Boyce & Ham, 1983, см. ириюкол 23.1 Invitrogcn. Cascade, Cambrex PromoCcll, Sigma
178
ГЛАВА 10. БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ
Окончанние табл. 10.4
Клетки или линия Бессы вороточная среда Ссылки (смотри табл. 10.1 Коммерческие производители
клеток (смотри табл. 10.1) и 10.2) (специфических сред или их альтернативных вариантов)
L клетки (L929. LS) NCTC109, NCTC135 Birch & Pirt. 1970,1971, Higuchi. 1977 Sigma
Лимфобластондные клеточные линии человека Iscovc's Iscovc & Melchers. 1978 JRH Bioscienccs. UcllGcnix, Amcrsham
Эпителий молочной железы MCDB 170 Hammond et al, 1984. см. протокол 22 3 Cascade. Cambrcx
Эпителий почки собаки MDCK Почка свиньи LLC-PK К-1, РС-1 К-2 Taub, 1984 Taub, 1984 Cambrcx
Меланоциты Gilchrcst Cm. upnioKo.T 22.18 Cambrcx. Cascade, PromoCell
Меланома Gilchrcsr См. пр<1<ок<1Л 22 18, Halaban. 2001 Cambrcx. Cascade, PromoCell
Мышиные эмбриональные фибробласты. K.ieiKM ЗТЗ Mouse leukemia MCDB 402 Shipley & Ham, 1983, Ham, 1984 Murakami. 1984 Biosource
Мышиный эритролейкоз Мышиная миелома Мышиная нейробластома SF12 (среда Ham’s F12 с экстра незаменимыми и заменимыми аминокис- лотами). Iscovc's MCDB 411, DMEM F12 N1 Frame et a).. 1980, Frcshney, 1980. Iscovc & Melchers. 1978 Murakami. 1984 Agy et al.. 1981, Bottcnstcin. 1984 MP Biomedicals. Invitrogcn. Sigma Sigma, Invitrogcn
Нейроны Остеобласты DMEM.F12/N3, B27 нейробаза. |ьная Bottcnstcin. 1981, Brewer. 1995 Shiga et al .2003 N2. Invitrogcn OGM. Cambrcx, PromoCell
Предстательная железа Почка Гладкомышечные клетки Скелетные миобласты WJAC 404. См. табл. 10.11. Poehl, 2002 Goto et al., 1999 Cambrcx REGM (для эпителиальных клеток) MsGM (дли мезан- i иазыных клеток). Cambrcx Cascade. Cambrcx, PromoCell PromoCell
Уршелий Подложка MCDB 153, KSFMc Southgate et al, 2002 KGM-2, Cambrcx В-D Bioscienccs, MP Biomedi- eals, Invitrogcn, Biosourec; Sigma
Дополнительные рекомендации ио выбору среды можно наши в работах McKechan [ 19771. Barneset а]. 11984а и Mather 11998].
см. также табл. 10.1 и 10.2
и затем субкультивируют клетки в среде, содержащей
новую пониженную концентрацию сыворотки. При
адаптации клеток может возникнуть необходимость
обтатить среду известными факторами для замены
сыворотки (см. разд. 10.4. 10.6).
10.6. РАЗРАБОТКА БЕССЫВОРОТОЧНОЙ
СРЕДЫ
Есть два главных подхода при разработке бессыворо-
точной среды для индивидуальной клеточной линии
или первичной культуры. Первый из них: берется из-
вестная пропись среды для родственного ти па клеток с
или без 10 20*о диализованной сыворотки и вносятся
изменения в состав компонентов, индивидуально или
комбинированно, одновременно снижая концентрацию
сыворотки, до тех нор пока среда не будет оптимизи-
рована в соответствии с вашими индивидуальными
требованиями. Этот прием был применен Наш с со-
авторами | Hani, 1984] и обычно позволяет подобрать
оптимальные условия. Если было обнаружено, что
труппа компонентов эффективна при снижении кон-
центрации сыворотки, активные составляющие можно
идентифицировать путем систематического исключе-
ния отдельных компонентов, и, таким образом, опти-
мизируют концентрации необходимых добавок [Ham,
1984]. Однако этот процесс трудоемкий и занимает
10.9. Заключение
179
много времени. На каждой стадии получают кривые
клеточного роста и проводят исследования эффектив-
ности клонообразивания. Неразумно проводить, но
крайней мере, три года, разрабатывая новую среду для
нового типа клеток.
Трудоемкая природа первого подхода подводит нас
ко второму подходу: обобщение существующих сред,
таких как RPMI 1640 [Carney et al., 1981J или комби-
нированных сред, таких как среда Ham’s F12 с DMEM
[Barnes & Sato, 1980]. При этом нет необходимости
проводить манипуляции с их составляющими для roi о,
чтобы уменьшить список компонентов. К последним
относятся селен, трансферрин, альбумин, инсулин,
гидрокортизон, эстрогены, трийодтиронин, этанолампн,
фосфоэтаноламин, факторы роста (EGF, FGF, PDGF,
добавки для (хила эндотелия и т.д.). простагландины
(PGE1, PGF2ct) и некоторые друт ие вещества, которые
могут иметь особую важность (см. разд. 10.4; табл. ЮЛ).
Как было показано, селен, трансферрин и инсулин
обычно необходимы для большинства клеток, тогда как
требования к другим компонентам могут варьировать.
10.7. ПРИГОТОВЛЕНИЕ
БЕССЫВОРОТОЧНОЙ СРЕДЫ В
В настоящее время для индивидуальных типов клеток
используется ряд репецтур бессывороточных сред,
некоторые имеются в продаже (см. Приложение II)
[Cartwright & Shah, 1994; Mather, 1998; см. также
табл. 10.1 и 10.2 и 1л. 23]. Процедура приготовления
бессывороточных сред сходна с приготовлением обыч-
ных сред (см. протокол 11.9; см. также [Wayinotilh,
1984]). Необходимо использовать сверхчистые реаген-
ты и воду и следует проявлять осторожность, работая
с растворами Са2* и Fe2t или Fe3-, чтобы избежать
выпадения осадка. Соли металлов имеют тенденцию
выпадать в осадок при щелочных pH в присутствии
фосфата, особенно если среда или солевой раствор
подвергается автоклавированию, поэтому катионы
в исходном растворе должны содержаться при низ-
ких pH (ниже 6,5) в отсутствие фосфата. Растворы
необходимо стерилизовать путем автоклавирования
или фильтрования (см. разд. 11.3). Часто рекомен-
дуется добавлять катионы в последнюю очередь, не-
посредственно перед использованием среды. Друг им
возможным вариантом, который часто применяется,
является приготовление серии исходных растворов
неорганических компонентов и витаминов в виде
1000-кратного концентрата, тирозина, триптофана и
фенилаланина в 0,1 Н НС1 в виде 50-кратного кон-
центрата, незаменимых аминокислот — 100-кратного
концентрата в воде, солей— 10-кратного в воде, и
некоторые другие специальные кофакторы, липиды
и т.д. в виде 1000-кратных концентратов в соответству-
ющих растворителях. Их комбинирую*!' в необходимых
пропорциях и разбавляют до конечной концентрации,
после чего проверяют pH и осмотическое давление (см.
разд. 11.2.5). Факторы роста, гормоны и факторы кле-
точной адгезии добавляют отдельно, непосредственно
перед использованием среды, так как может возникнуть
необходимость внесения изменений в соответствии с
индивидуальными условиями эксперимента.
10.8. СРЕДЫ, НЕ СОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКОВ
Со стороны контролирующих органов усиливаются
требования удалить все продукты животного проис-
хождения, которые контактируют с культивируемыми
клетками, при производстве биофармацевтической
продукции. Трипсин может быть заменен рекомби-
нантным трипсином или протеазами неживотного
происхождения (см. разд. 10.4.1), а факторы роста ре-
комбинантными факторами роста. BSA часто может
быть заменен добавлением таких факторов, как липи-
ды, гормоны, неор1анические соединения и факторы
роста (см. разд. 10.4), которые обычно в сыворотке
связываются с BSA, так как пока не установлено, что
BSA сам шрает какую-то роль. Адаптация клеток к
среде, не содержащей белков, может потребовать до-
полнительной селекции клеток.
10.9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В преимуществе использования бессывороточных
сред мо1ут возникнуть сомнения, так как применение
сред, содержащих сыворотку, отличается простотой.
Для применения некоторых бессывороточных сред
требуются специальные методики, значительные
затраты времени, усилия и источники для приготов-
ления новых рецептур или адаптации существующих,
многочисленность сред в случае, если необходимо
культивировать несколько типов клеток, все это
отпугивает большинство лабораторий от использо-
вания в своей работе бессывороточных сред. Однако
существует необходимость в создании постоянных
известных условий культивирования при исследова-
нии ретуляторных процессов, контролирующих рост и
дифференцировку. Кроме того, различные биотехноло-
t цп требуют укрощения процессов очистки продуктов.
И наконец, существует необходимость удаления всех
потенциальных источников инфекции. Все это, в ко-
нечном счете, заставит применять бессывороточные
среды в более широком масштабе.
Глава 11
ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ
И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
11.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
И МАТЕРИАЛОВ
Все растворы химических реактивов и посуда, ис-
пользуемые при культивирован ии тканей, должны
храниться отдельно и предназначаться только для .н их
целей. Следы тяжелых металлов или друюх токсичных
веществ жмут быть трудноудалимы и определяться
только но постепенному ухудшению роста культуры.
Следовательно, стеклянная иосуда, предназначенная
для различных целей, требует разных способов мытья.
Требования к качеству мытья иосуды для культиви-
рования тканей выше, чем в целом для лабораторных
работ. Хотя уровень загрязнения иосуды при работе
может быть меньше, может потребоваться применение
специальных детергентов (см. разд. 113.4), следует
также избе1ать возможности химического загрязне-
ния при контакте с обычной лабораторной посудой.
Практически повсеместно принятая практика исполь-
зования одноразовою пластика снимает проблему
обработки стеклянных флаконов, используемых для
культивирования животных клеток; тем не менее в
тех случаях, ко1да для хранения либо для культиви-
рования используется лабораторное стекло, остается
существенной проблема химического за1рязнения.
Следовательно, требованием культивирования тканей
является абсолютная чистота посуды.
11.2. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ОБОРУДОВАНИЯ
И ЖИДКОСТЕЙ
Все оборудование и жидкости, которые контактируют с
культурами или реактивами, должны быть стерильны.
Выбор метода стерилизации зависит, i лавным образом,
от температурной стабильности объекта (табл. 11.1).
В целом, большинство предметов устойчивы к дей-
ствию высокой температуры, - металлы, стекло,
термоустойчивый пластик, например политетрафтор-
этилен (ПТФЭ), можно стерилизовать сухим жаром.
Это один из самых простых и эффективных методов
стерилизации, обеспечивающий достижение высокой
температуры во всех частях загруженной партии мате-
риала в течение определенного времени. Стерилизация
горячим паром, или автоклавирование, также высоко-
>ффективна и может применяться для стерилизации
термостабильных жидкостей, таких как вода, растворы
солей и некоторые специально разработанные среды.
Для стерилизации термолабильных материалов может
использоваться радиоактивное излучение. Наиболее
эффективным является у излучение, источником ко-
торых является '"Со или ,3’Cs. Поскольку необходимая
эффективно действующая доза достаточно высока
(25 кГр), обычно такая обработка производится цен-
трализованно, на оборудовании, позволяющем про-
изводить также электронно-лучевую стерилизацию.
Для термолабильною пластика может использоваться
обработка окисью этилена, но это вещество способно
абсорбироваться на поверхности пластика и может
потребоваться несколько дней для его высвобождения
и улетучивания. Друше химические стерилизующие
соединения включают гипохлорит натрия и формаль-
де1 ид, но эти вещества чаще Bcei о используются для
обеззараживания (см. разд. 7.8.5) жидкостей и одно-
разового пластика. Формальдегид также используется
для фумигационной обработки (см. разд. 7.8.6).
Термолабильные жидкости стерилизуются мик-
роиоровой фильтрацией (см. разд. 11.5.2), при этом
может быть использовано как положительное давление
с использованием серии насадок на шприц, располо-
женных но размеру фильтров, — дисков диаметром
293 мм или гофрированных картриджей 1000 см2, так
и отрицательное давление с использованием флаконов
с присоединенным фильтром (см. протокол 11.12).
При наличии вакуумной линии или насоса фильт-
рация наиболее простой и эффективный метод
стерилизации, при котором фильтруемая жидкость
поступает в сосуды, в которых она будет храниться.
Однако фильтрация при отрицательном давлении
приводит к возрастанию pH, поскольку происходит
удаление растворенного в среде СО,.
В следующих разделах описаны предпочтительные
методы стерилизации оборудования, культуральной
посуды и растворов (табл. 11.2 и 11.3).
11.3. ОБОРУДОВАНИЕ
11.3.1. Стеклянная посуда
Если для размножения клеток используются стеклян-
ные поверхности, стекло должно не только быть чис-
тым, но и иметь определенный заряд. Едкие щелочные
детергенты приводят поверхность стекла в состояние.
11.3. Оборудование
181
Таблица 11.1. Мыоды стерилизации
Метод Условия Материалы Ограничения
Сухой жар 160 °C. 1ч Термостабильные металл, стекло, ПТФЭ Возможно обугливание, например, индикаторных этикеток и ватных пробок
Автоклавирование 121 °C, 15-20 мин Термостабильные жидкости* вода, солевые растворы, автоклавируемые среды. Умсрснно-тсрмостабиэьный пластик: силикон, поликарбонат, нейлон, полипропилен Требуется мроннкнпвение пара ко всем предметам, т.е пароироницаемая упаковка. Загрузка большого объема требует большого времени для пол- ного прогревания
Излучение у-излучснис 25 кГр Пластик, органические каркасы, тер- мочувствительные рсакшвы и фар- маколо! ические препараты Возможно химическое изменение пластика Макромолекулярная де- градация
электронно-лучевое 25 кГр Пластик, органические каркасы, тер- мочувствительные рсакшвы и фар- макологические препараты Требуется высокоэнсргстичныи источ- ник Не подходит для установки в лаборатории средних размеров
микроволновое 5 мин полная мощность Водные растворы н гели, такие как Может исиользоватьея только для малых объемов, обычно для растап- ливания агара
коркживолновое уль- 254 нм. Плоские поверхности, циркулирую- Нс достшаст затененных областей
трафиоле юное 50-100 Вт. 30 мин шип воздух Своры усюйчпвы к обработке
Химическая обработка окись зтилена 1 ч Термолабильный пластик После обработки материалы должны выветриваться 24-48 ч, остаются токсичные остатки
гипохлорит 300-2500°;» 30 мин Зараженные растворы, пластик Требуется тщательное промывание после обработки. Могут оставаться остатки
70% этанол замачивание Хирургические инструменты (в ком- бинации с обжиганием в пламени). Некоторые виды пластика Нс убивает споры. Риск пожара при работе с пламенем. Пластик Precast Рсгрсх и Lucite может разрушаться при действии этанола
Фильтрация размер нор 0,1-0,2 мкм Все водные растворы, частично пригодна для термолабильных реактивов и сред. Специфичные фильтры для связывания низко- молекулярных белков для факто- ров роста и т д Нс ири| одна для нскогорых раствпров, например ДМСО. Медленно для вязких растворов
непригодное для прикрепления клеток, и поэтому тре-
буется последующая нейтрализация раствором НС1 или
Н ,SOt; нейтральные детергенты не изменяют поверх-
ности стекла и легче смываются. Наиболее эффективна
следующая процедура обработки стекла:
1) Не позволяйте грязной посуде высыхать. В воду,
заполняющую емкости для сбора грязного стекла,
должны быть добавлены стерилизующие агенты,
такие как i ииохлорит натрия, для того чтобы:
• уничтожить любые нет очники возможной биолот и-
ческой опасности;
• предупредить размножение бактерии в воде.
2) Выбирайте детергенты, эффективные в воде вашего
pei иона, ле>ко смывающиеся и нетоксичные (см.
разд. 11.3.4).
3) До высушивания посуды убедитесь, что она тща-
тельно промыта проточной водой и ополоснута
деионизированной или дистиллированной водой.
4) Суш ите посуду в перевернутом состоянии, так чтобы
остатки воды могли вытечь.
5) Стерилизацию посуды проводите сухим жаром, что
минимизирует риск переноса токсичных остатков,
возможный при стерилизации горячим нарим.
Протокол проведения стерилизации разработан
таким образом, чтобы не только убить делящиеся
микроорганизмы, но и уничтожить более устойчивые
споры. Горячий нар более эффективен для этих целей,
чем сухой жар, но обработка паром связана с риском
сохранения остатков загрязнения. Сухой жар предпоч-
тительнее, но в этом случае обработка должна продол-
жаться в течение 1 ч при минимальной температуре
160 °C. Горячий пар (для жидкостей и скоропортящих-
ся продуктов) следует применять при 121 °C в течение
15-20 мин (см. табл. 11.1, 11.2, 11.3). Для тоге чтобы
стерилизация паром была эффективнее, следует ia-
рантированно обеспечить проникновение пара ко всем
182
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Таблица 11.2. Стерилизация оборудования и
инструментов
Предметы Стерилизация
Ампулы для замораживания, Автоклавирование*
пластик (обычно поставля- ется стерильным)
Ампулы для замораживания. Сухой жар2
стекло
Закручивающиеся крышечки Автоклавирование
Инструменты Сухой жар
Инструменты, имеющие стек- Автоклавирование
лянныс части и силиконо- вые трубки
Магниты для магнитной мс- Автоклавирование
ша.»ки
Одноразовые наконечники Автоклавирование; в авто-
Д.»Я MllKpOIIUIICTOK клавирусмых поддонах пли нейлоновых пакетах
Плексиглас, Pcrpcx, Lucite 70% зтанол
Пошорно используемые ии- Ав токлавирование (отдельно
пстки или ширины ПТФЭчюршнп)
Поликарбонат Автоклавирование
Пробирки Сухой жар
Пробки, резиновые и сила- Автоклавирование
коновые
Силиконовая смазка (для Автоклавирование в стсклян-
выделения клонов) ной чашке Петри
Силиконовые трубки Автоклавирование
Стекла покровные Сухой жар
Стекла предметные Сухой жар
Стекло Сухой жар
Стеклянные бутылки с закру- Ав1ок.»авирование с ослаб-
чивающимися крышками ленными крышками
Стеклянные Пастеровские Сухой жар
пипетки
Стеклянные пипетки Сухой жар
Стеклянные шприцы Автоклавирование (отде- льноПТФЭ-поршни )
Фильтры многократного Автоклавирование, нс ис-
использования пользовать предваритель- ное или последующее раз-
реженпе
1 Автоклавирование. 100 кПа (1 атм). 121 “С. 20 мин
- Сухой жар 160 °C. 1 ч
предметам, что означает, что воздух из стерилизацион-
ной камеры должен быть полностью удален до того .как
туда поступит пар, либо воздух должен быть полностью
замещен паром, поступающим иод давлением.
Помещенные в стерилизуемую посуду (или рас-
твор), расположенный в центре стерилизационной ка-
меры, индикаторы типа Thennalog (см. Приложение II)
и датчик температуры, связанный с самописцем, позво-
ляют следить как за температурой, так и за влажностью
в ходе стерилизации. Для контроля процесса автокла-
вирования часто используется измерение температуры
вытекающей из автоклава воды, однако этот метод
недостаточно точно отражает температуру в камере.
ПРОТОКОЛ 11.1. Подготовка и стерилизация
изделий из стекла
Материалы
• Дезинфектанты: i ицох.юрит, — минимум 300 ppm
(частей на миллион) активной» хлора при раство-
рении в детергенте (например, таблетки Precept.
Clorox или Chloros
• Детергент (например. 7Х™ или Decon®)
• Ванна для замачивания
• Щетки для мытья бутылей
• Сетки-корзин ы из нержавеющей стали для сбора
и сушки вымытой и прополосканной посуды
• Алюминиевая фольга
• Индикаторы стерильности (Alpha Medical для су-
хожаровой H.IU паровой стерилизации. Thennalog
только для автоклавирования)
• Ярлык ii.ui .шикая лента для обозначения сте-
рильности (Bennett). Эти ярлыки отличаются от
используемых при автоклавировании, поскольку
температура в сухожаровых шкафах выше.
Большинство ярлыков для автоклавирования
обугливаются и выделяют следовые количества
летучих веществ из липкого слоя, которые moi ут
выпасть в осадок на стенках печи или даже на
стерилизуемом стекле.
• Стерилизационная печь, снабженная вентиля-
тором. способная давать температуру 160 °C, и,
предпочтительно, с pei истратором температуры
н । ибким зондом.
Протокол
Сбор и мытье стеклянной посуды (рис. 11.1)
1. Непосредственно uocie использования собери-
те стеклянную посуду, поместите ее в раствор
детергента, содержащего дезинфектант. Важно,
чтобы стекло не высыхало до замачивания, иначе
отмыть посуду будет значительно труднее.
2. Замочите на ночь в ванне для замачивания.
3. Промывание:
а) На следующее утро промойте при помощи
щетки вручную или механической щеткой для
бутылей (рис. 11.2); тщательно прополощите
четырьмя полными сменами проточной воды, а
затем трижды деионизованной водой. Полезно
использовать разбрыз! нвающую насадку для
промывания, при ееотсу ictbuh необходимо пол-
ностью заполнять водой бутыли и полностью их
опустошать при каждом ополаскивании.
б) Машинное промывание должно проводиться
без детергента. В этом случае можно умень-
шить количество прополаскиваний до двух
водопроводной водой и одного деионизиро-
ванной или очищенной при помощи обратного
осмоса воды.
4. После тщательного ополаскивания переверните
бутыли вниз । орлом, например в стальной прово-
лочной корзине, высушите.
11.3. Оборудование
183
5. Когда посуда остынет, закройте горлышки алю-
миниевой фольгой, поставьте на хранение
Стерилизация стеклянной посуды:
1. Приклеите небольшие квадратики липкой ленты
для индикации стерильности, напишите дату.
2. Поставьте посуду в стерилизационный шкаф с
вентилируемой циркуляцией воздуха, установите
температуру 160 °C.
3. Убедитесь, что температура в центре загруженной
камеры доспи аег 160 °C:
а) Поместите индикатор стерильности в бутыль
или типичный для этой загрузки сосуд в се-
редине камеры.
б) При использовании pei нитрирующего тер-
мометра поместите сенсорное устройство в
бутыль или типичный для этой загрузки сосуд
в середине камеры.
в) Не забивайте камеру стерилизационной печи
слишком плотно. Оставьте место для цирку-
ляции воздуха.
4. Закройте дверцу печи, удостоверьтесь, что темпе-
ратура вновь состаш1яет 160 °C, у плотните дверцу
полоской ленты с указанием времени начала
стерилизации (или установите автоматический
замок и самописец), оставьте на 1 ч
5. Через час выключите печь, позвольте ей остыть
с запертой дверью. Удобно установите автомати-
ческий таймер так, чтобы можно было оставить
посуду стерилизоваться на ночь, с последующим
выключением и остыванием. То|да остывшую
посуду вынимают утром. Э ги меры предосторож-
ности позволяют лучше сохранить стерильность
и минимизируют образование тепла в рабочее
время, koi да жарко работать
6. Используйте посуду в течение 24—48 ч
Pei истрирующие термометры имеют то преимущест-
во, что постоянно ведущиеся записи мщут храниться
в архиве. С другой стороны, индикаторы (например,
Therinalog) обеспечивают визуальное подтверждение
необходимого режима температуры и влажности и
поэтому MOiyr быть использованы для мониторит а
разных частей загруженной партии одновременно. Мы
рекомендуем использовать оба метода контроля.
Оргонические материалы должны храниться вне
жарового шкафа. Не используйте бумажную перфолен-
ту или упаковочный материал, если вы не убеждены,
что при нагревании не произойдет выделения летучих
продуктов. Эти продукты в конечном итоге осаждаются
на внутренней поверхности стерилизационного шкафа,
что создает запах при нагревании, некоторые продукты
MOiyr осаждаться на внутренней поверхности стекла
при стерилизации.
Кроме того, бутыли можно неплотно закрыть закру-
чивающимися крышками и сверху накрыть фольгой
для автоклавирования. Автоклавирование проводят
в течение 20 мин при 121 °C, в режиме, включающем
создание вакуума до и после поступления пара (см.
разд. 5.4.4). Затем, кота посуда несколько остынет,
крышки следует плотно завернуть. В процессе автокла-
вирования крышки должны быть закручены достаточно
слабо (но крайней мере один полный оборот до полного
закручивания), так, чтобы позволить пару проникнуть
в бутыли и предупредить всасывание вкладыша (если
таковой имеется) из крышки в бутыль. В противном
случае возникнет препятствие для пара, что будет
означать неполную стерилизации (рис. 11.3 и цв. вклад-
ка 22a). К сожалению, при автоклавировании бутылей
и колб часто имеет место аэрозольное запотевание,
при конденсации пара в них образуется небольшой
остаток. Кроме того, при охлаждении колб и бутылей
существует риск попадания нестерильного воздуха и
микробного заражения до того, как они будут плотно
закрыты. Стерилизация сухим жаром предпочтитель-
на, поскольку это позволяет охлаждать посуду в печи
(крышки автоклавируются отдельно; см. разд. 11.3.1).
11.3.2. Стеклянные пипетки
В культивировании тканей используются как стек-
лянные, так и пластиковые иииетки. К преимущест-
вам пластиковых пииеток относится однократность
использования, снимающая необходимость мытья
и стерилизации. Стеклянные иииетки значительно
дешевле, но требуется дополнительная работа ио заты-
канию ватных пробочек и их удалению каждый раз при
их использовании. Стеклянные иииетки необходимо
тщательно мыть в специальных моечных машинах или
устройствах для мытья пииеток, так, чтобы в них не
оставалось загрязнений, кроме того, их носики часто
забиваются.
• Требование безопасности. Стеклянные
пинетки легко повреждаются, надколотые концы
представляют собой опасность как для исследователя,
так и для обслуживающего персонала. Заменяйте или
выбрасывайте треснувшие и надколотые иииетки.
11.3.3. Завинчивающиеся крышки
Существует дваосновных типа крышек, которые исполь-
зуются для стеклянных бутылей: 1) алюминиевые или
пластиковые крышки с вкладышами из синтетической
резины или силикона и 2) полипропиленовые крышки
без прокладки, которые могут повторно использоваться
(Duran); эти крышки заворачиваются на большую глу-
бину и имеют кольцевую прокладку, обеспечивающую
надежную защиту от заражения и лучшее переливание
через край (несмотря на то что переливание не реко-
мендуется при выполнении стерильных работ). Следует
соблюдать следующие меры предосторожности:
1) Полипропиленовые крышки прочно удерживают
содержимое только при закручивании их до упора,
при эт ом горлышко бутыли не должно иметь сколов
184
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Таблица 11.3. Стерилизация жидкостей
Растворенное вещество Стерилизация Хранение
HCI, 1М Фильтр’ Комнатная температура
HEPES Автоклав’ Комнатная температура
NaHCO, Фильтр Комнатная температура
NaOH. 1 М Фильтр Комнатная температура
Агар Автоклав или кипячение Комнатная температура
Аминокислоты Фильтр 4 °C
Бакю-псптон Автоклав Комнатная температура
Бычий сыво|ютичный альбумин Фильтр (используйте стопку фильтров) 4 °C
Витамины Фильтр -20
Вода Автоклав Комнатная температура
Гидролизат лактальбумина Автоклав Комнатная температура
Глицерин Автоклав Комнатная температура
Глюкоза, 20% Автоклав Комнатная температура
Глюкоза, 1 -2% Фильтр (низкие концентрации, нри автоклавировании карамелизуется) Комнатная температура
Глютамин Фильтр 20
ДМСО Самостерилизация, диспенсирование в стерильные пробирки Комнатная температура, в темно- те. избегать контакте резиной, пластиком (кроме полипропи- лена)
Карбоксимстилцсллюлоза Пар4. .30 мин 4 “С
Коллагеназа Фильтр 20
Метилцсллюлоза Автоклав 4 °C
Пируват натрия. ЮОмМ Фильтр -20
Раствор солен (без глюкозы) Автоклав Комнатная температура
Сыворотка Фильтр (стоика фильтров) -20°
Трансферрин Фильтр -20
Трипсин Фильтр -20
Триптоза Автоклав Комнатная температура
Фак торы роста Фильтр (связывающий низкомолекулярные белки) -20‘
Феноловый красный Автоклав Комнатная температура
ЭДТА Автоклав Комнатная температура
1 Фильтр, размер пор 0,2 мкм.
’Автоклавирование. 100 кПа (1 атм). 121 °C. 20 мин
3 Пар, 100 °C, 30 мин.
пли дру I их изъянов на верхнем краю. При их нали-
чии замените бутыль.
2) Не оставляйте алюминиевых крышек пли других
алюминиевых предметов в щелочных растворах
детер| ентов более, чем на 30 мин. поскольку они
подвержены коррозии.
3) Не кладите в одну емкость для замачивания стек-
лянную посуду и крышки, поскольку алюминий
может загрязнять стекло.
4) Избегите детергентов, которые предназначены
для машинной мойки, поскольку они слишком
щелочные.
11.3.4. Выбор детергента
КО|да большая часть культуральных работ выполня-
ется при помощи стеклянной посуды, качество (заряд.
химические за|рязнения) стеклянной поверхности
становится критическим действующим фактором.
Поскольку большинство клеточных культур сейчас
ведется в одноразовом пластике, основными требова-
ниями к чистоте стекла являются а) эффективность
детергента, удаляющего загрязнения с поверхности
стекла, и б) отсутствие токсичных остатков после
мытья, которые moi ли бы попасть в среду или дру| не
реактивы. Некоторые производители оборудования
для культуральных лабораторий предлагают ряд детер-
гентов для ручною мытья, которые прошли испытания
на токсичность при культуральных работах (например,
7Х, MP, Biomedicals пли Decon), но часто детергенты
для моечных машин поступают от производителей ма-
шин или от общелабораторных поставщиков. Эффек-
тивность действия детергента может быть определена
опытным путем — отмыванием сильно загрязненного
стекла (например, бутыли из под сыворотки или среды.
11.3. Оборудование
185
Вымойте в машине без
детергента или вручную
при помощи щетки.
Тщательно прополощите
Высушите в лечи,
перевернутыми вверх
дном
Замочите на
ночь полностью
погруженными в
нетоксичное моющее
средство
Автоклавируйте отдельно
крышки, обернув их в
паро-водопроницаемую
пленку
Оберните фольгой горлышки
бутылей и стерилизуйте
сухой высокой температурой
или автоклавированием
Храните крышки в запечатанных
пачках до 1 мес
Охладите бутыли, храните
предохраняя от пыли до 72 ч
Рис. 11.1. Мытье и стерилизация лабораторного стекла. Процедура выполняется, как в протоколе 11.1. Условия стерили-
зации.- автоклавирование при 121 °C в течение 15 мин. сухой жар, 160 °C в течение 1 ч. Крышки счсрцдизуются отде 1ьно от
бу । buicii во избежание образования конденсата, формирующегося в бутылках, сели автоклавировать их вместе с крышками
(см рис 11.3)
содержащей сыворотку, которую подвер! ли автокла-
вированию). При проведении станда|>тной процедуры
мытья разными детергентами визуальный контроль
качества позволяет определить, какой из детергентов
обладает- наибольшей эффективностью.
Присутствие токсичных остатков лучше всеге опре-
деляется клонированием клеток (см. протокол 21.10),
например, на чашке Петри, которая вымыта этим де-
тергентом, прополоскана в соответствии со стандартом
процедуры (см. протокол 11.1) и прошла стерилизацию
сухим жаром. В качестве контроля используется плас-
тиковая чашка Петри. Этот метод может быть использо-
ван, если вы предиола! аете наличие остатков на посуде
1 юсле автоклавирования.
186
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Рис. 11.2. Механические щетки для мытья бутылей. Враща-
ющиеся щетки расположены иод защитным плексигласовым
экраном. Следует тщательно следить, чтобы не прижимать
слишком плотно бутыли к щетке, чтобы бутыль не разбилась
11.3.5. Прочее оборудование
Обработка. Все новое оборудование и материалы (си-
ликоновые трубки, держатели фильтров, инструменты
и т.д.) должны быть замочены в растворе детергента на
ночь, тщательно промыты пр<п очной водой и прополос-
каны в соответствии со стандартом и высушены. Все,
что может коррозировать при замачивании в щелочном
растворе детер| ента, - mhi кая стал ь, алюми ним, медь,
латунь и т. д., — должно быть вымыто вручную без пред-
варительною замачивания (или после замачивания в
течение 30 мин), ополоснуло и высушено.
После использования все предметы должны быть
промыты водопроводном водой и замочены в детер-
генте. Оставьте их в ванне для замачивания на ночь,
утром прополощите м высушите. Еще раз напоминаем,
что предметы, подверженные коррозии, не следует
замачивать более чем на 30 мин. Алюминиевые стака-
ны для центрифую, как и роторы, никогда не следует
замачивать в детергенте.
Особой заботы требуют предметы, обработанные
силиконовой смазкой и силиконовыми жидкостями.
Их следует обрабатывать отдельно от остальных
предметов, при необходимости силикон удаляется
четырех* чористым yi леродом. Силикон очень трудно
удаляется при случайном попадании на оборудование
и стекло.
Упаковка. В идеале, все оборудование, нодвер-
ающееся стерилизации, должно быть упаковано в
оболочку, позволяющую пару проникать внутрь, но
непроницаемую для бактерий, пыли и клещей. Службы,
обеспечивающие снабжение стерильными инструмен-
тами клинических учреждений, предоставляют им
соответствующие пакеты, имеющие метки-индика го-
ры, проявляющиеся после стерилизации (например.
Polysciences, Bio-Medical Products). Полупроницаемая
прозрачная нейлоновая пленка (например, Porlex
Рис. 11.3. Стерилизованные бутыли. Эти бутыли были авюклавирпваны с индикаторами стерильности Thermalog внутри.
Thcrinalog становится синим при дспствии высокой температуры и пара Синяя область перемещав >ся по полосе со временем
при требуемых условиях стерилизации. Крышка на крайней левой бутыли была сильно закручена, и каждая следующая крышка
была закручена все слабее, наконец, последняя бутыль стерилизовалась без крышки.
Крайняя левая бутыль нс стерильна, пшому что пар не попал в нее. Вторая бу1ыль нс стерильна также, потому что вкладыш
сместился на горлышко и запечатал ее Следующие три бутыли полностью стерильны, но коричневая окраска на индикаторе
показывает, что в конце цикла в них имелась жидкость Только бутыль справа стерильна и суха Стеклянные индикаторы
(ii|xi6upKii Брауна) показывают, что соответствующие бутыли были стерильны (см. также цв. вкладку 22а)
11.3. Оборудование
187
ПРОТОКОЛ 11.2. Подготовка и стерилизация
стеклянных пипеток
Материалы
• Цилиндры для пипеток (для сбора использован-
ных пипеток)
• Дезинфектанты, птох.юрит минимум 300 ppm
активного хлора при растворе и детергенте (на-
пример. таблетки Precept, Clorox или Cliloros)
• Детергент (например, 7Х™ или Decou®)
• Сетки-корзины из нержавеющей стали (для сбора
и сушки вымытых и прополосканных пинеток)
• Пеналы для нипеток (квадратного сечения, алю-
миниевые или из нержавеющей стали, с силико-
новым вкладышем на обоих концах; квадратные
пеналы не скатываются с рабочем поверхности)
(Thermo Electron)
• Индикаторы с герильности
• Ярлык или липкая лента для обозначения сте-
рильности (см. iipcnoKcct 11.1). Стерилизационная
печь, снабженная вентилятором, способная нагре-
ваться до температуры 160 °C, и пред почтительно
с pei итератором температуры и i hokum зондом.
Протокол
Сбор и обработка пипеток:
1. Налейте воду с детергентом и дезинфектантом в
цилиндр для иннегок.
2. Сбросьте иииетки вниз носиком в цилиндр сразу
после использования (рис. 11.5).
а) Не накапливайте i ризные пинетки на рабочей
поверхности и не позволяйте использованным
пипеткам высыхать.
б) Не кладите в этот же цилиндр иииетки. ко-
торые были использованы для агара или си-
ликоновых соединении (водоотталкивающие
жидкости, иено|аснтелн и т.д.). Для силико-
новых соединении используйте одноразовые
пипетки, после aiapa промойте пииетки горя-
чей проточной водой или также используйте
одноразовый пластик.
3. Замочите иииетки на ночь или как минимум на
2 ч. Если используется очень много иииегок,
заменяйте цилиндры но мере их заполнения и
замачивайте на 2 ч до передачи на мытье.
4. После .щмачивания удалите ватные пробки при
помощи сжатою воздуха
5 Перенесите пипетки в моечную машину для пи-
неток (рис. 11.4,1 I Дем. также рис. 4.6) носиками
вверх.
6. Промойте проточной водой сифонным устрой-
ством как минимум 4 ч или в автоматической мо-
ечной машине при помощи адаптера для пинеток,
но без детер| ента.
7. Поверните клапан для включения в цикл де-
ионизированной (DW) или обратно-осмотпче-
ски-очцщенной (ROW) поды (см. рис. 4.6). или
дождитесь, пока не протечет последняя порция
проточной воды из крана, опустошиге до конца
и заполните троекратно DW или ROW. (Ис-
пользуйте автоматический цикл промывки D W
в моечной машине.)
8. Перенесите пипетки в сушку для пинеток или |
сушильную печь и высушите в положении носи- ।
ками вверх.
9. Вставьте ватные пробки (рис. 11.6).
10. Разберите ио размерам и поместите на хранение, |
закрытое от пыли.
Стерилизация.
1. Поместите нииетки в пеналы д.>1я пинеток (полез
но пометить пеналы с обоих концов ярлыками с
указанием размеров пипеток).
2. Заполните пеналы пипетками одного размера.
3. Заполните несколько пеналом наборами пинеток ।
объемом 1 мл. 2 мл, 10 мл и 25 мл (например, ио
4 каждО| о объема).
4. Приклейте ярлык-индика гор стерилизации, one
чатайте крышку и поставьте дату на ярлыке.
5. Стерилизуйте сухим жаром в течение 1 ч при
температуре 160 °C, используйте самое малень-
кое количество липкой ленты пли .замените ее
на индикаторы температуры (Alpha medical,
Bennett), маленькие но размерам, и сделанные из
менее летучих материалов. Температура должна
измеряться в центре засуженной камеры, для
гою чтобы убедиться, что эта, самая труднодо-
ступная. часть печи прогревается достаточно для
достижения стерилизации. Оставьте место между
пеналами при загрузке печи, чтобы обеспечить
циркуляцию горяче| о воздуха (рис. 11.7).
6. Выньте пииетки из печи и охладите, перенесите
пеналы в лабораторию культивирования тканей.
Если вы предполагаете, что иииетки будут исиоль- '
зоваться не ранее чем через 48 ч, оберните линию |
соединении крышки с пеналом липкой лентой
Plastics. Applied Scientific, KNF) продается в рулонах
или плоских упаковках разною диаметра и может ис-
пользоваться как пакет с индикатором стерильности.
Несмотря на высокую стоимость, такая пленка может
использоваться несколько раз до того, как станет хруп-
кой и непригодной д^1я использования.
Пробирки и воронки должны быть завернуты при
помощи липкой ленты и бу Mai и или нейлоновой плен-
ки до общей упаковки. Иголки и другие острые пред-
меты должны быть завернуты вместе со стеклянными
тест-пробиркам и или другими соответствующими
предохранительными приспособлениями.
Стерилизация. Тип стерилизации зависит от вида
материала (см. табл. 11.1). Металлические предметы
лучше всего стерилизовать сухим жаром. Силиконовая
резина (которая более предпочтительна для использо-
вания но сравнению с обычной натуральной), ПТФЭ,
поликарбонат, ацетатцеллюлозные и нитратцеллюлоз-
188
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Рис. 11.4. Сифонное моющее устройство для пипеток.
Соединяется с iданной системой водоснабжения. При
медленном заполнении устанавливается принцип сифона
промывается основная ёмкость, Koiopan затем снова на-
полняется. Этот процесс повторяется много раз в течение
более чем 4-6 ч Пипетки, показанные здесь, собраны после
использования. Прежде, чем поместить корзину с пипе тками
в моющее устройство, выньте ватные и|юбкн из пипеток и
переверните их. как показано на рис. 11.5
ПРОТОКОЛ 11.3. Подготовка и стерилизация
завинчивающихся крышек
Материалы:
• Дезинфектанты: t ипохлорпт минимум 300 ppm
активною хлора нри растворе в детергенте (на-
пример, таблетки Precept)
• Детергент (например, 7Х™ или DeeontB))
* Ванны для замачивания
• Сетки-корзины из нержавеющей стали (для сбора
и сушки вымытых и прополосканных крышек)
• Индикаторы стерильности (см. также Приложе-
ние II)
• Чашки Петри (для упаковки)
• Автоклавируемая пластиковая пленка (см.
Приложение II) или бумажные пакеты для сте-
рилизации
• Автоклавируемая лента для обозначения сте-
рильности
• Автоклав с регистрирующим термометром с
гибким зондом, который может быть введен в
загруженную камеру
Протокол
Сбор и мытье:
Металлические или фенолопластиковые
крышки с вкладышами:
1. Замочите минимум на 30 мин в растворе детер-
2. Тщательно промойте в течение 2 ч (убеди гесь, что
все крышки утоплены). Вкладыши должны быть
удалены и вставлены после прополаскивания,
которое можно проводить двумя способами:
а) В химическом стакане (или ковше) в про-
точной воде, которая подводится шлангом ко
дну сосуда. Перемешивайте крышки вручную
каждые 15 мин.
б) В корзине или, лучше, в устройстве для мы-
тья пинеток. Прополощите в автоматической
моечной машине, но не используйте в этом
случае детергент.
Полипропиленовые крышки:
Эти крышки можно мыть и прополаскивать вручную,
как описано выше (включая замачивание в растворе
детергента). Поскольку эти крышки плавают на по-
верхности воды, следует утопить их при помощи гру-
за при замачивании н мытье. Для автоматического
мытья после замачивания в детергенте используйте
устройство для автоматического мытья шшеток,
нормальный цикл без использования детергента.
Пробки:
Завернутые крышки предпочтительнее г грибок, одна-
ко. если последние используются, следует выбирать
силиконовые или не содержащие металл пробки из
белой резины, которые предпочтительнее обычных
черных. Мыть и стерилизовать их как крышки
(в этом случае не будет проблем с плаванием на
поверхности)
Стерилизация:
3. Поместите крышки в стеклянные чашки Петри
открытой стороной вниз.
4. Оберните чашки Петри, содержащие пробки,
плотной бумагой или паропроницаемой нейлоно-
вой пленкой, заклейте автоклавируемой лентой
(рис. 11.8).
5. Приготовьте аналог ичную упаковку с индикато-
ром стерильности внутри и поместите в середину
гагрузочной партии.
6. Автоклавируйте 20 мин при 121 °C 100 кПа
(1 атм) (рис. 11.9).
ные фильтры и т.д. следует автоклавировать в течение
20 мин нрн 121 °C и 100 кПа (1 Бар) при полном цикле
автоклавирования, включая вакуумирование камеры
до н после действия пара (за исключением автоклави-
рования фильтров и комплексов фильтров, см. прото-
кол 11.4). При использовании маленьких настольных
11.3. Оборудование
189
Рис. 11.5. Мытье и стерилизация пипеток
Рис. 11.6. Полуавтоматическое устройство для затыкания
пипеток ватными пробками (Bellco). Толстый atciy i из ва|ы
пропускается через специальную доставочную апертуру. кос •
да соответствующая длина жгута вставлена в конец нппстки.
жгут обрезас ся Для пине ик различного размера требуются
жгуты ваты различной толщины
автоклавов и термобарокамер убедитесь, что автоклав
энер| ично кипел 15—20 мни до герметизации, чтобы
пар заместил воздух (проследите, чтобы в этом случае
были достаточно воды до начала испарения). После
стерилизации пар выпускается. Все предметы должны
быть высушены в печи или на штативе.
• Требование безопасности. Чтобы избежать
ожо| а, обратите внимание на момент выпускания пара
Рис. 11.7. Стерилизационный шкаф Пеналы с пинетками
сложены в стопки, гак чтобы позволять горячему воздуху
проходить между ними Коричневые пятна на фронтальной
поверхности шкафа являются свидс) ельством наличия лету-
чих веществ в ленте-индикаторестерильности
и вынимания горячих предметов. Надевайте изолиру-
ющие перчатки длиной долоктя и защищайте лицо от
попадания пара при открывании крышек автоклава,
дверей и т.д. Используйте замки безопасности на
автоклавах.
190
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Рис. 11.8. Упаковка закручивающихся крышек для стери-
лизации. Крышки сложены в стеклянную чашку Петри, кото-
рую затем заксчатали в автоклавируемый пакет из нейлона.
кПа
p.spi.
Рис. 11.9. Отношения между давлением и температурой.
Условия 121 °C и 100 кПа или 1 атм в течение 15-20 мин
обычно рекомендуемые
11.3.6. Стерилизационные фильтры
многократного использования
Хотя большинство лабораторий в настоящее время
использует одноразовые комплекты фильтров, неко-
торые крупномасштабные предприятия предпочитают
использовать комплекты фильтров в нержавеющей
оболочке. Комплекты фильтров должны составляться
и стерилизоваться в соответствии с протоколом 11.4.
Альтернативные методы стерилизации. Боль-
шое количество пластика не может подвергаться
действию высокой температуры, необходимой для
сухожаровой или паровой стерилизации. Для стери-
лизации таких предметов можно применить действие
70% этанола в течение 30 мин и высушивание при
УФ-облучении в ламинарном шкафу. Следует ак-
ПРОТОКОЛ 11.4. Стерилизация комплекта
I фильтров
I
Материалы
Нестерильные.
• Держатели фильтров (табл. 11.4)
• Микроиоровые фильтры, соответствующие дер-
жателям
• Предварительный фильтр, стекловолоконный,
если необходим
Паропроницаемый нейлоновый фильтр
Обозначающая стерильность автоклавируемая
• Автоклав
Протокол
1. После тщательно! о промывания в детергенте (см.
разд. 11.3.5) прополощите комплект фильтров
проточной водой с последующим прополаскива-
нием деионизированной водой и сушкой.
2. Вставьте опорную решетку в фильтр и помес-
тите фильтрующую мембрану па решетку. Если
мембрана сделана из поликарбоната, увлажните,
чтобы противодействовать статическому элект-
ричеству
3. Поместите предварительный фильтр (стеклово-
локонный или другой) на верхнюю часть филь-
тра.
4. Закрутите держатель фильтра, не затживайте
водностью (оставьте примерно один полный
оборот).
5. Закрутите впускное и выпускное отверстия алю-
миниевой фольгой.
6. Упакуйте комплекты фильтров в бумагу для
стерилизации или цароироницаемую нейлоновую
пленку, заклейте автоклавируемой лентой.
7. Автоклавируйте при 121 °C и 100 кПа (1 Бар,
15 фунгов дюйм*) в течение 20 мин без предва-
рительной и последующей вакуумизации (ис-
пользуйте «жидкостный цикл» в автоматических
автоклавах)
8. Выньте фильтры, охладите.
9. Не затяшвайте держатели фильтров полностью
до тех цор, пока фильтры не увлажнятся перед
фильтрацией (см. протокол 11.14.6).
куратно обращаться с некоторыми видами пластика
(например. Plexiglas, Perspex, Lucile), поскольку они
moivt деполимеризоваться под действием спирта или
ультрафиолетового излучения. Для стерилизации
пластика можно также использовать оксид этилена,
но для полного освобождения поверхности пластика
от него потребуется две-три недели. Самым лучшим
методом стерилизации пластика является у-излучение,
на уровне 25 кГрэй. Все предметы должны быть упа-
кованы и запаяны; можно использовать полиэтилен,
который запаивается действием температуры.
11.4. Реагенты и среды
191
11.4. РЕАГЕНТЫ И СРЕДЫ
Конечной целью при i отопления сред и реактивов
является получение их и чистом виде, при котором
исследователь 1) избе! ает случайного попадания инт-
биторов и токсичных веществ, 2) знает концентрации
и понимает функции всех составляющих элементов.
3) уменьшает риск микробного заражения.
Большинство реактивов и сред, если они термоста-
бильны, например вода, растворы солей, идролизаты
аминокислот, может быть стерилизовано автоклави-
рованием Термолабильные растворы стерилизуются
фильтрацией. Растворы должны быть разлиты в
стеклянные боросиликатные или пластиковые поли-
карбонатные бутыли и плотно закрыты во избежание
испарения и химическою загрязнения при автоклави-
ровании. Если используется натриевое стекло, то лучше
сохранить небольшой зазор, чтобы минимизировать
риск взрыва бутылей. Образование пара в бутыли по-
может предупредить попадание пара из автоклава, но
уровень жидкости уменьшится. Поэтому потребуется
его восполнение добавлением стерильной сверхчистой
воды. Также как при стерилизации оборудования, ин-
дикаторы стерильности (например, Thermalog) и зонд
записывающего термометра должны быть расположены
в образце, помещенном в центре камеры.
Среды и реактивы, расположенные рядами в круп-
номасштабных культуральных сосудах в промышлен-
ных и полупромышленных биореакторах, могут быть
стерилизованы кратковременной обработкой очень
высокой температуры (Alfa-Laval). Приспосабливая
процесс к промышленному производству сред, можно
достичь высокой эффективности при значительном
снижении стоимости.
11.4.1. Вода
Вода, используемая в культивировании тканей, в
частности для ирш отопления бессывороточных сред
(см. также разд. 5.4.2), должна быть очень чистой. По-
скольку снабжение водой очень различно, требуемая
степень очистки также может быть различна. Жесткая
вода может потребовать использования ионообменного
смя|чения до попадания в систему очистки, мятая
вода может непосредственно поступать из системы
водоснабжения в водоочишаюшую установку.
Существует четыре главных метода очистки воды:
обратный осмос, дистилляция, деионизация и угольная
фильтрация. Для получения сверхчистой воды (UPW)
первой стадии является стадия образ ного осмоса, но
она может быть замещена дистилляцией (рис. 11.10;
см. также рис. 5.17). Преимуществом дистилляции
является одновременная стерилизация воды теплом,
но этот процесс экономически дороже, поскольку тре-
бует расхода энер! ни и требуется регулярная очистка
бойлера. При использовании на первой стадии стек-
лянного дне гиллятора он должен контролироваться
с использованием электрического предохранителя,
Hat ревательные элементы должны быть выполнены из
боросиликатною стекла или покрыты кремнием. Об-
ратный осмос зависит от целостности фильтрационных
Рис. 11.10. Очистка воды. Вода из водопровода поступает в контейнер для хранения через ус 1рпйство для обратно осмотиче-
ской очистки или стеклянный дистиллятор. Эта полуочнщенная вода затем поступает обратно в емкость для хранения после
фильтрации через угольный фильтр, деионизацию и мнкропоровую фильтрацию. Вода необходимого качества для приго-
товления реаюнтов всегда доступна для использования из емкости для хранения, вода нужного качества для приготовления
среды доступна из резервуара после микропоровой фильтрации (направо от диаграммы). Если аппарат работает непрерывно,
то вода самой высокой чисто гы для приготовления среды может быть получена в первой порции в начале рабочего дня (см.
также рис . 5.17)
192
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
мембран; следовательно, должен вестись моннторин!
потока. Тик карт риджа, применяемого в обратно-осмо-
тической установке, зависит от pH воды, поступающей
из системы водоснабжения (подробнее см. специфи-
кации производители). Если стоимость энерти для
стадий дистилляции и замены картриджей вычитается
из ваше! о бюджета, то обратно-осмотическая очистка
воды представляется более дешевой, но если вы не оп-
лачиваете потребляемую электроэнерт ию или оплата
постоянна и не связана с реальным ее использованием,
то дистилляция дешевле.
Второй стадией является угольная фильтрация,
при которой происходит удаление opiанических и
неор1анических коллоидных частиц. Третья стадия —
высококачественная очистка на фильтре смешанной
за1рузки. при которой происходит деионизация для
удаления ионов opiанических веществ. Последняя
стадия — микроиоровая фильтрация для удаления
любых микроорганизмов, цокавших в систему, и захват
всех смол, которые moi ли кокасть из понообменника.
Для минимизации за1рязнении при хранении вода
должна собираться после микроиоровой фильтрации
непосредственно в конечные стерильные емкости.
Вода, полученная после первой стадии очистки, может
использоваться для ополаскивания при обработке по-
суды и инструментов. Если вода постоянно (например,
в течение ночи) циркулирует из микропорового филь-
тра в емкость, куда также поступает полуочищенная
вода из первой стадии очистки, обратно на микро-
поровую фильтрацию, то постепенно в этой емкости
происходит повышение чистоты воды («полировка»).
В такой системе вода может использоваться утром для
приготовления сред.
Качество деионизованной воды должно контролиро-
ваться по ее проводимости (или сопротивлению) через
определенные интервалы, картридж следует заменять
при видимом возрастании проводимости. Стандарт
ISO 3696 (Международная организация стандартиза-
ции International Standardization Organization) уста-
новил значение сопротивления I типа воды на уровне
> 10 МОм/см (проводимость < 0,lpS/cm) при 25 °C.
Общий органический ут лерод (ТОС) должен составлять
< 10 частей на миллиард. Кондуктометр обычно постав-
ляется вместе с системой очистки воды, измеритель
ТОС следует приобрести отдельно (см. Приложение II).
Дистилляция должна предшествовать деионизации,
обеспечивая поступление стерильной воды на стадию
деионизации. Стадия ультрафильтрации может нахо-
диться между стадией деионизации и микроиоровой
фильтрации для получения апирогенной воды.
Стерилизация воды достигается автоклавировани-
ем при 121 °C и 100 кПа в течение 20 мин. В емкостях
подходящего размера (например, в объеме, необхо-
димом для разведения концентратов сред) бутыли
должны быть закрыты до автоклавирования, что тре-
бует применения боросиликатного стекла (Ругех) или
поликарбонатного пластика (NalgeNunc). Если бутыли
не закрыты (например, ш> причине применения натрие-
вого стекла, которое может разбиться при автоклавиро-
вании), то необходимо добавить 10% дополнительного
объема воды на бутыль в расчете на испарение.
Количество, представленное в протоколе 11.5,
рассчитано на выполнение Упражнения 6 (см. тл. 2),
но может варьировать в соответствии с требованиями
лаборатории.
ПРОТОКОЛ 11.5. Приготовление
и стерилизация сверхчистой воды (UPW)
Оборудование и материалы
Нестерильные.
* Градуированные стеклянные боросиликатные
(например Ругех) или автоклавируемые плас-
тиковые (иолпкарбонатные) бутыли с заворачи-
вающимися крышками (убедитесь, что имеется
достаточное свободное пространство для после-
дующих добавок), 500 мл______________21
• Подходящие крышки____________________21
• Индикаторные полоски для определения сте-
рильности _____________________ ...2
Лента для индикации стерильности
Маркер или предварительно напечатанные яр-
Оборудование для очистки воды
• Автоклав
Pet истрацион ный журнал (для записей препара-
тивных работ и стерилизации)
Стандартный протокол
1. Подпишите бутыли, обозначив дату, содержимое
и номер партии.
2. Рано утром после ночного цикла слейте из очис-
тителя воды в отходы около 50 мл, проверьте
проводимость (или сопротивление) и общий ор-
танпческий утлерод (ТОС) на соответствующих
измерительных приборах, занесите записи в
pei истрационный журнал
3. Если измеренные параметры соответствуют
требованиям (сопротивление >10 МОм см при
25 “С. ТОС <10 частей на миллиард (ppb), собе-
рите воду непосредственно в емкости для хране-
4. Наполните бутыли до определенной отметки, на-
пример 430—450 мл. если вода будет использовать-
ся для разведения сред (10х) (см. протокол 11.8).
Если предцола! ается автоклавирование, добавьте
дополнительно 10% объема.
5. Поместите индикатор стерильности в одну из буты-
лей (после автоклавирования следует удалить).
6. Закройте бутыли закручивающимися крышками.
При использовании натриевого стекла, например,
если бутыли могут лопнуть при автоклавирова-
нии, ослабьте крышки.
7. Поставьте бутыли в автоклав вместе с бутылью,
содержащей индикатор стерильности, в центре
загрузочной партии.
11.4. Реагенты и среды
193
8. Закройте автоклав, проверьте параметры установ-
ки: 121 °C и 100кПа (1 Бар, 15 фунтов, дюйм’),
20 мин с отменой последующего вакуумирования.
9. Включите никл стерилизации.
10. По завершении цикла проверьте распечатку
самописца, чтобы убедиться, что необходимые
параметры сохранялись в течение всею цикла,
занесите записи в pei истрационный журнал.
11. Оставьте охладиться примерно до 50 °C.
12. Откройте автоклав, выньте бутыли. Если крыш-
ки были ослаблены, плотно закрутите их, коща
температура бутылей опустится до комнатной.
Замечание. Запечатывание бутылей, которые были
открыты в ходе автоклавирования .еще не остывших
до комнатной температуры, может вызывать втш и-
вание вкладышей из некоторых крышек в бутыли.
При первом открывании будет резкое втя1 и ванне
наружного воздуха и бутыль, что может вызвать за-
ражение. До тою как крышки будут плотно закрыты,
бутыли, которые были приоткрыты при автоклавиро-
вании, должны остыть до комнатной температуры в
стерильной атмосфере, например в автоклаве, или в
ламинарном шкафу с горизонтальным потоком.
Проверьте индикатор стерильности, убедитесь, что
был дости! нут режим стерилизации, сделайте записи
в pei истрационном журнале.
13. Поместите бутыли на кратковременное хранение
при комнатной температуре.
14. 3амените запасы UPW в культуральной ком-
ма ге, если это требуется, проверьте по наличию
индикаторной ленты, что бутыли прошли цикл
стерилизации.
11.4.2. Сбалансированный солевой
раствор (BSS)
Состав BSS обсуждался в предыдущих главах (см.
разд. 9.3). Формула раствора Хэнкса [Paul. 1975] вклю-
чает в себя хлористый ма1 ний вместо некоторых apyi их
рекомендуемых сульфатов (см. табл. 9.2); его следует
автоклавировать при pH ниже 6,5 для предупрежде-
ния выпадения в осадок фосфатов кальция и ма| ния
с последующей нейтрализацией pH. Аналш очным
образом, фосфатно-буферный раствор Дюльбекко
(D-PBS) готовится без кальция и мИ1 ния (D-PBSA),
раствор которых готовится отдельно (D-PBSB) и до-
бавляется при необходимости использования. DPBS
часто используется также и без добавления Са’* * и Mg2*;
в этой форме он называется (D-PBSA) либо (D-PBS)
без Са2* и Mg2*; мы условились в этой книге называть
этот раствор «D-PBSA». Сокращение «D-PBSt* так-
же используется для того, чтобы отличить раствор
Дюльбекко от простого фосфатно-буферного раствора
(PBS), в который не входят хлорид калия и который
является изотоническим раствором хлорида натрия
в фосфатном буфере и не должен рассматриваться
как сбалансированный солевой раствор. В докладах и
публикациях всегда должно быть точно указано, какой
именно BSS был использован в работе. Большинство
BSS содержат депокозу, которая может карамелизо-
ваться при высокой температуре автоклавирования,
поэтому лучше не добавлять ее в ходе npiu отопления
и стерилизации BSS, а готовить раствор отдельно и до-
бавлять перед использованием. Если раствор । люкозы
готовится в концентрированном виде 100х (2001 /л),
карамелизации при автоклавировании не происходит,
этот концентрат может быть затем добавляться в BSS
в объеме 5—25 мл/л с получением конечной концент-
рации 1 5 г/л Напротив, можно готовить полные
BSS. так же как и полные питательные среды (см.
протокол 11.8) и стерилизовать их фильтрацией (см.
протоколы 11.11 — 11.14) Протокол 11.6 дается для
DPBS-A, который обычно используется как раствор
для промывания и растворитель для трипсина или
EDTA, а также может быть использован для любых
BSS, в которых отсутствует глюкоза и бикарбонаты. Ко-
личество, упомянутое в упражнении 7 (см. л. 2), может
быть пропорционально увеличено ио требованию.
ПРОТОКОЛ 11.6. Приготовление
и стерилизация D-PBSA
Схема
Растворяют порошок при постоянном перемет п- >
ванн и. доводят до конечного объема, проверяют
pH. проводимость, разливают на порции и авто- |
клавируют.
Материалы
Нестерильные:
• Порошок D-PBSA (Раствор А, с пониженным со- ,
держанием Са2*и Mg2*, например Sigma D5652),
упаковка на 1 л__________________________1
• или таблетки (Oxoitl Вт 14а)... _ 10 I
• Сверхчистая вода (UPW, см. разд. 11.4.1) 1 л |
• Емкости:
* Чистый стеклянный или пластиковый отсос с
пробкой на выпускном отверстии в основании,
• Флакон и-л и бутыль Эрленмейера, соединенный с I
перистальтическим насосом, и трубками, 1 л_1
* Mai нитная мешалка и покрытый политетраф- I
горэтиленом вкладыш_____1
• Градуированные бутыли для хранения; бороси-
ликатное стек-jo (Pyrex, Scholl), 100 мл__10 |
• Кондуктометр или осмометр
• рН-метр
* Автоклавируемая лента или ярлыки-индикаторы |
стерильности
• Автоклав
194
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Протокол
1. Добавьте 1 л UPW в емкость.
2. Поместите емкость на маг нитную мешалку, уста-
новите режим вращения 200 об./мин.
3. Откройте пакет с порошком D-BPSA или отсчи-
тайте 10 таблеток, постепенно добавьте в воду
кри перемешивании.
1. Перемешайте до полного растворения.
5. Проверьте pH и проводимость образца, внесите
закиси в pet ис грационный журнал.
а) pH не должно отклоняться от установленного
более чем на 0,1 ед. pH (в различных рецепту-
рах pH может различаться).
б) проводимость ие должна отличаться от стан-
дарта более чем на 5% от 150 pS/cni. Можно
использовать осмолярность как альтернативу
проводимости (или в дополнение), при этом
в партии должна быть одинаковая плотность
раствора.
Замечание Важно определять параметры плотности
раст вора в качестве контроля качества, чтобы убе-
диться, что приготовление выполнено без ошибки.
Любая коррекция, например осмолярности, должна
проводиться после полной проверки качества при-
готовления раствора.
в) образец выбросьте в отходы, не возвращайте
обратно в основную емкость.
6. Разлейте содержимое емкости в градуированные
бутыли.
7. Закройте крышки, укупорьте. Полезно .закрыть
крышки бумагой, закрепив ее эластичной лентой.
Бумага должна быть снабжена датой и пометкой,
обозначающей содержимое бутыли, используя
штамп, эго позволит избежать смывания марки-
ровки с бутыли.
8. Приклейте небольшой кусок ленты для автокла-
вирования или ярлыка для индикации стериль-
ности, с подписанной датой.
9 Стерилизуйте автоклавированием в течение
20 мин ггргг 121 °C и 100 кПа в укупоренных бу-
тылях (см. рис. 11.9).
10. Храните при комнатной температуре.
11.4.3. Приготовление
и стерилизация среды
В ходе подготовки сложных растворов следует позабо-
титься о том, чтобы гарантировать, что все элементы
растворены и не остаются на фильтре при стерилизации
фильтрованием и что они остаются в растворе после
автоклавирования или при хранении.
Концентрированные среды часто готовят при низкой
pH (между 3,5 и 5,0), ч собы удержать все элементы в рас-
творенном состоянии, но д аже тогда может происходить
некоторое осаждение. Если все компоненты должным об-
разом растворены, то даже ири выпадении и в осадок они
обычно вновь растворяются; но если выпадение осадка
связано с разрушением некоторых компонентов среды,
то качество среды может снизиться. При образовании
осадка качество среды может быть ироверено ростом
и клонированием клеток на этой среде и обеспечением
совместимости и другими соответствующими тестами
для проверки специальных функций (см. разд. 9.6.2).
Коммерческие среды предоставляются к виде
1) растворов рабочей концентрации 1х с глутамином
или без него; 2) концентраты 10х, обычно без NaH СОЗ
и глутамина, которые поставляются как отдельные
концентраты; илгг 3) порошкообразные среды, с или
без NaHCO., и глутамина. Порошкообразные среды
наиболее дешевы и не намного дороже, чем составлен-
ные в вашей собственной химический лаборатории
из отдельных компонентов, если вы учтете время на
приготовление, стерилизацию и контроль качества,
стоимость исходных материалов высокой чистоты,
стоимость дополнительных расходов, таких как энер-
1 ия и заработная плата работникам. Порошкообразные
среды ироходят контроль качества на производстве в
отношении обеспечения роста клеток, но, конечно, не
на предмет стерильности. Они перемешиваются очень
качественно при помощи шариковых мельниц, поэтому
теоретически одна упаковка среды может быть разде-
лена на иорцип для использования за несколько раз.
Однако на практике оказывается удобнее приобретать
упаковки сред такого объема, чтобы использовать их
за один раз, поскольку в открытой уиаковке качество
содержимого может испортиться, и некоторые из ком-
понентов мог ут осесть на дно пакета.
Десятикратные концентраты стоят в два-три раза
дороже (в иересчете на 1 л среды рабочей концентра-
ции) по сравнению с порошкообразными средами, од-
нако при .пом происходит экономия за счет отсутствия
стадии стерилизации. Приобретение сред рабочей
концентрации наиболее дорого (в 4 5 раз по сравнению
с концентратом 10х), но наиболее удобно, поскольку
не требует дальнейших препаративных работ, кроме
добавления сыворотки, если эти необходимо. Прото-
кол 11.7 описывает приготовление полной среды из ос-
новного раствора 1х; упоминаемое количество связано
с выполнением упражнения 3 (см. гл. 2). Предлагаемые
объемы минимальны, хотя они могли быть предвари-
тельно отобраны из бутылей большего объема.
ПРОТОКОЛ 11.7. Приготовление среды
из концентрата с кратностью 1 х
Схема
Проверьте рецептуру; если это полная среда, она
может использоваться непосредственно после добав-
ления сыворотки, если эти требуется (см. разд. 9.6.
13.6.2). Если состав неполный (например, при не-
достатке глютамина), добавьте соответствующее
вещество- концентрат.
11.4. Реагенты и среды
195
Примечание. Компоненты (например, сыворотка или
антибиотики) это элемент, который добавляете» к
среде и отсутствует в первоначальной рецептуре.
Необходимо описание всех компонентов, которые
вы вводите в среду, в любой публикации. Другое
компоненты (например, i-чютамин или NaHCO,)
являются обычной составной частью рецептуры, и
они не должны описываться в публикациях, если
только вы не ввели какие-то изменения в значения
их концентрации.
Материалы
• Пииетки и т.д., как описано в Протоколе для
стерильной техники (см. протокол 6.1,6.2), плюс
дополнительное количество для обеспечения
работы upemio.iaiaeMOi'o объема:
• Основная среда, например МЕМ Эрла с солями
Хэнкса................................100 мл
• Глютамин. 200 шМ (должен быть разморожен на
бане..................................1 мл
• Бычья сыворотка (размороженная), фетальная
или новорожденного теленка............ 10 мл
• Антибиотики (если требуется; не рекомендуются
для обычного использования):
• Пенициллин в ССР или D-PBSA,
Ю,ОООЕд/мл............................0,5 мл
• Стрептомицин в ССР или D-PBSA,
10 mi мл.....................——.....0,5 мл
Протокол
1. Проверьте состав среды и определите, какие ком-
поненты требуются, например глютамин.
2. Перенесите среду вместе с необходимыми ком-
понентами в ламинар-бокс.
3. Снимите упаковку с бутылей, если они обернуты
в полиэтилен, протрите 70°Ь-м этанолом
4. Снимите крышки с бутылей.
5. Перенесите соответствующий объем каждого
компонента в основной раствор для получения
раствора правильной концентрации;
Для 100 мл среды используйте следующие компо-
ненты и количества*
Глютамин. 200 мМ....................1 мл
Антибиотики (если используются).....но 0.5 мл
Сыворотка..................10 мл (для 10%)
а) Используйте различные иииетки для каждой
добавки.
б) Перемещайте каждую новую бутыль с основ-
ной средой в противоположную сторону ла-
минар-бокса после внесения компонента так,
чтобы вы знали, что манипуляция проведена
в) Уберите все компоненты из ламинар-бокса
после завершения изготовления среды.
6. Этот протокол предполагает использование МЕМ
с солями Хэнкса, который имеет низкую концен-
трацию бикарбоната (4 мМ). Если используется
МЕМ с солями Эрла. или дручая среда с высоким
содержанием бикарбоната (2.3 мМ), то необхо-
димо добавление 5% СО, к |азовой фазе. Не про- |
пускайте газ через среду, содержащую сыворотку, .
так как образующиеся пузыри вызовут образова-
ние пены, которая может выходить из горлышка
сосуда, что связано с риском загрязнения.
7. Вновь закройте бутыли крышками.
8. Измените этикетки, внесите зап пси добавлен н ых I
компонентов, даты и инициалы оператора
9 Возвратите среду на хранение при 4 °C или не
посредственно используйте (см. 1Л. 2, упражне-
ние 4).
10. При использовании новой среды впервые внесите
пипеткой определенное количество ее во флакон
или чашку Петри, инкубируйте, но крайней мере,
1 ч (предпочтительно в ч ечен не ночи) при ваших
стандартных условиях, чтобы |арантировать,
что устанавливается равновесие pH в нужных
пределах. Если это не так, то откорректируйте
pH среды или измените концентрацию СО, в
газовой фазе.
Примечание к протоколу 11.7. Изменение кон-
центрации СО2в инкубаторе подействует на все
культуральные среды, находящиеся в инкубаторе.
Изменение концентрации углекислого >а.за должно
рассматриваться как однократное воздействие и не
должно использоваться для уменьшения колебаний pH
от партии к партии. Эти колебания лучше контролиро-
вать добавлением стерильной кислоты или щелочи.
Приготовление среды из концентрата 10х представ-
ляет собой компромиссное решение между экономиче-
ским выигрышем приготовления среды из порошка (см.
протокол 11.9) и ле1 костью использования раствора
рабочей концентрации 1х (см. протокол 11.7). Прото-
кол 11.8 разработан для того, чтобы быть использован-
ным при выполнении упражнения 10 (см. гл. 2).
Если потребуется добавить какие-то иные состав-
ляющие, растворенные в воде, то необходимо учесть
изменение объема и уменьшить соответственно объем
воды в бутыли. Если дополнительные компоненты
разведены в изотоническом растворе соли, то они могут
быть добавлены к конечному объему среды. Поскольку
сыворотка является изотоническим раствором, она
может быть также добавлена к конечному объему,
хотя это, естественно, несколько снизит концентрации
веществ в среде. Bceiaa контролируйте и доводите pH
до необходимого значения при 37 °C, поскольку при
повышении температуры снижается растворимость
СО,, а также изменяется рКаHEPES.
Регулирование pH. Количество щелочи, необходи-
мой для нейт]хыизацни концентрата среды 10х (которая
сделана кислой для обеспечения хорошей растворимости
компонентов), может варьировать от партии к партии
и от одной среды к другой. На практике, титрование
среды до pH 7,4 при 37 °C может быть достаточно за-
трудни гельным. Приготавливая новую среду впервые.
196
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
ПРОТОКОЛ 11.8. Приготовление среды
из концентрата с кратностью 10х
Схема
Простерилнзовать несколько порции деионизиро-
ванной дистиллированной воды такого объема, что-
бы одна аликвота использовалась в течение одной-
трех недель. Добавить концентрированную среду и
дру t ие добавки, довести pH и использовать раствор
или поставить в холодильник на хранение.
Материалы
Пипетки и т.д. аналошчно списку для стерильной
техники (см. протоколы 6.1. 6.2). плюс дополни-
тельное количество, достаточное для обеспечения
следующих манипуляций:
А. Для запечатанной фляси культуры с воздушной
газовой фазой, низкой концентрацией НСОЧ_, ат-
мосферной концентрацией СО2, и низкой буферной
емкостью.
Стерильные растворы для 500 мл среды:
• Предвари гельно определенное количество
UPW................................443 мл
• Среда, концентрат 10х, например. МЕМ < голями
Хзнкса................................50 мл
• Глютамин (размороженный) до конечной кон-
центрации 2 мМ, 200 шМ, 5 мл
• NaHCO-j, чтобы до конечной концентрации 4 мМ,
7,5% (0,89М)............................5 мл
• Бычья сыворотка (размороженная), до конечной
концентрации 10%. новорожденного теленка или
фетальная............................50 m.i
• Антибиотики если требуется ( не рекомендуются
для постоянного использования):
Пенициллин, до конечной концентрации
50 ед-/мл; 10,000 ед. мл.............2,5 мл
Стрептомицин до конечной концентрации
50 мкг/мл, 10 мг 'мл...............2,5 мл
• Н ЕР ES (если требуется). 1,0 М....5-10 мл
• NaOH, 1 М..................но потребности
Протокол
1 Разморозьте сыворотку и шютамин перенесите
в ламинар-бокс.
2 Перед внесением в ламинар-бокс протрите этано-
лом все бутыли, которые были в водяной ванне
3 Добавьте вещества, как описано в разделе сте-
рилизации растворов. Можно добавить HEPES,
чтобы увеличить буферную емкость раствора, для
некоторых клеточных линий с высокой клеточ-
ной плотностью, если образуется много кислоты,
можно использовать вентилируемые флаконы.
4 Добавьте IM NaOH, чтобы получить pH 7,2 при
20 °C. При инкубировании при 37 °C значение
pH среды повысится до 7.4, но первый раз, koi да
используется среда данного состава, это значе-
ние должно быть экспериментально проверено
титрованием (см. ниже, протокол 11.7, и >л. 2,
упражнение 10).
В. Для культур в открытых судах в СО2 инкубаторе,
или в запечатанных флаконах, с 5% СО2и высокой
концентрацией бикарбоната
Стерильные растворы на к 500 мл среды:
Предварительно измеренное определенное коли-
чество UPW............................443 мл
Концентрат среды 10х, например, М ЕМ с солями
Эрла...................................50 мл
• Глютамин (размороженный) до конечной кон-
центрации 2 мМ, 200 мМ..................5 мл
• NaH СО3, до конечной концентрации 26 мМ; 7,5%
(0.89 М)..............................14.5 мл
• Бычья сыворотка (размороженная), до конечной
концентрации 10%. новорожденного теленка или
фетальная.............................50 мл
• Антибиотики если требуется ( не рекомендуются
для постоянного использования):
Пенициллин; 10,000 ед/мл..............2,5 мл
Стрептомицин 10 mi мл..............2,5 мл
• NaOH, 1 М...................но потребности
Протокол
1. Разморозьте сыворотку и 1лютамин перенесите
в ламинар-бокс.
2. Перед внесением в ламинар-бокс протрите этано-
лом все бутыли, которые были в водяной ванне
3. Добавьте вещества, как описано в разделе сте-
рилизации растворов. Можно добавить HEPES.
чтобы увеличить буферную емкость раствора, для
некоторых клеточных линий с высокой клеточ-
ной плотностью, если образуется mhoi о кислоты,
можно использовать вентилируемые флаконы.
4. Добавьте IM NaOH, чтобы получить pH 7.2 при
20 С. При инкубировании при 37 °C значение
pH среды повысится до 7,4. но первый раз, ко1да
используется среда данною состава, это значение
должнс । быть экспериментально проверено титро-
ванием (см. доводка pH, ниже).
а) Внесите 5 мл в каждую из 5 чашек Петри.
б) Добавьте различное количество IN NaOH,
от 5 доэО мкл, в каждую чашку Петри
в) И нкубировать в атмосфере 5% СО > как ми ни-
мум двух, либо, предпочтительно, в течение
С. Для культур в открытых судах в СО2 инкубаторе,
или в запечатанных флаконах, с 2% СО2 и высокой
концентрацией бикарбоната
Стерильные растворы на 500мл среды.
Предварительно определенное количество
UPW...................................443 мл
• Среда, концентрат 10х, например, среда Хэма
F12.................................. 50 мл
11.4. Реагенты и среды
197
• Глютамин (размороженный) до конечной кон-
центрации 2 мМ, 200 мМ...................5 мл
• NaHCOj, до конечной концентрации 8 мМ, 7.5%
(0.89М)..................................9 мл
* HEPES, до конечной концентрации 20 мМ;
1,0 М................................10 мл
• Бычья сыворотка (размороженная), до конечной
концентрации 10%, новорожденною теленка или
фетальная................................50 мл
• Антибиотики, если требуется (не рекомендунпся
для постоянного использования):
I li-ни ци л. ин; 10.000 t-д, 'мл..2.5 мл
( <|><-1Г1омицин; 10 mi/мл...........2.5 мл
• ХаОН. 1 М...................по потребное!и
Протокол
1. Разморозьте сыворотку и 1лютамин перенесите
в лам и нар-бокс.
2. Перед внесением в ламинар-бокс протрите этано-
лом все бутыли, которые были в водяной ванне.
3. Добавьте вещества, как описано в разделе стери-
лизации растворов.
4. Добавьте IM NaOH. чтобы получить pH 7,2 при
20 °C При инкубировании при 37 °C значение
pH среды повысится до 7,4, но первый раз, koi да
используется среда данною состава, это значение
должно быть экспериментально проверено титро-
ванием (см. mat В4 выше и Доводка pH ниже).
добавляйте в различные порции среды определенные
количества NaHCO-,11 оставьте их при 37 °C в соответ-
ствующей газовой фале. Проверьте pH на следующее
утро и выберите правильное количество щелочи. Осталь-
ную среду кповьте в соответствии с результатом.
Бикарбонат натрия. Концентрация бикарбоната
важна ири установлении стабильного равновесия с
атмосферным СО,. Независимо от количества ис-
пользованного бикарбоната, если среда находится при
37 °C. и pH 7,4, каждой концентрации СО, будет соответ-
ствовать определенная концентрация бикарбоната (см.
разд. 9.2.2 и табл. 9.1). Некоторые среды разработаны
для использования при высоких концентрациях би-
карбоната и повышенной концентрации СО, (напри-
мер, среда Игла М ЕМ с солями Эрла), в то время как
друше имеют низкую концентрацию бикарбоната для
использования в атмосфере атмосферного воздуха (на-
пример, среда Hi ла МЕМ с солями Хэнкса,см. табл. 8.1
и 8.2). Если среда модифицируется и ее компоненты,
в том числе концентрация бикарбоната, меняются, то
важно удостовериться, что осмолярность находится в
приемлемом диапазоне. Осмолярность все1да следует
контролировать (см. разд. 9.2.5), koi да производится
любое значительное изменение среды, приводящее к
отличию от первоначальной рецептуры.
Добавки к среде. Если ваш расход питательных
сред достаточно высок (> 200 л/год) и вы приобретаете
готовые среды, то будет лучше, если вы будете приобре-
тать дополнительное количество компонентов, которые
должны быть использованы как добавки, поскольку это
будет дешевле. В частности, HEPES очень дорог, если
покупать его отдельно. Глутамин часто поставляется
отдельно от сред, поскольку он нестабилен; лучше
приобретать его отдельно и хранить в замороженном
виде. Время иолужизни 1лутамина в среде при 4 °C
составляет около 3 недель и при 37 °C около 1 неде-
ли. Некоторые дипептиды глутамина повышают его
стабильность, в то время как биолотческая ценность
глутамина сохраняется. К таким коммерческим препа-
ратам 1лутамина относится Gkitainax, производимый
компанией Invitrogen.
Выпадение осадка. Следует позаботиться о том.
чтобы все компоненты концентрата 10х находились
в растворенном виде или, ио крайней мере, были тща-
тельно ресусиендированы до разведения концентрата.
Некоторые соединения (такие как фолиевая кислота
или тирозин) могут выпадать в осадок и теряться ири
разведении. Инкубация при 37 °C в течение нескольких
часов может помочь преодолеть эту проблему.
Контроль качества. Если партия среды исследо-
вана на предмет ростовых и дру1 их свойств, и Они при
этом признаны удовлетворительными, то не требуется
проводить тестирование всякий раз при использовании
среды из этой партии. Однако стерильность среды,
полученной разведением концентрата 10х, до начала
ее использования должна быть проверена инкубиро-
ванием аликвоты полной среды при 37 °C в течение
48 ч (см. разд. 11.6.2).
11.4.4. Порошкообразные среды
Инструкция к применению порошкообразных сред
прилагается к каждой упаковке. Выберите такой раз-
мер упаковки, который вы можете использовать за один
раз, и используйте среду в течение трех месяцев. Вы-
бирайте рецептуру без i-чютамина. Если присутствуют
дру 1 ие нестабильные компоненты, их также можно не
включать и добавлять позже как стерильный концент-
рат. Хотя BSS MOiyr быть стерилизованы автоклави-
рованием (см. протокол 11.6), при этом нежелательно
добавлять! л юкозу и бикарбонат. Если BSS может быть
автоклавирован полностью, воспользуйтесь процеду-
рой приготовления для порошкообразных сред (см.
протокол 11.9).
Для тех, кто использует меньшие количества
(< 1,0 л нед) или несколько различных типов сред
меньших объемов, могут быть подготовлены полные
среды с глутамином, которые будут профильтрова-
ны непосредственно в емкости для хранения: (см.
разд. 11.5.2 и протокол 11.12). При использовании
фильтрационной системы отрицательно! о давления
некоторое количество растворенного СО,может быть
потеряно в процессе фильтрации, и pH может новы-
198
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
ПРОТОКОЛ 11.9. Приготовление среды
из порошка
Схема
Развести все содержимое пакета в нужном объеме
UPW, используя магнитную мешалку и добавляя
порошок постепенно с постоянным перемешивани-
ем. Когда все компоненты растворятся полностью,
среда должна быть немедленно профильтрована
Нельзя оставлять раствор нефильтрованным в
этом случае может произойти выпадение в осадок
какого-то из компонентов среды, либо появляется
микробное загрязнение. После внесения необходи-
мых добавок (например, глютамин, NaHCO^, или
сыворотка) следует отрегулировать pH среды.
Оборудование и материалы
Стерильные:
• Градуированные бутыли для среды. 100 мл.10
• Крышки для бутылей..................10
• У ниверсальные контейнеры для контроля загряз-
нения образцов.................... 3
Нестерильные:
• Сверхчистая вода................... 1л
• Порошкообразная среда, например М ЕМ с соля-
ми Эрла, без глютамина, 1-л пакет
* Градуированная бутыль или флакон Эрлен-
маиера, объемом 1 л плюс дополнительный
объем....................................1
• Магнггтная мешалка и PTFE-покрытыи вкла-
дыш. 50 мм...............................1
• Кондуктометр
Протокол
1. Внесите соответствующий объем сверхчистой
воды в контейнер.
2. Положите вкладыш маг нггтной мешалки.
3. Поставьте контейнер на ма1нитную мешалку,
установите режим около 200 об./мии
4. О скроите пачку порошка и медлен но добавьте
содержимое в контейнер при постоянном пере-
мешивании.
5. Размешайте до полного растворения порошка.
6. Возьмите образец, проверьте pH и проводимость
образца и произведите записи.
а) pH должен быть в пределах 0,1 от ожидаемого
уровня для данной среды.
6) Проводимость должна быть в пределах 2ио от
ожидаемой для данной среды
в) Сбросьте образец в отходы; не возвращайте
его в основную емкое гь со средой.
7. Стерилизуйте фильтрацией (см. разд. 11.5.2,
протоколы 11.11—11.14).
8. Закройте бутыли крышками, запечатайте.
9. Храните цри 4° С.
10 Перед использованием добавьте сыворотку и
глютамин, доведите pH до 7,4.
шаться. Убедитесь, что в среде находится правильное
количество NaHCO,, соответствующее данной газовой
фазе (см. разд. 9.2.2), цри установлении равновесия в
инкубаторе. Это должно быть подтверждено экспери-
ментально, когда среда используется первый раз.
Для крупномасштабного использования (> 10 л нед)
среда может быть подготовлена в сосуде иод давлением,
проверена через определенный промежуток времени
при помощи большой иииетки, чтобы определить,
является ли среда полной, с последующей стерилиза-
цией фильтрацией при положительном давлении через
встроенный одноразовый фильтр или многоразовый
фильтр, с поступлением в принимающий сосуд (см.
разд, 11.5.2, протокол 11.14).
11.4.5. Специализированная среда
Если кто-либо намеревается использовать различные
рецептуры сред либо среду, которая должна быть
составлена в лаборатории из отдельных составляю-
щих, то в этом случае удобно будет приг отопить ряд
основных концентрированных растворов - ами нокис-
лот - 50х или 100х; витаминов 1000х; тирозина и
триптофана — 50х в 0,1 М растворе НС1; глюкозы в кон-
центрации 200 г/л; и однократный раствор BSS. При
необходимости смешивается требуемое количество
каждого концентрата, смесь фильтруется через сте-
рилизационный фильтр с порами диаметром 0,2 мкм
и разводится в низко- или высокобикарбонатном BSS
(см. разд. 11.4.2, рис. 11.11, 11.12 и табл. 9.2). Пре-
имуществом такого типа составления специализиро-
ванных сред является возможность ее варьирования;
могут быть добавлены дополнительные питательные
вещества (оксо-кислоты, нуклеозиды, неорганические
вещества и т. д.), основная среда может быть изменена
в зависимости от требований. Однако на практике эта
система настолько трудоемка, что лишь некоторые ла-
боратории идут на прш отопление питательных сред из
отдельных компонентов, если только целью работы не
является изучение влияния постоянно меняющегося
состава питательной среды.
Надежность коммерческих сред целиком обусловле-
на проводимым соответствующим контролем качества.
Любая среда, приготовленная из отдельных компонен-
тов в лаборатории, также должна иройти исследования
на контроль качества (см. разд. 11.6.1).
В настоящее время существует достаточно много
надежных компании-поставщиков стандартных ос-
новных сред (см. Приложение II), многие из которых
могут предоставить специализированные бессыворо-
точные композиции и среды. Важно удостовериться,
что контроль качества, проводимый поставщиком,
соответствует' данной среде и тем клеткам, которые вы
предполагаете растить на ней. Вы могли бы кушпъ сре-
ду MCDB 153,которая исследуется на колониеибразо-
вание клеток HeLa, но этот тест не имеет* отношения и
не характеризует пригодность этой культуры для куль-
тивирования первичной культуры кератиноцитов.
11.4. Реагенты и среды
199
ПРОТОКОЛ 11.10. Приготовление
специвлизированной среды
Схема
Приготовьте основные концентраты сред (на осно-
вании табл. 9.3 или 10.1). храните в замороженном
виде. Разморозьте и смешивайте при необходимости
использовании
Стерилизуйте методом фильтрации и храните,
кока не потребуется.
Материалы
Концентрат аминокислот, ЮОх в воде, хранить
замороженным
• Тирозин и триптофан, 50х в 0.1 М HCL
• Витамины. 10(Юх в воде
• Глюкоза, ЮОх (200 t/л в ССР)
• Растворы добавок (например, микроэлементы
и нуклеозиды, юрмоны, или факторы роста,
которые должны быть добавлены только перед
использованием среды)
• Бутыли для хранения оптимального размера для
аликвоты того количества среды, которое потре-
буется для последующего разведения (см. икн 5
данного протокола)
Протокол
1. Разморозьте растворы, убедитесь, что все раство-
ры полностью прозрачны.
2. Смешайте компоненты в правильных колпчест-
а) концентрат аминокислот 100 мл
б) тирозин и триптофан 200 мл
в) витамины 10 мл
t) t люкоза 100 мл
3. Перемешайте, иростерилизуйтефильтрацией (см.
протоколы 11.12. 11.13).
4. Храните замороженным.
5. Для использования разведите 41 мл смеси кон-
центратов с 959 мл стерильного ССР 1х.
6. Доведите pH до 7,4.
7. Храните при 4 °C.
8. Непосредственно перед использованием среды
добавьте сыворотку или друше компоненты,
типа гормонов, факторов роста и липидов. Если в
качестве микроэлементов используются металлы,
лучше добавить их также только неред использо-
ванием среды, поскольку в концентрированных
растворах в присутствии фосфата они мотут
выпадать в осадок.
11.5. СТЕРИЛИЗАЦИЯ СРЕДЫ
11.5.1. Автоклавируемые среды
Некоторые поставщики предлагают автоклавируемые
варианты среды И1да МЕМ и дру1их сред. Автоклави-
рование намного снижает трудозатраты, экономически
дешевле и имеет более высокую надежность качества
стерильности но сравнению с фильтрацией. Процедура,
нри помощи которой проводится автоклавирование,
обычно бывает описана в инструкции производителя
и аналогична описанной ранее для D-PBSA (см. про-
токол 11.6). Кислотность среды доводят до pH 4,25 при
помощи сукцината, для того чтобы стабилизировать ви-
тамин В при автоклавировании и после нейтрализуют'.
Глутамин замещен на t лутамат или t лутамил, либо на
динецтиды t лутамила. Можно также добавить глюкозу
после автоклавирования.
BSS автоклавируют без и ичюкозы и глутамина,
а также без различных шдролизатов аминокислот,
типа триитозофосфатного бульона и друt их микро-
биологических сред, которые стерилизуются также
автоклавированием.
11.5.2. Стерилизация методом фильтрации
Фильтрация через микропористые фильтры с диамет-
ром пор от 0,1 до 0,2 мкм применяется для стерилизации
термолабильных растворов (рис. 11.11). В настоящее
время предлагаются многочисленные виды фильтров,
сделанные из различных материалов, включая поли-
эфирсульфон (PES), нейлон, поликарбонат, ацетат
целлюлозы, нитрат целлюлозы, PTFE, и керамику, и
размерами от насадки для шприца (рис. 11.12а, в) через
маленький и промежуточный встроенные фильтры
(рис. 11.126, в, е) до фильтров в картридже (рис. 11.13).
Фильтры связывающие белки низкой плотности, пре-
доставляв лея большинством поставщиков (например,
Durapore, Millipore); обычно считается, что PES- филь-
тры обеспечивают более высокую скорость фильтрации.
Поликарбонатные мембранные фильтры это абсо-
лютные фильтры с множеством отверстий одного диа-
метра; число отверстий на единицу площади возрастает
при уменьшении диаметра отверстий, это обеспечивает
однородную скорость потока. Большинство друз их
фильтров имеют разнообразные структуры сит и спосо-
бов захвата частиц на фильтре; они вообще имеют более
высокую скорость потока и уменьшенное засорение, но
мечут деформироваться при высоких давлениях.
Фильтрация может быть выполнена при поло-
жительном давлении (см. рис. 11.11а, рис. 11.126,
л, е), соединена г герметизируемым контейнером
(см. рис. 11.14) или с перистальтическим насосом
(рис. 11.15). Фильтрация иод высоким давлением от
сосуда иод высоким давлением быстрее, чем прокачка
нри помощи перистальтического насоса, но потребует
использования сосуда-приемника, поскольку поток
не может ре1улироваться так легко, принимая во
внимание, что насос может быть включен и выключен
нри необходимости. Высокое давление также имеет
тенденцию деформировать фильтры и не подходит
для вязких растворов тина сыворотки. Фильтрация
при отрицательном давлении часто более проста (см.
рис. 11.116, 11.12г, <)), особенно для маломасштабных
200
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
а ФИЛЬТРУЮЩАЯ НАСАДКА НА ШПРИЦ 6 ФИЛЬТРУЮЩАЯ НАСАДКА НА КОЛБУ
Рис. 11.11. Стерилизация фильтрацией, (й) Фильтрующая
насадка на шприц. Нестерильная среда tine tyuacT через насос
или из сосуда под давлением. (6) фильтрующая вакуумная
насадка на колбу или бутыль. Среда, налитая в верхнюю
емкость, переходит в нижнюю. Нижняя емкость может ис-
пользоваться для хранения
экспериментов, при сборе фильтрата непосредственно
в емкости для хранения. Фильт рация может вызывать
повышение pH из-за выделения С()2.
Одноразовые фильтры. Существуют различ-
ные конструкции одноразовых держателей фильтра,
включая простые дисковые фильтры, иоловолоконные
фильтры, и картриджи (см. рис. 11.11—11.13). Обычно
фильтрующие насадки для ширина используются для
малых объемов фильтрации (2—20 мл) и различны по
размеру: от 13 до 50 мм в диаметре (см. рис. 11.12с).
Фильтры промежуточною размера (для объемов
50 мл—5 л) могут использоваться с перистальтическими
насосами (рис. 11.14), и ли как фильтрующие насадки на
бутыли, используемые с вакуумной линией и стандарт-
ной бутылей для сред (рис. 11.12е) Фильтры средних
размеров moivt также быть куплены как комплект
фильтрующих блоков для присоединения к вакуумной
линии, с верхней емкостью для нестерильного раствора
и нижней емкостью для стерильной жидкости, эту ем-
кость затем сразу закрывают и используют для хране-
ния (рис. 11.12d). Фильтрующие картриджи большой
мощности (для объемов 20—500 л) обычно используют
под действием положительного давления (рис. 11.13,
11.15). Хотя одноразовые фильтры более дорш и, чем
фильтры многократного использования, они отнимают
меньше времени, реже приводят к неудачам.
Фильтры многократного использования. Держа-
тели фильтра миоюкратного использования могут
использовать мембраны (рис. 11.16) или картриджи
(рис. 11.136) и стерилизуются автоклавированием (см
протокол 11.4). Они обычно соединены с резервуаром,
находящимся под давлением (см. рис. 11.15) или с
перистальтическим насосом и работают иод положи-
тельным давлением.
Протоколы 11.11 11.14 разработаны для одноразо-
вого фильтра малого размера и для фильтра многократ-
ного использования для больших объемов.
Шприц может быть заполнен несколько раз, при
этом насадка возвращается в нижнюю половину
стерильной упаковки, снимается со шприца, шприц
заполняется и вновь соединяется с насадкой. Если
используемое г идростатическое давление возрастает,
возьмите новый фильтр.
Б вакуумной линии или при использовании насоса
удобно фильтровать объемы 50—500 мл с отрицатель-
ным давлением, собирая фильтрат во флакон-интегра-
тор (см. рис. 11.116, 11,12г)) пли при помощи насадки
на обычную бутыль для среды (см. рис. 11.12/). Про-
токол 11.12 разработан для использования в упражне-
нии 9 (см. гл. 2). Можно использовать дру< ие объемы
и фильтры дру1 их размеров (см. табл. 11.4).
В целом, этот метод фильтрации имеет низкий риск
заражения, поэтому образцы для проверки на заражен-
ность можно брать достаточно редко.
В качестве сосудов-ириемников большого объема
moivt быть использованы колбы для фильтрования
объемом 150—1600 мл. Если должен быть црофиль-
ПРОТОКОЛ 11.11. Стерилизация
с использованием фильтрующих насадок
на шприцы
Материалы
Стерильные:
• Пластмассовый шприц объемом от 10 до 50 мл
• Фильтрующая насадка на шприц (например, Pall
I Gelman Acrodisc или
• Mtllipore Millex)
I • Принимающий сосуд (например, универсальный
| контейнер)
I Нестерильные:
| • Стерилизуемый раствор (5-100 мл)
I
| Протокол
1. Протрите ламинар-бокс и принесите необходи-
' мые материалы.
' 2. Заполните шприц раствором, который будет
стерилизоваться.
। 3. Снимите крышку с принимающего сосуда
1. Распакуйте фильтр и присоедините к наконеч-
нику шприца, удерживая стерильный фильтры
нижней половиной в упаковке, пока не произой-
| дет соединение насадки со шприцом
5. Профильтруйте раствор через фильтр в при-
нимающий сосуд. Требуется только умеренное
давление.
6. Закройте крышку принимающего сосуда.
। 7. Поместите шприц и фильтр в отходы.
I____________________________________________
11.5. Стерилизация среды
201
Рис. 11.12. Одноразовые стерилизационные фильтры, (a) Milicx 25-мм дисковая фильтрующая насадка на шприц, (б) одно-
разовым фильтр с колоколом, (в) фильтр Stenvcx с колоколом и без, (г) филырующая насадка на бутыль, (<)) фильтрующая
крышка и емкость для хранения. (F) Большой встроенный фильтр с колоколом (а б.в г) Положительное давление, (г d) От-
рицательное давление (см. также рис. 11.11)
Сфотографировано с любезного разрешения Milliporc (UK). Ltd
Рис. 11.13. Фильтрационная установка большой мощности,
(о) Большие сосуды давления для фильтрации при поло-
жительном давлении, (б) фильтры для крупномасштабной
фильтрации в виде сложенных в стоику дисков и плиссиро-
ванного картриджа
Сфотографирована с любезною разрешении Milliporc
(UK), Ltd.
трован н разлит на меньшие порции большой объем
жидкости, го лучше использовать один из нескольких
типов фильтрующих насадок на бутыли, которые могут
соединяться непосредственно со стандартной бутылью
д.ля среды (см. рис. 11.12г). Напротив, растворы MOiyT
быть профильтрованы под действием положительного
давления либо из сосуда иод высоким давлением (см.
рис. 11.14), проходить через стерильные встроенные
мембранные фильтры или картриджи, оборудованные
раструбом для защиты принимающих сосудов от зара-
жения (см. рис. 11.11,11.12,11.14, И.15). Протокол 11.13
разработан для фильтров малого размера и может быть
использован при выполнении упражнения 9.
Масштаб фильтрации при положительном давле-
нии может быть увеличен путем возрастания размеров
фильтра и размеров принимающего сосуда. Перисталь-
тический насос часто заменяют на дополнительное
положительное давление, оказываемое на резервуар-
202
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
ПРОТОКОЛ 11.12. Стерилизация
с использованием фильтрующей
вакуумной насадки на колбу
Материалы
Стерильные:
• Фильтрующая насадка для объема 500 мл (см.
рис. 11.116; см. например, рис. 11,12г)).1
• Крышка для нижерасиоложенной емкости (если
кредиола] ается, что эта емкость будет использо-
вана для хранения).......................1
• Тиковая пробирка или универсальный контейнер
для проверки стерильности образца........1
Нестерильные:
• Среда для стерилизации.. ........ 450 мл
* Вакуумный насос или вакуумная линия
• Толстое генный соединительный шлан), соеди-
няющий соответствующее входное отверстию
фильтрующей насадки с насосом или линией
Протокол
1. Присоеди ните боковую отводящую трубку фильт-
рующей насадки к вакуумному насосу.
2. Снимите крышку с бутыли со средой и колпачок
с верхней камеры фильтрующей насадки.
3. Налейте нестерильную среду в верхнюю ем-
4. Включите насос.
5. Снимите крышку с нижней емкости, готовой к
приему стерильной среды.
6. Когда вся жидкость переместится в нижнюю
емкость, выключите насос и отсоедините фильт-
рующее устройство.
7. Перенесите 10 мл среды из нижней емкости в
универсальный контейнер или соответствующую
пробирку.
8. Заполните 1азом с 5% СО, свободное простран-
ство в нижней емкости и универсальном контей-
9. Закройте крышками нижнюю емкость и универ-
сальный контейнер.
10. Снабдите емкость и универсальный контейнер
наклейками с названием среды, датой, и вашими
инициалами.
11. Храните среду при 4 °C пока она не потребуется.
12. Инкубируйте 10-мл образец в универсальном
контейнер при 37 °C в течение 1 недели для про-
верки стерильности. Не используйте среду, пока
не доказано, что она стерильна.
приемник для среды в сосуде для высокого давления
(см. рис. 11.13). Протокол 11.14 подходит для объемов
до 50 л, но объем может быть увеличен до промышлен-
ных масштабов путем выбора соответствующего сосуда
высоко! о давления и фильтра (часто с использованием
гофрированного каргриджа или друт их фильтров боль-
шой мощности).
ПРОТОКОЛ 11.13. Стерилизация
с использованием малого
встроенного фильтра
Материалы
Стерильные:
• Встроенный фи л ьтр с колоколом (см. рис. 11.11а,
11.12е)..............................47 мм
• Градуированные бутыли для среды с горлышка-
ми, обернутыми фольгой, стерилизованные сухим
жаром (см. протокол 11.1)................7
• Автоклавированные крышки (см. прото-
кол 11.3)................................6
• Типовая пробирка или универсальный контейнер
для проверки стерильности................1
Нестерильные.
• Среда для стерилизации (из упражнения 9 и
протокола 11.9)......................550 мл
• Перистальтический насос (рис. 11.14) предпоч-
тительно с ножной педалью...............1
* С иликоновый шлан) для присоединения насоса
к входному отверстию фильтра.........50 см
Зажим для фиксации фильтра............1
Протокол
1 Присоедините шлан! для подачи среды через
перистальтически it насос.
2. Опустите верхний конец шлан] а в среду, которая
будет стерилизоваться.
3. Распакуйте фильтр и соедините с выходом перис-
тальтического насоса.
4. Закрепите фильтр в фиксаторе на подходящей
высоте, так чтобы бутыли для фильтрованной
среды с завернутым в фолы у горлышком moi ли
бы поместиться ниже фи дыра и фольга могла
быть легко удалена перед заполнением. Если
необходимо, используйте одну из стерильных
средних бутылей при установке фильтра, но не
используйте затем эту бутыль для окончатель-
ного собирания стерильной среды.
5. Включите насос, соберите около 20 мл в бутыль,
использованную для установки фильтра
6. Удалите бутыль из установки, закройте ее крыш-
кой и поставьте на этикетке № 1.
7. Удалите фолы у с первой бутыли и поместите иод
колоколом фильтра.
8. Включите насос.
9. Заполните бутыль до отметки 100 мл.
10. Выключите насос.
11. Удалите бутыль, закройте крышкой, поставьте
номер и замените на новую стерильную бутыль.
12. Повторите шаш 7 11, заполняя 5 бутылей но
100 мл. соберите остаток в последней бутыли. За-
полните 1 азом с 5% СО»свободное пространство
в каждой бутыли.
13. Заверните в алюминиевую фолы у крышку и
горлышко каждой бутыли, чтобы предохранить
от ныли при хранении
11.5. Стерилизация среды
203
14. Наклейте этикетки на бутыли, поставьте дату,
ваши инициалы.
15. Поместите бутыли, содержащие 100 мл среды,
для хранения на 4 °C (см. разд. 11.6.4).
16. Поместите первую и последнюю бутыли, запе-
чатанные, на 37 °C, инкубируйте в течение 1 нед.
(см. разд. 11.6.2).
17. Храните среду при 4 °C, пока не потребуется; не
используйте среду до полного завершения иссле-
дования стерильности. Если в испытательных
образцах обнаруживается заражение, иерефиль-
труйте всю партию или выбросите как брак
Положительное давление рекомендуется для опти-
мального использования фильтров и позволяет избегать
понижения концентрации СО? которая обычно имеет
место при фильтрации под действием отрицательного
давления. Положительное давление может также иметь
место при использовании перистальтического насоса
(рис 11.14), встроенного между нестерильным резер-
вуаром и одноразовым фильтром, таким как Millipak
(Millipore) который может быть использован вместо
комплекта фильтров многоразово! о использования
Подготовительные работы и стерилизация необходимы
только для принимающих бутылей, поскольку однора-
зовые фильтры поступают стерильными (фильтруемый
поток может быть легко прерван путем выключения
перистальтического насоса)
11.5.3. Сыворотка
Подготовка сыворотки является одной из самых слож-
ных процедур в культуре тканей в результате вариа-
бельности качества и плотности исходного материала, а
также из-за сложностей, возникающих при фильтраци-
онной стерилизации сыворотки, содержащей плотные
частицы и обладающей повышенной вязкостью. Более
того, сыворотка также является одним из наиболее
aopoi остоящих компонентов, используемых в культу-
ре тканей, составляющих 20—30% от общего бюджета,
если она приобретается у коммерческих поставщиков.
Приобретение стерильной сыворотки, безусловно, яв-
ляется оптимальным с точки зрения состава и контроля
качества, однако в случае, если стерильная сыворотка
должна быть приготовлена в лаборатории, предлага-
ется протокол 11.15. Основным принципом является
расположение нескольких фильтров ио градиенту
размеров пор, при этом эти фильтры не должны быть
стерильными и служат для удаления плотных частиц до
того как сыворотка поступит при невысоком давлении
на стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,1 мкм
(см. рис. 11.17).
Стерилизация небольшого объема сыворотки.
Если требуется небольшое количество сыворотки
(< 1 л), то может быть проведена процедура, аналсл ич-
ная описанной в протоколе 11.14. После сворачивания
кровяного сгустка (см. протокол 11.15; Свертывание
крови), полученное небольшое количество сыворотки
Рис. 11.14. Фильтрация при помощи перистальтического насоса Стерилизация фильтрацией при перекачивании нсси-рильноп
жидкости из емкое hi через стсрил11зац|Юнный фильтр (Millipak, Millipore. с любезного разрешения Milliporc (UK). Ltd.)
204
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Герметизируемая
емкос’ч
Встроенный
комплект фильтров
с держателем дги
0,22-мкм фильтра
Рис. 11.15. Крупномасштабная стерилизация фильтрацией с использованием большого встроенного комплекта фильтров.
Большой встроенный комплект фильтров, соединенный с герме шзирусмой емкостью (слева) и с сосудом — приемником (спра-
ва) Стерильны только комплект фильтров сосуд-приемник Обычно стеклянный колокол оборачивается защитной фольгой;
на рисунке он удален с целью иллюстрации
Таблица 11.4. Ра шеры фильтра и объем фильтруемой
жидкости
Маркировка или размер фильтра Одноразовый (0) или много- разовый (R) Приблизительный объем, рекомендуемый для фильтрации
Микролиты Коллоиды
25 мм, Millex D 1-100 mL 1-20 mL
47 mmoi R,D 0,1 1L 100-250 mL
Stcnvcx cartridge 90 nun R 1-10 L 0,2-2 L
Millipak-20 D 2-10 L 200mL-2L
Millipak-40 D 10-20 L 2-5 L
Millipak-60 D 20-30 L 5-7 L
Millipak-100 D 30-75 L 7-10 L
MiIlipak-200 D 75-150 L 10-30 L
Millidisk D 30-300 L 5-50 L
142 мм R 10-50 L 1-5 L
293 мм R 50-500 L 5-20 L
Примеры в таблице взяты из каталога Mil Ьроге. Аналшпчныс
продукты ирсдлашнпся компаниями Pall Gelman. NalgcNunc.
Sartorius и рядом других.
может быть отцентрифу! цровано (5000—10 0000 g) и
затем профильтровано через ряд одноразовых филь-
тров (например, через 50 мм Millipore Millex или Pall
German Acrodisc) u, окончательно, через 50 мм стерили-
зующий одноразовый фильтр с диаметром пор 0,1 мкм
(например, Millex).
Хранение. Для хранении сыворотки используйте
бутыли такого размера, чтобы использовать в течение
2—3 недель после размораживании. Замораживать сы-
воротку следует так быстро, как это возможно, а при
случайном размораживании не следует .юмораживать
ее повторно, если только не предполагается продолжи-
тельное ее хранение
При хранении при -20 “С сыворотку лучше исполь-
зовать в течение 6-12 месяцев после ирииггавления.
При -70 °C продолжительность хранения удлиняется;
но обычно создание больших запасов сыворотки ока-
зывается непрактичным. Желательно использовать
поликарбонатные ил и пол инрониленовые бутыли
(полипропилен высокой плотности), что снижает риск
разбивания при хранении при 70 °C. Независимо от
температуры морозильника или материала бутылей, не
11.5. Стерилизация среды
205
ПРОТОКОЛ 11.14. Стерилизация
с использованием большого
встроенного фильтра
Материалы
(См. рис. 11.13, 11.15, и 10.17)
Стерильные:
• Ф иji ьтр ( например, 90-мм мембран н ы й и держа-
тель фильтра многократного использования; см.
протокол 11.4; табл. 11.4; рис. 11.15) одноразовый
диск (например, Millipore Millex) или картридж
(например, Pall Gelman Capsule).
• Приемник для фильтрата с выпускным отверс-
тием в основании
• Силиконовый шлан! нагнетательного трубопро-
вода от фильтра до стерильно! о приемника
* Силиконовый ш.|ан1 трубки со стеклянным
колоколом и пружинным зажимом на выходе
приемника (см. рис. 11.15).
• Градуированные бутыли для среды с горлышка-
ми, обернутыми фольгой, стерилизованные сухим
жаром (см. протокол 11.1)
* Автоклавированные крышки для бутылей, (см.
протокол 11.3)
Нестерильные:
• Сосуд высокого давления, 5-50 L.
• Насос, 100 кПа (1 атм)
• Держа ie чи зажимов и зажимы, чгобы установить
фильтр (если держатель фильтра имеет окоры) и
стеклянный колокол на выходе
• Силиконовый ш.чан! для присоединения фильтра
к сосуду высокого давления
Протокол
1. Зафиксируйте держатель фильтра в нужном ио
ложении.
2. Соедините выход с принимающей емкостью.
3. Расположите выход приемника на подходящей I
высоте так, чтобы бутыли для фильтрованной
среды с завернутым в фолы у горлышком мо1ли I
поместиться ниже фильтра и фольга moi ла быть
nei ко удалена перед заполнением Если необхцди- I
мо, используйте одну из стерильных средних бу- |
ылей нри установке фильтра, но не используйте
затем эту бутыль, для окончательно! о собирания |
стерильной среды.
4. Соедините сосуд давления со входным отверсти-
ем фильтра
5. Фильтруйте среду в сосуд давления
6. Для фильтров многократного использования
открыть ненадолго насос, так чтобы увлажнить
фильтр. Остановите насос и уплотните держатель |
фильтра.
7. Включите насос, чтобы достичь 1UU кПа. К(ида |
приемник начинает заполняться, расиределитесре-
ду но бутылям аликвотами желательного объема I
8. Закройте крышку каждой бутыли после завил -
нения.
9. Оберните фольгой крышки.
10. Прикрепите этикетки с датой, инициалами .
11. В зависимости от числа и размера заполненных бу-
тылей, возьмите типовые бутыли в начале, середине
и конце процесса, инкубируйте при 37 °C в течение I
1 нед., чтобы проверить наличие заражения.
12. Храните среду при 4 °C. не используйте среду до I
полного .завершения исследования стерильности. ।
Рис. 11.16. Фильтры многократного использования, {а) Полипропиленовое встраиваемое нриснисобдснис Lucr; (б) фильтр
дискового типа высокой мощное in с держателем из цсржавеющасм стали; (в) 47-мм фильтр с резервуаром, (г) встраиваемый
фильтр 90 мм со шланговыми соединениями. (С любезного разрешения Mdhporc, UK. Ltd.)
206
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
ПРОТОКОЛ 11.15. Сбор и стерилизация
сывороток
Схема
Соберите кровь, позволив свернуться с образованием
ctycTica, и отделите сыворотку.
Простерилизуйте сыворотку через фильтры с
постепенным сокращением пористости, соберите
фильтрованную сыворотку в бутыль и заморозьте.
Сбор
Могут быть приняты какие-то меры, чтобы получать
цельную кровь из скотобойни. Кровь должна быть
собрана непосредственно из кровотока тела. Кровь
может быть также получена от животных, которые
живут при надлежащем ветеринарном наблюдении.
Последний вариант, нри выполнении одинаковой
последовательности действий на той же самой группе
животных, дает более воспроизводимую сыворотку,
но более низкий объем при большой затрате усилий.
Если процедура выполнена тщательно, кровь может
быть собрана асептически.
Свертывание крови
Позвольте крови свернуться, оставив ее на ночь в .«кры-
той емкости нри 4 °C. Эта, так называемая естественно
свернувшаяся сыворотка превосходит но качеству
сыворотку, которая физическим методом (цет|>ифу t it-
рование и дефпбринизация) отделена от клеток крови,
поскольку в ходе естественного сворачивания тромбо-
циты выделяют в сыворотку факторы роста. Отделите
сыворотку от сгустка и центрифугируйте сыворотку в
течение 1 ч нри 2,000 g. Удалите осадок.
Стерилизация
Сыворотка обычно стерилизуется фильтрацией че-
рез стерилизующий фильтр с пористостью 0,1 мкм.
Из-за вязкости и высок<и~о содержания микрочастиц
перед прохождением через заключительный фильтр
сыворот ка должна пройти через градуируемый ряд
стекловолоконных фильт ров или другой предва-
рительный фильтр (рис. 11.17). Только последний
фильтр, например 142-К 350-мм дисковый фильтр
или его одноразовый эквивалент (например, Millipak
200), должен быть стерильным. Предварительные
фильтры MOtyr бы гь сделаны из нержавеющей стали
с .заменяемым картриджем, можно также применять
отдельные фильтры или их комплекты, предлагаемые
производителями (Pall Gelnian). Соединенный в блок
комплект фильтров наиболее прост в употреблении,
но et о труднее чистить и повторно использовать.
Для стерилизации объемов 5-20 л:
Материалы
Стерильные:
• Фильтры для стерилизации: с диаметром пор
200 мм, 0,1 мкм (например. Millipak, Millipore).
Диаметр пор 0,2 мкм достаточен для антибак-
териальной и антигрибковой стерилизации, но
чтобы удалить микоплазмы, требуется фильтр с
размером пор 0,1 мкм.
• Стерильный приемный сосуд получения с вы-
пускным отверстием в основании.
• Стерильные бутыль с крышками и фольгой.
• Универсальные контейнеры для проверки сте-
рильности
Нестерильные.
• Перистальтический насос и шлаш
• Держатель зажимов и зажимы
• Нестерильные предварительные фильтры:
Стекловолоконный одноразовый фильтр или
фильтр многократного использования 142 мм
(например, Pall Gelman)
Одноразовый фильтр с диаметром пор 5 мкм
или фильтр многократно! о использования
(Например, Pall Gelman Versapore)
Одноразовый фильтр с диаметром пор 1,2 мкм
или фильтр многократною использования
(Например, Millipore Oplicap)
Одноразовый фильтр с диаметром пор
0.45 мкм или фильтр многократного исполь-
зования (Например, Millipore Millipak)
Примечание. Предварительные фильтры, предло-
женные в протоколе, не обязательны ajiu примене-
ния Вступить в контакт с вашим поставщиком и
запросить ряд фильтров и предварительных фильт-
ров. которые удовлетворят вашим требованиям
при получении сыворотки. Если зто однократ ное
действие, выбрать одноразовые фильтры. Если по-
лучение сыворотки будет повторяться ре|улярно, то
экономически более вьи одно приобрести держа te чи
фильтра многократного использования для стадий
предварительной фильтрации, с использованием од-
норазового фильтра для стерилизации фильтрацией
для дополнительной безопасности.
Протокол
1. Вставьте соответствующие нестерильные фильт-
ры в нестерильные держатели (если используют-
ся держатели многократною использования).
2. Соберите один или большее количество предва-
рительных фильтров на линии выше стерильного
одноразовою или держателя фильтра много-
кратно! о использования (рис 11.17). который
содержит фильтр с диаметром пор 0,1 мкм и
связан со стерильным принимающим сосудом
через перистальтический насос.
3. Поместите всасывающий конец трубки от насоса
в емкость с сывороткой.
4. Включите насос и проверьте все фильтры много-
кратного использования, ко: да они будут увлаж-
нены. Выключите насос и затяните держатели
фильтра ио мере необходимости.
11.5. Стерилизация среды
207
5. Повторно включите насос и продолжит е фильтро-
вание, контролируя наличие утечек или засоров.
Увеличение скорости потока увеличит скорость
фильт рации, но может повредить фильтры, кото-
рые могут забиться.
6. Соберите аликвоты стерильной сыворотки в
стерильные бутыль, оставляя как минимум 20%
пустого пространства над уровнем жидкости,
чтобы учесть расширение при замораживании.
7. Отберите на контроль стерильности образцы в
начале, середине и конце процесса.
б. Закройте бутыль крышками, приклейте этикетку,
напишите номер бутыли.
9. Вновь оберните фольгой крышку и горлышко
каждой бутыли для хранения.
10. Сыворотку храните при 20 °C, пока не закончится
проверка качества (см. разд. 11.6.1)
ПРОТОКОЛ 11.16. Диализ сыворотки
Материалы
Стерильные.
• Бутыль и крышки.
• Стерилизационный фильтр. 0,1 мкм.
• Предварительные фильтры: стекловолокон-
ный 5,0 мкм, мембранные фильтры 1,2, 0,45, и
0 22 мкм (например, Durapore. Millipore: см.
протокол 11.14)
Нестерильные:
• Диализные трубки.
• Мензурка с ультрачистой водой
• Бунзеновская орелка.
• Треножник с проволочной сеткой
• Сыворотка для диализа
• Раствор Хэнкса в 4° С.
• Измерительный цилиндр
Протокол
1. Прокипятите пять частей ЗО-ммх5ОО-мм диа-
лизных трубок в трех сменах дистиллированной
воды.
2. Перенесите трубки в сбалансированный раствор
солей Хэнкса (HBSS) и оставьте охлаждаться.
3. Завяжите двойные узлы на одном конце каждой
трубки.
4. До половины заполните каждую трубку сыворот-
кой (20 мл)
5. Выдавите воздух и завяжите открытый конец
трубы, оставив место (приблизительно половины
трубки) между сывороткой и узлом.
6. Поместите трубки в 5 л HBSS, перемешиваемый
на ма! нитной мешалке на ночь при 4 °C.
7. Замените HBSS и повторите ша| 6 дважды.
8. Соберите сыворотку в измерительный цилиндр
и обратите внимание на собранный объем. Если
объем меньше, чем первоначальный объем сы-
воротки, добавьте HBSS, чтобы возвратиться к
начальному объему. Если объем больше, чем на-
чальный объем сыворотки, сделайте необходимые
поправки при добавлении сыворотки к среде в
дальнейшем.
9 Стерилизуйте сыворотку через градуируемый ряд
фильтров (см. протокол 11,15).
10. Разлейте в бутыли и заморозьте сыворотку.
следует заполнять их до верха; учитывайте расширение
жидкостей при замораживании.
Сыворотка человека. Для культуры ткани вместо
или вместе с лошадиной сын бычьей кровью могут быть
использованы цельная человеческая кровь или плазма
но истечении срока их хранения в донорском банке.
Они должны быть стерильны и не требуют фильтрации.
Следует нейтрализовать антикоа|улянты (гепарин или
цитрат) титрованием Са'* *, оставив затем кровь на ночь
для образования сгустка, а затем отделить и заморозить
сыворотку.
• Требование безопасности. При работе с
донорской кровью следует удостовериться, что она не
заражена во.1будителями гепатита, ВИЧ, туберкулеза
и дру।ими случайными возбудителями.
Контроль качества. 11сиользуйте ту же процедуру,
что и для контроля качества среды (см. разд, 11.6).
Главной проблемой при использовании сыворотки
является возможность вирусной инфекции. Когда
на первое место по важности ставилась проблема
бактериального инфицирования, было относительно
jieiKo решить ее методом фильтрации через фильтр
с диаметром пор 0,1 мкм. В конечном итоге, стала
стандартной процедура фильтрации через фильтр с
диаметром пор 0,45 мкм. Однако обнаружилось, что
микоплазмы способны проникать через поры диамет-
ром 0,2 мкм, и коммерческие поставщики сыворотки
уменьшили размеры диамет ра пор при фильтрации до
0,1 мкм. Уменьшение размеров привело к снижению
вероятности заражения сыворотки микоплазмами, но
вероятность вирусного заражения еще существует.
Удаление вирусов фильтрацией кажется маловероят-
ным, но некоторые компании (например, Pall Gelmaun)
заявляют, что это возможно. Получение сыворотки
из районов с низким инди генным уровнем вирусного
инфицирования и скриниш до начала работы с кровью
является лучшей альтернативой.
Диализ. На определенных стадиях культивиро-
вания присутствие некоторых компонентов с низким
молекулярным весом (аминокислоты, глюкоза, нуклео-
зиды и т.д.) становится нежелательным. Эти вещества
moivt быть удалены методом диализа.
208
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Выход к сосуду-приемнику
' или стерильным бутылям
Рис. 11.17. Предварительный фильтр. Предварительный фильтр для фильтрования коллоидного раствора (например, сыворот-
ки) иди раствора с высоким содержанием частиц. Несколько предварительных фильтров мот у т быть связаны последовательно,
и только заключительный фильтр должен быть стерильным.
(в) Схематическое изображение принципа предварительной фильтрации. среда, проходящая через фильтры с постепенно
уменьшающимся диаметром пор, (г») ряд фильтров, сложенных в нестерильном держателе фильтра многократного использо-
вания с последующим поступлением раствора на стерильный одноразовый фильтр с диаметром нор 0.1 или 0.22-мкм, (в) один
одноразовый предварительный фильтр (нестерильный или стертыьныи) вставленный перед заключительным стерняизацп-
онным фильтром 0,22 или 0,1 мкм
11.5.4. Приготовление и стерилизация
других реагентов
Индивидуальные рецепты и процедуры представлены
в Приложении I. В целом,большинство термостабиль-
ных реактивов автоклавируются, если же они термола-
бильны, то стерилизуются методом фильтрации (см.
таил. 11.2). Фильтры со слабыми связывающими свой-
ствами (например, Millex-GV) могут быть использова-
ны для стерилизации растворов белков и пептидов.
11.6. КОНТРОЛЬ, ПРОВЕРКА КАЧЕСТВА
И ХРАНЕНИЕ СРЕД
11.6.1. Контроль качества
Качество среды, при готовленной в лаборатории,
должно быть проверено ди ее использования. Если
среда приобретена готовой как рабочий раствор 1х, то
ее можно использовать, надеясь на то, что контроль
качества был проведен компанией-производителем.
11.6. Контроль, проверка качества и хранение сред
209
если только у вас нет каких-либо особенных требова-
нии к качеству и свойствам среды. При использовании
концентрата среды 10х ростовые свойства и стериль-
ность также проверяются производителем, однако вам
следует проверить качество воды, используемой для
разведения. Учитывая, что проводимость и уровень
общею органически! о yi лерода падают в пределах
стандарта (см. разд. 11.4.1) и при добавлении воды не
происходит каких-то значительных изменении, в боль-
шинстве лабораторий считается, что контроль качества,
проводимый компанией, достаточен
Однако если среда готовится из порошка, а затем
стерилизуется в лаборатории, то требуется проведение
контроля качества, подтверждающее стерильность,
хотя иредпола|ается, что при полном растворении
всех компонентов контроль ростовых качеств среды
не требуется. Среда, сделанная прямо в лаборатории
из основных компонентов, требует проведения полного
контроля качества, включая как проверку стерильнос-
ти, так и исследование культуральных свойств.
11.6.2. Проверка стерильности
Точка образования пузырьков. П о завершении фильт-
рации при высоком давлении, koi да вся жидкость про-
шла через фильтр, поднимите давление на1 нетания до
тех пор, пока необразуются пузырьки в вытекающем из
фильтра потоке. Это точка образования пузырьков, ко-
торая соответствует давлению, более чем вдвое превы-
шающему давление, необходимое для фильтрации (см.
инструкцию производителя). Если пузырьки появляют-
ся на фильтре при стерилизующем давлении (100 кПа,
1 атм) или ниже, то фильтр перфорирован и должен
быть заменен. В атом случае весь собранный фильтрат
должен рассматриваться как нестерильный и повторно
фильтруется. Фильтры одноразового использования
редко не проходят тест на появление пузырьков, по-
скольку их использование кратковременно. Фильтры
многократно! о использования следует подвергать этом}
тесту каждый раз после завершения фильтрации
Инкубация. Отбираются образцы в начале, середи-
не и конце процесса фильтрации. Если бутыли, в кото-
рые собирается фильтрат, маленькие, то можно просто
по завершении фильтрации взять для исследования
отдельные бутыли. Если бутыли большие, то для того,
чтобы не расходовать большие порции, отберите образ-
цы в маленькие емкости через определенные интервалы
времени в ходе фильтрации. Помните, однако, что если
вы бутилируете в объемы 1000 мл, отбор 1-мл образцов
снизит чувствительность в тысячу раз. Если вас не
устраивает использование всех бутылей для хранения
такого объема, то для анализа контроля качества сле-
дует взять, по крайней мере, 100 мл. Лучше не извлекать
образцы из отдельных бутылей, поскольку это повыси?
риск контаминации бутылей для хранения и уменьши?
объем их содержимО! о, что приведет к последующему
изменению объема добавок в эту бутыль.
Инкубируйте образцы в соответствии с одной из
нижеописанных процедур:
1) Инкубируйте образцы среды при 37 “С в течение
1 недели. Если какой-то из образцов становится
мутным, удалите его и повторно простерилизуйте
всю партию. Если имеются признаки заражения в
друтих хранящихся бутылях, вся партия должна
быть выбракована.
2) Для более тщательного теста, а также в случаях,
koi да фильтруемый раствор не содержит собствен-
ных питательных веществ, возьмите образцы, как
это описано выше, и разведите одну треть каждого
объема в питательной среде (например, L-бульон,
шдролизат бычьего сердца и тиогликолевый рас-
твор). Разделите каждый образец на две порции, и
инкубируйте ори 37 °C и при 20 Св течение 10 дней
с инокулироваными контролями. Если после инку-
бации возникнут какие-то сомнения, перемешайте и
посейте на чашку с питательным ai аром небольшое
количество и инкубируйте при 37 °C и при 20 °C.
Вторичная фильтрация по направлению струи.
Поместите разъемный 0,45мкм стерильный фильтр в
систему фильтрации после главней о стерилизующего
фильтра. Любое заражение, которое может возникнуть
при повреждении первого фильт ра, будет задержано на
втором. В конце процесса удали ге вторичный фильтр и
поместите его на питательный агар. Если вырастут ко-
лонии, выбросьте или профильтруйте среду повторно.
Этот метод имеет то преимущество, что позволяет вес-
ти мониторин! всего фильтрата, а не только некоторой
его порции. Однако и в этом случае нельзя избе! путь
риска заражения при бутилировании и закрывании.
Автоклавированные растворы. Оценка стериль-
ности автоклавированных растворов менее сущест-
венна, поскольку считается, что при соответствующем
контроле температуры, давления и времени автокла-
вирования при температуре стерилизации в центре
закладки происходит стерилизация всей партии (см.
разд. 11.4).
11.6.3. Проверка культуральных свойств
Среда, производимая в коммерческих масштабах,
проверяется на предмет поддержания роста одной или
нескольких клеточных линий. (Если это не делается,
поменяйте поставщика!) Тем не менее при опреде-
ленных условиях вы можете пожелать исследовать
вашу среду на качество ростовых свойств. Это может
быть, если:
1) среда составлена в лаборатории из основных ком-
понентов;
2) произведены любые изменения в составе среды,
например, внесены какие-то добавки;
3) среда будет использоваться для каких-то специаль-
ных целей, которые не мсиут быть проверены про-
изводителем;
210
ГЛАВА 11. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
4) среда с-делана ил порошка и существует риск потери
компонентов в ходе фильтрации.
Среда можегстать зараженной токсическими вещест-
вами при фильтрации. Например, некоторые фильтры
обрабатываются детергентами, следовые количества
которых oo.'iei чают смачивание. Этот детергент может
выходить в среду при фильтрации. Такие фильтры
должны промываться проточным PBS или BSS до
использования или первая порция фильтрата должна
выбрасываться. Поликарбонатные фильтры (напри-
мер, Nucleopore) ле] к» смачиваются без применения
детергентов и предпочтительны для некоторых видов
работы, в частности, koi да в среде низкая концентрация
сыворотки.
Существует три основных типа тестирования куль-
туральных свойств:
1) эффективность посева;
2) изучение кривой роста при постоянной проверке
плотности;
3) изучение проявления специальных функций ( напри-
мер, дифференцировка в присутствии индуктора,
размножение вируса, образование специфического
продукта или экспрессия специфического антиге-
на). На новой партии среды должны проводиться
все эти тесты с использованием постоянной среды,
которую вы используете в качестве контроля.
Эффективность посева. Тест на эффективнос ть
посева (см. протокол 21.10) является наиболее чув-
ствительный культуральным тестом, определяющим
минимальный недостаток питательных веществ или
низкую концентрацию токсинов, которые не обнару-
живаются при более высокой клеточной плотности.
В идеале, ei о следует проводить при лимитированной
концентрации сыворотки, которая в противном случае
может маскировать дефицит среды. Для определения
этой лимитированной концентрации произведите
первоначальный посев при различных концентрациях
сыворотки и выберите ту концентрацию, которая соот-
ветствует эффективности посева примерно вдвое ниже
по сравнению с обычной, но еще делает возможным
формирование колоний.
Кривая роста. I Тсследование роста клона не все] да
позволяет обнаружить недостаток в количестве отдель-
ных веществ. Например, если концентрация одной или
более аминокислот низкая, это может не оказывать
влияние на рост клона, но может подействовать на
величину максимальной концентрации вырастающих
клеток.
Кривая роста (см. протоколы 21.7 21.9) позволяет
определить три параметра: 1) продолжительность
lag-фазы до начала клеточной пролиферации после
субкультивирования, которая показывает возможность
адаптации клеток к условиям культивирования в дан-
ной среде; 2) время удвоения культуры в середине фазы
экспоненциального рос га, которое показывает росговой
потенциал среды и 3) конечную плотность клеток. В тех
клеточных линиях, рост которых не чувствителен к
плотности клеток (например, постоянные клеточные
линии; см. разд. 18.5.2), конечная клеточная плотность
определяет общий возможный клеточный выход и
отражает общее содержание аминокислот и глюкозы.
Помните, что среда, которая дает половину конечной
плотности клеток, стоит вдвое дороже при пересчете
на одну полученную клетку.
Специальные функции. Если вы исследуете спе-
циальные функции, то для испытания новой среды
следует провести стандартный тест, который вы
применяете в ходе вашей экспериментальной работы
( нац ри мер, определ ите титр вируса в среде после опре-
деленного срока), при этом в качестве контроля должна
быть старая среда, на которой вы уже работали.
Главной предпосылкой к проведению этого теста
является определение возможности их применения
в дальнейшем в случае истощения запасов той среды,
которую вы постоянно используете, так чтобы в работу
могли быть внесены соответствующие поправки и было
время для приготовления новой среды, если проверя-
емая среда окажется непригодной для специальных
функций.
Ведение записей. Все качественные результаты
культуральных тестов должны записываться в pei ист-
рационную KHiuy или компьютерную базу данных,
наряду с номером партии раствора, который подвергали
тестированию, а также именем исследователя. Лицо,
ответственное за подготовительные и стерилизацион-
ные работы, должно следить за ведением этих записей
и определять нормы и направления, определяя необхо-
димость дальнейших испытаний.
11.6.4. Хранение
В отношении хранения различных сред (на полках)
существуют различные мнения. По грубой оценке,
среда без । лутами на может храниться, по крайней мере,
fi—9 месяцев при температуре 4 °C. При добавлении
1 лутамина, сыворотки или антибиотиков время хране-
ния сокращается до 2—3 недель. Следовательно, среда,
содержащая лабильные компоненты, должна быть
использована в течение 3 недель после приготовления
или храниться при 20 °C.
Некоторые формы люминесцентного света могут
вызвать разрушение рибофлавина. триптофана и ти-
розина с образованием токсичных продуктов, i лавным
образом, перекисей [Wang & Nixon, 1978; Edwards el
aL, 1994J. Следовательно, люминесцентные лампы не
следует использовать в холодной комнате, в которой
хранятся среды, и в термальной комнате, 1де куль-
тивируются клетки. Кроме того, любой свет должен
быть выключен, если в комнатах не ведется работа.
Бутыли со средой не должны подвергаться действию
люминесцентного света более чем несколько часов.
Для долговременного хранения рекомендуется темный
морозильник.
Глава 12
ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
12.1. ТИПЫ ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУР
КЛЕТОК
Первичной культурой называют культуру клеток на
стадии непосредственно после выделения клеток и до
цервою посева. Рассмотрим 4 стадии: 1)получение
образца; 2) выделение ткани; 3) препарирование и или
дезагрегация и 4) культура после посева в культураль-
ный сосуд. После выделения первичная культура кле-
ток может быть получена как путем ми i рации клеток
из фра| мента ткани и прикрепления их к подходящему
субстрату, так и при деза|ре|ации ткани (механичес-
ким путем или с помощью ферментов) для получения
суспензии клеток, некоторые из которых, в конечном
итоге, прикрепятся к субстрату. Для большинства
нормальных нетрансформированных клеток, за исклю-
чением гематопоэтических, необходимо прикрепление
к плоской поверхности для выживания и максимально
эффективной пролиферации. Трансформированные
клетки (см. разд. 18.5.1), в особенности индивиду-
альные клетки из трансплантируемых опухолей жи-
вотных, напротив, часто способны пролиферировать
в суспензии.
К ферментам, которые наиболее часто использую?
для дезагрегации ткани, относятся неочищенные препа-
раты трипсина, коллагеназа, эластаза, ироназа, дне паза,
ДНКаза и шалуронидаза, которые используют либо ио
отдельности, либо в различных комбинациях, напри-
мер аластазу с ДНКазой для выделения альвеолярных
клеток II типа | Dobbs & Gonzalez, 2002J. коллагеназу
вместе с диспаши [ Booth & O’Shea, 2002J и коллагеназу
вместе с шалуронидазои [Berry & Friend, IS69; Seglen,
19751. Другое ферменты, не животного происхожде-
ния, такие как Trypzean (Sigma) - рекомбинантный
кукурузный трипсин, TrypLE (Invilrogen) - реком-
бинантный трипсин, продуцируемый микробами и Ас-
cutase и Accumax (Innovative Cell Technologies), также
подходят для первичной дезаipeiации. Препараты
грубой очис тки часто более эффективны, чем очищен-
ные ферментные препараты, так как первые содержат
примеси дру| их протеаз, хотя последние обычно менее
токсичны и их действие более специфично. Трипсин
и ироназа дают более полную деза1ре1ацию, но MOiyi
повреждать клетки. С другой стороны, коллагеназа и
дисиаза дезагре! ируют клетки неполностью, но менее
токсичны. Гиалуронидаза используется в сочетании
с коллагеназой для разрушения внутриклеточного
матрикса, а ДНКаза используется для уничтожения
ДНК, высвободившейся из лизированных клеток; ДНК
снижает эффективность протеолиза и содействует
реагре1ации клеток (см. табл. 13.4).
Хотя для обработки каждой ткани может потребо-
ваться своя последовательность действий, для боль-
шинства имеются некоторые общие требования:
1) Жир и некротические ткани лучше всего удалять во
время препарирования.
2) Ткань следует мелко нарезать острым инстру-
ментом для тою. чтобы повреждения были ми-
нимальными.
3) Использованные для дезагрегации ферменты долж-
ны быть впоследствии удалены с помощью mhi кого
центр пфу i ирования.
4) Концентрация клеток в первичной культуре должна
быть намного выше, чем обычно используемая при
субкультивировании, так как процент клеток, ко-
торые выживут в первичной культуре, может быть
довольно низким.
5) Предпочтительней использовать богатые среды,
такие как среда Хэма F12, а не простые, такие как
MEM Hi ла. Если требуется сыворотка, следует
учесть, что фетальная бычья сыворотка способ-
ствует лучшей выживаемости ио сравнению с
телячьей или лошадиной. Для выделения специ-
фических типов клеток, вероятно, потребуются
селективные среды (см. разд. 10.2.1 и 1Л. 23).
6) Дезагре!ация эмбриональных тканей проходит
легче, чем тканей взрослого opi анизма, выживает
больше клеток, и они быстрее начинают пролифе-
рировать.
12.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ ТКАНИ
Перед началом работы с тканями животных или
человека вы должны быть уверены, что ваша работа
соответствует требованиям медицинской этики или
современным законодательным нормам в отношении
экспериментов с животными (см. разд. 7.9.1). Напри-
мер, в Великобритании использование эмбрионов или
плодов после середины срока беременности регулиру-
ется законом об экспериментах на животных 1986 года
(Animal Experiments (Scientific Procedures) Act of 1986).
Для работы с биопсийным или фетальным материалом
человека обычно требуется coi ласие местного комитета
212
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
но .пике и пациента и/или его или ее родственников
(см. разд. 7.9.2).
• Требование безопасности. Работа с тканями
человека должна выполняться в соответствии с Уров-
нем защиты 2 в ламинарных шкафах II класса биоло-
1 ической зашиты (см. разд. 7.8.3).
Необходим» попытаться иростерилизовать место
резекции 70%-м спиртом (в случае если есть вероят-
ность загрязнения, например на коже). Асептически
вырежьте ткань и как можно скорее перенесите ее в
лабораторию культуры ткани в BSS (DBSS) или в
среде для транспортировки (см. Приложение I). Не
препарируйте животных в лаборатории культуры
тканей, так как животные могут внести бактериальную
контаминацию. Если задержка в транспортировке
ткани неизбежна, ткань можно хранить при 4 °C до
72 ч, хотя лучший результат достигается при быстрой
транспортировке.
12.2.1. Мышиный эмбрион
Эмбрионы мыши — это удобный источник клеток для
получения недифференцированных фибробластоид-
ных кулыур. Их часто используют в качестве фидер-
ного слоя (см. рис. 14.2.3).
ПРОТОКОЛ 12.1. Выделение мышиного
эмбриона
Схема
Асептически удалить матку у мыши с заданным
сроком беременности и вырезать эмбрион
Материалы
Стерильные:
• DBS.S BSS для препарирования (BSS с высокой
концентрацией антибиотиков, смотри приложе-
ние I) в пробирке с закручивающейся пробкой
объемом 25—50 мл или в универсальном кон-
тейнере.
• 50 мл BSS в стерильном стакане (используется
для охлаждения инструментов после стерилиза-
ции пламенем)
• Чашки Петри диаметром 9 см
• Остроконечные пинцеты.
• Остроконечные ножницы
Нестерильные:
• Малый шкаф с ламинарным потоком
• Мышь с необходимым сроком беременности
• 70%-й спирт в кромывалке
• 70°о-й спирт для стерилизации инструментов
(см. рис. 7.4)
• Горелка Бунзена
• Требование безопасности. При стери-
лизации инструментов путем шлружения их в
спирт и последующего нрожш ания следите за тем,
чтобы не вернуть инструменты в спирт пока они
еще горят.
Протокол
1. Индукция ист руса. Если самцы и самки раз-
мещены ио отдельности, поместите их вместе
для спаривания. Течка у самок начнется через
3 суток. Это позволит планировать образование
эмбрионов в назначенное время. Бремя для
удачного спаривания можно определить, прове-
ряя каждое утро жесткость и слизистую пробку
влагалища
2. Датировка лчбрштов. День выявления ваги-
нальной пробки или «дата пробки» записывается
как нулевой день, и развитие эмбриона отсчиты-
вается с этой даты. Полный срок беременности
19 21 день. Оптимальный возраст эмбриона
для получения культуры из полностью дезагре-
1 ированного эмбриона около 13 дней, когда
эмбрион уже относительно большой (рис. 12.1,
12.2), но еще содержит высокий ироцент не-
дифференцированной мезенхимы, которая и
является главным источником культуры клеток.
Однако для изоляции и проведения манипуля-
ций с эмбрионом после середины полное о срока
беременности может потребоваться лицензия
(например, в Великобритании), поэтому, воз-
можно, пред почтительней брать работать с
9-10-дневными эмбрионами. Хотя количество
ткани, полученной из этих эмбрионов, будет
существенно меньше, больший ироцент клеток
пойдет в рост. Большинство индивидуальных
ореанов, за исключением мо.иа и сердца, на-
чинают формироваться примерно на 9-й день
беременности, но их трудно выделить до 11-го
дня. Препарирование индивидуальных органов
проще проводить на 13 14-й день. Большинство
органов полностью формируются к 18-му дню.
3. Забейте мышь путем дислокации шейных поз-
вонков (процедура описана в Правилах про-
ведения работ I Великобритании) и обильно
протрите брюшную поверхность 70%-м спиртом
(рис. 12.3а).
4. Сделайте разрез кожи с брюшной стороны
перпендикулярно медиане до диафрагмы
(рис. 12.36) и, сжав пальцами кожу с двух сто-
рон разреза, потяните ее в противоположных
направлениях, чтобы обнажить нетронутую вен-
тральную поверхность стенки брюшной полости
(рис. 12.3«).
5. Стерильными ножницами сделайте надрез
вдоль линии медианы, обнажая внутренности
(рис. 12.3г). На этой стадии матка с эмбрионом
хорошо видна в тазовой области брюшной полос-
ти (рис. 12.3г))_
12.3. Выделение образцов ткани
213
6. Извлеките матку и поместите ее во флакон с
завинчивающейся крышкой объемом 25 мл
или 50 мл, заполненный 10 или 20 мл DBSS
(рис. 12.Зе)
Примечание. Все предыдущие этапы должны про-
водиться вне лаборатории культуры тканей. Малый
шкаф с ламинарным потоком и быстрое проведение
операции помогут обеспечить стерильность Не
приносите живых животных в лабораторию куль-
туры тканей, так как животные мо1ут быть конта-
минированы. Если с тушкой животною необходимо
проводить какие-либо манипуляции в зоне работы
с культурой тканей, убедитесь, что тушка была на
короткое время погружена в спирт или тщательно
протерта спиртом и после использования быстро
удалена из помещения.
7. Перенесите интактную матку в лабораторию
культуры тканей и поместите ее в новую чашку
Петри со стерильным DBSS (рис. 12.3.Ж.).
8. Препарирование эмбрионов:
а) Вскройте матку с помощью двух стерильных
пинцетов, держа концы пинцетов близко
Apyi к другу, чтобы избежать разрыва матки,
и не давите слишком сильно на эмбрионы
(рис. 12.3ж,з).
б) Освободитеэмбрионы от оболочек (рис. 12.3г?)
и плаценты и поместите их с одной стороны
чашки для стекания крови.
9. Перенесите эмбрионы в новую чашку Петри. Если
требуется большое количество эмбрионов (на-
пример, необходимо больше четырех или пяти по-
метов), может быть полезно поместить чашку на
лед (для последующего препарирования и куль-
тивирования, смотри протоколы 12.4 12.8).
Рис. 12.2. Мышиные эмбрионы. Эмбрионы на 12-й, 13-й и
14-й дна беременности. 12-дневнын эмбрион (внизу) получен
из малого помета (три), и он больше по размеру, чем обычно
бывает на этой стадии
101С
10®
109
ю7
ю9
10®
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Дни беременности
Рис. 12.1. Общий вес и выход клеток мышиного эмбриона, (а) Общий вес эмбриона без плаценты и оболочек, средние зна-
чения ± стандартное отклонение [ко Paul et aL, 1969]. (б) Выход клеток на эмбрион после инкубации в 0 25% трипсине 4 ч при
37 °C без промежуточного сбора (квадраты) или после инкубации в 0.25% грщгсинез ч при 4 °C с последующей инкубацией в
течение30 мин при 37 °C (треугольники, протокол 12 6)
214
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
Рис. 12.3. Препарирование мыши. С1адии препарирования беременной мыши для забора эмбрионов (смотри протокол 121).
(а) Протирание брюшной полости (б. в) Расин иванис кожи для того, ч гобы обнажить стенку брюшной полости, (г) Вскрытие
брюшной полости, (д) Выявление местонахождения мажи. (е) Извлечение матки (ж, з) Извлечение эмбрионов из матки.
(и) Удаление оболочек (к) Удаление головы (необязательно), (л) Измельчение эмбриона, (м) Перенос кусочков во флакон для
тринсинизации (д.1>1 тепловой тринсинизации, ем. прогокол 12.5). (и) Перенос кусочков в малый флакон Эрлснмайера (д.ш
холодной тринсинизации, см протокол 12.6). (о) Помещение флакона налед
12.3. Выделение образцов ткани
21S
Рис. 12.3. Препарирование мыши
12.2.2. Куриный эмбрион
Куриные эмбрионы проще препарировать, так как инн
больше мышиных эмбрионов на анало! ичной стадии
развития. Так же как и мышиные эмбрионы, куриные
эмбрионы попользуются для получения первичной
культуры мезенхимальных клеток для исследования
клеточной пролиферации, для получения клеток для
фидерного слоя и как субстрат для наращивания виру-
са. Из-за KpyiiHOi о размера у куриных эмбрионов легче
изолировать индивидуальные органы для получения
специфичных типов клеток, таких как |еиатоциты,
кардиомиоциты и легочный эпителий. Как и в случае
с мышиными эмбрионами, эксперименты с куриными
эмбрионами подпадают под действие закона об экспе-
риментах на животных (например, в Великобритании),
поэтому для работы с эмбрионами после половины
срока беременности может потребоваться лицензия.
216
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
ПРОТОКОЛ 12.2. Извлечение куриных
эмбрионов
Схема
Извлечь из япца эмбрион в асептических условиях
и поместить его в чашку.
Материалы
Стерильные:
• DBSS: BSS для препарирования (BSS с высокой
концентрацией антибиотиков, смотри Приложе-
ние I) в пробирке с закручивающейся пробкой
объемом 25—50 мл или в универсальном кон-
тейнере.
• 50 мл BSS в стерильном стакане (используется
для охлаждения инструментов после стерилиза-
ции пламенем).
• Маленький стакан 20—50 мл или поставка для
Прямой и изогнутый пинцеты.
Чашки Петри диаметром 9 см.
Нестерильные:
• Яйца с 10-дневными зародышами
• 70% спирт
Тампоны
• Инкубатор с увлажненной атмосферой (без до-
полнительного со,у.
Протокол:
1 Инкубируйте яйца при 38,5 °C в увлажненной
атмосфере: ежедневно переворачивайте яйца
на 180°.
2 . Хотя куриные яйца насиживают от 20 до 21 дня,
продолжительность стадий развития эмбрио-
на отличается от стадий развития мышиного
эмбриона. Для получения культуры изолиро-
ванных клеток из целою эмбриона яйцо необ-
ходимо инкубировать 8 дней, для выделения
рудиментарных органов - около 10 13 дней
(в Великобритании без лицензии максимально
10 дней).
3 Протрите яйцо 70%-м спиртом и поместите
ею тупым концом вверх в маленький стакан
(рис. 12.4а).
4 Разбейте скорлупу в верхней части (рис. 12.46)
и снимите скорлупу над воздушным мешком
стерильным пинцетом (рис. 12.4в).
5 Простерилизуйте пинцет (например, погружая
его в спирт и далее прожигая спирт на пинцете,
и охладив пинцет в стерильном BSS) и удалите
белую скорлуиовую оболочку, чтобы обнажить
нижнюю хорноаллантоисную оболочку (ХАО)
с кровеносными сосудами (рис. 12.4г, с)).
6 Прорвите ХАО стерильным изогнутым пин-
цетом (рис. 12.4е) и вытащите эмбрион, осто-
рожно придерживая его пинцетом ниже головы
(рис. 12.4ж, з). Не сжимайте иинцет слишком
сильно, иначе порвется шея, поместите средний
палец иод пинцет и используйте иодушечку,
чтобы уменьшить давление указательного пальца
(рис. 12.4ж). Перенесите эмбрион в чашку Петри
диаметром 9 см с 20 мл DBSS (рис. 12Au). (Даль-
нейшее препарирование и культивирование
описано в протоколе 12.7.)
12.2.3. Биопсийный материал
человека
При использовании биопсийною материала челове-
ка возникают определенные ироблемы, с которыми
не сталкиваются при работе с тканями животных.
Обычно необходимо получить согласие 1) комитета
по этике больницы, 2) лечащего врача или хирурга
и 3) донора или больного или родственников боль-
ною (см. разд. 7.9.2). Кроме того, образцы биопсии
обычно берут для диагностических целей, и, следо-
вательно, в первую очередь учитываются интересы
патолога. Значение этого фактора снижается в случае
обширной хирургической резекции или при заборе
непатологических тканей (например, плаценты или
пуповины).
Операции часто выполняются постоянными со-
трудниками больницы во время, не всегда подходящее
для лаборатории культуры тканей, таким образом,
должна быть предусмотрена система временною хра-
нения на тот период, когда вы или кто-либо из ваших
сотрудников не сможет находиться в лаборатории.
Если налажена доставка материала в вашу лаборато-
рию, то должна быть организована система получения
образцов, записи подробностей об источнике, ткани,
патологии и т.д. (см. разд. 12.3.11) и оповещения со-
трудника, который будет заниматься культивировани-
ем, о прибытии образца; в противном случае ценный
материал может быть потерян или испорчен.
• Требование безопасности. При работе с
биопсийным материалом человека существует опас-
ность инфекционного заражения сотрудников (см.
разд. 7.8.3), поэтому работать с ним необходимо в
соответствии с Уровнем зашиты 2 в ламинарных
шкафах II класса биологической защиты. Все мате-
риалы и инструменты после использования должны
быть продезинфицированы автоклавированием или
погружением в соответствующий дезинфектант (см.
разд. 7.8.5). Ткани должны быть протестированы на
наличие случайных инфекций, таких как гепатиты,
ВИЧ и туберкулез [требование Министерства здраво-
охранения и социальною обеспечения Соединенных
Штатов, 1993; Консультативный комитет ио опасным
инфекциям; 1995b в Великобритании], если только
больного уже не проверяли на эти инфекции.
12.3. Первичная культура
217
Рис. 12.4. Извлечение куриного эмбриона из яйца. Стадии извлечения целою куриного эмбриона т яйца, (и) Протирание
яйца спиртом, (б) Разбивание скорлупы, (в) Удаление скорлупы (?) Удаление скорлуновой оболочки, (д) Обиа-кенис хорно-
аллантоисной (ХАО) оболочки с кровеносными сосудами, (е) Удаление ХАО пинцетом, (лс) Захватывание змбриона вокруг
шеи (.з) Извлечение змбриона из яйца, (и) Изолированный 10-дневный эмбрион в чашке Петри
12.3. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
Разработано несколько методик для дезагрегации тка-
ни при получении первичной культуры. Эти методики
можно подразделить на 1) простые механические ме-
тоды, включающие рассечегзие с некоторыми видами
размя1чения или без, и 2) методы с использованием
ферментативной дезагре] ации (рис. 12.5). Первичные
эксплантаты применяются, когда доступны лишь
очень малые количества ткани*, энзиматическая деза] -
pei ация является предпочтительной, koi да имеются
в наличии большие объемы ткани. Механическую
деза] pei ацию хорошо использовать, размельчая мя] -
кие и некоторые плотные ткани, koi да количество
218
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
жизнеспособных клеток на выходе не является су-
щественным.
12.3.1. Первичный эксплантат
Метод первичного эксплантата, разработанный Harrison
[1907]. Carrel [1912] и другими учеными, был первым
методом получения культуры ткани. В ориг инальном
варианте фрагмент ткани погружали в плазму крови
или лимфу, смешивали с гетеролог ичной сывороткой и
эмбриональным экстрактом и помещали на покровное
стекло, переворачивали и заключали в часовое стекло.
ПРОТОКОЛ 12.3. Биопсийный материал
человека
Схема
Поговорите с персоналом больницы, обеспечьте
маркированными контейнером (и) со средой и до-
говоритесь о сборе образцов из операционной или
из кабинета патолога.
Материалы
Пробирки для образцов (15—30 мл) с герметичной
крышкой, наполовину заполненные культуральной
средой, содержащей антибиотики (смот ри Приложе-
ние I: среда для сбора образцов), на которых указаны
ваше имя, адрес и иомер телефона.
Протокол
1 Подготовьте четко подписанные контейнеры
со средой для сбора образцов в приемной опера-
ционной или лаборатории патоло( ии.
2 Договоритесь, чтобы вам сообщили, когда мате-
риал будет г отов для сбора.
3 Заберите контейнеры после операции или найди-
те кого-то, кто иришлет их вам сразу после сбора
и сообщит вам, когда они были отправлены.
4 Перенесите образцы в лабораторию культуры
тканей. Образцы должны быть завернуты в три
слоя (например, герметично закрытую пробирку
помещают в герметичный пакет, заполненный ад-
сорбентом на случай протечки; пакет помещают
в упаковку с мягкой подложкой с написанным
вашим именем, адресом и номером телефона,
см. разд. 20.4). Обычно нри хранении ири 24 °C
клетки в образцах биоцсии выживают в течение
как минимум 24 ч и даже 3 и ли 4 дней, хотя при
увеличении интервала времени от операции до
культивирования большая часть образцов, ио-
видимому, дег радирует
5 Зарег истрируйте образец иод соот ветствующим
номером в рукописном регистрационном жур-
нале для иоследующего переноса информации в
компьютерную базу данных или занесите данные
в базу данных сразу после поступления.
6 . Дезинфекция. Хотя большинство хирург ических
образцов извлекают в стерильных условиях,
могут возникнуть проблемы ири иоследующих
манипуляциях. Образцы биопсии поверхнос-
тных тканей (нацример, биопсия кожи, мела-
номы и т.д.) и желудочно-кишечного тракта
особенно подвержены контаминации, даже если
кожа предварительно иродез инфицирован а
перед взятием биопсии, а перед операцией же-
лудочно-кишечною тракта пациент получает
инъекцию антибиотика. Может быть полезным
проконсультироваться со специалистом ио ме-
дицинской микробиологии, чтобы определить,
какая флора представлена в данной ткани и затем
в соответствии с этим выбрать антибиотики,
которые вы будете использовать при заборе об-
разцов и препарировании. Если хирург ические
образцы достаточно большие (а именно, 200 мг
или больше), быстрое погружение (а именно,
30 с - 1 мин) в 70%-й спирт поможет снизить
поверхностную контаминацию, не повреждая
центральную часть образца ткани.
Комок плазмы удерживал ткань на месте, и эксплан-
тат можно было рассматривать с помощью обычного
микроскопа. Гетеролог ичная сыворотка индуцировала
сворачивание плазмы, эмбриональный экстракт, сыво-
ротка и плазма снабжали клетки питательными вещес-
твами и факторами роста и стимулировали миграцию
клеток из эксплантата. Эта методика используется до
сих пор, но, ио большей части, заменена упрощенным
методом, описанным в протоколе 12.4.
Этот метод особенно полезен при работе с неболь-
шим и количествами ткани, например при биопсии
кожи, когда есть риск потери клеток в ходе механичес-
кой или ферментативной дезагрегации. Недостатки его
заключаются в низкой адгезивности некоторых тканей
и селекции клеток в процессе роста. На практике, од-
нако, большинство клеток, особенно эмбриональных,
успешно мигрируют
Прикрепление эксплантатов. Как прикрепление, так
и миграцию клеток можно простимулировать, помес-
тив на поверхность эксплантата стеклянное покровное
стекло или исцарапать эксплантат пластиковой чаш-
кой Петри перед прикреплением ткани к поверхности
флакона [Elliget & Lechner. 1992J (см. протокол 23.9).
Прикрепление также можно стимулирова ть или улуч-
шить, обработав пластик иолилизином или фибронек-
тином (см. иротокол 8.1) или сформировав фидерный
слой (см. иротокол 14.3). Исторически сложилось, что
для улучшения прикрепления использовали сгустки
плазмы. Поместите каплю плазмы на пластиковую
поверхность и заключите в ней эксплантат. Это должно
индуцировать сворачивание плазмы в течение несколь-
ких минут, после чего можно добавить среду. В качестве
альтернативы можно использовать очищенный фибри-
ноген и тромбин [Nicosia & Ottinetti, 1990].
12.3. Первичная культура
219
ВЫДЕЛЕНИЕ ОБРАЗЦА ТКАНИ
ПРЕПАРИРОВАНИЕ
Выбор нужной ткани; удаление жира и
некротических клеток
ОКОНЧАТЕЛЬНОЕ
ПРЕПАРИРОВАНИЕ
вырезание кусочков
эксплантата нужного размера
ЭКСПЛАНТАТ
РАЗРАСТАНИЕ
Перанос в
другой флакон
ПЕРВИЧНЫЙ ЭКСПЛАНТАТ
МЕХАНИЧЕСКАЯ ДЕЗАГРЕГАЦИЯ,
Например, протирание через
сито, многократное пропускание
через шприц, или интенсивное
пипетирование
ХОЛОДНЫЙ ТРИПСИН
В течение ночи на
холоду, короткая
инкубация
ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕЗАГРЕГАЦИЯ
ТЕПЛЫЙ ТРИПСИН
КОЛЛАГЕНАЗА
ДИСПЕРСНАЯ
ПЕРВИЧНАЯ
КУЛЬТУРА
Длительная
инкубация,
полная среда
Длительная
инкубация, повторный
отбор проб
центрифугирование
Ресуспендирование
и посев
Пассирование
2-Я КУЛЬТУРА
ЭКСПЛАНТАТА
ЛИНИЯ КЛЕТОК
Рис. 12.5. Варианты первичной культуры. Различные пути получения линии клшок, в цен i ре и слева иучем механической
дезагрегации, справа путем ферментативной дезагрегации. Эксплантаты можно переносить, чсобы стимулировать даль-
нейший рост клеток эксплантата, в то время как вышедшие из эксплантата клетки можно еубкультивировать для получения
линии клеток
12.3.2. Ферментативная дезагрегация
Межклеточная адгезия в тканях опосредуется различ-
ными гомотипически взаимодействующими глико-
пептидами (молекулы клеточной адгезии, или САМ)
(см. разд. 3.2.1), некоторые из которых кальций-зави-
симые (кадгерины) и, следовательно, чувствительны к
хелатирующим агентам, таким как ЭДТА или ЭГТА.
Интегрины, которые связываются с аршнин-глицин-
аспараг иновая кислота (RGD) мотивом внеклеточного
матрикса, также имеют Са2*-связывающий домен, и уда-
ление Са21 на них тоже влияет. Межклеточный матрикс
и базальные мембраны содержат друг ие гликопротеины,
такие как фибронектин и ламинин, чувствительные к
протеазам, и менее чувствительные протеогликаны,
которые иногда поддаются протеолизу гликоназами,
такими как г иалуронидаза или гепариназа. Простейш ий
подход заключается в переходе от простого раствора для
дезагрегации к более сложному (см. табл. 13.4). Вначале
используется раствор трипсина или смеси трипсин.
ЭДТА, далее добавляют друг ие протеазы чтобы улуч-
шить дезагрегацию и на следующей стадии, трипсин при
220
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
ПРОТОКОЛ 12.4. Первичные эксплантаты
Схема
Ткань разре.пиот на кусочки, промывают, помещают
на поверхность культурального флакона или чашки
Петри в маленьком объеме среды с высокой кон-
центрацией (а именно, 40—50%) сыворотки таким
образом, чтобы поверхностное натяжение удержи-
вало кусочки на месте, цока они не прикрепятся
спонтанно к поверхности (рис. 12.6ft). После того как
это будет достшнуто, обычно следует разрастание
клеток (рис. 12.66; цв. вкладки la, 26)
Стерильные материалы
• Ростовая среда (например, 50:50 DMEM. F12 с
20% фетальной бычьей сыворотки.
• 100 мл DBSS
• Чашки Петри диаметром 9 см, не для культуры
клеток.
• Пинцет.
• Скальпели.
• Пииетки на 10 мл с широким концом
• Центрифужные пробирки на 15 или 20 мл или
универсальные контейнеры.
• Культуральные флаконы на 25 см2 или чашки
Петри для культуральных работ диаметром
5—6 см. Размер флаконов и объем ростовой сре-
ды зависит от количества ткани, на 10 мт ткани
необходимо приблизительно пять флаконов на
25 см2.
Протокол
1. Перенесите ткань в свежий стерильный DBSS и
промойте.
2. Перенесите ткань во вторую чашку, удалите не-
желательные ткани, такие как жир или некроти-
ческий материал, и перенесите в третью чашку.
3. Мелко нарежьте скрещенными скальпелями (см.
рис. 12.6й, вверху) на кусочки размером около
1 кубического миллиметра.
4. С помощью иииетки (10—20 мл с широким носи-
ком) перенесите в стерильную центрифужную
пробирку объемом 15 или 50 мл или в универ-
сальный контейнер. (Предварительно смочите
пинетку изнутри BSS или средой, иначе кусочки
ткани будут прилипать.)
5. Дайте кусочкам осесть.
6. Промойте путем ресусиендирования кусочки в
DBSS, дайте кусочкам осесть и удалите суперна-
тан г. Повторите эту операцию не менее двух раз.
7. Перенесите кусочки (не забывая смачивать пи-
нетку) в культуральный флакон, приблизительно
20—30 кусочков на флакон площадью 25 см2
8. Удалите большую часть жидкости и добавить
1 мл ростовой среды на 25 см2 ростовой иоверх-
9. Закройте флакон и поместите его в инкубатор
или термальную комнату на 37 °C на 18—24 ч.
10 Если кусочки прикрепились, далее объем среды
можно постепенно увеличивать в течение следу-
ющих 3-5 дней до 5 мл на 25 см2и затем менять
среду еженедельно, пока не будет наблюдаться
значительный рост клеток (см. рис. 12.66).
11. После достижения роста клеток оставшийся экс-
плантат может быть удален с помощью скальпеля
(рис. 12.6») и перенесен предварит ельно смочен-
ной пипеткой в свежий культуральный сосуд.
(И далее повторить начиная с этапа семь.)
12. Меняйте среду в первом флаконе до тех иор, пока
растущие клетки не покроют, но крайней мере,
50% ростовой поверхности, после чего клетки
можно пересевать (см. протокол 13.2)
необходимости удаляется, для того чтобы увеличить
выживаемость клеток. Обычно повышение чистоты
ферментов позволяет лучше контролировать процесс
и, повышая специфичность, снижать токсичность, но
может также приводить к ухудшению дезагрыации.
Механическая и ферментативная деза1регации
ткани позволяют избежать проблемы селекции кле-
ток, возникающей нри их миграции из эксплантата,
и повышают выход большею количества клеток,
которые отражают состав ткани за короткое время.
Однако, подобно тому как метод первичного эксплан-
тата приводит к селекции клеток по их способности
ми! рпровать из ткани, методы диссоциации приводят
к селекции клеток по их устойчивости к протеазам и
механическому стрессу.
Эмбриональные ткани лучше поддаются дисперги-
рованию и дают больший выход пролиферирующих
клеток, чем ткани новорожденных или взрослых. На
повышение сложности получения жизнеспособных
пролиферирующих клеток с увеличением возраста
донора влияют несколько факторов, среди которых
возникновение дифференцировки, повышение со-
держания трубоволокнистой соединительной ткани
и внеклеточною матрикса и снижение пула недиф-
ференцированных пролиферирующих клеток. Кот да
для дезагре! ации ткани требуются более жесткие про-
цедуры (например, продолжительная триисинизация
или интенсивное перемешивание), наиболее нежные
компоненты ткани мотут разрушаться. Например, в
фиброзных опухолях очень трудно добиться полной
диссоциации клеток трипсином так. чтобы при этом
еще и остались жизнеспособные клет ки карциномы.
Выбор степени чистот ы трипсина веет да труден,
гак как существуют две противоположные точки
Зрения: 1) более чистый трипсин менее токсичен, и
результат его действия более предсказуем; 2) т рипсин
рубой очистки более эффективен, возможно, из-за
присутствия в нем дру! их протеаз. На практике могут
понадобиться предварительные эксперименты для
определения оптимальной степени чистоты, необхо-
димой для получения жизнеспособных клеток, так
как трудно предсказать, какой будет баланс между
12.3. Первичная культура
221
После приблизительно 1 недели
можно увидеть, как клетки
радиально мигрируют из
эксплантата
Рис. 12.6. Культура первичного эксплантата, (а) Схематическая диа|рамма стадии препарирования и посева первичного
эксплантата. (б) Первичный эксплантат !лоскоклс|очной карциномы кожи мыши, эксплантат на ранней стадии роста клеток
через .3 дня после эксплантации (смо три также илл. 26) (в) Рост клеюк после удаления эксплантата через 7 дней после экс-
плантации Объектив 10х
чувствительностью клеток к токсическим эффектам и
дезагрегационний активностью трипсина.
Чаще всего для дезагре! ации тканей используется
трипсин грубой очистки [Waymouth, 1974], так как он
довольно хорошо переносится многими клетками и
эффективен в отношении многих тканей. Остаточная
протеазная активность, остающаяся после промы-
вания, нейтрализуется сывороткой культуральной
среды или, в случае использования бессывороточной
среды, ингибитором трипсина (например, интбитор
трипсина из сои).
особенно для целых мышиных или куриных эмб-
рионов. Метод плохо подходит для дезагрегации
тканей взрослых организмов, которые содержат
много фиброзной соединительной ткани, и некоторых
чувствительных типов клеток, таких как эпителий,
которые могут быть повреждены ири механическом
перемешивании Если после цеитрифуi ирования и
ресусиендирования будет наблюдаться pearpeiaunn
клепж, их необходимо проинкубировать в течение
10-20 мин с ДНКазой (10-20 mki мл) и повторно
отцентрифу ги ровать.
12.3.3. Теплый трипсин
Для сохранения максимальной выживаемости клеток
важно минимизировать время инкубации клеток в
активном трипсине. Следовательно, при три пси ни-
зании ткани при 37 °C, диссоциированные клетки
необходимо собирать каждые полчаса, трипсин должен
быть удален центрифугированием и нейтрализован
сывороткой среды.
Этот метод полезен для дезагрегации больших
количеств ткани за относительно короткое время,
12.3.4. Трипсинизация с преинкубацией
на холоду
Одним из недостатков использования трипсина для
дезагре! ации является повреждение тканей, которое
может происходить вследствие продолжительной
инкубации ткани ири 37 °C. Поэтому после каждых
30 мин инкубации в теплом трипсине необходимо
отбирать диссоциировавшиеся клетки, хотя для пол-
ной дезагрегации ткани требуется 3-4 ч. Более прос-
тым методом, который позволяет минимизировать
222
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
ПРОТОКОЛ 12.5. Дезагрегация ткани теплым
трипсином
Схема
Ткань разрезают на кусочки и перемешивают в трип-
сине в течение нескольких часов. Диссоциированные
клетки собирают каждые полчаса, центрифушру-
ют и объединяют в среде, содержащей сыворотку
(рис. 12.7).
Материалы
• Стерильные или приготовленные в асептических
условиях:
• Ткань, 1 —51
• DBSS, 50 мл (см. Приложение I)
• Трипсин (i рубый),2 5% в D-PBSA или физиоло-
1 ическом растворе
• D-PBSA, 200 мл
• Ростовая среда с сывороткой (например, DMEM/
F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки)
• Чашки Петри диаметром 9 см, не для культуры
ткани
• Предварительно взвешенные флаконы
• Центрифужные пробирки на 50 мл или универ-
сальные контейнеры, 2
• Флакон для триисинизации: флакон Эрленмейе-
ра (предпочтительно с насечками как на рис. 12.9)
или флакон с перемешиванием (см. рис. 13.5).
Mai нит для ма1нитной мешалки, автоклавиро-
ванный в пробирке
• И.мпнутый пинцет
• Пипетки (пастеровские на 2 и 10 мл)
Нестерильные
• Mai иитная мешалка
• Гемоцитометр или счетчик клеток
Протокол
1. Перенесите ткань в чашки П етри диаметром 9 см
со свежим стерильным DBSS и промойте.
2. Перенесите ткань во вторую чашку; удалите
нежелательные ткани, такие как жир или некро-
тический материал и перенести в третью чашку.
3. Нарежьте скрещенными скальпелями (см.
рис. 12.7) на кусочки размером около 3 кубиче-
ских миллиметров
4. Перенесите ткань с помощью изш нутого пинцета
в предварительно взвешенный флакон или про-
бирку.
5. Дайте кусочкам осесть.
6 Промойте путем ресусиендирования кусочки в
DBSS. дайте кусочкам осесть и удалите супер-
натант. Повторите эту операцию не менее двух
раз
7. Слейте жидкость из флакона или пробирки и еще
раз взвесьте.
8. Перенесите все кусочки в пустой флакон для
триисинизации, промытые DBSS флакон или
пробирку.
9. Удалите большую част ь оставшейся жидкости и
добавьте 180 мл D-PBSA
10. Добавьте 20 мл 2,5% трипсина. (На этой стадии,
если требуется, можно добавить друi ие фермен-
ты, например коллагеназу. шлуаронидазу или
ДНКазу.)
11. Поместите во флакон машит для мешалки.
12. Закройте флакон и поставьте ею на ма1нитную
мешалку в инкубатор или в термальную комнату
на 37 °C.
13. Перемешивайте на скорости 100 об., мин при
37 “С
14. После 30 мин инкубации соберите диссоцииро-
ванные клетки следующим образом.
а) Дайте кусочкам осесть
б) Слейте супернатант в центрифужную пробир-
ку и поместите его на лед.
в) Добавьте свежий трипсин к оставшимся во
флаконе кусочкам и продолжайте инкуба-
цию с перемешиванием в течение следующих
30 мин.
1) Центрифугируйте собранные на этапе 14(6)
клетки приблизительно 5 мин при 500 g.
д) Ресусиендируйте конечный осадок в 10 мл
среды с сывороткой и храните суспензию на
льду.
15 Повторяйте этап 11 до тех пор, пока не будет до-
сти1 нута полная де.1ш регация ткани или пока де-
загрегация не прекратится (обычно через 3—4 ч).
16. Соберите и объедините охлажденную клеточную
суспензию, посчитайте клетки с помощью гемо-
цитометра или электронного счетч ика клеток (см.
разд. 21.1) и проверьте жизнеспособность клеток
(см. разд. 22.3.1)
17 Так как клеточная популяция может быть очень
reiepoi енной, качибровка электронного счетчи-
ка клеток может быть затруднена и потребуется
подтверждение путем подсчета клеток с помощью
гемоцитометра.
18. Удалите все оставшиеся большие агреюты с по-
мощью фильтрования через стерильную марлю
или специальное сито (см., например, рис. 12.8).
19. Разбавьте суспензию клеток до плотности
1х10'/мл ростовой средой и иосейте их в такое
количество флаконов, какое потребуется, с плот-
ностью приблизительно 2x10’кл./см2. Если про-
цент выживания клеток неизвестен или непред-
сказуем. подсчет' клеток даст низкие значения
(например, ири биопсии опухолей, кота может
быть Очень высока доля некротических клеток).
Б этом случае установите диапазон концентраций
от 5 до 25 mi ткани на мл.
20. Меняйте среду через ршулярные интервалы
времени (2—4 дня, руководствуясь признаками
понижения pH). Проверьте, нет ли в суперна-
танте живых клеток, так как некоторые клетки
могут медленно прикрепляться или даже могут
пролиферировать в суспензии.
12.3. Первичная культура
223
Собрать супернатант,
содержащий клетки,
ресуспендировать в среде и
хранить на пьду
Рис. 12.7. Дезагрегация с помощью теплого трипсина
повреждения клеток в течение инкубации, является
погружение ткани в трипсин, охлажденный до 4 °C.
и инкубация в течение 6 18 ч для более полного про-
никновения фермента в ткань. В этих условиях про-
теолитическая активность трипсина низка (табл. 12.1).
После этой процедуры требуется только 20-30 мин
инкубировать ткань при 37 °C для дезагрегации
[Cole & Paul, 1966].
Метод холодной трипспнпзацпи обычно дает более
высокий выход жизнеспособных клеток и повышает
их выживаемость после 24 ч культивирования (см
рис. 12.1,12.10 и табл. 12.1). Также сохраняется больше
различных типов клеток, чем при теплой триггсиниза-
шш (см. цв. вкладки {а, г, <)) и 3). Культуры, полученные
из мышиных эмбрионов, содержат больше эпителиаль-
ных клеток, будучи приготовлены с помощью холодной
трипсинпзацип. Культуры эритроидных клеток, полу-
ченные из печени 13-дневных плодов мыши с помощью
холодной трипсинизации, отвечают на эритропоэтин,
чего не происходит с культурами, полученными с
помощью теплой трипсинизации, или механической
дезагрегации [Cole & Paul, 1966, Conkie, персональное
сообщение]. Метод холодной трипсинизации также
удобен тем, что не требуется ни перемешивания, ни
центрифугирования и инкубацию при 4 °C можно
проводить в течение ночи.
224
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
Рис. 12.8. Клеточное сито. Одноразовые полипропиленовые
фильтр и пробирка для отделении агрегатов из суспензии
клеток первичной культуры (BD Biosciences) Можно гакжс.
использовать для acaai pei ации мягких тканей (см. также
рис 12.13)
12.3.5. Рудиментарные органы куриного
эмбриона
Метод холодной тринсинизации особенно удобен для
малых количеств ткани, таких как эмбриональные орга-
ны. Хорошо воспроизводимые результаты получаются
при использовании протокола 12.7 при получении
культур из 10—13-дневных куриных эмбрионов, предо-
ставляя доказательства наличия нескольких различных
типов клеток, характеризующих ткани, из которых они
были получены. Этот протокол представляет собой
хорошее упражнение для обучения.
Анализ. После 3—5 дней инкубации в культурах
сердца может наблюдаться сокращение клеток; в куль-
турах пигментированной сетчатки появляются колонии
пи। монтированных клеток; в культурах скелетных
мышц начинается образование мышечных трубочек
Культуру можно зафиксировать и покрасить (см. про-
токол 16.2) для дальнейшего исследования.
12.3.6. Дезагрегация с использованием
других ферментов
Дезагре!ация с помощью трипсина может быть трав-
матичной для клеток (например, для некоторых эпп-
Удалить трипсин
и инкубировать
20-30 мин
Заменить BSS
трипсином и поместить
на ночь на лед
Рис. 12.9. Дезагрегация в холодном трипсине. См. также
цв вкладки 2 (а. г, Л) п 3
телиальных клеток) или малоэффективной (например,
для сильно волокнистых тканей, таких как фиброзная
соединительная ткань), в таких случаях необходимо
попытаться использовать друте ферменты. Так как
внеклеточный матрикс часто содержит коллаген,
особенно в соединительной ткани и мышцах, очевид-
ным выбором является коллагеназа [Freshney, 1972
Таблица 12.1. Количество выделенных клеток пос sc теплой холодной тринсинизации
Продолжительность и температурный режим тринсинизации После тринсинизации После 24 ч культивирования
Выделенные клетки/ на эмбрион, х107 % выживших кле- ток, определяемый по исключению красителя (трипа- нового синего) Общее количество жизнеспособных клеток хЮ7 Жизнеспособные, в % от общего коли- чества посеянных клеток Выживаемость, в % от количества посеянных живых клеток
4 "С 37 °C 0 ч 4 ч 1.69 86 1,45 17,2 54,9
5.5 ч 0.5 ч 3.32 60 1,99 74,5 124
24 ч 0.5 ч 3.40 75 2,55 60,3 80,2
12.3. Первичная культура
225
ПРОТОКОЛ 12.6. Дезагрегация ткани
холодным трипсином
Схема
Отрезать кусочек ткани и поместить ею в охлаж-
денный до 4 °C трипсин на 6—18 ч. После инкубации
удалить трипсин и диссоциировать клетки в теплой
среде (рис. 12.9).
Материалы
Стерильные или приготовленные в
асептических условиях:
• Ткань. 1 51, предварительно взвешенная
• Ростовая среда (например. DMEM.F12 с 10%
FBS)
• DBSS
• 0,25% трипсин грубой очистки в бессывороточ-
ной среде RPMI 1640 или МЕМ на солях Stirrer
(S-MEM)
• Чашки Петри диаметром 9 см, не для культуры
• Прямой и 11301 нутый пинцеты
• Скальпели
• Флакон Эрленмейера на 25 или 50 мл, с завин-
чивающейся крышкой, предварительно взвешен-
ный (или стеклянный флакон, или универсаль-
ный контейнер)
• Культуральные флаконы площадью 25 или 75 см2
• Пииетки (пастеровские на 2 и 10 мл)
Нестерильные
• Ледяная баня
Протокол
1. Перенесите ткань в чашку Петри диаметром 9 см
со свежим стерильным DBSS и промойте.
2. Перенеситеткань во вторую чашку; удалите не-
желательные ткани, такие как жир или некроти-
ческий материал.
3. Перенесите в третью чашку и разрежьте скрещен-
ными скальпелями (смотри рис. 12.9) на кусочки
размером около 3 кубических миллиметров.
Органы эмбриона, если они не превышают этот
размер, лучше брать целиком.
4. Перенеситеткань с помощью изотнутсч о пинцета
в предварительно взвешенный стерильный фла-
кон объемом 15 или 50 мл.
5. Дайте кусочкам осесть.
6. Промойте путем ресуспендирования кусочков в
DBSS, дайте кусочкам осесть и удалите надоса-
дочную жидкость. Повторите эту операцию не
менее двух раз.
7. Тщательно удалите оставшуюся жидкость и еще
раз взвесьте флакон.
8. Добавьте охлажденный до 4 °C трипсин в RPMI
1640 или S-MEM (10 мл/i ткани).
9. Инкубируйте смесь 6-18 ч нри 4 °C.
10 Тщательно удалите трипсин, оставив ткань толь-
ко в следовых количествах трипсина. (На этой
стадии, если требуется, можно добавить друше
ферменты, например коллагеназу, силуаронидазу I
или ДНКазу в количестве 1 2 мл.)
11. Поместите пробирку на 37 "С на 20—30 мин.
12. Добавьте приблизительно 1 мл на каждые 100 mi
исходной ткани теплой среды и осторожно ииие- ।
гируйте смесь, набирая в пипетку и выливая, пока I
ткань полностью не диссоциирует.
13. Если ткань не диСиер! ирует полностью, клеточ-
ную суспензию можно профильтровать через
стерильную марлю или сито из нержавеющей
ткани (100-200 мкм) или через одноразовый
пластиковый сетчатый фильтр (рис. 12.10), или
крупным частицам можно просто дать осесть.
Если ткани много, увеличение объема среды
для суспендирования до 20 мл на каждый 1рамм
ткани обле! чит осаждение и последующий сбор ।
надосадочной жидкости. Достаточно двух-трех
минут для того, чтобы избавиться от большей |
части больших кусочков.
14. С помощью ।емоцитометра или электронно!о I
счетчика клеток (см. разд. 21.1) определите
концентрацию клеток и их жизнеспособность I
(смотри протокол 22.1).
15. Так как клеточная популяция может быть в I
значительной степени гетерогенной, калибров- |
ка электронного счетчика клеток может быть
затруднена и потребуется подтверждение путем |
подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
16. Разбавьте суспензию клеток до плотности I
1х10ь/мл ростовой средой и косейте их в такое
количество флаконов, какое потребуется, с плот- I
ностью приблизительно 2х105кл./см". Если иро- ।
цент выживания клеток неизвестен или неиред- I
сказуем, подсчет клеток даст низкие значения
(например, при биопсии опухолей, koi да может
быть очень высока доля некротических клеток).
В этом случае установите диапазон концентраций
от 5 до 25 mi ткани на мл.
17 .Меняйте среду через pety-чярные интервалы
времени (2-4 дня, руководствуясь снижением
pH). Проверьте, нет ли в супернатанте живых
клеток, так как некоторые клетки могут медленно
прикрепляться пли даже могут пролиферировать
в суспензии
(карцинома кишечника); Speirset al., 1996 (карцинома
молочной железы); Chen et al., 1989 (почка); Booth &
O'Shea, 2002 (кишечник); Heald el al., 1991 (клетки
островков поджелудочной железы)] (см. разд. 12.3.6,
23.2.6—23.2.8). Также, с различной степенью успеха,
используются друт ие бактериальные протеазы, такие
как ироназа [Schaffer el al., 1997; Glavin el al., 1996] it
дисиаза (Boehringer-Mannheim) [Compton el al., 1998;
Inamalsu el al., 1998] Так как в процессах межкле-
точной ад1езии участвуют у1леводы, то в сочетании
с коллагеназой используют шалуронидазу [Berry &
226
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
Рис. 12.10. Теплая и холодная трипсиннзация. Выход
жизнеспособных клеток на эмбрион при теплой и холодной
триисинизации Выход жизнеспособных клеток на эмбрион
повышается нри холодной триисинизации до24 ч при 4 °C, но
восстановление рое са нос тс 24 ч культивирования выше ири
менее продолжит едьной холодной триисинизации (>100%,
вследствие пролиферации клеток) возможно из-за того, что
некоторые клетки, полученные с помощью холодной трцп-
ецнизации, нс пролиферируют
Friend. 1969] и нейраминидазу. На рынке продолжают
появляться и другие протеазы (см. разд. 12.1) Так что
если трипсин, коллатеназа, дисиаза, ироназа, гиалуро-
нидаза и ДН Каза ио отдельности или и комбинации не
сгффективны, теперь есть выбор друi их имеющихся в
продаже протеаз.
12.3.7. Коллагеназа
Эта методика очень проста и аффективна для многих
тканей: эмбриональных, взрослых, нормальных и
опухолевых. Она крайне полезна в том случае, когда
ткань слишком волокнистая или слишком чувстви-
тельная; в этих случаях использование трипсина ма-
ло:гффективнг>. Чаще используется коллагеназа грубой
очистки, возможно, частично ее действие обусловлено
контаминацией препарата друi ими несиецифическими
протеазами. Если неспецифическая протеолитическая
активность нежелательна, в продаже имеется коллаге-
наза более высоких степеней очистки, но эти препара-
ты могут быть не столь эффективны, как коллагеназа
грубой очистки.
Некоторые клетки, особенно макрофаги, могут при-
крепляться в нервом флаконе в процессе инкубации с
коллагеназой. При переносе клеток в новый флакон
после обработки коллагеназой (и последующим удале-
нием коллагеназы) значительное количество макрофа-
ПРОТОКОЛ 12.7. Рудиментарные органы
куриного эмбриона
Схема
Извлечь отдельные органы и ткани и поместить их
(желательно целиком) в холодный трипсин на ночь.
Удалить трипсин, кратковременно инкубировать ор-
ганы или ткань и дисперг ировать их в культуральной
среде. Развести и посеять в культуру.
Материалы
Стерильные:
• DBSS
• 0,25% трипсин грубой очистки (Dilco 1.250 или
аналогичный) в среде RPMI 1640 или S-MEM
на льду; при использовании трипсина более
высокой степени очистки можно иепцдьзовать
более низкие концентрации, например 0,05—0,1%
кристал^шческого трипсина производства Sigma
или Worthington Grade IV
• Культуральная среда (например, DMEM F12 с
10% FBS), минимальный объем — 12 мл на одну
ткань
• Чашки Петри диаметром 9 см, не для культуры
ткани
• Культуральные флаконы площадью 25 см’ (2 на
1 ткань)
• Скальпели (лезвие №11 для общих целей)
• Хирург ический нож для иридэктомии для тонко-
го препарирования
• Изогнутый и прямой тонкие пинцеты
• Пипетки (пастеровские на 2 и 10 мл)
• Пробирки, желательно стеклянные, на 10 15 мл
с закручивающимися крышками
Нестерильные.
• Куриные яйца с 10-13-дневными зародышами
(> 10 дней в Великобритании требуется ли-
цензия)
• Ледяная баня
Бинокулярная препаровальная лупа
Протокол
1. Извлеките эмбрион из яйца, как описано ранее
(см. иротокол 12.2) и поместите его в стерильный
DBSS.
2. Извлеките голову (рис. 12.11 а, б).
3. Извлеките глаз и аккуратно откройте его, удаляя
хрусталик, внутриглазную жидкость и стекловид-
ное тело (рис. 12.11в, /).
4. Захватите сетчатку двумя парами тонких пин-
цетов и осторожно отделите пигментированную
сетчатку от нейрональной сетчатки и соедини-
тельной ткани (рис. 12.1 Id). (Для препарирова-
ния 10-дневного эмбриона необходима препа-
ровальная лупа. Кратковременная инкубация в
0,25% трипсине в 1 мМ ЭД ТА упростит разделе-
ние двух тканей.) Положите ткани с одного края
чашки.
12.3. Первичная культура
227
5. Приколите верхнюю часть головы кривым пин-
цетом и извлеките мол (рис. 12.11е). Поместите
моз1 рядом с сетчаткой на край чашки.
6. Разделите туловище поперечно там, 1де розо-
вая вечен ь просвечивает через кожу живота
(рис. 12.1 Ijft?). Если сделать разрез ио линии диа-
фра! мы, то он пройдет между сердцем и печенью;
но инО1да печень может находиться не в нижней
части, а в верхней части
7. Аккуратно исследуйте изнутри разрезанную верх-
нюю часть туловища и извлеките сердце и ленте
(рис. 12.11 л; выделите ор<аны, но не разрезайте их
до идентификации). Отделите сердце от ле1 ких и
поместите на край чашки.
8. Прозондируйте нижнюю половину и извлеките
печень со скрученным кишечником, находящимся
между долями печени (рис. 12.11п). Отделите печень
от кишечника и поместите каждый на край чашки.
9. Ото1 ните стенку тела в обратную сторону, чтобы
раскрыть внутреннюю часть ладней поверхности
брюшной полости в нижней полови не тела. Про-
долговатые, состоящие из долек, почки должны
быть видны параллельно обеим сторонам средин-
ной линии.
10. Осторожно подведите кончик скальпеля под
каждую почку и извлеките почки из брюшной
полости (рис. 12.1 Izz). (Для препарирования
10-дневного эмбриона потребуется препароваль-
ная луца.) Аккуратно вырежьте ночки и помести-
те их с одной стороны
11. Расположи те концы скальпелей вместе на сре-
динной линии нижней части и. цродвшая концы
вперед, друг за дру1 ом, выдавите спинной мо.мтак
же, как вы выдавливаете зубную насту из тюбика
(рис. 12.11л). (Этот этап может быть трудновы-
полним при работе с 10-дневными эмбрионами.)
12. Поверните вверх заднюю часть туловища эмб-
риона и снимите кожу со спины и верхней части
ног(рис. 12.11.м). Соберите и поместите эту кожу
с одной стороны
13. Извлеките мышцу из каждого бедра и соберите
Эти мышцы вместе (рис. 12.11н)
14. Перенесите все эти ткани (и любые другое, кото-
рые вы может быть захотите) в отдельные пробир-
ки с 0,25%-м трипсином и поместите пробирки на
лед. Убедитесь, что препараты тканей полностью
погружены в трипсин.
15. Оставьте пробирки при 4 "С на 6—18 ч.
16. Осторожно удалите трипсин из пробирок, незатра-
< иная ткань; наклоняя и поворачивая пробирку
17. Инкубируйте ткань в следах трипсина 15—20 мин
при 37 °C.
18. Добавьте ио 4 мл среды в каждый из флаконов
площадью 25 см2 (2 на каждую ткань).
19. Добавьте ио 2 мл среды в пробирки с тканями и
остатками трипсина и пикетируйте для диссо-
циации ткани, осторожно набирая в иииетку и
выливая.
20. Дайте осесть крупным кусочкам ткани.
21. Перенесите надосадочную жидкость с помощью
иииетки в первый флакон, перемешайте и пере-
несите 1 мл разбавленной суспензии во второй
флакон. В результате этой процедуры получится
2 флакона с различной концентрацией клеток, и
это избавляет от необходимости считать клетки.
Оптимальная концентрация клеток для исиоль-
зования в последующих экспериментах оиреде- I
ляется опытным путем.
22. Смените среду, галда потребуется (например, .
для мозга может быть необходимо заменить
среду через 24 ч, а для it ш монтированной сет
чатки - возможно через 5—7 дней) и проверьте I
специфическую морфоло! ню ткани и функции.
гов выводится из культуры. Если потребуется, клетки в
первом флаконе можно тоже культивировать. Мя1 кая
тринсинизации удалит любые прикрепляющиеся клет-
ки, кроме мак]х>фа1 ов.
Метод дезагрегации тканей с помощью коллагеназы
подтвердил свою чрезвычайную полезность для полу-
чения культур опухолей человека [Pfragnerfi Freshney,
2004J, почки мыши, взрослого и эмбрионального моз1а
человека, печени (см. протокол 23.6) лескою и mhoiих
дру! их тканей, в особенности эпителия |Fie.shnej' &
Freshney, 2OO2J. Процедура юц кая и не требует меха-
нического перемешивания или специального оборудо-
вания. Однако если количество ткани превышает 1 i,
процедура становится трудоемкой на стадии препа-
рирования, а также удорожается из-за значительного
необходимого количества колла! еназы. Кроме того,
ири использовании коллагеназы, из соединительной
ткани высвобождается большое количество фиброб-
ластов, поэтому может возникнуть необходимость
в последующей селекции культуры или разделении
клеток (см. 1л. 15).
Отдельные кластеры эпителиальных клеток, полу-
ченные после деза1ре1ации ткани коллагеназой (см.
этап 9 протокола 12.8) и холодной тринсинизации
(см. ив. вкладки 2,3), мшут бы гь отобраны с помощью
препаровальной лупы и перенесены в отдельные лунки
планшета для микротитрования как необработанного,
так и с облученными или обработанными митоми-
цином С клетками фидерного слоя (см. разд. 14.2.3,
23.1.1.23.1.4)
12.3.8. Механическая дезагрегация
Выход клеток из первичного эксплантата относи-
тельно медленный процесс, который может быть в
значительной степени выборочным. Ферментативное
расщепление требует больше усилий, хотя потенциаль-
но дает культуру, которая лучше представляет ткань.
Так как при этом имеется риск протеолитического
повреждения клеток во время обработки фермента-
228
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
Рис. 12.11. Препарирование куриного эмбриона, (а, 6) Извлечение головы (в) Извлечение глаза, (г) Удаление хрусталика,
(с?) Отслаивание ее чатки (с) Извлечение мозга (ж) Разделение туловища, (з) Выделение сердца и ли ких из верхней половины,
(и) Выделение печени и кишечника из нижней половины (к) Введение кончика скальпеля между левой почкой и дорзальной
стенкой тела, (л) Выдав.И1ваниссиинногомо31а (л) Снятие кожи сосипны и задней чаны (н) Отделение мышцы от бедренной
кости, (о) Рудиментарные органы размещены ио исрефсрии чашки. Справа налево но часовни стрелке мозт. сердце. Леч кие,
печень, мускульный же ту док, почки, позвоночник, кожа и мышца
12.3. Первичная культура
229
ми, MHOiut люди выбирают альтернативный метод
механической aeaaipeiauuu. Например, сбор клеток,
которые высвободились из тщательно измельченной
ткани [Lasfargues, 1973], продавливание препарируе-
мой ткани через серию клеточных сит с постепенным
уменьшением размера ячеек или, в другом вариан-
те, пропускание фрагментов ткани через шприц (с
или без шлы с широким отверстием) [Zaroff el al.,
1961], или просто многократное пикетирование (см.
рис. 12.13). В результате этих процедур клеточная
суспензия получается быстрее, чем при фермента-
тивном расщеплении, но при этом мотут возникать
механические повреждения. Соскребание («стряхи-
ванием) (рис. 12.13«) и просеивание (рис. 12.136),
по-видимому, наиболее mhi кий механический метод,
в то время как пипетирование (рис. 12.13г) и особенно
шприцевание (рис. 12.13«), по всей вероятности, при-
водят к повреждениям. В протоколе 12.9 описан один
из методов механической дезагретации, который, как
было показано, с большим успехом используется для
мят ких тканей, таких как мозг.
Эта методика применима только для мят ких тканей,
таких как селезенка, эмбриональная печень, взрос-
лый моз1 и некоторые мят кие опухоли человека и
животных. Даже для тканей мозта, для которых .четко
достигается полная дезагретация, выживаемость полу-
ченных при механической дезагрегации клеток ниже,
чем при ферментативной дезагрегации, хотя затраты
времени значительно меньше. Когда количество ткани
достаточно велико, а эффективность выхода не имеет
значения, с помощью механической дезатретации
можно выделить за короткое время столько же клеток.
230
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
ПРОТОКОЛ 12.8. Дезагрегация ткани
с помощью коллагеназы
Схема
Поместить мелко нарезанную ткань в полную среду,
содержащую коллагеназу и инкубир<»вать. После де-
sai регации гкани удалить коллагеназу центрифут и-
рованием, посеять клетки в высокой концентрации
и культивировать (рис. 12.12)
Материалы
Стерильные:
Коллагеназа (2000 единиц мл), Worthington
CLS или Sigma 1А
• Культуральная среда (например, DMEM/F12 с
10% FBS)
• DBSS
• Пииетки на 1 и 10 мл
• Чашки Петри диаметром 9 см, не для культуры
ткани
• Культуральные флаконы площадью 25 см2
• Центрифужные пробирки или универсальные
контейнеры объемом 15—50 мл. в зависимости от
количества ткани
• Скальпели
Нестерильные:
• Центрифуга
Протокол
1. Перенесите ткань в свежий стерильный DBSS и
промойте.
2. Перенесите ткань во вторую чашку, удалите
нежелательные ткани, такие как жир или некро-
тический материал.
3. Перенесите в третью чашку и мелко нарежьте
скрещенными скальпелями (см. рис. 12.12) на
кусочки размером около 1 кубического милли-
метра.
1. Перенесите ткань с помощью пипетки (10—20 мл
с широким концом) в стерильную центрифужную
пробирку объемом 15 или 50 мл или в универ-
сальный контейнер. (Вначале смочить внутрен-
нюю поверхность иииетки DBSS, иначе кусочки
будут прилипать.)
5. Дайге кусочкам осесть.
6. Промойте путем ресусиендирования кусочков в
DBSS. дайте кусочкам осесть и удалите надоса-
дочную жидкость. Повторите эту операцию не
менее двух раз.
7. Перенесите 20-30 кусочков в один флакон
площадью 25 см2 и 100-200 кусочков во второй
флакон.
8. Слейте DBSS и добавьте 4,5 мл ростовой среды с
сывороткой в каждый флакон.
9. Добавьте 0,5 мл коллагеназы ।руной очистки
(2000 ед. /мл), чтобы получить конечную концен-
трацию коллагеназы 200 ед. мл.
10 Инкубируйте 4 48 ч при 37 °C без перемеши-
вания. Если дезагре1ация проходит медленно,
опухолевые ткани (например, фиброзные карци-
номы молочной железы или кишечника) можно
оставить в растворе до 5 дней, хотя, если будет
наблюдаться значительное снижение pH (то есть
<рН 6,5), может понадобиться центрифут ировать
ткань и ресусиендировать ее в свежей среде с
коллагеназой до окончания инкубации.
11 Проверьте эффективность дезагре! ации путем
осторожною покачивания флакона, кусочки
ткани будут «размазываться» ио дну флакона
н, при осторожном ||||иетированш|. распадать-
ся на отдельные клетки и небольшие кластеры
(рис. 12.13).
12. В некоторых тканях ( например..iei ком. почке и
карциномах молочной железы или кишечника)
небольшие кластеры эпителиальных клеток
MOiyT быть устойчивы к коллагеназе. Их можно
отделить от остальных клеток, дав нм осесть в
течение приблизительно 2 мин. Если потом эти
кластеры промыть DBSS путем ресусиендиро-
вания и осаждения, ресусиендировать осадок в
среде и посеять, они moivt дать начало островкам
шителиальных клеток Как правило. Эпителиаль-
ные клетки выживают лучше, если их диссоции-
ровать не полностью.
13. Koi да будет достш нута полная деза| регация или
К1ида будут собраны клетки в надосадочной жид-
кости (после удаления кластеров осаждением),
центрифугируйте суспензию клеток из дезагре-
прова иной ткани и всех промывочных растворов
3 мин при 50—100 g.
14. Удалите супернатант DBSS или среды, ресус-
иендируйте и объедините осадки в 5 мл среды и
посейте во флакон площадью 25 см2. Если после
обработки коллагеназой pH упадет (до pH 6.5 пли
ниже в течение 48 ч), после удаления коллагеназы
разбавьте суспензию клеток в 2—3 раза средой.
15. Через 48 ч смените среду.
сколько и при ферментативном расщеплении, но для
этого понадобится гораздо больше ткани.
12.3.9. Разделение жизнеспособных
и нежизнеспособных клеток
Когда прикрепленную первичную культуру получают из
суспензии диссоциированных клеток, нежизнеспособ-
ные клетки удаляются при первой смене среды. В случае
если клетки первичной культуры растут в суспензии,
с началом пролиферации нежизнеспособные клетки
постепенно разбавляются. Однако, если необходимо,
нежизнеспособные клетки можно удалить из суспензии
путем центрифуц|р<1вания клеток на смеси фиколла
и метризоата натрия (например, Hypaque или Trimil)
12.3. Первичная культура
231
Рис. 12.12. Дезагрегация ткани с помощью коллагеназы, (а) Схема препарирования ткани с последующей дезагрегацией
коллагеназой, (б) Кластеры клеток, полученные из карциномы кишечника человека через 48 ч после диссоциации клеток в
коллагеназе грубой очистки (Worthington CLS grade), до удаления коллагеназы (в) То же, что и (6), но после удаления кол-
лагеназы. деза! рсгации иинетированием и культивирования в течение 48 ч Ясно видны круглые кластеры (указаны черными
стрелками) в (б), из которых формируются зпитслиоподобныс с юн (указаны безымн стрелками) на фотографии (в), некото-
рые сохраняют трехмерную структуру, некоторые распластываются, а из неравномерно оформленных кластеров образуются
фибробласты (см. также цв вкладку 26)
[Vries el al., 197.3J. Эта методика сходна с методикой
выделения лимфоцитов из периферической крови (см.
протокол 27.1). Жизнеспособные клетки собирают на
границе между средой и фиколл метризоатом, а мерт-
вые клетки образуют осадок на дне пробирки.
Эта методику можно модифицировать, понижай
или повышая соотношение объема фиколла к объему
суспензии клеток (например, 5 мл клеточной суспен-
зии наслаивать на 1 мл фиколла).
12.3.10. Первичнвя культура,
краткие выводы
Дезагрегация ткани и получение первичном культуры
cociaBjiHKiT первую и, возможно, наиболее существен-
ную стадию в культивировании клеток со специфиче-
скими функциями. Если необходимые клетки на этой
стадии потеряны, эта потеря невосполнима. Многие
клетки различных типов можно культивировать, вы-
брав правильные методики (см. разд. 10.2.1 и гл. 23).
В общем случае трипсин является более жестким
ферментом, но сравнению с коллагеназой, но иногда он
более эффективен д^тя получения суспензии одиночных
клеток. Использование коллагеназы не дает быстрой
диссоциации эпителиальных клеток, но это свойство
является преимуществом при отделении эпителиаль-
ных клеток от стромальных. Механическая дезагрега-
ция намного быстрее, чем процедура с использованием
коллагеназы, но при этом повреждается больше клеток.
Лучшим подходом будет опробовать ме годики, описан-
ные в протоколах 12.4 12.9, гг выбрать метод, который
лучше всего себя зарекомендует* в ваших условиях.
Если не подойдет ни одна из этих методик, попробуйте
использовать дополнительные ферменты, такие как
ироназа, диеггаза, Аккутаза и ДНКаза, и поищите в ли-
тературе примеры более ранних работ с теми тканями,
которые вас интересуют.
12.3.11. Первичная документвция
Вне зависимости от методики, используемой для
получения культуры, важно вести точные записи о
происхождении культуры и ее источнике, включая
вид. ггол и ткань, из которой она была получена, любые
значимые патологии и процедуры, использованные
для дезагрегации и получения первичной культуры
(табл. 12.2). Если в работе вы применяете нормы
правильной лабораторной практики (good labora-
232
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
Таблица 12.2. Регистрация данных о первичной культуре
Дата........................Время ............... Оператор.......................
Рсч ист рационные записи
Происхождение ткани Вид
Порола или линия
Во трас <
Пол
Порядковым номер или номер меч ки животного
Ткань
Участок
Хранение ткани местонахождение ДН К
Патология
Агент, используемый для дезагре- гации Трипсин, коллагеназа и т л
Концснiрация
Продолжи i ел ьносч ь обработки
Раствор! пел ь
Подсчет клеток Концснiрация после ресуспсидироваппя (С1)
Объем (VI)
Выход (Y C14VI)
Выход на । рамм (сырой все шапп)
Посев Количество (N) и гип сосуда (флакон, чашка пли планшет)
Окончи]е |ьная копией iрация (CF)
Объем во флаконе, чашке и ш лунке планшета (VF)
Среда Вид
Номер пар гни
Вид сывороши ц концен! рация
Номер пар пи.
Дру । ие добавки
Концсн 1 рация СО2
Покрытие матриксом Например,фибронектин. Malngel. коллаген
Пассирование Восстановление к первому пересеву, клеток ф вакон
"„(восстановившиеся клеши ч посеянные клетки)
Маркировка шнии клеток
12.3. Первичная культура
233
ПРОТОКОЛ 12.9. Механическая
дезагрегация путем просеивания
Схема
Ткань в культуральной среде протирается через се-
рию сит с постепенным уменьшением размера ячеек,
пока не будет получена приемлемая суспензия от-
дельных клеток и малых агретатов. Далее суспензию
разбавляют и сразу культивируют.
Материалы
Стерильные:
• Ростовая среда, например DMEM F12 с 10%
FBS
• Пинцет
• Сип» (рис. 12.136) пли серия сит с постепен-
ным уменьшением размера ячеек от 100 мкм
до 20 мкм, или «клеточное сито» (Falcon) (см.
рис. 12.8)
• Чашки Петри диаметром 9 см
• Скальпели
• Одноразовые пластиковые шприцы (на 2 мл пли
на 5 мл)
• Культуральные флаконы
Протокол
1. После промывания и предварительного препа-
рирования ткани (см. этапы 1 и 2 протокола 2.5)
нарежьте ткань на кусочки размером 3—5 мм в
поперечнике и поместите несколько кусочков
одновременно в сито из нержавеющей стали или
полипропилена с размером ячеек 1 мм. Сито
поместите в чашку Петри диаметром 9 см (см.
рис 12.136) или в центрифужную пробирку (см.
рис. 12.8).
2. Протрите ткань через сито в среде, мя1 ко надав-
ливая поршнем от одноразовою пластиковою
шприца. Промойте средой из иииетки сито, чтобы
смыть клетки
3. С помощью иииетки перенесите частично де-
загре! ированную ткань из чашки Петри в сито с
мелкими порами, возможно размером 100 мкм, и
повторите этап 2
4 На этой стадии суспензию можно разбавить и
культивировать или ее далее можно пропустить
через сито с размером пор 20 мкм, если важно
получить суспензию одиночных клеток. Обыч-
но при получении сильно диссоциированной
клеточной суспензии клетки подвергаются ме-
ханическому стрессу и снижается их конечная
выживаемость.
5. Посейте клетки в культуральные флаконы с
плотностью 2x10s, 1x10*’и 2x1(1*'кл./мл, разводя
суспензию клеток средой.
Рис. 12.13. Механическая дезагрегация, (й) Соск1>сбанис
или «стряхивание» Разрезание или механическое трение по-
верхности [мзреза. в результате чего высвобождаются клетки
(6) Просеивание Протирание ткани через сито поршнем от
ш1|р|1ца.(Можно использовать клеточное сито производства
Falcon, см рис. 12 8 ) (е) Шприцевание. Пропускание ткани
через шприц с полой иглой гы и канюлей (г) Рссуспендиро-
вание с помощью циисткн Пипетирование фрагментов ткани
впсрсд-назад через пипетку с широким диаметром
234
ГЛАВА 12. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
ПРОТОКОЛ 12.10. Обогащение
жизнеспособных клеток
Схема
До 2x10' клеток в У мл среды можно наслоить наб мл Fi-
coll-Hypaque в центрифужном с гакане на 25 мл с ,кши н-
чпвающейся крышкой. Затем смесь центрифугируют и
из интерфазы собирают жизнеспособные клетки.
Материалы
Стерильные:
* Суспензия клеток с минимально возможным
количеством ai регатов
• Прозрачные центрифужные пробирки или уни-
версальные контейнеры
• D-PBSA
• Ficoll Hypaque или анало, ичныи реактив (см.
Приложение П)(фиколл. метрмзоат, доведенный
до плотности 1,077 , см3)
• Ростовая среда
• Шприц с канюлей с тупым наконечником imh с
то лой с тупым концом, пастеровские пипетки или
автоматическая пинетка
Нестерильные
• Гемоцитометр или счетчик клеток
• Центрифуга
Протокол
1. Дайте осесть крупным arpei атам клеточной сус-
пензии.
2. Наслоите!) мл клеточной суспензии наб мл смеси
Ficoll-paque. Этот этап необходимо проводить,
используя широкую прозрачную центрифужную
пробирку с крышкой, такую как универсальные
контейнеры Stenlin или Ntinclon или прозрачные
пластиковые пробирки на 50 мл Corning, удвоив
объемы, упомянутые выше.
3. Цеитрифу!ируйте смесь 15 мин при 400 g
1. Осторожно удалите верхний слой, не повредив
границу фаз.
5. Осторожно соберите границу фаз с помощью
шприца, пастеровской пипетки или автоматиче-
ской пинетки.
• Требование безопасности. Если вы рабо-
таете с материалом человека или дру| их приматов,
не используйте острую m лу или стеклянную пасте-
ровскую пипетку.
6. Разведите смесь средой (например, DMEM/
F12/ 10FB) до 20 мл.
7. Центрифyi ируйте смесь при 70 g 10 мин.
8. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок
в 5 мл ростовой среды.
9. Повторите этапы 7 и 8 для того, чтобы отмыть
клетки отфиколла.
10. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра
или электронного счетчика клеток.
11. Посейте в культуральный флакон(ы).
lory practice, GLP; wvvw.oecd.org department 0,2688,
еп 2649 34381 1 1 1 1 1,OO.hlinl), то такие записи
не только желательно, но и обязательны [Food and
Drug Administration, 1992; Department of Health and
Social Security. 1986; Organisation for EconoinicCo-op-
eralion and Development, 2004J. Записи можно вести в
тетради или на друтх бланках для записи, но лучше
всего на этой стадии создать запись в компьютерной
базе данных; эта запись затем станет первым шагом в
сохранении происхождения клеточной линии. Запись в
базе данных может не пойти дальше стадии первичной
культуры, но, с другой стороны, она может быть первым
шагом в создании точных записей, характеризующих
ценную клеточную линию. Если запись станет беспо-
лезной, ее все|да можно удалить, но если клеточная
линия приобретет значение, запись невозможно будет
создать позже с той же точностью.
Так как на более позднем этапе может возникнуть
необходимость подтвердить происхождение клеточ-
ной линии, особенно если возникнут подозрения о
перекрестной контаминации, важно сохранить образец
ткани, крови или ДНК гой жеособи в момент изоляции
ткани для первичной культуры. Этот образец может в
дальнейшем использоваться как стандартный материал
для ДНК-фингериринтинга (см. разд. 16.6.2) или для
дру1 их видов анализа ДНК (см. разд. 16.6.3).
Глава 13
СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
13.1. СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ
Первое субкультивирование представляет собой важ-
ный переходный период для культуры. Необходимость
субкультивирования подразумевает, что первичная
культура разрослась до таких пределов, что заняла
весь доступный субстрат. Хотя первичная культура
может иметь различные фракции (см. разд. 21.11.1), в
зависимости от типа клеток, представленных в культу-
ре, после первого субкультивирования фракция роста
становится достаточно высокой (80% и более). Из
очень гетерогенной первичной культуры, содержащей
много клеточных типов, представленных в исходной
ткани, возникают более гомогенные клеточные ли-
нии. Б дополнение к биоло| ическому значению, это?
процесс имеет высокую практическую значимость,
поскольку теперь культура может поддерживаться,
размножаться, храниться, может быть охарактеризо-
вана, и возможности культуры возрастают, включая
увеличение количества клеток и их единообразие, что
открывает широкие возможности для эксперименталь-
ных исследований (см. табл. 1.5).
13.2. ТЕРМИНОЛОГИЯ
Как только первичная культура прошла субкульти-
вирование (или пвссаж), она именуется клеточной
линией. Этот термин подразумевает присутствие
нескольких клеточных линий как сходных, так и от-
даленных фенотипов. Если выбрана одна клеточная
линия - методом клонирования (см. протокол 14.1),
методом физического разделении клеток (см. 1Л. 15)
или каким-либо иным методом селекции клеток, при
наличии некоторых специфических свойств, которые
идентифицируются у совокупности клеток в культу-
ре, клеточная линия начинает* называться клеточный
штамм (см. Приложение IV). Некоторые наиболее
используемые клеточные линии и клеточные штаммы
приведены в списке в табл. 13.1 (см. также табл. 3.1).
Если клеточная линия трансформирована in vitro, она
дает начало постоянной клеточной линии (см. разд. 3.8,
18.4), а если она клонирована и охарактеризована, то
она известна как постоянный клеточный штамм. На
этой стадии чрезвычайно важно подтвердить идентич-
ность клеточных линий и не допускать возможности
перекрестного заражения; многие клеточные линии,
обычно используемые, на самом деле не являются тем,
чем они заявлены, поскольку перекрестно контамини-
рованы клетками HeLa или иными энер! ично расту-
щими клеточными линиями (табл. 13.2). Тем не менее
иостиянные клеточные линии имеют ряд преимуществ;
преимущества и недостатки кинечных и постоянных
клеточных линий приведены в табл. 13.3.
Первое субкультивирование дает начало вторич-
ной культуре, повторное - третичной и т.д., хотя на
практике эта номенклатура редко используется далее,
чем третичная культура. В работах Хей флика [Hay-
flick & Moorhead, 1961] каждая субкультура делит
культуру пополам (т.е. индекс разведения 1:2), по-
этому номер пассажа совпадает с номером генерации.
Тем не менее это не одно и то Же. Номер пассажи это
количество раз, которое культура была пересеяна, в
то время как номер генерации - это количество удво-
ения клеток, которому подверглась культура, при том
что количество периодов удвоения устанавливается
весьма приблизительно. Koi да индекс разведения
составляет 1:2, как в экспериментах Хейфлика, номер
пассажа примерно равен номеру генерации. Тем не
менее если субкультивирование проводится при ин-
дексе разведения выше, чем 1:2, го номер генерации,
который представляет весьма важную характеристику
возраста культуры, будет возрастать быстрее, чем
номер пассажа, основанный на количестве периодов
удвоения клеток, так что клеточная популяция, кото-
рая произошла от предыдущего субкультивирования
(см. разд. 13.7.2). Ни одно из этих приближений не
учитывает потери клеток в результате некроза, апоп-
тоза или дифференцировки пли старения культуры
с выходом из цикла деления и роста. Однако все эти
явления moi ут иметь место при каждом цикле роста
между субкультивированием
13.3. ВОЗРАСТ КУЛЬТУРЫ
Клеточные линии с ограниченным временем жизни
называются конечными линиями и имеют опреде-
ленный тип репродуктивное™ (см. разд. 3.8.1). Они
растут и проходят определенное конечное число де-
лений, с формированием конечного числа клеточных
генераций, обычно от 20 до 80 периодов удвоения
клеточной популяции до начала yiacamm культуры.
Реальное количество удвоений зависит от вида и раз-
236
ГЛАВА 13. СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
Таблица 13.1. Обычно используемые клеючныс чннип
Клеточная линия Морфология Происхож- дение Вид Возраст Ппоидность Характеристики Ссылки
Конечные, иг 1 нормальных тканей
1MR-90 Фибробласты легкое Человек Эмбриональный Диплоидный Чувствительны к вирусным инфек- циям человека, контактное ингиби- рование Nichols etal, 1977
MRC-5 Фибробласты легкое Человек Эмбриональный Диплоидный Чувствительны к вирусным инфек- циям человека, контактное ингиби- рование Jacobs. 1970
MRC-9 Фибробласты легкое Человек Эмбриональный Диплоидный Чувствительны к вирусным инфек- циям человека. контактное ингиби- рование Jacobs, et al, 1979
VV1-38 Постоянные, Фибробласты легкое из нормальных тканей Человек Эмбриональный Диплоидный Чувствительны к вирусным инфек- циям человека Hayflick & Moor- head. 1961
293 Эпителиальные тетки почка Человек Эмбриональный Анеуплоидный Легко трансфециру- Graham et al, 1977
3T3-A31 Фибробласты Мышь BALB/c Эмбриональный Анеуплоидный Контактное ингиби- рование. легко трансформи- руются Aaronson & To- daro. 1968
3T3-L1 BEAS-2B Фибриб .асты Эпителиальные тетки легкое Мышь Человек Эмбриональный Взрос т ый Анеушюидный Адииозная диффе- ренцировка Green & Kehn.de, 1974 Reddel et al. 1988
ВНК21-С13 Фибробласты почка Сирийский хомячок Новорожденный Анеуплоидный Трансформируется вирусом полиомы Macpherson & Stoker. 1962
BRL3A Эпителиальные тетки печень крыса Новорожденный Продуцирует 1GF-2 Coon. 1968
С2 С7 Фнбробласт-по- добные клетки Эпителиоидные тетки скелетные мышцы гипоталамус мышь Мышь Эмбриональный Мышечные трубочки Нейрофизин, ва- зопрессин Morgan et at, 1992 De Vitiy et al. 1974
СНО-К1 Фибробласты яичник Китайский хомячок Взрослый Диплоидный Простое кариотипп- рование Puck et al, 1958
COS-1, COS-7 Эпителиоидные почка свинья Взрослый Хороший реципиент для трансфекции ДНК Gluzman. 1981
СРАЕ Эндотелиальные тетки Эндотелий легочной артерии корова Взрослый Диплоидный Фактор V111. ангиотензин 11 - конвертирующий фермент Del Vecchio & Smith, 1981
НаСаТ Эпителиальные кератино- Человек Взрослый Диплоидный Ороговение Boukamp et al. 1988
L6 Фибробласт-по- добные клетки Скелетные мышцы крыса эмбриональные Мышечные трубочки Richler & Yaffe, 1970
LLC-PK1 Эпителиальные почка свинья Взрослый Диплоидный На+-зависимый за- хват глюкозы Hull et al. 1976. Saier, 1984
MDCK Эпителиальные почка собака Взрослый Диплоидный Куполообразность. транспорт Gaush et al, 1966. Rtndler et al 1979
NRK49F Фибробласты почка Крыса Взрослый Анеуплоидный Индукция роста сус- пензии TGF-a Р De Larco & Todaro. 1978
STO Фибробласты Мышь Эмбриональный Аиеуплоидиыи Используется как фидерный слой для эмбриональ- ных стволовых Bernstein. 1975
13.3. Возраст культуры
237
Продолжение табл. 13.1
Клеточная линия Морфология Происхож- дение Вид Возраст Плоидность Характеристики Ссылки
Постоянные. Фибробласты почка из опухолевых тканей обезьяна Взрослый Анеуилоидный Субстрат для роста и исс зедования вирусов Норрл et al, 1963
А2780 Эпителиальные клетки яичник Человек Взрослый Анеуилоидный Химическая чувстви- те чьность с нали- чием резистентных вариантов Tsuruo er al, 1986
А549 Эпителиальные клетки легкое Человек Взрослый Анеуилоидный Продукция сурфак- Giard et al, 1972
А9 Фибробласты Подкожный Мышь Взрослый Анеуилоидный Получена из L929; недостаток HGPRT Littlefield, 1964b
Bib Фибробласт -по- добпыс клетки Меланома Мышь Взрослый Анеуилоидный Меланин Nikis & Makarski. 1978
С1300 Нейрональные Нейроб-iac- Крыса Взрослый Анеу и л i )идн ы й Аксоны Liebermann & Sachs, 1978
С6 Фибробласт -по- д<йные клетки Глиома Крыса Новорожденный Анеуилоидный Глиальный фибрил ярный кислотный протеин, GPDH Benda et al, 1968
Сасо-2 Эпителий Толстый ки- шечник Человек Взрослый Анеуилоидный Транспорт ионов и аминокислот Fogh, 1977
ЕВ-3 Лимфоциты Перифери- ческая кровь Человек Юношеский Диплоидный Чувствительна к вирусу Эпштейна- bapps Epstein & Barr, 1964
Friend Суспензионная Селезенка Мышь Взрослый Анеуилоидный Гемоглобин Scher et al, 1971
GH1.GH2. GH3 Эпителиоидные клетки Гипофи- зарная опухоль Крыса Взрослый Гормон роста Buonasstsi et al, 1962, Yasamura et al, 1966
Н4-11-Е-СЗ Эпителиальные Гепатома Крыса Взрослый Анеуилоидный Тирозин аминотрансфераза Pitot et al. 1964
HeLa Эпителиальные Шенка мат- Человек Взрослый Анеуилоидный GfiPDTim А Gey et al, 1952
HeLa-S3 Эпителий Толстый ки- шечник Человек Взрослый Анеуилоидный Высокая эффек- тивность посева, способна расти в суспензии Puck & Marcus, 1955
HEP-G2 Эпителиоидные клетки Гепатома Человек Взрослый Анеуилоидный Сохраняются неко- торые рибосомаль- ные ферменты Knowles et al. 1980
HL-60 Суспензионная Миелоид пая лей- кемия Человек Взрослый Анеуилоидный Фагоцитоз, восста- новление Неотет- разолия Голубого Olsson & Ologs- son, 1981
НГ-29 Эпителий Толстый ки- шечник Человек Взрослый Анеуилоидный Дифференцировка индуциртется NaBt Fogh & Trempe. 1975
К-562 Суспензионная Миелоид- ная лей- кемия Человек Взрослый Анеуилоидный Гемог тобин Andersson et al. 1979a.b
L1210 Лимфоциты Мышь Взрослый Анеуилоидный Ьыстрый рост; спо- собность к росту в суспензии Law et a!, 1949
L929 Фибробласты Мышь Взрослый Анеуилоидный Клон L-клеток Sanford et al. 1948
Lb Фибробласты Мышь Взрослый Анеуилоидный Роет в суспензии, производная L929 Paul & Struthers, шчное сооб- щение
X1CF-7 Эпителиальные Плевраль- ный вы- пот при опухоли молочной же чезы Человек Взрослый Анеуилоидный Рецепторы эстрогена, куполообразная форма, а- лакталь- бумин Soule et al. 1973
238
ГЛАВА 13. СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
Окончание табл. 13.1
Клеточная линия Морфология Происхож- дение Вид Возраст Плоидность Характеристики Ссылки
MCF-10 эпителиальные Фиброзно- кистозная опухоль молочной же тезы Человек Взрос ТЫЙ Почти ДИПЛО- ИДНЫЙ Формирование купо- лообразной формы Soule et al, 1990
MOG-G- ССМ Эпнтелдипидные Глиома Человек Взрос тый Анеуплоидный 1 лутамил synthetase Balmforth et al, 1986
P388D1 Лимфоцитарные Мышь Взрос ТЫЙ Анеуплоидный Рост в суспензии Dawe & Potter. 1957, Koten et al, 1975
S18I1 Фибробласты Мышь Взрос ТЫЙ Анеуплоидный Скрининг эффектив- ности химиотера- пии рака Dunham & Stew art, 1953
SK НЕР-1 Эндотелиальные Гепатома, эндоте- Человек Взрос ТЫЙ Анеуплоидный Фактор VU1 Heffelfinger et al., 1992
WEH1-3B D+ Суспензионная Костный Мышь Взрослый Анеуплоидный Продукция 1L-3 Nicola, 1987
ZR-75-1 Элите шалоьные Асцитная жидкость опухоли молочной же тезы Человек Взрос ТЫЙ Анеуплоидный Рецепторы эстрогена. EGF-рецепторы Engel et al. 1978
Таблица 13.2. Перекрестно-зараженные клеточные линии
Клеточная линия Вид Тип клеток Контами- Вид Тип клеток Источник данных
207 Человек Рге-В-лейкемия REH Человек Ргс-В-лейкемия DSMZ
2-474 90 Человек Рак же зудка НТ-29 Человек Ко.тонорсктальная рак DSMZ
2957 90 Человек Рак же тудка НТ-29 Человек Колоноректальная рак DSMZ
3051 80 Человек Рак же тудка НТ-29 Человек Колонпрскгальная рак DSMZ
ADLC-5M2 Человек Рак легкого HELA -S3 Человек Аденорак шейки матки DSMZ
AV3 Человек Амниотическая жидкость HeLa Человек Аденорак шейки матки ATCC
BCC-1 KMC Человек Базальноклеточная рак HELA -S3 Человек Аденорак шейки матки DSMZ
BM-1604 Человек Опухоль простаты DU-145 Человек Опухоль иропаты DSMZ
С16 Человек Фибробласты ле! ких эмбрп- HcLa Человек Аденорак шейки матки ЕСАСС
она клон MRC-5
CHANG liver Человек Эпителий легких эмбриона HeLa Человек Аденорак шейки ма|ки ATCCJCRB
COLO-818 Человек меланома COLO-800 Человек Меланома DSMZ
DAMI Человек Мс1акариотическис клетки HEL Человек Эри гролейкемия DSMZ
ECV304 Человек Энди гелий T24 Человек Рак мочевого пузыря ATCC
ECV304 Человек Нормальный эндотелий T24 Человек Рак мочевого пузыря DSMZ
EJ Человек Рак мочевого пузыря T24 Человек Рак мочевого пузыря ATCCJCRB
EPLC3-2M1 Человек Рак легких HELA -S3 Человек Аденокарцинома шейки матки DSMZ,JCRB
EPLC-65 Человек Рак легких HELA -S3 Человек Аденокарцинома шейки матки DSMZ
F2-4E5 Человек Эпи гелий тимуса SK-HEP-1 Человек Гепатома DSMZ
F2-5B6 Человек Эпителий тимуса SK-HEP-1 Человек Гепатома DSMZ
FL Человек Амниотическая жидкость HeLa Человек Аденокарцинома шейки матки ATCC
GHE Человек Астроцитома T 24 Человек Рак мочевою пузыря DSMZ
Girardi Heart Свинья Сердце взрослой свиньи HcLa Человек Аденокарцинома шейки матки ATCC
HAG Человек Аденоматозный зоб T-24 Человек Рак мочевою пузыря DSMZ
HEp-2 Человек Носоглоточнеый эпителии HeLa Человек Аденокарцинома шейки матки ATCC
взрослого человека
HMV-1 Человек Меланома HeLa-S3 Человек Аденокарцинома шейки матки DSMZ
HuL-1 HcLa Человек Аденокарцинома шейки матки JCRB
13.3. Возраст культуры
239
Окончание табл. 13.2
Клеточная Вид Тип клеток Контами- Вид Тип клеток Источник
линия нант данных
IMC-2 Человек Карцинома челюсти HcLa-S3 Человек Аденокарцинома шейки магки DSMZ
Intestine 407 Человек Эпи гелий тонкой кишки HcLa Человек Аденокарцинома шейки маз ки АТСС
J-Ul HcLa Че ювек Аденокарцинома шейки матки JCRB
JOSK-1 Человек Моноцитарная лепкемия U-937 Человек Гистиоцитарная лимфома DSMZ
JOSK-K Человек Моноцитарная лейкемия U-937 Человек Гистиоцитарная лимфома DSMZ
JOSK-M Человек Моноцитарная лейкемия U-937 Человек Гистиоцитарная лимфома DSMZ
JOSK-S Человек Моноцитарная лейкемия U-937 Человек Гистиоцитарная лимфома DSMZ
JTC-17 Человек HcLa Человек Аденокарцинома шейки матки Yatnakagc
0CRB)
кв Человек Эпигетий ротовой полости HcLa Человек Аденокарцинома шейки матки АТСС. JCRB
КО51 K562 Человек Миелоидная лейкемия DSMZ. JCRB
KOSC-3 Ca9-22 JCRB
L132 Человек Эпителий эмбриональных HcLa Человек Аденокарцинома шейки матки ATCC
ЛС1КИХ
LR106 Человек Ргс-В-клсточная лейкемия NALM-6 Человек Ргс-В-клсточная лейкемия DSMZ
МаТи человек Рак молочной железы HELA/-S3 Человек Аденокарцинома шейки матки DSMZ
МС-4000 Человек Рак молочной железы HELA, -S3 Человек Аденокарцинома шейки матки DSMZ
МКВ-1 Человек Т-клсточная лейкемия CCRF-CEM Человек Т-клсточная лейкемия DSMZ
MKN28 MKN74 JCRB
MOLT-15 Человек Т-клеточная лейкемия CTV-1 Человек Моноцитарная лейкемия DSMZ
МТ-1 Человек Рак молочной железы HELA/-S3 Человек Аденокарцинома шейки матки DSMZ
NCC16 PHK16-0b JCRB
Р1-1АЗ Человек Эпи ге.шй тимуса SK-HEP-1 Человек Гепатома DSMZ
P1-4D6 Человек Эпителий тимуса SK-HEP-1 Человек Гепатома DSMZ
P39TSU Человек HLfiO Че вовек Миелоидная лейкемия JCRB
PBEI Человек Пре-В-клеточная лепкемия NALM-6 Че говек Прс-В-клетпчная лейкемия DSMZ
PSV811 Человек Фибробласты WI38 Человек Фибробласты JCRB
RAMAK-1 Человек Синовиальная оболочка T-24 Человек Рак мочевого пузыря DSMZ
мышц
SBC-2 Человек Рак мочевого пузыря HELA/-S3 Че вовек Аденокарцинома шейки матки DSMZ
SBC-7 Человек Рак мочевого пузыря HELA/-S3 Че ювек Аденокарцинома шейки матки DSMZ
SCLC-16H Человек SCLC SCLC- Человек SCLC DSMZ
21 22H
SCLC-24 И Человек SCLC SCLC- Человек SCLC DSMZ
21 22H
SNB-19 U251 MG Человек Глиома ATCC
SPI-801 Человек Т-клсточная лейкемия K-562 Человек Миелоидная лейкемия DSMZ
SPI-802 Человек Т-клсточная лейкемия K-562 Человек Миелоидная лейкемия DSMZ
ТК-1 Человек? U251MG Че ювек Глиома JCRB
ТМН-1 IHH-4 JCRB
WISH Человек А м н иитичеекн и эн итсл ий HcLa Человек Аденокарцинома шейки матки ATCC
ново|южденного
личий и клеточных линиях, клональных вариаций и
условий культивирования, но оно обычно постоянно
для одного и того же типа клеток при одних и тех же
условиях культивирования. Таким образом, важно,
чтобы в описании клеточной линии было указано
приблизительное кили честно генераций или периодов
удвоения после эксплантации. Авторы подчеркивают,
что только «приблизительное», поскольку количество
генераций, которое проходит в первичной культуре,
трудно определить.
Постоянные клеточные линии (см. табл. 13.1) из-
бе! ают старения, поэтому номер генерации становится
менее важным, и становится более важным номер
пассажа после посадки культуры, находившейся на
хранении (см. разд. 13.7.2). Кроме того, в результате
возрастания интенсивности пролиферации клеток и
повышения плотности культуры (см. разд. 18.5) индекс
разведения становится значительно выше (1:20— 1:100)
и концентрация клеток в субкультуре становится более
критичной (см. разд. 13.73).
240
ГЛАВА 13. СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
Таблица 13.3. Свойства конечных и постоянных клеточных линии
Свойства Конечные Постоянные (трансформированные)
Плоид ность Эуилоидныс, диплоидные АнеуИЛДОИДНЫС, 1СТСрО|ЫОИДНЫС
Трансформация Нормальные Имморта.шзованные, изменены контроль роста и способность к опухолевому росту
Зависимость от подложки Да Нет
Коюактное HHi ибирование Да Нет
Ограничение клеточного деления плотное- Да Снижена или утрачена
тыо клеточной популяции
Тип роста Минослон Монослой или суспензия
Ведение культуры и пересев Циклическое Возможно устойчивое состояние
Потребность в сыворотке Высокое Низкое
Эффективность клонирования Низкая Высокая
Маркеры Специфические тканевые Хромоеомальныс, ферментативные, антигенные
Специальные функции (например, воспрн- Может быть сохранена Часто утрачена
нмчивоеть к вирусам, дифференцировка)
Скорость роста Медленная (TD 24 96 ч) Быстрая (I ,, 12 24 ч)
Ю1СТОЧНЫЙ выход Низкий Высокий
Контролируемые параметры Номер генерации, ткансспсци- фичсекис маркеры Маркеры (окраски)
13.4. МАРКИРОВКА КЛЕТОЧНОЙ
КУЛЬТУРЫ
Новым клеточным линиям должно быть дано обоз-
начение, включающее (например, normal human brain
(NHB) (нормальный мол человека)) номер клеточ-
ного штамма или клеточной линии (если из одного
источника получено несколько клеточных линий;
например. NHB1. HNB2); и номер клона, если произ-
водилось клонирование (например, NHB2-1, NHB2-2
и т.д.). Полезно вести учетный журнал или создать
компьютерную базу данных, где до инициации культу-
ры будет регистрироваться поступление биопсийного
материала или образцов. Входящий номер в учетном
журнале или файле базы данных, возможно, связан-
ный с буквенным идентификационным кодом, может
затем быть использован при маркировке клеточной
линии. Например, LT156 может означать материал
биопсии рака леисих (lung tumor biopsy) номер 156.
Этот принцип маркировки не очень хорош из-за воз-
можной двусмысленности толкования маркировки,
таких как одни и те же буквы для обозначения двух
различных линий клеток, и для создания автоматичес-
ких ссылок на запись поступления культур. Правило
конфиденциальности запрещает использование ини-
циалов донора для обозначения клеточной линии.
Для конечных клеточных линий через дробь должно
быть указано количество периодов удвоения популя-
ции (например, NHB2 2), и это число возрастает на
один при индексе разведения 1:2 (например, NHB2,2,
NHB2/3 и т.д.) или на 2, если индекс разведения 1:4
(например, NHB2,2, NHB2 4 и т.д.) и т.д. Ко|да мы
имеем дело с постоянной клеточной линией, то в конце
маркировки обычно ставят «р» и далее номер пассажа
после последнего оттаивания культуры, взятой с хра-
нения (см. разд. 20.4.2), например HeLa-S3/p4.
При упоминании клеточных линий в публикациях
и докладах полезно прибавить к маркиронке клеточной
линии индикационный код той лаборатории, |де была
создана данная культура (например, WI означает Wistar
Institute, NCI - National Cancer Institute, SK Sloan-
Kettering) [Federoff, 1975J. В публикациях и докладах
при первом упоминании и в разделе «Материалы и
методы» клеточные линии должны быть даны с их пол-
ным обозначением, а в дальнейшем может приводиться
сокращение. Существенно то, что маркировка каждой
клеточной линии уникальна. В противном случае
возникает путаница при последующих сообщениях в
литературе. Банки клеток решают эту проблему щш-
даванием каждой клеточной линии входящего номера;
поэтому при упоминании клеточной линии, получен-
ной из банка, необходимо в «Материалах и методах»
упомянуть pei истрационный номер, иод которым они
записаны в банке. Все знаки пунктуации также могут
быть причиной путаницы при поиске культуры в базе
данных, поэтому вещ да используйте стандартную сис-
тему знаков и не используйте апострофы и пробелы.
13.5. ВЫБОР КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ
Кроме специфических функциональных требований к
культурам клеток существует ряд общих параметров, ко-
торые следует учитывать при выборе клеточной линии.
1) Конечная или постоянная. Существует ли по-
стоянная клеточная линия, которая имеет* необ-
ходимые функциональные свойства? Постоянную
линию клеток обычно легое поддерживать, быст-
рее выращивать, легче клонировать, она произ-
водит более высокий урожай клеток во флаконе
и более приспособлена к бессывороточной среде
(см. табл. 13.3).
13.6. Обычный порядок поддержания культуры
241
2) Нормальная или трансформированная. Важно, являет-
ся линия злокачественно трансфсфмированной или нет?
Если да, то, вероятно, следует попробовать получить
иммортализованнуш линию, которая не будет туморо-
пенна, например juihiiu клеток ЗТЗ или ВКК21-С13.
3) Видовая принадлежность. Важна ли видовая при-
надлежность? Нечеловеческие линии клеток имеют
меньшее количество от раничений биобезопасности
и имеют то преимущество, что исходная ткань может
быть более доступна.
4) Ростовые характеристики. Что вам требуется в
отношении клеточного роста, выхода клеток, эф-
фективности посева и лет кости получения большого
числа клеток? Вы будете должны рассмотреть сле-
дующие параметры:
а) время удвоения популяции (см. разд. 21.9.7);
б) плотность насыщения (на флакон; см. разд. 21.9-5);
в) эффективность посева (см. разд. 21.10);
1) фракции роста (см. разд. 21.11.1);
д) способность расти в суспензии (см. разд. 18.5.1,
табл. 13-5).
5) Эксплуатационная готовность. Если вы должны
использовать конечную линию клеток, то доста-
точны ли доступные запасы, или вы будете должны
производить вашу собственную линию (линии)?
Если вы выбираете постоянную линию клеток, то
существует ли сертифицированный источник ис-
ходной культуры?
6) Валидация. Насколько хорошо охарактеризована
линия (см. разд. 7.10), если она уже существует, или,
если не существует, можете ли вы определить все
необходимые характеристики (см. тл. 16)? Является
ли линия аутентичной (см. разд. 163)? Жизненно
важно устранить возможность взаимною загряз-
нения линий перед осуществлением иротраммы
работы с линией клеток, как так в литературных
источниках много сообщений о перекрестном за-
грязнении (см. табл. 13.2).
7) Фенотипические проявления. Можно ли создать
линию, имеющую определенные фенотипические
характеристики (см. разд. 17.7)"'*
8) Контрольная линия клеток. Если вы используете
мутантную, трансфицированную, трансформи-
рованную или аномальную линию клеток, то су-
ществует ли доступный эквивалент - нормальная
клеточная линия, если это потребуется?
9) Стабильность. Насколько стабильна линия клеток
(см. разд. 18.3 и цв. вкладку 7)? Было ли проведено
клонирование? Если нет, то можете ли вы провести
клонирование и сколько времени займет процесс
клонирования для получения замороженных и i о-
товых к употреблению запасов?
13.6. ОБЫЧНЫЙ ПОРЯДОК
ПОДДЕРЖАНИЯ КУЛЬТУРЫ
Как только культура инициирована, независимо оз
того, является она первичной культурой или субкуль-
Рис. 13.1. Поврежденные клетки. Вакуолизация и грануля-
ция в клетках бронхиального эьитслня (BEAS-2B) возник-
шие, в данном случае, в результате несоошстствия среды.
Цитоплазма клеток становится гранулированной, особенно
вокру ядра, и происходит вакуолизация Клетки на краю мо-
нослоя могут сильно преломлять свет, если распространению
клеток что-то ьрспятствусг
турой, необходимо периодически заменять среду («ци-
таты* культуру) с последующим субкультивированием,
если клетки делятся. Б случае неиролиферирующей
культуры также требуется периодическая замена пи-
тательной среды, поскольку клетки продолжают обра-
зовывать метаболиты, и некоторые компоненты среды
истощаются или спонтанно деградируют. Промежутки
времени между заменами среды варьируют от одной
линии к друтой и зависят от темпов роста и метабо-
лизма культуры; быстрорастущие трансформирован-
ные линии, такие как HeLa, обычно субкультивируют
один раз в неделю, через четыре дня следует заменить
среду. Клеточные линии, которые растут медленнее, в
том числе нетрансформированные, могут потребовать
субкультивирования только каждые две, три или даже
четыре недели, а среда должна заменяться еженедель-
но в промежутках между субкультнвированиями (см.
разд. 13.6.2,13.7.1,21.9.2)
13.6.1. Необходимость исследования
клеточной морфологии
Какую бы процедуру ни производили над клетками,
чрезвычайно важно тщательно исследовать культуру
для подтверждения отсутствия признаков заражения
(см. разд. 19.3.1 и рис. 19.1). Клетки должны прове-
ряться на наличие признаков ухудшения их состоя-
ния, таких как грануляция вокрут ядра, вакуолизация
цитоплазмы, приобретение клетками округлой формы
с отделением их от субстрата (рис. 13.1). Такие при-
знаки могут означать, что культура требует замены
среды, либо может означать наличие более серьезной
и|хюлемы, например неадекватности пли токсичности
среды или сыворотки, микробною заражения или ста-
242
ГЛАВА 13. СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
рения клеточной линии. Дефицит каких-то веществ в
среде может также вызывать апоптоз (см. разд. 33.1 и
в. вкладку 17ц, г). В ходе стандартного поддержания
культуры, замены среды или периодическое субкульти-
вирование должно иметь целью предупреждение таких
ухудшений, поскольку часто вернуть клетки в хорошее
состояние весьма затруднительно.
Близкое знакомство с морфоло» ией клетки может
также позволить определить первые признаки пере-
крестной контаминации или обнаружить ошибку в
идентификации культуры. Полезно иметь серию фо-
тографий различных типов клеток, которые постоянно
используются в лаборатории (см. рис 16.2 и цв. вклад-
ки 9 и 10), сделанные ири различной плотности клеток
(предпочтительно, известной плотности, например с
подсчетом количества клеток на см2) с пояснениями
когда следует производить манипуляции с культурами.
В частности, это важно, когда появляется новый сотруд-
ник, которот о вводят в культуральные работы.
13.6.2. Замена среды
Существует четыре фактора, определяющих необходи-
мость замены культуральной среды:
1) Падение pH. Следует принимать во внимание
скорость падения и абсолютное значение величи-
ны pH. Большинство клеток перестают расти ири
падении pH от 7,0 до 6,5, а также начинают терять
жизнеспособность между pH 6,5 и 6,0. Поэтому если
цвет среды меняется (п красного через оранжевый
до желтой». то среду следует заменить. Постарай-
тесь оценить скорость падения pH; если скорость
падения pH в культуре, которая растет при pH 7,0,
составляет 0,1 ед. pH в день, то задержка питания
на один-два дна но каким-то причинам не вызовет
большого повреждения клеток. В то же время ири
скорости падения pH на 0,4 ед. в день необходимо
произвести замену среды в течение ближайших
24—48 ч, не оставляя культуру без питания на вы-
ходные дни
2) Концентрация клеток. При высокой концентрации
клеток в культуре истощение питательной среды
происходит быстрее, чем при низкой концентрации.
Этот фактор обычно (но не всегда) очевидно прояв-
ляется в скорости падения pH.
3) Тип клеток. Нормальные клетки (например, дипло-
идные фибробласты) обычно перестают делиться
при высокой плотности клетки (см. разд. 18.5.2) из-
за скученности клеток, истощения факторов роста и
по дру» им причинам. Клетки блокируются в Gj-фазе
клеточного цикла и долго сохраняются, даже будучи
оставленными в таком состоянии на две-три недели
и дольше. Однако состояние трансформированных
клеток, постоянных клеточных линий и некоторых
эмбриональных клеток быстро ухудшается ири
высокой плотности клеток, если только среду не
заменяют- ежедневно или не производят субкуль-
тивирование.
4) Морфоло!ические нарушения. Этот фактор сле-
дует предвидеть при ре1улярном обследовании
и хорошем знакомстве с клеточной линией (см.
разд. 13.6.1). Если позволить этому процессу зайт и
слишком далеко, то он может стать необратимым,
поскольку клетки имеют склонность входить в
апоптоз (см. разд. 3.3.1)
Объем, глубина и площадь поверхности. Обыч-
но отношение объема среды к площади поверхности
составляет 0,2 0,5 мл/см2 (см. также разд. 21.9.3).
Верхний предел определяется диффузией таза через
слой жидкости, а оптимальное соотношение зави-
сит от требования клет ок к содержанию кислорода.
Клетки с высокой потребностью в О2 чувствуют себя
лучше в тонком слое среды (например, 2 мм), те же.
потребности которых низки, мотут лучше расти в
тлубоких слоях среды (например, 5 мм). Если тлу-
бина среды более чем 5 мм, тазовая диффузия может
быть ограничена. В случае монослойной культуры
проблема может быть преодолена вращением бутыли
(см. разд. 26.2.3) или перфузии культуры средой и ор-
таннзациен т азообмена в промежуточном резервуаре
(см. разд. 25.3.2,26.2.5)
Сдерживающая среда. Сдерживающая среда
может бы гь использована для стимуляции митозов,
которые обычно сопровождают замену среды, даже
при высокой плотности клеток, если они нежелатель-
ны. Сдерживающая среда обычно представляет собой
обычную среду с концентрацией сыворотки, снижен-
ной до 0,5—2% или полностью удаленной из состава
среды. В бессывороточную среду не добавляется ири
этом никаких факторов роста или дру» их мито» енов.
В результате происходит ингибирование митозов у
большинства нетрансформированных клеток. Линии
трансформированных клеток не годятся для этой
процедуры, поскольку они могут успешно продолжать
делиться, либо культура испортится, поскольку транс-
формированные клетки не блокируются в Gj-фазе
клеточного цикла, как это делают нормальные клетки
(см. разд. 33.1).
Сдерживающая среда используется для поддер-
жания клеточных линий, которые имеют конечное
количество жизненных циклов, при этом не истощая
ресурс количества генераций (см. разд. 3.8.1). Редукция
сыворотки и прекращение клеточного деления также
создает благоприятные условия для проявления видо-
измененного фенотипа некоторых линий [Maltese &
Volpe, 1979;ScliousboeetaL 1979J. Среда, используемая
для сборов биопсийных образцов, может также быть
отнесена к сдерживающим средам.
Стандартный протокол смены среды. Прото-
кол 13.1 разработан для выполнения упражнения 4,
при этом используется среда, приготовленная при
выполнении упражнения 3 (см. гл. 2). Клетки и среда в
протоколе точно определены, но мотут быть изменены
в соответствии с индивидуальными потребностями.
13.7. Субкультура
243
ПРОТОКОЛ 13.1. Смена среды в монослойной
культуре
Схема
И следовать культуру невооруженным i лазом и
при помощи инвертированного микроскопа. Если
обнаружено, например, падение pH, удалить старую
среду и добавить новую среду. Возвратить культуру
в инкубатор.
Материалы
Стерильные:
• Клеточная культура А549, 4 день после посе-
ва при концентрации 2x10*кл. мл, флаконы
25 см-’.................................4
• Питательная среда.................100 мл
• Например, среда И|ла MEMxl с солями Хэнкса
и 4 шМ НС О,, без антибиотиков.
• Если протокол используется в качестве трени-
ровочного упражнения, использовать две среды,
подготовленные цри выполнении упражнения 3.
одна из которых хранилась при 4 С. а друi ая при
37 °C в течение одной недели.
• Пипетки, градуированные и заткнутые пробками.
Если пипетки стеклянные, то в ассортименте раз-
меров. 1 мл, 5 мл. 10 мл, 25 мл, в квадратном пе-
нале для пинеток. Пластмассовые пипетки могут
быть индивидуально обернуты и рассортированы
но размерам на подносе.
• Пииетки без пробок для удаления среды, если
имеются перистальтический насос или вакуум-
ная ЛИНИЯ.
Нестерильные:
• Пикетирующее устройство или груша (см.
рис. 5.5,6.6).
• Шла hi , соединяющий принимающий сосуд с ва-
куумной линией или перистальтическим насосом
(см. рис. 5.1 5.3).
• Этанол 70% в распыляющей бутылке.
• Безворсовые салфетки или тампоны для про-
тирки.
• Абсорбирующие бумажные полотенца
* Цилиндр для пинеток, содержащий воду и дезин
фектант (см. разд. 5.8.8,7.8.5).
• Ручка-маркер с этанол-нерастворимыми черни-
• Записная книжка, ручка, протоколы и т. д.
Протокол
1. Подготовьте ламинарный шкаф, удостоверив-
шись, что он чист, протрите 70%-м этанолом.
2. Принесите реактивы и материалы, необходи-
мые для процедуры, протрите бутылки 70%-м
этанолом, разместите необходимые материалы в
ламинарном шкафу (см. протокол 6.1).
3. Тщательно исследуйте культуру на признаки
контаминации или ухудшения состояния клеток
(см. рис. 13.1,19.1).
4. Проверьте предварительно описанные Крите- |
pun - pH и плотность клеток или концентрацию, .
и на основании ваших знании поведения куль-
туры решите, заменить ли среду. Если требуется
замена, действуйте следующим образом:
5. Перенесите культуру в стерильную рабочую |
зону.
6. Откройте флакон.
7 Возьмите стерильную пинетку и вставьте в грушу I
и jin иииетирующее устройство либо, используя I
пинетку без ватной пробки, присоедините ее к
вакуумной линии или насосу.
8. Уда. чите среду, сливая ее в емкость для отходов
(см. рис. 6.8). Предпочтительно отсасывать среду
при помощи вакуумной линии, подсоединенной
к внешнему насосу (см. рис. 5.2.5.3).
9. Поменяйте пипетку.
10. Откройте бут ылку со средой. .
11. Возьмите новую пинетку и добавьте тот же самый
объем свежей среды, который был удален; если
важно, чтобы не было никаких задержек клеточ-
ного роста, предварительно нагрейте среду до
37 °C. Вновь закройте бутылку.
12. Поменяйте пипетку.
13. Закройте флакон и бутылку со средой.
14. Верните культуру в инкубатор.
15. Произведите подробные записи наблюдений и
питания в pei истрационном листе или журнале |
лаборатории.
16. Уберите все иииетки. стеклянную посуду и т.д
и протрите рабочую поверхность шкафа
Замечание. Когда культура находится при низкой
плотности и медленно растет, может быть предпочти-
тельно при выполнении шага 8 удалить только полови-
ну среды и ,1аместить ее на шаге 11 таким же объемом
свежей среды, какой был удален.
13.7. СУБКУЛЬТУРА
Когда клеточная линия подвергается субкультивирова-
нию, то происходит повторный рост клеток до точки, в
которой культура становится готовой к последующему
субкулминированию. Обычно этот процесс можно
выразить в виде стандартного графика (см. рис. 13.2).
Lag-период наступает после посева, вслед за ним идет
период экспоненциального роста, называемый log-фа-
зой. Ко|да платность клеток (клеток, см2 субстрата)
достшает такого уровня, что весь доступный субстрат
оказывается занятым, или ко|да концентрация клеток
(клеток/мл среды) превышает возможности среды,
рост прекращается или значительно снижается (см.
рис. 16.26. г, е, ж, з, к, а также цв. вкладку 4г). Затем
следует либо заменить среду, либо культуру следует
разлепить. Для адгерентных клеточных линий деление
культуры, или субкультивирование, обычно включает
в себя удаление истощенной питательной среды и
244
ГЛАВА 13. СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
Дни после субкультивирования
Рис. 13.2. Кривая роста и поддержание культуры Полулогарифмический участок кривой, отражающей изменения концент-
рации клеток с течением времени, включает в себя lag-фазу, экспоненциальную фазу и плато, и отражает время, когда следует
проводить субкулыивцрование и замену среды культуры (см также разд. 21.9.2 и рис 21.6)
диссоциацию клеток монослоя при помощи трипси-
на, хотя некоторые культуры, образующие рыхлый
монослой (например, HeLa), могут быть субкульти-
вированы встряхиванием бутылки, переходом клеток
в среду и соответствующим разведением их в новом
флаконе в свежей среде. Существуют также некоторые
культуры, которые не диссоциируют под действием
трипсина и поэтому требуют применения некоторых
специальных протеаз, таких как ироназа, дисцаза и
коллагеназа (табл. 13.4). Проназа является наиболее
эффективным ферментом из этих протеаз, но может
быть токсичной для некоторых клеток. Дисиаза и кол-
лагеназа обычно менее токсичны, чем трипсин, но могут
не давать полной диссоциации эпителиальных клеток.
На рынке представлены также друг ие протеазы, такие
как протеазы беспозвоночных (Accutaze, Accuinax), а
также рекомбинантные формы трипсина (Trypzean или
TrypLE). Их эффективность должна быть проверена
в тех случаях, когда их применение не соответствует
стандартному протоколу дезагре|ации либо когда в
эксперименте следует избе|ать применения протеаз
млекопитающих (например, трипсина свиньи) или
бактерий (например. Pronase). Жесткость требований
предъявляемых к протеазам, зависит от типа клеток,
определяющего чувствительность клеток к протеоли-
зу. Следует выбирать такой протокол, который имеет
наименее стрщ ие требования к протеазе, но при этом
подходит для получения суспензии единичных клеток
с высокой жизнеспособностью.
Прикрепление клеток дру1 к другу и к субстрату
опосредовано гликопротеинами клеточной поверх-
ности и Са2* (см. разд. .3.2). Друг ие протеины, а также
иротео! ликаны, выделенные из клеток и из сыворотки,
связываются с клеточной поверхностью и с субстратом,
усиливая юге точную адгезию. Субкультивирование
обычно требует хелатирования Са2* и деградации вне-
клеточного матрикса, а также, возможно, внеклеточных
доменов некоторых молекул клеточной адгезии.
13.7.1. Критерии субкультивирования
Необходимость субкультипировать монослойную
культуру определяется следующими критериями:
1) Плотность культуры. Нормальные клетки должны
быть субкультивированы, как только они достигают
стадии, когда границы клеток смыкаются (конфлю-
энтное™). Если оставить их в этом состоянии более
чем на 24 ч, они выйдут из цикла деления, и вам
потребуется больше времени для топ», чтобы вос-
становить их пролиферативную активность после
пересева. Трансформированные клетки также сле-
дует субкультивировать но достижении конфлюэнт-
ности; хотя они будут продолжать пролиферировать
и после, но состояние культуры начнет ухудшаться
после приблизительно двух периодов удвоения, и
эффективность посева будет снижаться.
2) Истощение среды. Истощение среды (см.
разд. 13.6.2) обычно показывает, что среда должна
быть заменена, но если падение pH развивается
слишком быстро, то среду приходится менять чаще,
чем необходимо с точки зрения субкультггвирова-
ния. Обычно падение pH связано с возрастанием
плотности клеток, которое является главным ин-
дикатором потребности в субкультивировании.
Заметьте, что неожиданно падение pH может также
быть результатом заражения, поэтому следует про-
верить эту возможность (см. разд. 19.3).
13.7. Субкультура
245
Таблица 13.4. Мсшды диссоциации клеток
Метод Предваритель- ная обработка Диссоциирующий агент Среда Области применения
Стряхивание Her Мягкое механическое стряхивание, иокачи- вание или эноринное пипетирование Культуральная среда Митотические или другие слабо при- крепленные друг к другу клетки
Соскабливание Her Скребок для клеток Культуральная среда Клеточные линии, для которых не могут быть использованы про? сазы (например, при анализе рецепторов или поверхностных клеточных бел- ков), некоторые клетки могут быть повреждены, редко даст однородную клеточную суспензию
Действие TpilUCIl- Полное удало- 0,01-0,5%-й р-р неочи- D-PBSA.CMF Большинство постоянных клеточных
на* без других воздействий ние среды щенного трипсина,- обычно 0,25% или цщрат ЛИНИЙ
Предварительное отмывание 1 трипсиннзацисй D-PBSA 0.25%-й р-р неочищенно- го трипсина D-PBSA Некоторые сильно адгезирующие пос- тоянные клеточные линии и многие быстрорастущие часю пересеваемые культуры
Предварительное отмывание 1 трипсиннзацисй 1 mM EDTA в D-PBSA 0.25%-й р-р неочищенно- го трипсина D-PBSA Сильно адгезирующие часто пересева- емые культуры
Предварительное 1 юМ EDTA 0.25%-й р-р неочищенно- D-PBSA т Многие эиителиальныс клетки, нско-
«лмыванцс с трииспни зацней в D-PBSA го трипсина 1 шМ EDTA торыс могут быть чувствительны к ЭДТА, в этом случае используется EGTA
Триксин-ь колла- 1 пМ EDTA 0.25%-й р-р неочищенно- D-PBSA + Плотные культуры и монос.тои, в т.ч. с
геназа в D-PBSA го трипсина, 200 ед./мл неочищенной кшетлагеназы 1 шМ EDTA фибробластами
Дисиаза Нет 0,11,0 мг/мл дисиазы Культуральная среда Удаление эпителия в монослос (не разрушает эпителиальный слой)
Проназа Нет 0,1-1,0 мг/мл приказы Культуральная среда Образование качественной суспензии единичных клеток, может повреж- дать некоторые клетки
ДНКаза D-PBSA или 1 тМ EDTA в D-PBSA 2-10 мкг/мл кристалли- ческой ДНКазы Культуральная среда Использование других диссоциирую- щих агентов, которые повреждают клетки и способствуют высвобож- дению ДНК
* Пищеварительный фермент, поставляемый различными компаниями (Difeo. Worthington, Roche, Sigma) в различной степени
очистки Грубая очистка Difeo trypsin, 1:250. или Worthington CLgradc collagenase, содержит дру! не протеазы, которые могут
быть полезны при диссоциации некоторых клеток, но также могут быть токсичны для дру! их клеток.
Начните с грубой обработки и затем при необходимости проведите более тонкую обработку. Более тонкая обработка часто
связана с использованием более низких концентраций (мкг/мл), что связанос высокой специфичностью действия агентов (для
ферментов ед г). Очищенный трипсин при 4 °C рекомендуется для клеток, выращенных при низкой концентрации сыворотки
или в ее отсутствие [McKeehau, 1977]. и обычно считается более подходящим методом Может быть, необходимо ировссти
предварительную проверку партии, аналогично проверке качества сыворотки
3) Время, прошедшее с последнего субкультивиро-
нания. Рутинное субкультииирование наилучшим
образом проводится но строгому расписанию так,
чтобы воспроизведение культуры было качествен-
ным и контролируемым. Если клетки при этом не
достигают достаточно высокой плотности (т. е не
достш ают стадии конфлюэнтного монослоя) за со-
ответствующее время, то следует повысить концен-
трацию клеток при посеве. Если же они достигают
конфлюэнтности сл шиком быстро, то концентрацию
клеток при посеве следует уменьшить. Как только
установлен стандартный режим субкультивнро-
вания, то при данной постоянной концентрации
клеток при посеве иериодически повторяющийся
рост клеток должен иметь постоянную периодич-
ность и стабильный клеточный выход. Отклонения
246
ГЛАВА 13. СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
от этси о стандарта будет признаком отклонения от
нормальных условий или ухудшения состояния
клеток. В идеале следует найти такую клеточную
концентрацию, которая позволит проводить суб-
культивирование через 7 дней, со сменой среды
через 3—4 дня после субкультивирования.
4) Требования к другим процедурам. Koi да клетки
требуются для каких-то конкретных целей, отличных
от стандартного режима поддержания культуры, то
также требуется субкультивирование для того, что-
бы повысить выход культуры или изменить форму
культурального сосуда или тип среды. В идеале эта
процедура должна быть выполнена в обычное вре-
мя субкультивирования, т ел да будет известно, что
культура была выращена в стандартном режиме,
при известных условиях пересева и при ожидаемых
результатах культивирования. Тем не менее требо-
вание в отношении получаемых клеток не все1да
совпадает с установленным режимом их ведения,
поэтому следует искать компромисс. Однако в
любом случае 1) клетки не должны быть субкуль-
тивированы в lag периоде и 2) клетки все1 да следует
отбирать в промежутке времени между серединой
log-фазы и временем, koi да они вход ят в фазу цлато
предыдущего субкультивирования (если только нет
специальных требований к получению клеток, нахо-
дящихся на стадии плато; в этом случае потребуется
частая смена среды пли постоянная перфузия).
Манипуляции с различными клеточными линия-
ми. Манипуляции с различными клеточными линиями
должны проводиться отдельно, с различными наборами
сред и peai ентов. Если они все должны осуществлять-
ся в одно и то же время, то существует значительный
риск перекрестной контаминации. В частности, если
клетки относятся к быстрорастущим клеточным ли-
ниям, таким как HeLa, то их культивирование должно
вестись строго отдельно От медленно растущих линий
(см. разд. 19.5).
Типичный протокол субкулътивирования для кле-
ток, растущих в монослое. Протокол 13.2 описывает
трицсинизацию монослоя (рис 13.3, цв. вкладки 7—12)
после предварительной промывки в ЭДТА, для удале-
ния следовых количеств среды, двухвалентных катионов
и сыворотки (если она использовалась). Эту процедуру
можно проводить и без иромывки, либо только исполь-
зуя D-PBSA в качестве промывочного раствора, добав-
ляя 1 мМ ЭДТА в раствор трипсина, если это требуется,
в зависимости от тика клеток (см. табл. 1.3.4)-
Количество материалов, приведенное в протоколе,
относится к упражнению 13 из i л. 2, но оно может быть
изменено но потребности.
Поскольку расширение воздуха в пластиковых фла-
конах может вызвать набухание флаконов и нарушение
их горизонтального положения, давление воздуха во
флаконах должно быть снижено ослаблением крышек
через 30 мин после помещения флаконов в инкубатор.
Альтернативным решением лтой проблемы является
сдавливание флаконов сверху и снизу при навора-
чиванни крышки (будьте аккуратны, чтобы не сжать
ПРОТОКОЛ 13.2. Субкультивирование
монослойной культуры клеток
Схема
Удалить среду. Подвер!нуть клетки кратковремен-
ному действию трипсина. Инкубировать клетки Раз-
вести клетки в среде. Подсчитать клетки. Развести и
пересеять субкультуру.
Материалы
Стерильные:
• Клетки культуры А549, 7 дней и 14 дней пос-
ле пересева в 2х10'кл./мл, во флаконах 25см2
...................... но 1 каждой культуры
• WI-38, MRC-5, пли эквивалентная культура
нормальных диплоидных фибцюбластов 7 дней
и 14 дней после посева во флаконах 25см2
........................но 1 каждой культуры
• Ростовая питательная среда, например 1. МЕМ
с солями lit ла, 23 тМ НСО (, без антибиотиков
......................................100 мл
* Трипсин, 0.25% в D-PBSA (см. табл. 13.4)..1О мл
D-PBSA с 1 mM EDTA..................20 мл
’ Пииегки, градуированные и заткнутые пробками.
Если цицетки стеклянные, то в ассортименте
размеров 1 мл, 5 мл, 10 мл, 25 мл, в квадратном пе-
нале для пипеток. Пластмассовые иииетки могут
быть индивидуально обернуты и рассортированы
по размерам на подносе
• Пииегки без пробок для удаления среды, если
имеются перистальтический насос или вакуум-
ная линия.
• Универсальные контейнеры или 50-мл центри-
фужные пробирки..........................4
• Культуральные флаконы, 25 см2.........8
Нестерильные.
• Пппетирующее устройство или ipyiua (см.
рис. 5.5,6.6)
• Шлангтрубки на приемник, связанный с вакуум-
ной линией или перистальтическим насосом
Шлан1, соединяющий принимающий сосуд с ва-
куумной линией или перистальтическим насосом
(см. рис. 5.1—5.3)
• Этанол 70%, в распыляющей бутылке
Безворсовые салфетки или тампоны для протирки
Абсорбирующие бумажные полотенца
• Цилиндр для пинеток, содержащий воду и дезин-
фектант (см. разд. 5.8.8,7.8.5)
• Ручка-маркер с этанол-нерастворимыми черни-
лами
Записная книжка, ручка, протоколы и т.д.
• Гемоцитометр или электронная счетчик клеток
Протокол
1. Подготовьте ламинарный шкаф, принесит е реак-
тивы н материалы, необходимые для выполнения
процедуры (см. разд 6.5).
13.7. Субкультура
247
2. Тщательно исследуйте культуру на признаки
ухудшения или заражения (см. рис. 13.1.19.1).
3. Проверьте предварительно описанные критерии
(см. разд. 13.7.1) и на основании наших знаний
поведения культуры решите, проводить ли
субкультивиривание. (Тем, кто выполняет уп-
ражнение 13, нужно сделать записи о плотности
культуры, состоянии клеток, например наличии
митозов, многослойности, ухудшения состояния
клеток.) Если требуется субкультивирование,
действуйте следующим образом:
4. Перенесите флаконы с культурой в стерильную
рабочую зону, удалите и вылейте среду (см. про-
токол 13.1. шаш 7—9). Произведите манипуляции
с каждой клеточной линией отдельно, повторяя
процедуру, начиная с этою inaia. для каждой
клеточной линии.
5. Добавьте D-PBSA, EDTA для предварительной
промывки (0,2 мл/см2), направляя струю на сто-
рону, противоположную прикрепленным клеткам
так, чтобы избежать смещения клеток, произ-
ведите осторожное полоскание клеток, удалите
раствор. Этот niai предназначен, чтобы удалить
следы сыворотки, которая uhi ибирует действие
трипсина и истощает двухвалентные катионы,
необходимые для прикрепления клеток.
6. Добавьте трипсин (0,1 мл/см2), направляя струю
к стороне флакона, противоположной располо-
жению клеток. Поверните флаконы, положите
их так, чтобы монослой был полностью закрыт
раствором трипсина. Оставьте флаконы в таком
IHLIlCrilllltU и* 1.1—Ли с
7. Поднимите ф^1аконы так, чтобы удалить трипсин
с монослоя, и быстро проверьте, не отделяется ли
монослой от подложки. Использование трипсина
при 4 °C иомо1аетиредотвратиты1реждевремен-
ное отделение.
8. Удалите раствор, оставив несколько капель трии-
9. Инкубируйте флаконы в таком положении,
чтобы клетки находились горизонтально до тех
пор, пока клетки не ошарятся (рис. 13.3,13.4, цв.
вкладка 5); затем при наклоне флакона монослой
должен скользить вниз ио поверхности (Эго
обычно происходит после 5—15 мин инкубиро-
вания.) Не оставляйте флаконы дольше, чем
необходимо, но, с друюп стороны, не заставляйте
клетки отделяться прежде, чем они готовы это
сделать. Старайтесь, чтобы не образовывались |
комки.
Примечание. В каждом случае 1лавный дис
социирующий агент, трипсин или EDTA, при-
сутствует только кратковременно, и инкубация
выполняется в его небольшом объеме, после тоге
как большая часть агента была удалена. Если вы
столкнетесь с трудностью в отделении и диссо-
циации клеток, впоследствии при иодютовке
суспензии единичных клеток, вы можете исполь-
зовать альтернативные процедуры (см. табл. 13.4). |
10. Добавьте среду (0,1 0,2 мл/см2) и смойте клетки |
повторным пикетированием ио поверхности мо-
Инкубирование 37 °C в течение 7 дней
Клетки
ресуспендированы в
Конфлюэнтный монослой, растущий во
флаконе приблизительно через одну неделю
Ошаривание клеток после инкубирования
Рис. 13.3. Субкультивирование монослоя. Стадии в субкулыивприваннн и цикле pocia клеток монослоя после триисиниза-
ции (см также цв вкладки 4,5)
248
ГЛАВА 13. СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
11 Наконец, пикетируйте клеточную суспензию
вверх и вниз несколько раз с таким положе-
нием наконечника, ири котором не создается
иена. Примите во внимание, что угол наклона
иииетки может изменяться от одной клеточной
линии к другом: некоторые клеточные линии
диссоциируют ле1Ко, тогда как друте требуют
энершчного пикетирования. Почти все клетки
мшут претерпеть механическое повреждение,
если пипетирование ведется слишком энер! ично.
Первичные субкультуры и культуры с ранним
сроком пересева особенно склонны к поврежде-
нию, частично из-за их большей недолговечности
и частично из-за их большего размера. Постоян-
ные клеточные линии обычно более эластичны и
требуют энер! ичного пииетирования для полной
диза! 1 peiации. Обычно несколько движении
вверх-вниз достаточно для образования суспен-
зии единичных клеток. Если этот uiai затруднен,
примените более агрессивный диссоциирующий
а1ент (см. табл. 13.4). Желательно получение
суспензии единичных клеток при субкультивиро-
вании, если вы хотите обеспечить точный подсчет
клеток и стандартизовать условия клеточного
роста. Однородность и гомо<енность суспен-
зии отдельных клеток существенна также, если
проводится количественная оценка клеточного
деления или эффективности косев, а также если
11редиола1ается изоляция клеток для цостедую-
шего формирования клона.
12. Подсчитайте клетки ири помощи гемоцитометра
или электронного счетчика клеюк (см.разд. 21.1),
запишите полученные данные.
13. Разведите суспензию клеток до соответствующей
выбранной концентрации:
а) добавляя соответствующий объем клеточной
суспензии к предварительно отмеренному
объему среды в культуральном сосуде.
б) раст воряя клетки в полном объеме требуемым
объемом среды в нескольких флаконах.
Процедура (а) полезна для обычного субкуль-
тивирования, koi да используется только несколько
флаконов и точное количество клеток и воспроиз-
водимость не являются необходимыми. Процедура
(б^ире.шочтительна. koi и производится несколько
копий, потому что общее количество манипуляций
уменьшается и концентрация клеток в каждом фла-
коне будет идентична. Для выполнения упражне-
ния 13 используют процедуру (б): развести клетки
из каждого флакона до концентрации 2x10* кл./в мл
в 20 мл среды и иосея гь но 5 мл из каждой суспензии
в два флакона.
14. Если клетки культивируются при повышенном
содержании СО2 (ири использовании среды
МЕМ Игла с солями Эрла и 23 шМ NaHCO-,,
как указано в списке материалов), заполните
ia.ioM флакон, внося 1азовую смесь необходимого
состава (в данном случае 5% СО,) из цилиндра
с предварительно образованной газовой смесью
или из 1 азового смесителя, через фильтр, встро-
енный в линию. Газ вносится во флакон так,
чтобы заполнить его выше среды (см. рис. 6.11),
без образования пузырей в среде, поскольку обра-
зование пузырей может привести к денатурации
некоторых компонентов среды и увеличению
риска за1рязнения. Если нормальная газовая
фаза является воздушной, как с М ЕМ Игла с со-
лями Хэнкса (см. протокол 1.3.1). этот uiai можно
опустить.
15 Закройте флакон, поместите в инкубатор. При-
близительно через 1 ч проверьте pH. Если в сре-
де с воздушной 1азовой фаюй pH повышается,
верните флаконы в стерильную рабочую зону и
кратковременно (1 -2 с) подавайте газ с повышен-
ным содержанием (5%) СО2. Поскольку каждая
культура будет вести себя аналошчно в одной и
той же среде, вы. в конечном счете, будет знать,
какие клетки нуждаются в добавлении ia.«a после
пересева Если pH в среде повышается, koi да ia-
зовая 4>аза содержит 5% СО2 (как в этом случае),
увеличьте концентрацию СО, до 7% или 10% или
добавьте стерильный раствор 0,1 N HCL.
16. Повторите эту процедуру начиная с четвертого
шага для следующей клеточной линии.
Примечание. Процедура в шаге 15 не должна
стать долгосрочным решением проблемы снижения
высоко! о pH после субкультивирования. Если про-
блема сохраняется, то уменьшите pH среды во время
ее составления, и проверьте pH среды в инкубаторе
или во флаконе, заполненном 1азом.
слишком сильно и не разломать флакон) При инку-
бации происходит расширение 1аза, и форма флакона
восстанавливается
13.7.2. Цикл роста и индекс разведения
Рутинное субкультивирование приводит к повторению
стандартного цикла клеточного роста (рис. 13.4«, а так-
же рис. 13.2). Очень важно хорошо знать этот цикл для
каждого типа клеток, с которыми вы работаете, вклю-
чая посевную дозу, продолжительность периода роста
до субкультивирования, продолжительность времени
эксперимента и соответствующее время для взятия
образцов, которые дают самую высокую плотность.
Клетки, находящиеся в различных фазах цикла роста,
ведут себя различным образом в отношении клеточ-
ного деления, ферментативной активности, гликолиза
и дыхания, синтеза специальных продуктов и мношх
дру1 их свойств (см. разд. 21.9.4,25.1.1).
13.7. Субкультура
249
Дни
Рис. 13.4. Серийное субкультивирование (о) Повторение
стандартиого цикле роста в ходе ведения клеточной линии
сели клетки растут правильно, они должны достигать одной
и том же конечной концентраигнг (пики) после одного и того
же времени при каждом цикле, если посевная концентрация
(линия деления на секции) и интервал времени между суб-
культивированиями остаются постоянными (/>) Количество
генераций и пассажей каждая субкультура представляет со
бой один пассаж, но количество генераций (в данном случае
3 генерации на один пассаж) зависит от индекса разведения
(8 на 3 удвоения на пассаж)
Для конечных Клеточных линий удобно уменьшить
концентрацию клеток в субкультуре разведением в 2,
4, 8 и 16 раз (т.е. индекс разведения будет, соответ-
ственно, 2, 4, 8 и 16), что облег чает подсчет югеток и
Определение периода удвоения популяции (т.е. соот-
ветственно индекс разведения 2 относится к первому
удвоению популяции. 4 ко 2-му. 8 — к третьему и
16 — к 4-му); например, культура, разведенная в 8 раз,
требует тройной) удвоения для того, чтобы достигнуть
той же клеточной плотности, что исходная (рггс. 13,
146). Нежные или медленно растущие клеточные ли-
нии следует также разводить в отношении 1:2, в то вре-
мя как сильные, быстро растущие культуры могут быть
разведены в отношении 1.16, а постоянные клеточные
линии даже в отношении 1:50 или 1:100. Как только
клеточная линия становится постоянной (обычно что
происходит после 150 или 200 генераций), клеточная
концентрация становится главным параметром, кото-
рый определяет ггоддержание культуры гг требует суб-
культггвирования при достижении 10*или Ю’кл.бил.
Индекс разведения, или титр, также выбирается так,
чтобы установить удобный постоянный период между
субкультивированием, возможно 1 или 2 недели, а
также чтобы быть уверенными, что 1) клетки не разве-
дены ниже того ггредела, который позволяет цм снова
войти в цикл роста в течение lag-периода приемлемой
продолжительности (24 ч или менее), гг 2) не выходят
на гглато до следующего субкультивирования.
При первом манипулировании с клеточной линией
либо когда вы проводите начальный пассаж культуры,
опыт работы с которой у вас незначи гелен, при первой
попытке будет полезно провести субкультивирова-
ние клеток с индексом разведения 2 или 4, записав
концентрации клеток. которые вы ггспользовали. При
наличии большего опыта и ггри постоянной работе с
данной клеточной линией в вашей лаборатории, воз-
можно, вы повысите индекс разведения, т.е. снизите
концентрацию клеток, после субкультивггрования, но
всегда сохраняйте один флакон с низким индексом
разведения, ггри попытке снизить индекс разведения
остальной культуры.
Даже когда индекс разведения используется для
определения посевной концентрации в субкультуре,
количество клеток на флакон должно быть записано
ггосле трипсинизации гг при пересеве, так чтобы оце-
нить скорость роста в каждой субкультуре гг контроли-
ровать концентрацию клеток (см. протокол 21.7—21.9).
В противном случае, небольшие отклонения не будут
обнаружены ггри нескольких пассажах.
13.7.3. Концентрация клеток
в субкультуре
Идеальным методом для определения правильной
концентрации клеток ггри пересеве является состав-
ление кривой роста ггри различных посевных концент-
рациях (см. протоколы 21.7—21.9). Таким образом,
можно определить минимальную концентрацию,
ггри которой длительность lag-периода минимальна,
и культура быстро входит в фазу быстрою лог ариф-
мического роста (т.е. период удвоения популяции
короткий), но ггри этом вершина экспоненциальной
фазы достигается во время, удобное для следующею
субкультивирования.
Как правило, большинство постоянных клеточных
линий субкультивируются удовлетворительно при
посевной концентрации между 1x10’ и 5x10* кл., мл,
конечная клеточная линия фибробластов примерно
ггри такой же концентрации, большинство нежных
культур, таких как эндотелиальные и некоторые эпите-
лиальные культуры с ранними сроками пересева — ггри
концентрации 1x10s кл./мл. Для новой культуры начи-
найте с высокой посевной концентрации и постепенно
снижайте ее до тех пор, пока не получите удобный
для вас клеточный цикл без признаков ухудшения
состояния клеток.
250
ГЛАВА 13. СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
13.7.4. Культивирование в суспензии
Протокол 13.2. относится к субкулыивггроваггию 1! мо-
нослое, поскольку большинстно первичных культур и
клеточных линий растут таким образом. Тем не менее
существуют клетки, которые растут постоянно в сус-
пензии, поскольку они ненрикреиляемые (большинство
культур лейкемии или асцитных опухолей мышей), по-
скольку они удерживаются в виде суспензии при помо-
щи механических устройств, либо они селекционирова-
ны как суспензионные. В этом случае их можно растить
и поддерживать как культуру бактерий или дрожжей.
Суспензионные культуры имеют ряд преимуществ
(табл. 13.5); например, не 1ребуется воздействие трипси-
на, поэтому субкультивирование проводится быстрее и
лег че (см. также разд. 26.1). Замещение среды (питание)
в суспензионных культурах обычно не производится,
вместо этою кудьтуру разводят и распространяют,
разводят и выбрасывают ненужную часть, или часть
клеточной суспензии изымается и остаток разводится
до соответствующей посевной концентрации. В каждом
случае цикл роста, который получается в результате,
подобен тому, что существует в монослойной культуре,
но обычно имеет более короткий lag-период.
Клетки, которые спонтанно растут в суспензии,
могут поддерживаться в обычных культуральных фла-
конах, которые не должны обрабатываться каким-то
особенным образом (но, конечно, должны быть стериль-
ны). Правила глубины слоя среды такие же, что и для
монослойной культуры — т.е. 2-5 мм для осуществле-
ния 1 азообмена. Когда объем суспензионной культуры
повышается, например мри разрастании культуры, то
среда должна взбалтываться, что наилучшим обра-
зом достит ается путем использования ротационною
Таблица 13.5. Сравнительная характеристика
монослойной и суспензионной культур
Монослой
Требования к культуре:
Регулярное техническое обслу-
живание
Пересев с трццсннизацией
Роет ограничен площадью поверх-
ности
Особенности культивирования:
Контактное ин] ибирование
Клеточное взаимодействие
Диффузионный граничный слой
Используется для:
Цитологии
Изучение митотической актив-
ности клегок
Экстракции in situ
Применимо к:
Большпнст ну г гигов клеток, вклю-
чая первичные культуры
Суспензия
Стационарное состоя-
Развсденис
Рост ограничен объемом
(газообмен)
Гомогенная суспензия
Получение большого
количества клеток
Получение партии клеиж,
находящихся в митозе
Постоянное получение
продукта
Только трансформиро-
ванным клеткам
магнитного маятника, с помещением культурального
сосуда на маг нитной мешалке (см. рис. 13.5, см. также
рис. 26.1). Роллер-флаконы, вращающиеся на подстав-
ке, также могут быть нсиользованы для взбалтывания
суспензионной культуры (см. табл. 8.1 и рис. 26.11).
13.7.5. Субкультураклеток,
растущих в суспензии
Протокол 13.3. описывает рутинную процедуру суб-
культивирования суспензионной Культуры в свежий
сосуд. Постоянная культура может вестись в одном и
том же сосуде, но возможность контаминации посте-
пенно возрастает при накоплении небольших разбрыз-
т иваний на горлышке флакона г три разведении. Крите-
рии для субкультивирования аналог ичны таковым для
монослойной культуры.
1) клеточная концентрация, которая для большин-
ства суспензионных культур не должна превышать
1х10<!кл./мл.
2) pH, которая связана с клеточной концентрацией и
понижается при повышении концентрации клегок.
3) Время после последнего субкультивирования, ко-
торое, как и для монослоя, должно соответствовать
постоянному графику
Рис. 13.5. Перемешиваемая культура. Небольшой мешалоч-
ный флакон, разработанный Technc, объемом 250—1000 мл.
Клеточная суспензия перемешивается маятником, который
вращается в кольцеобразном вдавленном пространстве в
основании сосуда
13.7. Субкультура
251
4) Требовании к полученным клеткам для экспери-
ментальных и иных целей.
Протокол 13.3. разработан для использования в
упражнении 121л. 2. Клеточные линии, культуральные
сосуды и дру1 ие параметры могут быть заменены для
того, чтобы соответствовать тем линиям, с которыми
вы работаете.
ПРОТОКОЛ 13.3. Субкультивирование
суспензионной культуры клеток
Схема
Отобрать образец суспензии клеток, подсчитать
клетки и пересеять соответствующий объем кле-
точной суспензии в свежую среду в новом флаконе,
восстанавливая концентрацию клеток до первона-
чального уровня.
Материалы
Стерильные:
• Исходная культура: HL-60, L1210, или Р388,
7 дней и 10 дней после посева в концентрациях
1х10*кл.. мл, во флаконах объемом 25-см2
.................................по 1 каждой
• Среда рос товая, например М ЕМ с солями Спин-
нера (S-М ЕМ) или RPMI 1640, с 23 шМ NaHCO3,
сыворотка теленка 5%.................200 мл
• Градуированные иииетки с ватными пробками.
Если пипетки стеклянные, то в ассортименте раз-
меров 1 мл,5 мл, 10 мл,25 мл в квадратном пенале
для пииеток. Пластмассовые пипетки мшут быть
индивидуально обернуты и рассортированы ио
размерам на подносе
• Пипетка без пробки для отборасреды при помощи
перистальтического насоса или вакуумной линии,
если таковые имеются.................1 пенал
• Универсальные контейнеры или центрифужные
пробирки объемом 50 мл...................4
• Мешалочные флаконы объемом 500 мл с Mai нит-
ным маятником-мешалкой (Tecline, Bellco)..2
• Флаконы для культивирования 5 см2......4
Нестерильные:
• Пппетирующее устройство или груша (см.
рис. 5.5,6.6)
• Шлаш, соединяющий принимающий сосуд с ва-
куумной линией пли перистальтическим насосом
(см. рис. 5.1 -5.3)
• Этанол 70%, в распыляющей бутылке
• Безворсовые салфетки или тампоны для протирки
• Абсорбирующие бумажные полотенца
• Цилиндр для пииеток, содержащий воду и дезин-
фектант (см. разд. 5.8.8, 7.8.5)
• Ручка-маркер с этанол-нерастворпмыми черни-
лами
• Записная книжка, ручка, протоколы, и т.д.
• Гемоцитометр или электронный счетчик клеток
• Mai нитная мешалка
Суспензионная культура имеет ряд преимуществ
(см. табл. 13.5). Во-первых, продукция и получение
конечного выхода большого количества клеток может
быть достш нута без увеличения площади поверхности
субстрата (см. разд. 26.1). Кроме того, если разведение
культуры постоянно и концентрация клеток сохраня-
ется также постоянной, то может быть достш нуто ста-
Протокол
1. Подготовьте ламинарный шкаф, принесите реак-
тивы и материалы, необходимые для выполнения |
процедуры, (см. разд. 6.5).
2. Тщательно исследуйте культуру на признаки I
ухудшения или заражения. По сравнению с
монослойной культурой этот mai труднее для I
суспензионной культуры, но клетки, которые
находятся в плохом состоянии, характеризуются
уменьшением объема, неправильным строением
и или степенью детализации. Здоровые клетки
должны быть чистыми п прозрачными, с ядром,
видимым в фазовом контрасте; в статической
культуре часто образуют маленькие агрегаты.
3. Перенесите культуры в стерильную рабочую
юну, возьмите из них образцы и подсчитайте в I
образцах количество клеток
4. На основании предварительно описанных кри- '
терпев (см. разд. 13.7.1) и на вашем знании куль-
туры решите, требуется ли субкультивирование. ,
Если требуется (для упражнения 12 потребуется I
субкультура), поступите следующим образом:
5. Перемешайте клеточную суспензию и дисиер! и- I
руйте любые скопления клеток пипетированием |
клеточной суспензии вверх и вниз. .
6. Добавьте 50 мл среды в каждый мешалочный |
флакон.
7. Добавьте 5 мл среды в каждый из четырех |
25-см’ флаконов.
8. Добавьте достаточное количество клеток, чтобы
получить конечную концентрацию 1х10’кл./мл
для медленно растущих клеток (время удвоения
36—48 ч) или 2х 10' кл. мл для быстрорас гущей
культуры (время удвоения 12 24 ч). Для клеток, .
упоминаемых в материалах, используйте конеч- |
ную концентрацию 1х10* *кл./мл.
9. Заполните флаконы с культурами газом с 5% СО2.
10. Закройте флаконы и поместите в инкубатор. <
Положите флаконы i оризонтально. как в случае
монослойных культур.
11. Закройте крышками мешалочные флаконы и
поставьте на маиштные мешалки при скорости
вращения 50-100 об./ мин в инкубаторе или в
культуральной комнате при 37 °C. Проследите,
чтобы двшатель мешалки не перегревал культу-
ру. Подложите полистироловый коврик, если это
необходимо. Индукционные мешалки производят
меньшее количество тепла и не имеют движущих-
ся частей.
252
ГЛАВА 13. СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
Таблица 13.6. Запись данных. Питание
Дата
Время..
... Оператор.........
Дата
Клеточная линия Обозначение
Первичная культура или субкультура
Номер генерации или пассажа
Состояние Фаза ромового цикла
Внешний вид клеток
Плотность клеток
pH среды (примерно)
Прозрачность среды
Среда Тип
№ партии
Тип и концентрация сыворотки
№ партии
ДрУ1 ие добавки
Концсн। рация СО2
Другие параметры
Пильное состояние культуры, я то время как стабильное
состояние и монослойной культуре практически недо-
стижимо. Ведение монослойной культуры, по существу,
циклично, в результате чего темп роста и метаболизма
варьирует, в зависимости от фазы цикла роста.
13.7.6. Стандартизация условий
культивирования
Стандартизация условий культивирования— су-
щественный фактор получения фенотипической
стабильности клеток. Хотя некоторые условия могут
меняться в зависимости от требований эксперимента,
обстоятельств и технилос ии, однако рутинное ведение
культуры должно придерживаться определенных стан-
дартных условий.
Среда .Тик используемой среды оказывает вл ияние
на селекцию различных типов клеток и регулирует их
фенотипические признаки (см. разд. 9.6,10.2.1,10.2.2.,
17.2, 17.7). Следовательно, как только выбрана среда,
следует стандартизовать ее употребление, желательно
от одного поставщика, если среду приобретают ютовой
к употреблению
Сыворотка. Наилучшим методом элиминации
различий, связанных с сывороткой, является исполь-
зование бессывороточных сред (см. разд. 10.2), хотя, к
сожалению, бессывороточные рецептуры разработаны
не для всех типов клеток. Кроме того, переход на бессы-
вороточные среды потребует затрат времени и средств.
Составляющие элементы сыворотки (см. разд. 10.5.2)
мо|ут позволить получить более высокую концентра-
цию клеток и обычно дешевле, чем сама сыворотка или
факторы роста, используемые как добавки, но не могут
обеспечить тот контроль над физиоло]ическпм окру-
жением, который предоставляют бессывороточные сре-
ды. Если требуется сыворотка, выберите партию (см.
разд. 9.6.1) и используйте эту партию на всех стадиях
поддержания культуры, включая криоконсервацию
(см. разд. 20.2)
Пластик. Большинство из ведущих марок культу-
ральных флаконов и чашек позволяют получить сход-
ные результаты, однако мО|ут быть незначительные
различия при использовании пластикового оборудова-
ния различных компании (см. разд. 8.1.2). Следователь-
но, предпочтительно придерживаться какой-то одной
компании, а также одного типа чашек и флаконов.
Ведение клеточной линии. Клеточная линия мо-
жет изменить свои характеристики, если ведение ее
отличается от стандартною режима (см. разд. 13.6).
Режим поддержания должен быть оптимизирован (см.
разд. 13.7) и затем оставаться постоянным в ходе всех
манипуляций с клеточной линией (см. разд. 13.7.1,
13.7.2, 13.7.3). Культуры следует также заменять раз-
мораживанием рабочих культур (см. разд. 20.4.2)
13.7.7. Использование антибиотиков
Постоянное использование антибиотиков способствует
случайной контаминации, в частности микоплазмами,
и развитию антибиотикоустойчивых организмов (см.
разд. 9.4.7). Антибиотики также moi ут влиять на ис-
следуемые клеточные процессы. Тем не менее могут
быть обстоятельства, для которых контаминация очень
распространена либо ведутся очень дорогостоящие
13.7. Субкультура
253
Таблица 13.7. Запись данных Субкультивирование
Дата............. Бремя
. Оператор......
Дата
Клеточная линия Обозначение
пассажа или генерации
Состояние до субкультивиро- вания Фаза клеточного рос юного цикла
Внешний вид клеюк
Плотность клеток
pH среды (примерно)
Прозрачность
Диссоциирующий агент Предварительная отмывка
Трипсин
EDTA
Apvi ие
Механическое воздействие
Подсчет клеток Концентрация после рсзуспсндпрова- ННЯ (С[)
Объем (V,)
Выход клеток (Y-CpcV,)
Выход на ф.вакон
Посев Номер (N) и пш сосуда (флакон, чаш- ка, многолуночный планшет)
Конечная концентрация (Сг)
Объем на флакон, чашку или лунку (VF)
Коэффнциен г дробления (Y CrxVrxN) или количество засеян- ных флаконов / количество трипси- низнрованных флаконов, если все флаконы одного размера
Среда/сыворотка Тип
№ парши
Тип и концентрация сыворотки
.be пар гни
Дру । нс добавки
Концентрация СО,
Матричное вещество Например, фибронектин, Matrigel, коллаген
Другие параметры
клеточные линии, и в этих случаях мтут использо-
ваться антибиотики. Б этом случае важно поддержи-
вать несколько рабочих культур без антибиотиков
для тою, чтобы выявить случайное заражение; эти
рабочие культуры мтут вестись параллельно, и мож-
но чередовать периоды введения различных культур
без антибиотиков (см. рис. 13.6), до тех пор пока не
станет возможным постоянное ведение культур без
антибиотиков. Нецелесообразно усваивать этот метод
как постоянно используемый режим, и при наличии
хронической контаминации клетки должны быть унич-
тожены или заражение ликвидировано.
13.7.8. Ведение документации
Записывайте все детали ведения культур, включая
питание и субкультивирование (табл. 13.6, 13.7), а
также все отклонения или внесенные изменения,
которые производились в режиме поддержания кле-
точной линии. Бее эти моменты должны быть внесены
в базу данных. Такие записи требуются но правилам
GLP (Food and Drug Administration, 1992; Department
of Health and Social Security, 1986; Organisation for
Economic Co-operation and Development, 2004) для
первичных культур (см. разд. 12.3.11), но полезно
ГЛАВА 13. СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
С антибиотиками Без антибиотиков
Кулыу-
Культу-
раВ
Недели
Используйте свободные от антибиотика культуры
для экспериментов, криоконсервации и проверки на
наличие микоплазмы Экспериментальная культура
может содержать антибиотики до тех пор, пока из-
вестно, что они не нарушают изучаемых процессов.
Рис. 13.6. Параллельные культуры и антибиотики. Пред-
ложенная схема для поддержания параллельных культур
клеток с антибиотиками и без так, что ка-кдая культура всегда
выращивался некоторое врем» в отсутствии антибиотиков
ввести это в лабораторную практику в отношении
всех культур в любой лаборатории. Если определены
стандарты ведения культур, то записи могут быть
ограничены пометкой «питание* или «субкульти-
вирование» с датой и маркировкой линии. Любые
комментарии относительно визуального анализа, а
также отклонения от стандартного ведения должны
быть записаны.
Весь комплект записей составляет часть ведения
клеточной линии, и все данные, или. по крайней мере,
все основные элементы, т.е. изменение добавок к среде,
клонирование линии, трансфецирование или переход
к бессывороточной среде, должны быть внесены в базу
данных.
-
I
с
ё
т.
=
I
X
rt
X
КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ
256
ГЛАВА 14. КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ
считывать на то, что дочерние клетки не отрываются от
колонии при их образовании. Даже при монослойном
клонировании некоторые клеточные линии, такие как
HeLa-S3 и СНО, слабо прикреплены и клетки мотут
отсоединяться от колоний и образовывать дочерние
колонии, которые мот ут привести к неверной оценке
эффективности посева. Этот фактор можно миними-
зировать путем клонирования в МЦ без подложки,
позволив клеткам оседать на пластиковую поверхность
роста. Гематопоэтические клетки обычно клонируют
в суспензии; в зависимости от используемых клеток
и факторов роста колонии продуцируют in vivo и in
vitro недифференцированные клетки с высокой эф-
фективностью репоиуляции, либо они мо1ут дозреть
до колоний дифференцированных гематопоэтических
клеток с очень низкой эффективностью репоиуляции.
Клонирование гематопоэтических клеток становится
способом исследования репродуктивного потенциала
и идентичности стволовых клеток.
В связи с трансформированным состоянием, пос-
тоянные клеточные линии обычно имеют высокую
эффективность посева в монослое и суспензии, в то
время как нормальные клетки, которые moi ут иметь
умеренную эффективность клонирования в монос toe,
имеют очень низкую эффективность клонирования
в суспензии из-за их потребности в прикреплении к
субстрату и распластывании до начала вхождения в
клеточный пролиферативный цикл. Это различие поз-
воляет использовать метод клонирования в суспензии
в качестве изучения наличия и степени трансформации
клеток (см. разд. 18.5.1).
Клонирование с разведением [Puck & Marcus, 1955]
является методом, который используется наиболее
широко. Оно основано на том наблюдении, что клетки,
разведенные до определенной плотности, формируют
отдельные колонии. Количественные данные и инс-
трукции, приведенные в протоколе 14.1, соответствуют
упражнению 20, однако мотут варьировать в зависи-
мости от индивидуальных потребностей.
ПРОТОКОЛ 14.1. Клонирование
с разведением
Схема
Посеять клетки при низкой плотности и инкубиро-
вать до формирования колоний. Окрасить клетки
(для оиенки эффективности иосева и исследования
выживания; см. цв. вкладку 6а, d) или изолировать
их, и размножьте в клеточный штамм, если их ис-
пользуют для селекции (рис. 14.2)
Материалы
Стерильные или асептически подготовленные.
• Клетки СНО с поздней log-фазой, во флаконе
25-е ш2
• Среда Хэма F12, в состоянии равновесии 5ио СО',
10% FBS............................ 250 мл
• Трштсии, 0,25%, 1:250, или эквивалент.10 мл
• Пинетки, 1,5,10, и 25 мл по 10 шт
каждого объема
• Чашки Петри, 6 см, 1 упаковка.........20 шт
• Пробирки, или универсальные контейнеры, для
разведения...........................4 12 шт
• (число зависит от заключительного шага)
Нестерильные.
• Гемоцитометр или электронный счетчик клеток
Протокол
1. Трипсинизнруйте клетки (см. протокол 13.2),
чтобы получить суспензию единичных клеток.
При недостаточной тринсинизации мотут остать-
ся агрегаты клеток, избыточная триисинизация
уменьшит жизнеспособность клеток, однако
фундаментальным положением для обеспечения
клонирования является требование разведения
суспензии до единичных клеток. При проведе-
нии клонирования новой линии клеток впервые
может быть необходимо опробовать различные
режимы тринсинизации - продолжительности
и различных рецептов (см. табл. 13.4), чтобы оп-
ределить оптимальный режим, обеспечивающий
максимальную эффективность иосева.
2 В то время как клетки трипсттнизируются, прону-
меруйте чашки (со стороны дна) и отмеряйте среду
для разведения растворения Может потребоваться
уменьшить регулярный монослой для достижения
концентрации, подходящей для клонирования.
3. Кот да клетки приняли сферическую ф>орму и
начали отделяться, разведите монослой в 5 мл
среды, содержащей сыворотку или ингибитор
трипсина.
4. Подсчитайте клетки и разведите клеточную
суспензию до концентрации 1x10skji. /мл, затем
до концентрации, которая даст примерно 50 ко-
лоний на чашке Петри (см. табл. 14.1).
Для СНО-К1 это составит ~ 10 кл./мл, и разве-
дение будет состоять из следующих шагов:
а) Разведите суспензию до 1 х 10 ’кл мл (прибли-
зительно 1:10 или 1:20, в зависимости от числа
клеток во ф>лаконе).
б) Разведите 200 мкл суспензии 1x10' мл до
20 мл (1:100), чтобы получить 1x10* *кл. мл
в) Разведите 200 мкл суспензии 10*!кл. мл до
20 мл (1.100), чтобы получить 10 кл./мл.
Если вы желаете внести изменения в условия
клонирования, например изменить диапа-
зон концентраций сыворотки, использовать
различные сыворотки или ф>акторы роста, то
подготовьте ряд пробирок в соответствии с ва-
шими планами и добавьте 200 мкл суспензии
клеток 1х103 кл./мл в каждую из пробирок.
При первом клонировании клеток рекомен-
дуемый диапазон д.>1я определения эффектив-
ности посева составляет [0, 20,50,100. 200 и
2000 кл. мл (см. протокол 21.10)
14.2. Стимуляция эффективности посева
257
5 Посейте на 3 чашки Петри ио 5 мл каждой среды,
содержащей клетки, полученной на заключитель-
ной стадии разведения. Является также жела-
тельным произнести посев на чашки суспензии с
концентрацией клеток 2000 кл. мл для контроля
наличия клеток в суспензии, чтобы подтвердить
их присутствие, если не произойдет формирова-
ние клонов ири более низких концентрациях.
6 Поместите чашки в прозрачный пластмассовый
контейнер.
7. Поместите коробку во влажный СО,-пнкубатор
или наполните галим запечатанный контейнер
(2-10% СО2, см. разд. 9.3.2).
8. Оставьте культуры в покое в течение 1 недели.
Если колонии сформировались:
а) Для испытания эффективности посева (см.
также иротокол 21.10) окрасьте и подсчитайте
колонии (см. иротокол 16.3 и цв. вкладку 6).
б) Для клональной селекции изолируйте отдель-
ную колонию (см. иротокол 14.8).
Если нет видимых колоний, замените среду
и продолжите культивирование в течение
следующей недели. Смените среду еще раз
и снова культивируйте их в течение третьей
недели, если необходимее Если колонии не
появляются к 3 неделям, то маловероятно, что
они появятся вообще.
Замена среды. Поскольку плотность клеток при
клонировании очень низкая, необходимость замены
среды культуры на чашках спорна. Замена среды,
главным образом, связана с недостатком питательных
веществ (таких как i лютамин), которые нестабильны, а
также заменой факторов роста, которые разрушаются.
Тем не менее при каждой манипуляции возрастает риск
контаминации, поэтому есть смысл оставить чашки на
две недели без вмешательства и без дополнительного
внесения питательных веществ. Если необходимо оста-
вить чашки на третью неделю, то среда (или, по крайней
мере, ее половина) должна быть заменена.
Преимущественное формирование колоний в
центре чашки может бы гь результатом неправильного
посева как посева клеток в центр чашки, в которой уже
содержится среда, так и образования воронки в чашке,
так что клетки собираются в центре. Однако это может
Таблица 14.1. Связь между посевной плотностью
и эффективность посева
Ожидаемая эффектив- ность посева (%) Оптимальное количество клеток для посева
На мл На см’ На чашку. На чашку,
0.1 1х105 2x103 40 000 100000
1.0 1x10’ 200 4000 10000
10 100 20 400 1000
50 20 4 80 200
100 10 2 10 100
быть также связано с резонансом в инкубаторе (см.
разд. 8.2.5).
Микротитрационные планшеты. Если основной
целью клонирования является выделение колоний,
то иосев на микротитрационные планшеты может
иметь некоторые преимущества (рис. 14.3). При росте
клонов выделение их достаточно лег ко производить,
хотя следует вести постоянный мониторинг посевов
на ранних стадиях, чтобы отметить те лунки, в которых
будут развиваться единичные клоны. Статистическая
вероятность тою, что в лунке будет единичный клон,
может возрастать upu снижении плотности иосева до
такого уровня, чтобы предиолат алось развитие клонов
только в 1 из 5 или 10 лунок на планшете; т.е. в соответ-
ствии с табл. 14.1. ЮОкл./млпри 10% эффективности
иосева дадут 10 колоний /мл, либо 1 колонию цд 0,1 мл.
Если посевную концентрацию снижают до 10 кл , мл,
то теоретически только 1 из 10 лунок будет содержать
колонию, и возможность присутствия более, чем одной
колонии, в одной лунке очень низка.
14.2. СТИМУЛЯЦИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ПОСЕВА
Когда клетки посеяны при низкой посевной концентра-
ции, то степень выживания снижается в большинстве
линий, за несколькими исключениями. Обычно это
не представляет большой проблемы, если речь идет о
постоянных клеточных линиях, для которых эффектив-
ность посева редко падает ниже 10%. но для первичных
культур и конечных клеточных линий эффективность
иосева можег упасть достаточно низко до 0,5-5%
или даже до нуля. Было сделано множество попыток
повышения эффективности посевов, основанных на
том предположении, что клеткам при низкой плотности
требуется большее количество питательных веществ в
связи с их потерей ири утечке через мембраны. Предпо-
лагается также, что cut нальные молекулы, выделяемые
кдеткамп, или факторы кондиционирования, которые
присутствуют в культурах с высокой плотностью, от-
сутствуют либо имеют слишком низкую концентрацию
в культурах с низкой плотностью. Внутриклеточные
метаболиты, выходящие из клеток через мембрану в
плотной суспензии, вскоре достигнут равновесия с
окружающей средой, но для отдельных клеток дости-
жение этого равновесия невозможно. Этот принцип
был положен в основу разработки капиллярного метода
Sanford el al. [ 1948], при помощи которою был получен
клон L-клеток L929. Ограничения объема в капилляре
позволяет клеткам создать локальное микроокружение,
которое напоминает суспензию с высокой концентра-
цией. В микрокапельной технологии, разработанной
позже, клетки были посеяны в микрокапле под жидкий
парафин, что опять же позволяло создавать достаточно
высокую концентрацию клеток, удерживать одну фор-
мирующуюся колонию отдельно от другой и облег чая
иоследующее выделение отдельных клонов. При улуч-
258
ГЛАВА 14. КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ
Оцените для будущих разведений,
если число клеток слишком велико
Сделайте серию разведений от 10
до 200 кл /мл, в зависимости от
ожидаемой эффективности посева
Инкубируйте 1-3 недели, в
зависимости от скорости роста
Рис. 14.2. Клонирование с помощью разведения. Клетки получены из трииешшзированной монослойной культуры. Было
подсчитано число клеток и проведено разведение, достаточное для получения изолированных колонии, Когда колонии сфор-
мированы, они MOtyr быть изолированы (см рис 14 7.14.8). Если выделение не требуется, и клонирование выполняется для
количественного испытания (см. протоколы 21.10.22.3), колонии фиксируются, окрашиваются и подсчитываются (см также
цв вкладку 6а, е)
Окрасьте для подсчета числа колоний
ч для оценки эффективности посева и
j исследования выживания
Макрофотография с окраской по
Гимза, клетки клона HeLa-S3 после -
2 недель культивирования
шении качества среды удались повысить эффектив-
ность посева, поэтому Puck and Marcus [1955] смогли
продемонстрировать, что клонирование клеток при
помощи простои) разведения (как описано в протоко-
ле 14.1) с использованием фидерного слоя облученных
мышиных фибробластов (см. протокол 14.3) позволяет
получить приемлемую эффективность клонирования,
хотя последующее выделение клонов требует трциси-
низации внутри изолирующего кольца, отделяющего
каждую колонию (см. протокол 14.6).
14.2.1. Условия, которые улучшают
клональный рост
1) Среда. Выбирайте богатую среду, такую как среда
Хэма F12 или оптимизированную среду для того
типа клеток, которые вы используете (например,
MCDB ПО [Наш, 1963] д.,1я человеческих фиброб-
ластов. среда Хэма F12 или MCDB 302 для культу-
ры С НО [Наш, 1963, Hamilton & Ham, 1977]) (см.
разд. 9.6,10.5, табл. 10.1,10.2 и <л. 23).
14.2. Стимуляция эффективности посева
259
Отметьте, е каких пунках
Посейте клетки при низкой
плотности, например
10 клЛш в многолуночные
планшеты, 0,1 мл/лунка.
чтобы обеспе'мп,
вероятность присутствия <
1 клетки на лунку
Проверьте очаговый рост
Проверьте наличие роста по
падению pH и визуально с
Выберите подходящие
ячейки, в которых
предполагается
клонирование и
трипсинизируйте
Рис. 14.3. Клонирование в планшетах для микротитрации.
Клетки посеяны в достаточно нткой концентрации, чтобы
получить вероятность концентрации < 1 клетки/лунку, чтобы
в некоторых лунках была лишь 1 клетка, которая может быть
обнаружена визуально при исследовании с помощью микро-
скопа через несколько часов после посева. За теми лунками,
которые от мечены, наблюдайте, и если обнаружится падение
pH, которое указывает на рост колонии, юдшсрдигссс нали-
чие микроскопическим наблюдением. Колонию изолируют
триисинизациеи
2 ) Сыворотка. В тех случаях, koi да требуется сыворот-
ка, обычно лучше использовать фетальную бычью
сыворотку, а не телячью или лошадиную. Выберите
ту партию для экспериментов с клонированием, ко-
торая при испытании дала высокую эффективность
посева.
3) Гормоны. Обнаружено, что концентрации гормонов
1х10-1ОМЕ/мл повышает эффективность посева
некоторых типов клеток [Hamilton & Ham, 1977J.
Растворимый синтетический аналог шдрокорти-
зона, дексаметазон, и концентрации 2,5x10-5М,
10 мкг/мл улучшает эффективность посева миоб-
ластов цыпленка, нормальных 1лиальных клеток
человека, глиомы, фибробластов и меланомы и
повышает клональный рост (размеры колоний),
если через отмыть его через пять дней после иосева.
[Freshney et al., 1980а, Ь]. Обнаружено, что для эпи-
телиальных клеток предпочтительны более низкие
концентрации (наиример, 1x10“' М) (см. разд. 23.2.1,
23.2.4., 23.2.7).
4) Промежуточные метаболиты. Оксо-кислоты
(раньше известные как кето-кислоты) — напри-
мер пируват нли а-оксоглутарат (а-кетоглутарат)
[Griffiths & Pint, 1967; McKeehan & McKeehan, 1979]
и нуклеозиды [а-МЕМ; Stanners et aL, 1971] ис-
пользуются как добавки к среде и все1да включа-
ются в состав бо1атых сред, таких как среда Хэма
F12. Пируват также добавляется в среду И<ла в
модификации Дюльбекко [Dulbecco & Freeman,
1959, Morton, 1970]
5) Двуокись углерода. СО, является существенным
элементом при получении максимальной эффек-
тивности посева для большинства клеток. Хотя
обычно используется 5% СО,, для mhoiих клеток
лучше 2% концентрация, для человеческой 1лии
и фибробластов возможно даже несколько лучше
пониженная концентрация СО,. HEPES (20 мМ)
может использоваться с 2% СО?. что защищает
клетки от колебании pH ирн смене среды и в
случае нарушения работы системы подачи СО2.
Использование 2%-го СО,также снижает расход
аза. Если клетки, наоборот, требуют повышенною
содержания СО,, можно использовать основную
среду И1ла в модификации Дюльбекко (DMEM),
которая обычно находится в равновесии с 10%-й
концентрацией СО,м часто используется для кло-
нирования шбрмдом миеломы для продукции
моноклональных антител. Концентрация бикар-
боната должна бытьсо1ласована с давлением СО,,
если последняя меняется, равновесие достшается
при pH 7,4 (см. табл. 9.1)
6) Обработка субстрата. Пол и лизин улучшает
;>ффективиость посева для человеческих фиброб-
ластов при низких концентрациях сыворотки
[McKeehan & Ham, 1976а] (см. разд. 8.4):
а) Добавьте 1 mi/мл иоли-П-лпзина в UPW в чашках
(-5 мл. 25 см2)
б) Удалите и промойте чашки 5 мл D-PBSA на 25 см2.
Чашки мо1ут быть сразу использованы или поме-
щены на хранение на несколько недель до исполь-
зования.
Фибронектин также улучшает эффективность по-
сева MHOtMx клеток [Barnes and Salo, 1980]. Чашки
мО1ут быть предварительно обработаны 5 mki мл
фибронектина, разведенного в среде.
7) Трипсин. Очищенный (дважды перекристаллизо-
ванный) трипсин, используемый в концентрации
0.05 мкг/мл, предпочтительнее, чем неочищенный
трипсин, но мнения исследователей разделяются.
260
ГЛАВА 14. КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ
McKeehan [1977] отмечал повышение эффектив-
ности иосева ири тринсинизации (с очищенным
трипсином) при температуре 4 °C. Введение реком-
бпнантно! о трипсина TrypZean™ (Sigma), TrypLE™
(GIBCO) также позволяет использовать более
высоко очищенный трипсин неживотного проис-
хождения; Invitrogen утверждает, что TrypLE™
(GIBCO) повышает эффективность посева клеток
А549 (с сывороткой) и MDCK (без сыворотки)
14.2.2. Кондиционированные среды
Среда, которая использовалась для роста друт их кле-
ток, содержит метаболиты, факторы роста и продукты
матрикса, оставшиеся от этих клеток. Такие среды
называются кондиционированными и мотут повышать
:>ффективность посева некоторых клеток, если доба-
вить их в обычные ростовые среды.
ПРОТОКОЛ 14.2. Приготовление
кондиционированной среды
Схема
Собрать среду от гомолотичных клеток или клеток
другой линии, с поздней log-фазы. Профильтровать
и развести в свежей среде, как это требуется.
Материалы
• Клетки для кондиционирования: та же самая
линия клеток, друтая клеточная линия (напри-
мер, ЗТЗ клетки) или фибробласты мышиного
эмбриона (см. протоколы 12.1,12.5,12.6)
• Среды для клонирования: среда Хэма F12, с 10%
FBS или соответствующая клеткам, которые бу-
дут клонироваться.
• Стерилизующие фильтры. 0.45 мкм пли 0.22 мкм.
флаконы для фильтрования
Протокол
1. Вырастите кондиционирующие клетки до 50%
конфлюэнтности.
2. Замените среду, и инкубировать еще 48 ч.
3. Соберите среду.
4. Центрифут ируйте среду при 1000 g в течение
10 мин.
5. Профильтруйте среду через 0,4 мкм стерилизу-
ющий фильтр (может быть, сначала потребуется
очистить среду предварительной фильтрацией
через фильтры 5 мкм п 1,2 мкм; см. прото-
кол 11.14).
6. Храните среду замороженной ири 20 °C
7. Разморозьте среду перед использованием и до-
бавьте ее к среде для клонирования в следующей
мроцорции: 1 часть кондиционирующей среды к
2 частям среды для клонирования
Замечание. Центрифуi ирование, замораживание и
оттаивание, а также фильтрация позволяют избежать
риска переноса любых клеток, помимо тех, которые
культивируются. Если для кондиционирования и для
клонирования цс пользуются одни и те же клетки, то эта
проблема менее важна, однако для лучшего клонирова-
ния может быть лучше использовать различные типы
клеток пли первичную культуру мышиных фиброб-
ластов. Если клеточный штамм получен этим методом,
то идентичность клеток должна быть подтверждена
(например, см. протокол 16.10, 16.12,16.12) для того,
чкюы предупредить перекрестную контаминацию из
кондиционированной среды.
ПРОТОКОЛ 14.3. Приготовление фидерных
слоев
Схема
Посеять гомолошчные или гетерологичные клетки,
например эмбриона мыши, перевести их в неироли-
феративное состояние облучением или воздействием
препарата в средней концентрации до начала клони-
рования исследуемых клеток.
Материалы
Стерильные или асептически подготовленные:
• Вторичная культура фибробластов 13-дневного
эмбриона мыши
• (см. протоколы 12.6 и 13.2)
• Культуральная среда для клеток, которые будут
клонированы
• Основной раствор митомицина С, 100 mki/мл, в
HBSS или бессывороточной среде
• Источник X-лучей или '"Со, способный к из-
лучению 30 Грэй за 30 мин или менее (вместо
митомицина С)
Протокол
1. Трписиннзируйте первичную культуру эмбрио-
нальных фибробластов (см. протоколы 12.6
и 13.2) и пересейте клетки ири концентрации
1x10’кл. мл.
2. Блокируйте пролиферацию одним из следующих
четырех методов:
а) облучение
i) подверт ните культуры in silu во флаконах
действию радиоактивного излучения в дозе
60 Грэй при помощи рентгена или источни-
ка у-радиаиии типа <>0Со;
ii) подвер! ните триисинизированную суспен-
зию действию радиоактивного излучения
в дозе 60 Грэй при иомощи рентгена или
источника у-радиации типа * *’"Со. Посейте
при концентрации клеток 1х105кл. мл.
Альтернативно облученная суспензия мо-
жет храниться при 4 °C до 5 дней
б) обработка митомицином С
14.3. Суспензионное клонирование
261
i) добавьте митомицин С к субконфлюент-
ным клеткам в концентрации 0.25 mki мл.
инкубируйте мри 37 °C в течение ночи
(-18 ч) | Macpherson и Bryden, 1971], заме-
ните среду.
ii) добавьте митомицин С до конечной
концентрации 20 мкг/мл к триисини-
зированной суспензии с концентрацией
клеток 1x10'кл. мл (2 mki митомицина
С/10*’ клеток), инкубируйте 1 ч при 37 "С,
отмойте центрифугированием (4x10 мл),
чтобы удалить митомицин С,
Пересейте в 1х10’кл./мл | Стэнли, 2002J
или храните при 4 °C до 5 дней.
3. После дальнейшего культивирования 24 72 ч,
трнисиннзируйте клетки и пересейте или пере-
сейте хранившиеся клетки непосредственно в
свежую среду при 5x10’кл.. мл (1х10’кл., см2).
4. Инкубируйте культуру еще 24—48 ч и затем пе-
ресейте клетки для клонирования.
14.2.3. Фидерные слои
Причина тою, что некоторые клетки плохо клонируют-
ся, связана с их неспособностью выживать при низкой
клеточной плотности. Одним из путей поддержания
клеток при клоногенной плотности, имитируя при
этом условия окружающей среды, соответствующие
высокой плотности, является метод клонирования
клеток на фидерном слое клеток с подавленной проли-
феративной активностью (рис. 14.4). Фидерные клетки
могут предоставлять питательные вещества, факторы
роста и компоненты матрикса, которые обле<чают
выживание клонируемых клеток
Фидерные клетки останутся жизнеспособными еще
в течение 3 недель, но, в конечном счете, нотибнут и
не могут быть перенесены при выделении отдельной
колонии. Для повышения эффективности посева мо-
гут быть использованы apyi не клеточные линии или
гомолО(нчные клетки. Гетерологичные клетки имею?
то преимущество, что нри дальнейшей необходимости
выделения клона хромосомный анализ позволяет ис-
ключить случайную контаминацию клетками фидерно
го слоя. В качестве фидерного слоя обычно иснользукп
такие культуры, как ЗТЗ, MRC-5, STO. Мышиные
эмбриональные клетки первого пассажа moi у г проду-
цировать большее количество компонентов матрикса,
чем установившиеся клеточные линии, но скриннш
различных клеток — единственный способ выяснения
того, какой из типов клеток является наилучшим в
качестве фидерного слоя для конкретной культуры
Клетки MOtyr различаться по их чувствительности к
облучению или митомицину С, поэтому следует прово-
дить испытания до начала попыток клонирования, для
того чтобы удостовериться, что ни одна из фидерных
клегок не выжила (см. также гл. 2, упражнение 21,
Экспериментальный вариант 3). Даже в этом случае
Облучите фидерные
клетки или подействуйте
митомицином С
Трипсмнизируйте и посейте вс
флаконы или чашки Петри
Инкубируйте 48 ч для
получения субконфлюэнтной
культуры
Инкубируйте 1-3 недели, в
зависимости от скорости роста
J Посейте разведенную
суспензию клеток
на предварительно
образованный фидерный слой
Колония клеток
цервикального эпителия
-Дегенерация ЗТЗ клеток
фидерного слоя
Рис. 14.4. Фидерные слои. Клетки облучены и трипсинпз-
рованы (или вначале гркпеиннаированы и затем суспензия
облучена, или клетки обработаны митомицином С) и посеяны
при низкой плотности, чтобы повысить эффективность кло-
нирования (фото любезно предоставлено M .G. Frcshncy)
каждый раз при проведении клонирования в качестве
контроля желательно посеять на две пли три чашки с
фидерным слоем только фидерные же клетки.
14.3. СУСПЕНЗИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ
Некоторые клетки, в частности гематопоэтические
стволовые клетки, а также трансформированные
вирусами фибробласты, ле!ко клонируются в сус-
пензии. Для того чтобы удержать делящиеся клетки
вместе и предупредить смешивание колоний, клетки
суспендируют в at аре или метил целлюлозе (МП) и
сеют на а1аровую подложку или в чашки, которые
не должны быть предварительно обработаны для
тканевых культур. Протокол 14.4 предоставлен Магу
Fresltney. Британский центр исследований рака. Бри-
танские лаборатории Битсона, Университет Глазго
(Cancer Research UК Bealson Institute, Garscube Estate,
Switchback Road, Bearsden, Glasgow, G61 1BD, United
Kingdom), (см. рис. 14.5. и протокол 23.23).
262
ГЛАВА 14. КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ
ПРОТОКОЛ 14.4. Клонирование в агаре
Схема
Агар является жидкостью при высоких температурах,
но переходит в гель при 37 °C. Клетки суспендируют-
ся в теплой агаровой среде и при инкубировании пос-
ле формирования геля образуют дискретные колонии,
которые могут быть легко изолировано (рис. 14.5).
Материалы
Стерильные:
* Высококачественный agar, Difeo
• Среда в двойной концентрации (например,
Е12Хэма, RPMI 1640. МЕМ Дулбекко, или
CMRL1066). Приготовьте среду из концентрата
х1() в половине конечного объема и добавляйте
вдвое большее количество нормальной концент-
рации сыворотки, если требуется.
• Фетальная сыворотка теленка (если требуется)
• Среда для роста, 1х, для разведения клеток
• Стерильная сверхчистая вода (UPW)
• Стерильная коническая колба
• Пинетки, включая одноразовые стерильные плас-
тмассовые пипетки для растворов агара
• Универсальные контейнеры, флаконы-бижу или
центрифужные пробирки для разведения
• Чашки Петри, 3,5 см, сорт «не для культур ткани»
Нестерильный:
Буизеновская горелка и штатив
• Водяная баня на 55 °C
• Водяная баня на 37 °C
* Электронный счетчик клеток или гемоцитометр
• Поднос
Примечание. Перед подготовкой среды и клеток
выполните разведение клеток и маркировку чашек
Петри. Для измерения эффективности клонирова-
ния клеточной линии клетки ириг отови гь ио три
чашки для каждого разведения клеток. Удобное
количество клеток в 3,5-г.м чашке: 1 000, 333.111, и
37 клеток - то есть серия разведений третьей части
сусиензии клеток. Если в чашки должны быть до-
бавлены любые факторы роста, гормоны или друг ие
добавки, они должны быть внесены в 0,6%-ю агаро-
вую иодложку.
Протокол
1. Пронумеруйте или промаркируйте чашки Петри со
стороны дна. Удобно разместить их на подносе.
2. Приготовьте 2х среду, содержащую 40°« FBS, и
храните при 37 °C.
3. Взвесьте 1,2 г агара.
4. Отмерьте 100 мл стерильной L" РW в стерильной
конической колбе и друг не 100 мл в стерильной
бутыли. Добавьте 1.2 г агара в колбу Закройте
флакон и кипятите раствор 2 мин. Аг ар может
быть стерилизован в автоклаве заранее, но если
он ириготовлен заранее, то для использования
потребуется кипятить или разогреть в микровол-
новой печи до расплавления.
5. Переместите прокипяченный агар и бутыль со
стерильной UPW в водяную баню на 55 °C.
6. Приготовьте 0,6%-ю агаровую иодложку, объ-
единяя равный объем 2х среды и 1 2% агар
(рис. 14.6). Поставьте агаровую иодложку на
37 :С. Если используются любые добавки, фак-
торы роста, гормоны и т.д., они должны быть
добавлены к иодложке в атом пункте.
Примечание. Если проведена титрация факторов
роста или используется выбор различных факторов,
то следует добавлять требуемое количество в чашки
Петри до разливания иодложки
7 Добавьте 1 мл 0,6%-й агаровой среды в чашки,
перемешайте, удостоверьтесь, что среда закры-
вает дно чашки. Оставьте чашки при комнатной
температуре для охлаждения (см. рис. 14.5).
8. Прпютовьте суспензию клеток и подсчитайте
9. Прит отовьте 0,3%-й агар и поместите на 37 °C.
Эта среда может быть подготовлена разведением
2х среды (при 37 °C) в 1-2% агаре (при 55 °C) и
UPW (при 55 °C) в соответствующих объемах
2:1:1 (см. рис. 14.5)
10 Приготовьте следующие разведения клеток, делая
высшую концентрацию клеток
1x10'/мл
a) 1x10s/мл
б) Разведите 1x1О5 /мл в три раза так. чтобы ио-
лучить 3,Зх10*/мл
в) Разведите 3,3x10*/мл в три раза так, чтобы
иолучить 1,1х1()1 мл
г) Разведите 1,1x10*/мл в три раза так, чтобы
иолучить 3,7х 10* мл
11. Промаркируйте четыре флакона-бижу или про-
бирки, ио одной для каждого разведения, внесите
пипеткой по 40 мкл каждого разведения клеток,
включая концентрацию 1х 10’ мл в соответству-
ющую емкость. Добавьте 4 мл 0,3% агара ири
37 °C в каждый объем, перемешайте, перенесите
пипеткой по 1 мл из каждого флакона на три
ташки Петри (рис. 14.5). Эго даст следующие
конечные концентрации:
а) 1x10*/ мл/ чашку
б) 30'мл/чашку
в) 10/мл/чашку
г) 7 /мл, чашку
Примечание. Веет да удостоверяйтесь, что агар для
верхнего слоя имел достаточное время, чтобы охла-
диться до 37 °C перед добавлением к нему клет ок.
13. Поместите чашки Пегри в чистую пластмассовую
коробку с крышкой и инкубируйте ггрн 37 °C в
течение 10 дней.
14.3. Суспензионное клонирование
263
Рис. 14.5. Клонирование в суспензии. Культивированные клетки или первичная суспензия костного мозга или опухоли
суспендируемся в агаре или aiapoac с «низкой температурой таяния», которые образуют гечь с формированием колоний в
суспензии. Использование подложки предупреждает прикрепление клеток ко дну чашки. 1. Подготовка агаровой под.шмки.
агар 1,2?и, при 55 °C смешать со средой 2х. подогретой до 37 °C и немедленно разлить в чашки, где при комнатной температуре
или ири 4 °C образуется гечь 2. Поди> гонка агар-сроды развести агар до 1.2% в UPW при 55 °C смешать со средой 2х, чтобы
получить 03% агар для клонировании Использование агарозы с низкой точкой плавления позволяет работать при 37 °C, но
использование агарозы может затруднить образование геля 3 Клетки, которые растут в суспензии, полученные из кис гного
мозга, или трппсинизированные клс!ки монослоя подсчитываются и серийно разводя гея. Конечный продукт разводится в
агаре или ага|и>зс и сеется на агаровую подложку. 2 Подготовка агар-ервды
264
ГЛАВА 14. КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ
ПРОТОКОЛ 14.5. Клонирование
в метилцеллюлозе
Схема
Суспендировать клетки в среде, содержащей ме-
тил целлюлозу (МЦ). посеять клетки в чашки,
содержащие агаровую или а1арозную подложку
(рис. 14.6).
Материалы
Стерильные:
• Высококачественный aiap или aiapoea, Difco
• Среда в двойной концентрации (например, F12
Хэма, RPMI 1640, МЕМ Дулбекко, или CMRL
1066). Приютовить среду из концентрата 10х
в половине конечного объема и добавить вдвое
большее количество нормальной концентрации
сыворотки, если требуется.
• Фетальная сыворотка теленка (если требуется)
• Среда для роста, 1х, для разведения клеток
• 1.6“о МЦ, 4 Pa-s (4000 сантипуаз) в UPW;xpaHiri-
ся на льду (см. Приложение I Methocel)
• Стерильная сверхчистая вода (I’PW)
• Стерильная коническая колба
• Пипетки, включая одноразовые стерильные пласт-
массовые пипетки ajia растворов атара
• Универсальные контейнеры, флаконы-бижу, или
центрифужные пробирки
• Чашки Петри, 3,5-см, сорт «не для культур
ткани»
• Шприцы для дозировки МЦ (из-за своей вязкос-
ти МЦ прилипает к внутренней стороне пипеток,
делая разлив затруднительным и неточным)
Нестерильные:
• Буизеновская горелка и штатив
• Водяная баня на 55 °C
• Водяная баня на 37 °C
• Электронный счетчик клеток или гемоцитометр
• Поднос
Протокол
1. Приготовьте ai аровую подложку, как в протоко-
ле 14.4. uiai и 1 7.
2. Растворите МЦ до 0,8“» с равным объемом 2х
среды. Хорошо перемешайте и храните на л,ьду.
3. Трипсинизируйте клетки монослоя или соберите
клетки суспензионной культуры или костного
MO313 и подсчитайте их.
4. Прш отовьте следующие разведения клеток, де-
лая высшую концентрацию клеток 1х 10 ’ мл
a) 1x10s/мл
б) Разведите lx 10s мл в три раза так, чтобы по-
лучить 3,Зх10'/мл
в) Разведите 3,3x1 O'/мл в три раза так, чтобы
получить 1,1х 10’ /мл
1) Разведите 1,1x10’/мл в три раза так. чтобы
получить 3,7x10' мл
5. Промаркируйте четыре флакона-бижу или про-
бирки. ио одной для каждого разведения, внесите
пипеткой ио 40 мкл каждого разведения клеток,
включая концентрацию 1x10' мл в соответству-
ющую емкость. Добавьте 4 мл 0,8% МЦ в каждый
объем, хорошо перемешайте при помощи вортек-
са, если известно, что клетки хрупкие и нежные,
то перемешивать многократным осторожным
засасыванием и выдавливанием из шприца. Затем
используйте шприц, чтобы перенести из каждого
флакона в гри чашки Петри (рис. 14.6). Это даст
следующие конечные концентрации
a) IxlO3, мл/ чашку
б) 330/мл чашку
в) 110/мл/чашку
1) 37/мл/чашку
6. Инкубируйте чашки во влажном инкубаторе до
формирования колоний. Поскольку колонии
формируются в промежутке между агаром и МЦ,
через 1 неделю может быть добавлена свежая
среда, 1 мл на чашку, а затем через 2 недели среда
может быть снова удалена и заменена на новую
без повреждающего действия на колонии.
Агароза, имеющая в составе меньшее количество
сульфатированных полисахаридов, может заменить
aiap. Некоторые типы aiapoau имени' более низкую
точку гелеобразования, что позволяет работать при
температуре 37 °C. Они загустевани при 4 °C и затем
снова переносятся на 37 °C.
В результате сложности манипуляций с растаплива-
нием агара, содержащего клетки, а также некоторыми
примесями в агаре, некоторые лаборатории предпочи-
тают МЦ (Methocel), который представляет собой не
гель, а вязкий раствор [Buick et al, 1979J. В подогретом
виде он имеет более высокую вязкость. Поскольку это
золь, а не гель, клетки лшко мтут в нем осаждаться.
Таким образом, при использовании МЦ необходимо
использовать подложку. Колонии образуются на гра-
нице раздела между МЦ и aiаровой (или агарозной)
подложкой, помещаясь в одной фокальной плоскости,
что облегчает их анализ и фотографирование.
Мноте из рекомендаций, которые относятся к
компонентам сред, используемых для клонирования
на монослое, также применимы и к клонированию в
суспензии. Кроме того, инснда также используются
сульф1 идрильные компоненты, такие как меркаито-
этанол (5x10“’ М). глютатион (ItnM) п а-тио1лицерин
(7,5x10 SM) [Lscove el aL, 1980]. Macpherson [1973]
обнаружил, что включение декстрана DEAE оказы-
вает* положительное влияние на клонирование, что
позже было подтверждено Hamburger el al. [1978],
который также обнаружил, что макрофаги улучшают
клонирование опухолевых клеток, хотя дру| ие авторы
показали, что макрофаш, напротив, повреждают их.
Courtenay et al. [1978] вносили красные клетки крови
14.4. Выделение клонов
265
Рис. 14.6. Клонирование в мети лцеллюлозе. Серийные разведение клеток приготовлено так же. как для клонирования в ai аре,
клетки разведены 1 100 в метилцеллюлозе-срсдс и посеяны в чашки с агаровой подложкой
крысы в среду и демонстрировали, что низкое давление
кислорода улучшает клонирование. Проблема влияния
содержания кислорода может быть связана также и <
токсичностью свободного кислорода, в присутствии
красных клеток крови он может связываться с гемсл -
лобином. Вероятно, этот процесс можно смоделировать
перфторуглеродом (Lowe etal., 1998|.
Большинство различных типов клеток клонируются
в суспензии с более низкой :м|м|>ективностью, чем в мо-
нослое, некоторые клетки на два или три порядка ниже.
Однако выделение клонов из суспензии намного ле! че.
14.4. ВЫДЕЛЕНИЕ КЛОНОВ
Ко|да клонирование используется для селекции спе-
цифических клеточных штаммов, го формируемые
колонии (см. цв. вкладку 6) должны быть изолированы
для дальнейшего размножения. Если клетки моно-
слоя клонируются непосредственно в многолуночных
планшетах (см. иротокол 14.1 — Микротитрационные
планшеты), то колонии мслут быть изолированы трии-
сини.шцией отдельных ячеек. Так или иначе, необходи-
мо подтвердить клональное происхождение колонии в
ходе ее формирования иу гем регулярного наблюдения
иод микроскопом. Если клонирование проводится в
чашке Петри, то между колониями не происходит раз-
деления. Это разделение должно быть осуществлено
удалением среды и помещением нержавеющих или
керамических колец BOKpyi колонии, которые предпо-
лагается изолировать (рис. 14.7).
Moi ут быть применены флаконы с удаляемой верх-
ней пленкой (Nalge Nunc), которая может отслаиваться
для того, чтобы получить клоны. В тех случаях, когда
доступен источник облучения, клоны MOiyr быть вы-
делены экранированием одной колонии при помощи
свинцового диска и облучением остальною минослоя
в дозе 30 Грэй (см. иротокол 14.7).
Рис. 14.7. Кольца для клонирования. Нержавеющие сталь-
ные кольца, отрезанные от трубки, в 9-см стеклянной чашке
По 1 ри. Может быть использован также фарфор (Fisher), тол-
ст шлейный С1СКЛЯНЫЙ шакан (Scientific Laboratory Supplies)
или пластик (например, кольца, отрезанные от нейлонового,
силиконового или тефлонового толстостенного шланга)
Независимо от материала, нижний край кольца должен быть
ладким, чтобы с помощью силиконовой смазки приклеить
ко дну чашки Петри, а размер внутреннего диаметра должен
быть достаючно широк, чтобы обеспечить клонирование
одного клона без перекрывания смежного клона внешним
диамсцюм кольца
Если облучение и трицсиннзация проводятся, когда
колония состоит примерно из 100 клеток, то повторное
клонирование триисинизированных клеток приведет
к значительному повышению эффективности клони-
рования Этим методом за шесть недель может быть
осуществлено три серийных клонирования.
266
ГЛАВА 14. КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ
ПРОТОКОЛ 14.6. Выделение клонов с
использованием колец для клонирования
Схема
Колонию трипсиннзнру ют внутри фарфоровою,
стеклянного, стального или PTFE кольца и иерено-
сят в одну из лунок 24- или 12-луночного планшета
либо прямо в 25-см2 флакон (рис. 14.8).
Материалы
Стерильные:
• Кольца для клонирования (см. Приложение II):
стерилизованные в чашке Петри сухим жаром
или автоклавированием
• Силиконовая смазка; стерилизованная в стек-
лянной чашке Петри сухим жаром. 160 "С в те-
чение 1 часа или автоклавированием при 121 °C
в течение 15 мин.
• Желтые наконечники для автоматических пи-
неток либо Пастеровские иииетки с загнутым
концом (Ве11со#1273)
• Трипсин 0,25% в D-PBSA
• Ростовая среда
• Многолуночный планшет, 24-луночный, и/илп
25-см2 флаконы
Стерильные пинцеты
Нестерильные:
• Автоматическая пинетка, 50—100 мкл
• Фломастер или, предпочтительно, маркер для
колец Nikon или маркер для объектов, который
подходит к револьверу микроскопа вместо од hoi о
из объективов
Протокол
1. Обследуйте клоны, отметьте те из них, которые
вы хотите выделить ири помощи фломастера на
дне чашки или используйте маркер колец Nikon.
2. Удалите среду из чашки, осторожно промойте
клоны D-PBSA.
3. При помощи стерильного пинцета возьмите одно
кольцо для клонирования, погрузите в силиконо-
вую смазку и вдавите в чашку так, чтобы смазка
распространилась вокру! основания кольца.
4. Поместите кольцо BOKpyt выбранной колонии.
5. Повторите mat и 4 и 5 для двух или трех колоний
в одной чашке.
6. Добавьте 0^5%-й трипсин так, чтобы заполнить
внутреннее пространство в кольцах (0 1—0.4 мл, в
зависимости от внутреннего диаметра кольца).
7. Оставьте т рипсин на 20 с и затем удалите ею.
8. Закройте чашку, инкубируйте в течение 15 мин
ири 37 °C.
9. Добавьте 0,1— 0,4 мл среды в каждое кольцо.
10. По очереди для каждою клона диснершруйте
клетки многократным иииетпрованием среды,
перенесите среду в 24-луночный иланшет или в
25-см- флакон, поставленный вертикально. Ис-
пользуйте для каждою клона отдельную иииетку
или новый наконечник
11. Промойте кольцо в 0,1—0,4 мл среды, перенесите
среду в ту же лунку иланшета или флакон.
Замечание. Чашка высохнет, если оставлять ее
о гкрытой в течение Слишком долгою времени. Огра-
ничьте число выбранных клонов или закрывайте
чашку в промежутках между манипуляциям
12. Доведите количество среды в лунке до 1,0 мл, за-
кройте иланшет и инкубируйте ею. При использо-
вании флакона добавьте 1 мл среды в каждый фла-
кон tt инкубируйте в вертикальном положении.
13. Kot да клон вырастает так, что заполняет лунку,
проведите субкультивирование в 25-см2 флакон,
инкубируйте, как обычно, в 5 мл среды. Если вы ис-
пользуете метод культивирования в вертикально
стоящих флаконах (см. рис. 14.8), то удалите среду,
когда дно флакона будет покрыто конфлюэнтным
слоем, триисинизируйте клетки и положите фла-
коны илашмя. Продолжайте инкубирование.
ПРОТОКОЛ 14.7. Выделение клеточных
колоний путем облучения
Схема
Переворачивать флакон в рентгеновском аппарате
или в камере <>vCo излучателя, защитив выбранные
колонии свинцом
• Требование безопасности. Рентгеновский
аппарат и соСо излучатель должны использоваться
при соответствующем конт роле соблюдения безопас-
ности для оператора и находящихся рядом лиц (см.
разд. 7.7.4.). Свяжитесь с организацией, отвечающей
за радиологическую защиту в вашем pet ионе, прежде
чем приступать к экспериментам этого рода.
Материалы
Стерильные:
• Ростовая среда
• Трипсин 0,25“о
• D-PBSA
Нестерильные.
• Ренттеновский аппарат или 6иСо излучатель
Кусочки свинца, вырезанные из пласт ины толщи-
ной 2 мм размерами от 2 до 5 мм в диаметре
Протокол
1. Выберите желательную колонию, отметьте ее
фломастером или маркером для колец Nikoit.
2. Выберите кусочек свинца соответствующего
диаметра.
3. Внеси те флакон в зону облучения.
4. Переверните флакон иод излучателем.
5. Закройте колонию кусочком свинца толщиной 2 мм.
6. Облучите флакон в дозе 30 Грэй.
7. Верните флакон в стерильную рабочую зону.
8. Удалите среду, т риисинизируйте клетки, оставь-
те культуру для восстановления в том же фла-
коне, используя облученные клетки в качестве
фидерною слоя.
14.4. Выделение клонов
267
Рис. 14.6. Выделение монослойного клона. Материнские колонии исследуются иод микроскопом, подходящая выбранная
колония отмечаемся Среду удаляют, кольца для клонирования, погруженные в силиконовую смазку, помешаются гак. чтобы
окружить каждую выбранную колонию, которая затем обрабатывается трипсином внутри кольца
14.4.1. Другие методы выделения
монослойных клонов
1) Расположите небольшие покровные стекла или
кусочки разбитого покровного стекла на дне чашки
Петри. Ко[да плотность клеток достигнет необхо-
димой плотности, некоторые одиночные колонии
будут находиться на кусочках покровного стекла и
могут быть перенесены в свежую среду или в лунки
многолуночного планшета.
2) Используйте капиллярный метод Sang ford и др.
[1948]. Разведенная клеточная суспензия пере-
носится и стерильную стеклянную капиллярную
трубочку (например, 50-мкл Drummond Microcap),
позволяет колониям формироваться внутри капил-
ляра. Затем капилляр аккуратно разбивают с обеих
сторон от колонии и переносят на свежую среду.
Этот метод использовали Echarti и Maurer [1989,
1991] для изучения клоногенности гематопоэти-
ческих клеток и опухолевых клеток, для которых
эффективность колонпеобразования может быть
количественно определена путем сканирования
капилляра в денситометре.
3) Клетки мслут быть клонированы в камере (Jpli-
Cell, которая сделана из двух расположенных дру|
напротив дру ta поверхностей для роста на тонком
I ибком пластике, который может быть отрезан при
помощи скальпеля пли ножниц. Если обеспечена
стерильность наружных поверхностей, то из камеры
вырезают необходимый cei мент, содержащий коло-
268
ГЛАВА 14. КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ
ПРОТОКОЛ 14.8. Выделение суспензионных
клонов
Схема
Отобрать колонию автоматическом пинеткой или
пастеровской пинеткой, перенести во флакон или
лунку многол vночного планшета (рис. 14.9).
Материалы
Стерильные:
• Ростовая среда в универсальном контейнере
• Многолуночные планшеты (24 лунки)
• Культуральные флаконы. 25 см'
• Желтые наконечники для автоматической пинет-
ки или пастеровские пинетки
Нестерильные
• Препаровальная луна, увеличение 20 -50х
• Автоматическая пинетка, 100 мкл
• Фломастер или маркер для колец Nikon
Протокол
1 Обследуйте чашки в инвертированном микро-
скопе, отметьте колонии маркером Nikon или
фломастером
2 Внесите пипеткой но 1 мл среды в каждую лунку
24-луночног<> планшета.
3 Выберите колонии, используя препаровальную
луну
а) Используйте отдельный наконечник или пас-
теровскую пинетку для каждой колонии;
б) Установите на пинетке пипетируемый объем
100 мкл:
в) Наберите примерно 50 мкл среды в наконеч-
ник, поместите кончик пипетки напротив
колонии, которую выделяете, и осторожно
отберите колонию.
4 Перенесите содержимое пинетки в 24-луночный
планшет, смойте колонию струей среды. Если
среда ирИ1Х)товлена с использованием метилцел-
люлозы Methocel, колония осядет, если клетки
адгерентны, то они прилипнут и начнут расти
Клетки, обычно растущие в суспензии, осядут,
но, конечно, не прилипнут. Если среда сделана на
агаре, вам, возможно, потребуется нииетировать
колонию несколько раз в лунке, чтобы дисиер! и-
ровать at ар. Клоны можно также посеять прямо в
пластиковые флаконы, поставленные вертикаль-
но (см. иротокол 14.6)
нии, которые затем триисинизируются и переносят-
ся в mhoi олуночные планшеты или флаконы
14.4.2 . Суспензионные клоны
Выделение колоний, выросших в суспензии, проще, но
требует применения препаровальной луны.
14.5. ПОЛУЧЕНИЕ РЕПЛИКАТИВНЫХ
КОЛОНИЙ
Бактериальные колонии могут быть реплицированы
путем мягко! о придавливания влажной иодушечки к
колонии, растущей на питательном агаре, и перене-
сением этой подушечки на друзу к», свежую чашку с
агаром. Предпринимались различные попытки адапта-
ции этой методики для культур клеток, обычно путем
помещения влажного экрана или фильтра на монослой
клона на несколько дней и переноса его в новую чашку
[Hornsby et al., 1992]. Для клонов, которые образова-
лись в многолуночных планшетах, существует ряд при-
способлений, например Corning Transtar (см. рис. 5.13),
которые могут быть использованы для суспензионных
культур непосредственно после перемешивания или
для монослойных культур, после триизинизации и
ресуспендирования.
14.6. СЕЛЕКТИВНЫЕ ИНГИБИТОРЫ
Манипуляция с условиями культивирования путем
использования селективных сред является стандарт-
ным методом селекции микроорганизмов. Приложение
этого метода к клеткам животных имеет ot раничения,
однако на основании метаболического сходства боль-
шинства изолированных клеток одного животною
можно определить некоторые пищевые потребности
их культур. Проб, tew у усложняет действие сыворотки,
которое склонно маскировать селективные свойства
селективных сред.
Большинство селективных сред, в отношении кото-
рых обычно подтверждается успешность применения,
относятся к бессывороточным (см. разд. 10.2.1). Тем
не менее периодически демонстрируется успешность
применения ряда метаболических ингибиторов.
Gilbert and Migeon [1975, 1977] заместили L-валин в
культуральной среде D-валином и показали, что на
этой среде росли преимущественно клетки, облада-
ющие D-аминокислотной оксидазой Таким образом
были выделены клетки эпителия почечных канальцев
[Gross el al., 1992], эпителия молочной железы коровы
[Sordillo el al., 1988], эндотелиальные клетки кры-
синою MO3ta [Aliboll el al., 19921, а также культуры
Шванновских клеток [Arniali & Bonner, 1990]. Однако
этот метод не слишком эффективен для выделения
человеческих фибробластов [Masson et al.. 1993].
Большинство из попыток разработки селективных
условий имели целью подавление избыточного роста
фибробластов. Као and Prockop [1977] использовали
cis-OH-пролин, хотя он может оказаться токсичным
для дру! их клеток. Fry and Bridges [ 1979) обнаружили,
что фенилэтилбарбитуровая кислота ишибирует из-
быточный рост фибробластов в культуре гепатоцитов,
Braalen el al. [1974] удалось уменьшить контаминацию
фибробластами культуры неонатальных панкреати-
ческих клеток путем воздействия на культуру этил-
меркуртиосалицилатом натрия. Фибробласты также
14.6. Селективные ингибиторы
269
Рис. 14.9. Выделение суспензионных клонов. Отметьте колонию, как в случае моносюя, затем отберите при помощи пас-
теровской пипетки (или наконечника автоматическом иииетки). Перенесите колонию в культуральный флакон, разведите в
среде и инкубируте се Откорректируйте среду, когда клетки начнут расти
несколько более чувствительны к действию генетицина
(G418) в дозе 100 mki мл [Levin el al., 1995].
Одним из наиболее перспективных методов является
разработка моноклональных антител к стромальным
клеткам карциномы молочной железы человека [Ed-
wards el al.. 1980J. Показано, что при использовании
вместе с комплементом эти антитела становятся цито-
токсичными для фибробластов из различных опухолей п
помогают очисти гь ряд клеточных линии злокачествен-
ных опухолей. Клетки также могут быть избирательно
убиты при помощи конькиатов антит ел с токсинами или
фармаколш ическими соединениями [ например, Beatlie
el al., 1990J. Тем не менее селективные антитела более
широко применяются при «пэннпнге*» пли в сепаратив-
ном методе ма| нитного сортпнга (см. разд. 15.3.2).
Селективные среды также обычно используются
для выделения i пбридных клонов в экспериментах с
гибридизацией соматических клеток. НАТ-среда (см.
Приложение I) - комбинация iипоксантина, амино-
птерина и тимидина, - позволяет проводить селекцию
пбрпдов, обладающих ишоксантин |уанин фосфори-
бозилтрансферазу и тпмидпнкиназу от родительских
клеток, дефицитных по одному пли дру| dmv ферменту
(см. разд. 27.9.1) [Littlefield, 1964а].
Трансфецированные клетки также отобраны по ус-
тойчивости к ряду лекарственных соединений, таким как
неомицин, его аналог генетицин (G418), шдромицин и
метотрексат, путем включения в генетическую конструк-
цию для трансфекции генов устойчивости [например, пео
(аминоглико311дфосфотрансфераза),/>р/> (i идромицпн В
фосфотрансфераза), или г/Л/т(д|Пидр1х[ю.|ат редуктаза);
см разд. 28.5J. Культивирование при правильной кон-
цен {рации селективных маркеров, определенных путем
титрации против трансфецированного и нетрансфеци-
270
ГЛАВА 14. КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ
рованного контроля, позволяет проводить селекцию
стабильных трансфектантов. Селекция с метотрексатом
имеет дополнительное преимущество - возрастание
концентрации метотрексата проводит к амплификации
гена dhjr, а также может приводить к ко-амилификации
других генов генетической конструкции.
Возможна также нет ативная селекция при помощи
ГЛ'гена вируса простого герпеса (HS V), который пере-
водит ганцикловир (Ganciclovir, Syntex) в цитотокси-
ческий продукт [Jin el aL, 2003]. Трансфецнрованные
клетки будут более чувствительными к препарату.
Кот да в смеси клеток обнаруживается различная
чувствительность к факторами роста, становится
возможным стимулировать один клеточный тип со-
ответствующим фактором роста и затем, используя
преиодгщества более высокой чувствительности более
быстро растущих клеток, селективно уничтожить эти
клетки облучением или действием арабинозида цито-
зина (ага-с) (см. разд. 23.4.1). Напротив, если известен
некий ин1 ибитор или удаление какого-то фактора роста
ин1 ибирует рост клеток, то, выведя один тик клеток
из клеточного цикла, можно уничтожить оставшиеся
клетки облучением или ага-с.
14.7. ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ
ВАРИАНТОВ
Протокол 14.9 для получения мутантных клеточных
линий, которые амилифицируют ген диг идрофолатре-
дуктазы (DHFR), разработан June Biedler (Memorial
Sloan-Kettering Cancer Center. New York. New York)
ПРОТОКОЛ 14.9. Метотрексат-
резистентность и DHFR-амплификация
Принцип
Клетки, которые подвергаются действию супенчато
возрастающих концентраций антагонистов фолие-
вой кислоты, таких как метотрексат (МТХ), после
продолжительного периода времени ириобретают
устойчивость к токсическому действию иреиарата
[Biedler el aL, 1972]. Резистентность, возникшая в
результате амплификации гена DHFR, обычно раз-
вивается быстрее, хотя другие механизмы, например,
изменения в транспорте антифолата и/или мутации,
действующие на структуру пли аффинность фер-
мента, могут давать частично или полностью тот же
резистентный фенотип.
Схема
Клетки подвергаются ступенчатому воздействию
МТХ по возрастанию концентраций в течение не-
скольких недель с периодическим замещением среды
на свежую, с той же концентрацией иреиарата. Для
с^бкультивирования выбирают те флаконы, в кото-
рых небольшой процент клеток выжил и образовал
колонии. Повторное субкультивирование таких кле-
ток проводится нри такой же или в два или в десять
раз более высокой концентрации МТХ до тех пор,
пока клетки не приобретут желаемую степень резис-
тентности.
Материалы
Стерильные:
• К тетки китайского хомяка или быстро растущих
человеческих или мышиных клеточных линий
• Метотрексат натрия для иарентеральног о введе-
ния ( Lederle Laboratories)
• 0,15 М NaCl
• Флаконы для культуры тканей
• Пипетки
Культуральная среда, которая не содержит тими-
дина и г иаоксаггтина (например,среда Игла МЕМ
с 10% фетальной сыворотки теленка)
Нестерильные
* Инвертированный микроскоп
Морозильник с жидким азотом
Протокол
1. Клонируйте родительские клеточные линии для
получения быстро растущих, генотипически
единообразных популяций, которые будут ис-
пользованы для селекции.
2. Разведите МТХ в стерильном U,15 М (0,85%)
NaCl. Вещество расфасовывается для клиниче-
ского использования в растворе с концентрацией
2,5 мг Лил.
3. Внесите 2.5х 105 клеток в серию флаконов 25-см2,
не содержащих препарата, или содержащих 0,01,
0,02, 0,05 и 0.1 мкг/мл МТХ в полной тканевой
культуральной среде. Доведите pH каждого рас-
твора до 7,4, инкубируйте флаконы до 37 °C в
течение 5—7 дней.
4. Обследуйте культуру с помощью инвертирован-
ного микроскопа. Замените среду на свежун), с
той же концентрацией МТХ в культурах, обнару-
живающих клональный рост малой доли клеток
среди большого количества разросшихся, адге-
гировавших к субстрату и. возможно, йог ибших
клеток; повторно инкубировать эти культуры.
5. Оставьте клетки расти еще на 5 7 дней, заменяя
ростовую среду ио необходимости, но сохраняя
постоянную концентрацию МТХ. Когда клеточ-
ная плотность достигнет 2 ЮхЮ^кл. флакон,
перенесите клетки в новый флакон с той же или в
два или в десять раз более высокой концентрации
МТХ при 2,5х1(Гкл./флакон.
6. Через 5—7 дней оцените вновь пересеянные
флаконы и культуры из предыдущих пассажей,
которые были подвергнуты действию более вы-
соких концентраций. Замените среду и выберите
жизнеспособные клетки, как описано выше.
7 Продолжите селекцию с помощью ступенчато
повышаемых концентраций в каждой следующей
14.7. Выделение генетических вариантов
271
субкультуре, пока не будет получен желаемый
уровень резистентности: 2—3 месяца для клеток
китайского хомяка с низкой или умеренной
степенью резистентностью, повышением актив-
ности DHFR и или изменением транспорта;
4—6 месяца или более для более высокого уровня
резистентности и сверхцродукциц фермента для
клеток хомяка, мышиных или быстро растущих
человеческих линий
8. Периодически замораживайте образцы разви-
вающихся линий в жидком азоте (см. прото-
кол 20.1).
Анализ. Охарактеризуйте резистентные клетки ио
уровню резистентности к препарату в исследованиях
клонально! о роста (см. иротокол 22.3), ио возрастанию
активности или количества DHFR биохимическим
или электрофоретическим методами [Albrecht et al.,
1972; Melerael al., 1980], и или ио возрастанию mRNA
и количества копий гонов редуктазы при Нозерн-,
Саузерн-, и дот-блоттинге [Scottoet al., 1986] с DHFR-
сиецифичными зондами для определения механизмов
резистентности.
Вариации. Может использоваться среда для клеточ-
ной кул ьтуры, отличная m МЕМ-среды И|ла; предпола-
гается, чго состав среды (например, применение фоли-
евой кислоты) может оказывать влияние на скорость и
особенности развития МТХ-резистентности. Среды, со-
держащие тимидин. тиоксантин и |лицин(см.табл. 9.3,
10.1. 10.2), предупреждают развитие резистентности к
антифолату и поэтому их следует избрать. До селекции
клетки могут быть обработаны химическими мутагенами
[Thompson & Baker, 1973]; такая обработка может также
изменить скорость и тип селекции мутантов.
Селекцию можно также проводить с клетками, посе-
янными на среду, содержащую препарат в 10-см чашку
для культивирования тканей ири низкой плотности
(с выделением отдельных колонии при помощи колец
для клонирования:см. протокол 14.6), с использованием
единичных клеток в 96-луночном планшете или в мяг-
ком агаре, чти облегчает выделение одной из множест-
венных клональных популяций на каждом или любим
желательном этапе в ходе развития резистентности.
Анало! ичными методами клетки могут быть сдела-
ны устойчивыми к ряду дру । их агентов, таких как анти-
биотики, дру । ие антиметаболиты, токсичные метажчы
и т.д. Moiyr иметься различия в механизмах действия
Рис. 14.10. Селективные фидерные слои. Селективное клонирование эпителия молочной железы на конфлюэнтном фидер-
ном слое, (а) Отдельные колонии, сформированные на пластиковой чашке после посева 40П0 кл _см2(2х10,кл /мл) культуры
эпителиальной карциномы молочной железы Маленькие, плотные колонии эпителиальные клетки. Большие звездчатые
колонии фибробласты. (б) Колонии клеток той же культуры, посеянные при концсн i рации 400 кл см2 (2x10’ кл мл) на
конфлюэнтном фидерном с юс клеток FHS74Int [Owens ct al, 1974]. Эпителиальные колонии намного крупнее, чем в {а),
эффективность посева выше, нет колоний фнбр<>бластов (о) Колонии из различных культур карциномы молочной железы,
помещенные на один и тот же фидерный с toil Отметьте различную морфолошю колонии со светлым центром и кольцом в
месте контакта с фидерным с чосм (г) колонии из культуры нормального зиителия молочной железы, посеянные на фидерный
слой клеюк FHl (fetal human intestine, аналот FHS74lnt). В (в) и (г) присутствуют несколько маленьких колонии фибробластов
[Smith ct al, 1981, AJ. Hackett, личное сообщение] (см также цв. вкладку бе, /)
272
ГЛАВА 14. КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ
или степени токсичности агентов. Может оказаться, что
периодическое воздействие будет более эффективным,
чем постоянное, для селекции может потребоваться
более длительное время.
Клеточные линии различных видов или с более
низкой скоростью роста, такие как некоторые клеточ-
ные линии человеческих опухолей, мотут потребовать
различных (обычно более низких) начальных концен-
трации препарата, боле длительной зксиозиции при
каждой концентрации, и меньшей скорости нарастания
концентрации на каждом этапе селекции.
Солюбилизация МТХ в большей степени, чем сред-
ство Lederle, потребует добавления эквимолярного ко-
личества NaOH 11 стерилизации через 0,2 мкм фильтр.
14.8. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С СУБСТРАТОМ
14.8.1. Селективная адгезия
Различные типы клеток обладают различной степенью
связывания с культуральным субстратом и прикрепля-
ются с различной скоростью. Если первичную суспен-
зионную культуру посеять во флакон и перенести во
второй флакон через 30 мин, а затем в третий флакон
через час и т.д. вплоть до 24 ч, то большинство при-
крепляющихся клеток будут обнаружены в первом
флаконе, а наименее способные к прикреплению в
последнем. Макрофаш имеют тенденцию оставаться
в первом сосуде, фибробласты в следующих несколь-
ких флаконах, эпителиальные клетки в следующих
нескольких флаконах, и. наконец, гематопоэтические
клетки в последнем флаконе.
Если в полной среде для первичной дизаире! ации
тканей используется коллагеназа (см. протокол 12.8),
большинство высвобождающихся клеток не будет при-
крепляться в течение 48 ч, если только коллагеназа не
будет удалена из среды. Тем не менее макрофаги мигри-
руйте из фра! ментов тканей и прикрепляются даже в этот
период и могут быть отдалены от других клеток путем
переноса дезаи'регата в свежий флакон через 48—72 ч
действия коллагеназы. Этот метод работает при дезагг-
peiauuu биопсийных образцов опухолей человека.
14.8.2. Селективное открепление
Воздействие трипсина или коллагеназы на гетерогенный
монослой быстрее удалит некоторые клетки, по сравне-
нию с остальными. Периодическая быстрая обработка
т рипсином удалит фибробласты из культуры фетально-
го кишечника человека [Owens etal., 1974) и кожи [ Milo
et al., 1980J. Lasfargues [1973] обнаружил, что действие
коллагеназы на культуру клеток молочной железы в
течение нескольких дней приводит к удалению фиброб-
ластов и сохранению эпителиальных клеток. EDTA, с
другой стороны, может приводить к высвобождению
эпителиальных клеток быстрее, чем высвобождаются
фибробласты [Paul, 1975J. Действие Dispase II (Boeh-
Рис. 14.11. Рост клеток меланомы, фисробластов и глии в
суспензии. Клетки были посеяны в количешве 5x10’клеток
на 35-мы чашку (2,5x10 ’кл,/мл) в 1,5% мстилцсллюлозу на
1.25% aiаровои подложке Колонии былиефтографированы
через 3 недели а ме танома, б — нормальные фибробласты
кожи эмбриона человека, в нормальные клетки mini взрос-
лого че ювека
ringer Mannheim) приводит к селективному извлечению
эпителиальных слоев из культуры цервикальных клеток
человека, растущих на фидерных слоях клеток ЗТЗ без
разрушения самих ЗТЗ клеток (см. протокол 24.3). Эта
мегодика может быть эффективна ири субкультивиро-
вании эпителиальных клеток, полученных из различных
источников, для отделения их от фибробластов.
14.8.3. Природа субстрата
Хотя в настоящее время доступны различные источники
ЕСМ (см. Приложение II), остается важной проблема
14.8. Взаимодействие с субстратом
273
обеспечения выживания и дифференцировки клеток.
Еще недостаточно сделано в области селекции клеток
на «сконструированном» матриксе. По литературным
данным, пролиферации эпителиальных клеток способ-
ствует действие коллагена [Kibbey et al., 1992; Kinsella
et al., 1992], Matrigel также способствует выживанию и
дифференцировке эпителиальных клеток [Bissell et al..
1987; Ghosh et al., 1991; Kibbey et al., 1992]. Поскольку
действие составных частей среды сейчас лучше изуче-
но, то смесь различных коллгенов с цротеотликанами,
ламинином и дру! ими протеинами матрикса может
быть использована для создания более селективных
субстратов. Селективное действие субстрата на рост
может зависеть от дифференциальной скорости при-
липания и роста либо от результата их совокупного
действия [Lechner & LaVeck. 1985. Wise. 2002] (см.
протокол 23.5,23.9) и для поддержки эндотелиального
клеточного роста и функционирования [Relou et al.,
1998; Martin et al., 2004].
Пластиковая посуда Primaria (BD Biosciences) имеет
заряд на поверхности, отличный от того, который обще-
принят для пластика, используемого в культуре тканей.
Он разработан для улучшения роста эпителиальных кле-
ток ио сравнению с фибробластами. BD Biosciences и дру-
гие производители (см. Приложение II) также предлашет
пластик, покрытый природным или синтетическим мат-
риксом, кспорый может облегчать рост требовательных
типов клеток, но, возможно, делает это неселективно.
Дни культивирования после фракционирования
Рис. 14.12. Рост клеток в смешанной культуре. Замена
медленно растущей клеточной линии быстро растущими
клетками культуры-контаминанта. Этот график изобража-
ет щиотстичсский случай, однако показывает, что 10%-я
контаминация клеточной популяцией, которая удваивается
каждые 24 ч уже через 10 дней роста приведет к равному со-
отношению с клеточной популяцией, время удвоения ко шрон
составляет 36 ч
14.8.4. Селективные фидерные слои
Так же как кондиционирование субстрата (см.
разд. 14.2.3), для селективного роста эпидермальных
клеток также мо1ут быть использованы фидерные слои
[Rheinwait! & Green, 1975] (см. протоколы 23.1,23.4) и
для сдерживания сверхроста стромальных элементов
в культуре клеток молочной железы (рис. 14.10; см.
также цв. вкладку 6в, г) и карциномы толстой кишки
[Freshney et al., 1982b]. Роль фидерного слоя, возмож-
но, чрезвычайно сложна; он обеспечивает не только
внеклеточный матрикс для адгезии эпителия, но также
положительно действует на факторы роста и не<а-
тивные ршуляторы, инактивирующие TGF-p [Maas-
Szabo wski & Fusenig, 1996] Человеческая! л иомабудеч
расти на конфлюэнтных фидерных слоях нормальной
глии, в отличие от клеток, полученных из нормального
MO3ia [MacDonald el al.. 1985] (см. протокол 24.1).
14.8.5. Селекция на полужидкой среде
Трансформация мнос их культур фибробластов снижае!
зависимость клеточной пролиферации от субстрата
(см.разд. 18.5.1) [Macpherson & Monlagnier, 1964]. При
культивировании клеток на aiape (см. протокол 14.4)
после вирусной трансформации возможно отделение
колоний трансформированных клеток от нормальных
клеток. Нормальные клетки не будут образовывать
колоний в суспензии с высокой плотностью посева
трансформированных вирусом клеток, хотя ири низ-
кой посевной концентрации они мшут образовывать
колонии. Различия между трансформированными и
нормальными клетками не настолько выражены для
быстрорастущих культур с ранними сроками пересе-
ва, поскольку посевная концентрация в этом случае
должна быть достаточно низкой; нормальная 1лия и
фетальные фибробласты кожи также способны обра-
зовывать колонии в суспензии с примерно одинаковой
эффективностью (<1%)(рис. 14.11).
Клонирование клеток и использование селективных
условий имеет значительные преимущества перед фи-
зическими методами разделения клеток (см. i л. 15), при
этом контаминирующие клетки также полностью эли-
минируются клональной селекцией или подавляются
постоянной или периодически повторяющимся приме-
нением селективных условий. Даже наилучшие методы
физического разделения клеток позволяют иметь место
частичному перекрыванию свойств различных популя-
ции клеток и рекуррентному сверхросту. Стабильное
состояние не может быть доспи нуто, и состав культуры
постоянно изменяется. Из рис. 14.12 можно видеть, что
90%-я чистота клеточной линии А при 10% контамина-
ции ее быстрорастущей клеточной линией В (на 50%
быстрее, чем линия А) в течение 10 дней приводит к
одинаковому содержанию клеток в культуре. Таким
образом, для постоянных клеточных линий в допол-
нение или вместо физических сепаративных методов
требуется применение селективных условий.
Глава 15
РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК
Хотя клонирование и использование селективных ус-
ловий культивирования являются предпочтительным
методом при получении культуры (см. разд. 10.2.1,
14.1. 14.6), но в ряде случаев клетки после посева не
дают клоноц, или, по каким то причинам, невозможно
создать условия для селекции клеток. Таким образом,
может возникнуть необходимость прибе! путь к физи-
ческим или иммуноло! ическим методам разделения
клеток. Достоинство этих методов состоит в том, что
они дают более быстрое разделение клеток, по срав-
нению с клонированием, хотя и с меньшей степенью
гомо! ен ности.
Наиболее эффективные методики разделения
клеток основаны на различиях в 1) плотности клеток
(удельном весе), 2) аффинности антител к эпитопам
клеточной поверхности, 3) размеру клеток и 4) све-
торассеянию или флюоресценции при сортировке с
помощью проточной цитометрии. Для двух первых ме-
тодов требуется относительно несложное оборудова-
ние. и эти методы недорш ие. в то время как два вторых
метода высокотехноло! ичны и требуют значительных
денежных затрат. Для наиболее эффективного разде-
ления часто используются два или более показателей
для того, чтобы получить высокий уровень чистоты
культуры [смотри, например, Calder et al., 2004; AI-
Mufti el al., 20041.
15-1 - ПflOTH ОСТЬ КЛETO К
И ИЗОПИКНИЧЕСКАЯ
СЕДИМЕНТАЦИЯ
Разделение клеток по их плотности можно осуществить
путем центрифу! ирования при низких значениях g,
используя обычное оборудование [Prellow & Pret-
low, 1989; Sharpe. 1988: Calder el a].. 2004: Al-Mufti et
al., 20041. В градиенте плотности клегки оседают до
равновесного уровня, на котором плотность среды
эквивалентна их собственной плотности (изопикни-
ческая седиментация; рис. 15.1). Среда для разделения
должна быть нетоксичной и невязкой ири высоких
плотностях (1,101 мл) и не должна влиять на осмо-
тическое давление раствора. Для этой цели успешно
использовали сывороточный альбумин [Turner et al.,
1967], декстран [Schulman, 1968J. метризамид (Nygaard)
[Munlhe-Kaas & Seglen, 1974| и перколл (Aniershain
Biosciences) [Periofl & Laurent, 19821. Наиболее эффек-
тивными, используемыми в настоящее время средами,
являются перколл (коллоидный кремний) и рентгено-
контрастные йодированные соединения метризамид
и метризоат. Градиент можно создавать 1) наслаивая
перколл различной плотности пипеткой, шприцем
или с помощью насоса, 2) с помощью специального
1 радиентатора (рис. 15.2г) шш 3) высокоскоростного
центрифу! ирования (рис. 15.3).
Варианты
Внесение клеток. Клетки могут быть внесены в
градиент в процессе его образования при центрифуги-
ровании. Хотя при этом требуется только одно центри-
фу! ирование, центрифугирование клеток при высоких
значениях g может повредить их. Кроме того, перколл
[Pertofl & Laurent, 1982], Isopaque [Splinter et al., 19781
и метризамид [Freshney, 1976| могут поглощаться клет-
ками, поэтому предпочтительней наслаивать клетки на
уже сформированный градиент.
Другие среды Одной из наиболее распространен-
ных сред является фиколл, потому что, как и перколл,
его можно автоклавировать. Фиколл обладает немного
более низкой вязкостью при высокой плотности, чем
перколл, что может приводить к агрегации некоторых
типов клеток. Неионное производное метризоата
метризамид (Nycomed) йодированное соединение,
использующееся в радио! рафии (Lsopaque, Hypaque,
Renografin) и для выделения лимфоцитов (см. прото-
кол 27.1), при высоких плотностях обладает меньшей
вязкостью, чем фиколл [Rickwood & Birnie, 19751, но
может использоваться для некоторых типов клеток.
Маркерные гранулы Amershaiu Biosciences произ-
водит цветные маркерные гранулы стандартной плот-
ности, которые можно использовать для определения
плотности в различных участках градиента.
Изопикническая седиментация происходит быс-
трее, чем скоростное осаждение с ускорением (см.
разд. 15.2), и дает более высокий выход клеток на
заданный объем градиентной среды. Идеально, koi да
клетки четко различаются но плотности (>0,02 i см3).
На плотность клеток может влиять uoi лощение клетка-
ми среды, используемой при формировании градиента,
фаза клеточного цикла (в фазе плаго клетки обладают
1Б.2. Размер клеток и скорость седиментации
275
Рис. 15.1. Разделение клеток по их плотности. Клетки наслаивают на предварительно сформированный градиент (см рис. 15.2)
и пробирку цен 1 рифу! ируюг Пробирку помещают в градиентный коллектор, и флотационная среда (например, Fluorochemi-
cal FC43) закачнвас 1ся через входящую трубку на дно пробирки с градиентом, вытесняя градиент и клетки вверх и заставляя
их выходить через отводную трубку в мультнлуночный планшет. Клетки разбавляют средой (так, чтобы они осели на дно) и
культивируют. (Градиентный смеситель ио оршинальнои разработке Dr G.D Birnie.)
более высокой плотностью) и сыворотка [Freshney,
1976]. Так как при изопикнической седиментации не
требуется большое ускорение, ее можно проводить
даже при 1 g.
15.2. РАЗМЕР КЛЕТОК И СКОРОСТЬ
СЕДИМЕНТАЦИИ
На осаждение клеток также влияет их размер (площадь
поперечного сечения), который является решающим
фактором при осаждении клеток при 1 g и важнейшим
компонентом осаждения при высоких скоростях и
более высоких значениях g. Хотя соотношение между
размером частиц и скоростью седиментации при 1 g
сложно выразит ь для частиц субмикронного размера,
для клеток они достаточно просто и может быть выра-
жено приблизительно следующим образом:
V = r2'4
[ Miller & Phillips, 1969], где v скорость седиментации
в мм/ч, а г - радиус клетки в мкм (см. табл. 21.1).
15.2.1. Седиментация в поле силы тяжести
Наслаивание клеток на |радиент сыворотки в среде
позволяет- клеткам оседать в соответствии с вышеп-
риведенным уравнением. Однако с помощью седимен-
тации в поле силы тяжести невозможно обработать
большое количество клеток (-ЛхКУ'кл./см2 площади
276
ГЛАВА 15. РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК
ПРОТОКОЛ 15.1. Разделение клеток
центрифугированием в градиенте плотности
Схема
Сформировать t рад пент, центрифут ировать клетки
в традиенте, собрать фракции, разбавить средой и
культивировать (рис. 15.1).
Материалы
Стерильные:
• Ростовая среда
• Ростовая среда + 20%-й иерколл
• Центрифужные пробирки объемом 25 мл
• D-PBSA
• 0,2516-й трипсин
• Шприц или градиентный коллектор
• Планшеты 24-луночные или для микротитро-
ваиия
Нестерильные:
• Рефрактометр или ареометр
• Гемоцитометр или счетчик клеток
• Низкоскоростная центрифу! а
Протокол
Приготовление градиента плотности
а) Наслаивание
i) Доведите илотностьнерколла до 1.101 см*)и
осмотическое давление до 290 мосмоль/Ki.
ii) Смешайте иерколл и обычную среду в
различных пропорциях, чтобы получить
10 или 20 ступеней в заданном диапазоне
плотности (например. 1,020 1.1001 /см3).
iii)B центрифужной пробирке на 25 мл на-
слаивайте одну ступень на дру1ую (1 или
2 мл на ступень) пипеткой, шприцем или
с помощью перистальтического насоса,
начиная от раствора с самой высокой плот-
ностью и формируя ступенчатый i рад пент.
Можно также (и. возможно, это будет
предпочтительнее) начинать с раствора
г самой низкой плотностью и с помощью
шприца или перистальтическою насоса
подслаивать иод каждый слой раствор с
пост еиенно увеличивающейся плотностью.
Градиент можно использовать сразу после
получения или на следующий день.
б) С помощью t радиентатора: непрерывный ли-
нейный градиент можно создать, смешивая,
например 1,0201/мл иерколла с плотностью
1,080i, см<вградиентаторе(Г|чонч, Pharmacia,
Buehler; см. рис. 15.2).
в) Центрифу! ирование.
i) Поместите среду, содержащую иерколл с
плотностью 1,0851 см1, в пробирку.
ii) Центрифушруйте 1 ч при 20 000 g.
iii) В результате центрифугирования образу-
ется ешмоидный 1радиент (см. рис. 15.3),
форма которою определяется начальной
концентрацией иерколла, продолжитель-
ностью центрифугирования и центро-
бежной силой, формой пробирки и типом
ротора.
1. Триисинизируите клетки и ресусиендируйте их
в среде, содержащей сыворотку или ишибитор
трипсина. Убедитесь, что клетки в суспензии не
образуют агреютов.
2. С помощью шприца, автоматической иииетки или
сужающейся иииетки наслоите до 2x10* клеток в
2 мл среды на градиент.
.3. Пробирку можно оставить в штативе на 4 ч, чтобы
клетки оседали при 1 g. или можно центрифу! и-
ровать при 100—1000 g 20 мин. Если использовать
последнюю процедуру, то скорость центрифу! и-
рования увеличивать постепенно и не применят ь
торможение при остановке центрифу! и
4 Соберите фракции с помощью шприца или гради-
ентною коллектора (Fisons; см. рис. 15.1). Фрак-
ции объемом 1 мл можно собирать в 24-луночный
планшет, объемом 0,1 мл в планшет для мик-
ротитрования. Необходимо регулярно отбирать
образцы для подсчета клеток и для определения
плотности (р) среды с tрадцентом. Плотность
можно измерить рефрактометром (Hilger) или
ареометром (Paar).
5 Добавьте в каждую лунку равный объем среды и
перемешайте, чтобы клетки осели на дно лунки.
Через 24—48 ч инкубации смените среду для уда-
ления иерколла.
поверхностью верхней части градиента) и не позволяет
хорошо разделить клетки, за исключением случаев,
когда клетки значительно различаются ио размеру, а
каждая популяция гомогенна ио размеру клеток. Этот
метод используется при больших различиях в размере
клеток или для отделения агреютов от единичных
клеток, например после расщепления коллагеназой
(см. протокол 12.8).
15.2.2. Элюатриационное
центрифугирование
Большинство методик разделения клеток ио их размеру
основаны или на элюатриашюнном центрифугиро-
вании (которое дает посредственное разделение, но
высокий выход), или на сортировке клеток (точное
разделение с низким выходом; см. разд. 15.4). Центри-
фужный элюатриатор (Beckman Coulter) представляет
собой устройство для повышения скорости осаждения
и увеличения выхода и разрешения при разделении
клеток при выполнении разделения в специально
оборудованной центрифуге со специальным ротором
(рис. 15.4) [Lutz et al., 1992]. Суспензия клеток в среде
закачивается в камеру для разделения в роторе при
его вращении. При нахождении клеток в камере цент-
15.3. Методы, основанные на применении антител
277
Рис. 15.2. Устройство для создания градиента. В прозрач-
ном блоке из твердого пластика вырезаны 2 камеры, соедп
ненные между собой тонким каналом, который проходит
через основание камеры и выходит наружу. В наружное
отверстие вставлена трубка с наконечником из нержавею-
щей стали достаточной длины для ioro, чтобы доставать до
дна центрифужной пробирки. При закрытом клапане левая
камера заполняется средой с высокой плотностью. правая
камера — средой с низкий плотностью. Клапан 1 открывается,
наконечник из нержавеющей стали помещается на дно про-
бирки, запускается мешалка, и затем открывается клапан 2.
Когда раствор из левой камеры течет направо, жидкости
смешиваются, п плотность постепенно повышается, пока
смесь течет ио трубке
робежная сила выталкивает клетки к внешней части
ротора (рис. 15.5). При этом среда прокачивается через
камеру таким образом, чтобы центростремительная
скорость потока находится в равновесии со скоростью
осаждения клеток. Если клетки однородны, то они ос-
танутся неподвижны, но если они различаются по раз-
меру, плотности и структуре клеточной поверхности, то
они будут осаждаться ири разных скоростях. Б. ни одари
тому, что седиментационная камера имеет коническую
форму, скорость потока повышается в направлении
внешней части ротора и создается непрерывный гра-
диент скорости потока. Клетки с различной скоростью
седиментации будут достш ать равновесного состояния
в разных участках камеры. Седиментационная камера
освещается источником стробоскопического света, и за
ее содержимым можно наблюдать через специальное
окно. Кел да кдртки достш ают равновесного состояния,
скорость потока повышается, и клетки выкачиваются
в сосуд-приемник. Разделение можно проводить в
полной среде и продолжать культивировать непосред-
ственно сразу цис че разделения.
Процедура включает 4 этапа: 1) сборка и стерили-
зация аппаратуры, 2) калибровка, 3) загрузка образца
и установление равновесных условий и 4) сбор фрак-
ций. Подробный протокол представлен в инструкции
ио работе с элюатриатором (Beckman Coulter). Рав-
новесие достш ается в течение нескольких минут, и
полный umk.'I занимает 30 мин. За каждый цикл можно
разделить 1х 10м клеток, и разделение можно повторять
столько раз, сколько необходимо Прибор, однако,
достаточно дорогой, и для эффективного разделения
клеток требуется большой опыт работы. С помощью
этого метода можно разделять различные типы клеток
[Teofilieta]., 1996; Lag el al., 1996;Yoshiokaetal., 1997J,
а также клетки на различных стадиях клеточного цикла
[Breder el aL, 1996, Mikulits et aL, 1997]
15.3. МЕТОДЫ, ОСНОВАННЫЕ
НА ПРИМЕНЕНИИ АНТИТЕЛ
Рмс. 15.3. Градиент, полученный с помощью центрифу-
гирования. Градиент образуется при исшрифугированип
перколла ири 20 000 g в течение 1 ч
Существует ряд методик, основанных на специфиче-
ском связывании антитела с клеточной поверхностью.
К ним относятся: иммунный лизис, для которого
используют антитела к нежелательным клеткам, на-
пример фибробластам в популяции эпителиальных
клеток [Edwards et aL, 1980], направленная доставка
нитотоксина с помощью антител [Beattie et al.. 1990],
сортировка клеток с активацией флюоресценции (см.
разд. 15.4), иммунный пэнниш и сортировка на мй1-
нитных гранулах с иммобилизованными антителами
(ма< нитно-активированная сортировка клеток, MACS)
[SaalbachetaL, 1997] (см. разд. 15.3.2). Эффективность
этих методов зависит от специфичности выбранных
антител и презентации соответствующих эпитопов на
поверхности живых клеток, которая подтверждается
с помощью пммуноло! ических методов окрашива-
ния (см. разд. 16.11) или приточной цитометрии (см.
разд. 15.4,16.9.2,21.7.2).
278
ГЛАВА 15. РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК
Из резервуара с
Рис. 15.4. Центрифужный элютриаторный ротор (Beekman). Суспензия клеток и жидкость-носитель помещается в центр
ротора и прокачивается в направлении к периферии п далее в периферийную часть камеры разделения С про тивоположной
стороны ротора расположен обратный контур для уравновешивания
15.3.1. Иммунный пэннинг
Для разделения ряда клеток различных типов успешно
используется процесс прикрепления клеток к чаш-
кам Петри с сорбированными антителами, который
называется иммунный кзннинт [Murphy etal., 1992,
Fujita el al., 2004J. Все многочисленное разнообразие
методик пэннинга проистекает из работы Wysocki and
Sata [ 1978] с субпопуляциями лимфоцитов. Специфи-
ческие для каждого типа клеток антитела к эпитопам
клеточной поверхности сорбируются на дне чашки
Петри и затем в чашку добавляют смешанную попу-
ляцию клеток. Клетки, в отношении которых антитела
специфичны, быстро прикрепляются ко дну чашки.
Остальное затем можно удалить. Можно использовать
как положительный иммунный пэннинг (для того,
чтобы отобрать специфическую субпопуляцию клеток.
Рис. 15.5. Разделительная камера элюатриаториосо ро-
которые затем можно собрать с помощью механичес-
кой обработки или мя|кой триисинизации), так и
отрицательный (чтобы удалить ненужные клетки).
15.3.2. Магнитный сортинг
Для магнитной сортировки используют специфиче-
ские к поверхностным эпитопам клетки антитела,
иммобилизованные на ферритиновых ранулах (Dy-
nabeads производства Dynal; Иллюстрация 23а—с) или
микрогранулах (Miltenyi, Иллюстрация 23d, е). Ко|да
клеточную суспензию смешивают с гранулами и затем
помещают в матитное поле (рис. 15.6), клетки, при-
крепившиеся к Dynabeads, перемещаются к боковой
стенке камеры для разделения. Кома ток отключа-
ется, клетки и । ранулы отсоединяются от стенки, и
далее клетки можно отделить от гранул с помощью
триисинизации или интенсивного пипетирования.
В системе Miltenyi клетки иммуноло!ически сорби-
рованы на микро парама| нптных i ранулах, которые
MoiyT связываться с ферромагнитными шариками
разделительной колонки при внесении колонки в
машитное иоле (рис. 17.7). С помощью этого метода
разделяют мноше клетки, в том числе стволовые,
путем отрицательной сортировки [Bertoncello et al.,
1991J, очищают костный мозг от клеток лейкемии
[Trickett et al., 1990] и выделяют эпителий почечных
канальцев [Pizzonia et al., 1991]. Протокол исполь-
зования Dynabeads доступен на вебсайте Dynal (см.
Приложение III).
15.3. Методы, основанные на применении антител
279
Рис. 15.6. Магнитный сортинг. Отрицательная сортировка. Коммит ированные ирогеннторные клетки из суспензии костного
мозга связаны с парамагнитными гранулами Dynal с помощью антител к линссспсцифичсским маркерам. Отрицательные по
этим маркерам стволовые клетки нс связаны и остаются в суспензии для дальнейшем сортировки с помощью проточной цито-
метрии (а) Внесение пробирки в магнитный штатив (б) Пробирка сразу оказывается в магнитном поле (в) Пробирка через
30 с после помещения в магнитный штатив (см также пл л юс i рацию 23а)
Использование иммунномагнггтных микрогранул
[Gaudernacket al.. 1986] (рис. 15.7. Иллюстрация Plate
23d, е) позволяет продолжать культивировать клетки
или проводить дальнейшие процедуры сортировки
без предварительного удаления гранул (Miltenyi).
Поэтому этот метод особенно полезен для положитель-
ной сортировки. В протоколе 15.2 кратко изложена
инструкция Miltenyi (см. также протокол 23.18D).
Проверьте, нет ли более новой версии протоколов
внесения метки и разделения на вебсайте Miltenyi
(wvvw.millenyibiotec.com/).
ПРОТОКОЛ 15.2. Магнитно-активированный
клеточный сортинг (MACS)
Схема
Лейкоцитарная масса пли другая суспензия смеси
клеток смешивается с микрогранулами с иммоби-
лизованными антителами, разбавляется и наносит-
ся на маг нитную разделительную колонку. Ассоции-
рованные с микрог ранулами клетки связываются с
ферромагнитными шариками колонки, в го время
как несвязанные клетки выходят ггз колонки, не за-
держиваясь. При удалении колонки из маг нитного
поля связанные клетки освобождаются от носителя
и выдавливаются из колонки с помощью поршня.
Материалы
Стерильные:
• Буфер. D-PBSA, pH 7.2, содержащий 0,5% БСА
и 2 мМ ЭДТА
• Магнитный сортировщик клеток: Mini MACS, I
MidiMACS, VarioMACS или StiperMACS (Mil- ।
tenyi)
• Адаптеры для колонки RS+ илгг VS"1-
• Колонка для положительной селекции; MS+Z
RS+ для клеток в количестве до IxlO7; LS - '
VS+ до 1x10*
• Намагничивающиеся микрогранулы с иммо-
билизованными антителами к поверхностному
антигену выделяемых клеток
• Пробирка для сбора образца соответствующая
собираемому объему: для MS+» RS+ на 1 мл; для
LS+ 'VS+ на 5 мл
Протокол
Внесение метки
1. Выделите стандартным методом (см. прото-
кол 27.1) мононуклеарные клетки из перифе-
рической крови или приготовьте клеточную |
суспензию с помощью триисинггзацгги илгг аль-
тернативных процедур (см. протоколы 12.5.12.6.
12.8 и 13.2).
2. Избавьтесь от мертвых клеток с помощью Фи-
колл— Гггиак (см. протокол 12.10).
280
ГЛАВА 15. РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК
3. Удалите агрегаты, профильтровав клетки черен
нейлоновое сито с размером пор 30 мкм или
фильтр (Mikenyi. #414:07). (Перед использова-
нием смочить фильтр буфером.)
4. Промойте клетки буфером м отиентрифут ируите.
5. Ресусиендируйте осадок в 80 мкл буфера на
I О7 клеток (суммарных) (80 мкл минимальный
объем, даже если клеток <10').
6. Добавьте 20 мклмикрограиул MACS на 10'клеток.
7. Смешайте и инкубируйте суспензию 15 мин
при 6-12'С (для меньшего количества клеток
использовать тот же объем).
8. Разбавьте суспензию добавлением 10—20-крат-
ного объема бу (Jiepa.
9. Центрифу! ируите 10 мин при 300 g.
10. Удалите супернатант и ресусиендируйте клетки,
помеченные микрогранулами в 500 мкл буфера на
1x10” клеток.
Положительная магнитная сортировка:
11. Поместите колонку в маг ни гное ноле мат нитного
со пи ювщика клеток MACS.
12. Промойте колонку: MS-»- RS-е 500 мкл; LS+/
VS+ 3 мл.
13. Нанесите суспензию клеток на колонку: на MS+/
RS+ 500 1000 мкл,1 LS+/VSH 1 10 мл.
14. Дайте немеченым клеткам ироити сквозь ко-
15. Промойте колонку буфером. MS+ RS+ Зраза
по 500 мкл; LS+ ,'VS-> 3 раза uo 3 мл.
16. Удалите колонку из сортировщика и поместите
ее в пробирку для сбора образцов.
17. Нанесите пипеткой буфер на колонку (MS+/RS+
1 мл, LS+ VS+ 5 мл) и выдавите положительные
клетки поршнем, который поставляется в комп-
лекте с колонкой.
18. Посчитайте клетки, скорректировать концентра-
цию в ростовой среде:
a) 1x10s—IxlO** кл. мл и посеять в культуральный
флакон для первичной культуры.
б) 10 1000 клеток на 1 мл и посеять в чашку
Петри для клонирования
Парамагнитная микросфера диаметром 50 нм
-Антитело к типоспвцифическому
ферромагнитными сферами (показа-
ны черным цветам) в колонке
жидкости
Анти фибробпаст-ФИТЦ
Смесь фибробластов
и опухолевых клеток
до разделения
Анти-фибробласт-ФИТЦ
Отрицательная
фракция опухолевые
клетки без примеси
фибробластов
Анти-фИбробяаСТ-ФИТЦ
Положительная
фракция
обогащенных
фибробластов
(© Miltenyi Biotec, Germany)
Рис. 15.7. Магнитный сортинг клеток {MACS' Technology}. Положительный сортнш. («) Клетки предварительно инкуби-
руются с иммобилизованными на парамагнитных микрогранулах MACS антигезами к типоспецифическому клеточному по-
верхностному антигену, (б) После нанесения связаныхс микрограну.шми клеток на колонку, они удерживаются в магнитном
иоле, генерируемом магнтом и ма1рнцей колонки, немеченые клетки выходят из колонки (е) После освобождения колоний
из Mai нита клетки, прикрепившиеся к нама!ничснным микрогранулам, выдавливаются поршнем (См. также иллюстрацию
2.31, д.) (к) Um шрамма, полученная с помощью проточной цитометрии. распределения клеюк в культуре опухолевых кле-
ток, содержащей фибробласты, до MACS сортировки (верхняя панель), фракция на выходе после MACS сортировки с мик-
рогранулами с антитезами к фибробластам (см б). обогащенная фракция фибробласюв (нижняя панель) после удаления из
магнитного поля, (г <<' Miltenyi Biotec, исиользус1ся с разрешения производителя) (Анги-фиброблас'г-ФИТЦ измерение
интенсивности флюоресценции клеюк, меченных ФИТЦ-мечсными антителами к поверхностным антигенам фибробластов,
НЕА 125-РЕ измерение интенсивности флюоресценции клеток, меченных РЕ-антгие.игми к НЕ А 125. НЕ А 125 — маркер
опухолевых клеток. РЕ — фикоэритрин)
15.4. Флюоресцентно активируемый клеточный сортинг
281
15.4. ФЛЮОРЕСЦЕНТНО-АКТИВИРУЕМЫЙ
КЛЕТОЧНЫЙ СОРТИНГ
Разделение клеток с помощью флюоресценции
[Vaughan & Milner, 1989] основано на одншюточном
прохождении клеток через лазерный луч. Светорас-
сеяние клеток улавливается одним или несколькими
фотоумножителями и регистрируется (рис. 15.8,15.9).
Если клетки предварительно обработаны флюоресцен-
тным красителем (например, йодистым ироиидием
или хромомицином АЗ для окрашивания ДНК) или
антителами, меченными флюорохромом, то лазер
возбуждает флюоресценцию, которая регистрируется
вторым фотоумножителем. Полученная информация
обрабатывается и выводится на монитор в виде двух
мерною (рис. 15.10) или трехмерного графика
Проточный цитометр представляет собой анали-
тический прибор, который обрабатывает ст нал от
фотоумножителей для анализа состояния клеточной
популяции (например, для определения процента
клеток в разных фалах клеточного цикла, оценивае-
мого по сочетанию измерении флюоресценции ДНК
и размера клеток).
Флюоресцентно-актпивирующий сортер клеток
(FACS; например, FACSAria, производства B-D
Biosciences) представляет собой прибор, который ис-
пользует флюоресцентный сит нал каждой клетки для
сортировки клеток в одну из двух пробирок для сбора
образцов и в резервуар для слива. Если в специальных
координатах для отображения данных установить
ограничения, то сортировщик клеток разделит клетки
в соответствии с заданными в этих координатах свойс-
твами (например, ио высокому или низкому светорас-
сеянию, ио высокой или низкой флюоресценции) и
направит их в соответствующую пробирку-приемник,
расположенную ниже потока клегок. Поток разбива-
ется на капли высокочастотной вибрацией проточной
кюветы. Кайли, содержащие одиночные клетки со спе-
цифическими характеристиками, заряжены к моменту
выхода из кюветы. Эти капли отклоняются налево
или направо, в соответствии с их зарядом, так как они
проходят между двумя противоположно заряженны-
ми пластинами. Заряд подается на короткое время
в промежуток времени после пересечения клеткой
лазершл о луча таким образом, что кайля, содержащая
одну специфически помеченную клетку, направляется
в приемник. Концентрация клеток в потоке должна
быть достаточно низкой для того, чтобы между клет-
ками был достаточный интервал и две клетки не moi ли
попасть в одну каплю (Vaughan & Milner, 1989J.
Трубки для изолирующей жидкости
Трубка для образца
кювета
Пробирки для сбора образцов
Рис. 15.8. Флюоресцентно-активируемый сортер клеток (FACS). Крупным планом изображены проточная кювеча it камера
для разде тения клегок сортировщика клеток модели FACS IV' (Becton Dickinson, см также рис. 15 9)
282
ГЛАВА 15. РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК
Рис. 15.9. Проточная цитометрия. Принцип работы проточ-
ного цнтофо । ометра. Клетки в D-PBSA поступают сверху,
изолирующая жидкость (тоже D-PBSA) закачивается вокру|
потока клеток для создания ламинарного потока внутри
проточной ячейки Когда поток клеток выходит из ячейки, он
пересекает лазерный луч и генерируемый сигнал приводит
в действие заряженный электрод. заряжая, таким образом,
иогпк клеток. Затем 15-кГц вибрационный излучатель, за-
крепленный на проточной ячейке, индуцирует разбивание
потока клеток на капли Капли, выходящего потока несут
кратковременный заряд и отклоняются электродными плас-
тинами, расположенными ниже проточной ячейки. Заряд
подастся на пластины с достаточной задержкой, с учетом
времени прохождения клеток от пересечения лучом лазера
до вхождения в пространство между пластинами (см. |акжс
рис 15.8)
Все клетки, обладающие сходными свойствами, со-
бираются в одну пробирку. Можно установить вторую
систему координат и второй набор си раничений.вэтом
случае можно одновременно собирать в другую пробир-
ку вторую группу клеток, так как ири этом изменится
полярность потока клеток и клетки будут отклоняться
в обратном направлении. Все оставшиеся клетки соби-
раются в центральный резервуар для слива.
Данный метод может быть использован для разде-
ления клеток в тех случаях, koi да какие-либо различия
между клетками можно 3apei истрировать по их свето-
рассеянию (например, размер клетки) или флюорес-
ценции (например, содержание ДНК. РНК или белка;
ферментативная активность, наличие специфических
Номер канала (интенсивность флюоресценции)
Рис. 15.10. Распечатка, полученная после измерения на
FACS 11. Клетки Фрейнда (мышиная эритролейкемия)
фиксировали метанолом в суспензии и окрашивали хро-
момицином АЗ. Затем суспензию смешали с аналогичным
образом зафиксированными и окрашенными эритроцитами
цыпленка и измерили флюоресценцию на FACS II. На рас-
печатке на вертикальной оси отложено количество клеток,
на горизонтальной оси номер канала (интенсивность
флюоресценции). Так как интенсивность флюоресценции
прямо пропорциональна количеству ДНК в клетке, но кри-
вой можно анализировать распределение содержания ДНК
в клеточной популяции. Наиболее низкое содержание ДНК
в эритроцитах цыпленка, кпюрыс использовали в качестве
стандарта. Самый большой пик в районе канала 100 соответ-
ствует клеткам в фазе G1 клеточною цикла. Клетки в области
канала 200, соответственно. находятся в G2 и мет афазе
(с удвоенным количеством ДНК на клетку), а клетки между
двумя пикам и в фазе S (синтез Д Н К). Пик в канале 250со-
ответствует клеткам, в которых содержание ДНК превышает
размерностыикалы ii.uiагрегировавшим клеткам. (Любезно
предоставлено профессором Б D Young.)
анти тенив) и может быть применен к разделению
широкого спектра типов клеток. Наиболее широко
метод возможно использовать для т ематопоэтиче-
ских клеток [Battye & Shortman, 1991; Pipia & Long,
1997], которые относительно лет ко дезат ретировагь
ди необходимой в обязательном порядке клеточной
суспензии, но можно использовать и для солидных
опухолей (например, лет кого [Aitkenetal., 1991], кожи
[SwopeelaL 1997] u кишечника [Boxbergerelal., 1997,
см. также протокол 23.17]). Это чрезвычайно эффек-
тивный прибор, но епт производительность ограни-
чена (допустимый максимум клеток, которые можно
разделить за 1 раз, - приблизительно 1x107 клеток).
(Современные приборы позволяют вести сортировку
со скоростью 7-25 000 кл. с. Прим, пер.) Хотя более
сложные приборы для разделения клеток очень дорого
стоят (приблизительно 200 000 долларов США) и тре-
буют штатного высококвалифицированного операто-
ра, менее дорогие настольные приборы доступны для
аналитически! о использования (например, приборы
производства Guava Technologies).
15.5. Другие методы
283
15.5. ДРУГИЕ МЕТОДЫ
Дручие методы, которые успешно используют для
разделения клеток, слишком многочисленны, чтобы
подробно их описывать. Все они представлены в
табл. 15.1
Электрофорез в градиенте фиколла [Plai soucas el
al., 1979] или на висячем листе бумаш; второй метод,
ио-видимому, более эффективен и используется для
разделения клеток эпителия канальцев почек [Kreis-
berg et al., 19771
В аффинной хроматографии используют анти-
тела [Varon & Manthorpe, 1980; Au & Varon, 1979]
или растительные лектины | Pereira & Kabat. 1979].
иммобилизованные на нейлоновых волокнах [Edel-
man, 1973] или сефадексе (Amersham Pharmacia).
Этот метод представляется полезным для разделения
свежевыделенных клеток крови, но менее подходит для
культивируемых клеток.
Противоточное распределение [Waller, 1975,
1977, Sharpe, 1988] используется для очистки асцит-
ных опухолевых клеток мыши со средней жизнеспо-
собностью.
15.6. СОВЕТЫ НАЧИНАЮЩЕМУ
Начинать лучше всего с простых методик, таких как
разделение клеток в градиенте плотности или если
ТАБЛИЦА 15.1. Методы разделения клегок
Метод Принцип разделения Оборудование Примечания Ссылки
Седиментация при ус- корении 1 g Размер клеток Изготовленные по заказу делитель- ная воронка и пе- регородки Простой метод, но чистота разделения и выход нсвс- Miller & Phillips, 1969
Изопикническая седи- ментация Плотность клеток Центрифуга Простой и быстрый метод Pcrtolt & Lau- rent, 1982, см протокол 15.1
MACS Антитела к поверх- ности клеток Простой магнит и проточная камера Специфичный при наличии высокосиецифичных анти- тел к поверхности Gaudernack et al.. 1986, см. про- токол 15 2
Им.МунНЫЙ ПЭН НИ Hi Антитела к поверх- ности клеток Чашки с сорбирован- ными антителами Простой, несложная техноло- гия, сс 1и имеются в распо- ряжении планшеты, с пред- варительно сорбированны- ми антителами, но также зависит от специфичных антител к поверхности Wysocki & Sata, 1978
Элюатриашюнное цент- рифуг ированнс Размер клеток, плот- ность и конфи 1 ура- иия поверхности Специальная цент- рифуга и элюагрц- ационнын ротор Быстрый, высокий выход, но достаточно сложный процесс Lutz ci al., 1992
FACS Площадь пивсрхности клетки, флюоресцент- ные маркеры, флюо- рогенные субстраты ферментов, многопа- рамстричсский Проточный цито- Сложная технология Vaughan & Milner, 1989
Аффинная хромато- графия Поверхностные клеточ- ные антигены, повер- хностные клточныс углеводы Стерилизуемое Элютриация клеток с колон ки сложна, лучше прово- дить в неприкрепленной суспензии Edelman, 1973
Противоточное распре- деление Электрофорез в гради- енте или на висячем листе бумаги Сродство компонентов клеточной поверх- ности к фазе раство- рителя Поверхностный заряд Шейкер Прибор для электро- фореза на висячьы листе бумаш Неко торые клетки могут по- терять жизнеспособность, но метод в значительной степени эффективен для других кле гок Walter, 1977 Krcishcrg et al., 1977, Platsoueas et al., 1979
284
ГЛАВА 15. РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК
можно upoiпозировать наличие специфического
фенотипа клеточной поверхности, то можно ис-
пользовать ПЭННПН1 на сорбированных чашках пли
MACS. Если частота разделения или выход клеток
неудовлетворительны, тогда может возникнуть необ-
ходимость использовать FACS или элюатриационное
центрифу! ирование. Элюатриационное центрифу! и-
рование удобно для быстрой сортировки большою
количества клеток, но FACS, возможно, дает более
чистые клеточные популяции, так как селекция идет
но двум или более строшм критериям.
В тех случаях, ко1да требуется получить суспензию
клеток высокой чистоты, а выбранная культура не
удовлетворяет этим требованиям, возможно, необхо-
димо использовать двухэтаиное фракционирование
(аналошчно выделению белков). В таких методиках в
качестве цервою этапа используется разделение в гра-
диенте плотности, в качестве второю этапа - цэннинг
или MACS, и окончательное выделение выполняется
с помощью FACS Такая последовательность операций
применяется, например, при выделении гематопоэти-
ческих стволовых клеток [Cooper & Broxmeyer, 1994J.
Глава 16
ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
16.1. НЕОБХОДИМОСТЬ
ХАРАКТЕРИСТИКИ
Существует шесть основных требований к характерис-
тике клеточной линии:
1) Демонстрация отсутствия перекрестной контами-
нации (см. разд. 7.10.1,16.3,16.6.2,19.5; табл. 13.2)
2) Подтверждение специфичности происхождения
3) Корреляция с исходными тканями, включающая
следующие характеристики:
а) Идентификация линии дифференцировки, к
которой принадлежат клетки
б) Положение клегок на этой линии (например,
стволовые клетки, предшественники, или диф-
ференцированное состояние)
4) Определение, являются ли клетки трансформиро-
ванными или нет
а) Является ли клеточная линия конечной или
постоянной (см. разд. 18.2,18.4)?
б) Проявляет ли она свойства, связанные с малш -
низацией (см. разд. 18.6)?
5) Выяснение предрасположенности клеточной линии
к генетической нес габильности и фенотипической
вариации (см. разд. 17.11,18.3)
6) Идентификация специфических клеточных линий
внутри одной группы одного и того же происхож-
дения, селекционированных клеточных штаммов,
гибридных клеточных линий с демонстрацией
свойств, уникальных для этой клеточной .линии или
штамма.
16.2. ВЕДЕНИЕ ДОКУМЕНТАЦИИ
И ПРОИСХОЖДЕНИЕ КЛЕТОК
Когда получают новую клеточную линию из первичной
культуры или из уже существующей клеточной линии,
тогда возникает трудность оценки ее потенциальной
ценности. Часто только после определенного периода
использования и распространения клеточной линии
становится ясной важность и полезность клеточной
линии, и с этой точки зрения приобретает особое значе-
ния детальная информация о ее источнике и развитии.
Однако к этому времени бывает слишком трудно соб-
рать ретроспективные данные Поэтому чрезвычайно
важно вести правильные и полные записи начиная с
момента выделения тканей или получения новой кле-
точной линии, детально описывая источник выделения,
характеристики, все манипуляции с клеточной линией.
Эти записи образуют происгомдение (паспорт) линии,
и чем более детальны эти записи, тем более ценна кле-
точная линия (см. разд. 12..3.11 и 13.7.8).
Этот аспект культивирования клеток стал особенно
важным ирн широком распространении клеточных
линий в клеточных банках и при личных контактах
между исследовательскими лабораториями и ком-
мерческими компаниями, ири которых клеточные
линии распространяются далеко от своего источни-
ка. Подтверждение аутентичности Клеточной линии
включает характеристику такой клеточной линии ири
поступлении, периодически в ходе ее использования,
и подразумевает, что эти данные соотносятся с имею-
щимися в паспорте линии п дополнят их.
16.3. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ АУТЕНТИЧНОСТИ
Характеристика клеточной линии крайне необходима
не только нри определении ее функциональных свойств,
но также для подтверждения ее аутентичности. Особое
внимание должно быть уделено возможности перекрест-
ной контаминации линии с существующими постоян-
ными клеточными линиями, либо вероятным ошибкам
идентификации в результате неверной маркировки или
путанице ири манину^гяциях с линиями. Было показа-
но, что большинство клеточных линий, используемых
в США в конце 1960-х годов, было контаминировано
клетоками HeLa[Gartler, 1967;Nelson-Rees & Flander-
tneyer, 1977; Lavappa, 1978]. Это было первым проявле-
нием большой проблемы, однако дальнейшее использо-
вание культур клеток показали, что мног ие люди еще не
знакомы илгг не желают признавать, что мног ие широко
используемы линии (например, Hep-2. КВ. Girardi
Heart, WISH, Chang Liver) не являются аутентичными
(см. разд. 16.6.2, 16.6.3 и табл. 13.2). Использование
культур, контаминированных HeLa или другими пос-
тоянными Клеточными линиями, без соответствующих
представлений о признаках контаминации до сих
пор является большой проблемой [Stacey et а]., 2000:
Drexler el al., 2003], при этом авторы подчеркивают,
что любая энерг ично растущая клеточная линия может
дать избыточный рост но сравнению с любой медленно
растущей культурой [Masters et al., 1988; vanHelden
el al., 1988; Christensen el al., 1993; Gignac et al., 1993;
286
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
van Bokhuven et al., 2001a, b; Rush et al., 2002]. Хотя
некоторые из работ, проведенных на таких культурах,
остаются достоверными, например, при исследовании
общих молекулярных процессов, которые происходят
независимо от источника клеток. Однако любые по-
пытки соотнести поведение клеток с типом тканей, из
которых они, предполагаемо, были выделены, терпят
поражение и не MOtyT рассматриваться как достоверные
в связи с перекрестной контаминацией. К сожалению,
этот факт часто ut норируется редакторами журналов,
учреждениями, предоставляющими гранты, референ-
тами и исследователями, использующих клеточные
культуры. Характеристические исследования, в том
числе изучение постоянных клеточных линий, сдела-
ли процесс аутентификации жизненно важным для
подтверждения достоверности (валидации) данных
полученных на этой ку^туре.
Природа методов, используемых для характерист и-
ки, зависит от тина проводимых работ; например, если
.net ко доступны молекулярные техноло! ии,то предпоч-
тительны ДНК-фиш ерпринтиш (см. протокол 16.8),
изучение ДНК-профиля (см. протокол 16.9) или анализ
экспрессии генов (см. разд. 16.7 и протокол 27.8), кото-
рые в настоящее время наиболее широко используют-
ся. В то же время uhtoaoi ические лаборатории могут
проводить хромосомный анализ (см. разд. 16.5) вместе
с FISH и окрашиванием хромосом (см. протокол 27.9),
а лаборатории с оборудованием для иммуноло! ической
экспертизы moiутпредпочитать использование МНС
анализа (например, HLA-тииирование) одновременно
с исследованием линейно-сиецифических маркеров.
Комбинация функциональных исследований связана
с вашими собственными интересами, результаты их
должны обеспечивать достоверное подтверждение
аутентичности клеточных линий.
Независимо от возможностей лаборатории в на-
стоящее время славными стандартными процедурами
идентификации клеточной линии являются ДНК-
фи нгерир инти нс или исследование профиля ДНК сс
множественный изоферментный анализ в асарозном
сх?ле (см. протокол 16.10); еслсс вы не можете или не хо-
тите использовать проводить эти идентификационные
процедуры сами, то постарайтесь найтсс коммерческую
компанию, проводящую их.
Некоторые из методов обычно используемые для
характеристики клеточных .синий представлены в
табл. 16.1 [см. также Hay et aL, 2000].
16.3.1. Видовая идентификация
Хромосомный анализ, обычно называемый KCipitomti-
пировамие.и (см. протокол 16.7, 27.5), является одним
из наилучших методов для обнаружения различий
между видами. Анализ распределения полос при диф-
ференцированном окрашивании хромосом может быть
использован для различения человеческих и мышиных
хромосом (см. разд. 16.5), а последующее окрашивание
хромосом с использованием комбинации специфиче-
ских молекулярных зондов для с ибридизации сот дель-
ными хромосомамсс (см. разд. 16.5.3 сс 27.8.2) улучщат
разрешение и специфичность этого метода. Эти зонды
идентифицируют индивидуальные хромосомные пары
и видосссецифссчны. В настоящее время доступность
зондов ограничена несколькими видами, в частности
мышами сс человеком, но окрашивание хромосом
позволяет различать человеческие и мышиные хромо-
сомы iipit возможной перекрестной контаминации и
образованнее межвидовых шбридов. Изоферментный
электрофорез (см. протокол 16.10) также является
хорошим и более быстрым диаеностическим тестом,
чем хромосомное окрашивание. Существует простой
набор, позволяющий выполнить эти исследования
(см. протокол 16.10). Комбинация двух методов часто
используется с однозначными достоверными резуль-
татами [Hav. 2000]
16.3.2. Маркеры дифференцировки
или маркеры ткани
Отдельные органы составлены из тканей, например кожа
состоит из наружного эпидермиса и подлежащей дермы.
Ткансс, в свою очередь, состоят из индивидуальных
линий дифференцировки, например дерма содержит
соединительнотканные фиброциты, клетки сосудистого
эндотелия, 1ладкомышечные клетки, мезенхимальные
клетки кожных бугорков и др.. Можно проследить пр< чtc-
Таблица 16.1. Характеристика клеточных линий н клеточных штаммов
Критерий Метод Ссылка N°протокола
Кариотип Дифференциальное окрашивание хромосом Rothfcls & Snnmovitch, 1958, Roo- ney & Czcpulkowski, 1986 16.9
Изоферментный анализ Элск|р«|форсз в агарном геле Hay, 2000 16.12
Антигоны клеточной по- верхности Иммунщ ПС К1ХИМИЯ Hay, 2000, Burchell ct al., 1983,1987 16.13
Цитоскелет Иммуноцитохимия с анти юлами к спе- цифическим цитокератинам Latte, 1982. Moll ct al., 1982 16.13
ДНК фингерпринтинг Рестрикционный анализ, PAGE, зонды сате uiiiTHoii ДНК Hay. 2000, Jeffreys ct at 1985 16.10
ДНК профиль PCR мккросателлнтных повторов Masterset al ,2001 16.11
16.3. Подтверждение аутентичности
287
хождение каждого тика клеток через серию пролифера-
тивных стадий вплоть до стволовой клетки (см. рис. 3.6),
с формированием древообразной структуры. Каждая
«ветка» этого «дерева» может быть определена как
линия дифференцировки, начиная с базальной клетки
эпидермиса, следуя но кути дифференцировки до обра-
зования зрелого ороговевшего кератиноцита. Некоторые
линии дифференцировки, например миелоидные линии
гематопоэтической дифференцировки, могут ветвиться
на суб-линии (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы),
поэтому экспрессия маркеров клеточных линий также
оказывается код влиянием дифференцировки,т.е.связана
с положением клетки на линии дифференцировки (см.
разд. 16.10). Линейные маркеры полезны для установле-
ния родства отдельных клеточных линий с тканями, из
которых они происходят (таил. 16.1).
Антигены клеточной поверхности. Эти маркеры, в
частности, полезны при разделении гематопоэтических
клеток [Visser & De Vries, 1990], а также эффективны
ири отделении эпителиальных клеток от стромальных
элементов при помощи таких антител как анти—ЕМ А
[Heydenuair et al., 1979], антп-HMFG 1 и 2 [Burchell &
Taylor-Papadimitriou, 1989], а также отделения клеток
нейроэктодермального происхождения (например,
анти-А2В5) [Dickson et al., 1983] от клеток друшх эм-
бриональных слоев.
Белки промежуточных филаментов. Эти бел
ки относятся к наиболее широко распространенным
маркерам клеточных линий или тканей [Lane, 1982;
Ranraekers el al.. 1982]. Кислый 1лиальный фибрил-
лярный белок астроцитов (GFAP) [Bignami et al.,
1980] (см. цв. вкладку 116) и десмин [Bochaton-Pial-
lat et al., 1992; Brouty-Boy’e et al., 1992] мышечных
клеток является наиболее специфичным, в то время
как цитокератин является маркером эпителиальных
клеток и мезотелия [Lane, 1982; Moll et al., 1982] (см.
цв. вкладку 1 la). Белок нейрофиламентов маркирует
нейроны [Wu & de Vellis, 1987; Kondo & Raff, 2000] и
некоторые нейроэндокринные клетки [Bishop et al.,
1988]. Внментин (см. цв. вкладку Не), несмотря на то,
что обычно in two ограничен клетками мезодермаль-
ного происхождения, может in vitro быть обнаружен и
в дру t их типах клеток.
Продукты дифференцировки и особенности
фупкциониорвания. Гемоглобин клеток эритроидно-
го ряда, миозин или тропомиозин мышечных клеток,
меланин меланоцитов и сывороточный альбумин ге-
патоцитов относятся к наиболее известным примерам
специфических маркеров клеточных типов, но, так же
как и маркеры дифференцировки, они зависят от сте-
пени завершенности дифференцировки.
Транспорт неорганических ионов, а также связанный
с ним перенос воды являются характеристикой абсор-
бирующего и секреторного эпителия [ Abaza et al., 1974;
Lever, 1986]; при монослойном (госте некоторые эпители-
альные клетки формируют куполообразные структуры,
или гемицисты, образование которых в монослое связано
с накоплением воды на нижней поверхности монослоя
[Rabito el al., 1980] (рис. 16.1, см. цв. вкладку 12а, б).
Другие специфические функции, которые могут вы-
ражаться in vitro, включают мышечное сокращение и
деполяризацию мембран нервных клеток
Ферменты. Для ферментативной характеристи-
ки могут быть использованы три параметра. 1) кон-
ститутивный уровень (т.е. в отсутствие действия
индукторов и супрессоров), 2) реактивный уровень
(в ответ на действие индукторов или ингибиторов)
и 3) изоферментный полиморфизм (см. разд. 16.8.1.
16.8.2). Изофермент креатинкиназа ВВ является мар-
кером для нервных и нейроэндокринных клеток, как
и нейрон-специфичная енолаза. Лактатдег идрог еназа
присутствует в большинстве клегок, но в различных
изоферментных формах. Высокий уровень тирози-
наминотрансферазы, индуцируемой дексаметазоном,
обычно рассматривается как специфичный для гепа-
тоцитов (табл. 16.2) [Granner et al., 1968].
Рис. 16.1. Куполообразные образования, (а) Купол или гемпцист, образованный в эпителиальном miihoc.ioc в результате
нисходящего транспорта ионов и воды, нижний фокус (на монослое) (б) Верхний фокус (вершина купола) (см также цв
вкладку 12й. б)
288
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
Регуляция. Уровень экспрессии мши их продук-
тов дифференцировки находится иод ре1уляторным
контролем факторов окружающей среды, таких как
гормоны, матрикс, соседние клетки (см. разд. 17.7). Так
или иначе, измерение уровня специфических маркеров
линий клеточной дифференцировки может* потребо-
вать предварительной обработки или инкубирования
клеток, например в присутствии гормона, такого
как гидрокортизон, специфических факторов роста
или выращивания клеток на внеклеточном матриксе
определенного типа. Для иолучения максимальной
экспрессии тирозинаминотрансферазы в клетках пе-
чени и глютаминсинтетазы в глии требуется предвари-
тельная индукция дексаметазоном. Глютаминсинтаза
также сдерживается 1лютамином, поэтому 1лютамин
должен быть замешен в среде за 48 ч до исследования
[DeMars, 1958].
Клональное соответствие. Хотя mhoi ие из мар-
керов, описанных выше, считаются маркерами клонов,
они могут рассматриваться более правильно как ткане-
вые маркеры или маркеры клеточных типов, поскольку
они в большей степени являются характеристиками
функционирования клеток, а не источников их про-
исхождения. Цитокератин встречается в мезотелии
и почечном эпителии, хотя эти ткани происходят из
мезодермы. Нейронсиецифическая энолаза и креа-
тинкиназа В В экспрессируются в нейроэндокринных
клетках ла ких, хотя эти клетки, как теперь известно,
происходят из эндодермы, а не из нейроэктодермы,
как это можно было бы предположить в отношении
нейроэндокринного типа клеток.
16.3.3. Уникальные маркеры
Уникальные маркеры включают специфические хромо-
сомные аберрации (например, делеции,транслокации,
полисомию); антигены лавного комплекса i истосов-
местимости (МНС-антигены), например HLA у челове-
ка, которые обладают высокой степенью полиморфизма
и могут определяться при помощи ДНК-фингеририн-
тин1а (см. протокол 16.8) или изучение профиля ДНК
(протокол 16.9). Ферментативная недостаточность
(например, недостаточность тимидинкиназы (ТК“) и
лекарственная устойчивость (например, устойчивость
к винбластину, обычно соединенная с экспрессией
Р-гликоиротеина одним из пи/г-генов, которые кодиру-
ют выведение белка) не являются истинно уникальны-
ми. но они мо1ут быть использованы для обнаружения
различий между клеточными линиями из одних и тех
же тканей различных доноров.
16.3.4. Трансформация
Состояние трансформации является одним из главных
элементов ири характеристике клеточной линии и бу-
дет рассматриваться отдельно (см. 1л. 17).
16.4. МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК
Изучение морфоло! ии клеток является самым прос-
тым и наиболее прямым методом, используемым для
идентификации клегок Оно имеет* некоторые недо-
Табгица 16.2. Ферменты, являющиеся маркерами
Фермент Клеточный Индуктор Репрессор Ссылка
Глютамилсинтстаза Астроглия (мозг) Г идрокортизон Глютамин Hallcrmcycr & Ham- prccht, 1984
Тирозин аминотрансфераза Гепатоциты Г идрокортизон Granncrctal.. 1968
Сахароза Энтсроциты NaBt Pignataetal, 1994, Va- chon et al., 1996
Щелочная фосфатаза Пнсвмоциты II типа (в легочных альвеолах) Дексаметазон, оксо- статин, IL-6 TGF-₽ Edclson et al.. 1988, McCormick & Fresh- ney. 2000
Щелочная фосфатаза Энтсроциты Дексаметазон. NaBt Vachon et al, 1996
Нсспсцифическая эстфаза Макрофаги РМА. витамин D Muraoctal. 1983
Ahi нотензиниреобразуюпшй фермой1 Нсйронспецифическая енолаза Эндотелий Нейроны, нсириэндокрннные клетки Коллаген, Matrigcl Del Vecchio & Smith. 1981 Hausson et al.. 1984
Тиризиназа DOPA-декарбокенлаэа Меланоциты Нейроны, клетки мелкоклеточной карциномы net ких (SCLC) сАМР Park et al, 1993.1999 Dow ct al., 1995; Ga- zdarctal., 1980
Крсатинкнназа ММ Крсатпнкиназа В В Мышечные клетки Нейроны, нейроэндокринные клет- ки, SCLC IGF-II FGF-1,2,7 Stewart ct al.. 1996 Gazdarcial., 1981
16.4. Морфология клеток
289
статки, которые должны быть учтены. Большинство
из них связаны со свойством пластичности клеточной
морфоло! ни в ответ на культивирование в различных
условиях. Например, эпителиальные клетки, растущие
в центре конфлюэнтного монослоя, обычно имеют пра-
вильную полигональную форму, с ясно очерченными
краями, в то время как те же клетки, растущие на краю
монослоя, мо1ут иметь менее правильную, форму,
отличающуюся разнообразием, а ври трансформации
могут отрываться от монослоя и принимать фибро-
бластоцодобную форму.
В субконфлюэнтном монослое фибробластов, полу-
ченных выделением из почек хомяка или лы ких или
кожи человека, клетки имеют мультиполярную пли
биполярную форму (см. рис. 16.2«, е, цв. вкладку 8а) и
хорошо распластаны на культуральной поверхности
В конфлюэнтном монослое клетки биполярны п менее
распластаны (см. рис. 16.26, ж, цв. вкладку 86, Юг, 6).
Они также образуют характерные параллельные ре-
шетки и завитки, видимые невооруженным i лазом (цв.
вкладка 10д). МышиныеЗТЗ клетки (рис. 16.2;/, ф) при
низкой плотности растут как мультииолярные фибро-
бласты, но в конфлюэнтном монослое приобретаю!
эпителиоцодобную форму (рис. 16.2ц, ч. цв. вкладка
106). Изменения в составе субстрата [Gospodarovvicz
el al., 1978b; Freshney, 1980] и питательной среды
(см. разд. 17.7.2) мшут также привести к изменениям
морфологии клеток. Таким образом, сравнительное
изучение клеток должно всегда проводиться на одной
и той же стадии роста и при одинаковой клеточной
плотности на одной и той же среде, и при росте на одном
и том же субстрате.
Термины «фибробластный» и «эпителиальный»
используются в культуре тканей достаточно прибли-
зительно и часто описывают скорее внешний вид,
чем происхождение клеток. Так, биполярные или
мультииолярные мигрирующие клетки, длина кото-
рых обычно вдвое больше ширины, будут называться
фибробластными. В то же время полигональные
клетки монослоя, с более правильными контурами
клеток, растущие отдельными островками отдельно
от других клеток, обычно рассматриваются как эпи-
телиальные (рис. 16.2», е, и, к, н, о, с). Тем не менее,
koi да идентичность клеток не подтверждается, дол-
жен использоваться термин «фибробласт-кодобные»
или «эпител ий-подобные» (или эпителиоидные»)
клетки. Клетки, происходящие из карциномы, часто
выглядят как эпителиоидные, но имеют большую
вариабельность морфолот ии (рис. 16.2н, о. л, м), не-
которые мезенхимальные клетки, такие как СНО-К1,
и эндотелиальные клетки также при конфлюэнтном
росте обычно имеют эпителий-иодобную морфоло! ию
(рис. 16.2г, т).
Беглый обзор живых культур, преимущественно
при помощи фазово-контрастноцо микроскопа, яв-
ляется более полезным, чем редкие исследования
фиксированных и окрашенных культур, поскольку
морфолт ия живых культур дает более общее впечат-
лен пе о клеточной морфоло! ии и ее пластичности, а
также обнаруживает различия в грануляции и вакуо-
лизации, которые возникают в культуре. Нездоровые
культуры часто становятся гранулированными, а затем
в них обнаруживаются вакуоли, окружающие ядро
(см. рис. 1.3.1).
16.4.1. Микроскопия
Инвертированный микроскоп является одним из са-
мых важных инструментов в лаборатории культуры
тканей, однако часто он используется неправильно.
Поскольку толщина закрытых культуральных сосу-
дов делает наблюдение извне затруднительным из-за
большого рабочего расстояния, культуральный сосуд
помешают на предметный столик, освещают сбоку и
рассматривают снизу. Так как толщина стенок куль-
турального сосуда ограничивает рабочее расстояние,
максимальное увеличение объектива ограничено 40х.
Использование фазово-контрастной оитики, в которой
кольцевой источник света экранируется соответствую-
щими темными кольцами в объективе и виден только
дифракционный свет, позволяет видеть неокрашен-
ные клетки с более высокой контрастностью, чем ирн
обычном освещении. Поскольку это означает, что
интенсивность света более повышена, то для продол-
жительных наблюдений должен быть встроен фильтр
инфракрасно! о спектра.
ПРОТОКОЛ 16.1. Использование
инвертированного микроскопа
Схема
Поместить культуру на предметный столик микро- '
скопа, включить освещение и выбрать подходящую I
оптическую систему. Сфокусировать освещение на
образце, если необходимо, отре! улировать конден- I
сор и фазовое кольцо.
Материалы
Нестерильные:
• Инвертированный микроскоп (см. разд. 5.2.5) I
с фазово-контрастными объективами на 10х и
20х или 40х и конденсор с соответствующими I
фазовыми кольцами
* Салфетки для протирания линз
Протокол
1. Удостоверьтесь, что микроскоп чист. Протрите I
предметный столик 70%-м этанолом и объектив
при помощи специальной салфетки, если это |
необходимо.
2. Включите микроскоп, повышая реостатом интен-
сивность свечения лампы от самой низкой до он-
гимальной. Не включайте сразу на максимальное
освещение.
290
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
3. Проверьте положение конденсора и источника
а) Поместите окрашенный препарат, флакон или
чашку на предметный столик
6) Закройте полевую диаг]>раг му.
в) Сфокусируйте изображение ирисовой диа-
фра! мы.
1) Сцентрируйте изображение ирисовой диа-
фрагмы в ноле зрения.
4. Сцентрируйте фазовые кольца.
а ) Если имеется фазовое телескопическое уст-
ройство, вставьте его на место стандартного
окуляра. Затем сфокусируйте свет на фазовые
кольца и проверьте, чтобы конденсорное коль-
цо (белое на черном) совпадало с объективным
кольцом (черное на белом).
б ) Если фазового телескопического устройства
нет* *, то замените окрашенный образец неок-
рашенной культурой (живой или фиксиро-
ванной), снова наведите на фокус и двигайте
регулятор фазовою кольца до получения
оптимума контраста.
5 Исследуйте клетки. Фазово-контрастный объ-
ектив 10х выявляет достаточное количество
деталей для обычного исследования. Фазово-
контрастный объектив 4х не даст достаточную
детализацию, а большие увеличения, чем 10х,
ограничивают размеры ноля зрения.
а ) Обратите внимание на стадию роста (напри-
мер. редкий, субконфлюлнтный. полный,
плотный монослой).
б ) Обратите внимание на состояние клеток
(наиример, прозрачные и гиалиновые или
< рану лированные, вакуолизированные).
6 Проверьте прозрачность среды (наиример, от-
сутствие остатков клеток, плавающих гранул,
признаков контаминации). Выберите объектив с
большим увеличением (см. разд. 19.3.1. рис. 19.1а,
в, д, и цв. вкладку 16а, б, в).
7 Сделайте запись ваших наблюдений.
8 Поверните реостат и выключите питание микро-
скопа.
9 Верните культуру в инкубатор или перенесите в
ламинарный шкаф для дальнейших стерильных
манипуляций
В культуральных сосудах, взятых прямо из инкуба-
тора, образуется конденсат на внутренней поверхности
верхней части сосуда и крышки. Этот конденсат может
быть возвращен во флакон путем переворачивания
флакона, осторожным перемещением среды ио верх-
ней части сосуда (не позволяя иоиадать на горлышко)
и установкой флакона в вертикальное положение на
10—20 с для того, чтобы жидкость стекла вниз. В случае
использования чашек Петри освобождение от конден-
сата сложнее, и может потребоваться замена крышки на
новую. Если чашки промаркированы правильно,!, е. со
стороны дна, то замена крышки не приведет к каким-то
затруднениям в идентификации культуры. Культуры в
планшетах для микротитрования особенно сложно ис-
следовать из-за дифракции, вызываемой менисками.
В случае если возникает предположение об изме-
нении морфолог пн клеток, полезно иметь записанные
наборы фотографий при различной плотности кле-
ток (см. рис. 16.2) для каждой клеточной линии (см.
протокол 16.6), приготовленные вскоре после приоб-
ретения этой линии, и через определенный интервал
времени ее ведения. Фото1рафирование постоянно
используемых клеточных линий следует выводить на
дисплей, связанный с инвертированным микроскопом.
Сохраненные фотографии могут быть дополнены фо-
тографиями окрашенных фиксированных препаратов
и сканированными радиоаутограммами, полученными
при ДН К-фингерцринтинге либо цифровыми результа-
тами исследования профиля ДНК и храниться вместе
с историей ведения клеточной линии в цифровом или
распечатанном виде
16.4.2. Окрашивание
Применение полихромных красителей, используемых
при окраске мазков крови, таких как краситель Гимза,
является удобным методом для исследований культу-
ры. Однако при окрашивании мазков крови краситель
Гимза обычно применяется вместе с красителем Мэй-
Грюнвальда, не применяемого в культуре тканей. Сам
по себе краситель Гимза окрашивает ядро в розовый или
фуксиновый цвет, ядрышки в темно-синий, а цитоплаз-
му в бледный серо-голубой цвет. Он окрашивает клетки,
фиксированные в этаноле или формалине, но не будет
окрашивать препарат,если только в ходе подготовки не
произведена правильная и полная дегидратация.
ПРОТОКОЛ 16.2. Окрашивание по Гимза
Схема
Зафиксировать культуру в метаноле, окрасить ее
непосредственно неразведенным красителем Гимза,
и затем развести краситель 1:10. Промыть культуру,
и исследовать ее во влажном состоянии.
Материалы
Нестерильные.
• D-PBSA
D-PBS А: метанол, 1:1
Концентрированный краситель Гимза
• Метано,!
• Деионизированная вода
Протокол
Этот иротокол иредиолагает, что исиользуется
монослой клеток, но, начиная с шаг а 6, можно
16.4. Морфология клеток
291
использовать также фиксированные клетки клеточ-
ной суспензии (см. разд. 16.4.4)
1. Удалите среду.
2. Промойте монослом D-PBSA, удалите раствор
3. Добавьте 5 мл D-PBSA метанола на площадь
25 см2. Инку б u ру iire в течение 2 мин и затем
слейте смесь DPBSA/метано^ь
4. Добавьте 5 мл свежею метанола и инкубируйте
10 мин.
5. Слейте метанол замените его свежим безводным
метанолом. Промойте монослой, затем удалите
метанол.
6. В этом пункте монослой во флаконе может
быть высушен и переложен на хранение или
непосредственно окрашен. Важно, чтобы ок-
рашивание было выполнено непосредственно
после промывки свежим безводным метанолом,
даже ири использовании высушенного флакона
Если метанол был вылит из флакона за некоторое
время до окрашивания, то вода будет* шл лощена
остаточным метанолом и ингибирует последую-
щее окрашивание. Даже «сухие» монослои могут
ио|лощать влагу из воздуха.
7. Добавьте профильтрованный краситель Гимза,
2 мл на площадь 25 см2, удостоверившись, что
весь монослои покрыт и остается закрытым в
течение всего времени окрашивания.
б. Через 2 мин разведите краситель в 8 мл воды,
мя|ко покачивайте дальнейшие 2 мин.
9 . Смойте краситель водой так, чтобы образующаяся
пена смывалась струей воды и не оставалась на
клетках. Осторожно промойте клетки проточной
водой, вока не исчезнет розоватый оттенок воды,
но клетки останутся окрашенными (обычно
10-20 с).
10 Слейте воду, промойте монослой вдемонизованной
воде и исследуйте клетки иод микроскопом, пока
монослой все еще влажен. Храните в высушенном
состоянии, перед исследованием увлажните.
Примечание. Окрашивание ио Гимза является прос-
той процедурой, которая дает хороший, высококонт-
растный полихромный препарат, однако преципитация
красителя может привести к появлению пятнышек на
клетках. Преципитат образуется в результате окис-
ления при добавлении воды как иена на поверхности
и ио всей толшине раствора красителя, в частности
на поверхности предметного стекла. Промывание
краситщш восходящим потоком проточной воды уда-
ляет ирецииитированные частицы лучше, чем простое
споласкивание проточной водой или дру не способы
промывания стекла, поскольку обеспечивает удаление
всех частиц цены из препарата.
Препараты фиксированных клеток могут также
быть окрашены ири помощи кристалл-виолета. Крис-
талл-виолет является монохромным красителем
окрашивает ядро в темно-юлу бой, а цитоплазму в
светло-голубой цвет. Этот краситель не так хорош для
морфоло! и чес ких исследований, как краситель Гимза,
но метод легок в использовании и может использовать-
ся повторно. Его удобно применять для окрашивания
клонов ири подсчете, поскольку нет проблем с преци-
питацией, которая есть в случае окрашивания но Гимза,
легче отмывается, позволяя иолучить светлый фон и
обеспечивая ле!кость подсчета колоний.
16.4.3. Культуральные сосуды
для цитологии: монослойные
культуры
Ниже приводится список культуральных сосудов, при-
меняемых для цитологических исследований
1) Обычные 25-см2флаконы или 5-см чашки Петри
2) Покровные стекла (стеклянные ют пластиковые;
см. Приложение II) в многосекционных чашках,
чашках Петри или пробирках Лейтона (рис. 16.3а;
см. также рис. 8.2 и 8.3).
3) Стекла для микроскопа в 9-см чашках Петри или с
iiprijiaiaeMbiMH мноюсекционными камерами (см.
Приложение II; рис. 16.36)
4) Двухмембранные камеры для культур тканей Opti-
СеП(рис 16.3«).
ПРОТОКОЛ 16.3. Окрашивание
кристалл в иол етом
Материалы
Нестерильные:
• D-PBSA
• D-PBSA МеОН: метанол 50% в D-PBSA
• Метанол
• Кристаллвиолет
• Фильтровальная воронка и фильтровальная бу- I
мага таких размеров, чтобы слить 5 мл красителя
с каждой чашки
• Бутыль для использованной краски.
Протокол
1. Удалите среду.
2. Промойте монослой D-PBSA, слейте D-PBSA
3. Добавьте5 мл D-PBSA/МеОН в 25 см2. Оставьте |
на 2 мин и затем слейте D-PBSA, МеОН.
4. Добавьте5 мл свежею метанола и оставьте на |
10 мин
5. Удалите метанол. Промойте проточной водой |
чашки и позвольте им высохнуть.
6. Добавьте 5 мл кристаллвиолета на 25 см2 и ос-
тавьте на 10 мин.
7. Поместите фильтровальную воронку в бутылку
для использованной краски.
8. Слейте краситель в фильтровальную воронку.
9. Промойте чашки проточной водой и затем в ।
деионизованной воде и оставьте чашки до высы- I
хания.
292
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
5) Чашки Petnperin (Heraeus), целлюЛовноацетат-
ные пли поликарионатные фильтры Thermanox и
покровные стекла с PTFE-покрытием, которые ис-
пользуются для ЕМ-цитолО1 ических исследовании
(может потребоваться предварительная обработка
фильтров или PTFEnpii помощи желатина, коллаге-
на, фибронектина. Матри| еля или сыворотки см.
разд. 8.4.1).
16.4.4. Приготовление суспензионной
купьтуры дпя цитологии
Неприкрепляющиеся клетки moi ут быть перемещены
на стеклянную или пластиковую поверхность для ци-
толо! ических исследований. Традиционные методы,
используемые для клеток крови, например даготовле-
ние мазка крови, в случае суспензионных клеточных
культур работают не очень хорошо, поскольку клетки
склонны разрушаться при нанесении мазка, хотя это
разрушение может быть уменьшено путем покрывания
стекла сывороткой и затем распространения клеток в
слое сыворотки.
Центрифугирование. Цитологическое центри-
фу! ирование стало предпочтительной альтернативой
для получения монослойного мазка из суспензионной
культуры клеток. Производители предлагают большой
выбор центрифу। (обычно называемые цитоцентри-
фугой) со специальными держателями для стекол, на
которые осаждаются клетки при центрифу! ировании
(см. Приложение II и рис. 16.4). Держатели, которые
вставляются в роторы, имеют специальные отделы для
образцов, с отверстиями, расположенными напротив
предметных стекол для микроскопов. Обработка сте-
кол сывороткой позволяет предупредить разрушение
клеток при их ударе о стекло
ПРОТОКОЛ 16.4. Подготовка
суспензионной культуры клеток
для цитологических исследований
методом цитоцентрифунгирования
Схема
Развести небольшой объем концентрированных
клеток в отделении для образца in situ и поместить
напротив предметного стекла. Центрифу! ировать
клетки для их перемещения на стекло.
Материалы
Нестерильные.
• Суспензия клеток, 5x10s кл /мл в 50-100% сы-
воротки
• Сыворотка
Рис. 16.2. Примеры морфологии клеток в культуре, (л) ВНК-21 (фибробласты почки детеныша хомяка) в log-фазе Куль-
тура нс конфлюэнтная, клетки хорошо распластаны и беспорядочно ориентированы (хотя начинает появляться некоторая
неслучайная ориентация), (б) клетки ВНК-21 в конце log-фазы и переход на стадию плато, (е) СНО-К1 клонированная линия
клеток яичника китайского хомяка, некоторые клетки фибробластоподобные, другие более эпителиоидные, (?) СНО-К1 клет-
ки при высокой плотности культивирования, пре.(Омляющис свет клетки п более эллиптической формы или эпителиоидные
клетки, меньшее количество веретенообразных клеток. (<)) клетки Vcro в log-стадии, .эпителиальные клетки, формирующие
пласт; (с) популяция клеток Vcro высокой плотности, постконфлюэнтная фаза, плот ный пласт с клетками меньшего диамет-
ра. (лс) низкая плотность (середина log-фаэы) MRC-5 фибробласты эмбрионального JteiKoro человека, случапный рост, хотя
начинается появляться некоторая ориентация, (з) конфлюэнтный монос юй клеток MRC-5c ясно выраженной параллельной
ориентацией, (и) клетки почечного эпителия эмбриона человека, НЕК 293 формирование слоя в середине log-фазы, (к) по-
пуляция клеток НЕК 293 высокой плотности, плотно расположенные эпителиальные клетки, (л) LNCAP, клон FGC клегок
иэ метастазов карциномы простаты в лимфатическом узле, переход к высокой плотности, (л) формирование агрегатов клет ок
LNCaP в культуре высокой плотности, (и) HcLa клетки че ювечсской цервикальной карциномы, (о) HcLa-S3 клон клеток
HeLa, (и) клетки нсй|юбластомы человека 1MR-32; (р) клетки тючки обезьяны Cos-7; (с) клетки почки собаки Madm-Darby
MDCK, (tn) клетки эндотелия аоргы быка BAE, (у) клетки Swiss ЗТЗ, субконфлюэнгный монослой (Sw-ЗТЗ)эмбриона мышл-
альблноса Swiss, (ф)МН-ЗТЗ клетки эмбриона мыши NIH, (х) L-929 клон мыши L-клстки. (ц) Sw-ЗТЗ в конфлюэнтном
монослое. Обратите внимание на низкую контрастность, указывающую на очень плоский монослой, («) постконфлюэнтный
монослой Sw-ЗТЗ, (га) посконфлюэнтный монос кит Sw-ЗТЗ виден центр трансформации, состоящий из клеток, растущих над
монослосм, состояние монослоя демонстрирует, почему эти клетки должны быть субкультивированы задолго до того, как они
достигнут состояния монос.юя, (щ) конфлюэнтный монослой ф>ибробласгов мышиного эмбриона STO, часто используемых
как фидерный слой для эмбриональных стволовых клеюк, (ю) конфлюэнтный монос юй клеюк опухоли молочной же тезы
мыши ЕМТ-6. легко формирует сфероиды, (во) субконфлюэнтный монослой карциномы яичника человека А2780, (бб) куль-
тура колонорсктальной карциномы Сасо-2. часто используемая при изучении трансэпителиального транспорта, (ев) Hcp-G2,
клетки гепатомы человека, иногда используемые для изучения метаболизма наркотиков или потенциальных цитотоксинов,
(zz) НТ-29 колоректальная карцинома, способна к дифференцировке при действии бутирата натрия, (Hd) PC-12, феохромо-
цитома надпочечника крысы, NGF стимулирует развитие нейронального фенотипа, (ее) U-373 MG, глиома человека, одна из
обширного ряда злокачественных и нормальных глиальных клеточных линий, полученных в Упсале, (Швеция) (Фотографии
a—c.y-ц с любезного разрешения ATCC. т с любезного разрешения Peter Del Vecchio, щ,ю. аа-ее — с любезного разрешения
ЕСАСС, см. также цв вкладки 7—10)
16.4. Морфология клеток
293
б
294
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
Рис. 16.2. Продолжение
16.4. Морфология клеток
295
т
Рис. 16.2. Проди мнение
296
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
ц ч ш
Рис. 16.2. Продолжение
16.4. Морфология клеток
297
аа бб
Рис. 16.2. Проди мнение
298
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
• Метанол
• Цитоцентрифуча (см. Приложение II)
• Предметные стекла для микроскопа
• Держатели стекол для центрифу! и
• Вентилятор
Протокол
1 Покройте стекла сывороткой и промойте.
2 Высушите стекла при помощи вентилятора.
3 Промаркируйте стекла.
4 Разместите стекла в держатели и вставьте держа-
тели в ротор.
5 Внесите приблизительно 1-2x10’ клеток в 200-
400 мкл среды, ио крайней мере, в два блока для
образцов (см. инструкцию изготовите.>1я).
6 Включите центрифу! у для перемещения клеток
на стекла при 100 g в течение 5 мин.
7 Быстро высушите стекла, поместите их в МеОН
на 10 мин.
Примечание. Некоторые цитоцентрифу! и требуют
проведения фиксации in situ.
• Требования безопасности. При использова-
нии клеток человека или приматов ротор должен быть
герметично закрыт.
Метод падающей капли. Эта процедура выполня-
ется так же, как в случае приготовления хромосомного
препарата (см. протокол 16.7), но без колцемида и мио-
тонического воздействия. Следует тщательно избегать
образования комков клеток, а Клеточная концентрация
должна быть такой, чтобы клетки не перекрывали дру!
друга. Клетки на краю капли могут разрушаться.
Фильтрация. Этот метод ишида используется в
эксфолиативной цитоло! ии (дальнейшие детали см.
Инструкции производителей Pall Gelman, Millipore,
Sartorius). Этот метод подходит для отбора образцов
из бо.ц>ших объемов с низкой концентрацией.
16.4.5. Микрофотография
Самым простым методом сохранения изображений
на микроскопе яв.>1яется цифровое фотографирование
при иомоши CCD-камеры. Выбор но крайней мере
5-ме|аииксельной камеры дает разрешение, более чем
достаточное для публикации результатов. Э^|ектрон-
ный вариант хранения изображений повышает удобс-
тво поиска, обеспечивает возможность их передачи
на дру! ие сайты, форматирование и редактирование.
Изображение, которое представлено на экране, в то
же время при необходимости может быть распечатано
в черно-белом или цветном варианте
С уменьшением стоимости цифровых камер трудно
оправдать использование пленочных фотоаппаратов.
Тем не менее если вам удобнее использовать фотоилен-
ПРОТОКОЛ 16.5. Фильтрование суспензии
клеток для цитологического исследования
Схема
Осторожно профильтровать суспензию клеток с
низкой концентрацией через вакуумный фильтр.
Промыть клетки и зафиксировать in situ.
Материалы
Нестерильные.
D-PBSA, 20 мл
• Метано.!, 50 мл
Краситель Гимза
• Клей (DPX или Pertuouul)
• Прозрачные фильтры (например, 25-мм ТРХ
или иоликарбонатный, с пористостью 0 5-мкм.
Millipore, Pall Gelman, Sartorius)
Держатель фильтра (например. Millipore, Pall
Gelman, Sartorius)
• Термос (Millipore)
• Суспензия клеток (К)"ячеек в 5 10мл среды с
20% сывороткой)
Вакуумный насос
Протокол
1. Соберите фильтрующий комплект (рис. 16.5) с
прозрачным фильтром диаметром 25-мм и диа-
метром пор 0.5-мкм.
2. Осторожно профильтруйте вакуум ным фильтром
суспензию клеток через фильтр, фильтруя оста-
ток среды до конца.
3. Осторожно добавьте 10 мл D-PBSA. koi да объем
суспензии достигнет 2 мл.
4. Повторите mai 3, когда объем D-PBSA уменьшит-
ся до 2 мл.
5. Добавьте 10 мл метанола к D-PBSA и продол-
жайте добавлять метано.!, пока чистый метанол
не будет фильтроваться через фильтр
6. Выключит е вакуум до топ», как профильтровался
весь метанол.
7. Поднимите фильтр и высушите на воздухе.
8. Окрасьте фильтр красителем Гимза, промойте
водой и высушите.
9. Поместите фильтр на предметное стекло, при
помощи клея DPX пли Peruiouni закройте по-
кровным стеклом с небольшим грузом, придав-
ливающим покровное стекло.
ку, то существуют два основных размера негативной
и позитивной пленки Polaroid, которые вы можете
использовать: 35 мм, который лучше подходит для
обычной цветопередачи, и большеформатные черно-
белые фотографии Эх 12 см (3,5x4,5 дюйма), которые
хороши для мелкосерийных черно-белых фото! рафий.
Может быть использована также пленка одноступен-
чатого процесса, производимая Fudji. В этом случае
вы можете получить немедленный результат без про-
16.4. Морфология клеток
299
Рис. 16.3. Культуральные сосуды для цитологии. («)
Флаконы Nalgc Nunc с подвижной стропой, флакон имеет
съемную сторону для обработки (6) Слайд-камсры Lab-Tek.
съемные пластмассовые камеры на обычном предметном
стекле микроскопа Имеются одно-, 2-, 4-, 8- и 16-камсрныс
стекла, (в) Культуральные камеры OptiCcll с верхними и
нижними пластмассовыми мембранами, используемые как
для культивирования кле, ок, так и для наблюдения (а, б
с любезною разрешения NalgeNunc. с любезного разрешения
доктора Donna Pcclil)
Рис. 16.4. Цитоцентрифуга. Общий вид внутренней части
центрифуги. Ротор и полипропиленовые держатели с юкол
помещены в пазы, один держании, в разобранном виде пред-
ставлен слева (Sakura Finetek)
цессов обработки и ленки а печати снимка. Стоимость
одного фотокомплекта достаточно высока, но при этом
происходит значительная .экономия времени. Тем не
менее некоторые фотокомнлекты одноступенчатой
300
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
ПРОТОКОЛ 16.6. Цифровая фотография
на микроскопе
Схема
Установить микроскоп, проверить выравнивание
оптики и сфокусировать объектив на выбранной
области образца. Проверить соединения камеры с
компьютером, перевести световой луч на камеру,
сфокусировать изображение и сохранить его
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные
• Культ ура для исследования (удостоверьтесь, что
культура является свободной от грязи, наиример
замените среду в первичной культуре перед фо-
тог рафированием)
Нестерильные:
• Инвертированный микроскоп (см. разд. 5.2.5) со
следующими атрибутами: фазово-контрастные
объективы на 10х и 20х или 40х
• Фазовый конденсор с фазовым кольиом для объ-
ектива 20х или 40х
• Тринокулярная головка или другой порт с адап-
тером для CCD камеры
• Нейтральные фильтры плотности, 2х и 4х
• Салфетки для линз
• Графический планшет
• Каретка с микромет рической установкой
Протокол
1. Приготовьте культуру для фотог рафирования:
а) Для культур во флаконе:
i) Перенесите культуру в ламинарный шкаф,
ослабьте крышку, оставьте культуру
охлаждаться.
ii) Затяните крышку на флаконе, когда со-
держание флакона приобретет комнатную
температуру, чтобы избежать любой де-
формации флакона при охлаждении.
iii)Ополосните средой внутреннюю часть
внутренней поверхности флакона, чтобы
удалить любое уплотнение, которое могло
сформироваться.
iv) Позвольте пленке, образованной средой,
высохнуть при вертикальном положении
флакона.
б) Для чашек н планшетов:
i) Позвольте куль гуре охладиться до ком нат-
нои температуры в ламинарном шкафу.
ii) Замените крышку чашки или планшеты
(удостовериться, что образец помечен со
стороны дна чашки или планшета).
2. Выберите иоле зрения и увеличение (4х лучше
для клонов или фотографирования монослоя,
10х -для репрезентативных снимков и 20х для
детализации клеток), избегая недостаточно хоро-
ших полей или попадания в поле зрения марки-
ровки на флаконе. (Всегда маркируйте боковую
сторону флакона или чашки, а не крышку или
основание.)
3. Проверьте фокусировку:
а)Сфокусируйте бинокуляр, отрегулируйте ио
глазам, используя окулярную шкалу.
б)Сфокусируйте микроскоп.
4. Подключите монитор, проверьте яркость гг контраст'
изображения на экране, регулируя интенсивность
света реостатом иа микроскопе для черно-белых за-
писей п с нейтральными фильграми плотности для
цветных (хотя изображение в дальнейшем может
быть повторно обработано с помощью компьютера,
если цветопередача неправильна).
5. Повторно сфокусируйте микроскоп, если необ-
ходимо
6. Сохраните изображение с разрешением, соот-
ветствующим окончательному использованию
изображения, обеспечивающему оптимальное
электронное хранение (наиример. 940x740 зани-
мает 2 МБ на диске и обеспечивает приемлемое
качество изображения при воспроизведении в
размерах 12x18 см).
7. Выключите свет, чтобы избежать перегревания
культуры.
Примечание. Чтобы минимизировать перегрева-
ние, может быть включен инфракрасный фильтр.
8. Повторите mai и 3—6 с применением каретки с мик-
рометрической установкой при том же увеличении,
чтобы показать масштаб увеличения. Если это
изображение обработано тем же самым способом,
как другие снимки, эта фотография может быть
использована для создания масштабной шкалы.
9. Возвратите культуру в инкубатор.
10. Заиишите название файла в таблицу с названием
культуры, иначе изображения будет трудно найти.
11. Сохраненные изображения могут рассматри-
ваться, редактироваться и форматироваться при
помощи ирог рамы типа Adobe Photo Shop и могут
быть распечатаны на высококачественном струй-
ном цветном лазерном принтере или принтере
Kodak ColorEase.
обработки не даю г достаточного качества, относи-
тельно низкоконтрастны, а цветопередача хуже, чем у
обычных фотопленок. Кроме того, у таких отпечатков
меньший срок хранения.
16.5. ХРОМОСОМНЫЙ СОСТАВ
Хромосомный состав, или кариотип, является одной из
основных характеристик и наиболее точным критерием
для идентификации клеточной линии и связи его с тем
видом н иолом животного, от которого они были полу-
чены. Примеры кариотипов мыши и человека можно
най ги на сайте wu'ie.pathology.washington.edu/galleries/
16.5. Хромосомный состав
301
Cytogallery/, а крысиный на сайте kUpy'/ratmapgyn.
gu-se.'Idiograin.htrnl. См. также кариотип человека в
М itelm an [1995] и других млекопитающих — Hsu and
Benirschke [1967], хотя последний был опубликован
прежде, чем была обнаружена исчерченность хромосом.
Хромосомный анализ может также позволять разли-
чать нормальные и трансформированные клетки (см.
разд. 183.1), поскольку количество хромосом наиболее
стабильно в нормальных клетках (кроме мышей, где
хромосомный набор нормальных клегок при культи-
вировании может достаточно быстро меняться).
ПРОТОКОЛ 16.7. Приготовление
хромосомного препарата
Схема
Зафиксировать клетки, блокированные в метафазе и
набухшие в г ииотонической среде. Капнуть клетки на
стекло, окрасить и исследовать (рис. 16.6) [ Rolhfels и
Siminovilch, 1958, Roouey и Czepulkowski, 1986].
Материалы
Стерильные или асептически подготовленные:
• Культура клеток в log-фазе
• Кольцемид, 1x10 ’ М в D-PBSA
• D-PBSA
• Трипсин неочищенный, 0,25%
Нестерильные:
• Гипотонический раствор: 0,04 М. KCL, 0,025 М
цитрат натрия
• Свежеири!отопленный фиксатор (уксусный
метанол). 1 часть ледяной уксусной кислоты
плюс .3 части безводного метанола или этанола,
хранить на льду
* Краситель Гимза
• DPX или Permount mountant
• Лед
• Центрифужные пробирки
* Пастеровские иииетки
• Стекла предметные
• Стекла иокровные, # 00
• Чашка для стекол
• Низкоскоростная центрифуга
• Вор гекс-миксер
Протокол
1. Внесите культуру во флакон 75 -см* 1 2 3 4 * ири плотности
2х10’-5х10’ кл./мл (4xl0-’u IxlO1 кл./см2) в объ-
еме 20 мл.
2. Приблизительно через 3—5 дня, ко!да клетки на-
ходятся в log-фазе роста, добавьте к среде 0,2 мл
колцемида 1x10 ~’М до конечной концентрации
1x10 7 М.
3. Через 4—6 ч осторожно удалите среду, добавьте
5 мл 0.25% трипсина и инкубируйте культуру
10 мин.
4. Центрифугируйте клетки в трипсине, удалите
супернатант с трипсином.
Добавить колхицин
колцемид или
винбластин к клеткам на
стадии log-фазы на 4-6 ч
для блокирования клеток
в метафазе митоза
Трипсинизировать
клетки или стряхнуть
метафазные клетки, если
они слабо прикреплены,
ресуспендировать
в гипотоническом
цитратном растворе при
37 °C на 5-30 мин
а
Поместить пробирку с
суспензией в холодный
уксуснокислый метанол,
центрифугировать, и
ресуспендировать в
свежем фиксаторе
Повторно
центрифугировать,
ресуспендировать в
свежем фиксаторе
при более высокой
концентрации, капнуть
суспензию на стекло и
быстро высушить
Проверить плотность
клеток и их
распластывание;если
удовлетворительное,
окрасить по Гимза и
закрепить покровное
стекло
Когда клей высохнет,
исследовать под
ЮОх иммерсионным
объективом
Рис. 16.6. Приготовление препарата хромосом. Пршхпх1влс-
нпс препарата хромосом из монослойиоп культуры методом
раскалывания
302
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
5. Ресусиендируйте клетки в 5 мл итотонпческого
раствора и оставьте их в течение 20 мин при 37 °C.
6. Добавьте равный объем свежеприготовленного
холодного уксусного метанола, постоянно пере-
мешивая, затем отцентрпфу! пруйте клетки при
100 g в течение 2 мин.
7. Удалите супернатант, разбейте осадок на вортекс-
миксере, медленно добавляя свежий уксусный
метанол при постоянном перемешивании.
8. Оставьте клетки в течение 10 мин на льду.
9. Центрифу!ируйте клетки в течение 2 мин при
100 g.
10. Удалите супернатант, содержащий уксусный ме-
танол, и ресусиендируйте осадок на вортекс-мик-
сере в 0,2 мл уксусного метанола, чтобы получить
суспензию отдельных клеток.
11 Наберите одну кайлю суспензии в кончик пасте-
ровской пипетки и каините примерно с высоты
30 см на холодное предметное стекло. Наклоните
стекло и позвольте капле стечь ио стеклу.
12. Быстро высушите стекло над сосудом с кипящей
водой, исследуйте в фазово-контрастном мик-
роскопе. Если клетки равномерно распределены
и не касаются друз дру1а, приготовьте большее
количество стекол, используя ту же самую кон-
центрацию клеток. Если клеток слишком много
и они перекрывают дру! дру1а, то надо развести
суспензию в 2 раза и в 4 раза и вновь сделать
препарат капли. Если клетки при разведении
находятся в удовлетворительной концентрации,
приготовьте большее количество стекол. Если
нет. то разведите суспензию далее п повторите
этот inai
13. Окрасьте клетки красителем Гимза:
а) Размести ге стекла в кювету для окрашивания,
помещенную над раковиной.
6) Полностью покройте клетки несколькими
каплями профильтрованного красителя Гимза
на 2 мин
в) Залейте стекла приблизительно 10-кратным
объемом воды.
1) Оставьте стекла для дальнейшей окраски еще
на 2 мин.
д) Отмойте краситель проточной водой.
Примечание. Не сливать краситель со стекол,
поскольку это оставит на стенке пену окислившейся
краски: все! да смывать краситель водой. Даже koi да
окрашивание проводится в чашке, краситель нпко! да
не сливают, он должен быть смыт струей воды.
е) Закончите окраску, промывая каждое стекло
про точной водой, чтобы удалить любой осадок
красителя.
ж) Проверьте окраску под микроскопом. Если
качество удовлетворительно, полностью вы-
сушите стекло, закройте покровным стеклом
#* 00 при помощи клея DPX или Permouni.
Варианты
Блокирование KiernoK в метафазе. 1) Можно ис-
пользовать винбластин, 1х10_,’М вместо колцемида.
2) Продолжительность блокирования клеток в мета-
фазе может быть увеличена для того, чтобы увеличить
количество метафазных пластинок на препарате для
подсчета хромосом, или укорочена для снижения
конденсации хромосом и улучшения распознавания
исчерченности (см. разд. 16.5.1).
Сбор митотических к temoK. Метафазные клет-
ки некоторых культур, например С НО или HeLa,
легко отделяются от субстрата при встряхивании
(метод «встряхивания»), не требуя трипсинизации.
Процедура проводится следующим образом: 1) до-
бавить колнемид, 2) осторожно удалить колцемнд и
заменить его i ипотоническим раствором цитрат/КС1,
3) встряхнуть флакон для того, чтобы отделить от под-
ложки метафазные клетки до или после инкубации в
1 ипотонпческой среде, и 4) фиксировать клетки, как
описано выше.
Гипотоническая обработка. Заменить только
0,075 М КС1 или вместе с 50% раствором HBSS в
дистиллированной воде на ыиютонический цитрат,
использованный в протоколе 16.9. Продолжительность
1 ипотонпческой обработки может варьировать от 5 до
30 мин для снижения лизиса или улучшения расплас-
тывания клеток.
Расп шстыаание клеток по стеклу. Возможно, на
этой стадии существует больше возможностей для ва-
риаций, чем на какой-то еще. Эти вариации призваны
обеспечить большую степень и площадь распласты-
вания клеток на препарате. Эти вариации включают:
1) изменение высоты падения капли на стекло (закре-
пите пипетку в штативе и отметьте положение стекла,
проведя пробную серию испытаний с определением
оптимального); 2) высушивание в пламени (высушите
стекло после падения капли прогреванием над пламе-
нем или выжш анием фиксирующей жидкости пламе-
нем сразу после распределения капли по стеклу; однако
последний может затруднить последующую идентифи-
кацию исчерченности); 3) i лубокое охлаждение стекла
(поместите стекло на твердый СО,до распластывания
клеток); 4) охлаждение осажденной клеточной суспен-
зии в холодильнике в течение ночи до того, как капнуть
на стекло; 5) капать на охлажденное стекло (например,
погрузить стекло в холодный этанол п высушить перед
применением) и затем поместить стекло над стаканом
кипящей воды; 6) наклонить стекло или сдуть каплю
ио стеклу в то время, как капля растекается (см. также
протокол 27.5,27.9).
16.5.1. Дифференциальное окрашивание
хромосом
Эта группа методов (см. [see Rooney & Czeptilkowski,
1986] была разработана для того, чтобы обле! чить
идентификацию отдельных пар хромосом при неболь-
16.5. Хромосомный состав
303
ших морфоло! ических различиях между парами [Wang
& Fedoroff, 1972,1973]. Для окрашивания по Гимза бел-
ки хромосом частично расщепляются трипсином, что
приводит к появлению исчерченности при дальнейшем
окрашивании. При окрашивании хинокрином трип-
синизация не требуется. Хромосомная исчерченность
индивидуальна для каждой пары хромосом (рис. 16.7).
Существуют следующие методы выявления хромо-
сомной исчерченности 1) метод Гимза (использование
только трипсина или, чаще, совместное применение
трипсина и EDTA); 2) Q-окрашивание [Caspersson el
al., 1968] (окрашивание клеток 5%-м (v v) раствором
ди1 идрохлорида хинокрина в 45%-й уксусной кисло-
ты, промывание препарата и заключение препарата в
деионизованной воде при pH 4.5) [Lin & Uchida.1973;
Uchida& Lin. 1974]; 3) С-окрашивание (этот метод поз-
воляет выделить районы центромеров, фиксированные
препараты предварительно обрабатываются в течение
15 мин 0,2 М HCI и 2 мин 0.07 М NAOH и затем обра-
батываются в течение ночи SSC (либо 0,03 М цитрата
натрия, 0,3 М NaCI или 0,09 М цитрат натрия, 0,9 М
NaCI) до окрашивания красителем Гимза [Arrighi &
Hsu, 1974] (см. протокол 27.5).
Методы, которые были разработаны для идентифи-
кации хромосом мыши и человека, преимущественно
помотают при анализе тибридов мышиных и челове-
ческих кариотипов. К этим методам относятся: флюо-
ресцентное окрашивание красителем Hoechst 33258,
вызывающею более интенсивное свечение мышиных
центромеров ио сравнению с человеческими [Hilwig &
Gropp. 1972; Lin et al., 1974], щелочное окрашивание
красителем Гимза («Giemsa-11») [Bobrow et al.. 1972:
Friend et al., 1976] (см. рис. 16.7») u т ибрттдизация in
situ с хромосомными красшпелши (см. ниже и прото-
кол 27.9).
16.5.2. Хромосомный анализ
Ниже описаны методы, при помощи которых может
быть проанализирован хромосомный набор клетки:
1) Подсчет хромосом. Подсчет количества хромосом
на препарате проводится для 50—100 мазков (хро-
мосомы должны иметь исчерченность). При помо-
щи кабельного телевидения или камеры-люцида
можно облегчить процесс. Вы должны постараться
подсчитать все митозы, которые вы увидите, и
классифицировать их а) ио количеству хромосом и
б) если подсчет невозможен, то как «почти дипло-
идные, без возможности подсчета» «полиплоидные
без возможности подсчета». Представьте результа-
ты в качестве i истограммы (см. рис. 3.9).
2) Кариотип. Сделайте цифровые фотографии при-
мерно 10—20 препаратов дифференциально окра-
шенных хромосом. Используя Adobe Photosliope
или аналогичные графические программы, вырежь-
те отдельные хромосомы и поместите их в новый
файл, iae их можно будет развернуть, подрезать,
разместить в линию и рассортировать (рис. 16.8).
Рис. 16.7. Окрашивание хромосом. («) Выявление диекоа
в хромосомах человека ко стандартному методу окраски по
Гимза (6} Тот же препарат, что и в (в). но окрашенный по
Hoechst 33258. (в) Гибрид человеческой и мышиной клеток,
окрашенный ио Гимза при pH 11 Хромосомы человека
менее интенсивно окрашены, чем мышиные хромосомы.
Некоторые хромосомы пречериелп транслокацию, образовав
человеческо-мышиный гибрид (С любезнеого разрешении
R L. Church.)
Для получения кариотипа следует использовать
программы, позволяющие автоматически анализи-
ровать изображение (например, Leica CW4000).
Дифференциальное окрашивание хромосом (см.
иротокол 27.5) и окрашивание хромосом (см. иро-
токол 27.9) позволяют получить совокупный образ
типичного кариотипа в виде стилизованной картины.
304
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
2 /л '• fl II «А»
»)! (I V р
£И«*»’ -
Приготовить цифровую фотографию
отдельно расположенных хромосом
Выбрать и скопировать каждую
хромосому отдельно
Повернуть хромосому так, чтобы она
располагалась вертикально, короткими
плечами вверх
Вырезать хромосомы и расположить
так, чтобы центромеры находились
на одной линии, рассортировать по
размерам и форме
Отбросить остатки, включая
нежелательные части примыкающих
хромосом
бб лл пл •
Когда все хромосомы на месте,
установите яркость и контрастность
так, чтобы подавить фон
Рис. 16.8. Препарат кариотипа. Последовательные этапы приготовления картины кариотипа с цифровой фотографии
метафазном пластинки Клетки китайского хомячка, повторно клонированные из штамма Y-5 Ycrgaiiianb and Leonard [19611
(уксуснокислый орсин)
называемой идеограммой. Идеограммы человека, мыши
и лошади доступны на сайте wuu'.pathology.Washington,
etlu/research. 'cytopages. 'а крысы - на сайте ratmap.gen.
gu.se Idiogram.html.
Подсчет хромосом и кариотииирование позволяет
провести видовую идентификацию клеток и при
использовании дифференциального окрашивания
хромосом различить варианты клеточных линий и
хромосомные маркеры. Тем не менее связывание и
кариотииирование являются трудоемким процессом.
Для подтверждения или исключения перекрестной
контаминации культур может быть эффективным
подсчет хромосом с быстрой проверкой морфологе и
самой большой хромосомы.
16.5.3. Окрашивание хромосом
С развитием флюоресцентно меченных зондов, которые
связываются со специфическим участком и даже со
специфическим геном на хромосоме, стало возможным
определить локализацию генов, идентифицировать
транслокации и определить видовой источник хромо-
сом. Этот метод применяется в технологеи гибриди-
зации in situ, которая также может быть использована
для экстрахромосомальной и цитоплазматической
локализации специфических аминокислотных после-
довательностей, а также для определения местонахож-
дения специфических видов месенджерной РНК (см.
протокол 27.8 и 27.9).
16.6. Содержание ДНК
305
16.6. СОДЕРЖАНИЕ ДНК
Содержание ДНК может быть намерено но флюорес-
ценции нроиидия йодида цри помощи CCD камеры
или в проточном цнтофлюорпметре | Vaughan & Milner,
1989 J (см. разд. 15.4 и 21.2), хотя создание необходимой
суспензии единичных клеток разрушает* исходную
топографию образца. Анализ содержания ДНК, в
частности, полезен при характеристике TpanctjiopMu-
рованных клеток, которые часто анеунлоидны или
гетероилоидны (см. разд. 18.3).
16.6.1. Гибридизация ДНК
Гибридизация специфических молекулярных зондов с
уникальными последовательностями ДНК (Саузерн-
блоттинг) [Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1996]
может позволить получить информацию о видоспе-
цифичных участках, амилифицированных участках
ДНК, или изменении основных последовательностей,
специфичных для данной клеточной линии. Таким
образом, штамм-специфическая генетическая амп-
лификация, например амплификация гена дигидро-
холатредуктазы (DHFR), может быть определена в
клеточных линиях при селекции по устойчивое г и
к метотрексату [Biedler et al.,1972); амплификация
М DR гена в винбластин-устойчпвых клетках [Schoen-
lein et al., 1992J; i ииерэксирессия специфических
онкогенов в трансформированных клеточных линиях
[Bishop, 1991; Hames & Glover, 1991; Weinberg, 1989];
а также делеция или утрата гетерозигоности супрес-
сорных генов [Witkowski, 1990, Marshall, 1991]. Хотя
подобные нарушения могут быть определены при
рестрикционном расщеплении цельной ДНК. метод
ограничен необходимым количеством ДНК и более
общепринято использование ПЦР-метода с приме-
нением специфических праймеров к интересующей
последовательности, позволяющей проводить де-
текцию при относительно малом количестве клеток,
что обусловливает ею использование в лаборатор-
ных условиях. В альтернативном методе детекции
специфических последовательностей ДНК методом
ибридизации in situ (см. разд. 27.8) могут быть ис-
пользованы специальные зонды, применение которых
имеет ряд преимуществ, позволяющих определить
iliiii* liiiiliiii
Рис. 16.9. ДНК-фингерпринтинг. Саузерн-блоттню ДНК клсiочных линий, расщепленных при помощи рестрикционного
фермента Hinfl и гибридизованныс с мпнисатетлитным зондом 33.15 [Jeffreys ct al., 1985[. (а) ДНК-фиш срирпнтинг HeLa
контаминированных клеточных линий и субклонов клеточной линии HeLa cell line. Связывающие участки идет ичны в случаях
ко|да анализировались исходные культуры, полученные из банка клеток (М) и полученные в ходе работы или при передаче
клеюк в друте банки (D). Участки финссряриншша были стабильны для клеточных линий, но в некоторых случаях были
обнаружены дополнительные полосы (а) (например. HeLa Ohio, INT 407, и Chang Liver). (С любезного разрешения G Stacey,
NIBSC. UK.) (б) Четыре линии человеческой тлпомы—MOG-G-CCM, U-251 MG. SB-18. и MOG-G-UVW (три отдельных
блока)—и удвоение полос контрольной ВНК-21 (С любезного разрешения G. Stacey. NIBSC. UK.)
306
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
тоши рафические особенности и гетерогенность ДНК
в клеточной популяции.
Также возможно помети гь клеточные штаммы для
дальнейшей идентификации путем трансфекции ре-
портерных генов, таких как зеленый флюоресцентный
белок (GFP), люцифераза или Р~1алакгозидаза [Krotz
el al., 2003], и затем определять его ко флюоресценции,
люминесценции или ири помощи Саузерн-блоттин!
или путем хромогенного ферментативного исследова-
ния генного продукта.
16.6.2. Фингерпринтинг ДНК
ДНК имеет области, известные как сателлитная ДНК,
которая, цо-видимому, не транскрибируется. Эти об-
ласти имеют большое количество повторов, их длины
различны, начиная от минисателлитной ДНК, имею-
щей от 1 до ЗО-kb повторов, до микросателлитной ДНК,
имеющей в повторяющихся последовательностях
только 2—4 основания. Функции этих областей недо-
статочно понятны, они могут иметь чисто структурную
функцию или moivt предоставлять потенциальную
область, кодирующую генетические рекомбинации для
дальнейшей эволюции. Тем не менее независимо от их
функции эти области не являются высококонсерва-
тивными, поскольку они не транскрибируются, и они
дают начало областям шиервариабельности. Koi да
ДНК режется специфическими эндонуклеазами, го
специфические последовательности мшут быть поме-
чены при помощи кДН К, которые i ибридизируются
с этими гимерварпабельнами участками, либо moivt
быть амилифицированы ПЦР-методом со специфи-
ческими матрицами. Эти зонды были разработаны
Jeffreys el al. [1985] (см. протокол 16.8; Stacey el aL,
1992). Электрофорез показывает' варианты в длине
фра1 ментов сателлитной ДН К (полиморфизм длины
рестрикционных фра1 ментов (RFLPs), которые явля-
ются специфичным для тоге ор1анизма, из которою
выделена ДНК. При анализе методом электрофореза
в полиакриламидном геле каждая индивидуальная
ДНК дает специфический шбридизационный учас-
ток (паттерн), который можно установить методом
ауторадиографии с радиоактивными или флюоресцент-
ными зондами. Эти участки извес гны как «отпечатки
пальцев» и специфичны д^гя каждой клеточной линии,
если только от одной особи не получено несколько
клеточных линий или если линии клеток не получены
из одной высоко инбредной линии животных.
ДНК-фингериринты достаточно стабильны. При
культивировании клеточных линий, полученных из
одного источника, но поддерживаемых в разных лабо-
раториях в течение mhoi их лет сохраняются очень по-
хожие фингериринты. ДН К-ф ин гериринтинг является
очень эффективным методом в определении происхож-
дения клеточной линии, если сохранилась исходная
клеточная линия, или ДНК. полученная из нее или от
донорской особи. Этим подчеркивается необходимость
сохранения крови, тканей, или образца ДНК ири вы-
ПРОТОКОЛ 16.8. Мульти локусный
I фингерпринтинг ДНК клеточных линий
I
а) Приготовление Саузерн-блотов
ДНК клеточных линий
Схема
Экстракция ДНКиз клеток расщеплением при помо-
щи рестрикционных ферментов иммобилизованных
на нейлоновой мембране методом Саузерн-блоттин-
га [Ausubel el aL, 1996.2002], и шбрцдизация ДНК
с меченой фаговой ДНК фа1а М13.
Материалы
Стерильные:
• D-PBSA: фосфатно-буферный раствор, без Са’*и
Mg-’ (pH 7,2)
• Hinfl фермент и буфер (например, Life Technolo-
gies)
Нестерильные.
• А1арозные гели: 0,7°о агароза (Тип 1А, Sigma) в
IxTBE. 1 mi л бромисто! о этидия
• Требование безопасности. Бромистый
этидий - потенциальный канцероген. Выполняйте
правила безопасности.
• ТВЕ, 5х (основной раствор, pH 8,2): 541 основно-
го Трис (Sigma), 27,51 борной кислоты (Sigma), и
20 мл 0,5 М. EDTA, динатриевой соли (Sigma)
• 3ai ру.ючный буфер, 6х: 0.25% (объемных) бром-
фенол-синий, 0,25% (объемных) цианол ксилола,
и 40% (объемных) сахарозы в дистиллированной
воде
* Кислотный промывочный раствор. 500 мл 0,1 М
HCL
• Щелочной промывочный раствор: 500 мл 0,2 М
1 идроокись натрия, 0,6 М NaCl
• Нейтрализующий раствор: 500 inL 0.5 М Трис,
pH 7,6,1,5 М NaCl
* SSC. 2х: 1-к-10 разведение основного раствора
20х SSC
• SSC, 20 (основной раствор) 175,3 г NaCl (Analar,
Merck) и 88,21 цитрата натрия (Analar, Merck)
растворенного в дистиллированной воде до ко-
нечного объема 1,0 л, ири pH 7,2.
Протокол
1. Дважды отмойте в D-PBSA приблизительно
1х107ячеек (полученных соскребанием или
триисинизацией) и получите осадок клеток в виде
таблетки.
2. Из определенного небольшого количества экстра-
• ируйте высокомолекулярную геномную ДНК,
как описано в шаге 6 этого протокола; проверьте
ее целостность электрофорезом в минигеле. Ме-
тод экстракции ДНК без применения фенола.
16.6. Содержание ДНК
307
которым обычно используется для клеточных
линий, был описано u Stacey et al [1992]
3. Определите количество ДНК УФ-сиектроско-
иией, используя разведение ДНК 1.501 Sainbrook
etal., 1989].
4. Смешайте 5 mki ДНК с 40 U фермента Hinfl,
3 мкл 10х ферментною буфера и стерильной
дистиллированной водой до конечною объема
30 мкл.
5. Инкубируйте смесь при 38 ' С в течение ночи.
Повторно перемешайте, через 1 час микроцент-
рифу| ируйте । идролизат.
6. Проверьте.1авершен1Х»стьрасщепления,электро-
форезом в агарозном минигеле 1 мкл i идролизата
в 9 мкл электрофоретического буфера (IxTBE) и
2 мкл 6х загрузочного буфера. Hinfl i идролизат
должен показать полоски низкомолекулярных
фра| ментов ДНК (< 5 КБ) без остаточной по-
лосы геномной ДНК (20—30 КБ).
7. К остатку i идролизата добавьте 6 мкл 6х загру-
зочной смеси, поместите в аналитический агароз-
ный гель (0,7% в lx ТВЕ. 1 mi л бромистчл о эти-
дия, ио крайней мере, 20 см длиной) параллельно
с маркером расщепления Hindlll и i мдролизатом
5 mki ДНК стандартной клеточной линии (на-
иример, HeLa). Проведите Электрофорез смеси
приблизительно в 3 Vz см пока <]>pai мент Hind III
с 2.3 КБ не достигнет конца геля (т.е. 17-20х).
Сфото| рафируйте гель против бедой линейки
в ультрафиолетовом трансиллюминаторе для
оценки величины перемещения.
8. Обработайте выделенные фрас менты ДНК в геле
кислотным промывочным раствором (15 мин),
щелочным раствором (30 мин) и, наконец, ней-
трализующим (30 мин). Затем агорозный гель
может быть перенесен на нейлоновую мембрану
Hybond N, Amersliain). Наиболее просто исполь-
зование капиллярного действия, использую-
щею 20х SSC буфер, как описано Sainbrook el
al [ 1989]. Затем промойте мембрану в 2х SSC,
высушите и заверните в специальную упаковку
Saran Wrap (Dow) или ее эквивалент
9. Зафиксируйте фра1 менты ДНК на мембране пу-
тем экспозиции ДНК в ульт рафиолетовом свете
(302 нм) в течение 5 мин, используя UV-трансил-
чюминатор (например, ТМ20, UVP Inc).
10. Фиксированные мембраны должны храниться в
темном месте в сухих полиэтиленовых мешках до
Iибридизаци и.
б) Подготовка меченного фаговой
ДНК М13 фага
Схема
Пометить ДНК M13mp9 DNA случайным расши-
рением праймера [Feinberg u Vogelslein, 1983] и
очистить ДНК на колонке Sephadex.
Материалы
Стерильные:
• Матрица: M13mp9 ssDNA (0,25 нг, рмл; Boeh- |
ringer Mannheim), растворенный 1:4 в дистилли- ।
рованной воде
• HEPES, 1 М., pH 6,6
• DTM реактив: dATP, dCTP, и dTTP, ио 100 мкМ I
каждого в 250 тМ Трис - HCL, 25 мМ MgCLu |
50 мМ 2-меркаит<ютанола (pH 8.0)
• Требование безопасности. Помните, что |
2-меркаитоэтаиол летуч и ядовит.
• ОЬреактив: 90 О. D. единиц олигодеоксирибонук-
леотидов в 1 шМ Трис и 1 mM EDTA (PH 7,5)
• Буфер для метки. LS буфер (100:100.28 1 М I
HEPES: DTM: OL)
* Бычий сывороточный альбумин (20 mi /мл, для
использования в молекулярной биолоши, Life |
Technologies)
• а [ 12Р| dGTP (3 Ci/ммоль; Amershatu Interna-
tional Pic)
• Требование безопасности. Помните, чю
32Р источник частиц, обладающих высокой
энершей, действие которых должно быть мини-
мизировано. Всегда используйте перчатки и 1-см
плексш ласовый экран.
Фермент Кленова (1 мкг мл, для сиквенса; I
Invitrogen)
Sephadex колонка (наиример. колонка NICK, I
Amershain Pharmacia)
Буфер для колонок: 10 тМ Трис - HCL, pH 7.5,
1 тМ EDTA
Протокол
1. Смешайте 2 мкл растворенного ДНК М13 с
11 мкл дистиллированной воды в стерильной I
ми кроиробирке.
2. Поместите пробирку в кипящую водяную баню I
на 2 мин
3. Переместите пробирку на лед на 5 мин.
4. Добавьте в пробирку 11,4 мкл LS буфера и 0,5 мкл |
BSA.
5. За плексш ласовым экраном добавьте в пробирку
10 мкл [,2Р| dGTP и 2 мкл фермента Кленова.
6. Перемешайте содержимое пробирки, кратковре-
менно центрифу! ируйте.
7. Оставьте пробирку на ночь при комнатной тем-
пературе за плексигласовым экраном.
8. Аккуратно нанесите содержимое пробирки ири
помощи пинетки на колонку Sephadex, предвари-
тельно уравновесив с 10 мл буферного раствора
для колонок.
9. Применив 2х 400 мкл буфержи о раствора для ко- ।
лонок, соберите элюат со второй порции, 400 мкл,
в микропробирку как очищенную пробу.
308
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
• Требование безопасности. В колонке ос-
танется высокий уровень радиоактивности, из-за
задержания в ней невключенного нуклеотида
10. Кипятите очищенную пробу в течение 2 мин и
охладите на льду перед смешиванием гебриди-
зационным раствором.
в) Гибридизация
Схема
Гибридизовать меченую ДНК №13шр9 с ДНК кле-
ток, полученной методом Саузерн-блоттинга; после
тщательной отмывки использовать авторадиогра-
фию чтобы визуализировать образцы фрагментов,
связавшие последовательности №1.3 (Westneal и
друше, 1988].
Материалы
Нестерильные:
• Ilpei мбридизационныи i ибрадизационныи рас-
творы: 0,263 М ди натриифосфат, 7% (объемных)
додецилсульфат натрия, 1 мМ EDTA. 1% (объем-
ных) V фракции BSA (Roche)
• Раствор для тщательной промывки: SSC, 2х
• SSC, 20х (основной раствор): 175,31 хлористого
натрия (Analar, Merck) и 88,2 цитрата натрия
(Analar, Merck) растворенных в дистиллирован-
ной воде до конечного объема 1 л при pH 7,2
Протокол
1. Добавьте мембраны к 200 мл (до трех мембран)
предварит ельно нагретого до 55 °C раствора для
npei ибридизации в полиэтиленовой коробке для
бутербродов.
2. Покачивайте коробку 4 ч при 55 °C.
3. Переместите мембраны в 150 мл предвари ге.чьно
нагретого раствора для {ибридизации во второй
коробке для бутербродов при 55 °C, добавьте
ирокипяченый и охлажденный зонд.
4. Покачивайте коробку при 55 °C в течение ночи,
как минимум 16 ч.
5. Перенесите (до двух мембран) в 1 л раствора для
тщательной промывки и покачивайте смесь при
комнатной температуре в течение 15 мин.
6. Повторите шаг 5.
7. Замените промывочный раствор 1 л предвари-
тельно нагретого до 55 °C промывочного раствора
плюс 0.1% SDS и покачивайте коробку мри 55 °C
в течение 15 мин
8. Промойте мембраны в lx SSC при комнатной
температуре.
9. Подсушите мембраны на воздухе на бумажном
фильтре, затем оберните их в Saran Wrap и опре-
делите при помощи счетчика Гейгера Мюллера
уровень радиоактивности. Примените метод ав-
торадио! рафии при 80 °C, позволяющий оце-
нить время экспозиции пленки для pei истрацип
X-лучей. Используйте две пленки (например, Fuji
RX) для 1 ибрпдизованной Саузерн-мембраны в
кассете для авторадиографии.
10. Проявите одну пленку после ночной экспозиции,
для того чтобы обеспечить более точную оценку
требуемого времени экспозиции. Используйте
стандартные реактивы для pei истрации X-лучей
(например, 1:5 (по объему) проявитель CD 15
в течение 5 мин и CD40 фиксатор в течение
5 мин).
делении первичной культуры (см. разд. 12.3.11). Более
того, при предиола! аемой перекрестной контаминации
или подозрении на неправильную идентификацию
фингерпринтин] может быть использован для иссле-
дования клеток и всех потенциальных источников
Заражения. ДН К-фингерпринтиш может подтвердить
результаты ранее проведении! о и.зоферментного ана-
лиза или кариотипирования, [Garller. 1967; Nelson-Rees
& Flandermeyer, 1977; Lavappa, 1978;Nelson-Reesetal_,
1981 J, показав, что мноше широко используемые кле-
точные линии заражены линией HeLa (см. разд. 16.3,
7.10.1, 19.5; рис. 16.9 п табл. 13.2). Дальнейший про-
токол ДНК-финкгернринтипга был разработан Glyn
Stacey (NIBSC, South Minims, Herts EN6 3QG, England,
United Kingdom). После публикации первого сообще-
ния о мультилокусном ДН К-фиш ерпринтинге Jeffreys
et al. [ 19851 было разработано множество зондов для
анализа полиморфных локусов, называемых VNTRs
(variable number landein repeals, вариабельное коли-
чество тандемных повторов). При мультилокусном
ДНК-фингерпринтин! е зонды используются в таких
условиях, которые позволяют проводить перекрестную
ибрпдпзацию с различными семействами ДН К с пов-
торяющимися последовательностями. Таким образом,
конечный результат представляет собой разнообраз-
ную информацию из различных частей генома и, таким
образом, метод потенциально чувствителен к измене-
ниям в составе ДНК генома клеточной линии. Первый
протокол, приводимый здесь, основан на исходной
методике мультилокусно! о ДНК-фиш ерпринтинга,
разработанного Jeffreys et al. (1985), который был с
успехом применен в экологических исследованиях кле-
ток млекопитающих и немлекопитающих животных,
а также растений и микроор! анизмов. Пока еще этот
подход требует высокою уровня образования и опыта
проведения электрофореза в ai арозном геле. Быстрый
блог-анализ при Саузерн-блоттинге основан на при-
менении си шальной системы щелочной фосфатазы,
что позволяет получить результаты анализа за один
рабочий день. Использование в качестве зонда повто-
ряющихся последовательностей генома фага М13 для
исследования идентичности было продемонстрировано
на животных, растениях и бактериях и таким образом
представляет собой очень широкомасштабную технику
аутентификации, которая имеет дополнительное пре-
имущество, заключающееся в том, что чистые ДПК-
16.6. Содержание ДНК
309
зонды коммерчески доступны, и при предполш аемом
исследовании клеточных линий имеющих различную
видовую принадлежность, этот метод анализа иден-
тичности клеточной линии имеет достаточно низкую
стоимость. Коммерческие наборы и системы для
ПЦР-анализа являются быстрым решением вопроса
аутентичности клеточных линии человека, и будут
обсуждаться ниже.
• Требование безопасности. Описанная проце-
дура включает работу с радиоактивными материалами
и должна проводиться в соответствии с государствен-
ными и частными требованиями безопасности. До
начала проведения такой работы проконсультируйтесь
в комитете но биоло! ической безопасности.
Обсуждение. Этот простой метод фингерпринтин-
га использует ДНК фаге М13 (рис. 16.9), который дает
подходящие образцы для фиш ериринтиша клеточных
линий широкого Kpyi а клеток животных, включая на-
секомых. Обратите внимание, что некоторые культуры
мо< ут дать фингериринты с полосами высокого моле-
кулярного веса, которые плохо различимы. И в этом
случае может быть полезно интерпретировать только
те полосы, которые находятся в диапазоне МВ 3 15 kb
Разрешающая способность данного метода можеч
быть повышена использованием 0,78 kb фра1 мента
Clal-Bsml М1.3 DNА,содержащего наиболее полезные
зондовые последовательности. MoiyT применяться
также нерадиоактивно меченные зонды [Moreno,
1990]. Кроме того, для фннгерцрннтинга могут быть
полезны зонды 33.15 и 33.6 [Jeffreys el al., 1985J и
олигонуклеотцдные зонды, например (GTG)- [Ali el
al., 1986], которые предла1аются компаниями Tepnel
и Fresenius, соответственно. Тем не менее ДНК фаге
М13 является наиболее лег кодоступным и дешевым
зондом для мультилокусног о фиш ериринтиш а, кото-
рый может быть с успехом применим для широкого
диапазона видов клеток
Разнообразные однолокусные зонды и ГЩР-метид
для анализа VNTR также успешно испытан для иден-
тификации различных культур клеток. Мультиплекс-
ные PCR-наборы для человеческих клеточных линий
(например, Promega) позволяют получать профили,
специфичные для данного источника происхожде-
ния культуры клеток. Однако опыт работы с такими
системами показывает, что Саузерн-тест-системы
могут оказаться неспособны обнаружить различия
между клоном и общим источником (Y. Reid, American
Type Culture Collection, личное общение), хотя эти
различия мо< ут быть найдены при помощи мультило-
кусного ДНК-фингерцринтинга [Stacey el al., 1993].
При использовании методов, основанных на рандо-
мизирован ном амилифнццрованном полиморфном
анализе ДНК, которые используют короткие случайно
выбранные праймерные последовательности могут
возникать проблемы в воспроизведении результатов
Тем не менее однопраймерный методы, основанные на
мини- или микросателлитных последовательностях,
являются более мног ообещающими н могут получить
в дальнейшем широкое распространение [Meyer el
al., 1997J. ПЦР-методы также могут применяться
для определения видового происхождения клеточ-
ной линии [Stacey el aL, 1997J. Существуют также и
другие методы идентификации, которые не требуют
использования ПЦР, в том числе изофермент ный
анализ (см. разд. 16.8.2) и электрофорез продуктов
рестрикции геномной ДНК в а(арозном геле [Stacey
et al., 1997].
Для аутентификации человеческих клеточных
линий существует все возрастающее число комкании,
иредла! ающих системы идентификации (Приложе-
ние II). Автор не может ручаться за качество систем,
предоставляемых этими организациями, иолому очень
важно при взаимодействии с подобными комканиями
задать ряд вопросов, которые позволят вам убедиться
в том, что предлагаемое оборудование соответствует
вашим потребностям. Необходимо узнать следующее:
• Производят ли они иредла! аемые системы сами или
только являются посредниками, осуществляющими
продажу?
• В чем специфичность метода, используемого для
индивидуальной идентификации?
• Использую гея л и генетические маркеры, при помо-
щи которых работают профессиональные оргениза-
ции пли дру1 ие экспертные центры?
• Имеется ли опыт интерпретации данных для кле-
точных линий?
• Имеются ли у них специалисты, но работе с этим
методом, для консультации в интерпретации полу-
ченных данных?
• Имеют ли они аккредитацию соответствующей
профессиональной или правительственной гума-
низации или формальное членство в какой либо
экспертной группе или организации?
Следует помнить, что крупные оргонизации по сбо-
ру и коллекции образцов, такие как АТСС (hllp:/ wwvv.
atcc.org), ЕСАСС (hpa.org), DSMZ (blip: /www.dsmz.
de), JCRB (http /cellbank.nibio.go.jp/ ), также MOiyr
дать консультацию ио тестированию и провести его
как сервисная ор1анпзация.
Мультилокус ные методы имеют определенные
возможности для определения изменений в генети-
ческой структуре во мнелих локусах генома [Thacker
el aL, 1988] и в целом более универсальны для анализа
большого количества видов. Метод фингерпринтинга,
описанный в протоколе 16.10. предлагает дешевый и
несложный путь для проведения качественного конт-
роля клеточных линий, полученных из различных
видов животных. Такие методы дают возможность
одновременного подтверждения идентичности и ис-
ключения перекрестной контаминации. Как показано
рядом авторов (например, Stacey el aL, 2000; Masters
el al., 2001) существуют важные критерии для того,
чтобы подтвердить сопоставимость полученных дан-
ных и исключить потерю времени и средств, которые
неизбежны ири неправильной идентификации или
перекрестной контаминации культур.
310
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
16.6.3. Анализ профиля ДНК
Поскольку микросателлитные последовательности
достаточно маленькие, то возможно их идентифици-
ровать и определять количество коротких тандемных
повторяющихся (STR) последовательностей в опре-
деленных локусах. Мультиплексная система второ! о
поколения (SGM) исследует 7 различных областей
генома, a SGM Plus® исследует 11, давая разделяющий
потенциал 1:10s. Пока это единственная система, кото-
рая применяется для человеческих линий клеток, но
имеется большой потенциал для получения большо! о
количества данных, которыми можно было бы обме-
няться между различными лабораториями | Masters el
а]., 2001; Langdon, 2OO4J. Исследование профиля ДНК
предлагается как сервисное обслуживание множеством
лабораторий, включая LGC u АТСС. Следующий иро-
токол был представлен Amber Janies (LGC Diagnostics
Dept., Queens Road, Teddington, Middlesex, TW11ONJ,
England, UK).
ПРОТОКОЛ 16.9. STR-анализ профиля
ДНК клеточных линий
Теоретическое обоснование
Перекрестная контаминация между линиями кле-
ток - давняя и частая причина научных ошибок и
заблуждений. По оценкам, до 36% клеточных линий
имеет иное происхождение, чем предполагают иссле-
дователи. STR-анализ профиля ДНК ири помощи
SGM Plus'" обеспечивает быстрый и недоро! ой путь
идентификации STR профиля линии клегок, которая
передается и распространяется между лаборатория-
ми | Masters et al., 2001J
Схема
DNA извлекается из осадка клеток при помощи
мин и-наборов Qiagen® QIAampE1; лкстрашрованная
ДНК амнлифицируегся при помощи SGM Plus'" и
затем разюняется на акриламидном геле кри помощи
секвенатора ABI377 DNA, с последующим анализом
при помощи про! раммного обеспечения GeneScan®
Genotyper®.
а) Экстракция осадка
Реактивы и иатериалы
• ДНК-мини-набор QIAamp®
• Мпкроцентрифужные пробирки. 1,5 мл (наири-
мер, пробирки Eppeudorf Biopure Safelock)
• Центрифу!а (наиример, Eppendorf 5415D пли
подобная спецификация)
* Водяная баня или духовка, способная к поддер-
жанию температуры 56 °C
• Вортекс-миксер
• Абсолютный этанол
Фосфатный буфер, 0701 М. (например, таблетки
Sigma PBS, 2 таблет ки, разведенные в 400 мл
воды)
• Перед началом процедуры должны быть подго-
товлены следующие реактивы:
а) Разведенный раствор протеазы: добавить
соответствующее количество растворителя
протеазы к лиофилизированной протеазе
Qiagen® Раствор является устойчивым до
2 месяцев при хранении кри 2-8 °C.
б) Буферные растворы AW 1 и AW2: добавить
соответствующее количество абсолютного
этилового спирта в бутылки, содержащие
концентраты AW 1 и AW2. Буферные раство-
ры AW1 и AW2 стабильны при комнатной
температуре в течение года.
в) AL буферный раствор: перед использова-
нием тщательно перемешать, переворачивая
флакон.
Протокол
(Протокол изготовителя набора с незначитель-
ными модификациями.)
Если клетки не суспендированы в кулыпуромтой
среде, начните с шага 5.
Если осадок был получен из культуральной
среды:
1 Центрифу! ируйте образцы при 20 000 g в течение
2. Используя автоматическую цииетку с лепим
нажимом, тщательно удаляющую супернатант,
слейте его.
3. Ресусиендируйте клетки в 200 мкл PBS
4. Повторите шаш 1 и 2 еще раз.
5. Ресусиендируйте клетки в 200 мкл PBS
6. Внесите пипеткой по 20 мкл протеазы Qiagen® в
пустые маркированные 1,5-мл микроиробирки.
7. Добавьте 200 мкл каждого образца в пробирки,
содержащие протеазу.
8. Добавьте 200 мкл AL буфера (лизирующего бу-
фера) в каждую пробирку.
9. Перемешайте каждую пробирку при помощи
вортекс-миксера приблизительно 15 с.
10 Инкубируйте образцы при 56 °C в течение
10 мин.
11. После этого осадите содержимое каждой пробир-
ки центрифу! ированием приблизительно 3 с ири
1000 g.
12. Аккуратно откройте каждую пробирку и добавьте
200м к л абсолютного этилового спирта.
13. Перемешайте при помощи вортекс-миксера
каждую пробирку 15 с и центрифугируйте при
1000 g в течение 3 с для формирования осадка.
14. Аккуратно перенесите смесь в соответственно
маркированную QI Аатр® вращающуюся колон-
ку, помещенную в 2-мл собирающую пробирку.
15 Закройте крышку колонки и вращайте при 6000 g
в течение 1 мин
16.6. Содержание ДНК
311
16. Поместите вращающуюся колонку в чистую
собирающую пробирку и слейте пробирку, со-
держащую фильтрат.
17. Аккуратно откройте крышку вращающейся ко-
лонки и добавьте 500 мкл буфера AW 1.
18. Повторите шЭ| и 15 ц 16.
19. Аккуратно откройте крышку вращающейся ко-
лонки и добавьте 500 мкл буфера AW2.
20. Закройте крышку и центрифу! ируйте цри
20 000 g 3 мин.
21. AW2 буфер может оказать негативное влияние на
дальнейшие процессы, поэтому же.>1ательно заме-
нить собирающую пробирку и вращать колонку в
течение Следующей минуты при 20 000 g, чтобы
гарантировать, что весь AW2 буфер удален.
22. Поместите колонку в соответственно маркиро-
ванную м икроцентрифужную 1,5-мл пробирку.
23. Откройте крышку колонки и добавьте 200 мкл
АЕ буфера (элюирующий буфер)
24. Инкубируйте при 56 °C в течение 1 мин, затем
центрифу! ируйте при 6000 g в течение следую-
щей минуты.
25. Определите количество ДН К в каждом образце,
например, цри помощи Picogreen (Molecular
Probes).
26. Если образцы не должны быть амилифнцированы
немедленно, поместите их на хранение заморо-
женными.
6) Амплификация при помощи SGM Plus™
Реактивы и уатериалы
• Компоненты SGM Plus1” PCR смесь (реакцион-
ная смесь AMPF STR" PCR, набор праймеров
AMPF STR* SGM Plus™, ДНК полимераза
Amplitaq gold*)
• Чистая стерильная вода (например, вода для
культуры тканей Sigma)
• Термоциклер (например, ABI9700)
Протокол
1. В «>ответствии с инструкцией к термоциклеру
ABI приготовьте соответствующую смесь для
образцов, которые будут амилифнцированы
На каждый образец потребуется:
а) 21 мкл реакционной смеси AMPF STR'" PCR;
б) 11 мкл набора праймеров AMPF 'STR® SGM
Plus™-,
в) 1 мкл ДНК полимеразы Aniplilaq gold®).
2. На каждый образец разлейте но 30 мкл реакцион-
ной смеси в индивидуальные PCR пробирки imh
в тонкую пластину для микротитрации, окружен-
ную стенкой, запечатайте пластину адгезивной
фольгой
3. Выньте образцы из морозильника и разморозьт е.
4. Перемешайте образцы.
5. Добавьте приблизительно 1 hi ДНК к соответ-
ствующей аликвоте SGM смеси Plus™ PCR
SGM, доведите объем чистой стерильной водой |
до 20 мкл.
6. Одновременно амилифицируйте образец с из- |
вестным генотипом в качестве контроля (типа
контрольного набора).
7. Поместите образцы на заирщ раммированный
гермойиклер с соответствующими деталями I
цикла, указанными ниже, начните процесс.
а) 95 °C в течение 11 мин±5 с
б) 94з:1 °C в течение 1 мин± 2 с
в) 59±1 °C в течение 1 мин±2 с
г) 72 ± 1 СС в течение 1 мин±2 с
8. Повторите main 7(6)-7(i) 28 раз.
9. 60± 1 °C в течение 45 мин±5 с.
10. Храните при 4 °C пока не потребуется.
в) Гель-электрофорез с использованием
ДНК секвенатора ABI 377
Реактивы и материалы
• ДНК-секвенатор ABI 377 (рис. 16.10)
* Материал для подготовки голя: мерный цилиндр. ।
весы, фильтрующий блок (например, 150-мл I
Sartolab), вакуумный насос, гребенки, 2-мм про-
кладки для геля, ма! нитная мешалка, мочевина
(например, Fisher), акриламидная подложка (на-
пример, Bio-Rad 40% Acrylamide/BIS 19:1), чистая
стерильная вода (например, Fisher AR), mixed bed
гечп1(нацример, Sigma), пероксид сульфат аммония
(например, Sigma), 10хТВЕ (например. National
Diagnostics). ТЕМ ED (например, Sigma)
* Материалы для голевой установки: голевая плас-
тина и кассетный аппарат, буферная система,
пластина для теплообмена
* Ледяная или электронная холодная пластина |
(например, Caiulab Icecube)
• Термоциклер (например, ABI9700)
* Смесь для внесения образца в голь (.кирузоч-
ная смесь) SGM Plus™: формамид, краситель
декстран синий (входит в набор), GeneScan 500
(GS500 ROX) (входит в набор)
Протокол
1. Приготовьте 4%-й иолиакри л амидный голь, I
смешивая в химическом стакане следующие
компоненты:
а) Мочевина, 18 г
б) Акриламид, 40%. 5.2 мл
в) Вода, 27 мл
с) Mixed bed resin, 0,5 i
2. Залейте гель.
3. В соответствии с технической инструкцией рас
положите ABI377 для разгонки голя.
4. Возьмите амилифицированные образцы из
термоциклера и приготовьте за|рузочную смесь I
следующим образом.
а) формамид 1,2 мкл;
б) GS500 ROX, 0,13 мкл;
312
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
и; загру.«очный буфер с декстраном синим,
0,2 мкл.
5 Аликвота 1,5 мкл заг рузочной смеси смешива-
ется в соответствующей пробирке или плас тине.
Одновременно приготовьте загрулонную смесь
для двух аллельных контролен (поставляются
в наборе). К соответствующей пробирке или
ячейке добавьте приблизительно 1 мкл амили-
фицированного PCR продукта или контроля
Осторожно перемешайте.
6 Чтобы денатурировать ДНК, нагрейте загрузоч-
ную смесь для геля, содержащую амплнфициро-
ванный ПЦР-иродукт, приблизительно до 95 °C
примерно на 3 мин, затем немедленно перенесите
на лоток со льдом или ллектронный блок охлаж-
дения до остывания до 0 °C.
7 В соответствии с технической инструкцией за-
пустите секвенатор и загрузите се.гь начиная с
образцов, которые будут заг ружены в нечетные
ряды.
8 Гель разгоняется приблизит ельно 2,5 часа.
г) Анализ результатов исследования
клеточной линии
Материалы
• Программное обеспечение. GeneScan® и Geno-
typer®
• Компьютер PowerMac
Протокол
Этот раздел охватывает 2 главные области: анализ
полученных данных, собранных при помощи ДНК-
секвенатора с анализирующим программным обеспе-
чением GeneScan®, и использование программного
обеспечения Genotyper® для того, чтобы присвоить
аллельные обозначения к профилям, предваритель-
но проанализированным программным обеспечени-
ем GeneScan®.
1. О скройте изображение геля, отрегулируйте кон-
траст, убедитесь, что все цвета могут быть ясно
видны.
2. Установите диапазон анализа, включающий
стандартные внутренние пики размера 75-bp и
450-Ьр.
3. Восстановите изображение геля.
4. Проследите в автоматическом режиме все резуль-
5. Когда прослеживание закончено, проверьте, что
оно выполнено правильно; данные могут тогда
быть получены из каждого ряда для того, чтобы
формировать индивидуальные типовые файлы.
Выберите в меню исследуемые ряды.
6. Программное обеспечение GeneScan® исполь-
зует два главных контрольных окна. Контроль
Анализа и Контроль Результатов. Контроль Ана-
лиза появляется, когда проект сначала открыт, и
используется, чтобы определить внутренний
размер стандарта и изменить параметры анализа.
Контроль Результатов может быть выбран, когда
анализ образцов закончен. Это позволяет выбрать,
какие из результатов будут показаны на дисплее,
а также определить формат этих результатов.
7. Используя окно Контроль Анализа, выберите
стандартный размер для каждого анализируемого
образца, размеры пиков следующие: 75,1(10,140
150,160,200,250,300.350,400,450.
8. Инсталлируйте соответствующую матрицу.
9. Отметьте мышкой цветные столбцы, помечен-
ные буквами В, G, Y, u R, чтобы выдвинуть на
первый план все ряды, которые будут проанали-
зированы. Нажмите на «анализировать», чтобы
начать анализ образцов. Все образны, которые
проанализированы, будут показаны маленьким
треуг ольником в соответствующей клетке.
10. Затем проанализированные образцы могут быть
открыты в окне Контроль Результатов.
11. Распечатайте электрофореграмму (EPG) Gene-
Scan® для каждого образца (рис. 16.11).
12. Затем может быть использовано Программное
обеспечение Genotyper®, которое обработает
результаты, полученные GeneScan®
13. Все данные от отдельного геля могут быть обрабо-
таны вместе как отдельный файл Genotyper®.
14. Импортируйте все данные из файла GeneScan®
в матрицу SGM Plus Genotyper®.
15. Промаркируйте пики, нажимая ( Apple+ 1).
16. Важно удостовериться, что стандартный размер
правильно распознан в каждом образце
17. Аллельные контроли должны также приняты во
внимание. Удостоверьтесь, что все представлен-
ные аллели правильно идентифицированы.
18. Если вышеупомянутое выполнено, проверьте
метки образцов
19. Проверьте правильность всех обозначений, уда-
лите любые обозначения, которые могут быть
ошибочными.
20 Как только будет проведена проверка правиль-
ности всех обозначений, распечатайте результаты
анализа Genotyper® для каждого образца и при-
ложите к распечатке GeneScan® EPG
21. Затем может быть сделано сравнение проанализи-
рованного профиля с опубликованным профилем
каждой клеточной линии.
16.7. РНК И ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА
Клетки со специфическими фенотипическими ха-
рактеристиками могут быть распознаны анализом
экспрессии гена Нозерн-блоттингом [Sainbrook el al.,
1989; Ausubel el al., 1996J с использованием радио-
активных, флюоресцентных или люминесцентных
исследований. Эта процедура может* быть выполнена
16.7. РНК и экспрессия белка
313
Рис. 16.10. Секвенирование ДНК. Сиквснатор ABI 377.
использующий ашоматичсскнй электрофоретический
анализатор на полиакриламидном геле для разде >сния и
количественной амплификации последовательностей STR
(С любезного разрешения A James, LGC Promochcm.)
на клеточном уроине, как в FISH (см. протокол 27.9).
или in situ гибридизации с радиоактивными зондами
(см. протокол 27.8). Качественный анализ общею
белка клетки показывает различия между клетками,
кси да целые клетки или экстракты клеточных мембран
разюняются на двухмерных гелях [O’Farrell, 1975].
Этот метод дает характерный «отпечаток иальца>>,
подобный тюлипетидной карге тидролизата белка, но
содержит так мною информации, что интерпретация
может быть затруднена. Существует возможность
просмотра этих гелей при помощи компьютеризиро-
ванного денситометра (Molecular Dynamics), который
приписывает количественные параметры каждому
пятну и может нормализовать каждый фингериринт,
чтобы установить стандарты и интерпретировать по-
зиционные различия в расположении пятен. Мечение
клеток ‘,2Р, [3lS] метионином, пли комбинацией ”С
меченых аминокислот, сопровождаемые ауторадио-
графией, позволяет проводить более лет кии анализ, но
этот метод пока не является общераспространенным,
если только в лаборатории не используется постоянно
технолот ия подт отовки двухмерных т елей. В настоя-
щее время количественный анализ фенотниической
экспрессии более доступен при помощи RT-PCR ана-
лиза транскриптов гена в крупном масштабе методом
микрочииового анализа экспрессии генов (Affvine-
Lrix)) [Kiefer el al., 2004; Staab el al., 2004]
Пример приведен на цв. вкладке 24, i де сравнивают-
ся три различных тина клеток, для которых этот метод
ясно демонстрирует различия в профиле фенотипиче-
ской экспрессии.
16.8. АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ
Специализированные функции клеток in vivo часто
выражаются в активности определенных ферментов,
некоторые из которых могут быть выявлены in vitro
(см. табл. 16.2). К сожалению, активность мнот их фер-
ментов утрачивается in vitro (см. разд. 3.4.2, 17.1.1),
и такие ферменты не могут служить маркерами тка-
невой специфичности, например паренхима печени
теряет арт иназную активность в пределах нескольких
дней культивирования. Однако некоторые линии
клеток экспрессируют определенные ферменты, т акие
как тирозинаминотрансфераза в клеточных линиях
гепатомы крысы НТС [Granner et al., 1968]. При по-
иске специфических маркерных ферментов должны
быть измерены и сравнены конститутивный уровень
и индуцированный уровень активности со сравни-
тельным исследованием нескольких контрольных
клеточных линий. Глутамилсинтетазная активность,
например, характерная для астроглии мозга, возрас-
тает в несколько раз, кот да клетки культивируются
в присутствии тлутамата вместо глутамина [DeMars,
1958; McLean el al., 1986]. Индукция активности фер-
мента требует специализированных условий для каж-
дою фермента, и информация об этих условиях может
быть получена из литературы. Общими индукторами
являются тлюкокортикоидные тормоны типа декса-
метазона; полипептидные тормоны типа инсулина и
глюкагона; изменения в субстрате или концентрации
продуктов в среде, как в вышеупомянутом примере с
глутамилсинтетазой.
16.8.1. Изоферменты
Активность ферментов можно качественно сравнить
у разных клеточных штаммов, с использованием ви-
дового ферментативною белкового полиморфизма
и иногда отдельных рас, индивидуумов, и тканей в
пределах вида. Эти так называемые изоферменты, или
изозимы, можно выделить хроматотрафически или
электрофоретически. Образцы распределения (зи-
мограммы) могут оказаться специфичными для вида
или ткани (рис. 16.12). Nims el al. [ 1998] обнаружили,
что межвиждовая перекрестная контаминация кле-
точных культур может* быть определена при помощи
изоферментного анализа, если клетки контаминиру-
ющей культуры представляют ио крайней мере 10%
общею количества популяции клеток. Среды для
электрофореза включают ат арозу, ацет-ат целлюлозы,
крахмал и полиакриламид. В каждом случае сырой
экс грат проданный фермент наносится на одну точку в
геле, и разность потенциалов прикладывается поперек
геля. Различные изоферменты мнт рируют с различной
скоростью и мот ут быть обнаружены позже окраши-
ванием с хромогенным субстратом. Окрашенные т ели
мотут читаться непосредственно невооруженным
глазом, фотот рафироваться и исследоваться позже
или при помощи денситометра. Протокол 16.10 для
изоферментного анализа, использующет о агарозный
гель, предоставлен by Jane L. Сарп to (American Type
Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas,
Virginia 20110, USA).
314
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
Рис. 16.11. Изучение профиля ДНК. (с) и (б) Клеточные линии HcLa nT47D анализировались при помощи программы Gcn-
escan для детекции расположения пиков, обнаруженных секвенатором ABI377 DNA при гсль-элсктрофорсзс. (в) Результаты
анализа клеток HcLa и T47D при помощи Genotyper с «предо ichiicm локализации алло 1ьных типов в отношении размеров
пиков (любезно предоставлено A James, LGC Promochem)
16.8.2. Изоферментный электрофорез
при помощи Authentikit
Видовая принадлежность источника клеточной линии
может быть определена при помощи гель-электро-
форезной системы Authentikit которая используется
для определения мобильности семи изоферментов
нуклеозидфосфорилазы (NP; Е. С. 2.4.2.1), |люкоза-6-
фпсфатазде! идрогеназы (G6PD; Е. С. 1.1.1.49), малатде-
। идрогеназы ( М D, Е. С. 1.1.1.37), лактатде! идрогеназы
(LD; Е. С. 1.1.1.27), аспартатамннотрансферазы (AST,
Е. С. 2.6.1.1), манноза-6-фосфат-п.юмеразы (MPI, Е. С
5.3.1.8), и пептидазы В (Рер В, Е. С. 3.4.11.4). Эта система
позволяет ле> ко проводить скриниш шести клеточных
линий в одном геле с определением семи генетических
маркеров менее, чем за 3 часа [Нау, 2000]. В большин-
стве случаев видовая принадлежность источника может
быть определена использованием только четырех из
семи изоферментов: нуклеозидфосфорилазы, глюко-
за-6-фосфагаздегидрогеназы, малатде! идрогеназы и
лактатде! идрогеназы. Аналсп ично, межвидовая пере-
крестная контаминация клеточных линии может быть
определена в большинстве случаев с использованием
тех же изоферментов [Nimselal., 1998], хотя пептидаза
В также нужна для анализа контаминации мышиной
клеточной линии клетками хомяка.
Ana.iU3 электрофореграмм. Приложить высушен-
ный гель к форме для документации геля, выровнять
16.9. Антигенные маркеры
31S
Аспартатаминотрансфераза Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа Лактатдегидрогеназа Малатдегидрогеназа
Рис. 16.12. Изоферментный электрофорез. Анализ четырех изоферментов при помощи гсль-элсктрофорезной системы
Authcntik (Innovative Chemistry) {а) набор из четырех кювет с блоком питания на заднем плане, реактивы справа, три сбор-
но-блочных камеры для геля на переднем плане, (б) лотки д.ш окраски и отмывки геля (Corning), (e-е) электрофореграммы,
полученные в результате анализа ( яюбезно предоставлено АТСС)
участки нанесения образцов, произвести измерении.
Яркая желтая подложка формы разлинована ио
миллиметрам и дает максимальную контрастность и
улучшает читаемость малиновых полос на сухом геле
(см. рис. 16.12). Измерьте расстояние мш рации фер-
ментов путем измерения расстояния от середины зоны
аппликации до середины зоны фермента. Зашшште
данные измерений расстояний миграции ферментов
для стандартного, контрольного и опытного образцов в
стандартную форму. Перенесите данные в форму Cell I
для заключительной видовой идентификации клеток
Подробные инструкции для идентификации неизвест-
ной линии включены в форму. Сохраните форму в
вашей тегради для постоянных записей результатов.
Подробные инструкции по каждому ферменту вы може-
те найти в руководстве Handbook for Cell Authentication
and Identification, Innovative Chemistry, Inc.
Альтернативные методы выделения. Клеточные
экстракты могут быть приготовлены ультрацентрифу-
гированием, быстрым троекратным замо|№гкиванием
и оттаиванием или обработкой октиловым спиртом.
[Масу, 1978]. Буфер для клеточной экстракции можно
приобрести в Innovative Chemistry, Inc Контроль и
стандарт можно ирш отовить с использованием стан-
дартной процедуры приготовления экстракта (см.
протокол 16.10). Стандарт готовится из линии клеток
мышей L929 (АТСС CCL-1), контроль готовится из
линии клеток человека HeLa (АТСС CCL-2). O’Brien
el al. [ 1980] показали, что образцы мглут храниться при
70 °C до года без существенной потери ферментатив-
ной активности.
16.9. АНТИГЕННЫЕ МАРКЕРЫ
В результате большого разнообразия и изобилия
антител и наборов для определения, иредлашемых
промышленными компаниями (см. Приложение II),
иммунное окрашивание является наиболее полезным
и доступным методом для характеристики клеточных
□синий (таб.1.16.3). Однако, независимо от источника
антител, необходимо убедиться в их специфичности
путем использования соответствующего контрольного
материала. Это справедливо как для моноклональных
316
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
ПРОТОКОЛ 16.10. Изоферментный анализ
Схема
Собрать клетки, промыть их D-PBSA, ресуспендиро-
вать до концентрации 5x10' клеток мл. приготовить
клеточный экстракт. Хранить при 70 °C. Пригото-
вить аппарат для геля. Внести 1-2 мкл исследуе-
мого клеточного экстракта, а также стандартную и
контрольную пробы в aiapo.iHbiii гель. Заполнить
камеру водой, поместить а!арозный гель в камеру и
проводить электрофорез в течение 25 мин. Добавить
реагенты для ферментов на 5—20 мин, промыть гель,
высушить и исследовать полученный гель с зонами
локализации фермента.
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные.
Клетки
Экстракты (Innovative Chemistry, Inc.):
Стандартный экстракт L929
Контрольный экстракт HeLa S3
• Буферный раствор для экстракции клеток (Inno-
vative Chemistry, Inc.) или Triton Х-100 раствор
для экстракции,'. 1:15, v v
• Triton Х-100 в 0,9% NaCl, pH 7,1, содержащий
6,6x10’* М EDTA (Хранить ири 4 °C)
Нестерильные:
• Прибор и реактивы Authentikit (Innovative Chem-
istry, 1ПС.):
Пленки агарозного геля, SAB 8,6. по одному на
каждый исследуемый фермент
Вкладыши в лотки для инкубирования по одному
на каждый исследуемый фермент
Лотки для инкубирования
Лотки для окрашивания и промывки
Термостатированные крышки для электрофоре-
тической камеры и донная часть
Источник постоянного тока (160 V) с таймером
Соединительное устройство
Инкубационная камераг сушка
Mai нитная мешалка с 1 -дюймовым вкладышем.
Буфер. SAB 8,6
Ферментативные субстраты, по 1 флакону
нуклеозидфосфорилаза (NP)
глюкоза-6-фосфатаздешдрогеназа (G6PD)
малатде! идрш еназа ( М D)
лактатде! идро! еназа (LD)
асцартатампнотрансфераза (AST)
манноза-6-фосфат-изомераза (MPI)
пептидаза В (Рер В)
Аппликатор образцов с тефлоновыми наконеч-
никами
Форма для документации геля
Форма для миграции ферментов
Итоговая форма для анализа идентичности кле-
гок Cell I. D
Шприц микролитровый
• Микроцентрифута (Eppendorf, Brinkmann)
Пробирки Eppendorf 1,5 мл
Автоматическая пипетка на 1,0 мл
Наконечники для автоматической пипетки
• Пипетки, 5,0 мл
• Градуированный цилиндр, 100 мл
• Маркер
Деионизованная вода
Дистиллированная вода
• D-PBSA
Защитные перчатки
Контейнер для отходов и использованных нако-
нечников
Протокол
а) Приготовление экстракта:
1 Вырастите клетки в стандартных условиях до
получения 2х 107 жизнеспособных клеток.
2. Соберите клетки в соответствии с процедурой,
рекомендуемой для этой клеточной линии.
3. Ресуспендируйте клеточный осадок, полученный
после центрифу! ирования в D-PBS А, подсчитай-
те количество жизнеспособных клегок.
4. Центрифу! ируйте суспензию при 300 g в течение
5—10 мин для осаждения клеток и удалите супер-
натан г.
5. Повторите шаш 3 и 4 до общего троекратного
количества отмывок
6. Добавьте 100 мкл экстра! ирующе! о раствора к
клеточному осадку
7. Осторожно перенесите суспензии» клеток в пи-
петку малого сечения и суспендируйте покачи-
ванием суспензии вверх-вниз, пока все клетки не
лизируются.
8. Перенесите лизат клеток в пробирки Eppendorf
(1,5 мл), пипетируйте лизат вверх-вниз несколько
минут, для того чтобы клеточные мембраны от-
делились и собрались вместе. Центрифут ируйте
лизат при максимальном ускорении (9000 g)
течение 2 мин в ультрацентрифуге Собрать
супернатант, разделите на аликвоты желаемого
объема, храните ири 70 °C,
б) Подготовка к работе прибора
для электрофореза
1. Включите инкубационную камеру.
2. Поместите один вкладыш в каждый лоток для
инкубирования.
3. Добавьте 6.0 мл деионизованной воды в каждый
лоток для инкубирования и поместите лотки при
37 °C на 20 мин.
4 Добавьте 95 мл буфера SАВ 8,6 в каждую камеру
прибора для электрофореза клеток (общее ко-
личество 190 мл буфера на одну донную часть).
Этот буфер не до.тжен повторно использоваться,
поскольку значение pH значительно меняется в
ходе электрофоретического процесса.
5 Соедините заполненную донную часть камеры с
соединительным устройством, которое подсоеди-
16.9. Антигенные маркеры
317
нено к источнику питания с регулируемым напря-
жением. Источник питания должен быть включен
в заземленную электрическую розетку
6. Заполните каждую термостатируемую крышку
ячеек для электрофореза 500 мл холодной воды
(4-10 Заполнять следует, держа крышку в
вертикальном положении, иначе вода выльется.
Охладите воду добавлением льда или храните
достаточный запас холодной воды в обычном
холодильнике. Заменяйте воду перед каждым
электрофорезом.
7. Налейте500 мл деионизованной или дистиллиро-
ванной воды в каждый лоток для окраски и опо-
лосните лоток. Эту воду не следует использовать
повторно.
в) Процедура электрофореза:
1. Промаркируйт е каждый at а розный гель, который
будет использован. Эго можно выполнить при
помощи ярлыков, предоставляемых Innovative
Chemistry Inc. или при помощи маркера, делая
надпись на оборотной стороне геля.
2. Поместите гель в камеру. Сориентируйте гель так.
чтобы лунка для помещения образна расиола|а-
лась наиболее близко к вам.
3. Промаркируйте каждую лунку для образца, кото-
рый должен быть проверен (наиример, стандарт,
контроль, неизвестный 1. неизвестный 2, и т.д.).
На одном । еле может быть проверено шесть не-
известных образцов.
4. Аккуратно снимите иленку а|арозною (еля с
твердого пластмассового покрытия. Будьте ос-
торожны, берите гель только за края. Выбросьте
твердое пластмассовое покрытие.
5. Добавьте клет очный экстракт в лунки для образ-
цов. Используйте диспенсер с присоединенными
тефлоновыми наконечниками, отмеряющими
1 мкл клеточного экстракта в каждую лунку.
Для каждого образца используйте свежий на-
конечник. Поместите стандартный экстракт в
трек 1, контрольный в трек 2, а неизвестные
образцы с 3 но 8. Лунку должна касаться только
кайля экстракта, не касайтесь геля наконечником,
чтобы не повредитьaiapo3y. Если требуется 2 мкл
клеточного экстракта, позвольте первой кайле
(1 мкл) диффундировать в aiapO3y прежде, чем
нанесете вторую
6. Вложите кaждvю агарозную иленку в крышку
электрофоретической ячейки. А1арозная сторо-
на должна быть обращена наружу. Сопоставьте
анодную (+) сторону агерозы с анодной стороной
(+) крышки ячейки. Может оказаться необходи-
мым сле| ка cot нуть иленку агарозного геля, чтобы
вложить его.
7. Соедините крышку ячейки с донной частью.
Черный конец с Mat нитом внутри должен быть
ближе к источнику тока. Включите напряжение
(160 V) и таймер на 25 мин.
8. Выньте из холодильника флаконы с реактивами-
субстратами для ферментов примерно за 5 мин
до конца процесса электрофореза, оставьте их
подогреваться при комнатной температуре.
9. Добавьте 0,5 1,0 мл деионизованной воды в I
каждый флакон с реактивами немедленно перед
использованием. Встряхните, чтобы полностью I
растворить реактив.
10 Котда электрофорез окончен, снимите крышку I
с донной части и поместите на фильтровальную |
бума! у
г) Процедура окрашивания.
1. Для того чтобы вы нут ь агарозный гель из крышки I
ячейки, возьмите гель за края, согните внутрь и
выньте гель.
2. Поместите иленку atapo3Horo геля на плоскую ।
поверхность на фильтровальную бумагу t елевой
стороной вверх, так чтобы лунки помещались |
напротив вас.
3. Аккуратно промокните остатки буфера с обоих |
концов atapO3HOtt пленки ири помощи бе.зволо-
конной салфетки.
4. Поместите 5-мл пипетку вдоль но нижнему краю ।
агарозной пленки.
5. Равномерно поливайте восстанавливающий суб- |
страт на агарозную иленку вдоль ио ведущему
краю иииеткн.
6. Однократным мя1 кнм движением толкните пи-
петку вдоль ио поверхности atapO3bt. Притяните
нииетку к себе и толкните ее поперек поверхности
еще раз. Сверните atapoav начиная с края, удаляя
избыток субстрата в процессе движения. Будьте
осторожны, чтобы не повредить агерозу. Необхо-
димо проследить, чтобы не было механического |
надавливания на гель.
7. Поместите иленку at арозши о геля atapusnoii I
стороной вверх в предвари ie чьно нагретый лоток
для инкубирования, поставить лот ок в инкубатор I
на 37 °C примерно на 5—10 мин.
8. После инкубирования промойте иленку atapO3- I
него t еля дважды в 500 мл бидистиллированной |
или деионизованной воды, каждый разно 15 мин,
покачивая при помощи мажитной мешалки. Пос-
ле первых 15 мин выньте гель из воды, удалите
воду, добавьте 500 мл свежей воды и погрузите
в воду гель. Закройте гель, чтобы защитить его
от света. Удостоверьтесь, что гель погружен, а не
плавает на поверхности воды.
9. Вы ньте гель из воды, поместите на подставку для
сушки в сушильной камере инкубатора или нечп. |
Сушите 30 мин, или пока at ароза не высохнет. .
Можно также сушить atapo.ty нри комнатной I
температуре в течение ночи.
10. Уберите рабочее место, вылейте буфер из донной I
части ячейки, промойте дистиллированной водой.
Вылейте воду из крышек, промойте крышки из- I
нутрн, высушите. |
318
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
11 Оцените результаты. Полосы стабильны, пленка
может храниться до использования по потребнос-
ти. Если продолжает развиваться окрашивание
фона, го это означает, что >ель недостаточно
промыт.
антител, так и для поликлональной антисыворотки.
Моноклональные антитела высокое иецифичны для
отдельного эпитопа, но специфичность экспрессии
этого эпитопа для отдельного клеточнот о типа должна
быть подтверждена.
16.9.1. Иммунное окрашивание
Локализация антител обнаруживается ио флюорес-
ценции, для которой антитела конъюг ируют с флюо-
рохромом, например флюоресциин или родамин, или
ио отложению продукта преципитации в результате ак-
тивности пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы,
конъкл ированной с антителами. Иммунологическое ок-
рашивание может быть прямым, например специфиче-
ские антитела сами ио себе конъкм ируют с флюорохро-
мом или ферментом и напрямую окрашивают образец.
Обычно, тем не менее, используют непрямой метод, при
котором первичные (специфичные) антитела в своей
нативной форме связываются с антигенами образца,
вслед за этим комплекс обрабатывается вторичными
антителами, индуцированными иммуноглобулином к
первым антителам. Вторичные антитела могут быть ко-
ньки ированы с флюорохромом [ Johnson. 19891 и визуа-
лизированы при помощи флюоресцентного микроскопа
(см. цв. вкладки 11а, 15г, д и 20»—е), или пероксидазой
и визуализированы для наблюдения в стандартном
микроскопе после обработки с хромогенным субстра-
том пероксидазы (см. цв. вкладки 116—г u 12а, б). Для
повышения чувствительности используются различ-
ные методы, в частности связанные с пероксидазной
активностью. В методе пероксндаза-антииероксидаза
(РАР) дальнейшее амилифицирующее связывание
дополнено реакцией пероксидазы, конъют ированной с
анти-иероксидазеными антителами того же вида, что и
первичные антитела [Jones & Gregory, 1989J.
Еще большая чувствительность получена при
использовании биотинконъют ированных вторичных
антител с стрептавидином, конъют ированным с пе-
роксидазой или щелочной фосфатазой (Auiersham)
или вторичными антителами, конъюгированными с
золотом (.Janssen) с последующей интенсификацией
серебром ( Ainershani).
Варианты
Фиксации. В случае окрашивания клеточной по-
верхности или при наличии антигенов, чувствительных
к фиксатору, необходимо сначала обработать клетки
антителами, а затем произвести последующую фик-
ПРОТОКОЛ 16.11. Непрямая
иммунофлюоресценция
Схема
Зафиксировать клетки, обработать их последова-
тельно первичными и вторичными антителами.
Исследовать клетки при помощи УФ-света.
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
* Культура, выращенная на покровном стекле,
предметном стекле со сдвижной камерой или в
полистироловой чашке Петри
Нестерильные.
• Свежеприготовленный фиксирующий раствор 5%-й
уксусной кислоты в этаноле (хранить при 20 °C)
• Первичные антитела, разведенные 1:100—1:1000
в культуральной среде в 10% FBS
• Вторичные антитела, видоспецифично индуциро-
ванные против первых антител (например, если
первые антитела были получены у кролика, то
вторичные антитела должны быть получены с ис-
пользованием животных другого вида, например
козы, с получением антител к иммуиотлобулину
кролика). Вторичные антитела должны бы гь ко-
нъют ированы с флюоресцеином или родамином
• Сыворотка свиньи или иной блокирующий агент
• D-PBSA
• Среда для заключения иреиарата*. 50% глицерин
в D-PBSA, содержащий ингибитор затухания
флюоресценции (Vecta)
Протокол
1. Промойте покровное стекло с тиетками в D-PBSA,
поместите в подходящую емкость, например в
24-луночный планшет для 13-мм покровных стекол.
2. Поставьте на 10 мин при 20 °C, добавьте холод-
ный фиксирующий раствор и оставьте еще на
20 мин.
3. Удалите фиксирующий раствор, промойте пок-
ровное стекло D-PBSA, добавьте 1 мл нормаль-
ной свиной сыворотки, оставьте при комнатной
температуре на 20 мин.
4. Промойте в D-PBSA, высушите на фильтро-
вальной бумаге, поместите, перевернув на каплю
(50 мкл) разведенных первичных антител.
5. Инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин или
при комнатной температуре 1-3 ч или при 4 °C
в течение ночи. В последнем случае (при 4 °C)
антитела мО1ут быть разведены 1:1000.
6. Промойте покровное стекло в D-PBSA, иерене-
ситеего в каплю вторичных ангител, разведенных
1.20, на 20 мин при 37 °C.
7. Промойте покровное стекло в D-PBSA, заклю-
чите в 50%-й глицерин в D-PBSА с ши ибитором
затухания флюоресценции (Vecta).
8. Исследуйте препарат при помощи флюоресцен-
тного микроскопа.
16.9. Антигенные маркеры
319
Таблица 16.3. Антитела, используемые для распознавания клеточных линий
Тип кпеток Антитела к Локализация Специ- фичность Комментарии
Передняя доля гипофиза hGH Аппарат Гольджи и секретиру емые вещества Высокая
Астроглия В-клетки GFAP CD22 Промежуточные филаменты цитоскелета Клеточная поверхность Высокая См. также табл. 22.2
Эпителий молочной же- А-лактальбумин, Аппарат Гольджи и секретиру- Высокая Необходима индукция дифференци-
лезы казеин емые вещества ровки
Колоноректальная и легоч- ная аденокарцинома СЕА Клеточная поверхность и ап- парат Гольджи Промежу- точная Молекулы клеточной адгезии
Эндотелий Фактор VIII Тельца Вейбеле-Паладе Высокая Зернистость
Эпителий V-CAM Клеточная поверхность Высокая Молекулы клеточной адгезии
Эпителий L-CAM Клеточная и<1Верхность Высокая Молекулы клеточной адгезии
Эпителий Цитокератин Промежуточный филамент цитоскелета Высокая Некоторые антитела также окрашивают мезотелий, специфические антитела для различных видов эпителия
Эпителий ЕМ А Клеточная поверхность Высокая Некоторые антигены как HMFG
Эпителий HMFG I & II Клеточная поверхность Высокая Некоторые антигены как ЕМ А
Фетальные гепатоциты AFP Аппарат Гольджи и секретиру емые вещества Высокая Экспрессируется также гепатомами
Гематопоэтические стволо- вые клетки CD34 Клеточная поверхность Высокая Только в предшественниках, нет в зре- лых клетках
Гепатоциты Альбумин Аппарат Гольджи и секретиру емые вещества Высокая Необходима дифференцировка
Незрелые В-клетки CD20 Клеточная поверхность Высокая Нет в плазматических клетках
Мезодермальные клетки Виментин Промежуточные филаменты цитоскелета Низкая Экспрессируется также на эпителиаль- ных и глиальных клетках в культуре
Мезотелий Антиген мезотели- альных клеток Клеточная поверхность Высокая
Моноциты и макрофаги CD14 Клеточная поверхность Высокая
Миелоидные клетки CD13 Клеточная поверхность Высокая
Миоциты Десмин Промежуточный филамент цитоскелета Высокая
Нервн ые и нейроэндокри н- ные клетки NSE Цитоплазма Промежу- точная Может экспрессироваться на SCLC
Нервные клетки N-CAM Клеточная поверхность Промежу- точная Также экспрессируется на некоторых SCLC
Нейрональные клетки Белок нейрофила- ментов Промежуточные филаменты цитоскелета Высокая Также окрашивают некоторые SCLC
Олигодендроциты Основной белок миелина Клеточная поверхность Высокая Также окрашивают периферические нейроны
Gal-C Клеточная поверхность Высокая См. также табл 22.2
Плацентарный эпителий hCG Аппарат Гольджи и секретиру - емые вещества Низкая Также экспрессируется на некоторых опухоевых клетках легких
Эпителий простаты PSA Аппарат Гольджи и секретиру емые вещества Высокая
Т-клетки CD3 Клеточная поверхность Высокая
Т-клетки и эндотелий ICAM Клеточная поверхность Промежу- точная
Сокращения' GFAP, глиальный фибриллярный кислый белок (glial fibrillary acidic protein); EMA, эпителиальный мембранный антиген
(epithelial membrane antigege); HMFG, человеческий глобулярный белок молока (human milk fat globule protein); AFP альфа- фето-
протеин (a-fetoprotein); CEA карциноэмбрнональный антиген (carcinoembryonic antigen) SCLC, мелкоклеточная карцинома легкого
(small cell lungcuncer); hCG, человеческий хориональный гонадотропин (human chorionic gonadotropin); I CAM, межклеточная молекула
адгезии клеток (intercellular cell adhesion molecule); NSE нейронспецифическая энолаза (neuron-specific enolase); PSA простата-
специфическвй антиген (prostate-specific antigen). Gal — С-галактоцереброзид (galactocerebroside), GRP — гастрин высвобождающий
пептид (gastrin-releasing peptide)
320
ГЛАВА 16. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК
сацию в соответствии с шагом 2. Koi да стеклянная
поверхность используется как субстрат, холодный
ацетон можно заменить на кислый этанол.
Непрямая пероксидаза. Заменить нероксидаза-
конъюгированные антитела на флюоресцентные
антитела на стадии 6 и затем перенести на субстрат
для пероксидазы (диаминобензидин-окрашенный
препарат может быть обезвожен и заключен в DPX,
но этилкарбазол должен быть заключен в 1лицерин
как в шаге 7).
РАР. Использовать пероксидаза-кон визированные
вторичные антитела на стадии 6 и затем перенести
покровное стекло в разведенный комплекс РАР (1:100)
(большинство иммунобиоло! ических компаний-про-
изводителей, наиример Dako, Vesta) в D-PBSA на
20 мин. Промыть, добавить пероксидазный субстрат,
как для непрямой пероксидазной реакции. Инкубиро-
вать, промыть и закрыть покровным стеклом
Маркеры к/втачной поверхности. Специфические
антигены клеточной поверхности обычно окрашиваются
в живых клетках (нри 4 °C в присутствии азида натрия
для иншбирования ииноцитоза), в то время как внут-
риклеточные антигены окрашиваются в фиксированных
клетках, и hoi да необходимо провести летую тринсини-
зацию для обеспечения доступа антител к антигенам.
HLA-антшены и антигены группы крови мо<ут
быть обнаружены на клетках мно< их культур человека
и служить полезным специфическими параметром.
В частности, особенно ценным считается Н LA-поли-
морфилм, особенно koi да известен профиль донора
[Espmark & Alilqvist-Rolh, 1978; Stoner el al., 1981;
Pollack el al., 1981].
16.9.2. Иммунный анализ
Исследование клеточно! о экстракта может быть прове-
дено при помощи ELlSA-метода в микротитрационных
Рис. 16.13. Прибор для иммуноанализа Agilent. Agilent
2100, способный проводить многоиарамсгрпческий анализ
сложных иммунофлюорссцснтно окрашенных образцов,
(с) ОIделение для образцов (б) Держатель для образца.
(С любезного разрешения PromoCeli 1
планшетах с покрытыми антителами лунками. Метод
снабжен специальными программами (например, Assay
Designs; R&D) и позволяет автоматически проводить
количественную оценку маркеров и экспрессии бел-
ковых продуктов. Анализ экспрессии антигена также
может быть автоматизирован и количественно оце-
нен при помощи проточной цитофлюориметрии (см.
разд. 21.7.2) (В-D Biosciences FACS Star or Guava Tech-
nologies), путем анализа образа потока клеток (Agilent
2100; рис. 16.13) или методом белковых микрочииов с
использованием антител (antibody niicroarray analysis,
antibody- MAA).
16.10. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
Mhoi ие из характеристик, описанных как антигенные
маркеры или активность специфических ферментов,
мшут также рассматриваться как маркеры дифферен-
цировки, и как таковые они мшут помочь провести
корреляцию клеточных линий с исходными тканями.
Друше примеры признаков дифференцировки и мар-
керов специфичных клеточных линий представлены
в 1л. 3 (см. табл. 3.1). Соответствующие исследования
этих свойств могут быть получены из ссылок, приве-
денных в таблице (см. также разд. 17.6 и 1л. 23).
Глава 17
ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
17.1. ЭКСПРЕССИЯ ФЕНОТИПА IN VIVO
Фенотип клеток, которые развиваются и распространя-
ются в культуре как клеточная линия, часто отличается
от фенотипа клеток, преимущественно доминирую-
щего в исходной ткани (см. разд. 3.4.2). Эти отличия
объясняются тем, что in vivo на клетки воздействует
ряд факторов, которые pet улируют геометрию, рост и
функции тканей, но подобные факторы отсутствуют в
микроокружении in vitro, (см. разд. 17.1.1).
Дифференцировка - это процесс, ведущий к про-
явлению фенотипических свойств, характерных для
функционально зрелых клеток этого тина in vivo. Этом
процесс может быть необратимым, как, наиример,
прекращение синтеза ДНК в ядре лригробласта или
зрелого кератиноцита, или обратимым, как, наиример,
индукция синтеза альбумина в дифференцированных
гепатоцитах, которая часто утрачивается в культуре, но
может быть реиндуццрована. Дифференцировка, как
она описывается в данном руководстве, представляет
собой комбинацию конститутивных (постоянно экс-
прессируемых без дополнительной индукции) и адап-
тивных (подверженных положительной и отрицатель-
ной pet уляции .iKCttpecctitt) свойств, присущих зрелой
клетке. Коммитирование подразумевает необратимый
переход клетки из стадии стволовой в специфическую
линию дифференцировки, завершающуюся формиро-
ванием клетки, способной проявлять О1раниченный
набор свойств, конститутивных или индуцируемых
Тем не менее концепция коммутирования вызываем
много вопросов, поскольку показано, что некоторые
клетки-предшественники могут превращаться в муль-
ти потентные клетки (Kondo & Raff, 2000, 2004; Le
Douarin el al., 2004).
Терминальная дифференцировка цреднола1ает, что
дифференцированная клетка прошла дифференци-
ровку но определенной линии до некоторой точки, в
которой фенотип зрелой полностью выражен и даль-
нейших изменений не иредиола1ается. В принципе,
это определение не должно исключать такие клетки,
как фиброциты, которые могут превращаться в ме-
нее фенотипически дифференцированные клетки с
возобновлением пролиферации, но на практике этом
термин имеет отношение к таким клеткам, как нейро-
ны, миоциты скелетных мышц, кератинизированные
сквамозные клетки, конечная дифференцировка ко-
торых необратима.
17.1.1. Дедифференцировка
Термин дедифференцировка обычно используется
для описания процесса утраты дифференцированных
свойств клеток некоторой ткани ири ее озлокачествле-
нпи или при ее росте в культуре. Следует с осторож-
ностью использовать термин «дедифференцировка»,
который подразумевает комплексный процесс, важный
вклад в неге вносят такие факторы, как шбель клетки,
избыточный селективный рост и аддитивный ответ. При
правильном употреблении термин «дедифференциров-
ка» означает утрату клеткой специфических фенотипи-
ческих характеристик, присущих зрелой клетке. Процесс
дедифференцировки может быть как адаптивным про-
цессом, подразумевающим, что дедифференцированный
фенотип может быть восстановлен с использовани-
ем правильно подобранных индукторов, (см. также
разд. 3.4), так и селективным процессом, подразумеваю-
щим, что клетка-предшественник была выбрана для се-
лекции в связи с более выраженным пролиферативным
потенциалом. В любом случае клетка-предшественник
может быть индуцирована к созреванию до полностью
дифференцированной клетки или к дедифференцировке
до стволовой клетки (см. разд. 19.1), в определенных
заданных условиях окружающей среды.
17.1.2. Линейная селекция
Если была выбрана неправильная линия для диффе-
ренцировки (наиример, из ткани печени выделены
стромальные фибробласты вместо гепатоцитов), то
никакие индукторы не пожнут восстановить необхо-
димый фенотип. В прошлом такие неудачи ошибочно
приписывались явлению дедифференцировки, однако
настоящей причиной тому является избыточный рост
стромальных фибробластов, вызванный такими фак-
торами роста, как фактор роста тромбоцитов PDGF
(platelet-derived growth factor) ниш пбнрованием про-
лиферации эпителиальных клеток трансформирующим
фактором роста-Р (TGF-P).
17.2. СТАДИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
Во взрослом ор1анизме существует два главных пути
дифференцировки. В постоянно возобновляющихся
322
ГЛАВА 17. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
тканях, подобных эпидермису, слизистой кишечника и
кроветворной ткани, существует небольшая популяция
тотипотентных и плюрипотентных недифференци-
рованных стволовых клеток, способных к самовозоб-
новлению, которые дают начало, в зависимости от
потребностей организма, клеткам-предшественникам,
которые будут делиться и развиваться до стадии
конечной дифференцировки, теряя upu атом способ-
ность к делению (см. рис. 3.6). Этот процесс приводит
к образованию зрелых, дифференцированных клеток,
которые обычно не делятся. Деление комиартмента
клеток-предшественников ре1улируется обратной свя-
зью, призванной обеспечить правильный объем пула
дифференцированных клеток.
В тканях, которые не обновляются так быстро, но
способны восстанавливаться после нанесения трав-
мы, в стадии покоя наблюдается невысокий уровень
пролиферации; однако зрелые клетки могут повторно
вступать в деление. В соединительной ткани, например,
клетки типа фиброцитов могут ответить на местное
уменьшение плотности клеток и/или присутствие
одного или большею количества факторов роста
утратой дифференцированных свойств (таких как
способный к синтезу коллагена) и перейти в проли-
феративный цикл. Когда ткань в результате деления
клеток восстановила соответствующую плотность,
деление клеток останавливается и возобновляется
дифференцировка. Этот тип обновления ткани быстр,
потому что относительно большая копуляция клеток
включается в процесс.
Неясно, являются ли клетки, которые повторно
входят в цикл деления для восстановления ткани, фе-
нотипически идентичными основной массе популяции
дифференцированных клеток или они представляют
собой небольшую субпоиуляцию обратимо дифферен-
цированных клеток. Показано, что в печени, которая
регенерирует в ответ на повреждение, зрелые гепа-
тоциты MOiyr вновь вступать в клеточный цикл, в то
время как в скелетных мышцах, в которых терминаль-
но дифференцированные клетки не moi ут вступать в
клеточный цикл, регенерация тканей осуществляется
за счет клеток, образующихся из сателлитных клеток,
в покое составляющих латентную субпоиуляцию ство-
ловых клеток (см. разд. 23.3.3). Зрелые фиброциты,
клетки сосудистою эндотелия и глиальные клетки
обнаруживают способность к повторному вступле-
нию в цикл деления для обеспечения регенерации, но
нельзя исключить также возможность существования
регенеративной субпопуляции внутри общей популя-
ции клеток.
17.3. ПРОЛИФЕРАЦИЯ И
ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
На поздних стадиях дифференцировки интенсивность
клеточною деления снижается, и, в конечном итоге,
оно прекращается. В большинстве клеточных систем
клеточное деление несовместимо с выраженностью
дифференцированных свойств. Опухолевые клетки
мшут иногда нарушать это ограничение, например в
меланоме меланин продолжает синт езироваться в ходе
пролиферации клеток. Тем не менее, даже в этих слу-
чаях, синтез продуктов дифференцировки возрастает
с прекращением деления.
В культуре тканей существует несколько серьезных
последствий этого правила. Поскольку при культивиро-
вании клеток и тканей размножение и распространение
часто являются i лавными задачами, то неудивительно,
что большинство клеточных линий не проявляют
полностью фенотипи ческих дифференцирован ных
свойств. Этот факт был обнаружен много лет назад при
наблюдениях за свойствами органной культуры (см.
разд. 25.2), которая оставалась трехмерной, обладала
высокой клеточной плотностью и характерной архи-
тектурой и предупреждала диссоциацию и избыточный
селективный рост недифференцированных клеток.
Поэтому, несмотря на значительную ценность
обнаруженных механизмов межклеточных взаимо-
действий, pei улирующих дифференцировку, opi анная
культура всегда страдала невозможностью получения
большого количества копий идентичных культур, в
частности, если требовалось большое количество кле-
ток. Гетерогенность образца, которая также является
существенным препятствием для получения фенотипа
тканей, делает проведение итогово! о биохимического
анализа чистой копуляции клеток и их ответа крайне
затруднительными. Однако в последние годы было
осуществлено несколько попыток восстановления
дифференцированного фенотипа в чистой популяции
клеток путем создания специального микроокруже-
ния и, таким путем, определения индивидуального
влияния, обнаруживаемого по индукции и контролю
дифференцировки. Этот процесс обычно предполагает
прекращение клеточного деления и образование интер-
активной клеточной популяции высокой плотности,
как в 1 истотииичной, так и в органотиипчной культу-
ре. Межклеточное взаимодействие стало ключевым
моментом в создании искусственно конструируемых
тканей (см. разд. 25.3.8)
17.4. КОММИТИРОВАНИЕ
И ЛИНИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
Развитие стволовой клетки по специфичному пути
дифференцировки традиционно предполщает быст-
рое нарастание коммитированпя, т.е. приобретение
клеткой структурно-функциональных свойств, ха-
рактерных для зрелой дифференцированной клетки,
по мере прохождения стадий развития (см. рис. 3.6).
Гематопоэтическая стволовая клетка после коммити-
рования лимфатической дифференцировки не будет
изменять линию дифференцировки на поздней стадии
и не приобретет характеристики миелоидного или эрит-
роцитарного ряда. АналО1 ично, простейшая нейроэкто-
дермальная стволовая клетка после коммитированпя к
нейрональной дифференцировке не превратится в гли-
17.4. Коммитирование и линии дифференцировки
323
альную клетку. Таким образом, коммитирование може’1
рассматриваться как точка между стволовой клеткой
и некоторой специфической стадией клетки-предшес-
твенника, в которой клетка или ее предшественник
больше не может превращаться в другую линию. Если
такая необратимая стадия коммитирования сущест-
вует, она должна быть позже, чем иредполатали ранее,
поскольку некоторые клетки-иредшественники мотут
дедифференцироваться в стволовые клетки с мульти-
линейным потенциалом (см. разд. 17.1).
В последние годы было получено много данных о
переходе клеток из одной линии в другую. Возможно,
наиболее существенные из них связаны с регенераци
ей хрусталика амфибии с помощью клеток радужной
оболочки глаза [Clayton et al., 1980; Cioni el al., 1986].
Поскольку радужная оболочка представляет собой пол-
ностью дифференцированный opi ан, но при этом обес-
печивает регенерацию хрусталика, это явление было
определено как трансдифференцироака. Однако это
один из немногочисленных примеров, и большинство
данных относилось к опухолевым клеточным системам,
для которых источник популяции опухолевых клеток
может быть неясным. Например, было обнаружено, что
мелкоклеточная карцинома лес ких может переходить в
сквамозную или крупноклеточную карциному с после-
дующим обострением после завершения химиотерапии.
Подразумевает ли это, что один клеточный тип, клетки
Кульчицкого [de Leij el al., 1985J, которые, как счита-
ется, дают начало развитию мелкоклеточной карцино-
мы, изменяет свое коммитирование, или же опухоль
исходно развивалась из мультииотентных стволовых
клеток, и в случае рецидива процесс развивается ио
иному пути, до настоящего времени неясно [Gazdar el
al., 1983; Goodwin etal, 1983; Terasaki etal, 1984J. Ана-
ло! нчно, развитие анапластических сквамозных раков
кожи может* дать начало клеткам, которые проявляют
себя как мезенхимальные [Oft el al., 2002].
Клеточная линия К562 была выделена при мие-
лоидной лейкемии, но позже было показано, что одна
способна к дифференцировке эритроидного ряда
[Andersson el al., 1979b]. Вместо того чтобы быть ком-
митированным, миелоидный предшественник преобра-
зуется в эритроидный; опухоль, возможно, развивает ся
из общей стволовой клетки, которая способна давать
начало как эроитроидной, так и миелоидной линиям
дифференцировки. По некоторым причинам, еще
не известным, постоянные культуры способствуют
преимущественному ра<витию клеток эритроидной
дифференцировки по сравнению с клетками миело-
идное о ряда, наблюдаемыми в исходной опухоли или
ранней культуре. Кроме того, в культуре, полученной
из опухолей, может развиться смешанный фенотип.
Например, в кчиоме крысы С6 обнаруживаются при-
знаки как астроцитов, так и олигодендроцитов, и эти
признаки мшут проявляться одновременно в одних и
тех же клетках (Breen & De Velis, 1974).
В целом, тем не менее, такие случаи необычны и
О1раничены опухолевыми культурами. Большинство
культур, полученных из нормальных тканей, хотя и мо-
гут дифференцироваться по различным направлениям,
не меняют линии дифференцировки. Это поднимает
вопрос об истинном статусе клеточных линий, полу-
ченных из нормальных тканей. Большинство культур
получено 1) из стволовых клеток или ранних клеток-
иредш ест вен ников, которые могут дифференциро-
ваться по одному или более направлением (например,
слизистая лы ких, которая может стать сквамозной
или муцин-секретирующей, в зависимости от способа
стимуляции), 2) поздних клегок-предшественников,
которые сохраняют свою линию дифференцировки, и
3) дифференцированных клеток, таких как фиброциты,
которые moi ут дедифференцировать и пролифериро-
вать, но сохраняют свойства линии (см. разд. 3.8). Неко-
торые культуры мышиных эмбрионов, в общих чертах
называемые фибробластами (например, различные
клеточные линии, обозначаемые ЗТЗ), возможно, более
правильно будет относить к категории (1), поскольку
они могут быть индуцированы к развитию до адипоци-
тов, мышечных клеток, остеоцитов и эндотелия, также
как и до фиброцитов.
Клеточные линии, возможно, следует рассматри-
вать как смешанную популяцию стволовых клеток,
клеток-предшественников и дифференцированных
клеток, равновесие между кот орыми определяется рас-
творимыми или контакт-оиосредованными сш налами
окружающей среды. В наиболее быстро делящихся
клеточных линиях большинство клеток имеет фенотип
предшественников, но может сохранять пластичность
и сдвшаться как в сторону стволовых клеток, так и в
сторону дифференцированного фенотипа, в зависимос-
ти от полученных сш налов.
В настоящее время описаны примеры дифферен-
цировки клеток-предшественников (наиример, клетки
02 А, общий предшественник олигодендроцитов и аст-
роцитов 2-го типа в мозге, которые остаются делящими-
ся клетками-предшественниками в присутствии PDGF
и bFGF), превращающихся в олигодендроциты в отсут-
ствие сывороточных факторов роста или в астроциты
2-го типа в присутствии фетальной сыворотки теленка
либо комбинации нейротропного фактора (CNTF) и
bFGF [Raff et al, 1978; Raff, 1990J (см. табл. 23.2). Од-
нако эти клетки, которые стали предшественниками
олигодендроцитов, могут вновь превращаться в клетки
с фенотипом, подобным стволовой клетке, если подверг-
нуть их действию BMPs (Kondo & Raff, 2000, 2004).
Миокардиоциты остаются недифференцированными
и делятся в сыворотке и в присутствии bFGF, но диф-
ференцируются в отсутствие сыворотки [Goldman &
Wurzel, 1992J, а культуры зародышевых эмбриональ-
ных стволовых клеток ди<|х|)еренцируют спонтанно.
Процесс дифференцировки может быть предотвращен
действием bFGF, SCF (фактор стволовых клеток, slem
cell factor), и LIF (фактор иншбирования лимфоцитов,
lymphocyte inhibitory factor) [Malsui el al, 1992J. В этом
случае клетки оставаются в пролиферирующем не
дифференцирующем состоянии
Следовательно, с разработкой более определенных
сред и идентификацией факторов, индуцирующих
324
ГЛАВА 17. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
дифференцировку, постепенно станет возможным
определить правильный набор факторов, который
будет поддерживать клетки в необходимом состоянии,
подобном стволовой клетке, клетке-предшественнику,
и дифференцированном состоянии.
17.5. ПЛАСТИЧНОСТЬ СТВОЛОВЫХ
КЛЕТОК
Традиционная теория стволовых клеток предпола-
гает, что на более ранних этапах развития стволовые
клетки обладают большей потенцией. Унипотентная
стволовая клетка - это клетка, которая может дать
начало только одной клеточной линии, наиример ство-
ловая клетка в базальном слое эпидермиса, которая
дает начало кератиноцитам. Бипотешпная стволовая
клетка способна дать начало двум линиям, наиример
лимфоидная стволовая клетка может дать начало Т- и
В-лимфоцитам. Мультипотентная стволовая клетка
дает более чем две линии, наиример стволовые клетки-
предшественники костного мозга, которые дают начало
гранулоцитам, моноцитам. Metакариоцитам, тучным
клеткам и эритроцитам. Тотипотентная стволовая
клетка дает начало всем известным клеточным тинам.
В 1емнатоиоэтической системе этот термин может
использоваться для стволовой клетки, которая дает
начало всем клеткам крови, но в своем общем значении
это название подразумевает эмбриональную стволо-
вую клетку (ES-клетка), которая но доминирующей в
настоящее время т еории способна дать начало любой
линии клеток. Порождая внутреннюю клеточную массу
paHHetxt эмбриона, ES-клетка, несомненно .должна быть
тотипотентной стволовой клеткой.
Еще одна традиционная концепция предполагает,
что чем выше степень коммитирования, тем выше
вероятность того, что стволовая клетка будет расиола-
1аться в специфической ткани, наиример гематопоэти-
ческие стволовые клетки расположены в костном мозге,
стволовые клетки энтероцитов — на дне криит кишеч-
ника, стволовые клетки кератиноцитов — в эпидермисе.
Вместе с уровнем коммитирования и определенной
t истоло! ической локализацией отмечается снижение
потенции разным направлениям дифференцировки.
Можно ожидать, что, наиример, стволовые клетки пе-
чени будут давать только клетки печени (гепатоциты,
клетки желчевыводящих путей). Более того, нельзя
ожидать, что те ткани которые не регенерируют, на-
иример нейроны в центральной нервной системе, будут
иметь стволовые клетки. Тем не менее эта довольно
аккуратная концепция линейною коммитирования,
потенции и тканевой локализации постоянно вызывает
вопросы (Vescovi et al., 2002], поскольку есть данные
исследований, которые показывают, что 1) нерегене-
рирующие ткани, такие как нейроны моз1 а, содержат
стволовые клетки [Pevny & Rao. 2003] и 2) тканевая
локализация необязательно означает коммитирование
и снижение потенции стволовых клеток, поскольку
из стволовых клеток печени moi ут развиться нервные
клетки [Deng et al., 2003], стволовые клетки костного
MO3ta дают начало миоцитам, [Mangi et al., 2003], из
мышечных стволовых клеток ищут развиваться гема-
топоэтические клетки, [Cao et al., 2003], а стволовые
клетки нервной системы могут порождать эндотелий
[Wurtnser el al., 2004]. В некоторых случаях диффе-
ренцировка идет в непредсказуемом направлении,
например, клетки костного мозга развиваются в ге-
патоциты, кардиомиоциты или нейроны [Alison et al.,
2004: Alvarez-Dolado el al., 2003J. Возможной причиной
этого является слияние клеток [Greco & Reclil, 2003J,
однако дру। ие авторы утверждают*, что слияние клеток
не играет никакой роли [Wurmser et al., 2004J
Такие разработки нарушают традиционную концеп-
цию, принятую в биолги ии стволовых клеток, и меняют
понятие о коммитировании линий дифференцировки
(см. также разд. 17.1, 17.4), но они также открывают
бесконечные горизонты для использования биоло-
1ин соматических стволовых клеток в исследовании
pet уляции экспрессии генов и тканевой регенерации.
Однако остаются следующие проблемы: 1) определе-
ние надежных маркеров для выделения такою мень-
шинства клеточной копуляции [Zhou et al., 2001; Cai
et al., 2004J; 2) практические вопросы использования
для регенерации тканей взрослых стволовых клеток,
которые имеют ограничения способности пролифе-
рации, и 3) разработка условий культивирования для
распространения и дифференцировки, которые так
же эффективны, как те, которые используются для
эмбриональных стволовых клеток. Кроме тою, была
обнаружена еще одна категория стволовых клеток в
пупочном канатике. Хотя ио своим характеристикам
они относятся к гематопоэтическим, показана их муль-
тииотентность [Lee el aL, 2004; McGuckin el al., 2004],
поэтому использование этой категории стволовых
клеток может иметь меньшее количество ограниче-
ний этического клана, чем человеческие ES клетки,
и обеспечит большую долговечность полученных
клеточных линий.
17.6. МАРКЕРЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
Маркеры, которые начинают экспрессироваться на
начальных этапах дифференцировки и сохраняются на
протяжении последующих стадий созревания, обычно
носят название линейных маркеров. Это, например,
белки промежуточных филаментов, такие как шггоке-
рагины (эпителий) [Moll et al., 1982] или отчальный
фибриллярный кислый протеин (астроциты) [Eng &
Bigbee, 1979; Bignatni el al., 1980J. Маркеры зрелого
фенотипа, представляющего конечную стадию диф-
ференцировки, обычно являются специфическими
клеточными продуктами или ферментами, участвую-
щими в синтезе этих продуктов, наиример, t емО1 лобин
в эритроцитах, сывороточных альбумин в гепатоцитах,
транс!лутаминаза [Schmidt et al., 1985J или инволю-
крин [Parkinson & Yeudall, 2002] в дифференцирую-
щихся кератиноцитах, глицеролфосфатдешдрогеназа
17.7. Индукция дифференцировки
325
в олигодендроцитах [Breen & De Vellis, 1974] (см.
табл. 3.1). Эти характерные вещества часто появляются
на поздних стадиях дифференцировки, и, возможно, их
экспрессия является обратимой и находится иод адап-
тивным контролем гормонов, питательных веществ,
составляющих веществ матрикса и межклеточного
взаимодействия (см. рис. 17.1).
Поскольку в настоящее время идентифицированы и
секвенированы гены, кодирующие большое количество
продуктов дифференцировки [International Human Ge-
nome Sequencing Consortium, 2001J, стало возможным
обнаружение экспрессии белковых маркеров дифферен-
цировки с помощью RT-PCR [Ausubel et al., 1996,2002]
и МАА [Kawasaki, 2004], обнаруживающем экспрессию
специфических мРНК (см. цв. вкладку 24). Этот метод
не требует дру| их методов, подтверждающих синтез
конечного продукта. Кроме того, возможно определить
различия при очень низких концентрациях (вди даже
отсутствии экспрессии) и очень высоком уровне экс-
прессии специфических генных транскриптов. Мпжет
быть произведен одновременный скрининг мhoi их
генов, что дает значительное преимущество перед дру-
гими методами определения продуктов экспрессии.
Дифференцировка должна рассматриваться как
процесс, связанный с экспрессией одного или, пред-
почтительно, более чем одного маркера, караю ерного
для конечного этапа дифференцировки. Хотя линей-
ные маркеры полезны для подтверждения клеточной
идентичности, выраженность функциональных свойств
зрелой клетки является наилучшим критерием для
установления терминальной дифференцировки и под-
тверждения происхождения клеток.
17.7. ИНДУКЦИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
Существует пять основных параметров, которые ре-
гулируют процесс дифференцировки (см. рис. 17.1).
межклеточное взаимодействие, взаимодействие клетки
с матриксом, форма клеток и полярность, давление
кислорода и растворимые системные факторы.
17.7.1. Межклеточные взаимодействия
Гомотипичпое. Взаимодействие между гомоло! оч-
ными клетками возникает при высокой клеточной
плотности. Это взаимодействие может включать ком-
муникацию через щелевые контакты [Finbow & Pitts,
1981], при котором метаболиты, вторичные мессенд-
жеры, такие как цАМФ, диацилглицерии ( DAG), Ca_t,
или электрический заряд, могут перемещаться между
клетками. Это взаимодействие, возможно, скорее со-
гласует экспрессию дифференцировки внутри популя-
ции сходных клеток, чем инициирует ее. Присутствие
гомотипичных молекул межклеточной адгезии, таких
как С AMs или кад! ерин, которые являются кальций-
зависимымп, обеспечивает функционирование другого
механизма при помощи которого могут взаимодейство-
вать контактирующие клетки. Эти молекулы адгезии
обеспечивают первоначальное взаимодействие между
похожими клетками через идентичные рециирокно вза-
имодействующие внеклеточные домены (см. рис. 3.2.1),
ко горые, видимо, обеспечивают передачу cm нала путем
фосфорилирования внутриклеточного домена ] Doherty
el al.. 1991: Gumbiner. 1995].
Гетеротипичное. Взаимодействие гетероло! оч-
ных клеток, например между клетками, имеющими
мезодермальное и эндодермальное или эктодермаль-
ное происхождение, ответственно за инициацию и
прохождение дифференцировки. В ходе гаструляции
эмбриона и сразу после нее, а также позже в ходе орга-
нов енеза происходит взаимодействие между клетками,
развивающимися из различных зародышевых листков.
Такое взаимодействие стимулирует дифференцировку
[Yamada el al., 1991; Hirai et al., 1992; Henimati-Brivaniou
el al., 1994; Muller el al., 1997J. Например, когда эндо-
дермальные клетки образуют дивертикул кишечника
и пролиферируют внутри прилегающей мезодермы,
тогда мезодерма индуцирует образование альвеоляр-
ных п бронхиальных путей и сама индуцирует свое
преобразование в эластичную ткань [Hardman el al.,
1990; Caniggia et al., 1991].
МЕЖКЛЕТОЧНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ
Гомотипичное
Контакт опосредованное (CAMS, щелевые
контакты)
Растворимые гомокринные факторы
Гетеротипичные.
Растворимые паракринные факторы
Внеклето-жый матрикс
Моделирование in vitro: Высокая плотность
(гистотипичное моделирование), рекомбинантные
культуры (органотипичное)
СИСТЕМНЫЕ ИЛИ ЭКЗОГЕННЫЕ ФАКТОРЫ
Естественные Гормоны, циркулирующие
цитоожы и факторы роста, витамины, Са:*
Синтетические Двумерно полярные сседичеьмя,
РМА
Моделирование in vitro: Среда культивированная
со специальными добавками
ДАВЛЕНИЕ КИСЛОРОДА
Моделирование т vitro Расстояние от
поверхности среды
Концентрация кислорода в газовой стадии
ФОРМА И ПОЛЯРНОСТЬ
Мембранный транспорт
Секреция
Презентация рецептора и рециркуляция
Положение ядра
Моделирование in vitro: Фильтрующие вкладыши
матриксы и складчатость, растягивающая или
сжимающая сила
МАТРИКСНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ
Внеклеточный матрикс
Коллаген, ламинин, протеогликаны, интегрин
передача сигналов
Связывание и перенос цитоклчсв
Моделирование m vitro: продукты матрикса, Matrigel,
внеклеточный матрикс (ЕСМ)
Рис. 17.1. Регуляция дифференцировки Параметры, контролирующие экспрессию дифференцировки in vitro
326
ГЛАВА 17. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
Рис. 17.2. Реципрокное паракринное взаимодействие.
Схематическое изображение двойного паракринного пути
регулирования роста кератиноцитов в ортанитиличной
ко-кулыуре е фибробластами, влючающего IL-1, KGF, и
GM-CSF. а также их рецепторы [см. также Maas-Szabowski
et al, 2000. Szabowski ct al.. 2000) Адаптированный рисунок
приводится no [Maas-Szabowski ct al, 20021
Bo что выливаются эти процессы во взрослом
оргенизме - неясно, но есть свидетельства, подтверж-
дающие, что зрелые клетки эпидермиса сохраняют
реципрокное взаимодействие с подлежащим слоями
дермы. Это взаимодействие, опосредованное дей-
ствием факторов роста KGF и GM-CSF, а также таких
цитокинов, как IL-laand IL-lp, необходимо для фор-
мирования кератинизированных чешуек с полностью
перекрестно-связанным кератином (рис. 17.2) [Maas-
Szabowski et al., 2002).
Паракринные факторы роста
Положительное действие. Если взаимодействующие
клетки относятся к различным линиям дифференци-
ровки, то имеет место действие яяперотитпных па-
ракринных факторов, например KGF в простате [Planz
el al., 1998], альвеолярный фактор созревания в лет ких
[Post et al., 1984J, и дру! ие потенциальные кандидаты,
такие как IL-6 и онкостагин М при развитии лектих
[McCormack el al., 1996, McCormick & Freshney, 2000),
фактор созревания глии в мозге, [Kelesetal., 1992J (см.
разд. 17.7.1; цв. вкладки 12 г? u 13е, f), и интерфероны
[см., например, Pfeffer & Eisenkrafl, 1991J. Некоторые
факторы роста действуют как морфогены [Gumbiner,
1992J, например эаиморфцн [ Hirai etal., 1992; Radisky
et al., 2003J и фактор роста гепатоцитов 'фактор рас-
сеивания (HGF SF) [Kino.shila & Miyajima, 2002J.
HGF является представителем семейства геплрин-
связывающих факторов роста (HBGF) (см. табл. 10.3),
которые высвобождаются из фибробластов, таких
как MRC-5 [Kenworthy et al., 1992J. Эииморфпн и
HGF вызывают образование трубочек в постоянной
культуре клеток MDCK из иочек собаки [Orellana et
al., 1996, Montesano et al., 1997J, эпителии слюнных
желез [Ftirue & Saito, 1997J, и эпителии молочной
железы [Soriano et al., 1995J. KGF, который являет-
ся паракринным фактором, продуцируется фибро-
бластами кожи и простаты. Он оказывает влияние на
эпидермальную дифференцировку [Aaronson el al.,
1991; Gumbiner, 1992; Maas-Szabowski el al., 2002] и ре-
йдирует дифференцировку эпителия простаты [Planz
et al., 1998, Thomson et aL, 1997]. Такие факторы роста,
как FGF-1. -2. и -3. KGF (FGF-7), TGF-fJ и активин,
также учас гвуют в эмбриональной индукции [Jessell
& Mellon, 1992]. Оба фактора, HGF и KGF, продуци-
руются фибробластами, связываясь с рецепторами,
найденными на дру! их клетках (в основном эпите-
лиальными), и являются классическими примерами
паракринных факторов роста. В некоторых случаях
высвобождение паракринных факторов роста может
находиться иод контролем i ормонов системного дей-
ствия. Было показано, что tn vivo альвеолярные клетки
II типа в ле< ких производят сурфактант в ответ на
действие дексаметазона. В экспериментах in vitro об-
наружено, эта индукция синтеза сурфактанта зависит
от связывания стероидов с рецепторами в строме, что
приводит к высвобождению пептида для активации
альвеолярных клеток [Post etal., 1984]. Аналшичным
образом, ответ эпителиальных клеток мышиной про-
статы на андрогены опосредован стромой [Thomson
et aL, 1997]. Было показано, что KGF является по
крайней мере одним из компонентов взаимодействия
в простате [Yan et al., 1992].
Дифференцировка энтероцитов тонкой кишки,
стимулированная i идрокортпзоном, также требует
участия подлежащих фибробластов стромы [Kiedinger
el aL, 1987]. В данном случае происходит модификация
межклеточного матрикса между этими двумя типами
клеток
[Simon-Assmann el al., 1986|. Дексаметазон-зависи-
мая модификация матрикса также включена в развитие
ответа альвеолярных клеток II типа на действие парак-
ринных (см. разд. 17.7.3), [Yevdokimova & Freshney,
1997]. Дифференцировка в гематопоэтической системе
находится под контролем нескольких положительно
действующих линейно-специфичных факторов роста,
таких как IL-1, IL-6, G-CSF и GM-CSF (см. табл. 10.3
и 23.3), причем активация последне!Х> также зависит от
матрикса [de Wynter et al., 1993]. Сульфаты гепарина
матрикса также участвуют в активации FGF |Klagsb-
run & Baird, 1991; Fernig & Gallagher, 1994].
Гомокринные факторы являются /.омотипичными
паракринными факторами, производимыми в одной
клетке и действующими на соседние клетки той же
линии, а аутокринные факторы стимулируют ту же
самую клетку, которая продуцировала их (см. разд. 3.5
17.7. Индукция дифференцировки
327
и рис. 3.7). Гомокринные и аутокринные факторы, ви-
димо, неразличимы с практической точки зрения.
Отрицательное действие. Такие факторы, как
MIP- 1р, позволяют поддерживать фенотип стволовой
клетки [Graham el aL, 1992], a PDGF и FGF 2 иниции-
руют рост и самообновление клеток-предшественников
О-2А, но иншбирует их дифференцировку [Bogler el
aL, 19901. Друч ие отрицательные регуляторы диффе-
ренцировки включают LIF, участвующий в клеточной
дифференцировке ES-клеток [Smith et aL, 1988] и Т GF-
Р. ре1улирующнй дифференцировку альвеолярных
клеток II [Torday & Kotirembanas, 1990: McCormick &
Freshney, 2000; McCormack et aL, 1996].
17.7.2. Системные или экзогенные факторы
Физиологические индукторы (табл. 17.1). Различа-
ют следующие системные филиолтм ические pei улято-
ры, которые вызывают дифференцировку: 1) Гормоны,
которые in vivo образуются в отдаленных opiauax и
тканях и достш ают органа-мишени ио сосудистому
руслу (эндокринные факторы). В эту категорию входя?
t идрокортизон, 1люкагон и тироксин (или трнйод-
тиронин). 2) Витамины, такие как витамин D3 [Jeng
el aL, 1994, Rattner el aL 1997] и ретиноевая кислота
[Saunders et aL, 1993; Hafny et aL, 1996; Ghigo et aL,
1998), поступают в организм из продуктов питания
и могут быть модифицированы в результате мета-
болизма. 3) Heopt анические ионы, в частности Са2*.
Высокая концентрация Са2* обеспечивает процесс
дифференцировки кератиноцитов [С ho & Bikie. 1997].
(см., наиример, разд. 23.2.1). Вероятно, это связано с ро-
лью кальция в клеточном взаимодействии (кадгерины
являются кальций-зависпмыми), внутриклеточной пе-
редаче сшнала и потоке кельция через мембрану в так
называемых «кальциевых волнах», которые передаю?
ст нал от одной отвечающей клетки к другой, рядом
расположенной, клетке той же линии (см. рис. 3.7).
Наряду с коммуникацией через щелевые контакты и,
возможно, 1 омокринными факторами и сульфатом ге-
парина, кальциевые механизмы помгнают генерировать
скоординированный ответ*.
Дру!не физиоло! ические индукторы - это па-
ракринные факторы, о которых шла речь выше (см.
разд. 17.7.1). Предиола|ается, что они действуют прямо,
от клетки к клетке, без участия транспорта но кровенос-
ной системе. Тем не менее некоторые из этих факторов
(FGF, PDGF, интерлейкины) обнаруживаются в крови,
поэтому они MOiyr играть системную роль.
Нефизиологические индукторы. Rossi and Friend
[1967] обнаружили, что клетки мышиной эритро-
лейкемии, обработанные диметилсульфоксидом
(DMSO), для производства вируса лейкемии Friend
приобретают красную окраску в результате продук-
ции 1емО1лобина (см. цв. вкладку 13а, б), что было
подтверждено возрастанием экспрессии гена 1лобина
(см. цв. вкладку 13«, г). Впоследствии было показано,
что mhoi ие дру! ие клетки - нейробластомы, миеломы
и карциномы молочной железы — отвечают на действие
DMSO дифференцировкой. В список нефизиолошчес-
ких индукторов дифференцировки в настоящее время
внесены и дручие вещества: гексаметилен бис-аце-
тамид (НМВА); АГ-метилацетамид; бензодиазепины,
действие которых может быть родственно действию
DMSO, и ряд цитотоксических препаратов, таких
как метотрексат, цитозинарабпноза и митомицин С
(табл. 17.2). Бутират натрия тоже был отнесен в список
нефпзиоло!ических индукторов дифференцировки,
однако некоторые данные показывают, что бутират
может являться естественным регулятором, например
доказано, что он pei у л пру ет в норме поведение кле-
ток в кишечнике. Механизм действия этих веществ
неясен, но он может быть опосредован изменениями
в текучести мембраны (в частности, это относится к
полярным растворителям, какими являются DMSO,
анестетики и транквилизаторы). Кроме тою, их дей-
ствие может быть связано с взаимодействием с фермен-
тами, участвующими в передаче сш нала, такими как
нротеинкиназа С(РКС) и фосфолипаза D(PLD). Такое
взаимодействие приводит к изменению локализации
из растворимой формы в цитоплазме в эндоплазма-
тический ретикулум, где он активируется. К тому же,
эти вещества MOiyr изменить метилирование ДНК или
ацетилировании i истонов. Индукция дифференциров-
ки полярными растворителями, такими как DMSO,
может быть фенотипически нормальным явлением, в
то время как индукция цитотоксическими препаратами
может также вызывать экспрессию i ена, не связанною
с дифференцировкой [McLean et а!.. 1986]. Показано,
что активаторы опухолей, такие как миристпнфорбо-
лацетат (РМА), вызывают сквамозную дифференци-
ровку в бронхиальной слизистой, иритом что этого не
происходит с бронхиальной карциноме [Willey et aL,
1984; Masui et aL, 1986 a, b; Saunders et aL 1993]. Хотя
такие активаторы не являются нормальными pei уля-
торами in vivo, они связываются со специфическими
рецепторами и активируют передачу сш нала, напри-
мер, путем активации РКС [Dotto el aL, 1985].
17.7.3. Взаимодействия клетки с матриксом
Поверхность большинства клеток окружает слож-
ный матрикс гликопротеинов и протеогликанов,
высокосиецифичный для каждой ткани и даже для
отдельных частей ткани. Retd [1990] показал, что,
изменяя состав искусственного матрикса внесением
различных веществ, можно регулировать экспрессию
генов. Например, добавление матриксного материала,
выделенною из печени, вызывает экспрессию гена
альбумина в гепатоцитах. Более тою, было обнаружено,
что коллаген важен для экспрессии функциональных
генов mhoi их эпителиальных клеток [Вш wen & Pilelka,
1980; Flynn el aL, 1982; Berdichevsky et aL, 1992] и для
эндотелия при созревании капилляров [Folkman &
Haudenscliild, 1980J. Показано также, что во мн<них
328
ГЛАВА 17. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
Таблица 17.1. Растворимые индукторы дифференцировки, физиологические
Индуктор Клеточный тип Ссылка
Стероидные и родственные им вещества Глия, глиома Легочные альвеолярные клетки II типа Гепатоциты Эпи юлив молочных желез Миелоидная лейкемия McLean ct al., 1986 Rooney ct al., 1995,- McCormick ct al., 1995 Granncr ct al., 1968 Marte ct al., 1994 Sachs, 1978
Ретиноиды Пептидные гормоны Трахеобронхиальный эпителий Эндотелий Энтсроциты (Сасо-2) Эмбриональная карцинома Меланома Миелоидная лейкемия Нсиробластома Kaartmcn ct al, 1993 Lcchardcur ct al, 1995, Hafny ct al.. 1996 McCormack ct al., 1996 Mills ct al.. 1996 Lotau & Lotan, 1980, Mcyskcns and Fuller. 1980 Degos, 1997 Ghigo ct al., 1998
Мелаиотрои пн Меланоциты Goduigand Fisher, 1997
Тироголин Щи ювидная же юза Chambard ct al.. 1983
Эритропоэтин Эритробласты Goldwasscr. 1975
Пролактин Эпителий молочной железы Takahashi ct al.. 1991, Rudland, 1992. Marte et al. 1994
Инсулин Цитокины Эпителий молочной железы Marte ct al., 1994, Rudland, 1992
Фактор pocia нервов NGF Нейроны Levi-Moiitaleini, 1979
Фактор созревания глин CNTF, PDGF. ВМР2 Глиальные клетки KclcsctaL, 1992. Raff, 1990, Kondo & Raff, 2000,2004
Эипморфин Почсчныи эпителии Hirai ct al., 1992
Фиброцнтарный-лнсвмо- цитарный фактор Пнсвмоциты II типа Post ct al, 1984
Интсрфсрон-а, р Клетки А549 HL60. Миелоидная лейкемия McCormack ct al, 1996 Kohlhepp et al, 1987
Интерферону Нсйроблаеюма Wuann et al., 1991
CNTF Астроциты 2 типа Raff. 1990
IL-6. OSM Клетки А549 McCormack et ai, 1996. McCormick & Freshncy. 2000
BMP Клетки 10TI 2 Shea ct al.. 2003
KGF Кератиноциты Эпителий простаты Aaronson ct al., 1991 Thomson ct al, 1997. Yan ct al., 1992
HGF Почки (MDCK) Гепатоциты Bhargava ct al, 1992; Li ct al.. 1992 Montesano ct al, 1991
TGF-₽ Бронхиальный эпителий, меланоциты MasuictaL, 1986a, Fuller and Mcvskcns, 1981
Эндите тин Витамины Меланоциты Aoki ct al, 2005
Витамин Е Нейробластома Prasad ct al., 1980
Витамин D3 Моноциты (U937) Миелома Остеобласты Энтсроциты (IEC-6) Yen ct al, 199.3 Murao ct ai, 1983 Vilainitjana-Amcdce ct al, 1993 Jcngctal, 1994
Витамин К Ретиноиды (см. выше) Неорганические вещества Гепатома Почсчныи эпителии Bouzahzah ct al. 1995 Cancelactal, 1997
Са? Кера 1 иноциты Bovcc & Ham, 1983
случаях последовательность RGD (aptинин-глицин-
acnapai ивовая кислота) в молекулах матрикса способна
взаимодействовать с рецепторами клетки [Yamada &
Geiger, 1997J. Небольшие полипептиды, содержащие
эту последовательность, эффективно блокируют мат-
рикс-индуцированную дифференцировку, что цред-
тюлатает необходимость наличия интактных молекул
матрикса [Pignatelli & Bodmer, 1988J.
17.7. Индукция дифференцировки
329
Были предприняты относительно успешные попыт-
ки сымитировать действие матрикса с использованием
синтетических макромолекул. Наиример, молекулы
иолн-О-лизина использовались для активизации роста
аксона нервной клетки в нейрональной культуре (см.
разд. 23.4.1), однако, возможно, требуются еще дли-
тельные доиолнительные исследования специфичнос-
ти взаимодействия с матриксом. Электростатический
заряд сам ко себе, ио-видимому, недостаточен для моде-
лирования более сложных сиг налов, продемонстриро-
ванных для многих различных типов взаимодействия
клеток с матриксом, но изменение заряда, вероятно,
позволяет клеткам прикрепляться и распластываться
на субстрате, и при этих условиях клетки способны
производить свой собственный матрикс.
Было показано, что эндотелиальные клетки (Kin-
sella el al., 1992; Garrido el al., 1995J и мнение эпите-
лиальные клетки дифференцируют более эффективно
на Матригеле [Kibbey el al., 1992, Darcy el al., 1995;
Vetikalasubramanian el al.,2000, Porinoy et al., 2004J,
матриксном материале, произведенном клетками
саркомы Engelberth-Holni-Swarm (EHS) и нанесен-
ном чаще всего на ламинин. В качестве подложки
используется также коллаген или протеогликан.
Ряд клеточных линий, например А549 тип II или
клетки аденокарциномы леиенх Clara, обнаруживаю?
очевидный морфогенез при росте на Матршеле (см.
цв. вкладку 12в). Этот метод полезен, но имеет* ряд
проб.гем, связанных с внесением друшх биологичес-
ких изменений в систему. Тем не менее для решения
некоторых задач требуется определенный матрикс,
который должен быть создан в условиях лаборатории,
если его нет в коммерческой продаже
Фибронектин, ламинин, коллаген и ряд других
компонентов матрикса могут быть приобретены в
разных компаниях. Тем не менее специфичность мат-
рикса, возможно, определяется протеогликановыми
функциональными t руинами, внутри которых имеется
потенция.'! для широкой вариабельности, в частности
в количестве, типе и распределении сульфатирован-
ных гликозаминогликанов, таких как геиарансульфа?
(Fernig & Gallagher, 1994J.
Внеклеточных матрикс может также играть роль
в модуляции активности факторов роста. Предио-
ла1 ается, что иротео1ликаны матрикса, в частности
геиарансульфатиротео!ликаны (HSPGs), могут свя-
зываться с определенными факторами роста, такими
как GM-CSF [Damon el al.. 1989: Luikarl el al.. 1990J.
и делать их более доступными для расположенных
поблизости клеток. Трансмембранные HSPGs могу?
также действовать как низко-аффинные рецепторы
для факторов роста и обеспечивать транспорт этих
факторов роста к высокоаффинным рецепторам
(Klagsbrun & Baird, 1991; Fernig & Gallagher, 1994J.
Клеткам A549 требуй лея t люкокортикоиды для ответа
на индукторы дифференцировки, такие какОЗМ, IL-6,
и среда, кондиционированная фибробластами ле1-
ких. Глюкокортикоид, в данном случае дексаметазон
(DX), стимулирует синтез фракции геиарансульфата
с низкозарядной плотностью, в клетках А549, которая,
как показано, при частичной очистке замещает DX и
активирует OSM, IL-6, и кондиционированную фибро-
бластами среду (Yevdokimova & Freshney, 1997]
17.7.4. Полярность
и форма клетки
Исследования, проведенные на гепатоцитах (Saltier
et al., 1978J, показали, что для полною созревания
необходимо культивировать клетки на коллагеновом
геле с последующим отделением геля от дна чашки при
помощи шпателя или cot нутой пастеровской пипетки.
Эти манипуляции индуцируют сокращение геля и пос-
ледующим изменениям очертаний клетки от расплас-
тавшейся до кубоидальной или даже колоннообразной.
Одновременно или вслед за изменениями формы, а так-
же, возможно, для того, чтобы обеспечить доступ к среде
через гель, у клеток развивается полярность, видимая
нри использовании электронной микроскопии, при
котором ядро становится асимметрично расположен-
ным, ближе к базальному концу клетки, формируется
активный комплекс Гольджи и на апикальном конце
клетки происходит секреция.
Похожие процессы установления полярности были
показаны в клетках эпителия щитовидной железы
| Chainbard et al., 19831 при помощи комплекта филь-
трующих ячеек. В данном случае нижняя (базальная)
поверхность образует рецепторы для тиреотропного
гормона (ТТГ) и секретирует трийодтиронин, а верх-
ний (апикальный) конец высвобождает тиреоглобу-
лин. Исследования на гепатоцитах (Guguen-Guillouzo
& Guillouzo, 1986] (см. разд. 23.2.6) и бронхиальном
эпителии (Saunders et al., 1993J предполагают, что
коллагеновый матрикс не шрает существенной роли,
но успех культивирования в фильтрующих лунках
(см. разд. 24.7.4) подтверждает роль контакта нижней
поверхности клеток со средой.
17.7.5. Давление кислорода
Достижение стадии полной кератинизации при сква-
мозной дифференцировке требует расположения
эпидермальных клеток в opt анотипической конструк-
ции на поверхности раздела сред воздух .жидкость
(Maas-Szabowski el al.. 2002]. Таким же образом рас-
положение альвеолярных клеток Птица необходимо
для оптимальной дифференцировки II типа (Dobbs
el aL, 1997J, а эпителий только трахеи на поверхности
воздух, жидкость начнет секретировать слизь, остава-
ясь сквамозным при росте на дне чашки (Kaarlinen el
al., 1993, Paquette el al., 2003J. Суммируя сказанное,
можно сказать, что расположение клеток на границе
раздела жидкой и газовой фаз улучшает 1азовый обмен,
чрезвычайно обле! чая захват кислорода без повышения
парциального давления н риска образования токсич-
ных свободных радикалов. Тем не менее возможно, что
330
ГЛАВА 17. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
тонкая пленка над культурой имитирует физические
условия in vizv (поверхностное натяжение, недостаток
питательных веществ) так же, как оксигенация. При-
сутствие D-PBS на апикальной поверхности может в
действительности оказаться предпочтительнее полной
питательной среды [Chambard etal., 1983,19871.
подтверждают наличие взаимной связи между выра-
женностью дифференцированных свойств качеств и
выраженностью признаков злокачественности, вплоть
до вывода, что индукция дифференцировки может рас-
сматриваться как способ терапии |Spremulli & Dexter,
1984; Freshney, 1985].
17.8. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
И ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТЬ
Часто отмечается, что при нарастающем развитии рака
1 истоло! ическое исследование опухоли обнаруживает
менее дифференцированные клетки, и, с прО1ности-
ческой точки зрения, больные с малодифференци-
рованными опухолями обычно имеют более низкую
выживаемость, чем больные с дифференцированными
формами рака. Кроме того, считается установленным,
что рак является результатом нарушения способности
клеток к нормальной дифференцировке (см. табл. 17.2).
В самом деле, большая часть результатов фундамен-
тальных исследований была получена на клетках
мышиной лейкемии Friend, клетках миеломы мыши и
человека и нейробластомы. Тем не менее эти данные
17.9. ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
Понятно, что при созданных правильных условиях
окружающей среды и предполатая, что в культуре при-
сутствуют соответствующие клетки, дифференцировка
в клеточной культуре достижима частично или даже
полностью. Как общий метод индукции и обеспечения
дифференцировки, противоположный методам клеточ-
ной пролиферации и размножения, можно предложить
следующий:
1) Выбрать нужный тип клеток при помощи соответ-
ствующих условий выделения и селективных сред
(см. разд. 10.2.1 и гл. 23).
2) Вырастить клетки до высокой клеточной плотнос-
ти (>1х105 кл./См2) на соответствующем матриксе.
В качестве матрикса можно использовать коллаген.
Таблица 17.2. Растворимые индукторы дифференцировки, нефизноло! ические
Индуктор Клеточный тип Ссылка
Двухмерно-полярные компоненты DMSO Мышиная эрВ|ро.1СЙкемпя Rossi & Friend. 1967, Dmncn & Ebisuzaki, 1990
Бутират натрия Миелома Нейробластома Эпителии молочной же тезы Гепатоциты Эритролейкемия Tarellaetal, 1982 Kunliictal, 1976 Rudland, 1992 Mitaka ct al.. 1993, Htnoctal., 1999 Andersson et al, 1979b
N-мстилацстамид Рак толстил кишки Глиома Vclcichetal.. 1995 McLean ctaL, 1986
N-мстнлформамид, димстилформампд Рак толстой кишки Dexter etal.. 1979
НМВА Эритролсйкем ия Osborne ct al 1982, Marks ct al.. 1994
Бензодиазепин Эритролейкемия Clarke and Ryan. 1980
Цитотоксические препараты Генистенн Эритролейкемия Watanabe ctaL, 1991
Цнтоэинарабиноза Миелоидная лейкемия Takeda ct al.. 1982
Митомицин С, антрациклины Меланома Raz. 1982
Метотрексат Колоректальная кариинома Lcsufilcur ct al. 1990
Модуляторы передачи сигнала РМА Бронхиальный эпителий Willey ct al, 1984, Masui ct al, 1986a
Эпителий молочной же тезы Толстый кишечник (НТ29, С асо-2) Моноциты (U937) Эритролейкемия (К562) Нейробластома Wada etal, 1994 Vclctch ct al.. 1995, Pignata et al, 1994 Hass ct aL. 1993 Kujotli and Fahl, 1997 Spinelli ctaL, 1982
Аббревиатуры. НМ ВА. Гсксамш плен бис-ацетамид (hcxanicthy Icnc bisacetaintde). PM A (TP А), форбол мирис rar аце тат (pborbol
myristate acetate)
17.S. Практические аспекты
331
соответствующий коллагену и.< ткани источника
клеток. Матрикс может иметь более сложный состав
и быть полученным из тканей или клеток, (см. про-
токол 8.1), наиример, Matrigel (см. разд. 17.7.3) или
синтетический матрикс (наиример, поли-П-лизин
для нейронов)
3) Перенести клетки в соответствующую среду, кото-
рая более подходит для дифференцировки чем для
размножения, наиример для клеток эпидермиса не-
обходимо увеличение концен i рации Са2,до величин
около 3 мМ, для бронхиальной слизистой возраста-
ние концентрации сыворотки (см. протокол 23.9).
Для других клеточных типов этот шат может
потребовать различных факторов роста, необходи-
мых для продолжения клеточной пролиферации и
ответственных за индукцию дифференцировки.
4) Добавить агенты-индукторы дифференцировки, та-
кие как глюкокортикоиды, ретиноиды, витамин D3.
DMSO; НМВА; проста! ландины и цитокины, на-
пример bFGF, EGF, KGF, HGF, IL-6, OSM,TGF-0,
интерфероны, NGF. u меланоцит-стимулирующий
гормон (MSH), в соответствии с типом клеток (см.
табл. 17.1 и 17.2).
5) Добавить взаимодействующий тип клеток в ходесо-
ответствующей фазы роста (mai 2 этой процедуры),
индукционной фазы (ша< и 3 и 4 данной процедуры),
или обеих фаз. Выбор правильного типа клеток не
всетда очевиден, но фибробласты лет кого, необхо-
димые для созревания легочно!о эпителия [Post
et al., 1984; Speirs el al., 1991], глиальные клетки
для созревания нейронов [Seifert & Muller, 1984] u
адипоциты костного мо;ма для гематопоэтических
клеток (см. протокол 23.22) представляют собой
лучше всего охарактеризованные примеры.
6) Культивирование в фильтрационной ячейке [см.
наиример, Chambard el al., 1983] может быть пред-
почтительно, особенно для определенных типов
эпителия. В ходе культивирования необходимо
обеспечить доступ базальной поверхности клеток к
питательным веществам и лшандам, возможность
установления полярности и pei уляции питательных
веществ и кислорода на апикальной поверхности, пу-
тем подбора состава и i лубины подлежащей среды.
Не все из этих факторов мшут потребоваться, по-
следовательность, в которой эти этапы представлены,
означает лишь определенную степень приоритетности.
Большое значение может также иметь определенный
график работ. Например, матрикс обычно медленно
обновляется, поэтому может быть важным пролон-
гированное действие матрикс-индуцированных ус-
ловий, в то время как некоторые гормоны MOiyr быть
эффективны ири относительно коротком времени
экспозиции. Более того, ответ на гормоны может за-
висеть от присутствия соответствующих компонентов
внеклеточно! о матрикса, плотности клеток или взаи-
модействия гетероло! ичных клеток.
Глава 18
ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
18.1. РОЛЬ В ХАРАКТЕРИСТИКЕ
КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ
Трансформации рассматривается как отдельное собы-
тие или серия событий, которые определяются генети-
ческой нестабильностью. Она меняет mhoi ие снойстна
клеточных линий, включая темпы роста, тип роста
(прикрепленный или суспензионный), продукцию
специализирован ных продуктов, продолжительность
жизни и туморогенность (табл. 18.1). Таким образом,
трансформация является важным событием, поскольку
эти характеристики важны для доказательства прина-
длежности клеточной линии при определении того,
происходит ли полученная линия из неопластических
клеток или в линии произошла трансформация ири
культивировании. Состояние трансформации являет-
ся принципиально важной характеристикой, которая
должна быть известна, когда культивируются клетки,
полученные из опухолей. В этом случае необходимо
подтвердить, что клетки получены из неопластической
компоненты опухоли, а не из нормальных фиброблас-
тов, инфильтрирующих ткань, клеток кровеносных
сосудов или клегок воспаления.
Для подтверждения неопластического происхож-
дения необходим более чем один критерий, поскольку
большинство из вышеупомянутых характеристик про-
являются и в нормальных клетках на определенных
стадиях их развития. Исключение составляют анеуи-
лоидия, гетероплоидня и канцерогенность, которые
вместе взятые рассматриваются как неоспоримые по-
ложительные индикаторы злокачественной трансфор-
мации. Тем не менее некоторые опухолевые клеточные
линии мотут быть почти эуплоидны и нетуморогенны,
поэтому требуются друt ие критерии
18.2. ЧТО ТАКОЕ ТРАНСФОРМАЦИЯ?
В микробиологии, тде этот термин впервые был ис-
пользован в таком контексте, трансформация под-
разумевает изменение фенотипа, которая зависит от
захвата нового генетического материала. Этот процесс
теперь может быть воспроизведен искусственно в
клетках млекопитающих (см. разд. 27.11), он назы-
вается трансфекцией, или переносам ДНК, для тою
чтобы отличать его от трансформации. Трансформация
культивированных клеток подразумевает спонтанные
или индуцированные перманентные фенотипические
изменения, возникшие в результате наследуемых
изменений в структуре ДНК и экспрессии генов.
Хотя трансформация может развиться в результате
инфекции трансформирующим вирусом, таким как
вирус нолиомы, либо трансфекции такими генами, как
мутантный ген ras, она также может развиться спон-
танно после воздействия ионизирующей радиации или
химическою канцерог ена.
Трансформация ассоциируется с генетической
нестабильностью и тремя основными классами фено-
типических изменений, один из которых может быть
выражен в одном клеточном штамме.* 1) бессмертие,
приобретение бесконечною срока жизни, 2) аберрант-
ный контроль клеточного роста, утрата клеточной
подвижности в результате контактною инг пбирования
подвижности, утрата ограничения клеточной проли-
ферации при высокой клеточной плотности и утрата
зависимости от прикрепления к субстрату и 3) з юка-
честченность, доказательством которой служит рост
инвазивных опухолей in vivo. Термин трансформация,
обычно используемый здесь, подразумевает все три
этих процесса. Приобретение «бессметрия» само по
себе называется иммортализацией, поскольку оно
может быть достиг нуто без значительных нарушений
механизмов контроля роста и злокачественности, ко-
торые обычно взаимосвязаны.
18.3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ
Характеристики клеточных линий не всегда оста-
ются стабильными. В дополнение к уже описанным
фенотипическим изменениям (см. разд. 3.4.2, 17.1.1)
клеточные линии также склонны к генетической
нестабильности. Нормальные, конечные человеческие
клеточные линии обычно генетически стабильны,
но клеточные линии, полученные из других видов,
в частности из мышей, генетически нестабильны и
способны к трансформации. Постоянные клеточные
линии, в частности полученные из опухолей, незави-
симо от вида, очень нестабильны, что неудивительно,
поскольку именно их нестабильность обеспечивает
возможность мутаций, необходимых для того, чтобы
стать постоянными Обычно имеют место делеции
или изменения в структуре генов регуляторных ДНК,
таких как р53. Следовательно, постоянные клеточные
18.3. Генетическая нестабильность
333
Таблица 18.1. Свойства трансформированных клеток
Свойство Анализ Протокол, рис. или ссылка
Рост
Иммортализованныс Рост свыше 100 pd* Коррсг & Hajdu 2004, Meeker and De Marzo 2004
Независимость от субстрата Клонирование в агаре, может расти в переме- шиваемой суспензии Протоколы 14.4,14.5,13.3
Утрата контактного торможения Наблюдение иод микроскопом Запись фильма о поведении клеток Рис. 18 3; цв вкладка 9
Рост гомологичных клеток в конфлюэнтном монос 'ЮС Образование фокусов трансформации Рис. 183
Снижено ограничение роста при высокой плот- Высокая плотность популяции, высокая доля Протоколы 18.3,2110,
ности популяции делящихся клеток при высокой плотности клеток 21.11
Низкая потребность в сыворотке Клонирование при низкой концентрации сыворотки в среде Протоколы 21.9,22 3
Независимость от факторов роста Клонирование при низкой концентрации сыворотки в среде Протоколы 21.9,22 3
Продукция аутокринных факторов роста Иммуноокрашиванис, клонирование при низкой концентрациисыворо1ки в кондици- онированной среде, рсцептор-блокирующие антитела или пептидные иш нбиторы Протоколы 16.13,21.9,22.3
Продукция трансформирующего фактра роста Суспензионное клонирование NRK Протоколы 14.4.14 5
Высокая эффективность посева Клонирование при низкой концентрации сыворотки в среде Протоколы 21.9.22.3
Укорочение периода удвоения популяции Генетические свойства Кривая роста Протоколы 21.7.21 8
Высокий темп слон ганнои мутации Обмен сестринскими хромат идами Протокол 22 5
Лнеуплпидия Хромосомный набор Протокол 169
Гстероилоидия Хромосомный набор Протокол 16 9
Свсрхэксирсссия или мутированные онкогены Саузерн блот, FISH, иммуноокрашиванис. Aiisubel ct al., 1996,2002,
МАА протоколы 28.2,1613, цв. вкладка 24
Делсциции или мутации генов-супрессоров Саузерн блот, FISH, иммуноокрашиванис. Aiisubel ct al., 1996,2002;
МАА протоколы 28.2,1613, цв. вкладка 24
Транслокации генов и хромосом Структурные свойства FISH, хромосомное окрашивание Протокол 28 2
Модификация актинового цитоскелета Иммуноокрашиванис Протокол 16 13
Утрата связывания фибронектина с клеточной поверхностью Иммунноокрашивание Протокол 16 13.
Модифицированный внеклеточный матрикс Иммуноокрашиванис, DEAE хроматография Протокол 16 13, Yevdokimova and Freshney, 1997
Изменение экспрессии ichob молекул клешчнои адгезии (С AMs, кадгерины, интегрнны) Иммуноокрашиванис Протокол 16 13
Нарушение клсточнои полярности Иммуноокрашиванис. поляризационный гран- Протокол 16 13. Hallcux and
Неопластические спорт в фильтрующих лунках Schneider, 1994
Туморогенные свойства Ксенотрансплантация в мышах Nude и Giovanella ct al, 1974, Russo
Sc id** etal.. 1993
Ангиогенные свойства САМ-исследование, фильтрующие ячейки. Цв вкладка 9; Ment ct al..
продукция VGEF 1997, Buehler ct a!, 2004
Усиление секреции прогеаз (активатор плазми- Исследование активатора плазминогена Рис. 188; Whurct al., 1980,
ногена) Boxinan ct al, 1995
Инвазивность Инвазия опухолевых клеток в выдстснныс н Рис. 18.6. 18 7. Marcel ct al,
культивируемые ткани, исследование инва- зии в фнльт ру ющих ячейках 1979, Brunton eta!, 1997
* pd population doubling -период удвоения популяции
** Sc id -severe combine iminunodcficitc syndrome — тяжелый комбинированный иммунодефицит
334
ГЛАВА 18. ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
Рис. 18.1. Клональные вариации. Различия в активности
тиризинаминспрансфсразы в четырех субклонах клона 18
штамма H-4-I1-E-C3 клеток гепатомы крысы с минимальны-
ми отклонениями. Клетки клона 18 были выделены, выраще-
ны, повторно клонированы. к.к>ны второго поколения бы.|И
исследованы на тнрозинаминотрансфсразную активность
с предварительной обработкой культуры дексаметазоном
(ДМ) и без обработки ДМ. Светло-серые столбики ба-
зальный уровень; темно-серые столбики индуцированный
уровень (данные J Somerville)
штаммы даже после клонировании содержат напор ге-
нотипов, которые постоянно изменяются.
Существует две основных причины генетической
гетерогенности: 1) высокая скорость спонтанных му-
таций, которая выше in vitro, видимо, в связи с высокой
скоростью клеточного деления и 2) отсутствие эли-
минации мутантных клеток, если только эти мутации
не нарушают рост клеток. Минимально-девиантные
клетки печени крыс, нри росте в культуре, обладают
конститутивной тирозииаминотрансферазной актив-
ностью, которая может* быть в дальнейшем индуциро-
вана гексаметазоном, [Granner et al., 1968], но субклоны
клонированных штаммов H4-1I-E-C3 [Pitotetal., 1964]
различаются как конститутивным уровнем ферментов,
так и возможностью индукции их активности декса-
метазоном (рис. 18.1).
18.3.1. Хромосомные аберрации
Для обнаружения генетических нарушении может
быть использован подсчет хромосом (см. рис. 3.9) и
кариотипический анализ. Хотя кариотип мышиных
клеток состоит исключительно из маленьких телоцент-
рических Хромосом, BO МНО1 их постоянных мышиных
клеточных линиях в результате слияния теломер по-
является несколько метацентриков (рис. 18.2а; Роберт-
сонпанское слияние (Robertsonian fusion)). Более того,
хотя практически каждая клетка у животных имеет
нормальный диплоидный набор хромосом, в культуре
кариотип более вариабелен. Б крайних случаях, т.е.
в штаммах постоянных клеточных линий, таких как
18.4. Иммортализация
335
HeLa-S3 менее чем половина клеток будет иметь тот
же кариотип, т.е. эти линии гетероплоидны (см. также
рис. 3.9). Мотут обнаруживаться оба варианта измене-
ний плоидии и возрастание частоты индивидуальных
хромосомных аберраций (рис. 18.26) [Biedler, 1976;
Croce, 1991]. Вариации количества хромосом встре-
чаются также в большинстве опухолевых культур
(см. рис. 3.8; протокол 16.9, [Sandberg, 1982]). Число
случаев генетической нестабильности и частота хро-
мосомных перестроек мотут быть определены методом
изучения обмена сестринских хроматид [Venitt, 1984]
(см. протокол 22.5 и цв. вкладку 17с), е). Некоторые спе-
цифические аберрации связаны с определенными типа
мп злокачественности [Croce, 1991]. Первой докумен-
тированной аберрацией была Филадельфийская хро-
мосома. обнаруженная ири хронической миелоидной
лейкемии (трисомия 13-й хромосомы). Впоследствии
трнаслокации длинного илеча 8-й и 14-й хромосом
были обнаружены при лимфоме Беркитта [Lebeau &
Rowley, 1984]. Некоторые другие лейкемии также
связаны с транслокациями [Mark, 1971 ]. Менинт номы
часто имеют постоянно присутствующее аберрации, а
ири мелкоклеточном раке легкого зачастую обнару-
живается делеция Зр2 [Wurster-Hill et al., 1984]. Эти
аберрации представляют собой оиухолесцецифичные
маркеры, которые могут быть чрезвычайно ценны при
характеристике клеточных линий или подтверждении
новообразований.
18.3.2. Изменение
содержания ДНК
Проточная цитометрия [Traganosetal., 1977] показыва-
ет, что содержание ДНК опухолевых клеток отражает
хромосомные аберрации, т.е. оно может отличаться
от ДНК нормальных соматических клеток и служить
маркером гетерогенности популяции. Анализ ДНК не
заменяет хромосомный анализ, поскольку клетки с
определяемым нормальным содержанием ДНК могут
иметь анеуплоидный кариотип. При анализе ДНК
также возникают ошибки, поскольку могут взаимно
уничтожаться делеции ц иолисомия либо могут иметь
место транслокации без общих потерь ДНК.
18.4. ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
Большинство нормальных клеток имеют конечный
срок жизни продолжительностью в 20—100 генераций
(см. разд. 3.8.1), но некоторые клетки, преимущест-
венно полученные от грызунов и большинство клеток
опухолей, могут давать начало постоянным клеточным
линиям с неопределенной продолжительностью жизни.
Клетки 1 рызунов кариотицически нормальны ири вы-
делении и примерно через 12 генераций проходят через
кризис; большинство клеток noi ибают в ходе кризиса,
но некоторое их количество выживает и характеризу-
Рис. 18.3. Фокусы трансформации. Моносчей нормальных мышиных NIH ЗТЗ фибробластов, обладающих контактным
торможением, ославленный в состоянии конфлюэнтного монослоя на 2 недели, (о) 75-см2флакон, окрашенный по Гимза (б)
Фазово-контрастное изображение фокусов трансформированных клечок. имеющих избыточный рост ио сравнению с нормаль-
ным монослосм (10х объектив) (см. также цв вкладку 14в)
336
ГЛАВА 18. ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
ется ускорением темной роста и развитием постоянных
клеточных линий.
Если постоянные клеточные линии, полученные из
мышиных эмбрионов (т.е. различные ЗТЗ клеточные ли-
нии), поддерживаются при низкой клеточной плотности,
что не позволяет образовывать конфлюэнтный слой
при любой продолжительности времени культивирова-
ния, то они остаются чувствительными к контактному
торможению и ограничению роста плотностью клеток
[Todaro & Green, 196.3J. Однако если клеткам позволяют
сформировать конфлюэнтный слой и находиться в нем в
течение продолжительного периода, то образуются фо-
кусы клеток со сниженным контактным торможением,
которые накапливаются и, в конечном итоге, приобрета-
ют способность к избыточному росту (рис. 18.3).
То г факт, что эти клетки неразличимы при низкой
плотности или когда конфлюэнтный монослой только
формируется, предполагает, что они могут возникать de
novo, в результате трансформационных изменений. Эти
клетки приобретают преимущества в росте, и последую-
щее субку>1ьтивирование быстро приведет к избыточному
росту случайным образом изменившихся клеток. Этот тип
клеток часто обнаруживает высокую туморогенность.
18.4.1. Контроль физиологического
старения
Конечный жизненный цикл клеток в культуре регули-
руется группой из 10 или более доминантно действую-
щих тенов старения, продукты которых негативно
регулируют прохождение клеточного никла [Goldstein
et al., 1989; Sasaki el al., 1996]. Экс перименты uo сомати-
ческой i ибридизации конечных и имморта-шзованных
клеток обычно даю г гибриды с конечным жизненным
циклом, что позволяет предположить, что гены старе-
ния являются доминантными [Pereira-Smith and Smith,
1988]. Похоже, что один или более из этих генов нега-
тивно регулируют экспрессию теломеразы [Holt et al.,
1996; Greider & Blackburn, 1996; Smith & de Lange. 1997;
Bryan & Reddel, 1997 ], необходимой д.,1я терминального
синтеза теломерной ДНК, которая в противном случае
постепенно укорачивается в ходе циклов клеточного
деления, до тех пор пока хромосомная Д Н К не сможет
больше реплицироваться. Теломераза экспрессируется
в половых клетках и обладает умеренной активностью,
но отсутствует в соматических клетках. Делеции и или
мутации в генах старения либо сверхэксирессия или
мутация одного или более онкогенов, которые переве-
шивают действие генов старения, позволяет клеткам
избежать негативного контроля жизненного цикла и
ре-экспрессировать теломеразу.
Суммируя, можно сказать, что иммортализация яв-
ляется многоступенчатым процессом, включающим в
себя инактивацию рядя г енов-регуляторов клеточног о
цикла, таких как Rb и р53. Ген SV40 LT часто исполь-
зуется для индукции иммортализации. Известно, что
продукт этого гена, Т-антиген, связывает Rb и р53,
не только обеспечивая большую продолжительность
пролиферативного жизненного цикла, но и ограни-
чивая активность таких генов-регуляторов ДНК, как
р53, таким образом гговышая нестабильное гь генома
и давая больше шансов образованию новых мутаций,
предпочтительных для иммортализации (т. е. положи-
тельно регулирующих образование теломеразы или
подавляющих какой-то из инг ггбиторов теломеразы).
Трансфекция теломеразного г ена при помощи регули-
руемог о промотора достаточна для иммортализации
клеток [Bodnar et al., 1998; Vaziri & Benchimol, 1998].
Иммортализация сама по себе не подразумевает раз-
витие аберрантного контроля клеточного роста и озло-
качествления, поскольку ряд иммортализованных кле-
точных линий, таких как ЗТЗ гг ВН К21-С13, сохраняют
способность к контактному торможению клеточной
подвижности, ограничению пролиферативной актив-
ности гглотностью клеточной популяции, зависимость
от прикрепления к субстрату и не являются тумороген-
ными. Суммируя, следует заключить, что некоторые
аспекты контроля роста являются нетипичными и что
они участвуют в повышении геномной нестабильнос-
ти. Более тог о, иммортализованные клеточные линии
часто утрачивают способность к дифференцировке,
но есть сообщения, касающиеся теломераза-ипдуци-
рованной иммортализации кератиноцитов [Dickson
et aL, 2000] и сателлитных клеток скелетных мышц
[Wootton et al., 2003] без снижения активности р53 и
задержки способности к дифференцировке.
18.4.2. Иммортализация с использованием
вирусных генов
Для иммортализации клеток используют ряд вирусных
генов (табл. 18.2). Было обнаружено, что вирус SV40
может быть использован для иммортализации клеток,
при этом, видимо, геном, ответственным за этот процесс,
является большой Т-ген (L7) [Mayne et al., 1996]. Другое
вирусные гены, которые используются для иммортали-
зации клеток, - аденовирусный ген Е1а [Seigel, 1996],
гены Е6 и Е7папилломавируса человека (Н PV) [Peters
et al., 1996; Le Poole el al., 1997], и гены вируса Эпш-
тейн—Барра (EBV; обычно используется весь вггрус)
[Bolton & Spurr, 1996]. Большинство этих генов, ве-
роятно, действуют путем блокирования инг ибирования
прохождения клеточного цикла путем ингибирования
активности таких генов, как CIP-1/WAF-1t'p21, Rb,
р53. и р16. что приводит к возрастанию продолжитель-
ности жизни, снижению контроля ДНК и повышает
возможность дальнейших мутаций. К наиболее широко
используемым в иоследнее время генам относятся: EBV
для лимфобластных клеток [Bollon & Spurr, 1996],
SV40LT для адгезирующих клеток, таких как фибро-
бласты [Mayne et al., 1996], кератиноциты [Steinberg,
19961, гг эндотелиальные клетки [Punchard el al., 1996],
и hTERT для мезенхимальных стволовых клеток (см.
протокол 18.2) и ряда других клеток Эндотелиальные
клетки могут быть имморгализованы действием радио-
активного излучения [Punchard el al., 1996].
18.4. Иммортализация
337
Таблица 18.2. Гены, использованные для иммортализации
Ген Вставка Клеточный тип Ссылка
EBV. ebna, Impl инфекция В-лимфоцпты Bulton and Spurr, 1996, Bounl- lot ct a), 1998, Sugimoto ct al., 2004
SV40LT Липофекцпя Ксратиноциты Steinberg, 1996
Фосфатно- кальциевая (рансфскция Фибробласты Mayne ct al, 1996
Фисфатно- кальциевая фансфскция Астроглиальные клетки Burke etal. 1996
Аденовирусная инфекция Эпителий пищевода Inokuchi ct al, 1995
Микроинъекция Эндотелий крысиного мозга Lechardeur ct aL, 1995
Трансфекция Эпителий простаты Rundlctt et al., 1992
Трансфекция Эпи гелий молочной железы Shay ct al.. 1993
Фосфатно-стронциевая трансфекция Бронхиальный эпителий De Silva etal, 1996
Фосфатно-стронциевая трансфекция Мсзтсдиальныс клетки Duitcan ct a!., 1996
HPV16E6 Е7 Ретровирусный перенос Цервикальный эпителий Demers ct al., 1994
Трансфекция Керт пноипты Bryan ct al, 1995
Фосфат но-пронцисвая трансфекция Мезотелиальные клетки De Silva eta), 1994
Фосфатно-стронциевая трансфекция Бронхиальный эпителии De Silvaetal, 1994
Ретровирусная инфекция Поверхностный эпителий яичника Tsao ct aL, 1995
А<15 Е1а Эпителиальные клетки Douglas and Quinlan, 1994
htrt Трансфекция Пигментный эпителий сетчатки Bodnar ct al. 1998
Трансфекция Фибробласты крайней плоти Bodnar eta). 1998
Трансдукция Стволовые клетки костного мозга Simonsen ct aL. 2002
Трансдукция Ксратиноциты Dickson ct al, 2000
Трансдукция Миобласты Wootton et aL, 2003
Обычно клетки трансфецируются или ретровирусно
инфицируются иммортализующим геном до того, как
они входят в фазу старения. В результате происходи!
увеличение продолжительности времени пролифера-
тивной активности клеточной линии на следующие
20 30 периодов удвоения популяции, после чею
клетки прекращают делиться и входят в кризис. Пос че
критического периода, продолжительность которого
варьирует (до нескольких месяцев), субионуляция
иммортаjui3oванных клеток дает избыточный рост.
Фракция клеток, которые в конечном итоге имморта-
лиюваны, может составлять 1х10-5до IxlO-9
18.4.3. Иммортализация человеческих
фибробластов
Нижеприведенное введение в технику иммортализа-
ции человеческих фибробластов излщ ается в сжатом
виде по Mayne et al. [1996]. Несомненно, наиболее
успешным и наиболее часто используемым методом
получения иммортализованных человеческих фиброб-
ластов проводится путем экспрессии SV40 Т-антш ена,
которая не приводит непосредственно к имморта-
лизации, но инициирует цепь событий, результатом
которых является получение иммортализованнон
производной линии, возникающей с низкой вероят-
ностью, оцениваемой как 1 к 10' [Shay & Wright, 1989;
Huschlcha & Holliday, 1983]. SV'40-трансфицирован-
ные клетки проходят прямую селекцию в соответству-
ющих условиях культивирования, выжившие клетки
после субкультивирования дают рост до пре-кризисной
популяции SV'40-трансформированных клеток. Эти
клетки постоянно культивируют до тех пор, пока они
не потеряют способность к пролиферации, ко|да они
неминуемо входят в кризис. Затем культуру необхо-
димо поддерживать с величайшей тщательностью и
осторожностью; должно быть культивировано доста-
точно большое число клеток, для того чтобы иметь
достаточную вероятность появления иммортализо-
ванных производных.
Выбор векторов, экспрессирующих Т-антиген,
зависит от выбора доминантного селектируемо! о |ена-
маркера, который является источником промоторов,
которые обеспечивают экспрессию Т-антигена и сами
альтернативные формы Т-антш ена. Хотя, но нашему
опыту, [Mayne et al., 1996J, в случае человеческих
фибробластов эффективна селекция для gpl, тем не
менее. G418 (иео) и и гигромиинн (hygB) более эф-
фективны и ле!че для использования. Большинство
клеточных линий человеческих S V40-иммор гализован-
ных фибробластов были получены при использовании
SV40-вирусов или конструктов, таких как pSV3neo, ко-
торые экспрессируют Т-антш ен с эндогенно! о промо-
тора. Мы рекомендуем использоватьpSV3neo [Southern
& Berg, 1982; Mayne et al., 1986] для конститутивной
экспрессии T-анти гена. Следует использовать клет-
ки между 7-м и 15-м пассажами Триисинизируйте
клетки за 24—48 ч до трансфекции, концентрация
клеток должна составлять не более 2—2,5x10’ кл. 'на
338
ГЛАВА 18. ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
ПРОТОКОЛ 18.1. Иммортализация
фибробластов
Материалы
Стерильные
• Буфер HEPES: HEPES. 12.5 мМ; pH 7,12
• 16х CaHEPES: CaCl,, 1,25 М. HEPES, 125 мМ:
pH 7,12
• 2х HEPES-забуференный фосфат (2х НВР)’
Na.HPO,. 1,5 мМ; NaCl, 280 мМ; HEPES,25 мМ;
pH 7.12
• NaOAc. NaOAc. 3 М; pH 5.5
• Раотвор EDTA в Трис-буфере (ТВЕ): Tris НС1,
2 мМ» EDTA. 0.1 мМ; pH 7.12
* Абсолютный этанол
• Среда Иыа МЕМ 15% FCS
• G418 (Invilrogeu). 20 mi /мл в буфере HEPES, pH
7.5, стерилизованный фильтрацией через 0,2-мкм
мембрану, хранящийся в малых аликвотах при
-20 °C
• Гигромицин (Roche Applied Science): 2 мг мл в
сверхчистой воде, стерилизованный фильтрацией
через 0,2-мкм мембрану хранящийся в малых
аликвотах при —20 °C
• S\’40 Т-нтшен ДНК
Протокол
1 Оцените количество ДНК, требуемое д,1я транс-
фекции:
а) И с пользуйте максимум 20 mki ваше! о
Т-антигенного вектора (без носителя ДНК)
на каждую чашку и 60 mki векторной ДНК на
чашку.
б) Включите дополнительно 20 мкг ДНК, по-
скольку не Bceiaa возможно восстановить
полностью ожидаемое количество после ири-
।отопления преципитата.
2 Приготовьте стерильный раствор векторной ДНК
в микроцентрифужнои пробирке.
а) Осадите ДНК с одной десятой но объему
частью 3.0 М NaOAc, pH 5,5 и 2,5 объемами
этанола.
б) Хорошо перемешайте, убедитесь, что все внут-
реннее содержимое пробирки вошло в контакт
с раствором спирта.
в) Ос тавьте пробирку на льду на короткое время
(5 мин).
।) Центрифу| ируйте пробирку в микроиентри-
фуге 15 мин при 15 000 об./мин для получения
осадка.
д) Осторожно выньте пробирку из центрифу!и,
откройте в ламинарном шкафу.
е) Удалите супернатант отсосом, стараясь не
взболтать осадок. Убедитесь, что этанол уда-
лен полностью.
ж) Оставьте осадок в лам пиарном шкафу для
культивирования клеток, пока не улетучатся
остатки этанола.
з) Ресусиендируйте осадок ДНК в ТВЕ до ко-
нечной концентрации 0.5 мг ‘мл. Может по-
требоваться использование вортекса для того,
чтобы отделить осадок от стенок пробирки.
и) Инкубируйте пробирку при 37 С в течение
5—10 мине периодическим применением вор-
текса, пока не убедитесь, ч го осадок полностью
ресусиендирован.
Замечание. Не используйте более высокие
концентрации ТВЕ для ресуиендирования вашей
ДНК, поскольку это может нарушить образование
преципитата ДНК
3. Пршотовьте преципитат ДНК с фосфа! ом к^ыьция.
а) Подсчитайте обший объем требуемого пре-
ципитата. Конечная концентрация ДНК в
преципитате должна быть 20 mki/мл, и вам
потребуется но 1 мл на каждую 9-см чашку и
3 мл на каждый флакон с площадью 175-см’.
Помните, что нужно сделать дополнительный
1 мл преципитата, чтобы с достоверностью
получить объем, достаточный для всех ваших
культур, поскольку некоторые потери объема
будут происходить в ходе приготовления ире-
цццитатата.
б) Разведите смесь ДНК /ТВЕ в 12,5 мМ HEPES
до получения 20 мкг/мл в конечной смеси.
в) Добавьте 10х СаС|2, один к десяти исходя из
конечного объема
।) Добавлять раствор по одной кайле, перемеши-
вая, до равного объема 2х НВР. Например, на
9-см чашки при 1 мл/ чашку плюс 1 мл допол-
нительно (т. е. 10 мл смеси)
i) ДНК ТВЕ........... ......0,5 мл
ii) 12,5мМ HEPES.. 3,5мл
iii) 10. CaCl,................1,0 мл
iv) Добавить но капле к 2х НВР 5.0 мл
Конечные концентрации в смеси будут составить:
ДНК 20 mki mj
CaCl, 0.125 M
Na2PO, 0.75 мМ
NaCl 140 мМ
HEPES 12,5 мМ
1>Н 7,12
Замечание: при получении фосфатно-кальцпе-
виц» преципитата ДНК используйте пластиковые
иииетки и пробирки, поскольку преципитат очень
прочно прилипает к с геклу. Для смеси мы рекомен-
дуем использовать две пипетки в двух портативных
нииетирующих устройствах, одно для иробулькива-
ния стерильного воздуха и второе для аккуратного
добавления ДНК/кальциевой смеси в раствор фос-
фата; при качественном перемешивании получает-
ся однородный преципитат. Используйте 1—5 мл
иииетки, в зависимости от желаемого объема пре-
ципитата. В процессе добавления ДНК/кальциевого
18.4. Иммортализация
339
раствора к раствору фосфата начинает образовывать-
ся ли кий однородным осадок. Этот осадок достаточ-
но хорошо заметен и дает молочное помутнение ио
.завершении процесса
д) После того как весь ДНК/кальциевый раствор
добавлен к фосфату, замените крышку на про-
бирке, аккуратно переверните пробирку один-
два раза и оставьте пробирку при комнатной
температуре на 30 мин.
е) Важно получить имитацию ирецииитата без
ДНК. Это позволит вам обеспечить эффектив-
ность выбора условии. Имитация ирецииитата
может быть получена также, как описано для
получения истинного ирецииитата, но ДНК
в этом случае замещается дополни тельным
объемом буфера HEPES.
4. Добавьте 1 мл ДНК пли имитации ирецииитата в
каждую чашку или 3 мл в каждый флакон. Убеди-
тесь, что объем ирецииитата составляет не более
десятой части общего объема культуральной
среды уже имеющейся на клетках.
5. Оставьте ирецииитат на клетках как минимум на
6 ч, но не более чем не ночь (16 ч). Для фиброб-
ластов, полученных от некоторых животных,
действие кальция и фосфата более чем 6 ч может
быть токсичным
6. Удалите фосфатно-кальциевый ирецииитат
вакуум-асиирацией. Нет необходимости в пос-
ледующем промывании клеток, или, по нашему
опыту, в дальнейшей обработке клеток DM SO
и jin 1лицерином.
7. Добавьте среду в культуры, инкубировать их,
пока не закончится 48 ч с начала эксперимента
Затем добавьте в культуры селективные аген-
ты, в зависимости от вектора, используемою
при трансфекции. Векторы, несущие ген пео,
придают устойчивость к (>418 (Генетицин). а
векторы, несущие ген hygb, придают устойчи-
вость к (игромииину В (Roche Applied Science).
Все фибробласты, ио нашему опыту, требуют
100—200 mki/мл (>418 или 10—20 мкг.'мл гиг-
ромицина В для того, чтобы постепенно убить
клетки за одну неделю.
8. Смените среду на трансфецированных чашках:
а) Разлейте общий требуемый объем среды в
подходящие ио размеру стерильные бутылки,
добавьте G418 или пиромшшв В из основных
концентрированных растворов до получения
необходимой конечной концентрации.
б) Осторожно вращайте раствор для его переме-
шивания.
в) Отсосите среду из чашек или флаконов и за-
мените ее селективной средой.
I) Верните чашки или флаконы в инкубатор.
9. Следите за действием селективной среды путем
ежедневного обследования культуры под микро-
скопом. При значительном количестве клеток.
отделившихся и пошбших, замените среду
свежей селективной средой. Селекция должна
продолжаться все время.
10. Продолжайте замену среды, пока основная
часть клеток не всплывет и не noi ибнет. Чашки |
с имитацией трансфекции, в которых ДНК-
трансфекция не была проведена, через 7 10 дней I
не должны содержать жизнеспособных клеток.
Если жизнеспособные клетки сохраняются, то I
селекция была проведена неадекватно и может |
оказаться необходимым повысить концентрацию
селективно! о агента.
11. Как только основная часть клеток 1101116ла,
исчезает необходимость в стандартной замене
питательной среды. Клетки следует оставить, не
беспокоя, в инкубаторе на 4—6 недель для тою,
чтобы трансфецированные клетки мо1ли нарасти
и сформировать колонии.
12. Как только появились колонии, выделите инди-
видуальную колонию с использованием колец для
клонирования (см. протокол 14.6) или отберите
несколько колоний вместе путем трипсинизации
чашки или флакона.
13. Замораживайте разлитую на порции суспензию
клеток цри первой возможности и ршулярно I
пересевайте оставшиеся клетки. Как только |
грансфекганг достш нет достаточною размера и
будет заморожено в жидком азоте достаточное
количество образцов культуры, необходимо обес- '
иечить ведение культуры в течение продолжи-
тельного периода времени до достижения кризиса. ।
Для то! о чтобы ми нимилировать риск заражения I
грибами, добавьте амфотерицин В (Fungizone,
Invilrogeii) до концен1рацпи 2,5 mki/мл. I
14. Субкультивируйте культуры в обычном порядке, I
пока они не потеряют способности к делению. Как
только клетки достш нут кризиса, часто скорость |
роста замедляется. Если культуры начинают деге-
нерировать и деление клеток прекращается, то в I
дальнейшем субкультивировании клеток нет необ-
ходимости. Тем не менее если тяжелый клеточный
дебрис начинает прилипать к остающимся жиз-
неспособными клеткам, то можно посоветовать
провести триисинизацшо клеток для удаления
дебриса. Как при возвращении всех клеток в тот же
сосуд, так и при использовании меньшего сосуда
необходимо компенсировать клеточную i ибель. В
общем, клеточный рост и выживание улучшаются,
если культуры не слишком разрежены. При тер-
пеливом, тщательном отношении и удовлетвори-
тельном качестве клеточной культуры вы можете |
получить иост-кризисную линию.
15. Koi да начинают появляться здоровые клетки,
позвольте колониям вырасти до значительных
размеров до субкультивирования и затем начните
субкультцвировать колонии снова. Не подда-
вайтесь желанию посеять слишком маленькое
количество клеток в большой флакон.
340
ГЛАВА 18. ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
16. Заморозьте клетки, разделенные в ампулы, при
первой возможности и продолжайте пополнять
основные запасы в ходе всего использования
культуры.
17. Для тою чтобы проверить, является ли иост-
кризнсная линия действительно иммортализо-
ванной, мы рекомендуем провести селекцию п
выделение отдельного клона из культуры. До-
полнительная польза этой процедуры состоит в
достижении гомогенности культуры, полученной
из единичной клетки.
9-см чашку Петри или не более 5,5—6.8x10s клеток на
175-см2флакон. Клетки должны достигнуть 70—80%
конфлюэнтностц, когда они цодверюются трансфек-
ции, в конечном объеме среды 10 мл/9-см чашку или
30 мл/175-см2 флакон.
Метод фосфатно-кальциевой преципитации ос-
новывается на образование преципитата ДНК в
присутствии ионов кальция и фосфата. Сначала
ДНК стерилизуется в этаноле и ресусиендируется в
стерильном буфере. Затем тщательно перемешивается
с кальцием, и полученный раствор очень медленно
добавляется, при перемешивании, в раствор фосфата.
Важно заметить, что при образовании преципитата
оптимальный перенос генов осуществляется при ко-
нечной концентрации ДНК в преципитате 20 мкг/мл.
Объем преципитата ДНК, используемого в культуре,
нико1 дане должен превышать одну десятую от обще! о
объема. Необходимо оставить смесь для завершения
процесса в течение 30 мин прежде, чем добавлять к
клеточным культурам.
Посттрансфекционное ведение культуры
1) Уровень селективно! о агент а выбирается так, чтобы
обеспечить мт кое уничтожение в течение пример-
но недельного периода. Большая часть клегок в
ДНК-обработанных чашках должна иошбнуть за
семь дней, а те клетки, которые останутся, явля-
ются успешно трансфецироваными, т.е. являются
трансфектанатами
2) Можно иосовет овить заморозить ампулы с клетками
ио обычной методике, для toi о чтобы создать запас
трансфектантов и сэкономить время, которое пот-
ребуется для восстановления культуры, если она
будет утрачена в результате контаминаиии.
3) В большинстве случаев кризис является заметным
событием, koi да большинство клеток обнаруживает
признаки ухудшения состояния и происходит зна-
чительное снижение количества жизнеспособных
клеток. В среднем, кризис продолжается примерно
3—6 месяцев, и состояние культуры может ухудшить-
ся до того, что при обследовании будет обнаружи-
ваться очень малое количество визуально здоровых
клеток, если они вообще будут обнаруживаться
4) Как только культура вошла в кризис, вы сможете
достоверно предсказать время вхождения в кризис
для параллельных культур, хранящихся в жидком
азоте. Это позволяет извлечь ампулы с параллель-
ными культурами из морозильника и получать ряд
флаконов, находящихся в преддверии кризиса. Как
только эти параллельные культуры войдут в кризис
и начнут терять жизнеспособность, содержимое этих
флаконов может- быть объединено. В некоторых
случаях во флаконе может быть удовлетворительное
количество клеток, но уровень клеточного дебриса
слишком высок. В этом случае пересейте клетки.
Клетки должны быть трнисинизированы и центри-
фу! ированы, затем осадок должен быть возвращен
в исходный флакон, который перед этим можно
промыть несколько раз трипсином для удаления
всех прикрепленных частей клеточного дебриса.
5) Первым признаком выхода клеток из кризиса обыч-
но является появление одного или более фокусов
относительно здоровых, жизнеспособных клеток
с типичными чертами 5У40-трансформированных
клеток. При субкультивировании эти фокусы рас-
пространяются, давая здоровую, регенерирующую
культуру. Во mhoi их случаях рано появляющиеся
иост-кризисные клетки растут плохо, но ростовые
свойства улучшаются при дальнейшем субкульти-
вировании, а субклонирование иомтает отобрать
отдельные клоны с наилучшими ростовыми свой-
ствами. Важно замораживать ампулы с вашими
новыми клетками, как только вы нарастите доста-
точное Д4я этого количество. Наше рабочее опреде-
ление иммортализованной культуры предполагает,
что культура может после трансфекции выдержать
как минимум 100 периодов удвоения популяции и
переносит последующее субклонирование
6) Поскольку иоявление иммортализованных произ-
водных в культурах достаточно редкое событие,
то существенным требованием является проверка
происхождения клеток, подтверждающая соответ-
ствие исходного источника полученной имморта-
лизованной культуре, которая, таким образом, не
является результатом контаминации другой им-
мортализованной культурой, с которой работают в
лаборатории (см. разд. 7.10.1,16.1,163,16.6.2,19.5;
табл. 13.2; и протоколы 16.8-16.10).
18.4.4. Теломераза-индуцированная
иммортализация
Теломеры играют существенную роль в стабильности
хромосом и определяют продолжительность клеточно-
го цикла. Теломераза или терминальная трансфераза
состоит из двух главных субъединиц, РНК-комионен-
ты, (hTR) и белковой каталитической субъединицы
(hTERT). РНК-субъединица повсеместно распро-
странена как в нормальных, так и в злокачественных
тканях, в то время как hTERT экспрессируется только
в опухолевых тканях, половых клетках и активирован-
ных лимфоцитах. Предпола!ается, что первопричина
старения заключается в укорочении теломер, которое
18.4. Иммортализация
341
Рис. 18.4. Совокупное количество периодов удвоения по-
пуляции (PD) иммортализованных клеток hTERT по срав-
нению со стареющими контрольными клетками. Совокупное
количество PD было подсчитано для культур человеческих
мезенхимальных стволовых клеток (см. протокол 18 2)
сравнено со временем роста в культуре клеток с эктопичес -
кой экспрессией hTERT после ретровирусной трансдукции
(кружочки) и контрольных (нстрансдуцированных) клеток
(квадратики) (С любезного разрешения N Serakmet)
сопровождается слиянием теломер и образованием
дииентрических хромосом с последующим апоптозом.
Клетки, трансфицированные теломеразным гоном
htn, приобретают способность к увеличению времени
жизни клеточной линии (см. рис. 18.4). а часть этих
клеток становится бессмертными, но не Х'юкачественно
трансформированными [Bodnar el al., 1998, Simonsen el
al., 2002]. Поскольку значительная доля клонов htrt+
становится бессмертными ( иммортализованн ыми ),
постольку этот подход представляется многообещаю-
щим. Хотя функциональность некоторых из этих линий
требует подтверждений, однако имеется несколько
обнадеживающих сообщений о ненарушенной диф-
ференцировке кератиноцитов [Dickson el al., 2000] и
миоцитов [Woolton el al., 2003]. Предварительное вве-
дение и протокол 18.2. предоставлены Nediine Serakinci
(Department of Human Genetics, Bartholin Bygningen,
Universitelsparken, 8000. Aarhus C, Denmark). Данный
протокол был успешно использован для мезенхималь-
ных и нервных линий стволовых клеток человека и
первичных культур.
18.4.5. Трансгенные мыши
Трансгенная мышь линии Inimorioinoiise (H-2Kb-lsA58
SV40 large Т) несет температуро-чувствительный ген
SV40LT. Ряд тканей этой мыши дает начало бессмер-
тным клеточным линиям, включая эпителий толстого
кишечника [Fenton & Hord, 2004], астроглию мозга
[Noble & BarnelL, 1996], мышцы [Ahtned et al., 2004], и
эндотелий сетчатки [Sn el al., 2003].
ПРОТОКОЛ 18.2. Иммортализация
мезенхимальных стволовых клеток человека
с помощью теломеразы
Материалы
Основные (стерильные).
• Ростовая среда Дюльбекко в модификации Игла I
(DMEM) с высокой концентрацией глюкозы, i
4,51 /л н Е-1люгам(1ном, 2мМ, с добавкой 10%
фетальной бычьей сыворотки. 100 ед./мл пени-
циллина и 100 mki мл стрептомицина
• Полибрин, 8 mi мл
• Универсальные контейнеры
• Культуральные флаконы 25 см', 75 см'
Получение ретровирусного вектора
• Клеточные линии
G13 [Miller el aL, 1991]
GP+E-86 [Markovilz, 1988]
• Ретровирусный вектор GCsajnhTERT
• ДН К htn для трансфекции
• Буфер Тх:
HEPES, 0,5 М, pH 7.1..............200 мкл
NaCl, 5 М.......................100 мкл
Na2HPO„ NaHjPO», 1 М............. 3 мкл
Сверхчистая вода.............. 1,7 мл
Общий объем 20 мл
• Буфер А:
NaCI(5M)..............................600 мкл
EDTA (0.5М).........................40 мкл
Tiis HCI pH 7,5(0,5М)...............400 mkj
Скерхчщтая кола...................19 мл
Общий объем 20,04 мл
• CaCl, 2,5 М
Трансдукция клеток hMSC
• Клетки hMSC
• Флаконы. 75 см-
• Многолуночные планшеты (6-луночные)
Посттрансдукция
• Материалы для крио консервации (см. прото-
кол 20,1)
• Материалы для ДНК-финщрпринтинга (см. |
протокол 16.8) или профилин!а ДНК см. прото- ।
кол 16.9) либо дру। их процедур ау гентификации |
(см., например, протокол 16.10)
Реактивы для ПЦР
• ДНК, 100 mki/мл
• ПЦР-буфер 10x(+Mg)
• Сенсорный праймер (2 мкМ)
• Антисенсорный праймер (2 мкМ)
• Смесь dNTP (10 мМ)
• ДН К-полимераза
• Сверхчистая вода
Протокол
Получение ретровирусного вектора
Ретровирусный вектор с гоном hTERT объединен I
с вирусом лейкемии человекообразной обезьяны |
342
ГЛАВА 18. ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
। иббона (GALV) u ст руппирован в клеточной линии
PG13 [Milleretal., 1991] в ходе двухша! ивой проце-
дуры. Сначала проводится трансфекция клеточной
линии GP+E-86, при .этом используется 20 mki /m..i
ДНК htn (Geron) [ Markov ilz et al., 1988], полученный
при культивировании супернатант затем использу-
ется для инфицирования клеток PG13.
1 Посейте в небольшой культуральный флакон
(25 см2) 6,7x10'клеток культуры GP+E-86
2 Трансфекция клеток GP+E-86:
а) Разлейте в пробирки (универсальные контей-
неры) по 280 мкл буфера Тх.
6) Приготовьте пробирки с ДНК:
Назва- ние кон- структа Концент- рация ДНК днк Буфер А СаС1, 2,5 М Общий
Z* mki мл X* 280-30-Х 30 280
ГдеХх2 = 15 мю
в) Постепенно (по одной капле) добавляйте бу-
фе]» Тх в пробирки,содержащие раствор ДНК.
Осторожно перемешайте.
1) Инкубируйте при комнатной температуре в
течение 30 мин до образования ирецииитата
д) Добавьте свежую среду поверх клеток GP+
Е-86,5 мл на флакон 25-см2.
е) Осторожно добавьте смесь растворов (Тх+
ДНК) к клеткам GP-“-E-86 и инкубируйте
4-6 ч при 37 °C.
ж) Трижды тщательно промойте клетки в
D-PBSA во 25-см2 флаконах.
з) Добавьте свежун» среду к клеткам, и нкубируli-
re при 37 °C в течение ночи.
3 Поменяйте среду, покрывающую клетки, добавив
2 мл свежей среды вместо 5 мл, для продукции
вирусов.
4 В тот же день, что и при выполнении шага 3,
посейте клетки PG13, посевная доза 1x10* на
каждую лунку 6-луночного планшета.
5 На следующий день соберите супернатант от
трансфицированных клеток GP+E-86 и добавьте
Полибрин до конечной концентрации 8 мкг Аил
(т.е. 1 мкл. мл супернатанта).
6 Пропустите супернатант через 0,45-мкм фильтр
и добавьте 2 мл фильтрата в каждую лунку, со-
держащую клетки PG13.
7 Цен грифу! ируйте планшеты при 32 °C и 1000 g.
8 . Инкубируйте при 37 "С в течение ночи
9 На следующий день поменяйте среду
Трансдукция клеток hMSC:
1 Посейте 2х 10*’ трансдуцированных клеток PG13
в культуральный флакон 75-см2.
2 На следующий день добавьте 6 мл свежей среды
к клеткам PG13.
3 На следующий день досейте клетки hMSC для
трансдукции в 6-луночный планшет при концент-
рации приблизительно 2,5х 10’ 7,5х 101 кл. мл.
4 Соберите супернатант, добавьте Полибрин до
конечной концентрации 8мк1/мл, пропустите
супернатант через 0,45-мкм фильтр.
5 . Добавьте 2 мл фильтровании! о ретровирусно-
11» супернатанта в каждую лунку 6-луночного
планшета.
6 . Центрифу! ируйте планшеты при 32 °C и 1000 g,
инкубируйте при 37 “С в течение ночи.
7 . Удалите ретровирусный супернатант и добавьте
свежую среду к клеткам.
Пост-трансдукционное ведение культур:
1. Клетки, которые не включили ген h TERT, должны
начатыюшбатьпримерночерез 10—12 пассажей;
остающиеся клетки должны представлять собой
клетки, инкорпорировавшие ген hTERT, и таким
образом они будут селекционированы в ходе
последующих пассажей.
2 Можно посоветовать заморозить ампулы с
клетками обычным путем для формирования
основного запаса трансдуцированных клеток на
различных этапах удвоения популяций (PD),
которые соответствуют' кривой роста, для того
чтобы сэкономить время, если культура будет
утрачена в результате контаминации.
3 Используйте следующие формулы для теорети-
ческого определения PD в каждом субкультиви-
ровании и установлении PD кривой роста:
PD - ln(N, _/Nllal) In 2,
где PD количество периодов удвоения популяции,
1н натуральный логарифм, Nlla4 количество
клеток, первоначально посеянных, NKltJ1общее
количество клеток, выросших в субкультуре.
Припер (для 3,2x10h клеток, полученных и
результате пшена 2х 10 ’ клеток):
PD • In (3,2xlO'/2xlOs) In 2
PD -In(16)/ln2
PD-2,7726 0,6931 -4
Если клетки делить 1:4 при каждом субкультиви-
ровании, то конечное число клеток умножается
в 4 раза при каждом субкультивировании клеток.
Поэтому в приведенном выше примере с 10 субкуль-
тивированиями NKUHt4 составляет (3,2х 1О’')х4, десять
раз. или 3.4x10’'
Пример (для 3,2х 10е’ к temoK полученных
из пе/монача 1ьно посеянных 2х 10 ’, после
10 субкулътгкшрований с де /ение.ч клеток о
отношении 1:4):
PD - In (3,4xl0'2/2xl0’)/ln 2
PD In (1,67x10') In 2
PD - 16,6309 0,6931-23
18.Б. Абберантный контроль роста
343
4 Очень важно проверять аутентичность иммор-
талпяованной клеточной линии в течение всего
периода работы для того, чтобы быть уверенным,
что она получена их исходного начального мате-
риала п не является результатом перекрестной
контаминации с дру: ими имморталнзованными
линиями, с которыми ведется работа в лабора-
тории (см. разд. 19,5). Это может быть сделано,
наиример, методом ПЦР против транс! ена,
hTERT (см. ниже), ДНК-фингерпринтинга (см.
протокол 16.8), или ДНК-ирофилинга (см. про-
токол 16.9).
ПЦР для hTERT:
1. Разморозьте реактивы для ПЦР, держите их на
льду.
2. Сделайте шаблонную смесь, помните о включе-
нии положительного контроля (другой hTERT
положительный образец) и отрицательного конт-
роля (матрица без ДНК).
ДНК, 100 mki /мл____________1 мкл (100 нс)
10х ПЦР буфер (+Mg)______________ 2 мкл
Сенсорный праймер (2 мкМ)_______________2 мкл
Антисенсорный праймер (2 мкМ)______2 мкл
dNTP смесь (10 мМ)______________ 0,4 мкл
ДНК полимераза________________ 0,1 мкл
Сверхчистая вода_____________________12,5 мкл
Конечный объем_______20 мл (включая ДНК)
3. Поместите пробирки в ПЦР-црибор и включите
iipoi рамму: Первичная денатурация ири 94 °C в
течение 3 мин, денатурация ири 94 °C в течение
30 с. отжи! при 59 °C в течение 30 с, амплифика-
ция при 74 °C в течение 1 мин 30 циклов, затем
74 °C в течение 10 мин
4. Разгонка продуктов ПЦР в atapo.iHOM 1,5—2%
голе.
18.5. АБЕРРАНТНЫЙ КОНТРОЛЬ РОСТА
Культивированные клетки опухолей, так же как и
культуры, трансформированные in vitro, обнаружива-
ют аберрантность в факторах, контролирующих рост
культуры, например рост при более высокой плотности
популяции [Dulbecco & Elkington, 1973J, образование
клонов в aiape [Freedman & Shin.19741, и рост в конф-
люэнтном монослое гомолш ичных клеток [Aaronson el
al., 1970J. Эти клеточные линии демонстрируют также
более низкую зависимость от сыворотки и факторов
роста, обычно формируют клоны с большей эффектив-
ностью, и в целом приобретают некоторую степень ав-
тономного контроля роста в результате суиерэкспрес-
сии онкогонов из-за делеции генов-супрессоров. Конт-
роль роста в данном часто является аутокринным, т. е.
клетки секретируют митогены, к которым сами имею?
рецепторы, либо клетки экспрессируют рецепторы, или
элементы передачи сигналов, которые перманентно
активны и нерегулируемы. Хотя иммортализация не
обязательно подразумевает утрату контроля роста,
многие клетки ле! ко переходят от иммортализации к
аберрантному неконтролируемому росту, возможно,
потому, что иммортализованному гонотииу присуща
генетическая нес габильность.
18.5.1. Независимость от прикрепления
к субстрату
Mhoi не свойства, связанные с неопластической транс-
формацией in vitro, являются результатом изменении
клеточной поверхности [Hynes, 1974; Nicolson, 1976;
Bruyneel et aL, 1990], т.е. изменений связывании
лектинов [Laferle & Loh. 1992), изменений 1ликоцро-
теинов клеточной поверхности (Bruyneel et al., 1990;
Carraway el al., 1992J и молекул клеточной адгезии
[Yang et al., 2004J. Многое из этих изменений мшут
коррелировать развитием инвазивности и способнос-
ти к метастазированию in vivo. При трансформации
фибробластов в результате перестройки пнтегринов
клетки теряют способность поверхности связываться
с фибронектином, белком LETS (large extracellular
transformation-sensitive, большой внеклеточный бе-
лок, чувствительный к трансформации) [Hynes, 197.3;
Valieri et al., 1976J. Эта потеря может вносить вклад
в снижение в степень межклеточной п клеточно-суб-
стратной адгезии [Yamada et al., 1991; Reeves, 19921 и
снижать зависимость деления клеток от прикрепления
и распластывания на подложке. Трансформированные
клетки moi vr иметь недостаток специфических С AMs
(например, L-САМ), которые, ири трансфекции в
клетку, вызывают регенерацию клетки до нормального
неинвазивного фенотипа [Mege el al., 1989J, поэтому
они мшут рассматриваться как гены-супрессоры
опухолей. Другое С AMs moivt быть сверх-экспресси-
рованы, например N-САМ при мелкоклеточном раке
ле! koi о [Patel el aL, 1989J, при этом внеклеточный
домен подвер!ается альтернативному силайсишу
[ Rygaard et al.,1992). Может меняться также экспрессия
и степень фосфорилирования пнтегринов [Wall, 1991],
потенциально изменяя взаимодействие с цитоскеле-
том, регуляцию 1 енов транскрипции, ад! езию клеток
к субстрату и взаимосвязь между распластыванием
клеток и клеточной пролиферацией [Fata et al., 2004J.
В дополнение к этому, утрата межклеточного распоз-
навания, результат снижения клеточной адгезии, ведет
к делор! анизации роста клеток и утрате контактного
торможения клеточной подвижности и ограничению
клеточного деления плотностью популяции (см.
разд. 18.5.1). Клетки moivt расти неприкрепленными
к субстрату как в перемешиваемой суспензионной
культуре, так и суспендированными в полужидкой
среде, такой как aiap или метил целлюлоза. Существует
видимое сходство между изменениями клеточной ад-
гезии и открепления от тканей, в которых развивается
опухоль и последующим образованием метастазов в
дру!их участках, однако пока не ясна рациональная
344
ГЛАВА 18. ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
основа для этого сходства. Возможно, в этом процессе
принимают участие новые механизмы адгезии.
Суспензионное клонирование. Macpherson and
Montaguier [1964] смогли показать, что иолиома-
трансформированные клетки ВНК21 могли расти
преимущественно в мяп<ом aiape, в то время как не-
трансформированные клетки клонировались очень
плохо. Впоследствии было показано, что образование
колоний в суспензии часто улучшается после вирусной
трансформации. Ситуация, касающаяся спонтанных
опухолей, менее ясна, несмотря на тот факт, что Shin
с соавторами показали высокую корреляцию между
туморогенностыо и суспензионным клонированием в
метилцеллюлозе (Methocel) [Freedman and Shin, 1974;
Kahn & Shin. 1979J. Хотя Hamburger u Salmon [1977]
показали, что mhoi ие опухоли человека содержат не-
большой процент клеток (<1,0%), которые образукл
клоны в ai аре, ряд нормальных клеток также будут об-
разовывать клоны в суспензии [Lauget al., 1980; Peehl &
Stanbridge 1981; Freshney & Hart, 1982J (cm. pnc. 14.11).
Поскольку среди клеток встречаются нормальные
фибробласты, ценность этою метода для обнаружения
присутствия опухолевых клеток в короткоживущих
культурах из человеческих опухолей сомнительна. Тем
не менее метод сохраняет свою ценность для изучения
неопластической трансформации in vitro с применением
опухолевых вирусов, и он был широко применен Styles
[1977J для изучения механизмов канцерогенеза.
Метод клонирования в суспензии описан в гл. 14
(см. протоколы 14.4 и 14.5). В случае неопластических
клеток особенность применения этого метода связана
с выбором среды для суспендирования. Было предло-
жено [Netigut & Weinstein, 1979J использовать aiap
только для образования клонов наиболее сильно транс-
формированными клетками, в то время как aiapo.ia (в
которой имеется недостаток сульфатированных по-
лисахаридов) менее избирательна. Montagnier [1968]
показал, что рост нетрансформированных ВНК21
клеток, способных расти в агарозе, но не растущих
в aiape, может быть подавлен добавлением в aiapo^y
декстрансульфата
18.5.2. Контактное торможение
Утрата контактною торможения может быть обнару-
жена морфоло! ически ио образованию дезориенти-
рованною монослоя клеток (см. цв. вкладку 14а, б)
или округлению клеток в фокусах внутри обычною
образца нормальных окружающих клеток (см. рис. 18.3
и цв. вкладку 14в). В культурах человеческой глиомы
дезор! авизованные участки роста со снижением плот-
ность-зависимого ограничения роста обнаруживаются
по более высокой плотности популяции, чем в линиях
нормальных 1лиальных клеток (рис. 18.5) [Freshney
el al, 1980а, bj. Поскольку различия в размерах кле-
ток влияют на плотность культуры, то наилучшим
методом измерения падения илотность-зависимого
Дни
Рис. 18.5. Ограничение клеточной пролиферации в зави-
симости от плотности. Различия в уровне плато (плотности
насыщения), достигнутого культурами клеток нормального
мозга (кружочки, сплошная линия) и клеток глиомы (квад-
раты. прерывистая линия). Клетки были посеяны на 13-мм
покровное стекло, через 48 ч покровные стекла были перене-
сены в 9-см чашку Петри, содержащую 10 мл ростовой среды,
для того чтобы минимизировать фактор истощения среды
ограничения роста является определение индекса
мечения с использованием | 1Н[-тимидина при разной
плотности популяции (см. протокол 21.11). Глиома
человека, меченная |* *Н (-тимидином в течение 24 ч
в плотной популяции, дает индекс мечения 8%, в то
время как нормальные ытальные клетки дают 2%
[Guneretal., 1977].
ПРОТОКОЛ 18.3. Ограничение клеточной
пролиферации в зависимости от плотности
культуры
Схема
Выращивание культуры до плотности насыщения в
условиях, не ограниченных средой, и авторадиогра-
фическое определение процента клеток, меченных
[ ’Н [-тимидином
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
• Культуры клеток, готовые к субкультивированию
• Ростовая среда
Среда для поддержания культуры (без сыворот-
ки и факторов роста), содержащая 37 КБк мл
(1.0 мк Ки мл) | *Н (-тимидина, 74 ГБк ммоль
(2 Ки/Ммол)
• D-PBSA
• Трипсин, 0,25%
• Многолуночный иланшет, 24-луночный, содер-
жащий покровные стекла 13 мм в диаметре
18.S. Абберантный контроль роста
345
• Чашки Петри. 9 см (бактериолог ические, uo 1 на
покровное стекло)
Протокол
1. Трипсинизггруите клетки и посейте 1х 10' кл. мл
в 24-луночный планшет. 1 мл/лунку, поместите
в каждую лунку покровное стекло 1.3-мм в диа-
метре.
2 Инкубируйте клетки в СО,-инкубаторе с увлаж-
нением в течение 1—3 дней.
3. ПеренесЬп1 покровные стекла в 9-см бактериоло-
1 ические чашки Петри, каждая содержит 20 мл
среды, поместит! чашки в СО,-инкубатор.
4. Продолжайте культивирование, меняя среду
каждые 2 дня, пока клетки не образуют конфлю-
энтный слой на иокровных стеклах
5. Трипсинизируйте и подсчитывайте клетки с двух
иокровных стекол каждые 3 4 дня. Как только
клетки станут расиолататься компактно на ио-
кровном стекле, может потребоваться добавить
200—500 ед. мл коллагеназы к трипсину для того,
чтобы достичь полной диссоциации клеток для
их подсчета.
6. Когда клеточный рост прекратится, т. е. при двух
последовательных подсчетах не обнаружено зна-
чительно! о возрастания числа клеток, добавьте
2,0 мл 37 КБк/ мл (1,0 МкКи мл) [‘HJ-тимидина,
74 ГБк/ммоль (2 Ки, ммоль) и затем инкубируй-
те клетки в течение 24 ч.
• Требование безопасности. Манипуляции
с [ !Н]-тимидином следует проводить с осторожно-
стью. Хотя это источник низко.-гнергетичного |3-пз-
лучения, он включается в ДНК и может вызывать
радиолитическое повреждение. Надевайт е перчатки,
не работайте с [ ‘HJ-тимидином в ламинарном шкафу
с горизонтальным иотоком, используйте ламинар-
ный шкаф для работы с препаратам и, токсическими
или представляющими биологическую опасность
(см. разд. 7,5.4), уничтожайте жидкие и твердые
радиоактивные отходы в соответствии с правилами
работы с радиоизотопами, принятыми у вас.
7. Перенесите иокровные с текла обратно в 24-лу-
ночный планшет, триисннизировать клетки для
авторадиографии (см. разд. 27.2). Клетки мог ут
быть фиксированы в суспензии или в капле на
стекле, как upu изготовлении хромосомного
препарата (см. протокол 16.7 без 1 миотонической
обработки), центрифуг ированы на стекле ири по-
мощи цитоцентрифуги (см. протокол 16.4). или
задержаны на фильтре при вакуум-фильтрации
(см. протокол 16,5).
Замечание. Культуру с высокой плотностью для
авторадиографии необходимо гриисинизировать, по-
скольку из-за толщины слоя и слабости проникновения
[3-излучения от [3Н]-меченых клеток в подлежащие
слоях они не будут регистрироваться радиочувстви-
тельной эмульсией, в результате абсорбции [3-частиц
вышележащими клетками (длина среднего пробега
Р-частиц в воде составляет примерно 1 мкм). Если
клетки остаются в монослое ири высокой плотности,
то этот шаг можно опустить, а авторадиограмма может
быть ирги отовлена установкой покровного стекла ио-
верх клеток на предметном стекле.
Анализ. Подсчет количества меченых клеток
представляется как их процентная доля от общего ко-
личества клеток. Просмотрите авторадиограмму иод
микроскопом и подсчитайте общее количество клеток
и долю меченых клеток в репрезентативной части ире-
иарата (см. рис. 21.14).
Вариации. Клетки, синтезирующие ДНК, мо-
гут быть мечены ири помощи бромдеоксиуридина
(BUdR) и затем обнаружены ио реакции с антителами
к BUdR-меченой ДНК (Dako). Человеческие клетки,
находящиеся в стадии пролиферации, могут быть
мечены ири помощи моноклональных антител Ki67
(Dako) против ДНК-иол и меразы или анти-PCNA
против антигена пролиферирующего клеточного
ядра (PCNA, proliferating cell nuclear antigen). Хотя
существует достаточно хорошее соответствие между
[*Н]-тимидином и BudR- меткой, но Ki67 и PCNA
свяжутся с большим числом клеток, поскольку анти-
ген присутствует в течение всего клеточного цикла
и не ограничен S-фазой. Рост клеток ггри высокой
плотности в нелимитирующей среде может быть так-
же достш нут вырашиванием клеток в фильтрующей
лунке (В-D Biosciences, Corning Millipore), при этом
следует выбирать диаметр фильтра так, ч гобы он был
значительно меньше, чем у чашки (например, 8-мм
фильтр для 24-луночной чашки, Corning Costar) и
подсчета количества клеток в плате. который прово-
дится при помощи авторадиографии или иммунного
окрашивания с Ki67 или анти-PCNA.
18.5.3. Зависимость от сыворотки
Трансформированные клетки имеют более низкую
зависимость от сыворотки, чем соответствующие им
нормальные клетки [Temin, 1966, Eagle etal., 1970], бла-
i одари, в частности, секреции факторов роста опухоле-
выми клетками [Todaro & DeLarco. 1978]. Эти факторы
были описаны как аутокринные фак горы роста. В этом
определении подразумевается, что 1) клетка продуци-
рует фактор; 2) клетка имеет рецепторы к этому факто-
ру и 3) клетка отвечает на данный фактор вступлением
в митоз. Некоторые из этих факторов могут обладать
несомненной трансформирующей активностью в отно-
шении нормальных кле гок (например, TGF-а)? связы-
ваясь с EGF рецептором и индуцируя митоз [Richmond
etal., 1985], хотя, в отличие от истинной трансформации
(см. разд. 18.2), данный тип трансформации обратим.
Эти факторы также приводят к тому, что нетрансфор-
346
ГЛАВА 18. ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
мированные клетки приобретают трансформирован-
ный фенотип и начинают расти в суспензии [Todaro
& DeLarco, 1978]. Этот эффект может быть достш пут
обработкой клеток NRK кондиционированной средой
от исследуемых клеток и последующим их клониро-
ванием в суспензии (см. протоколы 14.2, 14.4, и 14.5).
Опухолевые клетки могут также производить мною
гематопоэтических факюров роста, таких как интер-
лейкины 1, 2, и 3, наряду с колониестимулирующим
фактором (CSF) [Fontana el al., 1984; Metcalf, 1990].
Было высказано предположение [Cullillael al., 1985],
что некоторые факторы, такие как гастрин-релизинг-
фактор и вазоактивный интестинальный пептид (VIР)
и человеческий хорионический гонадотропин (hCG),
которые, как до настоящею времени нолаюли, яв-
ляются эктопическими гормонами, производимыми
легочной карциномой, могут на самом деле быть ауто-
кринными факторами рос га. Аутокринные факторы
роста могут быть обнаружены при помощи иммунною
окрашивания (см. иротокол 16.11), но их ценность как
маркеров трансформации ограничена, поскольку мно-
ше нормальные клетки, наиример 1лиальные клетки,
фибробласты и эндотелиальные клетки, продуцируют
аутокринные факторы в ходе пролиферации.
18.5.4. Онкогены
Автономный контроль роста также достш ается в транс-
формированных клетках ири действии онксленов, экс-
прессируемых как модифицированные рецепторы, на-
иример продукт онкогена егЬ-В2 и модифицированный
G-белок, мутантный ген ras или сверхэкспрессия генов,
pet улирующая стадии передачи сшнала (наиример, src
киназа) либо регулирующих транскрипционный конт-
роль (тус, fos njim) [Bishop, 1991]. Bo mhoi их случаях
продукт гена перманентно активен и не может быть
ре1улирован. Сверхэкспрессия онкогенов может быть
обнаружена методом иммунною окрашивания (см.
иротокол 16.11), । ибридизацией in situ (см. разд. 27.8),
иммуноблоттингом белковою продукта, RT-PCR для
inRNA, или МАА (см. разд. 16.6.1 и цв. вкладку 24).
В некоторых случаях продукт онкогена (например,
erft-B2, активированный Ha-ras) можно отличить от
нормального продукта (рецептор EGF и нормальный
ras, соответственно) как качественно, так и количест-
венно с использованием специфических антител
18.6. ТУМОРОГЕННОСТЬ
Трансформация - это mhoi осту цен чатый процесс,
который часто завершается образованием неопласти-
ческих клеток [Quintanilla el al., 1986J. Однако клеточ-
ные линии, полученные нз злокачественных опухолей,
предположительно уже трансформированные, moivt
подвер! аться дальнейшей трансформации с возраста-
ние темпов скорости роста, снижением зависимости
от прикрепления к субстрату, более выраженной ане-
уилоидией и иммортализацией. Это доказывает, что
для злокачественной трансформации требуется некий
порядок шагов, нестрого контролируемый и не взаимо-
зависимый, и не обязательно туморогенный в каждом
индивидуальном случае. Более того, все клеточные
линии, представленные в опухоли, не должны обладать
одними и теми же трансформированными свойствами,
а одинаковый набор качеств не должен быть представ-
лен в каждой опухоли Прогрессирование опухоли
может подразумевать экспрессию новых свойств или
исчезновение старых, что может привести к развитию
метастазов пли даже спонтанной ремиссии.
Таким образом, существует несколько этапов транс-
формации, последовательность которых может опреде-
ляться селективным давлением условий окружающей
среды. In vitro, t де существует мало ограничений роста,
трансформационные события не обязательно следуют
в том же порядке, что и in vivo.
18.6.1. Малигнизация
Мали! низация или злокачественность подразумевает,
что в клетках возникла и развилась способность обра-
зовывать инвазивные опухоли при их имплантации in
vivo изолО! ичному хозяину либо как ксенотрансплан-
танг животному с подавленным иммунитетом. Хотя
развитие злокачественности может быть обнаружено
как дискретное фенотипическое событие, оно часто
сопровождается развитием аберрантно! о контроля
роста, что позволяет предположить, что некоторые
повреждения, ответственные за аберрантный контроль
роста, также вызывают злокачественность. Одним из
видимых кандидатов, вызывающих такие поврежде-
ния, является дефицит межклеточною взаимодей-
ствия, который лишает клетку контроля деления
(щраничения клеточной пролиферации при высокой
плотности культуры) и контроля подвижности (кон-
тактное торможение). Обычно используются два
подхода для исследования свойс гв, связанных со зло-
качественностью: 1) рост в культуре и характеристика
клеток, выделенных из опухолей, и 2) трансформация
in vitro при помощи вируса или химическою канце-
рогена или трансфекция онкогеном, позволяющая
получить клетки, которые были бы туморогенными
и которые можно было бы сравнивать с нетрансфор-
мированными клетками. Второй подход позволяет
получить трансформированные клоны той же линии,
которые moi ут рассматриваться как малы визирован-
ные, и эти клоны могут сравниваться с немалы визи-
рованными. К сожалению, многие характеристики
клеток, трансформированных in vitro, не были найде-
ны в клетках, полученных из спонтанных опухолей.
В идеале, должны быть выделены и охарактеризованы
опухолевые клетки и эквивалентные им нормальные
клетки. К сожалению, существует относительно мало
примеров, для которых такой порядок действий был
бы возможен, но даже тогда, koi да клетки могут при-
надлежать одной и той же линии дифференцировки.
18.6. Туморогенность
347
их положение в этой линии не всегда ясно, и, таким
образом, сравнение их не строго оправданно. Хотя
клетки, выделенные из нормальных взрослых тка-
ней, будут дифференцированными и не способными
к активации, мри развитии опухоли они склонны к
утрате дифференцировки и пролиферации. Это будет
отличать иоцуляцпю опухолевых клеток, независимо
от степени малш низации, от копуляции нормальных
клеток. Более того, оказались, что многие, если не
большинство клеток в опухоли, не имеют продоти-
рованною времени жизни в культуре, а популяция,
критическая для распространения опухоли и поэтому
являющаяся основной мишенью для химиотерапии,
может' быть достаточно маленькой и эквивалентной
популяции стволовых клеток в нормальной ткани.
До настоящею времени накоплено мало данных,
подтверждающих возможность культивирования
этих клегок, но количество попыток сделать это все
возрастает [Petersen el al., 2003; Takahashi et al., 2003;
Aarti el al., 2004 J.
18.6.2. Опухолевая трансплантация
Единственным общепризнанным признаком злока-
чественности является доказательство способности
к инвазивности или метастазированию опухолей т
vivo. Трансплантируемые опухолевые клетки (-1x10’’),
введенные изогенным хозяевам, будут образовывать
инвазивные опухоли в большой доле случаев, в то
время как нормальные клетки из того же источника в
дозе 1 х 10ъ не образуют опухолей. Для изучения туморо-
генности человеческих опухолей разработаны модели
с использованием иммуносупрессивных и иммуно-
дефицитных животных. Мыши «nude», генетически
лишенные тимуса [Giovanella et al., 1974], так же как
и тимусэктомированные облученные мыши [Bradley
el al., 1978а; Selby et al., 1980], широко используются
как хозяева для ксенотрансцлантантов. Они способны
воспринимать широкий ряд ксенотрансплантантов,
однако имеется мною примеров неудачных попыток
привить достаточно точно определенные опухолевые
клеточные линии и опухолевые биопсии, в результате
которых не развивались ксенотрансплантантные опу-
холи либо, несмотря на способность клеток к инвазии,
не формировались метастазы. Приживаемость клеток
может быть улучшена действием сублетальной дозы
радиации (30-60 Гр), на мышей nude либо использова-
нием аспленических атимических мышей (acid), а также
путем имплантирования клеток в Matrigel [Pretlow el
al., 1991]. Несмотря на частоту ложноотрнцательных
результатов, туморогенез остается хорошим индика-
тором малш низации.
18.6.3. Инвазивность
Изучение туморосенеза всегда должны сопровож-
даться гистологическими исследованиями для до-
Сердце эмбриона
цыпленка
Рис. 18.6. Эксперимент с использованием клеток сердца
цыпленка. Опухолевый сфероид (см протокол 25.2) сокуль-
тггвнровалн вместе с обработанными фрагментами сердца
8-дневного эмбриона цыпленка. 1) Сфероид прикрепляется
к кусочку сердца через несколько часов 2) Клетка сфероида
начинает проникать в кусочек сердца через 24-48 ч. 3) Опу-
холевые клетки из сфероида распространяются внутри фраг-
мента сердца 4) Сердечные ткани полностью замещены через
8-10 дней [по Marcci ct al, 1979]
Сфероид
опухолевых
клеток
казательства инвазивности и для подтверждения
гистоцатологического сходства индуцированного
новообразования и исходной опухоли. Однако если
клетки не туморог ен ны или если возможности для
трансплантации отсутствуют либо проведение опы-
тов на животных нежелательны, то возможно огра-
ничиться проведением ряда исследовании in vitro.
Некоторые виды исследовании также предоставляют
возможности использования моделей, позволяющих
иолучить более точные количественные результаты,
чем эксперименты in vivo.
Хориоаллантоисная мембрана цыпленка. I Ис-
следования на хориоаллантоис ной мембране цып-
ленка (САМ) могут осуществляться на эмбрионе
цыпленка in ovo или на эксплантированной САМ in
vitro. Easty & Easty [ 1974J показали, что инвазия САМ
может быть показана на органной культуре, позже
другие исследователи попытались с ограниченным
успехом [Hart & Fidler, 1978] сконструировать каме-
ру для количественных исследований проникнове-
ния опухолевых клеток через САМ Преимущество
исследований САМ in ovo заключается в том, что
возможно также одновременно показать ангиогенез
(см. разд. 18.6.4 и цв. вкладку 15е, ж), а последующие
гистологические исследования помогут выяснить,
проникают ли опухолевые клетки в подлежащие слон
базальной мембраны.
Инвазии опухолевых клеток в выделенные куль-
тивируемые ткани. Mareel el al. [1979] разрабо-
тали модель для инвазии in vitro с использованием
фрагментов сердца куриного эмбриона, совместно
культивированного с перегруппированными в единые
кластеры опухолевыми клетками (рис. 18.6). Обнару-
жено, что процесс инвазии коррелирует* со степенью
злокачественности источника клеток, развивается и
вызывает деструктивные изменения тканей хозяина.
Применение этого метода к клеткам человеческих
опухолей показывает наличие высокой корреляции
348
ГЛАВА 18. ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
Рис. 18.7. Инвазия в фильтрующей ячейке. Клетки, посеянные на нижнюю сторону фильтра, мигрируют через фильтр в бед-
ный факторами роста Матригель в лунке фильтрующего вкладыша при стимуляции добавлением хсмиоаттрактанта, такого
какфибробласт-кондииионщктванная среда, на верхнюю сторону Магригсля [но Brunton ct aL 1997]
между злокачественностью и инвазпвностью клеток
[de Ridder & Calliauw, 1990]. Этот метод широк» ис-
пользовался, но его результаты сложно определить
количественно и их интерпретация требует навыков
i истолш ической работы.
Фильтрующие ячейки. Разработан ряд методов,
основанный на проникновении клеток через фильтры,
покрытые Matrigel или какими-то еще веществами
внеклеточного матрикса (рис. 18.7) [Repesh, 1989;
Schlechle et al., 1990; Brunton et a]., 1997; Lamb et
al., 1997]. Степень проникновения в гель или через
дистальные стороны фильтра показывает степень
инвазивности и цитологически определяется но
количеству клегок и расстоянию, которое они пре-
одолели, либо ио подсчету радиоактивных клеток,
предварительно меченных |251, на дистальной стороне
фильтра или на дне чашки. Этот метод дает количест-
венные результаты, однако его недостатком является
отсутствие нормальных клеток хозяина в барьере,
обычно связанных с инвазией in vivo. Проникновение
в Matrigel перспективно для оценки степени дет рада-
ции матрикса и отражает продукцию клетками про-
теаз или гликозидаз. Однак» неясно, как мотут быть
изучены в этой модели клетки, которые не производят
собственных ферментов деградации п обычно исполь-
зуют протеазы, образуемые в строме.
18.6.4. Ангиогенез
Многие высвобождаемые факторы опухолевых
клегок, включая VEGF [Joukov et а]., 1997], FGF-2
[Thomas et al., 1997], и аниюгенин [Hu et al., 1997J,
способны к индукции образования сосудов [Folkman,
1992; Skobe & Fusenig, 1998]. Фрат менты опухолей,
осадки культивированных клеток или клеточные
экстракты, имплантированные на поверхность САМ
куриного яйца, вызывают активизацию роста сосудов,
заметную невооруженным глазом через 6—8 дней
(цв. вкладка 9). Поскольку этот тин исследований
недостаточно количественный, для более количе-
ственных исследований могут быть использованы
методы стимуляция клеточной мшрации, [Bagley
et al., 2003], продукции VEGF [Buehler et al., 2004],
или морфогенеза культуры сосудистого эндотелия
[Chen et al., 1997; Ment et aL, 1997; Jain et al., 1997] в
фильтрующей ячейке.
Клеточная линия
Рис. 18.8. Активатор плазминогена (РЛ). РА продуциро-
ванный опухолевыми клетками m vitro (единицы измерения
активности выбраны произвольно). Активности РА четырех
культур глиом JPT, AT A RAT. и VAG — были выше, чем в
культурах клеток из нормального мозта человека (NMB-C,
GDU-T) Также было обнаружено, что только клетки ССМ
и С6. которые продуцируют дифференциальный маркер
глии фибриллярный кислый белок, имеют самый низкий
уровень активности РА
18.6. Туморогенность
18.6.5. Активаторы плазминогена
Друшми продуктами, которые имеют тенденцию к
стимуляции развития трансформированных клеток, яв-
ляются протеолитические ферменты [Mahdavi & Hynes,
1979J, давно связываемые с теориями инвазивного роста
[ Liolta, 19871. Поскольку протеолитическая активность
может быть связана с клеточной поверхностью mhoi их
нормальных клеток и отсутствует во mhoi их опухоле-
вых клетках, в качестве контроля с применением этого
критерия должны быть использованы эквивалентные
нормальные клетки. Активатор илазмишлена (РА) в
некоторых культурах человеческой глиомы выше, чем
в культурах нормальных клеток мозга [Hince & Roscoe,
1980] (рис. 18.8), предварительно показано, что РА
связаны со мно111ми опухолевыми культурами [de Vries
el al., 1995; del Vecchio el al., 1993; Schwartz Albiez et al„
1991]. PA может быть измерен путем отстаивания фи-
биринового сгустка или выделения свободного раство-
римого ,2Я из [,2SIJ фибрина [Unklesseial., 1974; Strick-
land & Beers, 1976]. В дополнение к лому, существует
простое хромогенное исследование, разработанное Whur
el al. [ 1980J. Предцолат ается, что в случаях некоторых
карцином растворимый урокиназа-иодобный РА(иРА)
характерен более, чем тканевой РА (tPA) [Markus et al.,
1980; Duffy et al., 1990], поэтому достаточно информа-
тивным методом исследования является хромогенное
исследование вместе с зимограммным анализом [Davies
el al., 1993; Boxinan el al., 1995J и последующим имму-
ноблоттингом для определения доли каждого типа РА.
Глава 19
КОНТАМИНАЦИЯ
19.1. ИСТОЧНИКИ КОНТАМИНАЦИИ
Поддержание асептических условий является еще
одной из наиболее трудных задач для новичков в
работе с культурой клеток. Проблемы, возникающие
в период начальною обучения, могут быть преодоле-
ны приобретением опыта работы, но в определенных
ситуациях даже наиболее опытные сотрудники будут
страдать от контаминации. Существует несколько
потенциальных путей, приводящих к контаминации
(табл. 19.1), включающих нарушение режима стери-
лизации растворов, стеклянной посуды и иипеток,
турбуленцию воздуха, наличие твердых частиц (пыль
и споры) в воздухе комнаты, плохое состояние ин-
кубаторов и холодильников, дефекты ламинарною
шкафа, внесение контаминированных клеточных
линий или биопсийных препаратов и оплошности в
осуществлении стерильных процедур. Последний из
них, надо полагать, наиболее важен.
19.1.1. Основные приемы
стерильной работы
Если используются стерильные реактивы и оборудо-
вание находится в надлежащем рабочем состоянии,
возможность контаминации зависит от квалифика-
ции оператора и состояния окружающей среды. Если
уровень квалификации и тщательность работы опера-
тора высоки и атмосфера чистая (отсутствуют пыль и
сквозняк), то контаминация в результате манипуляций
оператора происходит редко. Если состояние внешней
среды ухудшается (наиример, в результате строитель-
ных работ >lih сезонного повышения влажности) или
техника работы оператора ухудшается (пропускается
одна или более якобы необязательных мер предосто-
рожности), то вероятность заражения возрастает. Если
и то, и другое происходит одновременно или последова-
тельно, результаты мотут быть катастрофическими.
Давайте рассмотрим такое совпадение событии в гра-
фической форме (см. рис. 6.1). Результаты работы при
соблюдении надлежащей техники отражены на верхнем
графике. Случайные оплошности изображены в виде
направленных вниз ников. Нижняя кривая отображает
результаты работы при плохом состоянии внешней сре-
ды с отдельными случаями спорадического возрастания
риска контаминации, например при случайном открыва-
нии контаминированной чашки Петри в стерильной зоне
или образование пыли при эксплуатации оборудования.
Только в случае, если две кривые (надлежащей техники
работы и высокого качества состояние внешней среды)
Значительно расходятся, совпадение оплошностей в
методологии и загрязнение окружающей среды будут
происходить редко. Однако если происходит прогрес-
сирующее ухудшение техники или состояния внешней
среды, частота контаминации будет возрастать, а если
ухудшится и то, и другое, то контаминация будет проис-
ходить регулярно и широко распространяться.
19.1.2. Состояние внешней среды
Совершенно очевидно, что состояние внешней среды в
зоне культивирования клеток необходимо поддержи-
вать в максимально возможно чистом состоянии, ком-
ната не должна быть проходной и в ней не должно быть
беспорядка. Следует избегать культивирования клеток
в обычной лабораторной комнате; ламинарный шкаф не
дает достаточной защиты от нестабильного состояния
окружающей среды в типичной лаборатории. Предпоч-
тительное выделение чистой непроходной зоны — отде-
льная комната или отдельный блок (см. разд. 4.3,6.2.1).
Оборудование, вносимое в стерильную зону со склада,
поток воздуха от двери, холодильники, центрифуги,
перемещения онераторов, все это повышает риск
контаминации. Мойте поверхности и оборудование в
соответствии с жестким графиком и полностью проти-
райте все, что вносится в стерильную зону.
Не существует взаимнооднозначного соответствия
между профилактической мерой и причиной конта-
минации, указанных в таблице; предупредительные
меры взаимосвязаны и могут относиться к нескольким
причинам
19.1.3. Использование и поддержание
в рабочем состоянии
ламинарного шкафа
Наиболее общий пример неудовлетворительной тех-
ники неправильное использование ламинарного
шкафа Если ламинарный шкаф перегружать буты-
лями и оборудованием (рис. 6.2, 63), то нарушается
ламинарный поток и потенциально биологически
19.1. Источники контаминации
351
Таблица 19.1. Пути контаминации
Путь или причина контаминации
Предотвращение
Процедуры
Манипуляции, пикетирование, дозирование и т.д.
Нестерильные поверхности и оборудова-
Брызги жидкости на горле и на внешней
части бутылей и на рабочей поверх-
ности.
Вымойте рабочую зону заранее.
Регулярно протирайте 70%-м спиртом. Нс переливайте жидкости через край. До-
зируйте или переливайте их с помощью пипетки, автоматического дозатора или
устройств для переливания Если переливания через край не 1ьзя избежать, то.
1) делайте это одним непрерывным движением, 2) удалите бутыль, из который
вы наливали и 3) вытрите брызги.
Касание пинетки или удерживание пинет-
ки слишком низко, касание горлышка
бутылей с внутренней с троны в области
закручивающейся крышки.
Разбрызгивания из емкости для слива
Осадок ныли или частицы с поверхности
кожи на культуре или бутылях, переме-
щение рук или инструментов над откры-
1 ыми чашками или бутылями.
Рабочие поверхности
Держите пипетку выше градуировки.
Не работайте над открытыми сосудами.
Сливайте отходы в ст акан с помощью воронки или, предпочтительней, удаляйте
огходы в резервуар с помощью вакуумного насоса.
Не работайте над (в ламинарных шкафах с вертикальным ламинарным истоком
н на открытом месте) или за и над (в ламинарных шкафах с горизонтальным
ламинарным истоком) открытыми бутылями или чашками.
Пыль и брызги
Волосы, руки, дыхание, одежда оператора
Пыль с кожи, волос или одежды упала или
занесена потоком воздуха в культуру.
Аэрозольные частицы в процессе разгово-
ра. кашля, чихания и т.д
Протирайте поверхность 70%-м спиртом до, в течение и после работы
Вытирайте брыз| и немедленно.
Тщательно мойте руки или пользуйтесь перчатками Носите лабораторную без-
ворсовую одежду с облегающими манжетами и перчатки, прикрывающие их
Сведите разговоры к минимуму и отворачивайтесь от рабочего ироетранства
при разговоре
Старайтесь нс работать при инфекционных заболеваниях носа и горла или но-
сите маску.
Длинные волосы завязывай ic в узел сзади или надевайте шапочку
Надевайте особую лабораторную одежду Нс используйте лабораторную одежду,
в которой вы работав!с в общей лабораторной зоне или в виварии.
Матерна ты и реактивы
Растворы
Нестерильные реактивы и среда
Плохие условия хранения (грязь)
Неадекватные методы стерилизации
Плохой поставщик
Стеклянная посуда и завинчивающиеся крышки
Пыль и споры в результате хранения
Фильтруйте или автоклавируйте растворы перед использованием
Регулярно мойте и дезинфицируйте места хранения реактивов
Контролируйте работу автоклава, регистрируя показания термометра или инди-
катора стерильности (см. Приложение II и иротокол 11.5)
Проверяйте целостность фильтров при темпера type кипения или проводите
анализ фильтров на ирису iciвис микропрганизмов после использования
После стерилизации тестируйте вес растворы.
Проверяйте растворы, смените поставщика
НеудовлстворИ|сдьная стерилизация (на-
пример, ицтеполнение камеры автоклава
или слишком большой объем жидкости в
бутылях препятствуют входу пара)
Инструменты, пипетки
Неудовлетворительная стерилизация
Прикрывайте крышки фольгой. Протирайте бутыли 70%-м спиртом перед вне-
сением в ламинарный шкаф
Меняйте запас неиспользованной посуды в дальней части полки. Нс храните
ничего герметично нс закрытого более 24 ч.
Проверяйте температуру загруженного содержимого в течение цикла стери-
лизации. При автоклавировании крышки пустых бутылей нс должны быть
плотно закручены. Правильно заполняйте сушильный шкаф и автоклав (см.
Перед использованием стерилизуйте инструменты сухожаровым способом.
Контролируйте работу сушильного шкафа.
Заново простсрилнзуйте инструменты. (Используйте 70%-м спирт, прожгите в
пламени и охладите инструменты )
Нс бери гесь руками за ту час гь инструмента или пипетки, которая будет помещена
внутрь культурального сосуда.
Культуральные флаконы и бутыли со средой, находящиеся в использовании
Пыль и споры из инкубатора или хило- Вместо пробок используйте закручивающиеся крышки Протнрайтсбутыли перед
дильннка помещением в ламинарный шкаф Упаковывай 1е планшеты и чашки
Контакте нестерильной поверхностью или
нестерильными предметами
352
ГЛАВА 19. КОНТАМИНАЦИЯ
Окончание табл. 19.1
Путь или причина контаминации
Плохие условия хранения или инкубации
(грязь).
Среда на внутренне!! стороне крышки и
брызт н на внешних сторонах бутыли
Оборудование и аппаратура
Воздух помещения
Вентиляция. завихрения, сквозняк, пыль.
П редотвращение
При хранении или инкубации прикрывайте крышки и горло бутылей алюмини-
евой фольгой Протирайте флаконы и бутыли 70%-м спиртом перед исполь-
зованием. Регулярно мои гс места хранения и инкубаторы
Выбраковывайте все бутыли с видимыми брызгами на внешней стороне горлыш-
ка. Нс допускайте проливания жидкостей.
Очистка фильтрованного воздуха.
Снизьте интенсивность движения и иосгорпннюю активность в чистой зоне
Регулярно мойте пол и рабочие поверхности
Ламинарные шкафы
Повреждение фильтра
Необходимое 1ь замены фильтра
Брызги, в особенности внутри ламинар-
ного шкафа или на нижней рабочей
поверхности.
Сухие инкубаторы
Рост плесени и бактерий на каплях жид-
Влажные СО2-инкубаторы
Рост плесени и бакт ерии на стенках и пол-
ках во влажной атмосфере
Споры и т. д, внесенные при принудитсль-
нои циркуляции воздуха.
Регулярно проверяйте, нет ли отверстий в фильтре и нс нарушена ли герметич-
Проверьте герметичность установки филыра.
Регулярно мойте внутреннюю часть ламинарного шкафа и нижнюю рабочую
поверхность. Дайте спирту проникнуть в щели
Протирайте любые брызго тампоном с 70%-м спиртом Регулярно мойте инку-
батор.
Вымойте инкубатор детергентом, а затем 70%-м спиртом (см протокол 19 1)
Открытые чашки Петри помещайте в пластиковые контейнеры с плотно при-
гнанными крышками (но нс закрывайте крышки герметично)
Перед гем как открыть инкубаторы, протирай го их 70%-м спиртом В воду
добавляйте фунгицид или антибактериальный препарат (но предварительно
проверьте его токсичность)
Другое оборудование
Пы ть на цилиндрах, насосах in л
Клещи, насекомые, другие источники инфекции из деревянного инвентаря или установок, из инкубаторов и с мышей и
т.д., принесенных из вивария.
Проникновение клещей и т д. в стерильные
контейнеры
Перед внесением протирайте 70%-м спиртом.
Загерметизируйте все стерильные упаковки.
Избегайте, по возможности, использования деревянного инвентаря, используйте
цельное пластиковое покрытие или рабочие поверхности из нержавеющей
Если используется деревянный инвентарь, покройте его полиуретановым
лаком или восковой политурой и регулярно мойте дезинфицирующими
растворами.
Нс держите животных в лаборатории культуры тканей.
Добавляйте антибиотики в растворы для препарирования (см разд. 12 3)
Все потенциально инфицированные большие образцы ткани погружайте на 30 с
в 70%-й спирт
Внесение биологических материалов
Образцы ткани
Образец от инфицированного источника
или занесение Инфекции при препари-
ровании
Поступающие в лабораторию линии клеток
Контаминация в лаборатории-песочнике Работайтестакими линиями клеток отдельно, предпочти тсльно, в карантине, уже
линии или при транспортировке. после того, как выполнены все стерильные работы. Посте работы протирайте
рабочую поверхность или ламинарный шкаф 2%-м фенолом в 70%-м спирте и
нс работайте там до следующего утра
В течение двух недель проверяйте наличие контаминации. культивируя культуру
без антибиотиков. (Параллельно сохраните эту же культуру с антибиотиками
на стадии первого пассажа )
Проверяйте наличие контаминации визуально с помощью фазово-контрастной
микроскопии и окрашиванием микоплазмы красителем Hoechst. Использо-
вание индикаторных клеток позволит провести проверку на контаминацию
до первого пересева
19.1. Источники контаминации
353
опасные вещества попадают в комнату. Кроме того,
возрастает риск контакта стерильных пипеток с несте-
рильными поверхностями бутылей и т.д. В ламинар-
ный шкаф необходимо вносить только те предметы,
которые непосредственно необходимы для выполне-
ния текущей операции.
Также ламинарные шкафы должны peiy-iapHO об-
служиваться технически, целостность фильтров, воз-
духодувов и корпуса должна проверяться, но крайней
мере, дважды в год опытным специалистом. Специа-
лист также должен проверять герметичность рабочей
области, так как воздух изнутри не должен выходить
наружу, а внешний воздух не должен проникать внутрь.
И то. и друг ое зависит от скорости циркуляции внут-
реннего воздуха и внешних завихрений
19.1.4. Инкубаторы с увлажнением
Одна из основных причин контаминации - это ис-
пользование инкубаторов с увлажненной атмосферой
(см. разд. 6.6.1). Высокая влажность не требуется, если
не используются открытые сосуды; плотно закрытые
флаконы лучше держать в сухом инкубаторе или
термальной комнате (см. разд. 4.4). Для того чтобы
избавиться от необходимости использовать газовые
баллоны с СО,, можно использовать среды для культи-
вирования ири низком содержании СО, (например, на
основе солей Хэнкса, см. разд. 9.3.2). Если же возникла
необходимость заполнения флаконов углекислым га-
зом. то лучше ввести аз из баллонов или центральной
системы подачи СО2. затем плотно закрыть флаконы
и поместить их в обычный инкубатор. Использование
газопроницаемых крышек (см. разд. 8.2.3) минимизи-
рует риск контаминации, но стоят флаконы с такими
крышками дороже, и степень риска заражения при
содержании таких флаконов в обычной атмосфере
выше, чем в сухом инкубаторе. Для переноса флаконов
в инкубатор без подачи СО2. газопроницаемые крышки
можно плотно закрывать второй резиновой крышкой
(В-D Biosciences). Если флаконы с приоткрытыми или
газопроницаемыми крышками содержатся в СО2-инку-
баторе, но возможности держите инкубатор сухим, а для
открытых планшетов используйте другой инкубатор.
Если в инкубаторе отсутствует вода, то необходимо
заново откалибровать систему контроля СО,, необхо-
димо контролировать испарение жидкости во флаконах
и. при необходимости, закручивать крышки флаконов
после уравновешивания pH.
Однако во mhoi их случаях необходимо использовать
инкубатор с увлажненной атмосферой. Для того чтобы
снизить риск контаминации, из внутренней камеры
инкубатора необходимо вынуть все дос гу иные детали и
тщательно вымыть. Культуры, хранящиеся в инкубато-
ре, должны быть помещены в пластиковые контейнеры
(см. разд. 6.6.2). Использование вентилятора в СО,-ин-
кубаторе уменьшает время восстановления заданных
значений как СО2, так и температуры, но ценой явля-
ется повышение риска контаминации (см. разд. 5.3.2,
6.6.1); культуры в открытых планшетах лучше культи-
вировать в неподвижном воздухе и и как можно реже
открывать инкубатор. Наличие сухого инкубатора без
СО2для плотно закрытых флаконов и кратковременных
процедур, таких как триисинизация, поможет умень-
шить частоту открывания инкубатора, используемого
д,1я открытых планшетов и клонирования.
Фунгициды. Облицованные изнутри медью инку-
баторы снижают рост грибов, но обычно они на 20—30%
дороже, чем обычные. Помещение медной фолы и в
поддон для воды также ингибирует' рост |рибов, но
только в лотке, и не защищает стенки инкубатора. Час-
то используют ряд противогрибковых агентов, среди
которых сульфат меди, рибофлавин, додецилсульфат
натрия (SDS) и 2%-й раствор специализированного
иротиво!рибкового детергента Roccall. Сравнение
колониеобразования в инкубаторах с и без Roccall
показало отсутствие токсического эффекта. Mhoi ие из
этих агентов являются детергентами, поэтому важно,
чтобы СО,или воздух не проходили через поддон с
водой, иначе жидкость будет цениться. Помните, фун-
। ицид будет только защищать поддон, не используйте
его для обычно| о мытья!
Мытье инкубаторов. Инкубатор следует pei улярно
мыть 10%-м Roccall или аналогичным нетоксичным
противогрибковым моющим средством. Частота мытья
зависит от расположения инкубатора; если он находится
в чистой зоне с фильтруемым воздухом, то мыть его
нужно ежемесячно. В сельской местности следует мыть
чаше, так как там больше спор. Чаше следует мыть и в
случае строительных работ или ремонта. Частота откры-
вания инкубатора также влияет на повышение контами-
нации грибами. В рабочем инкубаторе любые бры.я и не-
обходимо немедленно вытирать, а контаминированные
культуры удалять сразу же после обнаружения.
ПРОТОКОЛ 19.1. Обработка инкубаторов
Схема
Перенести культуры в запасной инкубатор, выклю-
чить пустой инкубатор, вымыть его детергентом и I
спиртом, включить нагрев и дать инкубатору вы-
сохнуть. Наполнить водой поддон и возобновить I
подачу СО2
Материалы
Нестерильные:
• 2%-й раствор Roccall или аналогично!о про- |
гивО| рибковщ о агента в воде для наполнения
поддона
• Запасной СО,-инкубатор или пластиковый кон-
тейнер и । ерметизирующая лента
• Детергент: 10% Roccall или другой иротивогрпб- ।
ковый детергент
• 70%-й спирт
354
ГЛАВА 19. КОНТАМИНАЦИЯ
Протокол
1. Перенесите все культуры в другой СО2-инкубатор
или поместите культуры в герметично закрыва-
ющийся контейнер (например, в эксикатор), за-
полните их СО, и поместите в обычный инкубатор
или термальную комнату
2. Отключите инкубатор, который будете мыть.
3. Выньте все полки, поддон для воды и съемные
панели инкубатора.
4. Вымойте внутреннюю камеру инкубатора раство-
ром детергента; постарайтесь промыть все углы и
зазоры.
5. Промойте водой.
6. Протрите внутреннюю камеру инкубатора 70%-м
спиртом.
7. Включите нагрев (но не С()2) и оставьте дверь
открытой до тех пор, пока камера не просохнет.
8. Вымойте полки и панели детергентом, промойте
водой и протрите 70%-м спиртом.
9. Поставьте на месго панели и колки в инкубаторе.
10. Поставьте на место поддон и заполните его сте-
рильной водой, содержащей 2%-й Roccall.
11. Закройте дверь и возобновите подачу СО2
12. Когда уровень температуры п СО,стабилизиру-
ется, верните культуры в инкубатор.
Если инкубатор имеет цикл стерилизации, он должен
быть включен после выполнения 9-го niai а.
19.1.5 . Холодильные камеры
В холодильниках и холодных комнатах также возмож-
но появление грибковой контаминации на стенках в
увлажненной атмосфере из-за возникновения кон-
денсата, образующегося каждый раз при открывании
двери и впускании влажного воздуха. Влажный воздух
повышает риск попадания спор на хранящиеся в холо-
дильнике бутыли; поэтому их необходимо протирать
сци|>1'ом перед внесением в ламинарный шкаф (см.
разд. 6.5). Холодильные камеры должны быть чистыми,
каждые несколько месяцев необходимо мыть стенки и
полки дезинфектантами.
19.1.6 . Стерильные материалы
Ни стерильный пластик, ни стерильные реагенты не
должны быть источником контаминации, если они
прошли соответствующий контроль качества в фирме-
производителе или у поставщика. Однако нарушение
стерильности может произойти, например, в случае
слишком плотной упаковки при загрузке в стери-
лизационный шкаф или автоклав, так как при том
образуются локальные участки недостаточно высокой
температуры, или при повреждении упаковки до или
в процессе хранения, или ири низкоуровневой конта-
минации, которая не была обнаружена цри проверке
качества продукта. Избежать этих непредвиденных
обстоятельств сложно, кроме как выполняя надлежа-
щие процедуры (см. разд. 11.6) и проверяя целостность
всех упаковок.
Критическим является момент появления новых
сотрудников в лаборатории культуры тканей, которые
мо1ут вносить изменения в процедуры стерилизации
(см. гл. 2, Упражнения 3—9), даже если они не будут
выполнять эти процедуры сами. Они также должны
быть осведомлены о различиях между стерильными и
нестерильными материалами и о местах их хранения
(см. разд. 2.2). Единичная ошибка нового сотрудника
может стать причиной ряда проблем, и может пройти
несколько дней, пока эта ошибка будет обнаружена.
19.1.7 . Привезенные клеточные линии
и биопсийные образцы
Так как линии клеток и образцы тканей, привезенные в
лабораторию культуры тканей, могут быть контамини-
рованы. полученные клетки должны быть помещены в
карантин (см. разд. 19.1.8) до тех пор, пока не выявится
контаминация, и только после лого полученные клетки
или их производные можно помещать в совместные
хранилища для общего использования (см. разд. 6.2.5).
Bcei да, koi да это возможно, все линии клеток необходи-
мо приобретать в банках клеток с хорошей репутацией,
в которых проводится скрининг на контаминацию.
Линии клеток из дру1 их источников, так же как и био-
псийный материал от человека или животных, должны
рассматриваться как контаминированные, пока не
будет доказано обратное.
19.1.8 . Карантин
Любая культура, заподозренная в наличии контами-
нации, и любой привнесенный непротестированный
материал должны быть помещены в карантин. Пред-
почтительно. чтобы для карантина была отведена отде-
льная комната с ламинарным шкафом и инкубатором,
но если ,-ло неосуществимо, можно использовать один
из ламинарных шкафов общего пользования. В этом
случае с подозрительным материалом следует рабо-
тать в конце рабочего дня, а после работы необходимо
опрыскать и вымыть все поверхности 70%-м спиртом,
с добавлением 2% фенол-содержащего дезинфектанта.
До следующего дня в этом ламинарном шкафу работать
не следует.
19.2. ВИДЫ МИКРОБНОЙ
КОНТАМИНАЦИИ
Культура клеток может быть контаминирована бакте-
риями. дрожжами, 1рпбами, микоплазмой и изредка
простейшими. Обычно род или вид инфекции не
19.3. Контроль контаминации
355
важны до тех пор, цока заражение не станет часто
повторяться. Необходимо только отметить общие виды
контаминаций (наиример, из бактерий - палочки и
кокки, дрожжи и т.д.), которые были обнаружены,
место, в котором с культурой последний раз работа-
ли, и имя оператора Если какой-то отдельный вид
инфекции часто повторяется, возможно, uo.ie.3HO
идентифицировать ее, для того чтобы найти причин}
возникновения. [Более подробно описание процедур
скриниша микробной контаминации описан в Euro-
pean Pharmacopoeia, 1980; United Slates Pharmacopeia,
1985, Doyle et al., 1990; Doyle & Bolton, 1994; and Hay
& Cour, 1997.J В целом, быстро растущие микроор
ганизмы являются меньшей проблемой, так как они
обычно ясно выражены и легко обнаруживаются,
после чего культура может быть отбракована. Слож-
ности возникают, koi да контаминация скрытая либо
потому, что микроор! анизмы слишком мелкие и их
нельзя увидеть в микроскоп, наиример микоплазма
пли медленнорастущие микроор!анизмы, которые
можно не обнаружить. Использование антибиотиков
может быть частой причиной скрытой контаминации,
оставшейся необнаруженной (см. разд. 9.4.7).
19.3. КОНТРОЛЬ КОНТАМИНАЦИИ
В табл. 19.1 приведены возможные источники конта-
минации, а также меры предосторожности, которые
необходимо предпринимать, чтобы избежать конта-
минации. Однако контаминация происходит даже в
лучших лабораториях, поэтому рекомендуется выпол-
нение следующих процедур:
1) Проверяйте наличие контаминации визуально и
с помощью микроскопа каждый раз при работе с
культурой. Раз в месяц тестируйте культуры на
микоплазму.
2) Если есть подозрение на то, что культура конта-
минирована, но нет подтверждения in situ, уберите
из ламинарно! о шкафа или со стола все, за исклю-
чением подозрительной культуры и контейнера
с Пастеровскими пинетками. Так как при этом
возникает риск для другох культур, лучше это
делать после окончания других культуральных
работ. Отберите из культуры образец и поместите
его на предметное стекло. Просмотрите стекло иод
микроскопом, желательно, с фазовым контрастом.
Если подтвердится предположение о том. что
культура контаминирована, выбросьте пинетки,
протрите ламинарный шкаф или стол 70%-м спир-
том, содержащим феноловый дезинфектант, и не
пользуйтесь ламинарным шкафом или столом до
следующей) дня.
3) Pei истрируйте характер контаминации.
4) Если контаминация новая и не распространилась
на другое культуры, выбросьте культуру, исполь-
зуемую бутыль со средой и другое реактивы (на-
иример, трипсин), которые использовались ири
работе с культурой. Поместите все эти предметы в
дезинфектант, желательно, в вытяжной шкаф и вне
зоны работы с культурой ющток.
5) Если контаминация новая и широкорасиространен-
ная (а именно, но крайней мере, на две различные
культуры), выбросьте все среды, исходные раство-
ры, трипсин и т.д.
6) Если ранее уже происходила контаминация такого
же типа, проверьте на контаминацию исходные
растворы а) путем инкубации растворов отдельно
или в питательном бульоне (см. разд. 11.6.2 и цв.
вкладку 16г) или б) поместив раствор в питатель-
ную агоризованную среду (Oxoid, Difco). Если
результаты (а) и (б) отрицательные, но подозрение
на контаминацию все еще есть, проинкубируйте
100 мл раствора, профильтруйте его через фильтр
с размером пор 0.2 мкм и поместите фильтр в пита-
тельную агоризованнуш среду.
7) Если контаминация широко распространена,
мульгиспецифична и повторяется, проверьте
а) процедуру стерилизации (например, температуру
стерилизационных шкафов и автоклавов, особенно
в середине процесса стерилизации), б) правила
упаковки и хранения (наиример, негорметично
закрытую стеклянную посуду следует заново сте-
рилизовать каждые 24 ч) ив) целостность чистой
комнаты и фильтров ламинарно! о шкафа.
8) Неделайте попыток лечить кон шминированные куль-
туры, если они не являются невосстановимыми.
19.3.1. Визуально определяемая
микробная контаминация
Характерные признаки микробной контаминации:
1) Внезапные изменения pH. pH обычно снижается
в большинстве случаев бактериальной инфекции
(цв. вкладка 16а), мало изменяется при дрожжевой
контаминации (цв. вкладка 16»), цока контамина-
ция не станет очень сильной, и иногда повышается
ири контаминации грибами.
2) Помутнение среды (см. цв. вкладки 16а—в), ин<)1да
тонкая пленка или иена на поверхности, или пятна
на ростовой поверхности, которые исчезают, ко|да
флакон встряхивают (цв. вкладка 166).
3) Под микроскопом при малом увеличении (~х100)
в пространстве между клетками видны мерцаю-
щие 1ранулы, которые мО|ут быть бактериями
(рис. 19.1а). Дрожжи представляют собой отдель-
ные кру|лые или овальные частицы, от которых
могут отпочковываться более мелкие частицы
(рис. 19.16). Грибы образуют тонкие нити мицелия
(рис. 19.1в) и инО|да плотные скопления спор.
В случае токсичной инфекции наблюдается неко-
торое ухудшение состояния клеток
4) Под микроскопом при большом увеличении (~х4()0)
можно рассмотреть индивидуальные бактерии и
различить палочки и кокки. При ;>том увеличении
видно, что причиной мерцания, наблюдаемого при
некоторых инфекциях, является движение бакте-
356
ГЛАВА 19. КОНТАМИНАЦИЯ
Рис. 19.1. Типы контаминации. Примеры микрооршнизмов, обнаруженных в контаминированных культурах клеюк (с) Бак-
терии (6) Дрожжи (в) Мицс шй гриба (г) Колонии микоплазмы, растущие в специальном цитате 1ьном агаре (Э-е) Фотогра-
фии, сделанные с помощью сканирующего электронного микроскопа, микоплазмы, растущей на поверхности культивируемых
клеюк (г-e, любезно предоставлены Dr. М Gabndge, а-в. объектив 10х) (микоплазму, окрашенную Hoechst 33258 см на
цв. вкладке 16Э, в)
рий. Некоторые бактерии образуют скопления или
ассоциаты с культивируемыми клетками.
5) Сделав препарат на стекле, можно исследовать
морфоло! ию бактерии при увеличении xlOOO, но
обычно в этом нет необходимости. Бактериальную
инфекцию можно спутать с выпавшими в осадок
компонентам и среды и с клеточным дебриепм,
но она отличается ре|улярн»й морфолотей.
Преципитаты могут быть кристаллическими или
глобулярными или неправильной формы и раз-
ного размера. Скопления бактерий можно спутать
с выпавшими белками, но mhoi о отдельных или
соединенных в цепочки бактерий можно увидеть,
особенно при встряхивании. Если вы сомневаетесь,
поместите образец среды в питательный aiap (см.
разд. 11.6.2).
19.3. Контроль контаминации
357
19.3.2. Микоплазма
Наличие заражения микоплазмой (рис. 19.1г—е) нельзя
определить с помощью обычной микроскопии, увидеть
можно только ухудшение состояния культуры. Для
детекции микоплазмы требуется применение методов
флюоресцентного окрашивания, ПЦР, И ФА, иммуно-
окрашивания, авторадио! рафии или микробиологи-
ческие исследования. Флюоресцентное окрашивание
ДНК красителем Hoechst 33258 [Chen, 1977] является
самым простым и наиболее достоверным методом (см.
протокол 19.2) и позволяет выявить микоплазменную
инфекцию в виде окрашенных мелких частиц или ни-
тей на поверхности цитоплазмы при увеличении х500
(цв. вкладка 16<9, е). Ядро культивируемых клеток при
использовании этого метода тоже ярко окрашено, что
является положительным контролем ири использо-
вании лого метода. Большинство друt их бактерий
тоже выявляется при флюоресцентном окрашивании,
таким образом можно определить наличие инфекции
при низком уровне контаминации или выявить при-
сутствие очень мелких микроортанизмов, таких как
микрококки.
ПРОТОКОЛ 19.2. Выявление микоплазмы
методом флюоресценции
Схема
Культивировать клетки без антибиотиков не менее
недели, внести среду из супернатанта клеткам ин-
дикаторной культуры, находящимся в начале лота-
рифмической фазы роста, инкубировать 3—5 дней,
зафиксировать и окрасить клетки, искать флюорес-
ценцию вне ядра.
Материалы
Стерильные или приготовленные
в асептических условиях:
• Среда из супернатанта, без антибиотиков, пос-
ле культивирования клеток в течение 7 дней в
монослое или после центрифу! ирования суспен-
зионной культуры
• Индикаторные клетки (например, ЗТ6, NRK,
Veto, А549)
• Чашки Петри диаметром 6 см
Нестерильные:
• Краситель Hoechst 33258, 50 нг/мл в BSS без
фенолового красного (BSS-PR) или D-PBSA
• BSS-PR: BSS Ханкса без фенолового кр^снш о
• D-PBSA: PBS Дюльбекко без Са и Mg
• Деионизованная вода
• Фиксатор: свежеприготовленный метанол-уксус-
ная кислота (3:1, на льду)
• Забуференная t лицериновая среда для заключе-
ния препарата (см. Приложение I. Peat енты для
определения микоплазмы)
Протокол
1. Посейте индикаторные клетки в чашки Петр и без
антибиотиков таким образом, чтобы конфлюэнт-
ность чер^з 4—5 дней составила 50 60% (напри- ।
мер, 2x10 NRK или 1x10 А549 в 5 мл среды).
2. Добавьте 1,5 мл среды из тестируемой культуры.
3. Инкубируйте культуру до достижения 50—60% I
КОнфлЮЗНТНОСТИ
Примечание. К моменту фиксации культура не |
должна достигать конфлюэнтности, иначе окраши- '
вание будет подавляться и дальнейшая визуализация |
микоплазмы будет ухудшена.
4. Удалите среду
5. Промойте монослой BSS-PR и чи D-PBSA и уда- I
лите промывочный раствор.
6. Добавьте свежий BSS-PR или D-PBSA разве
денный 50.50 фиксатором, промойте монослой,
удалите промывочный раствор.
7. Добавьте чистый фиксатор, промойте, удалите
раствор.
8. Добавьт е свежий фиксатор (-0,5 мл см2) и с]>ик I
СИруйте 10 мин.
9. Удалите фиксатор.
10. Полностью высушите монослой, если он вредна- |
значен для хранения. (Образцы можно собирать
на .ной стадии, а окрашивать позднее.)
11. Если вы собираетесь далее проводить окраши
вание, смойте фиксатор деионизованной водой I
и удалите промывочный раствор.
12. Добавьте Hoechst 33258 в BSS-PR или D-PBSA и I
окрашивайте 10 мин при комнат ной т емпературе. |
13. Удалите краситель.
14. Промойте монослой водой и удалите промывоч-
ный раствор.
15. Заключите иод покровное стекло в кайле забуфе- I
ренной t лицериновой среды и удалите излишек
с краев покровною стекла.
16. Анализируйте флюоресценцию монислоя, ие-
пользуя фильтр возбуждения 330/380 нм и ба- I
рьерный фильтр LP 440 нм
Важно принимат ь во внимание то обстоятельство,
что микоплазмы невежда обнаруживают свое присут-
ствие. влияя на состояние клеток или среды. Mhoi ие
микоплазмы, особенно в постоянных клеточных
линиях, растут медленно и не повреждают клетку-
хозяина. Однако они могут влиять на метаболизм
культуры различными способами. Так как микоилазмы
потребляют тимидин из среды, в инфицированных
культурах наблюдается аномальный уровень включе-
ния [ Н]-тимидина (см. рис. 27.2). Иммунолш ические
исследован ия также moi ут не дать нужного результата
ири контаминации микоплазмой, так как вместо по-
лучения антител к поверхностным антигенам клетки,
получают антитела к белкам микоилазмы. Миконлаз-
358
ГЛАВА 19. КОНТАМИНАЦИЯ
мы мог ут влиять на поведение и метаболизм клеток и
многими другими путями [McGarrity, 1982; Doyle el
al., 1990, Izulsu el al., 1996; Dorazio el al., 1996; Giron el
al., 1996; Paddenbergelal., 1996], поэтому абсолютным
требованием при проведении рутинных периодических
анализов является проверка возможности контами-
нации всех культур клеток, особенно постоянных
клеточных линии.
Контроль культур на микоплазмы. Внешние
признаки хронической микоплазменной инфекции
включают снижение скорости пролиферации клеток,
снижение насыщающей плотности [Slanbridge &
Doersen, 1978] и слипание клеток при культивирова-
нии в суспензии [Giron el al., 1996]. Острая инфекция
приводит к общей деградации клеток, при этом могут
оставаться несколько устойчивых колоний, хотя эти
клетки и выросшие из них линии совсем необязательно
свободны от контаминации, они могут быть хронически
инфицированы.
19.3.3. Окрашивание микоплазмы
флюоресцентными красителями
Культуры окрашивают флюоресцентным красителем
Hoechsl 33258, который специфично связывается с
ДНК [Chen, 1977]. Так как микоплазмы содержат
ДНК, их можно лет ко обнаружить но характерным
флюоресцирующим частицам или нитям на поверх-
ности клеток и, в случае обширной контаминации, в
окружающих областях. Монослойные культуры клеток
можно зафиксировать и окрасить непосредственно.
При исследовании клеток, растущих в суспензии, после
центрифугирования суспензии, культуральную среду
добавляют к индикаторным клеткам (т.е. к другой мо-
нослойной культуре), гарантированно не зараженным
микоплазмой, но являющимся хорошими клетками-
хозяевами для микоплазмы и хорошо распластанными
в культуре, что позволяет обнаружить присоединившу-
юся к клеткам микоплазму. Для этого подходят клетки
Vero, ЗТ6, NRK и А549.
Использование индикаторных клеток рекомендует-
ся в нижеследующем протоколе, так как это помогает
избежать проблем с ложно позитивными результатами,
возникающими из-за дебриса при анализе, проводимом
сразу после размораживания клеток или в первичных
культурах. В случае большого количества дебриса среду
можно профильтровать через стерильный фильтр с раз-
мером пор 5 мкм пли отцентрифугировать upu 100 g.
Анализ. Исследуйте внеядерную флюоресценцию.
Микоплазма проявляется в виде флюоресцентных
точек или нитей над цитоплазмой гг, иногда, в межкле-
точном пространстве (см. цв. вкладку 16J. е). Точки гго
размеру близки к пределу разрешающей способности
50х объектива (0,1 1,0 мкм) и обычно имеют одинако-
вые размеры и форму. Не обязательно все клетки будут
инфицированы, поэтому необходимо просмотреть как
можно больше ггреггаратов перед тем, как утверждать,
что культура не инфицирована.
Причиной иногда наблюдающегося слабого од-
нородного окрашивания цитоплазмы, ио-видимому,
является РНК. Эта флюоресценция имеет тенденцию
ослабевать при хранении препарата и при исследовании
на следующий день (после хранения в сухом и прохлад-
ном месте) обычно не обнаруживается. Этот артефакт
никогда не выглядит как характерные для микоплазмы
точки или нити и легко может быть расггознан при
некотором опыте наблюдений.
Если имеются какие-либо сомнения в интерпре-
тации флюоресцентного теста, его следует повторить
после следующего пассажа тестируемых клеток в
отсутствие антибиотиков. Если результаты остаются
неясными, следует применить друг ой метод, такой как
ПЦР илгг ИФА.
19.3.4. Использование ПЦР
для детекции микоплазм
Следующий протокол гг введение предоставлены Cord
С. Uphoff и Hans G. Drexler (DSMZ, Braunschweig,
Germany)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является
очень чувствительным и специфичным методом для
прямого определения микоплазмы в культуре клеток
при низких затратах труда, времени и средств. Метод
отличается простотой, объективностью интерпретации,
воспроизводимостью и документальной обоснован-
ностью результатов. Оггубл и кованы праймеры как
для обычной, так гг для гнездной ПЦР, с узкой или
широкой специфичностью, ajih микоплазм и различных
видов эубактерий. В большинстве случаев в качестве
мишени используется последовательность 168рДНК,
так как этот гон содержит области с более или менее
консервативными последовательностями. Этот ген
также дает возможность проведения ПЦР с 16S рДНК
или ОТ-ПЦР (ПЦР с использованием обратной транс-
криптазы) с кДНК 16S рРНК.
Здесь мы описываем, какая смесь олигонуклеотидов
используется для специфического определения мико-
плазм. Этот подход значительно снижает вероятность
получения ложногголожительных результатов из-за
возможной контаминацигг растворов, используемых
при подготовке образцов и для проведения ПЦР, и из
друг их материалов, в которые из воздуха могут попасть
бактерии. Одной из основных проблем, связанных с
проведением ПЦР образцов из культур клеток, явля-
ется несггецифическое инг ибнровангге Та^-полимера-
зы. Для удаления этих инг ггбиторов мы рекомендуем
обязательно экстрагировать и очищать образцы ДНК
с помощью стандартной фенол-хлороформ ной экс-
тракции или с ггомощью соответствующей колонки
или носителя.
Для подтверждения правильности приготовления
образцов и проведения ПЦР необходимо включать
при проведении ПЦРсоответствующие контроли. Они
19.3. Контроль контаминации
359
включают внутренний контроль ДН К для каждого об-
разца и параллельно положительный и отрицательный
контрили, а также контроль воды. Внутренний конт-
роль состоит из фра! мента Д Н К с теми же праймерам и
для амплификации, но с отличающимся от ампликона
содержащих микоплазму образцов размером. Этот
контроль ДНК добавляется в смесь для ПЦР в опре-
деленном заранее предельном разведении для демон-
страции чувствительности ПЦР
ПРОТОКОЛ 19.3. Выявление микоплазмы
с помощью ПЦР
Материалы
• D-PBSA (фосфатно-солевой раствор): 1.37 мМ
NaCI, 2,7 мМ КС1, 8,1 мМ Na2HPO4, 1,5 мМ
КН2РО4, pH 7,2. Автоклавировать 20 мин нри
121 'С для стерилизации раствора.
• ТАЕ (Трис, уксусная кислота, ЭДТА), 50х: 2 М
Трис. 5,71% ледяная уксусная кислота (ио объе-
му), 100 мМ ЭДТА. Довести pH до 8,5
• Система для экстракции и очистки ДНК, напри-
мер фенол хлороформная экстракция и осажде-
ние этанолом или набор для экстракции ДНК с
применением ДНК-связывающих матриц
• Амилификатор
• Taq ДНК-иолимераза
• Реакционный буфер 6х: 0,09% (вес обьем) бро-
мфеноловый синий, 0,09% (w, v) ксилол цианол
FF, 60% tлииерин (v • у), 60 мМ ЭДТА.
• Праймеры (от любого производителя):
5' праймеры (Мусо—5').
cgc cig agt agi acg iwc gc
tgc cig rgt agt аса tic gc
cgc cig agt agt atg etc gc
cgc cig ggl agt аса tic gc
3' праймеры (Муси-3’):
geg gig Igl аса ага ccc ga
geg gig Igl аса aac ccc ga
(г - смесь g и а;
w — смесь i и а)
Исходные растворы праймеров 100 мкМ в дис-
тиллированной воде, хранить замороженными ири
—20 °C. Рабочие растворы: смесь прямых прайме-
ров но 5 мкМ каждою (Мусо—5) и смесь обратных
праймеров но 5 мкМ каждого ( Мусо—3) в Н ,О диет,
аликвотировать но 25—50 мкл и хранить заморожен-
ными нри 20 °C.
• Внутренний контроль ДНК: Внутренний конт-
роль приготовить, как описано [Uplioff & Drexler.
2002]. Предельное разведение должно быть оп-
ределено экспериментально проведением ПЦР с
серией разведений внутреннего контроля ДНК.
• Положительный контроль ДНК: 10-кратное
разведение любою положительного на присут- I
ствне микоплазмы образца, приготовленного как |
описано выше.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов(<]КТРп1>х):
смесь содержиз дезоксиаденозин трифосфат
(tlATP), дезоксицитидин трифосфат (<1СТР),
дезокст уанозиитрнфосфат (dGTP) и дезок-
ситпмидин грифосфат (tlTTP) в концентрации
5 мкМ в Н2О диет., хранить аликвоты ио 50 мкл
ири 20 °C.
Гель агарозный 1?3%-ТАЕ
Протокол
А. Сбор образцов и приготовление ДНК.
1. Перед сбором образцов клеточные линии, тести-
руемые на присутствие микоплазмы, необходимо ।
несколько дней культ ивировать без антибиоти- ।
ков, а после разморозки не менее двух недель. |
Это обеспечит титр микоплазм в среде из суперна- ।
ганта, достаточный для обнаружен ия с помощью |
ПЦР анализа.
2. Соберите 1 мл среды из супернатанта прикреп-
ляющихся клеток или после осаждения су с-
иензионных клеток. Собранные таким образом
образцы будут содержать некоторое количество
живых или мертвых клеток, что является мреиму- ।
ществом, так как некоторые штаммы микоплазм I
в основном прикреплены к эукариотическим
клеткам или даже проникают внутрь них. Среду I
из супернатанта следует хранить при 4 °C в те- ।
чение нескольких дней или при —20 °C в течение
нескольких недель. После ра<морозки образцы |
можно нспользова-! ь немедленно. .
3. Среду из супернатанта центрифугируйте при
1.3 000 g 5 мин, осадок ресусиендируйте в 1мл
D-PBSA путем перемешивания на вортексе.
4. Суспензию еще раз центрифу! ируйте и промойте |
еще раз D-PBSA, как описано в нункте.З.
5. После центрифу! ирования ресусиендируйте оса- ।
док в 100 мкл D-PBSA путем перемешивания на
вортексе и затем 15 мин нагревайте при 95 °C.
6. После лизиса клеток немедленно экстра! ируйте
ДНК и очищайте стандартным методом фенол/
хлороформной экстракции и преципитации эта-
нолом или дру! ими методами.
В. ПЦР-реакция
Следует строп» выполнять правила, установленные
для проведения ПЦР, предотвращающие перенос
ДНК’ (!) экстракцию ДНК, проведение ПЦР реак-
ции и электрофорез следует выполнять в местах,
отделенных дру! от apyia; (ii) все реаюнты необ-
ходимо хранить в малых количествах для того,
чтобы обеспечить постоянный источник незара-
женных реагентов., (iii) избщаите реамилификаций;
(iv) запасные пипетки, наконечники и пробирки
должны использоваться только для ПЦР, цииетки
360
ГЛАВА 19. КОНТАМИНАЦИЯ
необходимо часто облучигь ультрафиолетом; (у) ио-
рядок проведения ПЦР, описанный ниже, необхо-
димо выполнять точно; (vi) ири приготовлении об-
разцов и проведении ПЦР необходимо использовать
перчатки; (vii) включайте надлежащие контроли,
такие как внутренний, положительный, отрицатель-
ный и контроль воды.
1 Поставьте каждый тестируемый образец на две
реакции со следующими растворами. Только
образец: 1 мкл tlNTPs, 1 мкл Мусо-5,1 мм
Мусо-3, 1,5 мкл 10х PCR буфера, 9,5 мкл Н2О
диет.. Образец и внутренний стандарт ДНК: 1 мкл
dNTPs, 1 мкл Мусо-5,1 мкл Мусо-3,1,5 мкл 10х
PCR buffer, 8,5 мкл Н,О дттст.. 1 мкл внутренний
контроль ДНК. Смешайте исходные растворы
для кратного количества образцов, три образца
для реакции без внутреннего контроля ДНК (для
положительного, отрицательного контролей и
контроля воды) и два для внутреннего контроля
ДНК для положительного и отрицательного кон-
тролей, плюс излишек для нинетирования.
2 Поместите 14 мкл каждого предварительно
смешанного исходно! о раствора в реакционные
пробирки на 0.2 мл и добавьте 1 мкл Н ,О диет, к
водному контролю.
3 П риг отовьте смесь Taq Д Н К-оолимеразы (10 мкл
на реакцию плюс 1 дополнительная реакция -
поправка на иииетирование), содержащую 1х
ПЦР буфер и 1 U Taq полимеразы на реакцию.
4 Уберите все реагенты, используемые для приго-
товления предварительных исходных растворов.
5 Возьмите тестируемые обращы ДНК и поло-
жительный контроль ДНК. Не держите в руках
реагенты и образцы одновременно.
6 Добавьте 1 мкл препарата ДНК в одну реакци-
онную пробирку, не содержащую внутренний
контроль ДНК, и в одну пробирку, содержащую
внутренний контроль ДНК.
7 Для запуска ПЦР перенесите реакционные смеси
(без Taq полимеразы) в амплификатор и запус-
тите 1 цикл со следующими параметрами: шаг 1:
7 мин при 95 °C, шаг 2: 3 мин при 72 °C, шаг 3:
2 мин при 65 °C, шаг 4:5 мин при 72 °C.
Во время шага 2 откройте крышку и добавьте
10 мкл Taq полимеразы в каждую пробирку. Для
многих образцов продолжительность этого этапа
может быть увеличена. Открывайте и закрывайте
каждую пробирку но отдельности, чтобы избежать
испарения образцов. Подождите не менее 30 с после
добавления Taq полимеразы в последнюю пробирку,
перед тем как закрыть крышку амплифнкатора для
того, чтобы температура во всех пробирках урав-
новесилась и удалился конденсат с крышки перед
продолжением следующего шаг а цикла.
8 После этого инициирующего цикла выполните
32 цикла нагревания со следующими параметра-
ми, шаг 1:4 с при 95 °C, шаг 2:8 с при 72 °C, шаг 3
16 с при 72 сС плюс 1 с дополнительного времени
в течение каждого цикла.
9 Закончите реакцию последним шагом амплифи-
кации при 72 °C 10 мини затем охладите образцы
до комнатной температуры.
10. Приготовьте 1,3% агароза-ТАЕ гель, содержащий
0,3 мкг мл бромистого этидия. Погрузите гель в
IxTAE и добавьте 12 мкл амплифицированного
продукта (10 мкл реакционной смеси плюс 2 мкл
6х буфера для нанесения) на каждую дорожку и
проводите электрофорез при 10 V см.
11. Визуализируйте специфические продукты с
помощью освещения соответствующей лампой
и задокументируйте результаты.
Интерпретация результатов
1) В идеале, все образцы, содержащие внутренний
контроль ДНК, демонстрируют полосу в 986 Ьр.
Если вторая дорожка показывает отсутствие полос
образца и внутреннего контроля, всю процедуру
необходимо повторить.
2 ) Положительные но микоплазме образцы дают поло-
су в 502-520 пн, в зависимости от вида микоплазмы
(рис. 19.2)
3) При контаминации реагентов специфической ДНК
микоплазмы или ПЦР-нродуктом появляется
полоса в контроле воды и или в образце с отри-
цательным контролем. Слабые специфичные для
микоилазмы полосы дают инфицированные куль-
туры клеток, обработанные антимикоплазменными
агентами или ггри постоянном применении других
антибиотиков. В этих случаях положительную
Рис. 19.2. Детекция микоплазмы с помищью ПЦР. Флюо-
ресценция бромистого этидия ПЦР-лродуктов инфициро-
ванных. неннфицированных и контрольных клеток после
элскгрпфорсза в 1.3?;,-й агарозе ДНК-стандарты. 100, 200.
300.400.500 (сильно окрашенная полоса), 600,700,800.900,
1031, 1200,1500. 2000 и 3000 пн Полосы микоилазмы око-
ло 510 пн Полоса внутреннего контроля- почти 1000пн.
(С ,тюбезного разрешения Cord Uphoff, DSMZ.)
19.4. Устранение контаминации
361
реакцию дает как остаточная ДНК в культураль-
ной среде из мертвых клеток микоплазмы, так и
устойчивые к антибиотикам клетки микоплазмы с
очень низким титром
19.3.5. Альтернативные методы детекции
микоплазмы
Биохимические. Для детекции микоплазменной ин-
фекции мотут быть использованы методы определения
специфичных для микоплазмы ферментов, таких как
артцниндезаминаза или нуклеозидфосфорилаза [ел.
Schneider & Slanbridge, 1975; Levine & Becker, 1977].
На этом основан тест по определению токсичности
6-метилнуриндезоксирибозида (Mycotecl. Invilrogen)
Микробиологический. Этот очень чувствительный
метод широко распространен при проведении конт-
роля качества и процедур валидации. Однако он может
быть использован только при наличии специального
оборудования и соответствующей экспериментальной
базы в микробиолот ии, так как эти микроорт анизмы
чрезвычайно привередливы. Кроме того, необходи-
мо культивировать живую микоплазму в качестве
положительною контроля. Культивируемые клетки
высеваются в питательный бульон для микоплазмы
[Doyle el al., 1990]. выращивают 6 дней, после чего
их высевают в специальный питательный aiap [Нау,
2000]. Колонии, образовавшиеся через 8 дней, можно
распознать ио размеру (-200 мкм в диаметре) и ха-
рактерной морфолог ии «яичницы-глазуньи». - плот-
ный центр с более светлой периферией (рис. 19.1г).
Коммерческие наборы для микробиоло! и ческою
определения микоплазмы (Му cot rim) можно купить
в «Irvine Scientific».
Хотя культивирование в селективных условиях
и исследование морфологии колоний не дают воз-
можности идентифицировать виды микоплазмы,
микробиологический метод занимает много времени
и более трудоемок по сравнению с флюоресцентным
окрашиванием. Тестирование микоплазмы в микроби-
олог ической культуре является полезным методом (см.
Приложение II). Специфические моноклональные ан-
титела в настоящее время позволяют характеризовать
микоплазменную инфекцию.
Молекулярная гибридизация Молекулярные
пробы, специфичные для ДНК микоплазмы, можно
использовать в Соузерн-блот анализе для детекции ин-
фекции с помощью стандартного метода молекулярной
1 ибридизации. Доступен набор для простого односта-
дийного выделения гибридной ДНК с последующей
детекцией с помощью измерения сцинтилляционным
методом (GenProbe. Fisher Scientific).
з
Включение [ HJ-тимидина. Одним из методов,
который чрезвычайно успешно используется, является
авторадиография с использованием [ Н]-тимидина
[Nardone et al., 1965]. Культуру инкубируют в течение
ночи с 4 К Бк/мл (-0,1 мкКи мл) [ Н]-тимидина с вы-
сокой удельной активностью. Далее получают автограф
(см. протокол 27.3). Зерна над цитоплазмой являются
индикатором контаминации (см. рис. 27.2), которая
может сопровождаться снижением включения метки
в ядро из-за поглощения тимидина микоплазмой на
клеточной поверхности.
19.3.6. Вирусная контаминация
Привнесенные клетки, продукты естественного
происхождения, присутствующие в среде, такие как
сыворотка, и ферменты, такие как трипсин, исполь-
зуемые для субкультивирования, являются потен-
циальными нсгочниками вирусной контаминации.
Ряд реагентов проходят проверку у производителя
на присутствие ограниченного количества вирусов.
Также предполагают, что крупные вирусы задержи-
ваются при фильтрации. Но в настоящее время нет
способов избавиться от вирусной контаминации. Луч-
шим способом избежать ее является гарантия в том,
что продукт получен от не зараженных известными
вирусными заболеваниями животных. Для этот о вам
необходимо полагаться на контроль качества выпол-
ненный поставщиком.
Детекция вирусной контаминации. По-видимому,
лучшим способом определения вирусной инфекции
является проверка с использованием панели антител
методом иммуноокрашивания (см. протокол 16.11)
или ИФА. Альтернативным методом является ПЦР
с подбором соответствующих вирусных праймеров.
Некоторые коммерческие фирмы (BioReliance) пред-
лагают услугу проверки или тестирования на вирусы.
19.4. УСТРАНЕНИЕ КОНТАМИНАЦИИ
19.4.1. Бактерии, грибы и дрожжи
Наиболее надежный способ избавиться от микробной
контаминации - это выбросить культуру и использо-
вавшиеся среду и реагенты, так как лечение культуры
может быть неэффективным и привести к развитию
резистентных к антибиотикам микроорганизмов. По-
пытки деконтаминации должны проводиться только в
экстремальных ситуациях, в карантине и под руковод-
ством эксперта. В случае неудачи культуру и использу-
емые реагенты следует ироавтоклавировать сразу после
того, как неудача станет очевидной
Общим правилом, которое должно выполняться
для контаминированных культур, является отбра-
ковка этих культур. Деконтаминацию следует прово-
дить только в случае жизненной необходимости для
сохранения линии клеток В любом случае, полной
деконтаминации трудно добиться, особенно при за-
ражении дрожжами, и при попытках достичь этого
362
ГЛАВА 19. КОНТАМИНАЦИЯ
можно получить более устойчивые, резистентные к
антибиотикам штаммы.
19.4.2. Устранение микоплазмы
Если в культуре обнаружена микоплазма, выполняется
первое и главное правило для всех форм контамина-
ции культура должна быть отбракована, проавтп-
клавированаили сожжена. Б исключительных случаях
(например, если контаминированная линия незаме-
нима) можно попытаться провести деконтаминацию
кул ьтуры. Деконтаминацию должен проводить гол ько
опытный оператор, и работа должна выполняться в
условиях карантина.
Против микоплазмы аффективны некоторые агенты
к числу которых относятся канамицмн, гентамицин,
тилозин [Friend et al., 1966], полианетол сульфонат
[Mardh, 1975] и 5-бромурацил в сочетании с Hoechst
33258 и облучением ультрафиолетом [Marcus et al.,
1980]. В некоторых случаях moi ут быть эффективны ко-
культивпрование клеток с макрофа! ами [Schinnnelpfeng
el al., 1968], пассирование в животных [Van Diggeleti
etal., 1977] и введение цитотоксических антител [Pol-
lock & Кеппу, 1963]. Однако наиболее эффективными
агентами являются тилозин (MP Biomedicals), Агент
для удаления микоплазмы (Mycoplasma Removal Agent,
MRA, также производства MP Bioinedicals) [Drexler el
al., 1994], ципрофлоксацин (Bayer) [Mowles, 1988; Hhi-
binovaet al., 1994] u ВМ-цикдин (BM-Cycline, Roche).
Контаминированные культуры необходимо обраба-
тывать в соответствии с протоколом 19.3 с использова-
нием MRA, ВМ-циклина пли тплозинав концентраци-
ях, рекомендованных фирмой-производителем вместо
обычных антибиотиков в DBSS и культуральной среде.
Однако эти операции необходимо проводить только в
случае крайней необходимости, и даже при этом выпол-
нять их должен опытный специалист в изолированном
месте работы [Uphoff & Drexler 2004]. Гораздо безопас-
ней уничтожитьинфицированные культуры.
ПРОТОКОЛ 19.4. Ликвидация микробной
контаминации
Схема
Обработать культуру несколько раз антибиотиками
в высокой концентрации, промывая монослой или
центрифугируя и ресуспендируя суспензионные
клетки. Затем культивировать три пассажа с анти-
биотиками и три пассажа без. Проверять на конта-
минацию после каждого пассажа
Материалы
Стерильные:
• DBSS (см. Приложение I: BSS для препариро-
вания)
• Среда с высоким содержанием антибиотика (см.
Приложение I: Ассортимент сред и табл. 9.4; для
микоплазмы см. разд. 19.4.2)
Материалы для субкультивирования (см. про-
токол 13.2)
Нестерильные.
Микроскоп, предпочтительно с фазово-контраст-
ными объективами 4Ох и ЮОх
Материалы для окрашивания микоплазмы (см.
протокол 19.2)
Протокол
1. Аккуратно отберите контаминированную среду.
Если возможно, протестируйте микроорганизмы
на чувствительность к набору индивидуальных
антибиотиков. Если нет проавтоклавируйте
среду или добавьте i ииохлорит (см. разд. 7.8.5).
2 Промойте клетки DBSS (разведение может сни-
зить количество контаминантов на два порядка
после каждой промывки, если только они не
прикрепились к клеткам):
а) Для монослой ных культур: промойте три раза
DBSS, триисинизируйте и промойте клетки
дважды или более DBSS путем центрифу! и-
рования и ресусиендирования.
б) Для суспензионных культур: промойте пять
раз DBSS путем центрифу] ирования и ресус-
иендирования.
3. Посейте клетки в новый флакон в самой низкой
допустимой концентраци и.
4. Добавьте среду с высоким содержанием антиби-
отика и меняйте ее каждые 2 дня.
5. Пассируйте клетки в среде с высоким содержа-
нием антибиотика.
6. Повторяйте этапы 1—4 в течение трех пассажей.
7. Удалите антибиотики и культивируйте клетки
без них следующие три иассажа
8. Проверьте культуры с помощью фазово-контраст-
ной микроскопии и окрашивания Hoechst (см.
протокол 19.2).
9 Культивируйте клетки в течение следующих двух
месяцев без антибиотиков, проверяйте клетки
для тоге, чтобы быть уверенным в элиминации
контаминации (см. разд. 11.6.2).
19.4.3 . Устранение вирусной контаминации
Надежных методов элиминации вирусов из культуры
в настоящее время не существует; остается только либо
уничтожить культуру либо смириться с наличием
вирусов
19.4.4 . Персистирующая контаминация
Мно< ие лаборатории страдают от периодической конта-
минации, которая производит впечатление устойчи вой
19.6. Заключение
363
ко всем средствам защиты, предложенным в табл. 19.1.
Простого решения этой проблемы нет, кроме как сле-
довать указанным ранее рекомендациям с использова-
нием лО1 ических и аналитических методов, обращать
особое внимание на изменения в методиках, работу
новых сотрудников, новых поставщиков, новое обору-
дование и неправильное обслуживание ламинарных
шкафов или другого оборудования. Обычно уровень
контаминации повышается ири нарушении асептичес-
кой техники, увеличении количества спор в воздухе,
плохом обслуживании инкубаторов, контаминации в
холодильнике или холодной комнате или дефекты в
работе стерилизационного шкафа или автоклава (либо
неправильная закладка стерилизуемых предметов, либо
нарушение контроля стерилизационного цикла)
Постоянное использование антибиотиков также
способствует развитию хронической контаминации.
Антибиотики иншбируют размножение mhoiих мик-
poopt анизмов, но не убивают их. MttKpoopt анизмы
будут сохраняться в культуре, оставаясь необнару-
женными в течение долгого времени, но периодически,
ири смене условий культивирования, проявляться.
Необходимо культивировать клетки в среде без ан-
тибиотиков, во крайней мере, хотя бы часть времени
(см. рис 13.6), а желательно постоянно; в противном
случае скрытая контаминация будет персистировать,
ее происхождение будет трудно установить и изба-
виться от нее будет невозможно.
Небольшие изменения в методиках, появление
новых сотрудников или увеличение объема работ,
сопровождающееся работой на одном оборудовании
и с одними и теми же материалами большего числа
сотрудников, - все это может влия гь на повышение
уровня контаминации. Процедуры необходимо веет да
строго выполнять, даже если их значение не всегда
ясно для оператора и изменения в рутинной работе не
должны происходить ио небрежности. Если методики
строго выполняются, от контаминации, может быть,
и не удастся полностью избавиться, но вероятность
ее появления будет снижена и контаминация будет
быстро обнаружена
19.5. ПЕРЕКРЕСТНАЯ КОНТАМИНАЦИЯ
С развитием методов культивирования клеток поя-
вились линии клеток с коротким временем удвоения
популяции и высокой эффективностью посева. Хотя
эти свойства делают такие клеточные линии удобными
для экспериментальной работы, они также создают
потенциальную опасность для перекрестного инфи-
цирования такими клетками дру| их клеточных линий
[Nelson-Rees & Flandermeyer, 1997; Lavappa, 1978; Nel-
son-Rees et al., 1981; Kneuchel & Masters, 1999; Dirksei
al., 1999; MacLeod et al., 1999. van Bokhoven et al., 2001a.
b; Rush et al., 2002; Milanesi el al., 2003; Drexler et al.,
2003] (см. также табл. 13.2). Распространенная пере-
крестная контаминация мнотих линий клегок HeLa
и другими быстро растущими клетками в настоящее
время точно установлена [Stacey et al., 2000; MacLeod
et al., 1999], но многие операторы еще не осведомлены
о наличии серьезного риска (см. также разд. 7.10.1,
16.1,16.3,16.6.2; табл. 13.2). Руководитель несет ответ-
ственность за то, чтобы новые сотрудники осознавали
степень опасности. Редакторы журналов и рецензенты
рукописей и организации, предоставляющие гранты,
прежде чем принимать рукописи или предложения на
выполнение гранта, должны требова гь доказательства
аутентификации линий клеток. Если не принять эти
условия, ситуация будет только ухудшаться.
Следующие методики помогают избежать перекрест-
ной контаминации:
1) Покупать линии клеток в банках клеток с хорошей
репутацией, в которых проводится надлежащая
валидация линий клеток (см. разд. 7.10.20.2; При-
ложение И: Банки клеток), или проводить необхо-
димую аутенфикацию самостоятельно как можно
быстрее (см. разд. 16.3).
2) Не открывать одновременно культуральные флако-
ны, содержащие разные линии клеток, не открывать
одновременно бутыли со средой для этих клеток.
3) Работать с быстро растущими линиями, такими
как HeLa, отдельно и после работы с другими
культурами
4) Никогда не использовать одну и ту же иииетку для
разных линий клеток.
5) Никогда не использовать одну и ту же бутыль со сре-
дой, трипсином и т.д. для разных линий клеток.
6) Не вносить иииетку назад в бутыль со средой,
трипсином и т.д. после того, как она побывала в
культуральном флаконе с клетками.
7) Вначале вносить в культуральный флакон среду и
друг ие реагенты, и только йотом клетки.
8) Не использовать вскрытые пипетки или автома-
тические пипетки без сменных наконечников для
рутинных работ.
9) PeryjtHpHo проверять характеристики культуры и
следить за неожиданными изменениями морфоло-
t ии, скорости роста или друт ими фенотипическими
свойствами. Перекрестная контаминация или ее
отсутствие мотут быть подтверждены с помощью
геномной идентификации (см. протокол 16.8) [Sta-
cey el al., 1992], определения ДНК-профиля (см.
протокол 16.9), кариотиттирования [Nelson-Rees &
Flandermeyer, 1977] (см. разд. 16.5; протоколы 16.7,
27.5,27.9) или изоферментного анализа [O’Brien el
al.. 1980] (см. протокол 16.10).
Необходимо постоянно учитывать, что перекрестная
контаминация может произойти и происходит. Нужно
принимать предупредительные меры и регулярно про-
верять характеристики линии
19.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• Регулярно проверяйте живые культуры на наличие
контаминации с использованием световой и фазо-
во-контрастной микроскопии, а наличие микоилаз-
364
ГЛАВА 19. КОНТАМИНАЦИЯ
мы - с помощью флюоресцентного окрашивания
фиксированных препаратов или ПЦР.
Не добавляйте при рутинных работах всем культу-
рам антибиотики. Культивируйте ио крайней мере
но одному образцу каждой клеточной линии без
антибиотиков не менее двух недель и. желательно,
дольше для того, чтобы проявилась возможная
скрытая контаминация.
Не делайте попыток деконтаминировать культуру,
за исключением, если эта культура является незаме-
нимой, и в этом случае проводите деконтаминацию
в условиях строгого карантина.
Помещайте в карантин все новые линии клеток,
попавшие в вашу лабораторию, до тех пор, пока не
убедитесь в отсутствии контаминации.
Не пользуйтесь общими средами или другими
растворами для линий клеток или операторов,
периодически проверяйте характеристики клеток
(см. разд. 16.3) для предотвращения перекрестной
контаминации.
Новые клеточные линии должны быть охаракте-
ризованы, желательно, с помощью геномной идеи -
тификации или определения ДНК-ирофиля сразу
после выделения.
Глава 20
КРИОКОНСЕРВАЦИЯ
Поскольку в лаборатории ведется работа с клеточными
культурами клеток, ряд клеточных линий поддержи-
вается или приобретается ири необходимости, если
только в лаборатории не занимаются исключительно
первичными культурами. Различные характеристики
клеточной линии, выявленные ири ее исследовании,
добавляются в описание ее происхождения, при этом
каждая информация является ценным материалом.
Будучи уникальной, клеточная линия не может быть
воспроизведена или замещена. Б лучшем случае заме-
щение является дорогостоящей и требующей времени
процедурой. Таким образом, существенным моментом
работы в лаборатории культуры клеток является пре-
дупреждение потери ценных клеток путем консервации
клеточных линий.
20.1. ПРЕДПОСЫЛКИ МЕТОДА
ЗАМОРАЖИВАНИЯ
Клеточная линия при постоянном культивировании
склонна к вариациям в результате селекции в культуре
ранних пассажей (см. разд. 3.8), старения в конечных
клеточных линиях (см. разд. 3.8.1, 18.4.1), а также
генетической и фенотипической нестабильности (см.
разд. 16.1,18.3) постоянных клеточных линий. Кроме
того, даже в очень хорошо работающей лаборатории
возможна поломка оборудование и контаминация. Пе-
рекрестная контаминация и неправильная идентифи-
кация (см. ралд. 7.10.1,16.1,16.3,16.6.2,19.5; табл. 13.2)
также постоянно происходят с достаточно высокой
частотой. Таким образом, существует мною причин, ио
которым требуется замораживание надежною запаса
клеток. Суммируя, можно назвать следующие:
1) Генотипический сдвиг в результате генетической
нестабильности.
2) Старение и проистекающее из этого угасание кле-
точной линии.
3) Изменение характеристик рост а и приобретение
свойств, связанных с малги низацией
4) Фенотипическая нестабильность в результате се-
лекции и дедифференцировки.
5) Контаминация мнкр<к>рганизмами
6) Перекрестная контаминация дру! ими линиями.
7) Неправильная идентификация в результате небреж-
ной работы.
8) Поломка инкубатора.
9) Экономия времени и материалов, необходимых
для поддержания клеточной линии в период, пока
культура не используется.
10) Необходимость распределения между различными
пользователями.
20.2. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ
ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ
Существуют определенные требования, которые сле-
дует выполнить до того, как клеточная линия будет
1ЮД1 отовлена для криоконсервации (табл. 20 1).
Валидация. До криоконсервации должно быть по-
казано, что клеточная линия свободна от контаминации
(см. разд. 19.3) и аутентична (см. разд. 16.3). Несколь-
ко ампул вновь полученной клеточной линии может
быть заморожено до завершения процесса валидации
(см. разд. 20.4), но собственно валидация должна быть
проведена до тоге, как будет замо1>аживаться основной
запас (см. разд. 7.10) или основная масса клеток.
При замораживании. В случае конечной кле-
точной линии для тою, чтобы получить количество
клеток, достаточное для замораживания, культуру
растят примерно до няттл о удвоения популяции. Пос-
тоянные клеточные линии должны быть клонированы
(см. разд. 14.1, 14.3, 14.4), охарактеризованные клоны
отобраны и выращены до концентрации клегок, доста-
точной для замораживания. Постоянные линии имеют
определенные преимущества; они сохраняют жизне-
способность неопределенно долго, растут быстрее и
легче могут быть клонированы, однако они обладают
меньшей генетической стабильностью. Конечные кле-
точные линии обычно диплоидны или близки к этому, и
существует стабильность линии между определенными
пассажами, однако их труднее клонировать, и они могут
случайно uoi ибнуть или трансформироваться.
20.3. ПРИНЦИПЫ КРИОКОНСЕРВАЦИИ
20.3.1. Теоретическое обоснование
замораживания клеток
Оптимальное замораживание клегок для сохранения
максимальной жизнеспособности при восстановле-
нии после размораживания зависит от минимизации
366
ГЛАВА 20. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ
Таблица 20.1. Требования к ку чьтурс перед замораживанием
Приобретение Конечная клеточная линия Постоянная клеточная линия Замораживание при ранних пассажах (< 5 субкультур) Клонирование, селекция, и характеристика; амплификация
Стандартизация Среда Сыворотка (если используется) Субстрат Выбор оптимальной среды, и твердо придерживаться этой среды Выбор парт ии для использования на всех счадпях (см. разд 9 6) Стандартизируют ио одному типу и поставщику хотя непбязашльно по размеру пли конфигурации
Валидация Происхождение Ау гентафикация Т рансформация Контаминация Кросс-контаминация и ошибоч- ная идентификации Записи деталей происхождения, истории жизни, и свойств Проверка характеристик клеточной линии в сравнении е источником м !|роисхождснисм (см разд. 16.1, 16.3) Определение трансформированного состояния (ем табл 18.1) М||КробиолО!Нчсскос исследование (см разд. 19 3,11.6.2) Микоплазмы (см. протоколы 19.2,19.3) Критерии подтверждения иден- тичности (см. разд 163)
образования внутриклеточных кристаллов льда, а
также предотвращения образования ича<ов высокой
концентрации солей, возникающих при заморажива-
нии внутриклеточной воды. Это достигается, а) путем
медленного замораживания, так чтобы позволить воде
покинуть клетку, но не настолько медленно, чтобы
спровоцировать рост ледяных кристаллов; б) путем
использования шдрофильных криопротекторов для
уменьшения содержания воды; в) путем хранения
клеток ври самой низкой температуры, какую только
возможно достш путь, для тою чтобы минимизировать
действие высокой концентрации солей на денатурацию
белков в мицеллах внутри льда и t) путем быстрого
размораживания для того, чтобы минимизировать
рост кристаллов льда и появление градиента солей,
образующегося в процессе таяния остаточного внут-
риклеточного льда.
20.3.2. Концентрация клеток
Показано, что выживание клеток повышается при их
замораживании при высокой концентрации клеток. Это
в основном эмпирическое наблюдение, но, возможно,
связано, в частности, с тем, что уменьшение жизнеспо-
собности при размораживании требует более высокую
посевную концентрацию; уменьшение жизнеспособ-
ности может объясняться тем, что при криогенном
повреждении содержимое клетки вытекает. Высокая
концентрация клеток при замораживании также обес-
печивает достаточное разведение криопротекторов при
размораживании и последующем иосеве, позволяющем
избежать центрифу! ирования (по крайней мере, для
большинства клеток). Количество замороженных кле-
ток должно быть достаточным для того, чтобы обеспе-
чить дос гаточно высокую их посевную концентрацию
при разведении 1:10 пли 1:20 при размораживании,
позволяющем развести криопротектор до низких кон-
центраций. Например, при нормальном субкультиви-
ровании используется концентрация клеток 1х105/мл,
поэтому нри замораживании следует иметь концентра-
цию клеток 1x10' мл среды. После размораживания
клеток 1 мл суспензии следует развести добавлением
среды до 20 мл, что даст концентрацию 5х10®кл./мл
(в пять раз выше обычной посевной концентрации).
Это разведение снизит концентрацию криопротекто-
ра с 10% до 0,5%; последняя с меньшей вероятностью
будет токсична для клеток. Остаточные количества
криопрот ектора мглут быть разведены при дальнейшем
пересеве, как только культура начнет расти (в случае
суспензионной культуры) или при замене среды после
того, как только клетки прикрепятся к субстрату (для
монослойной культуры).
20.3.3. Среда для замораживания
Клеточную суспензию замораживают в присутствии
криопротекторов, таких как глииерин или диме-
тилсульфоксид (DMSO) [Lovelock & Bishop, 1959].
Показано, что из двух этих криопротекторов более
эффективным является DMSO, возможно потому, что
он проникает в клетки лучше, чем глицерин. Обычно
используются концентрации между 5% и 15?о, чаще
всего 7,5% или 10%. Бывают ситуации, нри которых
DMSO может являться токсичным или индуцировать
дифференцировку клеток (см. разд. 17.7.2), например
в случае гематопоэтических клеточных линий L5178Y
или HL60 (М. Freshney, личное сообщение). В этих
случаях предпочтительно использовать глииерин или
центрифу! ировать клетки после ра!моражи вания для
удаления криопротектора.
Есть мнение, что клетки должны храниться при 4 °C
после добавления DMSO в среду для замораживания,
однако предварительные эксперименты, проведенные
автором, позволяют предположить, что эта процедура
не повышает выживание клеток после размораживания
и может даже снизить ее (неопубликованные данные),
возможно, в результате проникновения среды внутрь
клеток. Тем не менее этот вопрос еще недостаточно
решен и требует дальнейших экспериментальных ис-
следований (см. !Л. 2, упражнение 17).
DMSO должен быть бесцветным, и его следует
хранить в стеклянном или пропиленовом флаконе,
поскольку он является сильным растворителем и
выщелачивает примеси из резины и некоторых пласт-
20.3. Принципы криоконсервации
367
масс. Глицерин должен быть не старее одного года,
при более продолжительном хранении он может стать
токсичным.
Возможно использование также других криопро-
текторов, таких как иоливиншширролидон (PVP) [Su-
zuki el al., 1995], нолиэгиленгликоль (PEG) (Monroy et
al., 1997] и iидрокснлэтиловый крахмал (HES) [Pasch
et aL, 2000], но общего признания эти криопротекторы
не получили, хотя показано некоторое повышение
выживания при использовании трегалозы [Eroglu el
al., 2000; Buchanan el al., 2004]. Мншие лаборатории
также повышают концентрацию сыворотки в среды для
замораживания до 40%, 50% или даже до 100?о.
20.3.4. Скорость охлаждения
Большинство культивированных клеток лучше выжи-
ваю г, если они охлаждаются со скоростью 1 °C, мин
[Leibo & Mazur, 1971; Harris & Griffiths, 1977]. Воз-
можно, эта скорость является компромиссом между
быстрым замораживанием, минимизирующим рост
кристаллов, и медленным охлаждением, способс-
твующим миграции воды из клеток. Вид кривой
охлаждения определяется: а) температурой окружа-
ющей среды; б) наличием изоляционного материала
вокруг клеток, включая ампулу; в) специфической
теплоемкостью и объемом содержимого ампулы и
г) поглощением теплоты фазового перехода. Когда
клетки замораживают в теплоизолирующем контей-
нере, помещенном в сверхнизкую температуру замо-
|>аживания. как описано в п. (1)—(4), это приводит к
быстрому снижению температуры в начале кривой,
когда перепад температур больше всего, до минимума
в эвтектической точке, некоторому подъему в начале
замерзания, последующему плато, отражающем ла-
тентное поглощение теплоты фазового перехода, и
затем к более быстрому падению температуры после
окончания замерзания, иостепенно достш ающей тем-
пературы замораживающей камеры (рис. 20.1).
Когда клетки помещены в морозильник с жидким
азотом (ши на конечной стадии при замораживании в
программируемом морозильнике),температура быс гро
издает до 180 °C и 196 °C. Контролируемая скорость
охлаждения может быть достигнута несколькими
способами:
1) Поместить ампулы на вату в пенополистироловую
коробку со стенами толщиной примерно 15 мм. Эта
коробка плюс вата должны обеспечить достаточно
эффективную изоляцию, при которой ампулы будут
охлаждаться со скоростью 1 “С/мин, если кор<юка
находится при температуре —70 °C или —90 °C в
обычном низкотемпературном морозильнике пли
изолированном контейнере с твердым СО2.
2) Поместить стержневый держатель для ампул в иено-
изолируемую трубку со стенками толщиной около
15 мм (рис. 20.2), и поставить их в обычный низко-
температурный морозильник при —70 °C или 90 °C
или изолированный контейнер с твердым СО2.
Рис. 20.1. Кривая замораживания. Регистрация падения
температуры в ампуле, содержащей среду, закрепленной
вместе с дру। ими пятью ампулами на алюминиевом стержне,
.заключенной в гильзу и помещенной в ценополиуре|ановую
трубку (см рис 20 2) и затем в морозильник при 70 °C
3) Поместить ампул ы в узкогорлый морозильник Tay-
lor Wharton с пробкой (рис. 20.3) и закрыть пробкой
горло морозильника.
4) Поместить ампулы в замораживающий контейнер
Nalge Nunc (рис. 20.4) при температуре 70 °C или
-80 °C.
5) Использовать морозильник с npoi раммнруемой
скоростью замораживания. 1 °C, мин (рис. 20.5), с
ускоренным замораживанием после достижения
эвтектической точки (см. рис. 20.1).
При использовании любого из первых четырех
методов, наиример метода изолированной трубки (2)
(см. рис. 20.2), скорость охлаждения будет результатом
среднего арифметического от различных скоростей
на протяжении кривой. При этом не учитывается ш-
Рис. 20.2. Ампулы на стержне. Пласжковысампулызакрсп-
лены на алюминиевом стержне (внизу), заключены в гильзу
(в середине) и помещены в пенополиуретановую трубку
(в верхней части фото). Теплоизолированная трубка заткнута
с обоих концов хлопковой ВЙ1ОЙ или друI им подходящим
изолирующим материалом
368
ГЛАВА 20. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ
Рис. 20.3. Пробка для узкогорлого морозильника. Моди-
фицированная пробка для узкогорлого морозильника, поз-
воляющая проводить кон iротируемое охлаждение с разной
скоростью (Taylor Wharton). Показано в разрезе горлышко
морозильника с модифицированной пробкой внутри. Уплот-
нительное кольцо обычно используется, чтобы поместить
верх ампул в горловой части морозильника. Чем ниже опус-
каются ампулы, гем быстрее замораживание
перохлаждение в эвтектической точке или удлинение
плато, которое отражает латентное поглощение теп-
лоты фазовою перехода, что может улучшить выжи-
ваемость клеток. Если выживаемость клеток низкая,
можно изменить среднюю скорость замораживания
(например, изменяя толщину слоя изоляции). Исполь-
зуйте программируемый морозильник (см. рис. 20.5)
с зондом, определяющим температуру в ампуле, и с
добавлением жидкого азота в морозильную камеру с
необходимой частотой, чтобы обеспечить предвари-
тельно определенную скорость охлаждения и быстрое
охлаждение после достижения эвтектической точки.
Различные темпы охлаждения в разных фазах кривой
Рис. 20.4. Охлаждающее устройство Nalge Nunc Cooler.
Пластиковый держатель с основанием, .заполняемым ох-
лаждающейся жидкостью. Специфический тыщовоЙ эффект
охлаждающего агента в основании изолирует контейнер и
даст скорость охла-кдения содержимого ампул примерно
-1 °C мин
Рис. 20.Б. Программируемый морозильник. Ампулы по-
мещаются в изолированную камеру, скорость охлаждения
pciy.iiipycicn впрыскиванием жидкого азота в камеру в ре-
жиме. определяемом чувствительным датчиком на решетке
с ампулами и предваритетьно выбранной в пульте управ-
ления программой (Planer Biomcd). (о) Контрольный блок
и морозильная камера (крышка о крыта), (б) Увеличенное
изображение замораживающей камеры с четырьмя ампулами,
одна из которых содержит датчик
охлаждения. экспериментально оптимизированные для
конкретных клеток, могут быть запрограммированы
путем внесения соответствующих изменений в кривую.
Прш раммируемое устройство для охлаждения и замо-
раживания, однако, достаточно дорого но сравнению с
простым оборудованием, описанным выше (1)—(4), и
имеет не очень много преимуществ, если только вы не
предпола] аете варьировать скорость охлаждения [см.
Foreman & Pegg. 1979] или изменять вид кривой ох-
лаждения. При использовании методов изолированных
контейнеров скорость охлаждения пропорциональна
различию в температуре между ампулой и окружа-
20.3. Принципы криоконсервации
369
ющей атмосферой. Если ампулы помещены в моро-
зильник при -70 °C, они будут охлаждаться быстро
до температуры —50 °C, но затем скорость охлаждения
значительно снизится (см. рис. 20.1). Таким образом,
время, которое ампулы проводят при 70 °C, должно
быть дольше, чем количество времени, предварительно
пре диола! аемое для скорости охлаждения 1 °С/мин.
поскольку нижняя часть кривой асимптотична. Безо-
паснее оставить ампулы при 70 °C на ночь до того,
как вы перенесете их в жидкий азот. Более того, при
перенесении из замораживающего устройства ампулы
будут на1реваться со скоростью примерно 10 °С/мпн.
Критичным является нагревание до —50 °C, поскольку
затем начинается ухудшение состояния клеток, по-
этому перенос ампул в жидкий азот должен произво-
диться меньше чем за две минуты.
20.3.5. Морозильные камеры
Хранение в морозильниках с жидким азотом (рис. 20.(5,
20.7; см. также разд. 5.5.2) является наиболее удовлет-
ворительным методом сохранения культивируемых
клеток [Hay et al., 2000J. Замороженные клетки быстро
переносят в морозильную камеру, 1де они находятся
при температуре —70 °C и ниже. Конструкции моро-
зильных камер различны по размерам горлышка, через
который осуществляется доступ, ио используемой
системе хранения и расположению жидкою азота
(рис. 20.7).
Размеры горлышка. Баллонные системы хранения
обычно имени' узкое горлышко (рис. 20.6а, о, 20.7а),
что позволяет уменьшить скорость испарения жид-
кого азота, но делает доступ к материалам достаточно
затрудненным. Широкогорлые морозильные камеры
выбираются для удобства доступа и максимального
использования объема, обычно для хранения в раз-
личных отсеках, однако в этом случае происходи!
более быстрое испарение жидкого азота. Тем не менее
можно выбрать относительно узкогорлые морозильные
камеры, использующие систему кассет и отсеков для
хранения. Последние удобнее для контроля со стороны
исследователей, поскольку существует система квад-
ратных областей, предназначенных для размещения
кассет и лотков, которые располагаются на штативах,
доступ к которым осуществляется аналошчно той
системе, что имеется в узкогорлых морозильниках
(рис. 20.6г, 20.76). Эти морозильники обладают умерен-
ной вместительностью, но удобство в использовании
и сотовая структура расположения кассет делают их
использование предпочтительным для многих иссле-
дователей (см. ниже).
Система хранения. Имеется два основных типа
хранения, которые используются для 1-мл ампул при
работе с клеточными культурами. Система стержне-
вых штативов, основанная на опыте хранении спер-
мы, использует ампулы, прикрепленные на длинных
алюминиевых стержнях, заключенных в картонную
трубку и затем помещенных в цилиндрическую кассету
в морозильной камере. Преимуществом .-лого метода
является возможность вынуть один набор из шести
ампул, в то время как остальные ампулы останутся в
камере, возможно также вынуть все ампулы с одной
клеточной линией, что ускоряет и упрощает перенос их
из замораживающего устройства в морозильную каме-
ру на хранение. Штативы мо< ут быть промаркированы
и окрашены, что обле! чает их поиск п позволяет изъять
необходимые ампулы, не трот ая дру! ие ампулы.
Некоторые исследователи предпочитают исполь-
зование прямоугольных ящиков, считая такой путь
распределения и поиска ампул более ле! ким. В этом
случае отдельная ампула может быть идентифициро-
вана ио номеру ящика и координатам внутри яшика.
В данном случае, однако, имеет значение размер ящика,
в котором может- располагаться от 20 до 100 ампул,
которые одномоментно вынимаются из морозильной
камеры. Кроме того, при необходимости изъятия
нижних отсеков вам потребуется вынимать весь блок.
Загрузка большого количества ампул в ящик должна
производиться поочередно — но одной ампуле за один
раз, в результате чего имеется большой риск длитель-
ного перегрева хранящихся клеток.
Ампулы. Для экспериментальной работы и в учеб-
ной лаборатории предпочтительны пластиковые ам-
пулы, поскольку работа с ними безопаснее и удобнее,
однако в отдельных случаях в хранилищах и клеточных
банках предпочитают работать со стеклянными ампу-
лами. обеспечивающими более длительное хранение.
При использовании запаянных с соблюдением тре-
бований герметичности ампул обеспечивается абсо-
лютная герметичность. Пластиковые ампулы, обычно
полипропиленовые, имеют наиболее общепринятый
объем 1,2 мл (см. цв. вкладку 226). Они мО1ут быть
отмечены маркерами или этикетками, которые должны
быть этанол-устойчивы и способны выдержать низкую
температуру морозильника (см. Приложение II, Крио-
маркеры и Крио-этикетки). Этикетки должны содер-
жать обозначение клеточного штамма и, желательно,
дату и инициалы исследователя, хотя последние не
всегда могут уместиться на имеющемся пространстве.
Различный цвет колпачков также помогает идентифи-
цировать ампулы (см. цв. вкладку 226).
Помните, что клеточные культуры, которые хра-
нятся в жидком азоте. мо1ут пережить вас! Они ле1ко
мтут, по крайней мере, пережить ваше пребывание в
данной лаборатории. Поэтому запись следует делать
понятной для дру!их и достаточно подробной, чтобы
клетки moi ли быть использованы друтми людьми.
При закручивании крышки пластиковой ампулы
требуется приложить правильно рассчитанное усилие,
поскольку при слишком сильном закручивании может
произойти деформация прокладки. Имеет смысл пот-
ренироваться с новой партией ампул, чтобы убедиться,
что они: а) закрываются правильно и б) устойчивы к
низкой температуре. Бракованная партия ампул мо-
370
ГЛАВА 20. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ
Рис. 20.fi. Морозильники с жидким азотом, (а) Узкогорлый морозильник с иодгатовлснными для хранения амиуламн на
стержнях в кассетах. (б) Внутреннее ib узкогорлого морозильника- внешний вид кассет, расположенных в центре, как они
должны быть расположены для удобства изъятия Нормальное расположение хранящихся образцов иод «плечом» моро-
зильника. как з1о показано справа вверху (в) Широкогорлый морозильник с хранящимися образцами в треугольных штативах
(г). Узкогорлый морозильник с хранящимися образцами в квадратных штативах (см. также рис. 20.7) (й) Морозильник боль-
шой емкости с открытым смещенным портом доступа показывает стержни в кассетах, (е) Морозильники большой емкости в
клеючном банке. На ближнем морозильнике заметны соединения для мониторинг и автоматического заполнения (фото (о)
и (е) любезно предоставлены АТСС)
20.3. Принципы криоконсервации
371
Жидкий азот
из хранилища
Рис. 20.7. Конструкция азотного морозильника. Четыре основных типа азотных морозильников, (а) Узкогорлый с ампула-
ми на стержнях в кассетах (большая емкость, низкая скорость выкипания азота) (о) Узкогорлый с ампулами в квадратных
штативах (средняя емкость, низкая скорость выкипания) (в) Широкоюрлыи с ампулами в треугольных штативах (высокая
емкость, высокая скорость выкипания), (г) Широкогорлый с хранением в ящиках, жидкий азот подводится по трубкам, раз-
брыз! ивается через стенки морозильника, режим работы контролируется автоматически по сенсорным датчикам верхнего и
нижнего уровней (в верхней левой части)
жег разрушаться при размораживании. Пластиковые
ампулы большего диаметра выше, чем эквивалентные
стеклянные ампулы, поэтому могут потребоваться
Специальные кассеты.
• Требование безопасности. Неопытные иссле-
дователи должны избегать использования стеклянных
ампул, поскольку существует' высокий риск взрыва
при размораживании. Ec.ru используются стеклянные
ампулы, они должны быть тщательно и быстро запаяны
в пламени газовой горелки. При слишком долгом запа-
ивании клетки могут перегреться гг rrot ибнуть, а воздух
в ампуле расширится и прорвет дырку в ампуле. Если
ампула запаяна недостаточно герметично, она может
набрать жидкий азот ггри хранении в жидкой фазе
азотной камеры и впоследствии при размораживании
резко взорвется.
Можно проверить наличие герметичности ампул
путем погружения их в 1%-й раствор метиленового
синего в 70°о-м этаноле ири 4 °C на 10 мин до замо-
раживания. Если ампулы недостаточно герметично
закупорены, метиленовый синий попадет в ампулу и
ампулу следует выбросить.
Местонахождение жидкого азота. Еслгг жидкий
азот располагается в основной части морозггЛьггогг
камеры, то существует возможность выбора между
372
ГЛАВА 20. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ
полным заполнением камеры азотом с погружением
в него ампул только частичным заполнением с хра-
нением ампул в карах азота. Хранение в жидкой фазе
предполагает, что контейнер может быть полностью
заполнен, и таким образом жидкий азот будет доль-
ше находиться в камере. Однако в этом случае есть
риск попадания азота в ампулы, которые затем при
размораживании мшут взорваться. Также в этом слу-
чае увеличивается вероятность контаминации между
ампулами и переноса загрязнения извне, вносимого
вместе с погружением материала и концентрируемого
при испарении жидкого азота в емкое ги. При исполь-
зовании хорошей изоляции и уменьшении испарения
предпочтительно использование газофазного храни-
лища. При этом уменьшается риск расплескивания
жидкого азота при его переливании через край, koi да
что-то иен ружается в него, а также уменьшается испа-
рение азота и его попадание в атмосферу комнаты. Тем
не менее существует традиент температуры примерно
в 80 °C от —190 °C у поверхности жидкого азота до
-110 °C у горлышка баллона [Rowley & Byrne, 1992],
хотя конструкция и структура штативной системы
мо1ут снизить этот 1радиент.
Некоторые морозильные камеры имеют структуру,
в которой жидкий азот наливается между стенками и
не попадает в камеру для хранения. Он пополняется
автоматически мри контрольных значениях датчиков
низкого и высокого уровней азота (рис. 20.7г), при
этом испаряющийся азот выпускается через предох-
ранительный выпускной клаиан. Такая конструкция
имеет все преимущества газофазного хранения и, кроме
того, дополнительное преимущество более низкого
расхода жидкого азота и отсутствие температурного
1радиента.
Однако уровень азота не является видимым и не
может быть измерен глубиномером, поэтому полная
уверенность в том, что поддерживается нужная тем-
пература, может быть только при электронном мони-
торит е (см. ниже). Кроме того, любое препятствие,
вызывающее нарушение поступления жидкого азота в
пространство между стенками, трудно, uhoi да даже не-
возможно, удалить, поэтому существенным моментом
является фильтрация жидкого азота, и на этой ступени
не должно быть попадания воды или ее паров в систему,
поскольку лед может блокировать иоток азота.
• Требование безопасности. Материалы, пред-
ставляющие собой био.цм ическую опасность, диюш
храниться в 1а.м>вой фазе, для обучения и демонстра-
ции также следует использовать 1азофазное хранение.
Кроме т01 о, если используется жидкофазное хранение
пользователь должен быть осведомлен об опасности
взрыва как стеклянных, так и пластиковых ампул и
должен надевать защитный щиток или очки.
Мониторинг и пополнение уровня жидкого азота.
При расчете затраты средств на азотную морозильную
камеру следует учитывать расходы на его содержание,
которые могут быть достаточно велики и должны быть
определены путем жесткого режима моннториша и
применением электронных ст нализаторов измене-
ния уровня азота. Когда азот находится в отсеке для
хранения, то уровень его должен контролироваться
при помощи щупа-i лубпномера по крайней мере раз в
неделю с записью данных. Это следует делать также ири
наличии автоматического заполнения оборудования,
поскольку эта система может отказать. Koi да жидкий
азот полностью отгорожен от камеры для хранения, то
заполнение его производится автоматически, но этот
процесс должен быть также подкреплен предпочти-
тельно двумя независимыми термосенсорными датчи-
ками, каждый из которых может дать сшнал тревот,
если температура на одном из них превысит -170 °C,
а на другом 150 "С
Если морозильная камера с жидким азотом недо-
ступна, клетки могут храниться в обычном морозиль-
нике. Температура в этом морозильнике должна быть
настолько низкой, насколько это возможно. Неболь-
шое ухудшение состояния клеток было обнаружено
при -196 °C [Green et al., 1967], значительное ухуд-
шение (5—10% в год) может иметь место при хранении
при -70 °C.
ПРОТОКОЛ 20.1. Замораживание клеток
Схема
Вырастить культуру, до поздней log-фазы. приго-
товить суспензию клеток высокой концентрации
в среде с криопротектором разлить определенное
количество в ампулы, и медленно заморозить (см.
рис. 20.8).
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
• Куль гура, которая бу де г заморожена
• Если монослой: PBSA и 0.25% неочищенного
трипсина
• Ростовая среда. (Сыворотка улучшает выжива-
ние клеток после замо|>аживания; используйте
до 50%, или даже чистую сыворотку. Если
сыворотка используется с бессывороточными
культурами, то следует отмыть сыворотку после
размораживания.)
• Криопротектор, свободный от примесей (см.
выше): DMSO в стеклянном или полипропиле-
новом пузырьке или 1лицерин, свежий и в уни-
версальном контейнере
* Шприц, 1—5 мл, для размешивания 1лицерина
(поскольку глицерин вязкий)
• Пластмассовые ампулы, 1,2 мл, предварительно
промаркированные с обозначением клеточной
линии и даты замо|>аживания
Нестерильные.
• Гемоцитометр или электронный счетчик клеток
20.3. Принципы криоконсервации
373
• Стержни и стойки для хранения (стойки могут
уже быть размещены в морозильнике)
• Изолированный контейнер для замораживания:
пенопластовая коробка с ватой или пластмассо-
вой иеноизоляцпей. Пробирка (см. рис. 20.2, или
морозильник с контролируемой скоростью охлаж-
дения, если он имеется в наличии, см. рис. 20.5)
• Защит ные перчатки, нптрильные
Протокол
1. Удостоверьтесь, что культура удовлетворяет
критериям для замораживания (см. табл. 20.1);
проверьте невооруженным i лазом и при помощи
микроскопа для определения:
а) признаков здоровой культуры (см.
разд. 13.6.1):
б) морфоло!ических характеристик (см.
разд. 16.4);
в) стадии цикла роста (должна быть позд-
няя log-фаза перед выходом на плато (см.
разд. 13 6.6);
!) свободы от загрязнения (см. разд. 19.3).
2. Вырастите культуру до поздней log-фазы и, если
вы используете монослойную культуру, трии-
синизируите и подсчитайте клетки (см. прото-
кол 13.2). Если вы используете суспензионную
культуру, подсчитайте и центрифу! ируйте клет-
ки (см. протокол 13.3).
3. ресусиендируйте до концентрации 2x10*’
2х10'кл..мл. '
i. Растворите один из криопротекторов в ростовой
среде, чтобы приготовить среду для заморажи-
вания:
а) добавьте ди метилсульфоксид (DMSO) до
10 20%.
• Требование безопасности. DMSO может
проникать через mhoi ие синтетический и естествен-
ные мембраны, включая кожу и резиновые перчат-
ки | Horita и Weber, 1964]. Следовательно, любые
потенциально вредные вещества ири регулярном
использовании (наиример, канцерогенные вещества)
могут ле« ко быть перенесены через кожу и даже через
резиновые перчатки. DMSO должен всегда исполь-
зоваться с осторожностью, особенно в присутствии
.любых ядовитых веществ.
Или
б) Добавьте глицерин до 20—30%
5. Разведите клеточную суспензию 1:1 в среде для
замораживания, чтобы получить приблизительно
1x10’’- 1x10' кл. мл и 5-10% DMSO (или 10-15%
ыицерина). Нежелательно помещать амиулы на
лед в шшыгке минимизировать ухудшение со-
стояния клеток. Нахождение до 30-и минуты при
комнатной температура не вредно при исполь-
зовании DMSO и полезно при использовании
глицерина.
6. Разлейте клеточную суспензию в иредваритель- |
но маркированные ампулы; заверните ампулы, .
npu.iai ая адекватное усилие, избе! ая деформаци:i |
прокладки.
7. Поместите ампулы в держатели для хранения в I
емкостях с азотом (см. рис. 20.2, 20.6й, б. 20.7«)
или оставьте их незакрепленными для хранения I
в ящике (см. рис. 20.6л, /, 20.7б-г).
8. Заморозьте ампулы со скоростью 1 °С/мин одним I
из методов, описанных выше (см. разд. 20.3.4).
С применением термоизолированных контей- I
неров это потребует как минимум 4—6 ч после I
помещения их при 70 °C при начальной темпе-
ратуре окружающей среды 20 °C (см. рис. 20.1 и I
разд. 20.3.4). Предпочтительно быстрое иомеще- ।
ние ампул в контейнер ири 70 °C.
9. Кшда ампулы достигли —70 °C или ниже, про-
верьте записи использования морозильника
перед удалением ампулы из морозильника на
—70 С или морозильника с управляемой ско-
ростью замораживания, и выберите подходящее
местоположение для ампул.
10. Переместите амиулы в морозильник с жидким I
N,, предпочтительно не пшружая в жидкость,
разместите держатели для ампул и пробирки в I
выбранную емкое*! ь или индивидуальные ампулы |
на определенные места в определенном ящике.
Это перемещение должно быть выполнено быстро
(< 2 мин), так как ампулы мен ут повторно нагре-
ваться примерно со скорое: ью -10 °C/inin, и если
температура будет выше чем -50 °C, состояние
клеток будет ухудшаться.
• Требование безопасности. При размещении
ампул в жидком азоте должны использоваться за- I
щитные перчатки и маска для лица
11. Когда амиулы надежно расположены в моро- '
зильнике, заполните соответствующие pei ист- I
рационные графы в pei истрациоином журнале
морозильника (см. табл. 20.2 и 20.3)
20.3.6. Протоколирование работы
морозильника
Записи должны обеспечивать а) учет, показывающий,
что находится в каждой части морозильника, б) ин-
дикацию свободного пространства в морозильнике и
в) указатель клеточных штаммов, описание клеточных
линий: их обозначение, их происхождение, детали ве-
дения культуры и процедуры замораживания, каковы
были особые характеристики этих процессов и где они
расиола1аются в морозильнике. Эти записи мтут хра-
ниться в обычном карточном виде либо в компьютерной
базе данных, которая даст последнюю дату хранения
и возобновления запаса. Этот тип данных может быть
связан с отдельными таблицами, в той же базе данных,
используемыми для учета происхождения клеточных
374
ГЛАВА 20. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ
Рис. 20.8. Замораживание клеток. Трткинизировйнныс
клетки в среде с криопротектором, раз тяпаются по аликво-
там в ампулы, которые затем закрепляются на алюминиевом
стержне, вводятся в гильзу и затем в изолирующую трубку
Трубка и се содержимое помещаются на 4 ч или на ночь при
температуре 70 °C или -80 °C а затем гильза, содержащая
ампулы, переносится в кассеты на хранение в жидком азоте
(см. рис 20.7в)
линий (табл. 20.2, 203; см. также разд. 12.3.10, 13.8).
Материалы, хранящиеся на дисках или ленте, должны
иметь копии на диске или иметь бумажную копню.
Использование компьютерной базы данных требует,
чтобы ответственный за морозильники вел закиси в
этой базе. Если введение новых данных должно быть
сделана друг ими пользователями, то их записи жыжны
быть доступны для чтения и редактирования, в то вре-
мя как закиси по основным запасам культур клеток и
их распределению должны быть доступны только для
куратора. Либо весь файл может быть доступен для
чтения и внесения изменений куратором с бумажных
носителей — карточек или записей в рет истрационной
книге, которые заполняются пользователями.
20.3.7. Размораживание хранившихся
ампул
Когда возникает необходимость, клетки размораживают
и пересевают в относительно высокой концентрации
для более быстрот о восстановления культуры. Ампулы
должны быть разморожены так быстро, как это возмож-
но, для тою чтобы минимизировать внутриклеточные
повреждения, вызванные появлением кристаллов льдав
ходе процесса нагревания. Это может быть сделано йот -
ружением в теплую воду в ведерке или на водяной бане,
но, если ампула находилась при жидкофазном хранении,
сот ревающая баня должна быть закрыта крышкой на
случай, если ампула протекала и набрала жидкий азот,
который затем при нагревании может взорваться.
После размораживания клеточная суспензия должна
быть медленно разведена, поскольку быстрое разведе-
ние снижает жизнеспособность. Этот ступенчатый про-
цесс, в частности, важен при использовании DMSO, в
этом случае быстрое разведение может вызвать острый
осмотический шок и снизить выживаемость вполовину.
Большинство клеток не требуют центрифуг ирования.
поскольку разведение суспензионной культуры при
пересеве и замещение среды на следующий день для
монослойной культуры достаточно для того, чтобы
удалить криопротектор. Тем не менее некоторые клетки
(часто суспензионные культуры) более чувствительны
к криопротекторам, в частности к DMSO, и требуют
центрифугирования после размораживания. Однако
в этом случае они также должны быть разведены мед-
ленным добавлением питательной среды.
| ПРОТОКОЛ 20.2. Размораживание
замороженных клеток
I
Схема
Быстро разморозить клетки, медленно развести
их, и пересеять при высокой плотности клеток
(рис. 20.9).
Материалы
Стерильные:
* Культуральные флаконы
• Центрифужные пробирки (если требуется цент-
рттфу । прованне)
• Среда для роста
• Пипетки, 1 мл, 10 мл
• Шприц и игла 19-g (если вы используете стек-
лянные ампулы)
Нестерильные.
• Защитные перчатки и маска для лица
• Стерильная вода ири 37 °C. слой глубиной 10 см в
чистом, протертом этанолом ведерке с крышкой
• Пинцет
• Этанол 70%
• Тампоны
• Красители: нафтиленовый черный (Amido Чер-
ный), 1%, или Трицановый синий, 0,4%
I Протокол
1. Проверьте рет истрационн ый номер и местополо-
жение ампулы, которая будет размораживаться.
20.3. Принципы криоконсервации
37S
Таблица 20.2. Запись клеточной линии
Клеточная линия Дата замораживания Новая карточка
Место хранения
Вид Нормальная/ нсоплае- тпчная Взрослая ная/NB Микоп- Метод’ лазма: Инструкции по замораживанию Режим Крнолротсмор %
Дата исследования Результаты
Ткань Автор У час гок Ссылка Паспорт Основной № Тип роста Аутентификация Дата исследования Метод Инструкции по оттаиванию Размо]>аживать быстро до 37°С Развести до: 5 мл 10 .мл
20 мл 50 мл
Особые характеристики Нормальное ведение Частота Посевная субкуль- концент тивиро- рация ван ня Частота Тип замены среды Газовая Буфер фаза Агент Сыворотка и т.д. рн Центрифугировать для Да/нст удаления криопротектора? Специальные требования
Лицо, заполнившее карту Любые другие особые условия Требования биобезопасности
2. Соберите все необходимые материалы, приго-
товьте среду и промаркируйте флакон.
3. Выньте ампулу из морозильника, проверьте по
ярлыку правильность, и если ампула не была
погружена в жидкий азот, поместите ее в стериль-
ную воду при 37 "С в мензурке, пластмассовом
ведерке, или водяной бане. Если возможно, из-
бегайте попадания воды на крышку, поскольку
это увеличивает возможность за| рязнения.
• Требование безопасности. При выни-
мании ампулы из морозильника следует надевать
закрытый лабораторный халат и перчатки. Если
ампула хранилась погруженной в жидкий азот, на-
девайте защитный щиток, или защитные очки, так
же как и закрытый лабораторный халат и перчатки.
Ампулы, включая пластмассовые, хранившиеся в
жидком азоте, мшут содержать жидкий азот и. при
размораживании мгиут взорваться. В этом случае
для размораживания должно использоваться плас-
тмассовое ведерко с крышкой чтобы предохранить
исследователя от последствий взрыва.
4. Kot да ампула разморожена, дважды проверьте
маркировку, чтобы подтвердить идентичность
клеток, затем протрите тампоном, смоченным 70%-
м этанолом, и вскройте в ламинарном потоке
5. Перенесите содержимое ампулы в культурадь-
ный флакон при помощи 1-мл пипетки.
6. Медленно добавьте ростовую среду к суспензии
клеток: приблизительно 10 мл за 2 мин,добав.>1яя
капля за каплей в начале, и затем немного быстрее,
постепенно разводя клетки и криопротектор.
Для клеток, которые требуют центрифугирова-
ния для удаления криопротектора:
а) Медленно разведите клетки, как в шаге 6, но в
центрифужной пробирке или универсальном
контейнере.
б) Центрифу! ируйте их в течение 2 мин при
100 g.
в) Удалите супернатант среды с криопротек-
тором.
г) Ресусиендируйте клетки в свежей ростовой
среде
д) Перенесите во флакон для культивирования
376
ГЛАВА 20. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ
Таблица 20.3. Ведение pci истрационных записей но морозильникам
Перечень: Морозильник №. .... Канистра секция № . Пробирка ящик№
Клеточный штамм , линия . Дата замораживания .. Заморозил {ФИО) .
Число замороженных ампул Количество клетпк / ампул В мл
Среда ростовая... Сыворотка. . Концентрация ... Среда для замораживания
Метод охлаждения .
Регистрация размораживания:
Дата размо- Кол-во Осталось Пересев Жизнеспособность Примеча-
раживания ампул ампул Конц. Объем Среда Исключение | красителя -% прилипших Эффективность кло- нирования НИЯ
|
|
1
1
1
1
7 Осадок в ампуле может быть окрашен нафтилено-
вым черным или тринановым синим для опреде-
ления жизнеспособности (см. протокол 22.3.1).
8 Проверьте после 24 ч:
а) Для прикрепляющихся к субстрату моно-
слой ных культур подтвердите прикрепление
и попытайтесь оценить процент выживания
на основании фоттл рафий клеток при ожи-
даемой плотности разведения (кл.см-) с
полным выживанием (см. разд. 13.6.1, 16.4.5;
цв. вкладку 4).
6) Для суспензионных культур проверьте внеш-
ние признаки (прозрачность цитоплазмы,
отсутствие । рануляции) и разведите до обыч-
ной посевной концентрации. Это может быть
сделано более точно, если клетки подсчитаны
и проведена оценка жизнеспособности (см.
разд. 22.3.1), в этом случае клетки moi ут быть
разведены до обычной посевной концентра-
ции Жизнеспособных клеток.
Рис. 20.9. Размораживание клеток. Ампулы вынимаются
из морозильника и быстро размораживаются в теплой воде
под крышкой, чтобы избежать возможного взрыва ампул,
хранившихся в жидкой фазе
Данные но оценке жизнеспособности методом пог-
лощения красителя и друте данные (наиример, доля
клеток, прилипших к субстрату через 24 ч) должны
быть записаны в соответствующей карте или в файле
для использования при последующих процедурах
размораживания. Одна ампула должна быть разморо-
жена после каждО|О нового замораживания для оценки
успешности процедуры замораживания.
20.4. Планирование и контроль замораживания культур клеток
377
Флаконы для замораживания. Можно замора-
живать целые флаконы путем выращивания клеток до
поздней лшарифмической фазы, добавления 5 10%
DMSO к минимальному объему среды, который полно-
стью покроет монослой, и помещением флакона в рас-
ширяющийся полистироловый контейнер с толщиной
стенок 15 мм [Ohnoetal., 1991J. Термоизолированный
контейнер помещается в морозильник при 70—90 °C
и замораживается примерно со скоростью 1 °C. мин. В
течение нескольких месяцев выживаемость остается
хорошей, если флакон не вынимается из морозильника.
24-луночные планшеты также можно замораживать
аналотчным образом [Ure et al., 1992J примерно с
150 мкл среды для замораживания на лунку, таким
образом можно заморозить большое количество клонов
в ходе процедуры опенки.
20.4. ПЛАНИРОВАНИЕ И КОНТРОЛЬ
ЗАМОРАЖИВАНИЯ КУЛЬТУР
КЛЕТОК
Как только образуется небольшой избыток клеток,
полученных при первичном культивировании либо
ири ведении вновь полученной клеточной линии, под-
тверждено отсутствие контаминации, несколько ампул
с культурой должны быть заморожены, этот процесс
называется «пробная заморозка». Koi да клеточная ли-
ния успешно наросла или проведена селекция клонов
с определенными характеристиками, их идентичность
и свобода от контаминации подтверждены, следуei
провести замораживание посевного стока для хранения
(табл. 20.4)
20.4.1. Контроль за состоянием запасов
клеток в морозильнике
Начальная культура должна быть защищена и не-
доступна для общею пользования. Когда ампул}
размораживают для проверки жизнеспособности
замороженной начальной культуры и если в ближай-
шем будущем цредиола! ается использование этой
клеточной линии, клетки могут быть выращены для
распределяемой культуры и вновь заморожены. Эти
ампулы выдаются ио индивидуальной потребности.
Индивидуальные пользователи данной культуры при
длительном периоде работы с ней должны затем вновь
заморозить их собственную пользовательскую культу-
ру, которая должна быть уничтожена по завершении
работы. Пользовательская культура никогда не должна
передаваться дру1 им пользователям, поскольку она не
является достаточно валидированной; новые пользова-
тели должны затребовать культуру или ампулу из рас-
пределяемой культуры. Koi да распределяемая культура
заканчивается, она может быть пополнена из посевной
культуры. Юида количество ампул посевной культуры
станет менее инти, она должна быть пополнена прежде,
чем будет использована, с минимальным количеством
пассажей после первого .замораживания.
20.4.2. Периодическая замена
культивируемых клеток
Рабочие культуры должны заменяться в морозильнике
через определенные интервалы времени для того, что-
бы минимизировать действие генетического дрейфа и
фенотипических вариаций. После того как клеточная
линия находилась в культуре в течение 2,5 месяцев,
разморозьте следующую ампулу, проверьте характе-
ристики. удостоверьтесь, что культура свободна от
контаминации (см. разд. 19.3), и размножьте ее, чтобы
замени гь имеющиеся клетки.
Уничтожьте существующие культивируемые клет-
ки, которые разморожены более чем три месяца назад,
и перейдите на новые клетки (рис. 20.10). Повторяйте
этот процесс каждые 3 месяца для клеток, которые
имеют время удвоения популяции (PDT) примерно
24 часа; для клеточных линий с более коротким iijii
Таблица 20.4. Сбор и хранение клеточных линии
Стадия Источник Количество ампул Распределение Проверка
Замороженная по- севная культура Автор Исходная культура 1-3 Нет Нет (только пополнение Происхождение
пли заморожен- ная культура 12 запаса для распреде- ления культуры) Жизнеспособность Аутентичнопь Трансформация Контаминация Перекрестная контаминация
Запас для распрсде- Пробная размере- 50—100 (пли больше. Пользовании, включая Жизнеспособность
ления культуры женная посевная культура если требуется) другие лаборатории Контаминация Перекрестная контаминация
Пользовательская культура Запас для распреде- ления культуры 20 (5-лстний проект, за- мещение 4 раза в год) Жизнеспособность Контаминация Перекрестная контаминация
378
ГЛАВА 20. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ
Рис. 20.10. Серийное возобновление культуры. Ампула разморожена, клетки выращены до желаемого количества для обыч-
ного использования, культура поддерживается в течение 3 месяцев Через три месяца лосю первого размораживания новую
ампулу размораживают, выращивают и после проверки характеристик в соотвеиггвии с используемой посевной культурой
используют для замены используемой, которая затем уничтожается. Цикл повторяется каждые три месяца, поэтому культура
нс остается в использовании лилсетрсх месяцев
дсьиим РОТ может потребоваться, соответственно,
более короткий или долгий период замещения.
20.5. БАНКИ КЛЕТОК
Существует несколько банков клеток (см. Приложе-
ние II) для безопасною хранения и распределения ва-
ли дизированных клеточных линий. Поскольку mhoi ие
клеточные линии, особенно i ибридомные и дру< не ге-
нетически модифицированные клеточные линии, могут
иметь патентные oi раничения, необходимо обеспечить
патентные базы данных с oi раниченным доступом. Как
правило, предпочтительно иолучить вашу первичную
посевную культуру из заслуживающею уважения
клеточною банка. То<да не возникает' необходимость
характеризовать и повторно проводить уже сделанный
контроль качества клеточной линии. Более того, чрез-
вычайно рекомендуем вам передавать ценные культуры
клеток в банк клеток в дополнение к вашему хранению
замороженной культуры, поскольку банк защитит вас
от потери вашей линии и будет отслеживать ее распре-
деление среди дру।их пользователей. Если вы считаете,
что ваши клетки не должны быть переданы друшм
пользователям, они мел ут быть сохранены в банке с
oiраничениями, наложенными на них. Большинство
банков клеток имеют* информационный каталог, до-
ступный on-line, 1 де они выступают в качестве i лавного
Рис. 20.11. Контейнер для транспортировки клеток. Клетки погружаются в контейнер в замороженном виде в ампуле или
в состоянии растущей культуры, (о) Твердая коробка из плотного картона с изолирующим (пенопластом) полистироловым
упаковочным материалом, содержащим сухой лсд и ампулу, закупоренную в пробирку' с абсорбирующей ватой Пробирка
укладывается в закрывающийся полиэтиленовый пакетик, помещаемый в сухой лед (6) Двустенный пластиковый контейнер
с флаконом, помещенным во внутреннее ирос гранство и фиксированным в нем путем заполнения контейнера (азом (Air Вих.
Air Packaging Technologies)
20.6. Транспортировка клеточных культур
379
источника информации. Существует также несколько
баз данных, которые также могут быть доступны on-
line, 1 де содержится информация о клеточных линиях,
которые имеются у подписчиков этих баз данных в их
лабораториях (см. Приложение II). Этот тин банков
данных обеспечивает исследователей обширным ма-
териалом, который потенциально доступен, однако
следует помнить, что клеточные линии, полученные
из дру1 их лабораторий, будут значительно отличаться
но большинству характеристик и ко особенностям их
культивирования.
20.6. ТРАНСПОРТИРОВКА
КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
Культуры могут быть переданы из одной лаборатории
в другую как в виде замороженных ампул, так и в виде
живых культур. В любом случае:
1) посоветуйтесь с принимающей лабораторией в
отношении тою, koi да клетки должны быть от-
правлены,
2) отправьте ио факсу или электронной почте ин-
струкцию, в которой будет указано следующее:
а) что следует сделать ио получении;
б) требуемая среда или сыворотка;
в) любые особые добавки;
1) режим субкультивирования;
3) распечатайте спецификацию на клетки и копию
инструкции и наклейте на обратную сторону пакета,
в который будет упакована культура, чтобы получа-
тель знал, что делать прежде, чем вскроет пакет.
20.6.1. Звмороженнвя ампула
Переправляйте замороженные ампулы в сухом СО2
(сухой лед), в толстостенном пенополистироловом
контейнере (рис. 11а). Переносите ампулы из жидкою
азота в сухой СО,возможно быстрее, поскольку ско-
рость на1ревания ири комнатной температуре состав-
ляет около 10—20 °C 'мин и не должна подняться выше
—50 °C. Поместите опечатанную полипропиленовую
центрифужную пробирку в сухой СО2 в теплоизо-
лирующей коробке. Выньте ампулу из морозильной
камеры, быстро оберните абсорбирующей бумажной
салфеткой (на случай вытекания) и поместите в по-
липропиленовую пробирку, закрыв плотной крышкой.
Коробка должна иметь размеры примерно 30x30x30 см
с толщиной стенок 5 см и центральным пространством
около 20x20x20 см. Вам нотребуется примерно 5 Ki
сухого СО2, чтобы заполнить центральное простран-
ство. Обычно клетки остаются замороженными до
3 дней, если упакованы, как описано; если произошло
их медленное размораживание, их жизнеспособность
быстро падает. Курьер должен быть проинформирован
о том, что клетки находятся в сухом СО,. По прибытии
ампула должна быть разморожена и пересеяна, как
обычно (см. протокол 20.2).
20.6.2. Живые культуры
Криме тою, клетки могут быть переданы в виде
растущей культуры. Клетки должны находиться в
середине или в поздней log-фазе; конфлюэнтная или
постконфлюэнтная культура истощит питательную
среду быстрее и может отслаиваться при транспор-
тировке. Флакон должен быть заполнен до горлышка
средой, обмотан для безопасности вокру! горлышка
растя! ивающейся непромокаемой адгезивной пленкой
п запечатан в полиэтиленовый пакет. Упакованный
флакон помещается в жесткий контейнер и затем в
пенопластовую или полиэтиленовую противоударную
упаковку. Идеальным для транспортировки флакона с
живой культурой является надувной пакет (Air Pack-
aging Technologies, Inc). Флакон запечатывается во
внутреннее пространство (рис. 20.116) и фиксируется
за счет наполнения воздухом внешней оболочки. По-
местите на контейнер этикетки «хрупкий» и большими
буквами НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!
По получении флакон удаляется из упаковки, тща-
тельно протирается 70%-м этанолом и открывается в
стерильных условиях. Большая часть среды удаляется
из флакона, оставляется обычное количество куль-
туральной среды около 5 мл на 25-см2 флакон для
питания клеток. Культура может быть культивируе-
ма в новой среде, koi да она будет готова к пересеву,
но следует сохранить транспортировочную среду на
случай, если возникнут проблемы адаптации к новым
условиям.
Обычно лучше пересылать клетки с курьером, кото-
рый должен быть проинструктирован как в отношении
содержимого пакета, так и о срочности доставки. При
использовании международной почты потребуется
оформлять прохождение таможенно! о контроля, по-
этому компетентный представитель, знакомый с этим
типом информации, сможет помочь быстро провести
посылку через таможенный контроль. Клетки, пересы-
лаемые в США. должны проходить карантин и конт-
рольную проверку департаментом сельскою хозяйства
(Department of Agriculture), поэтому лучше пересылать
клеточные культуры через клеточные банки ЕСАСС
или АТС С.
Глава 21
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
Количественный анализ в культуре клеток требуется
для характеристики ростовых свойств различных
клеточных линий для экспериментального анализа
и для установления воспроизводимых условии куль-
тивирования первичной культуры и поддержания
клеточных линий (см. разд. 13.6). Работа в стерильных
условиях и необходимость мининимизации времени,
которое культура проводит вне инкубатора, часто
приводят к поиску компромисса между скоростью
и точностью. Хотя первичная культура и рутинное
подержание культуры требуют количественною
подхода для подтверждения воспроизводимости
результатов, скорость манипуляции является клю-
чевым моментом для хорошею выживания и роста
клеток, поэтому в этой ситуации снижение точности
при пинетировании, например, может быть приемле-
мым в целях более быстрого выполнения процедуры.
Тем не менее в экспериментальных условиях следует
работать как возможно точнее, даже если при этом
действия несколько замедлятся. Хотя при обычном
ведении культуры может быть приемлемой ошибка
±10%, в экспериментальных условиях она должна
быть уменьшена до ±5%. В настоящей главе описыва-
ются методы подсчета клеток и ряд друi их подходов,
используемых в количественной оценке процессов
клеточною деления, а также дру! ие методы оценки
клеточною состава — например, ДНК и белка. Методы
исследования цитотоксичности и жизнеспособности
клеток описаны в гл. 22.
21.1. ПОДСЧЕТ КЛЕТОК
Хотя оценка стадии роста культуры может быть
сделана ио ее внешнему виду простым наблюдением
при помощи микроскопа, стандартизация условий
культивирования и соответствующие количественные
эксперименты затруднительны для анализа и воспро-
изведения, если не производится подсчет клеток до,
после, а также, желательно, в ходе проведения каждого
эксперимента.
21.1.1. Гемоцитометр
Концентрация клеточной суспензии может быть оп-
ределена помещением клеток в оптически плоскую
камеру под микроскопом (рис. 21.1). Подсчитывается
количество клеток внутри определенной площади из-
вестной глубины (т.е. в определенном объеме), затем
исходя из этой величины высчитывается концентрации
клеток в суспензии.
Протокол 21.1 может быть использован при выпол-
нении упражнения 12 (см. гл. 2).
ПРОТОКОЛ 21.1. Подсчет клеток
при помощи гемоцитометра
Схема
Триисинизировать монослоиную культуру или
подготовить образец суспензионной культуры,
подготовить стекло для гемоцитометрии и добавить
клетки в счетную камеру. Подсчитать клетки под
микроскопом и определить концентрацию клеток
Материалы
Стерильные:
• D-PBSA
• Неочищенный трипсин 0,25%
• Ростовая среда
• Желтые наконечники для автоматических пи-
петок
Нестерильные.
• Автоматическая пипетка 20 мкл или с регулиру-
емым объемом, 100 мкл
• Гемоцитометр (Improved Neubauer)
Программируемый счетчик
Микроскоп
Протокол
1. Подготовка клеток
а) Для монослойной культуры
i) Трппсинизируйте культуру, как при
обычном субкультивировании (см. про-
токол 13.2), и ресусиендируйте клетки в
среде примерно до концентрации 1х 10* *'/мл.
В случае кот да образец подсчитывается в
ходе экспериментального роста, трипсин
не следует удалять, и клетки мотут быть
дисиерт ированы в растворе трипсина и
подсчитаны неиосредс гвенно в этом раст-
воре или после разведения 50:50 в среде,
21.1. Подсчет клеток
381
Рис. 21.1. Использование гемоцитометра. («) Предметное стекло гемоцит оме тра (улучшенная модификация Neubauer) и
покровное стекло перед использованием (г>) Придавливание покровного стекла (в) Внесение клеточном суспензии в счетную
камеру, (г) Продольное сечение гсмоцптомстра. показывающее положение клеточного образца в камере глубиной 0,1 мм
(<)) Помещение стекла под микроскоп, (е) Увеличенный вид общей зоны подсчета. Центральная область, обведенная пунктир-
ный окружностью, зто зона, которая должна находиться в поле зрения объектива 10х. Эта область составляет квадрат решетки
примерно 1x1 мм (ж) Микрофотография малого увеличения ( Юх), показывающая 25 малых (200х200-мкм) квадратов решетки,
составляющих центральную зону, в которе внесены клетки, предварительно обработанные Naphthalene Black (Amido Black)
(л) Микрофотография одного из малых квадратов с высоким разрешением (40х), ограниченного тремя сплошными линиями,
и содержащего 16 самых маленьких (50х 50 мкм) квадратов Жизнеспособные клетки неокрашенные и прозрачные, с неровным
кольцом, окружающим их, нежизнеспособные клетки темные и не имеют кольца вокруг
382
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
содержащей сыворотку, если клетки склон-
ны образовывать агрегаты.
ii) Как следует перемешайте суспензию для
того, чтобы полностью диснергировать
клетки, и перенесите некоторое количество
(~1 мл) в пузырек или универсальный
контейнер.
б) Для суспензионной культуры
i) Тщательно перемешайте суспензию для
дисиерт ирования возможных сгустков.
ii) Перенесите около 1 мл суспензии в пузы-
рек или универсальный контейнер.
Для данного метода требуется концентра-
ция как минимум 1х10ькл./мл. поэтому,
возможно, потребуется концентрировать
суспензию центрифугированием (ири
100 g в течение 2 мин) и ресуспендировать
ее в измеренном меньшем объеме.
2. Подгот овка стекла.
а) Протрите поверхность стекла 70% спиртом,
стараясь не поцарапать иолуиосеребренную
поверхность.
6) Протрите покровное стекло и, слетка увлаж-
нив края, прижмите очень осторожно поверх
канавок и полуиосеребрениой поверхности
для подсчета (см. рис. 21.1). Появление зоны
интерференции (Ньютоновские кольца - ра-
дужные пятна между поверхностным стеклом
и нижним стеклом, подобные тому, что обра-
зует масло на воде) показывает, что покров-
ное стекло прилегает как следует, определяя
1 лубину счетной камеры.
3. При помощи пипетирования тщательно пере-
мешайте образец клеток, чтобы диспер! ировать
любые сгустки, и отберите 20 мкл в наконечник
пипетки
4. Перенесите клеточную суспензию непосред-
ственно в счетную камеру гемоцитометра. Для
лого поднесите наконечник пинетки к краю каме-
ры гемоцитомегра и, выпустив каплю, позвольте
ей распределиться в камере под поверхностным
стеклом. Старайтесь избегать недостаточного
или избыточного заполнения камеры, поскольку
в этом случае измерения будут неправильными
в результате изменений поверхностного натяже-
ния; жидкость должна проникать только через
края желобков.
5. Перемешайте клеточную суспензию, повторно за-
полнив наконечник пипетки, и заполните вторую
камеру, если она есть.
6. Промокните любые излишки жидкости (не осу-
шая камеру) и перенесите счетную камеру на
предметный столик микроскопа (см. рис. 21.1).
7. Выберите объектив 10х и сфокусируйте мик-
роскоп на линиях решетки. Если фокусировка
затруднена из-за малой контрастности, закройте
иоле ирисовой диаг раммы или сделайте освеще-
ние еле! ка наклонным смещением конденсора.
8. Перемешайте счетную камеру так, чтобы ноле,
которые вы видите, находилась центральная
часть решетки и самая большая зона, которую вы
видите, была ограничена тремя параллельными
линиями. Эта область составляет 1 мм'. При
стандартном объективе 10х эта область почти
заполняет все иоле зрения либо углы решетки
слегка выходят за его пределы (см. рис. 21.1).
9 Подсчитайте клетки, лежащие в пределах 1 мм2-
Зоны. пользуясь делением на суб-области (также
ограниченные тремя параллельными линиями) и
единичные клетки сетки, отделенные одиночными
линиями. Подсчитайте клетки, которые лежат на
верхних и левых линях каждого квадрата, но не
учитывайте те, которые лежат на нижних и иравых
линиях, ограничивающих каждый квадрат для
тог о, чтобы избежать повторного подсчета одних
и тех же клеток. Для стандартного субкультиви-
рованпя попытайтесь подсчитать клетки при кон-
центрации 100 и 300 кл./мм2; чем больше клеток
подсчитывается, тем точнее результат подсчета.
Для более точного количественной оценки экспе-
римента следует подсчитывать 500 1000 клеток
а) Если у вас в распоряжении очень мало клеток
(<100/мм2), подсчитайте один или более до-
полнительных квадратов (каждый площадью
1 мм2), окружающих центральный квадрат.
б) Если у вас слишком много клеток ( >1000/мм).
подсчитайте только нить малых квадратов,
которые ограничены тройными линиями по
диагонали большого квадрата (1 мм2).
10. Если имеется две камеры, перейдите ко второй
камере и сделайте повторный подсчет. Если нет,
то промойте стекло и повторите подсчет со све-
жим образцом.
Анализ. Обсчитайте результаты двух подсчетов и
определите концентрацию вашего образца по формуле
с- n/v.
1цес - концентрация клеток (кл./мл), п количество
подсчитанных клеток, v - подсчитанный объем (мл).
Для гемоцитометра Improved Neubauer глубина камеры
составляет 0.1 мм, С учетом того что центральная пло-
щадь составляет 1 мм2, v равен 0,1 мм3, или 1х10-1мл.
Тогда формула принимает вид:
си/10-*, или с ~ п х 10'.
Если концентрация клеток высока и подсчиты-
вается только пять диагональных квадратов внутри
центральной зоны, площадью 1 мм2 (т.е. 15 от общей
площади), то это равенство превращается в
с - и х 5 х 10'.
21.1. Подсчет клеток
383
Если клеточная концентрация низка, то сосчитайте
десять 1 мм2 квадратов, ко пять в каждой камере гемо-
цитометра. Выражение примет вид:
с _ и х 10' 10 или с ~ п х 103.
Подсчет клеток при помощи гемоцитометра дешев и
дает вам возможность видеть иодсчи тыкаемые клетки.
Если клетки были предварительно перемешаны с рав-
ным объемом витального красителя (см. протокол 22.1;
рис. 21. Ijk; з), то в то же время может быть определена
жизнеспособность клеток. (Не забудьте учесть раз-
ведение ири окончательном подсчете концентрации
клеток.) Однако процедура достаточно медленна и
может давать ошибку как при взятии образца, так и
при подсчете общего количества клеток. Кроме того,
для этого метода требуется как минимум 1х10<’кл./мл.
Большая часть ошибок при этом методе происходи!
из-за неправильного взятия образца и переноса клеток
в камеру. Удостоверьтесь, что клеточная суспензия как
следует перемешана до топ», как вы переносите обра-
зец, и не позволяйте клеткам осесть или адгезировать
в наконечнике автоматической иииетки в процессе
переноса их в счетную камеру. Убедитесь также, что
вы получили суспензию единичных клеток, поскольку
агрегаты делают подсчет неточным. Большие ai рега-
ты клеток могут проникать в камеру медленнее, чем
суспензия, или не проходить вовсе. Если в ходе приго-
товления клеточной суспензии не удается преодолеть
агрегацию клеток (см. табл. 13.4), лизируйте клетки в
Рис. 21.2. Электронный счетчик клеток CASY. Счетчик
клеюк CASY 1 (Scharfc Systems), также подходит для опре-
деления размеров клеток и обнаружения жизнеспособных
н нежизнеспособных клеток, а также одиночных клеток и
агрегатов (С любезного разрешения Scharfc Systems.)
0,1 М лимонной кислоты, содержащей 0,1% крцстал-
лвиолета при 37 °C в течение 1 ч и затем подсчитайте
ядра [Sanford et al., 1951].
21.1.2. Электронный подсчет клеток
Основным поставщиком электронных счетчиков кле-
ток являются компании Beckiuan Coulter (Coulter Z1 u
Z2) u Scharfe Systems (CASY 1; см. ниже). Оба кроиз-
K насосу
400 мкм ___
t Считывание результатов:
количество клеток в
отношении к диаметру клеток
иоьем । а (по изменению сопротивления)
Жидкость для счетчика, например D-PBSA или CASY-электролит
Рис. 21.3. Схема работы счетчика клеток CASY. Электро-
тит (например, D-PBSA или CASY-T.icKipo.iirr) в трубке с
отверстиями соединен с насосом и пропускает определенный
объем образца клеток из стакана. Клетки, проходя через от-
верстие, изменяют поток струи и генерируют сигнал, ампли-
туда которого пропорциональна объему клетки. (С любезного
разрешения Scharfc Systems.)
384
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
водителя используют принцип, разработанный Coulter
Electronics (теперь Beckman Coulter) но которому
клетки, прогоняемые через маленькое отверстие, по-
вышают электрическое сопротивление тока, текущего
через это отверстие пропорционально объему клетки,
что дает серию импульсов, которые сортируются и
подсчитываются.
Электронный счетчик клеток CASY' (см.
рис. 21.2). В нас гоящем электронном счетчике имеется
три основных компоненты (см. рис. 21.3): 1) дроссель-
ная трубка с отверстием, диаметром 150 мкм, связанная
с дозирующим насосом; 2) усилитель, анализирующий
интенсивность импульса, и иересчетное устройство,
соединенное с двумя электродами, одним в дроссельной
трубке и друг им — в стаканчике с образцом; 3) аналого-
во-цифровое считывающее устройство, показывающее
результаты подсчета клеток и другие количественные
параметры, такие как объем клеток и расиредыение
клеток ио размерам, в зависимости от модели обору-
дования (Scharfe Systems).
Когда начат подсчет клеток, измеряемый объем
клеточной суспензии пропускается через отверстие
(см. рис. 21.3). При прохождении каждой клетки через
отверстие ина изменяет сопротивление потока жидкос-
ти, протекающей но трубке пропорционально размеру
клетки. Это изменения сопротивления генерирует
импульс, который усиливается и регистрируется. По-
сколысу размеры импульса пропорциональны объему
клетки (или любой другой частицы), проходящей через
отверстие, генерируется серия сш налов различной ам-
плитуды. Нижний порог измерения (диаметр клетки)
ограничивается установленным на счетчике для того
чтобы снизить электронный шум и не учитывать сгус-
тки клеточного дебриса, регистрируя только клетки
(см. ниже раздел Калибровка). Верхний порог также
устанавливается исследователем или остается постоян-
ным в зависимости от модели счетчика. Эти порши
определения устанавливают размеры pei истрируемых
частиц. На дисплее счетчика изображается тстограмма
распределения клеток ио размерам
Протокол 21.2. может быть использован вместе с
упражнением 12 (см. 1Л. 2).
ПРОТОКОЛ 21.2. Электронный подсчет
клеток на основании электрического
сопротивления
Схема
Развести образец клеток в электролите (физиолО! и-
ческий раствор или D-PBSA), поместить разведен-
ный образец под дроссельную трубку и подсчитать
клетки, upoi нав 0,5 мл образца через счетчик.
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные.
• Культура клеток
• D-PBSA
• 0,25% неочищенный трипсин
• Ростовая среда
Нестерильные.
• Стаканчики для подсчета
Протокол
1. Триисинизируйте клеточный монослой или от-
берите образец суспензионной культуры. Клетки
должны быть хорошо перемешаны и суспендиро-
ваны до единичных клеток
2. Разведите образец клеточной суспензии в от-
ношении 1:50 в 20 мл жидкости для подсчета
в 25-мл химическом стакане или одноразовых
стаканчиках для счетчика. Применение авто-
матического диспенсера (см. рис. 5.20) ускорит
разведение и повысит воспроизводимость ре-
зультатов.
Замечание. Быстрое разливание жидкости для
подсчета может вызвать образование пузырей воз-
духа, которые могут быть оценены как клетки ири
прохождении через канал счетчика. Следовательно,
жидкость должна стоять несколько секунд до нача-
ла подсчета. Если сначала разливается жидкость, а
затем добавляются клетки, то эта проблема будет
мин имизирована.
3. Хорошо перемешайте суспензию, поместите ее
под наконечник дроссельной трубки, убедив-
шись, что канал закрыт и наружный электрод
ширужен в жидкость в стаканчике с образном
4 Проверьте настройку upoi раммы:
а) Выберите порш (и) настройки (минимальный
размер клетки, обычно 7,0 мкм).
б) Объем, который будет подсчитан (обычно
0.5 мл).
в) Необходимые арифметические вычисления
(если используется).
) Индекс разведения (наиример, 50 если под-
считывается 0,4 мл в 20 мл D-PBSA)
5. Проверь те визуальны й аналоговый дне илей:
а) убедитесь, что все клетки попадают в пределы
порогов подсчета;
б) проверьте жизнеспособность или клеточ-
ный дебрис (обнаруживается но падению на
кривой min гистограмме ниже нормального
уровня);
в) проверь! е наличие агрегации (обнаруживает-
ся ио решетрации частиц, размеры которых
значительно превышают установленный
диапазон определяемых клеток).
6. Начните процесс подсчета ири помощи счетчика.
7. Koi да подсчет клеток закончен, распределение
клеток ио размерам будет представлено на
аналоговом дисплее (рис. 21.4). Переключение
на цифровую форму даст количество клеток в
миллилитрах.
21.1. Подсчет клеток
385
Диаметр клеток
Рис. 21.4. Аналоговая распечатка результатов подсчета
клеток на электронном счетчике CASY. Сопоставление
числа клеток и их диамет ра позволяет провеет и анализ
раслрсдслсння клеток но размеру и выявить нижний предел
определения (вертикальная штриховая линия) На распечатке
верхнип предо i мпже г быть уе ановлен на уровне 30 мкм ил и
может быть оставлен неопределенным. Пик до вертикальной
пунктирной линии и вертикальной точечной линии представ -
ляет собой нежизнеспособные клетки, данные могут быть
использованы вместе с данными подсчета жизнеспособных
клеток для определения процента жизнеспособности (С лю-
безного разрешения Scharfc Systems.)
Анализ. Если препаративная работа и разведение
выполнены правильно, то концентрация клеток будет
подходящей HjIH использования в качестве начальной
для последующего разведения. В противном случае,
если счетчик установлен на измерение 0,5 мл ири раз-
ведении 1:50, конечный подсчет результата следует ум-
ножить на 100 для того, чтибы получить концентрацию
исходной клеточной суспензии в кл. мл. Тем не менее
некоторые счетчики автоматически компенсируют
разведение образца, поэтому внимательно изучите
инструкцию к прибору
Калибровка. Старые счетчики требовали калиб-
ровки путем подсчета клеток в пробах возрастающей
концентрации начиная с пороговой величины (верх-
ний предел не устанавливается). График полученных
результатов дает плато, центр которою определяет.
В современных счетчиках с аналоговым дисплеем
нижний uopoi может быть установлен вручную на
дисплее, обычно эта величина составляет 7,0 мкм,
верхний uopoi устанавливается на уровне 30 мкм или
оставляется неопределенным. Установление порога на
значении 7,0 мкм может привести к подсчету нежизне-
способных клеток, в то время как более высокие зна-
чения пороговой величины (12 мкм на рис. 21.4) буду?
исключать большинство нежизнеспособных клеток.
Нежизнеспособные клетки имеют, видимо, меньший
диаметр, поскольку цитоплазматическая мембрана
становится проницаемой, в то время как цитоплазма
сохраняет то же сопротивление, что и электролиты, а
cm нал, возникающий при определении сопротивле-
ния, генерируется за счет ядра. Обнаружение клеток с
диаметром 30 мкм и выше означает наличие агре|атов,
которые могут быть частично исключены установле-
нием верхнею предела измерения (например, 25 мкм
или 30 мкм на рис. 21.4) либо использованием ста-
тистических методов, подходящих для программного
обеспечения данного прибора
Электронный счетчик клеток Beckman Coulter
Vi-CELL. Этот счетчик использует анализ внешнего
вида сканируемой клетки в оптическом потоке клеток
и определяет различия между живыми и мертвыми
клетками путем их окрашивания Тринаном-синим.
Результаты мтут быть представлены на дисплее, где
жизнеспособные клетки обведены зеленым цветом, а
нежизнес иособные красным. Счетчик также создает
аналоговый график распределения клеток ио размерам,
устанавливая верхний и нижний пределы (рис. 21.5).
Этот счетчик должен быть настроен но четырем пара-
метрам для каждого типа клеток.
Электронный подсчет клеток — быстрый метод, ко-
торый имеет низкую собственную ошибку, поскольку
подсчитывается большое количество клеток Хотя
из-за наличия агре|атов, мертвых клеток и частиц деб-
риса большого размера имеется большая возможность
неверной интерпретации результатов, возможна их
коррекция путем исключения мертвых клеток и агрт-
гатов как на CASY, так и на Vi-CELL, ири этом CASY
может вносить программируемую соответствующую
коррекцию по исключению aiperarou. Клеточная cvc-
Рис. 21.5. Электронный счетчик клеток Beckman Coulter
Vi-CELL. Неразбавленная клеточная суспензия помещает-
ся в чашечке в держа |сль для образца, образец отбираемся
в счетчик (справа), смешивается с трилановым синим и
анализируется в потоке клеток Результаты представлены
на дисплее (с зева) в виде графика распределения клеток ио
размерам или как вид клеток иод микроскопом, где живые
kjicikii обведены зеленым цветом, а мертвые красным. (С лю-
безного разрешения АТСС.)
386
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
пензия должна быть тщательно исследована до начала
разведения и подсчета на счетчике
CASY; Vi-CELL дает возможность визуального на-
блюдения за клеточной суспензией в ходе подсчета.
Электронные счетчики клеток дороги, но при
правильном использовании удобны и дают большую
скорость и точность при подсчете клеток.
21.1.3 . Окрашенные монослой
Бывают случаи, кот да клетки не могут быть собраны
для подсчета или кот да их слишком мало в суспензии
(наиример, при низкой концентрации в микротитра-
ционных планшетах). В этом случае клетки могут быть
фиксированы и окрашены in situ, а затем подсчитаны
визуально под микроскопом. Поскольку эта процедура
утомительна и связана с высокой ошибкой оператора,
предпочтительнее использовать метод изотопного
мечения или оценку общего количества ДНК (см. иро-
токол 21.3) или белка (см. иротокол 21.4), хотя эти из-
мерения не могут прямо коррелировать с количеством
клеток — например, если варьирует клеточная илоидия.
Грубая оценка количества клеток в ячейке может быть
получена окрашиванием клеток кристалл-виолетом и
измерением светшии лощения денситометром. Этот
метод также использовался для подсчета количества
клеток на колонию при исследовании клонального рос-
та [McKeehan el al., 1977J. Окрашивание клеток Кумас-
cu-блю, сульфородамином В [Boyd,1989; Skehan el al.,
1990], или MTT [Plumb et al., 19891 также дает оценку
количества клеток, если допустить, что в стандартном
графике зависимости поглощения от количества клеток
имеется линейная зависимость (см. протокол 22.4)
Окрашивание МТТ имеет еще то преимущество, что
окрашиваются лишь жизнеспособные клетки.
21.2. ВЕС КЛЕТОК
Сырой вес редко используется, если только не имеют
дело с очень большим количеством клеток, поскольку
значительное количество адгерентной внеклеточной
жидкости вносит большую ошибку измерения. Одна-
ко, по очень грубой оценке, можно считать, например,
что около 2рх 10* клеток HeLa (14 16 мкм в диаметре)
весят 11 сырого веса, так же как примерно 8 10x10х кле-
гок мышиной лейкемии например, мышиной лимфомы
L5178Y, клеток мышиной эритролейкемии Friend,
миеломы и гибридом (11 12 мкм в диаметре). Около
1,8х 10х клеток человеческих диплоидных фиброблас-
тов (16—18 мкм в диаметре) также весят один грамм
(табл. 21.1). Сухой вес также используется редко,
поскольку соли, выделившиеся из среды, вносят свой
вклад в вес нефиксированных клеток, а фиксированные
клетки теряют часть внутриклеточных низкомолеку-
лярных веществ и липидов. Тем не менее оценка сухого
веса может быть получена при помощи интерферометра
[Brown & Dunn, 1989].
21.3. СОДЕРЖАНИЕ ДНК
На прак! ике, помимо подсчета количества клеток, наи-
более полезными количественными методами оценки
клеточного материала являются методы оценки ДНК
и белка. ДНК может быть исследована несколькими
флюоресцентными методами, включая реакцию с
DAPI [Brunk et al., 1979], PicoGreen (набор для иссле-
дований компании Molecular Probes), либо Hoechst
33258 [Labarca and Paigen, 1980]. Флюоресцентное
излучение Hoechst 33258 при 458 нм возрастает ири
взаимодействии зонда с ДНК при pH 7,4 и ири высокой
концентрации соли из-за диссоциации белков хромати-
на. Этот метод обладает чувствительностью 10 hi 'мл,
но требует наличия интактной двухцепочечной ДНК.
ДНК также может быть измерена по абсорбции при
260 нм, при этом концентрация 50 мкг .’мл дает оптичес-
кую плотность (O.D.) 1.0. В результате интерференции,
связанной с друг ими клеточными компонентами, метод
прямого поглощения полезен только для очищенной
ДНК. Протокол 21.3 является относительно простым
и прямым методом определения количества ДНК.
21.4. БЕЛОК
Оценка количества белка и белковый состав клетки
широко используются для оценки общего количества
клеточного материала, в том числе в экспериментах
по клеточному росту, а также как мера экспрессии
специфической активности ферментов, содержания
рецепторов или концентрации внутриклеточных ме-
таболитов. Количество белка в солюбилизированных
клетках может быть оценено прямо но измерению шм -
лощения при 280 нм, с минимальным взаимодействием
с нуклеиновыми кислотами и друшми веществами.
Поглощение ири 280 нм может определить до 100 мкг
Таблица 21.1. Соотношение между размером клетки, объемом и массой
Тип клетки Диаметр (мкм) Объем (мкм3) Количество кл_/г у 10"®
Теоретическое Измеренное
Мышиная лейкемия (такие как L5178Y or Friend) 11 12 800 1250 1000
HcLa 14 16 1200 800 250
Диплоидные фибробласты человека 16-18 2500 400 180
21.5. Скорость синтеза
387
ПРОТОКОЛ 21.3. Оценка содержания ДНК с
использованием красителя HOECHST 33258
Схема
Гомогенизировать клетки или ткань в буфере и затем
обработать ультразвуком гомогенизат. Перемешать
аликвоту культуры с красителем Н3.3258 и измерить
флюоресценцию.
Материалы
Нестерильные:
• Буфер: 0.05 М NaPOt; 2,0 М NaCl, pH 7,4, содер-
жащий 2x10 ‘М EDTA
• Hoechst 33258: в буфере. 1 мкг/мл если концент-
рация ДНК выше 100 hi/мл и 0,1 мкг/мл если
ДНК составляет 10—100 hi /мл
Протокол
1. Гомогенизируйте клетки в буфере, 1x10 'кл./мл в
течение 1 мин, используя гомогенизатор Поттера.
2. Обработать ультразвуком клетки в течение 30 с.
3. Разведите клетки в отношении 1:10 в Hoechst
33258 и буфере.
4. Определите интенсивность флюоресценции при
492 нм с длиной волны возбуждения 356 нм,
используя ДНК тимуса теленка в качестве стан-
дарта.
белка или примерно 2x10s клеток. Колориметрическое
исследование является более чувствительным, чем из-
мерение not лощения, и среди прочих методов наиболее
часто используется реакция Брэдфорда с красителем
Кумасси-голубой [Bradford, 1976].
ПРОТОКОЛ 21.4. Оценка содержания белка
методом Брэдфорда
Схема
Развести белок, перемешать с цветным реагентом |
и через 10 мин снять показатели оптической плот-
ности (ОП).
Материалы
• Лаурилсульфат натрия (SLS, SDS), 3,5 мМ в воде
или 0,3 М NtfOH
• Кумасси яркий синий G-250.0,12 мМ (0,01%), в
4,7% этанола и 85% (вес объем) фосфорной кис-
лоты: растворить 100 mi Кумасси синего в 50 мл
95% этанола; добавить 100 мл 85% фосфорной
кислоты: и доведите водой объем до 1 л
• Стандартный раствор белка (например, BSA,
10 mki .мл); при первом проведении исследования
и через 1—2 мес для получения калибровочной
кривой использованием BSA или аналошчного
стандартного белка (1—50 mki мл)
Протокол
1. Рашедите белок (1 20 мкг) и.-ui клетки (пример- ।
но 1x10е) в 100 мкл 3.5 мМ SDS в воде или 0,3 М
NaOH. 1
2. В три различные пробирки внесите 100 мкл SLS
(д;1я контрольного измерения), 100 мкл иссле-
дуемо! о раствора белка и 100 мкл стандартного
BSA.
3. Добавьте в каждую пробирку 1,0 мл Кумасси |
синен). Перемешайте и оставьте на 10 мин.
4. Проведите измерения на спектрофотометре при |
595 нм против SLS.
21.4.1. Солюбилизация образца
Поскольку большинство исследований основывается
на последнем колориметрическом этапе, они должны
проводиться в чистых растворах. Клеточный монослой
и клеточный осадок moi ут бы гь растворены в 0,5—1,0 М
NaOH с прогреванием до 100 °C в течение 30 мин или
в течение ночи при комнатной температуре. Дру i им
методом является действие 0,3 М NaOH и 1% лаурил-
сульфата натрия в течение 30 мин при комнатной
температуре. Метод Брэдфорда не зависит от специ-
фических аминокислот и достаточно чувствителен, для
него требуется 50-100 000 клеток. Краситель Кумасси-
голубой подпер!ается спектральным изменениям при
связывании с белком в кислотном растворе. Цвет воз-
никает на определенном этапе после кратковременной
инкубации и может быть измерен в течение 30 мин.
Варианты. Реактивы для метода Брэдфорда
доступны в виде наборов компании Bio-Rad. Для
определения белка moivt быть использованы также
сульфородамин В [Skehan et a]., 1990J и би-хинная
кислота (ВСA) [Smith et al., 1985]. Чувствительность
этих методов позволяет использовать их для микротит-
рации в планшетах. Набор для микро-ВС А, который
производится компанией Pierce (см. Приложение III),
очень чувствителен и подходит для небольшого коли-
чества клеток (-1x10*).
21.5. СКОРОСТЬ СИНТЕЗА
21.5.1. Синтез ДНК
Измерение параметров синтеза ДНК часто рассмат-
ривают как репрезентативный метод количествен-
ной оценки процессов пролиферации (см. также
разд. 22.3.5). рН]-тимидин([-*Н]-ТаК) или pHJ-де-
зоксицитидин является обычным предшественником,
который используется в этих исследованиях. Экспози-
ция с одним из этих препаратов может быть кратков-
ременной (0,5—1 ч) для оценки скорости синтеза или
длительной (24 ч и более) для того, чтобы измерить
накопление синтезированного ДНК при изначально
388
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
низкой скорости синтеза (например, и культурах с
высокой плотностью). [‘HJ-TdR не следует исполь-
зовать для инкубации более чем в течение 24 ч или
при наличии высокий специфической активности, на-
пример ири наличии радиолитического распада ДНК.*
из-за короткой длины иробега ^-излучения (-1 мкм)
распадающегося трития происходит высвобождение
знерггггг внутри ядра, и это вызывает разрушение цепей
ДНК. При продолжительной инкубации или наличии
высокосиецифических активностей требуется исполь-
зование ["CJ-TdR или 32Р.
ПРОТОКОЛ 21.5. Оценка уровня синтеза ДНК
методом включения Н* 2 э * * 6 *-тимидиновой метки
Схема
Пометить клетки [‘HJ-TdR, экстра!ировать ДНК,
определить уровень радиоактивности при помощи
сцинтилляционного счетч и ка
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные.
• Клетки на подходящей фазе деления (выращен-
ные в стеюгянных пузырьках или п|хк>ирках для
тестирования, если используется метод горячего
2 М PC А, в противном случае используйте обыч-
ный пластик)
• [’HJ-TdR, 0,4 МБк/мл (около 10 мкКгг мл),
100 мкл на каждый мл культуральной среды
Замечание: Некоторые среды. например среды Хэма
F10 u F12, содержат'тимидин, который, в конечном
итоге, определяет специфическую активность до-
бавленной метки [ ’HJ-TdR. Следует учитывать этот
фактор при оценке количес гва изотопа, которое вы
будетедобавлять.Хотя40 кБк мл (около 1,0 Ки мл)
изотопа может быть достаточно для большинства
сред, в случае F10 или F12 лучше использовать
0,2 МБк мл (около 5 мкКи/мл)
Нестерильные:
• Трихлоруксусная кислота (ТХУ) 0,6 М (на льду),
6 мл на 1 мл культуры
• HBSS или D-PBSA, на льду, 2 мл на 1 мл куль-
• Перхлорная кислота (PC А), 2 М, или 0,3 М NaOH
с 35 мМ лауриле ул ьфата натрия (SLS. SDS),
0,5 мл на 1 мл
• Метиловый спирт, 1 мл на 1 мл культуры
• Сцинтилляционные пузырьки
• Сцинтиллятор (10х объем перхлорной кислоты
или NaOH SDS)
Протокол
1 Нарастите культуру ди желаемой плотности
(обычно середина log-фазы для максимального
синтеза ДНК или фаза плато для случая ограни-
чения синтеза ДНК плотностью культуры, см.
разд. 18.5.2).
2. Добавьте [’HJ-TdR, 10 К Бк/мл (око-
ло 1,0 мкКи/мл) или 2 МБк . моль (около
50 Ku/моль) в HBSS
3. Инкубируйте клетки 1 24 ч, ио необходи-
мости.
4. Осторожно удалите радиоактивную среду, помес-
тив ее в соответствующий контейнер для жидких
радиоактивных отходов.
5. Тщательно промойте клетки 2 мл HBSS или
D-PBSA, добавьте холодную 0,6 МТХУ (на льду)
на 10 мин. Если клетки плохо прикрепляются,
сначала фиксируйте их метиловым спиртом (см.
протокол 21.6).
6. Повторите дважды иромывку в ТХУ ио 5 мин
каждый раз.
7. Добавьте 0,5 мл 2 М перхлорной кислоты, по-
местите раствор на горячую плитку при 60 °C
на 30 мин, затем оставьте раствор остывать.
В альтернативном случае можно добавить 0.5 мл
SLS в NaOH, и инкубировать в течение 30 мин
при 37 °C или в чеченце ночи ири комнатной
температуре.
8 Соберите раствор, перенесите в сцинтиллятор и
определите радиоактивность в сцинтилляцион-
ном счетчике
Замечание. Если вы используете метод перхлорной
кислоты для определения белка, осадок может быть
растворен в щелочи (см. протокол 21.4). Для того что-
бы подтвердить, что результаты оценки синтеза ДНК
отражают количество клеток, должны быть приготов-
лены реплицированные культуры. Для суспензионных
культур ири выполнении шагов 4,5 и 6 осадите клетки
при 100 g в течение 10 мин. Перемешайте клетки в
Вортекс-миксере для разбивания осадка до каждого
промывания (в 0,6 М ТХУ и 2 М перхлорной кислоте)
на шаге 7. Осадите клетки после шага 7 при 1000g в
течение 10 мин для того, чтобы отделить преципитат
(для оцен ки белка, если .-их» требуется) от су ггернатанта
(для сцинтилляционного счетчика).
• Требование безопасности. [‘Н)-тггмидин
представляет собой биологическую опасность, по-
скольку вызывает радиационное повреждение ДНК.
Позаботьтесь о том. чтобы избежать случайного ио-
падания в организм через пищеварительный тракт, на
поврежденные участки кожи или через дыхательные
пути в виде аэрозоля. При использовании [’Н]-ти-
мидина работайте в боксе биологической опасности
или на открытой рабочей поверхности, но не исполь-
зуйте ламинарный бокс с горизонтальным потоком,
поскольку в этом случае аэрозоль будет выдуваться
прямо на вас.
Инкубация с изотопным предшественником может
привести к различным результатам, в зависимости от
условий инкубации и последующих процессов. Инку-
21.5. Скорость синтеза
389
бация после кратковременного промывания в холод-
ном (на льду) BSS и перенесения в 0,6 М ТСА позво-
лит определить включение метки и, при соблюдении
продолжительности эксперимента в несколько минут,
дает прямое измерение однонаправленного потока.
Считается, что мри экспериментальном измерении
включения н коротком времени инкубации включение
метки в кислотно-нерастворимые молекулы, такие как
белки и ДНК, минимально. Б этих условиях только
кислотно-растворимые молекулы участвуют в процес-
се экстракции в холодной 0,6 М ТХУ. При длительной
инкубации (2—24 ч) пред uo.iai ается, что пул предшест-
венников становится насыщенным. Уровни равновесия
moivt быть определены экстракцией холодной ТХУ;
инкорпорация в полимеры может быть измерена экс-
тракцией с горячей 2 М перхлорной кислотой (ДНК)
и холодным раствором щелочей (РНК) либо горячим
раствором 1,0 М NaOH (белок).
21.5.2. Синтез белка
Колориметрическое исследование позволяет измерить
общее количество белка, присутствующее в данный мо-
мент. Последующее наблюдение в ходе определенного
периода времени может быть использовано для изме-
рения накопления или утраты спектра белков (напри-
мер, синтез-де1радация белка), в то время как скорость
синтеза белка может быть определена путем инкубации
клеток с радиоизотопно меченой аминокислотой, такой
как [ *Н]-лейцин или [,sSJ-метионин и измерением
(например, сцинтилляционным подсчетом) количества
радиоактивной метки, включенной в кислото-раствори-
мые вещества на 101' клеток или на миллиграмм белка в
течение конкретного периода времени.
• Требование безоласности. Манипуляции с
радиоизотопами следует проводить с осторожностью
и в соответствии с местным руководством, регулиру-
ющим разрешенные количества, рабочие зоны, мани-
пуляции и уничтожение радиоактивных веществ (см.
разд. 7.8.5)
ПРОТОКОЛ 21.6. Синтез белка
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
• Культура клеток, наиример 1х10’-1х10|,кл./лун-
ке, в 24-луночном планшете.
• [ЧН] лейцин, 2 МБк мл (около 50 мкКи мл) в
культуральной среде без сыворотки (специфиче
ская активность неважна, поскольку она будет оп-
ределяться ио концентрации лейцина в среде).
Нестерильные
• Лаурилсульфат натрия (SLS или SDS). 1“®
(35 мМ) в 0,3 М NaOH
• Трихлоруксусная кислота (ТХУ)
• Сцинтилляционные пузырьки
* Пробирки Eppendorf
• Сцинтилляционная жидкость с минимум 10%
допустимым содержанием воды
Протокол
1. Инкубируйте культуру до требуемой клеточной |
плотности.
2. Выньте культуру из инкубатора, добавьте пред- ।
варительно подогретый раствор радиоизотопа в I
среде или сбалансированном солевом растворе с
разведением Г.Ю (т.е. 100 мкл на 1 мл на лунку). .
3. Верните культуру в инкубатор так быстро, как |
возможно.
4. Инкубируйте культуру 4—24 ч.
Замечание. Различные белки образуются с различ-
ной скоростью. Пршхжол не имеет в виду какую-то ।
специфическую группу белков, но относится к обще- I
му белку в быстро пролиферирующих клетках. Кот да
проводите анализ синтеза белка в клеточной линии в
первый раз, убедитесь, что скорость си нтеза линейна
в течение выбранного времени инкубации. Могут
возникнуть некоторые сложности, связанные с тем,
что пул аминокислот медленно насыщается.
5. Выньте культуру из инкубатора и осторожно уда- |
лиге среду из ячеек, перенося ее в контейнер для
жидких радиоактивных отходов (уничтожение |
радиоактивных отходов см. разд. 7.7.2).
6. Осторожно промойте клетки холодным раство- I
ром HBSS или D-PBSA
Замечание: Некоторые монослойные культуры, в ।
частности некоторые слабо прикрепляющиеся нос- I
тоянные клеточные линии, такие как HeLa-S3, moi ут I
отделяться от стенок лунки при отмывке. В этом
случае после удаления изотопа добавьте метанол для |
фиксации монослоя. Оставьте культуру на 10 мин.
осторожно удалите метанол и высушите монослой.
7 Перенесите чашки на лед. Добавьте 0,6 М ТХУ
up о 4 °C, на 10 мин для удаления невключенных
предшественников.
8. Повторите mai 7 дважды, изменив время инкуба-
ции до 5 мин.
9. Отмойте культуру с метиловым спиртом, высу
шите чашки
10. Добавьте 0,5 мл 0.3 М NaOH. содержащего 1 % SLS, I
оставьте на 30 мин при комнатной температуре.
11. Смешайте содержимое каждой ячейки п перене
сите в отдельные сцинтилляционные пузырьки.
12. Добавьте 5 мл сцинтиллятора и произведите |
подсчет на сцинтилляционном счетчике.
Замечание: Предпочтительно использовать сцин-
тилляторы, способные к биодеградации, наиример, ।
Ecosciul, которые, в отличие от толуол- или кси- I
лолсодержащнх жидкостей, менее токсичны при |
390
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
манипуляциях и могут быть вылиты в раковину с
большим избытком проточной воды, так чтобы уро-
вень радиоактивности упал ниже установленного
законодательством.
При работе с суспензионными культурами, на
шаге 5 для удаления среды осадите клетки при
1000 g в течение 10 мин, так же как на шагах 6,7,
и 8. шаг 9 опустите, чашки мшут быть количест-
венно исследованы м(»1 помощи системы форми-
рования изображения на основе фосфора.
21.6. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ
ДЛЯ ФЕРМЕНТНОГО И
ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
Поскольку количество клеточною материала, доступ-
ного в культуре, часто слишком мало для гомогениза-
ции, требуются друг ие методы лизиса, позволяющие
высвобождаться растворимым продуктам и фермен-
там, которые затем могут быть исследованы. Удобно
поместить культуру в необходимом количестве в
многолуночные планшеты или пробирки для образцов
(см. разд. 22.3.5 и протоком 21.8) или трипсинизиро-
вать партию культуры и поместить аликвоты клеток
в пробирки для исследований. В .любом случае клетки
следует промыть в HBSS или D-PBSA, для того чтобы
удалить сыворотку, а затем добавить лизирующий
буфер. Лизирующий буфер следует подбирать в
соответствии с последующими исследованиями, но
если это не является определяющим, то можно ис-
пользовать 0,15 М NaCl или D-PBS. Если продукты,
концентрация которых будет измеряться, являются
мембранно-связанными, то добавьте в лизирующий
буфер 1% детергента (деоксихолат Na, Nonidet Р40).
Если клетки находятся в осадке, ресуспендируйте их
в буфере при помощи Вортекс-миксера. Проведите
троекратное замораживание-оттаивание путем поме-
щения в этиловый спирт, содержащий твердый СО,
(—90 °C) примерно на 1 мин и затем в воду при 37 "С
на 2 мин (для образцов объемом более 1 мл дольше).
Наконец, осадите пробу при 10 000 g в течение 1 мин
(например, в центрифуге Eppendorf), и соберите супер-
натант для исследования. Можно т акже использоват ь
весь экстракт для изучения ферментативной актив-
ности. а затем осадить центрифуг ированием нераст-
воримую часть, если это необходимо для дальнейших
исследований.
21.7. ЦИТОМЕТРИЯ
21.7.1. Мечение in situ
Флюоресцентное мечение, как прямое с флюоресцент-
ной меткой (наиример, Hoechst 33258 для ДНК) или с
конъкл ированными антителами для определения анти-
гена либо с молекулярным зондом (см. протокол 27.9 и
27.8), позволяет измерить количество фермента, ДНК,
РНК, белка, или друг их клеточных компонентов in situ
при помощи CCD камеры. Этот процесс обеспечивает
проведение как качественного, так и количественного
анализа, но при большом количестве клетоъ, которые
должны быть сканированы, требует достаточно mhoi о
времени.
21.7.2. Проточная цитометрия
Проточная цитометрия клеточной суспензии [Vaughan &
Miller,1989J (см. также разд. 16.9.2; рис. 15.9), в образце
с концентрацией до 1x10' клеток позволяет измерять
различные клеточные компоненты и активности
[Kurtz & Wells, 1979; Klingel et al., 1994]. Этот метод
дает* возможность изучать корреляционные взаимо-
связи этих параметров с друг ими, такими как размеры
клетки, линия дифференцировки, содержание ДНК и
жизнеспособность клеток [ Al-Ruheai et al., 19971.
21.8. УВЕЛИЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА
ОБРАЗЦОВ ДЛЯ СТАТИСТИЧЕСКОГО
АНАЛИЗА
Поскольку в большинстве случаев культивируемые
клетки могут быть приг отоплены в виде однородной
суспензии, необходимость получения большого коли-
чества повторов для статистического анализа является
редкой. Обычно достаточно получить три повтора,
а для многих простых исследований (наиример, для
подсчета клеток) достаточно дуцликатов. Многие
типы культуральных сосудов мог ут применяться для
получения повторов экспериментов монослойных
культур (см. разд. 8.2), выбор культуральных сосудов
определяется 1) количеством клеток, требуемых для
каждого образца, и 2) кратностью или типом отбора об-
разцов. Наиример, если время инкубации не меняется,
предпочтительно выращивание одинаковых образцов
в многолуночных планшетах, таких как микротитра-
ционные планшеты или 24-луночные планшеты. Од-
нако если образцы собираются в течение некоторого
периода времени (например, ежедневно в течение
5 дней), то постоянные манипуляции с планшетами
для ежедневных отборов проб могут ухудшать качество
роста в остальных лунках. В этом случае дубликаты,
образцы лучше готовить в отдельных пробирках или
4-луночных планшетов. Могут быть использованы
плоские стеклянные или специально обработанные
для культуры тканей пластиковые пробирки. Наилуч-
шими являются пробирки Leighton, поскольку они
обеспечивают плоскую поверхность роста. С другой
стороны, если оптические свойства пробирок неважны,
плоскодонные стеклянные пробирки для образцов и
даже стеклянные сцинтилляционные пузырьки мо-
ут быть достаточно хорошими контейнерами. Если
используются стеклянные пузырьки или пробирки.
21.9. Клеточная пролиферация
391
они должны быть вымыты и обработаны как стекло
для культивирования тканей (см. разд. 11.3.1); они не
должны быть использованы для тканевой культуры
после сцинтиллятора. Запечатывание большого ко-
личества пузырьков или пробирок может стать доста-
точно утомительным, поэтому многие исследователи
предпочитают запечатывать пробирки виниловой
лентой, а не заворачивающейся крышкой. Такие ленты
могут быть разноцветными, что позволяет исполь-
зовать цвет в качестве кодировки для разных целей.
Адгезивная пленка может быть также использована
для запечатывания микротитрационных планшетов
(см. Приложение II: Приспособление для заклеива-
ния планшет ов). Это позволяет- снизить испарение
и контаминацию и дает больше преимуществ перед
друt ими планшетами. Это также означает, чт о инди-
видуальные лунки или ряды могут быть взяты для
получения образцов, без открывания остальной части
планшета. Манипуляции с суспензиями обычно легче,
чем с монослой нымн культурами, поскольку форма
контейнера и его поверхностный заряд менее важны.
М HOt ократный отбор образцов может быть произ-
веден из одного и тоге же флакона с суспензионной
культурой. Этот метод удобнее применят ь, используя
запечатанную бутыль с силиконизированной резино-
вой мембраной ловушкой (Pierce) и применением
ширина и иглы (не забывайте возмещать объем отби-
раемой культуры равным объемом воздуха).
21.8.1. Получение данных
Анализ данных, полученных на культурах клеток,
не обязательно отличен от анализа результатов, по-
лученных при друtux исследованиях. Тем не менее
достаточно легко обеспечить получение большого
количества данных в экспериментах на клеточной
культуре. В частности, при работе с микротитрацион-
ными планшетами исследователь получает- несколько
сотен цифр без больших затруднений либо даже
несколько тысяч при использовании роботизирован-
ных устройств. Манипуляции с этими результатами
будут зависеть от тоге, как они получены, от условий
эксперимента и ряда других параметров. Хотя подсчет
клеток является приемлемым методом для получения
данных и последующего построения кривой роста для
одной линии клеток при двух-трех наборах условий,
построение большого числа кривых роста при дей-
ствии комбинации разных факторов роста не является
распространенным методом. Если выбран колоримет-
рический анализ как конечный этап, то может быть
использовано поглощение (например, МТТ-исследо-
вание; см. протокол 22.4) или флюоресцентное излу-
чение (например, сульфородамина |Воу<1,1989]),тогда
планшеты исследуют ся на ридере автоматическом
считывающем устройстве, и уменьшение количества
данных достигается использованием соответствую-
щег о программного обеспечения. На последнем этапе
радиометрического анализа (наиример, с |'Н]-тими-
дином) микротитрацмонные планшеты могут быть
одномоментно протестированы в сцинтилляцион-
ном счетчике (PerkinElmer). Аналогичным образом,
большое количество пробирок с образцами и у или
P-метками может быт ь автоматически считано путем
роботизированной системы (Beckman Coulter).
21.8.2. Анализ данных
Способность дават ь большое количество данных обус-
ловлено возможностью анализа большого количества
рейликацио иных систем, таких как микротитраци-
онные системы. Как в случае анализа ELISA, шаг ом,
ограничивающим скорость исследований, является не
этап получения данных, а период их анализа. Таким
образом, важно ири выборе параметров измерения
подобрать такую систему культивирования, которая
обеспечит не только получение определенного коли-
чества данных, но и предполагает методы их обработки.
Самым простым методом является прямое введение
данных в компьютер: в локальную сеть или в персо-
нальный компьютер, в котором содержатся результаты
выполняемого проекта. Ряд компаний поставляют на
рынок компьютерные программы, которые выводят
на дисплей и анализируют данные, получаемые с
микротитрационных рпдеров (не только ELISA). Эти
программы включают титрационные кривые, фермен-
тативную кинетику и исследование связывания. При
наличии необходимых навыков и с использованием
электронных таблиц для импорта данных, вы сможете
сами установить такой тип программы либо пригла-
сить консультанта из компании, выпускающей ридеры
планшетов (см. Приложение II).
21.9. КЛЕТОЧНАЯ ПРОЛИФЕРАЦИЯ
Измерение скорости клеточной пролиферации часто
используется для определения реакции клеток на
отдельные стимулы или токсины (см. протоколы 21.7
и 21.8). Количественный анализ кривой роста также
важен при обычном поддержании культуры, поскольку
он является решающим элементом для мониторинга
постоянства культуры и позволяет определить наилуч-
шее время для субкультивирования (см. разд. 13.7),
оптимальное разведение, и оценить эффективность
посева при различной клеточной плотности. Тести-
рование среды, сыворотки, новых культуральных
сосудов или субстратов и т. д. также требуют количес-
твенной оценки.
21.9.1. Планирование эксперимента
Знание стадии роста культуры и параметров ее кине-
тики является критическим для планирования экс-
перимента в культуре клеток. Культуры значительно
отличаются друг от друг а но мног им свойствам в lag-
392
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
фазе, периоде экспоненциального роста (log-фазе) и
периоде стационарного роста (млато). Таким образом,
важно принимать во внимание не только состояние
культуры, но и стадию начала эксперимента, время
отбора образцов, для того чтобы определить наличие и
интенсивность пролиферации в эти моменты, а также
время удвоения популяции (PDT) и продолжитель-
ность клеточною цикла. Популяция клеток, которые
выходят на стадию плато, имеет значительно меньшую
долю рас гущих клеток и разнообразную морфолт ию,
клетки moi ут быть более дифференцированными или
более поляризованными. Обычно они имеют тенден-
цию к секреции больше! о количества внеклеточно! о
матрикса, и мтут возникнуть сложности при дезан*-
peiauiiii. В целом, клеточные культуры более единооб-
разны в log-фазе. отбор образцов в конце log-(Jia3bi дает
самый высокий выход клеток и воспроизводимость.
Важно также учитывать действие продолжитель-
ности эксперимента на переход из одного состояния
культуры в другое. Добавление фармаколо! ического
препарата в середине экспоненциальной фазы и в более
поздние сроки может привести к различным резуль-
татам, в зависимости от того, находится ли культура
еще в экспоненциальной фазе, koi да ее снимают для
анализа, или уже перешла в фазу млато. Исследование
цитотоксичности при помощи микротитрациониых
планшетов (см. разд. 22.4) moivt привести к ошибоч-
ным результатам, если культура достш ает фазы плато
в процессе исследования; в то время как клетки в тех
ячейках, в которых плотность выше, достигают млато
и скорость пролиферации снижается. В результате
отмечается значительный сдвш величины ID5U (ин-
шбирование 50% культуры), который тем выше, чем
большее количество ячеек содержит клетки в ({йзе
плато (см. протокол 22.4). Таким образом, график об-
работки и отбора образцов требует де гально! о знания
параметров цикла роста.
21.9.2. Цикл роста
Как было описано выше (см. разд. 13.7.2), мосле суб-
кч'льтнвирования клетки развиваются по определенной
схеме, проходя через этапы lag-фазы, экспоненциаль-
ной или log-фазы и стационарной или фазы илато
(рис. 21.6). Фазы ло1 и илато дают крайне важную
информацию о клеточной линии, в том числе и время
удвоения клеточной популяции (PDT) в ходе экспо-
ненциального роста и максимуме клеточной плотности,
достш аемой в фазе плато (т.е. плотности насыщения).
Измерение PDT используется для количественной
оценки ответа клеток на различные ншибиторы или
стимуляторы культур, такие как различия концентра-
ции ми гательных веществ, действие гормонов или ток-
Дни субкультивирования
Рис. 21.6. Кривая роста. Полулогарифмическая кривая возрастания клек1чной концентрации (левая ось) и плотности клеток
(н|)авая ось) иослесубкультивировання Культуры были посажены в 25-см2флаконы, ежедневно образцы отбирались для под-
ечС|э. Можно провести прямую линию через ту часть графика, кторая представляет собой экспоненциальную фазу, и получить
время удвоения попучяции (PDT) из серединной области этой фазы. Промежуток времени, отделеннып точкой пересечения
е линией, экстраполированной от начала экспоненциальной фазы, с линией начальной посевной концентрации время lag-
фазы. доС| ижение плотности насыщения
клеточной концентрации без ее возрастания)
выход на плато (но крапней мерс. три точки, показывающие неизменную величину
21.9. Клеточная пролиферация
393
сических препаратов. Эт<л показатель также хорош для
контроля культивирования ири серийных пассажах и
позволяет оценивать клеточный выход и рассчитывать
фактор разведения ири субкультивировании.
Отдельные временные точки недостаточны для мо-
ниторинга роста культуры, если неизвестны параметры
и форма кривой роста. Снижение количества клеток
после, скажем, 5 дней может быть вызвано снижением
скорости роста некоторых или всех клеток; удлинением
lag-периода, пред иолатающим адаптацию клеток или
потерей клеток (трудно обнаружить различия между
последними двумя процессами); или снижение плот-
ности насыщения (см. рис. 21.8). Это не означает, что
кривые роста не представляют ценности. Они мотут
быть полезны для испытания сред, сывороток, фак-
торов роста и некоторых лекарственных препаратов.
Если при мониторинг е культуры ответ* на воздействие
оказывается полностью охарактеризован, и тип ответа
становится предсказуемым (например, изменения
PDT), то отдельные точки наблюдения мотут быть
определены как известные в середине log-фазы. Кривые
роста, в частности, полезны для определения плот-
ности насыщения, хотя степень роста при плотности
насыщения должна оцениваться ио индексу мечения
ири помощи pHJ-тимидина (см. разд. 18.5.2 и прото-
колы 21.11,21.12).
Значение PDT, полученное из кривой роста, не
следует путать с продолжительностью клеточного
цикла или временем тенерации. PDT представляет
собой интетральную величину, которая применима
ко всей популяции, и описывает суммарный резуль-
тат широкого спектра скоростей клеточною деления,
включая нулевую, имеющих место в конкретной
культуре. Время клеточного цикла, или время генера-
ции. измеряется от одной точки клеточного цикла до
следующей такой же точки (см. разд. 21.12) и имеет
отношение только к делящимся клеткам в популяции,
в то время как PDT зависит как от нерастущих, так
и от погибающих клеток. Значения PDT варьируют
от 12—15 ч в быстро растущей культуре мышиных
лейкемических клеток, (наиример, L1210) до 24—36 ч
во многих ирикрепленных ггостоянных клеточных
линиях и даже до 60 или 72 ч в медленно растущих
конечных клеточных линиях. Новый цикл роста начи-
нается каждый раз, когда культура пересаживается и
может* быть проанализирован более детально, как это
описано в протоколе 21.7. Использование флаконов
для получения кривой роста повышает интенсив-
ность работы, ограничивая количество репликаций
до двух в день в течение 10 дней, требуя 20 флаконов
и 4 дополнительных флакона для окрашивания илгг
использования в качестве резервных. Для быстрорас-
тущих клеточных линий следует выбрать клеточную
концентрацию 2х 10* кл./мл; для медленно растущих
конечных клеточных линий 1x105 кл. мл. После-
дующее гговторение кривой роста с более высокой
и более низкой посевной концентрацией позволит
скорректировать величину посевной концентрации
и установить интервал субкультивггровання (см.
ПРОТОКОЛ 21.7. Кривая роста монослоя
во флаконах
Схема
Прш отовнть флаконы и ежедневно подсчитывать
клетки пока культура не достиг нет фазы плато.
Материалы
Стерильные или асептически притотовленные:
• Монос* до иная клеточная культура, А549, Vero,
или HeLa-S3, в 75-см2 флаконе, на стадии поздней
log-фазы...............................1
• Трипсин неочищенный, 0.25%, с 10 мМ
EDTA...............................5 мл
• Ростовая среда с 4 мМ NaHCO,......200 мл
• D-PBSA (для предварительной промывки и под-
счета вдеток).........................50 мл
• Флаконы, 25 см2___ . .............24
Протокол
1. Трипсинизируггте клетки, как обычно, ири суб-
культивированин (см. нротокол 13.2)
2. Разведите клеточную суспензию до 2x10’ кл./ мл I
в 150 мл среды.
3. Посейте клетки в 24 25-см2 флакона
4. Закройте флаконы и ггоставьте в инкубатор при |
температуре 37 °C
Замечание. Для большей простоты при выполне-
нии зтого ггротокола предусмотрена низко-бикар-
бонатная (4 гпМ) среда. нг> если вы используете
би карбонатную среду, (наггрггмер, 23 мМ), то запол-
ните флаконы 5й;» СО2 или поместите их, ослабив ।
крышки или используя газопроницаемые крышки
в СО2-инкубатор.
5. Через 24 ч возьмите два ггервых флакона из ин-
кубатора, подсчитайте клетки:
а) Полностью удалите среду.
б) Добавьте 2 мл трипсина или смеси трипсин/ ।
EDTA в каждый флакон
в) Инкубируйте 15 мин.
г) Диспергируйте клетки в смеси трипсин EDTA
и ггеренесите 0,4 мл суспензии в 19,6 мл |
D-PBSA.
д) Подсчитайте количество клеток в электрон-
ном Счетчике клеток. ।
6. Повторить отбор образцов через 48 и 72 ч. как в I
шаге 5.
7. Если через 72 ч илгг ранее обнаруживается па-
дение pH, поменяйте среду (см. нротокол 13.1; |
цв. вкладку 226).
8. Продолжайте ежедневный отбор образцов для |
быстро растущих культур (с периодом удвое-
ния популяции (PDT) 12-24 11), для медленно
растущих культур (PDT >2411), снизьте частоту
взятия образцов до 1 раза в 2 дня, пока не будет
достигнута фаза плато.
394
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
9 Продолжайте менять среду каждые 1,2, или 3 дня
кри падении pH.
10. Окрасьте клетки к одним флаконе на 2, 5, 7, и
10 дни (см. разд. 16.4.2)
Замечание: Для подсчета клеток можно использо-
вать гемоцитометр, однако ei о использование может
быть затруднено малым количеством клеток в начале
кривой роста. Если вы используете гемоцигометр,
снизьте объем трипсина до 0,5 мл, тщательно диспер-
। ируйте клетки при помощи автоматической пинетки
стараясь не вспенивать трипсин, и перенесите клетки
в гемоцитометр.
разд. 13.7.2). Данный протокол может быть исполь-
зован вместе с упражнением 16 (см. гл. 2).
Этот тик исследования полезен для сравнения
различных сред, добавок, стимуляторов и ингибито-
ров роста. Однако для количественною анализа ири
одном или нескольких изменяющихся параметрах
предпочтительно использовать мноюлуночные план-
шеты. Протокол 21.8 может также быть использован
для 12-луночных планшетов цри выполнении упраж-
нения 16 (см. гл. 2).
ПРОТОКОЛ 21.8. Кривая роста монослоя
в многолуночном планшете
Схема
Подготовить серию многолуночных планшетов с
культурами upu грех различных концентрациях
клеток, ежедневно подсчитывать количество клеток
на одном планшете, иока культуры не выйдут на
стадию плато.
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные.
• Монослой ная клеточная культура, А549, Vero,
или HeLa-S3, в 75-см2флаконе, на стадии поздней
log-фазы................................1
• Трипсин неочищенный, 0,25%, с 10 мМ
EDTA...............................5 мл
• Ростовая среда, 100 мл, с 26 мМ NaHCOt 300 мл
D- PBSA (для предварительной промывки и
подсчета клеток).....................50 мл
• Планшеты, 12- луночные......... ....10
Нестерильные:
Пластиковые коробки для хранения планшетов.
• СО2-инкубатор или С О,-источник для продува-
ния 5% СО,
Протокол
1. Трписинизпруйте клетки, как при обычном суб-
культивировании (см. протокол 13.2).
2. Разведите клеточную суспензию до 1х10’кл./мл,
Зх10* *кл./мл, и 1x10*кл./мл, в 25 мл среды для
каждой концентрации.
3. Посейте три 12-л у ночных планшета, по 2 мл
клеточной суспензии при концентрации
1x10*/мл в 4 верхних лунки, ио 2 мл клеток,
Зх10*/мл, во второй ряд лунок и по 2 мл клеток
с концентрацией IxlO1 'мл в каждую лунку тре-
тьего ряда (рис 21.7). Добавляйте клеточную
суспензию медленно, от центра ячейки, что
позволит предотвратить завихрение ио стенкам
лунок. Не встряхивайте планшеты для переме-
шивания клеток, поскольку циркулярное дви-
жение среды приведет к концентрации клеток
в центре ячейки.
4. Поместите планшеты во влажный С О,-инку-
батор или закупоренные стеклянные коробки
с 5% СО2.
5. Через 24 ч возьмите первый планшет и.з инку-
батора и подсчитайте количество клеток в трех
ячейках при каждой концентрации.
а) Полностью удалите среду из трех лунок, содер-
жащих клетки, которые будут подсчитаны.
б) Добавьте0.5 мл смеси трипсин EDTA в каж-
дую из трех лунок.
в) Инкубируйте планшет в течение 15 мин.
1) Добавьте 0,5 мл среды с сывороткой, дисцер-
1 ируйте клетки в смеси трипсин EDTA сре-
да и перенесите 0,4 мл суспензии в 19,6 мл
D-PBSA.
д) Подсчитайте клетки в электронном счетчике
клеток
6. Окрасьте клетки в оставшихся лунках при каждой
плотности клеток (см. разд. 16.4.2).
Замечание: Для подсчета клеток можно использо-
вать гемоцитометр, однако его использование может
быть затруднено малым количеством клеток в начале
кривой роста. Если вы используете гемоцитометр,
снизьте объем трипсина до 0.5 мл, тщательно дис-
иерт ируйте клетки при помощи автоматической пи-
петки. стараясь не вспенивать трипсин, п перенесите
клетки в 1 емоцитометр.
7. Повторите отбор образцов через 48 п 72 ч, как в
ша< ах 5 и 6.
8. Если через 72 ч или ранее обнаруживается па-
дение pH. поменяйте среду (см. протокол 13.1:
цв. вкладку 226).
9 Продолжите ежедневный отбор образцов для
быстрорастущих культур (с периодом удвое-
ния популяции (PDT) 12-24 ч), для медленно
растущих культур (PDT >24 ч) снизьте частоту
взятия образцов до 1 раза в 2 дня, пока не будет
достш нута фаза плато.
10. Продолжайте менять среду каждые 1,2, или 3 дня
при падении pH
21.9. Клеточная пролиферация
395
21.9.3. Анализ кривой роста монослоя
1) Подсчитайте количество клеток на одну лунку, на
мл культуральной среды (см. рис. 21.6) и на см2 рос-
товой поверхности в лунках следующим образом:
а) Перчичиый подсчет. Результаты подсчета, полу-
ченные при помощи электронного счетчика или в
гемицитометре, - это количество клеток на 1 мл
триисиннзированной культуры.
б) Количество клеток но флакон или лунку. При
использовании трипсина в объеме 1 мл коли-
чество клеток на флакон или лунку совпадает
с результатом первичного подсчета (см. выше).
При добавлении 2 мл трипсина следует удвоить
результат, при добавлении 0,5 мл разделить
на 2, полученный результат будет означать ко-
личество клеток во флаконе или в лунке.
в) Количество клеток на 1 мл культуральной сре<)ы
(концентрация клеток). Разделите количество
клеток в лунке или флаконе на объем среды,
использованной ири культивировании.
1) Количество клеток на1 с и2 поверхности (к сеточ-
ная плотность). Разделите количество клеток
в лунке или флаконе на площадь поверхности
лунки или флакона. Поскольку обычно имеются
незначи тельные вариации размеров между раз-
ными производителями оборудования, постольку
следует подсчитать ростовую поверхность имен-
но для тех флаконов или лунок, которые вы
используете в работе. По грубой оценке, каждая
2 3 4
!_______________ Клетки для
! подсчвта
Клетки для окрашивания
Клетки ____________ ! ________ Клетки
1 го типа *"1 2-го типа
"г 3 4 5 6 \
Рис. 21.7. Внешний вид многолуночных планшетов. Внешний вид (а) 12-луночншт> планшета е клетками в трех различных
концентрациях и лунками, для подсчета и окрашивания и (б) 24-луночного планшета с дополнительными вариациями для
двух типов клеток
396
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
лунка в 24-луночном планшете имеет площадь
2 см-, a в 12-луночном планшете 3,8 см-. Фла-
коны, рекомендуемые и протоколе 21.7, имеют
площадь поверхности 25 см2.
2) Составьте график зависимости клеточной плотности
(кл./см2) и клеточной кониентрации (кл. 'мл) (оба
параметра в лшарифмической шкале) от времени
(в линейной шкале) (см. рис. 21.6). Шкалы измере-
нии по обеим вертикальным осям одинаковы, но не
учитывают фак гор, связывающий площадь и объем
среды. В 25-см2 флаконе обычно помещается 5 мл
среды, покрывающей данную площадь, 0,2 мл см2
или 5 см2 .мл среды, поэтому правая ось будет свя-
зываться с данными на левой оси фактором 5, т.е.
1x10’ на левой оси будет эквивалентно 2х1О5 на
правой оси.
3) Определите время lag фазы, PDT и плотность кле-
ток на плато (см. рис. 21.6; см. также разд. 21.11.1).
4) Установите соответствующую начальную плот-
ность для рутинной процедуры пересева из прото-
кола 21.7. Повторите эксперимент по получению
кривой роста при различных концентрациях клеток,
если это необходимо.
5) Сравните кривые роста при различных условиях
(рис. 21.8) и постарайтесь интерпретировать данные
(см. пояснения к рис. 21.8).
6) Исследуйте окрашенные клетки при различных
плотностях для тою, чтобы
а) определить, является ли распределение клеток
по флакону или в лунке единообразным и растут
ли клетки на боковых сторонах лунки;
б) исследуйте различия в клеточной морфолоти
при возрастании клеточной плотности;
Рис. 21.8. Интерпретация кривой роста. Изменения формы
кривон роста могут быть интерпретированы различными
способами, поме ки в «легенде» на этом графике объясняют
отличия нормального графика от остальных кривых
в) сравните межклеточные взаимодействия в
нормальных и трансформированных культурах
клеток.
21.9.4. Объем среды, концентрация
и плотность клеток
При использовании мноюлуночных планшетов и
сравнении результатов с культивированием во фла-
конах важно помнить, что объем среды, используемой
в мноюлуночных планшетах, часто пропорционально
выше, чем во флаконе для данной площади поверх-
ности и плотность клеток будет выше для одной и той
же клеточной концентрации (см. разд. 13.7.3)
Если посеять 5 мл суспензии 2х101кл./мл в
25-см2 флакон, то плотность клеток при посеве будет
4000 кл. см2 (20 000x5-1-25), в то время как если такая
же концентрация клеток посеяна в 2-мл лунку 12-лу-
ночною планшета, то концентрация клеток составит
10 500 кл. см2 (20 000x2-^3.8) Эта плотность вдвое
выше, чем во флаконе, и клетки доспи нут плато по
крайней мере на 1 день раньше. Если проводится стро-
гое сравнение, то должно учитываться отношение сре-
ды с поверхностью культивирования, которое должно
быть одним и тем же, и объем 0,75 мл для одной и той же
клеточной концентрации потребует достижения такой
же клеточной плотности в многолуночном планшете,
что и в 25-см2 флаконе. К сожалению, такой низкий
объем может вызвать неравномерное распределение
клеток в результате искривления мениска жидкости, и
клетки будут распределяться с большей плотное? ыо у
краев лунки. С уменьшением диаметра лунки эта про-
блема усиливается, поскольку относительная кривизна
мениска возрастает с уменьшением диаметра лунки.
Многолуночные планшеты подходят для сравнения
различных условий роста, среды, сыворотки и фак-
торов роста или цитотоксинов, но если исследования
кривой роста используются для установления условий
рутинною ведения культуры, то эти исследования
должны проводиться в тех же емкостях, в которых
затем будет проводиться субкультивирование (хотя
различие между 25-см2 флаконом и 75-см2 флаконом
будут минимальным, если объем среды в см2 остается
постоянным). Можно проводить построение кривой
роста в микротитрационных планшетах, наиример
как контроль для мониторинга количества клеток ири
исследовании цитотоксичности (см. разд. 22.3.3). Од-
нако, поскольку площадь поверхности роста на лунку в
этом случае очень мала, количество клеток будет также
очень малым, ио крайней мере в начале эксперимента,
поэтому для подсчета клеток следует 1руппировать
четыре—восемь лунок.
21.9.5. Суспензионные культуры
Кривая роста также может быть получена при росте
клеток в суспензии, обычно без замены среды. Цели
21.9. Клеточная пролиферация
397
исследования в этом случае обычно бывают такими
же, как в случае монослойных культур, т.е. определе-
ние условии Культивирования для рутинного ведения
культуры или исследование различии в условиях роста.
Поскольку в данном случае не требуется трипсиниза-
ция, поскольку из одного и того же сосуда может быть
отобрано несколько проб.
Варианты. Посейте ио 20 мл клеточной суспензии
в два 75-c.vr флакона для каждой концентрации клеток
Отбирайте ио 0,4 мл культуры из каждого флакона
ежедневно или так, как вам это необходимо. Тщательно
перемешивайте культуру каждый раз перед отбором
образцов, держите флаконы вне инкубатора в течение
минимального промежутка времени. Не меняйте пита-
тельную среду и не добавляйте питательных веществ в
ходе построения кривой роста.
Помимо того, вы можете использовать флаконы с
перемешиванием (Techne, Integra, Bellco) и ежеднев-
но отбирать образцы. Если в таких флаконах имеется
ПРОТОКОЛ 21.9. Кривая роста
суспензионной культуры
Схема
Подготовить серию культур мри трех различных кон-
центрациях клеток, подсчитывать клетки ежедневно,
пока культура не достш нет фазы плато
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
• Суспензионная клеточная культура
• Ростовая среда, 100 мл
• D-PBSA (для подсчета клеток)
• Планшеты 24-луночные
Нестерильные:
• Пластиковые коробки для хранения планшетов
• СО, инкубатор или СО, источник для продувания
5% СО,
Протокол
1. Добавьте клеточную суспензию в ростовой среде
в лунки планшетов в тех же концентрациях, что
и в случае монослойных культур (см. прото-
кол 21.8).
2. Отберите но 0,4 мл культуры из трех лунок через
равные интервалы убеждаясь, что клетки хорошо
перемешаны н полностью дезл pei провали.
3. Подсчитайте образцы на электронном счетчике
клеток (см. разд. 21.1.2) или гемоцитометре (см.
разд. 21.1.1).
4. Подсчитайте клеточную концентрацию в образце
и постройте график зависимости концентрации
клеток в лшарифмической шкале от времени в
линейной шкале (см. разд. 21.9.3). Понятие «кле-
точная плотность» неприменимо к суспензион-
ной культуре, поскольку клетки не адгезивны
мембранное перекрытие, то отбор образцов может про-
изводиться без вынесения их из термальной комнаты
путем прокалывания мембраны иглой и отсасывания
образца шприцом.
21.9.6. Фазы цикла роста
Цикл роста (см. рис. 21.6) может быть подразделен на
три фазы:
Lag-фаза (латентная фаза). Эта фаза представ-
ляет собой промежуток времени после субкультиви-
рования и пересева, в ходе которого не происходит
видимого увеличения числа клеток. В этот период
адаптации в клетках происходит замена элементов
клеточной поверхности и внеклеточного матрикса,
утраченных при тринсинизации, прикрепление к суб-
страту, и распластывание по поверхности субстрата.
В ходе последнего процесса происходит восстанов-
ление цитоскелета как интегральной части процесса
адгезии. Возрастает активность ферментов, таких
как ДНК-нолимераза, затем начинается синтез новой
ДНК и структурных белков. Некоторые специализи-
рованные клеточные продукты мшут исчезать и не
появляться вновь до прекращения клеточного деления
при высокой плотности клеток.
Log-фаза (фаза логарифмического роста). Эта
фаза — период экспоненциально! о нарастания коли-
чества клеток вслед за окончанием латентной фазы,
и она завершается одним или двумя удвоениями
популяции клеток после достижения стадии конфлю-
ентного монослоя. Продолжительность фазы ло1 ариф-
мического роста зависит от посевной концентрации
клеток, скорости роста клеток, и плотности клеток,
ишибирующей клеточное деление. В log-фазе фрак-
ция делящихся клеток высока (обычно 90 100%), и
культура находится в своем наиболее репродуктивном
состоянии. Это оптимальное время для взятия образца,
поскольку популяция наиболее однородна н жизнеспо-
собность наивысшая. Тем не менее клетки случайным
образом распределены по стадиям клеточного цикла и
для некоторых целей необходимо их синхронизировать
(см. разд. 27.5).
Фаза плато (стационарная фаза). Ближе к за-
вершению ло1 арифмической фазы культура становится
конфлюэнтной, т. е. вся поверхность, доступная и под-
ходящая для роста культуры, оказывается занятой клет-
ками, которые контактируют друг с другом. После .лого
скорость роста культуры снижается, и в некоторых слу-
чаях клеточное деление полностью прекращается после
одного или двух последующих удвоений популяции
(см. разд. 18.5.2). На этой стадии культура переходит
на стадию плато, и фракция делящихся клеток падает
до значений от 0 до 10%. Клетки становятся менее под-
вижными; некоторые фибробласты становятся особым
образом ориентированными относительно друг друга,
398
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
образуя типичную сеть клеток. Волны возбуждения
ци тоилазматическои мембраны уменьшаются, клетка
занимает меньшую площадь поверхности, н меньшая
площадь ее контактирует' со средой. Может произойт и
относительное повышение синтеза специализирован-
ных либо структурных белков, может измениться состав
и заряд клет очной поверхности. Прекращение подвиж-
ности, снижение активных перемещений в мембране
клетки, и прекращение роста клеточной культуры, ко-
торые происходят ио дост ижении конфлюэнтного слоя,
были впервые описаны Abercrombie и Heaysman [1954].
Совокупность этих процессов получила название кон-
тактного торможения. Позже было установлено, что
подавления роста нормальных клеток посче конфлю-
энции достигается не только в результате контакта с
дру! ими клетками. Оно также связано с уменьшением
степени распространенности клетки [Stoker et al., 1968;
Folknian& Moscona, 1978J, нарастанием концентрации
ишибиторов, и истощением питательных веществ, в
частности факторов роста [Dulbecco& Elkington, 1973;
Stoker, 1973; Weslermark & Wasteson, 1975] в среде
[Holley el al., 1978]. Эго истощение может быть локаль-
ным астатическом монослое, с образованием размытого
пограничного слоя вокру! клеток [Stoker, 1973], что
может быть преодолено орошением монослоя. Термин
плотностное ограничение (клеточной пролиферации)
обычно используется для тою, чтобы подчеркнуть,
что контакты клеток не являются 1лавным О1рани-
чивающим фак юром [Stoker & Rubin,1967], а термин
контактное торможение лучше использовать для собы-
тий, которые являются непосредственным результатом
клеточного контакта (например, снижение клегочной
подвижности и мембранной активности, происходящее
при формировании монослоя с ориентацией клеток в
отношении другдрхча
Культуры нормальных простых эпителиальных и
эндотелиальных клегок прекращают расти по достиже-
нии конфлюэнтного монослоя и пребывают в состоянии
монослоя. Однако большинство культур, тем не менее,
при pei улярном обновлении среды будут продолжать
делиться (хотя и со сниженной скоростью), несмотря
на конфлюэнтность, что приводит к формированию
многослойной клеточной структуры. Эмбриональные
легочные фибробласты и фибробласты кожи взрослого
человека, у которых имеет место контактное hhi иби-
рование подвижности, будут продолжать делиться,
укладывая слои коллагена между клеточными слоями,
до тех пор. цока не будет сформирована многослойная
структура, в оптимальных условиях из шести или семи
слоев [Kruse etal., 1970].
Эти фибробласты сохраняют упорядоченность
параллельных сеточных структур. Таким образом, тер-
мины плато или стационарная фаза не совсем точно
определяют сущность процесса и должны использо-
ваться с осторожностью. Культуры, склонные к спон-
танной трансформации или трансформированные при
помощи вируса или химическо! о канцерогена.обычно
будут достигать более высокой клеточной плотности на
стадии илато, чем их нормальные эквиваленты [Wes-
Lenuark, 1974] (рис. 21.9). Эта более высокая плотность
клеток связана с более высокой фракцией делящихся
клеток и снижением чувствительности клеточной
пролиферации к плотности клеток. Фаза плато в этом
случае представляет собой стадию равновесия между
Рис. 21.9. Плотность насыщения В результате трансформации клеток пропеходит повышение плотности насыщения суспен-
зии, в сравнении с эквивалентными нормальными клетками. Это возрастание часто сопровождается укорочением ВУП [данные
получены на к.(стках нормальной человеческой глин и клеточной линии глиомы, Frcshney et aL неопубликованные данные!
21.10. Эффективность культивирования
399
клеточной пролиферацией и t ибелью клеток. Рост этих
культур часто является невависитм от прикреп имия
к субстрату, т.е. они могут быть легко переведены в
суспензионные кул ьтуры.
21.9.7. Данные, получаемые
при исследовании кривой роста
Построение кривой роста производится на основании
подсчета числа клеток через определенные интервалы
времени после toi о, как субкультивирование позволяет
произвести измерение множества параметров, которые
должны быть найдены, чтобы охарактеризовать клеточ-
ную линию в данных условиях культивирования.
Первый из этих параметров продолжительность
латентного периода, или lag-время, полученное путем
экстраполяции линии, проходящей через точки фазы
экспоненциального роста, пока она не пересечется с
линией посевной концентрации, т.е. участка линии
кривой роста, соответствующей 1а§-фазе(см. рис. 21.6).
Затем измеряется время, начиная с момента пересева
до этой точки пересечения. Второй параметр — период
удвоения популяции (PDT), то есть время, необхо-
димое для культуры, чтобы увеличить количество
клеток в два раза в середине экспоненциальной фазы
или log-фазы роста. Этот параметр не следует путать
с временем генерации или продолжительностью кле-
точного цикла (см. разд. 21.12), которые определяются
измерением перехода популяции клеток от одной
точки клеточного цикла, до его возвращения к тому
же самому пункту.
Последний из обычно получаемых параметров
цикл роста — уровень плато и плотность насыщения.
Уровень плато это концентрация клеток (клеток/мл
среды) на стадии илато и зависит от типа клеток и
частоты замещения питательной среды. Плотность
насыщения — плотность клеток (кл./см2 поверхности
роста) в стадии плато. Плотность насыщения и уровень
илато трудно определить точно, поскольку устой-
чивое состояние в стадии илато неле|КО доспи нуть
В идеале, культура должна быть перфузирована, без
питательных слраничений или истощения факторов
роста. Разумный компромисс достигается путем вы-
ращивания клеток на о|раниченном пространстве,
скажем, покровною стекла диаметром 15-мм или в
фильтрующей лунке, в чашки Петри с диаметром 9 см
и объемом среды 20 мл, которая заменяется ежедневно
(см. иротокол 18.3) При этих условиях ограничение
роста со стороны среды минимально, и плотность
клеток является основным фактором, оказывающим
влияние на параметры кривой роста.
Число клеток при этих условиях является более
точным и воспроизводимым, чем при выходе на плато
при обычных условиях культивирования. Обратите
внимание, что термин плато не подразумевает полное
прекращения клеточною деления, но представляет
собой устойчивое состояние, в котором деление клеток
сбалансировано утратой клеток.
Хотя неправильно творить о «плотности насыще-
ния» в суспензионной культуре, не прикреилящиеся
клетки moi ут выйти на стадию плато из-за истощения
среды. Часто, однако, клетки суспензионной культуры
в стадии плато будут входить в стадию апоп гоза доста-
точно быстро и не смогут даже дать реальное плато.
В случае нормальных клеток, устойчивое состояние
может быть достижимо путем истощения среды — без
дополнительною внесения в среду факторов роста.
В этом случае клетки пересеваются и растут, и плато
доспи ается без замены среды. Ясно, что условия, ко-
торые используются в таких случаях для достижения
стадии плато, должны быть тщательно определены.
21.10. ЭФФЕКТИВНОСТЬ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Формирование колоний на чашках Петри с плотной
питательной средой при низкой плотности клеток, или
определение эффективности культивирования, являет-
ся предпочтительным методом для анализа пролифера-
ции клеток и их выживания (см. также протокол 22.3).
Этот подход показывает различия в скорости роста в
пределах популяции и обнаруживает различия между
изменениями в скорости роста (размер колонии) и
выживании клеток (число колоний). Нужно помнить,
тем не менее, что клетки moivt расти по-другому в
виде изолированных колоний при низкой плотности
клеток. В этой ситуации даже при идеальных условиях
в живых останется меньшее количество клегок, и все
факторы, связанные с взаимодействием клеток будут
потеряны, пока не начнет формироваться колония.
Гетерогенность клонального роста отражает различия
в способности пролиферации клонов в пределах попу-
ляции, но эти различия могут быть незначительными
в монослое ири наличии межклеточных контактов
или большей концентрации и возможности развития
межклеточных взаимодействий. При посеве клеточной
суспензии на чашки Петри в низкой концентрации
(2—50 кл. см2), клетки растут как дискретные колонии
(см. протокол 14.1 и цв. вкладку 6). Число этих колоний
может использоваться, чтобы выразить эффективность
культиви рования
N,' N.X100 РЕ,
где N2 количество сформированных колоний: N, -
количество посеянных клегок; РЕ —эффективность
культивирования (plate efficiency).
Если может быть подтверждено, что каждая ко-
лония выросла из отдельной клетки, то этот термин
может быть заменен на эффективность к юнирования.
Измерения эффективности клонирования проводятся
путем подсчета числа колоний размерами более неко-
торого определенного (обычно около 50 клеток) рас-
тущих на чашке после посева в низкой концентрации.
Этот термин не должен использоваться для характе-
ристики культуры при восстановлении прикрепляю-
400
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
щейся культуры при более высокой плотности клеток.
Выживание в этом случае следует характеризовать
эффективностью посева:
N,. N.xlOO-SE,
iaeN-, количество прикрепившихся клеток; N, — ко-
личество посеянных клеток; SE эффективность
посева.
SE следует измерять по завершении прикрепления
большинства клеток, подо начала митозов. Этот момент
трудно точно определить, поскольку разрыв между
завершением прикрепления большей части клеток и
началом митотическою деления может быть очень
небольшим, и эти события нередко перекрываются.
Тем не менее такой подход позволяет грубо оценить
например, выживаемость при рутинном ведении куль-
туры при восстановлении после замораживания, при
формировании первичной культуры и т.д.
Протокол 21.10., разработанный для определения
РЕ, может быть применен при выполнении упражне-
ния 21 (см. гл. 2), наиример с небольшими вариация-
ми, концентрации сыворотки (см. цв. вкладку (>с) и с
применением и без применения фидерно! о слоя (см.
протокол 14.3).
ПРОТОКОЛ 21.10. Определение
эффективности посева на чашках Петри
Схема
Посеять клетки при низкой концентрации клеток
и инкубировать, пока не образуются колонии (см.
протокол 14.1): окрасить и подсчитать колонии.
Материалы
Стерильные:
• Рогюклн грела......................41)0 ли
• I рппсин груби очищенный. 0.25“<.К) мл
• ‘киски П|три,(>гм....................2d
• Пробирки пли уникерс и.1ьные кинк-йнеры для
разведений............................20
Нестерильные:
• Гемоцитометр или электронный счетчик клеток
• Фиксирующая жидкость:
безводный метанол...................100 мл
• D-PBSA..............................200 мл
• Краситель: кристалвиолет............100 мл
• Фильтровальная воронка и фильтровальная
бума! а
Протокол
1 Триисинизируйте клетки (см. протокол 13.2) для
получения суспензии единичных клеток
2 Пока клетки трипсинизпруются,
а) Пронумеруйте чашки со стороны дна
б) Отмеряйте среду для последующего разведе-
ния клеток (рис. 21.10). Должно быть более
чем достаточно среды для трех параллельных
разведений каждой концентрации.
3 Koi да клетки приобретут окруцчую форму и на-
чнут отделяться:
а) дпс пер! ируйте монослой в среде, содержащей
сыворотку или ишибитор трипсина;
б) подсчитайте клетки:
в) разведите клетки до
i) 2x10* * /мл в двух 25-см2флаконах для обыч-
ного поддержания культуры
ii) 2x10* /мл как наивысшая концен |рация для
последующе! о разведения
iii) пять дальнейших разведений суспензии (ii)
должны дать 200. 100,50.20, и 10 кл./мл.
4. Посейте в чашки Петри клетки в каждой из
концентраций в 5 мл среды (iii). Посейте клет-
ки в 2 6-см чашки Петри при концентрации
2x10*к.! , мл для тово, чтобы использовать в
качестве контроля в случае, если клонирование
будет безуспешным (дли подтверждения того, что
в исходной суспензии клетки присутствовали, по
крайней мере, при максимальной концентрации).
5. Заполните флаконы 5% СО2 и поместите в ин-
кубатор.
6. Поместите чашки Петри в прозрачную пластико-
вую коробку и поместите во влажный СО2-инку-
батор. желательно ограничить доступ к одной из
чашек и сохранить ее для клонирования.
7. Инкубируйте чашки до появления видимых не-
вооруженным глазом колоний (13 нед.).
8. Окрасьте колонии кристалвиолетом.
а) Удалите среду из чашек.
б) Промойте клетки D-PBSA, смейте промывоч-
ный раствор
в) Добавьте 5 мл свежего D-PBSA и затем 5 мл
метанола, осторожно перемешивая (избщая
повреждения колоний).
i) Замените смесь D-PBSA: метанол (50:50) на
5 мл свежего метанола и фиксируйте клетки
в течение 10 мин.
д) Удалите метано.!, добавьте профильтрован-
ный кристалвиолет 2—3 мл на 6-см чашку, убе-
дившись, что вся поверхность роста покрыта
красителем.
е) Окрашивайте 10 мин.
ж) Удалите краситель, верните ею обратно в
бутылку, профильтровав через фильтр.
i) Промойте чашки водой, позвольте высохнуть.
9 Подсчитайте колонии в каждой чашке, исключая
те колонии, в которых имеется менее 50 клеток.
Увеличивающий окуляр может обле:чить под-
счет колоний.
Будет необходимо определить nopoi, за которым
колонии не будут учитываться. Если большинство
колоний содержат от стадо нескольких тысяч клеток,
то пределом следует считать 50 клеток в колонии.
На практике это фактически естественный предел
21.10. Эффективность культивирования
401
Ри с. 21.10. Разведение клеток для клонирования. Предлагаемый режим серийного разведения клеток даст ш ироний диапазон
плшностн посева, подходящий для клонирования клеточной линии в первый раз или для установления линейной зависимости
эффективности посева or посевной (см рис. 21 11). Впослсдовнн, когда выбрана подходящая концентрация, клетки могут быть
разведены в несколько шагов до желаемой концентрации
видимости невооруженным глазом. Однако, если
колонии очень малы (<!()() клеток), то предел со-
ставляет' 16 клеток на колонию. Ниже 16 клеток,
что эквивалентно 4 последовательным клеточным
делениям, было бы затруднительно предполагать
продолжительное клеточное деление
21.10.1. Анализ формирования колоний
Подсчитайте эффективность культивирования (см.
Подсчет во введении к этому разделу) при каждой
посевной плотности. Эффективность культивиро-
вания должна оставаться постоянной независимо от
плотности посева (т.е. iрафик количества колоний в
зависимости от количества посеянных клеток должен
быть линейным). Тем не менее некоторые клетки могут
не образовывать колоний при очень низкой посевной
концентрации, и эффективность культивирования
снизится. Это влияние можно минимизировать путем
использования фидерного слоя (см. разд. 14.2.3). Если
эффективность культивирования надает при более вы-
соких концентрациях, то это предполагает агрегацию
клеток или слияние колонии. Посевная концентрация,
которая соответствует линейному участку iрафика
402
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
Рис. 21.11. Линейность эффективности посева. Если эффек-
тивность посева остается постоянной в пределах широкого
диапазона концентраций клеток, кривая линейна (пунк-
тирная линия), в то время как при низкой выживаемости
при низкой плотности или агрегации клеток при высокой
плотности зависимость эффективности посева от посевной
концентрации нешней на (сплошная линия)
Рис. 21.12. Автоматический счетчик колоний. Автомати-
ческий счетчик колоний, применяемый для оценки эффек-
тивности посева и исследований выживаемости (Perceptive
Biosystems)
зависимости эффективности культивирования от ко-
личества посеянных клеток (рис. 21.11), должна быть
выбрана как рабочая для последующих исследований.
Можно также провести исследование распределе-
ния колоний по размерам (наиример, при исследовании
стимулирующей рост клеток активности среды или
сыворотки, см. разд. 11.4.3) путем подсчета количества
клеток в колонии визуально или ио данным денсито-
метрии. Для тою чтобы это сделать, при помощи денси-
тометра измеряют ши лощение света после фиксации и
окраски колонии кристалл-виолетом [McKeehan el al.,
1977] или определяют размер колоний на автомата чес-
ком счетчике колоний (см. разд. 21.10.2).
21.10- 2. Автоматический счетчик колоний
Если колонии единообразны но форме и достаточно
дискретны, они мщут быть подсчитаны при помощи
автоматического счетчика колоний (см. Приложение II:
Счетчики колоний), которые сканируют планшет при
помощи CCD-телекамеры и а нал пзпруют изображение с
получением mi новенною результата подсчета количества
колоний (рис. 21.12). Дискриминатор размеров позволяет
анализировать размеры колоний на основе средней вели-
чины диаметра колоний, но диаметр колоний не все| да
пропорционален количеству клегок в колонии, поскольку
клетки могут накапливаться в центре колонии.
Хотя автоматические счетчика колоний достаточно
д<>рО1 и, они moi ут сэкономить мною времени и сделать
подсчет колоний менее субъективным. Тем не менее
они не достаточно хорошо работают, если происходит
перекрывание колоний более чем на 20% или колонии
имеют неправильные контуры.
ПРОТОКОЛ 21.11. Индекс мечения
Н3-тимидином
Схема
Вырастить клетки до соответствующей плотности.
Пометить клетки [ *Н J-tu миди ном в течение 30 ми н.
Промыть, фиксировать клегки. Удалить невключив-
шийся предшественник (т.е. ’НТ) и прин>товить
авторадиограммы.
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
• Культура клеток для исследования
• Ростовая среда
• Трипсин неочищенный. 0,25%
- D-PBSA
• [’Н [-тимидин, 2,0 МБк/мл (~50мкКи/мл).
75 ГБ к моль (~2Ки/моль)
• Требование безопасности: Манипуляции
с |‘,Н]-тимидином должны проводиться с осторож-
ностью, поскольку 1>н радиоакт ивен и 1енотоксичен.
Следуйте принятым Руководствам ио ею использо-
ванию (см. разд. 7.7).
• Мноюл vночные планшеты, содержащие 13-мм
покровные стекла Thennanox (Nalge Nunc).
Нестерильные.
• Гемоцптометр или электронный счетчик клеток
- D-PBSA
• Уксуснокислый метанол (1 часть ледяной ук-
сусной кислоты на 3 части метанола), на льду,
свежеприготовленный
• Предметные стекла
21.11. Индекс мечения
403
• Среда для заключения препаратов (например,
DPX или Permount)
• Трихоруксусная кислота (ТХУ), 0,6 М, на льду
• Деионизованная вода
• Метанол
Протокол
1. Приготовьте культуру в концентрации 2х 10" кл./
мл 5x10* кл./ мл в 24-луночном планшете, со-
держащем покровные стекла.
2. Позвольте клеткам прикрепиться и начать де-
литься (48—72 ч), растите до желаемой Клеточной
плотности.
3. Добавьте [‘Н J-тимидин к среде 100 К Бк мл
(около 5 мкКи мл), и инкубируйте культуры в
течение 30 мни
Замечание. Некоторые среды, например среды Хама
F10 и F12, — содержат тимидин (см. табл. 9.3,10.1, и
10.2). Б этих случаях концентрация радиоактивного
тимидина должна быть увеличена для получения
таком же специфической активности в среде.
4. Удалите среду, содержащую метку, слив ее в
контейнер для жидких радиоактивных отходов
5. Промойте трижды покровные стекла в D-PBSA.
Приподнимайте покровные стекла со дна лунок,
( не вынимая их полностью) при каждой промыв-
ке, чтобы удалить изотоп из-под них.
6. Добавьте но 1мл в каждую лунку раствор
D-PBSA: уксуснокислый метанол, 1:1, затем не-
медленно удалите eio
7. Добавьте 1 мл уксуснокислого метанола при 4 °C
в каждую лунку, оставьте на 10 мин.
8. Выньте покровные стекла, высушите их при по-
мощи вентилятора.
9. Приклейте покровные стекла на предметные стек-
ла при помощи среды для заключения препарат,
клетками наверх.
10. Оставьте на ночь высохнуть.
11. Поместите стекла в 0,6 М ТХУ при 4 °C в чашке
для окрашивания поставьте на 10 мин. Замените
ТХУ дважды в ходе экстракции, что позволит
удалить невключившиеся предшественники
(‘НТ).
12. Промойте стекла деионизованной водой, зат ем в
метаноле и высушить стекла.
13. Приготовьте авторадиограммы (см. прото-
кол 27.3).
14. После экспозиции авторадиограммы в течение
соответствующего периода (обычно!-2 неде-
ли), обработайте и окрасьте клетки (см. прото-
кол 27.3), исследуйте под микроскопом с об ьек-
тивом 40х.
15. Подсчитайте процент меченых клеток. Чтобы
исследовать репрезентативное поле, следуйте
направлениям сканирования, представленным
на рис. 21.14.
21.11. ИНДЕКС МЕЧЕНИЯ
Клетки, которые синтезируют ДНК, будут включать
метку |',Н|-тггмидин (см.разд. 21.5.2.). Процент' меченых
клеток, определяемый авторадггографггчески (см. прото-
кол 27.3), называется индексом мечения (LI, labeling in-
dex) [см., например, Weslermark, 1974, Macieira-Coellu»,
1973J. Измеренгге LI после 30—60-минутного периода
включения метки с [‘Н J-тимндггном обнаруживает боль-
шую разницу между экспоненциально растущими клет-
ками (LI - 10—20%) и клетками на стационарной стадии
(LI- 1%). Было показано, что нормальные клетки Mvl Lu
имеют более низкий LI ггри мечении [’НJ-тимидином,
чем их неопластические производные, трансфициро-
ванные мутантным геном гая неопластических клеток
[Khan el al., 1991J (см. нв. вкладку 14г и рис. 21.13).
Поскольку LI для клеток на фазе плато очень низок,
продолжительность времени мечения [’HJ-тимидином
может быт ь увеличен до 24 ч для выявления различия
ггри плотности насыщения.
Рис. 21.13. Индекс мечения. Пнсвмоцггты норки, MvlLu.
и онкоген-трансфицированные производные были мечены
[‘HJ-TdR в течение 1 ч. фиксированы, покрыты авторадио-
графической эмульсией (см. протокол 27.3), окрашены по
Гимза (см цв. вкладку 14г). или мечены в течение 1 ч бром-
дсоксиуридином (ВийК),фикс1грованы и окрашены ггммуно-
перокстгдазой с антитс.гами про tub BUdR, связанной с ДНК
Меченые ядра были подсчитаны в процентном соотношении
от общего количества в каждом случае. MvlLu —контрольная
клеточная линия. Ml MvlLu, трансфицированная онко-
геном myc, N1 MvlLu, грансфицпрованная нормальным
человеческим геном гая, Т1 MvlLu, грансфицированная
мутантным человеческим геном гая Т1-клстки были туморо-
генны и имели статистически боле высокий индекс мечения
(р < 0,001) ио сравнению е MvlLu, также отмечаемом при
мечении с бромодсоксиурпдином [данные Khan etal, 1991 ]
404
ГЛАВА 21. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
ПРОТОКОЛ 21.12. Определение фракции
пролиферирующих клеток
Схема
Вносить метку в культуру на протяжении 48 ч, пе-
риодически отбирая пробы для радиоавтографии
Протокол
Следуйте протоколу 21.10. за исключением того, что
ири выполнении шага 3 инкубация должна прово-
диться 15 мин, 30 мин, а затем 1,2,4,8,24 и 48 ч.
21.11.1. Фракция пролиферирующих
клеток
Если клетки метят | *Н|— тимидином в течение различ-
ных промежутков времени вплоть до 48 ч, то i рафик
зависимости LI от времени представляет собой быстро
возрастающую в течение первых нескольких часов кри-
вую, которая потом выравнивается с очень небольшим
градиентом практически до плато (рис. 21.15). Уро-
вень этого плато, соотнесенный с вертикальной осью,
называется фракцией пролиферации культуры — т. е.
долей клеток, находящихся в клеточном цикле во
время мечения.
Анализ. Подсчи таите количество меченых клеток
как процент от общего количества клеток, используя
РИС. 21.14. Направление сканирования препаратов или
чашек. Шаблон сканирования для анализа цитологических
препаратов на стеклах или чашках Ка-кдая пунктирная линия
представляет собой одно иоле зрения микроскопа, большой
круг протяженноегь образца (наиример, покровное с 1скло,
чашка для культивирования, ячейка, или группа клеток на
стекле) Линии могут быть нарисованы при помощи фломас-
тера или маркера светлыми прозрачными чернилами
Рис. 21.15. Фракции роста. Для того чтобы определить фрак-
цию пролиферирующих клеток, клетки попоинно метятся
[3Н [-тимидином, процент меченых клеток определяется через
определенные интервалы времени меюдим авторадиографии
(см текст)
образец сканирования из протокола 21.10. Постройте
график зависимости против времени (см. рис. 21.15).
Замечание. Авторадио! раммы с *Н мсиут быть
приготовлены, только koi да клетки находятся в моно-
слое, затем, после включения метки, они должны быть
триисинизированы и препараты должны быть приго-
товлены методом капли (см. протокол 16.7), поскольку
энершя р-излучения [‘HJ-тимидина слишком низкая,
чтобы проникнуть сквозь вышележащие слои клеток.
LI можно определить также путем мечения клеток
бромдиоксиуридином (BUdR), который включается
в ДНК. Это включение может быть обнаружено затем
при помощи иммуноокрашивания с анти- BudR - ан-
тителами (Dako). Результаты, полученные этим
методом, обычно сшласуются с результатами при
использовании [’Н]-тимидина. [Khan etal., 1991 j (см.
также рис. 21.13).
21.11.2. Митотический индекс
Митотический индекс это фракция или процент кле-
ток, находящихся в митозе, определяющаяся путем
подсчета митозов в окрашенных культурах как доля
от общей популяции клеток. Образец сканирования
препарата таков же, как для подсчета меченых ядер
(см. рис. 21.14).
21.11.3. Индекс пролиферации
Ряд антител, таких как Ki67 [Zhu & Joyce, 2004] или
антн-PCNA [ Kat dare el al., 2004], способны окрашивать
21.13. Клеточная миграция
клетки, находящиеся в клеточном цикле. 3 ги антитела
выработаны против белков, экспрессируемых во время
клеточного цикла и не экспрессируемых в покоящихся
клетках. Некоторые из этих антител направлены про-
тив ДНК-полимеразы, эпитопы друi их неизвестны.
Клетки окрашиваются методом иммунофлюоресцен-
ции или иммунопероксидазогг (см. иротокол 16.11), и
доля окрашенных клеток определяется цитолог ически
(см. рис. 21.14) или методом проточной флюоримег-
рии (см. разд. 16.9.2). Этот показатель дает более вы-
сокий индекс, чем полученный подсчет митотического
индекса или ДНК-мечение, поскольку клетки окра-
шиваются в ходе всего клеточного цикла. Это также
позволяет определять фракцию роста популяции.
21.12. ВРЕМЯ КЛЕТОЧНОГО
ЦИКЛА
Для определения продолжительности клеточного
цикла (времени генерации) и его составляющих частей
клетки постоянно метят при помощи BUtlR и вклю-
чение метки определяют через различные интервалы
времени методом иммунофлюорес цент ной микро-
скопии пли проточной цитометрии Для проточной
цитометрии клетки также окрашивают иод истым
(гропидием и анализируют включение BUdR против
содержания ДНК, что позволяет проследить продви-
жение клеток в клеточном цикле [Dollшаге & Selden,
1994; Pool el al., 1994|.
21.13. КЛЕТОЧНАЯ МИГРАЦИЯ
Клетки в культуре, в частности фибробласты, подвиж-
ны и могут мигрировать на значительное расстояние
ио субстрату, в зависимости от клеточной плотности и
присутствия стимуляторов, таких как факторы рос га.
Подвижность характеризуется ио активности клеточ-
ной мембраны, которая визуализируется замедленной
видеосъемкой. Степень подвижности трудно охарак-
теризовать количественно, но оценка клеточной миг-
рации может быть осуществлена путем тщательного
анализа последовательности кадров видеозаписи (см.
иротокол 27.4) или путем анализа изображения или
треков, оставшихся в результате клеточного фагоци-
тоза на поверхности чашки, ио крытой коллоидным
золотом [Kawa el al., 1997J. Миграция также может
быть исследована путем движения клеток через по-
ристую мембрану, как ири исследованиях хемотаксиса
в камере Бойдена [Sclior, 1994J или при изучении в
фильтрующей ячейке (разд. 18.6.3).
Глава 22
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ
22.1. ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ,
ТОКСИЧНОСТЬ И ВЫЖИВАЕМОСТЬ
Как только клетка переносится из ее норма.>гьной in
vivo окружающей среды, вопрос жизнеспособности, в
частности в отношении экспериментальных исследо-
ваний, становится фундаментальным. Предыдущие
главы име^ш отношение к состоянию материалов для
культивирования, связанных с тканями источника-
ми происхождения, с характерными количественными
изменениями в росте, и фенотипической экспрессии.
Однако никакие из экспериментальных данных не мо-
гут считаться ириелыемыми, если только не доказано,
что большинство клеток сохраняют жизнеспособность.
Более того, многие эксперименты, которые проводятся
in vitro, имеют единственную це.ль опреде.>гить потен-
циальную цитотоксичность некоторого изучаемого
вещества, в частности если это вещество является
фармакологическим или косметическггм препаратом,
и в этом случае необходимо показать, что вещество не-
токсично, либо, если препарат предполагается исполь-
зовать как противораковый, цитотоксичность является
существенным моментом его активности.
Новые лекарства, косметика, шгщевые добавки, и
т.д. проходят мноочпсленные испытания на цитоток-
сичность до того, как они будут доггущены к широкому
использованию. Эти испытания обычно включают
большое количество экспериментов на животных,
хотя в Европе в отношении этих экспериментов раз-
рабатывается новое законодательство, которое, как
предполагают, будет введено в 2009 г. для средств
местного ггрггмененггя и в 2013 г. для средств общего
действия. Существует значительное давление как со
стороны общественности, так гг с экономической точки
зрения требующее проводить, по крайней мере, часть
исследований цитотоксичности на культуре клеток in
vitro. Введение специализированных клеточных линий
и интерактивных органотигигческих культур, а также
продолжи тельное использование дол гоживущих куль-
тур могут послужить обоснованным пред<гоженггем для
решения этого вопроса.
Токсичность ком и леке явлгений, имеющих место
in vivo, среди которых могут быть прямое поврежде-
ние клеток, как в случае цитотоксического действия
протггвораковых препаратов, физиологические .гффек-
ты такие как мембранный транспорт в почках или
нейротоксичность в мозге, воспалительное действие,
как местное, так и общее, и другие системные эффекты.
В настоящее время трудно выявлять системные и фи-
зиологические эффекты in vitro, поэтому большинство
исследований определяют токсическое действие на
клеточном уровне, или цитотоксичность. Определе-
ния цитотоксичности разнообразны, в зависимости
от природы исследований, а также от того, убивает
препарат клетки или просто изменяет ггх метаболизм.
Поскольку может потребоваться, чтобы противо-
раковый агент уничтожал югеткгг, то обнаруженное
отсутствие токсичности может привести к проведе-
нию 6ojiee тонкого анализа специфических мишеней,
такого как нарушение ггередачгг сиг нала в югетке или
межклеточного взаимодействия, результатом которых
может быть развитие воспалительной или аллергиче-
ской реакцшг.
Все эти исследования чрезмерно упрощают собы-
тия, которые они моделируют и ггзмеряют, однако они
применяются благодаря тому, что они дешевы, легко
могут быть количественно охарактеризованы и вос-
производимы. Тем не менее накапзпгваются данные,
показывающие, что они не всегда адекватны целям
исследованггя фармакологических препаратов, которые
действуют на уровне специфических молекулярных
мишеней и точного определения метаболической
регуляции. Приблизительных тесты ццтоксичности
пока еще используются, однако существует все возрас-
тающая потребность применения более тонких тестов,
позволяющих обнаружить метабо.пгческие нарушения.
Возможно, наиблмее наглядным примером является ин-
дукция развития воспалительного или аллергического
ответов, которые не предполагают непосредственно
цитотоксического поврежденггя со стороны аллергена
или воспалите^гьного агента. Этот феномен является
цока наиболее трудновосггроизводимым in vitro
В этой главе не предгихгагается оиредежггь все тре-
бования к исследованиям цитотоксичности, многие из
которых могут быть достаточно специализированы в
отношении целей исс^гедованггя. Вместо этого я сосре-
доточусь на тех аспектах, которые влияют на клеточных
рост и выживаемость. Под клеточным ростом обычно
подразумевают регенеративный гготенциал клегок,
который определяется по клональному росту (см.
протокол 21.10), величине отклоненггя от расчетной
кривой роста популяцгш (наиример, гго кривой роста,
см. протоколы 21.7 и 21.8), либо изменению к^геточной
массы (общее количество белка или ДНК) или мета-
22.2. Ограничения in vitro
407
болической активности (наиример, синтез ДНК, РНК
или белка; МТТ редукции).
22.2. ОГРАНИЧЕНИЯ IN VITRO
Важно то, что любые измерения in vitro могут быть ин-
терпретированы для предсказания ответа in vivo таких
же или похожих клеток. По крайней мере, различия,
которые существуют между измерениями в условиях
in vivo и in vitro, подробно исследованы.
Фармакокинетика. Измерения токсичности in
vitro обычно предполагает наблюдения за событиями
на клеточном уровне. Наиример, будет очень затруд-
нительно воспроизвести комплекс фармакокинетики
лекарственного действия in vitro, и между эксперимен-
тальными процессами in vitro и in vivo обычно сущест-
вуют различия во времени действия, концентрации
препарата, скорости изменения концентрации, мета-
болизма, проницаемости тканей, клиренса и выведе-
ния. Хотя возможно моделирование этих параметров,
например использование многоклеточных опухолевых
сфероидов для исследования проницаемости препарата
или изменением режима перфузии для восггроизведе-
ния эффекта изменяющейся концентрации и времени
(СхТ), — большинство исследовании концентриру-
ются на прямом клеточном ответе на прямое действие
цитотоксичного агента, повышая таким образом вое
ироизводимость и простоту исследовании.
Метаболизм. Многие нетоксичные вещества
становятся токсичными после их метаболизма в пе-
чени. Кроме того, многие вещества, токсичные in vitro,
могут быть детоксицированы ферментами иечени.
Для испытаний in vitro, которые рассматриваются как
альтернатива испытаниями на животных, должно быть
продемонстрировано, что потенциальные токсины
достигают клеток в модели in vitro в той же форме, что
и in vivo. Этот факт для своего подтверждения может
потребовать проведения дополнительных исследо-
вании с применением очищенных микросомальных
ферментов иечени [McGregor el al., 1988J, кокультиви-
рования с активированными гепатоцитами [Guillotizo,
1989; Frazier, 1992J, либо генетической модификацией
клеток-мишеней с введением им генов метаболических
ферментов иод контролем регулируемого промотора
[Mac el а!.. 1994].
Тканевой и системный ответы. Природа отве-
та должна также тщательно учитываться. Ответ на
действие токсина in vitro может быть измерен изме-
нениями выживания клеток (см. иротокол 22.3) или
метаболизма (см. разд. 22.3.4), в то время как главную
проблему in vivo могут составлять тканевой отвез- (на-
иример, воспалительная реакция, фиброз, поражение
иочек) гглгг системный отвез- (например, лихорадка,
сосудистая реакция). Для повышения эффективности
испытаний in vitro должны быть созданы модели таких
ответов, возможно, с использованием органозиии-
ческих культур, воссозданных на основе нескольких
клеточных типов и поддерживаемых в еггециальном
гормон-содержащем окружении. Не следует считать,
что сложено-комплексные тканевые и даже системные
реакции не мог уз- быть смоделированы и воспроизве-
дены в культуре тканей in vitro. Исследования воспа-
лительного ответа, тератог енные нарушения, невроло-
г ические дисфункции могут быть выполнимы in vitro,
с учетом понимания межклеточных взаимодействий,
и роли гормонов в их взаимодействии с местными
паракринными гг аутокринными факторами.
22.3. ПРИРОДА ИССЛЕДОВАНИЙ
Выбор типа исследования будет зависеть от изучаемого
агента, природы предполагаемого ответа и, в частности,
от клеток-мишеней. Исследования можно разделить на
иять основных классов:
1) Жизнеспособность:непосредственный или быстрый
ответ, такой как изменение мембранной проницае-
мости или нарушение определенного метаболичес-
кого пути; коррелирующего с клеточным делением
и выживаемостью.
2) Выживаемость: долговременное сохранение спо-
собности к самовоспроизведению (5 10 поколений
и более).
3) Метаболизм: исследования, проводимые обычно
при помощи микротитрацгггг, на определение про-
межуточною метаболита. Параметры метаболичес-
кого ответа могут быть измерены в ходе (например,
активность дегидрогеназы, синтез ДНК, РНК или
белка), во время или вскоре после окончания дей-
ствия изучаемого агента. Проведение измерений
через два-три периода удвоения популяции после
экспозиции препарата может в большей степени
отражать потенциал клеточного роста и может кор-
релировать с выживаемостью клеток.
4) Трансформация: выживаемость клеток в изменен-
ном состоянии (проявление генетической мутации,
изменения контроля роста, злокачественная транс-
формация).
5) Раздражение: ответ, аналог ичный реакции воспале-
ния, аллергии или раздражения in vivo\ пока трудно
моделируется in vitro, но может оказаться возможным
исследовать раздражение путем мониторинга высво-
бождения цитокинов в органотгшических культурах.
22.3.1. Жизнеспособность
Исследования жизнеспособности проводятся для изме-
рения доли жизнеспособных клеток после гготенциально
травматичной процедуры, такой как первичная дезин-
теграция тканей, клеточное разделение, криохранение.
Большинство тестов основывается на нарушении мем-
бранной целостности, измеряемой по проникновению
красителя, для которого в норме клетки непроницаемы
408
ГЛАВА 22. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ
(например, три пановый синий, зрит|ммин, нафталино-
вый черный) или высвобождению красители, который
в норме захватывается н остается в жизнеспособных
клетках (например, диацилфлюоресциин или ней-
тральный красный). Тем не менее это прямой эффект
действия препарата, который не веет да предполагает не-
посредственную связь с выживаемостью клеток. Более
тон», процесс определения включения красителя при-
водит к переоценке жизнеспособности. Так, например,
90% клеток, размороженных после хранения в жидком
азоте, мО|ут не включать трипановый синий, но только
60% мтут быть способны прикрепляться к субстрату
через 24 ч. Обратите внимание, что обычное определе-
ние жизнеспособности при субкультивировании может
быть неинформативным для триисинизированных
клеток, поскольку большинство нежизнеспособных
клеток будет утрачено при замене питательной среды
и предварительной промывке перед трипсинизации.
Точное определение жизнеспособного состояния цри
субкультивировании требует того, чтобы все клетки
были извлечены из среды и предварительно промыты и
подсчитаны вместе стриисинизированными. Тем не ме-
нее жизнеспособность пересеянных клеток будет точно
определиться без «той поправки. Протокол 22.1 может
быть использован вместе с yup. 12 и 17 (см. 1Л. 2).
ПРОТОКОЛ 22.1. Оценка жизнеспособности
методом отторжения красителя
Принцип
Жизнеспособные клетки - непроницаемы для на-
фталинового черного, тринановоГОсинего, и множес-
тва друшх красителей [Kallenbach el al., 1958].
Схема
Смешайте суспензию клеток с краев ге чем, и иссле-
дуйте ее ири малом увеличении микроскопа.
Материалы
Стерильные или асептически подготовленные-.
• Клетки дли исследований, флакон для трииси-
низации, замороженная пробирка с клетками,
предназначенными для размораживании, или
первичная дежи гредированная культура
• Ростовая среда в соответствии с типом
клеток_________________________________20 мл
• Трипсин, 0,25%_____________________ 5 мл
• D-PBSA_____ „.10 м.1
Нестерильные:
• Гемоцитометр.
• Краситель для оценки жизнеспособности
• (Например, С.4% трпиановый синий или 1% на-
фта леновым черный в D-PBSA или HBSS) 1-мл
• Пастеровские пипетки
• Микроскоп
• Устройство для подсчета клеток
Протокол
1. Приготовьте суспензию клеток с высокой концен-
трацией (-1x106 кл. мл), триисиннзацией или
центрифу!ированием с последующим ресусиен-
дированием.
2. Возьмит е чистое стекло для гемоцитометра и
установите покровное стекло (см. протокол 22.1 и
рис. 21.1).
3. Смешайте одну каплю суспензии клеток с одной
каплей триианового синего или четырьмя капля-
ми нафталенового черно! о.
4. Заполните камеру для подсчета (см. прото-
кол 22.1).
5. Оставьте стекло в течение 12 мин (не дольше,
поскольку состояние жизнеспособных клеток
будет ухудшаться, и они будут окрашиваться).
6. Поместите стекло под микроскоп и, используй
объектив 10х, найдите в поле зрения сетку для
подсчета клеток (см. рис. 21.1).
7. Подсчитайте общее количество клеток и число
окрашенных клеток
8. Вымойте гомоцитометр и верните в коробку.
Анализ. Подсчитайте процент неокрашенных клеток
Это число представляет собой процент жизнеспособных
клеток, определенный этим методом. Если на шаге 3
использованы соответствующие объемы клеточной
суспензии и красителя, то этот метод определения жиз-
неспособности может быть включен в протокол 22.1.
ПРОТОКОЛ 22.2. Оценка жизнеспособности
методом поглощения красителя
Принцип
Жизнеспособные клетки захватывают диацетил-
флюоресцеин и гидролизуют его до флюоресцеина,
для которо! о мембрана живой непроницаема [Roliuan
& Papermaster, 1966]. В результате живые клетки
флюоресцируют зеленым светом; а мертвые клетки
нет. Нежизнеспособные клетки мО|утбыть окрашены
иропидиум иодидом и впоследствии флюоресциро-
вать красным. Жизнеспособност ь выражают как про-
центную долю клеток, флюоресцирующих зеленым.
Этот метод может применяться upu CCD анализе или
проточной цитометрии (см. разд. 21.7.2).
Схема
Окрасить клеточную суспензию в смеси ироиидия
иодмда и диацетил флюоресцеина, и исследовать
клетки методом флюоресцентной микроскопии или
проточной цитометрии.
Материалы
Стерильные или асептически подготовленные:
• Суспензия клеток
• Диацетаг флюоресцеина. 10 мкг/мл, в HBSS
22.3. Природа исследований
409
• Иодид пропидия, 500 ню/мл
• Нестерильные.
• Флюоресцентный микроскоп
• Фильтры:
• Флкюресцеин: возбуждение 450 590 нм, излуче-
ние LP 515 нм
• Иодид пропидия: возбуждение 488 пт. излучение
615 нм
Протокол
1. Приготовьте суспензию клеток, как для оценки
жизнеспособности, методом освобождения кра-
сителя (см. протокол 22.1), но в среде без фенола
красною.
2. Добавьте флюоресцентную окрашивающую
смесь, окрасьте смесь в пропорции 1:10. до ко-
нечной концентрации 1 мкс/мл диацилфлюо-
ресцеина и 50 мкг/мл иодида пропидия.
3. Инкубируйте клетки при 37 °C' в течение
10 мин.
4. Поместите каплю клеток на стекло для микроско-
па, покройте покровным стеклом, исследуйте клет-
ки при иомоши флюоресцентной микроскопии.
Анализ. Клетки, которые флюоресцируют зеленым,
являются жизнеспособными, в то время как нежиз-
неспособные светятся красным. Жизнеспособность
может быть выражена как процент клеток, которые
флюоресцируют зеленым, от общего коли чества клеток.
Окрашенная клеточная суспензия также может быть
проанализирована методом проточной цитометрии
(см. разд. 21.7.2).
Рис. 22.1. Клоногенные исследования монослойных кле-
ток. Клетки трипсинизируюц подсчитывают и разводят так
же, как в случае клонирования с разведением (см. прото-
кол 14 1). Испытываемое вещество может быть добавлено
перед трипсиннзацисй или после клонирования (см сек-
цию 22 3.2) Колонии фиксируют- и окрашивают, когда они
достигают размера, достаточною для визуального подсчета,
но прежде, чем они начинают перекрывать друг друга
Окрашивание нейтральным красным. Живые
клетки захватывают нейтральный красный из куль-
туральной среды ири его концентрации 40 мкг/мл,
задерживая ею в лизосомах. При этом ней тральный
красный не удерживается нежизнеспособными клет-
ками. Захват нейтрального красного количественно
определяется после фиксации клеток в формалине
растворении красителя в уксуснокислом этаноле, что
позволяет получить результаты путем Считывания
окраски в лунках планшетов на планшетном сканере
ELISA при 570 нм [Borenfreund el al., 1990; Babich &
Borenfreund, 1990J. Нейтральный красный способен
преципитпровать, поэтому среду с красителем перед
использованием обычно инкубируют в течение ночи, а
затем центрифут пруют. Это исследование не определя-
ет общее количество клеток, но показывает снижение
ши лощения, связанное с утратой жизнеспособных
клеток и полностью автоматизировано.
22.3.2. Выживаемость
Хотя кратковременные исследования удобны и обычно
быстры и ле<ко осуществимы, они выявляют только
hoi пбшие клетки, (т. е. те, которые стали проницаемы
для красителя) в ходе исследования. Однако иногда
клетки, подвергнувшиеся повреждающему действию
(в т. ч. изучения, противораковых препаратов), обна-
руживают эффект через несколько часов. Природа
исследовании, необходимых для проведения измере-
ния жизнеспособности, в этих случаях должна быть
отлична, поскольку к тому времени, koi да будут про-
изведены измерения, noi ибшие клетки moi ут исчез-
нуть. Таким образом, в ходе долгосрочных испытаний
выживаемость должна быть отражена точнее, нежели
краткосрочными исследованиями токсичности, ре-
зультаты которых могут быть обратимыми Выжи-
ваемость подразумевает сохранение регенеративных
способностей и обычно измеряется эффективностью
посева (см. протокол 21.10). Эффективность посева
позволяет измерить выживаемость путем определения
способности к пролиферации в течение нескольких
поколений, предпола!ая, что эффективность посева,
достаточно высокая для того, чтобы обеспечить реп-
резентативный подсчет колоний, позволяет охарак-
теризовать всю клеточную популяцию в целом. Хотя
определение эффективности посева нельзя считать
идеальным методом, при значении выше 10% резуль-
таты ею являются допустимыми.
410
ГЛАВА 22. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ
ПРОТОКОЛ 22.3. Клоногенный анализ
прикрепившихся клеток
Схема
Подействовать на клетки экспериментальным
агентом в диапазоне концентраций в течение 24 ч.
Трикси визировать клетки, посеять их в низкой
концентрации клегок, и инкубировать 1 3 недели.
Окрасить кле тки (см. цв. вкладку 6a, е) и подсчитать
число колонии (см. рис. 22.1).
Материалы
Стерильные:
• Ростовая среда
• D-PBSA
• Неочищенный трипсин. 0.25%
• Тестируемое химическое соединение, в деся-
тикратной максимальной концентрации, раз-
веденное в бессывороточной среде; проверьте
pH и осмоляльность исследуемого раствора, и
отрет ул ируйте, если необходимо.
• Флаконы, 25 см2
• Чашки П етрн. 6 или 9 см. помеченные со стороны
дна
Нестерильные ;
• D-PBSA
• Метанол
• Кристаллвполет 1%
• Гемоцитометр или электронный счетчик клеток
Протокол
1. Приготовьте ряд культур в 25-см'флаконах:
три для каждой из шести концентрации дей-
ствующего агента, и три контрольных. Посейте
клетки в концентрации 5х10*кл./мл в 4,5 мл
ростовой среды, инкубируйте в течение 48 ч, за
это время культуры разовьются до log-стадии (см.
разд. 21.9.2).
2. Приготовьте последовательное разведение хими-
ческого соединения до объема 2 мл при 10-крат-
ной концентрации относительно конечной
а) Если вы проверяете состав впервые, исполь-
зуйте и 5-кратные разведения в диапазоне
10‘- 10s.
б) Если вы можете предполагать приблизитель-
ную токсичную концентрацию, выберите
более узкий диапазон (10—100).
3. Разведите каждую концентрацию 1:10, добавляя
0.5 мл из 10х концентратов в каждый из трех
флаконов для каждой концентрации, начиная с
контрольной среды и (без добавления агента) и в
прогрессирующей концентрации от самой низкой
до самой высокой.
4. Верните флаконы в инкубатор.
5. Если токсическое действие происходит медленно
или частично обратимо, повторите uiai 3 дваж-
ды; т.е. подвер!ните культуры действию агента
в течение 3 дней, заменяя ежедневно среду и
добавляя тот же агент заново. Для быстродей-
ствующих соединений может* быть достаточна
экспозиция в течение 1 ч.
6. Удалите среду из каждой группы из трех флако-
нов (от самой низкой концентрации действую-
щего агента до самого высокой) и трипсинизи-
руйте клетки.
7. Разведите и посейте клетки в чашки Петри ири
требуемой для клонального роста плотности (см.
протокол 14.1), разводя все культуры до той же
концентрации, что и контрольная. Начинайте ра-
боту с флаконов, иодвер! нутых действию самой
высокой концентрации до самой низкой, и затем
берите контроль.
8. Инкубируйте культуры до формирования ко-
лоний.
9. Фиксируйте культуры в абсолютном метаноле и
окрашивайте их в течение 10 мин в 1% кристалл-
виолете (см. иротокол 16.3).
10. Промойте чашки в проточной воде, дайте стечь и
подсушите, установите в перевернутое положе-
ние, чтобы высушить.
11. Подсчитайте колонии с > 50 клетками (> 5 гене-
раций).
Анализ кривой выживания
12. Вычислите эффективность посева при каждой
действующей концентрации.
13. Вычислит е относительную эффективность посева:
эффективность посева при каждой концентрации
как доля от контрольной. Это - доля (яыжиишшя.
14. Постройте зависимость доли выживания в лша-
рифмической шкале от концентрации в линейной
или ло1арифмической шкале, в зависимости от
используемого диапазона концентраций (см.
рис. 22.2).
15. Определите 1С или 1С9и, которые являются зна-
чением концентрации цитотоксического агента,
обеспечивающего uhi ибирование формирования,
соответственно, 50% или 90% колоний.
Поскольку применяется иолуло! арифмический
рафик, лучше использовать поскольку
это значение, более вероятно, будет падать на
линейную часть кривой, принимая во внимание,
что IC50 имеет тенденцию попадать на колено
кривой, давая менее стабильное значение
16. Проанализируйте кривую на предмет различий
в чувствительности:
а) Наклон кривой и длина колена. Более поло! ий
наклон и/или более длинное колено свиде-
тельствует о пониженной чувствительности;
более крутой наклон и/или более короткое ко-
лено означает повышенную чувствительность.
Как длина колена, так и наклон влияют на
значение 1С50 и ICgu, хотя более существенное
различие может наблюдаться для ICS(I (см.
рис. 22.3). 1С90 часто используется как простая
производная.
22.3. Природа исследований
411
б) Ремстшшая доля. Доля резистентных кле-
ток обозначена переходящим на плато участ-
ком конца кривой.
в) Полная резистентность характеризуется от-
сутствием како| d-то градиента на кривой.
) Область под кривой'. Совокупность кривых
выживания может быть сравнена вычисле-
нием области иод кривой, но это делается
для определенных целей и математически не
достоверно.
Изменяемые параметры
в определении выживаемости
Концентрация действующего агента. При первой по-
пытке Определ ить действующую кониентраци ю должен
быть использован широкий диапазон концентраций в
л тарифы и ческой |радации (т.е., 1х10ьМ, 1x10s М,
IxlO'M, IxlO1 и контроль). На основе первой серии экс-
периментов диапазон концентраций (логарифмы чески й
или линейный) должен быть сужен и в дальнейшем
эксперименты проводятся в этом диапазоне.
Неизменяемые концентрации агентов. Некоторые
условия сложно изменить, например качество среды,
воды или пластика. В этих случаях можно менять кон-
центрацию сыворотки. Сыворотка может оказывать
маскирующий эффект для веществ с низким уровнем
токсичности. Токсичность можно выявить в отсутствие
сыворотки или при ее низкой концентрации.
Продолжительность воздействия агента. Некото-
рые агенты действуют быстро, в то время как дру| ие
Рис. 22.2. Кривая выживания Полулогарифмический гра-
фик доли выживающих клеток (отношение количества коло -
Hiui. формирующиеся из экспериментальных клеюк к числу
колоний, формирующихся в кон ipn.ie) против концентрации
цитотоксина. Типичная кривая имеет «колено», и падение
ICsob линейном диапазоне кривой Значение 1С5(|, попадаю-
щее на «колено», обладает меньшей стабильностью.
Концентрация цитотоксина
Рис. 22.3. Интерпретация кривых выживания. Полуло-
гарифмический график зависпмоС|И выживания клеток от
концентрации патотоксина. Наклон увеличиваемся с увели-
чением чувствительности и уменьшается со снижением чув-
ствительности, пока кривая не становится полностью плоской
для полностью устойчивых клеток. Частичная резистентность
клеток может быть выражена как стабильная фракция, пока-
занная на кривой. выравнивающейся к концу
действуют медленно. При действии ионизирующей
радиации, например, нужно лишь несколько минут,
чтобы достичь требуемой дозы облучения, в то время
как продолжительность действия некоторых антиме-
табол ических препаратов, эффективность действия
которых зависит от продолжительности клеточного
цикла, может составлять несколько дней до достиже-
ния обнаруживаемо! о эффекта. Продолжительность
воздействия (Т) и концентрация агента (С) связаны,
хотя величина СхТ не все|да является постоянной.
Пролон! ированное действие может повышать чув-
ствительность сверх предпола!аемой на основании
соотношения СхТ в результате влияния клеточного
деления и кумулятивности повреждений.
Время воздействия агента. Koi да исследуемый ai ент
растворим и, предположительно, токсичен, следует
использовать схему, описанную в протоколе 22.3, но
когда качество агента неизвестно и можно ожидать как
стимуяяции, так и ми нимального эффекта (например,
более вероятно 20% mhi ибирование чем многократное
подавление), то агент может быть введен не в стадии
преинкубации, а в фазе клонального роста. Подтверж-
дение предполагаемой токсичности, например для ци-
тотоксичных препаратов, требует точных и аккуратных
исследований, с минимальным временем воздействия,
сравнимым с временем действия in vivo, применением
агента до клонального роста. Подтверждение отсут-
ствия токсичности (например, для водопроводной воды
или нетоксичных фармаколdi ических препаратов)
требует более жестких испытаний, с иролош ированным
длительным временем экспозиции-
412
ГЛАВА 22. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ
Клеточная плотность в ходе воздействия агента.
Плотность клеток в ходе воздействия агента может ме-
нять ответ клеток на действие агента; наиример, клетки
HeLa менее чувствительны к алкилирующему агенту
мастину при высокой плотности клеток [Freshney etal.,
1975]. Для определения действия клеточной плотности
на эффект следует варьировать ее на стадии иреинку-
бацпи в ходе воздействия препаратом.
Клеточная плотность при клонировании. Коли-
чество колоний может падать при высоких концентра-
циях токсичного аг ента, однако возможно компенсиро-
вать этот эффект посевом большего количества клеток
так, что при каждой концентрации сформируется
примерно одинаковое число колоний. Эта процедура
снижает риск влияния на выживаемость клеток низкой
клональной плотности и улучшает статистическую на-
дежность. Вместе с тем может возрастать вероятность
ошибки, поскольку клетки, иодвер|нутые действию
более высокой концентрации препарата, будут посеяны
при более высокой клеточной концентрации, и этот
фактор может повлиять на выживаемость. Поэтому
предпочтительно сажать клетки на предварительно
сформированный фидерный слои, плотность которого
составляет (5х10‘' кл./см2), что значительно превышает
количество клонируемых клегок. Выполнение этой»
этапа позволит надеяться, что клеточная плотность
будет постоянной, независимо от клонального выжива-
ния, которое вносит незначительный вклад в значение
общей плотности клеток. Заметьте, что клонирование
на фидерном слое может иногда выявить резистентную
фракцию клеток, которая не проявляется без исполь-
зования фидерного слоя (рис. 22.4).
Размер колоний. Некоторые агенты являются ци-
тостаточными (т.е.они ингибируютклеточную проли-
ферацию), но не цитотоксичными, и в ходе продолжи-
тельной эксиозиции они могут приводить к уменьшению
размеров колоний без снижения количества колоний.
В этом случае размер колоний следует определять
путем измерения оптической плотности [McKeehan et
al., 1977], автоматизированною ггодсчета колоний или
визуального ггодсчета количества клеток в колонии
Для подсчета колоний начальное количество клеток
в колонии (наггример, 50, как в протоколе 21.9) явля-
ется абсолютно произвольным, и предполагается, что
большинство колоний значительно превышает это
число. Колонии должны расти до достаточно больших
размеров (>1х10‘* клеток), когда рост более крупных
колоний станет замедляться, а меньшие, хотя и жиз-
неспособные, колонии начнут захватываться более
крупными.
Для определенияразмера колоний окрасьте культуры
до того, как снизится скорость роста крупных колоний,
и подсчитайте все колонии
Концентрация 5-фторурацила, М
Рис. 22.4. Влияние фидерного слоя на долю выживания
клеток. Клег кп человеческий глиомы были посеяны на чашки
в присутствии (пунктирная линия) и в отсутствие (сплошная
линия) фидерного слоя после обработки 5-фторурацилом в
различных концентрациях! При концентрации препарата
1x10 *М только в присутствии фидерного слоя выявляется
10% резистентная доля В отсутствие фидерного слоя не-
большое количество колоний показывает, что резне ген t ная
фракция была неспособна выжить без поддержки
Растворители. Некоторые агенты, которые дгщж-
ны быть исследуемы, имеют низкую растворимость
в водной среде, н может быть необходимым исполь-
зовать органический растворитель для того, чтобы их
разводить. Для этих целей обычно используют этанол,
проггилеш лнколь и диметилсульфоксид, но они сами ио
себе могут быть токсичны для клеток. Следовательно,
для получения растворов нужно использовать мини-
мальные концентрации растворителей. Агент может
быть растворен, наггример, в растворителе с высокой
концентрацией, наиример в 100%-м этаноле, а затем
постепенно разведен в ССР и доведен до конечной
концентрации с учетом разведения в среде. Конечная
концентрация раствори ге. гя в среде должна быть <0,5%,
кроме того, следует включить контроль действия рас-
творителя (т.е. контроль роста клеток при добавлении
той же конечной концентрации растворителя без добав-
ления испытываемого агента).
Будые осторожны ири использовании органических
растворителей, соприкасающихся с пластиком или ре-
зиной. Лучше всего для хранения органических раство-
рителей иеггользовать стекло и использовать пластик,
только когда концентрация растворителя <10%.
Хотя подсчет эффективности является одним из
наилучших методов для исследования степени выжи-
вания клеток, его следует иеггользовать, только есчи
эффективность клонирования достаточно высока для
формирования колоний, гак чтобы реггрезентатив-
22.3. Природа исследований
413
ностьдля популяции is целом была достаточно высока.
В идеале, это означает, чти в контроле эффек гивность
посева должна составлять 100. На практике, однако,
это редко осуществимо и в контроле :>ффективности
посева составляет обычно 20% или менее, что считается
приемлемым.
22.3.3. Анализ, основанный
на клеточной пролиферации
Подсчет клеток через несколько дней после культиви-
рования также может быть полезен для определения
действия различных компонентов на клеточную про-
лиферацию, но, по крайней мере на ранних стадиях
исследований, требуется составить полную кривую
роста (см. протоколы 21.7,21.7,21.8 и 21.9), поскольку
подсчет клеток, проводимый в отдельной точке време-
ни, может быть неоднозначным (см. рис. 21.8, день 7).
Анализ кривой роста с использованием подсчета кле-
ток осуществим только для относительно небольшого
числа количества образцов, поскольку при широком
скрин ин ie он становится слишком трудоемким. В
случаях, ко|да исследуется много образцов, можез
использоваться подсчет клеток в отдельный моменз
времени, наиример количество клеток через три или
пять дней после экспозиции агента. Время следует
выбирать в log-фазе, предпочтительно в ее середине
исходя из значений для контрольных клеток. Любой
значительный эффект должен быть подтвержден
полной кривой роста в течение всего цикла роста или
какими-то альтернативными исследованиями, таки-
ми как кривая выживания, полученная при помощи
клоно|енных исследований (см. протокол 22.3) или
МТТ-тест (см. протокол 22.4).
22.3.4. Метаболический анализ
цитотоксичности
Исследования эффективности посева связаны с высо-
кой интенсивностью труда и затратой времени для их
проведения и анализа, в частности когда используется
большое количество образцов и продолжительность
каждого эксперимента может продолжаться от 2 до
4 недель. Более того, некоторые клеточные линии об-
ладают низкой эффективностью посева, в частности,
нормальные свежевыделенные клетки, поэтому раз-
работан ряд альтернативных методов определения
цитотоксичности клеток при их высокой плотности.
К этим методам относится метод использования мик-
ротитрационных план шетов (см. разд. 22.3.5). Однако
ни один из этих тестов не измеряет* непосредственно
выживаемости. Вместо этого определяют чистое уве-
личение количества клеток (прирост культуры; см.
разд. 22.3.3), увеличение общего количества белка и>ш
ДНК, либо изменение постоянной метаболической
активности, такой как редукция тетразолиевоп соли
формазана, либо синтез белка или ДН К. Выживаемость
в этих случаях определяют* как сохранение метаболи-
ческой или пролиферативной способности клеточной
популяции как целого в течение некоторого времени
после прекращения токсического воздействия. Тем не
менее такие исследования не могут обнаружить разли-
чия между снижением метаболической или пролифе-
ративной активностями в отдельных клетках, а также
обнаружить уменьшение количества клеток и, таким
образом, любое новое или исключительное явление,
обнаруженное этими меюдами, должно быть подтверж-
дено клоногенными исследованиями выживания.
22.3.5. Микротитрационный анализ
Введение многолуночных планшетов революционизи-
ровало метод увеличения числа образцов в культуре
тканей. Эти планшеты экономичны в использовании,
годятся для автоматического обслуживания и анализа
и могут обладать хорошими оптическими свойствами.
Наиболее популярны в настоящее время 96-луноч-
ные микротитрационные планшеты, каждая ячейка
имеет размеры области роста 28—32 мм2, вмещает 0,1
или 0,2 мл среды и до 1x10s клеток. Микротптрация
предлаюет метод, посредством которого большое
количество образцов может быть исследовано од-
новременно. Используя этот метод, вся популяция
подвер! ается действию агента, и впоследствии опре-
деляется жизнеспособность, обычно путем измерения
метаболических параметров, таких как концентрация
АТР или NADH NADPH Большое количество на-
боров предла!аются компанией Promega (см. При-
ложение III). Конечной точкой микротптрационного
анализа обычно является оценка количества клеток.
Хотя этот результат может быть достигнут прямо
путем подсчета клеток или методом непрямых мето-
дов, таких как включение изотопа, оценка жизнеспо-
собности клеток при помощи МТТ-теста [Mosmann,
1983J широко распространена и рассматривается как
оптимальная методика [Cole, 1986; Alley el al., 1988J.
МТТ — это желтый водорастворимый тетразолиевый
краситель, который превращается под действием
живых клеток в красный формазановый продукт,
нерастворимый в водных растворах. На редукцию
МТТ может оказывать влияние ряд факторов [Vistica
el aL, 1991]. Процесс исследования, описанный в про-
токоле 22.4, предоставленном Jane Plumb из Центра
онколщии и прикладной фармакологии (University
of Glasgow, Scotland, United Kingdom), позволит по-
лучить одинаковые результаты в качестве стандарт-
ного клоногенною исследования [Plumb el al., 1989].
Он иллюстрирует использование микротитрации в
исследовании противораковых препаратов, но может
быть применим, с небольшими модификациями, для
любых исследований цитотоксичности.
Варианты МТТ-исследоваиия
Друше применения. Похожее исследование мо-
жет быть использовано для определения клеточной
414
ГЛАВА 22. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ
Установите микротитрацион-
ный планшет, инкубируйте
приблизительно до двойного
удвоения популяции
Когда клетки находятся в
фазе экспоненциального
роста, добавьте препарат или
токсин
КЛЕТКА
А
КЛЕТКА
В
КЛЕТКА
А
КЛЕТКА
В
Удалите препарат и позволь-
те клеткам восстановиться в
ростовой среде
После двух или трех пери-
одов удвоения популяции
удалите среду и замените на
среду с МТТ или ХТТ Через
3-4 ч пропустите через
планшетный сканер, исполь-
зующее поглощение света
для получения кривой инги-
бирования, вычислите 1СМ
Рис. 22.5. Микротитрационное исследование. Стадии
испытания двух различных линии клсiок, подвергнутых
воздействию широкого диапазона концентраций одного и
того же препарата, степень выживания которых оценивалась
методом МТТ (см. протокол 22.4) Дальняя левая колонка
нс имеет клеток и может использоваться как нулевой ряд, в
установках планшетного сканера Э го исследование проводят
при использовании закрытых пластин, когда вес ячейки экви-
валентны: однако при исследовании планшетов с крышками
имеется риск влияния краевого эффекта, вероятно, из-за
испарения, поз <тму лучше оставить крайние левые и крайние
правые колонки незаполненными (т.е, только со средой, как
в прот околе 22 4), некоторые исследователи оставляют также
незаполненными верхний и нижний ряды
радиочувствительности [Carmichael et al., 19871» |.
МТТ-тест может быть использован для определения
количества клеток после ряда воздействий, отличных
от воздействия цитотоксичных препаратов, таких как
стимуляция, факторами роста. Однако в этом случае
существенной является необходимость убедиться, что
воздействие само ио себе не оказывает действия на
способность клегок к редукции красителя.
Продолжительность воздействия Как в случае
клоногенного анализа (см. протокол 22.3), некоторые
агенты могут действовать быстрее, и период воздей-
ствия гг восстановления укорачивается. Клетки должны
оставаться в экспоненциальной ф>азе роста на всем
протяжении исследования (см. разд. 13.7.2 и 21.9.2),
ПРОТОКОЛ 22.4. Оценка цитотоксичности
I при помощи МТТ-теста
Принцип
Клетки в экспоненциальной стадии роста подверга-
ются действию цитотоксического иреиарата. Про-
должительность действия обычно определяется как
время, требуемое для максимальног о повреждения,
но также связано со стабильностью препарата. После
удаления иреиарата клеткам позволяют развиваться
в течение двух-трех удвоений популяции (PDTS),
ч гобы увеличить различие между клетками, которые
остаются жизнеспособными и способны к быстрому
увеличению популяции и темп, которые остаются
жизнеспособными, но не могут культивироваться.
Затем определяю! число остающихся в живых
клеток косвенно по уменьшению МТТ-окрашива-
ния. Количество образовавшегося МТТ-формазана
может определяться сиектрофотометрически, если
только МТТ-формазан растворен в подходящем
растворителе.
Схема
Инкубируйте монослойные культуры в микро-
тнтрацпонных планшетах в выбранном диапазоне
концентраций цитотоксичного препарата (рис. 22.5).
Удалить препарат и заменять питательную среду в
планшетах ежедневно до двух-трех PDTs; затем еще
раз замените питательную среду, и добавьте МТТ в
каждую лунку. Инкубировать планшеты в темноте
в течение 4 ч, затем удалите среду гг МТТ. Разведите
нерастворимые в воде кристаллы МТТ-формазан в
DMSO, добавьте буфер, чтобы довести конечное зна-
чение pH, и измерьте поглощение в автоматическом
спектрофотометрическом планшетном сканере.
Материалы
Стерильные:
• Ростовая среда
• Трипсин (0,25% + EDTA, 1 мМ, в PBSA)
• МТТ: 3-(4,5-диметилтиазол -2-ил)-2,5-дифенил-
тетразолпна бромид (Sirma). 50 мг/мл, стерпли-
гованный фильтрацией
• Глициновый буфер Соренсена (0,1 М глицин,
0,1 М NaCl, pH доводится до 10.5 при помощи
1 М NaOH)
* Микротитрационные планшеты (Iwaki)
Наконечники для автоматических пипеток,
предпочтительно в автоклавируемой коробке для
наконеч ников
• Чашки Петри (неавтоклавируемые), 5 см и 9 см
или емкость (Corning)
У ниверсальные контейнеры и ли пробирки, 30 мл
и 100 мл
Нестерильные.
• Пластмассовая коробка (чистая пенопластовая
коробка для хранения планшетов)
22.3. Природа исследований
41S
Многоканальная автоматическая пипетка
Диметилсульфоксид (DMSO)
DMSO-дисиенсер (не обязательно): Labsyslems
Microplate Dispenser (Каталожный номер5840 127,
Thermo Electron)
ELISA-планшетном сканере (Molecular Devices,
SOFTmax PRO; см. также Приложение II)
Держатель планшета для центрифу! и (для роста
клеток в суспензионной культуре)
Протокол
Осаждение клеток:
1. Триисинизируйте субконфлюэнтную монослой-
ную культуру, соберите клетки в ростовой среде,
содержащей сыворотку.
2. Центрифу!ируйте суспензию (5 мин при 2001)
до образования осадка. Ресусиендируйте клетки
в ростовой среде, подсчитайте их.
3. Разведите клетки до 2,5—50x1 О'* кл./мл, в зави-
симости от скорости роста клеточной линии, в
расчете 20 мл суспензии клеток на микротитра-
циониый планшет.
4. Перенесите суспензию клеток в 9-см чашку Петри,
при помощи многоканальной автоматической ии-
иетки добавьте ио 200 мкл в каждую лунку 10 цент-
ральных КОЛОНОК ПЛОСКОДОННОЙ 96-луночной
пластины (80 лунок), начиная со 2-й колонки и
заканчивая колонкой 11, таким образом, помещая
0,5—10x10’1 клетки в каждую лунку.
5. Добавьте 200 мкл ростовой среды в восемь лунок
в колонки 1 и 12. Колонка 1 будет'использоваться
как нулевой уровень для планшетного сканера;
колонка 12 поможет поддержать влажность ко-
лонки 11 и минимизирует « краевой аффект».
6. Поместите планшеты в пластмассовую коробку
и перенесите в увлажненную атмосферу, где
инкубируйте при 37 °C в течение 1—3 дней, за
которые клетки перейдут в экспоненциальную
4>азу к моменту добавления препарата.
7. Для неадгезирующих клеток ириютовьте суспен-
зию клеток в свежей среде. Разведите клетки до
концентрации до 5— 100x1 О'* кл.//мл и пересейте
100 мкл из суспензии в крзчлодонные 96-луноч-
ные планшеты. Добавьте немедленно препарат в
эти планшеты
Добавление препарата:
8. Приготовьте ряд последовательного пятикратного
разведения цитотоксичного препарата в ростовой
среде для получения восьми концентраций. Этот
набор концентраций должен быть выбран так,
чтобы самая высокая концентрация убивала боль-
шинство клеток. и самая низкая не действовала
на клетки. Если токсичность препарата известна,
может использоваться меньший диапазон концен-
траций. Обычно используются три планшета д.>!я
каждого препарата, чтобы провести троекратное
определение в пределах одного эксперимента.
9. Для адгезирующих клеток удалите среду из
лунок в колонках от 2 до 11. Это можно сделать
с помощью голы для подкожных инъекций, ири- |
соединенной к вакуумной линии.
10. Замените среду на 200 мкл свежей в восьми лун-
ках в колонках 2 и 11; эти клетки - контроль.
11. Добавьте цитотоксический препарат к клеткам в I
колонках 3—10. Для каждой концентрации иреиа- ।
рата необходимы только четыре лунки, поэтому I
ряды А-D moivt быть использованы для одного |
препарата, а ряды Е-Н для второго препарата. .
12. Перенесите растворы препарата в 5-см чашки
Петри, добавьте 200 мкл в каждую iруину из
четырех лунок при помощи автоматической ни- I
иетки с четырьмя наконечниками.
13. Верните пластины в пластмассовую коробку и I
инкубируйте их в течение определенного пери-
ода. Для неадгезирующих клеток при готовьте
разведение препарата в два раза выше желатель-
ной конечной концентрации и добавьте 100 мкл
к 100 мкл клеток в лунках.
Период роста:
14. В конце периода действия препарата удалите
среду их всех лунок, содержащих клетки, и под-
кормите клетки добавлением 200 мкл свежей сре-
ды. Отцентрнфу! ируйте планшеты, содержащие
неадгезирующие клетки (5 мин при 200 i) для
получении осадка клеток, затем удалите среду,
используя тонкую iiieiy, чтобы сохранить осадок
клеток или не удалить осадка клеток.
15. Меняйте среду ежедневно до 2—3 PDTS.
Оценка выживания клеток: .
16. Поддерживайте рост заменой 200 мкл свежей
среды в конце роста, добавьте 50 мкл МТТ во все
лунки в колонках 1 11.
17. Оберните планшеты алюминиевой фольгой и
переведите их на 4 ч в увлажненную атмосферу
ири 37 °C. Обратите внимание, что 4 ч время
минимальной инкубации, планшеты мшут ин-
кубироваться до 8 ч.
18. Удалите среду и МТТ из лунок (для неадгезиру
ющих клеток центрифу i ированием ) и растворите I
оставшиеся кристаллы МТТ-формазана добав- '
леннем 200 мкл DMSO во все лунки в колон-
19. Добавьте i лициновый буфер (25 мкл в лунку) во I
все лунки, содержащие DMSO.
20. Измерьте uoi лощение ири 570 нм немедленно, .
потому что продукт нестабилен- Используйте
лунки в 1 колонке, которые содержат среду и
МТТ, но не содержат клеток как нулевой уровень |
для планшетного сканера.
Анвлиз МТТ-теста:
21. Постройте । рафик зависимости ноiлощения
(Y-ось) от концентрации препарата (Х-ось).
416
ГЛАВА 22. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ
22 Вычислите ICW как концентрацию препарата,
который требуется, чтобы уменьшить noi лоще-
ние до половины контрольного уровня. Среднее
значение uoiлощения в лунках колонок 2 и 11
используется как контроль. По<лощение.опреде-
ляемое в колонках 2 и 11, должно быть одинаково.
И нот да они, однако, отличны, и это указывает на
неравномерный посев клеток в планшете.
23 Абсолютное значение величины нот лощения
должно быть таким, чтобы значение not лоще-
ния контроля мотло быть сравнимо с опытными
данными, в этом случае данные могут тог да быть
преобразованы в кривую процента иншбирова-
ния (рис. 22.6), чтобы можно было сравнивать
серию полученных кривых
а клеточная концентрация в конце работы должна
еще находиться на линейном участке результатов
спектрофотометрическою анализа ММТ-теста. При
первом исследовании клеточной линии следует по-
сеять параллельные чашки для подсчета клеток, чтобы
получить кривую роста (см. иротокол 21.8) для опти-
ческого поглощения МТТ-формазан, чтобы убедиться,
что поглощение пропорционально количеству клеток.
Если кривая роста показывает, что клетки перемеща-
ются в стационарную фазу, либо поглощение имеет
нелинейную .зависимость от концентрации, укоротите
время исследования и приступите прямо к шагу 16
протокола 22.4.
Продолжительность экспозиции связана с количес-
твом клеточных циклов, которые прошли клетки в ходе
воздействия и восстановления. При более короткой
продолжительности клеточного цикла за время воз-
действия не только будет быстрее возрастать клеточ-
ная плотность, но и ответ на препараты, действующие
Концентрация цитотоксина
Рис. 22.6. Кривая ингибирования. Показатель ингибиро-
вания рассчитывается как процент выживших клегок гл
контроля, и составляется график зависимости от концент-
рации ццтнгокеина Типичная сигмовидная кривая, в идеале
1Станаходится в центре изгиба кривой
Долговременное. РОТ >24 ч
Рис. 22.7. Продолжительность исследования Стандарт
продолжительности кратковременного и долговременного
исследований. Верхняя диаграмма представляет исс гсдова-
нис, которое применяется д.гя клетки с PDT < 24 ч, нижняя
диаграмма представляет исследование, которое |1рименяе|ся
для клеюк с PDT > 24 ч, хотя возможны промежуточные
варианты
на клеточным цикл, будет обнаруживаться быстрее.
Время клеточного цикла будет влиять на выбор между
кратковременным и долговременным исследованиями
(рис. 22.7, 22.8). При первых попытках провест и ис-
следование может быть желательным брать образцы
ежедневно, в ходе действия препарата и восстановления
клеток. Если ранее получено стабильное значение IC50,
то исследование может быть упрощено.
Конечная точка. Сульфородамин, флюоресцент-
ный краситель, окрашивающий белок, может также
быть использован для оценки количества белка (в т. ч.
клеточного) в лунках планшета с последующим анали-
зом на автоматическом планшетном сканере планше-
тов, регистрирующем флюоресценцию [Boyd, 1989].
Он окрашивает все клетки и не различает живые и
пог ибшие клетки.
Использование мечения нри помощи [ 'Н|-тпмидина
(синтез ДНК), [3Н] лейцина [Freshney et al., 1975] или
[•’’S]метионина [Freshney & Morgan,1978] (синтезбел-
ка), либо других изотопов может заменять МТТ-тест.
Количественная оценка может быть достигнута мето-
дом сцинз ил ляцион ной обработки мнкротитрацион ных
планшетов. Предлаг ается два типа сцинтгглляцион ного
подсчета: 1) клеточное содержимое может быть пе-
ренесено на фильтры с трипсинизацией и на стекло-
волоконные фильтры нри помощи пересасывающего
устройства, и .затем фильтры высушиваются, и степень
радиоактивности подсчитывается на сцинтилляцион-
ном счетчике; 2) излучение всех лунок иланшета может
одновременно быть обсчитано с применением специ-
ально адаптированного сцинтилляционного счетчика
(PerkinElmer).
На ирактике может не иметь значения, какой крите-
рий исиользуется для определения жизнеспособности
или выживания в конце исследования. Важнее разра-
ботать оптимальную схему исследования, т. е. продол-
жительность воздействия ирепарата и восстановле-
ния клеток, учет фазы клеточного цикла (клеточная
22.3. Природа исследований
417
Количество клеточных циклов в контроле после момента добавления цитотоксина
Рис. 22.8. Кривая времени падения IC50 Идеальная кривая для действующего агента с прогрессивным увеличением цито-
токсичности с течением времени, в конечном счете происходит достижение максимального влияния после трех циклов деления
клеток. Не все цитотоксические препараты будут соответствовать этому образцу [см. Frcshncy at а!.. 1975]
плотность, скорость роста и т.д.). Б кратковременном
исследовании в отсутствие и с минимальным периодом
восстановления, в конечной точке исследования мосуч
измеряться только жизнеспособные клетки (например,
МТТ); в более продолжительных исследованиях в ко-
нечной точке измеряются различия между лунками, в
которых было возрастание, и теми, в которых не было
повышения, либо даже было понижение количества
жизнеспособных клеток. Наконец, в монослойных ис-
следованиях нежизнеспособные клетки будут потеряны
и измеряется возрастание или снижение количества
клеток относительно контрольных лунок, при этом
исследования при помощи МТТ, сульфородамина или
введения изотонов становятся менее важными.
Манипуляции. Ряд манипуляций автоматизирован
при помощи таких приборов, как, например, автодис-
пенсеры, ди лЮтеры, коллекторы и прсмраммссруемые
планшетные сканеры планшетов (см. рис. 5.10—5.12),
для снижения времени манипуляций, необходимых
для работы с одним образцом.
22.3.6 . Сравнительная оценка
микротитрационного
и клоногенного анализа выживания
Объем среды, требуемый для анализа однеи о образца
ири микротптрации менее чем одна пятнадцатая о'с
того, что требуется для клонирования, хотя количество
клеток примерно одинаково для обоих методов. Микро-
титрационные исследования также короче по времени
и лесче подлежит автоматизации манипуляций, сбора
данных и анализа. Микротитрация, однако, не можеч
обнаруживать различия между ответом разных клеток
в популяции н степенью выраженности ответа в каждой
клетке, например 50% инг ибированиенекоторого мета-
болического параметра могло бы означать, что каждая
клетка ишибируется на 50%, но это становится менее
важно при продолжительном периоде восстановления
клеток, кш да относительное возрастание клеточной
пролиферации становится основным критерием выжи-
вания. Сравнение значений 1Ста, полученных методом
микротитрации и методом исследования эффективнос-
ти посева, показало хорошую корреляцию между двумя
методами (рис. 22.9), применяемыми для испытания
противоопухолевых препаратов [Morgan el al., 1983].
Б случае 1С№) корреляция была не такой выраженной.
Важным характерным свойством микротитрационных
исследований, в частности с фотометрической и радио-
метрической конечной точкой, является получение
огромною количества данных, часто в сотовом для
компьютерного анализа формате (см. разд. 21.8.2). Тем
не менее важно произвести сканирование рядов данных,
включая нулевой ряд, поскольку компьютерный анализ
может использовать различные допущения и коррек-
ции, кос да он имеет дело с аберрантными точками,
которые не являются очевидными, если не произведено
тщательное рассмотрение рядов данных
22.3.7 . Взаимодействие
лекарственных препаратов
Исследование цитотоксичности часто включает в себя
изучение взаимодействия лекарственных препаратов,
совместное действие которых может быть обнаружено
в микротитрационных системах, в которых может быть
одновременно исследовано несколько различных от-
ношений взаимодействующих препаратов. Anajuis ле-
карственного взаимодействия может быть осуществлен
с использованием изоболограммы для интерпретации
418
ГЛАВА 22. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ
lg ICS0, М (микротитрация)
Рис. 22.9. Корреляция между микротитрацнонным и кло-
ногенным методами исследования выживания Проведено
измерение значении 1С,0 группы пяти клеточных линий
человеческой глиомы при действии шести препаратов (виик-
рист ин. блеомицин, VM-26 эцидофило токсин, 5-фторурацил,
мстил CCNU, митрамицин). Большинство выпадающих то-
чек было получено на одной линии клетки, что позже было
доказано использованием смеси различных типов клегок
Пунктирная линия представляет собой регрессию, точки
ко юрой получены с использованием icicpoi-енной клеточной
линии. Микрогитрационная 1СИ была получена введением
| ' S] метионина |Frcshuey & Morgan. 1978] [по Freshney ct
al., 1982a]
данных [Steel, 1979; Berenbaum, 1985J. Прямолинейный
график предполагает суммирование ответа клеток на
препараты, в то время как криволинейный график
означает синерг ню, если кривая надает ниже предпола-
гаемой прямой, и антагонизм, если кривая идет выше.
22.4. ПРИМЕНЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЦИТОТОКСИЧНОСТИ
22.4.1 .Скрининг противораковых
препаратов
Скрининг различных веществ для идентификации
новых противораковых препаратов может быть трудо-
емким и часто неэффективным методом поиска новых
биологически активных соединений. В настоящее
время основным направлением стала разработка и
мониторинг действия препаратов, имеющих конкрет-
ную мишень действия. Тем не менее продолжаются
поиыгки улучшить скрининг иутем использования
адаптированных, легко автоматизируемых систем, на
основе которых можно быстро определять количество
жизнеспособных клеток методом их окрашивания, на-
пример методом МТТ [Mosmann, 1983; Carmichael et at,
1987a; Plumb etal., 1989]. Для дальнейшего сокращения
количества манипуляций инкубацию с МТТ можно
опустить, и конечная точка определяется измерением
количества общею белка с сульфородамином В [Boyd,
1989J. Хотя этот метод быстрее и лег че, чем МТТ-тест,
следует помнить, что нежизнеспособные и определенно
неделящиеся клетки еще могут окрашиваться, поэтому
при обнаружении цитотоксической активности ре-
зультаты исследования должны быть подтверждены
с использованием более надежных методов, таких как
клоногенность или редукция МТТ.
22.4.2. Прогностические исследования
противоопухолевых препаратов
Существует возможность исследования индивиду-
альной химиочувствительности клеток, выделенных
из опухоли некоего пациента, к противоопухолевым
препаратам с разработкой оптимального режима его
последующего лечения [Freshney, 1978). Этот метод до
настоящего времени еще не был тщательно отработан,
хотя результаты маломасштабных предварительных
исследований были обнадеживающими [Hamburger
& Salmon, 1977, Baleman el al., 1979; Hill, 1983; Thomas
et al., 1985; Von Hoff et ah, 1986J. Требуется лишь раз-
работать достоверную и воспроизводимую методику
культивирования неопластических клеток, из наиболее
часто встречающихся опухолей (например, опухолей
молочной железы, легких, толстого кишечника), с
гем чтобы приготовление и ведение культуры чис-
тых опухолевых клеток, способных к пролиферации
сверх обычного количества клеточных циклов, стало
обычной манипуляцией. Поскольку многие из клеток
опухоли имеют ограниченное время жизни,основными
мишенями для химиотерапии являются клоног енные
популяции, с неограниченным репойуляционным
потенциалом [Al-Hajj el al., 2004; Jones el al., 2004].
Разработанные в области стволовых клеток методы
распознавания (см. разд. 23.7) могут сделать выделение
стволовых опухолевых клеток осуществимым. Были
надежды, что клоногенные исследования в мягком
агаре [Hamburger & Salmon, 1977] помогут в выделении
трансформированных стволовых клеток для последу-
ющих испытаний, однако, несмотря на первоначально
обнадеживающие результаты, выделенные клины не
обладали долговременной регенеративной способнос-
тью. Рутинные методы выделения клеточных популя-
ций с долговременной эффективностью реггопуляции
еще не разработаны, но когда это станет возможным
для улучшения специфичности и направленности
действия препаратов, проведение прогностических
исследований противоопухолевых препаратов будет
иметь большее значение. Эти исследования должны
проводиться в большом проценте случаев, желатель-
но в течение 2 недель после получения биопсийного
материала. Основной проблемой, тем не менее, явля-
ется организация процесса. Нужно найти достаточное
количество больных с опухолями, для которых точно
выделенные Клетки-мишени: 1) будут расти in vitro
достаточно успешно для того, чтобы быть исследован-
ными; 2) будут отвечать на воздействие и 3) обнаружи-
ваемый ответ может быть слишком мал, чтобы быть
22.5. Трансформация и мутагенез
419
зарег истрированным. Однако эти проблемы связаны
с любыми исследованиями in vitro, используемыми
в качестве прогностических, нискольку связаны с
достоверностью экспериментальных исследований в
нелом. Корреляция низкой эффективности действия
препаратов in vitro с чувствительностью опухоли в
организме больного достаточно высока, но лишь не-
которые врачи отказываются от введения препарата
на основании отрицательных результатов теста in vitro,
в частности потому, что тот препарат, который прове-
рялся, возможно, будет использоваться не отдельно, а
в комбинации с друi ими.
22.4.3. Фармацевтическое тестирование
Ряд фармакологических компаний поддерживают про-
граммы испытаний in vitro, предполагая, что это может
стать более приемлемой экономически и этически
альтернативой испытаниям на животных. Внедрение
нового законодательства, от раничиваюгцего использо-
вание тестов на животных, затруднено комплексностью
действия широкого диапазона эффектов, наблюдаемых
in vivo, которые пока не могут быть адекватно воспро-
изведены in vitro. Однако существует значительное
политическое давление в отношение введения таких
законодательных ограничении, п это определяет
крупномасштабные исследования на выживаемость
для сравнительного анализа эффективности разнооб-
разных существующих тестов | Knight & Breheny, 2002:
Vanparys, 2002].
22.5. ТРАНСФОРМАЦИЯ И МУТАГЕНЕЗ
Обычно применяемые in vitro тесты для исследования
трансформации включают исследования зависимости
от прикрепления к субстрату (см. протоколы 14.4,14.5),
зависимости клеточной пролиферации от плотности
клеточной суспензии (см. протокол 18.3), и обнаружение
признаков мутагенеза (см. также табл. 18.1). Мутагенез
может быть обнаружен путем решстрации обмена сес-
тринских хроматид. Эта процедура описана в протоко-
ле 22.5, предоставленном Maureen Illand и Robert Brown
из Центра онкологии и прикладной фармаколо|ии
(University of Glasgow. Scotland, United Kingdom).
22.5.1. Анвлиз мутагенеза методом
обмена сестринских хроматид
Обмен сестринских хроматид (sister chromatid exchan-
ges, SCEs) представляет собой реципрокный обмен
участками ДНК между сестринскими хроматидами в
идентичных локусах в ходе S-фазы клеточного цик-
ла. Поскольку SCEs является более чувствительным
индикатором мутагенной активности, чем разрывы
хромосом, они становятся основным инструментом в
исследованиях мутагенеза [Latl, 19811.
С изобретением аналога тимидина бромдеоксиури-
дина (BUdR) и его последующего применения в экспе-
риментах по мечению ДНК, разрешающая способность
метода SCEs значительно возросла ио сравнению с
предыдущими методами, которые были основаны на
включении радиоактивно меченых нуклеотидов при
репликации ДНК [Taylor, 1958]. Позже разработанный
Perry and Wolf метод «флюоресценция плюс Гимза»
(FPG) [1974] для подсчета SCEs был усовершенство-
ван, и впервые была осуществлена стабильная окраска
SCEs. Прежде в ходе подсчета участков обмена нуклео-
тидами происходило быстрое выгорание флюоресцен-
тного красите^ [Latt, 1981].
Метод FPG включает в себя два существенных
этапа: 1) клетки метятся при помощи BUdR в течение
двух полных циклов деления и затем обрабатываются
кольцемидом (колхизином. Прим. ред. перев.) для
блокирования деления клеток в метафазе. После экспо-
зиции BudR ДНК одной хроматиды в каждой хромосо-
ме содержи г бромоурацил в одной цепи, в то время как
Д Н К в сестринской хромосоме содержит бромурацил в
обеих цепях; 2) затем из этих клеток изготавливаются
хромосомные препараты, которые окрашиваются флю-
оресцентным красителем Hoechst 33258, а затем произ-
водят фотодеградацию при помощи ультрафиолетового
света; затем следует окраска ио Гимза. Этот конечный
этап позволяет выявить различные участки включения
бромоурацила в сестринские хроматиды. ДНК, содер-
жащая бромоурацил, гасит флюоресценцию комплексов
ДНК-Hoechst. Таким образом,хроматида, содержащая
бромоурацил в обеих цепях, слабо флюоресцирует и
слабо окрашивается по Гимза. в то время как хрома-
тиды, содержащие бромоурацил только в одной цени,
флюоресцируют более интенсивно. BUdR разрушается
с последующим более темным окрашиванием по Гимза
(см. цв. вкладку 17с), е). Если имеют место любые SCEs,
то в результате этого метода получают препарат хромо-
сом, который получил название арлекин-хромосомы.
ПРОТОКОЛ 22.5. Обмен сестринских
хроматид
Схема
Меченные BUdR в течение двух клеточных циклов
клетки, блокированные в метафазе, триисинизиро-
вать, инкубировать в г ипотоническом буфере и затем
фиксировать. Приготовить препараты клеток, после
обработки Hoechst 33258, и фотодеграднровать окра-
шенный препарат хромосом. Окрасить хромосомы
красителем Гимза, рассмотреть в световой микро-
скоп, используя иммерсионный объектив.
Материалы
Стерильные:
• D-PBSA
• РЕ; 10 мМ EDTA в PBS
• Трипсин: 0,12% в РЕ
420
ГЛАВА 22. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ
• Bl’dR (Sigma): 1 мМ концентрат в стерильной
UPW
• Кагуошах.* КоЛьцемид, 10 mki мл (Invitroien)
• Ростовая среда
Нестерильные:
• SSC, 2х. разведение Г. 10 20х SSC (см. Приложе-
ние I)
• Гипотонический буфер: 0,075 М KCL
• Буфер Соренсена, фосфат ный буфер, 0.066 М.,
pH 6,8 (таблетированный. Merck)
• Метанол: уксусная кислота, 3:1, на льду, свеже-
приготовленный раствор красителя Гимза 0,76%:
поместите 1 порошка красителя Гимза (Merck)
в 66 мл глицерина в водяной бане ири 56—60 °C
на I’.j—2 ч. Охладить раствор, добавить 66мл
абсолютного этанола
• 3,5% краситель Гимза в буфере Соренсена,
pH 6.8
• Hoechst 33258 (Sirtna), 20 мкг мл, в UPW
• Латекс
• Ксилол
• Среда для заключения DPX (Merck)
• Покровные стекла, 22х 15 мм
• Сосуд Coplin
• Штатив для стекол (ThernioElectron)
• Коротковолновая UV лампа в коробке для об-
лучения
• Требование безопасности. Hoechst 33258
канцерогенен; взвешивайте и разводите era в вытяж-
ном шкафу.
Протокол
Предварительная обработка
1. Посейте клетки в соответствующей плотности
(например, 1х106клеток в 75-см2 флакон) и ин-
кубируйте 2 дня при 37 °C.
2. Добавьте BUdR к ростовой среде до конечной
концентрации 10 мкМ.
3. Инкубируйте клетки в темноте ири 37 °C в тече-
ние 48 ч (~2 клеточных циклов).
4. Добавьте кольцемид к клеткам за 1—6 ч до оконча-
ния инкубирования в зависимое ги от продолжи-
тельность времени деления клеток. Для челове-
ческих клеточных линии конечная концентрация
кольцемида должна составлять 0,01 mki , мл.
Снятие клеток:
5. Отмойте клетки D-PBSA и триисинизируйте их
с 1 мл 0,12% трипсина в РЕ.
6. Ресусиендируйте клетки в 10 мл ростовой среды.
Перенесите суспензию клеток в 50-мл центри-
фужные пробирки
7. Центрифу! ируйте суспензию ири 1200 g в течение
8. Удалите супернатант, оставляя приблизительно
1,2 мл над осадком. Постукивая ио иробирке,
ресусиендируйте осадок.
9 Медленно добавьте 10 мл тиотонического
(предварительно иодшретога до 37 °C) и ин-
кубируйте в течение 10—15 мин ири комнатной
температуре.
10. Осадите клетки в настольной центрифуге при
1200 g 5 мин.
11. Удалите супернатант, оставляя 1,2 мл над осад-
ком, постукивая но пробирке, ресусиендируйте
осадок.
12. Добавьте 10 мл фиксирующего раствора, охлаж-
денного на льду, вначале кайля ш> кайле, хорошо
перемешивая. Оставьте пробирку на льду на
10 мин.
13. Повторите uiai и 10—12 еще раз, оставив клетки в
фиксирующем растворе на ночь ири 4 °C. чтобы
у.ц'чшиться качество препарата.
14. Осадите фиксированные клетки ири 1200 g в
течение 5 мин, ресусиендируйте в 3—5 мл смеси
метанол уксусная кислота
15. Храните клетки при —20 'С.
Подготовка препарата.
16. Стекла должны быть чистыми и обезжиренными,
поэтому протрите их абсолютным этанолом.
17. Используя короткую стеклянную пастеровскую
пипетку, наберите приблизительно 500 мкл фик-
сированных клеток
18. Держа стекло иод нисходящим углом и удерживая
пастеровскую иииетку ио крайней мере в 15 см
над стеклом, каините 3 капли суспензии на с текло
(см. протокол 16.7)
19. Высушите на воздухе в темноте.
20 Проверьте иренарат в фазово-контрастном мик-
роскопе, чтобы убедиться в том, что метафазные
пластинки, имеющиеся там, равномерно распре-
делены по препарату и что хромосомы хорошо
разделены
Арлекин Окраска
21. Погрузите стекла в сосуд ля окрашивания пред-
метных стекол с красителем Hoechst 33258 ири
концентрации 20 мк</мл на 10 мин. (Используйте
перчатки, так как Hoechst ядовит.)
22. Перенесите препараты в штатив для стекол и
капните 500 мкл 2х SSC на каждый препарат.
23.Закройте препараты покровными стеклами
22x50 мм и зафиксируйте края временным гер-
метизирующим вещее гвом типа латекса, чтобы
предотвратить загрязнение
24. Поместите препараты в штатив, иокровными
стеклами вниз, и поставьте штатив с препарата-
ми для обработки в коробку с коротковолновым
UV, сохраняя расстояние между препаратами
и источником UV приблизительно 4 см. Чем
дольше ирепараты подвергаются действию UV,
тем более бледным станет хроматид; облучайте
стекла приблизительно 25—60 мин.
25. Удалите покровные стекла, промойте стекла три
раза по 5 мин в I1PW Закройте штатив алюми-
ниевой фольгой.
22.5. Трансформация и мутагенез
421
26. Высушите препараты в темноте на воздухе.
27. Окрасьте препараты в сосуде (в емкости для ок-
рашивания стекол), содержащей 3,5% красителя
Гимза в буфере Соренсена, pH 6.8,3—5 мин.
28. Тщательно ополосните препараты в проточной
воде, дайте стечь, осушить фильтровальной бу-
магой.
29. Высушите стекла на воздухе на столе в течение
1 ч. Погрузите каждый препарат в Ксилол, на-
несите 4 капли заключающего вещества DPX
(Merck) на препарат, и заключите под покровное
стекло 22x50 мм, удаляя воздушные пузырьки
с помощью кусочка ткани. (Выполняйте этот
заключительный шаг в вытяжном шкафу, так
как пары ксилола ядовиты. Также используйте
перчатки.)
30. Высушите препараты на воздухе в вытяжном
шкафу в течение ночи.
Анализ.
31. Просмотрите препараты под 40х объективом све-
TOBOi о микроскопа для обнаружения метафаз.
32. Найдите область на стеклах 1де расположено
большинство метафазных пластинок, и иссле-
дуйте .пу область с иммерсионным объективом
33. Кшда не происходит обмена сестринских хро-
матид, (sister chroinatide exchange, SCEs), то
каждая хромосома имеет одну равномерно окра-
шенную бледную хроматиду и одну равномерно
окрашенную темную хроматиду. Один SCE
происходит, koi да обнаруживается одна область
темною окрашивания и на светлой хроматиде
и одна светлая область на темной сестринской
хроматиде (см. цв. вкладку 17с), е). Каждая точка
неоднородности в окрашенных хромосомах учи-
тывается как один SCE
34. Подсчитайте число SCES в клетке, а также число
хромосом в клетке.
35. Большие хромосомы обычно имеют больше SCES,
чем меньшие, частота SCES может варьировать
от клетки к клетке, поэтому более точным пара-
метром для определения SCE яв.>1яется среднее
количество SCES на хромосому, определяемое
ио следующей формуле:
среднее количество SCES в клетке
среднее количество хромосом на клетку
Старайтесь подсчитать приблизительно пятьде-
сят метафазных пластинок в каждой изучаемой
клеточной линии.
Вариации. Импульсное мечение ири помощи BUdR
и последующее окрашивание, как было описано выше,
позволяют обнаружить различия в pei ионах ранней и
поздней репликации хромосом в ходе клеточною цикла.
Кшда клетки метятся при помощи BUdR в поздней
стадии клеточного цикла, ДНК, которая реплициро-
валась рано, окрасится ири помощи краски Гимза в
темный цвет, поскольку внедрится очень мало BudR.
Те peiионы, 1де хромосомы нодвер1лись импульсному
мечению в ранней стадии клеточного цикла и 1 де ДН К
реплицировалась на этих ранних стадиях, Гимза даст
слабую окраску [Latl, 1973J.
Кроме того, клетки, которые нодверютись посто-
янному мечении» BUdR в ходе только одного клеточ-
ного цикла, имеют дифференциальное окрашивание
хроматид только в определенных зонах (латеральная
асимметрия) в результате различия содержания тимина
в ДНК [Brito Babapulle, 1981J. После фотодег|»адации
BUdR для окрашивания SCEs может также быть
использован флюоресцентный краситель акридин
оранжевый. При помощи этого красителя в pei ионах,
которые имеют двухцеиочечные ДНК, обнаруживается
зеленая флюоресценция, и таким образом можно за-
ключить, что здесь произошло мало включений BudR.
Красная флюоресценция наблюдается в pei ионах, i де
имеется одноцепочечная ДНК, в которую произошло
включение BUdR. Таким образом, красная флюорес-
ценция эквивалентна светлой окраске с Гимза, а зеленая
флюоресценция эквивалентна темной окраске с Гимза
[Karenberg & Freelander, 1974].
22.5.2. Канцерогенность
Потенциал исследований канцеро1енности in vitro
весьма значителен [Berky and Sherrod, 1977; Grafslrom,
1990а, b; Zhu el al., 1991 J. Это область, в которой иссле-
дования in vivo далеки от адекватности; модели слабо
разработаны и исследования требуют недели и даже
месяцы для их проведения. Разработке удовлетвори-
тельного подхода исследования in vitro препятствуют
1) отсутствие универсального приемлемого критерия
злокачественной трансформации in vitro и 2) присущая
клеткам человека, как основным объектам исследова-
ния, стабильность.
Большинство общеупотребительных тесгов предпо-
лагают, что канцерогенез в большинстве случаев связан
с мутагенезом (см. разд. 18.3). Это предположение
основывается на исследованиях Ames [ 1980), 1де в ка-
честве объекта использовались бакгерии, а активация
осуществля.>1ась при помощи микросомальных фермен-
тов печени. Этот тест имеет высокую upoi ностическую
ценность, но, несмотря на это, различия в захвате,
чувствительности и типе клеточного ответа привели
к внедрению альтернативных тестов, использующих
клетки млекопитающих и человека в качестве мишеней,
например исследование обмена сестринских хроматид
(см. разд. 22.5.1).
Некоторые из этих тестов также применяются в
исследованиях му гагенеза, с использованием суспензии
клегок лимфомы L5178Y как клеток-мишеней [Cole
el al., 1990J путем индукции мутаций или реверсии.
Кроме того, они используются в оценке таких цитол!»-
। ических событий, как обмен сестринских хромосом
(см. протокол 22.5), как признаков мутагенеза. Дру1 ие
исследователи [Styles, 1977J используют трансформа-
цию как конечный пункт, проводя испытания клоноген-
ности в суспензии (см. разд. 18.5.1) в качестве критерия
422
ГЛАВА 22. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ
трансформации. Критики говорят. что эти системы
используют в качестве объекта клетки, которые уже
частично трансформированы; даже клетки ВНК21-С13,
использованные некоторыми научными работниками,
являются постоянной клеточной линией и не moivt
рассматриваться как абсолютно нормальные. Более
тою. большая часть раковых опухолей развивается
в эпителиальных тканях и не развивается в клетках
соединительной ткани.
Демонстрация возрастания экспрессии онкогенов
или амплификация, либо возрастание концентрации
продуктов экспрессии измененных онкогенов может
быть достоверным критерием, в некоторых случаях
функционально связанных с канцерогенезом. Теперь
это возможно обнаружить с помощью микроанализа.
Анало! нчно этому, делении или мутации в супрессор-
ных генах также доступны для молекулярного анализа,
в то время как делении или мутации в генах р53, Rb,
р16, и L-САМ (Е-кадгерин) moivt быть признаками
большого количества злокачественных трансформаций.
В настоящее время осуществимо проводить анализ
экспрессии генов, что может стать альтернативой ис-
пытаний мутагенности и канцерогенности [Nuwaysiret
al., 1999, Desai el al., 2002; Vondracek et al., 2002].
22.6. ВОСПАЛЕНИЕ
В настоящее время растет необходимость исследований
сложных событий на моделях культуры клеток, таких
как воспалительная реакция, развивающаяся в ответ
на фармаколо! ическое воздействие пли аппликацию
косметического препарата или ксенобиотика, которые
мшут проникать в организм путем ишаляции или с
пищей, и которые могут быть причиной развития аллер-
1 ии. Это область, которая находится на ранних стадиях
развития, но имеет mhoi ообещающие результаты в бу-
дущем. Группы защитников прав животных раздражает
неоправданное использование большого количества
животных для испытания новых косметических пре-
паратов. Зги испытания имеют небольшое значение,
помимо коммерческой прибыли для производителей
косметики, в частности при испытании таких веществ,
как шампуни, применяется тест Дрэйза, при котором
вещество добавляется в глаз кролика. Более важны
клинические исследования, касающиеся возрастающих
аллер! ических ответов на фармацевтические вещества
и ксенобиотики. Эти реакции недостаточно понятны
и мало контролируемы, 1лавным образом поскольку
отсутствуют простые воспроизводимые тесты in vitro
С начала развития техноло! ии фильтрующих ячеек
(filter well technology) разработано несколько моделей
для изучения реакции кожи и роговицы [Braa and
Triglia, 1991;Triglia etal., 1991: Fusenig, 1994b; Roguel
Рис. 22.10. Органотипическое исследование. Гипотетиче-
ская система исследования для изучения действия исследуе-
мого вещества на некий слой клеток (наиример,эпидермаль-
ных кератиноцитов), при совместном культивировании их с
другим связанным типом клетки (например, фпбрпбласты
кожи в коллагеновом голе) к раздражи и-лю и измерение реак-
ции по выделению цитокинов (см. также цв вкладку 21)
et al., 1994; Kondo et al., 1997; Brinch & Elvig, 2001],
использующих оборудование для совместного культи-
вирования различных типов клеток. В этих системах
предполагается, что взаимодействие аллергена или
раздражающего вещества с первичной мишенью (на-
пример, клетки эпидермиса) инициирует паракринный
ответ, который вызывает высвобождение цитокинов из
вторичных стромальных компонентов (например, соб-
ственно кожи) (рис. 22.10). Эти цитокины мшут быть
обнаружены и измерены методом ELISA, что позволяет
вести мониторинг степени ответа. Хотя эти исследова-
ния находятся на ранней стадии развития, некоторые
производители предлагеют наборы для обнаружения
ответов на раздражение [Epiderm (MalTek) [Kuschieral
al., 1997]; Episkin (Saduc) [Cohen elab 1997]; SkinEthic
[ Brinch & Elvig, 2001; см. цв. вкладку 21]. Протокол для
культуры роговицы, подходящий для моделирования
ответа глаза на раздражение предоставлен Carolyn
Calm (см. протокол 23.2).
Этот тип систем может быть важной областью иссле-
дования. с реальной перспективой использования для
скринин! а аллергенов в отношении opi анотинических
культур, созданных на основе клеток кожи отдельных
пациентов. Такие системы мш ут также быть использо-
ваны для анализа раздражающего действия на желудоч-
но-кишечный тракт аллергенов, ответственных за раз-
витие синдрома раздраженного кишечника. В каждом
случае существует важная возможность исследования
специфических механизмов нарушения межклеточных
взаимодействий, имеющих место при mhoi их аллер! н-
ческих и дегенеративных заболеваниях.
Глава 23
КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ
ТИПОВ КЛЕТОК
Для mhoi их людей клеточные культуры являются прос-
то субстратом для продукции некоторого количества
клеток, достаточного для экспериментальных или
промышленных целей. Тем не менее отмечается воз-
растание интереса к специфическим щеточным типам,
используемым ajih исследования специализированных
процессов н их иатоло! ии либо для использования в
клеточной терапии. Генерация специализированной
клеточной культуры может быть получена несколь-
кими путями: 1) выделением дифференцированных
клеток или тканей для кратковременной нерегенера-
тивной культуры (см. 1л. 25), 2) выделением клеток-
предшественников, наращиванием их в селективных
условиях культивирования (см. ниже и разд. 10.2.1,
14.6) с последующей индукцией дифференцировки
(см. разд. 17.7), пли 3) путем выделения стволовых
клеток и создания культуры, которая мосла бы как
поддерживаться в виде популяции стволовых клеток,
так и дифференцироваться ио одному из нескольких
возможных путей дифференцировки до получения
желательно! о фенотипа (см. разд. 23.7). В каждом слу-
чае технолш ии различны, и настоящая глава призвана
представить некоторые техно лО1 ни для специфических
типов тканей.
23.1. КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ
СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК
Имеется много обзоров, посвященных технике куль-
туры специфических типов клеток [Doyle et al.,
1990-1999; Pollard & Walker, 1990; Freshney et al., 1994;
Leigh & Watt, 1994; Freshney & Freshney, 1996; Ravid
& Freshney, 1998; Haynes, 1999; Federoff & Richardson,
2001; Freshney & Freshney, 2002; Wise, 2002; Vunjak-
Novakovic & Freshney. 2005: см. также табл. 3.1 J.
Развитие техники иммортализации клеточных ли-
ний [Freshney & Freshney, 1996] (см. также разд. 18.4)
подразумевало, что станет возможным создание по-
стоянных клеточных линий на основе конечных линий,
выделенных из нетрансформированных тканей [Chang
el al., 1982; Freshney et al., 1994; Klein el al., 1990; Steele
et al., 1992; Wyllie el al., 1992]. Во многих случаях
дифференцированные свойства бывают' утрачены, но
использование ре1улируемых промоторов (напри-
мер, температурно-чувствительных) может сделать
возможным восстановление дифференцированного
фенотипа. Получение транс! енных мышей, несущих
крупный Т-ген SV40, открыло новый диапазон воз-
можностей [Jat et al., 1991; Yanai et al., 1991; Morgan el
al. 19941, поскольку клеточные культуры. выделенные
из этих животных, уже являются иммортализованны-
ми, но сохраняют некоторые дифференцированные
функции. Поскольку эти клетки несут температурно-
чувствительный промотор иммортализованного гена,
возможно восстановление нормально! о фенотипа при
температуре 37 °C.
Многое специализированные клетки (наири-
мер, эпидермальные кератиноциты и меланоциты,
эндотелиальные клетки, 1ладкомышечные клетки,
фибробласты дермы и меланоциты, а также эпите-
лий молочной железы) коммерчески доступны (см.
Приложение II). Стоимость их очень высока, но при
увеличении приобретаемой партии стоимость может
упасть. Культуры клеток кожи для цитотоксических
исследований и изучения воспалительных процессов
также можно приобрести в компаниях Episkin (Saduc),
Epidenn (MatTek)n SkinElhic. Эти продукты приготов-
лены в фильтрующих ячейках путем комбинирования
кератиноцитов с фибробластами дермы и коллагено-
вой подложкой, поддерживаемой нейлоновой сеткой
в так называемом «эквиваленте кожи». Дpyi ие ткани,
в частности роговица (SkinElhic), также готовятся
подобным образом для исследования токсичности (см.
протокол 23.2; цв. вкладку 21).
В настоящее время разработан ряд специализиро-
ванных процедур, и специалисты в разных областях
предложили несколько репрезентативных примерив.
Протоколы в данной 1лаве пре дно латаю г, что исследо-
вателям доступны основные методики и оборудование,
описанные в гл. 4. Соответственно, такое оборудование,
как ламинарный шкаф, инвертированный микроскоп,
водяная баня, настольная центрифуга и up.. не входят
в список материалов.
23.2. ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
Эпителиальные клетки ответственны за специфиче-
ские функции mhoi их ор! анов (например, поляризо-
ванный транспорт в почках и кишечнике, секреция в
печени и поджелудочной железе, газообмен в ле! ких,
барьерная защита в коже). Эпителиальные клетки
интересны также как модель дифференцировки и ки-
424
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
метики стволовых клеток (например, эпидермальные
кератиноциты [Walt, 2001, 2002]) и они относятся к
основным тканям, в которых обычно развивается ра-
ковый процесс. Следовательно, культуры различных
эпителиальных клеток находятся в фокусе внимания
исследователей в течение многих лет. Главной пробле-
мой для получения чистой культуры Эпителиальных
клеток является избыточный рост стромальных клеток,
таких как фибробласты соединительной ткани и сосу-
дистый эндотелий. Большинство вариаций методов
имеет своей целью предупреждение такого избыточно-
го роста путем манипуляций с добавками в среду или
изменение субстрата для культуры (табл. 23.1), кото-
рый ускоряет рост недифференцированно! о эпителия
и преимущественно стволовых клеток. Дальнейшие
модификации могут быть направлены на облегчение
дифференцировки эпит елия, хотя обычно это проис-
ходит за счет снижения пролиферации.
Факторы, содержащиеся в сыворотке (многие из
них получены из тромбоцитов), обладают сильной
митогенной активностью в отношении фибробластов,
а также имеют тенденцию к инг ибированию пролифе-
рации эпителия в результате индукции терминальной
дифференцировки. Следовательно, одной из наиболее
значительных задач в выделении и размножении кле-
точной культуры является разработка селективной
бессывороточной среды (см. разд. 10.2.1) и добавок со
специфическими факторами роста (см. табл. 10.3).
Выделение эпителиальных клеток из донорских
тканей часто лучше всего осуществляется ири помощи
коллагеназы (см. протокол 12.8), которая разрушает
стромальные клетки, но сохраняет эпителиальные клет-
ки в небольших кластерах, позволяя выделять их путем
перенесения на питательный субстрат и поддержания
их жизнеспособности.
23.2.1. Эпидермис
Эпидермис представляет собой одну из наиболее ин-
тересных моделей эпителиальной дифференцировки
в связи с выраженной эволюционной иерархией г ис-
тологической структуры и еще потому, что он был
одной из первых моделей, в которой использован
фидерный слой ЗТЗ, поддерживающий рост клеток.
Было осуществлено бесчисленное количество попыток
использовать культуру эпидермальных кератиноцитов
как модель дифференцировки, как идеальную тка-
невый конструкт для ортанотииической культуры и
исследований межклеточною взаимодействия [Maas-
Szabo wski el al., 20021, а также как трансплантацион-
ный материал для пересадки при ожогах и раневых
повреждениях.
Протокол 23.1 для культуры эпидермальных керати-
ноци тов был предоставлен Norbert Е. Fusenig и Hans J.
urgen Stark. Division of Carcinogenesis and Differentia-
tion, German Cancer Research Center, Iin Netienheimer
Feld 280,6900 Heidelberg, Germany.
В результате развития основных технолог ий куль-
туры клеток и нашего понимания требований культуры
различных эпителиальных клеток, в культуре клеток
могут быть выделены и исследованы кератиноциты
Таблица 23.1. Ингибирование избыточного роста фиб|юбластов
Метод Действующий агент Ткань Литературный источник
Селективное открепление Трипсин Коллагеназа Кишечник плода, сердечная мышца, эпидермис Корцинома молочной железы Owens ct aL, 1974, Mdo et al., 1980 Freshney, 1972, Lasfargues, 1973
Конфлюэнтные фидер- ные слои Мышиные фидерные клетки ЗТЗ Фидерные клетки кишечника плода человека Эпидермис Эпителии нормальной ц ма- лиг нитированноп молочной железы Карцинома толстой кишки Rheuiwald and Green, 1975 Stanipfcrci al.. 1980 Freshney ci al., 1982b
Селективные ингибиторы D-валин Cis-OH- пролин Этилмеркурнтиосалициаат Фенобарбитал Антпмсзодсрмальныс антитела Генсгпцин Почечный эпителий Клеточные линии Неонатальная поджелудочная железа Печень Сквамозная карцинома Голстокпшечная аденома Меланоциты, ме ганома Gilbert and Migcon, 1975, 1977 Kao and Prockop, 1977 Braaten ct al, 1974 Fry and Bridges, 1979 Edwards ct al, 1980 Paraskeva et al, 1985 Levin ct al, 1995
Селективная среда MCDB 153 MCDB 170 Низкая концентрация Са2+ Эпидермис Молочная железа Эпидермальные меланоциты Boyce and Ham. 1983 Hammond ct aL. 1984 Nacyacrt ct aL, 1991
23.2. Эпителиальные клетки
425
ПРОТОКОЛ 23.1. Эпидермальные
кератиноциты
Схема
Выделить эпидермис из кожи ферментативным
способом, диза| rpei ировать кератиноциты, посеять
их в бессывороточну to среду пли на фидерный слой
клеток, пролиферация которых блокирована
Материалы
Стерильные:
• Подготовленный 3-дневный фидерный Слой (см.
разд. 14.2.3 и протокол 23.4). Облучите клетки
ЗТЗ интенсивностью 30 Грэй, фибробласты че-
ловека 70 Грэи, предпочтительно в концентри-
рованной клеточной суспензии.
• FAD: среда для культивирования на фидерном
слое с высоким содержанием кальция; Среда
Хэма F12 и DMEM с добавками ио Wu et at
119821: среда Хэма F12 в смеси с DM ЕМ, 1:3, с до-
бавлением аденина (1,8x10"* М), холерноготокси-
на (1х 10“w М ), EGF (1 -10 hi л), i идрокортизона
(0,4 mi мл, 1,1 мкМ), 5—10% FCS, пенициллина
(100 U/Mji) и стрептомицин (50 mki мл).
• Бессыворпточная среда для роста кератиио-
цитов (keratinocyte growth medium, KGM):
на основе исходной рецептуры среды MCDB
153, разработанной Воусе and Ham 11983] (см.
табл. 10.1 и Приложение II), дополненная ш-
цофизарным экстрактом быка с низким содер-
жанием Са’*(0,03—0,5 мМ), которая может быть
увеличена добавлением СаС1,
• Селективная среда для выделения кератиноцитов
(keralitiocyle-defined medium, KDM): бессыво-
роточная среда (см. Приложение II), основанная
на исходной среде MCDB 153 ио Воусе and Hani
11983]; полностью определенная среда, испытанная
наор|анотииических культурах | Stark el aL, 1999]
• KDM с добавками (supplemented KDM (SKDM)):
а) Взять селективную среду для выделения
кератиноццгов (КDM) без |иш>физарн01о
экстракта (Promocell, Clonetics);
б) добавить: инсулин (5 mi,’мл), iидрокортизон
(0,5 mki/mji), rhEGF (0,1 hi мл), трансфер-
рин (20mki . мл), 0,1% высокоочищенный
бычий сывороточный альбумин (свободный
от эндотоксинов и жирных кислот, например,
А-8806. Sigma), и L-аскорбиновая кислота
(50 мкг/мл).
в) Довести Са2*1о 1,3 шМ.
i) Первичная культура кератиноцитов может
поддерживаться на необработанных чашках
в SKDM. но ири низкой пролиферативной
активности. Скорость роста культуры может
быть повышена, если использовать чашки,
обработанные коллагеном (1 типа).
В opiaHOTuuiiueCKiix культурах на возвышенных
кол лагенов ых гелях, выращенных с фиброб. щстам и.
эта среда обеспечивает эпидермальный рост и
дифференцировку, сходную с полученной в FAD I
| Stark etal, 1999].
• D-PBSA
• EDTA (05%; 15 мМ)
• Глицерин (аналитическая степень чистоты)
• Среда FAD с 20% FCS и 10% ишиерина
• Ферменты.
а) Термолизин (Т-7902, Sigma)
б) Трипсин (1:250; 0,2 and 0,6%)
в) Дисиаза (степень!!, 2,4 U мл, Boehringer ।
Mannheim)
• Раствор бетадина (10% иод)
* Ампулы для криоконсервации
• Центрифужные пробирки, 50 мл
• Нейлоновая сетка
• «Cell Strainers (Becton Dickinson)
• Чашки Петри, бактериолш ические 10см
• Скальпели, изо| нутые пинцеты
Протокол
Образцы:
1. Получите крайнюю плоть (неонатальную или
ювенильную) наиболее часто используемый
источник человеческой кожи или образец кожи,
полученный в ходе xupypiическои операции или
посмертного вскрытия (до 48 ч после смерти).
Кератиноциты, полученные из крайней плоти,
прикрепляются u пролиферируют лучше, чем
клетки, полученные из кожи взрослого человека.
2. Инкубируйте биопсийный образец до 30 мин в
растворе Бетадина (10% иод) для предупрежде-
ния инфицирования (это не снижает видимым
образом жизнеспособность кератиноцитов).
3. Промойте дважды в D-PBSA но 10 мин.
Отделение эпидермиса
Оптимальная толщина образца получается при рас-
слоении кожи.
4. Разделите образец кожи при помощи дерматома
Castroviejo (Siurz Instrument) на слои толщиной
0.1-0,2 мм. Возможно также использовать под-
кожные слои ткани, при этом часть дермиса может
быть удалена при помощи кривых ножниц.
5. Рассеките кожу на кусочки размерами 1x2 см при |
помощи скальпеля.
6. Промойте ткань от двух до пяти раз в D-PBSA.
7. Инкубируйте ткань с протеазой одним из следу -
ющих способов:
а) Трипсин: инкубировать плавающие образцы
кожи в 0,6% растворе трипсина в D-PBSA (pH
7,4) в течение 20—30 мин ири 37 °C Либо (эту
работу, в частности, можно проделать с целым
образцом кожи).
б) Холодный трипсин: инкубировать плавающие
образцы в 0,2% трипсине на льду (4 °C) в те-
чение 15-24 ч.рН раствора трипсина должен
постоянно контролироваться при помощи
426
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
фенола красного для того, чтобы избежать
сдвига pH. который может* привести к изме-
нению ферментативной активности и снизит ь
жизнеспособность клеток.
в) Дисцаза (степень II): инкубируйте с фермен-
том 2.4 U /мл в течение 30 мин при 37 °C.
।) Термолизнн (0,5 mi мл) [Germain et al.. 1993]:
инкубируйте 12—16 ч при 4 °C.
8. Тщательно контролируйте процесс разделения
эпидермиса. Koi да первые признаки отщепления
эпидермиса будут заметными на краю среза об-
разца кожи, поместите кусочки (дермнсом вниз)
в 10-см пластиковую чашку Петри и полейте 5 мл
полной культуральной среды с сывороткой.
9. Отслоите Эпидермис при помощи двух изО1нутых
пинцетов и поместите его в 50-мл центрифужную
пробирку, содержащую 20 мл полной культу-
ральной среды.
а) Если разделение производилось при помощи
трипсина, жизнеспособные кератиноциты мо-
гут быть отделены от эпидермального участка
посредством осторожно|о пипетирования
и просеиванием через нейлоновую сетку с
ячейками 100-мкм (“Cell Strainer,” В-D Bio-
sciences) .
б) Для получения единичных клегок из эпи-
дермиса, отделенного при помощи дисиазы
пли термо.шзина, требуется дополнительная
инкубация с трипсином (0,2%) и 1,3 мМ EDTA
(0,05%), в течение 10 мни при 37 °C.
10. После расслоения кожи в трипсине осторожно
соскребите рыхло прикрепленные эпидермаль-
ные клетки на оставшейся дермальной части и
добавьте клетки к эпидермальной суспензии. Это
может привести к более высокому клеточному вы-
ходу, если чис гота популяции кератиноцитов не
HBjineTCH основным вопросом культивирования,
но количество мезенхимальных клеток, загрязня-
ющих полученную в результате процедуры куль-
туру кератиноцитов, будет значительно выше
11 Промойте выделенные эпидермальные клетки
дважды в культуральной среде путем центри-
фушрования при 100 g в течение 10 мин, под-
считайте общее количество клеток и количество
жизнеспособных клеток (которые не абсорби-
руют Трииановый синий, см. протокол 22.1).
Первичная культуре
12 . Посейте клетки при 37 Св среду FAD или KGM
при желаемой плотности:
а) В FAD с фидерными клетками (чашки, засе-
янные на три дня ранее иостмитотическими
ЗТЗ клетками [Rheinwalil & Green, 1975J
(протокол 14.3) или фибробластами кожи
[Li ma I et al., 19891), посеять кератиноциты в
количестве 2-5х 101 кл./см2.
6) Для культуры, свободной от фибробластов,
посейте в FAD первичную культуру кератино-
цитов при высокой плотности (1 —5х 10s кл./см2)
и поддерживайте ее при высокой плотности
при субкультивировании.
в) Можно, кроме того, посеять клетки при низ-
кой (1х103кл. см2) и высокой (5x10* кл./см2)
плотности в KGM при низкой концентрации
Са2* (0,03—0.1 мМ), и субкультивировать в той
же среде.
i) Клетки будут прикрепляться и расти, но с
более низкой скоростью в SKDM. поэтому
эта среда также рекомендуется для экспери-
ментальных условий, koi да требуется низкая
пролиферативная активность.
13 . Koi да клетки прикреплены (через 1-Здня),тща-
тельно сполосните культуру средой для того, чтобы
элиминировать неирикреиившиеся. шлибшне и
дифференцированные клетки, и иродшоките куль-
тивирование в среде FAD или KGM. Наслаивание
и медленное падение роста могут быть доспи нуты
путем сдвига концентрации Са2* в KGM
Субкультивирование
14 .Субкульгивирование производится следующим
образом:
а) Культивирование в FAD:
i) Инкубировать в 1,3-2,7 мМ (0.05-0,1%)
EDTA в течение 5 -15 мин для того, чтобы
инициировать отслоение клеток, которое
заметно по расширению межклеточных
пространств.
ii) Инкубируйте в 0,1% трипсина и 1,3 мМ
(0,05%) EDTA при 37 °C в течение 5-
10 мни, с последующим осторожным пиие-
тированием до полного отделения клеток
б) Культивирование в KGM:
i) не требуется предварительной обработки
EDTA из-за низкой концентрации Са-
ii) Инкубировать в 0,1% трипсине с 1,3 мМ
EDTA. как при культивировании в FAD.
Криоконсервация:
15. Криоконсервация часто бывает необходима для
поддержания большого количества клеток, по-
лученных из одного образца ткани; наилучшие
результаты получают, koi да используются клетки
из преконфлюэнтной первичной культуры.
а) Трнисинизцруйте клетки, как описано выше,
центрифу! ируйте при 100 g в течение 10 мин.
6) Ресусиендируйте клетки в полной культураль-
ной среде с сывороткой и подсчитайт е.
в) Разаликвотьте но 2х106кл./мл в FAD с 20%
FCS и 10% |лицерином в иробнркидля крио-
консервации
i) Инкубируйте для установления равновесия
при 4 "С в течение 1—2 ч.
д) Заморозьте клетки в cells программируемом
аппарате для замораживания (Planer) со
скоростью охлаждения 1 °C 'мин. Иначе крио-
23.2. Эпителиальные клетки
427
консервация может проводиться путем поме-
щения пробирок в коробки для заморажива-
ния, заполненные изоиропанолом (т.н. Cryo 1.
С Freezing Container, cal. no. 5100-0001, Nalge
Nunc), который позволяет осуществлять адек-
ватную скорость охлаждения при помещение
в морозильник с температурой —80 °C.
е) Для восстановления клеток:
i) быстро оттайте пробирки в водяной бане
при температуре 37 °C
ii) разведите клетки культуральной средой в
десять раз
iii)центрифут ируйте клетки и ресуспенди-
руйте их до необходимой концентрации в
выбранной среде, засейте культуральный
сосуд.
большинства стратифицирующихся эиителиев. Сква-
мозный эпителий кожи и выделенные из него эпители-
альные клетки, — кератиноциты, обычно применяются
для исследования их физиологии и ватолоши in vitro.
В дополнение к Этому, были выделены и культивирова-
ны в особых условиях клетки слизистой рта [Tomakidi
el al., 1997; Grafsiroin, 2002J, а также такие структуры
кожи, как волосяные фолликулы [обзор см. Ftisenig el
aL, 1994J. Осуществлены попытки создания ткани в
культуре и в трансплантате |Liniat el al., 1995, Maas-
Szabovvski et al.,2000,2002 J.
Отделение эпителиального комиартмента от подле-
жащих соединительных тканей обычно проводится пу-
тем ферментативно! о расщепления трипсином [см. на-
иример, Smola el al., 1993J, диспазой типа 11(2,4 ед./мл,
Boehringer Mannheim [Tomakidi el al., 1997J), или
термолизином [Germain el al., 1993J. Изолированный
эпителий затем диспер! ируется дополнительным инку-
бированием в трипсине или механическим пикетирова-
нием, после чего фильтруется через нейлоновую сетку
и суспендируется в бессывораючной среде с низким
содержанием кальция или на фидерном слое клеток
с б^жированной пролиферативной активностью в
различных средах с разной рецептурой. Субиопуляция
кератиноцитов с характеристиками стволовых клеток
может быть выделена и благодаря их селективной
ад1езии к компонентам базальной мембраны [см.
Bickenbach and Chism, 1998].
Для toi о чтобы избежать избыточного роста ме-
зенхимальных клеток, эпителиальный компартмент
должен быть отделен от соединительной ткани н дис-
uepi ирован до одиночных клеток, которые затем куль-
тивируются на средах различною состава. Наиболее
общеупотребительным является метод фидерною слоя,
впервые разработанный Rheinwald & Green [1975J,
которые использовали иостмитотические (облучен-
ные или обработанные митомицином-С) клетки ЗТЗ
в качестве мезенхимальных питательных элементов.
Вместо них могут также использоваться первичные
фибробласты, выделенные из кожи или субмукозною
слоя, переведенные в цостмитотическое состояние
[Lima! el al., 1989; Tomakidi el al., 1997J. Фидерные
клетки обладают широким спектром физиолш ических
функций [Maas-Szabowski & Fusenig, 1996J. Кроме
тою, кератиноциты мшут быть выращены без фидер-
ных клеток в бессывороточной среде с добавлением
экстракта гипофиза или ряда факторов роста и друг их
добавок, как при низких (0,03-0,06 мМ) концентра-
циях Са2-для ин! ибирования расслоения так и при
нормальных (1,2 —1,4 мМ) концентрациях Са-* для
расслоения и керати низации [см обзор Holbrook &
Hennings, 1983J. Хотя поддержание субкультуры при
высокой клеточной плотности в присутствии фидер-
ных клеток (например, облученных ЗТЗ) или культуры
ири низкой концентрации кальция в бессывороточной
среде помогает снизить контаминацию фибробластами,
мезенхимальные клетки не полностью элиминируются
при выполнении этих процедур.
Человеческие и мышиные клетки могут культи-
вироваться на всех трех средах в течение нескольких
месяцев. Мышиные клетки могут быть субкультиви-
рованы только один-два раза, а человеческие клетки
мшут быть пересеяны четыре н более раз в FAD и KGM
соответственно.
Характеристика культур кератиноцитов. Куль-
тивированные клетки должны быть охарактеризованы
для подтверждения их эпидермального (эпителиаль-
но! о) фенотипа, чтобы исключить загрязнение мезен-
химальными клетками. Это может быть достш нуто,
ири использовании цитокера ги н-детерминированных
антител к эпителиальным клеткам
Контаминация эндотелиальными клетками может
быть идентифицирована антителами против CD31
или антигена родственною фактору VIII. Однознач-
ное распознавание фибробластов является затрудни-
тельным, потому что использование антител против
виментина (элемент мезенхимальною цитоскелета) не
является специфическим; кератиноциты in vitro мшут
начать синтез виментина с различной интенсивностью,
которая зависит от условий культивирования. Для
практической оценки мезенхимального за! рязнения
клегок, клетки следует посеять при посевной кон-
центрации 1—5х102кл.усм~) на фидерные клетки, и
морфолог ня клеток 10— 14-дневной культуры должна
быть идентифицирована при малом увеличении пос-
ле фиксации и окраски гематоксилином и эозином
(Н&Е). Более высокочувствительный метод иден-
тификации загрязнения фибробластами — анализ
экспрессии фактора роста кератиноцитов (KGF) мето-
дом RT-PCR. Поскольку .пот фактор продуцируется
фибробластами, но не продуцируется кератиноцитами,
он представляет собой селективный маркер. Более тою,
экспрессия KGF усиливается при сокультивировании
с кератиноцитами, поэтому этот метод позволяет об-
наружить минимальное загрязнение фибробластами
[Maas-Szabowski el aL, 1999]. Отдельные фибробласты
в монослое кератиноцитов могут быть обнаружены ме-
тодом гибридизации in situ с DNA KGF. Человеческие
фибробласты мш ут быть идентифицированы и коли-
428
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
чественно оценены методом фибробласт-сиецифиче-
ских антител A SO 2 (Dianova) иммуноиероксидазным
методом [Saalbach et al., 1997].
Вариации. Кератиноциты мотут быть получены
из внешнего эпителиального влаталища корня волос
(ORS) выдернутых волосяных фолликул скальпа
путем отделения клеток от рассеченного фолликула
[Limat el al., 1989] Из трех фолликул может быть по-
лучено до 5x10* клеток при посеве на фидерный слой
фибробластов, по завершении 15-дневной культуры
будет приблизительно 1х 10** клеток. Подобно межфол-
ликулярным кератиноцитам, ORS-клетки могут быт ь
субкультивпрованы на чашках с фидерным слоем и
заморожены. Эти ORS-полученные кератиноциты,
подобно культуре интерфолликулярных клеток, фор-
мируют правильный эпидермис при пересадке мышам
Nude и могут бы ть использованы в клинических целях,
чтобы закрыть хронические раны [Litnat el al., 1996].
Кератиноциты можно также вырастить в клональ-
ной плотности для изучения клональной клеточной по-
пуляции и их пролиферативного потенциала. Для этой
цели кератиноциты ко-культивируются с облучеными
рентгеновскими лучами ЗТЗ клетками [Rheinvvald &
Green. 1975] при сниженной концентрации Са2* в
фибробласт-коидиционированной среде [Yuspa el al.,
1981], или в определенной бессывороточной среде
[Воусе & Ham, 1983].
Для того чтобы обеспечит ь условия, более сходные
с условиями in vivo, и изучить pei улирование физиоло-
1 ии эпителиально- мезхенхимального взаимодействия
кожи, разработаны органотипические со-культуры,
которые получают посевом клеток на коллагеновые
гели (с предварительно посеянными фибробластами)
или кусочки дермы, с подъемом подложки в воздушной
среде [см. обзор Fusenig, 1994а.] В этих улучшенных
условиях роста кератиноцитов проявляется множество
аспектов роста и дифференцирования эпидермиса in
vivo, включая ультраструктурные особенности и нали-
чие полной базальной мембраны, — свойства, которые
отсутствуют или менее явно варажены в погруженной
в среду культуре на пластике [Smola et al., 1998]. Такие
ор1анотипические культуры могут теперь также быть
созданы и поддерживаться в течение трех недель в
определенной SKDM среде, что позволяет исследовать
молекулярные взаимодействия между эпителиальными
и мезенхимальными клетками, анализировать их без
влияния сыворотки или их неопределенных экс фактов
тканей [Slack el al., 1999].
Такие органотимические культуры также коммер-
чески доступны (см. рис. 22.10 и разд. 22.6) как в виде
co-культуры с фибробластами, так и в виде монокуль-
туры кератиноцитов на полиуглеродном фильтрующем
вкладыше (Falcon# 3501), и все более используются
для исследований токсичности и биолш ической сов-
местимости изделий, взаимодействующих с кожей in
vitro [Fusenig, 1994b].
Оптимальный рост и дифференцировка изоли-
рованных кератиноцитов досттаются в условиях in
vivo, к<м да клетки трансплантируются как интактные
культуры или в виде суспензии на мышей Nude [см.
обзор Fusenig 1994а]. Это приводит к почти полной
экспрессии значимых белков, дифференцированным
характеристикам нормального эпидермиса и всем био-
химическим и ультраструктурным характеристикам
полностью кератинизированного эпителия, включая
формирование базальной мемебраны [Breilkreutz el
al., 1997]. В настоящее время доступны коммерческие
комбинированные культуры эпидермиса и стромы,
посаженные на сетчатые фильтры (Episkin, Epiderin,
Skin Ethic), которые предлагается использовать в
качестве моделей для исследования раздражающе-
го действия различных веществ и воспалительного
процесса.
23.2.2. Роговица
В настоящее время проводятся попытки заменить ис-
следования на глазе кролика (Draize) исследованиями
на культуре эпителия роговицы, поэтому к культуре
роговицы имеется высокий интерес исследователей
[Dart.2003]. Последующие инструкции и протокол 23.2
для культивирования нормальной poi овицы человека
в бессывороточной среде были предоставлены Caro-
lyn Cahn, Gillelle Medical Evaluation Laboratories, 101
Professional Drive, Gaithersburg, MD 20879.
Эпителий роговицы непосредственно контактирует
с внешней окружающей средой и является цервой тка-
нью, которая вовлечена в раневое повреждение глаза.
Наиболее часто в качестве модели для исследования
поверхности человеческого глаза используются модели
животных. Система, которая будет описана ниже, раз-
работана для токсиколо! ических исследований in vitro,
которые мшут дополнить исследования tn vivo.
Эпителий роговицы in vivo получает кислород путем
диффузии из пленки слезной жидкости; кроме того,
клетки активно делятся. Эти две характеристики вкупе
с наличием ткани донорской роговицы делают- модель
эпителия роговицы хорошим исходным материалом
для создания первичных культур.
Среди источников для получения ткани роговицы
имеется усовершенствованная система банка донорс-
ких глаз, которая предоставляет донорскую роговицу
для трансплантации. Ткани из этого банка имеют- по-
ниженное качество и мшут применяться для исследо-
ваний после трех дней хранения, поскольку существует
ограниченная жизнеспособность слоя эндотелиальных
клеток in vitro. Хотя эндотелий лабилен, эпителий со-
храняет- генеративные способности в течение продол-
жительного периода при хранении при 4 °C, что делает
ткани с просроченным сроком годности пригодными
к дальнейшему употреблению в качестве источника
жизнеспособного эпителия.
Немедленно после пассажа клетки приобретают
специфические веретенообразные очертания и реф-
рактильные свойства, сопровождающиеся высокой
ми!рацией. В течение 7 дней контрольные культуры
23.2. Эпителиальные клетки
429
ПРОТОКОЛ 23.2. Эпителиальные клетки
роговицы
Схема
Ткань роговицы помещают на коллаген и позволяют
клеткам прикрепиться, клетки растут и размножа-
ются в бессывороточной среде на поверхностях,
покрытых фибронектином-коллагеном.
Материалы
Стерильные и ли асептически приготовленные:
• Бессы вороточная среда для кератиноцитов
(KGM, Clonetics), содержащая 0.15 мМ каль-
ция, человеческий эпидермальный фактор роста
(0,1 нг/мл), инсулин (5 mki/мл), гидрокортизон
(0,5 mki мл) । ипофизарный экстракт быка
(30 mki/мл)
• Минимальная среда И<ла
• D-PBSA: фосфат но-буферный раствор Дюльбек-
ко без Са2' и Mg’*
• FBS
• Трииси н-EDTA: трипсин. 0,05%. EDTA, ОД мМ
• Фибронектин колла!ен (FNC): фибронек-
тин, 10 мкг мл, коллаген, 35 mki . мл, с Б С А,
100 mki /мл в качестве стабилизатора
• Шестилуночный планшет с биолш ическим пок-
рытием, предварительно обработанным колла| е-
ном крысиного хвоста, тип I (В-D Biosciences)
Протокол
Первичные культуры:
1. Поместите донорскую роговицу эпителиальной
стороной вверх на стерильную поверхность и
порежьте на 12 треугольных клинов, используя
однократные разрезы скальпелем, избегая пиля-
щих движений. Аккуратные манипуляции с poi о-
вицей таким способом снижают повреждение по
отношению к колла| еновому матриксу стромы и
минимизируют высвобождение фибробластов.
2. Переверните каждый cei мент роговицы эпители-
альной стороной вверх, поместите четыре cei мен-
та в каждую лунку шестилуночного планшета
3. Прижмите тщательно каждый cei мент ири по-
мощи пинцетов для того, чтобы убедиться, что
достигнут хороший контакт между тканью и по-
верхностью, на которой будет происходить куль-
тивирование. Оставьте подсохнуть на 20 мин.
4. Осторожно поместите ио одной капле KGM на
каждый cei мент и инкубируйте в течение ночи
при 37 С в 5% СО,. Хотя донорская роговица,
получаемая из банка глазных трансплантатов,
хранится в среде, содержащей антибиотик (Мс-
Сагеу—Kauffman или Dexsol), все манипуляции
следует проводить в условиях, свободных от
антибиотиков.
5. На следующий день добавьте 1 мл KGM в каждую
лунку. В ходе первоначально! > периода культи-
вирования отмечается миграция клеток только с
лимба роговицы. Из центрального pei иона или
склеры миграции клеток не наблюдается. Из-
быточный рост фибробластов минимизируется
использованием бессывороточной среды, которая
имеет низкую концентрацию кальция (0.15 тМ)
и это сокращает до минимума повреждение кол -
лагенового матрикса.
6. Через 5 дней после начала эксплантации удалите
се<менты донорской ткани при помощи пинцета
и добавьте Змл среды. После удаления участков
ткани прикрепившиеся клетки продолжают про-
лиферировать, и в течение 2 недель с момента
установления культуры формируется конфлю-
энтный монослой, обнаруживающий типичную
морфоло! ию «булыжной мостовой », связанной
с эпителием. Выход клеток составляет примерно
1—5x10е клеток на роговицу.
Размножение культуры
7. В ходе первоначального периода разрастания
производите смену среды культуры дважды в
неделю.
8. При достижении 70—80% конфлюэнтности про-
мойте клетки в DFBSA и разрушьте слой инкуба-
цией в растворе трипсин/EDTA в течение 4 мин
при 37 °C
9. Остановите реакцию действием 10% FBS в
D-PBSA
10. Промойте клетки (центрифу< ированием после ре-
суспеидированмя в KGM), подсчитайте и посейте
при концентрации 1х 10* кл./ см2 на поверхности
для культивирования тканей, покрытые FNC.
11. И нкуби руйте культуру при 37 °C в 95% атмосфе-
ры и 5% СО2.
12. Через день «осле трипсинизации и пересева за-
мените культуральную среду на свежую.
дисти|ают 70—80% конфлюэнтнети, продолжая мор-
фоло1ически сохранять вид «булыжной мостовой»
и, если это возможно, при постконфлюэнтном росте
стратифицируясь на дискретные области. Хотя эпите-
лий роговицы может быть субкультивирован вплоть
до пяти раз (примерно 9 10 удвоений популяции), в
основном пролиферация происходит между первым и
третьим пассажами. Приблизительный выход из одной
poi овицы составляет 1 2х 101’ клеток. Старение культу-
ры Bcei да происходит после пятого пассажа.
Получение постоянной клеточной линии. Разра-
ботаны клеточные линии эпителия роговицы человека
(НСЕ) с нео| раниченным временем жизни (см. про-
токол 18.1), призванные производить большое коли-
чество клеток для экспериментальных целей.
Долговременное хранение клеток. Клетки мтут
храниться замороженными в жидком азоте (см. про-
токол 20.1).
430
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
Фенотипическое развитие in vitro. Как первич-
ная культура, так и линии клеток НСЕ сохраняют
фенотипические характеристики эпителия роговицы
in situ. Они продолжают синтезировать коллагеназу и
экспрессировать EGF-рецепторы и специфичные для
рО1рвицы цитокератины, хотя уровень экспрессии
при текущих условиях культивирования ниже, чем
отмечается in situ. В культуре эпителия роговицы на
коллагеновой мембране на жидко! азовом разделе сред
их морфоло! ня и барьерные функции в известной сте-
пени достаточно хорошо сохраняются. Созданы куль-
туры стратифицирующихся мембран, которые способ-
ны к ишибированию диффузии Na-флюоресцеина.
Культура на границе раздела жидкой и газовой фаз
может выживать в течение 2 недель in vitro и обычно
используется для исследования раневых повреждений
и механизмов репарации. Более полная трехмерная
тканевая модель может быть сконструирована путем
использования подложки из фибробластов рогови-
цы в коллагеновом геле (см. разд. 25.3.6). Клетки
роговицы человека, размножающиеся in vitro, MOiyi
послужить подходящей моделью для исследования
основных биолoiических клеточных механизмов,
а также токсикологических исследовании. Хотя
первичные культуры являются адекватными для
исследований in vitro, линии НСЕ с нео1 рани чей ным
временем жизни предоставляют лучший источник
материала, который к тому же может быть передан
между лабораториями.
23.2.3. Молочная железа
Грудное молоко [Buehring, 1972; Сенат et al., 1979] и
материал, полученный при редукционной маммоплас-
тике [Slampfer el aL, 2002], являются пригодными
источниками для получения нормальною эпителия
протоков молочной железы. Метод выделений из
молока дает чистые культуры эпителиальных клеток.
Дезаирегеция в коллагеназе [Speirs et aL, 1996] пред-
почтительна для первичной дезан регации, рост на
конфлюэнтных фидерных слоях фетальных клеток че-
ловеческого кишечника [Stampfer elal., 1980; Freshney
el aL, 1982b] подавляет контаминацию стромальными
клетками как нормальной так и малш визированной
ткани (см. цв. вкладки бе, г, 156). Оптимизация среды
[Slampfer et aL, 1980; Smith et aL, 1981; Hammond et aL,
1984] обеспечивает серийные пассажи и клонирование
эпителиальных клегок. Культивирование в коллаге-
новом теле обеспечивает формирование трехмерной
структуры, которая хорошо коррелирует с i исто лот пей
исходной донорской ткани [Berdichevsky et aL, 1992,
Gomm el aL, 1997].
Как и в случае эпидермиса, рост эпителиоидных
клеток нормальной молочной железы in vitro стиму-
лируется холерным токсином [Taylor-Papadimilriou
elal., 1980] и EGF [Osborne etaL, 1980]. Гормональная
картина более сложна. Mhoi ие эпителиальные клетки
лучше выживают при действии инсулина (1 — 10IU мл)
и гидрокортизона (~1х10“нМ), добавленных в среду.
Дифференцировка ацинарною эпителия молочной
железы в opi анной культуре требует добавления гидро-
кортизона, инсулина и пролактина [Darcy et аЦ 1995].
Показано также, что для клеточной культуры требуется
добавление эстрогена, прогестерона и гормона роста
[Klevjer-Anderson & Buehring, 1980].
Дальнейшее введение и протокол 23.3 для получе-
ния культуры клеток из молока человека предоставлен
JoyceTaylor-Papadimilriou, Cancer Research UK Breast
Cancer Biology Group, Guy’s Hospilal, ThomasGuy
House, London SEI 9RT, UK.
Молоко ранней стадии лактации или после отни-
мания ребенка от 1руди дает самый высокий выход
клеток и содержит сгустки эпителия, который способен
к пролиферации в культуре [Buehring, 1972: Taylor-
Papadimitriou et aL, 1980]. Первичные культуры ири
росте на среде с человеческой сывороткой и добавление
гормонов дают клеточные линии, которые имеют огра-
ниченное количество жизненных циклов, но являются
клоногенными [Stoker el aL, 1982]. Эти линии обычно
в конечном итоге оказываются зараженными неэнн-
телиальными клетками «позднего молока» | McKav &
Taylor- Papadimitriou, 1981].
ПРОТОКОЛ 23.3. Эпителий молочной железы
Схема
Клетки, полученные центрифугированием молока
ранней стадии лактации, выращивают в присут-
ствии эндо! енных макрофагов в обогащенной среде
и moi ут быть субкультивированы в хелатирующем
растворе смеси протеаз.
Материалы
Стерильные
• Ротовая среда RPMI 1640
• Фе ч альная сыворотка теленка (FBS)
• Человеческая сыворотка ( Н и S; устаревшая сыво-
ротка из банка донорской крови, отрицательная
по австралийскому антигену)
• Маточные растворы
а) Инсулин (Sigma), 1 mi/мл в 6 шМ НС1
б) Гидрокортизон, 0,5 mi мл в физиологическом
растворе
в) Холерный токсин (см. Приложение II),
50 mki /мл в физиологическом растворе.
Примечание. С ыворотка и маточные растворы инсу-
лина, 1пдрокортизона, холерного токсина и трипсина
следует хранить при 20 °C
• Раствор для тринсинизации (TEGPED):
a) EGTA (этилен! л и коль-бис-(Р-ам и ноэти-
л эфир ) -N,N,N .N-тетрауксус н ая ки сл ота)
(Sigma) 13 шМ в D-PBSA....... 10 мл
6) EDTA (Sigma), 7 шМ в D-PBSA ...4мл
23.2. Эпителиальные клетки
431
в) Трипсин (Difco, В-D Binsciences), 0,2% в
HBSS...............................4 мл
I) Панкреатин (Difco, В-D Biosciences), 1,0% в
HBSS...............................2 мл
• Ростовая среда: RPMI 1640, содержащая 15%
FBS; 10% HuS; холерный токсин, 50ш мл; i нд-
рокортизон, ОД мкг,-мл; инсулин, 1 mki/мл
• Пластиковые чашки Nunc, 5 см, пли флаконы
25-см’
• У ниверсальные контейнеры пли 20—50-мл цент-
рифужные пробирки
Протокол
Молоко (2-7-й дни после родов) лучше всего по-
лучить из районной больницы. Молочная железа
протирается стерильной водой, молоко вручную
сцеживается в стерильный контейнер. Обычно полу-
чают от 5 до 20 мл от одной пациентки. Порции мо-
лока объединяются, разводятся средой RPMI 1640 в
отношении 1:1 для обличения центрифу! ирования
Первичная культура
1. Центрифу!ируйте разведенное молоко при
600—1,000 g в течение 20 мин.Тщательно удалите
супернатант, оставив некоторое количество жид-
кости так, чтобы не нарушить осадок
2. Промойте осевшие клетки два четыре раза в
RPMI, содержащей 5% FCS, пока супернатант не
будет прозрачным.
3. Ресусиендируйте осадок в ростовой среде, посей-
те 50 мкл суспензии в 5-см чашку (Nunc) в 6-мл
ростовой среды. Инкубируйте культуру при 37 °C
в 5% СО,.
4. Через 3—5 дней замените среду, затем меняйте
среду два раза в неделю. Колонии появляются
примерно через 6-8 дней и распространяются ио
чашке, расталкивая макрофа| и молока, которые
первоначально появляются и действуют как фи-
дерный слой.
Субкуяьтшя/рование к /еток молока
5. Инкубируйте клетки в TEGPED (1,5 мл в 5-см
чашке) нри 37 °C, в течение 5— 15 мин, в зависи-
мости от возраста культуры до получения суспен-
зии отдельных клеток.
6. Центрифу! ируйте клетки при 100 g в течение
5 мин и ресусиендируйте в 6 мл среды.
7. Поделите сус пензию на три новых 5-см чашки ио
2 мл в каждую или в 25-см2 флаконы.
8 Разведите в три раза добавлением 4 мл свежей
среды.
Варианты. В качестве фидерного слоя удобно ис-
пользовать макрофаш, которые уже присутствуют в
молоке, но они постепенно теряются при размножении
колоний эпителиальных клеток. Тем не менее макро-
фа! и могут быть удалены путем абсорбции на стекле, и
в этом случае могут быть добавлены дру! ие фидерные
клетки. Облученные 1ыи обработанные митомицином
клетки ЗТ6 (см. протоколы 14.3,23.4) обладают' самой
лучшей возможностью обеспечения роста [Taylor-
Papadimitriou et al., 1977]. Вместо холерного токсина
moivt использоваться аналоги циклической АМР
[Taylor-Papadimitriou el aL, 1980], хотя при исполь-
зования макрофагов в качестве фидерных клеток это
невозможно, поскольку они пошиают при действии
этих аналогов АМР.
Использование и применение культуры эпителиаль-
ных к lemvK молока. Культура молока позволяет полу-
чить клетки из полностью функционирующих желез
и позволяет определить фенотипы иммуноло! ических
маркеров [Chang & Taylor-Papadimitriou, 198.3]. Клет-
ки молока успешно трансформируются при помощи
вируса SV40 [Chang el al.. 1982] и используются для
генотоксических исследований [Marlin el aL, 2000].
23.2.4. Шейка матки
Кератиноциты шейки матки мтут быть выращены в
Серийной культуре при клональной плотности путем
использования модификации [Stanley & Parkinson,
1979] метода, описанного для эпидермальных керати-
ноцитов [Rheinvvald & Green, 1975]. Протокол 23.4 для
культуры эпителиальных клеток из биопсийного мате-
риала был предоставлен Margaret Stanley, Department
of Pathology, University of Cambridge, UK.
ПРОТОКОЛ 23.4. Цервикальный эпителий
Схема
Суспензия отдельных клеток, полученная фермен-
тативной диза| rpei ацией эпителия из биопсийной
пробы шейки матки, инокулируется в чашки или
флаконы с летально инактивированными юшками
Swiss ЗТЗ и выращивается в среде с добавлением
сыворотки и ростовыми факторами (протокол А)
или на бессывороточной среде для выращивания
кератиноцитов (КСМ)без фидерной подложки с ис-
пользованием модификаций методов, первоначаль-
но описанных для эпидермальных кератиноцитов
(Воусе & Наш, 1983). Koi да колонии кератиноцитов
достш нут размера 1000 клеток или более, культуры
могут быть трипсинизированы и вновь пересеяны с
использованием фидерного слоя фибробластов
Материалы
Стерильные:
• Транспортная среда: Среда И|ла в модифика
ции Дюльбекко (DMEM), обтащенная 10%
фетальной сыворотки теленка, с добавлением
100 mki мл сульфата гентамицина и 10 мкг/мл
амфотерицина.
• Раствор трипсин, EDTA для ди.запре1ации
эпителиальных клеток:©,25% трипсина (v v),
432
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
0.25 шМ (0,01%) EDTA как двунатриевая соль с
pH 7,4 в D-DPBSA
* Среда для протокола А. среда для культивиро-
вания кератиноцитов (КСМ): DMEM с добав-
лением 10% FBS, 0,5 mki, мл । идрокортизона и
1х10“’°М холерного токсина
а) Не все партии FBS одинаково хорошо обес-
печивают рост клеток. Следует провести
тестирование образца сыворотки и закупить
большую партию подходя щего качества
6) Эпидермальный фактор роста (EGF): Sigma,
100 pg разводится в 1-мл стерильной UPW.
Разлить на аликвоты но 100-мкл и хранить
при -20 °C. Рабочий раствор tотовнтся раз-
ведением 100 мкл EGF с концентрацией
100 mki мл в 10 мл среды с сывороткой. Хра-
нить при 4 °C. Для использования развести в
отношении 1:100 в среде, содержащей сыво-
ротку до конечной концентрации 10m мл.
в) Холерный токсин (СТ) (Sigma): Добавьте
1,18 мл стерильной UPW до 1 mi СТ. чтобы
получить раствор 10“’М. Хранить при 4 °C.
Рабочий раствор: 100 мкл СТ 10 5М развести
в 10 мл среды с сывороткой. Стерилизовать
фильтрацией и хранить 4 °C. Использовать
нри конечной концен1рации 10“"’М.
t) Гидрокортизон (Signia): Растворить 1 mi 1ид-
рокортнзона в 1 мл 50% этанола в воде (v. v).
Разлить ио аликвотам 100-мкл и хранить при
-20 °C. Использовать при конечной концент-
рации 0,5 mki мл.
• Среда Jjih протокола В: среда для роста керати-
ноцитов KGM (Bio-Whittaker), или Keralmocyte-
SFM (Invitrogen)
• Чашки Петри для культуры тканей, диаметром
6-см и 9-см
Пинцеты с зубцами
• Искривленные ножницы для иридэктомии
• Одноразовые скальпели лезвие No. 22
• Пииетки
• Центрифужные пробирки
Нестерильные:
• Гемоцитометр
• Источник излучения (рентгеновский или ""Со)
Фибробласты Swiss ЗТЗ (Только протокол А).
а) Следует приготовить и заморозить большой
ростковый запас клеток в отдельных ампулах
при концентрации 1х 10йклеток. Клетки не
должны быть использованы более чем в тече-
ние 20 пассажей.
1) Вырастить клетки ЗТЗч в DMEM с 10%
сыворотки теленка в культуральном фла-
коне 175-см-. Инокулировать клетки при
концентрации 1,5x10’кл./см2. Через два
дня заменить среду. Субкультивировать
каждые 4—5 дней.
ii) Для Tot о чтобы избежать незначитель-
ной контаминации, поддерживайте один
маточный флакон с клетками в среде без
антибиотика; затем эти клетки используй-
те при каждом пассаже инокулируя их во
флаконы для получение фидерного слоя.
б) Фидерный сдой инактивируется излучением
мощностью 60 Грэй (6000 рад), от рентгенов-
ского источника или а,Со. Облученные клетки
(XR-3T3) могут храниться при 4 °C в течение
3—4 дней
в) В отсутствие источника излучения инактиви-
руйте клетки митомицином С.
i) Экспозиция клеток ЗТЗ, выросших в мо-
нослое 400 mki мл с митомицином С в
течение 1 часа ири 37 С.
ii) Трипсин из ируйте обработанные клет-
ки, ресусиендируйте и дважды отмойте
клеточный осадок свежей средой с сыво-
роткой, ресусиендируйте до приемлемой
концентрации в полной среде и затем
используйте.
Протокол А: с фидерным слоем ЗТЗ
Первичная культура:
1. Выньте цервикальный бионтат из транспортной
среды, промойте клетки два-три раза в 5 мл сте-
рильной D-PBSA, содержащей 50 мкг/мл суль-
фата 1ентамицина и 5 mki мл амфотерицина.
2. Поместите биоитат на стерильную культураль-
ную чашку эпителиальной поверхностью вниз.
3. Используя одноразовый скальпель, оборудо-
ванный лезвием № 22, максимально срежьте и
соскребите мышцы и строму, оставляя тонкую
матовую эпителиальную полоску.
4 Тщательно измельчите эпителиальную полоску
ири помощи искривленных ножниц для ирид-
эктомии.
5. Добавьте 11) мл смеси трипсин EDTA (предва-
рительно подогретой до 37 °C) к измельченному
Эпителию, и перенесите ткань в стерильный стек-
лянный универсальный контейнер, содержащий
небольшой покрытый пластиком Mat нит для
магнитной мешалки.
6. Добавьте еще 5—10 мл смеси трипсин/EDTA.
7. Поместите универсальный контейнер на ма|-
нитную мешалку в инкубаторе или термальную
комнату ири 37 °C, и медленно перемешивайте в
течение 30 10 мин.
8. Оставьте суспензию при комнатной температуре
на 2—3 мин.
9. Отберите верхний слой отстоявшейся жидкости,
содержащий единичные клетки, и профильтруй-
те их через снто из пластика пли нержавеющей
ткани (Cell Strainer, BD Biosciences) в 50-мл
центрифужную пробирку (см. рис. 12.10).
10. Добавьте 10мл полной среды к фильтрату.
11. Добавьте следующие 15 мл теплой смеси трип-
син/EDTA к фра! ментам ткани в универсаль-
ном контейнере, и дважды повторите шаш 5—9.
23.2. Эпителиальные клетки
433
Соедините отобранные верхние слои, содержа-
щие трипсин, открутите на настольной центри-
фуге при 1000 rpni (80 g) в течение 5 мин.
12. Удалите супернатант, добавьте 10 мл полной сре-
ды к осадку, энершчно ресусиендируйте клетки до
получения суспензии отдельных клеток, подсчи-
тайте клетки в гемоцитометре. Оцените жизнеспо-
собность клеток методом окрашивания трииано-
вым синим мертвых клеток (см. протокол 22.1).
13. Разведите суспензию клеток цервикального
эпителия в КСМ, посейте клетки на чашки при
концентрации 2х10*кл./см2 вместе с летально
инактивированными клетками ЗТЗ в концент-
рации 1х10’*кл./См2 (т.е. на IxlO1 цервикальных
клеток 5x10’XR-3T3 набО-мм чашку).
14. Инкубируйте культуры при 37 °C в 5"о СО,
15. Через 72 ч после первичного посева замените
среду полной средой, содержащей EGF10 нт/мл.
Проверьте культуру микроскопически, чтобы
убедиться в адекватности фидерною слоя. До-
бавить фидерных клеток если необходимо.
16. Дважды в неделю меняйте питательную среду, в
которой должен содержаться EGF, кроме первич-
ного посева. Колонии кератиноцитов становятся
видимыми в микроскоп на 8— 12-и дни, а нево-
оруженным глазом на 14 16-й. В .гго время
культуры следует пересеять.
Субкультивирование:
17. Удалите среду с клеточного монослоя и удалите
также фидерный слой быстрым ополаскиванием
0,01% EDTA. Дважды промойте D-PBSA.
18. Добавьте предварительно иодо!ретую смесь
трипсин EDTA, чтобы она покрыла клетки. Ос-
тавьте культуру при 37 °C, пока кератиноциты
не отслоятся, удостоверьтесь в отделении клеток
ири помощи микроскопа. Не оставляйте клетки
в трипсине более чем на 20 мин.
19. Отберите клеточную суспензию из чашки и пере-
несите в стерильную центрифужную пробирку.
20. Ополосните поверхность роста полной средой,
добавьте суспензию. Перемешайте и распреде-
лите суспензию при помощи 10-мд иииетки.
21. Центрифу! ируйте клетки при 80 100 g в течение
5 мин.
22. Удалить супернатант, добавить 10 мл полной
среды, энершчно ресуспендировать клетки при
помощи 10-мл. иииетки для получения суспензии
отдельных клеток.
23. Подсчитайте клетки при помощи гемоцитометра.
24. Клетки moiут быть пересеяны на инактивирован-
ные ЗТЗ клетки, как это описано выше, либо за-
морожены для последующего восстановления.
Протокол В: Бессывороточная среда.
Первичная культура
1. Следуй re uiai ам 1-11 протокола А для получения
суспензии отдельных клетокв среде, содержащей
сыворотку.
2. Осадите суспензию при 1000 об./’мин (80 g) в
течение 5 мин. Удалите супернатант и ресусиен- I
дируйте клетки в 10 мл D-PBSA
3. Вновь осадите суспензию и отмойте клетки од
нократно с D-PBSA. Ресусиендируйте клетки в |
10 мл среды KGM (приготовленной в соответ- ।
Отвин с инструкцией производителя) и посейте
в чашки для культивирования или флаконы при
плотности 2x10'кл./ем2 (10*’клеток на5-см чашку I
Петри, 4х10ьна9-см чашку Петри).
4. Инкубировать культуру при 37 "С в 516 СО2 .
5. Через 72 ч заменить среду; Затем менять дважды
в неделю. Культура становится конфлюэнтной в
течение 14—20 дней и в это время должна быть I
пересеяна.
Субкультивирование:
6. Следуйте шагам 17 23 протокола А
7. Осадите суспензию при 80 100 g в течение 5 мин. .
Удалите супернатант, ресусиендируйте клетки в |
10 мл D-PBSA.
8. Вновь осадите суспензию и однократно отмой-
те клетки в D-PBSA. Ресупендируйте клетки в
KGM и посейте их на культуральные чашки при
концентрации 10’кл./см2(5x10sклеток на 5-см
чашку Петри, 2x10е на 9-см чашку Петри).
9. На этой стадии клетки также мот ут быть заморо- |
жены для последующего восстановления.
Цервикальные кератиноциты, выращенные как опи-
сано выше, могут быть использованы для различных
целей, включая исследования папилломавирусного
канцерогенеза, стадий дифференцировки, и изучения
ответа этих клеток на мутагены и канцерогены.
23.2.5. Желудочно-кишечный тракт
Литература но выделению культуры нормального
эпителия из кишечной выстилки не очень обширна,
хотя имеется большое количество публикаций о вы-
делении постоянных клеточных линий из карциномы
толстой кишки человека (см. разд. 24.8.3). Owens el al.
[ 1974J смо1ли культивировать клетки из кишки плода
человека как конечную клеточную линию (FHS 74 Ini),
широкое распространение получила клеточная линия
IEC-6 из кишки крысы |Rak el al., 1995; Bedrin el al.,
1997]. Протокол 23.5 основан на методе Booth & O’Shea
[2002]. Приготовление образцов ткани для клеточной
культуры обычно начинается за 1—2 часа после изъятия
от больного. Если это возможно, тщательно порежьте
ткань на мелкие кусочки (1-2 мм) ири помощи скаль-
пеля. Хранение в течение ночи при 4 °C в промывочной
среде (HBSS/PSG, см. ниже) также может обеспечить
успешное выделение клеток.
Крииты могут быть посеяны также на чашки, пок-
рытые коллагеном или на ЗТЗ фидерный слой. Этот
метод позволит вести рутинное культивирование в
течение примерно одной недели. По истечении этого
434
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
ПРОТОКОЛ 23.5. Выделение
и культивирование клеток крипт
толстого кишечника
Схема
Тщательно измельченную ткань дизагрегируют в
коллагеназе и диспазе. крипты отделяют седимен-
тацией и сорбите.
Материалы
Стерильные
• HBSS, PSG: сбалансированный солевой раствор
Хэнкса с пенициллином. 100 U/мл, стрептомици-
ном. 30 mki мл, и гентамицином 25 mki мл
• Ферментированная расщепляющая смесь, кол-
лагеназа. тип XI, 150 U/мл, дисцаза. 40 mki /мл,
FBS, 1%, в DMEM
• Ростовая среда: DMEM содержащей 25 мМ
1ЛЮКОЗЫ, 6,8 мМ пирувата, 0,25 U/мл инсулина,
50н1/мл EGF, 2,5% FBS, и антибиотик как в слу-
чае HBSS. описанном выше, забуференный до pH
7,4 бикарбонатом натрия в 7,5% СО,
• S-DMЕМ: Ростовая среда с2% сорбитом (0.11 Ml
стерилизован ная фильтрацией.
• Температура всех сред должна поддерживаться
37 °C.
• Чашки Петри, 9 см
• Универсальный контейнер или 30—50-мл цент-
рифужная пробирка
• Mhoi «луночный планшет, 24 лунки, покрытых
коллагеном:
а) Разведите маточный раствор коллагена (Vil-
rogen) в десять раз
б) И н куби руine чашки с 0,5 мл/лунку в течение
в) Удалите излишний ViLrogen и высушите план-
шеты в ламинарном шкафу
Подготовленные планшеты мшут храниться
обернутые ад|езирующей пленкой (Satan
Wrap) до 1 недели ири 4 °C.
• Флаконы, 25 см2
Скальпели, держатель #4, лезвие #22
• Пипетки Movetie (или анало! ичные пластиковые
пипетки с широким диаметром)
Протокол
Выделение крипт из толстого кишечника человека:
1. Ткань для культивирования должна быть помеще-
на в DMEM как можно быстрее после получения
от больною. Предварительные исследования
показывают, что при небольшой продолжитель-
ности времени между выделением и помещением
в DMEM образец способен выдержать хранение
в течение небольшого периода (до 2 ч) при 4 °C,
более длительное хранение не рекомендуется.
2. Дважды промойте интактную ткань в lx HBSS/
PSG, чтобы удалить любые факторы контами-
нации.
3. Перенесите ткань в чистую чашку Петри со све-
жей средой HBSS/PSG.
4. Максимально удалите мышечный слой, измель-
чите ткань при помощи двух скальпелей.
5. Промойте кусочки измельченной ткани: пере-
несите их в 25-см2 флакон, содержащий 20 мл
HBSS, PSG и несколько раз иипетируйте при
помощи пипетки Movette.
6. Дайте отстояться содержимому флакона и уда-
лите HBSS/PSG.
7. Повторяйте процедуру до тех пор. пока раствор
HBSS PSG не будет оставаться почти прозрач-
ным. Обычно для этого требуется 5 повторных
промывочных процедур.
8. Перенесите ткань в чашку Петри и удалите ос-
татки HBSS/PSG.
9. Измельчите ткань при помощи скальпелей, пока
не получите однородную консистенцию. Пере-
несите измельченную ткань в 25-см2 флакон при
помощи пипетки большою калибра (убедитесь,
что внутренняя часть пипетки увлажнена HBSS/
PSG для предупреждения прилипания).
10. Позвольте суспензии о гоняться, удалите избы-
ток HBSS PSG
11. Добавьте 25—30 мл ферментативной расщепляю-
щей смеси.
12. Инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
13. Замените расщепляющую смесь:
а) Позвольте кусочкам ткани осесть.
б) Тщательно удалите расщепляющую смесь
из флакона (следя за тем, чтобы не удалить
нерасшепленные ткани).
в) Добавьте свежую расщепляющую смесь и
продолжите инкубацию при 37°С в течение
последующих 1-2 ч.
) Проверяйте ткань каждые 15—30 мин, чтобы
убедиться, что крипты не подвер! л ись избы-
точному расщеплению. Выделение завершено,
если примерно 70—80% отдельных крипт ос-
вободились от окружения.
N.B. Не ждите, пока все крипты станут свободными,
поскольку это может привести к снижению выхода
клеток, вызванного избыточным расщеплением.
Седиментация крипт толстого кишечника
человека:
Выделенные крипты очищают седиментацией в сор-
бите. Вы можете обнаружить, что крупные ai регаты
жировых/мезенхимальных тканей поднимаются к
верхним слоям в пробирке при седиментации; они
должны быть удалены в первую очередь, поскольку
они могутвызватьпроблемы при седиментационном
процессе.
14. Разделите содержимое флакона с ферменти-
рованной тканью на два стерильных 30-мл
универсальных контейнера и сделайте иометку
«Комплект 1'>
23.2. Эпителиальные клетки
435
15. Добавьте S-DMEM до объема 25 мл и удалите
любые плавающие ио поверхности частицы жи-
ровой или мезенхимальной ткани.
16. Позвольте содержимому пробирки осесть в тече-
ние 1 мин, чтобы отцедить все нерасщеиленные
ферментативно кусочки ткани.
17. Удалив любые плавающие остатки жировой
ткани на поверхности, перенесите супернатант
из пробирки в две чистых пробирки, пометив их
«Комплект 2».
18. Оставьте раствор на 30 с.
19. Перенесите содержимое в следующую партию
пробирок и пометьте «Комплект 3>>.
20. Заполните доверху S-DMEM.
21. Центрифут ируйте пробирки третьего комплекта
при 200—300 g в течение 4 мин. (Обычно самая
низкая скорость на стандартной настольной
центрифуге.)
22. Удалите супернатант.
23. Взболтайте осадок потряхиванием и постукива-
нием ио основанию пробирки.
24. Ресусиендируйте крипты еще раз в S-DMEM и
повторите центрифу! ированне. Это отмывание в
S-DMEM с иоследующим центрифугированием
может быть повторено до 5 раз, либо пока супер-
натант не будет чнс гым.
25. Оставшийся в пробирках 1 и 2 комплекта дебрис
следует исследовать микроскопически на пред-
мет присутствия крицт. Если обнаруживается
высокая доля крицт, материал можно взболтать
и повторить процедуру седиментации. Если в де-
брисе содержится только неферментнрованный
материал, ei о можно выбросить.
26. Крииты готовы к дальнейшему культивирова-
нию, koi да супернатант прозрачен. Для хорошего
роста культуры критическим является исход-
ная посевная плотность. Обычно лучше всего
рост клеток криит отмечается ири плотности
800—1000 криит. мл в одной лунке 24-луночного
планшета Для того чтобы определить число вы-
деленных крицт:
а) ресусиендируйте изолят в 10 мл ростовой
среды;
б) отберите 10U мкл и добавьте к 900 мкл росто-
вой среды;
в) возьмите 100 мкл от полученного образца и
подсчитайте количество криит.
N криит/мл - N подсчитанных криит х 100
27. Инкубируйте планшеты ири 37 °C в 7,5% СО2 и
позвольте клеткам прикрепиться к субстрату в
течение 2 дней.
28. Удалите из планшета среду, содержащую все
неприкрепленные клетки, и замените на свежую
среду.
29. Через каждые 5 дней добавляйте 0,5 мл свежей
среды.
периода рост эпителиальных клеток ухудшается и
затем становится иревалентным рост контамини-
ровавших культуру фибробластов. Культура плохо
субкультцвируется. Были предприняты попытки
применения разнообразных восстанавливающих
агентов, однако пока успехи в суб культивировании
эпителиальных клеток кишечника очень ограничены.
Фибробласты moi ут быть достаточно ле! ко субкуль-
тивированы и являются потенциальным источником
клеток фидерно! о слоя.
23.2.6. Печень
Культуры клеток из печени взрослого человека не
экспрессируют полный набор свойств паренхимы
печени, и есть некоторые сомнения в том, что мож-
но культивировать правильную линию клеток. До
настоящего времени попытки создания пролифери-
рующей клеточной линии не были особенно успеш-
ными, хотя функционально активные гепатоциты
могут быть культивируемы в определенных стр<мих
условиях [Guguen-Guillouzo, 2002J. Некоторые из
наиболее полезных постоянных клеточных линий
с минимальными отклонениями в структуре были
получены из крысиных гепатом Reuber Н35 [Pilot
eL а]., 1964] и Morris [Granner et al., 1968]. Введение
тирозинаминотрансферазы в эти клеточные линии с
дексаметазоном является хорошей моделью для изу-
чения ре1уляции ферментативной адаптации в клетках
млекопитающих [Granner et al., 1968; Reel & Kenney,
1968]. Такие клеточные линии, как Hep-G2, также
были созданы на основе клеток человеческой гепато-
мы и сохраняют некоторые метаболические свойства
нормальной печени [Knowles el aL, 1980].
Протокол 23.6 д.1я культуры выделенных гепато-
цитов человека был предоставлен Christiane Guguen-
Guillouzo, Hopital de Ponlchaillou, INSERM U49, Rue
Henri le Guilloux, 35033 Rennes, France. При прове-
дении перфузии в печень через сосуды и капилляры
с адекватной скоростью потока протеолитические
ферменты, такие как коллагеназа, которые относи-
тельно нетоксичны, будут разрушать межклеточные
соединения. Разрушение соединительнотканной осно-
вы произойдет в течение 15 мин, если печень предва-
рительно промыта от крови и Са_+ путем промывания
бескальциевым буфером [Berry & Friend, 1969]. Гена
тоциты выделяют из клеточной суспензии двумя-тремя
дифференциальными центрифу! ированиями.
При использовании соответствующих компонентов
биоматрикса для покрытия чашек, наиример фибро-
нектина, колла! ена или Матршеля (см. разд. 8.4.1),
можно полностью избежать добавления FBS.
Анализ. Определите клеточный выход и жизнеспо-
собность путем подсчета клеток с хорошо сохранившей-
ся лучеиреломляющей формы или теста с трицановым
синим (0,2% w/v; обычно 4—6x10” клеток с жизнеспо-
собностью около 95%).
436
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
ПРОТОКОЛ 23.6. Выделение гепатоцитов
крысы
Схема
Ввести канюлю в мортальную вену или портальную
ветвь, промыть печень бескальциевым буфером в
течение 15 мин, ttept|)узировать печень ферментатив-
ным раствором (15 мин), собрать и промыть клетки,
подсчитать жизнеспособные епатоциты | Guguen-
Guillouzo & Guillouzo, 1986j.
Материалы
Стерильные'.
• Среда Лейбовича L-15
• Среда Хама F12 иди Williams’ Е, обогащенные
0,2% БСА (степень очистки V, Sigma) и 10 mki /мл
бычьего инсулина (80 100 мл)
• Минимальная среда 3jih культивирования гепа-
тоцитов (НММ): среда Шла МЕМ, 67,5%, среда
199,22,5% (или William’s Е место этих двух сред),
бычий инсулин, 5 MKt/ мл, БСА.1 м</ мл, пируват
20 мМ, пенициллин, 100 U 'мл, стрептомицин,
100 мкг/мл, 20% FBS
• HMM SF: бессывороточная НММ <. 1х 10 ’М
гемисукцината ret идрокортизона
• Бескальциевый буфер НЕ PES, pH 7,65:160,8 мМ
NaCl; 3.15 мМ КС1: 0,7 мМ Na,HPO4-12H2O,
33 мМ HEPES.стерилизовать фильтрацией через
0,22-м км -микроноровый фильтр, хранить ири
4 "С (2 месяца)
• Раствор коллагеназы: 0,025% коллагеназа ( Sigtua,
степень чистоты 1 или Roche #103578), 0,075%
СаС12-2Н2О в бескальциевом буфере HEPES, pH
7,65: подготовка и стерилизация фильтрацией
перед использованием
• Нембутал (Abbott, 5%)
• Гепарин (Roche)
• Пробирки Tygon (внутренний диаметр 3,0 мм;
внешний диаметр 5,0 мм)
• Одноразовые ш лы для внутривенного вливания
в вены кожи 1оловы, 20G (Dubernard Hospital
Laboratory. Bordeaux, France)
* Нити для подшивания канюли
• Бутылки с делениями или чашки Петри
• Хирур! ическнй инструментарий (заостренные,
кривые и прямые ножницы и зажимы)
* Одноразовые шприцы, I и 2 мл
Нестерильные.
• Хронометр
• Перистальтический насос (10—200 об./мин)
• Водяная баня
Протокол
1. Подогрейте промывочный буфер HEPES и
раствор колла! еназы в водяной бане (обычно
примерно до 38—39 °C чтобы получить в печени
37 °C). Оксигенация не обязательна.
2. Установите скорость пропускания в перисталь-
тическом насосе 30 мл/мин.
3. Анестезируйте крысу (вес 180—200 g) внутрибрю-
шинным введением Нембутала (150 mki 1001),
и введите teitaptiH в бедренную вену (1000 IU).
4. Протрите брюшную поверхность тела крысы 70%
.тепловым Спиртом.
5. Вскройте брюшную полость, наложите незатяну-
тую лш атуру впкру! портальной вены примерно
в 5 см от печени, введите канюлю в печень, затя-
ните л шатуру.
6. Быстро вскройте подпеченочные сосуды, чтобы
избежать избыточного давления, и начните пер-
фузию 500 мл безкальциевси о буфера HEPES при
скорости потока 30 мл мин: удостоверьтесь что
печень белеет в течение нескольких секунд.
7. Перфузируйте 300 мл раствора коллагеназы при
низкой скорости потока 15 мл/мин. в течение
20 мин. Печень становится набухшей.
8. Удалите печень и промой ге ее буфером HEPES.
9. После разрушения t лиссоновой капсулы распре-
делите клетки в 100 мл среды Лейбовича L-15.
10. Профильтруйте суспензию через 2 слоя марли
60—80-мкм нейлоновой сетки, оставьте суспен-
зию на 20 мин для осаждения жизнеспособных
клеток (обычно при комнатной температуре), и
удалите супернатант (60 мл) содержащий дебрис
и мертвые клетки.
11. Промойте клетки три раза низкоскоростным
центрифугированием (50 g в течение 40с) для
удаления коллагеназы, поврежденных клеток и
ненарензиматозных клеток.
12. Суспендируйте выделенные гепатоциты в НММ.
13. Через 2—3 ч, живые клетки прикрепятся к плас-
тику и начнут распластываться. Удалите мертвые
клетки вместе с верхним слоем среды.
14. После прикрепления клеток удалите FBS и замес-
тите среду на свежую НМ М/ SF. В последующем
заменяйте среду каждый день.
Вариации
Выделение гепатоцитов других видов. Основная
двухшаговая процедура перфузии [Seglen, 1975] может
быть использована для получения гепатоцитов из раз-
личных видов грызунов, включая мышей, кроликов,
морских свинок или сурков путем адаптации объема
и скорости потока перфузионного раствора к разме-
рам печени. Метод может' также быть адаптирован к
печени человека [Guguen-Guillouzo etal., 1982] путем
перфузии доли печени (обычно 1,5 л HEPES буфера
и 1 л раствора коллагеназы ири 70 и 30 мл . мин, соот-
ветственно) или путем взятия биопсии (15-30 мл, мин
в зависимости от размеров образца ткани). Полное
выделение до суспензии единичных клеток может
быть осуществлено путем дополнительной инкубации
с коллагеназой при 37 °C при осторожном иеремеши-
23.2. Эпителиальные клетки
437
ванигг в течение 10 20 мин (особенно в случае иечени
человека) [Guguen-Guillouzo & Guillotizo, 1986]. Гепа-
тоциты рыбы мо1ут быть получены канюлированием
интестинальной вены и иссечением сердца для избе-
жания избыточного давления. Перфузия проводится
при комнатной температуре при скорости потока
12 мл/мин.
Поддержание и дифференцировка. Выделенные
паренхиматозные клетки могут поддерживаться в
суспензии в течение 4—6 ч и использоваться в крат -
косрочных экспериментах. При посеве на питательную
среду с добавлением 1х 10-ь М дексаметазона на плас-
тиковые чашки для культуры (7x10'жизнеспособных
клеток/мл) клетки живут несколько дней. Выживание
в течение нескольких недель может быть достигнуто
иосевом клеток в биоматрикс [Rojkind el al., 1980]. Тем
не менее клетки быстро теряют* свои сггецифическгге
дифференцированные функции. Высокая стабиль-
ность (2 мес) может быть иолучена ко-культивиро-
ванием геиатоцитов с эпителиальными клетками
иечени крысы, предположительно выделенными из
первичных билиарных клеток [Guguen-Guillouzo et al..
198.3]. Гепатоциты также более стабильны при посеве
на Матригель [Bissell el al., 1987] и способны пройти
один—три клеточных деления, когда они культиви-
руются в питательной среде с добавлением EGF и
пирувата [McGowan, 1986] или никотинамида [Milaka
etal., 1991]. Комбинация EGF и DMSO стимулирует
дифференцировку геиатоцитов [Milaka et al., 1993;
Hioo etal., 1999].
23.2.7. Поджелудочная железа
Как ацинарные [Bosco et al., 1994], так и клетки
островков [Vonenet al., 1992; Cao el al., 1997] были
выращены из панкреатической ткани. Были иолучены
линии, выделенные из «пммортал изованн ых мышей»
[Blouin el al., 1997]. Конверсия аденомы в карцином}
привела к повышению интереса к культуре [Perlel al.,
1998]. Протокол 23.7 для культуры ацинарных клеток
поджелудочной железы предоставлен Robert J. Нау &
Maria das Gracas Miranda, American Type Culture
Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209.
Фракционированные популяции панкреатических
ацинарных эпителиальных клеток инокулировали на
обработанные коллагеном чашки для культуры, позво-
ляя развиться двумерным аг регатным колониям, кото-
рые затем изучали [Нау, 1979; Ruoff & Нау, 1979].
Вариации. После прикрепления клеток, F12K-C20
может быть замещена бессывороточной средой МЕМ
с инсулином (10 нг/мл), трансферрином (5нг мл),
селеном (9 нг/мл), и EGF (21 нг/мл). Эта среда под-
держивает рост панкреатических клеток в течение,
ио крайней мере, 15 дней без изменения клеточной
морфолог ии. Предшествующий метод применялся для
ПРОТОКОЛ 23.7. Поджелудочный эпителий
Схема
Диссоциировать клетки ткани поджелудочной желе-
зы морской свинки, профильтроват ь суспензию сме-
шанных клегок через ситовую ткань гиги нейлоновое
сито, от делить слой суспензии над раствором БСА.
После трех последовательных центрифугирований
и фракционирований взболтать клеточный осадок
и посеять клетки в сосуды для культивирования,
обработанные коллагеном.
Материалы
Стерильные
• Культуральная среда F12K с 20% сывороткой |
теленка (F12K-CS20)
• HBSS
• HBSS без Са2*u Mg2' (HBSS-DVC)
• D-г докоза (декстроза) ( D ifco, No. 0155-174, В-D |
Biosciences)
• БСА. фракция V (Sigma)
• Раствор трипсина: 1.250 (Difco, В-D Biosciences)
в 0,25% цитратном буфере; 3 г л тринатрпевого
цитрата; 6 г л NaCI, 5 г/л D-глюкозы; 0,02 г ' г |
фенолового красного; pH 7.6.
• раствор коллагеназы: растворимая коллагеназа
(GIBCO) в lx HBSS-DVC (pH 7.2) до конечной
концентрации 1800 U/мл. Доведите pH раство-
ра до pH 7,2, диализировать с использованием
12-KDa диализной мембраны в течение 4 ч при
4 °C против lx HBSS-DVC, содержащей 0,2%
глюкозы. HBSS удаляют. Этот шаг повторяют
16—18 ч со свежей HBSS-DVC. Фильтруют, сте-
рилизуют, хранят* раствор разлитым ио аликво-
там 10—20 мл при температуре ниже —70 °C.
• Конический флакон, 25 мл (Bellco), силиконп-
зированный
• Пипетки, 5 или 10 мл с широким горлышком |
(Bellco)
• Делительная воронка Бюхнера
• Диализная установка (Speclrn-Pnr)
• Емкость, 250 мл
• Полипропиленовые центрифужные пробирки,
50 мл
• Ситовая ткань
• Культуральные сосуды, покрытые коллагеном |
(Biocoal, BD Biosciences)
Нестерильные:
• Водяная баня с перемешиванием (Backer модель ।
M5B# 11-22-1)
• Центрифуга
Протокол
1. Приготовьте диссоциирующий раствор (смесь
1 части ко.гглагеназы с 2 частями раствора трип- I
сина) и подогрейте до 37 °C.
2. Асептически удалите всю поджелудочную железу
(0,5 1,0 г) и поместите орган в F12K-CS20.
438
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
3. Обрежьте брыжеечные мембраны и друг ие вне-
<»рганные структуры, измельчите поджелудочную
железу на 1-3-мм фрагменты.
4. Перенесите фра! менты в сил иконизированный
25-мл конический флакон в 5 мл предварительно
iioaoi ретой диссоциирующего раствора. Переме-
шивайте раствор в качалочной бане примерно
15 мин при 120<>б./м||н при 37 °C. Повторите
этот шаг два-три раза со свежим раствором, пока
большая часть тканей не прейдет в диспергиро-
ванное состояние.
5. После каждой диссоциации позвольте крупным
фрагментам осесть, перенесите супернатант в
50-мл полипропиленовые центрифужные про-
бирки, содержащие примерно 12 мл холодной
среды F12K-CS20 для нейтрализации диссоии-
ирующег о раствора
6. Центрифугируйте суспензию при 600 об., мин
в течение 5 мин, и ресусггенд ировать осадок в
5-10 мл холодной среды F12KCS20. Храните
суспензию клеток на льду.
7. Объедините клеточную суспензию и пропустите
через несколько слоев стерильной фильтрующей
ткани в Бюхнеровской делительной воронке.
Используйте небольшое разреженгге путем встав-
ления ствола делительной воронки в вакуумный
флакон при фильтрации. Отберите аликвоту для
оценки количества клеток.
8. Обычно на этом этапе получают 1— 2x10s кл./ мг
ткангг с 90—95% жизнеспособности.
9. Перенесите слой, содержащий 5х1О’-5х1Ок кле-
ток из полученной суспензии на поверхность
2—4 колонок, содержащих 35 мл 4% холодного
БСАв HBSS-DVC (pH 7,2) в полипропиленовых
50-мл центрифужных пробирках. Центрифу-
гируйте пробирки при 600 об./мин в течение
5 мггн. Этот шаг критичен для достижения хо-
рошег о разделения ацинарных клеток от клеток
островков, ггротоков и стромы поджелудочной
железы. Удалите суггернатант и повторите фрак-
ционирование дважды, каждый раз объединяя и
ресусггендггруя осадок в холодной F12K-CS20.
10. Соберите клеточные осадки в 5-10 мл холодной
F12K-CS20. Отберите аликвоту для подсчета
клеток. Получают 2— 5x10' кл./Mi ткани с жизне-
способностью 80—95% от общей» количества аци-
нарных клеток. Плотность инокуляции может
составлять 3x10’/см’. Клетки прикрепляются гг
образуют колонии примерно в течение 72 ч.
исследований на тканях морской свинки и человека
(донорский трансплантат). Добавление облученных
человеческих фибробластов из легких в качестве
фидерного слоя приводило к заметной стимуляции
(вплоть до 500%) включения [лН]-тпмидинаи продле-
вали выживание
23.2.8. Почка
Почки структурно являются комплексным органом, в
котором система нефронов и собирательных трубочек
состоит из большого количества функционально и фе-
нотипически различимых сег ментов. Эта сегментарная
гетерогенность сопровождается многообрашем клеток,
которое еще не до конца охарактеризовано. Некоторые
тубулярные сегменты содержат несколько морфологи-
чески различных клеточных типов. Кроме того, есть
свидетельства возможности быстрых адаптивных из-
менений в клеточной ультраструктуре, которые мог ут
коррелировать с изменениями клеточных функций
[Stanton el al., 1981]. Структурная и клеточная гете-
рог енность представляет дополнительные трудности
специалистам гго культурам клеток, ггри получении
чистой или высокообогащенной клеточной ггопуляцгггг.
Проблема возрастает при работе ггочек человека, форма
которых и обращение с образцами мог ут сделать неко-
торые манипуляции, такие как сосудистая перфузия,
затрудненными или невозможными
В культуре клеток специфических тубулярных
сег ментов успешно используется несколько подходов.
Метод градиента плотности является общеггримени-
мым для выделения обогащенных популяций фермен-
тативно расщепленных тубулярных сегментов, в част-
ности этот метод эффективен в получении культуры
тубулярных клеток проксимальных отделов канальцев
почек экспериментальных животных [Taub et al., 1989].
Специфические нефроны или сегменты собиратель-
ных трубочек могут также быть выделены методом
микросечений и затем эксгглантированы в субстрат
для культуры. Этот метод, разработанный с использо-
ванием экспериментальных животных [Horsier, 1979],
был применен к культуре человеческих ггочек [Wilson
el al., 1985] гг эпителия стенки кисты поликистозной
почки [Wilson el al., 19861. Методы иммунодиссекции
[Smith & Garcia-Perez, 1985] и иммуномагнитного
разделения [Pizzonia el al., 1991] также были разрабо-
таны для выделения специфических типов нефронов
на основе экспрессии тггпоспецифичных клеточных
эктоантигенов. Эти изящные методы являются мно-
гообещающими для изучения специфических почеч-
ных клеточных шггов в норме и патолог ии, однако
они пока применяются практически исключительно
для исследований на экспериментальных животных.
Ограниченная (и непредсказуемая) доступность и
непостоянная форма (например, иссеченный кусок, по-
врежденная система васкуляризации, длинный период
после нефроэкгомгги) человеческой донорской почки
повышают значение постепенного ферментативной»
расщепления для практических целей ггри культуре
клеток человеческой ггочкгг.
Описан ряд методов для первичной культуры ткани
человеческий ггочки [Delrisac el al., 1984, Slates el al.,
1986; McAteer et al., 1991]. Протокол 23.8 и предшест-
вовавшее введение были предоставлены James McAteer,
Stephen Keinpson, and Andrew Evan, Indiana University
School of Medicine, Indianapolis, IN 46202-5120.
23.2. Эпителиальные клетки
439
Первичная культура тканевых фраг ментов, извле-
ченных из внешней коры человеческой почки, пред-
став.гяет собой способ выделения клеток, которые
проявляют много функциональных характеристик
проксимальных трубочек [Kempson el al., 1989J.
Посте иен ное ферментативное расщепление и г ру-
бая фильтрация приводят к получению отдельных
клеток и небольших агрегатов клеток, которые ири
иосеве с высокой плотностью дают рост етерпгеннои
популяции, обогащенной эпителиальными клетками.
Большое количество клеток может быть получено
таким методом, что позво.гяет использовать его для
установления множественных реиликатов первичной
культуры или размножить клетки для последующего
замораживания и хранения. При наличии определен-
ною опыта функциональные характеристики таких
первично культивированных и субкультцвированных
клеток яв.гяются воспроизводимыми для почек от
различных доноров, и соответствующие манииуляции
с образцами позволяют получить хорошие культуры
даже от почек с длительным ггост-нефроэктомцчес-
ким периодом.
ПРОТОКОЛ 23.8. Эпителий почки
Схема
Фрагменты ткани изв.>гекают из внешнего коркового
слоя почки, пзме.>гьчают, отмывают и и нкубируют в
качалочной водяной бане в растворе коллагеназа/
трипсин. Ткань периодически гтггетцруют до обра-
зования однородной смеси, диссоциированью клетки
фильтруют через фильтр с ячейками ограниченного
размера для удаления нерасгцеиленных фрагментов.
Клетки затем трижды отмывают от ферментов, сус-
пендируют в среде с сывороткой и сеют на пласти-
ковую посуду для ку.>гьтивирования.
Материалы
Стерильные:
• Основная среда DMEM/F 12: смесь DMEM и
среды Хама F12 в от ношении 50:50
• FBS (Slerile Systems, Hyclone)
• Полная культуральная среда DMEM F12c до-
бавлением 10% FBS
• BSS
• Ко-глагеназа (VVortliinglon.THn IV). 0,1%, трипсин
(1:250, Sigma), 0,1% раствор в 0.15 M NaCl
• DNase, 0,5 мг/мл в растворе
• Раствор трипсин EDTA: трипсин (1:250). 0,1%,
EDTA (Sigma, для культур) 1 мМ
• Скальпели, тканевые пинцеты
• фнльт]) нитекс (160 мкм) (Tetko)
• Культуральные чашки, флаконы
• Пробирки стерильные, 50 мл
Нестерильные'
• Кольцевой шейкер (Bel 1со)
Протокол
Диссоциация тканей
1. Отрежьте образцы коры почки толщиной
5 10 мм, промойте фрагменты в охлажденной
основной среде.
2. Извлеките фраг менты наружного коркового слоя
гг, используя перекрещенные лезвия, измельчите
ткань до размера 1—2 мм.
3. Перенесите примерно 5 мл фрагментированной
ткани в 50-мл пробирку, содержащую 20 мл теп-
jroro раствора кол.гаг еназа трипсин. Закрепите
пробирку на инкубируемой платформе кольце-
вого шейкера при температуре 37 °C.
4. Инкубируйте ткань с осторожным потряхивани-
ем в течение 1 часа.
5. Удалите и замените раствор ферментов.
6. Затем отберите супернатант через 20 мин после
добавления 20 мл основной среды, содержащей
0,05 мт мл Dnase, и осторожно гомогенизируйте
при помощи 10-мл пипетки (10 циклив).
7. Разведите собранный супернатант равным объ-
емом полной культуральной среды и храните
полученную суспензию на льду.
8. Повторите процедуру сбора пять или более раз, ।
пока фрагменты ткани не будут полностью дис- I
ггерг ированы.
9. Объедините собранные супернатанты и разлейте
на аликвоты в 50 мл пробирки.
10. Центрифугируйте при 100 g в течение 15 мин,
ресусиендируйте каждый осадок в 45 мл полной
питательной среды, содержащей DNase.
11. Профшгьтру йте суспензию через нитекс-фильтр I
(160 мкм).
12. Протокол выделения предполагает выделение
как отдельных клеток, так и их агрегатов. Следо-
вательно, подсчет клеток невозможен. Для суб-
культивирования itiui замораживания клеточной |
культуры ггосейте 15 мл в 75-см2 флакон.
Субкультура и криоконсервация. Субкультура
клеток NHK-C ведется обычными методами. Диссо-
циация ири помощи трипсин ЭД ТА дает монодис-
ггерсную суспензию, которая подходит для ггодсчета
на гемоцитометре. Посейте клетки на чашки Петри для
культуры тканей с плотностью примерно IxIO’Kjl. см* *.
Крцоконсервация проводится обычными методами с
использованием полной среды, содержащей 10% ди-
метилсульфоксида (см. протокол 20.1)
Комментарии и меры предосторожности Опреде-
ленные вариации этого метода связаны с качеством
образца почки. Важно, чтобы процедуры, применяемые
для получения ткани, были стандартными. Донорская
ткань обычно включает в себя сегменты почки, полу-
ченные при хирург ической операции (нефроэктомии,
наггример, ири почечноклеточной карциноме), и ин-
тактную почечную ткань, которую посчитали не под-
440
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
ходящей для трансплантации (наиример, и результате
нарушенной сосудистой системы). Эти образцы могут
быть собраны при различных условиях (наиример,
при наличии или в отсутствие перфузии с различным
периодом тепловой ишемии, или с различной ггродол-
жител ьностью иостнефро.жтомического периода).
Кроме того, различия в возрасте и состоянии здоровья
донора приводят к тому, что не существует двух экви-
валентных образцов почки. Хотя не все образцы почки
дают удовлетворительный выход клеток, приведенный
11|хгтокол вполне подходит для широкого спектра образ-
цов, включая свежевыделенные хирургическим путем
и интактные образцы почки, если они находились на
холоде при перфузии в течение примерно 100 ч.
• Требование безопасности. Работа, включаю-
щая в себя контакты с любыми тканями и биологи-
ческими жидкостями человека, требует соблюдения
соответствующих мер иредосторожности во избежание
контакта с возбудителями, переносимыми кровью (см.
разд. 7.8).
ПрименениеЪШК-С клетки главным образом обла-
дают функциональными характеристиками почечных
проксимальных канальцев, включая специфическую
Na'-зависимую транспортную систему неорганическо-
го фосфата, ингибируемую паратиреоидным гормоном
(РТН) [Kempson et al., 1989]. Они также обладают
флоризин-чувствительной Na'-зависимой системой
транспорта гексозы, тигг гормональной стимуляции
с АМР, характерный для проксимальных канальцев
(РТН-завнсимый, вазо пресс ин-стимулируемый), и
зксггрессггруют некоторые ферменты щеточной каемки
проксимальных канальцев (мальтаза, лейцинамино-
ггеггтвдаза, гамма-г лю гамилтранс ггеггтидаза). Помимо
того, клетки NHK-C обычно нс пользуются для демонс-
транции специфичности ингибитора ко-транс порта
Na Р( [Yusufi el al., 1986], а также служат в качестве
моделгг оксидативногх) повреждения почечных каналь-
цев |Andreoli & McAteer. 1990J.
23.2.9. Бронхиальный
и трахеальный эпителий
Протокол 23.9 для выделения и культивирования
нормальных эпителиальных бронхиальных и тра-
хеальных клеток человека, полученных методом
аутопсии, был предоставлен Moira A. LaVeck u John
F. Lechner, National Institutes of Health, Bethesda,
MD, Bayer Diagnostics, P.O. Box 2466, Berkeley, CA
94702, USA.
В присутствии сыворотки нормальные клетки
бронхиального эпителия (NHBE) прекращают де-
литься н вступают в терминальную дифференцировку
В бессывороточной среде, оптимизированной для
роста клеток NHBE, в которой не поддерживается
пролиферация легочных фибробластов, происходит
получение чистой культуры клеток NHBE | Lechner &
LaVeck, 1985].
ПРОТОКОЛ 23.9. Бронхиальный
I и трахеальный эпителий
I
Схема
Эта процедура включает выделение фрагментов круп-
ных воздухоносных путей, помещение их в бессыворо-
точную среду ( LHC-9) д,гя того, чтобы инициировать
и поддерживать рост культуры NHBE клегок без
фибробыастов; обычно проводится четыре субкуль-
тивирования и 30 периодов удвоения популяции.
Материалы
Стерильные:
• Культуральная среда:
a) L-15 (Invilrogen)
б) LHC-9 [Leclrner & LaVeck, 1985] (см. табл. 10.1)
в) НВ | Lechner & LaVeck, 1985] (см. Приложе-
• Бронхиальная ткань (аутопсийный материал от
доноров, не больных раком).
* Пластиковые чашки для культивирования тка-
ней (6 и 10 см).
• FN/V BSA: Смесь чеяовеческог о фибронектина
10 мкг мл (Collaborative Research. В-D Biosci-
eirces), коллагена (Vilrogen 100,30 мкг мл; Col-
lagen Corp.), и кристаллического БСА 10 мкг/мл
(Bayer) в основной среде LHC (Biosource Inter-
national) | Lechner & LaVeck, 1985]
• Трипсин, 0,02%, ЕСТА (Sigma), 0,5 мМ, и uo-
ливииилпирролидон (PVP) (L'SB), 1% раствор
(Lechner & LaVeck, 1985]
• Скальпели No. 1621 (В-D Biosciences)
Хирург ические ножницы
Полу искривленные щг ш цы для мггкродиссекции
• Газовая смесь с высоким содержанием О, (50%
О,, 45% N,, 5% СО,)
Нестерильные.
• Перчатки (человеческие ткани могут быть конта-
минированы биолог ическгг опасными агентами)
• Камера с контролируемой атмосферой (Bellco
№ 7741)
Качалочная платформа (Bellco No. 7740)
Протокол
1. Покройте культуральные чашки смесью FN/V7
BSA - 1 мл на 6-см чашку и инкубируйте чашку в
С О,-инкубаторе с влажной атмосферой при 37 °C
в течение ио крайней мере 2 ч (не ггревышать48 ч).
Удалите смесь при помощи вакуум-аспирации и
заполните чашки 5 мл культуральной среды
2. Асептически иссеченные ткани аутоисийного мате-
риала лег кого от не больных раком доноров в пред-
шествующие 12 ч помещают в холодную (на льду)
среду Е-15д,гя транспортировки в лабораторию,
где бронхи подвергаются дальнейшему иссечению,
отделяются от периферической легочной ткани.
3 До начала культивирования процарапайте лез-
вием скальпеля область площадью в один квад-
23.2. Эпителиальные клетки
441
ратный сантиметр на одном краю поверхности
6-см чашки для культуры
4. Откроите воздуховодные пути (погруженные в
среду L-15) при помощи xupypi ических ножниц
и порежьте (резкими режущими движениями,
не пилите) ткань при помощи скальпеля на два
кусочка: 2x3 см.
5. Используя скоблящие движения, чтобы предуп-
редить повреждение эпителия, соберите влажные
фра< менты ткани и поместите их эпителиальной
стороной вверх на очерченную зону 6-см чашки.
Удалите среду, инкубируйте фра> мент при ком-
натной температуре 3—5 мин чтобы произошла
адгезия к процарапанной зоне на чашке.
6. Добавьте 3 мл среды НВ в каждую чашку и помес-
тите их в камеру с контролируемой атмосферой
на качалочную платформу.
7. Заполните камеру тазовой смесью с высоким
содержанием кислорода.
8. Вращай те камеру при скорости 10 оборотов в
минуту, заставляя среду постоянно омывать по-
верхность эпителия.
9. Инкубируйте таким образом фратменты тканей
нри 37 °C, заменяя среду и атмосферу через день
и в последующие 6-8 дней через двухдневный
интервал. Этот этак улучшает последующее
культивирование клеток, поскольку восстанавли-
вает ишемические повреждения, которые moi ли
возникнуть во время смерти донора, цока ткань
не была помещена в холодную среду L-15.
10. До культивирования процарапайте семь зон на
поверхности каждой 10-см культуральной чашки
скальпелем, покройте поверхность отмеченных
чашек раствором смеси FN/V BSA, удалите из-
быток жидкости, как описано выше.
11. Порежьте влажные фра1 менты, восстановленные
после ишемии, на кусочки 7x7 мм, поместите
кусочки эпителиальным слоем наверх на обоз-
наченные зоны
12. Инкубируйте кусочки при комнатной темпера-
туре без среды в сечение 3—5 мин, как описано
выше.
13. Добавьте 10 мл среды LHC-9 в каждую чашку, и
инкубируйте в паровом 5%СО2-инкубаторе при
37 °C
14. Заменяйте среду на свежую каждые 3—4 дня.
15. Через 8—11 дней инкубации, кота эпителиаль-
ные клетки перерастут i рани цы эксплантата
более чем на 0,5 см, перенесите эксплантат на
новую культуральную чашку, с процарапанной
зоной и покрытой FN V 'BSA для получения
новой области роста эпителиальных клеток. Этот
шаг можно повторять до 7 разе высоким выходом
NHBE клеток.
16. Инкубируйте последующий рост клеток в среде
LHC-9 еще 2—4 дня до трипсинизации (с раство-
ром трипсин EGTA, PVP) и субкультивирова-
ния для экспериментальных исследований.
23 .2.10. Эпитепий ротовой полости
Кератиноциты ротовой полости были культивированы
в среде, аналошчно LHC-9 и MCDB153, с применени-
ем чашек, обработанных для лучшего прикрепления
клеток FN/C BSA. Протокол 23.10 представляет собой
сокращенный протокол, описанный Grafstrom |2002].
ПРОТОКОЛ 23.10. Кератиноциты ротовой
полости
Материалы
Стерильные:
• Транспортная среда Лейбовича L-15 с 100 мкг/мл
гентамицина. 100 U/мл пенициллина. 100 мкг/мл,
Фу Н( изон, 1 мкг/мл.
• Ростовая среда модифицированная MCDB 153
[Grafcir6in,2002]
• Рост овая среда с антибиотиком: рост овая среда с
гентамицином 100 mki мл, пенициллин-стрепто- |
МИНИНОМ 100 U мл и фуН1 изоном, 1 МК1 мл
• D-PBSA. Дюльбекко PBS без Са* 1 2 3 4 5 6* и Mg2'
• Трипсин 0,17% в D-PBSA
• РЕТ: трипсин 0,025%; EGTA, 0,5 м М, поливинил
пирролидин (PVP), 40 KDa, 1% в D-PBSA
* Скальпели, лезвие #11
• Ножницы
* Пинцеты, 2 кары
• Чашки Петри для культуры тканей, 5 или 10 см
• Чашки Петри не для культуры тканей (для иссе
чения тканей) 3.5 или 10 см
• Центрифужные пробирки конические, 15 мл
• Мпкрииииетки, например, Gilson, 100 мкл
• Культуральные чашки, обработанные FN C/BSA,
5 см (см. протокол 23.9)
Протокол
Первичная культура:
1. Получите материал, — xupypt ический иди ранний I
аутоцсийный. Поместите в холодную транспорт-
ную среду и перенесите в лабораторию как можно I
быстрее.
2. Поместите ткань в 10-см чашку и ополосните |
фосфатно-буферным раст вором (D-PBSA).
3. Максимально удалите соединительную ткань.
включая части, содержащие кровь. Если образцы I
канн имеют* площадь поверхности около 1 см2,
поделите на меньшие кусочки.
4. Поместите образцы в 3,5-см чашку и добавьте ।
раствор трипсин 0,17% в таком объеме, чтобы
покрыть образец (1-2 мл) и инкубируйте в те- |
чение ночи при 4 °C.
5. Удерживая каждый образец пинцетом, отслаи- I
вайте н соскребайте эпи ге чий другим пинцетом
в раствор трипсина.
6. Тщательно гомогенизируйте суспензию несколько ।
раз для дальнейшей дезагре! ацин клеток, затем не- I
ренесите суспензию в центрифужную пробирку.
442
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
7. Ополосните чашку D-PBSA, затем добавьте этот
раствор в клеточную суспензию. Используйте
тот же объем для ополаскивания, который вы
использовали при дезагрегации тканей в шаге 4.
8. Отберите аликвоту микропипеткой для опреде-
ления клеточно! о выхода.
9. Осадите клетки на 125 g ири 4 С, предпочтитель-
но на центрифу! е с охлаждением, затем ресусиен-
дируйте клетки в ростокой среде.
10 Разведите суспензию ростовой средой до необ-
ходимой концентрации и посейте клетки ири
5x10* * «см2 на чашки, обработанные FN C/BSA.
Если клетки получены из аутопсий ного мате-
риала, используйте среду, содержащую антиби-
отики для первых 3 4 дней культивирования.
11. Замените питательную среду у клеток через 24 ч
для удаления возможного клеточного дебриса и
эритроцитов.
12. Меняйте среду через день.
Субкультивирование:
1. 3. Ополосните однократно клетки D-PBSA.
14. Добавьте раствор РЕТ, так чтобы клетки были
покрыты раствором полностью, наиример исполь-
зуйте 3 мл на10-см чашку
15. Инкубируйте при комнатной температуре, пока
клетки не начнут округляться и/или отрываться
от чашки. Следите за отделением клегок иод
микроскопом (процедура обычно занимает
5-10 мин). Скорость отделения может бытыювы-
шена добавлением высокой концентрации трип-
сина или повышением температуры до 37 °C.
16. Ко1да большинство клеток отделились, осто-
рожно постучите по чашке и пинеткой направьте
раствор трипсина на поверхность роста так, чтобы
механически ускорить отделение.
17. Когда клетки отделились, добавьте в чашку 5—
10 мл D-PBSA. чтобы инактивировать действие
трипсина.
18 Перенесите суспензию клеток в центрифужную
пробирку и осторожно гомогенизируйте для по-
лучения равномерного распределения клеток в
суспензии.
19 Используя 1 -мл иииетку, отберите образец клеток
для подсчета и перенесите их в камеру 1 емоцпто-
метра (см. протокол 21.1).
20. Определите концентрацию клеток в суспензии.
21. Осадите клетки центрифу! нрованием в течение
5 мин на 125 g ири 4 °C.
22. Удалите супернатант и, аккуратно постукивая по
пробирке, взболтайте осадок.
23. Добавьте |хк.~говую среду по желанию и осторож-
но размешайте клеточную суспензию пипеткой,
распределите но культуральным сосудам.
24. Поместите все сосуды на лоток. Осторожно
вручную покачивайте лоток с сосудами в разных
направлениях, чтобы быть уверенным, что плот-
ность клеток в каждом сосуде одинакова (простое
вращение чашек приведет к сосредоточению
клеток в центре чашки). Важно, чтобы полки, на
которых рас пола! аются сосуды, были одинаково
закреплены в инкубаторе, а сам инкубатор не
вибрировал, а также располагался так, чтобы слу-
чайные сотрясения не нарушали прикрепление и
рост клеток.
25. Инкубировать клетки 4—24 ч до замены среды.
23.2.11. Простата
В ряде публикаций описывается использование кле-
точных культур из тканей простаты [Cronauer el al.,
1997; Peehl, 2002J, ири этом особый интерес вызывает
ре1уляния клеточной пролиферации и дифференци-
ровки паракринными факторами роста [Yanetal., 1992;
Chopra el al., 1996; Thomson el al„ 1997]. Прот окол 23.11
для первичной культуры клеток эпителия простаты
крысы предоставлен W.L. McKeehan, Texas А&М
University, 2121 West Holcombe Boulevard, Houston,
Texas 77030-3.30.3, USA. Выделенные эпителиальные
клетки нормальной простаты крысы являются хорошей
моделью для изучения клеточной биоло! ии поддержа-
ния, роста и функционирования нормальной и|юстаты
в контролируемых исследователем определенных
условиях [McKeehan el al., 1982, 1984; Chaproniere &
McKeehan, 1986]. Нормальные клетки служат в ка-
честве контрольною типа клеток при исследовании
клеток аденокарциномы простаты. Условия, подобные
описанным здесь, подходят и для первичной культуры
эпителиальных клеток перевиваемых опухолей. Клю-
чевые характеристики этою метода являются специфи-
чески поддерживающими для эпителиальных клеток
путем применения улучшенной питательной среды и
гормоноподобных факторов роста [Yan et al., 1992], в
то же время происходит конкурентное hhi ибирование
роста фибробластов в условиях дефицита или ингиби-
руюшег о действия среды.
ПРОТОКОЛ 23.11. Эпителий простаты
Схема
Изъять и подготовить простату для культивирова-
ния клеток (30 мин). Инкубировать ткань простаты
с коллагеназой (1 ч), собрать отдельные клетки и
небольшие агрешты клеток (1 ч). Инокулировать
клетки и культивировать до конфлюэнтного моно-
слоя (7 дней).
Материалы
Стерильные:
• Ростовая среда WAJC404 [McKeehan et al., 1984;
Chaproniere & McKeehan. 1986] (см. табл. 10.1)
• Среда-солевой раствор (MSS) [McKeehan el al.,
1984]:
a) NaCl.... .... 12 мМ
23.2. Эпителиальные клетки
443
б) KCI ........................ 2 мМ
в) КН,РО<...... .... 1 мМ
О HEPES, pH 7,6.. . 30 мМ
д) Глюкоза......................4 мМ
е) Феноловый красный.........3,3 мкМ
• фетальная бычья или лошадиная сыворотка
• Пенициллин
• Канамицин
• Холерный токсин
• Дексаметазон
• Эпидермальный фактор роста (EGF)
• Овечий шш крысиный пролактин
• Инсулин
• Частично очищенный [McKeehan el а!.. 1984;
Chaproniere & McKeehan, 1986] или очищенный
[Crabb et а!.. 1986] цростатроиин (фактор роста
эпителиальных кдеток простаты)
• Коллагеназа, тин I (Sigma)
• Чашки Петри (стеклянные или пластиковые),
60 мм
И Ножницы
• Шприц и канюля 14-G
• Флакон Эленмайера, 25 мл
• Проволочное сито, ячейки 1 -мм, сделанное так,
чтобы подходить к 50-мл конической центри-
фужной пробирке
• Коническая центрифужная пробирка, 50 мл
• Нейлоновые фильтры 50,150,100, и 40 мкм, под-
ходящие для 50-мл коническим пробиркам
• 25-луночные планшеты для культуры тканей
Нестерильные:
• Водяная баня-шейкер при 37 °C
• Центрифут а
• Гемоцитометр или счетчик клеток Coulter
• Крысы, самцы, 10—12 недель
Протокол
1. Асептически выделите желаемую долю простаты и
поместите ее в стерильную 60-мм чашку Петри.
2. Удалите жир с доли и взвесьте его.
3. Добавьте 2 мл коллагеназы. 675 И/мл в MSS, со-
держащем 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл
канамицина.
4. Измельчите ткани при помощи ножниц на кусоч-
ки примерно но 1 мм. Дос гаточно маленькие для
того, чтобы проходить через канюлю 14-G.
5. Используя шприц и канюлю 14-G, перенесите
измельченные фра! менты ткани в стерильный
25-мл флакон Эрленмайера Добавьте колла! е-
назу. 1мл на 0,11 исходного веса ткани.
6. Инкубируйте в течение 1 ч цри 37 °C в водяной
бане-шейкере.
7. Отсосите через канюлю 14-G расщепленную
ткань трижды, а затем пропустите суспен-
зию через 1 рубое (1 мм) металлическое сито,
вставленное в 50-мл пластиковую коническую
пробирку для удаления дебриса и нерасщецлен-
ного материала. Промойте суспензию равным
объемом MSS, содержащего 5% цельной феталь- |
ной сыворотки геченка или лошади
8. Соберите клетки центрифу! ированием на 100 g |
в течение 5 мин цри 4 "С.
9. Ресусиендируйте клеточный осадок в 5 мл MSS
с 5% сыворотки и пропустите суспензию через
нейлоновые фильтры с размером ячеек 250, 150,
100 и 40 мкм. Промойте каждый фильтр 5 мл
MSS с 5°п сыворотки.
10. Соберите клетки центрифу! ированием и ресус- |
пендируйте 5 мл питательной среды WAJC404.
11. Подсчитайте клетки п доведите концентрации, до |
4x10** кл.. мл.
12. Поместите 50 мкл, содержащих 2x10s клеток, в I
каждую ячейку 24-луночного планшета (площадь
лунки 2 см2), содержащего 1мл среды WAJC404,
10 hi/мл холерного токсина, 1 мкМ дексаметазо-
на, 10 hi мл EGF, 1 mki мл пролактина, 5 mki мл
инсулина, 10 нг/мл цростатроиина, 100 U /мл
пенициллина и 100 mki мл стрептомицина. ,
Частично очищенный источник цростатроиина |
может быть заменен как описано McKeehan el al.
[1984J и Chaproniere и McKeehan 119861.
13. Инкубируйте культуру во влажной атмосфере 95%
атмосферного воздуха и 5% СО2 цри 37 "С„ Заме- I
ните среду на 3-й и 5-й дни. Клетки дгыжны быть |
близки к конфлюэнтному монослою на 7-й день. ,
Вариации. Представленная процедура может быть
применима к культуре эпителиальных клеток проста-
ты человека в модификации, описанной Chaproniere и
McKeehan [ 1986]. Очищенный фактор роста иростатро-
иин идентичен связывающему гепарин фактору роста
фибробластов перво! о типа, который ранее назывался
кислый FGF или HBGF-1 [Burgess &. Maciag, 1989J.
По новой номенклатуре, выработанной в результате
col лашения, этот фактор роста называется FGF-1. При
молекулярной характеристике новых членов семейства
лигандов FGF, так же как и семейства рецепторов FGF
в клетках простаты, было обнаружено, что эпителиаль-
ные клетки простаты экспрессируют специфические
силайс-варианты (FGF-R2IIII>) но одному из четырех
FGF-рецецторных генов. Специфический рецептор
распознает FGF-1, а стромальная клетка продуцирует
FGF-7 (также называемый фактором роста кератино-
цитов), но не продуцирует FGF-2 (ранее называемый
bFGF или HBGF-2). описанный Yan el al. [1992].
Стромальные клетки простаты экспрессируют только
ген FGF-R2, который распознает FGF-1 и FGF-2, но
не FGF-7. Поскольку стромальные клетки отвечают
как на FGF-1, так и на FGF-2, цростатроиин FGF-1,
используемый для обеспечения дополнительной се-
лекции эпителиальных клеток, может быть заменен в
вышеописанной процедуре на FGF-7.
FGF-2 не заменяет FGF-1 или FGF-7. Если в
протоколе используется очищенный FGF-1, то его
активность может быть повышена путем добавления
гепарина в концентрации 10—50 mki мл.
444
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
23.3. МЕЗЕНХИМНЫЕ КЛЕТКИ
Данный раздел включает в себя те клетки, которые
происходят из эмбриональной мезодермы и не вклю-
чает гематопоэтическую систему (см. разд. 23.5).
Мезенхимные клетки включают в себя структурные
(соединительнотканные, мышечные и костные) и
сосудистые (эндотелий и 1ладкие мышцы кровенос-
ных сосудов) клетки. В то время как эпителиальные
клетки рассматриваются как паренхима или 1лавные
функциональные клетки органа, соединительноткан-
ные клетки классифицируются как стромальные или
поддерживающие ткани.
23.3.1. Соединительная ткань
Клетки соединительной ткани обычно считаются «сор-
няками в сад^', взращиваемом культуральщиком». Они
выживают в большинстве случаев ири механической
и ферментативной эксплантации и могут быть куль-
тивированы на mhoiux простых средах, в частности
в присутствии сыворотки. Хотя эти клетки, которые
обычно широко называют фибробластами, MOiyy
быть выделены из mhoi их разнообразных тканей, ири
этом подразумевается, что они являются элементами
соединительной ткани, точное распознавание клеток
это!о класса не всегда однозначно. Линии фиброб-
ластов (наиример, ЗТЗ из мышеи) продуцируют и
выделяют в среду коллаген I и Штина [Goldberg,
1977]. Хотя продукция колла!ена не ограничива-
ется фибробластами, синтез типа I в относительно
большом количестве характерен для соединительной
ткани. Тем не менее клетки ЗТЗ moivt дифференци-
роваться до адиноци гов при определенной индукции
[Kuriharcuch & Green, 1978; Smyth et ah, 1998], клетки
10T1 2 мо<ут дифференцироваться до хондроцитов
и кости [Shea el al., 2003] в ответ на морфогенетичес-
кие белки (BMPs). Показано, что клеточные линии
фибробластов мышиных эмбрионов, такие как группа
клеточных линий ЗТЗ u 10Т1,2, представляют собой
примитивные мезодермальные клетки, дифференци-
ровка которых может быть индуцированна более чем
в одном направлении.
Фибробласты человека, хомяка и цыпленка мор-
фолошчески отличаются от мышиных фибробластов,
для них характерна веретенообразная морфоши ии нри
конфлюэнтности. что приводит к разработке парал-
лельных исследований клеток, отличных от культуры
типа «булыжной мостовой», которую образуют мы-
шиные фибробласты. Веретенообразные клетки могут
представлять собой более высококоммитированные
предшественники и могут быть более точно определены
как фибробласты. Клетки NIH3T3 могут приобрести
веретенообразную форму, если культивировать нри
высокой клеточной плотности. Можно также пред-
положить, что клеточные линии фибробластов могут
быть получены из васкулярных перицитов, — клеток
кровеносных сосудов, подобных клеткам соединитель-
ной ткани, но в отсутствие специфических маркеров их
трудно дифференцировать.
Таким образом, ясно, что Клеточные линии, обычно
называемые фибробластными, MOiyr быть получены
из эмбриональных и взрос чых тканей, но эти линии не
следует рассматривать как идентичные или классифи-
цировать как фибробласты без достаточного подтверж-
дения путем экспрессии соответствующих маркеров их
способности дифференцировки в зрелые фиброциты.
Коллаген I тина является одним из таких маркеров.
Антиген Thy I также раньше использовался в ка-
честве маркера [Raff et al., 1979; Saalbach el al., 1997],
хотя он может также появляться на некоторых гемато-
поэтических клетках.
Культуры эмбриональных или взрослых фибро-
бластов MOiyT быть приготовлены путем общеприня-
тых процедур, таких как первичная эксплантация (см.
протокол 12.4), теилая (см. иротокол 12.5) и холодная
(см. протокол 12.6) триисинизации и коллагеназное
расщепление (см. иротокол 12.8).
23.3.2. Жировая ткань
Хотя может быть затруднительно получить культуры
из зрелых жировых клеток, может быть индуцирован-
на дифференцировка в культурах мезенхимальных
клеток (наиример, мышиных клеток ЗТЗ-Ll) путем
ведения клеток при высокой плотности в течение не-
скольких дней [Kuriharcuch & Green, 1978; Vierick el
al., 1996J. Показано, что за индукцию дифференциров-
ки до жировых клеток отвечает ацииогенный фактор
сыворотки. Первичные культуры жировых клеток
могут также быть получены из эпидидимиса крысы;
иротокол 23.12 приводится с некоторыми сокращени-
ями но Quon [1998].
Жировые клетки (адипоциты) — это терминально
дифференцированные, специализированные клетки,
основная физиоло! ическая роль которых классически
характеризуется как энергетический резервуар для
организма. Адипоциты являются хранилищем триг-
лицеридов при избыточном поступлении энергии и
источником энер! ии в форме свободных жирных кис-
лот, высвобождающихся путем липолиза тогда, когда
эта энер!ия понадобится. Жировые клетки шрают
важную роль как активные ре1уляторы углеводною
и жирового метаболизма [Flier, 1995; Reaven, 1995].
Специфические нарушения жировой ткани moivt
вносить непосредственный вклад в патогенез таких
распространенных заболевании, как диабет, i ииерто-
ния и ожирение [Flier, 1995; Holamisligil el al., 1995;
Reaven, 1995; Walston et al., 1995; Zhang et al., 1994). В
протоколе 23.12 дана модификация метода выделения
клеток, описанная Rodbell [1964J, оптимизированная
для получения примерно 4 мл плотно расположенных
адипоцитов из скоплений жировой ткани эпидидими-
сов четырех крыс путем флотации диза! гре< ированных
клеток после центрифу! ирования. Данный иротокол
может быть изменен для увеличения или уменьше-
23.3. Мезенхимные клетки
445
ния желаемого выхода клеток и может быть также
использован для получения инсулин-peai ирующих
клеток, используемых для перемещения ДНК при
электропорации
ПРОТОКОЛ 23.12. Первичная культура
адипоцитов
Материалы
Стерильные:
• DMEM-A* DMEM, pH 7,4, содержащий 25 мМ
люкозы, 2мМ 1лютамина, 200 нМ (R)-N6-
(1-метил-2-фенилэтил) аденозин (РТА, Sigma),
100 mki /мл гентамицина и 25 мМ HEPES. Приго-
товьте аликвоты по 100 мл и подогрейте до 37 °C
перед использованием.
• DMEM-Bl DMEM-А с добавлением 7% BSA
• Буфер KRBH: среда Кребса-Риш ера, pH 7,4,
содержащий 10 мМКаНСО4.30 мМ HEPES (Sig-
ma), 200 нМ аденозина (Roche) и 1% (w v) BSA
(Intergen). Приготовить 1 л буфера KRBH: доба-
вить? 1 NaCl. 0,55 i КН2РО„ 0.251 MgSOt-7H2O,
0,841 NaHCO* 0,11 i CaCl,, 7,151 HEPES. 101
BSA, 1 мл 200 мкМ аденозина. Добавить UPW до
1 л. Разделить на аликвоты ио 100 мл. Подогреть
до 37 'С, довести pH до 7,4
• Буфер KRBH-A. KRBH с 5% BSA
* Коллагеназа, 20 mi мл в 2 мл буфера KRBH .
стерилизованною фильтрацией через фильтр с
порами 0,22-мкм.
• Чашки Петри для культуры тканей, диаметр 6-см
(В-D Biosciences)
• Конические центрифужные пробирки, 50 мл
(Corning)
• Полипропиленовые пробирки, 17 ммхЮО мм
• OjiaKOH из полипропилена с низкой плотностью,
30 мл
• Нейлоновой сито 250 мкм в держателе или филь-
трующей воронке
• Наконечники для пипеток широкою калибра
200 мкл
• Ножницы: две пары пли острые ножницы для
иссечения 10 см; пинцет Перри, 12,5 см.
Нестерильные:
• Крысы самцы Спрэй 1 -Доули весом 145—170 г,
CD линия (Charles River Breeding Laboratories)
• Пластиковые коробки, наполненные изовой
смесью 70% СО2,30% О
• Гильотина
• Автоматическая пинетка и наконечники на
200 мкл
Протокол
Иссечение жирового скопления эпидидимуса
1. Анестезируйте крыс в пластиковой коробке с
газовой смесью 70% СО,, 30% О,.
2. Декапитируйте крыс на i ильотине и обескровьте. |
3. Быстро оботрите тело 70%-м этанолом.
4. Извлеките жировое скопление эпидидимуса, |
поддерживая максимально возможный уровень
стерильности
а) Прорежьте кожу нижней части брюшка при
помощи одной пары ножниц, обнажите брю- I
шину.
б) Используя вторую пару ножниц, откройте |
брюшину и пинцетом вытяните яичко.
в) Срежьте жировой скопление эпидидимуса, .
стараясь сохранить кровеносные сосуды на |
задней стороне.
5. Отправьте ткань в культуральную лабораторию.
Коллагеназное расщепление
и отмывание адипоцитов:
6. Добавьте 4 г жировой ткани (примерно равно
8 жировым скоплениям) в 30-мл флакон из поли-
пропилена низкой плотности, содержащий 4 мл
буфера KRBH ири 37 °C.
7 Измельчите жировые скопления при помощи
ножниц на кусочки примерно ио 2 мм в диа- I
метре.
8. Добавьте 1 мл раствора коллагеназы во флакон,
содержащий измельченную жировую ткань,
инкубируйте кусочки в водяной бане-шейкере
при 37 °C примерно 1 ч, пока клеточная смесь не
приобретет консистенцию сливок.
9. После коллагеназною расщепления добавьте во I
флакон 10 мл буфера KRBH при 37 °C.
10. Перемешайте клетки во флаконе вращательным I
движением, осторожно перелейте клетки через ।
нейлоновое сито 250-мкм в 50-мл коническую
пробирку.
11. Промойте клетки добавлением 30 мл буфера
KRBH ири 37 °C в пробирку и быстро центра- |
фу1 ируйте при 200 g в настольной центрифуге.
Удалите осадок при помощи пипетки. Обратите
внимание, что адипоциты будут плавать на по-
верхности водного буфера.
12. Повторите отмывание клеток еще два раза до- |
бавленпем 40 мл буфера KRBH, центрифу! про- ।
ванием и удалением осадка.
13. Дважды отмойте клетки в 40мл DM ЕМ-А при I
37 °C.
14. После заключительного отмывания ресуспенди- ।
руйте клетки, находящиеся на поверхности среды I
в DMEM-А при цитокрите примерно 40%.
Пераичная культура адипоцитов:
15. Перенесите но 2 мл суспензии в DMEM-А с
40%-м цитокритом. используя 200-мкл иииетку с
широким диаметром носика в каждую чашку для
культуры тканей (6-см)
16. Поместите клетки во влажный инкубатор при |
37 °C с содержанием СО25% на 1,5 ч.
17. Добавьте 5 мл DMEM-В в каждую чашку.
446
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
На этой стадии обычно проводится исследование
захвата шюкозы [Quon, 1998] в аликвоте клеток для
проверки их жизнеспособности
23.3.3. МЫШЦЫ
Гладкие мышцы Гладкомышечные клетки получены
культивированием сосудистой ткани [Subramanian el
al., 1991] и затем сокультивированием с сосудистым
эндотелием [Jinard et al., 1997; Klinger & Niklason,
2005]. Протокол 23.13 приводится по Klinger and
Niklason [2005].
ПРОТОКОЛ 23.13. Выделение
и культивирование гладкомышечных клеток
Материалы
Стерильные:
• Среда для гладкомышечных клеток (SMCM):
Модифицированная ио Дюльбекко среда Игла
(DMEM) с добавлением 20% фетальной сыво-
ротки теленка, пенициллин 100 V 'мл, стрепто-
мицин 100 мкт мл, 0,25% трипсин/EDTA (см
протокол 12.1 и Приложение I).
• Чашки Петри: 15x2.5 см, 6x1,5 см
• Скальпель с хиру pi ическим лезвием #10
• Ножницы для иссечения
• Пинцет для тканей
Протокол
1. Получите грудную аорту от молодого теленка.
2. Погрузите аорту в раствор Хлнкса.
3. Поставьте на лед до начала выделения клеток.
4 Поместите аорту в чашку Петри 15х2,5-см для
иссечения.
5. Разрежьте аорту продольно ири помощи ножниц.
6. Осторожно скребите просветную поверхность
аорты лезвием скальпеля для удаления эндоте-
лиальных клеток
7. Рассеките медиальный слои аорты, свободный от
интимы и адвентициальною слоя.
8. Порежьте медиальный слой аорты на cei менты
площадью примерно 1 см-.
9. Поместите медиальный се1мент интимальнои
стороной вниз в чашку Петри 6х 1,5см.
10. Оставьте cei менты примерно на 10 мин для при-
крепления клеток к чашке.
11. Добавьте 1 мл SMCM непосредственно на меди-
альный cei мент в каждую чашку.
12. Поместите медиальные се< менты в увлажненный
инкубатор upu 37 °C и 10% СО,на ночь.
13.На следующий день добавьте 5 мл свежею
SMCM в каждую чашку, стараясь не нарушить
прилегание cei мента к чашке.
14 Инкубируйте чашки еще 10 дней, после чего
1ладкомышечные клетки должны мшрировать
с cei ментов и начать формировать двумерную
культуру.
15. Пересевайте клетки, ко<да они доспи нут стадии
субконфлюэнтного монослоя, используя смесь
0,25% трипсин/EDTA.
Сердечная мышца и трансплантация скелетных
миобластов. Сердечная мышца может быть выделена
методом холодной триисинизации (протокол 11.6),
при этом кардиомиоциты сохраняют сократительную
способность в течение 3 дней в культуре [Deshpande el
al., 1993J. Хотя кардиомиоциты человека также мшут
быть выращены в культуре [Goldman & Wurzel, 1992],
трансплантация сократимых и несократимых клеток
из скелетных мышц представляет собой новую стра-
те! ию для лечения осгрою инфаркта миокарда; она
была осуществлена на кролике, крысе, свинье, собаке
и овце с доказанным улучшением функции миокарда in
vivo [Leobon et al., 2003; Menasche, 2004; Taylor, 2001J.
В свете этих обнадеживающих результатов клеточная
терапия, в особенности клеточная трансплантация,
может* * быть применима в случае многих патолошй
[Bhagavati & Xu, 2004J. Трансплантация аутолшичных
скелетных миобластов в иостинфарктный рубец недав-
но была применена к людям [Menasche el al., 2001J. Эти
недавние результаты вызвали новый интерес к фунда-
ментальным исследованиям молекулярных условий
множенной пролиферации и дифференцировки in vitro
[Neumann et al., 2003; Mai & Harter, 2003; Anderson &
Wozniak. 2004: Li et al.. 2004: Carvalho et al.. 2004], a
также быстро развивающийся интерес к культуре ство-
ловых клеток, дающих миогенные клетки [Bhagavati &
Хи, 2004; Seruya et al., 2004; Bossolasco et al., 2004].
Миогенные клетки из скелетных мышц. В опре-
деленных условиях, ири которых клетки продолжают
проявлять по крайней мере некоторые из своих ха-
рактерных особенностей, возможно культивирование
миогенных клеток из взрослых скелетных мышц
нескольких видов. Так называемые сателлитные клет-
ки - это миогенные клетки, частично воспроизводящие
первую ступень дифференцировки скелетных мышц.
Они пролиферируют и беспорядочно мшрируют по
субстрату и затем выстраиваются в линию и, наконец,
подвер!аются процессу слияния с формированием
мноюядерных миотрубочек [Richler & Yaffe, 1970.
Campion, 1984; Hartley & Yablonka-Reuveni, 1990]. Хотя
с применением триисинизации может быть проведено
три-четыре пассажа, после дифференцировки (т. е. сли-
яния) проведение субкультивирования невозможно.
Ниже приведено два различных протокола. Прото-
кол 23.13 является традиционным методом (расщеп-
ление и механическая юмогенизация, за которыми
следует посев изолированных клеток). Протокол 23.14
основывается на использовании единичных мышечных
волокон. Для культуры животных тканей мшут быть
использованы оба протокола, однако первый может
23.3. Мезенхимные клетки
447
быть также использован для культуры человеческих
клеток. Тем не менее второй протокол дает более
близкое воспроизведение mhoichhoio процесса in
viro. Первый метод ле1 коосутцествим и дает хорошие
результаты но клеточному выходу и возможностям
дифференцировки, особенно если вы используете
достаточно исходного материала. Однако процент
миогенных клеток, полученных на единицу мышеч-
ной ткани, очень низок, <1% от всех представленных
клеток [Rosenblatt et al., 1995], что вызывает вопрос о
том, является культура, полученная в результате, дей-
ствительно репрезентативной для ткани-источника.
Этот метод описан для первичных культур из биопсии
Здоровою человеческого сердца, которая имеет высокое
содержание миогенных клеток (но крайней мере, 85%
положительны по иммуно-окрашиванию на десмин на
10 день после посева). Он также может быть исполь-
зован для мышц животных (например, крысы, мыши,
кролика, свиньи или собаки).
Для получения культуры единичных мышечных
волокон, мышцы выделяются индивидуально и ин-
кубируются в колагеназе для расщепления соедини-
тельной ткани Мягкая механическая гомогенизация
затем высвобождает отдельные интактные мышечные
волокна. Мышечные волокна, вместе с ассоциирован-
ными сателлитными клетками, могут быть получены
из индивидуальных мышц. Это позволяет проводить
сравнение между ответом различных групп мышц на
экспериментальные процедуры или между мышцами
разною возраста или генетического происхождения.
Более тою, тяжелые цепи миозина из индивидуальных
мышечных волокон могут бы гь определены методом
S DS - гель-электрофореза, поэтому можно сравнивать
мышечные волокна с различными типами тяжелых
цепей миозина [Rosenblatt el al., 1996]. Мигленные
культуры могут быть успешно получены из единичною
мышечного волокна, выделенною из мышцы животно-
го любого возраста, хотя увеличение возраста приводи!
к некоторому снижению эффективности культивиро-
вания. У животных, страдающих хроническими миопа-
тиями, такими как мышечная дистрофия, отмечается
некоторая контаминация фибробластами, возможно
в результате возрастания доли соединительной ткани
[Bockhold el al., 1998].
Протокол 23.14 и часть предшествовавшего вве-
дения были предоставлены М. Malo, S. Bonavaud, Ph.
Thibert,and G. Barlovatz-Meimon, Facultredes Sciences,
Universite Paris XII, Vai deMarne. Avenue General de
Gaulle, F-94010 Creleil, France.
Индукция пролиферации и дифференцировки.
Кривая роста культуры миогенных клеток человека,
полученной в среде Хэма F12 с добавлением 20%
FBS, показывает наличие трех традиционных фаз (см.
разд. 21.9.2): lag- фазу, фазу экспоненциального роста и
илато, которое совпадает с началом слияния. Слияние,
оцениваемое ио таким параметрам, как количество ядер,
включенных в мышечные трубочки, или индекса, сли-
яния (процент ядер, инкорпорированных в мышечные
ПРОТОКОЛ 23.14. Культура миобластов
взрослой мышцы взрослого человека
Схема
Первичная культура может быть лет ко выращена I
в среде Хэма F12c добавлением 20% фетальной
сыворотки теленка (FBS). Без изменений условий I
культивирования эти клетки делят ся н дифференци- ।
руются путем слияния с образованием мнпгоядерных
мышечных трубочек, что подтверждает иринадлеж- |
ность культивируемых клеток к миоцитам
Материалы
Стерильные:
• Транспортная среда Хэма F12 (Seronied 08101)
без NaHCO-, и с 20 мМ HEPES (Serva 25245),
75 мл 1
• Ростовая среда Хэма с 20% FBS ((ЛВСО 011—
06290), 200 мл
• Раствор проназы: 0,15%, нроназы (Sigma Р-6911)
и 0,03% EDTA (Merck 8418) с 20 IU/мл пеницил-
лина и 20 mki мл стрептомицина (0,4% Eurobio
PES 3000), в F12 или DPBS. 100 мл
• D-PBSA, 100 мл
• Нейлоновое гцтп, 100 мкм
• Скальпели
* Длинные ост рые ножницы
• Чашки Петри для иссечения, 9 см
• Флаконы. 25 см-, 4 шт.
• Центрифужные пробирки, 20 мл, или универ-
сальные контейнеры, 5 шт.
Нестерильные.
• Гемоцитометр
Протокол
Диссоциация:
1. Обрежьте немышечные ткани с образца, получен-
ного при биопсии, и промойте в D-PBSA
2. Порежьте ткань на фра1 менты параллельно во- ।
локнам, промойте в D-PBSA, взвесьте.
3. Поместите фрат менты параллельно дру< другу
в крышку чашки Петри, порежьте на тонкие
цилиндры и затем, наконец, на кусочки объемом
1 мм *, стараясь не разрушить ткань. Последние
разрезы должны быть сделаны в пробирке ири
помощи длинных ножниц, старайтесь избегать ।
разрушения ткани.
4. Промойте в D-PBSA и дайте осесть, удалите су
периатант.
5. Ферментативно разрушьте фра< менты в течение I
1 ч при 37 °C в растворе нроназы (используйте
15 мл для биоитата весом 1 —3 мг), осторожно |
встряхивая пробирку через 10—15-мин.
6. После инкубирования гомогенизируйте культу
ру при помощи пинетки. Среда должна стано- ।
виться все более мутной но мере высвобождения
клеток
448
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
7. Позвольте фра! ментам осесть на дно код дей-
ствием силы тяжести с образованием осадка Р1
и супернатанта S1.
8. Профильтруйте S1 через нейлоновое сито 100 мкм
в 20-мл центрифужную пробирку. Осторожно
встряхивайте или шшетируйте супернатант для
ресусцендирования клеток.
9. Центрифу!ируйте пробирку 8—10 мин при .350 g.
Удалите супернатант аспирацией.
10 Очень аккуратно ресусиендируйте осадок, ис-
пользуя иииетку с резиновой грушей, отмерив
ровно 10 мл ростовой среды и подсчитайте коли-
чество клеток в гемоцитометре
И.Разведите суспензию в ростовой среде для
посадки в культуральные сосуды с концентра-
цией примерно 1.5x10* кл./мл. Из биопсии от
здоровою донора получают обычно примерно
1-2х10’кл./1.
12. Добавьте 15 мл расщепляющей среды к Р1,
инкубируйте фра< менты в течение 30 мин в
водяной бане при 37 °C, с периодическим встря-
хиванием
13. Пикетируйте суспензию, чтобы деза! pei нровать
клетки и затем профильтруйте их через нейло-
новое сито. Промойте фильтр 20 мл ростовой
среды.
14. Центрифу! ируйте суспензию в течение 8—10 мин
ири 350 g, подсчитайте клетки, и косейте, как
описано выше.
15. Перенесите флаконы в инкубатор с влажной
атмосферой с 5% СО, на 37 °C.
• Требование безопасности. Остаток био-
псийного материала, все пробирки, планшеты, чашки
и прочие использованные материалы должны быть
обработаны тиохлоритом до уничтожения или
мытья (см. разд. 7.8.5).
Поддержание культуры:
16. Аккуратно заменяйте среду через 24 ч после
иосева и затем каждые 3 4 дня. Развитие этих
культур происходит 1лавиым образом в сторону
дифференцировки. Хронометрирование длитель-
ности трех фаз человеческих мышечных клеток
показывает продолжительность около 4—6 дней
до достижения кика пролиферации, затем клетки
выстраиваются по одной линии примерно на 8-
й день и около 10— 12-го дня отмечается активи-
зация процесса клеточною слияния. Тем не менее
каждый исследователь должен иметь в виду, что
некоторые клетки могут дифференцироваться
раньше, а друi ие еще будут пролиферировать,
koi да большая часть клеточной культуры уже
вступит в дифференцировку
Субкультивирование:
1 Осторожно добавьте небольшой объем EDTA к
клеткам и немедленно удалите.
2. Добавьт е достаточное количество раст вора трип-
сина (0,25%). так чтобы он покрыл слой клеток.
3. Koi да клетки отделятся от чашки, добавьте
5 10 мл полной ростовой среды, очень осто-
рожно однократно соберите и слейте культуру
пипеткой и центрифушруйте клетки в течение
10 мин при 350 g.
4. Подсчитайте количество клеток в аликвоте
суспензии и посейте клетки в выбранной кон-
центрации.
трубочки в отношении к общему числу ядер), начина-
ется обычно примерно на 8-й день после посева и резко
возрастает примерно на 10-й день. В зависимости от
образца эта хроноло! ия может быть сдвинут на один
день раньше или позже.
Таким образом, дифференцировка, выраженная
количеством ядер на миотрубочку/см2, может наблю-
даться морфоло! ически. Однако процесс дифферен-
цировки может также быть решстрируем с использова-
нием биохимических маркеров (таких как саркомерные
белки), ферменты, вовлеченные в дифференцировку
(например, креатинфогфокнназа и ее время-зависи-
мые мышце-сцецифичные изоформы, либо появление
а-актина [Buckingham, 1992J.
Было показано, что семейство генов, наиболее
изученным из которых является MyoD, активирует в
миогенных предшественниках экспрессию гена, спе-
цифического для мышц [см. обзор Buckingham, 1992J.
Дифференцировка мишенных клеток предполагает
как активацию спектра различных генов с соответству-
ющими изменениями адгезивных свойств клеточной
поверхности [Dodson et al., 1990], так и активацию
урокиназы, активатора плазминогена на клеточной
поверхности и ее рецептора [Quax et al., 1992].
Вариации и применение. Метод эксилантации-ре-
зксплантации был разработан группой исследователей
[Askanas el al., 1990; Pegoln et al.. 1990J; надежность
и достоверность eio были подтверждены в течение
длительного времени, особенно для исследований
мышечных дефектов.
Кшда целью работы является изучение механиз-
мов дифференцировки, следует делать выбор между
эксплантацией и методами ферментативною расщеп-
ления с последующей клональной или неклональной
культурой или трехмерным культивированием. Если
целью работ является получение большого количества
клеток для биохимических или молекулярных иссле-
дований, го ферментативный метод представляется
предпочтительным.
Протокол 2.3.15 для культуры единичною мы-
шечною волокна и связанное с ним введение, приве-
денное выше, предоставлены Т. Partidge & L. Н eslop.
Muscle Cell Biology Group, MRC Clinical Sciences
Centre. Hammersmith Hospital, Du Cane Road, London
W12 CNN. Данная процедура имеет ценность, koi да
23.3. Мезенхимные клетки
449
она необходима для выделения всех сателлитных
клеток, а также важна, если необходимо избежать
контаминации немиогенными клетками. Метод вы-
деления единично! о мышечного волокна может быть
осуществлен для любой мышцы, которая может быть
выделена с содержанием большой доли неповрежден-
ных волокон, предпочтительно в виде «сухожилие
к сухожилию». В лаборатории этих сотрудников,
обычно используют мышиные мышцы: длинный раз-
гибатель пальца (extensor digilorum lougus, EDL), a
также пяточную и переднюю большеберцовую (tibialis
anterior, ТА) мышцы.
ПРОТОКОЛ 23.15. Культура отдельных
мышечных волокон скелетных мышц
Схема
Отдельные миофибриллы высвобождаются раз-
мельчением цельной скелетной мышцы, обрабо-
танной коллагеназой, после культивирования на
Матрш еле.
Материалы
Стерильные:
• Malrigel™ (В-D Biosciences) 1 мг/мл в DMEM
• Среда Игла модифицированная но Дюльбекко
(DMEM, GIBCO, Invitrogen)
• Ьмлюгамин, 200 мМ (Sigma)
• Рас 1 вор пенициллина, 104 U/мл, и стрептомини-
на 10 мг/мл в 0.9% NaCI (Sigma)
• Экстракт куриного эмбриона (MP Bioinedicals)
• Лошадиная сыворотка (Invitrogen)
• Фетальная сыворотка теленка (FBS, PAA Labo-
ratories)
• Посевная среда: DMEM плюс лошадиная сыво-
ротка 10%. экстракт куриного эмбриона 0,5%,
Ь-|ЛЮтамин 4 мМ. пенициллин, 100 U/мл, стреп-
томицин 100 mki/мл
• Пролнфе рацио иная среда. DMEM плюс 20%
FBS, 10% лошадиная сыворотка, экстракт кури-
ного эмбриона 1%, Е-1лютамин 4 мМ, пеницил-
лин, 100 U /мл, стрептомицин 100 mki мл
• Колла! еназа тип I (Sigma)
• Чашки Петри, 9 см
• Модифицированные пастеровские пипетки: пас-
теровские иииеткн отрезаются алмазным стекло-
резом так. чтобы получились срезы различных
размеров, затем следует оплавить на Ot не, чтобы
неровные края не повредили миофибриллы
• Многолуночные планшеты, 24 лунки, обра-
ботанные, 1м!,мл Malrigel™ (Primaria™ В-D
Biosciences) в DMEM и инкубированные при
37 °C в течение 30-60 мин до формирования геля
Malrigel™ (В-D Biosciences).
Нестерильные:
• Алмазный стеклорез
• Водяная баня-шейкер при 35 °C
• Трансиллюминационный препаровальный сте-
рео микроскоп FBS (PAA Laboratories)
Протокол
1. Иссеките мышцу немедленно после забоя живот-
ного. стараясь манипулировать с мышцей, исполь-
зуя сухожилия и не повреждая миоволокна.
2. Поместите мышцы в 0,2% (w , v) колла!еназу
гии I в DMEM инкубируйте в водяной бане-
шейкере нри 35 °C в течение 60—90 мин. Для |
мышц большого размера требуется, как правило,
более длительное время обработки, длинная
мышца-ра31 ибатель пальца (extensor digilorum
lougus, EDL), выделенная из мыши 6—8-недель
требуется 60 мин.
3. Приготовьте чашки Петри для выделения мио-
фибрилл: промойте чашки сывороткой лошади
для предупреждения прилипания миофибрилл
к поверхности чашки и добавьте 20 мл DMEM.
4. После расщепления коллагеназой перенесите
мышцу в чашку Петри, содержащую DMEM
5. С использованием грансиллюминационного мик-
роскопа выделите отдельное мышечное волокно
ири помощи модифицированной пастеровской
пипетки. Пипетки также следует смочить 10%-й
лошадиной сывороткой в DMEM для предупреж-
дения прилипания миофибрилл к стеклу.
6. Как только мышечные волокна выделены, диа-
метр мышцы уменьшается и Следует использо-
вать пастеровскую шшетку с постепенно умень-
шающимися размерами отверстий.
7. Как только будут выделены 20—30 миофибрилл,
мышечную массу нужно перенести в свободную
чашку Петри и далее выделять волокна, пока
не будет* * диссоциировано достаточное их коли-
чество.
8. Для отщепления волокон, находящихся в серд-
цевине мышцы большего размера, может потре-
боваться повторный этап обработки; после того,
как диссоциировали поверхностные волокна,
верните оставшуюся мышечную массу в коллла-
геназу для дальиейшейобработки.
9. Поместите миофнбриллы в планшеты для куль
гуры тканей, предварительно обработанные |
Malrigel (Primaria™).
а) Поместите отдельные мышечные волокна в
центре лунки и позвольте им прилипнуть к
Матрнгелю. Важно убедиться в чистоте под-
готовительно! о этапа, важно посеять только
неповрежденные волокна, без участков т-
перконтрактур, которые наблюдаются при
«агрязнениях адгеренными клетками, часто
ассоциированными с фра! ментами микро-
сосудов.
б) Медленно добавьте в ячейку посевную среду,
стараясь не потревожить волокна.
10 Поместите планшеты в инкубатор при 37 °C и 5%
СО».
450
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
Пролиферация:
Сателлитные клетки начинают мшрировать с ро-
дительской миофпбриллы через 12—24 ч культиви-
рования. Через 3—4 дня каждое мышечное волокно
будет окружено примерно 50—300 клетками, точное
число клеток зависит от разных факторов, включая
вид мышцы, из которых получают миофибриллы
[Rosenblatt et al., 1996] и возраст мыши-донора
[Bockhold el al., 1998J
11. Koi да из миофибриллы мигрирует достаточное
количество клеток, удалите ее из культуры при
помощи пастеровской пипетки, вытянутой в
пламени до очень тонкого конца.
12. Продолжайте культивировать оставшиеся клетки
в той Же лунке.
13. Если требуется, проведите субкультивирование
(см. протокол 13.2) и посейте в иролиферацион-
ную среду.
Дифференцировка. Пролиферирующие миогенные
к легки могут быть индуцированы к дифференцировке
до миотрубочек путем снижения содержания лошади-
ной сыворотки в среде DMEM до 5%.
Миогенность клеток, мигрирующих из мышечных
волокон, может быть исследована методом иммунно! о
окрашивания на десмин — мышцеспецифичный белок
промежуточных филаментов. По нашим данным, все
клетки, мигрирующие из 98—99% единичных мышеч-
ных волокон, экспрессируют десмин
Единичные мышечные волокна moivt быть при-
(Отовлены из мышц трансгенных мышей Н-2К1,-
1чА58для получения миогенных клеток, способных
к многократным циклам деления in vitro [Morgan el
al., 1994J. Трансгенные мыши H-2Kh-tsA58 содержа!
температурно-чувствительный мутант tsA58 большого
Т-антигена обезьяньего вируса 40 (SV40) под контро-
лем индуцируемого промотора (Н-2КЬ) [Jatetal., 1991].
Белок isА58 яв.>1яется активным при 33 °C, транскрип-
ция может быть стимулирована добавлением мышиного
у-интерферона. Миогенные клетки, полученные из эт их
мышей, пролиферируют в присутствии у-интерферона
(20 Ед/мл) при 33 °C. При включении по достижении
температуры 37—39 °C в отсутствии у-интерферона как
в культуре, так и при транс плантации in vivo, они диф-
ференцируются с образованием мышечных волокон, в
быстром и синхронном порядке.
23.3.4. Хрящ
Протокол 23.16 для культивирования клеток из сустав-
ного хряща был предоставлен Francois Lemare, Sophie
Thenet, and Sylvie Demignot of Laboratoire de Pharma-
cologie Cellulairede L’Ecole Pratique des Haute.s Eludes.
Centre de Recherches Biomredicales des Cordeliers, 15 rue
de L’Ecole deMedecine, 75006 Paris, France
Хондроциты являются высокоспециализирован-
ными клетками мезенхимальной) происхождения.
которые ответственны за синтез, поддержание и де-
(радацию хрящевою матрикса. Большое количество
исследований в области ревматологии сосредоточены
на понимании механизмов, которые индуцируют ме-
таболические изменения в суставных хондроцитах
при остеоартрозе и ревматоидном артрите. Суставные
хондроциты в культуре являются очень полезным
инструментом, но при культивировании в монослое
они медленно делятся, становятся фибробласто-по-
добными и утрачивают свои биохимические характе-
ристики [Benya et al., 1977; von der Mark, 1986]. Уже
при первом пассаже отмечается частичный сдвш от
синтеза коллагена II типа к коллагену I и III типов и
от агрекана к низкомолекулярным протеоишканам.
Одновременно с фенотипическими изменениями
меняется метаболический ответ на пнтерлейкин-1[3
в процессе субкультивпрования [Blanco el al., 1995;
Lemare et al., 1998].
Среди разнообразных методов, используемых
для поддержания фенотипа хондроцитов [см. обзор
Adolphe & Benya, 1992], наиболее многообещающим
представляется метод культивирования на алы инат-
ных бусинах, поскольку показано, что эта система
культивирования приводит к образованию матрикса,
подобного тому, который формируется в естественном
суставном хряще [Ндиче1тапп et al., 1996; Petit et al.,
1996]. Данная система поддерживает экспрессию диф-
ференцированного фенотипа и также способна восста-
навливать его в дедифференцированных хондроцитах
[Bonaventure etal., 1994; Leinare el al., 1998]. Еще одним
преимуществом над друi ими трехмерными методами
является ле! кость извлечения клеток по завершении
культивирования, что iio3BOjineT проводить изучение
экспрессии белков и генов [Lemare etal., 1998].
ПРОТОКОЛ 23.16. Хондроциты
на альгинатных бусинах
Схема
Культивирование на алы инатных бусинах основано
на структурировании суспензии хондроцитов в раст-
воре алы ината в хлористом кальции.
Материалы
Стерильные:
• Для ана гомирования сустава п извлечения хряща,
а также ферментативною расщепления хряща
используется среда Д;1Я иссечения хряща (СDM);
среда Хэма F12 (Invilrogen), с добавлением нетил-
миццна (20 mki мл), ванкомицина (10 mki мл), и
цефтазидима (30 мкг мл) (все Sigma)
• Ростовая среда’ DMEM (ыюкоза, 1 i л)/среда
Хэма F12 (1:1, v 'v), гентамицин. 4 мкг/мл, с до-
бавлением 10% FCS.
Примечание. Следует сравнить различные партии
сыворотки для оценки их способности поддерживать
23.3. Мезенхимные клетки
451
рост хондроцитов, так же как и выражение диффе-
ренцированного фенотипа (оцениваемой, наиример,
методом иммуномечения коллагена II типа). Koi да
отобрана одна партия, следует закупить ее в таком
объеме, чтобы несколько месяцев не изменять пар-
тию сыворотки.
• Растворы фермента для расщепления хряща.
а) Трипсин, О 05%, панкреатический свиной
(Sigma) среде Хэма F12
б) Коллагеназа, 0,3%, тип 1 (Worthington, CLS1)
в среде Хэма F12
в) Коллагеназа 0,06% в среде Хэма F12 10%
FCS
Все растворы стерилизовать фильтрацией
через фильтры с диаметром кор 0.22 мкм.
Примечание. Новые партии коллагеназы должны
быть проверены на эффективность расщепления
хряща ио сравнению с предыдущей партией.
• Раствор трипсин EDTA (для субкультивирова-
ния): 0,1% vv/v
• Свиной панкреатический трипсин в PBSA с 5 мМ
(0.02% w/v) EDTA
• Раствор алыииата натрия: 1,25% w/v алыината
натрия (Fluka) в 20 мМ HEPES. 0,15 М. NaCl
Подготовка:
а) Используя мешалку с подогревом, сначала
растворите HEPES в 0.15 М. NaCl и доведите
температуру до -60 °C.
б) Добавьте алы инат натрия и продолжайт е раз-
мешивать до полного растворения (> 2 ч).
и) Тщательно доведите pH раствора до 7,4 до-
бавлением 1 MNaOH; не превышайте pH 7,4,
так как добавление кислоты (НС L или Н ,SO,)
кончается необратимой преципитацией.
1) Разлейте раствор на аликвоты, стерилизуйте
автоклавированием ири 121° С в течение
10 мин.
Альтернативная подготовка: Быстро растворите
алыинат натрия в HEPES/NaCL (-10 мин) в мик-
роволновой иечи, тщательно следя за тем, чтобы не
произошло карамелизации
• Раствор желатина: CaCl,, 102 tn М, Н ЕР ES, 5 м М,
PH 7,4
• Раствор для солюбилизации: EDTA, 50 мМ,
HEPES. 10 мМ, pH 7.4
• Стерильный вкладыш для мш нитной мешалки
Протокол
Анатомирование:
1. Приготовьте культуры из коленного, плечевого
п бедренного суставов. Эмбрионы или молодые
доноры предпочтительнее, чем взрослые, по-
скольку они обеспечивают иолучение больших
количеств клеток и дольше не стареют. Идеально
подходят месячные кролики Fauve Bourgogne
или новозеландские. Однако бедренный сустав,
полученный при хируpiической резекции взрос- I
лого человека, также подходит как источник |
хондроцитов.
2. Тщательно промойте кусочки тканей в CDM
перед анатомированием. Диссоциация тканей
должна быть начата немедленно. Удалите кожу,
мышцы и сухожилия сустава. Аккуратно отбери-
те фра1 менты хряща от частей сустава, которые
свободны от соединительной ткани.
Диссоциация:
Чтобы предотвратить высыхание хряща, выполни-
те все этапы диссоциации в 10-см чашке Петри, не
обработанной ТС, содержащей CDM. Количества
растворов фермента, указанные в остальной части
протокола, подходят для плечелопаточного и тазо-
бедренного суставов одного кролика, но они должны
быть адаптированы к тому количеству хряща, кото-
рое должно быть выделено.
3. Используя крескюбразные скальпели (см. про- '
токол 12.4), измельчите пластинки хряща на |
кусочки объемом 1-мм3.
4. Перенесит е фра1 менты хряща в 30-мл илоскодон- I
ный 4ыакон.
5. Добавьте 10 мл 0,05% раствора трипсина, фра1 -
менты с умеренным перемешиванием на ма1 нит- I
ной мешалке в течение 25 мин в запечатанном
флаконе при комнатной температуре.
6. Удалите раствор трипсина после оседания фра1
ментов.
7. Добавьте 10 мл 0,3% раствора коллагеназы и инку- ।
бируйте культуру с умеренным перемешиванием I
на ма1 нитной мешалке в течение 30 мин в запеча-
танном флаконе ири комнатной температуре. I
8. Удалите раствор коллагеназы пос че осадка фр;и -
ментов.
9. Добавьте 10 мл 0,06% раствора коллагеназы.
10. Перенесите суспензию в 100-мм чашку для
культивирования бактерий. Ополосните флакон I
дополнительно 10 мл свежего 0,6%-го раствора
коллагеназы, перенесите раствор в чашку Петри
и инкубируйте ири 37°С в инкубаторе с 5% СО2.
11. Перенесите суспензию клеток в 50-мл центри- ।
фужную пробирку и несколько секунд переме-
шивайте на вортекс-миксере.
12. Удалите остаточный материал, оставлен ный иос- I
ле ферментативной обработки, процеживанием
через 70-мкм нейлоновое клеточное сито (В-D I
Biosciences, см. рис. 12.10).
13. Центрифугируйте при 400 g в течение 10 мин.
14. Ресусиендируйте клеточный осадок в 20 мл |
С DM. и подсчитайте клетки ири помощи гемо- '
цитометра.
15. Центрифутируйте клетки ири 400 g в течение |
10 мин
Захват
16. Ресусиендируйте клеточный осадок в 1 мл рас-
твора алы ината натрия, затем прогрессирующе
452
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
разведите суспензию в большем количестве рас-
твора алы ина га натрия, пока не будет достиг нута
клеточная плотность 2х10ькл./мл. Это прогрес-
сивное растворение негкгходимо, чтобы получить
гомогенную суспензию клеток в альг инате
17. Быстро выпустите суспензию клеток в каплях
через шлу 21G в желатинизирующий раствор
при умеренной скорости перемешивания на маг-
нитной мешалке, позвольте альг инату полимери-
зоваться в течение 10 мин. чтобы сформировать
бусины.
18. Промойте бусины Зраза в 5 объемах NaCI,
0,15 М.
19. Разлейте бусины ио 5мл (1x10'клеток), в 75-
см'флаконы, содержащие 20 мл ростовой среды.
20. Инцубнруйте культуру в 37 °C в увлажненной
атмосфере 5% СО,и 95“о воздуха.
Восстановление:
21. Удалите среду.
22. Добавьте 2 объема солюбилизирующего раствора.
23. Инкубируйте культуру 15 мин в 37 °C.
24. Центрифуг ируйте клетки нри 400 g в течение
10 мин.
25. Ресусиендируйте клеточный осадок в ростовой
среде, содержащей 0,06“« коллагеназы.
26. Инкубируйте клетки в течение 30 мии при 37 °C
в увлажненной атмосфере 5% СО2 и 95% воз-
духа.
27. Центрифугируйте клетки при 400 g в течение
10 мин.
28. Ресусиендируйте клеточный осадок в бессыво-
роточной среде Хэма F12/DM ЕМ и подсчитайте
число клеток в гемоцитометре.
29. Центрифуг ируйте клетки при 400 g в течение
10 мин.
30. Повторите шаги 28 и 29, без подсчета клеток.
Анализ фенотипа хондроцитов
Коллаг ен II типа представляет собой 85—90% об-
щего синтеза коллагена хондроцитами в первичной
культуре. Коллаген II типа является высокосиеци-
фичным для хондроцитов и рассматривается как их
основной маркер дифференцировки. Экспрессия кол-
лагена II типа может быть проанализирована методом
непрямой иммунофлюоресценции с использованием
специфических антител, которые, однако, должны
быть тщательно проверены, чтобы убедиться, что не
имеется перекрестного реагирования с коллагеном
I типа, который экспрессируется дедифференциро-
ванными клетками. Иммуноцитохимические исследо-
вания экспрессии коллагена в культуре хондроцитов
на альгинатных бусинах делают необходимым рассе-
чение бусин, как это описано в Lemare el al. 11998]
Для более гочног о анализа фенотипа коллаг ена при-
меняется SDS-PAGE и двумерное CNBr-ггеггтггдное
картирование очищенного коллагена после включения
[*Н]-пролина [Benya, 1981]. Относительно основных
типов коллагена, SDS-PAGE анализ может выявить
присутствие коллагена III типа или наличие а2(1)
цепи коллагена I. Тем не менее этот метод не может
распознать ос 1-цепи коллагена I и IIтипов (т.е. не
может г^гужить для распознавания и оценки колла-
гена I и II). поэтому для подтверждения экспрессии
коллагена II типа необходимо проведение двумерного
CNBr-пептидного картирования. Экспрессия этих
г енетически различных типов коллаг ена может также
быть проанализирована на транскрипционном уровне
Нозерн-блоттингом с использованием общеупотреби-
тельных методов переноса и гибридизации [Lemare et
al., 1998] или при помощи real-lime PCR [Murphy &
Polak, 20041.
Протеогликаны Окрашивание опиионовым синим
при кислых pH широко используется как индикатор
присутствия сульфатированного агрекана [Lemare et
al., 1998]. Так же как и при иммуноцитохимическом
исследовании, это окрашивание требует рассечения
бусин. Более точный анализ различных типов синте-
зированных протеогликанов может быть осуществлен
после внедрения 3,SO4 [Verbruggen el al., 1990]. Как и в
случае генов коллаг ена, анализ экспрессии генов агре-
кана и связанных с ним белков может быть осуществлен
Нозерн-блоттингом [Lemare el al., 1998] или real-time
PCR [Murphy & Polak, 2004].
Вариации и применение. Некоторые исследования
1юка.цыи, что культура хондроцитов на алы инатных
бусинах представляет собой привлекательную альтер-
нативную модель хондроцитов [Grandolfo el al.. 1993.
Hauselmaiiii el al., 1994,1996; Petit el al., 1996]. Главным
преимуществом этого метода перед друг ими трехмер-
ными методами является то, что клетки мог ут лег ко
быть извлечены после культивирования, что позволяет
производить исследования экспрессии белков и генов
[Lemare el al., 1998].
Количество доступных клеток часто становится
лимитирующим фак гором для изучения метаболизма
хондроцитов, суставной хрящ трудно получить в боль-
ших количествах, и он имеет низкое содержание клеток.
В этом случае количество доступных хондроцитов
может быть увеличено иутем первичного культиви-
рования клеток в монослое (2 пассажа) и последую-
щего восстановления дифференцированных свойств
хондроцитов иутем культивирования на альгинатных
бусинах в течение 2 недель [Bonaventure el al. 1994.
Lemare el al., 1998]. Одновременно с восстановлением
фенотипа метаболический ответ на интерлейкин- 1р в
этих клетках восстанавливается на количественном
уровне аналогично тому, который имеется в первич-
ной монослойной культуре [Lemare et al., 1998]. Это
делает культуру на алы инатных бусинах релевантной
моделью для изучения биолог ии хондроцитов. Нако-
нец, каркас, заполненный хондроцитами, введенный в
алы инатный гель, может быть предложен для тканевой
инженерии и трансплантации [Cancedda el al., 2003;
Marijnissen el al., 2002; Sall el al., 2005].
23.3. Мезенхимные клетки
453
23.3.5. Кость
Хотя с костью трудно механически манипулировать,
тонкие срезы, обработанные EDTA и расщепленные
коллагеназой [Bard el al.,1972J, дают начало культуре
остеобластов, которые обладают некоторыми функцио-
нальными характеристиками данной ткани. Для того
чтобы предотвратить избыточный рост фибробластов
без инг ибирования остеобластов, обычно используется
антисыворотка против коллагена [Dtiksin et al., 1975J.
Из остеосаркомы получены постоянные клеточные
линии [Smith et al., 1976; Weichselbaum et al., 1976), но
из нормальных остеобластов постоянных клеточных
линий получить пока не удалось. Мезенхимальные
стволовые клетки (см. разд. 23.7.2) могут быть куль-
тивированы и индуцированы с формированием осте-
оцитов. пригодных для тканевой инженерии [Lennon
& Caplan, 2005; Hofmann et al., 2005J
Протокол 23.17 для культуры костных клеток пре-
доставлен Edith Schwartz, Departments of Orthopedic
Surgery and Physiology, Tufts University Schoo] of Medi-
cine, 136 Harrison Avenue, Boston, MA 02111.
Культура костных клеток страдает от того, что ио
присущей этим клеткам природе манипуляции с этими
тканями затруднены. Тем не менее общепринятая тех-
ника первичного эксплантата или расщепления в колла-
геназе и трипсине приводит к высвобождению клеток,
которые могут быть пересеяны обычным способом.
ПРОТОКОЛ 23.17. Остеобласты
Схема
В качестве эксплантата культуры используйте фраг -
менты ткани, достаточно маленькие для того, чтобы
они могли прикрепиться к стенке культурального
сосуда в минимальном количестве среды (см. про-
токол 12.4). Прикрепившиеся эксплантаты затем
заливаются средой, контролируется рост культу-
ры. Для дизагрегированной клеточной культуры
используются трабекулы кости, рассеченные на
2—5-мм части и расщепленные в растворе ферментов.
Суспендированные клетки переносятся во флаконы
со средой 12.
Материалы
Стерильные:
• СредаХэма F12 с 12% FBS.2 3 мМ Mg2* *. 100 U/мл
пенициллина, н 100 мкг/мл стрептомицина SO,
• Раствор трипсина, который обычно используют
для пассажа клеток: растворить 125 мг трипсина
(Sigma, тип XI) в 50 мл раствора Тиродабез Са2*и
Mg’*. Доведите конечное значение pH раствора
до 7.0 и простерилизуйте фильтрацией. Разлейте
аликвоты по 5 и 10 мл в пробирки Ругех и храните
ггри -20 °C
• Расщепляющий раствор для выделения остео-
бластов
• Раствор А; 8,0 г NaCl, 0,2 г KCL, 0,05 г NaH 2РО, |
Н,О в 100 мл UPW
• Раствор В (Раствор коллагеназа трипсин): рас-
творите 137 мг коллагеназы (тип I, Worthington
Biochemicals) u 50 мг трипсина (Sigma, тип III)
в 10 мл раствора А. Доведите pH объединенного
раствора до 7,2, и затем доведите UPW объем до
100 мл. Стерилизуйте фильтрацией и разлейте по ।
10-мл аликвотам, храните при —20 С
• Чашки Петри, 9 см
• Флаконы для культуры 25 или 75 см2
* Скальпели
• Пинцеты
Протокол А: Культивирование эксплантата
1. Получите экземпляры кости из операционной.
2. Ополосните ткань несколько раз при комнатной
температуре стерильным физиологическим рас- I
гвором.
3. Если кость не может использоваться немедленно, .
залейте образец стерильной средой Хэма F12,
содержащей 12% FBS. пенициллин, и сульфат
стрецтомици на. Кость может храниться в течение I
ночи при 4 °C.
4. На следующее утро промойте ткань в растворе, I
содержащем пенициллин (100 U мл) и сульфат |
стрецтомици на. (100 мкг мл).
5. Поместите кость в чашку Петри и с использова- I
нием скальпеля и иринцета извлеките трабекулы
и помести те их в новую чашку Петри.
6. Добавьте 10 мл раствораТирода, ч гобы он покрыл
выделенные трабекулы. Промойте трабекулы не-
сколько раз раствором Ти рода до удаления крови |
п жировых клеток.
7. Предварительно приготовьте 25-см" флакон, пу-
тем предварительного инкубирования его с 2 мл
полной среды в течение 20 мин югя достижения
равновесия среды с газовой фазой. Доведите pH
ио мере необходимости при помощи СО,, 4.5%
NaHCOjunn HCI.
8. Порежьте трабекулы на фрагменты 1—Змм.
9. Удалите преинкубационнуго среду из флакона и |
добавьте 2,5 мл свежей среды Хэма F12.
10. Перенесите 25-40 фрагментов трабекул во |
флакон.
11. Держа флакон в вертикальном положении,
скользящими движениями переместите частички
эксплантата ио основанию флакона при помощи
инокуляционной петли и распределите части
жсцлантата равномерно.
12. Оставьте флакон в вертикальном положении в |
течение 15 мин в 37 "С.
13. Медленно верните флакон в нормальное i оризон - I
гальное положение. Части эксплантата останутся
прикрепленными к основанию флакона.
14. Оставьте флакон в горизонтальном положении
при 37 С на 5—7 дней После этого периода
проверьте рост культуры гг замените среду во |
454
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
флаконе на свежую. Для того чтобы предотвра-
тить открепление частей эксплантата, медленно
поднимите флакон в вертикальное положение
перед переносом ею из инкубатора в ламинар или
к микроскопу.
15. Чтобы поддерживать культуры, заменяйте среду
дважды в неделю.
16. Когда достш нут конфлюэнтный рост, удалите
части эксплантата, триисинизируйте клеточный
слой, выделите клетки центрифу! приданием и
отберите их во флаконы или лунки.
Протокол В: Монослойные культуры
из дизаггрегированных клеток
1. Промойте образцы костных трабекул многократ-
но в растворе Тирода для удаления клеток жира
и крови. Трабекулы извлекаются при помощи
скальпеля и пинцета в стерильных условиях.
2. После максимально возможною сбора костного
материала отмойте остающуюся кровь и жировые
клетки ополаскиванием раствором Тирода три
раза и разрежьте на фра! менты 2—5 мм.
3. Промойте фра! менты трабекул средой F12. со-
держащей FBS
4. Разместите части кости в маленьком стерильном
флаконе с ма! нитным вкладышем для мешалки
и добавьте 4 мл расщепляюще! о раствора (Это
количество должно покрыть образцы кости.)
5. Перемешивайте раствор, содержащий фра! мен-
ты кости при комнатной температуре в течение
45 мин.
6. Удалите суспензию высвобожденных клеток,
потому что в полученной суспензии, наиболее
вероятно, содержатся фибробласты.
7 Вновь добавьте 4 мл раствора ферментов для рас-
щепления фра! менгов кости, и перемешивайте
смесь ири комнатной температуре 30 мин.
8. Соберите расщепляющий фра1ментный раствор,
и центрифу! ируйте в течение 2 мин при 580 g при
комнатной температуре.
9. После удаления супернатанта суспендируйте
клетки в 4 мл среда Хэма F12 с 20% FBS, и под-
считайте число клеток.
10. Центрифу! ируйте суспензию при 580 g в течение
10 мин, ресусиендируйте клетки в 4 мл полной
среды. Эта суспензия станет инокулятом.
1 (.Предварительно инкубируйте 75-см2флаконы в
течение 20 мин с 8 мл полной среды F12 до рав-
новесия с 1азовой фазой.
12. Удалить преинкубационную среду и добавьте
2 мл среды F12.
13. Добавьте 4 мл среды, содержащей суспензию
клеток. Инокулят должен содержать 6000—
10 000 клеток на 1 см2 поверхности.
14. Наконец, добавьте еще 6 мл среды Хэма F12.
чтобы получить полный объем 12 мл.
15. Тем временем добавьте дополнительно 4 мл рас-
щепляющею раствора к остающимся фра!мен-
там кости и повторно обрабатывайте в течение
30 мин. Высвободившиеся клетки соберите, если
необходимо, повторите этот inai еще несколько
рал. Для большою количества костной ткани,
период ферментативной обработки может быт ь
увеличен до 1—3 ч. Клеточный индекс подсчи-
тывается после каждого периода обработки.
Высвобожденные клетки поместите в различные
флаконы
Субкультивирование:
1. Удалите части эксплантата.
2. Удалите среду, и промыть слой клеток D-PBSA,
0,2 мл/см2.
3. Добавьте трипсин во флакон, 0,1 мл/см’, инку-
бируйте при 37 °C. пока клетки не ошарятся и не
отделятся друт от дру! а. Отделение клетки конт-
ролируйте иод микроскопом. Обычно достаточно
10 мин инкубации.
4. Перенесите высвобожденные клетки в центри-
фужную пробирку с равным объемом среды Хэма
F12c20e; FBS.
5. Центрифу! ируйте клетки ири 600 g в течение
6. Удалите супернатант, и ресусиендируйте клетки
в полной среде осторожным пмиетированием.
7. Отделите одну аликвоту суспензии для опреде-
ления клеточной концентрации и дручую для
определения DNA (см. протокол 21.3).
8. Поместите остаювщеся клетки во флаконы для
культуры пли лунки, которые предварительно
были обработаны для установления равнове-
сия с газовой фазой. Клетки должны повторно
прикрепиться к стенке емкости для культуры в
течение 24 ч.
23.3.6. Эндотелии
К эндотелиальной клеточной культуре проявляется
большой интерес, поскольку потенциальное участие
эндотелиальных клеток в сосудистых заболеваниях,
восстановлении кровеносных сосудов и ангиоге-
незе в опухолях весьма значительно. Folkman and
Haudenschild [1980J описали развитие трехмерной
структуры, включающей в себя капиллярную сосу-
дистую сеть, полученную из чистой эндотелиальной
линии in vitro. Факторы роста, включая фактор ан! ио-
генеза, выделенные из культуры клеток Walker 256 in
vitro, шрают важную роль в поддержании клеточной
пролиферации и ее выживании, что позволяет фор-
мироваться вторичным структурам. Эндотедиальные
культуры являются хорошей моделью для исследо-
вания контактною ишибирования и плотностною
шраничения роста культуры, поскольку клеточная
пролиферация сильно hhi ибпруется ири достижении
конфлюэнтною роста [Haudenschild et al., 1976J. Эндо-
телиальные клеточные культуры также коммерчески
23.3. Мезенхимные клетки
455
доступны (см. Приложение II). Дальнейшее введение
и протокол 2.3.18 для культуры эндотелиальных клеток
крупных сосудов были предоставлены Dr. Charlotte
Lawson, Royal Veterinary College, Royal College Street,
London NW1 OUT, United Kingdom.
Внутренняя поверхность всех кровеносных сосудов
состоит из одного слоя эндотелиальных клеток. Эндо-
телий обеспечивает наличие i ладкой антпкоап'лянт-
ной поверхности, участвует в сократительной функции
кровеносных сосудов и действует как проницаемый
барьер, позволяющий осуществляться транспорту
питательных веществ и [азов, а также влияет на мш-
рацию иммунных клеток из крови. Эндотелиальные
клетки MotyT быть выделены из крупных кровеносных
сосудов, включая человеческую пупочную вену [Jaffe
et aL. 1973] и бычью [Booyse et al.. 1975] или свиную
[Braver}' et al., 1995] аорту. Микрососудистые эндоте-
лиальные клетки moi ут быть выделены из адренало-
вых желез быка, [Folkman et al., 1979], мо.иа крысы
[Bowman et al., 1981], человеческой кожи [Davison el
aL, 1983], человеческой жировой ткани [Kern el al.,
1983], а также из человеческого [McDouall el al., 1996]
и мышиного [Marelli-Berg et al., 2000. Lidinglon el al..
2002] сердца.
ПРОТОКОЛ 23.18. Выделение
и культивирование клеток сосудистого
эндотелия
Схема
Инкубирование просвета кровеносною сосуда в
растворе коллагеназы приводит к высвобождению
эндотелиальных клеток, которые мО|утбыть культи-
вированы в течение нескольких периодов удвоения
популяции на субстрате, покрытом желатином в
подходящей ростовой среде. Для отделения эндо-
телиальных клеток от диза! rpei пропавших частиц
сердечной мышцы используется имму немагнитное
разделение (см. разд. 15.3.2; рис. 15.6,15.7).
А. Выделение эндотелиальных клеток
из пупочной вены человека (HUVECs)
[Адаптированный метод Jaffe el al., 19731
Общие материалы для всех протоколов
выделения эндотелиоцитов
Стерильные или асептически приготовленные:
• D-PBSA на льду
• Сбалансированный солевой раствор Хэнкса
(HBSS)
• HBSS PSG содержащий 300 U Мл пенициллина
• 300 mki/мя стрептомицина (Sigma) и 50 мкг/мл
гейтам пци на (Invitrogen)
• Трипсин,500 mki мл. EDTA. 5 мМ (0.2%) (Sigma
кат. номер. Т4174)
• Культуральные флаконы, 25 см-, покрытые 0,5%
желатина
а) Развести 2% раствор желатина типа В, полу-
ченного из кожи быка (Sigma, G1393) в 4 раза
в D-PBSA
б) Инкубировать во флаконе в течение 20 мин
при 37 °C |
в) Удалить желатин непосредственно перед до-
бавлением клеток
* Скальпель и лезвия No. 22
• И|лы
* Шприцы, 20 мл
• Зубчатый зажим (типа «крокодил»)
* Кровоостанавливающий зажим
• Пинцеты
* острые ножницы
Нестерильные:
• Метанол. 70%
• Бумажные салфетки
* Алюминиевая фольга
• Ад|езивная пленка (Clingfilm пли Saran Wrap)
* Доска для выделки кожи
* Крепкая нить
Материалы для HUVECs
• Пупочный канатик человека в HBSS/PSG
• Среда роста для HI’VEC: среда Ml99 с стыями I
Хэнкса, 2 мМ L-i лютам ина, 25 мМ HEPES. с
добавлением 20% (FBS), 150 ед мл пенициллин/ I
стрептомицина и добавки для роста эндотелиаль- I
пых клеток ( ECGS) из моз|а быка (Roche кат. но-
мер 1033484,75 мг; испольвуется в концентрации |
20 мкг/мл с гепарином 50 mki мл или Sigma кат. ।
номер Е2759.15 mi : используется в концентрации I
30 mki/мл с гепарином 10 мкг/мл)
• Коллагеназа Н: из Clostridium hislolyticum (Roche
кат. номер 1074059; 0,5 мг/мл вереде Ml99. Сте-
рилизация фильтрацией)...............25 мл
• Сыворотка новорожденного теленка (NBS), хо-
лодная ..............................5 мл
• Адан горы Люэра (кат. номер 700 180 700).2
Протокол
Выделение эндотелиальных клеток:
1. Покройте доску для обработки кожи алюминие-
вой фольгой.
2. Поместите бумажную салфетку на фолы у и про-
питай те 70% метанолом.
3. Продавите пупочный канатик по всей длине и
удалите любые остатки крови.
4. Отрежьте 2 см или немного больше от одного
конца канатика, включая любые следы от за-
жима.
5. Введите адаптор Люэра Insert Luer adaptor по
всей длине вены (рис. 23.1).
6. Приколите к разделочной доске иголками кана-
тик рядом с веной, тщательно следя за тем. чтобы
не проколоть сквозь просвет вены
7 Используя скальпель и пинцет, отделите артерии
на длину -2 см.
456
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
Рис. 23.1. Вид кровеносных сосудов в пупочном канатике
человека. Черными с грелками указаны луночные артерии
Белыми стрелками указаны пупочные вены с введенными
адэлторами Люэра
8. Закрепите переходник нитью, используя два
очень прочно затянутых узла.
9. Закроите другой конец канатика при помощи
зажима, влейте в него около 25 мл D-PBSA при
помощи 20-мл ширпца присоединенного к пере-
ходнику. Проверьте наличие любых поврежде-
ний на вене, раздувшейся от давления D-PBSA,
зубчатыми зажимами зафиксируйте все отверс-
тия, не пережимая при .ггом вену.
10. Вылейте из канатика D-PBSA в емкость для от-
ходов.
11. Отрежьте 2 см от другого конца канатика, введите
и зафиксируйте адаптер как в шаге 8.
12. Иснользуя другой 20-мл шприц, влейте при-
мерно 25 мл коллагеназы в канатик, пока он не
раздуется
13. Заверните канатик в кленку Clingfilm, смоченную
метанолом и оставьте на 8 мин при 37 °C.
14. Выдавите колагеназу из канатика и отберите при
помощи шприца.
15. Вылейте коллагеназу из шприцов в пробирку,
содержащую 5 мл NCS.
16. Вставьте шприц с одного конца канатика и, ис-
пользуя другой шприц, влейте в канатик 25 мл
D-PBSA.
17 Сжимайте или постукивайте канатик ио всей
длине несколько секунд, затем отберите D-PBSA
обратно в шприцы.
18. Добавьте содержимое шприцов в пробирку из
rnaia 15.
19. Центрифут ируйте пробирку 10 min. 210 g, 4 °C.
20 Ресусиендируйте осадок в 5 мл ростовой среды
HUVEC
21. Удалите избыток желатина из флакона и добавь-
те клетки, полученные на шаге 20.
22. На следующий день удалите среду из флакона.
23. Дважды промойте в D-PBSA и замените на све-
жую среду HUVEC.
Ведение культуры:
24. Удаляйте иолавину среды и заменяйте насвежую
три раза в неделю.
25. Пересевайте, разводя клетки в отношении 1:2,
используя смесь трипсин ЭДТА на флаконы,
обработанные желатином примерно один раз в
неделю.
26. Не используйте дольше шестого пассажа.
В. Выделение эндотелиальных клеток аорты
свиньи (РАЕС)
[Адаптированный метод Bravery et al., 1995]
Материалы для РАЕС
HBSS/PSGA: HBSS содержащий ЗООед./мл
пенициллин/стрептомицина, 50 mki/мл гентами-
цина, 2,5 mki мл амфотерицина В (GIBCO)
Свежевыделенная аорта свиньи (асептически
отобранная, если возможно) для транспортиров-
ки погруженная в HBSS/PSGA
• Ростовая среда РАЕС среда М199с солевыми
добавками Ханкса, 2 мМ L-глютамина, 25 мМ
HEPES, с добавками 150 ед. мл пенициллин/
стрептомицина, 50 мкг 7мл гентамицина, 2,5 mki . мл
амфотерицина В, 10°<. FBS, 10% NBBS
* Коллагеназа Н
(как в Материалах для HUVEC) _. _.5б мл
• FBS в 50-мл пробирке._ .._______.. .5 мл
Протокол
1 Покройте доску алюминиевой фольгой.
2. Положите аорту на ткань, сбрызнутую метанолом
и, завернув, промокните.
3. На доске, покрытой фольгой, удалите лишние
ткани, оставляя только ветви, но не отрезайте
слишком коротко.
4. Перевяжите ветви ниткой и пережмите зажимом
гонкий конец аорты.
5. Заполните D-PBSA зажмите сверху.
6. Закройте зубчатыми зажимами любые отверстия,
через которые происходит утечка.
7. Слейте D-PBSA.
8. Заполните аорту теплым раствором коллагена-
1Ы, перезакреиите зажимы, оберните пленкой,
сбрызнутой метанолом, инкубируйте 8 мин ири
37-С
9. Бережно массируйте аорту для разрыхления
клеток.
16. Перелейте коллагеназу из аорты в 50-мл пробир-
ку, содержащую 5 мл FBS
1 (.Заполните аорту холодным (на льду) D-PBSA,
закрепите зажимом, массируйте, добавьте к про-
бирку из шага 10, повторите лтот шаг.
23.3. Мезенхимные клетки
457
12. Центрифу। ируйте клетки при 500 g в течение
6 мин ири 4 °C.
13. Ресусиендируйте клеточный осадок в 5 мл среды,
поместите в 25-см2флакон и инкубируйте в тече-
ние ночи при 37 "С.
14. На следующий день удалите среду из флакона.
15. Дважды промойте D-PBSA и замените на свежую
среду.
Поддержание культуры
16. Трижды в неделю заменяйте среду, если клетки
образуют монослой менее 50% конфлюлнтности,
удаляйте и заменяйте только половину среды;
если монослой клеток достш ает 50—80% конф-
люэнтное™, удаляйте и заменяйте всю среду.
17. Когда клетки достшнут 80% конфлюэнтности
монослоя, пересейте, разводя клетки в отноше-
нии 1:3 с использованием трипсин, ЭДТА.
18. Не используйте долее седьмого пассажа.
С. Выделение эндотелиальных клеток
сердца мыши (МСЕС)
{Адаптированный метод Marelli-Berg et а]., 2000]
Материалы для МСЕС
• Сердцамышив HBSS/PSG(cM.протокол 23.16А),
содержащем 300 ед./мл пенициллин стрептоми-
цина и 50 mki мл гентамицина,5
• Ростовая среда для МСЕС: DMEM с 25 мМ i лю-
козы и 4 мМ L-i лютам ина, с добавками 10% FBS,
150 ед./мл пенициллина. 150 mki / мл стрептоми-
цина и добавки для роста эндотелиальных клеток
(ECGS) из мозгобыка
• Среда для неэндотелиальиых клеток. DMEM
(1000 mi, л 1люкозы), содержащая 15% FCS
• HBSS, PS. HBSS с 150ед./мл пенициллина
• 150 mki , м.| стрептомицина
• HBSS. FB: HBSS с 1% FBS
• CMF. HBSSбез Са2* и Mg2"c 150 ед. мл пеницил-
лина, 150 mki мл стрептомицина
• Трипсин/ ЭДТ А ( Sigma)
• FBS
• Колла|еназа А. из Clostridium htsiolyticum (Roche
кат. номер 103586); используемая концентрация
1 mi/мл в HBSS, свежеприготовленная и стери-
лизованная фильтрацией................10 мл
• Клеточное сито с ячейками 70 мкм (В-D Biosci-
ences)
• Чашки Петри. 9 см....................2
• Иррелевантные контрольные антитела, напри-
мер, человеческие ОКТ4 анти-СО4 (DAKO)
......................................5 мкг
• Антитела крысы против мышиных клеток
(CD105); клон MY7,' 18 (Plijrin ingeti, В-D Biosci-
ences) ...............................5 мкг
• Антитела козы против крысы на микробусинах
(Miltenyi кат. номер 130-048-501)
• Блок для разделения MidiMacs (Miltenyi) LS
MACS колонка (Miltenyi 130-042-401)
Протокол
1. Поместите сердца в чашку Петри, содержащую
примерно 5 мл HBSS PS.
2. Удалите аорту, легочную артерию и друine при- ।
латки.
3. Разрежьте сердце пополам и удалите крупные |
кровяные CiycTKii и соединительные ткани.
4. Поместите сердце в новую чашку Петри с CMF,
промойте и замените на свежую среду CM F.
5. Порежьте материал в чашке Петри с помощью |
скальпеля.
6. Промойте в CMF путем ресуиендирования и |
осаждения.
7. Поскребите и соберите ткани боковой стороной I
лезвия скальпеля и перенесите в универсаль-
ный контейнер, содержащий 10 мл подогретого I
свежеириготвленного раствора коллагеназы А в ।
концентрации 1 mi /мл. I
8. Инкубируйте в течение 30 мин при 37 С с пере-
мешиванием.
9. Добавьте CMF.
10. Дисиер! ируйте клетки, встряхивая ткани и давая
им осесть. Соберите клеточную суспензию и не- I
ренесите в свежую пробирку.
11. Повторите inai 10 несколько раз
12. Центрифу! ируйте клеточную суспензию при |
300 g в течение 8 мин.
13. Осторожно удалите супернатант из клеточного |
осадка.
14. Ресусиендируйте клеточный осадок в 5 мл трип- I
син EDTA, стараясь разрушить любые агре|аты
клеток путем uiiueTupoBaHiiH и инкубирования в I
течение 10 мин при 37 °C.
15. ДобавьтеЮ мл HBSS FB, содержащего 1% FS, к I
au.iai rpei ированным клеткам для расщепления и
профильтровать через клеточное сито с ячейками
70 мкт.
16. Промойте ткань в клеточном сите при помощи |
20 мл холодного HBSS, FB.
17. Центрифу। ируйте клетки фильтрата в течение |
8 мин при 300 g
18. Тщательно отсосите супернатант, удалите, сохра-
няя клеточный осадок.
19. Добавьте -5 mki иррелевантных антител (напри- I
мер, ОКТ4 ОКТ8) к клеточному осадку, дисиер- '
। ируйте осадок, еле!ка постукивая ш> пробирке, I
инкубируйте на льду в течение 20 мин, чтобы
блокировать Fc рецепторы.
20. Добавьте к клеточному осадку 5 mki крысиных |
анти гел к мышиному эндг>| лнну (клон MY7/18), .
встряхивая пробирку, и инкубируйте ее при 4 °C |
в течение 20 мин.
21. Добавьте 30 мл HBSS и центрифу!ируйте ири I
300 g в течение 8 мин при 4 °C.
22. Добавьте 50 мкл бусин с козьими антителами к I
иммуншлобулину крысы в 200 мл HBSS.
23. Инкубируйте в течение 15 мин при 4 °C.
458
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
24. Добавьте 30 мл HBSS, промойте и центрифуги-
руйте при 300 g в течение 8 мин при 4 С.
25. Поместите колонку MidiMacs на магнит и про-
мойте в 500 мкл HBSS 1% FCS в соответствии с
рекомендациями производителя
26. Добавьте Змл HBSS/1 % FBCS к клеточному
осадку и перенесите в колонку
27. Промойте колонку Зх в 1 мл HBSS/FB с после-
дующей конечной промывкой в 500 мкл ростовой
среды.
28. Удалите колонку и поместите в 15-м л пробирку,
добавьте 4 мл ростовой среды МСЕС, вставьте
поршень, чтобы собрать бусины, связывающие
клетки. Перенесите клеточную суспензию в
25-см2 чашку, покрытую желатином.
29. Для выделения популяции неэндотелиальных
к дето к осадите центрифу! ирован нем смыв с
колонки и посейте в 25см’чашку в DMEM
(1000 mi л 1люкозы) содержащей 15% FBS.
Ведение культуры:
30. Заменяйте среду дважды в неделю; если клетки
образуют менее чем 50% конфлюэнтный моно-
слой, удаляйте и заменяйте только половину
среды; если клетки достигли 50—80% конфлю-
энтности монослоя, удаляйте и заменяйте всю
среду.
31. Kim да клетки достш нут 80% конфлюэнтности
моносюя, пересейте, разводя клетки в отноше-
нии 1:3 с применением трипсина EDTA
32. Не используйте дольше третьего пассажа.
D. Выделение эндотелиальных клеток
сердца человека (hCEC)
Возможно выделение С ЕС из левого желудочка
человека по методу McDouall el al. [1996].
Материалы для НСЕС
• Mai нитные бусы, покрытые антителами к челове-
ческим МНС класса II или человеческим клеткам
CD31 (Dynal)
• Ростовая среда НСЕС: Ml99 с 4 мМ Е-1лютами-
на с добавкой 10% FBS, 10% человеческой АВ
сыворотки (мужчины) (Sigma), 150 ед мл пени-
циллина. 150 mki/мл стрептомицина, и ECGS как
в Протоколе А
• Коллагеназа II (Roche), 1 mi мл
Протокол
1 Следуйте протоколу 23.18С.
2 Проведите расщепление тканей с коллагеназой
II (Roche) как в шаге 7.
3 Используйте ма1 нитные бусы, покрытые ан-
тителами к человеческому МНС класса II или
человеческим CD31 (Dynal) для выделения эндо-
телиальных клеток как в niai е С20 и переходите
к шагу С23.
4 Ведение клеток hCEC в ростовой среде НСЕС.
Рис. 23.2. Иссечение обонятельной луковицы. Схемати-
ческое изображение выделения обонятельных луковиц из
мозга новорожденной крысы. (С любезного разрешения
Susan Barnett)
Идентификация клеток сосудистого эндотелия.
Сосудистые эндотелиальные клетки являются поли-
гональными и обладают характерной морфологией
«булыжной мостовой» при культивировании в ста-
тичных условиях (рис. 2.3.2). Контаминация фибро-
бластами может быть легко идентифицирована ио их
веретенообразной морфологии ири рассмотрении в
фазово-контрастном инвертированном микроскопе.
Сосудистые эндотелиальные клетки мшут быть иден-
тифицированы по продукции фактора VIII [Hoyer
et al., 1973J. ашиотензин-преобразуюшего фермента
[Del Vecchio & Smith, 1981 J, захвату ацетилирован-
ного липопротеина низкой плотности [Voyta et al.,
1984J, присутствию телец Weibel-Palade [Weihel &
Palade, 1964J, и экспрессии эндотелий-сиецифичных
антигенов клеточной поверхности, включая РЕСАМ-1
(CD31) [Parunis el al., 1990; Albelda et aL, 1990J и эн-
ДО1ЛИН (CD 105) [Gougos & Lelarte, 1990]. Сосудистые
эндотелиальные клетки будут образовывать трубки в
Матригеле [McGuire & Orkin, 19871.
Вариации. Клетки эндотелия крупных сосудов мо-
ут также быть выделены из аорты человека или быка,
из мышечных артерий, включая легочные, коронарные
и из вен ио протоколам, аналогичным приведенному
выше. Микрососудистые эндотелиальные клетки мо1ут
быть выделены из кожи [Davison el al., 1983], мозга
[Bowman el al.. 1981J и .sei ких [Magee et aL 1994 J. а так-
же из специализированных васкулярных полостей ор-
ганов, включая печень [Shaw el al., 1984J, почку [Green
et aL, 1992], и лимфатический узел [Ager, 1987].
23.4. НЕЙРОЭКТОДЕРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
23.4.1. Нейроны
По-видимому, нервные клетки являются более требо-
вательными в выборе субстрата, чем большинство дру-
23.4. Нейроэктодермальные клетки
459
тих клеток. Они плохо выживают на необработанном
стекле или пластике, но при использовании посуды,
обработанной коллагеном или поли-D-лизином, обна-
руживают избыточный рост нейритов, который также
усиливается нри действии полипептида — фактора рос-
та нервов [NGF; Levi-Montalcini, 1979] и друг их факго-
ров, секретируемых глиальными клетками [Marchionni
et al., 1993; Barnett, 2004; Miklic et al., 2004; Wu el al.,
2004]. Клеточная пролиферация не была обнаружена в
культуре большинства нейронов, даже в случае koi да
клетки были взяты на эмбриональной стадии развития
ор1анизма, koi да in vivo обнаруживается большое коли-
чество митозов. Тем не менее недавние исследования
на эмбриональных стволовых клетках показали, что
некоторые нейроны мО1ут быть простимулированы к
пролиферации in vitro | Thoms: in el al.. 19981 u реколони-
зированы в щланизме [Snyder el al., 1992]; такие
нейроны могут быть извлечены даже из му ночного ка-
натика [Sanchez-Ramos, 2002; Newman et al., 2003].
Протокол 23.19 для монослойной культуры ней-
ронов мозжечка был представлен Berni Engelsen and
Rolf Bjerkvig, Department of Cell Biology and Anatomy,
University of Bergen. Zrstadveien 19. N-5009 Bergen.
Norway.
Клетки мозжечка в культуре дают хорошо охаракте -
ризованную популяцию нервных клегок, которая под-
ходит для морфолог ических и биохимических исследо-
ваний [Drejer el al., 1983; Kingsbury et al., 1985]. Клетки
получают из мозжечка?—8-дневных крыс, рост не-ней-
рональных клеюк предупреждается кратковременным
добавлением в культуру арабинозида цитозина.
ПРОТОКОЛ 23.19. Гранулярные клетки
мозжечка
Схема
Мозжечки от четырех—восьми новорожденных крыс
порезать на маленькие кубики и триасинизировать в
течение 15 мин ири 37 °C в PBS Хэнкса. Суспензию
клеток посеять в культуральные флаконы пли лунки,
покрытые ноли-L-лизином
Материалы
Стерильные:
• DMEM с добавками
а) Глюкоза......... ОмМ
б) L- тлютамин .. 2 мМ
в) KCI 24,5 мМ
।) Инсулин (Sigma 1-1882).... 100 мЕд/л
д) р-амннобензоевая кислота (Sigma А-3659)
............ ................ 7 мкМ
е) Гентамицин... .......100 мкт мл
ж) Фетальная сыворотка теленка, термоинактн-
вированная........................10“«
• Сбалансированный соляной раствор ( BSS) Хэн-
ксасЗт лВ5А(НВ55)
• Поли-L-лизин, МВ. >300 000 (Sigma Р-1524)
• Арабиновид цитозина (Cylosiar, Upjohn; порош- |
кообразный)
• Трипсин (тип II). 0,025ио в HBSS
• Силикон (Aquasil, Pierce 42799)
• Чашки Пет ри для культуры тканей, 3,5 см
* Инструменты для иссечения: скальпели, ножни- ।
цы, пинцеты
• Пастеровские пипетки и 10-мл цицетки
• Тест-прпбиркн 12 и 50 мл
Нестерильные:
• Водяная баня
• Силиконизирование Пастеровских пипеток
а) Разведите Aquasil 0,1 1% в UPW
б) Погрузите в раствор пинетки или пропустите
раствор через пинетку. ।
в) Просушите цицетки на воздухе 24 ч или не-
сколько минут ири 100°С
т) Стерилизовать иинетки сухи жаром.
• Обработка культуральных сосудов ноли-Ь-лизином |
а) Растворите коли-L-л изпн в UPW (10 мт/л).
6) Стерилизуйте раствор фильтрацией
в) Добавьте 1 мл раствора ноли-L-лизина в каж-
дую из чашек Петри (35-мм)
г) Удалите раствор поли-Е-лизина через 10—15 мин,
добавьте 1—15 мл культуральной среды.
д) Поместите культуральные чашки в инкубатор |
(минимум на 2 ч) до посева клеток ।
Протокол
1. Иссеките асептически мозжечки крыс и помес-
тите в Н BSS.
2. Измельчите ткань ири помоши скальпеля на I
маленькие кубики размером примерно 0,5 мм* *.
3. Перенесите измельченные ткани в тест-цроиирку
(12 мл) и промойте ткани три раза в HBSS. Ос-
тавляйте пробирки для осаждения кусочков на
дно между промывками
4. Добавьте 10 мл 0,025*» трипсина (в HBSS) ктка-
ням, инкубируйте пробирку в водяной бане мри I
37 °C в течение 15 мин.
5. Перенесите триисинизированные ткани в 50-мл I
центрифужную пробирку, добавьте 20 мл росто- |
вой среды, чтобы остановить действие трипсина. .
6. Дизатрег ируйте ткани тритурацией через сили-
конизированную пастеровскую цицетку, пока не
будет получена суспензия отдельных клеток.
7. Оставьте суспензию клеток в центрифужной
пробирке 3—5 мин. позволяя маленьким сгусткам I
тканей оседать на дно. Удалите осадок при иомо- |
щи пастеровской пипетки.
8. Центрифу! ируйте суспензию отдельных клеток |
при 200 g в течение 5 мин, отбери те супернатант. .
9. Ресусиендируйте осадок в ростовой среде, посейте |
клетки в концентрации 2,5—3,Ох Ю^кл./ чашку.
10. Через 2-4 дня (наилучшие результаты обычно
получаются через 2 дня), инкубируйте культуру
с 10 мкМ цитозина арабинозида в течение 24 ч.
11. Регулярно меняйте культуральную среду.
460
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
Характеристика нейрональных культур Нейро-
ны могут быть идентифицированы иммунолог ически
с использованием нейронсиецифических антител к
энолазе или ири помощи тетанус-токсина в качестве
нейронального маркера. Контаминация астроцитами
может быть количественно оценена с использованием
глиального фибриллярной» кислотного белка в ка-
честве маркера.
Вариации Суспензия единичных клеток может
быть получена механическим продавливанием через
нейлоновые сита с уменьшающимися ячейками (про-
токол 12.9) или последовательной трипсин изацией
(наиример, обработка трипсином в течение 3-5 мин).
Вместо HBSS можно ис пользовать раствор Пака, Креб-
са или другой буфер с глюкозой.
23.4.2. Глиальные клетки
Были выделены и культивированы глиальные клет-
ки из мозга птиц, грызунов и человека. Нормальные
линии астроглии взрослого человека экспрессируют
глиальный фибриллярный кислый белок (glial fibrillary
acidic protein, GFAP) [Burke el al., 1996J, способны к
высоко-аффинному захвату у-аминомасляной кислоты
и г лютамата и имеют высокую активность г лютамат-
синтетазы [Frame et al., 1980J. Олигодендроциты
представляют собой не без труда выживающую суб-
культуру, но клетки-предшественники олигодендро-
цитов зрительного нерва были субкультивированы с
использованием PDGF и FGF2 в качестве митогенов
[Bugler et al., 1990J. Шванновские клетки были куль-
тивированы с применением холерного токсина как
митогена [Raff el al., 1978; Brockes etal., 1979J, однако
в настоящее время обнаружено, что оптимальный рост
получается upu действии глиального фактора роста
и форсколина в среде, содержащей 10% сыворотки
[Davis & Stroobant, 1990]. Достаточно успешно были
культивированы и трансплантированы глиальные
клетки для восстановления повреждения спинного
мозга (см. разд. 25.3.8).
Протокол 23.20 разработан для очистки крысиных
ольфакторных капсульных клеток из ольфакторных лу-
ковиц путем клеточного сортинга (fluorescenceaclivated
cell sorter, FACS) u предоставлен Susan Barnett, Divi-
sion of Clinical Neuroscience, University of Glasgow, CR
UK Beatson Laboratories. Garscube Estate. Bearsden
G61 1BD, Glasgow, Scotland.
Возможность производить высок1х»бо1ащенную по-
пуляцию индивидуальных клеточных типов является
жизненно важной для успешного биолог ического иссле-
дования различных элементов, которые контролируют
клеточный рост, дифференцировку и функции. С этой
точки зрения, клеточный сортер является мощным
инструментом для получения обогащенной, хотя от-
носительно маленькой популяции клеток, выделенной
из гетерогенной клеточной популяции. Первоначально
клеточный сортер предназначался для характеристики
Таблица 23.2. Характеристика г.шальных клегок методом
иммуноокрашиванпя
Клеточный тип GFAP Gal-C 04 А2В5 HTF
О2-А +
Астроциты I типа
Астроциты II типа
Олигодендроциты з ьа
ONEC+z-" +
' Зрелые олигодендроциты, лишенные А2В5 и ставшие GalC ,
а 1акжс 04*.
*' ONECs, утратившие 04 при культивировании.
“ GFAP могут быть фпб|юзные юш аморфные. ONECs. при-
обретшие экспрессию GFAP при культивировании
и сортировки клеток гематопоэтической системы, для
которой было разработано большое количество клеточ-
но-специфичных антител. С возрастанием доступности
антител, которые характеризуют как глию (табл. 23.2),
так и нейроны, с гало возможным перенести эту технику
на область нейробиолог ии [Abney et al., 1983; Williams
etal., 1985; Trotter & Schachner, 1988; Barnett et id., 1993;
Franceschini & Barnett, 1996].
Ольфакторные луковицы представляют собой
ткань, к которой проявляется высокий интерес, по-
скольку это единственная ткань центральной нервной
системы млекопитающих, (ЦНС), которая может под-
держивать нейрональную регенерацию в течение жиз-
ни [Moulton, 1974; Graziadei & Monti Graziadei, 1979,
19801. Как только происходит г ибель нейрона, в ходе
нормального клеточного цикла или после поврежде-
ния. вновь образован н ые нейроны рекрутируются из
предполаг аемого пула постоянно пролиферирующих
стволовых клеток в ольфакторном эпителии [Schwob,
2002J. Эти нейроны способны образовывать аксоны,
которые реиннервирую г ольфакторную луковицу и
восстанавливают обоняние. Полагают, что популяция
глиальных клеток, представленная в обонятельном
нервном слое клеток ольфакторной луковицы, на-
зываемых ольфакторными капсульными клеткаами
(olfactory enshealhing cells, OECs), поддерживает
или провоцирует рост ольфакторных аксонов в ЦНС
[Doucette, 1984, 1990]. На самом деле, недавние экс-
перименты показали, что OECs способны к ремиели-
низации экспериментально демиелинизированных
повреждений спинного мозга крыс [Franklin etal., 1996;
Imaizumi et al., 1998], а также что они поддерживают
регенерацию отрезанных аксонов [Li el al.. 1997.2003а,
b; Ramon-Cueto el al., 1998]. В настоящее время сущест-
вует много обзоров, касающихся использования этих
клеток в восстановлении ЦНС. [Franklin & Barnett,
1997,2000; Raisman, 2001; Wewelzer el al., 2002; Barnett
& Riddell, 2004; Barnett & Chang, 2004J.
Для того чтобы детально изучать биолог иго OECs,
необходимо отделить их от других основных типов
клеток, которые состав.>1ягот ольфакторную луковицу;
нейроны, глиальные клетки ЦНС, олигодендроциты и
астроциты, эндотелиальные клетки, и менингеальные
клетки [Barnett & Chang, 2004].
23.4. Нейроэктодермальные клетки
461
Ольфакторная луковица крысы отвечает крите-
риям успешною клеточною разделения методом
FACS при котором: 1) она лето образует суспензию
единичных клеток после ферментативной обработки
и 2) мышиные моноклональные антитела 04 |IgM;
Sommer & Schachner, 1981], в конъюгации с анги-
галактоцереброзидными антителами (анти-GalC)
[Ranscht et ai., 1982], мтут быть использованы для
узнавания OECs среди других клеточных типов, ко-
торые присутствуют в суспензии ]Barnett etal., 1993;
Franceschini & Barnett, 1996]
Антитела 04 распознают сульфатид, иолулипид и
ироолигодендробластный антиген [Bansal el al., 1992]
и метят многие глиальные клетки центральной и пери-
ферической нервной системы, включая Шванновские
клетки, олигодендроциты и клетки предшественники
олш одендроцитов 2-ю типа п астроцитов (0-2А)
[Gard & Pfeiffer, 1990; Mirskey et al., 1990, Sommer &
Schachner, 1981]. Ольфакт орная луковица содержит три
клеточных популяции, которые мог ут быть помечены
04 антителами: OECs, олигодендроциты и О-2А пред-
шественники ] Barnett el al., 1993]. В отличие от OECs
олигодендроциты и 0-2 А предшественники также могуч
метиться анти-GalC антителами, что позволяет таким
образом проводить негативную селекцию, используя их
как маркеры. Используя эти два типа антител в соеди-
нении, было показано, что 8—14% 04-положительных
клеток представляли собой OECs и менее чем 1% от
общего количества 04-положительных клетко состав-
ляли олигодендроциты или 0-2А предшественники.
Более того, характерная сильно разветвленная или
биполярная морфология олигодендроцитов и О-2А
предшественников, соответственно, позволяет легко
отличить их от плоских фибробласт-подобных OECs.
04-иоложительные FACS-очищенные OECs могуч
быть разделены на два типа клеток, различающихся ио
набору нейрональных маркеров подобные Шваннов-
ским клеткам и астроцитоиодобные, ] Doucette, 1990,
Franceschini & Barnett, 1996; Wewetzer et al., 2002]. Эти
два типа клеток могут иметь различные функциональ-
ные роли in vivo Факторы роста, которые регулирую!
их рост и дифференцировку, в настоящее время изу-
чаются. В ирисугствии кондиционированной среды
из астроцитов 1 типа (ACM), OECs обладают хорошей
выживаемостью и ростом в течение, по крайней мере,
14 дней. Этот метод для роста астроцитов в культуре
можно найти в Noble and Murrey [1984] u WoLswijk and
Noble [1989|. Дальнейшие эксперименты показали,
что изоформа нейро! л ина — фактор нейро-дифферен-
цировки-р — была идентифицирована как фактор в
АСМ ]Pollock el al., 1999]. Сравнительно недавно была
обнаружена комбинация факторов роста, являющаяся
мощным митогеном для ОЕС, которая включает смесь
ACM. FGF-2, форсколина и нейроглина в 5% фетальной
бычьей сыворотке [Alexander et al., 2002].
Протокол 23.20 описывает быстрый метод очистки
небольшой популяции глиальных клеток из ольфак-
торной луковицы путем использования антител к
клеточной поверхности и FACS. Эти принципы, тем
не менее, могут применяться к очистке фактически
любых глиальных или нейрональных популяций, если
при этом выполняются два главных критерия.
Исследователь может получать суспензию отдель-
ных жизнеспособных клеток; подходящие типоспе-
цифичные антитела, пригодные для идентификации
желаемых клеток * * з) * * б)
ПРОТОКОЛ 23.20. Ольфакторные капсульные
клетки (ОЕС)
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
• Пол и-L-лизин (Sigma), основной раствор, 4 мг/мл, ।
развести 1.300 в стерильной UPW для исиользо- I
вания в конечной концентрации 13,3 мкг/мл
• Коллатеназа тип I (MP Bioniedicals, кат. но-
мер. 195109): основной раствор. 2000 Ед мл в L-15
• Сбалансированный солевой раствор Хэнкса без
Са1* и Mr1* (HBSS. Invitrogen)
* Среда Л ейбовитца L-15 с 25 мкг /мл гентамицина |
(MP Bioniedicals)
• DMEM, FBS: DMEM (GIBCO) c 5% FBS
• DMEM/BS. DMEM (GIBCO) с добавками (все |
компоненты Sigma) [Bollenslein & Salo, 1979]:
а) Глюкоза.....................25 мМ (4,5 г/л) I
б) Гентамицин (Invitrogen).......25 mki, мл |
в) BSA Palliocyle (MP Biotnedicals)
............................. 0,0286% (v/v) I
г) Глютамин.2 мМ
а) Бычий панкреатический инсулин
................................ Юpg/мл
е) Человеческий трансферрин.....100 mki/мл
ж) Прогестерон.........................0,2 мкМ
з) Путресцин . .. .0,10 мкМ
и) L-тироксин .. ...0,45мкМ
к) Селен.............................0,224 мкМ
л) 3,3‘,5-трнйод - L-тиронин.....0.49 мкМ
• Моноклональные антитела
04: МАВ345 (Chemiron)
Анти-галактоцереброзид [Ranscht et al., 1982] |
(anti-GalC): MAB342 (Chemicon).
• Вторичные антитела: анти-мышиные флюоресце- I
ин-меченые IgM и анти-мышиные фикоэритреин- '
меченые IgG3 (Southern Biotechnology Associates I
или Cambridge Biosciences).
• Флаконы, чашки и покровные стекла, покрытые I
13,3 mi/мл поли-Ь-лизина:
а) Инкубируйте но крайней мере 1 ч (максимум
24 ч).
б) Промойте пластик и покровные стекла один I
раз в D-PBSA
в) Высушите на воздухе перед использованием
• Чашки Петри.
• Полипропиленовые 15-мл конические пробирки |
Фалькона с крышками.
• Пинцеты, искривленные и прямые (размер 7).
462
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
• Пробирки полистироловые. 12x75 мм, с круглым
дном и крышкой [Falcon #2058, В-D Biosciences;
эти пробирки таятся как для помещения и них
образцов, так и в качестве собирающих устройств
для FACS].
Ножницы, искривленные для иссечения.
* Скальпель.
Нестерильные:
• Крысы Сирейг-Доули, 6—8 дней после рождения,
наибольший выход клеток ОЕС получается из
новорожденных крыс, хотя возможно приготов-
ление из крыс любого возраста.
• Доска для иссечения и булавки.
• Спирт, 70%. в бутыли с аэрозолированием
• Клеточны it сортер с акт ивацией флюоресценции
(FACS: В-D Biosciences: см. разд. 15.4).
Протокол
Приготовление суспензии
диссоциированных ОЕС:
1. Убейте крыс декапитацией. Используйте 15-20 жи-
вотных для FACS сортинга в течение 2—3 ч чтобы
получить достаточно OECs для 10—15 покровных
стекол (10 000 клеток на одно покровное стекло).
2. Приколите дорзальную сторону головы к доске
для иссечения и обрызгайте 70% этанолом.
3. Погрузите все инструменты для иссечения в 70%
спирт перед использованием и высушите.
4. Удалите с головы кожу, используя острые кри-
вые ножницы, и сделайте круговой надрез для
удаления верхней части черепа, открывая мо31 и
две ольфакторные луковицы на переднем копие
коры возле носа (рис. 23.3)
Рис. 23.3. Клетки сосудистого эндотелия в культуре.
Общий вид монослиинои кулыуры энд<пе.|иа.|ьных клеюк
аорты человека в фазово-контрастном микроскопе Увели-
чение 10х.
5. Используя кривой пинцет, осторожно высвобо-
дите ольфакторные луковицы и поместите их в
чашку Петри, содержащую каплю L-15 с гента-
мицином.
6. Используя стерильные лезвия скальпеля, измель-
чите ольфакторные луковицы.
7. Поместите кусочки в маленький флакон, содер-
жащий 1 мл исходного раствора коллагеназы и
1 мл L-15.
8. Инкубируйте при 37 °C в течение 30—45 мин.
9. Центрифу! ируйте получившуюся суспензию при
100 g в течение 5 мин и удалите супернатант.
10. Ресусиендируйте осадок тканей луковиц в 1 мл
раствора Хэнкса без Са2- и Mg’ .
11. Глиальные клетки очень хрупкие, поэтому для
получения суспензии одиночных клеток ткани
ольфакторных луковиц должны быть диссоци-
ированы очень аккуратно, без образования воз-
душных пузырей. Диссоциацию проводите путем
мя1 кого пропускания через ш лу для подкожного
впрыскивания, сначала 23G, потом 19G
12. Добавьте 5 мл раствора Хэнкса без Са2" и Mg2+ и
вновь центрифу 1 ируйте суспензию нри 100 g в
течение 10 мин. Удалите супернатант и ресусиен-
дируйте клетки в DMEM-FBS при концентрации
5x10''кл. мл.
FACS-сортинг OECs:
Для того чтобы максимально удалить 04 оли-
годендроциты из сортируемой популяции клеток
можно пометить их вторичными антителами к галак-
тоиереброзиду [anli-GalC: Ranschl et aL 1982: Barnett
el al., 1993], это позволяет провести распознавание
и разделениеоли1дендроцитов и ОЕС.Таким путем
может быть осуществлен двухцветный сортиш, при
котором нежелательные клетки, меченные антитела-
ми, мшут не приниматься во внимание. Сортиш при
помощи FACSVantage занимает 1 час.
13. После диссоциации тканей ресусиендируйте
клетки в концентрации 5х10ьв 500 мкл смеси
супернатантов i ибридомы антител к 04 и анти-
GalC, инкубируйте 4 °C в течение 30 45 мин в
15-мл центрифужной пробирке. Возможно, сус-
пензия будет содержать более чем 5x106 клеток,
поэтому приготовьте достаточное количество
пробирок для ряда клеток. Если супернатант
t ибридом не будет содержать достаточной кон-
центрации антител, то повышение концентрации
клеток приведет к видимому снижению процента
клеток О4+. Аналш ичное рассуждение примени-
мо к супернатанту i ибридомы анти-GalC. Таким
образом всета необходимо проводить титро-
вание антител путем FACS анализа до начала
использования.
14. Через 30—45 мин, дважды промойте клетки
в DMEM, FBS и ресусиендируйте в 500 мкл
DMEM, FBS, содержащей смесь козьих антимы-
шиных флюоресциин-меченых IgM и антимыши-
23.4. Нейроэктодермальные клетки
463
ных фикоэритрин-меченых IgG3 в разведении
1:100. Инкубируйте клетки еще 30 мин при 4 °C.
15 Отмойте клетки дважды в 15 мл DMEM-FCS
путем центрифут ировання и ресупендируйте
их до концентрации 2x10*’ клеток, мл в холодной
(на льду) среде DMEM, FBS в пробирках для
клеточное» сортннга (В-D Biosciences 2085).
Храните суспензию клеток на льду. Профиль
FACS антитела-меченых клеток остается ста-
бильным по крайней мере 3—4 ч при хранении
клегок на льду.
16. Данный протокол описывает метод, использу-
емый для сортннга клеток на сортере FACSlar.
Однако клеточный сортер любсно типа дает
сходные результаты. Настройте лазер на волну
излучения 488-нм. Компенсация флюоресценции
должна быть установлена так, чтобы перевести
избыточную флюоресценцию в индивидуальные
каналы флюоресценции. Контрольный образец
клеток, меченный вторичными антителами,
должен быть проанализирован до того, как про-
водится мечение исследуемых клеток, так чтобы
все неспеццфические меченые клетки moi ли быть
учтены и удалены путем снижения усиления на
фотомножительной трубке
17. Поместите окно клеточного сортера возле клеток
04+ GalC-. Средний процент клеток 04+ должен
составлять около 10±1°о.
18. Отсортируйте 04+ GalC- клетки в полистироло-
вую крутлодонную пробирку, содержащую 4 мл
DMEM/FBS
19. После сортиша перенесите отделенные клет-
ки в 15-мл центрифужную пробирку, отмойте
пробирку для сортища средой, добавьте в эту
же центрифужную пробирку, и дополните ее до
верху DMEM BS. Центрифуi ируйте при 100 g в
течение 15 мин
20. Удалите супернатант и ресусиендируйте клетки
в DMEM FBS. Оптимальная жизнеспособность
и рост клеток для ОЕС могут быть получены при
разведении DMEM, BS:АСМ с соотношением 1:1
[Barnett et al., 1993]. АСМ получают путем отбора
из монослойной культуры очищенных кортикаль-
ных астроцитов [Noble & Murrey, 1984], инкуби-
рованных 48 ч в DMEM, BS. Клетки также MOiyr
быть выращены в АСМ (1:5), FGF2 (IOhi мл) и
форсколине (10 мкМ), растворенных в DMEM'
BS и затем разведенных в отношении 1:1 DMEM
содержащей 10% FBS [Alexander el al., 2002J.
описанных в электронно-микроскопических исследо-
ваниях [Doucette, 1984;
Raisnian, 1985], исследования продолжаются в
направлении изучения и дальнейшей характеризации
клеток.
23.4.3. Эндокринные клетки
Проблемы культивирования эндокринных клеток
[O’Hare et al., 1978] обусловлены относительно малым
количеством эндокринных клеток в специфических
тканях, в отношении к стромальным и паренхима-
тозным клеткам. Salo с колле! ами [Buonassisi et al.,
1962; Salo & Yasumura, 1966] культивировали функ-
ционирующие адреналовые и iипофизарные клетки
из крысиных опухолей путем механической диза: ре-
tauHii опухоли [Zaroff et al., 1961] и поддержанием
обычной монослойной культуры. Функциональное
единство клеток поддерживалось путем периодиче-
ское пересева клеток как перевиваемой опухоли в
крыс [Buonassisi el al., 1962; Tashjian el al., 1968]. Эти
линии в настоящее время полностью адаптированы к
культуре и мшут поддерживаться без пассажа через
животных. [Tashjian, 1979] и в некоторых случаях мо-
гут поддерживаться на полностью охарактеризованных
средах [Hayashi &Sato, 1976].
Фибробласты редуцируются в культуре клеток
панкреатических островков путем обработки этил-
меркуритизозалицилатом [Braatenetal., 1974],клетки
островков очищают также путем центрифу! ирования в
градиенте плотности | Prince el al., 1978] и путем цент-
рифугальной элютриации [Brelzel el al., 1990]. Клетки
островков, как известно, продуцируют инсулин, но
утрачивают эту способность при культивировании.
Кратковременные клеточные культуры также были
получены из клеток-предшественнпков протоков
железы, способных к дифференцировке до пнсулин-
секретирующих клеток в бессывороточной среде [Gao
etal., 2003].
Из мышей были выделены гипофизарные клетки,
которые производят гормоны i ипофиза в течение жиз-
ни нескольких субкультур [de Vitry el al., 1974]. Хотя
нормальные человеческие i ипофизарные клетки выжи-
вают плохо и большинство культур аденомы гипофиза
человека постепенно утрачивают способность к синтезу
гормонов, некоторые культуры продолжают продуци-
ровать гормон роста [см., например. Bossis el al.. 2004],
трехмерная культура аденомы гипофиза продолжает
секретировать пролактин [Guiraud etal., 1991].
Данный протокол дает высокообогащенную попу-
ляцию 04+1.'шальных клеток ольфакторной луковицы
(>97%). Эти клетки могут быть посеяны на обрабо-
танные поли-Ь-лпзином покровные стекла, чашки
Петри или флаконы и использоваться в дальнейших
исследованиях. В настоящее время имеются данные,
подтверждающие прнадлежность этих клеток к OECs,
23.4.4. Меланоциты
Для получения культуры, преимущественно состоя-
щей из меланоцитов, используется высокая зависи-
мость культуры от субстрата, которая играет роль в
прикреплении п росте клеток на среде с добавлением
гормонов [Naeyaerl et al., 1991]. Система помогает
464
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
избежать проблемы контаминации кератиноцитами, в
то время как пролиферация хорошо поддерживается
при минимальном добавлении сыворотки [Gilchrest
el al., 1985; Wilkins et aL, 1985J в отсутствие химио-
терапевтических агентов или промоторов опухоли,
таких как эфиры форбола. Эти вещества негативно
регулируют протеинкиназу С (protein kinase С, РКС)
и, следовательно, тирозиназную активность, сокращая
продукцию ии1 мента [Park el aL, 1993J. При общеупот-
ребительной дозе добавлении сыворотки (5—20%) рост
меланоцитов значительно лучше, чем описанный в
друг их системах, а рост фибробластов может быть пре-
дупрежден снижением концентрации Са2* * до 0,0.3 мМ
[Naeyaerl et al.. 1991J. Система, описанная здесь, может
быть в дальнейшем модифицирована удалением из нее
холерно! о токсина (который провоцирует рост мела-
ноцитов иутем значительного возрастания внутрик-
леточного уровня сАМР) и дибутирила сАМР. Такая
среда обеспечивает' физио.ки пческии уровень РКС и
сАМР, что, в свою очередь, позволяет проводить изу-
чение сАМР-модулирующих агентов [Park el aL, 19991
в условиях, которые оптимальны для исследований
меланогенеза.
Приведенное введение и иротокол 23.21 для куль-
туры меланоцитов человека были предоставлены Hee-
Young Park, Mina Yaar, and Barbara A. Gilchrest, Depart-
ment of Dermatology, Boston University School of Medi-
cine, 80 East Concord St., Boston, MA 02118-2394.
ПРОТОКОЛ 23.21. Меланоциты
Схема
Эпидермис, отделенный от небольшого фрагмента
кожи после триисинизации, диссоциируют в EDTA
и культивируют в бессывооточной среде с добавками
главного FGF (FGF-2).
Материалы
Стерильные:
• D-PBSA
• Фетальная сыворотка теленка (FBS)
• Среда с гормональными добавками для мелано-
цитов (MHSM):
Основной
раствор
Объем
основного
раствора
. 93,1мл
__0,1 мл .
0,1 мл ..
0,1 мл ..
0,1 мл .
а) Среда 199
(GIBCO 400-1200)....
б) EGF(B-D
Biosciences), 10 mki мл .
в) Трансферрин
(Sigma), 10 mi мл
г) Инсулин
(Sigma), 10 mi мл
д) Трийодтиронин
(Sigma), 1 мкМ.
Конечная
концен-
трация
. . 10 hi /мл
.. 10 мкг/мл
.. 10 mki /мл
....1нМ
е) Гидрокортизон
(Calbiochein), 0,28 мМ.... 0,5 мл .. .. 1,4 мкМ
ж) Холерный токсин
(Calbiochem), 0,1 мкМ.....1,0 мл........1 нМ
Холерный токсин может быть заменен на лкстрак г
гипофиза быка (Clonelics), концентрация исход-
ного раствора 35 мкг/мл, конечная концентрация
0,7hi мл, и дибутирил сАМР (Sigma), 1 мМ,
конечная концентрация 100 мкМ
з) Главный FGF
(Amgen), 200 нг мл....5,0 мл .. . 10 hi /мл
• Трипсин/ EDTA: трипсин 0.25% в D-PBSA с 0,1%
(3,5 мМ) EDTA (GIBCO 610-5050)
• Соевый ин1 ибитор трипсина (Sigma), 10 mki мл
• Чашки для культуры тканей (Falcon, В-D Biosci-
euces), диаметром 10,6 и 3,5 см diameter
• Пипетки
Центрифужные пробирки, 15 и 50 мл
Нестерильные.
• Инкубатор с увлажнением (37 °C, 7% СО2)
Водяная баня
Электронный счетчик клеток или
Протокол
Получение первичной культуры
День 1:
1. Проио.щощите образец кожи в 70%-м спирте и
затем дважды в D-PBSA.
2. Перенесите ткань в стерильные 10-см чашки,
эпидермисом вниз.
3. При помощи ножниц для иссечения удалите
подкожный жир и । лубокие слои дермы.
4. Порежьте оставшуюся ткань на кусочки разме-
рами 2x2 мм при помощи скальпеля точными
режущими движениями сверху вниз (не исполь-
зуйте пилящие движение), поднимая лезвие над
тканью.
5. Перенесите фрагменты ткани в 15-мл центри-
фужную пробирку, заполненную холодным
0,25% трипсином.
6. Инкубируйте фрагменты ткани 1 1,5 ч мри ком-
натной температуре. Для некоторых доноров
инкубирование нри 37 С в течение 1—2 ч после
инкубирования мри 4 °C в течение 18 24 ч может
дать более высокий выход меланоцитов.
День 2:
7. Осторожно постукивая ко пробирке, отделите от
днафрагменты, которые прилипли к нему, затем
быстро перелейте содержимое пробирки в 6-см
чашку.
8. Используя пинцет, перенесите фраг менты ткани
по отдельности в сухую 10-см чашку, эпидер-
мальной стороной вниз. Осторожно подвигайте
каждый фрагмент ткани ио чашке. Эпидермаль-
ная выстилка должна прилипнуть к чашке, что
23.5. Гематопоэтические клетки
465
позволяет точно отделить дерму ири помощи
пинцета. Выбросьте фрат менты дермы
9. Перенесите все эпидермальные фра!менты в
стерильные 15-мл центрифужные и|хюирки, со-
держащие 5мл 0.02% (0.7 мМ) EDTA. Старайтесь
поместить каждый эпидермальный фратмент в
раствор EDTA, а не на пластиковую стенку цен-
трифужной пробирки.
10 Осторожно встряхивайте пробирку, чтобы ди-
зат грет ировать эпидермальные пленки до сус-
пензии единичных клеток.
11. Центрифу! ируйте клетки в течение 5 мин при
350 g. а затем отберите супернатант.
12. Ресусиендируйте осадок в бессывороточной
среде MHSM?
13. Подсчитайте клетки при помощи гемоиито-
мегра и инокулируйте 1x10* клеток (примерно
2 1x10*меланоцитов) на 3,5-см чашку в 2 мл
MHSM содержащего 5% FBS для улучшения
прилипания клеток.
14. Меняйте питательную среду, вновь добавляя
MHSM, содержащую факторы роста и экстракт
। ииофиза быка дважды в неделю.
Дни 3-30-
15. В течение 24 ч культуры будут содержать пер-
вичные кератиноциты с рассеянными меланоци-
тами (рис. 23.4а). Пролиферация кератиноцитов
должна прекратиться в течение нескольких дней
и колонии меланоцитов начнут формировать-
ся в течение второй недели. К концу третьей
недели должны остаться только меланоциты
(рис. 22.46, в). В большинстве случаев культуры,
доспи ш не почти конфлюэнтного состояния, го-
товы к пересеву через 2 1 недели.
Субкультивирование:
16. Осторожно дважды сполосните культуральные
чашки 0,02% (0,7 мМ) EDTA.
17. Добавьте Змл 0,25% трипсин 0,1% (2,5 мМ)
EDTA и инкубируйте при 37 °C Обследуйте
чашки иод фазово-контрастным микроскопом
каждые 5 мин для обнаружения отделения клеток
от поверхности.
18. Когда большинство клеток отделились, инакти-
вируйте трипсин соевым инитбитором трипсина
(10 mki /мл) или 1 мл среды, содержащей 10% сы-
воротки теленка. ( Меланоциты, куль гура которых
получена в бессывороточных условиях, получают
значительную стимуляцию при «сывороточном
толчке!» во время субкультивирования.)
19. Пииетируйте содержимое чашки для того, чтобы
убедиться, что меланоциты полностью отдели-
лись от чашки.
20. Соберите клеточную суспензию в центрифужную
пробирку и центрифу! ируйте в течение 5 мин при
350 g.
21. Отсосите супернатант, ресусиендируйте клетки
в бескальциевой среде для меланоцитов, содер- I
жащей 5% FBS, и пересейте на 100-мм чашку в
концентрации клеток 2—4x10*. Для хорошего
прикрепления меланоцитов к пластиковой чаш-
ке (>75%) требуется FBS. однако, если чашки
обработаны предварительно фнбронектиом или
коллагеном типа I/Ш, можно не применять FBS
[Gildirestel а]., 1985].
22. Два раза в неделю меняйте среду на бессыворо-
гочную или содержащую сыворотку среду для
меланоцитов. Среда, содержащая сыворотку, даст
более высокий выход меланоцитов, но усилит рост
фибробластов. Снижение концентрации кальция
до 0.03 мМ не оказывает действия на иролифе-
рацию меланоцитов, но иншбирует избыточный I
рост фибробластов [Naeyaerl el al., 1991].
23.4.5. Подтверждение идентичности
меланоцитов
Культуры меланоцитов могут быть изначально конта-
минированы керагиноцитами и в какое-то другое время
кожными фибробластами. Обе формы контаминации
достаточно редки в установившейся и поддерживаемой
культуре, если она ведется опытным лаборантом или
исследователем, однако является часто встречающейся
проблемой для новичков. Принадлежность культиви-
руемых клеток к меланоцитам может быть достаточно
точно подтверждена с помощью частого исследования
культуры иод фазовым микроскопом, что, в свою
очередь, иредиола1ает, что исследователь знаком с
соответствующей морфолш ней клеток (рис. 23.46, д).
Более точная идентификация может быть проведена
путем электронно-микроскопического исследования,
DOPA окрашивания или иммунофлюоресцентного
окрашивания с антителами Me] 5 против тирозиназа-
родственного протеина-1.
23.5. ГЕМАТОПОЭТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ
Гематопоэтические клетки были выращены ири ис-
следовании колониеобразующей способности клеток
костного мозга в долгоживущей культуре и как посто-
янные культуры клеток |Freshney el а].. 1994: Klug &
Jordan, 2002]
Под контролем специфических факторов роста ге-
матопоэтические стволовые клетки CFU-A moi ут быть
повторно клонированы из агаровых культур (см. прото-
кол 23.23). Показано, что MIP- 1а является основным
фактором, который поддерживает стволовые клетки в
регенеративном состоянии. Тем не менее большинство
колоний, полученных из суспензии клеток, только од-
ной линии выживают только как первичная культура,
утратившая :>ффективность обновления популяции и
не мо1ут быть субкультивнрованы. Гранулоцитарные
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
Рис. 23.4. Культура меланоцитов, а) Культура меланоци-
тов, выделенных из крайней плоти полового члена новорож-
денного через 1 неделю после инокуляции клег«гк Обратите
внимание на колонии кератиноцпюв, страгифирующнсся в
цен । ре и формирующие илотные соединения эпителиальных
клеюк на периферии Меланоциты относительно малень-
кие темные клетки с отростками, большинство нт которых
контактируют с колониями кератиноцитов посредством
выступающих дендритов (наблюдение через фазовый конт-
раст). б) Десятидневная первичная культура эпидермальных
меланоцитов новорожденного в среде с недостатком ТРА
У мнотнх клеток отмечается ветвистость дендритов, другие
клст ки изменяю г морфологию от биполярности до ноли-
тональности (наблюдение через фазовый контраст, х320)
в) Вторичная культура ТРА- обработанных эиидермальных
меланоцитов Обрати ге внимание на морфологию дендритов
у клеток, пигментацию и их узкую вытянутую форму
колонии являются наиболее общеупотребительными;
однако при соответствующих условиях могут быть
получены н друг ие линии (см. протокол 23.23)
Ряд миелоидных клеточных линий был получен
из мышеи с лейкемией [Horibata & Harris, 1970], и
было показано, что, подобно некоторым линиям че-
ловеческим лимфобластоидов [Collins et al., 1977],
они производит глобулиновые цепи и в некоторых
случаях формируют завершенные а- и у-г глобулины
(см. разд. 27.10).
Некоторые из этих линии могут быть выращены
в бессывороточной среде [Iscove & Melchers, 1978].
Т-клеточные линии требуют факторов роста Т-клеток
[например, интерлейкин IL-2; Gillis & Watson, 1981],
описаны также факторы роста В-клеток [Howard etal.,
1981; Sredni et al., 1981; см. также Freshney et al.,1994].
Первые человеческие клеточные линии лимфоблас-
тов были получены культивированием лимфоцитов
периферической крови ири очень высокой клеточной
плотности (~ 101' 'мл), обычно в глубоком слое (>10 мм)
[Mooreetal.. 19671. Потом были получены иммортали-
зованные клеточные линии благодаря гену EBV (вирус
Эиштеина—Барра) и в настоящее время эти мет оды
широко используются [Bolton & Spun*, 1996].
Rossi and Friend [1967] показали, что мышиный
РНК-вирус (“Friend virus”) может вызывать сплено-
мегалию и эритробластозы у инфицированных мышей.
Клеточные культуры, выделенные из измельченной
селезенки этих животных, в некоторых случаях да-
вали начало постоянным клеточным линиям клеток
эритролейкемии. Все эти линии трансформированы
тем, что в настоящее время определяется как комплекс
дефективных и вспомогательных вирусов, выделенных
из вируса саркомы Молони [Osteriag & Pragnell, 1978,
1981]. Некоторые клеточные линии могут быть полу-
чены с использованием вируса, который инфективен in
vivo. но не эффективен in vitro. Эти клетки могут быть
пересеяны как солидная или асцитная оиухоль мышам
DBA2 или BALB-C
Обработка культуры клеток Friend рядом агентов,
включая DMSO, бутират натрия изобутировую кисло-
ту, гг бисацетамид гексаметилена стимулирует эритро-
идную дифференцировку [Friend et al., 1971; Leder &
Leder. 1975]. Необработанные клетки образуют комп-
лексы недифференцированных проэритробластов, в
то время как в обработанных клетках обнаруживаются
признак ядернои конденсации, уменьшение размеров
клетки и аккумуляция гемоглобина (см. разд. 17.7)
в меньшем объеме, так что центрифугированный
клеточный осадок имеет красный цвет. Признаки
дифференцировки могут- быть продемонстрированы
окрашиванием клеток на гемоглобин с помощью
бензидина (см. цв. вкладку 13а, б) и гибридизацией
с глобин-специфической РНК гп situ (см. цв. вклад-
ку 13e, г) Такие клеточные линии лейкемических
клеток как К562 могут также быть индуцированы к
дифференцировке действием бутирата натрия и геми-
на. хотя DMSO не оказывает индуцирующего действия
[Andersson et al., 1979с].
Макрофаг и могут бы гь выделены из мног их тканей
путем сбора клеток, которые прикрепляются к поверх-
ности при ферментативной дезаг грегации. Тем не менее
выход клеток в этом случае достаточно низок, и в на-
стоящее время разработан ряд методов, позволяющих
23.5. Гематопоэтические клетки
467
получить большее количество макрофагов. Минераль-
ное масло или бульон с тиоыиколатом [Adams, 1979J
могут быть введены в брюшную полость мыши, через
3 дня перитонеальные смывы будут содержать высокую
долю макрофагов. При необходимости макрофа! и мо-
гут быть очищены за счет способности прикрепляться
к субстрату в присутствии протеаз (см. разд. 14.8.1).
Макрофа! и с трудом могут быть субкультивированы в
результате их резистентности к трипсину. Разработаны
методы, использующие । идрофобные пластики (напри-
мер, чашки Petripenn, Vivascience, Sartorius).
Имеются сообщения о перевиваемых клеточных
линиях макрофа!ов, ьтавным образом, из мышиных
неопластических образований. Нормальные мышиные
макрофа!и не пролиферируют, хотя можно культиви-
ровать их клетки-предшественники по методу DexterS
Spooncer (см. протокол 23.22).
23.5.1. Долгоживущие культуры клеток
костного мозга
Последующее введение и протокол 23.22 для долго-
живущей культуры гематопоэтических клеток кост-
ною моЗ! а был предоставлен Е. Spooncer, Department
of Biomolecular Sciences. UMIST, Sackville Street,
Manchester M60 1QD, U. K.
При культивировании цельного костного MO3ia под-
держиваются отношения между стромой и стволовыми
клетками, в присутствии соответствующих гематопо-
этических клеток и при наличии этого межклеточного
взаимодействия стволовые клети и специфические
предшественники мо:ут делиться в течение более чем
нескольких недель [Dexter el al., 1984; Spooncer et al.,
1992). Клетки-предшественники, выделенные из свеже-
го костного MO3i а или долгоживущие культуры MOiyi
быть исследованы путем клоногенного роста в mhikom
aiape [Heyworth & Spooncer, 1992J или в мышах [Till &
McCulloch. 1961 J.
ПРОТОКОЛ 23.22. Долгоживущая культура
гематопоэтических клеток костного мозга
Схема
Костный мол отсасывается и переносится в пита-
тельную среду п затем выращивается в виде культу-
ры прикрепившихся клеток в течение 12—30 недель.
Стволовые клетки, а также созревающие и зрелые
миелоидные клетки высвобождаются от прикрепив-
шихся клеток и переходят в ростовую среду
Предшественники гранулоцитов макрофагов
могут быть исследованы в mhikhx гелях (см. прото-
кол 23.23).
Материалы
Все реактивы должны быть предварительно провере-
ны на способность поддерживать рост кулы уры
Стерильные:
• Среда Фишера (Invitrogen), дополненная 50 Ед/мл
пенициллина и 50 mki/мл стрептомицина и со- |
держащая 16 мМ (1.32 i/.i) NaHCO,
• Ростовая среда: среда Фишера, как указано выше, I
разлитая на аликвоты по 100 мл с добавлением
1 мкМ i идрокортизона сукцината натрия и 20% I
лошадиной сыворотки (i идрокортизин сукцина- ।
га натрия делают как 1 мМ основной раствор в I
среде Фишера и хранятся при —20 °C).
* Шприцы 1 мл, с шлами 21G
* Марлевые тампоны, ножницы, пинцеты
• Флаконы для культуры ткани, 25 см2
Нестерильные:
Пять мышей (С57В1 64 DBA 2), Fj-клетки костного
мозга вторых хорошо растут в долгоживущей куль- I
гуре в отличие от мышей дру: их линии (например,
СВА) [Greenberger, 1980J
Протокол
1. Убейте мышеи-доноров методом цервикального |
смещения.
2. Протрите 70%-м спиртом шерсть и отрежьте оба I
бедра. Соберите 10 бедренных частей в чашку
Петр 11 на льду, содержащую среду Фишера. Одно I
бедро содержит 1,5 2,0x10’клеток.
3. В ламинарном шкафу:
а) Полностью удалите все оставшиеся мышечные |
ткани при помощи марлевых тампонов.
б) Удерживая бедренную кость при помощи I
пинцета, срежьте кек №нный конец. Конец иглы
21G должен плотно входить в полость кости.
в) Срежьте другой конец бедренной кости так ।
близко к концу, как это возможно.
г) Введите конец кости в 100-мл бутылочку с |
ростовой средой и всасывая и выдавливая
поршень шприца несколько раз до тех пор, |
пока костный мозг вымывается из бедра.
д) Повторите rnai и (a)—(i) с оставшимися девя- I
тью костями.
4. Дисперг ируйте костный моз! до суспензии путем I
пппетпрования крупных участков костномозго-
вого стержня через 10-мл пипетку. Нет необхо- ।
дпмости в дезацгегацип мелких сгустков.
5. Разлейте 10-мл аликвоты суспензии клеток в
25-см2 флаконы д.ля культуры тканей, постоянно
взмучивая суспензию вращательным движением
для того, чтобы быть уверенным в равномерности
распределения клеток в 10 культурах. ।
6. Заполните флаконы 5% СО2 в воздухе и плотно
заверните крышки.
7. Инкубируйте культуры в горизонтальном поло- '
жении при 33 °C.
8. Еженедельно производите смену среды.
а) Осторожно взболтайте флаконы для суспен-
дирования слабо прикрепленных клеток.
б) Удалите пипеткой из каждого флакона по 5 мл I
ростовой среды вместе с суспензией клеток, |
468
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
стараясь не повредить слой прикрепленных
клеток.
в) Добавьте 5 мл свежей ростовой среды в каж-
дый флакон. Для того чтобы избежать пов-
реждения, не направляйте струю из пипетки
на клетки.
11 Заполните флаконы г азом, верните их в инку-
батор.
Анализ. Клетки, собранные при смене среды куль-
туры, могут быть исследованы рядом методов, включая
морфологические исследования, CFC исследования
(см. иротокол 23.23), и CFU-S in two для стволовых
клеток (Till & McCulloch. 1961 ]
Вариации. Выращены культуры мышиных эритро-
идов |Dexteretal., 1981J и В-лимфоидов (Whitlocketal.,
1984J, а также человеческие долгоживущие культуры
(Gartner & Kaplan, 1980; Coutinho et al., 19921.
23.5.2. Анализ колониеобразования
культуры гематопоэтических клеток
Клетки-предшественники гематопоэтических клеток
мшут быть клонированы в суспензии в полужидкой
среде в присутствии соответствующих факторов роста
(Heyworth & Spooncer, 1992J. В зависимости отиотент-
ности выделенных стволовых клеток могут быть полу-
чены чистые линии или смеси колоний. Исследования
используемые для определения колониеобразования
гранулоцитов и макрофагов (GM-CFC), эритроид-
ных бурст-образующих единиц (BFU-E), смешанных
колониеобразующих единиц (CFC-mix), а также
гранулоцитарных, эритроцитарных, макрофагальных
и мег акариоцитарных колоние-образующих клеток
(CFC-GEMM) описаны Testa & Molineux (1993J, и
их мести в технологии рутинных гематопоэтических
клеточных культур уже хорошо определено | Metcalf,
1990j. Последующее введение и протокол 23.23 осно-
ваны на Freshney et al. 11994J.
Эффективность роста колоний в данном исследо-
вании возрастает ири использовании Метоцеля вместо
агара в качестве полужидкой среды. Данная практика
разработана для более плотных колоний, которые лег-
че оценить и сосчитать. Поскольку Метоцель является
жидкостью с высокой вязкостью, а не гелем, как агар,
клетки будут оседать сквозь него, хоть и медленно, и
осаждаться на пластиковом дне чашки. Это движение
приведет к тому, что они все расположатся в одной
фокальной плоскости, удобной для последующего
наблюдения. Колонии будут образовываться, если
рост происходит в атмосфере 5% СО2 в воздухе, но
для адекватного гематопоэза идеальной является
смесь 10% СО,и 5% О2в воздухе (Bradley etal., 1978b J.
Если инкубатор с газовой смесью недоступен, можно
использовать баллон с газовой смесью. Поместите
чашки в пластиковую коробку с дыркой в крышке.
Запечатайте ко|хкгку пластиковой лентой и заполните
газом коробку через дырку, затем ее тоже запечатайте.
Чашка с водой в коробке позволит сохранить влажную
атмосферу.
ПРОТОКОЛ 23.23. Анализ
колониеобразования культуры
гематопоэтических клеток
Схема
Суспендируйте клетки костного мозга в агаре или
метилцеллюлозе, посейте на чашки с соответствую-
щими факторами роста
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
• Клетки костного мозга (см. протокол 23.22,
шаги 1—4 для приготовления). Подсчитайте ядро-
содержащие клетки в г емоцитометре после окра-
шивания их с метиленовым синим, или лизируйте
клетки Z apoglob in и подсчитайте количество
ядер на электронном счетчике клеток (Beckman
Coulter). Каждая бедренная кость даст примерно
1,0- 1,5х 107 клеток.
• Метилселлюлоза, 4000 cP ( Fluka)
• Агар Noble (Difco, В-D Biosciences)
• Альфа МЕМ основной раствор (Invitrogen)
- FBS
• Факторы роста (табл. 23.3). рекомбинантные
(R&D) пли из кондиционированной среды
• BSA, 10% в D-PBSA
• Чашки Петри, 3 см
• Wehi-cell-кондиционированная среда (Welii
СМ): Wehi ЗВ представляет собой миеломоноци-
тарную клеточную линию, которая при культи-
вировании выделяет в среду IL-3 (мульти-CSF)
| Bazill el al., 1983j. (Метод приготовления конди-
ционированной среды см. иротокол 14.2.).
• Метилцеллюлоза (Methocel)
а) Взвесить 7.2 Methocel добавить ее в 500-мл
колбу, с большим вкладышем для маг нитной
мешалки
Таблица 23.3. Добавки клеток п факторов роста при
исследовании способности к колонпеобразованпю
Факторы роста/мл
Частота
встречае-
Исследование IL-6 rMurGM' rlL-З6 Еро Клетки мостиЛО5
BFU-E 0,1 нг 1 нг 2 U 5xl01 40-80
CFC-inix 1 HI 20 5x10’ 100-180
CFU-GEMM 100 нг 1 НГ 20 5xl01 92-106
а 10% AF1-19T СМ может быть замешено на GM-CSF |Prag-
ncll et al.. 19881
6 10% Wchr-CM может быть замещено на rIL-3 [Bazill ct al.,
19831
23.6. Гонады
469
б) Стерилизовать Methocel автоклавированием,
в) Добавить 400 мл сте|шльной UPW подогреюй
до 90 °C чтобы увлажнить метилцеллюлозу.
1) Перемешивать смесь при 4°С в течение ночи
до растворения метилиеллюлозы. Получаем
раствор Methocel 2х. Для более точною разли-
вания метилцеллюлозы следует использовать
не иииетку, а шприц бел шлы.
• Среда Alpha основной раствор
а) Среда Alpha, порошкообразная (GIBCO, упа-
ковка на 10 л)
б) Витаминный основной раствор МЕМ. 1и0х,
100 мл
в) Гентамицина сульфат, 200 мt. Перемешивай те
среду на мешалке с подогревом до раство-
рения. доведите до Зл добавлением UPW
(не допускайте повышения температуры
выше 37 °C.) До конечной фильтрации через
0.22-мкм филы рэффективно профильтровать
среду через серию фильтров размерами 5,1,2,
0,8 и 0,45 мкм. Разлейте среду ио аликвотам
21-мл. храните при -20 °C.
• Среда Alpha, 2х
а) Основной раствор среды Alpha, 21 мл
б) FBS, 25 мл
в) Глютамин 200 мМ, 1 мл
1) NdHCO„ 7,5%, 3 мл
Смешать ингредиенты в стерильной иосуде, до-
вести до 37 °C.
Нестерильные:
• Для ai ара используйте две водяных бани, одну на
.37 °C и друтую на 55 °C
• Инкубатор: газовая фаза, 10% СО,, 5%О2,85% N2
Протокол A: BFU-E, CFC-Mix, и CFU-GEMM
1. Для получения требуемого количества среды для
эксперимента смешайте равные объемы среды
Alpha 2х, в которую добавлен 1% BSA с Метил-
целлюлозой 2х. Храните на холоде. Methocel
более жидкий в холодном состоянии.
2 Получайте культуру в трех копиях, но приготовь-
те такое количество смеси, ч гобы было достаточ-
но для 4 чашек, поскольку Methocel прилипает к
стенкам пробирок и некоторое количество Beet да
теряется.
3. Добавьте в пробирку факторы роста до необхо-
димой концентрации (табл. 23.3).
4 Добавьте 5х 10’ клеток.
5. Доведите общий объем до 4,4 мл добавлением
среды 1х, перемешайте на вортекс-миксере.
6. При помощи шприца поместите но 1 мл среды в
3-см чашки Петри (для культивирования тканей).
7. Инкубируйте культуру при 37 С во влажной
атмосфере с 10% СО, и 5% 0,8-15 дней.
Идентификация колоний
Колонии BFU-E мосут быть как единичными,
составленными из очень маленьких клеток, так и
мулыицентричными колониями (пачка;, каждая с
плотно упакованными очень маленькими розовы- I
ми или красными клетками. Эти колонии содержат
40—80 10 ’ костномозговых клеток ।
CFC-inix колонии могут быть единичными ком-
пактными колониями, обычно окруженные клетка-
ми очень разнообразного размера. Они moivt быть
мультицентричными, но клеточная популяция ири
этом выраженно гетерогенна. Инцидентноегь этих
колоний составляет в данном исследовании обычно
100 180/10 ’ костномозговых клеток, из них только
примерно 10% будут смешанными колониями, со-
держащими эритроидные клетки. Если эритроидные
клетки не красные, то может быть затрудни гельно
для неопытного исследователя точно идентифнци- ।
ровать колонии. Колонии следует сфотсл рафиро- I
вать, отобрать, провести препаративное центрифу-
1 ирование, фиксировать и окрасить ио Гимза (10%), .
а затем попросить о помощи в идентификации |
клеток [Heyworth & Spooncer, 1992].
Протокол В: GM-CFC
1. Рассортируйте 3-см чашки Петри и промарки-
руйте их (не для культивирования ткани).
2. Приготовьте 0,3% atapouyto среду (см. прото-
кол 14.4) и храните при 37 °C.
3. Приютовьте костномозговые клетки (см. про-
токол 23.22). Подсчитайте ядросодержащие
клетки после окрашивания метиленовым синим
или лизируйте клетки Zapoglobiti и подсчитайте
количество ядер на электронном счетчике клеток
(Beckuian Coulter). Каждая бедренная кость даст
примерно 1,0— 1,5х 10' клеток.
4. Добавьте 0,1 hi /мл rMurGM-CSF в каждую чашку. .
5. Добавьте 1мл агаровой среды, содержащей
7,5x10’ клеток, осторожно покручивая, иереме- ।
тайте клетки и at ар. Оставьте при комнатной I
температуре до застывания at ара.
6. Другой метод: 0,8% среды Methocel. Обычно этот I
метод дает более плотные колонии, которые легче
считать
7 Помести re чашки в чистую пластиковую коробку. |
8. Инкубируйте чашки в течение 6 дней во влажном
инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% СО2
9. Используя инвертированный микроскоп, под-
считай ге количество колоний, содержащих более
50 клеток, и выразит е результаты подсчета в виде
отношения количество колоний. 10’посеянных
клеток. I
10. Инцидентность GM-CFC в нормальном костном
мо.ие составляет 100-120 10’клеток.
23.6. ГОНАДЫ
Зернистые клетки яичника могут поддерживаться и
частично сохранять функциональную активность в
первичной культуре [Orly et al., 1980], но ири субкуль-
470
ГЛАВА 23. КУЛЬТУРЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ТИПОВ КЛЕТОК
тивировании специфические функции утрачиваются.
Клеточная линии, происходящая из яичника китайско-
го хомяка [С НО-KI, Као & Puck, 1968], поддерживается
уже много лет. однако ее происхождение до настоящего
времени не идентифицировано. Хотя клетки вьцлядят
эпителиоидными на некоторых стадиях роста, они
подвергаются фибробласт-подобной модификации,
koi да они культивируются в присутствии дибутирил
цикличной АМФ [Ilsie & Puck, 1971].
Клеточные фракции из яичек выделены методом
седиментации, однако сообщений о продолжительно
поддерживаемой культуре этих фракций нет. Линия
ТМ4 представляет собой линию эпи гениальных клеток
из мышиных яичек, но их дифференцируемые свойства
не описаны. Клетки Сертоли из яичек также были вы-
делены в культуре [Mather. 1979]
23.7. СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
Культура стволовых клетко была впервые разработана
для гематопоэтических клеток, де осуществлена иден-
тификация маркеров клеточных линий, а относитель-
ная ле! кость деза! регации гематопоэтических тканей,
таких как костный моз:, переводит выделение этих кле-
гок в разряд осуществимых задач (см. протокол 23.22).
Выделение и культивирование стволовых клеток из
плотных тканей более проблематичны, но к настоящему
времени при развитии соответствующих методов до-
сти| нут прогресс в идентификации и культивировании
таких клеток, например, из молочной железы [Welni
el al.. 20031. Одной из п|х>блем является недостаток
маркеров стволовых клеток в плотной ткани, однако и
в этой области имеются опредленные сдвиги [Zhou el
al., 2001; Pollen tai., 2003], открывающие возможности
для идентификации и выделения клеток.
23.7.1. Эмбриональные стволовые клетки
Эмбриональные клетки из организмов различных ви-
дов. в частности мышей, раньше широко использова-
лись для исследования дифференцировки [ Martin &
Evans, 1974; Martin. 1975, 1978; Rizzino, 2002; ztir
Nieden et al., 2003], поскольку duh могут диффе-
ренцироваться до ряда различных клеточных типов
(мышцы, кости, нервы и т.д.). Те клетки, которые
прошли пассаж на животных, приводили к формиро-
ванию тератом, анало!ичных спонтанным тератомам
человека. Клетки, выращенные на фидерном слое,
например мышиные фибробласты SCO, будут проли-
ферировать, но не будут дифференцироваться. Когда
клетки растут на желатине без фидерно! о слоя или
в неадгерентных пластиковых чашках, образуются
узелки, которые в конечном счете дифференцируют-
ся. Фактор, ин| ибирующпй лейкемию (LIF), видимо,
является одним из основных ре!уляторных факторов,
который удерживает клетки в состоянии стволовых
клеток, в то время как ретиноиды, витамин D3 и
плоскостные полярные компоненты индуцируют ли-
ния-специфичную дифференцировку у клеток мыши
и человека [Draper el al., 2002].
В настоящее время получены культуры стволовых
клеток человеческого эмбриона, обнаружены пути их
дифференцировки, что открывает перспективы для их
использовании в восстановлении тканевых поврежде-
ний [Thomson el al., 1998; Rippon & Bishop, 2004)
23.7.2. Мульти потентные стволовые
клетки взрослого организма
Кроме того, имеется большое количество сообщений
о выделении мультипотентных стволовых клеток из
ряда взрослых тканей, включая костный мозг [Suva
el al., 2004], печень [Deng et al., 2003], головной мозг
[Vesci>vi el al., 2002; Greco & Rechl, 2003], мыщцы [Cao
el al., 2003] и пупочный канатик [Sanchez-Ramos, 2002;
Newman el al., 2003]. Идентификация мульти потент-
ных стволовых клеток из взрослых тканей открывает
неожиданно обширную область в биоло: пи стволовых
клеток, ранее закрытую из-за существования концеп-
ции и тканеспецпфпчности клеточной регенерации.
Это дает начало мнтим волнующим перспективам
для понимания коммитирования и дифференциров-
ки взрослых клеток-предшественников, но также
поднимает ряд важных вопросов. Если в головном
мозге существуют стволовые клетки, то почему не за-
мещаются нейроны? Если существует потенциал для
цирку.гяцип стволовых клеток для репопуляцпп дру-
I их тканей, то почему сателлитные клетки скелетных
мышц не замещают кардпомиоциты при повреждении
сердца, ес.ш только они не введены искусственно?
В чем биолог ический смысл, с эволюционной точки
зрения, регенеративной способности и мультипотен-
тности стволовых клеток во многих тканях, которые
никогда не используются? Та концепция, по которой
стволовые клетки могут изменять свою способность
к дифференцировке, но не прямо от одной линии к
дру:ой (например, от астро:.шальной клетки до оли-
годендороглип или от эритроидной к миелоидной), а
от производных одного зародышевого листка к про-
изводным дру: ого зародышевого листка (от таких как
нейроэктодермальные до мезодермальных [Wunnser
et al., 2004] или эндодермальных в нейроэктоджер-
мальные [Deng et al., 2003]), так сильно противоречит
установленной парадигме линейной привязанноеги.
что mhoi ие считают ее причиной атипичного развития
стволовых клеток в эктопичном участке, объясняя
это тем, что введенные стволовые клетки сливаются с
резидентными клетками-предшественниками [Alvarez-
Dolado et al., 2003; Greco & Rechl, 2003]. Тем не менее,
хотя такое слияние клеток принципиально возможно
и и: рает роль в дифференцировке некоторых эктопич-
ных стволовых клеток, доказательства пластичности
стволовых клеток весьма убедительны [Wurmser et
al., 2004]. В свете данных, доказывающих, что клеткп-
предшественннки, которые ранее считались линейно
23.7. Стволовые клетки
471
коммитированными, могут претерпевать обратные
стадии и реверсироваться млн конвертироваться в
мультикотентные стволовые клетки (см. разд. 17.1),
кажется возможным, что стволовые клетки из одной
ткани moi уть превращаться в различные стволовые
клетки с различной иотентностыо в эктоиичном сайте,
возможно, через стадию тотипотентных клеток.
23.7.3. Источники стволовых клеток
и ребота с ними
Мышь. Мнение из кервоначаеьных клеточных линий
карциномы, такие как F9 и Р19, были выделены из мы-
шиных тератокарцином, которые затем периодически
трансплантировались иод почечную капсулу | Martin &
Evans, 1974]. Линии эмбриональных стволовых кле-
ток (ES), такие как ES-D3, J1 и R1, были получены
из внутренней клеточной массы преимилантацион-
но1 о эмбриона [Evans &Kaufinan, 1981; Martin, 1981],
клеточные линии эмбрионального листка (EG) были
получены из легочного зародышевого листка [Malsui el
а]., 1991; Resnick el al., 1992]. Эти культуры moi ут быть
культивированы в недифференцированном состоянии
на фидерном слое клеток STO или в присутствии LIF
[Schamblott el al., 2002]. В долгоживущей культуре в
отсутствие LIF или фидерного слоя имеет место спон-
танная дифференцировка, в частности, если допустить
образование клеточных агрегатов. Дифференцировка
может быть спровоцирована действием ретиноидов.
плоских полярных компонентов, таких как DMSO
или НМВА, дибутирил цикличной АМФ (dbcAMP),
витамина D3, и некоторых цитокинов.
Человек. Клетки человеческой тератокарцино-
мы, такие как NTera-2 [ Paquet- Durand et al., 2004] и
ES-клетки [Thomson et al., 1998], так же, как u EG-клет-
ки [Schamblott el al., 1998], могут также быть выращены
в культуре в присутствии LIF, FGF-2, и форсколина
[Schamblott et al., 2002] с возможностью дифферен-
цировки и значительным потенциалом для тканевой
инженерии [Laslelt el al., 2003; Rippon & Bishop, 2004].
Культуры, полученные из спонтанно развившихся
эмбриональных тел, выделенные из EG-культур и де-
загрег ированные ири помощи колла! еназы и диспазы,
дают начало EBD- клеточным линиям (embryoid body
derived). Эти линии, видимо, легче поддерживаются и
имеют более длительную иродожительность жизнен-
ного цикла в культуре [Schamblott et al., 2002]. Они
также способны к дифференцировке ио ряду различных
направлений u moi ут иметь значительный потенциал
для тканевой инженерии [Kerr el al., 20031
Стволовые клетки могут быть выделены из ряда
тканей взрослого человека ири помощи FACS или
ма> нитного сортинга клеток, несмотря на недостаток
линейных маркеров, но благодаря наличию таких мар-
керов стволовых клеток, как Sca-1 [Kawadael al., 2004;
Oh el al., 2004], Kit [Das el al., 2004; Takahashi et al.,
2004], c_Met [Suzuki el al., 2004], или выбросу Hoechst
33342 [Bhatt et al., 2003].
Глава 24
КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
24.1. ПРОБЛЕМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
Получение культуры клеток из опухолей, в частности
Спонтанных человеческих опухолей, имеет те же про-
блемы, что и культуры специализированных клеток
из человеческих тканей. Опухолевые клетки должны
быть отделены от нормальных соеди нительнотканных
клеток, предпочтительно путем использования селек-
тивной среды, которая поддерживает рост опухолевых
клеток, ни не подходит для нормальных клеток. Хотя
разработка селективных сред для нормальных клеток
имеет значительные успехи (см. разд. 10.2.1 игл. 23),
достижения в опухолевых культурах ограничены рядом
различий как между образцами, так и в самой структуре
образцов опухолевой ткани. Часто удивляет то, что
опухоли, которые образуются in vivo, в результате раз-
множения клеток, не подчиняющихся регуляторным
сигналам организма, не MOiyr расти in vitro.
Существует ряд возможных причин неспособности
к выживанию некоторых опухолевых культур. Их
требования к наличию питательных веществ могут
отличаться от тех, которыми обладают эквивалентные
им нормальные клетки. С другой стороны, попытки
удалить стромальные клетки moivt лишить опухо-
левые клетки матрикса, питания или необходимых
для выживания сиjнальных молекул. Кроме того, в
культуре опухолевых клеток сильное разведение для
обеспечения достаточною количества питательных
веществ на каждую клетку может также привести к
снижению концентрации аутокринных факторов рос-
та, производимых клетками. Строго говоря, истинные
аутокринные факторы должны быть независимы от
разведения, если они секретируются на поверхности
клетки и действуют на эту же клетку, но, возможно,
некоторые так называемые аутокринные факторы
являются на самом деле гомокрииными (см. разд. 3.5),
т. е. они действуют на рядом расположенные подобные
клетки, а не только на саму клетку, высвобождающую
их. Таким образом, требуется близкое взаимодействие
клеток в популяции. Взаимодействие с определенны-
ми типами стромальных клеток может обеспечивать
паракринные взаимодействия, если строма способна
продуцировать требуемые факторы роста, как спон-
танно существующие, так и возникающие в ответ на
сш налы от опухолевых клеток, необходимые для их
выживания.
Возможно, что опухолевые клетки не имеют тонкой
зависимости от факторов роста как нормальные клетки
аналогичной ткани, из которой произошла опухоль.
Отц'холевые клетки мот ут продуцировать эндогенные
аутокринные факторы роста, такие как TGF-a, и искус-
ственное введение экзогенных факторов роста, таких
как EGF, может привести к конкуренции за одни и те
же рецепторы. Более тою, ответ опухолевой клетки на
фактор роста или гормон будет зависеть от тою, какие
еще факторы роста присутствуют в ткани, некоторые
из которых, возможно, продуцируются самой опухо-
левой клеткой, и от состояния клетки. Нормальная
клетка, способная к экспрессии супрессоров роста, и
генов старения, может отвечать на эти сш налы иначе,
чем опухолевые клетки, в которых один или более из
этих юнов инактивированы или мутантны и в которые
иперэкспрессируют антагонистические ohkoi ены,
инициирующие неконтролируемый рост.
Поэтому существует мною возможных причин
тою. что популяция опухолевых клеток иначе, чем
нормальные клетки той же линии, отвечает на пи-
щевые в митогенные воздействия окружения. Для
подтверждения этого различия требуется больше ин-
формации об опухолевых клетках, однако в результате
существования гетерогенности опухоли первой задачей
является снижение этой гетерогенности. Имеющиеся
сегодня данные о пищевых потребностях индивидуаль-
ной опухолевой линии клеток пока не могут успешно
использоваться в терапевтических целях. Поэтому
большой tipoipecc в терапии может быть достш нут
в результате изучения ответа опухолевых клеток на
воздействие факторов роста и исследования различий
в путях внутриклеточной передачи сигнала.
Возможно, что основная часть клеток в опухоли
имеет ограниченное время жизни в результате ге-
нетических аберраций, терминальной дифференци-
ровки, апоптоза и естественного старения, и только
некоторые клетки как анало| и популяции стволовых
клеток в нормальной ткани обладают способностью к
выживанию. Низкая концентрация клеток в культуре
может привести к снижению количества этих клеток,
а также их взаимодействию с другими клетками, так
что выживание их становится невозможным. Клетки
многоклеточных животных, в отличие от прокариот,
плохо выживают при выделении из организма. Даже
опухолевые клетки еще продолжают оставаться эле-
ментами многоклеточного органа, им может* потре-
24.2. Взятие образцов
473
боваться постоянное клеточное взаимодействие для
выживания. Судьба опухоли для хозяина определя-
ется неконтролируемой инфильтрацией опухолевых
клеток в ткани и их колониальным ростом, однако
происхождение большей части клеточной популяции
может быть связано с относительно небольшим коли-
чеством трансформированных стволовых клеток [Jones
et al., 2004, Al-Hajj et al., 2004]. Этот пул стволовых
клеток может быть таким малым, что его разведение
в эксплантате приводит к лишению клеток основных
необходимых условий для выживания, в частности па-
ракринных факторов роста, получаемых от стромаль-
ных элементов, и гомокринных факторов, от других
опухолевых субклонов.
Целью исследователя становится создание правиль-
ных условии определенного нишевого и гормонального
окружения или, при невозможности этого, в предостав-
лении некоторого поддерживающего окружения, — не-
определенного, но тем не менее способной» обеспечить
выживание соответствующей или репрезентативной
популяции. Существует тенденция использования
сыворотки и фидерных слоев для поддержания роста
опухолевых клеток, и только некоторые опухоли спо-
собны расти на бессывороточной среде. Mhoi не транс-
формированные клетки не ишибируются действием
TGF-fJ. Поэтому удаление сыворотки изсреды исполь-
зуется для решения главной проблемы ищ ибирования
роста фибробластов. Адаптация среды, разработанной
для эквивалентных нормальных клеток, пока остается
наиболее ящичным подходом к получению линий опу-
холевых клеток, даже ири добавлении минимального
количества сыворотки или кондиционированной среды,
полученной от других клеток [Dairkee et al., 1995]
24.2. ВЗЯТИЕ ОБРАЗЦОВ
Помимо решения проблемы избыточного роста со-
единительной ткани или сосудистых клеток, которые
стимулируются к инвазии и пролиферации ростом
mhoihx опухолей, получение культуры опухолевых
к четок требует отделения трансформированных клеток
от нормальных клеток эквивалентной ткани, которые
мо|ут иметь аналотчные характеристики. Более того,
хотя любой раздел желудочно! о эпителия может рас-
сматриваться как репрезентативный д-ш данной специ-
фической зоны слизистой желудка, опухолевая ткань, в
зависимости от генетических вариаций и естественной
селекции развития, обычно гетероген на и состоит из
серий часто разнообразных субклонов, демонстриру-
ющих значительное фенотипическое разнообразие.
Убедиться в том, что культуры, выделенные изданной
гетерогенной популяции, являются репрезентативны-
ми, трудно, и hukoi да нет полной |арантии, если только
для исследования не берется опухоль целиком и выжи-
ваемость не составляет 100%. Поскольку эти условия
практически недостижимы, на практике культура опу-
холи представляет собой нечто среднее. Предпола|ая,
что репрезентативные субпопуляции сохраняются в
культуре и способны к взаимодействию, полученная
культура может быть подобна исходной опухоли.
Проблема селективности приобретает особое
значение, кшда образцы берутся из вторичных мета-
стазов, которые часто растут лучше, но могут не быть
типичными ни для первичной опухоли, ни для дру । их
метастазов. Тем не менее интересно предположить, что
существует некая аналотя между метастатическими
проявлениями и эктопическим развитием стволовой
клетки (см. разд. 23.7.2).
В свете этой мно|огранной проблемы, стоящей на
пути культивирования опухолей, удивительно, что в
этой области вообще могут быть получены какие-то
достоверные данные. Однако они получены, это может
быть результатом: 1) вышеупомянутой автономии
опухолевой популяции, которая может обеспечить про-
лиферацию опухолевых клеток в условиях, в которых
невозможно деление нормальных клеток; 2) возраста-
ния размеров иролиферативнО|О пула, который может
быть больше, чем у большинства нормальных тканей;
3) способности опухоли давать начало новой опухоли
как ксенотрансплантату у мышей с подавленным имму-
нигетом и возрастанию успеха в выделении культуры
клеток из ксенотрансплантатов и 4) склонности давать
начало иммортализованным постоянным линиям, бо-
jiee выраженной у злокачественно трансформирован-
ных, чем у нормальных клеток. Это последнее свойство,
более чем какие-то другие, позволяет вести широкие
исследования, выделяя популяции опухолевых кле-
ток даже с относительно нормальными процессами
дифференцировки, несмотря на неопределенность их
отношений с опухолью. из которой они выделены.
Хотя неопределенность состояния постоянных
клеточных линий сохраняется, тем не менее они явля-
ются ценным источником клеточных линий человека
Ajih молекулярных и вирусологических исследований.
Вопрос о том, являются они репрезентативными для
прогрессивного развития опухоли, развитие которой
ускоряется в культуре, за счет таинственных популяций
стволовых клеток или это исключительно артефакт,
возникающий in vitro, еще должен быть решен. Полу-
ченные Клеточные линии определенно отличаются от
большинства опухолевых культур ранних пассажей, но
moi ут еще содержать значительное количество элемен-
тов генотипа роди сельских клеток, от которых они про-
изошли. Их бессмертность, с большей вероятностью,
устанавливается благодаря делеции или супрессии
генов, индуцирующих старение клеток [Pereira-Smith
& Smith, 1988, Goldstein et al., 1989; Holt el al., 1996;
Sasaki el al., 1996] и возрастанию теломеразной актив-
ности [Bryan & Reddel, 1997; Bodnar et al., 1998], а не
сверхэксиресси генов, имеющих отношение к малиг-
низации как таковой.
24.3. ДЕЗАГРЕГАЦИЯ
Некоторые опухоли, типа человеческой карциномы
яичников, некоторые |лиомы и многиетрансплантиру-
474
ГЛАВА 24. КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
емые опухоли 1 рызунов ле! ко деза! rpei ируются чисто
механическими способами типа пипетирования или
разделения на ситах (см. разд. 12.3.8), которые могут
также способствовать минимизации стромальной
контаминации, поскольку стромальные клетки часто
более прочно связаны с волокнистой соединительной
тканью. Мнотие из обычных человеческих карцином,
однако, являются твердыми или уплотненными, и
опухолевые клетки расиолатаются среди большого
количества волокон стромы, что делает механическую
деза! регацию трудной, хотя возможной ири соскреба-
нии среза плотной опухоли, успешно используемой для
высвобождения опухолевых клеток в так называемой
технике разбрыакивания (spillage) [Lasfarcues, 1973;
Oieetal., 1996].
Б большинстве случаев ферментативное разру-
шение оказывается предпочтительнее ко сравнению
с механической дезафеюцией. Хотя трипсин часто
использовался для этой цели, эффективность ею про-
тив волокнистой соединительной ткани О1раничена,
и это может уменьшать эффективность отбора опухо-
левых клеток [Lounis et al., 1994J; было обнаружено,
что неочищенная коллагеназа более эффективна для
нескольких различных типов опухоли [Dairkee et al.,
1997]. Ферментативное разрушение также высвобож-
дает mhoi о Стромальных клеток, что требует дополни-
тельных методов ведения культуры для их устранения
(см. разд. 24.7; рис. 15.7г; цв. вкладку 23). Обработ ка
колла! еназой может быть проведена в течение не-
сколько часов или даже дней в полной среде для роста
культуры (см. протокол 12.8).
Обширный некроз - также ирсюлема опухолевой
ткани, с которой обычно не сталкиваются исследо-
ватели, работающие с нормальной тканью. Обычно
прикрепление к субстрату жизнеспособных клеток поз-
воляет удалить некротизированные при последующем
пассаже, но если количество некротического материала
велико и с трудом удаляется при иссечении, то для
тою, чтобы удалить некротизированные клетки, может
оказаться необходимым использовать разделение в
Ficnll-Hypaque (см. протокол 12.10).
24.4. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
Некоторые клетки, например макрофас и, прикрепля-
ются к субстрату в процессе коллагеназною разруше-
ния. но они могут быть удалены переносом суспензии
дезагрес ированных клеток в свежий флакон, после
удаления коллагеназы. Прикрепившиеся клетки мо1ут
остаться во флаконе. Их можно отдельно культивиро-
вать, или облучить, или обработать митомицином С с
последующим использованием в качестве фидерно! о
слоя (см. разд. 14.2.3; цв. вкладки 6г, 11а, 156; прото-
колы 23.2,23.4). Пересеянные клетки будут содержать
mhoi о стромальных клегок (главным образом, фиброб-
ластов и эндотелиальных клеток), некоторые из кото-
рых мшут быть удалены путем повторного переноса
в свежий сосуд через 2—4 ч, поскольку опухолевые
клетки, в частности кластеры злокачественно изме-
ненною эпителия, часто требуют большею времени
для прикрепления. Этот метод удаления методом се-
рийных переносов, всюбще i оворя, только отчасти дает
успешный результат, но, тем не менее, обычно, требует
селективных условий культивирования для полною
удаления стромальных клеток. Тем не менее он может
иметь то преимущество, что позволяет использовать
стромальные клетки в качестве фидерно! о слоя.
Для удаления стромальной контаминации раньше
использовался физический метод разделения [Csoka
el aL, 1995; Oie el al., 1996; см. также гл. 15J, но, в об-
щем, эти методы подходят, только если клетки будут
использоваться немедленно, поскольку в отсутствие
селективных условий обычно позже развивается стро-
мальный избыточный рост. Тем не менее показано, что
ма1 нитный сортиш (см. разд. 15.3.2 и цв. вкладку 23) с
анти-фибробластными микробус и нами (см. рис. 15.7/;
Miltenyi Biotech) является в Этом случае эффектив-
ным методом.
Клонирование как метод очистки имеет определен-
ные ограничения, поскольку опухолевые клетки в пер-
вичной культуре часто имеют низкую эффективность
посева (<0,1%). В качестве метода выделения не только
опухолевых клеток, но и опухолевых стволовых клеток
было предложено суспензионное клонирование [Ham-
burger & Salmon, 1977J. Однако к тому времени, когда
клон вырастает до достаточно большою количества
клеток, которые можно использовать для исследования
клетки могут иодвер! нуться значительным изменени-
ям, и даже стать достаточно гетерогенными в результате
генетической нестабильности. Клонированные изоляты
из опухоли должны быть исследованы в совокупности
и даже в сокультуре для полной и достоверной интер-
претации данных.
Имеются определенные сложности в получении
и размножении клеточных линий из первичных
клонов, в частности из клонов, выделенных методом
суспензионною клонирования. Может случиться, что
клетки, являясь клоногенными, ири этом не будут
стволовыми, либо, будучи первоначально стволовы-
ми, спонтанно перейдут в зрелое состояние в резуль-
тате суспензионною роста и утраты регенеративной
способности. Тем не менее клеточные штаммы, кло-
нированные прямо из опухоли, moi ли бы быть ценным
материалом для изучения опухолевою клональною
многообразия и взаимодействия. Эти штаммы moivt
представлять собой перспективную область буду-
щих исследований, в частности, ири разработке и
использовании селективных условий для выделения
опухолевых стволовых клеток.
24.5. ХАРАКТЕРИСТИКА
Выделение клеток из опухоли может дать нача-
ло нескольким различным типам линий клеток.
Помимо неопластических клеток, фибробластов
соединительной ткани, клеток сосудистого эндо-
24.6. Размножение клеточных линий
47S
телия и гладкомышечных клеток, инфильтрующие
лимфоциты, гранулоциты и макрофа! и, так же как и
элементы нормальной ткани, в которой произошло
новообразование, — все эти элементы могут пережить
эксплантацию. Гематопоэтические компоненты редко
формируют линии клеток, хотя гематопоэтические
клеточные линии были получены из маленькой
клетки карциномы легкою, вызвав серьезное за-
мешательство, потому что карцинома также нмееч
тенденцию образовывать суспензионные культуры,
которые могут экспрессировать миелоидные марке-
ры [Ruff & Pert, 1984]. Макрофа! и и i ранулоциты
являются хорошо прикрепляющимися и непролифе-
рирующими клетками, поэтому они обычно теряются
в субкультуре. Гладкомышечные клетки не делятся
без соответствующих факторов роста и селективной
среды. Поэтому главным потенциальным контами-
нантом опухолевой культуры являются фибробласты,
эндотелиальные клетки и нормальные эквиваленты
неопластических клеток.
Среди этих контаминантов главную проблему со-
ставляют фибробласты, которые jieiKO растут в куль-
туре и moi ут также отвечать на митогенные факторы
опухолевою происхождения. Точно так же эндотели-
альные клетки, особенно в отсутствие фибробластов,
могут давать ответ на выделенные опухолью факторы
ан| иогенеза и ле! ко размножаться. Труднее определить
роль нормального эквивалента клеток, поскольку их
подобие неопластическим клеткам приводит к тому,
что соответствующие эксперименты трудно проана-
лизировать. Критерии оценки клеток должны быть
выбраны так. чтобы исключить нормальные клетки
Наиример, эндотелиальные клетки являются пози-
тивными по фактору VIII, подвер! аются контактному
uni ибированию и рост их культуры чувствителен к
ограничению плотностью клеток. Фибробласты имеют
характерную веретеновидную форму, рост их является
ограниченным плотностью популяции (хотя меньшей
степени, чем эндотелиальные клетки), имеют конеч-
ную продолжительность жизни 50 поколении или
около этою, продуцируют колла! ен типа I и строю
диплоидны.
В целом, нормальные клеточные компоненты,
фенотипически эквивалентные опухолевым клеткам,
труднее выделить и устранить. Клетки будут дипло-
идны, хотя некоторые опухолевые клетки moi ут быть
близки к диплоидным. Они обычно зависимы от
прикрепления к субстрату и будут иметь конечную
продолжительность жизни, хотя Опять же существукл
случаи постоянных клеточных линии нормальных
эпителиальных клеток [Вон Lamp et aL, 1988J, и, если
клетки эпителиальные, то они, более вероятно, будут
ишибироваться TGF-0, содержащимся в сыворотке.
Опухолевые клетки, вероятно, обнаружат генетичес-
кие отклонения, такие как амплификация ohkoi енов.
транслокаций, и делений гена- супрессора которые
можно обнаружить FISH (см. протокол 27.9). Ве-
роятно также, что опухолевые клетки аннюгенны и
обнаруживают более высокую экспрессию урокиназа-
подобных активаторов плазминогена (нРА), а гакже
обладают инвазивной активностью (см. разд. 18.6).
В поведенческом аспекте способность неоплас-
тических клеток расти на предварительно сфор-
мированном монослое нормальных клеток тою же
типа - хороший критерий идентичности для опухо-
левых клеток и потенциальная модель для их распоз-
навания. Нормальные клетки также обеспечивают
формирование фидерного слоя, для поддержания
роста опухолевых клегок. Глиома, например, будет
хорошо расти (лучше, чем на пластмассе в некоторых
случаях) на предварительно сформированном моно-
слое нормальных 1лиальных клеток [MacDonald el
al., 1985J, но их нормальные копии не обладают этим
качеством. Этот может быть верно также для клеток
гепатомы и карциномы кожи.
Нормальные клетки в условиях предельно на-
сыщенного рос га имеют тенденцию к содержанию в
популяции небольшой фракции делящихся клеток
(см. разд. 18.5.2 и 21.11), тО1да как неопластические
клетки продолжают быс ро делиться после достижения
конфлюэнтности. Поддержание культуры при высо-
кой плотности может инО1да обеспечивать условия
для избыточною роста неопластических клеток (см.
разд. 25.3.6 и протокол 18.3).
24.6. РАЗМНОЖЕНИЕ
КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ
Первичные культуры клеток карциномы не все1да
moi ут быть подвер! нуты пересадке с трипсинизацией.
и многие клетки в первичной культуре мшут быть
не способны к размножению, из-за генетических или
фенотипических отклонений, конечной дифференци-
ровки, или недостатка питательных веществ. Однако
некоторые первичные культуры, выделенные из опу-
холи, могут быть субкультивированы, что открывает
огромные возможности. Существование субкультуры
опухолевых клеток подразумевает, что в субкультуре
нет дру! их клеток, которые имеют избыточный рост.
Возможен вариант, когда исследуемые клетки имеют
более высокую скорость роста, чем загрязняющие их
нормальные клетки, поэтому они moi ут быть доступны
для клонирования или друт их методов селекции куль-
туры (см. разд. 10.2.1,14.6,24.7.2).
Одним из 1лавных преимуществ субкультуры
является возможность ее роста и размножения. На-
ращенные клетки MoiyT быть заморожены. Реплици-
рованные культуры используют для характеризации
и исследования определенных параметров, таких как
геномные изменения, изменения в экспрессии генов,
химиочувствительность и инвазивность. Отрицатель-
ным качеством субкультуры является последующее
развитие с серьезными отклонениями от первона-
чальною фенотипа клеток, выделенных из опухоли,
вследствие свойственной клеткам генетической
неустойчивости и селективной адаптации клеток к
окружению в культуре.
476
ГЛАВА 24. КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
24.6.1. Постоянные клеточные линии
Одним из главных кри гериев неопластического про-
исхождения культуры является способность форми-
ровать постоянную линию клеток, которая обычно
анеуилоидна, t етеронлоидна, нечувствительна к
ограничению роста плотностью клеток, не зависит
от прикрепления к субстрату и часто туморО1енна
(см. разд 18.6.2) Отношения атой клеточной ли-
нии к первичной культуре и родительской опухоли
трудно оценить, т. к. клетки не всегда типичны для
популяции опухоли. Клетки постоянной линии мот ут
представлять собой* 1) дальнейшую трансформацию,
стимулируемую адаптацией к культуре, возможную
в соответствии с непостоянными тенотниическимн
характеристиками опухолевой клетки. или 2) опреде-
ленную субт руину или стволовые клетки популяции
опухоли. В настоящее время вторая возможность
кажется более вероятной [Petersen el al., 2003], так
как появление постоянной клеточной линии (часто из
колоний в пределах монослоя) иредиолатает, что эта
постоянная линия является результатом иммортали-
зации малой субгруииы клеток нонуляции опухоли,
развившейся благодаря обеспечению соответству-
ющих условий для их размножения.
Способность формировать постоянные линии
клеток является полезным критерием для подтверж-
дения злокачественного происхождения, и некоторые
авторы подтверждают что характеристики клеточных
линий (например, туморогенность, щеголемические
изменения, химиочувствительность и т.д.) коррели-
руют с опухолевым происхождением [Tveil & Pihl
1981; Minna et al., 1983]. В любом случае эти кле-
точные линии представляют собой полезный экспе-
риментальный материал, хотя время, требуемое для
их развития, делает непосредственное клиническое
применение трудным. Линии опухолевых клеток
описаны в ряде кнш Masters и Palsson [Masters &
Palsson. 1999-2000].
своим успехом продукции пептидных факторов роста
мелкоклеточной формой рака лещих, для которых
разработана эта среда. Некоторая доля биопсий, хотя
и не все, будут расти на чистой среде HITES; другие
будут выживать при добавлении низкой концент-
рации сыворотки (например, 2,5%). Среда HITES
является модифицированной средой RPMI 1640 с
добавлением шдрокортизона, инсулина, трансфер-
рина, эстрадиола и селена. Наиболее важными из
Этих компонентов являются, видимо, селен, инсулин
и трансферрин, они встречаются в составе многих
бессывороточных сред (см. табл. 10.2). Группа NCI
также производит селективную среду для аденокар-
циномы, ио общему мнению, подходящую для лег ких,
толстой кишки и, возможно, мнО1 их дру। их карцином
[Brower el а!.. 1986). Зга среда также в основе имеет
RPMI 1640, в которую добавлены селен, инсулин и
трансферрин, а также гидрокортизон, EGF, трии-
одтиронин, BSA и пируват натрия (см. табл. 10.2).
Другое селективные среды успешно используются
для карциномы простаты [Uzgare el al., 2004J, желч-
ного пузыря [Messing el al., 1982], и молочной железы
[Ethier el al., 1993].
Другие типы селективных сред основаны на ме-
таболическом инг ибировании роста фибробластов и
не являются специфически оптимизированными для
какого-либо типа опухолей (см. разд. 14.6). Тем не
менее пока не найдены ингибиторы, которые будут
эффективны, за исключением использования моно-
клональных антител против фибробластов, разрабо-
танных Edwards el al. [1980] и Paraskeva el al. [1985].
Эти антитела успешно используются в выделении
культуры клеток из рака гортани и толстой кишки.
Показан также положительный эффект использова-
ния антител для позитивной селекции эпителиальных
клеток или негативном сортинге стромальных клеток
и удалении их из суспензии опухолевых клеток путем
иэннища или магнитного сортинга (см. разд. 15.3.2,
24.4: рис. 15.7г; цв. вкладку 23).
24.7. СЕЛЕКТИВНАЯ КУЛЬТУРА
ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
Три t лавных методических подхода в культуре тканей
были адаптированы к культуре опухолевых клеток:
использование селективных сред (см. разд. 10.2.1,
14.6), применение конфлюэнтных фидерных слоев
(см. разд. 24.7.2), и суспензионное клонирование (см.
разд, 14.3,14.8.5).
24.7.1. Селективные среды
Из-за присущих опухолевым клеткам проблем ва-
риабельности и гетерогенности существует лишь
несколько сред, которые разработаны для них как
селективные. Одной из таких сред является HITES
[Carney et al., 1981; см. табл. 10.2], которая обязана
24.7.2. Конфлюэнтные
фидерные слои
Метод конфлюэнтных фидерных слоев (см. рис. 14.4
и 14.10; цв. вкладку бе, г), возможно, более чем любой
другой метод, успешно применяется для культиви-
рования опухолевых тканей разных типов. Smith и
другое [например, Lan el al., 1981] использовали кон-
флюэнтные фидерные слои эмбриональной тонкой
кишки человека FHS74INT для того, чтобы вырастить
эпителиальные клетки карциномы молочной железы, в
среде, кондиционированной другими клеточными ли-
ниями. В более поздних сообщениях предполагается,
что использование селективных культур в М CD В 170
является более воспроизводимым подходом [Ham-
mond el al., 1984].
Фидерные слои мышиных клеток ЗТЗ или эмбри-
ональные фибробласты БТОбыли успешно исиользо-
24.7. Селективная культура опухолевых клеток
477
ваны для культивирования клеток рака груди, толстой
кишки и базалномы [ Rhein wald & Beckett, 1981; Leake
etal., 1987]. На том же основании можно освободить от
любых контаминаций нормальным эпителием клетки
карциномы молочной железы, если посадить их на
конфлюэнтную культуру нормальных клеток эпителия
молочной железы с прекратившимися за счет контакт-
ною ин1 ибирования ростом (см. иротокол 23.3)
ПРОТОКОЛ 24.1. Выращивание клеток
на конфлюэнтном фидерном слое
Схема
Обработать фидерные клетки в середине экспонен-
циальной фазы митомицином С и пересеять клетки
для получения конфлюэнтного монослоя. Посеять
на конфлюэнтный монослой опухолевые клетки,
отделенные от биопсийною образца коллагеназ-
ным расщеплением или из первичной культуры
трипсином (рис. 24.1). Колонии из эпителиальной
опухоли moivt образовываться от 3 недель до 3 ме-
сяцев. Фибросаркома и глиома не всетда образуют
колонии, но ищут инфильтрировать фидерный слой
и постепенно давать сильный рост
Материалы
Стерильные:
• Фидерные клетки (например, ЗТЗ, STO, ЮТ 1 2,
или FHS74Int)
• Мнтомииин С (Sigma), 1 mi/мл
Замечание: При использовании фидерных клеток
впервые рекомендуется сделать кривую доза-ответ с
митомицином С для того, чтобы быть уверенным, что
выбранная доза позволяет фидерному слою выжить
в течение 2—3 недель, но не дает клеткам в фидерном
слое возможности дальнейшей репликации после
примерно двух периодов удвоения. В этом случае
поступайте следующим образом:
а) Обработайте клетки митомицином С в кон-
центрации 1 100 mki /мл в течение ночи (18 ч)
в 25-см'флаконе
б) Триисивизируйте клетки и пересейте все со-
держимое из 25-см2 флакона в 75-см2флакон
с 20 мл свежей среды.
в) Выращивайте клетки в течение 3 недель, сме-
няя среду дважды в неделю
।) Окрасьте культуру и проверьте выживание
колоний
• Ростовая среда
• Ксьыагеназа, 2 000 Ед/мл, степень очистки CLS
(Worthington) или ее эквивалент
• Трипсин. 0,2 5 %, в PBSA
* Биопсийный образец опухоли или первичная
культура
• Нэш нутые пинцеты
* Скальпели с лезвиями #22
• Чашки Петри для иссечения, как для первичной |
культуры
Протокол
1. Вырастите фидерные клетки до 80% конфлюэн-
гности в шести 75-см'флаконах.
2. Добавьте митомицин С до получения необхо-
димой конечной концентрации, обычно около |
5 мкг/мл.
3. Инкубируйте клетки в течение ночи (-16 ч) с
митомицином С.
4. Удалите среду с митомицином С, промойте мо- I
нослой свежей средой. ।
5. Вырастите клетки в течение последующих 24-
48 ч.
6. Триисинизируйте клетки и пересейте их в
25-см'флаконе при концентрации 5x10’кл. мл
(1x10’ кл. см2). И нкубируйте культуру в течение
24 ч. ' ।
7. Если вы используете биопсийный материал, об-
разец следует иссечь и поместить в коллагеназу I
на шаге 2
8. Посейте суспензию клеток из биопсии примерно I
20—100 mi флакон, в два 25- см2флакона, так,
чтобы каждый флакон содержа.'! 6 мл суспензии. .
Отберите но 1 мл суспензии из каждо! о флакона
и добавьте к 4 мл среды в оставшихся двух флако-
нах. Треч ью пару флаконов следует сохранить как I
контроль сохранности фидерного слоя и выжи- ।
вания клеток после обработки митомицином С.
Если вы используете первичную культуру, трии-
синизируйте или отделите клетки в растворе кол-
лагеназы, конечная концентрация 200 Ед . мл (см.
иротокол 12.8), посейте на фидерный слой с кон-
центрацией Ю'кл./мл в двух флаконах и Ю’кл./мл
в двух флаконах. Если клетки выделены из глиомы
(цв. вкладка 156) или фибросаркомы (цв. вкладка 1г),
колонии мшут не появляться, поскольку клетки опу-
холи свободно мигрируют среди фидерных клеток.
Выживание клеток этих опухолей будет подтверж-
дено только путем субкультивирования клеток без
фидерного слоя (к этому времени нормальные клетки
элиминируются).
Важно подтвердить видовую специфичность любой
клеточной линии, выделенной этим методом, ajiH того
чтобы исключить случайную контаминацию устой-
чивыми клетками из фидерного слоя. Вид исходного
источника клеток может быть подтвержден хромосом-
ным анализом (см. протокол 16.7) и изоферментный
электрофорезом (см. протокол 16.10), если фидерный
слой имеет иное видовое происхождение, отличное от
первичной культуры Если фидерные клетки отно-
сятся к тому же виду, что и используемая первичная
культура, то необходимо исследование профиля ДНК
478
ГЛАВА 24. КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
Инкубируйте тщательно измель-
ченные кусочки в коллагеназе в
течение 1-5 дней
Диспергируйте осторожным ги-
петироеанием, перенесите в про-
бирку и оставьте для осаждения
на 2-3 мин
Соберите супернатант, центрифу-
гируйте и ресусиендируйте осадок
и посейте на сформированный
фидерный слой
Инкубируйте 1-3 недели {в зависимости от скорости роста)
Рис. 24.1. Конфлюэнтные фидерные г.юи. Эпителиальные класт еры после обработки коллагеназой будут формировать ко-
лонии эпителиальных клеток на конфлюэнт ных фидерных е юях, таких как фетальный эпителий тонкой кишки (FHS74Int),
нормальной i.iHii человека или облученные клетки ЗТЗ или STO cells Диспергированные клетки, даже при контаминации
стромальными клетками, могут также образовывать колонии на конфлюэнтных фидерных слоях со значительным ограни-
чением избыточного роста стромальных клегок. Селекция проводится в отношении стромальных компонентов, при этом нс
затрагивав г клеток нормальною эпителия
(см. протокол 16.9) или ДНК-фингериринтин|а (см.
протокол 16.8) как фидерного слоя, так и любой куль-
туры, которая была получена из первичной культуры.
Затем следует провести сравнение результатов с ис-
следованием биопсии или любой ткани, полученной
от донора.
24.7.3. Суспензионное клонирование
Трансформация клеток in vitro приводит к возраста-
нию их клоно!енности в aiape (см. разд. 14.3, 18.5.1);
показано также, что туморогенность корррелирует
со способностью клонирования в мети л целлюлозе
[Freedman & Shin, 1974] (см. протокол 14.5). По-
скольку клетки могут быть клонированы в суспензии
прямо из дезагре! ированной опухоли [Hamburger &
Salmon, 1977J или, по крайней мере, образовывать
больше колоний, чем нормальные клетки (которые,
возможно, и не будут клонами), постольку суспен-
зионное клонирование может рассматриваться как
потенциально селективный метод. Тем не менее
эффективность колоннеобразовання часто бывает
очень низкой (часто <0 1%). а клетки, выделенные из
колонии, размножаются с трудом.
Хотя этот метод не приводит к образованию клеточ-
ных линии, он использовался раньше для скриниша
лекарственных препаратов в отношении биопсийных
образцов (см.разд. 4.1). FACS или иммунома! нитныи
положительный сортиш клоногенных клеток путем
экспрессии маркеров клеток, таких как Sca-1, Kit
[Takahashi el al., 2004 J, u транспортер ABC [Zhou el al.,
2001J (см. также разд. 23.7.3) и отрицательный сортиш
для более дифференцированных линейных маркеров
может позволить 0601 атить пул предиола! аемых ство-
ловых клеток, которые мшут стать лучшей мишенью
для изучения молекулярных механизмов действия
лекарственных препаратов и их скрининга.
24.7.4. Гистотипическая культура
Отдельно от собственно органной культуры (разд. 25.2),
которая имеет не больше фундаментальныхотлпчпй от
опухолевой ткани, чем нормальная ткань, существуют
методы, специфически применимые к опухолевой
культуре: сфероидная культура (см. протокол 25.2)
и культура в фильтрующих колодцах (лунках) (см.
протокол 25.4).
Сфероиды. Нормальные стромальные клетки не
образуют сфероидов или даже не включаются в состав
сфероидов, полученных из опухоли. Таким образом,
культура клеток, выделенная из опухоли, которой
позволяют образовывать сфероиды на неадгезивных
субстратах, таких как агароза (см. протокол 25.2), будет
иметь тенденцию к избыточному росту по сравнению
со стромальными компонентами. Некоторые культуры
из рака молочной железы и мелкоклеточной легочной
карциномы мшут дать сфероиды или неправильные
клеточные оргоноиды, которые всплывают и MOiyr
быть собраны из верхне! о слоя среды, при этом стро-
мальные элементы останутся внизу. Тем не менее сфе-
роиды или органоиды не BCeiaa быстро появляются в
культуре, и иногда требуются недели или даже месяцы,
чтобы образовались предположительные производные
из малой клеточной популяции в опухоли. В друз их
случаях, например для карциномы молочной железы,
органоиды moi ут представлять собой нормальные
эпителиальные компоненты [Speirs, 2004]. Генерация
24.7. Селективная культура опухолевых клеток
479
сфероидов возникает не во всех опухолевых культу-
рах, но уже описана для нейробластомы, меланомы и
глиомы (см. разд. 25.3.3). Их потенциал для получения
клеточных линий еще не полностью использован,
тем не менее для исследовательских целей большее
внимание уделяется прикрепленным монослоям и
суспензионным колониям в at аре.
Вкладыши для фильтровального колодца. Вкла-
дыши для фильтровального колодца созданы для того,
чтобы воссоздавать клеточно-матриксное взаимодей-
ствие в тканях, из которых получены клетки. Таким
образом, они представляют собой идеальную модель
для исследований инвазивностн (см. разд. 18.6.3),
аниютенеза (см. разд. 18.6.4), и других нарушений
клеточных взаимодействий в оцухоли.
возможность получения линии «голых» мышей или
имеются препятствия для проведения неонатальной
тимэктомии и облучения, то ксенотрансплантаты
следует рассматривать как первый mat в генерации
культуры. Хотя при этом может быть получено только
небольшое количество опухолей, выделенную опухоль,
возможно, будет легче вести в культуре и можно будет
сделать несколько попыток выделения культуры с пос-
ледующим пассажем культуры опухоли через мышей.
Тем не менее следует проявить особую тщательность,
поскольку ири выделении клеток фидерного слоя из
мышей Следует убедиться, что Клеточные линии, вы-
жившие в итоге, являются человеческими, а не мыши-
ными. Подтверждение происхождения производится
методами изоферментного и хромосомного анализа
(см. разд. 16.5)
24.7.5. Ксенотрансплантат
Kot да культуры получают из опухолей человека, то
недостаток материала и редкая возможность повторить
биопсию затрудняют повторное получение клегок и тем
более исключают многократное получение культуры
одной и той же опухоли. Рост некоторых опухолей у
иммунодепрессивных животных позволил разрабо-
тать альтернативный подход [Rofsiad, 1994], который
позволяет получить значительно большее количество
опухолевой ткани. Было обнаружено, что культуры
мтут быть инициированы гораздо легче путем извле-
чения ее из ксенотрансплантата, перевитого животному
из родительской опухоли, хотя до настоящего времени
неясно, происходит это благодаря доступности боль-
ше! о количества материала, обогащению материала
трансформированными клетками, прогрессии опухоли
или модификации опухолевых клеток в организме
rerepo.'iotичного хозяина (например, иод действием
мышиных ретровирусов).
Используется два ичавных типа хозяев: генети-
чески бестимусные «голые», которые являются де-
фицитными ш» Т-клеткам [Giovanella el al., 1974], и
неонатально тимэктомированные животные, которые
затем иодвер!аются облучению и обрабатываются
цитозинарабинозидом [Selby el al., 1980; Fergusson el
aL, 1980]. Первый тип хозяев дорщ для приобретения
и сложен для содержания, но поддержание опухоли
при этом длительнее. Тимэктомированные мыши
более хлопотны при подготовке, но дешевле и ttpoiue
получить их в большом количестве. Тем не менее они
могут вновь стать иммунокомпетентными н, в конеч-
ном итого, через несколько месяцев отторс нуть при-
витую опухоль. Приживаемость опухоли улучшается
путем использования мышей, которые, помимо тимуса,
лишены также селезенки бл31 одари генетическим из-
менениям (например, мыши seid) пли спленэктомии,
либо путем сублетально! о облучения «голых» мышей.
Имплантация с использованием фибробластов или
Матрнгеля также, как оюбщают, улучшает прижива-
емость опухоли [Topley el al., 1993]. Если существует
24.7.6. Характеризация культур
опухолевых клеток
Общие характеристики, которые могут быть использо-
ваны для идентификации опухолевых клеток в куль-
туре, описаны в । л. 18 (см. разд. 18.3-18.6 и табл. 18.1).
Хотя эти характеристики часто выражены в постоянных
клеточных линиях, их обнаружение в культурах ранних
пассажей может быть более сложным в результате боль-
шей гетерогонности. Может потребоваться определение
специфических генетических нарушений, полисомия,
хромосомные делеции, транслокации, су иерэксирессия
мутагена и мутация или деления гона опухолевого роста
(см. разд. 27.8.1). Подобным образом, t инерэксирессия
продуктов онкогона, таких как мутантный гон р53 или
erfe-B, может быть обнаружена методами иммунного
окрашивания, приготовления цитологического препа-
рата либо проточной цитометрии
24.7.7. Сохранение тканей замораживанием
Часто оказывается затруднительным использовать
весь объем ценного материала, который дает большая
биопсийная масса В этих случаях можно сохранить
ткани замораживанием.
]
ПРОТОКОЛ 24.2. Замораживание биопсии
Схема
Измельчить опухоль, обработать кусочки DMSO и |
заморозить аликвоты в жидком азоте.
Материалы
Стерильные:
• Биопсия
• Пластиковые ампулы, 1,2 мл (Nalge Nunc)
480
ГЛАВА 24. КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
• DBSS (см. Приложение I)
• Питательная среда для сбора материала (При-
ложение I)
• DMSO (самостерилизующийся, если помещен в
стерильный контейнер)
• Инструменты (скальпели, пинцеты, чашки и т.д.,
как ajtn первичной культуры)
Протокол
1 После удаления некротизированной, жировой и
фиброзной тканей измельчите опухоль на кусоч-
ки примерно 1—2 мм, промойте кусочки в DBSS
как для первичной культуры.
2 Поместите от пяти до десяти кусочков в каждую
ампулу.
3 Добавьте к кусочкам 1 мл ростовой среды, содер-
жащей 10% DMSO, tt оставьте ttx на 30 мин нри
комнатной температуре.
4 . Заморозьте ампулы при скорости 1 “С. мин (см.
протокол 20.1) и перенесите их в морозильник с
жидким азотом (чтобы избежать риска взрыва,
не погружайте ампулу в жидкий азот).
5 Д->1я оттаивания ампулы поместите ее в воду с
температурой 37 ’С (с соблюдением необходи-
мых мер предосторожности, см. протокол 20.2)
6 Тщательно протрите ампулу спиртом, откройте
ее, дайте кусочкам осесть, удалите половину
среды.
7 Медленно замените среду на свежую, не содержа-
щую DMSO Смешайте осторожным встряхива-
нием и оставьте на 5 мин.
8 Постепенно замените всю среду на свежую, не
содержащую DMSO, перенесите кусочки в чашки
Петри и продолжайте работу как с первичной
культурой, но оставляйте в чашке в два раза
больше материала.
24.8. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ОПУХОЛЕВЫЕ
КУЛЬТУРЫ
Общие протоколы, описанные в !Л. 12 (см. протоко-
лы 12.3 12.10), вместе с селективным культивиро-
ванием (см. разд. 24.7 и 1л. 23) обеспечат хорошую
начальную точку для культивирования большинства
тиков опухоли. В целом, разумный подход к культуре
опухоли состоит в том, чтобы комбинировать кол-
лагеназное разрушение (например, протокол 12.8) с
тканесиецпфичными подходами, описанными в прото-
колах в гл. 23, с использованием или без использования
фидерного слоя. Хотя для клеток нормальных тканей
часто бывают определены бессывороточные условия
культивирования, пищевые требования и потребности
в факторах роста клеток опухоли мсп ут быть более раз-
нообразны (см. разд. 24.7.1) и требуют использования
сыворотки. Ниже кратко описаны некоторые специфи-
ческие примеры опухолевых культур.
24.8.1. Молочная железа
Культура карциномы молочной железы может быть
получена колла! еназным разрушением биопсийного
материала [Leakeel al., 1987; Dairkee el al., 1995,1997;
протоколы см. Speirs, 2004J tt размножением на фидер-
ном слое или в MCDB 170. Однако mhoi ие из условий,
используемых, чтобы иолучить культуры из нормаль-
ней! молочной железы (дополнительные факторы роста,
коллагеновое покрытие) могут не быть оптимальными
для карциномы молочной железы [Ethier el al., 1993J,
поэтому может потребоваться проверка разшюбразных
условий в предварительных попытках культивирова-
ния, а также подтверждение неон л астич ной идентич-
ности культивированных клеток.
Идентификация клеток опухоли молочной железы,
в отличие от нормальных анало! ичных клеток, пот-
ребует подтверждения определенных 1енетнческих
повреждений, включая егЬВ-2, с-гпус, рецептор фак-
тора роста фибробластов (FGFR) 2 [Ethier et al., 1993;
Ray el al., 2004 J и определение повышенною уровня
циклпна Е [Willmar th et al., 2004J. Происхождение
клеток может быть подтверждено но наличию цито-
кератина, ЕМ A [Heydermanet al., 1979J it анти-HMFG
1 и 2 типа [Burchell и Taylor-Papadimilriou, 1989];
было предложено считать, что in vitro экспрессия
кератина 19 более вероятна в опухолевых клегках,
чем в нормальных клегках молочной железы | Taylor-
Papadimitriou el al., 1989].
24.8.2. Легкое
Как мелкоклеточная (SCLC),так и не мелкоклеточная
саркома (NSCLC) были успешно культивированы
[Oie el al., 1996; протоколы см. Wu, 2004] с помощью
механического разрушения биоитата в бессывороточ-
ной селективной среде, — НITEC для SCLC и ACL4
для NSCLC с последующим разделением в i радиенте
плотности Ficoll для выделения клеток. Существен-
ная группа этих линий клеток была накоплена NCI,
некоторые линии доступны через АТСС. Также было
изучено влияние матрикса на экспрессию онкогена и
фактора роста [Pavelic et al., 1992], которые использо-
вались, чтобы обле! чить формирование культуры кле-
ток карциномы ле1кого из микрометастазов костного
MO3ta [Panlel et al., 1995]. Испытание действия хими-
отерапевтических препаратов на метастазы в мозге из
опухоли ле! кого in vitro обнаруживает значительную
гетерогенность ответа [Marsh el al., 2004].
Для идентификации клеток SCLC in vitro имеется
ряд маркеров, включая бомбезин-иодобную имму-
нореактивность, DO РА-деккарбоксил азу, N-rnyc, и
сверхэксирессию изофермента В В креатин киназы
[Carney et al.. 1985; Pedersen el al., 2003], но раз-
ные варианты SCLC и NSCLC мшут не иметь этих
маркеров. Известно, что клетки сквамозного рака
леюоге сверхэкспрессируют EGFR, егАВ-2, it TGF-a
[Piyaihilake el al., 2002], показано, что друюе клеточ-
24.8. Специфические опухолевые культуры
481
ные линии клеток NSCLC проявляли нарушенные
свойства in vitro, включая HER2 NEU, ТР53, и K-ras,
которые коррелируют с фенотипом опухоли in vivo, из
которой они были получены | Wisluba el al., 1999].
24.8.3. Желудок
Солидные опухоли рака желудка мотут быть разру-
шены ножницами и пикетированием, что позволяет
высвободить опухолевые клетки из волокон стромы.
Асцит может быть очищен центрифугированием на
Ficoll метризоат [см. Park el al., 2004]. Возможно
произвести обогащение клетками опухоли путем ме-
ханической» собирания агрегатов опухолевых клеток и
субкультпвпрованпем их с очищением от фибробластов
или ди<]х])еренц|1альнои триисиниллцией. Мор<]х»ло1пя
клеточных линий разнообразна, диапазон ее распро-
страняется от хорошо распластанных плоских монос-
лоев, имеющих вид «гладкой панели», до «булыжной
мостовой», с близко расположенными агрегатами
клеток (рис. 24.2).
24.8.4. Толстый кишечник
Были описаны бессывороточные условия культивирова-
ния некоторых видов клеточных линий колоректального
рака человека [Fanlini el al., 1987; Murakami & Mastii,
1980], но эти условия в целом не подходят для недавно
изолированных культур карциномы, которые требуют
присутствия сыворотки. Колоректальная карцинома
была выделена в культуре из биопсий, которые были
взяты как от первичных опухолей, так и из метастазов
[Danielson el al., 1992; Paraskeva&Williams, 1992; Park
and Gazdar, 1996]. Как в случае карциномы легкого, не-
которые колоректальные опухоли обладают нейроэндок-
ринными свойствами; имеются сообщения об успешном
использования среды HITES (см. табл. 10.2) для их куль-
тивирования [Lundqvist el al.. 1991]. Для очистки клеток
карциномы для первичного культивирования в обычной
Среде(RPMI 1640 с 10% FB) использовали плотностное
центрифу» ирование на Percoll [Csoka el al., 1995].
Протоколы для культуры карциномы толстой киш-
ки доступны в Whilehead [2004]. Протокол 24.3 взят из
работ Paraskeva и Williams [1992].
Рис. 24.2. Клеточные линии карциномы желудка, (а) Хорошо распластанным монослой клеточной линии SNU-216 карциномы
желудка, (б) Монос юй типа «мощеной мостовой» клеточном линии карциномы желудка SNU-484 (в) Болес мягкие клетки
образуют с sod тина «булыжная мостовая», клеточная линия карциномы желудка SNU-668. Раковые клетки могут расти как
прикрепленная культура, обнаруживая диффузное распространение роста клегок опухоли с веретенообразным пли полиго-
нальным контурами, (г) Клеточная линия карциномы желудка SNU-620. Раковые клетки ратуг как в прикрепленном виде,
гак и в виде плавающих клеточных агрегатов Воспроизводи гея ио Park et al [2004]
482
ГЛАВА 24. КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
ПРОТОКОЛ 24.3. Культура колоректальных
опухолей
Аденомы обычно расщепляются ферментативно, а
карциномы измельчаются хируршческими лезви-
ями. Если хорошо дифференцированная колорек-
тальная опухоль не высвобождает раковые клетки,
ко1да образец порезан на части, она может' быть
расщеплена ферментативно.
Материалы
Стерильные:
• Ростовая среда: DMEM, содержащая 2 мМ глю-
тамина и с добавлением 20% FBS (существенным
является выбор партии сыворотки), шдрокор-
тизона сукцината натрия (1 mki /мл), инсулина
(0.2 Ед/мл), 2 мМ глютамина, пенициллина
(100 Ед мл), и стрептомицина 100 mki /мл).
• Промывочная среда: ростовая среда с 5% FBS,
200 Ед/мл пенициллина, 200 mki мл стрепто-
мицина, и 50 mki мл гентамицина. Гентамицин
добавляют в первичную культуру в течение, по
крайней мере, первой недели, а затем удаляют.
• Раствор для расщепления: DMEM и антибиоти-
ки, как описано для промывочного раствора, с
коллагеназой (1.5 mi 'мл, тип IV, Worthington),
1 иалуронидазой (0,25 mi мл, тип 1, Sigma) и
2,5—5% FBS. Хотя мы используем коллагеназу
Worthington, можно использовать также Sigma
(для культуры тканей).
• Диспаза для субкультуры: приготовьте раствор
дисиаяы: (нейтральная протеаза, степень 1,
Roche) 1) 2 Ед/мл в DMEM, содержащей 10%
FBS, 1 лютамин, пенициллин и стрептомицин.
Простерилизуйте раствор фильтрацией и хра-
ните ири 20 °C. Если при размораживании
образуются хлопья, раствор следует центрифу-
гировать, отбирается и используется активный
супернагант.
• Флаконы, 25 см-, покрытые коллагеном, тип IV, с
фидерным слоем Swiss ЗТЗ с концентрацией кле-
ток примерно 1х101 кл 'см2 (см. иротокол 23.4)
Протокол
Ферментативное рвсщепление
1 Промойте образцы опухоли четыре раза в промы-
вочной среде.
2 Порубите в маленьком объеме той же самой
среды, достаточной только чтобы покрывать
ткани. (Не позволяйте ткани высыхать!) Ткани
измельчают крестообразными хирургическими
лезвиями пли острыми ножницами до фра1 мен-
тов приблизительно 1 мм*.
3 После измельчения промойте ткани снова четыре
раза (число промывок может быть изменено с
опытом, в зависимости то» о, является ли конта-
минация вероятным <]>ак1орам) в настольной цент-
рифуге (.300 g, 3 мин) с ресуспендированием.
4 После промывания фра1 менгов опухоли помес-
тите их в расщепляющий раствор и инкубируйте
при вращении ири 37 "С, обычно в течение ночи
(приблизительно 12 16 ч). Время, на которое
образцы оставляются в растворе, не критическое,
потому что расщепление мя1 кий процесс, одна-
ко важно не допускать, чтобы в ходе процедуры
среда стала кислой. Низкий pH указывает, что
образцы были в среде слишком долт п или слиш-
ком много ткани было помещено в объем расщеп-
ляющей смеси. Приблизительно 1 см3 опухолевой
ткани помещают в 20—40 мл расщепляющего
раствора
Неферментативная обработка ткани:
Аденомы почти веет да нуждаются в расщеплении
ферментами. Однако для карцином показано, что
ири измельчении ткани опухоли при помощи лезвий
до размеров 1 мм3 маленькие скопления опухолевых
клеток высвобождаются из ткани опухоли в среду.
В этом случае может быть выполнена следующая
процедура:
1. Соберите промывочную среду, содержащую вы-
свобожденные скопления клеток
2. Разделите большие и маленькие ci устки, оставив
их оседать в течение нескольких минут в центри-
фужной пробирке
3. Удалите супернатант.
4. Поместите оставшиеся части ткани непосред-
ственно в культуру или осторожно вращайте
ткань 30-60 мин в промывочной среде, чтобы
высвободить более маленькие ciустки. которые
могут тогда быть собраны, посеяны п помещены
в культуру отдельно от остающихся больших
частей ткани.
5. Промойте все образцы три раза перед помеще-
нием их в культуру.
Стандартные условия для первичной культуры:
1. Иноку лиру йте трубочки и сгустки клеток, полу-
ченных из образцов ткани в обработанные колла-
геном 25-см2 флаконы с 4 мл среды с фидерными
клетками.
2. Инкубируйте при 37 “С в инкубаторе с 5% ССУ.
3. Заменяйте среду в культуре дважды в неделю.
Трубочки и клетки начинают прикрепляться к под-
ложке эпителиальные клетки мигрируют в пределах
1-2 дней. Больше всего эпителиальных клеток выде-
ляется из трубочек п маленьких пустков эпителия
в течение 7 дней, но для прикрепления к подложке
более крупных opi аноидов может потребоваться до
6 недель, хотя они останутся жизнеспособными все
Это время.
Прикрепление эпителия в ходе первичной куль-
туры и субкультуры более воспроизводимо и эф-
фективно, koi да клетки инокулируют в стандартные
флаконы, покрытые коллагеном (Biocoal, В-D Bio-
24.8. Специфические опухолевые культуры
483
sciences, см. также протоколы 23.2 и 23.9), и значи-
тельно лучший рост получен на фидерном слое кле-
ток ЗТЗ, чем без него. Когда эпителиальные колонии
размножаются до несколько сотен клеток в колонии,
они становятся менее зависимыми от фидерных
клеток и дальнейшее добавление фидерных клеток
не требуется.
Субкультура и распространение-
Большинство первичных культур колоректальной
аденомы и линии клеток, полученные из аденомы, не
мсиут быть пассированы при помощи установившей-
ся практики обработки трипсин EDTA [Paraskeva
el aL, 1984. 1985]. Дезасре1ация клеток аденомы до
суспензии отдельных клеток с 0,1% trypsin в 0,25 мМ
(0.1) uo EDTA завершается чрезвычайно бедным рос-
том. Поэтому вместо этого используется диспаза.
1. Добавьте диспазу к клеточному монослою в объе-
ме, достаточном для того, чтобы закры гь клетки
(-2,5 мл/25-см2 флакон), и оставьте на 40—60 мин
для первичной культуры и 20 10 мин для клеточ-
ных линии.
2. Как только эпителиальные слои начинают от-
деляться (они обычно отделяются слоями, а не
отдельными клетками), uomoi ите пипеткой этому
отделению и дезагрегации до меньших скоплений
клеток
3. Промойте и пересейте клетки в стандартных
условиях для культуры. Может потребоваться
несколько дней для прикрепления скоплений
клеток, поэтому будьте аккуратны при замене
среды.
Контаминация культур колоректальной опу-
холи фибробластами. При контаминации культуры
фибробластов может быть применен один из нижепри-
веденных подходов или их комбинация:
1) Физически удалите хорошо заметные колонии
фибробластов путем соскребания тупой стороной
стерильного инструмента (например, клеточный
скребок). Следует не менее шести раз особо тща-
тельно промыть культуры, чтобы удалить любые
фибробласты, которые мО1ли отделиться от моно-
слоя, для того чтобы предупредить их повторное
прикрепление.
2) Для некоторых карцином может быть применена
дифференциальная трипсинизации [Kirkland &
Bailey, 1986].
3) При пассажах дисиаза предпочтительно (но не
исключительно) удаляет эпителий и оставляет
большую часть фибробластов прикрепившимися к
культуральному сосуду [Paraskeva el al., 1984]. При
субкультивировании клетки, которые были удале-
ны дейс твоем диспазы, могут быть предварительно
инкубированы в пластиковой чашке Петри в тече-
ние 2-6 ч для того, чтобы позволить осуществиться
первичному прикреплению фибробластов, которые
moi ли выделиться вмести с Эпителиальными клет-
ками. Сгустки эпителиальных клеток, которые еще
остаются плавать, moi у г быть перенесены в новый
флакон при стандартных условиях культивирова-
ния. Этот метод имеет преимущества, поскольку
фибробласты в целом прикрепляются к пластику
намного быстрее, чем сгустки эпителиальных
клеток, поэтому возможен данный этап частичной
очистки.
4) Использование конъкиата анти-Thy-l монокло-
нальных антител и токсином рицином [Paraskeva el
aL, 1985]. Thy-1 антиген представлен в колоректаль-
ных фибробластах, но отсутствует в эпителиальных
клетках толстой и прямой кишки, поэтому конь-
ки ат убивает фибробласты, контаминировавшие
культуру эпителиоцитов, ири этом не повреждая
культуру, независимо от того, выделена она из
аденомы или карциномы.
5) Снижение концентрации сыворотки примерно до
2,5—5°о, если фиб|х>бласты присутствуют в куль-
туре в большой концентрации. Стоит помнить, что
нормальные фибробласты имеют конечное число
клеточных циклов in vitro и использование любого
или всех представленных методов будет в конце
концов проводить клетки через большое число
делений и фибробласты погибнут в результате
естествен ного старения.
24.8.5. Поджелудочная железа
Клеточные линии из первичных или метастатических
опухолей поджелудочной железы были выделены
на среде RPMI 1640 с добавлением FBS. Клеточные
линии были адаптированы к безбелковой среде для
исследования клеточных продуктов [Yamaguchi el
al., 1990] (см. также протокол 23.7). Культура кар-
циномы поджелудочной железы была использована
для исследования действия сенистеина на ат иогенез
[Buehler el aL, 2004]. Линии панкреатических клеток
были созданы для изучения аутокринного контроля
роста иод действием гастрина [Monstein el al., 2001];
при этом корреляции между экспрессией i астрина и
рецепторами холецистокнинина (ССК), которые в
норме связывают i астрин, не была обнаружена. Ли-
ния KCI-MOH1 является клоном аденокарциномы
поджелудочной железы после пассажа через мышей
SCID [Mohammad etal., 1999]. Ксенотрансилантатная
опухоль также была использована для установления
клеточной линии НРАС для изучения 1люкокортико-
идных рецепторов [Gower el aL, 1994]. Протоколы для
культуры карциномы поджелудочной железы путем
разрушения в коллагеназе и посева на чашки, покрытые
коллагеном можно, найти у Iguchi el al. [2004], который
выделил Клеточные линии из первичных повреждений,
асцитов и метастазов печени. Две линии из метастазов
печени были получены путем пассажа через «голых»
мышей путем инъекции в селезенку (рис. 24.3).
484
ГЛАВА 24. КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
Рис. 24.3. Клеточные линии рака поджелудочной железы.
Микрофотографии клеточных линии KP-1N (л) и КР-З(б)
из метастазов в печень, ксснотрансплантированных в «го-
лых» мышей. Фазово-контрастным объектив (х125). По
Iguchictal [20041
24.8.6. Яичники
Из опухолей эпителия яичников был получен ряд кле-
точных линий, наиример серии линий ()АW [Wilson
et al., 1996], OVCAR-3 [Hamilton el al., 1983J, A2780,
[Tsuruo el al., 1986], некоторые n бессывороточной
среде [Jozan et al., 1992]. Дру1 ие линии были получены
после коллагеназного разрушения в среде, содержащей
сыворотку, наиример в среде OSE, содержащей М199 и
MCDB105 в отношении 50:50, с добавлением 15% FBS
[Lounis el al., 1994]. Jlei че получить i енерации культур
из асцитов или легочного экссудата, чем из материала
плотной опухши [ Verschraegen el al. 2003]. Для очистки
клеток карциномы яичника для получения первичной
культуры использовалось плотностное центрифу! иро-
вание на Per coll, как в случае карциномы толстой кишки
| Csoka et al., 1995]. Протоколы для культуры карцино-
мы яичника можно найти в работе Wilson |2004|
24.8.7. Простата
Метод с применением матрикса, описанный выше для
легочной карциномы, успешно был применен для выде-
ления клеточных линий из опухолей простаты [PanLei
el al., 1995]. Для получения культур клеток нормальной
простаты, а также доброкачественных и злокачествен-
ных опухолей также использовались бессывороточные
культуры [Chopra el al., 1996; Bright & Lewis, 2004)
(см. также протокол 23.11). После иммортализации с
использованием ретровирусных конструктов, кодиру-
ющих трансформирующие белки Е6 и Е7 герпесвируса
HPV16, можно было получить долгоживущие культу-
ры [Bright & Lewis, 2004].
Известно, что развитие эпителия простаты нахо-
дится иод паракринным контролем со стороны стро-
мы, секретирующей факторы роста семейства FGF,
включающего KGF [Thomson et al., 1997]. Показано,
что при получении культур из нормальных тканей,
доброкачественной тперцлазии простаты (ВРН) и
карциномы уровень FGF-17 был выше в два раза в
культуре из ВРН [Polnaszek el al., 2004]. Опухолевый
am иогенез также изучали в культуре из нормальной и
неоцластически измененной простаты с использова-
нием оксида азота [Wang el aL, 20031 и добавлением
VEGF [Shih et al., 2003]
24.8.8. Мочевой пузырь
Было показано, что культура карциномы, которая яв-
ляется поверхностной опухолью, имеет ограниченную
продолжительность жизненных циклов, в то время
как клеточные линии из миоинвазивных опухолей
часто образуют постоянные клеточные линии [Yeager
et al.. 1998]. Первичная культура клеток карциномы
переходного эпителия мочевого пузыря обычно ис-
пользовалась для изучения роли FasL в иммунной
защите от клеток рака мочевого пузыря [Chopin el al.,
2003]. Протоколы для культуры карциномы мочевого
пузыря можно найти в Fu el al. 120041.
24.8.9. Кожа
Меланома. Пшментные клетки кожи MOiyr быть куль-
тивированы в 1фисутС1вии соответствующих факторов
роста (см. протокол 23.21), также с определенным
успехом культуры moivt быть получены из меланомы
[Creasey el al., 1979; Mather &Salo, 1979a, bj. Пер-
вичные меланомы часто контаминированы фиброб-
ластами. но возможно проведение клонирования на
конфлюэнтных фидерных слоях нормальных клеток
[см. протокол 24.1; Creasey el al., 1979; Freshney el al.,
1982b]. Клеточные культуры, полученные путем ме-
ханического разрушения, могут быть освобождены от
фибробластов обработкой 100 mki /мл Genelicin (G418)
[Halaban, 2004].
Для роста меланоцитов нормальной кожи, дисплас-
тических невусов и метастазов меланомы применяется
среда MCDB 153, с добавлением FGF-2, инсулина,
трансферрина, а-токоферола, экстракта m иофиза
быка, гидрокортизона и 5% сыворотки с добавлением
24.8. Специфические опухолевые культуры
485
также при первых двух пассажах каталазы и РМА
[Levin et al., 1995]. Протоколы для культивирования
клеток меланомы можно найти в Halaban [2004].
Базалъно-клеточная карцинома. Фидерный
слой клеток ЗТЗ предоставляет возможность куль-
тивирования базальноклеточной карциномы (ВСС)
кожи [Rheinwald & Beckett, 1981] (см. протокол 23.1).
Oh et al. [2003] использовали первичные культуры
из базальноклеточной карциномы дли изучении
ангио1енезно|О потенциала и обнаружили eto кор-
реляцию с ai рессивностью развития опухоли. Было
показано также, что культуры ВСС являются более
чувствительными к цитотоксическому действию ин-
терферонов, чем нормальные кератиноциты [Brysk
etal., 1992].
Сквамозноклеточная карцинома. SCC и эрнт-
роплакии были культивированы на фидерных слоях
ЗТЗ [ протоколы см. в Edington el al., 2004], ч то привело
к выделению ценных клеточных линий серии BICR,
представляющих собой различные стадии малш низа-
ции и иммортализации [Fitzsimmons et al.. 2003: Gordon
etal., 2003].
24.8.10. Шейка матки
Культуры доброкачественных и злокачественных опу •
холей шейки матки могут быть получены из биопсии
методом применения фидерных слоев ЗТЗ, описан-
ным для нормальных клеток шейки матки [Stanley &
Parkinson, 1979] (см. протокол 23.4). Такие клеточные
культуры используются для изучения хромосомной
нестабильности и инте| рации человеческого папилло-
мавируса, который участвует в развитии рака шейки
матки [Koopman el al., 1999].
Протоколы для культуры опухоли шейки матки
можно найти в Stern et al. [2004].
Рис. 24.4. Культуры глиомы человека. Две клеточ-
ных культуры анацлас 1 ической астроцитомы человека
(а) Первичная культура, полученная обработкой коллаге-
назой. обнаруживает типичные астроциты, которые могут
быть дифференцированными опухолевыми клетками или
реактивной глией (б) Постоянная клеточная линия MOG-
G-U VW. обнаруживающая один из нескольких морфологи-
ческих типов, на11денных в культурах клеток, полученных
из глиомы В данном примере клет ки имеют плеоморфную
фибробласт-подобную форму,- типичная мультниоляр-
ность, характерная для астроцитов и часто утрачиваемая в
постоянных клеточных линиях, отсутствует (см. также цв
вкладки 7а, б, в, 9е и 116.)
24.8.11. Глиома
Культуры человеческой глиомы moi ут быть выделены
механическим разрушением, трипсинизацией или кол-
ла! еназной обработкой [ Westerniark et al., 1973; Ponlen,
1975; Freshney, 1980; протоколы см. Darling, 2004; см.
также рис. 16.2с и 24.4]. Ряд глиом были культивирв-
ваны после выделения из грызунов, среди них особого
упоминания заслуживает клеточная линия С6 [Benda
el al., 1968], которая экспрессирует- маркер астроци-
тов — тлиальный фибриллярный кислый белок до
98% клеток [Freshney et al.. 1980а], но при этом имеет
ферменты тлицеринфосфатдетдрогеназу и 2’,3’-цикл
нуклеотидфосфорплазу |Breen & De Vellis, 1974], кото-
рые являются маркерами олигодендроцитов. Эта линия
является интересным примером клеток-предшествен-
ников, которые одновременно мотут созревать по двум
феноти пическим направ. гениям.
Культуры ьтиомы человека обычно используются
для прО1ностических тестов на химиочувствитель-
ность [Thomas et al., 1985], а также, реже, в изучениях
ретровирус-опосредованной терапии [Rainov & Ren
2003] и терапии направленной» действия с исполь-
зованием пептидных лшандов, слитных с цитоток-
синами, селективно действующих на опухоль мозга
[Liu etal., 2003].
24.8.12. Нейробластома
Было выделено несколько линий нейробластомы
(наиример, SK-N-BE (2) [Biedler and Spengler, 1976],
[Tumilovviczetal., 1970]). которые являются предметом
определенного интереса в связи с их способностью к
486
ГЛАВА 24. КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
дифференцировке [Diiniirotilakos el al., 1994]. Было
обнаружено, что мышиные нейробластомы являются
подходящим субстратом для трансмиссивных губча-
тых энцефалопатий (TSEs) [Solassol el al., 2003].
24.8.13. Сперматоцитома
Тестикулярные сиермагоцитомы были культивиро-
ваны с использованием клеточного фидерного слоя
STO с последующим добавлением фактора стволовых
клеток (SCF), LIF, и FGF-2, как это применяется в
культуре эмбриональных стволовых клеток [Olie et
al., 1995]. Хотя культуры были i етерозиготны, они не
давали роста культуры герминативных клеток.
24.8.14. Лимфома и лейкемия
Обычная методика получения клеточных линий для
лимфомы и лейкемических клеток затруднена. Мно-
1 ие существующие постоянные линии клеток были
выделены из лимфомы Беркитта [Drexler & Minovvada
2000]. Показано, что они несут интегрированные сены
ЕВ вируса. Протоколы для культивирования лимфо-
мы-лейкемии можно найти в Drexler [2004].
Глава 25
ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
25.1. МЕЖКЛЕТОЧНОЕ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ
И ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ
Исторически возникшее расхождение между поддер-
жанием эксплактированных фра1 ментов ткани и
культивированием клеток, которые были выделены из
них, кривело к развитию методов органной культуры
и клеточной культуры (см. разд. 1.5), при этом клеточ-
ная культура стала ведущей. В настоящее время, кия
потенциал использования банков клеточных линий
далек от полного использования, mhoi ие исследователи
сходятся на том мнении, что питательные и гормональ-
ные добавки сами ио себе недостаточны для полного
воспроизведения структурной и функциональной
компетенции данной клеточной популяции. Жизненно
важным фактором, не учитываемым ири поддержании
клеточной культуры, является межклеточное взаимо-
действие и сш нальные системы.
25.1.1. Роль клеточной плотности
Межклеточное взаимодействие проявляет себя на
простейшем уровне, koi да клеточные культуры до-
сти1 ают конфлюэнтности, и клетки начинают сильнее
взаимодействовать дру1 с другом. Это взаимодействие
реализуется в результате контакт-оиосредованной
передачи сш налов, формирования межклеточных
контактов, включая щелевидные соединения, и уве-
личения потенциала обмена гомокри иными факто-
рами (см. разд. 3.5, 17.7.1). Первый значительный
эффект - прекращение подвижности клетки и выход
из клеточного цикла (контактное uhi ибнрование, см.
разд. 18.5.2) в нормальных клетках и снижение клеточ-
ной пролиферации и возрастание уровня апоптоза а
трансформированных клетках. Если клетки обладаю?
способностью к дифференцировке, то часто отмечает-
ся увеличение числа дифференцированных клеток.
Клетки крысиной 1лиомы С 6 обнаруживают увеличе-
ние процентной доли GFAP-положительных клеток,
(рис. 25.1), секреторные или всасывающие эпите-
лиальные клетки формируют куиолы (см. рис. 16.1;
цв. вкладку 12а, б), и скелетный симиласт миоцитов
образует отдельные многоядерные миотрубочки
Нормальный фибробласт, несмотря на контактное
ин1 ибнрование, после достижения конфлюэнтности
будет секретировать большее количество коллагена,
и культура будет иметь тенденцию к формированию
многослойной структуры, с верхним слоем более мел-
ких и более темных клеток, похожих на фиброциты
(см. цв. вкладку 10е).
25.1.2. Реципрокные
взаимодействия
Взаимодействие популяций различных клегок ока-
зывает кооперативный эффект на их соответству-
ющий фенотип (см. разд. 17.7.1), а получившиеся в
результате фенотипические характеристики приводят
к развитию новых взаимодействий. Межклеточное
взаимодействие, таким образом, является не еди-
ничным событием, а каскадом событий. Подобным
образом, экзогенные сш налы инициируют развитие не
единичного события как это происходит в гомогенной
клеточной популяции, а могут вызвать развитие нового
каскада, как результат экзо1 енно модифицированного
фенотипа одного или более партнеров. Наиример,
альвеолярные клетки легких синтезируют и высво-
бождают сурфактант только в ответ на гормональную
стимуляцию расположенных рядом фибробластов
[Post el al., 1984J; аналоеичным обраюм, ответ эпи-
телия простаты на сш нал от стромы, в свою очередь,
активируется андрогеном, связавшимся со стромой
[Thomson etal., 1997J и вызывающим высвобождение
KGF. Linser and Moscotia [1980J отделили Мюллеров-
ские клетки из нервной ретины от ши ментированной
ретины и нейронов и показали, что глюкокортмкоид-
индуцированная дифференцировка не осуществляет-
ся, если Мюллеровские клетки (астроглия) находились
отдельно от нейронов ретины. Присутствие нейронов
из дру1 их отделов мо.и а было не эффективно. Диффе-
ренцировка эпителия в ответ на компоненты матрикса
часто определяется совместным действием эпителия с
одной стороны и соединительной ткани с другой, как
это показано в случае взаимодействия между' эпидер-
мисом и дермисом in vitro [Fusetiig, 1994а; Limal el
al., 1995]. Следовательно, цельная интегрированная
ткань может различным образом отвечать на повсе-
местно распространенные сшналы не в результате
специфичности сш нала или аффинности рецептора,
а вследствие качества микроокружения, заключающе-
гося в особенности взаимодействия данного клеточ-
488
ГЛАВА 25. ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
Рис. 25.1. Действие клеточной плотности на экспрессию
GFAP в клетках С6. Флаконная кулыура выращивалась до
различной клс।очной плотности, фиксировалась ii окраши-
валась иммуномсроксидазой для выявления GFAP, ирпцет
окрашенных клеток подсчитывался исходя из воспроиз-
водимых результатов подсчета в репрезентативных нолях.
(С любезного разрешения R.L. Shaw )
ного типа с рядом расположенными специфическими
субстанциями. Аналошчным образом, в человеческом
сообществе ответ одного индивидуума на экзогенный
стимул обусловлен как его пространственными и вре-
менными отношениями с дру 1 ими индивидуумами,
так и присущими ему внутренними особенностями.
На клеточном уровне недифференцированная нейро-
нальная клетка может стать нейроном, эндокринной
клеткой или меланоцитом, в зависимости от их оконча-
тельного расположения, взаимодействия с рядом рас-
положенными клетками, их ответа, опосредованно! о
этими соседними клетками, на гормональные стимулы.
По существу, эта преамбула призвана показать, что,
несмотря на то что некоторые клеточные функции, та-
кие как клеточная пролиферация, i л и кол из, дыхание,
транскрипция генов, мо>ут протекать изолированно,
их рефляция, связанная с функционированием мно-
гоклеточного ор1анизма, в конечном итоге зависит от
взаимодействий между клетками соответствующих
линий, от стадии развития данной линии, и от взаи-
модействия между клетками дифференцированных
линии, находящихся в данном микроокружении. Эта
концепция нредиолаюет, что если вы хотите изучать
61ЮЛО1ИК1 изолированных клеток или использовать
клетки в качестве субстрата, общепринятый метод
монослойной или суспензионной культуры может
быть адекватен, но если вы хотите выяснить что-то об
интегративных функциях или дисфункциях клеток
in vivo, потребуется гистотипическая или ор1аноти-
пическая модель.
25.1.3. Выбор модели
Для достижения этой цели существуют два подхода.
Одним из них является принятие клеточного распре-
деления в изучаемой ткани, эксплантация их и под-
держание как opi анной культуры. Второй заключается
в очищении и размножении отдельных клеточных
линий, изучение их ио отдельности в условиях взаи-
модействия гомолошчных клегок, их комбинирова-
ния и обоюдного влияния. Эти подходы дали начало
развитию трех главных типов методов: 1) органная
культура, при которой целый opi ан или ею репре-
зентативная часть поддерживается в виде небольшо-
ю фра! мента в культуре и сохраняет присущее ему
распределение количественное и пространственное
клеток, представленных в этом фра! менте; 2) гисто-
типическая культура, при которой распространенные
клеточные линии выращиваются но отдельности до
высокой плотности в трехмерном матриксе, и 3) орга-
нотипическая культура, в которой клетки различных
линий рекомбинированы в экспериментально опре-
деленном соотношении и специфических связях для
воспроизведения некоторою компонента изучаемою
циана (рис. 25.2).
Opi анная культура пытается сохранить исходные
структурные взаимоотношения клегок одного и тою
же или различных клеточных типов, а, следовательно,
их интерактивные взаимоотношения для того, чтобы
изучить действие экзогенных стимулов на дальней-
шее развитие [Lasnitzki, 1992]. Эти взаимоотношения
могут быть сохранены путем эксилантирования ин-
тактной ткани или вое произведен ния ее структуры
путем разделения ее компонентов и последующего их
объединении, как это сделано в ставшими классиче-
скими экспериментах Grobstein & Auerbach и друшх
в органо! енезе [Auerbach & Grobsleiti, 1958; Cooper,
1965; Wessells, 1977] (см. также разд. 17.7.1). Opi аноти-
пическая культура представляет собой синтетический
подход, в то время как трехмерная культура, имеющая
большую клеточную площадь, воспроизводится из
изолированных (и, предпочтительно, очищенных
и охарактеризованных) клеточных линий, которые
затем комбинируются, после чею исследуется их
взаимодействие и характеризуется их ответ на экзоген-
ные стимулы. Этими экзогенными стимулами moivt
быть ре1уляторные гормоны, питательные вещества
или ксенобиотики. В каждом случае ответ может
быть отлич ным от реакции чистою клеточною типа
выращенных изолированно при низкой клеточной
плотности клеток.
25.1. Межклеточное взаимодействие и фенотипическая экспрессия
489
ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
Рис. 25.2. Гистотипическая и органотипическая культура
490
ГЛАВА 25. ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
25.2. ОРГАННАЯ КУЛЬТУРА
25.2.1. Обмен питательных веществ и газов
Главным недостатком в тканевой архитектуре в ор-
1 анной культуре является отсутствие сосудистой
системы, ограничивающей размеры (в результате
диффузии) и потенциальную полярность клеток в
орг анной культуре Кота клетки культивируются
в плотной массе ткани, 1азовая диффузия и обмен
питательных веществ и метаболитов осуществляются
только на периферии, и это О1раничивает размеры
ткани. Размеры индивидуальных клеток в суспен-
зии или монослое таковы, что диффузия проходит
быстро, однако при формировании arpeiaroa клеток
около 250 мкм в диаметре (5000 клегок) рост клеток
начинает oi ранг гчиваться диффузией, а примерно при
1,0 мм и более в диаметре (~2,5х10sклеток) часто про-
является центральный некроз. Для снижения остроты
этой проблемы органные культуры часто помещают на
границу раздела жидкой и газовой фаз для улучшения
газового обмена, ири сохранении доступа питательных
веществ. Большинство систем достигают этого путем
использования вкладышей в фильтрующую лунку,
помещая эксплантат на фильтр (см. рис 25.7,25.8) или
на плотик или гель, обращенный в воздушную среду
(рис. 25.3). Эксплантат, закрепленный на плотном
субстрате, может также аэрироваться путем враще-
ния культуры, периодически погружая образец то в
жидкую среду, то в газовую фазу [Nicosia et al., 1983;
Lechner and LaVeck, 1985; см. протокол 23.9J, или пу-
тем использования роллерных бутылей или пробирок
(см. протокол 26.3)
Закрепление на плотном субстрате может привести
к развитию разрастания клеток из эксплантата и пос-
ледующею изменения геометрии образца, хотя этот
эффект может быть минимизирован использованием
несмачиваемых поверхностей. Одним из преимуществ
культуры на газовожидкостной поверхности контакта
Рис. 25.3. Органная культура. Маленькие фрагменты ткани
на фи.гырс кладут на вершину решетки из нержавеющей
стали над центральным колодцем чашки с opt анной куль-
турой
является то, что эксплантат сохраняет* сферическую
геометрию жидкости, если уровень жидкости под-
держивается на правильном уровне. Если жидкость
слишком глубока, газообмен ухудшается, если она
слишком мелкая, поверхностное натяжение может
привести к всилыванию эксилантата и простимулирует
разрастание клеток за пределы образца.
Повышенная проницаемость кислорода также мо-
жет быть достиг нута использованием повышения кон-
центрации кислорода вплоть до использования чистою
кислорода или применения гипербарической оксиге-
нации. Определенные ткани, например щитовидной
железы [de Ridder & Mareel, 1978J, простаты, трахеи
и кожи [Lasnitzki, 1992], в том числе новорожденною
пли взрослого организма, могут иолучить пользу от
повышения давления О2, но часто эта польза связана
с риском О2-индуцированной токсичности. Поскольку
простое возрастание давления О2 не улучшает высво-
бождения СО, или обмена питательных веществ и
метаболитов, преимущества повышения концентрации
кислорода могут быть перекрыты другими лимитиру-
ющими факторами.
25.2.2. Структурное единство
Поддержание структурного единства, вне всяких
сомнений, было и остается главной причиной выбора
орг анной культуры как метода in vitro перед клеточной
культурой. В то время как клеточные культуры исполь-
зуют клетки, диссоциированные механическими или
ферментативными методами или выделившиеся за
счет спонтанной миграции клеток, в органной культуре
поддерживаются клеточные связи, существующие в
ткани. Первоначально органная культура была пыбрана
для упрощения исследования гистологических харак-
теристик, но в конечном итоге было обнаружено, что
определенные элементы фенотипической экспрессии
проявляются, только если клетки плотно взаимодей-
ствуют друг с друюм (см. разд. 25.1).
25.2.3. Рост и дифференцировка
Существует связь между ростом и дифференцировкой,
так как дифференцированные клетки утрачивают спо-
собность к делению (см. разд. 17.3). Возможно также,
что прекращение роста независимо от клеточной плот-
ности может само по себе вносить вклад в индукцию
дифференцировки только путем формирования такою
фенотипа, который делает возможным рецепцию эк-
зогенных индукторов дифференцировки. В результате
ог раничений клеточной пролиферации плотностью
культуры и физических ограничений, накладывае-
мых геометрией органной культуры, большинство
органных культур не растут или, если растут, то их
пролиферация ог раничена внешними слоями клеток.
Следовательно, состояние культуры допускает диффе-
ренцировку и ири данных соответствующих клеточных
25.2. Органная культура
491
взаимодействиях и наличии растворимых индукторов
(см. разд. 17.7) может предоставить идеальные условии
для осуществления дифференцировки.
25.2.4. Ограничения метода
органной культуры
Экспериментальный анализ ор!анных культур зависит
главным образом от i истоло! ических методов, которые
сами по себе не позволяют проводить биохимический и
молекулярный анализ. Биохимический мониторингтре-
бует наличия воспроизводимости значений показателей,
которую труднее доспи нуть в орт энной культуре, ио
сравнению с распространенными клеточными линиями
в силу особенностей приготовления образцов органной
культуры, некоторых различий в манипуляциях с образ-
цами и их геометрии, а также вариациях в соотношении
клеточных типов внутри культуры (см. табл. 1.4).
Кроме того, органные культуры приготовить слож-
нее, чем реиликаты культур из распространенных
клеточных линии. Кроме того, отсутствует преиму-
щество наличия охарактеризованных первоначально
полученных клеточных культур, которым они мш уч
быть родственны. Органные культуры не мшут быть
размножены, и, следовательно, каждый эксперимент
требует использования повтор нот о обращения к
ткани исходною донорского ортана, что усложняет
рабочую процедуру. Более того, в качестве реагиру-
ющей популяции клетки moivt быть малой частью
культуры. Для правильного определения типа клеток,
которому приписывают молекулярный ответ на раз-
дражитель, требуется проведение 1 цстолот ических
исследований с i и стохимическим или иммунохими-
ческим анализом in situ.
Opi энная культура является более информативным
методом для исследования интегративных взаимоотно-
шений внутри ткани ио сравнению с изолированными
клетками. Можно точно сказать, что будущее понима-
ние контроля экспрессии гонов (и в конечном итоге
поведения клеток) в многоклеточном организме может
оказаться обманчивым, но ограничения, налагаемые
системой opi энной культуры таковы, что комбини-
рованные системы чистых клеточных типов moivt
принести больше информации на определенной стадии
исследований. Тем не менее нет сомнений, что opi энная
культура вносит большой вклад в наше понимание
биоло! ии развития и межтканевых взаимодействий.
Применение opi энной культуры будет продолжаться
до тех пор, пока отсутствуют адекватные комбиниро-
ванные синтетические системы.
25.2.5. Типы органных культур
Поскольку техника работы с органной культурой
главным образом определяется требованием разме-
щать ткань так, чтобы обеспечить оптимальных обмен
питательных веществ и 1азов. в большинстве методов
ткань рас 11ола1 ается на границе раздела газ/жидкость
на полужидком i елевом субстрате или агаре [Wolff &
Haffen, 1952J, свернувшейся плазме [Fell & Robison,
1929) или плотике из микроиорового фильтра, обер-
точной бумаге для линз или вискозной ткани, располо-
женной на решетке из нержавеющей стали [Lasnitzki,
1992; рис. 1.3J или прикрепленной к полоске плексш-
ласа. Этот тип конфш у рации в настоящее время легче
всего достигается иутем использования вкладышей в
фильтрационную лунку (см. протокол 25.4). Прото-
кол 25.1 использует зачаток opiana, выделенный из
эмбриона цыпленка, но применим ко mhoi им другом
типам клеток.
ПРОТОКОЛ 25.1. Органная культура
Схема
Иссечь opiан или ткань, измельчить до разме-
ров 1 мм'1 или до тонкой мембраны или палочки, .
поместить на подложку на 1ранице раздела сред |
воздух—среда (например, на вкладыш для фильтра-
ционной лунки (см. рис. 25.7. 25.8). Инкубировать I
во влажном С ()2-инкубаторе, заменяя среду, кота ।
это требуется
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
• Инструменты для иссечения
• Среда (например, М199). с сывороткой или без
• Вкладыш в фильтрационную лунку, обработан- ।
ный для нетканевых культур (например, Coslai
Traiisvvells поликарбонат #3423, Corning)
• Многолуночные планшеты, 12 лунок (Corning)
Нестерильные:
• Оплодотворенные яйца курицы, 8 дней инку
бацни
Протокол
1. Поместите вкладыш для фильтрационной лун-
ки в лунку многолуночнш'о планшета, добавьте I
достаточное количество среды до уровня дна |
фильтра (-1 мл).
2. Поместите чашки во влажный СО2-инкубатор, I
позволяя pH среды достичь равновесия при
37 °C.
3. Прш от овить ткань, или иссечь целый эмбриональ- ।
ный орган (например, бедро или голень 8-дневного I
эмбриона цыпленка, см. протоколы 12.2 и 12.7). ।
Ткань не должна иметь толщину в одном изме- I
рении более 1 мм, предпочтительно еще менее
(например, голень 8-дневного эмбриона цыпленка
может иметь 5 мм в длину, но только 0.5—0,8 мм в
диаметре). Фра1 мент кожи может быть площадью
10 мм* 1 2, но только 200 мкм толщиной. Кусочки
тканей, которые должны быть измельчены, чтобы
получить нужный размер, такие как печень или
почки, не должны быть более 1 мм3.
492
ГЛАВА 25. ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
4 Для кратковременною хранения иссеченных
тканей (<1 ч) можно использовать HBSS, однако
для более длительною процесса иссечения ис-
пользуйте 50% сыворотку в Н BSS, забуференную
HEPES до pH 7,4.
5 Выньте чашки из инкубатора, осторожно пере-
несите ткани на фильтры. Для аспирации любой
избыточной жидкости, перенесенной с экспяан-
том, обычно лучше всею подходит Пастеров-
ская пипет ка, хотя при атом следует особенно
внимательно следить за тем, чтобы не проткнуть
фильтр. Увлажните внутреннюю сторону ии-
иетки средой до аспирации, чтобы предупредить
протыкание фра! мента ткани пинеткой.
6 Проверьте уровень среды, убедитесь, что ткань
смочена средой, но не полностью в нее погружена,
и верните чашки в инкубатор.
7 Проверьте через 2—4 ч, убедитесь, что пленка сре-
ды ио прежнему покрывает фильтр и эксплант, но
слой среды не на столько глубок, чтобы эксплант
всплыл.
8 Инкубируйте чашки в течение 1—3 недель, заме-
няя среду каждые 2—3 дня и отбирая пробы но
мере необходимости.
Вариации. Большая часть вариаций включает в себя
следующие аспекты.
1) Среда. Ml99 или CMRL 1066 могут быть исполь-
зованы с сывороткой или без, для хрящей и костей
можно также использовать среду BGJ | Biggers el
aL, 1961].
2) Тип подложки. Ортанная культура может использо-
вать в качестве подложки фильтр (например, поли-
карбона гный), положенный на решетку из нержаве-
ющей стали в чашке для органной культуры ( Falcon
#3037, В-D Biosciences; рис. 25.3). Тем не менее
использование вкладыша в фильтрационную лунку
имеет ряд преимуществ в манипуляциях, размерах
образца, материалах и матриксном покрытии (см.
рис. 25.7; табл. 25.1). Различные типы тканей могут
быть комбинированы на разных сторонах фильтра
для изучения их взаимодействий (см. разд. 17.7.1).
Более того, возможно применение маленьких
вкладышей в фильтрационную лунку (например,
6,5 мм, Corning Coslar #3423). При .тгом лунка, об-
разованная на верхней стороне комплекса фильтров
формирует мениск из среды, с большой площадью
поверхности, достаточной для i а.пк>бмена. Можно
также изменить конфи! ураццю ткани повышением
или понижением уровня среды в чашке и, следова-
тельно, в лунке. Более 1лубокий слой среды дает
сферический эксплантат, более мелкий слой дает
плоскую конфш урацию.
3) Давление О2. Эмбриональные культуры обычно
лучше хранятся на воздухе, но ткани .шбрионов
поздних стадий, новорожденных и взрослых орга-
низмов лучше содержать при повышенном давле-
нии кислорода [Trowell, 1959; de Ridder & Mareel,
1978; Zellinger & Holbrook, 1997].
4 ) Перемешиваемые или статические культуры. Пере-
мешиваемые культуры малых фра! ментов тканей
раньше использовались для конфронтационных
культур при исследовании инвазии [Mareel el al.,
1979; Bjerkvig et al., 1986a, b] (см. протокол 25.5).
5) Качалочные или вращаемые культуры. Ткань при-
крепляется к субстрату и подвер!аегся поперемен-
ному воздействию жидкой культуральной среды
п газовой фазы путем помещения культурального
сосуда на раскачивающуюся платформу [см. прото-
кол 23.9; Nicosia el al., 1983], или прикрепления тка-
ни к стенке вращающе: ося флакона или пробирки
(см. разд. 5.3.4 и протокол 26.3).
25.3. ГИСТОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
Гистотипическая культура в данном контексте опре-
деляется как клеточная культура высокой плотности,
близкой к плотности клеток в ткани in vivo. Были
сделаны разнообразные попытки воспроизведения
тканеподобной архитектуры на основе дисиер! ирован-
ных моносдойных культур. Green and Thomas [1978]
показали, что эпидермальные кератиноциты человека
будут образовывать дермато! лифы (т. е. фрикционные
рубцы), если их содержать без пересадки в течение
нескольких недель, a Folknian and Haudeuschild [ 1980]
смогли показать образование капиллярных трубочек в
культуре сосудистою эндотелия в присутствии факто-
ра роста эндотелия и среды кондиционированной опу-
холевыми клетками. Koi да клетки достигают высокой
плотности, им может недоставать питательных веществ.
Чтобы избежать этою, отношение объема среды к ко-
личеству клегок должно оставаться примерно таким
же, как в культуре с низкой плотностью клеток. Это
может быть достш нуто посевом клеток на небольшое
покровное стекло в центре большой чашки типа «не
для культуры ткани» или использованием вкладышей
в фильтрационные лунки, которые дают возможность
образования как поляризованных культур с высокой
плотностью клеток, так и гетеротипической комбина-
ции клеточных типов с последующим воссозданием ор-
анотииических культур (см. протокол 25.4). Высокое
отношение среда/клетки может также быть достш нуто
путем перфузии (см. разд. 25.3.2).
25.3.1. Метод геля и губки
Leigh Ion первым продемонстрировал тот факт, что
как нормальные, так и мал и! визированные клетки
проникают в целлюлозную 1убку [Leighton el al.,
1968], обработка коллагеном усиливает лгот процесс.
Вместо целлюлозы может быть использован Gelfoam
(желатиновый |убчатый матрикс, используемый в
восстановительной хирурти) [Sorour el al., 1975], он
был использован в исследованиях действия механичес-
25.3. Гистотипическая культура
493
кого растяжения на развитие лыких [Liu et al., 1995|.
Эти системы требуют iистоло!ическо!о анализа и
oi раничены и размерах, подобно opi анным культурам,
в результате необходимости диффузии 1азов и пита-
тельных веществ. Использование трехмерной 1убки и
гелей значительно повысилось при развитии тканевой
инженерии Гем. разд. 25.3.8k
Коллагеновый гель. Коллагеновый гель (нативный
коллаген, в отличие от денатурированного коллагено-
вого слоя) представляет собой магрикс для морфоге-
неза первичных эпителиальных структур. Показано,
что различные типы клеток moi ут проникать в такой
матрикс с развитием тканеподобной шетоло! ической
структуры Эпителий молочной железы образует
рудиментарные трубчатые и железистые структуры
при росте в коллагене [Goiinn et al., 1997], в то время
как карцинома молочной железы обнаруживает менее
упорядоченный рост [Berdichevsky el al., 1992]. Кле-
точная линия MDCK почечного эпителия отвечает на
паракринную стимуляцию со стороны фибробластов
продукцией трубчатых структур, но только в колла-
геновом геле [Kenworthy el al.,1992]. Рост отростков
невритов из нейронов симпатического 1ан1лия, расту-
щего на коллагеновом геле, соответствует ориентации
колла!еновых волокон в геле [Ebendal, 1976].
Матригель. Matrigel представляет собой коммер-
ческий продукт, (В-D Biosciences), полученный из
внеклеточного матрикса мышиной саркомы Engel-
breth—Holm—Swarm (EHS), который был использован
для обработки пластика (см. разд. 8.4.1), но также мо-
жет применяться для образования геля. Он состоит из
ламинина, коллагена, фибронектина и иротео! ликанов
с рядом связанных с ними факторов роста, хотя он
может быть получен в форме со сниженной концен-
трацией факторов роста. Обычно его используют в
качестве субстрата для исследований эпителиального
морфогенеза [Larsen et al., 2004], образования капил-
ляров из эндотелиальных клеток [Jain et al., 1997; Vou-
ret-Craviari el al., 2004], и в изучении злокачественной
инвазии [De Wever et al., 2004]. Тем не менее Matrigel
является комплексным, не до конца изученным мат-
риксом и может ин! ибировать некоторые морфогенети-
ческие события, такие как тубуло! енез клеток MDCK,
индуцированный фактором роста гепатоцитов (HGF)
[Williams & Clark, 2003].
25.3.2. Пустотелые волокна
Поскольку при высокой клеточной плотности поступ-
ление среды и газообмен становятся шраниченнымц
[Knazek elal., 1972; Gullinoand Knazek, 1979] разрабо-
тали перфузионную камеру на основе пучка пластико-
вых капиллярных волокон, которая в настоящее время
является коммерчески доступной (см. Приложение II,
иоловокнцстая перфузионная культура) Волокна
являются проницаемыми для газов и питательных
веществ и поддерживают клеточный рост на их внеш-
ней поверхности. Среда, насыщенная 5% СО2, прока-
чивается насосом через центры капилляров, а клетки
добавляются во внешнюю камеру, окружающую пучки
волокон (см. рис. 8.11; см. также рис. 26.6). Клетки
прикрепляются и растут на внешней стороне пучков
волокон, питаясь за счет диффузии из прогоняемой по
волокнам среды, и могут достичь клеточной плотности
анало! ичной таковой в тканях. Различные пластики и
ультрафильтрационные свойства материалов позволя-
ют регулировать молекулярный вес диффундирующих
веществ, О1раничивая его 10,50 или 100 k Da.
Считается, что клетки этого типа в культуре с
высокой плотностью ведут себя как ткани in vivo. На-
иример, в таких культурах клетки хориокарциномы
высвобождают больше человеческого хорионического
гонадотропина [Knazek el al., 1974], чем в соответ-
ствующей монослойной культуре, а клетки карциномы
толстой кишки производят более высокий уровень
CEA [Rutzky et al., 1979; Quarles et al., 1980]. Тем не
менее существует* ряд техноло! ических сложностей в
подключении камер, и они достаточно дорогостоящи.
Более того, взятие образцов из таких камер, определе-
ние клеточной концентрации также сложно. В целом,
однако, полые волокна представляются идеальной
системой для изучения синтеза и высвобождения
биофармацевтических препаратов, что позволяет в на-
стоящее время использовать их в полупромышленных
масштабах (см. разд. 26.2.6).
25.3.3. Сфероиды
При культивировании диссоциированных клеток во
вращательном шейкере они могут вновь объединяться
в кластеры. Дисиер! ированные клетки из эмбриональ-
ных тканей будут высокоспеццфичным образом рас-
пределяться в ходе этой агрегации [Linser & Moscona,
1980]. Показано, что клетки в этих гетеротипичных
ai регатах способны подразделяться на группы с фор-
мированием тканетштчных структур. Гомотшшческая
peat 1 pei ация также происходи г достаточно ле1 ко. Сфе-
роиды, которые образуются во вращательном шейкере
или при росте на агаре, используют обычно в качестве
модели для исследований в химиотерапии in vitro
[Twentyman, 1980] и для характеристики злокачествен-
ной инвазии [Mareel et al., 1980]. Как и в случае орган-
ной культуры, рост сфероидов ограничен диффузией,
может быть достш нуто стационарное состояние, ири
котором клеточная пролиферация во внешних слоях
уравновешивается центральным некрозом (рис. 25.4).
Дальнейшее введение и протокол 25.2 для приготов-
ления mhoi окдеточных опухолевых сфероидов предо-
ставлены М. Boyd and RJ. Mairs, Center for Oncology
and Applied Pharmacology, Glasgow University. Cancer
Research L’K Beatson Laboratories, Garscube Estate,
Bearsden, Glasgow G61 1BD, Scotland
Mhoi оклеточные опухолевые сфероиды являются
пролиферирующей моделью бессосудистого метаста-
494
ГЛАВА 25. ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
точных линий не образуют сфероидов таким методом.
Агрегаты могут быть иолучены иначе: из клеточной
сусиензии в стационарных флаконах, предварительно
покрытых агаром. Агрегаты могут быть оставлены в
тех же флаконах или перенесены индивидуально при
помощи пипетки во многолуночный планшет, где про-
должение роста в течение нескольких недель приведет
к образованию сфероидов максимального размера, при-
мерно 1000 мкм [Yulias el а!.. 1977; Sutherland, 1988].
Рис. 25.4. Разделение клеток в сфероидах. Сечение че-
рез зрелый сфероид диаметром примерно 600-800-мкм
(в) Аугорадиографичсскн меченый [,351[ ноддеоксиуридин
(IUdR), обнаруживает распределение метки на периферии
(6) Иммунопсроксидазное окрашивание с антп-BUdR, даст
похожее раснрсдс гснис метки по периферии сфероида. (С лю-
безного разрешения All Ncshastcrcz.)
зирования. Трехмерная структура сфероидов позво-
ляет экспериментально изучать различные аспекты
проникновения лекарств и устойчивости опухолевых
клеток к облучению и химиотерапии, которые зависят
от межклеточных контактов. Сфероиды также хорошо
подходят для изучения побочного эффекта при экспе-
риментальной направленной избирательной терапии
или генной терапии [Boyd et al., 2002,2004]. Опухоле-
вые сфероиды человека лег че получить из установив-
шихся клеточных линий или ксенотрансплантатов, чем
из первичных опухолей [Sutherland, 1988]. Из суспен-
зии единичных клеток (трииси визированного моно-
слоя или дезагрегированной оиухоли) клетки могут
быть инокулированы в сосуды с маг нитной мешалкой
(Techne) с инкубацией, позволяющей образоваться
маленьким агрегатам через 3-5 дней [ Boyd et al., 2001].
Эта процедура оитимальна; однако большинство кле-
ПРОТОКОЛ 25.2. Сфероиды
Схема
Триисинизировать клетки монослоя или дизагре-
гировать первичную ткань и посеять клетки на
субстрат, покрытый агаром. Перенести агрегаты в
24-луночные планшеты для анализа.
Материалы
Стерильные:
• Инертный агар (Noble) (Difco, В-D Biosciences).
• Ростовая среда
• Сверхчистая вода (UPW)
• Триисии 0.25%, в PBSA
• Флаконы, 25 см* 1 2 3 4, или 24-луночные планшеты
• Чашки Петри, 9 см
Замечание. Когда для покрытия субстрата исполь-
зуется агар, все флаконы, чашки, планшеты должны
быть стерильны, но нет необходимости доводить
стерильность до степени работы с тканевыми куль-
турами
Нестерильные.
• Pi-насос (см. Приложение И) или эквивалентное
пипетирующее устройство
Протокол
Обработка агаром 25-смг флаконов
1. Добавьте 1 г агара Noble в 20 мл UPWb 100-мл в
бутыль из боросиликатного стекла со свободно
завинчивающейся крышкой.
2. Подогрейте агар на водяной бане при 100"С в
течение 10 мин до иол ног о растворения агара
3. Немедленно добавьте содержимое бутыли к 60 мл
ростовой среды, предварительно подогретой до
37 °C. разлейте ио 5 мл в каждый флакон. Убе-
дитесь, что в агаре нет пузырьков.
4. Оставьте агар ири комнатной температуре
-5 мин, в результате получите флакон, покрытый
1,25% агаром.
Обработка агаром многолуночных планшетов:
1. Добавьт е 0,5 г агара к 10 мл UPW, подогрейте,
как описано в шаге 2 для 25 см2флаконов. а затем
добавьте 40 мл UPW.
2. Поместите 0,5 мл гголучившегося раствор в
каждую лунку 24-л у ночного планшета, чтобы
25.3. Гистотипическая культура
495
получить покрытие основания лунок 1°о аиром.
Аккуратность и точность манипуляции важны
для того, чтобы правильно проводить фокуси-
ровку микроскопа цри последующем наблюдении
сфероидов.
Инициализация сфероидов:
1. Триисивизируйте конфлюэнтный монослой
(для установленных клеточных линий, см. про-
токол 13.2) или дезагрет ируйте (для плотных
опухолей, см. протоколы 12.5. 12.6 и 12.8), чтобы
получить суспензию единичных клеток.
2. Нейтрализуйте трипсин при помощи среды, со-
держащей сыворотку (если необходимо)
3. Подсчитайте количество клеток, используя элек-
тронный счетчик клеток или гемоцитометр.
4 Поместите 5x105 клеток в 5 см ростовой среды
в каждый 25-см2 флакон, обработанный aiapOM,
инкубируйте культуры. Если клетки способны к
формированию сфероидов, через 3—5 дней будут
спонтанно образовываться маленькие (примерно
100—300 мкм в диаметре) агршаты клеток.
Для последующего роста сфероиды должны быть
перенесены в новые 25-см'флаконы или 24-луночнй
планшет.
Перенос в 25 смг флаконы:
1. Перенесите содержимое исходных флаконов в
конические центрифужные пробирки или уни-
версальные контейнеры.
2. Оставьте сфероиды осаждаться, удалите супер-
натант с единичными клетками.
3. Ресусиендируйте сфероиды в свежей среде и
перенесите суспензию в новые флаконы, обра-
ботанные aiap<»M, 1де рост будет продолжаться
за счет деления клеток во внешнем слое.
Перенос в 24-луночный планшет:
1. Перенесите содержимое каждо! о из 25-см2 в 6-см
чашку Петри.
2. Добавьте 0,5 мл среды в каждую покрытую aia-
ром лунку 24-луночного планшета.
3. Выберите отдельные сфероиды выбранного раз-
мера при малом увеличении (х40) и, используя
пастеровскую пипетку, и Pi-насос или другое
аналотчное устройство при соответствующем
тщательном контроле, перенесите выбранные
сфероиды примерно одинакового диаметра в пок-
рытые aiapOM лунки 24-луночною планшета.
4. Поместите планшет в СО,-инкубатор.
5 Заменяйте среду в планшете один или два раза в
неделю (заменяя 0.5 мл каждый раз), или добав-
ляйте 0,5 мл среды (не удаляя среду) один-два
раза в неделю, в результате через 2—4 недели
получите объем 2 мл в каждой лунке.
Анализ. Рост сфероидов в лунках или флаконах
может бы гь количественно учтен путем pei улярного
(2—3 раза в неделю) измерения их диаметра с исполь-
зованием окуляра-микрометранли координатной сетки
либо, что предпочтительно, путем измерения площади
сечения с помощью сканнера-анализатора изобра-
жений Самая точная кривая роста получена путем
выращивания сфероидов в лунках и индивидуального
их мониторинга. Сфероиды также могут использовать-
ся для клоногенных исследований после обработки
тестируемым ai ентом. Сфероиды собирают в универ-
сальный контейнер, отмывают в С-РВ5Адля удаления
остатков среды и затем инкубируют с трипсином при
37 °C в течение 5 мин. Затем сфероиды деза! pei ируют
до суспензии единичных клеток путем пропускания
через И1лу шприца, затем подсчитывают. Количество
жизнеспособных клеток оценивается по исключению
триманового синего (см. протокол 22.1). Клетки затем
moivt быть использованы для соответствующих кло-
ногенных исследований [Boyd et al., 2001,2004].
Вариации
Трансфецироаанные мозаичные сфероиды. Сфероиды
мО1ут быть выращены из популяций клеток, которые
были трансфецированы различными генами. Клетки
сначала выращивают в монослое и затем трансфеци-
руются трансгеном и подвер1аются селекции транс-
ген-экспрессирующих клеток. Мозаичные сфероиды
формируют добавлением тринсфецированных и нетран-
сфецированных монослойных клеток в любых жела-
тельных пропорциях [Boyd etal., 2002,2004]. Различные
клеточные популяции распределены в получившихся
сфероидах приблизительно равномерными мозаичны-
ми участками, с поддержанием той же пропорции транс-
фецированных и нетрансфецированных клеток, какая
была на стадии формирования (цв. вкладку 12л).
Приложения. Сфероиды имеют широкую сферу
применения при моделировании бессосудистого опу-
холевого роста [Ward & King, 1997], исследовании
роли трехмерной пространственной конфш урации
в экспрессии гена в клеточной популяции [Waleh et
al., 1995; Dangles et al., 1997], а также цитотоксичного
воздействия. Параметры конечной точки воздействия
включают задержку роста, определение доли сферои-
дов, стерилизованных («вылеченных») в результате
воздействия, формирование колоний в монослое мос-
ле дезагрегации обработанных сфероидов [Freyer &
Sutherland, 1980, Boyd et al., 1999,2004].
Важной областью использования сфероидов яв-
ляется изучение проникновения цитотоксических
препаратов, антител или дру i их молекул, использован-
ных в направленной избирательной (таргет) терапии
[Sutherland, 1988; Carlsson & Nedermau, 1989]. Эта
категория представляет собой особую область приме-
нения, которая невозможна для суспензии единичных
клегок или монослойной культуры. Сфероиды также
могут быть полезны для изучения i ибели клеток иод
действием радионуклидов направленного действия
[Mairs & Wlieldou, 1996, Boyd el al., 2001, Fullerton el
al., 2004]. Культура сфероидов также применяется в
сравнительных экспериментах ио изучению инвазив-
ности сфероидов, полученных из малш визированных
клеточных популяций, которые выращены в неиосред-
496
ГЛАВА 25. ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
ственной близости от нормальных клеточных культур
[tie Ridder, 1997]. Такие методы также применялись
в неонколщ ических исследованиях иатолт ических
процессов, таких как исследования ревматоидно!о
артрита [Ennis et al., 1998J. Мозаичные сфероиды
являются новой вариантной и имеют особое приме-
нение в исследовании побочного дейс гвия. Наиример,
определенную сложность для 1енной терапии рака
представляет неэффективность процедур !енного
переноса; они вызывают значительные побочные
эффекты в опухолевой популяции, которая не была
успешно трансфецирована. Мозаичные сфероиды от-
ражают эту ситуацию in vitro и позволяют произвести
оценку различных форм побочного эффекта, таких как
радиационные перекрестные помехи при наирвленном
действии радиоактивных at ентов на трансфеиирован-
ные клетки [Boyd el al., 2002,2004].
25.3.4. Вращающиеся камерные системы
Биореактор Miniperm. Перемешивание и аэрация
также может быть достигнуты вращением куль-
турального сосуда в обычной роллерной бутыли
(см. иротокол 26.3) или в двухкамерных системах
(рис. 25.5). Если клеточная суспензия ограничена до
одно!о небольшого комиартмента, то клеточная кон-
центрация может быть достаточно высокой, поскольку
клетки не разводятся средой. Концентрация продук-
та (наиример, антител) накапливается в клеточном
комиартменте, в то время как питательные вещества
и продукты отходов диффундируют через полупро-
ницаемую мембрану в мембранный комцартмент и из
нею. Примером такою рода оборудования является
система MiniPERMTM, двухкомиартментный ци-
линдр с клетками в меньшем комиартменте и средой в
большем, разделенными полупроницаемой мембраной
(Vivascience, Sartorius; см. рис. 25.5). Он вращается
для гарантированною получения смеси, а среда может
быть сохранена или заменена без разрушения клеток
или продукта, хотя t лавной целью является получение
партии продукта, наиример моноклональных антител.
Конфигурация камеры и медленное вращение приво-
дят к образованию at pet атов и таким образом может
иовысить получение продукта.
Вращательная система культуры клеток
(RCCS). Заинтересовавшись концепцией клеточною
роста в условиях уменьшенной t равнтации в 1980-х 11.,
NASA сконструировала вращательную систему, в ко-
торой клетки, растущие в суспензии, оказываются иод
воздействием смоделированной нулевой гравитации в
медленно вращающейся камере, постоянно изменяю-
щей вектор седиментации (рис. 25.6). Клетки остаются
стационарными и подпер! аются нулевому касатель-
ному напряжению, что приводит к формированию
трехмерных atper-атов, сфероидиодобных структур,
которые могут стать более дифференцированными с
повышением уровня формирования продукта [Мате-
риалы рабочею совещания NASA ио регуляции клеток
и дифференцировке клеток в биореакторах, 1997].
Газообмен происходит в направлении из цилиндра,
содержащего клетки, через центральную силиконовую
мембрану. Ко1да вращение прекращается, агреюты
оседают, и среда может быть замещена. Такой биоре-
актор производится компанией Synthecon, Inc. в форме
одноразового блока RCCS или системы многократ-
ного использования STLV (медленно вращающийся
латеральный сосуд). В дополнение к первоначальной
цели, для определения действия невесомости на клет-
ки с применением в космической программе [Freed &
Vunjak Novakovic, 2002] этот культуральный сосуд
также может использоваться как биореактор для пар-
тии культуры или гканево-инженерных конструктов
| Dutt et aL, 2003; Vunjak-Novakovic, 2005].
Рис. 25.5. Вращающаяся камерная система. Heraeus
Miihpenii. Концентрированная клеточная суспензия в левой
камере отделена от- камеры со средой полупроницаемой мем-
браной. Продукт с высоким молекулярным весом остается
вместе с клетками и может быть выделен через порт для
отбора проб, в то время как замещение среды осуществляе ten
через правый порт. Перемешивание достигается путем враще-
ния камеры на роллерном счеллаже (Miniperm Vivascicncc.
Sartorius AG)
25.3.5. Иммобилизация живых клеток
в альгинате
Метод инкапсулирования живых клеток в альгинатных
шариках был широко использован в эксперименталь-
ных исследованиях, наиример для исследования гцб-
ридомных клеток ири производстве моноклональных
антител [Lang el al., 1995], гормон-иродуцирующих
клеток, использованных в модели животных для ле-
чения сахарною диабета [Soon-Shioug et al., 1992] и
хондроцитов (см. иротокол 23.16, цв. вкладку 186).
Алыинат первоначально был выделен из корич-
невых морских водорослей Laminaria, Macroaystt и
Ascophyllum. Он состоит t-чавным образом из двух
типов моносахаридов: L-глюкуроновой кислоты (G) и
D-маннуроновой кислоты (М). Структурно алыннат
содержит чередующиеся молекулы М it G валентные
катионы связаны между отдельными единицами G, и
инициируют образование растянутой сети алы инатно-
ю юля. Алы инатные юли могут формировать шарики,
25.3. Гистотипическая культура
497
Рис. 25.6. Вращающаяся система для культуры клеток
Synthecon Rotatory Cell Culture System. В системе Rotary
Cell Culture System™ клетки поддерживаются в суспензии
путем установления скорости вращения цилиндрической
культуральной камеры. Газопроницаемый силиконовый мем
бранный сердечник jaei клеткам достаточное количество газа,
в то время как отсутствует трение жидкости, вызывающее
формирование пузырей. Биореактор, сконструированный
NASA, можно приобрести в компании Synthecon (см При-
ложение III) и широкой сети дистрибьютеров (а) Камера
многократного использования, (о) Камера одноразового
использования (см так-ке цв вкладку 22в)
если капать его малыми порциями в буфер, содержащий
двухвалентные катионы, такие как Са* 1 2-. Механическая
прочность, объем, стабильность и пористость коррели-
руют с содержанием G, так что алы инатные шарики с
высоким содержанием G имеют больший размер пор, в
диапазоне 5-200 нм [Martinsen et al.. 1989: Miura el al.,
1986]. Поры таких размеров позволяют идт и свободной
диффузии макромолекул из алы штатных шариков и
внутрь них. Иммунная реакция хозяина на алыиназ
может быть значительно снижена использованием
альгината при высоких концентрациях G и низких
концентрациях М [Otterlei et al., 1991 J.
В настоящее время большое количество клеточных
типов мшут быть генетически сконструированы для
получения различных специфических белков Пу-
тем инкапсулирования клеток в алыинате получено
средство доставки для транспорта рекомбинантных
белков в орт анизм. Таким образом, такие алы инатные
«биореакторы» могут иметь важный терапевтический
потенциал для лечения ряда болезней, при которых
алы инат может защищать инкапсулированные клетки
от разрушения иммунной системой.
Протокол 25.3 и предшествовавшее введение в аль-
। пнатное инкапсулирование предоставлены Tracy-Ann
Read и Rolf Bjerkvig, Department of Anatomy and Cell
Biology, University of Bergen, Norway
ПРОТОКОЛ 25.3. Альгинатное
капсулирование
Схема
Триисинизпроватъ клетки из флакона 75-см2, под-
счпта гь их и смешать с раствором алыпната натрия.
По кайле выдавить смесь в раствор хлорнсто! о на-
трия для формирования шариков и культивировать
в суспензии
Материалы
Стерильные:
• Ростовая среда для выбранных клеток
• D-PBSA
• Трипсин (концентрация соответствует принятой
для субкультуры данных клегок)
• Солевой раствор, содержащий:
a) NaCl............................. .8,0 г
б) D-i-чюкоза....................... 1,0 г
в) Довести объем UPW до...... ....1л
।) Довести pH до 7,2—7,4 добавлением HCI или
NaOH
д) Стерилизовать автоклавированием
CaCl,, 0,1 М, содержащий
е) Солевой раствор..... .. 500 мл I
ж) СаС12 - 2Н ,О....................7,35 г I
з) Довести pH до 7,2-7А добавлением НС1 или I
NaOH
и) Стерилизовать авт оклавированием
• Алы инат натрия (PRONOVA™ U Р LVG). высо- |
кой чистоты, низкой вязкости, с высоким содер- I
жанием тлюкуроновой кислоты
• Стерилизующие фильтры, 0,45 мкм нештроген- |
ные (Millipore)
Протокол
1. Растворите алыинат в солевом растворе до
концентрации 1,5% и встряхивайте на шейкере
получившийся раствор как минимум 4 часа при
комнатной температуре, пока весь алы инат пол-
ностью не растворится. Растворенный алы инат
может храниться при 4 °C не более 3 дней.
2. Профильтруйте алы инат трижды через стериль-
ные нештроген н ые 0,45-мкм фи л ьтр. Последнюю i
фильтрацию следует проводить непосредственно I
перед использованием алы ината.
498
ГЛАВА 25. ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
3. Вырастите клетки до конфлюэнтного слои.
4. Трицсинизируйте клетки добавлением 3 мл трип-
сина и подсчитайте их.
5. Центрифу!ируйте клетки мри 900 об./мин в
течение 4 мин и удалите полностью удалите су-
пернатант с трипсином.
6. Смешайте клетки с алы инатом до концентрации
2х10**кл./мл осторожным ресуспенднрованием
клеток в алы инате. Очень важно не допускать
образования пузырей воздуха в алы инате, по-
скольку эго может привести к образованию дыр
в алы инатных шариках.
7. Перенесите суспензию клеток в алы инате в сте-
рильный шприц, с надетой на него иглой 27G.
8. По каплям выпускайте суспензию в стакан,
содержащий 0.1 М СаС12ири постоянном пере-
мешивании жидкости, что инициирует форми-
рование альгинатных шариков.
9. Оставьте примерно на 10 мин, затем трижды
отмойте в D-PBSA
10. Последний раз отмойте в ростовой среде.
11. Культивируйте шарики в 175-см* 1 2 3 4 культураль-
ных флаконах, содержащих ростовую среду при
37 °C, 100% относительной влажности, и 5% СО,
в воздухе.
25.3.6. Вкладыши для фильтрационных
лунок
Вкладыши для фильтрационных лунок представля-
ют собой коммерциализацию системы для культуры
ор1анов на основе фильтра, которые развивались с
1950-х годов и используются с тех пор в различных
формах. Фильтрующий субстрат представляет собой
микроокружение для изучения межклеточных взаимо-
действий, расслоения, поляризации и моделирования
тканей. Полярность и функциональное единство мо-
жет быть установлена ио типу эпителия щитовидной
железы [Chambard el al., 1983], кишечника [Halleux &
Schneider, 1994] u почки [Mullin el al., 1997] (cm.
разд. 17.7.4). Культуры на фильтрах позволяют воссо-
здавать многослойный эпидермис [Liinal el al., 1995;
Kondo el al., 1997; Maas-Szabovvski el al., 2000, 2002].
Дру i не культуры используются для изучения инвазии
гранулоцитов или злокачественных клеток [McCall et
al., 1981: Elvin etal., 1985; Repesli. 1989: Schleclneet al.
1990, Brunion el al., 1997]. Одним из самых главных
преимуществ вкладышей в фильтрационные лунки
является возможность рекомбинации клеток при очень
высокой плотности, близкой к тканевой. При этом в
мультирецликативной форме сохраняется доступ к
среде и 1 азообмен. В настоящее время различными
компаниями кредла!аются вкладыши в фильтраци-
онные лунки (см. Приложение II) из разнообразных
прозрачных ii полупрозрачных материалов, включая
поликарбонат, PTFE тетрафталат полиэтилена разме-
рами от 6,5 мм до 9 см, подходящих для 24-, 12- и 6-лу-
ночных планшетов чашек большего размера (рис. 24.5,
24.6; цв. вкладка Plale 13; табл. 25.1). Фильтры могут
быть предварительно покрыты коллагеном, ламини-
ном, фибронектином или Matrigel.
Анализ:
1) Проницаемость: Некоторые эпителиальные (на-
пример, MDCK п Сасо-2) и эндотелиальные клет-
ки (например, из пупочной вены) образуют плот-
ПРОТОКОЛ 25.4. Вкладыши
для фильтрационных лунок
Схема
Посеять клетки на вкладыши для фильтрационных
лунок, и культивировать клет ки при излишке среды
в мнопмуночных планшетах
Материалы
Стерильные:
• Примерно 0,5х 10" клеток на см2 фильтра
• Ростовая среда. 1 -20 мл на фильтр (в зависимос-
ти от емкости принимающей фильтр)
• Вкладыши для фильтрационных лунок
• Многолуночные планшеты для вкладышей: 6-,
12- или 24-луночные
• Пинцеты искривленные
Нестерильные.
• Автоматическая иииетка
Протокол
1. Поместите фильтрационные лунки в планшет'
или чашку.
2. Добавьте среду, наклоняя чашку так, чтобы среда
заполнила пространство иод фильтром и вытес-
нила воздух. Добавляйте среду, пока ее уровень
не будет на уровне фильтра (2,5 мл для 6-луноч-
ного планшета, 1,0 мл для 24-луночного).
3. Установите уровень в чашке и добавьте 1x10й кле-
ток в 2 мл среды на верхнюю часть фильтра при
25-мм диаметре фильтра пли 5x10s 6 в 200 мкл
среды при 6,5-м диаметре фильтра стараясь не
повредить фильтр.
4. Поместите чашку во влажный СО,-инкубатор
в защитную коробку (см. разд. 6.6.2). Чрезвы-
чайно важно избе<ать встряхивания коробки,
культуры не должны передвигаться в инкубаторе
во избежание расплескивания и последующей
контами нации.
5. Монослои должны установиться на 3 5 дней,
хотя для 1 пстотииической дифференцировки
может потребоваться еще 5—10 дней или больше
(например, для установления поляризационного
транспорта)
6. Культуры moi ут поддерживаться неопределенно
долго, с замещением среды или перенесением
вкладыша в свежую лунку или чашку каждые
3-5 дней.
25.3. Гистотипическая культура
499
Таблица 25.1. Типы вкладышей в фильтрационную лунку
Изготовитель Название Материал Характеристики Прозрачность Пористость (мкм)
Milhporc Milliccl Нитроцеллюлоза Полиолефин Сетчатый Сетчатый Непрозрачный Прозрачный 0,45 0.45
Corning Costar Transvclls Поликарбонат Абсолютный Прозрачный Полупрозрачный * 5-8 0,45-1,0
Falcon (В-D Biosciences) Inserts Тстрафталат полиэтилена Абсолютный Прозрачный 045-3
Nunclon Earl-Clay Auoccl Ultraclonc Керамика Коллаген Решетчатый Сетчатый Прозрачный Прозрачный 0,01
* Чем выше частота пор, тем ниже прозрачность. Низкоиоровый фильтр имеет высокую частоту пор и, соответственно, мень-
шую прозрачность
ные межклеточные контакты в течение нескольких
дней после достижения конфлюэнтности. Этот
процесс можно ускорить предварительной обра-
боткой мембран коллагеном. Трансэнителиальная
проницаемость после этого становится ограничен-
ной физиологически регулируемым транспортом
через клетки, а межклеточный транспорт надает
до нуля. Это процесс можно регулировать, наблю-
дая перенос красителя (например люциферина
желтого), или меченого соединения, такою как
[МС] метил целлюлоза пли [ПС] инулин, через
мембрану. Проницаемость также можно оценить
но трансэпител нал ьном у электрическому сопро-
тивлению (TEER).
2) Поляризованный транспорт. Добавление меченой
1 люкозы или аминокислоты в верхний комнартмент
вкладыша позволит наблюдать транспорт их в ниж-
ний комнартмент, при условии отсутствия обратно-
го потока. Если клетки обладают р-гликоцротеи ном
или каким-то дру । им транспортером веществ нару-
жу, то в нижний комнартмент могут быть добавлены
цитотоксин (наиример, винбластин), который бу дез
переноситься в верхний комнартмент, но не будет
возвращаться обратно.
3) Проникновение кнопок через фильтр Трипсинн-
зирунте и подсчитайте клетки на каждой стороне
фильтра но очереди (трипсинизированные клетки
не проходя г даже через фильтр с диаметром пор
8-мкм, поскольку их сферический диаметр в сус-
пензии превышает эти размеры) или фиксируйте
фильтр, залейте и приготовьте стандартные срезы
для электронной микроскопии или гистоло! ических
исследований. Визуализация тотального препарата
возможна путем заливки и окраски всего препарата
но Гимза на предметном стекле в DPX под покров-
ным стеклом при давлении, так ч гобы расплющить
препарат. Дифференциальный подсчет возможно
провести при последовательной фокусировке мик-
роскопа на различных оптических плоскостях.
4) Отделение кнопок от фильтра и седиментация их
на дно чашки. Подсчитайте клетки н<н?ле тринсини-
зации или путем сканирования.
5) Разграничение пространства над и под фильтром.
Подсчитайте клетки как в ц. (3), или предваритель-
но пометьте клетки родамином пли изотиоцианатом
флюоресцеина (5 mki мл в течение 30 мин в трин-
си низированной суспензии) и измерьте с каждой
стороны фильтра флюоресценцию солюбилизиро-
ванных триисинизированных клеток (0,1% SDS в
0,3 N NaOH в течение 30 мин).
6) Клеточная инвазия. Предварительно покройте
фильтр клеточным слоем нормальных «фиброблас-
тов, MDCK либо подобных им клеток. Используя
микроскоп, убедитесь, что достш нуто конфлюэнт-
ное состояние, и затем посейте EDTA-диссоцииро-
ванные клетки поверх этого слоя (101-!О’1 клеток
на «фильтр). Если исследуемые клетки RITC- или
FITC-меченые, то измерьте флюоресценцию, ко-
торая появится в результате появления клеток под
фильтром.
7) Инвазия через матрикс. Нанесите на фильтр
Matrigel, поместите клетки над Matrigel, и следи ге
за появлением клеток под фильтром [Repesh, 1989;
Sclilechleel al.,1990]. Можно также посеять клетки
на нижнюю поверхность фильтра, покрыть верх-
нюю поверхность фильтра Matrigel, и наблюдать
за инвазией клеток в Matrigel при помощи конфо-
кального микроскопа [Brunton el al.. 1997].
Вариации
1) Глубина слоя среды. Толщина слоя среды над филь-
тром определяет давление кислорода на уровне рос-
та клеток. Кератиноциты или цневмоциты типа II
из легочных альвеол потребуют меньшей толщины
слоя среды и высокого давления кислорода, в то
время как энтероциты, такие как Сасо-2, будут луч-
ше расти при более глубоком по«ружении и более
низком давлении кислорода.
2) Пористость фильтра. Фильтры с диаметром пор
1 мкм позволяют осуществляться межклеточному
взаимодействию и контакту без проникновения
через фильтр. Фильтр с диаметром пор 8-мкм
позволяет живым клеткам проходить сквозь
фильтр. Фильтры с порами 0,2-мкм, ио-видимому,
исключают межклеточный контакт. Низкоиоровые
фильтры мо«ут быть использованы для изучения
клеточного взаимодействия без непосредственного
контакта клеток.
SOO
ГЛАВА 25. ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
Среда
Чашка Петри или
пунка многолуночного
планшета
Взаимодействующим клеточный слой
например стромальных фибробластов
Рис. 25.8. Вкладыши Transwells. Вкладыши в фильтра-
ционную лунку в 12-луночном планшете, отдечьно сбоку
вкладыш (Corning.)
Взаимодействующий клеточный слой,
например стромальных фибробластов,
заключенный в коллагене
образовалось капиллярное пространство между
крышкой и фильтром. Инкубируйте фильтр в
течение 18 ч. Капиллярность будет удерживать
среду и клетки, пока клетки не осядут на фильтр
и не прикрепятся к нему [Brunton el al., 1997]. На
следующий день переверните фильтр и внесите в
лунку взаимодействующие клетки или Malrigel,
как это описано в протоколе 25.4.
Взаимодействующий клеточный слой, например
эндотелиальные клетки под фильтром
Рис. 25.7. Вкладыши в фильтрационную лунку. Схема
ГИМОТСТПЧССКО1 о вкладыша в фильтрационную лунку
(в) Монос чой, выросший на верхней части фильтра, (б) Мо-
нослон, выросший на матриксе на верхней части фильтра
(в) Взаимодействующий клеточным слой, добавленным к
нижней стороне фильтра, (г) Взаимодействующим клеточ-
ный слон, добавленный к матриксу (d) Взаимодействующий
клетчнып слой, добавленный к нижней стороне фильтра с
матриксным покрытием над ним
3) Взаимодействия клеток через фильтр. Переверните
вкладыш в фильтрационную лунку, поместите его
верхней стороной в чашку Петри и нанесите на
его нижнюю стирону (теперь pacuo.'iaiающуюся
сверху) 0,5 мл сусиенлии клеток с концентрацией
2х 10екл./мл. Поместите крышку поверх чашки
и, сле1 ка касаясь капли клеточной суспензии, до-
бейтесь, чтобы вся среда протекла через фильтр.
Глубина чашки должна быть примерно на 0,5— 1 мм
больше, чем высота вкладыша в лунку, так чтобы
25.3.7. Культуры нейрональных агрегатов
Агрегирующие культуры фетальных клеток MO3ia
широко используются для изучения дифференци-
ровки нервных клеток [Seeds, 1971; Trappet al., 1981;
Bjerkvig el aL, 1986a|. Агретрующпе клетки проходят
те же стадии дифференцировки, которые наблюдаются
tn vivo, что приводит к формированию органоидной
структуры, состоящей из зрелых нейронов, астроцитов
и олигодендроцитов. Также формируются выступаю-
щие нейропили. В области биоло! ии новообразований
aipeiaTbi мо1ут быть использованы для изучения in
vitro инвазивных процессов клеток опухоли MO3ia
[Bjerkvig el al., 1986bJ. Предварительное введение и
протокол 25.5 для arpei ирующих культур клеток мозга
предоставлены Rolf Bjerkvig, Department of Cell Biology
and Anatomy, University of Bergen. S' Zrstadveien 19
N-5009, Bergen, Norway.
В течение 20 дней в культуре агрегаты станут сфе-
рическими в приобретут opi аноцдную структуру.
Анализ. Зафиксируйте образец и залейте его в
парафин или дру1ую среду для 1истоло1 ических или
элек rjKiH но-микроскоиических исследован ий. Олиго-
дендроциты, астроциты и нейроны мО1ут быть иденти-
фицированы путем электронно-трансмиссионной мик-
роскопии или иммуно! истохимического исследования
локализации основного миелинового белка, кислого
25.3. Гистотипическая культура
501
ПРОТОКОЛ 25.5. Нейрональные агрегаты
Схема
Изъять MO3t из плодов крыс на 17-й или 18-й день
созревания (проконсультируйтесь с местным Коми-
тетом ио Биоэтике, см. разд. 7.9.1) и «повитьсуспен-
зию единичных клеток мозга. Формировать агрегаты
клеток мозга культивированием в покрытых агаром
лунках многолуночного планшета. Клетки в arpeta-
тах образуют зрелую opt аноидную структуру мозга
в течение 20 дней культуры.
Материалы
Стерильные:
• Модификация Дюльбекко среды Игла, содер-
жащая 10% термически инактивированной сы-
воротки теленка; четырехкратная концентрация
BCtiOMOtательных аминокислот; Ь-тлютамин,
2 мМ; пенициллин 100 U/мл; стрептомицин,
100 mki/мл
• Фосфатно-буферный раствор (PBS) с Са^г и
Mg2’
• Трипсин, тин II (0.025% в D-PBSA)
• At ар (Difco)
• Мши олу ночная культура ткани (24-луночные
планшеты; Nalge Nunc)
• Чашки Петри, 10 см
• Тестовые пробирки. 12 мл
• Скальпели, ножницы хирургические пинцеты.
• Флаконы Эрленмайера, 100 мл, 2 шт
• Обработать ячейки агар-содержащей средой сле-
дующим образом:
а) Приготовьте 3% маточный раствор (3 г агара
в 100 мл D-PBSA) во флаконе Эрленмайера.
б) Подогревайте флакон в кипящей воде, пока
aiap не растворится. Поместите пустой флакон
Эрленмайера в кипящую воду и добавьте 10 мл
горячего раствора агара.
в) Медленно добавьте во флакон теплую полную
ростовую среду, пока концентрация at ара в
среде не достш нет 0,75%.
।) Добавьте 0,5 мл теплого раст вора агара в среде
в каждую лунку многолуночного планшета.
д) Оставьте at ар остывать с образованием геля.
Обработанный мнщолуночный планшет
может храниться в холодильнике в течение
1 недели
Нестерильные:
• Водяная баня
Протокол
1. Иссеките асептически целый мо.и новорожден-
ного крысенка или плода на 17-й или 18-й день
развития и поместите ткань в 10-см чашку Петри,
содержащую D-PBSA.
2. Используя скальпель, измельчите ткань на мел-
кие кубики, размером -0,5 см3.
3. Перенесите ткань в пробирку и трижды промой ге
в D-PBSA, оставляя ткань оседать на дно иробир- ।
ки между промываниями.
4. Добавьте 5 мл раствора трипсина к ткани и ин-
кубируйте в водяной бане в течение 5 мин цри |
37 °C.
5. Дезагpet ируйте ткань comoi енизацией ири иомо- I
щи пастеровской пинетки примерно 20 раз.
6. Оставьте ткань для оседании примерно на 3 мин, I
перенесите суспензию молочно! о вида без сгус-
тков в пробирку, содержащую 5 мл ростовой
среды.
7. Добавьте 5 мл свежею трипсина к недиссоиии-
рованной ткани и повторите триисинизацню и I
процедуру диссоциации еще дважды.
8. Центрифуtируйте Клеточную суспензию цри I
200 g в течение 5 мин.
9. Отберите и удалите супернатант, ресусиенди-
руйте клетки, объедините их в 10 мл ростовой |
среды.
10. Подсчитайте клетки и добавьте 3x1 О*1 клеток в |
1 мл в каждую лунку, покрытую aiapOM
11. Поместите многолуночный планшет в СО2-инку
батор на 48 ч.
12. Перенесите arpetaibi в стерильные 10-см чашки I
Петри и добавьте цо 10 мл ростовой среды в |
чашку.
13. При помощи пастеровской иииетки перенесите I
более крупные arpeia-гы но одному в лунку, пок-
рытую агаром.
14. Меняйте среду каждый третий день, тщательно |
отбирая старую среду и добавляя новую.
глиального фибриллярною белка и нейрон-сиецифи-
ческой энолазы, соответственно.
Вариации. Суспензия единичных клеток может
быть получена механическим просеиванием через
стальное или нейлоновое сито [Trapp el al., 1981 ] (см.
разд. 12.3.8). При помощи ротационною шейкера мож-
но получить peat третирующие культуры. Выберите
необходимую скорость (около 70 об./мин), перенесите
клетки в вортекс, так чтобы увеличить количество
столкновений клеток между собой. Это встряхивание
позволяет предупредить прикрепление клеток к стен-
кам культуральною флакона.
25.3.8. Тканевой эквивалент
и тканевая инженерия
Успехи технологии фильтрационных лунок, которые
поддерживались их коммерческой эффективностью,
привели к их быстрому распространению ири разра-
ботке методов ор1анотииической культуры. Эквива-
лент кожи был получен путем совместной культуры
Эпидермиса и дермы (Mauek Epidenn, Episkin, Skin-
Б02
ГЛАВА 25. ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
Неразлагающиеся
Искусственный
шелк, нейлон,
стекло
ВОЛОКНО
PGA, PLA,
Коллаген
Неразлагающиеся
Силикон, PTFE
(Goretex)
ТРУБКА Биодеградирующие
Коллаген
Искусственный
шелк, нейлон,
стекло
Искусственный
шелк, нейлон,
стекло
2-D СЕТЬ
Коллаген,
PGA. PLA
3-D СЕТЬ
Коллаген,
PGA, PLA
ПУЧОК МИКРОКАПИЛЛЯРОВ
Альгинат
3-D ГУБКА
Коллаген,
желатин
Рис. 25.9. Каркасы и матрицы. Обзор различныхтигюв каркасов и матриц, используемых в тканевых инженерных конструктах.
Разработано много различных геометрических вариантов, включая линейные волокна или трубки (сверху), двумерные сетчатые
экраны или филыры (в центре) и трехмерные кубы и сферы (внизу) Хотя использовались неразлагающиеся материалы (слева
в каждом столбике), имеется общая тенденция к применению биодеградирующих материалов (сирава в каждом столбике), таких
как коллаген, желатин, полнгликолсвая кис юта (PGA) или полимолочная кислота (PLA) и фосфат кальция
гибкая. коллаген,
желатин (Gelfoam)
Твердая- фосфат
кальция
Ethic), с использованием промежуточного слоя кол-
лагена либо дермальных фибробластов, включенных
в коллаген [Linial et al., 1995; Maas-Szabowski el al.,
2000, 2002J. Модели паракринною контроля роста и
дифференцировки были разработаны на основе клеток,
выделенных из легких, [Speirs et al., 1991J, простаты
[Thomson etal., 1997J и молочной железы [Van Roozen-
dalil el al., 1992|.
Возможность применения гетеротипической куль-
туры для изучения межклеточною взаимодействия
открыла широкие перспективы для изучения воспале-
ния и раздражения in г ilro (см. цв. вкладку 21; см. также
разд. 22.6). а также для создания моделей тканевого
взаимодействия с возрастанием соответствия модели и
процессов in vivo [Emura et al., 1997; Gonunel al., 1997J.
Конструкция культур тканевых эквивалентов делает
возможной заместительную терапию. Эквиваленты
кожных культур используются при лечении ожого-
вых повреждений [Hunziker & Linial 1999; Gobet el al..
1997; Wright et al., 1998J. В настоящее время тканевая
инженерия применяется для создания замещающих
фрагментов во mhoiих органах и тканях, включая
хрящи, костные фрагменты, связки, Сердечные и ске-
летные мышцы, кровеносные сосуды, печень и желч-
25.3. Гистотипическая культура
503
Рис. 25.10. MR1 мониторинг клеток в 3D конструктах, (в) Резервуар со средой и оборудование для подачи газа обеспечивают
конструкты тканево-инженерных хрящей в биореакторах BR1 и BR2 (б) Увеличенное изображение биореактора [см. также
Neveset aL 2003].(в) Каталка е оборудованием для питания конструктов резервуары со средой и газовое снабжение, поддержа-
ние температуры при помощи водяной бани (г) (й) Снятие показаний приборов с биореактора, соединенного с подачей среды,
помещенного в ЯМ Р-детектор. Выход может быть визуализирован в двух- и трехмерном изображении MRI (см рис. 25.11) или
подперт нут спектральному анализу (см. рис 26 18) (С любезного разрешения А.А Neves & К. Brindle )
Б04
ГЛАВА 25. ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
ный пузырь [Atala & Lanza, 2002; Vunjak-Novakovic &
Freshney, 2005].
Как органотивические культуры требуют межкле-
точного взаимодействия, так и конструкты, применя-
емые в тканевой инженерии, часто требуют подобных
взаимодействий, например взаимодействия между
эндотелием и 1ладкомышечными клетками ири рекон-
струкции кровеносных сосудов [Klinger and Niklason,
2005]. В дополнение к биолсмическим взаимодей-
ствиям, некоторые конструкты требуют наличия
физических сил. Так, нацример, скелетные мышцы
нуждаются в механической на>рузке на растяжение
[Shansky et al., 1997; Powell el al.. 2002; Shansky et al.,
2005]; кости [Mullender et al., 2004] и хрящи [Seidel el al.,
2004] требуют сжимающего напряжения, а сосудистый
эндотелий в конструктах кровеносных сосудов требует
пульсирующего кровотока [Niklason el aL, 20011.
Инженерия тканевых конструктов зависит от не
скольких компонентов, в зависимости от тика ткани:
1) Клетки ткани требуемой линии, цри этом находя-
щиеся на пролиферативной стадии клеток-предше-
ственников.
2) Взаимодействующие (дополнительные, интерактнв-
ные) клетки, например дермальные фибробласты
для кожи, 1ладкомышечные клетки в кровеносных
сосудах, или 1лиальные клетки в нейрональных
конструктах.
3) Биодеградирующая подложка, например оолш ли-
нолевая кислота (PGA); иолцмолочная кислота
(PLA), или фосфат кальция (рис. 25.9).
4) Матрикс, например коллаген Matrix, вместо мя1 ких
тканей, или покрывания подложки для улучшения
прилипания клеток.
5) Механический стресс; растживающнй для мышц,
сжимающий для хрящей и костей, пульсирующий
для кровеносных сосудов.
Нервные клетки также используются для тканевой
реконструкции, но в этих случаях чаще используется
клеточная суспензия, чем конструкт. Суспензия клеток
инъецируется в поврежденный участок [Franklin &
Barnett, 1997; Franklin & Barnett 2000; Wewelzer el al.,
2002; Toloiu et al., 2004, Groves et al., 1993].
Рис. 25.11. MRI конструкта хряща. Яркость изображения
пропорциональна клеточной плотное ги. Расс шянис на шкале
в мм (С любезного разрешения Dr Kevin Brindle [по Thclwcll
etal, 20011)
25.4. СОЗДАНИЕ ТРЕХМЕРНЫХ
ИЗОБРАЖЕНИЙ КЛЕТОК
(З-О-РЕКОНСТРУКЦИЯ)
Кшда клетки вносятся в подложку в органотиииче-
ский 3D конструкт, микроскопическое исследование
становится затруднительным. В этом случае использу-
ются альтернативные методы визуализации состояния
клеток в конструкте. К таким методам относятся ЯМР
(ядерно-машитный резонанс), если есть возможность
поместить биореактор в ЯМР-детектор (рис. 25.10).
Результат исследования может быть представлен как
ма1 нитно-резонансное изображение (MRI) (рис. 25.11),
может* быть проанализирован также эмиссионный
спектр (см. рис. 26.18).
Глава 26
КРУПНОМАСШТАБНОЕ
ПРОИЗВОДСТВО КЛЕТОК
Различие между обычным лабораторным масштабом
производства клеток и широкомасштабным полу-
чением партии культуры является исключительно
условным, но обычно связывается с таким уровнем
продукции клеток, нри котором требуется специаль-
ная аппаратура и технологии. Хотя количество кле-
ток 1х10ы-1 xlOw может быть получено при простом
культивировании на мешалке объемом около 1 10 л
(см. разд. 13.7.5), крупномасштабное иолучение куль-
туры в количестве 1 х10“-1х10'2 клеток потребует
использования оборудования, от 100 л лаборатор-
но! о ферментера до полупромышленных опытных
установок объемом от 100 до 1000 л. В промышленных
масштабах используют биореакторы объемом 5000-
20 000 л, но эти вопросы выходят за пределы данной
кни! и. Термины культивирование с перемешиванием
или спинкультура, являются синонимами, которые
используются для простых систем культивирования
клеток с постоянным перемешиванием в условиях
низкою технического уровня лабораторного обору-
дования. Термины ферментер и биореактор хотя и не
являются синонимами, но их значения в значительной
мере перекрывают дру! дру! а. Наименование фермен-
тер получено для ми кробиоло! ической культураль-
ной системы, исходно разработанной для бактерий
и дрожжей и первоначально использовавшейся в
качестве лабораторною оборудования объемом при-
мерно 50—100л, однако увеличение в масштабах в
соответствии с развитием биотехноло!ической про-
мышленности вместе с повышением разнообразия
в создании как монослойных так и суспензионных
культур привело к введению термина биореактор.
В тканевой инженерии этот термин включает* куль-
тивирование компонентов системы в относительно
небольших объемах.
Выбор метода увеличения масштабов культуры
зависит от гою, делятся клетки в суспензии или они
должны быть прикреплены к субстрату. Методы,
используемые для суспензионных культур, обычно
проще и MoiyT быть использованы первыми. Моно-
слойные культуры, которые связаны с прикрепле-
нием к субстрату и, следовательно, с площадью роста
культуры, обычно более сложны, и рекомендуется
приступать к ним позже. Многие методы работы с
монослонными культурами приемлемы также для
суспензионных клеток.
26.1. КРУПНОМАСШТАБНОЕ
ПРОИЗВОДСТВО СУСПЕНЗИОННЫХ
КУЛЬТУР
Крупномасштабное производство клеток суспензи-
онной культуры, включает в себя, прежде всею, уве-
личение объема культуральной среды. Необходимо
перемешивание среды, если глубина слоя составляет
более 5 мм, при глубине выше 5—10 см (в зависимости
от соотношения площади поверхности и объема) для
поддержания адекватною газообмена требуется продув
СО,и воздуха (рис. 26.1,26.2). Перемешивание таких
культур лучше производить медленно нри помощи
машита, заключенною в стеклянном маятнике (Techne,
Integra), или при помощи лопасти с большой площадью
Рис. 26.1. Большой сосуд для перемешивания. 5-литровый
сосуд Techne 5-L на магнитной мешалке Обратите внимание
на выступ мая । ника, который ибсснсчиваст движение сто по
кольцеобразному углублению дна флакона. Боковые гор-
ловины используются для взятия образцов, перфузии СО,,
которые могут |Ю1ребова|ься при данном объеме среды (см
рис 262)
506
ГЛАВА 26. КРУПНОМАСШТАБНОЕ ПРОИЗВОДСТВО КЛЕТОК
Рис. 26.2. Перемешиваемая культура. Схема большого
сосуда для перемешивания, пригодная для культивирования
до 8 л культуры
поверхности (Bellco). Скорость перемешивания долж-
на быть между 30 и 100 об./мин. что достаточно для
предупреждения осаждения клеток, но не так много,
чтобы силы трения в жидкости могли привести к
повреждению клеток. Когда содержание сыворотки
в среде превышает 2%, следует добавлять пеногаси-
тель Anlifoam (Dow Chemical Со.) или Pluronic F68
(Sigma) в концентрации 0,01—0,1%, в частности, при
барботировании. В отсутствие сыворотки может быть
необходимым повысить вязкость среды добавлением
карбоксиметилцвдлюлозы (1-2%) (МВ-10’).
ПРОТОКОЛ 26.1. Перемешивание 4-литровой
емкости с суспензионной культурой
Процедура приготовления суспензионной культу-
ры клеток объемом 4 л производится следующим
образом:
Схема
Вырастить пробную культуру клеток и добавить ее в
предварительно подогретый аспиратор среды уже с
установившимся равновесием 5% СО2. Медленно пе-
ремешивать суспензию клеток с пропусканием газа,
пока не будет достигнута необходимая концентрация
клегок, затем собрать клетки.
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
• Сосуд для стартовой культуры (малый <]ыакон с пе-
ремешивающим устройством, см. рис. 7.6 и 12.7)
• Ростовая среды, иодогрегая до 37 °C
• ПенО|аситель (силикон: Dow Corning, Merck;
Pluronic F68. Sigi на)
• Большая емкость для перемешивания (Bellco,Tech-
пе; см. рис. 26.1 и 26.2); в которой подготовьте:
a) Mai нитный стержень, заключенный в стеклянный
маятник или другое подходящее устройство для
перемешивания (см. разд. 26.1), закрепленный на
крышке и перемешивающий суспензию во всем
объеме (наиример, Tecline).
б) Одно впускное отверстие со съемной СО,-прони-
цаемой крышкой (например, крышка с цельной
микроиоровой мембраной) (см. разд. 8.2.3), или
крышкой с силиконовой диафра! мой с проходя-
щей через нее шлой широкою диаметра с соеди-
нением Люзра, присоединенной к стерильному
фильтру (наиример, Millex).
в) Второе впускное отверстие с трубкой для подклю-
чения к юзовой линии (наиример, Bellco #1965)
с внутренним диаметром 2-3 мм, которое почти
достш ает дна сосуда, но не задевает движущею-
ся маятника при перемешивании культуры и с
внешним входом, ограничивающимся насадкой
для соединения Люзра, закрытым алюминиевой
фольгой.
г) Простерплизуйте культуральный сосуд в сборе,
но без СО,-||роницаемой крышки автоклавиро-
ванием при 100 kPa в течение 20 мин. крышку
стерилизуют отдельно.
* Соедините стерильный микропоровый фильтр
диаметром 25-мм, размер пор 0,2 мкм (наиример,
Millex), с подающей |азовой линией перед нача-
лом использования
Нестерильные.
• Mai нитная мешалка
• Источник 5% СО», предпочтительно с изме-
рителем использованною объема юза, при
-10-30 кПа.
• D-PBSA для подсчета клеток
• Электронный счетчик клеток или гемоцитометр
Протокол
1. Установите начальную культуру (см. прото-
кол 13.3 и рис. 13.5) в 200 мл среды, посейте ее
с посевной концентрацией 5x10’- 1x10’кл./мл.
Поместите культуру на машитную мешалку,
вращающуюся при 60 об. м, инкубируйте куль-
туру пока не будет достигнута концентрация
5x10'— 1x10’’кд./мл. {Замечание: не превышайте
концентрацию 1х10ьклеток/мл, поскольку клет-
ки мшут войти в апоптоз).
2. Соберите большой сосуд, как показано на
рис. 26.2.
3. Добавьте 4 л среды во флакон
26.1. Крупномасштабное производство суспензионных культур
507
4. Добавьте 0.4 м,г пеногасителя, используя однора-
зовую пипетку или шприц.
5. Закройте боковые горлышки СО?-проницаемой
крышкой.
6. Поместите сосуд на маг нггтную мешалку в инку-
батор или комнату с установленной температурой
37 °C.
7. Подсоедините линию, подающую воздухе 5°ь СО2
через стерильный микроиоропый фильтр, через
впускное отверстие, снабженное Люэровским
соединением.
8. Включите подачу газа на низкой скорости, при-
мерно 10—15 мл мин.
9. Перемешивайте культуру при 60 об. мин.
10. Инкубируйте большой сосуд при перемешивании
примерно 2 ч до установки температурного рав-
новесия и давления СО,.
11. Закройте ггодачу СО2, отсоедините сосуд от линии
подачи СО,.
12. Принесите большой сосуд и стартовую культуру
в ламинарный бокс
13. Перенесите стартовую культуру в большой сосуд,
вередив ее одним mmi ким движением.
14. Верните большой сосуд в комнату с температурой
37 °C или инкубатор.
15. Продолжайте перемешивание с частотой переме-
шивания 60 об. мин
16. Подсоедините линию подачи 5% СО,, отрегу-
лируйте газовый поток до 10-15 мл/мин. (Если
нет измерителя скорости потока г аза, то скорость
потока оценивается но количеству пузырей.)
17. Инкубируйте культуру в течение 4—7 дней, отби-
рая образцы каждый день для проверки скорости
деления клеток:
а) Перенесите сосуд в ламинарный бокс.
б) Удалите крышки с боковых горлышек
в) Отберите 5—10 мл суспензии клеток.
г) Подсчитайте клетки, гг проверьте их жизнеспо-
собность методом исключения красителя.
18. Когда концентрации клеток достиг нет желаемого
уровня,
а) Перекройте газ и выключите магнитную ме-
шалку,
в) Отсоедините сосуд от линии подачи г аза;
।) Перенесите культуру в лабораторию, перелей-
те в центрифужные флаконы
д) Центрифугируйте клетки при 100 g в течение
10 мин. и соберите клет ки (из осадка) или су-
пернатант, в зависимости от обстоятельств.
Анализ Ежедневно контролируйте скорость роста
клеток. Для наилучшего результата клетки не должны
иметь lag-ггериод более чем 24 часа и должны еще быть
в стадии экспоненциального роста ггри получении
продукта. Проводите ежедневный подсчет* клеток,
проводите итоговый сбор клеток при концентрации
приблизительно 1х10*’кл./мл. Суспензионные куль-
туры имеют тенденцию к выходу в апоптоз, если эта
концентрация превышена.
Вариации.
Добавление среды. Следующие процедуры альтерна-
тивы для добавления среды в сосуды, объемом больше
1) Покупают среду в пакетах (см. Приложение II).
которые можно подвешивать рядом с перемешивае-
мой емкостью, и, будучи подог ротой до 37 °C, среда
бесконтрольно поступает в емкость.
2) Стерилизуют перемешиваемую емкость с предва-
рительно измеренным объемом UPW и составляют
среду из концентратов in situ. Отметьте уровень
воды на стенке емкости, так, чтобы любая вода, по-
терянная при испарении в ходе автоклавирования,
могла быть восполнен^.
3) Используют автоклавируемую среду (см. Приложе-
ние П). и автоклавируют ее in situ.
Сбор клеток. Переливание из большой перемеши-
ваемой емкости мижот быть трудным, еелгг не имеется
сливного отверстия у основания. Однако такие отвер-
стия имеют тенденцию засоряться мертвыми клетками,
и лучше избегать применения таких конструкций. Сбор
продукта лучше выполнять при помощи насоса или
вытеснением:
1) Удаляют действующий фильтр от газовой линии и
присоединяют силиконовый шланг или сифон либо
используют перистальтический насос, наклоняя
судно, когда жидкость опускается до уровня осно-
вания сосуда.
2) Отсоединяют линию подачи 5% СО2, заменяют
микрогюровый фильтр на г ггбкую трубку, присоеди-
няют линию поступления 5% СО,к другому порту,
и выдувают клетки через газовую линию.
26.1.1. Постоянная культура
Если требуется, чтобы клетки сохранились при посто-
янной концентрации, культура может поддерживаться в
хемостате или бггостате. В этом типе системы культуры
клетки выращивают до середины log-фазы (контролиру-
емой ежедневным подсчетом клеток); измеренный объем
клеток удаляют каждый день, заменяя равным объемом
среды. Кроме того, клетки можно непрерывно удалять
с постоянной скоростью, начиная с середины log-фазы.
добавляя с той же скоростью свежую среду. В последнем
случае потребуется сосуд с перемешиванием с четырь-
мя портами, два для впуска гг выпуска СО?, один для
ггодачгг среды и один для выведения среды с клетками,
собираемой в отдельную емкость (рис. 26.3). Скорость
потока среды может быть рассчит ана гго скорости роста
культуры [Griffiths, 2000], но лучше определить ее эк-
спериментально последовательным подсчетом клеток
при различных скоростях потока среды. В биореакторе
подсчет клеток может быть выполнен в пробе, взятой
через место соединения с линией подачи СО2. Линию
508
ГЛАВА 26. КРУПНОМАСШТАБНОЕ ПРОИЗВОДСТВО КЛЕТОК
Рис. 26.3. Биостат. Модификация сосуда для суспензионной культуры, представленного на рис 26.1. с постоянным подве-
денным впуском свежей среды и выходом клеточной суспензии Це и>ю такого процесса являегся скорее поддержание условий
культивирования, чем получение большого количества клеток (см. также рис 26.17 и 26 18). Собственно первоначальная
культура лучше получается в сосудах, представленных на рис. 26 1 или рис. 26 17
отсоединяют и отбирают образец шприцом с двойным
люэровским адаггтором. Скорость потока может регули-
роваться перистальтическим насосом на входе.
Получение партии клеток в объеме 1 —20 л лучше
проводить методом одной партии, описанном в прото-
коле 26.1. Для мониторинга метаболических изменений
требуется установившийся режим стационарной фазы,
связанный с плотностью клеток, однако в атом случае
выше стоимость среды и выше вероятность контами-
нации. Тем не менее если работы ведутся в объеме
50—1000 .г, то наибольшие труд о- и капиталовложения
производятся на стадии генерации культуры, и метод
одной партии станови гея более дорогостоящим по вре-
мени и материалам. Поэтому с точки зрения экономии
времени лучше в этих случаях использовать постоян-
ные культуры. Суспензионные культуры можно также
перемешивать иутем вращения бутылей на ргылерных
штативах (см. рис. 26.11), так же как и монослой ные
культуры (см. иротокол 26-3).
Прикрепленные клетки. Клетки, зависимые от
прикрепления к субстрату, не могут быть выращены
в жидкой суспензии, кроме использования метода
культуры на микроносителях (см. иротокол 26.4).
Трансформированные клетки (наиример. вирус-транс-
формированные и ли спонтанно трансформированные
постоянные клеточные линии, такие как HeLa-S3)
могут быть культивированы в суспензии. Поскольку
эти клетки сохраняют' способность к прикреплению,
необходимо покрыть сосуды для культуры водоот-
талкивающим силиконом (наиример, Repelcote), а
концентрация кальция в этом случае должна быть
снижена. Среда S-MEM (Invitrogen, Sigma) является
вариантом среды Игла МЕМ без кальция в составе,
она обычно используется для культивирования клеток
Не La-S3 и других клеток в суспензии.
26.1.2. Масштаб и комплексность
Стандартная настольная культура с перемешиванием
удовлетворительно обеспечивает работу со средой и
получение партии клеток в объеме до 10 литров. Если,
тем не менее, требуется уделить больше внимания
контролю процесса, то следует использовать контро-
лируемый ферментер или биореактор. Эти культу-
ральные емкости регулируют поступление среды и газа
и обеспечивают возможность получения данных ио
концентрации кислорода, СО2 н глюкозе благодаря на-
личию соответствующих электродов в культуральном
сосуде. О ни контролируются программируемым конт-
рольным блоком, который записывает и представляет
данные и может быть использован для регулирования
посту мления и удаления газа и жидкости, скорости
перемешивания и т.д. (см. разд. 26.3)
26.1.3. Перемешивание и аэрация
Проблемы увеличение масштаба производства клеток
в суспензионных культурах в основном связаны с пе-
ремешиванием и газообменом. Б отличие от простой
перемешиваемой культуры большинство ферментеров
лабораторного масштаба перемешивают среду при по-
мощи вращающейся турбины или широкой лопасти.
Конструкции таких ферментеров разнообразны, глав-
ным образом они призваны обеспечить максимальное
движение жидкости при минимальном стрессирую-
щем действии трения жидкости на клетки. Удачные
конструкции обычно используют медленно вращаю-
щуюся турбину с относительно большой площадью
поверхности логгастей [Griffiths, 2000] Некоторые
конструкции минимизируют повреждающий эффект
трения жидкости добавлением Plutonic F68, карбокси-
26.1. Крупномасштабное производство суспензионных культур
509
метилцеллюлозы (КМЦ) или гголивинилнирролидона
(PVP) [Cherry & Papoulsakis, 1990J.
Культуральные пакеты (см. Приложение II).
Для суспензионном культуры клеток можно использо-
вать пластиковые пакеты со средой. Они газопроницае-
мы и могут перемешиваться путем переворачивания на
штативах или плоской крутящейся платформе.
Ферментеры с восходящим потоком воздуха.
Крупномасштабные ферментеры часто используют
принцип восходящего движения воздуха (рис. 26.4): 5“«
СО2 в воздухе продувается насосом в пористое стальное
кольцо в основании центральною цилиндра, пузырьки
воздуха барботируют центральную часть устройства,
унося с собой поток жидкости. Воздух выпускается
затем через верхнюю часть ферментера, а жидкость
опускается на дно цилиндра. Это простое устройство
широко используется в биотехнологической промыш-
ленности вплоть до объемов в 20 000 л.
Аэратор культуры BelloCell. Это необычное
устройство имеет нижнее отделение для среды, которое
выдавливает среду через слой клеток, заякоренных на
Рис. 26.5. Аэратор культуры BelloCell. Клетки выращивают
на матриксном материале, который с другом стороны пог-
ружен в среду, газовым обмен осуществляется при помощи
прокачивания нижнего отдела устройства
Рис. 26.4. Ферментер с пропусканием воздуха. В фермен-
тере г пропусканием воздуха биорсакюр состоит из двух
концентрических цилиндров, внутренний цилиндр короче с
обоих концов, чем внешний, так что образуются внутренняя
и внешняя камеры Дно внутренней камеры имеет синтсрмро
ванное стальное кольцо, через котортте пропускается воздух с
5% СО,- Пузырьки газа поднимаются, унося с с<)бпй клеточную
суспензию Воздушно-газовая смесь удаляется из верхней час-
ти емкост и, а клеточная суспензия опускается на дно внешней
камеры (модифицированный метод Griffiths [2000])
пористом матриксе, и затем отсасывает среду обрат-
но в ритме «дыхательных» движений нижней части
(рис. 26.5). Оптимум перемешивания и аэрации опреде-
ляется минимумом повреждения клеток (Cesco Bioengi-
neering; Metabios; www.metabios.com/ BelloCeli.htm).
Перфузионная суспензионная культура. Перфу-
зионные системы на основе полых волокон и мембран
также действуют на принципе комиартментализаиии.
Клетки находятся в комиартменте с малым объемом
при высокой концентрации. Среда проходит через
полые волокна внутри клеточною комиартмента
(рис. 26.6) или через прилегающие мембранные
структуры (Membroferm, Poly тип Scientific; рис. 26.7).
Регуляция газообмена в среде происходит за предела-
ми культуральной камеры. Одна из версий системы
Membroferm позволяет собирать продукт в третьем
мембранносвязанном комиартменте [ К lenient el al.,
1987]. Подобные комиартменты могут также быть
связаны в комплекты для серийной перфузии. Сущест-
вуют также системы с двойными концентрическими
пространствами с полыми волокнами. В них продукт
собирается во внешнем пространстве, а клетки растут
между двумя концентрическими трубками.
Реакторы с псевдожидким слоем для суспен-
зионной культуры. Хотя микроносители первона-
чально были разработаны для монослойных культур
(см. разд. 26.2.4), пористые микроносители могут пре-
доставлять площадь суспензионным культурам внутри
узких щелей матрикса носителей. В результате более
высокой плотности микроносителей они могут быть
медленно перфузируемы снизу ири такой скорости, что
510
ГЛАВА 26. КРУПНОМАСШТАБНОЕ ПРОИЗВОДСТВО КЛЕТОК
Рис. 26.6. Перфузия на полых волокнах, (в) графическое
изображение перфузионном системы на полых волокнах
Среда циркулирует из резервуара в камеру с культурой иод
действием перистальтического насоса. Аэрация и обмен СО2
раулируются в резервуаресо средой (б) Картриджи полых
волокон Spectrapor. (в) Картридж с заменяемыми концами
(fi, в с любезною разрешения Spectrapor)
их скорость седиментации соответствует скорости по-
тока. Бусины, таким образом, остаются и стационарной
суспензии, омываемые средой с постоянно заменяемы-
ми питательными веществами и сбором продукта в ни-
жележащем резервуаре. Газообмен осуществляется ине
реактора, не требуется механическое перемешивание.
Макропористые бусины или волокнистый матрикс так-
же раньше использовались для суспензионных культур
в реакторах с неподвижным слоем с перфузией пита-
тельной средой (CelliGen, New Brunswick Scientific).
26.2. КРУПНОМАСШТАБНОЕ
ПРОИЗВОДСТВО МОНОСЛОЙНЫХ
КУЛЬТУР
Правила, касающиеся использования трансформиро-
ванных клеток для получения биофармацевтических
препаратов, в настоящее время достаточно мят кие, тем
не менее ряд требований, касающихся клеток, зависи-
мых от прикрепления к субстрату, сохраняются. Хотя
клетки, которые рас гут в суспензии, легче поддерживать,
прикрепленные клетки, благодаря их потенциалу к раз-
витию полярности, могут представлять собой лучшую
модель для иосттрансляционной модификации белков
и соответствующих мембранных потоков, ведущих к
секреции белков из клеток в биологически активной
форме. Для зависимых от прикрепления к субстрату
монослойных культур необходимо обеспечить доста-
точную площадь поверхности субстрата соответственно
количеству клеток и пропорционально объему среды.
Эти требования привели к развитию ряда стратег иче-
ских подходов, как простых, так и сложных.
26.2.1. Многослойные пропагаторы
(культиваторы)
Система Nunc Cell Factory. Одной из простейших сис-
тем для линейного увеличения площади монослойных
культур является система Nunc Cell Factory (рис. 26.8;
см. табл. 7.1). Эта система состоит из четырехугольных
блоков, подобных чашке Петри, с общей площадью
поверхности 600—24 000 см2, взаимно соединенных в
двух соседних углах вертикальными трубками. В ре-
зультате наличия сквозных отверстий в вертикаль-
ных трубках среда может протекать между отсеками,
только если блоки расположены на ребре. Когда блок
поворачивают и кладут плашмя, жидкость в каждом
отсеке оказывается изолированной, хотя сквозные
отверстия в соединяющих вертикальных трубках
позволяют осуществляться свободному газообмену.
Данная система имеет то преимущество, что геометрия
и природа субстрата в данном случае не отличаются от
общепринятой чашки Петри. Рекомендуемый метод
использования системы Cell Factory описан в прото-
коле 26.2 (см. рис. 26.9)
Анализ. Контроль роста клегок в этих камерах
затруднен, поэтому одна илашка оборудована так.
26.2. Крупномасштабное производство моноспойных культур
511
Рис. 26.7. Система Membroterm. Трехкамерный мембранный реактор Mcmbrofcnn [Element ct al., 1987[. Пластинчатая
структура полупроницаемых мембран, основанная на тройных блоках, в которых клетки внутри двойной мембраны питаются
из верхнего отдела через мембрану, проницаемую для низкомолекулярных веществ Продукты секреции клеток проходят в
нижнюю камеру через мембрану, проницаемую для высокомолекулярных веществ Каждый базовый блок из трех элементов
может быть соединен с образованием перфузионной системы с отдельными слоями среды и слоев продукта секреции от-
дельных или объединенных
ПРОТОКОЛ 26.2. Система NUNC CELL
FACTORY
Схема
Приготовить клеточную суспензию в среде и внести
суспензию в камеры блика псъинкенные на длинный
край (см. рис. 26.9). Повернуть блоки на 90°, а за гем
положить блоки горизонтально и заполнить СО;.
Запечатать и инкубировать блок.
Материалы
Стерильные:
• Клеточный монослой
• Ростовая среда
• Трипсин, ipyoo очищенный, 0.25%
• D-PBSA
• Система Nunc Cell Factory, 10-камерная
• Силиконовые трубки и соединители
Нестерильные
• Гемоцитометр пли электронный счетчик клеток
и жидкость для подсчета
Протокол
1. Трипсинизируйте клетки (см. протокол 13.2),
ресусиендируйте их, подсчитайте клетки (см.
протоколы 21.1, 21.2), и разведите суспензию до
2x10* * кл.умл в 2 л среды.
2. Положите камеру на длинный край, и присоеди-
ните трубку для доставки среды к разъему: насад-
ка для соединения Люэра на питающей трубке к
порту на дне системы (см. рис. 26.9).
3. Пропустите клетки и среду через подающую
трубку. Среда во всех камерах достш нет одного
уровня.
4. Поверните камеру на 90° в плоскости монослоя,
так чтобы блок -iei на короткий край с входным
портом и питающей трубкой наверху.
5. Отсоедините трубку для доставки среды от резер-
вуара со средой в месте Люэровского контакта.
6. Поверните камеру на 90°. перпендикулярно |
плоскости монослоя, так чтобы камера легла на
основание, а поверхность культуры pacuojiaia- |
лась।оризонтально.
7. Продуйте блок струей воздуха с 5% СО, в течение I
5 мин, а затем освободите зажим и выпускное от-
верстие (камера может быть постоянно заполнена
газом, если это желательно).
8. Перенесите блок в инкубатор, удалив среду из |
питающих и вентилирующих портов.
9. Для замены среды (или ее сбора) выполните
шаг 6 в обратном порядке, удалите фильтр на I
входящей трубке и затем выполните шаг 4 в об-
ратном порядке.
10. Протрите соединение Люэра, откройте зажим и |
слейте среду.
11. Заменяйте среду как в mai ах 2—8.
12. Для того чтобы собрать клетки:
а) Удалите среду как описано в шагах 9 и 10.
б) Добавьте 500 мл D-PBSA и затем удалите |
его.
в) Добавьте 500 мл трипсина при 4 °C, и через |
30 секунд удалите его
1) Инкубируйте клетки с остатками трипсина в |
течение 15 мин.
д) Добавьте среду к клеткам и потрясите камеру
для ресусиендирования клеток.
е) Удалите среду с клеток, как в ща| ах 9 и 10.
13. Остаток может быть использован для засева
следующей культуры. хотя при использовании I
этого метода трудно контролировать посевную ।
плотность клеток.
чтобы использоваться как экспериментальная куль-
тура Предиола|ается, что эта отдельная плашка будет
вести себя так же, как остальная система. Супернатант
может быть собран неоднократно для выделения ви-
руса или очистки продукта, выделяемо го клетками.
Сбор клеток для анализа зависит от эффективности
трипсинизации.
512
ГЛАВА 26. КРУПНОМАСШТАБНОЕ ПРОИЗВОДСТВО КЛЕТОК
Рис. 26.8. Система Nunc Cell Factory для культуры клеток. Штабелированные поддоны для культуры, каждый площадью
632 см2. (в) Двухкамерная, 1264 см2 и 10-камсрная. 6320 см2системы Cell Factories, (б) 40-камерная система Cell Factory.
25 280 см2. (С любезного разрешения Nunc A S.)
Рис. 26.9. Заполнение системы Nunc Cell Factory
Эта техника имеет преимущество простоты, но
может оказаться дорогой, если блоки выбрасываются
каждый раз после получения клеток. Этот метод был
разработан, прежде всего, для сбора супернатанта, но
он также хорош для получения большою количества
клеток (lxl08-lxl0“').
26.2.2. Многоцелевые диски, спирали
и пробирки
Диски, спирали и пробирки использовались для уве-
личения площади поверхности для роста монослоя, но
немно| ие из .них систем теперь доступны на коммер-
ческой основе. Большая часть матриксных или много-
листных nponaiaropOB в настоящее время развиваются
в направлении перфузионных систем (см. разд. 26.2.6),
с акцентом на восстановлении продукта. Предла|аемая
компанией Corning на рынок мноюлистная (много-
слойная) перфузионная система, называемая Cell Cube
(рис. 26.10) является полым полистироловым кубом,
с многочисленными внутренними пластинами, оро-
шаемыми обо!ащенной кислородом нагретой средой.
Внутренняя пластина способна к поддержке роста
монослоя на обеих поверхностях.
26.2.3. Роллерные культуры
Если клетки посеяны в круглую бутыль или пробирку,
которая затем вращается вокру| собственной длинной
оси на роллерном штативе (рис. 26.11), то среда, несу-
26.2. Крупномасштабное производство монослойных культур
513
Рис. 26.10. Система для культуры клеток Corning Cell-
Cube. Многолистный клеточный культиватор с допустимой
площадью поверхности роста клеток 6500-см2. (С любезного
разрешения АТСС.)
щая клетки, течет по внутренней части бутыли. Если
клетки не прикрепляются, они будут взбалтываться
катящимся воздействием, но останутся в среде. Если
клетки способны прикрепляться к субстрату, они
постепенно ад|езируют к внутренней поверхности
бутыли и начнут расти с формированием монослоя
(рис. 26.12). Эта система имеет три главных преиму-
щества ио сравнению со статической монослойной
культурой: 1) увеличение используемой поверхност-
ной области для сосуда данного размера; 2) постоян-
ное. но нежное взбалтывание среды: и 3) увеличенное
отношение площади поверхности среды к ее объему,
что позволяет обеспечить повышенный обмен |аза
через тонкую пленку среды над клетками, ненадолго
погружающимися в глубокую часть среды.
Анализ. Мониторинг клеток в роллерных бутылях
может быть затруднен, но обычно возможно увидеть
клетки с помощью инвертированного микроскопа.
Тем не менее для некоторых микроскопов конденсор
должен быть удален, а в друг их случаях бутыль может
не помещаться на предметный столик. Таким образом,
выбирайте микроскоп с достаточным пространством
на предметном столике. Д->гя повторяемого сбора боль-
шого количества полученных клеток или для сбора
супернатанта роллерная система является, возможно,
наиболее экономичной, хотя требуется большая интен-
сивность труда и вложение финансов в приобретение
роллерного стеллажа (см. рис. 26.11)
Вариации
Агрегация. Некоторые клетки мог у г иметь тен-
денцию к формированию агрегатов прежде, чем онгг
прикрепятся к стенкам бутыли. Такое поведение кле-
ток сложно предотвратить, но можно снизить путем
снижения скорости вращения до 5 или даже 2 об./мин,
пробуя различные типы или партии сыворотки либо
предварительно обрабатывая поверхность бутылей
фибронектином или гголилизином (см. разд. 8.4)
Размер. Существуют разнообразные бутыли (размер
500—1800 см2), как стеклянные, так и одноразовые (см.
табл. 8.1; рис. 26.13; Приложение II Роллерные бутыли).
Некоторые бутыли имеют гофрированную внутреннюю
поверхность для увеличения площади поверхности,
доступной для клеточного роста (Corning).
Объем. Объем среды может быть различен. Малый
объем обеспечивает лучший газообмен и может лучше
подойти для нетрансформированных клеток. Транс-
формированные клетки, которые более анаэробны,
растут быстрее и производят больше молочной кисло-
ты, для них может быть лучше большой объем среды.
Объемы, представленные в табл. 8.1, означают вмес-
тимость и могут быть уменьшены вдвое или удвоены
ио потребности.
Механические устройства. Для бутылей пред-
почтительно использовать роллерные стеллажи (см.
рис. 26.11b). поскольку они экономично используют
Рис. 26.11. Бутыли для ролерных культур на стеллажах, (а) Малый настольный с те.итаж (б) Большой напольным разд виж нои
сто тлаж. (С любезного разрешения Bellco.)
S14
ГЛАВА 26. КРУПНОМАСШТАБНОЕ ПРОИЗВОДСТВО КЛЕТОК
Рис. 26.12. Схема работы роллерной системы культуры.
Клеточный монос юй (пунк, ирная линия) постоянно омы-
вается жидкое 1ыо. но находится в not ружейном состоянии
только примерно одну четверть цикла, что обсспсчивае'1
многократный обмен среды и свободный газообмен
ПРОТОКОЛ 26.3. Роллерная бутылочная
культура
Схема
Посеять клеточную суспензию в среду и круглую
бутыль и медленно поворачивать бутыль на рол-
лерной стойке.
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные.
• Среда и диспенсер дли среды
• D-PBSA
• Трипсин грудоп очистки, 0,25%
• Монислойная культура
• Роллерные бутыли
Нестерильные:
• Гемоцитометр или Электронный счетчик клеток
и жидкость для подсчета
• Источник 5% СО2
• Роллерная стоика (см. рис. 26.11)
Протокол
1. Триисинизируйте клетки и посейте их при обыч-
ной для этих клеток плотности.
Замечание. Газовая фаза в роллерных бутылках
составляет большую часть объема, поэтому при
использовании сред, основанных на солях Хэнкса
и воздушной |азовой фазе, (см. табл. 9.1). может
потребоваться добавление в бутылку немного
5% СО2 (например, в течение 2 с при скорости
10 л/мин). Если среда COj/ НСОч-забуференная,
то газовая фаза должна быть продута 5% СО, (при
скорости потока 20 л мин. 30 с 1 мин в зависи-
мости от размеров бутыли; см. протокол 13.2)
2. Поместите бутыль на роллерную стойку, и вра-
щайте ее при 20 об /ч, пока все клетки не прилип-
нут (24—48 ч).
3. Повысьте скорость вращение до 60—80 об./ч но
мере увеличения клеточной плотности.
4. Для тою чтобы произвести смену среды или
собрать среду, перенесите бутыли в стерильную
рабочую зону, удалите среду, как обычно, и заме-
ните ее на свежую среду (см. протокол 13.1). Для
добавления свежей среды можно использовать
трансфузионную систему (см. рис. 5.7) или пакет
го средой. Если значение объема среды является
критическим, ею можно разливать пинеткой
или при помощи перистальтического насоса (см.
разд. 5.2.7).
5. Для тел о чтобы собрать клетки:
а) Удалите среду, промойте клетки 50—100 мл
D-PBSA, затем удалите D-PBSA.
б) Добавьте 50—100 мл трипсина при 4 °C и вра-
щайте бутыль в течение 15 с вручную или на
роллерной стойке со скоростью 20 об./мцн.
в) Удалите трипсин, инкубируя бутыль в тече-
ние 5—15 мин, и добавьте среду в бутыль.
) Встряхивайте и вращайте бутыль, промойте
клетки иииетированмем.
пространство и позволяют лег ко наблюдать за состо-
янием бутылей. Роллерные барабаны (рис. 26.14), с
другой стороны, требуют больше места для данною
объема культуральной емкости, но могут быть полезны
для большого количества малых емкостей флаконов
и пробирок. Флаконы и пробирки могут быть также по-
мещены в цилиндрический держатель с последующим
размещением его на роллерном стеллаже.
26.2.4. Микроносители
Монослойные клетки могут быть выращены на мик-
робусинах диаметром 90—300 мкм, сделанных из плас-
тика. стекла. желатина или коллагена [Griffiths. 2000]
Рис. 26.13. Примеры бутылей дли роллерных культур.
В центре и слева одноразовые пластиковые бутыли (Falcon.
Corning), справа стеклянная бутыль
26.2. Крупномасштабное производство моноспойных культур
515
Рис. 26.14. Барабанный роллерный аппарат. Барабанный
роллерный аппарат используется для роллерной культуры
большого количества небольших объемов (флаконов или про
бирок) (С любезного разрешения New Brunswick Scientific )
(табл. 26.1). Культивирование минослойных клеток
на микроносителях дает максимальное соотношение
площади поверхности, занимаемой культурой, к объ-
ему среды, которое может доходить до 90 000 см2 /л,
в зависимости от размера и плотности бусин. Такой
тип культивирования имеет дополнительное преиму-
щество, которое заключается в том, что с клетками в
монослое можно обращаться как с суспензией.
В то время как Nunc Cell Factory позволяет уве-
личить масштаб производства в соответствии с обще-
принятой геометрией конструкции (см. разд. 26.2.1),
микроносители требуют* значительных отклонений от
обычной конструкции субстрата. Тем не менее это раз-
личие оказывает относительно небольшое влияние на
микроскопическом уровне (цв. вкладка 18«), поскольку
клетки в этом случае растут на i ладкой поверхности на
разделе жидкой и твердой сред, хотя радиус кривизны
бусин оказывает влияние на некоторые клетки, эти
культуры лучше растить на бусинах большого диаметра
или плоских поверхностях (см. цв. вкладку 18/).
Таблица 26.1. Микроносители
Название Поставщик Состав Удельная масса Диаметр, мкм
DEAE Декстран Cytodcx 1 Aincrsham Pharmacia DEAE-дскстран 1,03 160-230
Cytodcx 2 Amcrsham Pharmacia DE АЕ-дскс 1ран 1,04 115-200
Microdcx Dextran Products DE АЕ-дскс ipan 1,03 150
Dormaccll JRH Bioscienccs DEAE-дскстран 1,05 140-240
Пластик Acrobcads Galil Полиакролсин. покрытый оболочкой 1,04 150
Biosilon Nalgc Nuuc ТС-обработанныи полистирол 1,05 160-300
Biocarncrs Biorad Полиакриламид / DMAP 1,04 120 180
Bioplas Whatman. Ccllon Полистирпл 1,04 150-210
Cytosphcrcs Lux ТС-обработанный полистирол 1,04 160-230
BioSPEX PlastiSPEX JRH Bioscienccs Полистирол 1,02,1.03.1,04 90-210
Rapidccll P ICN Полистирол 1,02,1.03 90-210
Желатин Vcntrcgcl Vcntrcx (Bayer) Желатин 1,03 150-250
Cytodcx 3 Aincrsham Pharmacia Деке гран, покрытый желатином 1,04 130-210
Cultisphcrc-G Sigma Желатин N А 120 180
Cultisphcre-GL Sigma Желатин N А 150-330
Cultisphcrc-S Sigma Желатин N А 120 180
Стекло Bioglas Whatman. Ccllon Стекло, покрытое пластиком 1.03 150-210
BioSPEX GlasSPEX JRH Bioscienccs Стекло, покрытое полистиролом 1,02, 1.03.1,04 190-210
Rapidccll C ICN Стекло 1,02, 1.03 90-210
Vcntrcglas Vcntrcx (Bayer) Стекло 1,03 90-210
Glass, Sigma Стекло многократного использования 1,03,1.04 95-210
Целлюлоза DE-52 53 Whatman D Е А Е-цсллюлоза 1,03 Волокна
Коллаген или покрытые коллагеном носители BioSPEX JRH Bioscienccs Полистирол, покрытый коллагеном 1,2,1,03,1,04 90-210
Cytodcx 3 AnicTsham Pharmacia Коллаген 1,04 130-210
Rapidccll C ICN Микроносители, покрытые коллагеном 1,02, 1.03 90-210
Biospheres Whatman. Ccllon Микроносители, покрытые коллагеном 1,02 150-210
516
ГЛАВА 26. КРУПНОМАСШТАБНОЕ ПРОИЗВОДСТВО КЛЕТОК
Основное отличие, имеющееся у систем микроно-
сителей, состоит в механике манипуляций [Griffiths,
1992]. Существенным является эффективное пере-
мешивание без взаимного трения бусин, что может
быть достигнуто при помощи вращающегося маят-
ника (Techne) (см. рис. 26.1; рис. 26.2) или лопасти
(Bellco), так же как в случае суспензионных культур,
вращающихся со скоростью 30 об./мин. Техническая
литература, которая обычно поставляется компаниями-
изготовителями микроносителей, описывает условия,
оптимально позволяющие выращивать культуры, су-
ществует ряд опубликованных протоколов для систем
с микроносителями [Griffiths, 1992].
ПРОТОКОЛ 26.4. Микроносители
Схема
Посеять клетки при высокой концентрации клеток
и бусины, развести, перемешать и отбирать клетки
ио необходимости
Материалы
Стерильные:
Ростовая среда
• Микроносители (см табл. 26.1 и Приложение II)
• Стартовая культура
* Флаконы для перемешивания (см. Приложе-
ние II)
Нестерильные:
• Mai нитная мешалка (Techne, Bellco)
Протокол
1. Суспендировать бусины при 2—3 л водной трети
конечного объема среды.
2. Триисинизируйте и подсчитайте клетки. Посейте
клетки. Посейте клетки в суспензию бусин при
концентрации клеток, превышающей нормальную
посевную концентрацию в три или пять раз.
3. Перемешивайте культуру при 10 25 об./мин в
течение 8 ч.
4. Добавьте среду для достижения конечного
объема, обусловленного концентрацией бусин
0,7-1 t/л.
5. Повышайте скорость перемешивания примерно
до 60 об./мин.
6. Если pH надает, то произведите питание культу-
ры следующим образом: выключите мешалку на
5 мин, позвольте бусинам осесть, затем замените
от одной второй до двух третей среды.
7. Для того, Ч1обы собрать клетки:
а) Удалите среду.
б) Отмойте клетки путем осаждения
в) Обработайте бусины в смеси трипсин/EDTA.
1) Позвольте бусинам осесть
д) Осадите клетки.
е) Отмойте клетки центрифугированием и ре-
суспендированием.
Анализ. Подсчет клеток на бусинах может быть
затруднен, так как скорость роста клеток должна быть
проверена определением DNA (см. протокол 21.3);
белка (см. иротокол 21.4), если используются небел-
ковые бусины, или дегидро!еназной активности, с
использованием теста МТТ (см. иротокол 22.4) на
образце бусины.
Вариации. Большинство вариацией этого метода
является результатом выбора бусин или конструкции
культурального сосуда и перемешивающего устройства
[Griffiths, 2000]. Плот ность бусин изменяется от 1,03 до
1,05i/cm3u влияет на скорость перемешивания, потому
что для бусин с более высокой плотностью требуется
более высокая скорость. Состав, или покрытие, бусин
также будет влиять на прилипание клегок. более чувс-
твительные клетки мшут предпочитать желатиновые
или коллагоновые бусины, которые растворяются нри
действии протеаз. Стеклянные бусины являются са-
мым лежим материалом для обработки и повторного
использования.
26.2.5. Макроносители
Так же как в случае пористых микроносителей, ко-
торые позволяют клеткам расти в порах бусинки,
существуют пористые макроносители со структурой,
состоящей из ряда различных материалов тина иоли-
молочной кислоты (PLA), цолигликолевои кислоты
(PGA), коллагена или желатина (Gelfoam) в разнооб-
разных конфш урациях (см. рис. 25.9). Они могут быть
загружены клетками и затем помешены в перемешива-
емый биореактор или быть перфузированы в реакторе
с неподвижным или нсевдожидким слоем (рис. 26.15;
рис. 26.16). Макроноситель Fibracel — один из таких
продуктов, разработанных для использования в био-
реакторе Celligen (New Brunsick Scientific; рис. 26.156)
или в перемешиваемом биореакторе-
26.2.6. Перфузионные монослойные
культуры
Перфузия часто используется, чтобы облегчить замену
среды п восстановление продукта. Система Cellcube,
(Corning-Costar) представляет собой перфузируемый
многолистовой itpoitaiarop одноразового использова-
ния с площадью поверхности роста культуры от 21 250
до 85 000 см 2 (см. рис. 26.10), соединенный с насосами,
оксигенатором и контроллерной системой. Друше пер-
фузионные системы используют клетки, заякоренные
на макроносителях или бусинах в реакторе с неподвиж-
ным слоем (см. ниже).
Мембранная перфузия. Многое системы зави-
сят от технологии мембранного фильтра, в которой
культуральный слой представляет собой плоский,
водопроницаемый лист. Meiuhroferm — это комнарт-
26.2. Крупномасштабное производство монослойных культур
517
Рис. 26.15. Реакторы с неподвижным слоем. Клетки растут на поверхности бусин или микроносителей, омываемых средой
Бусины обычно стеклянные и располагаются в плотном слое на перфорированном основании на дне культурального сосуда
либо, если сделаны из легкого материала, заключены в каркас. При культивировании бусины перестают двигаться и среда
просачивается между ними (а) Предполагаемая схема реактора, (б) PeaKiopCelhgen.(C любезного разрешения New Brunswick
Scientific )
ментализированная таким способом конструкция, в
которой клетки, поступление среды и выведение про-
дукта занимают различные мембранные комнартменты
(см. разд. 26.13: рис. 26.7).
Перфузия на полых волокнах. Существует ряд
перфузионных систем, в которых адгерентные клетки
растут на внешней поверхности перфузируемых пучков
микрокаи илл я ров. Высокомолекулярные продукты
концентрируются во внешнем пространстве вместе с
клетками, в то время как поступление питательных
веществ и удаление метаболитов происходят через
внутренние пространства волокон (см. разд. 253.2
рис. 26.6). Возможности этой системы для прикреп-
ленных культур состоят в воссоздании высокой тка-
нетииичнои клеточной плотности, взаимодействии
с матриксом и установлении клеточной полярности.
Все эти свойства мшут быть важны для иосттранс-
ляционнО|О ироцессиша белков и экзоцитоза. Хотя
иоловолоконные системы были первоначально разра-
ботаны для прилипающих клеток, они также широко
используются для суспензионных культур, таких как
। ибридомы (см. разд. 27.10)
Реакторы с неподвижным слоем. Разработаны
также системы со стеклянными или матричными
бусинами (рис. 26.15), со средой, которая через непод-
вижный слой перфузируется вверх или просачивается
вниз иод действием гравитации. Использованная среда
собирается в резервуар. Эти системы детально описаны
Speir& Griffiths [1985-1990] u Griffiths [2000,2001].
Реакторы с псевдожидким слоем для монослой-
ных культур. В реакторах с псевдожидким слоем
пористые бусины с относительно низкой плотно-
стью - из керамики, или смеси керамики и натураль-
ных продуктов типа колла!ена суспендированы
в восходящем потоке среды, ко!да скорость потока
Рис. 26.16. Реакторы с псевдоожиженным слоем. В реакто-
рах с псевдоожиженным слоем бусины с низкой плотностью
плавают в перфузате, скорость ши ока которого подобрана
так. чп>бы находиться в равновесии со скоростью седимен-
тации бусин
518
ГЛАВА 26. КРУПНОМАСШТАБНОЕ ПРОИЗВОДСТВО КЛЕТОК
КОНТРОЛЬНЫЙ БЛОК
Рис. 26.17. Системы контроля биореактора. Схематическое представление биоректора с перемешиванием с непосредствен-
ным исследованием проб (слева), передачей сшнала на контрольный блок (слева вверху), в китиром хранится данные и при
помощи которого регулируются условия Kvjib'i'iiBiipoBaHUM в реакторе. Порт для взятия образцов справа отбирает клеточную
суспензию из биореактора для анализа
среды соответствует скорости седиментации бусин
(рис. 26.16), пли циркулируют (Cytopilol, Amersham
Biosciences) в камере, подобной ферментеру с восхо-
дящим движением воздуха (см. рис. 26.4). В го время
как суспензионные клетки понадают п находятся в
пористых бусинах как в ловушках, клетки монослоя
прикрепляются к внешним поверхностям, таким как
в норах бусины или макроносителя.
Микрокапсулирование Альгинат натрия ведет
себя как золь или <ель, в зависимости от концент-
рации двухвалентных катионов. При высокой кон-
центрации дивалентных катионов он в виде геля
образует полую сферу вокруч клеток в суспензии (см.
протоколы 25.3 и 23.16; цв. вкладку 186). Поскольку
альгинат дейс гвует как барьер для молекул с высоким
молекулярным весом, макромолекулы, секретируе-
мые клетками, оказываются заключенными в преде-
лах везикул, в то время как питательные вещества,
метаболиты и газ свободно проникают сквозь <ель.
Продукт и клетки могут быть высвобождены сниже-
нием концентрации двухвалентных катионов. Эти
«ели имеют низкую иммунореактивность и мтут
быть введены in vivo.
26.3. КОНТРОЛЬ ПРОЦЕССА
Развитие суспензионных культур контролируется из-
мерением pH, кислорода, СО2, и «люкозы при помощи
соответствующих электродов, которые находятся в
культуре in situ, а также исследованием потребления
питательных веществ типа i люкозы и аминокислот или
увеличением концен грации метаболитов типа молоч-
ной кислоты и аммиака, и продуктов типа иммуногло-
булина или гибридом (рис. 26.17). Количество клеток
и значения дру! их параметров, например содержание
АТФ, ДНК и белка, определяют в образцах, получен-
ных из культуры. Эти данные используются, чтобы
вычислить общее количество биомассы. Температура
среды pet улируется предварительным насреванием
поступающей среды п подогревом водяной рубашки,
который в свою очередь pei улируется обратной связью
от датчика температуры. Скорость потока среды также
контролируется и может соответствовать скорости
выхода продукта, если суспензия постоянно выделя-
ется в режиме биостата (см. разд. 26.1.1). Скорость
перемешивания может регулироваться но вязкости
среды, чтобы уменьшить повреждающее действие
трения жидкости.
26.2. Крупномасштабное производство монослойных культур
519
Рис. 26.18. ЯМР-анализ клеток. Клеточный рост в полых волокнах, анализируемый мсищом ЯМР р'Р] ЯМР-спскгр кле-
ток СНО, растущих в ректоре на полых волокнах. Клетки были выращены на макропоровых бусинах в экстра капиллярном
пространстве особым образом сконструированных картриджей полых волокон, которые могут быть приспособлены к 25-мм
диаметру ячейки для проб, ЯМР-спектроскопа. Клетки были представлены iipu плотности примерно 7x107кл /мл
Сокращения РМЕ фасфомоноэфнры, включая фосфохолин и фосфоэтаноламнн. Р, - внеклеточный неорганический
фосфор, Р, (acid) пул кислого (pH 6.7) внсклеючно|0 Р, в биореакторе, РСг фосфокрсагпн. у-АТР у-фпсфа| АТФ, а-
АТР — а-фосфат АТФ, PDE фосфоднэфиры, DPDE дифосфодиэфиры, включая 1ЮР-1люкозу, р-АТР, р-фосфат АТФ,
NADH, редуцированный никотинамидаденцндинуклеотид. Шкала химического сдвига соотнесена с фосфокрсатином при
0,0 ppm. (С любезного разрешения Dr. Kevin Brindle.)
При повышении масштаба производства монослой-
ных культур клеток, в частности при культивировании
на половолоконных системах или в реакторах с не-
подвижным слоем, обнаруживается проблема.* в этих
условиях невозможно непосредственно наблюдать
клетки и осуществлять контроль развития культуры,
подсчет клеток и определение биомассы становятся
затруднительными. В одном из подходов к этой про-
блеме [Brindle, 1998;Thelwall,et al., 2001J используется
ядерныи машитный резонанс (ЯМР) для исследо-
вания содержимо|О камеры, в которой происходит
развитие культуры. Помещая клетки в перфузируе-
мой половолоконной камере в машитное поле ЯМР-
спетроскопа, исследователь получает характеристики
ЯМР-спектра, что позволяет идентифицировать и
количественно определять определенные метаболиты
(рис. 26.18). ЯМР-спектроскоп можно также исполь-
зовать как устройство для получения изображений, с
получением квазпонтического сечения камеры, для
toio, чтобы показать распределение клеток и даже
различить размножающиеся и неразмножающиеся
зоны культуры.
Глава 27
СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
Эта глава включает в себя ряд методов, которые явля-
ются вспомогательными, зависят от типа клеточной
культуры, но которые не являются существенным
компонентом для начала работы с культурами или
их постоянного ведения. Эти методы представляют
интерес прежде всею для специалистов. Они moivt
представлять ценность для некоторых читателей, для
остальных iiOMOiyT обосновать применение культуры
тканей.
27.1. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ
И ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИМФОЦИТОВ
Наиболее часто используемым методом выделения
лимфоцитов является флотационное обогащение в
смеси фиколла и метризоата натрия (Ficoll—Hypaque)
[Boyum, 1968a, bj, позволяющее отделить лимфоциты
от эритроцитов и сыворотки. Этот метод подходит
для стимуляции лимфоцитов фитО|емаилютинином
(РНА) (см. протокол 27.2), хромосомною анализа,
обогащения популяции жизнеспособных клеток (см.
протокол 12.10), а также на первом этапе выделения
различных подклассов лимфоцитов.
ПРОТОКОЛ 27.1. Приготовление лимфоцитов
Схема
Слой цельной цитратной или гепаринизированной
крови или плазмы, освобожденные от эритроцитов
методом декстран-активированной седиментации,
нанести наслои Ficoll-Hypaque. После центрифу! и-
рования большая часть лимфоцитов будет обнаружи-
ваться на границе раздела фаз между Ficoll-Hypaque
и плазмой
Материалы
Стерильные:
• Проба крови в гепарине или цитрате (концент-
рация определяется типом контейнера для
сбора крови, исходно содержащею гепарин или
цитрат)
• Чистые центрифужные пробирки или универ-
сальные контейнеры
• D-PBSA
• Ficoll-Hypaque, доведенный до 1,077 г/см3 ( При-
ложение И)
* Бессывороточная среда
Ширин с тупоконечной канюлей, пластиковые
Пастеровские пипетки или автоматические пи-
петки
Нестерильные.
* Гемоцитометр или электронный счетчик клеток
Центрифуга
Протокол
1 О гберите пробу крови в цитрат-содержащий или
еиаринизированный контейнер и доставьте в
лабораторию.
• Требование безопасности. Человеческая
кровь может быть инфицирована БИЧ, вирусом
гепатита или друт им возбудителем, поэтому мани-
пуляции с кровью человека должны проводиться
с соблюдением правил предосторожности (см.
разд. 7.8.3).
2. Разведите кровь в D-PBSA в отношении 1:1,
нанесите слой объемом 9 мл поверх 6 мл Ficoll-
Hypaque. Это следует делать в широкогорлых
прозрачных центрифужных пробирках с крыш-
ками, таких как 25-мл универсальные контейнеры
Sterilin или Nunc, либо в чистых пластиковых
50-мл пробирках Corning.
3. Центрифу! ируйте суспензию в течение 15 мин
при 400 g (измеренной в центре поверхности
раздела).
4 Осторожно удалите плазму D-PBSA, не нарушая
слой на границе раздела
5. Соберите смой на Гранине раздела при иомоши
шприца (с тупоконечной канюлей) или пластико-
вой Пастеровской пинеткой, разведите ею в 20 мл
бессывороточной среды (например. RPMI1640).
• Требование безопасности. При работе с
кровью человека не следует использовать стеклян-
ные Пастеровские иииетки и шприцы с остроконеч-
ной иглой. Вместо этою следует использовать 1-мл
автоматическую иииетку или шприце тупоконечной
канюлей.
27.2. Авторадиография
521
6. Центрифу 1 ируйте разведенную отобранную сус-
пензию клеток при 70 g в течение 10 мин.
7. Сбросьте супернатант, ресусиендируйте осадик
в 2 мл бессывороточной среды. Если потребует-
ся провести несколько отмывок, например для
удаления сывороточных факторов, повторите ре-
суспендирование в 20 мл бессывороточной среды
и центрифу! ирование еще два-три раза, прежде
чем окончательно ресусиендироватьосадок в 2 мл
бессывороточной среды.
8. Окрасьте образец полученных клеток метиле-
новым синим, подсчитайте количество клеток,
содержащих ядра, на гемоцитометре. Можно
также лизировать образец клеток с Zapoglobin
(Beckman Coulter) и подсчитать количество ядер
на электронном счетчике клеток с дроссельной
трубкой диаметром 70—100 мкм.
Лимфоциты будут концентрироваться на поверх-
ности раздела наряду с некоторым количеством тром-
боцитов и моноцитов. Здесь также мшут быть обнару-
жены небольшое число i ранулоцитов, хотя основная
масса их будет находиться в Ficoll-Hypaqtie и в осадке,
полученном ири выполнении шага 3. Моноциты и оста-
точное количество гранулоцитов могут быть удалены
из фракции лимфоцитов за счет их преимущественной
адгезии к стеклу (бусины или поверхность флакона)
или пропусканием через нейлоновое сито. Для более
тщательной очистки используйте положительный сор-
тин! MACS (см. разд. 15.3.2) или FACS (см. разд. 15.4)
с использованием специфических поверхностных мар-
керов соответс гвующег о подкласса лимфоцитов.
27.1.1. Бласттрансформация
Лимфоциты в очищенной фракции или в цельной
крови moi ут быть стимулированы при помощи мито-
генов, таких как фитогемагглютинин (РНА), митоген
лаконоса (PWM), или антигена (Berger, 1979; Hume
& Weidemann, 1980]. Развившийся ответ может быть
использован для количественного анализа иммуноком-
петентности клеток. РНА-стимуляция также может
использоваться для получения митозов при хромо-
сомном анализе периферической крови [ Rooney &
Czepulkowski. 1986: Walt & Stephen. 1986] (см. прото-
кол 16.7).
27.2. АВТОРАДИОГРАФИЯ
Данный раздел имеет своей целью дать представление
о микро-авторадиог рафии малых молекулярных пред-
шественников, включающихся на холоде в кислотно-
растворимые макромолекулы, такие как ДНК, РНК
или белки. В тексте этого разделы упомянуты разные
варианты, которые более подробно освещены в цити-
ПРОТОКОЛ 27.2. ФГА-стимуляция
лимфоцитов
Материалы
Стерильные:
• Среда с 10% FBS или автолитической сывороткой
• Фито! ема! 1ЛЮТ11НИН ( ФГА), 50 mki, мл
• Пробирки для исследований или универсальные
контейнеры
• Предметные стекла
• Колцемид. 0.01 мкг/мл в BSS
• 0,075 М КС1
Протокол
1. Используя отмытую фракцию лимфоцитов после
шага 7 протокола 27.1 никубируйте клетки в кон-
центрации 2x10'' к л ./мл вереде, 1,5—2,0 см 1 дуби-
ной, в HEPES или СО^-забуференную DMEM,
CMRL 1066, или RPMI 1640 с добавлением 10%
аутологической сыворотки или FBS.
2. Добавьте ФГА, 5мк1/мл (конечная концентра-
ция) для стимуляции митоза от 24 до 72 ч.
3. Отберите образцы через 24, 36, 48, 60 и 72 ч,
приготовьте мазки или цитоцентрифужные пре-
параты образцов для определения оптимального
времени инкубации (т.н. пик митотического ин-
декса).
4. Добавьте колцемид до U.001 mki/мл (конечная
концентрация) на 2 ч, в течение которых ожида-
ется пик митозов, обнаруженный в шаге 3 | Ber-
ger, 1979].
5. Центрифу! ируйте клетки после обработки кол-
цемидом, ресусиендируйте осадок в 0,075 М КО
для гипотонического набухания, дальнейшая
обработка как в случае приготовления препарата
хромосом (см. протоколы 16.7,27.5).
руемой литературе | Rogers, 1979; Stein & Yanishevsky,
1979] (см. также протокол 27.8). Поскольку автора-
ди<нрафия широко используется для локализации
материала в электрофоретических бло гах и микроско-
пических препаратах, эти два метода можно разделить
на макро-авторадиографию и микро-авторадиографию,
соответственно (см. Приложение IV: Глоссарий).
Изотопы, которые могут применяться для микроав-
торадиографии приведены в списке в табл. 27.1. Низ-
коэнергетичные излучатели (например, 3Н или S:’Fe) в
сочетании с тонкой эмульсией дают внутриклеточное
разрешение. Несколько более высокоэнергетичные
источники (например. ,1С n‘toS) позволяют оценить ло-
кализацию на клеточном уровне. Высокоэнергетичные
изотопы (например, L,lI, S9Fe и 32Р) дают низкое разре-
шение на микроскопическом уровне, но используются
обычно в макроавтографах, хроматограммах и блотах
ири элект|хм]»орезе ДНК, РНК и белка, для которых
низкоэнергетичные излучатели будут ог раничивать
возможность определения включения изотопа. Низкие
S22
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
Таблица 27.1. Изотопы, которые могут быть использованы
для авторадиографии
Изотоп Тип излучения Энергия (mV) (средняя) Т1/2
‘И Р- 0,018 12,3 лет
’Те Х-лучи 0,0065 2,6 года
12>| Х-лучи 0,035,0,033 60 дней
“С Р- 0,155 5,57 лет
”s Р- 0,167 87 дней
,яСа Р- 0,254 164 дня
концентрации высокоэнергетичных источников (1!Си
выше) при использовании в толстослойный ядерных
эмульсиях дают треки, которые полезны при определе-
нии местонахождения небольшого количества высоко-
энергегичных меченых частиц (наиример, вирусных час-
тиц, инфицирующих популяцию клегок или ткани).
При авторадиографии на клеточном уровне чаще
всего используется тритий, поскольку выделяющиеся
0-частицы имеют в водной среде средний пробег около
1 мкм, что дает очень хорошее разрешение. Тритий-
меченые компоненты обычно дешевле, чем |4С- или
‘’S-меченые эквиваленты, и имеют более длительный
период полураспада. В результате их низкой энерг ии
излучения, тем не менее, важно, чтобы радиочувстви-
тельная эмульсия располагалась в непосредственной
близости от образца и между клеткой и эмульсией ни-
чего не было. Даже в этой ситуации будет per цстрцро-
ваться включение изотопа на толщину образца только
1 мкм. 0-Частицы, входя в эмульсию, дают скрытое
изображение в кристаллической решетке галогенида
серебра эмульсии в точке, в которой они останавли-
ваются и высвобождают энергию. Это изображение
может быть визуализировано как зерна металлического
серебра путем обработки щелочным восстановителем
(проявителя) и последующего удаления оставшегося
неэкспонированного галогенида серебра кислым фик-
сажем. Скрытое изображение более стабильно при
низкой температуре и безводных условиях, поэтому его
чувствительность (величина сиг нала по отношению к
фону) может быть улучшена экспонированием в холо-
дильнике на слое влагопоглотителя. Эта манипуляция
позволит уменьшить фоновое образован ие зерен сереб-
ра иод действием температуры.
ПРОТОКОЛ 27.3. Микрорадиография
Схема
Инкубировать культуру клеток с соответствующим
меченым изотопом предшественником (наиример,
| ‘HJ-тимидином для мечения ДНК), отмыть, фик-
сировать и высушить клетки (рис. 27.1). Произвести
необходимые действия (наиример, удаление невклю-
ченниго предшественника). Покрыть образец эмуль-
сией в темноте и оставить для экспозиции. После
проявления серебряные зерна могут наблюдаться
в зонах, располагающихся над областью включения
метки (рис. 27.2; см. цв. вкладку 14z).
Материалы:
Установка культуры:
Стерильные:
• Клетки
- D-PBSA
• Трипсин
• Ростовая среда
Покровные или предметные стекла или чашки
Петри (можно использовать чашки не для работы
с культурой тканей, если работа идет на иокров-
ных стеклах) или пластиковые флаконы
Нестерильные.
Гемоцитометр или Электронный счетчик клеток
и сцинтгиьгяционная жидкость
Мечение изотопом:
Стерильные:
• Изотов
• HBSS
Нестерильные.
* Защитные перчатки
Контейнер для сбора радиоактивных ггггиеток
Контейнер для слива жидких радиоактивных
отходов
Фиксирование и обработка клеток:
Нестерильные.
Уксуснокислый метанол (1:3, на льду, свежепри-
готовленный)
• DPX
• Трихлоруксусная кислота (ТХУ), 0,6 N
• Деионизованная вода
• Желатин: 0,2 г в 200 мл UPW; разогретый в
СВЧ-ггечи в течение 2 мин, охлажденный и про-
фильтрованный
Получение ауторадиографов:
Нестерильные.
• Светофильтр Kodak Wraiien II или аналог ичный
• Эмульсия (Arnershaur Hypercoat Emulsion LM-1,
RPN40)
Замечание: Удобно растопить эмульсию и разлить
гго аликвотам в сосуды для погружения, которые
позволяют одновременно манипулировать с несколь-
кими стеклами одновременно (Aurersharn). Если
стекла герметично закупорены в темные коробки, то
их можно хранить при 4 °C, пока не потребуются.
Светонепроницаемые коробки для предметных
стекол (Clay Adams, Raven)
• Силикагель (Fisher)
• Темная виниловая лента (например, электроизо-
ляционная лента)
Черная бумага или полиэтилен
27.2. Авторадиография
523
Приготовление препарата меченных изотопом клеток
Фиксация в холодном
уксуснокислом
метаноле
эмульсию
Расположить
вертикально для
стекания излишка
Сушить, расположив
горизонтально,
экспонировать и проявить
Рис. 27.1. Микроавторадиография. Стадии подготовки микрорадиоавтографа из культуры клеток
Замечание. Всю стеклянную посуду и оборудование
следует тщательно промывать и оберегать от изо-
топного заражения. Пластиковые покровные стекла
Следует предпочитать сгегогянным для минимизации
радиоактивного фона. Будьте особенно тщательны
в предупреждении разбрызгивания и немедленно
удаляйте любые брызги. Носите ггерчатки и регу-
лярно их меняйте, наиример, когда вы иереходите
от инкубации (высокий уровень изотоиов) к работе
с отмытыми фиксированными препаратами (низкий
уровень изотопов)
Обработка ауторадиографов:
Нестерильные.
• Проявитель: Phenisol (Ilford), 20%
• Стой-ванна: 1% уксусной кислоты
• Фото-фиксаж: 30% тиосульфат на грия
• Просветляющий агент (Kodak)
• Покровные стекла (#00)
Окрашивание:
Нестерильные:
• Гематоксилин (фильтрованный перед исиользова-
нггем) илгг краситель Гимза (см. протокол 16.2)
S24
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
Рис. 27.2. Микроавторадиографы. Эта пара фотогра-
фии пример включения j *Н (-тимидина в монослой кле-
ток Нормальные глиальные клоки были инкубированы с
0.1 мкКи *мл (3.7 кБк/мл), 200 К и ммоль (7,4 Бк мкм),
pH|-тимидин в течение 24 ч, промыты и обработаны, как
это описано в протоколе 27.3. (А) Типичные меченые ядра,
подходящие для определения индекса мечения (см. прото-
кол 2111) (В) Подобная культура, инфицированная мико-
плазмой, показано включение рН]-тимиднна в цитоплазму
• Фосфатный буфер, 0.01 М, pH 6,5
• Этанол, 50,70 и 100**о
• Histoclear (Fisher)
• DPX (Merck)
Протокол
Подготовка культуры
1. Поместите репликатную минослойную культуру
на покровные стекла (Nunc, Bellco) или чашки
Петри.
2. Инкубируйте культуру ири .37 °C, пока клетки не
достш нут необходимой для мечения Стадии.
Добавление изотопа:
3. Добавьте изотоп, обычно в диапазоне 0,1
10 мкКи мл (-4.0 КБк-0.4 МБк/мл), 100 Ки/
ммоль (-4 ГБк/мкмоль), в течение 0,5—48 ч в
соответствии с требованиями инструкции.
• Требование безопасности. При работе с
радиоизотопами следуйте принятым правилам. По-
скольку в разных странах эти правила различны, в
настоящем руководстве не приводятся специальные
рекомендации, помимо следующих: носите перчатки,
не работайте в ламинарных шкафах с горизонталь-
ным воздушным потоком, используйте плоские лот-
ки с впитывающей тканью для абсорбции случайных
разбры.и иваний. инкубируйте культуры в коробке
или подносе с отметкой, обозначающей работу с
радиоактивностью, уничтожение радиоактивных
отходов производите в соответствии с местным за-
конодательством (см. разд. 7.7.2).
4 Удалите все среды, содержащие изотоп, тща-
тельно промойте клетки в BSS, собирая среду и
промывочную жидкость в контейнер для жидких
радиоактивных отходов.
• Требование безопасности. ‘Н-нуклеозиды
высокотоксичны, поскольку их конечная локализа-
ция происходит в ДНК (см. разд. 7.7.1).
Фиксация и обработка клеток:
5. Фиксируйте клетки в уксуснокислом метаноле
на льду в течение 10 мин.
6. Приготовьте стекла:
а) Покровные стекла: поместите покровные
стекла клетками вверх на предметное стек-
ло с заключающим веществом, таким как
DPX или Perniouni.
б) Клеточная суспензия (суспензионная куль-
тура или триксинизированный монослой),
клетки центрифу! ируйте на предметное
стекло (см. протокол 16.4) или сделайте
препарат из капли (см. протокол 16.7.
шаш 4-12).
в) Приготовьте несколько дополнительных
контрольных стекол для использования
27.2. Авторадиография
525
при определении оптимальной продол-
жительности экспозиции. Все препараты
далее будут называться «стекла».
7. Экстра! ируйте кислоторастворимые предшест-
венники (при мечении ДНК, РНК или белка) на
льду 0,6 N ТХУ (3x10 мин), и проведите дру 1 не
контрольные экстракции (например, растворение
липидов полярными растворителями или cjx'fi-
мента гивное расщепление).
8. Погрузите стекла в раствор желатина на 2 мин.
9. Дайте стечь раствору, держа стекла вертикально,
высушите их (стекла мшут храниться ири 4 °C в
сухом виде).
Проведение ауторадиографии:
10. Внесите стекла в темную комнату.
11. При красном светофильтре растопите эмульсию
в водяной бане при 46 °C.
12. Осторожно перемешайте эмульсию цри помощи
чистого стекла, стараясь не создавать пузырей.
13. Погрузите стекла'
а) Потрузите стекло в эмульсию на 5 с нри
46 °C, удостоверьтесь, что клетки покры-
ты эмульсией. Заметьте, что температура
является критичным моментом, определя-
ющим толщину слоя эмульсии и, следова-
тельно, разрешение.
б) Выньте стекло из эмульсии со, дайте стечь
5 с.
в) Погрузите стекло в эмульсию еще раз на
5 с.
1) Выньте стекло из эмульсии, дайте стечь 5 с,
держа его вертикально.
д) Протрите бумажной салфеткой заднюю
часть стекла.
е) Оставьте подсыхать в горизонтальном
положении на бумажной салфетке или
фильтровальной бумаге в течение 10 мин.
ж) Поместите стекла в штатив в светонепро-
ницаемой коробке и оставьте до полного
высыхания. Не высушивайте стекла в патоке
сухого воздуха, позвольте им высыхать мед-
ленно во влажной атмосфере во избежание
деформации и трещин эмульсионного слоя.
14. Когда стекла высохнут (2—3 ч), перенесите их в
светонепроницаемую коробку для микроскопи-
ческих препаратов с влагопот лотителем, таким как
силикагель. Проследите за тем. чтобы не прика-
саться пальцами к поверхности эмульсии и чтобы
стекла не касались дру< друга или осушителя.
15. Опечатайте коробки темной изолентой, обмо-
тайте их черной бумагой или полиэтиленом и
поместите в холодильник. Данный холодильник
не должен применяться для хранения изотопов.
16. Оставьте коробки ири 4 °C в течение 1—2 недель.
Точное время будет зависеть от активности
образца может быть определено проявле-
нием контрольных стекол через определенные
промежутки времени. Стекла с щюдолжительным
временем экспозиции имеют более высокий фон
и склонны к регрессии скрытого изображения.
Лучше повысить активность метки, чем увели-
чить продолжительность экспозиции.
Проявление ауторадиографов:
17. Верните коробки в темную комнату и при красном |
светофильтре вскройте коробки.
18. Оставьте стекла в комнатной атмосфере - цри |
комнатной влажности и температуре (-2 мин).
19. Приготовьте раствор проявителя ири 20 "С.
20. Поместите стекла в проявитель на 2,5 мин при |
постоянном осторожном покачивании.
21. Быстро ополосните стекла UPW.
22. Перенесите стекла в фототрафический фиксаж I
на 5 мин ,
23. Промойте стекла в деионизованной воде и затем
поместите их в тиосульфатный осветляющий |
лент на 1 мин.
24. Промойте стекла в проточной чистой воде пли I
пять раз сменяя воду не менее 5 мин.
25. Высушите стекла, исследуйте их на микроскопе,
можно использовать фазовый кон1рас г, поместив
сверху тонкое покровное стекло (#00) смоченное
водой. Удалите покровное стекло, котда вы за-
кончите исследование стекла и прежде, чем вода
высохнет, в противном случае покровное стекло
прилипнет к эмульсии
Окрашивание:
26. Для того чтобы окрасить гематоксилином.
а) Окрасьте стекла в свежее профильтрованном |
растворе гематоксилина в течение 45 с.
б) Промойте стекла в проточной воде в течение |
в) Де> идратируйте стекла в восходящей концент-
рации этилового спирта: 50,70 и 100% ЕЮН.
() Просветлите стекла в Histoclear; заключите в I
DPX. Если используются покровные стекла,
используйте #00 с минимумом тиснуотиче- I
ской среды для заключения, чтобы обеспечить |
оптимальное рабочее расстояние для работы с
объективом 100х.
27. Для окраски по Гимза:
а) Нанесите на сухие стекла краситель Гимза на I
1 мин.
б) Разведите краску in situ Г. 10 в 0.01 М фосфат
нога буфера (pH 6,5) на 10 мин.
в) Удалите окрашивающий раствор восходящей
струей воды. Стекла не следует вынимать из
красителя, краску не следует сливать обыч- ।
ным способом, поскольку частички краски,
которые располагаются поверх слоя краски,
прилипнут к образцу.
г) Тщательно промойте протонной водой, пока
краска не иерее ганет выходить из эмульсии,
оставаясь лишь в клетках.
526
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
Анализ
Количественный. Определите специфическую ло-
кализацию зерен, наиример, только над ядром или
преимущественно над одним из типов клеток.
Качественный
1) Подсчет зерен. Подсчитайте количество зерен на
клетку, на ядро, или локализующихся еще i де-то в
клетке. Количественный анализ возможен только
ири низкой плотности зерен около 5—20 зерен на
ядро, 10—50 на клетку, — чтобы не было перекрыва-
ния зерен и низкого однородного фона.
2) Индекс мечения. Подсчитайте количество меченых
клеток как долю от общего количества клеток (см.
также протокол 21.11). Для этого анализа плот-
ность зерен должна быть выше, чем при подсчете
зерен, что обле! чит распознавание меченых клеток
(см. цв. вкладку 14г). Если плотность зерен высока
(например, 100 зерен на ядро), то устанавливают
более низкий nopoi определения, скажем, 10 зерен
на ядро или на клетку. Однако помните, что низкий
уровень мечения, значительно превышающий фо-
новый, может быть важным, наиример, ири оценке
репарации ДНК.
Микроавторадио! рафия полезный инструмент
для определения распределения изотона, включенного
в популяцию клеток, но он меньше подходит для об-
щего количественного анализа захвата или включения
изотопа, для которого предпочтителен сцинтилля-
ционный подсчет.
Вариации. Изотопы с двумя различными энер! иями,
наиример *Н и "С. мо1ут быть выявлены в одном экспе-
рименте путем нанесения на препарат сначала тонко! о
слоя эмульсии, затем слоя чистого желатина и, наконец,
нанесением желатина с вторичным слоем эмульсии
[Rogers, 1979]. Более слабое P-излучение ’Н останав-
ливается в первом слое эмульсии и желатиновом слое.
В то же время более высокоэнергетичное Р-излучение
ИС, имея большую среднюю длину пути, около 20 мкм,
проникнет до верхней эмульсии. Adams [ 1980] описал
метод приготовления радиоавтографа из чашек Петри
или флаконов. Для этого жидкую эмульсию наливают
непосредственно на фиксированные препараты без
триисинизации.
Мя1 кие Р-излучателп можно также обнаруживать
в препарате с помощью световой микроскопии. Для
Этого используют очень тонкую пленку эмульсии или
i а догони д серебра возгоняют непосредственно на ис-
следуемый срез [Rogers, 1979].
Вместо радиоизотопных меток в настоящее время
чаще применяют флюоресцентные и люминесцентные
зонды (Atnershatn Biosciences) (см. протокол 27.9).
Разрешение этих методов часто значительно выше,
количественный анализ их возможен путем примене-
ния конфокальной микроскопии (Bio-Rad) или CCD
камеры (Dage-MTI), а утилизация реагонтов более
безопасна для окружающей среды Однако оборудо-
вание для микроскопического исследования дорого
(-50 000-200 000 долларов).
27.3. СЪЕМКА В РЕЖИМЕ
ЗАМЕДЛЕННОГО ВРЕМЕНИ
Съемка в режиме замедленного времени была разрабо-
тана исходно как кинематографическая техника, при
помощи которой естественный медленный процесс moi
наблюдаться в значительно более высоким темпе. Из-
начально эта техника требовала использования камеры,
автоматически включающейся ш> сигналу таймера. На-
учная кинематография началась с первой кинокамерой,
которую использовал Матеу для pei истрации движения
животных в 1888. В 1950-х u. Michael Abercrombie был
первым исследователем, который применил киносъем-
ку для исследования тканевых культур клеток строго
количественным способом [Abercrombie & Heaysman,
1954]. Постепенно кинокамеры были заменены на
видеокамеры, и «видеомикроскопия» наилучшим об-
разом позволила соединить видеосъемку со световой
микроскопией [Inoue & Spring, 1997]
Качество видеоизображения постепенно улучша-
лось, и цифровая форма постепенно вытеснила 16-мм
пленку. Сама но себе микроскопическая техника оста-
ется критическим пунктом в этом процессе. Коммер-
чески доступная микроскопическая техника обычно
требует трудоемкого управления или, по-крайней
мере, полу интерактивно! о покадрового анализа запи-
сей. Автоматический анализ поведения клетки путем
цифровой обработки изображения был достигнут с ис-
пользованием организмов, имеющих высокое прелом-
ление [Wessels etal., 1996]. Полностью автоматический
анализ неокрашенных тканевых культур позвоночных
требует специальной микроскопии: цифровая запись
с интерференционного микроскопа с автоматическим
сдвигом фаз [Dunn & Zicha, 1997]. Автоматический
анализ поведения клеток является важным аспектом
съемки в режиме замедленного времени, поскольку
большое количество данных обычно требуется для
исследования явления в этой области с высокой вари-
абельностью свойств.
Эта предварительная информация и протокол 27.4
для съемки в режиме замедленного времени были пред-
ставлены Daniel Zicha. Cancer Research L’K London Re
search Institute, Light Microscopy Laboratory, 44 Lincoln’s
Inn Fields, Loudon, WC2A 3PX, England, UK.
ПРОТОКОЛ 27.4. Видеозапись в замедленном
режиме времени
Схема
Приготовить клетки в культуральной камере с
подходящими для микроскопии оптическими свой-
ствами. Микроскоп, оборудованный видеокамерой,
соединен с записывающим устройством, дополни-
тельное оборудование обеспечивает желательную
температуру для культуры клеток. В ходе записи
отдельные кадры снимаются путем включения авто-
матического ре1улятора, который также открывает
27.3. Съемка в режиме замедленного времени
527
диафра! му, О1раничивая излишнее действие осве-
щения на клетки.
Материалы:
• Среды. МЕМ с солями Хэнкса. 12 мМ бикарбона-
та, 10% сыворотки теленка 4 мМ L-глютамина
• Трипсин EDTA.трипсин (Difeo). 0.25% в EDTA.
0.5 мМ
• Покровные стекла, 18x18 мм, No 1,5 (Merck),
промытые в концентрированной серной кислоте
и дважды прокипяченные в UPW с использова-
нием тефлоновых держателей для покровных
стекол (Eppendorf), стерилизованные автокла-
вированием
• Чашки Петри, пластиковые, 3,5 см
• Камера д.!я видеозаписи:
а) Предметное стекло толщиной 1 мм с отвер-
стием 15 мм в диаметре в центре, закры-
том покровным стеклом #3, приклеенным
УФ-отвердевающим клеем для стекла (South-
ern Watch and Clock Supplies).
б) Стерилизовать в 70%-м спирте, с последую-
щим обдуванием чистым сжатым воздухом
в) Восковая смесь: пчел ины й воск ( Fisher), мя i -
кий желтый парафин (Fisher), и парафиновый
воск сточкой плавления 46 "С; Fisher), в отно-
шении 1:1:1
• Микроскоп: Axiovert 135 TV (Zeiss)
• П лексшласовая коробка, позволяющая помес-
тить в нее станину микроскопа, оборудование,
контролирующее систему подогрева (сконструи-
рованную но специальному заказу, автоматичес-
кий peiy.iH'rop 208 2739, температурный датчик
219 4674, нагревательный элемент224 565, низко-
шумовой аккумуляторный вентюштор 583—325,
RS Components, UK)
* Компьютерре!улируемый затвор диафра! мы и
фильтра (Ludl Electronic)
• Камера. RTE/CCD-1300-Y/HS (Princeton Ins-
truments)
• Компьютер: Macintosh G3
• Программное обеспечение для построения изоб-
ражения IPlali (Scanalylics), позволяющее запи-
сывать изображение, полученное микроскопом в
режиме замедленного времени.
Протокол
1. Заранее включите все оборудование, особенно
нагрева гель, чтобы установить и стабилизировать
температуру в пределах камеры
2. Высвободите ад|езивиую культуру в суспензию,
используя трипсин EDTA
3. Поместите примерно 20 000 клеток на покровное
стекли чашку Петри, позвольте клеткам осесть
при 37 ‘ С во влажной атмосфере с 3% СО2 в те-
чение ночи.
4. Установите покровное стекло на камеру для
видеосъемки, которая должна быть заполнена
культуральной средой, оставив маленький пу-
зырь, чтобы ।арантировать равновесие СО, с
солями Хэнкса. Запечатайте покровное стекло |
горячей смесью воск,/парафин.
5. Используйте соответствующую микроскоииче- I
скую технику, например фазови-контрастную или
флюоресцентную для LD Achroplati 32х 0,4 Ph2 I
объектив. Объектив с более высоким разрешени- ।
ем и с коротким рабочим расстоянием потребует
использования вертикального микроскопа для
наблюдения за адгезивной культурой, рас про- I
страняющейся в камере.
6. Подготовьте компьютер к получению изобра-
жения:
а) Калибруйте размер изображения, используя |
киорди натный м икрометр.
б) Выберите время экспозиции; обычно 0,1 с, ।
достаточное для фазового контраста, ирини- I
мая во внимание, что слабая флюоресценция |
требует более длительной экспозиции, - 0,4 с
или больше.
в) Выберите интервал времени между кадрами.
номер рамки и название файла. Анализ транс-
локации клеток при медленном перемещении
(фибробласт- подобные клетки) даст удовлет- I
верительные результаты при интервале около |
5 мин. Наблюдение за клеточной морфоло- I
। ней. которая изменяется намного быст рее, но- I
требует интервала примерно в 1 мин или даже
меньше. Также запись транслокации быстрых |
клеток, таких как нейтрофилы и лейкоциты,
потребует установления интервала в 1 мин I
или менее.
с) Используйте следующий сценарий, чтобы
провести чередование получения фазови-кон- |
трастных и флюоресцентных изображении:
i) Произведите сохранение выбранного |
названия файла.
ii) Вставьте ярлык START
iii) Переведите колесо фильтров на флюорес- ।
ценцию, и откройте диафрашу дуговой
лампы.
iv) Полностью обеспечьте получение флюо-
ресцентно! о изображения, используя |
соответствующее время экспозиции.
v) Установить колесо фильтра на фазовый I
контраст, и закройте диафра! му дуговой
лампы
vi) Сохраните флюоресцентное изображение
vii) Откройте диафра! му |алогеновой лампы. .
viii) Получите фазово-контрастное изображе-
ние, используя соответствующую экспо- ।
зииию
ix) Закройтедиафрашу галлогеновой лампы.
х) Сохраните фазово-контрастное изобра- I
жение.
xi) Пауза.
хй) Закройте все окна
S28
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
xiii) Вернитесь к ярлыку START, если только
указанный номер рамки не был заре> ист-
рирован.
xiv) Выйдите из программы.
Отделите фазово-контрастную и флюоресцент-
ную записи. Последовательности кадров мтут
рассматриваться независимо или в комбинации
с iPLab мультипликацией.
7. Сохраните последовательности изображений на
CD диске.
• Требование безопасности. 1) Будьте аккурат-
ны, кт да промываете покровное стекла концентриро-
ванной кислотой. 2) Контролируемый электрический
натреватель, сконструированный на основе Radio
Spares (RS) компонентов, должен быть как следует
изолирован и заземлен, вентилятор следует распола-
тать так, чтобы предупредить случайное повреждение
вращающимися лопастями.
Анализ. Для интерактивного измерения положе-
ния, области и интенсивности окраски изображения
может быть использовано компьютерное npoi раммние
обеспечение для создания изображения IPLab . Теория
моментов является хорошей основой для автомати-
ческого анализа поведения клегок [Dunn & Brown,
1990]. Она может бытьпрнменима к флюоресцентным
изображениям для оценки в морфолт ических иссле-
дованиях клеточной транслокации с использованием
положения центра тяжести, распределения клеток с
использование плошади клетки, интенсивности флюо-
ресцентного сш нала или коэффициенты формы.
Вариации. Выбор среды зависит от потребностей
исследуемых клеток. Среда с солями Хэнкса имеет то
преимущество, что равновесие pH в этом случае уста-
навливается автоматически в герметично закрытой ка-
мере с культурой. О гкрытая камера может быть сконс-
труирована так, чтобы чашка Петри распола1алась над
отверстием в дне камеры. Такое расположение требует
увлажнения и доставления в камеру смеси воздуха и
СО2. Среда на основе среды Хэнкса с 12 мМ 1идрокар-
боната потребует добавления примерно 3% СОа среда
Дюльбекко МЕМ ширебует 10f<. СО2. Открытая камера
требует использования инвертированного микроскопа
и высоко! о разрешения, которое может быть достш ну-
то, кшда используются у-облученные микролу ночные
3,5-см чашки (MalTek) No. 1,5 со стеклянным дном,
без предварительного покрытия. В настоящее время
имеются специализированные проточные камеры с
местным подо!ревом (см. рис. 5.22; Inlracell, Royston).
Уже не заслуживают серьезного внимания пленочные
или даже видеометоды ретстрации, поскольку циф-
ровая запись на компьютере обеспечивает- большее
удобство и дру1 ие преимущества, а именно: обработка
изображения, контрастное выделение контуров, вычи-
тание фонового «шума» и щмлраммное обеспечение
анализа. Альтернативным программным обеспечени-
ем записи изображения в течение заданного времени
для персонального компьютера является MetaMorph
Imaging Software (Universal Imaging Corporation, PA,
USA). Дифференциальный интерференционный кон-
траст (DIC) является общей альтернативой фазовому
контрасту деталей при высоком разрешении.
27.4. КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ
Съемка в режиме замедленного времени или запись
в режиме реального времени может быть сделана на
видеокамере с высоким разрешением или CCD. Эти
системы позволяют вести запись распределения и пе-
рераспределения красителя или флюоресцентных проб
внутри клетки. Флюоресцентное изображение может
быть использовано для локализации клеточных opia-
нелл, таких как ядро или комплекс Гольджи [ Lippincott -
Schwartzetal., 1991 j; измерения колебаний внутрикле-
точных концентраций кальция [Cobbold & Rink, 1987J,
а также проникновение в клетку и перемещение в ней
лекарств [Neyfakh, 1987; Encana el al., 1990]. Измере-
ния могут быть проведены в трех измерениях, в то же
время возбуждение и система определения позволяют
проводить визуализацию оптических сечений через
клетку и ее поверхности через короткие промежутки
времени. Конфокальная микроскопия может помочь
визуализировать клетки в трехмерной системе культу-
ры, как и в исследовании инвазии в фильтрационной
лунке [Brunton etal., 1997]
27.5. СИНХРОНИЗАЦИЯ КЛЕТОК
Для того чтобы исследовать особенности прохождения
клетками клеточного цикла, был разработан ряд мето-
дов, в соответствии с которыми клеточная популяция
может быть фракционирована или метаболически
блокирована так, чтобы по возвращении к обычным
условиям культивирования клетки смО1ли находиться
в той же фазе и продолжить синхронное прохождение
по клеточному циклу.
27.5.1. Разделение клеток
Методы разделения клеток были описаны в гл. 15.
Может быть использована седиментация на основе
силы тяжести, [Shall & McClelland, 1971; Shall, 1973J,
но метод центрифужной элютриации предпочтителен,
если требуется большое количество клеток (>5x10')
[Breder et aL, 1996; Mikulils el al., 1997] (см. рис. 15.4
и 15.5). Клеточный сортиш на основании активации
флюоресценции (см. рис. 15.8 и 15.9) также может
быть использован вместе с нетоксичным обратимым
окрашиванием ДНК, например красителем Hoechst
33342. Выход продукта ниже для этого метода, чем для
центрифужной элютриации (-10’клеток или менее),
но, чистота фракции будет выше.
27.6. Культура амниоцитов
529
Одним из самых простых методов сепарации,
синхронизирующей клетки, является митотическое
стряхивание: клетки в монослойной культуре склон-
ны к ошариванию в мегафазе и откреплению, koi да
встряхивают флакон, в котором они растут. Этот метод
хорошо работает для клеток СНО [Tobey et al., 1967;
Petersen el al., 1968] и некоторых линий, производных
от HeLa-S3. Инкубирование клеток при 4°С в течение
от SO мин до 1 часа может также бытьисцользовано для
синхронизации клеток в клеточном цикле [Rieder &
Cole, 2002] и улучшения выхода продукта при мито-
тическом стряхивании | Miller el al., 19721.
27.5.2. Блокирование клеточного цикла
Обычно используют два типа блокирования клеточ-
ного цикла:
1) Ингибирование синтеза ДНК (S-фаза). Агенты,
которые используют обычно для ингибирования
синтеза ДНК, включают в себя тимидин, сидрок-
симочевину, арабинозид цитозина и аминоцтерин
[Stubblefield, 1968]. Действие этих агентов вариа-
бельно, поскольку MHOt ие из них токсичны и бло-
кируют клеточный цикл в дру1 их фазах клеточного
цикла, помимо G1, что приводит к ухудшению со-
стояния клеток. Следовательно, культура будет со-
держать нежизнеспособные клетки, клетки, которые
блокированы в S-фазе, но жизнеспособны, и клетки,
которые избежали блокирования клеточного цикла
[Yoshida & Берри, 1990J.
2) Трофическое блокирование (Gl-фаза) В этих
случаях сыворотка [Chang & Baserga, 1977J или
изолейцин [Ley & Tobey, 1970J удаляются из
среды в течение 24 ч и затем вновь добавляются,
что приводит к синхронизации клеточного цикла
[Yoshida & Верри, 19901. Высокая степень синх-
ронизации (>80%) может быть достигнута только
в первом цикле деления; на втором цикле степень
синхронизации может быть <60%, а на третьем цик-
ле распределение клеток но фазам клеточного цикла
может приближаться к случайному. Химическая
блокада часто оказывается токсичной для клеток,
а трофическое блокирование работает не слишком
хорошо для mhoi их трансформированных клеток.
Физические методы фракционирования, возможно,
наиболее эффективные и наименее повреждающие
для клеток (см. разд. 15.2.15.4).
27.6. КУЛЬТУРА АМНИОЦИТОВ
Кариотип эмбриона человека может быть определен
культивированием амниотической жидкости, полу-
ченной пункцией плодного пузыря, которую можно
провести начиная с 11-й недели беременности, хотя
в большинстве случаев пункцию выполняют между
15-й и 18-й неделями беременности. Врожденные
нарушения обмена, а также связанные с полом или
аутосомные рецессивные и доминантные мутации
могут быть диагностированы главным образом на ос-
новании исследовании тканей плаценты, полученных
из образцов хориональных ворсинок с использованием
прямых методов (например, с использованием некуль-
тивированного материала). В дополнение к этому, в
настоящее время коммерчески доступны новые методы
(AneuVysion from Vysis), позволяющие обнаружить ос-
новные трисомии и анеунлоидию половой хромосомы
ири помощи некультивируемых амниоцитов. Друше
разработанные подходы обнаруживают трисомии при
помощи молекулярного полиморфизма. Однако боль-
шинство пренатальных auai нозов синдрома Дауна до
настоящего времени основываются на полном хромо-
сомном анализе амниотической жидкости, включаю-
щей культуру клеток.
Метод покровных стекол в протоколе 27.5 был пер-
воначально предложен Marie Ferguson-Smith, East An-
glian Regional Genetics Service, Addenbrookes Hospital,
Hills Road, Cambridge, CB2 2QQ England, UK. Позже
он был несколько доработан, альтернативный метод
закрытых пробирок был предложен Mike Griffiths, Re-
gional Genetics Laboratory, Birmingham Women’s Hos-
pital, Edgbaston, Birmingham, B152TG, England, UK.
Принцип культивирования амниотической жидкости
основан на выделении клеток центрифуг ированием и
помещением клеточной суспензии в подходящий куль-
туральный сосуд. Сущее гвует ряд подходов, которые
используют как закрытые, так и открытые системы
для роста клеток в пробирках, флаконах или камерах
с предметными стеклами, либо на покровных стеклах
в чашках Петри Высококачественные, быстрые ре-
зультаты мог ут быть получены при помощи любой из
этих техник, но система закрытой пробирки имеет ряд
преимуществ в надежности, простоте и минимальном
использовании ресурсов.
ПРОТОКОЛ 27.5. Культура амниоцитов
А. Культуральная система в закрытой
пробирке
Схема
Инкубировать клеточную культуру в пластиковых
пробирках Лейтона в стандартном инкубаторе при I
37 °C, собрать клетки методом триисинизации
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
• Образец амниотической жидкости, 10—15 мл
• Полная среда. 100 мл среды Хэма FlOc добав- .
лением 20 мМ буфера HEPES, 2 мМ глютамина,
100 U 'мл пеннцюыина и 100 мкг 'мл стрептоми-
цина с 10% FBS или 2% Ultroser (Invitrogen)
• D-PBSA
• Колцемид, 10 мкг мл: для получения рабочего I
раствора добавить 1—9 мл стерильного D-PBSA,
БЗО
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
затем добавить по 0.1 Mji рабочего раствора на
каждый 1 mji среды в культуре для достижения
конечной концентрации 0,1 мкг/mji
• Тимидин: приготовьте маточный раствор 15 mi /мл
в D-PBS А. стерилизуйте фолы рацией. Добавьте
0,1 мл маточного раствора тимидина к 10 мл сре-
ды. Поменяйте среду на тимидин-содержащую
перед сбором клеток. Конечная концентрация в
среде должна составлять 0,15 mi /мл.
• Бромдеоксиуридин, BUdR. флакон, содержащий
250мг: развести содержимое в 25 мл стерильной
D-PBSA, стерилизовать фильтрацией. Добавить
0,5 мл раствора к 11,5 mji перильного D-PBSA и
8 Mji разведенного раствора колиемида. Разлить
получившийся раствор по аликвотам и хранить
замороженными. Добавить 0 1 мл смеси BUdR-
колцемид к каждому 1 мл культуры. Конечная
концентрация до-гжна составлять 25 mki/мл
BUdR и 0,04 mki/мл колцемида.
• Трипсин (Baclo, Difeo): Растворите содержи-
мое флакона в 10 mji UPW, следуя инструкции
производителя для получения 5% раствора
(вес. объем).
• EDTA, 0,5 мМ в изотоническом физиолО] оче-
ском рас гворе (Invitrogen)
• Триисин/EDTA (ТЕ), раствор для субкульти-
вирования и сбора клеток: 2 мл разведенного
три ценна (Baclo) в 100 mji EDTA, что дает 0,1 %-й
раствор трипсина (вес. объем)
• Универсальные контейнеры для сбора образцов
амн иотической жидкости
• Пластиковые одноразовые 10-м.ч пипетки и
приспособление для пииетирования для уста-
новления культур
• Пробирки Лейтона (с плоскими ребрами, плас-
тиковые) И КрЫШКи ДЛЯ НИХ (NutlC)
• Шприцы, 20 мл; пластиковые и пластиковые
И|лы для перемешивания (Henley Medical) для
питания культур
• Переносящие иииетки/Пастеровские пипетки,
1 мл и 3 мл, пластиковые одноразовые
• Histopaqtie-1077 (Sigma), модифицированный по
инструкци и производителя
Нестерильные:
• Дезинфектанты [например, Virkon (Merck)J;
следуйте инструкции производителя
* Гипотонический раствор хлористого калия,
0,075 М KCI в U PW; добавить 5,574 г хлористого
калия ( чда) к 1 л I," PW
• Фиксирующий раствор, свежеприготовленный:
3 части метанола (чда) к 1 части ледяной уксус-
ной кислоты (чда)
• Переносящие иипетКи/Пастеровские иииетки,
1 мл, пластиковые, одноразовые
• Предметные стекла, предварительно очищенные
(Berliner Gias KG, Skan, компания-посредник
Richardsons of Leicester)
Флаконы Copiiii
• Раствор перекиси водорода, 5% (по объему): Раз-
вести 1 часть 30°о перекиси водорода в 5 частях
воды
• ФизиолО] и чески и раствор, ().9uo NaC I в U PW
• Раствор трипсина в физиологическом растворе
для определения исчерченности. добавить 1,4 мл
разведенного трипсина (Difeo) к 50 мл физио-
логического раствора, конечная концентрация
0,14°г, трипсина.
• Буферный раствор. pH 6.8 (Gurr, Merck): доба-
вить одну таблетку буфера к 1 л UPW.
• Краска Лейшмана (Gurr, Merck), обычно разво-
дится 1 часть к 4 частям буфера pH 6,8
• Гйстоло] ический D РХ для закл ючения препара-
тов и покровные стекла
• Термостат 60 °C
Горячая пластина при 75 °C
• Светло-польный и фазово-контрастный вер-
тикальный микроскоп для оценки полученных
препаратов и исследования хромосомной исчер-
ченности ири хромосомном анализе
Протокол
• Требование безопасности
а) Носите перчатки и лабораторные халаты. Все
манипуляции с образцами следует проводить
в стерильных условиях в микробиоло! ических
боксах II уровня биоло! ической безопасности
(см. разд. 7.8.2).
б) Отработанн ые среды и i ииотонический супер-
на гант ( но не фиксирующий раствор) следует
сливать в дезинфицирующий раствор, напри-
мер пшохлорит или Virkon. Фиксирующий
раствор следует сливать в раствор бикарбоната
натрия, чтобы нейтрализовать кислоту Через
два часа оба типа отходов могут быть слиты
в обычную канализацию вместе с большим
количеством проточной воды
в) Бромдеоксиуридин (BUdR) является силь-
ным мутагеном, его употребление не обяза-
тельно. Следует ознакомиться с местными
требованиями безопасности (например,
COSHH Control of Substances Hazardous to
Health) до начала работы с этим соедине-
нием. Растворы и супернатант, содержащие
значительное количество этого вещества,
должны сливаться в опечатывающийся сосуд,
содержащий вермикулит или иной абсорбент
с последующим сжш анием.
।) Протокол ы, вкл ю чаю щ и е исп ол ьзование
метанола и уксусной кислоты для фиксации
и приготовления препаратов, должны нахо-
диться в вытяжном шкафу.
Установление и мониторинг культур в пробирках
1. Предположительно 10— 15 м.< амниотической жид-
кости будет доставлено в лабораторию в пласти-
ковых стерильных универсальных контейнерах.
27.6. Культура амниоцитов
531
2. Используйте стерильные 20-мл шприцы, снаб-
женные стерильными пластиковыми и i ламп для
перемешивания (или 10-мл иииетки) для того,
чтобы разделить образец натри пробирки Лейто-
на. Промаркируйте пробирки идентификацион-
ными ярлыками, отражающими данные пациента
и тип культуры. Если образец небольшой (объем
менее 5 мл), установите только две культуры.
3. Центрифу! ируйте пробирки 5 мин при 150 g.
4. Перелейте супернатанты назад в исходный кон-
тейнер [для биохимических или иммуноло! ичес-
ких исследований, наиример для оценки уровня
ct-фето протеи на (AFP)J, или слейте в емкость с
дезинфицирующим раствором (Virkoii).
5. Ресусиендируйте клеточный осадок в 1 мл куль-
туральной среды в каждой пробирке Лейтона.
6. Инкубируйте при 37 "С
7. Оставьте культуры в покое на 5—7 дней, чтобы
клет ки осели и сформировали колонии
8. Оцените культуры. В .зависимости от степени
роста клеток, добавьте 0,5 мл свежей среды или
удалите старую среду и добавьте примерно 1 мл
свежей среды
9. Впоследствии оценивайте рост клеток ио необхо-
димости (каждые 2—4 дня), заменяя среду, пока
не будет достш нут удовлетворительный рост Д;!я
получения желаемой) продукта, обычно через
7—12 дней после инициации культур. Если воз-
можно, накануне сбора клеток поменяйте среду.
а) Быстрый рост клеток может* быть простиму-
лирован размножением колонии с использо-
ванием трипсина (см. Дисиер! ирование и суб-
культивирование ниже). Культуры, имеющие
избыточный рост, могут быть восстановлены
путем распределения ио нескольким дополни-
тельным пробиркам Лейтона или флаконам.
ec.ui требуется большое количество клеток.
б) Образцы амниотической жидкости,содержащие
кровь, мшут расти не так хорошо, как чистые.
Одним из методов работы с такими образцами
является отделение некоторой части амнио-
цитов от красных кровяных клеток с исполь-
зованием । радиентного центрифут ирования
(наиример, Нв>1орацие;см. протокол 12.10).
в) Оценка сильно окрашенных кровью образцов
на 6-7 день обычно невозможна без удале-
ния среды, содержащей кровь. Среда может
быть собрана в дополнительные пробирки,
которые затем мО|ут быть уничтожены,
если в исходных пробирках отмечается рост
клеток, либо moi ут инкубироваться, если это
необходимо
i) Дополнительные пробирки moivt быть ус-
тановлены при первой смене среды в любом
случае, ко|да уничтожение исходной суспен-
зии нежелательно.
1 Диспергирование и субкультивирование
10. Предварительно нагрейте примерно до 37 °C ио
1,5 мл стерильного раствора ТЕ на каждую про- |
бирку, которую предиола! ается обработать.
11. Удалите среду из культуральных пробирок, опо-
лосните один раз 1 мл стерильного раствора ТЕ
12. Для того чтобы диспергировать культуру:
а) Добавьте 0,2 мл ТЕ к культуре, инкубируйте
культуру ири 37 °C к течение 1 2 мин до от- I
деления клеток от стенок пробирок
б) Просмотрите клетки в инвертированный мик-
роскоп. Koi да клетки перейдут в суспензию, I
добавьте 1 мл культуральной среды и верните
пробирки в инкубатор (сыворотка в среде I
инактивирует раствор ТЕ).
13. Для субкультивирования:
а) Добавьте 0,5 мл ТЕ в культуру, инкубируйте ।
ее при 37 “С в течение 1-2 мин до отделения
клегок от стен пробирок.
б) Просмотрите культуру в инвертированный
микроскоп. Kim да клетки перейдут в суспен-
И1Ю, добавьте 1 —2 мл культуральной среды
и разделите суспензию между соответству-
ющим количеством пробирок для субкуль- ।
тивирования. Может быть засеяно от 2 до
8 пробирок, в зависимости от первоначальной
плотности клеток. Обычно имеет значение ва- ।
риабельность концентрации клеток в каждой |
субкультуре, что повышает шансы получить
хороший выход клеток при оптимальной кле- I
точной плотности.
в) Залейте каждую субкультуру свежей средой I
до конечного объема 1 мл и инкубируйте
14. Проверьте на следующий день состояние клеток,
если они осели, замените среду.
Стандартная процедура сбора клеток
из пробирок
Сбор клеток может быть проведен с первичной
культуры по стандартной методике, если имеется
резерв клеток. Если остается лишь одна культура,
то сначала следует провести субкультивирование
либо восстановить культуру после ochdbhoi о сбора
продукта.
15. Ко|да культуры готовы к процедуре сбора про-
дукта, добавьте в каждую культуру по 0,1 мл |
разведенного колиемида.
16. Инкубируйте культуры, пока не образуется до- I
статочное количество шпаренных митотически |
делящихся клеток. Обычно это занимает 2—3 ч, .
но может составлять полчаса для активных
культур или более 4 ч для медленнорастущих
культур.
17. Сбросьте среду в раствор Virkon, быстро осушите |
пробирки бумажным полотенцем.
18. Добавьте 2 мл ТЕ, инкубируйте культуры при
37 °C в течение 3 мин для отделения клеток <п
стенок пробирок.
S32
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
19 Кшда клетки перейдут в суспензию, добавьте
7 мл i миотонического раствора КС1, и оставьте
культуры при 37 °C в течение 5 мин.
20. Центрифу(мруите пробирки при 1501 в течение
21. Осторожно слейте супернатант в раствор Virkon.
Обсушите пробирки салфеткой.
С л ежа постукивая ио стенке пробирки, ресусиен-
дируйте клетки в небольшом количестве остав-
шейся жидкости
22. Медленно влейте свежеприготовленный фикси-
рующий раствор, фиксируйте клетки:
а) Постукивая ио стенке пробирки, добавьте пер-
вые 12 мл фиксирующего раствора капля за
каплей, постоянно встряхивая клетки, чтобы
избежать образования комков.
б) Добавить еще 3—4 мл фиксирующего раствора.
23. Центрифу(ируите пробирки при 150 g в течение
24. Удалите супернатант, сливая его в раствор бикар-
боната натрия.
25. Осторожно ресусиендируйте клеточный осадок,
добавьте 5 мл фиксирующего раствора.
26.3амените фиксирующий раствор, повторив
центрифугирование, сливание супернатанта и
добавление раствора (uiai и 9 11).
27 Вновь центрифу! ируйте клетки, слейте суперна-
тант, ресусиендируйте клеточный осадок в остат-
ках раствора и приготовьте препараты клеток (см.
ниже Приготовление препаратов).
Замечания
а) Суспензии фиксированных клеток могут хра-
ниться ири —20 °C на любой стадии фиксации.
Перед приготовлением препарата дважды
замените фиксирующий раствор.
б) Восстановление культуры после сбора клеток
может использоваться как альтернатива суб-
культивированмю. кшда остается только одна
культура. Этот метод требует применения
стерильного колцемида и стерильно! о ТЕ на
начальной стадии сбора клеток, которая сле-
дует «осле переноса клеток в отдельную цен-
трифужную пробирку мосле того, как клетки
отделились от стен пробирки, но до того, как
добавлен ишотонический раствор. В исход-
ную пробирку сможет быт ь добавлен свежая
питательная среда: затем на следующий день
среду следует поменять, чтобы удалить ос-
таточные количества трипсина и колцемида.
При этом клетки уже должны вновь осесть.
в) Если при выходе клеток уровень метафаз
неприемлемо низок, то альтернативной стра-
rei ней может быть следующая:
i) Субкультпвпруйте клетки во флаконе,
который закреплен иод небольшим у1лом
к горизонтальному положению, пока клет-
ки не осядут. Наклоняйте флакон таким
образом, чтобы ведущая граница роста
клеток, которые всшда растут с оптималь-
ной скоростью, проходила ио всей ширине
флакона.
п) Инкубируйте клетки с пониженной кон-
центрацией кольцемида в течение ночи.
1) Более длинные хромосомы для анализа при
более высоком разрешении мшут быть полу-
чены путем использования тимидиновой синх-
ронизации или экспонирования с колцемидом
в течение ночи. Тем не менее оба этих подхода
лучше работают на клетках, находящихся в
экспоненциальной фазе роста, что требует
тщательного наблюдения за культурой
Тимидин-синхронизированный сбор клеток
1. Угром того дня. кшда предполагается сбор кле-
ток, замените среду в культурах, используя тими-
дин-содержащую среду (конечная концентрация
0,15 mi мл).
2. В начале дня отмойте тимидин, используя пред-
варительно иодшретую среду. Слейте среду и
промойте клетки дважды. Добавьте 1 мл среды
без тимидина, что снимет тимидиновый блок.
Время снятия блока зависит от времени, кшда вы
предполагаете проводит ь < бор клеток культуры.
3. Инкубируйте культуру в течение 4 ч, затем до-
бавьте 0,1 мл раствора колцемида.
4. Инкубируйте культуру в течение еще 2 ч, затем
соберите клети ио обычной процедуре (начиная
с шага 2 Стандартная процедура сбора клеток из
пробирок, см. выше).
Сбор клеток после ночного инкубирования
с бромдиоксиуридином и кольцемидом.
1. Замените среду в культурах, в которых предпо-
лагается сбор клеток утром предыдущего дня.
2. В этот же день добавьте 0,1 мл раствора BUdR-
колцемид в каждый 1 мл культуральной среды
(конечная концентрация в культуре. BUdR,
25 mki / мл; колцемид, 0,04 mki* мл).
3. На следующее утро (примерно после 20 ч экс-
позиции) слейте BITdR-колцемид-годержащую
среду в опечатываемый контейнер, заполненный
вермикулитом. Добавьте в каждую культураль-
ную пробирку ио 2 мл предварительно нагретого
ТЕ, инкубируйте 3 мин до отделения клеток от
стенок.
4. Убедитесь, что клетки перешли в суспензию,
добавьте? мл шцотони ческою раствора 0.075 М
КС1. Инкубируйте 5 мин.
5. Центрифус ируйте культуру при 150 g в течение
6. Слейте гипотонический супернатант в контейнер
с вермикулитом.
7. Осторожно ресусиендируйте клеточный осадок,
медленно проведите фиксацию клеток и про-
должите сбор клеток, как это описано, начиная с
шага 6 (Стандартная процедура сбора клеток из
пробирок, см. выше).
27.6. Культура амниоцитов
533
Приготовление препаратов:
1. Используйте чистые стекла. Они мотут быть
куплены уже в обработанном виде, тем не менее
может оказаться полезным добавить 1 кайлю
свежею фиксируютцето раствора на каждое
стекло и протереть стекло бумажным полотенцем
непосредственно перед использованием. Если
есть возможность контроля влажности и темпе-
ратуры, храните чистые стекла при 20—25 °C и
относительной влажности 40—50%.
2. Поместите одну кайлю суспензии клеток, на каж-
дое стекло, капнув суспензию с высоты 1—Зсм,
оставьте препарат высохнуть ири комнатной
температуре.
3. Исследуйте качество распределения на фазово-
контрастном микроскопе, если распределение
клеток приемлемо, ирш отовьте остальные стек-
ла, рнулируя плотность клеток добавлением
новых капель фиксатора, если это необходимо.
4. В некоторых обстоятельствах требуется улуч-
шить распределение клеток. В этом случае могут
помочь Следующие меры.
а) Сначала подышите на стекло, а затем каините
кайлю суспензии клеток с высоты 1—3 см.
Оставьте препарат высыхать естественным
образом.
б) Поместите одну каплю суспензии на стекло,
не важно, подышав на него или нет. Оставьте
стекло на несколько секунд, а затем, прежде
чем суспензия клеток успела высохну, ь, каи-
ните кайлю свежего фиксатора поверх капли
суспензии.
в) Поместите одну кайлю суспензии на стекло, не
важно, подышав на него или нет. Оставьте стек-
ло на несколько секунд tt затем, как только на
высыхающей поверхности появится рябь или
обнаружатся кольца Ньютона, каините кайлю
свежего фиксатора. Оставьте высыхать.
t) Если качество распределения остается не-
удовлетворительным, поместите суспензию
клеток в фиксирующем растворе на морозиль-
ник и оставьте на ночь, переделяйте препарат
на следующий день.
Выявление G-дисков с помощью трипсина
1. Предварительная обработка препарата может быть
проведена до тринсинизацни, но в зависимости от
возраста препарата может быть несущественна
Для свежих препаратов хорошо работает предва-
рительная обработка перекисью водорода, кон-
центрированный раствор Х.и1кса хорошо работает
для старых препаратов. Подходящей емкостью
являются флаконы Коилэна (Coplin). Мечут быть
использованы также необработанные препараты.
2. Может бы гь использован любой из следующих
методов обработки.
а) Покройте свежий препарат (после одного часа
высыхания) 5%-й перекиси водорода от 26 с
до 2 мин
б) Инкубируйте свежие препараты в термостате
при 60 °C в течение нескольких часов или в
течение ночи. Нанесите на препарат 5х раствор |
Хэнкса на 5 мин.
в) На стекла, приготовленные день назад или |
ранее, нанесите на 60 с буфер pH-6,8
3. Промойте препараты буфером pH 6,8
4. Нанесите на препараты 0,14°п-й трипсин в физио-
ли ическом растворе от 3 с до 2 мин
5. Хорошо промойте препараты буфером pH 6,8.
6. Окрасьте препараты красителем Лейшмана све-
жеразведенным буфером pH 6,8 в отношении |
1:4 в течение 4 мин.
7. Промойте проточной водопроводной водой,
с тряхните остатки воды, аккуратно промокните.
8. Исследуйте нс черче нность хромосом в свет- I
ло-иольном микроскопе при увеличении 400х.
Если препараты недостаточно окрашены, го
краска может быть удалена буфером pH 6,8 или
метанолом и процедуру окрашивания можно пов-
торить. Если препараты перекрашены, начните
процедуру вновь на другом препарате, варьируя
время действия трипсина или изменив процедуру
предварительной обработки.
9 Положите препараты на t причую платформ}
(75 °C) на несколько минут, чтобы убедиться, |
что они полностью высохли, затем заключите их
в DPX иод покровное стекло.
Окрашивание хромосом рассматривается позже в I
этой 1лаве (см. протокол 27.9).
В. Культуральная система на открытых
покровных стеклах:
Схема ,
Культивируют клетки на покровном стекле, по-
мещенном в чашки Петри в инкубатор с 5% СО2 в
воздухе и влажностью 95%. I
Материалы
Материалы для данной процедуры в большинстве |
своем те же, что и дли системы культуры в закрытых
пробирках со следующими вариациями:
Стерильные:
• СредаХэмаМО с L-глютамином, пенициллином, ।
стрептомицином и FBS u Ultroser G.забуферен- I
ная бикарбонатом натрия как для культивирова-
ния в пробирках
• Пластиковые чашки Петри, 3,5 см, с вентилиру
емой крышкой
• Стеклянные иокровные стекла, 22 мм. стерили-
зованные сухим жаром
• Пинцеты
Нестерильные'
• Гипотонический раствор, 0,05 М КС1 в UPW |
S34
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
• Трипсин, 0,8% в физиоло! ическом растворе для
исследования исчерченности (0,4 мл трипсина
Difco, разведенного в 50 мл физиоло!ического
раствора)
Протокол
Подготовка клеточной культуры
1. Цен грифу! ируйте два образца в универсальных
контейнерах ири 150 g в течение 10 мин. Если
образец дос гавлен только в одном контейнере,
отлейте часть во второй контейнер до центрифу-
1 нрования, чтобы избежать риска утери образца
при разбивании контейнера во время центрифу-
1нрования
2. Поместите стерильные покровные стекла в две
чашки Петри, нанесите на дно и крышку чашек
маркировку, соответствующую образцу.
3. Удалите супернатант нрн помощи пинетки, оста-
вив примерно 1 мл жидкости поверх клеточного
4. Ресусиендируйте осадок, перенесите суспензию
в чашки Петри.
5. Добавьте Змл среды в каждую чашку, инкуби-
руйте культуры в термостате при 38 С с 5% СО,
в во.щухе и повышенной влажностью
6. Через 5—7 дней проверьте культуры на предмет
клеточного роста, используя инвертированный
микроскоп.
7. Частично замените среду, удалив примерно 2 мл
старой среды при помощи стерильной пастеров-
ской иииетки.
8. Исследуйте культуру и заменяйте среду два раза
в неделю.
Клетки готовы к сбору, koi да имеется достаточное
количество активно растущих колоний подхо-
дящего размера, обычно на 10—14-й дни после
инициации культуры.
Сбор клеток с покровных стекол in situ
9. Перенесите покровные стекла в новые чашки Пет
ри (предварительно промаркированные) запол-
ненные средой, за 24 часа до пред шишгаемого сбора
клеток. Исходные чашки следует сохранить как
резервный источник дополнительных клеток.
10 Добавьте 0,3 мл разведенного колцемида в чаш-
ки Петри до получения конечной концент)>ации
0,1 mki мл,инкубируйте чашки 2-3 ч.
11. Осторожно удалите среду при помощи пастеров-
ской иииетки, замените ее на шиотонический
раствор 0,05 М KCI (3 мл), предварительно по-
догретого до 37 °C. Инкубируйте 10 мин.
12. Выньте чашки Петри из инкубатора и поместите
их на подходящий поддон, пометив крышку под
чашкой.
13. Добавьте 6 капель фиксирующего раствора, осто-
рожно спуская ио стенке чашки Петри и позволяя
фиксирующей жидкости распространиться ио
тииотоническому раствору Оставьте чашку на
14. Добавьте еще 6 капель фиксирующего раствора
в чашку Петри. Оставьте чашку на 1 мин.
15. Удалите2 мл супернатанта из чашки Петри,заме-
ните его на 2 мл свежего фиксирующего раствора,
добавляя раствор осторожно но стенке чашки.
Оставьте чашку на 2 мин.
16. Удалите весь супернатант из чашки Петри и заме-
ните его на 3 мл свежего фиксирующего раствора,
добавляя раствор осторожно ио стенке чашки.
Оставьте чашку на 10 мин.
17. Удалите весь фиксирующий раствор, оставьте
покривные стекла высыхать на воздухе в чашке.
После удаления фиксирующего раствора иод дон
может быть поднят с одной стороны, чтобы про-
стимулировать стекание фиксирующего раствора
с иокровных стекол.
Выявление G-дисков с помощью трипсина
18. Оставьте для созревания иокровные стекла
(в чашке Петри для идентификации) в термостат
при 60 °C на ночь или на горячую платформу при
75 °C на 2 ч.
19. Нанесите 0.04% раствор трипсина в физиоло! и-
ческом растворе и непосредственно перед окра-
шиванием смешайте 1 часть красителя Л ейшмана
с 4 частями буфера pH 6,8.
20. Используя пинцет, поместите иокровные стекла в
раствор трипсина, мя> ко взбалтывая его в течение
нескольких секунд (точное время варьирует в
зависимости от возраста препарата)
21. Промойте покровные стекла буфером, верните их
в чашки Петри.
22. Залейте чашки Петри раствором красителя
Лейшмана на 2—4 мин (в зависимости от качества
красителя).
23. Ополосните покровные стекла буфером, поставь-
те их на ребро в чашках Петри на абсорбирующую
бумагу, оставьте до высыхания.
24. Стекла могут быть исследованы на предмет ка-
чества окрашивания до заключения в DPX.
25. Поместите покровное стекло на маркированное
предметное стекло, используя DPX.
27.7. КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК
ПОЙКИЛОТЕРМНЫХ ЖИВОТНЫХ
Метод культуры клеток холоднокровных животных
(иойкилотермных) похож на методы, используемые
для теплокровных животных, поскольку, главным
образом, эти методы исходно разрабатывались д;1я мле-
копитающих животных и птиц. Различия в техниках
первичной культуры заключаются в использовании
различных протеолитических ферментов, таких как
трипсин, ЭДТА и хелатирующих агентов. Эмбриональ-
ную бычью сыворотку хорошо заменяет гомоло! ичная
сыворотка или гемолимфа (которая более легкодоступ-
на), но модифицированная рецептура среды может
улучшить клеточный рост. Ряд таких сред доступен
27.7. Культуры клеток пойкилотермных животных
535
через коммерческие компании (см. Приложение II).
Процедуры, используемые для этих сред, во многом
похожи на разработанные для клеток млекопитающих.
Проверьте эти среды и сыворотки, которые в настоя-
щее время доступны, исследуя их влияние на рост,
эффективность иосева и специализированные функ-
ции (см. разд. 9.6, 10.5). Поскольку разработка сред
для mhoi их линии клеток беспозвоночных животных
проводилась для их эмбриональной стадии развития,
может оказаться необходимым разработать новые ре-
цепты для неизученного класса беспозвоночных или
изучаемого типа тканей. Большая часть накопленного
опыта до настоящего времени относится к насекомым
и моллюскам.
Два обзора [Vago, 1971, 1972; Maramorosch, 1976]
включают в себя некоторые из ранних разработок в
этой области и некоторые недавние разработки в био-
техноло! ии, которые были опубликованы Европейским
обществом технологов животных клеток [Jain el al.,
199 Г, Kliippinger el al., 1991; Speir el al., 1991 J. Последние
данные были связаны с применением бакуловирусных
векторов в клеточных линиях насекомых, которые
имеют ряд преимуществ в посттрансляционной моди-
фикации, обнаруженной на линиях млекопитающих и
без регуляторных проблем, существующих в биофарма-
цевтической отрасли, связанных с выделением клеток
млекопитающих животных и человека.
Культура клеток позвоночных, отличных от птиц
и млекопитающих, также ведется в соответствии с
культуральными процедурами, разработанными для
теплокровных млекопитающих и поэтому в целом нет
больших различий между технологиями культивиро-
вания. Поскольку это развивающаяся область, следует
пока учитывать определенные основные параметры,
чтобы воспроизводить оптимальные условия для роста
культуры, которые, возможно, потребуется устано-
вить: например, pH, осмоляльность, (которые moi у?
варьировать от вида к виду), питательные элементы,
концентрация минералов. Температура может быть
менее важна для жизни, но должна быть фиксирована
в определенном диапазоне температуры окружающей
среды и регулирована в пределах ±0,5 °C; перегревание
может привести к значительному повреждению.
27.7.1. Клетки рыб
Культура клеток рыб становится все более популяр-
ной в результате растущего коммерческого интереса
к рыбоводству. Протокол 27.6 для культур клеток
рыб полосатого данио приводится по Collodi [1998].
Эти рыбы имеют ряд благоприятных характеристик,
которые делают их популярным объектом для исследо-
ваний, представителем позвоночных, не относящимся
к млекопитающим, удобным для токсиколо! ических
исследований и изучения биологии развития [Powers,
1989; Driever et al ,1994]
Данио достигают половой зрелости примерно в 3 ме-
сяца, самки производят от 100 до 200 икринок каждую
неделю круглый год. Эмбриогенез заканчивается вне
тела матери в течение 3—4 дней и более, прозрачные
эмбрионы доступны для экспериментальных мани-
пуляций, включая мечение клеток и метод аблации
[Westerfield, 1993]. Методы in vitro, включающие
культуры эмбриональных клеток также разработаны
для изучения развития рыб. Установлены клеточные
линии и долгоживущие клеточные культуры, иници-
ированные из бластулы, 1аструлы и поздней стадии
эмбриогенеза [Collodietal., 1992, Ghosh & Collodi, 1994;
Sun el al., 1995a, I»; Peppelenbosch el al., 1995].
Линии клеток, полученные от эмбрионов ран-
ней стадии. Поскольку дифференцировка эмбрионов
полосатого данио происходит в течение гоструляции,
клетки эмбрионов более ранней стадии типа бластулы
являются плюрипотентными [Kane el al., 1992], и ме-
тоды были разработаны для культуры клеток этих эмб-
рионов ранней стадии развития. Линия клеток ZEM-2,
полученная из эмбрионов в середине стадии бластулы
эмбрионального развития, растет в культуре в течение
более чем 300 поколений в среде, содержащей низкие
концентрации FBS и сыворотки форели, инсулина.
эксграк1а эмбриона форели, и среды, кондициониро-
ванной клетками иечени крысы Буффало [Ghosh &
Collodi, 1994].
Линия клеток фибробластов, ZEF, также была полу-
чена из эмбрионов ранней стадии в среде с добавлением
FBS и FGF. Однажды установленная, линия поддержи-
валась в среде LDF (см. материалы в протоколе 27.6)
содержащей 10% FBS [Sun el al., 1995а]. Клетки линии
ZEF использовались как фидерный слой для первич-
ных культур эмбриональных клеток полосатого данио
[Sun el al., 1995а, Bradford et al., 1994а].
Первичные культуры, полученные от эмбрионов
ранней стадии. В дополнение к постоянно растущим
линиям эмбриональных клеток, которые являются
коммерчески доступными, были разработаны методы
получения первичных культур из ранних эмбрионов
данио [Sun et al., 199511, Bradford el al., 1994a, bj. Пер-
вичные культуры, полученные из ранних эмбрионов
стадии гаструлы, с поддержанием диплоидного набора
хромосом имеют морфоло! ические характеристики
плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток
(ES) при росте на фидерном слое фибробластов ZEF
в среде, содержащей FBS, сыворотку форели, экстракт
эмбриона рыб, инсулина, и фактор иш ибирующий лей-
кемию [Sun el al., 1995b; Bradford et al., 1994а].
Линии клеток, полученные из эмбрионов позд-
ней стадии. Поздняя стадия развития эмбрионов
данио (20—24 ч после оплодотворения) использует-
ся для получения трех линий фибробластов: ZF29,
ZF13 [Peppelenbosch et al., 1995], и ZF4 [Driever &
Rangini, 1993]. Линии были получены в среде L-15
Леибовитца (ZF29 и ZF13) или смеси F12 Хэма и
Игла - модифицированной среде Дюльбекко (ZF4)
с добавлением FBS.
S36
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
ПРОТОКОЛ 27.6. Культуры клеток эмбриона
полосатого данио
Материалы
Стерильные:
• Основная питательная среда LDF
• среда Лебовитца L-15.100 мл
• DMEM, 70 мл
• среда Хэма F-12,30 мл
• Селенит натрия 6 мкМ. 200 мкл
• Хранить в холодильнике при 4 °C.
• Первичная среда LDF: основная питательная
среда LDF. с добавками:
• FBS1%
• Сыворотка форели. 0,5%
• Экстракт эмбриона форели, 40 mki белка/мл
• И нсул ин, 10 mki /мл
• Фактор. ИН| ибирующий лейкемию (LIF), чело-
веческий рекомбинантный, 10 hi, мл
• рабочая среда LDF. основная среда LDF с до-
бавками.*
• FBS, 1%
• Сыворотка форели (Sea Grow. East Coast Bio-
logicals), 0,5%
• Экстракт эмбриона форели, 40 mki белка/мл
• И нсул ин, 10 mki /мл
• BRL-кондп цианированпая среда, 50%
• D-среда: DMEM F12/10FB:50 50 DMEM/среда
Хэма F12 с 10% FBS
• Экстракт эмбриона форели:
а) Соберите эмбрионов форели (Shasta Rainbow
или другого вида), 28 дней после оплодотво-
рения, выращенных при 10 °C; или полосатою
данио, три дня после оплодотворения, содер-
жавшихся при 28 °C, храните замороженными
при 80 °C.
б) Чтобы приготовить экстракт, разморозьте
эмбрионы (примерно 1501), гомо! енизируйте
в 10 мл LDF в течение 2 мин на льду, исполь-
зуя гомО| енизагор Tissuemizer homogenizer
(Tekniar).
в) Процедите гомогенат через несколько слоев
марли, чтобы удалить хорионы и затем цент-
рифу! ируйте гомогенат при 20 000 g в течение
30 мин при 4 °C.
1) П осле центрифут ирования соберите суперна-
тант. оставляя на поверхности ярко-оранже-
вый липидный слои.
д) Перенесите супернатант в новую пробирку,
центрифу! ируйте как в ша> е (в).
е) Соберите супернатант, оставляя следы липида,
и затем ультрацентрифу! ируйте при 100 000 g
в течение 60 мин ири 4 °C
ж) После ультрацентрифу! ирования соберите
супернатант, оставляя липидный слой. Разве-
дите супернатант в LDF (1.10) и стерилизуйте
фильтрацией.
з) Экстракт должен пройти через серию филь-
тров (1,2 мкм, 0,45 мкм и 0,2 мкм).
и) Храните экстракт замороженным при 80 °C
по 0,5-мл аликвотам.
к) При использовании экстракта для культуры
клеток определите концентрацию белка (см.
протокол 21.4) п затем разведите экстракт в
LDF до желательной рабочей концентрации.
л ) Храните разведенный экстракт в холодильни-
ке при 4 °C не более двух месяцев
* Среда LDF, кондиционированная ростом клеток
BRL
а) Вырастите культуру клеток BRL (АТСС)
при 37 °C в 75-см2флаконах в среде DMEM/
F12/10FB.
б) Ко1да культура станет конфлюэнтной, заме-
ните среду FD па LDF с добавлением 2% FBS,
инкубируйте клетки при 37 °C.
в) Через 5 дней удалите LDF, профильтруйте и
храните среду ири -20 °C.
1) Добавьт е свежую LDF к клеткам BRL, повтори-
те процесс через 5 дней. Кондиционированная
среда LDF может быть собрана трижды с одно-
го флакона, прежде чем клеточный монослой
разрушится и нужно будет вновь дшкидаться
формирования конфлюэнтного монослоя
• Буфер Хольтфретера:
NaCl, 701
КС1,1,01
NaHCO,, 4,01
СаС12.2.01
UPW, до 1000 мл
Хранить ири 4 °C. Рабочий раствор приготавли-
вается разведением 1:20 в UPW.
• Прона.» Е, 0,5 mi мл в буфере Хольтфретера
(Hollfreler)
• Трипсин, 1%. EDTA, 1 мМ, в D-PBSA
А. Фидерные слои фибробластов
Схема
Готовят фидерные слои фибробластов полосатого да-
нио со стадии 1аструяы (Sun el aL, 1995а] путем уда-
ления хориона в проназе, культивировании клеток в
среде с добавлением FGF и селекцией фибробластов
дифференциал ьной три исинизацией
Материалы для фидерных слоев
Стерильные или асептически приготовленные
• Эмбрионы, 8 ч после оплодотворения
Приказа
• Трипсин
• FBS
• Первичная среда LDF с 10 нг мл бычьего FGF
(смесь а+ Ь)
• Основная среда LDF с 10% FBS
Флаконы 25 см-
27.7. Культуры клеток пойкилотермных животных
537
Протокол
1- Соберите примерно 30 эмбрионов (восемь часов
после оплодотворения)
2. Удалите хорион обработкой в проказе [Sun etal.,
1995а].
3. Инкубируйте эмбрионы в трипсине (1 мин) с
осторожным иииетированием для диссоциации
клеток.
4. Добавьте FBS (конечная концентрация 10%)
чтобы остановить действие трипсина.
5. Соберите клетки в осадок путем центрифугиро-
вания (при 500 g в течение 10 мин).
6. Ресусиендируйте осадок клеток в 5 мл первичной
среды LDF, содержащей FGF перенесите клетки
в 25-см2 флакон.
7. Позвольте клеткам прилипнуть и вырасти до
конфлюэнтной стадии роста при 26 С.
8. Пересейте культуру в такую же среду.
9. После 2—3 пассажей в культуре будет представ-
лена смешанная популяция эпителиальных
клеток и фибробластов, поддерживайте клетки
на основной среде LDF с 10% FBS. Селекцию
фибробластов д,1я дальнейшей культуры прово-
дят дифференциальной трипсинизацией.
а) Обработайте культуру трипсином в течение
1 мин для удаления большинства фиброблас-
тов, оставьте эпителиальные клетки прилип-
нуть к пластику.
б) Перенесите фибробласты в другой флакон,
повторите процедуру, кшда культура станет
конфлюэнтной.
в) После двух-трех пассажей культура будет
состоять из гомо1енной популяции фибро-
бластов.
10. Приготовьте фидерный слои из фибробластов с
блокированным ростом.
а) Добавьте клегки вески ветствующий культура^-
ный флакон или чашку, иозва.ня гефибjxjujiaciам
сформировать конфлюэнтный монослой
б) Добавьте митомицин С, 10 мкг/мл к культуре,
инкубируйте культуру 3 ч ири 26 °C
в) Затем ополосните три раза LDF, культура
фибробластов с заблокированным ростом
может бы гь использована в качестве фидер-
ного слоя для культур эмбриональных клеток
полосатого данио.
В. Первичные культуры
Схема
Собирают эмбрионы, удаляют хорион, дезагрес иру-
ют эмбрионы в трипсине и выращивают первичные
культуры клеток эмбрионов данио со стадии блас-
тулы и ранней гаструлына фидерном слое эмбрио-
нальных фибробластов
Материалы для первичных культур:
Стерильные
• Первичная среда LDF
• Буфер Хольтфретера
• Разведенная хлорная известь, 0,1% в UPW
• Раствор нроназы Е
• Фидерные слои эмбриональных фибробластов
• Человеческий рекомбинантный фактор иншиб- |
рования лейкемии (LIF), 1 mki/мл
Протокол
1 Соберите эмбрионы на стадии средней бластулы I
или ранней i аструлы, промойте несколько раз |
чистой водой.
2. Перенесите эмбрионы в 6-см чашки Петри (50— I
100 эмбрионов /на чашку), переместите в лами- '
парный шкаф и далее работайте в асептических I
условиях.
3. Замочите эмбрионы на 2 мин разведенной хлор- I
ной известью и несколько раз промойт е в стериль-
ном буфере Хольтфретера
4. Удалите хорион инкубированием в 2 мл раствора I
нроназы Е в течение 10 мин, затем осторожным
помешиванием в чашке Петри отделите эмбрионы |
от частично расщепленного хориона.
5. Наклоните чашку, чтобы собрать эмбрионы на I
одной стороне, осторожно отберите 1,5 мл рас-
твора нроназы пастеровской пипеткой. Чтобы
предупредить прилипание эмбрионов к чашке,
удерживайте чашку в наклонном положении, так
чтобы эмбрионы оставались суспендированы в
остатках раствора нроназы.
6. Осторожно промойте эмбрионы добавлением I
2 мл буфера Хольтфретера и аккуратным пере-
мешиванием.
7. Наклоните чашку и удалите большую часть бу- ।
фера Хольтфретера, оставив эмбрионы примерно
в 0,5 мл. .
8. Повторите промывание еще два раза.
9. После окончательного промывания оставьте
эмбрионы суспендированными в 0,5 мл буфера
Хольтфретера, добавьте 2 мл раствора трипсина.
10. Инкубируйте эмбрионы в трипсине в течение
1 мин, диссоциируйте клетки осторожным иипе-
гированием (3—4 раза)/
11. Сразу после этого перенесите суспензию клеток
в стерильные ноли пропиленовые центрифужные
пробирки, добавьте в каждую пробирку 200 мкл
FBS чтобы остановить действие трипсина.
12. Соберите клетки центрифу! ированием (нри 500 g, ।
5 мин), ресусиендируйте осадок в первичной сре- I
де LDF (без FBS или сыворотки форели).
13. Посейте клетки при 1x10’кл./см2 на фидерный
слой эмбриональных фибробластов в многолу- |
ночных планшетах или флаконах.
14. Позвольте клеткам прикрепиться к фидерному
слою (~ 15 мин) затем добавьт е FBS и сыворотку
форели Добавление в среду человеческого реком-
бинантного LIF (10 ng, мл) обычно используется
чаще, чем BRL-кондиционированная среда [Sun
et al.. 1995а. bj.
S38
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
С. Клеточные линии
Материалы для клеточных линий
Стерильные или асептически приготовленные
• Клетки ZEM-2 (или анало! ичные)
• Среда LDF
Протокол
1. Растущие культуры, такие как ZEM-2, получен-
ные из эмбрионои данио ранней стадии, выращи-
вайте на среде LDF до -70% конфлюэнтности.
2. Инкубируйте культуры при 26 "С атмосфере
окружающей среды.
3. Меняйте среду примерно каждые 5 дней.
1. Субкультивируйте с трипсинизацией (см. прото-
кол 13.2).
Показано, что сыворотка форели и экс факт эмбрио-
на также стимулируют рост эмбриональных клеток рыб
друтих видок [Collodi & Barnes, 1990j.
27.7.2. Клетки насекомых
В течение некоторого времени имелся значительный
интерес к культуре клеток насекомых для изучений
контроля пестицидов и токсикологии окружающей
среды. Однако самое большое повышение интереса к
использованию культуры клеток насекомых последо-
вало за введением бакуловирусов для клонирования
гена [Midglev el al., 1998]. Бакуловирус хорошо раз-
множается в клетках S19, постоянной клеточной линии
полученной из осеннего «походного червяs> Spodoptera
fruprperda. Протокол 27.7, разработанный для культуры
клеток S19, является сокращенным вариантом метода
Midgley et al [1998]. В этом методе постоянный рост
клеток S19 поддерживается в перемешиваемой фляге
(см. протокол 13.3) или сосуде с плоским основанием
с мат нитным вкладышем. Перемешивание поддержи-
вается приблизительное частотой81) об. мин, при этом
мешалка не должна быть источником тепла. В идеале,
температура культивирования должна поддерживаться
27 °C, но возможно вырастить клетки без инкубатора в
ПРОТОКОЛ 27.7. Культуры клеток насекомых
Схема
Механически диспертировать клетки монослоя;
поддерживать культуру нри 27 "С.
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные.
- Клетки: Sf9 [Smith et aL. 1983] (ATCC #CRL-
1711) или линии, полученные из капустной пя-
деницы Tnchuplusia ni (Tn368, or BTI-TN-5B1-4;
также известная как «High Fives», Invitrogen)
• Среда: EX-CELL 400 (JRH Biosciences), содер-
жащая 2 мМ Е-тлютамина с добавлением 5%
FBS, 5 мл пенициллин .стрептомициновою
раствора (пенициллин, 50 U/мл; стрептомицин,
50 mki z мл). Хранить среду при 4 °C в темноте,
подогревайте до комнатной температуры перед
использованием. Клетки Sf9 очень чувствитель-
ны к изменениям ростовой среды, поэтому при
тюбых изменениях (наиример, ири использо-
вании бессывороточной среды EX-CELL 400),
адаптируйте клетки к новой среде постепенным
добавлением ее в течение нескольких дней.
• Диметилсульфоксид (DMSO), 10% в FBS
• Сурфактант Pkironic F68
Культуральные флаконы
Флаконы для перемешивания и Mat нитная ме-
шалка
• Инкубатор, 27 С (СО2 не требуется)
Протокол
Стандартное ведение культуры:
1. 0 гделите клетки от стенок флаконов с культурой
осторожным соскребанием или смыванием струей
среды, можно использовать клетки, выращенные
в суспензии в мешалочном флаконе.
2. Подсчитайте клетки на гемоцитометре, опреде-
лите жизнеспособность методом исключения
трипанового синего или нафталенового черно to
(см. протокол 22.1)
3. Посейте клетки в мешалочный флакон в кон-
центрации 0,5— 1х10ь жизнеспособных клеток/мл
(20-100 мл в 500-миллилитровый флакон).
4. Инкубируйте клетки при 20—28 -С (оптимальная
температура 27 °C.)
5. Разводите клетки до 0,5-1 хЮ’'кя./мл каждые
48 72 ч, или когда их концентрация будет дости-
1 ать примерно 4 5х 10*’ кл. ,мл.
6. Переносите клетки в чистый флакон каждые
3—4 недели.
7. Если клетки образуют сгустки, попробуйте по-
высить частоту перемешивания и добавьте сур-
фактант Pluronic F-68 (0,5-1.0%) д.»1я снижения
деформации клеток.
Замораживание клеток для хранения
(см. также протокол 20.1):
1. Подсчитайте клетки, центрифугируйте при
1000 об мин (-200 g) в течение 5 мин.
2. Ресусиендируйте осадок ири 1х107кл./мл 10%
DMSO в FBS.
3. Разлейте клетки по аликвотам, поместите в ам-
пулы, охлаждайте на льду в течение 1 ч.
4. Упакуйте пробирки в пенопластовый кон-
тейнер.
5. Медленно заморозьте пробирки (-1 °C мин) в
течение ночи до —70 "С
6. Перенесите пробирки в морозильную камеру с
жидким азотом.
27.8. Молекулярная гибридизация in situ
539
7. Для тою чтобы вое стан овить замороженные
клетки, быстро разморозьте ампулы ири .37 °C.
(Если клетки хранятся в жидкой фазе, осторож-
но размораживайте их в закрытом сосуде, чтобы
избежать риска повреждения при возможном
взрыве ампулы.)
8. Перенесите клетки в 25-см2 флакон, содержа-
щий 5 мл среды. Наклоните фчакон, чтобы клетки
растеклись равномерно
9. Удалите среду после 2—3 ч, ко<да большая часть
клеток прикрепится, добавьте 5 мл свежей среды.
10. Оставьте клетки на 2—3 дня для восстановления
до отделения их от стенок, затем перенесите в
флакон для перемешивания или большой плас-
тиковый флакон, как описано выше.
комнате с постоянной температурой между 20 и 28 °C.
Для этих сред не требуется СО2. Клетки могут расти в
стандартных пластмассовых флаконах для культуры
тканей, однако, поскольку клетки прикрепляются к по-
верхности флакона, для субкультивирования следует
отделять их от стенок, соскребая или смывая клетки
сильной струей среды. Однако этот метод приводит к
I ибели большого количества клеток, потому что клетки
сильно прикрепляются к пластмассе, когда растут в
присутствии сыворотки. Клетки должны иметь время
удвоения популяции < 24 ч.
27.8. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ
IN SITU
Гибридизация нуклеиновых кислот используется
обычно для обнаружения определенных нуклеотидных
последовательностей ДНК (Саузерн-блот) или РНК
(Нозерн-блот). Эта техника может рассматриваться
как прикладной цитолог ический метод работы с фик-
сированными клетками для определения нуклеочидной
последовательности m situ (см. цв. вкладку 13», г). Про-
токол 27.8 для шбридизаиии in situ был любезно предо-
ставлен W. Nicol Keith, Centre for Oncology and Applied
Pharmacology, University of Glasgow, Garsctibe Estate,
Switchback Rd., Glasgow G611BD, Scotland, UK.
27.8.1. Анализ экспрессии генов PHK
методом гибридизации in situ
Молекулярные методы могут быть разделены на две
группы: анализ лизата клеток и анализ in situ. В случае
применения методов анализа лизата (Саузерн-блот и
ПЦР) берется биопсия ткани, которая гомогенизиру-
ется, для разрушения пространственных отношений
между клетками ткани разрушаются [Murphy et al.,
1995]. Этот процесс ведет к потере информации о
гетерогенности клеток и маленьких субиоцуляциях,
ПРОТОКОЛ 27.8. Авторадиографическая
гибридизация in situ
Схема
Гцбрпдизовать радиоактивно меченые зонды с
фиксированними клетками на предметных стеклах.
Затем визуализовать участки г пбридизации методом I
микроавторадиографии
Материалы
Нестерильные: ।
• Мпкроцентрифужные пробирки (например, Ep-
pendorf)
• Микроцентрифуг а ( Eppendorf)
Линеаризация плазмидной ДНК:
• Набор для мечения РНК ( Amersham, RPN |
3100)
• Д11.Н илиирокарбокат (DEPC; Sigma)
• DEPC-вода: 1% DEPC в дис тиллированной воде |
(dH2O). автоклавированная
* Фенол-хлороформ-изоамиловый спирт, pH 8 |
(Sigma)
• Ацетат натрия (NaAc), .3 М, pH 8,0
• Абсолютный спирт, (ЧДА)
• Гликоген, 20 мг /мл (Roche)
• Аг ароза, 1 %, для электрофореза (Invitrogen)
Реактивы и растворы для мечения:
• Дпгиотреитол (DTT). 0,2 М (Sigma)
* DTT, 50 мМ: разлить ио аликвотам и хранить ।
при 20 °C
• [ ,5S] UTP (Amersham SJ 603)
• Колонки G50 Sephadex (Amersham Biosciences) .
• Буфер для колонок: 0,3 М NaAc, 1 мМ EDTA, 1% |
SDS, автоклавированный
• Фенол, pH 5.0 (Sigma)
• Хлороформ-изоамиловый спирт (Biogene)
• Сцинтилляционная жидкость: Ecoscinl A (Na-
tional Diagnostics) '
Реактивы и растворы для гибридизации
in situ:
• Histoclear (Fisher)
• NaCl- DEPC: 0,85uo NaCl, 1 % диэтцяиирокарбонат |
(DEPC), автоклавированный
• D-PBSA, 1% DEPC, автоклавированный
• EDTA. 0.5 M. растворить в 1% DEPC в dH2O; pH I
7,5, автоклавированный
• Буфер для протеиназы К: 1 М Tris НС1, 0,5 М |
EDTA, 1% DEPC pH 7,5, автоклавированный
* Основной раствор протеиназы К (Sigma):
20 мг/мл в DEPC Н,О; разделить на аликвоты |
п хранить при 20 °C
• Формалин
• Триэтаноламин, 0,1 М с 1% DEPC, автоклави-
рованный
• Уксуснокислый аншдрид (Sigma)
S40
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
• DTT, 1 М: разделить на аликвоты и хранить ири
-20 °C
• Смесь дли гибридизации, 60%.
Формамид (Fluka), 6 мл
Декстрансульфат, 50%, в 1% DEPC, 2 мл
SSC, 20х, 1 мл
Tris-HCl, 1 М, 100 мкл
Раствор Денхардта, 50х, 200 мкл
SDS. 10%. 100 мкл
iRNA (10 mi мл; Sigma), 400 мкл
DNA лосося (10 mi мл; Sigma). 200 мкл
Хранить при —20 °C разлитым ио аликвотам объ-
емом 400-мкл
Моющие растворы и реактивы:
• SSC, 20 (см. Приложение I. также Invitrogen);
развести до 5х SSC, 2х SSC и 0,1х SSC
• Формамид, 50% в 2х SSC
• р-меркаптоэтанол (Sigma)
• РНКазный буфер: 0.5 М NaCl, 0,5 М EDTA, 1 М
Tris, pH 7.5
• Маточный раствор РНКазы (Sigma): 10мг/мл
в DEPC, Н,О: хранить при -20 "С в 400-мкл
аликвотах
• Желатин: 0,2 г в 200 мл <1Н, О; растопить в СВЧ-
кечи 2 мин, охладить, профильтровать
Реактивы и растворы для авторадиографии:
См. протокол 27.3.
Протокол
Манипуляции с РНК
Все растворы, применяемые ири иод1 отовке зондов
и дру1 их манипуляциях вплоть до отмывки после
। ибридизаипи, должны быть свободны от РНКазы.
Растворы следует готовить с DEPC и автоклавиро-
вать в течение 20 мин цри 121 °C. Данная процедура
удаляет большую часть РНКаз, но в результате
повсеместной распространенности РНКаз она не
заменяет необходимость обработки растворов, стек-
ла и пипеток. Целесообразно иметь набор пинеток,
который используется только ajin работы с РНК, ре-
гулярная их обработка с DEPC-водой в течение ночи
или использование патентованных анти-РНКазных
средств, таких как RNase-Zap (Ainbion). также может
быть полезной. Все стекло должно быть завернуто
в алюминиевую фолы у и автоклавировано перед
использованием. Пластиковые пробирки Eppendorf
мшут быть обработаны DEPC водой или RNase-Zap
перед автоклавированием.
Подготовка зонда:
РНК-зонды (рибозонды)
Подютовка РНК-зондов требует использования
ДНК-матрицы с целевой последовательностью,
возможно получение смыслового и антисмыслово-
го РНК-зондов с включенными радиоактивными
нуклеотидами. Одноцеиочечная РНК-зонд является
идеальной, если требуется высокая чувсч вительность.
Обычно используются зонды длиной 200—1000 кар
нуклеотидов (ин), однако, возможно, оптимальной
является длина 150—200 ин, поскольку проницае-
мость тканей может быть сниженной при больших
размерах зонда. Для уменьшения размеров зонда при
необходимости может использоваться ограниченный
щелочной 1идролиз. Гибриды РНК-РНК или ДНК-
РНК более стабильны, чем их олигонуклеотиды
или ДНК- прототипы (counterparts), что делает их
наиболее популярными зондами.
Промышленно производимые зонды
и контрольные зонды
Коммерчески доступны промышленно производи-
мые ДНК-матрицы (Ainbion) к актину и GAPDH
мшут быть использованы для получения РНК-зон-
дов при их использовании в качестве положительных
контролей, поскольку они участвуют в контроле
геном и экспрессирую гея повсеместно. Смысловые
зонды обычно используются в качестве негативных
контролен, н .лучше использовать их как контроль,
чем «пропускать» пробы. Хорошо охарактеризо-
ванные образцы опухоли с определенным уровнем
экспрессии РНК мечут также использоваться как
положительный контроль при каждом пропускании
(run) препарата. Образцы опухоли разных тканей
также предлагаются разными производителями.
Линеаризация плазмидной ДНК:
1. Используйте 10—20 mki ДНКвмикроцентрифуж-
ной пробирке
2. Добавить 10 единиц рестрикционного фермента
на 1 mki ДНК, проведите ферментативное рас-
щепление в соответствие с инструкцией произ-
водителя фермента.
3. Оставьте реакцию протекать при 37 °C в течение
3 ч или ночи.
Фенол-хлороформная экстракция:
4. Добавьте 400 мкл фенол-хлороформ-изоамилп-
вого спирта (pH 8,0), перемешайте на вортекс-
мешалке.
5. Открутите смесь в течение 3 мин ири 13 000 об./
мин в микроцентрифуге ири комнатной темпе-
ратуре.
6. Соберите супернатант, перенесите в чистую про-
бирку, добавьте 10 мкл 3 М NaAc (pH 8).
7. Добавьте 250 мкл 100% этанола (хранить ири
-20 °C).
8. Добавьте 1 мкл 1ликогена, чтобы облшчить пре-
ципитацию ДНК.
9. Поместите пробирку в сухой лед на 1 ч.
10. Открутите 15 мин нри 13 000 об./мин
11. Удалите супернатант, сохранив осадок.
12. Добавьте к осадку 400 мкл 70% этанола (храня-
щегося ири —20 °C) для отмывания осадка
13. Открутите 10 мин цри 13 000 об./мин
27.8. Молекулярная гибридизация in situ
541
14. Удалите 70% этанол, высушить осадок на воздухе.
15. Ресусиендируйте осадок в 10—20 мкл DEPC/H,O.
в зависимости от количества используемого ДНК
(см. шаг 1), рассчитывая, что конечная концент-
рация должна составлять 1 mki ‘мл.
16. Прогоните 0,5 мкл суспензии на 1% ашрозним
Мечение РНК:
Эта часть процедуры включает в себя включение
радиоактивных нуклеотидов. Используйте набор
Amershain (RPN3100*. Amersham Biosciences) в со-
ответствии с инструкцией на вкладыше со ссылкой
на следующий метод:
1. В микроцентрифужную пробирку внесите*
а) Транскрипционный буфер 5х......4 мкл
6)DTT, 0,2М.. 1 мкл
в) HPR1..............................1 мкл
1) АТР, СТР и GTP..................0,5 мкл
д) Линеаризованную ДНК-матрицу
(1 мкг/мл).......................... 1 мкл
е) |HS]UTP.................... 9,5 мкл
ж) РНК-полимераза... 2 мкл
2. Смешайте компоненты, инкубируйте раствор
1.5 Ч при 37 °C.
ДНКазная экстракция ДНК-матрицы:
3. Добавьте 10 Ед фермента ДНКаза L.
4. Добавьте 1 мкл интибитора РНКазы.
5. Перемешайте раствор, инкубируйте 10 мин при
37 °C
Удаление невключенных нуклеотидов:
6. Уравновесьте колонку G50 Sephadex внесением
2 мл колоночного буфера.
7. Добавьте зонд в колонку.
8. Добавьте 400 мкл колоночного буфера, позвольт е
буферу протечь сквозь колонку.
9. Добавьте еще 400 мкл колоночного буфера, собе-
рите элюат в пробирку.
Фенол-хлороформная экстракция:
10. Добавьте 400 мкл фенола (pH 5,0) в пробирку,
перемешайте на вортекс-мешалке, центрифуш-
руйте 3 мин ири 13000 об./ мин.
11. Соберите супернатант, перенесите в новую
микроиробирку и добавьте 400 мкл хлороформ-
изоамилового спирта. Перемешайте, центрифу-
1 ируйте 3 мин ири 13000 об./мин.
12. Соберите суиернатанат и отберите 1 мкл для
подсчета включения метки.
13. Добавьте 2,5 объема 100% этанола (хранивше! ося
нри —20 °C) к оставшемуся супернатанту.
14. Добавьте 1 мкл гликогена дрожжей для ускорения
преципитации.
15. Поместите пробирку на сухой лед на 30 мин.
16. Центрифутируйте 15 мин при 13 000 об /мин.
17. Удалите спирт и оставьте осадок не поврежденным.
18. Отмойте осадок 70% этанолом, центрифу! ируйте |
10 мин при 13 000 об., мин, удалите этанол.
19. Подсушите осадок на воздухе, ресусиендируйте |
в 50 мМ DTT, подсчитав объем 50 мМ DTT еле- ।
дующим образом*.
а) Добавьте 1 мкл супернатанта, полученного
на шане 12 к 2-3 мл сцинтилляционной жид-
кости, определите число импульсов в минуту
(СРМ) на сцинтилляционном счетчике
б) Объем VOTT - (СРМх400) 6x10s
тде 400 объем после фенол-хлороформной
экстракции, 6х 10' — требуемое общее число |
импульсов в минуту в растворе DTT.
в) Так определяется объем 50 мМ DTT, в кото-
ром следует ресусиендировать пробу.
20. Отберите 1 мкл и снова подсчитайте СРМ чтобы I
подтвердить активность пробы.
Гибридизация in situ:
Подготовка образца:
Целью настоящего раздела процедуры является
сохранение структуры и морфоло! ни ткани и сохра- I
некие РНК-продуктов. Быстрая обработка образцов
ткани замораживанием или фиксацией к формалине
обеспечивает сохранение РНК. Поперечно свя-
зывающие фиксирующие жидкости, такие как 4%
параформальде! ид и 4% формальде! ид, являются
фиксаторами выбора для сохранения и /или доступ-
ности детекции клеточной РНК продолжите льность
фиксации будет зависеть от размеров образца. Более
длительная фиксация обеспечит лучшую сохранность
морфолш ии ткани, но может уменьшить доступность ।
для зонда. Парафиновый воск является средой выбо- I
ра для заливки обраща. Он позволяет делать срезы |
толщиной до 1 мкм и ле! ко удаляется перед i ибрид и- '
зацией. Поскольку срезы будут проводиться через ряд
растворив, рекомендуется использовать предметные
стекла с предварительной обработкой, удерживающей
препарат на стекле. Замороженные обращы должны
быть охлаждены до 70 °C, и после получения срезов
на криомикротоме они должны быть помещены на |
обработанное стекло и зафиксированы.
Подготовка тканей к гибридизации:
Эта стадия обработки ткани перед шбридизацией
требуется для улучшения доступа зонда к целевой
последовательности РНК и снижения неспенпфич-
ного фонового связывания. Образец подвер! ается
обработке протеазой для повышения доступности
целевой РНК для зонда, особенно если размеры зон-
да превышают 100 и н. Важно провести последующую
фиксацию в формальде! иде, чтобы предупредить
дезинте! рацию ткани. Несиецифическое связыва-
ние с аминогруппами снижается ацетилированием
под действием уксуснокислого ашидрида. В ходе
подготовки ткани большое внимание должно быть I
уделено защите образа от действия РНКаз. Вся |
Б42
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
стеклянная посуда должна быть обработана, чтобы
удалить какую бы то ни было контаминацию. Все
растворы должны быть обработаны DEPC, в ходе
процедуры оператор должен работать в перчатках.
Манипуляции со срезами тканей должны быть све-
дены до минимума.
Гибридизация:
Для некоторых пар зонд целевая последователь-
ность может быть критичной температура iибри-
дизации. Формамид в i ибридизационном буфере
как дестабилизатор цени снижает точку плавления
пбридов и обеспечивает снижение температуры
i ибридизации. Более низкая температура иомо|ает
сохранить тканевую структуру. В качестве оптималь-
ной выбрана температура 52 °C. Декстран сульфат в
। ибридизационном буфере повышает концентрацию
зонда за счет исключения объема растворителя и
таким образом уменьшает время ибридизации. Хотя
реакция iибридизации практически завершается
через 5—6 ч, удобнее оставить реакционную смесь на
ночь. Концентрация ионов натрия в буфере служит
для стабилизации i ибридов.
Постгибридизационная отмывка:
Главноп целью носи ибридизационном отмывки
является удаление несвязанных и несиецифнчес-
ки связанных зондов путем подбора температуры,
концентрации соли и концентрации формамида.
Использование РНКазы обеспечивает' расщепле-
ние одноцеиочечнои РНК, не связанной с целевой
последовательностью, но фермент не действует на
связанные комплексы РНК-РНК.
Предварительная обработка парафиновых
срезов:
1. Депарафинируйте срезы действием Histoclear.
Два раза но 10 мин.
2. Регидратируйте, проведя срезы по спиртам нис-
ходящей концентрации: 100%, 90%, 70%, 50% и
30%, но 10 секунд в каждом.
3. Промойте в 0,85% NaCl и растворе D-PBSA но
5 мин.
4. Обработайте срезы в Proteinase К 7,5 мин: 400 мкл
маточного раствора Proteinase К разведите в
200 мл протеиназного буфера.
5. Промойте в D-PBSA; 3 мин.
6. Обработайте в 4%, формалина или 4% нарафор-
мальде! нда.
7. Промойте в DEPC-воде в течение 1 мин.
8. Ацетилируйте в 200 мл 0,1 М триэтаноламина
с 500 мкл уксуснокислого ан i идрила в течение
10 мин, перемешивая в вытяжном шкафу.
9. Промойте ио 5 мни в D-PBSA и 0,85% NaCl.
10. Детдратируйте. проведя но спиртам восходящей
концентрации: ио 10 с в каждом. 30%, 50%, 70%,
90% и 100%
11. Высушите срезы.
Приготовление зондов и гибридизация:
12. На 20 парафиновых срезов соедините 16 мкл 1М
DTT, 344 мкл 60% Hybridtnix и 40 мкл зонда.
Быстр» перемешайте на вортекс-мешалке.
13. Денатурируйте зонд при 80 °C в течение 3 мин.
Охладите на льду
14. Применяйте 20 мкл смеси из шага 12 на каждый
срез, закройте стеклянным покровным стеклом.
15. Проведите шбридизацию раствора при 52 °C в
течение ночи в увлажнительной камере.
Постгибридизационая отмывка:
16. Предварительно подогрейте все рабочие растворы
до требуемой температуры.
17. Отмойте срезы в 200 мл 5х SSC с 250 мкл р-мер-
каптоэтанола в течение 30 мин при 50 °C.
18. Отмойте в 200 мл 50% формамида и 2х SSC с
1,4 мл Р-меркаитоэтанола в течение 20 мин при
65 °C.
19. Промойте дважды в 200 мл РНКазного буфера в
течение 10 мин каждый раз при 37 °C.
20.Отмойте в 200 мл РНКазного буфера с 400 мкл
раствора РНКазы А в течение 30 мин при
37 °C
21. Повторите mai 19, при каждой отмывке увеличив
время до 15 мин.
22. Повторите uiai 18.
23. Отмойте в 200 мл 5х SSC и затем в 200 мл 0,1х
SSC ио 15 мин каждая отмывка при 50 °C.
24. Де1 идратируйте в серии спиртов восходящей кон-
центрации: 50%, 70% и 100% ио 1 мин в каждом.
25 . Высушите на воздухе.
26. Погрузите стекла со срезами в раствор желатина
на 1 мин, затем высушите.
Д вторадиография:
См и. Получение ауторадиографов протоко,! 27.3.
особенно при биопсии опухоли, и представляет собой
результат усреднения изменений. Однако количест-
венно эти методы могут быть более простыми и более
точными, чем в подходах in situ. При сравнении этих
подходов методы in situ th ua P HK-i ибридизаци и in situ
позволяют производить выявить экспрессию гена в ин-
дивидуальных клетках в пределах их шстологического
контекста [Soder et al., 1997,1998; Keith, 2003J.
Принцип । ибридизации in situ основан на специфи-
ческом связывании меченого нуклеинового кислотного
основания с комплементарной последовательностью в
образце ткани, сопровождаемом визуализацией иссле-
дования. Этот процесс позволяет как обнаружить, так и
определить локализацию искомой последовательности.
Предпосылками для успеха этой процедуры является
наличие искомых нуклеиновых кислот в образце и
досягаемость этих последовательностей для исследова-
ния. Образцами, подходящими для in situ hybridization
(ISH), являются клетки культуры и ткани целого ор-
ана или биопсии.
27.8. Молекулярная гибридизация in situ
543
Анализ
1) Исследуют срезы, используя световую микроско-
пию в светло- и тем но-цельном освещении.
2) Отмечают различия при сравнении с положитель-
ным и отрицательным контролем.
27.8.2. Флюоресцентная гибридизация
in situ (FISH) при анализе генов
и хромосом
Протокол 27.9 для флюоресценции при |ибридиза-
ции in situ (FISH) предоставлен Nicol Keith, Centre
for Oncology and Applied Pharmacology, University of
Glasgow, Garscube Estate, Bearsden, Glasgow G61 1BD,
Scotland UK.
Флюоресценция при i ибридизации in situ наибо-
лее прямой путь для определения линейного порядка
генов в хромосомах. Использование хромосома и ген-
сиецифическцх зондов может также быть применено
для анализа количественных и структурных отклонений
в пределах индивидуальной клетки. Эти методы имеют
широкий ряд применений при диагностике |енетиче-
ских болезней и идентификации делеций, транслокаций
и амплификации гена в ходе развитие рака | Wiktor &
Van Dyke, 2004; Krupp et al., 2004; Camps et al., 2004].
ПРОТОКОЛ 27.9. FISH с использованием
однокопийных геномных зондов
и хромосомных красителей
Схема
Гибридизовать биотин или дигокси гении-меченые
зонды с денатурированными хромосомами и про-
вести детекцию зондов ио флюоресцентному окра-
шиванию с двойными антителами.
Материалы
Нестерильные:
• SSC, 2х (см. Приложение I для SSC, 20х)
• SSC, 1х
• D-PBSA
• Гликоген, 2l) mi мл (Boehringer Mannheim)
• Этанол (EtOH), 70%
• EtOH, 100%
• Фиксатор: метанол: уксусная кислота, 3:1
• РНКаза. 100 mki /мл в 2х SSC
• Параформальде! ид, 1%, в PBSA
• Формамид, 70%, в 2х SSC
• Буфер для i ибридизации: формамид (50%). дек-
странсульфат (5%) 2х SSC, ДНК молоки лосося
(500 mki , мл)
• Меченые зонды:
Большие космидные клоны более всего подходят
для зондов, применяемых для Определения одноко-
цийных генов. Тем не менее можно также использо-
вать кД НК-зонды. ДН К метят при помощи «ник» —
трансляции, с использованием коммерческих наборов
Roche (раньше Boehringer Mannheim), которая может
быть использована для внедрения бит ина или дигокси-
генина в соответсвии с инструкцией производителя.
Преципитация зонда, содержащего
повторяющиеся последовательности:
Большие космидные зонды часто содержат иовто-
ряющиеся последовательности, которые, не будучи
су пресс ированы до i ибридизации, приводят к но- |
вышению уровня неспецифической ибридизации.
Повторяющиеся последовательности мшут быть
суирессированы конкурентным взаимодействием с
немеченой СоИДНК человека, которая обтащена
повторяющимися последовательностями. Реакция с
Coll ДНК может быть включена в процедуру на ста-
дии преципитации (uiai (б) настоящего протокола).
а) Д..1Я 20-мКл реакции «ник-трансляции», до-
бавьте к зонду 1 мклО,5М EDTA, 2,5 мкл 4,0 М
LiCl, 1 мкл гликогена, от 100-до 1000-кратный
избыток человеческого Coll DNA( Invitrogen)
и 100 мкл этанола.
б) Поместите на сухой лед на 30 мин или при I
-20 °C на ночь для образования ирецииитата.
в) Осадит е намнкроцентрифуге в течение 15 мин
для образования осадка ДНК.
।) Отмойте осадок в 70% этаноле.
д) Осадите ДНК и высушить осадок.
е) Ресусиендируйте ДНК в iибридизационном |
буфере до концентрации 2—10 hi мкл.
Преципитация зондов, не содержащих
повторяющихся последовательностей:
Следуйте указанному протоколу, но не включайте в |
реакцию преципитации С oil ДНК.
Денатурация зонда:
а) Для зондов, содержащих повторяющиеся иос-
ледовательности, которые требуют подавле-
ния с использованием Coll ДНК, iioaoi рейте
реакционную смесь до 70 °C в течение 10 мин.
Поместите смесь в инкубатор на 37 °C на 1 ч |
до нанесения на стекло.
б) Для зондов, не содержащих повторяющихся I
последовательностей, подО| рейте смесь до
70 °C в течение 10 мин. Охладите реакцион- I
ную смесь на льду в течение 10 мин.
• Буфер ajih детекции зонда, TBST: 0.05% Tween I
20 в 0.1 М Tris, 0,15 М NaCl; pH 7,5
• Формамид, 50%, в lx SSC
• Антитела:
в) Первичные антитела, поликлональная сыво- '
ротка овцы к дигокснгенину или биотину, титр I
в соответствии с рекомендациями поставщика
(Roche).
г) Вторичные антитела, например, FITC -конъ ।
ки ированные антитела осла против IgG овцы
(Jackson Iminunoresearch Inc.)
S44
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
д) Разведите антитела в 3% BSA u TEST
• Резиновый латексный клей
• Смесь для заключения препарата: Vectashteld;
содержит uhi ибитор фотообесцвечивания (Vec-
tor Labs)
Протокол
Приготовление препарата хромосом
и денатурация:
1. Приготовьте клетки с блокированной метафазой
ко стандартной методике (см. протоколы 16.7,
27.5), каините фиксированные клетки на стекла.
Обозначьте область распространения капли ал-
мазным резцом.
2. Повторно фиксируйте клетки в течение 1 ч в све-
жеирш отовленном фиксаторе: метанол: уксусная
кислота. 3.1, высушите с текла на воздухе.
3. Прополощите стекла в 2х SSC в течение 2 мин
ири комнатной температуре.
4. Инкубируйте с 100 мкг/мл РНКазы в 2х SSC ири
37 °C в течение 1 ч.
5. Прополощите в D-PBSA.
6. Повторно фиксируйте в свежеприготовленном
1% растворе иараформальдешда в D-PBSA в
течение 10 мин ири комнатной температуре (эта
стадия необязательна).
7. Промойте в D-PBSA.
8. Дет идратируйте в течение 2 мин в большом объ-
еме 70% этанола и затем 100% этанола. Подсуши-
те стекла на воздухе
9. Денатурируйте хромосомы в 70% растворе фор-
мамида в 2х SSC ири 70 “С в течение 2—4 мин
(определите оптимальную продолжительность
экспериментально, начав с 2 мин). Убедитесь,
что 70%-й формамид подотрет до 70 °C перед
использованием.
10. Отмойте стекла в нескольких сменах 70%-го эта-
нола на льду.
11. Дет идратируйте в соответствии с шагом 8, высу-
шите <тек.>а
12. Хромосомы готовы к тибридизации.
Гибридизация:
13. Нанесите 10 мкл денатурированного зонда по-
верх зоны распространения препарата хромосом,
накройте покровным стеклом 22x22 мм.
14. Опечатайте иокровные стекла по краям резино-
вым латексным клеем
15. Поместите стекла в коробку с влажной атмосфе-
рой при 37 °C на ночь.
Детекция зонда:
16. Удалите покровные стекла, погрузив в 2х SSC
(при комнатной температуре) и сорвав латекс.
Поместите стекла в сосуд Коплена (Coplin jar).
17 Погрузите стекла, два раза ио 10 мин, в 50% рас-
твор формамида в lx SSC, ири 42 °C.
18. Промойте стекла, два раза ио 10 мин, в 2х SSC
при 42°С.
19. Прополощите в TEST.
20. Блокируйте несиецифическое связывание инку-
бированием стекол в 3% растворе BSA в TBST в
течение 30—60 мин при 37 °C.
21. Добавьте первичные антитела. Используйте
100 мкл первичных антител на одно стекло, за-
тем закройте каждое стекло покровным стеклом
Parafilm.
22. Инкубируйте стекла ири 37 °C в течение 1 ч.
23. Промойте стекла в 500 мл TBST в течение
10 мин ири комнатной температуре.
24. Добавьтеь на стекла вторичные антитела, конъ-
ю< проданные с флюорохромом, в 3% BSA TBST,
в разведении, рекомендованном производителем
или экспериментально определенном.
Замечание. Убедитесь что вы используете правиль-
ную комбинацию антител, наиример поликлональ-
ную сыворотку овцы к дигоксигонину в качестве
первичных антител с последующим действием FITC-
конъкп ированных антител осла против IgG овцы
25. Инкубируйте 30 мин ири 37 °C
26. Промывайте 30 мин в 500 мл TBST ири комнат-
ной температуре.
27. Проведите контрастирующее окрашивание
0,8 мкч мл DAPI и /или 0,4 mki/мл йодистого
проиидия в TBST в течение 10 мин. Закройте
покровным стеклом с использованием заключа-
ющего состава препятствующего выцветанию.
28. Исследуйте стекла при помощи флюоресцентной
микроскопии ири помощи соответствующей ком-
бинации фильтров.
Нуклеиново-кислотные основания метят неи-
зотоиными метками, путем введения нуклеотидов,
модифицированных такими молекулами, как биотин
или дигоксиц?н11н. После гибридизации меченых
зондов с хромосомами производится детекция по-
следовательностей, которая достигается формирова-
нием комплексов с антителами, которые распознают
биотин или дигоксигенин в образце. Гибридизация
визуализируется с использованием антител, конъюги-
рованных с флюорохромами. Флюоресцентный сш нал
может быть обнаружен разными путями. Если сш нал
достаточно силен, может использоваться стандартная
флюоресцентная микроскопия. Однако анализ данных
и их хранение могут быть значительно улучшены при
помощи систем цифрового отображение типа кон-
фокального лазера, сканирующего микроскопа или
охлаждаемой камеры CCD. Главным преимуществом
флюоресцентной i ибридизации insilu (FISH) является
отсутствие радиоактивности, быстрота исследования,
возможность хранения данных и манипуляций с ними
и высокая чувствительность. FISH также показывает
27.9. Слияние соматических клеток
545
точную локализацию chi нала, позволяет од непремен-
но проводить анализ двух или больше флюорохромов
и обеспечивает количественное и пространственное
распределение сш нала.
Вариации
Хромосомное окрашивание. Красители для окраши-
вания хромосом коммерчески доступны из множества
источников, включая Invitrogen, Cambio, и Опсог
Поэтому больше нет необходимости i отопить ваши
собственные красители. Протоколы для < ибридизации
и детекции изменяются в каждом случае, однако в це-
лом перед । ибридизацией может использоваться раздел
приведенною протокола: а) Подютовка хромосомы
и денатурация. Гибридизация и детекция мшут быть
выполнены согласно инструкциям поставщика. Если
краситель помечен биотином, как в случае красителей
Cambio paint, может применяться раздел (6) (Детекция
зонда) при использовании соответствующих комбина-
ций антител.
Недавние усовершенствования. Классический кари-
отипический анализ производится методом исследова-
ния исчерченности хромосомы, с использованием их
дифференциального окрашивания (см. протокол 27.5)
Таким образом, каждая хромосома может быть иденти-
фицирована по определенному образцу исчерченности.
Однако традиционные методы не мО|ут охаракте-
ризовать mhoi не сложные хромосомные аберрации.
Недавно были разработаны новые методы кариоти-
пирования, основанные на окрашивании хромосом,
а именно спектральное кариотииирование (SKY) и
мульти цветная флюоресценция при i ибридизации
in situ (MFISH). Эти методы позволяют проводить
одновременную визуализацию всех 24 человеческих
хромосом с окрашиванием в различные цвета. Кроме
тел о, визуализация результирующих образцов флюо-
ресценции в соответствии с upoi раммами компьютера
делает эти методы более чувствительными, чем поз-
воляет человеческий |лаз. Эти методы чрезвычайно
успешно применяются ири идентификация новых
хромосомных изменении, которые ранее не мотли быть
обнаружены традиционными подходами [Wienberg &
Stanyon, 1997; Ried et al., 1997; Macville et al., 1997;
Nordgren, 2003; Lim et al., 2004]
27.9. СЛИЯНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Соматические клетки сливают культивированием
вирусом Сендай или полиэтилен!ликолем (ПЭГ)
(Pontecorvo, 1975]. Часть слившихся клеток доходят
до слияния ядер, некоторая доля этих клеток проходит
через митоз, так что оба набора хромосом копируются
вместе и формируется i ибрид. В некоторый межвидо-
вых । ибридах наиример «человек—мышь», один набор
хромосом (человеческий) постепенно был утрачен
[Weiss & Green, 1967]. Таким образом, возможна
генетическая рекомбинация in vitro, и, в некоторых
случаях, возможна также cei pei ация. Поскольку про-
порция жизнеспособных i ибридов низка, требуются
селективные среды, чтобы поддержать выживание
гибридов за счет родительских клеток. Используют-
ся мутанты ТК и HGPRT (см. разд. 27.9.1) из двух
родительских типов клегок, селекция проводится на
среде HAT (ппюксантин, аминоптерин, тимидин)
(рис. 27.3) [Littlefield, 1964а]. Остаются в живых толь-
ко клетки, сформированные слиянием двух различных
родительских клеток (гетерокарионы), потому что
родительские клетки и продукты слияния одинаковых
родительских клеток (i омокар ионы) дефектны по
тимидинкиназе или i ииоксантин|уанинфосфорибо-
зилтрансферазе. Родительские клетки и i омокарионы
не могут, следовательно, использовать тимидин uju
ппюксантин из среды. Поскольку аминоптерин бло-
кирует эндо|енный синтез пуринов и пиримидинов,
они не способны к синтезу ДНК. Протокол 27.10
для слияния соматических клеток предоставлен Ivor
Hickey, Science Department, St. Mary's University Col
lege, Belfast, Northern Ireland, UK. Хотя во mhoi их ли-
ниях клеток происходит спонтанное слияние, частота
таких случаев очень низка. Для получения i пбрндов в
существенном количестве клетки обрабатывают хими-
ческим стимулятором слияния полиэтилен! лнколем
(ПЭГ) [Pontecorvo, 1975]. В этом случае чтобы вы де
лить клоны । ибридных клеток, используются системы
селекции, которые убивают родительские клетки, но
не убивают i ибриды.
ПРОТОКОЛ 27.10. Гибридизация клеток
Схема
Для слияния клеток обеспечивают их плотный
контакт в суспензии или монослое. Обрабатывают
клетки кратковременным воздействием PEG для
минимизации । ибели клеток. Обычно клеткам дают
время 24 ч для восстановления иеред селекцией для
получения । ибридов
Материалы
Стерильные:
• PEG 1000 (Merck);
а) Автоклавируйте PEG до перехода в жидкое
состояние и стерилизуйте его
б) Охладите до 37 °C, затем иебремешайте с
равным объемом бессывороточной среды,
предварительно иодо! ретой до 37 °C
в) Доведите pH примерно до 7.6 7,9, используя |
1,0 М NaOH.
() Храните раствор ири 4 °C не более 2 недель.
• Полная ростовая среда
• Бессывороточная ростовая среда
• NaOH, 1,0 М
• Чашки Петри, 5 см
• У ниверсальные контейнеры
S46
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
РОДИТЕЛЬСКИЕ
КЛЕТКИ
СЛИЯНИЕ
КЛЕТКИ,
ОБРАЗОВАННЫЕ
В РЕЗУЛЬТАТЕ
СЛИЯНИЯ
СЕЛЕКЦИЯ В
СРЕДЕ HAT
ВЫЖИВШИЕ
КЛЕТКИ
Устойчивость
KBUdR
Устойчивость к
В-азагуанин
Рис. 27.3. Гибридизация соматических клеток. Селекция гибридных клеток пос че слияния (см. текст)
Протокол
А. Слияние клеток монослойной культуры:
1. Внесите равное количество двух типов клеток,
которые будут Сл пт ы, в 5-см чашку для культуры
тканей. Обычно бывает достаточно использовать
2,5 Х10’ -2,5 X10е клеток каждой из родительских
линий на одну 4auii<v
2. Инкубируйте смешанную культуру в течение ночи.
3. Подогрейте раствор PEG до 37 °C. Возможно, при
.лом потребуется вновь довести pH примерно до
7,6-7,9. используя 1,0 М NaOH.
4. Тщательно удалите среду из культур и однократ-
но промойте бессывороточной средой.
5. Добавьте 3.0 мл раствора PEG и равномерно
распределите его поверх монослоя клеток.
6. Удалите раствор PEG точно через 1 мин, промой-
те монослой три раза в 10 мл бессывороточной
среды до возвращения клеток к полной среде.
7. Растите клетки в течение ночи.
8. Добавить селективную среду.
В. Слияние клеток суспензионных культур:
9 Центрифу! ируйте смесь клеток родительских л ц-
ний: но 4х 10'' клеток каждой из клеточных линий
при 150 g в течение 5 мин при комнатной темпера-
туре. Проводите центрифу! ирование и последую-
щее слияние в 30-мл пластиковых универсальных
контейнерах или центрифужных и|хюирках.
10. Ресусиендируйте осадок в 15 мл бессывороточной
среды, повторно центрифу! ируйте.
11. Отберите среду
12. Ресусиендируйте клетки в 1 мл раствора PEG
осторожным п ипетированием.
13. Через 1 мин разведите суспензию добавлением
9 мл бессывороточной среды и перенесите сус-
пензию в равных количествах в два универсальны
контейнера или центрифужные пробирки, содер-
жащие 15 мл бессывороточной среды.
14. Центрифу! upviiTe суспензию при 150 g в течение
5 мин. Удалите супернатант и ресусиендируйте
клетки в полной среде
15. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 "С
16. Клонируйте клетки в селективной среде.
Вариации. В литературе встречается описание
большого количества разновидностей методов слияния
с использованием ПЭГ Хотя процедура, описанная
выше, работает хорошо для клеток мыши, хомяка и
человеческих клеток при межвидовых и внутривидовых
27.10. Продукция моноклональных антител
547
слияниях, но вряд ли она будет оптимальна для всех
клеточных линий. Включение 10% DMSO в раствор
ПЭГ имеет преимущество в снижении вязкости, ио
некоторым данным, улучшает слияние [Norwood et al.,
1976]. Также, молекулярный вес используемого ПЭГ
должен быть не более 1000 Да. ПЭГ с молекулярным
весом от 400 до 6000 Да успешно применялся для по-
лучения гибридов.
Отбор клонов гибридов. Метод отбора, исполь-
зованный в любом специфическом случае, зависит от
исходного видового происхождения двух роди тел ьских
клеточных линий, ростовых свойств клеточных линий,
наличия выбираемых генетических маркеров на обеих
клеточных линиях. Наиболее часто отбираемые в сис-
теме НАТ1 ибриды*. 10 1М гипоксантина, 6x10"' М ами-
ноитеринаи 1,6x10"'’ М тимидина [Littlefield, 1964а]. Эта
система может использоваться для выделения i ибрид-
ных клеток, полученных слиянием пар клеток мутант-
ных линии, дефицитных по ферментам тимидинкиназе
(ТК ) и । иноксантингуанозинфосфорибозилтрансфера-
зе (HGPRT ), соответственно. ТК"-клетки выделяются
экспозицией с BUdR, а HGPRT^-клетки экспозицией с
тиогуанином после процедур, описанных Biedler вгл. 14
(см. протокол 14.9). Когда только одна родительская
клеточная линия несет такую мутацию, тогда селекция
на НАТ еще может применяться, если другая линия
клеток не растет или растет плохо в культуре (например,
лимфоциты, стареющие первичные культуры).
Дифференциальная чувствительность к сердечному
гликозиду строфантину является важным фактором в
выборе г ибридов клеток грызунов и клетками множества
друг их видов, включая человеческие. Клетки грызунов
резистентны к концентрациям этого антиметаболита
до 2,0 мМ, а человеческие клетки ши ибают нри 10 мкМ
строфантина. Гибриды намного более резистентны к
строфантину, чем человеческие родительские клетки.
Если HGPRT-дефицитная линия клеток грызуна сли-
вается с немаркированными человеческими клетками,
то г ибриды могут быть выделены в среде, содержащей
НАТ и низкие концентрации строфантина.
Хотя существует мног о с<юбщений о друг их систе-
мах селекции, широко использовались немног ие. Мо-
гут успешно использоваться экзог енные доминантные
маркеры типа резистентности к G418. Следует под-
черкнуть, что какой бы метод ни использовался, чтобы
изолировать клоны предполагаемых i ибридов, должно
быть получено подтверждение гибридной природы
клеток. Для этого используется стандартно проведен-
ный цитогенетический анализ (см. иротокол 16.7) ням
молекулярные методы. В некоторых случаях сравнение
числа гибридов с частотой ревертантов может быть
единственным путем этого подтверждения.
27.9.1. Ядерный перенос
Генетические рекомбинантные эксперименты могут
также быть выполнены с изолированными ядрами, но
Исследуйте клоны.
распространив положительные ;
клоны, испытайте на продукцию/
антител и специфичность,
заморозьте клонированные
Рис. 27.4. Производство гибридом Схематическая диа-
грамма получения клонов |пбрядом. способных к секреции
моноклональных антител
главный интерес в этой технике связан с клонировани-
ем индивидуальных животных [Kono, 1997; Wolfel al.,
1998]. Фраг менты клеток, содержащие ядро и неболь-
шой объем цитоплазмы, мо< ут быть получены центри-
фугированием клеток после обработки цитохалазином
В. Затем производится слияние извлеченных ядер с
рециииентными целыми клетками или безядерными
цитоцластами в присутствии ПЭГ (рис. 27.4). Однако в
экспериментах но клонированию животных, чтобы уда-
лить ядро, используются методы микроманипуляции,
затем ядро одной клетки вводят в оплодотворенную
яйцеклетку первой стадии имплантации, из которой
было удалено существующее ядро.
27.10. ПРОДУКЦИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ
АНТИТЕЛ
Моноклональные антитела стали обязательным инстру-
ментом в исследованиях, диагностике и терапии. С тех
иор как Kohler и Milstem создали в 19751. t ибридомную
технолог ию, во многих различных приложениях метода
моноклональные антитела заменили поликлональные
антитела. Следующее введение и иротокол 27.11 были
предоставлены Janice Payne and Tina Kuus-Reichel из
S48
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
Hybrilech Incorporated, дочерней компании Beckman
Coulter Inc., 7330 Carroll Road, San Diego, CA 92121.
Гибридомы получают слиянием нескретирующих
миеломных клеток с антитела-продуцирующим и
В-лимфоцитами в присутствии ПЭГ (рис. 27.4).
Миеломная клетка дефицитна по HGPRT или ТК,
которые необходимы для синтеза ДНК. поэтому она
не может выжить на селективном среде, содержащей
шиоксантин, аминоптерин и тимидин. В-лимфоциты
селезенки, не слившиеся с миеломной клеткой, не мо-
гут жить в культуре больше нескольких дней. Любая
шбридная клетка В-лимфоцит/мнеломная клетка
должна содержать генетическую информацию из обеих
родительских клеток и, таким образом, быть способной
выжить на селективной среде HAT. Такие клетки могут
быть культивированы неопределенно долго и способны
продуцировать неограниченное количество антител.
Супернатант выживших гибридом исследуется на на-
личие антител методом ELISA. Те i ибридомы, которые
выбраны, затем субклонируются, чтобы удостоверить-
ся, что они продуцируют антитела, специфичные для
отдельного эпитопа. Продукция антител может быть
пропорционально повышена in vivo в виде асцитной
опухоли мышей или in vitro в качестве суспензионной
культуры. Гибридомы также хорошо растут в полых
волокнах и культуральных системах ферментации.
ПРОТОКОЛ 27.11. Продукция
моноклональных антител
Схема
Используя полил шленгликоль (PEG), проводят сли-
яние клеток селезенки иммунизированных мышей
с клетками миеломы (Р3.653). Выделяют колонии
1 ибридов (гибридомы) в среде HAT. Исследуют су-
пернатанты методом ELISA через 10—14 дней после
слияния (ELISA скрининг, Протокол должен быть
разработан до слияния клеток), наращивают, замо-
раживают и субклон ируют желаемые i ибридомы для
достижен ия м< 1ноклональности.
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные.
• Мыши (Ball) с или A J), 6—10 недель
• Миелома Р3.653: эта линия миеломных клеток
АТСС не секретирует hmmvhoi лобулин и хорошо
участвует в слиянии.
• Антиген (оптимальное количество 125 мкг на
мышь, маленькие молекулы могут быть для по-
вышения антигенных свойств конъют ированы с
гемоцианином (keyhole limpet hemocyanin, KLH,
Sigma)
• Адъюванты (квасцы или адьюван г Фрейнда; пол-
ный или неполный, Sigma): подробное описание
этих и дру । их адъювантов можно найти в Vogel &
Powell 11995)
Буфер TCD (T-cell depletion): сбалансированный
солевой раствор Хэнкса + 10 мМ HEPES + 0,3%
BSA
• NH,C1, 0,16 М
• Антитела Anlimouse Thy 1.2 (Accurate). Для
использования разведите в буфере TCD в отно-
шении 1:500, стерилизуйте фильтрацией.
• Комплемент кролика, Lovv Тох М (Accurate).
Растворите в 1 мл холодной UPW разведите в
буфере TCD 1:12, стерилизуйте фильтрацией.
• D-PBSA
SFM (бессывороточная среда). МЕМ, которая
хранилась при комнатной темпера гуре с неплотно
закрученной крышкой, так чтобы moi выходить
СО2; pH должна быть щелочной.
PEG (полиэтилен! л иколь): растопить 10,5 мл
PEG 1450 (Sigma) в водяной бане 56 °C;
добавить 19,5 мл теплой стерильной МЕМ (pH
8,3—8,7), хорошо перемешать; оставить раствор до
достижения равновесною состояния с неплотно
закрученной крышкой на 5—7 до слияния
• Маточный раствор HAT (100х) (10 мМ пшоксан-
тина, 40 мкМ аминоптерина, 1,6 мМ тимидина).
1,361 (ипоксантина, 729 мкл амнно|1терина, (из
концентрированного раствора, концентрация
25 mi мл), 0,387 г тимидина, 0,022 i iлицина,
разведенною в 4 мл 5 М NaOH + 26 мл UPW.
Доведите до 1 л добавлением UPW. Стерилиза-
ция фильтрацией
• Среда HAT: к основной среде, такой как МЕМ
или RPMI, + 10% FBS + 20% среды кондициони-
рованной клетками селезенки, добавляют маточ-
ный раствор HAT (конечной разведение 1:100)
* SCM (среда, кондиционированная клетками
селезенки): Препарируйте при помощи иглы
3—5 селезенок интактных (наивных) мышей в
D-PBSA. Подсчитайте клетки, ресусиендируйте
в МЕМ-i- 10% лошадиной сыворотки до кон-
центрации 1x10^ кл. мл. Перенесите суспензию
во флакон для перемешивания объемом 500-мл,
инкубируйте при 37 °C в 5% СО, в течение 48 ч.
Удалите клетки центрифугированием, храните
супернатант замороженным.
• 8-А.1а1уанин, маточный раствор, 10 мМ (100.).
1.52 1 8-аза1уанина, разведенного в 4 мл 5 М
NaOH + 21 мл UPW. Доведите объем до 1 л до-
бавлением UPW. Стерилизуйте фильтрацией.
М ЕМ. 10% фетальной сыворотки теленка. 0.1 м М
8-аза1уаннна (для поддержания клеток миеломы
Р3.653).
• НТ маточный раствор (100х). 0,40811 ипоксанти-
на, 0,1161 1 тимидина, 0,0067 11лицина, развести
в 2 мл 5 М NaOH + 8 мл UPW. Довести объем
до 300 мл добавлением UPW. Стерилизуйте
фильтрацией.
• НТ среда: НТ маточный раствор развести ЮОх в
основной среде (как для среды HAT, см. выше)
Шприцы, 1 мл, И1лы 25G
27.10. Продукция моноклональных антител
549
Шприцы, 1 мл, иглы 23 G, х 2
Инструменты для препарирования (ножницы и
пинцеты)
Чашки Петри, 60x15 мм
Центрифужные пробирки, 15 мл и 50 мл
Многолуночные планшеты, 24 и 96 лунки
Культурал ьные флаконы
100-мл бутыли Nalgene
Наконечники для пипеток
Резервуары для автомат ических многоканальных
иипеток (100 мл. Matrix Technologies; Corning
Costar)
Нестерильные:
• Трипановый синий (Sigma)
• Автоматические 12-канальные пипетки (Matrix
Technologies)
• Инвертированный фазово-контрастный микро-
скоп
• Система Unopetle microcollection system (BD
Biosciences)
• Гемоцитометр
Протокол
Иммунизация.
1. Возьмите кровь мышей для проверки сыворотки
на базальную антигенную реактивность в день
0 перед иммунизацией.
2. Иммунизируйте мышей (А/J или Balb/c) анти-
геном, в эмульсии с адъювантом Фрейнда или в
смеси с квасцами в отношении 1 10 (по объему),
хорошо перемешанным на вортекс-мешалке. Про-
ведите три инъекции антигена внутрибрюшинно,
в соответствии со следующим режимом
День Количество Адъювант
антигена
0 50 mki Квасцы или полный адъ-
ювант Фрейнда
14 25 mki Квасцы или неполный
адъювант Фрейнда
28 25 мю Квасцы или D-PBSA
3. Возьмите кровь у мышей на 35-й день, определить
титр антител в сыворотке методом ELISA.
4. После разведения сыворотки 1:30 проведите се-
рийное разведение сыворотки 1:4 до получения
разведения 1:30720.
5. Выберите мышей с самым высоким соотношени-
ем титра сыворотки к антигену для проведения
слияния.
6. Произведите выбранным мышам конечную сти-
муляцию введением 10 мкг антигена внутривенно
или 25 мкг антти ена внутрибрюшинно в течение
3 дней до слияния
Миелома:
1. Удобно проводить слияние клеток в четверг, так
чтобы мыши получили конечную антигенную
стимуляцию в понедельник.
2. Поддерживайте клетки миеломы Р3.653 в МЕМ
+• 10% фетальной сыворотки теленка + 8-азагуа- I
нина.
3. Разводите клетки РЗ.бэЗдо 3,5x10s кл./мл каж- ।
дый день. Последнее разведенце проведите за три I
дня до слияния.
Т-клеточное истощение:
1 Возьмите кровь у мышей с подходящим титром I
сыворотки и забейте методом цервикальной дне- |
локации. .
2. Асептически выделите селезенки, поместите их
в стерильные чашки Петри с 5 мл стерильного
D-PBSA
3. При помощи двух 1-мл шприцов с надетыми
ш ламп 23G осторожно препарируйте селезенки. I
Грубое разрушение селезенок приводит к высо- |
кой концентрации фибробластов.
4. Перенесите клетки в 15-мл коническую пробирку,
и оставьте для осаждения комков.
5. Перенесите клетки селезенки (без щустков) в I
50-мл коническую пробирку и после разведения
1:100 в Unopetle подсчитайте клетки в i емоиито- I
метре.
6. Центрифу! ируйте клетки при 200 g в течение |
8 мин.
7. Для лизиса красных кровяных клеток ресуспен-
дируйге получившийся осадок в 0,84% NH,4CI
(10 мл на селезенку) и инкубируйте суспензию
при 4 °C в течение 15 мин.
8. Введите в качестве подлежащего Слоя к суспензии
клеток селезенки 14 мл лошадиной сыворотки,
центрифу! ируйте при 450 g в течение 8 мин.
9. Ресусиендируйте получившийся осадок в 50 мл
буфера TCD, центрифу! ируйте суспензию ири |
200 g в течение 8 мин.
10. Для Т-клеточного истощения ресуспендируli-
re получившийся клеточный осадок в раст-
воре anti-Thy 1.2 при конечной концентрации I
1х107 кл./мл.
11. Инкубируйте суспензию при 4 °C в течение
45 мин, и затем центрифу! ируйте ири 200 g в |
течение 8 мин.
12. Ресусиендируйте осадок в растворе комплемента |
кролика.
13. Инкубируйте суспензию при 37 °C в течение I
45 мин и затем центрифугируйте при 200 g в
течение 8 мин
14. Подсчитайте клетки методом исключения
гриианового синего на гемоцитометре (см. про- I
гокол 22.1). Восстановление В-клеток должно |
составлять 30-50%
Слияние:
1. Смешайте клетки миеломы и В-клетки в 50-мл I
центрифужной пробирке. Одна процедура ели- ।
яния может быть произведена не более чем на
1,2x10’* клетках селезенки. Смешайте их с миелом- |
S50
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
ными клетками Р3.653 в отношении 4:1; таким
образом, максимальное количестве! клеток Р3.653
на одну процедуру составит 3x107 клеток.
2. Центрифу! ируйте суспензию при 200 g в течение
8 мин.
3. Взмутите полученный осадок путем потряхива-
ния и добавляйте 1 мл PEG в пробирку в тече-
4. Перемешайте суспензию осторожным прокручи-
ванием пробирки в течение 75 с.
5. Добавляйте! мл SFM в течение 15 с. и осторожно
перемешивайте пробирку в течение 45 с.
6. Добавляйте 2 мл SFM в течение 30 с, перемеши-
вайте содержимое пробирки 90 с.
7. Добавляйте 4 мл среды НАТ в течение 30 с, пере-
мешивайте содержимое пробирки 90 с.
8. Наконец, добавьте 8 мл НАТ среды в течение
30 с, перемешивайте содержимое пробирки
90 с.
9 Добавить лот объем (16 мл) в стерильные
бутылки Nalgene, содержащие подсчитанное
количество среды НАТ (125 мл, если использу-
ется максимальное количество клеток). 16 мл
суспензии, содержащей 1,5x10**клеток, полу-
ченной на шаге 1 данного раздела настоящего
протокола с добавлением 125 мл среды НАТ в
бутыли составит 141 мл. Вместе с промывкой на
следующем шаге (шаг 10) общий объем составит
150 мл и даст конечную концентрации) клеток
1х10*’кл./мл.
10.Ополосните 50-мл коническую пробирку 9 мл
среды НАТ. и добавьте этот объем в бутыль.
11. Хорошо перемещайте содержимое бутыли и пе-
ренесите клетки в стерильный резервуар.
12. Используя 12-канальную автоматическую пипетку,
посейте клетки по 200 мкл, лунку в стерильный
96-луночный планшет. Конечная концентрация
составит 2x10s кл. <лунку.
Селекция гибридом:
1. Замените питательную среду через 5 дней после
слияния, путем аспирации большей части среды
из лунок и добавлением 150—200 мкл свежей
среды НАТ на лунку.
2. Производите питание культур два раза в неделю.
3. Через две недели после слияния проведите ск-
рининг клонов для селекции положительных
1 ибридом методом ELISA.
4. Через каждые 48 ч повторно исследуйте 1 ибридо-
мы, которые на предыдущем этапе были выбраны
как положительные.
5. Нарастите наиболее продуктивные i ибридомы
в двух лунках 96-луночного планшета в среде,
содержащей 10% FBS и НТ.
6. Повторите исследование клонов, распространив
положительные i ибридомы в 24-луночный план-
шет, и пересейте их в среду, не содержащую НТ,
нри этом 2 мл супернатанта культуры следует
взять на исследование. На этом этапе берут объем,
достаточный для того, чтобы провести несколько
селективных испытаний, чтобы убедиться, что ан-
титела направлены только против интересующего
антигена.
7. Нарастите iибридомы так, чтобы их хранить в
I лунках 24-луночного планшета, и сохраните их
замораживанием (см. протокол 20.1).
8. Проведите вторичное криоконсервирование пос-
ле выращивания i ибридомы в 75-см2 флаконе
Скрининг. Позаботьтесь о развитии страте! ии ск-
рининга, чтобы получить моноклональные антитела
с желательными характеристиками. Супернатант шб-
ридомной культуры должен быть исследован так рано,
как только это становится выполнимым, на предмет
иммунореактивности желательных антител. После
первоначальной селекции методом ELISA ио реактив-
ности к иммуногену супернатант распространенной
культуры должен быть проверен в том исследовании,
для которого антитело разрабатывается (Вестерн-блот-
тин1, конкурентное иммуноисследование, проточная
цитометрия, и т.д.). Более детальное обсуждение ELISA
и дру! их иммуноло! ических методов исследования
можно найти в Knott el al [1997].
Субклонирование. Чтобы i арантировать монокло-
нальность, произведите субклонирование i ибридом,
которые вас интересуют. Это может быть выполнено
последовательно разведением клеток и посевом эк-
вивалента 1 клетки в 3 лунки 96-луночного планшета
(см. разд. 14.1) или. сортингом нри помощи автома-
тизированного блока осаждения клеток (ACDU) на
FACSlarplus (BD Biosciences) и посевом по одной
клетке в каждую лунку. Субклонирование может быть
выполнено на фидерном слое мышиных спленоцитов.
Фидерный слой готовят, препарируя ири помощи
и1лы селезенку наивной мыши, затем высевая клетки в
концентрации 1x10*’ кл./мл. Затем клетки пересевают в
96-луночный планшет*для микротитрацин при конечной
концентрации 2x10s кл лунку. После субклонирования
обычно колонии можно заметить на 5-й день, затем они
должны быть проверены визуально на моноклональ-
ность. Планшеты заполняют свежей средой, начиная
с 7-1 о дня. Скриннн! на положительность i ибридом
обычно делается между 10-м и 14-м днями. Выбранные
клоны затем размножаются и замораживаются таким
же образом, как родительская 1 ибридома
Произвовство антител. Концентрированные ан-
титела из интересующих исследователя клонов могут
быть произведены in vivo из асцита в IFA обрабо-
танных мышах (Balb/c или пи. пи [Gillette, 1987]) или
in vitro при выращивании суспензионной культуры.
Существуют также иоловолоконные системы для куль-
туры клеток (см. Приложение II и разд. 25.3.2, 26.1.3,
26.2.5). Когда 1 ибридомы иноку лируют в иоловолокон-
ную систему, клетки поддерживаются в определенном
27.11. Перенос ДНК
551
комиартменте биореактора, в то время как свежая среда
и продукт жизнедеятельности клеток заменяются. Вы-
сокие концентрации анти гея, произведенных клетками,
могут быть выделены из супернатанта в многократно
в разное время.
27.11. ПЕРЕНОС ДНК
Чтобы изучать функцию индивидуальных генов и регу-
ляторные последовательности, фрагменты ДНК могут
быть субклонированы и затем перемещены в клетки
хозяина разнообразными методами, типа трансфекции,
лииофекции и ретровирусной инфекции (рис. 27.5).
Клонированную ДНК часто удобно поддерживать как
часть бактериальной плазмиды, мши ие плазмиды могу?
достигать большого числа копий в течение бактериаль-
hoi о роста, таким образом гарантируя обильный запас
ДНК для эксперимента. Плазмидная ДНК, очищается
от бактерий перед использованием. Как только инте-
ресующая последовательность проходит субклониро-
вание, она может использоваться как дополнительный
инструмент, например для субклонирования промотор-
ной последовательности. Путем генетических мани-
пуляций, цлследоватеяьности промотора могут быть
связаны с ренортерным геном (например. Pgal или
CAT), продукты которых (соответственно, Р-галакто-
зидаза или хлорамфеникол ацетилтрансфераза) moi у?
быть легко обнаружены после трансфекции. Зеленый
флюоресцентный белок (GFP) тихоокеанской медузы
Aequoria victoria, который может использоваться как
репортер, будет флюоресцировать в живых клетках,
освещенных ультрафиолетовым светом, что ггозволяет
обнаруживать жизнеспособные трансфецированные
клетки на инвертированном микроскопе, что может
использоваться для FACS-сортинга.
Трансфекция может быть временной (транзитор-
ной) или устойчивой. Транзиторная трансфекция
Клонировать
в бактериях в
СеПСхПвяА
условиях
Рис. 27.5. Перенос ДНК. Изолированные фрагменты
Трвнефец^овать в
эндонуклеазы ДНК амплифицируют методом клонирова-
ния генов, добавляют к целым клеткам, и инкорпорируют
.|цц<|фскцией. электропорацией пли ко-лреципитациеи е
Са3(РО,),
существует короткое время, и продукт используется
вскоре после трансфекции, эффективность которой
определяется исследованием реггортерного гена. ДН К,
используемая для устойчивой трансфекции, содержит
селективный маркер типа пео или hyg В, которым
придают резистентность к G418 (генетицин, аналог
неомицина) или г игромицину, соответственно. Транс-
фецированные клетки затем подвергаются селекции
длительной экспозицией селектирующего агента,
затем могут быть выделены резистентные клоны (см.
протоколы 14.6 и 14.8).
Ниже представлены два протокола: один для устой-
чивой трансфекции с использованием электропорации
и один для транзиторного процесса (использование
лииофекции). Протокол селекции для устойчивой
трансфекции может быть добавлен к протоколу лиио-
фекции, при условии что конструкт, используемый для
трансфекции, содержит соответствуюгций селективный
маркер. Перенос ДНК методом копреципитации с
фосфатом кальция и вирусная трансдукция описаны
в гл. 18 (см. протоколы 18.1,18.2).
27.11.1. Копреципитация с фосфатом
кальция
Метод фосфата кальция для введения генов в клетки
млекопитающих был впервые оггггсан Graham and Van
dec Eb [1973] и все еще широко исггользуется. В этом
методе экзогенная ДНК смешивается с хлористым
кальцием и зат ем добав.>гяется в раствор, содержащий
ионы фосфата. Образующийся фосфатно-кальциевый
преципитат ДНК захватывается клетками млекопи-
тающих в культуре с последующей экспрессией экзо-
генного гена. Этот метод может использоваться, чтобы
внедрить любую ДНК в клетки млекопитающих для
исследований транзиторной экспрессии или долго-
срочной трансформации. Эта процедура оцисана для
иммортализации фибробластов с антигеном SV40 Т
(см. протокол 18.1).
27.11.2. Липофекция
Первоначальный метод оиосредованной катионны-
ми липидами трансфекции ДНК в культивируемые
клетки [Feigner et al., 1987] был улучшен в 1993 г.
.гаменой монокатионного липидного реагента на гголи-
катионный агентЛииофектамин [Ciccaroireelal., 1993;
Hawley-Nelson et al., 1993]. Метод основан на ионных
взаимодействиях ДНК и липосом с формированием
комплекса, который может доставлять функциональ-
ную ДНК в культивируемые клетки. Плазмидная
ДНК находится в комплексе, но не инкапсулирована
внутри монослойных липосом размером 600—1200 нм
в диаметре [Mahato et al., 1995а], сформированных
катионными липидами в воде. Преимущества оиосре-
дованной катионными липидами трансфекции перед
другими методами заключаются в более высокой
552
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
эффективности; возможности успешной трансфекции
для широкого Kpyia (более .300 сообщений) эукарио-
тических клеточных линий, mhoi не из которых устой-
чивы к другом методам трансфекции; и относительно
низкая токсичность для клеток. Другое преимущество
состоит в том, что основная процедура трансфекции
ДНК может быть приспособлена к трансфекции РНК,
синтетических олигонуклеотидов, белков и вирусов.
Наконец, катионные липосомы мотут использоваться
для успешной доставки функциональных генов или
вирусного тенома in vi&o [Mahato et al., 1995b; Tagawa
el al., 1996; Thorsell et al., 1996J. Неудобством метода
является относительно высокая стоимость реактивов,
которая фактически устраняет крупномасштабное
использование.
Протокол 27.12 представляет собой сокращенный
метод Bichko [1998]
ПРОТОКОЛ 27.12. Транзиторная
трансфекция методом
липофекции
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
• Катионные липиды
• Липофектамин: состав липосом 3:1 (ио объему)
ноликатионныи лииид DOSPA (2,3-диолеилок-
си-ЬГ[2(сиермин карбоксамид).>тнл]-М,Ы-диме-
тил-1-проианамин трифторацетат и нейтральный
лииид DOPE ( Д иоленлфосфати дилэтаноламин)
в воде (Invilrogen)
• Лииофектин: состав липосом 1:1 (ио объему)
катионный липид DOTMA (К-[1-(2,Здиоле-
илокси)-ироиил]-К,ЬЦХ-триметиламмония
хлорид) и нейтральный (пппд DOPE в воде
(Invilrogen)
• Липофект lipofeciACE: состав липосом 1:2,5 (ио
объему) катионный липид DDAB диметилдиок-
тадециламмония бромид и нейтральный лииид
DOPE в воде (Invilrogen)
Клетки для трансфекции
ДНК для трансфекции
• Ростовая среда. DM ЕМ (1х) с 10% FBS, пеницил-
лин (100 U/мл), и стрептомицин (100 мкг мл или
как это требуется для используемых клеток)
• Среда со сниженным содержанием сыворотки:
OPTI-MEM 1 (содержит 2% FBS; Invilrogen)
• Бессыворогочная среда: DMEM без сыворотки
и антибиотиков
• D-PBSA
• Солевой буфер:
NaCl. 0,15 М
К,НРОЪ 0.006 М
КН, РО, 0,002 М
• Трииснн, 0.25%, в D-PBSA
• Многолуночные планшеты, 6 лунок, или 3,5-см
чашки Петри
Протокол
А. Трансфекция адгерентных клеток
1. Посейте примерно 1x10s—3x10’клеток на лунку
в 6-луночные планшеты в .3 мл ростовой среды.
2. Инкубируйте клетки при 37 °C в СО2-ннкубат0ре
пока клетки не достшнут 50 90% конфлюэнт-
ности. Этот этап обычно занимает 18—24 ч, или,
по крайней мере, не менее 16 ч.
3 До трансфекции приготовьте растворы ДНК и
лииидов в стерильных пробирках:
а) Для получения раствора ДНК разведите
1 2 мкт ДНК в 0,5 мл среды с пониженным
содержанием сыворотки.
6) Для получения раствора липидов разведите
2—25 мкл катионно-липидного реагента в
0.5 мл бессывороточной среды.
в) Соедините два раствора, аккуратно размешай-
те. инкубируйте при комнатной температуре в
течение 15 45 мин, для обеспечения форми-
рования ДНК/липидных комплексов.
4. Отмойте клетки один раз в 2 мл бессывороточной
среды.
5. Нанесите ДНК. липидные комплексы на клетки.
В ходе трансфекции следует исключить антибак-
териальные компоненты.
6. Инкубируйте клетки с комплексами при 37 СС в
COj-инкубаторе в течение 2—24 ч; обычно бывает
достаточно 5—6 ч.
7. После инкубации удалите трансфекционную
смесь с клеток, .замените ее на 3 мл полной рос-
товой среды.
8. Замените ростовую среду на свежую среду через
18 24 ч после начала трансфекции.
9. Исследуйте ростовую среду от трансфецирован-
ных клеток на транзиторную активность 1ена по
обстоятельствам (см. протоколы 27.14 п 27.15).
В. Трансфекция в суспензии клеток
1. Приготовьте трансфекционную смесь в стериль-
ных пробирках следующим образом:
а) Разведите 2—5 мкг ДНК в 0,5 мл среды с по-
ниженным содержанием сыворотки.
б) Разведите 2—20 мкл реагента для катионно-
липидного реагента в 0,5 мл бессывороточной
среды.
в) Соедините два раствора, осторожно переме-
шайте получившийся раствор, инкубируйте
его при комнатной температуре в течение
15 15 мин, чтобы обеспечить формирование
ДНК . липидных комплексов.
2. Центрифу! ируйте суспензию клеток содержащую
примерно 1х10ь—2x10s клеток, и асиирационно
отберите супернатант.
3. Ресусиендируйте клетки в трансфекционной
смеси, перенесите суспензию в 3,5-см чашку.
4. Инкубируйте клетки в СО,-инкубаторе в течение
1-6 ч
27.11. Перенос ДНК
553
5. В каждую чашку добавьте 0,5 мл ростовой среды,
содержащей 30% сыворотки (большое количество
сыворотки необходимо для тоги, чюбы защитить
клетки в суспензии, которые более чувствитель-
ны к токсическому действию составляющих
частей л икосом).
6. Инкубируйте чашки в СО2-инкубаторе в течение
7. Добавьте 2 мл полной ростовой среды в каждую
чашку и инкубируйте чашки в СО,-инкубаторе
8. Через 24-72 ч после начала трансфекции, иссле-
дуйте клетки или среду на предмет активности
ена (см. протоколы 27.14 и 27.15).
27.11.3. Электропорация
Д НК может быть введен в клетки методом электропо-
рации, koi да клетки в высокой концентрации кратков-
ременно иодвер1аются действию высокого напряжения
электрическою коля в присутствии ДНК, приготовлен-
ной для трансфекции [Chu el al., 1987J. В мембране кле-
ток кратковременно образуются маленькие отверстия
[Zimmerman и Vienken, 1982J, которые позволяют ДНК
войти в клетки; в некоторых клетках ДНК включается в
геном. Оборудование для элект ропорацпи коммерчески
доступно (Bio-Rad). Большинство клеток, невоспри-
имчивых к химическим методам переноса гена, были
успешно трансфицированы методом электропорации
[Andreason & Evans, 1988; Chu el al., 1987J.
Электропорация обычно производится в иоле пос-
тоянной емкости (так обеспечивается постоянная про-
должительность импульса) с различным напряжением
поля (500-1500 кВ см) для пилотных исследований. Для
большинства клеток значение параметров, ири которых
приблизительно 20-50% клеток остается жизнеспособ-
ным, после электропорации считается достаточным для
переноса ДНК [Chu etal., 1987; Andreason & Evans, 1988].
Электропорация обычно производится при комнатной
температуре, впоследствии клетки хранят на льду, что-
бы продлить период времени, ко1да мембранные поры
остаются открытыми [Andreason & Evans, 1989J.
Существуют линейные отношения между концент-
рацией ДНК, захватом ДНК, и экспрессией репортер
ною гена [Chu el al., 1987J. Предполагается, что линеа-
ризированная ДНК более эффективна для получения
устойчивых трансфектантов. чем суперспиральная
конформация ДНК, возможно, из-за повышенной эф-
фективности, с которой .линейная ДНК встраивается в
геномную ДНК [Poller el al., 1984; Chu el al 1987]. Элек-
тропорация приводит к интеграции ДНК в низком чис-
ле копий [Boggs et al., 1986; Toneguzzo el al., 1988], хотя
число введенных копий может бытьотре1улировано пу-
тем изменения концентрации ДН К в суспензии клеток.
Химические методы трансфекции обычно приводят к
интеграции больших конкатемеров, которые мшут ио
своей природе нарушать функционирование клетки и
приводить к неоднозначным результатам исследования,
включая сверхэкспрессию специфичного гена [Robins
etal., 1981; Kucherlapali & Skoultchi, 1984].
Суспензия клеток легче трансфецируются методом
электропорации, чем прикрепленные клетки, потому
что прикрепленные клетки должны быть отделены
от стенок культурального сосуда. Недостатки метода
электропорации связаны с требованием большего ко-
личества клеток и ДНК, чем необходимо для переноса
гена химическими методами. Кроме того, при элект-
ропорации отмечается вариабельность в оптимальных
параметрах между гиками клеток. Настоящее введение
п протокол 27.13 являются сокращенным вариантом
метода Cataldo et al [1998]. Протокол описывает ус-
ловия электропорации, необходимые для устойчивой
трансфекции клона (Y10) мышиных мегакариотиче-
ских клеток линии L8057 [Ishida el al. 1993]. Клетки
L8057-Y10 растут в сусиендии и поддерживаются в
среде Хэма F12 с добавлением 10% термоннактивиро-
ванной FBS, пенициллина (50 U/мл) и стрептомицина
(50 mki /мл). Здесь представлена общая схема устойчи-
вой трансфекции клеток L8057-Y10.
ПРОТОКОЛ 27.13. Устойчивая трансфекция
методом электропорации
Материалы
Стерильные или асептически приготовленные:
Экспрессирующие векторы
и приготовление ДНК:
• Линеаризованный вектор pSVTKGH [Selden el
al., 1986]. Этот вектор содержит iен-усилитель ।
SV40 и тимидинкнназную промотор ную после- I
довательность герпес-вируса, которая запускай
экспрессию человеческого гормона роста (hGH).
UGH секретируется непосредственно в куль-
туральную среду, и обнаруживается методом
радпонммуноанализа [Ravid etal., 1991].
• Линеаризованный вектор pcDNA3 (Invitrogen). ।
Этот экспрессирующий вектор содержит энхан- I
серно-цромоторную последовательность чело-
веческого цитоме!аловируса, расположенный
выше его мультиклонирующего сайта, а также
cut нальную последовательность полиаденили-
рования и транскрииционно-терминационную
последовательность сена гормона роста быка
(bGH), расположенного ниже мультиклони-
рующео сайта. Вектор pcDNAЗтaкжe содержит
ген устойчивости к неомицину, что снижает
необходимость одновременной трансфекции
гена антибиотик-резнстентности для селекции и
стабильных трансформантов активно экспресси-
рующих отдельный интересующий исследователя
ген. pc DNA3 также может быть использован как
селективный маркер при одновременной транс- ।
фекцнн с реиортерными конструктами, как это I
представлено в данном протоколе.
S54
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
Культура ткани:
• Клетки L8057-Y10
• Флаконы, 75 см1 2 * * *
• Планшеты шестилуночные
• D-PBSA
• Среда Хэма F12. FB: F12 с ыютамином (2 мМ),
пенициллином (50 U мл), и стрептомицином
(5 мкг/мл), с добавлением 10°г, FBS (термоина-
ктивированная); GIBCO #16140-014)
• Geneticiu (Invitrogen), 50 mi мл h D-PBSA (в
зависимости от активности, например если ак-
тивность партии 731 мкг/mi, разведите 64,4 mi
G418 на млВ-PBSA)
• Селективная среда: F12 FB, содержащая
600 mki/мл G418
Электропорация:
• Буфер для электропорации [Ravid et al., 1991]
NaCl. 30,8 мМ
KCI. 120,7 мМ
ИаЛРОДЬМ
КН2РО„ 1.46 мМ
MgCI,, 5 мМ
• Кюветы Gene Pulser Cuvettes
Нестерильные •
• Прибор Gene Pulser II (Bio-Rad)
• Ретранслятор Емкостного сопротивления Gene
Pulser II Capacitance Extender Plus
Протокол
1. Посейте клетки L8057-Y10 в концентрации
5x10 ’ кл./мл в 75-см2культуралыгом флаконе, ин-
кубируйте флакон при 37 °C в 5% СО2 в F12 FB.
2 В ходе поздней log-фазы соберите клетки цен-
трифу шрованнем цри 4 °C при 380 g в течение
3. Отмойте клеточный осадок в 10 мл DPBSA,
центрифу।ируйте при 4 °C при 380 g в течение
1. Отмойте клеточный осадок в 5 мл буфера для
электропорации и подсчитайте клетки, используя
гемоцитометр.
5. Соберите клетки центрифу! ирован нем при 4 °C
ири 380 g в течение 5 мин.
6. Ресусиендируйте клетки при 1х106 7 8 9кл./0,8 мл
буфера для электропорации.
7. Перенесите 0,8 мл клеток в предварительно ох-
лажденные кюветы bjih электропорации.
8. Добавьте 50 mki линеаризованною pSVTKGH,
вместе с 5 mki линеаризованного pcDNA3 к
Клеточной суспензии (при анализе специфи-
ческой экспрессии иромоторно-реиортерных
генов, подходящим отрицательным контролем
является электропорация клеток в отсутствие
плазмид ной ДНК).
9. Смешайте ДНК/клеточную суспензию, удержи-
вая кювету за грани и постукивая ио дну. Инку-
бируйте суспензию на льду в течение 10 мин.
10 .Электропорацию суспензии проводят при
100 V 500 mkF, записывая продолжи гельность
импульса.
11. Удалите кювету из импульсной камеры и помес-
тите на лед на 10 мин.
12. Перенесите клетки после электро иорации в
10 мл F12 FB, промойте кювету средой для
удаления всех клеток и соберите клетки цент-
рифугированием
13. Ресусиендируйте клетки в 20 мл F12 FB, вы-
ращивайте суспензионную культуру в 75-см2
флаконе при 37 °C в 5°о СО, для toi о чтобы
обеспечить экспрессию выбираемою маркерного
неомицинового гена.
14. Через 24—48 ч соберите клетки центрифу! ирова-
нием. затем ресусиендируйте в 20 мл селективной
среды.
15. Меняйте селективную среду каждые 2—4 дня в
течение, ио крайней мере, 2 недель для того чгобы
удалить обломки иошбшнх клеток и позволить
расти устойчивым клеткам.
16. Проведите исследование экспрессии liGH и су-
пернатанте (см. разд. 27.11.5)
Вариации. Генетицин. Культивируемые клеточные
линии различны ио чувствительности к генегицину,
наиболее подходящая концентрация для использо-
вания должна быть эмпирически определена путем
получения кривой i поели (см. протокол 22.3) на той
клеточной линии, которая трансфецируется. Клетки
должны оставаться в селективной среде в течение
длительного периода роста. Выбор колоний. См. про-
токолы 14.6 и 14.8.
Транлшпорная трансфекция. Используйте кольце-
вые плазмиды, такие как pCMVP-gal, для того чтобы
заместить pcDNA3. После выполнения uiaia 10 ресус-
иендируйте клетки в 2 мл культуральной среды без
селективного агента и культивируйте их в шестилуноч-
ном планшете в течение трех-четырех дней. Исследуйте
транзиторную экспрессию 11GH в супернатанте, приго-
товьте клеточный лизат для определения активности
[1 । алактозидазы.
Экспрессия реггортерного гена. В случае транзитор-
ной трансфекции плазмида, содержащая реиортерный
ген р-галактозидазы ко-трансфецируется д.>1я того что-
бы нормализовать экспрессию гена 11GH для суммарной
эффективности эяектроиораиии. Существуют коммер-
чески доступные наборы для определения как секреции
hGH (Nichols Institute Diagnostics, #40-2205), так и
активности Р-галактозидазы (Promega, #Е2000).
27.11.4. Другие методы переноса ДНК
Ретровирусная инфекция Ретровирусы обладают вы-
сокой эффективностью переноса генов и могут инкор-
порировать большие фра! менты ДНК, чем плазмиды,
спонтанно инфицируя клетки хозяина [Ausubel et al..
27.11. Перенос ДНК
555
1996; Hicks et al., 1998J. Введенные гены становятся
постоянными. Процесс включения в геном достигается
в ходе нормально!о клеточного деления, он не пов-
реждает клетки хозяина и не вызывает генетических
изменений (см. протокол 18.2).
Бакуловирус. Введение геномной последователь-
ности в бакуловирусы, которые затем размножаются
в клетках насекомых (таких как клетки линии Sf9),
также позволяют клонировать большие участки
(>100 тысяч нар нуклеотидов). Образующиеся белки
проходят посттрансляционную модификацию, кото-
рая не характерна для прокариотических систем, хотя
существуют отличия от процессии! а в клетках мле-
копитающих. Бакуловирусы не передаются в клетки
млекопитающих, поэтому клетки .линии Sf9 не несу!
опасности контаминации вирусами млекопитающих;
при этом предполагается, что все добавки к средам, по-
лученные от млекопитающих (например, FBS), прошли
тщательную проверку перед использованием. Клетки
Sf9 могут быть субкультивированы без трипсина |см.
протокол 26.9; Midgiey el al., 1998].
Искусственные хромосомы дрожжей. Искусст-
венные хромосомы дрожжей (YACs) (Strauss, 19981
также представляют собой 1еном, который можеч
содержать более крупную последовательность ДНК,
чем бактериальные плазмиды, с нисходящим пост-
трансляционным процессингом, таким, который об-
наруживается в эукариотических клетках, хотя это?
последний аспект, вероятно, имеет значительные
отличия от таковою в клетках млекопитающих. Рас-
пространение в дрожжах также дает высокий выход и
стабильную культуральную систему, ее не так сложно
поддерживать, чем крупномасштабные культуры кле-
ток млекопитающих или насекомых.
Искусственные хромосомы млекопитающих.
Имеются значительные успехи в применении принци-
пов YACs к системам клеток млекопитающих | Bridger,
2004J, для того чтобы инкорпорировать крупные
нуклеотидные последовательности млекопитающих,
содержащие одну или более структурных и множест-
венные pei уляторные гены в одном конструкте. Такие
конструкты известны как искусственные хромосомы
млекопитающих (MACs) и вводятся в клетки млеко-
питающих при помощи монохромосомальных методов
переноса [Newbold &Culhberl. 1998]. Эта технология в
настоящее время привела к созданию искусственных
хромосом человека, открывая новую эру в генной те-
рапии [Larin & Mejia, 2002; Katoh et al., 2004].
27.11.5. Репортерные гены
Исследования трансфецированных клеток в отношении
реиортерных генов, таких как fi-gal или CAT, подтверж-
дают инкорпорирование конструктов в ДНК, которые
экспрессируются трансфецированной популяцией.
Pgal окрашивание также может быть использовано для
прослеживания суд ьбы грансфецированных клеток в ис-
следовании межклеточных взаимодействий | Bradley &
Pitts, 1994]. Протокол 27.14 представляет собой упро-
щенный мегод Bichko 11998], разработанный на основе
Sanes et al. 11986] и модифицированный Invitrogen.
ПРОТОКОЛ 27.14. Окраска in situ
на р-галактозидазу
Материалы
Нестерильные:
• D-PBSA
• Субстрат: X-gal (Invilrogen), 20 mi млвдимегил- ।
формамиде. Хранить при —20 °C в темноте, в по- I
лиироинленовой пробирке не более 6 месяцев.
• Фиксирующий раствор: формальдегид, 1,8%;
глютаральдегид, 0,05% в PBSA. Приготовить |
фиксирующий раствор смешиванием 85 мл воды, .
10 мл 10х D-PBSA, 5 мл формалина (37% раствор
формальде! ида) и 0.2 мл ыпотаральдешда (25%
раствор). Хранить при 4 С
• Красящий раствор. 5 мМ железосинерод исто- ।
го калия, 2мМ MgCl, в D-PBSA. Хранить при
4 °C. 1
• Субстрат красящий раствор 1 мг мл X-gal в
красящем растворе. п| шготовить непосредственно |
перед использованием
• Формалин, 10% в D-PBSA.
• В данном случае экспрессирующая плазмида для
Р gal будет использоваться как рен<>|ггерпый ген I
для трансфекции (например. pCMVPgal [Mac-
Gregor & Caskey, 1989]).
Протокол:
1. Отмойте клетки (наиример, в 6-луночном план-
шете) один раз в 2 мл D-PBSA. ,
2. Фиксируйте клеткач в 1 мл фиксирующег о рас- I
гвора 5 мин при комнатной температуре.
3. Отмойте клетки дважды в 2 мл D-PBSA.
4. Добавьте в каждую лунку но 1 мл смеси субстрат/
красящий раствор, инкубируйте 2 ч и более (в
течение ночи) при 37 °C.
5. Ополосните клетки в каждой лунке добавлением
2 мл D-PBSA. Исследуйте клетки в инвертиро-
ванном микроскопе, подсчитайте голубые (p-gal
положительные) клетки
6. Для храпения планшетов фиксируйте клетки в ।
каждой лунке добавлением 1 мл 10% формалина
в солевом буфере в течение 10 мин при комнатной |
гемперагуре, отмыть клетки в буферном растворе,
хранить в буферном растворе при 4 °C.
В качестве исследования репортерного гена при
трансфекции может использоваться экспрессия CAT
(например, pCMVCAT [Bosharl el al., 1985]). Прото-
S56
ГЛАВА 27. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
кол 27.15 представляет собой упрощенный вариант
метода Bichko [1998] на основе Neumann et al. [1987]
модифицированный Invitrogen.
ПРОТОКОЛ 27.15. Определение активности
хлорамфениколацетилтрансферазы
(CAT ASSAY)
Материалы
Стерильные:
• D-PBSA
• Многолуночные планшеты: 6-луночные, 3,5 см
Нестерильные:
• Трис-буфер: Tpuc-HCl, 0,1 М. pH 8,0
• Трис Тритон:Трис-НС1,0,1 М, pH8.0.0.1% Три-
тон Х-100; хранить при 4 °C
• Буфер для разведения CAT: Трис-НС1,0,1 М, pH
8,0.50% глицерин. 0,2% BSA
• Субстрат: 250 мМ хлорамфеникола (GIBCO) в
100% этаноле; хранить в аликвотах нри -70 °C.
* [ ,1С]-СоА: [1 *С] бутирил Коэнзи м А (10 мКи/мл;
Amersliaiii Bioscietices)
• CAT -фермент стандарты (Invitrogen): пригото-
вить стандартные растворы 0,2,1,2.4, и 10II, мл в
буфере для разведения CAT. Хранить при 4 °C.
• Жидкий сцинтилляционный коктейль: Econo-
fluor (Invitrogen)
• Деионизированная дистиллированная вода
(DDW)
• Полипропиленовые сцинтилляционные флако-
ны, .3.5 мл
• Микроцентрифужные пробирки
• Микроцентрифу! а
• Ледяная баня
Протокол
Сбор клеток с 6-луночных 35-мм планшетов:
1. Отмойте клетки один раз в D-PBSA 24—72 ч после
трансфекции.
2. Поставьте чашки налед, добавьте в каждую лунку
1 мл смеси Трис. Тритон.
3. Заморозьте на 2 ч при —70 “С.
4. Разморозьте планшеты при 37 °C и затем поло-
жите их на лед.
5. Перенесите клеточные лизаты в микроцентри-
фужные пробирки, центрифу! ируйте 5 мин при
максимал ьной скорости
6. Соберите супернатант, прогрейте при 65 °C в тече-
ние 10 мин для инактивации ингибиторов CAT.
7. Центрифу! ируйте на максимальной скорости
3 мин и соберите супернатант клеточною экстра-
кта. Храните при 70 “С
Исследование CAT:
8. Поместите 5—150 мкл клеточного экстракта из
каждого образца в 3,5-м л полипропиленовый
сцинтилляционный флакон добавьте достаточно
большое количество 0,1 М Трис так, чтобы конеч-
ный объем составлял 150 мкл.
9. В качестве отрицательного контроля используйте
150 мкл 0.1М Tris.
10. В качестве положительного контроля.
а) Добавьте 150 мкл 0,1 М Трис в каждый из
5 флаконов.
б) Добавьте 5 мкл каждого ил стандартных рас-
творов CAT во флаконы, чтобы получить стан-
дартную кривую 1,5,10,20, и 50 mU CAT.
U.K каждому обращу (включая контрол и) добавьте
100 мкл следующей смеси:
a) UPW....... .84 мкл
6) Трис.0,1 М... 10мкл
в) Хлорамфеникол ........ 1 мкл
1) [”С]-СоА................. 5 мкл (50 нКи)
12. Закройте крышками образцы и инкубируйте их
при 37 °C в течение 2 ч.
13. Добавьте Змл Ecotiofluor в каждую пробирку,
снова закроите крышками.
14. Перемешайте содержимое, переворачивая про-
бирки.
15. Инкубируйте пробирки при комнатной темпера-
туре в течение 2 ч.
16. Подсчитайте образцы в течение 30 с в жидкост-
ном сцинтилляционном счетчике.
Глава 28
РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ
Независимо от того, насколько хорошо работает
лаборатория, вместе с новыми методами, новым пер-
соналом, новым оборудованием или другими новыми
обстоятельствами возникают проблемы, дестабили-
зирующие повседневный рабочий процесс. Одним из
подходов к решению таких ироблем является разра-
ботка стандартных операционных процедур (СОП)
и неуклонное выполнение принятых протоколов без
каких-либо отклонений. Изменения в протоколах мо-
гут быть введены только после исчерпывающей оценки
(проверки) возможных последствий. Тем не менее
реализовать этот подход очень трудно, в частности, в
исследовательской среде, где успех и развитие науки
требуют постоянных изменений и постоянного вве-
дения новых методов. Советы, данные в предыдущих
главах, в основном касались практических аспектов,
инструкции типа «как это делается ъ. ИнО1 да встреча-
лись замечания ио поводу того, что «не надо делать».
Данная t лава пытается осветить некоторые возможные
проблемы, а также возникающие трудности и вопросы,
а также, надеюсь, их решение.
28.1. МЕДЛЕННЫЙ РОСТ КЛЕТОК
28.1.1. Проблемы, ограниченные вашими
собственными исходными
культурами
1. Проверьте ваши клетки на предмет контаминации
а) Если вы работаете без применения антибиотиков
(а вы должны работать без них!), в большинстве
случаев контаминация будет визуально заметна
i) Исследуйте культуру визуально невооружен-
ным глазом и под микроскопом (см. разд. 28.6,
19.3.1).
ii) Уничтожьте контаминированные клетки.
б) Микоплазму нельзя заметить визуально, поэтому
ре1улярно проверяйте ваши культуры на микро-
плазмы (см. протоколы 19.2.19.3).
в) Проверьте возможные пути перемещения и пе-
редачи культур (см. разд. 28.6; 19.1).
2. Проверьте рост ваших клеток в другой среде и сыво-
ротке (наиример, различных партий или от разных
поставщиков). Если вы обычно используете сухие
среды или 10х, купите другой исходный материал
или среду 1х. Если в результате обнаружится, что
проблема заключается в среде, см. подраздел о сре-
дах ниже в нас гоящем Разделе.
3. Если проблема состоит не в среде, она может быть
связана с вашими клетками.
а) Разморозьте новую ампулу, взятую из морозиль-
ника. Сравните ее с вашей текущей культурой.
Все манипуляции проводите с культурами па-
раллельно, но раздельно, во избежание контами-
нации основно! о запаса клеток. Делайте это до
проверки пли одновременно с пунктами (б)—(t)
проверки (см. ниже).
б) Подсчитайте ваши клетки в субкультуре, по-
стройте ростовую кривую (см. протоколы 21.7
и 21.8), чтобы сравнить с вашими предыдущими
записями, касающимися этих клеток. Проверьте,
влияют ли на ваши клетки следующие факторы:
i) Плотность посева была слишком низкой для
переноса.
ii) Клетки были субкультивированы слишком
iii) Клетки оставались на фазе плато слишком
долго до субкультивирования.
в) Были ли изменения в партии трипсина или дру-
(их диссоциирующих агентов? Проверьте номер
партии tt поставщиков.
t) Для оценки жесткости действия диссоциирую-
щего агента, проверьте:
i) Небылали продолжительное гь действия трип-
сина (или другого агента) слишком долгой?
ii) Не был ли диссоциирующий агент слишком
концентрированным и не имел ли он спе-
цифической активности, которая была бы
чересчур высокой?
iii) Не был ли инкубатор, использованный для
триисинизации, слишком теплым?
iv) Не было ли пикетирование при диссоциации
с,ц1шком интенсивным?
у) Не были ли клетки чувствительны к EDTA
(если вы использовали EDTA)?
vt ) Правильный ли ра.1бавитель для трипсина вы
использовали?
vii) Хорошую ли партию разбавителя для трип-
сина вы использовали?
28.1.2. Более общие проблемы,
возникающие и у других
сотрудников
Проверьте оборудование и реактивы
коллективного использования
Термальная комната и инкубаторы
1) Температура и стабильность работы контролирова-
лись неадекватно.
а) Термостаты недоброкачественные.
558
ГЛАВА 28. РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ
б) Слишком часто открывались инкубаторы.
в) Дверь термальной комнаты оставили открытой.
г) Вентиляторы в системе циркуляции воздуха
сломаны или nepei реваются. Проверьте инку-
баторы при помощи портативных термографов
(см. разд. 5.3.3).
2) Влажность С02-инкубатора недостаточно хорошо
поддержи вается
а) Поддон с водой не заполнен.
б) Нарушена герметичность дверей.
в) Слишком частый доступ в инкубатор.
г) Проверьте скорость испарения путем ежеднев-
ного взвешивания чашки Петри с PBSA.
3) Концентрация СО, в С О,-инкубаторе плохо конт-
ролируется
а) Слишком частый доступ в инкубатор.
б) Имеются проблемы с контролем уровня СО2.
1. Проверьте pH in situ ири помощи чашки Петри со сре-
дой с предварит ельно определенным уровнем pH.
2. Проверьте атмосферу в инкубаторе при помощи
С О,-тестера (Carborile).
3. Перекалибруйте на индикаторе установку нулевого
уровня и концентрацию СО2 в стандартной । азовой
смеси.
Среды и реактивы см. разд. 28.2.
28.1.3. Не было ли у вас в лвборатории
квких-л ибо изменений?
Персонал
1) Персона.'!, работающий с культурами
2) Персона.'!, работающий в подготовительной зоне
3) Подготовительные процедуры
4) Курсы и трениш и
5) Распределение места и перемол ценность помещения
людьми
Материалы
Химические загрязнения
(см. также разд. 28.8)
Среды (см. ниже)
1) Поставщик
2) Партия
3) Тип
4) Хранение
Методы
1) Время инкубации
2) Скорость проведения операций
3) Последовательность Операций
4) Месторасположение
5) Масштаб работ
Оборудование
1) Замена оборудования: было ли добавлено какое-то
новое оборудование?
2) Рабочее состояние: возможно, какое-то оборудова-
ние сломалось?
3) Месторасположение, оборудование обычно исполь-
зовалось на том же месте или рядом расположенное
оборудование было переставлено?
4) Рабочая температура: работает ли оборудование в
оптимальном температурном режиме и подходит
ли зта температура для ваших образцов?
28.2. СРЕДА
Связаны ли возникшие проблемы только
с вашими собственными запасами или
они касаются общих запасов сред?
Срок ГОДНОСТИ
1. Проверьте номер партии и дату приобретения среды.
Она должна быть не больше 1 года со дня выпуска.
2. Если среда содержит лютамин, она сохраняет ста-
бильность только в течение 1 месяца при 4 °C.
Условия хранения
1. Проверьте температуру в холодной комнате и холо-
дильнике, она должна быть не выше 4 °C
2. Проверьте, хранилась ли среда в темноте или, по
крайней мере, вдали от прямого солнечного света и
источников ультрафиолетового излучения, которые
приводят к разрушению среды.
Адекватность используемой среды
1. Проверьте качество и адекватность среды по срав-
нению с друт ой средой (см. разд. 9.6).
2. Купите новую среду 1х, сравните ее с той, которую
вы использовали.
3. Если вы использовали среду 1х, проверьте среду
от другого производителя, проверьте отдельные
добавки к среде (например, сыворотку, факторы
роста, гормоны и т. д_).
Частота замены среды
Проверьтеконцен грацию клеток и pH. Возможно,pH на-
дает ниже 7,0 в переделах 48 ч, уровень pH слишком низок
в начале периода рек* га >ии концен] рация клеток слишком
высока. Кроме того, возможна контаминация среды.
Свойства сред
pH
Проверьте, находится ли pH в интервале между 7.0
и 7,4 в ходе культивирования, нет ли значительных
колебаний pH.
1. Проверьте поступление СО2в инкубатор (см. Обо-
рудование выше)
2. Проверьте регулировку поступления СО, (см. Обо-
рудование выше)
Если уровень pH слишком высокий,
а) возможно, концентрация СО, в инкубаторе слишком
низкая
б) Концентрация НСО , в среде слишком высокая
28.2. Среда
559
в) Если вы испольяуете DMEM, следует использовать
также |азовую смесь, содержащую 10?о СО,, если
она upniотовлена в соответствии со стандартной
рецептурой.
Осмоляльность; среда может быть гипер-
или гипотонической
1) Возможно, среда для исходной культуры была не-
верно составлена.
2) Возможно, неверно добавление одною из компо-
нентов.
3) Возможно, неверно произведено разведение.
1. Проверьте осмотические свойства на осмометре; она
должна находиться между 270 и 340 мОсмоль кг.
2. Проверьте подготовительные процедуры.
а) Правильно ли взято количество воды, необходи-
мое для разведения среды 10х или сухой среды?
б) Не влияет ли добавление реактивов на осмоляль-
ность?
Случайно пропущено добавление
одного из компонентов среды
1. Прш отовьте свежую порцию среды (это быстрее,
чем пытаться решить, какой компонент забыт)
2. Возможны, компоненты среды имели низкую рас-
творимость или произошла преципитация перед
фильтрацией, проверьте растворимость всех ком-
понентов до фильтрации.
3. Возможно, преципитация произошла при хранении,
убедитесь, что преципитат был растворен путем
перемешивания и подогревания до 37 °C.
4. Если осадок не растворяет ся, выбросьте всю партию.
5. Если осадок вновь образуется, обратитесь с жалобой
к производителю, или поменяйте поставщика.
Некачественные компоненты
1. Заменяйте по очереди компоненты, каждый раз
используя новый компонент от другою производи-
2. Сохраняйте записи номеров партий среды.
Новая партия среды для исходной культуры,
по-видимому, некачественная
1. Сравните партию с предыдущей, если остатки еще
сохранились
2. Сравните парты ю с партией от друЮ1 о поставщи ка,
если не сохранились остатки предыдущей.
Если среду готовят на BSS, удовлетворительно
ли качество BSS?
1. Проверьте резул ьт аты работы дру| их сотрудников,
использующих этот BSS.
2. Проверьте альтернативные источники BSS или
другой состав.
Если среду разводят в воде, удовлетаорительно
ли качество воды7
1 Проверьте результаты работы дру t их сотрудников.
2 . Сравните со свежей полной средой 1х.
28.2.1. Выбор среды
Производилось ли изменение состава среды
с момента получения клеток?
1. Вернитесь к ранее использованному типу среды
или проведите скринин! различных сред (см.
разд. 11.6.3). если исходная недоступна или не-
адекватна.
2 Пол уч ите среду из тою же источника, который был
поставщиком или автором клеточной линии.
3. Сравните компоненты среды с теми, которые вхо-
дили в среду от поставщика или автора клеточной
линии.
При получении (выделении) новой
клеточной линии:
1 Проведитескринин! нескодькихсред(см.разд. 11.6.3)
по нескольким параметрам;
а) Тип среды (см. разд. 9.6).
б) Тип сыворотки (см. разд. 9.6).
в) Концентрация сыворотки (см. протоколы 21.7,
21.8,21.9,21.10,и22.4).
2. Включите бессывороточную среду в скрининг (см.
разд. 10.5).
а) Селекции на основе критериев культуры тканей,
например MCDB 153 для эпидермальных кера-
тиноцитов.
б) Проверьте добавление факторов роста (см.
табл. Ю.З).
3. Проверьте качество фидерною слоя (см. разд. 8.4.2,
14.2.3) и кондиционированной среды (см. разд. 14.2.2)
и/или качество обработки матриксом (см.
разд. 8.4.1).
28.2.2. Нестабильные реактивы
Гпютамин
1 Хранить в замороженном состоянии при 20 °C.
2. Поскольку । лютамин разрушается до 50% в течение
3—5 дней при 37 °C, заменяйте среду каждые 3 дня.
3. Используйте стабильные альтернативные компо-
ненты — например, дипепгид Glutamax — с предва-
рительным тестированием.
Сыворотка
1. Храни гь замороженной
2. Если сыворотка сле| ка подтаяла, разморозьте ее
полностью, перемешайте и вновь заморозьте.
3. Проверьте партию сыворотки перед использованием.
4. Поочередно используйте разные партии среды, на
случай если плохое качество среды проявляется
медленно. (Возможно, потребуется 2—3 субкульти-
вирования.)
Другие компоненты
1 Храните при 4 °C
2. Большинство компонентов сред стабильны в тече-
ние 1—2 недель при 37 °C.
560
ГЛАВА 28. РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ
3. Храните добавки в виде малых аликвот, которые
размораживаются и используются однократно, не
замораживайте повторно основные растворы.
Трипсин
1. Храните концентрированные замороженные
основные растворы в виде малых аликвот для
однократного размораживания при одном исполь-
зовании
2. Приготовьте раствор из концентрата и храните
разведенный раствор ири 4 °C не более 2 недель.
3. Трипсин будет разрушаться, если оставить его при
комнатной температуре более чем на 30 мин.
28.3. ЧИСТОТА СОСТАВЛЯЮЩИХ
ЧАСТЕЙ
28.3.1. Правильно ли работает
система очистки воды?
Качество получаемой воды
1 Исследуйте проводимость воды.
2. Определите общее содержание органического угле-
рода в воде (total organic content, TOC; оборудова-
ние Millipore).
3. Проверьте среду, приготовленную разведением
сухой смеси в воде, сравнивания ее со средой 1х.
Режим технического обслуживания
оборудования
1. Koi да последний раз заменяли ионообменник?
2. Кота меняли картридж для обратного осмоса?
3. Все ли соединительные трубки чистые? Нет ли
признаков водорослей, грибов или бактерий?
4. Проверьте сосуды для хранения воды на предмет
зарастания водорос чями и грибами.
5. Проверьте, не происходит ли переход ионообмен-
ной смолы в воду.
6. Проверьте химические загрязнения или их оста-
точные количества в стеклянной емкости тепло-
обменника.
а) Снимите кожух со стеклянной емкости.
б) Промойте ее 1 М HCI и тщательно ироиоло-
в) Вылейте первую порцию воды после промы-
вания.
Следы химических веществ
в пластиковых трубках
1. Отсоединит е и очистите трубки
а) Замочите в горячем детергенте.
б) Прополощите и замочите в 1 М НС1.
в) Тщательно прополощите в деионизированной
воде.
г) Восстановите соединения трубок, первую пор-
цию полученной воды вылейте.
2. Замените трубки на новые инертные промы-
тые, стерилизованные пластиковые трубки (см.
разд. 11.3.5).
28.3.2. Бикарбонат
Правильна ли концентрация бикарбоната?
1. Проверьте проводимость или осмоляльность по
сравнению со стандартным раствором.
2. Попробуйте использовать другую партию.
3. Проверьте нет ли следов осадка.
Неправильно приготовленная концентрация
1. Проверьте, не ошиблись ли вы при приготовлении
среды (см. табл. 9.1.9.3,10.1 и 10.2).
2. Проверьте концентрацию СО, в инкубаторе.
28.3.3. Антибиотики
Проблемы могут быть связаны с
1) частотой использования
2) концентрацией
3) номером партии
4) комбинациями препаратов
5) употреблением фунт ицндов (наиример, амфотери-
цин В может быть токсичен)
28.3.4. Сыворотка
Вы используете новую партию?
1. Проверьте контроль качества, проведенный постав-
щиком.
2. Сравните па|>тию с предыдущей партией или с дру-
I ими партиями.
Концентрация
Слишком низкая? Слишком высокая?
1. Перепроверьте отсутствие токсичности, стимуля-
цию роста и эффективность иосева
а) Постройте кривую роста (см. протоколы 21.7,
21.8,21.9).
б) Проведите исследование клонального роста (см.
протокол 21.10).
2. Попробуйте заменить на
а) новую сыворотку от другого производителя
б) бессывороточную среду (см. разд. 10.5)
в) друтую среду с добавлением сыворотки (см
разд. 10.5.2)
28.4. ПЛАСТИКОВАЯ ПОСУДА
Вы используете новую марку,
тип или партию?
1. Проверьте вашу партию в сравнении с преды-
дущей.
28.5. Стеклянная посуда
561
2. Попробуйте использовать пластик от другого пос-
тавщика.
28.5. СТЕКЛЯННАЯ ПОСУДА
28.5.1. Мытье посуды
Имеют ли другие клетки признаки старения или
ухудшения роста? Есть ли проблемы у других ис-
следователей?
Имеются ли признаки следов загрязнения на стек-
лянных стенках бутылей для хранения или пипет-
ках? (см разд. 28 7.)
Достаточно ли хорошо были прополосканы после
мытья крышки? (Следует добавить несколько мл
BSS, изменение pH покажет присутствие детер-
гента, оставшегося на крышке.)
Не было ли совместной обработки посуды для куль-
туры тканей и посуды для химических реактивов?
28.6. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ
КОНТАМИНАЦИЯ
См. также табл. 18.1.
28.6.1. Контаминация, ограниченная
одним исспедователем
Спорадическая
Отдельные виды
1. Проверьте правильность приемов асептической
работы оператора (см. разд. 6.3—6.5).
2. Являются ли какая-то среда или реагент уникаль-
ными для это! о исследователя?
3. Проверьте личную чистоплотность и аккуратность
оператора.
а) Моет ли он руки до и после работы с культурой?
б) Меняет ли лабораторный халат?
в) Если у него длинные волосы, завязывает ли он
их сзади?
4. Распорядитесь, чтобы оператор надевал перчатки.
Микоплазма
1 Проверьте, нет ли у других исследователей призна-
ков контаминации микоплазмой.
2 . Удостоверьтесь, что осуществляется пршрамма
отбраковки контаминированных культур.
3 . Наиболее частым источником инфекции являются
принесенные из дру! их лабораторий культуры. До
применения их в скрининге для ишиыьзования
в основной культуральной зоне выдержите их в
необходимом карантине. Ведите журнал записи
поступления культур.
4 Проверьте продукты естественного происхождения
(сыворотка, трипсин) при помощи индикаторной
клеточной линии (см. протоколы 19.2,19.3).
5 (Граничьте использование антибиотиков при
формировании и ведении первичной культуры и в
критических экспериментах.
Мультиспецифическая
контаминация
Может возникнуть в результате !рубых нарушений
методов стерильной работы.
1 Убедитесь, что все необходимые процедуры прово-
дятся правильно (см. протокол 6.1):
а) Рабочее место в ламинарном боксе не загромож-
б) Все материалы протираются спиртом перед по-
мещением их в ламинарный бокс.
в) Все разбрызшвания и за:рязнения сразу же
вытираются.
2 Проверьте использование лабораторных халатов:
а) Заменялись ли лабораторные халаты перед на-
чалом культуральных работ?
б) Пришиты ли пуговицы на халаты и застешуты
Jin они? (Даже просто проходя мимо ламинар-
ных биксов в незасте! нутом халате с развеваю-
щимися полами, люди могут нарушить JiaMimap-
ный поток).
3 Проверьте, нет ли аналогичных проблем у дру!их
исследователей, работающих в том же ламинарном
боксе, возможно, работа ею нарушена и он нужда-
ется в техническом обслуживании.
Повторная контаминация
Отдельные виды
Проблема может быть связана с реактивами hjiii с
клеточной линией
1 Проверьте, есть ли какие-то реактивы, которые не
используются дру:ими исследователями.
2 . Проверьте, используется ли данная клеточная ли-
ния дру! ими исследователями.
Мультиспецифическая
контаминация
1 Проверьте приемы стерильной работы (см.
разд. 6.3—6.5).
2. Проверьте нестандартные рабочие методики.
3. Проверьте расположение рабочего места: возможно,
рядом располагается слишком много оборудования
или мимо рабочего места идет интенсивное движе-
ние (см. разд. 6.2)?
4. Не загромождено ли рабочее место в ламинарном
боксе?
5. Не используются ли нестерильные реактивы?
6. Проверьте использование лабораторных халатов
(см. разд. 26.8.1).
Постоянная контаминация
Отдельные виды
Контаминированный раствор
1 Смешайте среду (без антибиотика) 1:1 с питатель-
ным бульоном (например, L-бульон) и инкубируйте
раствор.
562
ГЛАВА 26. РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ
2. Нанесите среду на кровяной aiap. Инкубируйте
чашки, перевернув их вверх дном, с параллельным
«пустым» контролем.
Контаминированная клеточная линия
1. Проверьте клетки окрашиванием но Хехсту (см.
протокол 19.2).
2. Перемешайте клетки с бульоном и инкубируйте.
Мумьтиспецифическая контаминация
1. Проверьте приемы стерильной работы (см.
разд. 6.3-6.5).
2. Проверьте нестандартные методики на сохранение
стерильности.
3. Проверьте расположение рабочего места.* возможно,
рядом располагается слишком много оборудования
или мимо рабочей, места ндет интенсивное движе-
ние (см. разд. 6.2)?
4. Проверьте, сколько оборудования и дру,их материа-
лов находится одномоментно в ламинарном боксе.
Не зат ромождено ли рабочее место в лампнаре?
5. Проверьте, не используются ли (случайно или пред-
намеренно) нестерильные реактивы?
28.6.2. Распространенная контаминация
Спорадическая
Отдельные виды
1. Проверь те редко используемые реактивы или среды,
которые могут быть заражены.
2. Проверьте инкубаторы. Помойте, если это необхо-
димо (см. протокол 19.1)
3. Проверьте, не увеличилось ли количество спор в
воздухе путем экспозиции открытых бактериоло-
гических чашек с питательной средой в комнате в
нерабочее время.
Мультиспецифическая контаминация
Нарушения стерилизации
1 Проверьте стерилизационные шкафы на предмет*.
а) Избыточной загрузки стерилизуемым содержи-
мым, что препятствует адекватной циркуляции
воздушного потока.
б) Целостности дверных затворов и других от-
верстий.
в) Температуры и продолжительности цикла сте-
рилизации (160 °C в течение 1 ч).
2. Проверьте автоклавы на предмет:
а) Избыточной загрузки стерилизуемым содержи-
мым. что препятствует адекватной циркуляции
б) Температуры и продолжительности цикла
стерилизации (121 °C в течение 15—20 мин) с
применением эквивалентного образца в качестве
контроля, расположив его в середине загрузки.
в) С ледует убедиться, что все пустые сосуды откры-
ты перед автоклавированием для проникания в
них пара (см. рис. 11.3; цв. вкладку 22а).
Новый сотрудник не соблюдает правил СОП
1. Проверьте уровень работы новых сотрудников ири
помощи контролирующего опытного сотрудника.
2. Своевременно проводите тренин!и (см. разд. 2.1,
6.3-6.5).
Контаминированные хранилища
(холодные комнаты и холодильники)
1. Вымойте все хранилища.
2. Убедитесь, что стерилизованное оборудование не
хранится на открытых полках.
3. Проверьте цикл использования стерильных запасов.
Повторная контаминация, отдельные виды
Контаминированные реактивы или среда
1. Проверьте частотv использования реактивов раз-
ными сотрудниками, чтобы сузить проблему до
общеуиотребляемых реактивов.
2. Исследуйте наиболее подходящие «кандидатуры»,
инкубируя их с бульоном 1:1.
3. Проверьте инкубаторы на предмет контамина-
ции, при необходимости вымойте их (см. прото-
кол 19.1).
4. Проверьте ламинарный бокс
а) Протрите рабочую поверхность и боковые по-
верхности рабочей зоны раствором фенолоаль-
дет одного дезинфектанта в 70%-м спирте.
6) Протрите поверхность иод рабочей зоной раство-
ром фенолоальде( идного дезинфектанта в 70%-м
спирте.
в) Проверьте дру, ие компоненты воздуходувной
системы на предмет щелей и контаминации.
с) Проверьте целостность фильтров при помощи
анемометра или чашек с питательным агаром
(см. разд. 6.4).
а) Проверьте, не являются ли фильтры загрязнен-
ными или забитыми, наиример, нет ли перепада
давления на фильтре (см. разд. 6.4).
е) Проверьте соблюдение режима санитарной об-
работки, измените его, если необходимо.
5. Проверьте график профилактического ремонта и
технического обслуживания оборудования, изме-
ните его, если необходимо.
Повторная мулыписпецифическая
контаминация
Нарушенная стерилизация
1. Проверьте. не перегружаются ли автоклавы и сте-
рилизационные шкафы.
2. Проверьте, нет ли механических и электрических пов-
реждении автоклавов и стерилизационных шкафов.
3. Проверьте записи и распечатки циклов стери-
лизации
4. Проверьте целостность стерилизационной камеры.
5. Проверьте, выполняют ли новые сорбенты требова-
ния стандартных протоколов.
6. Проверьте уровень подготовки новою персонала.
7. Проверьте выполнение протоколов в присутствии
опытного сотрудника.
28.7. Химическая конатминация
563
8. Oi раничьте использование антибиотиков.
9. Проверьте, не было ли изменений в протоколах
и или в требованиях к их вы пол нению.
10. Перепишите СОП так, чтобы они соответствовали
изменившимся условиям.
Зараженные хранилища
(холодильники или холодные комнаты)
1 Вымойте хранилища.
2 . Убедитесь, что стерилизованные предметы не хра-
нятся на открытых полках.
Контаминированный воздух комнаты
1. Проверьте уровень контаминации комнатного воз-
духа путем оставления открытых чашек с кровяным
агаром в комнатах, koi да они не используются, но
вентиляция остается включенной.
2. Проверьте выполнение требований асептики опе-
раторами.
3. Проверьте целостность вытяжных колпаков.
4. Проверьте качество работы оборудования для по-
дачи воздуха и
5. Проверьте качество обработки вновь поступающего
оборудования.
6. Не проводятся ли ремонтные работы рядом с мес-
том работы с культурами? Если да, то постарай-
тесь улучшить качество изоляции культуральной
лаборатории (например, плотно закрывайте двери,
установите изолирующий экран, запретите проход
через культуральную лаборатории! всем сотрудни-
кам, не работающим в ней, мойте все оборудование
и материалы, поступающие в лабораторию)
28.6.3. Идентификация контаминации
Бактериальная, грибная
1. Проверьте на бактериальную и грибковую контами-
нацию клетки или среды, используя фазово-конт-
растную микроскопию.
2. Инкубируйте клетки в бульоне.
3. Посейте клетки на кровяной aiap и инкубируйте
культуру.
4. Окрасьте по Грамму клетки или проконсультируй-
тесь у микробиоло|а.
Микоплазменная
1 Окрасьте культуру по Хехсту а.3.3258 (см. прото-
кол 19.2).
2. Проверьте уровень цитоплазматического синтеза
ДНК (включение pHJ-тимидина), с использованием
авторадиографии (см. протокол 27.3).
3. Используйте коммерческие диагностические набо-
ры для определения микоплазмы (Приложение II
Определение микоплазмы).
Вирусная
1. Проверьте наличие вирусной контаминации, ис-
пользуя
а) Трансмиссионную или сканирующую электрон-
ную микроскопию.
б) Иммунное окрашивание флюоресцентными кра-
сителями или антителами конъю| ированными с
пероксидазой (см. протокол 16.11).
в) Исследованием ELISA
i) ПЦР
2. Получением клеточных линий и биоло!ических
реактивов из источников, свободных от вирусного
заражения.
28.6.4. Деконтаминация
1. Уничтожьте все рабочие культуры и не пытайтесь
произвести обеззараживание культур. ес.ш только
они могут быть восстановимы.
2. Деконтаминируйте клетки, только если они невос-
становимы (см. протокол 19.4).
а) Деконтаминацию должен проводить опытный
сотрудник.
б) Работайте в условиях карантина (см. разд. 19.1.8).
28.7. ХИМИЧЕСКАЯ КОНТАМИНАЦИЯ
28.7.1. Стеклянная посуда
Химические остатки после мытья посуды
1 Храните стеклянную посуду для культуральных
работ отдельно от посуды, предназначенных для
химических реактивов.
2 . Убедитесь, что не происходит переноса химических
остатков из последней промывки химической посу-
ды в посудомоечной машине
3 Проверьте наличие признаков загрязнения посуды
а) визуально;
б) добавлением небольшого объема BSS с феноло-
вым красным и наблюдением за уровнем pH,
в) добавлением небольшого объема UPW и провер-
кой электрической проводимости.
4. Клонируйте клетки в стеклянной посуде после сте-
рилизации сухим жаром.
5 Тщательно выбирайте детергент (см. разд. 11.3.4).
Накопление пыли при храпении
1 Закрывайте горлышки сосудов фольгой при хранении.
2 . Храните в зоне, чистой от пыли или в контейнере.
28.7.2. Пипетки
Остатки или засорение после мытья
1. Убедитесь, что пипетки промыты и высушены но-
сиками вверх.
2. Собирайте пипетки в емкость с детергентом, но
промывайте в чистой воде без добавок.
3. Не разрешайте использовать стеклянные пипетки
для разлива агара.
Б64
ГЛАВА 28. РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ
4. Проверьте иииетки после прополаскивания перед
стерилизацией
а) визуальным исследованием;
6) добавлением небольшою объема BSS с феноло-
вым красным н наблюдением за изменением pH;
в) добавлением небольшого объема UPW и провер-
кой проводимости.
5. Убедитесь, что ватные пробки были удалены перед
мытьем.
28.7.3. Очистка воды
См. разд. 11.4.1, 28.3.1.
28.7.4. Другие реактивы
Загрязнение DMSO растворенным пластиком
или резиной тары
1. Храните DMSO встеклянных или полипропилено-
вых емкое гях со стеклянными или полипропилено-
выми крышками.
2. Переливайте DMSO при помощи стеклянной пи-
нетки или автоматической пипетки с полипропи-
леновыми наконечниками.
Ухудшение качества глицерина
при длительном хранении
1. Покупайте небольшое количество лицерина, кото-
рое будет использовано в течение 3—6 месяцев.
2 Храните в темных бутылях.
28.7.5. Порошки и аэрозоли
1. Все манипуляции с токсичными химикатами, ко-
торые образуют порошки и аэрозоли, проводите в
защитном вытяжном колпаке (см. разд. 7.5.4)
2. Избегайте включения thi и при взвешивании порош-
ков или разливании жидкостей.
3. Контролируйте передвижение людей и перемеще-
ние оборудования в культуральную лаборат орию и
препаративную зону
4. Переодевайтесь в чистый лабораторный халат перед
входом в лабораторию культуры тканей.
28.8. ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА
28.8.1. Низкий выход клеток
в первичной культуре
Первичные эксплантаты не прикрепляются
1. Процарапайте субстрат сквозь эксплантат (см. про-
токолы 12.4 и 23.9).
2 Прижмите эксплантат покровным стеклом (см.
протокол 12.4).
3. Залейте в оусток плазмы (см. протокол 12.4).
Незавершенная дезаггрегация
1. Инкубируйте клетки в растворе протеазы в течение
более продолжительно! о времени
2. Попробуйте холодную предварительную обработку
перед инкубированием (см. протокол 12.6).
3. Используйте альтернативную или дополни тельную
обработку протеазой (см. табл. 13.4; разд. 12.3.6).
Завершенная дезаггрегация
при слабом прикреплении
Плавающие клетки жизнеспособны
1. Обработайте субстрат
а) Покройте пластик коллагеном, фибронектином,
ламинином, иоли-И-лизином или ноли-L-лизи-
ном (см. разд. 8.4.1).
б) Используйте фидерный слой (см. разд. 8.4.2:
протоколы 14.3,23.4 и 24.1).
2. Культура может быть неадгерентной, поэтому сле-
дует растить культуру в суспензии.
Плавающие клетки преимущественно
нежизнеспособны
1. Oi pei улиру йте концентрацию клеток путем иоде че-
та жизнеспособных клеток.
2. Удалите нежизнеспособные клетки (см. прото-
кол 12.10)
Плавающие клетки нежизнеспособны,
при этом небольшое количество клеток
прикрепилось к субстрату
Клеточная плотность
Клеточная плотность чересчур низкая, повысьте ее до
1х10'’кл./мл.
Плохая клеточная адгезия
Обработайте субстрат (см. разд. 8.4.1, 8.4.2 ц протоко-
лы 14.3.23.4. 24.1)
Используемые ферменты
слишком токсичны
1. Замените на apyiyio протеазу (см. разд- 12.3.6 и
табл. 13.4).
2. Уменьшите время экспозиции.
3. Используйте холодную предварительную обработ-
ку протеазой перед инкубированием (см. прото-
кол 12.6).
Очень кислая среда
1. Проверьте, не заражена ли среда (см. разд. 19.3).
2. Уменьшите концентрацию клеток при посеве или
через 24 часа после посева.
3. Добавьте буфер HEPES, приоткройте флакон
Неправильно выбранная
или плохо приготовленная среда
1. Проверьте ассортимент сред (см. разд. 9.6; табл. 9.3,
9.6,10.1,10.2 и 10.4).
28.10. Смена среды
565
2. Изучите литературу, касающуюся среды, которую
вы использовали для своих клеток (если вы до сих
пор не сделали этого)
Добавки в среду
1. Используйте разные партии или серии сыворотки
(см. разд. 9.6.2).
2. Замените сыворотку на бессывороточную среду (см.
разд. 10.5).
3. Используйте различные факторы роста (см.
разд. 10.4.3 и табл. 10.3).
4. Используйте другие митогены (наиример, РМА;
upocrat ландины; 1идрокортизон или друте сте-
роиды; цетидные гормоны, такие как инсулин и
трансферрин, см. табл. 10.2)
5. Используйте кондиционированные среды (см
разд. 9.7.3; протокол 14.2).
28.8.2 . Неверно выбраны клетки
Избыточный рост фибробластов
или эндотелия
1. Используйте селективные среды (см. разд. 10.2.1 и
14.6).
2. Используйте селективные субстраты (см. разд. 8.4.1
и 14.8).
3. Используйте селективный фидерный слой (см.
протокол 24.1).
4. Проверьте црисутс гвие перекрестной контаминации
из фидерного слоя или ксенотрансплантата (см.
разд. 19.5: протоколы 16.8.16.9 и 16.10).
Перекрестная контаминация с другими
клеточными линиями
Сравните с дру! ими линиями, которые в настоящее
время находятся в культуре (см. разд. 7.10.1,16.1, 16.3,
16.6.2, 19.5; табл. 13.2).
28.8.3 . Контаминация
1. Проверьте на предмет контаминации (см. разд. 19.3).
2. Предварительно обработайте ткань антибиотиками
(см. Приложение I: Среды и DBSS) или 70% этано-
лом (см. шаг 7, протокол 12.3).
3. Проведите эрадикацию контаминации, но только
если культура невосстановима (см. разд. 19.4).
28.9. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
28.9.1. Клетки не дифференцированы
1 Примените условия улучшающие дифференциров-
ку среды (см. разд. 17.7).
2. Используйте селективную среду (см. разд. 10.2.1;
табл. 10.1 и 10.2) ири выделении клеток и в ходе
наращивания культуры.
3. Растите культуру с соответствующим фидерным
слоем (см. разд. 17.7.1,17.7.3).
28.9.2. Снижение образования
продукта
1. Проверьте уровень экспрессии релевантного гена
с использованием RT-ПЦР или Нозерн-блоттиша
[Ausubel el al., 1996,2002J либо insitu i ибридизации
(см. разд. 27.8).
2. Проверьте экспрессию репортерного t ена (исполь-
зуя RT-ПЦР или Нозерн-блотиш [Ausubel el al.,
1996]; см. разд. 27.12.5).
3. Примените условия, индуцирующие дифференци-
ровку (см. разд. 17.7).
4. Используйте соответствующие селективные среды
для данною типа клеток (см. разд. 10-2.1; табл. 10.1 и
10.2) при выделении клеток и ведении культуры.
28.10. СМЕНА СРЕДЫ
28.10.1. Обычные монослои
pH падает слишком быстро
1 Проверьте на предмет бактериальной контаминации
(см. разд. 19.4.1).
2. Проводите смену среды чаще.
3. Посев клеток проводите при более низкой концент-
рации.
4. Добавляйте буфер HEPES в среду (см. разд. 9.2.3)
и используйте вентилируемые флаконы (см.
разд. 8.2.3).
pH повышается после смены среды
1 Уменьшите количеств бикарбоната или другого
щелочного компонента в среде.
2. Повысьте концентрацию СО, в среде.
3. Проверьте, нет ли протекания флаконов, инкуби-
руемых на воздухе, или в манжетном уплотнении
либо в крышке при инкубировании в СО,-инку-
баторе.
28.10.2. Клоны
Уровень pH слишком высокий
или слишком низкий
См. разд. 28.12.1,28.5.
Контаминированные чашки
1 Инкубируйте чашки в Специальной коробке (см.
разд. 6.6.2) и протирайте коробку спиртом перед
открыванием.
2. Выбрасывай те крышки от флаконов и чашек, в част-
ности, если на них есть следы среды Протирайте
снаружи 70% спиртом.
3. Не используйте вентилятор в инкубаторе.
566
ГЛАВА 26. РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ
Требования к смене среды
Монослой
Замените среду (см. протокол 12.1) и проверьте через
24 ч.
Суспензия
1. Добавьте среду в at ар для культуры.
2. Добавьте среду с Methocel в случае клонов Methocel;
питательные вещества диффундируют через метил-
целлюлозу.
28.11. СУБКУЛЬТУРА
Данный раздел посвящен обсуждению проблемы
низкого выхода клеток или медленного роста после
субкультивирования (см. также разд. 28.1).
28.11.1. Фазы клеточного цикла
при субкультуре
1. Субкультуру проводите на экспоненциальной
или поздней экспоненциальной фазе (см. прото-
кол 133).
2. Убедитесь, что посевная концентрация выбрана
правильно— при слишком низкой концентрации
клетки будут иметь слишком длительную lag-фазу,
при слишком высокой они будут выходить на плато
до того, как будет проведено субкультивирование
(см. разд. 13.73).
3. Не проводите субкул ьтивирование на стадии плато
поскольку клетки на этой стадии склонны иметь
продолжительную lag-фазу. Состояние некоторых
культур, например tибридом, клеток мышиной
лейкемии, будет быстро ухудшаться в фазе илато.
4. Не проводите субкультивирование чаще, чем это
необходимо. Подберите клеточную концентрацию
и интервал субкультивирования, которые наиболее
удобны и дают наиболее воспроизводимый резуль-
тат (см. разд. 13.7.2)
28.11.2. Старение
1. Проверьте количество поколений, после которых
развиваются признаки старения культуры, клетки
мщут быть приближаться к концу конечного жиз-
ненного цикла (см. разд. 3.8.1,13.7.2,18.4.1).
2. Замените рабочие культуры, как это обычно дела-
ется иутем размораживания (см. разд. 20.4.2).
3. Если необходимо, используйте иммортализацию
(см. протоколы 18.1,18.2).
28.11.3. Среда
Как в случае медленного клеточного роста (см.
разд. 28.1).
28.11.4. Неравномерный рост
Неслучайное распределение клеток
Как в случае клонирования (см. разд. 28.9.4).
Неправильный посев
1. При пикетировании старайтесь не вызвать враща-
тельного движения суспензии.
2. Не вносите клетки пинеткой в середину чашки без
перемешивания.
3. Не вращайте чашку с целью перемешивания клеток,
перемешивание производите покачиванием слева
направо и вперед-назад либо осторожным иииети-
рованием без завихрений суспензии.
Сотрясения инкубатора
1. Уменьшите частоту достуца в инкубатор
2. Проверьте надежность и устойчивость расположе-
ния инкубатора.
3. Убедитесь, что полки имеют горизонтальное распо-
ложение без yt ла наклона.
4. Поместите упругую прокладку под флаконы, чашки
и планшеты.
Неравномерное нагревание (см. рис. 8.10)
1. Поместите флаконы или чашки на теплоизоляци-
онную плитку или металлическую чашкз.
2. Проверьте воздух и распределение т емпературы.
28.12. КЛОНИРОВАНИЕ
См. также Медленный клеточный рост в данной главе.
28.12.1. Низкая эффективность посева
Слишком мало колоний на чашку
1. Повысьте посевную концентрацию.
2. Используйте фидерный слой.
3. Улучшите эффективность посева (см. разд. 14.2).
Колонии слишком диффузные
1. Выберите чашку Петри большего диаметра, чтобы
получить больше пространства для распростране-
ния колоний.
2. Используйте 1.чюкокортикоид (наиример, декса-
метазон. 1х10-5-1х1(Г'’М1.
Микоплазменная контаминация
1. Проведите скриниш на микоплазмы (см. протоко-
лы 1933-193.5).
2. Произведите эрадикацию микоплазм, но только как
последнее средство, если клеточная линия невосиро-
изводима (см. разд. 19.4.2; иротокол 19.4).
Неаккуратные манипуляции с культурой
1. Не находились ли клетки вне инкубатора слишком
продолжительное время?
28.13. Перекрестная контаминация
567
2. Не было ли время нахождения в растворе слишком
продолжительным?
3. Не испарилась ли среда во время инкубирования?
Среда
Тип среды
1. Выберите богатую среду (например, среда Хэма
F12).
2. Если среда бессывороточная, (например, MCDB 153
для кератиноцитов, см. табл. 10.1 и 10.2), попробуйте
друт ие бессывороточные среды.
3. СО, является существенным элементом, поэтому
всегда инкубируйте культуру выше минимума в
2% СО,-
4. Проверьте испарение путем взвешивания тест-чаш-
ки со средой ири тех же условиях в начале и в ходе
периода культивирования.
Если присутствие сыворотки существенно
1 Используйте FBS, которая обычно лучше подходит
для клонирования, чем сыворотка лошади или те-
2. Если FBS уже использовалась, повысьте ее концен-
трацию
3. Выберите партию на основе эффективности посева
клеток, которые вы используете (см. разд. 11.6.3,
протокол 21.10).
Бедный субстрат
Не изменили ли поставщика пластиковой посуды для
культуры?
1 Проверьте источник поступления пластика и. если
необходимо, измените его.
2. Попробуйте противоположно заряженный плас-
тик, например. Primaria (BD Biosciences), Cell-
BIND (Corning)
3. Покройте пластик матриксом (см. разд. 8.4.1, про-
токол 8.1; 17.7.3; протокол 23.9. FN V/ BSA).
28.12.2. Диффузные колонии
1. Обработайте чашки матриксом (см. разд. 8.4.1, про-
токол 8.1; 17.7.3; протокол 23.9: FN/V BSA).
2. Используйте 1люкокортикоид (например, 1х10~7-
IxKT’M дексаметазон) в течение первых 48—72 ч.
3. Используйте фидерный слой (см. протокол 14.3).
28.12.3. Слишком много колоний на чашку
1. Уменьшите посевную концентрацию (кл./мл).
2. Посейте то же количество клеток на чашку большего
размера.
Перекрывающиеся колонии
1 Уменьшите посевную плотность (кл. /см2).
2. Растите колонии в течение более короткого времени
(меньше клеток на колонию).
3. Посейте то же количество клеток на чашку большего
размера.
28 .12.4. Неслучайное распределение
См. также разд. 28.11.4.
1 Добавьте клетки к среде в бутыли, перемешайте
клеточную суспензию, а затем посейте чашки.
2. Не взбалтывайт е чашки при перемешивании клеток
или цри пипетировании.
3. Убедитесь, что чашки горизонтальны.
4. Удостоверьтесь, что среда покрывает все дно чашки
равномерно.
5 Убедитесь, что инкубатор не сотрясается.
6 (Граничьте доступ остальных работников к инку-
батору.
7. Промаркируйте коробку или иодное, содержа-
щий чашки с пометкой «КЛОНИРОВАНИЕ. НЕ
ТРОГАТЬ!»
8. Поместите коробку или иодное в i дубину инкуба-
тора.
9. Коробку или поднос следует поставить на коврик.
(Мойте коврик pei ул ярно)
28.12.5. Неприкрепляющиеся клетки
Клетки, независимые от прикрепления
к субстрату
1 Клонируйте клетки в aiape (см. протокол 14.4),
ai арозе или метилцеллюлозе Methocel (см. прото-
кол 14.5), нанесенные на подложку в чашках не для
культуры тканей.
2. Добавите факторы роста или добавки к подложке.
3. Используйте чашки для культуры тканей и посейте
фидерный слой до заливки подложки.
Плохо адгезирущие клетки
Клонируйте клетки в Methocel в чашках для культуры
тканей (см. протокол 14.5)
28.13. ПЕРЕКРЕСТНАЯ
КОНТАМИНАЦИЯ
В данном разделе обсуждается проблема перекрестной
контаминации с дрУ1 ой клеточной линией
28.13.1. Симптомы перекрестной
контаминации
Изменения во внешне виде
Морфология клеток изменяется
Клетки накапливаются и громоздя гея дру! на друiа
при высокой плотности на стадии плато, ири этом в
норме в культуре имеет место контактное ишибиро-
вание роста.
568
ГЛАВА 28. РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ
Изменение ростовых характеристик
Скорость роста повышается (т. е. укорачивается время
удвоения популяции (PDT).
Клетки растут до более высокой плотности насыщения.
Характеристики клеточных линий
Изменения фенотипических характеристик (см.
разд. 16.1,17.1,18.3).
28.13.2. Предупреждение перекрестной
контаминации
См. также разд. 19.5.
1. Не пользуйтесь одной банкой реактивов вместе с
дру| ими исследователями.
2. Не используйте одну банку реактивов для несколь-
ких клеточных линий
3. Не манипулируйте одновременно с более чем одной
клеточной линией
4. Не возвращайте иииетку в среду после исполь-
зования или после использования в работе с
клетками.
5. Не используйте автоматическую пинетку для се-
рийных манипуляций, если только не применяются
наконечники с фильтрами.
6. Манипуляции с быстрорастущими культурами, та-
кими как HeLa и дру! не, производите в последнюю
очередь.
7. Проводите аутентификацию клеток перед замора-
живанием (см. разд. 16.1,16.3).
28.13.3. Элиминация перекрестной
контаминации
1. Уничтожьте культуры!
2. При ран нем обнаружен ии контаминации (наири-
мер, при наличии признаков смешанной культу-
ры) и отсутствии возможностей иолучить чистые
исходные культуры клонируйте клетки (см.
протокол 14.1) и изолируйте колонии, напомина-
ющие желательные культуры (см. протоколы 14.6
и 14.7).
3. Выполните позитивный и ншативный сортиш
методом FACS (см. разд. 15.4) или MACS (см.
разд. 15.3.2).
28.14. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ
28.14.1. Плохое восствновпение
б) Используйте доступный морозильник для изме-
нения скорости замораживания и формы кривой
роста.
Концентрация клеток
При замораживании
Повысьте концентрацию клеток при замораживании
(оптимальной обычно является концентрация 1х10‘‘
1x1(1'/кл./мл, см. разд. 20.3.2; протокол 20.1).
Размораживание и пересев
1. Разведите культуру медленнее после разморажива-
ния (см. протокол 20.2) путем постепенного добав-
ления среды к клеткам.
2. Пересейте клетки в посевной концентрации в
пять раз превышающей нормальную (см. прото-
кол 20.2).
3. Запасите несколько ампул (вам потребуется цен-
трифу! ировать несколько раз для отмывания кон-
серванта, см. протокол 20.2).
4. Удалите нежизнеспособные клетки (см. прото-
кол 12.10)
Консервант
DMSO
1. Проверьте, нет ли химического за! рялнеиия DMSO
(пластиком или резиной).
а) Проверьте цвет; DMSO должен быть бес-
цветным
б) Если DMSO бесцветный, проведите спектрофо-
тометрическое исследование и сравните резуль-
таты со свежим DMSO.
2. Проверьте, способны ли клетки к дифференцировке
последействия DMSO(см.разд. 17.7.2).
3. Центрифугируйте клетки, растущие в суспензии,
чтобы удалить консервант
Гпицерин
Глицерин токсичен при хранении в течении нескольких
месяцев на свету (он переходит в акролеин)
1. Разлейте 1лицерин но аликвотам.
2. Храните глицерин в темноте.
28.14.2. Изменение внешнего вида
купьтуры после криоконсервации
Ошибочная идентификация
1. Проверьте маркировку ампулы. Если маркировка
неразборчива, уничтожьте ампулу.
2. Проверьте записи (см. разд. 20.3.6).
3. Проверьте аутентификацию (см. разд. 16.3).
Скорость замораживания
1. Измените скорость охлаждения (см. разд. 20.3.4).
хотя 1 °C. мин обычно оптимально.
а) Измените толщину стенки если используется
неизолированный контейнер для заморажи-
вания.
Изменились условия с тех пор, как клетки
растились последний раз
1) Появились новые члены лаборатории?
2) Появились новые методы работы?
3) Изменились поставщики сред?
4) Начали использовать новую партию сред?
28.16. Подсчет клеток
569
28.14. 3. Контаминация
Негерметичность ампул
Проверьте герметичность: крышка должна быть плот-
но закрыта, уплотняющая прокладка не должна быть
деформирована.
Контаминация из водяной бани при
размораживании
1. Не заливайте ампулу водой полностью, поместите
ее в поднос только частично погруженной в воду.
2. Размораживайте ампулы в подогреваемой емкости.
3. Тщательно протирайте ампулы после разморажи-
вания.
• Требование безопасности. Помните, что ам-
пулы MoiyT взрываться при хранении в жидкой фале
азота, поэтому при размораживании помещайте ее в
поддон и закрывайте сверху.
Контаминация из жидкого азота
Не погружайте ампулы в жидкий азот полностью. Ис-
пользуйте для хранения фазу, содержащую пары азота
или перфузируемый кожух морозильника.
28.14. 4. Утрата рабочей культуры
Утрата рабочей культуры пользователем
Получите новую рабочую культуру от распределителя
культур (дистрибьютера).
Утрата культуры у дистрибьютера
Вновь нарастите рабочую культуру из исходной куль-
туры.
Утрата исходной культуры
1. Проверьте надежность контроля за хранением; он
должен проводиться только заведующим.
2. Восстановите запасы из надежной» клеточного банка
(см. Приложение II Клеточные банки)
28.15. ГРАНУЛЯЦИЯ КЛЕТОК
Внутриклеточная
Клетки нездоровы?
1. Проверьте кривую роста (см. протоколы 20.7 и 20.8)
2. Проверьте эффективность посева (см. иротокол 20.9).
Имеет ли место высокий уровень фагоцитоза?
Проверьте уровень захвата нейтрального красного или
флюоресцентного декстрана (FITC-dexlran, Sigma)
ири помощи <|йзои!НХ) микроскопа при большом уве-
личении.
Внеклеточная
Единообразный размер частиц
Проверьте на предмет контаминации (см. разд. 19.3).
Различный размер частиц
1. Проверьте преципитацию среды (см. разд. 28.2,
28.2.2).
2. Нет ли преципитации из сыворотки (обычно не
опасной)?
28.16. ПОДСЧЕТ КЛЕТОК
28.16.1. Гемоцитометр
Различные значения при подсчете
Ошибка взятия образца
1 Тщательно перемешивайте клеточную суспензию
перед взятием образца.
2 . Клетки должны быть суспендированы до единич-
ных клегок и не образовывать щустков (см. прото-
кол 21.1).
Использование гемоцитометра
1 Убедитесь, что покровное стекло upiijieiaer пра-
вильно (видны интерференционные кольца; см.
разд. 21.1.1.).
2. Убедитесь, что счетная камера заполнена полно-
стью, но не переполнена
3. Достаточным считается количество клеток >200.
Различимость клеток
1. Серебрение в счетной камере не должно поврежд ать
клетки
2. Используйте фазово-контрастную оптику.
3. Если фазово-контрастная оптика недоступна, ис-
пользуйте нецентрованный световой пучок.
4. Исследуйте окраску клеток до их подсчета.
28.16.2. Электронный счетчик
клеток посредством
измерения сопротивления
при пропускании
через дроссель
Вариабельность подсчета
Ошибки взятия образца
1. Тщательно перемешивайте клеточную суспензию
перед взятием образца.
2. Клетки должны быть суспендированы до единич-
ных клеток и не образовывать щустков (см. прото-
кол 21.2).
Подсчет клеток останавливается,
не начинается или идет медленно
(более 25 с)
Забит дроссель
или клеточный канал
1 Проведите промывочный цикл.
2. Проведите цикл промывания дроссельного отвер-
S70
ГЛАВА 28. РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ
3. Протрите дроссель кончиком пальца или мягкой
кисточкой.
4. Замочите в детер! енте на 1—18 ч и повторите проце-
дуру промывания дросселя и трижды промывочный
цикл всего счетчика.
Значения при подсчете ниже, чем ожидалось,
или дроссель часто забивается
Клеточная суспензия агрегирует
1. Энер< ично дисиер! ируйте клетки анкетированием
исходного образца, разведите образец и продолжите
подсчет.
2. Используйте различные методы дезагре1ации (см.
табл. 13.4).
Фоновые значения высокие,
но подсчет клеток не ведется
Электрод не помещен в стакан или отсоединен
1. Поместите электрод в стакан.
2. Проверьте присоединение электрода.
3. Замените электрод, если отсутствует плата с клем-
мами.
Цикл подсчета не начинается
Забит дроссель
1. Проведите промывочный цикл.
2 Проведите цикл промывания дроссельного отверстия.
3. Протрите дроссель кончиком пальца или мягкой
кисточкой.
4. Замочите в детергенте на 1—18 ч и повторите проце-
дуру промывания дросселя и трижды промывочный
цикл всего счетчика
Недостаточно отрицательное давление
1 Проверьте заполненность емкости для слива отходов.
2. Проверьте насос ( см. Инструкция, дна, ностический
тест) и соединения.
3. Если обнаружены поломки в насосе, вызовите ин-
женера.
Высокий фон подсчета
Проблемы, связанные с интерференцией
от электрических проводов или радиоволн
Существуют проблемы, связанные
с электрооборудованием (двигатели,
флюоресцентные лампы инкубаторы)
1 Проверьте и удалите возможные источники пробле-
мы путем установки 1асителей шумов на оборудова-
ние. Можно приобрести линейные фильтры, однако
они не всшда эффективны
2 . Проверьте заземление счетчиков, в том числе кор-
пуса п установочной станины.
Твердые примеси в жидкости для подсчета
1. Приготовьте свежую жидкость.
2. Профильтруйте жидкость через одноразовый
фильтр Millex или аналш ичный фильтр.
28.17. ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ
28.17.1. Морфологические признаки
Грануляция и вакуолизация
(см. также разд. 28.15)
Внутриклеточная грануляция обычно связана с тем,
что клетки нездоровы. Вакуолизация обычно также
показывает, что клетки нездоровы (см. рис. 13.1).
Утрата двойного лучепреломления
Монослойные клетки
Если клетки в норме обещают двойным лучепреломле-
нием (на краях клетки в фазово-контрастном микроско-
пе обнаруживается гало), то утрата его обычно связана
с последующей потерей жизнеспособности, например
при высыхании в ходе смены среды в культуре.
Суспензионные клетки
Суспензионные культуры клеток обычно чистые и
прозрачные; грануляция или мутность свидетельствует
о тбе.ш или ухудшении состояния клеток.
1. Поменяйте среду. Монослойные клетки всплывут,
если они нежизнеспособны и таким образом не пот-
ребуется специальных процедур для их удаления.
2. В случае суспензионных или первично дезагре! иро-
ванных клеток, обогащение жизнеспособных клеток
производится путем осаждения из на Ficoll-Paque
(см. протокол 12.10).
28.17.2. Определение жизнеспособности
Если имеется промежуточная утрата клеток, связанная
с манипуляциями, проверьте их жизнеспособность ме-
тодом исключения красителя (см. протокол 22.1) или
включения красителя (см. протокол 22.2) постарайтесь
удалить причину.
а) Жизнеспособность первичных культур обычно
составляет 50—90%.
б) Жизнеспособность клеточных линий обычно
90-100%.
в) Жизнеспособность размороженных клеток обыч-
но 50-80%.
28.17.3. Цитотоксичность
Если ухудшение состояния культуры продолжается
длительное время, попробуйте обнаружить возможную
причину методом клоногенного исследования (см. про-
токол 22.3) или микротитрации (см. протокол 22.4).
Глава 29
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Моим намерением было на страницах этого руковод-
ства описать достаточно подробно основы клеточной
культуры, с обращением к литературе, которая может
потребоваться, только если исследователь решит рас-
ширить спектр выполняемой работы сверх обычных
методов или прояснить некоторые дополнительные
детали основных приемов и методов. Исходя из опыта
при чтении лекций, в заключение цикла дается неко-
торое резюме, которое подчеркивает основные пункты,
на которых останавливался лектор. Сейчас я хотел бы
сделать заключение вышеприведенному тексту.
Существуют определенные требования, которые
являются принципиальными для успешной и вос-
производимой клеточной культуры, они мотут быть
определены следующим образом.
• Удостоверьтесь, что ваши инстру кции и под: отовка
всех, кто работает с вами, происходят из заслужива-
ющих доверия источников.
• Работайте в чистых помещениях, не перегруженных
оборудованием и сотрудниками, используя для
работы асептические зоны, которые следует обра-
батывать по окончании работы.
• Для того чтобы избежать переноса контаминации,
включая перекрестную, не делите ни с кем среды,
реактивы, культуры или материалы.
• Не думайте, что ваша работа не подвержена дей-
ствию микоплазмы, даже если вы никогда не наблю-
дали ее; регулярно поводите проверку.
• Ведите адекватные записи, в частности отмечай-
те все изменения в методах, средах, реактивах и
фото<рафируйте клеточные линии, которые вы
используете.
• Работайте только с теми клеточными линиями, ко-
торые были получены из соответствующим образом
сертифицированных источников, таких как Меж-
дународный банк клеток. Не доверяйте остальным
клеточным линиям, даже происходящим от автора,
если только вы не можете подтвердить аутентич-
ность клеточной линии
* Как можно более детально ознакомьтесь со свойства-
ми клеточной линии, которую вы использует е — внеш-
ние признаки, ско]ххл ь роста и особые характеристи-
ки так. чтобы вы moi ли немедленно oi peai ировать
на любые изменения, происходящие в культуре.
• Убедитесь, что ваша работа не угрожает вашей соб-
ственной безопасности или безопасности сотрудни-
ков, окружающих вас.
• Храните ростковые клеточные линии в жидком
азоте и регулярно .шменяйте рабочие линии.
• Защищайте исходные культуры жизнеспособных
клеточных линий и используйте для передачи и рас-
пределения культуры дру! ие рабочие культуры
• Старайтесь работать в таких условиях, которые в
точности определены, включая минимальное ис-
пользование неопределенных добавок к среде, не
вносите никаких изменений в методики ио незна-
чительным поводам
• Не смешивайте работу с клеточными культурами с
микробполо! пческими работами
Для того чтобы рассмотреть все увлекательные ас-
пекты клеточных и тканевых культур, потребовалось
бы написать много томов и изменить цель написания
данной книти. Предоставление всей информации,
достаточной для создания и налаживания работы ла-
боратории культуры тканей, превышало мои задачи.
Для этого потребовалось бы описать подготовку необ-
ходимых материалов, разработку некоторых наиболее
важных методов, необходимых для характеристики п
понимания свойств ваших клеточных линий. Эта киша
сама по себе для вас, возможно, окажется недостаточно
полной, но с помощью ваших сотрудников и колле!
из других лабораторий она облеотит вам вхождение в
работу с культурой тканей и сделает ее более приятной
и приносящей удовлетворение.
Приложение I
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
Данное Приложение содержит список реактивов, ко-
торые используются в нескольких различных прото-
колах, использованных в книге. Специализированные
реактивы, используемые только в одном протоколе,
в основном расположены в разделе Материалы это, о
протокола
Замечание. Разведения, которые упоминаются
в тексте, 1:10 или 1:100, являются объемными (v/v),
и подразумевается, что конечный объем составляет
10 или 100 частей соответственно.
Агар 2,5%
At ар...............................2,51
UPW...... .. ...............100 мл
1) Кипятить до растворен ия at ара
2) Стерилизовать автоклавированием или кипячением
в течение 2 мин
3) Хранить ири комнатной температуре
Амидо Черный
См Нафтиленовый черный
Аминокислоты, главные
См. разд. 9.4.1 и табл. 9.3. Предлагаются в виде кон-
центрата 50х в 0,1 М HCI такими компаниями, как
Invitrogen, MP Biomedicals, и Sigma.
1) Приготовьте тирозин и триптофан вместе в концент-
рации 50х в 0,1 М HCI и оставшиеся аминокислоты
при ЮОх в UPW.
2) Развести для использования, как описано в прото-
коле 11.10.
3) Стерилизовать фильтрацией.
4) Хранить в темноте при 4 °C.
Аминокислоты, второстепенные
Ингредиенты........................г/л (ЮОх)
I. аланин...............................0.К1
I. а< параши Н,().......................1.50
I. испари inноваи кт лота...............1.33
I лицин.................................0.75
I. t липам инока и кислота..............1.47
I. иролин...............................1,15
I. серин................................1.05
Вода... ....................1000 м.)
2) Хранить ири 4 °C.
3) Использовать при концентрации 1:100.
Антибиотики
См. отдельные заголовки Оксици i /ин, Стрептомицина
сульфат. Канамицина сульфат. Гентамииин. Мико-
статин.
Бактопептон, 5%
Difco Bactopeptone..........................5 г
Раствор Хэнкса BSS........................100 мл
1) Перемешивать до растворения
2) Разлить но аликвотам в соответствии с использова-
нием как раствор 1:50, автоклавировать.
3) Хранить ирн комнатной температуре.
4) Развести 1 /10 перед использованием
Буферный раствор Mcllvaines, pH 5,5
Ha20.v.i
0,2 М Na.HPO, (28.41, л) 11,37 мл
0,1 М лимонной кислоты 8,63 мл
(21,0 г л)
На 100 мл
56,85 мл
43,15 мл
Версен
См. EDTA
Витамины
Подробно представлены в описаниях сред (см. табл. 9.3,
10 1,10.2) и поставляются в концентрациях ЮОх.
1) Пр1и отапливается индивидуально как основной рас-
твор 1000— Ю,000х и соединяется ио необходимости
с друшми концентратами ЮОх.
2) Стерилизовать фильтрацией.
3) Хранить при -20 °C в темноте.
Гентамицин
Развести до 50 mki мл перед использованием
Гимза краситель
Краситель Гимза можно приобрести в сухом виде и
затем развести его в буферном растворе или воде (см.
иротокол 16.2), либо развести в буферном растворе
непосредственно перед использованием. Автор находит
более удачным для культуры клеток первый метод
1) Стерилизация фильтрацией
1) Приготовление буфера:
Приложение 1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
573
NaH,HPO,*2H,O.........0,01 М.......1,381/л
Na2HPO4• 7Н2О.........0,01 М.......2,681 <
Доведите pH до 6,5.
2) Разведите концентрат красителя Гимза 1:10 в 100 мл
буфера.
3) Профильтруйте раствор через бумажный фильтр
Whatman No. 1.
4) Каждый раз готовьте свежий раствор, поскольку
концентрат дает преципитацию ври хранении.
Глюкоза, 20%
Глюкоза.....................................201
Раствор Хэнкса до.......................100 мл
1) Стерилизовать автоклавированием.
2) Хранить при комнатной температуре.
Глютамин, 200 мМ
L-глютамин............................29,2 i
Раствор Хэнкса........................1000 мл
1) Разведите глютамин в BSS, стерилизуйте фильтра-
цией (см. протоколы 11.12, 11.13).
2) Разлейте но аликвотами и храните при —20 °C
Глютатион
1) Приготовьте 1 ООх раствор (т. е. 0,1 М в HBSS или D-
PBS А), и разведите до 1 мМ перед использованием
2) Стерилизовать фильтрацией.
3) Разлить по аликвотам и хранить при 20 °C
Дексаметазон (Merck)
1 мг/мл (ЮОх)
Этот реактив поступает уже стерильным в стеклянных
флаконах.
1) Для разведения добавьте 5 мл воды шприцом во
флакон.
2) После растворения отберите шприцом.
3) Разведите до 1 мг, мл, примерно 2,5 мМ.
4) Разлейте по аликвотам и храните при —20 °C.
5) Для использования разведите раствор до получения
10—50 нМ (диапазон физиоло| ической концентра-
ции), 0.1—1,0 мкМ (диапазон фармаколо! ических
доз) или 25 100 мкМ (диапазон высоких доз).
Р-метазин ((Лахо) и метилпреднизолон (Sigma) moi уч
быть приготовлены таким же образом
Забуференный глицерин (для заключения)
См. Микоплазма
Канамицина сульфат (канназин), 10 мг/мл
Канаминин........................4,1-г флаконы
BSS Хэнкса..............................400 мл
1) Добавить 5 мл HBSS из 400-мл бутыли HBSS в
каждый флакон.
2) Оставить на несколько минут для растворения.
3) Отобрать HBSS и канамицин из флаконов и вернуть
раствор в сосуд с HBSS.
4) Добавить еще 5 мл HBSS в каждый флакон, прополос-
кать и вернуть в бутыль с BSS. Хорошо перемешать.
5) Разлить раствор но 20-мл аликвотам в стерильные
контейнеры и хранить при 20 °C
6) Тест на стерильность: добавить 2 мл реактива к
10 мл стерильной среды без антибиотиков, инкуби-
ровать раствор при 37 °C в течение 72 ч.
7) Исиользоватьпри концентрации 100 mki мл.
Карбоксиметилцеллюлоза КМЦ (СМС)
1) Взвесить 41 КМЦ и поместить в химический стакан.
2) Добавить 90 мл солевого раствора Хэнкса и перенес-
ти смесь в кипящую баню, чтобы увлажнить КМЦ.
3) Оставить на ночь при 4 °C для отстаивания.
4) Довести объем до 100 мл раствором Хэнкса.
5 ) Стерилизовать автоклавированием. КМЦ снова крис-
таллизуется, но может быть растворена при 4 °C.
6) Для использования (например, для повышения
вязкости среды в суспензионной культуре), исполь-
зуется 3 мл на 100 мл ростовой среды.
Коллагеназа
2000 Ед /мл в растворе Хэнкса
Коллагеназа Worthington CLS-степени
очистки или эквивалентной
(активность 1500—2000 Ед/'мг).....100000 Ед
Раствор Хэнкса...........................50 мл
1) Для растворения смеси перемешивать 37 °C в тече-
ние 2 ч пли при 4 °C в течение ночи.
2) Стерилизовать фильтрацией как сыворотку (см.
протокол 11.15).
3) Разделить на аликвоты, так чтобы использовать в
течение 1—2 недель.
4) Хранить при —20°С.
Коллаген аза-трипсин-сыворотка цыпленка
(СТС) [Coon &Cahn, 1966]
Стерильное
вещество
Раствор солей без С а1 2* и Mg’*
[Moscona, 1952]
Трипсин, 2,5%,
Коллагеназа, 1%,
Сыворотка цыпленка
Разлить на аликвоты и хранить при —20 °C
Объем
Конечная
концентрация
1 мл
10 мл
Колцемид
Колцемид, концентрат ЮОх..............100 мг
Раствор Хэнкса........................100 мл
1) Перемешивать до растворения.
2) Стерилизовать фильтрацией.
3) Разлить на аликвоты и хранить при 20 °C
• Требование безопасности. Кольцемид токси-
чен; все манипуляции проводить в вытяжном шкафу в
резиновых перчатках
S74
Приложение 1. ПРИГОТОВГЕНИЕ РЕАКТИВОВ
Красители для оценки жизнеспособности
См. Нафтиленовый черный
Трииановый синий поставляется большинством
компаний-поставщиков материалов для культуры
тканей (см. Приложение II).
Кристаллвиолет 0.1%. в 0.1 М лимонной
кислоте
Лимонная кислота . _._ _______.. ._____21,0 i
Кристаллвиолет_________________________1,0 i
1) Довести до 1000 мл деионизированной водой.
2) Перемешивать до растворения.
3) Для осветления профильтруйте раствор через филь-
тровальную бумагу Whatman No. 1.
Кристаллвиолет 0,1% в воде
Крцспылвиолет_________________________100 mi
Бода__________________________________100 мл
Фильтровать через бумажный фильтр Whatman No. 1
перед использованием.
Поставляется в готовом виде компанией Merck.
Лактальбумина гидролизат 5% (10х)
Лактальбумина гидролизат________________5 i
HBSS__________________________________100 мл
1) Подогреть до растворения.
2) Стершшзовать авток.1авированием.
3) Исшыьзовать в концентращш 0,5°о.
Лимонная кислота/кристаллвиолет
См. Кристаллвиолет
МЕМ
См разд. 9.4 и табчь 93.
2-меркаптоэтанол (MW 7В)
Основной раствор, 5 мМ_______________4 мкл
HBSS____________________ 10 мл
1) Стерилизовать фильтрацией в вытяжном шкафу.
2) Хранить при 20 °C и.ш каждый раз готовить све-
жий раствор.
Метоцель (Methocel).
См Метилцеляю.юза.
Метилцеллюлоза (1,8%)
1) Взвесить 7,2 i Methocel и добавить в 500-мл бутьшь,
содержащую больший вЮ1адыш для машитной ме-
шалки.
2) Стерилизовать автоклавированием с ослабленной
крышкой для проникновения пара.
3) Добавить 400 мл стерильной L’PW, подогретой до
90 °C для увлажнения Methocel
4) Перемешивать при 4 °C в течение ночи до рас-
творения (Methocel будет образовывать плотный
гель, если не перемешивать с помощью мешалки).
В результате получается раствор Methocel 2х, для
использования он должен быть разведен равным
объемом среды 2х по вашему выбору. Бсыее точно
можно набрать объем Methocel, ec.m использовать
шприц без Htjtbi.
5) Перед использованием добавьте клеточную сус-
пензию в малый объем ростовой среды (см. прото-
кол 143).
Митомицин С
Основной раствор, 10 mki мл (50х)
Митомицин______________________2-Mi флакон
1) Внести 20 мл HBSS в стерильный контейнер.
2) Отобрать 2 мл HBSS шприцом и добавить вофлакон
с митомицином.
3) Оставить до растворения. Отобрать получившийся
раствор и вернуть обратно в контейнер с HBSS.
4) Хранить в течение 1 неде^т при 4 "С в темните (за-
крыть контейнер алюминиевой фо^пьгой).
5) Для более продолжительного хранения хранить
ири 20 °C.
6) Развести до 0,25 mki мл для 18- часовой экспозиции
клеток ilui 20 mki мл для 10-часовой экспозиции
(см. протоколы 14.3,23.4).
• Требование безопасности. Митомицин яв-
ляется токсичным, все манипуляции с порошкчюбраз-
ным митомицином следует производить в вытяжном
шкафу.
МТТ
1) Растворить 3-(4,5-диметилтиазолин-2-ил)—2,5-дифе-
нилтетразолия бромид (МТТ) 50 мг мл в D-PBSA.
2) Стерилизация фильтрацией.
Требование безопасности. МТТ токсичен;
взвешивать в вытяжном шкафу в перчатках.
Микоплаза, реактивы
Красители (см. Хехст 33258)
Гистолспическая среда: итцерин в буфере Mcllvaines
pH 5,5
Для приготовления 40 ил
0,4 М Na,HPO, (5,8 г/л)____________11,37 мл
0,2 М Лимонной кислоты (42.0 г/л)__8,63 мл
Глицерин___________________________20,00 мл
1) Добавить Vectashield (Vector) чтобы уменьшить
затухание флюоресценции (см. Инструкцию про-
изводителя).
2) Проверить pH и довести до 5,5.
Микостатин (Нистатин)
1) Приготовить раствор (10()х) с концен (рацией 2 мг мл.
Микостатин_____________________________200 mi
Раствор Хэнкса BSS_____________________100 мл
Приложение 1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
575
2) Далее по той же методике, что и прш отопление канамицина (см.). 3) Конечная концентрация 20 mki/мл. Раствор Тайрода (Tyrode’s Solution) Nat I 8.001 Kt I 0.20 i Cat 1, 0.201
Нафталеновый черный 1) Приготовить раствор 1% в BSS Хэнкса. Mg Cl,611,() 0.10 1 Na 11,1’0, 11,0 0.05 i Глюкоза 1.00 i
Нафталеновый черный 1 g Раствор Хэнкса В S S 100 мл ll’W-io 1л Газовая фаза.... ... Воздух
2) Максимально растворить краситель. 3) Профильт ровать насыщенный раствор через бумаж- ный фильтр Whatman No. 1. Раствор Хекста (Hoechst) 33258 [Chen, 1977] 2-[2-(4-i идроксифенол)-6-бензимидазоил]-6-( 1-метил- 4-нииеразил) бензимидазола тригидрохлорид
Пеногаситель RD эмульсия 9964.40 (см. Приложение II) 1) Прш отопить основной раствор 1 mi мл в D-PBSA или HBSS без феноловою красного. 2) Хранить раствор ири 20 °C. Перед использованием
1) Разлить но аликвотам и стерилизовать автоклави- рованием. 2) Хранить при комнатной температуре. 3) Развести 0,1 мл/л (1:10 000). развести 1:20000 (1,0 мкл в 20 мл) в D-PBSA или HBSS без феноловою красною нри pH 7.0. • Требование безопасности. Поскольку данное вещество может быть канцерогенно, все манипуляции
Пенициллин (например Crysiapen benzylpenicillin [sodium j) 1000 000 Ed во флаконе. с ним проводите в вытяжном шкафу. Сбалансированный солевой раствор (BSS) См. табл. 9.2.
1) Приготовление как для канамицина, конечная кон- центрация 10 000 U, мл. 1) Развести каждый компонент отдельно, последним добавить СаС12.
Crysiapen 4 флакона (4 х 10" Ед) HBSS 400 мл 2) Довести до 1 л. 3) Довести pH до 6,5. 4) Стерилизовать раствор автоклавированием или
2)Хранить замороженным при 20 °C в аликвотах ио 5 10 мл. 3)Исиользоваты1ри концентрации 50-100 Ед мл. фильтрацией. При автоклавировании pH должен оставаться ниже 6,5, чтобы предупредить преципи- тацию фосфата кальция; кальций можно исключить и добавить позже. Если в состав входит тлюкоза.
Перколл (Percoll) 1) Percoll поставляется стерильным и готовым к упот- реблению, он должен быть разведен средой или HBSS до получения необходимой плотности. 2) Проверьте осмотические свойства. Для доведения до 290 мОсм/кг потребуется, чтобы разводящая жидкость была i иио- или i ииертонической, поэтому лучше развести сначала небольшое количество и проверить осмоляльность и затем рассчитать для большего объема раствор следует стерилизовать фильтрацией, чтобы избежать карамелизации 1люкозы, либо глюкозу следует автоклавировать отдельно (см. Глюкоза, 20%, в настоящем Приложении) ири высокой концентрации (наиример, 20%) и добавлятьиозже. Перед автоклавированием отметьте уровень жид- кое ги. Хранить раствор при комнатной температу- ре, и если произошло испарение, довести раствор до метки стерильной UPW перед использованием. При использовании боросиликатною стекла бу- тыль может быть плотно запечатана, в этом случае
Питательная среда жидкая См. Инструкцию производителя для приготовления. См. также Бактопептон и триптом-фосфатный бульон. Стерилизовать автоклавированием испарения не будег. Сбалансированный солевой раствор Гея NaCI 7,00 г Kt 1 0.37 । Cat 1, 0.17 i
Раствор Хэма F12 См. табл. 9.3. MgCI, 611,0 0.21 1 MgSO, 7 11,0 0.07 i Na, H I’O, 12 H,() 0.30 i
Раствор HBSS См разд. 9.3 и Сбалансированный солевой раствор в данном Приложении. К 11,1’0, 0.03 < NallCO, 2.27 i Глюкоза 1.00 i
Б76
Приложение 1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
Вода до.........................................1000 мл
СО2.................................................5?-i
Сбалансированный солевой раствор
для иссечения тканей (DBSS)
1) К раствору Ханкса BSS без бикарбоната, стерилизо-
ванного автоклавированием, добавить стерильные
растворы:
Пенициллин..........................250 ед /мл
Стрептомицин...................250 мкг/мл
Канамицин....................100 mki <‘мл
Гентамицин.....................50 mki .мл
Амфотерицин Б... ...............2,5 рмК1 мл
2) Хранить ири 20 °C.
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса
(BSS)
См. разд. 9.3 и сбалансированный солевой раствор, в
данном приложении.
Сбалансированный солевой
раствор Хэнкса без фенолового
красного:
Следуйте предыдущей инструкции, но не добавляйте
феноловый красный.
Среды
Основные компоненты mhoi их сред общие, наиболее
часто используемые приведены в главах 9 и 10 (см.
табл. 9.3,10.1, и 10.2), вместе с рекомендуемыми мето-
дами ириииовления. Для тех сред, которые не описаны,
см. Morton [1970], или каталоги фирм-поставщиков
сред (см. Приложение II: Среды).
Среда для биопсийных образцов
Ростоваясреда......... .___ ... ..........500мл
I k-tiiiiiii/LiiiH...........................125 (ИМ) с,1.
('I peiri <iMimuti.................................125 mi
Канамицин.....................................50 мг или
I «-тамкиин.........................................25 mi
Амф|>1 rptllllltl ................................1,25 Mt
Хранить при 4 °C до 3 недель или ири —20 °C в течение
более длительного периода.
Среда HAT
Вещество Концентрация Развести в Молярность
(конечный
раствор
ЮОх)
Гипоксантин 136 мг. 100 мл 0,05 N НС] 1 х 10 zM
(Н)
Аминоцте- 1.76 мг/100 мл 0.1 N NaOH 4 х 10" ’ М
рин (А)
Тимидин (Т) .38,7 мг/100 мл HBSS 1,6х103М
1) Для использования перемешайте равные объемы
трех веществ, стерилизуйте фильтрацией и добавьте
смесь в питательную среду как 3% (v • V).
2) Хранить Н и Т мри 4 °C, А при 20 °C.
Среда НВ
К среде CMRL 1066 добавить
Инсулин.
I ИД|)1>КОр1ИЗОН ....
(1 реши плаце! ;п .
Iлниамин..................
11 t t । и uiiji. a it ><.
Ct pent ом it tut н.
I I'H'iiiMitЦИН...........
Фу tit ИЗОН...............
IBS.......................
..5 мкг/мл
.0,36 мкг/мл
...0,1 mki/мл
.1.17 мМ
.50 Г.д/мл
....50 мкг/мл
.... 50 мкг/мл
... 1.0 мкг/мл
Среда SF12
Среда Хэма F12 (см. табл. 9.3) с добавлением среды
И1 ла МЕМ. главных аминокислот (2х) и второстепен-
ных аминокислот (1х) без тимидина, но с фолиевой
кислотой |0х.
Стрептомицин
1) Возьмите 2 мл из бутылки стерильною HBSS
100 мл, добавьте в 1-г флакон стрептомицина.
2) Kot да стрептомицин растворится, верните обратно
в бутыль с 98 мл HBSS.
3) Разведите 1:200 для использования. Конечная кон-
центрация должна составлять 50 mki/мл.
Трипсин
2,5% (w/v) в 0.85% (0.14 М) NaCl
Раствор трипсина можно приобрести уже готовым к
употреблению. Для самостоятельною ирш отопления:
1) Приготовьте 2,5% раствор:
TpuucttH (наиример Difeo. 1:250)..........25 г
NaCl, 0,85%............................... 1л
2 ) Рашешивайте в течение 1 ч мри комнатной темпера-
туре или 10 ч при 4 °C. Если трипсин не разводится
полностью, профильтруйте через бумажный фильтр
Whatman No. 1.
3) Стерилизуйте фильтрацией.
4) Раазлейте ио 10-20-мл аликвотам и храните при
-20 °C.
5) Разморозить и развести 1:10 в D-PBSA или РЕ перед
использованием.
6) Хранить разведенный трипсин при 4 °C не более
3 недель.
Замечание. Трипсин может иметь грубую степень
очистки (например, Difeo 1.250) или быть очищенным
(Worthington или Sigma Зх перекристаллизованный).
Грубо очищенный трипсин содержит дру t ие протеазы,
которые MOiyr быть важны для клеточной диссоциа-
Приложение 1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
577
ими, но также мшут повреждать более чувствительные
клетки. В обычной практике используется грубо очи-
щенный трипсин, если только не отмечается снижение
жизнеспособности и ухудшение состояния клеток либо
снижение клеточного роста. В этом случае используется
очищенный трипсин, который имеет высокосцецифич-
ную активность и должен использоваться нри пропор-
ционально более низких концентрациях (например,
О О | или 0,05%). При использовании грубо очищенною
трипсина, проверяйте на микоилазмы.
Фи то гемагглютинин (ФГА, РИА)
1) Приготовить основной раствор 500 мкг/мл (ЮОх)
из лиофилизированной PH А добавлением HBSS в
ампулу шприцом.
2) Разлить ио аликвотам и хранить при—20 °C.
3) Развести 1:100 для использования.
Фосфатно-буферный раствор (Раствор
Дюльбекко A; D-PBSA)
См. табл. 9.2 и протокол 11.6.
Трипсин/EDTA
См. Трипсин, шаг (5)
Фосфатно-солевой буфер Дюльбекко без Са2*
и Mg2+ (D-PBSA) (см. протокол 11.6)
Трипсин, Версен, Фосфат (TVP)
Трипсин (Di'fco 1:250).,.. „.....25 mi (или 1 мл 2,5%)
Фосфатно-буферный раствор, D-PBSA..........98 мл
Версен (Двунатриевая соль EDTA (2Н2О)....37 мг
Сыворотка цыпленка (MP Biomedicals).......1 мл
1) Смешать D-PBSА и Е DTA, автоклавировать смесь,
и хранить ири комнатной температуре.
2) Добавить сыворотку цыпленка и трипсин перед
использованием. Если используется сухой трипсин,
стерилизовать фильтрацией перед добавлением к
сыворотке.
.3) Разлить по аликвотам и хранить при 20 °C
Триптозофосфатный бульон
1) Приготовить 10% раствор в HBSS
Триптозы фосфат (Difco)..................100г
Среда Хэнкса............... .. 1000 мл
2) Перемешивать до растворения.
3) Разлить по аликвотам но 100 мл и стерилизовать
автоклавирован нем.
4) Хранить при комнатной температуре.
5) Развести 1.100 (конечная концентрация 0.1%) перед
использованием.
Уксусная кислота/метанол
Добавить 1 часть ледяной уксусной кислоты кЗ частям
метанола. Готовится непосредственно перед употреб-
лением, хранится на льду.
Фикколл, 20%
1) Высыпать 20г Ficoll (СЕ Heaihcare) на поверхность
80 мл UPW.
2) Оставить на ночь гак, чтобы Ficoll осел и растворился.
.3) Довести до 100 мл добавлением UPW.
4) Стерилизовать автоклавированием.
5) Хранить при комнатной температуре.
Фиксирующая жидкость для культуры тканей
См. Уксусная кислота/метанол.
Используйте чистый безводный этанол или метанол
(протокол 16.2), 10% формалин, 1% глютаровый аль-
дегид или 5% цараформальдегид.
Фосфатно-буферный раствор /EDTA, 10 мМ (РЕ)
1) Приготовить раствор D PBSA.
2) Добавить EDTA двунитриевую соль, 3,72 г/л и пе-
ремешать.
3) Разли гь, автоклавировать гг хранить при комнатной
температуре.
4) Развести D-PBSA EDTA 1:10 для получения 1 мМ
(наиболее частое употребление) или 1:2 (5 мМ) для
высоко хелатообразующих условий (например,
триггсинизация клеток СаСо-2).
Цитрат натрия/Хлорид натрия (SSC) SSC 20х
1) Приготовить концентрированный раствор SSC:
Тринатриевый цитрат
(дигидрагированный)........0,3 М..........88,2 г
NaCl.......................3,0М..........175,3 г.
Вода......................1000 мл
2) Развести до 1х или 2х гго обстоятельствам.
Экстракт эмбриона цыпленка
[Paul, 1975]
1) Выделите эмбрион из яиц, как описано в протоко-
ле 12.2, и поместите эмбрионы в 9-см чашки Петри.
2) Удалите глаза, используя две пары стерильных
пинцетов.
.3) Перенесите эмбрионы в плоскодонные или круг-
лодонные 50-мл контейнеры гго два эмбриона в
каждый контейнер.
4) Добавьте равный объем раствора Хэнкса в каждый
контейнер. Используя стерильную стеклянную
палочку, которая была предварительно раскалена в
пламени горелки и расплющена на конце, раздавли-
вайте эмбрионы в BSS, пока они не диссоциируют'.
5) Оставьте смесь стоять в течение 30 мин при комнат-
ной температуре.
6) Центрифугируйте смесь в течение 15 мин цри
2000 g.
7) Соберите супернатант и, после проверки на сте-
рильность (см. разд. 11.6.2), разлейте гго аликвотам.
Хранить цри —20 С.
Экстракт цыпленка и друг их тканей может также быть
приготовлен гомогенизацией в гомогенизаторе Поттера
или Уорена [Coon & Cahn, 1966].
S78 Приложение 1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
1) Гомогенизируйте измельченные эмбрионы с рав- ным объемом среды Хэнкса. 2 ) Перенесите гомогенат в центрифужные, центрифу- гируйте при 1000 g в течение 10 мин. 3) Перенесите супернатант в свежие пробирки и цен- трифуг ируйте еще 20 мин ири 10000 g. 4) Проверьте на стерильность (см. разд. 11.6.2). 5) Разлейте на аликвоты. 6) Хранить ири 20 °C ЭДТА (Versene) 1) Приготовьте концентрат 10 мМ, 0,374 г л в D- PBSA. 2) Стерилизуйте фильтрацией. 3) Разведите 1.10 или 1:5 для использования при 1,0—2,0 мМ или в исключительных случаях 1.2 для использования при 5 мМ, разведенный в D-PBSA или в растворе триисина в D-PBSA. ЭГТА Готовится так же, как ЭДТА, но ЭГТА может быть ис- пользована при более высоких концентрациях, потому что обладает меньшей токсичностью. PBS См. Фосфатно-буферный раствор. D-PBSA См. Фосфатно-буферный раствор. РЕ См. Фосфатно-буферный pacmeop/EDTA.
Приложение II
ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ
И МАТЕРИАЛОВ
В настоящее время существует большое количество комканий-производителей и поставщиков реактивов, обо-
рудования и материалов, используемых в культуре клеток, поэтому представлены не все возможные источники,
приведены только некоторые поставщики этих продуктов. Адреса поставщиков можно найти в Приложении III.
Список дру« их фирм-ироизводителец представлен в книге BiosupplyNel Source Book, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, а также на сайтах www.biosupplynet.com:www.biocompare.com; http zin forniagen.com ; http,/. www.marlex.
co.uk •laboratorysupplies/index.htm; http '/vvww.bioscieucetechnology.com/; www.caio.com/biolech/bio-prod.hluil;
www.ispex.ca/naccbiologicals.html;www.biospace.com. serviceand supplier.cfm; www.sciqtiest.com; http . www.coe.
montana.edu/che ConipAlph.hlni#A
Наименование материа-
лов и оборудования
Авидин-FITC
Автоклав настольный,
скороварка
Автоклавируемые среды
Автоклавы
Автоматическая нипетка
Автоматическая пипетка
с репетиром
Автоматические диспен-
серы
Автоматические пипетки
Gilson
Агар
Агар ЕМ, набор
Агароза
Агароза-мочевина, гель
Агент декальцинирую-
щий RDO
Агент для уничтожения
микоплазм (MRA)
Поставщик
Vector Laboratories
Astell Scientific; Harvard
Apparatus; LTE; Napco;
Valley Forge
JRH Biosciences; Medi-
atech
Ace; Astell: Bennet; Glob-
al; Integra; LTE; Preci-
sion Scientific; SP Indus-
tries; Steris; VWR
Alpha; BD Biosciences;
Roche Diagnostics;
Corning; Gilson; MP
Bioniedicals, Jencons;
Labsystems; Rainiti
Brand; Cole-Parmer; Pop
per; Radleys
Corning; Genetic Research
Instr.; Gilson; Jencons;
Matrix Technologies;
Michael Smith; MP
Bioniedicals; Robbins
Scientific
Bellco; Corning; Gilson;
Schott; Wheaton
Invilrogen; BD Biosci-
ences (Difeo); Oxoid
Plano; Polysciences
Cambrex; FMC Bioprod-
ucts; Sigma
Applied Biosystems
Apex Engineering
MP Biomedicals
Адаптеры Люзра
Аденин (гидрохлорид)
Аденинмонофосфат db-
сАМР
Адипоциты
Азот мочевины остаточ-
ный. Реактивы
Азот мочевины, анализ
Аккутаза (Accutase),
Accumax
Акрихина дш идрохлорид
Аланин L
Альбумин (БС А)
Альбумин бычий сыво-
роточный (BSA)
Альбумин крысиный
Альгинат
Аминокислоты
Аминокислоты несуще-
ственные
Аминокислоты основные
Аминопроиилтриэток-
силан
Аминоптерин
Аминоэтанол
Ампулы -«малышки»
Bijou
Ампулы, пластик
BD Biosciences (Clay Adams)
Sigma
Sigma
См. Специализированные
к lertiKu
Slanbio Labs
Stanbio Labs
Sigma; TCS; Upstate Bio-
technology
Sigma
См. Xu мические реактивы
Sigma
Amersham; Bayer; Bio-
Source; BD Biosciences;
Calbiochem; Cauibrex
(Clonelics); MP Bio-
medicals; Invilrogen;
Intergen; Sigma
MP Bioniedicals
ISP; NovaMatrix
JT Baker: Merck; Sigma
Invilrogen; MP Biomedi-
cals; Sigma
См. Основные аминокис-
ютпы MEM
Fluka
Sigma
См. Этаноламин
Bibby Sterilin
Alpha Laboratories, CLP;
Corning; Fisher Scientif-
ic; Greiner; Nalge Nunc
580
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
Ампулы, стекло
Амфотерицин В (Фунги-
аон, Fungizone)
Анализ изображений
Анализ изоферментный
электрофоретический
Анализ изоферментный
электрофоретический,
набор
Анализ хромосом
Анализ цитогенетиче-
ский
Анемометры
Антибиотики
Антитела CD31-PE
(555446)
Антитела CD34-APC
(555824)
Антитела CD44-FITC
(555478)
Антитела CD45-APC
(555485)
Антитела MUC-1 (му-
Цин)
Антитела р53: D0-1,
РАЬ421. РАЬ240
Антитела вторичные
FITC-конъюгированные
Антитела иммуноглобу-
линовые кроличьи про-
тив мыши
Антитела к актину альфа
гладких мыши
Антитела к актину альфа
гладкой мускулатуры
Антитела к альбумину,
кроличьи против кры-
синого альбумина
Антитела к антигену эпи-
телиальной мембраны
(ЕМА)
Антитела к виментину
Антитела к десмину мы-
шиные
Wheaton, Triple Red
Cainbrex (BioWhillaker);
Invitrogen, MP Biomed-
icaLs, PAA; Sigma
Applied Imaging; Bio-Rad;
Carl Zeiss; Hamamatsu;
Imaging Associates; Im
aging Research; Leica;
Molecular Dynamics;
Nikon; Nonlinear Dy-
namics Perceptive In-
struments; PerkinElmer;
Scanalylics; Syngene
ATCC; Cell Culture Char-
acterization Services;
DSMZ; ECACC
Innovative Chemistry
Cell Culture Characteriza-
tion Services
Cell Culture Characteriza-
tion Services
Technika; TSI; см. также
Ламинарный шкаф
см. Среды
BD Biosciences (Phannin-
gen)
BD Biosciences (Pharmin-
gen)
BD Biosciences (Pharmin-
gen)
BD Biosciences (Pharmin-
gen)
Chemicon
Oncogene Science
См. Антитела
Dako Diagnostics
DAKO
DAKO
VIP Biomedicals
Dako
Sigma
Sigma
Антитела к кератину 19
(K19)
Антитела к фактору VIII
Антитела к фактору ван
Виллебрандта (фак-
тор VIII)
Антитела к цитокератин)
Антитела козы Alexa
Fluor 488 к мышиному
IgG
Антитела козы тирози-
назные (С-19) иротив
человека
Антитела кролика иро-
тив человеческого кол-
лагена I тина
Антитела
Аноптоза ингибиторы
Апротинин (Трасилол.
Trasylol)
Аргинин HCI
AcnapaiHH
Аспираторы(резервуар)
Ацеиромазин
( Acepromazine )
Ацетилхолин (Acetyl-
choline)
Ацетонитрил (Acetoni-
trile)
Бактерициды для водя-
ной бани
Бактопеитон BD
Баня водяная
Баня водяная качалоч-
ная
Баня для органов
Барабан роллерный
Белки костные морфоге-
нетические (BMPs)
Dako
Roche Diagnostics
Roche Diagnostics
DAKO; Lab Vision; Santa
Cruz Biotechnology:
Zymed
Invitrogen; Molecular
Probes
Santa Cruz Biotechnology
Biodesign
Amersham; BD Biosci-
ences; Biopuol, DAKO;
Dianova; Invitrogen; MP
Biomedicals; Peprolech;
R&D Systems; Serolec;
Roche Diagnostics; San-
ta Cruz Biotechnology;
Sigma; Upstate Biotech-
nology; Vector
MP Biomedicals
Baver: Serologicals; Sigma
См. Химические реактивы
См. Химические реактивы
Bel-Art; Bibby Slerilin;
Camlab; Corning; In-
tegra; Kimble-Konies:
Techmate
Henry Schein
Sigma
TAAB
Guest Medical; Henry
Schein
Biosciences (Difco), Invi-
trogen
Camlab; Cole-Parmer;
Grant; Polyscience; Sci-
Gene; Thermo Electron
Baker; Grant
Radnoti
Genetic Research Instr.;
New Brunswick
См. Факторы роста
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
581
Белки, исследование
Белок костный морфоге-
нетический ВМР-2
Бетадин
Библиотека кДНК
Биобезопасность, про-
дукция для обеспече-
ния
Биореактор HARV
Биореактор NASA
Биореакторы
Биореакторы с непод-
вижным слоем
Биореакторы с псевдо-
ожиженным слоем
Биосенсоры
Биотин
Блок переключения для
баллонов СО, автома-
тический
Блок фильтров для
ширина Millex-SV, раз-
мер вор 5 ед
Блоки биобезопасности
Бокс ламинарный биоло-
гической защиты
Бокс микробиологичес-
кой защиты
Бромдиоксиуридин
BUdR
Бульон питательный
Бульон триитозо-фос-
фагный
Бульоны
Бумага фильтровальная
для геля (секвениро-
вание)
Pierce
Wyeth
Bruce Medical
Clontecli
Air Sea Atlanta; Altec;
Bel-Art; Cellutech; Cin-
Made; Jencons; Kim-
berly-Clark; Lab safety
Supply; Saf-T-Pak
Synthecon
Cellun; Synthecon
Alfa Laval; Bellco; Biotech
Instruments; Biovest;
Braun; Cellon; Charles
River: Corning; Genetic
Research Instrumenta-
tion; Global Medical;
James Glass; KBI; New
Brunswick Scientific;
PerkinElmer; Sartorius;
Sythecon; Vivascience;
Wave Biotech
New Brunswick
Amersham Biosciences
Analytical Technologies; Ap-
plied Biophysics, CellStat;
Nova Biomedical; YSI
Sigma
Air Products and Chemi-
cals Inc; Gow-Mac, Lab
Impex; Nuaire; Thermo-
Shandon
Millipore
Cm. Luminar-Jlaa.’ hoods
См. Бокс
микробиологической
защиты
Plas Labs; См. также
Ламинарные шкафы
Sigma; см. также Мече-
ние ДНК клеток BrdU,
набор
BD Biosciences (Difco);
Invitrogen: MP Biomed-
icals; TCS
BD Biosciences (Difco);
Invitrogen; Oxoid
См. Питательные
бульоны
Bio-Rad
Бусины-маркеры для
центрифу! ирования в
градиенте плотности
Бутандиона моноксим
(BDM)
Бутыли из жароупорного
стекла
Бутыли
Буфер CHAPS
Буфер Weise
Буфер боратный
Буфер для образцов
Laemmli
Вакуумная консистен-
тная смазка Edwards
High
Валидация клеточных
линий
Валин
Видеокамера
Видеомагнитофоны
Видеосистема для съем-
ки в режиме замедлен-
ного времени
Видео-система съемки в
реальном времени ABI
Prism 7000
Виллин
Винбластин
Витамин В12
Витамины
Витамины, стерильные
растворы
Вкладыши Transwell
Вкладыши в держатели
для фильтров Millicell-
НА
Вкладыши в фильтраци-
онные лунки
Amersham Biosciences
Sigma
Camlab; Fisher; Schott
Applied Scientific; BD
Biosciences; Bel-Art;
Bellco; Bibby Sterilin;
Caisson; Camlab; Corn-
ing; Fisher; Integra;
Kimble Konies; Nalge
Nunc; Polytech; Radleys;
Schott; Techmate; VWR
Calbiochem
Merck
Sigma
Bio-Rad
BOC Edwards
ATCC; Bio Reliance; Cell-
mark; ECACC; LGC
Promochem
Cm. Химические реактивы
См. CCD-камеры; камеры
цифровые; микроскопы
См. Видео в режи ие
замедленного времени
Dage-MTI; Hamamatsu;
Imaging Associates;
см. CCD-камеры;
Видео камеры;
Видеомагнитофоны (см.
также иротокол 27.4)
\pplied Biosyslems
Novacastra Laboratories;
Santa Cruz Biotechnol-
ogy; Cheuiicon
Sigma
Sigma
Sigma; См. также Среды
См. Среды
Corning; см. также Вк ta-
дыши « фильтрацион-
ную лунку
Millipore
BD Biosciences; Bibby
Sterilin; Corning Integ-
ra; Millipore; Nalge Nunc
582
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
Вкладыши для культуры
клеток
Вода для увлажнения
тканей
Вортекс-миксер
Впитывающие салфетки
Benchcote
Вращающаяся колба
Выделение РНК, набор
Газ утлекислый СО2
Газогенераторы
Газопроницаемые крыш-
ки
Газопроницаемые па-
кеты для культуры
тканей
Газы
Гекса фтор-2-пропанол
(HFIP)
Гексамеры рандомизи-
рованные
Гели полиакриламидные
Гематоксилин
Гематоксилин Харриса
Гемоцитометр
Генетицин (geneticin)
Гентамицин
Гепарана сульфат
Гепарана сульфата про-
теогликаны (HSPGs)
Гепарин
Гепатоциты
Герметик для ткани,
фибриновый Tisseel
VH
Гиалуронизаза
Гибридизация флюорес-
центная in situ (FISH)
Гидрогели
Гидрокортизон
Гидрокортизон и его
аналоги
См. Вкладыши в филь-
трационные лунки
Baxter
Gallenkamp; Fisher; gen-
eral
Whatman
См. Флаконы c
перемешиванием
Qiagen
Air Products; Cryoservice;
Taylor- Wharton
Bioquell; Peak Scientific:
Sarlec; Texo]
См. Сашки, флаконы
планшеты для
культуры
См. Пакеты д ш сред или
пикеты для культур
Air Products; British
Oxygen; Cryoservice;
Matheson Gas; Messer;
Taylor-Wharton
Aldrich
Invitrogen
Amersham Biosciences;
Bio-Rad
Merck; Sigma
Fisher
Fisher; Omnilab, Thermo
Electron
Invitrogen
Gemini; Invitrogen; Sigma
Sigma
Sigma
Roche; Sigma
См. Специализированные
клетки
Baxter
Sigma; Worthington
Cell Culture Characteriza-
tion Services (реактивы
см. Красители хромо-
сомные')
Nektar
Amersham Biosciences;
Merck; Sigma: Upjohn
Biosource; Merck; Sigma
Гидроксиламина шдро-
хлорид
Гидроксисукцинимид
(NHS)
Гипоксантин
Гипоталамус быка
Гипофиз быка
Гипофиз быка, экстракт
Гипохлорита водный
раствор Clorox
Гипохлориты
Гистидин НС-1Н?О
Гистолошческий нож
Глицерин
Глицерофосфат
Глицин
Глюкагон
Глюкоза
Глюкоза стерильная
Глютамин
Глютамин, стерильный
Глютаминовая кислота
Глютаровый альдегид
Глютатион
Гомогенизатор для мик-
ротитрационных план-
шетов
Гомогенизатор тканей
Гормоны
Гофрированный карт-
ридж для фильтрации
Груша резиновая для ци-
петирования
Гуанидина гидрохлорид
8М
Датчик давления
Датчик изометрической
силы (для культуры
миоцитов)
Датчик кислорода
Дезинфектант Clidox
Дезинфектант Virkon
Дезинфектанты
Pierce
Pierce
Sigma
Pel-Freez
Pel-Freez
Cambrex (Clonetics);
Cascade; Hanimond Cell
Technology; Invitrogen;
PromoCell
Polyscience (см. также
Дезинфектанты)
См. Дезинфектанты
См. Химические реактивы
Alabama Research & De-
velopment
Fisher; Mallinckrodt;
Merck; Sigma; VWR
Invitrogen; Sigma
Sigma
Bedlord Laboratories
См. Химические реактивы
См. Среды
См. Химические реактивы
См. Среды
См. Химические реактивы
Fisher Scientific; Plano;
Roth; Sigma
Sigma
См. Измельчитель Mini-
Bead Beater
Kimble-Kontes
Sigma
Pall Gelman
Bel Art, Bellco; Bibby
Sterilin; Cole-Parmer;
Fisher; Jencons Scien-
tific; VWR
Pierce
Gould; Maxim Medica
Radnoli
Microelec trodes
Tecniplasl (Indulab)
Du Pont Animal Health
Solutions; Scientific
Laboratory Supplies
Anachem; BioMedteal
Products; DuPont Ani-
mal Health; Guest
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
583
Деионизаторы
Деконтаминация (обо-
рудования и систем
обслуживания)
Дексаметазон
Декстран
Декстран DEAE
Декстроза
Денситометр
Денситометры
Деоксирибонуклеаза
Держатели для фильтров
Дерматотом
Детергент Roccall
Детергенты
Диаминобензидин
Диатилфлюоресциин
Диметилметиленовый
синий
Диметилсульфоксид
(DMSO)
Диметилэтилформамид
Диоксид у1лерода
ДинеитидилиеотидазаIV
(CD26)
Диски для клонирова-
ния. 3 мм
Диспаза
Диспенсеры для горло-
вины бутыли
Диспенсеры для жид-
костей
Medical; Hays Chemical
Distribution; Johnson
&Johnson; Lab Impex;
Lab Safety Supply;
Markson LabSales; MP
Bioniedicals; National
Chemical; Polyscience;
Sigma; Sleris; Tecniplast,
Thomas;
Barnstead Therniolyne;
Bellco; Corning; Dow
Corning; Elga; High-
Q; Millipore; Purite;
U.S. Filter: Vivendi Wa-
ter Systems; VWR
Anachem; Sleris; см. также
Sigma; Merck
Calbiochem; Fisher; Sigma
Amersham Biosciences;
Bio-Rad
Fisher
Meiller Toledo; Parr
Beckman Instruments; Pall
Gelman Sciences; Gilford
Instruments; Helena;
Molecular Dynamics
Sigma
См. Фияътры
Stortz Instruments
(см. также Ноле
гистологический)
Henry Schein Rexodent
Alconox; Calbiochem; De
con, MP Biomedicals;
Pierce
Sigma: Vector
Fisher; Sigma
Polysciences; Sigma
ATCC; JT Baker; Merck;
Sigma
См. Химические реактивы
Air Products; Cryoservice;
Messer; Taylor-Wharton
Biosource; Neomarkers
Sigma
BD Biosciences; Invitro-
gen; Roche
Brand; Jencons; Fisher;
Polytech
Accuramatic; Barnstead;
Corning; Gilson;
Диссоциация клеток,
агенты
Дистилляторы
Дитиогреитол
Диэтилиирокарбонат
(DEPC)
ДНК Htrt DNA
ДНК матрицы
ДНК полимераза Premix
ДНК тимуса теленка
I типа
ДНКаза
ДНК-фингерпринтинг и
ДНК-нро филин!
Емкости
Железа сульфат гепта-
i и драч Fe2SO47H2O
Железо сернокислое
Жидкость Буэна фикси-
рующая
Жидкость сцинтилляци-
онная
Жидкость сцинтилляци-
онная Ecoscinl
Замедлители угасания
флюоресценции
Заменители сыворотки
Заменители сыворотки
Biota in-MPS
Заменители сыворотки
тем, ТСН
Заменители сыворотки,
CPSR
Jencons; Lawson Mardon
Wheaton; Matrix Tech-
nologies; Mettler Toledo;
Michael Smith; MP
Biomedicals; Polytech;
Popper; Robbins; Tecan;
Thermo Electron; Zinsser
См. Отиелъные фермен-
ты и заменители трип-
сина
Corning; Jencons; Steris
Sigma
Sigma
Geron
Ambion
Takara Bio
Sigma
Lome; Serologicals: Sigma:
Worthington
Anglia DNA Bioservices;
ATCC; Cellmark UK;
DNA Bioscience; DNA
Solutions; EC ACC; Lab-
oratoryCorporalion of
America; LGC Promoch-
em; Orchid-Cellmark;
Verilabs Biosciences; cm.
также Аутентификация
См. Аспираторы
См. Химические реактивы
См. Химические реактивы
Sigma
Amersham Biosciences;
BS & S; National Diag-
nostics: New England
Nuclear (DuPont);
Perkin Elmer (Packard)
BS & S; National Diagnos-
tics; Perkin Elmer
Calbiochem; Cilifluor,
Vector
Biosource; Irvine;
Metachem; Pre >t ide; cm.
также Специфические
заменители сыворотки
ниже
Cambrex
Celox, MP Biomedicals
Sigma
S84
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
Заменители сыворотки,
Excell-900
Заменители сыворотки,
Ex-cyte
Заменители сыворотки,
ITS Premix
Заменители сыворотки,
Nutridoma
Заменители сыворотки,
Serxtend
Заменители сыворотки,
SIT
Заменители сыворотки,
тем. ТСН
Заменители сыворотки,
Ultroser
Заменители сыворотки,
Ventrex
Заменитель коллагена
Vitrogen
Заменитель сыворотки
Biotain-MPS
Заменитель сыворотки
CPSR
Заменитель сыворотки
Serxtend
Заменитель сыворотки
SIT
Заменитель сыворотки
Ultroser G
Заменитель сыворотки
Ventrex
Зонды молекулярные
PicoGreen
Иглы (для шприцов)
Иглы для биопсии
Идентификация клеточ-
ных линий
Измельчитель тканей
McIlwain
Измерение TEER
(трансэнителнальное
электрическое сопро-
тивление)
Измерители потока газа
JRH Biosciences Измерители расхода См. Измерители потока газа
Bayer Измеритель скорости потока воздуха (см. Анемометры)
MP Biomedicals Roche Diagnostics Изолейцин Изоиротенола 1идрохло- рид Изотонический раствор См. Химические реактивы Sigma Beckman Coulter; Scharfe;
NEN (DuPont) для счетчика клеток Изотопы см. также См. Радиоизотопы
Sigma Celox; MP Biomedicals Invitrogen Иммуноанализатор Иммуноглобулин IgG авидин-биотинилиро- ванный, набор Agilent; Guava (см. также Проточный флюори- метр) Dako Diagnostics
JRH Biosciences Иммуноглобулин IgG биотинилированный Sigma: Vector
BD Biosciences; Cohe- sion Technology; Col- lagen Corp.; см. также Иммуно1лобулин IgG биотинилированный анти-мышиный Vector
Коллаген Cainbrex (BioWhittaker) Sigma NEN (DuPont) Иммуноглобулин IgG осла против кролика Иммуноглобулин IgG, крысиный Иммуноглобулин анти- кроличий IgG АВС, пероксидазный набор Jackson ImmunoResearch Sigma Vector
Sigma Invitrogen: см. также Заменители сыворотки Иммуноглобулин анти- мышиный IgG АВС, щелочно-фосфатазный набор для определения Vector
JRH Biosciences: см. также Заменители Иммуноглобулины мы- шиные против кролика Dako
сыворотки Инвертированный мик- Leica; Nikon; Olympus;
Molecular Probes См. Шприцы роскоп Иш ибитор трипсина со- евый SBTI Zeiss Sigma
Ranfac; Stille Ишибиторы обесцвечи- См. Замедлители
ATCC; Bioreliance; Cell Culture Characteriza- вания флюоресценции угасания флюоресценции
tion Services; Cellmark; DSMZ; ECACC; LGC Ишибиторы протеазы Intergen; Roche Diagnos- tics; Sigma
Promochem: Orchid Cellmark; см. также Ишибиторы трипсины Biosource; Cascade; Sigma; Serologicals
ДНК-прифилинг Campden Instruments Индикатор стерильности Thermalog Индикаторы стериль- Bennet; Popper Appleton Woods; Applied
Applied Biophysics: BD Biosciences, World Pre- ности Scientific; Bennett; Jen- cons:
cision Instruments Индикаторы температу- ры, полоски См. ИнОикаторы стерильности
Muis Controls; Omega Индометапин Sigma
Engineering; Titan Enterprises (см. также Смесители газа) Инкубаторы ATR; Barnstead; Bellco; Binder; Boro Labs; Cam- lab; Fisher, Genetic
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
585
Инкубаторы СО2
Инкубаторы для яиц
Инструменты для иссе-
чения
Инструменты хирург и-
ческие
Инсулин
Инсулин/трансферрин/
селен (ITS)
Интерлейкины
Иодонитротетразол фио-
летовый (INT)
Исследование ELISA
Исследование идентич-
ности
Исследования цитоток-
сичности
Кабельное телевидение
(CCTV)
Какодилатный буфер
Research Instr.; Global
Medical; Harvard; Ken-
dro; Infors; Lab-Line;
LEEC; LMS; LTE;
Memmert; MP Biomedi-
cals; Napco; New Bruns-
wick Scientific; Nuaire;
Omnilab; Precision Sci-
entific, Robbins; RS Bio-
tech; Sanyo Gallenkamp,
Scientific Instrument
Centre; SciGene; SP
Industries; Thermo Elec-
tron; Triple Red; VWR.
Barnstead-Therniolyne;
Boro Labs; Camlab; Fish-
er; Heinecke; Kendro;
Lab-Inipex; Lab-Line;
LEEC; Memmert; MP
Biomedicals; Napco; New
Brunswick Scientific;
NuAire; Omnilab; Preci-
sion Scientific; Sanyo
Gallenkamp; SP Indus-
tries; Thermo-Electron;
Triple Red
G.Q.F. Manufacturing
Cole-Panner; EMS; Fine
Scientific Tools; Fisher;
Roboz; Swann-Morton,
VWR
См. Инструменты Оля
иссечения
Cambrex (Clonetics); CP
Pharmaceuticals, Eli
Lilly; Intergen; Invilro-
gen; Sigma
BD Biosciences; Fisher
Scientific; Invilrogen:
Roche Diagnostics;
Sigma
См. Факторы роста
Sigma
Assay Designs. R & D Sys-
tems
См. Аутентификация
к /еточных линий и
ДНК-фиигерпринтинг. и
ДНК-профи./инг
Bio Reliance (Invitrogen);
MatTek; Promega; Ski-
nElhic
Dage-MTI; Hamamatsu;
Leica (см. также Каме-
ры CCD, Мкроскопы)
Plano; TA AB
Калия дигидрогеноорто- См. Химические реактивы
фосфат
Калия ферроцианид См. Химические реактивы
KaFe(CN)6
Калия ферроци- См. Химические реактивы
анид тригидрат K4Fe3(CN)e-3H2O
Калия фосфат одноос- См. Химические реактивы
новный
Калия хлорид КС1 См. Хи мические реактивы
Калия хлорид См. Химические реактиеы
Кальний-связываюший- Sigma
реагент
Кальций -фос форный Sigma
комбинированный стандарт
Кальция определение Sigma
Кальция хлорид CaCL, См. Химические реактивы
Камера для наблюдения Bioplechs; Buck Scientific;
в режиме замедленно- Carl Zeiss; Intracel
го времени
Камера с контролируе- Bellco; Vineland; NJ
мой атмосферой
Камера трансплантаци- Greiner
онная (эпидермис)
Камеры CCD BioWorld; Dage-MTI, Hamamatsu; Leica; Scan- alytics; Sony; см. также Микроскопы
Камеры Leica; Olympus: Nikon: Zeiss (смю также Камеры CCD и Камеры цифровые)
Камеры инкубационные Buck Scientific; Imaging
для микроскопа Associates
Камеры цифровые Canon; Kodak; Leica; Nikon; Olympus; Pola- roid (см. также Камеры CCD; Микроскопы)
Канамицин Invilrogen; MP Biomedi- cals; Sigma
Канюли BD Biosciences; Roboz;
Карбодиимид, 1-этил- Pierce
3-( диметиламинопро- nmi)-EDC
Карбоксиметилцеллюло- Fisher; Merck
за (КМЦ)
Кариотииирование Cell Culture Characteriza- tion Services
Каркас PGA Albany International
Каркасы для тканевой Albany; Cook Biotech:
инженерии EBI; Minucells; Zimmer
Картриджи перфузион- Advanced Tissue Sciences
ные цоликарбонатные
Кассета для диализа Pierce
586
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
Катетер для сосу-
дов пластиковый
Angiocath, 20
Катетеры
Каучук силиконовый,
адгезивный
Каучук силиконовый,
листы
Каучук силиконовый,
пробки
Керамика на основе ко-
ралла
Керамические палочки и
основы для культуры
Кератиноциты
Кетамин
Кетанест
Кислота аскорбиновая
Кислота аспарагиновая
Кислота липоевая
Кислота пантотеновая
Кислота селеновая
Кислота соляная НС1
Кислота соляная
Кислота трихлоруксус-
ная ТХУ
Кислоты аскорбиновой
2-фосфат
Клетки Balb/c ЗТЗ А31
Клетки HLF
Клетки Swiss ЗТЗ
Клетки бронхиального
эпителия
Клетки костного мозга
стромальные челове-
ческие
Клетки эндотелиальные
Клеток линии
Клеточные банки
Клеточный скребок
КМЦ
Кожи перфоратор
Коллаген хвоста крысы
Коллаген
BD Biosciences
BD Biosciences
Dow Corning; GE Sili-
cones
Nusil; Silicone Specialty
Fabricators
Bibby Sterilin
Interpore
Zimmer
См. Специализированные
клетки
Henry Schein: Sigma
Parke-Davis
Sigma; Wako
См. Химические реактивы
Sigma
Sigma
Merck; Sigma
См. Химические реактивы
См. Химические реактивы
См. Химические реактивы
См. Химические реактивы
АТСС
Cone]] Institute for Medi-
cal Research
ATCC
См. Специализированные
клетки
Clonelic-Poietics
См. Специализированные
клетки
См. Cell banks
ATCC; Coriell Cell Repos-
itories (CCR); ECACC;
DSMZ; HSRRB, JCRB;
Riken
Applied Scientific, Bel-Art;
BD Biosciences; Corn-
ing; Nalge Nunc; Tech-
mate; Techno Plastic
См. Карбоксиметилцел-
люмаа
Miltey
BD Biosciences
BD Biosciences; Biocolor;
Biodesign; Biomedical
Коллагеназа
Коллагеновая губка Ul-
trafoam
Коллагеновая губка
Коллагеновый имплант
Zyderm 2
Кольца^'цилиндры для
клонирования
Кольцевой шейкер
Кольцевые маркеры
Кольцемид
Компании-поставщики
лаборат орного обору-
дования, основные
Комплекс АРААР
Комплекс встроенных
фильтров многоразо-
вого использования
Комплект дисковых
фильтров для стерили-
зации
Компоненты сыворотки
Ехсе11-900
Компоненты сыворотки
Ex-cyte
Компоненты сыворотки
Nutridoma
Компоненты сыворотки,
смесь ITS
Кондуктометры
Контейнеры для образ-
цов
Technologies; Biosource
Internationa]; Cam-
bridge Biosciences; Cel-
Ion; Cliondrex; Cohesion
Technologies; Collagen
Corporation; CR Bard;
Davol; Invitrogen; In-
amed, Insmed; KeLab;
Lal» Vision; MP Biomed-
icals; Roche; Seikagaku;
Sigma; Stratech; Univer-
sal Biological*
Chondrex; Invitrogen;
Lome; Roche; Serva;
Sigma: Worthington
Davol
Avitene Ullrafoam CR
Bard; Davol; McGIian
Medical
Insmed: McGhan Medical
BelArt; Bellco: Fisher;
Scientific Laboratory
Supplies
Bellco
Nikon
Sigma
Camlab; Cole-Parmer; Fish-
er; Scientific Instrument
Centre; Thermo Electron;
Triple Red; VWR
DAKO: Vector
См. Фильтры
См. Фильтры
JRH Biosciences
Bayer
Roche Diagnostics
MP Biomedicals
Corning; Mettler Toledo;
Quadrachem; Technika;
Thermo Electron
Alpha Laboratories; Corn
ing; Bibby Sterilin;
Nalge Nunc. VWR: cm.
также Контейнеры
для транспортировки
образцов
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
587
Контейнеры для стекол
для микроскопии
Контейнеры для транс-
портировки
Контейнеры для транс-
портировки образцов
Контейнеры универсаль-
ные стеклянные
Контроллеры СО2
Контроллеры темпера-
туры
Конфокальный микро-
скоп
Коробки для пинеток
Коробки для стекол све-
тонепроницаемые
Кран трехсторонний за-
порный
Красители
Красители тстоло! ичес-
кие
Красители ДНК
Краситель WST-1 инди-
катор цитотоксичности
Краситель Гимза
Краситель для оценки
жизнеспособности
трипановый синий
Краситель малахитовый
зелёный
Краситель Мэй-Грюн-
вальда. раствор
Краситель прочный
красный TR соль
Краситель прочный фио-
летовый
Corning; Raymond Lamb;
Raven; Richardsons
Air Packaging Technolo-
gies; Air Sea Atlanta; Al-
tec; Bel-Art; Cellutech:
Cin-Made; Jencons;
Kimberly-Clark, Lab
Safety Supply; Nalge
Nunc; Saf- T-Pak
Saf-T-Pak; Nalge Nunc;
Air Sea Atlanta; Cel-
lutech; Cin-Made Corp
(см. также www.uos.har-
vard.edu/ehs/biobioshi.
shtml и www.ehs.ucsf.
edu/Safely *o20Updates/
Bsu/ Bsu5.pdf)
Camlab
Air Products; Gow-Mac;
Lab-Line; Lab Impex;
Therma Electron (For-
ma; Holpak)
См. Термостаты,
пропорциональные
контроллеры
Biotech Instruments; Lei-
ca; Molecular Dynamics;
Nikon; Zeiss
Bellco; Thermo Electron
Bel-Art; Cole-Parmer;
Raven; Raymond Lamb;
BD Biosciences; Raven
Scientific
Baxter Healthcare; Sher-
wood-Davis & Geek
Fisher, Merck; Molecular
Probes; MTR, Sigma;
TCS Biologicals
Merck; MTR Scientific;
Sigma
Hoechst, Molecular Probes
Serva
Fisher; Merck; TCS Bio-
logicals; Sigma
Merck; См. также Среды
Sigma
Merck
SERVA
Sigma
Краситель флюоресцен- Sigma
тный для ДНК Hoechst 33342
Краситель флюоресцен- MP Biomedicals (набор);
тный для микоплазм Polysciences; Sigma
Hoechst 33258
Криомаркеры GA International
Криопробиркн См. Ампулы
Криофлаконы См. Ампулы
Кристаллвиолет Merck, Fisher
Крысы Charles River; Harlan Sera-Lab
Крышки СО2-проница- См. Чашки флаконы
емые и планшеты для культуры
Крышки проницаемые См. Га:юпроницаемые крышки
Ксилазин NLS Animal Health; Sigma
Ксилазина гидрохлорид Bayer Vital
Rompun
Ксилен См. Химические реактивы
Культуральная камера BioCrystal
Opticell
Культуральные камеры См. CmeKia для культуральных камер
Культуральные пробир- См. Чашки флаконы
ки и планшеты для культуры
Культуры клеток специ- BD Biosciences; Cambrex;
ализированные Cascade; Cell Systems; PromoCell; SkinElhic
Культуры перфузионные Amicon; Bioptechs; Cellco; Endolronics; Microgon
Кумасси синий R Sigma
Лабораторное стекло Bellco; Corning; Kimble- Kontes; Schott; Wheaton
Лактальбумина гидро- BD Biosciences (Difico);
лизат Invitrogen
Лактатде! идрогеназный Roche Applied Science;
тест для оценки жизне- Sigma
способности, набор
Ламинарный шкаф/бокс AES; Atlas Clean Air; Baker; Bigneal; Bioquell; Biosero; Contamination Control; Envair; Erlab; Germfree Labs; Kendro; Kojair; Labcaire; LTE; Medical Air Technology (Kendro); MP Biomedi- cals: Nuaire; Safelab; SP Industries; Thermo Elec- tron
Ламинин BD Biosciences; Bio- medical Technologies; Invitrogen: Lab Vision; Sigma; Slralech
588
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
Латекс, частицы (стан-
дарт для измерителей
размеров клеток)
Левамизол
Лейцин
Лента индикаторная для
стерилизации
Лизин HCI
Лимоннокислый свинец
Рейнольда
Линии клеток, базы дан-
ных
Линия клеток 5637
Линия клеток гепатомы
человека HepG2
Лития бромид
Лития карбонат
Лубрикант силиконо-
вый, инертный
Лубрикант хирургичес-
кий Surgilube
Магнитные мешалки
Магния сульфат гепта-
гидрат MgSOZi -7Н2О
Mai ния сульфат
Магния хлорид MgCl2 -
6Н2О
Mai ния хлорид
Макроносители
Марками
Маркер для колоний
Маркеры для колоний
Маркеры спирто-нераст-
воримые
Маркеры, ампулы
Марля хирургическая
Марля, сетка
Матригель
Матрикс
Beckman Coulter
Serva
Sigma-Aldrich
См. Индикаторы
стерильности
См. Химические реактивы
EMS; SPI Supplies
ATCC; Coriell; DSMZ;
ECACC, HSRRB, ICLC
DSMZ
См. Клеточные банки
См. Химические реактивы
См. Химические реактивы
Dow Corning
Fougera
Bellco; Camlab; Chemap;
Cole-Parmer; Fisher;
Hanna; Jencons; Lair-
Line; Techne; Thomas;
Wheaton
См. Химические реактивы
См. Химические реактивы
См. Химические реактивы
См. Химические реактивы
New Brunswick
NLS Animal Health
Nikon
Nikon
Radleys
GA International'. Radleys
Johnson & Johnson; Ken
dall
См. Сетчатые фильтры
и сетки
BD Biosciences; Serva
Accurate Chemical (as-
says); BD Biosciences;
Biocolor (assays); Biode-
sign; Biomedical Tech-
nologies; BioSource;
Cellon; Cook Biotech;
Harbor Bio-Products;
Imperial; Lab Vision;
Matrix Technologies;
NovaMalrix; Pierce; Pro-
tein Polymer; R&D Sys-
tems; Sigma; Stratech:
TCS; Tebu-bio
Матрикс ECM
Матрикс EHS (Матри-
гель, Ma trigel)
Матрикс внеклеточный
Машина моющая для
пинеток, сушильное
устройство для пине-
ток
Машина моющая для
стекла
Меди сульфат
Меланоциты
Мембранные фильтры
для шприцов
Мембраны Nyaflo
Меркантоэтанол
Метакрилат, поли(2-гид-
роксиэтил)
Метакрилат: 3-(триме-
токсизилил) пропил-
метакрилат
Метанол
Мегилпеллюлоза
Метилцеллюлоза Metho-
cel
Метионин
Метьризамид
Мечение ДНК клеток
BrdU, набор
Мешалки См. Магнит-
ные мешалки
Микоплазмы, наборы
для детекции
Микостатин, нистатин
Микроанализ, оборудо-
вание
Микроденситометр
Микрокрышки, пробир-
ки микрокапиллярные
Микроманипуляторы
См. Матрик<
BD Biosciences
См. Матрикс
Bel Art, Thermo-Shandon;
Radleys
Burge; Lancer; Miele;
Scientek; Scientific In-
strument Centre; Sleris
Corp.
См. Химические реактивы
См. Специализированные
клетки
См. Фильтры
Gelman Sciences
См. Химические реактивы
Sigma
Sigma
См. Химические реактивы
Dow Corning; Fluka:
Fisher; Sigma; Stem Cell
Technologies
Dow Corning
См. Химические реактивы
Nycomed
Invitrogen (Invitrogen);
Protnega; Sigma
ATCC; Gen-Probe; Irvine
Scientific: Metachem;
MP
Bio Whit taker; MP Bio
medicals; Invitrogen;
Sigma
Affymelrix; Agilent; Bio-
Rad, Brinkmann; Chemi-
con; Imaging Research;
Nonlinear Dynamics;
Schleicher & Schnell;
Stralagene; Tecan
См. Анализ изображении,
сканирующая
цитометрия
(Drummond) Thermo-
Shandon: Fisher
Brinkmann; Eppendorf;
Leica; Nikon; Steris;
Stoelling
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
589
Микроносители
Микропипетки
Микропланшеты, гомо-
генизатор-измельчи-
тель MiniBead Beater
Микроскоп электронный
сканирующий (SEM)
Микроскоп электронный
трансмиссионный
Микроскопия электрон-
ная
Микроскопы
Микроскопы флюорес-
центные
Микротитрационный
планшетный сканер
Микротитрация, обору-
дование
Микроцентрифужные
пробирки с фильтром
Митомицин С
Мозг костный
Монитор давления
Мониторинг Real-time
Мониторинг биоэлектри-
ческий
Мониторинг метаболи-
ческий
Морозильник с жидким
азотом с регулируемой
скоростью охлаждения
Amersham Biosciences;
Bibby Sterilin; Bio-Rad;
Nalge Nunc; Invitrogen;
MP Biomedicals; Sigma;
SoloHill; TCS
Alpha; Anachem; Applied
Scientific; Bibby Steri-
lin; Biohit; Brinkmann;
Corning; Elkay; Eppen-
dorf; Genetic Research
Instr.; Gilson; Jencons;
Lawson Mardon Whea-
ton; Oxford; Roche:
Thermo Electron
Biospec; Dainlree
Electro Scan; JEOL
Philips
Electron Microscopy Ser-
vices; TAAB: Structure
Probe
Carl Zeiss; Leica; Olympus;
Nikon; Prior
См. Микроскопы
См. Риверы вля
планшетов
Anachem; Berthold; Bio-
Rad; Biospec; BMG
Lairlech; Brand; Camlab;
Corning; Dynex; Elkay;
ESA; Genetic Research
Instr.; Gilson; Integra;
Invitrogen; Molecular
Devices; Nalge Nunc;
Nonlinear Dynamics;
Perkin Ehner; R &D Sys-
tems; Robbins; Tecan;
Techmate; Thermo Elec-
tron; VWR; Whatman;
Zinsser
Corning
Roche Diagnostics; Sigma
Cambrex
Hewlett- Packard
См. Биосенсоры
См. Биосенсоры
См. Биосенсоры
Messer; Nalge Nunc;
Planer; Thermo Electron;
Slatebourne; Taylor-
Wharton
Морозильники азотные
Морозильники с жидким
азотом
Морозильники
Морозильники, -20 еС
Морозильники, -70 сС
Мочевина
Муравьиная кислота
Мыши BALB/ с nu/nu
Мыши Nude
Мыши SC ID
Мышиные антитела
CD105 (555690)
Набор Endofree Maxi
Набор Eukitt
Набор FuGENE 6
Набор LEUCOperm Kit
Набор Qiagen Rneasy
Mini Kit
Набор QIAshredder
Набор QuiAmp DNA
mini kit
Набор RNAseZap®
Набор RNeasy mini kit
Набор Vectastain Elite
ABC Kit
Набор Vectastain Quick Kit
Набор гисюлогических
красителей Histostain-
SP kit (Streptavidinpe-
roxidase)
Набор для выделения
ДНК
Набор для опенки жиз-
неспособности Live/
Dead
Набор для растяжения
катетеров
Набор коллагена I типа
ELISA
См. Морозильники,
жидкий азот
Aire Liquide; Barnsiead-
Thermolyne; Boro Labs;
Chart Biomed; Cryotned;
Genetic Research; Jeti-
cons; Messer Cryotherm;
Planer; Slatebourne;
Taylor-Wharton; Ther-
mo Electron; VWR.
См. Морозильник c
жидким азотом
с регулируемой
скоростью охлаждения
Barnstead; Fisher; New
Brunswick Scientific
Barnstead; Fisher; New
Brunswick; Nuaire; Pre
cision Scientific; Revco:
Thermo Electron
См. Xu мические реактивы
См. Химические реактивы
Nippon С LEA
Charles River; Nippon
CLEA
Charles River
BD Biosciences (Pharmin-
gen)
Qiagen
Fl uka
Roche
Seroiec
Qiagen
Qiagen
Qiagen
Ambion
Qiagen
Vector Laboratories
Vector Laboratories
Zymed Laboratories Inc.;
San Francisco; CA;
U.S.A
Qiagen
Molecular Probes
Interlink Baxter Health-
Care
Chondrex
S90
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
Наборы RNAimage Наборы для исследова- GenHunter CellStat; см. также Иссле-
ния цитотоксичности дования цитотоксич-
Нагревательные системы ности Genetic Research Instr.;
Найл красный Robbins; VP Scientific Sigma
Наконечники для пипе- ток, устойчивые к аэ- розолям
Насос Pi-Pump Applied Scientific; Bel-art;
Насос воздуходувного Polytech; Radleys Gorman-Rupp Industries
типа
Насос перистальтичес- Cole-Parmer
кий непрерывного дей- ствия
Насос шприцевой Harvard Apparatus
Насосы вакуумные BO; Cole-Parmer; Mil
Насосы перистальтичес- lipore; Pall Gelman; Varian Altec; Amersham; Cole-
кие Parmer; Gilson; Michael
Насосы перистальтичес- Smith; Watson Altec: Amersham; Cole-
кие Parmer; Gilson; Michael
Натрия азид Smith; Watson Marlow Sigma
Натрия алы инат ISP Alginate
Натрия бикарбонат См. Химические реактивы
Натрия бутират (NaBt) Sigma
Натрияидроокись Sigma
Натрия деоксихолат Sigma
Натрия лаурилсульфат Sigma
(SLS: натрия деокси- холат)
Натрия ортованадат Sigma
Na„VO«
Натрия пируват См. Химические реактивы
Натрия пируват, сте- См. Среды
рильный раствор
Натрия селенат Sigma
Натрия селенит Sigma
Натрия соли См. Химические реактивы
Натрия тиосульфат Sigma
Натрия формиат Fisher
Натрия фосфат, двуос- См. Химические реактивы
новный гецтагидрат
Натрия хлорид См. Химические реактивы
Натрия хлорид, 0.9% Baxter
Натрия цитрат См. Химические реактивы
Нафтиленовый черный R.A. Lamb (см. также
Красители)
Нафтол-AS-MX фосфат
Нейлоновые сита, филь-
тры и марля
Нейтральный красный
Неорданические соли
Ниацинамид
Нигрозин
Нистатин
Нитрат свинца II
Нитрофенила фосфат
Нитрофенол стандарт-
ный раствор
Нить хирургическая,
дакрон
Нить хирургическая,
дексон
Нить хирур!ическая,
шелк
Нож-вибратом
Ножницы с пружиной
Ножницы
Нуклеозиды
Оборудование для анес-
тезии, ветеринарное
Оборудование для сте-
рильной упаковки
Оборудование для упа-
ковки трансиортаци-
онной
Оборудование для
фильтрации
Одежда защитная
Опкостатин М
Определение размера
клеток
Органотиническая куль-
тура
Освещение, волоконная
оитика
Осмия тетроксид
Осмометр
Нафтол AS-MX щелоч- Sigma
ной раствор
Основной фактор роста
фибробластов (bFGF)
Остеогенный протеин 1
(OP-1; ВМР-7)
Serva
См. Фильтры сетчатые
TCS Biologicals
Merck
Sigma
Sigma; TCS Biologicals
Sigma; Invitrogen
См. Химические реактиеы
Sigma
Sigma
Davis and Geek
Davis and Geek
Harvard Apparatus
Campden Instruments
Fine Science Tools Inc.:
VWR, lm. также
Инструменты для
иссечения
См. Инструменты для
иссечения
Sigma
SurgiVet
Applied Scientific; Buck
Scientific; KNF Corp.
Porlex; Portland Plas-
tics; Roth
См. Контейнеры для
транспортировки
образцов
См. Фильтры
Alexandria Workwear; Lab
Safely Supply; Sigma
См. Факторы роста
Beckman Coulter; Scliarfe
ACM-Biotech; MatTek;
Minucells; SkinElhic
Fischer Scientific
Plano; Roth; Sigma
Advanced Instruments;
Analytical © Technolo-
gies; Gonotec; Nova Bio-
medical; Wescor
См. Факторы роста
См. Факторы роста
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
591
Пакеты биоло! ической
опасности
Пакеты для сред
Пакеты для стерилиза-
ции
Пакеты и пленка авто-
клавируемые
Пакеты и пленка нейло-
новые автоклавируе-
мые
Пакеты культуральные
Панкреатин
Папаин
Параформальдегид
Пастеровские пинетки
Pastette
Пенициллин
Пенициллин/ стрептоми-
цин
Пеногасители
Пентобарбитал
Пепсин
Пептид RGD: GRGDS:
H-Gly-Arg-Gly-Asp-
Ser-OH
Пептид глгщин-api инин-
i лицинаспартат-серин
(GRGDS)
Пептидаза, Дипептидил,
IV (CD26)
Пептиды: RGD, GRGDS.
H-Gly-Arg-Gly-Asp-
Ser-OH
Перекись водорода
(30"ъраствор)
Перемешивающие фла-
коны
Перколл
Пермаунт DPX
Перфузия капиллярного
русла
См. Пакеты и пленка
автоклавируемые
American Fluoroseal; Cell
Genix; DuPont; MP Bio-
medicals: Sigma
См. Упаковка стерильная
Allee; Applied Scientific:
Bibby; Sterilin: Elkay;
Jencons; Lab Safely Sup-
ply; KNF; Portex
Applied Scientific; KNF
Corp.: Poriex
Cell Genix; Du Pont;
Metabios; MP Biomedi-
cals; PAW BioScience
Products (см. также
Пакеты для сред)
Invitrogen; Sigma
Worthington; Sigma
Electron Microscopy Sci-
ences; Merck; Sigma
Alpha Laboratories; Bibby
Sterilin; Elkay, Polylech;
Richardsons
См. Среды
См. Среды
Bayer; Dow-Coming:
Merck; Sigma
Abbott
Sigma
Calbiochem
Перчатки защитные для
криоконсерва ции
Перчатки нитриловые
Печи, сушильные шкафы
Пинетки Movette
Пипетки автоматические
многоканальные
Пипетки аспирационные
Пипетки и микронниетки
автоматические
Sigma
Biosource; Neomarkers
Calbiochem
Bellco; Corning; Genetic
Research Instr.; Integra;
Lawson Mardon Whea-
ton; Techne; см. также
Магнитные мешалки
Amersham Biosciences;
Sigma
m. Красители
См. Половолоконная
перфузионная культура
Пипетки с широким диа-
метром
Пиридоксин НС1
Плазма лошадиная
Плазма цыпленка
Планшетный сканер
ELISA
Перчатки
Пинцет изогнутый
Пинцеты
Пинцеты, зажимы
Пипетки
Ansell Medical, Applied
Scientific; Cryomed;
Johnson & Johnson Med-
ical; Lab Safely Supply;
Radleys; Renco Corp.;
Safeskin; Sentinel Labo-
ratories; Stocking; Surgi-
con; VWR Scientific
T aylor- Wharton; Jencons
Ansell; Cole-Parmer; Lal)
Safety Supplies; Radleys:
Sentinel; Sloelting
Astell; Barnstead; Cam-
lab; Dynalab, Harvard;
Kendro; LEEC; LTE,
Meminerl; Precision Sci-
entific; Scientific Instru-
ment Centre: Thermo
Electron
См. Хирургические
инструменты
См. Инструменты для
иссечения
Fisher Scientific
Alpha Laboratories, BD
Biosciences; Bellco;
Corning; Fisher; Nalge
Nunc, Sterilin
Invitrogen
См. Пипетки и
микропипетки
автоматические
Corning Coscar
Alpha Laboratories,
Anachem; Applied Scien-
tific; Barnstead; Bellco;
Bibby Sterilin; Brand;
Cole-Parmer; Corn-
ing; Daiger, Eppendorf;
Fisher; Genetic Research
Instr.; Gilson; Integra,
Jencons; Lawson Mardon
Wheaton; Matrix Tech-
nologies; Merck; Messer;
Mettler-Toledo; MP
Biomedicals; Polytech;
Radleys; Rainin; Roche;
Socorex; Thermo Elec-
tron; Whatman
Bellco
Sigma-Aldnch
MP Biomedicals
Invitrogen; MP Biomedicals
Cm. Plale readers
S92
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
Планшетный сканер
Планшет четырехлуноч-
ный
Планшеты микротнтра-
ционные
Планшеты микротитра-
ционные с удаляемыми
стенками
Планшеты микротитра-
ционные, диспенсеры
для разлива
Планшеты многолуноч-
ные с биопокрытием
Планшеты многолуноч-
ные с фильтрующим
дном
Планшеты с питатель-
ным агаром
Планшеты
Пластик Sylgard
Пластик лабораторный
Пластины многолуноч-
ные фильтровальные
Платформы качалочные
Пленка для стерилиза-
ции
Пленка нейлоновая иа-
ронроницаемая
Пленка нейлоновая по-
лупроницаемая
Плёнка полиамидная
Пленка рентгеновская
Поверхностно-активное
вещество Pluronic F-68
Поддоны и штативы для
морозильника
Позитивный фоторе-
зист, OCG 825-835
St, Shipley 1813, или
Shipley 1818
Покровные стекла Ger-
man glass
Bio-Tek; Berthold; Bio-
Rad; BMG; Camlab;
Dynex; Fisher; Merck;
Messer; Molecular De-
vices; Molecular Dynam-
ics; PerkinElmer; Tecan;
Thermo Electron.
См. Чашки, флаконы, план-
шеты для культуры
Applied Biosystetns;
см. также Чашки,
флаконы, планшеты для
культуры
Invitrogen
Thermo Electron
BD Biosciences
NalgeNunc; Techmale;
Whatman
Oxotd
См. Чашки, флаконы
и планшеты для
культуры к&ток
Dow Corning
Falcon (BD Biosciences)
Whatman
Bellco
См. Упаковка стерильная
См. Пленка и пакеты
ней юновые
авток ювируемые
См. Упаковка стерильная,
оборудование
Applied Scientific, Buck
Scientific; KNF Corp.;
Portex; Portland Plas-
tics; Roth
Eastman Kodak; Fuji
Invitrogen: MP Biomedi-
cals; Serva; Sigma
См. Морозильники r
жидким азотом
Shipley
Carolina Biological Sup
plies
Покровные стекла стек-
лянные
Поли(2-
гидроксил)метакрилат
(PolyHEMA)
Поливинилпирролидон
Полилизин, поли-D-и
поли-L
Полимиксин В
Полипропиленовые ем-
кости, 30 мл
Полиэтиленгликольдиак-
рилат (PEGDA)
Полиэтиленгликоль-
диакрилат (PEGDA),
3.4 kDa
Половолоконная перфу-
зионная культура
Праймеры
Праймеры флюоресцен-
тно-Су5-меченые
Препаровальная луна
Приспособление для за-
клеивания микротитра-
ционных планшетов
Приспособление для
заклеивания пластико-
вых планшетов Mylar
Приспособления для за-
клеивания планшетов
Пробирки Accuspin
Пробирки круглодонные
с крышками
Пробирки Лейтона
Пробирки пластиковые
Пробирки поликарбо-
натные Nalge Nunc
Пробирки центрифуж-
ные конические
Пробирки центрифуж-
ные
Прогестерон в абсолют-
ном этаноле
Chance Propper; Wheaton
Sigma
Calbiochem; Sigma; USB
Biomedical Technologies;
BD Biosciences: Sigma:
Stratech
Invitrogen
NalgeNunc
Nektar Transforming Ther-
apeutics: Shearwater
Nektar: Shearwater
Argos; Bellco; Biovest; Fi-
berCell; JM Separations;
Spectrum
Applied Biosciences; Re-
search Genetics; Riken
Amersham Biosciences
Daigger; Olympus; Leica;
Nikon; Zeiss
См. Приспособление для
заклеивания планшетов
MP Biomedicals; In vitro
gen
Anachem; Brandell; Elkay;
Greiner; MP Biomedi
cals; Porvair
Sigma Diagnostics
Alpha Laboratories; BD
Biosciences (Falcon),
Bellco; Corning; Kimble-
Kontes
Bellco; Corning; Techno
Plastic
См. Пробирки
центрифужные.
См. Пробирки
центрифужные
Alpha; Bibby Sterilin; BD
Biosciences (Falcon);
Corning; Du Pont; Ep-
pendorf; Greiner; Chn
nilab; Nalge Nunc; Tech-
no Plastic Products
Sigma
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
593
Программа компьютер-
ная BMON
Программа компьютер-
ная Fast-Track Wave-
maker32 ver.6.6
Программа компьютер-
ная Fragment Manager
Программа компьютер-
ная Scion-Image
Программа компьютер-
ная для испытания
усталостной прочности
связок Wavemaker32
Программа компьютер-
ная для сбора и хране-
ния данных Cell Quest
Программа компьютер-
ная для статистической
обработки SPSS (ver-
sion 10.0)
Программируемый мо-
розильник
Пролин
Пролиферация клеток,
исследование
Проназа
Пропилил иодид
Протеаза нейтральная
(Диспаза)
Протеиназа К
Проточные цитометры
Проявители для фотоли-
тографии Shipley 354,
1813,1818
Проявитель для фотоли-
тографии и фотогра-
фии OCG 825-835,934
Путресцин 2HCI
Радиоизотопы
Распылитель краски
Раствор Krebs- Henseleit
Раствор для счетчика
клеток
Раствор несущественных
аминокислот в МЕМ
Раствор силиконизирую-
щий (Sigmacote)
Раствор солевой забу-
ференный MES
Ingenieurbiiro Jacket
Instron
Amersham Biosciences
Scion
Instron
BD Biosciences
SPSS
Messer; Planer; Thermo
Life Sciences (Cryoined);
Stalebourne
См. Химические реактивы
Lumilech (Cambrex); Pro-
mega; Upstate
Calbiochem, Roche Diag-
nostics; Sigma
Sigma
Roche Diagnostics
Sigma
Agilent; BD Biosciences;
Beckman Coulter; Ge-
netic Research: Guava
Technologies
Microchem Corp.
Cilia Specialty; см. также
Химические реактивы
Sigma-Aldrich
Amersham; MP Biomedi
cals; PerkinElmer; Sigma
Badger Air Brush Co.
Sigma
Beckman Coulter; Scharfe
См. Среды
Sigma
Pierce
Раствор солевой сбалан-
сированный без Mg'+ и
Ca2t (HBSS)
Раствор солевой сбалан-
сированный Эрла без
Са*м Mg2t(CMF)
Раствор солевой Тирода
(TBSS)
Раствор Хэнкса сбалан-
сированный солевой
(HBSS)
Реагент, блокирующий
пероксидазу
Реактивы биохимичес-
кие
Решстраторы темпера-
туры
Ретиноевая кислота
Ретинола ацетат, trans
Рефрактометр
Решетки и чашки для ор-
ганной культуры
Рибофлавин
Роботизированные сис-
темы
Родамин В
Роллер-флаконы, плас-
тик
Роллер-флаконы, стек-
лянные
Роллер-флаконы, шта-
тивы
Роторы
Сафранин О
Сахароза Fluka; Sigma
Сбалансированный со-
левой раствор, раствор
Хэнкса, Эрла и т.д.
Секвенирование автома-
тическое, оборудова-
ние
Секвенирование, набор
Сепарация клеток
См. Среды
Invitrogen
См. Среды
См. Среды
Cytomation; Dako
Calbiochem; Fluka; Merck;
Pierce; Roche Diagnos-
tics; Sigma; U.S. Bio-
chemical
См. Термометры с регист-
рирующим устройствам
Sigma
Sigma
Beckman; Cole-Parmer;
Fisher; Technika.
BD Biosciences
Sigma
Beckman Coulter; Bio-
Rad; Cytogration; Gil-
son; Innovative Cell
Technologies
Sigma
Applied Scientific; BD
Biosciences; Caisson;
Corning; Integra
Bellco
Argos; Bellco; Genetic-
Research Instr.; Integra;
Lawson Mardon Whea-
ton; New Brunswick Sci-
entific; Robbins;
New Brunswick Scientific
Sigma
См. Среды
ALFred Amersham Biosci-
ences
Amersham Biosciences
Accurate Chemical &
Scientific, Applied Im-
mune Sciences; BD Bio
sciences;
S94
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
Серебра нитрат
Серин
Сетка нейлоновая Scry-
nel NYHC
Сетчатые и металличес-
кие фильтры
Сиквенс ДНК
Силикагель
Силикон
Система амилификаци-
онная Superscript
Система культуры кле-
ток ротационная RCCS
Система культуры
клеток ротационные
(RCCS)
Система охлаждающая
с закрытым горлом и
контролируемым ре-
жимом охлаждения
Система очистки воды
Система перфузионная
мембранная Membro-
ferm
Система сжатие/растя-
жение для культуры
миоцитов
Системы с обратным ос-
мосом
Сита
Сита из нержавеющей
стали
Сита клеточные
Сито с ячейкой 200-мм
Скальпели
Слайд-контейнеры
для эмульсии (Cyto-
Mailer)
BioCarla; Biochrom.
Dynal; Kendro; Miltenyi;
PerkinElmer; Siem Cell
Technologies
См. Химические реактивы
См. Химические реактивы
Merck; см. также
Фильтры нейлоновые
сетчатые
Dynal; Merck; Miltenyi;
Sefar; Slanier; Teledyne
Tekinar; (см. также
Фильтры клеточные и
Сита клеточные)
Ceron
Fisher; Merck
Fisher; Merck; Serva:
Sigma
Invitrogen
Synlhecon; Cellon
Synthecon; Cellon; Syn-
lhecon; Inc.
Taylor-Wharton
Applied Biosciences; Barn-
stead; Elga; Genetic
Research Instr.; High-Q;
Millipore; Ptirile; Triple
Red; U.S. Filter; Vivendi;
Whatman
Polymun Scientific
Instron
Barnstead; Elga; Millipore;
U.S. Filter
Markson; Relsch: cm.
также Сетки, сетчатые
фильтры
BD Biosciences; см. также
Сетчатые фильтры
BD Biosciences; Dynal;
Miltenyi Biolec
BD Biosciences, Tekinar
См. Инструменты для
иссечения
Lab-Tek; Ftsher; Stallab
Слайд-флаконы
Смазка силиконовая
Смесители 1аза
Смесь Pen/Strep Fungi-
zone
Смешанная перфузион-
ная система с капил-
лярным слоем
Соединения Люэра
Сорбитол
Сортер клеточный FACS
Сортер клеточный FAC-
SCalibur
Сортер клеточный
MACS
Сортер клеточный флюо-
ресцентно-активиро-
ванный (FACS)
Сортин! магнитный
Состав герметезирую-
щий для тканей Tissue
Tek-O.T-C
Сосуд культуральный
(STLV, Slow Turning
Lateral Vessel)
Сосуды для культуры
Спектрофотометр для
микроиланшетов Spec-
tra Мах 250
Спирт хлороформизоа-
миловый
Среда 199
Среда CMF-PBS
Среда CMRL-1066
Среда Daigo’s Т
Среда DMEM со стаби-
лизированным глюта-
мином
Среда DMEM/F12,
50/50
Среда F12
Среда F12: DMEM
Среда F12H
Среда HEPES
Среда LHC-9
Среда Ml99
Nalge Nunc; см. также
Слайд-камеры
ВОС Edwards; British
Oxygen, Dow Corning;
Girovac
Gow-Mac; Signal
См. Среды
См. Система перфузион-
ная половолоконная
Altec; Applied Medical
Technol., Harvard Appa-
ratus: Popper
Sigma
BD Biosciences; Beckman-
Coulter
BD Biosciences
Dynal; Miltenyi
BD Biosciences
Dynal; Miltenyi
Sakura Finetek
(Raymond Lamb in UK);
Sakura Finetek
Europe
Synihecon; Cellon
См. Чашки флаконы
и планшеты для
культуры
Molecular Devices; см.
также Ридеры для
планшетов
Biogene
См. Среды
См. Среды
См. Среды
Wako
Invitrogen; Biochrom
Bioc hr om; Cellgro- Medtat-
ech; Invitrogen; Sigma
См. Среды
См. Среды
См. Среды
См. Media
BioSource
См. Среды
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
595
Среда McCoy’s 5А См. Среды Среда заключающая Fishei
Среда MCDB 105 См. Бессывороточные Histoclear
среды Среда заключающая Lab Storage Systems Inc.
Среда MCDB 153 См. Бессывороточные HistoGel
среды Среда заключающая Sigma
Среда MCDB-170 and stocks Среда МЕМ Среда МЕМ, 10х Среда MSCGM Среда RPMI 1640 Среда S-MEM Среда альфа Среда бессывороточная Epi-Life Среда бессывороточная Panserin™ 401 Среда Вильямса Е Среда Гипак-Фиколл Среда для заключения См. Бессывороточные среды См. Среды См. Среды Cambrex См. Среды См. Среды См. Среды Sigma Histopaque Среда замороженная (DMSO) ORIGEN™ Среда Лейбовитца L- 15 без лютамина Среда минимальная под- держивающая Среда определенного состава для кератино- цитов (KDM) Среда определенного состава для керати- ноцитов с добавками (SKDM) Среда основная LHC Origen Biomedical См. Среды См. Среды Cambrex; Cascade; Invit- rogen: См. Среда для роста кератиноцитов BioSource Invitrogen
CoaChrom Invitrogen; Sigma См. Фикол i—Гипак Fisher Vector Laboratories
Среда редуцированная с
Среда для заключения Vecta shield DAPI сывороткой Opti-MEM Среда Хэма F-10
Vector Laboratories Invitrogen
Среда для заключения Vectashield (10 мкМ тирозина),
Среда для заключения Biomeda; Citifluor; Merck: Microm; RA Lamb; Slatlab Среда Хэма F-10 См. Среды
срезов Среда Хэма F12 См. Среды
Среда для заключения Biomeda Среда Хэма F12: DMEM См. Среды
срезов на основе воды Среды ACM Biotech; AES;
Gel, Mount ATCC, Biochrom; BD
Среда для заключения срезов с флюоресцен- цией Cytoseal ТМ 60 Microin; Stephens Scien- tific; VWR См. Среда для криокон- Biosciences: Biosource: Caisson; Cambrex, Cas- cade; CellGenix; Cell- Gro-Media lech; Con-
Среда для заморажива- naught; Gemini; Genetic
ния сервации Research Instr.; Medi-
Среда для криоконсер- MP Bioinedicals; Invitro- alech; MP Biomedicals;
вации gen; JRH Biosciences; Irvine Scientific; Invil-
Sigma rogen; JRH; PAA; Paesel
Среда для роста брон- Cambrex (Clonelics; Bio- & Lorei; Perbio; Promo-
хиального эпителия Whiuaker) Cell; Sigma; SletnCell
(BEGM) Technologies; Wako
Среда для роста керати- Cambrex; Cascade; Invit Среды бессывороточные BD Biosciences; Biosource;
ноцитов (KGM) rogen; PromoCell; Sigma Cascade; CellGenix;
Среда для роста кле- Cambrex (Clonelics) CoaChrom; Roche Di-
ток скелетных мышц agnostics; Biofluids;
(SKGM) Cambrex (Clonelics);
Среда для уплотнения Amersham; Genetic Re- Cascade Biologicals; Hy-
search Instr.. MP Bio- clone; Hycor; Invitrogen;
medicals; Nycomed; Rob- Irvine; JRH Biosciences;
bins Scientific; Sigma Medialech; Melachem;
Среда Дюльбекко мо- См. Среды MP Biomedicals: PAA;
дифицированная по PromoCell; Roche;
Iscove’s (IMDM) Sigma; Slratech; TCS
Среда Дюльбекко моди- См. Среды Veil Works
фицированная по Игла Среды для культуры кле- BD Biosciences; Bio-
(DMEM) ток насекомых Source; Cambrex;
596
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
Среды для культуры
тканей
Среды для приготовле-
ния лимфоцитов
Среды для фосфатного
буфера
Среды на заказ
Среды, солевые раство-
ры для культуры
Стволовые клетки (вы-
деление, маркеры, хра-
нение)
Стекла FlexiPERM (8 ка-
мер)
Стекла SonicSeal 4-лу-
ночные
Стекла для камер для
культур тканей Lab-
Tek 8 Chamber Tissue
Стекла для культураль-
ной камеры
Стекла для микроскопии
Стекла многолуночные
Стекла покровные Ther-
manox
Стекла покровные плас-
тиковые
Стекла покровные
Стекла предметные
Стеклянные волокна
Стерилизаторы и су-
шильные шкафы
Стерилизаторы
Стрептавидин-НТС
Стрептомицин
Hyclone, Invilrogen; MP
Bioniedicals; Novagen;
Sigma
См. Среды
Amersham Biosciences;
Cambrex; MP Biomedi-
cals; Nycomed; Robbins
Scientific; Sigma
Caisson; см. также Среды
См. Среды
Chemicon; Geron;
Melachem; Miltenyi;
Origen; Roche; Universal
Biologicals
Sartorius
Nalge Nunc
См. Стекла для камер
Applied Scientific; Bayer;
BD Biosciences* Bibbv
Slerilin; Heraeus;
Melachem; Nalge Nunc;
Siem Cell Technologies
Bellco; Berliner Gias;
H.V. Skan; Laboratory
Sales, Lab-Tek; Microm,
Nalge Nunc; Propper;
Ravniond Lamb; Rich-
ardsons; VWR
См. Ка меры для
культивирования,
стекла для
культуральной камеры
Nalge Nunc (см. также
Стекла покровные,
пластик)
Bayer; Corning; MP Bio-
niedicals: Lux; Invilrogen
Bayer; Corning; Fisher;
Invilrogen, Whealon
См. Стек ю для
микроскопии
Millipore; Pall; Whalman
См. Пени, сушильные
шкафы
См. Автоклавы, печи,
сушильные шкафы
Dako Diagnostics
См. Среды
Сульфо-NHS, N-гидрок-
сисульфосукцинимид
Счетчик клеток элект-
ронный
Счетчики клеток
Счетчики колоний
Сыворотка FCS
Сыворотка быка (отоб-
ранные партии)
Сыворотка донорская
лошади
Сыворотка донорская
теленка (DCS)
Сыворотка козы
Сыворотка козы норма-
лизованная
Сыворотка крысы
Сыворотка лошади
Сыворотка рыбы
Сыворотка теленка
Сыворотка фетальная
теленка FBS
Сыворотка фетальная
теленка термоинакти-
вированная (HIFBS)
Сыноротка цыпленка
Сыворотка, заменители
Сыворотки
Таблетированные сред-
ства
Таблетки PBS
Термометры с регистри-
рующим устройством
Термометры электрон-
ные
Pierce
См. Cell counters
Beckman Coulter; New
Brunswick; Scharfe
BioWorld; BioDu Pont
(NEN Life Sciences);
Cole-Parmer; Don Whit
ley; Perceptive Instru-
ments; PerkinElmer;
Synbiosis
См. Сыворотка
Gemini; Invilrogen; MP
Bioniedicals; Sigma; Ser
aLab
Gemini
См. Сыворотки
Sigma
Vector
Pel-Freeze
См. Сыворотка
East Coast Biologies
См. Сыворотки
См. Сыворотка
Invilrogen; MP Bioniedi-
cals; TCS Biologicals
См. Компоненты сыво-
ротки
ATCC; Biochrom, Bio-
source; Caisson; Cam-
brex; Invilrogen; Gemini;
Globephann; Harlan
Seralab; HyCkme; Invit-
rogen; Irvine; Melachem:
MP Bioniedicals; JRH
Biosciences; PAA; Per-
bio; PromoCell; Sero-
logicals; Sigma; TCS
Biologicals
Johnson & Johnson
Oxoid; См. также Среды
Comark; Cole-Parmer;
Fisher; Harvard; Grant;
Omega; Pierce; Ruslrack
Comark; Cole-Parmer;
Fisher; Harvard; Grant;
Labox; Omega; Pierce,
Thermo Electron
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
597
Термостаты, пропорцио-
нальные контроллеры
Тест МТТ
Тест ХТТ
Тестирование на микоп-
лазмы
Тетраме1илбензидин
Тефлоновые листы и
тубы
Тиамин-НС1
Тимидин
Тимидин меченный три-
тием
Тиоглицерин
Тирозин
Токоферол
Толуидин синий
Трансплантат сосудис-
тый дакроновый
Трансферрин
Трансферрин человече-
ский
Треонин
Трииодтиронин
Трипсин
Триисин/ЭДТА
Трипсина заменители
Трипсина заменитель
Trypzean
Триптофан
Трис
Тритон Х-100
Триэти ламин
Трубка диализная
Трубки Pharmed
Трубки силиконовые
Трубки силиконовые для
обмена воздух/СО2,
уплотненные платиной
Трубки термоусажива-
ющиеся полиолефи-
новые
Уве личивающие окуля-
ры
Углерод общий органи-
ческий (ТОС), оборудо-
вание для опреде тения
Controls & Automation;
Fisher:
Sigma
Sigma
ATCC; Bionique; EC ACC;
DMSZ; Mycoplasma Ex-
perience
Research Diagnostics
Interplast; Plaslitn
Sigma
Sigma
NEN Life Sciences
(DuPont)
Sigma
Cm. Xu мические реактивы
Sigma
Sigma
Bard
BD Biosciences: Sigma
Sigma
См. Химические реактивы
Sigma
Sigma; Worthington; cm.
также Среды
См. Среды
Hyclone; Innovative Cell
Technologies; Invitro-
gen; Perbio; Sigma
Sigma
См. Химические реактивы
См. Химические реактивы
Sigma; Fisher
Fisher; Sigma
Cole-Parmer; Chemicon;
Pierce: Serva; Spectrum
Cole-Parmer
Altec; Bibby Slerilin; Dow
Corning; Cole-Parmer;
Nusil, PAW BioScience
Products; Thomas: Wat-
son-Marlow
Cole-Partner
Appleton Electronics
Bellco; New Brunswick
Scientific
Millipore; Sartec; Thertno-
Eleclron
Уголь активированный Sigma
Улыра-ТМВ (3,3г, 5,5г- Research Diagnostics
ттетраметилбензидин)
Ультрамикротом Leica
Универсальные контей- Bibby Sterilin; Camlab;
неры Corning: Elkay; Nalge Nunc
Упаковка стерильная. Applied Scientific; Buck
бумага, нолупроницае- Scientific; KNF Corp;
мая нейлоновая пленка Portex; Portland Plas- tics; Roth
Уранилацетат Plano; SPI Supplies
Устройства захвата изоб- Scion
ражения (в режиме за- медленного времени)
Устройство для ионного Gatan; Fison
напыления
Устройство для ионного Fison
напыления Polaron SC502
УФ Источники Cole-Parmer, L’VP
УФ-отвердевающий Summers Optical
клей для стекла
Фактор ECGS См. Факторы роста
Фактор FGF, человече- См. Факторы роста
ский рекомбинантный
Фактор GM-CSF См. Факторы роста
Фактор TGF-pl R&D Systems; Research Diagnostics
Фактор роста EGF ре- См. Факторы роста
комбинантный
Фактор роста EGF См. Факторы роста
Фактор роста HGF/SF. См. Факторы роста
человеческий, реком- бинантный
Фактор роста KGF, че- См. Факторы роста
ловеческий рекомби- нантный
Фактор роста LIF См. Факторы роста
Фактор роста NGF См. Факторы роста
Фактор роста редуциро- BD Biosciences; Fisher
ванный Matrigel Scietitific
Фактор роста фиброб- См. Факторы роста
ластов
Фактор роста эпидер- См. Факторы роста
мальный (rEGF)
Фактор роста эпидер- См. Факторы роста
мальный человеческий (hEGF)
Факторы прилипания См. Матрикс
Факторы роста и цито- Amersham; Amgen; Aus-
кины tral Biologicals; BD Biosciences; Biodesign; Biosource; Cainbrex; Cambridge Bioscience; Collaborative Research
598
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
Факторы роста стволо-
вых клеток (SCF)
Фенилаланин
Фенилендиамин (OPD).
таблетки
Фенилизотиоцианат
Феноловый красный
Ферментеры
Фибриновый герметик,
TisseelVH
Фибробласты
Фибронектин
Фибронектин /коллаген
БСА
Фибронектин человече-
ский fibronectin
Фиколл
Фиколл-Гипак
Фильтр нитекс нейлоно-
вый, 100 мкм
Фильтрация стерилиза-
цией
Фильтры HTTuffryn
Фильтры Tuffryn
Фильтры клеточные
Фильтры стерилизаци-
онные
Фильтры стерилизаци-
онные
Фильтры, сита и марле-
вые тамионы
(BDBiosciences); Gen-
zyme; Invitrogen; MP
Bioniedicals; Paesel &
Larei; Pepro-Tech;
PerkinElmer: Proniega;
R&D Systems; Roche;
Serologicals; Sigma;
Slralecli; Universal
Biologicals; Upstate Bio-
technology
См. Факторы роста
См. Химические реактивы
Sigma
Pierce
Sigma
См. Биореакторы
Baxter
См. Специализированные
к /етки
Amersham; BD Bioscienc-
es. Biomedical Technolo-
gies; Biosource Interna
lional; Invilrogen; Lab
Vision. R & D: Sigma;
Slralech; См. также
Матрикс
Biosource International
BD Biosciences (Collab-
orative Research)
Amersham Biosciences;
MP Biomedicals; Sigma
Amersham Biosciences;
Cambrex; MP Biomedi-
cals; Nycomed; Sigma
Tekmar-Dohrmann (cm
также Неи.юновое cumo)
См. Фильтры
Pall-Gelman
Pall-Gelman
BD Biosciences; Miltenyi
BD Biosciences; Bibby
Slerilin; Corning; Mil-
lipore; Nalge Nunc; Ora-
nilab. Pall Gelman; Sar-
torius; Techno Plastic;
VWR; Whatman.
См. Фильтры.
стерилизации
См. Сетчатые фильтры
Фильтры-насадки на
шприцы
Фильтры-шприцы
Фитогемагглютинин
Флаконы для заморажи-
вания
Флаконы для культуры
тканей Falcon
Флаконы для культу-
ры тканей Lifecell
(#420030)
Флаконы для культуры
тканей
Флаконы и мини флако-
ны сцинтилляционные
Флаконы и чашки Pri-
maria®
Флаконы и чашки для
культуры тканей, плас-
тик
Флаконы полистироло-
вые
Флаконы
Флаконы Эрленмайера
Флюоресценция, среды
для заключения
Флюоресценция, среды
для заключения Fluor-
Save
Фолиевая кислота
Формалин забуферен-
ный
Формалина раствор, за-
буференный
Формальде! ид
Формамид
Форсуночные порты,
системы Interlink
Фосфокреатин
Фосфоэ ганоламин
Фотографические реак-
тивы, иленки и фото-
бумага
Фотолитография /фото-
гравировка
Фотолитография /фо-
тогравировка, прояви-
тель MF-319
Microgon; Millipore; Pall-
Gehnan; Sartorius; см
также Фильтры
См. Фильтры
Amersham Biosciences;
Sigma
См. Ампулы
BD Biosciences
Nexell Therapeutics
См. Чашки, флаконы
и планшеты для
культуры
PerkinElmer (Packard)
BD Biosciences (Falcon)
Promo Cell; Sigma
См. Чашки, флаконы
и планшеты для
культуры
См. Чашки, флаконы
и планшеты для
культуры
См. Чашки, флаконы,
планшеты для
культуры
См. Лабораторное стек ю
Bio Media; Citifluor; Mi-
crom; Slepbens Scien-
tific; Vector; VWR
Calbiocliem
Sigma
Fisher
Sigma
См. Химические реактивы
Merck
BD Biosciences
Sigma
Sigma
Agfa, Eastman Kodak;
Fuji; Ilford
Microchem Corp; Cilia
Specialty Chemicals
Microchem Corp.
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
599
Фотолитография/ фото-
гравировка MF-319
Фотопленка Kodak X-
ОМАТ
Фотореактивы просвет-
ляющие
Фотосенсибилизатор
для фотолитографии
Irgacure2959
Фотосенсибилизаторы
для фотолитографии
Irgacure 2959
Фторотан
Фунгизон
Фунгициды
Характеризация клеточ-
ных линий
Хвосты крысиные
Химические реактивы
Хлор
Хлорамфеникол
Хлороформ
Холерный токсин
Холина хлорид
Хоидроитинсульфат
Хондроциты
Хромосомные красители
Центрифуги
Цен грифу гирование в
микротитрационных
планшетах
Циклин-ВМ
Циклический АМФ
Циклоспорин
Цилиндры или лотки для
пинеток
Цинка сульфат гелтагнд-
рат
Ципрофлоксацин
Цистеин
Microchem Corp.
Eastman Kodak
Kodak
Ciba Specialty Chemeicals
Ciba Specially Chemicals
Henry Schein
См. Амфотерицин В
Bio Whittaker; MP Bio
medicals; Invitrogen;
Sigma
См. Аутентификация
клеточных линий; ДНК-
фингерпринтинг и
ДНК-профилинг
Biotrol
Calbiochem; Fisher; JT
Baker; Merck; Pierce:
Research Organics;
Roche; Scientific&
Chemical Supplies; Sig-
ma; USB; Wako
Hays Chemical Dis
tribution (см. также
Дезинфектанты)
Sigma
См. Химические реактивы
EMD; List Biological;
Merck; Sigma
Sigma
Sigma
Cm. Specialized cells
Applied Imaging; Cambio;
Vysis
Beckman; DuPont (Sor-
val); Fisher; Kendro;
Thermo-IEC; Life Sci-
ences International
Beckman Coulter; Thermo
Electron
Roche Diagnostics
Sigma
Novartis; Sigma
Bel Art; Fisher; Nalge
Nunc; Radleys
См. Химические реактивы
Bayer
Sigma
Цистеина1идрохлорида
идрат
Цистин
Цитобакеты
Цитокины
Цитометр сканирующий
Цитометр
Цитофектнн GSV
Цитоцентрифуга
Чашки
Чашки Petriperm
Чашки для культуры на
предметных стеклах
Чашки культуральные,
бактериологические
Чашки Петри Stanzen
Чашки Петри
Чашки с иоли-П-лизино-
вым покрытием
Чашки с пониженным
прилипанием, 35 мм
Чашки
Чашки флаконы и план-
шеты для культуры
Чашки флаконы и план-
шеты для культуры,
обработанные колла-
геном
Шейкер ротационный
Шейкер-инкубатор
Шпатели
Шприц Cornwall
Штопфер для автомати-
ческих пинеток
См. Химические реактивы
См. Хи мические реактивы
Thermo Electron Corpora-
tion
См. Факторы роста
Beckman Coulter; Com-
pucyte (см. также
Микроскопы)
См. Проточный
цитометр;
сканирующий
цитометр
Glen Research
Bayer; CSP; Electron
Microscopy Sciences;
Thermo Electron; Sakura
Finetek; Wescor
Combi Ring Dish Renner;
Germany
Sartorius
Vivascience; см. также
Чашки, флаконы,
планшеты для
культуры
BD Biosciences; Fisher
Greiner
См. Чашки, флаконы,
планшеты для
культуры
BD Biosciences (Biocoat)
Corning (Costar)
См. Культуральные
чашки, флаконы и
планшеты
BD Biosciences (Falcon);
Bibby Sterilin; Corning
(Costar); Fisher; Greiner;
Invitrogen, Iwaki; MP
Biomedicals (Lux); Nalge
Nunc; Sarstedt; TPP
BD Biosciences; Corning;
Iwaki Glass
Boeker Scientific; New
Brunswick
Camlab; New Brunswick;
Radleys
Fisher; VWR
Popper; Cole-Parmer
См. Штопфер для
пипеток
600
Приложение II. ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
Штопфер для пипеток
Щелочная фосфатаза.
Материалы для иссле-
дования
Щелочная фосфатаза.
Набор реактивов для
определения (Red)
Щприны
ЭГТА
ЭДТА
ЭДТА, раствор стериль-
ный
Экстракт) инофиза < РЕ)
Экстракт эмбриона цып-
ленка
Эластаза
Эластаза поджелудоч-
ной железы
Электрофорез
Элютриатор центрифуж-
ный
Эмульсия для автора-
диографии
Эндотелии 1, человече-
ский, свиной (ЕТ-1)
Bellco; Camlab; Volac
Sigma
Vector
Baxter: BD Biosci-
ences; Popper(и
основные поставщики
лабораторного
оборудования)
Sigma
JT Baker; Merck; Sigma
См. Среды
Cambrex (Clonettcs); Cas-
cade, Invitrogen; Promo-
Cell
Accurate Chemical & Sci-
entific; Invitrogen
Roche Diagnostics: Sigma
Sigma
Amersham Biosciences;
Anachem; Bio-Rad; Invt-
Irogeti; Haake; Innova-
tive Chemistry, Thermo
Electron
Beckman Coulter
Amersham Biosciences
Sigma
Энтеллан, Entellan
Эпидермальный фактор
роста
Эпинефрин
Эрленмайера флаконы
для культуры тканей
Эстрадиол
Этанол
Этаноламин
Этидий бромистый
Этикетки для заморажи-
вания
Этилендиаминтетрааце-
тата днунатриевая соль
Ядерный быстрый крас-
Яйца куриные
Ярлыки
EDC, 1-этил 3-(3-димети
ляминО! ipouH л )карбод
иимид
туо-инозитол
ТРА, 12-О-тетрадекано-
илфорбол-13-ацетат
TRIzol
Tween 20
Tween 80
X-gal: 5-бром-4-хлор-3-
индолил-р-В-галакто-
ииранозид
Merck
См. Факторы роста
Sigma
Merck; LR-White; Roth
См. Лабораторное, стекло
Sigma
См. Химические реактивы
Sigma
Sigma
Computer Imprintable
Label Systems: GA Inter-
national;
Cm. EDTA
Sigma
Charles River Laboratories
Triple Red; Cm
также Ярлыки для
криофлаконов
Pierce
Sigma
Sigma
Invitrogen
Sigma
Sigma
Roche
Приложение III
ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ
И ДРУГИЕ источники
Вначале приводятся номера телефонов, затем номера факсов; два номера, отделенные точкой с запя гой означают*,
что доступно две линии. Международному коду предшествует знак который следует заменить соответствующим
кодом выхода на международную телефонную сеть. Продукция упомянута в конце; приводятся только те, которые
упоминаются в настоящем руководстве пли связанные с культуральной работой. У авторов не было намерения
давать весь список продукции, предоставляемой поставщиками
Abbott Laboratories. 100 Abbott Park Road, Abbott
Park, North Chicago, IL 60064-3500, USA. 800-323-
9100; 1-847-937-6100. www.abbott.com. Нембутал.
Accuramatic. 40 12 Windsor Road, Kings Lynn, Norfolk
PE30 5PL, England, UK. 01553 777253.01553 777253.
info@accuramatic.co.uk. www.accuramatic.co.uk. Авто-
матические диспенсеры, устройства для разлива жид-
костей, перистальтические разливочные машины.
Accurate Chemical & Scientific Corp. 300 Shames Dr.,
Westbury, NY 11590, USA. । 1 516-333-2221; 800-
645-6264. +1 516-997-4948. mfo@accuratechemical.
com. www.accurateehemical.com,. Антитела; сепарация
биомассы; экстракт эмбриона цыпленка; исследова-
ния межклеточного вещества; клетки HeLa; микро-
центрифуг и.
ACE-Autoclave Control Engineering. Unit E, Caven-
dish Courtyard, Sallow Road, Weldon North, Corby,
Norlhants.,NNl 5JX, England, U K. +44 (0)1536 206 200.
+44 (0)1536 206 202. sales@aceautoclaves.co.uk. www.
ace-auliidaiesco.iik Крупномасштабные автоклавы;
парогенераторы.
ACM-Biotech GmbH. Josef-Engert Strasse 9, D-
93035 Regensburg, Germany. +49 (0)941 942 743. +49
(0)941 942 7444. techservue@acm-biotech.com, www
acm-biotech.com. Эндотелиальные клетки; Epiflow;
EPIFLOW: система культивирования клеток с исполь-
зованием непрерывного обмена среды п постоянного
снабжения газом; гепатоциты; исследования in vitro;
кератиноциты; мембранная перфузия; органотипичес-
кая культура; селективные бессывороточные среды.
Advanced Instruments Inc. Two TecbnologyWay, Nor-
wood, MA 02062, USA. 781 320 9000, 800 225 4034.
781 3208181. mail@aitests.com, www.aitests.com. Oc-
мометр
AES Laboratoire. Rue Maryse Basti. e, Ker Lann, CS
17219.F-35172 Brtizcedex, France.+33 (0)2 23 50 12 12.
+33 (0)2 23 50 12 00. aes@aeslaboraloire.com, www.
aeslaboratoire.com. Ламинарный шкаф; среды; боксы
микробполгм ической защиты.
Affymetrix Inc. 888-362-2447. +1 408-731-5441. support©
affymetrix.com; sales@affymetrix.com. www.affymetrix.
com. Микрочипы для анализа ДНК.
Afiymetrix UK. +44 (0) 1628 552550. +44 (0) 1628 552598.
supiwteuiope@affymetriA .com; saieseutope@affymetrix.com,
www.affymetrix.com. DNA Микрочипы для анализа.
Agilent Technologies. Quantum Analytics. Inc., 363 Vin-
tage Park Drive, Foster City, CA 94404, USA. 800-227-
9770: 800-992-4199. cag enquiry@agilent.com. www.
chem. agilent.com. Флюоресцентный биоанализатор;
мпкрочииы для анализа ДНК.
Agilent Technologies UK Ltd. Life Sciences & Chemi-
cal Analysis Group, Lakeside, Cheadle Royal Business
Park, Stockport, Cheshire SK8 3GR, England, UK.
^44 (0)161 492 7500; 0845 712 5292. 0845 600 8356.
cag enquiry@agilent.com. www.agilent.com/chem uk.
Флюоресцентный биоанализатор; микрочипы для
анализа ДНК.
Air Packaging Technologies Inc. 25620 Rye Can-
yon Road, Valencia, CA 91355, USA + 1 661-294-
2222.+1 661-294-0947. Ilchappell@aol.com. Упаковка
в пакеты с наполнением воздухом; транспортные
контейнеры для клеток.
Air Products & Chemicals, Inc. 7201 Hamilton Blvd,
Allentown, PA 18195, USA. 610-481-4911; 800-654-
4567. 800-880-5204. info@apci.com. www.airproducts,
com/. CO2, автоматический блок переключения для
баллонов с углекислым газом, СО2-контроллеры.
Air Products pic. 2 Millennium Gate, Westmere Drive,
Crewe CW1 6AP, England, UK. 0800 389 0202.0193
2 258 502. info@apci.com. www.airproducts.co.uk. CO,,
автоматический блок переключения для баллонов с
углекислым газом, С О,-контроллеры.
Air Sea Atlanta. Atlanta, GA. 1-404-351-8600-. www.
airseaatlanta.com. Контейнеры для транспортировки;
системы безопасности.
Aire Liquide. Division Materiel Cryogenique, Parc Gus-
tave Eiffel, 8 rue Gutenberg, Bussy Saint Georges 77607,
Mar me-la-Valle, Cedex 3, France. +33 (0) 1 64 76 15 00.
+33 (0)1 64 76 1699. www.dmc.airiiquide.com,. Моро-
зильники с жидким азотом. Сосуды Дюара.
Aire Liquide America Corp. 2700 Post Oak Blvd., Suite
1800, Houston, Texas 77056, USA. + 1 713 624 8000 +1
713 402 2149. wtcw.dmc.aitliquide.com . Морозильники
с жидким азотом. Сосуды Дюара.
602
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
Aire Liquids (ПК). Си. Borolabs. www.dmc.airliquide.
com,. Морозильники с жидким азотом. Сосуды
Дюара.
Alabama Research and Development. A Division of Ala-
bama Specialty Products, P.O. Box 739. Munford, AL
36268, USA. +1 (256) 358-0460 M (256) 358-4515.
www.alspi.com/Slicer.htm. Гистоло!ический нож для
тканей Krumdieck.
Albany International Research Co. Albany International
Research Co., PO Box 9114,777 West Street, Mansfield,
MA 02048-9114, USA. +1 508 339 7300; 800 992 5017
tvsearch@albmt.com. www.airesco.com. Платформы для
тканевой инженерии.
Alconox Inc. 30 Glenn Street, Suite 309, White Plains, NY
10603, USA. +1 914 9484040. +1 914 948 4088. cfeau-
ing@alconox.com. www.alconox.com. Детер] енты.
Aldrich Chemical Co., Inc. 1001 W. St. Paul Ave., Mil-
waukee, WI 53233, USA. 800-325-3010.414 273 4979.
www.sigma.sial.com/aldnch. Химические соединения,
биохимические иещества; ЭДТА.
Alexis Corp. (UK) Ltd. P.O. Box 6757, Bingham, Not-
tinghamNG13 8LS, England, UK. +44 (0)1949 836 111.
+44 (0)1949 836 222. alexix-uk@alexis-corp.com. www.
alexis-corp.com. Ahi иогенез; антитела: цитокины, ин-
терфероны; рецепторы, передача пинала; VEGF.
Alexis Corp. (USA). 6181 Cornerstone Court East, Suite
103, San Diego, СА 92121, USA.+1 858-658-0065; 800-
900-0065. +1 858-550-8825; 800-550-8825. axxoraus©
axxora.com. www.alexis-corp.com. Ahitioi енез; анти-
тела: цитокины, интерфероны; рецепторы, передача
сш нала; VEGF.
Alfa Laval. 7DomanRoad, Camberley, Surrey GU15 3DN,
England, UK. -r44 (0)1276 63383. +44 (0)1276 685035
general, uk@alfalaval.com. www.alfalaval.co.uk. Фер-
ментеры, биореакторы паровые стерилизаторы.
Alpha Laboratories Ltd. 40 Parham Drive, Eastleigh,
Hants S05 4NU, England, UK. +44 (0) 23 8048 3000.
+44 (0) 23 8064 3701. info@alphalabs.co.uk. www.
alphalabs.co.uk.. Ампулы; автоматические пипетки;
центрифужные пробирки; флаконы для заморажи-
вания; сухие на] реватели блока цилиндров; микро-
пипеткн Past el les; пипетки; пастеровские пипетки,
приспособление для пипет ирования; наконечники
для автоматических пинеток.
Alfa Medical. 59 Madison Ave., Hempstead, NY 11550,
USA. 800-801-9934. +1 516-489-9364. eMaiI@sienli-
2ers.com. www.sterilizers.com/. Полоски-индикаторы
стерильности.
Altec Products Ltd. Bude Business Centre, Bude,
Cornwall, EX23 8QN, England, UK. 0845 359 9000;
+44 1288 357820. 0845 359 9090; +44 1288 357822.
sales@altecweb.com. www.allecweb.com. Автоклавиру-
емые пакеты; соединения Люэра; перистальтические
насосы; продукция для обеспечения безопасности;
силиконовые трубки.
Ambion Inc. 2130 Woodward, Austin, ТХ78744-1832, USA.
800445-1161; 1 (512) 651-0200+1 (512) 651-0201.
cusiom@ambion.com. www.ambion.com. ДНК-матрицы;
выделение РНК; иРНК, RNAseZap; siRNA; RT-PCR.
Ambion UK. Ermine Business Park. Spitfire Close, Hunt-
ingdon, Cambridgeshire, PE29 6XY, England, UK. 144
(0)1480373020; 0800 138 1836. +44 (0)1480 373010.
custom@ambum.com. www.ambion.com. ДНК матрицы;
выделение РНК, RNAi; RNAseZap; siRNA; RT-PCR.
American Association for Cancer Research. 615 Chest-
nut St., 17lh Floor, Philadelphia, PA 19106-4404, USA.
-r 1 (215) 440-9300. +1 (215) 440-9313. membership@
aacr org. www.aacr.org. Общество исследования рака;
журналы, научные встречи.
American Fluoroseal. 431-D East Diamond Avenue,
Gaithersburg, MD 20877, USA 301.990.1407, 301
990 1472. info@americunfluoroseal.com. www.toafc.
com . Мешки для сред.
American Society for Cell Biology. 8120 Woodmont
Avenue Suite 750, Bethesda, MD 20814-2762. USA.
-r 1 301347 9300. +1 301 347-9310. aschmfo@ascb.org.
www.ascb.org . Журналы, научные встречи, научные
общества.
American Туре Culture Collection, {см. ATCC).
Amersham Biosciences. 801) Centennial Ave., P.O. Box
1327, Piscataway, NJ 08855-1327, USA. 800-526-3593.
877-295-8102. cs-us@ametsham.com. www4.amersham -
biosciences.com. Антитела; наборы для исследования;
среды для хроматографии; цитокины; DEAE декстран;
уплотняющие среды; станда|игы ДНК; элект]хк|ю{>ез;
ELISA; лпидермальный фактор роста; фибронектин;
Фиколл-i ипак; факторы роста; Hybond N; среда для
при) отопления фракции лимфоцитов; маркерные бу-
сины; микроносители; Перколл; перистальтические
насосы; ФГА; поставки сухих сред; радиоизотопы;
рецепторы; передача сигнала: мегри.юат натрия:
Ultraser-G; Verax.
Amersham Biosciences. Amersham Biosciences UK Ltd.,
Pollards Wood, Nightingales Lane, Chalfont St. Giles,
Bucks, HP8 4SP, England, UK. 0870 606 1921. +44
(0) 1494 498 231; 0800 616 927. orders.gb@amersham.
com. www4.amershambiosciences.com. Продукция см.
Amersham Biosciences (USA).
Amersham Pharmacia Biotech, си. Amersham Biosci-
ences
Amgen, Inc. One Amgen Center Drive, Thousand Oaks,
CA 91320-1799, USA. +1 805-447-1000. +1805-447-
1010. newproducts@amgen.com. www.Amgen.com. Фак-
торы роста; FGF.
Amicon, Inc. cm. Millipore.
Amphioxus Cell Technologies, Inc. 11222 Richmond
Ave, Suite 180, Houston. TX 77082-2646. USA.800-
777-2707.281-679-7910. uctivox@amphioxus.com. www.
amphiaxus.com. Белки сьшоротки человека; клеточные
линии печени человека; гепатоциты; половолокон-
ные системы культивирования; токсиколо! ические
исследования in vitro.
Anachem Ltd. Anachem House, 20 Charles Street, Luton,
Beds LU2 0EB, England, UK. +44(0)1582 745 060. +44
(0)1582 745 115. Iifescience@anachem.co.uk, sales®
anachem.co.uk.uww.anachem-ltd.com. Деконтаминация;
создание цифровых образов; электрофорез; хранение
в морозильнике; среды; микротитрационные планше-
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
603
ты; микроиробирки; наборы для выделения и очистки
нуклеиновых кислот; пипетки; автоматические пи-
петки; геметезирующие прокладки для планшетов;
поддоны; перемешивающие флаконы; тампоны для
взятия мазков; наконечники, пробирки.
Analytical ©Technologies. Lynchford House, Lynchford
Lane, Farnborough, Hampshire, GU14 6LT, England,
UK. +44 (0)1252 514 711. +44 (0)1252 511 855 info©
analyticaltechnologies.co.uk. wwwMnalyticaliechnoht-
gies.co.uk. Биохимический анализатор; биосенсоры;
коллоид-осмометр; мониторинг: миокоза, глютамин,
। лютамат, лактат? осмометры.
Anglia DNA Bioservices, Ltd. Norwich Research Park,
Colney Lane, Norwich, NR4 7UH, Norfolk, UK. t-44
(0)8454 565 365. office@angfiadna.coMk. wu’WMngli-
adnaui.uk. Аутентификация. Генетическая идентич-
ность, тестирование; ДНК-ирофилин|.
Ansell Medical. Ansell Medical, 119 Ewell Road, Surbiton,
Surrey KT6 6AL, England, UK. +1 (0)181 481 1804.
+ 1 (0)181 481 1828. ww>w.ansell.com. Нитрильные
перчатки.
Ansell Healthcare. Ansell—Red Bank, 200 Schulz Drive,
Red Bank, NJ 07701, USA. +1 732 345 54OO.K® a>.e«se/Z.
com. Нитрильные перчатки.
Anton Paar GmbH. Karnler Strasse 322, A-8054 Graz,
Austria. +43316257 0. +43 316257257. density@an-
tonpaar.com', rheology@anton-paar.com. wwwMnton-
paurjcom •. Денситометры, реометры, вискозиметры.
Anton Paar USA Inc. 10215 Timber Ridge Drive, Ashland,
VA 23005, USA. (800)-722-7556, +1 804-550-1051.
804-550-1057. infVMs@anlon-paar.com. www.anionpaar.
com, Денситометры, реометры, вискозиметры.
Apex Engineering Products Corp. 1241 Shoreline Drive, Au-
rora, IL60504, USA.+1 815 436 2200;8004516291.+1 630-
820-8886;815 436 9418, rdo@rdo-apexxom. wwwjdo-apex.
com. Декальцифицирующне агенты для исследователь-
ских и научных целей (RDO).
Appleton Electronics. 205 W. Wisconsin Ave., Appleton,
WI54911, USA. (800) 877-8919.001 (920) 734-5172.
www.aedwis.com. Элементы электронного обору-
дования; полиолефиновые термоу сажи вающиес я
трубки.
Apple ton Woods Ltd. Lindon House, Heeley Rd.,
Selly Oak, Birmingham B29 6EN, England, UK. +44
(0)121 472 7353.+44 (0)121 414 1075.info@appleton-
woodsxoMk. wwwMppletonwoods-.co.uk. Термоиндика-
торные полоски.
Applied BioPhysics, Inc. 1223 Peoples Ave., Troy, NY
12180, USA. + 1 518 276 2165. i-l 518 276 2907.'www.
biophysics.com. Клеточная адгезия; импеданс клетки;
TEER; транс.м|||телиа.|ьное сопротивление
Applied Biosciences Corp. P.O. Box 520518 Sall Lake
City. L’T 84152, USA. 800-280-7852; 801-485-4988.
801-485-4987. www.applied-biosciences.cotn. Системы
ОЧИСТКИ воды.
Applied Biosystems. 850 Lincoln Centre Drive, Foster
City, C A 94404, USA. 800 327 3002; +1 650 638 5800 +
1 650 638 5884. www.appliedbiosyslems.com. Праймеры
TaqMan 2X PCR Master Mix.
Applied Imaging. 120 Baytech Drive, San Jose CA
95134-2302, USA. +1 408 719 6400; 800 634 3622.
+ 1 408 719 6401. info@aicorp.com. wwwMicorp.com.
Хромосомное окрашивание; анализ изображения;
подсчет окрашенных точек.
Applied Imaging International Ltd. BioScience Centre,
Times Square, Newcastle upon Tyne, NE1 4EP, England,
UK. +44 (0)191 202 3100. +44 (0)191 202 3101. info®
aii.coMk. wwwMicorpxo. Хромосомное окрашивание;
анализ изображения; подсчет окрашенных точек.
Applied Immune Sciences. 5301 Patrick Henry Dr., Santa
Clara, CA 95054, USA. +1 408-980-5812. Иммунное
окрашивание, сепарация клеток.
Applied Medical Technology Ltd. 4 Orwell Furlong,
Cowley Road, Cambridge CB4 0WY, England, UK.
+44 (0)1223 420415. +44 (0)1223 420797. support©
applied-medical.co.uk. www.apphed-medical.co.uk'.
Инфузионные насосы; инфузионные системы; кон-
некторы Люэра и QR
Applied Scientific. 154 W. Harris Ave., Smith San Francis-
co, CA 94080, USA. +1 650 244 9851. +1 650 244 9866.
Антибиотики; мешки для автоклавирования, мешки
био.Ю! ической опасности; скребки д ля клеток; клеточ-
ные сита; стекла д.>1я камер; криофлаконы; скриниш
культуры; флаконы; перчатки; среды; микроиииетки;
многолуночные планшеты; иглы; пипетки; автомати-
ческие пииетки; Pi-насосы; роллерные бутыли; липкие
ленты для индикации стерильности; шприцы.
Appropriate Technical Resources Inc. с.и. ATR.
Argos Technologies Inc. 1141 East Main Street, Suite
104, East Dundee, IL 60118, USA. +1 847 783 0456.
+ 1 847783 0380. pkneisel@atgos-techxom. wwwMtgos-
tech.com. Оборудования для раллива жидкостей,
иоловолоконные перфузионные системы культур;
роллерная культура; мешалочная культура; вакуум-
ный насос.
Astell Scientific Ltd. Powerscrott Road, Sidcup, Kent,
DAU 5DT, England, USA. +44 (0)20 8309 2023.+44
(0)20 8309 2036. sales@astell.com. www.aslellxom. Ав-
токлавы, настольные автоклавы; устройство pei ист-
рации данных; стерилизаторы, сушильные шкафы
АТСС (American Type Culture Collection). 10801 Uni-
versity Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA.
+ 1 703-365-2700. +1 703-365-2701. Информация о
продукции: tech@alccjorg. База данных: help@aicc.
org. www.atccxtrg. Клеточные линии; клеточный банк;
фидерные слои; i ибридомы; среды; служба детекции
микоплазм: наборы для ПЦР- определения микоп-
лазм; сыворотка; плазмиды.
Atlas Clean Air Ltd. 176 Lomeshaye Business Village,
Turner Road, Nelson, Lancashire BB9 7DR, England,
UK. +44 (0)1282 447 666. +44 (0)1282 447 789. info©
atlascleanair.com. wwWMthtscleanairxom. Лам пиарные
шкафы; боксы микробиологической защиты.
ATR (Appropriate Technical Resources) Inc. P.O. Box
460, 9157 Whiskey Bottom Road, Laurel, MD 20723,
USA. +1 301 470 2799 +1 410 792 2837. inforeq©
atrbiotechxom.wwwMlrfiiotechxom. Инкубаторы, фер-
ментеры; шейкеры.
604
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
Austral Biologicals. 125 Ryan Industrial Ct., Suite
207, San Ramon, CA 94583, USA. +1 925 8208390;
800 433 7105. +1 925 820 6843. sales@auslralhio.com.
www.uustralbiologicals.com. Антитела: цитокины; фак-
торы роста; рецепторы.
Autogen Bioclear. Holly Ditch Farm, Mile Elm, Caine,
Wiltshire, SN11 0PY, England, UK. 0800 652 6744: +44
(0)1249 819008. +44 (0)1249 817266. www.autogenbiu-
clear.com. Антибиотики. Клетки НЕК 293; MCDB 153,
среды; Primocin; Sebomed.
Axxora LLC. 6181 Cornerstone Court East, Suite
103, San Diego, CA 92121-4727, USA. 800 550 3066,
+ 1858550 8824. *1 (858)550-8825; 1-800-550-8825.
www.biolog. de/usaJitml. Ангиогенез; антитела.- цито-
кины; факторы роста, передача сигнала; VEGF
Baker Со. Inc. P.O. Drawer Е, 161 Gatehouse Road, San-
ford, ME 04073, USA. -r 1 207 324 8773; 800 992 2537.
+ 1 207 324 3869,800-992-2537. bakerco@bakerco.com.
www.haketco.com. Ламинарные шкафы, боксы микро-
биолог ической защиты.
Bard, С. R., Inc. см. C.R. Bard Inc.
Barnstead Thermolyne Corp. 2555 Kerper Boule-
vard, P.O. Box 797, Dubuque, IA 52004-0797, USA.
800 446 6060; +1 319 589 0538. +1 319-589-0516. mkt©
bamsteadlhenmdyneam.wwwJiamsteadthermolynexom/.
СО2-к<>нтроллеры; СО2-инкубат»ры; диспенсеры; дис-
тилляторы обратного осмоса; морозильники; терми-
ческий кожух; плитки; морозильники с азотом; печи;
автоматические пинетки; pei истрирующие устройства;
стерилизаторы, мешалки, системы очистки воды.
Baxter Healthcare. One Baxter Parkway. Deerfield, IL
60015-4625, USA. 800-422-9837; +1 847-948-4770;
+ 1 847-948-2000. i-l 847-948-3642. www.baxLer.com.
Соединения Люзра клапанные; шприцы; наборы
соединительных трубок.
Bayer Corp. Bayer Consumer Care Division, 36 Colum-
bia Road. P.O. Box 1910, Morristown, NJ 07962-1910,
USA. 800-331-4536. www.bayermhc.com. Антибиоти-
ки; ципрофлоксацин; гистология; прш отопление
срезов; элиминация микоплазм; покровные стекла
Thermanox.
Bayer pic. Strawberry Hill, RG14 1JA Newbury, Berkshire,
England, L’K. +44 (0)1635 563 000. +44 1635 563 300.
medical.science©bayer.co.uk. www.bayer.co.uk . Антиби-
отики; ципрофлоксацин; i истология; приготовление
срезов; элиминация микоплазм; покровные стекла
Thermanox.
BCL. См. Roche Diagnostics.
BD Biosciences—Discovery Labware. 2 Oak Park,
Bedford, MA 01730-9902, USA. 800 343 2035.
800 743 6200. labware@bd.com. www.bd.com . Агар, ав-
томатические пипетки, Бактоиентон; бронхиальный
эпителии; исследования на Сасо-2; вкладыши для
культуры клеток; скребки для клегок; колллаген; чаш-
ки, обработанные коллагеном; стекла для культуры;
фибронектин; фильтры; вкладыши в фильтрацион-
ную лунку; FACS; флаконы; проточный цитометр; га-
зопроницаемые крышки; факторы роста; i идролизат
лактальбумина; ламинин; Матрнгель; микробиоло-
1 ические среды, многолуночные планшеты; Natrigel;
питательные бульоны; чашки для opi анной культуры;
сетки для opi анной культуры; определение пептидов
peptide TEER; трип гола, пробирки, витронектин.
BD Biosciences. Tullastrasse 8-12. 69126 Heidelberg,
Germany. +49 6221 305 0. +49 6221 305 216. mail®
bdbiosciences.com. www.bd.com . Продукция см. BD
Biosciences— Discovery Labware.
BD Biosciences Immunocytometry Systems. 2350 Qume
Dr.. San Jose, CA 95131-1807, USA. 877 232 8995.
+1 408-954-2347. facservice@bdis.com. www.bd.com.
Антитела, сепарация клеток; FACS; проточный ци-
тофлкюриметр
BD Biosciences UK Ltd. Between Towns Road, Cow ley,
Oxford,OX4 3LY,England,UK.+44 1865 781688.+44 1
865 781 578.mail@bdbiosciences.com. www.bd.com/. Cm.
BD Biosciences—Discovery Labware.
Beckman Coulter Inc. 4300 N. Harbor Blvd., Box 3100,
Fullerton, CA 92834-3100, USA. 1-800 742 2345;
+1 714 871 4848.800 643 4366; +1 714 773 8283. www.
beckmancoulter.com/. Счетчики клеток; центрифуж-
ный прибор для отмучивания; центрифу! и; деление
клеток по размерам; денситометры: ДНК-зонды;
проточные цитометры; реактивы для иммуногисто-
химии; латексные частицы (стандарт); манипуляции
с жидкостями, автоматизированное рабочее место;
центрифу! ирование микротитрационных планшетов;
роботизированные системы для клеточных исследо-
вании; сцинтилляционные счетчики; спетрофотомет-
ры (UV, VIS); Vi-CELL.
Beckman Coulter (UK) Ltd. Oakley Court, Kingsmead
Business Park, High Wycombe, Bucks., HP11 1JU, Eng-
land, UK. ч-44 (0)1494 441 181. +44 (0)1494 447 558.
beckmancouller uk@beckman.com. www.beckmancoulter,
com. Продукция см. Beckman Coulter Inc.
Becton Dickinson. Cm. BD Biosciences.
Bel-Art Products. 6 Industrial Road, Pequannock,
NJ 07440-1992, USA +1 973 694 0500; 800 4BEL-
ART.+ l 973 694 7199. www.hel-art.com. Аспираторная
емкость; мешкодержатели; бутыли; держатели буты-
лей; оплетенные бутыли; скребки для клеток; кольца
для клонирования; коробки для культур; культураль-
ные камеры; штативы для культуральных флаконов;
сушильная камера; счетчики для жикостей и 1азов;
лотки; ма1 нитный скребок для клеток; груша для пи-
иетирования; цилиндры для пииеток; автоматические
пинетки; перистальтический насос; поддоны; очки
биобезопасности: сифонное устройство для мытья
пипеток; коробки для предметных стекол; запорные
клапаны; система трубок.
Bellco Glass Inc. 340 Edrudo Rd., Vineland, NJ 08360-
3493, USA. 609 691 1075,800 257 7043. 609 691 3247.
sales@bellcoglass.com. www.hellcoglass.com. Биореак-
торы; боросиликатное стекло; кольца для клониро-
вания; деионизаторы; флаконы для ферментеров,
инкубаторы; машнтные мешалки; увеличивающее
устройство для иростмотра; емкости для иипеток;
штопферы для пипеток; поддоны; шейкеры; флаконы
для тринсинизации.
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
605
Bennett Scientific. Тог Green, Croft Road, East Ogwell,
Newton Abbot, Devon, TQ12 6BA, England, UK. +44
(0)1626 369 990. +44 (0)1626 369 992. sales@nbe.nnet-
sdentific.com. www.bennetl-scientific.com. Автоклавы;
ма1нитные мешалки; насосы: перистальтический,
пистонный, вакуумный, индикаторы стерильности
Thernialog.
Berthold Technologies. The Priory, High Street,
Redburn, St Albans, AL3 7BR, England, UK +44
(0)1582 79 1999. +44 (0)1582 79 1937. James.Grand&
Berthold.com. www.Bertholdtech.cu.uk. Поглощение
света; биоаналитнческие инструменты; флюорес-
ценция; люминесценция; микропланшетный сканер;
Mithras.
Berthold Technologies. Cahnbaclier Strasse 22,75323 Bad
Wildbad. Germany. +49 (0)7081-177 216.+49 (0)7081-
177 301. Winfried. Erdmann@Berlhold.com. www.her-
tholdtech.com. П01 лощение света; биоаналитнческие
инструменты; флюоресценция; люминесценция;
микропланшетный сканер; Milliras.
Bibby Sterilin Ltd. Beacon Road, Slone, Statlord shire,
ST15 0SA, England, UK. +44 (0)1785 812 121.+44
(0)1785 815 066. hsl@bibby-sterilin.com. www.hibby-
sterilin.com. Аспираторы; мешки биобезопасности,
вкладыши в крышки для бутылей; диспенсеры для
юрловин бутылей; бутиловые пробки; стекла для
камер; криофлаконы; чашки; ESCO резина; микро-
носители Fibra-Cel; фильтры; флаконы; стеклянные
чашки; магнитные мешалки; ручное устройство для
подсчета колоний; бутыли для сред; микропипетки;
кольцевые шейкеры; пипетки; качалочный штатив;
силиконовые трубки: силиконовые стопперы: Si-
lescol; стерилизационные мешки; универсальные
контейнеры.
Bigneat Ltd. 4 & 5 Piper’s Wood Industrial Park, Water-
bury Drive, Waterlooville, Hampshire, PO7 7XU, Eng-
land, UK. +44 (0)23 92 266400. +44 (0)23 92 263 373.
infu@bigneat.com. www.bigpeat.com. 1азовые шкафы
без выводных каналов: ламинарные шкафы: боксы
биоло! ической защиты.
Binder GmbH. Bergslrasse 14, D-78532 Tuttlingen, Ger-
many. +49 (0) 7461 1792 0. +49 (0) 7461 1792 10. info©
binder-worid.com. www.binder-world.com. Инкубаторы:
безводные, CO2, с охлаждениемением.
BioCarta. 1-877-641-2355x227. + ! 760-804-1395.info©
biocarta.com. www.biocarla.com . сепарация клеток;
цитокины; выделение лимфоцитов; бусины для маг-
нитного разделения клеток: реактив для выделения
лимфоцитов PrepaCyle.
BioCarta Europe. +49 40 525 7030. +49 40 525 70377.
info, europe@biocarta.com. wtcw.biocarta.com/. сепа-
рация клеток; цитокины; выделение лимфоцитов;
бусины для ма> нитно! о разделения клеток; реактив
для выделения лимфоцитов PrepaCyle.
Biochrom AG. РОВ 46 03 09, D-12213 Berlin, Ger-
many.+49 30 77 99 06 0. +49-30 77 10 01 2; 49-30-
77 99 06 66. info@biochrnm.de. tcwtc.biochrom.de
Антитела; среда для выделения клеток; среды; сы-
воротки.
Biocolor Ltd. 10 Malone Road, Belfast BT9 5BN,
Northern Ireland, UK +44 (0) 1232 459 008. +44 (0)
1232 551 733. info@biocolor.co.uk. www.biocolor.co.uk.
Коллаген; исследования коллагена; Blyscan GAG
исследования; исследования матрикса.
Biocompare, www.biocompare.com. Руководство для
пользователей, справочник по продукции: источники
материалов и оборудования.
BioCrystal, Ltd. 575 McCorkle Blvd., Westerville,
OH 43082-8888, USA. +1 (614) 818-0019+1 (614)
818-1147. sales@opticell.com. www.opticeli.com. Куль-
туральная камера OpliCell.
Biodesign International. 60 Industrial Park Road, Saco,
ME 04072, USA. 207-283-6500; 888-530-0140.207-283-
4800. info@biodesign.com. www.biodesign.com. антитела;
кардиальные маркеры: CD маркеры: коллаген: цито-
кины; факторы роста; матрикс; сыворотка
Biofluids. C.v. Biosource International
Biogene. BioGene House, 6 The Business Centre, Har-
vard Way, Kimbolton, Cambs PE28ONJ, England, UK.
+44 0845 1300950. +44 0845 1300 960. info@biogene.
com. www.hiogene.com/. хлороформ изоамиловый
спирт; реактивы, используемые в молекулярной и
клеточной биоло! ии.
Biohit, Inc. 3535 Route 66, Building 4, P.O. Box 308,
Neptune, NJ 07754-0308, USA.+1 732 922 4900.+ 1 73
2 922 0557. pipet@biohit.com. www.biohit.com. Микро-
шшегки, наконечники для пинеток; автоматические
пипетки.
Biohit Oyj. Laippalie 1,00880 Helsinki, Finland. +3589
773 861. +358 9 773 86 200. info@biohit.com. www.hio-
hil.com. Микропипетки: наконечники для пипеток:
автоматические пинетки
Biohit, Ltd. Unit 1, Barton Hill Way, Torquay, Devon
TQ2 8JG, England, UK. +44 1803 315 900. +44 1803 315
530. info@biohit.co.uk. www.biohit.com. Микроиипетки,
наконечники для пипеток; автоматические пипетки.
Biomedical Technologies, Inc. 378 Page Street, Stough-
ton, MA 02072, USA. +1 781 344 9942. +1781 341 1451.
info@bliinc.com. http:/ www.htiinc.com;. Антитела;
факторы адгезии; матрикс; коллаген; фибронектин;
ламинин; добавки к среде; поли-О-лизин; факторы
роста.
Bionique Testing Laboratories, Inc. Bloomingdale
Rd., RR1, Box 2, Saranac Lake, NY 12983, USA.
+ 1518 891 2356. +1 518 891 5753. www.bionique.com/.
Исследование на микоплазмы
Bio-Nobile Oy. P.O. Box 36, Tykisl. okatu 4 B, FIN-
20521 Turku, Finland, t-35 824 161 100.+35 824 101 123.
pickpen@bio-nobile.com. www.biu-nobile.com. Mai нит-
пая сепарация; счетчик колоний Pickpen.
Bioptechs, Inc. 3560 Beck Road, Butler, PA 16002, USA.
877 LIVE-CELL; +1 724 282 7145. +1 724 282 0745.
info@bioptechs.com. www.bioptechs.com. Культура на
покровных стеклах; подогреваемые чашки с микро-
наблюдением; перфузионная камера; наблюдение в
замедленном времени.
Bioquell Medical Ltd. 29-31 Lynx Crescent, Weston-
super-Mare, Somerset, BS24 9BR, England, UK.
606
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
+44(0)1934410500. enquiries@btoquellmedical.co.uk.
www.bioquellmedical.co.uk. Стерилизация перекисью
водорода; ламинар-боксы: боксы биобезопасности;
стерилизаторы.
Bioquell UK Ltd. 34 Walworth Road, Andover,
Hants SP10 5AA. England, UK. 800 220 700; +44
(0)1264 835 835. +44 (0)1264 835 836. enquiries©
bioquell.com. ичете.bioquell.co.uk. Чистые комнаты;
изоляторы; стерилизация перекисью водорода; газо-
генератоы; ламинарные шкафы; боксы микробиоло-
гической защиты.
Bio-Rad Laboratories. Life Science Group Div., 2000 Al-
fred Nobel Dr., Hercules, CA94547, USA. 510-741-1000;
800 424 6723. 800-879-2289. /sg websupport@biorad.
com. wtew.bio-rad.com. Хроматография; декстран
DEAE: перенос ДНК: электрофорез: трансфекция;
анализ изображения; микроносители; микроиланшет-
ные сканеры; системы микрочипов роботизированная
микротитрацня.
Bio-Rad Labs Ltd. Bio-Rad House, Maylands Av-
enue. Heniel Hempstead, Herts, HP2 7TD, Eng-
land, UK.0800 181134; +44 (0)20 8328 2000. +44
(0)20 8328 2550. ukJsg. marketing@bio-rad.com. www.
bio-rad.com. Хроматография; декстран DEAE; перенос
ДНК; .электрофорез; трансфекция гена; микроноси-
тели; ридеры для микротитрационных планшетов;
роботизированная микротитрация.
BioReliance. Invitrogen Bioservices, 14920 Broschart
Rd., Rockville, MD 20850-3349, USA. И 301 738 1000;
800 553 5372. +1 301 610 2590. info@bioreliance.com.
www.btoreliance.com. Токсиколо! ия in vitro', исследо-
вания цитотоксичности: исследование no контролю
качества; вирусоло! ический скрининг
BioReliance (UK). Invitrogen Bioservices, Todd
Campus, West of Scotland Science Park, Glasgow
G20OXA, Scotland, UK. +44 (0)141 946 9999. +44
(0)141 576 2412. www.bioreliunce.com. Токсиколт ия
in vitro’, исследования цитотоксичности; исследо-
вание no контролю качества: вирусологический
скрин ин 1.
Biosource International. 542 Flynn Road, Camarillo,
CA 93012, USA. 800 242 0607.805 987 3385. www.bio-
source.com. Антибиотики; покрытие БСА; коллаген;
дипептил пептидаза IV (cd26) клон 202.36; фибро-
нектин; FNC; гентамицин; факторы роста; HEPES;
iидрокортизон; кератиноциты; среда LHC; среда
MCDB 402; микостатин; среда для нервных клеток;
NR-1: селективна среда: сыворотка: бессывороточная
среда; компоненты сыворотки, пенициллин; стрепто-
мицин; иншбитор трипсина; витамины.
Biospec. Biospec Products, РОВ 788, Bartlesville, OK
74005, USA. +1-918-336-3363; 800-617-3363. 1-918-
336-6060. info@biospec.com. www.btospec.com. Гомоге-
низация; отбор проб для микротитрации; MiniBead-
Bealer; экстрация РНК.
BioSupplyNet. Cold Spring Harbor Laboratory Press
www.biosupplynet.com. Руководство для пользовате-
лей; справочник ио продукции; источники материа-
лов и оборудования.
Biotech Instruments, Ltd. Biotech House, 75a High
Street, Kimpton, Hertfordshire SG4 8 PU, England,
UK. +44 (0)1582 417 295. (+44 0)1582 457491. www.
biolinst.demon.co.uk,. Конфокальный микроскоп;
электрофорез; ферментеры.
Bio-Tek Instruments Inc. Highland Park, PO Box 998,
Winooski, VT 05404-0998. USA. 61802 655 4740.
888451 5171. 802 655 7941. Iabcsr@biotek.com. www.
biotek.com Ридеры для планшетов
Biotrol. Крысиные хвосты.
Biovest International. 8500 Evergreen Boulevard, Min-
neapolis. MN 55433, United Stales. +1 763 786 0302.
+ 1 763 786 0915. accountservices©d>iovesl.com. www bio-
vest.com. Биореакторы; иоловолоконная перфузион-
ная культура; крупномасштабное культивирование;
промышленное производство.
Biosero, Inc. 825 S. Primrose Ave, Suite G, Monrovia, CA
91016, USA +1 626-303-0309.+ 1626-256-6060. info©
bioseromc.com. www.btoseroinc.com. Ламинарные шка-
фы; гезовые камеры без выводящих каналов; боксы
биологической защиты
BMG Labtech GmbH. Hanns-Martin-Schleyer-Str.
10. D-77656 Offenburg, Germany. +49 781 969 68-0.
+49 781 969 68-67. germany@bmglabtech.com. www.
bmglabteth.com Ридеры для микротитрационных
планшетов; aoi лощение, флюоресценция, люминес-
ценция.
BMG Labtech Inc. 2415 Presidential Drive, Building 204,
Suite 118, Durham, NC 27703, USA. +1 919 806 1735.
+1919 8068526. usa@bmglabtech.com. www.bmglabtech.
com. Микропланшетные сканеры, флюоресценция,
люминесценция, ши лощение.
BMG Labtech Ltd. PO Box 73, Aylesbury, HP20 2QJ,
England, UK. +44 (0)1296 336 650. +44 1296336651.
uksales@bmglabtech.com. www.bmglabtech.com. Микро-
планшетные сканеры, флюоресценция, люминесцен -
ция, uoi лощение.
ВОС Edwards. Manor Royal, Crawley West, Sus-
sex, RH10 9LW, UK. +(44) 1293 528844. +(44)
1293 533453. wu’w.bocedwards.com. Насосы, диафра!-
мальные; PTFE, вакуумные, силиконовая смазка
ВОС Edwards USA. 301 Ballardvale Street, Wilmington,
MA 01887, USA. 800 848 9800, +1 978 658 5410. +(1)
978 657 6546. www.bocedwards.com. Насосы: диафрш-
мальные; PTFE, вакуумные, силиконовая смазка.
Boehringer Mannheim. См. Roche Applied Sciences.
Borolabs, Ltd. Unit F The Loddon Centre, Wade
Road, Basingstoke. RG24 8FL, England. UK. +44
(0)870 300 1001. т-44 (0)870 300 1004. enquiries©
borolabs.co.uk. www.borolabs.co.uk. СО2-ин кубаторы;
устройство для pei истрации данных; морозильники
с жидким азотом; Ьешстрагоры температуры.
Brand GmbH. Postfach 11 55, D-97861, Germany- +49
(0) 9342 8080. +49 (0)9342 808 236. info@brand.de.
www.brand.de. Диспенсеры для горловин бутылей;
лабораторное стекло планшеты для микротитрации;
многоканальные автоматические пипетки; пипетки;
автоматические пипетки; приспособления для пипе-
тирования; штативы; циклические автоматические
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
607
иииетки; ступенчатые автоматические иииетки,
пробирки.
BrandTech Scientific Inc. 11 Bokutn Road, Essex, CT
06426-1506, USA. +1-860-767 2562. +1-860-767 2563.
matl@brandlech.com. wwwjtrandlechxom. Cm. Brand
GmbH.
Brandel Corp. 8561 Allas Drive, Gaithersburg, MD20877.
USA. 800-948-6506. +1301-869-5570. sales@brandel.
com. wwwdirandelxom Оборудование для i ерметиза-
ции планшетов.
Braun В Biotech, Inc. См. Sartorius. Ферментеры.
Brinkmann Instruments, Inc. 1 Canliague Road, West-
bury, NY 11590-0207, USA. 800 645 3050; * 1 516 334
7500. +1516 334 7506. info@hrinkmann.com. ww&.brink-
таппхот. Центрифужные пробирки; градуированные
покровные стекла: оборудование для разлива жидкос-
тей микрочииьцмикрокаиилляры; микроцентрифу! и;
микроцентрифужные пробирки; микроинъекторы;
микроманииуляторы; микропипетки; наконечники
для пииеток; автоматические иииетки.
British Association for Cancer Research (BACR).
Contact: BACR Secretariat, с/ о The Institute of Cancer
Research, Me Elwain Laboratories, Cotswold Road, Sut-
ton, Surrey SM2 5 NG, UK. +44 (0) 20 8722 4208. + 44
(0) 20 8770 1395. bacr@icr.ac.uk. www.bacrxirg.uk. Об-
щество врачей и исследователей Объединенного ко-
ролевства Великобритании по исследованию рака.
British Oxygen Со., Ltd. The Priestly Centre, 10 Priestly
Road, The Surrey Research Park, Guilford, Surrey
GU2 5XY, England, UK. 800 111333; +44 (0)1483
579857. www.hoc.com. Газы; газовые регуляторы; CO2;
вакуумные насосы.
British Society for Cell Biology. Контактное лицо
M. Clements, Department of Zoology, Downing St.,
CambridgeCB2 3EJ, England. UK.+44 (0)1223 336 655.
00 44 (0) 1223 353 980. bsch@bscb.org. hup: Wwwjicl.
ac.uk kis schools life sciences biomed/bsch topjitml.
Научное общество с особым интересом к клеточной
и молекулярной биолог ии.
Bruce Medical Supply. 411 Waverly Oaks Rd., Sle.154,
Wallham, MA 02452, USA. 8002258446; + 1781-894-
6262. +1781-894-9519. sale.s@brucemedical.com. wow.
store.yahoo.com/hrucemedical. Антиген гики; Betadine;
пинцеты; растворы для промывания; чашки для об-
разцов; ножницы.
BS & S (Scotland), Ltd. 5 7 West Telferton, Portobello
Industrial Estate, Edinburgh EH7 6UL, Scotland, UK.
0131 669 2282. 0131 657 4576. bss@lelferlon.co.uk
Ecosciut.
Buck Scientific, Inc. 58 Fort Point St., East Norwalk, CT
06855.203-853-9444; 800-562-5566.203-853-0569. a-aw.
buikscicom. Инкубационные камеры для микроскоиа;ин-
кубаторы для съемки в режиме замедленной съемки.
Burge Scientific. 6 Langley Business Court, World’s End,
Beedon, Nr. Newbury, Berkshire RG20 8RY, England,
UK. +44 (0)1635 248171. +44 (0)1635 248857. sales©
burge.co.uk. www.huige.co.uk ; http-//wwwxirrowmight
co.uk burge indexJttm. Моечная машина для лабора-
торного стекла
Caisson Laboratories, Inc. 5 West Center, Sugar City,
ID 83440, USA. +1 208 656 0880; 1877 840 0500.
+ 1 208 656 0888. cusl.sen@caissonlabs.com. wwwxais-
sonlabs.com. Изготовление сред на заказ; фетальная
сыворотка теленка; флаконы; media; фосфатно-бу-
ферный раствор, пинетки; роллерные бутыли; трип-
син, вентилируемые крышки.
Calbiochem-Novabiochem Corp. См. EMD Biosciences
(North America), Merck Biosciences
Cambio, Ltd. The Irwin Centre, ScotlandRoad, Dry
Drayton, Cambridge, CB3 8AR, England, UK. +44
(0)1954 210 200. +44 (0) 1954 210 31)0. support@cambio.
co.uk. www.cumbio£o.uk. Хромосомное окрашивание.
Cambrex—Bioresearch Products. 8830 Biggs Ford
Road, P.O.Box 127, Walkersville, MD 21793 0127,
USA. +1 301-898-7025: 800-638-8174. 301-845-8338.
biotechsen>@cambtexjcom. www.cambrex.com bioprod-
ucts. Агароза; антибиотики; пенициллин, стрепто-
мицин; ССР: Хэнкса, Эрла; факторы роста; среды:
селективные, бессывороточные; специализированные
клетки: астроциты; В-клетки, кость, гепатоциты, эн-
дотелиальные клетки, эпидермальные кератиноциты,
женские репродуктивные клетки, почечный эпите-
лий, легочный эпителий, клетки молочной железы,
меланоциты, предшественники нервных клеток,
остеобласты, клетки простаты, клетки почек, кожи,
гладкомышечные клетки, Т-клетки; витамины.
Cambrex Bio Science Wokingham, Ltd. 1 Ashville Way,
Wokingham, Berkshire RG41 2PL, England, UK. +44
(0) 1189 795 234. +44 (0)1189 795 231. saies.uk@cam-
biex.com. www£ambrex£om. Cm. Cambrex-Bioresearch
Products.
Cambrex Bio Science Verviers, S. p. г. I. Parc Industrie!
de Petit Rechain, B-4800 Verviers, Belgium. +32-8-732-
1609.+32-8-732-1634. info.europe@cambrex.com. www.
cambrer.com/bioproducts. Cm. Cambrex Bioresearch
Products.
Cambrex. Technical Sales Department, P O. Box 127,
0245 Brown Deer Road, San Diego, CA 92121. USA.
800-852-5663.858-824-0826. www.cloneticsxom.
Cambridge BioScience Ltd. 24-25 Signet Court, New-
market Road, Cambridge, CB5 8LA, England, UK. +44
(0) 1223 316 855. +44 (0) 1223 360 732. Tech@cbio£OMk.
wwwjtiosc iencexo.uk. Антитела; апоптоз; бакуловирус;
клеточный цикл; коллаген; цитокины; ДНК-исследо-
вания; перенос ДНК; ELISA; проточная цитометрия:
факторы роста; интерлеикин-2; молекулярные зонды;
онкогены; передача сигнала; тетрациклин.
Camlab Ltd. Norman Way Industrial Estate, Over, Cam-
bridge, CB4 5YE, England, UK. +44 (0)1954 233 100.
+44 (0)1954 233 101. mailbox@camlab.co.uk. www.
camlabxo.uk. Аспираторы; штопферы дли автомати-
ческих пипеток; оплетенные бутыли; центрифужные
пробирки; СО2-инкубаторы; контейнеры; система
управления замороженными запасами; лабораторное
стекло моечная машина для лабораторно! о стекла;
инкубаторы; маг нитные мешалки; плоская медицин-
ская склянка с крышкой; коробки и шейкеры дли
микротитрационных планшетов; иечи и сушильные
608
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
шкафы; Парафильм; мешалочные устройства; на-
конечники для пипеток; автоматические пинетки;
лабораторный пластик; планшетный сканер; шей-
керы для планшетов; штативы; сосуды; качалочные
инкубаторы; стерилизационные и сушильные шкафы;
стерилизационные фильтры; пробирки; мойка и
стерилизация; ультразвуковая баня; флаконы; про-
мывная склянка; моечные машины.
Campden Instruments. Leicester, UK. 0870 2403702.
UKsales@campdeninslrumentsx'om. wwwjcampden-inst.
сот/. Измельчитель тканей McIlwain.
Campden Instruments. Lafayette. IN, USA. +1765
423 1505. L'SsaIes@campdeninstrumentsjcom.wwwx.amp-
demnstxom, . Измельчитель тканей McIlwain.
Carl Zeiss AG. P. О. B.4041,37030 Gottingen, Germany
+49 (0) 551 5060 660. +49 (0) 551 5060 464.mifon@»zei»_
de. www.zeiss.de. Получение и обработка флюоресцент-
ных изображении; конфокальная микроскопия; ана-
лиз изображений; инкубируемая камера; микроскопы:
флюоресцентные, инвертированные, стерео, верти-
кальные; с оптическим сечением; фотомикроскопы;
видеосъемка в режиме замедленного времени.
Carl Zeiss, Inc. Microscope Division, One Zeiss Dr.,
Thornwood, NY 10594, USA. 1-1 914 747 1800;
1800 2.3.3 2343.+ 1 914 681 7446.mic,n>@ze»ss.com.tca?ffii.
zeissjcom/micro. cm. Carl Zeiss AG.
Carl Zeiss Ltd. 15-20 Woodfield Road, Welwyn Gar-
den City, Hertfordshire, AL7 1JQ, England, UK. +44
(0)1707 871200. +44 (0)1707 330237. uwwjeissxo.uk.
Продукция см. Carl Zeiss AG.
Cascade Biologies, Inc. 1341 Custer Drive. Portland, OR
97219, USA. 1 800 778 4770. +1 50.3 292 9521. info©
cascadebio x-om. www.cascadebio x:om. Клетки эпителия
роговицы; фибробласты кожи; эндотелиальные клет-
ки; эпидермальные кератиноциты; ростовые добавки
Epi Life; MCDB 154; меланоциты; бессывороточные
селективные среды; i ладкомышечные клетки; специа-
лизированные клеточные культуры; трицсин/EDTA;
иш ибитортрипсина.
Cascade Biologies, Inc., UK. Mansfield I-Centre, Oakham
Business Park, Hamilton Way, Mansfield, Nottingham-
shire NG18 5BR, England, UK +44 (0) 162.3 600 815.
+44 (0) 1623 600 816. ukinfo@cascadebioxx>m. www.
cascadebio.com. Cm. Cascade Biologies, Inc., USA.
Cato Research, www.cato.com biotech /bio-prodJhtml.
Интернет-список основных биотехнолог ических
компаний.
Cell Culture Characterization Services. 4581, Lapeer-
Road, Suite C, Orion Township, MI 48359.1-1248-656-
2542;+ 1248-563-149.3. +1 248-656-3899. bhukku@cell-
characlenzation.com. Аутентификация; хромосомный
анализ; хромосомное окрашивание; кариотипирова-
ние; изоферменты; FISH.
Cellex Biosciences Inc. См. Biovest International.
CellGenix Technologic Transfer GmbH. Am Flughafen
16, D-79108 Freiburg. i-49 761 888 89-330. i-49 761
888 89-830. info@cellgenix.com. www.cellgenix.com.
Системы CellGro; цитокины; бессывороточные среды;
культуральные макеты.
Cellgro. См. Mediatech.
Cellmark Diagnostics. См. Orchid Cellmark.
Cellmark UK. PO Box 265, Abingdon, Oxfordshire,
OX14 1YX, England, UK. +44 (0)1235 528000. cell-
mark@orchid.co.uk.uwwxellmark.co.uk. Аутентифика-
ция клеточных линий. Профили ДНК
Cellon SA. CELLON S. A., 29 Am Bechler, L-7213 Be-
reldange, Luxembourg. +352.312.313. +352.311 052.
info@cellonju. wwwxellonju, Биореакторы; коллаген;
культуральные пакеты; CulturSil; Ферментеры; мат-
рикс, макеты для сред; NASA, культуральная система
Rotary Cell Culture System; крупномасштабное про-
изводство клеток.
Се lion UK Ltd. 61 Dublin St., Edinburgh, EN3 6NL, Scot-
land, UK +44 (0)7714.332567 +44 (0)1472 852642.
info@cellonju. wwwx.ellon.lu/. Биореакторы: коллаген:
культуральные макеты; CulturSil; ферментеры; мат-
рикс, макеты для сред; NASA, культуральная система
Rotary Cell Culture System; крупномасштабное про-
изводство клеток.
CellStat. 755 Page Mill Road, B-6, Palo Alto, CA 94.304,
USA. +1 650 802 www.cellstat.com. Исследование
цитотоксичности; исследование действия лекарс-
твенных препаратов и метаболический мониторинг;
клеточный мониторинг в реальном времени
Cellular Products GmbH. Delitzscher Strasse 135,
04129 Leipzig, Sachsen, Germany. +49(0)341 971 9758.
+49 (0)341 972 5389. info@ceihdar-products.de. www.
cellularproductsxle. Человеческие цитокины.
Cellutech. Watertown,NY, USA. 800-575-5945. Системы
транспортировки, безопасность отходов.
Celox. См. Prolide Pharmaceuticals.
Celtrix Laboratories. Cm. Insmed.
Charles Austen Насосы Ltd. Royston Road, By fleet,
Surrey. KT14 7NY. England, UK+44 (0)19.32 355277.
+44 (0)1932.351 285. info@charlesausten.com. www.
chariesausten.com. Насосы: диафрагмальные; PTFE,
вакуумные.
Charles River Laboratories. 251 Ballard vale St., Wilm-
ington, MA 01887 +1 508 658 6000. 800-992-7.329;
978 658 7I32.comments@criverxom.wwwxriver.com. Ис-
следование эндотоксинов. Лабораторные животные.
Charles River (U. К.), Ltd. Manson Rd., Margate, Kent
CT94LT, England. +44(0)1843 823575. +44(0)1843
823497. crukcsd@uk xriver.com. www.criverxom cruk. Ис-
следование эндотоксинов. Лабораторные животные.
Chart Biomed. Domestic customer service. 800-482-2473;
+1 770-257-12.8-932-2473:770-257-1300. wwwxhart-
biomed.com/. Жидкостные морозильники с жидким
азотом.
Chart Biomed Europe. European Sales and OperaUon
Director +44 (0)1932 785570. +44 (0)1932 785 576.
wwwxhartbiomed.com/. Жидкостные морозильники
с жидким азотом.
Chemap. С.м. Alfa Laval.
Chemicon Europe. 9 Trident Way, Soulhall, UB18 7US,
England, UK +1 909 676 8080; 800 437 7500. +1 909
676 9209. wwwxhemiconxom. Cm. Chemicon Interna-
tional.
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
609
Chemicon International Inc. 28820 Single Oak Drive,
Temecula. CA 92590, USA. +1 909 6768080; 800437
7500. +1 909 676 9209. www.chemicon.com. Антитела
к цитокинам; диализные системы; исследование с
антителами к цитокинам; Gal С; ЕМ A; GFAP; об-
наружение гипоксии; интегрины; техноло! ия мик-
рочипов; MUC-1; муциновые нейротранспортеры:
онкопротеины; передача cm нала; стволовые клетки,
вилин; вирусы.
Chiron Corp. 4560 Ногюп Street, Emeryville, CA
94608-2916, USA. +1510 923-2300. +1510 923-3376.
communications@chiron.com. www.chiromcom. Цитокины;
фармацевтические препараты, иммуноисследования.
Chondrex Inc. 2607 151st Place NE, Redmond, WA
98052, USA. (425) 702-6365 or (888) CHONDRE.
info@chontlrex.com. www.chondrex.com. Колла> ен:
антитела к коллагену; коллагеновоке окрашивание;
коллагеназа.
Ciba Specialty Chemicals Corp. 540 While Plains Road,
P.O. Box 2005, Tarrytown, NY 10591-9005, USA.
+ 1 914 785 2000. +1 914 785 2211. ket-in.bryla@cibasc.
com. wwwxibftsc.com. Получение фото- и цифровых
изображений.
Cin-Made Corp. 1780Dreman Ave., Cincinnati, OH
45223, USA. 513-681-3600. 513-541-5945. www.cin-
madepat.kaginggroup.com. Контейнеры для транспор-
тировки; биобезопасность.
Clonetics. См. Cambrex.
CoaChrom Diagnostica GmbH. Leo Malhauser Gasse
71, A1230 Vienna, Austria. +43 1699 97 97 0. +43 1699
18 97. office@coachrom.com. www.coachrom.com/.
Антитела: цитокины: эндотоксиновый тест: бессы-
вороточные среды.
Cohesion Technologies. 2500 Faber Place, Palo Allo,
CA 94303, USA;. +1 650 320-5500. +1 650320-5522.
admin@cohesionteeh.com. www.cohesiontech.com. Кол-
лагеновое покрытие Cel) Prime; Антитела к фак ropy
VIII; Vilrogen
Cole-Parmer Instrument Co. 625 E. Bunker Ct., Vernon
Hills, IL 60061, USA. 847 549 7600, 800 323 4340.
+ 1847 247-2929 techinfo@coleparmer.com. www
coleparmer.com . Устройство для pei исграцин данных;
сушильная камера; электронный счетчик колоний,
измерительные приборы; pH метры; автоматические
пипетки; насосы; автоматический шприц для непре-
рывного введения; ко|хюки для стекол; качающаяся
горячая платформа; термометры; системы трубок;
ультразвуковая баня; водяная баня.
Cole-Parmer Instrument Со. Ltd. Unit 3, River Brenl
Business Park, Truiupers Way, Han well, London,
W7 2QA, England, UK. +44 (0)208 574 7556. +44
(0)208 574 7543. sales@coleparmer.co.uk. www.colepar-
mer.co.uk. Cm. Cole-Parmer Co., USA.
Collagen Corp. 2500 Faber Place, Palo Alto, CA 94303,
USA. 415-856-0200.415-856-2238. www.collagen.com/.
Коллаген, Vilrogen 100.
Collagen Corp. Cm. Inamed Aesthetics.
Comark Ltd. Comark House, Gunnels Wood Park, Gunnels
Wood Road, Stevenage, Hertfordshire, SGI 2TA, Eng-
land, UK. +44 (0)1438 367 367. +44 (0)1438 367 400.
salesuk@comarkltd.com. www.comarkltd.com. Электрон-
ные термометры; термометры с решетрирующим
устройством.
Comark Instruments Inc. 9710 SW Sunshine Court, Bea-
verton, OR 97005, USA. 800 555 6658; +1 503 643 5204.
+1 503 644 5859.sales@comarkUSA£om.www.comatklld.
com usa. Электронные термометры; термометры с ре-
1 истрирующим устройством
CompuCyte Corp. 12 Emily Street, Cambridge. A 02139,
USA. 800-840-1303; +1617-492-1300 +1 617 577 4501.
www.compucyte.com. Флюорохроматический цито-
метр.
Computer Imprintable Label Systems Ltd. 2 Southdown-
view Way, Broadw ater Business Park, Worthing, West
Sussex, BN14 8BR, England, UK. +44 (0)1903 219 000.
-r-44 (0)1903 219 111. sales@cils-labels.com. www.cils-
labels.com. Ярлыки для автоклавирования; ярлыки
для замораживания, ярлыки для распечатывания на
компьютере, ярлыки для криофлаконов.
Contamination Control Products. 1 Third Ave, Neptune
City, NJ 07753, USA. +1 877 553-2676. +1 732 869
2999. mfo@ccpcleanroom.com. www.cc/kieanroom.com/.
Ламинарные шкафы; боксы микробиологической
защиты.
Cook Biotech, Inc. 3055 Kent Avenue, West Lafayette, IN
47906, USA. + 1 765 497 3355. +1 765 4972361. vicosis©
cookbiotech.com. www.cookjtroup.com. ЕСМ; внеклеточ-
ный матрикс; платформа для тканевой инженерии.
Coriell Cell Repository (CCR). 403 Haddon Avenue,
Camden, NJ 08103, USA. 800-752-3805 из US); 856-
757-4848 (из-зи рубежа). 856-757-9737. ccr@coriell.
umdnj.edu. http:,' 'locus.umdnj.edu/ccr/. Клеточный
банк; клеточные линии; Архив генетически му-
тантных клеток человека NIGMS; Архив зрелых
клеток NIA.
Corning Inc., Life Sciences. 45Nagog Park, Acton,
MA 01720, USA. i-1 978 635 2200; 800 492 1110.
+1 978 635 2476. cLswebmad@coming.com. www.coming,
com Lifesciences. {См. также Sigma in Europe.) Авто-
матические диспенсеры; биореакторы; бутыли; куль-
туральные камеры Cellstack; центрифужые пробирки;
измерители провпдимпсти; культуральные сосуды:
электроды; вкладыши в фильтрационные лунки; фла-
коны; газопроницаемые крышки; лабораторное стек-
ло, ма1 нитные мешалки; микропипетки; контейнеры
для микроскопических срезов; микротитрационные
планшеты: мультиповерхносгные пропагеторы:
многолуночные планшеты, проницаемые крышки;
Чашки Петри; pH-метры; пипетирующее устройство;
пипетки; роллерные бутыли; вращающиеся флаконы;
устройство для контроля температуры.
Corning В.V. Life Sciences. Koolhovenlaan 12,1119 NE
Schiphol-Rijk, The Netherlands +31 (0) 20-659-60-
51.+31 (0) 20-659-76-73. cceurnl@coming.com. www.
coming.com/lifesciences. (См. также Sigma.) Продук-
ция с.и. Corning Inc.
Costar. Cm. Corning
Coulter. Си. Beckman Coulter.
610
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
СР Pharmaceuticals Ltd. Ash Road North, Wrexham
Industrial Estate, Wrexham LL13 9UF, Wales, UK;
www.cppharmaxo.uk home. him. Инсулин.
C.R. Bard Inc. Bard Urological Division, 8195 Industrial
Boulevard, Covington, GA 30014, USA. +1 770-784-
6100; 800-526-4455. bob.mccall@crbard.com. www.
bardcontigen.com. Коллагеновая 1убка.
Cryomed. C.w. Thermo Electron Corp, Themiu-Haake.
wwwlhermolsxom. Морозильник с контролируемым
режимом замораживания; перчатки; штативы для
морозильника; морозильники с жидким азотом.
Cryoservice Ltd. Cryoservice Limited, Prescott Drive,
Warndon Business Park, Worcester, WR4 9RH, Eng-
land, UK. +44 (0)1905 754 500. +44 (0) 1905 754 060
info@cryosen.'icexoiik.www£ryosen‘ice.c()iik. CO,; газы,
жидкий азот.
CryoTrack. i-l 650 305 9406; +1 650941 6774. info©
cryotrack.com. www.cryotraiji.com. Программное
обеспечения для системы контроля замороженных
запасов.
Cytogration, Inc. 113 N. Washington Street, Suite
342, Rockville, MD 20850, USA. +1301 3304754;
877 330 4754. +1 301 519 9474. info©cytogrationxom.
wwwxytogration.com. Роботизированные системы.
Dage-MTI, Inc. 701N. Roeske Ave, Michigan City,
IN 46360, USA. 219-872-5514. 219-872-5559. info©
dagemti.com.uiew.dagemti.com. CCD камеры;усилите-
ли изображения; обработка и.кюраженпя; мониторы,
видеосъемка в режиме замедленного времени.
Daigger. 620 Lakeview Parkway, Vernon Hills, IL
60061, USA. 1-800-621-7193. 1-800-320-7200;. daig
ger@daiggerxom. wwwdaiggerxom. Чашки: флаконы*
нитрильные перчатки; пииетирующее устройство;
лабораторный пластик.
DakoCytomation Inc. 6392 Via Real, Carpinteria, CA
93013, USA. 805 566 6655,800 235 5763.805 566 6688.
customerservice©dakocylomation.com. wwwdakocy-
tomation.us. Антитела; реактивы для определения
апоптоза; цитокератины; реактивы для приточной
цитометрии.
DakoCytomation Ltd. Marketing Dept., Denmark House,
Angel Drove, Ely, Cambridge, CB2 4ET, England,
UK. +44 (0)1353 669 911. M4 (0)1353 668 989. wu'w.
dakoltd.co.uk www.dakocytomation.co.uk. Антитела;
реактивы для определения апоптоза; цитокератины;
реактивы для проточной цитометрии.
DakoCytomation Denmark A/S. Produktionsvej 42,
D K-2600 Glostrup. Denmark.44 85 95 00.44 85 95 95
contact©dakocytomation.com.www^akocytomaUonxom.
Антитела; |>еак1ивы для определения апоптоза; цито-
кератины; реактивы для проточной цитометрии.
Damon IEC. См. Thermo Life Sciences.
Da vol Inc. 100 Sockanossett Crossroads, Cranston, RI
02920, USA. 800 556 6756. +1401 946 5379. info©
daeol.com. wwwdavol.com. KoTjiai ен: политетрафгорэ-
тиленовая сеть.
Day-Impex. См. Keison Products.
Decon Laboratories Ltd. Conway Street, Hove, East Sus-
sex, BN3 3LY, England, UK. +44 (0)1273 739 241+44
(0)1273 722 088. mail©decon.coj/k. uww.deconxo.uk.
Детергенты; чернила; маркеры, ультразвуковая мо-
ющая баня.
Deutsche Sammhing von Mikroorganismen und Zellkul-
luren (DSMZ). MascheroderWeg IB, D-38124 Braun-
schweig, Germany, contact@dsmz.de. www.dsmz.de.
Клеточный банк; клеточные линии; аутентификация
клеточной линии; исследование на микоплазмы.
DianovaGmbH. Mittelweg 176, D-20148 Hamburg, Ger-
many. +49 (0)40 450 670. +49 (0)40 450 67 490. info©
dianova.de. www.dianova.de. Ан гитела.
DiaSorin. 1951 Northwestern Avenue, P.O.Box 285,
Stillwater, MN 55082-0285, USA. * 1 612 439 9710,800
328 1482.+ 1 651 351 5tiW.www.diasonn.com .Кальци-
тонин; эстрадиол; FSH; hGH; остеолацин; пролактин,
трииодтиронин; витамин D.
DiaSorin S. p. A. Via Crescenlino, 13040 Sahiggia (VC),
Italy. +39.0161.487093. +39.0161.487628. wwwdiasorin.
com . Кальцитонин; эстрадиол; FSH; hGH; остеола-
цин; пролактин; трииодтиронин; витамин D.
Difeo. Си. BD Biosciences. Aiap; микробиоло! ические
среды; бактоиептин; шдролизат лактальбумина; пи-
тательные бульоны; триитсмо-фисфатныи бульон.
DNA Solutions. (Branches worldwide.) wwwJJNAsolu-
tions.com. Аутентификация; ДНК-профилиш; иссле-
довние идентичности ДНК ни судебному запросу.
Doity Engineering Ltd. P.O. Box 25, Isherwood
Street, Rochdale, Lancashire OL11 1ZZ, England,
UK. *44 (0)1706 646971; +44 (0)1706 345 515 *44
(0)1706 640 454. sales@doity.com. www.doity.com,
Оборудование для холодных комнат и для термаль-
ных: стальные штативы для хранения, покрытые
полииропи ченом.
Don Whitley Scientific Ltd. 14 Olley Road, Shipley,
West Yorkshire, BD 17 7 SE, England, UK. +44 (0) 1274
595728. +44 (0)1274 531197. info@dwscientific.co.uk.
wwwdwscientificxoMk. Счетчики колоний.
Dow Corning Corp. P.O. Box 0994, Midland, MI 48686-
0994, USA. +1 517-496-4000. +1 517-496-4586. www.
dowcumingxom. Пеногаситель; деионизатор; Methocel;
метилцеллюлоза; системы силиконовых трубок.
Laboratory Corporation of America. 1447 York Court
Burlington, NC 27215, USA. 800-334-5161; +1 336-
584-5171. wwwJabcorjj.com/. ДНК-профи л uhi; уста-
новление отцовства
DSMZ. См. Deutsche Sammlung vonMikroorganismen
mid Zellkulluren.
DuPont Animal Health Solutions. Chilton Industrial
Estate, Sudbury, Suffolk CO10 2XD, England, UK.
+44 1787 377305.+44 1787 310846. bioseanity@gbr.du-
pontxom. www.antecint.com. Дезинфектанты Virkon.
Dynal Biotech (USA). 9099 N. Deerbrook Tr., Brown
Deer, WI53223, USA. 1-800-558-4511.414-357-4518.
uscustserv©dynalbiolech.com., www.dynalbiotecJi.com.
Сепарация клеток, MACS; нама! ничнваемыебусины,
иммуноаффинное клеточное разделение; нейлоновые
сетчатые фильтры
Dynal Biotech UK. 11 Bassendale Road, Croft Busi-
ness Park, Bromborough, Wirral, CH62 3QL, UK.
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
611
0800 731 9037; +44 (0)151 346 1234. 0151 346 1223.
ukcustsen@dynalbiotechx:om. .dynalbiotech.com
См. Dynal Biotech (USA).
Dynalab Corp. 350 Commerce Drive, Rochester NY
14623, USA. 800 828-6595. 716-334-9496. labinfo©
dyna-labwarexxan. www.dynalabcorpxx>m/. Печи; чашки
для образцов, хранение.
Dynex Technologies Ltd. Columbia House, Colum-
bia Drive, Worthing. England, UK 01403 783381
01403 784397. Микротитрання: планшетные сканеры,
автоматический отбор образцов; дилютеры; диспен-
серы, миксеры, моющее устройство для планшетов,
программное обеспечение.
Dynex Technologies, Inc. 14340 Stillyfield Cir., Chan-
tilly, VA 20151-1683, USA. +44 (0) 1903 267555. +44
(0) 1903 267722. dynexuk@btconnectx:om. wwwxJynex-
techm>logjesx:oni/. Микротитрация: м икропланшетные
сканеры, автоматический отбор образцов; дилютеры;
диспенсеры, миксеры, моющее устройство для план-
шетов, iipoi раммное обеспечение.
East Coast Biologies, Inc. P.O. Box 489, North Berwick,
ME 03906-0489, USA. +1 207-676-7639. +1 207-676-
7658. info@easlcoasibio.com. www.eastcoastbio.com.
Антитела.
Eastman Kodak Co. Scientific Imaging Systems Div,
343 State St, Rochester, NY 14652-4115, USA. +1 203
786 5600; 800 225 5352. +1 203 786 5694. wanpJtodak.
com. CCD; цифровая камера цифровые изображения;
камеры к микроскопам; обработка фотографий; фо-
тографический проявитель и фиксаж; Рент] еновская
пленка.
EBI, L. Р. 100 Interpace Parkway, Parsippany.NJ 07054.
USA. 800-526-2579. ebimedical supporl@ebimed.com.
www-ebimedicalxxim,. Матрикс для костного транс-
плантата; платформа для тканевой инженерии.
ECACC (European Collection of Cell Cultures). CAMR,
HPA Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG,
England, UK.+44 (0)1980 612512 +44 (0)1980 611315.
ecacc@hpaxirg.uk. www.ecacc.org.uk. Аутентификация;
клеточный банк и помещение в него; клеточные
линии, база данных; характеристика; скринию на
микоплазмы; валидация.
Econo-med. Trafalgar House, Station Road, Long Sut-
ton, Spalding, Lincolnshire, PEI 2 8BP, England, UK.
+44 (0)1406 36 42 42. +44 (0)1406 3646 76. sales©
economedcom. www.econo-med.com. Перчатки нитри-
ловые, виниловые.
Electron Microscopy Services (EMS). 1560 Industry
Road Hatfield, PA 19440, USA. +1 215-412-8400.
+ 1 215-412-8450;. sgkcck@aol.com. wwwemsdtasum.
com fems. Cytotek цитоцентрифуча; инструменты для
иссечения; реактивы для электронной микроскопии,
фиксирующие растворы; лимоннокислый свинец;
ацетат уранила.
Elga LabWater, US Filter. 10 Technology Drive, Low-
ell, MA01851, USA.+l 508 887 6300; 800 466 7873 ex
5000.+ 1 508 887 6266;800 875 IblZ.www.elgplabwater
com. Фильтрация: ионный обмен; фотооокисление;
обратный осмос; оборудование для очистки воды.
Elga LabWater. High Street, Lane End, High Wycombe,
Bucks HP14 3JH, England, UK. +44 1494 887 555.
+44 1494 887 837. sandra.welch@veoliawater.com.
www.elgalabwal.er.co.uk. Фильтрация; ионный обмен;
фотооокисление; обратный осмос; оборудование для
очистки воды.
Elkay Laboratory Products. Unit 4, Marlborough Mews,
Crockford Lane, Basingstoke, Hampshire, RG24 8NA,
England, UK. +44 (0)1256 811118. +44 (0)1256 811116.
sales@elkay-uk.couk. www.elkay-uk.co.uk. Пакеты био-
безопасности; флаконы для замораживания, однора-
зовые крышки; фильтрующшие насадки; маркеры;
среды; сосуды; микропипетки; микроиипегки; пастет-
ки; пипетки; наконечники для пипеток; пастеровские
пипетки; оборудование для герметизации планшетов;
пробирки для транспортировки: пробирки: системы
трубок; флаконы; универсальные контейнеры.
EMD Biosciences. 10394 Pacific Ctr. Ct., San Diego,
CA 92121, USA. +1 858 450 9600; 800-854-3417.
800 776 0999; +1 858-453-3552. cuttomer.service@em-
dbtosciencesxwm. www.emdbiosciences.com. Антитела;
биохимические вещества; буферные растворы; хи-
мические реактивы, холерный токсин; детер; енты;
декстран; ЭДТА; сульфат G418; реактивы для опред-
ления сахаров; (игромицин В; иммунохимические
реактивы; ферменты.
EMS. Си. Electron Microscopy Services.
Endotronics. См. Biovest International.
EnvairLtd. York Ave, Haslingden, Rossendale, Lancashire
BB4 4HX, England, UK. +44 (0)1706 228416. +44
(0)1706831957. info@envair.co.uk. www.envair.co.uk.
Ламинарный шкаф, CCTV моннторшп; оборудова-
ние для очистки воздуха стерильных комнат; боксы
мпкробиолО! ической защиты.
Enzo Life Sciences, Inc. 60 Executive Blvd., Farmingdale,
NY 11735, USA. +1 631 694 7070. +1 631 694 7501;
800 221 7705. wwwnnzoxxim. Антитела; m-xpOMOi ра-
нни (клон РНЕ-5); микрочипы.
Eppendorf AG. Barkhausenweg 1,22331 Hamburg, Ger-
many. т-49 405 380 10. +49 405 380 1556. eppendorf©
eppendorf.com. www.eppendorf.com. Градуированные
покровные стекла; микрокапилляры; мнкроцентри-
фуш; микроцентрифужные пробирки; микроинъек-
торы; микроманипуляторы; микропипетки; наконеч-
ники для пипеток; автоматические пипетки.
Eppendorf UK, Ltd. Eppendorf UK Limited, Endurance
House, Chivers Way, Histon, Cambridge, CB4 9ZR,
England. UK.+44 (0)1223 200 440. +44 (0)1223 200 441.
sales@eppendorfx,o.uk. www.eppendorfxxt.uk. Градуиро-
ванные покровные стекла; микрокапилляры; микро-
центрифу! и; микроцен грифужные пробирки; мик-
роинъекторы; микроманипуляторы; микропипетки;
наконечники для пипеток; автоматические пипетки.
Eppendorf USA. См. Brinkmann
Erlab DFS SA. Parc D'affaires Des Portes, BP 403,
27104 Vai De Retnl Cedex, France. +33 2 32 09 55 80.
+33 2 32 09 55 lW>.Sales@erfab.net..w&w.erlaf>-dfsx,om
Вытяжные шкафы; ламинарные шкафы; защитные
кожухи.
612
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
Erlab DFS SA. St Thomas’s House, St Thomas’s Square,
Salisbury, Wiltshire, SP1 1BA, England, UK. +44
(0) 1722 341 940. +44 (0) 1722 341 950. SulesUK@erlub.
net. www.capiair.com. Вытяжные шкафы; ламинарные
шкафы; защитные кожухи.
ESA Inc. 22 Alpha Road, Chelmsford, MA 01824-4171,
USA. 800 959-5095, +1978 250 7000. +1 978 250-7090.
markelinff@esainc.com. www.esainc.com. Компьютерное
программное обеспечение; микротитрация.
ESACT-UK. Secretary: Alison Stacey, ESACT-UK, PO
Box 117, Saffron Walden, Essex, CB10 1XD, England,
UK. a.stacey@adpro.co.uk. www.esactuk.org.uk. Julian
Hanak, Chairman.
European Collection of Cell Cultures. См. ECACC.
European Life Scientist Organisation. Контактное лицо:
Ingeborg Falscher, P.O. Box 1151, D-69199 Sandliau-
sen, Germany. *49 6224 925613. *49 6224 925610.11,12.
contacl@elso.org. www.elso.org. Kai Simons, President.
European Society for Animal Cell Culture Technology
(ESACT). Office: PO BOX 1723, 5 Bourne Gardens,
Porlon, Salisbury, Wills SP4 0PL, England, UK.+44 1
980 610 405. +44 1 980 610 405. contact@esact.org; of-
fice@esact.org. www.esacl.org. Otto-Wilhelm Merten.
President
European Society of Toxicology In Vitro (ESTIV). ESTIV
Secretary: Dr Jan van der Valk, NCA, Dept. Animals. Sci-
ence & Society, P.O. Box80.166, NL-3508 TD Utrecht, The
Netherlands. +3130 253 2163. +3130 253 9227. secretary©
estiv.org. www.eslivMig. President: R. Combes (UK).
European Tissue Culture Society (ETCS). Secretary:
Petra Boukamp, Deutsches Krebsforschungzenlrum, Im
Neuenlieiiuer Feld 280. D-69120 Heidelberg, Germany.
wa'E’.elc.s. info/etcsmam.html. President: John Masters.
European Tissue Culture Society, UK Branch (ETCS-
UK). Контактное лицо: David Lewis, ECACC, Heath
Protection Agency, Porlon Down, Salisbury, SP4 0JG,
UK. +44 (0)1980 612 512. +44 (0)1980 611315. david.
lewis@hpa.org.uk. www.eeacc.org.uk/.
Falcon. Cm. BD Biosciences.
FiberCell Systems, Inc. 905 West 7th Street # 334,
Frederick, MD 21701, USA +1 301-471-1269. +1 301.
865.6375. gcadwell@adelphia.net. www.fibercellsystems.
com. Половолоконная перфузионная культуральная
система.
Fine Science Tools GmbH. Fahrlgasse 7 13, D-
69117 Heidelberg. Germany. +49 (0)62 21/90 50 50.
+49 (0)62 21/60 0001. europe@finescience.com. www.
finescience.com/. Инструменты ajw иссечения: хирур-
i ические инструменты.
Fine Scientific Tools. 373-G Vintage Park Drive,
Foster City, CA 94404-1139, USA. 800-521-2109;
+ 1 650 349 1636. 800-523-2109; 650-349-3729. info©
finescience.com. www.finescience.com/ Инструменты
для иссечения; xupypi ические инструменты.
Fisher Scientific Corp. 2000 Park Lu, Pittsburgh, PA
15275, USA. +1 412-490-8300; 800-766-7000. 800-926-
1166. www1.fishetsci.com . Бутылки из боросиликатного
стекла; КМЦ, центрифу!и; химические реактивы,
кольца для клонирования; СО,-инкубаторы; контей-
неры для ядерной фотоэмульсии; покровные стекла;
крнспылвнолет; днацетилфлюоресциин; инструменты
для иссечения; ЭДТА; флаконы Эрленмайера; элект-
ронные термометры; морозильники; краситель Гймза;
люкоза; ыицерин* гемоцитометры; магнитные мешал-
ки; микрокрышки (Drummond), Oxoid; иииетки; реф-
рактометры, стерилизационные и сушильные шкафы,
мешалка с подогревом; липкая лента; термоконтролле-
ры; pei истраторы температуры; вортекс-миксеры.
Fisber Scientific U.K. Bishop Meadow Road, Lough-
borough, Leicestershire LE11 5RG, England, UK. +44
(0)1509 231166. +44 (0)1509 231893. info@fisher.
co.uk. www.fisher.co.uk. Продукция см. Fisher Scientific
Corp
Fison Instruments. Cm. Fisher Scientific.
Fluka Riedel-de Ha. en. Industriestrasse 25, CH-
9471 Buchs SG, Switzerland. *41 (0)81 755 25 11.
+41(0)81 755 28 15. Fluka@sial.com. www.sigmaaldrich.
com Brands/Fluka. Биохимические вещества; хими-
ческие реактивы; ЭДТА; метилнеллюлоза.
Fluka Chemical Corp. См. Sigma-Aldrich, www.stal.com.
Биохимические вещества; химические реактивы;
ЭДТА; метилцеллюлоза.
Fluorochem Ltd. Wesley Street. Old Glossop, Derbyshire
SK13 9RY, England. 01457 868921.01457 869360. en-
quiries@fluorochem.co.uk. www.fluorochem.net/. Среда
уплотненная; среда для флотации; флюорохимиче-
ские реактивы.
FMC BioProducts. См. Cambrex. http:/ www.cambtex.
сот . Сиквенс ДНК, сепарация ДНК. обнаружение
мутаций; сепарация белков; ПЦР.
Forma. См. Thermo Electron Corp, www.theimo.com.
С О^-инкубаторы.
Fougera. Melville, NY. www.fougera.com. Стерильный
хирургический лубрикант Stirgilube.
Fresenius AG. D-61346 Bad Homburg v. d. H., Ger-
mauy.+49 6172 6080. www.fresenius-ag.com . Олиго-
нуклеотидные зонды.
Fuji Medical Systems U.S. A., Inc. Corporate Of-
fice, 419 West Avenue, Stamford, CT 06902, USA.
800 431-1850; +1 203 324 2000; Customer Service:
800 872-3854; *1203 602-3609. 203-327-6485. ssg@
fufimed.com. www.fujimed.com. Фотографические
принадлежности: пленка, проявители, фиксирующие
растворы, эмульсии, рентгеновская пленка.
Fuji Photo Film. PO Box 015, Leamington Spa, War-
wickshire, CV 31 YA, England. +44 (0)1926 335 537.
+44 (0)1926 887 793. www.fufifilm-europe.com/. Фото-
графические принадлежности: пленка, проявители,
фиксирующие растворы, эмульсии, ренттеновская
пленка.
G.Q.F. Manufacturing Со. P.O. Box 1552, Savannah, GA
31402-1552, USA. +1 912 236-0651. +1 912 234 9978.
sales@gqfmfg.com. www.gqfmfg.com. Инкубаторы для
яиц.
GA International. 965 Boul. Cure-Labelle, C. P.41534,
Laval, Quebec, H7V 4A3, Canada. +1450-973-9420,1-
800-518-0364. +1 450-973-6373. mail@labtag.com. www.
lablug.com. Ярлыки для криофлаконов; маркеры.
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
613
GE Heathcare. Си. Amersham Biosciences.
GE Silicones. World Headquarters, Wilton, CT 06897.800-
255-8886. wwwgesilicones.com . Клей-герметик для
силиконового каучука.
Gemini Bio-Products. 1301 East Beamer Street, Wood-
land, CA 95776, USA. 800 543 6464; +1 530 668 3636.
+ 1530 668 3630. wwwgembio.com . Антибиотики:
среды; сыворотка.
Genetic Research Instrumentation Ltd. Gene House,
Queenborough Lane, Rayne, Braintree, Essex
CM77 6TZ, England. UK. +44 (0)1376 332 900. +44
(0) 1376 344 724. gpi@gri.co.uk. wwwgri.co.uk. Автома-
тические диспенсеры; пленка для авторадисл рафии
кассеты; биореакторы; Buehler; морозильники с
регулируемым режимом замораживания; криофла-
коны: уплотнители среды: проявители и фиксажи:
ферментеры; проточный цитометр Guava; Hotpack
инкубаторы; Labconco; LEEC; среды для получения
фракции лимфоцитов; микропииетки; системы для
микротитрации; морозильники с жидким азотом;
наконечники для пипеток; автоматические пипетки;
охлажденный инкубатор; роботизированное обору-
дование для разлива жидкостей, роллерные стойки
для инкубатора; роллерный барабан; бокс биобе-
зопасности; перемешивающие флаконы; системы
очистки воды.
Gen-Probe, Inc. 10210 Genetic Center Drive, San Diego,
CA 92121, USA. 619-546-8000; 800-523-5001.800 288-
3141; 800 342—7441. customerservice@gen-probe,
com. wwwgen-probe.com/. Набор для обнаружения
микоилазм
Germfree Labs, Inc. 11 Aviator Way. Ormond Beach, FL
32174, USA. 800-888-5357; fl 386 677 7742+1386
677-1114. info@germfree.com. www germfree.com. Мик-
робиоло! ический бокс биобезопасности; ламинарные
шкафы; защитная камера с перчатками; изоляторы.
Geron Corp. 230 Constitution Drive, Menlo Park, CA
94025, USA. +1 650-473-7700. +1 650-473-7750. info©
geion.com. www.geion.com. Исследование эмбриональ-
ных стволовых клеток человека (bESC), руководство
но работе
GIBCO. См. Invitrogen.
Gilson Inc. 3000 W. Beltline Hwy., PO Box 620027, Mid-
dleton. WI 53562. USA. 608 836 1551, 800 445 7661.
608 831 4451. sales@gilson.com. www.gilson.com !.
Автоматические диспенсеры; оборудование для
разлива жидкостей, микропииетки; рабочее место
для микротитраиии: перистальтические насосы: ав-
томатические иииетки; роботизированные системы;
вакуумные насосы.
GilsonS. A. S. 19, avenue des Entrepreneurs. BP 145,
F-95400 Villiers le Bel, France. +33 01 34 29 50 00.
+33 01 34 29 50 20. wwwgdson.c<rm/. Автоматические
диспенсеры; оборудование для разлива жидкостей
микропииетки; рабоччее место для микротитрации:
перистальтические насосы; автоматические пинетки,
роботизированные устройства; вакуумные насосы
Glen Research Corp. 22825 Davis Drive, Sterling, VA
20164, USA. +1 703 437 6191;. +1 703 435 9774. sup-
porl@glenres.com. www.glenres.com/. Синтетические
олигонуклеотиды.
Global Medical Instrumentation, Inc. (GMI). 6511 Bun-
ker Lake Boulevard, Ramsey, MN 55303, UK. 763-
712-8717. 763-497-0176. richard@gmi-tnc.com. www.
gmiinc.com. Автоклавы; биореакторы; инкубаторы;
микробиолш ические боксы биобезопасности: сте-
рилизаторы; Verax.
Gonotec GmbH. Eisenacher Strasse 56. 10823 Beilin,
Germany. +49 (0)30 7809 588-0. +49 (0)30 7809 588-88.
coniacl@gonote( com. www.gonoiec.com. Осмометры.
Gow-Mac Instrument Co. 277 Broadhead Rd., Bethlehem,
PA 18017. USA H 610 954 9000. +1 610 954 0599.
sales@GOW-MAC.com. http://wwwgowmac.com, Га-
зоанализаторы; газовые смесители.
Gow-Mac Instrument Co. (Ire) Ltd. Bay К14a, Industrial
Estate, Shannon, Cty. Clare, Ireland. +353-61-471 632.
+353-61-471 042. sales@GOW-MAC.ie. hllp:/ www.
gowmac.com/. Газосмесители; газоанализаторы.
Grace Bio-labs. PO Box 228, Bend, OR 97709,
USA.+1 541318 1208. +1 541-318-0242; 800-813-7339.
custservice@gracebtft.com. www.gracebio.com. Стекла
для культуральной камеры; культура на покровных
стеклах; многолуночные стекла
Grant Instruments (Cambridge) Ltd. Shepreth, Cam-
bridge.SG8 6 GB, England,UK. +44(0) 1763 260 811.+1
(0) 1763 262 410. info^grant.co.uk. www gtani.co.uk.
Электронные термометры; термометры c pei итери-
рующим устройством; pei истраторы температуры;
водяная баня
Greiner Bio-One GmbH. Maybachstrasse 2, D
72636 Frickenhausen, Germany+49 (0)7022 948-0.+49
(0)7022 948-514. tnfo@degbo.com. wwwgreinerbtoo-
netnc.com. Чашки; вкладыши в фильтрационные
лунки; флаконы; многолуночные планшеты; обору-
дование для 1 ерметизации планшетов.
Greiner Bio-One Inc. 1205 Sarah St., Longwood, FL
32750, USA. +1 407-333-2800; 800 884 4703.+1 407-
333-3001. info@usgbo.com. wwwgreinerbiooneinc.com.
Чашки; вкладыши в фильтрационные лунки; фла-
коны; mhoi олуночные планшеты; оборудование для
герметизации планшетов.
Greiner Bio-One Ltd. Brunel Way, Stroudwaler Business
Park, Slonehouse, Glos., GL103SX, England, UK. +44
(0) 1453 825 255. +44 (0) 1453 827 277. sales@ukgbo.
com. www.gbo.com. Чашки; вкладыши в фильтраци-
онные лунки; флаконы, mhoi олуночные планшеты;
оборудование для герметизации планшетов
Guava Technologies, Inc. 25801 Industrial Blvd., Hay-
ward, CA 94545-2991, USA. +1 866448 2827 +1 510-
576-1500. www.guavatechnologies.com. Настольный
проточный цитометр.
Guest Medical, Ltd. Enterprise Way, Edenbridge, Kent
TN8 6EW, England, UK. 01732 876466.01732 876476.
GueslMedical@BTIntemet. com. wwwgueslmedtcal.co.uk.
Аквасан-водяная баня бактериостатическая; устрой-
ство сбора биоло! ически опасной разлитой жидкости;
1 ипохлорид таблетированный; автоклавируемые
одноразовые пакеты; глютаровый альде! ид.
614
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
Нааке Buehler. См Thermo Electron Corp., Therino-
Haake. Электрофорез; ai ент для создания градиента
плотности; боксы для окрашивания.
Hamamatsu System Division. Div. of Hamamatsu Corp.,
360 Foothill Rd., P.O. Box 6910, Bridgewater, NJ 08807,
USA. 908-231-1116. 908-231-0852. www.hamamatsu.
com. CCD-камеры; кабельное TV; анализ изображе-
ний; видеокамеры; видеома! нитофоны; видеосъемка
в режиме замедленного времени.
Hamamatsu Photonics К.К. 325-6, Sunayatna-cho, Hama-
matsu City, 430 Japan. (81)53 452 2141.(81)53 456 7889
www.harnamatsu.com. CCD-камеры; кабельное TV; ана-
лиз изображений; видеокамеры: видема: нитофоны;
видеосъемка в режиме замедленного времени.
Hammond Cell Technology. РО Box 1424, Windsor, СА
95492.707 473 0564.707 473 0564.hciculture@aol.com.
www.hammondcelllech.cctm. Экстракт гипофиза быка.
HamoAG. CH-2542 Pieterlen, Switzerland. +41 (0)32 376
0200. +41 (0)32 376 0200. info@hamo.com. wwwhamo.
com. Моющие машины для лабораторного стекла;
моющие машины.
Hamo UK Ltd. Spectra House, Boundary Way, Hetnel
Hempstead, HP2 7SH, England, UK. +44 (0) 1442 259
735. +44 (0) 1442 219 566. hamo.uk@hamo.com. www.
hamo.com. Моющие машины для лабораторного стек-
ла; моющие машины.
Hanna Instruments Inc. 584 Park East Dr., Woonsocket,
RI 02895, USA. +1-401-765-7500+1-401-762-5064.
sales@hannainsl.com. www.hannainsl.com. Ма|нитные
мешалки; pH-метры, кондуктометры.
Hanna Instruments. Eden Way. Pages Industrial Park,
Leighton Buzzard. Beds, LU7 8TZ, England, UK.+44
(0)1525 850 855. т-44 (0)1525 853 668.salesteam@han-
nainsi.co.uk. wtrw.hannainst.com,. Mai ни гные мешалки
pH-метры, кондуктометры.
Harlan Sera-Lab, Ltd. Hillcrest, Dodgeford Ln., Bel
ton, Loughborough, Leicester LE12 9TE, England,
UK.01530 222 123. 01530 224 970. h.slcsd@harlanuk
co.uk. www.harlanseralah.co.uk. Антитела; сыворотка.
Harvard Apparatus Inc. 84 October Hill Rd., Holliston,
MA 01746, USA. +1 508-893-8999; 800-272-2775
+ 1 508-429-5732. bioscience@harvardapparatus.com
www.harvardapparatus.com. Настольный автоклав;
инкубаторы; печи; стерилизационные шкафы.
Harvard Apparatus Ltd. Fircrofl Way, Edenbridge. Kent
TN8 6HE, England, UK. +44 (0)1732 864 001. +44
(0)1732 863 356. sales@hanardapparatus.co.uk. www.
harvardapparalus.co.uk. Настольный автоклав: инку-
баторы, стерилизационный шкаф.
Hays Chemical Distribution, Ltd. Hays House, Millmead,
Guildford. GU2 5HJ, Surrey, England, UK.+44 (0)113
250 5811 +44 (0)113 250 5811. Хлорсодержащий
дезинфектрант Chloros.
Hazelton. Cm. Covance.
Health Science Research Resources Bank (HSRRB).
Rinku-niinamihania 2-11, Sennan-shi, Osaka 590-0535,
Japan. + 81-724-80-1655. www.jhsf.or.jp. Помещение в
клеточный банк; продажа клеточных линий; клоны
ДНК.
Helena Laboratories. РО Box 752, Beaumont, ТХ
77704-0752, USA. +1 409 842 3714; 800 231 5663.
+1 409 842 6241. www.helena.com/. Денситометры.
Henry Schein Inc. 135 Duryea Road, Melville, NY 11747,
USA. 800-711-6032; +1-631-843-5500.5117.1-800-329-
9109,. custseru@henryschein.com. www.henryschein.com/.
Roccall.
Henry Schein Ltd. Centurion Close, Gillingham, Kent,
ME8 0SB England, UK 8700 102 043. 800 413 734.
sales@henryschein.co.uk. trww.hentyschein.co.uk. Roccall.
Heraeus. Equipment, c.w. Kendro. CO «-инкубаторы;
центрифу!и; ламинарный шкаф; печи.
Heraeus. Культуральные материалы си. Vivascience
AG. PelriPerm.
Heto-Holten. См. Thermo Electron. Ламинарный шкаф;
боксы микробиоло!ической защиты.
High-QInc. P.O. Box 440, Wilmette, IL 60091, USA. 800-
474-2674; +1-847-256-1231.800-474-2672; +1-847-256-
6114. sales@high-q.com. www.high-q.com. Дистилляция;
системы очистки воды.
Hotpack. См. SP Industries Co.
HRP, Inc. Cm. Covance Research Products, Inc.
HSRRB. Cm. Health Science Research Resources Bank.
H.V. Skan. Jeremy Drew,425-433 Stratford Rnad, Shirley,
Solihull. B90 4AE, England, UK. +44 (0)121733 3003.
44 (0)121 733 1030. info@skan.demon.co.uk. www.ber-
hnetglas.com. Препараты для микроскопии.
HyClone. 1725 South Ну Clone Road, Logan, UT 84321-
6212, USA. 800-492-5663; 435-792-8000.800-533-9450;
+ 1 435-792-8001. info@hyclone.com. www.hyclone.com.
Эмбриональная сыворотка теленка; среда; сыворотка;
бессыворогочная среда, заменители трипсина.
Hyclone Europe S. A. luduslriezone III, B-9320 Ereinbo-
degem-Aalst, Belgium. 53 83 44 04. 53 83 76 38. www.
hyclone.com. Эмбриональная сыворотка геленка сре-
да; сыворотка; бессывороточная среда, заменители
трипсина.
Hycor Biomedicals, Inc. Garden Grove, СА 92841, USA.
(800) 382 2527; (714) 933-3000. (714) 933 3220.
ELISA; химически детерминированная среда; бессы-
вороточные среды.
ICLC Interlab Cell Line Collection. Istituio Nazionale
per la Ricerca sul Cancro c/o CBA, Largo Rosanna
Benzi, 10, Genova (GE), 16132 Italy. +39-0105737 474.
-*-39-0105737 295. iclc@ist.unige.il. www.biotech.ist.unige.
it cldb Клеточный банк; банк данных во линиям
клеток.
ICN. См. MP Biomedicals
IEC. См. Thermo Electron Corp, www.thermo.com.
Центрифу!и; СО2-контроллеры; СО,-инкубаторы;
адаптеры для цитоцентрифуш; оборудование для
разлива жидкостей.
Ilford Imaging UK Ltd. Town Lane, Mobberley,
Knutsford, Cheshire, WA16 7JL, England, UK. +44
(0)1565 684 000. +44 (0)1565 873035. www.ilford.com.
Фогтрафическая эмульсия; проявители; фиксиру-
ющие растворы; пленка
Ilford Imaging USA Inc. W. 70 Century Road, Paramus,
NJ 07653, USA. +1 201-265-6000. www.ilford.com. Фо-
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
615
тографическая эмульсия; проявители; фиксирующие
растворы; пленка
Imaging Associates Ltd. 6 Avonbury Business Park,
Howes Lane, Bicester, Oxoti 0X26 2UA, England, UK.
+44 (0) 1869 356 240. +44 (0) 1869 356 241. enquiries©
itnas.co.uk. www.imas.co.uk. Анализ изображений; ин-
кубатор для инкубируемой камеры, инкубируемая
камера для микроскопа; микроскопы: конфокальный,
флюоресцентный, инвертированный, стерео, верти-
кальные; фотомикросконы; видеосъемка в режиме
замедленного времени
Imaging Research Inc. Brock University, 500 Glenridge
Avenue, St. Catherines, Ontario, L2S 3A1, Canada.
905 6882040. 905 685 5861. Цитометр; анализ изоб-
ражений; флюоресцентные зонды; микроанализ ДН К
и белка.
Inamed Aesthetics. 5540 Ekwill Street, Santa Barbara, CA
93111, USA.+1805 683 6761.+1805 967 3!KQ.t£WW.iname-
daestheticss.om. Коллагеновый имплантат; Zydertn 2
Infors AG. CH-4103 Bottiningen, Basel, Switzerland.
(0)61425 7700. (0)61 425 7701. Headoffice@inforsht.
cotn\ sertice@infors-ht.com. www.infors-ht.ch. Инкуба-
торы; ферментеры; шейкеры.
Infors U.K., Ltd. The Courtyard Business Centre,
Dovers Fam, Lonesome Lane, Reigale, GB-RH2 7QT
Surrey, England, UK. +44 (0)1737 22 3100. +44
(0)1737 24 72 13. infors.uk@infors-ht.com. www.infors.
ch. Инкубаторы; ферментеры; шейкеры.
Innovatis AG. Meisenstrasse 96, D-33607 Bielefeld, Ger-
many.+49 (0)5212997-300.+49 (0)521 2997-285. info©
innovatis.com. Kwusinnovatis.com. Счетчик клеток; под-
счет клеток в многолуночном планшете: определение
жизнес иособности.
Innovatis Inc. 333 Lancaster Avenue, Westgale V., 207,
Frazer, PA 19355-1823, USA. +1-888-283-1564; +1-
610-889-7319.+1-888-283-1631; + 1-610-889-7436.
info@innovatis.com. www.innovatis.com. Счетчик
клеток; подсчет клеток в многолуночном планшете;
определение жизнеспособности.
Innovative Cell Technologies, Inc. 6790 Top Gun St.
#1, San Diego, CA 92121, USA +1 858 587 1716
+ 1858.453 2117. info@innovativecelltech.com. www.
innovativecelltech.com. Диссоциирующие агенты Ac-
cutnax; Accutase; проточная цитометрия; роботизи-
рованная система; замещение трипсина
Innovative Chemistry, Inc. P.O. Box 90, Marshfield,
MA 02050. USA. +1 781-837-6709. +1 781-834-7325.
www.innovativechem.com/. Набор для изоферментного
электрофор ги чес кого анализа.
Insight Biotechnology Ltd. P.O. Box520, Wembley, Mid-
dlesex, HA9 7YN, England, UK. +44 (0) 20 8385 0303.
+44 (0) 20 8385 0302. info@insightbio.com. wwwinsighl-
bio.com. Антитела; цитокины; ELISA.
Insmed Inc. 800 E. Leigh St., Richmond VA 23219, USA.
+1 804-828-6893. +1804-828-6894. www.tnsmed.com/.
Коллагеновый имплантат, Zуderm 2; Vilrogen 100.
Instron. 100 Royal! Street, Canton, MA, 02021, IISA.1 800
564 8378; 1 781 828 2500. tewte.in.stron.com. Система
сжатие растяжение для культуры миоцитов.
Integra Biosciences AG. Schimbuhlstr. 8. CH-7000, Chur,
Switzerland. i-41 (0)81 286 95 30. +41(0)81 286 95 33.
info@integra-biosciences.com. www.integrabiosctences.
com. Аспирационный насос; автоклавы; автомати-
ческие пииетки; горелка; культуральные флаконы;
диспенсеры; вкладыши в фильтрационную лунку;
фильтровальные флаконы, крышка фильтра; мани-
пуляции с жидкостями; культура высокой плотности,
флаконы и камеры; оборудование д;1я разлива жид-
костей, ма| нитные мешалки; Maxisafe 2000; мемб-
ранные флаконы; микротитрация; многоканальные
автоматические пипетки; перфузионная мембранная
культуральная система; автоматические пипетки; пе-
ристальтические насосы и иинетирующие устройства,
соединенные с ними; роллерные бутыли; аппарат для
роллерной Ш'льтуры: шестилуночная камера: враща-
ющаяся культура; мешалочная культура; Tecnomouse;
вакуумные насосы.
Integra Biosciences UK. Си. Scientific Laboratory Sup-
plies
Integra Biosciences (USA). Си. Argos Technologies.
Intergen Co. Cm. Serologicals.
International Association for Plant Tissue Culture
(IAPTC). Abed A. Walad. Secretary-Treasurer, Depart-
ment of Ornamental Horticulture, ARO, The Volcaui
Center, P.O. Box 6, Bel Dagan 50205 Israel. +972 3
9683500. +972 3 9660589. vcwatad@volcani.agrigov.il.
http:, indy cc1.agri.ac.il/.tzvika iaptc ip-homeJilm.
Interplast Inc. 100 Connecticut Drive, Burlington. NJ
08016, USA. +1609-386-4990; 1-800-220-1159. 609
386-9237. wtete.interplaslinc.com/. PTFE; тефлон;
пробирки; пластины, палочки.
Interpore Cross International. 181 Technology Drive,
Irvine, CA 92618-2402, USA. +1949 453-3200.
+ 1 949 453-3225. www.inteiiiore.com . Керамика на
коралловой основе.
Intracel, Ltd. Unit 4, Station Road, Shepreth, Royston,
Herts SG86PZ, England, UK. 01763 262680. 01763
262676. Специализированные подогреваемые камеры
для иследований в режиме замедленного времени.
Invitrogen Corp. 1600 Faraday Avenue, Carlsbad,
CA 92008, USA. 800-955-6288; (760) 603-7200.
800 331 2286; +1 760 602 6500. catalog@invittogftn.com.
teww.invihogen.com. Arap; ампулы; антитела; экстракт
эмбриона цыпленка; плазма цыпленка; сыворотка
цыпленка; хромосомное окрашивание; DMEM, F12;
гентамицин; |лютамин; факторы роста; Хэнкса сба-
лансированный раствор (НССР). НССР без Са’* н
Mg2- (С М F); HEPES; среда для клеток нас екомых; 1s-
cove’s модифицированная среда Дюльбекко (IMD М );
канамицин; Е-ытютамин; Среда Мак-Кой 5а; среды;
планшеты для микрптитрации; минимальная среда-а
( М ЕМ-ct); микостатин; фосфатно-буферный раствор;
иенициллин-стреитомицин; Pluronic; рекомбинан-
тный эпидермальный фактор роста (rEGF); RPMI
1640; сывирптка; бессывороточные среды; трипсин;
трипсин /ЭДТА.
Invitrogen I td. 3 Fountain Drive, Inchinnan Business
Park, Paisley PA4 9RF, UK.+44 (0)141814 6100;
616
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
0800 269 210 (продажи); 0800 838 380 (сервисное
обслуживание). +44 (0)141814 6260; 0800 243 485.
euroinfo@invitrogen.com. www.invitrogen.com. См. In-
vilrogen, Inc.
Irvine Scientific, Inc. 2511 Daimler St., Santa Ana, CA
94303, USA. 800 577 6097; +1 949 261 7800 +1 949 26
1 б522.пис/еггх@1пчиехсг.с<ли. www.ininesci.com. Среда:
набор для детекции микоплазм; сыворотка; бессыво-
роточные среды; компоненты сыворотки.
Irvine Scientific, UK. См. Metachem Diagnostics; Smiths
Medical International.
ISP Alginate. San Diego, CA, USA. www.tsfKorp.com/.
Алыииат натрия.
J.T. Baker. Mallinckrodl Baker, Inc., 222 Red School
Lane, Phillipsburg NJ 08865, USA. +1 314-530-2000;
800-354-2050. +1314-530-2328. infombi@mkg.com.
www.jtbaker.com. Держатель для бутылок; буферные
растворы; химические реактивы.
J.T. Baker UK. См. Scientific & Chemical Supplies.
Jackson ImmunoResearch. P.O. Box 9,872 West Balti-
more Pike, West Grove, PA 19390, USA.+1 610 869 4024;
800 367 5296. +1 610 869 0171. cusen@jacksonimmuno
com. www.jacksontmmuno.com . Антитела; FITC-конъ-
joi нрованныи IgG обезьяны против овцы.
Jackson ImmunoResearch (UK). См. Stratech Scien-
tific.
James Glass Co. 14 Hanover St., Hanover, MA 02339,
USA. +1 781 829-0967. +1 781.829.2142. sales@james-
glass.com. waiw.jamesgjass.com. Биореакторы; фермен-
теры; выдувка стекла; лабораторное стекло.
Japanese Cancer Cell Collection. См. Health Science
Research Resources Bank (HSRRB).
Japanese Collection of Research Bioresources. Cm
JCRB and Health Science Research Resources Bank
(HSRRB).
Japanese Tissue Culture Association (JTCA). +81-3-
5814-5801.+81-3-5814-5820. http://jtca.umin.jp.
JCRB. Research Resource Division, National Institute of
Biomedical Innovation, 7-6-8-Sailo-Asagi, Ibaraki-shi,
Osaka 567-0085.Japan. (Распределение клеточных ли-
ний см. HSRRB.) +81 (0)72 641 9811. http: 'rellhank
nibiogojp. Клеточный банк; приобретение клеточных
линии; клоны ДНК
Jencons (Scientific) Ltd. Unit 6, Forest Row Busi-
ness Park. Station Road, Forest Row, East Sussex,
RH185DW, England, UK. +44 (0)1342 826836. +44
(0)1342 826771. uksales@jencons.co.uk. www.jenconsco.uk. Автоматические диспенсеры: макеты биобе-
зопасности, СО,-инкубатор; сосуды Дюара; моро-
зильники с жидким азотом; машитные мешалки;
микробиоло! ические боксы биобезопасности; микро-
миметки; замораживающее устройство контролиру-
емым режимом с закрытым горлом; автоматические
иииетки; стерилизационная лента; мешалки; Taylor
Wharlon.
Jencons Scientific Inc. 800 Bursca Drive, Suite 801, Brid-
geville.PA 15017, USA. 800-846-9959;+1 412-257-8861.
+ 1412-257-8809. info@fertconsusa.com. www.jertconsusa.
сот/. Продукция с и. Jencons (Scientific) Ltd.
JEOL. 11 Dearborn Road, Peabody, MA 01960, USA.
+1978 535 5900. +1 978 536 2205.www.jeol.com. Элек-
тронные микроскопы; сканирующие электронные
микроскопы.
JEOL (UK) Ltd. JEOL House, Silvercourt Walchmead,
Welwyn Garden City, AL7 1LT Herts, England, UK.
+44 (0) 1707 37 71 17. +44 (0) 1707 37 32 54. uk.sales@
jeoleuro.com. www.jeoleuro.com/. Электронные микро-
скопы; сканирующие электронные микроскопы.
JM Separations. P.O. Box 6268.5600 HG Eindhoven, The
Netherlands. +31 (0)40219 7480. +31 (0)40 219 7499.
info@jmseparalions.com. www.jmseparations.com.
Половолоконная перфузионная культура Cellmax;
микрокаииллярная перфузия: Triac концентрические
полые волокна.
Johnson & Johnson, Medical, Ltd. Coronation Road, Ascot,
Berks SL5 9EY, England, UK. +44 (0) 1344 871 000. +44
(0) 1344 872 599. Дезинфектанты; Рекомендуемые таб-
летки; (ицохлорит; протирочный материал; перчатки.
Jouan. См. Thermo Electron Corp, www.thermo.com.
Центрифу!и; инкубаторы; печи; боксы микробиоло-
। ической безопасности; водяная баня.
Jouan Nordic А/S. Си. Thermo Electron.
JRH Biosciences. 13804 W. 107th Street, Lenexa, KS
66215 USA. + 1913-469-5580; 1 800-255-6032.+1 913-
469-5584. info-us@jrhbio.com. www jrhbio.com. Автокла-
вируемая среда; партии культуры; пакеты для сред;
сыворотка; бессывороточные среды; Thermo-POW;
Ventrex; витамины.
JRH Biosciences Ltd. Snieatou Road, West Poriway, An-
dover, Hampshire SP 10 3LF, UK. +44 (0) 1264-333311.
+44 (0)1264-332412. mfo-eu@jrhbio.com. wwwjrhbio.
com. Cm. JRH Biosciences (USA)
KBI BioPharma, Inc. P.O.Box 15579, 1101 Hamlin
Road, Durham, NC 27704, USA. +1 919 479 9898.
+1919 620 7786..sales@kbibiopharma.com. www.kbibio-
pharma.com. Центрифужный Bio Reactor; подложка
для клеток высокой плотности.
Keison Products. P.O.Box 2124, Chelmsford, Essex
CM13UP, England, UK. +44 1245 600560. +44 1245
6000. info@kei.son.co.uk. www.keison.co.uk/day-impex.
Сосуды Дюара.
Keison Products, USA. 233 Rogue River Highway #425,
Grants Pass. OR 97527-5429, USA. +1 541 956 9929.
1 541 610 1646. tnfo@keison.co.uk. www.keison.co.uk'
dayimpex. Сосуды Дюара.
KeLab. KeLab, Karl-Erik Ljung AB, Knipplagatan 10,
414 74 Goteborg, Sweden. +46 (0)31-12 51 60. +46
(0)31-14 82 60. goteborg@kelab-biochem.com. www.
kelabbiochem.com, kontakl.html. Коллаген.
Kendro Laboratory Products. 308 Ridgefield Court,
Asheville, NC 28806, USA. 11 828 658 2711.+1 828 64
5—3368. info@kendro.spx.com. www.kendro.com. Сепа-
ратор клеток; центрифу! и, СО2-инкубаторы, инку-
баторы, ламинарные шкафы; микробиоло! ические
боксы биобезопасности; микроцентрифу! и, печи,
морозильники.
Kendro Laboratory Products. Rohert-Bosch-Slrasse 1,
63505 Langenselbold, Germany. 800-1-536 376 (Sales);
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
617
800-1-112 110 (Service). 800 1112 114. injo.de@kendro.
spx.com. wwwJiendroxom. Сепаратор клеток; центри-
фу! н, С О,-инкубаторы, инкубаторы, ламинарные
шкафы микроб поло! ические боксы биобезопасности;
микроцентрифу! и, печи, морозильники.
Kendro Laboratory Products. Slorlford Hall Park, Bish-
op's Storlford, Hertfordshire, CM23 5GZ. England, UK.
+44 (0)1279 82 77 00. +44 (0)1279 82 77 50. info.uk©
kendro.spx.com. ware.kendro.com. Сепаратор клеюк;
центрифу! и, С О,,-инкубаторы, инкубаторы, ламинар-
ные шкафы микробиоло! ические боксы биобелоиас-
ност и; микроцентрифу! и, печи, морозильники.
Kimberley-Clark. 12671 High Bluff Drive, San Diego, CA
92130, USA 800 255 6401. service@sufeskin.com. адаге.
kcsafety.com/. Нитрильные перчатки.
Kimble-Kontes. Vineland, NJ, USA. +1 (888) 546-
2531 Ex 1; (856) 692-3600 Ex 1. +1 (856) 794-9762.
cs@kimkon.com. www.kimble-kontes.com. Пластиковые
пастровские пипетки; лабораторное стекло, центри-
фужные пробирки.
Kinetic Biosystems, Inc. См. KBI BioPhanna.
KNF Corp. 734 West Penn Pike, Tainaqua, PA.18252,
USA.+1 (570) 386-3550.+1 (570) 386-3703 wwwJtnf-
Corp.com/. Автоклавируемая нейлоновая салфетка.
Kodak Ltd- (См. also Eastman Kodak). P.O. Box 66,
Heniel Hempstead, Hertfordshire, HP1 1JU, UK. +44
(0)1442 261 122. +44 (0) 1442 240 609' www.kodak.
co.uk. CCD; цифровые камеры; цифровые изображе-
ния; просветляющий агент; камеры для микроскопа;
фото!рафпческий проявитель, фотографический
закрепитель; рентгеновская пленка.
Kojair (UK) Ltd. 143 Reading Road, Wokingham, Berk-
shire, RG41 1LJ, England, UK. -r44 (0)118977 0957.
+44 (0)118 977 5302. info@kojuir.co.uk. www.kojair.
co.uk. Ламинарный шкаф; блоки микробиоло! ической
защиты.
Lab Safety Supply. РО Box 1368, Janesville, W1
53547 1368, USA. 800 356 0783; +1 608 754 7160.
800 543 9910; +1 608 754 3937. custsvc@lubsafety.
com. www.labsafety.com . Пакеты биобезопасности,
контейнеры для oho.ioi ически опасных отходов; де-
зинфектанты; бутылочки для промывания !ла& рес-
пираторы; нитрильные перчатки; ярлыки; защитная
одежда; контейнер Hjih острых и режущие отходов;
шпохлорит натрия; этикетки.
Lab Vision Corp. 47790 Westinghouse Drive, Fremont,
CA 94539, USA. 800-828-1628; +1510-991-2800.
+ 1510-991-2826. Lab Vision ©Lab Vision.com. www.
labvision.com. маркеры анипменеза; антитела:
коллаген, фибронектин, GFAP, ламинин, муцин,
маркеры апоптоза, факторы роста клеточного цикла,
OHKOieHbi, герегулин, p21WAFl, MUC2, миелин,
pl6INK4a, BrdLT, BUdR, циклим, EGFR, Е-кадгерин,
фибронектин, желудочный муцин, цитокератин, ре-
цептор ламинина, nni23; концентраторы; цитокины;
внеклеточный матрикс; наборы для экстракции,
инвазионные камеры
Labcaire Systems, Ltd. 175 Keim Road, Clevedon, North
Somerset, BS21 6LH, England, UK. +44 (0) 1275 793000.
+44 (0) 1275 341313. mfo@labcaire.co.uk. wwwJabcutre.
co.uk. Блоки микробиоло: ической защиты II класса;
ламинарный шкаф.
Labco Limited (U. К.). Brow Works, Copyground Lane,
High Wycombe, Buckinghamshire, HP 12 3HE, United
Kingdom. +44 (0)1494 459741. -‘-44 (0)1494 465101.
saies@lubco.co.uk. www.labco.co.uk. Корзины для био-
ло! ически опасных отходов.
Lab-Line. См. Barnstead Thermolyne Corp.
Labmart (Cambridge), Ltd. 1 Pembroke Avenue, Water-
beach, Cambridge CB5, UK. +44 (0) 1223441257.+44
(0) 1223861990. Автоклавы; системы криобиоло|и-
ческого хранения; морозильники с жидким азотом;
низкотемпературные морозильники.
Laboratory Impex Systems Ltd. Impex House, 15 Riv-
erside Park, Wimborne, Dorsel, BH21 1QU, England,
UK.+44 (0)1202 840685. t44 (0)1202 840701. safes©
labimpex-systems.co.uk. www.lab-impex-systems.co.uk.
CO,-контроллеры; дезинфектанты; холодильники;
морозильники; штативы д,!я морозильников.
Laboratory Sales (UK) Ltd. Units 20-21, Transpenntne
Trading Estate, Rochdale OL11 2PX, England, UK +44
(0) 1706 356 444. +44 (0) 1706 860 885. sales@lg-uk.com.
www.ls-uk.com. Покровныые и предметные стекла для
микроскопии; флаконы и уплотняющие вкладыши.
Labox Ltd. The Oval, Hackney Road, London, E29DU,
England, UK. +44 (0)207 613 2400. +44 (0)207 613 3420.
Iabox.uk@lahrrx.biz. www.labox.hiz. Канистры; коробки,
контейнеры, электронные термометры; лабораторный
пластик; насосы; сифоны; вентильные сифоны.
Labsales. Си. Camlah. Температурное устройство ре: ис-
трации данных; термометр с ре: пстратором.
Lab Storage Systems Inc. P.O. Box 968, St. Peters, MO,
3376, USA. 800 345 4167; +1 636 928 8988.800 45 4117;
+ 1 636.922.4474. www.labstore.com. Среда для заклю-
чения срезов.
Lamb, R.A. См. Raymond A. Lamb.
Lancer UK Ltd. 1 Pembroke Avenue, Waterbeach, Cam-
bridge CB5 9QR, England, UK. +44 (0)1223 861 665.
+44 (0)1223 861 990. sales@luncer.com. www.lancer.
co.uk. Моечная машина для лабораторного стекла.
Lancer USA Inc. 140 Slate Road 419, Winter Springs,
FL 32708, USA. +1 407 327 8488. +1 407 327 1229.
sales@luncer.com. www.lancer.com. Моечная машина
для лабораторного стекла.
Lawson Mardon Wheaton. 1501N. Tenth St., Millville,
NJ 08332-2092, USA. 609-825-1100; 800-225-1437.
+1 856-825-1368: +1 856-825-4568. www.wheatonsci.
com. Ампулы, боросиликатное стекло; покровные
стекла; диспенсеры; флаконы Эрленмайера; автома-
тические пипетки Gilson Pipelteman; лабораторное
стекло; оборудование д,ш разлива жидкостей; мик-
ропипетки; автоматические пипетки; лабораторный
пластик; роллерные штативы; перемешивающие
флаконы: многократного и однократного использо-
вания.
LEEC Ltd. Private Road, No.7 Cnlwick Industrial Estale,
NoltinghainNG4 2AJ, England, UK. +1 (0)115 961
6222.+1 (0)115 9616680. sales@leec.co.uk. www.leec.
618
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
co.uk. СО2-инкубаторы, механические щетки для
бутылок; стерилизационные шкафы.
Leica Microsystems. 2345 Waukegan Road, Bannock-
burn, IL 60015, USA. H 847 405 0123,800 248 0123.+
1 847 405 0164. www.leica-micrtfsystems.com/. Камеры;
CCD камеры; CCTV; конфокальный микроскоп;
анализ изображения; инвертированный микроскоп;
кариотииирование микроманипуляторы; микроско-
пы; рефрактометры
Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH. Lilienthalsirasse
.39-45, D-64625 Bensheim, Germany. +49 6251 136 0.
+49 6251 136 155.wU4rJeica-microsystems.com/. Каме-
ры; CCD камеры; CCTV; конфокальный микроскоп;
анализ изображения; инвертированный микроскоп;
кариотииирование; ми кроманииуляторы; микроско-
пы; рефрактометры.
LGC Promochem. Queens Road, Teddington, Middlesex,
TW11 0LY, England, UK. +44 (0)208943 8480. +44
(0)20 8943 7554. uk@lgcpromochem.com-, atcc@lgcpro-
mochem.com. www Jgcpromochem.com. Аутентификация;
клеточные линии; ДНК-ирофилинг; тренировочные
курсы.
Life Sciences International, см. Thermo Electron Corp.
www.thermo.com. Аварийная cm нализация; CO,-ин-
кубаторы; морозильники с регулируемым режимом
охлаждения; pei исграторы данных; система регистра-
ции замороженных запасов; ламинарные шкафы; обо-
рудование для разлива жидкостей; морозильники с
жидким азотом; низкотемпературные морозильники;
бокс микробиоло! ической защиты; микроиииетки;
микротитрация: планшеты, ридеры для планшетов,
моюшие устройства для планшетов: машитный
сортиш; азотные морозильники; прш раммируемые
морозильники; система радиоинформации и аварий-
ная сигнализация.
Life Technologies. См. Invitrogen.
List Biological Laboratories. 501 -В Vandell Way. Camp-
bell, CA 95008, USA. 800 726-3213; +1408 866 6363.
+ 1 408866 6364. info@Jistlabs.com. teww.listlabs.com.
Холерный токсин.
LMS Ltd. The Modern Forge, Riverhead, Sevenoaks,
Kent, N13 2EL, Eugland, UK. +44 (0)1732 451 866.
+44 (0)1732 450 127. sales@lms.ltd.uk. wuw.lms.ltd.uk.
Настольные автоклавы; инкубаторы с охлаждением;
морозильники; холодильники.
Lome Biochemicals. Reading, Berks., UK. +44 (0) 118 934
2400. +44 (0)118934 2788. info@lomelabs.com. www.
lomelabs.com. Коллагеназа; ДНКаза: i иалуронидаза
трипсин.
LTE Scientific Ltd. Greenbridge Lane, Greenfield, Old-
ham, OL3 7EN, England, UK. +44 (0) 1457 876 221.
+44 (0) 1457 870 131. info@lle-scientific.co.uk. www.
lte-scientific.co.uk. Автоклавы; настольные автоклавы;
инкубаторы: СО,, с охлаждением; сушильные шкафы;
ламинарные шкафы, блоки ми кробиолш ической
защиты; сухожаровые шкафы.
Ludl Electronic Products. 171 Brady Ave., Hawthorne,
NY 10532, USA. +1 914 769-6111 x223. +1 914-769-
4759. Cust-Service@Iudl.com. wuw.ludl.com,. Электрон-
ные комплектующие; компьютеризованный затвор;
сменные светофильтры; управляющая система для
съемки в режиме замедленного времени.
Lumitech Ltd. См. Cambrex. Наборы для определения
цитотоксичности; наборы для определения клеточной
пролиферации; наборы для определения контамина-
ции микоплазмой; люцифераза, набор для определе-
ния доли аденилатных нуклеотидов.
МА Bioservices. См. BioReliance
М all inckrodt -Baker. См. J.T. Baker.
Markson LabSales Inc. 5285 N.E. Elam Young Pkwy, State
A-400. Hillsboro, OR 97124, USA. +1 503 648 0762,800
528 5114. t-1 503 648 8118. markson@teleport.com. www.
matkson.com. Реактивы для хроматографии; дезинфек-
танты; фильтры; молекулярные сита; рефрактометр.
Matrix Technologies Corp. 22 Friars Drive, Hudson,
NH 03051, USA. +1 (0)603 595 0505, 800345 0206.
+ 1 (0)603 595 0106. info@matrixtechcoTp.com. www.
matrixtechcmp.com. Автоматические диспенсеры; ав-
томатические иииетки с ретулируемым расстоянием
между наконечниками, автоматические пипетки;
пипетпрующие устройства; роботизированное обо-
рудование для разлива жидкостей.
Matrix Technologies Corp. Lower Meadow Road,
Brooke Park, Handforlh, Cheshire, SK9 3LW, Eng-
land, UK. 0800 389 4431; +44 (0) 161 486 2110. +44
(0) 161488 4560. info@matiixtechcorp.eu.com. www.
matrixtechcoip.com. Автоматические диспенсеры; ав-
томатические пипетки с регулируемым расстоянием
между наконечниками, автоматические пииетки;
пииетирующие устройства; роботизированное обо-
рудование для разлива жидкостей.
MatTek Corp. 200 Homer Avenue, Ashland, MA 01721,
USA. 800-634-9018; +1 508-881-6771 ь 1 508-879-
1532 information@matlek.com. www.mattek.com,'
Исследование цитотоксичности органотиинческне
культуры; тканевой эквивалент; трансплантаты.
MBL International Corp. MBL International, 15 BConsli-
tutiou Way, Woburn, MA01801, USA. +1781 939 6964;
1-800 200 5459. +1 781 939 6963. info@mblintl.com.
www.mblintl.com . Антитела; апоптоз; BUdR, клеточ-
ная пролиферация; рецепторы PCNA (proliferating
cell nuclear antigen, ядерный антш ен пролифериру-
ющих клеток); передача сш нала.
MDH Ltd. См. BioquelL
Mediatech Inc. 13884 Park Center Road, Herndon, VA
20171, USA. 800 235 5476. www.cellgrtr.com. Автокла-
вируемая среда (MEM): глютамин: сухая среда Хама
F12; сбалансированный солевой раствор Хэнкса без
Mg2tH Са2* (CMF-HBSS); среда для культуры клеток
насекомых; Plurouic; бессы ворог очная среда.
Medical & Biological Laboratories (MBL) Co Ltd.
Suuiiloinoslioji Marunouchi Bldg. 5F, 5-10 Martin -
ouchi 3chome, Naka-ku, Nagoya 460-0002, Japan.
+81 52 971 2081. +81 52 971 2337. www.mbl.co.jp. Ан-
титела; аиоцтоз; BUdR; пролиферация клеток; PCNA;
рецепторы; передача сш нала.
Medical Air Technology (MAT) Ltd. Airology Centre,
Mars Street, Oldham OL9 6LY, England, UK. +44
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
619
(0)161 621 6200. т-44 (0)161 624 7547. Sales@medairtec.
сот. www.medicalairtechnology.com/ Ламинарные
шкафы; ламинарные шкафы; боксы микробиоло! и-
ческой защи гы.
Memmert GmbH. P.O. Box 1720, D-У 1107 Schwabach,
Germany. -49 (0) 91 229 250. --49 (0) 91 221 4585.
info@memmert.com. www.memmert.com. СО,-инкуба-
торы; инкубаторы с охлаждением; стерилизационные
шкафы
Merck Biosciences, Ltd. Padge Road, Beesion, Not-
tingham NG9 2JR, England, UK. 800 622 935; +44
(0)115 943 0840. +44 (0)115 9430951. customer, ser-
vice@merckbiosciences.co.uk. www.merckbiosciences.
co.uk. Антитела; иеншаситель; биохимические реак-
тивы; буферы; КМЦ;химические реактивы: холерный
токсин: Кристалл-виолет; деконтаминиру юший агент
Decou; детергенты; дексаметазон; декстран; ДМСО;
ЭДТА; ферменты; G418 сульфат; краситель Гимза;
1 люкоза; глицерин; реактивы для исследования саха-
ров; 1 идрокиртизин; i игромицин В; иммунохимичес-
кие реактивы; меркаптоэтанол; ПЭГ; автоматические
иииетки; ридеры для планшетов; роллерная культура;
силикагель; красители; Трииановый синий.
Merck USA. Си. EMD Biosciences.
Merck KGaA. См. VWR. de.vwr.com Продукция. См
Merck Biosciences.
Messer Cryotherm. Euteneuen 4 D-57548 Kirchen Sieg,
Germany- +49 27 41/95 85-0. +49 27 41 69 00. info®
tiyotherm.de. www.messer-cryothetm.de. Морозильники;
охлаждающие системы с ретулируемым режимом;
морозильники с жидким азотом.
Messer UK Ltd. Cedar House, 39 London Road, Reigate,
Surrey RH2 9QE,England, UK. t-44 (0)1737 241133.+44
(0)1737 241842. wtcw.messergroup.com. CO,;охлажда-
ющие системы с регулируемым режимом; заморажи-
вающие системы; сухой лед; газовые смеси; кислород;
азот; морозильники с жидким азотом; калибрацион-
ные газовые смеси; ретуляторы таза; автоматические
иииетки; планшетные сканеры.
MetaBios Inc. 1.35-Innovalion & Development Center,
University of Victoria, R-Hut McKenzie Avenue,
Victoria, British Columbia, V8W 3W2, Canada <-l
(250) 472-4334. +1 (250) 721-6497. info@metabios.
com. www.metabios.com. Воздуходувные биореакторы;
пакеты для культуры; пакеты для сред.
Metachem Diagnostics Ltd. 29 Forrest Rd.. Piddinglon,
Northampton. NN7 2D A, England, UK. +44-1604-
870370.+44-1604-870194. info@metachem.co.uk.
metachem.co.uk. Среда; сыворотка; тест-набор на
микоплазмы; бессывороточная среда; компоненты
сыворотки.
Mettler-Toledo GmbH. PO Box VI-400. CH-8606 Grei-
feiisee, Switzerland. +41 1944 22 11. +41 1944 31 70.
www.mt.com. Весы, кондуктометры, денситометры,
pH-метры; диспенсеры: автоматические иииетки:
рефрактометры.
Mettler-Toledo Inc. 1900 Polaris Parkway, Colum-
bus, OH 43240. 800 METTLER, +1 614 438 4511.
+1 614 438 4900. us@mt-shop.com. www.mt.com. Весы,
кондуктометры, денситометры, pH-метры, диспенсе-
ры; автоматические иииетки; рефрактометры
Mettler-Toledo Ltd. 64 Boston Road, Beaumont Leys,
Leicester, LE4 2ZW, England, UK. 070000 MTSHOP.
0116 236 5500. uk@mt-shop.com. www.mt-shop.com.
Весы; конду ктометры; денситометры, pH-мет ры; дис-
пенсеры; автоматические иииетки, рефрактометры.
Michael Smith Engineers Ltd. FREEPOST SCE 7470,
Woking, Surrey, GL'21 lBR,England,L’K.0800316 7891.
+44(0)1483 723 110. www.michaelsmith-engineers.co.uk.
Автоматические диспенсеры; измеряющие и дис иен-
сирующие насосы; перистальтические насосы.
Microflow. См. Bioquell.
MicroGeN2. См. Texol Products.
Microgon Inc. См. Spectrum. Фильтры; половолоконная
система: стерилизующие фильтры: фильтры-насадки
на шприц.
Microm International GmbH. Robert-Bosch-Str. 49, D-
69190 Walldorf, Germany. +49 6227-8360. +49 6227-
836 111. www.microm.de. Cyloseal 60; стекла для мик-
роскопа. Среда для заключения стекол
Miele Inc. 9 Independence Way, Princeton, NJ 08540,
USA. 609 419 9898; 800 843-7231. +1 609 419 4298.
tpww.labtrashers.com/. Моечная машина для лабора-
торного стекла
Miele Со., Ltd. Abingdon, Охоп, ОХ14 1TW, England,
UK. 845 3303618. www.mieleprofessional.co.uk. Моеч-
ная машина для лабораторного стекла.
Miles Inc. См. Bayer Corp.
Miles Ltd. См. Bayer plc.
MilHpore Corp. 290 Concord Rd., Billerica, MA 01821,
USA. +1 978 715 4321: (800) ILLIPORE.(781) 533-
3110. www.millipore.com/. Угольный фильтр; деиони-
зация; электродеионизация; фильтры; держатели для
фильтров; стерилизация фильтрацией; вкладыши в
фильтрационную лунку; молекулярная фильтрация;
насосы; обратный осмос; стерилизация фильтрацией;
Slerivex; сверхчистая вода; очистка воды.
Millipore (U. К.), Ltd. 3&5The Courtyards, Hallers
Lane. Waterford, Hertfordshire, WD18 8YH, England,
UK. 870 900 46 45. 870 900 46 44. www.millipore com!
pun-commerce. Cm. Millipore Corp.
Miltenyi Biotec GmbH. Friedrich-Eberl-Strasse 68,
51429 Bergisch Gladbach, Germany- +49 2204 83060.
+49 220485197. macs@miltenyibiotec.de. www.MHteny-
iBiotec.com. Антитела; Ac 133, CD34; клеточная сепара-
ция, секреция, анализ секреции цитокинов; сепарация
эпителиальных клеток; сепарация эндотелиальных
клеток; сепарация фибробластов; магнитный сор-
тинг; магнитные бусины; нейлоновые сита; маркеры
стволовых клеток
Miltenyi Biotec Inc. 12740 Earhart Avenue, Auburn,
CA 95602, USA. +1 530 888 8871; 800 FOR MACS.
+ 1 530 888 8925. macs@miltenyibiotec.com. www.
MiltenyiBiotec.com. Cm. Miltenyi Biirtec GmbH. UK.
0118 944 8000.0118 944 8001. info@moldev.com. www.
moleculardevices.com Микротнтрация: ичаншетные
сканеры, флюориметры, upoi раммное обеспечение,
с иектрофотометры.
620
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
Miltenyi Biotec Ltd. Almac House, Church Laue, Bis-
ley, Surrey GU24 SDR, England, UK. 01483 799 800.
01483 799 811. macs@millenyibioiec.co.uk. www.Milt-
enyiBiotec.com. Cm. Miltenyi Biotec GmbH.
Miltex Instruments Co., Inc. 700 Hicksville Road, Beth-
page, NY 11714, USA. 800-645-8000; +1 717 840 9335.
+ 1 717 840 9347. customerservice@miltex.com. www.
miltex.com. Инструменты для иссечения и хирурги-
ческие инструменты.
MinucellsandMinutissue Vertriebs-GmbH. Starenstrasse
2, D-93077 Bad Abhach, Germany. +49 (0)9405 962 440.
+49 (0)9405 962 441. minucells.mimtissue@Lonline.de.
www.minuKJiemKu.de. Камеры для микроскопа; ор-
ганотипическая культура; перфузионная культура;
клеточный каркас для культуры; опорная структура
для ткани; курсы по культуре ткани.
Molecular Devices Corp. MaxLine Div., 1311 Orleans
Dr., Sunnyvale, CA 94089, USA. 408-747-1700; 800-
635-5577. 4+1 08-747-3602. info@moldev.com. www.
moleculardevices.com. Микротитрация: рндер для
планшетов, флюориметры, программное обес печение,
Спектрофотометры.
Molecular Devices Ltd. 135 Wharfedale Road, Winners]»
Triangle, Winnersh, Wokingham, RG41 5RB, England,
UK. 0118 944 8000. 0118 944 8001. info@moldev.com.
www.moleculardevices.com. Микротитрацня: ридер для
планшетов, флюориметры, программное обеспечение,
Спектрофот ометры.
Molecular Dynamics. См. Amersham Biosciences. www1.
amershambiosciences.com . Конфокальные микроско-
пы; денситометры; рндеры AjIh планшетов.
Molecular Probes, Inc. 29851 Willow Creek Road, Eugene,
OR 97402-0469, USA. 800 438-2209, -r 1 541 335 0338
+ 1 541 335-0305. ordet@probes.com. www.probes.com.
ДНК флюорохром; субстраты для ферментов; флюо-
ресцентные зонды; PicoGreen; красители для оценки
жизнеспособности.
MP Biomedicals, Inc. 15 Morgan,Irvine, CA92618-2005,
USA. 800.633.1352, +1 949.833.2500; Life sciences
div: 800 854 0530; +1 330 562 1500. +1 949 8595989
custserv@mpbio.com www.mpbio.com/. Наборы ам-
нокислот; антибиотики; антитела; ингибитор апоп-
тоза Apotame; автоматические диспенсеры; плазма
цыпленка; цыпленка сыворотка; С О2-инкубаторы;
коллаген; среда для криоконсервации; детергенты;
дезинфектанты; Фикол-гииак среды; глютамин;
факторы роста; HEPES; инкубаторы; ламинарные
шкафы; среда для получения лимфоиитов Lvnipho-
prep; флаконы с несколькими поверхностями роста,
средство для уничтожения микоплазм (MRA); набор
для обнаружения микоплазм; фосфатно-буферный
раствор; автоматические пипетки; оборудование для
герметизации планшетов, Pluronic F68; пенициллин;
бокс биобезопасности; бессывороточные среды;
стрептомицин: трипсин: сыворотка: Tliermanox;
Vitrogen.
MP Biomedicals NV/SA. Dornveld 10.1731 AsseRelegem,
Belgium. +32 2 466 00 00; 008000 7777 9999. +32 2
466 26 42. www.mpbio.com,. Cm. MP Biomedicals, Inc.
MTR Scientific, LLC. 9639-122 Dr. Perry Road, Ijarns-
ville, MD 21754, USA. +1301-831-1377. +1 01-874-
1899. info@mtrscienLific.com. www.mLrscientific.com.
Сиквенс ДНК; решетка для культуры тканей чело-
века; красители.
Muis Controls Ltd. 10610-172 Street, Edmonton, Alberta,
T5S 1H8, Canada. +1 780 486 2400. +1 780 486 2500.
www.MuisControls.com. Анемометр; расходомер.
MVE Inc. Cm. Chart Binmed.
Mycoplasma Experience. Reigaie, UK. +44 (0)1737 226
662. +44 (0)1737 224 751. mexp@mycoplasma-exp.
com. www.mycoplasma-exp.com. Тестирование на ми-
коплазмы.
Nalge Nunc (Europe) Ltd. Unit la,Thorn Business Park,
Hereford HR2 6JT, England, UK. +44 (0) 1432 263933.
+44 (0) 1432 376567. sales@nalgenunc.co.uk. www.nal-
genunc.com. Cm. Nalge Nunc International.
Nalge Nunc International. International Department,
75 Panorama Creek Drive, Rochester, NY 14625, USA.
800-625-4327; +1 716 264 3898. +1 585-586-8987,
+1 716 264 3106. nnics@nalgenunc.com. www.nalgenunc.
сот/. Ампулы; стержни; вкладыши для клеточных
культур; клеточные фабрики; клеточные скребки:
слайды для камер; конические пробирки; контейне-
ры; покровные стекла; криомаркеры, криопробирки;
криифлаконы; культуральные пробирки; чашки;
планшеты для микротитрацип с дренажным дном;
фильтры; стерилизационные фильтры, вкладыши в
фильтрационные лунки; флаконы; контейнеры для
замораживания; газопроницаемые крышки; маркеры;
пакеты для сред; микроносители; мультиповерхност-
ные пропагаторы; покровные стекла Thernianox.
Napco. 170 Marcel Dr., Winchester, VA 22602, USA.
800-621-8820. info@napco2.com. www.napco2.com,.
С02-инкубаторы; моечные машины для лаборатор-
ного стекла.
Napco. См. Precision Scienltfic/Napco. СО,-инкубаторы;
моечные машины для лабораторною стекла.
National Химические реактивы. 1259 Seaboard Indus-
trial Blvd., Atlanta, GA 30318, USA. 800 237 0263. www.
natchem.com . Дезинфектанты; иодофор.
National Diagnostics, Inc. 305 Patton Dr., S.W. Atlanta,
GA 30336-1817, USA. H 404 699-2121,800-526-3867.
+1 404-699-2077. info@nationaldiagnoslics.com. www.
nationaldiagnostics.com. Сцинтилляционная жидкость
Ecoscint.
Nektar AL. 490 Discovery Drive, Huntsville, AL 35806,
USA. 800 457 1806. +1 256 533 48O5.nektar@ai.nektar.
com. www.nektar.com. Гидрогели; полиэтиленгликоля
диакрилат (PEGDA).
Nektar UK. 69 Lislerhills Science Park, Campus Road,
Bradford, West Yorkshire, BD7 1HR, England, UK.
+44 (0)1274 305 540. +44 (0)1274 305 570. nektar©
uk.nektar.com. www.nektar.com. Гидрогели; полиэти-
лен! л иколя диакрилат (PEGDA).
NEN Life Sciences. См. PerkinElmer.
New Brunswick Scientific Co Inc. Box 4005,44 Talmadge
Road, Edison, NJ 08818-4005, USA.800 631-5417;
+1 732 287 1200. +1 732 287 4222. bioinfo@nbsc.com.
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
621
tfiea.nlac.com . Биореакторы; С О,-инкубаторы;
сушильный шкаф; ферментеры; ротационный шей-
кер; инкубаторы; увеличивающие устройства для
наблюдения за культурой; качалочные платформы;
роллерная культура; роллерный барабан; роллерные
штативы; масштабирование; шейкер-инкубаторы;
стерилизационный шкаф; ультранизкотемиератур-
ные морозильники.
New Brunswick Scientific (U. К.), Ltd. 17 Alban Park,
Hatfield Road, St Albans, Herts, AL4 OJJ, England,
UK.0800 581 331. +44 (0)1727 835 G66. bioinfo@nbsuk.
co.uk. www.nbsuk.co.uk. Cm. New Brunswick Scientific
Co Inc.
New England Biolabs. 32 Tozer Road, Beverly, MA
01915-5599, USA.800-632-5227; +1 978-927-5054.800-
632-7440: +1978-922-7085. cusiomersemce@neb.com.
www.neb.com. Реактивы для молекулярной биолшии;
векторы; передача сш нала.
New England Biolabs (U. К.), Ltd. 73 Knowl Piece,
Wilbury Way, Hitchin, HertsSG4 OTY, England, UK.
+1 (0)1462 420 616; 800318 486. +1 (0)1462 421 057;
800 435682. info@ukjteb.com. wwwjieb. uk.com/. Моле-
кулярная биоло| ия, век горы, передача сш нала.
Nichols Institute Diagnostics Div. 1311 Calle Ba-
tido, San Clemente, CA 92673, USA. +1 949-940-7200
+ 1 949-940-7271. wwwjticholsdiag.com . Иммуноис-
следования: кость, щитовидная железа, адреналовая
функция.
Nikon Europe B.V. P.O. Box 222.1170 AEBadhoevedorp,
The Netherlands. +31 20 4496 222. +31 20 4496 298.
wwwnikon-instnmtents.jp/eng/. Cm. Nikon Inc.
Nikon Inc. 1300 Walt Whitman Road, Melville, NY
11747-3064, USA. +1 631 547 8500. +1 631 5470306.
biosules@nikonincmail.com. wwwnikonusa.com. CCD-
камеры; кольцевой маркер колоний; конфокальный
микроскоп; цифровые камеры; флюоресценция
микроскопы; анализ изображений; инвертированный
микроскопы; микроманииуляторы; микроскопы;
микрофотография; стереомикросконы.
Nikon Instech Со., Ltd. Parale Mitsui Bldg., 8,
Higashidachn. Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanagawa,
210-0005, Japan. +81 -44-223-2167.+81 -44-223 2182.
ww. nikoninsimmenls.jp eng . Cm. Nikon Inc.
Nikon UK Ltd. Nikon House, 380 Richmond Road, Kings-
ton upon Thames, Surrey KT2 5PR, England, UK.+ 1
(0)181 5414440;+l (0)208481 6826.+1 (0)181 5414584.
wwwJtikon-inslmments.com. Cm. Nikon Inc.
NLS Animal Health. 800-638-8672.+1-888-568-2825
webadmin©nlsanimalhealthcan. wwwjtlsanimalhealth.
com, Анестетик Marcaitie.
Nonlinear Dynamics. Cuthbert House, All Saints,
Newcastle upon Tyne, NE1 2ET, England, UK.+44
(0)191 230 2121. +44 (0)191 230 2131.авда>.иопй‘яе«г.
com, Компьютерное нрт'раммное обеспечение; ана-
лиз изображений; микрочииы; микротитрация.
Nonlinear USA Inc. 4819 Emperor Blvd, Suite 400, Du-
rham, NC 27703, ITSA +1 919 313 4556. wwwjionlinear
com,'. Компьютерное программное обеспечение;ана-
лиз изображений, микрочииы; микротитрация.
Nova Biomedical Corp. 200 Prospect Street, Waltham,
MA 02454, USA. 800 458 5813; H 781 894 0800.
+ 1 781 893 6998 info@novabio.com. www.novabio-
medical.com. Блок анализа биоректора; биосенсоры:
нашатырный спирт; электролиты, t люкоза; глютамин;
t лютамат, лактат; осмометры; рН-мониторы.
Nova Biomedical. С3-5, Evans Business Centre, Deeside
Industrial Park, Deeside, Flintshire, CH5 2JZ, Wales,
UK. +44 1244 287 087 +44 1244 287080 office©
novubiomedical.co.uk. wwwjtovabiomedical.com. Блок
анализа бноректора; биосенсор: нашатырный спирт;
электролиты, t люкоза; глютамин; глютамат; лактат;
осмометры; рН-мониторы.
Novocastra Laboratories Ltd. Balliol Business Park
West, Benton Lane, Newcastle upon Tyne, NE12 8EW,
UK. +44 (0)191 215 0567. +44 (0)191 215 1152. вида.
noiocastracouk. Антитела. NC-L-Villin.
NovaMatrix. FMC BioPnlyiner, Pharmaceutical,
1735 Market Street, Philadelphia, PA 19103, USA.
+ 1 215 299 6420; +1 215 817 6571. +1 215 299 6669.
noi'umulrixinfv@fmc£(rm. tcwwJtovamutnxJjiz-, www.fme.
com. Алыинат; соли хитозана и основания; инкапсу-
ляция; матрикс; t иалуронат натрия.
NovaMatrix. FMC BioPolymer, Gausladallreen 21, N-
0349 Oslo,Norway. +47 2295 8638. +47 269 6470.noz>«-
malrixinfo©fmccom. wwwjiovamatrixJtiz; www.fmc.com.
Алы инат; соли хитозана и основания; инкапсуляция;
матрикс; i иалуронат натрия.
Novartis Pharmaceuticals UK Ltd. Friinley Business
Park, GB- Fr ini ley Camberley, Surrey GU16 7SR, Eng-
land, UK. +44 (0)1276 692 255. +44 (0)1276 692 508.
wwwnovartis.co.uk. Циклоспорин.
Novartis Institutes for BioMedical Research, Inc.
400 Technology Square, Cambridge, MA 02139, USA.
+1 617 871 8000.+ 1 617 551 9540. wwwns.sandoz.com.
Ц1 IK .'lOCttOpttH.
Novo Nordisk A/S. Novo Nordisk A S, Novo Alle,
2880 Bagsvxrd, Denmark. +45 4444 8888. +45 4449
0555. webmastet@novonordisk.com. wwwjtovonordisk.
com. Соматостатин.
NuAire Inc. 2100 Fernbrook Lane, Plymouth, MN 55447,
USA.+ 1 763553 1270; 1 8003283352. +1 763553 0459.
nuaire@nuatte.com. wwwjtuaire.com. СО,-анализаторы it
аварийная сш нализация; CO2 многоходовой распреде-
литель; СО,-инкубаторы; ламинарный шкаф; низкотем-
пературные морозильники; бокс биобезопасности.
Nuclepore Corp. См. Corning.
Nunc. См. Nalge-Nunc.
Nusil Silicone Technology. 1050 Cindy Lane, Carpinteria,
CA93013, USA.+1 805 684 8780.+ 1 805 566 9905.ste-
veb@nusil.com. wwwjtusil.com. Ад1 езивные вещества;
эластомеры; гели; силиконовая смазка.
Nycomed Danmark ApS. Langebjerg 1, P.O.Box
88, DK 4000 Roskilde, Denmark. -*-45 46 77 11 11.
+45 46 75 66 40. wwwjtycomed.dk. wwwjtycomedjio.
Плотностная среда; среда для получения лимфоци-
тов; метриламид; метризоат натрия
Nycomed UK Ltd. Die Magdalen Centre, Oxford Sci-
ence Park, Oxford OX4 4 GA, England, UK. t-44 1865
622
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
784 500. +44 1865 784 501. list@nycomed.com. wwwxty-
comed.com . Плотностная среда; среда для получения
лимфоцитов; метризамид; мегризоат натрия.
Olympus America Inc. 2 Corporate Center Drive P.
O. Box 9058. Melville. NY 11747-9058, USA. 800-446-
5967. +1 516 844 5112. olympus@performark.com. www.
olympusamenca.com/. Конфокальная микроскопия;
цифровые камеры; инвертированный микроскопы;
микрофотография; исследовательские микроскопы;
стереомикроскоиы.
Olympus Optical Со. (Europe) GmbH. Wendenslrasse
14-18, D-20097 Hamburg, Germany. +49 40 23 77 30.
+49 40 233 765. main@olympus.uk.com. www.
olympuseuropa.com. Cm. Olympus America. Inc.
Olympus U.K. Ltd. Dean Way, Gt. Western Industrial
Park. Soulhall, Middlesex, UB2 4SB, England, UK. +44
(0)207 2500179. +44 (0)207 250 4677. microscope©
olympus.uk.com. http://www.olympus.co.uk mictoscopy/.
Конфокальная микроскопия; цифровые камеры;
инвертированный микроскоп; микрофотография; ис-
следовательские микроскопы; стереомикроскоиы.
Omega Engineering, Inc. One Omega Drive, Box
4047, Stamford, CT 06907-4047, USA. 8008484286;
+ 1 203 359 1660. +1 203 359 7700. info@omega.com
www.omegy.com. Кондуктометры; электронный тер-
мометр; анемометр; расходомер; temperature indicator;
pH-метры.
Omnilab. Robert-Hooke-Str. 8, 28359 Bremen, Ger-
many.+49 (0)421 175 99 0.+49 (0)421 175 99-300.
info@omnilab.de. www.omnilab.de. Центрифужные
пробирки; СО2-инкубаторы; фильтры; флаконы;
гемоцитометры.
Oncogene Research Products. См. EMB Biosciences
(USA), Merck Biosciences (Calbiochetn). Ahi иогенез;
апоптоз; ELISA наборы; IGF; LIF; PCNA; TGF; TNF,
VEGF.
Oncor, Inc. Marketing Division. 209 Perry Parkway,
Gaithersburg, MD 20877, USA. +1301963 3500.
+ 1301 926 6129. www.oncor.com. Хромосомное окра-
шивание.
Orchid BioSciences, Inc. 4390 U.S. Route One, Prince-
ton, NJ 08540, USA. +1 609 750 2200. +1 609-750-6400.
mail@orchid.com. www.orchid.com. Аутентификация;
ДНК-профи л инг; судебная идентификация.
Orchid Cellmark. 20271 Goldenrod Lane, Suite 120,
Germantown, MD 20876, USA. +1301428 4980,
800 872 5227 +1 301 428 4877. wuw.orchidcellmark,
com. Аутентификация; ДНК-профили hi: судебное
исследование; тест на идентичность ДНК
Origen Biomedical. 4020 S. Industrial Dr., Suite 160,
Austin, TX 78744. USA. +1512 474 7278. +1 512 617-
1503. sales@crrigen.com. www.origen.com,. Пакеты для
криохранения; среда для замораживания; хранение
стволовых клеток.
Orion Researchinc. См. Thermo Electron Corp. www.
lhermo.com. Измерительные приборы; растворенный
кислород, pH, температура.
Oxford Instruments Inc. 130А Baker Ave. Exten-
sion, Concord, MA 01742, USA. +1978 369 9933.
-i-1 978 369 6616. info@ma. oxinst.com. www.oxinst.com/.
Микропииетки.
Oxford Instruments pic. Old Station Way, Eynsham,
Witney, Oxon 0X29 4TL, UK. +44 (0) 1865 881 437.
+44 (0) 1865 881944. info.oiplc@oxinst.co.uk. www.
oxinst.com/. Микропииетки
OxoidLtd. Wade Road, Basingstoke, Hampshire, RG24 8PW,
England, UK. +44 (0) 1256 841144. +44 (0) 1256 463388.
oxotd@oxoid.com. www.oxoid.com «^.Система иденти-
фикации бактерий; Кровяной aiap, планшеты; мик-
роииоло! ический агар, планшеты; питательный агар,
планшеты; питательные бульоны; фосфатно-буферный
раствор, таблетки; триитон-соевый бульон.
Oxoid Inc. 800 Proctor Avenue. Ogdensburg, New York
13669, USA. +1 613 226 1318. +1 613 2263728. www.
oxoid.com/us. Cm. Oxoid Ltd.
PAA Laboratories GmbH. Haidmanweg9, A-4061, Pasch-
ing, Austria. +43 7229 648 65. +43 7229 648 66. info©
paa.al. www.paa.at. Антибиотики; факторы адгезии;
БСА; эмбриональная сыворотка теленка; среды; се-
лективные бессывороточные среды.
PAA Laboratories, Ltd. 1 Technine Guard Ave-
nue, Houndstone Business Park, Yeovil, Somerset
BA22 8YE, England, UK. +44 (0)1935 411 418. +44
(0) 1935 411 480. info@paalaboratones.co.uk. www.paa.
al. Продукция см. PAA Laboratories GmbH
Paar Scient ific Ltd .{cm. also Anton Paar). 594 Kingston
Rd.. London SW20 8DN, England, UK. 0208 540 8553.
0208 543 8727. paat@psl.anton-paar.co.uk. www.paar-
scientific.com. Денситометры; вискозиметры
Paesel & Lorei GmbH. & Co. Moselstr. 2b, D-
63452 Hanau, Germany. +49 (0)6181 18 70-0.+49
(0)618118 70-70. info@paesel-lorei.de. wwwpaesel-lorei.
de. Среды; факторы роста; антитела.
Pall Corp. Bio Support Div., 25 Harbor Park Dr., Port
Washington, NY 11746. USA. +1516-484-3600; 800-
289-7255.+1 (516) 484-3651. custsvc@pall.com. www.
palLcom/laboratory. Фильтры; держатели для фильтров;
фильтрация; фильтр со вставным складчатым фильтру-
ющим элементом; насосы; вакуумные насосы; фильтра-
ция микоплазм; ультрафильтрация; денситометры.
Pall Corp. (UK). Havant Street, Portsmouth, Hamp-
shire, PO13PD, England, UK. +44 (0)23 9230 3303.
+44 (0)23 9230 2509. www.pall.com/laboratory. Cm.
Pall Corp.
P & T Poultry Supplies and Equipment. Cleeton Cottage
Farm, Cleeton Lane, Cleeton St Mary, Nr Cleobury Mor-
timer, Shropshire. DY 14 0QU. England, UK. +44 (0)1584
890263. info@pandtpoultry.co.uk. www.pandtpoultry.
co.uk,. Инкубаторы для яиц; оплодотворенные яйца.
PAW BioScienee Products, Inc. +1732 842 3939.
+1 732 842 G&02.admin@pawbioscience.com.www.paw-
bioscience.com. Культуральные пакеты; перфузионный
биореактор с иоловолоконной системой; силиконо-
вые системы трубок.
Peak Scientific Instruments. 5424 Sea Edge Dr..
Punta Gorda, FL 33950-8735, USA. +1 866 647 1649.
+1866 647 l64S.info@peakscientific.com. wwwpeaksci-
entific.com/. Газогенераторы; генераторы азота.
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
623
Peak Scientific Instruments, Ltd. Fountain Crescent,
Inchinnan Business Park, Inchinnati, Renfrewshire,
PA4 9RE, Scotland, UK. +44 (0)141812 8100. +44
(0)141812 8200.info@peakscientific.com. www.peaksci-
entific.com . Газогенераторы; генераторы азота
PelFreeze. См. Dynal Biotech.
Pepro Tech, Inc. Princeton Business Park. 5 Crescent
Ave. Rocky Hill. NJ 08553-0275, USA. (800) 436-9910,
(609) 497-0253. (609) 497-0321. info@pepmtech.com-,
www.iteprorech.com. Антитела; хемокины; цитокины;
ELISA.
PeproTech EC Ltd. Peprotech House, 29 Margra-
vine Road, London. W6 8LL. England. UK. +44
(0)20 7610 3062. +44 (0)20 7610 3430.info@peprolech.
co.uk. www.peprotech.com. Антитела; хемокины; цито-
кины*. ELISA.
Perbio Science UK Ltd. Century House, High Street,
Tallenhall, Cheshire CH3 9RJ, England, UK. +44
(0) 1829 771 744+44 (0)1829 771 644. uk.info@perbio.
com. www.perbio.com. Культуральные пакеты; среды;
пакеты для сред; фетальная сыворотка теленка; за-
мещение трипсина.
Perceptive Instruments. Blois Meadow Business Centre.
Steeple Bumpstead, Haverhill, Suffolk CB9 7BN, Eng-
land. UK. 01440 730773. 01440 730630. sales@percep-
tive.co.uk. www.perceplive.co.uk. Счетчики колоний;
анализ изображений.
PerkinElmer LAS (Germany) GmbH. Ferdinand Porsche
Ring 17, 63110 Rodgau-Jugesheim, Germany. 0800 1
81 00 32. 0800 1 81 00 31. de.instruments.perkinelmer.
com, Продукция см. PerkinElmer Life Sciences.
PerkinElmer LAS (UK) Ltd. P.O. Box 66, Hounslow
TW5 9RT, England. UK. 0800896046, 0800891 715.
0800 891714. www.PerkinElmer.com. Продукция см.
PerkinElmer life Sciences.
PerkinElmer Life Sciences. 549 Albany Street, Boston,
MA 02118, USA. 800-762-4000; + 1 617 482 9595.
617 482 1380. Productlnfo@perkinelmer.com. www.
PerkinElmer.com. Биореакторы; сепарация клеток:
центрифуги; счетчики колоний; цифровые камеры
для микроскопа; ферментеры; оборудование для по-
лучения флюорографического изображения; факторы
роста; NGF, bFGF (FGF-2), TGF-a, TGF-p; анализ
изображений; люминометр; изотопные счетчики для
микротитрационных планшетов; микротитрация;
программное обеспечение; молекулярные зонды:
планшетные сканеры; радиоизотопы; сцинтилля-
ционные счетчики: сцинтилляционная жидкость:
заменители сыворотки SerXtend.
Pharmacia. См. Amersham Biosiences.
Pharmingen. 10975 Torrey ana Road, San Diego, CA
92121. +1 877 232 8995. +1 858 812 8888. www.
pharmingen.com. Антитела: передача сигнала, ци-
токины, интерлейкин-2, рецепторы; реактивы для
проточной цитометрии.
Phoretix International. См. Nonlinear Dynamics.
Photometries. 3440 East Britannia Drive, Tucson, AZ
85706, USA. +1520 889 9933. www photomei.com .
CCD камеры и запасные части к ним.
Pierce Chemical Со. 3747 N. Meridan Rd., P.O. Box
117, Rockford, IL 61105, USA. +1815 968 0747;
800 874 3723. 800 842 5007; +1 815 968 8148. cs@
piercenet.com. www.piercenet.com. Биохимические
вещества; химические реактивы; детергенты; мат-
рикс-покрытые планшеты; пронектин; исследование
белков; флаконы для образцов.
Planer pic. Biomedical Division, Windmill Road, Sun-
bury, Middlesex TW16 7HD, England, UK +44(0)1932
755 000. +44(0)1932 755 001. www.planer.co.uk/.
Морозильники с жидким азотом; замораживание
клеток; программное обеспечение для контроля
замораживания и регистрации данных; контроль
учета; морозильники с контролируемой скоростью
замораживания.
Plas Labs Inc. 401 East North St., Lansing, MI 48906.
USA. +1 517 372 7177. +1 517 372 2857. PLI@Plas-
Labs.com. www.Plas-Labs.com. Бокс биобезопасности;
защитная камера с перчатками.
Plastim Ltd. Unit 100, Ashville Business Park, Commerce
Road, Slaverton, Glos, GL2 9QJ, England, UK. +44
(0)1452 857 733. +44 (0)1452 857 744. www.plastim.
co.uk. Изделия из ПТФЭ: палочки, пластины, про-
бирки.
Polaroid Corp. Polaroid Corp., North America Sales &
Marketing, 1265 Main St. W2-2C, Wallham, MA 02451,
USA. 800-343-5000.617 386 6271. www.polaroid.com/.
Моментальное фотокамеры; кабельное TV; цифро-
вые камеры; эмульсии; фотопленка и фотопластины;
камера для микроскопа; фотомикроскопия: камера
Polaroid Land.
Polaroid (U. К.), Ltd. UK Sales & Marketing, 800 The
Boulevard, Capability Green, Luton, LU 1 3BA, Bed-
fordshire, England, UK. +44 (0)1582 409 800. +44
(0)1582 409 801. www.polaroid.com. Cm. Polaroid Corp.
Polyfiltronics. Си. Whatman. Дисковые фильтры; филь-
тры; оборудование для фильтрации; держатели для
фильтров; manifolds; микрочипы, микротитрация;
пробирки; системы очистки воды.
Polymun Scientific. Nussdorfer Lande 11, 1190 Vienna,
Austria. +43 1 36006 6202. +43 1 369 7615. office©
polymun.com. www.polymun.com. Биореактор Mem-
broferni.
PolyScience. 660u West Touhy Avenue, P.O. Box 48312,
Niles, IL 60714, USA. 800 229 7569; +1 847 647 0611.
+ 1 847 647 1155. customerservice@polyscience.com.
www.polyscience.com/. Набор для аналитической
химии; холодильные установки: циркуляционный
насос; Clorox; дезинфектанты; глютаровый альдегид;
водяные бани.
Polytech Scientific. 5 Haddonbrook Business Cen-
tre, Fallodan Road, Orton Southgate, Peterbor-
ough, Cambridgeshire, PE2 6YX, England, UK. +44
(0)1733 371 724. +44 (0)1733 371 M5.sales@polytech-
scientific.com. www.polytechscientijic.com. Диспенсеры
для горловин бутылей; бутыли, пластик; камеры для
подсчета клеток; центрифужные пробирки: коничес-
кие и плоскодонные; криофлаконы; система учета за-
мороженных запасов; система криохранения; i азовые
624
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
горелки; пипетирующее устройство; шшетирующий
насос; Pi-насос; автоматические пинетки; пластико-
вые пастеровские иииетки; пластиковые клапаны,
чашки для образцов; лента для индикации стериль-
ности: автоклавы и сушильные шкафы; штативы для
пробирок; универсальный контейнер, 50 мл.
Popper & Sons, Inc. 300 Denton Ave., New Hyde Park,
NY 11040, USA. 888 717 7677; +1 516 248 0300.
888 557 6773; +1 516 747 1188. sales@popperandsons.
com. www.popperandsons.com. Шприц Корнуэлла;
шлы; шприцевой диспенсер повторного цикла; ин-
дикаторы стерильности; Thermalog; шприцы; много-
позиционные диспенсеры.
Porvair Sciences. Unit 6, Shepperton Business Park, Gov-
ell Avenue, Shepperton, Middlesex, TW17 8BA, Eng
land. UK. +44 (0)1932 240 255. +44 (0)1932 254 393.
www.porvair-sciences.com. Оборудование для гермети-
зации планшетов.
Precision Scientific/Napco. 170 Marcel Dr., Wmchesier
VA, 22602 USA. (800) 621-8820; + 1-540-869-9892.
+ 1 540 869 0130. www.precisionsci.com/lab/another
napco2.
Автоклавы; центрифу! и, С О,-инкубаторы, моечные ма-
шина для лабораторного стекла; ламинарные шкафы;
низкотемпературные моро шльники; микробиолп-
1 ические боксы биобезопасности; стерилизующие и
сушильные печи; вакуумные насосы.
Princeton Instruments. 3660 Quakerbridge Road, Tren-
ton, NJ 08619, USA. +1609-587-9797. + 1609-587-
1970. www.princetoninstruments.com . CCD камеры и
комплектующие.
Prior Scientific Instruments Ltd. 3-4 Fielding Indus-
trial Estate, Wilbraham Road, Fiilbourn, Cambridge,
CB15ET, England, UK. 44 (0)1223 881 711. 44
(0)1223 881710. uksales@prior.com. www.prior.com.
Микроскопы: флюоресцентные, исследовательские,
стерео; с механизированной платформой; автомати-
ческий счетчик.
Prior Scientific Inc. 80 Reservoir Park Drive, Rockland,
ME 02370, USA. +1 781 878 8442. +1 781 878 8736
info@prior.com. Микроскопы: флюоресцентные, ис-
следовательские, стерео, с механизированной плат-
формой; автоматический счетчик.
Priorclave Ltd. 129-131 Nathan Way, Woolwich, Lon-
don, SE28 0AB. England, UK. +44 (0)208 3166620. +44
(0)208 855 t)6\.6.sales@pri<rrclave.co.uk. www.priordaveco.uk. Автоклавы; стерилизаторы.
Promega Corp. 2800 Woods Hollow Rd., Madison,
WI 53711, USA. +1 608 274 4330, 800 356 9526.800
356 1970; +1 608 277 2601. custseru@promega.com.
www.promega.com. Набор для изучения апоптоза;
набор для изучения клеточной пролиферации;
исследовние цитотоксичности; перенос ДНК; эн-
дотелиальные клетки; трансфекция гена; факторы
роста; иммортализация; реактивы для молекуляр-
ной биологии.
Promega U.K. Della House, Chilworlh Recearcb Centre,
Southampton SO 16 7 NS, England, UK. +44 (0)23 8076
0225; 800 378 994. M4 (0)1703 767014; 800 181037.
ukcustserpe@promega.com. www.promega.com/uk . Cm.
Promega Corp.
PromoCell GmbH. Sickingensirasse 63 65, D-69126 Hei-
delberg, Germany. +49 (0)6221 64934-0; 800 776 66 23.
+49 (0)6221 64934-40; 800 10083 06. info@promocell.
com. www.promocell.com,. Адипоциты; хондроциты;
цитокины; фибробласты кожи; ELISA; эндотелиаль-
ные клетки; эпидермальные кератиноциты; среды; ме-
ланоциты; клетки назального эпителия; ос геобласты;
перфузионная камера; селективные среды; сыворотка;
бессывороточные среды; клетки скелетных мышц;
ладкомышечные клетки; специализированные кле-
точные культуры; трипсин.
Protein Polymer Technologies Inc. 10655 Sorrento
Valley Road, First Floor, San Diego, CA 92121, USA.
619 558 6064, 800 755 0407. 619 558 6477. info@ppli.
com. www.ppli.com. Malnx; Proneclin; бессывороточ-
ные среды; факторы клеточной адгезии; тканевые
факторы.
Protide Pharmaceuticals, Inc. 1311 Helmo Avenue,
St. Paul, MN 55128, USA. +1 612 730 1500. +1 612
730 8900. info@celox.com. www.protidepharma.com,.
СС P. среда Эрла для криохранения; бесе ывороточные
среды; компоненты сыворотки; витамины.
PuriteLtd. BandetWay.Thaine, Охоп ОХ9 3SJ, England,
UK. +44(0)1844 217 141.+44(0)1844 218098.той©
purite.com. www.purile.com Системы очистки воды.
Qiagen Inc. 27220 Turnberry Lane, Valencia, CA 91355,
USA. 800 426 8157; 800-DNA-PREP (800362 7737).
800 718 2056.www.qiagen.com/. Приготовление ДНК,
приготовление РНК.
Qiagen Ltd. Qiagen House. Fleming Way, Crawley, West
Sussex, RH10 9NQ England, L’K. +44 (0)1293 422 911.
+44 (0)1293 422 911. CustomerService-uk@qiagen.com.
www.qiagen.com/. Приготовление ДНК; приготовле-
ние РНК.
Qiagen, GmbH. QIAGEN GmbH., QIAGEN Strasse 1,
40724 Hilden, Germany. 800 79612; +49 (0)2103 29
12000. +49 (0)2103 29 22000. orders-de@qiagen.com.
www.qiagen.com/. Приготовление ДНК; приготовле-
ние РНК.
QMX Laboratories Ltd. Bolford Street, Thaxted, Essex,
CM6 2PY, England, UK. +44 (0)1371831611. +44
(0)1371831 622. sales@qmxiabs.com. www.qmxlabs.com.
Фильтры для шприцов KlarilyTM.
Quadrachem Laboratories Ltd. Kingfisher House,
Forest Row Business Park, Forest Row, East Sussex,
RH185DW, England UK. +44 (0)1342 820 820. +44
(0)1342 820 825. enquines@qclscientific.com. www.
qclscientific.com. Измеритель растворенного кисло-
рода; кондуктометры; pH-метры.
R & D Systems. 614 McKinley Place, NE, Minneapo-
lis, MN 55413, USA. 800 328 2400; +1 612 379 2956.
800 343 7475. info@mdsystems.com. www.mdsystems.
com. Антитела; цитокины; набор для оиредления
эйкозаноидов; ELISA; эпидермальный фак гор роста;
фибронектин; факторы роста; интерлеикин-2; мат-
рикс; матриксные металлопротеиназы; микротитра-
ция; программное обеспечение.
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
625
R& D Systems Europe. 4 10 The Quadrant, Barton Lane.,
Abingdon, Oxon 0X14 3YS, England, UK. 800 37 34 15;
+44 (0)1235 529 449. +44 (0)1235 533 420. info@RnD-
Systems.co.uk. www.rndsystems.com. Cm. R&D Systems
(USA).
Radleys. Shire Hi)), Saffron Walden, Essex CB11 3AZ,
England, UK.+44 (0)1799 513 320. +44(0)1799 513 283.
sales@radleys.co.uk. www.radleys.co.uk. Спирт-иераст-
норимые маркеры; бутыли; коробки для культуры;
культуральные камеры; воздуходувное стекло; су-
шильная печь; анемометры; лабораторные тележки;
нитрильные перчатки одноразового использования;
груша для пипеток; цилиндр для пинеток; лоток для
пииеток; автоматические пинетки; Pi-насос; штативы;
димпенсеры; шейкер-инкубатор; сифонная моечная
машина для пипеток: ступенчатые автоматические
пипетки.
Radnoti Glass Technology Inc. 227 West Maple
Avenue, Monrovia, CA91016, USA. 800 428 1416;
+1 626 357 8827. +1 626 303 2998. Desmond©radnoti.
com. www.radnoti.com. Кюветы для opi анной и ткане-
вой культур.
Rainin Instrument Со., Inc. Mack Road, PO Box 4026.
Woburn, MA 01888-4026, USA. +1617 935 3050,
800 472 4646.+ 1617 938 1152. pipeLs@rainin.com. www
raimin.com/. Автоматические пинетки.
Ranfac Corp. 30 Doherty Avenue, P.O. Box 635, Avon,
MA 02322, USA 800 272 6322; +1 508 588 4400.
+1508584 8588. info@ranfac.com. www.ranfac.com
И1лы для биопсии.
Raven Biological Laboratories. 8607 Park Dr., Omaha,
HE 68106, USA. 800 728 5702; +1 402 593 0781.+1 40
2 593 0921; т 1402 593 0995. info@ravenlabs.com. www.
ravenlabs.com/. Микробиоло! ические среды; коробки
для стекол; индикаторы стерильности.
Raymond A- Lamb LLC. 7304 Vanclaybon Drive, Apex,
NC 27502, USA. +1 919 387 1237. +1 919 387 1736.
sales, na@ralamb.com. www.ralamb. net information,
html. Покровные стекла, предметные стекла; кассета
для стекол.
Raymond A. Lamb Ltd. Units 4 & 5 Parkview Indus-
trial Estate. Lollbridge Grove, Eastbourne, East Sussex
BN23 6QE, England, UK. +44 (0)1323 737000. +44
(0)1323 733000.;sales@ralamb.com. www.ralamb.co.uk/.
Покровные стекла; стекла для микроскопа; коробки
для стекол.
Recearch Diagnostics Inc. Research Diagnostics
Inc., Pleasant Hill Road, Flanders, NJ 07836, USA
+1 973 584 7093; 800 631 9384. -rl97.3 584 0210;. Re-
searchD@aol.com. www.researchd.com,. Ahi попол ни-1;
антитела; тетраметилбензидин; TGF-pi; ультра- тет-
рам етилбенз! щ пн.
Recearch Organics Inc. 4353 Е. 49th St.. Cleveland,
OH 44125-1083, USA. 800 321 0570; +1 216 883 8025.
info@resorg.com. www.tesorg.com. Биохимические ве-
щества; HEPES.
Retsch GmbH. & Co., KG. Rheinische Strasse 36,
42781 Haan, Germany. +49 21 29 55 61-0. +49 21 29
87 02. info@retsch.de. www.retsth.de. Сита.
Revco Scientific, Inc. 308 Ridgefield Ct, Asheville,
NC 28806, USA. 800-252-7100; (Canada) 800-447-
3826;+l 828-658-2711. +1 828 645 3368. sales@revco-
sci.com. www.revco-sci.com. Морозильники ультра-
i л v6oKoro замораживания.
Richardsons of Leicester. 112A Milligan Road, Leices-
ter, LE2 8FB. England, UK. +1 (0)116 283 8604. +1
(0)116 283 7109. .sales@richardsonsofleicester.co.uk.
www.richardsonsofleicester.co.uk Стекла для мик-
роскопа (Berliner Gias KG); пастеровские пипетки;
контейнеры для образцов.
Riken. 3-1-1 Koyadai, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-0074,
Japan, www.brc.riken.go.jp еП/. Клеточный банк; кле-
точные линии; клоны ДНК; праймеры
Robbins Scientific (Europe) Ltd. The Exchange,
24 Haslucks Green Road, Shirley, Solihull, West Mid-
lands, B90 2EL, England, UK. +44 (0)121744 7445.
+44 0121 744 0775.sales@robsci.co.uk.www.rohsci.co.uk.
Автоматические диспенсеры; плотные среды; noaoi -
ревающие блоки; средыдля приготовления фракции
лимфоцитов; системы микротитрации; роботизи-
рованные системы разлива жидкостей; роллерные
СТОИКИ ДЛЯ инкубат оров.
Robbins Scientific (Europe) Ltd. См. also Genetic Re
search Instrumentation.
Robbins Scientific, USA. Cm. SciGene. www.robsci.com.
Roboz Surgical Instrument Co. Inc. PG Box 10710,
Gaithersburg, MD 20898-0710, USA. 800-424-2984. +1
888 424 3121. info@tToboz.com. www.roboz.com. Канюли;
инструменты; стерилизаторы; шприцы; индикаторы
стерильности.
Roche Applied Science (Germany). Sandhofer Str 116,
D-68305 Mannheim 31, Germany. 800-759-4152 Or-
ders: +49 (0)621/759-4136. www.roche-appliedscience.
сот/. Автоматические пинетки; антитела; наборы для
исследования апоптоза; биохимические вещества; ВМ
цилин; бомбезин хроматогранин; коллаген; коллагена-
за; DAPI; диспаза; перенос ДНК; DGTAP; DOSPER;
ELISA; ЭДТА; Fugene; фак юры роста; GM-CSF; ге-
парин; интерлеикин-3 (IL-3); линофекция; микропи-
иетки; среда; эрадикаиия микоплазм; бессыворпточная
среда; фактор стволовых клегок (SCF); витамины.
Roche Applied Science (UK). Bell Lane, Lewes, West
Sussex BN7 1LG, England, UK.+44 (0)1273 480 444;
808 100 9998.808 100 80 60. www.roche-applied-science.
com,. Cm. Roche Applied Science (Germany).
Roche Applied Science (USA). P.O. Box 50414, 9115
Hague Rd, P.O. Box 50414, Indianapolis IN 46250-0414,
USA. 800-428-5433.800-428-2883. www.rocheapplied-
science.com/. Cm. Roche Applied Science (Germany).
RS Biotech. Laboratory Equipment Division, 4 Mackin-
tosh Place, South Newmoor, Irvine, Ayrshire, KAI 1 4JT,
Scotland, UK. *-44 (0)1294 222770. +44 (0)1294
222248. galaxy@rsbiotech.com. www.rsbiotech.com. CG2-
инкубаторы; Galaxy.
RS Components, Ltd. Birchington Road, Corby, Norlhanls,
NN17 9RS, England, UK. +44 (0)1536 444 222. www.rs-
components.com/index.htm. Электронные вентиляторы;
контроллеры подогрева; нагреватели; термисторы.
626
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
Safelab Systems, Ltd. 2 Vines Industrial Centre, Nailsea,
Bristol, BS48 1BG, England, UK.44(0)1275 855 2Э2.+44
(0)1275 855 131. sales@safelab.co.uk. wu-w.safelab.co.uk.
Ламинарные шкафы; боксы микробиоло! ической
защиты.
Safetec of America Inc. 887 Kensington Ave., Buffalo, NY
14215, USA. +1716-895-1822; 800-456-7077. +1 716-
895-2969. www.safetecjcom/. Стерильная комната; лами-
нарные шкафы; боксы микробиоло! ической защиты.
Saf-T-Pak. 10807-182 Street, Edmonton, Alberta,
T5S1J5, Canada. (780) 486-0211; 1-800-814-7484. (780)
486-0235; 1-888-814-7484. www.saftpak.com/. Транс-
портировочные контейнеры; сис гемы безопасности.
Sakura Finetek Europe. См. Bayer pic and Raymond
A. Lamb, wwwjMkuraeu.com . Цитоцентрифу!а; тка-
невой каисулирующий состав.
Sakura Finetek U.S. A., Inc. 1750 West 214th Street,
Torrance, CA 90501, USA. 800-725-8723; +1 310-972-
7800. +1 310-972-7888. mail@cotjnsakuraus.com. wwui
sakuraus.com. Цитоцентрифу|а; тканевой каисулиру-
ющий состав.
Santa Cruz Biotechnology Inc. 2145 Delaware Ave.,
Santa Cruz, CA 95060-5706, USA. 800 457 3801,
831 457 3800. +1 831457 3801. scbt@netcom.com. www
scht.com. Антитела: актин, инте|рины, кад герины,
молекулы клеточной адгезии, цитокерагин, десмин,
фибронектин, GFAP, внментин; реактивы для про-
точной цитометрии.
Sanyo Gallenkamp pic. Monarch Way, Belton Park,
Loughborough, Leics LE11 5XG, England, UK. +44
(0)1509 265 265. +44 (0)1509 269 770. sanyo@san-
yobiomedical.co.uk. uwu.sanyogallenkamp.com . CO2-
инкубат op ы; морозильники.
Sanyo Scientific. 1062 Thorndale Avenue, Bensenville,
IL 60106, USA. 630-875-3530; 800-858-8442.630-238-
0074. info@sss.sanyo.com. www.sanyobiomedical.com .
И нкубаторы; морозильники.
Sarstedt AG & Co. Rommelsdorfer Strasse, Poslfach
1220, 51582 Numbrecht, Germany. +49 2293 305 0
+492293 305 1222. info@sarstedt.com. www.sarstedt.
сот/ CO .-проницаемые крышки; флаконы.
Sarstedt Inc. 1025, St. James Church Road, P.O. Box
468, Newton NC 28658-0468, USA. +1 828 465 400003
+ 1 828 465 0718. info@saistedt.com. www.sarstedl.com/.
Флаконы для культуры тканей, СО2-ироницаемые
крышки.
Sartec Group. Century Farm, Reading Street, Tenterden,
Kent, TN307HS, England. UK. +44 (0)1233 758 157.
+44 (0)1233 758 158. sale.s@sartec.co.uk. www.sartec.
co.uk. Газогенераторы; анализ уровня общею орга-
ническою углерода (ТОС): ТОС анализаторы; ТОС
стандарты; определение чистоты воды.
Sartorius AG. Weender Landstrasse94-108, D -37075 Got-
tingen, Germany. +49.551.308.00. +49.551.308. 3289.
www.sartorius.com/. Весы; биореакторы: среда для
хромато! рафии; дисковые фильтры; ферментеры;
фильтры; держатели фильтров; фильтрационное
оборудование; инвертированный микроскоп; пакеты
для сред; микроскопы; Miniperm.
Sartorius Corp. 131 Heartland Blvd., Edgewood, NY
11717, USA. 516 254 4249,800 368 7178.516 254 4253.
www.sartonus.com/. Весы; биореакторы; среда для
хроматографии; дисковые фильтры; ферментеры;
фильтры; держатели фильтров; фильтрационное
оборудование; инвертированный микроскоп; пакеты
для сред; микроскопы; Miniperm.
Sartorius Ltd. Blenheim Road, Longmead Indus-
trial Estate, Epsom, Surrey KT19 9QN, England, ГК.
+44.1372.737100. +44.1372.720799. sartorius.uk@sarto-
rius.com. www.sarlorius.co.uk. Весы; биореакторы; среда
для хроматографии; дисковые фильтры; ферментеры;
фильтры; держатели фильтров; фильтрационное
оборудование; инвертированный микроскоп; пакеты
для сред; микроскопы; Mini perm.
Scanalytics, Inc. 8550 Lee Highway, Suite 400, Fairfax,
VA 22031-1515, USA. t-1 703-208-2230. i-l 703-208-
1960. sale.s@scanalytics.com. www.scanalytics.com. Про-
граммное обеспечение для получения и обработки
изображений; CCD камеры; анализ изображений.
Scharfe Systems. Krammerstrasse 22, D-72764 Reutlin-
gen, Germany. +49 (0)7121 387 86-0.+49 (0)7121
387 86-99. mail@CASY-TeLhnology.com. www.CASY-
Technology.com. Счетчик клеток; анализаторы кле-
точною размера; жидкость для счетчиков; детер! ент;
чашечки дляобразцов.
Schleicher & Schuell Bioscience. 10 Optical Avenue,
Keene, NH 03431, USA. 800-245-4024. +1603-357-
7700. custserv@schleicher-schuell.com. www.schleicher-
schuell.com. Мембраны для блоттинга; стерилизация
фильтрацией; микроанализ.
Schleicher & Schuell BioScience GmbH. Hahnes-
trasse 3, D-37586 Dassel, Germany. -r49 5561 791 463.
+49 5561 791 583.salesbio@schleicher-schuell.de. www.
schleicherschuell.com. Мембраны для блоттинга; сте-
рилизация фильтрацией; микроанализ
Schleicher & Schuell, UK Ltd. Unit 11, Brunswick Park,
Industrial Estate, London Nil 1JL, England, UK. +44
(0) 208 361 3111. +44 (0) 208 361 6352. Salesuk@
schleicher-schuell.de. www.schleicher-schuell.com. Мем-
браны для блоттинга; стерилизация фильтрацией;
микроанализ.
Schott AG. Haiteiibergslr. 10,55122 Mainz, Germany.+49
(0)6131 66-0.+49 (0)6131 66-2000. info@schou.com.
tt'macscAort.com. Лабораторное стекло; боросиликатное
стекло; бутыли; бутыли из жаропрочного стекла.
Schott North America, Inc. 555 Taxter Road, Elmsford, NY
10523. USA. +1914831 2200. +1914 8312201. info@
us.schotl.com. www schotl.com. Лабораторное стекло, бо-
росиликатное стекло, жаропрочное стекло, бутыли.
Schott Corp. Drummond Road, Stafford, ST16 3EL, Eng-
land, UK.+44 (0)1785 223 166. +44 (0)1785 223 522.
info.uk@scholt.com. www.schotl.com. Лабораторное
стекло, боросиликатное стекло, жаропрочное стекло,
бутыли.
Scientek. 101-11151 Bridgeport Rd., Richmond, ВС V6X
1T3, Canada. 1-866-321-3828;+! 604-273-9094.+ 1 604-
273-1262. sales@scientek.net. www.scientek.net/. Моеч-
ная машина для лабораторного стекла.
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
627
Scientific & Chemical Supplies. Carlton House, Living-
stone Road, Bilston, West Midlands, England, UK. +44
(0)190-2402402. +44 (0)190 240 2343. scs@scichem.
co.uk. www.sci-chem.co.uk. Химические реактивы.
Scientific Instrument Centre. Unit 34D Parham Drive,
Boyatl Wood, Eastleigh, Hants, SOSO 4NU, England,
UK. +44 (0)23 «061 6821. +44 (0)23 8062 9700. enqut-
rie.s@sic.uk.com. www.stc.uk.com. Инкуба горы; детер-
i енты; моечная машина для лабораторного стекла;
генераторы азота; печи; ультразвуковая баня.
Scientific Laboratory Supplies Ltd. Wilford Indus-
trial Estate, Rudditigton Lane, Wilford, Nottingham,
NG11 7EP, England, UK. *44 (0)115 982 1111 *44
(0)115 982 5275. sales@seientific-labs.com. www.scien-
tific -labs.com. Кольца для клонирования; криофлако-
ны; чашки; флаконы: многолуночные планшеты.
SciGene. 530 Mercury Drive, Sunnyvale, С A 94085,
USA+1 408-733-7337.+1 408-733-7336. sales@scigene.
com. wwu’.scigene.com, Инкубаторы; водяная баня
Scion Corp. Suite H,82 Womans Mill Ct, Frederick, MD
21701, USA +1 301 695 7870. +1 (301) 695-0035. info@
sciomorp.com. www.scioncorp.com. Устройство захвата
изображения (в режиме замедленного времени)
Sefar Inc. Фильтрация Division, Moosstrasse 2, CH-
8803 REtischlikon, Switzerland. +41 1 724 65 11
+41 1 724 15 25. www.scientific-labs.com . Марлевые
фильтры; сетчатые фильтры, полиэстер, полиамин,
полипропилен.
Sefar Фильтрация USA. 333 S. Highland Ave., Bri-
arcliff Manor, NY 10510, USA. +1816 452 1520.
+ 1 816 452 2183. www.sefar.com. Марлевые фильтры;
сетчатые фильтры: нитекс. полиэстер, иол нами н.
полипропилен.
Seikagaku America Inc. 124 Bernard St Jean Drive,
East Falmouth, MA 02536-4445, USA 888395 2221;
508 540 3444. +1 508-540-8680. info@acciusa.com. u>ww.
seikagaku.com; www.acciusa.com. Коллаген I типа.
Sentinel Laboratories Ltd. Units 12 13 Lindfield En-
terprise Park, Lewes Road. Lindfield, West Sussex,
RH16 2LH, England, UK. +44 (0)1444 484044.+44
(0)1444 484045. bnan@sentinel-laboratories.com. www
sentinel-iaboratories.com . Нитрильные перчатки,
защи гные маска.
Serologicals Corp. 5655 Spalding Drive, Norcross, GA
30092, USA. *1678728-2000. info@serologicals.com.
www.setologicals.com. Антитела; апротинин; БСА, хи-
мотрипсин; цитокины; ДН Каза; ELISA; акторы роста;
сыворотка человека; добавки к среде: продукция для
молекулярной биологии; ПЦР; зонды; ингибиторы
протеазы, сыворотка; трипсин.
Serotec Inc. Serotec Inc., 3200 Atlantic Avenue, Suite 105,
Raleigh.NC 27604, USA800-265 7376;+1 919 878 7978.
+ 1 919 878 3751. seroiec@serotec-inc.com. www.serolec.
com. Антитела: CAMS, integrins, цитокины, EGFr,
фибронектин, факторы роста и цитокины. IL-2. IL-6.
KGF, OSM, VEGF; ELISA
Serotec Ltd. 22 Bankside, Station Approach, Kidlington,
Oxford OX5 1JE, England, UK. +44 (0)1865852700.
+44 (0)1865 373 899. seroiec@setoiec.co.uk. www.serotec.
com. Антитела: CAMs. интегрины, цитокины, EGFr,
фибронектин, факторы роста and цитокины, IL-2,
IL-6, KGF, OSM. VEGF; ELISA.
SERVAЭлектрофорез GmbH. Carl-Benz-Str.7, P. О. B.
10 52 60,69115 Heidelberg, Germany. 800 73 78 24 62;
+49 (0)6221 13840-0.+49 (0)6221 13840-10. info©
serva.de. www.serva.de. Альбумины; антибиотики;
коллагеназа; декстраны; диализные системы трубок;
реактивы для лектрофореза; HEPES, латексные час-
тицы, Pluronic-F68; ПЭГ; силикон.
SGM Biotech, Inc. 10 Evergreen Drive Suite E, Bozeman,
MT 59715, USA. +1 406 585-9535.+1 (406) 585-9219.
order@sgmbiotech.com. www.sgmbiotech.com. Полоски
для индикации спор; индикаторы стерильности.
Shamrock Scientific Speciality Systems, Inc. 34 Da-
vis Dr., Bellwood, IL 60104, USA. +1 708 547 9005,
800 323 0249. (800) 248-1907; +1 708 547 902 l.s«fe.s@
shamrocklabels.com. www.shamrocklabels.com. Лента-
индикатор стерильности; лента, чувствительная к
давлению; ярлыки; лента для нанесения ярлыков;
этикетки; полоски-индикаторы температуры.
Sbandon-Scientific. См. Thermo Electron Corp.,
Thermo-Shandon. wwwijhermo.com. Цитоцентрифуга:
СО» автоматическое переключение блоков в балло-
нах, электрофорез; гемпццтометры, микрокацилляры;
моечная машина для пинеток; сушильное устройство
для пипеток.
Sigma-Aldrich. PO Box 14508, St Louts, МО63178,
USA. 800 325 ЗОЮ; +1314 771 5765. +1 314 7715757.
OCDOMHC@sial.com. www.sigmaaldrich.com. Амино-
кислоты; антитела; биохимические вещества; БСА;
химические реактивы: кольцемид; коллаген: коллаге-
наза; дексаметазон; декстран; диацетилфлюоресциин;
дезинфектанты; DMSO; ДНКаза; бромистый этидии;
ЭДТА; формамид; i лютамин; iлниатион; факторы рос-
та; среды; заместитель сыворотки MegaCell; соли; бес-
сывороточные среды; трипсин; Trypzean; витамины.
Sigma-Aldrich Chemie GmbH. Eschenstrasse 5, 82024
Taufkirchen, Germany. 800 51 55 00. 800 64 90 000.
www.sigma-aldrich.com. Продукция см. Sigma-Aldrich
(USA).
Sigma-Aldricb Co. Ltd. Fancy Road, Poole. Dor-
set BH17 7NH, England, UK. e 44 1202 733114;
800 717 181. +44 1202 715460; 800 378 785. ukcustsv©
europe.sial.com. www.sigmaaldrich.com. Продукция см.
Sigma-Aldrich (USA).
Signal Instrument Co Ltd. Стандарт ы House, 12 Doman
Road, Camberley, Surrey, GU15 3DF, England UK. +44
(0)1276 682 841. -r44 (0)1276 691302. Инструменты©
signalgrottp.com. wtciw.signal-group.com. Смеси газов;
i азосмесители
Signal USA. 355 North York Rd., Willow Grove, PA
19090, USA. 866-SIGNAL-U; +1 215 830 8882. +1 215
830 8922. sales@k2bw.com. wiwwi.signal-group.com/.
Смеси газов; газосмесители.
Силиконовый Specialty Fabricators. 3077 Rollie Gates
Drive, Paso Robles, CA93446, USA. 800 394 4284;
805 239 4284.805 239 0523. www.ssfab.com/. Силико-
новая смазка.
628
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
Skan. Cw. H.V. Skan.
SkinElhic. 45 Rue St Philippe, 06000 Nice, France.+33 4
93 97 77 27. +33 4 93 97 77 28. infos@skinethic.com.
www.skinethic.com. Альвеолярный эпителий; пузыр-
ный эпителий; культуры роговицы; исследования
цитотоксичности; исследования раздражения; сре-
да; ротовой эпителий: орюнотшшческая культура;
реконструированный эпидермис человека; специа-
лизированные клеточные культуры; тканевые экви-
валенты; вапшальмый эпителий.
Smiths Medical International Ltd. Military Road, Hythe,
Kent, CT215BN. England, UK. +44 1303 260551.+44 1
303 26676 l.j.townsend@portex.com. www.smithsmedical.
com,. Полупроницаемая нейлоновая пленка.
Society for In Vitro Biology (SIVB). SIVB Busi-
ness Office, 13000-F York Road, #304 Charlotte,
NC 28278, USA. (800) 761-7476; +1 704 588 1923.
+ 1 704 588 5193. sivb@sivb.org. www.sivb.org. Биоло-
гическое научное общество с особым интересом к
клеточной культуре и родственным методам.
Socorex ISBASA. Ch. Champ-Colomb7, P.O. Box 1U24,
Ecublens, Lausanne, Switzerland. +41 21 651 6000.
+41 21 651 6001. socorex@.socorex.ch. www.socorex.ch.
Цифровые автоматические пипетки; многоканальные
автоматические пипетки; шаг овая автоматическая
миметка.
SoloHill Engineering Inc. 4220А Varsity Drive, Ann
Arbor, MI 48108, USA. 866 807 3953; +1 734 973 2956.
+ 1 734 973 3029. solohill@ic.net. www.solohill.com.
Микроносители.
Sorvall. Cm. Kendro. http://www.sorvall.com .
Southern Biotechnology Associates, Inc. P.O. Box
26221, Birmingham, AL 35260, USA. -r 1 205-945-1774;
800-722-2255. 205-945-8768. info@SouthernBiotech.
com. www.southembiotech.com. Антитела, против мыши
IgGB-фикоэритрин.
SP Industries Co. SP Industries Co., 935 Mearns Road,
Warminster, PA, USA. +1 215-672-7800. H 215 672
7807. holpuck@hotpack.com. www.hotpack.com. Авто-
клавы; COj-инкубаторы; морозильники; ламинарный
шкаф; бокс биобезопасности.
Spectrum Europe B.V. P.O. Box 3262,4800 Breda, The
Netherlands. +31 76 5719 419. +31 76 5719 772. info©
spectrumeurope.nl. wwwjtpectrumeurope.nl. Cellmax;
системы трубок для диализа; моловолоконная пер-
фузионная культура; микрокапиллярная перфузия;
концентрические полые волокна.
Spectrum Medical Inc. 18617 Broadwick Street, Ran-
cho Dominguez, CA 90220, USA. ^1310 885 4600;
800 634 3300. И 310 855 4666; 800 445 7330. custom-
ersertice@speclrumlabs.com. www.spectrumlabs.com.
Cellmax; системы трубок для диализа; поло воло-
конная перфузионная культура; микрокапиллярная
перфузия; концентрические полые волокна.
SPI Supplies. С.м. Structure Probe, Inc.
SPSS Inc. 233 S. Wacker Drive, 11th Floor, Chicago, IL
60606. 312.651.3000. www.spss.com • SPSS (version
10.0) программное обеспечение статистическою
анализа.
Staniar, J. & Co. 34 Stanley Road, Whitefield, Manches-
ter, M45 8QX, England, L’K. +44 (0)161767 1500. +44
(0)161 767 I502.sales@johnstaniar.co.uk. wwwjohnsta-
niat .co.uk/. Марлевые и нейлоновые сита, mesh; сито
из нержавеющей стали.
Statebourne Cryogenics. 18 Parsons Road, Parsons In
dustrial Estate, Washington, Tyne & Wear, NE37 1EZ,
England, UK. +44 (0)191 416 4104. +44 (0) 191415 0369.
sales@staleboumexom. www.stateboume.com. Морозиль-
ник с контролируемым режимом замораживания;
морозильники с жидким азотом; сосуды Дюара.
Statlab Medical Products. 106 Hillside Driv, Lewis-
ville, TX 75057, USA. +1 972 436 1010; 1-800 442-
3573.+ 1 972 436-1369. info@statlab.com. www.statlab.
сот/. Гистоло! ическая среда для заключения срезов;
контейнер для радиоавтографической эмульсии.
StemCellTechnologies France. 29 Cheniin du Vieux Chene,
Z. I. R. S. T, F-38240, Meylan, France. +33 (0)4 76 04 75 30.
+33 (0)4 76 18 99 63. info@stemcellfiance.com. www.slem-
cell.com. Cm. SleinCell Technologies Inc.
StemCell Technologies Inc. 808-777 West Broadway,
Vancouver, BC, Canada, V5Z 4J7. -*-l 604 877 0713;
800 667 0322. +1 604 877 0704; 800 567 2899. infoweb@
stemcell.com. www.stemcell.com. Антитела; сепарация
клеток; слайды для камер; атлас колонии; цитокины;
чашки; культура клеток-предшественников гемопо-
этическою ряда; интерлейкин-2; среды с метил цел-
люлозой; ирщраммное обеспечение; вращательные
флаконы; очистка стволовых клеток; видео.
Steris Corp. 5960 Heisley Rd., Mentor, OH 44060-1834,
USA. +1 440-345-2600; 800-J IT-4-USE. +1 440-350-
7081. www.steris.com. Автоклавы: деконтаминация:
дезинфектанты; сублимационная сушка; моечная
машина для лабораторного стекла; микроманииуля-
торы; микроннъекторы; дистиллятор; парогонера го-
ры; Wescodyne.
Steris Corp. STERIS House, Jays Close, Viables, Bas-
ingstoke, Hampshire RG22 4AX, England, UK. +44
(0)1256 840 400. +44(0)1276 685662/3. www.sleris.com.
Автоклавы; деконтаминация; дезинфектанты; субли-
мационная сушка; моечная машина для .щборатор-
ного стекла; микроманипуляторы; микроннъекторы;
дистилляторы; парогенераторы; Wescodyne.
Stille АВ. Gordsvogen 14, Box 709, SE-169 27 Soina,
Sweden. 0046 8 588 58 000. 0046 8 588 58 005; info©
stille.se. www.stille.se. И>лы для биопсии.
Stille-Sonesta, Inc. 2220 Canton Suite 209, P.O. Box
140957, Dallas, TX 75201, USA. (800) 665 1614;(214)
741 2464. (214) 741 2605;. siille@ah7nail.net. wwwstille.
se И< лы для биопсии.
Stoelting Co. 620 Wheal Lane. Wood Dale, IL 60191,
L’SA. +1 630 860 9700. +1 630 860 9775. physiology©
stoellingco.com.www.stoeltingco.com/physio.3iunHiHbie
маски; перчатки, латекс, нитрил; стерилизатор для
инструментов; манипуляторы; Парафильм; контейне-
ры джля режущих отходов; колоски-индикаторы сте-
рильности; хирур! ические инструменты; салфетки
Stratagene. 11011N. Torrey Pines Rd., La Jolla, CA92037-
1073, USA. +1 512 3213321; 800 894 1304. Fax orders:
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
629
+ 1 512 321 3128; Tech Services: 858 535 0034. tech ser-
vices@stralagene.cam.wwwsiiatagene.com. Библиотеки
клопов генов: микроанализ; ПЦР; векторы.
Stratech Scientific Ltd. Unit 4, Northfield Business Park,
Northfield Road, Soham, Cambridgeshire, CB7 5UE,
England, UK. +44 (0)1353 722 500. +44 (0)1353 727755.
info@stratech.co.uk. www.sttalech.co.uk. Антитела: мар-
керы ан1 иогенеза, коллаген, фибронектин, GFAP,
ламинин, муцин, маркеры апоптоза, клеточный цикл,
коллаген I; концентраторы; культура на покровных
стеклах; цитокины; чашки; внеклеточный матрикс;
наборы для экстракции; вкладыши в фильтрацион-
ные лунки; флаконы; факторы роста; инвазионные
камеры; матрикс для обработки; mhoi ол у ночные
стекла; онкогены; чашки Петри; иояилизин; бессы-
вороточные среды, наборы для скриниша.
Structure Probe, Inc. 569 East Gay Street, West Chester,
PA 19380, USA. l-(800)-2424-SPI; l-(610)-436-5400.1-
(610)-436-5755. spi3spi@2spi.com. www.2spi.com/. SPI-
Cbein; реактивы д,1я электронной микроскопии; Epon
заместитель; реактивы для световой микроскопии.
Stuart Scientific. Holmethorpe Industrial Estate, Redhill,
Surrey, RH1 2NB, England, UK. +44 (0)1737 766431.
+44 (0)1737 765 952. www.hibhtf-sterilin.com Ручной
счетчик колоний.
Summers Optical. Division of EMS Acquisition Corp.,
1560 Industry Road. P.O. Box 380, Hatfield, PA 19440,
USA.+1 215 412 8380. +1215 41 8450;+1 215 412 8451.
sgkcck@aol.com. www.emsdiasum.com/Summers optical/
cements/cements/uv.html. УФ-загвердевающий клей
для стекла (цемент).
Surgicon, Ltd. Wakefield Rd., Brighouse, W. Yorkshire
HD61QL, England. i-44 (0)1484 712 147. -r44 (0)1484
400 106. Перчатки; индикаторы стерильности (авто-
Swann-Morton Ltd. Owlerton Green, Sheffield, S6 2BJ,
England, L’K. +44 (0)114 234 4231. +44 (0)114 231 496.
info@swann-morton.Lom. www.swann-morlon.com. Хи-
pypiические инструменты; инструменты для иссе-
чения; скальпели, лезвия.
Synbiosis. 97Н Monocacy Blvd., Frederick, MD, 21701
USA. 603 465 3385.603 465 2291. www.synbiosis.com .
Счетчики колоний.
Synbiosis. Beacon House, Nuffield Road, Cambridge, CB4
1TF, England, UK. +44 (0)1223 727 125. +44 (0)1223
727 101. sales@synbiosis.com. www.synhiosis.com; www.
acolytecounter.com. Счетчик колоний Acollye; счетчи-
ки колоний: распределение колоний ио размерам.
Syngene. Beacon House, Nuffield Road, Cambridge,
CB4 1TF, England, L’K. +44 (0)1223 727 123.+44
(0)1223 727 101. eurosales@syngene.com; intlsales© syn-
gene.com. www.syngene.com. Подсчет колоний; анализ
геля; анализ изображений.
Syngene USA. 5108 Pegasus Court, Suite M, Frederick,
MD 21704, USA. +1800-686-4407. +1 301-631-3977.
ussales@syngene.com. www.syngene.com. Подсчет ко-
лоний; анализ гелей; анализ изображений.
Synthecon, Inc. 8054 El Rio, Houston. TX 77054, USA.
+1 713 741 2582. +1 713 741 2588.rccs@synthecon.com.
www.synthecon.com. Биореактор NASA; вращательная
культуральная камера.
TA AB Laboratories, Equipment, Ltd. 3 Minerva House,
Calleva Park, Aldermaston, Berks, RG7 8NA, England,
UK. +1 (0)118 9817775. +1 (0)118 9817881. sales©
taah.co.uk. www.taab.co.uk. Ацетонитрил; буферные
растворы; инструменты для иссечения; электронная
микроскопия; фиксирующие растворы: глютаровый
альдет ид; иммуноцитохимия; какодилат натрия.
Taylor-Wharton Cryogenics. РО Box 568, Theodore, AL
36590-0568, USA. +1-251-443-8680:800 898 2657. + 1-
251-443-2209. lwsales@hatsc o.com. www.taylorwharton.
сот/. СО»; системы охлаждения с роулируемым ре-
жимом; морозильники; сосуды Дюара; жидкий азот;
морозильники с жидким азотом
Taylor-Wharton GmbH. Poslfach 14 70, D-25804 Hus-
lum, Germany. 49 48 41 985 0. 49 48 41 985 30. www.
taylor-wharlon.com. CO,; системы охлаждения с регу-
лируемым режимом; морозильники; сосуды Дюара;
газы; морозильники с жидким азотом.
Taylor-Wharton UK. См. Taylor-Wharton GmbH
TCS Biologicals Ltd. Botolph Claydon, Buckingham
MK18 2LR, England, UK. +44 (0)1296 714 222. +44
(0)1296 714 806. sales@tcsgmup.co.uk. www.tcshiosci-
ences.co.uk/ Стекла для бактериальной культуры;
продукты из крови; сыворотка цыпленка, плазма;
кристаллвиолет; Гимза краситель; гематоксилин; кра-
ситель Лейшмана; микробиоло! ические красители;
Нейтральный красный; нигрозин; плазма; сыворотка;
флаконы для хранения.
TCS CellWorks Ltd. Park Leys, Botolph Claydon,
Buckinghamshire MK18 2LR, England, UK. >-44
(0)1296 713 120. ->-44 (0)1296713 122. office@tcscell-
works.co.uk. www.tcscellworkscatalogye.co.uk/. AccutdSe;
Accumax; набор для изучения ан> иогенеза; брон-
хиальные клетки; кадгерины: CAMs; хондроциты;
кондиционированная среда; эпителий роювицы:
эндотелиальные клетки; фибробласты; гепатоциты;
интегрины; кератиноциты, лейкоциты; удаление ми-
коплазм; клетки назального эпителия; остеобласты:
бессывороточные среда; гладкомышечные клетки;
синовиальные клетки
Tebu-bto APS. Forskersparken CAT, DTU Bygn-
ing 347, 2800 Lyngby, Denmark. +45 45 25 64 01.
+45 45 25 64 03. scandinavia@tebu-bio.com. www.lebu-
bio.com. Изучение матрикса; покрытие матриксом.
Tebu-bio Ltd. Unit 7, Flag Business Exchange, Vicarage
Farm Road, Peterborough. Cambs PEI 5TX, England,
UK. ->-44 (0)1733421 880. -r44 (0)1733 421 882. uk@
lehu-bio.com. www.lehu-hio.com. Изучение матрикса;
покрытие матриксом.
Tecan Sales Switzerland AG. Cm. strasse 103, CH-
8708 MEannedorf, Switzerland. +41 1(0) 922 89 22.
+41 1 (0)922 89 23. tecan.sales.ch@tecan.com. www.
tecan.com. Сканнеры для микрочииов; микротит-
рация: ридер для планшетов, диспенсеры, моющие
устройства
Tecan UK Ltd. Theale Court, 11-13 High Street,
Theale, UK-Reading RG7 5 AH, England, UK. +44
630
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
(0)1189 300 300. i-44 (0)1189 305 671. helpdesk-uk@
tecan.com. ww’wiecan-uk.co. uk. Ридеры для микро-
титрационнных планшетов, диспенсеры, моечные
устройства для планшетов.
Tecan US Inc. P.O. Box 13953, Исследовательски-
eTriangle Park, NC 27709, USA. +1 919 361 5200.
+ 1 919 361 5201. helpdesk-us@tecan.com. wwu’lecun.
com. Микротитрация: планшеты, ридеры, диспенсеры,
моечные устройства для планшетов.
Techmate Ltd. 10 Bridgeturn Avenue, Old Wolverton,
Milton Keynes, Bucks.. MK125QL, England, UK. +44
(0)1908322222. +44 (0)1908319941. sales@techmate.
co.uk. utL-wlechmatecoiili. Амиулы; асии| мпиры; автокла-
вируемые корзины; бутыли; вкладыши для клеточных
культур: клеточные скребки; центрифужные пробирки;
стекла для камер: конические пробирки: контейнеры*
покровные стекла: криоиробирки, маркеры для крио-
пробирок; криофлаконы; культуральные пробирки; су-
шильная камера; чашки: дренажное дно, планшеты для
микр< л и 1 рации; фильтры; стерилизация фильтрацией;
вкладыши в фильтрационную лунку; флаконы: шта-
тивы для замораживания; газопроницаемые крышки;
ручные вакуумные насосы; пакеты для среды; моечные
устройства для пинеток; лабораторный пластик.
Techne (Cambridge) Ltd. Duxford, Cambridge, CB2 4PZ,
England, UK. 01223 832401. 01223 836838. safes©
techne.com. www.lechne.com/. Mai нитные мешалки;
перемешивающие флаконы; суспензионная культура;
флаконы для культуры с микроносителями.
Techne Inc. 3 Terri Lane, Suite 10, Burlington, N. J.
08016, USA. +1 609-589-2560; 800-225-9243. +1 609-
589-2571. wwwlechneusa.com/. Maiнитные мешалки:
перемешивающие флаконы;суспензионная культура,
флаконы для культуры с микроносителями.
Technika. 4757 East Greenway Rd., Suite 107 В PM В 177,
Phoenix, AZ 85032, USA. +1 480 348 0279. www.Tech-
nika.com. Анемометры; кондуктометры; измерители
растворенного кислорода; рефрактометры.
Techno Пластик Products (ТРР) AG. Zollstrasse 155,
CH-8219 Trasadingen, Switzerland. info@tpp.ch. www.
tpp.ch Клеточные скребки; centrifuge пробирки;
чашки; фильтры; флаконы; газопроницаемые крыш-
ки; пробирки Лейтона; многолуночные планшеты;
пипетки;скребки.
Tecniplast UK Ltd. 2240 Parkway. Kettering Venture
Park, Kettering Norlhants NN15 6XL, England, UK.
info@TecniplaslUK.com. www.tecniplastit. Клетки для
животных и оборудование; дезинфектанты.
Tekmar-Dohrmann. См. Teledyne Tekinar.
Tekto Inc. См. Sefar Фильтрация USA.
Teledyne Tekmar. 4736 Socialville Foster Rd., Mason,
OH 45040, USA. + 1 513-247-7000; 800 874 2004.
+ 1 513-247-7050. sales@tekmar.com. wwwlekmar.com.
Нейлоновые сита, ннтекс; общий органический уг-
лерод, определение.
Texol Products Ltd. Myrekirk Road, Dundee, Scot-
land, DD2 4SX, UK. +44 (0) 1382 618400 +44 (0)
1382 618422. info@texolco Mk.www.gasgen.co.uk/. Ге-
нератор азота.
Thermo Electron Corp. 81 Wyman Street. Waltham, MA
02454-9046, USA. +1 781 622 1000. +1 781 622 1207.
Контактное.шцо www.lhermci.cotn. Аварийная chi нали-
зация; центрифу! и; С О,-контрол леры; СО,-инкубато-
ры; кондуктометры; морозильник с контролируемым
режимом замораживания; оборудование для крио-
презервации; коробки для клеток; цитоцентрифу1а;
pei истраторы данных; электронные термометры; элек-
трофорез; система учета замороженных запасов; моро-
зильники; гемоцитометры; инкубаторы; ламинарные
шкафы; оборудование для разлива жидкостей; моро-
зильники с жидким азотом; низкотемпературные мо-
розильники; ма, нитный сортинг; микробиолш ические
боксы биобезопасности; микрокрышки (Drummond);
микронипетки; планшеты для микротитрации; реакти-
вы для мнкротцтраиии: диспенсеры: морозильники с
жидким азотом; кольцевые шейкеры; печи; pH-метры;
сушильное устройство для пипеток; моющее устрой-
ство для пипеток; автоматические пинетки; планшет-
ный сканер; программируемый морозильник; система
радиоинформации и аварийная сш нализация; бокс
биобезопасности; TOC-анализатор, водяная баня.
Thermo Electron UK. Unit 5, Hie Ringway Centre, Edi-
son Road, Basingstoke, Hampshire RG21 6YH, England,
UK.+44 (0)870 609 0203. +44 (0)870 6099202. sales.
htd.uk@thermo.com. www.thermo.com. Продукция см.
Thermo Electron Corp.
Thermolyne. Cm. Barnstead Thermolyne.
Thomas Scientific. 99 High H ill Rd., P.O. Box 99. Swedes-
boro, NJ 08085, USA. +1 856 467 2000; 800 345 2100.
+ 1 856467 3087. value@lhomasscicom. www.thomassci.
com. Дезинфектанты: инструменты для иссечения:
ножи для иридоэктомии; ма1 нитные мешалки; мик-
рошнрицы; силиконовые системы трубок; хирур! и-
ческие инструменты.
Titan Enterprises Ltd. Unit 2, 5A Cold Harbour Busi-
ness Park, Sherborne, Dorsel, DT94JW, England, UK.
+44 (0)1935 812 790. +44 (0)1935 812 890. info©
Доп’Измерителъные приборы.co.uk. http://www.
flow Измерительные приборы.co.uk/. Анемометр;
расходомер
ТРР. См. Teclio PlasticProducis. wwwipp.ch.
Triple Red Laboratory Technology Ltd. Triple Red
Ltd., Unit D4 Drakes Park, Long Crendon Ind Esl.,
Long Crendon, Buckinghamshire, HP18 9BA. England,
UK. +44 (0)1844 218 322. +44 (0)1844 218 332. info©
triplered.com. www.triplered.com. СО2-инкубаторы;
ярлыки для криофлаконов: устройство для печата-
ния этикеток; ярлыки; ламинарный шкаф; системы
очистки воды.
TSI Inc. 500 Cardigan Road, St. Paul, MN. 55126-3996,
USA. 1-800-874-2811; +1 651-490-2811 +1 651-490-
3824. unstL-ets@lsi.com. wwwlsicom. Анемометы, счет-
чики расхода и измеригель скорости воздуха.
U.S. Filter (с.м. also USF), Ltd. 40-004 Cook Street,
Palm Desert, CA 92211, USA. 800.875.7873 ext. 5000;
+1 760-340-0098 +1 760-341-9368. labproducts@us-
filter.com. www.nsfilter.com. Деионизация; обратный
осмос; очистка воды.
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
631
Unibioscreen S.A. 40, Avenue Joseph Wybran, 1070 Brus-
sels, Belgium.+32 (0)25 29 58 34; +32 (0)25 29 58 34.
+32 (0)25 29 59 42. suppott@unibioscreen.com. www.
unibioscteen.com. Терапия рака; инвазия; ксенотран-
сплантаты.
UniEquip. Fraunhoferstrasse 11, D-82152 Martinsried,
Munich, Germany. +49 (0)89 857 52 00. +49 (0)89 856
13 04. umequip@t-online.de. www.uniequip.com. Газовая
горелка, зажигаемая инфракрасным излучением
Universal Biologicals (Cambridge) Ltd. Passhouse Farm-
house, Papworth St Agnes, Cambridge, CB3 8QU, Eng-
land, UK. +44 (0) 1480 839 015. +44 (0) 1480 831 912.
inf о ©universalbiologicals.ltd.uk. www.universalbio -
logicals.ltd.uk. Антитела: актин, G белки, нервные
стволовые клетки, тубулин; коллаген; реактивы для
цитометрии: факторы роста; протеинкиназы.
Upstate Biotechnology. 1100 Winter Street, Suite 2300,
Waltham, MA02451, USA. 800-233-3991, 781-890-
8845. 781-890-8845. info@upslatebiotech.com. www.
upstate.com. Антитела; апоптоз; наборы для исследо-
вания; набор для изучения клеточной пролифера-
ции; клеточные сигналы; ферменты; факторы роста;
нейробиолш ия.
Upstate Biotechnology. Upstate House, Gemini Cres-
cent, Technology Park, Dundee, DD2 1SW, Scotland,
UK.+44 (0)1382 560812. 08000190 444. ukinfo@up-
state.com. www.upstate.com. Антитела; апоптоз; наборы
для исследования; набор для изучения клеточной
пролиферации; клеточные сш налы; ферменты; фак-
торы роста; нейробноло1ня.
USB Corp. 26111 Miles Rd., Cleveland, OH 44128,
USA.+ l 216 765 5000; 800 321 9322. 800 535 0898:
+ 1216 464 5075. customerserv@usbweb.com. www.
usbweb.com. Биохимические вещества; поливинил-
пирролидин
UVP, Inc. 2066 W 11th St., Upland, CA 91786, USA.
+1909 946-3197;800 452 6788. +1909 9463597. info©
uvp.com. www.uvp.com. Ртутные лампы; флюоресцен-
ция; УФ-лампы: УФ-трансиллюмпнаторы.
UVP, Ltd. Unit 1, Trinity Hall Farm Estate, Nuf-field
Road, Cambridge CB4 1 TG, England, UK. +44(0)
1223-420022. +44(0)1223-420561. uvp@uvp.co.uk.
www.uvp.com. Ртутные лампы; флюоресценция; УФ-
лампы; У Ф-трансиллюминатор.
Varian. 3120 Hansen Way, Palo Allo, CA 94304 1030,
USA. +1 650 213 8000. custserv@varianinc.com. www.
varianinc.com. Вакуумные насосы.
Vector Laboratories, Inc. 30 Ingold Road, Burlingame,
CA 94010, USA. 800 227 6666; +1 650 697 3600.+ 1 65
0 697 0339. vector@ve.ctorlabs.com. www.vectorlabs.com.
ABC набор; щелочная фосфатаза; антитела; биотин/
авидин; ELISA; ферментативный иммуноанализ;
реактивы для проточной цитометрии; ингибиторы,
замедляющие выцветание и гашение флюоресценции;
I люкозы оксидаза; скрининг i ибридом; лектины; клей
для стекол; ингибитор затухания УФ-свечения.
Vector Laboratories, Ltd. 3 Accent Park, Blakewell Road,
Orton Southgate, Peterborough PE2 6XS, England, UK.
+44 (0)1733 237 999. +44 (0)1733 237 119. vector©
veclorlabs.co.uk. www.vectorlabs.com. Продукция см.
Vector Labs Inc.
Verilabs Europe. Postbus 1336, 2302 BH Leiden, Neth-
erlands. +31 (0)900-3628378. info@verilabs.nl. www.
verilabs.nl . Аутентификация; ДНК-профплинг; ге-
нетический тест на идентичность ДНК.
Vision Biosystems. Balliol Business Park West, Benton
Lane, Newcastle upon Tyne. NE12 8EW, England, UK.
+44 (0)191 215 4242. +44 (0)191 2154227. sales.eu@
vision-bio.com. www.vision-bio.com. Антитела: NC-L-
Villin.
Vision BioSystems Inc. 700 Longwaler Drive, Norwell
MA 02061, USA. -*-1 781616 1190. +1781616 1193.
sales.usa@vision-bio.com. www.vision-bio.com . Анти-
тела: NC-L-Villin.
Vivascience AG. Feodor-Lynen-Strasse 21; 30625 Han-
nover, Germany. -r49 (0)511524 875-0.4-49 (0)511
524 875-19. info@vivascience.com. www.vivascience.de.
Биореакторы; слайды для камер; чашки для культу-
ры; Flexiperin; Miniperm; многолуночные планшеты;
Quadriperm; Pelriperm.
Vivendi Water Systems. High Street, Lane End, High
Wycombe, Bucks HP14 3JH, UK. +44 (0) 1494 887 555.
+44 1494 887 837. sandra.welch@veoliawater.com.
www.elgalabwaier.com Фильтрация; ионный обмен;
фотооокисление; обратный осмос; системы очистки
воды.
Volac. См. Camlab, Cole-Parmer
V&P Scientific Inc. 9823 Pacific Heights Boulevard,
Suite T, San Diego, CA 92121, USA. 800 455 0644;
+ 1 8584550643. +1 8584550703. sales@vp-scientific.
com. www.vp-scienltfic.com/. Подогревающие блоки.
VWR International. 1310 Goshen Pkwy. W. Chester. PA
19380, USA.+1610 431 1700;800 932 5000.+1610 436 17
61. www.vwr.com. Автоклавы; бутыли; элекгрофорез обо-
рудование; защитные маски; перчатки: латекс, нитрил,
винил; инкубаторы; лабораторные запасы; магнитные
мешалки; микрошпрпцы; микротитрация: фильтры,
планшеты; морозильники с жидким азотом; рН-метры:
насосы; покровные и предметные стекла; стерилизаци-
онные фильтры; насадочные фильтры для шприцов;
ультразвуковая баня; системы очистки воды.
VWR International, Ltd. Hunter Boulevard, Magna
Park, Lutterworth, Leics LE17 4XN, England, LTK.
0800 22 33 44; +44 (0)1202 669 700. +44 (0)1455 558
586. uk.sales@uk.vwr.com. www.vwr.com. Продукция
см. VWR International, USA.
Vysis. 3100 Woodcreek Dr., Downers Grove, IL
60515. USA. 800-553-7042. Ex.l; 1 708 271 7000.
+ 1 708 271 7008. vysis help@vysis.com. www.vysis.com.
Хромосомные красители; молекулярные зонды.
Wako Химические реактивы USA, Inc. 1600 Bellwood
Road, Richmond, VA 23237-1326, USA. +1 804 271
7791.+ 1 804 271 7791. www.wakousa.com. Антитела;
аскорбиновая кислота; биохимические вещества:
ферменты; среда Дпаго Т.
Wallac. См. PerkinElmer.
Watson-Marlow Bredel Насосы Inc. 37 Upton Tech-
nology Park, Wilmington, MA 01887-1018, USA.
632
Приложение III. ПРОИЗВОДИТЕЛИ ПРОДУКЦИИ И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
+ 1 978 658 6168; 800-282-8823. +1978 6580041.
support ©wmbHacocut.com. www.watsonmarlow.com.
Перистальтические насосы; силиконовые системы
трубок.
Watson-Marlow Bredel Насосы Ltd. Falmouth, Corn-
wall TR11 4BR, England, UK. *-44 (0)1326 370 370;
800 0189 844. +44 (0)1326 376 009. info@watson-mar-
low.co.uk. www.walson -tnarlow.Lo.uk. Перистальтиче-
ские насосы; силиконовые системы трубок.
Wave Biotech AG. Ringstrasse 24, CH-8317 Ta-
gelswangen, Switzerland +41 (0)52 354 36 36. +41
(0)52 354 3646. Контактное лицо via web page. www.
wavebiotech.ch. Биореакторы; культуральные пакеты;
качалочные платформы; волновое перемешивание.
Webb Microtome Ltd. Dr Sim Webb, Webb Mini-Mi-
crotome, Brisimany. Walnut Hill, Surlingham, Norwich,
NR14 7DQ, England, UK. +44 (0)1603 592 268.+44
(0)1603 592 250.s.f.webb@edipse.co.uk. www.mictolome.
co.uk. Портативный микротом.
Wescor, Inc. 459, South Main Street, Logan, Utah 84321,
USA. 800 453-2725; +1 435 752 6011. 801 752 4127.
biomed@wescor.com. www.wescor.com/. Цитоцентри-
фуга; осмометры; красители для срезов.
Whatman Inc. 9 Bridewell PI., P.O. Box 1197, Clif-
ton. NJ 07014, USA. +1 (617) 485-6590; 800-631-
7290.+ 1 973 7733991. info@whalman.com. www.what-
man.com. Хроматог рафия; фильтрующие заглушки;
фильтровальная бумага; 24-луночные фильтрующие
планшеты; фильтры, стекловолокна, бума(а; планше-
ты с фильтрационными лунками; многоканальные
автоматические шшетки; планшеты для мнкротит-
раиии; фильтры Nuclepore: автоматические пипетки*
вакуумные насосы.
Whatman pic. 27 Great West Road, Brentford, Middlesex,
TW8 9BW, England, UK +44 (0) 208 326 1740.+44 (0)
208326 1741. information@whatman.co.uk. www.what-
man.plc.uk. Продукция см. Whatman Inc.
W’heaton Science Products. Cm. Lawson Mardon
Wheaton.
Wissenschaftlich-Technische Werkstatten GmbH.
&Co. KG. Dr Karl-SIevogt-Strasse 1, D-82362 Weil-
heim, Germany. +49 (0)881 183-0.+49 (0)881 183-420
info@WTW.com. www.W~TW.com. Счетчики колоний;
измерительные приборы: проводимость, кислород,
pH. термометры; анализ воды.
World Ргес1£юпинструменты. 175 Sarasota Center Bou-
levard, Sarasota, FL 34240-9258, USA. +1941 371 1003.
+ 1941 377 5248. wpi@wpiinc.com. www.wpiinc.com.
Вкладыши в фильтрационные лунки; измерители
сопротивления; ТЕ ER; измерение трансэиителиаль-
ного электрического сопротивления.
World Ргес&юпинструменты. Aslonbury Farm Business
Centre, Aston, Stevenage, SG2 7EG, England, UK. +44
(0)1438 880025. +44 (0)1438 880026. wpiuk@wpieu-
rope.com. www.wpi-europe.com. Вкладыши в фильтра-
ционные лунки; измерители сопротивления; TEER,
измерение трансэпителиального электрическот о
сопротивления
Worthington Biochemical Corp. 730 Vassar Avenue, Lake-
wood, NJ 08701, USA. 800-445-9603; +1 732 942 1660.
800 368—3108; +1732 942 $21Woffice@worthingtonbio-
chern.com.www.worthinglon- biochem.com. Коллагеназа;
ДНКаза; шалуронидаза; трипсин.
WPI. См. World Precisionlnslruments.
WTW Measurement Systems, Inc. 6E Gill St., Wo-
burn, MA 01801, USA. 800 645 5999; +1 781 569 0095.
+ 1781-932-3198. info@wtw-inc.com. www.wtw.com,.
Счетчики колоний, измерительные приборы: прово-
димость, кислород, pH, термометры; анализ воды.
YSI Inc. 1700 1725 Brannum Lane, Yellow Springs,
Ohio 45387, USA. +1937 767 7241; 800 659 8895.
+1 937 767 8058. Контактное лицо via web page. www.
YSI.com. Биохимические анализаторы, анализаторы;
биосенсоры; мониторинг: холин, глюкоза, i лютамат,
глютамин, лактат.
Zeiss. См. Carl Zeiss.
Zimmer Corp. P.O. Box 708, 1800 West Center Street,
Warsaw, IN 46581-0708, USA. 800-613-6131. +1 574-
372-4988. Контактное лицо via web page. www.zimmer.
com. Керамические палочки u клеточный каркас для
культуры ( тканевая инженерия).
Zinsser Analytic (U. К.), Ltd. Howarth Road, Staffer-
ton Way, Maidenhead, Berks SL6 1AP, England. +44
(0) 1628 773 202. +44 (0) 1628 672 199. officeuk @zins-
seranulytic.com. www.zinsser-analytic.com/. Автомати-
ческие пипетки; флаконы; диспенсеры; оборудование
для разлива жидкостей; микротитрация; насосы:
перистальтические, вакуумные.
Zinsser Analytic GmbH. Eschborner Landstrasse 135,
D-60489 Frankfurt, Germany. +49 69 78 91 06-0.
+49 69 78 91 06—80. info@zinsser-analytic.com. www.
zinsseranalytic.com. Автоматические пипетки; флако-
ны; диспенсеры; разлив жидкостей; микротитрация;
насосы: перистальтические, вакуумные.
Zymed Laboratories, Inc. 561 Eccles Avenue, South San
Francisco, CA94080, USA. 800-874-4494; 650-871-4494.
+1650 871 4499. tech@zymed.com. www.zymed.com. Ан-
титела: Ki-67, цитокератин, рак молочной железы.
Приложение IV
СЛОВАРЬ УПОТРЕБЛЯЕМЫХ ТЕРМИНОВ
[по Schaeffer, 1990]
Авторадиография. Локализация изотопов в клетках
и срезах тканей (микроавторадиография), а также
в окрашенных электрофоретических препаратах
(блотах) при электрофоретических исследованиях;
достигается путем экспозиции фотографической
эмульсии, помещенной в непосредственной бли-
зости от образца.
Адаптация. Индукция или подавление синтеза макромо-
лекул (обычно белков) в ответ на стимул, например,
ферментативная адаптация - изменения фермента-
тивной активности, обусловленное действием индук-
тора или репрессора и включающая в себя изменение
скорости синтеза и деградации ферментов.
Аллотрансплантат см. Гомотрансплантат.
Амниоцентез. Пренатальная пункция плодного иу
зыря.
Анемометр. Прибор для измерения скорости потока
воздуха.
Анэуплоид. Нарушение гаплоидного числа хромосом
(см. Гаплоид).
Апоптоз. Клеточная гибель путем биолотически конт-
ролируемых внутриклеточных процессов, включая
расщепление ДНК и фрагментацию ядра.
Асептический. Свободный от микробиологического
инфицирования
Аутокринный. Рецеитор-оносредованный ответ клетки
на фактор, продуцируемый этой же самой клеткой.
Аутотрансплантат Трансплантат, взятый от одной
индивидуально особи и трансплантированный той
же особи.
Биореактор. Культуральный сосуд для получения
клеток в большом количестве, как прикрепленных
к субстрату, так и растущих в виде суспензии.
Биостат. Культуральный сосуд, в котором физические,
физико-химические и физиологические условия,
в т. ч. концентрация веществ, поддерживаются
постоянными. Обычно это осуществляется путем
перфузии, мониторинга и подачи питания в соот-
ветствии с результатами мониторинга.
Валидация (клеточных линий). Процесс, который
включает в себя аутентификацию, характеризация
и демонстрацию отсутствия контаминации клеточ-
ной линии.
Вариант (мутант, дивергент) Клеточная линия, экс-
прессирующая стабильный фенотип, отличный от ро-
дительской культуры, из которой она произошла.
Вирусная трансформация. Стабильное изменение фе-
нотипа, вызванное генетическим или наследуемым
действием трансформирующего вируса.
Время генерации. Интервал от одной точки в клеточ-
ном цикле до такой же точки в следующем цикле.
Отличайте от периода удвоения популяции, которое
определяется путем оценки общего количества кле-
ток в популяции, и таким образом, среднее значение
времени удвоения популяции, включает эффект
нерастущих клеток.
Время удвоения популяции. Интервал времени, не-
обходимый для увеличения количества клеток в
популяции в два раза к середине лог арифмической
фазы роста.
Гаплоид. Такой набор хромосом, при котором каждая
хромосома представлена один раз, у большинства
высших животных такой набор хромосом представ-
лен в гаметах; половина набора хромосом, имеющих-
ся в обычных соматических клетках.
Генетика соматических клеток. Раздел генетики,
изучающий рекомбинацию и сегрегацию генов в
соматических клетках, обычно путем их слияния.
Генотип. Общие генетические характеристики клеток.
Ген-супрессор. Ген, который иншбирует трансформи-
рованный (малигнизированный) фенотип обычно
связан с доминантно-негативной регуляцией кле-
точной пролиферации или клеточной миграции;
часто в трансформированных клетках обнаружива-
ется мутация ггли деления гена-суирессора.
Гетерокарион. Клетка, содержащая два или более
генетически различных ядра; обычно получается
путем слияния клеток.
Гетероплоид. Культура, в которой клетки имеют число
хромосом, отличное от диплоидного и различающе-
еся друг от друга.
Гибридизация in situ. Связывание специфически
комилементарных нуклеи ново-кислотных зондов
с внутриклеточными компонентами; кДНК зонды
для локализации последовательностей мРНК, или
PH К зонды для локализации ДНК (см. Хромосомное
окрашичаниё). Визуализируется методом радиоизо-
топного мечения и микроавтораднографин, либо с ис-
пользованием флюорохрома, связанного с зондом.
Гибридная клетка. Одноядерная клетка, которая
получается в результате слияния двух различных
клеток, приводящего к формированию синкариона
(см. Синкарион).
Гистотииичная культура. Культура, сформирован-
ная в соответствии с- морфологией ткани in vivo.
Обычно трехмерная культура воспроизводится
путем восстановления диет терт ированной клеточной
культуры в результате клеточной пролиферации
634
ПРИЛОЖЕНИЕ IV. СЛОВАРЬ УПОТРЕБЛЯЕМЫХ ТЕРМИНОВ
с образованием многослойное?!! или реагретации
тканеобразной структуры. Ор1анные культуры не
могут быть размножены, гистотипичные культуры
можно наращивать.
Гликокаликс. Гликозилированные пептиды, белки и
липиды, а также 1ликозамино1ликаны, располза-
ющиеся на поверхности клетки.
Гомойотермный. Способный к поддержанию по-
стоянной температуры тела независимо от колеба-
ний температуры в окружающей среде.
Гомокарион. Клетка, содержащая два или более гене-
тически идентичных ядра; обычно продукт слияния
клеток.
Гомотрансплантат (аллотрансплантат). Трансплантат,
полученный от генетически отличающегося донора
того же вида, что и реципиент.
Де дифференцировка. Необратимая утрата специали-
зированных свойств, которые клетки экспрессируют
in vivo. По мере накопления данных, говорящих о
том, что дедифференцировка культуры возникает
путем сочетания селекции недифференцированных
стромальных клеток и дезадаптации, возникшей в
результате отсутствия специфических индукто-
ров, термин постепенно выходит из употребления
Будет правильно применять его в отношении
прогрессирующей утраты дифференциальных
морфолог ических признаков при i истоло! ическом
исследовании, наиример, опухолевой ткани.
Дезадаптация. Обратимая утрата специфических
свойств в результате отсутствия соответствующих
индукторов (не всегда определенных).
Диплома. Каждая хромосома представляет собой iiapv
хроматид, идентичных в аутосомных и женских
истовых хромосомах и неидентичных в мужских
хромосомах, в соответствии с хромосомой, номером
хромосомы и морфологией большинства соматиче-
ских клеток тех видов, из которых эти хромосомы
выделены.
ДНК-нрофильное исследование. Генетический тер-
мин для изучения шиервариабельных участков
сателлитных ДНК, в настоящее время главным
образом используется для определения частоты
коротких тандемных повторов (STRs) в микроса-
теллитных ДНК при помощи RT-ПЦР единичного
локуса. Более чувствтельныи метод, чем мультило-
кусный ДНК-фингериринтин!, ле> ко поддающийся
количественному определению.
ДНК-фишерпринт- Мульти локус ные кДНК-зон-
ды, связанные с 1 ииервариабельными pei ионами
сателлитной ДНК, вырезанные эндонуклеазами
рестрикции и визуализированные методами ав-
торад ио!рафии. Участки, специфичные для того
индивидуального организма, из которого была
выделена ДНК.
Зависимость от прикрепления к субстрату. Необхо-
димость для культуры клеток в прикреплении к
плотному субстрату для выживания и роста
Злокачественная трансформация. Развитие способ-
ности к инвазии в нормальную ткань без регуляции
во времени и пространстве; может также приводить
к метастатическому росту (колонизации отдаленных
участков с последующим нерегулируемым инвазив-
ным ростом).
Злокачественный. Инвазивным или метастатический
(т.е., колонизирующий другое ткани). Термин, ис-
пользуемый для обозначения типа опухоли, обычно
развивающейся и ведущей к разрушению клеток
хозяина и, в результате, его гобел и.
Идеограмма. Распределение хромосом клетки в поряд-
ке возрастания размера и морфоло! ни для изучения
кариотипа и генетического анализа.
Изотрансплантат. Трансплантат, полученный от доно-
ра, генетически идентичного или почти идентичного
реципиенту
Иммортализация. Приобретение клеткой неопределен-
ной продолжительности жизни. Может быть индуци-
рована в конечной клеточной линии г|>ансфекцией те-
ломеразы, онкогенов или большого T-pei иона генома
SV40, целого вируса SV40 или вирус Эпштейн—Барра
(EBV). Иммортализация не обязательно является
злокачественной трансформацией, хотя может быть
компонентом злокачественной трансформации.
Индекс разведения. Делитель при разведении клеточ-
ной культуры ири субкультивировании (наиример,
koi да один флакон делят на четыре, или 100 мл до-
водят до 400 мл, индекс разведения составит 4).
Индукция. Усиление действия, производимое опреде-
ленным стимулом.
Инфекция (определение, отличное от общеприня-
того). Перенос геномной ДНК с ретровирусным
конструктом, содержащим последовательность
ДНК в условиях исследования, обычно совместно
с иромоторной последовательностью и реиортер-
ным геном, таким как Р-галактозидаза; продукт
инфекции может быть определен окрашиванием с
хромосомным субстратом.
Кариотип. Характерный хромосомный набор клеток.
Карцинома. Опухоль, развившаяся из эпителия, обыч-
но из клеток эндодермального или эктодермального
происхождения.
Квазиплоид. см. Псечдоп.юио.
Клетка-предшественник. Клетка на некоторой стадии
клеточной дифференцировки, которая предполагает
возможность коммитирования к определенному
типу дифференцировки. Ранние стадии будут
пролиферативными, поздние могут быть не проли-
феративными.
Клеточная гибридизация. См. Гибридная к/етка.
Клеточная концентрация. Количество клеток в 1 мл
среды.
Клеточная культура. Рост клеток, диссоциированных
из родительских тканей путем спонтанной миграции
пли механического или ферментативного расщеп-
ления.
Клеточная линия. Выросшая культура после первого
субкультивирования.
Клеточная плотность. Количество клеток на1 см'
субстрата.
ПРИЛОЖЕНИЕ IV. СЛОВАРЬ УПОТРЕБЛЯЕМЫХ ТЕРМИНОВ
635
Клеточное слияние. Образование единого клеточного
тела путем слияния двух друiих клеток, спонтанное
или, чаще, индуцированное действием инактиви-
рованного вируса Сендай или полиэтнлешликоля.
Клеточный штамм. Охарактеризованная клеточная
линия, полученная селекцией или клонированием.
Клон. Популяция клеток, полученная из одной
клетки.
Количество пассажей. Количество произведенных
пересевов культуры (переносов субкультуры).
Коммитирование. Необратимое развитие из стволовой
клетки до определенного клеточного типа закан-
чивающееся образованием клетки с возможность
экспрессии ограниченного набора свойств. Детер-
минация.
Конечная клеточная линия. Культура, которая была
выращена путем субкультивирования, но способна
только к ограниченному числу клеточных генераций
in vitro до 1 ибели клеток.
Конститутивный. Экспрессируемый клетками в отсут-
ст вне внешних регулирующих факторов.
Контактное ингибирование. Ишибирование колеба-
ний цитоплазматической мембраны и подвижности
клеток, koi да клетки находятся в контакте с рядом
располагающимися клетками, как в конфлюэнтной
культуре; часто предшествует, но не обязательно
причинно связано с прекращением клеточною
деления.
Конфлюэнтный монослой. Моносюй клеюк, в кото-
ром все клетки контактируют с клетками, располо-
женными ио их периферии и при этом не остается
свободною от клеток субстрата
Кривая роста. Полуло1арифмическая кривая зави-
симости лшарифма количества клеток от времени
роста культуры; обычно делится на lag-фазу (фаза
до начала активного роста), ло1арнфмическую
фазу (период экспоненциальною роста) и илато
(постоянное количество клеток, достигается, koi да
культура прекращает расти при высокой плотности
клеток).
Ксенотрансплантат. Трансплантация ткани виду,
отличному от того, от которою он выделен; термин
часто используется для описания имплантации
опухоли человека бестимусным (nude) мышам, а
также мышам с подавленным пли отсутствующим
иммунитетом.
Культура тканей. Термин возник для обозначения
поддержания жизнеспособности фра, ментов тканей
in vitro, но в настоящее время используется как об-
щепринятый термин, означающий культивирование
эксплантата ткани, ортанную культуру, культуру
диспертированных клеток, включая культуру
поддерживаемых клеточных линий и клеточных
штаммов.
Купол. Полусферическое или подобное пузырю обра-
зование на поверхности конфлюэнтною монослоя,
предполагающее наличие ионною транспорта через
монослой и приводящее к накоплению воды под
монослоем.
Ламинарный бокс. Рабочее место с фильтрованным
потоком воздуха ламинарною типа (бестурбулент-
ного), параллельною или перпендикулярного ра-
бочей поверхности, для поддержания стерильности
рабочею места; параллельный поток называется
обычно горизонтальным, а перпендикулярный
оертгжальным.
Ламинарный поток. Поток, который полностью пов-
торяет форму обч екаем ой поверхности, без тур-
булентности; термин используется для защитных
колпаков или боксов, характеризующихся стабиль-
ным потоком воздуха над рабочей поверхностью с
минимальной турбулентностью потока.
Лейкемия. Злокачественная болезнь гематопоэтиче-
ской системы с выраженной циркуляцией бластных
форм клеток.
Лимфома. Солидная опухоль лимфоидных клеток
Лииофекция. Трансфекция ДНК путем слияния с
липпд-цнкацеулированной ДНК.
ЛИФ-фактор (LIF). Фактор, ингибирующий лейке-
мию, цитокин семейства интерлейкин-6; обычно
используется для ингибирования дифференци-
ровки и поддержания фенотипа стволовых клеток
в культуре эмбриональных клеток ES.
Логарифмическая фаза (log-фаза). См. Кривая
роста.
Магнитио-активируемый клеточный сортинг (MACS).
Сортинг клеток путем ма> нитного притяжения на-
ма1 ничивающихся частиц железа, покрытых анти-
телами, которые связываются со специфическими
антш енами клеточной поверхности.
Макроауторадиография. Распределение радиоизо-
топов в срезах органов и окрашенных препаратах
(блотах) при электрофорезе, получаемое путем эк-
спозиции фото1 рафической эмульсии, помещенной
в непосредственной близости от образца, обычно
помещают пленку с блогом в кассету с интенсифи-
цирующим экраном
Манометр. Прибор для измерения давления, включает
трубку U-образной формы, содержащую жидкость,
уровень которой в каждой из частей отражает раз-
ницу давления между концами трубки.
Мезенхима. Рыхлая, часто мигрирующая эмбриональ-
ная ткань, происходящая из мезодермы, дающая на-
чало соединительной ткани, связкам, мышцам, гемо-
поэтическим клеткам и т.д. взрослою ор1анизма.
Мезенхимальные стволовые клетки (MSCs). Стволо-
вые клетки, обычно происходящие из костною моз-
га, обладающие мультипогентными способностями
к дифференцировке до кардиомиоцитов, нервных
клеток, гепатоцитов, а также клеток гематопоэти-
ческого ряда.
Мезодерма. Один из эмбриональных листков, раз-
вивающийся между эктодермой и эндодермой и
дающий начало мезенхиме, которая, в свою оче-
редь, дает начало соединительной ткани и т.д. (см.
Мезенхима)
Миелома. Опухоль, развившаяся из миелоидных кле-
ток; используется для получения моноклональных
636
ПРИЛОЖЕНИЕ IV. СЛОВАРЬ УПОТРЕБЛЯЕМЫХ ТЕРМИНОВ
антител, кем да миеломная клетка может продуци-
ровать иммуноглобулин.
Микроавторадиография. Распределение радиоизо-
топов в клетках и срезах тканей, визуализируемое
путем экс позиции фотографической эмульсии в
непосредственной близости от образца, обычно
путем погружения в расплавленную эмульсию.
После проявлении образец может быть исследован
иод микроскопом.
Моноклональное антитело. Антитело, продуцируемое
клоном лимфоидных клеток, как in vitro так и in vivo.
In vitro клон обычно получается из г ибрида сенси-
билизированной клетки селезенки и непрерывно
делящейся клетки миеломы.
Моноклональный. Полученный из одною клона клеток.
Морфогенез. Развитие формы и структуры организма.
Неопластическая трансформация. Преобразование
неканцерш ешюй клетки в канцерогенную.
Неопластический. Вновь возникший процесс проли-
ферации клеток, не обусловленный потребностями
организма и приводящий к развитию опухоли.
Онкоген. Ген, который будучи трансфицирован или
инфицирован в нормальную клетку, обычно вызы-
вает злокачественную трансформацию; обычно по-
ложительно функционирующий ген, кодирующий
факторы роста, рецепторы, молекулы-передатчики
сигнала или ядерные регуляторы.
Органная культура. Поддержание или рост зачатка
органа, либо части или целого органа in vitro, так что
условия культуры позволяют происходить диффе-
ренцировке и сохранению строения или функции
данного орг ана.
Органогенез. Развитие органов
Органотипический. Гистотипическая культура, со-
стоящая более чем из одного клеточного типа,
позволяющая создать модель межклеточных взаи-
модействий, характерных для некоторог о орг ана in
vivo. В данном случае подразумевается реконструк-
ция из диссоциированных клеток или фраг ментов
ткани, в отличие от органной культуры, в которой
структурная организация эксилантпрованной т кани
сохраняется.
Осмоль. Количество вещества, содержащее 1 моль
осмотически акт цвных частиц.
Осмоляльность, осмотическое давление. Концентра-
ция осмотически активных частиц в водном раст-
воре, выраженная в осмоль/ кг.
Осмолярность, осмотический свойства Концентрация
осмотически активных частиц в водном растворе,
выраженная в осмоль, л.
Паракринное действие. Действие одной клетки на дру-
гую, рядом расположенную клетку, опосредованное
некоторым растворимым фактором, без участия
системного кровообращения.
Паренхима. Часть ткани, выполняющая основную
функцинг данной ткани, например, гепатоциты в ие-
чени, в отличие от стромы, такой как фибробласты
соединительной ткани, составляющей опорную
час гь ткани.
Паскаль. Единица давления в системе СИ, эквивален-
1 пая 1 ньютону на квадратный метр.
Пассаж. Перенос субкультуры клегок из одного куль-
турального сосуда в другой, обычно, но не всег да,
предполагающий деление на части пролифери-
рующей клеточной популяции, обеспечивающее
размножение клеточной линии или клеточного
штамма.
Первичная культура. Культура, полученная из клеток,
тканей или органов, взятых непосредственно из
организма, ло первого субкультивнрования.
Первичный эксплантат. Фраг мент ткани, выделенный
из организма, и помещенный в культуру, таким об-
разом, чтобы были обеспечены выживание и роста
жизнеспособных клеток за пределы фрагмента.
Плато. См. Кривая роста.
Плои дня. Соотношение обнаруженного количества
хромосом данного типа соматических клеток с
обычным количеством хромосом в нормальных
соматических клетках in vivo. (см. также Гапло-
идный, Дип.юдный, Эуп.юидный, Анеуплоидный и
Гетероплоидныи).
Плотностное ограничение роста. Ингибирование
митотического деления, связанное с возрастанием
плотности клеток нри конфлюэнтном росте.
Плотность насыщения. Максимальное количество
клеток, которые могут расположиться на см' (в мо-
нослойной культуре) или в мл (в суспензионной
культуре) в определенных условиях.
Плотность популяции. Количество монослойных
клеток на единицу площади субстрата; для клегок,
растущих в суспензии, плотность популяции иден-
тична концентрации клеток.
Поддерживающая среда. Среда, обычно без сыворотки
и факторов роста, или с минимальным количеством
сыворотки, создается для поддержания клеток в
жизнеспособном состоянии без пролиферации
(например, для сбора биопсийных образцов или
поддержания клеток на стадии плато без продол-
жения деления).
Пойкилотермный. Имеющий метаболически не регу-
лируемую температуру гела, близкую к температуре
окружающей среды.
Постоянная (стабильная) клеточная линия или кле-
точный штамм. Клеточная линия или штамм, обла-
дающие способностью к неопределенному количест-
ву жизненных циклов. Раньше также употреблялись
термины «установленная» и «бессмертная» или
«имморталпзованная».
Псевдоплоид. Численно диплоидный хромосомный
набор, имеющий хромосомные аберрации.
Реактив. Вещество (элемент, компонент или смесь),
которое участвует в химической реакции.
Ростовая среда. Среда, исиользуемая для поддержания
клеточной линии', обычно используется основная
среда с добавками, например, сывороткой или фак-
торами роста.
Сантипуаз. Единица вязкости; 1000 сантипуаз экви-
валентно 1 Па/с.
ПРИЛОЖЕНИЕ IV. СЛОВАРЬ УПОТРЕБЛЯЕМЫХ ТЕРМИНОВ
637
Саркома. Опухоль, образованная клетками мезо-
дермального происхождения [например, клетками
соединительной ткани мышц (миосаркома), или
кисти (остеосаркома)].
Сбалансированный солевой раствор. Изотонический
раствор неор|анических солей, примерно воспроиз-
водящий необходимые физигигог ические концентра-
ции; может также содержать глюкозу, но обычно не
содержит дру| их ор|анцческих компонентов.
Синкарион. Гибридная клетка, которая образуется в
результате слияния ядер, которые она содержит.
Среда поддерживающая. Среда, которая сохранит
клет ки в жизнеспособном состоянии без клеточ
ной пролиферации (наиример, бессывороточные
среды или среды с низким содержанием сыворотки,
используемые для культур клеток, зависимых от
присутствия с ывороткгг).
Среда ростовая. Среда, которая используется при
обычной культуральной работе для поддержания
деления клеток и их накопления.
Среда. Смесь неор|анических солей и друiих пита-
тельных соединений, способных к поддержанию
выживания клеток in vitro в течение 24 ч
Старение. Биолог ически регулируемый процесс утраты
пролиферативного потенциала клеток, связанный с
укорочением теломеров хромосом.
Стволовая клетка. Самая ранняя в линии дифферен-
цировки клетка, способная стать предшественником
для всех клеток данной линии дифференцировки
при развитии из нее популяции и поддержании этой
популяции. Унипотентная стволовая клетка
даст начало только одному пути дифференцировки.
бипотентная двум, мг/лътшютентиая более
чем двум, плюрипотентная — нескольким, а то-
типотентная - всем типам дифференцированных
клеток (см. также Эмбриональные стволовые клетки
и Мезенхимальные стволовые клетки).
Строма. Считается, что эта часть ткани выполняет
опорную функцию, как, например, фибробластная
соединительная ткань и ее сосудистая сеть.
Субконфлюэнтный. Менее чем конфлюэнтный моно-
слой, не весь доступный для роста субстрат покрыт
клетками.
Субкультивирование. см. Пассаж.
Субстрат. Матрикс или плотная подложка, на котором
растет культура.
Суперконфлюэнтный. Монослой, развивающийся
после состояния конфлюэнтности, при котором
все клетки прилегают к субстрату, формирование
м косослойности.
Суспензионная культура. Кулыура, в которой клетки
растут и делятся при суспендировании их в культу-
ральной среде.
Теломеры. Терминальные регионы хромосом, ко-
торые предупреждают рекомбинацию с другими
хромосомами и поэтому способны поддерживать
пролиферативную способность клеток. Постепенное
укорочение теломеры имеет место при старении
клетки. В стволовых клетках и некоторых Опухо-
левых клетках длина теломеры поддерживается
постоянной при помощи теломеразы.
Тетраплоид. Двойной диплоидный (или четверной
аплондный) набор хромосом.
Тип мощеной мостовой. Тип расположения клеток
в монослое, мног оугольные клетки. Правильнее
употреблять термин «эпителиоидные» ют «эггите-
лиоггодобные клетки».
Трансдифференцировка. Явление, при котором
клетки из одной линии приобретают способность
дифференцироваться в клетки дру| ой линии диф-
ферен ц и ровк и.
Трансфекция. Перенос генетического материала из
одной клетки в другую при помощи искусственных
переносчиков; при этом переносится менее чем
все ядро донорском клетки. Трансфекция обычно
достигается путем переноса отдельных хромосом,
участков ДНК или клонированных генов.
Трансформация. Долговременное изменение клеточ-
ного фенотипа, которое считается возникающим в
результате необратимых генетических изменении.
Может быть спонтанной как при развитии быстро
растущих постоянных клеточных линий из медлен-
но растущих клеточных линий грызунов ранних
пассажей, либо индуцированной химическим или
вирусным агентом. Обычно дает клеточные линии,
которые имеют более высокую скорость роста, не-
определенную продолжительность времени жизни
низкую потребность в сыворотке.
Фактор роста. Фактор, выделяемый клетками, ко-
торый вызывает пролиферацию других клеток;
главным образом, паракринного действия, но может
выделяться в кровь, например, тромбоцитами или
эндотелием.
Фенотип. Совокупность всех экспрессированных
свойств клетки, результат взаимодействия генотипа
с регулирующими условиями окружающей среды.
Ферментативная индукция. Возрастание синтеза
фермента, индуцируемое, наиример. гормональной
стимуляцией.
Ферментер. Культуральный сосуд для выращивания
клеток в крупных масштабах, часто используемый
для клеток в суспензии; термин сохранился от на-
звания подобного оборудования, используемого в
микробгголог ин.
Фибробласт. Пролиферирующая клетка-предшествен-
ник зрелого дифференцированного фиброцита.
Фибробластный. Напоминающий фибробласты [т.е.
веретенообразная (бигголярная клетка) или звезд-
чатая (мультигголярная) форма]; обычно органи-
зованная в параллельные ряды при формировании
конфлюэнтного слоя, если имеется контактное
ингибирование. Часто этот термин безоснова-
тельно используется для недифференцированных
мезодермальных клеток мигрирующего типа или
клеток с выростами, превышающими диаметр ядра
в три раза и более. Более точно называть такие
клетки фибробласто подобным и или фггброблас-
тондными.
638
ПРИЛОЖЕНИЕ IV. СЛОВАРЬ УПОТРЕБЛЯЕМЫХ ТЕРМИНОВ
Фиколл-иак. Уплотняющая среда, приготовленная из
Фи колла (Ficoll) в сочетании с рентгеноконтраст-
ным йодированным веществом, таким как натрий
амидотризоат.
Флюоресцентная гибридизация 1и situ (FISH). Свя-
зывание специфических флюоресцентных зондов
со специфическими внутриклеточными участками
методом 1 ибридизации in situ (см. также Хромосом-
ное окрашивание').
Флюоресцентно-активируемый клеточный сортер
(FACS). Клеточное разделительное оборудование,
основанное наэлектромашитной сортировке. Сус-
пензии единичных клеток вследствие дисперсии
света или флюоресцентных свойствах отдельных
клеток, обнаруживаемых при лазерном сканирова-
нии потока отдельных клеток (см. также Фяюири-
метр проточный).
Флюориметр проточный. Оборудование, позволяющее
проводить качественный и количественный анализ
отдельных клегок в популяции путем сканирова-
ния единичных клеток потока при помощи лазера
с различной длиной волн или комплекса лазеров с
разными длинами волн и записью света, который рас-
сеивается или флюоресценции, которая излучается.
Химически детерминированный. Нечто, полностью
приготовленное из чистых определенных составля-
ющих (например, среда); отличайте от «бессыворо-
точной», в состав которой могут вместо сыворотки
входить друт ие плохо охарактеризованные и нестан-
дартизированные компоненты.
Хроматиды. Парные компоненты, составляющие хро-
мосому, связанные центромерой.
Хромосома. Комплекс ДНК и нуклеопротеинов, об-
разующих определенную морфоло! ическую струк-
туру в ядре, наблюдаемый в метафазе клеточного
деления. Состоит из двух идентичных хроматид,
соединенных в центромере и представленных оп-
ределенным набором характеристик для каждого
вида ор1анизмов.
Хромосомное окрашивание. 11спользование специфи-
ческих флюоресцентных зондов для окрашивания
определенных pei ионов хромосом.
Центромера. Точка соединения двух хроматид в хро-
мосоме; место прикрепления к веретену деления в
метафазе, телофазе и анафазе клеточного цикла.
Цикл роста. Период роста культуры от момента суб-
культивирования до вершины лшарифмической
фазы, когда культура готова к следующему субкуль-
тивированшо.
Цикличный рост. Рост из низкой клеточной плотнос-
ти до высокой клеточной плотности с постоянным
периодом субкультивирования, постоянным пов-
торением ростового цикла с целью поддержания
культуры.
Цитокин. Фактор, выделяемый клеткой, который бу-
дет вызывать рецеитор-оиосредованное действие
на пролиферацию, дифференцировку, воспаление
других клеток; обычно паракринного ближнего
действия, реже системного.
Цитостаз. Прекращение клеточной пролиферации.
Цитотоксичность. Клеточное повреждение одного или
более метаболического пути, внутриклеточного
процесса или структур, приводящее к нарушению
функций. Часто, но не всыда, связано с утратой
жизнеспособности.
Число генераций. Количество периодов удвоения
популяций (оцениваемое по разведениям субкуль-
туры), которое может произойти в культуре после
эксплантации; обязательно содержит примерное
количество 1енераций в первичной культуре.
Эксплантат. Фрагмент ткани, трансплантированной
из исходного участка, культивируемый в искусст-
венной среде.
Эксплантация. Выделение тканей для их культуры
in vitro, строго как небольшие фрагменты или с
сопровождающим почечным разрастанием (см.
Первичный эксплантат), но часто используемый как
общий термин для выделения культуры ткани.
Эктодерма. Внешний слой эмбрионального зачатка,
дающий начало эпителию кожи.
Эмбриональная индукция. Взаимодействие (часто
реципрокное) клеток из двух различных гермина-
тивных слоев, ускоряет дифференцировку.
Эмбриональные стволовые клетки. Тотипотентные
стволовые клетки, выделенные из внутренней кле-
точной массы эмбриона ранней стадии развития;
может быть культивирована как клеточные линии
с широким диапазоном возможностей дифферен-
цировки.
Эндодерма. Самый глубоколежащий герминативный
слой эмбриона, дающий начало эпителиальной
компоненте оринов, таких как кишечник, печень
и ле1 кие.
Эндокринные факторы. Сшнальные факторы, такие
как гормоны, высвобождающиеся какой-то тканью
и оказывающие действие на отдаленные ткани через
систему кровообращения.
Эндотелий. Эпптелиоподобный клеточный слой, вы-
стилающий пространства в тканях мезодермального
происхождения, таких как кровеносные сосуды, и
происходящие из мезодермы эмбриона
Эпителиальный. Описанные клетки получены из эпи-
телия. но термин часто используется более узко для
описания любых клеток многоугольной формы с яс-
ной четкой границей между клетками. Более точно
последние должны называться эпителиоиодобными
или эпителиоидными клетками.
Эпителий. Покровный слой или выстилка из клеток,
как на поверхности кожи или кишечника, обычно
полученный из эмбриональной эндодермы или
эктодермы, но uhoi да он происходит из мезодермы,
как, например, в почечных канальцах и мезотелии,
выстилающем полости тела.
Эуллоид. Кратное умножение 1аилоидного набора
хромосом. Правильная морфилш ическая характе-
ристика каждой пары хромосом данного вида, из ко-
торого произошла клетка, не указана в определении,
но обычно подразумевается. В противном случае мы
ПРИЛОЖЕНИЕ IV. СЛОВАРЬ УПОТРЕБЛЯЕМЫХ ТЕРМИНОВ
639
сказали бы «эуплоид с некоторыми хромосомными
аберрациями &.
Эффективность культивирования. Процент клеток,
посеянных при субкультивировании, которыедакп
начало колониям. Если считать, что каждая колония
образовывается из одной клетки, то эффективность
посева идентична эффективности клонирования.
Иногда этот термин не совсем верно использую?
для описания количества клеток, выживших после
субкультивирования, но в этом случае лучше ис-
пользовать термин «эффективность посева».
Эффективность посева. Процентная доля внесенных
клеток, которые крепились к субстрату в течение
определенного периода времени (подразумевается
жизнеспособность, но не обязательно пролифера-
тивная активность).
In ovo — «в яйце», обычно в курином яйце.
In vitro. Лат., букв, «в пробирке»; общепринятое
обозначение исследований вне организма хозяина,
наиример культуры клеток, ор<анные культуры
или препараты ор|анов в питательной среде корот-
кого времени жизни. Термин также используется
для обозначения биохимических и молекулярных
реакций, которые проводятся в лабораторных про-
бирках, но в этом случае лучше употреблять термин
«бесклеточные исследования».
In vivo. В живом оргонизме — растении или жи-
вотном.
Приложение V
ОСНОВНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Alberts В.. Bray D., Le wis J . Raff M , Roberts К. & Watson J C
(2002) The molecular biology of the cell, 4th cd. New York,
Garland.
Ausubel F M . Brent R., Kingston R E.. Moore D.D.. Scid-
man. J.G., Smith J. A. Strubl K. (Eds) (2002). Short Piotoads
in Molecular Biology. 5th Edition Vol. 1 & 2. Hoboken. NJ,
John Wiley & Sons.
Barlovatz-Mctmon G & Adolphe M (2003). Culture de cel-
lules uMmales, methodologies, applications. Paris Editions
INSERM.
Butler M (cd.), (1999). Mammalian cell btotevhnology, a practi-
cal appioach Oxford, U К. IRL Press at Oxford UMveisity
Davis J M. (2002). Basu. cellcultre, и practical approach. Oxford,
UK, IRL. Press at Oxford UMvcrsity Press.
Doyle A. GnffitsJ.B. & Newell D G (eds). (1993). Cell and
tissue culture Laboratory procedures Chichester. U.K. John
Wiley & Sons
Doyle A, Hay R. & Kirsop B.E (eds.). (JWW). Living resourcesfoi
biotechnology Cambridge, UK. Cambridge Uni vercity Press.
Fteshney RI & Freshney M C. (eds.). (2002). Culture of epithe-
lial cells. New York, Wiley-Liss.
Freshney R.I (1999). Freshney's Culture of aMmal cells, a mult-
medta guide. New York. Wiley-Liss.
Freshney R.I & Freshney M G. (1996) Culture of immortalazed
ce//s.Ncw York, Wiley-Liss.
Freshney R.I., Pragncll C.B. & Freshney M G (eds.). (1994)
Culture of hematopoietic cells. New York, Wiley Liss, Second
in the senes «Culture of specialized cells*.
Haynes L.W (cd)(1999) The neuron tn tissue culture, Chichester
UK. John Wiley & Sons
Leigh IM., Lane E B. & Watt F M (eds.) (1994). Thekerutmo-
cyte handbook. Cambridge, U К Cambridge Univcrcity Press.
Leigh I.M. & WattF.M. (eds.). (1994) Keratinocyte methods
Cambridge, U.K., Cambridge University Press.
Lodish H , Berk A, Matsudatra P., Kaiser C.A, Kreigcr M ,
Scott M P. Zipursky S.L & Darnell J. (2004) Molecular cell
biology,5'1' cd New York. Scientific American Books Freeman.
Masters J.R.W. (eds). Animal cell culture, a practical approach
3"1 cd Oxford, U.K, IRL Press (2000).
Masters J.R.W (cd). (1991) Human cancer tn primary culture
London, Kluwer
Masters J.R.W. & Palsson В (1999). (eds.) Human cell culture
Dordrecht, The Netherlands. Kluwer.
Pfragncr P & Freshney R I. (eds.) (2004). Culture of human tumor
cells. Hoboken. NJ Wiley-Liss.
Pollack R. (cd) (1981) Reading in mammalian cell culture. 2"J
cd. Cold Spring Harbor. NY, Cold Spring Harbor Laboratory
Press
Ravid К & Freshney R.I (eds.). (1998) DNA tranfer to cultured
cells. New York. Wiley-Liss
Shahar A., de Vcllis J., Vcrnadakts A & Haber B. (1989) A dis-
section and tissue culture manual of thenervous system. New
York, Wiley Liss.
Vtinjak Novakovtc G & Freshney R.I (eds ). (2005) Culture
of cells fortissue ingineering. Hooboken. N.J.. Wiley Liss (in
press)
Методы культур тканей
Celt preservation technology
Cytotechnology (в настоящее время входит в Methods in Cell
Science)
In Vitro Cell amd Development Biology
Tissue Ctlture Research Communiocation (Japanese)
Клеточная биология
Cell
Celt Biology, International Reports
Cellulat Biology
Cell Crowth&Differeniation
Current Opinion in Cell Biology
Eunpean Journal of Cell Biology
Experimental Cell Biology
Experimental Cell Research
Journal of Cell Biology
Journal of Celular Phisiology
Journal, of Cell Science
Nature Biotechnology
Nature Cel! Biology
Рак
British Journal of Cancer
Cancer Research
European Journal of Cancerand Clinical Uncofogy
Oncology
International Journal of Cancer
Journal of National Cancer Institute
Список литературы
Aaronson, S А. & Todaro, G J (1968) Development of 3T3-like
lines from Balh/c mouse embryo cultures Transformation
susceptibility to SV4O J. Cell Physio! 72.141 -148
Aaronson, S. A, Bottaro, D. P, Mikl. T., Ron, D, Finch, P W..
Fleming, T P.. Ahn, J, Taylor, W G & Rubin, J. S. (1991)
Kcratinocytc growth factor' A fibroblast growth factor family
member with unusual target cell specificity. Ann, NY Acad.
Sci 638 62-77.
Aaronson, S. A, Todaro, G J & Freeman, A F.( 1970). Human
sarcoma cells in culture Identification by colony-form •
mg ability on monolayers of normal cells Exp. Cell. Res.
61 1-5
Abaza, N. A. Leighton, J & Schultz. S. G (1974). Effects of
ouabain uii the function and structure of a cell line (MDCK)
derived from canine ktdncy. I Light microscopic nliscrvattons
of monolayer growth In Vitro 10 172 183
Abbott, N J, Hughes, С C, Revest, P. A & Green wood, J. (1992).
Development and characterisation ol a rat brain capillary
endothelial culture-Towards an in vitroblood-brain barrier.
J. Cell Set. 103 (Pt 1): 23-37
Abercrombie, M. & Hcaysinan, J E.M (1954). Observations on
the social behaviour of cells in tissue culture.- II “Monolaver-
ing" of fibroblasts, Exp Cell Res. 6- 293-306
Abney. E. R, Williams. В P. 4 Raff, M. C. (1983) Tracing the
development of oligodendrocytes from precursor cells using
monoclonal antibodies, fluorescence activated cell sorting
and cell culture, Dev. Biol. 100. 166-171.
Adams, D C. (1979) Macrophages. In Jakoby, W B. &
Pastan. I. H.(cds.).Methods tn enzymology. vol. 57.cell culture.
New York, Academic Press, pp 494-506.
Adams, R L. P. (1980) In Work T. S. & Burdon. R. H. (cds.)
Laboratory techniques tn biochemistry and molecular biology.
Cell culture for btochetsts, Amsterdam, Elsevier North Hol-
land Biomedical Press.
Adolphe, M. (1984.). Mu triplication and type II collagen produc
tion by rabbit articular chondrocytes cultivated tn a defined
medium. Eip. Cell Res, 155 527-536.
Adolphe. M. & Benya. P D (1992). Different types of cultured
chondrocytes- The tn vitro approach to the study of biochemi-
cal regulation, in Adolphe, M, cd, Biological regulation of the
chondrocytes Boca Raton, FL, CRC Press, pp. 105-139.
Advisory Committee on Dangerous Pathogens (1995a) Cat-
egorisation of Biological Agents According to Hazaral and
Categories of Containment. The Stationary Office, P.O. Box
276. London SW8 5DT. England.
Advisory Committee on Dangerous Pathogens (1995b). Protcc •
tion against blood-borne infections in the workplace HIV
and hepatitis The Stationery Oflicc. P.O Box 276 London
SW85DT, England
Advisory Committee on Dangerous Pathogens (2003) Infection
at work. Controlling the risks. Department of Health, PC box
777. London SEI 6XH.
Ager, A (1987). Isolation and culture of high endothelial cells
from rat lymph nodes. J Cell Sci 87 (Pt I)-133-144
Agy, PC., Shiplev. G. D. & Ham. R C. (1981). Protein-free me-
dium for mouse neuroblastoma cells In Vitro 17 671 680
Ahmed, I, Collins, C. A., Lewis, M P, Olsen, I. & Knowles, J. C
(2001) Processing, characterisation and btocompatibility of
iron-phosphatc glass fibres for tissue engineering Biomaten-
als 25 (16); 3223-3232
Aigner. J , Tcgelcr, J , Hutzler, P., Campoccia, P. Pavcsio, A..
Hammer. C.. Kastcnhaucr, В & Naumann. A. (1998). Car-
tilage tissue engineering with novel nonwoven structured
biomaterial based on hyaluroMc acid benzyl cster.J Biomed,
Mater. Res. 42 (2)-172-181.
Aitken, M L.. Villaion, M , Vcrdngo, P & Namcroff, M (1991)
Enrichment of subpopulations of respiratory epithelial
cells using flow cytometry. Am. J Resp. Cell Moll. Biol 4
174-178
Albclda, S. M., Oliver. P O., Rosner, L. H & Buck, C A (1990)
EndoCAM a novel endothelial cell-cell adhesion molecule
J. Cell Biol, 110.1227-1237
Alberts, B., Bray, D. Johnson, A., Lewis, J , Raff J . Roberts,
K. & Walter, P (1997). Essential cell biology. New York,
Garland
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. &
Walter, P. (2002), Molecular biology of the cell. 4 th cd. New
York Garland
Albrecht A M, Bidder, J. L & Hutchison, D. J (1972) Two
different species of dihydrofolate reductase in mammalian
cells differentially resistant toamethopterm and mcthasquin.
Cancer Res 32.1539-1546
Alexander, C. L., FitzGerald. U. F. & Barnett. S C. (2002).
Identification ofgrowth factors that promote long-term pro-
liferation of olfactory ensheathing cells and modulate their
antigcMc phenotype Cha 37 349-364.
Al-Hajj, M, Becker. M. W_ Wicha. M_ Weissman. L. Clarke, M F
(2001) Therapeutic implications of cancer stem cells Curr
Opin Genet. Dev, 14.43-47
Ah, S.. Muller, C. R & Epplen.J.T (1986). DNA finger printing
by oligonucleotide probes specific for simple repeats. Hum
Genet. 7 6 239-243.
Abson, M. К. Vig, P., Russo. F-, Bigger. В W., Amofah, E, The-
mis. M & Forbes, S (2004). Hepatic stem cells from inside
and outside the liver? Cell Proltf 37. 1
Alley, M. C., Scudiero. D A, Monks, A., Hurscy, M. L., CzcrwiM-
ski. M. J., Fine, D. L, Abbot, B. J_ Mayo. J. G.. Shoemaker,
R. H & Boyd, M P. (1988) Feasibility of drug screening
642
Список литературы
with panels of human tumour cell lines using a microculturc
tetrazolium assay. Cancer Res. 48 589-601.
Al-Mufti. R., Hambley, H., Farzaneh F. & Nicolaides, К H
(2004). Assessment of efficacy of cell separation techniques
used in the enrichment of fractal erythroblasts from maternal
blood: triple density gradient vs. single density gradient. Clin
Lab. Haematol. 26 (2) 123-128
Al-Rubcai, M & Smgh, R. P. (1998) Apoptosis ш cell culture,
Cur. Optn. Biotechnology. 9 152 156
Al-Rubcai. M . Wclzenbach, K-, Lloyd, D. R & Emery, A. N
(1997). A rapid method for evaluation of cell number and
viability by flow cytometry Cytotechnology 24 161-168.
Alvarcz-Dolado, M. Pardal, P., Garcia-Verdugo, J. M , Fike.J. R,
Lee, H O., Pfeffer К, Lois, C., Morrison, S J & Alvarcz-
B uy Ila. A. (2003) Fusion of bone-marrow-derived cells with
Purkinje neurons, cardiomyocytcs and hepatocytes Nature
425.968-973.
Ames. В N (1980). Identifying environmental chemicals causing
mutations and cancer. Science 204 587-593.
Andersson. J E. & Wozniak, A. C (2004) Satellite cell activa-
tion on fibers, modeling events in vm an invited review Can
J Phusiol. Pharmacol, 82 300-310
Andersson. L. C .Jokincn. M & Gahmberg, C. G. (1979c). Induc-
tion of erythroid differentiation m the human leukaemia celt
line K562. Nature, 278 364-365
Andersson. L C.. Jokincn, M., Klein, C & Nilsson, К (1979b)
Presence uf erythrocytic components in the K562 cell Ime
Int J. Cancer 24.5-14.
Andersson, L. C, Nilsson, К A., Gahmberg, C G (1979a)
K562 - a human erythroleukemic cell line. Int J Cancer
23 143-147
Andreason, G L & Evans. G. A. (1988) Introduction and expres-
sion of DNA molecules in eukaryotic cells by electroporation
BioTechniques 6.650-660.
Andreason, G L & Evans, G A. (1989) Optimizaion of electro-
poration for trarsfcction of mammalian cells Anal. Biochem
180.269-275.
Andreoli, S P. & McAtccr, J. A. (1990). Reactive oxygen mol-
ecule-mediated unjures in endothelial and renal tubular
epithelial cells in vitro Kidney In. 38 785-794
Andzaparidzc, O. G (1908). Chnical experience with vaccines
produced in the human diploid cell line Wl-38 Natl Cancer
Inst Monogr. 29 477-484.
Antoniades, H N. Scher, C D & Stiles, C. D. (1979). Purifica-
tion of human platelet-derived growth factor. Proc. Natl.
Acad Set. VSA76 1809.
Aoki, H . Motohashi, T. Yoshimura, N, Yamazaki, H., Ya-
manc, T.. Panthier.J. J & Kunisada, T. (2005). Cooperative
and indispensable roles of endotheltn 3 and КГГ signalings
in melanocyte development Dev. Dyn. 2005, Mar 14. Online
ahead of publication
Armatt, P J. & Bonner, J. (1990). A tcchiquc for promoting
Schwann cell growth from fresh and frozen biopsy nerve
utilizing d-valinc medium In vitro Cell Dev. Biol, 26
1116-1118
Arnghi, F. E & Hsu. T C (1974) Staining constitutive het-
erohromatin and Giemsa crossbands nf mammalian chromo-
somes, In Yunis J (cd.). Human cromosome methodology, 2'"’
cd. New York, Academic Press
Artursson. P & Magnusson, C (1990). Epithelial transport
of drugs in cell culture II Effect of extracellular calcium
concentration on the paracellu br transport of drugs of dif-
ferent Ifpophilicites across monolayers of intestinal epithelial
(Caco-2) cells.J Pharmaceut Sei 79- 595-600
Askanas, V.. Borncmann, A & Engel. W К (1990). Immunocy-
tochemical localization of desmin at human neuromuscular
junctions Neurology 40 949-953
Atala, A. & Lanza. R. P (2002). Methods of tissue Engineering.
San Diego. Academic Press.
Au. A. M -J & Varon. S. (1979). Neural cell sequestration on
immunoaffinity columns. Eip. Cell Res. 120 269.
Auerbach, R & Grobstcin, C (1958). Inductive interaction of
embryonic tissues after dissociation and rcaggregarion. Exp.
Cell Res, 15 384-397.
Ausubcl, F. M, Brent, R, Kingston, R. E.. Moore, D. D. Scid-
man.J. G-. Smith, J. A &Struhl,K (cds.) (1996). Current pro-
tocols tn Molecular biology. New York. John Wiley & Sons
Ausubcl, F. M„ Brent, R, Kingston, R. E., Moore, D. D.. Scid-
man, J G, Smith, J. A & Struhl, K. (cds.) (eds) (2002).
Short Protocols in Molecular Biology 5th Edition, Vol. 1 &
2 Hoboken, NJ, John Wiley & Sons
Babich. H & Borenfreund. E (1990) Neutral red uptake. In
Doyle, A., Griffiths, J В &Ncwall, D G (cds.). Cell and tis-
sue culture. Laboratory procedures Chichester, U.K. Wiley,
Module 4B 7
Bagley, R G., Waltcr-Yohrling. J. Cao. X., Weber, W.. Si-
mons. B., Cook, В. P, Chartrand. S D.. Wang, C., Madden,
S. L. & Teichcr, В A (2003). Endothelial precursor cells as a
model of tu mor endothelium characcrization and comparison
with mature andothclial cells Cancer Res.63 5866-5873.
Bakolitsa, C.. Cohen, D M. Bankston. F. A. Bobkov. A. A,
Cadwell, G W .Jennings L, Cntchley, D. R, Craig. S. W &
Liddington, R. C. (2004) Structural basis for vinculin activa-
tion at sites of cell adhesion. Nature 430 583-586,
Balin, A. K-. Goodman, В. P, Rasmussen. H. & Cristofam, V' J.
(1976). The effect of oxygen tension on the growth and me-
tabolism of WI-38 cells J. Cell Physiol.89 235-250
Balkovctz. D. F & Lipschutz, J H (1999) Hqratocytc growth
factor and the kidney. It is not just for the bver. Int. Rev.
Cytol. 186:225-260
Ballard, P. L. (1979), Glucocorticoids and differentiation Glu-
cocorticoid Horn. Action. 12 439-517
Ballard, P. L. & Tomkins. G M (1969) Dexamethasone and cell
adhesion. Nature 244.341-345.
Balmforth., A.J , Ball, S. G-, Freshney, R. I. Graham, D I. Mc-
Namee. В & Vaughan, P. F. T (1986). D-l dopamincr-gic
and beta-adrenergic stimulation of adcnylatcyclase in a
cloncdcrivcd Irom the human astrocytoma cell line G-CCM.
J. Neuochem. 47:715-719
Baltimore. D (2001). Our genome unveiled. Nature, 409.814-816.
Bansal, R.. Stefans son, K. & Pfeiffer. S. E (1992). Proligodcn-
droblasr antigen (PO A), a developmental antigen expressed
by А007/ 04-positive oligodendrocyte progenito to the ap-
pearance of sulfatidc and galactoccrcbrosidc. J Neurochem.
58 2221 2229.
Bard. D R., Dickens. M J.. Smith, A II & Sarck, J. M (1972).
Isolation of living cells from mature mammtlan bone Nature.
236 314 315.
Список литературы
643
Barnes, D. & Saco. G (1980; Methods for growth of cul-
tured cells in scrum-free is medium Anal Biochem, 102
255-270
Barnes, W D, Sirbasku. D. A. & Sato. G. H. (eds.). (1984a). Cell
culture methods for molecular and cell biology Vol. 1 Methods
for preparation of media, supplements and substrata for serum-
free animal cell culture New York, Alan R. Liss.
Barnes, W D, Sirbasku. D. A & Sato. G. H (eds.). (1984b)
Cell culture methods for molecular and cell biology Vol. 2
Methods serum-free culture of endoeryne system. New York,
Alan R Liss.
Barnes, W D, Sirbasku. D A. & Sato, G. H (eds.). (1984c). Ceil
culture methods for molecular and cell biology Vol.3 Methods
forserum-free culture of epithelial and fibroblastic cells. New
York, Alan R Liss.
Barnes W D, Sirbasku. D A & Sato. G H. (eds.) (1984d). Cell
culture methods for molecular and cell biology. Vol. 4 Methods
for serum-free culture of neuronal and lymphoid cells. Nev
York, Alan R Liss.
Barnett. S C. & Chung, I (2004) Olfactory ensheathmg cells
Going solo or in need of a friend? Tends Neuroset 27 (1).
54-60.
Barnett. S C. & Riddell. J S (2001) Olfactory eusheating cells
(OECs) and the treatment <if CNS injury: advantages and
possible caveats J. Anat 24.57-67
Barnett. S C (2004) Olfactory eusheating cells-untqe glial cell
types?J Neuiotrauma 21.375-382.
Barnett. S. C , Hutchins, A.-M & Noble, M (1993) Purification
of olfactory nerve Olfactory eusheating cells of the olfactory
bulb Dev. Biol 155.337-350.
Bateman, A. E , Pcckman, M J & Steel, G. G. (1979) Assays
of drug sensitivity for cells from human tumours: In vitro
and in vivo rests on a xenografted tumours. Br. J Cancel 40
81-88.
Battyc, F L & Shortman, К (1991). Flow cytometry and cell-
separation procedures Curt Opin Immunol. 3 238-241.
Bazill, G. W, Haynes, M , Garland, J. & Dexter, T. M. (1983)
Characterisation and partial urification of haemopoietic cell
growth factor in WEHI-3 cell condioned medium Biochem.
J. 210.747-759.
Beattie, G M, Lappi. D. A.. Baird. A , Hayek, A. (1990). Selective
chmintion of fibroblacts from pancreatic islet monolayers by
basic fibroblast growth factor-saponn mitotoxin Diabetes.
39 1002-1005
Beddington. R. (1992) Transgenic mutagenesis m the mouse.
Trends Genet. 8 10.
Bcdnn. M S .Abolafta. С M & Thompson. J. F. (1997). Cyro-
skclctal association of epidermal growth factor receptor and
associated signalling proteins is regulated by cell density in
IEC-6inrcstinal cells J. Cell Physio! 172.126-136.
Bell. E, Sher, S.. Hull, В, Merrill, C-, Rosen, S., Chamson, A, As
selineau. D, Dnbcrtret, L.. Coulomb. В, Lapicrc, C..Nusgcns.
В & Nevcux. Y. (1983) The reconstitution of living skin.
J. Invest. Dermatol. 81: no I Suppl 2s- 10s
Benda. P. Lightbody. J., Sato, Levine. L. & Sweet. W. (1969)
Differentiated rat glial cell strain tn tissue culture. Science,
161 370.
Benders, A. A, G. M. van Kuppevclt, T. H M., Oosrchof. A. &
Veccrkamp. J. H. (1991), The biocemtcal and strutural matu-
ration of human skeletal muscle cells in culture- The effect of
scrum substitute. Ultroscr. G. Exp Cell Res 195.284-294.
Benya, P. D. (1981) T wo dimensional CNBr peptide patterns of
collagen typcsl, II and III Coll Relat. Res 1. 17-26
Benya, P. D, Padilla. S. R, & Nimmi, M. E (1977). The progeny
of rabbit articular chondrocytes synthesize collagen type I and
III and I trimmer, but not type II. Verification by cyanogen
brimude peptide analysis Biochemistry 16 865-872
Berdichevsky, F.. Gilbert. C-, Shearer, M. & Taylor-Papadtmi-
trou, J. (1992). Collagen-induced rapid morphogenesis of
human mammary epithelial cells- The role of the alpha 2 beta
lint egrin J Cell Set.. 102 437-446
Berenbaum, M. C. (1985) The expected effects of a combi-
nation of agents The general solution J. Theor biol, 114
413 132
Berger. S. L. (1979), Lymphocytes as resting cells, in Jakoby. W.
В & Pastan, I H (eds.). Methods tn enzymology, vol. 57, Cell
Culture. New York, Academic Press, pp 486 194
Bcrky.J J & Sherrod, P C (eds ) (1977) Short term, tn vitro test-
ing for carcinogenesis, mutagenesis and toxicity Philadelphia,
Franklin Institute Press.
Bernstein. A. (1975). Differciation of clonal lines of teratocarcj-
noma cells. Formation of embryoid bodies tn vitro Proc Natl
Acad Sci USA72 1441-1445
Bcrnstine. E G., Hooper, M L.. Grandchamp, S & Ephrussi, B.
(1973) Alkaline phosphatase activity in mouse teratoma Proc
Natl. Acad Set. USA 70.3899-3903.
Berry M N & Friend, D. S. (1969) High yield preparation
isolated rat liver parenchymal cells A biocemtcal and line
structural study./. Cell Biol 43.506-520
Bcrthussen K. (1993). Growth of cells in a new defined protein
free medium.. Cytotechnology 11.219-231
Bcrtoncello, I, Bradley. T. R. & Watt, S M. (1991) An improved
negative immunomagnctic selection strategy for the purifica-
tion of primitive hemopoietic cells from normal bone marrow
Exp Hematol 19.95-100.
Bettger. W Boyce. S. T., Walthall. B. J & Ham. R C. (1981)
Rapid clonal grow th and serial passage of human diploid fi-
broblasts ina lipid-enriched synthetic medium supplemented
with EGF. insulin and dexamethasone. Proc. Natl. Acad. Sa.
HSA. 78 5588-5592.
Bhagavati, S & Xu, W (200t). Isolation and enrichment of
skeletal muscle progenitor cells from mouse bone marrow
Biochem Biophys res Commun. 318.119-124
Bhargava. M .Joseph, A.. Knescl, J , Halaban. R.. Li, Y-,
Pang, S.. Golhcrg, I, Setter, E, Donovan, M. A.. Zarncgar. R.,
Falctto, D & Rosen, E M (1992). Scatter factor and hq>a-
tocytc growth factor activities, properties, and mechanism
Cell Crou th Differ 3 11 20
Bhatt, R. I, Brown, M. D, Hart, C. A, Cilmorc, P., Ramani, V. A.,
George, N J & Clarke. N. W. (2003) Novel method for the
isolation and characterisation of the putative prostatic stem
cell. Cytometry 54A (2) 89-99
Bichko, V. V (1998). Canonic liposomes. In Ravid. K. & Fresh-
ney. R. I (eds ). DNA transfer to cultured cells. New York,
Wiley-bss.pp 193-212.
Bickenbach. J R. & Chism, E (1998). Selection and extended
grow th of murine epidermal stem cells m culture. Exp- Cell
Res 244 184-195
644
Список литературы
Biedler. J. L. (1976). Chromosome abnormalities in human tu-
mour cells in culture. In Fogh, J (cd.). Human Tumor Cells
In Vuto. New York. Academic Press.
Biedler. J. L. & Spengler. В A (1976). A novel chromosomal
abnormality in human ncuroblestomaand anti-folate resistant
Chinese hamster cell lines in culture J Natl. Cancer Inst 57
683-695
Biedler, J. L, Albrecht, A. M , Hutchinson, D. J & Spengler, B. A
(1972). Drug response, dihydrofolate reductase, and cytoge-
netics of amethopterin-rcsistant Chinese hamster cells tnvitro
Cancer Res 32 151-161.
Biggers. J. D , Gwatkin, R. В. C. & Heyner. S. (1961) Growth ol
embryonic avian and mammalian tibiae on a relatively simple
chemically defined medium Exp Cell Res 25 41.
Bignami, A.. Dahl, D. & Rueger, D. G (1980) Glial fibrillary
acidic (CFA) protein in normal neural cells and in pathological
conditions. In Federoff. S & Hertz, L. (cds.). Advances in cef-
lularneurobtology, vol 1. New York, Academic Press. Biosafety
in Microbiological and Biomedical Laboratories (1984) Divi-
sion of Safety, BG31, ICO2.NIH, Bethesda, MD
Bireh. J R. & Pitrt. S. J. (1970) Improvements in a ehcmtcal-
lydcfined medium for the growth of mouse cells (strain LS)
in suspension./ Cell Set 7:661-670
Bireh. J. R. & Pirt. S J (1971) The quantitative glucose and
mineral nutrient requirements of mouse LS (suspension) cells
in chemicalli-defined medium./ CellSci 8.693-700
Birnie. G. D & Simons. P. J. (1967). The incorporation ol
3H-thyundine and 'H-uridine on stainless steel Exp. Cell
Res 46.355-366.
Bishop, A E., Power, R. F. & Polak, J M. (1998). Markers for
neuro endocrine differentiation Pathol Res Pruct 1988 Apr,
183(2) 119-128
Bisbop.J M (1991). Molecular themes in oncogenesis Cell f>i
235-248.
Bissell, D M, Arenson, D M., Maher. J J. & Roll. F.J. (1987)
Support of cultured hepatocytes by a laminin-rich gel: Evi-
dence for a functionally significant subendothelial matrix in
normal liver J. Clin Invest 79 801-812
B-jerkvig, R. Laerum, O. D & Melia, O. (1986a) Glioma cell
interactions with fetal rat brain aggregates in vitro, and with
bratn tissue tn vivo. Censer Res. 46.4071 4079
Bjerkvig, R, Stcinsvag, S. K. & Laerum, O. D (1986b). Rcaggre-
gation of fetal rat brain cells tn a stationary culture system, I
Methodology and cell identification In Vitro 22-180-192
BLaker, G. J., Birch. J. R & Pirt, S J (1971) The glucose, insulin
and glutamine requirements of suspension cultures of HeLa
cells in a defined culture medium /. Cell Set. 9 529-537
Blanco. F.J Geng. Y. & Lotz, M (1995) Differentiation
dependent effects of IL-1 and TGF-b on human articular
chondrocyte proliferation are related to nitric oxide synthase
expression./ Immunol. 154 4018-4026
Blouin, R.. Grondin, G„ Beaudoin, J . Anta. Y. Daigle, N . Tal-
bot, В G, Lebel. D & Monsset, J (1997). Establishment
and immunocharacterization of an immortalized pancreatic
cell line derived from the H-2 Kb-tsA58 transgenic mouse
In Vitro Cell Dev. Biol. Amm 33.717-726
Bobrow, M , Madan. J. & Pearson, P. L (1972). Staining of some
specific regions on human chrusumes, particularly the second-
ary constriction of no. 9, Nature 238 122-124.
Bochacon-Ptallat, M. L.. Gabbtani, F.. Ropraz, P. & Gabbiant. G.
(1992)Culturcd aortic smooth muscle cells from newborn and
adult rats show distint cytoskclctal featres Differentiation
49 175-185
Bockhold. K.J.. Rosenblatt. J D.& Partridge, T A (1998). Aging
normal and dystrophic mouse muscle analysis of myogenictty
in cultures of living single fibres Muscle Nerve 21 173-183
Bodnar, A G.. Ouellette, M., Frolkis, M , Holt, S. E, Chiu, C.-P.,
Morin. G В, Harley, С. B.. Shay, J. W. Lichstcincr, S. &
Wright, W. E. (1998) Extension of life-span by introduc-
tion of telomerase into normal human cells. Science 279.
349-352.
Boggs, S S, Gregg, R G. Borcnstcin, N & Smithies, O. (1986).
Efficient transformation and frequent single-site, single-copy
insertion of DNA can be obtained in mouse erythroleuke-
mia cells transformed by electroporation. Exp. Hematol 14.
988-994.
Boglcr, O.. Wren, D., Barnett, S. C, Land. H. & Noble, M. (1990).
Cooperation between two growth (actors promotes extended
self-renewal and inhibits differentiation of ohgodendroeyte-
type-2 astrocyte (O-2A) progenitor cells. Proc. Natl Acad.
Sci. USA 87.6368-6372
Bolton. B. J & Spurr. N К (1996). B-lymphocytcs In Fresh-
ney, R. I & Freshney, M. G (cds ), Culture of immortalized
cells New York, Wiley-Liss, pp 283-298.
Bnnaventure,J.. Kadhom, N, Cohcn-Solal. L., Ng, К H., Bour-
guignon.J.. Lassclin, C. & Freisinger. P. (1994). Reexpression
of cartilage-specific genes by dedifferentiated human articular
chondrocytes in alginate beads Exp Cell Res. 212 97-104
Booth, C.& O'Shea, J A (2002). Isolation and culture of intesti-
nal epithclial cells. In Freshney, R I. & Freshney, M. G. (cds.).
Culture of epithelial cells 2'“' cd.. Hoboken. NJ. Wiley-Liss,
pp. 303-335
Buoyse, F. M , Scdlak, В J. & Rafclson, M E. (1975) Culture of
arterial endothelial cells: Characterization and growth of bo-
vine aortic cells. Thromb Dtathes Ahemorrh 34 825-839
Borenfreund, E.. Babich. H. & Martin-Alguacil.N. (1990) Rapid
chcmoscnsttivtty assay with human normal and tumor cells
tnvitro In Vitro Cell Dev. Biol 26.1030-1034
Bosen. D , Soriano. J. V , Chanson. M & Meda, P (1994). Hetero-
geneity and contact-dependent regu lation of ainy lasc release
by individual acinar cells./ Cell Physiol 160 378-388
Boshart, M., Weber, F, Jahn. G, Dorsch-Hasler, К, Flcckcn-
stetn. В & Schaffner, W (1985). A very strong enhancer
is located upstream of an immediate early gene of human
cytomegalovirus &//41.521-530
Bussis, L. Voutctakis, A, Matyakhina. L., Pack, S.. Abu-Asab, M„
Bourdcau, I.. Grtffin. K.J, Courcoutsakis, N.. Stcrgtopoulos.
S. Batista, D.. Tsokos. M & Stratakis. C A (2004). A plcio-
moqrhic GH pituitary adenoma from a Carney complex patient
displays universal allelic loss at the protein kinase A regulatory
subunit 1A (PRKARIA) locus./ Med Genet 41.596-600.
Bossolaseo, P.. Corti, S, Strazzer, S., Borsotti, C., Del Bo. R,
Fortunato. F., Salani, S, Qutrici. N, Bertoltni. F, Gobbi, A,
Debitors, G. L, Pietro Corni. G. & Soligo. D (2004) Skeletal
muscle differentiation potential of human adult bone marrow
cells. E\p. Cell Res. 295.66-78.
Bottcnstcin, J. E (1984) Culture methods for growth of neuronal
cells lines in defined media. In Barnes. D. W. Sirbasku, D A,
Список литературы
645
Sato. G. Н., eds.. Methods for Serum-Free Culture of Neuronal
and Lymphoid Cells,Nev. York, Alan R Liss. pp. 3-13.
Bottenstcin, J E. & Sato, G. (1979). Growth of a rat neuroblas-
toma cell line in scrum free supplemented medium Proc. Natl
Acad Sa USA 76 514-517
Boukamp. P., Pctruscvska, R. T.. Breitkrcutz, D, Hornung, J &
Markham. A (1988). Normal kcratintsation in a spontane-
ously nutuorCaltscd. aneuplutd hunian keratiiuieytc cell line.
J. Cell Biol. 106 761 -771
Bounllot. P Y., Waltzcr, L., Sergeant, A. & Manet. E. (1998)
Transcriptional repression by the Epstein-Barr virus
E BN A3 A protein tethered to DNA does not require RBP-
Jkappa.J Gen Virol 79 363-370
Bouzahzali, В, Nishikawa, Y., Simon. D. & Garr, В. I. (1995)
Growth control and gene expression in a new hepatocellular
carcinoma cell line. Hep 10 Inhibitory actions of vitamin К
J. Cell Physiol 165 459-467
Bowman. P D., Betz, A. L.. Ar, D., Wohnsky, J S, Penney, J B.,
Shivers, R. R & Goldstein, G. (1981). Primary culture of
capillary endothelium from rat brain In Vitro 17 353-362
Boxherger, H J_, Meyer, T F, Grausam, M C. Reich, К, Be-
cker, H. D. & Scssler, M. J (1997) Isolating and maintaining
highly polarized primary epithelial cells from normal human
duodenum for grow th as spheroid-like vesicles Ln Vitro Cell
Dev. Biol. Anim 33 536-545.
Bosnian, D L. A., Quax, P. H A. Lowick. C W G M, Papapoulos.
S.E.,Vcrhcijcn,J & Ponce, M. (1995) Differential regulation
of plasminogen activation in normal kcratinocytcsand SCC-4
cells by fibroblasts.J Invest Dermatol. 104 374-378.
Boyce, S T &Ham,R G (1983). Calcium-regulated differentia-
tion of normal human epidermal kcratinocytcs in chemical h
defined clonal culture and scrum-free serial culture./. Invest
Dermatol 81 33s-40s
Boyd, M , Mairs, R J.. Cunningham, S H, Mairs. S. C., McClus-
key, AG, Livingstone, A. Stevenson, K, Brown, M M..
Wilson L., Carilm, S. & Whcldon, T. E (2001), A gene
therapy targeted radiotherapy strategy for radiation cell kill
by[n,I]MIBG J Gen Med 3 165 172
Boyd, M . Mairs, R. J. Keith. W N., Ross, S. C. Welsh. P_.
Akabam, G . Owens, J ., Vatdyanathan, G , Carruthers. R..
Darrens. J & Zalutsky, M. R. (2004). An efficient targeted
radiotherapy / gene therapy strategy utilising human telom-
erase promoters and radioastatinc and harnassing radiation-
mediated bystander effects./ Gene Med 6 937 -947
Boyd, M, Mairs, S C., Stevenson, K.. Livingstone, A, Clark. A. M..
Ross, S. C & Mairs. R J. (2002) Transfectant mosaic spher-
oids a new model for evaluation of tumour cell killing in
targeted radiotherapy and experimental gene therapy./ Gene
Med 4 1-10
Boyd, M. R. (1989). Status of th NCI prcclinical antitumor drug
discovery screen Pnn Prac Oncol. 10 1-12
Boyd. M , Cunningham. S. H, Brown, M. M, Mairs. R J & Whel
don,T E (1999). Noradrenaline transporter gene transfer for
radiation cell kill by [,J1I] mcta-iodobcnzyl-guanidmc Gene
TherB.1147-52
Boy uni. A (1968a ). Isolation of leucocytes Irani buntan blood.
A two-phase system for removal of red cells with mcthylccl-
lulose as erythrocyte aggregative agent Scand.J Clin. Lah.
Invest (Suppl 97) 21.9-29
Boyum. A. (1968b). Isolation of leucocytes from humanblood
Futhcr obscrvations-mcthylecllulose, dextran and Ficoll as
erythrocyte aggregating agents Scand J Clin. Lah. Invest
(Suppl 97) 31 50.
Braa, S. S. & Triglia. D (1991). Predicting ocular irritation us-
ing three-dimensional human fibroblast culturcs-Cbsmefics
Toiletries 106 55-58.
Braaten, J. T, Lee, M J, Schewk, A & Mintz, D H (1974) Re-
moval of fibrohlastoid cells from primary monolayer cultures of
rat neonatal endocrine pancreas by sodium cthylmcrcunthio-
salyctlate. Biochem Biophys. Res Common 61,476 482
Bradford, C, S., Sun, L. & Barnes. D. W. (1994a). Basic FGF
stimulates proliferatron and suppresses melanogenesis m cell
cultures derived from early zebrafsh embryos Mol Mar. Biol
Biotech. 3 78-86
Bradford.C.S_ Sun, L.Collodi,P & Barnes D. W.(1994b).Cell
cultures from zebrafish embryos and adult tissues / Tissue
Cult Methods 16 99-107
Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quanti-
fication of microgram quantities of protein utilizing the prin-
ciple of protein-dye binding Anal Biochem. 72.248-254.
Bradley, C. & Pitts, J. (1994) The use of genctuc marking to
assess the interaction of sensitive and multirdrug resistant
cells in mixed culture. Br J. Cancer70 795-798
Bradley N J , Bloom, H J. G, Davies, A J. S & Swift. S. M
(1978a). Growth of human gliomas in immune-deficient
mice A possible model of prc-clinical therapy studies. Br.
J. Cancer 38.263.
Bradley, T R.. Hodgson, G. S & Rosendaal, M. (1978b). The
effect of oxygen tension on haemopoietic and fibroblast cell
proliferation tn viva. J. Ceil Physiol ST. (Suppl 1). 517-522
Bravery. C. A.. Batten. P.. Yacoub, MH, Rose, M L (1995)
Direct recognition of SLA-and HLA-hkc class II antigens
on porcine endothelium by human T cells results in T cell
activation and release of intcrlcukin-2. Transplantation 60
1024-1033.
Bredcr. J, Roller. S, Roller. Lu Schlaak, M. & vandcr Bosch,J
(1996) Induction of cell death by cytokines in cell cycle-
synchronous tumor cell populations restricted to Gl and G2
Exp Cell Res 223 259-267
Breen, G. A M. & Dr Vcllis, J (1974) Regulation of glycerol
phosphate dehydrogenase by hydrocortisone in dissociated
rat cerebral cell cultures Dev. Biol, 41.255-266.
Breitkrcutz, D. Stark. H.-J., Mirancca, N.. Tomakidi. P.. Stcm-
baucr, H. & Fuscing. N E. (1997) Integnn and basement
membrane normalization in mouse grafts of human keratmo-
cytcs. Implications for epidermal homeostasis. Diffirentiation,
61 195-209.
Brciunan, T R. Kent-, В R., Hcmmi, H. (1984) Studies of
growth and dffcrcnitiation of human myclomnonocytic Ic-
oukaemia cell lines in serum-free medium In Barnes. D. W.,
Sirbasku, D. A. & Sato, G. H. (eds,). Methods for serum-free
culture of neuronaland lymphoid ce/Zs, New York, Alan R. Liss,
pp 215-236.
Brctzcl, R. G. Bonath. К & Fcdcrlin. К (1990). The evaluation of
neutral density separation utilizing Ficull. sudtuui diatnzoat
and Nycodenz and centrifugal elutriation in the purification
of bovine and canine islet preparations. Hormone Metah. Res
(Suppl) 25 57-63
646
Список литературы
Brewer, G. J (1995). Serum-free B27/Ncurobasal medium sup-
ports differentiated growth of neurons from the striatum,
subsrantia nigra, septum, cerebral, cortex, cerebellum, and
dentate gyrus J. Neurosci Res, 42’674-683.
Bridger, J. M. (2004) Mammalian artificial chromosomes, modern
day feats of cngincenng-Isambard Kingdom Brunel style
Cytogenet. Genome Res. 107:5-8.
Briggs, R. & King T J. (I960)) Nuclear transplantation studies
on the early gastrula (Rana pipicns). I Nuclei of presumptive
endoderm Dev Biol. 1960Jun 2 252-270.
Bright. R. K. & Lewis, J. D. (2004). Long-term culture of normal
and malignant human prosatc epithelial cells. In Pfragncr,
R & Freshney, R I (cds.) Culture of human tumorous cells,
Hoboken, NJ, Wilcy-liss, pp. 125-144.
Brinch, D S. & Elvig, S. G (2001). Evaluation of an in vitro hu-
man corneal model as alternative to the m vivo eye irratiton
testing of enzymes. Toxicol Lett. 123. suppl. 1 22.
Brindle. К. M. (1998) Invcstigationg the performance of in-
tensive Mammalian cell bioreactor systems using magnetic
resonance imaging and spectroscopy. Biotech Genet Eng
Ret. 15.499-520
British Standard BS5726 (1992) Microbiological Safety
Cabinets. Parts 1 1 The Stationery Office. P.O. Box 276
Landon
Brito Babapulc, V'. (1981) Lateral asymmetry in human chromo-
somes 1,3,4.15 and 16 Cytogenet. Cel! Genet 29.198-202
Broekesj P, Fields, K. L. & Raff, M. C (1979). Studieson cultured
rat Schwann cells. J Estabbshiucntof purified populations from
cultures of peripheral nerve. Brain Res, 165 105-118.
Brouty-Boyc, D, Kolonias. D, Savaraj, N & Lampidis. T J
(1992). Alpha-smooth muscle actin expression in cultured
cardiac fibroblasts of newborn rat In Vitro Cell Dev Biol
28A. 293-296.
Brower. M , Carney, D. N., Oic, H. К, Gazdar, A. F. & Minna,J D
(1986). Growth of cell lines and clinical specimens of human
nonsmall cell lung cancer in a scrum-free defined medium
Cancer Res., 46 798-806
Brown, A. F. & Dunn, G. A (1989) Microintcrfcrometry ol
the movement of dry matter in fibroblasts J Cell Set, 92
379-389.
Brunk, C F, Jones, К C & James, T W (1979). Assay for
nanogram quantities of DNA in cellular homogenates. Anal
Biochem,92 497-500
Brunton. V'.. Ozannc, B., Paraskeva. C & Frame. M. (1997). A
role for epidermal growth factor receptor, c-Src and focal
adhesion kinase in an in vitro model for the progression ol
colon cancer Oncolene 14 283-293.
Bruyneel. E A , Debray, H . de Mcts, M Marcel, M. M , a
MontrcuLJ (1990). Altered glycosylation m Madm-Darby
canine kidney (MDCK) cells after transformation by murine
sarcoma virus. Clin Exp. Metastasis 8 241 253.
Bryan. D, Sexton. C. J., Williams, D., Leigh, I. M & McKay. I
(1995). Oral kcratinocy tes immortalized with the early region
of hu man papillomavirus type 16 show elevated expression ol
intelcukin 6. which acts as an autocrine growth factor for the
derived T103C cell line Cell Crouch Differ. В 1245-1250.
Bryan, T. M & Reddcl, R К (1997). Telomere dynamics and
telomerase activity in in vitro immortalised human cells. Eur
J Cancer.33.767-773.
Brysk, M M , Santschi, С. H.. Bell, T., Wagner, R F.. Jr
Tyrin, S K. & Rajaraman, S. (1992) Culture of basal cell
carcinoma J. Invest. Dermatol. 98 45-49
Bucana, CD, Giavazn. R..Nayar, R„ O'Brian, C. A., Scid, C., Earnest,
L. E. & Fan. D. (1990). Retention of vital dyescorrelatcs inversely
with the Multidrug-rcastant phenotype of adnamydn-selectcd
murine fibrosarcoma variants. Exp Cell Res, 190' 69.
Buchanan, S. S, Gross. S. A., Acker, J. P., Toner, M , Carpen-
ter, J. F. & Pyatt, D W (2004). Cryoprcscrvation of stem
cells using trehalose evaluation of the method using a human
hematopoietic cell line Stem Cell Dev. 13.295-305.
Buehler, P.. Reber. H A, Buehler, M. W.. Fncss, H.. Lavcy, R. S. &
Hines, О J. (2004). Antiangiogenic actavity of gcnistcin in
pancreatic carcinoma cells is mediated by the inhibition of
hypoxia inducible factor-1 and the down-regulation of
VEGF gene expression. Cancer 100 201-210
Buckingham, M. (1992) Making muscle in mammals Trends
Genet, 8 144-149.
Buchnng, G. C (1972) Culture of human mammary epithelia!
cells. Keeping abreast of a new method J. Natl Cancer Inst.
49 1433-1434.
Buick. R N.. Stanisic, T. H. Fry, S E.. Salmon, S. E, Trent,J M. &
Krosovich. P (1979) Development of an agar-methyl cellu-
lose clonogenic assay for cells of transitional cell carcinoma
of the human bladder. Cancer Res. 39.5051-5056
Buonassisi. V.. Sato, G. & Cohen. A 1(1962) Hormonc-produc-
ing cultures of adrenal and pituitary tumor origin. Pioc. Natl.
Acad Sci VSAi.8 1184-1190.
Burchell, J & Taylor-Papadimitrou, J (1989) Antibodies to hu-
man milk fat globule molecules. Cancer Invest, 17 53-61
Bnrchcil.J., Durbin. H & Taylor-Papadimitrou,J. (1983). Com-
plexity of expression of antigenic detenminants recognised
by monoclonal antibodies HMFG 1 and HMFG 2 in norma)
and malignant human mammary epithelial cells, J Immunol.
131 508-513.
Burchell, J, Gendlcr, S., Taylor-Papadimitrou, J. Girling. A,
Lewis, A., Milhs, R. & Lamport, D. (1987). Development
and characterisation of breast cancer reactive monoclonal
antibodies directed to the core protein of the human milk
mucin. Cancer Res. 47:5176-5482.
Burgess, W. H. & Maciag, T (1989). The heparin-binding fibro-
blast growth factor family of proteins Анни. Rev. Biochem.
58 575-606
Burke, J. F, Price. T.N. C. & Mayne, L. V (1996) Immortaliza-
tion of human astrocytes. In Freshney, R. I. & Freshney, M. G.
(cds.). Culture of immortalized cells. New York, Wiley-Liss,
pp. 299-314
Burrows. M T (1912) Rhytmischc Kontraktioncn dcr isolicrtcn
Herzrnuskelzellc Ausscrhalb des Organismus. Miinch Med.
WochenschrUX.. 1473.
Burwcn, S. J & Pitdka. D R. (1980). Secretory function of lac-
tating moose mammary epithelial cells cultured on collagen
gels Exp Cell Res. 126 249-262.
Butler, M (1991) Mammalian ceil biotechnology. Oxford. IRL
Press at Oxford University Press, Butler M & Christie. A.
(1991) Adaptation of tnaiti inalian cells to non-ammoniagcnic
media. Cytotechnology 15 87-94.
Cable. F. F_. Isom, H. C. (1997). Exposure of primary rat hepa-
tocytes in long-term DMSO culture to selected transition
Список литературы
647
metals induces hepatocyte proliferation and formation of
duct-ltke structures. Hepatology 26.1444-1457
Cai, J, Weiss, M L., Rao, M. S. (2004). In search of "sternness”
Exp Hematol. 32.585-398.
Calder, C. J., Livcrsidgc. J. & Dick. A. D (2004) Murine re-
spiratory tract dendritic cells: isolation, phenotyptng and
functional studies J Immunol. Metho ds 287 67-77
Campion D.G. (1984) The ninscle satellite cell — a review. Int.
Rev, Cytol 87 225-251
Camps, J.. Morales, C., Prat, E.. Rilias, M., Capella, G, Egozcue, J..
Peinado, M A & Miro, R. (2004). Genetic evolution in colon
cancer KM 12 cells and metastatic denvates. Int J Cancer.
110 869-874
Cancedda, R. Dozin, B., Gtannoni, P & Quarto, R (2003) Tis-
sue engineering and cell therapy of cartilage and bone. Matrix
Bio! 22.81-91
Cancela. M. L., Hu. B. & Price. P. A (1997). Effect of cell density
and growth factors on matrix GLA protein expression by
norma) rat kidney cells J. Cel! Physio! 171 125-134
Caniggia, I, Tscu. I.. Han, R. N., Smith, ВТ. Tanswcll. K. &
Post. M (1991) Spatial and temporal differences m fibroblast
behavior in fetal rat lung Am.J. Phy.•io!. Lung Mo! Cell Physiol
261 L424-L433
Саи. B., Zheng, B.. Jankowski, R. J.. Kiiuura, S , Ikezawa, M ,
Deasy, В., Cummins, J., Eppcrly. M , Qu-Petersen, Z. &
Hoard. J (2003) Muscle stem cells differentiate into hae-
matopoetic lineages but retain myogenic potential Nat. Cell
Bio! 5.640-646.
Cao. D.. Lin, G, Wcstphalc, E. M, Beyer, E. C. & Steinberg, T H
(1997) Mechanisms fertile coordination of intercellular calcium
signaling in insulin-secreting cells./. Cell Sci 110 497-504
Caplan. A I (1991.). Mescnchvmal stem cells J. Orthop Res 9
641 650.
Caputo, J L. (1996) Safety procedures. In Freshney, R L. <S
Freshney M.G.(eds.). Culture of immortaked cells New York.
Willey-Liss. pp. 25-51.
Carlsson, J. & Nedcrman. T. (1989). Tumour spheroid techno!
ogy in cancer therapy research. Eur. J. Cancer Clin Oncol.
25 1127-1133
Carmichael, J.. DeGraff. W. G.. Cazdar. A. F., Minna, J D &
Mitchell, J В (1987a). Evaluation of a tetrazolsuin-based
semiautomated colorimetric assay. Assessment of chcmoscn-
sitivity testing Cancer Res 47 936-942
Carmichael, J., DeGraff. W. G., Cazdar. A. F., Minna. J D. &
Mitchell, J. В (1987b) Evaluation of a tctrazolsum-based
semiautomated colorimetric assay. Assessment of radiosen-
sitivity testing Cancer Res 47.936-942
Carney, D. N, Bunn, P A, Gardar, A. F.. Pagan, J A. & Min-
na, J. D. (1981). Selective growth in serum-free hormone-
supplementcd medium of tumor cells obtained by biopsy from
patients with small cell carcinoma of lung Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 78 3185-3189.
Carney, D N., Cazdar, A. F, Bcplcr, G., Guccion, J. G., Marangus, P.J.,
Moodt, T. W., Zweig, M H. & Minna, G. D. (1985) Establish-
ment and identification of small cell lung cancer cell lung having
classic and variant features. Cancer Rec, 45 2913-2923
Carpenter, G & Cohen, S. (1977) Epidermal growth factor In
Acton, R T & Lynn. J D. (cds.), Cell culture and its applica-
tion New York, Academic Press, pp 83-105.
Carraway. К L.. Frcgien, N, Carraway. К L & Cartaway. C A
(1992) Tumor sialomucin complexes as tumor antigens and
modulator of cellular interactions and proliferation J. Cell
Sci 103.299-307
Carrel. A (1912). On the permanent lift of tissues outside the
organism./ Exp Med. 15 516-528
Carrel. A. & Ebeling, A. H (1923). Survival and growth of fibro-
blasts in vitro J. Exp Med XXXVIII 487.
Cartwright. T &Shah,G P (1994). Culture media In Davis, M
(cd ) Basic cell culture, a practical approach. Oxford, UK
IRL., Presss in Oxford University Press, pp 58-91
Carvalho. K. A., Cuanta-Soiiza, L. C., Rcbclatto. C. L.. Senega-
glia, A. C., Hansen, P, Mendonca, J. G, Сигу, C. C.. Francis-
co, J. C & Brofman, P R (2004). Could the cocultureof skeletal
myoblasts and mesenchymal stem cells be a solution for postin-
farction miocardtal scar? Transplantat Proc. 36.991-992.
Casanova, J. E. (2002). Epithelial cel cytoskeleton and intracel-
lular trafficking. V. Confluence of membrane trafficking and
motility tn cpithaclial cell models. Am.J. Physiol. Gasoointest.
Liver Physiol. 283 (5). G1015-G1019
Caspcrson, T, Farber, S., Foley, С. E., Kudinowski. J, Mod-
est. E J., Simonsson, E., Wagh. U & Zech. L. (1968) Chemi-
cal differentiation along metaphase chrtomosomes Exp. Cell
Res 49 219-222
Cataldo, L. M., Wang, Z & Ravid, K. (1998) Electroporation of DNA
into cultured cel lines. In Ravid, K., A Freshney, R. I. (cds). DNA
transfer to cultured cells. New York. Wiley-Liss, pp. 55-68.
Cavallaro, U. & Chnstofon. G (2004). Cell adhesion and signal-
ling by cadhcrins and Ig-C AMs in cancer. Natl Rev. Cancer
4. 118 132.
CDC Office of Health & Safety (1999) Biosafety in Microbio-
logical and Biomedical Laboratories (BMBL) 4"' Edition.
US. Department of Health and Human Services, Centers for
Disease Control and Prevention, and National National Instit-
tutes of Health, Fourth edition. May, 1999 US Government
Printing Office, Washington. 1999.
Centers for Disease Control. (1988). Update. Universal precau-
tions for prevention of transmission of human immunodefi-
ciency virus, hepatitis В virus, and other blood-borne patho-
gcncs in healthcare settings MMWR 37 377-382.387,388
Ccnani, R. L, Taylor-Papadiniitnou, J., Peterson. J. A. &
Brown, P. (1979) Characterization of cells cultured fromcariy
lactation milks In Vitro 15-356-362
Chambard, M., Mauchamp, J & Chaband, O. (1987) Synthesis
and apical and basolateral secretion of thyroglobulin by thy-
roid cell monolayers on permeable substrate Modulation by
thyroptropin./ Cell Physiol 133.37-45.
Chambard. M, Verner, В. Gabnon J, Mauchamp J.. Bugeia, J C.,
Pciassy. C. & Mercier, В (1983). Polarization of thyroid cell
in culture: Evidence (or the Iiasolateral localization of the
lodid «pump» and the thyroid-stimulating hormone ticcptor-
adrnyl cyclase complex./ Cell Bio! 96.1172 1177
Chang, H & Bascgra, R. (1977). Time of replication of genes
responsible for a temperature sensitive function ma cell cycle
specific to mutant from a hamster cell line/ Cell Physiol 92
333-343
Chang. R S.(1954) Continuous subcultivation of epithelial-like
cells from normal human tissues. Proc Soc. Eip. Biol Med
87.440-443.
648
Список литературы
Chang, S. Е. & Taylor-Papadimitnou. J. (1983) Modulation ol
phenotype incultures frini human milk epithelial cells and
its relation to the expression of a membrane antigen. Cell
Differ 12.143-154
Chang,S.E.. Keen, Lane,E B.& Taylor-Papadimitriou.J.(1982)
Establishment and characterisation of SV40-transformed hu-
man breast epithelial cell lines Cancer Res 42- 2040-2053.
Chaprnmer. D. M & McKeehan, W L (1986) Serial culture of
adult hiinan prostatic epithelia) cells m serum-free medium
containing low calcium and a new grow th factor from bovine
brain Cancer Res A6 819 -824
Chen. С.-S.. Toda, К -I, Maruguchi, Y. Matsuyoshi.N.. Horngu-
chi, Y.& Iroamura.S (1997). Establishment and characterisa-
tion of a no vel tn vitro angiogenesis model using a microvascu-
lar endothelial cell line. F-2C. cultured mchemically defined
medium In Vitro Cell Dev. Biol. Anim 33 796-802
Chen, T. C, Cunhoys, N P. Lagenaur, C. F. & Puschett, J В
(1989). Characterisation of primary cell cultures derived
from rat renal proximal tubules. In Vitro Cell Dev Biol. Anim
25 714 722.
Chen. T. R. (1977). In situ detection of inycoplasin contamination
in cell culture by fluorescence Hocclist 33258 stain Exp Cell
Res 104 255.
Cherry, R. S. & Papoutsakis E.T (1990).Ljjdcrstaiiditigandcon-
trolling fluid-mechanical injury of animal cells in hiorcactors.
In Spier., R E. & Gnggitlis. J.В Animal Cell Biotechnology,
VoL4, London. Acad. Press pp 71-121
Cho,J -K & Bikie, D D (1997). Decrease of Ca-ATPasc activity
in human kcratinocytcs during calcium-induced diffcrencia-
tion J CellPhystol. 172.146 154
Chopin. D , Barci-Moniri. R_ MaillcP., Le Frcre-Bclda, M
A., Muscatclli-Groux, B., Mcrendino N. Lccerf. L. Stop-
pacciano, A. & Velotti, F. (2003). Human urinary bladder
transitional cell carcinomas acquire the functional Fas ligand
during tumor progression Atn.J Pathol 162.1139-1149
Chopra, D P.. Xue-Hu, I. C. (1993). Secretion of alpha-amylase in
human parotid gland cpythclial cell in culture../ Cell Physiol
155:223-233
Chopra. D P. Grignoil. D. J.. Joiakim, A., Mathieu. P A, Mo-
hamed. A.. Sakr, W A. Powell. I. J.. Sarkar, F H (1996)
Differential growth factor responses of epathelial cell cul-
tures derived from normal human prostate, bening prostatic
hyperplasia andprnnary prostate carcinoma J Cell Physiol.
169.269-280.
Christensen. В, Hansen. C, Kieler, J & Schmidt,J. (1993). Iden-
tity of non-malignant human ungenital cell lines classified
as transformation grade I (TGrI) and II (TgrII). Anttcancei
Res 13.2187-2191
Chu, G. Hayakawa, H. & Berg, P. (1987). Electroporation for the
efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic
Acids Res 15 1311 1326
Cicearonc. V , Hawley-Nelson, P., Gcbeychu, G .Jessee, J. (1993)
Cationic liposome-mediated transfection of cucariotic cells
high-efficiency nucleic-acid delivery with lipofectin™, Lipo-
fectacc™ and Lipofcctainine ™ reagents FASEBJ. 7: Al 131
Сюне, C . Filoni, S., Aquila. C, Bernardini, S & Bosco. L. (1986)
Transdifferentiation of eye tissue in anuran amphibians.
Analysis of the transdiffcrentiation capacity of the iris of
Xenopus laevis larvae. Differentiation. 32 215-220.
Clarke, G D. & Ryan, P . J (1980). Tranquilizers can block mi-
togenesis in 3T3 cells and induce differcnciation in Friend
cells. Nature 287.160-161.
Clayton, M.. Bower, D. J , Clayton. P R. Patck, С E, Ran-
dall. F. E, Sime, C.. Wainright. N. R & Zchir. A (1980)
Cell culture in the investigation of normal and abnormal dif-
ferentiation of eye tissues. In Richards. R J. & Rajan, К T.
(eds.). Tissue culture in medical research (II). Oxford. UK,
Pergamon Press
Cobbold, P. H. & Rink, T. J. (1987) Fluorescence and biolumi-
nesccnce measurement of cytoplasmic free Ca2’ Biochem. J.
248 .313
Cohen, C, Roguctt. R.. Cottin. M« Olive, C., Lcclairc,J & Rou-
gier, A (1997). The use of Episkin, a reconstructed epider-
mis, in the evaluation of the protective effect of sunscreens
against chemical bpoperoxidation induced by UVA.J. Invest
Derematol 108 77
Cohen, S (1962). Isolation of a mouscsubmaxillary gland protein
accelerating incisor eruption and eyelid opening in the new-
born anima) J Biol Chern 237.1555-1562.
Cole, J, Fox, M., Garner. R. C. McGregor. D. В & Thacker, J
(1990). Gene mutation assays in cultured mammalian cells.
In Kirkland, D. J fed.). Basic mutagenicity tests UKEMS
recommended procedures. Part I (revised) Cambridge, U К ,
Cambridge University Press
Cole, R J. & Paul. J (1966) The effect of crythropoctin on
haem system in mouse yolk sac and cultured foetal liver cells.
J.Embnol Exp Morphol 15,245-260
Cole, S. P. C. (1986). Rapid chcmosensitivity testing of human
lung tumour cells using the MTT assay Cancer Chemother.
Pharmacol. 17- 259-263
Collen. D. St-usenJ M.. Marafino, B.J Jr. Builder, S, DcCock, F.,
Ogez, J., Tajin. D., Pcnmca. D.. Bennett, W F., Salwa,J. ct a).
(1984) Biological properties of human tissue-type plasmino-
gen activator obtained by expression of recombinant DNA in
mammalian cells J Pharmacol. Exp. Ther. 231 146-152.
Collins. С. H. & Kennedy, D. A. (1999). Evolution of microbio-
logical safety cabinets. Br.J Biomed. Set. 56 161 169
Collins. S. J.. Gallo, R C & Gallagher. R E (1977). Continuous
growth and differentiation of huiaan myeloid leukaemic cells
in suspension culture. Nature 270.347 -.349
Collodi, P. (1998) DNA transfer to blastula-derived cultures from
zebra fish In Ravid, К & Freshney. R. I (eds.), DNA transfer
to cultured cells. New York, Wiley-Liss, pp 69-92
Collodi, P.. Barnes, D. W (1990) Mitogenic activity from trout
embryos Proc Natl. Acad Sci. USA 87 3498-3502.
Collodi, P., Kamei. Y. Ernst, T.. Miranda, C. Buhler, D. R. &
Barnes, D. W. (1992). Culture of cells from zebrafish (Bra-
chidanio reno) embryo and adult tissues. Cell Biol. Toxicol.
8 43-61
Compton, С C , Warland, G. Nakagawa, H, Opitz, O. G. &
Rusgi, A K. (1998) Cellular characterization and successful
transfection of serially subcultured normal human esnphageal
kcrationocytcs J. Cell Physiol 177.274-281
Coon. H D (1968) Clonal cultures of differentiated rat liver
cells./ Cell. Biol. 39 29a
Coon. H. D & Cahn, R. D (1966) Differentiation in nitro Ef-
fects of Sephadex fractions of chick embryo extract. Science
53 1116-1119.
Список литературы
649
Cooper, Р D.. Burt, А. М& Wilson. J N.(1958). Critical effect of
oxygene tension on rate of growth of animal cells in continu-
ous suspended culture. Nature 182 1508-1509.
Cooper, S & Broxmeyer, H. (1954). Purification of murine
granulocytc-macrofagc progenitor cells (CFC-GM) using
counterflow centrifugal elutriation In Freshney, R L, Prag-
ncll. I В & Freshney. M. D. feds ), Culture of haempopoetit
cells. New York. Willey-Liss, pp 223-234.
Conclli.L.L .Tall. M.G & Gaskill, H.(1958).Common antigencs
m tissue culture cell lines. Science 128 198
Cou, J. Y (1978) Establishment of clonal human placental cells
synthesizing human chorionadotropin Proc Natl Acad. Sci.
USA 75 1854-1858.
Courtenay, V. D.. Selby, P. L, Smith, I. E., Mills,J. & Peckham. M.J.
(1978). Growth of human tumor cell colonics from biopsies
using two soft-agar techniques. Br. J Cancer 38 77-81.
Coutinho. L. H-. Gillcccc. M. H-, de Wynter, E. A., Will. A &
Tcasta, N. G (1992). Clonal and long-term cultures using
human bone marrow. In Tcasta,N G & Moulincux, G. (cds.).
Haemopoests:A practical approach. Oxford, UK., IRL Prssat
Oxford University Press, pp. 75-106
Crabb, I W_, Armes, L G .Johnson, С. M & McKeehan, W. L
(1986) Characterization of multiple forms of prostatropin
(prostate epithelial growth factor) from bovine brain. Bio-
chem. Btophys. Res Commun. 136:1155-1161
Creascy, A. A., Smith, H. S., Hackett, A L, Fukuyama, K.. Ep-
stein. W L. & Madin, S. H. (1979) Biological properties of
human melanoma cells in culture. In Vitro 15 342
Croce, (' M. (1991) Genetic approaches to study of the
molecular basis of human cancer. Cancer Res (Suppl) 51:
5015s-5018s
Cronaucr, MV, Eder. I. E, Hittmair. A.. Sicrek. G.. Hobisch. A-
Culig, Z, Thunhur, M, Bartsch. G & Klockcr, H (1997) A
rehblc system for the culture of human prostatic cells In Vitro
Cell Dev. Biol. Anim 33.742-744
Crouch, E. C, Stronc. K. R, Bloch. M. & McDivitt, R W. (1987)
Heterogeneity mthc production of collagens and fibronectin
by morphologically distinct clones of a human tumor cell
line. Evidence for intratumoral diversity in matrix protein
biosynthesis Cancer. Res 47.6086-6092.
Cruickshaank, C N D & Lowbury.E. J. L.(1952). Effect of ati-
biotics on tissue culture of human skin Br Med. J 2:1070
Csoka, K.. Nygrcn, P- Graf, W„ Pahlman, L, Glimclius, B. &
Larsson, R. (1995). Selective sensitivity of solid tumors to
suramin in primary cultures of tumor cells from patients Int.
J. Cancer63 356-360
Cuttitta, F.. Carney, D. N., Mulshinc. J. M., Moody, T. W. Fe-
dorko, J , Fichlcr. A & Minna. J. D. (1985) Bombesin-like
peptides can function as autocrine growth factors in human
small-cell lung cancer. Nature 316.823
Dairkce, S. H , Deng. G, Stampfer, M R.. Waldman, F M. &
Smith, H. S. (1995) Selective cell culture of primary breast
carcinoma. Cancer Res. 55 2516-2519
Dairkce. S. H.. Paulo, S C , Traquina, P, Moore, D. H , Lju-
ing. В M. & Smith. H. S (1997). Partial enzymatic degrada-
tion of struma allows enrichment and expansinn of primary
breast tumor cells Cancer Res 57 1590-1596.
Damon, D H . Lobb, R R, D’Amore, P A & Wagner. J A
(1989) Heparin portcntiate the action of acidic fibroblast
growth factor by prolonging its biological half-life J Cell.
Physiol 138.221 226.
Danen, E. H. & Yamada, К. M. (2001) Fibromccti, integnns, and
growth control./. Cell. Physiol 189 1 13.
Dangle, V, Fcmcnia. F, Lame, V., Bcrthclmy, M., LcRhun, D.,
Poupon, M F, Levy. D & Schwartz-Cornil. I (1997).Two
and three-dimensional cell structures govern epidermal
growth factor function on human bladder carcinoma cell lines
Cancer. Res. 57.3360-3364
Danielson, К G_. McEldrew, D. Alston, J T., Ruling, D B.,
Damjanov, L, Daska, I & Spinner, N (1992). Human colon
carcinoma cell lines fcom the primary tumopr and a lymph
node metastasis In Vitro Cell Dev. Biol. 28A. 7 10
Darcy, К M.. Shoemaker, S. F., Lee, P.-P. H. Vaughan. M M.,
Black, J D & Ip, M M (1995). Prolactin and epidermal
growth factor regulation of the proliferation of normal rat
mammary epithelial cells in three dimensional primary cul-
ture J. Cell Physio! 163.346-364.
Darlmg.J. L. (2004) In vitro culture of malignant brain tumors In
Pfragncr, R. & Freshney, R I (cds.) Culture of human tumor
cells. Hoboken, NJ. Wiley-Liss. pp. 349-372.
Darnel, J E (1982) Variety in the level of gene control in cu-
caryotic cells Nature 297 365-371
Dart. J (2003). Conical toxicity the epithelium and stroma in
iatrogenic and factitios disease Eye 17 886-892
Das, A V., James, J.. Zhao, X., Rahnenfuhrcr, J & Ahmad, I.
(2004) Identification ofc-Kit receptor as a regulator of adult
neural stem cells in the mammalian eye. interaction with
Notch signaling. Dev. Biol 273 (1). 87 105
Davies. В , Brown. P D., East, N, Cnmmin, M. J. & Balk-
will, F R. (1993) A synthetic matrix metalloproteinase bur-
denand prolonging survival of mice bearing ovarian carcinoma
xenografts Cancer. Res 53 2087-2091
Davis. J. B. & Stroobant, P. (1990) Platelet-derived growth
factors and fibroblast growth factors arc mitogens for rat
Schwann cells./ Cell. Biol. 110.1353-1360
Davison P M.Bensch, R & Karasck. MA.(1983) Isolation and
long-term serial cultivation of endothelial cells from microvcs-
sclsof the adult human dermis. In Vitro 19.937-945.
Dawe, C J. & Potter, M. (1957). Morphologic and biologic pro-
gression of a lymphoid neoplasm of the mouse tn vivo, and in
vitro Am J. Pathol 33.603.
Degos. L. (1997). Differentiation in acute promyclocytic leuke-
mia European experience J. Cell Physiol 173 285-287
DeLarco,J. E & Todaro, G. J (1978) Epithelioid and fibroblas-
totd rat kidney cell clones: Epidermal growth factor receptors
and the effect of mouse sarcoma virus transformation./. Cell
Physiol. 94.335-342.
De Let}, L., Poppema. S, Nulcnd, I. K.. Haar, A. T.. Scliwander, E.,
Ebbens, F., Postmus, P E. & The, T H. (1985). Neuroendo-
crine differentiation antigene on human lung carcinoma and
Kulchitski cells. Cancer Res. AS 2192-2200.
Del Vecchio, P & Smith, J. R (1981). Expression of angiotensin
converting enzyme activity in eulturated pulmonary artery
cndothehal cells./ Cell. Physiol. 108 337-345.
Del Vecchio, S. Stoppell, M. P., Carricni. M. V., Fouti, R.,
Massa. О Li, P Y, Botti, G. Cerra, M. d’Amto G, Es-
positi, G, Salvatore, M (1993) Human urokinase receptor
concentration tn malignant and benign breast tomiiurs by in
650
Список литературы
ttfro quantitative autoradiografy. Comparison with urokinase
levels. Cancer. Res., 53 3198-3206.
DeMars, R (1958). The inhibition of glutamine of glutamiyl
transferase formation in cultucrc of human cells. Biochem
Btophys Acta 27.435-436.
Demers, G W. Halbert, C L. & Galloway, D. A. (1994). Elevated
wild-type p53 protein levels in human epitheliil cell lines
immortalized by the human papillomavirus type 16 E7 gene
Viiogy 198 169-174
Deng, J., Stcmdlcr, D A, Lay well, E. D & Petersen, BE (2003)
Neural trans-diffcrcntiation potential of hepatic oval cells in
the neonatal mouse brain, Evp Neurol 182 373-382
Dennis. C. (2003). Developmental biology. Synthetic sex cells.
Nature. 424 364-366
Dennis, C , Gallagher, R & Campbell, P. (2001). The Humane
Genome. Nature 209 813-858.
Department of Health and Social Security. (1986) Good Labora-
tory Practice. The United Kingdome Compliance Programme
London HMSO.
De Ridder, L. (1997) Autologous confrontation of brain tumor
derived spheroids with human dermal spheroids. Anticancel
Res. 17.4119-4120
De Ridder, L & Calliauw, L (1990). Invasion of human brain
tuiuor tnvitro. Relationship to clinical evolution.,/. Neurosurg
72.589-593.
De Ridder, L & Mareel. M. (1978). Morphology and ,a*I-concen-
tration of embryonic ehiek thyroids cultured m an atmosphere
of oxygen Cell Biol Int. Rep 2.189-194.
Desai, К V . Kavanaugh, C. J., Calvo. A & Green. J E. (2002)
Chipping away at breast cancer insights from microarray
studies of human and mammary cancer Endoc. Relat. Cancer
9 207-220
Deshpande. A. К. Baig. M A, Carleton. S, Wadgoankar. K. &
Siddiqui. M A. Q. (1993). Growth factors activate cardio-
genic differentiation in avian mesodermal cells Mol Cel!
Differ, i 269-284.
De Silva, R_, Моу, E. L & Reddcl R R (1996). Immortaliza-
tion of human branchial epithelial cells In Freshney, R I &
Freshney M G. (cds.) Culture of immortalized cefis.New York
Wiley-Liss. pp. 121-144
De Silva, R, Whitaker, N.J, Rogan. E M & Reddcl, R.R.( 1994)
HPV-16 E6 and E7 genes, like SV40 early region genes, arc
insnfficcnt for immortalization of human mesothelial and
bronchial epithelial cells Exp Cell Res. 213 418-427
Dctnsac, C J, Sens, M A.. Garvin. A J.. Spicer, S S. & Sens, D. A.
(1984) Tissue culture of human kidney epithelial cells of
proximal tubule origin. Kidney Int 25 383-390
De Vitry, F, Camier. M , Czcrnichow. P . Benda P.. Cohen. P &
Tixicr-Vidal. A. (1974). Establishment of a done of mouse
hypothalamic neurosecretory cells sinthcsizmg neurophysin
and vasopressin. Proc Natl Acad Set USA 71 3575-3579.
De Vonne. T. L. & Mouray, H (1978). Human a2-macroglobulin
and its antitrypsin and antithrombin activities in scrum and
plasma. Clin Chem Acta 90.83-85.
De Vries, J. E., Diniens, W . N. M , De Bruync, G K., Ver-
spaget. H W . van dec Linden, E. P M , de Bruine, A. P ,
Mareel, M M., Bosman, FT & ten Kate. J. (1995) fowoand
tn vitro invasion in relation to phenotypic characteristics of hu-
man colorectal carcinoma cells Br. J Cancer 71 271-277.
De Wever, O.. Westbrock, W.. Vcrlocs. A., Blocmen. N ,
Brackc, M ., Gcspach, C., Bruyncel. E, Mareel, M (2004).
Critical role of N-cadhcrin in myofibroblast invasion and
migration tn vitro stimulated by colon-canccr-ecll-dcrivcd
TGF-p or wounding J Cell. Set. 117.4691-4703
De Wyntcr, E., Allen, T-, Coutinho, L, FlavcII, D.. Fla veil. S. U. &
Dexter. T J. (1993) Localisation of granulocyte macrophage
colony - stimulating factor in human long-term bone marrow
cultures./ Cell Sa 106 761-769.
Dexter, T. J, Spooncer. E_ Simmons, P. & Allen, T. D. (1984).
Long-term marrow culture An overview of technique and
experience In Wright. D G. & Crccnbcrgcr, J S. (cds.),
Longe-term bone marrow culture. New York. Alan R Liss
Kroc Foundation Series 18. pp. 57-96.
Dexter. T. M., Allen, T D., Scott. D & Tcich, N M. (1979)
Isolation and caractcrisation of a bipotcntial haemopoietic
cell line. Nature 277.417-474.
Dexter, T. M, Testa. N. G.. A Hen, T. D, Rutherford. S. & Scolnick,
E (1981). Molecular and cell biological aspects of cry thropoi-
csis in long-term bone marrow culture Blood 58 699-707
Dickson, M. A.. Hahn, W. C., Ino, Y.. Ronfard, V., Wu, J. Y, Wein-
berg, R. A., Louis, D.N, Li, F P,Louis, D.N- Li,F.P.. A Rhe-
inwald. J C. (2000). Human keratuiocytcs that express hTERT
and also bypass a p!6 (INK4a)-cnforccd mechanism that hunts
life span become unmortal retain normal growth and differen-
tiation characteristics Mol. Cell Biol 20 1436-1447
Dickson,J D.Flanigan,T.P & Kcmshcad,J.T.(1983) Mono-
clonal antibodies reacting specifically with the cell surface of
human astrocytes in culture. Biochem. Soc. Trans. 11 208.
Dimitroulakos, J, Squire, J., Pawlin, G. & Yeger, H. (1994).
NUB-7: A stablc-1-typc human neuroblastoma cctllinc ind-
duciblc along N-and S-type cell lineages Cell Growth Differ.
5 373-384
Dinnen. R & Ebisuzaki, К (1990) Mitosis may be an obligatory
route to terminal differentiation in the Friend erythroleuke-
mia cell Exp Cell Res., 191 149-152
Dirks, W.G.. MacLeod, R A F & Drexler. H. C. (1999) ECV304
(endothelial) is really T24 (bladder carcinoma) cell hue
cross-contamination at source. In Vitro Cell Dev. Biol. Antm.
35.558-559
Dobbs, L. G. & Gonzalez, R. F. (2002) Isolation and culture of
pulmonary alveolar epithelial type II cells In Freshney, R. I. &
Freshney, MG. (cds). Culture of epithelial cells, 2nd cd.,
Hoboken, NJ, Willey-Liss, pp. 278-301.
Dobbs, L. G-, Plan, M., Dumars, S., Maglio, M , Alien. L. (1997).
Maintenance of the differentiated type II cell phenotype
by culture with an apical air surface. Am J. Physiol. 273.
L347-L354
Dodson, M. V, Mathison, B. A. & Mathison, В D (1990). Effects
of n icdium and substratum on ovine satellite cell attachment,
proliferation and differentiation. In Vitro Cell Dev. Biol 29
(1). 59-66.
Doering, С. B., Healey, J. F, Parker, E. T., Barrow, R. T & Lol-
lar. P (2002) High level expression of recombinant porcine
coagulation factor VIII J. Biol Chetn 277 38345-38349.
Doherty, P , Ashtini, S. V, Moore, S E. & Walsh, F. S. (1991).
Morphoregulatory activities of NCAM andN-cadhcnncan be
accounted for by G-protein-dependent activation of L-andN-
typc neuronal Ca2*-ehanncls. Cel! 67.21-33.
Список литературы
651
Dolbcare. F, Selden, J. R. (1991) Immunochemical quantitation
of bromodeoxyuridtnc: Application to ccll-eyele kinetics.
Metod Cell Bio! 41.297-316
Dorazio.J A,Cole, В C & Steinstreilein,J.(1996). Mycoplas-
ma-arthnttdis mitogen up-rcgulatcs human NK cell activity.
Infect. Immun 64 (2). 441-447
Dotto. G P., Parada. L. F. & Weinberg, R. A 11985). Specific
growth response nf rax-transformed embryo fibroblasts to
tumour promoters. Nature 318 472 175
Doucctrc.J R. (1984) The glial cells in the nerve fibre layer of
the rat olfactory bulb. Anal. Rec 210.285-391.
Doucette. J R. (1990). Gbal influences on axonal growth tn the
primary olfactory system Cha 3.433-449.
Douglas, J L. & Quinlan, M.P. ( 1994) Efficient nuclear localiza-
tion of the Ad5 E1A12S protein is necessary for immortaliza-
tion but not cotransformatnin of pnmarv epithelial cells. Cell
Growth Differ. 5 475 183.
Douglas, W. H J, McAtccr, J A.. Dell'Orco, R. T & Phelps. D
(1980) Visualization of cellular aggregates cultured on a tlirec
dimcnttonal collagen sponge matrix In Vitro 16 306-312.
Dow, J, Lindsay. G & Morrison. J (1995). Biochemistry,
molecules, cells and the body. Workingham, U.K Addison
Wesley
Doyle, A. & Bolton, В J (1994). The quality control ol cell
lines and the prevention, detection and cure of contamina-
tion. In Davis. J. M. (cd.), Basic cell culture, a practical ap-
proach Oxford, U К, IRL Press at Oxford University Press
pp. 242-271.
Doyle, A., Griffiths, J. В & Ncwail. D G (eds.) (1990-1999).
Cell and tissue culture tlaboratory procedures Chichester.
UK. Wiley.
Doyle, A. Morns. C & Mowcl. J. M. (1990) Quality control. In
Doyle, A, Hay., R. & Kirsop. В E. (eds ) Animal cells, liv-
ing resources for biotechnology. Cambrige, U.K. Cambridge
Uni veretty Press. pp 81-100
Draper, J. S., Pigott, C., Thomson, J. A. & Andrews, P. W. (2002).
Surficc antigens of human emhrionte stem cells, changes upon
differentiation tn culture./ Anal 200:249-258.
Drejer. J.. Larsson. О M & Schousbue. A (1983). Characteriza-
tion of uptake and release processes for and </-a»d /-aspartate
in primary cultures of astrocytes and cerebellar granule cells
Neurochem Ref 8.231-24.3
Drexler. H. G, Dirks, W. G-, Matsuo, Y & McLeod. R. A. (2003).
False leukemia-lymphoma cell lines an update on over
500 cell lines. Leukemia 17.416 126.
Drexler, H. G, Gignac. S M. Hu, Z-B. Hopert. A., Flcckcn-
stcin, E.. Vigos M. & Uphoff, С C (1994). Treatment of
mycoplasma, contamination in a large panel of cell cultures
In Vitro Cell Dev Biol 30A 344-347.
Drexler. H. G. (2004). Establishment and culture of human leu-
kemia-lymphoma cell lines In Pfragner R. & Freshney, R. I
(eds), Culture of human tumor cells. Hoboken. NJ. Wiley-Liss.
pp .319-348.
Drexler, H C. & Mmowada, J. (2000) Human leukcmia-lyom-
phona cell lines, historical perspective, state of die art and
future prospects. In Masters. J. R. W. & Palsson, В. O. (eds.).
Human ceil culture. Vol. Ill Cancer cell lines, Part 3' Leuke-
mia and lymphomas. Dordrecht, The Netherlands. Kluwer,
pp. 1-88
Dncvcr. W. & Rangtni. Z. (1993) Cliaractcnsatton of a cell line
derived from zebra-fish (Brachydanto reno).In Vitro Cell Dev
Bio! Anim.29A. 749-754.
Dncvcr. W., Stemple. D., Schier, A & Solniea-Krczel, L. (1994),
Zebrafish- Genetic tools for studying vertebrate development
Trends Genet 10 152-159
Duffy, M J. Reilly. D_. O'Sullivan, C.. O’Higgins. N. Fcn-
nelly.J J. & Andreasen. P.(1990). Urokiumasc-plasmnitigen
activator, anew and independent prognostic marker tn breast
cancer. Cancer. Res.. 50 6827-6821
Dukstn, D., Maoz, A. & Fuchs. S. (1975) Differential cytotoxic
activity of anttcollagcn serum on rat osrcoblasrs and fibro-
blasts in tissue culture Cell 5.83-86.
Dulbecco, R. (1952). Production of plaques tn monolayers of tis-
sue cultures by single particles of an animal virus Pioc. Natl
Acad. Sa. USA 38.747.
Dulbecco, R. & Elkington J. (1973). Conditions limiting multi-
plication of fibroblastic and epithelial cells in. dense cuilturcs.
Nature 246 197-199
Dulbecco, R. & Freeman. G (1959). Plaque formation by the
polyoma virus Virology 8 396-397.
Dulbecco, R, Vogt, M (1934) Plaque formation and isolation
of pure cell lines with poliomyelitis viruses. J. ftp. Med 199
167-182
Dunean, E. L, De Silva. R & Rcddcl, R. R (1996). Immortaliza-
tion of human mesothelial cells. In Freshney. R I. & Fresh-
ney, M.G. (eds.) Culture of immortalized cells. New York.
Wiley-Liss pp 2.39-258
Dunham, L. J & Stewart, H L. (1953). A survey of transplant-
able and transmissible animal tumors./. Natl. Cancer Inst.
13 1299-1.377
Dunn G A. & Brown. A. F. (1990). Quantifying cellular shape
using moment invariants. In Alt. W. & Hofman. G. (eds.)
Biological motion: Lecture in btomathemattes 89, Berlin
Springer-Verlag, pp 10-34
Dunn, G. A & Zicha, U. (1997) Using tlie DRIMAPS system of
interference microscopy to study cell behavior. In Celis. J. F
(cd.). Handbook of cell biology, 2nd cd. New York, Academic
Press pp. 44-53.
Dunn, M. E, Schilling, К & Mugnaiui. F. (1998) Development
and fine structure of murine Purkinje cells in dissociated cere-
bellar cultures: Neuronal polarity Anat. Embryo! 197.9-29.
Dutt, К, Harris-Hooker. S . Ellcrson. LI. Layne. D. Kumar, R
and Hunt. R. (2003) Generation of 3D retma-hke structure
from a human retinal cell line in a NASA biorcactor Cell
Transplant 12 717-7.31.
Eagle, H (1955) The specific amino acid metabolism of mamma-
lian cells (stain L) in tissue culture./ Btol Chem. 214 839
Eagle, H (1959) Amino acid metabolism tn mammaltan cell
cultures Science 130.432
Eagle, H (1973) The effect ol environmental p H on the growth
of normal and malignant cells /. Cell Physiol. 82 1-8.
Eagle, H.. Foley, G. E, Koprowski, H.. Lazarus, H, Levine, F. M &
Adam.-,, R. A (1970). Grow th characteristics of virus-trans-
formed cells./ Exp Med. 131.863-879.
Earle. W R„ Schilling. E L, Stark, T H , Straus. N P ,
Brown, M. F. & Shelton, E. (1943). Production of malignancy
in vitro, IV- The mouse fibroblast cultures and elianges seen
in the living cells./ Natl Cancer Inst, 4 165-212
652
Список литературы
Easty, D М., Easty, G ( (1974j Measurement of the ability
of the cells to infiltrate normal tissues in vitro Br.J Cancel
29 36-49
Ebendai, T (1976). The relative roles of contact inhibition and
contact guidance is orientation of axons extending on aligned
collagen fibrils tn nitro CellRes.98 159-169
Echarti, C. & Maurer, H. R. (1989). Defined, serum-freeculture
conditions for the GM -microclouogeiuc-assay using agar-
capillarics. Blut 59 171-176
Echarti. C & Maurer, H. R (1991) Lymphokinc activated
killer cells, determination of their tumor cytolytic capacity
by a clinogcnic microassay using agar capillaries J. Immuno!
Methods 143 41-47
Edelman, G M (1973).Notienzymaticd>ssociations, В Specific cell
fractionation of chemically derivatized surface".. In Kruse, P. F,
Jr & Paterson, M К Jr (cds ), Tissue culture methods and
applications. New York. Academic Press pp 29-36
Edeison, J. D., Shannon. J. H. & Mason. R. J. (1988) Alkaline
phosphatase A marker of alveolar type II cell differentiation,
Am Rev. Resptr Dis. 138.1268-1275
Edington. K, G, Berry. I J. O'Prey. M., Burns,J. E. Clark, L. J,
Mitchell, R., Robertson. G. Soutar, D., Coggins, L. W. &
Parkinson. E. K. (2001). Multistage head and neck sqna-
mous cell eareiixinia. In Pfragncr, R. & Freshney, R. I (eds ),
Culture of Human Tumlour Cells. Hoboken, NJ Wiley-Liss,
pp. 261-288.
Edwards, A M , Silva, F , Jofre, B., Becker. M. I. & De
Joannes, A. E. (1994). Visible light effects on tumoral cells in
a culture medium enriched with tryptophan and riboflavin,
J Phutocem Photolnol.U 179-186
Edwards, R G. (1996). The history of assisted human conception
with especial reference to endocrinology. Eijj. Ciin Endocrinol
Diabetes 104 (3) 183-204
Edwards. P A. W., Easty, D. M & Foster. C S. (1980) Selective
culture of epithelioid cells from a human squamous carcinoma
using a monoclonal antibody to kill fibroblasts. Celt Bio! Ini
Rep 4.917-922.
Eismger, M , Lee, J S., Hefton. J M , Darzykicwicz, A ,
Chiao, J W . Dcharven, E (1979) Human epidermal cell
cultures-gruwtli and differentiation iu the absence of dermal
components or medium supplements. Proc. Natl. Acad. Ser
USA, 76.5.340
Elliget, K. A & Lechner, J. F. (1992) Normal human bronchial
epithelial cell cultures In Freshney, R I (cd ), Culture oj
epithelia! cells. New York. Wilcy-Liss. pp. 181 -196.
Elvin. P„ Wong, V & Evans, C.W.( 1985) A study of the adhe-
sive, locomotory and invasive behaviour of Walker 256 car-
cinosarcoma cells, Exp Cell. Biol 53 9 18
Etnura, M_, Katyal, S. L., Ochiai, A.. Hirohashi, S & Singh, G
(1997). In vitro reconstitution of human respiratory epithe-
lium. In Vitro Cell Dev. Biol 33 602-605
Enders,J. F , Weller, T.J. & Robbins, F. C (1949). Cultivation ol
Lansing strain of poliomyelitis in cultures of various human
embryonic tissues. Science 109 85.
Eng. L. F. & Bigbee, J W (1979) linmunochcmistry of nervous-
system specific antigencs. In Aprisun, M H. (cd.). Advances
tn neurochemistry. New York. Plcntum Press, pp 43-98
Engel. L. W.. Young.N. A., Tralka, T S, Lippman. M E, O'Brien,
S .J & Joyce, M. J. (1978) Establishment and characteriza-
tion of three new continuous cell lines derived from breast
carcinomas. Cancer Res, 38 3352-3364.
Eppig. J J & O’ Brien, M, J. (1996) Development in vitro of
mouse oocytes from primordial follicles. Biol Reprod, 54.
197-207.
Epstein, M &Barr.Y M (1964). Cultivation tn vitro of human
lymphoblasts from Burkitt’s malignant lymphoma Lancet
1 252
Ennis. A.. Muller. В. Hopf, T.. Hopf, C, Rcinhergcr, К, Just-
cn. H. P., Welter, C & Hannselman. R. (1998) Invasion
of human cartilage by cultured multicellular spheroids of
rheumatoid synovial cells a novel in vitro model system for
rheumatoid arthritis J Rheumatol 23.208-213.
Eroglu, A., Russo. M. J., Bieganski. R, Fowler, A.. Chclcy, S.,
Bayley, H & Toner, M (2000). Intracellular trehalose im-
proves the survival at cryopreserved mammalian cells Nat.
Bivtechnol 18 163-167
Espmark, J. A & Ahlqvist-Rotb, L. (1978). Tissue typing of cells
in cultures, I: Distinction between cell lines by the various
patterns produced in mixed hacmabsorption with selected
multiparous sera.J. Immunol. Methods 24 141-153.
Ethier, S. P, Mahacck, M L, Gulltk, W. J., Frank. T. S. & We-
ber. В L. (1993) Differential isolation of normal luminal
mammary epithelial cellsand breast cancer cells from pnniiary
and metastatic sites using selective media Cancer Res. 53
F.627-635.
European Cominitec for Standardisation (1999). Biotechnol-
ogy performance criteria for microbiological safety cabinets
[W191J. CEN TC233 Biotechnology. Central Secretariat,
Eurojican Committee for Standardisation, Rue de Stassart
36, B-1050 Brussels, Belgium
European Pharmcopoeta. (1980) Biological tests. 2nd cd.. Part 1.
Vol. 2 Maisonneuve, S. A., France.
Evans, T., Rosenthal. E. T, Youngblom, J.. Distcl. D & Hunt. T.
(1983). Cyclin. a protein specified by maternal mRNA in sea
urchin eggs that is destroyed an each cleavage division. Cell
33 389-396
Evans, M. J & Kaufman, M H. (1921) Establishment in cul-
ture of pluripotent cells from mouse embryos Nature 292.
154-156.
Evans, V' & Bryant. J C (1965) Advances in tissue culture at the
National Cancer Institute in the United States of America. In
Ramakrishan, С. V. (cd). Tissue culture. The Hague, W Junk,
pp. 145-167
Evans. V.J., Bryant.J C.. Fioramonti. M. C., McQuilkin, W T_,
Sanford. К. К & Earle, W R. (1956) Studies of nutrient media
for tissue C cells tn vitro, I: A protein-free chemically defined
medium for cultivation of strain L cells Cancer Res 16 77
Evans, V. J. & Sanford, К К (1978). Development of defined
media for studies on malignant transformation tn culture. In
Katsuta, H (cd ), Nutritional Requirements of Cultured Cells.
Baltimore, University Park Press.pp 149-192
Fantini. J, Galons, J P, Abadie, B., Canioni, P.. Cozzonc, P J,
Marvali, J & Tirard, A (1987) Growth in scrum-free me-
dium of human colonic adenocarcinoma cell Imeson micro-
carriers A two-step method allowing optimal cell spreading
and growth. In Vitro 23.641-646.
Fata, J E , Werh, Z. & Bissell. M.J. (2004). Regulation of mam-
mary gland branching morphogenesis by the extracellular
Список литературы
653
matrix and its remodelling enzymes Breast Cancer Res, 6
1 11.
Fcdcroff. S (1975). In Evans V J. Perry, V P & Vincent, M M
(cds ) Manual of the Tissue Culture Association 1.53-57
Fcdcroff, S. & Richardson. A. (2001) Protocols for neural celll
culture Clifton. NJ, Humana Press
Feinberg, A. P. & Vogclstem, B. (1983). A technique for radio-
labeling DNA restriction fragments to high specific activity.
Anal. Btochem. 132.6-13
Feigner, P, Gadck, T. Holm, M, Roman, R, Chan. H. W.
Wenz, M , Northrop, J. P., Ringold, G. M & Daniclscn.
M (1987) Ltpofcetion: A highly efficient, hpid-mediated
DNA-transfection procedure. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84
7413-7417
Fell. H В & Robinson, R. (1929). The growth, development and
phosphatase activity of embryonic avian femora and limb buds
cultivated tn vitro. Btochem.J 23.767 784.
Fenton. J. I & Hord, N. G- (2004). Flavonoids promote cell
migration in nontumorogeme colon epithelial cells differing
m Ape genotype. Implications of matrix metalloproteinase
activity Nutr. Cancer, 48.182 188
Fcrgusson, R.J , Carmichael. J. & Smyth, J. F (1980). Human
tumor xenoprafts growing in immunodeficient mice. A. use-
ful model for assessing chemotherapeutic agents in bronchial
carcinoma. Thotax 41 376-380.
Fcrmg. D. G. Gallagher, J. T. (1994). Fibroblast growth factors
and thenr receptors. An information network controlling tis-
sue growth, morphogenesis and repair. Prog Growth Factor
Res. 5-353-377
Finbow, M E., Pitts, J. D (1981). Permeability of junctions
between annual cells. Exp Cell. Res 131.1 13.
Fionno, A. S. Diehl. A M.. Lm. H Z.. Lcmischka. I. R. &
Reid, L M (1998). Maturation-dependent gene expression
in a conditionally transformed liver progenitor cel) line in
Vitro Cell Dev Bio! Antm 34 247-258.
Fischer, A. (1925). Tissue culture. Studies in experimental mor
phology and general physiology of tissue cells tn vitro London.
Hcineman
Fischer, G. A & Sartorelli, A C. (1964) Development, main-
tenance and assay of drug resistance. Methods Med. Res, 10
247-258
Fisher, H. W., Puck. T. T & Sato. G. (1958) Molecular growth
requirements of single mammalian cells. The action of fetuin
in promoting cel) attachment of glass. Proc. Natl Acad. Set.
USA 44 4-10.
Fitzsimons, S. A, Ireland, H, Barr, N I., Cuthbert, A. P , Go-
ing, J J, Newbold. R. F. & Parkinson, F К (2003). Human
squamous cell carcinomas lose a mortality gene from chromo-
some 6ql 4.3 to q 15. Oncogene 22.1737-1746
Flier, J S. (1995). The adipocyte, storage depot or node on the
energy information superhighway? Cell 80 15-18
Flynn, D.. Yang, J, Nandi, S (1982) Growth and differentiation
of primary cultures of mouse mammary epy thcliun i embedded
in collagen gel. Differentiation 22.191 -194.
Fngh, J- (1977). Absence of HeLa cell contamination in 169 cell
lines derived fruni human tumors. J. Natl. Cancer, inst. 58
209-214
Fogh, J & Trcinpc, G. (1975). in Fogh. J (cd ), Human tumor cells
tn vitro. New York, Academic Press, pp 115-159
Folkman, I. & Moscona. A (1978) Role of cel) shape in growth
control. Nature 273 345-349
Folkman, I., Haudcnschild, С. C. & Zertcr, В R (1979). Long-
term culture culture of capillary cndotclial cells. Proc. Natl
Acad. Set. USA 76.5217-5221
Folkman, J (1992). The role of angiogenesis in tumor growth
Sent. Cancer Biol. 3 65-71.
Foikman, J. & D’Amnore, P. A. (1996) Blood vessel formation
what is its molecular basis? Minircvicw Cell 87 1153-1155
Folkman, J. & Haudcnschild, C. (1980). Angiogenesis tn vitro
Nature 288 551-556
Fontana. A.. Hcngarncr. H ,dc Triholet, N & Weber, E (1984)
Gliotblastoma cells release interleukin 1 and factors inhib-
iting interleukin 2-mediatcd effects J. Immunol. 132 (4)
1837-1844.
Food and Drug Administration. (1992) Federal Register. 21 Code
of Federal Regulations, Part 58 Office of the Federal Register,
National Archives and Records, Washington. DC
Foreman, J. & Pegg, D. E (1979) Cell preservation in a pro-
grammed cooling machine. The effect of variations in super-
cooling Cryobudogy 16 318-321
Foster, R & Martin, G S. (1992). A mutation m the catalytic
domain of pp60v-src is responsible for the host and tcm-
perature-depcudcnt phenotype of the Runs carctnotiia virus
mutant tsLA33-l. Virology 187.145-155.
Frame, M, Freshney, R. I., Shaw, R & Graham, D I. (1980)
Markers of differentiation in glial cells. Cell Biol Int Rep
4:732
Franceschmi, I A & Barncrtt, S. C. (1996). Low-affinity NGF-
rcecptor and E-N-CAM expression define two types of olfac-
tory nerve- enshcathtng cells that share a common lineage
Dev. BioL 173 327-343.
Franklin, R. J. M. & Barnett, S C. (1997; Do olfactory glia have
advantages over Schwann cells for CNS repair? J. Neuro.sci
Res 50 1-8.
Franklin, J. M., Gilson, J M., Franccsehmi, I. A. & Barnett, S C
(1996) Schwann ссИ-like myelination following transplanta-
tion of an olfactory-nervc-enslieating-ccll line into areas of
demyelination in the adult CNS Glia 17:217-224.
Franklin, R.J. M. & Barnett, S C (2000) Olfactory cnshcatihg
cclls-and CNS regeneration the sweet smell of success?
Neuron 28. 1-4
Frazier. J M. (1992) In vitro toxicity testing. New York, Marcel
Dekker
Fredin, В L, Sciffcrt, S C. & Gclchrtcr, T. D (1979) Dcxa-
mcthasone-induccd adhesion in hepatoma cells. The role of
plasminogen activator Nature 277 312-313.
Freed. L. E. & Vunjak-Novakovich. G. (2002) Spaceflight bio-
rcactor studies of cells and tissues Adv. Space Biol. Med. 8
177-195.
Freedman. V'. H. & slim. S (1974) ecDulaar tumorogenicity in
nude mice: Correlation with cell growth in semi-solid medium
Cell3.355-359.
Freshney, M. G. (1994). Colony-forming assays for CFC-GM,
BFU-E,CFC-GEMM,andCFC-mix. InFreshney. R I, Prag-
ue!]. I. В & Freshney, M G (cds ) Culture of haempopoetic
cells. New York. Willey-Liss
Freshney, R. I (1972) Tumour cells disaggregation in collage-
nase Lancet.2 488-489.
654
Список литературы
Freshney, R. I. (1976) Separation of cultured cells by isopycnic
centrifugation in metnzamide gradients. In Rick-wood, D
(cd ) Biological separation London amd Washington, Infor-
mation Retrieval, pp. 123-130.
Freshney, R I (1980). Culture of glioma of the brain. In Tho-
mas, D G T. & Graham, D I (eds ), Brain tumours:scientific
basis, clinical tmestigation and current therapy. London, But-
terworths, pp 21-50
Freshney, R. I. (1985). Induction of differentiation inncoplastic
cells. Anticancer Res., 5:111 130.
Freshney, R. I (cd.). (1992) Culture ofepithelial cells New York
Willey-Liss.
Freshney, R I & Freshney, M G (eds.) (1996)/ Culture of im-
mortalized cells New York, Willey-Liss.
Freshney, R I & Hart, E (1982) Clonogenicity of human glia
in suspension. Br J Cancer46.463.
Freshney, R I. & Morgan. D.( 1978) Radioisotopic quantitation
inmicrotitration plates by an autoradiographic method Cell
Binl.lnt Rep. 2.375-380
Freshney. R. L, Cclik. F & Morgan, D (1982a). Analysis ol
cytotoxic and cytostatic effects. In Davis, W.. Malvoni. C. &
Tannenberg, St (eds.) The control of tumor growth andits
biological base, Forchntte in der Onkologte. Band 10. Berlin
Akadenne-Verlag, pp 349-358
Freshney, R. L. Hart, E. & Russel, J. M. (1982b). Isolation and
purification of ccllcultutrc from human tumours In Reid, E,
Cook. G M. W. & Moore, D J. (eds.). Cancer cell organelles;
methodological surveys (B) Biochemistry, Vol 2 Chichester,
U.K. Norwood, pp 97 110
Freshney, R I. Morgan, D . Hassanzadah. M , Shaw, R &
Frame, M (1980a). Glucocorticoids, proliferation and the
cell surface. In Richards. R J. & Rajan, К. T (eds ) Tissue
culture tn medical research (Ii). Oxford U.K Pergamon Press,
pp. 125-132.
Freshney. R. I., Paul. J & Kane, I M (1975) Assay of anticancer
drugs in tissue culture Conditions affecting thetr ability to
incorporate ’H-lcucinc after drug treatment Br J. Concet-
ti 857-866.
Freshney. R I. Pragnell. I В & Freshney, M.. (eds ) (1994)
Culture of haempopoetic cells. New York, Willey-Liss
Freshney. R I. Sherry, A, Hassanzadar, M , Freshney, M , Cnl-
ly, P & Morgan, D. (1980b). Control of cell proliferation m
human glioma by glucocorticoids, Br J. Cancer U 857-866.
Freshney, R I (2002). Other epithelial cells In Freshney. R. I
(cd ) Culture of epithelial cells 2"d cd Hoboken, NJ. Wiley-
Liss, 402-436
Freshney, R. I. & Freshney, M G. (2002). In Freshney. R I (cd )
Culture of epithelial cells. 2'“’ cd. Hoboken NJ. Wilcv-Liss
Chapters 6,10,11.12,13.
Freycr.J P & Sutherland, R. M. (1980). Selective dissociation
and characterisation of cells from different regions of multicell
tumour spheroids. Cancer Res AO. 3956-3965.
Friend, C.,Patulcia.M C & Nelson, J В (1966) Antibiotic effect
of tylosmc on a mycoplasma contamination in a tissue culture
leukemia cell line. Proc Soc Exp Biol Med 121 1009.
Friend, К. К.. Dorman, В P , Kucherlapati, R S. & Ruddle, F H
(1976). Detection of interspecific translocations in mouse-
human hybrid hy alkaline Gimsa staining Exp. Cell Res. 99
31-36.
FroundS.J (1999) The development, benefitsand disadvantages
of serum-free media. Dev. Biol Stand. 99 157-166
Fry, J., Bridges, J W. (1979). The effect of phenobarbitone on
adult rat liver cells and primary cell lines Toxicol Lett, i-
295-301.
Fu. V. X. Schwarzc, S. R., Rczmkoff. C A. & Jarrard, D F.
(2004)/ The establishment and characterization of bladder
cancer cultures in vitro. In Pfragner. R & Frcsshncy, R I.
(eds.) Culture of human tumor cells Hobokcn.NJ. Wiley-Liss
pp. 832-839.
Fujita H, Asahma, A, Mitsui. H & Tamaki, К (2004). Lang-
erhans cells exhibit low responsiveness to double-stranded
RNA, Biochem Biophys. Res. Common 319- 832-839.
Fuller. В В & Mcyskens, F. L. (1981). Endocrine responsiveness
in human melaniocytc and melanoma cells in culture./. Natl.
Cancer Inst 66.799-802
Fullerton, N E, Boyd, M., Mairs, R J.. Keith, W. N, Alder-
wish. О. Brown. M. M , Livingstone. A. & Kirk, D. (2004).
Combining a targeted radiotherapy and gene therapy ap-
proach for adenocarcinoma of prostate. Prostate Cancer
Prostatic Dis 7:355-363.
Furue. M. & Saito, S. (1997) Ayncrgistic effect of hepatocyte
growth factor and fibroblast growth (actor-1 on the branching
morphogenesis of rat submandibular gland epithelial cells.
Tissue Ctlt. Res. Commun 16 189-194
Fusenig, N. E. (1994a). Epithclial-mesemchymal interactions
regulate keratinocyte growth and differentiation in vitro. In
Leigh, I. M., Lane, E B. & Wat. F. M. (eds.) Keratynocyte
handbook. Vol. 1. Cambridge, U.K. Cambridge University
Press, pp 71-94.
Fusenig. N. E. (1994b). Cell ulturc models, reliable tools in
pharmacotoxicology? In Fusenig. N. E. & Graf, H (eds )
Cell culture tn pharmaceutical research Berlin & Heidelberg,
Springer-Verlag. pp. 1-7.
Fusenig. N. E, Limat. A , Stark, H.-J & Brcitreutz. D (1994).
Modulation of the differentiated phenotype of kcratynoeytes
of the hair follicle and from epidermis J. Dermatol. Sct.l
142 151.
Gao, R., Ustinov,J . Pulkkmen. M A.. Lundin. К. Korsgren, O. &
Otonkoski. T. (2003) Cliaractcnzation of endocrine progeni-
tor cells and critical factors for thetr diffcmtiation in human
adult pancreatic cells culture. Diabetes 52 2007-2015.
Gard, A. L. & Pfeffer, S. E (1990). Two proliferative stages of
the oligodendrocyte lineage (A,B5+O5-and O,GalC-) under
different mitogenic control Neuron 5.615-625
Gardner, D. K. & Lane. M (2003) Towards a single embtyo trans-
fer Reprod. Biomed Online 200.3June 6 (4). 470 181.
Garrido. Ricse, H H, Aracil, M. & Perez-Aranda, A (1995)
Endothelial cell differentiation into capillary-like structures
in response to tumor cell conditioned medium, a modified
chemotaxis assay. Br. J Cancer. 71:770-775.
Gartner, S M. (1967). Genetic markers as tracers in cell
culture 2'“’ Decennial Review Conference on Cell. Tissue and
Organn Culture NCI Monograph 26. pp. 167-195
Gaudernack, T, Leivcstad. T. Ugclstad, J. & Thorsby, E. (1986).
Isolation of pure fuuctioanlly active CD8+ T cells. Positive
selection with monoclonal antibodies directly conjugated to
monosized magnetic microspheres. / Immuno! Methods 90
179-187.
Список литературы
655
Gaush,C.R,Hard,W L. & Smith, T F (1966) Characterization
of an established line of canine kidney cells (MDCK). Proc.
Soc Exp Biol Med 122-931-933
Gazdar A.F.. Carney. D N & Minna J D. (1983). The biology of
nonsmall cell lung cancer Setntn. Oncol 10. .3-19
Gazdai. A F , Carney. D N , Russel, E K, Suns, H L., Bay-
lin, S В, Bunn, P A., Guccion, J- G. & Minna, J. D. (1980)
Establishment of continuous deniable cultures of small cell
carcinoma of the lung which have amine precursor uptake and
decarboxylation properties. Cancer Res 40:3502-3507
Gazdar, A. F, Zweig. M N , Carney, D. N., Van Stetrteghen, A. C..
Baylin, S. В & Minna, J D (1981) Levels of creatine kinase
and its BB isoenzyme in lung cancer specimens and cultures.
Cancer Res 41.2773 2777.
Germain, L, Rouabhia, M.. Gutgnard, R., Carrier, L., Bou-
vard. V & Auger, F. A (1993). Improvement of human
keracinocytc isolation and culture using thertnolysm. Bums
19.99-104
Gerper, P, Whang-Peng J. & Monroe, J. H. (1969) Transfer
mation and chcromosomc changes induced by Epstem-Barr
virus in normal human leukocyte cultures Proc. Natl Acad.
Sci USA 63(3) 740-747
Gcy.G O, Coffman. W D &Kubicck.M.T (1952) Tissue cul-
ture stuies of the proliferative capacity of cervical carcinoma
and normal epithelium. Cancer Res. 12 364-365
Ghigo, D, Pnotto, C, Migjtormo. D, Gcromtn, D, Franchino. C..
Todde, R. Coctamcgna, C , Pcscarmona, G. & Bosia, A
(1998) Retinoic acid-induced dtfferenciation in a human
neuroblastoma cell line is associated with an increase in nitric
oxide syntesis./ Cell Physiol 174.99-106.
Ghosh, D., Collodi, P (1994). Culture of cells from zabrafish
(Brahydanto reno) blastula-stage embryos. Cytotechnology
14.21-26.
Ghosh, D.. Danielson, КС, Alston, J, T. & Heyner, S. (1991)/
Functional differential of mouse uterine epithelia) cells grown
on collagen gels or reconstituted basement membranes In
Vitro Cell Dev Biol, 27 A. 713-719.
Giard. D J , Aaronson, S A.. Todaro, G. J , Arnstein, P..
Kersey, J H. Dosik. K. & Parks, W P. (1972) In vitro culti-
vation of human tumors Establishment of ceil lines derived
from senes of solid tumors./. Natl. Cancer Inst 51 1417
Gignac, S. M , Steubc, K.. Schlcithoff, J W, MacLeod. R A..
Qucntmcier, H & Drexler. H. G. (1993) Multiparamctcr
approach in the identification of criss-cmtaminatcd leukemia
cell lines Leukemia Lymphoma 10 (4-5). 359-368
Gilbert, S. F. & Migeon, В R. (1975) d-Valtnc as a selective
agent for normal human and rodent epithelial ells in culture.
Cell 5.11-17.
Gilbert, S F & Migeon, В R (1977). Renal cnxzymcs tn kid-
ney cells selected by d-valine medium./. Cell. Physiol. 92
161 168.
Gilchrest, В. A., Albert, L. S, Karassik, R L. & Yaar, M. (1985)
Substrate influences human epidermal melanocyte attach-
ment and spreading in vitro. In Vitro Cell Dev. Biot. 21 114
Gillctc. R. W. (1987). Alternatives to pristane priming for as-
citic fluid and monoclonal antibody production./ Immunol.
Methods 99.21-23.
Gillis, S. & Watson, J (1981). Interleukin-2 dependent culture
of cytplyttc T cell lines Immunol. Rev 54.81-109.
Gtmbronc. M. A.. Jr., Cotran. R. S. & Folkman, J (1974) Humna
vascular endothelial cells tn culture, groth and DNA synthesis.
/. Cell Biol 60 673-681
Giovanella. В C , Stchlin. J. S & Williams. L. J. (1974) Hetero-
transplantation of human malignant tumonn «nude» mice, II
Malignant tumors induced by injection of cell cultures derived
from human solid tumors./ Natl. Cancer Inst 52.921.
Girou, J. A., Lange, M & Baseman. J B. (1996). Adherence, fibro-
ncettn-bindmgand induction of cutoskcleton reorganization
in cultures human-cells by Mycoplasma penetrans. Infect.
ImmunoLGi. 197-208.
Gjerset, R., Yu.. A. & Haas. M (1990). Establishment of continu-
ous cultures of T-cell acute lymphoblastic leukemia cells at
diagnosis. Cancer Res 50.10-14.
Glavin, G В, Szabo, S.. Johnson, В R, Xing, P. L. Morales. R E.,
Plcbani. M & Nagy, L (1996) Isolated rat gastric mucosal
cells. Optimal conditions for cell harvesting, measures of
viability and direct cytoprotection./ Pharmacol Etp. Thera-
peutic 276 1174 1179.
Gluzman, Y. (1981). SV40-transfonned simian cells support the
replication of early SV40 mutants Cell. 23.175-182.
Gobet, R.. Raghunnath, M., Altcrmatt, S, Meuh-Simmen. C.,
Benathan. M . Dietl. A & Meuli, M (1997). Eficacy ofcul-
turedepithelial autigrafts tn pediatric burns and reconstrutivc
surgery Surgery 121 546-661
Godtng, C R & Fisher. D. E. (1997) Meeting review-regula-
tion of, melanocyte differentiation and growth. Cell Growth
Differ 8.935-940
Goldberg, В. (1977). Collagen synthesis as a marker for cell type
m mouse 3T3 lines. Cell 11 169-172
Goldman, В. I. & Wurzcl,J. (1992). Effects of suhculttvation and
culture medium on differentiation of human fetal cardicac
myocytes In Vitro Cell Dev Biol Anim. 28A: 109-119
Goltstein, S.. Murano. S.. Benes, H.. Moorman, E. J.. Jones, R. A. &
Thweatt, R. (1989)Studtes on the molecular genetic basis
of replicative senescence tn Werner syndrome and normal
fibroblasts Exp Gerontol24 (5-6). 461 -468.
Goldwasscr, E (1965) Erythropoetin and the differentiation of
red blood cells. Fed. Proc. 34:2285-2292.
Gontni, J J.. Coope, R. C.. Browne, P J and Coonibes, R C
(1997) Separated human breast epithelial and myoepithelial
cells have different growth factor requirement tn vitro but can
reconstitute normal breast lobuloalvcolar structure /. Cell
Physiol. 171: 11-19.
Good. N E, Winget, G D, Winter. W. Connolly, T.N Iza-
wa. S & Singh, R. M. M. (1966). Hydrogen ion buffers and
biological research. Biochemistry 5.467-477
Goodwin. G, Shaper, J H.. Abezoff, M D. Mendelsohn. G. &
Baylin, S. В (1983). Analysis of cell surface proteins de-
lineates a differentiation pathway linking endocrine and
nonendocrinc human lung cancers Proc Natl. Acad Sci USA
80.3807-3811
Gordon К. E., Ireland, H, Roberts. M, Steeghs, К. McCaul.J. A.,
MacDonald, D. G. & Parkinson, E. К (2003) High levels of
telomere dysfunction bestow a selective disadvantage dur-
ing the progression of human oral squaninus cell carcinoma.
Cancer Res. 63 458-467,
Gospodarowicz, D., Rudland, P., Lindstrom, J & Bentrschke, К
(1975). Fibroblast growth factor" its localization, purification.
656
Список литературы
mode ос action, and physiological significacc. Adv. Metal)
Disord. 8 301-335.
Gospodarowicz, D (1974). Localization of fibroblast growth
factor and its effect alone and with hydrocortisone on 3T3
cell growth Nature 249 123-127.
Gospodarowicz, D. & Moran, J. (1974) Growth factors in mam-
malian cell cultures Annu. Rev. Btochem. 45* 531-558
Gospodarowicz, D , Dclgalo, D. & Vlodavsky, I (1980), Permis-
sive effect of the extracellular matrix on cell proliferation tn
vitro Proc Natl. Acad USA 77.4094-4098,
Gospodarowicz, D., Greenburg, G. & Birdwell, C R (1978b)
Determination of cell shape by the extracellular martix and
its correlation with the control in cellular growth. Cancer
Res. 38.4155-4171
Gospodarowicz, D., Greenburg, G, Bialecki, H. & Zetter, В R
(1978a). Factors involved in the modulation of cell prolifera-
tion tn vivo and tn vtro The role of fibroblast and epidermal
growth (actors in the proliferative response of mammalian
cells. In Vitro 14.85 118
Goto, S., Miyazaki, К, Funabiki, T. & Yasumistu, H. (1999)
Serum-free culture conditons for analysts of secretory pro-
teinases during myogenic differentiation of mouse C2C12
myoblasts Anal Biochem 272.135-112
Cougos, A & Lctartc, M. (1990) J Biol Chem 265.8361-8364
Cower, W R., Risch, R. M ,Godellas,C V.&Fabrt.P J (1994)
HPAC, a new human glucocorticoid sentensive pancreatic
ductal adenocarcinoma cell line. In Vitro Cell Dev BiolSOA
151 161.
Grafstrom, R. C. (1990a) In vitro studies of aldehyde effects
related to human respiratory carcinogenesis Mutation Res.
238:175-184
Grafstrom, R C (1990b). Carcinogenesis studies in human
epithelial tissues and cells tn vttro: Emphasis on serum-free
culture conditions and transformation studies. Acta Physiol.
Scand 140 93-133.
Grafstrom. R C (2002) Human oral epithelium In Fresh-
ney, R. I. & Freshney, M G. (cds ), Culture of epithelial cells,
2nd cd. Hoboken, NJ Wiley-Liss, pp 195-255.
Graham, F L. & Van der Eb, A J. (1973) A new technique for
the assay of infectivity of hu man adenovirus 5 DNA. Virology
52 456-461.
Graham, F. L., Smiley, J, Russell, W. C. & Nairn, R (1977)
Characteristics of a human cell line transformed by DNA from
human adenovirus type J. Gen Virol. 36 59-72
Graham, G L., Freshney, M. G, Donaldson, D & Pragncll, I. В
(1992). Purification and biochemical characterisation ol
human and minute stem cell inhibitors. Growth Factors 7
151 160.
Crampp, G E., Samlianis, A & Stephanopoulos, G. N. (1992) Use
of regulated secretion in protein production from animal cells'
An overview Adv Btochem. Eng Btotechnol. 46.35-62
Grandolfo, M., d'Andrea, P., Paolctti, S., Martina, M., Silves-
trini, G„ Bionucci, E. & Vittur, F (1993) Culture and dif-
ferentiation of chondrocytes entrapped in alginate beads
Calcif. Tissue Int. 52 131-138
Granner, D. K., Hayashi, S , Thompson, E. B. & Tomkins, G. M
(1968). Stimulation of tyrosine aminotransferase synthesis
by dexamethasone phosphate in cell culture./ Mol. Biol. 35
291-301.
Graziadci, P. P C & Monti Graziadci, G. A (1979) Ncurogcncsis
and neuron regeneration in the olfactory system of mam mats,
I Morphological aspects of differentiation and structural
organisation of the olfactory sensory neurons./. Neurocytol.
8 1-18.
Craziadet, P. P. C. & Monti Graziadei, G. A. (1980) Ncurogcncsis
and neuron regeneration in the olfactory system of mammals,
III Dcaffcrentation and reinnervation of the olfactory bulb
following section of thefila olfactorta in rat./. Neum. utul. 9
145-162.
Greco, В & Recht, L. (2003) Somatic plasticity of neural stem
cells. Fact or fancy?/ Celt Biochem. 88 51-56
Green, A. E., Athreya, В, Lehr, H. B. & Conell, L. L (1967).
Viability of cell cultures following extended preservation in
liquid nitrogen. Proc. Soc.Exp Biol Med 124 1302-1307
Green, D. F, Hwang, К. H., Ryan, U. S. & Bonrgoignie, J. J
(1992). Kidney Int ii 1506-1516
Green, H & Kehinde, O. (1974). Sublincs of mouse 3T3 cells that
accumulate lipid. Cell 1 113-116
Green, H & Thomas, J (1978) Pattern formation by cultured
human epidermal cells. D evclopmcnt of curved ridges resem-
bling dermatoglyphs. Science 200 1385-1388
Green, H , Kehinde, O. & Thomas, J. (1979). Growth of cultured
human epidcrinarl cells into multiple epithelia suitable for
grafting Proc Natl. Acad. Sci USA 76 5665-5668
Crcenbcrgcr, J. S (1980). Self-renewal of factor-dependent
haemopoietic progenitor cell lines derived from long-term
bone marrow cultures demonstrate significant mouse strain
genotypic variation J. Supramol Struct. 13 501 511
Greene, L, A. & Tischler, A. S (1976) Establishment of a nor-
adrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells
which respond to nerve growth (actor Pioc Natl Acad Set
USA 73 2424-2428.
Grcider, C W. & Blackburn, E. H. (1996) Telomeres, telomerase,
and cancer. Sci. Am, February 1996
Griffiths, В (2001) Scalc-upof suspension and anchorage-depen-
dent animal cells Mol. Btotechnol. 17* 225-238
Griffiths, B. (2000). Scaling up of animal cell cultures In Mas-
ters, J. R. W (cd.). Animal Cell Culture, a Practical Approach.
Oxford, U.K., Oxford University Press, pp. 19-67
Griffiths, J. B. & Pirt, G. J. (1967). The uptake of ammo acids by
mouse cells (Strain LS) during growth in batch culture and
chemostat culture* The influence of cell growth rate Pioc. R.,
Soc. Biol. 168 421-438.
Griffiths, J. B. (1991). Products from animal cells. In Butler, M.
(cd.). Mammalian cell Biotechnology, a prarctical appioaeh,
Oxford, U.K, IRL Press at Oxford University Press,
pp. 207-235
Grizzle, W E. & Polt, S. H (1988) Gudclmcs to avoid personal
contamination by infective agents in research laboratories
that use human tissue./ Tissue Cult Methods 11 191-200
Gross, S K-, Lycrla, T. A., Williams, M. A. & McCluer, P. H.
(1992). The accumulation and metabolism of glycosphingo-
hpids m primary kidney cell cultures from beige mice. Moll
Celll Btochem 118.61-66
Groves, A., Barnett, S C., Franklin, R. J M , Craug, A. J.,
Mayer, M Blakemore, W & Nobel, M (1993). Repair of
demyelinated lesions by transplants of purified 0-2A progeni-
tor cells Nature 362 453-455
Список литературы
657
Gugel.E А & Sanders, J.E (1986) Needle-suck transmission of
human colonic adenocarcinoma New Eng! J. Med 315,1487.
Gugucn-Guillouzo, C (2002) Isolation and culture of annual and
human hepatocytes. In hi Freshney, R. Land Freshney, M.G.
(eds). Culture ofepithelial cells 2nd cd Hoboken, N J, Wilcy-
Liss. pp 337-379
Gugiicn-Giullouzo, C & Cnillouzo. A. (1986). Methods for
preparation of adult and fetal hepatocytes. In Cugucn-Cuil-
louzo, C & Cnillouzo. A. (eds ) Isolated and cultured hepato-
cytes. Paris Les Editions INSERM, John Libhcy Eurotcxt.
pp.1-12.
Gugucn-Guillouzo, C., Campion, J P. Bnssot. P., Glaise, D ,
Launois, В, Bourel, M & Cnillouzo A (1982). High yield
preparation of isolated human adult hepatocytes by enzymatic
profusion of the liver CeliBtol.Int Rep.6:625-628
Gugucn-Guillouzo. C., Clement. B., Baffet. G_ Beaumcnt. C_
Morel-Chany, Clise, E. Glaise, D & Guillouzo, A (1983)
Maintenance and reversibility of active albumin secretion by
adult rat hepatocytes co-culturcd with mother liver epithelial
cell type. Exp Cell. Res. 143:47-54.
Cuilbert, L. I & Iscove, N N (1976).Partial replacement of scrum
by selenite, transferrin, albumin and Iccitin in hacmopoetic
cell cultures. Nature 263.594-595.
Guillouzo. A. M A (1989) Methodes in vitro en pharmacotocoxi-
cologie. Les Editions INSERM 170 200.
Guiraud,J. M , Beuron, F, Sion. B., Brassier, G, Faivrc, J, Thei-
ulant, M L & Duval, J (1991). Human prolactin producing
pituitary adenomas in three dimensional culture In Vitro Cell
Dev.Biol 27a 188-190
Gullmo, P M & Knazek, R, A. (1979). Tissue culture on artifi-
cial capillaries Injakoby. W B. &Pastan. I (eds) Methods
in enzymology. Vol. 58- Cell Culture New York Academic
Press, pp. 178-184
Gumbincr, В (1992) Epithelial morphogenesis Cell 69
385-387
Gumbincr, В M (1992). Signal transduction of be tacatcnm. Cwt.
Opin Cell Biol, 7:634-640
Gumbincr, В & Simoib. K. (.1986). A functional assay for pro-
tein involvedincstabbsbing an epithelial occluding barrier:
Identification of a uvinnorulm- like polypeptide./ Cell. Biol.
102 457-468.
Guncr, M , Freshney. R I- Morgan. D., Freshney, M. G, Tho-
mas, D.G.T.& Grabant. D l.( 1977). Effects of dexamytasonc
and betamethasone on in vivo cultures from human astrocy-
toma Br J. Cancer35 439-447
Gupta, К, Ramaknshnan, S., Browne, P V., Solovcy, A & Hcb-
bel R. P (1997). A novel technique for culture of human
dermal mtcrovascular endothelial cells under either scrum-
free or scrum-supplemented conditions Isolation by panning
and stimulation with vascular endothelial growth factor Exp
Cell Res 230.241-251
Gustafson, C. J , Eldh, J. & Kratz. G (1998) Culture of human
urothelial cells on a cell-free dermis for autotransplantation.
Eur Urol 33.503-506
Hafny, В E. L_ Bourrc. J -M. & Roux. F. (19961. Synergistic
stimulation of gauoua-gly taioyl transpeptidase and alkaline
phosphatase activities by retinoic acid and astroglial factors
in immortalised rat bratn microvcsscl endothelial cells./ Cell.
Physiol 167 451-460
Halaban, P (2004). Culture of melanocytes from normal, benign,
and malignant lesions In Pfragner. R & Freshney. R. I
(eds ) Culture of human tumor cells. Hoboken. NJ, Wiley-Liss
pp 289-318.
Hallcrmcyer, K. & Hainprccht, В (1994). Celiu lar hetcrogenec-
ity in primary cultures of brain cells revealed by imnnuno-
cytochcmical localisation of glutamyl synthetase. Brain Res
295.1 11
Halleux, C. & Schneider. Y -J (1994) Iron absorption by Caco-
2 cells cultivated in serum-free meddium as in vttro model of
the human intestinal epithelial barrier / Cell. Physiol 158
17-28
Ham, R.G.(1963). An improved nutrient solution for diploid Chi-
nese hamster and human cell lines. Exp Cell. Res 29.515.
Ham, R. G. (1965) Clonal growth of mammalian cells in a
chemical I у defined synthetic medium. Proc. Natl Acad. Sci
USA 53 288.
Ham, R G. (1984). Growth of hn man fibroblasts in scrum-free
media In Barnes. D. W., Sirbasku, D. A & Sato. G. H. (eds)
Cell culture methodsfor molecular and cell biology.VcA 3.Ncw
York Alan R Liss, pp 249-264
Ham, R G & McKeehan, W.L. (1978). Development ol improved
media and culture conditions for clonal grow th of normal
diploid cells. In Vitro 14.11 -22
Ham, R G. & McKeehan, W L. (1979) Media and growth re-
quirements In Jakoby, W В & Pastan, I H (eds ), Methods
tn enzymology, vol.58. Cell culture.New York, Academic Press
pp 44-93.
Hamburger, A. W & Salmon, S. E (1977). Primary bioassay of
human tumor stem cells. Science 197 461-463
Hamburger, A. W. Salmon, S E., Kim. M. B., Trent, J. M ,
Soehnlen. B_ Alberts. D S. & Schmidt. H J. (1978) Direct
clontng of human ovarian carcinoma cells in agar Cancer
Res 38 3438-3444
Hames, B. D. & Glover, D M. (1991). Oncogenes. Oxford, UK
IRL Press at Oxford University Press
Hamilton T. C, Young. R. C., McKoy, W M , Grotzingen К R.,
Green, J A., Chu, E W-, Whang-Peng. J. Rogan, A. M„
Green. W. R. & Ozols. R. F, (1983) Characterization of a
human ovarian caretiiouiaccll line(NIH.O VCAR-3) with an-
drogen and estrogen receptors Cancer Res 43,5379-5389
Hamilton, W. G & Ham. R G. (1977) Clonal growth of Chi-
nese hamster cell lines in protein-free media. In Vitro, 13
537-547
Hammond, S L_ Ham. R. G & Stampfer, M. R. (1984). Serum
free growth of human mammary epithelial cells Rapid elonal
growth in defined medium and extended scnalpassagc with
pituitary extract Plot. Natl. Acad. Set. USA 81:5435-5439
Hanks, J H. & Wallace, R E. (1949) Relation of oxygen and
temperature in the preservation of tissues by refrigeration.
Proc Soc Exp Biol Med. 71 196.
Hansson. B_. Ronnback, L, Persson. L. I , Lowcnthal, A,
Noppe, M. Alling, C. & Karlsson, В (1981) Cellular com-
position of primary cultures from cerebral cortex, striatum,
hippocampus, bratn-stem and cerebellum Brain Res. 300
9-18.
Hardman, P, Klcmcnt, В J. & Spooner, В S (1990) Growth
and morphogenesis of embryonic mouse organs on Bioporc
membrane. In Vitro Cell Dev Biol 26.119-120.
658
Список литературы
Harrington, W. N & Godman, G. С (1980) A selective inhibitor
of cell proliferation from normal serum Pioc. Natl. Acad. Set.
USA. 77.423-427.
Harris. H. & Watkins. J. F (1965) Hybrid cells from mouse and
man. Artificial heterokaryons of mammalian cells from differ-
ent species. Nature 205.640-646.
Harris. L. W. & Griffiths. J В (1977). Relative effects of cooling
and wanning rates on mammalians cells during the freeze-
thaw cycle Cryobiology 14.662-669.
Harris. M. (1959) Essential growth factor in serum dialysate for
chick skeletal muscle fibroblasts Proc. Soc Exp Biol. Med
102.468
Harrison, R. G. (1907) Observations on the living developing
nerve fiber. Proc Soc. Exp Biol Med 4.140-143.
Hart. I R & Fidler, I. J (1978) An in ritro quantitative assay for
tumor cell invasion Cancer Res 38.3218-3224
Hartley, R S„ A Yablonka-Reuvcni, Z. (1990) Long-term
maintenance of primary myogenic culture on a rcconstitcd
basement membrane In Vitro Cell Dev Biol 26 955-961.
Hashimota. N (2004). Stem cell systems in skeletal muscle
Tanpakushttsu Kakusan Koso 49 741 -748
Has.-,, R., Gunji, H., Hirano. M., Wcichselbaum. R. & Kufe. D
(1993). Phorbol ester-induced monocytic differentiation
is associated with G2 delay and down regulation of cdc25
expression. Cell Growth Differ. 4 159-166.
Hassell, J R. Robey. PG. Barrach, H. J., Wilczck. J., Ren-
nard, S. I. & Martin, G. R (1980) Isolation of a heparan
sulfatc-containnig proteoglycan from basement membrane
Proc Natl Acad Set USA 77 4494-4498.
Haudcnsehtld, С. C , Zahniser, D, Folkman, J & Klagsbrun, M
(1976) Human vascular endothelial cells m culture, Exp Cell
Res 98.175-183
Hauschka,S.D &Konigshcrg, I. R. (1966) The influence of col-
lagen on the development of muscle clones Proc Natl. Acad
Set USA 55; 119-126
Hauselmann, H. J, Fernandes, R J.. Mok, S. S , Schmid, T M ,
BlockJ A .Aydelotte.M В, Kncttncr,KE..Thonar, E.J -M A
(1994) Phenotypic stability of hovine articular chondroevtes
after long-term culture in alginate beads J. Celt Set. 107
17 27.
Hauscltnann, H J.. Masuda, K.. Hunziker. E B.. Neidhart. M.. Mok
S S. Michel, В A. & Thonar, E J -M A. (1996). Adult human
chodrocytcs cultured in alginate form a matrix similar to native
human cartilage Am J Physio! Cell Physio! 40. C742-C752.
Hawley-Nelson, P, Ciccarone, V.. Gebevehu, G., Jessee, J. (1993)
A new polycationic liposome reagent with enhanced activity
for transfection FASEB7 A167.
Hay, E. D. (cd.) (1991) Cell biology of extracellular matrix New
York. Plenum Press.
Hay, R. J. (1979). Identification, separation and culture of mam-
malian tissue cells. In Reid, E (cd.). Methodological surveys tn
biochemistry. Vol 8 Cell Populations. London. Ellis Horwood,
pp. 143-160
Hay, R J. (2000). Cell line preservation and characterization,
In Masters, J R. W (cd.) Animal cell culture, a practical
approach. Oxford. U.K, IRL Press at Oxford University
Press, pp 95-148
Hay, R. J & Cour, I (1997) Testing of microbial contamination
Bacteria and fungi. In Doyle, A.. Griffits, J. B. & Ncwall, D G
(cds.) Cell and tissue culture'Laboratory piocedures. Chiches-
ter, U.K.. Wiley, Module 7A 2.
Hay, R J. & Strchlcr. В L. (1967). The limited growth span of
cell strains isolated from the chick embryo. Exp Gerontol.
2 123
Hay. R. J., Caputo, J. & Macy M. L. (1992). Establishing of
verifying cell line identity. In ATCC quality control methods
for cell lines, 2nd cd. Rockville, MD American Type Culture
Collection, pp. 52-66.
Hay. R. J . Miranda-Cleland, M. Durkin. S. & Reid, Y. A
(2000). Cell hue preservation and authentication In Mas-
ters. J. R W. (cd.). Animal cell culture. Oxford University
Press, Oxford, pp 69-103
Hayashi, I. & Sato. G H. (1976). Replacement of scrum by hor-
mones permits growth of cells in a defined medium. Nature
259 132-134.
Hayflick. L (1961) The estabbshmernt of a line (WISH; of hu-
man amnion cells in continuous cultivation. Exp Cell. Res.
23 14-20
Hayflick. L & Moorhead. P S. (1961) The serial cultivation of
human diploid cell strains. Exp Cell. Res. 25.585-621.
Haynes. L. W. (1999) The neuron in tissue cultuic. Chichester,
U.K., John Wiley & Sons.
Heald, К A., Hail, C. A & Downing. R. (1991). Isolation of
islets of Langerhans from the weanling pig Diabetes Res.
17.7-12
Health and Safety Commission (1985). Approved Code of Prac-
tice «The Protection of Persons Against Ionising Radiation
from An Work Activity». HMSO. London
Health and Safety Commission (199 la). Safe working and pict en-
tton of Infection in clinical Laboratories HMSO Publications,
P O. Box 276 London. SW8 5DT. England
Health and Safety Commission (1991b) Safe working and pre-
vention of Infection tn clinical Laboratories Model Rules
for Staff and Visitors, HMSO Publications, P О Box 276,
London, SW8 5DT, England
Health and Safety Commission (1992) Genetically Modified
cd Organisms (Contained Use) Regulations: SI 1992/3217
HMSO, ISBN 0-11-025332-9.
Health and Safety Commission (1999a) Carcinogens ACOP and
Biological agents ACOP Control of Substances Hazardous
to Health Regulations, Approved Codes of Practice, L5 HSE
Books. HMSO Publication Centre. P.O. Box 276, London
SW85DT England
Health and Safety Commission (1999b) Control of Substances
Hazardous to Health Regulations Statutory Instruments.
No.437, HSE Books. Sudbury, U К
Health Services Advisory Committee (1992) Safe Disposal of
Clinical Waste HSE Books. Sudbury, U K.
Hcffclfinger, SC, Hawkms, H.H. Barnsh, J, Taylor, L. & Dar-
lington. G (1992). SR HEP-1. A human cell line of endothe-
lial origin. In Vitro Cell Dev. Biol 28A-136 142
Heldin, С H, Westermark, В & Wasteson. A. (1979). Plate-
let derived growth (actor Purification and partial characte-
rization. Proc Natl Acad Sci USA 76 3722-3726.
Heniniati-Bnvaniun, A , Kelly. O. G. & Melton, D. A. (1994).
Follistatin. an antagonist of activin, is expressed in the Spe-
mann organizer and displays direct ncuralizing activity. Cell
77 283-295.
Список литературы
659
Hcydcrman, Е., Steele, К & Ormcrod, М. G. (1979) A пси
antigen on the epithelial membrane* Its immunopcroxidasc
localisation in normal and neoplastic tissue J. Clin Pathol.
32.35-39.
Heyworth, С M. & Spooncer, E. (1992) In vitro clonal assays
for murine multiipotential and lineage restricted myeloid
progenitor ceils, in Testa, N. G. & Mohncux, G. (cds.). Hae-
mopoiesis. A practical approach. Oxford, U.K.. IRL Press at
Oxford University Press, pp. 37-54.
HHS Publication No. (CDC) 93-8395. 3rd Edition (1993).
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories.
U S. Department of Health and Human Services, Public
Health Service. Centers for Disease Control and Prevention,
and National Institutes of Health U.S Government Printing
Office, Washington.
Hicks, G.G.. Chen. J &Ruley, H.E (1998) Production and use
of retroviruses In Ravid. К & Freshney, R. I (cds ), DNA
transfer so cultured cells. New York, Wiley-Liss, pp 1 -26
Higuclu, К (1977). Cultivation of mammalian cell lines in scrum.
free chemically defined medium, Metod Cell Biol 14.131.
Hill, В T (1983). An overview of clonogenic assays for human
tumour biopsies. In Dendy, P. P. & Hill, В. T. (cds ), Human
tumour drug sensitivity testing tn vitro. New York. Academic
Press, pp. 91-102.
Hilwig, I & Gropp, A. (1972) Staining of constitutive hctcro-
chromatme in mammalian chromosomes with a new fluoro-
chrome. Exp. Cell. Res 75 122-126
Hincc, T A & Roscuc, J. P. (1980). Differences in pattern and
level of plasminogen activator production between a cloned
cell line from an ethylnitrosourea-induccd glioma and one
from normal adult rat brain. J Cell Phystol. 104:199-207.
Hino. H. Tatcno, C. Sato, H., Yamasaki. C., Katayama. S-, Ko-
hashi, T, Aratani, A., Asaliara, T. Dohi, K. & Yoshizato. К
(1999). A long-rcnn culture of human hepatocytes which
show a high growth potential and express their differentiated
phenotypes Biochem. Biophys. Res. Commun 256* 184-189
Hirai, Y., Takcbe, К, Takashina, KL. Kobayashi, S. & Takcichi, M
(1992). Epimorphm: A mesenchymal protein essential for
epithelial morphogenesis Cell 69 471 481
Hlubtnnva, К, Feldsamova, A. & Praehar.J (1994) Evaluation
of two methods for elimination of mycoplasma. In Vttto Cell
Dev. Bio! 30A. 21-22.
Hofmann. S., Kaplan. D , Vunjak-Novakovic, G. Mcincl, L.
(2005). Tissue engineering of bone. In Vunjak-Nova-
kovic. G. & Freshney, R I (cds.) Culture of cells for tissue
ingineering Hoboken. NJ, Wiley-Liss.
Hoheisel, D., Nitz, T. Franke, H, Wegener, J., Hakvoort, A.
Tilling, T. & Galla. H. J (1998). Hydrocortisone reinforces
tlic blood-brain properties in a scrum free cell eu Iture system.
Biochem Biophys. Res. Commun 247 312-315
Holbrook, K. A & Hennings, H. (1983). Phenotypic expression
of epideiitai cells tn vino. A review. J Invest Dermatol 81
lls-24s.
Hollenberg, M D & Cuatrecasas, P. (1973). Epidermal growth
factor Receptors in human fibroblasts and modulation
of action by cholera toxin Proc Natl Acad. Sci USA 70
2964-2968
Holley, R. W, Armour. R & Baldwin, J. H (1978). Density- de-
pendent regulation of growth of BSC-1 cells in cell culture.
Growth inhibitors formed by the cells. Ptoc. Natl. Acad. Sci
USA 75 1864-1866
Holt, S. E., Shay, J. W & Wright, W. E. (199b). Refining the
telomere-telomerase hypothesis of ageing and cancer. Nat
Btotechnol. 14.836-839.
Hoober.J.K, Cohen, S (1907) Epidermal growth factor I. The
stimulation of protein and ribonucleic acid synthesis in chick
embryo epidermis Btochem. Biophys Acta 138 347-356
Hopps, H, Bernheim. В. C., Nisalak. A., Tjio.J. H. & Smadcl J. E.
(1963) Biologic cliaractcristics of a continuous cell line
derived from the African green monkey. J. Immunol. 91
416-424
Horibata, К & Harris, A. W (1970). Mouse myelomas and lym-
phomas in culture Exp. Cel! Rev. 60 61-77.
Horita, A & Weber. L. J. (1964), Skin penetrating property ot
drugs dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) and other
vehicles. Life Set 3 1389-1395.
Hornsby, P J, Yang, L.. Lala, D. S., Cheng, C. Y. & Salmons, В
(1992) A modified procedure for replica plating of mamma-
lian cells allowing selection of clones based on gene expression
Biotechntques 12 244-251
Horstcr, M (1979) Primary cultura of mammalian neophron
epithelia, cpi rbelia. requirements for cell outgrowth and prolf-
cratton front defined explanted nephron segments. Pflagers
Arch 382.209-215.
Hotamishgil, G. S, Amer. P, Caro, J. F_. Atkinson, R. L &
Spcigelman, В M (1995) Increased adtposc tissue expres-
sion of tumor necrosis factor-а in human obesity and insulin
resistance J. Clin Invest 95:2409-2415
Howard, M , Kessler, S.. Chuscd.T. & Paul, W E (1981) Long
term culture of normal mouse В lymphocytes Proc. Natl Acad
Sci USA 78> 5788-5792
Howie Report. (1978) Code of practice for prevention of infec-
tion tn clinical laboratories and post-mortem rooms London
Stationery Office
Hoyer. L. W. de los Santos, R. P. & Hoyer, J R. (1973) Anti-
hemophilic factor antigen localization in endothelial cells
by immunofluorescence microscopy, J. Clin Invest. 52
2737-2744.
HSE (1990) A guide to the Genetically Modified Organisms
(Contained Use) Regulations 1992 (as amended), NSE Books,
ISBN 07176 11868.
Hsu T C. & Bcnirschkc, К (1967). Atlas of mammalian chromo-
somes Vols. 1-4 New York, Springer.
Hu, G.-F-, Riordan, J F. & Valec, В L. (1997) A putative angio-
genin receptor in angiogenin-responsive human endothelial
cells Proc. Natl. Acad. Sa. USA 94.204-209.
Hughes. S E. (1996) Functional characterization of the spon-
taneously transformed human umbilical vein endothelial cell
line ECV304. Use in an tn vitro model of angiogenesis. Exp
CellRes 225 171-185
Hull, R N_, Cherry, W. R. & Weaver, G W (1976). The origin
and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PKi In
Vitro 12 670-677
Human Cytogenetic Nomenclature See Intcmationsl System for
Human. Cytogenetic Nomenclature.
Hume, D A & Wcidcmann. M J. (1980) Mitogenic Lympho-
cyte transformation. Amstcrdainc Elscvicr/North Holland
Biomedical Press.
660
Список литературы
Hunziker. Т & Limat. А. (1999) Cultured kcratinocytcs grafts.
Curr Prohl Dermatol, Zh 57-64.
Huschtscha. L. L & Hollyday. R. (1983) Limited and unlimited
growth of SV'40-transformcd cells from human diploid M RC-
5 fibroblasts.J Cell. Sci.63.77-99.
Hynes. R О (1983) Alteration of cell-surface proteins by viral
transformation and by proteolysis. Proc Natl. Acad. Set. USA
70 3170 3174.
Hynes. R. О (1974) Role of cell surface alterations in cell
transformation. The importance of proteases and cell surface
proteins CelLi 147-156
Hynes. R О (1992) Intcgrincs- Versatility, modtulation, and
signaling in cell adhesion Cell 69. 11-25
Hyvogen, T., Alakuijala, L, Anderson. L. Khomutov, A. R.,
Khomutov R M. & Eloranta, T 0.(1988). l-Aminu-qxy-
3-aminopropanc revcrsivbly prevents tile proliferation oi
eultutred babty hamster kidney cells by interfering with
polyamine synthesis J.Btol.Chetn 263 1138-1144.
Ido, H., Harada. K., Futaki. S, Hayashi. Y., Nishiuchi, R, Nat-
suka, Y, Li, S, Wada, Y-. Combs, A. C. Ervasti.J M. & Seki-
gucht, K. (2004) Molecular dissection of tlic alpha-dystrogly-
can-and integrin-binding sites within the globular domain of
human laminin-10.J Biol Chem. 279.10946-10954
Iguchi. H., Mizuiuoto К , Kiiiki, A. & Takiguchi, S (2004). Pan-
creatic cancer-derived cultured cells, genetic alterationsand
application to an experimental model ofpancrcatic cancer
mct-istasis In Pfragner, R & Freshney, R I. (eds.) Culture of
human tumor cells. Hoboken. NJ, Wiley-Liss, pp 81-96.
Ikonomou. L.. Schneider. Y J & Agathos. S. N. (2003) Insect
cell culture for industrial production of recombinant proteins
Appl. Microbiol. Btotechnol 62 1-20.
Illmensee. К & Mintz. В (1976) Totipotency and nornialdiffcr-
enciation ol sisnglc teratocarcinoine calls cloned by injection
into blastocyts. Pioc. Natl Acad. Sei. USA. 73.549-553.
Ilsic, A W. & Puck, T T. (1971). Morphological transformation
of Chinese liamstcr cells by dibutil adenosine cycline 3’-5’-
monophospliate and testosterone. Ptoc Natl. Aead. Sei USA
2 358-361
Imaizumi. T-. Lankford. K. L., Waxman. S G. Greer. C. A and
Kocsis (1998) Transplanted olfactory ensheastnig cells
rcmyclinatc and enliance axonal conduction m the demy-
elinated dorsal columns of thcrat spinal cord. J. Neuroset le
6176-6185
Inamatsu, M., Matsuzaki.T™ Iwarani, H. & Yoshizato, K. (1998)
Establishment of rat dermal papula cell lines that sustain the
potency toinduce hair foilices from a follicular skin J. Ini cst
Dermatol 111: 767-775.
Inokuchi. S, Handa H, Imai. T, Makuuchi. H. Kidokoro M ,
Tohya, H., Aizawa. S., Shimamura. K., Ucyama. Y.. Mi-
tomi, T. & Sawada, Y. (1995). Immortalisation of human
oesopliagal epithelial cells by a recombinant SV40 adenovirus
vector. Br J. Cancer 71.819-825
Inoue, S. & Spring, К R (1997) Video microscopy 2nJ cd new
York and London, Plenum Pres»
International Human Genome Sequencing Consortium (2001)
Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature
409.860-921
International System for Human Cytogenetic Nomenclature
(1978). Report of the Standing Commettec on Human Cytoge-
netic Nomenclature Washiagtnnc, DC. National Foundation
of the March of Dimes
Ireland, G. W . Dopping-Hepcnstal, P. J , Jordan. P. W &
O’Neill. С H. (1989) Limitation of substratum size alters
cytoskclctal organization and beliaviour of Swiss 3T3 fibro-
blasts. Cell Biol. Int Rep. 126 121 -126.
Iscove, N. N_ Guillbert. L. W & Wevmann, C. (1980). Complete
replacement of serum in primary culture of erythropoctm-dc-
pendent red cell precursors (CFU-E) by albumin, transferrin,
iron, unsaturated fatty acid. Iccitineand cholesterol. Exp Cell.
Res. 126:121-126
Iscove. N & Melchers, F (1978) Complete replacement of
scrum by albumin, transferrin and soybean lipid tn cultures
of lipopolysacharide-rcactivc В lymphocytes J. Exp. Med.
147 923-933.
Ishida, Y, Levin. J., Baker. G-, Stenberg. P., Yamada, Y-, Sa-
saki, H, Inoue, T. (1993). Biological and biochemical char-
acteristics of murine megacaryoblastic cell line L8057. Exp.
Hematol 21 289-298
Itagaki, A & Kimura, G. (1974). TES and HEPES buffers in
mammalian cell cutures and viral studies Problems of carbon
dioxide requirements. Exp Cell. Res 83.351-360
Ivor, V'. R., Eisen, M. B., Ross. D T , Schuler. G-. Moore. T..
Lee, J C F., Trent, J M., Staudt, L. M , Hudson. J.. Jr., Bo-
guski, M. S, Lashkari. D, Shalon. D. Botstcin, D. & Brown,
P O. (1999). The transcriptional program in the response of
human fibroblasts to scrum. Science. 283.83-87
Izutsu, К T., Fathcrazi, S., Belton, С. M., Oda, D., Cart-
wright, F. D. & Kenny, G. E. (1996). Mycoplasm orale infec-
tion affects К and Cl currents in the HSG salivary gland cell
line In Vitro Cell Dev. Btol. Anim 32.361-365
Jacobs, J P (1970) Characteristicsofa human diploid cell des-
ignated MRC-5. Nature 227:168-170
Jacobs, J. P., Garrett, A J. & Meron, R (1979) Characteristics of
a serially propagaterd human diploid cell designated MRC -9.
J Biol Stand.! 113-122
faffc, E. A., Nachman, R.L, Becker, G.C &Ninick.C R.(1973).
Culture of human endotelial cells derived from umbillical
veins J. Clin. Invest. 52 2745-2756.
Jain, D , Raittasubrainaiuaiiyaii, K., Gould, S , Lenny, A, Caiide-
lore,M ,Tota,M..Strader.C, Alves.K.,Cuca,C .Tung,J.S,
Hunt. G, Junker. B., Buckland, В C. & Silbcrklang, M.
(1991). In Sspcir, R. E., Gnffits, J. B. & Mcigmcr. B. (eds.)
Productton of biologicals from animal cells tn culture. Oxford,
U K., Butterworth-Heinemann, pp. 345-351.
Jain. R. K., Schlenger, К. Huckcl, M & Yuan, F (1997) Quanti-
tative angiogenesis assays: Progress and problems Nat Med.
3 1203-1208.
Janssen. M. L.. van Lecwcn, M. В, Schokmcijcr, К, van Коп-
ии, T. G, Dijkhuizen. L. & Wostcn, H A (2003). Coating
with genetic cngencering hydrophubin promotes growth
of fibroblasts on a hydrophobic solid Biomatenals. 23
4847-4854
Jat, P. S .Noble,M D,Ataliotics. P., Tanaka, Y.,Yannoutsos,N,
Larsen. L. & Kiossis, D (1991). Direct Derivation of confi-
detially immortal cell lines from an H-2 Kb-tsA58 transgenic
mouse. Proc Natl Acad Set USA 88 5096-5100.
Jeffreys. A. J, Wilson, V. & Tlicm. S. L. (1985) Individual specific
«fingerprints» of human DNA Nature. 316 76-79.
Список литературы
661
Jcng. Y.-J.. Watson, C.S & Thomas. M. L. (1994). Identification
of vitamin D-stimlatcd phosphatase in lEC-fi cells, a rat small
intestine crypt cell line. Exp Cell Res 212 338-343
Jenkins, N (cd ) (1992) Growth factors, a practical approach.
Oxford, U К, IRL Press at Oxford University Press
Jcsscll, T. M. & Melton. D. A. (1992). Diffusible factors in verte-
brate embryoMe induction. Cell 68.257-270
Jni, D. I.. Lee, S H.. Choi, J. H , Lee, J. S , Lee, J. E., Park, К W.
Seo. J. S. (2003). Targeting efficiency' of a-l,3-galactosyl
transferase gene in pig fetal fibroblast cells. Exp. Mol Med
35 572-577
Jinard, F., Sergent-Engclen. T_. Trouct. A., Remade, C &
Schneider. Y.-J. (1997). Compartment coculturc of porcine
arterial endothelial and smooth muscle cells on a microporous
membrane. In Vitro Cell Dev. Biol AMm 33.92-103.
Johnson, G D (1989) Immunofluorescence In Catty, D (cd.)
Antibodies. Vol. II A practical approach Oxford, U К, IRL
Press ar Oxford UMvcrcity Press, pp. 179-200
Jones, E L., Matsui, W H & Smith, B. D. (2004), Cancer stem
cells: arc we missing the target? J- Natl Cancer Inst. 96
583-585.
Jones, E. L. & Gregory, J. (1989) Immunopcroxidase methods. In
Catty, D (cd.) Antibodies. Vol. II: A practical approach Oxford.
U K.. IRL Press ar Oxford UMvcrcity Press, pp. 155 177.
Joukov, V'.. Kaipainen, A,Jcltsch, M, Pajusola, К Olofsson, B.,
Kumar, V , Eriksson, U. & Alitalo, К (1997) Vascular endo-
thelial growth factors VEGF-B and VTGF-C.J Cell Physiol.
173 211-215.
Jozan, S.. Roche, H.. Chcutin.J., Carton. M. & Salles, В (1992).
New human ovarian cell line OVCCR1 sf in serum-free me-
dium In Vitro Cell Dev. Biol. 28A. 687 689
Kaartinen.L..Ncttcshcim.P .Adler,К.В & Randcll S. H (1993).
Rat tracheal epithelial cell differentiation tn vitro. In Vitro Cell
Dev. Biol. 29A. 481-492.
Kahn, P & Shin, S.-L. (1979) Cellular tumorigeMcity in nude
mice. Test of association among loss of cell-surface fibronc
crin, anchorage independence and tumor-forming ability.
J. Cell Biol. 82 1.
Kaltcnhach. J. P. Kaltenbach. M, H & Lyons, W В (1958)
Mgrosm as a dye for diffcrentatnig live and dead ascites cells
Exp Cell Res. 15 112 117
Kaminska, B.. Kaczmarek, L. & Grzclakowska-Szrabcrt, В (1990)
The regulation of Go-S transition m mouse T-lymphocytes
by polyamincs Exp Cell Res. 191 239 -245
Kane, D. A. Warga, R M. & Kimmel, С. В (1992). Mitotic
domains in the early embryo of the zebrafish. Nature 360
735-737
Kao, F T &Puck,T T (1968) Genetics of somatic mammalian
cells, VII Induction and isolation of nutritional mutants
in Chinese hamster cells. Proc Natl. Acad. Set USA 60
1275-1281
Kao, W-Y & Prockop. D I (1977) Proline analogue removes
fibroblasts from cultured mixed cell populations Nature 266.
63-64.
Karenherg,J R & Freclnadcr, E F. (1974) Giemsa techMquc
for the detection of sistcrchromatid exchanges Chromosoma
48 355-360
Katdarc. M . Osborne, M., Telang, N -T (2004). Soy isoflavonc
geMstein modulates cell cycle progression and induces
apoptosis in HER-2/neu oncogene expressing human breast
epithelial cells Int J. Oncol 21 809-815.
Katoh, M, Ayabe, F..Norikanc, S, Okada, T, Masumoto, H, Hor-
ikc. S., Shirayoshi, Y. & Oshuuira, M. (2004) Construction of
a novel human artificial chromosome vector for gene delivery
Btochem Btophys Res. Common 321 280-290
Kawa, S , Kimura, S., Hakomon. S & Igarashi. V'. (1997). Inhibi-
tion of chemotactic motility and trans-cndothelial migration
of human neutrophils by sphingosin 1 -phosphate. FEBS Lett
420.196-200
Kawada. H Fujita. J. Kinjo, K, Matsuzaki, V.. Tsuma. M., Mi-
yatake, H., Mugurumma, Y, Tsuboi, К, Itabashi. Y.. Ikeda, Y,
Ogawa, S_. Okano, H. Hotta, T, Ando К & Fukuda, К
(2004). Nonhcinatopoictic mesenchymal stem cells can be
mobilized and differentiate into cardiomiocytcs after myo-
cardial infarction Blood 104 3581 3587.
Kawasaki E. S (2001). M icroarrays and the gene expression
profile of a single cell. Ann NY Acad Set 1020 92 100
Kedinger, M., Stmtin-Assmann. P., Alexandre F. & Halfen, К
(1987). Importance of a fibroblastic support for in vitro differ-
entiation of intestinal endodermal cells and for their response
to glucocorticoids. Cell Differ 20 171 182.
Keen, M J & Rapson. N. T. (1995). Development of a serum-
free culture medium for the large scale production of a
recombinant protein from a Chinese hamster ovary cell Imo
Cytotechnology 17. 153-163.
Ketlova, H. (1948). The effect of streptomycin on tissue cultures
Experimental 4 483
Keith, W. N. (2003). In situ analysts of tclonmerase RNA gene
expression as a marker for tumor progression. Methods Mol
Med 75.163-176
Kclcs G. E Berger. M S. Lim. R. & Zahccr, A (1992) Ex-
pression of glial fibrillary acidic protein in human medul-
loblastoma cells treated with recombinant glia maturation
factor-beta Oncol Res 4.431-437.
Kelley. D S.. Becker, J. E & Potter, V. R. (1978) Effect of insu-
lin, dexamethasone and glucagon on the aminoacid transport
ability of four rat hepatoma cell lines and rat hepatocytes in
culture. Cancer Res 38 4591-4601
Kctiipsini, S A, McAtecr, J. A.. AI-Mahrnuq, H. A, Dousa. T P.,
Dougherty, G. S & Evan, A. P. (1989). Proximal tubule char-
acteristics of cultured human renal cortex cpitclium J Lab
Clin. Med. 113.285-296.
Kenworthy, P., Dowrick, P, Baillie-Johnson, H.. McCann, B.,
Tsuboucln. H, Arakaki, N, Daikuhara. Y & Warn. R. M
(1992) The presence of scatter factor in patterns with meta-
static spread to the pleura. Br. J Сапсегбб 243-247.
Kern. P. A., Knedler. A & Eckel. R H (1983) Isolation and
culture of microvascular endothelium from human adi|>osc
tissue J. Clin. Invest 71.1822-1829.
Kerr, D A., Lladc, J., Shamblott, M J , Maragakis, N J,
Irani, D. N., Crawford, T. О, Krishnan, C.. Dike, S.. Gear-
hart, J D. & Rothstein. J. D. (2003) Human embryonic germ
cell derivatives facilitate motor recovery of rats with diffuse
motor neurone injury J. Neurosti, 23 5131 -5140
Khan, M. Z., Spaudidos, D A., Kerr, D. J. McNicol, A M.,
Lang, J C, de Ridder, L & Freshney, R. I. (1991) Oncogene
transfection of m>nk lung cells effect on growth characteris-
tics tn vttro atd tn vuo. Anticancer Res. 11 1343-1348.
662
Список литературы
Kibbey, М С., Royce, L S., Dym, М., Baum, В. J & Klein-
man, Н К (1992) Glandular-hke morphogenesis of the
human submandibulartumor cell hue A253 on basement
membrane components Exp Cell Res. 198 343-351.
Iscovc, N & Melchers, F. (1978). Complete replacement ol
scrum by albumin, transferrin and soybean lipid in cultures
of lipopolysacharidc-rcactivc В lymphocytes J Exp. Med
1471923-933.
Ishida, Y. Levin, J Baker, G., Stenberg, P., Yamada, Y., Sa-
saki, H, Inoue, T. (1993) Biological and biochemical char-
acteristics of murine mcgacaryoblastic cell line L8057. Exp
Hematol. 21-289-298
Itagaki, Л & Kimura, G (1974). TES and HEPES buffers in
mammalian cell cuturesand viral studies. Problems of carbon
dioxide requirements. Exp Cell. Res 83.351-360.
Iyer, V. R-, Eisen, M B., Ross. D. T., Schuler, G. Moore, T
Lce.J C F., Trent,J. M„ Staudt, L. M , Hudson, J, Jr., Bo-
guski, M. S, Lashkari, D„ Shalon, D, Botstein, D & Brown,
P. O. (1999) The transcriptional program in the response of
human fibroblasts to scrum. Science 283.83-87.
Izutsu, К. T, Fatbcrazi, S., Belton, С M., Oda, D , Cart-
wright, F D & Kenny, G.E (1996). Myeoplasm orale infec-
tion affects К and Cl currents in the HSG salivary gland cell
hoc in Vitro Cell Dev Btol.Anim 32 361-365
Jacobs, J. P (1970) Characteristics of a human diploid cell des-
ignated MRC-5. Nature 227.168-170
Jacobs, J. P., Garrett, A J. & Mcron, R (1979) Characteristics ol
a serially propagaterd human diploid cell designated MRC-9
J Bio!Stand.7 113-122
Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, G. C & Ninick, C R. (1973)
Culture of human cndotclial cells derived from umbilhca!
veins J. Clm. Invest. 52 2745-2756
Jain, D, Ramasubrainamanyan, K., Gould, S, Lenny, A, Candc-
lorc, M , Tota, M, Strader, C , Alves, K, Cuca, C., Tung. J. S,
Hunt, G., Junker, В, Buckland, В C. & Silbcrklang, M
(1991). In Sspcir, R E., Griffith,J. B. & Mcignicr, B. (cds)
Production of biological* from animal cells tn culture. Oxford,
U.K., Butterworth-Heinemann, pp. 345-351
Jain, R K, Schlcngcr. К, Hockcl, M &Yuan, F (1997). Quanti-
tative angiogenesis assays’ Progress and problems. Nat Med
3 1203-1208
Janssen, M L., van Lccwcn, M. В , Scholtmcijer, К, van Koo-
ten, T G, Dijkhuizcn, L. & Wostcn, H A. (2003). Coating
with genetic engeneenng hydrophobin promotes growth
of fibroblasts on a hydrophobic solid. Biomaterials. 23
4847-4854
Jat, P S .Noble,M D, AtaKotics. P.,Tanaka, Y., Yannoutsos,N,
Larsen, L. & Kiossis, D. (1991) Direct Derivation of confi-
detially immortal cell lines from an H-2 Kb-tsA58 transgenic
mouse. Proc Natl Acad Sci USA 88’5096-5100.
Jeffreys, A J, Wilson, V &Thcm,S L (1985) Individual specific
«fingerprints* of human DNA Nature 316.76-79.
Jcng,Y-J .Watson,C S.&Thomas,M L.( 1994).Identification
of vitamin D-stimfated phosphatase in IEC-6 cells, a rat small
intestine crypt cell line Exp. Cell Res. 212.338-343
Jenkins, N. (cd.) (1992) Cruuth factors, a practical approach
Oxford, U.K, IRL Press at Oxford University Press.
Jcssell,T M & Melton, D A. (1992) Diffusible factors in verte-
brate cmhryoMc induction. Cel!68 257-270
Jin. D. I, Lee, S H, Choi.J. H., Lce.J. S., Lce.J. E., Park, K.W ,
Seo, J S. (2003). Targeting efficiency of a-l,3-galactosyl
transferase gene in pig fetal fibroblast cells Exp Mol Med
35 572-577
Tmard, F, Scrgent-Engelcn, T., Trouct, A, Rcmaelc, C. & Schnei-
der, Y -J. (1997) Compartment coculturc of porcine arterial
endothelial and smooth muscle cells on a microporous mem-
brane. In Vitro Cell Dev. Biol. AMm 33 92-103
Johnson, G D (1989). Immunofluorescence In Catty, D (cd).
Antibodies. Vol II: A practical approach. Oxford, U К, IRL
Press ar Oxford UMvcrcity Press, pp. 179-200.
Junes, E. L, Matsui, W H. & Smith, В D (2004), Cancer stem
cells, arc we missing the target? J. Nad. Cancer Inst. 96
583-585.
Jones, E L & Gregory, J (1989) Immunopcroxidasc methods.
In Catty, D. (cd.) Antibodies. Vol. II A practical approach.
Oxford, U.K., IRL Press ar Oxford University Press,
pp. 155-177.
Juukov, V, Kaipaincn, A., Jcltsch, M , Pajusola, К, Olofsson, В,
Kumar, V., Eriksson, U & Alitalo, К (1997). Vascular endo-
thelial growth factors VEGF-B and VTGF-C.J Cell Physiol.
173 211 215.
Jozan, S., Roche, H. Chcutin.J., Carton, M & Salles, B. (1992).
New human ovarian cell line OVCCR1 sf in scrum-free me-
dium. In Vitro Cell Dev Biol 28A 687-689.
Kaartinen. L, Ncttcsheim, P., Adler, К B. & Randcll, S. H (1993).
Rat tracheal epithelial ceil differentiation in vitro. In Vitro Cell
Dev Bio! 29A. 481-492.
Kahn, P & Shin, S.-L. (1979) Cellular tumorigcMcity in nude
mice Test of association among loss of cell-surface fibronc-
erm, anchorage independence and tumor-forming ability.
J Cell Bio! 82.1
Kaltcnhach, J P., Kaltenbach, M, H. & Lyons, W. В (1958).
Mgrosinas a dye for diffcrcntatmg live and dead ascites cells.
Exp Cell. Res. 15:112-117.
Kaminska, B., Kaczmarek, L. & Grzclakowska-Szrabcrt, B. (1990).
The regulation of Go-S transition in mouse T-lymphocytes
by polyamines. Exp Cell. Res 191.239-245.
Kane, D. A, Warga, R. M & Kimmel, ( B. (1992) Mitotic
domains iu the early embryo of the zebrafish Nature 360
735-737.
Kao, F T. & Puck, T. T. (1968) Genetics of somatic mammalian
cells, VII. Induction and isolation of nutritional mutants
in Chinese hamster cells. Proc. Natl Acad Sci. USA 60
1275-1281.
Kao, W.-Y & Prockop, D I. (1977). Proline analogue removes
fibroblasts from cultured mixed cell populations Nature 266
63-64.
Karcnbcrg, J. R. & Frcclnader, E. F (1974) Giemsa tcchMquc
for the detection of sister chromatid exchanges. Chromosoma
48 355-360
Katdarc, M., Osborne, M, Tclang, N -T. (2004). Soy isoflavonc
gcnistcin modulates cell cycle progression and induces
apoptosis in HER-2 ncu oncogene expressing human breast
cpithchal cells Int.J Oncol 21.809-815
Katoh, M., Ayabc, F, Nonkane, S., Okada, T, Masuiunto, H., Hor-
ikc, S., Shirayoshi, Y & Oshiimra, M (2004). Construction of
a novel human artificial chromosome vector forgone delivery.
Biochem Biophys. Res Commun. 321 280-290.
Список литературы
663
Kawa, S_. Kimura, S., Hakomori, S & Igarashi. V'. (1997). Inhtbi
tion of chemotactic motility and trans-cndothelial migration
of human neutrophils by sjihingosin 1-phosphatc FEBSLett.
420 196-200
Kawada, H., Fujita J., Kmjo, K., Matsuzaki, V., Tsuma, M ,
Miyatakc. H.. Mugurumma. Y. Tsuboi, K. Itabashi. Y.
Ikeda, Y., Ogawa, S, Okano. H. Hotta, T. Ando К & Fu-
kuda, К (2004) Nonhcniatopoictic mesenchymal stem cells
can be mobilized and differentiate into cardtomiocy tes after
myocardial infarction. Blood 104.3581 3587.
Kawasaki, E. S (2004) M icroarrays and the gene expression
profile of a single cell Ann NY Acad Sci 1020 92-100.
Kedingcr, M., Simon-Assmann. P., Alexandre F. & Haffen. К
(1987). Importance of a fibroblastic support for m vitro differ
entiation of intestinal endoderma) cells and for their response
to glucocorticoids. Cell Differ 20.171-182
Keen, M. J & Rapson. N. T. (1995), Development of a serum-
free culture medium for tbc large scale production of a
recombinant protein from a Chinese hamster ovary cell line.
Cytotechnology 17 153-163.
Krilova, H. (1948) The effect of streptomycin on tissue cultures.
Experimentia 4 483
Keith. W. N (2003). In situ analysis of tclonmcrasc RNA gene
expression as a marker for tumor progression. Methods Mol.
Med 75 163-176
Kelcs, G. E.. Berger, M. S., Lim. R & Zahccr. A (1992). Ex-
pression of gltal fibrillary acidic protein in human medul-
loblastoma cells treated with recombinant glia maturation
factor-beta Oncol Res 4.431 4.37
Kelley. D S, Becker, J E & Potter, V. R. (1978) Effect of insu-
lin, dexamethasone and glucagon on the ammoacid transport
ability of four rat hepatoma cell lines and rat hepatoevtes in
culture. Cancer Res. 38:4591 4601.
Kempson,S A,McAtecr,J.A,Al-Mahrouq,H.A.,Dousa,TP.
Dougherty, G.S & Evan. A P (1989). Proximal tubule char-
acteristics of cultured human renal cortex cpitclium J. Lab
Chn Med 113 285-296.
Kenworthy, P.. Dowrick. P. Baillie-Johnson, H.. McCann. B..
Tsubouchi, H, Arakaki, N., Daikuhara. Y. & Warn, R. M
(1992) The presence of scatter factor in patterns with meta-
static spread to the pleura. Br. J Cancer 66 243-247.
Kern, P. A, Kncdler, A. & Eckel, R H. (1983) Isolation and
culture of microvascular endothelium from human adipose
tissue J. Chn. Invest 71.1822-1829
Kerr. D. A. Lladc. J.. Shamblott, M J., Maragakis. N J .
Irani, D N, Crawford. T. O., Krishnan. C . Dike. S .
Gearhart, J D. & Rothstein, J. D (2003) Human em-
bryonic germ cell derivatives facilitate motor recovery
of rats with diffuse motor neurone injury .J. Neurosci, 23.
5131-5140.
Khan, M. Z., Spandidos, D A, Kerr, D J , McNicol, A M .
Lang. J. C., de Ridder. L & Freshney, R. I. (1991). On
cogcnc transfection of mink lung cells: effect on growth
characteristics in vitro aid tn vivo. Anticancer Res 11
1343-1348.
Kibbey, M C . Royce, L. S. Dyni, M, Baum. B. J. & Klein-
man, H K. (1992) Glandular-like morphogenesis of the
human submandibulartumor cell line A253 on basement
membrane components. Exp Cell Res. 198 34.3-351
Kiefer, J, Alexander. A. & Farach-Carson. M. C (2004). Type I
collagen-mediated changes in gene expression and function of
prostate cancer cells. Cancer. Treat Res 118 101-124
Kimhi. Y H., Palfrey, C & Spector, I. (1976) Maturation of
neuroblastoma cells in the presence of dimethyl sulphoxide.
Proc Natl. Acad Sci USA 73 462-466.
Kingsburv. A. Gallo, V. Woodhams. P. L & Balazs, R (1985)
Survival, morphology and adhesion ]>ropcrties of cerebellar
interneurons cultured in chemically defined and serum-
supplemented medium. Dev Brain Res 17.17-25.
Kinoshita. T, Miyajuna, A. (2002). Cytokine regulation of liver
development Biochem Btophys. Acta 1592.303-312.
Kinsella, J L., Grant, D S, Weeks. В S & Kleinman, H К
(1992) Protein kinase C regulates endothelial cell tube for-
mation on basement membrane matrix. Matrigcl Exp Cell
Res 199 56-62
Kirkland. S C. & Bailey. I. G (1986). Establishment and charac-
terisation of six human colorectal adenocarcinoma cell lines
Br J. Cancer53 779-785.
Klagsbrun, M & Baird, A. (1991). A dual receptor system is
required for basic fibroblast growth factor activity. Cell 67
229-231
Klein, B.. Pastink. A., Odijk. H.. Wcstcrvcld. A. & van dcr Eb, A J
(1999). Transonnatton and iuimortalizatiimof diploid .xeroderma
pigmentosum fibroblasts. Curr Opin Btotechno!191 256-262
Kleinman. H K, Philp, D. & Hoffman. M. P (2003). Role uf the
extracellular cell matrix in morpogcncsis. Curr Opin Btotech-
nol. 14 526-532
Kleinman. H К, McGoodwin, E B., Rennard. S I, Martin. G R
(1979) Preparation of collagen substrates for cell attachment
Effect of collagen concentration and and phosphate buffer
Ana! Biochem 94 308-312
Klcmsmith. L.J. & Pierce. G. В (1964) Cancer Res 24.1544-1551
Klcment, G.. Scherrer, W & Katinger, H. W (1987) Construc-
tion of a large scale membrane reactor system with different
compartments for cells, medium and product Dev. Biol. Stand
66 221 226.
Klevjer-Anderson. P. & Buehrig, G C. (1980). Effect of hormones
on growth rates of malignant and nonmalignant human mam-
mary epithelia tn cell culture In Vitro 16. 491-501
Klmgel, S, Rothe, G.. Kellennann. W. & Valet. G (1994). Flow
cytometric determination of cysteine and serine proteinase
activities in living cells with rhodamine 110 substrates. Meto d
Cell. Biol, ii 449-459.
Klinger, R. Y. & Niklason, L. E. (2005) Tissue engineered blood
vessels In Vubjak-Novakovic. G. & Freshney, R. I (cds.).
Culture of cellsfortissue ingtneenng Hoboken. NJ, Wiley-Liss
(in press)
Kloppingcr, M . Fcrtig, G., Fraunc, F. & Miltcnburgcr, H. G.
(1991) High cell density perfusion culture of insect cells
for production of baeulovirtus and recombinant protein. In
Speir, R. E., Griffiths. J В & Meignier. В (eds ), Production
of hiologicals from animal cells tn culture Oxford, U К But-
terworth-heinemann. pp. 470-474
Klng,C A. & Jordan, С. T. (2002) Hematopoettc stem cellptoto-
cols Clifton, N.J. Humana Press.
Knazek. R A.. Gullmo, P Kohler, P О & Dedrtek, R (1972)
Cell culture on artificial capillaries. An approach to tissue
growth in vitro Science 178.65-67
664
Список литературы
Knazek, R. A., Kohler, Р О & Gullino, Р. М. (1974) Hormone
production by cells grown tn vitro on artificial capillaries. Eip
Cell Res. 84 251
Kncdler, A. & Hain, R G (1987). Optimized madium for clonal
growth of human microvascular endothelial cells with mini-
mal scrum. In Vmo 23 (7) 481-491
Kneuchel, D J & Masters, J. R W. (1999) Bladder Cancer. In
Masters,/ R. W & Palsson, B. (eds.) Human cells culture,
Vol. I, Dordreht. Kluwer, pp. 213-230.
Knight. D J. & Breheny. D (2002) Alternatives toannual testing in
the safety evaluation ol products. Alteni Lab. Anim. 3(1.7 22
Knott. C, L., Kuus-Rcichcl, К, Liu. R & Wolfert. R L (1997)
Development of antibodies for diagnostic assay's. In Price. C &
Newman, D. (eds.). Principles and practice of immunoassay
2nd cd New York. Stockton Press, pp 36-64
Knowles, В B.. Howe. С. C. & Aden D P. (1980). Human hepato-
cellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins
and hepatitis В surface antigen. Science 209. 497-499.
Kohler, G. & Milstem, C (1975). Contmuous cultures of fused cells se-
creting antibody of predefined specificity Nature256:495-497.
Kohlhepp, E. A.. Condon M E. & Hamburger. A. W (1987)
Recombinant human intcrfcron-a enhancement of retinoic
acid induced differentiation of HL-60 cells Exp. Hematol
15 414-418.
Kondo. S . Kooshcsh, F. & Saudcr, D. N (1997). Penetration ol
keratinucytc-dcrivcd cytokines into basement membrane
J Cell. Physiol. 171 190-195.
Kondo. T. & Raff. M (2000). Oligodendrocyte precursor cells
reprogrammed to become rnultipotcntial CNS stem cells
Science 289.1754-1757
Kondo.T & Raff, M (2004) Chromatin remodeling and histone
modification in the conversion of oligodendrocyte precursors
to neural stein cells. Genes Dev 18.2963-72.
Kono, T. (1997) Nuclear transfer and reprogramming Rev
Reprod 2:7480.
Ktxipman. L. A., Szuhat, K., van Ecndcnhurg. J D., Bczrook-
ovc. V'.. Kcntcr, С. C., Schuurtng, E..Tankc, H & Flcurcn. G.J
(1999). Recurrent integration of human papillomavtuscs 16,
45 and 67 near translocation breakpoints in new cervical
cancer cell hues. Cancer Res 59.5615-5624
Koppcr, L. & Hajdu, M (2004) Tumor stem ceils. Pathol Oncol.
Res 10.69-73.
Koren. H. S.. Handwcrgcr, В S. & Wunderlich. J. R. (1975)
Identification of macrophage-like characteristics in a murine
tumor cell line J Immunol 114.894-897
Korenberg, J. R. Chen, X. N., Adams. M D & Venter. J. C
(1995). Toward a cDNA map of the human genome. Genomic
29 364-370.
Koschier, F. J., Roth. R. N., Wallace, K. A., Curren, R D. &
Harhcll.J W (1997) A comparison of three-dimensional hu-
man skin models to evaluate the dermal irritation of selected
petroleum products In Vitro Toxicol. 10 391-405
Krcisberg, J L.. Sachs, C , Pretlow, T G E. & Me Guirc, R. A
(1977). Separation of proximal tubule cells from suspensions
of ran kidney cell by frcc-flow electrophoresis./ Cell Physio!
93 169-172.
Krotz. F, Sohn, H. Y, Gloc, T.. Plank. C. & Pohl. IJ (2003) Mag-
netofection potentiates gene delivery to cultured endothelial
cells./ Vase Res 40.425-34.
Krupp, W. Geiger, К , Schobc, R., Sicgcrt, G & Frostcr, U. G.
(2004). Cytogenetic and molecular cytogenetic analyses m
diffuse astrocytomas Cancer Genet. Cytngenet. 153.32-38
Kruse. R.H., Puckett, W.H & Richardson.J H (1991). Biologi-
cal safety cabinetry. Clin Microbiol Rev 4.207-241
Kruse, P. F.. Jr.. Kuen, L. N. & Whittle, W. L. (1970) Some
distinctive characteristics of high density perfusion cultures
of diverse cell types. In Vitro 6.75-78.
Kuchcrlapati, R. & Skoultchi, A (1984). Introduction of puri-
fied genes into mammalian cells. CRC Crit. I Rev Biochem.
16 349-379
Kujoth, G. C, Fahl. W. E. (1997). C-sis, platelet-derived growth
factor-B promoter requirements for induction during the
12-0-tctradecanoylphorbol-13-acetatc-mcdtatedmegakaryo-
blastie differentiation of K562 human erythroleukemia cells.
Cell Gtut th Differ 8 963-977.
Kunliarcuch. W & Green, H. (1978). Adipose conversion of
3T3 cells depends on a scrum factor Proc Natl Acad. Set.
75 6107-6110.
Kurtz, J W & WcHs. W W. (1979). Automated fluorometric
analysis of DNA, protein, and enzyme activities Application
of methods tn cell culture Anal Biochem 94:166
Labarca, C. & Paigcn, К (1980). A simple, rapid, and sensitive
DNA assay procedure Anal Biochem 102 344-352.
Lafcrte, S. & Loh, L C (1992) Charactcrizationof a family
of structurally related glycoproteins expressing beta 1-6-
branchcd asparagtnes-linkcd oligosaccharides in human colon
carcinoma cells Biochem J. 283 192-201
Lag, M., Becher. R, Samuclscn.J. T.. Wigcr, R.. Refsnes, M.. Hint-
field, H. S. & Schwarzc. P E (1996) Expression of CYP2B1
in freshly isolated and proliferating cultures of epithelial rat
lung cells Exp Lung Res 22 627-649.
Lamb. R. F, Hcnntgan. R. F, Katsanakis, K. D, Turnbull, К,
MacKenzic. E. D.. Birnic, G. D & Ozannc. В W (1997).
AP-l-mcdiatcd invasion requires increased expression of the
hyaluronan receptor, CD44. Mo! Cell Biol. 17.963-976
Lan, S., Smith. H S. & Stampfcr, M. R. (1981). Clonal growth
of normal an malignant human beast epithelia./. Surg. Oncol.
18 317-322
Lane, E В (1982). Monoclonal antibodies provide specific intra-
molecular markers for the study of tonofilamcnt organisation.
/ Cell Bo! 92.665-673.
Lang, M S.. Hovcnkamp, E.. Saclkoul, H. F , Kncgt, P & van
Ewtjk, W.( 1995). Immunotherapy with mononclonal antibod-
ies directed against the immunosuppressive domain of pl5E
inhibits tumour growth. Clin Exp Immunol. 102.468-475.
Langdon, S P (2004) Characterization and authentication
of cancer cell lines* an overview Methods Mol. Med 88
33-42.
Lapgc, W.. Bruggcr, W., Rosenthal, F. M , Kanz, L. & Linde-
mann, A (1991). The role of cytokins in oncology Ini. Cell
Cion 9 252-273
Larin, Z. & Mqia, J. E (2002) Advances in human artificial
chromosome technology Trends Genet 18 313-319
Larsen. M C . Brake, P. В . Pollcnz. R S & Jccoate, C. R (2004).
Linked expression of All receptor, ARNT, CYP1A1, and CY-
P1B1 in rat mammary epithelia, tn vitro, is each substantially
elevated by specific extracellular matrix interactions that
precede branching morphogenesis Toxicol Set 82.46-61.
Список литературы
665
Lasfargucs. Е. Y (1973). Human mammary tumors In Kruse, P..
Paterson. M К (cds) ^Tissue Culture Methods and Applica-
tions * New York, Academic Press, pp. 45-50
Laslctt, A. L., Filipczyk, A A. & Pera, M F (2003). Character-
ization and culture of human embryonic stem cells. Trends
Cardiovasc. Med 13.295-301.
Lasnitzki. I (1992) Organ culture. In Freshney. R I (cd).
Animal cell culture, a practical approach Oxford, U К , IRL
Press at Oxford University Press, pp 213-261
Latt, S A. (197.3) Microfluoromctrtc detection of DNA replica-
tion in human metaphase chromosomes. Proc Natl. Acad. Set.
USA 70 3395-3399.
Latt, S. A (1981) Sister chromatid exchange formation. Annu.
Rev Genet. 15. 11-55.
Laug. W. E, Tokes, Z A., Benedict, W F. & Sorgente, N. (1980)
Anchorage independent growth and plasminogen activa-
tor production by bovine endothelial cells. J. Cell Biol 84
281 293
Lavappa. K. S. (1978). Survey of ATCC stocksof human cell lines
for HeLa contamination. In Vitro 14 (5). 469-475.
Law, L W., Dunn, T B., Boyle. P. J. & Miller, J. H. (1949)
Observations on the effect of a folic acid antagonist on
transplantable lymphoid leukemia in mice- J Natl. Cancer
Inst 10 179-192.
Leake, R. E.. Freshney. R. I. & Munir, I. (1987) Steroid responses
in vivo and in vitro. In Green, B. & Leake. R E (cds ), Steroid
hormones, a practical apptoach, Oxford, U К, IRL Press at
Oxford University Press, pp. 205-218.
Lebeau, M. M. & Rowley. J D. (1984). Heritable fragile sites in
cancer Nature 308 607-608
Lechardcur. D.. Schwartz. B., Paulin. D. & Schcrman. D. (1995)
Induction of blood-brain barrier differentiation ina rat brain
derived endothelial cell line Exp Cell Res. 20 161-170
Lechner, J. F & LaVcck, M A. (1985) A scrum free method for
culturing normal human bronchial epithelial cells at clonal
density J. Tissue Cult Methods 9 43-48.
Lechner, J. F_ Haugen, A , Autrup. H., McClendon. I. A.
Trump, В F. & Harris. С. C (1981) Clonal growth of epi-
thelial cells from normal adult human bronchus. Cancer Res.
41.2294-2304
Leder, A & Leder, P. (1975). Butyric acid, a potent inducer of
erythroid differentiation in cultured erythroleukemic cells
Cell 5.319-322.
Le Douarin, N M., Crcuzet. S, Couly, G., Dupin, E. (2004)
Neural crest cell plasticity and its limits Development 131
4637-50.
Lee. M. W., Choi. J , Yang, M. S. Moon. Y J., Park, J. S.
Kim, H. C . Kim. Y J (2004) Mesenchymal stem cells from
cryopreserved human umbilical cord blod. Btochem. Biophys
Res. Commun 320.273-8.
Lcc.D R.,Kaproth, M T.&Parks,J.E (2001) In vitro produc-
tion of haploid germ cells from or frozen-tbawed testicular
cells of neonatal bulls. Biol. Reprod. 65.873-878.
Lee.T.H..Baik,M.G..Im.W.В ,Lce,C S.,Han, Y.M,Kim.S J..
Lee. К. K. & Choi, Y J. (1996) Effects of EHS matrix on
expression of transgcncs in HC11 cells, in Vitro Cell Dev Biol.
Antm. 32 454 456.
Lehlc, К, Buttstaedt, J. & Birnbaum. D. E. (2003). Expression of
adhesion molecules and cytokines in vitro by endothelial cells
seeded on various polymer surfaces coated with titaniumcar-
boxonitnde J. Biomed Mater. Res. 65A. .393 101.
Lcibo, S. P., Mazur, P. (1971) The role of cooling rates in low-
tcmpcraturc preservation. Cryobiology, 8.447-52.
Leibovitz, A (1963) The growth and maintenance of tissue cell
cultures tn free gas exchange with the atmosphere An.J. Hyg
78 173-183
Leigh, I. M & Watt, F. M (1994). Kerattnocyte methods. Cam-
bridge, U К, Cambridge University Press
Leighton. J (1991). Radial histophysiologic gradient culture
chamber rationale and preparation. In vitro Cell Dev Biol.
27A 786-790
Leighton, J, Mark, R & Rush, G. (1968). Patterns of three-di-
mensional growth in collagen coated cellulose sponge. Carci-
nomas and embryonic tissues Cancer Res. 28 286-296
Leinare, F.. Steimhcrg, N. Lc Gricl C , Dcnngnot. S & Adolphe,
M (1998). Dedifferentiated chondrocytes cultured in algi-
nate beads. Restoration of the differentiated phenotype and
of the metabolic response to intereukin-ip. J. Cell Physiol
176 303-313
Lennon, D & Caplan, A. (2005) Mesenchymal stem cells In
Vunjak-Novakovic, G. & Freshney, R. I (cds ), Culture of cells
for tissue engineering Hoboken, NJ, Wiley-Liss (In press).
Leobou, B.. Garcin. L. cnasche. P., Vilquin. J T , Audinat, E &
Charpak, S. (2003). Myoblats transplanted into rat tnfarctcd
myocardium are functionally isolated from their host. Proc
Natl Acad Sci. USA 100 7808-7811.
Lc Poole. I. C., van den Berg, F. M„ van den Wijngaard, R. M.,
Galloway, D. A., van Amstel, P.J., Buffing, A A., Smiths, H L.,
Wcstcrhof, W & Das, P K. (1997) Generation of a human
melanocyte cell line by introduction of HP16 E6 and E7 genes
In Vitro Cell Dev Btol.Anim 33 42-49
Lc Roith. D. & Raizada, M К (cds) (1989) Molecular and cel-
lular biology of insulin-hkegrowth factors and their receptors
New York, Plenum.
LcsufHeur. T.. Barbat, A, Dussaulx, E & Zwcibaum, A. (1990)
Growth adaptation to methotrexate of HT-29 human colon
carcinoma cells is associated with their ability to differentiate
into columnar absorptive and mucus-secreting cells Cancer
Res 50 6334-6343
Lever, J (1986) Expression of differentiated functions in kidney
epithelial cell lines Min Elec. Metab 12.14-19.
Lcvi-Montalcini, R. (1966). The nerve growth factor its mode of
action on sensory and sympathetic nerve cells. Harvey Leet
60.217-259.
Lcvi-Montalcini. R. С. P. (1979) The nerve growth factor Sci
Am. 240:68
Levin. D В, Wilson. K.. Valadares de Amorim, G., Webber, J.,
Kenny, P. & Kusser, W (1995) Detection of p53 mutations
in benign and dysplastic nevi. Cancer Res. 55.4278-4282
Levine, E. M & Becker. В G. (1977) Biochemical methods for
detecting mycoplasma contamination. In McGarrity, G T.,
Murphj', D. G. &Ntchols. W. W (cds ), Mycoplasma infection
of cell cultures. New York, Plenum Press, p 87 104.
Ley. К D. & Tobey, R. A (1970). Regulation of initiation of
DNA synthesis in Chenese hamster cells, II. Induction of
DNA synthesis and cell division by isolcuctne and glutamine
in G, -arrested cells in suspension culture- J. Cell Biol. 47
453-459
666
Список литературы
Li, Y . Dcchcrchi, P & Raisman, G. (2003a) Transplant anon ol
olfactory enshcatlung cells into spinal cord lesions restores
breathing and climbing. J Neurosci. 3 727 731
Li, Y., Foster, W, Deasy. В M, Chan, Y. Pnsk, V, Tang, Y.
Cummins, J. & Hoard, J. (2004). Transforming growth fac-
tor-bctal induces the differentiation of myogenetic cells into
fibrotic cells in injured skeletal muscle a key event in muscle
fibrogenesis. Am J Pathol 164 1007-1019.
Li, Y. M , Schachcr. D H, Liu, Q., Arkins, S., Rebeiz, N . Mc-
Cusker. R. H ,Jr., Dantzer, R. & Kelley, K. W. (1997). Regula-
tion of myeloid growth and differentiation by the tnsuhn-hke
growth factor I receptor. Endocrinology 138 362-368
Li, A P., Roque, M. M, Beck, D.J. & Kaniinskt, D L. (1992)
Isolation and culturing of hepatocytes from human livers
J Tissue Cult Methods 14.139-146.
Li, Y ct al. (2003b). Transplanted olfactory cnsbeathing cells
promote regeneration of cut adult rat optic nerve axons
J Neurosci. 23 2000-2002.
Lidington, E A, Rao, R. M, Mardli-Berg, F. M.,Jat. P S. Has-
kard, D. O. & Mason, J C. (2002). Am.J Physiol. Cell Physiol.
282. C67-C74.
Liebermann. D. & Sachs. L. (1978). Nuclear control of ncuritc in-
duction in neuroblastoma cells. Exp. Cell Res 113.383-390
Lillie, I. H.. MacCallum, D K„ Jepseu, A. (1980) Fine structure
of subeultivated stratified squamous epithelium grown on
collagen rafts. Exp Cell Res. 125 153-165
Lira. G, Kanakova. J, Vukovic, В, Bayani, J, Bchcshti. B.. Ber-
nardini, M , Squire, J. A & Ztelcnska, M. (2004). Combined
spectral karyotyping, multicolor banding, and microarray
comparative genomic hybridization analysis provides a detailed
characterization of complex structural chromosomal rearrange-
ments associated with gene amplification in the osteosarcoma
cell line MG-63. Cancer Genet Cytogenet. 153.158-164
Limat. A. Breitkreutz, D., Thickottcr, G., Klein, E C , Braa-
then, L. R., Hunziker, T. & Fusenig. N. E (1995). Formation of
a regular neo-epidcnnis by cultured human outer roor sheath
cells grafted on nude mice. Transplantation 59.1032 1038
Limat, A, Hunziker, T, Boillat, C., Bayreuthcr, К & Noser. F
(1989). Post-mitotic human dermal fibroblasts efficiently
support the growth of human follicular keratinoeytes./ Invest.
Dermatol. 92 758-762.
Limat. A. Mauri. D &Hunzikcr,T (1996) Successful treatment
of chronic leg ulcers with epidermal equivalents generated
from cultured autologous outer root sheath cells. J Invest
Dermatol. 107:128-135.
Lin,C C.&Uchida, I. A (1973) Fluorescent banding of chromo-
somes (Q-bands) In Kruse, P. F. & Patterson, M K. (cds ),
Tissue culture methods and applications New York. Academic
Press, pp 778-781
Lm. M. A. Latt, S. A. & Davidson. R L. (1974) Identification ol
human and mouse chromosomes in human-mouse hybrids by
centromere fluorescence. Exp Cell Res 87.429-433
Linser, P & Moscona, A. A. (1980). Induction of glutamine
synthetase in embryonic neural rettna-locahzation in Muller
fibers and dependence on cell interaction. Proc. Natl. Acad
Set. USA 76.6476-6481
Liotta. L (1987) The role of ccllural proteases and their inhibi-
tors in invasion and metastasis. Introductionary overview
Cancer Metastasis Rev 9.285-287.
Lippincott-Schwartz, J., Ghekman. J., Donaldson. J. G., Rob-
bins. J . Kreis. T. E„ Seamen. К В, Sheetz, M. P. & Klau«-
ncr. R D (1991) Forskolin inhibits and reverses the effects
of Brcfcldtn A on Goldi morphology by acAMP-indepcndcnt
mechanism J. Cell Biol 112.567
Littlefield, J. W. (1964a). Selection of hybrids from matings of
fibroblasts in vitro and their presumed recombinants Science
145 709-710.
Littlefield, J- W (1964b) Three degrees of guanylic acid pyro-
phosphorylase deficiency in mouse fibroblasts. Nature 203
1142-1144
Litwin, J (1973) Titanum disks. In Kruse. P F & Patter-
son, M К (cds). Tissue culture methods and applications New
York. Academic Press, pp. 383-387.
Liu, T F., Cohen, К. A.. Willingham. M C., Tattci. S B.,
Puri, R. К & Frankel. A E (2003) Combination fusion
protein therapy of refactory brain rumors demonstration of
efficacy in cell culture. J Neurooncol. 65 77-85
Liu. L., Dclbc, J, Blat, C., Zapf, J. & Hard, L (1992) Insulin
like growth factor binding protein (IGFBP-3). an inhibitor
of scrum growth factors other than IGF-I and -II J. Cel!
Physiol 153 15-21.
Liu. M, Xu,J., Souza, P. Tanswcll. B., Tanswcll, A. K. & Post. M.
(1995). The effect of mechanical strain on fetal rat lung cell
proliferation: Comparison of two- and three-dimensional
culture systems In Vitro Cell Dev. Btol. Anim 31.858-866
Lopez-Casillas, F., Wrana, J. L. & Massaguc. J (1993) Betagly-
can presents ligand to the TGF-0 signaling receptor Cell 73
1435-1444
Lotan, R & Lotan, D (1980) Stimulation of melanogenesis in
a human melanoma cell line by retinoids. Cancer Res. 40
33-45.
Lounis. H, Provencher, D. Godbout, C, Fink. D.. Milot. M.-J. &
Mes-Masson, A -M (1994). Primary cultures of normal and
tumoral ovarian epithelium: A powerful tool for basic molecu-
lar studies. Exp. Cell Res. 215.303-309.
Lovelock, J. E. & Bishop. M. W. H (1959) Prevention of freez-
ing damage to living cells by dimethyl sulphoxide Nature
183 1394-1395.
Lowe, К. C., Davey, M. R & Power, J B. (1998). Pcrfluurii-
chcmtcals their applications and benefits tn cell cultur. Trends
Biotechnol 16 272-277
Luikart, S. D, Mamglia, C A.. Fureht. L. T, McCarthy. J. В &
Ocgama.T R.(1990) A heparan sulphatc-contaming fraction
of bone marrow stroma induces maturation of HL-60 cell tn
vitro. Cancer Res. 50.3781-3785
Lundqvist, M. Mark,J.. Funa, К, Hcldin,N E, Morstyn, G., Wed-
del, В Layton, J. & Oberg, K. (1991) Characterisation of a
cell line (LCC-18) from a cultured human ncurocndocrine-dif-
fcrenttated colonic carcinoma. Eur. J Cancer 12-1662-1668.
Lutz, M. P., Gacdickc, G. & Hartmann. W (1992) Large-scale
cell separation by centrifugal elutriation. Anal Biochem 200.
376-380.
Maas-Szabowski, N.. Stark, H J. & Fusenig. N E. (2000) Kcra-
tinocytc growth regulation m defined organotypic cultures
through IL-1-induced KGF expression in resting fibroblasts.
J Invest. Dermatol 114 1075-1084.
Maas-Szabowski, N., Stark, H. J. & Fusenig, N E (2002). Cell
interaction and epithelial differentiation In Freshney. R. I. &
Список литературы
667
Freshney, М. G. (eds.). Culture of epithelial cells. 2n,1cd Hobo-
ken, NJ, Wiley-Liss. pp. 31-63.
Maas-Szabowski. N & Fusenig, N. E (1996) Interleukin-1-
induccd growth factor expression in postmitotic and resting
fibroblasts J. Invest, Dermatol. 107.849-855.
Maas-Szabowski, N-, Fusenig. N. E & Shimotoyodotnc, A (1999)
Kcratinocyte growth regulation in fibroblast co-culturcs via a
double paracrine mechanism. J Cell Set 112 1843-1853.
McDonald, С M., Freshney, R. I. Hart. E & Graham. D I
(1985). Selective control of human glioma cell proliferation
by specific cell interaction. Eip. Cell Biol. 53 130-137
Mace,K„Gonzalez,F.J, McConncl, I R .Garner,R.C, Avanti,О.
Harns, С. C. & Pfeifer. A M. A. (1994). Activation of promuta-
gens in a human bronchia! epithelial cell line stably expressing
human cytochroc P450 1A2 Mol. Carcinogen 11 65-73.
MacGregor. G. & Caskey. C. (1989). Construction of plasmids
that express E. coli bcta-galactosidasc in mammalian cells
Nucleic Acids Res 17 2363-2365
Maciag. T., Cerondolo. J, Isley, S., Kelley. P. R. & Forand. R
(1979). Endothelial cell growth factor from bovine hypo •
thalamus-identification and partial characterization. Proc.
Natl. Acad Set. USA 76 5674-5678.
Macieira-Coelho, A. (1973) Ceil cycle analysis. A: Mammalian
cells In Kruse, P. F. & Patterson. M К (eds ), Tissue cul-
ture methods and applications. New York, Academic Press
pp.412 122.
Mackhs, J D.. Sidman, R L. & Shine. H D. (1985). Cross-linked
collagen surface for cell culture that is stable, uniform, and opti-
cally superior to conventional surfaces. In Vitro 21.189-194
MacLeod, R A. Dirks, W G., Matsuo. Y , Kaufmann, M .
Milch, H.. Drexler, H. G (1999) Widespread intraspccies
cross-contamination of human tumor cell lines arising at
source. Int J. Cancer83 555-63.
Macpherson, I (1973). Soft agar technique In Kruse, PF. £
Patterson. M. K. (eds ), Tissue culture methods and applica-
tions New York, Academic Press, pp 276-280.
Macpherson, I & Brydcn, A. (1971). Mitomycin C treated cells
as feeders. Exp. Cell Res 69. 240-241
Macphcrson.I & Montagnier, L. (1964) Agar suspension culture
for the selective assay of cells transformed by polyoma virus.
Virology 23.291-294
Macpherson, I. & Stoker. M (1962) Polyoma transformation of
hamster cell clones-an investigation of genetic factors affect-
ing cell competence. Virology 16 147
Macvilte. M , Veldman. T.. Padilla-Nash. H.. Wangsta, D.
O’Brien, P., Schrock. E &Ricd,T (1997) Spectral keratyp-
ing, a 24-colour FISH technique for the identification of chro-
mosomal rearrangements. Histochemistry 108 299-305
Macy. M (1978) Identification of cell line species by isoenzyme
analysis Manual Am. Tissue Cult Assoc. 4- 833-836.
Magee, J. C.. Stone, A. E, Oldman. К T. & Guice, K. S. (1994)
Am.J Physio! Lung Mol Cell Physio! 267 L433 L441
Mahato, R. I, Kawabata, К . Nomura, T. Takakura, Y &
Hashida. M. (1995a). Physicochemical and pharmacokinetic
characteristics of plasmid DNA, cationic liposome complexes.
J.Pharmaceut Set 84. 1267 1271
Mahato, R I, Kawabata, K., Takakura, Y. & Hashida, M. (1995b)
In vivo disposition characterictTcs of pbsmul DNA complexed
with cationic liposomes./ Drug Targeting 3 149—157
Mahdavi. \ & Hynes, R. О (1979). Proteolytic enzymes in
normal and transformed cells Biochim. Biophys. Acta 583
167-178
Mairs.R I.&Wheldon,T E.(1996) Experimental tumour tlicra-
py with targeted radionuclides in multicellular tumour spher-
oids. In Hagen, U .Jung, H. & Strcffer, C. (eds ), Radiation
research. 19S5-1995 (Proceedings of the 10’1' International
Congress of Radiation Research, Wurzbrg, Germany)
Mai, A. & Harter, M. L (2003). MyoD is functionally linked to the
silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal
myogenesis. Proc. Natl Acad. Set. USA 100.135-1739
Maltese, W A. & Volpe, I. J (1979). Induction of an oligoden-
droglial enzyme in C-6 glioma cells maintained at high density
or in serum-free medium./ Cell Physiol. 101:459-470
Management of Health and Safety at Work Directive 89/391/
EEC
Management of Health and Safety at Work Regulations. (1999)
Statutory Instrument 1999 No 3242 The Stationery Office
Limited, ISBN 0 11 085625 2
Mangi, A A, Noiseux, N. Kong, D.. Нс, H., Rczvani, M.. Ing-
wall.J S &Dzau,V.J (2003) Mesenchymal stem cells modi-
fied with Akt prevent remodeling and restore performance of
infracted hearts Nat Med 9 1195-1201
Maniatis, T , Hardison, R. C , Lacy, E.. Lauer, J , O’Counel, C-,
Quon, D, Sim. G. К & Elstradiadis, A (1978). The isolation
of structural genes from libraries of eukaryotic DNA. Cell 15
687-701
Marainoroseh. K. (1976) Invertebrate tissue culture. New York,
Academic Press
Marchiotim, M A.. Goodearl, A D.. Chen, M.S Bermmgham-Mc-
Donogh, О, Kirk, C.. Henricks. M. Danchy. F, Misuini, D.,
Sudhaltcr, J., Kobayashi K. Wroblewski, D., Lynch. C.,
Baldassarc. M.. Hiles, L. Davis, J. В, Hsuan. J J., Totty, N F.,
Otsu, M, McBurncy, R. N-Waterfield, M D, Stroobant, P. &
Gwynne, D. (1993). Glial growth (actors are alternatively
spliced crbB2 ligands expressed in the nervous system Nature
362.312-318
Marcus, M., Lavi. U.. Nattcnberg, A.. Ruttcm, S. & Markowitz, О
(1980) Selective killing of mycoplasmas from contaminated
cells in cell cultures. Nature 285.659-660
Mardh, P H. (1975). Elimination of mycoplasmas from cell
cultures with sodium polyancthol sulphonate Nature 254
515-516
Marcel, M M, Bruyneel, E. & Stonne. G (1980) Attachment of
mouse fibrosarcoma cells to prcculturcd fragments of embry-
onic chick heart. Virchows Arch В Ceil Pathol 34.85-97.
Marcel, M., Kint. J. & Mcyvisch. C. (1979) Methods of study
of the invasion of malignant СЗН-mouse fibroblasts into
embryonic chick heart n vitro. Virchows Arch. В Cell Pathol
30.95 111.
Marelli-Berg, F M. Peck, E, Ltdington, E. A, Stauss, H J &
Lechler. R. I (2000) / Immunol. Methods 244 205-215
Marh, J., Trcs. L.L Yamazaki, Y., Yanagimachi. R. & Kierszen-
baum, A L. (2003). Mouse round spermatids developed in
vitro from preexisting spermatocytes can produce normal
offspring by nuclear injection into m vivo-developcd mature
oocytes. Biol Reprod. 69.169-176.
Marjnisscn, W J., van Osch, G.J, Aigner,J. van dcr Veen, S W.,
Hollandei, A. P., Verwocrd-Verhocf, H. L. & Vcrhaar. J A
668
Список литературы
(2002). Alginate as a chondrocyte-delivery substance in
combination with a non-woven scaffold for cartilage tissue
engineering. Biomaterials 23 1511-1517.
Mark, J (1971) Chromosomal characteristics of neuroenic tu-
mours in adults Heredttas 68 61 100
Markovitz. D., Goff. S & Bank, A (1988). A safe packaging
line for gene transfer separating viral genes on two different
plasmids J. Virol 62:1120-1124.
Marks, P. A. Richon, V. M, Kiyokawa. H. & Rifkind, R. A
(1994). Inducing differentiation of transformed cells with
hybrid polar compounds: a cell cycle-dependent process Proc
Natl Acad. Set. USA 91 10251-10254.
Markus. G .Takita. H., Camiolo, S. M..Corsanti.J, Evers,J L &
Hobika, J. H. (1980). Content and cltaracterization of plas-
minogen activators in human lung tumours and norma! lung
tissue. Cancer Res 40.841-848
Marsh,J. W, Donovan, M., Burholt, D R., George, L D & Korn-
blith, P L (2004). Metastatic lung disease to the central
nervous system in vitro response to cliemothcrapcutic agents.
J Neuiooncol.66.81-l)0
Marshall, C J. (1991) Tumor suppressor genes. Cef/64.313-326.
Marte. В. M, Meyer, T., Stabel, S., Standke, G. J. R, Jakcn. S,
Fabbro. D & Hynes. N. E. (1994). Protein kinase C and mam-
mary cell differentiation Involvement of protein kinase C
alpha tn the induction of beta-casein expression. Cell Growth
Differ.5 239-247.
Martin. F L, Cole, К J.. Williams.J A.. Millar. В C, Harvey, D
Weaver, G .Grover,P L & Phillips.D H (2000) Activation
of genotoxins to DNA-damaging species in exfoliated breast
milk cells Mulat. Res 470 115-124
Martin, G. R. (1975). Teratocarcinomas as a model system for the
study of embryogenesis and neoplasia. Ceil5 229-243
Marcin, G. R. & Evans, M. J (1974) The morphology and growth
of a pluripotent tcratocarcinoma cel) line and its derivatives
in tissue culture Cell2 163 172.
Martin, G. R. (1978). Advantages and limitations of tcratocarci-
noma stem cells as models of development. In Johnson, M H
(cd ), Deiclopment in mammals. Vol. 3 Amsterdam, North-
Hiilland Publishing, p. 225
Martin, G R. (1981). Isolation of a pluripotent cell lute from
early mouse embryos cultured in medium conditioned by
tcratocarcinoma stem cells Proc. Natl. Acad. Sci USA 78
7634-7638
Martinsen, A, Skjak-Вгжк, G. & Smidsred. О (1989) Aginatc
as immobilization materia!. 1: Correlation between chemi-
cal and physical properties of alginate gel beads. Btotechnol
Btoeng 33.79-89.
Maskell. R & Green, M. (1995). Applications of the comet assay
technique Int. Mier. Lab. 6 2-5.
Massaguc.J., Chcifctz. S., Laiho, M., Ralph, D A.. Weis, F M. &
Zcntclla, A. (1992). Transforming grow th factor-beta. Cancel
Surveys 12.81-103
Masson. E A., Atkin, S L. & White. M. C (1993) d-vahnc se-
lective medium does not inhibit human fibroblast growth in
vitro. In Vitro Cell Dev. Biol Antm. 29A 912-913.
Masters, J. R.W & Palsson. В (cds.) (1999-2000) Human cell
culture. Vol I-IV, Dordrecht, Kluwer
Masters,J R-. Bedford, P.. Kearney. A., Povcy, S & Freanks, L. M
(1988) Bladder cancer cell line cross-contamination. Identifi-
cation usinga locus-specific inmisatellite probe Br.J Cancer
57(3)-284 286
Masters, J. R W.. Thomson, J A., Daly-Burns, В, Reid, Y. A,
Dirks, W G„Packer,P,Toji, L. H, Ohno.T,Tanabe.H, Ar-
lctt,C.F,Kclland,L R„ Harrison, M .Vnrnani. A.. Ward. T H,
Ayres. K. L. & Dcbcnham, P G (2001) STR profiling pro-
vides an international reference standard for human cell lines.
Proc. Natl Acad. Set. USA 98.8012-8017
Masui, T, Lechner, J. F., Yoakum, G H.. Willey, J. C. & Har-
ris, С. C. (1986b). Growth and differentiation of normal and
transformed human bronchial epithelia! cells Cell Physiol.
(Suppl) i 73-81.
Masui, T., Wakefield, L. M., Lechner, J. F., LaVcck, M A.,
Sporn.M.B & Harris, C C.(1986a) Type beta transforming
growth factor is the primary differentiation-inducing scrum
factor for normal human bronchia) epithelial cells Pioc. Natl.
Acad Sci USA 83 2438-2442
Mather, J. (1979) Testicular cells in defined medium. In Ja-
koby, W. В & Pastan, I H (cds ), Methods tn enzymology:
Vol. 57: Cell culture. New York, Academic Press, pp. 103.
Mather, J. P (1998). Making informed choices Medium, scrum,
and scrum-free medium, how to choose the appropriate me-
dium and culture system for the model you wish to create.
Methods Cel! Biol 57.19-30
Mather, J. P. & Sato. G H (1979a). The growth of mouse mela-
noma cells in hormone supplemented, scrum-free medium.
Exp. Cell Res. 120.191
Mather, J. P &Sato,G H (1979b). The use of hormone supple-
mented scrum-free media in primary cultures Exp Cell Res.
124 215
Matsui, A. Zscbo, K. & Hogan, В L. M. (1992) Derivation of
phiripotcntial embryonic stem cells from murine primordial
germ cells in culture Cell 70.841-847
Matsui, Y., Toksoz, Nishikawa, S ., Williams. D.. Zscbo, K., Ho-
gan, B. L. (1991). Effect of steel factor and leukemia inhibi-
tory factor on murine primordial germ cells in culture Nature
353 750-752.
Mayne, L. V, Price, T. N. C, Moorwood, K. & Burke, J F. (1996).
Development of immortal human fibroblast cell lines In
Freshney. R. I. & Freshney. M. G. (cds.). Culture of immortal-
ized celts. New York, Wilcv-Liss. pp. 77-93.
Mayne, L. V., Priestly, A.. James. M. R. & Burke. J F (1986).
Efficient iminortalisatin and morphological transformation
of human fibroblasts with SV40 DNA linked to a dominant
marker. Exp. Cell Res 162 530-538
McAteer. J. A., Kempson. S A & Evan, A P (1991) Culture of
human renal cortex epithelial cells, у Tissue Cult. Methods
13 143-148
McCall, E_ Povcy, J. & Duinondc, D C. (1981) The culture of
vascular endothelial cells on microporous membranes. Thromb.
Res. 24.417-431.
McCormack, S. A, Viar, M J., Tague, L. & Johnson, L. R. (1996).
Altered distribution of the nuclear receptor rar ((>) accom-
panies proliferation and differentiation changes caused by
retinoic acid in Caco-2 cells In Vitro Cell Dev. Biol. Antm.
32 53-61
McCormick, C. & Freshney, R. I (2000). Activity of growth fac-
tors in the IL-6 group in the differentiation of human lung
adenocarcinoma Br J Cancer 82 881-890
Список литературы
669
McCormick, С, Freshney, R. I & Spcirs. V (1995). Activity of
interferon alpha, interleukin 6and insulin in the regulation of
differentiation in A.549 alveolar carcinoma cells. Br.J. Cancer
71 232-239
McDouall, R. M., Yacoub, M. & Rose, M L. (1996) Isolation,
culture, and characterisation of MHC class Il-positive ini-
crovascular endothelial cells from the human heart Mtcroasc.
Res. 5i 137-152
McFarland, D. C., Liu, X, Vrllcman, S G, Zeng. C, Coy, C S. &
Pcsall. J E (2003). Variation in fibroblast growth factor
response and heparin sulfate proteoglycan production in
satellite cell populations. Comp Biochem. Physiol C Toxicol.
Pharmacol 134.341-351
McGarrity, G J (1982) Detection of mcoplasmic infection of cell
cultures In Maramoroscli, К (cd ), Advances tn cell culture.
Vol 2. New York. Academic Press, pp. 99 131.
McGowan, J A. (1986). Hepatocyte proliferation in culture In
Guillouzo, A & Guguen-Guillouzo. C (cds ), Isolated and
cultured hepatoctes Paris. LesEditions Inscrm, John Libbcy
Eurotcxt, pp. 13-38
McGregor, D B., Edwards, I, Riaeh. C. J, Cattenach, P. Mar-
tin. R, Mitchell, A. & Caspry. W. J. (1988). Studies of an
S9 based metabolic activation system used in the mouse
lymphoma L51768Y cell mutation assay Mutagenesis 3.
485-490.
McGuckin, С P-, Forraz. N , Allouard. Q., Pcttengcl, R. (2004).
Umbilical cord blood stem cells can expand hematopoietic and
neuroglial progenitors in vitro Exp Cell Res. 295 350-9
McGuire. P G. & Orkin, R. W. (1987). Lab. Invest 57.94-105.
Mcllwrath, A., Vasey, P.. Ross, G. & Brown, R. (1994) Cell
cycle arrests and radioscnsitivity of human tumour cell lines.
Dependence on wild-type p53 for radiosensitivity. Cancer
Res. 54 3718-3722.
McKay, I. & Taylor-Papadimitriou, J. (1981) Junctional com
munication pattern of cell cultured from human milk Exp
Cell Res 134 465 470
McKeehan, W. L (1977) The effect of temperature during
trypsin treatment on viability and multiplication potential
of single normal human and chicken fibroblasts. Cell Biol.
Int. Rep 1.335-343
McKeehan. W. L. & Ham, R G (1976a). Stimulation of clonal
growth ol normal fibroblasts with substrata coated with basic
polymersJ.CellBiol.71 727 734
McKeehan. W. L. & Ham, R. G (1976b) Methods lor reducing
the scrum requirement of growth in vitro of non-transfer med
diploid fibroblasts. Dev. Biol. Standard37.97-98
McKeehan. W. L. & McKeehan, K. A. (1979). Oxocarboxyht
acids, pyridine nuelcotide-linked oxidorcductascs and serum
factors m regulation of cell proliferation. J Cell Physiol. 101
9 16
MeKcehan.W.L. Adams. P. S. & Rosser. M P.(1984) Modified
nutrient medium MCDB 151 (WJAC401), defined growth
factors, cholera toxin, pituitary factors, and horse serum
support epithelial cell and suppress fibroblast proliferation
in primary cultres of rat ventral prostate cells In Vitro 18
87-91
McKeehan. W L, Adams. P. S. & Rosser, M P. (1984). Direct
mitogenic effects of insulin, epidermal growth factor, cholera
toxin, unknown pituitary factors and possibly prolactin, but
not androgen, on normal rat prostate epithelial cells tn scrum-
free primary cell culture Cancer Res. 44-1998-2010.
McKeehan, W. L., Hamilton. W G & Ham, R G (1976).
Selenium is an essential trace nutrient for growth of
WI38 diploid human fibroblasts. Pioc. Natl. Acad Sci USA
73.2023-2027
McKeehan, W L.. McKeehan. K. A.. Hammond, S. L. &
Ham, R G. (1977). Improved tnedtuiu for cloua! growth of
human diploid cells at low concentrations of scrum protein
In Vitro 13 399-416
McLean,J S,Frame,M C, Freshney, R. I, Vaughan, P F T.&
Mackie, A E (1986). Phenotypic modification of human
glioma and non-smaUccll lung carcinoma by glucocorticoids
and other agents Anttcaneer Res 6 1101 1106
Medical Research Council (2002). Human Tissue and Biological
Samples for Use in Research, Operational and Ethical Guide-
lines Available from MRC External Communications +44
(0)2076 376 422 or online at www.mrcac.uk.
Meeker. A К & De Marzo. A M. (2004) Recent advances in
telomere biology: implications for human cancer. Curr. Opin
Oncol 16 32-38.
Mcgc, R M., Matsuzaki, F.. Gallin, W J, Goldberg, J. I.. Cum-
mingham. B. A & Edelman. G M (1989) Consctruetion of
epithelial sheets by transfection of mnuse sarcoma cells with
cDNAs for chicken cell adhcnsion molecules. Proc. Natl. Acad.
Sci USA 85 7274-7278
Molera, P. W.. Wolgcmuth. D, Bicdlcr. J. L. & Hcssion. C. (1980).
Anrifoiatc-resistant Chinese hamster cells. Evidence from
independently derived sublines for the overproductions of
two dihydrofolatc* reductases encoded by different inRNAs
J.Biol.Chem 255 319-322
Menasche. P. Hagcgc. A. A, Seosin. M . Ponzer, B. Dcsnos, M.,
Duboc, D.. Schwartz, K., Vilquin, J T & Marollcau, J P.
(2001). Myohlast transplantation for heart failure. Lancet
357.279-280
Menasche, P. (2001) Skeletal myoblast transplantation for car-
diac repair Expert Rev. Cardiovase. Ther 2 21-28.
Mcnt. L. R, Stewart. W В, Scaramuzzino, D. & Madri, J. A
(1997) An in vitro three-dimensional coeulture model of
cerebral uncrovascular antiogcnesrs and diflerentiatum In
Vitro Cell Dev Biol Animal33.684-691
Merten. О W (1999) Safety issues of animal products used in
scrum-free media Dev. Bol. Stand. 99.167 180.
Messing, E. M. Fahey, I L., dcKcrnion, I В. Bhuta, S. M. &
Bubbers, I E (1982). Scrum-free medium for the in vitro
growth of normal and malignant urinary bladder epithcial
cells Cancer Res 42.2392 2397
Metcalf. D (1969). Studies on colony formation in vitro by mouse
bone marrow cells. I Continuous duster formation and rela-
tion ofclusters to colonics. J. Cell Physiol. 74 323-332.
Metcalf. D (1990). The colony stimulating factors. Cancel 65.
2185-2195.
Meyer, W, Latouche, G N , Daniel, H. M., Thanus. M , Mitch-
ell, T G, Yarrow. D„ Sehonian, G. & Sorrel, T C (1997).
Identification of pathogenic yeasts of the imperfect genus
Candida by polymerase chain reaction fingerprinting. Elec-
trophoresis 18.1548-1549
Mcyskcns, F L. & Fuller. В В. (1980) Characterization of the
effects of different retinoids on the growth and differentiation
670
Список литературы
of a human melanoma cell line and selected subclones. Cancer
Res. 40.2194-2196
Michalopoulos, G. & Pitot. H. C (1975). Primary culture of pa-
renchymal h ver ceils on collagen membranes Morphological
and biochemical observations. Exp. Cell Res. 94 70-78
Michlcr-Stukc, A. & Bottenstcin, J. (1982) Proliferation of gltal-
dertved cells in defined media.J Newosct. Res 7 215-228.
Midglcy, C. A.. Craig, A. L.. Hite,J. P. & Hupp.T R (1998) Baculo-
vtruscxptvsMon and the study of the regulation of the tumorsup-
pressiir protein p53. In Ravid, К & Freshney, R I (eds.), DNA
transfer to cultured cells New York, Wiley-Liss, pp 27-54.
Mikhc, S., Juric, D M & Caman-Krzan, M. (2004). Differences
in the regulation of BDNF and NGF synthesis in cultured
neonatal rat astrocytes Int.J. Dev. Neurosci 22.119 130
Mikulits, W, Dolznig, H, Edelmann. H, Sauer, T, Deincr. E. M
Ballou. L.. Beug, H. & Mullncr. E W. (1997). Dynamics ol
cell cycle regulators. Artcfact-frcc analysis by recultivation
of cells synchronized by centrifugal elutriation DNA Cell
Biot. 16 849-859.
Milanesi. E. Ajmone-Marsan, P., Bignottt, E., Losto, M N_,
Bernardi, J, Chcgdani. F, Sonant, M. & Ferrari. M (2003)
Molecular detection of cell line cross-contaminations using
amplified fragment length polymorphism DNA fingerprinting
technology In Vitro Cell Dev Bio! Anima! 39 124 -130
Miller. A D., Garcia, J. V., von Suhr, N.. Lynch. С. M„ Wil-
son. C & Etden, M. V (1991) Construction and properties
of retrovirus packaging cell based on gibbon abc leukemia
vfrusJ.ViW.65 2220-2224.
Miller,G, Lisco, H„ Kohn, H. I, Stitt, D & Endcrs.J F (1971)
Establishment of cell lines from normal adult human blood
leukocytes by exposure to Epstein-Barr virus and neutraliza-
tion by human sera with Epstein-Barr virus antibody Proc
Soc. Exp. Biol. Med. 137.1459 1465
Miller, G. G.. Walker, G. W R & Giblack, R E. (1972) A rapid
method to determine the mammalian cell cycle. Exp Res 72
533-538.
Miller, R. G. & Phillips, R A (1969) Separation of cells by veloc-
ity sedimentation J Cell Physiol 73 191-201
Mills. К J., Volherg, T. M , Nervi. C.. Gnppo. J F.. Daw-
son. M. I &Jettcn, A. M (1996) Regulation of rettnoid-in-
duced differentiation in embryonal carcinoma PCC4, azalR
cells. Effects of retinoid-rcccptor selective ligands Cell Growth
Differ.! 327-337.
Milo. G.E, Ackerman, G. A & Noyes, ]. (1980). Growth and
ultrastructural characterization of proliferating human kc-
ratniocytcs in vitro without added extrinsic factors. In Vitro
16 20-30
Minna, I D, Carney. D. N . Cuttitta. F & Gazdar A. F (1983)
The biology of lung cancer. In Chabner, B. (cd ). Rational
basts for chemotherapy. New York, Alan R. Liss.
Miskcy. R., Dubois, C , Morgan, L. & Jessen, K. R (1990). 04
and A007 su fat ide antibodies bind to embryonic Schwann
cells prior to the appearance of galactoccrcbrosidc. Regulation
by axon-Schwann cell signals and cyclic AMP. Development
109.105 116
Mitaka, T .Nnrioka, К -I & Mochizuki, Y (1993). Rcdtffcrcntia-
tion of proliferated rat hepatocytes cultures in L15 medium
supplemented with EGF and DMSO. In Vitro Cell Dev. Bio!
29A 714-722
Mitaka, T. Sattler, C A., Sattler, G. L., Sargent. L. M. & Pi-
tot, H C (1991) Mult iplc cell cycles occur in rat hepatocytes
cultured I the presence of nicotinamide and epidermal growth
factor. Hepatology 13.21-30.
Mitelman, F (eds ) (1995) ISCN. An international system lor
human cytogenetic nomenclature. Basel. S. Karger
Miura, Y.. Akimoto. T.. Kanazawa, H & Yagi. K.(1986) Synthe-
sis an secretion of protein by hepatocytes entrapped within
calcium alginate Amf Organs 10 460 165
Mohammad, R. M, Li, Y, Mohamed. A.N.. Pettit. G. R., Adsay, V.,
Vattkcvieius, V. К, Al-Katib, A. M. & Sarkar, F H (1999).
Clonal preservation of human pancreatic cell line derived from
primary pancreatic adenocarcinoma. Pancreas 19 353-361.
Moll. R., Franke. W. W & Schiller, D. L. (1982). The catalog of
human cytokeratins Patterns of expression in normal epithe-
lia tumours and cultured cells. Cell 31 11-24
Monroy, B., Honiger, J, Darquy, S & Reach. G. (1997) Use of
polyetbylencglycol for porcine islet cryoprescrvation. Cell
Transplant. 6 613-621.
Monstem, H J. Ohlsson. В & Axelson, J. (2001). Differential
expression of gastrin, cholccystokinin-A and cholccystoki-
nin-B receptor mRNA in human pancreatic cancer cell lines.
Scand J Gastroenterol 36:738-743
Miintagmer. L. (1968). Correlation entre la transformation des
cellule BHK21 ct lour resistance aux polysaccharides acides
cn mi leu gelifte CR Acad. Sa. D 267- 921-924
Montesano, R. Matsumoto. K., Nakamura. T & Orel, L. (1991).
Identification of a fibroblast-derived epithelial morphogen as
hepatocyte growth factor. Cell 67 901-908.
Montesano, R., Soriano, J. V, Pepper, M S. & Orel, L. (1997).
I nduction of epithelial branching tubulogcne-sis in vitro J Cell
Physiol 173 152-161
Moore, G. E., Gcrner, R E & Franklin, H. A. (1967). Culture of
normal human leukocytes J. Am Med. Assoc 199.519-524
Moreno, R. F. (1990) Enhanced conditions for DNA fingerprint-
ing with biotinylated M13 bacteriophage J. Forensic Sci 35.
831-837.
Morgan,J E, Beauchamp,J R, Pagel, C. N., Peckham, M., Atali-
otis,P.Jat,P S.,Noble,M D.Farmer,К &Prtridgc,T.A.
(1994). Myogenic cell lines derived from transgenic mice
carrying a thermolabile T antigetp a model system for the
derivation of tissue-specific and mutation-specific cell lines.
Dev Bio! 162.486-498
Morgan,J. E., Freshney, R 1, Darling.J. L., Thomas, D. G T. &
Cclik, F. (1983). Assay of anticanccr drugs in tissue culture,
cell cultures of biopsies from human astrocytoma. Br.J. Cancer
47 205-214
Morgan,J E. Moore, S. E, Walsh, F. S. & Partridge. T A. (1992).
Formation of skeletal muscle in vivo from the mouse C2 cell
line J. Cell Set 102 779-787
Morgan, J. G.. Morton, H J. & Parker, R C. (1950) Nutrition of
animal cells in tissue culture. I. Initial studies on a synthetic
medium. Proc Soc Exp Bio! Med 73-1.
Morton, H J. (1970). A survey of commercially available tissue
culture media. In Vitro & 89-108
Moscnna, A A. (1952) Cell suspension Irani organ rudiments of
chick embryos Exp Cell Res. 3-535.
Moscona, A. A & Piddington, R (1966). Stimulation by hydro-
cortisone of premature changes in the developmental pat-
Список литературы
671
tern of glutamine synthetase m embryonic retina Btochem
Biophys. Acta 121.109-411
Mosmann,T (1983) Rapid colorimetric assay foreellulargrowth
survival. Application to proliferation and cytotoxicity assays
J. Immuno! Methods 65.55-63.
Moulton, D. G. (1974) Dynamics of cell populations tn the olfac-
tory epithelium. Awn NY Acad Sci 237,52-61.
Mowles. J (1988) The use of ciprofloxacin for the cliniiuatnni of
mycoplasma from naturally infected cell lines. Cytotechnoiogy
1.355-358.
Muirhead, E. E.. Rightsei, W. A., Pitcock. J A & Inaganii, T.
(1990). Isolation and culture of juxtaglomcrularand renomed-
ullary interstitial cells. Methods Enzymol. 191.152 167
Mullcndcr, M.. El Haj, A. J.. Yang. Y, van Duin. M A, Bur-
ger, E. H & Klcin-Nulcnd, J. (2004) Meehanotransduction
of hone cells in vitro* mechanobiology of bone tissue. Med
Bio! Eng. Сотри t 42.14-21.
Muller, U., Wang, D, Denda, S., Meneses, J J.. Pedersen, R A. &
Rcichardt, L. F (1997) Integrin alpha 8 beta 1 is critically
important for epithelial-mesenchymal interactions during
kidney morphogenesis. Cel!88 603-613
Mullin. J M. Marano, C. W., Laughlin, К. V. Nuciglio. M, Ste-
venson. В R & Soler. A P (1997) Different size limitations
for increased traiisepithchal paracellular solute flux across
phnrbol ester and tumour necrosis factor treated epithelial
cell sheets. J. Cell Physiol 171.226-233.
Munthc-Kaas, A C & Seglcn, P О (1974) The use of metn-
zamidc as a gradient medium for isopycnic separation of rat
liver cells FEBSLett.&3 252 256
Murakami. H (1984). Serum-free cultivation of plasmacyto-
mas and hyhndomas In Barnes, D W., Sirliasku, D A &
Sato, G. H (cds ), Methods fo serum-free culture of neuronal
and lymphoid cells. New York. Alan R. Liss, pp. 197-206.
Murakami, H. & Masui. H (1980) Hormonal control of human
colon carcinoma cell growth in serum-free medium Proc Natl.
Acad Sa USA 77 3464-3468.
Murao. S_, Gemmell, M A. & Callighan, M F (1983). Control
of macrophage cell differentiation in human promyclocytic
HL-60 leukemia cells by 1,25-dihydroxy vitamin D, and phor-
bol-12-niyrisiaie-13-acctatc. Cancer Res. 43 4989 -4996.
Murphy. C. L & Polak, J. M. (2004). Control of human articular
chondrocyte differentiation by reduced oxygen tension./. Cell
Physiol. 19.451 459.
Murphy, D S., Hoarc, S F- Going, J. J., Mallon, E E .
George, W D. Kaye, SB, Brown, R., Black, D M. &
Keith, W. N. (1995). Characterization of extensive genetic
alterations in ductal carcinoma in situ by fluorescence in situ
hybridization and molecular analysis./. Natl Cancer Inst 87
1694 1704
Murphy. S. J.. Watt, D & Jones, G E. (1992) An evaluation of
cell separation techniques in a model mixed cell population.
/. Cell Sci. 102 297-798.
Naeyaert, J M , Eller, M, Gordon, P. R., Park, H.-Y. & Gil-
chrest, A. (1991) Pigment content of cultured human mela-
nocytes docs not correlate with tyrosinase message loci Br.
J Dermatol 125. 297-303.
Nardone, R. M , Todd, G.. Gonzalez. P. & Gaffney, E. V (1965)
Nucleoside incorporation into strain L cells* Inhibition hy
pleuropneumonia-like organisms Science 149 1100-1101.
National Research Council. (1989). Biosafety in the laboratory.
Prudent practices for the handling and disposal of infectious
materials. Washington, DC, National Academy Press
National Sanitation Foundation. (1983) Standard 49 Class II
(laminarflow) biohazard cabinetry Ann Arbor, Michigan
Nelson. J В, cd. (1960). Biology of the pleuropneumonia-like
organisms. Ann Nte York Acad. Set. 79 305
Nelson-Rees, W. A., Daniels, D & Flandcrincycr, R. R. (1981)
Cross-contamination of cells in culture. Science 212.446-452
Nelson-Rees, W & Flandcrmcycr, R R. (1977) Inter- and intra-
spccies contamination of human breast tumor cell lines HBC
and BrCa5 and other cell cultures. Science 195.1343-1344
Ncugut, A I & Weinstein, I. B. (1979). Use of agarose in the
determination of anchorage-independent growth In Vitro
15.351.
Neumann. T. Heuschka S. D & Sanders. J E (2003) Tissue
engineering of skeletal muscle using polymer fiber arrays
Tissue Eng. 9 995-1003.
Neumann, J., Moroney, C. A. & Russian. К О (1987). A novel
rapid assay for chloramphenicol acetyltransferase genc-cx-
prcssion BiotechntquesS 444
Neves, A A., N., Mcdcalf, Brindle. K. (2003) Functional assess-
ment of tissue-engineering meniscal cartilage by magnetic
resonance imaging and spectroscopy Tissue Eng. 9 51-62
Newbold, R. F & Cuthbert, A. P (1998) Mapping human senes-
cence genes using microccll-mcdiatcd chromosome transfer
In Ravid, К & Freshney, R. I. (eds ),DNA tiansfer to cultured
cells. New York. Wiley-Liss, pp. 237-264.
Newman. M В, Davis. C. D.. Kuzmin-Nichols, N & Sanbetg, P R.
(2003) Human umbilical cord blood (HUCB) cells for central
nervous system repair. Neurotox Res 5:355-68.
Ney lakh, A. A. (1987). Use of fluorescent dyes as molecular probes
for the study of multidrug resistance. Exp Cell Res 174 168
Nichols. W. W., Murphy, D G. & Christofalo, V J. (1977).
Characterization of a new diploid human cell strain. IM R-90
Science 196 60-63
Nichola, N. A (1987). Hemopoietic growth actors and their
interactions with specific receptors / Ceil Physiol (Suppl)
5.9-14
Nicholson. G L. (1976). Trans-membrane control of the recep-
tors on normal and tumor cells, II. Surface changes associated
with transformation and malignancy'. Biochtm Biophys Acta
458 1 72
Nicosia. R F. & Ottinctti. A. (1990) Modulation ol microvas-
cular growth and morphogenesis by reconstituted basement
membrane gel in three-dimensional cultures of rat aorta
A comparative study of angiogenesis in Matrigel, collagen,
fihrtn, and plasma clot. In Vitro Cell Dev Biol 26 119-128
Nicosia, R. F, Tchao, R. & Leighton, J (1983) Angiogenesis-
dependent tumor spread in reinforced fibrin clot culture
Cancer Res 43.2159-2166
Nielsen, V. (1989). Vibration patterns in tissue culture vessels
Nunc Bulletin 2 (May 186. rev March 1989). Roskildc, Den-
mark, A/S Nunc.
Niklason, L. E.. Abbott. W., Gao. J.. Klcggcs. В. Hirschi, К. K.,
Ulubayrani, K- Conroy,N-, Jones. R., Vasanawala, A.. Sanz-
giri, S. & Langer, R (2001) Morphological and mechanical
characteristics of engineered bovine arteries /. Vase. Surg
33(3): 628-638.
672
Список литературы
Nilos. R.M & Makarski, J S (19780 Control of melanogenesis in
mouse melanoma cells of varying metastatic potential./ Natl
Cancer Inst 61 523-526.
Nims, R W , Shoemaker. A P, Bauternsehub, M. A.. Rec, L J &
Harbell. J. W (1998). Sensitivity of isoenzyme analysis for
the detection of intcrspecicsccll line cross-contamination In
Vitro Cell Dev. Biol. Anitn. 34.35-39.
Noble, M & Barnett. S C. (1996). Production and growth ol
conditionally immortal primary glial cell cultures and cell
lines. In Freshney, R. I. & Freshney, M G. (cds.). Culture of
immortalized cells New York, Wiley-Liss, pp 331-366
Noble. M. & Murrey. К (1984). Purified astrocytes promote the
in vitro division of a bipoten tial glial progenitor cell. EMBO
J 3.2243-2247
Nordgren, A. (2003). Hidden aberrations diagnosed by interphase
fluorescence in situ hybridization and spectral karyotyping
in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma
44 2039-2053.
Norwood, T H, Zeigler, C J & Martin. G. M. (1976) Dimethyl
sulphoxide enhances polyethylene glycol-incdiatcd somiatic
cell fusion. Somatic Cell Genet 2.263-270.
Nurse, P. (1990) Universal control mechanism regulating onset
<if M-phasc Nature 344 503-508
Nuwaysir, E. F , Bittner, M., Trent, J., Barrett, J C & Af-
shari, C. A. (1999) Microarrays and toxicology: the advent
of toxicogenomics Mol. Carcinog 24 153-159
Obata. Y., Kono.T- & Hatada, I (2002) Gene silencing: matura-
tion of mouse fetal germ cells in vitro Nature 418 497
O'Brien, S. J.. Shannon, J. E & Gail, M. H. (1980) Molecular
approach to the identification and individualization of human
and animal cells in culture- Isozyme and allozymc genetic
signatures. In Vitro 16 119-135.
O'Farrell, P H. (1975). High resolution two-dimensional elec-
trophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 4007-4021
Office of Nuclear Regulatory Research, see U S. Nuclear Regula-
tory Commission
Oft, M.. Akhurst, R.J. & Balmain, A. (2002). Metastasisisdriven
by sequential elevation of H-ras and Smad2 levels Natl. Cell
Biol. 6 487-494
Oh, С K., Kwon. Y W , Kiui, Y. S.. Jang. H . S , Kwon, K. S
(2003) Expression of basic fibroblast growth factor, vascular
endothelial growth factor, and thrombospondtn-1 related to
microvcssel density in nonaggressive basal cell carcinomas./
Dermatol. 30.306-13.
Oh, H. Chi. X. Bradfute, S B., Mishina, Y. Pocius, J , Mi-
chael, L H, Behringer. R. R, Schwartz, R. J, Entman, M L &
Schneider, M. D (2004). Cardiac muscle plasticity in adult
and embryo by heart-derived progenitor cells Ann NY Acad
Set. 1015.182 189.
Oh, Y. S, Kim, E. J, Schaffer, В. S., Kang, Y H.. Bindcrup, L.,
MacDonald, R G & Park, J H (2004). Synthetic lowcal-
cacmic vitamin D , analogues inhibit secretion of insulin-like
growth factor II and stimulate production of insulin-likc
growth factor-binding protcin-6 in conjunction with growth
suppression of HT -29 colon cancer cells. Mol. Cell Endocrinol
183.141-149.
O'Hare. M. J., Ellison, M. L, Ncrville, A. M. (1978) Tissue culture
in endocrine research. Perspectives, pitfalls, and potentials
Curr. Top. Xp. Endocrinol 3.-1-56
Ohmtchi, H.. Koshtmizu, U., Matsumoto, К & Nakamura. T.
(1998) Hepatocyte growth factor (HGF) acts asa mesen-
chyme-derived inorphogentc factor during fetal lung develop-
ment. Development 125.1315-1324
Ohno, T , Saijo-Kunta, К. Miyamoto-Eimon, N. Kurose, T ,
Aoki, Y. & Yosimura, S. (1991) A simple method for in situ
freezing of anchorage-dependent cells including rat liver
parenchymal cells. Cytotechnology 5:273-277
Oie, H K., Russel. E. К, Carney, D. N. & Gazdar, A. F (1996).
Cell culture methods for the establishment of the NCI scries
of lung cancer cell hues / Cell Biochem. Suppl 24.24-31.
Olic. R A.. Looijcnda, L. H. J., Dekker, M C, de Jong. F. H.. van
Dissel-Emiliaui, F. M F., de Rooij, DG. van dcr Holt. В &
Oostcrhuis, J. W (1995). Heterogeneity in the in vitro
survival and proliferation of human seminoma cells But.
J. Cancerli. 13-17.
Olsson, I. & Ologsson. T (1981) Induction of differentiation in
a human promyelocytic leukemic cell line (HL-60) Exp. Cell
Res. 131.225-230.
Operational Guidelines for Ethics Committees That Review
Biochemical Research (2000) World Health Organization,
Geneva, TDR PRD ETHICS,20001
Orellana, S A.. Neff, C.D. Sweeney. W E &Avncr,E D (1996).
Navel Madin Darby canine kidney cell clones exhibit unique
phenotypes in response to morphogens./и Vitro Cell Dev Biot.
Animal32 329-339
Organisation for Economic Co-operation and Development
(2004). The application f the principles of GLP to in vitro
studies. OECD Scries on Principles of Good Laboratory
Practice and Compliance Monitoring, No. 14, ENV JM
MONO (2001)26
Orly, J., Sato. G. & Erickson, G F (1980). Scrum suppresses
the expression of hormonally induced function in cultured
granulosa cells Cell 20* 817-827
Osborne, С K., Hamilton. B.. Tisus, G. & Livingston, R. В (1980).
Epidermal growth factor stimulation of human breast cancer
cells ш culture Cancer Res. 40:2361-2366.
Osborne, H B., Bakke, A C&Yu,J.( 1982). Effect of dexametha-
sone on HMBA-induced Friend cell erythrodiffercntiation.
Cancer Res. 62 513-518.
Osborne. R, Durkin, T., Shannon, H, Dornan, E. & Hughes. C.
(1999) Performance <if pen-fronted microbiological safety
cabinets the value of operator protection tests during routine
servicing J.Appl Microbiol. 86 962-970.
Ostcrtag, W & Pragncll, I В (1978). Changes in genome com-
position of the Friend virus complex n erythroleukaemia cells
during the course of differentiation induced by DMSO. Proc.
Natl. Acad. Set. VSA 75.3278-3282
Ostcrtag, W. & Pragncll, I. В (1981) Differentiation and viral
involvement in differentiation of transformed mouse and rat ery-
throid cells. Curr. Topics Microbiol Immunol. 94 95 143-208.
Ottcrlei. M., 0stgaard, К, Skjak-Вгжк, G., Smidsrad, О , Soon
Shiong, P & Espevik. T (1991). Induction of cytokine pro-
duction from human monocytes stimulated with alginate.
/ Immunother. 10 286-291.
Owens, R. В, Smith, H S. & Hackett, A. J (1974) Epithelial cell
culture from norma) glandular tissue of mice Mouse q>ithelta)
cultures enriched by selective trypsinisation./ Natl Cancer
Inst 53 261-269.
Список литературы
673
Paddcnberg, R, Wulf, S- Weber. A., Heimann, P , Beck, L. &
Mannherz, H. G. (1996). Intcrnucleosomal DNA fragmen-
tation in cultured cells under conditions reported to induce
apoptosis may be caused by mycoplasma endonucleases.
Europ. J Cell Biol 71.105-119
Pantcl, К, Dickmanns, A., Zippclius, A., Klein, C., Shi, J .
Hocchtlen-Vollmar, W, Schllmok, G , Weckcrmann, D .
Obcrnerdcr. R., Fanning. E. & Rictmiillcr, G (1995) Estab-
lishment of microinctastatic cell lines A novel source of tumor
cell vaccines. J. Natl Cancer Inst. 87 1162-1168.
Paquet-Durand, F., Tan, S. & Bicker, G (2004) Turning tcra-
tocarcinoma cells into neurons, rapid differentiation of NT •
2 cells in floating spheres Brain Res Dev Brain Res 142
161 167
Paquette, J. S.. Tremblay. Bernier. P V.. Auger, F A, Lavio-
lettc, M , Germain. L.. Boutct. M.. Boulet, L P & Goulet. F
(2003). Production of tissue-engineered three-dimensional
human bronchial models. In Vitro Cellular 2, Developmental
Biology-Animal. 39 pp 213-220
Paraskcva, C & Williams, A C (1992) The colon. In Fresh-
ney. R I. (cd.). Culture of epithelial cells. New York, Wiley-
Liss. pp.82-105.
Paraskcva. C, Buckle. В G & Thorpe, P. E. (1985) Selective
killing of cuntaiuinating human fibniblasts in epithelial
cultures derived from colorectal tumors using an anti-Thy-1
antibodyricin conjugate Br. J Cancer 51.131 134.
Paraskcva. C . Buckle, B. G, Sheer, D. & Wigley, С. B. (1984).
The isolation and characterisation of colorectal epithelial
cell lines at different stages in malignant transformation
from familial polyposis coli patients. Int J- Cancer 34.
49-56.
Pardee, A B., Chcnngton. P & Medrano. E E (1984) On de-
ciding which factors regulate cell growth. In Barnes, D W..
Sirbasku, D A. & Sato, G. H (eds.). Methods for serum-free
culture of epithelial and fibroblastic cells New York, Alan
R Liss, pp. 157-166.
Park, H. Y., Perez, J. M., Laurscn. R, Hara, M & Gilchrcst, B. A
(1999) Protein ktnase C-bcta activates tyrosinase by pbos
phiirylattng serine residues in its cytoplasmic domain./. Biol
Chem. 274.16470-8.
Park, H. Y, Russakovsky. V., Ohno, S. & Gilchrcst, B. A. (1993)
The p isuform of protein kinase C stimulates melanogenesis
by activating tyrosinase in pigment cells J Bio! Chem. 268
11742-11749
Park, J. G. & Gazdar. A F.(1996) Biology of colorectal and gas-
tric cancer cell lines J. Cell Biochem. Supp! 24.131-141.
Park, J -G. Ku, J -L, Kim, H -S.. Park, S -Y. & Ruttcn, M. J
(2004) Culture of normal and malignant gastric epitheliu m
In Pfagncr, & Freshney, R. I (eds ), Culture of human tumor
cells. Hoboken, NJ, Wiley-Liss, pp 23-66.
Parker. R C, Castor, L N & McCulloch, E. A. (1957) Altered
cell strains in continuous culture. Special publications. Ni
Acad Sa 5.303-313.
Parker. R C. (1961) Methods of tissue culture, 3"1 cd, London.
Pitman Medical, p 47
Parker. R C , Healy, G M & Fisher, D. C (1954). Nutrition of
animal cells in tissue culture VII. Use of replicate cell cul-
tures in the evaluation of synthetic media. Canad.J. Biochem.
Physiol 32.306
Parkinson, E K. & Ycudall, W. A. (2002). The epidermis In
Freshney, R. I (cd.). Culture of epithelial cells, 2"J cd New
York, Wiley-Liss, pp 65-94
Parums, D V., Cordell, J. L, Micklcm, K., Hcryet, A. R.,
Getter, К C , and Mason. D Y. (1990) / Clin Pathol 43
752-757
Pasch. J, Schicfer. A., Hcschcl. I. Dimoudis.N. & Rau. G. (2000)
Variai ii hi of the HES concentration for the cryuprcservation
of kcratinocytcs in suspensions and tn monolayers. Cryobiol-
ogy 41.89-96
Patel. К, Moore, S E.. Dickinson. G.. Rosscll, R.J., Beverley, P-,
Kcmshcad.J T &Walsb, F S. (1989). Neural cell adhesion
molecule (NCAM) is the antigen recognised by monoclonal
antibodies of similar specificity in small-cell lung carcinoma
and neuroblastoma. Int J Cancer 4A. 573-578
Paul. J. (1975) Cell and tissue culture. Edinburgh. Churchill
Livingstone, pp. 172-184.
Paul, J.. Conkic, D & Freshney, R I. (1969) Erythropoietic cell
population changes during the hepatic phase of erythropoiesis
in he foetal mouse. Cell Tissue Kinet. 2 283-294
Pavchc. К, Antonie, M., Pavchc, L., Pavclic, J , Pavchc, Z. &
Spavcnti, S (1992) Human lung cancers growing on extra-
cellular matrix* Expression of oncogenes and growth factors
AnticamerRes 12.2191 2196
Peat, N. Gcndlcr, S. J , Lalatu, N. Duhig, T & Taylor-Papad-
imitriou, J. (1992) Tissue-specific expression of a human
polymorphic cptthcltal mucin (MUC1) in transgenic mice
Cancer Res 52 1954-1960
Pederson, N-, Mortenson. S, Sorensen, S В, Pederson. M. W.,
Rieneck, K., Bovin. L. F. & Poulsen, H S (2003). Transcrip-
tional gene expression profiling of small cell lung cancer cells
Cancer Res 6(8) 1943-1953
Pechl, D. M. & Stanbridgc, E.J (1981). Anchorage-independent
growth of normal human fibroblasts Proc. Natl Acad. Sci.
USA 78 3053-3057.
Pcehl, D. M & Ham, R. G. (1980). Clonal growth of human
kcratinocytcs with small amounts of dialysed scrum In Vitro
16.526-540.
Pechl, D. M. (2002). Human prostatic epithelial cells In Fresh-
ney. R. I. & Frchncy. M. G. (eds ), Culture of epithelial cells,
2™1 cd., Hoboken, NJ. Wiley-Liss. pp. 171-194
Pcgolo, G„ Askanas, V & Engel, W К (1990) Expression of
muscle-specific isozymes of phosphorylase and creatine
kinase in human muscle fibers cultured ancurally in scrum-
free, honnonally/chcmically enriched medium Int. J Dev.
Neurosci. 8 299-308.
Pcppclcnbosch, M P., Tertoolcn, L G. J., DcLaat, S. W. &
Zivkovic. D (1995) Ionic responses to epidermal growth
factor in zebrafish cells Exp Cel! Res. 218 183-188.
Pereira. M E. A. & Kabat. E A. (1979) A versatile imunoadsor-
bent capable of binding lectins of various specificities and
its use for the separation of cell populations./. Cell Biol. 82
185-194
Pereira- Smith. О & Smith, J (1988). Genetic analysis of indefi-
nite division in human cells. Identification of four complemen-
tation groups Proc Natl. Acad Sa USA 85 6012-6046.
Perl, A -K_ Wilgcnbus, P., Dahl. U., Scmb, H & Clinstofon, G
(1998). A causal role for E-cadhcrtn in the transition from
adenoma to carcinoma Nature 392 190-193
674
Список литературы
Perry, Р. & Wolf, S. (1974). New Giemsa method for the differ-
ential staining of sister chromatids Nature 251 156-158.
Pertoft. H & Laurent, T C. (1982). Sedimentation of cells in
colloidal silica (Percoll) In Pretlov.. T. G. & Pretlow, T. P
(cds.), Celt separation, methods and selected applications.
Vol. 1 New York, Academic Press, pp 115-152
Peters. D. M , Dowd, N., Brandt. C & Compton. T. (1996) Hu-
man papilloma virus E6/E7 genes can expand the lifespan
of human corneal fibroblasts In Vitro Cell Dev Biol. Anima!
32 279-284.
Petersen, О W„ Gudjonsson, T., Villadscn. R , Bissell, M. J. &
Ronnov-Jessen, L. (2003) Epithelial progenitor cell lines as
models of normal breast morphogenesis and neoplasia. Cell
Proltf 36 Suppl 1 33-44
Petersen, D F, Anderson. E C. & Tobey, R A (1968) Mitotic
cells as a source of synchronized cultures. In Prescott. D M
(cd ). Methods tn cell physiology. New York, Academic Press,
pp. 347-370.
Petit, В. Masuda. К, d'Souza, A.. Otten, L.. Pictryla, D. Hart-
mann, D. J., Morns, N. P, Ucbelhart, D., Schmid, T M. &
Thonar. E J.-M A. (1996). Cliaraetcrization of crosslinked
collagens synthcsiczcd by mature articu lar chondrocytes
cultures in alginate beads. Comparison of two distinct matrix
compartments Exp Cell Res 225.151 161
Pevny, L. & Rao, M S (2003) The stem-cell menagerie Trends
Neumsci 26 351-359
Pfeffer. L. M & Eisenkraft, B. L. (1991). The antiproliferative
and antitumour effects of human alpha interferon on cultured
renal carcinomas correlate with the expression of a kidney-
associated differentiation antigen Interferons Cytokines 17
30-31.
Pfagner. R & Freshney. R. I (cds ) (2004) Culture of human
tumor cells, Hoboken, NJ, Wiley-Liss, Chapters 1.2,3,5,14
Phillips, P. D. & Cnstofalo, V. J (1988). Classification system
based on the functional equivalency of mitogens that regulate
WI-38 cell proliferation. Exp. Cell Res 175.396-403
Pignata, P. D & Maggini, L., Zarrilli, R., Rea, A & Acqua-
viva, A M. (1994). The entcrocytc-hkc differentiation of the
Caco-2 tumour cell line strongly correlates with responsive-
ness t<i cAMP and activation of kinase A pathway Cell Growth
Differ. 5 967-973.
Pignatclli, M. & Bodmer. W F (1988). Genetics and biuchem-
istry of collagen binding-triggered glandular differentiation
in a human colon carcinoma cell line. Proc. Natl Acad. Set
USA 85.5561-5565
Pipia, G. G. & Long, M. W. (1997) Human hematopoietic pro-
genitor cell isolation based on galactose-specific cell surface
binding Nat Biotechnol 15.1007-1011
Pitot. H.. Penano. C.. Morse, P. & Potter, V'. R. (1964). Hepato-
mas in tissue culture compared with adapting liver in vitro
Natl Cancer Inst Monogt 13.229-245.
Piyathilake, C J., Frost, A, Manne, U, Weiss, H., Beil, W. C,
Hcimburgcr, D C. & Grizzle, W. E. (2002) Differential
expression of growth factors in squamous cell carcinoma
and preeancerous lesions of the lung. Cltn Cancer Res 8
734 744.
Pizzonia, J H, Gesek, F. A., Kennedy, S. M, Coutcnnarach, B. A,
Bacskal, В J & Friedman. P. A. (1991) Immunumagnctic
separation, primary culture, and characterisation of cortical
thick ascending limb plus distal convoluted tubule cells from
mouse kidney In Vitro Cell Dev. Biol. 27 A. 409-416
Planas-Silva, M. D. & Weinberg, R. A. (1997) The restriction
point and control of cell proliferation. Curr. Opin. Cell Btol.
9 768-772
Planz, В, Wang, Q, Kirley, S D, Lin. C. W. & McDougal. W. S.
(1998). Androgen responsiveness of stromal cells of the human
prostate. Regulation of cell proliferation and kcratinocylc
growth factor by androgen J. Urol 160.1850-1855.
Platsoucas. C. D , Good, R. A. & Gupta, S. (1979) Separation of
human lymphocytc-T subpopulations (T-mu. T-gainma) by
density gradient electrophoresis. Pioc. Natl. Acad Set. USA
76 1972.
Plumb, J. A., Milroy, R. & Kaye, S В (1989) Effects of the pH
dcpcndenceof3-(4,5-dimcthylthiazol-2-yl)-2.5-diphcnyltct-
razolium bromidc-formazan absorption on chemosensitivity
determined by a novel tctrazolium-bascd assay Cancer Res.
49 4435-4440.
Pollack, M. S. Heagney, S. D. Livingston, P. О & Fogh, J.
(1981). HLA-A, В, C & DRalloantigcn expression on forty-
six cultured human tumor cell lines, f Natl. Cancer Inst. 66
1003-1012.
Pollack. R. (1981). Readings in mammalian cell culture, 2"'1 cd. Cold
Spring Harbor, NY Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Pollard. T. D. & Bonsy, G G. (2003). Cellular motibty driven by as-
sembly and disassembly of actin filaments. Cell 112.453-465.
Pollard, J. W & Walker, J M (cds.). (1990) Animal cell culture
Methods tn molecular biology, 5 Clifton, NJ, Humana Press,
pp. 83-97
Pollock, G S.. Franccschini. I. A., Graham. G & Barnett, S C.
(1999). Ncurcgulin is a mitogen and survival factor for old-
factory bulb ensheathing cells and a related isoform is pro-
duced by astrocytes Eur.J Neutosci. 11 769-780
Pollock. M. F & Kenn, G E. (1963) Mammalian cell cultures
contaminated with plcura-pncumonia-like organisms-. III.
Elimination of plcura-pncumonia-like organisms with specific
antiserum Pioc. Soc. Exp. Biol. Med. 112.176-181.
Plnaszek, N, Kwabi-Addo. B.. Wang, J. & Ittmann. M. (2004).
FGF 17 is an autocrine prostatic epithelial growth factor
and is upregulated nt benign prostatic hyperplasia. Prostate
60 18-24
Pontecorvo. G. (1975) Production of mammalian somatic cell
hybrids by means of polyethylene glycol treatment Somat.
Cell Genet 1.397-400.
Ponten, J. (1975) Ncoplasic human glia cells in culture. In.
Fogh, J (cd ), Human tumor cells tn vttm. New York, Plenum,
pp. 175-185
Ponten. J. & Westermark. В (1980). Cell generation and aging
of nontransforined gltal cells from adult humans. In Fc-
doroff, S. & Hertz, L. (eds.).Azft'aHces tncellular neurobiology,
Vol. 1 New York, Academic Press, pp 209-227
Poot, M.. Hoehn, H., Kubbics. M, Grossmann, A. Chen, Y. &
Rabinovitcb, P. S. (1994) Cell-cycle analysis using continu-
ous bromodcoxyuridinc labeling and Hoechst 33358-cthidium
bromide bivariate flow evtometry. Methods Cell Biol. 41
327-340.
Post. M , Floros, J & Smith, В. T (1984) Inhibition of lung
maturation by monoclonal antibodies against fibroblast-
pneumocytc factor. Nature 308.284-286.
Список литературы
675
Potten. С. S_. Booth. С.. Tudor, G. L., Booth, D. Brady, G., Hur
Icy, P.. Ashton, G-, Clarke, R., Sakakihara. S. & Okano. H.
(2003) Identification of a putative intestinal stem cell and
early lineage marker, musashi-1. Differentiation 71 28-41.
Potter. H.. Weir, L. & Leder, P (1984) Enhancer-dependent
expression of human k immunoglobulin genes introduced
into mouse pre-B lymphocytes by electroporation Pioc. Natl.
Acad Set USA 7161 7165.
Powell, C. A., Smiley, B. L , Mills, J & andenburgh, H H
(2002). Mechanical stimulation improves tissue-engineered
human skeletal muscle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283
С1557-C1565.
Powers. D. A (1989). Fish as model syterns Science 246
352-357
Pragncll, I. B., Wright, E G, Lunmorc, S A., Adam. J., Rosendaal.
M . deLamarter. J. F., Freshney, M. Eckmann. L. Sproul.
A. & Wilkie, N. (1988) The effect of stein cell proliferation
regulators demonstrated with an in vitro assay Blood 72
196-201
Prasad, К N & EdwardsPrasad, J , Ramanujam. S. & Sakamoto.
A (1980). Vitamin E increases the growth inhibitory and
differentiating effects of tumour therapeutic agents on neu-
roblastoma and glioma cell in culture. Pmc. Soc. Exp. Biol.
Med 164 158-163
Pretssman, A., Weismann, R., Bucholz, R.. Werner, R G. &
Noe, W. (1997). Investigation on oxygen limitations of
adherent cells growing on maeroporous microcarriers. Cyto-
technology 24 121-134
Prctlow, T G. & Prctlow, T P. (1989). Cell separation by gradient
centrifugation methods. Methods Enzymol. 171.462 182.
Prctlow, T. G, Delmoro, С. M.. Dilley. G. G, Spadafora, C. G &
Prctlow, T P (1991).Transplantationofhumanprnstaticcarci-
noma into nude mice in Matngcl. Cancer Res 51.3814-3817
Prince. G A, Jenson. A. В. Billups. L. C & Notkins, A. L (1978).
Infection of human pancreatic beta cell cultures with mumps
virus Nature 271 158-161
Proeccdings-NASA biorcactors workshop on regulation of cell
and tissue differentiation (1997). In Vitro Cell De Biol.Amm.
33 325 Ю5
Provision and use of work cquqHiicnt (1995). Directive 89/355/
EEC and 95,63 EC.
Provision and use of tc-ork equtpmet (1992). Health and Safety
Executive, Broad Lane, Sheffield S3 7HQ, England
Puck, ТТЛ Marcus. P. I. (1955) A rapid method for viable
cell titration and clone production with HeLa cells in tissue
culture: The use of X-irradiatcd cells to supply conditioning
factors Proc Natl. Acad Sei USA 41 432 137.
Puck. T T- Cieciura. S J. & Robinson. A (1958) Genetics
of somatic mammalian cells, III. Long term cultivation of
euploid cells from human and animal subjects. J. Exp Med.
108- 945-956
Punchard, N., Watson. D., Thomson, R & Shaw. M. (1996).
Production of immortal human umbilical vein endothelial
cell» In Freshney, R. I & Freshney. M G. (eds ), Culture of
immortalized cells. New York. Wiley-Liss. pp. 203-238.
Qwarles, J. M . Morns, N. G. & Leibovitz. A (1980) Car-
cmoeinbryontc antigen production by human colorectal
adenocarcinoma cells in matrix-perfusion culture In Vitro
16 113-118
Quax, P. H., Fnsdal, E. Pederson, N, Bonavaud. S, Thibert. P.,
Martclly. I, Verheijen, J. H, Blasi. F. & Barlovatz-Mci-
mon, G (1992) Modulation of activities and RNA level of
the components of the plasminogen activation system during
fusion of human myogenic satellite cells in vitro. Dev. Biol
151.166-175
Quintanilla. M . Brown. K.. Ramsden. M & Balmatn. A (1986)
Carcintigcn specific mutation and amplification of Ha-ras
during mouse skin carcinogenesis. Nature 322.78-79.
Quon, M. J (1998) Transfection of rat adipose cells by electro-
poration. In Ravid. K. & Freshney, R. I. (eds ), DNA transfer
to cultured cells. New York, Wiley-Liss. pp. 93-110.
Rabito, C. A.. Tchao, R., Valentich. J & Leighton, J. (1980). Ef-
fect of cell substratum interaction of hcmicyst formation by
MDCK cells In Vitro 16 461-468.
Radisky D C.. Hirai Y Bissell. M. J (2003) Delivering the
message, cpitnorphm and mammary epithelial morphogenesis
Trends Cell Biol. 13 426-34
Raff. M. C. (1990) Glial cell diversification in the rat optic nerve
Scince 24:1450-1455
Raff, M. C . Abney. E., Brockes, J P & Hornby-Smith. A. (1978)
Schwann cell growth factors. Cell 15 813-822
Raff, M. C„ Fields. К L., Hakomon, S. L.. Minsky, R-,
Pruss. R. M & Winter. J. (1979) Cell-type-specific markers
for distinguishing and studying neurons and the major classes
of glial cells in culture. Brain Res 174 283-309
Ramov, N. G. & Ren, H. (2003). Clinical trials with retrovirus
mediated gene therapy what have we learned?J. Nemooncol
65.227 36
Raisman, G (1985). Specialized neuroglial arrangement may
explain the capacity of vomeronasal axons to reinnerveate
central neurons. Neuroscience 14 237 254
Raisman, G (2001). Olfactoryenshcathingcclls-another miracle
cure for spinal cord injury? Nat Rev. Neuiosci. 5.369-75.
Rak, J., Mitsuhashi, Y, Erdos, V., Huang. S.-N, Filmus, J. & Ker-
bd. R. S (1995) Massive programmed cell death in intestinal
epithelial cells induced by three-dimensional growth condi-
tions Suppression by mutant c-H-ras oncogene expression
J. Cell Biol. 11 1587-1598.
Ramaekers. F. C. S., Puts, J. J. G. Kant. A, Miicsker, О.,
Jap. P. H K.&Vootjs.G P (1982). Use of antibodies to in-
termediate filaments m the characterization of human tumors
ColdSpnng Harbor Symp. Quant. Biol. 46 331-339
Ramon-Cueto. A, Plant,. W.. Avila, J & Bunge, M. B. (1998)
Long-distance axonal regeneration m the transected adult
rat spinal cord is promoted by olfactory cnsheathing glia
transplants J. Neumsa 18 3803-3815.
Ranseht. B., Clapshaw P A. Price. J. Noble. M. & Seifert . W
(1982) Development of oligodendrocytes and Schwann cells
studied with monoclonal antibody against galactocerebrosidc.
Pmc Natl. Acad Set USA 79 2709-2713.
Rathjen, P D, Lake, J.. Whyatt, L. M.. Bettcss, M D &
Rathjen, J (1998) Properties and uses of embryonic stem
cells Prospects for application to human biology and gene
therapy Reprod. Fertt! Dev. 10 31 47
Rattner, A. Sabidn, О , Mssoubre, C „ Rasdc, F & Frey, J
(1997). Characterization of human osteoblastic cells. Influ-
ence of the culture conditions In Vitro Cell Dev Biol Antrn
33 757-762.
676
Список литературы
Ravid, К. & Freshney. R I (1998). DNA transfer to cultured cells.
New York. Wiley-Liss.
Ravid, К, Dm, T, Beeler. D. L., Kilter, D J. & Rosenberg, R. D
(1991). Transcriptional regulation of the rat platelet factor 4
gene. Interaction between an enhancer silencer domain and
the GATA site Mol. CellBtoL 116116-6127.
Ray, M E, Yang. Z. Q., Albertson. D., Klccr. C G., Wash-
bum, J G-, Macnska, J. A. & Ethier, S. P (2004) Genomic
and expression analysis of the 8pll-12 amplicon in human
breast eanccr cell lines. Cancer Res 64.40 17
Raz, A (1982). В16 melanoma cell variants- Irreversible in-
hibition of growth and induction of morphologic differen-
tiation by anthraeyeline antibiotics./. Natl. Cancer Inst. 68
629-638
Reason. G M (1995) The fourth musketccr-from Alexandre
Dumas to Claude Bernard Diabetologia 38 3-13
Reddel, R, Ke, Y., Gerwin, В. I., MeMcnamin, M. G, Lech-
ner. J. F, Su, R. T., Brash. D E, Park, J. В, Rhim, J S. &
Harris, С. C (1988). Transformation of human bronchial
epithelial cells by infection with SV40 of adcnovirus-12
SV40 hybrid virus or transfection via strontium phosphate
coprecipitation with a plasmid containing SV40 early region
genes. Cancer Res. 48 1904-1909.
Reed, S. I (2003) Ratchets and clocks the cell cycle, nbiquity-
lation and protein turnover Nat. Ren Mol. Cell Btol. 4(11)'
855-864
Reel, J. R & Kenney, F T. (1968) «Superinduction» of tyrosine
transaminase in hepatoma cell cultures. Differential inhibition
of synthesis and turnover by actinomycin D. Proc Natl. Acad.
Sa USA 61.200-206.
Reeves, M. E. (1992) A metastatic tumour cell Hue has greatly
reduced levels of a specific homotypic cell adhesion molecule
activity. Cancer Res. 52:1546-1552.
Reid. L. M. (1990) Stem cell biology hormonc/matnx synergies
and liver differentiation Cun. Opin. Cell BtoL 2 121 130
Reid. L. M & Rojkmd, M. (1979) New techniques for cultur-
ing differentiated cells Reconstituted basement membrane
rafts In Jakoby, W B. & Pastan. I. H. (eds ) Methods tn
enzymology, vol 57, cell culture. New York, Academic Press
pp. 263-278.
Rcitzcr, L J., Wicc. В. M. & Kennel, D (1979) Evidence that
ghitaininc, not sugar, is the major energy source for cultured
HeLa cells J. Btol. Chem 254 2669-2677.
Rclou, I. A., Damcn, С. A., van dcr Schaft. D. W., Grocnewc-
gen, G , Griffioen. A W (1998). Effect of culture conditions
on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue Cell
30 525-30
Rcpcsh. L. A (1989) A new in vitro assay for quantitating tumor
cell invasion Incas. Metast 9 192 208.
Resnick, J. L, Bixler, L. S & Donovan, P. J (1992) Long terra
proliferation of mouse primordial germ cells in culture. Nature
359.550-551.
Rhctnwald, J. G & Beckett, M. A. (1981). Tumorigenic kcratino-
cyte lines requiring anchorage and fibroblast support support
cultured from human squamous cell carcinomas Cancer Res.
41 1657-1663.
Rhcmwald.J G & Green, H (1975). Enal cultivation of strains
of human epidermal kcratinocytcs. The formation of keratin-
izing colonics from single cells. Cell6.331-344
Rheinwald, J. G & Green, H. (1977). Epidermal growth factor
and the multiplication of cultured human kcratinocytcs
Nature 265.421-424.
Richard, O., Duittoz, A H & Hcor, T К (1998) Early, middle,
and late stages of neural cells from ovine embryo in primary
cultures. Neuroscience Res 31.61-68.
Richter. C & Yaffc. D (1970), The in vitro cultivation and dif-
ferentiation capacities of myogenic cell lines Dev BtoL 23
1-22
Richmond, A., Lawson, D. H , Nixon, D. W. & Chawla, R. K.
(1985). Characterization of autostimulatory and trans-
forming growth factors from human cells Cancer Res. 45
6390-6394
Rickwood. D &Birnic,G. D (1975) Metrizanude, a new density
gradient medium. FEBSLett. 50 102 -110
Ried, T.. Liyanagc, M , du Manoir, S, Hcsclmcycr. K., Auer. G.
Macvillc, M. & Schrock, E. (1997). Tumor cytogenetics
revisited. Comparative genomic hybnzation and spectral
karyotyping./ Mol. Med. 75 801-814.
Rieder. CL. & Cole, R W. (2002). Cold-shock and the mam-
malian cell cycle Cell Cycle.! 169-175.
Rmdlcr.M J.. Chuman.L. M.. Jr. (1979) Retention of differen-
tiated properties in an established dog kidney epithelial cell
line (MDCK)/. CellBtol81 635-648.
Rtppon, H J & Bishop, A. E. (2004). Embryonic stem cells Cell
Prohf.37 23-34
Rizzmo, A. (2002). Embryonic stem cells provide a powerful and
versatile model system. Viton Harm. 64.1 -42
Robertson, К. M. & Robertson. C. N. (1995). Isolation and growth
of human primary prostate epithelial cultures. Methods Cell
Sa. 17 177-185
Robins. D. M.. Piplcy, S, Henderson. A S 4 Axel . R. (1981).
Transforming DNA integrates into the host chromosome.
Cell 23 29-39
Rodbell, M. (1964) Metabolism of isolated fat cells: Effects of
hormones on glucose metabolism and lipolysis./. Btol Chem.
239 37-380.
Rodrigues, A M , Elabd, C. Dclteil. F.. Astier, J., Vcrno-
chct, C., Saint-marc. P, Guesnct.J., Gnczciincc. A., Amri, E Z.,
Dani. C. & Ailhaud, G (2004). Adipocyte diffcrentiatiou of
multipotent cells established from human adipose tissue.
Biochem Biophys. Res. Comtnun. 315 255-263.
Rofstad, E. K. (1994) Orthotopic human melanoma xenograft
model systems for stydics of tumor angiogenesis, patho-
physiology, treatment sensitivity and metastatic pattern. Br.
J Cancer70.804-812
Rogers, A W. (1994) Techniques, of autoradiography, 3d cd.
Amsterdam, Elscvicr/North-Holland Biomedical Press
Rcguct, R, Cohen, C & Rougter, A. (1994) A reconstituted
human epidermis to assess cutaneous irritation photoirnta-
tion and photoprotection tn vitro. In vitro Skin Toxicol 10
141-149
Rojkind, M.. Gatmaitan, Z. Mackenscn. S., Giambronc. M. A,
Ponce, P. & Retd, L. M. (1980). Connective tissue biomatrix.
Its isolation and utilization for long-term cultures of normal
rat hepatocytes J. Cell Btol. 87 255-263
Rnnncy, D. E. & Czcpulkowski, В H (eds) (1986) Human cy-
togenetics, a practical approach. Oxford. U K., IRL Press at
Oxford University Press.
Список литературы
677
Rooney, S A.. Young, S L. & Mendelson, C. R (1995) Molc-
sular and cellular processing of lung surfactant FASEB J 8
957 967
Rosenblatt, J. D, Lunt, A. L, Parry. D. J. & Partridge, T A.
(1995) Culturing satellite cells from living single muscle fiber
explant.-. In Vitro Cell. Dev. Biol. 31- 773-779
Roscnhhtt.J. D. Lunt. F. I. Parry. D.J. & Partridge, T. A (1996)
Phenotype of adult mouse muscle myoblasts reflects their
fiber type of origin Dif ferentiation 60.39 15
Rosenfeld, M A, Yoshimura. К, Trapncll. В. C, Yoneyama, K..
Rosenthal, E. R., dalcmcnas, W., Fukayama, M , Bargon, J..
Sttcr, L E.. Stratford-Pcrncaudet, L.. Pcrricaudet, M , Gug-
gino, W. B., Pavirani, A.. LecocqJ -P. & Crystal, R. G. (1992).
In vivo transfer of the human cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator gene to the airway epithelium. Cell
68 143 155
Roscnman, S. J. & Gallatin, W M. (1992) Cell surface glyco-
conjugatcs tn intercellular and cell-substratum interactions
Semin. Cancer Biol. 2 3 57-366.
Rosst, G. В & Friend, C (1967). Erythrocytic maturation of
(Friend) virus-induced leukemic cells in s.spleen clones. Proc.
Natl. Acad Sci. USA 58 1373-1380.
Rothblat. G. H. & Morton, H E (1959). Detection and possible
source of contaminating pleuropneumonia-like organisms
(PPLO) in culture of tissue cells Proc. Soc Exp. Biol Med
100 87
Rothfcls.K H & Siminovitch, L. (1958). An air drying technique
for flattening chromosomes in mammalian ceils growth in
vitro Stain Techno! 33.73-77.
Rotman, B. & Papermaster, B. W (1966) Membrane properties
of living mammalian cells as studies by enzymatic hydrolysis of
fluorqgenic esters Proc Natl. Acad Sei USA 55 134-141
Rous, P. & Jones, F A A. (1916). A method of obtaining suspen-
sions of living cells from the fixed tissues, and for the plating
out of individual cells J. Exp. Med. 23.555
Rowley, S D.& Byrne. D V.(1992) Low-temperature storage of
bone marrow in nitrogen vapor-phase refrigerators decreased
temperature gradients with an aluminum racking system
Transfusion 32750-754.
Rudland, P. S (1992) Use of peanut lectin and rat mammarn
stein cell lines to identify a cellular differentiation pathway
for the alveolar cell in the rat mammary gland.J Cell Physiol.
153 157-168
Ruff, M R &Pcrt,C В (1984). Small cell carcinoma ol the lung:
Macrophage-specific antigens suggest hematopoietic stem cell
origin. Science-225.1034-1036
Ru les and guidance for pharmaceutical manufacturers and distrib-
utors. (1997). The Stationery Office. Ltd, London. U K.
Rundlctt, S E., Gordon, D A & Micsfeld, R L. (1992) Char-
acterisation of a panel of rat ventral prostate epithelial cell
lines immortalized in the presence or absence of androgens
Exp Cel! Res. 203 214-221
Ruof f, N M & Hay. R J. (1979). Metabolic and temporal studies
on pancreatic exocrine cells in culture. Cell Tissue Res. 204
243-252
Rush, L. J., Hciuiincn, К. Mrozek, К, Wolf BJ. Abdcl-Rah-
inan, M , Szyinanska, J., Pcltomaki, P., Kapadia, F , Bloom
field, C. D.. Cabgiuri, M A & Plass, C. (2002). Comprehensive
cytogenetic and molecular genetic characterization of the TH
acute myeloid leukemia cell line reveals cross-contaminatton
with К-562 cell line Blood 99-1874-1876.
Russo, J , Calaf. G., Russo, I. H. (1993) A critical approach to
the malignant transformation of human breast epithelial
cells with chemical carcinonogens. Cnt. Rev Oncog 4 (4)
403-417
Russo. A A., Tong, L.. Lee, J O.. Jeffrey, P D. & Pavletich. N P
(1998) Structural basis (or inhibition of thccyclm-dcpendent
kinase cdk6 by the tumour suppressor pl61NK4a Nature
395.237-243
Putzky, L. P.. Tomita,J. T, Calcnoff, M. A. & Kalian, В D. (1979)
Human colon adenocarcinoma cells. III. In vitro organoid
expression and carcino-cmbryonic antigen kinetics in hollow
fiber culture J. Natl. Cancer Inst 63.893-902
Rygaard. K.. Moller. C-, Bock, E. & Spang-Thomsen. M (1992)
Expression of cadherin and NCAM in huiucn stall cell lung
cancer lines and xenografts. Br J. Cancer65 573-577
Saalbach, A., Aust, G, Haustcin, U. F.. Herrmann. K. & An-
deregg, U. (1997). The fibroblast-specific MAh AS02 a novel
tool for detection and elimination of human fibroblasts. Cell
Tissue Res. 290. 593-599.
Sachs, L. (1978). Control of normal cell differentiation and the
phenotypic reversion of malignancy in myeloid leukaemia
Nature 274 535-539
Safe Use of Work Equipment. Provision and use of Work Equip-
ment Provision and Use of Work Equipment Regulations
(1998) Approved Code of Practice and Guidance. L22, HSE
Books, ISBN 0 7176 1626 6.
Safewodnngandthepreventtonof infection inclinical laboratories.
(1991) Health and Safety Commission, HMSO Publication,
P.O Box 276, London, SW8 5DT, England.
Sager, R (1992) Tumor suppressor genes in the cell cvclc. Curr
Opin. Cell Biol 4.155-160
Sax. R.. Thonar, E & Masuda. K. (1991) Tissue engineering of
articular cartilage In Vtnjak-Novakovic, G.. Freshney. R I
(cds ), Culture of cells for tissue engineering Hoboken, HJ,
Wiley-Liss (In press).
Saicr, M. N (1984) Hormonally defined, scrum free medium for
a proximal tubular ktdncy epithelial cell line, LLC-PKI In
Barnes, WD (cd.). Methods for serum free culture of epithelial
and fibroblastic cells New York, Alan R Liss. pp. 25-31.
Sambrook. J., Fritsch. E. F. & Maniatts, T (1989) Molecular
cloning A laboratory manual, 2d cd. Use of recombinant
Cold Spring Harbor. NY, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 3 vols
Sanchez-Ramos, J R (2002). Neural cells derived from adult
bone marrow and umbilical cord neityblood.J. Neutosci. Res
69 880-893
Sandberg. A. A. (1982) Chromosomal changes in human cancers
Specificity and heterogeneity. In Owens, A. H.. Coffey, D. S &
Baylin, S B. (cds.). Tumour cell heterogeneity New York,
Academic Press, pp 367 397
SancsJ R, Rubenstein, J L. & Nicolas, J F (1986). Use of re-
combinant retrovirus to study post-tmplantation cell lineage
in mouse cinbryos. EMBO J 5.3133-3142.
Sanford, К К, Earle, W R & Likely, G D. (1948). The growth in
vitro of single isolated tissue cells. J Natl Cancer Inst 11 773
Sanford, К К., Westfall. В. В., Fioramonti. M. С.. Мс-
Quilkin. W Т.. Bryant. J. C.. Peppers, E. V. & Earle, W. R
678
Список литературы
(1955). The effect of scrum fractions on rhe proliferation ol
strain L mouse cells in vitro.J Natl. Cancer Inst. 16 789
Sarang, Z, Haig, Y, Hansson, A, Vondracek. M. Warngard, L, Graf-
strotn, R C (2003) Microarray assessment of fibronectin, col-
lagen and intcgnn expression and the role fibronectin-collggcn
coating m the growth of normal, SV40 T-antigen-immortslizcd
and malignant human oral kcratinocytcs. ATLA, 31 575-585.
Sasaki, M , Honda, T, Yainada, H , Wake. N & Barrett. J. C
(1966) Evidence for multiple pathways to cellular senescence
Cancer Res. 54 6090-6093.
Sato, G H & Yasumura, Y (1966). Retention of differentiated
function in dispersed cell culture Trans. NY acad Set. 28
1063-1079
Sattler G A., Michalopoulos, G., Sattler, G. L & Pilot. H C
(1978). Ultrastructure of adult rat hepatocytes cultured on
floating collagen membranes Cancel res 38.1539-1549
Sauncrs. N. A. Bcrnacki, S. H., Voilbcrg, T. M & Jcttcn, A. M
(1993). Regulation of transglutaminase typc-I expression in
squamous differentiating rabbit tracheal epithelial, cells hu-
man epidermal kcratinocytcs - effects of retinoic acid and
phorbol esters Mol. Endocrinol. 7 387-398.
Scanlon, E F-. Hawkins, R. A Fox, W. W. & Smith, W S. (1965)
Fatal homotransplantcd melanoma (a case report) Cancer
12 782-789.
Schaeffer. W I. (1990) Terminology associated with cell, tissue
and organ culture, molecular genetics. In Vitro Cell Dev Biol
26 97-101
Shaeffer.К,Hcrrmuth.H_.Mueller,J -Coy.D.H .Wong,H C.
Walsh, J H., Classen, M , Schusdziarra. V & Schcpp, W
(1997). Bombesin-like tides stimulate somatostatin release
from rat fundic D cells in primary culture Am J Physiol
Castromtest Liver Physio! 273 G686-G695
Schamblott, M. J . Axchnan.J.. Stcrncckert. J, Chrtstoforou, N,
Patterson, E. S„ Siddtqi, M A., Kahler, H- Ifcanyi. L A &
Gearhart, J. D (2002). Stem cell culture: pluripotent stem
cells In Methods of tissue engineering. Atala, A & Lanza. R P,
Eds., San Diego, Academic Press, pp. 411-420.
Schamblott. MJ., Axelman. J., Wang, S_. Bugg, E M., Little-
field, J W. Donovan, P J, Blumethal. P D., Huggins. G. R &
Gearhart, J. D. (1998) Derivation of pluripotent stem cells
from cultured human primordial germ cells Proc Natl. Acod
Set. USA. 95:1.3726-13731.
Scher. W.. Holland, J. G & Friend, C. (1971). Hemoglobin syn-
thesis in in tnurtne virus-induced leukemic cells tn vitro. I
Partial purification and identification of hemoglobins Blood
37 428-437.
Schimmclpfcng, I, Langcnbcrg, U & Peters, I. M. (1968). Mac-
rophages overcome mycoplasma infection of cells tn vitro
Nature 285 661.
Schlccbte. W, Brattain, M. & Boyd. D. (1990). Invasion of extra-
cellular matrix by cultured colon cancer cells. Dependence on
urokinase receptor display Cancer Commun. 2 173-179
Schlcssinger. J.. Lax. I & Lemmon, M. (1995). Regulation of
growth factor activation by proteoglycans. What is the role
of the low affinity receptors? Сей83 357-360
Schmidt, R , Reichert. U., Michel. S , Shrott, В & Buullicr, M
(1985) Plasma membrane transglutaminase and cornified
envelope competence in cultured human kcratinocytcs FEBS
Lett. 186.204
Schneider. E. I. (1975) A simple biochemical technique for the
detection of mycoplasma contamination of cultured cells.
Methods Cell Biol 10 278-290.
Schoenlcin. P V , Shen, D -W , Barrett, J T.. Pastan, I. T & Got-
tesman, M. M (1992) Double minute chronosomescarrytng the
human multidrug resistance 1 and 2 genes arc generated from
the dimerization of submtcroscopis circular DNAs tn colchi-
ciuc-sclcctcd KB carcinoma cells Mol. Btol. Cell3:507-520
Schor, S. L (1994). Cytokine control of cells motility modula-
tion and mediation by the extracellular matrix. Png. Growth
Factor Res. 5:223-248
Schousboe, A. Thorbck, P. Hertz, L. & Krogsgaard-Larsen, P.
(1997). Effects of GABA analogues of restricted conformation
on GABA transport m astrocytes and brain cortex slices and
on GABA receptor binding J. Neurochetn. 33 181-189
Schulman H. M. (1968). The fractionation of rabbit reticulo-
cytes tn dextran density gradients. Btochim Btophys Acta
148 251 255.
Schwartz Albicz, R., Hcidtroann, H.-H.. Wolf. D., Schirrma-
cher, V. & Moldcnhauer, G (1991). Three types of human
lung tumour celt lines can be distinguished according to
surface expression of endogenous urokinase and their capacity
to bind exogenous urokinase Br.J Cancer65 52-57
Schwob. J. (2002) Neuronal regeneration and the peripheral
olfactory system Anal. Rec 269.33-48.
Scott, W. N., McCool. К & Nelson, J. (2000). Improved method
(or the production of gold colloid monolayers for use tn the
pbagokinctic track assay (or cell motility. Anal Biochem.
287 .343-344.
Scotto, К W. Bicdler, I. L. & Mclcra. P W. (19860 Amplification
and expression of genes associated with multidrug resistance
in mammalian cells. Science 232 751 755
Seeds, N W. (1971) Biochemical differentiation tn rcaggrcgating
brain cell culture. Proc Natl. Acad Sa. USA 68 1858-1861.
Seglcn.P О (1975) Preparation of isolated rat liver cells Meth-
ods Cell Btol 13.29-83.
Seidel. J. О. Pci, M., Gray, M L.. Langer. R.. Freed, L E. &
Vunjak-Novakovic. G (2004). Long-term culture of tissue
engineered cartilage in a perfused chamber with mechanical
stimulation. Btorheology 41.445 158.
Seifert, W & Muller. H. W. (1984) Ncuron-gha interaction in
mammalian brain Preparation and quantitative bioassay
of a neurotropic factor (NTF) from primary astrocytes In
Barnes, D. W.. Sirbasku. D A. & Sato, G H. (cds ), Methods
for serum free culture of neuronal and lymphoid cells. New
York, Alan R. Liss, pp 67-78
Seigel, G. A. (1996). Establishment ofan E la-immortahscd reti-
nal cell culture. In vitro Cell Dev Bio! Antm. 32.66-68
Selby, P. J.. Thomas. M J, Monaghan, P.. Sloane. J. & Peck-
ham, M. J. (1980). Human tumour xenografts established
and serially transplanted in mice immunologically deprived
by thymectomy, cytosine arabinoside and whole-body irradia-
tion Br J. Cancer hi 52
Selden, R. F.. Howie, К В, Rowe, M E. Goodman. H M &
Moure, D (1986) Human growth hormone as a reporter gene
in regulation studies employing transient gene expression.
Mol Cell Biot. 6.3173-317$
Scruya, M., Shah, A.. Pedrotty, D., du Laney, T.. Melgin, R,
Mckcc, J. A, Young, H E & Niklason, L E (2004). Clonal
Список литературы
679
population of adult stem cells life span and differentiation
potential. Cell Transplant 13.93-101
Shah, G (1999). Why do we still use scrum tn the production of
biophannaccuticals? Dev Btol. Stand 99. 17-22
Shall. S (1973) Sedimentation in sucrose and Fieoll gradients
of cells growth in suspension culture. In Kruse, P. F. & Pat-
terson, M К (eds.). Tissue culture methods and applications.
New York, Academic Press, pp 198 204.
Shall, S & McClelland. A. J (1971). Synchronization of mouse
fibroblast LS cells growth in suspension culture. Nat. Nett
Bio! 229.59-61.
Shansky, J., Chromiak, J., Del Tatto. M & Vandenburgh. H
(1997) A simplified method for tissue engineering skeletal
muscle organoids in vitro. In Vitia Cell Dev Btol. Anim. 33.
659-661
Shansky. J, Ferland. P.. McGuire. S, Powell. G, DclTatto, M_
Nackan, M. Hennessey,J & Vandenburgh. H. H. (2005) Tissue
engineering human skeletal muscle for clinical applications. In
Vunjak-Novakovic. G & Freshney. R. I (eds.). Culture of cells
for tissue engineering Hoboken, NJ. Wiley-Ltss (tn press)
Sharpe. P T (1988) Methods of cell separation. Amsterdam.
Elsevier
Shaw, R G-. Johnson, A R.. Schulz, W. W.. Zahltcn. R N. &
Combes. B. (1984) Hepatology 4 591-602
Shay, J W & Wright, W. E (1998) Quantitation of the fre-
quency of immortalization of normal human mammary
diploid fibroblasts by SV 40 large T antigen Exp. Cell Res.
184 109-118
Shay. J W.. Wright. W. E , Brasiskytc, D & der Haegen, A
(1993) E6of human papillomavirus type 16 can overcome the
M1 stage of immortalization in human mammary epithelial
cells but not in human fibroplasts. Oncogene 8.1407-1413
Shea, С M , Edgar. С M., Teinhorn. T A., Louis, C. & Gersten-
feld. L. C (2003). BMP treatment of G3H10T1 2 mesen-
chymal stem induces both chondrogencsis and osteogenesis
J. Cell Biochem 90 1112-1127
Shiga. M., Kapila, Y. 1, Zhang, Q., Hayami.T. & Kapila. S. (2003).
Ascorbic acid induces collagenase-1 in human periodontal
ligament cells but not tn MC3T3-E1 osteoblast-like cells:
potential association between collagenase expression and
changes in alkaline phosphatase phenotype./. Bone Miner
Res. 18 67-77.
Shih, S J. Dall’Era. M. A, Westphal.J R, Yang.J, Sweep, C. G..
Gandour-Edwards. R & Evans, С. P (2003) Elements
regulating angiogenesis and correlative inicrovcssel density
in benign hyperplastic and malignant prostate tissue Prostate
Cancer Prostatic Dts. 6.131-137
Shipley CD &Ham.R G.(1983) Multiplication of Swiss 3T3
cells m a serum-free medium Exp Cell Res. 146 249-260
Simon-Assmann. P., Kedinger, M & Haffen. K. (1986). Immu-
nocytochemical localization of extracellular matrix protoin
in relation to rat intestinal morphogenesis. Differentiation.
32 59-66
Simonsen, J. L., Rosada, C., Serakinci, N.. Justesen. J„ Stcndcrup.
К. Rattan. S 1 .Jensen. T G & Kassem, life-span and main
tains tile osteogenic potential of human bone marrow stromal
cells Nat Biotechno! 20.560-561.
Sinha. M К, Buchanan. C, Raineri-Maldonado, C. Khazante, P..
Atkinson. S, DiMarchi. R. & Caro,J. F. (1990). IGF-II recep-
tors and IGF-Il-stnnulatcd glucose transport in human far
cells Am.J Physio! 258. E534 E542.
Skchan, P.. Smoreng. R., Scudie D, Monks. A, McMahon, J., Vis-
tica. D.. Warren. J. T.. Bokcsch, H.. Kenney, S. & Boyd, M. R
(1990) New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-
drug screening J. Natl Cancer Inst 82.1107 1112
Skodc. M & Fusenig. N. E. (1998). Tumorigenic conversion of
immortal human kcratinocytcs through stromal cell activa-
tion. Proc. Natl Acad Set. USA 95 1-6.
Smith, A D. Datta. S P, Smith. G. H, Campbell, P N, Bent-
ley. R & Mckcnzie, H. A. (eds ). (1997). Oxford dictionary
of biochemistry and molecular biology, Oxford. Oxford Uni-
versity Press.
Smith, A G, Heath, J K., Donaldson, D D., Wong, G. G,
Moreau. J, Stahl, M & Rodgers, D (1988). Inhibition of plu-
ripotential stem cell differentiation by purified polypeptides
Nature 336 688-690
Smith, H S., Lan,S., Genani. R, Hackett, A.J.& Stampfer, M. R
(1981) Clonal proliferation of cultured non-malignantand ma-
lignant human breast epithelia Cancer Res. 41.4637-4643
Smith, H S, Owens, R. B.. Hiller. A. J., Nelson-Rees, W A. &
Johnston. J. О (1976). The biology of human cells in tissue
culture. I Characterization of ceils derived from osteogenic
sarcomas. Int J. Cancer 17 219- 234.
Smith, M D., Summers, M. D & Frazer, M J (1983) Produc-
tion of human beta interferon in insect cells infected with a
baeulovirus expression vector. Mo! Cell Btol 3:2156-2165
Smith, P K.. Krohn, R. 1, Hermanson. G. T, Mallia, A. К, Gart-
ner. F. H., Provenzano. M D, Fujimoto, E. K.. Goeke, N V.,
Olson. В J & Klcnk, D. C (1985) Measurement of protein
usingbicinchonmic acid. Anal. Biochem 150 235-239
Smith, S & de Lange, T. (1997). TRFL. a mammalian telomeric
trotcin. Trends Genet 113.21-26.
Smith, W. L. & Garcia-Perez, A. (1985). Iminunodisscction Use
of monoclonal antibodies so isolate specific types of renal cells
Am.J Physiol 248 Fl F7
Smola, H, Stark. H -J., Thickottcr, G, Mirancca.N. Krieg, T. &
Fusenig, N. E (1998). Dynamics of basement membrane for-
mation by kcratinocytc-fibroblastin organotypic skin culture
Exp Cell Res 239 399-410
Smola, H. Thickottcr. G. & Fusenig, N E (1993). Mutual induc-
tion of growth factor gene expression by epidermal-dermal
cell interaction. J Cell Biol 122 417 429
Smyth, M. J., Rodney. L Sparks, R. L., Wharton, W'. (1993).
Proadipocytc cell lines- models of cellular proliferation and
differentiation J. Cell Sei. 106 1 -9
Snyder, E. Y-. Dcitchcr. D L., Walsh. C, Arnold Aldca, S,
Hartwieg, E. А.. Серко. C L. (1992) Multipotens neural cell
lines can engraft and participate in development of mouse
cerebellum Ceil 68,33-51.
Sodcr, A. L, Going, J.J.. Kaye, S В & Keith, W. N (1998). Tu-
mour specific regulations of telomerase RNA gene expression
visualized by in situ hybridization. Oncogene 16.979-983
Sodcr, A I, Hoare, S F.. Muir. S, Going,J.J, Parkinson, E. K. &
Keith. W N (1997). Amplification, increased dosage an in
situ expression <if the telomerase RNA gene in human cancer
Oncogene 14 1013-1021.
Sulassnl, J . Crozet. C. & Lehmann. S. (2003) Prion propagation
in cultured cells Br Med. Bull. 66.87-97
680
Список литературы
Sommar. I & Schachner, M. (1981) Cells that arc* 04-antigen-
positive and 01-antigen-negative differentiate into 01 anti-
gen-positive oligodendrocytes Neuroset. Lett 29 183-188.
Soon-Shiong, P.. Feldman, E.. Nelson, R., Komtebcdde.J, Sinid-
srod, О, Skjak-Br&k, G, Espcvik, T„ Heintz, R. & Lee, M
(1992). Successful reversal of spontaneous diabetes in dogs
by intraperitoneal microencapsulated islets Transplantation
54 769-774.
Sordillo, L. M.. Oliver, S. P & Akers, R M (1998) Culture ol
bovine mammary epithelial cells in d-valinc modified medium
Selective removal of contaminating fibroblasts. Cell Biol. Int
Rep 12:355-364
Soriano. V.. Pepper. M S.. Nakamura, T., Orel. L. & Montesano. R
(1995). Hepatocyte growth factor stimu latcs extensive devel-
opment of branching duct-like structures by cloned mammary
gland epithelial cdk.J. Cell Sci 108 413-430
Soncul, S & Ephrussi. В (1961). Karyoiogical demonstration
of hybridization of mammalian cells in vitro. Nature 190
653-654
Sorour, O„ Raafat, M . El-Bolkainy. N. & Moliamad, R (1975)
Infiltrative potentiality of brain tumors in organ culture
J Neurosurg 43.742-749
Soule. H D, Maloney, T. M, Wolman, S R.. Teterson, W D,
Breuz, R, McGrath, С M . Russo.J, Pauley, R J„Joues, R F. &
Brooks, S. C. (1990). Isolation and characterization ofaspon-
tancously immortalized human breast epithelial cell line,
MCF-10 Cancer Res 50.6075-6086
Soule, H D. Vasquez, J.. Long. A, Albert. S. & Brennan, M
(1973) A human cell line from a pleural effusion derived from
a breast carcinoma. J Natl Cancer Inst. 5i 1409-1416.
Southam, С M. (1958) Homotransplantation of mammalian cells
to antibiotic resistance with a bactcrialgenc under control of die
SV40 early region promoter. J Mol.App Genet 1.327-341
Southern, P J. & Berg, P.(1982). Transformation of mammalian
cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under con-
trol of the SV40 early region promoter. J. Mol. App Genet
1 327-399.
Southgate,J, Masters.J. W. R. & Trcjdosicwicz, L. K. (2002) In
Freshney, R. I. & Freshney. M G feds). Culture of epithelia!
cells. 2™’ cd. New York. Wiley-Liss. pp. 383-399
Speir, R. E, Griffiths.J B. & Meignier, B. (cds). (1991) Produc-
tion of biological from animal cells in culture. Oxford, U К,
Butterworth-Heinemann
Speir, R & Griffiths, J B. (1985-1990) Animal cell biotechnology
London, Academic Press, 4 vols.
Speirs, V (2004). Primary culture of human mammary tumor
cells InPfagner, R & Freshney R I.(eds), Culture of human
tumor cells Hoboken. NJ, Wiley-Liss, pp 205-219
Speirs, V. Green. A. R. & White, M C. (1996). Collagenase III
A superior enzyme for complete disaggregation and improved
vitability of normal and malignant human breast tissue In
Vitro Cell Dev. Biol. Anim 32.72-74.
Speirs, V.. Ray, К. P. & Freshney. R I (1991). Paracrine control
of differentiation in the alveolar carcinoma, A549, by human
foetal lung fibroblasts. Br J. Cancer64 693-699
Spinelli. W. So line life Id, К H & Ishii, N. (1982). Effects of
phorbol ester tumor promoters and nerve growth factor on
ncuritc outgrowth in cultured human neuroblastoma cells
Cancer Res 42 5067-5073.
Splinter, T. A W. Beudeker, M. & Beck. A. V (1978). Changes
in cell density induced by isopaque. Exp. Cell Res. Ill
245-251.
Spooncer, E, Eliason,J & Dexter, T. M. (1992) Long-term mouse
bone marrow cultures In Testa, N. G. & Molincux, G (eds ),
Haemopoiesis a practical approach. Oxford, U K., IRL Press
at Oxford University Press, pp. 57-74.
Sprciuulli. E N & Dexter, D. L. (1984). Polar solvents A novel
class of antincoplastic agents./ Cltn. Oncol 2.227-241.
Sredni, B . Sicckmann, D. G, Kumagai, S. H. Green, I &
Paul, W. E (1981). Long term culture and cloning of
non-transfonned human B-lymphocytcs. J. Exp Med 154
1500 1516
Stacey. G. N. Bolton, В J. & Doyle, A (1993) Multilocus
DNA fingerprinting used for definitive isolation of HeLa
contamination in cell lines and determination of genetic
diversity amongst HeLa cell clones. In Vitro Cell Dev. Biol.
29A. 123A.
Stacey. G N. Bolton. В J., Morgan, D. Clark, S. A. & Duyle. A.
(1992). Multilocus DNA fingerprint analysis of cell-banks.
Stability studies and culture identification in human B-
lymphoblastoid and mammaban cell lines. Cytotechnology
8 13-20
Staecy. G. N.. Hoclzl. H.. Steheiisoii, J. R & Duyle. A (1997).
Authentication of animal cell cultures hy cultures bv direct
visualization of repetitive DNA. aldolase gene PCR and iso-
enzyme analysis. Btologicals 25 75-85
Stacey. G N., Masters,J. RM. Hay. R.J.. Drexler, H. (>, Mac-
Leod, R. A F & Freshney, R I. (2000) Cell contamination
leads to inaccurate data, we must take action now. Nature
403 356.
Stainpfcr. M , Halconcs R. G. & Hackett. A J (1980) Growth
of normal human mammary cells in culture. In Vitro 16
415-425.
Stainpfcr, MR, Yaswen, P. & Taylor-Papadimitnou, J. (2002).
Culture of human mammary epithelial cells In Fresh-
ney, R I & Freshney, M. G. (cds ). Culture of epithelial cells,
2'“’ ed Hoboken, NJ, Wiley-Liss, pp. 95-135.
Stanbndge. E. J. & Doerson. C -J. (1978) Some effects that my-
coplasmas have upon their injected host In McGarrity, G. J .
Murphy, D G & Nichols, W W.(eds.), Mycoplasma infection
of cell cultures New York, Plenum Press, pp. 119-134
Stanley, M A. & Parkinson, E. (1979) Growth requirements of
human cervical epithelial cells tn culture. Int-J Cancel 24
407-414.
Stanley, M A (2002) Culture of human cervical epithelial cells.
In Freshney, R I & Freshney, M G.(cds), Culture of epithe-
lial cells. 2"л cd Hoboken. NJ. Wiley-Liss. pp. 138-169.
Stanners, С. P.. Ehceri, G L. & Green, H (1971). Two types of
nhosome in mouse-hamster hybrid cells Nat New Biol. 230.
52-54.
Stanton, В A., Bicmcsdcrfcr, D., Wade. J B. & Gicbisch, G.
(1981). Structural and functional study of the rat distal
nephron Effects of potassium adaptation and depletion.
Kidney Int 19.36-48.
Stark. H. J., Baur. M , Breitkrcutz, D, Mirancca, N. & Fusc-
mg, N E (1999) Organotypic kcratmocytc cocultures is
defined medium with regular epidermal morphogenesis and
differentiation./ Invest Dermatol 112 681-691
Список литературы
681
States, В., Foreman, J., Lee, J & Segal,S (1986) Characteristics
of cultured human renal cortical epithelia. Biochem. Med.
Metab. Btol. 36 151 161.
Steel. G. G. (1979). Terminology in the description of drug
radiation interactions Int J. Radial. Oncol. Biol. Phys 5.
1145-1150
Steele. M. P, Levine, R. A., Joyce-Brady, M. & Brody ,J S. (1992).
A rat alveolar type 11 cell line developed by adenovirus 12
SE1A gene transfer Am. J Resp. Cell Mol Btol 6.50-56
Stem. H. G. & Yanishevsky. R. (1979) Autoradiography. In
Jakoby. W В & Pastan, I H. (cds), Methods in enzy-
mology, vol. 57: Cell culture. New York, Academic Press,
pp 279-292.
Steinberg, M. L. (1996) Immortalization of human epidermal
kcratinocytcs by SV40. In Freshney, R I & Freshney, M. G.
(cds ), Culture of immortalizes cells. New York Wiley-Liss,
pp 95-120
Stern. P, West. C. & Burt, D. (2004) Culture of cervical car-
cinoma cell lines In Pfragncr, R. & Freshney, R I (cds ).
Culture of human tumor cells. Hoboken, NJ, Wiley-Liss,
pp 179-204.
Stcube, К G, Grunickc, D., Drexler, H. G (1995) Isoenzyme anal-
ysts as rapid method for the examination of the species identity
of cell cultures. In Vitro Cell Dev Btol Amm 31.115-9.
Stewart, С. E. H.,James, P. L., Fant, M E. & Rotwcin, P. (1996)
Ovcrexprcssion of insulin-hke growth factor-II induces accel-
erated myoblast differentiation J. Cell Physiol. 169 23-32
Stoker, M. G. P. (1973). Role of diffusion boundary layer in
contact inhibition of growth Nature 246 200-203
Stoker, M. G. P. & Rubin, H. (1967) Density dependent inhibi-
tion of cell growth in culture Nature 215 171 172.
Stoker, M. O'Neill. C. Berrvman. S. & Waxman. В (1968)
Anchorage and growth regulation tn normal and virus trans-
formed cells Int.J.Cancer3 683-693.
Stoker, M , Perryman, M. & Eelcs, R. (1982) Clonal analysts
of morphological phenotype in cultured mammary eptthe-
lial cells from human milk Proc. R Soc. Land ser. В 215
231 240
Stoner, G D. Katoh, Y. Foidart, J -M . Trumph, В F., Stei-
nert, P & Harris, С C (1981). Cultured human bronchial
epithelial cells. Blood group antigens, keratin, collagens and
fibronectin. In Vitro 17.577-587.
Strange. R. Li. F, Fris, R R, Rcichmann, E_. Haennt, В &
Burn, P. H. (1991). Mammary epithelial differentiation in
vitro. Minimum requirements for a functional response to
hormonal stimulation. Cell Cion th Differ. 2 549 559.
Strangeways, T. S P. & Fell, H. B. (1925) Experimental studies
on the differentiation of embryonic tissues growing in vivo
and tn vitro. I. The development of the undifferentiated limb-
bud (a) when subcutaneously grafted into the post-embryonic
chick and (b) when cultivated m vitro Pioc Roy Soc. London,
ser. В 99 340-366.
Strangeways, T. S P. & Fell. H. B. (1926) Experimental studies
on the differentiation of embryonic tissues growing in vivo
and in vitro II. The development of the isolated early embry-
onic eye of the fow 1 when cultivated in vitro. Pmc Roy. Soc.,
London, ser. В 100.273-283.
Strauss. W M (1998). Transfection of mammalian cells with
yeast artificial chromosomes In Ravid. K. & Freshney. R I.
(cds.), DNA transfer to cultured cells New York, Wiley-Liss,
pp 213-236.
Strickland, S & Beers, W. H (1976). studies on the role of plas-
minogen activator tn ovulation* In vitro response of granulose
cells to gonadotropins, cyclic nucleotides, and prostagland-
mgs.J Biol Chem. 251.5694-5702
Strver, L.(1995).BioJiemisrn/.4L’’cd NcwYork.WH Freemann,
p.505.
Stubblefield, E. (1968). Synchronization methods for mammalian
cell cultures. In Prescott, D. M. (cd.). Methods tn cell physiol-
ogy . New York. Academic Press, pp. 25-43.
Sty les. J A (1997) A method for detecting carcinogenic organic
chemicals using mammalian cells in culture. Br-J. Cancer
36.558.
Su, X. Sorenson, С M & Shetbani, N (2003) Isolation and
characterization of murine retinal endothelial cells Mol Vis
1.171 178.
Su. H Y., Bos. T. J, Monteclaro, F. S & Vogt, P К (1991). Jun
inhibits myogenic differentiation Oncogene 6 1759-1766
Subramantan, M , Madden. J. A. & Harder, D. R (1991). A
method for the isolation of cells from arteries of various sizes
J. Tissue Cult Methods 13 13-20
Subramanian, S. V.. Fitzgerald. M. L & Bernfield, M (1997)
Regulated shedding of syndecan- 1 and -4 ectodoniains by
thrombin and growth factor receptor activation./. Biol. Chem.
272.14713-14720.
Suggs,J. E, Madden. M. C, Friemann, M & Edgcll. C J S
(1986) Prostacyclin expression by a continuous human cell
line derived from vascular endothelium Blood4.825-829
Sugimoto, M. Tabara, H, Ide, T & Furuichi, Y (2001) Steps
involved in immortalization and tumongcncsis in human
Blumphoblastoid cell lines transformed bv Epstein-Barr virus
Cancer Res 64 3361- 3364
Suh, H, Song, M.J. & Park. Y.N. (2003) Behavior of isolated rat
oval cells in porous collagen scaffold. Tissue Eng 9.441-20.
Sun, L., Bradford, C S. & Barnes, D W (1995a). Feeder cell
cultures for zebrafish embryonal cells in vitro Mol. Mar. Btol
Biotech. 4 43-50
Sun, L. Bradford, C S. Ghosh. C. Collodi, P & Barnes, D W
(1995b) ES-likc cell cultures derived from early zebrafish
embroyos. Mol Mar. Btol. Biotech. 4 193-199
Sundqvtst, К , Liu, Y. Arvidson, K., Ormstad, К, Nilsson, L.,
Toftgard, R & Grafetrom, R. C (1991). Growth redulatton
of serum-free cultures of epithelial cells from normal human
buccal murosa. In Vitro Cell Dev Biol 27 A. 562-568
Sutherland, R M. (1998). Cell and micro environment interac-
tions in tumour mteroregions: The multiccll spheroid model
Science 240 117-184.
Suva. D, Garavaglia, G, Menctrey, J, Chaputs, B., Hoffmeyer, P-,
Bernheim, L & Kindler, V' (2004). Non-homatopotetic hu-
man bone marrow contains Long-lasting, pluripotential
incsenchumal stem cells J. Cell. Physiol 198 110-118
Suzuki. A.. Nakaucht. H & Taniguchi, H. (2004). Prospective
isolation of multipotent using flowcytoinctric cell sorting.
Diabetes. 53.2143-2152.
Suzuki. T.. Saha, S , Suniantn. C.. Takagt, M & Bocdionn. A
(1995). The influence of polyvinylpyrrolidone on freezing
of bovine IVF blastocysts following, biopsy Cryobiology 32.
505-510
682
Список литературы
Swope, V В., Supp.A Р, Babcock, G. F & Boyce. S T. (1997)
Regulations of pigmentation in cultured skin substitutes
sorting ofmclanocytcs and kcratinocytcs./ invest Dermatol
109:289 295
Sykes. J A, Whitcscarvcr, J., Briggs. L. & Anson. J. H. (1970)
Separation of tumor cells from fibroblasts with use of discon-
tinuous density gradients J. Natl. Canter Inst 44.855-864
Tagawa. M . Yokosuka, О , Imazeki, F., Ohto, M & Omata. M
(1996). Gene expression and active virus replication in the
liver after injection of duck hepatitis В virus DNA into the
peripheral vein of ducklings J. Hepatol. 24 328-334.
Takahashi. H, Yanagi, Y, Tamaki, Y, Muranaka. K., U sui, T &
Sara, M (2004). Contribution of bone-morrow-derived cells
to choroidal neovascularization. Btothem. Btophys. Res Com-
mim3M 372-375
Takahashi. K. & Okada. T. S (1970) Analysis of the effect ol
«conditioned medium» upon the cell culture at low density
Dev Growth Differ. 12 65-77
Takahashi. K., Mitsui. K. & Yamanaka. S. (2003) Role of Eras
in promoting tumour-like properties stem cells Nature 423
541-545.
Takahashi. K.. Suzuki, K., Kawahara, S & Ono, T (1991). Effects
of lastogenic hormones on morphological development and
growth of human breast epithelial cells cultivated m collagen
gels Jpn.J Cancer Res 82 553.
Takeda, К , Minowada. J & Bloch, A (1982). Kinetics of appear-
ance of differentiation-associated characteristics in MH, a line
of human mycloblastic leukaemia celts, after treatment with
TRA, DMSO, or Ara-C Cancer Res 62 5152-5158.
Tarclla. C.. Ferrero, D.. Gallo, E.. Luyca Pagliardi, G & Rus-
cctti, F. W. (1982) Induction of HL-60 cells by dimcthyl-
sylphoxidc- Evidence for a stochastic model not linked to the
cell division cycle. Cancer Res 42:445-449
Tashjian, A H.. Yasamura, Y., Levine, L.. Sato, G. H & Parker, M
(1968) Establishment of clonal strains of rat pituitary tumorcells
that secrete growth hormone Endocrinology 82 342-352.
Taub. M (1984). Growth of primary and established kidney cell
cultures in serum-free media. In Barnes. D. W.. Strbasku, D A
Sato. G H.. eds.. Methods fur Serum-Free Culture of Epithelia!
andFibroblastic Cells, New York. Alan R. Liss, pp. 3-24.
Taub, M. L.. Yang, S. I. & Wang, Y . (1989). Primary rabbit proxi-
mal tubule cell cultures maintain differentiated functions
when cultured in a hormonally defined scrum-free medium
In Vitto cell Dev Biol 25.770-775.
Taylor. D A (2001). Cellular cardiomyoplasty with autologous
skeletal myoblasts for ischemic heart disease and heart failure
Curr. Control. Trials Cardiovase. Med. 2:208-210
Taylor. J H (1958) Sister chromatid exchanges m tritium labeled
chromosomes. Genetics 43 515-529.
Taylor-Papadimitriou, J, Purkiss, P. & Fentiman, I S (1980)
Cholcratoxm and analogues of cyclic AMP stimulate the
growth of cultured human epithelial cells. J Cell Physio!
102:317-322.
Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M & Stoker. M.G P (1977)
Growth requirement of human mammary epithelial cells in
culture Int.J Cancer20.903-908.
Taylor-Papadimttriou. J, Stainpter. M . Bartck. J, Lewis, A,
Boshcll, V, Lane, E В & Leigh, I. M (1998) Keratin ex-
pression in human mammary epithelial cell cultured from
normal and malignant tissue, relation to in vivo phenotypes
and influence of medium./ Cell Set. 94.403-413.
Tedder, R. S., Zuskerman, A. M., Goldstonc. A. N, Hawkins, A. E,
Fielding. A , Briggs, E M., Irwin, DC, Hcptonstali, J &
Brink, N S. (1995). Hepatitis В transmission from contami-
nated cryoprescrvatton tank Lancet 346 137-140
Temin. H. M (1966) Studies on carcinogenesis by avian sarcoma
viruses. Illi The diflerential effect of scrum and polyanicms
on multiplication of uninfected and converted cells. J. Natl.
Cancer Inst 37. 167-175.
Tcofili, L. Rutelh. S.. Picrclli, L„ Ortu La Barbera, E..di Mario, A.,
Mcmchclla. G., Rumi, C. & Leone, G (1996) Separation
of chemotherapy plus G-CSF-mobihzcd peripheral blood
mononuclear cells by counterflow centrifugal elutriation In
vitro characterization of twu different CD34 cell populations.
Bone Marrow Transplant. 18 421-425
Terasakt, T. Kaincya, T. Nakajima. T., Tsumuraya, M., Shnno-
sato, Y, kato, K.. Ichinosc. H, Nagatsu, T & Hasegawa, t.
(1984). Intcrconvcrsion of biological characteristics of stall
cell lung cancer cells depending on the culture conditions.
Gann 75.1689-1699
Testa, N G & Mohncux, G (eds). (1993) Haemopoiesis. Oxs-
ford. U.K, Oxsford Univcrssity Press
Thacker, J, Webb, M В & Dcbcnham. P G. (1988). Finger-
printing cell lines. Use of human by per variable DNA probes
to characterise mammalian ceil cultures. Somat. Cell Mol.
Genet 14.519-525.
Thclwall. P E., Neves. A A. & Brindle, К M. (2001). Measure-
ment of biorcactor perfusion using dynamic contrast agent-
enhanced magnetic resonance imaging. Biotechno! Bioenp.
75 682-690
Thomas. D G T., Darling, J. L, Paul. E A., Mott. T. C.,
Cod Ice, J. N., Tobias, J S., Capra, L. G., Collins. C. D.,
Mooney, C„ Bozek. T-, Finn, G. P., Arigbabu, S. О, Bul-
lard, D E, Shan-non. N. & Freshney. R. I. (1985) Assay of
anti-cancer drugs in tissue culture. Relationship of relapse free
interval (FRI) and in vitro chcmosensitivity in patients with
malignant cerebral glioma. Br. J. Cancer 51.525-532.
Thomas, S. Gray, E & Robinson. C J (1997). Response of HU
VEC and EAhy926 and fibroblast growth factors. In Vitro
Cell Dev Bio! Anim. 33 492 494
Thompson, E. B., Tomkins,J. M. & Curran, J. F. (1966) Induction
of tyrosine a-kctoglutarate transaminase by steroid hormones
in a newly established tissue cu Iturc cell hne. Proc. Natl. Acad.
Set. USA 56.296-303.
Thompson, L. H. & Baker, R M (1973) Isolation of mutants of
cultured mammalian cells In Prescott. D. (cd ), Methods in cell
biology. Vol 6. New York, Academic Press, pp. 209-281
Thomson, A. A.. Foster, ВАЛ Cunha, G. R (1997). Analysis
of growth factor and receptor mRNA levels during develop-
ment of the rat seminal vesicle and prostate Development
124 2431-2439.
Thomson, A W (cd) (1991) Cytokine handbook London.
Academic Press.
Thomson. J. A., Itskovitz-Eldor, J.. Shapiro. S. S, Waknitz. M. A. &
Swiergicl.J J (1998) Embryonic stem cell hues derived from
human blastocysts. St tence 282 1145-1147
Thorsell,A.Blomqvist,A G &Hcilig.M (1996) CationicBpid-
mediated delivery and expression of prcpro-ncuro-peptidc Y
Список литературы
683
cDNA after intra ventricular administration tn rat: Feasibility
and limitions. Regul Peptiefes 61.205-211.
Till. J. E & McCulloch, E. A (1961). A direct measurement of
the radiation sensitivity of normal mouse hone marrow cells
Radiat.Res 14.213-222.
Tobey, R A.. Anderson, E C & Peterson, D F (1967). Effect of
thymidine on duration of G1 in Chinese hamster cells.J. Cell.
Bio! 35.53-67
Todaro, G. J. & DcLarco, I. E (1978) Growth factors pro-
duced by sarcoma virus-transformed cells. Cancer Res. 38
4147 4154
Todaro, G J. & Green, H. (1963) Quantitative studies of the
growth of mouse embryo cells in culture and their develop
ment into established lines. J Cell Biol. 17 299-313.
Tomaktdi, P, Fusenig, N. E., Kohl. A. & Komposch. G (1997)
Histomorphological and biochemical differentiation capacity
organotypic co-culturesof primary gingival cells./. Periodont
Res. 32 388-400
Toneguzzo, F.. Keating. A, Glynn, 5 & McDonald, K. (198b)
Electrical field mediated gene transfer Characterization of
DNA transfer and patterns of integration in lymphoid cells
Nucleic Acids Res 16 5515-5532.
Toplcy. P., Jenkins. D. C., Jessup, E A & Stables. J. N. (1993).
Effect of reconstituted basement membrane components on
the growth of a panel of human tumour cell lines in nude mice
Br. J Cancer 67.953-958
Torday.J. S & Kourembanas, S. (1990) Fetal rat lung fibroblasts
produce aTGF-p homologue that blocks type II cell matura-
tion. Dev. Bio! 13 35 11
Totoiu, M. O.. Nistor, G I.. Lane. T E. & Kcirstcad, H. S. (2004)
Remyebnatton, axonal sparing, and locomotor recovery follow-
ing transplantation of glial-committed progenitor cells into the
MHV model of multiple sclerosis Eip Neurol 187:254-265
Tozer, В T & Pirt, S J (1964). Suspension culture of mammalian
cells and macromolecular growth promoting fractions of calf
scrum. Nature 201 375-378
Tragatuis, F., Darzynkicwicz, Sharpless, T & Melamed, M R
(1977) Nucleic acid contentand cell cycle distribution of five
human bladder cell lines analyzed by flow cytofluoromctry.
Int.J Cancer 26.30-36.
Trapp, B. D, Honegger, P. Richclsnn, E & Webster, H. de F
(1981) Moqihologtcal differentiation of mechanically dis-
sociated fetal rat brain m aggregating cell cultures Brain
Res. 160 235-252
Trickett, A E., Ford. D J.. Lam-PoTang, P R. L. & Vowels, M R.
(1990) Comparison of magnetic particles for tmmunomag-
nctic bone marrow purging using an acute lymphoblastic
leukaemia model. Transpl. Proc 22.2177-2178
Tnglia, D.. Braa, S. S.. Yonan, C & Naughton, G. K. (1991). Cyto-
toxicity testing using neutral red and MTT assays on a three-
dimensional human skin substrate. Tone In Vitro 5.573-578
Trotter, J & Schachner, M (1988). Cells positive for the 04 sur
face antigen isolated by cell sorting are able to differentiate
into oligodendrocytes and type-2 astrocytes Dev. Brain Res.
46 115 122
Tro we 11. О A (1959). The culture of mature organs tn a synthetic
medium. Exp. Cell Res. 16 118-147
Troyer, D. A & Kreisberg, J- I. (1990). Isolation and study' of
glomerular cells Methods Enzymo! 191 141-152
Tsao, M. C., Walthall, В. I & Ham, R. G. (1982). Clonal growth of
normal human epidermal kcratmocytcs in a defined medium
J. Ceil Physiol 110 219-229
Tsao. S.-W, Mok, S. C., Fey, E G, Fletcher,J. A, Wan, T. S K.,
Chew. E.-C.. Muto, M G, Knapp, R. G. & Berkowitz. R. S
(1995) Characterisation of human ovarian -.urfacc epithe-
lial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes
(HPV-E6E7ORFs).£.r/> Cell. Res 218 499-507.
Tsuruo, T., Hamilton, T. C . Louis, K. G, Behrens, В. C,
Young. R C & Ozols. R. F. (1986) Collateral susceptibil-
ity of adnamyctn-, and mclphalan-. and cisplatin-resistant
human ovarian tumor cells to bleomycin.Jpn.J Cancer Rea
77.941-945.
Tumilowicz,J. J , Nichols, W W., Cholon, J.J. & Greene, A E
(1970) Definition of a continuous human cell line derived
from neuroblastoma. Cancer Res 30 2110-2118,
Turner, R. W A.. Simmovitch, L, McCulloch, E A. & Till, J J
(1967) Density gradient centrifugation of hemopoietic col-
ony-forming cells./ Cell. Physiol 69.73-81
Tuszynski, M. H , Roberts, J, Senut, M C., U, H. S & Gage, F. H
(1996) Gene therapy in the adult primate brain Intraparcn-
chymal grafts of cells genetically modified to produce nerve
growth factor prevent cholinergic nteuronal degeneration.
Gene Therapy 3 365-314
Tveir, K. M. & Pihl. A (1981). Do cells lines in nitro reflect
the properties of the tumours of origin? A study' of lines
derived from human melanoma xenografts Br. J. Cancer 44
775-786
Twenty man P R (1980) Response to chemotherapy of
EMT6 spheroids as measured by growth delay and cell sur-
vival Eur.J Cancer42:297-304.
U.S Departament of Health and Human Services (1993) Bio-
safety tn microbiological and biomedical laboratories, 3d cd
Publication (CDC) 93-8395, Centers for Disease Control
US Govt. Printing Office, Washington. DC
U S. Nuclear Regulatory Commission (1997). Draft regulatory
guide DG-0006. Guide for the preparation of applications
for commercial nuclear pharmacy Licenses Office of Nuclear
Regulatory Research, U S. Nuclear Regulatory Commission,
Washington. DC 20555
Uchida,! A.& Lin.C.C.(1974) Quinacrinc fluorescent patterns
In Yunis,J (cd ) Humanchromosome methodologi/,2d.cd.Nev>
York, Academic Press, pp 47-58
United States Pharmacopeia (1985) Sterility tests, 21st re-
vision. United States Pharmacopetai Convention. Inc.,
pp 1156-1160.
Unkless, I_ Dano. K., Kellerman, G. & Retch, E. (1974). Fibri-
nolysis associated with oncogenic transformation Partial
purification and characterization ofccll factor, a plasminogen
activator./ Bio! Chem. 249.4295-4305
Uphoff,C.C. & Drexler. H. G (2002) Comparative PCRanalysts
for detection of mycoplasma infections in eonttonuous cell
lines In Vitro Cell Dev Biol. Animal 38r 79-85.
Uphoff C.C. & Drexler, H G (2004) Elimination of Mycoplasma
from infected cell lines antibiotics Methods Mo! Med 88
327-334
Urc,J M.,Ficrtng.S & Smith, A G. (1992). A rapid and efficient
method for freezing and rcco venng clones of embryonic stem
cells Trends Genet 8.6
684
Список литературы
L'zgarc, A. R, Xu, Y. & Isaacs, J T. (2004) In vitro culturing and
characteristics of transit amplifying epithelial cells from hu-
man prostate tissue./ Cell. Biochem. 91 196-205.
Uzgarc, A. R.. Xu, Y. & Isaacs. J. T. (2004). In vitro culturing
and characteristics of transit amplifying epithelial cells from
human prostate tissue J Cell Biochem. 91 196-205.
Vachon. PH, Perreault. N. Magny. P & Beallicu, J.-F. (1996)
Uncoordinated transient mosaic patterns of intestinal hydro-
lase expression in differentiating human cntcrocytcs J Cell
Physiol. 166.198-207.
Vago, C. (cd) (1971) Invertebrate tissue culture. Vol. 1. Neu-
York. Academic Press.
V-jgn, C. (cd). (1972). Inzertebrate tissue culture. Vol 2 New York
Academic Press.
Vaheri, A, Ruoslanti. F., Wcstcrmark, B. & Pontdn.J (1976)
A common cell-type specific surface antigen in cultured hu-
man glial cells and fibroblasts; Loss in malignant cells./. Exp
AfeJ. 143.64-72.
van Bokhoven. A, Varclla-Garcia, M . Korch, C & Miller. G. J
(2001a) TSU-Prl and JCA-lcell arc derivatives of T24 blad-
der carcinoma cells and are not of prostatic origin Cancer
Res. 61.6340-6344
van Bokhoven, A.. Varclla-Garcia, M.. Korch, C.. Hesscls, D. &
Miller. G J (2001b) Widely used prostate carcinoma cell
lines share common origins Prostate 47 36-51.
Van Diggelcn, О, Shin, S. & Phillips. D (1977) Reduction
in cellular tumorigenicity after mycoplasma infection and
elimination of mycoplasma from infected cultures by passage
in nude mice. Cancer Res. 37 2680-2687.
Van Heldcn, P D., Wild, I J . Albrecht, C. F., Theron, E.,
Thornley. A L. & Hoal-van Heldcn, E G. (1988). Cross-
contamination of human esophageal squamous carcinoma
cell lines detected by DNA fingerprint analysis. Cancer. Res
48 5660-5662.
Vanparys. P (2002). ECVAM and pharmaceuticals. Aitem Lab
Anim , 30 Suppl 2.221-3.
Van Roozcndahl, С, E. P, van Ooijcn, В Klijn, J G M.
Claasen, C„ Eggcnnont, A. M. M , Hcnzcn-Logmans, S C &
Foekcns, J. A. (1992) Stromal influcnees on breast cancer cell
growth Br J. Cancer65.77-81
Varga Wctsz. P D & Barnes. D W.(1993) Characterization ol
human plasma growth inhibitory activity on scrumfrcc mouse
embryo cells. In Vitro Cell Dev. Btol 29A 512-516
Varon, S. & Manthorpe. M. (1980) Separation of neurons and
glial cells by affinity methods In Fedoroff, S & Hertz, L
(cds.). Advances tn cellular neurobiology. Vol 1. New York,
Academic Press, pp. 405-442
Vaughan. A. & Milner, A. (1989) Fluorescence activated cell
sorting In Catty, D (cd.). Antibodies, Volume II A practical
approach. Oxford, U.K, IRL Press at Oxford University
Press, pp 201-222
Vaziri. H & Benchiinol, S (1998) Reconstitution of telomer-
ase activity in normal human cells leads to elongation of
telomeres and extended replicative life-span. Curr. Biology
8 279-282
Vclcich, A., Palumbo, L.. Jarry, A., Laboisse, C , Racevskis, J &
Augcnhcht, L (1995) Patterns of expression of hncage-spccif-
ic markers during the tn t'itro-induccd differentiation of HT29
colon carcinoma cells. Cell Growth Dif fer. 6 749-757,
Vcnitt, S. (1984). Mutagenicity testing, a practical approach.
Oxford. U.K., IRL Press
Venkatasubramanian, J, Sahl. J., Rao, M C (2000) Ion transport
during growth and differentiation. Лии NY Acad Sci. 2000,
915 357-72
Verbruggen, G, Veys, E. M , Wtcine, N.. Malfait, A M.. Gijsel-
brecht, L, Nimmcgccrs. J. Almquist, К F & Broddclez. C.
(1990) The synthesis and immobtlizatmti nf cartilage-specific
proteoglycan by human chondrocytes in different concentra-
tions of agarose. Clin Exp. Rheumatol 8.371 378.
Vcrschracgcn. C F., Hu. W., Du, Y. Mendoza. J., Early, J.,
Deavers, M., Freedman. R. S, Bast, R S.. Jr. Kudclka, A P,
Kavanagh. J J. & Giovanclla, В. C (2003) Establishment
and cliaractenzation of cancer cell cultures and xenografts
derived from primary or metastatic Mullcrtan cancers. Chn.
Cancer Res 9.845-852
Vcscovi. A, Gntti, A.. Cossu. G. & Galli. R. (2002) Neural stem
cells: plasticity and their transdiffcrcntiation potential Cells
Tissues Organs 171 64 76.
Vicrick. J L., McNamara, P & Dodson, M. V. (1996) Prolifera-
tion and differentiation of progeny of ovine unilocular fat
cells (adipofibroblasts) In Vitro Cell Dev. Btol Antm 32.
564-572.
Vilauutjana-Amedce, J , Bareile. R, Rouais. F., Caplan, A. I &
Harmand, M. F (1993) Human bone marrow stroma) cells
express an osteoblastic phenotype in culture. In Vitro Cell
Dev Biol. 29A. 699-707
VisserJ.W & De Vries. P (1990). Idcntilicatfon and purifica-
tion of murine liematopoietic stem cells by How cytometry.
Methods Cel! Biol 33.451-468.
Vistica. D. T., Skclian. P., Scudicro, D., Monks, A. Pittman. A &
Boyd, M R. (1991) Tctrazohum-hascd assays for cellular
viability: A critical examination оГ selected parameters
fonnazan production Cancer Res 51-2515-2520.
Vlodavsky. I, Lui, G M & Gospodarowicz. D (1980) Morpho-
logical appearance, growth behavior and migratory activity of
human tumor ceils maintained on extracellular matrix versus
plastic Cell i9 607-617
Vogel. F. R. & Powell. M F. (1995) A compendium of vaccine
adjuvants and excipients In Powell, M F. & Newuian. M.
(cds.). Vaccine destgh The subuntt and adjuvant approach.
New York. Plenum Publishing, pp. 141-228
von Bncscn, H, Andrccscn, R_, Esser. R, Brugger, W.. Mctchsncr,
C, Becker. К & Rubsantcn-Waigmann, H. (1990). Infection
of monocytes macropliages by HIV tn vitro Res Virol 141
225-231
Von dcr Mark, K. (1986) Differentiation, modulation and dcdif-
fcrcntiat ton of chondrocytes. Rheumatology 10. 272-31 5
Vondracek, M.. Weaver, D. Sarang. Z.. Hcdbcrg, J J, Willey,J,
Warngard, L. and Grafstroin, R. C (2002) Transcript pro-
filing of enzymes involved tn detoxification of xenobiotics
and reactive oxygen in human normal and Simian virus 40 T
antigen-immortalized oral kcratinocytcs. Int. J. Cancer 99
776-782.
Voncn, B., Berthcusscn, К. Giaevcr. A. К. Florhohnen, J. &
Burhol, P. G. (1992) Effect of a new synthetic serum replace-
ment on insulin and somatostatin secretion from isolated rat
pancreatic islets in long term culture /. Tissue Cult Methods
14 45-50
Список литературы
685
Von Hoff. D D.. Clark. G. M., Weis, G. R., Marshall, M. H.,
Buchok.J В, Knight. W. A. & Lcmaistrc. C. F (1986) Use
of № vitro dose response effects to select antmeoplastics for
high dose or regional administration regimens J. Cin. Oncol.
4 18-27.
Vourct-Cravian, V., Boulter, E., Grail, D, Matthews, C. & Van
Оbberghen-Schilling, E (2004) ILK is required for the as-
sembly of matrix-forming adhesions and capillary morphogen-
esis m endothelial cells J. Ceil Sci 117 4559-4569
Voyta,J. C, Via. D. P, Butterfield, C. W. & Zettcr, В R. (1984).
Identification and isolation of endothelial cells based on thetr
increased uptake of acctylated-low density lipoprotein./ Cell
Biol 99.2034 2040
Vries, J. C, Benthem, M. & Rumkc, P (1973) Separation of vi-
able from nonviable tumor cells by flotation on a Ficoll-triosil
mixture Transplation 5.409-410
Vunjak-Novakovic, G (2005). Basic principles of tissue engineer-
ing. In Vunjak-Novakovic, G. & Freshney, R. I. (eds ), Culture
of cells fortissue engineering. Hoboken, NJ, Wiley-Liss (in
press).
Vunjak-Novakovic, G. & Freshney. R I. (eds.) (2005). Culture
of ceils fortissue engineering. Hoboken, NJ, Wiley-Liss (in
Wada, T, Dacy, К M., Guan, X.-P & Ip, M M (1994). Phorbnl
12-mynstatc 13 acetate stimulates proliferation and ductal
morphogenesis and inhibits functional differentiation of
normal rat mam тагу epithelial cells m primary culture./ Cell
Physiol 158 97 109.
Waleh, N. S.. Brody, M. D, Knapp. M A., Mendonca, H L..
Lord. E M., Koch, C. J, Ladcroutc, К R & Sutherland.
R M (1995). Mapping of the vascular endothelial grow th
factor-producing hypoxic cells in multicellular tumour
spheroids using a hypoxia-specific marker. Cancer Res. 55.
6222-6226.
Walston, J., Silver, К, Bogardis, C.. Knowlcr, w. C , Cell. F S..
Austin, S., Manning, B.. Strosberg, A. D., Stern, M. P., Ra-
ben, N, Sotkin. J. D, Roth. J. & Shuldincr. A. R. (1995)
Time of onset of non-insulin-dependent diabetes mclhtus and
genetic variation m the beta 3-adrcncrgjc-rcccptorgcne Engl.
J. Med. 333 343-347
Walter, H. (1975). Partition of cells in two-polymcr aqueous
phases: A method for separating cells and for obtaining
information on thetr surface properties. In Prescott, D M
(cd.). Methods in cells biology. New York. Academic Press,
pp 25-50
Walter, H. (1977). Partition of cells in two-polymcr aqueous
phases.- A surface affinity method for cell separation. In
Catsimpoolas. N. (cd.). Methods of cell separation New York.
Plenum Press, pp. 307-354.
Wang.J.. Torbenson, M., Wang, Q.. Ro,J. Y. & Bccich. M (2003).
Expression of inducible nitric oxide synthase in paired neo-
plastic and non-neoplastic primary prostate cell cultures and
prostatektomy specimen Urol Oncol 21 117-122
Wang, R J & Nixon, В R. (1978). Identification of hydrogen
peroxide as a photoproduct toxic to human cells in tissue-
culture medium irradiated with "daylight” fluorescent light.
In vitro 14.715-22
Wang, H. C. & Fedoroff, S. (1972) Banding in human chromo-
somes treated with trypsin Nat Nine Btol 235..52-53.
Wang, H. C. & Fedoroff, S (1973) Karyology of cells in culture
Trypsin techique to reveal G-bands, In Kruse, P. F & Pat-
terson, M J. (eds.). Tissue culture methods and applications
New York, Academic Press pp 782-787
Ward. J P. & King, J. R- (1997). Mathematical modelling of avas-
cular tumour growth. IM A J Math App Bio! 14 39-69.
Watanade. T.. Kondo, К & Oishi, M. (1991). Induction of tn vitro
differentiation of mouse erythroleukemia cells by gciustctn, an
inhibitor of tyrosine kinases. Cancer Res. 51 764-768
Watt. F. M (2001). Stem cell fate and patterning in mammalian
epidermis Curr Opin Genet Dev 11 410-417
Watt. F. M (2002) The stem cell compartment in human intcr-
follicular epidermis./ Dermatol Sci 28 173-180.
Wart. F (1991) Annual Meeting of European Tissue Culture
Society. Krakow, Poland
Watt, J L. & Stephen, G. S. (1986). Lymphocyte culture for
chromosome analysis In Rooney. D E & Czcpulkows-
ki. В. H (eds.). Human cytogenetics, a practical approach
Oxford, U.K.. IRL Press at Oxford University Press,
pp. 39-56.
Waymonth, C. (1959). Rapid proliferation of sublincs of NCTC
clone929 (Strain L) mouse cells in simple chemically defined
medium (MB752 1)./ Natl Cancer Inst. 22 1003.
Waymonth. C. (1970). Osmolaty of niaiiniialian blond and of
media for culture of mammalian cells. In Vitro 6.109 127.
Waymonth, C (1974) To disaggregate or not to disaggregate
Injury and cell disaggregation, transient or permanent? In
Vitro 10 97-111
Waymonth, C. (1979). Autoclavahlc medium AM 77B /. Cell
Physiol. 100:548-550,
Waymonth, C. (1984). Preparation and use of serum-free cul-
ture media. In Barnes, W. D, Sirbasku. D. A & Sato. G H
(eds.). Cell culture methods for molekular and cell biology.
Vol 1. Methods for preparation of media, supplements, and
substrata for serum-free animal cell culture New York, Alan
R. I. iss, pp 23-68
Wcibel. E. R & Paladc, G. E (1964). New cytoplasmic compo-
nents in arterial cndothclia./ CellBtol 23.101-102.
Wcichsclbaum. R. Epstein, I & Little. J. В (1976). A technique
for developing established cell lines from human iistensarco-
mas. In Vitro 12:833-836
Weinberg, R. A. (cd ) (1989) Oncogenes and the molecular ori-
gins of cancer. Cold Spring Harbor. NY, Cold Spring Harbor
Laboratory Press
Weiss, M C & Green, H (1967) Human-mouse hybrid cell
lines containing partial complements of human chromosomes
and functioning human genes. Proc. Natl Acod. Set. USA 58
1104-1111.
WclLs, D. L.. Lipper, S. L.. Hilliard, J. К, Stewart, J A, Hol-
mes, G. P.. Herrmann, K. L., Kiley, M. P. & Schonbergcr, L В
(1989) Herpesvirus stmtae contamination of primary rhesus
monkey kidney cell cultures* CDL recommendations to mini-
mize risks to laboratory personnel Diang Microbiol Infect
Dis 12.333-335.
Wclm. B. Bchbod. F.. Goodell, M A. & Risen, J. M. (2003)
Isolation and characterization of functional uiannuary gland
stem cells. CellProhf. 36 (si) 17-32
Wcssells. N. K. (1977). Tissue interactions and development Menlo
Park. CA, W.A Benjamin.
686
Список литературы
Wessels, D., Titus, M. & Sell, D R (1996) A Dtccytistelium
myosin I plays a crucial role in regulating the frequency ol
pseudopods formed on the substratum. Ceil Moul Cytoskel-
eton 33.64-79
Westerfield, M (1993). The zebrafish book. A guide f or the
laboratory use of zebrafish (Biachydanio reto). Eugene, OR,
University of Oregon Press.
Wcstennark.B (1974) The deficient density-dependent growth
control of human malignant glioma cells and virus-trans-
formed gltalikc cells in culture. Int J Cancer 12 438-451
Wustermark, B. (1978) Growth control in miniclones of human
glial cells. Exp Celt. Res 111.295-299.
Westermark, B., Ponten, J & Hugosson, R. (1973) Determi-
nants for the establishment of permanent tissue culture lines
from human gliomas Acta Pathol. Microbiol. Scand. A 81
791-805
Westermark, В, Wasteson, A. (1975). The response of cultured
human normal glial cells to growth factors. Adv Metab Disord,
8 85-100.
Westneat, D. F, Noon, W. A., Reeve, H. К & Aquadro, C. F
(1988). Improved hybridisation conditions for DNA finger-
prints probed with M13. Nucleic Acids Res. 16.4161
Wewetzrer. К. Verdu, F, Angelov, D. N. & Navarro, X (2002)
Olfactory unsheathing glia and Schwann cells two of a kind?
Cell Tissue Res 309 337-345.
Whitehead, R H (2004) Establishment of cell lines from colon
carcinoma. In Pfragner, R. & Freshney. R. I. (cds ), Culture of
human tumor cells. Hoboken, NJ. Wiley-Liss, pp 67- 80.
Whitlock, C. A, Robertson, D & Witte, O. N (1981) Murine В
cell lymphopoiesis in long term culture./. Immunol Methods
67 353-369.
Whur,P.,Magudia M .Boston ! .Lockwood,J & Williams D C
(1980). Plasm ninogen activator in cultured Lewis lung car-
cinoma cells measured by chromogenic substrate assay Br
J Cancer 42.305-312.
Wienberg, J. & Stanyon, R. (1997) Comparative painting
of mammalian chromosomes. Curr. Opm Genet Dev 7
784 791
Wiktor, A. & Van Dyke, D. L (2004) Combined cytogenetic
testing and fluorescence m situ hybridization analysis in the
study of chronic lymphocycic leukemia and multiple my-
eloma. Cancer Genet. Cytogenet 153 73 76
Wiktor, T. J , Fernandes, M. V'., Koprowski, H. (1964). Cultiva-
tion of Rabies Virus in Human Diplotd Cell Strain WI-38
J Immunol. 93 353-66
Wilkcnheiscr, К A., Vorbroker, D. К, Rice, W. R., Clark, J. C ,
Bachurski, C. J, Oic, H K. & Whitscrtt.J E (1991). Pro-
duction of immortalized distal respiratory epithelial cell
lines from surfactant protein C/stmian virus 40 large tumor
antigen trans-gcnic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90
11029-11033.
Wilkins, L Gilchrest, B. A, Szabo, G., Weinstein, R. & Maciag, T
(1985). The stimulation of normal human melanocyte pro-
liferation tn vitro by melanocyte growth factor from bovine
brain J. Cell Physio! 122 350
Willey, J C , Moser, С. E, Jr, Lechner, J. F. & Harris, С . C
(1984) Differential effects of 12-O-tetradecanoylphorbol-
13-acctatc on cultured normal and neoplastic human bron-
chial epithelia! cells. Cancer Res. 44:5124-5126
Williams, M J & Clark, P (2003). Microscopic analysis of the
cellular events during scatter factor/hepatocyte growth
factor-induced epithelial tubulogcncsis J. Anal 203
483-503
Williams, В. P., Abney. E. R & Raff, M C (1985) Macroglia!
cell development in cmbnonic rat brain: Studies using mono-
clonal antibodies, fluorescence-activated cell sorting and cell
culture Dev Biol. 112 126-134.
Williams, G M. &Cunn,J M (1974). Long-term cell culture of
adult rat liver epithelial cells. Exp. Cell Res 89.139-142
Willmarth, N E , Albertson, D G & Ethier, S. P (2004).
Chromosomal instability and lack of cychn E regulation in
hCdc4 mutant human breast cancer cells. Breast Cancer Res.
6 R531-R539.
Wilson, A. P, Dent, M., Pcjovic, T, Hubbold, L. & Rodford, H.
(1996) Characterisation of seven human ovarian tumour cell
lines.BrJ Cancer7^722-727.
Wilson. A. P (2004). The development of human ovarian epithe-
lial tumor cell lines from solid tumors and ascites. In Culture of
human tumor cells, Ed Pfragner, R., Freshney, R I., Hoboken,
NJ, Wiley-Liss, pp 145-178
Wilson, P. D, Dillingham, M. A., Breckon, R. & Anderson, R J.
(1985). Defined human renal tubular epithelia in culture-
Growth, characterization, and hormonal response. Am.
J PhyctoL 248. F436-F443.
Wilson, P. D, Schricr, R. W., Breckon, R. D & Gabnw, P. A.
(1986) A new method for studying human polycystic kidney
disease epithelia tn culture. Kidney Int 30 371 378
Wise, C . (2002) Epithelial cell culture protocols Clifton, NJ,
Humana Press
Wistuba, I I.. Bryant, D, Behrens, C , Milchgrub, S, Vir-
mani. A. К . Ashfaq, R. Minna, J D. & Gazdar A F. (1999).
Comparison of features of human lung cancer cell lines and
their corresponding tumors Clin. Cancer Res. 5 991 1000.
Witkowski, J A. (1990). The inherited character of cancer-an
historical survey. Cuncer2.229-257
Wolf, D P, Meng, L., Ely, J. J & Stouffer, R L. (1998) Recent
progress in mammalian cloning. J. Assist Reprod Cancer. 15
235-239.
Wolf, E. T & Haffen, К (1952) Sue unc methode de culture
d’organecs cmbryonnaircs tn vitro Tex. Rep Bio! Med 10
463-472.
Wolswijk, G & Noble, M. (1989). Identification of an adult-spe-
cific ghal progenitor eel) Development 105.387-400.
Wootton, M , Stcegbs, K., Watt, D, Munro,J, Gordon, K., Ire-
land, H, Morrison, V'., Behan. W. & Parkinson, E К (2003).
Telomerase alone extends the replicative lifespan of human
skeletal muscle cells without compromismggcnnmic stability.
Hum. Gene Therapy 14:1473-1487
Work with Ionising Radiation. Ionising Radiation Regulations
(1999). Approved Code of Practice and Guidance, L121, HSE
Books, ISBNO 7176 1746 7
Wright, К A., Nadirc, KB, Busto, P, Tubo, R., McPher-
son, J. M. & Wentworth, В. M. (1998) Alternative delivery
of keratinoeytes using a polyurethane membrane and the
naph- cations for its use in the treatment of full-thickness
burn injury Bums 24 7 17.
Wu,D К &dcVellis,J (1987) The expression of the intermedi-
ate filament-associated protein (NAPA-73) is associated with
Список литературы
687
the stage of terminal differentiation of ehick brain neurons
Brain Res. 421.186-93
Wu, H., Friedman, W. J. & Dreyfus. C. F. (20114) Differential
regulation of ncurotrophm expression in basal forebrain as-
trocytes by neuronal signals J. Neutusci Res. 76 76-85.
Wu, R. (2004) Growth of human lung tumor cells in culture.
Culture of human tumor cells. Ed. Pfragncr, R .Freshnev, R. L,
Hoboken, NJ, Wiley-Liss, pp. 1-21
Wu, Y. J.. Parker. L M , Binder, N. E, Beckett, M A, Sinard,J
H., Griffiths. C.T.& Rhemwald. J G (1982). The mesothelial
keratins: A new family of cytoskcletal proteins identified in
cultured mesothelial cells and nonkcratintzingepithelia. Cell
31 693-703
Wuann, L, Verity. M A & Sidell, N. (1991). Effects of in-
terfcron-gamma and its interaction with retinoic acid on
human neuroblastoma differentiation. Int J. Cancer 48
136-141
Wurmscr, A E . Nakashima, К, Summers, R C., Toni. N,
D’amour, К A, Lie, С. C. & Gage, F H (2004). Cell fu-
sion-independent differentiation of neural stem cells to the
endothelial lineage. Nature 430.350-356
Wurster-Hill, D., Cannizzaro, L A.. Pcttengill, О S, Sorenson,
G. D. Cate. С. C. & Maurer, L. H (1984) Cyrogcnctics of
small cell carcinoma of the lung. Cancer Genet. Cytogenet.
13 303-330
Wyllie, F S, Bond, J. A., Dawson. T. White, D.. Davies, R. &
Wynford-Thomas. D (1992) A phenotypically and karyo-
typtcally stable human thyroid epithelial line condition-
ally immortalized by SV40 large T antigen Cancer Res 52
2938-2945.
Wysocki. L. J. & Sata, V L (1978). «Panning» for lymphocytes
A method for cell selection Proc. Natl. Assad. Set. USA 75
2844-2848
Yaffc, D. (1968). Retention of differentiation potentialities dur-
ing prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl A ssad
Sci USA 61 477-483.
Yamada, К M. & Geiger, B. (1997) Molecular interactions in cell
adhesion complexes. Curr. Optn Cell Btol. 9 76-85
Yamada, T, Placzek, M . Tanaka H., Dodd, J AJcssell. T M
(1991). Control of cell pattern in the developing nervous
system: Polarizing activity of the floor plate and notochord
Cell6i 635-647
Yamadagucht. N-, Yamamura, Y , Koyama К , Ohtsuji, E.,
Imantshi, J. & Ashthara, T (1990). Characterization of new
pancreatic cancer cell lines which propagate tn a protein-free
chemically defined medium. Cancer Res. 50 7008-7014
Yan. G., Fukabort, Y-. Nikolaropoulost, S, Wang. F. & McKcc-
han W. L (1992). Heparin binding keratinocyte growth
factor is a candidate stromal to cptthchalccll ahdromedin.
Mol. Endocrinol 6.2123-2128.
Yanai, N, Suzuki, M & Obtnata, M. (1991) Hepatocyte cell
lines established from transgenic mice harboring tempera-
ture-sensitive simtan virus 40 large T-antigen gene. Exp. Cell
Res. 197 50-56
Yang, J . Mani. S A. Donahcr. J L., Ramaswamy, S., Itzyk-
son, R. A, Come, C, Savagner. P., Gitclman. I. Richard-
son, A & Weinberg, R A. (2004). Twist a master regulator
of morphogenesis plays an essential role m tumor metastasis.
Cell ii7 927-39
Yasamura, Y. Tashjian, A. H & Sato. G (1966) Establishment
of four functional clonal strains of animal cells in culture.
Science 154 1186-1189.
Yeager T. R.. DeVries, S.. Farrard, D. F, Kao, C .Nakada, S.Y.,
Monn, T. D., Bruskcwits, R. Stadler. W M , Meisner, L. F.,
Gilchrest, K. W, Newyton, M. A, Waldman, F M. & Rezni-
koff, C. A. (1998) Overcoming cellular senescence in human
cauccr pathogenesis Genes Dev 12 163 174.
Yen, A., Coles. M. & Varvayanis, S (1993). 1.25-dthydroxy
vitamin D^and 12-O-tctradccanoyl phorbol-13-acctatc
synergistically induce monocytic cell differentiation. FOS
and RB expression./ Cell Physiol. 156 198-203.
Ycoh, G. С T.. Hilliard, C.. Fletcher, S & Douglas, A. (1990). Gene
expression in clonally derived cell lines produced by In vitro
transformation of rat fetal hepatocytes- Isolation of cell lines
which retain livcr-speciltc markers. Cancer Res 50 75-93
Yergantan, G & Leonard. M J (1961). Maintenance ol normal
in .situ chromosomal features in long-term tissue cultures
Science 133,1600-1601.
Yevdokimova, N.& Freshney, R 1.(1997) Activation of paracrine
growth factors by heparan sulphate induced by glucocorticoid
in A549 lung carcinoma cells. Bnf J. Cancer 76 261-289
Yoshida, M & Beppu, T. (1990) In Doyle, A., Griffiths, J B. &
Newell. D G.. Cell and tissue culture' Laboratory procedures
Chichester. U.K, John Wiley & Sons. Module 4E2.
Yoshioka, M, Nakajima, Y.. Ito. T, Mtkami, О. Tanaka, S., Mi-
yazaki, S & Motoi, Y. (1997). Primary culture and expression
of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer
cells Vet Immunol. Immunopathol. 58 155 163
Young, H. F., Duplaa. C., Romero-Ramos, M., Chesselet, M. F.,
Vourc’h, P. Yost. M. J.. Ericson, K.. Terracio, L.. Asahara, T.,
Masuda, H, Tamura-Ntnomiya. S., Detmer, К , Bray, R A.,
Steele,T A,Hixson,D ,cl-Kalay,M .Tobin,B.W, Russ,R D,
Horst, M. N_, Floyd. J. A, Henson. N L, Hawkins, К C.,
Groom, J., Parikh, A.. Blake. L.. Bland, L. J., Thompson, A. J.,
Kinncich, A., Moreau, C., Hudson, J, Bowyer, F. P. 3rd,
Lm. T J & Black, A.C Jr (2004). Adult reserve stem cells
and their potential for tissue engineering. Cell. Biochem.
Btophys. 40 1-80
Yulias, J M , Li, A. P., Martinez. А. О. & I adman, A J (1977) A
simplified method for production and growth of multicellular
tumour spheroids (MTS). Cancer Res 37 3639-3643
Yuspa, S. H. Koehler, В. Kulesz-Martin, M. & Hennings. H. (1981)
Clonal growth of mouse epidermal cells tn medium with reduced
calcium concentration J. Invesrt Dermatol 76 144 146.
Yusuft A.N К, Szezcpanska-Konkcl, M, Kempson, S. A., Mc-
Atcer.J. A. & Dousa, T P (1986) Inhibition of human renal
epithclsal Na , Pi cotransport by phosphonoformte acid
Btochem. Btophys Res. Common 139 679-686.
Zaroff. L„ Sato, G. H & Mills, S. E (1961). Single-cell platings
from freshly isolated mammalian tissue. Exp. Cell Res 23
565-575.
Zclttngcr, J. & Holbrook, К A (1997). A model system for long-
term serum-free suspension organ culture of human fetal
tissues Experiments on digits and skin from multiple body
regions Cell Tissue Res. 290 51-60
Zcng,C„ Pcsall.J. E.Gilkcrson. К К & McFarland, D. С. (2002)
The effect of hepatocyte growth factor on turkey satcllitecell
proliferation and differentiation Poult Set. 81.1191-1198
688
Список литературы
Zhang, Y., Proenca, R , Maffei, M , Barone, M.. Leopold,
L. & Friednman, J. M. (1994) Positional cloning of the
mouse obese gene and its human homologue Nature 372
425 432,
Zhou, S, Schuetz,J D, Bunting, К D, Colapictro, AM, Sam-
path. J, Morris,J.J, Lagutina, I, Grosveld, G C, Osawa, M
Nakauclu, H. & Sorrentino, В. P (2001).The ABCtransporter
Bcrp 1 ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and
is a molecular determinant of the side-population phenotype
Nat. Med 7:1028-1034.
Zhu, C. & Joyce N. C. (2004) Proliferative response of corneal
endothelial cells from young and older donors Invert. Oph-
thalmol. Vis. Sa. 65.1743-1751,
Zhu, S Y., Cunningham, M. I., Gray, T E. & Nctteshcim. P
(1991)Cytotoxicity. genotoxicity transfoming activity of
4-(mcthylnitrosamino)-l-(3-pyndyl)-l-butanonc(NNK)in
rat trachea epithelial cells Mutation Re-, 261 (4). 249-259
Zimmermann, H, Hillgartncr. M.. Manz, В, Felten, P.. Brun-
nenmcicr, F.. Leinfelder. U, Weber, M , Cramer, H., Sch-
neider. S, Hcndncli, C, Volke, F. & Zimmermann, U (2003).
Fabrication of homogeneosly cross-linked, functional alginate
microeapsulcs validated by NMR-, CLSM- and AFM imag-
ing. Biomatenals 24 2083-2096
Zoubiane. G S., Valcntijn. A., Lowe. E T.. Akhtar. N . Bagley, S.
Gilmore. A P & Strculi. С. H. (2003). A role for the cyto-
skeleton in prolactin-dependent mammary epithelial ceil
differentiation./ CellSci 117 271-280
zur Niedcn, N. L. Kcmpka, G & Ahr, H J (2003) In vitro differ-
entiation of embryonic stem cells into mineralized osteoblasts.
Differentiation 71.18-27
Zwain. I H., Morris, P. I. & Cheng, C. Y. (1991) Identification
of an inhibitory factor from a Sertoli clonal cell line (TM4)
that modulates adult rat Leydig cell line steroidogenesis Mol
Cell Endocrinol. 80.115-126
Предметный указатель
Аберрантный контроль роста 343
Автоклавируемые среды 199
Автоматические пипетки 90
Автоматическим диспенсер 100
Автоматический счетчик колоний 402
Авторадиография 521
Активаторы плазминогена 349
Альгинат 496
Анализатор размера клеток 93
Анализ профиля ДНК 310
Ангиогенез 348
Антибиотики 158,252
Антигены клеточной поверхности 287
Апоптоз 62
Асептическая зона 73,85
— обслуживание 73
Асептические методы 106
Аспирационный насос 87
Аутентичность 138
Аутокринная сигнальная система 66
Аутокринные факторы 326
Аффинная хроматография 283
Аэратор культуры BelloCell 509
Базальная пластинка 60
Бакуловирус 555
Белки промежуточных филаментов 287
Бессывороточные среды
— недостатки 168
— преимущества 168
— приготовление 44, 179
- разработка 178
— селективные 149
Бикарбонат 197,560
Биологическая опасность 129
Биопсийный материал человека 216
Биореактор 505
Биоэтика 136
Бипотентная стволовая клетка 324
Бласттрансформация 521
Блокирование
— клеток в метафазе 302
— клеточного цикла 529
Блот-анализ при Саузери-блоттинге 308
Буферизация 151
Валидация 137
Вентилирование 143
Вентиляция 72
Весы 98
Внеклеточный матрикс 60,146
Возраст культуры 235
Время генерации 393
Вставные фильтры 145
Вторичная культура 235
Вторичная фильтрация по направлению
струи 209
Выбор бессывороточной среды 171
Выбор детергента 184
Выбор клеточном линии 240
Выбор среды и сыворотки 160
Выделение клонов 265
Выживаемость 407, 409
Газы 125
Гемоцитометр 1U4,3811
Генетицин 554
Генетическая нестабильность 332
Гетероплоидия 70
Гетероплоидные линии 335
Гетеротипическая паракринная система 66
Гибридизация 305,308
Г идролизат аминокислот 163
Гипотоническая обработка 302
Гистотипическая культура 25,35,478,488
Глютамин 559
Гомокринная передача сигнала 66
Гомокринные факторы 326
Гомотипическая паракринная передача
сигнала 66
Горелка 110
Гормоны 158
Деадаптация 65
Дедифференцировка 32.64,321
Дезагрегация 224,227
Дезинфектанты 105
Дезинфекция окуриванием 136
Десмосомы 59.61
Диализ 207
Диспенсеры 90
Дифференциальное окрашивание хромо-
сом 302
Дифференцировка 63,287,321
ДНК-фингерпринтинг 286
мультилокусный 308
Дозирование 89
Желагин 145
Жидкий азо г 126
Жизнеспособность 230,407
Завинчивающиеся крышки 183
Зависимость от подложки 34
Замена среды 242
Замораживание клеток 52,372
Идентификация культуры клеток 71
Излучение
— от высокоэнергетнчных источников 127
ионизирующее 126
от меченых реагентов 127
Изопикническая седиментация 274
Изоферментный анализ 55,316
Изоферментный электрофорез 314
Изоферменты 313
Иммортализация 69,332
Иммунный анализ 320
Иммунный пэннинг 278
Инвертированный микроскоп 88
Ингибирование пролиферации 62
Ингибиторы 160
Индекс мечения 403
Индекс пролиферации 404
Индекс разведения 235,248
Индукция дифференцировки 63
Инкубаторы 78,94,114
Инкубирование 73
Искусственные хромосомы дрожжей 555
Карантин 73,78
Кариотип 300,303
Каркотипирование 286
Клеточная адгезия 58
Клеточная культура 25,34
Клеточная линия 51,68
Клеточная плотность 395
Клеточная подвижность 61
Клеточная пролиферация 62.398
Клеточно-субстратное взаимодействие 58
Клеточный цикл 62
Клеточный штамм 34.235
Клональное соответствие 288
Клонирование в агаре 262
Клонирование в метилцеллюлозе 264
Клонирование в монослое 56
Клонирование клеток 255
Коллаген 145
Коллагеназа 226
Коллагеновый гель 493
Кольца для клонирования 266
Коммитирование 321
Компоненты для бессывороточного куль-
тивирования 170
Кондиционирование 145
Кондиционированная среда 163,260
Кондуктометр 100
Конечные линии 235
Контактное ингибирование 61
Контактное торможение 344.398
Контаминация 138,167
виды микробной контаминации 354
вирусная 361
мультиспецифическая 561
повторная 561
постоянная 561
распространенная 562
устранение 362
Контроль, проверка качества и хранение
сред 208
Контроль безопасности 120
Контроль клеточной пролиферации 62
Конфиденциальности требования 134
Конфлюэнтная культура 68
Конфлюэнтные фидерные слои 476
Конфокальная микроскопия 528
Концентрация действующего агента 411
690
Предметный указатель
Концентрация клеток 243,395
Концентрация сыворотки 57
Копреципитация с фосфатом кальция 551
Краситель Гимза 49.50,290
Краситель Мэй Грюнвальда 290
Кривая роста 162,210
Крноконсервация
- контейнеры для криокюнсервации 102
- культивируемых клеток 51
Критерии субкультивирования 244
Ксенотрансплантат 479
Культивирование
- в атмосфере C(J2 119
- в суспензии 250
- на альгинатных бусинах 450
- с перемешиванием 505
- эффективность 399
Культура амниоцитов 529
Культуральные пакеты 509
Культура ткани 25
Куриный эмбрион 215
Ламинарное оборудование 77
Ламинарные шкафы 72,73,85,129
Ламинарный поток 112
Латентная фаза 397
Липофекцня 551
Личная гигиена 108
М-фаза 62
Магнитная мешалка 96
Магнитная мешалка с подогревом У9
Магнитно-активированный клеточный
сортинг (MACS) 279
Магнитный сортинг 278
Макроносители 516
Малигнизация 346
Маркерные гранулы 274
Маркеры
- антигенные 315
- дифференцировки 286.324
- ткани 286
- уникальные 288
Маркировка клеточной культуры 240
Матригель 146,493
Межклеточное распознавание 58
Межклеточные контакты 59
Мембранная перфузия 516
Метаболизм 407
Металлические субстраты 148
Метод градиента плотности 438
Метод иммуномагнитного разделения 438
Метод микросечений 438
Метод падающей капли 298
Метод холодной трипсиниэации 223
Методы иммунодиссекции 438
Метотрексат-резистентность 270
Микоплазма 357,561
- обнаружение 52
Микрокапсулирование 518
Микроносители 514
Микротитрационные планшеты 257
Микротитрационный анализ 413
Микротрубочки 61
Микрофотография 298
Митотический индекс 404
Многослойные пропагаторы 510
Моечная машина 100
Молекулы клеточной адгезии 58.219
Монослойная культура 34,291
Монослойные клоны 267 Подсчет клеток в гемоцитометре 45
Морозильники 101 Подсчет хромосом 303
МТТ-тест 413 Подтверждение аутентичности 285
Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг Полилиэин 145
308 Полная питательная среда 154
Мультипотентная стволовая клетка 324 Полные питательные среды 154
Мышиный эмбрион 212 Получение первичной культуры 67
Получение постоянных клеточных ли-
Нагреватели 79 ний 34
Направленная миграция 61 Полые волокна 145
Неадгезивные субстраты 148 Пользовательская культура 377
Необратимый переход в стадию диффе- Помещение для мытья посуды 81
ренцировки 62 Помещение для стерильных манипуля-
Неорганические элементы 160 ций 77
Неравномерный рост 144 Порошкообразные среды 197
Нестабильность клеточных линий 32 Порядок поддержания культуры 241
Нозерн-блоттинг 312 Посевной сток 377
Номер пассажа 235 Постоянная клеточная линия 235
Постоянный клеточный штамм 235
Оборудования количесгво72 Поспрансфекционное ведение культуры 340
Одноразовые фильтры 200 Препаровальная лупа 93
Одноразовый пластик 139 Приготовление питательной среды 40
Ожоги 126 концентрата 44
Окрашивание из порошка 45
клеточной культуры 49 Приготовление сред 81
кристаллвиолетом 291 Приготов тение стандартных растворов 43
по Гимза 290 Прикрепление и рост клеток 139
Онкогены 346 Прикрепление эксплантатов 218
Опухолевая трансплантация 347 Проверка культуральных свойств 209
Органические добавки 158 Продукты дифференцировки 287
Органная культура 25,33,488 Промежуточные филоменты 61
Органогипическая культура 27,488 Противоточное распределение 283
Осмометр 100 Протирание поверхностей 109
Осмотическое давление 152 Проточная цитометрия 282
Отбор и анализ проб 143 Проточные цитометры 104
Оттаивание замороженных клеток 52 Прямой микроскоп 102
Отходов уничтожение Пустотелые волокна 493
биологически опасных 136
радиоактивных 127 Раздражение 407
Оценка риска 120 Размораживание замороженных клеток 374
Очиститель воды 96 Распластывание клеток по стеклу 302
Распределяемая культура 377
Паракринные сигнальные молекулы 66 Реакторы
Паракринные факторы роста 326 с неподвижным слоем 517
Параллельные культуры 254 с псевдожидким слоем для монослой-
Паровой стерилизатор (автоклав) 98 ных культур 517
Пассаж 34,235 для суспензионной культуры 509
Пенообразование 154 Регистратор температуры 95
Первичная документация 231 Репликативные колонии 268
Первичная культура 55.211,217 Репортерные гены 555
Первично эксплантпруемая культура 34 Ретровирусная инфекция 554
Первичный подсчет 395 Реципрокная передача сигнала 61
Первичный эксплантат 218 Реципрокные взаимодействия 487
Первое субкультивирование 235 рН-метр 99
Передача клеточных сигналов 66 Роллерные культуры 512
Переливание 112 Роллерные штативы 96
Перенос ДНК 332 Рост субкультуры 46,47
Перенос жидкостей 37,38
Перфузионная суспензионная культура 509 Саузерн-блоты ДНК клеточных линий 306
Перфузия на полых волокнах 517 Сбалансированные солевые растворы
Пипетирование 37.38,89,110 151.154.193
Пипетки 104 Сбор митотических клеток 302
Плато фаза 399 Сдерживающая среда 242
Плотностное ограничение 398 Селективная адгезия 272
Плотность клеток 243 Селективное открепление 272
Плотность насыщения 399 Сервисные тележки 88
Плотные контакты 59 Сигнальные молекулы 66
Поверхностное натяжение 154 Скорость седиментации 275
Подготовительная зона 73 Смена среды в монослойной культуре 41
Подложки проницаемые 145 Составление сред 149
Предметный указатель
691
Сосуды для культивирования клеток 139
Специализированная среда 198
Спинкультура 505
Спорадическая контаминация 561
Среда Игла в модификации Дюльбекко 149
Среда Хэма 149
Среда Хэма F12 211
Стадия сливного роста 68
Стандартная лабораторная практика
(CLP) 113
Стандартная процедура (СОП) 113,120
Стандартные операционные процедуры 120
Старение культуры 68
Стационарная фаза 397
Стекло 139
Стеклянные пипетки 183
Стерилизационные фильтры 105
— многократного использования 190
Стерилизация 97,187
— воды 42
— методом фильтрации 199
- среды 194,199
— стеклянной посуды 42
- фосфатно-буферного раствора для
среды Дюльбекко 43
Стерильная зона 106
Стерильность 163
Стимуляция эффективности посева 257
Субкультивирование 235,243
Субкультура 34
— клеток. растущих в суспензии 250
Субстрат 139
Суспензионная культура 34,142
Суспензионное клонирование 261
Сушильные шкафы 97
Сушка пипеток 96
Сфероиды 478,493
Счетчик клеток 92
Сыворотка 159,203,559
— недостатки 164
Тепловая инактивация 163
Термальная комната 78
Терминальная дифференцировка 321
Термостаты 79
Тестирование сыворотки 162
Техника ведения культуры ткани 37.39
Типы культуры ткани 33
Типы первичных культур клеток 211
Ткани животных 136
Ткани человека 136
Тотипотентная стволовая клетка 324
Транзиторная трансфекция 551.554
Трансгенные мыши 341
Трансдифференцировка 323
Трансмембранные протеогликаны 59
Трансмемранные протеогликаны 59
Трансфекция 332
Трансформация 69,288,332,407
Трансформация in vitro 69
Требование безопасности 83, 85,92,113,
183,189,207,212,216,298,306
Требования конфиденциальности 134
Трехмерные матриксы 147
Трипсин 221,560
Трипсинизация 221
Тромбоцитарный фактор роста 62
Туморогенность 346
Унипотентная стволовая клетка 324
Уровни биологической защиты 129
Устранение микоплазмы 362
Фаза логарифмического роста 397
Фазы сливного роста 61
Факторы роста 158,160
Ферментеры 505
— с восходящим потоком воздуха 509
Ферменты 287
Фидерные слои 57,146,261
селективные 273
Фильтрация 298
Фильтры многократного использования 200
Флюоресцентно-активируемый клеточ-
ный сортинг 281
Фосфатно-кальциевая преципитация 340
Характеристика клеточных линий 54
Химическая токсичность 124
Холодильники 101
Хранение 82
Хромосомные аберрации 334
Хромосомный анализ 303
Хромосомный препарат 301
Центрифуга 89
Центрифугирование 292
Центрифужный элютриатор 104
Цикл роста 248
фазы 397
Цилиндры для пипеток 87
Циркуляция воздуха 79
Цитометрия 390
Цитоскелет 61
Цитотоксичность 57,406
Цифровая фотография на микроскопе 300
Человеческий биопсийный материал 131
Экспрессия белка 312
Экспрессия репортерного гена 554
Электропорация 553
Электрофорез 283
Эмбриональный экстракт 163
Эндокринные сигнальные молекулы 66
Эффективность клонирования 399
Эффективность посева 162.210
DHFR-амплификация 270
ELISA-метод 320
G 1-фаза 62
Lag-фаза 397
Log-фаза 397
МЕМ Игла 211
S-фаза 62
а) Карцинома легкого человека. Раэраста
нис культуры из первичного эксплантата,
полученного из сквамозно-к.1с1 очной кар-
циномы легкого человека. MOG-L-DAN.
Окрашивание ио Гимза. Объектив 10х
б) MOG-GP Астроцитома. Астроглиальные клет-
ки анапластической астроцитомы Окрашивание
iio Гимза Объектив 40х
в) Интраэпителиальная цервикальная нео-
плазия человека (CIN). Первичная культу-
ра из цервикальной биопсии субкультивиро-
вана на фидерный слой ЗТЗ, некоторые де-
генеративные клетки которого сохранились
на препарате вверху справа. Окрашивание
ио Гимза. Объектив 10х. (С любезного раз-
решения M.G. Freshney )
г) Фибросаркома человека. Первичная куль-
iypa посажена на фидерный е юй эмбриональ-
ного кишечника. Клетки фибросаркомы имеют
веретенообразную форму, клетки фидерного
слоя многоугольной формы Окрашивание по
Гимза. Объектив 10х
Цветная вкладка 1. Первичная культура, человеческая
б) Первичный эксплантат.
Клетки мышиной сквамозно-
клеточной карциномы Фазо-
вый контраст Объектив 10х
а) Почечные канальцы мыши. Деза! ерсгация
ночки новорожденном мыши ме годом холодной
триисинизации. Соедини ильная ткань диссо -
циирована, но фрагменты канальцев и клубочков
ос 1ались целыми Аналогичный препарат полу-
чен при коллагеназном расщеплении Нормаль-
ное свст.юиольнос освещение. Обьскшв 4х
в) Коллагеназное расщепле-
ние. Карцинома толстой кишки
человека. Свет.юпольнос осве-
щение Объектив 4х
д) Почка новорожденной крысы. Первичная культура
из тринсинизированной (холодным методом) почки
новорожденной крысы. Окраска но Гимза. Объектив
10х (С любезного разрешения М G Freshney.)
г) Разрастание культуры из почечных каналь-
цев. Распространение клеток из прилипших
фрагментов после дизаи-рсгации методом
холодной трипсинизации. Фазовый контраст
Объектив 10х
Цветная вкладка 2. Первичная культура, эксплантат, холодная трипсинизация и коллагеназа
A "5 '
а) Легкое эмбриона цыпленка. Первичная куль-
тура легкого 13-дневного эмбриона цыпленка
через 48 ч после дезат грегации методом холодном
траисиназацитт Окрашивание по Гимза и фазо-
вый контраст Объектив 10х
б) Печень эмбриона цыпленка. Детали
») Почка эмбриона цыпленка. Детали куль-
туры как в (а) Окрашивание по Гимза, свет-
лоиольнос освещение Объектив 10х
в) Бедренная мышца эмбриона цыпленка.
Детали культуры как в (а) Обратите внимание
на многоядерные мышечные волокна (красная
стрелка), возникшая в результате слияния мио-
цитов (маленькие веретенообразные клетки
темной окраски) Окрашивание по Гимза, свст-
лонольнос освещение. Объектив 10х
Цветная вкладка 3. Первичная культура, эмбрион цыпленка
б) Переход в log-фазу. KjictkuNRK через 48 ч пос-
ле пересадки Фазовый кон грает Объектив 10х
а) Свежая монослоиная субкультура. Клетки
NRK через 24 ч после пересадки Фазовый конт-
раст. Объектив 10х
в) Середина log-фазы. Клетки NRK через Здня
после пересадки, готовы к замене питательной
среды Фазовый контраст. Объектив 10х
г) Поздняя log-фаза. Клетки NRK через 7 дней
после пересадки, гот овы к следующему субкульти-
вированию Фазовый контраст. Объектив 10х
Цветная вкладка 4. Фазы ростового цикла
а) Монослой NRK клеток перед трипсинизацией. Фазовый б) Монослой NRK клеток после обработки D-PBSA/
контраст Объектив 20х EDTA. Предварительное промывание. Фазовый контраст.
Объектив 20х
в) Монослой NRK сразу после удаления трипсина. Фазовый г) Монослой NRK через 1 мин после удаления трипсина,
контраст Объектив 20х Фазовый конт раст Объектив 20х
й) Монослой NRK через 5 мин после удаления трипсина
Фазовый контраст Объектив 20х
в) Полностью дезаггрегированный монослой NRK. Через
10 мин после удаления 1 рпиенна культура плова к диспергиро-
ванию и подсчету клегок. Фазовый конераст Объектив 20х
Цветная вкладка 5. Субкультивирование методом трипсинизации
а) Клоны HeJLa. Клоны Не1_а-5г полученные клониро-
ванием разведением и окрашенные но Гимза через 3 нед.
Масштабный отрезок 5 мм
б) Клон NKK. Маленький клон клепок NRK, клонирова-
ние разведением Фазовый контраст Объектив 4х
в) Карцинома молочной железы, JU W. Клонирование
на пластике. Микрофотография вторичной ку >ьтуры
из карциномы молочной железы человека. Культура
с и.ю шестью 4000 кл /см3, выращенная на плас пеке
Главным образом, фибробласты Окрашивание но Гимза.
Объектив 10х
г) Карцинома молочной железы на фидерном слое.
Микрофотография колонии эпителиальных клегок
карциномы молочной железы человека. 400 кл.,см2,
выращенная на конфлюэнтном фидерном слое клеток
эмбрионального кишечника FHS74Int. Окрашивание по
Гимза. Объектив 10х
д) Действие сыворотки на эффективность культиви-
рования. Клетки MvlLu, трансфицированные онко-
геном тус, посеяны на чашки Петри диаметром 6-см
в дозе 500 кл /чашку, фиксированы и окрашены через
2 нед Слева 10% FBS, справа 20% FBS Масштабный
отрезок 10 мм. (С любезного разрешения M.Z Khan )
е) Действие глюкокортикоидов на эффективность
культивирования. Клетки культуры глиомы человека
раннего пассажа в отсутствие (слева) и присутствие
(справа) 0.25 мкМ дексаметазона Макрофотография,
общее увеличение приблизительно 10х
Цветная вкладка б. Клонирование клеток
а) Клон постоянной клеточной линии глиомы MOG-
G-CCM. Эллиптическая и веретенообразная морфоло-
гия клегок. Окрашивание по Гимза Объектив 10х
г) Клонированная культура клеточной линии раннего
пассажа. Клетки немелкоклеточной карциномы легкого
человека (NSCLC) Окрашивание по Гимза. Масштаб-
ный отрезок 10 мм
б) Другой клон той же постоянной клеточной линии
глиомы MOG-G-CCM., что и в (а). Эпителиоидная
морфология Окрашивание по Гимза Объекта 10х
д) Клоны культуры NSCLC человека. Окрашивание
по Гимза. Объектив 4х
е) Третий клон постоянной клеточной линии глиомы
MOG-G-CCM. Сквамозно-попел иоидная морфоло-
гия Увеличение такое же, что в (й) и (б). Окрашивание
ио Гимза. Объектив 10х
с) Клонированные культуры Л2780. Постоянные кле-
точные линии карциномы яичника человека
Цветная вкладка 7. Клонирование клеток. Морфологическое разнообразие
а) Нормальные эмбриональные легочные
фибробласты человека. Субконфлюэт-
ный монослой нормальных эмбриональных
легочных фибробластов человека. Окраши-
вание по Гимза. Объектив 10х
в) Эндотелии пупочного канатика чело-
века. Клеточная линия. полученная путем
промывания коллагеназой пупочной вены
человека. Окрашивание по Гимза. Объек-
тив 20х
б) Конфлюэнтный слой фибробластов.
Плотная культура нормальных эмбрио-
нальных легочных фиброблас hib человека.
Фазовый контраст. Объектив 10х
г) Меланоциты человека. Вторичная культу-
ра ТРА-обработанных эпидермальных мела-
ноци iob, выделенных из крайней плоти ново-
рожденного р< бенка (афро-американца) Об-
ратите внимание на морфологию дендритных
клеток и их удлиненную веретенообразную
форму В противоположность мечаноцитам,
выделенным из крайней илоти новорожден-
ного ребенка кавказского происхождения,
эти меланоциты обладали высоким уровнем
ранул меланина (фазовый контраст.ув 320х)
(С любезного разрешения Н -Y Park )
Цветная вкладка 8. Конечные клеточные линии
б) Л549 Аденокарцинома легкого
человека. Окрашивание ио Гимза
Объектив 10х
a) HeLa-S3 Цервикальная карци-
нома человека Фазовый контраст.
Объектив 40х
в) MOG-G-UVW. Глиома человека.
Окрашивание по Гимза. Объектив
10х
г) Сасо-2. Колоректальная карци-
нома человека, образующая купол.
Данная клеточная линия должна быть
субкультмвирована прежде, чем она
достиг нсг этом с гадим, пока она сто
субконфлюэнтна. Фазовый кон грает.
Объектив 40х
Цветная вкладка 9. Постоянные клеточные линии из опухолей человека
a) СНО-Ki. Клон СНО, постоянном клеiочной линии,
выделенной из яичника китайского хомячка. Фазовый
контраст. Масштабный отрезок 100 мкм
б) Swiss ЗТЗ. Фибробласт-подобныс клетки мы-
шиного эмбриона Swiss Окрашивание по Гимза.
Масштабный отрезок 100 мкм
2 мкм
в) Окрашенная но Гимза культура ВНК-21 во
флаконе, клон 13. фибробласт ы почки новорожден-
ного хомячка после достижения конфлюэнтности
формируют типичную «воронку», образованную
параллельными лучами из клеток. Окрашивание
но Гимза. Макрофотография. Масштабный отрезок
2 мкм
г) ВНК-21-С13. Фибро-
бласты почки новорожден-
ного хомячка, достигшие
стадии конфлюэнтности и
формирующие параллель-
ные лучи Окрашивание по
Гимза. Масштабный отрезок
250 мкм
д) Культура ВНК-21-С13 вы-
сокой плотности. Постконф-
люзнтная культура фиброб-
ласт ив почки новорожденного
хомячка, формирующая вто-
рой монослой более плотно
окрашенных клеток. Окраши-
вание по Гимза. Масштабный
ел резок 250 мкм
е) Культура к теток почки собаки Madin-
Darby MDCK.J 1инияэпи тслиоцодобных
клеток из почки собаки. Окрашивание по
Гимза. Масштабный отрезок 100 мкм
ж) Эпителиальная клеточная линия MvlLu из легких
норки. Иммуноперокспдазнос окрашивание на цитоксра-
тнн (первичные анти ела АЕЗ) (С любезного разрешения
М Z Khan ) Масштабный отрезок 100 мкм
Цветная вкладка 10. Постоянные клеточные линии из нормальных тканей животных
а) Нормальные кератиноциты человека на фидерном слое фибробластов кожи
взрослого человека. Панцигоксратнн керашноцитов окрашен в зеленый цвет, а
вимсн! ин фибробластов в красный. Объектив 40х. (С любезного разрешения
Hans-Jurgen Stark )
б) Глиома человека. Клетки MOG-G-CCM
иммунопсроксидазнос окрашивание на
белок GFAP Объектив 10х
в) Стромальные фибробласты молочной железы. Иммунопс-
роксидазнос окрашивание на вцментин (коричневый) Объек-
тив 40х (С любезною разрешения Valeric Spcirs.)
г) Эндотелиальные клетки пупочной вены человека. Им-
мунопсроксидазнос окрашивание фактора VIII. Объектив
iOx. (С любезного разрешения R.L. Shaw&M. Frame )
Цветная вкладка 11. Иммунное окрашивание
о) Формирование купола в монослое культуры клеток
аденокарциномы легкого№11_. Фокусировка микроско-
па на вершине купола. Мозаичное чередование СЕА-по-
ложитсльных и СЕА-отрицаюльных клеюк. Иммуноис-
роксидазнос окрашивание Объектив 40х
б) Формирование купола в монослое культуры клеток
аденокарциномы легкого WIL. Изображение сфоку-
сировано на монослое у основания купола. Мозаичное
чередование СЕ А-положительных и СЕА-отрица-
гсльных клеток. Иммуноисроксидазное окрашивание.
Объектив 4 Ох
в) Культура клеток аденокарциномы легкого
А549, растущая на матригеле. Верхнее фото-
объектив 4х, нижнее- 10х неокрашенный препа-
рат, свстлоиольная микроскопия. (С любезного
разрешения Jane Sinclair)
г) Культура клеток аденокарциномы легкого А549 на пласти-
ке «не для культуры тканей». Рос i на чашках Петри «нс для
культуры тканей» с легочными фибробласт ами, растущими
на покровных стеклах в центре чашки. Объектив 10х. Свстло-
иольная микроскопия. Окрашивание iio Гимза. (С любезного
разрешения Valeric Speirs )
Цветная вкладка 12. Морфологическая дифференцировка эпителиальных клеток
а, б) Гемоглобин в клетках Friend. Окрашивание гемоглоби-
на бензидином в клетках Friend эритролейкемии* контроль
(о), с добавлением 2°i DMSO (б), объекта ЮОх. (С любез-
ного разрешения David Conkic ) Окрашивание ил Гимза
в, г) Авторадиографическое мечение клеток Friend in situ.
Действие DMSO на индукцию мРНК глобина* контроль (в),
индуцированная 2% DMSO (?) Объектив ЮОх (С любезного
разрешения David Conkic ). Окрашивание iio Гимза
д) Нормальные глиальные клетки человека. Недифферен-
цированные нормальные .шальные клетки мозга че ювека
Общее увеличение 200х (С любезного разрешения Margaret
Frame )
с) Дифференцированные глиальные клетки человека.
Морфологическая дифференцировка нормальных ышальных
клеток, индуцированная фактпром созревания глии Окра-
шивание по Гимза. Общее увеличение 200х.(С любезного
разрешения Margaret Frame.)
Цветная вкладка 13. Дифференцировка клеток Friend и глиальных клеток человека
а) Контактное ингибирование. Поздняя log-фаза
культуры ВНК21-С13. Клетки стремятся к при
обретению параллельной ориентации и нс будут
перекрывать друг друга. Микроскоп Olympus СК2
Объск1ив 10х
в) Формирование фокуса в культуре клеток ЗТЗ.
Монослой клеток Sw3T3, оставленный в сосюянни
конфлюэнтном» в течение 3 нсд. обнаруживаются
фокусы трансформированных клегок, в которых нс
происходит контактного Ин1 ибировання Фото ввер-
ху флакон 75-см2, внизу объектив 4х Окрашивание
по Гимза
б) Утрата контактного ингибирования. Полиома-
трансформированный клон клеток ВНК21-Р ¥.
в котором отсутствует распознавание клетками
присутствия друг друаа и рост происходит случай-
ным образом с перекрыванием клеток. Микроскоп
Olympus СК2 Объектив 10х
г) Внедрение метки [лН]-тимидина в клетки легкого нутрии
MvlLu. Клежн легкого нутрии Mvllu были мечены | 'H|-TdR и
покрыты радноавтографичсскои эмульсией (см Ирш нкол 27.3),
а затем окрашены но Гимза. Верхнее фото контрольная ли-
ния клеток Mvl, в середине М vILu. М1, линия клеток MvILti,
трансфицированная онкогеном тус, внизу клетки TI с мутант-
ным геном ras. Клетки Т1 были туморогенными и статистически
досюнсрно (р< 0.001) име1и повышенный уровень мечения
ио сравнению с MvlLu Анало! ичный результат был получен с
мечением бромдеоксиурцдином [Khan etal., 1991] Масштабный
отрезок50 мкм. (С любезною разрешения М Z. Khan.)
Цветная вкладка 14. Трансформация
а) Нормальная линия клеток FHS4Int эмбрио-
нального кишечника человека. Монослои клеток,
характеризующихся контактным uhi ибированисм.
Объектив 10х. Гимза
б) Клеточная линия WLY глиомы человека. Ин
фильтрация монослоя FHS4Int с контактным iihui-
бированисм клетками WLY. Нормальные! лиальные
клетки нс инфильтруют такой конфлюэнтный моно-
слой (см. цв вкладку 15а) Объектив 10х. Окраши-
вание по Гимза
там; й) Миграция L-DAN в фибробластах.
Объектив ЮОх, непрямая флюоресценция.
Окрашивание на цитоксратин
е) Индукция ангиогенеза. Контроль. Грубый экс-
тракт нормальных глиальных клеток был помещен
на хориоаллантоисную мембрану через 10 дней
инкубации иослсднси Мембрана была удалена че-
рез 2 нсд Размеры прцблизи le.ibuo соответствуют
натуральной величине. (С любезного разрешения
Margaret Frame )
ж) Индукция ангиогенеза. На хориоа.ьлантоисную
мембрану цыпленка через 10 дней сс инкубации был
нанесен грубый экстракт клеток карциномы Walker
256 Мембрана была удалена через 2 нсд Размеры
приблизительно соответствуют натуральной величи-
не. (С любезного разрешения Margaret Frame.)
Цветная вкладка 15. Свойства трансформированных клеток
с) Контаминированный флакон. По- б) Коагулированная контаминация. Бактериальная контаминация
ниженис pH и ному гнение среды с небольшим понижением pH
в) Контаминированная бутыль со
средой. Помутнение с выпадением
осадка. Дрожжи
г) Образцы микробиологического бульона. Контроль чистый
(слева), положите гьный конч роль мутный (справа), нее чсдусмый
образец от'рица|е.1ьныи (в середине)
е) Микоплазма. Высокое разрешение. Окрашенные красителем
Хехет клс1ки, инфицированные микоплазмой. Объектив ЮОх,
общее увеличение 800х
Микоплазма контаминирует культу-
ру, что обнаруживасгся при окраске
красителем Хехет 33258 Объектив
40х, общее увеличение ЮОх
Цветная вкладка 16. Примеры контаминации
V X Ж U Ж
X • “ ’ . t Ж Ж Ж Ж
ж £ Ж Ж Ж .
Ж’; ХЖЯЖМ -
«•к ХЖ’ЖХЖ
жж ж*, ж ж
ж жжяж
а) Цитотоксический тест с высвобождением красителя.
Нафтиленовый черный. Стекло гемоцитомстра площадью
200 мкм3с жизнеспособными (неокрашенными) и нежизне-
способными (окрашенными) клетками Объектив 4Ох
б) Тест МТТ. Микро i и грационным планшет с вдетками,
окрашенными МТТ, через 24 ч в диапазоне концен ipamiii
VP 16 Крайний левый и крайний правый столбцы пустые,
второй c.icna и второй справа необработанные кот роли
С 3 ио 8 столбцы — концентрация VP16 с О до 10 мкм
в) Клетки НТ29. К.ютки Т29, обработанные TRAIL (TNF-
связанный апоптоз-инду цирующий лиганд) в концен i рации
0,25 мкм в течение 16 ч. окрашенные акридином оранжевым
Прикрепившиеся клетки имею г нормальную морфолт ню.
Объектив 40х. Общее увеличение ~300х. (С любезного раз-
решения Angela Hague )
г) Апоптоз клеток НТ29. Клетки, отделившиеся от субстрата
обнаруживают конденсацию хроматина и фрагментацию, что
является признаками апоптоза. Объектив 40х. Общее увс чи-
чсние -ЗООх (С любезного разрешения Angela Hague )
д) Обмен сестринскими хроматидами (SCE). Необработан-
ные клетки А2780 Ср70 с добавочной перенесенном челове-
ческой хромосомой 2(A2780/Cp70+chr2). Объектив ЮОх.
(С любезного разрешения Robert Brown & Maureen Illand.)
е) Индуцированный SCE. Клег ки А2780 Ср70, обрабшанныс
10 мкм цисплатина в течение 1 ч, обнаруживается зкс<снсив-
ный SCE. темные участки, окрашенные ио Гимза, чередущея
между цепями внутри отдельных хромосом Объектив ЮОх
(С любезного разрешения Robert Brown & Maureen Illand )
Цветная вкладка 17. Жизнеспособность и цитотоксичность
а) Трансфицрованныс мозаичные сфероиды.
Выделенные из клеточной линии ишоыы
человека MOG-G-UVW. сфе|юиды, распре-
деляются по размеру от 100 до 500 мкм в
диаметре, состоят из смеси клеюк, iратифи-
цированных i-сном GFP (зеленый) и клеток,
1рансфицированных геном NAT Объектив
40х (С любезного разрешении Marie Boyd &
Rob Mairs )
в) Микроносители. Клетки Vcro. растущие на
микроносителях. Объектив 10х
J А 1 го мкм
б) Альгинатное инкапсулирование. Изоб-
ражение клеток, инкапсулированных в
алыинат через 2 ч (), 3 недели (и) и 4 мес
(ш) tn vitro Внутри альгинатной буси-
ны обнаруживаются клетки погибшие и
делящиеся, у mhoi их клеточных линий
внутри альгинатной бусины образуются
многоклеточные сфероиды. Масштабный
отрезок 70 мкм (С любезного разрешения
Tracy-Аип Read & Rolf Bjerkvig )
г) Гексагональные микроносители. Nunc Micro-
hex Beads. Общее увеличение 20х. (С любезного
разрешения Nalge Nunc )
Цветная вкладка 18. Сфероиды, инкапсуляция и микроносители
а) Культура на вкладыше в фильтрационной лунку.
Клетки аденокарциномы легких человека А549 на ио-
ликарбонатном фильтре. Видны отверстия в фильтре
(15 мкм). в частности, в верхнем нравом утлу Объектив
4х Окрашивание по Гимза
б) Сокультивирование на вкладыше в фильтрационной
лунке. Эпителиальные клетки эмбриональных лет ких
человека На обратной стороне фильтра растут фибро-
бласты легких. Объектив 4х. Окрашивание ио Гимза
в) Со-культура клеток легких. Фокус на вершине.
Эпителиальные клетки эмбриональных легких человека.
Изобрл-кение сфокусировано на клетках, покрывающих
фильтр. Объектив 40х. Окрашивание по Гимза
г) Сокультивирование на вкладыше в фильтрационной
лунке. Эпителиальные клетки эмбриональных легких
человека. И «обращение сфокусировано на клетках под
фильтром. Объектив 40х Окрашивание по Гимза
Э) Срез co-культуры. Срез через фильтр v клетками
А549 и фибробластами. Оба клеточных типа были посе-
яны поверх фильтра, но фибробласты мигрировали через
фильтр, хотя некоторые остались поверх него видны
три клетки, проникающие через поры Окраска Н&Е.
объектив 4 Ох
е) Легкие эмбриона цыпленка. Первичная культура
клеток эмбрионального лет кого 13-дневного цыпленка,
дизаггрегированного методом холодной тринсинизации
72 ч после иосева при концентрации 1х106кл_, мл. Объ-
ектив 40х Окрашивание по Гимза
ж
Цветная вкладка 19. Органотипическая культура в фильтрационной лунке
а) Со-культура кератиноцитов и дермальных фибро-
бластов. Органотииичсская культура через 2 нед культи-
вировании tn vitro Окрашивание Н&Е. Объектив 40х
б) Органотипическая культура имплантированная т
vivo. Органотипическая со-кулыура in vivo через 3 нед
пос ic трансплантации на мышь nude Окрашивание Н&Е
Объекта 40х
в) Интегрин и цитокерагин в co-культуре in vitro. Им-
мунофлюорссцснтнос окрашивание на <х-6-ингС1рин
(зеленый), кератин (краснып), ДНК-флюоресценция
(синий) Объектив 40х
г) Интегрин и цитокератин в орханотинической культу-
ре, имплантированной in vivo. Иммуноф.чюорссцснтное
окрашивание насс 6-интсгрин (зеленый) и кератин (крас-
ный), ДН К-флюорссценция (синий) Объектив 40х
й) Инволюкрин и коллаген в органотипнческой со-
культуре через 2 нед. Со-культура кератиноцитов ii
фибробластов с окрашиванием коллагеновою leia на
инволюкрин (зелен ыи) и основной компонент мембраны
коллаген VII (красный). Объектив 40х
е) Инволюкрин и коллаген в органотмпической со-
культуре через Знед. Со-культура кератнноцихов и
фибробластов с окрашиванием коллагеновою геля на
инволюкрин (зс хеныхх) и компонент базальнон мембра-
ны коллаген VII (красный). Объектив 40х
Цветная вкладка 20. Органотипическая культура кожи. (С любезного разрешения Hans-Jxirgen Stark.)
а) Действие контрольного раствора в течение 10 мин
б) Действие 1 раствора SDS в течение 10 мин
в) Действие контрольного раствора в течение 20 мин г) Действие 1% раствора SDS в течение 20 мин
д) Действие контрольного раствора в течение 60 мин
с) Действие 1% раствора SDS в течение 60 мин
Цветная вкладка 21. Токсичность в органотипической модели in vitro
а) Стерилизованные бутылки. Эти бутылки были автокла-
вированы с индикатором стерильности Thcnnalog внутри.
Индикатор становится синим при высокой температуре
и давлении пара. Голубая область движется ио полоске с
течением времени стерилизации. Крышка самой крайней
слева бутылки была плот но завернута, ио мере расстановки
слева направо крышка все более ослаблена, пока, наконец, у
самой крайней справа бутылки крышка нс открыта совсем.
Самая крайняя слева бутылка нс стерильна, поскольку лар
нс попал в нее Вторая недостаточно стерильна, поскольку
прокладка в крышке плотно прилипла к горлышку и за-
печатала его, следующие три стерильны, но коричневая
окраска на индикаторе обозначает, что в конце цикла в
них оставалось остаточное количество жидкости только
крайняя бутылка справа стерильная и сухая
б) Стандарты pH. Индикатор pH феноловый красный
в стандартном наборе растворов. Крайний слева и
крайний справа неприемлемы и требуют немедленного
действия замены среды, субкультнвирования или
наполнения газом
pH 6,5 pH 7,0 pH 7.4 pH 7,6
в) Вращающаяся система культуры клеток. Камера вра-
щается для создания нулевой силы тяжести, так, чтобы
клетки не осаждались и росди в камере в виде агрегатов
г) Культуральная система BelloCell. Клетки растут
на макробусинах в центре камеры, а нижележащая
камера наполнена культуральной средой, которая
поочередно то прогоняется сквозь камеру с буси-
нами « "«’вращается обратно
д) Разноцветные сосуды для криоконсервирования. Полипроиа-
иленовые сосуды для криоконсервирования емкое 1ыо 1,0-4,6 мл
Разноцветные вкладыши в крышки помогают предупредить ошибки
в идентификации
Цветная вкладка 22. Приготовление среды, культуральные системы и флаконы для криоконсервации
а-в) Магнитный сортинг на системе Dy nabeads (Dynal). Отрицательный сортинг; коммитированные клст-
ки-предшеетвенники, выде ленные из суспензии костного мозга, связываются с парам»! ни гными гранулами
Dynal с антшелами к маркерам клеточной линии Клетки, нс имеющие линейных маркеров (стволовые),
нс связываются и остаются в суспензии, готовыми к сортингу на проточном флуориметре* (а) Помещение
пробирки в маюитнып держатель (6) Пробирка сразу после установки в copiep (в) Пробирка через 30 с
после начала сортннга
г-д) Магнитный сортингна системе MidiMacs Separator (Miltenyi Biotec), (г) Колонка, магнит поддон и
штатив, (г)) MidiMaes Separator с колонкой LD (С любезного разрешения Miltenyi Biotcc )
Цветная вкладка 23. Магнитна активированный клеточный сортинг
CM
GenBank
accession no.
M92642
AI982638
M91669
X14420
M26576
X05610
Y14690
X15880
M20777
X15882
L02870
X57527
L41162
X17033
X17033
M59911
M59911
X06256
S66213
S66213
X53586
AF032108
M14648
M14648
AF011375
X53587
M 35198
gene
COL16A1
COL16A1
COL17A1
COL3A1
COL4A1
COL4A2
COL5A2
COL6A1
COL6A2
COL6A2
COL7A1
COL8A1
COL9A3
ITGA2
ITGA2
ITGA3
ITGA3
ITGA5
ITGA6
ITGA6
ITGA6
ITGA7
ITGAV
ITGAV
ITGB4
ITGB4
ITGB6
Экспрессия транскриптов фибронектина, коллагена и интсгрина Определена при помо-
щи микроанализа нуклеотидов в нормальной (NOK), 5¥40Т-антнген- имморталиэован-
ной (S VpgC2a) и злокачественной (SqCC, Y1) линиях кератиноцитов ротовой полости
человека Сокращения в наименования GenBank. COL16A1 = коллаген типа XVI, цепь 1
и I щ, ITGA2 = интегрин 2 субъединица и тл, ITGB4 = интегрин, 4 субъединица и т д
(по Sara ng ct aL 2003. ФЕДФ 31 575-585 с разрешения издаюля и автора)
Цветная вкладка 24. Анализ экспрессии генов, Affymetrix Microarry Analysis
Учебное электронное издание
Фрешни Р Ян
КУЛЬТУРА ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК
Практические руководство
Ведущий редактор канд биол наук В В. Гейдебрехт
Редактор канд. биол наук О. П Кисурина
Художник Н. А Новак
Технический редактор Е В Денюкова
Корректор Д И Мурадяи
Компьютерная верстка: О А Леяипенко
Подписано 11.07 12. Формат 60x90/8.
Усл леч. л. 87.
Издательство «БИНОМ Лаборатория знаний»
125167, Москва, проезд Азропорта, д. 3
Телефон: (499)157-5272
e-mail: binomfoi Lbz.ru, http.//www.Lbz.ru