П ІКалер - Ю. Корд ее
ОСНОВЫ
БИОЛОГИЧЕСКОЙ
ХИМИИ

Г. Малер, Ю. Кордес
основы
БИОЛОГИЧЕСКОЙ
ХИМИИ
Перевод с английского
Под редакцией и с предисловием
чл.-корр. АН СССР А. А. БАЕВА
и проф. Я. М. ВАРШАВСКОГО
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР» МОСКВА 1970

BASIC
BIOLOGICAL
CHEMISTRY
by
HENRY R. MAHLER, EUGENE H. CORDES
Department of Chemistry
Indiana University
A Harper International Edition
jointly published
by
HARPER & ROW, NEW YORK, EVANSTON & LONDON
AND JOHN WEATHERHILL, INC., TOKYO 1968

УДК 577.1
Учебник биологической химии, отражающий современное
состояние этой быстро развивающейся науки. Материал изложен предельно
ясно и последовательно, с учетом новейших данных; рассмотрены
основы всех важнейших теоретических подходов и экспериментальных
методов. Книга хорошо иллюстрирована, снабжена подробным
предметным указателем и списком дополнительной литературы.
Предназначена для студентов и аспирантов биологических
и химических факультетов университетов и пединститутов,
медицинских и сельскохозяйственных вузов.
Редакция биологической литературы
Инд. 2-10-2
116-70

ПРЕДИСЛОВИЕ К РУССКОМУ ИЗДАНИЮ
Предлагаемый вниманию читателей учебник Г. Малера и Ю. Кордеса
«Основы биологической химии» отличается от традиционных учебников
биохимии во многих отношениях. Для правильной его оценки
немаловажное значение имеет предыстория книги: у этого учебника существует
предшественник — капитальное руководство тех же авторов «Биологическая
химия», вышедшее в США тремя изданиями и получившее отличные отзывы.
Выпуская в свет это капитальное руководство, авторы ориентировались
в основном на лиц, достаточно хорошо подготовленных в области химии
и физики. Они обстоятельно рассмотрели в нем практически все разделы
современной биохимии, широко используя математику, причем строгость
рассмотрения и количественный подход нигде не были принесены в жертву
доступности изложения. В результате руководство «Биологическая химия»
получилось весьма объемистым и слишком трудным для многих лиц,
изучающих биохимию. Книга «Основы биологической химии» появилась на
свет в значительной мере как компромисс между «максималистскими»
установками авторов, которые остались, судя по их предисловию, неизменными,
и запросами широкого круга читателей, недостаточно хорошо
подготовленных в области физики и химии, но нуждающихся в полноценном
современном учебнике по биохимии; это в основном студенты и аспиранты
медицинских институтов и биологических факультетов университетов.
К сожалению, по традиции, биологическую химию у нас до сих пор относят
к разряду биологических дисциплин и поэтому готовят
специалистов-биохимиков в медицинских институтах и на биологических факультетах. Между
тем, биохимия в ее современном виде уже давно является по существу
разделом химии. Безусловно, меньшим злом для биохимика была бы
недостаточно хорошая подготовка по ботанике и зоологии, чем слабое знание
математики, физики и химии.
Учебник «Основы биологической химии» обладает целым рядом
достоинств. Его отличают широкий подход к проблемам биологической
химии, дух современности, полнота материала и умелое его изложение.
Основное отличие этой книги от большинства учебников биохимии состоит
в том, что наряду с обычными сведениями по химическому строению
биологически активных соединений и их метаболизму в книге неизменно
приводится молекулярно-биологическая интерпретация биохимических процессов —
их термодинамические и кинетические характеристики, сведения о влиянии
специфических особенностей пространственной структуры биополимеров на
механизм реакций и т. д. Молекулярно-биологический «уклон» книги не
случаен, т. е. определяется не только научными вкусами авторов. Он
отражает тот факт, что граница, разделяющая современную биохимию и
молекулярную биологию, весьма условна и не всегда различима. Хорошо
известно, что молекулярная биология возникла из некоторых разделов
биохимии; однако очень большую роль в ее формировании сыграли и другие

Предисловие к русскому изданию
смежные дисциплины. Важно не то, что основное внимание молекулярной
биологии направлено на белки и нуклеиновые кислоты — без них не
обходится и биохимия. Для молекулярной биологии существенны не только
объекты, которыми она занимается, но, в еще большей степени, ее
методология, характеризующаяся единством физического, химического и
биологического подходов. Книгу Г. Малера и Ю. Кордеса нельзя считать
учебником молекулярной биологии, но то, что авторы сделали определенный шаг
в этом направлении, несомненно. Достаточно указать, что в этой книге
специальные главы посвящены таким проблемам, как «Структура и функция
гена» и «Биосинтез белка», т. е. темам, типичным для молекулярной
биологии. Широкий подход, характерный для «Основ биологической химии»,
дает читателям более гармоническое и всестороннее представление о
химических и физических основах жизнедеятельности.
Химия промежуточного обмена изложена в книге подробно и умело.
Биохимики, вероятно, будут удовлетворены этими главами. Следует
обратить внимание читателей на многочисленные схемы, изображающие
метаболические циклы и пути реакций. Они составляют единое целое с текстом;
иными словами, схема и текст по большей части не повторяют друг друга,
а представляют собой два самостоятельных источника информации.
Кое-что в книге кажется нам сейчас несколько устаревшим, но это судьба
всякой большой книги, которая не может угнаться за быстрым накоплением
фактов, понятий и теорий в современной биохимии и молекулярной
биологии.
Как обычно, при переводе пришлось встретиться с терминологическими
трудностями, касающимися номенклатуры ферментов, символов и
сокращений. В основном все оставлено так, как в оригинале. В переводе
использованы лишь некоторые обозначения, принятые в русской биохимической
литературе, в частности такие, как АТФ, ФФН (для пирофосфата) и проч., хотя
проистекающие отсюда неудобства очевидны.
В первой (вводной) главе читатель найдет перечень журналов, в которых
публикуются результаты научных исследований в области биохимии. Мы
дополнили этот перечень, включив в него журналы, выходящие в СССР,
а также имеющиеся на русском языке учебные пособия по биохимии и
молекулярной биологии. Кроме того, каждую главу учебника авторы снабдили
небольшим списком литературы; к этим спискам мы также добавили ссылки
на книги, изданные на русском языке.
Нужно надеяться, что книга будет полезна в качестве дополнительного
пособия для студентов —• биологов и медиков, а также аспирантов и научных
работников — специалистов в смежных с биохимией науках, таких как
физиология, биоорганическая химия, медицина и микробиология.
Перевод книги осуществлен канд. биол. наук Н. М. Амельянчик
(гл. IX — XI), А. Я. Варшавским (гл. III, XIX — XXI), канд. хим. наук
Ю. М. Евдокимовым (гл. I, II, V и VI), канд. физ.-мат. наук В. И.
Ивановым (гл. XII —XVI), канд. биол. наук Р. И. Татарской (гл. XVII и XVIII)
и д-ром хим. наук Р. М. Хомутовым (гл. IV, VII и VIII).
А. Баев
Я. Варшавский

ИЗ ПРЕДИСЛОВИЯ АВТОРОВ
Теплый прием, оказанный нашему первому учебнику
—«Биологической химии»,— побудил нас написать эту вторую книгу, рассчитанную на
несколько иной круг читателей, но вместе с тем сохраняющую в какой-то
степени главные особенности своей предшественницы. Опыт показал, что
с успехом пользоваться «Биологической химией» могут лишь студенты,
имеющие хорошую подготовку как по физической, так и по органической
химии. Кроме того, эту книгу оказалось довольно трудно приспособить
не только для односеместрового, но даже и для более длительного курса
обучения, в котором наряду с основным материалом рассматривается
значительное количество сведений частного характера, не имеющих] прямого
отношения к главным проблемам биохимии. Слабо подготовленные по химии
студенты и короткие учебные курсы — явление совершенно обычное, но
вряд ли этим можно извинить настолько поверхностное изложение предмета,
чтобы студент так и не приобрел в конечном итоге знаний, необходимых для
понимания тех проблем, с которыми ему предстоит иметь дело. Учитывая
это, мы попытались подготовить своего рода адаптированное издание
«Биологической химии», которое удовлетворяло бы предъявляемым требованиям.
Таким образом, главные различия между «Основами биологической химии»
и «Биологической химией» касаются не содержания или композиции, а самого
подхода к предмету. Математический анализ данных во всех тех случаях,
когда он представлялся нам слишком трудным, заменен простым описанием;
основной упор сделан не на физическую химию макромолекул или кинетику
и механизм ферментативных реакций, а на рассмотрение процессов
метаболизма и на проблемы молекулярной биологии; опущены слишком
подробные описания экспериментов и, наконец, для введения студентов в новые
области биохимии в меньшей степени используются оригинальные
экспериментальные данные. Мы надеемся, что при таких изменениях нам удастся
донести материал, составлявший содержание «Биологической химии», до
новой группы студентов, сделав его понятным и для них. Глубина
изложения, разумеется, приносится при этом в жертву как из-за сокращения
объема книги, так и потому, что мы вынуждены считаться с возможностями
нашей новой аудитории. Однако нам кажется необходимым подчеркнуть,
что и в таком новом виде освещение каждого раздела останется достаточно
серьезным и глубоким. Читатели старого и нового учебников будут,
очевидно, пользоваться разным языком, но общее понимание предмета будет
у них приблизительно одинаковым.
В композиционном отношении и по содержанию настоящая книга
отличается от «Биологической химии» следующим: 1) термодинамические
представления вводятся в ней раньше, 2) добавлена новая глава по химии
углеводов и 3) раздел по молекулярной биологии подвергся существенной
переработке.
Г. Малер
Ю. Кордес

Глава I ,
КРАТКАЯ ИСТОРИЯ И ПРЕДМЕТ БИОХИМИИ
ИСТОРИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ
Биологическая химия — наука, сложившаяся в основном в двадцатом
столетии. На современном этапе развития область, охватываемая
классической биохимией, расширилась настолько, что границы между этой наукой
и другими химическими и биологическими дисциплинами постепенно
стираются. Вполне вероятно, что в недалеком будущем биохимия как
самостоятельная отрасль знаний либо практически исчезнет вообще, либо,
напротив, расширится еще больше, вобрав в себя ряд таких разделов, которые
мы сейчас относим к химии или биологии.
Изучение проблем, составляющих предмет современной биохимии,
началось, по-видимому, около 200 лет назад. В течение последней половины
XVIII в. и на протяжении XIX в. неоднократно предпринимались попытки —
в том числе и довольно успешные — проникнуть в сущность процессов
жизнедеятельности, уяснить себе их природу как в структурном, так и в
метаболическом аспекте. Однако из-за очень большой сложности
рассматриваемых проблем нельзя было надеяться получить достаточно глубокое
представление о веществах, участвующих в этих процессах, и о химических
реакциях, из которых эти процессы слагаются, до тех пор пока другие
химические дисциплины, и в первую очередь аналитическая и органическая
химия, не достигли должной ступени развития.
Успехи структурной биохимии с самого начала были неразрывно
связаны с развитием органической химии. Толчком к развитию биохимии
послужили работы великого шведского химика Карла Шееле A742—1786),
посвященные изучению химического состава растительных и животных тканей.
Шееле выделил ряд природных соединений, в том числе винную, молочную,
мочевую, щавелевую, лимонную и яблочную кислоты, глицерин, некоторые
эфиры и казеин. В начале XIX в. в лабораториях Йёнса Берцелиуса и Юстуса
Либиха были разработаны новые, усовершенствованные методы
количественного элементарного анализа. С помощью этих методов было
установлено, что вещества, выделенные Шееле, содержат углерод. Вслед затем
начались попытки синтезировать углеродсодержащие, т. е. органические,
соединения. Это направление было очень важным, более важным, чем может
представиться на первый взгляд. Дело в том, что в то время был широко
распространен витализм, т. е. убеждение, что органические соединения
могут синтезироваться лишь с помощью особой «жизненной силы»,
присутствующей, как полагали, только в живых тканях. Синтез мочевины,
осуществленный Фридрихом Вёлером A800—1882) в 1828 г., по существу
показал несостоятельность витализма (хотя лишь немногие исследователи в то
время поняли это). Успешный синтез мочевины был неожиданным
результатом попыток приготовить цианат аммония при помощи реакции между
цианатами металлов и солями аммония. Несколько позднее, в 1844 г.,
Адольф Кольбе синтезировал уксусную кислоту, а в 1850-х годах Марселену
Бертло удалось уже осуществить синтез целого ряда органических соедине-

10 Г л а в а I
ний. Витализм получил отставку. Органический синтез начал развиваться
стремительными темпами.
В изучении структурной химии липидов важную роль сыграли работы
Мишеля Шеврёля A786—1889). Исследуя реакции омыления, Шеврёль
показал, что жиры состоят из жирных кислот и глицерина; некоторые из
этих жирных кислот ему удалось выделить. Заметный вклад в развитие
структурной биохимии внесли и некоторые другие авторы. Однако наиболее
изящные и значительные работы в этой области вышли, несомненно, из
лаборатории немецкого химика Эмиля Фишера A852—1919). Этот
замечательный человек полностью революционизировал исследования,
касающиеся структуры углеводов, аминокислот и жиров.
В XIX в. началось также выделение и описание высокомолекулярных
соединений, которые играют столь важную роль в живом организме.
Особенно следует отметить работы Мюльдера, Либиха, Шютценбергера и
других исследователей по выделению аминокислот из гидролизатов белка и опять-
таки опыты Фишера, который доказал, что аминокислоты связываются между
собой посредством карбоксильных и аминогрупп и высказал предположение
о том, как они связаны в нативном белке. В 1868 г. Ф. Мишер открыл
нуклеиновую кислоту в ядрах клеток гноя и тем самым положил начало изучению
этого важнейшего класса веществ.
Некоторые исследования, касающиеся метаболизма, также были начаты
еще в XIX и даже в XVIII в. под давлением нужд медицины и сельского
хозяйства. Особого упоминания заслуживают фундаментальные
исследования Антуана Лавуазье по дыханию, выполненные в период с 1779 по 1784 г.
Сравнивая при помощи калориметрических методов количества тепла,
выделяемые при горении и при дыхании живых клеток, Лавуазье пришел к
выводу, что дыхание — это, по существу, то же горение, хотя и более медленное,
но в принципе не сильно отличающееся, например, от горения древесного
угля. Это открытие стимулировало исследования по энергетике метаболизма,
в результате чего уже в начале XIX в. были определены количества тепла,
выделяемые при сгорании одного грамма углеводов, жиров и белка.
Приблизительно в то же время Теодор Шванн открыл, что процесс брожения
имеет биологическое происхождение. Шванн показал, что дрожжи — это
растительный организм, способный превращать сахар в спирт и СО2.
Многие ведущие химики того времени (среди них Берцелиус, Вёлер и Либих)
считали дрожжи неживыми и полагали, что брожение зависит
исключительно от присутствия кислорода.
Позднее многие крупные химики изучали процесс брожения. Самым
выдающимся среди них был Луи Пастер. Он идентифицировал ряд
микроорганизмов, осуществляющих различные типы брожения, в том числе и мас-
лянокислое, протекающее в отсутствие кислорода. Тем самым Пастер ввел
представление об аэробных и анаэробных микроорганизмах и о
соответствующих процессах брожения. Либих, придерживавшийся своей старой точки
зрения, возражал против выводов Пастера. Кульминацией этих
исследований явились опыты Эдуарда Бюхнера, который в 1897 г. показал, что
экстракты из дрожжевых клеток способны сбраживать'сахар. Это открытие
Бюхнера положило начало экспериментам, в ходе которых были
идентифицированы отдельные реакции или отдельные этапы процесса брожения,
а также отдельные ферменты, катализирующие каждую из этих реакций.
Кроме того, оно раз и навсегда покончило со всеми еще сохранявшимися
остатками витализма.
К другим важным научным событиям XIX в. относятся исследования
Соссюра по фотосинтезу и фиксации СО2 в растениях, работы Ладзаро
Спалланцани, Рене Рюомюра, Уильяма Бомонта и Клода Бернара по
физиологии пищеварения и разработка хирургических методов исследования,

Краткая история и предмет биохимии 11
применяемых в физиологии и биохимии животных. Важнейшим выводом
всех этих исследований явилось признание биохимического единства всего
живого. Наряду с биохимической индивидуальностью, свойственной
каждому отдельному виду, было обнаружено поразительное сходство общих
принципов и механизмов, при помощи которых резко отличающиеся друг
от друга формы жизни решают сходные задачи. Этот вывод чрезвычайно
упрощал общую проблему понимания природы жизненных процессов.
Подлинный расцвет биохимии наступил в XX в. Важные открытия во
многих областях следовали одно за другим. В области медицинской
биохимии наиболее существенным явилось выяснение пищевых потребностей
человеческого организма. Фредерик Гопкинс и его коллеги в Кембриджском
университете установили значение ранее не известных компонентов пищи
и на этой основе развили концепцию заболеваний, обусловленных пищевой
недостаточностью. За этими работами последовала серия опытов на
животных с применением синтетического корма. Важную роль сыграли при этом
исследования Бэбкука, Мак-Коллума, Осборна, Шермана и Менделя. Было
установлено, что пеллагра, цинга, рахит и бери-бери вызываются
неполноценным питанием; «лекарством» от таких болезней оказались витамины
(этот термин был введен польским биохимиком Функом). Витамины
удалось выделить, а затем и охарактеризовать главным образом благодаря
работам Мак-Коллума, Сент-Дьёрдьи, Стинбока и Эльвейема.
Во многих лабораториях — в том числе в лабораториях Гардена и Йонга
ж Эмбдена и Мейергофа — продолжались работы, начатые Бюхнером на
бесклеточных системах, способных катализировать процесс брожения. В
результате этих работ были четко установлены биохимическрте характеристики
этого процесса. Варбург выяснил структуру некоторых кофакторов,
необходимых для брожения. Спустя два десятка лет появилась замечательная
работа Кребса по окислительному метаболизму углеводов и ряд других
важных исследований по промежуточному метаболизму, в частности работы
Грина, Линена, Лелуара, Блоха, Кеннеди, Кребса и Дэвиса. Изложению
результатов этих исследований посвящена большая часть нашей книги.
В остальной части излагаются преимущественно результаты работ по
изучению свойств макромолекул, главным образом белков и нуклеиновых
кислот.
Интерес к структуре и биохимическим свойствам белков резко
стимулировала классическая работа Самнера. Этот автор в 1926 г. установил, что
биокатализаторы, т. е. ферменты, представляют собой белки. Само явление
катализа было описано в 1835 г. Берцелиусом. В своей статье он указывал,
что диастазу из картофеля — фермент, катализирующий гидролиз крахмала,—
можно рассматривать как пример биокатализатора и что, по-видимому,
все компоненты живых тканей образуются под действием таких
катализаторов. Последующие работы полностью подтвердили этот вывод. Некоторые
вещества этого рода были известны и ранее, еще до открытия
биокатализаторов; теперь же многие биокатализаторы были выделены и
подвергнуты частичной очистке, что дало возможность исследовать кинетику
катализируемых ими реакций. Эти исследования наряду с развитием
динамических аспектов биохимии (о чем шла речь выше) привлекли пристальное
внимание к ферментам. Тем не менее до работ Самнера химическая природа
ферментов оставалась совершенно неизвестной. Правда, первые
исследователи, работавшие в этой области, высказывали предположение, что
ферменты имеют белковую природу, но в начале XX в. принято было считать,
что ферменты не принадлежат ни к одному из известных классов
органических соединений. Открытие Самнера было встречено весьма скептически,
особенно со стороны Вилъштеттера и его учеников. Между тем утверждение
Самнера основывалось на экспериментальных данных: ему удалось полу-

12 Г л а в а I
чить в кристаллическом виде фермент уреазу, изучить ее химический состав
и показать, что под действием протеолитических ферментов кристаллическая
уреаза деградирует и утрачивает свою ферментативную активность. Самнер
был упорным и настойчивым человеком, он был вооружен убедительными
доказательствами и не капитулировал перед авторитетами. Немного позднее
эксперименты Нортропа и Кунитца по очистке ферментов подтвердили
белковую природу биокатализаторов и Самнер был единодушно признан
отцом современной энзимологии. Неоценимые заслуги в развитии этого
направления связаны с именами дю Виньо, Сэнгера, Штайна, Мура, Перутца,
Кендрью и Филлипса. Одновременно благодаря работам Чаргаффа, Уотсона,
Крика и Уилкинса была выяснена структура дезоксирибонуклеиновой
кислоты. Наступила эра молекулярной биологии.
ПРЕДМЕТ БИОХИМИИ
В начале XX в. биохимики занимались в основном изучением
промежуточного обмена, т. е. выяснением путей синтеза и распада веществ,
входящих в состав живых тканей. Эти исследования сохранили свое значение
и по нынешний день, однако теперь они уже це занимают центрального места
в биохимии. В настоящее время можно указать девять основных
направлений биохимических исследований:
1. Промежуточный обмен.
2. Физическая химия биологических макромолекул, главным образом
белков и нуклеиновых кислот.
3. Органическая химия реакций, катализируемых ферментами.
4. Биосинтез белков и нуклеиновых кислот.
5. Биоэнергетика, главным образом механизмы образования аденозин-
трифосфата (АТФ) в процессах окисления и фотофосфорилирования.
6. Регуляторные механизмы клетки.
7. Ультраструктура клетки.
8. Молекулярные основы наследственности и процессов морфогенеза.
9. Молекулярные основы различных физиологических явлений, таких,,
как проведение нервного возбуждения, мышечное сокращение, зрение и
перенос веществ через мембраны.
БИОХИМИЧЕСКАЯ ЛИТЕРАТУРА
В настоящее время важнейшие открытия в биохимии быстро следуют-
одно за другим. Это делает совершенно обязательным достаточно полное
знание биохимической литературы. Поэтому мы помещаем ниже список
наиболее важных периодических изданий, в которых публикуются работы
по биохимии.
Журналы, в которых публикуются обзорные статьи1
Advances in Carbohydrate Chemistry (Advan. Carbohydrate Chem.).
Advances in Enzymology (Advan. Enzymol.).
Advances in Protein Chemistry (Advan. Protein Chom.).
Annals of the New York Academy of Sciences (Aim. N.Y. Acad. Sei.).
Annual Reports of the Chemical Society (Ann. Uops.).
Annual Review of BiocbcmisLry (Ann. Rev. Biochem.).
Annual. Review of Microbiology (Ann. Rev. Microbiol.).
Annual Review of Physiology (Ann. Hev. Physio!.).
Annual Review of Plant Physiology (Ann. Rev. Plant Physio!.).
Bacteriological Reviews (Bacteriol. Rev.).
1 В скобках приведено название, припятое и библиографических ссылках
(сокращенное нли полное .

Краткая история и предмет биохимии 13
Biochemical Journal (Biochem. J.).
Biochemical Society Symposia (Biochem. Soc. Symp.).
Biological Reviews (Biol. Rev.).
British Medical Bulletin (Brit. Med. Bull.).
Chemical Reviews (Chem. Rev.).
Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology (Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol.).
Essays in Biochemistry (Essays in Biochem.).
Harvey Lectures (Harvey Lectures).
Physiological Reviews (Physiol. Rev.).
Quarterly Review of Biology (Quart. Rev. Biol.).
Quarterly Reviews of the Chemical Society (Quart. Rev. (London)).
Vitamins and Hormones (Vitamins and Hormones).
Успехи современной биологии (Успехи соврем, биол.).
Успехи биологической химии (Успехи биол. химии).
Журналы, в которых публикуются оригинальные работы
Acta Chemica Scandinavica (Acta Chem. Scand.).
American Journal of Physiology (Am. J. Physiol.).
Analytical Biochemistry (Anal. Biochem.).
Archives of Biochemistry and Biophysics (until 1951, Archives of Biochemistry) (Arch.
Biochem. Biophys. (until 1951, Arch. Biochem.)).
Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft (Chem. Ber.).
Biochemische Zeitschrift (Biochem. Z.).
Biochimica ot Biophysica Acta (Biochim. Biophys. Acta).
Biochemical and Biophysical Research Communications (Biochem. Biophys. Res. Comn.).
Biochemistry (Biochemistry).
Biochemistry (Eng. trans, of Biokhimiya) (Biochemistry (U.S.S.R.) (English trans.).
Biopolymers (Biopolymors).
Bulletin de la Societe Chimie Biologique (Bull. Soc. Chim. Biol.).
Canadian Journal of Biochemistry (Can. J. Biochem.).
Comparative Biochemistry and Physiology (Сотр. Biochem. Physiol.).
Comptes Rendus (Compt. Rend.).
Enzymologia (Enzymologia).
Federation Proceedings (Federation Proc).
Helvetica Chimica Acta (Helv. Chim. Acta).
(Hoppe—Seyler's) Zeitschrift fur Physiologische Chemie (Z. Physiol. Chem.)
Journal of the American Chemical Society (J. Am. Chom. Soc).
Journal of Bacteriology (J. Bactoriol.).
Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.).
Journal of Cell Biology (J. Cell. Biol.).
Journal of Cellular Physiology (J. Cellular Physiol.).
Journal of Chromatography (J. Chromatog.).
Journal of Lipid Research (J. Lipid Res.).
Journal of Molecular Biology (J. Mol. ?iol.).
Journal of Biochemistry, Tokyo (J. Biochom. (Tokyo)).
Journal of the Chemical Society (J. Chem. Soc).
Journal of Experimental Medicine (J. Exp. Med.).
Journal of General Microbiology (J. Gen. Microbiol.).
Journal of General Physiology (J. Gen. Physiol.).
Journal of Immunology (J. Immunol.).
Journal of Neurochemistry (J. Nourochem.).
Journal of Nutrition (J. Nutr.).
Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.).
Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (J. Pharmacol. Exp. Therap.).
Journal of Physical Chemistry (J. Phys. Chem.).
Journal of Physiology (J. Physio].).
(Liebig's) Annalen der Chemie (Ann. Chem.).
Nature (Nature).
Naturwissenschaften (Naturwissenschaften).
Plant Physiology (Plant Physiol.).
Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.).
Proceedings of the Royal Society (Proc. Roy. Soc. (London)).
Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine (Proc. Soc. Exp. Biol.
Med.).
Science (Science).
Zeitschrift fur Naturforschung (Z. Naturforsch.).

14
Глава І
Биохимия
Молекулярная биология (Мол. биол.).
Украинский биохимический журнал (Укр. биохим. журн.).
Журнал эволюционной биохимии и физиологии (Журн. эвол. биохим. и физиол.).
Вопросы медицинской химии (Вотгр. мед. химии).
Биофизика
Прикладная биохимия и микробиология (Прикл. биох. и микробиол.).
Химия природных соединений (Хим. природи, соед.).
Известия Академии Наук СССР, серия биологическая (Изв. АН СССР, сер. биол.).
Доклады Академии Наук СССР (Докл. АН СССР).
ПРИНЯТЫЕ В БИОХИМИИ СОКРАЩЕНИЯ
Язык биохимии использует сокращения, быть может, гораздо чаще, чем
язык любой другой дисциплины. В табл. 1 и 2 приведен ряд таких
сокращений. Список этот, конечно, не является исчерпывающим, но он,
несомненно, может помочь читателю ориентироваться в литературе.
Таблица 1
Сокращенные обозначения мономерных единиц в макромолекулах
(или фосфорилированиых соединениях)
Сокращение,
принятое в
иностранной
литературе
A. Ado
Ala
Arg
Asp
Asp(NH,), Asn
C, Cyd "
Cvs1)
Cys
de, d
f
Fru
Gal
G, GIc
G. Guo
GlcA
GlcN
GicNAc
GlcUA
Glu
Glu(NH2), Gin

Сокращение,
принятое в
русской
литературе
А
Ала
Apr
Асп
Аспн
Ц
Цисі)
Цио
д
Гал
Г
Глу
Глун
Полное название
Аденозин
Алании
Аргинин
Аспарагшювая
кислота
Асцарагин
Цитидиті
Цистин
Цистсин
Дезокси- (в
названиях углеводов
и яуклеотидов)
Фураноза
Фруктоза
Галактоза
Глюкоза
Гуаноаиы
Глюконовая
кислота
Глюкоз амин
N-ацетилглюкоз-
амин
Глюкуроновая
кислота
Глутаминовая
кислота
Глутамиы
Сокращение,
принятое в
иностранной
литературе
Gly
His
Hyl
Hyp
I, Ino
He
Leu
Lys
Man
Met
Nir
Orn
P. V
P
Phe
Pro
Rib
Ser
Thr
Trp
T, Thd
Туг
U, Urd
Val
Хао

Сокращение ПЛИ-
нятое в
русской
литературе
Гли
Гпс
Опро
И
Илей
Лей
Лиз
Мот
Ф
Фен
Про
Р
Сер
Тре
Три
Т
Тир
У
Вал
Кс
Полное название
Глицин
Гистидин
Оксилизин
Оксипролии
Инозин
Изолойцин
Лейцин
Лизин
Маниоза
Метионин
Рибозшшикотин-
амид
Орнитин
Фосфат
Пираноза
Фонилаланин
Пролип
Рибоза
Серив
Треонин
Триптофан
Тпмидин
Тирозин
Уридин
Валин
Ксантозин
1) Символ относится к половине шолокулы цпстипа, т.е. к остатку цистсина (поскольку молекула
цистина состоит из двух остатков цистеина). Чтобы подчеркнуть это, в иностранной литературе
принято, пользуясь символом Cys, ставить над буквой s (или под ней) химическую связь.

Таблица 2
Сокращения полусистематических или тривиальных названий
некоторых важных соединений
Сокращение, принятое
в иностранной
литературе
АСТН
ADP
AMP
ATP
BAL
CDP
CM-cellulose
CMP
Co A, CoASH
CoASAc
CTP
DEAE-cellulose
DDT
DFP
DNA
DNP-
DOPA
DPN
DPT
EDTA
FAD
FDNB
FMN
GDP
GMP
GSH
GSSG
GTP
Hb, HhCO, HhO2
IDP
IMP
ITP
Mb, MbCO, MbO2
MetHb, MetMb
MSH
NAD
NADP
NMN
P*
PP;
HNA
TBAE-celhilose
TPN
Tris
UDP
UDPG
UMP
UTP
Сокращение,
принятое в
русской литературе
АКТГ
АДФ
АМФ
АТФ
БАЛ
ЦДФ
КМ-целлюло-
за, КМЦ
ЦМФ
Ко А
Ацетил-КоА
ЦТФ
ДЭАЭ-целлю-
лоза
ДДТ
ДФФ
ДНК
ДНФ-
ДОФА
ДПН і)
ТПФ
ЭДТА
ФАД
ГДФ
ГМФ
ГТФ
ИДФ
ИМФ
ИТФ
мсг
НАД
НАДФ
нмн
Фп
ФФн
РНК
ТТТН 2)
ТРИС
УДФ
УДФГ
УМФ
УТФ
Полное название
Адренокортикотрошшй гормон
Аденозин-5'-дифосфат
А денозин-5' -фосфат
А денозин-5 ' -трифосфат
2,3-димеркаптопропанол (британский антилюизит]
Цитидип-5'-дифосфат
О-(карбоксиметил)-целлюлоза
Цити дии-5 ' -фосфат
Кофермент А
Ацетилкофермент А
Цитидин-5 '-трифосфат
О-(диэтиламиноэтил)-целлюлоза
1,1,1-трихлор-2,2-бис-(гс-хлорфевил)-этан
Диизопропилфторфосфат
Дезоксирибонуклеиновая кислота
2,4-динитрофенил-
3,4-диоксифенилаланин
Дифосфопиридшшуклеотид
Дифосфотиамии (тиаминпирофосфат, кокарбо-
\? f* Tf ТТ її Q Д \
Этилепдиаминтстраацетат
Флавянадениндинуклеотид
1-фтор-2,4-динитробензол
Рибофлавип-5'-фосфат (флавипмононуклаотид)
Гуанозин-5 '-дифосфат
Гуанозин-5'-фосфат
Глутатиои
Окисленный глутатион
Гуанозин-5 '-трпфосфат
Гемоглобин, карбоксигвмоглобин, оксигемо-
глобин
Ипозин-5 '-дифосфат
Инозин-5 '-фосфат
Ипозші-5 ' -трпфосфат
Миоглобил, карбоксимиоглобин, оксимиоглобин
Мстгемоглобин, метмиоглобип
Мзланоцитстимулирующий гормон
Никотинамидадепиндинуклеотид (козимаза, ко-
фермонт 1, дифосфопиридиннуклеотид)
Никотинамидадепиіідинуклеотидфосфат
(кофермент II, трифосфопиридиннуклеотид)
Ншсотинамидмопонуклеотид
Неорганический ортофосфат
Неорганический пирофосфат
Рибонуклеиновая кислота
О-(триэтиламиноэтил)-целлголоза
Трифосфопиридиннуклеотид
2'рис-(оксимстии)-амииометан B-амино-2-оксиме-
тилнропан-1,3-дмол)
Уридшгдифосфат
Уридиндифосфатглюкоза
Уридиимоиофосфат
Урпдинтрифосфат
і) В настоящее время используется обозначение НАД.
2) В настоящее время используется обозначение НАДФ.

16 Г л а в а I
ЛИТЕРАТУРА
С h і t t о n d о n R. И., The Development of Physiological Chemistry in the United
States, Chemical Catalogue Company, Inc., New York, 1930.
I h d о A. J., The Development of Modern Chemistry, Harper and Row, Publishers, Inc.,
New York, 1964.
Partington J. R., A Short History of Chemistry, Harper and Row, Publishers, Inc.,
New York, 1960.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
З б a p с к и й И. В., И в а н о в И. И., Мордашев СР., Биологическая химия,
изд-во «Медицина», Л., 1965.
Фердиан Д. Л., Биохимия, изд-во «Высшая школа», М., 1966.
III. т р а у б Ф. Б., Биохимия, изд-во АН Венгрии, Будапешт, 1965.
Рапопорт С. М., Медицинская биохимия, изд-во «Мир», М., 1966.
Б р о о л е р С. Е., Введение в молекулярную биологию, изд. 2-е, изд-во «Наука»,
М.— Л., 1966.
В ольконште й н M. В., Молекулы и жизнь, введение в молекулярную биофизику,
изд-ио «Наука», М., 1965.
Мартин Р., Введение в биофизическую химию, изд-во «Мир», М., 1966.
Грин Д., Г о л ь д б е р г о р Р., Молекулярные аспекты жизни, изд-во «Мир», М.,
1968.
И н г р э м В., Биосинтез макромолекул, пзд-во «Мир», М., 1966.
А п ф и н с о н К., Молекулярные основы эволюции, ИЛ, М., 1962.
Хаггис Дж., Михи Д., Мюир А., Роберте К., Уокер П., Введение
в молекулярную биологию, изд-во «Мир», М., 1967.
Па сын с кий А. Г., Биофизическая химия, изд. 2-е, изд-во «Высшая школа», М.,
1968.
У от с он Дж., Молекулярная биология гена, изд-во «Мир», М., 1967.
Д ж у а М., История химии, изд-во «Мир», М., 1966.

Глава II
ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
Для получения полного представления о биохимических процессах
часто бывает необходимо определить равновесные (термодинамические)
характеристики отдельных реакций или систем реакций. В этой главе
изложены основы протолитического равновесия и равновесия с участием ионов
металлов, а также методы расчета изменений основных термодинамических
функций — свободной энергии G (или F), энтальпии H и энтропии S. Кроме
того, приведены отдельные примеры расчета биохимически важных
равновесий.
ПРОТОЛИТИЧЕСКОЕ РАВНОВЕСИЕ
Многие биохимические процессы зависят от степени ионизации
участвующих в них молекул. К их числу относятся реакции, катализируемые
ферментами, связывание белками различных ионов, процесс переноса кислорода
с участием гемоглобина, конформационные изменения белков и других
биополимеров, поведение малых и больших молекул при электрофоретическом
и хроматографическом разделении и т. д. Мы начнем поэтому наше
рассмотрение с проблемы протолитического равновесия.
pH-шкала. «Кислотность» водных растворов удобнее характеризовать
не самой концентрацией ионов водорода, а ее отрицательным логарифмом,
т. е. величиной pH. Если не учитывать различия между концентрациями
и активностями (что приводит обычно к ошибке <0,1 единицы pH), то можно
написать
pHs-lg[H+].
Это означает, что для 0,1 M раствора любой сильной кислоты pH равен 1,
для чистой воды — 7, а для 0,1 M раствора сильной щелочи — 13.
Величины pH измеряют обычно pH-метром, снабженным стеклянным
электродом. Если измерения проводить тщательно, то хороший современный рН-
метр обеспечивает точность ±0,01 единицы pH. Более точные определения
pH проводятся с использованием ячеек для измерения ЭДС, в которых
исключена возможность переноса раствора.
ВЫЧИСЛЕНИЕ ЗНАЧЕНИЙ pH В СИСТЕМАХ,
СОДЕРЖАЩИХ КИСЛОТУ ИЛИ ОСНОВАНИЕ ИЗВЕСТНОЙ СИЛВІ
Для водных растворов сильных (т. е. полностью диссоциированных)
кислот или оснований значения pH могут быть легко вычислены, если
известна концентрация кислоты или основания в растворе. Ясно, что в случае
сильных одноосновных кислот pH = — lg С, а в случае сильных
оснований pH = 14 — lg С, где С — молярная концентрация кислоты или
основания, а 14 — отрицательный логарифм константы диссоциации воды, Kw =
= [Н+] [ОН"] = 10~14. Для водного раствора слабо диссоциированной
2—246

18 Глава 11
кислоты (или основания) расчет несколько усложняется. Пусть Ка~
константа диссоциации слабой кислоты НА, а С — общая концентрация А-
содержащих частиц (молекул или ионов), т. е.
к J№\V?\ (ИЛ)
а~~ [НА| •
Условием общей электронейтральности раствора является равенство
концентраций анионов и катионов:
= [H+]. (П.2)
Поскольку концентрация гидроксильных ионов в умеренно кислых растворах
очень мала, уравнение (II.2) можно записать в упрощенной форме
(II.3;:
Подставляя уравнение (И.З) в уравнение (II.1), получаем
Решив это квадратное уравнение относительно [Н+], получаем
[Н+] = 1/2 \-Ка ± {Kl iJ
В большинстве случаев пользуются несколько более простым уравнением,
которое может быть выведено из уравнения (П.4), если учесть, что обычно
С > |Н+]. Например, для 0,1 M раствора уксусной кислоты С = 0,1,
а [Н+] ~ 0,002. Решение уравнения (П.4) приводит в таком случае к
выражению
СКа. (П.6)
Производя логарифмирование и перестановки и учитывая, что — lg/iT = pA'a,
получаем
til
В случае упомянутого выше 0,1 M раствора уксусной кислоты расчетУпо
уравнению (И.5) дает для pH величину 2,878, а расчет по уравнению (II.7) —-
величину 2,875 (Ка уксусной кислоты принимается при этом равным
1,76• 10~5, а трКа = 4,75). Этот расчет ясно показывает, что если молярная
концентрация; С не слишком мала, а кислота является не слишком сильной,
то уравнение (И.7) вполне пригодно для вычисления значения pH.
Аналогичные уравнения могут быть выведены и для слабо диссоциированных
оснований. Уравнение, аналогичное уравнению (П.7), имеет в этом случае
следующий вид:
где j)Ka относится к сопряженной кислоте добавленного в раствор
основания.
ТИТРОВАНИЕ СЛАБОЙ КИСЛОТЫ СИЛЬНЫМ ОСНОВАНИЕМ
Уравнение Гендерсона — Хассельбаха. Значения pH для раствора
слабой кислоты, к которому добавлено известное количество сильного
основания (например, едкого натра или едкого кали), можно рассчитать, исходя
иа рассуждений, аналогичных приведенным выше. Основное отличие в этом
случае состоит в том, что уравнение электронейтральности раствора должио
быть переписано таким образом, чтобы в него вошло выражение для катиона •

Термодинамические характеристики биохимических процессов
19
сильного основания. Так, например, если С имеет прежний смысл, а X
означает количество прибавленного сильного основания, то уравнение
эдектропейтральности будет иметь вид
[М+] + 1Н+] = [А-] + ЮН-] - 1А-].
A1.9)
Учитывая, что [М+] = X, уравнение для Ка можно записать в следующем
виде:
^ _[H+]fA-l _ [Н+] [Н+ + Х1
[НА]
6' —X —[H+J
(П.10)
Хотя это уравнепие может быть решено непосредственно, лучше
воспользоваться тем, что обычно X, С^>[Н+[; в этом случае уравнение (П.10)
упрощается и принимает вид
к LH+i fxJ
с-х
(U.li)
Логарифмируя обе части уравнения, получаем
г, ,, , , X „ , ГОснование]
pH = vKa-I- lg -c—^ = PAa + lg Lj^
A1.12)
Это хорошо известное и очень полезное уравнение, называемое уравнением
Гендерсона — Хасселъбаха. Оно показывает, что рА"а есть точно то
значение pH, при котором половина молекул НА находится в диссоциированной
форме, а половина — в ассоциированной, иными словами, при котором
концентрация кислоты равна концентрации основания. Значение рКа
количественно характеризует силу кислоты: сильные кислоты имеют низкие рКа,
а слабые — высокие. В табл. 8 приведены значения р7?0 для,наиболее часто
встречающихся аминокислот; для ряда других соединений, интересных
с биохимической точки зрения, значения j)Ka указаны в табл. 3.
Таблица S
Значения констант кислотной диссоциации (рКа) некоторых важных кислот
Кислота
Уксусная
Хдоруксусная
Трихлоруксусная
Пропионовая
Молочная
I [ировиноградная
Ацетоуксусная
Яблочная
Малат-моноаниоп
Фумаровая
Фумарат-моноавпон
Лимонная
Сопряженное
основание
Ацетат
Хлорацетат
Трихлорацетат
Пропиоиат
Лактат
Пируват
Ацетоацотат
Малат-моноанион
Малат-дианион
Фумарат-моно-
анион
Фумарат-дианион
Цитрат-моно-
ашгоп
4,75
2,86
0,65
4,88
3,86
2,50
3,58
3,40
5,20
3,03
4,54
3,09
Кислота

Цитрат-моноаннон
Цитрат-диапион
Иоп аммония
Иоп метиламмо-
ния
Ион имидазолия
Иоп трис-(окся-
метил)-метил-
аммония
Н3РО4
п2ро5-
НРОГ
Сопряженное
основание
Цитра т-дианион
Цитрат-трианиои
Аммиак
Метиламин
Имидазол
Грис-(оксиме-
тил)-аминоме-
тан
H2POj
НРОі-
РО|-
4,75
5,41
9,21
10,62
7,12
8,10
Мало
7,21
12,32
На фиг. 1 представлена кривая зависимости величины pH титруемого
раствора уксусной кислоты от числа эквивалентов прибавляемых гидро-
ксильных ионов. Величину -рКа часто оценивают, исходя из положения
средней точки на кривой титрования. В области, удаленной от рКа, т. е. от
pH 4,75 для уксусной кислоты, добавление даже небольших количеств

20
Глава II
основания вызывает очень быстрое изменение pH. Вблизи трКа, т. е. при
значениях pH, близких для уксусной кислоты к 4,75, pH раствора кислоты
при добавлении основания изменяется очень слабо: в этой области растворы
уксусной кислоты представляют собой буферы. Буферный эффект важен
для биохимика в двух отношениях: во-первых, за счет этого эффекта в
организме может поддерживаться более или менее постоянное значение pH как
во внутриклеточной, так и в межклеточной среде; во-вторых, этот эффект
позволяет поддерживать постоянство pH растворов, что часто бывает
необходимо при работе с биохимическими препаратами в лаборатории. Легко
доказать, что буферная емкость является максимальной при значении pH,
равном величине ipKa кислого компонента буферной смеси. Если буферное
Фиг. 1, Титрование уксусной кислоты.
число определить как dX/d!pH и обозначить через а отношение [Основание]/
/([Кислота] +• [Основание]), то dX/dpH = const-аа/атрИ. Записывая
уравнение Гендерсона — Хассельбаха в дифференциальной форме и вводя в него
величину а, получаем
откуда следует, что
= 2,3a(l — a), или -r—^= const-2,3aA — a).
A1.13)
A1.14)
Поскольку произведение a A—a) имеет максимум при a = 0,5, т. е. при pH,
равном трКа, отсюда прямо следует, что буферная емкость также достигает
максимума при трКа. Практически данную пару кислота — основание можно
обычно использовать в качестве буфера в интервале pH, охватывающем
значения от (рКа — 1) до (трКа + 1).
Двухосновные кислоты. Протолитическое равновесие аминокислот.
На фиг. 2 представлена кривая титрования глицина. Такая кривая
характеризует две ступени диссоциации этого соединения со значениями j>Ka,
равными 2,35 и 9,78. Данные, приведенные в табл. 8, показывают, что puTal

Термодинамические характеристики биохимических процессов
21
B,35) соответствует ионизации карбоксильной группы^глицина, a
(9,78) — ионизации иона аммония. Хотя такая интерпретация кривой
титрования довольно точно отражает ионизацию глицина, она все же слиш-
2,0
i?
1,6
1,2
J 10
I о,8
0,2
10 12
pH
Фиг. 2. Титрование глицина.
ком упрощена и в отдельных случаях может приводить к существенным
ошибкам. Истинную картину ионизации глицина можно представить в виде
следующей схемы:
H3N
H3N-CH2-CO?
ш
НАН
2—СН2-СО2Н^
NH2—СН2—СОЇ
A1.15)
АН
Эта схема описывает ионизацию при помощи четырех промежуточных
констант диссоциации (микроконстант) ка, къ, кс и kd, каждая из которых
соответствует одному из четырех промежуточных процессов диссоциации
в системе. Константы связаны между собой соотношением какс = kbkd.
Следовательно, если известны три промежуточные константы, то четвертая
определяется однозначно. Наблюдаемые на опыте константы диссоциации
(макроконстанты) Kt и К2 связаны с промежуточными константами
следующим соотношением:
1 [HAH]
[H+] [А]
2 ([НА]-НАН])"
ьі
kckd
A1.16)
A1.17)
Таким образом, в выражение для наблюдаемой константы Kt входят
члены, отражающие процесс отщепления протона как от карбоксильной,

22 Глава II
так и от аммониевой форм глицина. В выражение для К2 входят
аналогичные члены. Поскольку мы имеем три независимые промежуточные константы
и только две константы, измеряемые на опыте, последних недостаточно для
определения первых. Однако величина къ может быть оценена исходя из
константы диссоциации, например, этилового эфира глицина Ка = 2-10~8.
Принимая fef, = Ка и используя уравнения A1.16) и A1.17), имеем
ка = Kt -kb = Ki - Ка = 4,45 • КГ3 - 2 • Ю'8 ~ 4,45 • 10,
ni,
В случае глицина, следовательно, величина К^ весьма близка кка, а
величина Кг — к кс, что согласуется с приведенным выше определением
наблюдаемых констант как индивидуальных констант ионизации. Существенные
различия между наблюдаемыми и промежуточными константами
отмечаются только в тех случаях, когда константа ка близка по величине к
константе къ или кс близка к kd.
Отношение ка/кь позволяет получить независимое от pH отношение
между концентрациями цвиттерионной и незаряженной форм молекулы
глицина:
къ [АН]
Величина этого отношения ясно показывает, что при всех значениях pH
раствора цвиттерионная форма глицина преобладает над незаряженной
формой (см. стр. 46).
РАВНОВЕСИЕ ИОН МЕТАЛЛА - ЛИГ АНД
Связывание протонных кислот (кислот Брёнстеда) с анионными или
нейтральными основаниями может рассматриваться как частный случай
связывания обобщенных кислот (кислот Льюиса и Брёнстеда) с
обобщенными основаниями. Другой очень важный частный случай — связывание
ионов металлов с анионными или нейтральными лигандами. Эти два случая
очень сходны, поскольку гидратированпый протон и ионы металлов часто
конкурируют друг с другом за реакционноспособные участки в молекуле
соответствующих оснований, таких, например, как аммиак и имидазол.
Ионы металлов играют заметную роль в биохимических процессах,
обусловленную отчасти их способностью связываться как с большими,
так и с малыми молекулами. Большие молекулы — это нуклеиновые кислоты
и белки. Комплексы ионов металлов с белками подразделяются на две
основные группы. В комплексах первой группы ионы металла являются
составной частью структуры белковых молекул и не могут быть выделены
из белка без разрушения этой структуры. Такие белки называют металло-
протеидами. Помимо них известно большое число комплексов, для которых
характерно обратимое взаимодействие ионов металла с белком. Образование
комплексов, принадлежащих к этой второй группе, обычно стабилизирует
определенную конформацию белковой части комплекса. Ярким примером
важности взаимодействия между ионами металлов и малыми органическими
молекулами может служить связывание АТФ с ионами металлов, абсолютно
необходимое для того, чтобы молекулы АТФ могли принимать участие
в ферментативных реак иях, зависящих от АТФ.

Термодинамические характеристики биохимических процессов
23
Основное различие между протолитическим равновесием и равновесием
с участием ионов металлов определяется тем, что ионы металлов обычно
реагируют более чем с одним участком молекулы лиганда основной природы.
Так, системы ион металла — лигапд могут быть описаны, если
предположить ступенчатое образование комплексов MA, MA2 . • • МА„, где M — ион
металла, А — лиганд и п — максимальное число лигандов, способных
связываться с М. Для последовательного присоединения лигандов к ионам
металла можно написать серию констант равновесия К^, К2 ... Кп:
К,=
I MA]
|МА2]
••• ЛП-=
IMAJ
A1.20)
]M]lAj ' "z
G другой стороны, те же системы могут быть описаны как функции
суммарных констант ассоциации ?1; ?2 . . . ?„, для которых можно написать
?„ = [МА„1/[М][А1™. Эти константы связаны с «постадийными»
константами соотношениями ?± = -ЙГі, ?2 ~ KiK2 . . .?„ = К{К2 ¦ ¦ ¦ Kn.
Суммарные константы ассоциации могут быть измерены методом кондуктометрии,
спектрофотометрии и при помощи ряда других методов.
Для ионов металлов характерна способность реагировать либо с двумя
лигандами (линейное расположение), либо с четырьмя лигандами
(расположение лигандов в одной плоскости или в углах тетраэдра при центральном
размещении иона металла), либо с шестью лигандами (расположение
лигандов в углах октаэдра при центральном размещении иона металла). Число
комплектирующихся лигандов и стереохимия комплекса зависят как от
природы иона металла, так и от природы лиганда.
Как правило, константы ассоциации при ступенчатом образовании
комплекса (уравнение 11.20) имеют тенденцию к уменьшению по мере
увеличения числа лигандов. (В качестве примера укажем, что логарифмы констант
ассоциации, характеризующих присоединение одной, двух, трех или
четырех молекул имидазола к иону Си2+, равны соответственно 4,36; 3,57; 2,85;
2,06.) Эта тенденция обычно проявляется особенно сильно в тех случаях,
когда основная форма лиганда несет суммарный заряд (пример —
кислородсодержащий анион), так как присоединение последующих лигандов
приводит к возникновению между лигандами постепенно возрастающего
электростатического отталкивапия.
В табл. 4 приведены логарифмы констант ассоциации при образовании
комплексов ион металла — лиганд A : 1).
Таблица 4
Логарифмы констант ассоциации при образовании некоторых комплексов
Лиганд
Уксусная кислота
Щавелевая кислота
Аммиак Ку
А'2
Этилендиамин
Имидазол
Гистидип
Глицип
Глутатион (только сульф-
гидрильная группа)
Меркаптоуксуспая
кислота
Меркаптопропиоповая
кислота
2-меркаптоэтиламип
Цистеип
Н+
4,7
4,2
9,3
10,1
7,0
9,2
9,7
8,9
10,6
10,4
10,8
10,5
Mg2+
0..
3,4
Са2+
0,5
3,0
-0,2
0,1
1
3,4
1,4
3,9
2,7
1,7
1,8
3,4
1,9
4,4
4,1
Fe2+
4,7
4,3
5,5
6,2
6,2
Со 2+
4,7
2,1
1,6
5,9
2,4
6,9
5,2
3,7
5,8
10,2
9,3
юн
0,7
5,3
2,8
2,2
7,7
3,3
8,7
6,2
4,0
7,0
5,2
10,1
10,5
Cu2+
2,0
6,2
4,2
3,5
10,6
4,3
10,4
8,6
Zn2+
1,0
4,9
2,4
2,4
5,7
2,6
6,6
5,5
5,0
7,8
6,8
9,9
9,9

24 Г лав а II
На основе этих данных можно заключить, что стабильность комплексов
ион двухвалентного металла — лиганд изменяется в следующем порядке:
Са < Mg < Мп < Fe < Со < Ni < Си > Zn.
Этот порядок практически не зависит от природы лиганда.
Данные табл. 4 показывают также, что константы ассоциации тех лиган-
дов, которые содержат более одного участка, доступного для связывания
с ионом металла, во много раз превышают константы лигандов с одним
реакционноспособным участком. Более того, константы ассоциации лиганда
с двумя активными участками больше суммы констант ассоциации двух
отдельных лигандов, содержащих эти активные участки. Так, например,
глицин связывает ионы металлов сильнее, чем смесь уксусной кислоты
и аммиака. В тех случаях, когда ион металла связывается с двумя или более
атомами одного лиганда, говорят об образовании хелатного комплекса. Все
аминокислоты, например, способны образовывать с ионами металлов хелат-
пые комплексы. Особый интерес представляют с этой точки зрения гистидин
и цистеин, поскольку эти аминокислоты могут давать целый ряд хелатных
структур. Ниже приведены формулы хелатных комплексов, образуемых
цистеином.
/° //°
,0 — Сч Ж УО С ,S- СН,
M ,С +М
+М
^S—CHa^NHt NnTH2—С—H NsNH2— С — Н
I I
CH2SH COj
Гистидин и цистеин связывают ионы металлов более прочно, чем любые
другие аминокислоты; можно думать, что они принимают непосредственное
участие в образовании комплексов ионов металлов с белками.
ИЗМЕНЕНИЕ СВОБОДНОЙ ЭНЕРГИИ.
РЕАКЦИИ, НЕ СОПРОВОЖДАЮЩИЕСЯ ОКИСЛЕНИЕМ
И ВОССТАНОВЛЕНИЕМ
Изменение свободной энергии — наиболее важная для наших целей
термодинамическая характеристика химической реакции. AG есть мера
количества полезной химической энергии, которая может быть получена
за счет данной реакции. Кроме того, знак и величина AG позволяют судить
о возможной глубине реакции. Если реакция характеризуется
отрицательным значением AG и это значение достаточно велико по абсолютной
величине, то такая реакция завершается почти нацело; реакции же,
характеризующиеся большим положительным значением AG, протекают в отсутствие
внешней «движущей силы» лишь до известного предела (а при добавлении
продуктов реакции могут даже идти в обратном направлении). Следует
помнить, что величина AG для той или иной химической реакции дает
возможность судить лишь о глубине реакции и о количестве освобождающейся
при этой реакции энергии; какой-либо информации о скорости реакции эта
величина, вообще говоря, не несет. Однако для многих химических реакций
факторы, стабилизирующие или дестабилизирующие исходное вещество
или продукты реакции, стабилизируют или дестабилизируют также и
переходное состояние. В этих случаях действительно имеет место по крайней
мере приблизительная корреляция между величиной AG и скоростью реакции.
Связь между действительным изменением свободной энергии в данной
химической реакции AG, изменением стандартной свободной энергии AG0

Т ермодинамические характеристики биохимических процессов 25
и концентрацией реагирующих веществ определяется уравнением
AG = AG° + i?rin-[C1C [D-^- . A1.21)
f[A]a[Bp
Поскольку в состоянии равновесия Д?? = 0, имеем
[Gea\c \De0]d
l q
О =bG° + RT In ,
[Ae3]a [Beq]t>
а так как
WM
га ia m іь
ТО
AG°=—ДГ1п?вд>
где /fg3 — константа равновесия реакции. Это уравнение указывает путь
экспериментального определения AG0, основанного на измерении константы
равновесия. Для реакции, протекающей при любых условиях,
действительное изменение свободной энергии может быть вычислено из уравнения A1.21).
Важно при этом отметить, что выражение [C]c[Dd]/[A]a[B]u в уравнении
A1.21), вообще говоря, не равно константе равновесия и становится равным
ей только при условии, если АС? = 0. Хотя уравнение A1.21) и может быть
написано в более сжатой форме: AG = AG0 + RT In [P]/[R], однако
величина [P]/[R] в этом уравнении есть отношение продуктов реакции к
исходным веществам в неравновесном состоянии; она становится равной Keq только
после достижения равновесия. Поэтому уравнение A1.21) не следует путать
с уравнением A G = AG0 + RT In К. Если все вещества находятся в
стандартном состоянии, т. е. если все активности равны единице, или, в более
общей форме, если отношение [P]/[R] равно единице, то уравнение A1.21)
принимает вид
AG = AG°. (II.23)
Таким образом, изменение стандартной свободной энергии есть мера той
полезной химической работы, которая может быть получена при
превращении 1 моль исходного вещества в продукты реакции при условиях, когда
IP]/[R] = 1.
Расчет изменений стандартной свободной энергии на основании
измерения константы равновесия и уравнения A1.22) на первый взгляд не является
тривиальным. Для реакций, включающих отщепление или присоединение
протона (весьма обычных в биохимических процессах), такие расчеты могут
быть выполнены тремя разными способами, причем все три способа
правильны. Первой измеренной константой равновесия была константа
равновесия реакции гидролиза этилацетата, определенная Бертло й Гило-
соы в 1863 г. На примере этой реакции можно рассмотреть все три способа,
используемых для подсчета изменений стандартной свободной энергии.
1-й способ. Гидролиз этилацетата может быть описан уравнением
О
СН3 —С — ОСН2СН3+Н,О^; СРІзСОзН + СНзСНаОН. A1.24)
Константа равновесия этой реакции равна
К = [СИ3СО2Н1 [СНзСИгОН! „„
[СН3СО2СН2СН3] [Н2О] '
(при подсчете активность воды была принята равной 55 М). Отсюда
непосредственно следует, что при 25°
AG0 = — RT In 0,33 = (-RT In 10) lg0,33 = - 2,3¦ 1,99¦ 298 lg 0,33 =
= 650 калімоль.

2(> Глав а І]
Вместо того чтобы вводить концентрацию воды в выражение для константы
равновесия реакций, протекающих в водном растворе, активность воды
обычно считают равной единице. Если переписать выражение для константы
равновесия реакции гидролиза этилацетата, приняв активность воды равной
единице, а не 55 М, то константа равновесия будет равна 0,33-55 — 18,
и изменение стандартной свободной энергии при 25° составит —1710 кал/моль:
AG° = - ЯГ In 18 = (-ЯГ In 10) lg 18,
AG0 ^= — 1710 кал/моль.
Таким образом, принимая активность воды равной единице, мы
автоматически получаем отрицательное значение AG0, которое меньше 650 кал/моль
на величину ВТ In 55, т. е. на 2360 кал/моль. Рассматривая другие способы
расчета величины AG,0 мы также будем считать активность воды равной
единице.
2-й способ. При физиологических условиях (pH 7) основным продуктом
гидролиза этилацетата является ацетат-ион. Поэтому напишем уравнение
гидролиза в следующей форме:
О
СНз-С—ОСН2СН3 + Н2О ^ СН3СО.7-ЬН++СН3СН2ОН. (П.25)
Константа равновесия этой реакции равна
А^ІСНзСОїИІЩСНзСНгОІЧ^ 76.10_5 = 3 9(М0-*
[СН3СО2СН2СН3] ' ' ¦
Величина К' может быть рассчитана из приведенной выше константы
равновесия и константы диссоциации уксусной кислоты
Kdiss = lCll3COO~] [H+]/[CH3GOOH] = 1,76.10-6.
Изменение стандартной свободной энергии в реакции гидролиза этилацетата
будет, следовательно, равно
AGo = 1,3-1,99-298-lg 3,20-Ю,
AG° = +4900 кал/молъ.
3-й способ. Оба приведенных выше способа расчета основаны на
использовании констант^равновесия, не зависящих от pH, и, следовательно, они
дают не зависящие от рИ значения изменений стандартной свободной
энергии. Полученные величины могут быть использованы для расчета
соответствующих изменений свободной энергии при любой концентрации
реагентов и при любом значении pH после подстановки в уравнение A1.21)
истинных концентраций указанных веществ при соответствующем рИ.
Вместо этого можно написать уравнение реакции гидролиза для некоторого
значения pH (обычно рИ 7) с учетом общей концентрации каждого из
реагентов при данном значении pH:
О
|| ч / СНзСОї- \
С1-13СОСН2СП3 + Н2О— -|- +СН3СЫ,ОН + Н+(рН 7). A1.26)
^ VCHCOIl/
Для этого уравнения соответствующая константа равновесия
_ ([CH3CO2I1J + [СИзСОі]) [СНзСНаОН] __
~ [СЛ3СО2СН2СЯ3] ~ ,
а изменение стандартной свободной энергии, которое мы обозначим через AG0',
AG°'= -2,3-1,98- 298- lg3,20-103,
AG°'= —4780 кал моль.

Термодинамические характеристики биохимических процессов 11
Обобщая сказанное, следует отметить, что каждый из этих трех способов
расчета правилен и полезен. Первые два позволяют вычислить не зависящее
от pH изменение стандартной свободной энергии, а третий — изменение
стандартной свободной энергии в зависимости от pH. Таким образом, третий
способ расчета дает величины AG0, относящиеся только к тем значениям pH,
для которых они были вычислены. При использовании двух первых способов
расчета изменений свободной энергии по уравнению A1.21) необходимо
знать истинные концентрации всех веществ с учетом кислотно-основного
равновесия. Для третьего способа достаточно знать общие концентрации.
Третий способ, по-видимому, наиболее удобен при решении различных
биохимических проблем. Во-первых, биохимические реакции, как правило,
протекают при рЫ, равном или близком к 7,0. Во-вторых, для расчета
изменений стандартной свободной энергии при помощи первого или второго
способа необходимо знать величины констант диссоциации кислот,
принимающих участие в реакции, а эти величины для биологически важных
соединений часто неизвестны. И наконец, первый способ не совсем удобен с
методологической точки зрения, так как он часто не вполне точно отражает
истинную реакцию, протекающую в растворе.
Прежде чем закончить обсуждение реакции гидролиза этилацетата,
которую мы избрали в качестве примера, нужно сделать два важных
дополнительных замечания. Во-первых, изменение свободной энергии в этой
реакции зависит от pH. Поскольку при pH > 5 начинается отщепление
одного из протонов, изменение свободной энергии по мере повышения pH
становится все более отрицательным; на единицу pH оно составляет
AG = —2,3-1,99-298 lg 10 = —1364 кал/моль. (К этому замечанию мы еще
вернемся позднее.) Во-вторых, изменение свободной энергии в этой реакции
зависит не только от относительных концентраций исходных веществ и
продуктов реакции, но также и от их абсолютных концентраций. Выше 6елло
показано, что если все компоненты находятся в стандартном состоянии
при 25°, то величина AG0' равна —4760 кал/моль. Если же концентрации
всех компонентов равпы 0,01 M (или, более точно, если их активности
равны 0,01), то величина AG0' оказывается равной —7560 кал/моль.
Рассмотрим теперь другой пример — биохимически важную реакцию
гидролиза аденозиптрифосфата (АТФ) до аденозиндифосфата (АДФ) и
неорганического фосфата (Ф„):
Н2О + АТФ ^ АДФ+ (!>„¦ A1.27)
Величина изменения стандартной свободной энергии для этой реакции
была рассчитана косвенным путем, исходя из экспериментально найденной
константы равновесия Keq реакции, катализируемой глутаминсинтетазой:
Глутамат + NH ? + ДТФ ^ Глуташш+АДФ-f ФН + Н2О. A1.28)
Выражая Keq по третьему способу, получаем
_. ІІ^утами^[2АДФ1_[2Ф„] _ д
^"ІГ^ЇЇйїІЇПЩТТаАТФГ" (Р '
В присутствии ионов магния, которые необходимы для АТФ-зависимых
реакций, вместо уравнения A1.29) следует написать уравнение
[Глутамип] ^.„e-^^^-j ,^-ш _,.,i2 /д с
ta" [Глутамат] [NLI+] [SMg-АТФ] '
которое учитывает образование комплекса между ионами металла и
полифосфатами. Реакция с участием глутаминсинтетазы может быть представлена

28
Глава II
как сумма двух реакции:
SMg-АТФ
A1.31)
[A1.32)
A1.33)
Глутамат -)- МЩ Глутамтгн К і, A<?°/.
Отсюда непосредственно следует, что
K'eq = К[ ¦ К'2; AGBe'q = AGI' + AGI'.
Теперь величину AGI' можно рассчитать, подставляя экспериментально
найденные значения K'eq (уравнение 11.30) и К'2 (уравнение 11.32) в
уравнение A1.33). Величина К'2, измеренная при 37° и pH 7, оказалась равной
2,5- lu М~х. Используя эту величину плюс ранее приведенное значение
для/^ед, можно рассчитать величину AGJ' — изменение свободной энергии
в реакции гидролиза хелатного комплекса Mg-АТФ при 37° и pH 7:
AG\' = 1'98 -2,3 -310 -lg 2,5 • 10~3 = 3750 калі моль,
AG°eg = 1,98-2,3-310-lg442= —3670 калімоль,
[' = AG°c'q
AG°' = — 3670 — 3750 = — 7420 калі моль.
Таким образом, величина изменения стандартной свободной энергии
в реакции гидролиза хелатного комплекса Mg-АТФ при 37° и pH 7
оказывается несколько более отрицательной, чем —7 ккалімолъ. Найденная
величина хорошо согласуется со значениями, полученными при помощи других
методов.
Истинная величина изменения свободной энергии при гидролизе 1 молъ
АТФ во внутриклеточных условиях более отрицательна, чем изменение
стандартной свободной энергии, и составляет, по-видимому, от —10 до
—12 ккал/молъ.
Значения, характеризующие изменение стандартной свободной энергии
при гидролизе ряда биологически важных веществ, представлены в табл. 5.
Таблица 5
Стандартная свободная энергия гидролиза некоторых биологически важных
соединений при pH 7
Соединение
Кислородсодержащие афиры
уксусной кислоты
Ацетилтиоловые эфиры
Ацатоацетил-КоА
Эфиры аминокислот
Ацетилфосфат
Ацетила денилат
Mg-АТФ (АДФ, Фн)
Mg-АТФ (АМФ, ФФН)
Обычные фосфомоиоэфиры
Обычные фосфодиэфиры
-AGO'
5100
7 700
10 500
8 400
10 500
13 300
7 400
7 600
3 000
6 000
Соединение
Альдозо-1-фосфаты
Креатинфосфат
Фосфоаполпируват
Пептиды
Глутамин
Ацотилимидазол
Гликозиды
Диполуацетали (сахароза)
S-аденозилметионин
Уридипдифосфатглюкоза
—AGO'
5 000
9 000 (pH 7,7)
13 000
500
3 400
13 300
3 000
6 570
10 000
7 600
ЗАВИСИМОСТЬ AG0' ОТ pH
Как было отмечено выше, величины AG0', рассчитанные исходя из
суммарных аналитических концентраций при фиксированных значениях pH
и являющиеся, следовательно, pH-зависимыми, используются чаще, чем
величины AG0, не зависящие от pH. Поэтому возникает проблема, как
оценить зависимость AG0' от pH. Если в уравнение входит член, содержащий Н+,

Термодинамические характеристики биохимических процессов 29
и стехиометрия реакции не меняется в используемом интервале значений pH
(т. е. если ни одно из исходных веществ не ионизируется в этом интервале pH,
а при наличии ионизации участники реакции, входящие в правую и левую
части уравнения, ионизируются в одинаковой степени), то реакцию можно
представить в следующем виде:
Для такой реакции в состоянии равновесия
ДСо=_ДГ1п[ШОШ^, A1.35)
или если
то
это последнее уравнение можно записать в виде
AG0' = AG0 — ге (ДГ In 10)-pH. (II.36)
При изменении pH от pHj до рН2 можно написать
AGg' = AGo; - п (RT In 10) • A pH, A1.37)
где АрН = рН2 — pHt. Если бы член, содержащий Н+, находился в левой
части уравнения A1.34), то знаки двух последних членов в уравнениях
A1.36) и A1.37) были бы положительными. Таким образом, видно, что для
реакций с участием одного II+ изменение величины AG0', приходящееся
на единицу pH, составляет RT In 10 кал/моль.
Хотя многие биохимически важные реакции могут быть описаны
уравнениями, аналогичными приведенным выше, известно также большое число
соединений, способных ионизироваться при значениях pH, близких к
нейтральному. Это вынуждает нас учитывать энергию ионизации. Чтобы оценить
эту величину, можно воспользоваться уравнением A1.38), в котором
Кі, К2 . . ¦ Кп — константы последовательного отщепления протонов от
молекул данного соединения:
Это уравнение позволяет оценить AGiOn при любом значении pH.
В качестве примера расчета изменения Л6?0' в зависимости от pH
рассмотрим случай гидролиза АТФ. Как АТФ, так и АДФ обладают сильной
кислотной ионизацией, которую мы не будем учитывать. Интересующие нас
константы диссоциации — это константы превращения трианиона АТФ
в тетраанион АТФ (КАТФ = 1,12-10~7), дианиона АДФ в трианион АДФ
(і?АДф = 2,09-10~7), моноаниона фосфата в дианион фосфата (К ні —
= 1,51 -10~7) п дианиона фосфата в трианион фосфата (К н2 = 3,16 X
ХІ03). Подставляя значения этих констант в уравнение A1.38), а затем
в уравнение, связывающее AG° реакции со значениями AG ионизации
реагентов, получаем
/ і+дг°уіо7+іс^^/юіЛ /і+^/10
+ V ф фф І \ і+кА™/№+] ) ' ( }
/і

зо
Глава II
где (AGpH — AG7 ) — разность величин AG0' при рассматриваемом значе
AG°'h - ЛбУ
нии pH и при pH 7. Кривая зависимости величины —-P—nf—— от рЫ
изображена на фиг. 3. Видно, что величина AG0' гидролиза АТФ остается почтя
-14-
Потенциометр
Солевой тоатик (агар-КС1)
•О
Стандартный
иолуэлсктрад 1
Полуэлентрод 2
Фиг. 3. И.'шолсяпо величины AG0' в заии- Фиг. 4. Схема аппарата для определения
симости от pH. при гидролизе АТФ. окислительпо-восстановптельных
потенциалов.
постоянной при изменении pH от 4 до 6, затем линейно уменьшается при
изменении pH от 7 до' И и, наконец, еще быстрее уменьшается при более
щелочных значениях pH.
ИЗМЕНЕНИЕ СВОБОДНОЙ ЭНЕРГИИ.
РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ - ВОССТАНОВЛЕНИЯ
Для расчета изменений свободной энергии в
окислительно-восстановительных реакциях необходимо количественно охарактеризовать способность
веществ отдавать пли принимать электроны, т. е. необходимо знать
окислительно-восстановительный потенциал системы.
Чтобы получить шкалу окислительно-восстановительных потенциалов,
следует выбрать некий общий стандарт, потенциал которого произвольно
полагается равным нулю и относительно которого можно отсчитывать
другие потенциалы. Этим общим стандартом служит водородный электрод
1/гНг —»~ Н+ + е~. Потенциал водородного электрода принимается равным
нулю при условии, если газообразный водород под давлением 1 атм
находится u равновесии с ионами водорода, активность которых равна единице.
Окислительно-восстановительный потенциал любого электрода можно
измерять относительно водородного электрода при помощи прибора,
схематически изображенного на фиг. 4. Металлические электроды из материала,
инертного по отношению к окислителям и восстановителям, помещают
в два сосудика, называемые полуэлектродами, и связывают между собой

Термодинамические характеристики биохимических процессов
31
через потенциометр — прибор для измерения разности потенциалов между
полуэлектродами, выражаемой обычно в вольтах. Два полуэлектрода
соединяют между собой солевым мостиком, который хотя и обеспечивает
миграцию ионов, но но допускает прямой химической реакции между
компонентами полуэлектродов. Теперь электроны стремятся течь либо к водородному
электроду, либо от него, в зависимости от того, имеет ли другой полуэлектрод
большую или меньшую тенденцию отдаиатъ электроны (по сравнению
со стандартным электродом).
Разность
окислительно-восстановительных, потенциалов двух, электродов
измеряется при помощи
потенциометра как напряжение (в вольтах),
необходимое для предотвращения
такого тока.
В количественной форме разность
между
окислительно-восстановительным потенциалом любого электрода
и водородного электрода определяет-
ся уравнением
0,3
0,2
0.1
RT_ JrodJI_
nF |oxj
A1.40)
-0.
-0.2
-0,3
10
30 50 70
Степень восстановления
90
где [red] — концентрация
восстановленной формы; loxj —концентрация
окисленной формы; R — газовая
постоянная; Т — абсолютная
температура; F — число Фарадея, равное
23 000 кал/абс. в-экв.; п — число
электронов, перенесенных при реакции, в
расчете на 1 г-экв вещества; Е —
наблюдаемая разность потенциалов,
измеренная в вольтах; Ео —
стандартный о кислите льно-восстановительный
потенциал рассматриваемого
электрода. Ясно, что если активность
окисляемого вещества равна активности восстанавливаемого, то измеряемая
разность потенциалов равна стандартному окислительно-восстановительному
потенциалу. Изменение'*/? в зависимости от степени окисления показано на
фиг. 5. Уравнение A1.40) может быть записано в более удобной форме:
Фиг. 5. Типичные кривые потенциометри-
ческого титрования для реакций с
переносом одного (/) и двух (/7) электронов.
Величина Ео произвольно принята равной яулю.
= Е0-
[ox]
nF
A1.41)
При 30° член 2,3RT/nF равен 0,06 для га = 1 и 0,03 для'|га=2.
Существует два разных способа оценивать знак
окислительно-восстановительного потенциала: в одном случае более отрицательные потенциалы
приписывают системам с повышенной способностью отдавать электроны
(восстановит,елъиые потенциалы), в другом такие потенциалы приписывают
системам с повышенной способностью присоединять электроны
(окислительные потенциалы). Мы в'этой книге пользуемся первым способом в
соответствии с рекомендациями Международного союза по чистой и прикладной
химии.
Подобно тому как AG для гидролитических реакций "нередко удобнее
определять при pH 7, так и величину стандартных
окислительно-восстановительных потенциалов часто требуется знать именно для этого значения pH,
а не для pli 0. Такие электродные потенциалы обозначают символом Е'„.

/ л а в а II
В табл. 6 приведены электродные потенциалы для некоторых биохимически
важных систем.
Таблица в
Стандартные восстановительные потенцналы биохимически важных систем
Система
Кислород/вода
Fe3+/Fe2+
Нитрат/нитрит
Феррицианид/ферроцианид
Кислород/перекись водорода
Цитохром о (Fe3+/Fe2+)
Цитохром с (Fe3+/Fe2+)
Кротонил-КоА/бутирил-КоА
Метгемоглобин/гемоглобин
Цитохром b2 (Fe3+/Fe2+)
Убихинои (окисл./восстан.)
Дегидроаскорбат/аскорбат
Метмиоглобин/миоглобин
Фумарат/сукцинат
Мвтиленовый синий
(окисл./воостан.)
«Желтый фермент»
(ФМН/восст. ФМН)
Пируват + аммоний/аланин
е'о (pH 7), в
0,815
0,77
0,42
0,36
0,30
0,29
0,22
0,19
0,17
0,12
0,10
0,08
0,046
0,03
0,01
-0,122
—0,13
Система
а-Кетоглутарат-^аммопий/глу-
тамат
Оксалоацетат/малат
Пируват/лактат
Ацетальдегид/атанол
Рибофлавин (окисл./восстан.)
Глутатион (окисл./восстан.)
Ацвтоацетат^-оксибутират
Липоевая кислота
(окисл./восстан.)
НАД+/НАД-Н(+Н+)
Пируват/малат
Мочевая кислота/ксантин
СО2/формиат
Н+/Н2
Ацетат/ацетальдегид
Сукцинат/а-кетоглутарат
Ацетат -f- CO2 /пируват
e'q (pH 7), «
-0,14
—0,17
-0,19
—0,20
-0,21
—0,23
—0,27
-0,29
-0,32
—0,33
-0,36
-0,42
-0,42
-0,60
-0,67
—0,70
Электродные потенциалы окислительно-восстановительных реакций,
в которых происходит поглощение или выделение ионов водорода, зависят
от pH. Наиболее простым примером такой реакции может служить сам
водородный электрод. Поскольку стандартный потенциал такого электрода
равен нулю, выражение для Е имеет вид
Это уравнение сводится к виду
= 0,061g[H4=--0,06pH,
A1.42)
A1.43)
так как стандартный водородный электрод определяется по отношению
к газообразному водороду, находящемуся под давлением, равным 1 атм.
При pH 7, следовательно, электродный потенциал водородного электрода
равен —0,420 в.
Несколько более сложным примером является реакция полуокисления
антрахинон-2,7-дисульфоната
он
2Н+
A1.44)
Определив две константы диссоциации продуктов восстановления
уравнениями
_ [Н+] [Н red-] _[H+][red3-]
1 Щ^аГ~ 2 [Н red-]
и установив, что общее количество этих продуктов (t. red) равно H2red +
-f-Hred"-(-red2", можно выразить количество продуктов восстановления в виде

Термодинамические характеристики биохимических процессов
33
функции Н2 red и приведенных выше констант равновесия
(, reared]
аЫ5)
Решая уравнение A1.45) относительно [H2red] и подставляя полученный
результат в уравнение, описывающее электродный потенциал этой системы,
[H2red]
получаем
— 0 + -2р-ш [t red]
При низких значениях pH [H+]2 "
ниє A1.47) сводится к виду
[ох] , RT
RT
In
2F
• irjH+j и [Н+]
A1.46)
¦ KtK2; поэтому уравне-
[t. red]
[ох]
[t. red]
— 0,06 pH. A1.48)
Если отношение концентраций окисленной и восстановленной форм
сохраняется постоянным, то электродный потенциал этой реакции линейно зависит
от pH, причем наклон прямой равен —0,06. Аналогичные
рассуждеслучае менее кислых растворов, для которых
^і^2, также имеет место линейная
зависиния показывают, что в
К, [И+] > [Н+Р и Ki [Н+]
мость между Е и pH,
характеризуемая наклоном прямой —0,03, а
в случае щелочных растворов, для
которых KtKz > Ш+Р и К1К2 >
> Kt [Н+], Е практически не
зависит от pH. Фиг. 6 иллюстрирует
все эти соотношения.
Вообще говоря, для
окислительно-восстановительной реакции, в
которой происходит освобождение
а протонов и переносп электронов,
Но red ^2 ox-f аН+,
выражение для электродного
потенциала имеет вид
RT [ox] RT
A1.49)
Изменение электродного
потенциала с изменением pH описывается,
следовательно, уравнением
0,1
-0,1
UJ
-0.2
-0,3
-0,4
рК,
4 5 6
8 9
pH
10 11 12
A1.50)
Фиг. 6. Зависимость электродного потенциала
попу окисления антрахинон-2,7-дисупьфоната
от pH.
а — тангенс угла наклона.
Учитывая приведенные выше
соображения, мы можем теперь
вернуться к вопросу об оценке действительных изменений свободной энергии при
окислительно-восстановительных реакциях. Если нам известно изменение
стандартной свободной энергии, то действительное изменение свободной
энергии при любых условиях можно рассчитать, пользуясь уравнением
A1.21). Проблема, таким образом, состоит в том, чтобы оценить AG0 на
основании стандартных окислительно-восстановительных потенциалов. Метод,
используемый для такой оценки, можно пояснить приведенным ниже
примером.
3-246

34 Глава II
Рассмотрим обратимую окислительно-восстановительную реакцию
состоящую из двух электродных реакций Ared ,. Аох и Bred ^1. ВОХ1 кото-
рьге характеризуются стандартными окислительно-восстановительными
потенциалами соответственно Ef ж Ej*. Очевидно, что в состоянии равновесия
электродный потенциал определяется следующими уравнениями:
Е = е? — In -Li (II .52)
или
V P? "І тл I ?'J /1 I KO\
Следовательно, мы можем написать
?*-^=^(InieHnw) (IL54)
и
M^ln^L^lnK. A1.55)
пЪ [A7.][?0] ni' v
Учитывая, что AG0 = — RT In К, получаем.
AG°= —uFAEq. (II. 56)
Типичной биохимически важной окислительно-восстановительной реакцией
является превращение ?-оксибутирата в ацетоацетат, при котором
окислительным агентом служит молекулярный кислород:
ОН О
СИ3 —С — СНа— GOj- + i/2O2 ^ СН3 — С — СНаСО^ + Ы2О. A1.57)
H
Значение Е'о, приведенное в табл. 6, показывает, что изменение стандартной
свободной энергии для этой реакции при pH 7 составляет
AG°'= —2-23000-[0,815 —( — 0,293)]= —46000-1,11= —51000 кал/молъ.
ИЗМЕНЕНИЕ СТАНДАРТНОЙ ЭНТАЛЬПИИ И ЭНТРОПИИ
Знание изменений энтальпии или энтропии при биохимических реакциях
в ряде случаев весьма важно для понимания этих реакций. Изменения
стандартной энтальпии, которыми сопровождаются реакции, оценивают обычно
при помощи уравнения Вант-Гоффа, исходя из экспериментальных данных
по температурной зависимости константы равновесия
d]nK __ Ago т _й.
dT ~ RT'i • A1. Do;
Интегрирование этого уравнения в предположении, что величина АЯ° не
зависит от температуры в исследуемом интервале температур, дает
In К--= - 4^°-+ const. (II.59)
Зависимость lg К от величины, обратной абсолютной температуре (при
условии, что независимость АН0 от температуры сохраняется),
описывается прямой с наклоном, равным —А#°/2,3/?, откуда величина АЯ° может
быть легко рассчитана.

Термодинамические характеристики биохимических процессов
35
Если для реакции при данной температуре определены значения ДС°
и АН0, то величина изменения стандартной энтропии AS0 может быть
найдена по уравнению
Таблица 7
Термодинамические параметры
денатурации химотрипсина,
трипсина и ингибитора
трипсина
Возможность использования изменений энтальпии (АЛ) и энтропии (AS)
для понимания природы биохимических реакций можно проиллюстрировать
на примере изучения температурной зависимости денатурации белков.
В табл. 7 приведены термодинамические
параметры денатурации химотрипсина,
трипсина и ингибитора трипсина. Изменения
энтропии при денатурации этих белков необычно
велики (для большинства реакций
денатурации величины AS0 лежат в пределах от -]-10
до —30 энтр. ед/молъ); столь сильные
изменения энтропии красноречиво
свидетельствуют о весьма высокой степени структурной
организации этих белков в нативном
состоянии и об утрате этой организации в
результате тепловой денатурации.
Знание величин Д//° и AS0 может
помочь также при идентификации природы кислотных или основных групп,
от которых зависит ферментативная активность (см. гл. VII), и при решении
вопроса о природе сил, обеспечивающих связывание субстратов или
ингибиторов с ферментами.
Фермент
Хнмотрішсіш (pli 3)
Ингибитор трипсина
Трипсин (pH 2)
АН
•14,4
57,3
68
AS
438
180
213
БОГАТЫЕ ЭНЕРГИЕЙ (МАКРОЭРГИЧЕСКИЕ) СОЕДИНЕНИЯ
Когда выяснилось, что некоторые соединения, такие, как АТФ, служат
движущей силой очень большого числа реакций, сопровождающихся
потреблением энергии, биохимически важные вещества начали делить на богатые
энергией (макроэргические) и бедные энергией, или иначе высокоэнергетические
и низкоэнергетические. Соединения, которые при физиологических
условиях характеризуются большой отрицательной величиной свободной энергии
гидролиза, например АТФ, стали относить к первой из этих двух категорий,
а такие соединения, как обычные фосфорные эфиры,— ко второй. Эта
несколько неопределенная классификация породила большую путаницу
в биохимической литературе, поскольку разные химики вкладывали в
понятие «богатые энергией» или «бедные энергией» разный смысл. В этой книге
мы будем исходить из определения, предложенного Дженксом: «Богатое
энергией соединение — это такое соединение, реакция которого с другим
веществом, обычно присутствующим в окружающей среде, характеризуется
при физиологических значениях pH большой отрицательной величиной
изменения свободной энергии». Как, однако, получить количественную
оценку, которая позволила бы отнести данное соединение к категории
высокоэнергетических веществ?
Четкой границы между высокоэнергетическими и низкоэнергетическими
соединениями, к сожалению, не существует. Чисто условно принято
считать высокоэнергетическими такие вещества, для которых, величина
свободной энергии гидролиза при pH 7 более отрицательна, чем —7 ккал/молъ.
Поскольку нас интересуют изменения свободной энергии црн
физиологических значениях pH, ясно, что для гпдродта и других аналогичных реакций
вычислять соответствующую величину ложно только по третьему из
рассмотренных вьтто способов.

36 Г л а в а II
Класс высокоэнергетических соединений включает в себя несколько
вполне определенных групп. Наиболее интересной из них является группа
производных фосфорной кислоты, в которую входят ангидриды фосфорной
кислоты, ацилфосфаты, гуанидинфосфаты и енолфосфаты. Кроме того,
к макроэргическим соединениям относятся также тиоловые эфиры, эфиры
аминокислот и дигидропиридины.
Ангидриды фосфорной кислоты. Как указывалось выше, лучшим
примером высокоэнергетического соединения может служить ангидрид фосфорной
кислоты — АТФ. Из табл. 5 видно, что при гидролизе 1 моль этого
соединения до АДФ и неорганического фосфата или до АМФ и пирофосфата
выделяется более 7 ккал свободной энергии. Приблизительно такими же
величинами AG при pH 7 характеризуются и другие ангидриды фосфорной кислоты.
Способность соединений этого типа выделять большое количество энергии
при гидролизе легче всего понять, рассмотрев химически более простое,
но весьма близкое по своей природе соединение — ангидрид уксусной
кислоты. Большая отрицательная величина изменения свободной энергии,
характеризующая гидролиз ангидрида уксусной кислоты при pH 7,
определяется двумя факторами. Первый из них — это стабилизация электрофиль-
ного карбонильного атома углерода за счет подачи к нему электрона и его
дестабилизация при оттягивании электрона. Поскольку ацетильная группа
является достаточно сильным электроноакцепторным заместителем,
замещение приводит к дестабилизации ангидрида уксусной кислоты по
отношению к продуктам реакции гидролиза. Влияние этого фактора легко
почувствовать, сравнив реакционную способность ацетилхлорида, ангидрида
уксусной кислоты, ацетилфосфата, этилацетата и ацетамида. Хотя в
названном ряду действуют, конечно, и другие факторы, однако четко видно, что
реакционная способность этих производных уксусной кислоты уменьшается
при уменьшении электроноакцепторной способности заместителя у
карбонильного углерода. Вторым фактором является значительно более высокая
стабильность продуктов гидролиза ангидрида уксусной кислоты при рИ 7
по сравнению со стабильностью самого ангидрида, о чем свидетельствует
тот факт, что энергия резонанса ангидрида уксусной кислоты B9 ккал)
значительно меньше энергии резонанса двух ацетат-ионов C6 ккал),
являющихся продуктами гидролиза при pH 7. Уменьшение энергии резонанса
при образовании ангидрида обусловлено тем, что я-электроны атома
кислорода, связывающего два карбонильных атома углерода, не могут
удовлетворить потребности в электронах обоих карбонилов одновременно:
сн,-с-о-с-снз
Ъ
Эта ситуация получила название конкурирующего резонанса, поскольку
две карбонильные группы конкурируют за электроны одного и того же
атома кислорода. Ясно, что такая конкуренция в случае продуктов
гидролиза не имеет места. Аналогичные рассуждения применимы и к гидролизу
ангидридов фосфорной кислоты, например к АТФ, хотя выигрыш в энергии
резонанса при этом, по-видимому, менее важен. В случае АТФ важную
роль играет, очевидно, еще один фактор. Поскольку АТФ s родственные
ему соединения существуют в растворах при нейтральных значениях pH
либо в виде трианионов, либо в виде тетрааниопов, электростатическое
отталкивание, более низкое у продуктов гидролиза, может обусловливать
дестабилизацию полифосфатов по отношению к этим продуктам.
Ацилфосфаты. Среди биохимически важных ацилфосфатов (ангидридов
фосфорной и карбоповой кислот) наибольшее значение имеют ацетилфосфаты

Термодинамические характеристики биохимических процессов
37
и аминоациладенилаты. Стандартные свободные энергии гидролиза этих
соединений при pH 7 равны соответственно —10,5 и —13,3 ккал (см. табл. 5).
Факторы, обусловливающие такую величину свободной энергии гидролиза,
аналогичны тем, которые были рассмотрены выше на примере ангидрида
уксусной кислоты. Этих факторов два: 1) дестабилизирующее влияние
электроноакцепторной фосфатной группы, меняющее свойства
карбонильной группировки, и 2) меньшая энергия резонанса исходного вещества по
сравнению с энергией резонанса продуктов гидролиза.
Гуанидинфосфаты. Примерами наиболее важных природных гуанидин-
фосфатов могут служить креатинфосфат, выполняющий роль
энергетического «депо» в мышцах, и аргининфосфат
H2N+
н
С
О-
I
О-
I
СН3—N —СН2
H2N+ О-
% H |
G —N —Р
! I
NH O-
I
(СН2)з
I
H —C—NH+
Креатинфосфат Аргининфосфат
Стандартная свободная энергия гидролиза таких соединений при
физиологических значениях pH составляет приблизительно —9 ккал (см. табл. 5).
Высокоэнергетическая природа этих соединений обусловлена главным
образом дестабилизацией иона гуанидиния из-за отсутствия возможности
нормального резонанса. Структура иона гуанидиния или алкилгуанидиния
почти симметрична, причем обе равновесные формы, которые могут быть
написаны для такой структуры, обладают приблизительно одинаковой
стабильностью. Высокая энергия резонанса, обусловленная наличием этих
симметричных форм, объясняет очень высокую основность гуанидинов.
Превращение гуанидинов в гуанидинфосфаты нарушает симметрию
молекулы. Крайне неблагоприятна, в частности, резонансная форма, в которой
положительно заряженный атом азота находится рядом с положительно
заряженным атомом фосфора:
R-
R-
H
N+H2
1 II
-N-C
4
H
-N-
NH
N + H2
-C
/
az
і
2
1
1
-P+-
o_
H
1
-> R—N*
-o-
NH2
NH2
H NH
і і
1 1
R—N+=C
\
\
->
2
N
H
H NH2
JR_N— С
%N +
o- <->
j
-p+—o-
o_
H2
H MJ
1 1
R—N—C
H
o-
i
!
~l
o_
Енолфосфаты. Фосфоенолпируват, одни из важнейших промежуточных
продуктов обмена углеводов,
ртт р р/-\_
Фосфоенолпихіуват
характеризуется такой большой отрицательной величиной свободной энер
гии гидролиза A3 ккал), что его реакция с АДФ, приводящая к образова
нию АТФ и пировиноградной кислоты, доходит почти до конца.

38 Г л а в а II
Соединения такой природы — превосходные фосфорилирующие агенты.
Эти соединения нашли недавно широкое применение при синтезе
органических фосфатов. Высокоэпергетичоская природа фосфоенолиирувата
обусловливается двумя факторами. Во-первых, енол пировиноградной кислоты,
в форме которого вынужден существовать фосфат, приблизительно
на 10—12 ккал/молъ менее стабилен, чем продукт гидролиза, находящийся
в кетоформе, так что превращение епольной формы в кетоформу
представляет собой, по существу, одну из движущих сил реакции гидролиза.
Во-вторых, гибридизация О — Р-связи в фосфоенолпирувате относится
к s/J-THny. Таким связям свойственна меныпая прочность, чем связям
с .ср3-гибридизап;ией, и, следовательно, енолфосфаты менее стабильны,
чом обычные эфиры фосфорной кислоты. Другим примером этого рода может
служить поведение ацилцианидов, в которых расщепляемая при гидролизе
связь возникает в результате sp-гибридизации. Именно поэтому ацилцианиды
являются превосходными донорами ацильной группы.
Тиоловые эфиры. Тиоловые эфиры, особенно кофермент А (см. гл. VJII),
играют очень важную роль в метаболизме, в частности при реакциях
переноса ацильной группы. Из табл. 5 видно, что стандартная свободная энергия
гидролиза таких соединений при физиологических условиях составляет
приблизительно —8 ккал/молъ. Таким образом, тиоловые эфиры относятся,
без сомнения, к категории высокоэнергетических соединений. Уменьшение
взаимодействия между it-электронами атома серы и карбонильной группы
в тиоловых эфирах по сравв:ению с обычными эфирами (содержащими вместо
атома серы атом кислорода) или с карбоксилатными анионами служит
движущей силой реакции гидролиза; им же следует объяснить и более высокую
стандартную энергию гидролиза тиоловых эфиров по сравнению с
кислородсодержащими эфирами (см. стр 28). Некоторые исследования
действительно заставляют считать, что атом серы не только не является эффективным
донором электронов для карбонильной группы, но может даже быть
акцептором электронов:
о о-
II I
Rt—С—О—R2 <-> Ri—C=O+— R2
О
R,—С—S—R2 <->
Малоэффективный резонанс
f ?" ?* 1
Lr1—C=S+—R2 <-> Ri—C=S-— RjJ
Эфиры аминокислот. Стандартные свободные энергии гидролиза эфиров
аминокислот, являющихся важными промежуточными продуктами при
биосинтезе белков, сравнимы с энергией гидролиза АТФ. Следует отметить,
что, например, свободная энергия гидролиза этилового эфира глицина
до свободной аминокислоты составляет почти такую же величину, как и AG
реакции гидролиза этилацетата. Однако из-за высокой кислотности глицина
(рКа — 2,3) по сравнению с уксусной кислотой (рКа — 4,76) стандартная
свободная энергия гидролиза эфира аминокислоты при pH 7 и 25° больше
соответствующей величины для этилацетата на 298-1,98-2,3 • Ap/fa ^:
==—3300 кал/моль. Хотя такое деление реакции гидролиза эфира при pH 7
на реакцию гидролиза до свободной аминокислоты и ионизацию кислоты
удобно при расчете изменений свободной энергии, было бы неверным
считать, что большие изменения свободной энергии, сопровождающие гидролиз
сильных кислот, обусловливаются высоким значением AG ионизации.
Свободная энергия является функцией состояния, т. с. не зависит от произволь-

Термодинамические характеристики биохимических процессов 39
но выбранного нами пути реакции. Термодинамическую неустойчивость
эфиров аминокислот правильнее рассматривать как следствие
дестабилизации эфира за счет характерного для аммониевой группы электроноакцептор-
ного эффекта.
ЛИТЕРАТУРА
Clark VV. 1\Г., Topics in Physical Chemistry, Williams and Wilkins, Baltimore, 1948.
E il s a 1 1 J. T., W y m a n J., Biophysical Chemistry, Academic, Now York, 1958.
Glasstonc S., Thermodynamics for Chemists, Van Nostrand, Princeton, N.J., 1947.
G a r d F. И. N., W і 1 с о x P. E., Complex Formation between Metallic Cations anil
Proteins, Peptides. aTid Amino Acids, Advances Proc. Chem., 11, 311 A956).
Klotz 1. ML, Chemical Thermodynamics, Prentice-Hail, EngJewood Cliffs, N.J., 1950.
L а і d 1 о r K. J., The Chemical Kinetics of Enzyme Action, Oxford, Fair Lawn, N.J.,
1958.
L і p m a n n F., Metabolic Generation and Utilization of Phosphate Bond Energy, Advan.
Enzyinol., 1, 99 A941).
Rossini F. 13., Chemical Thermodynamics, Wiley, New York, 1950.
В о s s о t t і F. J. С, R о s s о t t і IT., Determination of Stability Constants, McGraw-
Hill, Now York, 1961.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Брей Дж., Уайт К., Кинетика и термодинамика биохимических процессол, ИЛ,
М., 1959.
Пригожий И., Дефей Р., Химическая термодинамика, изд-ло «Наука»,
Новосибирск, 1966.
Гугенгейм Г., Термодинамика, М., 1952.
Карапетянц М. X., К ар апет ян ц М. Л., Оспошше термодинамические
константы неорганических ц органических веществ, изд-во «Химия», М., 1968.
Т е н ф о р д У., Физическая химия полиморон, иад-во «Химия», М., 1965.
Т агор А. А., Физико-химия полимером, изд. 2-е, шд-во «Химия», М., 1968.

Глава III
БЕЛКИ: КЛАССИФИКАЦИЯ, СВОЙСТВА, ОЧИСТКА
Белки (протеины) — непременный компонент всех живых организмов —
растительных, животных и бактериальных. Они играют важнейшую роль
в клеточной архитектуре, в катализе, в регуляции метаболизма, в
сократительных процессах и в реакциях, обеспечивающих высшим организмам
защиту от болезнетворных агентов. Таким образом, белки имеют
непосредственное отношение к подавляющему большинству событий на
физиологическом уровне (заметим, что название протеин образовано от греч. «про-
тос»— первичный).
Белки представляют собой высокомолекулярные соединения; молекулы
их построены из остатков а-аминокислот. Число аминокислотных остатков,
входящих в молекулу белка, может варьировать в широких пределах.
Нижней границей молекулярного веса белков условно считают величину
5000; аналогичные соединения с более низким молекулярным весом
называют полипептидами г. Молекулярные веса многих широко
распространенных белков достигают нескольких сот тысяч. Структура молекул такого
размера весьма сложна и при современном уровне наших знаний по физике
и химии полимеров с трудом поддается изучению.
Мы начнем наше рассмотрение с химии а-аминокислот, т. е. тех
структурных элементов, из которых построены белки; после этого мы обсудим
проблему сборки аминокислот в полимерные соединения, рассмотрим
некоторые свойства белков и в заключение кратко опишем методы выделения
белков из природных объектов и методы их очистки. Более подробно
структура белков рассматривается в гл. IV.
АМИНОКИСЛОТЫ - СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ БЕЛКОВ
СТРОЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ
При полном гидролизе белков образуется смесь приблизительно
из двадцати аминокислот. Первичная аминогруппа и карбоксильная группа
связаны в молекуле этих аминокислот с одним и тем же атомом углерода,
т. е. аминогруппа находится в а-положении по отношению к карбоксильной
группе. Такие аминокислоты называются а-аминокислотами; их общая
формула: NH2 — CHR — СООН. Исключение составляют пролин и окси-
пролин, относящиеся к сс-иминокислотам. Структурные формулы
аминокислот, обычно присутствующих в гидролизатах белков, приведены в табл. 8.
Эти аминокислоты можно разделить на семь классов: 1) алифатические
аминокислоты; 2) оксиаминокислоты; 3) дикарбоновые аминокислоты и их
амиды; 4) двухосновные аминокислоты; 5) ароматические аминокислоты;
6) серусодержащие аминокислоты; 7) имииокислоты.
Гидролизаты некоторых белков содержат помимо аминокислот,
перечисленных в табл. 8, еще и некоторые другие аминокислоты. Однако,
1 Такая классификация не является общепринятой.— Прим. ред.

Таблица 8
Аминокислоты, входящие в состав белков
Название
Структура
Примечание
I.
Алифатические амино
кислоты
1. Глицин
(Гли)
2. Алании
(Ала)
3. В алии
(Вал)
4. Лейцин
(Лей)
5. Изолей-
ция
(Илей)
И. Оксиамипо-
кислоты
6. Серии
(Сер)
7. Треонин
(Тре)
III. Дикарбоновые
аминокислоты
и их амиды
8. Аспара-
гиновая
кислота
(Асп)
9.
Аспарагіні
(Аспн)
H2N —CH2 —CO2H
СНз
H2N —СН —СО2Н
СНзх /СН3
I
H2N —GH —СО2Н
игізч /LjJri3
I
сн2
I
H2N-CH —CO2H
CH3
СН2
СН —СН3
I
H2N —СН —СО2Н
СН2ОН
H2N —СН —СО2Н
СНз
СН —ОН
HZN —СН —СОоН
со3н
сн2
СН —СО2Н
CONH2
I
сн2
!
H2N —СН—СО2Н
2,34; 9,60
2,35; 9,69
2,32; 9,62
2,36; 9,68
2,21; 9,15
2,63; 10,42
2,09
(а-карбок-
сил)
3,86
(?-карбок-
снл)
9,82
2,02; 8,80
5,97
6,02
5,97
2,36; 9,60 5,98
6,02
5,68
6,53
2,97
5,41
Содержит два

асимметрических атома
углерода
Содержит два

асимметрических атома
углерода

ПроЭолжение табл. 8
Название
10. Глута-
Аініговая
кислота
(Глу)
И. Глута-
МІШ
(Глуп)
IV. Двухосновные
аминокислоты
12. Лияин
(Лиз)
13. Оксили-
ЗШІ
(Олиз)
14. Гистп-
дин
(Гис)
15. Аргинин
(Apr)
V.
Ароматические
аминокислоты (ги-
стпдрш
отнесен к классу
IV)
16. Фонил-
аланпн
(Фон)
Структура
со,н
1
сиа
1
сн2
II2N-CH —СО2П
CONH2
1
сн2
сн2
1
H2N — СН — СО2Н
(CH2L-NH2
1
H2N —СН —СО2Н
СН2 —NH2
1
СН —ОН
(СИ 2J
1
H2N —СН —СО2Н
не/ X
11 /
C-N/
1 н
сл2
1
H2N —СН—СО2Н
H NH
! I!
(СН2)з —N —С —NH2
1
H2N—СН —СО2Н
/V
H2N-
[
\
-
1-СО2Н
2,19
(сс-карбок-
спл)
4,25
(?-карбок-
сил)
9,07
2,17; 9,13
2,18
8, J5
(сс-амиио-
грунпа)
10,53
(в-амяно-
группа)
2,13
8,62
( сс-амино-
группа)
9,67
(в-амино-
группа)
1,82
6,0
(имидазол)
9,17
2,17
Q ПА

(а-аминогруппа)
12,48
(ион гуаыи-
динпя)
1,83; 9,13
pi
3,22
5,65
9,74
9,15
7,58
10,76
5,98
Примечание
Содержит два

асимметрических атоАіа
углерода,
входит в
состав
коллагена и
желатины
8orq =¦ 2' 102

Продолжение табл. 8
Название
17. Тирозин
(Тир)
18.
Триптофан
(Три)
19.
Тироксин
VI. Серу
содержащие
аминокислоты
20. Цистепн
(Цис-SIl)
21. Цясттпт
(Uuc-S-S-Hnc)
22. Метио-
IIШТ
(Мет)
VII, Имипокпсло-
ты
23. Пролий
(Про)
24. Оксп-
пролпн
(Опро)
Структура
ОН
1
Ч/
1
сн2
1
H2N —СН—СОоН
/~ \
H2N —
/
-І — CO2II
NH2 /I yI
гтт ги ^—^ п ^—^ птт
1 2~\=/~ ~\=^/~
со2н \г \і
CH2-SH
H2N — СН — СО2Н
/ qY{ S \
VH2N — CH — CO2H/2
(CH2J — SCII3
1
H2N—CH —CO2H
\
—CO2II
H
HO
. —СОЛІ
\ N /
H
2,20
9,11
(а-амино-
группа)
10,07
(феиольный
гпдрокспл)
2,38; 9,39
1 71
8,33
(сульфгпд-
рнльпая
группа)
10,78
(а-амппо-
группа)
1,65; 2,26

(карбоксилы)
7,85; 9,85

(аминогруппы)
2,28; 9,21
« f-\/-\ A /~\ Г* 1~\
1,99; 10,60
1,92; 9,73
Pi
5,65
5,88
5,02
5,06
5,75
6,10
5,83
Прннечаї me
?чпах=;278 ммк
8о78 = 1Д-103
?ьтах = 279 ммк
Встречается
только в ти-
реоглобулине
(этот белок

синтезируется в
щитовидной желе-
ае)
Содсряпіт два

асимметрических атома
углерода;
входит в
состав
коллагена и жолати-
пы

Таблица 9
Некоторые другие аминокислоты (и их производные), имеющие биологическое
значение
Название
1. ?-Алапин
2. 7"Амин о-
масляная
кислота
3. Саркозин
4. Ботаин
5. О~диазоаце-
тилсерин
(азасерин)
6. Гомосерин
7. Орнитин
8. Цитру длин
9. Гистамин
10. 5-окси-
триптамин
(серотонин)
11. Адрепалин
(эпинеф-
рин)
12. Таурин
13. Пепицилл-
амин
Структура
H2N—СН2СН2-СО2Н
H2N-(CH2K-CO2H
N-метилглицин
N, N, N-трішетилглицин
СН2О —COCHN2
[
H2N-CH —СООН
СН2СН2ОН
1
H2N~CH-COOH
(CH2K-NH2
1
H2N —СН—СООН
0
II
(СН2)з —NH —С —NH2
1
H2N—СН —СООН
H2N CH2CH? —,
1
TTN N
illl 14
H2N-CH2CH2 ,, A_nn
\N/
H
H
СНз—N —CI-Ia-CH-!^ Ч-ОН
1
ОН ЧОН
H2N — СН2СН2 — SO3H
(СН3J—C-SH
1
H2N —СН —СООН
Примечание
Входит в состав витамина панто-
теновой кислоты и ее
производного—кофермодта А;
содержится также в природных
пептидах карнозипе и ансерине
Содержится в растениях, а также
в ткани мозга млекопитающих,
некоторых земноводных и птиц
Промежуточный продукт обмена
одноуглеродных соединений;
входит в состав актиномици-
нов — группы мощных
антиметаболитов
Содержится в растительных в
животных тканях;
промежуточный продукт обмена линидов
Антиметаболит, выделенный из
некоторых плесневых грибов;
подавляет синтез нуклеиновых
кислот
Важный промежуточный продукт
обмена; содержится в
растительных и животных тканях
Важный промежуточный продукт
биосинтеза мочевины
Важный промежуточный продукт
биосинтеза мочевины;
непосредственный предшественник
аргинина
Продукт декарбоксилирования
гистидина; обладает сильным
сосудорасширяющим действием
Соединение, играющее важную
роль в передаче нервных
импульсов
Производное тирозина; важный
гормон, участвующий во
многих регуляторных процессах
Продукт окисления,
образующийся в процессе обмена цис-
тоина; входит в состав солей
жолчпых кислот (в соедипении
со стероидом)
Зходит в состав антибиотика
пенициллина

Белки: классификация, свойства, очистка
поскольку эти аминокислоты встречаются редко, а роль их в структуре
и функции соответствующих белков большей частью неизвестна, мы здесь
рассматривать их не будем.
Белки построены из линейных цепей ковалентно связанных остатков
аминокислот. Каждая мономерная единица в такой цепи может быть
представлена любой из примерно двадцати различных аминокислот. Поэтому
общее число структурно неэквивалентных белков поистине огромно;
например, для белков, содержащих всего 100 мономерных единиц, это число
равно 20100. Именно колоссальной вариабельностью, свойственной этой
группе полимеров, частично объясняется широкий спектр биологических
функций белков.
Многие аминокислоты и их производные хотя и не входят в состав
белков, но также выполняют те или иные важные биохимические функции.
Краткий список таких веществ приведен в табл. 9.
ОПТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
Все получаемые из белков аминокислоты — за исключением глицина —
оптически активны, так как они содержат (в а-положении) асимметрический
атом углерода. Абсолютную конфигурацию аминокислот принято
обозначать исходя из абсолютной конфигурации L-глицеринового альдегида. Все
аминокислоты, получаемые из белков в условиях, исключающих
рацемизацию, принадлежат к L-ряду. Ниже представлены пространственные
конфигурации L-глицеринового альдегида и L-аланина.
сно
но
Ь(-)-2лщералъдегид
Ь(+)-аланин
Следует подчеркнуть, что обозначения L- и D- относятся не к направлению
вращения плоскости поляризации света, а к абсолютным конфигурациям
аминокислот, соответствующим абсолютной конфигурации глицеринового
альдегида.
Знак и величина оптического вращения зависят, естественно, от природы
боковой цепи аминокислоты. Кроме того, поскольку аминогруппы и
карбоксильные группы вступают в протолитические реакции, оптическое
вращение зависит также от pH раствора, в котором оно измеряется.
В молекулах треонина, изолейцина, оксипролина, оксилизина и цистина
имеется помимо асимметрического центра при а-углеродном атоме еще и
второй асимметрический центр. Таким образом, если не в живой природе,
то по крайней мере в лаборатории можно получить четыре диастереомера
каждой из этих аминокислот. Их обозначают как L-, D-, L-алло- и D-алло-
формы. Ниже приведены конфигурации для треонина:
СООН СООН СООН
-Н Н —С—NH2 H2N —С—1-І
-ОН НО —С—H НО —С —И
С-
H2N
н-с
СН3
L-треопин
-Н
СН3
D-треонин
СООН
н—с—ш2
И—С —ОН
СП3
Ь-алло-треопин
СП3
D-алло-треоНин
Цистин'Ъредставляет собой, очевидно, особый случай, так как в его
молекуле имеются два одинаковых асимметрических центра. В такого рода слу-

46 Г л а в а III
чаях, конфигурация одного из центров может быть зеркальным отражением
конфигурации другого; при этом в результате «внутренней компенсации»
молекула будет оптически неактивной. Подобные конфигурации называются
жезо-формами:
соои соод соон соон
II II
H2N-C-IJ, HaN-C-H HaN-C-H H-C-NH-
II II
H2C — S — S — CUa П2С _ S — S — CH2
L-цистин Мезо-цистии
Как отмечено выше, D-аминокислоты не встречаются в белках. Тем
не менее они широко распространены в живой природе. В частности,
D-аминокислоты — непременный компонент клеточных стенок бактерий. Кроме
того, они входят в состав многих антибиотиков, таких, как бацитрацин,
грамицидин и актиномицины.
КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА
Протолитические реакции, в которых участвуют аминокислоты, а также
реакции аминокислот с ионами металлов рассматривались в гл. П. Укажем
здесь лишь некоторые из кислотно-основных свойств амршокислот.
Каждая аминокислота содержит по крайней мере две группы, способные
принимать участие в протолитических реакциях в водном растворе.
Величина рКа для ос-карбоксильных групп аминокислот (т. е. значение pH,
при котором рассматриваемая группа в среднем наполовину
диссоциирована) лежит в пределах от 2 до 3. В то же время ос-аминогруппы
характеризуются значениями рКа (для сопряженной кислоты), близкими к 10. Таким
образом, в интервале pH от 4 до 9 аминокислоты существуют
преимущественно в форме биполярных ионов (цвиттерионов) с диссоциированной
карбоксильной группой и протонированной аминогруппой:
R
I
H3N+ — СН — СОО-.
В этом интервале pH аминокислоты с нейтральной R-группой обладают
небольшим средним зарядом; при определенном значении pH (изоэлектри-
ческая точка р/), характерном для данной аминокислоты, средний заряд
аминокислоты равен нулю. Легко показать, что у аминокислот, не
содержащих дополнительных кислотных или основных групп, р/ равно
полусумме двух значений рКа, т. е. что р/ — (p/faNH2 + рКаС0^1)/2. В табл. 8
приведены значения рКа и р/ для аминокислот, входящих в состав белков.
Боковые группы некоторых аминокислот (аспарагиновой и глутамино-
вой кислот, лизина, гистидина, аргинина, цистеина pi тирозина) имеют
кислый или основный характер. Соответствующие значения рКа также
приведены в табл. 8. Изоэлектрические структуры этих аминокислот зависят,
естественно, от кислотности или основности боковых групп. Превалирующие
изоэлектрические структуры аспарагиновой кислоты pi лизина,
определенные исходя из значений рКа, приведены ниже:
СООН NHt
| I
СН, (СН2L
ТІ —С —Nut Н—С —Ш,
I ' I
соо- соо-
Изоэлектрическая точка для аснарагиновой кислоты должна быть близкой
к полусумме значений рКа для се- и ?-карбоксилышх групп. При этом зыа-

Белки: классификация, свойства, очистка
47
чении pH B,97) аминогруппа в среднем почти полностью протонирована,
а-карбоксильная группа существует преимущественно в анионной форме,
а степень диссоциации ?-карбоксильной группы близка к нулю. Таким
образом, при pH 2,97 аспарагиновая кислота представляет собой
биполярный ион со средним зарядом, равным нулю (изоэлектрическая точка).
Аналогичное рассмотрение показывает, что изоэлектрическая точка для лизина
должна быть близкой к полусумме значений j>Ka для а-аминогруппы
и е-аминогруппы.
Биполярность структур обусловливает многие свойства аминокислот,
в частности хорошую растворимость в воде, сравнительно низкую
растворимость в органических растворителях, большие дипольные моменты и
высокие значения температуры плавления. Последнее свойство может частично
объясняться электростатическим притяжением противоположно
заряженных групп в кристаллической решетке.
ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
Для всех аминокислот характерны: реакции, в которых принимают
участие аминогруппы ртли карбоксильные группы или и те и другие
одновременно. Что же касается аминокислот, содержащих реакционноспособные
боковые цепи, то эти амртнокислоты могут, кроме того, принимать участие
и. в реакциях, специфических, для отих боковых цепей. Такие
специфические реакции представляют интерес главным образом по двум причинам.
Во-первых, реакции, приводящие к образованию окрашенных продуктов,
широко применяются для идентификации и полуколичествениого
определения белков и индивидуальных аминокислот. (Рассматривать их здесь
подробно мы но будем; ограничимся только сведениями, приведенными
в табл. 10.) Во-вторых, реакции, характерные для боковых цепей
аминокислот, часто используются в работах по химической модификации белков.
Таблица 10
Реакции, используемые для идентификации и полукодцчественного определения
аминокислот и белков
Название
Реакция Мидлона
Ксантопротеиновая
реакция
Реакция с гпиоксиповой
кислотой (реакция
Гопкипса — Кола)
Реакция Эрлиха
Реакция Сакагуши
Нитропруссидпая
реакция
Реакция Салливапа
Реакция Паули
Реакция Фолппа— Чпо-
калтеу
Реактивы
HgNO3 в азотной кислоте в
присутствии следов
азотистой кислоты
Кипящая концентрированная
азотная кислота
Глиоксиловая кислота в
концентрированной H2SO4
ге-Димотиламинобонзальдегид
в концевтрированной H Cl
(z-Нафтол и гинохлорит натрия
Нитролруссид натрия и
разбавленном растворе М13
\ ,2-нафтохішон-4-сульфонат
натрия и бисульфит натрия
Диазотированная султ.фаннло-
ная кислота в щелочном
|JtlL 1 iJUJJU
Фосфомолибдовольфрамомая
кнсиота
Определяемая
аминокислота
Тирозин
Тирозин
Триптофан
Фенилалатага
Триптофан
Триптофан
Аргинин
Цпстеин
Цисте пн
Глстпднп
Тирозин
Тиро.шп
Окраска
Красная
Желтая

Сине-фиолетовая
Синяя
Красная
Красная
Красная
Красная
Синяя

48 Глава 111
Многие реакции, типичные для аминогруппы и карбоксильной группы
{алкилирование, ацилирование, образование амидов и сложных эфиров),
хорошо известны из общего курса органической химии и здесь обсуждаться
не будут. Вместо них мы рассмотрим несколько специфических реакций,
широко используемых в химии аминокислот и белков.
Нингидрин. Реакция нингидрина (трикетогидринденгидрата) с
аминокислотами используется для обнаружения и количественного определения
аминокислот. Нингидрин, являющийся сильным окислителем, вызывает
окислительное дезаминирование аминокислоты, приводящее к образованию
аммиака, двуокиси углерода, соответствующего альдегида и
восстановленной формы нингидрина:
О О
и И
ОН /\/\ °Н
+ NH2 — CHR — СО,Н ~> || I ;S +пСНО + СО2 + ]\Щз. (Ш.1)
он ' \/\/ н
*—' Л. 11 IX,
О
Нингидрин Гидриндантин
Восстановленная форма нингидрина реагирует с избытом нингидрина и
аммиаком. При этом образуется продукт сине-фиолетового цвета с максимумом
поглощения около 570 ммк.
0 0 0 0
ОН л Л ОН /\/\
Поскольку поглощение при этой длине волны практически линейно зависит
от числа исходных аминогрупп, на основе нингидриновой реакции удалось
разработать удобный колориметрический метод количественного
определения аминов. Если нагревание с нингидрином проводить при pH 1—5,
то количество свободной аминокислоты можно определить по объему
выделившейся двуокиси углерода (полипептиды и первичные амины также дают
лиловое окрашивание с нингидрином, однако в этом случае СОг не
образуется). Таким образом, нингидриновая реакция позволяет определять
свободные аминокислоты даже в присутствии полипептидов. В случае имино-
кислот (пролина и оксипролина) образуется продукт ярко-желтого цвета
с максимумом поглощения около 440 ммк. Это позволяет использовать нин-
гидриновую реакцию для определения иминокислот в белковых гидроли-
затах, содержащих большой избыток аминокислот.
1-фтор-2,4-динитробензол. В структурной химии белков широко
используется реакция арилирования аминокислот 1-фтор-2,4-динитробензолом
(ДНФБ):
NO2 NO2
/ / И
O2N— ( y— F + NH2 — R —> O2N—<^ ^>—N —R + HF. (III.3)
Значение реакции динитрофенилирования состоит прежде всего в том, что
она приводит к количественному образованию кристаллических соединений
желтого цвета, которые легко отделяются при хроматографировании и могут
быть количественно определены спектрофотометрическим методом. Кроме
того, связь ДНФ — аминокислота в продуктах реакции
динитрофенилирования не гидролизуется кислотой, что позволяет использовать эту реакцию
для определения N-коицевых аминокислот в белках (см. гл. IV).

Белки: классификация, свойства, очистка 49
Фенилизотиоцианат. Фенилизотиоцианат легко реагирует с
аминокислотами с образованием соответствующих фенилтиогидантоиновых кислот:
R H S H R
С6НБ—N = C = S + NHa—СН —COjjH —*¦ С6Н5 —N—С—N —СН —СОаН. (III.4)
Фенилтиогидантоиновая
кислота
Эти соединения циклизуются при действии кислоты в неводных
растворителях, образуя фенилтиогидантоины:
S
H S H R l|
! Il I I H+ /\
C6H5 —N —C —N —CH —CO2H —> C6II5 — N NH + H2O. (III.5)
Нитрометан і І
J !CH-R
О
Фенилтиогидантоин
Амипоацильные производные фенилтиогидантоинов нетрудно
идентифицировать и количественно определить. Реакции аминокислот с фенилизотиоциа-
натом, так же как и реакции с ДНФБ, часто используются в структурных
исследованиях.
Фосген. При реакции фосгена с а-аминокислотами образуются N-карбок-
сиангидриды (ангидриды Лейкса):
О H
II |[ H N
R_C_NH2+C1 C1-*R-G \—o + 2HCl. (III.6)
СО2Н
О О
Ангидриды Лейкса легко взаимодействуют с нуклеофилышми реагентами
и играют важную роль в качестве промежуточных продуктов в синтезе
полипептидов. Аналогичная реакция имеет место с сероуглеродом:
H
H H N
CO2H /\/
О S
ПЕПТИДНАЯ (АМИДНАЯ) СВЯЗЬ
Очень важной характеристикой структуры любого полимера является
природа связей, соединяющих мономерные звенья. В 1902 г. Гофмейстер
и Фишер независимо друг от друга высказали предположение о том, что
белки синтезируются в результате образования вторичных амидных связей
между а-карбоксильными группами и а-амипогруппами соседних
аминокислот. Такие связи называют пептидными связями, а структуры,
возникающие в результате образования пептидных связей между остатками
аминокислот,— пептидами. Пептид, содержащий два аминокислотных остатка,
называют дипептидом; пептид, содержащий три остатка,— трипептидом
и т. д. Ниже в качестве примера приведена структурная формула тетрапеп-
4—246

50 Глава III
тида:
СІІз
S
СН3О П О И (СН2JО II СН2ОН
N11,
CHgO 11 О И (СН2JО П СН2ОН
! I! I II I I | [ I
1, —С—С—N —СН2 — С —N—СН —С —N —СН —СО»Н.
В структурных формулах пептидов концевую аминогруппу обычно пишут
слева, а концевую карбоксильную группу — справа. Название пептида
составляется из названий входящих в его состав аминокислот,
перечисляемых последовательно, начиная с N-конца, причем суффикс -ші в
названиях всех аминокислот, кроме С-концевой, заменяется на суффикс -ил.
Так, например, изображенный выше тетрапептид носит название аланил-
глицилм.етионилсерин.
Ниже перечислены данные, на которых основывается вывод о наличии
пептидных связей в молекулах белков.
1. Белки содержат сравнительно небольшое число титруемых
аминогрупп и карбоксильных групп, соответствующее числу концевых
аминокислотных остатков и числу боковых цепей аспарагиновой и глутами-
новой кислот, аргинина и лизина. В процессе гидролиза белков число-
титруемых карбоксильных и аминогрупп быстро возрастает, причем
скорость появления карбоксильных групп равна скорости появления
аминогрупп. Это дает основание считать, что в интактном белке в образовании
каждой пептидной связи участвует одна карбоксильная и одна аминогруппа.
2. Анализ неполного гидролизата белков указывает на присутствие ди-
и трипептидов, а также других олигопептидов. Структуру этих веществ
можно однозначно установить, сравнивая их с синтетическими пептидами.
3. При помощи модельных соединений с известной структурой было
показано, что специфичность протеолитических ферментов (т. е. белков,
катализирующих гидролиз других, белков) определяется их способностью'
вызывать гидролиз именно амидных (или аналогичных) связей.
H
4. Биурет (NH2CONCONH2) и аналогичные соединения, содержащие
пептидную связь, дают сине-фиолетовое окрашивание при действии
сульфата меди в щелочном растворе (биуретовая реакция). Для белков
характерна весьма интенсивная биуретовая реакция, что указывает на
присутствие большого числа пептидных связей.
5. Инфракрасные и ультрафиолетовые спектры белков также
свидетельствуют о наличии пептидных связей.
Г). Структура белка инсулина, а также некоторых природных
полипептидов (с более низким молекулярным весом) однозначно установлена
химическим синтезом этих соединений. Во всех случаях аминокислоты связывались
друг с другом пептидными связями *.
7. Изящные рентгеноструктурные исследования Перутца, Кендрью
и Филлипса (см. гл. IV) показали, что в таких белках, как миоглобин,
гемоглобин и лизоцим, аминокислоты связаны друг с другом пептидными связями.
Совокупность всех этих данных однозначно подтверждает гипотезу
Фишера — Гофмейстера о пептидных связях в белках, но не исключает
присутствия небольшого числа ковалентних связей другого типа. Очевидно,
L После выхода в свет этой книги был осуществлен полный химический синтез
рибонуклеази — белка, содержащего 124 аминокислотных остатка; все аминокислоты при е
также связывались пепти ными связями.— Прим. ред.
этол

Белки: классификация, свойства, очистка
К"
II
что амидные связи могут образовываться не только между а-аминогруппами
и а-карбоксильными группами, но и между карбоксильными группами
и аминогруппами боковых цепей некоторых аминокислот, например
аспарагиновой кислоты и лизина. Нельзя
исключить также возможность образования
сложвоэфирных связей, например между
глутаминовой кислотой и серином или
треонином. Действительно, было показано,
что в молекулах некоторых белков имеются
связи, отличные от амидных связей между
а-карбоксильной группой и а-аминогруппой
аминокислот. Тем не менее приведенные
выше данные свидетельствуют о том, что
наличие непептидных связей в белках — это
скорее редкое исключение, нежели правило.
Какие свойства пептидной группы
определяют ее роль в структуре белков?
Во-первых, шесть атомов пептидной группы
Са — СО — NH — Са (где Са означает а-
углеродные атомы соседних остатков в
пептидной цепи) лежат в одной плоскости.
Стабилизация этой системы определяется в
значительной мере тем, что условию копланарно-
сти отвечает максимальное взаимодействие
неподеленной электронной пары азота с я-
электронами С = О-связи. Длина связи С — N
в пептидной группе составляет
приблизительно 1,32 А, т. е. эта связь примерно на 50%
является двойной. Во-вторых, а-углеродныо
атомы пептидной группы находятся в транс-
положении относительно связи С—N.
Размеры и конфигурация полностью развернутой
полипептидной цепи указаны на фиг. 7. Ниже мы увидим, что копланар-
ность пептидной группы и транс-положение а-углеродных атомов по
отношению к связи С — N играют важнейшую роль в структуре белков.
СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ
Интерес к химическому синтезу пептидов обусловлен главным образом
возможностью использовать этот синтез, во-первых, для точного
определения структуры природных пептидов и, во-вторых, для получения
химических аналогов этих последних. Синтетические пептиды весьма широко
используются при изучении вопроса о связи между химической структурой
и биологической функцией; кроме того, некоторые из них находят важное
применение в медицине.
Синтез пептидов включает три главные стадии. На первой стадии
химически блокируются все те аминогруппы и карбоксильные группы, которые
не должны участвовать в реакции. Вторая стадия состоит в связывании
свободных карбоксильных групп со свободными аминогруппами, т. е. в
образовании пептидной связи. На третьей стадии осуществляется удаление
защитных групп. Если в реакции конденсации участвуют такие
аминокислоты, как цистеип, лизин и аспарагиновая кислота, которые содержат
реакционноспособпые боковые цепи, то эти боковые цепи также нуждаются
в химической защите. Блокирующие агенты, применяемые при синтезе
пептидов, должны удовлетворять определенным требованиям: 1) введение
4*
R1"
Фпг. 7. Размеры п конфигурация
полностью ра.'шерцутой полптгеп-
тпдпой цени.

52 Г лав а III
защитных групп должно быть количественным и не должно сопровождаться
рацемизацией аминокислоты; 2) защищенная аминокислота должна быть
устойчивой в условиях реакции конденсации; 3) защитная группа должна
легко удаляться в условиях, не приводящих к разрыву пептидных связей
и рацемизации пептида.
Легко видеть, что синтез даже простых пептидов — весьма трудоемкий
процесс, состоящий из многих стадий. Недавно предложенный Меррифялдом
твердофазный метод синтеза пептидов существенно упрощает и сокращает
описанную выше процедуру. Этот метод основан на образовании ковалент-
ной связи между карбоксильной группой С-концевой аминокислоты
и частицей специальной смолы. Присоединенная аминокислота
взаимодействует с активированной аминокислотой. При этом образуется
присоединенный к смоле защищенный дипептид, который очищают с помощью
обычной фильтрации. Удалением защитной группы и собиранием частиц смолы
завершается первый цикл синтеза. После присоединения всех требуемых
аминокислот законченный пептид освобождается из комплекса смола —
пептид и очищается электрофорезом. Использование этого метода позволило
синтезировать нонапептид брадикинин всего за 8 дней 1.
Существующие методы позволяют синтезировать пептиды различной
длины, в том числе и некоторые высокомолекулярные полипептиды
сравнительно сложного строения. Большое значение имеет также неупорядоченный
синтез полипептидов, в частности синтез гомополипептидов, таких, как
полиглицин, полисерин и полиглутаминовая кислота. Использование этих
соединений при изучении структуры белков рассматривается в гл. IV.
Гомополипептиды, а также гетерополипептиды с неупорядоченной
последовательностью аминокислотных остатков можно синтезировать из N-карбок-
сиангидридов, образующихся в результате реакции аминокислот с фосгеном.
N-карбоксиангидриды аминокислот легко реагируют с нуклеофильными
реагентами:
R H
I H О R
N I If I
I +R'NH2 —> R'—N —С —CH —NH2 + CO2. (III.8)
О V
При этом освобождается двуокись углерода и появляется свободная
аминогруппа, которая может реагировать с другой молекулой N-карбоксиангид-
рида, что ведет к удлинению цепи и появлению новой свободной
аминогруппы. Многократное повторение такого процесса приводит к
образованию полимера
R H
n H—
-N
I Инициатор
/ R О \
НІ H +nCO2.
V-N—CH—C—/n
(III.9)
О V О
Достигаемая степень полимеризации зависит главным образом от структуры
и концентрации инициатора реакции (т. е. молекулы, первоначально
атакующей N-карбоксиангидрид), от природы растворителя и от температуры.
Если правильно выбрать инициатор и подобрать надлежащие условия
реакции, то удается синтезировать полипептиды, степень полимеризации
которых варьирует в достаточно узких пределах.
1 Этим же методом Меррифипд недавно осуществил синтез рибонуклеазы.— Прим. ред.

Белки: классификация, свойства, очистка 53
ПРИРОДНЫЕ ПЕПТИДЫ
Почти все живые клетки содержат заметные количества
низкомолекулярных пептидов. Так, например, в большинстве растительных и животных
клеток содержится глутатион (¦у-Ь-глутамил-Ь-цистеинилглицин), а в
мышечной ткани позвоночных — карнозин (?-аланил-Ь-гистидин) и ансерин
(?-аланил-і-метил-Ь-гистидин).
ОН ОН
HjaN-CHjj—CHa-C-N-CH — СО2Н H2N-CH2—СН2 —С —N-CH-CO2H
СИ, СНо
NH N-СНз
Карнозин Ансерин
Наибольший интерес представляют, естественно, пептиды, обладающие
какой-либо биологической активностью (физиологической или
антибактериальной).
Задняя доля гипофиза млекопитающих вырабатывает несколько
пептидных гормонов, в частности два нонапептида — окситоцин и вазопрессин.
NH2 NH2
Іис-Тир-Илей Цис-Тир-Фен
S
Цис-Аспн-Глун Цис-Лспп-Глун
О I О
tt-C-P
Про-Лей- Гли-С-Гга2 Про-Арг-Г ли-C-NHa
Окситоцин быка Вазопрессин быка
Окситоцин вызывает сокращение гладких мышц матки, а также
стимулирует лактацию; вазопрессин повышает кровяное давление и уменьшает диурез
(объем мочи, выделяемой почками). Структура окситоцина и вазопрессина
была установлена и подтверждена химическим синтезом в классических
работах дю Виньо и его сотрудников. Различия между окситоцином и вазо-
прессином касаются только двух аминокислотных остатков в
положениях 3 и 8. Структуры нонапептидов, выполняющих функции вазопрессина
у разных видов млекопитающих, также могут различаться природой
аминокислотных остатков в положении 8 и (реже) в положении 3.
В промежуточной доле гипофиза синтезируются два полипептидпых
гормона, стимулирующих образование пигмента в меланоцитах,— а-мелано-
цитстимулирующий и ?-меланоцитстимулирующий гормоны.
Исследование структуры ?-меланоцитстимулирующего гормона показало, что он,
так же как и вазопрессин, обладает видовой специфичностью.
Последовательности аминокислотных остатков в гормонах, выделенных из различных
организмов, приведены на фиг. 8.
В передней доле гипофиза вырабатывается адренокортикотропный гормон
(АКТГ), стимулирующий рост и метаболическую активность коры
надпочечника. АКТГ представляет собой полипептид, состоящий из 39
аминокислотных остатков. Последовательность первых 24 остатков АКТГ
неизменна у всех изученных организмов, тогда как последовательность остальных
15 остатков у разных видов варьирует. Ниже приведена структура АКТГ

54 Глава III
человека:
Сер-Тир-Сер-Мет-Глу-Гпс-Фен-Арг-Тріт-Гли-Лнз-Про-Вал-Глп-Лпз-Лпз-Арг-Арг-Про-
Вал-Лиз-Вал-Тнр-Про-Асп-Ала-Глп-Глу-Асп^лун-Сер-Ала-Глу-Ала-Фен-Про-Леи-
Глу-Фен
Одна из наиболее интересных групп физиологически активных пептидов —
это пептиды, образующиеся из биологически инертных белков, обычно
присутствующих в плазме. В нее входят ангиотонины, брадикинин и каллидин.
Человек Ала-Глу-Лиз-Лиз-Асп-Глу-Гли-Про-Тир-Арг-Мет-Глу-Гис-Фен-Арг-Три-Гли-Сер-Про-Про-Лиз-Асп
Обезьяна Асп-Глу-Гли-Про-Тир-Арг-Мет-Глу-Гис-Феп-Арг-Три-Гли-Сер-Про-Про-Лиз-Асп
Лошадь Асп-Глу-Гли-Про-Тир-Лиз-Мет-Глу-Гио-Фец-Арг-Три-Гли-Сер-Про-Арг-Лиз-Асп
Бык Асії-Сер-Гли-Про-Тир-Лиз-Мет-Глу-Гис-Феи-Арг-Тррі-Гли-Сер-Про-Про-Лиз-Асп
Свинья Асп-Глу-Гли-Про- Тир-Лиз- Мет- Глу-Гис-Фен-Арг-Три-Гли-Сер-Про-Про-Лиз-Асп
Фиг. 8. Последовательность аминокислотных остатков в препаратах ?-меланоцитсти-
мулирующего гормона (?-МСГ), получевных из пяти различных организмов.
Замены аминокислот по отношению к ?-МСГ человека обозначены горизонтальной чертой.
Ангиотонинами называют группу октапептидов, обладающих
сосудосуживающим действием. Различия между ангиотонинами, полученными
из разных видов, касаются аминокислотного остатка в положении 5.
Ангиотонины образуются из присутствующего в плазме белка ангиотониногена
в результате последовательного расщепления определенных пептидных связей
протеолитическими ферментами — трипсином, ренином и особым ферментом,
катализирующим превращение неактивного ангиотонина І в активный ангио-
тонин II (фиг. 9).
Ренин Трипсин
І І
Аш-Арг-Вал-Тир-Илей-Гис-Про-Фон-Гис-Лей-Лей-Вал-Тир-Сер-Болок
Ангпотонпноген (неактивный)
Фермент, катализирующий превращение
ангиотонпна І в ангнотонин II
і
Асп-Арг-Вал-Тнр-Илей-Гис-Про-Фен-Гис-Лей
Ангнотонин I (неактивный)
і
Асп-Арг-Вал-Тир-Илей-Гис-Про-Фон
Ангиотонин II (активный)
Фиг. 9. Превращение апгиотощшогепа в пептид ангиотонин, обладающий
сосудосуживающим действием.
Брадикинин — нонапептид, образующийся при обработке плазмы
трипсином или змеиным ядом,— вызывает сокращение гладких мышц. Ниже
приведена его структура:
Арг-Про-Про-Гли-Фен-Сср-Про-Феп-Арг]
Брадикинин
Каллидин действует аналогично брадикинину. Этот декапептид
Лиз-Apr Про-Про-Гли-Фен-Сер-Про-Фон-Арг,
Каллидин
образуется из белка плазмы каллидиногена. От брадикинина каллидин
отличается присутствием одного дополнительного остатка лизина на N-конце
пептидной цепи.

Белки: классификация, свойства, очистка
55
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ
Количественное или полуколичественное определение белков — задача»
постоянно возникающая при работе с белками, в частности при их очистке
(см. ниже). Для этой цели были предложены различные цветные тесты,
основанные на реакции одной или нескольких аминокислотных боковых
цепей с соответствующим реактивом (см. табл. 10). Негидролизованные белки
240
250
260 270 280
Длина волны, ммк
Фиг. 10. Спектры поглощения триптофана (I), тирозина (П) п фештлаланина (III) в
ультрафиолетовой области.
также вступают в эти реакции, что указывает на отсутствие ковалентных
связей между большинством аминокислотных боковых цепей в интактном
белке. Однако такого рода методы не всегда пригодны для количественного
определения белков, поскольку частота, с которой встречается в белке
данная боковая цепь, а следовательно, и интенсивность наблюдаемой реакции
варьируют от белка к белку. Принадлежащий к группе протаминов салъмин,
85% которого (по весу) составляет аргинин, дает, например, гораздо более
интенсивную красную окраску на 1 г белка в реакции Сакагуши, чем белок
молока, ?-лактоглобулин, в котором содержание аргинина не достигает 3%.
Другой широко используемый метод определения белка — измерение
оптической плотности белковых растворов — также не свободен от этого
недостатка. Ультрафиолетовые спектры большинства белков имеют максимум
вблизи 278 ммк. Из данных, приведенных в табл. 8, следует, что в этой
области спектра B50—290 ммк) сильно поглощают только триптофан, тирозин
и фенилалании, причем интенсивность поглощения триптофана и тирозина
значительно превышает интенсивность поглощения фенилаланина (фиг. 10)].
1 Белок можно определять также, измеряя оптическую плотность при 230 ммк.
Преимущество такого способа спектрофотометрического анализа белков обусловлено
сравнительно слабой зависимостью коэффициента поглощения при этой длине волны от
-аминокислотного состава белка.— Прим. ред.

56 Г л а в а III
Поглощение монохроматического света растворенным соединением
описывается уравнением Бера — Ламберта
Ц\=ес1ъ (III. 10)
где Ій и I — интенсивности светового пучка, падающего на раствор и
прошедшего через раствор, е — коэффициент пропорциональности,
называемый молярным коэффициентом поглощения или коэффициентом экстинкции,
с — концентрация в молях на литр и I — длина оптического пути в
сантиметрах. Величину lg {Ijl ) нетрудно измерить с помощью спектрофотометра.
Ее называют поглощением (А) или экстинкциеи (Е). Измерения величины А
производят обычно в оптических кюветах с длиной пути 1 см. При этом
уравнение Бера — Ламберта принимает следующий івид:
As=E = ee, (ІІІ.И)
где е численно равно поглощению 1 M раствора данного вещества [при
выбранной длине волны и имеет размерность л/моль/см, т. е. М~х1см. Легко
видеть, что если известно значение е, то измерение А позволяет определить
концентрацию раствора. Поскольку значения е для многих веществ известны
или легко могут быть определены и поскольку измерение величины А не
вызывает затруднений, этот метод определения концентрации получил весьма
широкое распространение.
Недостаток спектрофотометрического метода определения белков состоит,
очевидно, в том, что содержание тирозина и триптофана (от которого зависит
величина е) в разных белках варьирует. Этот метод дает хорошие
результаты с гетерогенной смесью белков, а также с достаточно чистыми
препаратами индивидуального белка, коэффициент поглощения которого может
быть точно измерен или вычислен исходя из аминокислотного состава (при
условии, что последний известен).
Более точный (и соответственно более трудоемкий) метод определения
белка основан на количественном определении белкового азота. Среднее
содержание азота в разных белках составляет приблизительно 16%. Анализ
включает перевод белкового азота в аммиак (путем кипячения с
концентрированной серной кислотой в присутствии сульфата меди, сульфата ртути
или другого катализатора), отгонку с паром образовавшегося аммиака
из реакционной смеси и его количественное определение титрованием или
колориметрированием при помощи реактива Несслера (щелочной раствор
меркурииодида калия).
Биуретовая реакция также может быть использована для определения
концентрации белка, поскольку с помощью этой реакции выявляются
пептидные связи, среднее число которых на единицу веса белка для
большинства белков приблизительно одинаково.
Существуют и другие методы определения белка, основанные на
измерении 1) коэффициента преломления; 2) мутности после осаждения белка
трихлоруксусной кислотой и 3) сухого веса (этим методом пользуются для
калибровки и проверки других, чаще применяемых методов).
АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ
Точное определение аминокислотного состава белков весьма существенно
для их идентификации и для понимания их структуры. Аминокислотный
анализ включает две главные стадии: гидролиз белка до аминокислот и
количественное определение продуктов гидролиза.

Белки: классификация, свойства, очистка 57
ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ
Для полного гидролиза белков можно использовать сильную кислоту,
сильное основание или специфические катализаторы — протеолитические
ферменты. Наиболее часто используется для этой цели сильная кислота.
Обычная методика гидролиза состоит в кипячении белка с 6 н. НС1 в
запаянной ампуле (из которой предварительно откачивают воздух) при 110° в
течение 12—96 час. В этих условиях пептидные связи гидролизуются с
количественным выходом (для полного освобождения валина, лейцина и изо-
лейцина требуется сравнительно большое время) и в результате гидролиза
образуются гидрохлориды аминокислот. При пагревании с минеральными
кислотами триптофан полностью распадается, а оксиаминокислоты серии
и треонин подвергаются частичному разрушению. Эти потери определенным
образом учитываются. Рацемизации аминокислот при кислотном гидролизе
не происходит.
Для полного гидролиза белков можно использовать также щелочную
среду, например раствор едкого натра (белок инкубируют в 2—4 н. NaOH
при 100° в течение 4—8 час). Этот способ гидролиза применяется сравнительно
редко. Его используют главным образом для определения триптофана —
аминокислоты, распадающейся при кислотном гидролизе.
Полный ферментативный гидролиз белков осуществить трудно, так как
большинство протеиназ атакует с достаточно большой скоростью только
определенные типы связей (см. гл. VII). Метод ферментативного гидролиза
применяется с большим успехом в тех случаях, когда необходимо провести
частичный гидролиз, например при определении аминокислотной
последовательности белка (см. гл. IV).
АМИНОКИСЛОТНЫЙ АНАЛИЗ
После полного гидролиза белка производится количественное
определение каждой из аминокислот, присутствующих в гидролизате. Для разделения
аминокислот чаще всего применяется метод ионообменной хроматографии.
В качестве ионообмениика обычно используют сульфополистирольный катио-
нит. Смесь аминокислот вносится в верхнюю часть колонки при pH 3; в этих
условиях индивидуальные аминокислоты положительно заряжены.
Аминокислоты в форме катионов сорбируются на сульфополистирольной смоле
(содержащей группы — SOjNa+), замещая часть ионов натрия, и
удерживаются на материале колонки электростатическими силами. Очевидно, что
прочность сорбции аминокислоты возрастает с увеличением ее основности.
После внесения смеси начинается элгоция аминокислот при постепенном
увеличении pH и ионной силы буферных растворов, пропускаемых через
колонку. В этих условиях положительный заряд на аминокислотах
постепенно нейтрализуется и ионные взаимодействия ослабляются. Первыми
с колонки снимаются кислые аминокислоты (глутаминовая и аспарагиновая
кислота), затем нейтральные и, наконец, основные. С помощью этого метода
можно разделять все аминокислоты, обычно встречающиеся в белках,
поскольку прочность сорбции аминокислоты смолой зависит как от ионных,
так и от неионных взаимодействий. Сульфополистирольный катион
адсорбирует аминокислоты достаточно избирательно, так что все нейтральные
аминокислоты, которые нельзя разделить с помощью ионного обмена, тем
не менее элюируются с колонки в разных фракциях. Индивидуальные
аминокислоты, элюируемые с колонки, собираются автоматическим
коллектором фракций. Затем их количественно определяют путем измерения
интенсивности окраски, возникающей при действии нингидрина. В настоящее
время промышленность выпускает несколько типов автоматических амино-

58
Глава III
кислотных анализаторов. Эти аппараты автоматически разделяют
аминокислоты на ионообменной колонке, собирают их, добавляют нингидрин
и нагревают смесь для развития окраски, после чего измеряют интенсивность
окраски и регистрируют ее в виде графика. На фиг. 11 приведена типичная
запись результатов автоматического хроматографического анализа смеси
аминокислот. Положение пика, отвечающего каждой из аминокислот на
хроматограмме, строго фиксировано, причем измерение площади пика
позволяет определить содержание соответствующей аминокислоты.
Точность такого анализа (занимающего несколько часов) составляет обычно 2%.
',0
I 0.5:
I 0,3
I 0,2
0,1
Злюат,
мл
Цистеиновая
кислота
Аспарагииооая
кислота
Метионин-
.Треонин
spun
•лутаминовая
кислота
Пролий
л Алании
Цистин
АО 80 ПО 160 200 24\
* Колонка 150 см; pH 3,25', 0,2н. цитрат натрия
Вами . MemuoHUH
280
320
1,0 г
цз-
Q2-
0,1-
і j \ ] J V \
Лейцин
Тирозин
Фенилаланин
Гистидин
Аргинин
V I I
330
370 410 450
-рН4,25; 0,2 н. цитрат натрия—
490 50 90 130
—»-| Колонка 15см;рН 5,28;0,35«цитратдатрвд
Фиг. 11. Запись результатов автоматического хроматографпрованпя смеси аминокислот
с использовапиом сульфополпстцрольпого катиоыита.
Для разделения аминокислот могут использоваться не только катионооб-
менники (в частности, сульфополистирольный катионит), но и анионооб-
менники.
Смеси аминокислот можно фракционировать также с помощью давно
известного метода хроматографии па бумаге, основанного на различиях
в коэффициентах распределения аминокислот между органической и водной
фазами. Хроматография на бумаге с использованием какой-нибудь одной
системы растворителей обычно не дает возможности осуществить полное
разделение всех аминокислот. Значительно большей разрешающей
способностью обладает метод двумерной хроматографии. При этом лосле хрома-
тографирования в одном направлении с использованием одной системы
растворителей хроматограмму поворачивают па 90° и продолжают
разделение с помощью второй системы растворителей. Типичная двухиерная хро-
матограмма гидролизата белка приведена на фиг. 12. Индивидуальные
аминокислоты проявляются нингидрином і! виде, пятен сине-фиолетового
цвета. Пятна можно вырезать, элюировать и определить оптическую
плотность элюатов, которая пропорциональна количеству соответствующей
аминокислоты. Этот метод более трудоемок и обычно менее точен, чем автома-

Белки: классификация, свойства, очистка
59
тический анализ с использованием хроматографии на колонках, однако,
как правило, чувствительность его выше. Электрофоретическое разделение
аминокислот, так же как и разделение методом ионообменной хроматографии,
основано на различиях в заряде аминокислот (при соответствующих
значениях pH). Если, например, нанести смесь аминокислот на удобную
поддерживающую среду, или носитель (обычно — бумагу, насыщенную
подходящим буфером в водном растворе), и приложить разность потенциалов,
то глутаминовая и аспарагиновая кислоты при нейтральном pH начнут
I *~ A ) Бцтатл- цксцсная кислота
+ Аспарагиновая 'и Va
I
І
Тирозин
\ Гистидин
ШЛтт
BajiuH
MemuoHUH
Шолейціш
і Аргинич Лейцин
' Шпролии
Фенилсиїпнин
Фиг. 12. Двумерная хроматограмма смеси аминокислот.
перемещаться к аноду, а гистидин, лизин и аргинин — к катоду, т. е. будет
происходить разделение. После электрофоретического разделения
аминокислоты можно идентифицировать и определить их содержание так же, как
и при хроматографии на бумаге. Методы хроматографии и электрофореза
на бумаге часто комбинируются: хроматографическое разделение проводится
в одном направлении, а электрофоретическое — в другом.
Аминокислотный состав некоторых белков приведен в табл. 11.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО ВЕСА МАКРОМОЛЕКУЛ
Основными характеристиками белка служат аминокислотный состав
я молекулярный вес. Надежное и достаточно точное определение
молекулярного веса макромолекул — довольно сложная задача. Методы
определения молекулярного веса, обычно используемые для небольших молекул,
в частности эбулиоскопический (повышение точки кипения) и криоскопиче-
ский (понижение точки замерзания), так же как и метод, основанный на
изменении давления пара растворителя над раствором, малопригодны или даже
вовсе не пригодны для макромолекул из-за очень большой величины этих
последних, а также из-за их неустойчивости. Например, для того чтобы
точка замерзания водного раствора белка с молекулнрнъш весом 10 000

Таблица 11
Аминокислотный состав белков
A) Число граммов аминокислоты в 100 г белка
B) Число молей аминокислоты в 100 000 г белка
н. о.—не определялось
Белок
Молекулярный вес
Общий азот
Глицин
Алании
Серии
Треонин
Пролин
Оксипролин
Валин
Изолейцин
Лейцин
Фенилаланин
Тирозин
Триптофан
Цистин/2
Цистеин
Метионин
Аспарагиновая кислота
Глутаминовая кислота
Амиды (аспарагин-глу-
тамин)
Аргинин
Гистидин
Лизин
Оксили.шн
Сумма
Инсулин
быка
5733
Н. О.
B)
70,5
44,8
53,0
17.3
16.7
0
71,0
10,0
101,0
49,8
66,0
0
52,0
0
0
53,0
115,8
н. о.
16.3
34,5
14,5
0
786,2
Цитпо-
хром с
из сердца
лошади
12 100
IS ,98
B)
90,1
43,0
0
72,7
24,0
0
17,3
42,1
43,0
26,4
31,4
8,3
н. о.
18,2
н. о.
58,7
89,3
70,2
14,9
21,5
147,1
0
748,0
Сыворото чный
альбумин
человека
68 000
н.
(і)
1,60
н. о.
3,70
5,0
5,1
0
7,7
1,7
11,9
7,8
4,66
0,19
5,58
0,7
1,28
10,4
17,4
0,88
6,15
3,50
12,30
0
о.
B)
21,3
II. О.
35,2
42,0
44,3
0
65,8
13,0
90,8
47,3
25,7
0,9
46,5
5,8
8,6
78,2
11,8
62,9
35,3
22,6
84,2
0
780,0
Глюкагон быка
3647
17
A)
2,08
2,68
11,60
9,93
0
0
3,22
0
7,42
9,42
10,60
5,71
0
0
3,77
15,40
12,40
1,60
9,52
3,81
4,06
0
45
B)
27,7
30,1
110,5
83,4
0
0
27,5
0
56,6
57,1
58,6
28,0
0
0
25,3
115,8
84,4
114,3
54,7
24,5
27,8
0
812,1
а-Цепь

гемоглобина
человека
IS ISO
н. о.
B)
46,1
139,0
71,4
56,8
47,5
0
86,7
<0,06
121,0
46,4
18,7
5,9
6,1
н. о.
12,6
78,0
33,8
33,3
35,6
65,8
72,6
0
944,0
?-Цепь

гемоглобина
человека
15 860
н. о.
B)
82,4
95,0
29,6
42,8
46,0
0
112,5
<0,06
115,0
50,2
17,8
11,1
12,3
н. о.
6,11
81,9
76,3
62,6
18,6
56,0
69,6
0
978.2
Гистон и
i 'тимуса
теленка
15 500
17
(і)
5,07
9,68
4,92
5,47
4,62
0
5,79
4,59
8,18
2,79
3,69
0
0
0
1,14
5,12
9,71
0,71
11,61
2,48
17,35
0
4
B)
67,6
108,8
46,9
46,0
40,2
0
49,5
35.0
62,4
16,9
20,4
0
0
0
7,6
38,5
66.0
50,7
66,7
16,0
118,8
0
807,3
Коллаген
Эластоидин 1)
к.
IS,
(І)
25,53
11,39
4,43
2,87
14,11
9,68
2,02
2,46
2,50
2,45
1,72
0
0,22
0
2,05
6,13
12,07
0,56
9,02
0,70
3,59
1,17
о.
2
B)
330,4
128,0
42,2
24,1
122,7
73,9
17,3
18,8
19,1
14,8
9,5
0
1,8
0
13,8
46,1
82,1
40,8
51,8
4,5
24,6
7,1
1042,7
і) Белок, содержащийся в плавниках акулы.

Белки: классификация, свойства, очистка 61
понизилась на 0,1°, концентрация раствора должна была бы составлять около
5,5 кг/л\ Еще хуже обстоит дело с двумя другими упомянутыми методами.
Ниже рассматриваются основные методы определения молекулярного веса
белков. Заметим, что большинство этих методов применимо также и к
другим полимерам.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Определение содержания иона металла (в металлопротеидах) или
определение аминокислотного состава белка позволяет вычислить минимальные
молекулярные веса. Такой расчет основан на допущении, что каждая
молекула данного белка содержит один и только один атом металла или один
и только один аминокислотный остаток данного типа. Если молекула белка
содержит более чем один такой компонент, то вычисленный молекулярный
вес будет меньше истинного молекулярного веса во столько раз, во сколько
число таких компонентов, входящее в молекулу белка, больше единицы.
Можно, следовательно, написать
(Молекулярный вес компонента)-100 ,„» ,г,ч
min~~ Процентное содержание компонента ' \ • )
Зная, например, что гемоглобин (белок, переносящий кислород) содержит
0,335 г железа на 100 г белка, мы можем определить его минимальный
молекулярный вес; он будет равен E5,85/0,335) х 100 = 16 700. С помощью
физических методов (см. ниже) было показано, что истинный молекулярный
вес гемоглобина близок к 66 000. Следовательно, каждая молекула
гемоглобина должна содержать четыре атома железа. В аналогичных расчетах
с использованием данных по аминокислотному составу выбирают,
естественно, ту аминокислоту, содержание которой в белке минимально. Этот метод
используется главным образом для проверки результатов определений
молекулярного веса с помощью физических методов.
ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
Выбор оптимальных условий работы и правильное приготовление
препаратов позволяют получить в электронном микроскопе оптическое
разрешение, равное приблизительно 20 А 1. С помощью электронного микроскопа
можно непосредственно наблюдать и фотографировать отдельные молекулы
белков, так как их минимальные размеры в большинстве случаев
превышают 20 А. Молекулярный вес белка легко рассчитать, если
известны: 1) число белковых частиц (т. е. отдельных молекул) в данном поле
зрепия электронного микроскопа, 2) объем раствора, из которого были
получены эти частицы, и 3) сухой вес белка в миллилитре исходного раствора.
Условия A) и C) легко выполнимы (первое — путем подсчета числа частиц
на электронной микрофотографии, третье — с помощью рассмотренных
в этой главе аналитических методов). Объем, соответствующий данному
полю зрения, можно рассчитать, добавляя к исходному раствору известное
число частиц полистирольного латекса. Пусть, например, в электронном
микроскопе исследуется раствор, содержащий 1 мг белка и 1013 частиц
латекса на 1 мл, и пусть в поле зрения обнаруживается 10 частиц латекса и 1000
частиц белка. Из простого расчета следует, что каждая белковая частица должна
весить приблизительно 10~18 г, т. е. что молекулярный вес белка в дальто-
нах составляет около 6-Ю5. При определении молекулярного веса с помощью
электронного микроскопа необходимо производить статистическую
обработку данных из нескольких независимых измерений.
1 Лучшие образща современных электронных микроскопов обеспечивают
разрешение 2—3 А.— Прим. ред.

62
Глава III
В случае достаточно больших молекул электронная микроскопия
позволяет судить о форме наблюдаемых частиц. Отметим, однако, что
приготовление образцов для электронной микроскопии включает весьма жесткие
процедуры (в частности, высушивание образца), так что форма частицы,
наблюдаемой в электронный микроскоп, может и не соответствовать реальной
конфигурации молекулі»і белка в растворе. Тем не менее во многих случаях
Фиг. 13. Электронная микрофотография бактериофага Т2.
электронная микроскопия дает весьма ценную информацию о размерах
и форме макромолекулярных частиц. Этим методом удалось, в частности,
выяснить морфологию вирусных частиц. На фиг. 13 представлена
электронная микрофотография отдельных частиц бактериофага Т2.
ИЗМЕРЕНИЕ ОСМОТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ
Если раствор белка отделен от чистого растворителя полупроницаемой
мембраной, через которую могут проникать молекулы растворителя
и не проникают молекулы растворенного вещества, то величина давления
по обе стороны мембраны будет различной. Разность давлений по обе стороны
такой полупроницаемой мембраны называется осмотическим давлением.
Условием равновесия между раствором и растворителем является (помимо
равенства их температур) равенство химических потенциалов растворителя
в растворе и в чистом растворителе, причем вследствие полупроницаемости
мембраны равновесие имеет место только по отношению к растворителю.
Отсутствие равновесия по отношению к растворенному веществу приводит
к возникновению осмотического давления, которое нетрудно определить,
измерив минимальное гидростатическое давление, препятствующее переносу
растворителя через мембрану. Такие измерения производятся с помощью
осмометра, схематически изображенного на фиг. 14.

Белки: классификация, свойства, очистка
63
Для двухкоыпонентной системы, состоящей из растворителя и одного
высокомолекулярного вещества, осмотическое давление П связано с
концентрацией уравнением Вант-Гоффа, которое для наших целей удобнее
всего паписать в форме зависимости молекулярного веса M растворенного
вещества от его концентрации с
'-'" П 1 (III.13)
С-+0
М
С помощью отого уравнения можно вичислить молекулярный вес, так как
с, Т и П — экспериментально определимые величины. Поскольку в
уравнение (III.13) входит предельное значение H/RTc, для определения моде-
^.Давление Ро
Избыточное давление
¦— Капилляр
Чистый растворитель
Капилляр .
^Мембрана
Растворитель +
растворенное веиугство
ft, (давление Ро )
р." (давление Ро+ П )
Внешняя сторона Внутренняя сторона
Фиг. \h. Схема осмометра.
кулярного веса нужно измерить осмотическое давление при разных
концентрациях, построить график зависимости П от с и тщательно
экстраполировать кривую к точке с — 0. Трудоемкость такой процедуры
составляет основной недостаток данного варианта осмотического метода. Другой
вариант состоит в использовании более общего уравнепия
-Wc--W + Bc + Cc2+--- (IIL14)
Коэффициенты В, С и т. д. определяются из зависимости И от с. Уравнение
позволяет вычислять значения M без экстраполяция к с =-- 0.
Главными недостатками осмотического метода, помимо большого расхода
времени, являются: 1) возможность агрегации и осаждения белка за время,
необходимое для достижения равновесия; 2) необходимость проведения
измерений в условиях (часто заранее но известных), при которых средний
заряд белка равен нулю (см. ниже); 3) невозможность оценить
чистоту препарата. Если препарат гетерогенен, т. о. содержит молекулы
разного размера^ то измерение осмотического давления дает средпечисленный
молекулярный вес, определяемый выражением
(III. 15)

¦64Глава III
где Ci — концентрация j-го компонента, a Mi —¦ его молекулярный вес.
Отметим, что вклад относительно малых молекул в среднечисленный
молекулярный вес оказывается завышенным.
Если средний заряд белка не равен нулю, то измерение осмотического
давления дает завышенное (по сравнению с измерением в изоэлектрической
точке) значение П. Это явление обусловлено эффектом Гиббса — Доннана
(см. ниже). Рассмотрим поведение отрицательно заряженного белка в
растворе хлористого натрия. Обозначая внутреннюю и внешнюю стороны
мембраны соответственно через і и о, а концентрацию белка через [Р~],
можно записать условие электронеитральности в виде
для раствора і и
[Na+lo = [Cl-]o (III.17)
для раствора о, так как условие электронеитральности должно соблюдаться
по обе стороны мембраны. Поскольку отрицательные заряды белка
присутствуют только по одну сторону мембраны, распределение ионов натрия
и хлора в системе не является симметричным. Такое асимметрическое
распределение приводит к увеличению наблюдаемой величины осмотического
давления. Для реакции
при равновесии (см. стр. 24)
[Na+]O[C1Jo l '
я, следовательно,
[Na+]0[Cl-]0 = [Na-b]i[Cl-]i. A11.20)
Используя уравнения (III. 16), A11.17) и (III.20), легко показать, что
. (III.21)
Таким образом, относительная разность концентраций ионов, способных
диффундировать через мембрану, возрастает при увеличении концентрации
заряженного белка и уменьшается при увеличении ионной силы.
Следовательно, если значение pH, при котором средний заряд белка равен нулю,
неизвестно, то осмотическое давление растворов белков и других заряженных
макромолекул должно измеряться при высоких концентрациях соли. В
большинстве случаев достаточна концентрация соли, равная 0,2 М.
Проведенное выше рассмотрение легко может быть обобщено на случай
многовалентных электролитов и любого заряда белка.
ИЗМЕРЕНИЕ СКОРОСТИ СЕДИМЕНТАЦИИ
Быстрое развитие техники исследования макромолекул в сильных
гравитационных полях привело к существенному улучшению методов
определения молекулярного веса полимеров. Первая ультрацентрифуга была
построена в 1925 г. Сведбергом и его сотрудниками. Ультрацентрифуга
состоит из следующих основных частей: ротора, в котором находятся кюветы,
содержащие исследуемый материал; охлаждаемой вакуумной камеры, в
которой вращается ротор; скоростного электромотора; оптической системы,
позволяющей в процессе вращения ротора измерять концентрацию белка
или другого вещества в каждой точке кюветы. На фиг. 15 показано сечение
ультрацентрифуги с электрическим приводом. Скорость вращения ротора

Белки: классификация, свойства, очистка.
65
в современных ультрацентрифугах достигает 70 000 об/мин, что соответствует
центробежному ускорению в 500 000 g (g — величина ускорения силы
тяжести). Такие мощные поля быстро осаждают макромолекулы и могут
вызывать асимметрическое распределение низко молекулярных соединений
(например, сахарозы или хлористого цезия) в кювете ультрацентрифуги.
(Хороший обзор по ультрацентрифугам опубликован Шахманом, внесшим
Вода
г—г
о
1 1
Ю
ZI
/5 см
Фиг. 15. Поперечное сечелпо улътрацон-грифуги с электрическим приводом.
Гіі6е;іш вал-струпа (/) свявыпаст ротор B) с электромотором (-3).
много полезного в технику ультрацентрифугирования. В этом обзоре
описаны многие важные экспериментальные детали — конструкция кювет,
оптические системы и пр.,— а также теоретические основы метода.)
Существует несколько методов определения молекулярного веса с помощью
ультрацентрифуги. Ниже мы рассмотрим наиболее важные из пих, начиная
с классического метода, основанного на измерении скорости седиментации.
Можно показать, что молекулярний вес М, коэффициент диффузии D
и удельный парциальный объем молекулы белка v (величина, обратная
плотности молекулы) связаны следующей зависимостью:
D A — vc>)
|
de
{111.22)
5—246

66
Глава III
где ш — угловая скорость ротора в рад/сек, х — расстояние от оси
вращения до образца и у — коэффициент активности образца. Уравнение (III.22)
называется уравнением Сведберга. С помощью ультрацентрифуги
определяется величина (dx/dt)/uJx, которую называют константой седиментации
и обозначают через s. Таким образом, уравнение (III.22) принимает
следующий вид:Ц
М =
0A — vp)
A11.23)
Константа седиментации имеет размерность времени. За единицу константы
седиментации условно принята величина 10~~18 сек, названная сведбергом
и обозначаемая через S. Константы седиментации большинства белков лежат
в; пределах 1—50 S.
Скорость седиментации белка в гравитационном поле dxldt можно
определить фотографическим методом, фиксируя положения максимума кон-
і:',1ііЧі:ііі;і' i.l>.'iUOi'HUin
Фиг. 16. Седиментация триозофосфатдегидрогеначы.
Серия фотографий получена с помощью шлирсп-онтики, позволяющей определять градиент показателя
преломления в каждой точке кюветы.
центрации белка в процессе центрифугирования. Типичная седиментограшта
белка приведена на фиг. 16. Эти фотографии были получены с помощью
оптической системы (тплирен-оптика), позволяющей измерять производную
показателя преломления в каждой точке кюветы. В процессе седиментации
белка высота пика уменьшается, а его ширина возрастает, что обусловлено
диффузией молекул белка. Поскольку значение ш известно, а за изменением
величины х во времени можно следить по фотографиям, определение dxldt
позволяет вычислить константу s. Для точного определения константы
седиментации следует проводить измерения при разных концентрациях белка
и экстраполировать полученные значения s к нулевой концентрации (при
с—>- 0 коэффициент активности у стремится к единице). Кроме того,
предельное значение s необходимо привести к стандартным условиям (к
вязкости растворителя, равной вязкости воды при 20°; см. стр. 137).
Определение скорости седиментации часто позволяет оценить степень
гомогенности белкового препарата. Препараты, содержащие более чем один
компонент, дают несколько пиков или один асимметричный пик. Наличие
единственного симметричного пика, ширина которого не превышает
значения, обусловленного диффузией белка, служит, следовательно, критерием
гомогенности препарата.
Из уравнения (III.23) следует, что для определения молекулярного веса
необходимо знать величины/), s и v. Удельный парциальный объем определя-

Белки: классификация, свойства, очистка
67
— (-о
С=0
ется как увеличение объема при добавлении 1 г белка к достаточно большому
объему воды. Значения v могут быть определены путем измерения плотности
в пикнометре или же вычислены из данных по аминокислотному составу.
Обычно значения v для белков варьируют от 0,70 до 0,75 см3/г. ^Поскольку
плотность растворителя обычно близка к единице, величина A — vp) заметно
изменяется при небольших изменениях
v. Следовательно, точность
определения молекулярного веса методом, осно-
ванным на измерении скорости
седиментации, зависит от точности
измерения удельного парциального
объема. К сожалению, значение v чаще
вычисляется, чем измеряется.
Основное уравнение, описывающее
процесс диффузии, часто называют
первым законом диффузии Фит
100
^r=-DA[~) . A11.24)
dt \ ax It ч >
Согласно этому уравнению, количество
вещества ds, проходящее через данную
область А за время dt, пропорционально
градиенту концентрации дс/дх в этой
области. Коэффициент
пропорциональности D, зависящий от размера и
формы молекулы, называется
коэффициентом диффузии. Из уравнения A11.24)
можно получить второй закон диффузии
Фика, который позволяет более просто g
определить коэффициент диффузии:
(?).=*(¦?),• <ш-25>
В некоторых частных случаях
удается получить точное решение
уравнения (III.25). Пусть, например,
вещество диффундирует из бесконечно
толстого слоя раствора с концентрацией
Со в бесконечно толстый слой чистого
растворителя (в сосуде с постоянной площадью поперечного сечения).
Решение уравнения (III.25) для этого случая выглядит следующим образом:
Фиг. 17. Кювета для исследования
диффузии (А) и графики относительной
концентрации (Б) и градиента концептрации
(В) при диффузии.
Кювета повернута на —90° по сравнению с
ее расположением при проведении
эксперимента.
Сох
(III.26)
Таким образом, измерение (dcldt)x как функции t и расстояния х от исходной
границы позволяет определить D. На фиг. 17 приведены результаты одного
из таких экспериментов.
Если известен молекулярный вес, то знание коэффициента диффузии
позволяет составить ориентировочное представление о форме молекулы
белка в растворе. Отклонение величины ///0, называемой фрикционным
отношением, от единицы может служить мерой асимметрии и гидратации
молекулы белка (индексы а ж h относятся соответственно к асимметрии
5*

68
Глава III
и гидратации):
fo V /о I h V /о /а
/о
A11.27)
В табл. 12 приведены значения молекулярных весов, коэффициентов
диффузии, удельных парциальных объемов и фрикционных отношений для
нескольких белков.
Таблица 12
Молекулярные веса (М), коэффициенты диффузии (D), удельные
парциальные объемы (i>) и фрикционные отношения (///о)
для некоторых белков
Белок
Рибонуклеаза
Лшоцим
Хиыотряасиноген
?-Лакто глобулин
Опальбумип
Сывороточный альбумин
Гемоглобин
Каталаза
Уреаза
Гроцомиозин
Фибриноген
Коллаген
Миозин
м
13 683
14100
23 200
35 000
45 000
65 ООО
68 000
250 000
480 000
93 000
330 000
345 000
493 000
0,728
0,688
0,721
0,751
0,748
0,734
0,749
0,73
0,73
0,71
0,710
0,695
0,728
11,9
10,4
а,5
7,82
7,76
5,94
6,9
4,1
3,46
2,24
2,02
0,69
1,16
f/fo
1,14
1,32
1,20
1,25
1,17
1,35
1,14
1,25
1,20
3,22
2,34
6,8
3,53
Итак, определение констант седиментации и коэффициентов диффузии,
во-пнриых, позволяет вычислить молекулярный вое, во-вторых, дает
возможность оценить степень гомогенности препарата и, в-третьих, позволяет
судить о степени гидратации белковой дюлекулы и о ее форме.
МЕТОД СЕДИМЕНТАЦИОГ-ШОГО РАВїїСШЕСИЯ-
Другой метод определения монокулярного веса с применением ультра-
центрифуги основан на установлении седммептациоиного равновесия.
При малых скоростях вращения ротора, когда перенос вещества под
действием центрибежыого ускорения сравним с диффузионным потоком вещества,
происходит перераспределение концентрации вдоль кюветы, причем характер
равновесного распределения концентрации зависит от молекулярного веса
исследуемого вещества. При достаточно длительном центрифугировании
устанавливается равенство седимептациониого и диффузионного потоков,
направленных навстречу друг другу (седиментационное равновесие). Такое
равновесное распределение концентрации вдоль кюветы позволяет
определить молекулярний вес препарата. Напишем условие равенства седи-
ментациосшого и диффузионного потоков
„ de
dr
dx
A11.28)
Подставляя выражение для dxldt из уравнения (III.22), после
соответствующих преобразований получаем
да
r(u2 A — vp)
d (In у) I
de J A_ de
71F
(Ш.29)

Белки: классификация, свойства, очистка 69
Если экспериментально определить значения с и dc/dr, то с помощью
уравнения (III.29) можно вычислять молекулярные веса; при этом нет
необходимости в измерении коэффициента диффузии. Полученные значения M
экстраполируются к нулевой концентрации вещества, так как при с —v О вели-
Основной недостаток метода седиментационного равновесия состоит в
в том, что для установления равновесия требуется длительное время
(несколько дней и даже недель), на протяжении которого может произойти
агрегация и деградация белка. Этот недостаток можно устранить, если
пользоваться специальными кюветами с очень малой толщиной слоя —
не более ОД мм. Время установления равновесия при этом резко
сокращается.
Метод седиментационного равновесия позволяет оценить степень
гетерогенности исследуемого препарата. Для полидисперсной системы этот метод
дает средневесовой молекулярный вес, определяемый соотношением
где а — концентрация г-го компонента, a Mt — его молекулярный вес.
Более тяжелые молекулы вносят несколько больший вклад в средневесовой
молекулярный вес. Нелинейная зависимость In с от г2 свидетельствует
о гетерогенности препарата.
МЕТОД ПРИБЛИЖЕНИЯ К СЕДИМЕНТАЦИОІШОМУ РАВНОВЕСИЮ
(МЕТОД АРЧИБАЛЬДА)
Относительная простота определения молекулярного веса методом
седиментационного равновесия побудила Арчибальда (еще до появления кювет
с малой толщиной слоя) разработать такую модификацию этого метода,
которая дала бы возможность обойти главный его недостаток — слишком
длительное время установления равновесия. Он воспользовался тем
обстоятельством, что суммарные потоки вещества через границы раздела р кювете
(через мениск и через дно) равны нулю. Очевидно, что это условие
выполняется не только при равновесии.
Подставляя в уравнение (III.28) выражение для dxldt из
уравнения (III.22), аналогично тому как это было сделано при выводе
уравнения (III.29), имеем
Мт =
A — vp) CO2 cmrm
RT Гі+-
(Ш.32)
Индекс m относится к первой границе раздела — мениску, а индекс Ъ —
ко второй — дну. Экспериментальные параметры уравнений (III.31)
и (Ш.32) можно определить уже вскоре после начала центрифугирования
из фотографий, полученных с помощью шлирен-оптики или какой-нибудь
другой оптической системы. Вообще говоря, величины Мт и Мь неодинаковы
из-за различия в концентрациях раствора на дне и у мениска,
обусловливающего неравенство коэффициентов активности. Если же различием
коэффициентов активности у мениска и у дна можно пренебречь, то Мт = Мь-
Для гетерогенных препаратов метод Арчибальда дает средневесовой моле-

70
Глава ІП
кулярный вес, причем Мь > Мт. В табл. 13 приведены молекулярные веса
нескольких веществ, определенные с помощью метода приближения к седи-
ментационному равновесию.
Таблица 13
Молекулярные веса нескольких веществ, определенные с помощью метода
приближения к седимеитационному равновесию
Вещество
Сахароза (истинный
молекулярный вес = 342,3)
Рибонуклеаза
Молекулярный
вес Вещество
341
13 700
?-Лактоглобулин
Овальбумин
Сывороточный альбумин
Молекулярный
вес
38 000
43 500
68 000
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ
При длительном ультрацентрифугировании концентрированных
растворов низкомолекулярных веществ (обычно хлористого цезия или сахарозы)
в кювете устанавливается стационарный градиент плотности.
Макромолекулы, присутствующие в растворе, локализуются при этом в той области
кюветы, где плотность раствора равна плотности этих макромолекул. В
случае гомогенного вещества измерение ширины полосы позволяет определить
молекулярный вес (см. стр. 137) 1.
БЕЛКИ КАК ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТЫ
Многие интересные и важные свойства белков объясняются тем, что
белки содержат большое число ионизирующихся групп, в результате чего
они почти при всех условиях являются полиэлектролитами. В ионизации
участвуют главным образом боковые цепи глутаминовой и аспарагиновой
кислот, лизина, гистидина, аргинина, цистеина и тирозина (см. табл. 8).
Что касается а-аминогрупп и а-карбоксильных групп аминокислот,
составляющих молекулу белка, то их ионизация не имеет существенного значения,
так как подавляющее большинство этих групп участвует в образовании
пептидных связей.
ТИТРОВАНИЕ
Интерпретация кривых титрования белков сложна и не всегда
однозначна. Это обусловлено двумя причинами. Во-первых, в каждой молекуле белка
обычно содержится большое число титруемых групп (в среднем на 100 000
единиц молекулярного веса приходится от 50 до 60 таких групп). Во-вторых,
значения рйТа для каждой из титруемых групп в белках могут заметно
отличаться от соответствующих значений рКа для свободных аминокислот (см.
табл. 8). Так, например, в белке, содержащем 10 остатков аспарагиновой
кислоты, каждая из ?-карбоксильных групп этой аминокислоты
характеризуется своим особым значением р7Га (варьирующим в пределах от 3 до 6).
Такие различия в величине уКа для одних и тех же групп в белках (или
в других заряженных макромолекулах) обусловлены главным образом тремя
причинами: 1) электростатическими взаимодействиями с другими ионизиро-
1 Гомогенное вещество в градиенте плотности локализуется в полосе определенной
ширины, что обусловлено тепловым движением макромолекул.— Прим. ред.

Белки: классификация, свойства, очистка
71
ванными группами белка, 2) влиянием среды, которое определяется
близостью гидрофобных остатков, и 3) влиянием водородных связей.
На фиг. 18 изображены кривые титрования рибонуклеазы — белка
с небольшими, почти сферическими молекулами известного
аминокислотного состава. В табл. 14 число групп рибоцуклеазы, титруемых в различных
О
1
70
15
§ 20
25
ЗО
Нулевой
суммарный заряд -
Фиг. 18. Кривые тигрочаимя упбонуклеаиы при 25° i] Tpov ран.пичныч ;шаисниях иипиой
силы: t'.ni (_&'—), 0,03 ( — Л- ) ті 0,1,1 (—О —)•
Указана точка, отвечающая нуловом-у суммарному заряду (г =19), и изоионное значение pH,
отвечающее использованной в опыте концентрации белка.
интервалах pH, сопоставляется с ее аминокислотным составом. Легко видеть,
что данные аминокислотного анализа и данные титровапия совпадают.
Особый интерес представляет поведение фепольной группы тироаина. Из шести
фенольных групп, присутствующих в молекуле рибонуклеазы, три группы
Таблица 14
Титруемые группы рибонуклеазы
Группа
о-СООН
—СО ОН в боковой цепи
Имидазольная
a-NH2
Фенольная
—NH2 в боковой цепи
Гуанидиловая
рКо (на
данных для
малых
молекул)
3,75
4,6
7,0
7,8
9,6
10,2
>12
Число групп в
одной молекуле
(из данных по
аминокислотному
составу)
1
10
4
1
6
10
4
Данные, полученные из
кривых титровапия
число групп
" { Щ
5((I)
4
VKa
4,7
6,5
7,8
9,95
10,2
>12

72 Глава ПІ
характеризуются обычным значением внутренней \іКа, равным 9,95, тогда
как три другие не титруются вплоть до pH 12, т. е. до значений pH,
приводящих к денатурации белка. Это свидетельствует о тоді, что три феноль-
ные группы из шести в нативной рибонуклеазе труднодоступны для
растворителя. Титрование этих групп возможно только в условиях необратимого
изменения структуры белка; это подтверждается тем, что кривая обратного
титрования не совпадает с кривой прямого титрования.
Четкого соответствия между аминокислотным составом и числом групп,
титруемых в каждом интервале pH, вообще говоря, ожидать не следовало
бы, особенно в тех случаях, когда избегают пользоваться
концентрированными кислотами и основаниями. Тем не менее обычно наблюдается
удовлетворительное соответствие, так как большинство ионизирующихся групп
расположено, по-видимому, вблизи поверхности белковой молекулы.
Заметим, что во всех случаях для доказательства отсутствия (или наличия)
необратимых структурных изменений в белке, приводящих к освобождению
групп, экранированных в нативных молекулах, необходимо проводить
обратное титрование.
Изоэлектрическая точка. В процессе титрования белка от предельно
кислой до предельно основной формы должно существовать значение pH,
при котором средний заряд белка равен нулю. Это значение pH носит
название изоэлектрической точки. При значении pH, равном изоэлектрической
точке, данный белок не перемещается в электрическом поле (см. ниже
об электрофорезе). Изоэлектрическую точку можно приближенно
определить, зная аминокислотный состав белка. Поскольку средний заряд белка
зависит от концентрации соли (эта зависимость обусловлена способностью
белков связывать ионы, а также изменением р/?а при изменении ионной
силы), изоэлектрическая точка зависит от присутствия в растворе
посторонних веществ, в частности от природы и концентрации буфера. В то же
время она не зависит от концентрации белка. Изоэлектрические точки
большинства белков близки к 7, что обусловлено приблизительно одинаковым
содержанием в молекуле белка кислых и основных остатков. Однако
существуют и такие белки, у которых изоэлектрические точки существенно
отличны от 7. Так, например, пепсин — протеолитический фермент,
функционирующий в сильно кислой среде желудка,— имеет изоэлектрическую точку,
близкую к 1, а изоэлектрические точки протаминов близки к 12.
Изоионная точка. Раствор белка, не содержащий никаких других ионов,
кроме ионизированных аминокислотных остатков самого белка и ионов,
образующихся при диссоциации воды, называется изоионным раствором..
Изоионные растворы можно приготовить, пропустив раствор белка через
колонку, содержащую как анионообменник, так и катионообменник, которые
удаляют все посторонние ионы, кроме ионов водорода и гидроксильных
ионов. Другой метод получения изоионных растворов — диализ (см. ниже)
против дистиллированной воды. Этот способ, как правило, менее удобен,
чем применение ионообменников. Значение pH изоионного раствора белка
называется изоионной точкой этого белка. Согласно условию
электронейтральности,
[H+] + [P]Z=[OH-], (III. 33)
где [Р] — молярная концентрация белка, a Z — средний заряд молекулы.
Таким образом, за исключением случая, когда изоэлектрическая точка
равна 7, раствор белка не может быть одновременно изоэлектрическим
и изоионным. Согласно уравнению (III.33), изоионная точка зависит от
концентрации белка. Очевидно, что по мере уменьшения концентрации
любого белка изоионная точка раствора стремится к 7. При низких кон-

Белки: классификация, свойства, очистка 73-
центрациях белка изоионная точка слабо зависит от концентрации и различие
между изоэлектрическои и изоионной точками невелико, если только изо-
электрическая точка не измеряется в присутствии ионов, прочно
связывающихся с белком.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С НЕБОЛЬШИМИ ИОНАМИ
Способность белков связывать иопы водорода, о которой irr л а речь выше,
отражает их общую способность взаимодействовать с небольшими ионами.
Такие взаимодействия имеют важное физиологическое значение. Многие
ферменты, например, проявляют каталитическую активность только при
условии, если в состав их молекул входят ионы двухвалентных металлов;
перенос ионов в крови осуществляется главным о fi ралом белками (в
частности, сывороточным альбумином) и т. д.
Степень связывания ионов белками можно определять различными
методами; из них наиболее широко распространен метод равновесного диализа.
При диализе (так же как и при осмометрии) используют мешочек, стенкя
которого непроницаемы для молекул белка, но проницаемы для небольших
ионов. Диализный мешочек с раствором оелка помещают в раствор,
содержащий необходимый ион. После установления равновесной концентрации
диффундирующего иона по обе стороны мембраны измеряют концентрацию
иона в растворе, не содержащем белка; разность начальной и конечной
концентраций иона в не содержащем белка растворе позволяет определить
концентрацию иона в растворе белка. Если концентрации иона по обе
стороны мембраны равны друг другу, то это означает, что связывания не
произошло. Если связывание имело место, то концентрация иона в белковом
растворе должна быть выше, чем в растворе, не содержащем белка; разность
концентраций может служить мерой числа ионов, связанных с одной
молекулой белка. Для того чтобы исключить влияние эффекта Гиббса — Донна-
на, равновесный диализ проводят обычно либо в изоэлектрическои точке
белка, либо при высокой ионной силе. Такие методы, как
ультрафильтрация, распределительный анализ, а в некоторых случаях и адсорбционная
спектрофотометрия, также могут служить для определения степени
связывания ионов с белками.
Особенно важное значение имеет взаимодействие белков с ионами
многовалентных металлов (см. гл. II, в которой обсуждается взаимодействие
ионов с аминокислотами).
Белки могут связываться не только с ионами, но и с различными
небольшими молекулами, например со стероидами, углеводородами, высшими
спиртами и, конечно, с водой.
РАСТВОГИМОСТЬ БЕЛКОВ
Растворимость большинства белков зависит от ионной силы, pH і
концентрации органических растворителей. Рассмотрим влияние каждого из
из этих факторов.
Ионная сила. На фиг. 19 приведена зависимость растворимости кар-
боксигемоглобина (в изоэлектрическои точке) от ионной силы и типа ионов.
Ионная сила определяется следующим выражением:
где Ci — концентрация г-го компонента, a Z; — его заряд. Легко видеть,
что при низких ионных силах растворимость белка увеличивается, а при
высоких — уменьшается (эффект высаливания белка высокими
концентрациями солей). Такое поведение характерно для большинства белков.

J,0 2,0
Ионная сила fi
3.0
4,0
Фиг. 19. Зависимость растворимости карбоксигемоглобпна (в изоэлектричеокой точке)
от иошюй силы и типа notion.
S и S' — растворимости оелка соответсыерчп в воде и в солевых расізарах.
0,50-
-0,50
-1,00
4 б
Ионная cwia fi
10
Фиг. 20. Растворимость белков в растворах сульфата аммония.
фибриноген; Л — гемоглобин; III—псевдоглобулин; IV—сывороточный альбумин С V
миоглобин.

Белки: классификация, свойства, очистка
75
Согласно теории Дебая — Хюккеля, коэффициент активности для дан-
«ого иона связан с ионной силой зависимостью
, 1,81-10% „ -,/— ,ттт осч
— 1g Y = — s—^1^2 V №' (lll.oO)
где D — диэлектрическая постоянная среды, a Zf и Z2 — заряды иона
и противоиона; хотя при низких концентрациях соли белки являются
полиэлектролитами, их поведение можно качественно описать уравнением (III.35),
предназначенным для простых
ионов: возрастание концентрации
соли стабилизирует заряженные
группы белков (уменьшает их
коэффициент активности), вследствие
чего растворимость белка
повышается. Эффект высаливания,
наблюдающийся при высоких
ионных силах, обусловлен, вероятно,
конкуренцией между белком и
ионами соли за взаимодействие с
молекулами воды. При достаточно
высоких концентрациях соли
число молекул воды, которые могут
быть использованы для гидратации
белка, существенно уменьшается;
взаимодействия белок — белок
становятся при этом эффективнее
взаимодействий белок — вода, и
белок осаждается. При таких
концентрациях соли растворимость
многих белков экспоненциально
зависит от ионной силы:
lg? = ?'_ K'sii. (III.36)
В этом уравнении S —
растворимость в г/л; ?' — растворимость
белка в гипотетическом
растворителе при ионной силе, равной
нулю; K's — константа высаливания.
На фиг. 20 приведена зависимость
логарифма растворимости (в
растворе сульфата аммония) от ионной силы для нескольких белков,
подчиняющихся уравнению (III.36). Легко видеть, что небольшие изменения
ионной силы приводят к значительным изменениям растворимости. Этот факт
часто с успехом используется при очистке белков (см. ниже). Значение
константы Кe слабо зависит от природы белка, но в сильной степени зависит
от природы соли (фиг. 19). Что же касается константы ?', то она зависит
от природы белка весьма сильно.
pH. Зависимость растворимости большинства белков от pH при данной
ионной силе описывается U-образной кривой с минимумом вблизи изо-
электрической точки. Соответствующие кривые для ?-лактоглобулина
приведены на фиг. 21. Хотя растворимость ?-лактоглобулина сильно зависит
от ионной силы, минимум растворимости при всех значениях ионной силы
лежит в узком интервале pH E,2—5,4). Этот факт можно было бы объяснить
тем, что в изоэлектрической точке электростатистическое отталкивание
между растворенными молекулами предельно ослаблено и превалируют меж-
Фиг. 21. Зависимость растворимости
?-лактоглобулина от рИ при четырех различных
концентрациях хлористого натрия.
Цифры на кривых выражают концентрацию NaCl
(нормальность).

76
Глава III
молекулярные взаимодействия неэлектростатической природы. Однако такое
простое объяснение не является вполне удовлетворительным. У многих белков
влияние pH на растворимость носит гораздо более сложный характер;
известен даже случай, когда кривая растворимости имеет два минимума.
Органические растворители. Большинство органических растворителей
эффективно осаждает белки. Этот факт легко понять, поскольку известно,
что возрастание концентрации, например, такого органического
растворителя, как ацетон, уменьшает способность водных растворителей гидратировать
заряженные группы белков. В то же время некоторые органические
растворители с достаточно высокой диэлектрической постоянной хорошо растворяют
белки. К таким растворителям относятся, в частности, диметилсульфоксид,
формамид и дихлоруксусная кислота.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Электрофорезом называется движение заряженных частиц в жидкости
под действием электрического поля. С 1937 г., т. е. с того времени, когда
Тизелиус сконструировал прибор для электрофореза белков, этот метод
0
Восходящая
граница
Электроды -
Бомшие сосуды
с буферным раствором
-Только буфер
Буфер +
макроионы
0
Нисходящая
граница
Фиг. 22. Схема прибора Тизолиуса для измерения элоктрофоретической подвижности
методом движущейся границы.
Расположение электродов соответствует положительному заряду макроионов; для отрицательно
заряженных макроионов электроды необходимо поменять местами.
широко используется для анализа белков и белковых смесей. Поскольку
суммарный заряд молекулы — одна из наиболее специфичных характеристик
индивидуального белка, а электрофоретическая подвижность сильно зависит
от заряда, электрофорез оказался превосходным методом для изучения
состава сложных белковых смесей и для их разделения. Наиболее широко
применяются два варианта электрофоретического метода: фронтальный
и зонный электрофорез.
Фронтальный электрофорез (метод движущейся границы). На фиг. 22
изображена схема прибора для фронтального электрофореза. Прибор
сначала частично заполняют раствором белка, а затем с помощью специального
приспособления создают резкую границу между раствором белка и чистым
растворителем. После этого погружают электроды в буферный раствор
и помещают весь прибор в водяной термостат, предназначенный для отвода
тепла, выделяющегося в процессе электрофореза, и для поддержания постоян-

Белки: классификация, свойства, очистка
77
ной температуры. Электроды присоединяют к источнику постоянного тока и
регистрируют перемещение границ с помощью оптической системы.
В случае смеси из нескольких веществ с различными электрофоретическими
подвижностями наблюдается несколько движущихся границ. На фиг. 23
приведена электрофореграмма смеси белков, содержащихся в плазме крови
се.
J*—Исходные
Лвижение границы
в сторону анода
Движете границы
в сторону катода
Фиг. 23. Электрофореграмма нориальтюй плазмы человека ири pH 8,6.
При отом значении pH все белки плазмы заряжены отрицательно. Пик А отвечает сывороточному
альбумину, пики <хь аг, ? и V — смеси сывороточных глибулшнов, Ttmt Ф — фибриногену. Два не
обозначенных пика — стационарные пики вблизи исходной границы.
человека. Фронтальный электрофорез часто используется для анализа
сложных белковых смесей; однако этот метод но обеспечивает полного разделения.
Зонный электрофорез. Главное отличие зонного электрофореза от
фронтального состоит в том, что при зошюм электрофорезе используется
поддерживающая среда, в которой осуществляется движение вещества, тогда как
при фронтальном электрофорезе ионы свободно перемещаются в растворе.
Поддерживающей средой, или носителем, служат обычно бумага,
целлюлоза, крахмальные гели или блоки, пористые полиуретаны и полиакрил-
амидпые гели. На фиг. 24 приведена схема прибора для зонного
электрофореза.
Исследуемый материал наносится в виде узкой полосы на
поддерживающую среду приблизительно посередине между сосудами с буферным
раствором, в которых находятся электроды. Каждый из компонентов мигрирует
с определенной скоростью, зависящей от его заряда, к катоду или к аноду.
В результате все компоненты четко разделяются. После этого носитель
можно разрезать на соответствующие части:и элюировать каждый из
компонентов смеси. Таким образом, зонный электрофорез можно с успехом
использовать как для анализа многокомпонентных смесей, так и для
препаративного выделения чистых белков. Выбор носителя для зонного электро-
фореза зависит главным образом от задачи, которая стоит перед
экспериментатором. Если основной целью является разделение компонентов, то в
качестве носителей используются бумага, крахмал или лучше поли-
акриламидный гель. Если же целью является препаративное получение
чистого белка, то лучше всего использовать крахмальный блок, на который

Фиг. 24. Зонный электрофорез в блоке.
1 — крахмальный блок в момент @ (вид сбоку); 2 — исходная зона; 3— крахмальный блок в'момент
і (вид сверху); і — эталонные вещества с известной подвижностью, перемещающиеся в двух
противоположных направлениях; 5 — полоса, применяемая для формирования кра.хмального блока; 6 —
стеклянная подложка; 7 и S — двухкамерный сосуд для электродов; 9 — мостик, связывающий
электрод и крахмальный блок; 10 — электрод; 11 — лампа; 12 — соединительная трубка для выравнивания;
уровней жидкости в сосудах с электродами; a — расстояние от старта, до движущейся зоны; d0 —
расстояние от старта до вещества с нулевой подвижностью, движущегося вместе с потоком растворителя.
фиг. 25. Фотография, иллюстрирующая возможность количественного анализа
сывороточных белков с помощью электрофореза в крахмальном геле.
Внизу — фотография (снята в проходящем свете) окрашенного неразрезанного крахмального геля,
прозрачного благодаря погружению в глицерин; вверху — фотография соответствующей кривой,
возникающей на экране электронного денситометра.

Белки: классификация, свойства, очистка 79
легко наносить большие количества материала. Высокую разрешающую
способность зонного электрофореза в крахмальном геле иллюстрирует
фиг. 25. На приведенной электрофореграмме обнаруживаются 18 отделенных
друг от друга компонентов.
ОЧИСТКА БЕЛКОВ
Очистка белка, полученного из природного источника, представляет
собой в большинстве случаев нелегкую задачу. Интересующий нас белок
составляет иногда ничтожпую часть исходного материала —менее 0,1%
сухого веса. Ненужный материал — это часто тоже белки и притом нередко
близкие по своим свойствам к выделяемому белку. Из-за больших размеров
и неустойчивости белковых молекул для очистки белков невозможно
использовать многие обычные методы очистки органических соедипений, например
такие, как перегонка или экстракция органическим растворителем. Трудно
представить себе химика-органика, пытающегося выделить продукт реакции,
идущей с выходом всего лишь 0,1% и к тому же дающей сотни побочных
продуктов. Между тем именно такая задача часто стоит перед биохимиком,
желающим исследовать физико-химические свойства или биологическую
активность определенного белка.
Работа по очистке белка начинается с выбора природного материала,
из которого будут производить выделение (если только, разумеется,
экспериментатору есть из чего выбирать). Необходимо найти объект со
сравнительно высоким содержанием нужного белка. Если исследуемый белок обладает
какой-либо биологической активностью, которую можно точно оценить,
то содержание его часто удается определить непосредственно в неочищенных
смесях и подобрать таким образом наиболее подходящий исходный материал.
Такие предварительные опыты очень важны, поскольку содержание белков
в разных тканях сильно варьирует. Иногда содержание белка лл определенной
ткани удается повысить, изаієняя физиологические условия (рацион, состав
культуральной среды и т. п.).
После выбора подходящего природного объекта выделяют белок из ткани.
Это можно сделать различными способами, например подвергнуть ткань
воздействию ультразвука, разрушив ее в гомогенизаторе и т. д.
Для освобождения белка, прочно связанного с какими-нибудь
клеточными частицами, например с митохондриями, приходится прибегать к
обработке растворителями липидов или детергентами. В таких случаях первой
стадией очистки является, по существу, выделение определенной клеточной
фракции, содержащей белок (см. гл. IX).
В процессе выделения и фракционирования белков необходимо
принимать известные меры предосторожности. Необходимо контролировать
температуру, pH и концентрацию белка, а также ионную силу, концентрацию
ионов тяжелых металлов (их удаляют с помощью ЭДТА) и значение
окислительно-восстановительного потенциала (оно поддерживается на низком
уровне с помощью меркаптоэтанола или дитиотрейтола). Молекулы белков весьма
неустойчивы. Инкубация белков даже при умеренной температуре, например
при 37°, приводит, как правило, к их частичной денатурации. Большинство
операций при очистке белка должно поэтому проводиться при температуре,
близкой к точке замерзания используемого растворителя. Некоторые белки,
однако, довольно устойчивы к нагреванию. Кратковременная тепловая
обработка при выделении таких белков оказывается весьма полезной, так
как дает возможность осадить большую часть загрязняющего материала.
Весьма чувствительны белки также к сильно кислым и сильно щелочным
значениям pH. Поэтому очистка белка должна проводиться в присутствии
буферных растворов, обеспечивающих постоянство значения pH (в
большинстве случаев значение pH должно быть близким к 7). Наконе , кон-

80 Глава III
центрация белка должна быть возможно более высокой, так как многие
белки в разбавленных растворах проявляют тенденцию к денатурации.
Устойчивость белков-ферментов обычно повышается в присутствии их
субстратов. Это обстоятельство можно использовать нри выделении таких белков.
Существует много методов фракционирования белков. Некоторые из них
мы здесь рассмотрим.
Осаждение солью. Как показывает фиг. 20, растворимость белков в
концентрированных солевых растворах может быть весьма различной. Это
свойство используется при фракционировании смеси белков. Добавлением
определенного количества соли осаждают часть загрязняющих белков и удаляют
эти белки центрифугированием. Дальнейшее повышение концентрации соли
может привести уже к осаждению нужного белка вместе с некоторой частью
оставшихся загрязняющих белков. Очищенный белок (вместе с другими
белками, выпавшими в осадок после второго добавления соли) отделяют
центрифугированием. Удобнее всего применять для такого осаждения белков
сульфат аммония, однако нередко для этой цели используется также
сульфат натрия.
Изоэлектрическое осаждение. Поскольку растворимость большинства
белков вблизи их изоэлектрической точки оказывается минимальной, може о
подобрать такое значение pH, при котором нужный белок выпадет в осадок,
а большинство загрязняющих белков останется а растворе.
Осаждение органическими растворителями. Для избирательного
осаждения белков можно использовать органические растворители, например
ацетон, метанол и этанол. Однако следует иметь в виду, что добавление
этих растворителей часто приводит к денатурации белков; поэтому работать
с ними лучше при очень низких температурах.
Ионообменная хроматография. Белки, как и аминокислоты, можно
фракционировать на колонках с ионообменными смолами. Особенно удобны
ионообменники с гидрофильными боковыми цепями, например целлюлоза.
Для очистки белков обычно используют ДЭАЭ-целлюлозу (анионообменник,
образующийся в результате присоединения к целлюлозе диэтиламиноэтиль-
шлх групп) и КМ-целлюлозу (катионообмеиник, образующийся в результате
присоединения к целлюлозе карбоксиметильных групп). Фракционирование
белковых смесей, нанесенных на колонки, осуществляется пропусканием
через колонку буферных растворов с возрастающей ионной силой или
же растворов с возрастающей (или убывающей) величиной pH.
Разрешающая способиость таких колонок весьма высока.
Адсорбционная хроматография. Избирательное адсорбирование белков
некоторыми материалами и последующая их избирательная элюция часто
используются для очистки белков. Такое фракционирование может
проводиться как па колонках, так и на пластинках адсорбента. Для
адсорбционной хроматографии белков применяют обычно такие носители, как
гель фосфата кальция, алюмогель, диатомовая земля (целит), крахмал
xi гидроксилапатат.
Электрофорез. Kart указывалось выше, зонный электрофорез белковых
смесей с использованием емкого носителя, обычно крахмальных блоков,
обладает исключительно высокой разрешающей способностью и позволяет
почти количественно выделить нужный белок. Эта особенность метода
зонного электрофореза делает его исключительно эффективным при решении
проблемы очистки белков.
Молекулярные сита. Для очистки белков могут использоваться
молекулярные сита, разделяющие молекулы в зависимости от их размера.
Наиболее удобны для этой цели некоторые полисахариды и полиакриламиды с
порами разных размеров, известные под коммерческими названиями сефадекс
и биогелъ. Недавно появились молекулярные сита с диэтиламиноэтильными

Белки: классификация, свойства, очистка
81
и карбоксиметильными группами (на основе сефадексов), позволяющие
одновременно фракционировать смеси как по размерам частиц, так и по
их заряду.
Кристаллизация. Если очищенный белок может быть закристаллизован
(что в ряде случаев удается осуществить), то повторные перекристаллизации
дают возможность существенно повысить чистоту продукта. По своей
способности к кристаллизации белки сильно отличаются друг от друга. Условия
кристаллизации данного бедка приходится подбирать эмпирически.
Особенно важно строго контролировать значение pH, ионную силу,
концентрацию белка и температуру.
Вообще говоря, очистка белков не столько наука, сколько искусство.
Способ очистки данного белка выбирается обычно методом проб и ошибок.
О преимуществах выбранного способа судят по двум критериям. Критерии
эти — степень очистки и выход. Ясно, что способ, обеспечивающий 100-
кратную очистку, но с выходом всего лишь 1%, представляет небольшую
ценность. Степень очистки можно вычислить, сравнивая удельную
активность исследуемого белка до и после каждого этапа очистки. Удельная
активность определяется как отношение какой-либо активности,
свойственной данному белку (например, ферментативной активности), к общему
количеству присутствующего белка. В табл. 15 приведена гипотетическая
схема очистки белка, в которой указаны удельные активности, выходы
и степени очистки, рассчитанные для каждого этапа.
Таблица 15
Сравнительные характеристики разных методов очистки белка
Стадии очистки
Грубый экстракт
Осаждение сульфатом
аммония
Хроматография на ДЭАЭ-
ТТ Р ТІ 71 ТГі ТЇ П Ч Р
Препаративный электрофо-
Изоэлектрическое
осаждение
Кристаллизация
Объем
раствора,
мл
200
80
20
5
3
1

Содержание белка,
мг/мл
2,5
1,25
1,0
1,0
0,3
0,5

Активность,
ед/мл
100
200
500
1500
2000
5000
Удельная
активность,
ед. па 1 мг
белка
40
160
500
1500
6700
10 000

Суммарный
выход, %
100
80
37,5
37,5
30
25
Степень
очистки
1
4
12,5
37,5
167
250
При очистке белков используют помимо указанных выше методов
фракционирования также и ряд вспомогательных процедур. Особенно важны
две из них—-диализ и лиофилизация. Диализ, или удаление соли из раствора
белка, заключается в пассивном переносе ионов из раствора белка через
непроницаемую для белка мембрану в буферный раствор; этот метод известен
давно и применяется очень широко. Освобождение белка от соли путем
диализа необходимо проводить на многих стадиях очистки, в частности после
осаждения белка сульфатом аммония. Другой метод обессоливания —•
пропускание белкового раствора через соответствующие молекулярные сита.
Лиофилизация, или высушивание в замороженном состоянии,— важный
метод коЕщентрировапия белковых растворов. Для лиофилизации раствор
белка замораживается при помощи смеси сухого льда с ацетоном и
подключается к вакуумной линии. Охлаждение раствора, обусловленное испа-
6-246

82
Глава III
рением растворителя, оказывается достаточным для поддержания раствора
в замороженном состоянии. Большинство белков в условиях лиофильной
сушки не денатурирует и может затем сохраняться в сухом состоянии на
холоду в течение длительного времени без заметного уменьшения
биологической активности. Замороженные белковые растворы, не
подвергнутые лиофильной сушке, обычно менее стабильны. При откачке белковых
растворов во время лиофилизации следует избегать вспенивания, так как
большинство белков денатурирует на поверхностях раздела жидкость —
газ,
КРИТЕРИИ ЧИСТОТЫ
Один из наиболее трудных вопросов, стоящих перед исследователем
при очистке белка, это вопрос о том, когда можно считать очистку
законченной. Иными словами, как узнать, что белковый^ препарат гомогенен?
Существует ряд критериев для определения чистоты препарата.
Кристалличность. Несколько раз" перекристаллизованные
низкомолекулярные органические соединения обычно считаются чистыми. Ранее
полагали, что этот критерий чистоты можно использовать и для белков. Позднее,
О 0,4 O? 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 5,2 3,6
Общее содержание белкового азота в смеси, тг/мл
Фиг. 26. Кривые растворимости чистого А-пепсина (А) и кристаллического пепсина,
полученного из продажного препарата пепсина (Б), в полунасыщенпом растворе сульфата
магния в 0,05 M ацетатном буфере (pH 4,6) при 22°.
однако, было показано, что многие кристаллические белковые препараты
гетерогенны, т. е. содержат разные белки, кристаллизующиеся|совместно.
Следовательно, хотя получение какого-нибудь белка в кристаллическом
виде — всегда большая удача, считать кристаллизацию достаточным
критерием чистоты белкового препарата все же нельзя.
| Кривые растворимости. Одним из более надежных критериев чистоты
белка является форма, кривых растворимости. Кривые растворимости строят,
тщательно измеряя;количество белка в растворе при различных количествах
белка, добавленного в раствор. Ионная сила, температура и объем раствора
должны при этом оставаться постоянными; необходимым условием является
также достижение полного равновесия между твердой и растворенной фазами.
Для чистого белка зависимость количества белка в растворе от количества
внесенного белка строго линейна до точки насыщения; после точки насыщения
наклон кривой равен нулю. На фиг. 26 приведены кривые растворимости
для чистого и загрязненного препаратов протеолитического фермента
пепсина. Присутствие примесей может различным образом изменять идеальную
кривую в зависимости от растворимости загрязняющего вещества и от его
содержания в препарате. Однако и самое тщательное исследование формы

Белки: классификация, свойства, очистка 83
кривой растворимости не позволяет обнаружить примеси, содержание
которых составляет всего лишь около 5%.
Исследование в ультрацентрифуге. Форма, ширина и скорость
расширения пика белка при седиментации в ультрацентрифуге позволяют судить
о чистоте белкового препарата. Примеси обнаруживаются по возникновению
дополнительных пиков, появлению плеч на главном пике, по асимметрии
главного пика или по увеличению ширины пиков (в сравнении с их шириной,
соответствующей коэффициенту диффузии чистого белка). Такие
исследования желательно проводить при различных значениях pH и ионной силы.
Электрофоретическое исследование. Хорошим критерием чистоты белка
является вид электрофореграммы, полученной при разных значениях pH
(особенно если электрофорез проводят в крахмальном или в полиакрил-
амидном геле). Электрофореграмма, так же как и седиментограмма, должна
содержать один симметричный пик, ширина которого соответствует
коэффициенту диффузии белка.
Сравнение значений молекулярного веса, полученных разными методами.
Оценить чистоту белкового препарата можно, сравнивая результаты двух
независимых определений молекулярного веса, выполненных с помощью
разных методов.
Можно, в частности воспользоваться для этой цели методом, дающим
среднечисленные молекулярные веса, например измерением осмотического
давления, и методом, дающим средневесовые молекулярные веса, например
измерением рассеяния света. Ясно, что для гетерогенных препаратов сред-
невесовой молекулярный вес не будет равен среднечисленному.
Данные химического анализа. Для обнаружения примесей в препаратах
белка можно использовать данные по аминокислотному составу. Допустим,
например, что аминокислотный анализ обнаруживает присутствие 0,3 моль
гистидина на 1 моль белка.^ Естественно предположить, что гистидин
содержится в загрязняющем веществе, а не в белке, подвергающемся очистке.
Обнаружение примесей с помощью функциональных тестов. Ничтожные
количества примесей удается иногда обнаружить, если эти|примеси обладают
какой-либо специфической биологической активностью (например,
ферментативной или гормональной). Если один и тот же белок обнаруживает
несколько типов активности, то отношение этих активностей не должно
изменяться в процессе очистки. Если же оно изменяется, то следует сделать
вывод, что эти активности принадлежат разным белкам. Исследуемый белок
не может считаться чистым, пока посторонние активности не будут
устранены.
Поведение при хроматографировании. Гомогенность препарата можно
подтвердить его поведением при хроматографировании в нескольких системах
растворителей и на различных носителях.
Ни один из рассмотренных выше критериев сам по себе не дает
возможности однозначно установить гомогенность белкового препарата. Во всех
случаях необходимо использовать несколько различных критериев;
интерпретация полученных результатов, даже если все критерии дают
благоприятный ответ, требует[* большой осторожности.^"'
ЛИТЕРАТУРА
Со h n Е. J., Е d s а 11 J. Т., Proteins, Amino Acids, and Peptides as Ions and Dipolar
Ions, Reinhold Publishing Corporation, New York, 1942.
Edsall J. T., W y m a n J., Biophysical Chemistry, vol. 1, Academic Press Inc., New-
York, 1958.
F lor kin M., Stotz E. (eds.), Comprehensive Biochemistry, vols. 2, 3, 7 and 8,
Elsevier Publishing Company, New York, 1963.
6*

84 Глава 111
Fox S. W., Foster J. F., Introduction to Protein Chemistry, John Wiley and Sons,
Inc., New York, 1957.
F г u t о n J. S., The Synthesis of Poptides, Adv. Prot. Chem., 5, 1 A949).
Goodman M., Kenner G. W., The Synthesis of Peptides, Adv. Prot. Chem., 12,
465 A957).
Haurowitz F., The Chemistry and Function of Proteins, Academic Press Inc., New-
York, 1963. (Ф. Гауровиц, Химия и функция белков, изд-во «Мир», М., 1965.)
Hill R. L., Hydrolysis of Proteins, Adv. Prot. Chem., 20, 37 A965).
Martin R. В., Introduction to Biophysical Chemistry, McGraw-Hill Book Company,
Inc., Now York, 1964. (P. M a p т и н, Введение в биофизическую химию, изд-во
«Мир», М., 1966.)
Meister A., Biochemistry of the Amino Acids, Academic Press Inc., New York, 1965.
Neuberger A., Stereochemistry of Amino Acids, Adv. Prot. Chom., 4, 297 A948).
Neurath H. (ed.), The Proteins, vols. 1 and 2, Academic Press Inc., Now York, 1963.
N e u r a t h П., Bailey К., The Proteins, Academic Press Inc., New York, 1953.
Schachman H. K., The Ultracentrifuge: Problems and Prospects, Biochemistry, 2,
887 A963).
S e 1 a M., Katchalski E., Biological Properties of Poly-a ammo Acids, Adv. Prot.
Chom., 14, 391 A959).
Steiner R. W., The Chemical Foundation of Molecular Biology, Van Nostrand D.
Company, Inc., Princeton, N.J., 1965.
T anf or d C, Physical Chemistry of Macromolecules, John Wiley and Sons, Inc., Now
York, 1961. D. T э h ф о p д, Физическая химия полиморов, изд-во «Химия», M.,
1965).
Tristram G. R., S m і t h R. H., Amino Acid Composition of Protein, Adv. Prot.
Chem., 18, 227 A963).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Физико-химические методы изучения, анализа и фракционирования биополимеров, под
ред. Г. В. Самсонова, изд-во «Наука», М., 1966.
Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот, под ред. 10. С. Лазур-
кина, изд-во «Наука», М., 1967.
Новейшие методы исследования полимеров, под ред. Б. Ки, изд-во «Мир», М., 1966.
Номенклатура ферментов, ВИНИТИ, М., 1966.
Б е й л и Дж., Мето ы химии белков, из -во «Мир», М., 1965.

Глава IV
СТРУКТУРА БЕЛКОВ
В гл. III мы уже рассмотрели некоторые структурные характеристики
белков. Было описано строение аминокислот, т. е. тех мономерных единиц,
из которых состоят белки, и способ соединения отдельных аминокислот
друг с другом в линейную последовательность при помощи пептидной связи.
В этой главе мы обсудим структуру белков более подробно, а также опишем
ряд физических и химических методов, используемых для ее изучения.
УРОВНИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ
Чрезвычайная сложность структуры белков определяется уже самими
размерами их молекул. Чтобы это стало понятнее, следует обратиться к
рассмотрению нескольких уровней структурной организации белков, а именно
их первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры. Эти уровни
отличаются друг от друга природой взаимодействий, необходимых для
поддержания структуры. Первичная структура белка определяется ковалент-
ными связями, т. е. числом и последовательностью аминокислотных остатков,
соединенных между собой при помощи пептидных связей. Таким образом,
первичную структуру белка можно охарактеризовать обычной структурной
формулой, такой, какую пишут для любого органического соединения.
Для низкомолекулярных органических соединений, обладающих
относительно небольшим числом возможных конформаций, такие структурные формулы
в основном соответствуют истинной картине, т. е. ориентировочно отражают
пространственные отношения между атомами. Очевидно, ситуация не
является столь простой для молекул, состоящих из одной или нескольких длинных
гибких цепей с молекулярным весом порядка 1 млн. и выше. Число
возможных конформаций в данном случае огромно, в связи с чем возникает
необходимость учитывать и более высокие порядки структурной организации.
Вторичная структура определяется упорядоченным расположением
гибких пептидных цепей, возникающим за счет образования водородных связей
между карбонильным кислородом и амидным азотом данной полипептидной
цепи
С = О ... H —N
/ \
Образование таких водородных связей может обусловливать ряд
конформаций полипептида. Эти конформаций подразделяются на два больших
класса: спиральные структуры и структуры типа складчатого слоя.
Ясно также, что для длинного спирального участка полипептида можно
допустить существование ряда конформаций, обусловленных
взаимодействиями между боковыми цепями различных аминокислотных остатков. К таким
взаимодействиям относятся водородные связи, вандерваальсовы силы,
взаимодействия, сопровождающиеся переносом заряда, солевые связи и т. д.
Структура, возникающая в результате взаимодействия между боковыми

86 Глава IV
цепями аминокислотных остатков полипептидных цепей, называется
третичной. Такого рода взаимодействие возникает обычно в тех случаях, когда
длинные спиральные участки исчезают и вместо них возникают более
короткие спиральные сегменты, перемежающиеся с участками, имеющими
структуру беспорядочно свернутого клубка.
Наконец, межмолекулярные взаимодействия между полипептидными
цепями, обладающими вторичной и третичной структурой, могут приводить
к образованию агрегатов, т. е. к возникновению четвертичной структуры.
Образование агрегата осуществляется за счетїповерхностньїх взаимодействий
менаду боковыми цепями аминокислотных остатков, а также между
открытыми участками полипептидных цепей отдельных субъединиц. Ниже мы
рассмотрим каждый из этих уровней структурной организации в отдельности.
ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ
Определение последовательности аминокислот в полипептидной цепи
отнюдь не простая задача. Лишь в 1955 г. Ф. Сэнгеру и его сотрудникам
в Кембридже впервые удалось полностью расшифровать первичную
структуру одного из белков — гормона инсулина, имеющего молекулярный
вес 6000.
Исследование первичной структуры включает целый ряд этапов: 1)
определение числа отдельных полипептидных цепей, входящих в молекулу
белка; 2) расщепление связей между этими полипептидными цепями и выделение
индивидуальных цепей; 3) специфическое расщепление каждой из
полипептидных цепей нативной молекулы на меньшие цепи (фрагменты) удобной
величины; 4) определение аминокислотной последовательности в каждом
из фрагментов; 5) выяснение порядка расположения фрагментов в цепи
и установление таким путем уникальной последовательности аминокислот
в каждой из цепей нативного белка; 6) идентификация мест, в которых
индивидуальные пептидные цепи соединены друг с другом. Таким образом,
молекулу белка расщепляют, затем определяют структуру продуктов расщепления
и, исходя из полученной информации, делают заключения о структуре
нативной молекулы. Прежде чем приступать ко всем этим операциям, определяют
молекулярный вес и аминокислотный состав данного белка с помощью
методов, описанных в гл. III.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ N- И С-КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТ
Каждая пептидная цепь белковой молекулы, если только она не замкнута
в кольцо и не блокирована на одном или другом конце, имеет N-концевую
аминокислоту со свободной а-аминогруппой и С-концевую аминокислоту
со свободной а-карбоксильной группой. Число полипептидных цепей может
быть, следовательно, установлено путем анализа концевых групп. Если,
например, обнаружено, что в данном белке имеется три N-концевых
аминокислоты — один аланин, один лизин и один серии на моль белка,— то следует
сделать вывод, что молекула этого белка состоит из трех пептидных цепей.
Существует четыре метода определения N-концевых аминокислот.
Первый из них основан на арилировании полипептида 1-фтор-2,4-динитробензо-
лом (уравнение II 1.3) с образованием 2,4-динитрофенильного производного
N-концевого остатка. Полный гидролиз белка, экстракция ДНФ-аминокис-
лоты органическими растворителями и хроматографирование или какое-
нибудь другое определение модифицированной аминокислоты позволяют
затем установить природу N-концевого остатка. Очевидно, что некоторые
другие группы белка, например е-аминогруппа лизина, также будут
реагировать с 1-фтор-2,4-динитробензолом, однако из а-аминогрупп будет моди-

Структура белков 87
фицирована только одна а-аминогруппа, а именно а-аминогруппа N-концево-
го остатка. Этот метод был разработан Сэнгером, и потому 1-фтор-2,4-ди-
нитробензол часто называют реактивом Сэнгера.
Вторым важным реагентом для определения N-концевых остатков служит
фенилизотиоцианат (реактив Эдмана). Это вещество реагирует со
свободными а-аминогруппами в разбавленных щелочных растворах с образованием
фенилтиокарбамилпептида (уравнение III.4). Последующая обработка
продукта реакции кислотой (предпочтительно, но не обязательно в
органических растворителях) приводит к циклизации с образованием фенилтиоги-
цантоина N-концевой аминокислоты (его структура может быть установлена
хроматографически) и новой N-концевой аминокислоты
S
S С6Н5 С
II \ / \
СО N NH
Н/ \Н [| H H+ ||
C6H5-N N-CHRj — C-N-R2 > С— C-H + NH2 — R2. (IV.l)
<f A,
Конингсберг и Хилл ввели важное усовершенствование в этот метод,
а именно хроматографическое разделение очищенного деградированного
пептида, что открыло возможность идентификации отщепленной
N-концевой аминокислоты путем сравнения результатов аминокислотного
анализа исходного и деградированного пептида. Благодаря этому реактив
Эдмана занял теперь центральное место в арсенале средств, используемых
для установления последовательности аминокислот. Определение концевой
аминокислоты можно повторять многократно, идентифицируя один
N-концевой остаток за другим (после того как будет отщеплен предыдущий).
Теоретически так можно пройти по всей пептидной цепи, однако на практике
приходится сталкиваться с трудностями, которые вынуждают ограничиться
примерно пятью успешными определениями.
Третий химический реагент, используемый для определения N-концевых
остатков,— это цианат калия. При действии цианата калия на пептиды
(в слабо щелочном растворе) происходит карбамилирование аминогрупп
[О
II
О СО
II н /\\п II н
NCO- + NH2 — CHRi — С — N — R2^-^ NH2 N —CHRt —С—N —R2.] «, (IV.2)
Обработка карбамилированных пептидов разбавленной кислотой при
повышенных температурах приводит к отщеплению N-концевого остатка и к его
циклизации с образованием гидантоина
О
III
II /\
|,С О HN NH
/ \Н || H н+ 1 |
HaN N — CHRt-C-N — R2 —-^> С С —H+R2NH2. ](IV.3)
О] lJ Hi
Эти реакции аналогичны тем, какие имеют место при использовании
фенилизотиоцианата. Главным преимуществом цианатной методики
является легкость отделения и идентификации гидантоина путем хроматографи-
рования на ионообменных смолах.
Четвертый метод определения N-концевой аминокислоты основан на
использовании одной из экзопептидаз, а именно лейцинаминопептидазы.

Глава IV
Для действия этого фермента необходимо присутствие свободной а-амино-
группы; поэтому он отщепляет от пептидной цепи только N-концевую
аминокислоту. Как и при действии реактива Эдмана, отщепление N-концевой
аминокислоты приводит к демаскированию следующего N-концевого
аминокислотного остатка. Изучение кинетики освобождения аминокислот ия
полипептида дает информацию о последовательности аминокислот в цепи.
В случае пептида, имеющего структуру H2N—A-B-G-D и т. д.,
аминокислота А будет освобождаться быстрее, чем аминокислота В, а эта
последняя в свою очередь быстрее, чем аминокислота С, и т. д. Лейцинаминопеп-
тидаза, как явствует из ее названия, легче всего отщепляет N-концевые
остатки лейцина; однако она способна отщеплять также и другие
аминокислотные остатки, хотя и значительно медленнее. Затруднения,
встречающиеся при использовании этой методики, связаны большей частью именно
с этими различиями в скорости отщепления. Если, например, в упомянутом
выше гипотетическом пептиде аминокислота В является хорошим субстратом,
а аминокислота А — плохим, то А и В будут отщепляться практически
одновременно.
Известные в настоящее время методы определения С-концевых остатков
менее удовлетворительны. Для этого определения может быть использован
фермент карбоксипептидаза (представляющий собой, по существу, группу
сходных ферментов). Карбоксипептидаза действует только на свободные
а-карбоксильные группы, подобно тому как лейцинаминопептидаза
действует на свободные а-аминогруппы. Другой метод, разработанный Акабори,
основан на полном гидразинолизе полипептида. Гидразин реагирует с каждой
пептидной связью, превращая все аминокислоты (за исключением С-кон-
цевой, карбоксил которой не участвует в образовании пептидной связи)
в ацилгидразины. С-концевую аминокислоту отделяют и идентифицируют
хроматографически. Значительно реже используется метод, основанный
на восстановлении С-концевой карбоксильной группы до спиртовой с
помощью подходящих доноров гидрид-иона. При последующем полном
гидролизе полипептида образуется аминоспирт, соответствующий С-концевой
аминокислоте. Этот аминоспирт может быть выделен и идентифицирован.
РАСЩЕПЛЕНИЕ ДИСУЛЬФИДНЫХ МОСТИКОВ
Отдельные полипептидные цепи, входящие н состав белковой молекулы,
часто бывают соединены друг с другом дисульфидными мостиками остатков
цистина. В белковых молекулах, состоящих из одной цепи, такие мостики
могут соединять две точки цепи, достаточно удаленные одна от другой,
если исходить из линейной последовательности аминокислот. Гидролиз
цепей, содержащих такие дисульфидные связи, может давать сложные смеси
пептидов. Кроме того, дисульфидные связи нестабильны в условиях
гидролиза и легко претерпевают различные перегруппировки. Поэтому, прежде
чем приступать к изучению последовательности аминокислот, дисульфидные
мостики обычно разрушают.
Существует два общих метода разрушения дисульфидных мостиков:
окисление и восстановление. При изучении структуры инсулина и рибо-
нуклеазы для окисления дисульфидных мостиков использовали надмуравьи-
ную кислоту, под действием которой образуются остатки соответствующих
производных цистеиновой кислоты
S H-C-O2H SO3
I > (IV.4)
S SO?

Структура белков
89
Эти остатки очень устойчивы к гидролизу и к ряду других воздействий,
а их полярный характер может быть с успехом использован при разделении
пептидов. Надмуравьиную кислоту применяли также для превращения
метиошша в соответствующий сульфон, который менее чувствителен к
окислению воздухом, чем сам метионин. Метод с использованием надмуравьи-
ной кислоты имеет два главных недостатка: во-первых, надмуравьиная
кислота разрушает триптофан и, во-вторых, она не обеспечивает
исчерпывающего окисления дисульфидных мостиков.
Дисульфидные связи могут быть восстановлены до сульфгидрильных
групп при помощи ряда различных реагентов, таких, как меркаптоэтанол,
тиогликолевая кислота или боргидрид натрия.
+ 2HSCH2CHaOH
SH S —СН
СН2СН2ОН
+ I
SH S —
(IV.5)
Наиболее подходит для этой цели меркаптоэтанол. Поскольку свободные
сульфгидрильные группы весьма реакционноспособны и легко
подвергаются реокислению до дисульфидных групп, их обычно блокируют, прежде
чем продолжать деградацию пептидной цепи. Раньше для этого пользовались
иодацетамидом или иодацетатом, которые алкилируют сульфгидрильные
группы. Однако позднее было показано, что лучшие результаты дает акри-
лонитрил. Цианэтилирование сульфгидрильных групп белка акрилонитрилом
протекает количественно и без побочных реакций:
R —SH+CH2 = CH—CN
R —S —
(IV.6)
Сведения о числе полипептидных цепей и дисульфидных мостиков в
молекулах некоторых белков приведены в табл. 16.
Таблица 16
Молекулярный вес, число цепей и число дисульфидных мостиков в молекулах
различных белков
Белок
Инсулин
Рибонуклеаза
Лизоцим
Миоглобин
Папаин
Трипсин
Химотрипсин
Карбоксипепти-
даза
Гексокиназа
Такаамидаза
Бычий
сывороточный
альбумин
Дрожжевая
еполаза
Гемоглобин
Щелочная
фосфатаза
Молекулярный
вес
5 800
13 700
14 400
17 000
20 900
23 800
24 500
34 300
45 000
52 000
66 500
67 000
68 000
80 000
Число
цепей
2
1
1
1
1
1
3
1
2
1
1
1
4
2
Число
связей
3
4
5
0
3
6
5
0
0
4
17
0
0
4
Белок
Алкогольде-
гидрогеназа
из печени
Гемеритрин
Глицоральде-
гидфос-
фат-дегидро-
гепаза
Лактатдсги-
дрогеназа
Альдолаза
Дрожжевая
алкогольде-
гидрогояаза
у-Глобудин
Глутаматде-
гидрогеяаза
Миозин
Молекулярный
вес
83 000
107 000
140 000
140 000
142 000
150 000
160 000
250 000
620 000
Число
цепей
2
8
4
4
3
4
4
4
3
Число
связей
0
0
0
0
0
0
25
0

90 Г л а в а IV
СПЕЦИФИЧЕСКОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ
Для определения аминокислотной последовательности в длинных
полипептидных цепях требуется специфически расщепить полипептид, т. е.
расщепить его в немногих определенных точках и получить фрагменты,
содержащие по нескольку аминокислот. Очень важно, чтобы расщепление было
строго специфичным, так как необходимо быть уверенным в том, что число
образующихся индивидуальных пептидов невелико, а их количества
достаточны для дальнейшего исследования. Специфичность расщепления
обеспечивает также и воспроизводимость результатов. Для специфического
расщепления пептидных цепей часто применяют протеолитические ферменты —
трипсин, химотрипсин и пепсин.
Каждый из этих ферментов атакует вполне определенные пептидные
связи. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, карбонильная
группа которых принадлежит одной из основных аминокислот, обычно
аргинину или лизину. Пепсин и химотрипсин предпочтительно катализируют
гидролиз тех пептидных связей, в образовании которых участвуют
ароматические аминокислоты, в частности триптофан, тирозин и фенилаланин.
Среди протеолитических ферментов наиболее высокой специфичностью
обладает трипсин; поэтому именно он наиболее подходит для такого рода
анализа. Ясно, однако, что при помощи только одного, пусть даже абсолютно
специфичного, фермента невозможно определить полную последовательность
аминокислот в полипептиде. Если, например, триптическое расщепление
полипептида дало пять фрагментов (пептидов), в сумме соответствующих
всей цепи, и если даже для каждого из них удалось установить
аминокислотную последовательность, то это еще не все; требуется узнать, в каком порядке
эти пептиды располагались в нативном полипептиде. Чтобы узнать это,
необходимо получить другие пептиды, которые перекрывались бы с первыми.
Главное преимущество ферментативного гидролиза — специфичность
реакции расщепления в отношении природы расщепляемых пептидных
связей — накладывает в то же время строгое ограничение на применимость
этого метода. В идеале желательно было бы, например, иметь возможность
расщеплять иногда те пептидные связи, которые в норме трипсином не
атакуются, или, наоборот, предохранять от расщепления связи заведомо
чувствительные. Недавно были предложены некоторые модификации методики,
которые позволяют в какой-то мере решить эту задачу. Так, например,
реакция е-аминогруппы лизина с этилтрифтортиоацетатом в слабо щелочном
растворе дает блокированный по аминогруппе остаток, пептидная связь
которого не атакуется трипсином
О О
R-NHa + CFs-C-S-CHaCHs —* R-N-C-CFs + CaHsSH. (IV.7)
При обработке такого пептида трипсином расщепляются только те пептидные
связи, в образовании которых участвуют остатки аргинина. Удалив
блокирующие группы в слабо щелочной среде, можно затем осуществить гидролиз
трипсином по остаткам лизина. Другим примером может служить алкили-
рование остатков цистеина ?-галоидэтиламинами, в результате которого
образуются пептидные связи, чувствительные к трипсину,
R — SH + Br — СН2СНа— NH2 -» R—S —СНаСНа —NH2 + HBr. (IV.8)
Подобного рода процедуры значительно расширяют возможности
использования трипсина в качестве специфического реагента для расщепления
пептидных связей, так как, подвергнув модифицированную полипептидную
цепь ряду последовательных обработок трипсином, исследователь может
получить перекрывающиеся пептиды.

Структура белков 91
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
В КОРОТКИХ ПЕПТИДНЫХ ЦЕПЯХ
После специфического расщепления полипептидных цепей и хромато-
графического разделения продуктов гидролиза следующей задачей
оказывается определение аминокислотной последовательности для каждого из
продуктов деградации. Обычно оно включает: 1) определение
аминокислотного состава каждого пептида, 2) определение N- и С-концевых групп
и 3) дальнейшее расщепление (если это необходимо).
Ясно, что если мы имеем дело с трипептидами, то для однозначного
установления аминокислотной последовательности достаточно первых двух
этапов. При расшифровке строения более длинных пептидов весьма полезным
оказывается реактив Эдмана. Последовательная, в несколько этапов,
идентификация аминокислот с N-конца наряду с выяснением аминокислотного
состава пептида и природы С-концевой аминокислоты в ряде случаев
оказывается достаточной для установления аминокислотной
последовательности в пептидах, содержащих от 8 до 10 аминокислот. Аналогичные
исследования, правда по большей части не столь успешные, можно проводить
также с помощью лейцинаминопептидазы и карбоксипептидазы.
После того как будет определена последовательность аминокислот во всех
продуктах деградации и в соответствующем числе перекрывающихся
пептидов, полную последовательность нативной полипептидной цепи можно
считать установленной. (Ниже мы это покажем на конкретном примере.)
Последнее, что требуется сделать,— это установить положение дисульфид-
ных мостиков. С этой целью подвергают ферментативному расщеплению
белок, дисульфидные связи которого не нарушены. Обычно небольшого
числа дополнительных анализов (по установлению последовательности)
оказывается достаточно для полной локализации групп, участвующих в
образовании дисульфидных связей.
СТРУКТУРА ИНСУЛИНА
Полипептидный гормон инсулин участвует в регуляции углеводного
обмена. Молекула бычьего инсулина содержит 51 аминокислоту и состоит
из двух цепей. Последнее подтверждается присутствием двух N-концевых
аминокислот — глицина и фенилаланина. Цепь с N-концевым глицином
называется А-цепью и содержит 21 аминокислоту; цепь с N-концевым фенил-
аланином называется B-цепью, и в состав ее входит 30 аминокислот. Сэнгер
и его сотрудники окислили инсулин надмуравьиной кислотой и провели
хроматографическое разделение двух цепей. После этого каждую цепь
подвергли ферментативному и кислотному гидролизу. На фиг. 27 и 28 указаны
главные пептиды, полученные при гидролизе каждой из цепей, и приведены
полные структуры цепей, установленные на основе этих данных. Видно, что
места, в которых трипсин, химотрипсин и пепсин расщепляют цепи,
согласуются с тем, что мы знаем о специфичности этих ферментов в отношении
синтетических соединений. Обнаружено также и несколько дополнительных
мест расщепления, в частности при гидролизе, катализируемом пепсином.
Особо следует обратить внимание на то, что перекрывающиеся пептиды,
полученные при использовании разных гидролитических методов, дополняют
друг друга и позволяют однозначно установить общую аминокислотную
последовательность. Для каждого из главных пептидов, приведенных на
фиг.|27 и 28, аминокислотная последовательность была определена путем
неспецифического гидролиза кислотой, установления последовательности
аминокислот в образовавшихся ди-, три- и тетрапептидах и объединения
полученных данных в общую картину. Как указывалось выше, в настоящее

Последовательности, Гли-Илей-Сал-Глу-Глу-Ццс-ЗОзН-Цис-вОзП-Ала- Сер-Лей-Тир-Глу-Лей-Глу-Асп-Тир-Цис-ЭОзН
установленные Сер-Вал-Цис-ЭОзН Цис-вОзН
исходя из строения
более коротких
пептидов
Пептиды, полученные Гли-Илей-Вал-Глу-Глу-Цис-ЗОзН-Цис-ЗОзН-Ала-Сер-Вал-Цис-ЗОзН-Сер-Лей Лей-Глу-Асп-Тир-Цис-ЗОзН-Асп
при переваривании Гли-Илей-Вал-Глу-Глу-Цис-вОзН-Цис-вОзН-Ала-Сер-Вал- Тир-Глу Глу-Асп-Тир-Цпс-ЗОзН-Асп
пепсином Гли-Илей-Вал-Глу Тир-Глу-Лей Асп-Тпр-Цис-ЗОзН-Асп
Тир-Глу-Лей-Глу
Лей-Глу
Пептиды, полученные Гли-Илей-Вал-Глу-Глу-Цис-ЗОдН-Цис-ЗОзН-Ала-Сер-Вал-Цис-ЗОзН-Сер-Лей-Тир Цис-ЗОзН-Асп
при переваривании Гли-Илей-Вал-Глу-І\іу-Цис-ЗО3Н-Цис-ЗО3Н-Ала-Сер-Вал-Цис-ЗОзН Глу-Лей-Глу-Асп-Тир-Цис-ЗОзН-Асп
химотрнпсином Сер-Лей-Тир
Глу-Лей-Глу-Асп-Тир
Структура А-цепи Гли-Илей-Вал-Глу-Глу-Цис-ЗОзН-Цис-ЗОзИ-Ала-Сер-Вал-Цис-ЗОзН-Сер-Лей-Тпр-Гпу-Лей-Глу-Асп-Тир-Цис-ЗОзН-Асп
12 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Связи, разрываемые ^ *¦ а ^ ^. а ^
пепсином ' ' І і і I 1
Связи, разрываемые t t t
химотрипсином ' ' '
Фиг. 27. Структура А-цопи окисленного инсулина.
Сплошные стрелки — главные разрываемые связи; пунктирные стрелки — прочие разрываемые связи.

Последователь- Фен-Вал-Асп-Глу-Гис-Леи-Цис.БОзН-Гли- Тир-Лей-Вал-Цис • 8О3Н-ГлИ
пости, установ- Сер-Гис-Лей-Вал-Глу-Ала Гли-Глу-Арг-Гли Тре-Про-Лиз-Ала
ленные .исходя Ала-Лей Гли-Фен
из строения Ала-Лей-Тир
более коротких
пептидов
Пептиды, полу- Фен-Вал-Асп-Глу-Гис-Лей-Цис- БОзН-Гли-Сер-Гис-Лей Лей-Вал-Цис-БОзН-Гли-Глу-Арг-Гли-Фен
ченные при Вал-Глу-Ала-Лей Тир-Тре-Про-Лиз-Ала
переваривании Гис-Лей-Цис- БОзН-Гли-Сер-Гис-Лей
пепсином
Пептиды, полу- Вал-Глу-Ала-Лей-Тир Тир-Тре-Про-Лиз-Ала
ченные при Лей-Вал-Цис-БОзН-Гли-Глу-Арг-Гли-Фен-Фен
переваривании
химотрипсином
Пептиды, полу- Гли-Фен-Фен-Тир-Тре-Про-Лиз
ченные при Ала
переваривании
трипсином
Структура B-цепи Фен-Вал-Асп-Глу-Гис-Лей-Цис-ЭОзН-Гли-Сер-Гис-Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тяр-Лей-Вал-Цис- 8О3Н-Гли-Глу-Арг-Гли-Фен-Фен-Тир-Тре-Про-Лиз-Ала
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1Є 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
К Л А Л Л Л Л Л А А
Связи,
расщепляемые пепси-
пом
Связи,
расщепляемые
химотрипсином
Связи,
расщепляемые
трипсином
Фиг. 28. Структура B-цепи окисленного инсулина.
Сплошные стрелки — главные разрыраемые связи; пунктирные стрелки — прочие разрываемые связи.
I S —S-
Гли-Илей-Вал-Глу-Глун-Цис-Цис-Ала-Сер-Вал-Цис-Сер-Лей-Тир-Глун-Лей-Глу-Аспн-Тир-Цис-Аспн
\ I
S S
s s
Феп-Вал-Аспи-Глуи-Гис-Лей-Цжс-Гли-Сер-Гис-Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тир-Лей-Вал-Цис-Гли-Глу-Арг-Гли-Фен-Фен-Тир-Тре-Про-Лиа-Ала
Фиг. 29. Ковалентная структура бычьего инсулина.

94 Г л ав а IV
время решение такого рода задач заметно упростилось благодаря наличию»
реактива Эдмана. В окончательном виде структура инсулина (фиг. 29) была
установлена после того, как были выявлены полные аминокислотные
последовательности А- и B-цепей и локализованы дисульфидные мостики, а также
амидные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот (эти последние
разрушаются при кислотном гидролизе).
СТРУКТУРА РИБОНУКЛЕАЗЫ
Вторым крупным достижением в изучении аминокислотной
последовательности белковых молекул явилось определение структуры рибонуклеазы.
выполненное Хирсом, Штейном, Муром и Анфинсеном. Молекула этого
фермента, представленная одиночной полипептидной цепью, состоит
из 124 аминокислот и содержит 4 дисульфидных мостика. При изучении
ее, так же как и в случае инсулина, использовали окисление надмуравьи-
ной кислотой с последующим ферментативным гидролизом. Однако для
выяснения первичной структуры этой более крупной молекулы
потребовалось ввести в методику некоторые усовершенствования: авторы применяли
ионообменные смолы для количественного разделения пептидов низкого
молекулярного веса и использовали количественные методы для определения
аминокислотного состава пептидов. Полная структура рибонуклеазы
показана на фиг. 30.
ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ БЕЛКОВ
Вслед за установлением структуры инсулина и рибонуклеазы были
расшифрованы аминокислотные последовательности еще нескольких белков,
а именно лизоцима, белка оболочки вируса табачной мозаики, химотрип-
синогена, трипсиногена, папаина, миоглобина, гемоглобина, цитохрома с.
клупеина и некоторых других.
ОБЩИЕ СООБРАЖЕНИЯ
Имеющиеся в нашем распоряжении данные по аминокислотной
последовательности белковых молекул позволяют высказать некоторые общие
соображения.
1. Расположение аминокислот в полипептидных цепях носит случайный
характер. Были найдены все или почти все возможные дипептидные
последовательности. Повторяющиеся последовательности в пределах одной и той
же молекулы встречаются редко.
2. Для белков характерна структурная специфичность. Рибонуклеазу,
например, нельзя рассматривать как некий класс полипептидов, отдельные
представители которого отличаются друг от друга несколькими случайными
замещениями в цепи. Сказанное не исключает, однако, возможности
упорядоченных замещений некоторых аминокислот в молекулах функционально
родственных белков, например белков, выполняющих одну и ту же функцию
у разных биологических видов.
3. Число и тип дисульфидных мостиков в разных белках различны,
но для каждого данного белка число и расположение этих мостиков служат
специфической характеристикой. Существуют белки, в молекуле которых
дисульфидные мостики вообще отсутствуют; у других имеются мостики либо
между отдельными цепями, либо внутри одной и той же цепи; наконец,
у третьих молекулы соде жат оба типа мостиков.

Лиз-*:—Тре-*— <Лей-*-Аспн
Цис-ч—Арг~*—Асп
28
Z9
30
31
32
-Тре-*—Аспн
45
41
40
и
39
за
37
36
35
33
Фиг. ЗО. Ковалентная структура рибонуклеазы.

96 Г л а в а IV
4. Работы по изучению аминокислотной последовательности белков
в значительной степени подтвердили специфичность действия протеолитиче-
ских ферментов, выявленную первоначально лишь при изучении пептидов
низкого молекулярного веса.
5. Эти работы подтвердили также и два других более ранних заключения:
они показали, что все аминокислоты, встречающиеся в белках,
принадлежат к L-ряду и что наличие в белковой молекуле каких-либо иных кова-
лентных связей, помимо пептидных, представляет собой крайне редкое
явление.
ИНДИВИДУАЛЬНОСТЬ БЕЛКОВ.
ВИДОВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И МУТАЦИОННЫЕ РАЗЛИЧИЯ
В гл. III указывалось, что первичная структура некоторых
полипептидных гормонов (в частности, вазопрессина и меланоцитстимулирующего
гормона) у разных биологических видов не вполне одинакова. Такая же видовая
специфичность наблюдается и у белков. Сэнгер и его сотрудники, работая
с препаратами инсулина, выделенными от разных видов млекопитающих,
во всех случаях обнаружили те или иные вариации либо в А-цепи (на участке,
ограниченном дисульфидным мостиком), либо в B-цепи (на ее карбоксильном
конце). В препаратах цитохрома с, выделенных от разных видов, также
были обнаружены индивидуальные различия, определяющиеся природой
аминокислот в ключевом пептидном сегменте. Помимо этих вариаций,
обусловленных видовой специфичностью, встречаются также и различия в белках
одного и того же вида, возникшие в результате мутаций. Большинство
сведений о влиянии мутаций на структуру белка почерпнуто нами из
прекрасных работ Ингрэма. Ингрэм и его сотрудники показали, что нормальный
гемоглобин взрослого человека и гемоглобин больных таким наследственным
заболеванием, как серповидноклеточная анемия, отличаются только тем,
что в определенном положении ?-цепи остаток глутаминовой кислоты в
аномальном гемоглобине заменен валином. (Напомним, что молекула
гемоглобина состоит из двух пар идентичных цепей: а- и ?-цепей в гемоглобине
взрослого человека или а- и у-цепей в гемоглобине плода.)
В дальнейшем было изучено большое число аномальных гемоглобинов
и отмечено много случаев замещения какой-нибудь одной из
аминокислот (фиг. 31).
Тонкие различия в первичной структуре родственных белков часто
удается выявить «методом отпечатков пальцев». Метод этот состоит в том, что
белок подвергают частичному перевариванию с помощью одного или
нескольких протеолитических ферментов, а затем разделяют продукты гидролиза
и идентифицируют их, пользуясь для этого либо электрофорезом, либо
хроматографией на бумаге. На фиг. 32 приведены полученные таким способом
«отпечатки пальцев», или «пептидные карты», нормального и аномального
гемоглобинов. Детальное изучение этих пептидных карт показывает, что
все пептидные пятна, за исключением одного, идентичны. Таким способом
генетически измененный структурный элемент выявляется очень легко,
и для установления природы структурного изменения нет надобности
устанавливать полную аминокислотную последовательность всей молекулы.
Действительно, в ряде случаев весьма определенные указания относительно
природы имеющегося замещения можно получить просто исходя из
результатов анализа аминокислотного состава соответствующих пептидов,
выделенных из двух белков. Но, конечно, однозначные доказательства замены
одной аминокислоты на другую получают только после установления
аминокислотной последовательности анализируемых пептидов.

:Ar-идентичны в а-и ?-цепях гемоглобина и в маоглобинв
• -замещены в аномальных гемоглобинах
•fr-различиы в р-и д-цепях
20
Трв~/1сп-
—Am- Вал
Вал -J1U3
р\вал\+і исАг\леиЦТре^Про\-\Гли+-ТлцА Щ/-КСер—Ала-\Вал^Тре-^-Ала^Лей
у Глп-тГисі-ФеиЛТре-\-Гли-ІГлд-\-АсіЦ^Ж-\Ала—Тре—Т1лей\-Тре\-Сер-ІЛеи
Гли—Ала—Гис—Ала—Гли-
сга/4- — АВалі-Асл-
Глу- -Тир-
-іВалі-Глу—Асп—Аяа-l
-Гли-
¦Млеи-\Мет— Гли—Acny-Ttpo
to
• •
42 A3 44 45 4ff 47 AS 4-9 50 57 52 53 54 55 55 57 58
Gl C8 68 70 77 7Й 73 74 75 76 77 78 79 80 81 02 83
Ала—Асп-
Ала-
-Леи—Тре- Аст -Ала—Вал- -Ал
Леи-\-Гли- Ала- -Феи—Сер-\
Асп- уТла—Лей-
-Лей-т-Тре— Сер—Лей— Гли\-Асп-ІАла-Нлей-Лиз-\ ЦЦ
"᳥ 69 70 77 72 "та" 74 75 76 77 78
¦Асп- -Мет-Про—Аслн-Ала—Леа—Сер—А
¦Ас - Леи—Лиз—Гли—Тре—Фен^-Ала—Тре
Acn-t/lea—c/Іиз—Гли—Тре-Фені-Ала—Глуі
79 "вО НІ 82 83 ~84 85' 86 87 88
92 95 94 95
Сер—Гис—Цис-
Гнс— Rat 4гп
ш .
Гли—Аспн-Вал- „шд
H J
S9 90 91 92 93 94 95
7E 776 777 178 170 ПО
97 98 99 100 101 102 103 104 105 706 107 108 109 710 777 И2 173 774 7J5 JJ6 J17 718
12? Г.1 П<\ Ш Uff ІтУ ГП ГТ ЯП 7ТТ 1Т" ПТ Ш Гг ТТТТ Г7 1Tff 1T" "l" f'l ~
m JUS 727 728 129 130 137 132 133 134 735 736 737 138 139 140 147 742 743 144 745 146
Фиг. 31. a-, ?- и у-Цетш нормального гемоглобина леловека.
а-Сшралыше участки обозначены двойной пинией, перечеркивающей номера соответствующих аминокислотных остатков
119 120 121 122 123 724

98
Глава IV
Фиг. 32. Пептидные карты трігатнчостшх гидролизатоп гомоглобипов Л и S.
А. Фотографии двух прптидных карт. Б. Расположение пятен на пептидных картах. Прерывистыми
пиниями обведены пятна, проявляющиеся только после нагревания хроматограммы.
ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ
Пониманием вторичной структуры белков, т.-е. структуры,
обусловленной образованием водородных связей между группами, участвующими в
образовании пептидных связей, мы в большой мере обязаны замечательным
работам Полинга и Кори. На основе обширных рентгеноструктурных
исследований, проведенных на низкомолекулярных кристаллических амидах,
Полинг, Кори и Бренсон сформулировали ряд требований, которые должны
быть удовлетворены для образования наиболее стабильной вторичной струк-

Структура белков
99
туры: 1) пептидная группа должна быть плоской, а длины связей и углы
должны быть идентичны тем, которые найдены в кристаллах простых
вторичных амидов (см. фиг. 7); 2) каждый атом кислорода карбонильной группы
и каждый атом азота амидной группы должны участвовать в образовании
водородной связи; 3) атомы водорода, принимающие участие в образовании
водородной связи, должны находиться вблизи линии, соединяющей атомы
кислорода и азота, участвующие в образовании этой связи; 4) операция
перехода от одного аминокислотного остатка к другому, соседнему (вдоль
центральной оси или при вращении вокруг центральной оси) должна быть
одинаковой для каждого остатка. Структуры, которые удовлетворяют этим
требованиям, подразделяются на две категории: спиральные структуры,
обусловленные образованием внутримолекулярных водородных связей,
и структуры типа складчатого слоя, обусловлепныо образованием
межмолекулярных водородных связей.
Среди многих возможных спиральных структур, рассмотренных Полин-
гом, Кори и другими исследователями, только одна структура отвечает всем
требованиям, обеспечивающим максимальную стабильность. Эта структура,
показанная на фиг. 33, носит название а-спирали. Согласно модели Полинга,
Л Я
Фиг. 33. Л оная (/I) и правая (В) а-сшірали, построенные из L-аминокислот.
Боковые цепи (R) и водородные атомы, присоединенные it а-углі'родам основной цепи, занимают
положения, соответствующие конфигурации, известной для L-аминокислот.
7*

100
Глава IV
на один виток а-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, а шаг
спирали равен 5,4 А. При переходе от остатка к остатку смещение
{трансляция) вдоль оси спирали равно 5,4/3,6 = 1,5 А, а угол поворота цепи
равен 36073,6 = 100°.
Предположение о том, что для структуры белков характерна а-спираль,
чрезвычайно убедительно подкрепляется также результатами более ранних
рентгеноструктурных исследований некоторых белков. Эти исследования
выявили расстояния в 5,4 и 1,5 А, точно отвечающие величинам,
предсказанным для спирали. На фиг. 33 видно, что водородные связи между отдельными
СО- и NH-группами пептидных связей почти параллельны длинной оси
спирали. Боковые цепи аминокислотных остатков выступают из а-спирали
наружу. Каждый атом кислорода карбонильной группы и каждый атом азота амид-
Фиг. 34. Складчатый слой из параллельных (А ) и антипараллельных (Б) цепочек.

Структура белков 101
ной группы участвуют в образовании водородной связи; карбонильный
кислород любого данного остатка соединен водородной связью с амидным азотом
четвертого по счету остатка (считая вдоль пептидной цепи назад). Таким
образом, повторяющиеся элементы структуры, связанные водородными
связями, могут быть представлены следующим образом:
О
II H
N —(С —CHR —NK —С
і - О
Белки со структурой а-спирали могут быть либо глобулярными, либо
фибриллярными.
Структуры типа складчатого слоя, обусловленные образованием
межмолекулярных водородных связей, бывают двух видов (фиг. 34), причем
и те и другие удовлетворяют требованиям Полинга, Кори и Бренсона. В
складчатом слое из параллельных цепочек все N-концевые группы обращены
в одну и ту же сторону. В складчатом слое из антипараллельных цепочек
N-концевые группы всех расположенных рядом цепей направлены в
противоположные стороны. В отличие от а-спирали водородные связи в
структурах типа складчатого слоя почти перпендикулярны главной оси
полипептидной цепи. Структура типа складчатого слоя характерна для
фибриллярных белков, которые, как правило, нерастворимы в полярных растворителях.
Ниже мы будем говорить главным образом о спиральных структурах, а также
о методах их обнаружения и исследования.
СПИРАЛЬНЫЙ КОМПОНЕНТ ПОЛИПЕПТИДОВ
Дисперсия оптического вращения. Доля спирализованных участков
в молекуле белка — важный параметр его структурной характеристики.
В парамиозине, например, более 90% аминокислотных остатков вовлечены
в спиральную структуру, тогда как в ?-лактоглобулине участки со
структурой а-спирали, вероятно, вообще отсутствуют. Большинство белковых
молекул содержит спирализованные участки различной длины,
чередующиеся с элементами структуры типа беспорядочно свернутого {статистического)
клубка. Долю спирализованных участков можно определить несколькими
методами. Чаще всего пользуются методом, основанным на изучении
дисперсии оптического вращения модельных полипептидов. На фиг. 35
схематически показана зависимость оптического вращения синтетического полипепти-
да поли-Ь-глутамата от длины волны при pH 7 и 4. Такое изменение
оптического вращения носит название дисперсии оптического вращения. Легко
видеть, что кривые дисперсии оптического вращения для двух значений pH
резко отличаются одна от другой как в области между 250 и 190 ммк, так
и в области между 350 и 700 ммк. Эти различия коррелируют с изменениями
в структуре полипептида: если при pH 4 структура поли-Ь-глутамата
является полностью спиральной, то при pH 7 полипептид имеет структуру
беспорядочно свернутого клубка. Поскольку спираль представляет собой
в основном асимметрическую структуру, вполне естественно, что наличие
спирализованных участков усиливает способность полипептидов вращать
плоскость поляризации (обусловленную присутствием в цепи остатков
асимметрических аминокислот). Важный, но еще не решенный вопрос состоит
в том, можно ли, исходя из данных по дисперсии оптического вращения,
количественно оценивать долю спиральных структур. В принципе такие
оценки можно делать на основе данных по оптическому вращению,
полученных в двух разных областях спектра. Для более длинноволновой области
Моффит и Янг предложили следующее эмпирическое выражение, описываю-

102
Глава IV
щее зависимость оптического вращения полипептидов от длины волны:
гді _-д .16 ^" (IV 9)
где \R]x — величина наблюдаемого вращения (нлюс некоторые поправки),
X — длина волны, ао, bo и Яо = 212 ммк — константы. Величина bo в этом
уравнении, которую получают графическим способом, может служить для
оценки доли спирализованных участков в данной структуре. На ряде
синтетических гомополипептидов было установлено, что те из них, для которых
180 200 220 240
Фиг. 35. J'l.niPiieime оптического вращения синтетического полпігоитіїда (ло.'ш-Ь-глу-
ТіЩІІНОВОІІ КИСЛОТЫ) I) МВИСЛШОСТЛ ОТ ДЛШП.Г ПОЛНЫ 1фГ7 pli A H 7.
Молекула иоли-1<-тлутаминовой нвелоты имеет спиральную структуру пріт pH 4 и структуру
статистического клубка при рП 7. Обратите внимание на изменение масштаба но пси ординат при переходе
к длинам волн «'ЗОН .«.та, что связано с увеличением вращения при малых длинах воли.
характерна спиральная структура, имеют величину bo, равную
приблизительно—630, тогда как для неспиральных структур величина Ъо близка
к пулю. Интерполяция наблюдаемых величин Ъопозволяет получить
промежуточные значения доли спирализованных участков. Использование величин
Ъо Для установления степени снирализации нативнътх белков дало в ряде
случаев хорошие результаты, хотя и несколько менее удовлетворительные,
чем с синтетическими полипептидами. Для некоторых белков, например,
величина bo оказалась более отрицательной, чем —630, что довольно трудно
интерпретировать в свете приведенного выше элементарного рассмотрения.
Неопределенности, возникающие при вычислении степени спирализадии
нативных белков на основе величин bo, объясняются несколькими причинами.
Причины эти следующие: 1) отсутствие теоретической основы для уравнения
Моффита — Янга; 2) взаимодействие между боковыми цепями, оказывающее
влияние на оптическую активность; 3) возможность присутствия (наряду
¦с а-спиралями) некоторых других типов упорядоченных структур; 4)
возможность присутствия в одной и той же белковой молекуле участков,
имеющих структуру правой а-спирали, и участков со структурой левой а-спнрали.
В последнем случае вклады этих участков в величину оптической активности
будут взаимно компенсироваться, так что определяемая степень спирали-
зации окажется соответственно заниженной.

Структура белков 103
Последние достижения в области приборостроения дали возможность
осуществить измерения оптического вращения полипептидпых и белковых
растворов в интервале между 185 и 240 ммк. Оказалось, что кривые
дисперсии оптического вращения полипептидов обладают в этой области спектра
некоторыми интересными особенностями (фиг. 35). Кривые для полипептидов,
имеющих структуру сс-слирали (напрршер, для поли-Ь-глутамата при pH 4),
имеют минимум при 233 ммк, точку перегиба (точка нулевого вращения)
при 225 ммк, плечо при 215—220 ммк, максимум яри 198 ммк и вторую точку
перегиба при 193 ммк. Способность вращать плоскость поляризации при 233
и 198 ммк зависит от конформации, т. е. она сама по себе может служить
количественной характеристикой степени слирализации исследуемого
полипептида.
ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ
Давно установлено, что большинство белков в нативном состоянии имеет
весьма компактную структуру. Этот вывод непосредственно следует из
результатов изучения гидродинамических свойств белков. Рассмотрим, например,
такое свойство макромолекул, как характеристическая вязкость,
определяемая выражением
[] Л
где V — объем частицы, m — ее масса, а Л — величина, зависящая от
отношения осей молекулы. (Для жестких сфер эта величина, как показал
Эйнштейн, равна 2,5; с ростом отношения осей она увеличивается.) В табл. 17
приведены значения [г\] для некоторых макромолекул, которые можно
сгруппировать в три класса: компактные глобулярные частицы, статистические
клубки и частицы, имеющие форму стержня. Как следует из
уравнения (IV. 10), для большинства нативных глобулярных белков значения [ц]
не зависят от молекулярного веса; различия в величине [г\], которые
иллюстрирует табл. 17, обусловлены разной формой макромолекул. Можно заме-
'шть, в частности, что значительное увеличение [ц] имеет место при
развертывании полипептидных цепей в результате расщепления дисульфидных
мостиков (рибонуклеаза, сывороточный альбумин) или после обработки
концентрированными растворами мочевины (овальбумин, сывороточный
альбумин). Наконец, следует указать на особо большие значения [ц] для таких
молекул, как коллаген и ДНК (обсуждение этого вопроса см. в гл. V), т. е.
для молекул, имеющих спиральную (вторичную) структуру, но лишенных
третичной структуры (обусловленной свертыванием самой спирали).
Данные табл. 17 позволяют сделать вывод, что для большинства белков
характерно наличие также и третичной структуры.
Трехмерная структура белка высокослецифичиа. Иными словами,
полипептидная цепь или цепи не просто свертываются с образованием структуры,
близкой к сферической; свертывание проходит ряд строго фиксированных
этапов, в результате чего возникает уникальная или почти уникальная
конфигурация. Этот вывод непосредственно следует из того факта, что
биологическая активность белков, в частности ферментативная активность, край-
пе чувствительна к любым изменениям в третичной структуре белка (см.
ниже). Ввиду большой сложности и высокой специфичности третичной
структуры, естественно, очень важно, во-первых, изучить тонкие детали этой
структуры и, во-вторых, попытаться попять природу сил, ответственных
за ее поддержание. Данные по вязкости, коэффициенту трения и
светорассеянию дают информацию относительно общей топографии макромолекул.
Более точные сведения, касающиеся деталей третичной структуры белков,
удается получить с помощью рентгеноструктурного анализа.

104
Глава IV
Таблица 17
Характеристическая вязкость некоторых макромолекул
Компактные глобулярные
частицы
вещество
Полистироль-
ные каучуко-
подобные ча-
f\ iwти" т г т. Т
О1ИЦЫ
Рибонуклеаза
Лизоцим
Миоглобин
?-Лактоглобу-
лин
Овальбумин
Сывороточный
альбумин
Гемоглобин
Алкогольде-
гидрогеназа
из печени
Гемеритрин
Альдолаза
Рибосомы
дрожжевых
клеток
Вирус
кустистой
карликовости
мол.
вес
109
13 700
14 400
17 000
35 000
44 000
65 000
67 000
83 000
107 000
142 000
3,5-10«
8,9-10«
[п],
смЗ/г
2,4
3,3
3,0
3,1
3,4
4,0
3,7
3,6
4,0
3,6
3,8
5,0
4,0
Беспорядочно свернутые клубки
вещество
Полистирол в
толуоле
Полистирол в
іилуиле

Восстановленная
рибонуклеаза
Окисленная

рибонуклеаза
Окисленная

рибонуклеаза в
мочевине
Овальбумип в
мочевине
Сывороточный
альбумин в
мочевине
Восстаповлен-
ный
сывороточный
альбумин в
мочевине
Миозин в
солянокислом
гуанидине
РНК
ДНК,
денатурированная
нагреванием
мол.
вес
45 000
70 000
13 700
14100
14100
44 000
66 000
66 000
200 000
1,5-10«
5-10"
[Ц],
смЭ/г
28
37
14,4
11,6
13,9
34
22
53
93
100
150
Частицы, имеющие форму
стержней
вещество
Фибриногеї
Коллаген
Миозин
Днк
втм
мол.
вес
330 000
345 000
620 000
5-106
4-Ю'
[Ц],
смЗ/г
27
1150
230
5000
29
РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ И ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ
Метод рентгеноструктурного анализа — один из наиболее эффективных
общих методов определения молекулярных структур. G его помощью были
успешно расшифрованы структуры многих сложных химических соединений
(сошлемся в качестве примера на витамин В12). В своем классическом виде
рентгеноструктурный анализ применялся для изучения молекул,
значительно менее сложных, чем даже самые простые белки. Однако Перутц и Кендрью
своими блестящими опытами убедительно показали, что, по крайней мере
в некоторых случаях, этот метод может быть с успехом применен также и для
исследования структуры белковых молекул.
Для получения рентгенограмм белков необходимо располагать
кристаллическими препаратами, отвечающими определенным требованиям. Во-пер-

Структура белков
105
вых, размер кристалла хотя бы в одном из направлений должен быть не
меньше 1 мм, а это значительно превышает размеры большинства белковых
кристаллов, полученных обычными методами. Во-вторых, для установления
структуры белка на основе данных по дифракции рентгеновских лучей
необходимо исследовать не только нативный белок, но и ряд его изоморфных
производных. Такие производные могут быть получены введением в белковые-
Фиі'. 30. Рентгенограмма шюглобина.
кристаллы атомов тяжелых металлов (например, Hg), по одному атому на
каждую элементарную ячейку кристалла. Важно, чтобы при этом не
изменялись величина и симметрия элементарной ячейки, а также расположение
атомов в ячейке. Именно этот этап, т. е. получение подходящих производных
белка, содержащих тяжелые атомы, часто представляет наибольшие
трудности при определении трехмерной структуры макромолекул методом
рентгеноструктурного анализа. Для расшифровки структуры миоглобина
Кендрью использовал четыре различных вида таких производных; Перутцу,
изучавшему структуру гемоглобина, потребовалось их шесть.
На фиг. 36 показана типичная дифракционная картина, полученная для
миоглобина. Темные пятна, или дифракционные максимумы, которые

106 Глава IV
мы видим на этой рентгенограмме, позволяют получить информацию о
структуре белка. Рентгенограмма дает фактически обращенную картину
кристалла; дифракционные максимумы, расположенные ближе к центру
рентгенограммы, соответствуют большим межплоскостным расстояниям, а максимумы,
расположенные ближе к периферии,— малым.
Определяя положение и интенсивность дифракционных максимумов (для
нативного белка и для соответствующего числа его изоморфных
производных), можно в принципе вывести из этих данных структуру интересующего
нас белка. Для получения высокого разрешения требуется провести
измерения на очень большом числе дифракционных максимумов. Кендрьто,
например, при расшифровке структуры миоглобина измерил более 10 000
максимумов и таким путем достиг разрешения около 1,5 А. Эта работа требует
весьма сложных математических расчетов, для выполнения которых
приходится использовать быстродействующие вычислительные машины.
СТРУКТУРА МИОГЛОБИНА
Миоглобином называется белок, осуществляющий перенос кислорода
в мышцах млекопитающих. Его молекула состоит из одной полипептидной
цепи, в которую входит 153 аминокислотных остатка, и одной
железосодержащей группы, называемой гемом или гомогруппой. Молекулярный вес
миоглобина равен 17 500. Миоглобин не очень типичный белок, во-первых, из-за
высокого содержания а-спиральных участков G7%) и, во-вторых, из-за
полного отсутствия дисульфидпых мостиков и свободных сульфгидрильных
групп. Кендрыо и его сотрудники, исследуя методом рентгеноструктурного
анализа миоглобин кашалота, определили полную структуру этого белка.
На первой стадии исследователи довольствовались разрешением 6 А. Уже
лри таком разрешении можно было видеть, что полипептидная цепь, которая
рассматривалась как область повышенной электронной плотности,
скручена весьма сложным образом и образует довольно компактную структуру.
Более точное определение структуры с разрешением 1,5 А позволило
однозначно установить положение большинства атомов в молекуле. При таком
разрешении аминокислотную последовательность белка можно определить
непосредственно из данных рентгеиоструктурного анализа. Сравнение
аминокислотной последовательности миоглобина, полученной из рештенострук-
турных данных, с последовательностью, установленной при помощи
классических химических методов, обнаружило хорошее совпадение.
1'азрешепие в 1,5 А позволяет также надежно вычислить межатомные
расстояния, а это в свою очередь дает информацию, касающуюся
взаимодействия боковых цепей аминокислот. Ниже мы еще вернемся к этому вопросу.
На фиг. 37 приведено схематическое изображение структуры
миоглобина, показывающее ход полипептидной цени и расположение «-спиральных
участков. Видно, что молекула миоглобина содержит восемь спиральных
участков, которые перемежаются с участками, имеющими структуру
беспорядочно свернутого клубка. Участки со структурой клубка располагаются,
как правило, в углах молекулы, т. е. там, где полипептидная цепь, изгибаясь,
резко меняет свое направление. В табл. 18 приведены основные параметры
а-спиральных участков молекулы миоглобина, но данным Кендрыо, в
сопоставлении с соответствующими величинами, рассчитанными для сс-спирали
Полингом и Кори. Такое сопоставление убедительно подтверждает наличие
ос-спиральных структур в молекуле миоглобина. Полная модель структуры
миоглобина представлена на фиг. 38.
Кендрыо суммировал основные характеристики структуры миоглобина
следующим образом: 1) молекула миоглобина компактна, причем внутри

NH
СООН
Фиг. 37. Схематическое изображение структуры миоглобппа
Двойными линиями обозначены учпгтші. нмічоіщн- "Труктуру г/.-гшфа/ш. Црфшл уіїазьіватот длину
KcUh'/foro участка (lUijjja.KOUnyio чж.'.інім аліііікиїмслігіяьіч остатков).
Фш'. 38. Модель молекулы мпоглооіша.

108
Глава IV
Таблица 18
Параметры, характеризующие спиральные участки молекулы миоглобина
Спираль
А
В
D
Ej
Е2
Число
остатков
16
16
7
10
10
ф, рад
1,73
1,69
1,73
1,74
1,71

Трансляция вдоль
оси
спирали, Л
1,50
1,47
1,45
1,52
1,49
Спираль
F
G
H
а-Сшраль
Число
остатков
9
19
24
Ф, рад
1,70
1,75
1,73
1,74

Трансляция вдоль
оси
спирали, А
1,46
1,53
1,49
1,50
нее содержится несколько молекул воды (не более четырех); 2) почти вс©
полярные группы (Лиз, Apr, Глу, Асп, Гис, Сер, Тре, Тир, Три) находятся
на поверхности молекулы и, следовательно, соприкасаются с молекулами
растворителя; 3) ко всем полярным группам, находящимся на поверхности
молекулы миоглобина, присоединены молекулы воды; 4) жидкость,
окружающая кристалл, не проявляет никаких признаков упорядоченности (если
не учитывать присоединения молекул воды к полярным группам); 5)
внутренняя часть молекулы миоглобина состоит из неполярных остатков; 6) пятая
координационная связь атома железа в тетрапиррольной простетической
группе занята остатком гистидина; шестая координационная связь (за
плоскостью тетрапиррольного кольца), вероятно, занята молекулой воды.
В оксигенированной форме миоглобина вода, по-видимому, замещена
кислородом.
При исследовании структуры белков методом рентгеноструктурного
анализа всегда возникает вопрос о том, насколько структура белка в
кристалле соответствует его структуре в водном растворе. Окончательный ответ
на этот вопрос пока еще не получен. Наиболее убедительные данные в
пользу того, что кристаллические структуры и структуры в водном растворе
весьма близки друг к другу, были получены в работе Гёрда и его
сотрудников. Эти авторы исследовали реакцию между боковыми цепями некоторых
амиггокислотных остатков миоглобина и алкилирующими агентами. Было
показано, что те боковые цепи, которые в кристаллической структуре
находятся в контакте с растворителем, легко вступают в реакцию, а те боковые
цепи, которые, по данным рентгеноструктурного анализа, запрятаны внутрь
молекулы и, следовательно, не должны реагировать, действительно не
реагируют. Это подтверждает предположение о том, что основные характеристики
молекулы миоглобина в кристалле и в водном растворе одинаковы.
СТРУКТУРА ГЕМОГЛОБИНА?
Гемоглобин — кислородпереносящий пигмент крови млекопитающих —
в структурном отношении гораздо сложнее миоглобина, хотя он я близок
к нему. Молекула гемоглобина (мол. вес 65 000) состоит из двух пар
идентичных цепей, обозначаемых как а- и ?-цепи. При изучении структуры
гемоглобина был использован почти такой же подход, как и в случае миоглобина.
Однако хотя работы эти были начаты на несколько лет раньше, чем опыты
с миоглобином, детальную структуру гемоглобина вследствие ее большей
сложности удалось расшифровать только в самое последнее время.
Работа Перутца и его сотрудников по расшифровке структуры
гемоглобина позволила сделать ряд важных выводов. В частности, было установлено,
что третичная структура цепей гемоглобина близка к структуре молекулы

Фиг. 39. Модели восстановленного гемоглобина человека (А) и оксигемоглобіни лошади
(Б).
Фиг. 40. Схематическое изображение конформации полипептидной цепи лизоцима.
Заштрихованные прямоугольники изображают дисульфидные мостики; цифры указывают номера
аминокислотных остатков, начиная с N-конца.

110 Г л а в а IV
миоглобина и что оксигенация гемоглобина приводит к заметному изменению
его структуры. Ыа фиг. 39 приведены модели оксигенмроваиного гемоглобина
лошади и восстановленного гемоглобина человека. Легко видеть, что при
оксигенации гемоглобина расстояние между ?-цспями уменьшается (на
7 А ). Это связано, по-видимому, лишь с изменением в относительном
расположении ?-депей; сама структура ?-цопей при этом, очевидно, не изменяется.
СТРУКТУРА ЛИЗОЦИМА
Недавно Филлиису и его сотрудникам удалось на основе принципов,
использованных в работах по реитгеноструктурному анализу миоглобина
и гемоглобина, установить кристаллическую структуру лизоцима (фермента,
присз^тствующего в яичном белке) с разрешением 2 Л. Молекула лизоціша,
как выяснилось, достаточно компактна и имеет форму эллипсоида. Она
состоит из одной полипептидпой цени, в которую входят 129 аминокислотных
остатков. Трехмерная конформация этой по ли пептидной цепи
поддерживается четырьмя дисульфидными мостиками. Fla фиг. 40 схематически изображен
ход іюлипептидной цепи лизоцима и показано расположение этих дисуль-
фидных мостиков. Как видно из фиг. 40, структура лизоцима весьіма сложна,
особенно па участке между 35-м и 80-м аминокислотными остатками. Доля
спирализовашшх участков в молекуле лизоцима несколько меньше, че.и
в молекуле миоглобина (максимум 42%).
В лизоциме, так же как и в миоглобипе, все боковые цепи лизина и
аргинина обращены в сторону растворителя. Однако по крайней мере один
остаток серина и один остаток глутаминовой кислоты, видимо, не контактируют
с растворителем. Кроме того, несколько гидрофобных боковых цепей явно
находятся на поверхности молекулы или, точнее говоря, выступают наружу
с ее поверхности.
В настоящее время ведутся рентгеноструктуриые исследования некоторых
других макромолекул, в том числе инсулина, химотршісипогена и карбо-
ангидразы. Можно не сомневаться, что скоро станут известными трехмерные
структуры ряда белков 1.
СИЛЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ПОДДЕРЖАНИИ ВТОРИЧНОЙ
И ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУР
Можно выделить четыре типа взаимодействий, ответственных за иод-
держание вторичной и третичной структуры белков: 1) водородные связи
между пептидными группанаи; 2) водородные связи между боковыми цепяии
аминокислотных остатков; 3) ионные связи и 4) неполярные, или гидрофоб-
вые, связи (фиг. 41). Отнюдь не исключено, что и другие типы
взаимодействий также могут вносить вклад в поддержание свернутой формы некоторых
полипептидных цепей, однако мы о них пока практически ничего пе знаем.
ИЕГТОЛЯРИЫЕ СВЯЗИ
Тенденция углеводородов и других неполярных молекул к ассоциации
в водных растворах обусловлена образованием неполярных (или
гидрофобных) связей. Имеется много указаний в пользу того, что неполярные связи —
очень важный, а может быть и важнейший, фактор, обеспечивающий
поддержание вторичной и третичной структуры белков. Наиболее полная инфор-
1 В последнее время расшифрована пространственная структура химотрипспна.
и карбоксипептидазы А.— Прим. перев.

Структура белков
111
нация относительно вклада неполярных и полярных взаимодействий в
стабилизацию белковой структуры была получена при изучении структуры мио-
глобина. С помощью вычислительной машины Кендрыо рассчитал попарно
все межатомные расстояния в молекуле миоглобипа. Обычно принимают,
что атомы, расстояние между которыми больше 2 и меньше 3,1 Л , участвуют
в полярных взаимодействиях, а атомы, расстояния между которыми больше
3,1 и меньше 4,1 А , участвуют в неполярных взаимодействиях. Поданным
H
o
1!
с
о cocr ..r..^
H
o-
1
c=o
1
Водородная связь Водородная связи ионная Неполярная turfu
между пептидными лтеасйу боковыми связь гидрофобная,
группами цепями связь
Фиг. 41. Внутримолекулярные нековалентпыо слязп, ответственные за цоддержанп©
вторичной и третичной структуры.
Кендрью, число атомных пар, участвующих в неполярных взаимодействиях,
превышает число пар, участвующих в полярных взаимодействиях, па целый
порядок величины. Отсюда следует, что, по крайней мере в случае ыноглоби-
на, главную роль в образовании компактной структуры белковой молекулы
играют неполяриые связи.
Какие же силы лежат в основе образования неполярных связей?
Естественно предположить, что открытые (т. е. доступные для молекул
растворителя) гидрофобные остатки в растянутой (не свернутой) полипептидной цепи
определенным образом ориентируют окружающие молекулы воды. Этот
ориентирующий эффект ограничивает свободу вращения и поступательного
движения молекул воды и, следовательно, ведет к уменьшению энтропии.
Если же углеводородные остатки скрыты внутри молекулы нативного белка,
то такая структурированная оболочка из молекул растворителя практически
отсутствует. Следовательно, образование неполярных связей в значительной
степени обусловлено том, что переход неполярных остатков из водной среды
в безводную сопровождается повышением энтропии.
ПОЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
Сведения о полярных взаимодействиях в белках также были получены
главным образом при рептгеноструктурном исследовании миоглобнна. Эти
данные суммированы в табл. 19.
Наибольший интерес представляет тот факт, что из общего числа
возможных полярных взаимодействий реализуется лишь малая доля. В
большинстве случаев полярные группы связаны с растворителем. Предварительный
вывод из этого, но крайней мере для случая миоглобина, состоит в том, что
белковая молекула стремится принять такую конформацию, при которой
максимальное число полярных групп располагается на ее поверхности;
сильные же полярные взаимодействия между аминокислотными остатками

112
Главі
IV
Таблица 19
Полярные взаимодействия в миоглобине
Аминокислотный
остаток
Лиз
Apr
Глу или Глун
Асп или Аспн
Сер
Тре
Гис
Три
Тир
Общее
число
остаткив
19
4
19
8
6
5
И
2
3
Число
остатков,
окруженных
растворителем или
находящихся
на
поверхности глобулы
19
4
19
8
5
3
7-8
2
3
Число
остатков,

спрятанных
внутри гли-
булы
0
U
0
0
1
1—2
3
0
0
Взаимодействия (за исключением
взаимодействий с растворителем)
отсутствуют
вообще; меш-
молекулярпые
или слабые

внутримолекулярные
16
2
12—13
3-4
2
1—2
7—8
1
2
сильные


молекулярные
3
1
2-3
1
1—3
3
1
3
1
1
1
1
2
1
1
1
партнеры
Глу
Асп, Пропионил
Аси, Аспн
Лпз
Лиз, Три
Собственная NH-
группа в
полипептидной цепи
Apr
Гис
СО-группа в поли-
нецтидной цепи,
отстоящая на 4
остатка назад
NH-1'руппа в поли-
пептидпой цепи
СО-группа в поли-
нептидной цепи,
отстоящая на 4
остатка назад
СО-группа в
полипептидной цепи,
отстоящая па 2
остатка назад
NH-группа в
полипептидной цепи
СО-группа в
полипептидной цепи;
Fe2+ (H2O)
Асп
Глу
СО-группа в
полипептидной цепи
проявляются лишь в тех случаях, когда этому не препятствуют
ограничения, налагаемые структурой, которая в значительной мере определяется
неполярными взаимодействиями. Остается выяснить, насколько эти
обобщения, полученные при изучении структуры миоглобина, справедливы в
отношении других белков.
СООТНОШЕНИЕ МЕЖДУ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРОЙ
И СТРУКТУРАМИ БОЛЕЕ ВЫСОКОГО ПОРЯДКА
Как указывалось выше, большинство белков (если только не все они)
имеет вполне определенную структуру как в том, что касается
последовательности аминокислотных остатков, так и в смысле специфического
свертывания полипептидных цепей. Естественно возникает важный вопрос о
происхождении структур более высокого порядка. Наиболее простое допущение

Структура белков
113
состоит в том, что трехмерная структура белков полностью определяется
их первичной структурой. Это равноценно утверждению, что в белке
реализуется такая конформация, которая в существующих условиях
термодинамически наиболее стабильна. Согласно другому предполсжению,
специфическая трехмерная структура реализуется в процессе синтеза и сохраняется
после того, как белок освободится из системы, в которой он синтезируется.
Б этом втором случае конформация, принимаемая белком, не обязательно
должна быть термодинамически наиболее стабильной. Необходимо только,
чтобы энергетический барьер, отвечающий структурным переходам (транс-
конформациям), был достаточно высок, с тем чтобы такие переходы были
(мочевцна+меркаптоэтакол )
Фиг. 42. Схема, иллюстрирующая денатурацию и ренатурацию белка.
Полипеитидная цепь нативного белка, свернутая и скрепленная внутримолекулярными дисульфид-
ными мостиками, развертывается в результате восстановительного разрушения этих моетиков в 8 M
мочевине с добавлением ?-меркаптоэтанола. После удаления мочевины и меркаптоэтанола происходит
спонтанное свертывание и реокислепие.
маловероятными, а их скорость была низкой. Суммированные ниже данные
свидетельствуют в пользу первой из этих двух альтернатив.
Наиболее убедительным доказательством того, что первичная структура
определяет вторичную и третичную, могут, по-видимому, служить опыты
по восстановлению нативной структуры белка после денатурации {ренатура-
ция белка). Если, например, полностью «развернуть» молекулу рибонуклеа-
зы путем восстановления четырех ее дисульфидных мостиков меркаптоэта-
нолом в 8 M мочевине, а затем вызвать реокисление таких развернутых
молекул в контролируемых условиях, то молекулы (от 95 до 100%) вновь
приобретают нативную конформацию, что подтверждается восстановлением
не только физических свойств, но и ферментативной активности. Этот опыт
схематически представлен на фиг. 42. Статистические расчеты показывают,
что если бы реконструкция дисульфидных мостиков происходила
совершенно произвольно, то нативную конформацию приобретало бы лишь
небольшое число молекул — около 1%. В табл. 20 приведены данные по рена-
турации некоторых белков. Во всех случаях, за исключением инсулина,
степень восстановления нативных структур значительно превышает
величину, которой следует ожидать, исходя из статистических соображений. Эти
данные вовсе не означают, однако, что процесс образования дисульфидных
связей в белках может протекать in vivo без направленного катализа.
Реконструкция нативных белковых структур после восстановительного разрыва
дисульфидных мостиков представляет собой слишком медленный процесс,
не соответствующий скорости синтеза биологически активных белков
8-246

114
Глава TV
Таблица 20
Ренатурация белков, содержащих дисульфидные мостики (после восстановления
дисульфидных связей и развертывания глобулы)
Белок
Рибонуклеаза (из поджелудочной
железы быка)
Лизоцим (из яичного белка)
Такаамилаза (Aspergillus oryzae)
Трипсин (бычий)
обработанный на колонке с карбокси-
метилцеллюлозой (нерастворимая
форма)
лоли-БЬ-аланилтринсин (растворимая
форма)
Инсулин (бычий)
Щелочная фосфатаза (из Е. coli)
Поіісшгоген (свиной)
Сывороточный альбумин (человека)
Число
дисульфидных мостиков
4
4
4
6
3
2
3
17
Наблюдаемое
восстановление
активности
белка, %
95—100
50—80
48
4
8
5—10
80
50
50
Ожидаемое
восстановление
активности 1), %
1
1
0,3
0,01
6,7
33
6,7
?
1) При условии, если бы восстановление происходило случайным образом.
в живой клетке. Известно, например, что в печени быка имеется ферментная»
система, способная ускорять реактивацию восстановленной рибонуклеазы.
Эксперименты по ренатурации белков показывают, что ненаправленная
реконструкция дисульфидных мостиков восстановленных белков приводит
в большинстве случаев к образованию структур, полностью идентичных
структурам тех же белков в той форме, в которой их выделяют из природных
источников. Поскольку ненаправленное восстановление третичной
структуры должно, по-видимому, давать термодинамически наиболее стабильную
конформацию, мы вправе, очевидно, сделать из этих опытов вывод, что
нативная конформация есть конформация термодинамически наиболее
стабильная.
ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВ
Проблема трансконформации белков, а следовательно, и их денатурации
всегда привлекала пристальное внимание химиков, исследующих белки-
Этот интерес вызван несколькими причинами. Во-первых, исследования
такого рода в большой мере способствуют пониманию структуры белков,
а также природы сил, ответственных за поддержание структуры. Во-вторых,
представляется вполне вероятным, что соответствующие реакции играют
определенную роль в явлениях ферментативного катализа. И наконец,
в-третьих, реакции эти очень сложны, а все сложное, как известно, всегда
представляется особенно заманчивым для исследователей. Козмен определил
денатурацию белков как «процесс (или последовательность процессов),
в результате которого пространственное расположение полипептидных
цепей внутри молекулы становится отличным от их расположения в нативном
белке и более беспорядочным». Хотя это определение, казалось бы,
достаточно широко, но и оно не охватывает все возможные конформационны&
переходы.
Одна из наиболее сложных задач, возникающих при изучении
денатурации,— это задача, связанная с оценкой степени денатурации. В табл. 21
приведены некоторые параметры, изменение которых может служить мерой

Структура белков
115
денатурации белка. Для измерения степени денатурации можно использовать
широкий набор различных методов. Однако при этом следует всегда полнить,
что результаты таких измерений сильно зависят именно от примененного
метода. Возможны, например, случаи, когда определенная, обработка белка
коренным образом изменяет его биологическую активность, тогда как самые
тонкие физические методы не обнаруживают при этом каких-либо нарушений
структуры в целом или отдельных ее деталей.
Таблица 21
Методы исследования денатурации белков
I. Изучение свойств, зависящих cm
формы белковых молекул
A. Гидродинамические свойства
1. Фрикционное отношение
2. Инкремент вязкости
3. Коэффициент вращательной
диффузии
Б. Расссяпие излучения
1. Рассеяние света
2. Рассеяние рентгеновских лучей
под малыми углами
B. Электронная микроскопия
II. Изучение свойств, зависящих от.
взаимодействия близко расположенных групп
A. Термодинамические свойства
1. Энергия и теплоемкость
2. Растворимость
Б. Оптические свойства
1. Оптическое вращение и
вращательная дисперсия
2. Инфракрасное поглощение и
дихроизм
3. Поглощение в видимой и
ультрафиолетовой области
4. Показатель преломления
B. Химические свойства
1. Реакционная способность отдельных
групп
2. H-D-обмен
3. Способность связываться с малыми
молекулами
4. Иммунохимические свойства
5. Биологическая активность
6. Электрофоретическое поведение
Денатурацию вызывают различные агенты и факторы: тепло,
ультрафиолетовое излучение, органические растворители, мочевина, солянокислый
гуанидин, бромистый литий, детергенты, кислоты, щелочи и т. д. Состояния,
к которым приводит вызванная этими агентами денатурация, могут быть
весьма различными. Так, например, полная денатурация нагреванием часто
оказывается необратимой, а денатурация под действием мочевины обычно
обратима — при удалении мочевины нативная форма белка
восстанавливается. Совершенно очевидно, что состояния, в которых оказывается
молекула белка при обратимой и необратимой денатурации, должны существенно
различаться.
Мерой относительной эффективности действия различных химических
соединений в качестве денатурирующих агентов служит их влияние
на константу равновесия между нативным и денатурированным состояниями
(при условии, что процесс денатурации является обратимым). Действие
данного денатурирующего агента может быть связано либо с дестабилизацией
нативного состояния, либо со стабилизацией денатурированного состояния,
либо и с тем и с другим. Если исходить из данных по денатурации миоглоби-
на, приняв этот белок в качестве модели, то можно сделать вывод, что
большинство полярных групп как в нативном, так и в денатурированном
состоянии обращено в сторону растворителя, тогда как полипептидная цепь и непо^
лярные группы контактируют с растворителем только в денатурированном
состоянии, а в нативном они в значительной мере изолированы от него-
Денатурирующее действие таких агентов, как мочевина и родственные ей
соединения, должно, по-видимому, обусловливаться их стабилизирующим
8*

116 Г л а в а IV
влиянием на наружные участки полипептидных цепей и неполярные остатки.
Это вытекает из того, что влияние денатурирующего агента на стабильность
полярных групп должно быть одинаковым как в нативном, так и в
денатурированном состоянии, а полипептидная цепь и полярные группы в нативном
состоянии изолированы от действия этого агента. Сравнительное изучение
способности различных денатурирующих агентов переводить в растворимое
состояние такие модельные соединения, как ацетилтетраглицин и карбобенз-
оксидиглицинамид, позволяет высказать предположение, что действие этих
агентов в значительной мере определяется их способностью стабилизировать
пептидные связи и неполярные остатки.
Химические основы денатурирующего действия изучены недостаточно
хорошо, хотя этой проблеме посвящено большое число исследований.
Активные денатурирующие агенты имеют следующую общую структуру:
X
R—C-N-Y
причем их денатурирующая способность снижается для каждого из
радикалов в указанном ниже порядке:
для X: NHa > S > О,
для R: NH2 > CH3S ~ СН3О > S > О ~ II ~ СН3,
для Y: H > NH2 > анион.
Исходя из этой закономерности, можно ожидать, что мочевина (X = О,
R = NH2, Y = H), соли гуанидиния (X = NH2, R = NH2, Y = H)
и S-метилизотиомочевина (X = NH2, R = GH3S, Y = H) должны быть
очень хорошими денатурирующими агентами, и это действительно так.
ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ
Молекулы многих белков состоят из нескольких индивидуальных
полипептидных цепей, не связанных одна с другой ковалентными связями.
К таким белкам относится, в частности, гемоглобин, молекула которого,
как уже отмечалось выше, состоит из четырех полипептидных цепей и не
содержит ни одного дисульфидного мостика. О таких белках говорят, что
они обладают четвертичной структурой. При этом каждая из
индивидуальных цепей может иметь свою собственную первичную, вторичную и
третичную структуру. Теперь известно, что молекулы многих белков состоят
из нескольких субъединиц. Можно думать, что из субъединиц состоят все или
почти все белки с молекулярным весом больше 50 000. Впервые концепция
о том, что белковые молекулы состоят из субъединиц, была выдвинута
в 1930-х г.г. Сёренсеном и Сведбергом; однако эта концепция долго не имела
сторонников и получила признание лишь в последние несколько лет.
Ферменты, молекулы которых состоят из нескольких полипептидных
цепей, диссоциируют на субъединицы под влиянием тех же агентов, какие
обычно используются для денатурации белков. Для некоторых белков
хороню исследован процесс ассоциация — диссоциация. Рассмотрим два
наиболее подробно изученных в этом отношении белка — глутаматдегидрогеназу
и альдолазу. Молекула глутаматдегидрогеназы обладает тремя типами
организации на уровне четвертичной структуры. Непосредственно после
выделения ее молекулярный вес составляет от 1,0-10е до 1,3- 10е (определения
по скорости седиментации и диффузии). В результате диссоциации фермента,
которая стимулируется восстановленным НАДФ, некоторыми пуриновими
нуклеотидами или просто разбавлением фермента, получаются субъединицы

Структура белков 117
с молекулярным весом от 250 000 до 350 000. Отсюда следует, что полностью
ассоциированная молекула фермента является, по-видимому, тетрамером
(хотя структура тримера также не может быть полностью исключена). Это
равновесие тетрамер — мономер устанавливается легко и является
полностью обратимым. При обработке субъединиц с молекулярным весом 300 000
лаурилсульфатом натрия, 6 M мочевиной или умеренными концентрациями
либо кислоты, либо основания происходит дальнейшая диссоциация (уже
необратимая) на субъединицы с молекулярным весом 40 000 (по всей
вероятности, идентичные).
Два важных вопроса были выяснены при изучении равновесия мономер —
тетрамер. Первый касается каталитической активности субъединиц. Фриден
тщательно изучил условия образования тетрамера в зависимости от
концентрации белка и убедился, что в очень разбавленных растворах, в которых
глутаматдегидрогеназа проявляет ферментативную активность, фермент
существует исключительно в форме субъединиц с молекулярным весом
300 000. Отсюда прямо следует вывод о том, что ферментативной
активностью обладают именно эти субъединицы с молекулярным весом 300 000.
Более мелкие субъединицы с молекулярным весом 40 000 лишены
ферментативной активности. Второй вопрос касается характера действия
восстановленного НАДФ или, например, гуаниловой кислоты — соединений,
препятствующих ассоциации крупных субъединиц. Как показали исследования,
выполненные также в лаборатории Фридена, эти вещества соединяются
с субъединицами и, по-видимому, вызывают в них какие-то конформационньте
изменения, препятствующие ассоциации.
При обработке кислотой (pH <^ 2,9) альдолаза, имеющая молекулярный
вес 150 000, распадается на субъединицы с молекулярным весом 40 000.
Следовательно, молекула нативной альдолазы должна быть тетрамером.
Образующиеся субъединицы ведут себя одинаково при
ультрацентрифугировании и не разделяются при электрофорезе. Кроме того, было показано,
что каждая из этих субъединиц имеет на С-конце тирозин. Все это говорит
о том, что субъединицы, составляющие молекулу альдолазы, идентичны
или, во всяком случае, очень сходны друг с другом. Субъединицы обладают
резко выраженной асимметрией: отношение осей составляет у них 30 : 1.
Для тетрамера же это отношение равно 6:1. Следовательно, диссоциация
нативных молекул на субъединицы должна сопровождаться развертыванием
этих последних.
СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ СУЩЕСТВОВАНИЯ ИЗОФЕРМЕНТОВ
Четвертичная структура белков имеет, по-видимому, непосредственное
отношение к существованию изоферментов. Изоферментами называются
ферменты, встречающиеся у одного и того же биологического вида в разных
структурных формах. Особенно хорошо изучен в этом отношении благодаря
исследованиям Каплаиа, Маркерта и их сотрудников фермент лактатдегидро-
геназа; этот фермент был выделен из организма цыпленка в двух главных
формах, из которых одна характерна для скелетных мышц, а другая —
для сердечной мышцы. Эти две формы заметно отличаются одна от другой
как по аминокислотному составу, так и по некоторым физическим,
иммунологическим и каталитическим свойствам. Общее число различных форм
лактатдегидрогеназкг, обнаруженных у цыплят, а также выделенных из
других источников, равно пяти. Три из них занимают по своим свойствам
промежуточное положение между формой, характерной для скелетных мышц,
и формой, характерной для сердечной мышцы. При электрофорезе,
например, получается пять отдельных полос, находящихся друг от друга на равном
расстоянии, причем крайние полосы соответствуют мышечной и сердечной

118
Глава IV
формам. Аминокислотный состав этих пяти изоферментов также
характеризуется постепенным изменением в пределах между двумя крайними формами.
Иммунологические свойства и ферментативная активность обнаруживают
аналогичные плавные переходы.
Все это легко объяснить, исходя из структуры лактатдегидрогеназы.
Известно, что при обработке концентррірованньїми растворами солянокислого
гуаттидиния в присутствии меркаптоэтанола молекулы лактатдегидрогеназы
диссоциируют на четыре субъединицы, откуда, по-видимому, следует, что
натнвцая лактатдегидрогеназа представляет собой тетрамер. Если
допустить, что имеется два генетически разных, т. е. кодируемых разными гена-
Фиг. 43.
А. Элоктроипая микрофотография пируватдегидрогеназного комплскка Е. coli (метод негативного
контраста); Х200 000. Б. Электронная микрофотография дигндролипоилтрансацетилазного компонента;
Х2()О 000. Можно видеть частицы трацеацетилазы в двух проекциях: в направлении кубической оси
симметрии четвертого порядка (обозначено кружком) и в направлении кубической оси симметрии
второго порядка (показано стрелкой), В а Г. Электронные микрофотографии пируватдегидрогеназного
и дигпдролішоилдегидрогепазноі'О компонентов; X 200 000. Д и Е. Модель пируватдегидрогеназпого
комплекса в двух проекциях; 12 молекул пируватдегидрогеназы (черные сплющенные сфероиды)
и 6 молекул дигндролипоилдегндрогеназы (светлые продолговатые сфероиды) располагаются
соответственно на 12 реб ах и 6 гранях кубической модели.

Структура белков 119
ми, типа субъединиц, а именно тип M (от англ. muscle — мышца) и тип H
(от англ. heart — сердце), то общее число возможных тетрамерных форм
лактатдегидрогеназы будет равно пяти: НННН, НННМ, ННММ, НМММ,
ММММ. (Это объяснение, конечно, предполагает, что все положения в тетра-
мере эквивалентны; в противном случае, например, структуре НННМ
соответствовали бы четыре различные формы.) Если молекулы отдельных изо-
форм лактатдегидрогеназы действительно состоят из переменных количеств
двух разных типов субъединиц (притом, что общее число субъединиц в
молекуле равно четырем), то этим можно объяснить постепенное изменение свойств
язоферментов между двумя крайними формами — НННН и ММММ.
Остается выяснить, так ли обстоит дело и с другими изоферментами.
В случаях, подобных описанному, логичнее было бы говорить не об изофер-
ментах, а о гибридных ферментах.
МУЛЬТИФЕРМЕПТИЫЕ КОМПЛЕКСЫ
Образование мультиферментных комплексов имеет много общего с
возникновением четвертичной структуры белков. Некоторые мультиферментные
комплексы мы рассмотрим в других разделах этой книги. Хорошим
примером мультиферментного комплекса может служить пируватдегидрогеназа
Е. coli (см. стр. 297 и фиг. 43). Эта частица с молекулярным весом 4 000 000
состоит из трех типов ферментов, из которых по крайней мере один в свою
очередь состоит из субъединиц. Полная частица пируватдегидрогеназного
комплекса содержит не менее 88 отдельных полипептидных цепей. Эта
сложная система обладает замечательной способностью к самоорганизации: при
смешении отдельных ее составных частей комплекс образуется
самопроизвольно, причем реассоциация протекает с высоким выходом.
ЛИТЕРАТУРА
Crick F. H. С, Kendrew J. С, X-ray Analysis and Protein Structure, Adv. Prot.
Chem., 12, 133 A957).
Fl orkin M., S t о t z E. (eds.), Comprehensive Biochemistry, vols. 2, 3, 7, and 8, Else-
vier, New York, 1963.
Harrington W. F., Josephs R., Segal D. M., Physical Chemical Studies on
Proteins and Polypeptides, Ann. Rev. Biochem., 35, 599 A966).
Harris J. I., I n g r a m V. M., Methods of Sequence Analysis in Proteins, in P.
Alexander and R. J. Block (eds.), Analytical Methods of Protein Chemistry, vol. 2, Per-
gamon Press, New York, 1960.
H і r s С. H. W., The Chemistry of Peptides and Proteins, Ann. Rev. Biochem., 33, 597
A964).
К a и z m a n W., Some Factors in the Interpretation of Protein Denaturation, Adv.
Protein Chem., 14, 1 A959).
К с ті d r e w J. C, Side Chain Interactions in Myoglobin, Brookhaven Symp., 15, 216
A962).
Klotz I., Non-covalent Bonds in Protein Structure, Brookhavon Symp., 13, 25 A960).
Lindcrstrom-Lang K. U., Schellman J.A., Protein Structure and
Enzyme Activity, in P. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (ods.), The Enzymes, vol. 1,
Academic, New York, 1959.
L о w B. W., The Use of X-ray Diffraction in tho Determina Lion of Protein Structure, J.
Polymer Sei., 49, 153 A961).
Low В. W., E d s a 1 1 J. T., Aspects of Protein Structure, in D. E. Green (od.),
Currents in Biochemical Research, Interscience, New York, 1956.
Martin R. В., Introduction to Biophysical Chemistry, McGraw-Hill, New York, 19O4.
(P. M a p T и п, Введение в биофизическую химию, изд-во «Мир», М., 1966.)
Muі г he ad H., Perutz M. F., Structure of Reduced Human Hemoglobin, Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 28, 451 A963).
Neurath H. (ed.), The Proteins, vols. 1 and 2, Academic, New York, 1963.
R ei thel F., The Dissociation and Association of Protein Structures, Adv. Protein
Chem., 18, 124 A963).
Richards F. M., Structure of Proteins, Ann. Rev. Biochom., 32, 269 A963).
Sanger F., The Arrangement of Amino Acids in Proteins, Adv. Protein Chem., 7,1A952).

120 Глава IV
S a n g е г F., The Structure of Insulin, in D. E. Green (ed.), Currents in Biochemical
Research, Interscience, New York, 1956.
Schachman H., Considerations on the Tertiary Structure of Proteins, Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol., 28, 409 A963). («Биосинтез белка и его регуляция», сб.
статей, изд-во «Мир», М., 1967.)
S с h г о e d е г W. A., The Hemoglobins, Ann. Rev. Biochem., 32, 301 A963).
Steiner R. F., The Chemical Foundations of Molecular Biology, Van Nostrand,
Princeton, N.J., 1965.
T a n f о r d C., Physical Chemistry of Macromolecules, Wiley, New York, 1961.
Timasheff S. N., Gorbunoff M. J., Conformation of Proteins, Ann. Rev. Bio-
cbom., 36, 13 A967).
Urnes P., D о t y P., Optical Rotation and the Conformation of Polypeptides and
Proteins, Adv. Protein Chem., 16, 401 A961).
W і tk op В., Methods for Cleavage and Modification of Proteins, Adv. Protein Chem.,
16, 221 A961).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
К є н д р ь іо Дж., Трехмерная структура глобулярных белков, Сб. «Современные
проблемы биофизики», том I, ИЛ, М., 1961.
П о г л а з о в Б. Ф., Структура и функции сократительных белков, шд-во «Наука».
М-, 1965.
Бирштойн Т. М.Дтицин О. Б., Конформация макромолекул, изд-во «Наука»,
М., 1964.
Войн пг теин Б. К., Диффракция рентгеновских лучей на цепных молекулах, Изд.
АН СССР, М. 1963.

Глава V
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Нуклеиновые кислоты выполняют в организме ряд важнейших функций:
они обеспечивают хранение и передачу генетической информации и они же
участвуют в тех механизмах, при помощи которых эта информация
реализуется в процессе синтеза всех клеточных белков, а следовательно, и всех
прочих клеточных компонентов. Эти функции нуклеиновых кислот
рассматриваются в гл. XVIII—XX. Здесь же мы коснемся лишь некоторых
аспектов химии этих соединений.
ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Нуклеиновые кислоты, подобно белкам, представляют собой
высокомолекулярные соединения. Самые большие из всех известных макромолекул
встречаются именно среди нуклеиновых кислот. Есть веские основания
полагать, что у некоторых микроорганизмов вся их дезоксирибонуклеино-
вая кислота (ДНК) представлена, по существу, одной-единственной
молекулой с молекулярным весом порядка 10е—109 и даже больше. Нуклеиновые
кислоты, как показывает само их название, обладают сильно выраженными
кислотными свойствами и при физиологических значениях pH несут
отрицательный заряд высокой плотности. Вследствие этого они легко
взаимодействуют в клетке с различного рода катионами, чаще всего с основными
белками (такими, например, как гистоны и гистоноподобные комплексы),
и с ионами щелочноземельных металлов, особенно с Mg2+, a также
с олигоаминами, например с кадаверином НгЩСНг^^На, путресцином
H2N(CH2LNH2, спермидином H2N(GH2LNH(GH2KNH2 и спермином
H2N(GH2KNH(GH2LNH(GH2KNH2. Для того чтобы разрушить сильные
и многочисленные электростатические связи между положительно
заряженным белком и отрицательно заряженной нуклеиновой кислотой, можно
воспользоваться несколькими различными методами. Очень часто для этой
цели применяют обработку нейтрального забуференного раствора такого
комплекса водным раствором фенола. Обработку обычно проводят в
присутствии веществ, вызывающих денатурацию белка (например, в присутствии
додецил(лаурил)сульфата или салицилата натрия); можно также вместо
этого проводить ее при повышенных температурах. Денатурировавший
белок экстрагируется фенольной фазой, а нуклеиновая кислота остается
в водном слое, из которого ее осаждают на холоду прибавлением двух или
трех объемов этилового спирта.
Чистые нуклеиновые кислоты содержат около 15% азота и 10% фосфора.
В их состав входят гетероциклические основания, которые обусловливают
сильное поглощение в ультрафиолетовой области спектра с максимумом
вблизи 260 ммк (см. ниже). На 1 г-атом фосфора в нуклеиновой кислоте
приходится 1 моль сахара; в рибонуклеиновой кислоте (РНК) это D-рибоза,
а в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) — 2-дезокси-О-рибоза. Сахара
можно идентифицировать и их содержание определить количественно

122
Глава V
с помощью специфических цветных реакций: рибоза дает реакцию с орцино-
лом и FeCl3 в HCL; дезоксирибоза — с дифениламином или индолом в НС1.
Отличить ДНК от РНК можно также при помощи реакции гидролиза
под действием специфических нуклеаз (ДНК-азы и РНК-азы).
МОНОМЕРНЫЕ ЕДИНИЦЫ
После полного химического гидролиза нуклеиновых кислот в идеальном
случае получают на 1 моль фосфата 1 моль сахара и 1 моль смеси
гетероциклических оснований. Если химический гидролиз проводится в мягких
условиях или если используют ферментативный гидролиз, то получают
Урацил У=Н
Тимш У=снз
HtjKJteomud
ЩклеозиЪ ЩклеотиЬ
( риба: X=OU,
Нуклеотид
Нуклеотид
Противокатион
(обеспечивающий ,,.,. .„,_..,
образование прочно-1 Рибоза: Л>ОН
га комплекса) 'Аезоксири6оза:х=>Н
Гетероциклические иснования ,
(пурин или пиримидин)
Фиг. 44. Часть гипотетической нуклоопротоидной цепи.

Нуклеиновые кислоты 123
либо эквимолекулярную смесь нуклеозидов (которые представляют собой
N-рибопроизводные или дезоксирибопроизводные оснований), либо
соответствующий набор нуклеотидов (т. е. сахарофосфатных эфиров оснований).
Именно нуклеотиды являются истинными мономерными единицами
нуклеиновых кислот (фиг. 44).
ОСНОВАНИЯ
Основания, встречающиеся в нуклеиновых кислотах, относятся либо
к пиримидинам, либо к пуринам (в молекуле пуринов содержится
объединенная пиримидин-имидазольная кольцевая система; фиг. 45). Обычно
в состав ДНК входят пиримидины — тимин (Т) и цитозин (Ц) и пурины —
аденин (А) и гуанин (Г). Иногда встречается также некоторое количество
5-метилцитозина, особенно в ДНК из высших растений (зародыши пшеницы).
я некоторых бактерий. В ДНК бактерий и бактериальных вирусов
(бактериофагов) в качестве минорного (редкого) основания присутствует 6-метил-
аминопурин. Имеются данные о том, что в ДНК некоторых бактериофагов
встречается урацил и 5-оксиметилурацил. У особого класса
бактериофагов — так называемых Т-четных фагов Escherichia coli — вместо цитозина
в состав ДНК входит 5-оксиметилцитозин, иногда связанный гликозидной
связью с остатками глюкозы. Структура всех этих оснований представлена
яа фиг. 45.
В состав большинства молекул РНК также входит только четыре
основания: пурины — аденин и гуанин — и пиримидины — урацил (а не тимин,
как в ДНК) и цитозин. В некоторых видах РНК, особенно в
низкомолекулярных («растворимых») РНК, осуществляющих перенос аминокислот к месту
синтеза белка и потому называемых транспортными (см. стр. 154),
присутствуют необычные основания: гипоксантин и различные метилированные
производные — тимин, 5-метилцитозин, 6-метиламинопурин, 6,6-диметил-
аминопурин, 1-метилгуанин, 2-метиламино-6-оксипуриы и 2,2-диметиламино-
6-оксипурин, а также дигидроурацил, гипоксантин, тиоурацил и пр.
(фиг. 45). Метилированные основания, входящие в состав РНК (и ДНК),
образуются, по-видимому, в результате метилирования готовых
полимерных нуклеиновых кислот, а не их мономерных предшественников.
Некоторые основания (а также их нуклеозиды и нуклеотиды), обычно не
встречающиеся в природе, возбудили недавно интерес как возможные химиоте-
рапевтические агенты и мутагены, поскольку оказалось, что они легко
включаются в нуклеиновые кислоты вместо «природных» оснований. К таким
соединениям относятся, в частности, аналоги урадила — 2-тиоурацил
и 5-фторурацил, аналог тимина — 5-бромурацил и аналоги гуанина —
8-азагуанин и 2,6-диаминопурин.
В живых организмах встречаются также и другие пуриновые и пирими-
диновые основания, которые, однако, не входят в состав нуклеиновых кислот.
К ним относятся: оротовая кислота, играющая роль промежуточного
продукта при биосинтезе пиримидинов (см. стр. 467), а также гипоксантин *,
ксантин и мочевая кислота — продукты катаболизма пуринов. С другой
стороны, нуклеотиды этих соединений — инозиновая и ксантиловая
кислоты — являются ключевыми промежуточными продуктами в биосинтезе
пуринов (см. стр. 461). Замещенные окисленные пурины теофиллин, теобромин
и кофеин входят в состав важных соединений растительного происхождения.
Три свойства, общие для всех оснований, представляют для нас особый
интерес. Первое из этих свойств — способность к лактам-лактимной и ен-
амин-кетаминной таутомерии. На фиг. 45 в качестве примера приведены все
таутомерные формы урацила. Для всех остальных оснований показаны
только преобладающие формы (эти формы являются преобладающими не только
1 Как сказано выше, это основание входит в состав транспортной РНК.

Пиримидин
Ю: -
Урацил C,4 -диоксипиримидцн)
і/Іактим Лактам
Галоидироваииый
урацил
ОН
„oV
лактимная форма
А
4lL?
н
Пі)рин
NH2
H
АЪапип
ОН
H2N - h
Гуанин
n
н
ОН
H2N
6-метімамино и 6,6-диметіи- 2-метиламино и 2,2-диметцл- 8-азагуаяцн
аяіинопурин амино-6-OKGunypuH
п О ОН .. _ 9. Снз
HN
h
Гипоксантин
F-оксипурин ),
лактамная
форма
н Н а СН3
Ксаятин Мочевая кислота Кофеив
B,6-диоксипурин\ B,6?-mpuoKCunupuH) A,3,7-триметая-
лактамная форма лактимтя форма ксантин)
СНз
Теобромин
C,7-диметил-
ксантин)
Фиг. 45. Структуры обычных пиримидииов (А) и обычных пуринов {В).
Показана таутомерпая форма, в которой основание находится в водном растворе при pH /~ 7. Для
пиримидина дана нумерация, принятая в Chemical Abstracts; в старой системе использовалась та жс-
нумерация, что и в пиримидиновой части пурина.

Нуклеиновые кислоты
125
для оснований, но и для их производных). Следует, однако, иметь в виду,
что более редкие таутомерные формы могут играть весьма важную роль
в некоторых биологических процессах, в частности при мутагенезе (см.
стр. 146). Второе важное свойство пуринов и пиримидинов заключается
в том, что все они являются слабыми основаниями. Значения рКа
составляют: для N1 урацила 9,5, для N1 тимина 9,9 и для (N1 — С6 — ОН) гуанина
Аденин рН2,5 —
рН7,О-
Цитозин pH 2,5-
^ лН 8,8-
180
220 240 260 280
Длина вшныгммк
300
Фиг 46 Спектры поглощения обычных оснований.
9,5; значение рКа для NHJ-группы цитозина равно 4,5, для NHJ-rpymibi
аденина —4,2 и для ІЧЩ-грушш гуанина — 3,2. Наконец, третье
характерное свойство оснований состоит в их способности поглощать свет в
ультрафиолетовой области спектра. Именно этим объясняется УФ-поглощение,
типичное для нуклеиновых кислот. На фиг. 46 показаны спектры
поглощения пяти обычных оснований.
НУКЛЕОЗИДЫ
Нуклеозидами называют N-гликозиды гетероциклических оснований.
Как уже отмечалось . е, в состав нуклеиновых кислот входят два сахара —
D-рибоза и D-2-дсзоксирибоза. Сахар связан ?-гликозидной связью с N1-aTO-
мом пиримидина и ІЧ9-атомом пурина; кольцо сахара имеет фуранозную
конфигурацию. Таким образом, аденозин представляет собой 9-?-D-pn6o-

126
Глава V
фуранозиладенин, дезоксиаденозин — 9-р-Б-2-дезоксирибофуранозиладенин,
гуанозин — O-?-D-рибофуранозилгуанин, дезоксигуанозин — 9-?-D-2-fle3--
оксирибофуранозилгуанин, уридин—l-?-D-рибофуранозилурацил, тимидин —
l-?-D-2-дезоксирибофуранозилтимин, цитидин — l-?-D-рибофуранозилцито-
зин и де зо кси цитидин — l-?-D-2-дезоксирибофуранозилцитозин.
NH2
ОН
он он
(А) Аденозин СЭ-р-О-рибофуранозиладенин)
9й. ,
он
он
(Т) Тимидин (і-іі-П-г-аєзоксирибофуранозшітимин)
Помимо необычных и метилированных оснований некоторые виды РНК,>
особенно транспортная РЫК, содержат в довольно значительных
количествах также еще один нуклеозид урадила, так называемый псевдоуридиві
(г|>-уридин, г|з-У или \\>), имеющий С-гликозидную связь
НОСН2
HN NH
т
(¦ф) Псевйоуридип
E-?-D-pu6oq>ijpam3iiJiJpuduH)
НУКЛЕОТИДЫ
Нуклеотидамигназываготся фосфорные эфиры нуклеозидов, в которых,
сахар связан с фосфатной группой через атом кислорода. Их можно
получить при химическом или ферментативном гидролизе нуклеиновых кислот,
если проводить гидролиз в мягких условиях. В случае рибонуклеотидов.
гидролизат может содержать смесь 2'-, 3'- и 5'-мононуклеотидов (т. е. рибо-
яуклеозид-2'-, рибонуклеозид-3'- или рибонуклеозид-5'-фосфатов; цифра со-
штрихом указывает положение, в котором произошла этерификация сахара);
в случае дезоксирибонуклеотидов в гидролизате могут присутствовать только

Нуклеиновые кислоты
12?
3'- и 5'-изомеры. Эти соединения встречаются в природе не только в
качестве продуктов или субстратов обмена нуклеиновых кислот; по крайней
мере некоторые из них входят также в состав иуклеотидных коформентов
(см. гл. VI11). Среди продуктов гидролиза нуклеиновых кислот
обнаруживаются циклические 2', З'-дифосфаты всех рибонуклеотидов (см. стр. 128);
циклический 3', 5'-фосфат аденозина выполняет функцию активатора фос-
форилазы и других ферментов (см. стр. 285), а аденозин-2',5'-дифосфат
и аденозин-3', 5'-дифосфат входят в состав двух коферментов — соответ
ственно НАДФ и кофермента А (см. стр. 228). Нуклеотиды можно
рассматривать также как моноэтерифицированные производные фосфорной
о
H,N
СН-Р-О-СНг^ О
4 W
НО ОН
Гуаиозии-5'-фосфат
(9^~Ври6офураиозилгуанш
5'-р ибонцыеот ид
О
ОРО
Тимидин- 3 '-фосфат
(^-И-аезоксириоофуранозімтшиіш-З'їросіраг)
HN il
ОН OPOf
Уридин-2 -фосфат
(l-?-D-рибофуранози/іураци^-г-фосфат)
2-рибонуплеотид
О ОН
Адеиозии-3'-5'-фоСфат
Фиг. 47. Строение некоторых обычных нуклеотидов (в качество примера показаны разные-
основания).
кислоты. Благодаря присутствию остатков фосфорной кислоты они
представляют собой сильные двухосновные кислоты со значениями $Ка, равными
1,0 и 6,0. Эта ионизация добавляется к ионизации, определяющейся
кислотными свойствами гетероциклических оснований. На фиг. 47 показана
структура четырех нуклеотидов. ь
ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ
ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА (ФОСФОДИЭФИРПАЯ ЦЕПЬ)
Огромное число данных показывает, что все природныегполинуклеотиды
имеют одну и ту же основную структуру (см. фиг. 44): все они представляют
собой линейные полимеры, в которых отдельные мономерные единицы —
остатки нуклеотидов — связаны между собой при помощи фосфатных групп
таким образом, что 3',5'-фосфодиэфирные мостики соединяют остатки пенто-
зы соседних нуклеотидов. Для изображения структуры таких линейных
полимеров пользуются обычно двумя способами сокращенной записи,.

128
Глава V
а именно
-ф
i
I
а
H., Іф
а
і
і
Н0|ф
а
!
і
Н+і |(р
а
Н
+2 f«
а
где Осн означает А, Ц, Г, У или Т; H — соответствующие нуклеозиды;
ф или Ф — фосфатные группы; а и Ь — точки присоединения Ф к О; фН =
= H — 5' — Ф и Нф = H — 3' — Ф или H — 2' — Ф. При включении
остатка фосфорной кислоты в полинуклеотидную структуру две из трех
способных к ионизации гидроксильных групп этерифицируются. Поэтому
в каждом фосфатном остатке «внутренних» нуклеотидов (укажем, что в цепи,
состоящей из п нуклеотидов, число внутренних нуклеотидов равно п — 2)
имеется только одна способная к ионизации ОН-группа, для которой рК'а ~
~ 1. Вследствие этого нуклеиновые кислоты, как уже указывалось,
встречаются обычно в виде солей (образующихся в результате их нейтрализации
различными катионами.)
МЕТОДЫ ГИДРОЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Полирибонуклеотиды деградируют под действием щелочи @,1 или 1 н.
гидроокиси щелочного металла) при комнатной температуре. В результате
образуется смесь, состоящая из 2'- и З'-рибонуклеотидов общим числом
(п — 2), которые соответствуют внутренней части полинуклеотидной цепи,
из одного 2'- или З'-фосфата «головного» нуклеотида (или нуклеозида) и из
одного нуклеотида (или нуклеозида) со свободной З'-ОН-группой на «хвосте».
Расщепление фосфодиэфирных связей во внутренней части
полинуклеотидной цепи происходит более или менее беспорядочно и идет по Ь-положениям.
Промежуточными продуктами при этой реакции являются циклические
2',3'-фосфаты, атака которых ионами ОН" приводит с одинаковой легкостью
к расщеплению любой из связей С — О — Р, вследствие чего и образуется
смесь 2'- и З'-фосфатов:
Осн-, -QH
2'-f-O-vH О
З' + О R
_О
ОсНо-ОН
+ОХ/
"(X
Осн«
--ОН
_о
Осн
Оч
-о/ ^о ч
снгон
-ОН
о / сн2он
(он-
-он
сн2он
В случае полидезоксинуклеотидов такая реакция невозможна, поскольку
у них отсутствует гшс-2'-ОН-группа. Сказанное делает понятным, почему

Нуклеиновые кислоты 129
полирибонуклеотиды легко поддаются щелочному гидролизу, тогда как
полидезоксирибонуклеотиды весьма устойчивы к нему. Деградация такого
типа (т. е. расщепление по положению Ъ) приводит к переносу фосфатного
остатка от 5'-нуклеотида к ближайшему соседу слева.
Фермент рибонуклеаза из поджелудочной железы быка — хорошо
охарактеризованный белок, полная структура которого теперь уже известна (см.
стр. 94)— расщепляет полинуклеотидную цепь аналогичным способом.
Этот фермент представляет собой эндонуклеазу, т. е. он атакует внутри-
нуклеотидные связи. При этом для действия его необходимо, чтобы
фосфатная группа, участвующая в образовании чувствительной к расщеплению
Р — О-связи, была присоединена в положении 3' пиримидинового нуклеози-
да. Первая стадия расщепления, т. е. образование циклических фосфатов
из полинуклеотидов, по-видимому, обратима. Того же типа расщепление
(по положению Ъ) вызывают фосфодиэстеразы, выделенные из различных
источников растительного происхождения (например, из растений гороха,
табака или райграса). Все эти фосфодиэстеразы относительно неспецифичны
в том смысле, что для их действия безразлична природа оснований,
входящих в состав «чувствительных» нуклеотидов. Известен, однако, фермент,
выделенный из Bacillus subtilis, который, по-видимому, обладает
специфичностью, дополняющей специфичность панкреатического фермента (т. е.
рибонуклеази, выделенной из поджелудочной железы). Он катализирует по
преимуществу гидролитическое отщепление остатков, соседних с З'-нурино-
выми остатками. Еще более высокой специфичностью обладают ферменты,
выделенные из неочищенных препаратов такадиастазы. Один из них —
рибонуклеаза ТІ — катализирует расщепление только тех межнуклеотидных
связей, в образовании которых участвуют З'-гуаниловые нуклеотиды, а
второй — рибонуклеаза Т2 — расщепляет только связи, образованные с
участием З'-адениловых нуклеотидов.
Все рассмотренные выше ферменты специфичны, очевидно, только в
отношении рибонуклеотидов, так как для действия их необходимо наличие
свободных ОН-групп в 2'-положении. Менее специфичный фермент был выделен
из селезенки быка. Для действия его, по-видимому, безразлична не только
природа основания, но также и природа сахара, ибо он атакует как
полирибонуклеотиды, так и олигодезоксирибопуклоотиды. Этот фермент
представляет собой экзонуклеазу типа Ъ. Он отщепляет от цепи постепенно один
нуклеозид-З'-фосфат за другим, начиная преимущественно с «головного»
конца, несущего свободную 5'-ОН-группу.
Весьма ценный для биохимиков фермент с иной специфичностью был
выделен в очень чистом виде из яда некоторых змей (Vipera russeli, гремучая
змея и др.). Он также представляет собой экзонуклеазу, сравнительно
малоспецифичную в отношении природы оснований, и тоже обладает
способностью катализировать гидролиз как полирибонуклеотидов, так и олигоде-
зоксирибонуклеотидов. По своей специфичности он принадлежит к типу а;
иными словами, он постепенно отщепляет от полинуклеотидной цепи нуклео-
зид-5'-фосфаты, начиная с «хвоста» цепи, где должна находиться свободная
З'-ОН-группа.
Различные методы гидролиза, которые могут быть использованы для
установления структуры полирибонуклеотидов, поясняет схема,
приведенная на фиг. 48, где изображен некий гипотетический декануклеотид.
С помощью этих методов была недавно успешно выявлена полная нуклеотид-
ная последовательность некоторых транспортных РНК.
Полидезоксирибонуклеотиды устойчивы к действию щелочи, однако
при помощи ферментов их также можно подвергнуть гидролитическому
расщеплению. Один из пригодных для этой цели ферментов — это дезокси-
рибоыуклеаза (ДНК-аза I), выделяемая из поджелудочной железы быка.
9—246

Пмоза Хвост
Г У Ц А А У Г Ц П А
ЧФ
ЧФ
1
N. IS.
N \
¦к
Ф
\
ЧФ
\
\
ЧФ
\
„$А. фПр,Уф,и.(р,А(р,Аф,Уф, Гф,ЦфДф,А_
^ф,УфДф.Аф^ф^ф, Гф,Цф,Цф,/5
¦*¦ Щелочь, so чеРНК-иза
-&¦ Аф,Аф,У(р
J плю
]™іїшктаза_(рнк-аза ТІ)
плюс Цф,Аф
фТф,УфЦрАфАфУфГф, {ММщ^^рн^ ЦфЦфА
+ Цф,ЦЦ],Н
а) щелочная фосфатаза e) контролируемый
ФГ фУ,фЦ,фА,фА,фУ,фГ,фЦ,фЦ,фА гидролиз под действием^
Ьиэстеразы из змеиного
УфЦфАфАфЫрГ
УфЦфАфАфУ
УфифАфА
УфЦфА
УфЦ
У
Фиг 48 Гидролитическое расщоплепие полинуклеотидов.
- \, T,nx,„J4oK™r)HR«'™"^nTHna. Во ясех случаяхіподчеркпттм елпі:
Показан декарибонуклеотпд и аналогичный участок ітолидезоксири
ІСТВЄННО
возможные последовательности.

Нуклеиновые кислоты 131
ДНК-аза I (белок с молекулярным весом 61 500) принадлежит к числу эндо-
нуклеаз. Для проявления ее активности необходимо присутствие ионов
двухвалентных металлов (обычно Mg2+). Фермент активен при нейтральных
значениях pH и катализирует беспорядочное расщепление межнуклеотидных
связей по а-типу, разрывая главным образом связи между пуриновыми
и пиримидиновыми нуклеотидами. Продуктами гидролиза являются при
этом олигонуклеотиды. Последующая или одновременная обработка смеси
очищенной фосфодиэстеразой из змеиного яда (не содержащей примесей
каких-либо других ферментов) дает почти количественный выход дезоксири-
бонуклеозид-5'-фосфатов, входивших в состав исходного продукта.
«Комплементарной» специфичностью, т. е. способностью катализировать
расщепление 6-типа, обладает ДНК-аза II — фермент, имеющий оптимум
при кислых значениях pH и не нуждающийся для проявления активности
в ионах металла. ДНК-азы типа II были выделены из тканей млекопитающих
(селезенка, тимус), а также из некоторых бактерий (Staphylocnccus aureus).
Продуктами гидролиза и в этом случае являются олигонуклеотиды, которые
затем можно расщепить при помощи фосфодиэстеразы из селезенки до
дезоксирибонуклеозид-3'-фосфатов. Особенно ценны для некоторых
специальных исследований ДНК-азы или фосфодиэстеразы, способные
различать полинуклеотиды, находящиеся в одноцепочечиой или двухцепочечной
форме (см. стр. 152). Такой способностью обладает, например,
панкреатическая РНК-аза: она легко гидролизует одноцепочечные (но не двухценочеч-
ные!) участки в РНК или гибридные комплексы РНК — ДНК, благодаря
чему ее можно использовать для идентификации таких структур.
Большинство обычных ДНК-аз лишено подобной конформационной специфичности.
Однако и среди ДНК-аз удалось найти ферменты, обладающие некоторой
специфичностью в отношении конформации субстрата. Такие ферменты были
выделены как из бактериальных клеток (экзонуклеаза 1 Escherichia coli),
так и из тканей животных. Имеются сведения, что при тщательно
контролируемых условиях ДНК-аза II из Staphylococcus aureus ведет себя
аналогичным образом.
Слабое нагревание полидезоксирибонуклеотидов при низких значениях
pH (>60°; pH -^ 3) приводит к интересным последствиям. Первичная
структура в основном сохраняется (т. е. расщепляется лишь относительно
небольшое число фосфодиэфирных связей полинуклеотидной нити), но при этом
разрываются все связи между сахаром и пуринами, в результате чего
образуются апуриновые кислоты. Аналогичным образом обработка ДНК
гидразином приводит к образованию апиримидиновых кислот.
ПОЛИДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДЫ
ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИЯ
У всех организмов, за исключением вирусов и бактерий, клеточная ДНК
сосредоточивается в основном в ядрах. Некоторое количество ДНК
содержится также в хлоропластах, митохондриях и других крупных органеллах,
которые обладают по крайней мере потенциальной способностью к
самовоспроизведению. В бактериальных клетках ДНК присутствует,
по-видимому, в виде нескольких (от 1 до 3) агрегатов, или нуклеоидов, которые
хотя и располагаются внутри клетки, но при этом связаны с мембраной,,
тогда как у ДНК-содержащих вирусов она занимает центральную часть
головки вириона (имеющей форму шара или многогранника). Ядра животных
клеток содержат около 2 мг ДНК на 1 з свежего веса ткани. Это означает»
что на ядро приходится от 4-Ю2 до 8-Ю2 г, или от 4 до 8 пикограммов
(пг) ДНК. Содержание ДНК в клетках совершенно не зависит от
физиологического состояния животного, но зависит от плоидности клеток, т. е. от
9*

Нуклеотидный состав ДНК из различных источников
Вид
Человек
Курица
Черепаха
Сольдь
Locusta migra-
toria
(саранча)
Paracentrotus
lividus
(морской еж)
Морские крабы
Семена
пшеницы
Aspergillus ni-
ger
(плесневый гриб)
Saccharomyces
cerevisiae
(пекарские
дротжи^
Euglena graci-
Lis
С h lam ydomonas
Sarcina lutea
Brucella abortus
Escherichia co-
li W
Staphylococcus
aureus S A-B
Clostridium
perfringens
Фаг T2 E. coli
Фаг Т7 E. coli
Фаг срХ174

(изолированный вирус)
Фаг фХ174
E. coli (репли-
кативная
форма 6))
Фаг а В. mega-
terium
(вирус)
Цепь А
Цепь В
Источник
ДНК
Тимус
Эритроциты
Эритроциты
Сперма
Целое
насекомое
Сперма
Все ткани

(минорный
компонент 3)
ДНК)
Целые
клетки
Митохонд-
рим
Целые
клетки
Хлоропла-
сты
Целыеклет-
кн
Хлороп
ласты
А
г
ЦІ)
Т
А/Т
Животные и растения
30,9
28,8
29,7
27,8
29,3
32,8
47,3
27,3
25,0
31,3
41,3
22,6
38,2
18,0
29,9
13,4
21,0
24,7
30,8
36,9
32,5
26,0
24,6
26,3
28,4
30,1
24,0
19,9
20,5
22,0
22,5
20,5
17,7
2,7
22,7
25,1
18,7
11,3
27,7
12,3
29,3
20,6
19,8
21., 5
21,3
20,7A,9)
20,7@,2)
17,3A,1)
2,7
22,8
25,0
17,1
10,0
28,8*)
11,3
32,1
18,7
29,4
29,2
27,9
27,5
29,3
32,1
47,3
27,1
24,9
32,9
37,5
24,4
38,1
20,5
30,8
Бактерии и вирусы
37,1
29,0
26,0
21,0
14,0
18,2
24,0
24,1
22,3
22,1
24,1
19,9
37,1
28,9
25,7
19,0
12,8
16,8 5)
24,0
18,5
22,3
22,3')
21,3
24,2
12,4
21,1
23,6
29,2
36,3
32,5
26,0
32,7
26,4
27,4
24,5
32,1
1,05
1,02
1,05
1,00
1,00
1,00
0,95
1,10
0,93
1,00
0,88
0,98
1,08
1,00
1,04
1,05
1,00
1,00
0,75
1,00
1,04
1.23
0|75
Г/Ц
1,00
0,95
1,03
1,00
1,00
1,00
1,09
1,03
1,07
1,09
0,91
1,10
1,00
1,00
1,01
1,11
1,08
1,00
1,30
1,00
0,98
1,13
0,82
Пур/Пир
1,04
0,97
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,10
1,01
1,02
0,90
1,01
1,02
1,00
1,02
1,07
. u .
1,03
1,00
0,95
1,00
1,02
1,19
0,79
(А + Т)/(Г +
+ Ц2))
1,52
1,38
1,31
1,23
1,41
1,85
1,75
1,19
1,00
1,79
3,69
0,88
3,23
0,63
1,55
0,35
0,73
0,93
1,50
2,70
1,44
¦1,08
1,34
1,18
1,25
1,20
1,23
і) В скобках показано содержание 5-метилцитозина.
2) Включая различные замещенные производные.
3) Приблизительно 30% ДНК относится к этому типу.
4) Содержит 10 моль 5-метилцитозина на 100 моль цитозина.
6) Оксиметилцитозин полностью заменяет цитозин.
6) Выделена из клеток, инфицированных фагом.
?) Содержит 5-океиметилурацил.

Нуклеиновые кислоты 133
числа хромосомных наборов в клетке. Бактериальные клетки содержат
приблизительно в 1000 раз меньше ДНК, чем животные, т. е. около 4-Ю пг,
а у ДНК-содержащих вирусов количество ДНК на вирион колеблется в
пределах от 2-Ю до 2-10~8 пг. Мы располагаем в настоящее время надежными
доказательствами того, что у всех этих организмов ДНК выполняет функцию
генетического материала. Обсуждению этой проблемы посвящена гл. XIX.
Состав оснований, или нуклеотидный состав ДНК, изучен весьма
тщательно на препаратах ДНК, выделенных из самых разных источников. Первые
исследования такого рода, заложившие те химические и аналитические
основы, на которых покоится все внушительное здание современной
молекулярной биологии, были выполнены Чаргаффом и его сотрудниками в период
между 1950 и 1953 гг. Некоторые обобщения, вытекавшие из этих работ
и получившие в дальнейшем надежное подтверждение, можно
сформулировать следующим образом (см. также табл. 22):
1. Нуклеотидный состав ДНК является характеристикой данного
организма (т. е. данного биологического вида).
2. В различных клетках и тканях одного и того же организма ДНК имеет
идентичный или по крайней мере достаточно близкий нуклеотидный состав;
на него не оказывают влияния стадия развития, возраст, питание и прочие
физиологические факторы или условия окружающей среды.
3. Относительное содержание различных оснований в ДНК колеблется
у разных организмов в широких пределах (от 25 до 75 мол. % Г + Ц). У
бактерий эти колебания выражены гораздо сильнее, чем у высших организмов.
Показателем такого рода изменчивости служит отношение (А + Т)/(Г + Ц).
4. У близкородственных организмов близок и нуклеотидный состав ДНК.
Это обстоятельство используют теперь для построения химической
систематики бактерий.
5. Химический состав всех «нормальных» типов ДНК обнаруживает
определенные закономерности, выражаемые правилами Чаргаффа, а именно:
А = Т; Г s= Ц; А + Г = Ц + Т (т. е. содержание пуринов равно
содержанию пиримидинов); А + Ц = Г + Т (при старой системе наименования
пиримидинов это правило формулировалось так: содержание 6-аминогрупп
равно содержанию 6-кетогрупп) г.
6. Если нуклеиновая кислота не содержит никаких других оснований,
кроме А, Г, Ц и Т, и если правила Чаргаффа для нее не соблюдаются, то
очевидно, что эта нуклеиновая кислота должна обладать какими-то
необычными структурными особенностями (такова, например, ДНК из бактериофага
фХ174, не соответствующая модели Уотсона — Крика).
На основании этих обобщений и рентгеноструктурных данных Уилкинса,
а также исходя из химических данных, рассмотренных нами выше, Уотсон
и Крик предложили в 1953 г. новую модель структуры ДНК. Эта модель
впервые дала возможность объяснить ряд важных биологических явлений
в точных терминах химической структуры. Появление ее послужило
отправной точкой для подлинной революции в биологическом мышлении,
происшедшей в течение последующего десятилетия. За этот вклад в науку
Уотсон, Крик и Уилкинс были удостоены в 1962 г. Нобелевской премии.
С 1953 г. модель претерпела некоторые изменения в связи с получением более
точных рентгеноструктурных данных. Характерные черты этой структуры
показаны на фиг. 49 и 50.
Молекула ДНК в B-конфигурации, устойчивой при высокой ( >66%)
относительной влажности, представляет собой двойную плектонемически
1 В тех случаях, когда ДНК содержит «необычные» основания, такие, например,
как замещенные цитозипы, под Ц подразумевается Ц плюс все замещенные цитозияы,
а под Т — урацил плюс все замещенные урапилы (включая тпмин).

tu Жї О« Ar, Оо
>Г"
w
.'OU
Фиг. 49. Структура ДНК в В-кон-
формации.
А. Пространственная модель с учетом
вандерваальсовых радиусов. ІЗ.
Проекция этой модели.
закрученную г правую
спираль, образованную двумя
антипара л лелъными 2 поли-
нуклеотидными цепями.
Основания располагаются внутри
спирали, образуя пары,
составленные таким образом,
что пиримидин одной цепи
всегда образует пару с
пурином другой цепи,и наоборот.
В силу пространственных
ограничений соединяться
водородными связями могут
лишь вполне определенные
основания: А с Т и Г с Ц
(или с замещенными
производными Ц). Эти правила
спаривания оснований требуют
комплементарности
оснований в двух цепях, вследствие
чего нуклеотидная
последовательность одной цепи
однозначно определяет нуклеотид-
ную последовательность
другой цепи. Нуклеозидные
пары, находящиеся внутри
спирали, располагаются так,
что расстояние от GI до Ci
равно приблизительно 11 A;
плоскости их ароматических
колец образуют прямой угол
с осью спирали, а их
неполярные части размещаются одна
над другой, причем
расстояние между парами оснований
равно 3,4 А. Фосфодиэфирная
цепь, составляющая основу
спирали и несущая большой
отрицательный заряд,
наоборот, обращена наружу, и ее
1 Плектонемическим
называется такое закручивание, при
котором двойная спираль не может
быть разделена на отдельные
компоненты без раскручивания.
2 На химическом языке это
означает, что межнуклеотидные
связи в одной цепи
ориентированы в направлении 3'-^- 5', а в
другой — в направлении 5'->- 3'.

,сн.
сн3
51.5° \2^—~\ Ю.85А
Фиг. 50. Водородные связи между парами оснований аденин — тимин.
I — обнаруженные Хугстином для A : 1)-комппекса З-КГ-метилтимина и 9-К-метиладенииа; 2 —
постулируемые Уотсоном и Криком (в позднейшей модификации Арно). Водородные связи гуанин —
цитозин: з — по Хугстину, і — по Уотсону и Крику.

136
Глава V
сильно полярные группы могут благодаря этому взаимодействовать с
компонентами водной среды. На один виток двойной спирали приходится
10 пар оснований, и поскольку шаг спирали равен 34 А, то отсюда следует,
что спираль имеет винтовую ось 10-го порядка, причем винт является
правым. Спираль имеет одну мелкую бороздку (шириной около 12 А) и одну
глубокую (шириной около 22 A). Электронные микрофотографии многих
вирусных и даже некоторых бактериальных ДНК, а также другие данные,
Фиг. 51. Электронные микрофотографии кольцевых ДНК из бактериофагов Хс Ъ2ЬЪ и Хс„
Черная полоса на верхней фотографии имеет длину 2 жк.
полученные,^физическими методами, свидетельствуют о том, что молекулы
этих ДНК имеют!структуру двойной спирали, замкнутой в кольцо.
Прямые экспериментальные доказательства существования структуры,
соответствующей модели Уотсона — Крика, состоят в следующем:
1. Можно рассчитать длину неразветвленной двойной спирали любого
данного молекулярного веса, состоящей из данного числа нуклеотидных
пар и обладающей требуемыми характеристиками. Такой расчет дает для
ДНК фага фХ174 (в ее двухцепочечной репликативной форме) величину
2,0 мк, для ДНК фага К — 17,5 мк, для ДНК фага Т2 — 63 мк и, наконец,
.для ДНК Е. coli — около 1400 мк. Прямые измерения длины молекул ДНК
из этих организмов, проведенные методом радиоавтографии и электронйой
микроскопии (фиг. 51), показали, что эти молекулы действительно имеют
размеры, постулированные на основании модели.
2. Доказательства комплементарности и антипараллелыюсти двух цепей
были получены методом определения частот ближайших соседей (см.
стр. 510). Этот метод должен давать разные результаты для
антипараллельных и параллельных цепей; например, в первом случае мы должны
получить ТфГ = ЦфА и ГфА = ТфЦ, а во втором ТфГ = АфЦ и ГфА = ЦфТ.
Опыты, проведенные Джоссом и Корнбергом, убедительно свидетельствуют
в пользу первой из этих двух альтернатив (см. стр. 511).
3. Согласно модели Уотсона — Крика, две цепи хотя и являются
комплементарными, но могут|иметь разный нуклеотидный состав х. Поэтому в
принципе их можно разделить при помощи какого-нибудь физического или
химического4 метода. Такое разделение (с определением нуклеотидного состава
1 Это можно выразить следующим образом:
где индексы 1 и 2 относятся к 1-й и 2-й цепям.
Tt : А2 и Г4 : Ц2 Ф Ці : Г2,

Нуклеиновые кислоты 137
цепей), действительно, было осуществлено сначала для ДНК фага а (см.
табл. 22), а затем и для ДНК из ряда других источников.
4. Химические и физические свойства ДНК в растворе (см. ниже) хорошо
согласуются с предсказаниями, вытекающими из модели Уотсона — Крика.
ИЕКОМПЛЕМЕНТАРНЫЕ И ДРУГИЕ НЕОБЫЧНЫЕ
ПОЛИДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДЫ
Первая ДНК, которая, по-видимому, не подчинялась правилам Чаргаф-
фа, была выделена из фага срХ174 Е. сой (см. табл. 22). Свойства этой ДНК
(имеющей молекулярный вес 1,6-106) ясно показывали, что по своей кон-
формации она сильно отличается от большинства «нормальных» типов ДНК
и скорее напоминает некоторые типы РНК. Теперь мы знаем, что ДНК
фага фХ174 является одноцепочечной. Весьма интересно, что, подобно РНК
некоторых РНК-содержащих вирусов, эта ДНК переходит при репликации
in vivo в так называемую репликативную форму, в которой имеется
комплементарная цепь и которая представляет собой, по-видимому, замкнутую
в кольцо двойную спираль.
При действии ДНК-полимеразы из Е. coli на смесь нуклеозидтрифосфа-
тов — (дАТФ плюс дТТФ) или (дГТФ плюс дЦТФ) — образуются два
необычных дуплексных полимера: в первом случае получается двойная спираль
с чередующейся последовательностью дАдТ : дТдА, во втором — гомополи-
мерная двойная спираль дГ : дЦ. Суэока выделил из различных тканей
морских крабов природную ДНК, близкую по своим свойствам к первому
из этих синтетических полимеров (но при этом содержащую небольшое
количество ГЦ-пар). Если полимераза действует на смесь (дАТФ плюс дТТФ)
в присутствии небольшого количества рА : рУ, играющего роль затравки,
то образуется полимер дА : дТ.
ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК В РАСТВОРЕ
Седиментация в гомогенной среде. Один из наиболее полезных методов
исследования веществ очень высокого молекулярного веса состоит в
изучении их поведения в ультрацентрифуге. Для подобных исследований обычно
используют сильно разбавленные растворы полимеров (чтобы свести к
минимуму агрегацию и другие концентрационные эффекты). Кроме того,
стремятся подобрать условия, при которых ДНК находится в наиболее
стабильной конфигурации. К таким условиям относятся: присутствие противоионов
(обычно одновалентных неорганических катионов, например Na+),
относительно высокая ионная сила (>0,1 М) и умеренная скорость вращения ротора
ультрацентрифуги. Низкая концентрация (~10 мкг/мл) требует
применения ультрафиолетовой оптики. Измеренная скорость перемещения
концентрационной границы подставляется в уравнение (III.24). Обычно
полученные в опыте значения константы седиментации sobs (выражаемой в
единицах Сведберга) приводят к s20,w, т. е. к величине константы седиментации
в растворителе с плотностью и вязкостью воды при 20°. Для этого
пользуются следующим уравнением:
PB-P20,
(V.I)
где r\t и їі2о — вязкость воды при температуре опыта и при 20°; т]/тЪ —
отношение вязкости растворителя к вязкости воды; рго.ю и р — плотность воды
при 20° и растворителя при температуре t соответственно; v — парциальный
удельный объем растворенного вещества. Величина v равна 1/рв, где рв —

138 Г л а в а V
плавучая плотность макромолекулы в исследуемой системе, являющаяся
функцией состава (см. ниже). В среднем эта величина для нативной двух-
цепочечной ДНК близка к 0,55. Одноцепочечные полинуклеотиды
характеризуются несколько более низкой величиной; так, например, для РНК ВТМ
она равна 0,524, для микросомной РНК — 0,53, а для транспортной РНК —
0,48. (Для белков значения парциального удельного объема близки к 0,725.)
Константы седиментации, определенные описанным способом, зависят от
концентрации ДНК в растворе.
Значения константы седиментации для полимера любого данного
молекулярного веса, как правило, тем выше, чем более жесткой (т. е. менее гибкой)
конформацией он обладает.
Центрифугирование в градиенте плотности. Конвекционные возмущения
и взаимодействие между молекулами растворенного вещества сводятся
к минимуму или совершенно исключаются, если центрифугирование проводят
в непрерывном градиенте плотности. Существует два метода этого типа:
метод, основанный на измерении скорости седиментации, и метод седимента-
ционного равновесия.
Для седиментационных экспериментов удобной средой является забу-
фереаный раствор сахарозы с линейным градиентом плотности (обычно
между 5 и 20%). Такой градиент можно создать в центрифужных пробирках
до начала работы при помощи простого аппарата для перемешивания. В ряде
случаев вместо сахарозы используют самообразующийся градиент плотности
хлористого цезия. Седиментацию вещества в градиенте плотности можно
регистрировать непрерывно при помощи ультрафиолетовой оптики, которой
снабжена аналитическая центрифуга. Вместо этого можно также просто
прокалывать дно пробирки или отбирать пробы с помощью сифона,
опущенного до самого дна пробирки. Отобранные пробы собирают в отдельные
пробирки на коллекторе фракций. Концентрацию вещества в каждой из фракций
определяют по поглощению света (в ультрафиолетовой области при 260 ммк),
по реакционной способности (содержание дезоксирибози), по
биологической активности, по содержанию определенной радиоактивной метки
(например, Р32) и т. д.
Наиболее удобный метод состоит в сравнении (при идентичных условиях,
желательно в той же центрифужной пробирке) неизвестного вещества со
стандартом, который имеет сходный состав и для которого значение s
известно. Такие стандарты в настоящее время доступны, а некоторые из них
даже поступают в продажу. В качестве белковых стандартов может служить
ряд ферментов (лизоцим: M = 17 200, s20:W = 2,15 S; дрожжевая алко-
гольдегидрогеназа: M = 150 000, s20,w = 7,6 S; каталаза: M = 250 000,
S2o,u> — 11,35 S). Для транспортной РНК из печени, из дрожжевых клеток
и из клеток E.coli величина s равна 4,5 S, a для двух типов рибосомной
РНК из E-coli она равна соответственно 16 и 23 S. Все эти типы РНК
могут быть использованы в качестве стандартов для РНК. ДНК из фагов
1 и Т7 относительно легко получается в неповрежденном виде в двух
формах — с константами седиментации 33,6 и 32,5 S соответственно; их можно
использовать в качестве стандартов для «нормальных» типов ДНК. Для
любой пары стандарт—неизвестное вещество с идентичным v выполняется
следующее простое соотношение:
S2o,u! (неизвестного вещества) = s20, ш (стандарта) -R, (V.2)
где R — отношение расстояния, проходимого от мениска неизвестным
веществом, к расстоянию, проходимому от мениска стандартом при v = const.
Равновесная седиментация ДНК в градиенте плотности CsCl была
впервые исследована Меселсоном, Сталем и Виноградом. При такой методике

Нуклеиновые кислоты
139
концентрированный раствор соли с высокой плотностью G,7 M раствор
CsCl, концентрированный раствор Cs2SO4 или концентрированный раствор
тартрата калия) прокручивают в ультрацентрифуге, вследствие чего после
установления равновесия между седиментацией и диффузией возникает
непрерывный, стабильный и линейный градиент плотности растворенного
вещества с наибольшей плотностью на дне центрифужной пробирки.
Если разбавленный раствор какого-нибудь высокомолекулярного
вещества, например ДНК, поместить в такую систему, то в состоянии равновесия
он образует относительно узкий слой на расстоянии, равном ?-0 от оси
вращения. Это расстояние соответствует плотности раствора р в, численно
равной плавучей плотности ДНК при данных условиях (фиг. 52). Если
плотность стандарта psw известна (перемещение на расстояние, равное
rstd), то при 44 700 об/мин и 25°
Рв = Pstd + 0,0092 (г; - rlu) [г/с*8].
(V.3)
Обычно в качестве стандарта
используется ДНК Е. coli E0%
Г + Ц), для которой р = 1,709 г/см3.
Плотность растворов двухцепочеч-
ной ДНК в концентрированном
растворе CsGl является линейной
функцией суммы молярных долей
1,7601,Ш 1,732.1,717 1,703
Нашивная
немеченая
ЛШ
Иативная
меченая
Совместная
ренатурация
меченой ии
немеченой
ДНК
Совместная
репатурация
и последующая
обработка
ферментом
Раздельная
ренатурация
с последующей
обработкой
ферментом
1,745
1,705
Плотность
Фиг. 52. Центрифугирование в градиенте плотности CsCl.
Слева: фотографии меченой N11— №5-ДНК, полученные в УФ-области спектра и показывающие
различные стадии разделения спирали на отдельные цепи под действием нагревания. Полоса справа служит
стандартом: она соответствует ДНК, выделенной из D. pneumonias. Другая полоса на верхней
фотографии характеризует гибридную ДНК, образованную in vivo. Вторая фотография свидетельствует
об устойчивости гибридной ДНК к 20-минутному прогреванию при 93,8°. При 100° число разделившихся
молекул быстро увеличивается по мере увеличения времени прогревания, как видно на следующих
трех фотографиях. (Пробы 30 мкг/мл выдерживали при этой температуре в 0,15 M NaCl + 0,015 M
цитрата натрия в течение 30 сек, 1 мин и 10 мин соответственно.) Справа: гидролиз нагретой и
отожженной смеси интенсивно меченной и нормальной ДНК В. subtilis под действием фосфодиэстеразы из Е. coli.
А, Б. Препараты нативной ДНК. В. Смесь (приготовленная таким образом, что конечная
концентрация каждого компонента составляла 5 мкг/мл) была нагрета и затем отожжена. Г. Проба (такая же,
как в предыдущем случае) была подвергнута диализу против 0,067 M глицинового буфера и
инкубирована с фосфодиэстеразой Е. coli. Д. Два препарата ДНК были нагреты и отожжены отдельно,
обработаны фосфодиэстеразой и затем смешаны. ,

і 40 Г л ае а V
(X) Г и Ц (т. є. Хт + Хц). Количественная зависимость между этими
двумя величинами имеет вид
рв = 1,660+0,098 (Хг + Хц). (V.4)
Одноцепочечные ДНК, в связи с тем что они обладают большей способностью
к связыванию тяжелых ионов Gs+, имеют плотность приблизительно на
0,016 г/см3 большую, чем соответствующая двухцепочечная ДНК. Поскольку
при тех же условиях плавучая плотность РНК значительно выше (~2,0),
а плотность белков — гораздо ниже, оба эти компонента могут быть
полиостью отделены от ДНК.
Если макромолекулы в градиенте плотности при равновесии гомогенны,
то распределение их концентраций вокруг значения г0 является гауссовым.
Более крупные макромолекулы диффундируют медленнее, и потому они
образуют более узкие полосы. Для гауссова распределения дисперсия а2
определяется выражением
?L(V.5)
0
Ms (dp/dr)
где dp/dr — градиент плотности, а индекс 5 относится к сольватированным
формам, присутствующим в системе в условиях опыта (значения остальных
величин пояснены выше). Смесь макромолекул с одинаковой плавучей
плотностью, но с разным молекулярным весом дает при центрифугировании
распределение, которое, будучи симметричным, не является, однако,
гауссовым. Это позволяет определять молекулярные веса на основе формы полос,
получаемых при центрифугировании в равновесном градиенте плотности.
Вязкость. Из-за больших размеров и резко выраженной асимметрии
молекул нативной ДНК растворы ДНК обладают очень высокой вязкостью.
На этом свойстве основан относительно простой, недорогой и удобный метод
определения размеров, формы и конформации молекул полимера.
Показателем вязкости служит параметр [г\], определяемый
выражением (V.6)
] (V.6)
где с — концентрация полимера, т] — вязкость раствора и т]0 — вязкость
чистого растворителя. Отношение ц/ч\0 называют относительной вязкостью
(ч\геі), а величину [(г]/т]0)— 1] — удельной вязкостью (y\sp)- Если
концентрацию с выражают в граммах на децилитр, то параметр, определяемый по
уравнению (V.6), называют характеристической вязкостью (таким образом,
характеристическая вязкость имеет размерность дл/г).
Вращающиеся цилиндрические вискозиметры позволяют проводить
определения в условиях, при которых гидродинамический сдвиг равен нулю.
Одним из важнейших свойств высокомолекулярной ДНК является ее
способность легко деградировать под действием гидродинамического сдвига.
Даже при простом набирании в пипетку разбавленных растворов
высокомолекулярной фаговой ДНК происходят разрывы (одновременно обеих
цепей двойной спирали), в результате которых молекулы распадаются на
фрагменты, длина которых равна половине, четверти и одной восьмой
исходной длины. Поэтому при работе с капиллярным вискозиметром, прежде чем
экстраполировать к нулевой концентрации, следует сначала провести
экстраполяцию к нулевому сдвигу.
Определение молекулярного веса и формы молекул на основании
гидродинамических данных. Если рассматриваемый раствор состоит, как это чаще
всего бывает, из популяции молекул, несколько различающихся по своим
свойствам, то различные методы, применяемые в химии полимеров, могут

Нуклеиновые кислоты 141
давать разные средние величины молекулярного веса. Обычно используют
три такие средние величины: средневесовой молекулярный вес Mw, средне-
численный молекулярный вес Мп и Z-средний молекулярный вес Mz,
определяемые при помощи следующих уравнений:
Во всех этих уравнениях nt — число молей частиц і (с молекулярным весом
Мі) в единице объема. Весовая концентрация в граммах на единицу объема
равна Ci = ПіМі- Наиболее «демократичной» мерой среднего молекулярного
веса является величина Мп, поскольку каждая молекула учитывается в этом
случае только один раз, независимо от ее веса. При вычислении величин
My, и Mz более тяжелые молекулы вносят больший вклад, иначе говоря,
учитываются с большим статистическим весом (особенно сильно это
сказывается на величине Mг). Среднечисленный молекулярный вес Мп определяют
исходя из данных по осмотическому давлению или на основании результатов
анализа концевых групп, а также с помощью рентгеноструктурных
и электронно-микроскопических измерений. Для определения средневесо-
вого молекулярного веса используют данные по светорассеянию, по
дисперсии диэлектрической постоянной, по деполяризации флуоресценции и,
наконец, по седиментации. Методом измерения вязкости получают среднюю
величину молекулярного веса, хотя и достаточно близкую, но все же не
равную My,.
Для монодисперсных систем, т. е. для систем, содержащих только
одинаковые молекулы, все три значения молекулярного веса совпадают. Что
касается полидисперсных систем, то степень их полидисперсности
характеризуется величиной отношения MwlMn. Большое удобство для химии
нуклеиновых кислот представляет то обстоятельство, что вирусы могут служить
источником строго тождественных макромолекул с высоким молекулярным
весом. Как мы уже знаем, в белковой химии и в других областях химии
полимеров величину M можно определять на основании измерения константы
седиментации s в сочетании с данными относительно формы молекул. Другой
метод состоит в измерении вязкости [т]]; молекулярный вес рассчитывают
при этом, пользуясь уравнением Шераги и Манделькерна
-I3'2 , (V.10)
где s — константа седиментации, скорректированная до %>,№; т] —
удельная вязкость полимера в дл/г; т]0 — вязкость растворителя; N — число
Авогадро; v — удельный парциальный объем полимера; р — плотность
растворителя при температуре t; ? — константа для данного полимера,
которая, однако, зависит от формы (и, в частности, от отношения осей)
молекулы. Величина ? меняется от 2,12- 10е (сфера) до 2,6-106 (беспорядочно
свернутый клубок) и 3,6-106 (жесткая палочка с практически бесконечно
большим отношением осей).
Уравнение (V.10) однозначно описывает поведение одноцепочечных поли-
нуклеотидов, к которым относится большинство типов РНК и полностью

142 Г л а в а V
денатурированных (или нативных одноцепочечных) ДНК. Величина ? для
таких полинуклеотидов равна 2,25-10е. Для нативных двухцепочечных ДНК
можно пользоваться эмпирическими уравнениями, выведенными Эйгнером
и Доти:
s20jlu~0,034M0'405 и [i]] = 6,9-1O-4-Mo.'o. (V.ll)
Светорассеяние. Если пучок света падает на молекулы растворенного
вещества в разбавленном растворе, то он рассеивается во всех
направлениях, что обусловлено вторичной эмиссией осциллирующих диполей,
наведенных в молекулах растворенного вещества под действием электрического
вектора излучения. Если в растворе находятся макромолекулы, например
молекулы нуклеиновой кислоты, то по крайней мере в одном из направлений
их размер будет всего лишь в 20 раз меньше длины волны падающего света
(обычно это свет ртутной лампы, которая дает монохроматическое излучение
с X 4358 или 5461 А). В этих условиях частицы растворенного вещества
уже не являются точечными диполями; их необходимо рассматривать как
частицы с несколькими центрами рассеяния. Количество света, рассеянного
в любом данном направлении, зависит от угла 6 между этим направлением
и направлением падающего пучка; оно максимально в прямом направлении
F = 0) и минимально в обратном F == 180°). Данным обстоятельством
можно воспользоваться для того, чтобы определять на основании одного и того
же типа измерений не только величину Mw, но также и форму
макромолекулы. К сожалению, методические трудности (требуется проведение
измерений под малыми углами — порядка 10° и менее) становятся практически
непреодолимыми как раз в той области молекулярных весов, которая
наиболее интересна с точки зрения химии ДНК, а именно для Af>3-106 (если
только не пользоваться специальными приборами). Для более мелких
молекул ДНК и для большей части видов РНК этот метод весьма эффективен
и отличается большой точностью. Следует, однако, помнить, что данный
метод пригоден не для всех макромолекул и может применяться лишь в тех
случаях, когда длина волны света больше V20 максимальной длины
молекулы, но меньше V2 этой максимальной длины.
Освещая раствор световым пучком с интенсивностью 10 и длиной волны
"к, исследователь обычно измеряет интенсивность iq света, рассеянного
в различных направлениях, пользуясь фотоумножителем, помещенным на
расстоянии г от раствора. Таким способом определяют релеевское отношение
R — івг2/І0 или чаще параметр Re, описываемый уравнением (V.12), который
численно равен релеевскому отношению при 6=0:
Л== в (V12)
В пределе, когда 0—>0, уравнение (V.13) описывает зависимость M от Re'.
(lim7r) =-^
Ч-vO -"e/?^const M
В этом уравнении В ж С — константы, характеризующие растворенное
вещество, К — оптическая константа системы *. С другой стороны, можно
показать, что если с —v 0, то уравнение (V.14) описывает зависимость Kc/Rq
1 Эта величина определяется как [2it2n§ (п — no)mk%N, где п0 — показатель
преломления растворителя, п — показатель преломления раствора, ?i0 — длина волны в вакууме
и N — число центров рассеяния в 1 см3.

Нуклеиновые кислоты 143
от формы как функцию Р§\
(V.14a)
9 'e=
, 4n . 6
h— -г- sin -7Г ,
(v-146>
Если пользоваться только уравнением (V.13), то данные по светорассеянию
позволяют оценить молекулярный вес (а именно Mw); если же
дополнительно использовать параметр RG (радиус инерции), то применение уравнения
(V.14) плюс уравнение (V.13) позволяет сделать вывод также о форме
молекул, поскольку величина RG связана с размерами макромолекул и зависит
от их формы. Так, например, для сфер, палочек и беспорядочно свернутых
клубков параметр RG равен C/5I/2r, (V12I/z/ и (V6I/2 (О'2>-I/2, где г — радиус
сферы, I — длина палочки, (<г2>I/2 — среднеквадратичное расстояние между
концами клубка. В общем можно считать, что чем более гибкой является
молекула полимера, тем больше величина RG.
Прямые физические методы. Самым старым и самым прямым методом
исследования биополимеров следует считать, по-видимому, электронно-
микроскопический метод. Недавно Клейншмидт обнаружил, что если
препарат нуклеиновой кислоты, непосредственно выделенный из живого
организма методом осмотического шока или взятый после предварительного
выделения, комплексировать с каким-нибудь основным белком, например
с цитохромом с, то его можно нанести на поверхность воды в виде моио-
молекулярной пленки. На фиг. 51 приведена электронная микрофотография
фаговой ДНК, полученная Томасом и Мак-Хатти при помощи этого метода.
Снимок позволяет оценить размеры молекулы ДНК и ясно показывает, что
эта молекула замкнута в кольцо. Определенная таким способом длина
молекулы, равно как и ее диаметр, соответствуют величинам, которых следует
ожидать на основе гипотезы Уотсона — Крика. Показано, что молекулы
ДНК из многих источников имеют форму кольца или замкнутой петли.
У ДНК фагов Я и Т2 переход от линейной формы к кольцевой осуществляется
легко и обратимо.
Весьма ценным методом является также радиоавтография. Этот метод
существует в двух вариантах. Первый из них напоминает методику, которой
пользуются также и для исследования ряда других объектов; меткой служит
при этом Н3 (источник мягкого ?-излучения), обычно в форме тритиированно-
го тимидина, включающегося в ДНК, что дает возможность получать
изображения молекулы с помощью достаточно чувствительной фотографической
эмульсии. В руках Кэрнса этот метод оказался превосходным орудием для
оценки молекулярных размеров ДНК вирусного и даже бактериального
происхождения. Полученные им результаты хорошо дополняют данные
электронной микроскопии и полностью согласуются с моделью Уотсона —
Крика.
Второй вариант радиоавтографического метода разработан Левинталем
и Томасом. Фаговую ДНК интенсивно метят радиоактивным фосфором
(Р32). Затем фаговые частицы или выделенную из них ДНК погружают
в светочувствительную эмульсию и после некоторого промежутка времени,
на протяжении которого происходит радиоактивный распад, проявляют
фотографическое изображение и измеряют число треков ?-частиц,
исходящих иэ точечных источников (соответствующих фаговой ДНК). Эти треки
имеют чаще всего форму звезд, поэтому описанный метод иногда называют
«методом звезд». Поскольку каждый трек отражает распад одного атома Р32,.

144 Г л а е а V
общее содержание фосфора в каждом точечном источнике (т. е. в каждой
молекуле фаговой ДНК) можно установить, зная число исходящих из него
треков, время экспозиции, период полураспада Р32 и удельную
радиоактивность использованного препарата фага (определяемую экспериментально).
Молекулярный вес ДНК фага Т2, определенный при помощи этого метода,
оказался равным 1,3-108, что соответствует общему содержанию ДНК в
фаговой частице. Следовательно, можно считать, что вся ДНК фага представлена
одной молекулой.
ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДНК В РАСТВОРЕ
Гипохромизм. Качественно охарактеризовать способность нуклеиновой
кислоты поглощать свет можно исходя из спектров поглощения входящих
в нее нуклеотидов. Важное значение, однако, имеет тот факт, что истинное
поглощение нуклеиновой кислоты в ультрафиолетовой области спектра
всегда меньше, чем можно было бы ожидать на основе простого
суммирования поглощения отдельных нуклеотидных хромофоров. Это явление носит
название гипохромизма. Ниже указаны некоторые общие оптические
свойства нуклеиновых кислот.
1. Все ДНК, независимо от их нуклеотидного состава, характеризуются
очень близкими коэффициентами поглощения при 260 ммк.
2. Гипохромный эффект непосредственно зависит от содержания (А + Т)-
пар.
3. Для ДНК гипохромный эффект больше, чем для РНК, а для двух-
цепочечных полимеров больше, чем для одноцепочечных.
4. Даже относительно бесструктурные полимеры, такие, как, например,
денатурированная нагреванием ДНК или одноцепочечные гомополинуклеоти-
ды, обнаруживают значительный остаточный гипохромизм. Это объясняется
том, что гипохромизм свойствен олигонуклеотидам и даже динуклеотидам
соответствующей структуры.
Гипохромизм важен не только сам по себе, как чрезвычайно интересное
оптическое явление, но главным образом как феномен, дающий нам в руки
простой и удобный метод, который можно использовать в химии нуклеиновых
кислот для качественной и количественной оценки процессов ориентации —
дезориентации (таких, как денатурация, ренатурация, обратимое
образование гомополимерных комплексов или образование гибридных спиралей
ДНК — РНК), а также для установления генетической связи между ДНК
из различных организмов или из различных клеток одного и того же
организма. Все, что требуется для проведения такой оценки,— это
спектрофотометр или какой-нибудь другой прибор, с помощью которого можно измерять
поглощение света в области 260 ммк. Первый максимум поглощения у всех
исследованных видов ДНК располагается в интервале 256—265 ммк; вблизи
230 ммк находится минимум, а второй максимум поглощения лежит в далекой
ультрафиолетовой области, при 195 ммк. Для обычных двухцепочечных
ДНК коэффициент поглощения в расчете на 1 моль фосфора колеблется
в пределах 6100—6900, что составляет 18,0—19,0 на 1 мг ДНК (для РНК
соответствующая величина близка к 23).
Оптическое вращение. Упорядоченные полинуклеотиды обладают
относительно сильной оптической активностью. Показателем оптического
вращения (в полинуклеотидах оно обычно положительно) служит либо величина
[а]в, либо величина [МР\в (молярное вращение в расчете на фосфат).
Оптическое вращение уменьшается по мере уменьшения степени
упорядоченности; соответствующие смеси нуклеотидов, полученные после полного
гидролиза, обнаруживают весьма незначительное вращение. Для двухцепочечной
ДНК в водном растворе [a]D колеблется в пределах от -j-100 до +150° (что

Нуклеиновые кислоты 145
соответствует значению [MP]D~ 40 000). После обработки, приводящей
к разрушению упорядоченной структуры ДНК, величина [a]D падает до
малых положительных значений или даже становится отрицательной; для
смесей мононуклеотидов величина [a]D близка к нулю. Одноцепочечные поли-
нуклеотиды с упорядоченной конформацией характеризуются величиной
[а\в в пределах 150—200, т. е. значениями по меньшей мере такими же
высокими, а возможно, даже и более высокими, чем соответствующий
показатель для ДНК, тогда как для динуклеотидов и коротких олигонуклеотидов
величина [а]в весьма мала: порядка ±10° и даже меньше. Таким образом,
ясно, что наблюдаемая на опыте высокая оптическая активность обусловлена
асимметрией молекул, связанной с тем, что упорядоченно расположенные
элементы полинуклеотидной цепи закручены в пространстве.
ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ДНК В РАСТВОРЕ
Реагенты, способные реагировать со свободными аминогруппами. В
качестве такого реагента в химии нуклеиновых кислот часто используется
формальдегид; он реагирует со свободными аминогруппами цитозина, гуанина
и аденина, образуя соответствующие оксиметильные производные (или —
после дегидратации — шиффовы основания). Эта реакция сопровождается
изменением спектра поглощения (смещением максимума в сторону длинных
волн и усилением поглощения в области максимума); поэтому ее можно
прослеживать спектрофотометрически. Все основания двухцепочечной ДНК
в ее нативной конформации, а также больший или меньший процент
оснований в других упорядоченных полинуклеотидах защищены от этой реакции,
т. е. не реагируют с формальдегидом, если соблюдаются определенные меры
предосторожности (нейтральное значение pH, низкая температура, низкая
концентрация), сводящие к минимуму конформационные изменения, которые
могут происходить даже в условиях, когда новые ковалентные связи не
образуются.
Другой часто используемый реагент (особенно ценный при исследовании
мутагенеза in vitro)— это азотистая кислота, образующаяся в 0,05—1,0 M
растворе NaNO2 в ацетатном буфере при pH 4—5. Под действием азотистой
кислоты, вызывающей окислительное дезаминирование, аденин
превращается в гипоксантин, гуанин — в ксантин и цитозин — в урацил. Каждое
основание характеризуется способностью спариваться с другим определенным
основанием (фиг. 53). Поэтому основания, образовавшиеся при
окислительном дезаминировании, ведут себя не так, как исходные основания. В
результате после двух циклов репликации исходная пара оснований заменяется
другой, т. е. возникает мутация. Под действием азотистой кислоты могут
иметь место по крайней мере два таких перехода:
А —Т —Д. Гкс-Т -> Гкс-Ц -+ Г —Ц
Репликация
Репликация
Другой процесс, протекающий обычно со скоростью, в четыре раза
меньшей, чем скорость дезамипирования, приводит (вероятно, через образование
общего промежуточного продукта — диазониевой соли азотистых
оснований — с последующим выделением N2 и одновременным алкилированием
соответствующих групп) к поперечному связыванию (сшиванию) двух цепей
ковалентними связями.
10-246

Кислая Нейтральная Щелочная
среда среда среда
(рН~3) (рН~7) (рН>12)
R
АЬенин-пшмин,урацил,бромурацім (обычно встречающаяся
таилюмерная форта)
I
Гуанин-цитозин, метил-или оксиметилцитозин (также происходит образование пары ксантин-цтазии}
о^ н
Гианин-тимин,ирацил, бромцрацил
(редко встречающаяся таутомерная форма)
o
Гцпаксонтин-цитозин
R
0х- h
2-аіиииопурин-цитозии или тияіин
Фиг. 53. Образованпэ водородных спязой между основаниями в разпых условиях.

Нуклеиновые кислоты 147
Такое сшивание может происходить при обработке ДНК кислотой, при
действии достаточно интенсивного ультрафиолетового излучения и,
наконец, под влиянием бифункциональных алкилирующих агентов, например
азотных аналогов иприта
СІСНаСНг —N —CHa-CHaCl.
R
Образование поперечных связей под действием последних из этих двух
факторов происходит между соответствующим образом расположенными
тиминовыми или гуаниновыми парами в полимере. Действие антибиотика
митомицина С, подавляющего синтез ДНК in vivo, тоже, по-видимому,
отчасти определяется тем, что он вызывает сшивание цепей ДНК. В принципе
ковалентная связь по типу конец-в-конец, при помощи которой замкнуты
в кольцо молекулы кольцевых ДНК, эквивалентна поперечной связи, ибо
она также препятствует расплетанию цепей ДНК. Именно поэтому
кольцевая двухцепочечная ДНК, например ДНК вируса полиомы, по многим своим
свойствам напоминает поперечносшитую ДНК.
Одним из наиболее эффективных мутагенов, действующих in vitro,
является гидроксиламин —NH2OH. В отличие от большинства других агентов он
подавляет биологические функции ДНК медленно и только при высоких
концентрациях (~1 М), причем действие его высокоспецифично: он
реагирует почти исключительно с цитозином (или с 5-оксиметилцитозином), в
результате чего образуются соответствующие производные урацила. Мутагенный
эффект вызывается в этом случае переходом
г_ц ES г-у -* а-у -> А_т.
Реакции присоединения и отщепления протона. Протонирование ДНК
в растворе происходит при значениях pH, отличающихся от тех, при которых
наблюдается протонирование в том же растворителе свободных оснований
и нуклеотидов. Если постепенно снижать pH, начиная от нейтральных
значений, то первыми протонируются аденин и цитозин (рКа между 5 и 4),
а затем гуанин (рК'а ~ 3). Формулы, приведенные на фиг. 53, показывают,
что при первом акте протонирования этих оснований как характер
спаривания оснований, так и размеры спирали остаются по существу неизменными;
более того, монопротонированные пары [А(Н+) — Т] и в особенности
[Г — Ц(Н+)] могут обладать даже большей стабильностью. Протонирование
же гуанина создает условия для мощного отталкивания зарядов внутри
одной и той же пары оснований, которое может привести к глубоким
и, по-видимому, необратимым структурным изменениям, происходящим
в очень узком интервале pH. Одноиепочечные ДНК, как и следует ожидать,
титруются при несколько более высоких значениях pH.
Отщепление протонов от гуаниновых и тиминовых оснований ДНК
в отличие от их протонирования должно наблюдаться, естественно, при
титровании раствора ДНК щелочью. В случае двухцепочечных ДНК этот
процесс происходит в чрезвычайно узком интервале pH — между 11 и 12.
При центрифугировании оттитрованного таким образом раствора ДНК
в CsCl наблюдается увеличение рв по сравнению с нейтральной формой на
величину, равную 0,063 г/см3. Одноцепочечные ДНК титруются при более
низких значениях pH A0—11) и в не столь узком их интервале.
Центрифугирование оттитрованного раствора в CsCl дает значение рв, увеличенное
приблизительно на 0,047.
Взаимодействие с малыми молекулами и ионами. Для того чтобы
нуклеиновые кислоты, будучи полианионами, оставались в то же время
электрически нейтральными, они должны экранироваться соответствующим числом
10*

148 Глава V
находящихся в непосредственной близости катионов. Степень связывания
катионов варьирует в очень широких пределах. Катионы щелочных
металлов, такие, как Na+ и Li+, служат только для того, чтобы электростатически
нейтрализовать отрицательные заряды фосфатных остатков (это дает
возможность молекуле нуклеиновой кислоты принимать наиболее компактную
конформацию). Что же касается двухвалентных катионов, таких, как,
например, катионы щелочноземельных и некоторых переходных металлов (Со2+,
Mn2+, Ni2+ и Zn2+), или органических диаминов, обычно сопутствующих ДНК
in vivo, то их поведение носит другой характер: скорее всего, они
связываются с фосфатными остатками стехиометрически. Эти двухвалентные катионы
воздействуют на конформацию макромолекул значительно сильнее, чем
одновалентные (так, например, в точке эквивалентности один ион Mg2+
эквивалентен 102—103 ионам Na+). Некоторые сравнительно крупные
органические молекулы могут также оказывать на структуру ДНК специфическое
влияние, которое не может быть вызвано действием неорганических
ионов.
Особый интерес представляет взаимодействие нуклеиновых кислот
с некоторыми полициклическими ароматическими (основными) красителями,
катионы которых имеют плоское строение. Примером таких соединений
могут служить акридины (профлавин, акридиновый оранжевый и т. д.).
Красители этого типа уже давно используются для окрашивания
биологических объектов. Избирательно связываясь с ДНК или РНК, они переводят
их в «видимую» форму. Этот эффект легко наблюдать по поглощению или
флуоресценции красителей. В последнее время такие красители приобрели
исключительно важное значение как мутагены, обладающие селективным
действием, а именно способностью вызывать вставки или делеции (т. е.
включение или выпадение единичных нуклеотидов) при репликации ДНК и таким
путем специфически подавлять эту репликацию (см. стр. 492).
ДЕНАТУРАЦИЯ
Общие положения. Если растворы ДНК, имеющие исходное значение
pH, близкое к нейтральному, и содержащие противоионы с умеренной
ионной силой, подвергнуть действию некоторых факторов, то молекулы ДНК
претерпевают ряд структурных (конформационных) изменений, иногда
обратимых, а иногда необратимых. Такими факторами могут служить: повышение
температуры, добавление гидроксильных или водородных ионов, удаление
противоионов или прибавление различных органических реагентов (спиртов,
гликолей, амидов, алифатических и гетероциклических аминов, замещенных
производных мочевины, фенолов, сульфоксидов и т. д.), а также некоторых
анионов (СС13СО~, CNS~, СЮ~). Конформационные изменения ДНК по
аналогии со сходными процессами в белковой химии (см. гл. IV) были
названы денатурацией, а факторы и агенты, вызывающие этот процесс,—
денатурирующими факторами или агентами. Любая из гидродинамических или
оптических характеристик макромолекулы (s0, [ц], RG, h, [а] и т. д.) может
быть использована для того, чтобы качественно оценить процесс
денатурации. Если же необходимо различать только два состояния —«нативиое»
и «денатурированное»— то, пользуясь тем или иным показателем, можно
исследовать процесс также и количественно. Агенты, относящиеся к
различным классам, часто являются как бы взаимно комплементарными по своему
денатурирующему действию. Так, например, при добавлении некоторых
денатурирующих агентов температура, при которой наступает денатурация,
понижается; аналогичным образом влияет и уменьшение ионной силы; при
повышенной температуре концентрация денатурирующего агента,
необходимая для получения желательной степени денатурации, оказывается более

Нуклеиновые кислоты
149
низкой, чем при комнатной температуре, и т. д. Фиг. 54 поясняет сказанное.
Ниже перечислены основные характеристики процесса денатурации.
1. Структурные переходы, наблюдаемые при денатурации, можно
представить в виде простых сигмоидных кривых, определяемых двумя
параметрами: положением средней точки и наклоном кривой'в этой точке (или таким
параметром, как ширина перехода). В отношении наклона и общей формы
1.0
©
і
0,5
А'
Аеиатурируюший агент *-
Фиг. 54. Кривые структурных переходов ДНК при денатурации.
А. ДНК (а% Г + Ц) из бактериофага. В.__ДНК (а% Г + Ц) из бактерии. С. ДНК (а% Г
Ц) из
высшего животного или из растения. А'. ДНК (Ь% Ґ + ц; Ь « о) из бактериофага; мол. вес примерно
тот же, что и в случае А. А". ДНК (с% Г + Ц; с > а) из бактериофага; мол. вес. примерно тот же,
что и в случаях А или А'. Ах. ДНК такая же, как и в случае А, но в присутствии денатурирующего
агента или в условиях, способствующих денатурации. А . ДНК такая же, как и в случае А, но в
присутствии стабилизирующего агента. D. Одноцепочсчная ДНК. По оси ординат отложена доля
денатурированных молекул ДНК A — 6), где 6 — отношение наблюдаемого изменения выбранного
параметра к максимальному его изменению.
кривые денатурации аналогичны кривым, описывающим
высококооперативные фазовые переходы типа «порядок — беспорядок» в кристаллах или
других полимерах.
2. Если в исследуемой системе имеется только два компонента (т. е. если
межмолекулярная гетерогенность отсутствует и молекулы могут находиться
только в двух формах — нативной и денатурированной,— равновесие между
которыми можно измерить, наблюдая изменения какого-нибудь из свойств)
и если переход является обратимым в широком интервале условий за
пределами точки перехода, то можно считать, что в этой точке статистически 50%
молекул денатурированы. (Это можно представить себе двояко: либо все
100% молекул денатурированы на 50%, либо 50% всех молекул
денатурированы на 100%.)
Выражение для константы равновесия KfT в точке перехода
Нативная форма ^ Депатурироваппая форма
имеет вид
Доля нуклеотидных пар в
областях
__ it п\ [Денатурированная форма] деспирализованных
'г I / [Нативная форма] == Доля нуклеотиднь:
ых пар в
спирализованных областях
(V.15)
В этой точке должно соблюдаться условие AGtT = 0 и AHtr = T1/2ASt]--
Если исследуемый переход является тепловым, т. е. если роль независимой
переменной играет температура, то он аналогичен плавлению одномерного
кристалла и температура точки перехода ti/2 (в абсолютной шкале Ti/a)
эквивалентна температуре плавления tm (или Тт).

150
Глава V
3. Значение 7*1/2 связано прямой, а часто и линейной зависимостью
с нуклеотидным составом ДНК: при увеличении доли (Хг + Хц) оно
увеличивается. Для ширины перехода такой зависимости не обнаружено. В то же
время значение 7\/2 сравнительно мало зависит от молекулярного веса
полимера, тогда как ширина перехода с возрастанием молекулярного веса может
увеличиваться. В случае теплового перехода в 0,2 M Na+ tm = 69,3 -\-
+ 0,41 (Хг -f-Хц), где 69,3 есть ?i/2 некоего, конечно гипотетического,
полимера, содержащего только (A -f- T). Использование этих двух параметров
Фиг. 55. Обратимая и необратимая денатурация.
Объяснение см. в тексте. Обратите внимание, что ионная сила па правом графике выше, чем на левом.
ti/2 и ширины перехода), по-видимому, одинаково правомочно как для
природных ДНК, так и для синтезированных ферментативным путем гомополи-
мерных дуплексов.
4. Кривые денатурации строят обычно при помощи одного из двух
способов (фиг. 55); переход измеряют либо при данных условиях эксперимента
(температура, pH и т. д.), либо после быстрого возвращения нагретого
раствора к некоторым стандартным условиям (температура, близкая к 20°;
pH 6—7; ионная сила 0,1—0,2). В первом случае (так называемый d-метод
анализа структурного перехода по Гейдушеку; кривая At на фиг. 55)
измеряется степень перехода (т. е. положение равновесия), действительно
наблюдаемая в момент измерения. Что же касается второй кривой (так
называемый і-метод анализа структурного перехода, кривая Аг), то она отражает
скорость установления термодинамического равновесия при стандартных
условиях. Если новый параметр, полученный по d-методу, идентичен
параметру, получаемому по і-методу (т. е. при стандартных условиях), то
наблюдаемые изменения обратимы; если же такой идентичности нет, то это
значит, что имел место какой-то необратимый процесс.
Природа стабилизирующих сил. В опровержение прежних представлений
теперь доказано, что водородные связи, хотя и очень важные для
определения специфической конформации двойной спирали, вносят относительно
малый (или даже нулевой), вклад в стабильность спирали. Правильность
этого, на первый взгляд довольно неожиданного, вывода подтверждается
тем, что водородные связи не изменяются заметным образом при переходе
от спирали к клубку. Водородные связи между основаниями просто
заменяются связями между основаниями и молекулами растворителя. И хотя
первые из них сами по себе могут быть несколько прочнее вторых, но зато

Нуклеиновые кислоты
151
число вторых должно быть большим, поскольку молекулы НгО могут играть
роль как доноров, так и акцепторов при образовании водородных связей.
Основной вклад в стабильность спирали вносят гидрофобные (неполярные)
силы или так называемое стэкинг-взаимодействие. О природе и величине
этих сил известно очень немногое.
Нативная и денатурированная конформации. При исследовании процесса
денатурации можно идентифицировать ряд конформации для
денатурированных форм. Одно предельное состояние — это, естественно, полностью
упорядоченная двуспиральная комплементарная конформация / (фиг. 56).
Фиг. 56. Гипотетические конформации, возникающие в процессе денатурации.
I—двойная спираль (комнатная температура, водный раствор, нейтральная среда); II—разупо-
рядоченпые и упорядоченные участки; цепи связаны, но в упорядоченных участках может уже не быть
водородных связей; III — разупорядоченные и упорядоченные участки; связь между цепями нарушена,
но сохранена возможность образования некомплементарных пар оснований, в основном за счет стэкинг-
взаимодействия; IV — упорядоченные участки почти полностью отсутствуют (беспорядочно свернутый
клубок); цепи все еще остаются соединенными; V—разделившиеся хаотические клубки;
VI—разделившиеся клубки со значительной степенью внутримолекулярной спиральности (показаны два
крайних случая).
Другим предельным состоянием является полностью разупорядоченная
конформация, отвечающая двум отдельным гибким беспорядочно свернутым
клубкам, у которых отсутствует какая бы то ни было степень структурной
организации (конформация V). Это состояние соответствует полностью
и «необратимо» денатурированной форме, в которую молекула ДНК
переходит при высоких температурах, при экстремальных значениях pH и т. д.
В этих случаях не только d-метод, но и г-метод обнаруживает завершение
перехода (кривая А2 на фиг. 55). После удаления денатурирующего агента
и возвращения к стандартным условиям упорядоченная структура в какой-то
мере все же восстанавливается. На фиг. 56 показаны два возможных типа

152 Глава V
конформации (III и VI), которые могут при этом возникнуть. Эти конфор-
мации отражают возможную степень восстановления упорядоченности одно-
цепочечных полинуклеотидов (либо гомогенной ДНК, либо РНК, если
считать, что имеется одна только цепь А). По своей форме кривые
денатурации таких полимеров аналогичны кривым второго цикла денатурации
«необратимо» денатурированного двухцепочечного полинуклеотида,
обозначенным на фиг. 55 как А" и А (А^~ для минимальной и А\~ для
относительно высокой степени комплементарности, присущей одиночным цепям).
Промежуточными состояниями в большинстве процессов денатурации
являются, по-видимому, конформации типа IV — весьма сильно
дезориентированные клубки, все еще удерживаемые один около другого очень
короткими комплементарными участками, идентичными по своему характеру
тем, какие присутствуют обычно в нативных структурах. Существованием
таких конформации объясняются различия между так называемыми
обратимыми и необратимыми процессами (см. описанные выше d- и і-методьі).
У ДНК с поперечными ковалентними связями или у кольцевых ДНК
некоторые участки всегда остаются спиральными, и денатурация в этих случаях
является обратимой до тех пор, пока не затронуты эти поперечные связи
(кривая В на фиг. 55). При тепловой денатурации и денатурации иод
действием высоких значений pH или некоторых органических растворителей
были идентифицированы также промежуточные формы типа // (фиг. 56).
В такой форме молекула содержит как полностью упорядоченные, так
и разупорядоченные участки и сохраняет способность при соответствующем
изменении условий немедленно принимать полностью упорядоченную
исходную конформацию.
Необратимая денатурация. В последние годы много внимания было
уделено изучению процессов разделения и рекомбинации комплементарных
цепей в двухцепочечных полинуклеотидах. Оказалось, что при
соответствующих условиях две комплементарные цепи можно полностью разделить.
Этот процесс протекает достаточно медленно (в течение нескольких минут)
и требует относительно жестких условий: он идет хорошо в тех случаях,
когда температура или величина отклонения pH от нейтрального значения
превышают значения, соответствующие точкам обратимого перехода (см.
фиг. 55). Процесс, обратный денатурации (рекомбинация двух цепей), может
быть осуществлен только при соблюдении некоторых, перечисленных ниже
условий.
1. Процесс рекомбинации должен быть термодинамически выгодным,
т. е. его следует проводить при температурах намного ниже tm в растворах
с относительно высокой ионной силой.
2. Этот процесс должен быть выгоден также и кинетически.
Рекомбинация разделившихся цепей представляет собой реакцию второго порядка,
и, следовательно, она должна идти легче при высоких концентрациях
нуклеиновой кислоты. Цепи должны иметь возможность «подойти» друг к другу
достаточно близко. Это также обеспечивается высокой ионной силой и, кроме
того, присутствием специфических противоионов (например, Mga+) и
отсутствием зарядов на основаниях, т. е. электронейтральностью цепей.
3. Для полного восстановления исходной степени упорядоченности
должны полностью восстановиться все комплементарные пары оснований.
Это условие легко выполняется в случае гомополимеров, т. е. при
образовании пар дГ : дЦ, рУ : рА или дАТ : дАТ. Что же касается природных
полинуклеотидов, то для них весьма высока вероятность беспорядочного и
некомплементарного спаривания, в результате чего должны возникать
структуры, содержащие лишь очень короткие комплементарные участки, а также
участки с несовершенным спариванием (тип III на фиг. 56). Для того чтобы
произошло полное восстановление структуры, такие участки с несовершен-

Нуклеиновые кислоты 153
ным спариванием должны быть предварительно вновь разрушены. Это
находит свое отражение в высокой свободной энергии активации, в том,
что температура, при которой может происходить процесс рекомбинации,
ниже tm, и, наконец, в достаточно большой продолжительности
рекомбинации. Процесс рекомбинации был удачно назван «отжигом» (см. фиг. 52,В
и Г, а также кривую Л^ на фиг. 55).
4. «Отжигу», или рекомбинации, благоприятствуют условия, при
которых отбираются и соединяются гомологичные спаривающиеся участки.
Для полинуклеотидных цепей в растворе важнейшим таким условием
является молекулярная гомогенность. Поэтому, например, легче всего
осуществляется ренатурация ДНК, выделенной из мелких вирусов; труднее
осуществить ее с ДНК из крупных вирусов, еще труднее — с бактериальной
ДНК и, наконец, совсем трудно (если только вообще возможно) — с ДНК
из высших организмов. Сказанное означает также, что процессу «отжига»
должны благоприятствовать условия, при которых одна из цепей остается
неподвижной (будучи, например, закреплена в агаровом геле или на колонке
с гидроксилапатитом), а другая распадается на фрагменты относительно
небольшой длины (мол. вес 10*—105).
5. Процесс гибридизации может быть использован для определения
степени сродства не только между комплементарными цепями ДНК из разных
клеток или организмов, но также и для определения сродства между каждой
из цепей ДНК и различными типами РНК, поскольку все клеточные РНК
синтезируются, как известно, на ДНК-матрицах х. Гибридизация между
N1SD- и №*Н-содержащими цепями из «тяжелой» и «легкой» ДНК
(первоначально присутствовавшей в растворе) служит также наиболее
убедительным доказательством существования самого феномена разделения двух
цепей и их рекомбинации (см. фиг. 52).
ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИДЫ
ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИЯ
Рибонуклеиновая кислота (РНК) была обнаружена почти во всех
клеточных фракциях. Однако наибольшее ее количество (обычно 50—60%, а в
некоторых клетках до 80% общего содержания) сосредоточено в рибонуклео-
протеидных частицах, называемых рибосомами. Рибосомы соединены в
агрегаты, которые носят название полисом или эргосом, а эти последние в свою
очередь могут быть ассоциированы с другими цитологически
идентифицируемыми компонентами клетки, такими, как эндоплазматическая сеть в
высокоспециализированных клетках высших организмов или клеточная мембрана
в микробных клетках. Сходные с рибосомами частицы обнаруживаются часто
в непосредственной близости от хромосом, т. е. от ядерного аппарата клетки.
С хроматином (иначе говоря — с ДНК) связаны по меньшей мере два типа
РНК — упомянутая рибосомная РНК и информационная РНК (см. ниже);
кроме того, значительное количество РНК содержится в ядрышке. Эти
разные формы ядерной РНК составляют в сумме 10—20% всей РНК клетки.
РНК была обнаружена также и в растворимой части цитоплазмы (т. е. в той
ее фракции, которая не осаждается после нескольких часов
центрифугирования при 140 000 g); на долю этой фракции приходится примерно столько
же, т. е. 10—20% всей клеточной РНК. Наконец, небольшое количество
1 Идентификация и выделение таких гибридных комплексов ДНК — РНК
облегчаются следующими обстоятельствами: 1) РНК, входящая в состав гибридного комплекса,
относительно малочувствительна к действию панкреатической РНК-азы; 2) при
центрифугировании в градиенте плотности CsCl гибридный комплекс дает полосу, занимающую
промежуточное положение между полосами ДНК и РНК; 3) гибридные комплексы
в отличие от РНК сорбируются на фильтрах из нитроцеллюлозы.

154
Глава V
РНК содержится в митохондриях животных и растительных клеток и в
хлоропластах растений. Функции всех этих типов РНК связаны с той или иной
фазой белкового синтеза (см. гл. XXI).
С рибосомами связан механизм, при помощи которого аминокислоты
вступают в реакцию поликонденсации, образуя полипептидные цепи.
Матрицей в этом процессе служит особая форма РНК — информационная РНК,
синтезируемая на одной из двух цепей соответствующего участка ДНК и
комплементарная этой цепи. Информационная РНК переносится от ДНК к
рибосомам и присоединяется к ним. Сюда же к рибосомам доставляются и
аминокислоты. Они переносятся к рибосомам и выстраиваются на РНК-матрице
при помощи адапторов, роль которых играют 20 с лишним различных
транспортных РНК, составляющих упомянутую выше фракцию растворимой РНК.
Еще один класс РНК мы встречаем у вирусов. В мелких сферических
вирусах бактерий и растений (таких, как вирусы f2 и MS2 Е. сой или вирус
желтой мозаики турнепса) содержится РНК с молекулярным весом от 1-Ю6
до 2-Ю6; небольшие палочковидные вирусы, вроде вируса табачной мозаики,
содержат РНК приблизительно такого же молекулярного веса, и, наконец,
в крупных вирусах животных (пример — вирус ньюкастльской болезни)
присутствует более высокомолекулярная РНК.
НУКЛЕОТИДНЫЙ СОСТАВ
Нуклеотидный состав различных типов РНК, выделенных из разных
источников, приведен в табл. 23. Легко видеть, что свойственная ДНК
удивительная комплементарность (см. выше правила Чаргаффа) отсутствует
даже у вирусных РНК. Единственная закономерность, которая
соблюдается для РНК, состоит в том, что Г -|- У ~ А + Ц. По своему
суммарному нуклеотидному составу информационная РНК, особенно в том случае,
если она синтезировалась путем считывания относительно больших участков
ДНК, часто ближе к ДНК, чем к другим типам РНК. Однако, как мы
увидим далее, сильно выраженная вторичная структура (спиральность) мешает
молекуле РНК выполнять свойственную ей функцию. Большинство видов
рибосомных РНК микробного происхождения содержит около 52 мол.%
Г -(- Ц, а большая часть растворимых РНК — около 58 мол.% Г -|- Ц,
причем эти величины никак не коррелируют с нуклеотидным составом ДНК
тех же клеток.
Таблица 23
Нуклеотидный состав различных
Источник 1)
Печень крысы D2% ГЦ)
Дрожжи C6% ГЦ)
Bacillus cereusC5% ГЦ)
Escherichia coli E0% ГЦ)
Тип РНК
Ядерная
Ядрышковая
Митохондриальная
Рибосомная
Растворимая (в основном
транспортная 2))
Информационная
Рпбосомная (средпее из двух
серий определений)
Растворимая 2i 3>
Информационная
Из неочищенных рибосом
Растворимая 2)
Из ЗОв-рибосом
типов
А
20,2
16,3
17,8
20,0
20,9
23,8
26,5
25,9
18,5
27,5
25,2
20,5
24,6
РНК
г
25,7
33,0
31,8
30,5
30,9
28,3
20,1
27,7
29,2
25,1
31,7
31,1
31,6
ц
29,5
29,9
28,4
31,6
28,5
27,4
24,0
19,4
28,4
20,3
21,9
28,0
22,8
У
24,6
20,7
20,9
20,2
20,4
20,5
29,4
26,7
20,0
27,1
21,2
18,8
21,0
¦фУ 2)
3,8
1,6
•

Нуклеиновые кислоты
155
Продолжение табл. 23
Источник 1)
Micrococcus lysodeikti-
kus G2% ГЦ)
Вирус табачной мозаики
Вирус желтой мозаики
турнепса
Вирус раневых
опухолей
Вирус полиомиелита
Реовирус
Вирус F2(MS2)
Тип РНК
Из 50Б-рибосом
Из 70S-pH6ocoM
Растворимая (сроднее из трех
серий определений)
Информационная
Из «больших» рибосом
Из «малых» рибосом
Растворимая 2)
Вирусная (из вирусов
растении)
То же
» »
Вирусная (из вирусов
животных)
То же
Вирусная (из вирусов
бактерий)
А
25,6
25,0
19,3
24,1
23,0
22,2
19,6
29
23
31,1
29
28,0
22
г
31,4
31,5
32,0
27,7
33,3
31,5
31,7
26
17
18,6
24
22,3
26
Ц
20,9
22,1
28,3
24,7
20,8
22,1
25,1
19
38
19,1
22
22,0
27
у
22,1
21,4
16,0
23,5
22,7
24 1
23',4
27
22
31,3
25
27,9
25
1|)У2)
5,9
і) В скобках указан нуклеотидный состав ДНК из того же источника.
г) Содержание і|)У в тех случаях, когда оно не указано, включено в содержание У. Растворимая
РНК, помимо 1|)У, содержит еще и ряд метилированных оснований в значительно более высоких
концентрациях, чем любой другой тип РНК. В растворимой РНК из печени крыс 25% У замещены на г|УУ;
кроме этого в ней содержится 10% 5-метилцитозина,,, 8,1% 6-метиламинопурина и приблизительно
по 3% 1-метилгуанина, 2-метил-6-оксипурина и 2,2-дпметил-6-оксипурина.
S) См. табл. 24.
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА
Рибосомную и вирусную РНК лучше рассматривать вместе, поскольку
мы имеем здесь дело с молекулами, близкими как по своим размерам, так
и по свойствам. Эти полирибонуклеотиды состоят, по-видимому, из
одинаковых одноцепочечных и чрезвычайно гибких молекул, легко
претерпевающих деформацию. В гидродинамическом отношении такие молекулы ведут
себя как беспорядочно свернутые клубки (особенно при низкой ионной силе
и высокой температуре). Из этого вытекают следствия, о которых мы уже
говорили выше: во-первых, сильная зависимость различных оптических
и гидродинамических свойств этих полирибонуклеотидов от ионной силы
и от некоторых других факторов и, во-вторых, близкое сходство ряда
теоретических и экспериментальных параметров с соответствующими параметрами
для других полиэлектролитов. Отдельные структурные компоненты в
молекуле РНК связаны между собой так же, как они связаны в ДНК; иными
словами, молекула этого полирибонуклеотида представляет собой одиночную
неразветвленную цепь, построенную из мономерных единиц, которые
связаны между собой 3',5'-фосфодиэфирными связями. Поскольку ОН-группа
в положении 2' не замещена, полирибонуклеотиды расщепляются под
действием не слишком концентрированной щелочи (что отличает их от поли-
дезоксирибонуклеотидов); другие характерные для них реакции рассмотрены
выше. Способность свободных аминогрупп вступать в реакции с такими
соединениями, как HNO2 и НСНО, у РНК выше, чем у ДНК (но ниже, чем
у свободных нуклеотидов); однако не все остатки, по-видимому, одинаково
реакционноспособны. Гипохромизм у РНК выражен слабее, а интервал
денатурационного перехода у них значительно шире, чем у двухцепочечных
ДНК. Кривые денатурации напоминают по форме кривые, получаемые при
плавлении одноцепочечных НК. Положение точки перехода у РНК, так же

fi —0 —Алатл
A
рГ = Ц
I I
I \ А-О-Феиилаланил
Г У I
к \
г-ц-г~ц у-ц-ц-г-г у
СН3 І у (Ч \ ГУ
І І її
ц=г ^г^ А \у=\д
,\~ г fHz m II m m m и m n m г
У Ф Г г—^-Г—Ц^ СН.Ц—У —Г-У —Г '
чи-г-ц' -*ц=г\ і
*-Ц-Ц~Г-^- ! J, Г—ГСНз
(У) АГ*
(А) Г=иСН3
І І
А -0 -Серил „ п '^ = "Ч.
її ' *
ц у у
f СН30Г—А—А
Г ¦*- Ц-У-У —
= 1 (У)
Г У
I / о
і і
I J А -0- Тирозил
__г /4 = У I
У Н, ""^х СОСНз I I .. Ц
І І VVf -г «=г
^=1р Л / унг '^ і і
Г "' А Ч с^/-у Р^ /
у _^ f-^m сн.ог и-ц-г^г ^г^ц-ц-ц—ц-г-ц
Vh"^/ . ' і II ill НІ снз Ні 111 111 ill III
И-Г-А г Г—Г—Ц Г— Г~Г— Ц— Г
М) чУНг.унГ^ сн311,\ ун,
УА = К
ц чд гн
| \ /СН3
У __ X
-*— Ц-4-У-*-
ГУ)
Фиг. 57. Полная структура некоторых транспортных РНК из дрожжей.
А. Аланиновая s-PHK; Б. Фенилаланиновая s-PHK. В. Сериновая s-PHK (два вида, ом. табл. 24).
Г. Тирозиновая s-PHK. В каждом случае показаны предполагаемый антикодон и комплементарные
ему основания в информационной РНК. Звездочкой указаны делении оснований в сериновой s-PHK:
И — инозин; г|) — псевдоуридин; Y — неидентифицированное основание; А — АИП означает 6-ами-
ноизопентениладенозин.

Таблица 24
Сравнение гомологичных нуклеотидных последовательностей аланшювой,
сериновой, тирозиновои и фенилаланиновой s-PHK (из дрожжевых клеток) 1)
Hi
d
10
н2
20
Щ
b 30
Нз
40
Аланино-
вая
s-PHK
фг
p
Г
Ц
г
У
г
*У
Г(СНз)
*г
*ц
г
ц
г
1
У
*А
*г
*УН2
Ц
*г
*г
—
—
УН2
*А
т
±
Ц
*г
•ц
*Г(СН,J
У
ц
Ц
Ц
У
*У
и
г
J.
Ц
И(СНз)
хр
Серино-
вая
s-PHK
ФГ
р
ц
А
А
ц
у
У
Г
Г
Ц
Ц(СОСНз)
Г
—
А
Г
УН2
—
Г(ОСНч)
V о/
—
—
УН2
А
\
г
г
ц
Г(СН3J
А
А
А
Г
А
У
И
р
А
А-АИП
А
Тирози-
новая
s-PHK
ФЦ
ц
У
ц
г
г
у
А
Г(СН3)
Ц
Ц
А
А
Г
УН2
УН2
Г(ОСНз)
УН2
УН2
УН2
А
д
г
г
ц
Г(СИ3J
\ OJ U
ц
А
А
Г
А
5
г
А
А(СН3J
А
Фенил-
аланино-
s-PHK
ФГ
Г
г
А
У
У
У
А
Г(СН3Ї
ц
У
ц
А
Г
УН2
УН2
г
г
—
—
г
А
і
А
Г
Ц
ПСИ-,).,
\ aj L
Ц
ц
А
Г
А
Ц(ОСНз)
Г(ОСНз)
д
/А.
А
Y
А
На
50
с
60
н4
L3
70
Ні
80
ІІ'і
dS6
Аланино-
вая
s-PHK
Г
г
г
А
Г
А
*г
—
—
—
—
—
—
ун2
J.TT
*ц
У
ц
ц
г
*г
*х
*г|з
*Ц
*Г
*А
У
У
•ц
ц
г
г
А
Ц
У
ц
г
У
ц
Ц
А
Серино-
вая
s-РНК
Ц
У
У
У
У(ОСНз)
г
г
р
1
ц
У
У(Ц)
г
ц
Ц
ц
г
ТТ/ПТТ \
Ц(СН3)
г
ц
А
Г
Г
т
1>
Ц
Г(А)
А
Г(А)
У
Ц
Ц
У
Г
ц
А
Г
У
У
г
У
ц
г
ц
Ц
А-
Тирози-
новая
s-PHK
Ц
У
У
Г
А
Г
А
z
—
—
—
—
—
—
УИ2
TT/PU \
Ц(СНз)
г
г
г
ц
г
т
ц
Г
А(СН3)
Ц
У
Ц
Г
ц
Ц
Ц
Ц
Ц
Г
Г
Г
А
Г
А
-ОН
Фенил-
панино-
s-PHK
Ц(СН3)
У
Г
Г
А
Г
Г(СН3)
Z
—
—
—
—
—
—
—
у
тт
ц
Ц(СНз)
У
Г
У
г
т
Ц
Г
А(СНз)
У
Д
ц
А
Ц
А
Г
А
А
У
У
Ц
Г
ц
А
1) Hl, H] — первая спиральная область; Н^, Нг — вторая сшгрпльпая область и т. д.; а, Ь, с, d —
связующие участки; Li, L2, L3 — петли. Звсядочкой отмечены осяооаиия, общие для исех четырех
типов РНК.

158
Глава V
как и у ДНК, зависит от нуклеотидного состава, однако эта зависимость
выражена слабее. Почти все переходы в случае РНК легко обратимы. Эти
и некоторые другие наблюдения позволяют предположить, что структура
высокомолекулярной РНК в растворе с высокой ионной силой включает
короткие спирализоваыные участки (содержащие стопки связанных
водородными мостиками АУ- и ГЦ-пар), чередующиеся с участками, где такого
рода упорядоченная организация отсутствует (или, во всяком случае, не
обнаружена).
Транспортные РНК (s-PHK) представляют собой небольшие полирибо-
нуклеотиды с молекулярным весом около 25 000. В силу своих небольших
Придан
Аденозин
\ О H —N
Mo /
"ЇХ
Рибоза
i
Цитидин Гуанозин о Н
H HN —C-C —NH-C*
H '-H-r^P »^
,МЛ _ >=N Рибоза
Рибоза ,ч*~~ i
i H
ch,oh
\( y
он он
/
0
ok)'
\
R
5fi ЬигиЬраиридин
S
oU
1
R
Тиоуриоин
0
HN NH
Ь-рибозилурацил
(псеваоцридии)
HN-\ N
^ I II '1
'і
R
Инозин
NH—СО—CHj
nA>
''l
R
-ацетилцитидин
N^-j^ N
R
NF)y, у-аиттшюллилаЬетзин
( 6-аминоизопентениладенозин}
Фиг. 58. «Необычные» основания и нуклеозиды транспортной РНК.
Стрелки указывают места, чувствительные к реакции алкилирования.
размеров эти полирибонуклеотиды могут служить особенно удобным
объектом для химического исследования. В настоящее время полностью
установлена структура нескольких таких РНК.
Несмотря на малый молекулярный вес и сравнительно высокое
содержание необычных (минорных) оснований (фУ и т. д.), структура этих РНК
обладает удивительно высокой степенью упорядоченности. Особенно высока
упорядоченность в присутствии ионов Mg2+, абсолютно необходимых для
осуществления биологической функции s-PHK; одновалентные катионы
даже в больших концентрациях подобного эффекта не вызывают. В
присутствии ионов Mg2+ меняется не только точка теплового перехода, но также
и его ширина (а следовательно, кооперативность перехода и стэкинг-взаимо-
действие между парами оснований). При этом оказывается весьма
затруднительной реакция с рибонуклеазой или формальдегидом. На фиг. 57 пока-
запы полная первичная и предполагаемая вторичная структуры аланиновой
5-РНК (исследована Холли), тирозиновой s-PHK (исследована Мэдисо-
ном в лаборатории Холли), двух достаточно близких сериновых s-PHK
(изучены Цахау и его сотрудниками) и фенилаланиновой s-PHK
(исследована группой Кораны). Все эти типы РНК были выделены из дрожжевых
клеток. Две сериновые РНК содержат по 84 нуклеотида, фенилаланино-

Нуклеиновые кислоты 159
вая — 76, аланиновая — 77 и тирозиновая — 78 нуклеотидов. Их
структуры, по-видимому, достаточно близки; Джукс высказал предположение,
что все они могли произойти из одного общего предшественника в результате
мутаций. Сходство, "гомология и различия между этими четырьмя
молекулами наиболее четко выявляются при рассмотрении табл. 24. Особо следует
обратить внимание на большое число минорных оснований и нуклеозидов
(в аланиновой s-PHK — 9, в сериновой — 12, в фенилаланиновой — 12
и в тирозиновой — 15).
Помимо псевдоуридина, инозина (И), представляющего собой нуклеозид
гипоксантина (см. фиг. 45), дигидроуридина (УН2) и различных N-moho-
и диметилпроизводных, встречаются также О-метильные производные и 6-
аминоизопентениладенозин. Структуры этих производных показаны на
фиг. 58. Их биологические функции рассмотрены в гл. XXI.
СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИДЫ
При действии полинуклеотидфосфорилазы на индивидуальные нуклео-
зиддифосфаты или на смеси разных нуклеозиддифосфатов образуются гомо-
или гетерополирибонуклеотиды (см. стр. 512). Эти соединения получили
широкое применение в качестве простейших моделей] РНК и ДНК (см.
стр. 152). Особенно полезными оказались гомополимерные пары поли-A -)-
-f- поли-У и поли-И -f- поли-Ц, образующие в растворе стехиометрические
дуплексы (рА : рУ и рИ : рЦ) \ а также гетерополимеры поли-АГУЦ с
различным соотношением оснований. В гл. XIX описывается применение этих
и некоторых других полимеров для решения проблемы генетического кода.
РНК-полимераза, использующая в качестве матрицы дГ или дЦ, а в
качестве субстрата — ЦТФ или ГТФ, образует дуплексы дГ : рЦ или дЦ : рГ.
ДНК-полимераза в присутствии такой затравки, как рА : рУ, с дАТФ -)-
-f- дТТФ в качестве субстрата образует дуплекс дА : дТ (мы уже упоминали
об этом выше в разделе «Полидезоксирибонуклеотиды»).
НУКЛЕОПРОТЕИДЫ
НУКЛЕОГИСТОНЫ
Как правило, все ДНК и РНК животного и вирусного происхождения
(за исключением, возможно, транспортных РНК) in vivo более или менее
прочно связаны с белками. Особый интерес с этой точки зрения
представляют гистоны — семейство чрезвычайно гетерогенных основных белков
относительно низкого молекулярного веса, которые, по-видимому, образуют
прочные стехиометрические комплексы с ДНК во всех соматических клетках
любого высшего организма, растения или животного. Гистоны можно отделить
от ДНК и подвергнуть хроматографическому разделению. При этом удается
получить четыре основные фракции. Другие методы разделения позволили
установить, что каждая из этих фракций, начиная от фракции I, наиболее
богатой лизином, и кончая фракцией IV, наиболее богатой аргинином, в свою
очередь может быть разделена на несколько фракций. С помощью рентгено-
структурного анализа были получены некоторые данные о вторичной
структуре свободных гистонов, выделенных из нуклеопротеидов, а также о
структуре белка и ДНК в составе нуклеопротеида. В свободных гистонах, судя
1 Молекулы поли-Г оказались менее склонными к образованию комплексов; они
лишь с трудом связываются друг с другом в растворе, а наиболее устойчивым
соединением с поли-Ц является тройной комплекс Г : Ц : Г. Что же касается поли-A, то в кислой
среде (pH ~ 4) эти молекулы спирализуются сами па себя и образуют несовершенные
двухцепочечные спирали. Двойной комплекс поли-А : поли-У представляет собой двух-
цепочечную спираль со структурными параметрами, очень близкими к параметрам ДНК.

160 Г л а в а V
по всему, весьма велик процент спирализованных участков (по-видимому,
в форме а-спирали); в нуклеогистоне, очевидно, сохраняется и
стабилизируется та же структура. Можно думать, что ДНК в составе нуклеогистона
имеет ту же конфигурацию (B-спираль), которая свойственна ДНК в растворе.
Неясным в настоящее время остается вопрос о том, как расположены в нуклео-
гистонах белковые спирали — параллельно спиралям ДНК или же под
прямым углом к ним. Если справедливо последнее, то структуру нуклеоги-
стопа можно было бы представить себе в виде решетки, в которой несколько
параллельных молекул ДНК скреплены лежащими поперек молекулами
гистона.
ДНК, соединяясь с гистонами, может утрачивать способность служить
матрицей в процессе транскрипции, т. е. при синтезе комплементарной РНК
в реакции, катализируемой in vitro ДНК-зависимой РНК-полимеразой
(см. гл. XX). Поскольку именно данный тип РНК выполняет в дальнейшем
роль матрицы при белковом синтезе, это влияние гистонов служит
механизмом, контролирующим синтез белка на уровне транскрипции (см. гл.
XXI).
В зрелой сперме некоторых рыб ДНК образует комплекс не с гистонами,
а с другими основными белками — протаминами. Эти белки обладают резко
выраженными основными свойствами и содержат большое количество
аргинина, что сближает их в какой-то мере с соответствующей фракцией
гистонов. От гистонов их отличает, однако, меньший молекулярный вес,
меньшая гетерогенность — по молекулярному весу и аминокислотному составу —
и, наконец, видовая специфичность, которая им, как можно думать,
присуща. Замена гистонов на протамины в процессе сперматогенеза — весьма
интересный факт, если иметь в виду химические аспекты субклеточной
дифференцировки.
ВИРУСЫ
В группе вирусов мы находим необычайно любопытный пример
автономных и гомогенных нуклеопротеидов. Вирусы — облигатные паразиты,
способные размножаться только в клетках организма-хозяина (которым в
зависимости от вида вируса является животное, растение или бактерия). Для
этого размножения вирусы используют метаболический аппарат хозяина,
перестраивая и направляя его работу. Вирусам присущи главнейшие черты
живого: способность воспроизводить самое себя, способность к размножению,
к мутациям и к обмену генетическим материалом (при наличии более чем
одного родителя). В то же время их можно выделять в чистом, а часто даже
и в кристаллическом виде, можно хранить, подвергать исследованию и
анализировать, короче говоря, с ними можно обращаться как с
индивидуальными химическими веществами. Таким образом, являясь частью живой
природы, вирусы вместе с тем снабжают исследователей относительно простыми
моделями тех процессов жизнедеятельности, которые характерны для более
сложных форм.
Рассмотрим в общих чертах основные классы вирусов и их хозяев. Вирусы
бактерий, или бактериофаги, часто имеют довольно большие размеры. Их
нуклеиновая кислота (обычно регулярная двухцепочечная ДНК) заключена
в многогранной головке, построенной из многих мелких (мол. вес около
2¦ 104) идентичных белковых субъединиц. Нередко у этих вирусов имеется
также более или менее гибкий отросток, или хвост, служащий для
присоединения вируса к клетке-хозяину и для введения в клетку вирусной ДНК. Этот
«хвост» представляет собой иногда весьма сложное образование, так как
он может состоять из многих частей, различных и по структуре и по функции;
соответственно этому и число различных белков, содержащихся в одном
и том же вирусе, может быть в ряде случаев достаточно большим. Некоторые

Нуклеиновые кислоты 161
мелкие бактериофаги содержат необычную нуклеиновую кислоту: у фага
срХ174 это относительно низкомолекулярная одноцепочечная кольцевая
ДНК; у фага MS2 — одноцепочечная молекула РНК. Этим обстоятельством,
а также икосаэдрической симметрией своей белковой оболочки (так
называемого капсида) упомянутые бактериофаги напоминают небольшие вирусы
растений или животных.
Капсид таких вирусов («поверхностный кристалл») состоит из
симметричных скоплений структурных белковых субъединиц. Эти блоки из
субъединиц называют капсомерами. Именно они представляют собой те
морфологические единицы, из которых построен капсид. Капсомеры легко видеть на
электронных микрофотографиях. Наиболее мелкие вирусы содержат 60
структурных белковых субъединиц, объединенных в 12 капсомеров.
Все вирусы растений содержат РНК. Существует два главных типа таких
вирусов. Для первого из них характерна спиральная структура. Примером
вируса этого типа может служить вирус табачной мозаики (ВТМ). Его капсид
состоит из многих B100) идентичных структурных субъединиц с
молекулярным весом 18 000, располагающихся по спирали вокруг центрального
канала (диаметром 40 А), в котором находится молекула РНК. Таким
образом, РНК ВТМ заключена как бы внутри трубки из белка, а вирус в целом
имеет форму палочки диаметром 150 A и длиной около 3000 А. Такие
палочки, во всех отношениях идентичные исходному вирусу, были получены
in vitro при смешивании изолированной высокоочищенной РНК ВТМ
и гомогенного белка ВТМ (полная первичная структура которого в
настоящее время известна). Следовательно, спиральный тип структуры может
образоваться путем непосредственной агрегации компонентов. Он
обеспечивает максимальную площадь поверхности, контактирующей с внешней
средой, и максимальное взаимодействие между нуклеиновой кислотой и белком.
Перед инфекцией или непосредственно в процессе инфекции структура этого
типа претерпевает, вероятно, полное разрушение.
Другой тип стабильного и симметричного построения найден у икоса-
эдрических вирусов, например у вируса кустистой карликовости томатов.
Изометрический капсид этого вируса (диаметром около 200 А) состоит
приблизительно из 60 капсомеров, содержащих около 200 структурных
субъединиц. Образование такой структуры есть, несомненно, результат
процесса более сложного, чем простая агрегация компонентов. Для этой
структуры характерна минимальная площадь поверхности,
контактирующей с внешгей средой. Необязательно, видимо, также, чтобы вся
нуклеиновая кислота находилась в контакте с белковой оболочкой, а сама белковая
оболочка не должна разрушаться для того, чтобы генетический материал
вируса мог выйти из нее наружу.
Вирусы животных содержат либо РНК, либо ДНК; в первом случае
они часто репродуцируются в цитоплазме, во втором — в ядре клетки
хозяина. Небольшие РНК-содержащие вирусы, например вирус коксэкки
или вирус полиомиелита, представляют собой простые полиэдрические
нуклеопротеиды, сходные с описанными выше вирусами растений. Вирусы,
вызывающие, например, энцефалит или грипп, также содержат
сравнительно низкомолекулярную РНК, но имеют при этом гораздо более крупные
размеры (оставаясь полиэдрическими), частью вследствие того, что в них
присутствуют помимо белка и РНК еще и другие компоненты — липиды или
полисахариды. Одна из наиболее интересных групп вирусов животных —
это так называемые реовирусы. Они содержат высокомолекулярную двуспи-
ральную РНК, состоящую из двух комплементарных цепей; по своим
химическим, структурным и функциональным свойствам эта РНК весьма
напоминает обычную ДНК. Сходная группа вирусов известна и у растений. Сход-
Н — 246

162 Глава V
ство проявляется в морфологии, в размерах (капсиды диаметром 700 А,
состоящие из 92 капсоморов) и, наконец, в содержании и структуре РЫК.
Эти вирусы патогенны для многих видов растений, а у некоторых видов они
вызывают опухоли, возникающие обычно на месте поранений (откуда и само
название — вирусы раневых опухолей). Вирусы этой группы размножаются
в растениях, но переносятся от одного растения к другому насекомыми
(цикадами).
К ДНК-содержащим вирусам относятся возбудители многих серьезных
заболеваний, в том числе вирусы герпеса, осповакцшгы, кори, свинки,
пситтакоза, бешенства и полиомы (крайне злокачественной опухоли
грызунов). Вирусы группы осповакцины и пситтакоза имеют крупные размеры —
от 1500 до 2000 А. По крайней мере один из них, а именно вирус
осповакцины, содержит, по-видимому, одноцепочочную ДНК. ДНК вируса полиомы
имеет молекулярный вес около 3,0-10е. Это первая двухцепочечная ДНК,
у которой (при помощи химических и физических методов) была выявлена
кольцевая форма.
Вирусная РНК с наименьшим молекулярным весом выделена из сателлита
вируса некроза табака. Этот вирус получил такое название потому, что он
неизменно встречается вместе с обычными штаммами вируса некроза табака,
а в отсутствие таких штаммов оказывается неспособным размножаться в
растениях. Тем не менее это особый вирус, который может быть идентифицирован
иммунологически. Его РНК (А = 28,9%, Ц = 22,1%, Г = 25,0% и У =
= 24,9%) имеет молекулярный вес 4,0-105 (s20, w = 13,5S; 1200 пуклеотидных
остатков). Молекулярный вес белковых субъединиц его капсида равен
39 000 C72 остатка). Следовательно, РНК вируса, очевидно, кодирует
только один этот белок (см. гл. XIX).
ЛИТЕРАТУРА
Allen F., Riborracleoproloins and Rihonucloic Acids, Elseviev, Amsterdam, 1962.
С h а г g а ї і Е., Essays on Nucleic Acids, Elsoyier, New York, 1963.
Davidson J. N., Biochemistry ot the Nucleic Acids, 4th ed., Wiley, New York, 1960.
Information Macromolecules, H. J. Vogel, V. Bryson, and J. O. Lampen (eds.), Academic,
New York, 1963. (Информационные макромолекулы, изд-во «Мир», M., 1905.)
J ci г d a n D. О., The Chemistry of Nucleic Acids, Butterworth, Washington, I960.
M a r t і n R. В., Introduction to Biophysical Chemistry, chaps. 6, 8, 10, 11, 13, and 17—20,
McGraw-Hill, New York, 1964. (P. Мартин, Введение в биофизическую химию, пзд-во
«Мир», М., 1966.)
M ichels on A. M., The Chemistry of Nucleosirtos and Nucleotides, Academic, New-
York, 1963.
Nucleic Acids, in «Comprehensive Biochemistry», vol. 8, part B, M. Florkin and E. H. Stotz
(cds.), Elsevier, New York, 1963.
P e ]¦ u t z M. F., Proteins and Nucleic Acids, Elsevier, New York, 1962.
Potter V. R., Nucleic Acid Outlines, vol. 1, Burgess, Minneapolis, 1960.
Procedures in Nucleic Acid Research, G. L. Cantoni and D. R. Davics (cds.), Harper and
Row, New York, 1966.
С п її p и и А. С, Macromolecular Structure of Ribonucleic Acids, Reinhold, New York, 1964.
Steiner R. F., Beers R. F., Jr., Polynucleotides, Elsovier, New York, 1961.
Structure and Biosynthesis of Macromoleculos, Biocliem. Soc. Symp., 21 A962).
Synthesis and Structure of Macromolecules, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 28,
A963).
T a n f о г d C, Physical Chemistry of Macromolecules, chaps. 5 and 6, Wiley, New York,
1961.
The Nucleic Acids, vols. 1—3, E. Chargaff and J. N. Davidson (eds.), Academic, New York,
1955, and I960.
The Nucleohiston.es, J. Bonner and P. Ts'o (cds.), Holden-Day, San Francisco, 1964.
«Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology», J. N. Davidson and W. E. Colin
(eds.), Academic, New York.
Baldwin R. L., Molecular Aspects of the Gene: Replication Mechanisms, in «The
Bacteria», vol. 5, p. 327, I. C. Gunsaliis and R. Stanier (eds.), Academic, New York, 1963.
F о 1 s e n f о 1 d G., M і 1 e s H. T., The Physical and Chemical Properties of Nucleic
Acids, Ann. Rev. Biochem., 36, 407 1967 .

Нуклеиновые кислоты 163
F г е е s е Е., Molecular Mechanisms of Mutations, in «Molecular Genetics», p. 207, J. H.
Taylor (ed.), Academic, New York, 1963. («Молекулярная генетика», стр. 226, изд-во
«Мир», M., 1964.)
Josse 3., Eigner J., Physical Properties of Deoxyribonucleic Acid, Ann. Rev. Bio-
chem., 35, 789 A966).
M с Q u і 1 1 о n К., Ribosomes, Progr. Biophys., 12, 67 A962).
R a j Bh., Stuart A., Nucleic Acids — Sequence Analysis, Ann. Rev. Bioclioui., 35, 759
A966).
S u є о k a N., Compositional Variation and Heterogeneity of Nucleic Acids, and Proteins,
in «The Bacteria», Vol. 5, p. 419, I. 0. Gunsalus and R. Stanier (cds.), Academic, Now
York, 1963.
Thomas CA., Jr., The Organization of DNA in Bacteriophago and Bacteria, in
«Molecular Genetics», p. 113, 3. H. Taylor (ed.), Academic, Now York, 1963. («Молекулярная
генетика», стр. 126, іізд-во «Мир», M., 1964.)
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Нуклеиновые кислоты, под ред. Э. Чаргаффа н Дж. Дэвидсона, ИЛ, М., 1957.
Белозерский А. 1-І., Баховские чтения, Изд. АН СССР, М., 1959.
Современные проблемы биофизики, том 1 и 2, ИЛ, M., 1961.
Химия и биохимия нуклеиновых кислот, сб. статей под ред. II. Б. Збарского п
С. С. Дебова, изд-во «Медицина» М., 1969.
Синтез и структура нуклеиновых кислот, Сб. статей, изд-во «Мир», М., 1966.
Г о л ь д ф а р б Д. М., 3 а м ч у к Л. А., Иммунология нуклеиновых кислот, пзд-во
«Наука», М., 1968.
Дэвидсон Дж., Биохимия нуклеиновых кислот, изд-во «Мир», М., 1968.
Нуклеиновые кислоты, сб. статей, изд-во «Мир», М., 1966.
Микельсон А., Химия нуклеозидов н нуклеотидов, изд-во «Мир», М., 1966.

Глава VI
КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Одним из проявлений жизни является удивительная способность
организмов кинетически контролировать химические реакции, подавляя
стремление к достижению термодинамических равновесий. Чтобы понять, каким
образом осуществляется этот контроль, следует рассмотреть основные законы
кинетики, определяющие протекание как простых химических реакций,
так и реакций, катализируемых ферментами.
ХИМИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА
КИНЕТИКА РЕАКЦИЙ, ПРОТЕКАЮЩИХ БЕЗ КАТАЛИЗАТОРА
Рассмотрим сначала некоторые простые химические реакции. В
простейшем случае
А -4 Р, (VI. 1)
т. е. вещество А самопроизвольно и практически необратимо превращается
в вещество Р (например, при реакции изомеризации). Скорость v такой
реакции в любой момент времени t равна —da/dt (т. е. скорости исчезновения
субстрата) или dp/dt (т. е. скорости появления продукта реакции). В
идеальном случае, для истинно мономолекулярного процесса, эта скорость по
закону действия масс должна быть пропорциональна концентрации а
вещества А в момент времени /:
"=-? = **. (VI.2)
Уравнение (VI.2), выражающее кинетический закон, называется
кинетическим уравнением рассматриваемой реакции. Правая его часть содержит
величину а в первой степени, в связи с чем такую реакцию называют
реакцией первого порядка относительно вещества Л. Коэффициент
пропорциональности к называют константой скорости реакции. Легко видеть, что эта
величина имеет размерность, обратную времени.
Рассмотрим теперь более общий случай бимолекулярной реакции, в
которой одна молекула А на стадии, лимитирующей скорость какого-то процесса,
реагирует с одной молекулой В, в результате чего образуется ряд продуктов:
А + В-^ P-MQ) + ... (VI.3)
Уравнение скорости реакции в этом случае имеет вид
da db dp
Хотя реакция в целом является реакцией второго порядка, так как ее
скорость пропорциональна произведению концентраций обоих реагирующих
веществ (соответственно а и 6), однако по каждому из реагирующих веществ
она имеет первый порядок. Константа скорости в этом примере имеет раз-
ерность (концентрация)'1- (время). В частном случае, когда реагируют

Кинетика ферментативных реакций 165
две молекулы А, кинетическое уравнение имеет следующий вид:
и=-ж=ка2- (VL5)
Эта форма уравнения сохраняется и в том случае, когда в начале реакции
концентрации веществ А и В равны.
Если в реакции, лимитирующей скорость какого-то процесса,
концентрация одного из исходных веществ во много раз превышает концентрации
всех остальных веществ, то ее можно считать практически постоянной.
Кинетическое уравнение реакции можно в этом случае записать в таком
виде, чтобы оно содержало произведение константы скорости на постоянную
концентрацию, в результате чего порядок реакции будет снижен на единицу.
Если, например, для реакции, протекающей по уравнению (VI.3), Ьо > а0,
то кинетическое уравнение этой реакции будет иметь вид:
v~kabo = k'a. (VI.6)
Иными словами, хотя реакция остается фактически бимолекулярной, ее
кинетика описывается уравнением первого порядка. Такие реакции
называются псевдомономолекулярными. Сказанное существенно не только для
кинетики обычных химических реакций, но главным образом для кинетики
ферментативных реакций, где нас обычно интересует^ лишь начальная
скорость, т. е. скорость в тот момент, когда а]= йо.
КИНЕТИКА РЕАКЦИЙ,
ПРОТЕКАЮЩИХ В ПРИСУТСТВИИ КАТАЛИЗАТОРА
Большинство обычных гомогенных химических реакций ускоряется
в присутствии особого дополнительного компонента реакции —
катализатора, концентрация которого в процессе реакции не изменяется.
Кинетическое уравнение для типичной реакции, в которой участвуют вещество А
и катализатор С, имеет вид
v — kac = k'a, (VI. 7)
где к' = кс. Реакция является бимолекулярной, однако описывается
кинетическим уравнением первого порядка, причем наблюдаемая константа
скорости к' равна истинной константе скорости реакции второго порядка,
умноженной на концентрацию катализатора с. «,.
Несколько иная ситуация имеет место в том случае, если на первой
стадии реакции катализатор соединяется с исходным веществом, а на
последующей стадии освобождается с образованием продуктов реакции. В этом,
случае имеем
""^ (VI. 8)
Кинетические уравнения, описывающие образование А, X, С и Р, имеют
вид г
—~ = Aj?c — кгх, (VI .9а)
~ = kfic - (к2 -f аз) х, (VI.96)
1 В этой книге для удобства приняты следующие обозначения: через kt, ks, къ . . .
¦ ¦ ¦ кгуї-і обозначены константы скорости отдельных стадий в прямом направления,
а через к2, &4, ^o • • • ^2п — коггетанты скорости тех же стадии а обратиоді
направлении (п — общее число стадий рассматриваемой реакции). Комиссии по ферментам
Международного биохимического союза рекомендует использовать для этих целей
обозначении кЛ і, к+2, к+3 . . . к+п и /с_4, /с2, к -з ¦ ¦ ¦ к _п. Иногда мы будем
пользоваться также и этими последними обозначениями (с дидактической целью).

166
Глава VI
de
-j—=(k2-\-k3)x — k.ac, (VI.9b)
-^f = ^, (VI.9r)
плюс уравнение баланса
co = c+x. (VI.9д)
Через определенный промежуток времени (начальный период реакции)
достигается стационарное состояние, при котором концентрация комплекса
х остается практически постоянной, т. е.
-jj- ~ 0 ~ ktac — (к2 -f- к3) х или к^с ~ (к2 + к3) х. (VI. 10)
Заметим, что стационарное состояние достигается тем быстрее, чем больше
отношение яо/со. Подставляя выражение для с из уравнения (VI. 10) в
уравнение (VI.9д), получаем
(VI.11)
Подстановка этого выражения в
уравнение (VI.9г) приводит к
основному уравнению
„ ^ da __ dP __ Z. _
(VI. 12)
ИЛИ
Va
К „
(VI. 13)
га
Фиг. 59. Кинетическая кривая,
характеризующая реакцию
где V — к$с0 и Ка — {к2-\-к3)/ку.
Интегрируя уравнение (VI.13), получаем
Vt = КаIn-— + (а0 — я). (VI. 14)
А + С —^ X —> Р + С при На фиг. 59 приведена кривая а, опи-
"аГ сываемая уравнением (VI.14). Кине-
кх = к2 = к3; а0 = 6О. тическое уравнение, описывающее
превращение одного исходного
вещества при участии регенерируемого катализатора, имеет смешанный порядок
(между нулевым и первым). Возможны два предельных случая:
1-й случай: а > Ка. Реакция имеет нулевой порядок, причем
v = V, (VI. 15а)
где V — предельная, максимальная скорость. Если а = 100 Ка, то
отклонение от нулевого порядка не превышает 1%; даже если а = 10 Ка, то
отклонение составляет всего лишь 9%.
2-й случай: а С Ка. Реакция имеет первый порядок, причем
v = k'a, (VI.156)
где к' = V/Ka. И в этом случае если а = /fa/100, то отклонение от первого
порядка не превышает 1%, а если а ~ /fa/10, то отклонение не превышает
10%.
Для всех промежуточных значений а (т. е. в общем случае) кинетическое
уравнение всегда может быть определено однозначно; кривая зависимости

Кинетика ферментативных реакций
167
К„ 2Ка 5Кп UKn 5КП 6КП 7Ка &Ка 9К.
Фиг. 60. Кривая, выражающая зависимость между скоростью реакция и концентрацией
Va
V =
»отав прямоугольных координатах представляет собой гиперболу (фиг. 60),
форма которой полностью определяется двумя кинетическими константами
(или параметрами): V и Ка. Первая из этих констант, как мы уже видели,
есть предельная скорость при а —>• со и, таким образом, имеет размерность
концентрации, деленной на время; вторая константа, Ка, численно равна
концентрации вещества А (обозначим ее ак), при которой о = V/2; она имеет
размерность концентрации (М).
КИНЕТИКА РЕАКЦИЙ, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ ФЕРМЕНТАМИ
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Если ферментативная реакция протекает при тщательно контролируемых
условиях, то изменение ее скорости по мере изменения концентрации
субстрата в большинстве случаев можно определить по уравнению (VI.13),
которое носит название уравнения Михаэлиса — Мептен. Это изменение
может быть графически представлено в виде кривой, показанной на фиг. 60.
Кинетические уравнения таких реакций однозначно определяются двумя
параметрами V и Ка при соблюдении условий:
1. В реакции принимает участие только один субстрат или если их
несколько, то концентрации всех других субстратов, за исключением одного,
остаются практически постоянными.
2. Измеряется истинная начальная скорость vc> при различных
начальных концентрациях (ао) вещества A; vo определяется как скорость,
полученная путем экстраполяции к нулевому моменту времени (—da/dt)t=o =
(d/d)
)
3. ао > бо, т. е. концентрация фермента, добавленного в начале опыта,
при любых значениях ао много меньше, чем концентрация добавленного
субстрата х; во всех опытах используется одинаковая концентрация
фермента во-
Если все эти условия действительно выполняются, то для случаев,
подчиняющихся уравнению (VI.13), это уравнение можно переписать в сле-
1 В большинстве работ субстрат обозначают буквой S, a не буквой А. Чтобы
записать приводимые нами уравнения в соответствующем виде, надо а заменить на s, a0 —
на «о и т. д.

168 Глав а VI
дующем виде (для Со = во и любой начальной концентрации субстрата ао):
где к = к3ао/(Ка -j- ао) и (dvo/de)a^const-~ к. Такті образом, начальная
скорость vo пропорциональна концентрации фермента; это положенно лежит
в основе кинетического анализа всех ферментативных реакций и позволяет
варьировать концентрацию фермента при измерениях начальной скорости
так, как это удобно исследователю (если справедливость уравнения VI.16
доказана).
4. Все другие возможные параметры — температура, используемый
буфер (pH, состав и ионная сила) — фиксированы и остаются постоянными
при всех измерениях.
Итак, главная задача состоит в том, чтобы определить V и Ка с
максимальной возможной точностью. Гиперболическая кривая, приведенная на фиг. 60,
не очень удобна для этой цели, так как в этом случае приходится определять
асимптоту г; = V, что, как известно, весьма трудно. Однако, преобразуя
уравнение (VI.13) в линейное уравнение, можно вместо гиперболы получить
прямую. Впервые это осуществили Лайнуивер и Бэрк, а также Эди и Хоф-
сти, вследствие чего и соответствующие уравнения носят имена этих
исследователей.
Уравнение Лайнуивера — Бэрка выражает зависимость между
величинами, обратными v я а, т. е. между l/v и 1/а:
1 = ф.1 + 4-, (VI. 17)
v V а ' V у '
а уравнение Эди—Хофсти — зависимость между величинами via и v:
— = — + -— (VI.18а)
ИЛИ
¦ir=JT-+-r- (VI-186)
Метод определения V и Ка при помощи этих уравнений иллюстрируется
графиками, приведенными на фиг. 61. График, описываемый уравнением
(VI.18), имеет, по-видимому, некоторые преимущества. Заметим, однако,
что для определения истинных значений V и Ка необходима статистическая
обработка, которую лучше проводить при помощи вычислительной машины.
Константа V имеет четкий физический смысл: это максимальная
скорость, полученная экстраполяцией экспериментальных данных при
определенных условиях. Константа Ка численно равна концентрации субстрата,
V
при которой v = -у :
Ka=(a)v=v2 (VI. 19)
Физический смысл этой величины зависит, однако, от механизма реакции,
который для каждой реакции необходимо предварительно выяснить тем
или иным способом. Для большинства реакций с участием одного субстрата
экспериментальные значения Ка лежат в пределах 10~2—10~6 М. Для
реакций с участием двух субстратов значения Ка бывают иногда очень низкими:
ю-8-ю-8 м.
Исходя из уравнения (VI. 16) можно дать определение ряду терминов,
часто встречающихся в литературе.
Единица активности фермента. В настоящее время обычно
определяется как количество субстрата, превращаемого в продукт реакции в единицу

Кинетика ферментативных реакций
169
времени при определенных условиях (pH, концентрация субстрата и т. д.).
Поскольку концентрация фермента пропорциональна его каталитической
активности (см. выше), за единицу активности фермента можно, например,
принять число молей продукта, образовавшихся за 1 мин.
1
о
Ъ
V
2
V
v v'a + V
/'*
/
/
кп
2_
Кп
Фиг. 61. Графическое выражение кинетического уравнения фермеитаттшисш реакция.
А. По Лайнуиверу и Бэрку. В. По Эдп и Хофсти.
Удельная активность. Выражается: а) в единицах фермента паї
мгбелка или б) числом молей продукта, образовавшихся за 1 мин на 1 мг белка.
Суммарная активность определяется как произведение удельной активности
на общее количество фермента.
„ Удельная активность (после п стадий)
Степень очистки = Ц^У~
„ „ __
Суммарная активность (после п стадий)
Суммарная активность (стандарт)
Каталитическая константа. Выражается числом молей продукта,
образовавшегося за 1 мин, на 1 моль очищенного фермента. Хотя возможность
определения каталитической константы непосредственно следует из
уравнения (VI.16), однако очевидно, что для определения этой величины
необходимо, во-первых, иметь чистый фермент и, во-вторых, знать его
молекулярный вес. Если молекулярный вес фермента неизвестен, то каталитическую
константу часто рассчитывают на 100 000 г фермента.
Число оборотов =
Каталитическая константа
^1 = V/co.
Число активных центров
Число оборотов равно каталитической константе, если молекула
фермента состоит только из одной полипептидной цепи и если каждая
ферментная молекула реагирует в данный момент времени только с одной молекулой
субстрата. В действительности, однако, молекулы многих ферментов состоят
из нескольких субъединиц и содержат более одного каталитически
независимого активного центра. Числа оборотов различных ферментов могут
варьировать в пределах от 102 до 106.

170 Глава VI
РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ ОДНОГО СУБСТРАТА
(МОНОСУБСТРАТНЫЕ РЕАКЦИИ)
При обсуждении механизма такого рода реакций мы рассмотрим частный
случай, когда в реакции принимает участие только один субстрат, и более
общий случай, когда в реакции участвуют два субстрата, но при этом
концентрация одного из них постоянна и настолько велика, что этот субстрат
практически не оказывает влияния на кинетику реакции. К последней
категории относится большой класс реакций, катализируемых гидролазами,
многие трансферазные реакции, протекающие при высокой концентрации
акцептора, а также реакции с участием многих изомераз и лиаз (см. гл. VII).
Механизм Михаэлиса — Ментен. Простейший из возможных механизмов
описывается уравнением (VI.8), в котором С (катализатор) следует заменить
на Е (фермент). Это — обратимое образование комплекса между А и Е
с последующим практически необратимым расщеплением этого комплекса,
в результате которого образуется продукт и регенерирует свободный
фермент. В особом 1, не часто встречающемся случае, когда к3 <^ к2,
уравнение (VI. 12) приобретает вид
J=^L^} (VI.12а)
К + а К '
где К а = кг1к^ — константа диссоциации реакции
а-1-е ;it х.
В этом примере, впервые описанном Михаэлисом и Ментен в 1913 г.,
Ка — константа Михаэлиса, определяемая на основании кинетических
данных,— численно равна Ка — константе диссоциации фермент-субстратного
комплекса 2.
Обратимое образование фермент-субстратного комплекса. Откажемся
теперь от ограничения, согласно которому фермент-субстратный комплекс
расщепляется необратимо, и вместо этого допустим возможность
образования его также и из продуктов реакции. Тогда имеем
А + Е ^ X ^ Е-1-Р, (VI.20а)
da , 7
dt
(VI. 206)
¦§¦ = (M + hp) e~(k2 + k3) x, (VI. 20в)
4f = (h -f ¦ k3) x - (klu + kiP) e, (VI.20r)
1 В случае бисубстратного фермента при большом избытке второго субстрата реакция
также описывается уравнением (VI. 12). Однако если в реакции происходит
упорядоченное образоваппе продуктов, т. с.
fti hs МНгО и т. д.)
Е + А —В ^ ЕАВ ^ ЕА + В, ЕА ^_ ...~" Е+Р,
то Ка = \(к2 + к3) кь\1[(к3 -\- кь) kL]. Эта величина равна Ка, только если А2 = h
(независимо от значения 1с3) или если к3 <С к2 л к3 <С А5.
2 Комиссия по ферментам рекомендует использовать для определяемой кинетически
константы Михаэлиса обозначение Кт, а для константы диссоциации
фермент-субстратного комплекса — обозначение Ks. Однако в тех случаях, когда в ферментативной
реакции участвует более одного фермента, использование таких обозначений приводит
к громоздким и неясным выражепиям.

Кинетика ферментативных реакций 171
^ (VI.2Ofl)
(VI.20e)
Для стационарного состояния, которое достигается при условии, если
<о { а и (или) р, dxldt ~ del dt ~ 0, имеем уравнение
3)х; (VI.20b')
совместно с уравнением (Vl.20e) оно дает для е и х выражения
g0 ¦ ' №г+/гЗ> g0
где D = ftjCt-j-ft^p + &2 + А:3. Подставляя полученные значения в уравнение
(VI.206) или (УІ.20Д), получаем
da ^ dp ^
dt ' dt (
Если принять, что р — 0, то уравнение (VI.22) сводится к уравнению Миха-
элиса — Ментен, включающему начальную скорость Vi прямой реакции:
/„ \ __ кф3аей __ Vta __ F і CVT 9Чя\
(l«)p=o- (ft2 + /C3)-|-^a""'"^T^"'7^^H:T * (VI.^a)
Если же принять, что а = 0, то уравнение (VI.22) сводится к
уравнению Михаэлиса — Ментен, включающему начальную скорость v2 обратной
реакции:
__ к2ейр ____ У2р
Для этого примера мы можем рассчитать также значения индивидуальных
констант скорости на основании экспериментально найденных значений
Ка, Кр, Vi и F2 при условии, что известна величина е0 (которую следует
определить как «число каталитических центров в расчете на 1 л»):
hi~ Kae0 ' hi~ e0 ' л»- ea ' *ч- Kpe0 •
По определению константа равновесия суммарной реакции А ^ В равна
Keq--= peqlcieq- В состоянии равновесия, когда у = 0, имеем
Kcq = ^, (VI.25)
т. е. константа равновесия суммарной реакции равна константе равновесия
стадии 1, деленной на константу равновесия стадии 2.
Кинетические уравнения для этого механизма, основанные на
уравнении (VI.22), можно представить также в другой удобной форме. В общем
виде можно написать
где Vi = Ni/Ce V2 = N2/C2; K^CJC^ KP = CO/C2; Keq^NJNz. Умножив
.приведенное выражение на N2/CiC2, получаем
_
~
Vj 27
KaV2-\ -aV2-\- Vip/ Кeq
Это уравнение скорости и другие уравнения подобного типа применимы
и к относительно сложным моносубстратным или псевдомоносубстратным
механизмам я к механизмам с участием двух или трех реагирующих веществ.

172 Глава VI
Т/равнение (VI. 27) описывает зависимость скорости от концентрации
реагирующего вещества не только в начале реакции при полном отсутствии
продукта (в случае прямой реакции) или субстрата (в случае обратной реакции),
но также и в любой момент времепи вплоть до установления равновесия.
При соответствующих ограничениях это уравнение должно, естественно,
сводиться к уравнению (V].23a) или (VI.236). Первый случай, когда р = О,
почти очевидеп. ? этом случае нужно принять р = 0 (при условии, что
]'., ф 0) и затем сократить на V%. В другом случае, а именно когда а = 0,
после умножения числителя и знаменателя на Keq/Vi получаем
v == \гРіЛ7 , (VI.28)
Это уравнение на первый взгляд но тождественно уравнению (VI.236). Однако,
используя приведенные выше определения (см. уравнение VI.26), легко
показать, что
KaqKaVz с0
1/4 ~ С2 ~АР (V1.ZJ)
или
^- (VI.30)
Это уравнение называется соотношением Холдейна. Заменяя постоянное
слагаемое в знаменателе правой части уравнения (VI.28) величиной Кр,
получаем уравнение (VI.236).
Соотношение Холдейна весьма интересно, так как оно показывает, что
кинетические параметры обратимой ферментативной реакции не являются
независимыми, а их отношение ограничено величиной константы
термодинамического равповесия суммарной реакции. Это равносильно
утверждению, что константы скорости отдельных стадий должны быть
определенным образом связаны с суммарной константой равновесия
(уравнение VI.25).
В большинстве случаев с увеличением концентрации продукта
ферментативные реакции замедляются. Этот эффект носит название ингибировапие
продуктом реакции. Чтобы лучше его понять, напишем кинетическое урав-
неште в несколько иной форме:
где ?>! — скорость прямой реакции
vl ^1 a
a l>2 — скорость обратной реакции
v2-~ к ,-, 2y ,y ¦ (знак минус указывает только направление), (VI. Зів)
J_ — _^_ J_ ( 4 _i_ —1 4- —
Здесь мы снова имеем симметричный набор уравнений, из которого
следует, что ферментативная реакция замедляется по мере приближения
к равновесию не только ввиду наличия обратной реакции (член со знаком
минус в числителе уравнения VI.31), но также из-за того, что возрастание

Кинетика ферментативных реакций
173
концентрации Р приводит к уменьшению концентрации свободного
фермента (образование EP-комплекса). Таким образом, кинетический эффект
ингибирования продуктом реакции присущ любому реальному, т. е.
обратимому, механизму ферментативного катализа. Влияние этого эффекта
представлено в графической форме на фиг. 62. Сравнение с фиг. 61, А и
уравнением (VI. 17) показывает, что отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат
(т. е. величина \lv), не меняется, но наклон прямой увеличивается на некую
постоянную величину A + р/Кр). Зависимость такого типа характеризует
•так называемое конкурентное ингибирование. Конкурентное ингибирование
1 ,
и
?
3
*i
_2_
1
Ц
ЛЬ
1 7 /Га/ ^ \ 1
і
1
a
Фиг. 62. Влияние продукта на кинетику ферментативной реакции.
проявляется всякий раз, когда ингибитор соединяется только с той формой
фермента, с которой соединяется субстрат, т. е. когда фермент может
образовывать два вида комплексов — ES и El. В нашем примере как РДтак
и А соединяются с Е, но ни один из них не соединяется с X.
Обратимое образование двух комплексов. Маловероятно, чтобы фермент,
способный образовать с А комплекс, подвергающийся обратимому
превращению в Р, не был в то же время способен образовать обратимый комплекс
с Р. Механизм, в котором учитывается это обстоятельство, можно записать
в следующем виде:
&1 ЙЗ йй
^X^Y^E + P. ' (VI.32)
Соответствующие кинетические уравнения, полученные с учетом
принципа стационарности, и уравнение баланса, имеют вид
v = -~- = k5y — каре, (VI.33а)
at
^ = kiae-(k2 + k3)x + hy, (VI.336)
-^- = кере^-к3х—(ki-\~k5)y, (Vi.ooB)
ей = е х + у. (VI. 33г)

174
Глава VI
В стационарном состоянии dxldt = dyldt = deldt = 0. Это условие приводні
к системе трех линейных уравнений, которую следует решить относительно
трех неизвестных и подставить полученный результат в уравнение (VI.33а).
Решение этой системы может быть найдено путем вычисления детерминанта
третьего порядка (для п форм фермента приходится вычислять детерминант
га-го порядка) или проще — при помощи метода Книга и Альтмана.
Этот метод состоит в следующем. Сначала чертят простую геометрическую
фигуру, схематически отражающую механизм реакции. В нашем случае это
будет треугольник
в котором стрелки, указывающие направление последовательных стадий
1 -> 3 -> 5 (прямая реакция) и 6 -> 4 ->¦ 2 (обратная реакция), всегда
должны быть ориентированы в одном и том же направлении.
Затем рисуют все возможные схемы, учитывающие взаимные
превращения возможных форм фермента (их изображают в виде прямых линий,
число которых на единицу меньше числа форм фермента, т. е. в нашем случае
равно 2). Любые замкнутые петли являются при этом запрещенными
и должны быть исключены из рассмотрения. В нашем случае имеем
В заключение пишут для каждой формы фермента выражение следующего
типа: (Концентрация данной формы фермента)/(Общая концентрация
фермента) = [Сумма (по всем нарисованным схемам) произведений констант
скорости (отвечающих направлениям, приводящим к данной
форме*фермента) на члены, характеризующие концентрацию (если они имеются)]/
/[Сумма всех членов числителя]. В напіем случае имеем
(VI. 34а)
(VI. 346)
ео
хкъа + к3кйр
(VI.34b)
Таким способом получают набор уравнений, позволяющих определить
долю фермента в любой его форме как функцию индивидуальных констант

Кинетика ферментативных реакций 175
скоростей. Этот метод оказывается полезным не только для целей, которые
нас здесь интересуют, но такжо и для выявления типа ингибирования, для
определения равновесия и скоростей изотопного обмена и т. д.
Подставляя эти уравнения (VI.34) в кинетическое уравнение (VI.33а),
получаем
(fries'1 —k2fc4/>:3p)eo ('VT Ч^4»
Введя соответствующие обозначения, это уравнение можно записать в ело-
дующем виде:
?
- Со-у Сia-\-Сор '
после чего оно становится идентичным уравнению (VI.26), которое было
выведено для более простого механизма. Таким образом, если проводить
измерения скорости реакции в стационарном состоянии, то между двумя
механизмами не обнаруяшвается никакого различия. Действительно, можно
строго показать, что при введении (между различными формами фермеита)
любого числа мономолекулярных стадий, содержащих одно и то же число
молекул субстрата (или продукта), форма кинетического уравнения остается
неизменной. Изменяется только набор кинетических параметров (величин У,
и Кі) или коэффициентов в членах, объединяющих индивидуальные
константы скорости.
Образование ковалентного промежуточного продукта. В гл. VII мы
увидим, что для некоторых гидролитических ферментов (например, для
химотрипсина, трипсина, холинэстеразы и некоторых фосфатаз) строго
доказано существование ацилированных соединений, т. е. образованно
производных, в которых фермент связан с реагирующим веществом кова-
лентной связью:
Е + А —В ^ (Е-А —В) ^EQ' + P, (VI.36)
EQ' ^ EQ ^ E + Q.
В тех случаях, когда значение Keq достаточно велико, полное кинетическое
уравнение приобретает вид
v = =-= =Л = =-= . (VI.37)
Ка + а + (KJKp)p + (Ka/Kq)q -г A!Кр) ар + (KJKpKq) pq
Если Q содержится в системе, а Р отсутствует, то это уравнение сводится
к более простому
v = ^= . (VI. 38а)
Если же система содержит Р и не содержит Q, то уравнение (VI.37)
приобретает вид
v = = ~ =- . (VI.386)
К№Л(К1КК)р] + СЦ\ + р1К)
Из этих уравнений видно, что добавление второго продукта реакции
обусловливает конкурентное ингибирование, поскольку при этом изменяется
только наклон прямой (см. фиг. 62); добавление же первого продукта
реакции меняет как наклон прямой, так и величину отрезка, отсекаемого на оси
ординат. Этот тип ингибирования называется неконкурентным. Таким обра-

170
Глава VI
зом, измерения скорости реакции по образующемуся продукту реакции
позволяют определить порядок расщепления исходных веществ, а также
константы V, Ка, Ка, Кр и Kq. Величина Ка = &2/&і, тогда как
тг
Таким образом, Ка может быть больше или меньше, чем Ка, в зависимости
от конкретных значений констант скорости. Величина Кq равна &7/А:8, если
kr., > &з (это условие выполняется, по-видимому, во всех известных случаях);
величина Кр равна fc3/&4.
БИСУБСТРЛТГШЕ РЕАКЦИИ
Общие положения. В ферментативных реакциях участвует, как правило,
более одного субстрата, и любое точное описание таких реакций должно
учитывать этот факт. Рассмотрим общее уравнение обратимой реакции типа
А + В -^ P+Q.
(VI.39)
Если мы измеряем начальную скорость реакции как функцию концентрации
только одного из субстратов, например а (этот субстрат называют в таком
случае вариабельным), то полученные данные описываются уравнением
Мпхаэлиса — Ментен [(VI.13), (VI.17) и (VI.18)] при условии соблюдения
ограничений, указанных на стр. 167 и 168, и постоянства концентрации
второго субстрата, в нашем случае Ъ (который называют при этом
фиксированным), т. е. при условии, что bi ^> е0. Если провести подобную
серию измерений при какой-либо другой концентрации Ь2 > е0, то и тогда
зависимость начальной скорости от величины а будет описываться
уравнением Михаэлиса — Ментен. Однако в этом случае его решение дает другие
значения двух кинетических параметров V и Ка. Следовательно, эти
параметры зависят также и от концентрации Ъ. Графическое выражение
кинетических уравнений в координатах обратных величин {график двойных
обратных величин) представляет собой два семейства прямых (см.
уравнения VI.39 и VI.40, а также фиг. 63), поскольку в силу симметрии
уравнения (VI.39) при перестановке местами фиксированного и вариабельного
субстратов или при рассмотрении обратной реакции вместо прямой
результаты кинетического анализа не должны изменяться. Для прямой реакции
мы будем использовать следующие обозначения: А, В; а, Ъ; Ка, Ка; k^-i',
Кa

m
Womoh=
Фиг 63 Графики двойных обратных величии для бпсубстратной реакции (уравнение
VI.40).
І и ц первичные прямые, описывающие зависимость между непосредственно наблюдаемыми
величинами а именно между величиной, обратной начальной скорости реакции, и величиной, обратной
концентрации вариабельного субстрата (в случае I концентрация вариабельного субстрата обозначена
через а, а в случае 11 она обозначена через Ъ); III — VI — построенные на основе графиков I и II
вторичные прямые, описывающие зависимость «отсекаемых отрезков» и наклонов прямых от величии,
обратных концентрации фиксированного субстрата; VII и VIII — первичные прямые для случая
КаКь = 0 (механизм типа <>пинг-понг,>), т. е. V1/vl = 1 + Ка/а + Кь/Ь (уравнение VI.42b).
Int— отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат; 1п\1 — предельное значение отрезка.
12—246

178
Глава VI
Vu Kt соответственно для субстратов, их концентраций, констант Михаэлиса
и констант диссоциации, индивидуальных констант скорости, максимальной
скорости и констант равновесия суммарной "реакции; для^обратной "реакции
соответствующие параметры будут обозначаться через Р, Q; р, q; Кр, Кр;
k2n; F2; К1,.
Таблица 25
Различные обозначения, используемые при кинетическом анализе
ферментативных реакций с участием|двух субстратов

Обозначения,
принятые в

настоящей
книге
Ка
Кь
Ка
Смысл обозначения
Предельная константа
Михаэлиса для А
Продельная константа
Михаэлиса для В
Константа диссоциации А
Предельная максимальная
скорость
Число оборотов
Обозначения, используемые разными авторами
Даль-
зиель
фо
Ф2
Фо
Ф12
ф-2
е
"фо"
1/фо
Альберти
кА
Кв
Кав
Kb
Vf
Блум-
фельд
и др.
Кав
Kb
Кав
KA
Ка
Vab
V AB
Клеланд
'E~t
Комиссия
по
ферментам
КА
m
Kf
V
При этом имеем
Ъ
КдКЪ
ab
(VI. 40а)
(VI.406}
Таким образом, очевидно, что для составления полного кинетического
уравнения бисубстратной реакции необходимо и достаточно иметь четыре
кинетических параметра: УІ5 Ка, Кь и Ка. (Напомним, что для описания
моносубстратной реакции необходимы только два параметра.)
Обычно определяют п-т значений начальной скорости vif
соответствующих п различным концентрациям а ж m различным концентрациям Ъ
(где п с^ т), а затем строят графики зависимости начальной скорости vt от
На и lib по способу, приведенному на фиг. 63, / и II. Наклоны этих
первичных прямых и отсекаемые ими на оси ординат отрезки используют затем
для построения новых графиков и получают четыре вторичные прямые —
две прямые (III и IV), построенные на основании «отсекаемых отрезков»,
будут отсекать на оси ординат одинаковые отрезки, равные 1/Vy, две другие
прямые (У и VI), построенные на основании наклонов, будут иметь
одинаковый наклон, равный KaKblV\. В конечном счете эти четыре вторичных
графика дают исследователю 2-4"уравнения с четырьмя неизвестными
кинетическими параметрами; решив эти уравнения, можно проверить внутреннюю
согласованность полученных экспериментальных данных.
1 Можно использовать и другие обозначения. Сравнение различных способов
обозначения для реакции, описываемой уравнениями (VI.39) и (VI.40), приведено в табл. 25.

Кинетика ферментативных реакций 179
Механизмы детально исследованных ферментативных реакций можно
делить на несколько главных типов х:
1. Механизм типа «пинг-понг», описываемый схемой
A PB Q
__Jc i___i i__
E (AE PE') E' (E'B EQ) E
к, к;
4+ Ez± (AE^ PE') z^P+ E' JE A ^ PE')
или Е Е
В этом случае продукты образуются до реакции с вторым субстратом за счет
превращения фермента (а чаще кофермента или простетической группы,
прочно связанной с ферментом) из формы Е в форму Е'. Напомним, что Р
обозначает продукт реакции, образующийся из A, a Q — продукт,
образующийся из В.
По этому механизму протекают некоторые важные реакции, в частности
реакции, катализируемые трансаминазами (аминотрансферазами),
коферментом которых служит пиридоксальфосфат (пир-СНО), а также реакции
дегидрирования, катализируемые некоторыми флавопротеидами (ФП)
(см. гл. VIII). В первом случае
О
_. H
RiCHCOa+Ферм-пир-СНО ^ ЕА ^ Е'Р ^ Ферм-шір-СН2Ш?+ігі — С— СО^
Е Е' Р
a+pmip-CHsNHa "^ Е'В ~^ EQ ~^ Ферм-пир-СНО + R2CHCOj (VI.42а
О N+Нз
BE' Е Q
а во втором
R-Нз + ФП ^: ЕА ^ Е'Р ^ ФП.На + R,
А ^ Е' Р (VI.426)
Ох + ФП-Н2 ^ Е'В ^ EQ ^ ФП + Ох-Н2
BE' Е Q
(R-H2 обозначает здесь окисляемый субстрат, а Ох — акцептор электронов,
или окислитель).
Анализ показывает, что для механизма этого типа в кинетическом
уравнении можно опустить последний член (т. е. член, содержащий
произведение а-Ъ); уравнение (VI.406) в этом случае приобретает вид
II = і ,|_ -Et -ь 4^ • (VI.42b)
vi ' а ' b y '
Отвечающий этому уравнению график двойных обратных величин
характеризуется одной необычной особенностью, которая состоит в том, что
зависимость l/v от На или от I/o, т. е. от величины, обратной концентрации
1 Мы приводим три способа записи механизмов реакций, включая сокращенную
запись, предложенную Клмандом.
12*

180 Г л а в а VI
вариабельного субстрата, всегда описывается прямой с одним и тем же
наклоном независимо от концентрации фиксированного субстрата
(см. фиг. 63, VII и VIII). Исследование полного кинетического уравнения
суммарной обратимой реакции обнаруживает другую характерную
особенность этого механизма: продукт реакции Q (но не Р) является конкурентным
ингибитором для субстрата А (т. е. он изменяет только наклон прямой,
не изменяя при этом величины отрезка, отсекаемого на оси ординат), а
продукт реакции Р (но не Q) является конкурентным ингибитором для
субстрата В.
2. Упорядоченный механизм, описываемый схемой
AB Р Q
I I t t (VI.43)
Б АЕ (АЕВ QEP) QE Е
ИЛИ
А + Е^АЕ
к,В
АЕВ
ши Е
к
В этом случае А и продукт его превращения Q называются ведущими
реагентами; обычно они являются коферментами. Упорядоченные механизмы
описываются кинетическими уравнениями (VI.39) или (VI.40). Правда,
в силу симметричности этих уравнений не сразу становится очевидным,
какой из субстратов следует считать ведущим реагентом (т. е. субстратом А).
Однако в большинстве случаев этот вопрос легко выяснить. Для этого
необходимо только исследовать реакцию присоединения. Известно, что кофер-
менты, если только они участвуют в реакции, связываются обычно прочнее,
чем соответствующие субстраты. Другим критерием служит то, что только А,
но не В конкурентно ингибируется продуктом своего собственного
превращения, т. е. Q.
Среди наиболее важных реакций, протекающих по этому механизму,
следует назвать в первую очередь реакции, катализируемые дегидрогенезами,
зависящими от НАД или НАДФ (см. гл. VIII). Такая реакция имеет вид
НАД++Е ^ НАД+-Е,
А ЕА
В
(HAfl+.E-CHOHRiRa^ НАДН-Е-ССШ^)
НАДН-Е ;i^ Е + НАДН. (VI.44)
QE Q
3. «Беспорядочный» механизм. В случае механизма, по которому все
возможные бинарные комплексы фермент — субстрат образуются быстро
и обратимо, единственной медленной стадией является взаимное превра-

Кинетика ферментативных реакций 181
щение двух трехчленных комплексов:
-^ Л ^?
(VI.45)
Кинетика реакций этого типа описывается уравнением (VI.40), причем
Fi = kte0 V2 = k2e0
К-a — Kt Кь = K5 Kp = К2 Kq~ K6
Ка = К7 Kb = K3 KP = K8 Kq = Kk (VI. 46)
Многие реакции с участием киназ (фосфотрансфераз), т. е. ферментов,
катализирующих реакцию А — II + RO — РО^~ ->• АРО^ + ROH,
протекают, по-видимому, по этому механизму. Хорошим примером таких
ферментов может служить креатинкиназа.
АКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТА
Активатором мы называем небольшую молекулу (часто неорганический
ион), присутствие которой обусловливает или, во всяком случае,
стимулирует активность фермента, но которая в отличие от кофермента сама по себе
не принимает явного участия в реакции. Можно написать ряд кинетических
схем, учитывающих взаимодействие таких активаторов с различными
компонентами системы; однако практическое значение имеют, по-видимому,
лишь немногие из таких схем. Мы ограничимся рассмотрением двух наиболее
общих случаев: в одном из них активатор обязательно взаимодействует
со свободным ферментом, а во втором — со свободным субстратом.
Взаимодействие со свободным ферментом. В активных центрах многих
ферментов присутствуют ионы металлов. Карбоксипептидаза и карбоангид-
раза содержат ионы Zn2 + (или Со2+), енолаза и фосфоглюкомутаза — ионы
Mga+ (или Мп2+), изоцитратдегидрогеназа, малатдегидрогеназа (декарбокси-
лирующая) и ряд других ферментов — ионы Мп2+. Для стабилизации
специфической конформации, обусловливающей максимальную каталитическую
активность многих других ферментов, необходимы, по-видимому,
одновалентные ионы, такие, как Na+, К+ или NH?.
Одна из возможных схем активации за счет соединения, способного
образовывать при диссоциации ион металла, имеет следующий вид:
Е + М ^ ЕМ,
&3 ^б ^7
S + EM ^ SEM ^ РЕМ ^ЕМ+Р. (VI.47)
hi feo ks
Аналогия между этим механизмом и механизмом, который описывается
уравнением (VI.43), только кажущаяся; эти два механизма становятся
кинетически эквивалентными лишь в том случае, если комплексы типа ЕМ,
с которыми соединяются Е и Р, не идентичны. Кинетическое уравнение для
данного механизма имеет вид
Vi = _ ЇЛИ ; ,2= _—hEL . (VI.48)
KK\Km + sm KK + Km}m

1.82 Глава VI
Взаимодействие с субстратом. Для большинства, если не для всех, важных
реакций, протекающих с участием нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфатов,
необходимо присутствие в реакционной смеси стехиометрических количеств
ионов двухвалентных металлов (обычно Mg2+). Исследование показало, что
возможный механизм такой активации состоит в обязательном
взаимодействии катиона с субстратом до его взаимодействия с ферментом. Таким
образом, истинным реагирующим веществом является комплекс субстрат —
металл, а не свободный субстрат. Реакция протекает по схеме
hi
S + M ^ SM
"иг"
кз H
SM + E ^ (ESM "^ К FM) ^ Е + РМ (VI.49)
hi' fee
РМ ^ Р+М
кз
При составлении кинетических уравнений для реакций, протекающих
по механизму этого типа, необходимо учитывать концентрацию SM, a не
концентрацию свободного субстрата или общую концентрацию субстрата.
ИНГИБИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ
Общие положения. Ингибиторами называются вещества, снижающие
скорость реакций. Классические исследования, в которых ингибиторные
эффекты изучались на изолированных ферментных системах и на
метаболических процессах, сыграли исключительно важную роль в установлении
строения субстратов, природы тех групп, при помощи которых субстрат
связывается с ферментом, а также в выяснении специфичности
ферментативных реакций и самого их механизма. В клетке ингибирование ключевых
реакций веществами, которые являются продуктами тех же реакций или
тех же (а иногда и других) метаболических процессов, служит тонким регу-
ляторным механизмом, обеспечивающим поддержание относительного
постоянства состава внутриклеточной среды, а также ответные реакции
на изменения во внешней среде. Наконец, избирательное ингибиторное
действие ряда природных и синтетичесішх соединений (антиметаболитов),
несомненно, должно быть положено в основу по крайней мере одного из подходов
к разработке рациональной фармакологии и химиотерапии. На этом пути
открываются две возможности. Первая связана с тем, что разные ферменты
имеют разную специфичность, а потому какой-нибудь «ненормальный»
продукт одной из начальных реакций данного метаболического пути вполне
может оказаться ингибитором какой-либо более поздней стадии того же
процесса (Петере назвал такую ситуацию «летальным: синтезом»). Вторая
возможность заключается в направленном изменении синтеза ферментов.
Поскольку сами ферменты являются продуктами метаболизма, их синтезом,
очевидно, можно управлять, воздействуя на метаболизм.
Ниже описаны основные кинетические характеристики ферментативных
реакций, протекающих в присутствии разных концентраций ингибиторов.
Зависимость l/v от ils для таких реакций является линейной, причем либо
наклон прямой, либо величина отрезка, отсекаемого на оси ординат, либо
оба эти параметра одновременно линейно зависят от величины A + i/Ktj)
(где і — концентрация ингибитора, а Кц — характеристическая константа).
Первый из этих трех случаев называется конкурентным ингибированием,
второй — бесконкурентным, а третий — неконкурентным. Графики для

Кинетика ферментативных реакций
183
наклонов или отрезков, отсекаемых на оси ординат, обычно представляют
собой прямые, однако иногда встречаются также параболы, гиперболы или
даже еще более сложные кривые (фиг. 64). Необратимыми (dead-end)
ингибиторами называются вещества, которые не могут превращаться в
продукты. Для них, как правило, характерно линейное ингибирование, если
только ингибитор не соединяется дважды с одной и той же формой фермента
Конкурентное
ингибировапие
Неконкурентное
V ,¦ ингибирввание
Бесконкурентное
ингибирование
у-
Наклон =-ф
V
Ингибирование
субстратом
Фпг. 64. Кинетические характеристики различных типов ингибирования.'
и если он не является продуктом, образующимся при протекании реакции
«по нижнему пути» (см. схему), и не возвращает субстрат (или субстраты)
обратно в состояние, в котором они соединены с ферментом. Следующая
схема п табл. 26 поясняют все три типа ингибирования на примере одного
Таблица 26
Три типа ингибирования
Тип

гибирования

Конкурентное


курентное


курентное
Условия
IES, IE не

образуются
El не
образуется
1ES не

щепляется
El не
образуется
Влияние
на
величины
h и К
= Kt =
= со
к' =0
K'i = оо
ifKi « і;
К s Ф К и
к' -=ркф
фО
Kv = со
Отрезок, отсекаемый
на оси ординат,
l/V
1 1
Y' ke
A + iKs/KisKi)
V
(i+iKjKtsRt)
V(l + ik'Ks/kKisKi)
Наклон прямой
К' IV
Ks
V
Ks{i + llKi)
V(l + ik'Ks/kKisKi)
К'
Ks(l + i/Ki)
Ks
(l + iKs/KisKi)
Ks(l + ifKi)
(i+iKs/KisKi)

184
Глава VI
субстрата:
IES
rc,=*.,A« (VI.50)
К ~к /к ¦
v к'
1+
Мультисубстратные случаи ингибирования. Если в ферментативной
реакции участвует более одного субстрата или если в ней образуется более
одного продукта, то кинетические эффекты, вызываемые ингибиторами,
могут проявляться в весьма сложной форме.
В тех случаях, когда исследователя интересует только качественная
картина ингибирования (т. е. только выяснение вопроса о том, какой тип
ингибирования — конкурентный, неконкурентный или бесконкурентный —
имеет место), проще всего проверить предполагаемый механизм
ингибирования с помощью следующих простых правил, сформулированных Клеландом:
1. Ингибитор меняет наклон прямой, описывающей зависимость 1/у
от l/s, в тех случаях, когда он и вариабельный субстрат S либо
непосредственно конкурируют за одну и ту же форму фермента, либо реагируют
с такими формами, которые в ходе реакции отделены одна от другой только
обратимыми стадиями, так что любой компонент может менять
концентрацию фермента, доступного для другого компонента, путем простого
смещения равновесия этих промежуточных стадий. В этих случаях
вызываемый ингибитором эффект может быть снят путем повышения концентрации
субстрата.
2. Ингибитор меняет величину отрезка, отсекаемого такой прямой на оси
ординат, если он соединяется с формой фермента, отличной от той, с которой
соединяется свободный субстрат. Влияние ингибитора проявляется при этом
в уменьшении общего количества того фермента, который находится в своих
обычных формах. Этот эффект нельзя спять путем повышения концентрации,
субстрата.
3. Описанные эффекты могут наблюдаться по отдельности. В этом случае
они вызывают либо конкурентное ингибирование (случай 1), либо
бесконкурентное (случай 2). Если же оба эти эффекта проявляются одновременно,
то это свидетельствует о неконкурентном ингибировании. Если субстрат
или ингибитор соединяются более чем с одной формой фермента, то общая
картина представляет собой результат наложения друг на друга разных
типов ингибирования. График, отвечающий такой ситуации, может
представлять собой прямую или может иметь более сложную форму (парабола,
гипербола и т. д.).
В качестве примера рассмотрим случай добавления ингибитора (в том
числе и продукта Q), конкурирующего за свободный фермент с тем
субстратом, который при упорядоченном механизме бисубстратнон реакции первым
связывается с ферментом, т. е. с субстратом А (см. уравнения VI.39, VI.40
и VI.43). Кинетическое уравнение имеет в этом случае вид
(VLSI)

Кинетика ферментативных реакций
185
Мы видим, что если А является вариабельным субстратом, то ингибирование
всегда бывает конкурентным, но если его концентрация постоянна, а
концентрация второго субстрата В меняется, то наблюдаемая картина отвечает
случаю неконкурентного ингибирования.
Если мы представим механизм в целом в виде схемы
AB PO
В ЕА ЕАВ
EPQ EQ Е
и рассмотрим три разных типа ингибиторов — необратимый ингибитор,
взаимодействующий либо с ЕА, либо с EQ, продукт Р и необратимый
ингибитор, взаимодействующий со свободным ферментом, то, исходя из правил
Клеланда, можно предсказать для всех этих трех случаев определенные типы
ингибирования (табл. 27).
Таблица 27
Типы ингибирования, вызываемые тремя разными видами ингибиторов
Тип
взаимодействия
EA + I^EAI
EQ-j-I^tEQI
Тип ингибироваиия
вариабельным
является
субстрат А

Бесконкурентное

Бесконкурентное
вариабельным
является
субстрат В

Конкурентное

Бесконкурентное
Тип
взаимодействия
EQ + P^BQP
Е + І^ГЕІ
Тчи ингибирования
вариабельным
является
субстрат А

Неконкурентное
Конкурентное
вариабельным
является
субстрат В
Неконку-
рентиое

Неконкурентное
Очевидно, что механизмы, включающие образование комплексов ЕА1,
EQI или El, можно легко отличить один от другого. Характер ингибирую-
щего действия продукта реакции может также служить критерием при
выборе допустимых механизмов; как уже было сказано выше, добавление
продукта Q (в случае прямой реакции) приводит к конкурентному ингиби-
рованию в отношении субстрата А и неконкурентному в отношении
субстрата В; продукт Р в случае упорядоченного механизма дает
неконкурентное ингибирование как в отношении А, так и в отношении В, а в случае
«беспорядочных» механизмов как Р, так и Q являются неконкурентными
ингибиторами в отношении обоих субстратов — А и В.
ВЛИЯНИЕ pH
Общие соображения. Почти все ферменты крайне чувствительны к
концентрации водородных ионов. Активность ферментов всегда уменьшается
при изменении pH в любую сторону от некоторого (оптимального) и
сравнительно узкого интервала значений. Влияние pH определяется сочетанием
трех факторов: 1) необратимыми изменениями структуры белка при
экстремальных значениях pH, в том числе и изменением прочности*- и способа
связывания ферментов с простетическими группами; 2) влиянием pH на
степень ионизации субстрата и 3) влиянием рИ на связывание субстрата с
ферментом и на реакционную способность при катализе. Мы рассмотрим здесь
только третий фактор. Что же касается первых двух, то их влияние можно
определить независимо от самой реакции, кинетика которой исследуется,
и на это влияние должны быть сделаны соответствующие поправки.
Зависимость начальной скорости ферментативной реакции от pH
характеризуется тремя различными фазами (фиг. 65, А): область низких значе-

186
Г л п.
VI
пий pH, в которой скорость реакции возрастает при повышении pH; область
высоких значений pH, в которой скорость реакции уменьшается при
возрастании pH, и промежуточная область (обычно вблизи нейтральных
значений pH), где активность фермента максимальна и сохраняется
приблизительно постоянной; эта область носит название области оптимальных
значений pH. Таким образом, зависимость начальной скорости ферментативной
Скорость
А
?
PH
__— Экспериментальная кривая "Теоретическая кривая
Фиг. 65. Влияние pH па простые ферментативпые реакции.
Объяснение см. в тексте.
реакции от pH описывается характерной колоколообразной кривой х. В ряде
случаев форму этих кривых объясняли исходя из констант ионизации либо
свободного фермента (Кєі и т. д.), либо фермент-субстратного комплекса
{Кеаі и т. д.). Вообще говоря, такая интерпретация не слишком корректна;
она правомочна только для тех областей, внутри которых реакция строго
подчиняется кинетике первого порядка (т. е. а < Ка и v = aV/Ka; см.
уравнение VI. 156) или нулевого порядка (т. е. а > Ка и v ~ V; см. уравнение
1 Иногда одну из ветвей кривой получить пе удается; в этих случаях кривая состоит
только из двух участков: одной вотви (восходящей или нисходящей) и горизонтального
участка, в который эта ветвь переходит.

Кинетика ферментативных реакций 187
VI.15а). Два таких случая показаны в виде соответствующих кривых
на фиг. 65, А. В этих двух крайних случаях точки перегиба, если они
рассчитаны правильно, могут действительно соответствовать в первом случае
константе ионизации фермента, а во втором — константе ионизации
фермент-субстратного комплекса. Однако обычно определяемая величина
начальной скорости лежит между этими двумя предельными .значениями
и ее зависимость от pH также имеет промежуточный характер, который
нельзя объяснить исходя из констант ионизации.
Для того чтобы оценить величину этих констант, лучше всего
использовать кривые зависимости величин lg V, lg (К')'1 = рК' и lg \V'IK'] (или
va <С Ка) от pH, построенные в двойном логарифмическом масштабе.
Идеализированные кривые для этих случаев показаны на фиг. 65, Б ж В.
Большинство из них удовлетворяет условиям, приведенным на фигуре либо
справа, либо слева, но возможно сочетание левой ветви левой схемы с правой
ветвью правой схемы, и наоборот. Несколько предложенных Диксоном
простых правил, позволяющих интерпретировать такую зависимость $К
от pH, состоят в следующем 1:
1. График зависимости рК от pH состоит из прямолинейных отрезков,
соединенных короткими криволинейными участками.
2. Наклоны прямолинейных отрезков равны 0, ±1 или ±2.
3. Каждый перегиб на кривой дает значение рК ионизирующейся группы
в одном из компонентов; если продолжить прямолинейные отрезки, то они
пересекутся при значении pH, соответствующем ])К.
4. При переходе от одного P-ff к другому наклон кривой изменяется
на единицу.
5. Каждое pisT группы, относящейся к комплексу ЕА, вызывает
увеличение (положительного) наклона с увеличением pH; каждое рК группы,
относящейся к свободному ферменту или к свободному субстрату, вызывает
уменьшение наклона кривой.
6. Кривизна в точках перегиба такова, что расстояние между точкой
пересечения продолженных соседних прямолинейных отрезков и
касательной к кривой в точке перегиба равно 0,3 единицы (т. е. lg 2). Если при
рассматриваемом pH происходит одновременная ионизация двух групп, то
расстояние будет равно lg 3.
7. Величина наклона каждого из прямолинейных отрезков численно
равна величине изменения заряда, происходящего в рассматриваемой
области pH при диссоциации комплекса ЕА на свободный фермент и субстрат.
ЛИТЕРАТУРА
Alberty R. A., The Rate Equation for an Enzymic Reaction, in «The Enzymes», 2nd ed.,
vol. 1, p. 157, P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eels.), Academic, New York, 1959.
Alberty R. A., Enzyme Kinetics, Advan. Enzymol., 17, 1 A956); The Interpretation
of Steady State Kinetic Data on Enzymatic Reactions, Brookhaven Symp. Biol., 15,
18 A962).
Bloom field V., Pell er L.,Alberty R. A., Multiple Intermediates in Steady
State Enzyme Kinetics: II. Systems Involving Two Substrates and Two Products, J.
Am. Chem. Soc, 84, 4367 A962), and III. Analysis of the Kinetics of Some Reactions
Catalyzed by Dehydrogenasis, J. Am. Chem. Soc, 84, 4375 A962).
Cleland W. W., The Kinetics of Enzyme-catalyzed 'Reactions with Two or More
Substrates or Products: I. Nomenclature and Rate Equations, Biochim. Biophys. Acta,
67, 104 A963); and II. Inhibition: Nomenclature and Theory, Biochim. Biophys. Acta,
67, 173 A963); and III. Prediction of Initial Velocity and Inhibition Patterns, Bio-
1 В более общих случаях зависимость lg (VIК) от pH определяется величиной
истинной константы диссоциации вариабельного субстрата или той формы фермента, с которой
он реагирует. Если мы заинтересованы в исследовании второго из этих двух случаев,
то необходимо иметь абсолютную уверенность в отсутствии первой возможности.

і 88 Г л а в а VI
chim. Biophys. Acta, 67, 188 A963); Enzyme Kinetics, Ann. Rev. Biochem., 36, 77
A967).
D a 1 z і e 1 K., Initial Steady State Velocities in the Evaluation of Enzymo-Coenzyme-Sub-
strate Reaction Mechanisms, Acta Chom. Scand., 11, 1706 A957).
D a w e s E. A., Enzyme Kinetics, cliap. 4, in «Comprehensive Biochemistry», vol. 12, p. 89,
M. Florkin and E. G. Stotz (cds.), Elsevier, New York, 1964.
D і x о n П., Webb E. C, Enzymes, 2nd ed., esp., chaps. 2, 4, 8, and 9, Academic,
New York, 1964. (M. Диксон, Э. У э б б, Ферменты, изд-во «Мир», M., 1966.)
King E. L., Altin an С, A Schematic Method of Deriving the Rate Lams for Enzy-
mecatalyzed Reactions, J. Phys. Chem., 60, 1375 A956).
King E. L., Unusual Kinetic Consequences of. Certain Enzyme Catalysis Mechanisms,
J. Phys. Chem., 60, 1378 A056).
L а і d l er К. J., The Chemical Kinetics of Enzyme Action, Oxford, Fair Lawn, N.J.)
1958.
Peller L., Alberty R.A., Multiple Intermediates in Steady Slate Enzyme Kinetics:
I. The Mechanism Involving a Single Substrate and Product, I. Am. Chem. Soc.,,81.
5907 A959),
Reiner J. M., Quantitative Aspects of Enzymes and Enzyme Systems, chap. 5, in
«Comprehensive Biochemistry», vol. 12, p. 126, M. Florkin and E. G. Stotz (eds.),
Elsevier, New York, 1964.
Segal H. L., The Development of Enzyme Kinetics, in «The Enzymes», 2nd ed., vol. 1,
p. 1, P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), Academic, New York, 1959.
Wai ter С, Steady-State Applications in Enzyme Kinetics, Ronald, New York, 1965.
W о n g J. T. F., H a n e s С. S., Kinetic Formulations for Enzymic Reactions Involving
Two Substrates, Can. J. Biochem. PhysioL, 40, 763 A962).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Яковлев В. А., Кинетика ферментного катализа, изд-во «Наука», М., 1963.
У э б б Л., Ингибиторы ферментов и метаболизма, изд-во «Мир», М., 1966.
Ферменты, сб. статей под ред. А. Е. Браушлтейна, изд-во «Наука», М., 1964.

Глава VII
ФЕРМЕНТЫ
Молекулы белков выполняют в живых системах целый ряд функций.
Наиболее удивительным свойством белков является их способность
специфически и весьма эффективно влиять на скорость различного рода реакций
и таким образом регулировать динамику всех процессов жизнедеятельности.
В свою очередь и сами белки подчиняются ряду разнообразных регулятор-
ных воздействий. Белки, обладающие каталитической активностью,
называются ферментами.
Самнер в 1926 г. первым неопровержимо доказал, что ферменты имеют
белковую природу. С тех пор в кристаллическом виде получено уже более
100 ферментов, и все они оказались белками. В настоящее время вопрос
о белковой природе ферментов решен настолько определенно, что под словом
фермент автоматически подразумевается белок.
Четыре особенности отличают ферменты от всех прочих катализаторов.
Во-первых, эти биокатализаторы исключительно эффективны. При
оптимальных условиях большинство ферментативных реакций протекает
в 108—1011 раз быстрее, чем те же реакции в отсутствие ферментов. Число
оборотов (т. е. число молекул субстрата, превращаемых за одну минуту,
на одну молекулу фермента) для большинства ферментов равно
приблизительно 1000, а в некоторых случаях может превышать 10е. Следует при этом
иметь в виду, что скорость отдельных стадий ферментативных реакций
лимитируется диффузией реагирующих веществ или, во всяком случае, зависит
от нее. Таким образом, многие химические реакции, которые обычно
протекают только при высоких температурах или только в сильно кислой или
сильно щелочной среде, в присутствии соответствующих ферментов могут
идти быстро и количественно при комнатной температуре и при значениях pH,
близких к нейтральному. Во-вторых, для большинства ферментативных
реакций характерна высокая специфичность как в отношении природы
катализируемой реакции, так и в отношении структуры используемого
субстрата. В-третьих, круг реакций, катализируемых ферментами, необычайно
широк. Ферменты катализируют реакции гидролиза, поликонденсации,
окисления — восстановления, дегидрирования, альдольной конденсации,
реакции переноса различных групп, а также ряд других реакций. Мы можем,
таким образом, сказать, что белки — катализаторы с исключительно
широким спектром действия. Наконец, в-четвертых, активность самих
ферментов в клетке строго регулируется. Скорость синтеза ферментов, а также их
конечная концентрация находятся под генетическим контролем и
регулируются с помощью малых молекул; эти малые молекулы часто являются
субстратами или продуктами реакций, катализируемых теми же
ферментами. Кроме того, ферменты могут существовать как в активной, так
и в неактивной форме, причем скорость и степень их превращения в каждом
конкретном случае зависит от свойств окружающей среды. Почти все биоло-

1Г0 Глава VII
гически важные реакции катализируются ферментами, и, следовательно,
все они подчинены такого рода контролю. Процесс биосинтеза самих
ферментов также катализируется ферментами.
КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА РЕАКЦИЙ,
КАТАЛИЗИРУЕМЫХ ФЕРМЕНТАМИ.
Систематическая классификация и номенклатура реакций,
катализируемых ферментами, утверждена Комиссией по ферментам Международного
биохимического союза. Согласно этой классификации, ферменты
подразделяются на шесть главных классов:
1. Оксидоредуктазы — ферменты, катализирующие
окислительно-восстановительные реакции.
2. Трансферазы — ферменты, катализирующие реакции переноса групп.
3. Гидролазы — ферменты, катализирующие реакции гидролиза.
4. Лиазы — ферменты, катализирующие присоединение групп к двойным
связям или, наоборот, отщепление групп с образованием двойной связи.
5. Изомеразы — ферменты, катализирующие реакции изомеризации.
6. Лигазы (синтетазы) — ферменты, катализирующие реакции конденсации
двух молекул, сопряженные с расщеплением пирофосфатной связи в
молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.
Каждый класс ферментов подразделяется на подклассы и поддодклассы
в зависимости от природы индивидуальных превращений. При этом
учитываются природа коферментов (если таковые участвуют в реакции), тип
изомеризации, тип гидролизуемой связи и т. п. Такая классификация
позволяет идентифицировать индивидуальные ферменты при помощи шифра,
состоящего из четырех чисел. Первое число указывает, к какому из шести
главных классов принадлежит данный фермент; второе и третье указывают
подкласс и иодподкласс соответственно, а четвертое число представляет
собой порядковый номер фермента в данном подподклассе. Этот способ
классификации иллюстрирует табл. 28 (сильно сокращенный вариант списка
ферментов, опубликованного Комиссией по ферментам Международного
биохимического союза).
Решение вопроса о названии фермента представляет собой довольно
сложную задачу. Во-первых, трудно создать подлинно систематическую
номенклатуру, которая точно описывала бы природу рассматриваемой
реакции, и, во-вторых, нельзя не считаться с существованием уже
установившейся и широко используемой тривиальной номенклатуры.
Систематическая номенклатура ферментов (вместе с их систематической
классификацией) в настоящее время разработана, однако наряду с систематическими
наименованиями сохранены для повседневного пользования также и
краткие тривиальные названия. Знакомство с обеими этими системами
наименований в равной мере необходимо.
Правила, которыми руководствуются при установлении систематического
названия фермента, можно уяснить себе, внимательно изучив табл. 28.
Большинство тривиальных названий дает некоторую информацию о
природе субстратов и характере катализируемых реакций. Такие названия
обычно имеют окончание «-аза». Ниже приведены краткие характеристики
нескольких широко распространенных групп ферментов.
1. Дегидрогеназы — ферменты, катализирующие дегидрирование
субстратов с использованием в качестве акцептора водорода любых молекул,
кроме кислорода. Если перенос водорода от молекулы донора трудно
доказуем, то для этих ферментов используется название редуктазы.
2. Оксидазы — ферменты, катализирующие окисление субстратов с
молекулярным кислородом в качестве акцептора электронов.

Таблица 28
Классификация и номенклатура реакций, катализируемых ферментами
Систематическое название
Тривиальное название
Реакция
1. ОКСИД OPE Д У КТ АЗЫ
1.1 Действуют на СН — ОН-группу доноров
1.1.1 Акцептором служит НАД или НАДФ
Алкоголь: НАД-
доредуктаза
L-Лактат : НАД -
доредуктаза
-окси-
L-малат : НАД —окси-
редуктаза
Алкогольдогидрогеиаза
Лактатдегидрогоназа
Малатдегидрогоназа
1.1.3 Акцептором служит кислород
?-D-глюкоза :
кислород — оксидоредукта-
за
Глюкозооксидаза
Алькоголь4 НАД =
Альдегид или кетон 4
становленими НАД
L-Лактат4 НАД = Пиру-
ват 4- Восстановленный
НАД
L-малат 4 НАД = Окса-
лоацетат 4-
Восстановленный НАД
?-D-глюкоза 4 О3 — D-
глюконо-б-лактои +
4Н3О2
1.2 Действуют на альдегидную или кетонную группу доноров
1.2.1 Акцептором служит НАД или НАДФ
Глицеральдегидфосфат-
дегидрогеназа, трио-
зофосфатдегидроге-
иаза
D-глицеральдегид-З-
фосфат : НАД — окси-
доредуктаза (фосфо-
рилирующая)
D-глицеральдегид-З-
фосфат -f фосфат 4-
4-НАД = 1,3-дифосфо-
глицерииовая
кислота -f- Восстановленный
НАД
1.2.3 Акцептором служит кислород
Ксаитин : кислород— Ксантииоксидаза
оксидоредуктаза
1.3 Действуют на СН —СН-группу доноров
1.3.1 Акцептором служит НАД или НАДФ
Ксаитин + Н3О + О2 =
= Урат + Н3О2
4,5-дигидроурацил :
НАД —
оксидоредуктаза
Дигидроурацил-дегид-
рогвиаза
4,5-дигидроурацил +
+ НАД = Урацил+
-\- Восстановленный
НАД
1.4 Действуют на СН — NH2-rpynny доноров
1.4.1 Акцептором слулшт НАД или НАДФ
L-глутамат : НАД —
оксидоредуктаза
(дезам инирующая)
L-амииокислота 4- Огл~
4 НгО = 2-оксокисло-
Глутаматдегидрогеиаза L-глутамат 4 Н3О 4-
4 НАД = 2-оксоглута-
рат 4 ^Нз +
Восстановленный НАД
1.4.3 Акцептором служит кислород
L-амипокислота: кисло- Оксидаза L-амино-
род—оксидорэдукта- кислот
за (деаамииирующая)
1.5 Действуют на С — NH-группу доноров
1.6 Действуют на восстановленный НАД или НАДФ
1.9 Действуют на группу гема доноров
ТРАНСФЕРАЗЫ
2.1 Переносят одноуглеродные остатки
2.1.2 Трансферази оксиметильиых, формальных и родственных групп
2.1.2.1
L-серии : тотрагидрофо-
лат — 5,10-оксиметил-
траисфераза
Сврип — oкcи^[єrШJr-
трансфераза
L-ссрин 4- Тетрагидрофо -
лат = Глицин4- 5,10-
1[отилеитетраг идрофо-
лат

Продолжение табл. 28
Номер
(шифр)
Систематическое название
Тривиальное название
Реакция
2.1.3 Карбоксил- и карбамоилтрансферазы (в тривиальпых названиях
вместо «карбоксиитрансфераза» и «карбамоилтрансфераза» допустимы обозначения
«транскарбоксилаза», «транскарбамоилаза»)
Карбамоилфосфат -\- L-
аспартат -= Ортофос-
фат + іЧ-кароамоил-Ь-
аспартат
2.1.3.2
Карбамоидфосфат : L-
аспартат — карба-
моилтрансфораза
Лспартат — карбам оил-
трапсфораза
2.2 Переносят альдегидные или кетоиные остатки
2.2.1.1
Седогептулозо-7-фос-
фат : D-глицеральдв-
гид-3-фосфат — гли-
кольальдегидтранс-
фераза
Транскетолаза, гли-
к о льаль дегидтранс-
фераза
2.3.1.8
2.4.1.8
2.6.1.1
2.7.1.2
Фосфат — ацотилтранс-
фераза
2.3 Ацилтрансферазы
2.3.1 Ацилтрансферазы
Ацетил-КоА : ортофос-
фат — ацетилтрансфе-
раза
2.4 Гликозилтрансферазы
2.4.1 Гексозилтрансферазы
Мальтоза : ортофос- Мальтозофосфорилаза
фат — глюкозилтранс-
фераза
2.0 Переносят азотистые группы
2.6.1 Аминотрансферазы
L-аспартат : 2-оксоглу-
тарат — аминотранс-
фераза
Лспартат — аминотранс-
фераза
Б-садогептулозо-7-фос-
фат + D-глицеральде-
гид-3-фосфат = D-рибо-
зо-5-фосфат + D-ксилу-
лозо-5-фосфат
Ацетил-КоА + Ортофос-
фат = КоА + Ацетил-
фосфат
Мальтоза + Ортофос-
фат = ?-D-глюкозо-1-
фосфат-f D-глюкоза
L-аспартат + 2-оксоглу-
тарат = Оксалоаце-
тат + L-глутамат
2.7 Переносят группы, содержащие фосфор
2.7.1 Фосфотрансферазы со спиртовой группой в роли акцептора
2.7.1.40
АТФ : глюкоза — 6-фос-
фотрансфераза
АТФ : пируват — фосфо-
трансфераза
Глюкокиназа
Пируваткиназа
АТФ + D-глюкоза =
= АДФ + D-глюкозо-
6-фосфат
АТФ + Пируват =
= АДФ + Фосфоенол-
пируват
2.7.2.1
2.7.2 Фосфотрансферазы с карбоксильной группой в роли акцептора
АТФ : ацетат — фосфо-
трансфераза
Ацетаткиназа
АТФ + Ацетат = АДФ+
¦+ Ацетилфосфат
3. ГИДРОЛАЗЫ
3.1 Действуют на сложноэфирные связи
3.1.1 Гидролазы эфиров карбоновых кислот
3.1.1.7
3.1.3.9
3.1.4.1
Ацетилхолин —
гидролаза
Ацетилхолинэстераза
3.1.3 Гидролазы фосфомоноэфиров
D-глюкозо-б-фосфат —
— фосфогидролаза
Глюкозо-6-фосфатаза
3.1.4 Гидролазы фосфодиэфиров
Фосфогидролаза орто-
фосфорных диэфиров
Фосфодиэстераза
Ацетилхолин + Н2О =
= Холин + Ацетат
D-глюкозо-б-фосфат +
+ НгО = D-глюкоза -(-
+ Н3РО4
Фосфодиэфир -|- Н2О =
= Фосфомоноэфир -\-
Спирт

Продолжение табл. 28
Номер
(шифр)
Систематическое название
Тривиальное название
Реакция
3.4 Действуют на пептидные связи (пептид — гидролазы)
3.4.4 Поптидил — пептидгидролазы
3-4.4.1
3.4.4.4
3.4.4.5
Пепсин
Трипсин
Химотрипсин
Гидролизует пептиды,
особенно по связям,
прилегающим к
остаткам ароматических
или дикарбоновых
L-амипокислот
Гидролизует пептиды,
амиды, сложные эфи-
ры и т. п. по месту
связей, в которых
участвуют карбоксильные
группы L-аргинина
и L-лизина
Гидролизует пептиды,
амиды, сложные эфи-
ры и т. ц., и особон-
ности по месту
связей, в которых
участвуют карбоксильные
группы ароматических
L-амішокислот
3.5 Действуют на С — N-связи, отличающиеся от пептидных связей
3.5.1 В линейных амидах
3.5.1.5
Карбамид — амидогид-
Уреа^а
Мочевина 4- Н2О = СО2 4-
ролаза
3.6 Действуют на кислотноангидридные связи
3.6.1 В фосфорилсодержащих ангидридах
3.6.
4. ЛИ
1.1
АЗЫ
Пирофосфат — фосфо-
гидролаза
Неорганическая пиро-
фосфатаза
4.1 Углерод — углерод-лиазы
4.1.1 Карбокси-лиазы
4.1.1.1
4.1.2.7
Карбокси-лиаза 2-оксо-
кислот
Пируватдокарбоксила-
за
4.1. 2 Альдегид-лиазы
Кетозо- 1-фосфат — аль-
дегид-лиаза
Альдолаза
4.3 Углерод — азот-лиазы
4.3.1. Аммиак-лиазы
4.3.
5. ИЗ
5.1.
1.1
L-аспартат — аммиак ¦
лиаза
Аспартат — аммиак -
лиаза
Пирофосфат + Н2О =
2 Ортофосфат
2-Оксокислота =
Альдегид -f CO 2
Кетозо-1-фосфат = Ди-
оксиацетопфосфат +
-f- Альдегид
L-аспартат = Фу марат +
+ Аммиак
ОМЕРАЗЫ
5.1 Рацемазы и эпимеразы
5.1.1 Действуют на аминокислоты и их производные
1.1 Аланинрацемаза Аланинрацемаза
13—246

194
Глава VII
Продолмсение табл. 28
Номер
(шифр)
Систематическое название
Тривиальное название
Реакция
5.1.2.1
5.1.3.2
0. ЛИГА
6.1.1.1
5.1.2 Действуют на оксикиолоты и их производные
Лактатрацемаза | Лактатрацемаза | L-лактат-Б-лактат
5.1.3 Действуют на углеводы и их производные
УДФглюкоза-
мераза
- 4-эпи-
УДФглюкоза — эпиме-
раза
У ДФглюкоза = УДФгаг-
лактоза
ЗЫ
6.1 Образуют С — О-связи
6.1.1 Лигазы, образующие аминоацил-РНК
L-тирозин : sPHK — ли-
газа (АМФ)
Тирозил-sPHK — синте-
таза
АТФ + L-тирозин -
РНК АМФ
6.2 Образуют С — S-евязи
6.2.1 Кислото-тиоловые лигазы
6.2.1.1
Ацетат : Ко А — лигаза
(АМФ)
Ацетил-Ко А — сиитета-
за
рофосфат + Ь-тиро-
зил-sPHK
АТФ-|-Ацетат +
К МФ
+ +
-\- Пирофосфат+ Аце-
тил-КоА
6.3 Образуют С — N-связи
6.3.4 Прочие С—N-лигазы,
6.3.4.2
6.4.1.2
УТФ : аммиак — лигаза
(АДФ)
ЦТФ-синтетаза
6.4 Образуют С — С-евязи
Ацетил-КоА : двуокись
углерода — лигаза
(АДФ)
Ацетял-КоА —карбо-
ксилаза
+ 3
АДФ +Ортофос-
фат + ЦТФ
А ТФ + Ацетил-Ко А +
СО О
+ 2 + 2 Д +
+ Ортофосфат-{- Мало-
нил-КоА
3. Гидроксмлазы — ферменты, катализирующие введение ОН-грутш
в субстраты с молекулярным кислородом в качестве донора кислорода.
4. Оксигеназы — ферменты, катализирующие прямое включение
молекулы кислорода в субстраты в ходе окислительного расщепления С — С-связи.
5. Киназы — ферменты, катализирующие перенос фосфата от АТФ
(или — значительно реже — от другого нуклеозидтрифосфата) к субстрату.
6. Тиокиназы — ферменты, катализирующие образование тиоловых эфи-
ров (кофермента А; см. стр. 210) из карбонових кислот, являющихся
субстратами в реакциях, связанных с расщеплением АТФ.
7. Фосфатазы — ферменты, катализирующие гидролитическое
расщепление фосфатных эфиров.
8. Фосфорилазы — ферменты, катализирующие присоединение остатков
фосфорной кислоты к гликозидным или аналогичным связям.
9. Трансферазы — ферменты, катализирующие перенос определенных
групп от одного субстрата к другому. Подклассы включают трансацетилазы
(перенос ацильной группы), транскарбамилазы (перенос карбамилыюй
группы) и транскарбоксилазы (перенос карбоксильной группы).
10. Мутазы — ферменты, катализирующие миграцию каких-нибудь,
групп от одного участка данной молекулы к другому.

Ферменты 195
И. Синтетазы — ферменты, катализирующие конденсацию двух
молекул, сопряженную'с расщеплением АТФ или другого нуклеозидтрифосфата.
В некоторых случаях названия ферментов образуют просто, добавляя
окончание «-аза» к названию субстрата (например, АТФ-аза, рибонуклеаза,
аконитаза). В то же время многие тривиальные названия не имеют
отношения ни к субстрату, ни к типу катализируемой реакции (таковы, например,
названия многих протеолитических ферментов — химотрипсин, трипсин,
пепсин, папаин, ренин и фицин). Известны также случаи, когда для одного
и того же фермента используется несколько названий. Фермент,
катализирующий образование цитрата из оксалоацетата и ацетил-КоА (см. гл. XIX),
называют, например, конденсирующим ферментом, цитратконденсирующим
ферментом, цитрогеназой и цитратсинтетазой (не считая систематического
названия). Наконец, имеются в тривиальной номенклатуре и такие
названия, смысл которых не нуждается в пояснениях. Некоторые из этих
названий (хотя далеко не все) Комиссия по фермептам рекомендует
использовать в качестве допустимых альтернатив (см. табл. 28).
АКТИВНЫЙ ЦЕНТР ФЕРМЕНТА
Главной целью при изучении механизма любой^реакции является
выяснение структуры переходного состояния и природы промежуточных
продуктов. В случае ферментативных реакций для определения структуры
переходного состояния необходимо не только знакомство с геометрией
молекулы субстрата, но также и знание трехмерной конформации фермента.
Характерные для ферментативных реакций специфичность и высокая
каталитическая эффективность определяются тем, что в данном каталитическом
процессе участвует несколько функциональных групп фермента. В силу
этого обстоятельства, а также из-за крайней сложности таких больших
молекул, какими являются молекулы белка, точное определение структуры
переходного состояния для ферментативных реакций представляется
исключительно трудным. Приходится поэтому, по крайней мере в настоящее время,
довольствоваться более простыми задачами: 1) выяснением отдельных
стадий реакции; 2) идентификацией аминокислот, участвующих в связывании
субстрата, а также в реакциях образования и разрыва связей; 3)
определением приблизительного расположения этих аминокислот в пространстве
и 4) разработкой такого гипотетического механизма реакции (с учетом
специфической каталитической роли участвующих в реакции групп), который
позволил бы объяснить наблюдаемую скорость ферментативной реакции
(хотя бы порядок величины). К сожалению, полностью решить все эти
задачи не удалось пока даже и в наиболее простых случаях.
В большинстве ферментативных реакций участвуют субстраты,
молекулы которых достаточно малы по сравнению с молекулами самих ферментов.
Естественно поэтому, что при образовании фермент-субстратного комплекса
лишь незначительная часть пептидных связей и боковых цепей аминокислот
оказывается в непосредственном контакте с молекулой субстрата.
Понимание этого обстоятельства породило представление об активном центре
фермента. Активный центр фермента образуют те боковые цепи и те
пептидные связи, которые находятся в прямом физическом контакте с молекулой
субстрата (возможно, при посредстве молекул воды), а также и те боковые
цепи или пептидные связи, которые, не вступая в прямой контакт с
субстратом, тем не менее принимают непосредственное участие в
каталитическом акте. (На фиг. 66 схематически изображен активный центр фермента.)
Функция остальной части полипептидной цепи состоит в том, что она служит
структурной основой, обеспечивающей такое взаимное расположение
отдельных компонентов активного центра в пространстве, какое требуется для
13*

196
Глава VII
эффективного осуществления специфической каталитической реакции.
Необходимость в такой структурной основе явствует из того факта, что кон-
формационные изменения белковой части фермента, вызванные влиянием
денатурирующих факторов (тепло, мочевина, органические растворители
Фиг. 66. Схематическое изображение активного центра фермента.
Заштрихованная полоса изображает связь, которая разрывается в процессе действия фермента;
буквами обозначены некоторые из боковых цепей аминокислотных остатков, а две черные полосы
изображают полипептидные цепи двух сегментов белковой цепи.
и т. д.), очень часто приводят к резкому изменению каталитической
активности. Естественно, однако, допустить, что какая-то часть молекулы
фермента может и не играть никакой роли в каталитическом процессе.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ] В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ ФЕРМЕНТА
Идентификация аминокислот, присутствующих в активных центрах
ферментов, разумеется, очень важна для понимания главных особенностей
механизма ферментативных реакций. Существует ряд методов, с помощью
которых можно идентифицировать хотя бы некоторые из аминокислотных
остатков, участвующих в построении активного центра. Наиболее прямой
метод состоит в присоединении к какому-нибудь аминокислотному остатку,
входящему в состав активного центра, ковалентной метки, которая
оставалась бы устойчивой в условиях деградации полипептидных цепей. С точки
зрения такой возможности все ферменты можно разделить на два класса:
в один из них входят ферменты, образующие в ходе каталитического
процесса ковалентно связанные промежуточные фермент-субстратные
производные, а в другой — ферменты, которые таких производных не образуют.
Для ферментов первого класса проблема введения специфической метки
в активный центр (а не просто неспецифического введения метки в белок)
часто решается путем использования в качестве носителей метки либо
обычных субстратов этих ферментов, либо соединений, структурно родственных
субстрату. Вследствие специфического сродства этих веществ к активному

Ферменти 197
центру вероятность попадания метки в какие-то другие места сильно
снижается. Что касается ферментов второго класса, то для них проблема
введения мотки в активный центр оказывается гораздо более сложной.
Существование ковалецтных фермент-субстратных производных было
продемонстрировано для ряда ферментов, причем число таких ферментов
все время растет. Этот список включает в настоящее время химотрипсин,
трипсин, триозофосфатдегидрогеназу, фосфоглюкомутазу, мутазу фосфогли-
цериновой кислоты, несколько фосфатаз, несколько альдолаз,
декарбоксилазу ацетоуксусной кислоты и некоторые другие ферменты. В нескольких
случаях фермент-субстратные промежуточные продукты оказались
термодинамически достаточно устойчивыми, что позволило осуществить их
выделение и изучение. Фосфорилированную фосфоглюкомутазу — промежуточный
продукт в процессе взаимопревращения глюкозо-1-фосфата и глюкозо-6-фос-
фата—можно получить, инкубируя дефосфофермент с его фосфорилирован-
ными глюкозными субстратами:
Фосфофермент + Глюкозо-і-фосфат ^^
Дефосфофермент-f- Глюкозо-1,6-дифосфат, (VII. 1)
Дефосфофермент + Г люкозо-1,6-дифосфат *¦
^~** Фосфофермонт + Глюкозо-б-фосфат. (VII.2)
При химической и ферментативной деградации фосфорилированного
фермента образуется фосфосерин, связанный по С-концу с остатком гистидина.
Если не считать этого остатка гистидина, то пептид, содержащий реакционно-
способный остаток серина, по своему аминокислотному составу напоминает
соответствующие пептиды, выделенные из протеаз и эстераз (см. ниже).
Аналогичным способом может быть получена и изучена фосфорилированная
мутаза фосфоглицериновой кислоты, которая по ряду своих свойств весьма
близка к фосфоглюкомутазе.
В большинстве случаев, однако, фермент-субстратные производные
недостаточно устойчивы по сравнению с исходными и конечными продуктами,
и потому выделить их в сколько-нибудь заметных количествах не удается.
Иногда такие лабильные промежуточные продукты можно стабилизировать
за счет химической модификации. Так, например, инкубация альдолазы
с радиоактивным диоксиацетонфосфатом или трансальдолазы с
радиоактивным фруктозо-6-фосфатом в присутствии боргидрида натрия
(восстанавливающий агент) приводит к необратимому включению радиоактивной метки
в белок. В обоих случаях среди продуктов полного кислотного гидролиза
белка был идентифицирован N-є-глицериллизин. Таким образом, при этих
реакциях должно происходить образование шиффова основания (в
результате реакции между кетогруппой молекулы субстрата и є-аминогрушіой
остатка лизина), которое затем восстанавливается боргидридом натрия
в стабильный вторичный амин:
Фермент — NH2 + 0
Фермент— N =<f -4-
— ч
-NaBH4;
Фермент — N
^> Фермент-
Ы
-N
\
1
H
Кислота
H
Лизин—N
Н<
I
H
(VII
(VU
.3)
Л)
Аналогичные результаты были получены и для декарбоксилазы
ацетоуксусной кислоты, которая также, по-видимому, катализирует образование
шиффова основания между кетогруппой субстрата и є-аминогруппой лизина.

І98
Глава VII
Это шиффово основание можно затем стабилизировать либо восстановлением
боргидридом натрия, либо присоединением цианида по двойной связи имина.
Более общим, хотя и менее надежным, является метод, основанный
на использовании в качестве ковалентных меток активного центра не самих
субстратов, а их аналогов (квазисубстратов). В качестве квазисубстрата
выбирают вещество, молекулы которого настолько сходны с молекулами
нормального субстрата, что могут образовать ковалентний
фермент-субстратный комплекс. Однако они должны в то же время и отличаться от
нормального субстрата настолько, чтобы этот комплекс либо вообще не
разлагался, либо разлагался достаточно медленно. Этот метод оказался полезным
при использовании диизопропилфторфосфата (ДФФ) в качестве
квазисубстратной метки активного центра эстераз и протеаз (табл. 29).
Таблица 29
Последовательность аминокислот около реакционноспособного остатка серина
в молекулах некоторых эстераз и протеаз
Последовательность
Гли-Вал-Сер-Сер-Цис-Мет-Гли-Асп-Сер-Гли-Гли-
-Про-Лей-Вал-Цис-Лиз
Аспн-Сер-Цис-Глу-Гли-Гли-Асп-Сер-Гли-Про-Вал-
-Цис-Сер-Гли-Лиз
Асп-Сер-Гли
Асп-Сер-Гли
Фен-Гли-Глу-Сер-Ала-
-Гли(Ала, Ала, Сер)
Глу-Сер-Ала
Гли-Глу-Сер-Ала-Тли-Гли
Аспн-Гли -Тре-Сер-Мет- Ала-
-Сер-Про-Гис
Тре-Сер-Мет-Ала
Тре-Ала-Сер-Гис-Асп
Лиз-Глун-Илей-Сер-Вал-Арг
Тре-Гли-Лиз-Про-Асп-Тир-Вал-
-Тре-Асп-Сер-Ала-Ала-
-Сер-Ала
Фермент
Химотрипсин
Трипсин
Тромбин:
Эластаза
Бутирилхолинэстераза
Ацетилхолинэстераза угря
Алиэстераза из печени лошади
Субтилизин (В. subUlis)
Протеаза (Aspergillus orizae)
Фосфотлюкомутаза
Фосфорилаза
Щелочная фосфатаза (Е. coli]
Поскольку ДФФ не является полным структурным аналогом нормальных
субстратов этих ферментов, опасность присоединения метки не к активному
центру, а к каким-то другим участкам молекулы фермента в этом случае,
естественно, больше, нежели в случаях,, описанных выше. Однако скорость,
стехиометрия и специфичность реакции присоединения ДФФ явно
указывают, что метка действительно попадает в активный центр. Известно,
например, что ДФФ специфически фосфорилирует один из двух остатков серина
в химотрипсине. Химотрипсин может быть помечен и многими другими
аналогичными агентами, в том числе ге-нитрофенилацетатом, причем в
каждом случае ацилируется одна и та же гидроксильная группа серина, тогда
как никакие другие группы не ацилируются. Во многих (хотя и не во всех)
исследованных эстеразах и протеиназах ДФФ фосфорилирует
гидроксильную группу только того серина, с N-концом которого связан либо аланин,
либо глицин. Данные, характеризующие окружение реакционноспособного
серина в некоторых белках, приведены в табл. 29. Из таблицы видно, что
даже ферменты, сильно различающиеся по своей специфичности, могут иметь
одинаковую последовательность аминокислот в участках, примыкающих
к остатку серина, содержащему реакционноспособную гидроксильную группу.
Это позволяет думать, что специфичность фермента и его способность ката-

Ферменты 199
лизировать реакции разрыва и образования связей зависят от разных
аминокислотных остатков и что остатки, группирующиеся около серина,
ответственны за разрыв и образование связей.
Если мы имеем дело с ферментами, не образующими ковалентных
фермент-субстратных комплексов, то избирательное введение ковалентной
метки в активный центр фермента представляется, как уже отмечалось
выше, весьма трудной задачей. Достаточно сослаться хотя бы на такой
пример. Известно, что многие ферменты реагируют с и-оксимеркурибензо-
атом или и-хлормеркурибензолсульфонатом, причем в результате меркури-
рования доступных сульфгидрильных групп образуется продукт, лишенный
каталитической активности. По большей части, однако, при этом неясно,
что, собственно, имеет здесь место — блокируется ли реакционноспособная
еульфгидрильная группа активного центра или же меркурирование одной
из сульфгидрильных групп, находящихся вдали от активного центра,
вызывает какие-то конформационные изменения, быть может и совсем
незначительные, но тем не менее приводящие к инактивации фермента.
Для выявления аминокислот, принимающих непосредственное участие
в каталитическом процессе, можно использовать косвенные методы, не
связанные с введением ковалентной метки в активный центр. Такие методы,
однако, не позволяют однозначно установить положение аминокислотного
остатка в нолипептидной цепи и окончательно решить вопрос о том,
находится ли этот остаток в активном центре или в каком-то другом участке
каркаса белковой молекулы.
Из косвенных методов чаще других используется метод, основанный
на изучении pH-зависимости некоторых параметров реакции, таких,
например, как максимальная скорость или константа Михаэлиса. Изменение этих
параметров в зависимости от pH часто напоминает но своему характеру
титрование одной ионизируемой группы (см. гл. VI). Можно поэтому
определить соответствующее значение р/?а этой группы и попытаться
идентифицировать ее путем сравнения полученного значения р/Са с известным
значением p/fo для боковых цепей различных аминокислот. Все это сопряжено
с известными трудностями. В результате взаимодействия с соседними
группами в белке, а также с субстратом или буфером величина трКа для
ионизируемой группы в белке может заметно отличаться от соответствующей
величины для той же группы, присутствующей в свободном виде в растворе.
Кроме того, величины трКа для различных титруемых групп белков в
значительной степени перекрываются. Например, группа с p/fa 10 может быть
либо аминогруппой, либо фенольной гидроксильной группой, либо сульф-
гидрильной группой. В некоторых случаях определение величины АН
ионизации помогает приписать данное значение ipKa той или иной группе, однако
нередко однозначное отнесение полученного значения piTa к определенной
функциональной группе оказывается все же невозможным. Известно также,
что pH-зависимость может отражать титрование нескольких остатков,
а не какой-либо одной индивидуальной группы. Наконец, крутые перегибы
кривых, описывающих зависимость скорости реакции от pH, могут
вызываться не только титрованием, но также и другими факторами, например
изменением стадии, лимитирующей скорость реакции. К счастью, все эти
осложнения возникают не всегда. Часто заключения, сделанные на
основании pH-зависимости, удается подкрепить другими методами. Исходя
из данных по зависимости максимальной скорости реакции от pH, следует,
например, считать, что у всех ферментов, перечисленных в табл. 29, в
каталитическом акте участвует остаток гистидина. Для химотрипсина это
заключение подтверждается тем, что соответствующий хлоркетон, являющийся
аналогом субстрата химотрипсина, избирательно реагирует с одним остатком
гистидина и вызывает таким путем инактивацию фермента. На основании

200 Глава VII
зависимости скорости реакции от pH можно было также высказать
предположение о наличии сульфгидрильной группы в активном центре папаина.
Ингибирование папаина реагентами, связывающими сульфгидрильные
группы, подтверждает это предположение.
С успехом используется для идентификации аминокислотных остатков
в активном центре также и метод, основанный на утрате каталитических
свойств при химической модификации аминокислот. Примером тарой
модификации может служить реакция и-оксимеркурибензоата с сульфгидриль-
ными группами. Широкому применению этого метода препятствует
отсутствие избирательного действия у большинства реагентов, используемых
для модификации аминокислот, а также неодинаковая реакционная
способность различных функциональных групп белков.
КОНФОРМАЦИЯ АКТИВНОГО ЦЕНТРА
Ни для одного из ферментов пока еще не удалось выяснить
пространственное расположение аминокислот, составляющих активный центр.
Неизвестно даже, специфична ли трехмерная конформация аминокислот
активного центра в отсутствие субстрата и если специфична, то
соответствует ли она каталитически активной конформации. Были предложены две
теории, касающиеся конформации активного центра фермента. В конце
прошлого века Эмиль Фишер, пытаясь объяснить специфичность
катализируемых ферментами реакций, высказал предположение, что фермент
существует в относительно жесткой конформации, так что субстрат связывается
с ним как с неким шаблоном. Очевидно, что с помощью этой «гипотезы ключа
и замка» можно объяснить специфичность ферментов, ибо ясно, что
жесткость шаблона должна обусловливать пространственные затруднения для
молекул, отличающихся по своей структуре от нормального субстрата
данного фермента. В противовес гипотезе Фишера Кошланд выдвинул свою
«теорию индуцированного соответствия» (induced-fit theory).
Эта теория основывается на трех постулатах: 1) присоединение субстрата,
к активному центру вызывает значительные изменения в геометрии белка;
2) для действия фермента необходима точная ориентация каталитических
групп; 3) субстрат индуцирует эту требуемую ориентацию, изменяя
геометрию белка.
Появление теории индуцированного соответствия было вызвано
необходимостью объяснить некоторые факты, которые не удавалось согласовать.
с гипотезой ключа и замка. Известно, например, что в определенных
ферментативных реакциях часть субстрата переносится на спирт, но не
переносится на воду. Согласно гипотезе ключа и замка, следовало бы ожидать,
что в отсутствие спирта будет протекать реакция с водой, так как в активном
центре почти несомненно должна присутствовать вода (из-за ее высокой
концентрации в водных растворах). Поскольку в действительности реакции
с водой не наблюдается, можно думать, что спирт, связываясь в активном
центре, вызывает какое-то изменение геометрии этого последнего, т. е. его
переход в каталитически активную конформацию. Химические данные
также указывают на изменение конформации фермента при связывании
субстрата.
ПУТИ И МЕХАНИЗМЫ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ
Очевидно, что для понимания механизма любой химической реакции —
независимо от того, катализируется она ферментом или нет,— необходимо
знать, какие связи разрываются и какие образуются, а также располагать
данными о природе промежуточных продуктов (если они возникают в ходе
реакции). Эта информация позволяет составить представление о путях

Ферменты 201
и механизмах реакций. Один из главных методов получепия такой
информации основывается на определении начальной скорости реакции, а также
на выявлении типа ингибирования исходя из кинетических данных в
условиях стационарного состояния (см. гл. VI). Ценные сведепия удается также
часто получать с помощью меченых соединений. Изотопы многих элементов,
например С14, Н3, Р32 и S35, радиоактивны, благодаря чему их можно
отличать от обычных изотопов тех же элементов. Другие изотопы, например
H2, N15 и О18, отличаются от обычных изотопов соответствующих элементов
только массой и, следовательно, могут быть определены но масс-спектрам 1.
Изотопный метод используют обычно в экспериментах двух типов —
в опытах по включению изотопов и в опытах по изотопному обмену.
Эксперименты первого типа, вообще говоря, позволяют выявлять положение
образующихся и разрывающихся связей; однако в некоторых случаях они
также дают возможность идентифицировать промежуточные продукты
реакции. Опыты по изотопному обмену, в процессе которого происходит
замещение имеющейся группы на аналогичную меченую группу, дают
информацию о существовании промежуточных продуктов реакции. Ознакомимся
с исследованиями первого типа на примере расщепления глюкозо-1-фосфата
щелочной фосфатазой. Эту реакцию, очевидно, можно представить себе как
результат расщепления либо С — О-связи, либо Р — О-связи. Если
проводить ее в водной среде, обогащенной Н2О18, то первый из двух возможных
путей должен привести к глюкозе, содержащей один атом О18:
СН2ОН СНгОН
О\| У
НОЧІ /S w-rwjn. Ho-
он он
а второй — к меченому фосфату
OH
(VI 1.6)
но'
Обнаружение одного атома О18 в неорганическом фосфате указывает, что
местом расщепления субстрата является Р— 0-связь. Почти все фосфатаз-
ные реакции протекают по этому пути. В то же время реакция фруктозы
с глюкозо-1-фосфатом в воде, обогащенной О18, дает сахарозу и
неорганический фосфат, который не содержит избытка О18. Следовательно, эта
реакция должна протекать с разрывом С — О-связи, что вообще характерно для
фосфорилазных реакций. Именно такие эксперименты позволили
установить, что фосфатазы являются ферментами, переносящими фосфорильную
группу, а фосфорилазы — ферментами, переносящими гликозильную группу.
Опыты по изотопному обмену можно проиллюстрировать на примере
такого фермента, как фосфорилаза сахарозы. Этот фермент катализирует
следующие обменные реакции:
Глюкозо-1-фосфат + Фн(рз2) ^ Глюкозо-1-фосфат(Р32) + фН) (VII.7)
Глюкозилфруктоза-f Фруктоза(С14) ^ Глгокозилфруктоза(С14) +Фруктоза, (VII.8)
1 Кроме масс-спектроскопии, существует и ряд других методов анализа стабильных
изотопов, а именно эмиссионная спектроскопия, оптические методы, донситомотрия,
ЯМР и т. д.— Прим. ред.

202 Глава VII
каждая из которых протекает в отсутствие второго субстрата. Это
свидетельствует в пользу существования ковалентно связанного глюкозил-фер-
ментного промежуточного продукта, т. е. указывает на то, что реакция
может протекать в две стадии:
Глюкозо-1-фосфат + Фермент ' ^ Глюкозилфермент-|-Фн, (VII.9)
Глюкозилфермент-f Фруктоза Глюкозилфруктоза-|-Фермент. (VII.10)
Важно понимать, что такого рода данные лишь указывают на возможность
существования промежуточного продукта. Рассматривать их как строгое
доказательство наличия такого промежуточного продукта нельзя потому,
что те же обменные реакции вполне можно представить себе как результат
прямого замещения. Отсутствие обменных реакций в свою очередь не
исключает существования ковалентного фермент-субстратного производного,
поскольку можно допустить, что для каталитической активности необходимо
наличие обоих субстратов. Так, например, имеются все основания считать,
что реакция, катализируемая цитратконденсирующим ферментом
(см. гл. XIX), включает атаку енола или карбаниона ацетил-SKoA по
карбонильной группе оксалоацетата. Однако инкубация одного только ацетил-
SKoA с этим ферментом не приводит к обмену водородом между метильной
группой ацетил-SKoA и растворителем. Следовательно, для образования
енола или карбаниона этого типа необходимо присутствие второго субстрата —
оксалоацетата. Таким образом, данные, которые могут быть получены
в опытах ло изотопному обмену, следует интерпретировать с осторожностью.
Более определенные выводы позволяет сделать реакция изотопного
обмена, катализируемая альдолазой:
c = o
I ch.,opo3h- оно
HO-C-H I " I
I -^ C=O + H —C-OH (VII.11)
H-C-OH I I
I CH2OH CH2OPO3H-
H—C—OH
CH2— OPO3H-
B ряде работ было показано, что инкубация диоксиацетонфосфата с альдо-
лазой в окиси дейтерия или в воде, содержащей окись трития, приводит
к включению одного атома дейтерия или трития в диоксиацетонфосфат.
Аналогичного включения не наблюдается, если использовать в качестве
субстрата глицеральдегид-3-фосфат. Это показывает, что альдолаза активирует
диоксиацетонфосфат, но не активирует глицеральдегид-3-фосфат, откуда
с достаточной степенью вероятности следует, что промежуточным продуктом
в реакции является связанный с ферментом карбанион, енол или енолят
первого субстрата. Альдолазная реакция может в таком случае
рассматриваться как сочетание двух реакций (см. гл. XI):
О
НО —СН:2—С —СН:2 —ОРО3Н- ^
О . 0-1
II H | (VII.12)
но—-сн—с—сн2—оро3н- <—> но—с = с —сн2—opo3H-J
о о он
)—-С —С—R + C —
H
НО--С —C-R + C-CH~CH2OPO3H- -^ Фруктозо-1,6-дифосфат. (VII.13)
H

Ферменты
203
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ХИМОТРИПСИНА
В настоящее время лучше всего изучен механизм каталитического
действия химотрипсииа. На примере этого фермента хорошо видно, как можно
использовать сочетание различных описанных выше экспериментальных
подходов для расшифровки механизма определенной ферментативной реакции.
Химотрипсин катализирует перенос ацильной группы. Он переносит
ацильиую группу от ряда доноров (эфиры, амиды, гидроксаматы и др.)
на ряд акцепторов (вода, спирты и амины). Ниже будет показано, что
катализируемые химотрипсииом реакции протекают, по-видимому, с
образованием промежуточного продукта — ацилфермента. Таким образом, эти
н
I
но
о"?
—R
ч о
"С
н
R,OH
H
і
1
Q
R
1
О
Ациміроаание
С—R
І
о
H /~3\c*LR
I
о
oC
о
II
C-R
OR2
Деацимровате
Фиг. 67. Гипотетический механизм реакций переноса ацильной группы,
катализируемых химотрішсином.
Атака карбонильного атома углерода субстрата гидроксилыюй группой серина представлена
протекающей по механизму как кислотного, так и основного катализа с участием имидазольной части остатка
гистидина. Переносчиком протона на стадии реакции, соответствующей кислотному катализу, служит
молекула воды. Считается, что распад тетраэдрического промежуточного продукта также происходит
по механизму кислотно-основного катализа, причем молекула воды служит переносчиком протона на ста-
чии основного катализа. Стадия деацилированпя суммарной реакции представляет собой обращение
стадии ацилированмя.
реакции по своему типу принадлежат к реакциям двойного замещения.
Современные представления о механизме этих реакций основываются главным
образом на следующих данных:
1. Активный центр химотрипсина может быть ковалентно помечен
квазисубстратами, в том числе /г-нитрофенилацетатом, диизопропилфторфос-
фатом и пеактивировапным метиловым эфиром коричной кислоты. Опыты
такого рода позволили прийти к заключению об образовании
промежуточного продукта реакции — ацилфермеита.
2. Максимальные скорости химотриптического гидролиза различных
производных ІЧ-ацетил-Ь-триптофапа одинаковы. Поскольку реакционная
способность самих этих производных весьма различна, данный факт
означает, что из этих более или менее специфичных субстратов образуется ацил-

204 Глава Vil
фермент и что стадией, лимитирующей скорость каталитического процесса,
является деацилирование. Равенство скоростей гидролиза различных
производных объясняется тем, что для всех субстратов ацилфермент одинаков —
во всех случаях это М-ацетил-Ь-триптофанилхимотрипсин.
3. Активный центр химотрипсина может быть ковалентно помечен также
специфическим субстратом, N-ацетилтриптофаном. Поскольку химотрипсин
предпочтительно расщепляет пептидные связи, образованные остатками
триптофана и тирозина, этот эксперимент является веским доказательством
в пользу гипотезы о существовании ацилфермента.
4„ Химическое и ферментативное расщепление различных ацилпроизвод-
ных химотрипсина показывает, что ацильная группа присоединена к гид-
роксильной группе остатка серина (см. табл. 29).
5. Превращение этого ключевого остатка серина в остаток дегидроалани-
на полностью инактивирует химотрипсин, что указывает на необходимость
образования в качестве промежуточного продукта ацилфермента с ацилиро-
ваниом по данной гидроксильной группе серина.
6. Изучение влияния pH на скорость катализируемых химотрипсином
реакций свидетельствует о необходимости для катализа непротонированного
остатка гистидина или его кинетического эквивалента. Это заключение
подтверждается утратой ферментативной активности при алкилировании
гистидина хлорметилкетоном — аналогом субстрата химотрипсина (метка по
сродству).
7. Скорость реакций, катализируемых химотрипсином в тяжелой воде
(D2O), в 2—3 раза меньше, чем в обычной воде. Это наблюдение согласуется
с тем, что на стадии, лимитирующей скорость, происходит перенос протона,
т. е. что реакция протекает по типу обычного кислотно-основного катализа.
На фиг. 67 представлен механизм действия химотрипсина, учитывающий
эти и некоторые другие данные. Этот механизм (впрочем, не единственный,
который можно согласовать со всеми имеющимися данными) учитывает
также возможность образования в качестве промежуточных продуктов
соединений тетраэдрического строения — обычных промежуточных
продуктов эстеразных реакций.
ПРОБЛЕМА СПЕЦИФИЧНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
Из многих аспектов ферментативного катализа один представляется
особенно интересным с химической точки зрения и важным для биохимии.
Речь идет о высокой специфичности ферментативных реакций. Совершенно
очевидно, что если бы круг субстратов, на который могут воздействовать
индивидуальные ферменты, не был строго ограничен, то ни о каком
упорядоченном обмене не могло бы быть и речи.
Проблеме специфичности ферментов посвящено очень большое число
исследований. В идеале для таких исследований требуется серия
структурных аналогов субстрата, подобранная с таким расчетом, чтобы каждая
из групп, принимающих участие в данной реакции, у какого-нибудь из
аналогов была модифицирована. Изучение кинетических параметров реакции,
протекающей с участием модифицированного субстрата, позволяет оценить
влияние модификации на процесс связывания субстрата и на способность
субстрата атаковаться данным ферментом. В опытах по изучению
специфичности необходимо использовать чистый фермент или хотя бы препарат,
не содержащий других ферментов, катализирующих тот же самый тип
реакции, т. е. нужно быть уверенным в том, что реакция ни в какой мере не
вызывается действием другого фермента. Кроме того, для таких исследований
требуются тщательно очищенные субстраты, чтобы исключить возможность
реакции за счет примесей.

Ферменты 205
Главной задачей при изучении специфичности ферментов является
выяснение тех структурных требований, которым должен удовлетворять
субстрат. Руководствуясь этими данными, можно бывает составить
представление о каталитически активной конформации активного центра данного
фермента (при этом неважно, представляет ли собой эта конформация
некий жесткий шаблон или она индуцируется субстратом).
Определенных успехов в такого рода исследованиях удалось достичь лишь
в нескольких отдельных случаях. Нередко подобный подход оказывается
вообще невозможным, так как многие ферменты обладают, по-видимому,
*сн2он алф *сн2он
I « I
-2[Н1
Н-С-ОН + АТФ —^-— Н-С-ОН
I I
сн2он сн2оро3н сн2оро3н сн2оро3н"
СН2ОРО3Н
с=о
но-с—н
H—С—ОН
I
Н-С-ОН
I
СНгОРО3Н
Фиг. 68. Судьба метки при ферментативном получении фруктозо-1,6-дифосфата из 1-С14-
глицерина.
абсолютной специфичностью, т. е. воздействуют только на один какой-
нибудь субстрат (или пару субстратов). Лишь в тех случаях, когда фермент
способен «терпеть» хотя бы незначительные изменения структуры субстрата,
можем мы рассчитывать на то, что нам удастся определить число и
пространственное расположение групп, участвующих в связывании субстрата
на поверхности фермента.
В последующих главах мы столкнемся со многими примерами
специфичности отдельных ферментов; поэтому здесь мы приводить такие примеры
не будем. (Обширная информация по этому вопросу содержится в книге
Диксона и Уэбба.) Коснемся лишь одного аспекта, который заслуживает
специального рассмотрения, а именно способности некоторых ферментов
различать химически идентичные группы. Ниже приведены три примера
такой специфичности.
Первый пример касается глицерокиназной реакции
сн2он сн2он
Н-С-ОН +АТФ -> П-С-ОН + АДФ (VII. 14)
СН2ОН С112ОРО3Н-
L-?-Глицсрофосфат
Продуктом этой реакции является только L-a-глицерофосфат. Это означает,
что фермент способен асимметрически атаковать химически идентичные
оксиметильные группы глицерина, ибо в противном случае должна была бы
образоваться смесь L-a- и D-a-глицерофосфата. В полном соответствии
с этим 1-С14-глицерин, образующийся ферментативным путем из 3,4-С14-глю-
козы, превращается в 3,4-С14-фруктозо-1,6-дифосфат, как показано на фиг. 68.
Из этих наблюдений вытекает, что глицерин фосфорилируется не по той
оксиметильной группе, предшественниками которой являются группы глю-

206
Глава VII
козы в положениях 3 и 4, так как если бы молекула реагировала
симметрично, то метка во фруктозо-1,6-дифосфате должна была бы обнаруживаться
не только в положениях 3 и 4, но также и в положениях 1 и 6.
Аналогичным образом ведет себя и фермент аконитаза, участвующий
в обмене лимонной кислоты (см. гл. XIX). Меченная по первичной
карбоксильной группе лимонная кислота (полученная из меченого оксалоацетата
и: немеченого ацетата) превращается ферментативным путем в а-кетоглута-
рат, меченный только по карбоксильной группе, находящейся рядом с
карбонильной группой (фиг. 69). Следовательно, аконитаза различает
химически идентичные карбоксиметильные группы лимонной кислоты.
О СН2—СО2Н
СН3С —SKoA
О = С —СО2Н
СН2 —*СО2Н
СН2-СО2Н Н —С-СО2Н
-HSKoA | Аконитаза ]
> НО —С-С*О2Н
-со2
НО-С-СО2Н
СН2-*СО2Н
СО2Н
сн2
' СН2
с=о
*СО2Н
Фиг. 69. Судьба метки при ферментативном получении а-кетоглутарата из 1-С14-цитрата,
Наконец, альдолаза, как об этом упоминалось выше, катализирует дей-
териевый или тритиевый обмен только между одним из атомов водорода
диоксиацетонфосфата и растворителем. Ясно, что если бы альдолаза была
-2Н
/ A
/
/
1
і
/ сн2-
/
сн
^^
-со2-
в
,-сог
со2-
с
1
1
/Поверхность
І фермента
Фиг. 70. Схематическое изображение присоединения цитрата к аконитазе.
не способна различать два атома водорода при соответствующем углеродном
атоме, то в обмен вступали бы оба эти атома водорода.
Для объяснения способности ферментов распознавать химически
идентичные группы Огстон предложил гипотезу, согласно которой субстрат
присоединяется к поверхности фермента в трех точках. (Фиг. 70 схематически
поясняет это на примере аконитазной реакции.) Однако если учитывать,
что две группы а в атоме СааЬс всегда будут различаться в отношении
асимметричного агента, то трехточечное прикрепление становится
необязательным. В любом случае при образовании трехмерного комплекса между
субстратом, имеющим атом СоаЬс, и асимметричной поверхностью фермента
расположение двух групп а оказывается различным.

Ферменты 207
ЛИТЕРАТУРА
Bender M. L., Breslow R., Mechanisms of Organic Reactions, in M. Florkin and
E. H. Stotz (eds.), «Comprehensive Biochemistry», vol. 2, p. 1, Elsevier, New York,
1962.
Bender M. L., Kezdy F. J., The Current Status of the Chymotrypsin Mechanism,
J. Am. Chom. Soc, 86, 3704 A964).
В о у є г P. D., Lardy H., My r b a с к К. (eds.), «The Enzymes», 2nd ed., vol. 1,
Academic, New York, 1959.
D і x о n M., Webb E. C, Enzymes, 2nd ed., Academic, New York, 1964. (M.
Диксон, Э. У э б б, Ферменты, изд-во «Мир», M., 1966.)
Eigen M., H a m m e s G. G., Elementary Steps in Enzyme Reactions, Adv. Enzymol.,
25, 1 A963).
Florkin M., Stotz E. H. (eds.), Comprehensive Biochemistry, vol. 13, Elsevier,
New York, 1964.
Goodwin T. W., Harris J. I., H а г t I e у В. S. (eds.), Structure and Activity
of Enzymes, Academic, New York, 1964.
J e n с k s W. P., Mechanism of Enzyme Action, Ann. Rev. Biochem., 32, 639 A963).
Koshland D. E., Jr., The Active Site and Enzyme Action, Adv. Enzymol., 22, 45
A960).
Kosower E. M., Molecular Biochemistry, McGraw-Hill, New York, 1962. (Э. К о с о-
в е р, Молекулярная биохимия, изд-во «Мир», М., 1964.)
Northrop J. H., К u n і t z M., H e г г і о t R. M., Crystalline Enzymes, 2nd ed.,
Columbia University Press, New York, 1948.
Hose I. A., Mechanism of Enzyme Action, Ann. Rev. Biochem., 35, 25 A966).
W a 1 e y S. G., Mechanisms of Organic and Enzymic Reactions, Oxford, Fair Lawn, N.J.,
1962.
Wolstenholme G. E. W., O'C о n n о г С. М., Steric Course of Microbiological
Reactions, Ciba Foundation Study Group No. 2, Little, Brown, Boston, 1959.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Ферменты, сб. статей под ред. А. Е. Браунштейна, изд-во «Наука», М., 1964.
Волькенштейн М. В., Физика ферментов, изд-во «Наука», М., 1967.
ферменты и синтез биополимеров, сб. статей, изд-во «Мир», М., 1967.

Глава VIII
КОФЕРМЕНТЫ
Многим ферментам, катализирующим широкий спектр биохимических
реакций, необходимо для эффективного осуществления каталитической
функции присутствие небольшой небелковой простетической группы, более
или менее прочно связанной с белком. Если эта небелковая группа
обслуживает два (или более) фермента, благодаря чему между ними может
происходить перенос групп, то ее обычно называют коферментом. В ферментативной
реакции различия между субстратом и коферментом не всегда ясны, так
как кофермент, подобно субстрату, может в ходе реакции претерпевать
структурные изменения. Однако при последующих реакциях
первоначальная структура кофермента обычно восстанавливается, тогда как субстрат
подвергается дальнейшим химическим превращениям. В тех случаях, когда
кофермент на определенной стадии реакции оказывается структурно
измененным, различие между коферментом и субстратом выявляется именно
на основании этой конечной регенерации структуры. Кроме того, при многих
кофермент-зависимых реакциях субстрат-ферментному взаимодействию
обязательно предшествует связывание кофермента с ферментом (см. гл. VI).
В этой главе рассматриваются наиболее важные коферменты. Основное
внимание уделяется при этом выявлению типа (или типов) соответствующих
ферментативных реакций с точки зрения механизмов этих реакций. Более
подробное рассмотрение коферментов, о которых мы будем говорить ниже
(а также и некоторых других), можно найти в руководстве «The Enzymes»
{т. 2 и 3). Материал, приводимый в этой главе, дополняет то, что было
сказано выше о механизме действия ферментов (см. гл. VII), и вместо с тем
служит введением к изложению проблем промежуточного обмена.
Большинство коферментов играет роль промежуточных переносчиков в реакциях
переноса групп.
АДЕНОЗИНТРИФОСФАТ
Биологическое окисление служит главным источником энергии,
необходимой для осуществления множества эндергонических биологических
процессов. Свободная энергия, получающаяся при переносе пары электронов
от субстрата к молекуле кислорода или к другому конечному акцептору
электронов, превращается в результате ряда еще не вполне выясненных
реакций (см. гл. XV) в химическую энергию макроэргического (богатого
энергией) промежуточного продукта — аденозинтрифосфата (АТФ). Сво-
бодвая энергия, выделяющаяся при полном гидролизе пирофосфатЕШх
связей АТФ, используется затем в какой-либо сопряженной энергетически
невыгодной ферментативной реакции (см. гл. II), благодаря чему эта
реакция и может быть доведена до конца. Липман первым указал на
фундаментальную роль гидролиза АТФ как движущей силы биохимических
процессов. Эти процессы включают мышечное сокращение, фотосинтез,
биолюминесценцию, разряд электрических органов, а также биосиытоз белков,
нуклеиновых кислот, сложных углеводов, липидов и т. д.

Коферменты
209
Mg
/ V
NH2
?" Т Г
О—P—О—P—О—P—О—CH,/- О
II II I! ¦
0 0 0
он
Комплекс Мд-АТФ
ОН
Число индивидуальных ферментов, для которых необходим АТФ (как
субстрат или как источник энергии), огромно. Многие реакции этого типа
описываются в главах, посвященных промежуточному обмену. В табл. 30
сведены лишь некоторые из наиболее важных реакций. АТФ-зависимые
реакции можно разделить на два больших класса", первый из них включает
реакции, связанные с переносом части молекулы АТФ на подходящую
акцепторную молекулу, второй объединяет реакции, при которых
расщепление АТФ служит движущей силой для других, энергетически
невыгодных реакций. Реакции первой категории можно классифицировать далее,
исходя из природы групп, донором которых является молекула АТФ (фос-
форильный, пирофосфорильный, адениловый или аденозиловый остатки).
Те реакции, в которых АТФ служит источником энергии,
катализируются лигазами (или синтетазами). Мы рассмотрим их здесь более
подробно.
Все АТФ-зависимые биосинтетические процессы включают образование
ковалентной связи между двумя субстратными молекулами, сопряженное
с расщеплением одной из пирофосфатных связей АТФ. Большинство
реакций этого типа принадлежит к одному из трех классов. Первый класс
объединяет реакции с последовательным участием двух ферментов — фосфотранс-
феразы или пирофосфотрансферазы на первой стадии и фосфорилазы или
пирофосфорилазы — на второй. Один из путей биосинтеза инозина из рибозы
и гипоксантина включает, например, образование рибозо-1-фосфата с
последующим образованием N-гликозидной связи. |,
НО-СН
но-сн
он
+ Mg-
он он
ОРО,Н
. + Mg-ддф
он он
(vin.0
но-сн,^ о
он он
о
НО-СН
он он
(VIII.2)
В то же время синтез аденозин-5'-фосфата из аденина и рибозо-5-фосфата
включает фосфорилирование, приводящее к 5-фосфо-а-Б-рибозилпирофос-
14—248

Таблица 3V
Важнейшие реакции с участием АТФ
Реакция или тип реакции
Уравнение
Природа R-групны
/ Перенесенная
группа
Окислительное фосфорилирование
Фотосинтетическое фосфорилирова
ние
Триозофосфатдегидрогеназа + гли-
цераткиназа
Енолаза (фосфоенолпируватгидра-
таза)
а-Оксоглу тарат-деги дрогенаяа
(оксидоредуктаза)
-f-Сукцинат : КоА—лигаза(ГДФ)
+ Нуклеозиддифосфаткиназа (ср.
с реакцией, привэденной ниже)
или h Сукцинат : КоА —лигаза
(АДФ)
Различные кпназы (АТФ: донор—
фосфотраисферазы)
Нуклоозиддифосфаткиназы (АТФ:
пуклеозиддпфосфат — фосфотрапс-
феразн)
Различные пук леотидилтрансферааы
О-глицеральдегид-3-фосфат4-Фн + НАД+ ^± 1,3-дифосфо-В-глице-
рат +НАД.Щ+Н+)
1,3-дифосфо-О-глпцерат-|-АДФ^: 3-фосфо-О-гліщерат + АТФ
2-фосфо-О-глицерат ^ фосфоенолпируват + П2О
Фосфоенолпируват + АДФ ^ Пируват + АТФ
а-Оксоглутарат+НАД+-{-KoASH -+ Сукцпнил-8КоА-1-НАД-Н(+Н+)
Сунцинил- SKoA -f Г ДФ ¦+- Фп
"'Ф АДФ ^Г ГДФ+ АТФ
^ Сукцинат + ГТФ + КоА
Сукцинил-SKoA + АДФ -\- Ф„ ^Г Сукцинат + АТФ + КоА
АТФ + Ацетат ^г Ацетилфосфат + А ДФ(+Н2О)
АТФ-f Креатин ^t Креатинфосфат-f АДФ(-]-Н2О)
АТФ + ROH -^-RO- фосфат + А ДФ(+Н2О)
АТФ f
АДФ ] НТФ
АТФ -f ФМН ^t ФА Д + ФФН
Неизвестна
Неизвестна
О
I!
— С —О —
H
Неизвестка
О
II
-G-O-
+NH2
II н
БіИзИзС— 0-
о-
[
X—Р—О—
II
о
о-
X—Р—О—
I!
о
Вероятно, Фн
Вероятно, Фн
Ф„
Фн
Фн
Фп
Фн
Фн
Ф.І
АМФ

АТФ: D-рибозо-5-фосфат—пирофос-
фотрансфераза
Различные НМФ-пирофосфорилазы,
пентозилтрансферазы
Различные лигазы (синтетазы групп
6.1 и 6.2; первая стадия)
Различные лигазы (вторая стадия)
Различный лигази (группа 6.3)
Различные синтетазы (X : R—лигазы]
АТФ: Ь-метионин-Б-адонозил —
— трапсфераза
+ -рибозо-5-фосфат
фат(ФРПФ)
-фосфо- а- D-рибозилпирофос-
ФРПФ + Оротат ^Оіютидин-5'-фосфат4 ФФП
О
II
АТФ + Фермент+RCO2 ^ [Фефмент-R—С—О —АМФ]+ФФН
О
II
[Фермент-R— С— О —
О
II
— С — О — X
ЛТФ + L-ііантоат + ?-Алании ^: L-паіітотоиат-f АМФ + ФФП
АТФ+Ксантозип-о'-фоофат + Л'Нз^ГМФ + АМФ ФФ
+ -глутамат + Ь-цистеин ^ у-Ь-глутампл-Ь-цистеин +
АДФ + ФН
+ Ь-мотионип^ S-адонозил-Ь-метиопии-{- Триметафосфат
-О
SCH-O-
—о
сн—о —
[Фермент •
О
II
.r_C_O-]
[Фермент-
о
• R —С—О —
О
— С —О —
О
ФФН
ФФН
АМФ
АМФ
X-S —СНЯ
Возможно,
отсутствует
Аденозин

212
Глава VIII
фату, с последующим образованием N-гликозидной связи
"HOjPOCHj^-O-v^ t "HO3POCH2^/Ov
он
W
он он
он он
? ?
"О-Р--О—Р-ОН
II II
о о
+ Mg-АМФ
(V1II.3)
-искроен
ОРО3Н"
ОН ОН
он он
Ко второму и третьему классу относятся АТФ-зависимые синтетазные
реакции, связанные с активацией карбоксильной группы, в которых
участвует один, а не два фермента. Они различаются природой продуктов, обра-
зукщихся при гидролитическом расщеплении АТФ. Например, фермент,
который превращает ацетат в ацетил-КоА (тиоловый эфир; см. ниже),
расщепляет АТФ на АМФ и пирофосфат, а фермент, превращающий глутамат
в глутамин, расщепляет^АТФ на|АДФ и фосфат.
Ферменты второго класса катализируют две последовательные реакции,
включающие промежуточное образование ациладенилата, связанного с
ферментом
Ацииаденімат
ОН
Особенно подробно исследована в этом отношении упомянутая выше аце-
тил-ЭКоА-синтетазная''реакция, которая, по-видимому, протекает согласно
схеме •
+ ДТФ
Г ° ,. 1
1сНз-С-О18-/»Мф]-
|-Ферлтент+ФФ„
СНз-СІ-О'-ЛМф]-
о
Фермент+HS Ко Л ^СНз— C-SKoA + Фермент
+ Аденозин —5
'_0-Р-ОІвН
(vins)
(га. в)
II
О
Хуже изучен третий класс синтетазных реакций, т. е. реакции,
катализируемые одним ферментом и приводящие к образованию АДФ и фосфата.
Известно, что некоторые реакции этого класса протекают с включением
одного кислорода карбоксильной группы субстрата в освобождающийся

Коферменты
213
фосфат, что указывает на промежуточное образование ацилфосфата:
О О
R —СО^ + АТФ
R — С — О — Р — О" f АДФ,
ОН
О
0 0
II II . II
R— С— О — Р — О-+ Акцептор R —С —Акцептор-'пФп-
(VIII.7)
(VIII.8)
УРИДИНОВЫЕ НУКЛЕОТИДЫ
Одним из главнейших современных достижений в изучении
метаболических процессов явилось установление роли уридиннуклеотидных коферментов
в обмене углеводов. Из различных источников были выделены
многочисленные уридиндифосфатсахара, которые, очевидно, распространены в природе
повсеместно. Эти соединения имеют сходное строение, отличаясь лишь
природой остатка сахара, альдегидный углерод которого связан с концевым
фосфатом уридиндифосфата:
о
о
О О
||
Сахар Д-О-Р-О-Р-
( н О- О-
он
он он
Общая структура УДФ-сахаров
В процессе биосинтеза УДФ-сахара образуются в результате
ферментативной реакции между УТФ и 1-фосфатсахарами
і-фосфатсахар + УТФ"^: УДФ-caxap-f Піірофосфат
называются
(VIII.9)
УДФ-углевод-
Ферменты, катализирующие такие реакции,
пирофосфорилазами или уридилтраисферазами.
В ферментативном катализе уридиновые коферменты играют двоякую
роль. Прежде всего такие коферменты участвуют в разнообразных реакциях
переноса гликозильного остатка. Например, УДФ-глюкоза (УДФГ)
участвует в реакциях переноса глюкозильных групп на фруктозу с
образованием сахарозы, на антраниловую кислоту с образованием о-аминобензоил-
глюкозида и на концевую глюкозу молекулы гликогена, что приводит к
удлинению глюкозильной цепи:
4- Фруктоза ^Сахароза + УДФ
NH2
УДФГ \
СО2Н ^С-О-Глюкоза+УЛФ
II
О
+ (ґлюкоза),і—>(Глюкоза)пН + УДФ
YIII К»

214
Глава VIII
Сходным образом УДФ-ацетилглюкозамин и УДФ-глюкуроновая кислота
являются промежуточными продуктами при синтезе сложного
полисахарида — гиалуроновой кислоты. В реакциях переноса гликозильных групп
УДФ-сахара аналогичны ациладенилатам, которые, как упоминалось выше,
участвуют в реакциях переноса ацильных групп, также протекающих с
участием различных акцепторов.
Для второго общего типа реакций УДФ-сахаров характерны химические
превращения в молекуле самого сахара. Например, УДФГ-4-эпимераза
(УДФглюкозо-4-эпимераза) катализирует взаимопревращение УДФГ и УДФ-
галактозы:
сн2он
о.
сн2он
он
О-УДФ
он
он
(VIII.11)
Другими примерами могут служить окисление УДФГ до УДФ-глюкуроновой
кислоты, протекающее при участии никотинамидадениндинуклеотида (см.
ниже)
снгон
СО2Н
но
НАЛ
ОН
О-УДФ ZT НО
он
он
О— УДф
(VIII.12)
он
и декарбоксилирование УДФ-глюкуроновой кислоты до УДФ-ксилозы
со,н
О—УДФ
О—Щф
+ СО2 (VIII.13)
ЦИТИДИНОВЫЕ НУКЛЕОТИДЫ
Как указывалось выше, аденозиновые и уридиновые нуклеотиды
участвуют как переносчики групп в реакциях с субстратами, находящимися
на уровне окисления, соответствующем альдегидам и ацилам. Реакции
переноса групп на уровне окисления, соответствующем спиртам, часто
протекают с участием цитидиновых нуклеотидов. Кеннеди и Вейсс
обнаружили, что ЦДФ-холин и ЦДФ-этаноламин являются необходимыми
промежуточными продуктами в биосинтезе лецитинов (важный класс

Коферменты 215
липидов) :
NH2
CH3 0 0 r
СН3
CHr-№-CH,-CHr-0-P-0-P-0CH|^'0>4l
1 о- он \ /
Л ( NH2
он он N
ЦДФ-XDJJUH
О О
HjNi-CHj-CH.-O-P-O-P-OCHj/ О
О- ОН
он он
ЦДФ-этаноламин
ЦДФ-спирты синтезируются in vivo из ЦТФ и алкилфосфатов
ЦТФ + Алкипфосфат ^ ЦДФ-спирт + Пирофосфат, | (VIII. 14)
Эти коферменты переносят алкилфосфатную группу на различные
акцепторы. Например, ЦДФ-холин реагирует с а,р-глицеридами, в результате
чего образуются лецитин и ЦМФ:
О
С — R
О
ЦДФ-холин+НС-0-C-R —> HC-O-O-R + ЦМФ (VIII.15)
СН2ОН
Следует отметить, что реакции переноса, протекающие с участием аденози-
новых и уридиновых нуклеотидов, сопровождаются расщеплением ацил-
фосфатной и глюкозилфосфатнои связей соответственно, тогда как реакции
с участием цитидиновых нуклеотидов протекают с расщеплением пирофос-
фатной связи.
ГУАНОЗИНОВЫЕ И ИНОЗИНОВЫЕ НУКЛЕОТИДЫ
Известно сравнительно мало случаев, в которых гуанозиновые и инози-
новые нуклеотиды выполняют коферментные функции. Перечислим наиболее
важные из них.
1. Реакция ГТФ с маннозо-1-фосфатом протекает аналогично реакции
между УТФ и глюкозо-1-фосфатом и дает ГДФ-маннозу в качестве
промежуточного продукта при переносе остатка маннозы.

216 Г л а в а VIII
2. ГТФ (или ИТФ) образуется при фосфорилировании на уровне
субстрата, сопровождающем окисление а-оксоглутарата:
а-Оксоглутарат+ НАД+ + KoASH —> Сукципил-ЭКоА + НАД-Н( + Н+) + СО2, (VIII. 16)
Сукщшил-8КоА+ГДФ(ИДФ)+Фп ^ Сукцинат +KoASH+ ГТФ(ИТФ). (VIII.17)
3. ГТФ (или ИТФ) расходуется в оксалоацетат-карбоксикипазной
реакции, в процессе которой происходит взаимопревращение оксалоацетата
и фосфоенолпирувата:
Оксалоацетат-f ГТФ ^ Фосфоенолпируват + СО2-)-ГДФ. (VIII.18)
Кроме того, ГТФ выступает как источник энергии при образовании из ИМФ
и L-аспартата аденилсукцината, т. е. в реакции, которая является ключевой
стадией в биосинтезе АМФ (см. стр. 466). Роль ГТФ в биосинтезе белка
обсуждается в гл. XXI.-
КОФЕРМЕНТ А
Кофермент А — важнейший из коферментов, переносящих ацильные
группы. Его молекула имеет чрезвычайно сложную структуру и
содержит большое число функциональных групп:
NH,.
О О ОН CHj 0 0
HI! H II I ! Il I!
HS—CH2—CH,—N—С—CH,—CH,—N—С—СН—С—СНг—О—Р—О—Р—О-
I I I
СН3 О" О"
о он
I
-Р=0
Кофермент А ОН
Линен и его сотрудники выделили ацилкофермент А из дрожжей и
показали, что это вещество представляет собой тиоловый эфир. Отсюда
следовало, что реакционноспособным участком молекулы кофермента А является
в, биохимических реакциях концевая сульфгидрильная группа этой
молекулы. Затем было показано, что все идентифицированные ацильные
производные кофермента А также представляют собой тиоловые эфиры.
Поэтому мы теперь используем для кофермента А сокращение KoASH.
Ацильные производные KoASH, которые обычно образуются в АТФ-
зависимых синтетазных реакциях, принимают участие во многих
метаболических реакциях. Эти реакции можно разбить на четыре группы: 1)
реакции, включающие атаку нуклеофильных агентов по ацильному атому
углерода с последующим переносом ацильной группы на атакующий агент
и освобождением KoASH; 2) реакции, при которых происходят
превращения ацильной части молекулы (дегидрирование, дегидратация и т. д.);
3) реакции конденсации по а-углероду ацил-SKoA (такие реакции почти
всегда протекают через образование карбаниона цо этому положению);
4) реакции обмена ацилъных групп. Все эти четыре типа реакций
представлены в обобщенном виде на фиг. 71.
По сравнению с соответствующими кислородными аналогами
преимущества тиоловых эфиров в нуклеофильных реакциях по карбонильному атому
углерода, в реакциях присоединения по ?-атому углерода а,Р-ненасыщен-
ных субстратов и в реакциях конденсации по углероду в а-положении к
карбонильной группе достаточно очевидны. В каждом случае тиоловые эфиры
оказываются более активными, чем их кислородные аналоги. Кислород-

Коферменты
217
содержащие эфиры обладают меньшей реакционной способностью по
сравнению с тиоловыми эфирами, во-первых, потому что они стабилизированы
резонансом в большей степени и, во-вторых, потому что такой розонанс^зна-
чительно менее выгоден в переходном состоянии. Эти соображения пол-
RCH2CO2H
HSKaA
• АТФ
„ -<— н-он
но») о
I II / ||
R-CH-CH-C-SKo4 -н^ R-CH-CH-C-
он
¦ААФ,ФН
Чнх
R-CH2-C-Y
Фиг. 7J. Схематическое изображение превращений ацпл-КоА.
ностью применимы и к реакциям присоединения по ?-атому углерода этих
субстратов, поскольку такие реакции можно рассматривать как
присоединение к карбонильной группе по типу винильных соединений.
ЛИПОЕВАЯ КИСЛОТА
В кристаллическом состоянии липоевая кислота была впервые выделена
из водонерастворимого экстракта печени быка. Это выделение — один
из наиболее ярких эпизодов в работах по очистке природных продуктов:
из 10 m »ткани печени исследователи получили всего лишь 30 мг
кристаллической липоевой кислоты. В дальнейшем было показано, что
строение липоевой кислоты соответствует 1,2-дитиолан-З-валерьяновой кислоте.
S~S СН2СН2СН2СН2СО2Н
H
Липоевая кислота
По-видимому, главной коферментной функцией липоевой кислоты
является участие в окислительном декарбоксилировании а-кетокислот,
например в превращении пирувата в ацетат и двуокись углерода. Реакции
этого типа катализируются многокомпонентными ферментными системами
с участием нескольких коферментов и включают много стадий (см. гл. XI
и XIV). Липоевая кислота участвует в окислении и в переносе ацильных
групп. В результате первичной реакции декарбоксилирования образуется

218
Глава VIII
в качестве промежуточного продукта тиаминпирофосфат-альдегид (см. ниже).
На последующей стадии ацетальдегид переносится на липоевую кислоту
с образованием б-Э-ацетилдигидролипоевой кислоты
HS
о W
S_^_R + rJ^O
(VIII.19)
Затем ацетильная группа переносится на HSKoA, образуя ацетил-SKoA
и дигидролипоевую кислоту. Окисленная форма липоевой кислоты
регенерирует в результате действия специфичной дигидролипоил-дегидрогеназы.
Липоевая кислота ковалентно связана с дегидрирующим комплексом,
участвующим в общей реакции, посредством амидной связи между
карбоксильной группой кофермента и е-аминогруппой остатка лизина. Образование
и гидролиз этой амидной связи катализируются специфичными АТФ-зависи-
мыми ферментами — соответственно синтетазой и гидролазой.
ГЛУТАТИОН
Структура глутатиона, широко распространенного в биологических
системах трипептида, -у-Ь-глутамил-Ь-цистеинилглицина,
СОЛІ О СН„—SH О
I II H | || H
H2N —С-СН, —СН2 —С —N-CH C-N —CH,
І
H
Глутатион
-СО2Н
была установлена в 1929 г. Гопкинсом. Хотя глутатиону после его открытия
приписывалось множество биологических и биохимических функций,
известно относительно немного процессов, в которых глутатион выступает в роли
кофермента. К числу наиболее хорошо изученных относится глиоксилазная
реакция
О ОН
II /° I
СНд-С-СҐ -—— > CH3-C-CO2H
\ Глутатион , *
.(VIII.20)
Превращение метилглиоксаля в лактат представляет собой двухстадийный
процесс. На первой стадии, катализируемой глиоксилазой I, образуется
тиоловый эфир лактата и глутатиона, на второй стадии, катализируемой
глиоксилазой II, происходит гидролиз этого тиолового эфира, в результате
чего образуется лактат и регенерирует глутатион. Поскольку субстратом
глиоксилазы I является тиополуацеталь метилглиоксаля и глутатиона,
а источником а-водорода лактата служит неірастворитель, а карбонильный
водород метилглиоксаля, можно с большой долей уверенности
предположить, что при глиоксилазной реакции в промежуточном продукте происхо-

Коферменты 219
.дит гидридныи сдвиг:
(ХОЧ О" О
СН3— С—С— S— Глі/яншган^СН,—C-C-S-Глутатион (VIII.21)
H H
Наиболее важной метаболической функцией глутатиона (GSH) является
поддержание сульфгидрильных цистеиновых групп в белках в
восстановленном состоянии благодаря следующим реакциям:
RSSR' + GSH —» RSSG + R'SH He ферментативная реакция
RSSG + GSH —» RSH + GSSG Неферментативвая реакция
GSSG + HAfl<D-H( + H+) —> 2GSH + HAflO+ Ферментативная реакция
ПИРИДОКСАЛЬФОСФАТ
Пиридоксальфосфат замечателен тем, что с его участием протекает
множество различных ферментативных реакций. Почти все эти реакции связаны
с превращениями аминокислот. В исследованиях по физиологии питания
животных и в опытах на микроорганизмах было показано, что
недостаточность пиридоксаля (пиридоксина) — биохимического предшественника пири-
доксальфосфата — вызывает ряд нарушений белкового обмена. Первые
сведения о реакциях, для которых необходим пиридоксальфосфат, были
получены в 1934 г., когда обнаружилось, что с помощью особого пищевого
фактора можно излечить специфический дерматит, вызванный у молодых
крыс неполноценной диетой. Дьёрди назвал этот фактор витамином В6.
(В настоящее время этот термин употребляется для обозначения целой
группы биологически важных веществ, структурно родственных пиридок-
сальфосфату.) Было установлено, что витамин Be представляет собой 3-окси-
4,5-диоксиметил-2-метилпиридин, известный под названием пиридоксол.
Позднее выяснилось, что моча животных, которым вводится пиридоксол,
содержит продукты обмена этого соединения и что они являются гораздо
более активными ростовыми факторами для молочнокислых бактерий, чем
пиридоксол. В 1944 г. Снелл идентифицировал эти продукты как пиридок-
саль и пиридоксамин. Позднее было показано, что биологически активной
формой пиридоксаля (а в одном случае и пиридоксамина) является его
іфосфорилированное производное
СНО СНО
HjO3POCHj JL ОН HOCHj^ X J>H
Пириаоксояьфосфшп Пиридоксаль
CH2NH2
НОС1Ч JLJ™ HOCH, 1 ОН
Пиридоксоя Пиридоксамин
Как отмечалось выше, пиридоксальфосфат-зависимые ферменты
катализируют чрезвычайно много различных реакций. Перечислим типичные для
таких ферментов реакции:

220
Глава VIII
1. Рацемизация оптически активных аминокислот, например аланина
СН3 NH2
I
H
I
СН3 - С - СО2Н
H
(VIII.22)
2. Трансаыинирование, например обратимая реакция глутамата с оксало-
ацетатом, дающая аспартат и а-кето(а-оксо)глутарат:
СО2Н СО2Н
СН2
І
СН2
СО2Н
І
+ СН2
II —С —NH2 С = О
сн2 соан
СН2 -f СКа
! I
С = 0 Н —С —NIL,
I I I
СО2Е1 СО2Н СО2Н СО2Н
3. Декарбоксилирование аминокислот, в том числе и гистидина
NH2
(VIII.23)
-СН2—С—СО2Н
Н il
==1—СН2—СН2 —NH2
N^ N
NH
+ co2
(VIII. 24)
4. Реакции а,[і-алиминации, такие, как дегидратация серина
NH2 н2О NH2 Н2О NH3 О
НО-СН2-С-СО2Н -^ СН2=С-СО2Н ^-4 СН3-С-СО2Н (VIII.25)
H
5. Реакции р,у-элиминации, например десульфированпе гоыоцистеина
NH2 H2S NH2 H2O NH3
HS—СНг-СШ—С—СО2Н —А СНз—CH=C—CO2H -
H
(VIII.20)
6. Синтез триптофана из серина и индола
NH2
+ HO—CH2—C—CO2H
I
H
СНз—СН2—С—СО2Н
NH,
Н2-С-СО2Н + Н2О (VIII.27)
H
7. Альдольное расщепление серина, приводящее к образованию глицина
и формальдегида:
NH2
НОСИ2-С-СОаН + ТГФ ^ КН2-СНа-СО21-Ц-(НСНО)-ТГФ. (VIII.28)
M

Коферменты 221
Последняя реакция требует участия еще одного кофермента, тетрагидрофо-
лата (ТГФ), который является акцептором формальдегида (см. ниже).
Изучение на модельных системах механизмов ряда аналогичных реакций
(эти исследования были выполнены и обобщены Браунштейном и
Шемякиным, а также Снеллом и его сотрудниками) и послужило основой для
объяснения роли пиридоксальфосфата в перечисленных выше процессах.
Эти механизмы включают первичное образование комплекса металла с шиф-
фовым основанием, возникшим из катализатора и субстрата, последующие
реакции обмена двух или более связей внутри этого комплекса и конечный
гидролиз комплекса с регенерацией катализатора и образованием продукта.
-НО5РОСН2
"ТІ.
CHj
і
І
Комплекс шиффова основания с металлом (I) обеспечивает сопряженную
систему двойных связей от реакционного центра до сильно электрофилыюго
атома азота пиридиниевого цикла и способствует перемещению пары
электронов у а-углерода аминокислоты. Лабплизация этих связей (а, Ъ и с) в
комплексе I дает основу для понимания механизмов реакций, катализируемых
пиридоксалем.
Некоторые из таких механизмов изображены на фиг. 72 (для иллюстрации
взят конкретный пример — реакции с участием серина). Предполагается,
что рацемизация, трансаминирование и дегидратация серина включают
ионизацию протона, связанного с а-углеродом аминокислотной части
комплекса шиффова основания (фиг. 72, II), что дает комплекс продукта перо-
группировки (III). Присоединение протона по тому же положению этого
оптически неактивного промежуточного продукта с последующим
гидролизом приводит к реакции рацемизации (фиг. 72, путь 1). Присоединение этого
протона к карбонильному атому углерода с последующим гидролизом дает
продукты трансаминирования, пиридоксамин и кетокислоту (фит. 72,
путь 2). Полная реакция трансаминирования завершается обращением этого
процесса — взаимодействием на начальной стадии пиридоксамина и второй
кетокислоты, как показано уравнением (VIII.23). В результате этой реакции
регенерируется пиридоксаль и происходит превращение кетокислоты в
аминокислоту. Наконец, неподеленная пара электронов может быть использована
для удаления гидроксильного иона из соединения III, что дает соединение IV
(фиг. 72, путь 3). Гидролиз комплекса такого шиффова основания приводит
к а-аминакриловой кислоте, которая самопроизвольно гидролизуется
до пирувата. Подобные механизмы присущи и другим реакциям с участием
пиридоксальфосфата.
Четыре главные особенности отличают неферментативные реакции,
требующие участия пиридоксаля, от ферментативных реакций. Прежде всего
для большинства ферментативных реакций не требуется иона металла,
тогда как для неферментативных реакций он необходим. Вероятная роль
иона металла в неферментативных реакциях заключается в стабилизации
гаиффова основания, индуктивном оттягивании электронов от
реакционного центра и поддержании планарной структуры, необходимой

222
Глава VIII
для смещения электронов в результате резонанса. При ферментативной
реакции все эти функции выполняет, по-видимому, белок. Далее,
ферментативные реакции специфичны как в отношении субстрата, так и в
отношении типа катализируемой реакции, тогда как неферментативная реакция
не является избирательной. Кроме того, ферментативные реакции
протекают на много порядков быстрее, чем соответствующие неферментативные
CH2OH
H-cUf°
H
HOCH2-C-
Ог + М3
+ NH,
HOCHj-C-COI
H
H+
•11
N CH,
HOCH2 <?
носн
A
HOCH2 Vjb- HOCHZ
> \ p-
носнг. П-
. - v;H>
H H+ i
Ш
•I
сн.
II
CHjCCOj
НОСН2
NH
+ + IX +M
CH,
.OH HOCH2
3*- .
CH2NH2
1 +НОСН2-С-СОг
Фнг. 72. Механизмы рацемизации, ііереамшшровашіл и дегидратации серппа,
катализируемые пиридоксалем.
превращения. Как специфичность ферментативных реакций, так и
увеличение скорости процесса следует приписать влиянию белковой части фермента.
Наконец, ферментативные реакции начинаются, по-видимому, с реакции
трансиминирования, а не с образования шиффова основания. Данные
спектральных исследований, показавшие, что связанный с ферментом пиридок-
сальфосфат существует в виде шиффова основания, а не в виде свободного
альдегида, были подтверждены восстановлением пиридоксалевых
ферментов боргидридом натрия. Этот агент превращает пшффово основание
в стабильный вторичный амин:
н
=N-+NaBH4
(VIII.29)
H
После восстановления фосфорилазы Ь г, глутамат-аспартат-трансаминазы
и цистатионазы боргидридом натрия и последующей химической деградации
был выделен восстановленный комплекс кофермента с є-аминогруппой
остатка лизина. Исходя из того, что ферментативные реакции, как и
соответствующие им неферментативные реакции, протекают через промежуточ-
1 Роль пиридоксальфосфата в реакциях, катализируемых этим ферментом, ещо
не выяснена.

Коферменты 223
ное образование шиффова основания между пиридоксальфосфатом и
субстратом, можно думать, что начальная стадия катализируемой ферментом
реакции заключается в превращении шиффова основания, образованного
ферментом и пиридоксальфосфатом, в пиридоксальфосфат-субстратное шиф-
фово основание (реакция трансиминирования)
н
I
R—С—СО2Н
N
+ NH2—CHR—СОгН ;=± R' Г О" + Е—NH2
" " " (Viri.30)
ТИАМИНПИРОФОСФАТ
Тиаминпирофосфат — широко распространенный в биологических
системах кофермент — был открыт впервые как пищевой фактор, необходимый
для предотвращения полиневритов у птиц и бери-бери у человека. Йенсеп
и Донат в 1925 г. получили кристаллический витамин (тиамин), а Уильяме
и Клайн 10 лет спустя установили его структуру. Тиамин представляет
собой замещенный пиримидин, связанный метиленовой группой с
замещенным тиазолом
СН ?" ?"
NH2 LCHCHO
N Тиаминпирофосфат
Тиаминпирофосфат служит коферментом в трех типах ферментативных
реакций: при неокислительном декарбоксилировании а-кетокислот, при
окислительном декарбоксилировании а-кетокислот и при образовании
а-кетолов (ацилоинов). Первым указанием на участие тиаминпирофосфата
в ферментативных реакциях послужило обнаружение того факта, что для
декарбоксилирования пирувата, осуществляемого дрожжевыми клетками,
О О
II Mg2+ H
СН3 —С —СО2Н > СН3 —С —Н + СО2, (VIII.31)
необходим какой-то термостабильный органический кофактор.
Исследователи назвали его кокарбоксилазой. Ломан и Шустер выделили в
кристаллическом состоянии этот кофактор из дрожжевых клеток и показали, что
он является тиаминпирофосфатом. Тиамин-зависимая карбоксилаза
широкой специфичности обнаружена в самых разнообразных биологических
объектах; по-видимому, она распространена повсеместно.
Окислительное декарбоксилирование а-кетокислот, осуществляемое дегид-
рогеназами а-кетокислот, также зависит от тиаминпирофосфата. Эти
реакции, конечным акцептором в которых является кислород, могут быть
представлены следующим образом:
О О
II Mg ||
R —С — COsjH + VaOa > R —С—ОН + СО2. (VIII.32)
Роль тиаминпирофосфата в окислительном декарбоксилировании
аналогична той, какую он выполняет при неокислительном процессе. Окисли-

224 Глава VIII
тельное декарбоксилирование — процесс весьма сложный. В нем участвует
несколько коферментов, причем истинным и непосредственным окислителем
служит липоевая кислота. Такие реакции весьма распространены —
окислительному декарбоксилироваыию подвергаются многие а-кетокислоты
(см. гл. XI).
Ферментативное образование а-кетолов также является распространенной
реакцией; эта реакция катализируется, по-видимому, многими карбокси-
лазами и дегидрогеназами а-кетокислот. Типичным примером такого
процесса может служить реакция между пируватом и ацетальдегидом,
приводящая к*образованию ацетоина:
О О О ОН
II II II !
СН3С —СОаН + СНз —С —II —> СН3 — С— С — СН3 + СОа, (VIII.33)
или образование ацетоина из двух молей пиру вата:
О О ОН
2СН3С —СО,Н ~~> СН3—С —С —СН3 + 2СО2. (VIII.34)
I
H
Фермент транскетолаза (см. гл. XI) катализирует другую аналогичную
реакцию, в которой участвуют кетол и тиаминпирофосфат.
Всем тиаминпирофосфат-зависимым реакциям присуще много общего.
В каждом случае разрывается углерод-углеродная связь, смежная с кето-
группой, что приводит к стабильным продуктам, таким, как карбоксильная
группа или альдегид, и одновременно к возникновению аниона активного
альдегида, связанного с тиаминпирофосфатом. Реакция такого аниона
с протоном приводит к альдегиду; примером является неокислительное
декарбоксилирование пирувата (уравнение VIII.31). Реакция с
окисляющим агентом, таким, как окисленная липоевая кислота, дает ацетат;
примером является окислительное декарбоксилирование пирувата
(уравнение VIII.32). Реакция с карбонильной группой приводит к ацилоину, как
в случае образования ацетоина (уравнения VIII.33 и VIII.34).
Представления о коферментных функциях тиаминпирофосфата в
соответствующих ферментативных реакциях сложились в результате
изучения аналогичных реакций в неферментативных системах. После первых
работ, проведенных Югаи и другими авторами в 1943 г., было обнаружено
несколько тиамин-зависимых неферментативных реакций, весьма близких
к ферментативным процессам. Механизм неферментативных реакций был
установлен в результате замечательного открытия Бреслоу, показавшего,
что ароматический водород в положении 2 тиазолиевого кольца тиамина
легко обменивается с дейтерием растворителя. Период полупревращения
в водном растворе при комнатной температуре и pH 5 составляет около 2 мин.
При pH 7 реакция протекает настолько быстро, что исследовать ее обычными
методами невозможно. Этот факт показывает, что илид (V) практически
стабилен.
CHj R' СН
W

Коферменты
225
На этом основании могут быть сформулированы вероятные механизмы
тиамин-зависимых реакций (фиг. 73). Во всех случаях первичная реакция
включает присоединение карбаниона к карбонильному атому углерода а-кето-
кислоты с образованием, например, соединения VI. Сильно электрофильньтй
атом азота в этом соединении способствует его декарбоксилированию, что
приводит к соединению VII. Присоединение одного из электрофильных
сн
Фпг. 73. Механизмы тиамин-зависимых реакций пирувата.
агентов к карбонильному атому углерода с последующим отщеплением
исходного карбаниона дает требуемые продукты реакции. Реальность
существования такого промежуточного продукта в биологических системах была
доказана выделением из митохондрий дрожжевых клеток 2-оксиэтилтиазо-
лиевой соли тиаминпирофосфата. Кроме того, было установлено, что окси-
этилтиаминпирофосфат ферментативно активен при образовании ацеталь-
дегида, ацетоина и ацетата, а соответствующий промежуточный продукт —
диоксиэтилтиаминпирофосфат — активен в транскетолазной реакции.
15—24G

226 Глава VIII
ТЕТРАГИДРОФОЛИЕВАЯ КИСЛОТА
Перенос одноуглеродных фрагментов составляет важный класс
метаболических реакций. Такие превращения обычно протекают с участием кофер-
ментов, являющихся производными тетрагидрофолата (ТГФ)
СО2Н
0 ін2
11 ° 7! 9 H jf—\ il H I
II < б|__ ru м // ч\_с—N—CH—COZH
Тетрагидрофолиевая кислота
В состав ТГФ входят восстановленный птеридин, /г-аминобензойная кислота
и L-глутаминовая кислота. Полиглутаминовые производные ТГФ,
содержащие до семи остатков глутаминовой кислоты, связанных посредством -у-глута-
мильных пептидных связей, также встречаются в биологических системах
и осуществляют те же биологические функции, что и ТГФ. После того как
обнаружилось, что фолиевая кислота является фактором роста для
молочнокислых бактерий, начались исследования по выяснению биохимической
роли ТГФ-коферментов. Зависимость роста молочнокислых бактерий от
фолиевой кислоты была использована в качестве теста при очистке и
выделении этого вещества, что дало возможность исследовать его структуру.
В ранних работах удавалось выделить только фолиевую кислотуДчто
объясняется легким окислением ТГФ. Фолиевая кислота может быть
ферментативно восстановлена до ТГФ. Для дигидрофолата возможны три
структурных изомера G,8-, 5,6- и 5,8-); однако как при химических, так и при
ферментативных реакциях был однозначно идентифицирован только 7,8-изомер.
ТГФ-коферменты принимают участие в переносе одноуглеродных
фрагментов на уровнях окисления, соответствующих формиату, формальдегиду
и метанолу. На формиатном уровне окисления формильные производные
ТГФ существуют в четырех структурных формах: №°-формил-ТГФ,
№-формил-ТГФ, №-формимино-ТГФ и №,№°-метенил-ТГФ. В следующих
главах приводятся многочисленные примеры метаболических реакций с
участием этих коферментов; здесь же мы ограничимся в основном
рассмотрением их синтеза и взаимопревращений.
Синтез ]Ч10-формил-ТГФ катализируется формилтетрагидрофолат-синте-
таэой [формиат:тетрагидрофолат-лигазой (АДФ)], причем] для реакции
необходим АТФ:
й ^ №о-формил-ТГФ + АДФ-М§ + ФН. (VIII.35)
Гидролиз ]Ч10-формил-ТГФ катализируется специфической деацетилазой.
Формилглутамат — формилтрансфераза катализирует образование №-фор-
мил-ТГФ:
Формиминсну-Ь-глутамат + ТГФ —> №-формил-ТТФ + Глутамат. (VIII.36)
Родственный кофермент, ]Ч5-формимино-ТГФ, может образовываться из ТГФ
и формиминоглицина или формиминоглутамата:
H H
HN = C —N —R + ТГФ —* N5-(J>opMHMiiHo-Tr©+R-NH2. (VII 1.37)
Последняя реакция катализируется тем же ферментом, который катализирует
реакцию, представленную уравнением (VIII.36).

Коферменты
227
№-формил-ТГФ превращается в №°-изомер в процессе №-формил-ТГФ-изо-
меразной реакции, для которой необходим АТФ:
№-формил-ТГФ + АТФ —> NiO-формил-ТГФ + Фн + АДФ. (VIII.38)
N5,N10-мeтeнил-TГФ может возникать несколькими путями: из №°-фор-
мил-ТГФ, из ]Ч5-формимино-ТГФ, и, по-видимому, из №-формил-ТГФ.
Метаболические пути синтеза и взаимопревращений формильных производных
ТГФ и других описанных ниже коферментов обобщены на фиг. 74.
Метионин + ТГФ
Кобамидный
фермент ^
¦ Гомоцистеин
/Vs-jnemuji- ТГФ
ТГФ + Серии
АТФ АДФФН
Щрины
Г
Глицин
N5, N'°-MemiueH- ТГФ > Тимии +
оксиметил цитозин
ТГФ
Плутамат
-> мї)м'°-ліегаенил-ТГФ > Пурины
Цанлодезамииаэа
-АТФ
Г
NH,
-> Ы5-фортил-ТГФ Нъ-формимино-ТГФ
Глицин <-^ ^- y^ f* Тлутамат
глут
Фортимитглицин+ТГФ формиминоглутамат+ТРР
Фиг. 74. Метаболические взаимопревращения ТГФ-коферментов.
В противоположность переносу одноуглеродных фрагментов на формиат-
ном уровне окисления, где участвуют несколько ТГФ-коферментов,
аналогичные реакции на формальдегидном уровне окисления, по-видимому,
протекают с участием только одного кофермента, а именно ]Ч5,]М10-метилен-ТГФ.
/
—N N-R
N ,N -метилеи-ТГФ
Основным источником этого кофермента является, во-первых, реакция
восстановления №,]Ч1()-метенил-ТТФ, катализируемая специфической дегидро-
геназой, и, во-вторых, L-серин — оксиметилтрансферазная реакция (фиг. 74).
Для последнего фермента необходим пиридоксальфосфат, как указывалось
выше при рассмотрении этого кофермента.
Восстановление №,№°-метилен-ТТФ за счет восстановленного НАДФ или
НАД, происходящее при участии флавопротеида (см. ниже), дает №-метил-
ТГФ (фиг. 74) — кофермент переноса одноуглеродных фрагментов на мета-
15*

228 Глава VIII
нольном уровне окисления:
\5/ \Ю
N N—R
I H
сн3
№-метил-ТГФ служит донором метильной группы при биосинтезе метионина
из гомоцистеина (см. стр. 437).
ПИРИДИНОВЫЕ НУКЛЕОТИДЫ
Пиридиновые нуклеотиды были первыми обнаруженными коферментами.
В 1904 г. Гарден и Ионг показали, что для превращения глюкозы в этанол,
катализируемого бесклеточными экстрактами дрожжей, необходимо
присутствие диализуемого кофактора. Этот кофактор был назван козижазой.
Дальнейшему исследованию структуры кози мази способствовало выделение
из эритроцитов млекопитающих диализуемого кофактора, необходимого для
аэробного окисления глюкозо-6-фосфата. Это исследование было выполнено
в 1934 г. Варбургом и Кристианом, которые показали, что в состав данного
кофермента входит 1 моль аденина, 1 моль никотинамида, 2 моль пентозы
(D-рибозы) и 3 моль неорганического фосфата. Кофермент из эритроцитов
вполне заменял козимазу в бесклеточных экстрактах Гардена и Ионга, что
указывало на сходство двух этих коферментов. В дальнейшем было показано,
что козимаза состоит из никотинамидмононуклеотада и адениловой кислоты:
Он ОН
НикотинамидадешшЬипуклеотид ( НАЛ )
Этот кофермент называется теперь никотинамидадениндинуклеотидом (НАД),
хотя иногда используются и старые названия —• дифосфопиридиннуклеотид
(ДПН) и кофермент І (КоІ). Кофермент, выделенный Варбургом и
Кристианом, отличается от НАД только наличием фосфатной группы в положении
2 остатка рибозы адениловой части молекулы. Этот кофермент называется
никотинамидадениндинуклеотидфосфатом (НАДФ) или реже трифосфо-
пиридиннуклеотидом (ТПН), а также коферментом II (KoII).
В организме млекопитающих НАД и НАДФ образуются из никотинамида
(ниацина) или никотиновой кислоты (см. стр. 450). Недостаток этих
предшественников в пище вызывает у человека пеллагру —• заболевание,
проявляющееся симптомами со стороны кожи, желудочно-кишечного тракта
и нервной системы (дерматит, диаррея, деменция).

Коферменты 229
В качестве коферментов НАД и НАДФ участвуют во многих
окислительно-восстановительных реакциях, катализируемых дегидрогеназами.
Типичным примером является реакция, катализируемая алкогольдегидро-
геназой:
СЫ3СН2ОЫ + 11АД+ ^ СН3СНО + НАД.Н-І-Н+. (VIII.39)
Большинство пиридиннуклеотид-зависимых ферментов строго специфичны
в отношении НАД или НАДФ; у других специфичность в отношении кофер-
мента выражена слабее.
Превращение НАД+в восстановленную форму [иногда обозначаемую
как НАД-Н(+Н+)] сопровождается заметным изменением спектральных
характеристик кофермента. НАД имеет максимум поглощения около 260 ммк,
причем поглощение является более слабым, чем общее поглощение аденина
и никотинамида. В результате восстановления поглощение при 260 ммк
значительно уменьшается и появляется новый максимум при 340 ммк,
характерный для дигидроникотинамида. Изменение спектральных свойств часто
используется для определения пиридиннуклеотид-зависимых ферментов.
В реакциях окисления — восстановления принимает участие никотинамид-
ньш фрагмент этих коферментов. При восстановлении могут затрагиваться
положения 2, 4 или 6 пиридинового цикла с образованием соответствующих
дигидропроизводпых (IX, X и XI):
о о о
II
і І і
IX X XI
Пулмен, Сан Пьетро и Коловик установили, что восстановление происходит
в положении 4 (X).
Переход НАД+ в восстановленную форму сопровождается появлением
нового центра асимметрии. Восстановление НАД+ дитионитом в окиси
дейтерия дает два стереоизомера (фиг. 75), отличающихся другЕ*от друга поло-
CONH2 CONH2
А(илиое) B(ujiu?)
Фиг. 75. Стсреоизомсры восстановленного монодеытероникотинамидадешшдннуклеотпда.
жением атома дейтерия относительно плоскости восстановленного никотин-
амидного кольца. НАД- и НАДФ-зависимые дегидрогеназы проявляют
стереоспецифичность в отношении А- и B-форм восстановленного кофермента
(табл. 31). Это было убедительно показано Веннесландом и Вестхеймером
для алкогольдегидрогеназы (АДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Восстановленный дейтерированный НАД был получен при взаимодействии АДГ
и 1,1-дидейтероэтанола:
АДГ
СН3СБ2ОН + НАД+ > СН3СБО + НАД(Б). (VIII.40)
Когда восстановленный кофермент снова окислялся ацетальдегидом (при
участии АДГ) или пировиноградной кислотой (при участии ЛДГ), дейтерий
количественно переносился от кофермента на восстановленный субстрат.
В результате этих экспериментов было установлено следующее. Во-первых,

230
Глав
VIII
между субстратом и коферментом происходит прямой перенос водорода.
Во-вторых, АДГ и ЛДГ стереоспецифичны в отношении кофермента.
В-третьих, в переносе водорода с участием как АДГ, так и ЛДГ
затрагивается один и тот же участок молекулы НАД (А-форма). Впоследствии была
установлена стереоспецифичность многих дегидрогеназ. Некоторые
ферменты используют А-форму, другие — B-форму (табл. 31).
Таблица 31
Стереосцецифичность различных пиридиннуклеотид-завнснмых ферментов
в отношении НАД
Фермент
Алкогольдегидрогеназа (этанол)
Алкогольдегидрогеназа (изопропанол)
Ацетальдегиддегидрогеназа
L-лактат-дегидрогеназа
L-малат-дегидрогеназа
D-г лицерат-дегидрогеназа
Дигидрооротат дегидрогеназа
а-Глицерофосфат-дегидрогеназа
3 - глицеральдегидфосфат-дегидро-
геназа
L-глутамат-дегидрогеназа
D - глюкозо-дегидрогеназа
?-Оксистероид-дегидрогеназа
Цитохром с-редуктдза
H АДФ- трансгидрогеназа
Диафораза
L - р - оксибутирил- КоА- дегидрогеназа
ИСТОЧНИК
Дрожжи, Pseudomonas, печень,
зародыши пшеницы
Дрожжи
Печень
Мышца сердца, Lactobacillus
Сердце свиньи, зародыши пшеницы
Шпинат
Zymobacterium oroticum
Мышцы
Дрожжи, мышцы
Печень
Печень
Pseudomonas
Митохондрии из печени крыс, сердце
свиньи
Pseudomonas
Сердце свиньи
Мышца сердца
Стерео-
спе ци-
фич-
ность
А
А
А
А
А
А
А
В
В
В
В
В
В
В
В
В
Изящным способом Веннесланд и Вестхеймер показали, что помимо сте-
реоспецифичности в отношении кофермента при восстановлении ацеталь-
дегида в этанол АДГ проявляет и стереоспецифичность в отношении
субстрата. Меченный по карбонильному атому углерода дейтероацетальдегид
ферментативно восстанавливали немеченным восстановленным НАД, что
давало 1-монодейтероэтанол, который выделяли из водного раствора
перегонкой. При повторном ферментативном окислении этого вещества
получался ацетальдегид, в 1 моль которого содержался 1 моль дейтерия. Таким
образом, тот же самый водород, который переносился на ацетальдегид
на стадии восстановления, количественно удалялся при повторном
окислении. Следовательно, АДГ способна различать в этаноле два водорода в
положении 1. Эти выводы были подтверждены превращением монодейтероэтанола
в тозилат с последующим гидролизом по механизму iSn2. Так как последняя
реакция протекает с обращением конфигурации, то образовавшийся при
этом монодейтероэтанол должен быть антиподом исходного соединения.
Повторное ферментативное окисление такого вещества давало немеченый
ацетальдегид и НАД(Б), содержащий 1 моль дейтерия на 1 моль
восстановленного кофермента.
ФЛАВИНОВЫЕ КОФЕРМЕНТЫ
Обнаружение рибофлавина и исследование его функций в биологических
системах явилось важной главой в истории биохимии. Впервые рибофлавин
(или какое-то его производное) был выделен Блайфом в 1879 г. в виде неочи-

Коферменты
231
щенного смолистого пигмента, который он назвал лактохромом. В течение
последующих пятидесяти лет, вообще небогатых событиями в биохимии,
химики выделяли из различных природных источников неочищенный желтый
пигмент. Затем Вагнер-Яурегг и его сотрудники сумели выделить несколько
миллиграммов чистого кристаллического овофлавина из яичного белка,
благодаря чему удалось обнаружить, что это вещество, позднее названное
витамином В2, является необходимым пищевым фактором для
млекопитающих. После того как те же авторы получили относительно большие
количества чистого кристаллического лактофлавина из сыворотки молока, стало
возможным определить строение этого соединения. Структура лактофлавина,
известного теперь под названием рибофлавина, была установлена синтезом
в 1935 г. благодаря работам Куна, Каррера и их сотрудников. Рибофлавин
представляет собой замещенный изоаллоксазин, связанный с D-рибитолом:
II II H
СН2-(
CHs-
СІІ3-
у\
:-c-c—сн2он
1 1
OH OH OH
N N n
"NT 11
0
Рибофлавин
Большое значение как для установления структуры, так и для выяснения
биохимической роли рибофлавина имело наблюдение, показавшее, что
окисление восстановленного НАДФ катализируется «старым желтым ферментом».
При обработке метанолом фермент разделялся на бесцветный белок и не
содержащий белка пигмент, близкий по строению к рибофлавину. Теорелл показал,
что простетической группой желтого фермента является не сам
рибофлавин, но рибофлавин-5'-фосфат. Это вещество обычно называется рибофла-
винмононуклеотидом (ФМН) — название, строго говоря, не совсем точное,
так как основание и сахар соединены не глюкозидной связью.
В 1938 г. Варбург и Кристиан обнаружили, что фермент,
катализирующий окисление D-аминокислот молекулярным кислородом (оксидаза
D-аминокислот), является флавопротеидом и содержит простетическую группу,
отличную от ФМН. Структура этого нового кофермента, флавинадениндинук-
NH,
H H H
CH-,—C—C—C—CH2—'
нон
он он
Фмаеинадениндинуклеотид (ФАД )
леотида (ФАД), была установлена Тоддом в 1954 г. на основании изучения
продуктов деградации и подтверждена синтезом. Число известных флаво-
протеидов, использующих в качестве коферментов ФМН или ФАД,
достаточно велико, и такие ферменты широко распространены в природе. Флаво-

232
Главі
VIII
протеиды катализируют реакции дегидрирования. Типичными субстратами
служат для них пиридиновые нуклеотиды, а-аминокислоты, а-оксикислоты,
альдегиды, а также соединения, содержащие насыщенные
углерод-углеродные связи (эти соединения превращаются в олефины). В процессе окисления
изоаллоксазиновая циклическая система соответствующего кофермента,
ФМН или ФАД, претерпевает восстановление:
R
СН3-
I
NN о
W
-[-Восстановленный субстрат
+ Окпслеиный субстрат.
(VII Г.41)
Восстановленные флавопротеиды становятся в свою очередь субстратами
в реакциях с другими акцепторами электронов, благодаря чему окисленная
форма кофермента регенерирует. Поскольку природные акцепторы
электронов для этих реакций в лаборатории часто недоступны, определение флаво-
протеидов часто проводят с помощью синтетических акцепторов электронов
(см. гл. XV), таких, как метиленовий синий, индофенол, феназин, тетразо-
лиевые красители или молекулярный кислород.
ГЕМСОДЕРЖАЩИЕ КОФЕРМЕНТЫ
Коферменты, в состав которых входят ион металла и порфириновое ядро,
занимают центральное положение в различных процессах
жизнедеятельности. Сошлемся для примера на хлорофилл (магниевый комплекс
замещенного порфирина), принимающий участие в фотосинтезе, т. е. в процессе,
от которого в конечном счете зависит использование солнечной энергии
всеми организмами (см. гл. XII). В этой главе мы остановимся на
биохимических функциях коферментов — производных порфиринов, которые в
качестве комплексообразующего металла содержат железо.
Родоначальником ряда порфиринов можно считать тетрапиррольный
порфирин (XII), из которого все остальные порфирины получают, замещая
одородные атомы в положениях 1—8 различными радикалами, чаще всего
метильной, отильной и винилыюй группами или остатком прогаюновой
кислоты:

поферменты
233
Классификация порфиринов исходит из типа этих боковых цепей. Наиболее
важными считаются следующие классы: этиопорфирины, которые имеют
в качестве заместителей четыре метильные и четыре этильные группы; мезо-
порфирины с четырьмя метильными, двумя этильными и двумя карбокси-
этильными группами; протопорфирины, содержащие четыре метильные, две
винильные и две карбоксиэтильыые группы, и копропорфирины с четырьмя
метильными и четырьмя карбоксиэтильными группами. Порфирины,
которые содержат одинаковое число заместителей двух разных типов, например
этиопорфирины или копропорфирины, могут существовать в четырех
изомерных формах в зависимости от расположения боковых цепей
относительно порфиринового ядра. Соединения типа протопорфиринов, которые
содержат три различных типа боковых цепей, могут существовать в
пятнадцати изомерных формах.
Порфирины образуют комплексы с ионами многих металлов, таких,
как магний, железо, цинк, никель, кобальт, медь и серебро. В таких
комплексах ион металла находится в центре порфиринового ядра, причем его
четыре лигандных места заняты атомами азота пиррола. Наиболее важное
биохимическое значение имеют комплексы, образованные железом и протопор-
фирином IX. Комплекс, в котором железо находится в двухвалентном
состоянии, называют гемож, а комплекс с трехвалентным железом — гематином.
сн3 сн
СНГ
сн2-
CH2
СОгН
Л 'г* /=
N—Fe—N
/ ¦ N=
1
-CH3
-CH=CH2
г сн2 сн3
CH2
CO2H
Гем
Гем служит коферментом для белков, участвующих в переносе кислорода
в организме, для ферментов, катализирующих различные реакции
окисления, и для ферментов, катализирующих разложение перекисей (см. гл. XV).
Гемоглобин осуществляет перенос кислорода от легких к различным
органам, в которых протекают реакции окисления. Молекула гемоглобина
состоит из двух пар полипептидных цепей (их аминокислотная
последовательность известна) и четырех гемов, соединенных слабыми связями с гло-
биновой частью (см. гл. IV). Пятое и шестое лигандные места атома железа
гема заняты двумя имидазольными группами гистидиновых остатков
глобина. Гемоглобин обладает замечательной способностью вступать в
обратимую реакцию с молекулярным кислородом, образуя оксигемоглобин,
в котором кислород заменяет одну из имидазольных групп и становится
шестым лигандом атома железа, причем само железо не окисляется. Метге-
моглобин, в котором железо окислено до трехвалентного состояния, не
способен соединяться с кислородом. Помимо кислорода гемоглобин соединяется
и с другими небольшими молекулами или ионами. Следует, в частности,
отметить его способность образовать очень прочный комплекс с окисью
углерода, чем и объясняется известная токсичность этого соединения. Гем
служит коферментом и некоторых других белков, по своей биохимической

234 Глава VIII
функции сходных с гемоглобином. К их числу относится миоглобин, кисло-
род-переносящий белок мышц с молекулярным весом, в 4 раза меньшим,
чем у гемоглобина (молекула миоглобина состоит из одной полипептидной
цепи; см. гл. IV). Особый класс окислительно-восстановительных ферментов,
осуществляющих перенос электронов от флавопротеидов к кислороду или
к другим акцепторам электронов, составляют цитохромы. (Эти ферменты
подробно рассматриваются в гл. XV.) В отличие от железа гемоглобина,
которое при биохимических реакциях остается в двухвалентном состоянии,
атом железа, входящий в состав гема цитохромов, претерпевает циклическое
окисление и восстановление в ходе реакций, катализируемых этими
ферментами.
Наконец, гем служит кофактором гидропероксидаз. Существует два типа
этих ферментов: каталазы, освобождающие молекулярный кислород из
перекиси водорода:
Н2О2 —> H2O + VaOa, (VIII.42)
и пероксидазы, которые переносят электроны от соответствующих доноров
на гидроперекиси:
АН2 + Н2О2 —> А+2Н2О. (VIII.43)
В отличие от поведения атома железа в гемах гемоглобина и цитохромов
каталитический процесс в случае гидропероксидаз связан с промежуточным
окислением трехвалентного железа до более высоких валентностей.
Поскольку во всех перечисленных реакциях — в переносе кислорода,
в окислении — восстановлении и в расщеплении перекисей — используется
один и тот же кофермент, а именно гем, следует заключить, что
специфичность соответствующих ферментов в отношении типа реакции и субстрата
определяется исключительно белковой частью фермента. Это, несомненно,
один из наиболее интересных примеров специфичности ферментативных
реакций.
БИОТИН
Биотин — ростовой фактор дрожжей и необходимый компонент пищи
человека (витамин Н) — был впервые выделен Кеглем в 1935 г. Для
получения всего лишь 1 мг этого вещества потребовалось около 225 кг сухого
яичного желтка. Структура биотина была установлена дю Виньо в 1942 г.
О
UN NH
¦СНаСНаСНаСНаСО2Т1
Биотин
Биотин служит коферментом в двух типах ферментативных реакций.
Первый тип может быть представлен АТФ-зависимым карбоксилированием,
сопряженным с превращением АТФ в АДФ и неорганический фосфат, например:
а) ацетил-ЭКоА-карбоксилазной реакцией
О О
II II
СНз —С —SKoA-fCOjj + АТФ --> НОаС —СНа —С —SKoA-ЬАДФ + Фн (VIII.44)
б) пропионил-ЭКоА-карбоксилазной реакцией
О НОаС О
СН3-СН2-С-8КоА + СО2 + АТФ —> СН3 - С - С - SKoA-|- АДФ + ФН (VIII.45)
H

Коферменты 235
ж в) Р-метилкротонил-ЭКоА-карбоксилазной реакцией
О О
|| НО2С-СН2Ч ||
=СН —С —SKoA-f СО2 + АТФ —> >=СН —С —SKoA + АДФ + Фя.
СН3/
(VIII.46)
Второй тип биотин-зависимых ферментативных реакций иллюстрируется
метилмалонил-оксалоацетат-транскарбоксилазной реакцией
СО2Н О О СО2Н
SKoA + CH2 (VIII.47)
-С —KA C
C-SKoA С = О
/ I
о со2н
в которой субстраты обмениваются карбоксильной группой. Очень прочная
связь биотина с соответствующими ферментами и обнаружение в природных
объектах є-ІЧ-биотиниллизина (биоцитина)
О
11
HN
NH
О NH3
11 T-T I
\/\cH2L —С —N —(CH2L —С —СОЇ"
I
H
Биоцитин
указывали на то, что биотин может быть ковалентно связан с ферментом
посредством амидной связи между є-аминогруппой остатка лизина в
ферментном белке и карбоксильной группой боковой цепи биотина.
Действительно, Лейн и Линен однозначно доказали наличие амидной связи в
случае пропионил-карбоксилазы; весьма вероятно, что так же обстоит дело
и с другими биотиновыми ферментами, особенно с ацетил-карбоксилазой.
Важнейшую роль в выяснении механизма действия биотиновых
ферментов сыграли исследования Линена и его сотрудников. Эти авторы нашли,
что инкубация свободного D-)-биотина с ?-метилкротонил-карбоксилазой
в присутствии одной только СО2 приводит к образованию карбокси-(-|-)-био-
тина. Последний является лабильным соединением, особенно в присутствии
кислот, но может быть с помощью диазометана стабилизирован
превращением в диметиловый эфир. Синтезированный
?-метилкротонил-карбоксилазой диметиловый эфир карбокси-D-)-биотина идентичен веществу,
образующемуся при реакции метилового эфира (+)-биотина с хлоругольным эфиром.
Это позволяет предполагать, что карбокси-D-)-биотин имеет структуру XIII
О
II о
с II
/ \ /\
НО N NH
хш

236
Глава VIII
На основании этргх pi некоторых другріх Рісследовапий биотин-завпсимое
карбоксрілированріе можно рассматривать как двустадийиую реакцию, при
которой в качестве промежуточного продукта образуется связанный с
ферментом карбоксрібріотрін:
Биотипил-формент ^ М
(VIII. 48)
Карбокси-биотипил-фермент-р Субстрат "ЗІ Биотитгал-фермснт + Карбокси-субстраг.
(VIII. 49)
По-видимому, трапскарбоксилирование также протекает в две стадии,
причем связанный с ферментом биотин служит промежуточным
переносчиком для обменивающейся карбоксильной группы.
КОБАМИДНЫЕ (ВИТАМИН В12-) КОФЕРМЕНТЫ
Витамин В12 был выделен в чистом кристаллическом состоянии лить
через двадцать лет после того, как Мёрфи в 1926 г. обнаружил, что печень
содержит какой-то фактор, излечивающий злокачественную анемию. Между
тем за истекшее время накашшвались сведения о разнообразных
проявлениях недостаточнострі витамрша В12, который разные авторы именовали
по-разному: антріанемический фактор, фактор X, фактор L.L.D и т. д.
Первоначальные попьіткрі очрістріть витамин В12 давали плохие результаты,
во-первых, из-за низкого содержания этого витамина в печени и, во-вторых,
из-за того, что для проведения тестов требовались больные злокачественной
анемией. В 1948 г. группа Фолкерса в Соедріненньїх Штатах pi группа Смита
в Англии почти одновременно опубликовалрі сообщешія о выделении и
кристал лрізацрш чистого витамина В12 из пєчєнрі.
Выяснение структуры врітамріна В12 оказалось почти таким же труднылг
делом как и его выделение. На основании химических данных,
полученных главным образом в лабораториях Фолкерса, Смита и Тодда, а также
блестящих рентгеноструктурных исследований Ходжкин pi ее помощников
для витамрша В12 было предложено следующее строение:
H2NOCCH2
H2NOCCH2
HNOCCH2CH2
CH2CONH2
—CH2CH2CONH2
.сн3
сн3
CH2CH2CONH2
Витамин В12

Коферменты 237
Молекула витамина В12 состоит из двух главных частей — замещенного
по многим положениям восстановленного корринового ядра и нуклеотида,
который в отличие от нуклеотидов, полученных из нуклеиновых кислот,
содержит а-гликозидную связь. Трехвалентный кобальт в макроцикле
образует комплекс с четырьмя атомами азота этого цикла, с атомом азота
5,6-диметилбензимидазола и с цианид-ионом, который представляет собой
артефакт, зависящий от особенностей метода выделения. Вся структура,
за исключением цианида, носит название кобаламин; поэтому витамин В12
часто называют цианкобаламииом. Были получены и другие производные
кобаламина — оксикобаламин, аквакобаламин и нитритокобаламин, в
которых цианид замещен соответственно гидроксильным ионом, водой и
азотистой кислотой.
Существуют и такие аналоги витамина В12, в которых изменено азотистое
основание нуклеотидной части. В природных аналогах витамина В12 были
обнаружены (помимо 5,6-дшіетстлбензимидазола) аденин, 2-метиладенин,
гуанин и некоторые другие основания. Много биосинтетических аналогов
витамина В12 было выделено из микроорганизмов, которые выращивались
на среде с добавлением соответствующего основания и фактора В (аналог
витамина В12, не содержащий нуклеотида).
Ни в одной из известных ферментативных реакций витамин В12 не играет
роли кофермента. Коферментную функцию выполняет группа родственных
соединений — Вiz'KOферменты, или кобамидные коферменты. Впервые эти
соединения были выделены в 1958 г. Баркером и его сотрудниками.
Химические и рентгенографические исследования показали, что Ві2-кофермент,
содержащий 5,6-диметилбензимидазол, имеет структуру XIV, в которой
лигаидом для кобальта служит вместо цианида 5-дезоксиаденозильная
группа:
ОН ОН
XIV
Кобальт в В12-коферментах находится в трехвалентном состоянии.
Ферментативное превращение производных витамина В12 в дезоксиаде-
нозильные Ві2-коферментн является многостадийным процессом. В качестве
кофакторов в нем участвуют ФАД, восстановленный НАД, АТФ и глута-
тион. На первой стадии витамин В12(Со3+) восстанавливается до витамина
Ві2(Со+), что требует участия ФАД и восстановленного НАД
(восстановленная липоевая кислота способна заменить эти коферменты). Восстановленная
форма витамина В12 в результате реакции с участием АТФ превращается
в В12-кофермент. При этом из АТФ освобождается неорганический тримета-
фосфат.
Хотя производные витамина В12 участвуют во многих метаболических
процессах, известно, что В12-коферменты необходимы лишь для пяти
ферментативных реакций. Следующие ферменты катализируют эти реакции:
метилмалонил-КоА-мутаза (см. гл. XIII), глутаматмутаза, диолдегидраза
(фермент, ответственный за биосинтез метионина из гомоцистеина; см.
гл. XVII) и фермент, катализирующий превращение ЦДФ —»¦ дЦДФ
(см. гл. XVII).

238 Глава VIII
ЛИТЕРАТУРА
Baddiley J., The Structure of Coenzyme A, Adv. Enzymology, 16, 1 A955).
Bock R. M., Adenine Nucleotides and Properties of Pyrophosphate Compounds, «The
Enzymes», 2nd ed., vol. 2, p. 1, P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.),
Academic, New York, 1960.
Boyer P. D., Lardy H., Myrback (eds.), «The Enzymes», Academic, New York,
1958.
Брауншт'ейн, А. Е., Pyridoxal Phosphate, «The Enzymes», 2nd ed., vol. 2, p. 113,
P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), Academic, New York, 1960.
Brown G. M., Biosynthesis of Water-soluble Vitamins and Derived Coenzymes, Phy-
siol. Rev., 40, 331 A960).
І) і x о n M., W e b b E. C, Enzymes, 2nd ed., Academic, New York, 1964. (M. Диксон,
Э. У э б б, Ферменты, изд-во «Мир», M., 1966.)
F r і e d k і n M., Enzymatic Aspects of Folie Acid, Ann. Rev. Biocliem., 32, 185 A963).
George P., The Specific Reactions of Iron in Some Hemoproteins, Adv. Catalysis, 4,
367 A952).
H u e n n e k e n s F. M., The Role of Nucleotides and Coenzymes in Enzymatic Processes,
in «Currents in Biochemical Research», D. E. Green (ed.), p. 493, Interscience, New
York, 1956.
Huonnekens F. M., Osborn M. J., Folie Acid Coenzymes and One Carbon
Metabolism, Adv. Enzymology, 21, 369 A959).
H u t с h і n s о n D. W., Nucleotides and Coenzymes, Wiley, New York, 1964.
Jacnicke L., L y n e n F., Coenzyme A, «The Enzymes», 2nd ed., vol. 3, p. 1, P. D.
Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), Academic, New York, 1960.
Kaplan N. О., The Pyridine Coenzymes, «The Enzymes», 2nd ed., vol. 3, p. 105, P. D.
Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), Academic, New York, 1960.
К n о x W. E., Glutathione, «The Enzymes», 2nd ed., vol. 2, p. 253, P. D. Boyer, H. Lardy,
К. Myrback (eds.), Academic, New York, 1960.
L e m b e r g R., L e g g e J. W., Hematin Compounds and Bile Pigments, Interscience,
New York, 1949.
Lipmann F., Metabolie Generation and Utilization of Phosphate Bond Energy, Adv.
Enzymology, 1, 99 A941).
M e t z 1 e r D. E., Thiamine Coenzymes, «The Enzymes», 2nd ed., vol. 2, p. 295, P. D.
Boyer, H. Laidy, and K. Myrback (eds.), Academic, New York, 1960.
Rabinowitz J. C, Folic Acid, «The Enzymes», 2nd ed., vol. 2, p. 185, P. D. Boyer,
H. Lardy, and K. Myrback (eds.), Academic, New York, 1960.
Reed L. J., Lipoic Acid, «The Enzymes», 2nd ed., vol. 3, p. 195, P. D. Boyer, H. Lardy,
and K. Myrback (eds.), Academic, New York, 1960.
Sherman H. et al., Pyridoxine and Related Compounds, in «The Vitamins», W. H. Scb-
rell, Jr., and R. S. Harris (eds.), vol. Ill, chap. 14, Academic, New York, 1954.
Smith E. L., Vitamin B12, Methuen, London, 1960. (Л. Смит, Витамин Bi2, ИЛ,
M., 1962.) Vl
Sneli E. E., Chemical Structure in Relation to Biological Activities of Vitamin Bc,
Vitamins and Hormones, 16, 77 A958).
Strominger J. L., Nucleotide Intermediates in the Biosynthesis of Polysaccharides,
Angew. Chemie. (Intern. Eng. Ed.), 1, 134 A962).
Utter M. F., Guanosine and Inosine Nucleotides, «The Enzymes», 2nd ed., vol. 2, p.
75, P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), Academic, New York, 1960.
Vallee В. L., Metal and Enzyme Interactions, «The Enzymes», 2nd ed., vol. 3, p. 225r
P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), Academic, New York, 1960.
Vennesland В., Westheimer F. H., Hydrogen Transport and Steric
Specificity in Reactions Catalyzed by Pyridine Nucleotide Dehydrogenases, «The Mechanism
of Enzyme Action», W. D. McElroy and B. Glass (eds.), Johns Hopkins,
Baltimore, 1954.
Westheimer F. H., Enzyme Models, «The Enzymes», 2nd ed., vol. 1, p. 259, P. D.
Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), Academic, New York, 1959.
W y[m a n J., Heme Proteins, Adv. Prot. Chem., 4, 407 A948).
: »i ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Ферменты, сб. статей, под ред. А. Е. Браунштейна, изд-во «Наука», М., 1964.
Химия и биология пиридоксалевого катализа, Труды второго международного
симпозиума, под ред. А. Е. Браунштейна и др., изд-во «Наука», М., 1968.

Глава IX
ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТКИ
И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ЧАСТИЦЫ
Изучение клеточной организации и попытки установить связь между
структурой и функцией на различных иерархических уровнях — от простых
молекул до макромолекул и таких агрегатов, как мембраны или частицы,
до субклеточных единиц и, наконец, клеток — все это составляет одну
из самых увлекательных и перспективных областей исследования в
современной биологии. Для биохимика и цитолога выяснение химического
значения различных сложных структурных элементов, обнаруженных в клетке,
важно не только само по себе; оно является необходимой ступенью любого
исследования, направленного на то, чтобы понять, как происходит синтез,
распад и взаимодействие этих элементов. Мы начинаем догадываться, что
именно в этих сложных структурах скрыт секрет механизмов, с помощью
которых осуществляется регуляция клеточных процессов как в
пространстве, так и во времени. Этот секрет, возможно, заключается, по крайней
мере отчасти, в том, что различные клеточные компоненты — главным
образом ферменты, а также их субстраты и модификаторы (активаторы и
ингибиторы) — находятся в разных «отсеках» клетки и потому не всегда доступны
друг для друга. Из сказанного вытекает два вывода, подтвержденных
в последнее время многочисленными экспериментальными данными: 1) в
клетке существует четкое распределение некоторых ключевых компонентов,
особенно ферментов; они локализуются в (или на) определенных клеточных
структурах, представляющих собой микроскопические внутриклеточные
органы, так называемых органеллах; 2) эти структуры, а вместе с ними и
соответствующие клеточные компоненты можно выделить с помощью подходящих
мягких методов разрушения клеток (гомогенизация) и последующего
фракционирования.
Благодаря таким процедурам удается избежать применения хотя и
изящных, но сложных и часто весьма трудоемких методов гисто- и цитохимии,
заменив их обычными биохимическими методами. В принципе эти последние
позволяют получить полную химическую и функциональную характеристику
отдельных клеточных фракций. Однако следует подчеркнуть, что подлинное
понимание клеточных процессов может быть достигнуто лишь на основе
сочетания двух независимых друг от друга линий исследования, ведущих
к решению одной и той же общей проблемы; структуру и функцию
необходимо изучать параллельно, а явления, наблюдаемые на изолированных
компонентах, следует постоянно сравнивать с аналогичными явлениями
в интактной клетке и таким путем проверять свои наблюдения.
Ниже мы очень кратко рассмотрим данные по анатомии клетки,
полученные с помощью электронного микроскопа, и опишем соответствующие
клеточные структуры; затем мы обсудим методику фракционирования
клеточных компонентов и некоторые свойства получаемых фракций и, наконец,
попытаемся как-то оценить эти данные с точки зрения биохимии и энзимо-
логии.

240 Глава IX
СТРУКТУРА КЛЕТКИ
Возможно, читатель будет удивлен, узнав, что безоговорочное признание
клетки функциональной единицей высших (аукариотических, хромосомных)
организмов — событие сравнительно недавнее, относящееся лишь к 1839 г.,
т. е. к тому времени, когда ботаник Шлейден и зоолог Шванн независимо
друг от друга разработали свою клеточную теорию. Следующее важное
открытие в этой области было сделано в 1859 г., когда Вирхов показал,
что все клетки происходят только от других, ранее существовавших клеток.
С тех пор ведутся многочисленные микроскопические исследования, в
которых структура всевозможных животных и растительных клеток тщательно
изучается. Разрешающая способность микроскопов за это время чрезвычайно
сильно возросла: сначала исследования велись только с помощью светового
микроскопа; теперь используются электронные микроскопы. На основании
этих исследований возникло представление о клетке как о чрезвычайно
сложном образовании. Если раньше мы различали в клетке только мембрану,
капельку цитоплазмы, окруженную этой мембраной, и взвешенное в
цитоплазме ядро, содержащее хроматин, то теперь мы знаем, что клетка состоит
из множества разнообразных взаимосвязанных элементов, обладающих
весьма сложной структурой и организацией. Эти элементы могут варьировать
у разных организмов, в разных тканях и в разных типах клеток. Однако
во всей этой сложной картине можно уловить определенный порядок: хотя
в действительности и не существует такого образования, как типичная
клетка, почти всем клеткам, по-видимому, свойственны некоторые общие
черты. Можно указать некоторые общие субклеточные структуры, которые,
очевидно, являются гомологичными в морфологическом, топологическом,
а возможно, и в функциональном отношении во всех клетках независимо
от их происхождения. Попробуем теперь охарактеризовать некую типичную
животную клетку, пользуясь электронной микрофотографией, приведенной
на фиг. 76, и схемой фиг. 77. Такая клетка со средним диаметром около
20 мк B-105 А) и объемом 5000 мк? представляет собой чрезвычайно мелкий
объект, поскольку максимальное разрешение, достигаемое с помощью
электронного микроскопа, лежит в пределах 5—10 К.
ЯДРО
Ядро — самая крупная структура в большинстве клеток; оно легче
всех других структур различается в световом микроскопе (особенно после
соответствующего окрашивания или при использовании фазового
контраста) и оно же было первой клеточной органеллой, выделенной в
значительных количествах (Мишер, 1871 г.). По большей части в клетке бывает
только одно ядро. Это тельце приблизительно сферической формы
диаметром около 5 мк и объемом 45 мк3. Оно окружено трехслойной ядерной
межбраной *, или оболочкой (толщиной около 75 А), которая отделяет его
от цитоплазмы. Разделение, однако, не является полным, так как мембрана
может быть пронизана многочисленными порами или отверстиями; кроме
того, во многих клетках ядерная мембрана связана с другой цитоплазмати-
ческой структурой — эндоплазматической сетью (см. ниже). Возможно, что
именно через эти поры, имеющиеся в ядерной мембране, и переходят в клет-
1 Она состоит из двух плотных слоев, разделенных моное плотным слоем (внутри-
мембранным пространством). Таково, по-видимому, в основных чертах строение почти
всех мембранных систем, встречающихся в природе.

Фит. 76. Клеточные органоллы.
Эта электронная микрофотография, на которой видна часть паренхиматозной клетки печени крысы,
сделана при достаточно большом увеличении, х 27 000, которое позволяет различить структурные детали
некоторых обычных компонентов клетки. Например, видно, что митохондрии (AI) окружены двумя
мембранами, образующими оболочку этих мельчайших органелл. На внутренней мембране имеются
складки, или кристы (К), вдающиеся в гомогенный матрице, который заполняет внутреннее
пространство митохондрий. Вероятно, благодаря наличию таких складок увеличивается поверхность, на которой
упорядочению располагаются многие ферменты, локализующиеся в митохондриях. В тех клетках,
которые потребляют больше энергии (например, в клетках сердечной мышцы), число крист больше,
вероятно, для того чтобы обеспечить большую величину атой поверхности. В настоящее время считают,
что различимые в матриксе плотные гранулы (Г) диаметром от 20 до 30 мни представляют собой
скопления связанных ионов двухвалентных металлов, необходимых для тех ферментных систем, которые
локализуются в митохондриях.
В 'левой части микрофотографии видна небольшая часть клеточного ядра (Я). Оно ограничено
мембранной оболочкой, состоящей из двух мембран, пространство между которыми заполнено веществом
с низкой электронной плотностью. Как было неоднократно доказано, внешняя из втих двух мембран
сливается с мембранами, окружающими везикулярные элементы эндоплазматической сети ОС).
Поэтому эндоплазматическую сеть можно рассматривать как продолжение ядерной оболочки и считать обе
структуры частями единой мембранной системы. В цитоплазме печеночной клетки постоянно
присутствуют две формы этой мембрашюй системы. В одной из них на поверхности цистерн находятся
рибосомы— мелкие плотные гранулы (около 150 А в диаметре). Эту форму мощно обнаружить в клетках,
в которых белок синтезируется «на экспорт». В другой форме мембран цистерны не длинные и тонкие,
а короткие, почти круглые, с гладкой поверхностью. Эта часть эндоплазматической сети в некоторых
местах сливается с гранулярными элементами сети, поверхность которых покрыта рибосомными
частицами. Установлено, что в клетках печени агранулярпан форма связана с депо запасного гликогена
{Гл): поэтому считают, что ферментные системы, ответственные за хранение и выделение гликогена,
ассоциированы с пограничными мембранами. Рибосомы рассеяны по всей клетке: часть их связана с
эндоплазматической сетью, а часть находится в свободном состоянии в цитоплазматическом матриксе.
Комплекс Гольджи (КГ) также состоит из пузырьков, ограниченных гладкими мембранами, но в данном
случае они представляют собой уплощенные мешочки пли пузырьки, плотно уложенные в стопки.
Внутри пузырьков Гольддап белки, а возможно, и другие вещества, синтезированные в каких-то иных
участках клетки, накапливаются и образуют секреторные гранулы. В нескольких мешочках (на
фотографии — рядом с буквами ИГ) можно различить очень мелкие гранулы, вероятно представляющие
собой плазменные белки, которые, как известно, вырабатываются печеночными клетками. После
гомогенизации клеток фрагменты комплекса Гольджи вместе с фрагментами эпдоплазматической сети
составляют «микросомную» фракцию. Другие гранулярные компоненты клетки печени, называемые
микротельцами (Мт), содержат гомогенный матрикс и плотный пуклеоид, богатый ферментом уриказой.
На микрофотографии отчетливо видно строение желчного канальца (ЖН). Этот каналец, образованный
участками поверхности прилегающих клеток печени, усеян микроворсинками, которые выступают
с поверхности клеток во внеклеточное пространство.'Плотные перемычки и десмосомы отделяют каналец
от примыкающих межклеточных пространств.
16 — 248

Д|Г:—M
l\?Mp? 'ff •¦•фші Іш
:ч^
'Ж-
:*3 :
Фиг. 77. Схематическое изображение клетки печени.
Расположение органелл, показанных на фиг. 76, внутри паренхиматозной клетки печени крысы. Видны
ядро, митохондрии и длинные, тонкие очертания цистерн эндоплазматической сети (ЭС). Множество
рибосом находится либо на поверхности цистерн, либо в матриксс цитоплазмы. Цистерны обычно уло-
- -- ^ , - ~~, t ЦИСТСрі
и на сферических пузырьках самого комплекса Гольднш (Кг). Знаком ** обозначены отдельные стадии
переноса белка от ЭС к комплексу Гольджи, где происходят подготовка белков для «экспорта». С
другой стороны стопки цистерн ЭС граничат со скоплениями гликогена и с пузырьками агранулярнс й
эндоплазматической сети. Эти две формы ЭС часто являются продолжением друг друга; создается
впечатление, что агранулярная форма может развиться из гранулярной. Некоторые исследователи,
основываясь, правда, па недостаточно полных данных, считают, что агранулярная сеть принимает
участие в переносе глюкозы из клеток печени в процессе гликогенолиза. В цитоплазме видны также
лизосомы (Лиз), содержащие остатки органелл и матрикса, очевидно предназначенные для
переваривания, и микротслъца (Мт) неизвестного назначения, по всей вероятности, богатые Ферментами.
Единственная липидная гранула обозначена буквой Л.

Организация клетки и клеточные частицы 243
ке из одного «отсека» в другой некоторые макромолекулы, синтезирующиеся
в ядре, но функционирующие в цитоплазме (например, РНК, а возможно,
даже и рибонуклеопротеидные частицы).
Внутреннее содержимое ядра {нуклеоплазма), видимо, определенным
образом организовано. Обычно в нем можно различить обособленное, более
плотное сферическое тельце (или несколько таких телец), называемое
ядрышком. Ядрышки особенно богаты РНК; основная масса ядерной РНК
(составляющая 10—20% всей клеточной РНК) локализована, по-видимому, именно
в них. Почти вся клеточная ДНК (около 95%) заключена в ядре и
распределяется по нуклеоплазме в виде хроматина в период, когда клетка
находится в «покоящемся состоянии», т. е. когда все процессы — в промежутке
между двумя делениями — направлены на поддержание
жизнедеятельности и рост. Непосредственно, перед делением хроматин конденсируется,
образуя высокоупорядоченные дискретные линейные структуры, так
называемые хромосомы. Число хромосом, приходящееся на соматическую клетку,
постоянно, и этот набор хромосом в результате митотического деления
передается дочерней клетке.
МИТОХОНДРИИ
Вслед за ядром в клетке были открыты (около 1900 г.) так называемые
крупные гранулы, или митохондрии. По своим размерам эти клеточные
органеллы также стоят на втором месте непосредственно за ядром.
Митохондрии, окрашенные такими красителями, как янус зеленый, находятся
почти на пределе разрешения обычного светового микроскопа. В фазово-
контрастном микроскопе их различить легко. Однако подлинных успехов
в изучении структуры митохондрии удалось добиться только в последние
15 лет после появления электронного микроскопа. Число митохондрий,
их размеры и форма могут в разных клетках сильно варьировать, но их
ультраструктура во всех случаях в достаточной степени сходна и вместе с тем
отличается от ультраструктуры других органелл настолько, что в
большинстве случаев однозначная идентификация этих частиц не составляет
большого труда. Это фундаментальное сходство всех митохондрий независимо
от того, какому организму они принадлежат — человеку, грибу или
простейшему. Общее число митохондрий в клетке колеблется примерно от десятка
у дрожжей до нескольких сотен в животной клетке; отдельная митохондрия
напоминает по форме эллипсоид вращения, длинная и короткая оси
которого равны соответственно 1,5 и 0,5 мк, а средний объем составляет около
0,8 мк3. Наиболее характерной чертой строения митохондрий является
их мембранная система, которая состоит из относительно гладкой
наружной мембраны, межмембранного пространства и высокоструктурированной
внутренней мембраны, образующей многочисленные складки, называемые
кристами. Кристы глубоко вдаются в интрамитохондриальный матрикс,
или внутреннее пространство митохондрии. С внутренней мембраной и
кристами связаны многочисленные (до нескольких тысяч) отчетливо видимые
мелкие частицы.
Митохондрии изучены, вероятно, лучше всех других внутриклеточных
частиц как в смысле их фракционирования, так и в отношении их функций.
В результате всех исследований (см. последний раздел этой главы)
сложилось представление, что митохондрии — это те места в клетке, где
происходит генерирование и транспорт внутриклеточной энергии. Большая часть
ферментов цикла лимонной кислоты (см. гл. XIV) и некоторые
вспомогательные окислительные ферментные системы, например пируватдегидроге-
назный комплекс (см. гл. XI) и система ?-окисления жирных кислот (см.
гл. XIII), локализуются, по-видимому, либо на наружной мембране (от кото-
16*

244 Г л а в а IX
рой зависит проницаемость митохондрий), либо в матриксе. На внутренней
мембране локализованы ферменты цепи переноса электронов от
восстановленного НАД и сукцината к молекулярному кислороду, а также ферменты,
катализирующие окислительное фосфорилирование.
ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ СЕТЬ
Во многих типах клеток существует сложная мембранная система —
эндоплазматическая сеть, распространяющаяся па всем пространстве
от ядерной мембраны до клеточной мембраны и пронизывающая большие
участки протоплазмы. Эндоплазматическая сеть состоит из лииопротеидных
мембран, имеющих форму уплощенных мешочков, трубочек и пузырьков.
Все вместе они замыкают и ограничивают пространство, называемое интра-
цистерпалъныж. В зависимости от количества прикрепленных к эндош^зма-
тической сети: мелких, сферических частиц, непрозрачных для электронов,
различают два типа сети: гладкую, или агранулярную, сеть с небольшим
количеством частиц (или совсем без них) и шероховатую, или гранулярную,
усеянную такими частицами (фиг. 78). Эндоплазматическая сеть,
по-видимому, выполняет по крайней мере четыре функции. Функции эти: 1)
осуществление целого ряда важных и сложных биохимических процессов,
связанных с синтезом белков, а также, возможно, с синтезом сложных липидов
и полисахаридов; 2) транспорт образовавшихся продуктов к местам их
использования или хранения; 3) регуляция использования вновь
синтезированных сложных молекул (а также, вероятно, и поступивших извне);
4) выполнение роли предшественника других мембранных систем, например
аппарата Гольджи, а также, возможно, ядерной мембраны и наружной
мембраны митохондрий (не исключено, что эта функция связана с двумя
первыми).
Из всех этих процессов наибольшее внимание привлек к себе в
последнее время синтез белка. Эту функцию выполняет гранулярная сеть, или
точнее прикрепленные к ней рибояуклеопротеидиые гранулы, называемые
рибосомами. У рибосом, выделенных из высших организмов, вес частицы
равен ~4-106 дальтон 1, а константа седиментации — 75—80 S.
Соответственные величины для бактериальных рибосом приближаются к 2,7-106
и 70 S. Рибосомы растительных и животных клеток содержат
приблизительно 50% белка и 50% РНК, тогда как в бактериальных рибосомах
на долю РНК приходится около 60%. В клетках, предназначенных для
интенсивного синтеза белка и передачи образовавшегося продукта в другие
части организма, например в экзокрияпых клетках поджелудочной железы,
множество рибосом прикреплено к эндоллазматической сети в линейном
порядке, причем эти ряды рибосом настолько многочисленны, что их
присутствие накладывает особый отпечаток па всю клеточную архитектуру
(см. фиг. 78). В других типах клеток, продуцирующих белок главным
образом для собственного потребления (например, в эритроцитах, а также
в эмбриональных и раковых клетках), мы находим довольно хорошо
развитую агранулярную эндонлазматическую сеть, слабее выраженную
гранулярную сеть и многочисленные неприкрепленные рибосомы,
распределенные по цитоплазме и собранные здесь в группы (так называемые полисомы
или зргосомы). Для всей живой природы характерно, по-видимому,
удивительное единообразие рибосом независимо от их происхождения и
морфологической предыстории (т. е. от того, были ли они первоначально свобод-
1 Дальтон — единица, применяющаяся для измерения молекулярного веса. Один
альтон равен 1,65-104 г.

Организация клетки и клеточные частицы
245
нымиили прикрепленными). Рибосомы состоят из двух неравных субъединиц.
Вес этих субъединиц в рибосомах животного или растительного
происхождения равен примерно 1,5- 10е и 2,5-10е дальтон, а их константы
седиментации равны соответственно 35—40 S и 55—60 S. У бактерий эти две
субъединицы, как и сами рибосомы, несколько легче; их константы
седиментации равны соответственно 30 и 50 S (мол. вес 1-Ю8 и 2-Ю8 дальтон).
Состояние равновесия реакции ассоциация — диссоциация контролируется
концентрацией ионов Mg2+, причем высокая концентрация этих ионов
способствует ассоциации субъединиц.
з
P #
Ч. ь
Фиг. 78. Экзокринные клетки поджелудочной железы летучей мыши (X 11 500).
Клетка предназначена для производства и выделения пищеварительных ферментов. Видны
многочисленные мембраны эпдоплазматической сети (ЭС), усеянные рибосомами. НГ — комплекс Гольджи:
3 — вимогеповая гранула; M — митохондрия, Я — ядро. Клетки, выстилающие протоки
поджелудочной железы, по-видимому, относительно менее активны по сравнению с секреторными клетками. На этой
микрофотографии цитоплазма и небольшая часть ядра (Я') одной такой клетки расположены у
верхушек секреторных клеток. Можно видеть, что клетки протоков содержат лишь несколько органелл
и не имеют сложной мембранной системы.

246
Глава IX
Другой органеллой, в состав которой входят гладкие мембраны и
которая функционально, а возможно, и структурно связана с эндоплазматической
сетью, является аппарат, или комплекс Гольджи. Оц обычно расположен
совсем близко от ядра (в области так называемых центросом, или центросфер)
и состоит из уложенных в стопку гладких мешочков, а также из различного
числа цистерн, пузырьков и вакуолей с гладкой поверхностью. Хорошо
сформированные комплексы Гольджи в большом количестве встречаются
в секреторных клетках, таких, как экзокринные клетки поджелудочной
железы. Убедительные данные указывают на существование связи между
цистернами гранулярной сети и пузырьками комплекса Гольджи, которые
в свою очередь связаны с более крупными вакуолями комплекса. Вакуоли
Гольджи дают начало секреторным гранулам, например зимогеновым
гранулам, в которых содержатся и накапливаются белки, синтезированные
рибосомами гранулярной сети (фиг. 79).
Лизосомы — крупные цитоплазматические тельца, окруженные
непрерывной мембраной,— встречаются в самых различных типах клеток, но особен-
М,І'СМВС
'/I J^ І.ЧЩні'ї -с?
і.'іл';/." }.)'¦>» vvi^tifiuifui
Фиг. 79. Внутриклеточные структуры и их взаимоотношения в
А. Расположение оргаиелл в ащшарной клетке поджелудочной железы (см. фиг. 781. Б. Схематиче
поджелудочной железы и о функциональных взаимоотношениях се органелл. Белок, синтезированный
Здесь он накапливается и образует зимогеновые гранулы, которые хранятся в аникаль

Организация клетки и клеточные частицы
247
но много!их обнаруживается в клетках печени и почек млекопитающих.
В лизосомах заключена значительная часть гидролитических ферментов
клетки. Можно думать, что эти тельца являются центрами
внутриклеточного переваривания. В них перевариваются, с одной стороны, вещества,
поступающие в клетку извне в результате процессов, известных под
названием пиноцитоза и фагоцитоза, и с другой —¦ сами клеточные органеллы
(в клетках с интенсивным обменом и замещением или в клетках,
претерпевающих патологическую дегенерацию). В этом последнем случае лизосомы
называются аутофагирующими вакуолями.
Лизосомы и происходящие от них тельца вместе с комплексом Гольджи
участвуют также в транспорте и секреции вновь синтезированных макромо-
лекулярных веществ.
В высокоспециализированных клетках встречаются в большом
количестве и некоторые другие виды мелких везикулярных телец, такие, как
микротельца в клетках печени и синаптические пузырьки в нервной
ткани.
выдежит
Концентрировать
« формирование.
ОтйбштЬент
и тваюарт.
ащшарноп клетке поджелудочной железы.
ское изображение современных представ"іііішй о динамике образования секрета в ацинарной клетке
на рибосомах, выделяется в просветы опдоплазматической сети и транспортируется в зону Гольджи.
ной зоне цитоплазмы и в конечном счете выделяются па свободной поверхности клетки.

248 Глава IX
ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ЖИДКОСТЬ (МАТРИКС)
Значительная часть всех клеточных компонентов, включая многие
ферменты, питательные вещества и макромолекулярные продукты, находится,
по-видимому, в свободном состоянии в цитоплазме или клеточном соке.
Это видимое отсутствие структуры, возможно, является лишь иллюзией,
возникающей в силу нашей неспособности рассмотреть и исследовать
организацию этих КОМПОНЄЕТОВ in situ или после разрушения клеток и
фракционирования клеточного содержимого.
КЛЕТОЧНАЯ (ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ) МЕМБРАНА
Внешняя граница клетки образована клеточной (или плазматической)
мембраной (или оболочкой). Типичная двойная мембрана (называемая
«элементарной» мембраной) толщиной около 80 A, очевидно, представляет
собой относительно жесткую и упорядоченную структуру, состоящую
из бимолекулярного слоя полярных липидов, покрытого с обеих сторон
белковыми пленками. Эту мембрану ни в коем случае нельзя считать
гомогенной на всем ее протяжении. Наоборот, она представляет собой мозаику
из различных функциональных едини г;, слегка различающихся по своей
структуре, высокоизбирательных и специализированных в клетках разных
типов. Мембрана определяет такие весьма разнообразные и вместе с тем
чрезвычайно важные характеристики клетки, как избирательная
проницаемость, активный перенос питательных веществ и ионов (т. е. их поступление
в клетку), контрактильные свойства, способность клеток вступать в
ассоциацию друг с другом и распознавать друг друга (например, при
формировании органов). Плазматические мембраны могут служить также местом
протекания некоторых сложных ферментативных процессов, таких, как
гликолиз или даже синтез белка (у микроорганизмов).
ДРУГИЕ ТИПЫ КЛЕТОК
Приведенное выше краткое описание различных характерных
клеточных элементов нриложимо не только к большинству животных клеток
(дифференцированных или недифференцированных), но также и к клеткам
простейших одноклеточных растений, например плесневых грибов (Neuro-
spora crassa) или дрожжей. Клетки одноклеточных золеных растений
(водоросли) и вообще всех зеленых растений содержат, кроме того, еще одну
высокоспециализированную сложную структуру — хлоропласт (см. гл. XII).
Бактерии и сине-зеленые водоросли, относящиеся к протокариотическим,
или .хромонемным, организмам, резко отличаются по своему строению
от всех других клеток. Прежде всего они значительно мельче: по споим
размерам они приблизительно соответствуют цилиндру диаметром 0,2—1 мк
и: длиной 0,3—5 мк, т. е. относятся к той же категории, что и митохондрии
животных, а их объем примерно в 500 — 1000 раз меньше объема животных
клеток. Многие структуры, свойственные более высокоразвитым клеткалі,
здесь отсутствуют: нет окруженного мембраной четко выраженного ядра,
эндоплазматической сети и митохондрий '. Единственными структурами,
легко различимыми за оболочкой этих примитивных клеток, являются
многочисленные рибосомы, рассеянные по всей цитоплазме, а также клеточная
мембрана с многочисленными прикрепленными к ней частицами. Именно
этот набор структур чрезвычайно важен, по-видимому, для обеспечения
Недавно у бактерий обнаружены митохондрии.— Прим. ред.

Организация клетки и клеточные частицы 249
той структурной и функциональной организации, какой располагает
бактериальная клетка. Поэтому его можно считать аналогом, а быть может, даже
предшественником сложных и высокоспециализированных мембранных
элементов более высокоорганизованных клеток. С этой гипотезой согласуются
следующие наблюдения: 1) аппарат окислительного фосфорилирования
бактериальной клетки включен в ее мембрану или связан с ней; 2) рибосомы,
прикрепленные к мембране, очевидно, являются местом наиболее
интенсивного и эффективного синтеза белков; 3) наследственное вещество бактерий
(т. е. их ДНК), видимо, структурно связано с определенным участком
мембраны; 4) в некоторых быстро растущих растительных клетках мембрана
способна, по-видимому, создавать путем образования перетяжек структуры,
сходные с митохондриями; 5) для всех мембранных элементов характерна
определенная строгая упорядоченность, касающаяся состава, структуры
и некоторых свойств.
МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ
Точно так же как не существует типичных клеток, не существует и
стандартных методов фракционирования клеточного содержимого, которые были
бы одинаково применимы ко всем типам клеток. Тем не менее методика,
разработанная первоначально лишь для одной ткани одного вида
животных, а именно для печени крысы, оказалась в высшей степени
универсальной и приложимой к множеству других тканей и организмов.
4
ПРИНЦИПЫ ЦЕНТРИФУГИРОВАН ИЯ
Частицы, различающиеся по плотности или размеру (или по форме),
оседают под действием приложенной центробежной силы с различными
скоростями. Скорость седиментации прямо пропорциональна величине этой
силы G, которая определяется по формуле
^. »ХЛ,
где uj — угловая скорость в рад/сек, г — расстояние частицы от оси
вращения, N — число оборотов ротора центрифуги в минуту. Величина G обычно
выражается в единицах g (ускорение силы тяжести, равное 980 см/сек2).
При данной скорости вращения ротора время, требующееся для
осаждения в центрифуге популяции гомогенных частиц, обратно пропорционально
квадрату их радиусов и первой степени разности между плотностями частиц
и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Таким образом,
относительно гомогенные, приблизительно сферические частицы с примерно
одинаковой плотностью могут быть отнесены к разным классам на основании
одних только различий во времени, необходимом для их осаждения. Именно
на этом и основана классическая схема фракционирования клеточных
компонентов. Вначале удаляют целые клетки и крупные обломки клеток;
затем — фракцию, содержащую крупные и плотные ядра (плотность ДНК
при 4° равна ~1,75, а плотность большинства белков — только 1,188);
далее следует фракция, содержащая крупные частицы или гранулы (в
основном обычно митохондрии, а в специализированных тканях также и
некоторые другие структуры, например синаптические пузырьки ткани мозга,
лизосомы и т. д.); затем осаждается так называемая микросомная фракция,
которая содержит фрагменты и гладкой и шероховатой эндоплазматической
сети, а также другие везикулярные элементы со сходными седиментацион-
ньши свойствами, образовавшиеся из мембран комплекса Гольджи, плазма-

250 Глава IX
тической и ядерной мембран и пр.; последними осаждаются свободные
рибосомы.
Одним из главных усовершенствований в деле фракционирования
клеточных компонентов было введение техники центрифугирования в градиенте
плотности. Различают два типа градиентов: непрерывный, создаваемый
с помощью специальных устройств различной степени сложности, и
прерывистый, образующийся путем осторожного наслаивания друг на друга
вручную нескольких слоев с различной плотностью (при этом самый тяжелый
слой обычно помещается на дно пробирки). Градиенты плотности используют
для двух различных целей.
ЗОНАЛЬНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
В этом варианте препарат в виде тонкого слоя помещают в пробирку
поверх среды, плотность которой обычно меньше плотности выделяемых
частиц, и затем подвергают центрифугированию. Под действием приложенной
центробежной силы частицы движутся в виде отдельной полосы через
градиент, который служит лишь для того, чтобы предотвратить размывание
зоны, или полосы в результате конвекции. Этот исключительно полезный
метод, очень широко применяемый как для аналитических, так и для
препаративных целей, используется для выделения и характеристики частиц
всех размеров, начиная от таких крупных объектов, как вирусы, ядра
и митохондрии, и кончая рибосомами, а также чистыми белками и
нуклеиновыми кислотами.
РАВНОВЕСНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Если частицы осаждаются в градиенте плотности, составленном с таким
расчетом, чтобы он включал и плотность исследуемого вещества, то после
установления равновесия они образуют слой, положение которого
определяется их плавучей плотностью. В тщательно контролируемых условиях
удается получать очень узкие слои, или полосы, и это обеспечивает
эффективное разделение частиц, одинаковых по размерам и по форме, но несколько
различающихся по плотности.
Наилучшими средами для всех этих опытов являются забуференные
растворы сахарозы. Часто разрешающая способность метода увеличивается
при проведении разделения не в Н2О, а в D2O. В особых случаях сахарозу
заменяют сорбитом, маннитом, а также полисахаридами фиколом и
гликогеном.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ
ФЕРМЕНТОВ И БИОХИМИЧЕСКИХ АКТИВНОСТЕЙ
Де Дгов указывает, что любой эксперимент этого тина включает в себя
три стадии: 1) деструктивная стадия, в процессе которой суспензия ткани
или клеток превращается в гомогенат; 2) перераспределение компонентов
гомогената по «фракциям» на основании их физических свойств (т. е.
константы седиментации, плотности и т. д.); 3) анализ этих фракций. Для
интерпретации полученных результатов необходимо в свою очередь провести три
стадии реконструкции: 1) определение морфологических и биохимических
свойств выделенных фракций; 2) переоценка данных, полученных на
предыдущей стадии, применительно к компонентам исходного гомогената и
методам фракционирования, использованным вначале, и, наконец, 3)
отождествление компонентов гомогената с определенными внутриклеточными
образованиями.

Организация клетки и клеточные частицы
251
Обычно вначале проводят фракционирование по какой-либо схеме,
а затем избирают определенные ферменты, активности или какие-либо
вещества в качестве так называемых маркеров, или индикаторов, которые,
судя по опыту, могут быть полезны для идентификации некоторых
внутриклеточных частиц или компонентов. На основании полученных результатов
вычерчивают кривую распределения и таким образом определяют частицы
с точки зрения характерных биохимических активностей или, наоборот,
приписывают характерные биохимические свойства различным типам
частиц. Распространение этого метода на весь спектр ферментов и других
индикаторов позволяет закрепить определенные функции клетки за известными
внутриклеточными компонентами и, наоборот, описать и впоследствии
идентифицировать новые, или по крайней мере ранее не известные,
морфологические компоненты на основании биохимических данных. Примером
успешного применения такого подхода является отождествление «частиц
кислой фосфатазы» с лизосомами, а «частиц уратоксидазы» с микротельцами
(называемыми также пероксидосомами) в печени млекопитающих. В основе
этого подхода лежат два главных допущения, отмеченных де Дювом:
1) каждый из ферментов локализуется только в одном каком-либо месте
внутри клетки и 2) популяция субклеточных частиц в ферментативном
отношении гомогенна.
ФЕРМЕНТЫ-ИНДИКАТОРЫ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ
ВНУТРИ КЛЕТКИ
В табл. 32 приведены данные, относящиеся к ферментам и другим
компонентам клетки, которые обычно используются в качестве индикаторов, или
мониторов, для определения, во-первых, некоторых внутриклеточных
частиц и, во-вторых, некоторых важных биохимических процессов,
последовательностей реакции и т. д. Сложные метаболические процессы часто
требуют участия двух или нескольких фракций. Возможно, что именно
на этом основывается во многих случаях регуляция метаболических
процессов. В качестве классического примера можно указать процесс синтеза
белка (см. гл. XXI). Активация аминокислот и их ассоциация с
транспортными РНК происходят в цитоплазматической жидкости. Сборка
аминокислот в полипептиды, происходящая на полисомах, часть которых прикреп-
Таблица 32
Распределение некоторых ключевых ферментов и других компонентов клетки,
используемых в качестве индикаторов, или мониторов *)
Ядра
ДНК
-
Митохондрии
Сукципагпдегид-
рогеназа
(для ЦЛК и ЭП)
Цитпохром-
оксидаза 2)
(для ЭП)
Более мелкие частицы,
в том числе лизосомы
Уратоксида- 'Л
sa*)
Каталаза
Оксидаза 1
D-амипо- j- M
КИСЛОТ 1
Оксидаза 1
2-оксикис- !
лот J
Микросомная фракция
j эндоплазматиче-
рибо-
сомы
РНК
спая сеть,
аппарат Гольджи
и т. д.
Глюкозо-6-фос-
фатаза 4)
Нуклеозад-
дифосфата-
за 2.4)
НАДФ-окси-
дазы со сме-
таыными
функциями
Растворимая
фракция
НАДФ-изо-
цитрат-де-
гидрогепаза
Ашшоацнл-
sPHK-син-
тетаза

252
Глава IX
Продолжение табл. 32'
Ядра

ДНК-зависимая
РПК-по-
лимераза
Митохондрии
НАД-вдоцит-
рат-деги-
дрогоназа
(для ЦЛК)
К'ардиолшшн
(для ОП)
Медь
Сигнал ЭПР
при g—1,94
(для ' ЭГ1)
Глутаматде-
і'іідрогена-
АТФ-аза,

стимулируемая ионами
M[f2 11 ДП~

нитрофенолом (для

окислительного , ф()С~
форплиро-
вашшJ)
Ацетил-КоА-
гпдролаяа 2);
ацил-КоА —
спптетаза
(для
окисления жирных
кислот)
а-Кетоглута-
ратдегидро-
гепазш.ш
комплекс 3)
Пируватдегпд-
рогепазный
комплекс, 3)
? -Оксибутират-
дегидрогеяа-
за'2)
Асиартат —
амниот рапс-
фсраза 2)
(трансами-
нала)
Более мелкие частицы,
и том числе лизосомы
«Кислая» pu- д
бопуклеаза 2)
«Кислая» фос-
фата.ча 2)
«Кислая» дез-
оксирцбо-
пуклеааа 2) 1
?-Галактози- І лт
даза 2)
?-Глюкуроіга-
даза 2)
?-Маннояида-
за 2)
Катепсины2) ;
Ацотилхолип } С
Триисиноген
Химотрипск-
ногеп
Лицаяа
Амилиза
Рибонуклеаза
Q
U
Микросомная фракция

рибосомы
андоплазматиче-
ская сеть,
аппарат Гольджи
и т. д.
НАДФ-перо-
ксидаза ли-
пидов 2)
Сквалеицикло-
гндрокси-
ла.ча (для
биосинтеза
стероидов)
НАДФ-ацмл-
и НАДФ-
алкокси-
арилгмдро-
ксилази
Цитох]>ом Ь5
ІДитохром ba-
редуктаза
цитохрома
с2) (одна
специфична
для НАД,
а другая —
для НАДФ)
Растворимая
франция
Ацетпл-КоА-
карбокси-
лаза (для
биосинтеза
жирных
кислот)
Ацил-КоА-
сиптетаза
GгМалонил-

КоА-)-Ацетил-Ко А
Восст. НАДФ
Жирная Kirc-
лота-1-гаСО.Л
Глюкозо-6-фос-
фат-дегидро
гепаза-\~6-
d)ord)o злюко-
лшп-дезидро-
геназа
(окисли ТР Л Ь И Ы Й
путь
углеводного
обмена)
Транскегнолаза
Трансалъдола-
за (пентоз-
ный цикл)
Фосфофрукпо-
киназа
(гликолиз)
Л а к/пшпдегид-
рогеназа
і) Наиболее часто испольоуемые индикаторные ферменты выделены курсивом. Это то ферменты
активность которых в указанной фракции составляет более fiu% общей активности п гомогенате
В скобках приведены метаболические пути. ОП — перенос электронов; ЦЛК ¦- цикл лимонной
кислоты; M — мниротельца различных орглиов; Л — «лизосомы» органов позпоно'іньії- С — сштптичесние
пузырьки ткани мо:іі-а; 'd — зимогеновые гранулы железистой ткаїш (иоджелудопнан железа).
2) Латентный фермент (для BbiHUJteiniH полной активности необходимо разрушить частицы).
») Фермент может быть легко отделен от наружной мембраны митохондрий в виде гомогенного
препарата.
'!) Находится в гранулярной эндопла.чматичеспой сети,
лена к гранулярной эндоллазматической сети, запрограммирована
определенным видом молекул РНК (информационная РНК), которые
синтезируются в ядре под непосредственным контролем ДНК. Энергию для этого
процесса обеспечивает АТФ, образующийся главным обрааом в митохон-

Организация клетки и клеточные частицы 253
дриях. После завершения процесса образовавшиеся белки (по крайней мере
в секреторных клетках) отделяются от полисом и «концентрируются» в
аппарате Гольджи, а затем выделяются в запасающие гранулы.
НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА ВЫДЕЛЕННЫХ КЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ
Ядра. Высокоочищенные ядерные фракции содержат 90—95% всей
клеточной ДНК и 10% всего клеточного белка. Отношение белка к ДНК равно
в них 5, а РНК к ДНК - 0,15-0,22.
Митохондрии. Форма митохондрий печени соответствует эллипсоиду
вращения, у которого длинная ось равна -~3,3 мк, а короткая <1 мк. Сухой
вес одной частицы равен приблизительно 1,1 - 10~ІЗ з. В клетке печени крысы
имеется около 800 митохондрий, на долю которых приходится примерно
20% всего азота или белка клетки. Плотность митохондрий в 0,25 M
сахарозе равна 1,099, а константа седиментации — 1-10* S. Приблизительно 40%
всего сухого веса митохондрий составляют фосфолипиды, из которых
наиболее характерным является кардиолипин, поскольку он локализован
почти исключительно в митохондриях. Митохондрии сердечной мышцы
содержат на 1 г белка 1,46 мкг-атом Си и 3,3—6,4 мкг-атом Fe, не
связанных с гемом, а также ~2,5 мкг-атом Fe гема (цитохром). Кроме того, они
содержат на 1 г белка около 0,5—0,6 мкмоль флавина и 4 мкмоль кофер-
мента Q (убихинона). В настоящее время имеются достаточные основания
считать, что небольшие количества РНК (~1% от белка) и ДНК (<1%
от белка), ассоциированные даже с наиболее хорошо очищенными
препаратами митохондрий, не являются примесями, а играют какую-то
функциональную роль (быть может, в биосинтезе некоторых митохондриальных белков х).
Эндоплазматическая сеть и рибосомы. «Микросомная» фракция, состоящая
из кусочков эндоплазматической сети и ассоциированных с него рибосом,
а также из фрагментов других мембран со сходными седиментационными
свойствами, содержит приблизительно 20% всего клеточного белка и обычно
более 60% (иногда до 80%) всей клеточной РНК. В «микросомной» фракции,
выделенной из печени, содержится 20—30 мг белка, около 5 мг РИК и 5 —
8 мг фосфолипидов в расчете на 1 г ткани. Отношение РНК и фосфолипидов
к белку равно соответственно 0,20 и 0,30.
Рибосомы, связанные с эндоплазматической сетью (которые можно
получить путем дальнейшего фракционирования «микросомной» фракции), и
свободные рибосомы (которые получают при длительном центрифугировании
цитоплазмы), по-видимому, идентичны. Из этих рибосом можно
экстрагировать два типа РНК; каждый такой тип локализуется в одной из двух
субъединиц рибосомной частицы и специфичен для нее. Молекулярные веса
этих двух типов РНК равны приблизительно 5-105 и 1,3-10е, а константы
седиментации колеблются в пределах 16 —18 и 23—23 S соответственно.
Очень много белков, по-видимому, ассоциировано с рибосомами или входят
в их состав. Некоторые из них (но отнюдь не все!) — это, очевидно,
новообразованные белки, синтез которых па поверхности рибосомы только что
закончился.
Ферменты, локализованные на мембране эндоплазматической сети,
катализируют большое число чрезвычайно важных биосинтетических реакций.
К ним относятся, в частности, ключевые реакции биосинтеза стероидов,
фосфолипидов и сложных полисахаридов. Особенно характерны для этой
клеточной фракции реакции гидроксилирования многих органических
молекул (различные алифатические и ароматические амины, стероиды и т. д.).
1 В настоящее время это моншо утверждать положительно.— Прим. ред.

254 Глава IX
Эти реакции, в которых участвуют восстановленный НАДФ и
молекулярный кислород, катализируются гидроксилазами и оксидазами со смешанными
функциями (см. гл. XV).
ЛИТЕРАТУРА
AI If г е у V., The Isolation of Subcellular Components, in J. Brachet and A. E. Mirskj
(eels.), «The Cell», vol. I, p. 193, Academic Press, New York, 1959.
Anderson N. G., Techniques for the Mass Isolation of Cellular Components, in G. Oster
and A. W. Pollister (eds.), «Physical Techniques in Biological Research», p. 299,
Academic Press, New York, 1956.
Bloom W., Fawcctt D. W., A Textbook of Histology, W. B. Saunders,
Philadelphia, 1962.
Claude A., Studies in Cells: Morphology, Chemical Constitution and Distribution of
Biochemical Functions, Harvey Lectures, 48, 121 A948).
С о h n N. S., Elements of Cytology, Harcourt, Brace and World, New York, 1964.
Dalton A., Golgi Apparatus and Secretion Granules, in J. Brachet and A. E. Mirskj
(eds), «The Cell», vol. II, p. 603, Academic Press, New York, 1961.
De Duve C, Principles of Tissue Fractionation, J. Theoret. Biol., 6, 33 A964).
De Duve C, The Separation and Characterization of Subcellular Particles, Harvey
Lectures, 59, '49 A965).
De D u v e С, В e r t h e t J., В e a u f а у П., Gradient Centrifugation of Cell
Particles; Theory and Applications, Progr. Biophys., Biophys. Chom., 9, 325 A959).
De Duve C., Watt i aux R. Baudhuin P., Distribution of Enzymes between
Subcellular Fractions of Animal Tissues, Advan. EnzymoL, 24, 291 A962).
Descriptions of Various Fractionation Schemes, in S. P. Colowick and N. 0. Kaplan (eds.).
«Methods in Enzymology», vols. I, 1955, and V, 1962, Academic Press, New York.
G r a n і с k S., The Chloroplasts: Inheritance, Structure and Function, in J. Brachet and
A. E. Mirsky (eds.), «The Cell», vol. II, p. 489, Academic Press, New York, 1961.
Lohninger A., The Mitochondrion, Benjamin, New York, 1964. (А. Л е н и н д ж с р,
Митохондрия, изд-во «Мир», М., 1966.)
Mirsky A. E., О s a n d a S., The Interphase Nucleus, in J. Brachet and A. E. Mirsky
(eds.), «The Cell», vol. П, p. 677, Academic Press, New York, 1961.
N о v і k о f ? А. В., Mitochondria (Chondriosomes), in J. Brachet and A. E. Mirsky (eds.),
«The Cell», vol. II, p. 299, Academic Press, New York, 1961.
N ovikof f А. В., Lysosomes and Related Particles, in J. Brachet and A. E. Mirsky
(eds.), «The Cell», vol. II, p. 423, Academic Press, New York, 1961.
P al a d e G. E., The Organization of Living Matter, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S., 52,
613 A964).
Petormann M. L., The Physical and Chemical Properties of Ribosomes, Elsevior,
Now York, 1965. (M. П н т е р м а н, Физические и химические свойства рибосом,
изд-во «Мир», М., 1967.)
Р о r t о г К. R., The Endoplasmic Reticulum, in T. W. Goodwin and D. Lindberg (eds.),
«Biological Structure and Functions», vol. I, p. 127, Academic Press, New York, 1961.
R о о d y n D. B. (ed.), Enzyme Cytology, Academic Press, New York, 1967.
S e n о S., С о w d r y E. V., Intracollular Membraneous Structure, Japan Society of Cell
Biology, Okayama, 1965.
Whitt alter V. P., The Application of Subcellular Fractionation Techniques to the
Study of Brain Function, Progr. Biophys. Mol. Biol., 15, 39 A965).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
С и и р и п А. С, Г а в р и л о в а Л. П., Рибосома, изд-во «Наука», М., 1968.
Механизмы интеграции клеточного обмена, сб. статей под ред. С. А. Нойфаха, изд-во1
«Наука», М., 1967.
Молекулы и клетки. Выпуск I и II, изд-во «Мир», М., 1966 и 1967.

Глава X
ХИМИЯ УГЛЕВОДОВ
Углеводы, важный класс природных веществ, встречаются повсеместно —
в растительных, животных и бактериальных организмах. Название
«углеводы» возникло потому, что многие представители этих органических
соединений имеют эмпирическую формулу (С-Н2О)„. (п в этой формуле равно
трем или больше). Обмен углеводов крайне важен для организмов как в
индивидуальном, так и в коллективном аспекте. Все органические питательные
вещества в конечном счете возникают из углеводов, образующихся в
процессе фотосинтеза (см. гл. XII). В то же время в процессе катаболизма
углеводов производится основная часть энергии, необходимой для поддержания
жизни и выполнения работы. Углеводы играют также роль энергетических
депо и несут структурные функции. Прежде чем перейти к рассмотрению
биосинтеза и метаболизма углеводов, необходимо хотя бы в общих чертах
познакомиться со строением этих веществ. Существует много превосходных
руководств, из которых можно почерпнуть такого рода сведения. Все
стандартные учебники органической химии содержат главы, посвященные
углеводам. «Advances in Carbohydrate Chemistry»— ежегодный сборник
обзорных статей — публикует подробные отчеты о современном состоянии
отдельных разделов химии углеводов. Дополнительная литература приведена
в конце этой главы. Студенты могут воспользоваться указанными работами
для более детального ознакомления со структурной химией углеводов и для
получения информации относительно различных реакций, в которых
участвуют углеводы (здесь мы рассмотрим лишь самые главные из таких
реакций).
Углеводы делятся на три основных класса: моносахариды, олигосахариды
и полисахариды. Моносахариды содержат от четырех до семи или восьми
атомов углерода и только одну альдегидную или кетонную группу (или
же они являются производными молекул, имеющих такое строение).
Олигосахариды представляют собой олигомеры моносахаридов, связанных между
собой посредством гликозидных связей. В эту категорию зачисляют
соединения, содержащие от двух до восьми или десяти мономерных звеньев.
Для углеводов, характеризующихся более высокой степенью полимеризации,
применяется название полисахариды. В группе полисахаридов встречаются
молекулы очень большого размера, с молекулярным весом порядка многих
миллионов. К ним относятся такие важные вещества, как гликоген,
целлюлоза и крахмал. Мы начнем изложение предмета с рассмотрения структурной
химии моносахаридов, а затем перейдем к описанию более сложных веществ.
МОНОСАХАРИДЫ
Из моносахаридов в природе чаще всего встречается простой шестиугле-
родный сахар (гексоза), известный под названием глюкозы. Некоторые
особенности строения и ряд химических свойств этого сахара (а также
других, близких к нему молекул можно понять из рассмотрения фиг. 80,

256
Глава X
на которой структурная формула D-глюкозы представлена несколькими
различными способами. Формула / изображает D-глюкозу в виде прямой
цени с альдегидной группой при G-1 и спиртовыми группами при всех
остальных атомах углерода. Сахара, в которых терминальное положение занимает
альдегидная группа, называются альдозами. Рассмотрение структуры /
показывает, что в молекуле D-глюкозы имеется четыре асимметрических атома
углерода. Отсюда следует, что существует 24 = 16 оптических изомеров
альдогексоз, представителем которых является глюкоза. Установление
структуры всех оптических изомеров глюкозы было завершено в 1896 г.
выдающимся химиком Эмилем Фишером, много и успешно работавшим
в области химии углеводов. Для альдопентоз и альдотетроз число
оптических изомеров равно 23 = 8 и 23 = 4 соответственно. В каждом классе
сно
I
н—с—он
но—с—н
H—С-ОН
H—С—ОН
сн2он
Ш
D-гпюкоза
н—с—он
I
н—с—он
I
но—с—н
H —С—ОН
н—с—о—
сн2он
сн2он
(Ю
а-В-глюкоза
он
(Ш)
a-D-глюкоза
ОН
(IV)
OrD-глюказа
Фиг. 80. Различные способы изображения молекулы ct-D-глюкозы.
Сахаров эти изомеры подразделяются на D- и L-формы в зависимости от
конфигурации химических групп у предпоследнего атома углерода по
сравнению с их конфигурацией в D-глицеральдегиде. На фиг. 81 изображены сте-
рические взаимоотношения различных D-сахаров. Подобным же образом
структурные изомеры L-альдоз можно вывести из формулы L-глицеральде-
гида; каждый из них будет зеркальным изображением соответствующего
D-соединения
Структура // представляет собой изображение глюкозы в виде
циклического полуацеталя. Такая форма образуется в результате реакции
присоединения гидроксильной группы при С-5 к альдегидной группе при С-1.
Эта реакция свойственна всем альдозам, в связи с чем приходится
учитывать три дополнительных соображения. Первое заключается в том, что при
образовании полуацеталя возникает новый асимметрический центр при
С-1 D-глюкозы. Следовательно, должны существовать две формы этой
молекулы и в общей сложности 32 оптических изомера для циклических форм
гексоз. Эти две формы называют а- и ?-формой. В формуле // (фиг. 80)
гидроксил при С-1 написан справа, т. е. это сс-форма; в ?-форме его пишут
слева, так что ?-D-глюкоза имеет следующую структуру:
НО—С —H
H —С-ОН
но-с-н
Н-С-ОН
Н—С—О—
СН3ОН
?-D-глюкоза

сно
I
H —С—ОН
H —С —ОН
I
СНоОН
D-зритроза
н-
сно
I
-С —ОН
I
СН9ОН
D-глицерпповый
альдегид
СНО
I
НО —С —H
II-С-ОН
сн2ои
D-треоза
сно
H —С —ОН
H —С —ОТІ
Н-С-ОН
сн2он
D-рибоза
но
сно
-С-Н
Н_С-ОН
I
Н —С —ОН
I
сн2он
D-арабиноза
СНО
Н-С-ОН
НО —С —H
Н-С-ОН
I
сн2он
D-ксилова
СНО
I
НО—С —H
I
НО —С—H
H —С —ОН
I
СН2ОН
D-ликсоаа
СНО
Н-С-ОН
Н-С-ОН
Н-С-ОН
I
Н-С-ОН
I
сн2он
D-аллоза
сно
I
но—с—н
и-с-он
Н— С — ОН
Н —С —ОН
сн2он
D-альтроза
сно
н-с-он
I
но—с—н
I
Н-С-ОН
Н-С-ОН
СН2ОН
D-глюкоза
сно
НО —С —H
I
но—с—н
H —С —ОН
I
Н —С —ОН
I
сн2он
D-манноза
сно
сно
сно
сно
Н —С —ОН НО —С —II
Н-С-ОН
но-с-н
н—с—он
сн2он
D-гулоза
Н —С —ОН
НО —С —H
Н-С-ОН
сн2он
D-идоза
Н—С —ОН НО —С —H
I
но—с—н
но-с-н
I
Н —С —ОН
сн2он
D-галактоза
I
но —с—н
но-с-н
I
Н —С—ОН
СН2ОН
D-талоза
Фиг. 81. Конфигурационные взаимоотношения D-альдоз.

258
Глава X
Второе соображение касается размера колец. Помимо шестичленних
колец такого типа, какой мы встречаем в структурах II и III (фиг. 80),
некоторые сахара образуют близкие к ним пятичленные структуры. Эти
формы называются соответственно пиранозными и фуранозными формами,
поскольку они имеют формальное сходство с шестичленным циклическим
эфиром пираном и пятичленным циклическим эфиром фураном
/\
\ /
О
Пиран
V
Фуран
Таким образом, полное название структуры II или III (фиг. 80) будет
a-D-гліокопираноза. Несколько примеров фураноз мы встретим ниже.
И наконец, последнее — в каком соотношении существуют в растворе две
формы Сахаров — циклические полуацетали и формы с открытой цепью?
Это соотношение, безусловно, зависит от природы сахара, однако в целом
можно сказать, что для большинства альдогексоз и альдопентоз циклическая
форма является в растворе преобладающей.
Хотя структура // и отражает основные свойства a-D-глюкозы, она
дает недостаточное представление о действительной форме молекулы и
пространственном расположении различных функциональных групп
относительно друг друга. Хеуорс много лет назад предложил более совершенный
способ написания структурных формул углеводов. Примером проекционной
формулы Хеуорса является структура III (фиг. 80). При таком
изображении считается, что углеродный остов молекулы вместе с этерифицированнъш
кислородом лежит в одной плоскости; располагая замещающие группы
выше или ниже плоскости кольца, обозначают таким способом их
конфигурацию. При переходе от формул типа II к проекционным формулам Хеуорса
(структура III) руководствуются следующими правилами: 1) заместители,
находящиеся справа от остова молекулы при ее линейном изображении,
помещаются ниже плоскости кольца при изображении молекулы в
циклической форме, а заместители, находящиеся слева, занимают положение
выше плоскости кольца; 2) обратное правило применяется только для того
единственного углеродного атома, гидроксильная группа которого участвует
в образовании циклического полуацеталя. Так, у D-сахаров группа СН2ОН
пишется в верхнем положении, а водородный атом при том же углероде —
внизу, несмотря на то что он находится слева в линейной формуле. Эта
необычная ситуация возникает потому, что линейные формулы типа 11
на самом деле не дают правильного представления о структуре. Структурную
идентичность линейной и циклической формул значительно легче понять,
если изобразить линейную формулу следующим образом (это не влечет
за собой изменения конфигурации при С-5):
Н_ С —ОН
Н —С —ОН
но —с—н
Н-С-ОН
нонас —с—н

Химия углеводов 259
В такой формуле расположение заместителей при С-5 соответствует правилу,
установленному выше для всех остальных углеродных атомов. (Обратите
внимание, что в циклической форме гидроксильная группа при С-1 будет
расположена ниже плоскости кольца в а-форме и выше — в ?-форме.)
Структуру IV (фиг. 80) можно считать наиболее правильным
изображением D-глюкозы. В этом случае конформация сахара представлена в
форме кресла, а заместители располагаются либо по оси, либо в экваториальной
плоскости. Такая структура, безусловно, правильна для кристаллических
форм; возможно, что она существует также и в растворе. Однако, поскольку
правильная конформация для многих Сахаров еще точно не установлена,
мы предпочитаем пользоваться в дальнейшем проекционными формулами
Хеуорса.
Сахара, у которых вместо альдегидной группы имеется кетогруппа,
обычно при С-2, называются кетозами. Наиболее известны среди них
повсеместно распространенная гексоза фруктоза, а также пентозы рибулоза
и ксилулоза.
СН2ОН
с=о снгон снгон
но-с—н ^ с=о с=о
I сшек сн он | I
н-с-он _ L^ \j 2 н-с-он но-с-н
Н-С-ОН Н\| У ОН Н—С-ОН Н—С—ОН
і 1 Г і і
снгон он н сн2он сн2он
D-фруктоза D-рибулоза D-ксилулоза
Фруктоза, как и большинство альдопентоз, существует в растворе
преимущественно в фуранозной форме. Кетопентозы, такие, как рибулоза,
могут существовать как в нециклической, так и в фуранозной форме, когда
гидроксил при С-5 вовлекается в образование полуацеталя. Первая
конфигурация является преимущественной для этих Сахаров.
В химии моносахаридов доминирующими реакциями являются
превращения карбонильной и спиртовой групп. Некоторые из этих реакций
приводят нас к родственным классам углеводов, представляющим интерес
с биохимической точки зрения.
Хотя большая часть Сахаров существует, как было отмечено выше,
главным образом в циклических полуацетальных формах, равновесие между
этими формами и альдегидной формой является весьма подвижным; кроме
того, довольно значительная часть Сахаров в равновесном состоянии
находится в альдегидной форме, вследствие чего эти соединения могут вступать
в типичные реакции с реагентами на карбонильные группы. Альдозы,
например, восстанавливают ион серебра в растворе аммиака (реактив Толленса)
и комплекс иона меди с цитратом (раствор Бенедикта). Обе эти реакции
имеют большое значение при обнаружении и количественном определении
редуцирующих Сахаров. Кроме того, сахара реагируют с аминами. Особенно
важным примером реакции такого типа является реакция с фенилгидрази-
ном, взятым в избытке. Хотя механизм этой реакции не вполне ясен, она,
по-видимому, протекает по крайней мере в три стадии: первая стадия —
образование фенилгидразона, например фенилгидразона глюкозы; вторая
стадия — окисление атома углерода в положении 2 до карбонильной группы,
и третья стадия — реакция между карбонильной группой и второй
молекулой фенилгидразина с образованием фенилозазона глюкозы. Суммарная
17*

260 , ГлаваХ
реакция может быть изображена следующим образом:
H
НС = Ш-СвН5
СНО
H
H
СНОН + ЗСеНй — NNH2 —> C = NN — GeH5 + CeH5NH2 + NH3 + 2 H2O (X.l)
Озазоны обычно представляют собой кристаллические соединения.
Приведенная реакция была использована с большим успехом Эмилем Фишером
в его работе по выяснению конфигурации Сахаров. Установив, например,
что глюкоза, манноза и фруктоза дают один и тот же озазон, можно сделать
вывод, что конфигурация в этих сахарах при атомах углерода в положениях
3, 4 и 5 должна быть одинаковой.
Восстановление в мягких условиях, например амальгамой натрия,
приводит к превращению Сахаров в многоатомные спирты. При этом
альдегидная или кетонная группа восстанавливается с образованием спиртовой
группы. Соответствующие спирты называются пентитами, гекситами и т. д.
Некоторые из них встречаются в природе. К наиболее важным относятся
маннит, сорбит (из глюкозы) и рибит.
СН,ОН СН2ОН
І І
НО—С —H H— С —ОН СН2ОН
НО —С —H НО —С —H H —С —ОН
I I ' I
Н—С—ОН Н-С-ОН Н—С—ОН
Н—С—ОН Н—С—ОН н—С—ОН
СН2ОН СН2ОН СН2ОН
D-маннит D-сорбит D-рибит
Близкородственны этим веществам циклические гекситы, например
инозиты. Два из них изображены ниже:
он
но
он
Сцимит
Л/цо-инозит ^широко распространен в живой природе.
Моносахариды вступают в ряд окислительных реакций; среди продуктов
этих реакций можно выделить три класса кислот. Обработка альдоз таким
окислительным агентом, как бром, приводит к превращению альдегидной
группы при С-1 в карбоксильную группу с образованием алъдоновых кислот.
Применение более сильных окислительных агентов, например азотистой
кислоты, вызывает окисление химических групп при двух углеродных
атомах, С-1 и С-6, и приводит к образованию алъдаровых (сахарных) кислот.
Наконец, специфическое окисление гидроксила при С-6 дает алъдуроновые
кислоты. Ниже показаны кислоты этих трех типов, образовавшиеся из глю-

Химия углеводов 261
козы:
СО2И СНО СО2Н
Н —С —ОН Н —С —ОН Н —С —ОН
I I ¦ I
НО—С—H НО—С—H НО—С—H
Н-С-ОН Н-С-ОИ Н-С-ОН
Н-С-ОН Н-С-ОН Н-С-ОН
Г ! I
сн2он со3н со2н
D-глюконовая D-глюкуроновап D-сахарная
кислота кислота кислота
Альдоновые и альдуроновые кислоты часто встречаются в природе в
качестве компонентов полисахаридов, а также как промежуточные соединения
в углеводном обмене.
Кроме многоатомных спиртов, образующихся из моносахаридов при
восстановлении, и разнообразных кислот, образующихся из них при
окислении, существует еще два класса производных Сахаров, которые имеют
исключительно большое значение в биохимии. Эти производные —
аминосахара и метилпентозы. Среди аминосахаров особенно важную роль играют
2-Б-глюкозамин и 2-Б-галактозамин
СНО СНО
H-C-NH2 H-C-NH2
! I
но—с—н но—с—н
Н-С-ОН НО-С-Н
Н-С-ОН Н-С-ОН
СН2ОН СН2ОН
2-Б-глюкозамин 2-Б-галактозамин
Оба эти аминосахара входят в состав многих полисахаридов (обычно в виде
N-ацетильных производных; см. ниже). К наиболее известным метилиенто-
зам (или 6-дезоксигексозам) относятся рамноза, фукоза и б-дезокси-Б-глюкоза.
СНО СНО СНО
І І І
Н—С—ОН НО—С—H H—С—ОН
! ! I
Н-С-ОН Н-С-ОН НО-С-Н
НО—С—H H—С—ОН Н—С—ОН
НО—С—H НО-С—H H—С—ОН
І І І
СН3 СН3 СН3
L-рамноза L-фукоза б-дсзокси-Б-глюкоза
Они широко распространены в растениях, часто в качестве компонентов
полисахаридов.
В водном растворе легко происходит взаимопревращение а- и ?-форм
Сахаров (мутаротация), которое катализируется как кислотами, так и
основаниями. Эти реакции очень легко прослеживаются путем наблюдения
за изменением оптического вращения во времени. Известно, например, что
удельное оптическое вращение a-D-глюкозы равно 112°, а ее ?-аноме-
ра — 18,7°. При установлении равновесия наблюдаемое вращение равно
приблизительно 52,5°, и, следовательно, в этих условиях около 64% приходится

262
Глава X
на долю ?-аномера и около 36% — на долю а-аномера. Мутаротация
некоторых Сахаров катализируется ферментами. ,
Исключительно важной реакцией моносахаридов является образование
гликозидов. Если, например, D-глюкозу обработать метанолом в
присутствии НС1, то образуются два продукта:
сн2он
но
он
он .сн*он
неї
2
но
CHjiOH
Ї-І-О
о\?н Ан
OCH,
но
он
он
он
(Х.2)
В обоих случаях метилируется гидроксильная группа в положении 1. По
аналогии с названиями, которые мы приводили выше, эти продукты называются
а-метил-В-глюкозид и ?-метил-В-глюкозид. Более точно их следовало
он
НО
он
сно
он
он
он
BaHUJiuH-?-V-глюкозиЬ
(прироЬный источник
ванильного запаха)
но
CHjOH
он
СН2-СН=СНг
Ї-С
N—
он
Синигрин
(оаин из компонентов хрена )
Пе-торгонидин -p-D- глюпозиЪхлорид
(растительный пигмент)
СН2ОН
но
он
Нндикаи
(источник красителя индиго)
НО
ОН
Диеитогенин-а- D-глюкозиЬ
(сапонин)
Фиг 82. Некоторые природные гликозиды.
бы назвать а- и Р-метил-Б-глюкопиранозидами. Неуглеводная часть
их молекулы, т. е. группа, замещающая протон гидроксильной группы
в положении С-1, называется аглюконом. Соединения, имеющие одну или
несколько гликозидных связей, имеют большое значение в биохимии. Это —
основная связь, с помощью которой образуются все полисахариды и
большая часть олигосахаридов. Таким образом, гликозидная связь в химии

Химия углеводов
263
углеводов имеет такое же значение, какое в белковой химии имеет пептидная
связь, а в химии нуклеиновых кислот — фосфодиэфирная связь. Гликозид-
ные связи образуются также при соединении Сахаров со стероидами,
пигментами и другими веществами. Несколько примеров таких сопряженных
соединений приведено на фиг. 82. Наконец, нам уже знаком исключительно
важный класс гликозидов — N-гликозиды, в которых связь с аглюконом
осуществляется через азот, а не через кислород. Посредством такой связи
D-рибоза и 2-дезокси-0-рибоза соединяются с азотистыми основаниями
в молекулах РНК, ДНК, АТФ и НАД (см. гл. V и VIII).
ОЛИГОСАХАРИДЫ
Олигосахариды подразделяются на классы, называемые дисахаридами,
трисахаридами и т. д., в зависимости от того, состоят ли они из двух, трех
или более углеводных звеньев. Наиболее распространенным дисахаридом
является, по-видимому, сахароза — обычный пищевой сахар. Молекула
сахарозы состоит из одного остатка D-глюкозы и одного остатка D-фруктозы.
Ниже показана ее структура
сн2он
он
Сахароза
Для полной спецификации этого или любого другого дисахарида
необходимо располагать сведениями, которые позволят ответить на четыре вопроса.
Во-первых, требуется определить природу моносахаридов, из которых
состоит дисахарид; во-вторых, необходимо знать форму кольца каждого
моносахарида, входящего в состав дисахарида,— является ли она фуранозной
или пиранозной; в-третьих, необходимо определить те углеродные атомы,
через которые осуществляется связь между моносахаридами, и наконец,
в-четвертых, следует установить аномерную природу этой связи. Таким
образом, полным названием молекулы сахарозы будет a-D-глюкопира-
нозил-A -> 2)^-0-фруктофуранозид. Обратите внимание, что сахароза
не является редуцирующим сахаром, поскольку оба углеродных атома на
он
CH2OH
но
о-сн
он
Рафиноза
он
¦OCH
он
Генцианоза
он

264
Глава X
том же уровне окисления, что и углерод карбонильной группы, участвуют
в образовании гликозидной связи. На фиг. 83 приведены структуры
нескольких дисахаров; наряду с тривиальными названиями указаны и
систематические.
Среди природных трисахаридов важное значение имеют немногие.
Наиболее хорошо известны рафиноза [а-В-галактопиранозил-A —>¦ 6)-а-Б-глю-
сн2он
но
но
он сн2он
Целлооиоза ( ?-форма)
D-глюкопираноза
он сн2он
Лпктоза (?-форма)
СН2ОН
СНгОН
но
он он
Мальтоза (?-форма)
сс-В-глюкопираноэил-A+4-)-р-
В-глюкопираноза
СН2ОН
ОН
НО
D-глюкапираноза
Трегалоза.
а.-д-глюкотшраназил-{ 1^
В-глюкопираиозид
СНгОН
ОН
сн,он
ін
он
ОН
ОН
Генциобиоза (а-форма)
-глюкопираноз1М-A^-6)-
О-глюкопираноза
ОН
Мелибиоэа (?-форма)
а-0-галактопираиозил-A-*- В)- ?-
D-глюкопираноза
Фиг. 83. Структура и названия некоторых дисахаридов.
копиранозил-A -> 2)-Р-0-фруктофуранозид] и генцианоза [?-D-глюкопи-
ранозил-A -> 6)-а-Б-глюкопиранозил-A->2)-р-Б-фруктофуранозид],
строение которых показано на стр. 263.
Эти сахара входят в состав растительных тканей. Вообще олигосахариды,
присутствующие в растительных тканях, разнообразнее по своему составу,
чем олигосахариды животных тканей.
ПОЛИСАХАРИДЫ
Основная масса всех углеводов, встречающихся в природе, существует
в виде полисахаридов. С точки зрения их функционального назначения
полисахариды можно разделить на две основные группы. Первая группа,
в которую входит, например, целлюлоза, несет главным образом структур-
вую функцию. Вторая группа, представителем которой является, в
частности, гликоген, выполняет функции, связанные с питанием. Эти молекулы
играют в основном роль депо и могут быть легко мобилизованы путем прев-

Химия углеводов 265
ращения в моносахариды, претерпевающие затем дальнейшие превращения
в ходе обмена (см. гл. XI). С точки зрения общих принципов строения
полисахариды также можно разделить на две группы, а именно на гомополисаха-
риды и гетерополисахариды. Первая группа характеризуется наличием
в составе молекулы только одного вида моносахарида (хотя типы связей
между отдельными звеньями могут быть при этом различными); для второй
группы характерно наличие двух или более типов мономерных звеньев.
Химия гомополисахаридов несколько проще химии гетерополисахаридов
в том же смысле, в каком химия полиаминокислот проще химии белков;
поэтому в первую очередь мы рассмотрим несколько полисахаридов именно
этой группы.
Однако, прежде чем говорить о распространении или о структурных
и функциональных особенностях отдельных полисахаридов, следует,
вероятно, сказать несколько слов об общем состоянии структурных исследований
в этой области. В последние годы здесь достигнуты большие успехи.
Ежегодно удается выделить 10—20 новых полисахаридов. Определение
последовательности моносахаридов в полисахаридах в некоторых отношениях
легче, а в некоторых — труднее, чем определение последовательности
мономеров в полипептидах или нуклеиновых кислотах. Легче оно главным
образом потому, что полисахариды обычно построены из относительно
небольшого числа повторяющихся единиц и каждый мономер повторяется на
протяжении всей молекулы регулярным образом. В противоположность этому
индивидуальные аминокислоты или нуклеотиды, по-видимому, распределены
беспорядочно или почти беспорядочно в молекулах соответствующих
полимерных соединений. Если полисахарид строго регулярен, то определения
структуры повторяющейся единицы и молекулярного веса полимера
достаточно для установления его полной первичной структуры. Однако в
большинстве случаев встречаются некоторые особенности (например, наличие
в молекуле точек разветвления), которые в значительной степени
усложняют задачу. Главным осложняющим фактором в химии полисахаридов
является наличие нескольких типов связей между остатками моносахаридов.
В отличие от белков, в которых все аминокислотные остатки связаны
пептидными связями, и от нуклеиновых кислот, в которых нуклеотиды всегда
соединены между собой 3',5'-фосфодиэфирными связями, молекулы
полисахаридов могут содержать различные связи: а-A -> 2), ?-(l -> 3), а-(\ -> 4)
и т. д. Что касается числа типов мономерных единиц в отдельных
полисахаридах, то в этом последние более сходны с нуклеиновыми кислотами,
чем с белками: в пределах одной молекулы полисахарида редко встречается
более четырех типов мономеров. Стоит отметить как общее правило, что
установить последовательность мономеров в полимере, содержащем малое
число типов мономерных звеньев, гораздо труднее; при большом числе
типов эта задача решается проще.
Рассмотрим теперь свойства некоторых индивидуальных полисахаридов.
ЦЕЛЛЮЛОЗА
Самым распространенным структурным полисахаридом растений и вообще
самым распространенным органическим веществом на Земле является
целлюлоза. Ежегодно синтезируется около 1011 m целлюлозы. Этот полисахарид
встречается почти исключительно в растениях, где на его долю приходится
около 50% общего содержания углерода. Структура целлюлозы установлена
на основании следующих фактов. При полном гидролизе целлюлозы
образуется только D-глюкоза; частичный гидролиз дает целлобиозу; при
гидролизе полностью метилированной целлюлозы получается только 2,3,6-три-О-
метилглюкоза. Отсюда следует, что целлюлоза состоит из D-гліокопирапоз-

266
Глава X
ных мономерных единиц, линейно соединенных между собой ?-(l ->• 4)-гли-
козидными связями, как показано ниже.
снгон
он
Молекулярный вес полученных препаратов целлюлозы колеблется в
пределах приблизительно от 50 000 до >106. Следует заметить, что молекулы
целлюлозы, так же как и молекулы нуклеиновых кислот, легко распадаются
в процессе выделения и, следовательно, указанные молекулярные веса
могут быть значительно занижены. Так или иначе, в клеточных стенках
растений целлюлоза присутствует не в виде индивидуальных молекул,
а в виде микрофибрилл длиной в несколько сот ангстрем. Фибриллы
образуются из многочисленных цепей целлюлозы, располагающихся
параллельно друг другу.
ХИТИН
Хитин, по строению очень близкий к целлюлозе полисахарид,
выполняет сходные функции у низших растений, в особенности у грибов, а также
у беспозвоночных животных, главным образом у членистоногих. Он очень
широко распространен в пределах упомянутых групп организмов и,
вероятно, в количественном отношении занимает второе после целлюлозы место
среди органических веществ на Земле. Считается, что одни только
веслоногие рачки образуют около 109 m хитина в год.
Хитин состоит из остатков 2-ацетамидо-2-дезокси-Б-глюкозы,
связанных между собой ?-гликозидными связями, как показано ниже
"О.
сн,он
СН2ОН
о
NHCOCHj
NHCOCH,
Повторяющиеся единицы у хитина те же, что и у целлюлозы, но гидроксиль-
ная группа при С-2 замещена ацетамидной группой. Полисахариды,
которые, подобно хитину, содержат аминосахара или их производные,
объединяются под общим названием мукополисахаридов. Определить
молекулярный вес хитина в том состоянии, в каком он находится в клетке, трудно,
так как он всегда прочно связан с веществами неполисахаридной природы,
главным образом с белками и неорганическими солями. Для освобождения
хитина от этих веществ необходимы довольно жесткие условия, в которых,
вероятно, хитин может деградировать.

Химия углеводов
267
ПРОЧИЕ СТРУКТУРНЫЕ ГОМОПОЛИСАХАРИДЫ
У многих организмов для построения клеточных стенок и для
выполнения сходных структурных задач используются не целлюлоза или хитин,
а различные другие полисахариды, в том числе глюканы, маннаны, ксиланы
и т. д. Глгокан, выделенный из некоторых видов Agrobacter и Rhizobium,
построен из остатков D-глюкозы, связанных между собой по преимуществу
(но не исключительно) ?-(l —*- 2)-гликозидными связями:
Таким образом, этот полисахарид очень сходен с целлюлозой и отличается
от нее только природой связей между моносахаридными звеньями. Примером
более слоншого структурного полисахарида может служить маннан из
пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Этот полисахарид состоит, вероятно,
из следующих повторяющихся единиц:
гчон но/
НО\] [/
1 Г

268
Глава X
КРАХМАЛ
Крахмал является примером полисахаридов, играющих роль депо
питательных веществ; он служит запасным питательным веществом растений.
Основные повторяющиеся единицы, из которых синтезируется крахмал,—
это остатки D-глюкозы, последовательно соединенные между собой
а-A —v 4)-гликозидными связями (в отличие от целлюлозы).
Крахмал состоит из двух разных классов соединений, отличающихся
по типу строения: в амилозах остатки глюкозы соединены в длинные нераз-
ветвленные цепи; в амилопектинах цепи разветвлены, причем в точках
ветвления имеются а-A —v 6)-гликозидиые связи. Участок молекулы амило-
пектина в точке ветвления можно изобразить следующим образом:
но
Молекулярный вес крахмала колеблется в широких пределах.
Возможно, это отчасти объясняется деградацией в процессе выделения и очистки.
Довольно обычными являются значения молекулярного веса порядка
нескольких миллионов.
ГЛИКОГЕН
Гликоген также представляет собой полиглюкозу и также играет роль
депо питательных веществ, но только в отличие от крахмала он служит
запасным углеводом не в растительных, а в животных тканях. По своей
структуре гликоген сходен с амилопектином, так как его молекулы сильно
разветвлены. Молекулярные веса препаратов гликогена колеблются от
нескольких сотен тысяч до приблизительно 100 млн. В пределах препарата
обычно наблюдается значительная полидисперсность.
ГИАЛУРОНОВАЯ КИСЛОТА
В качестве первого примера гетерополисахарида рассмотрим гиалуроновую
кислоту. Это соединение состоит из эквимолярных количеств D-глюкуроно-
вой кислоты и 2-ацетамидо-2-дезокси-В-глюкозы, т. е. оно является также
мукополисахаридом. Остатки D-глюкуроновой кислоты и 2-ацетамидо-2-

Химия углеводов
269
дезокси-Б-глюкозы чередуются друг с другом в молекуле полисахарида.
Аминосахар соединен с кислотой ?-(l ->¦ 4)-связью, а кислота с аминосаха-
ром — ?-(l ->¦ 3)-связью. Таким образом, гиалуроновая кислота имеет
следующую структуру:
сн2он
о
со2н
о.
но
NHCOCH3
CHjOH
о
он
он
о
но
NHCOCH3
Этот полисахарид распространен весьма широко. Он присутствует всюду
в соединительных тканях животных, а также в стекловидном теле глаза
и в синовиальной жидкости. Кроме того, он синтезируется также
различными штаммами бактерий. Обычно гиалуроновая кислота бывает связана
с белками; комплексы гиалуроновая кислота — белок выделены из
природных источников. Предполагают, что функция гиалуроновой кислоты
заключается в том, чтобы связывать воду в интерстициальных пространствах
и удерживать клетки вместе в желеподобном матриксе. Кроме того, она
придает синовиальной жидкости смазочные свойства и способность смягчать
удары.
Молекулярный вес гиалуроновых кислот, выделенных из разных
источников, сильно колеблется — от нескольких сотен тысяч до нескольких
миллионов.
ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТЫ
Хондроитин — полисахарид, сходный с гиалуроновой кислотой, в
котором D-глюкозамин замещен D-галактозамином,— является исходным
соединением для трех полисахаридов, широко распространенных в качестве
компонентов соединительной ткани, а именно для хондроитинсулъфатов А,
В и С. (Хондроитинсульфат В часто называют также дерматансулъфатом).
Эти три вещества имеют следующую структуру:
-о.
СО „H
он
он
CHZOR
R'O
о.
NHCOCH
ч
ХондрошптсумфатA: R = H,R' = SO3H
d С : R = SO3H,R' = H
HjOH
Хоидроитиисульфат В
(дерматансумфат)
Хондроитинсульфаты А и С состоят из эквимолярных количеств D-глюк-
уроновой кислоты, 2-ацетамидо-2-дезокси-В-галактозы и сульфата. Их
структуры различаются только по положению сульфатных остатков. В хон-
дроитинсульфате В D-глюкуроновая кислота замещена на L-идуроновую
кислоту. Во всех случаях гликозидные связи ?-(l ->- 3)- и ?-(l ->- 4)-типа
чередуются между собой. Хондроитинсульфаты относятся к мукополисахаридам
с относительно небольшими молекулами: их молекулярные веса лежат
обычно в пределах от 50 000 до 100 000.

270
Глава X
КЕРАТОСУЛЬФАТ
Кератосулъфат сходен с хондроитинсульфатами как в структурном
отношении, так и по своему распространению. Он также является одним
из главных полисахаридов соединительной ткани; кроме того, он встречается
и в некоторых других тканях. Кератосульфат состоит из чередующихся
остатков D-галактозы и 2-ацетамидо-2-дезокси-Б-глюкозо-6-сульфата,
соединенных между собой чередующимися связями ?-(l ->- 4)- и ?-(l ->- 3)-типа.
сн2он
CH2OSO3~
о.
он
NHCOCHj
\,
ГЕПАРИН
Гепарин — интересный, но недостаточно хорошо изученный мукополи-
сахарид. Он открыт полвека назад, и было показано, что он обладает
важными биологическими свойствами, в частности является антикоагулянтом.
Однако ни структура, ни биологические функции этого вещества до конца
не изучены. Гепарин встречается главным образом в крови и лимфе
млекопитающих, а также в органах, в которых содержатся тучные клетки,
являющиеся, по-видимому, местом синтеза и хранения гепарина. Обычно гепарин
прочно связан с белком, и для выделения его из природных источников
приходится применять довольно жесткие методы.
Основной повторяющейся единицей в молекулах гепарина служит,
вероятно, изображенный ниже тетрасахарид (хотя помимо показанных
присутствуют и другие связи).
Молекулярный вес препаратов гепарина лежит, как правило, в пределах
10 000-20 000.
Мы рассмотрели здесь лишь немногие из полисахаридов. Кроме них
имеется еще ряд веществ той же природы. Полисахариды входят в состав
группоспецифических веществ крови и они же являются веществами,
определяющими антигенную специфичность бактериальных капсул; они служат
компонентами вещества оболочки бактериальных клеток и встречаются
в составе многих сложных соединений — гликопротеидов и липополисаха-
ридов.
ЛИТЕРАТУРА
Bell D. J., Natural Monosoccharides and Oligosaccharides: Their Structure and
Occurrence, in M. Florkin and H. S. Mason (eds.), «Comparative Biochemistry», vol. Ill,
part A, pp. 288—354, Academic Press, Inc., New York, 1962.

Химия углеводов 271
Brimacombe J. S., Webber J. M., Mucopolysaccharides, Elsevier Publishing
Co., New York, 1964.
Clark F., Grant J. К. (eds.), Biochemistry of Mucopolysaccharides of Connective
Tissue, Cambridge University Press, New York, 1961.
F 1 о г к і n M., S t о t z E., Comprehensive Biochemistry, Carbohydrates, sec. II, vol. 5,
Elsevier Publishing Company, New York, 1963.
Gottschalk A., The Chemistry and Biology of Sialic Acids, Cambridge University
Press, New York, 1960.
Hirst E. L., The Structure of Polysaccharides, in D. J. Bell and J. K. Grant (eds.), «The
Structure and Biosynthesis of Macromolecules», pp. 45—62, Cambridge University
Press, New York, 1962.
Jeanloz R. W., Recent Developments in the Biochemistry oi the Amino Sugars,
Advances in Enzymol., 25, 433—456 A963).
M a r t і n H. N., Biochemistry of Bacterial Cell Walls, Ann. Rev. Biochem., 35, 457 A96).
P і g m a n W. W. (ed.), The Carbohydrates: Chemistry, Biochemistry and Physiology,
Academic Press, Inc., New York, 1957.
R о s e m a n S., Metabolism of Connective Tissue, Ann. Rev. Biochem., 28, 545—578
A959).
S alt on M. R. J., Microbial Cell Walls, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1960.
Sharon N., Polysaccharides, Ann.- Rev. Biochom., 35, 485 A966).
Stacey M., Barker S. A., Polysaccharides of Microorganisms, Clarendon Press,
Oxford, 1960.
Stacoy M., Barker S. A., Carbohydrates of Living Tissues, D. Van Nostrand
Company, Inc., Princeton, 1962.
Symposium, Synthesis of Complex Polysaccharides, Federation Proc, 21, 1064—1092 A962).
Whistler R. L., Smart С L., Polysaccharide Chemistry, Academic Press, Inc.,
New York, 1953.
Whistler R. L., Wolfrom M. L. (eds.), Methods in Carbohydrate Chemistry,
Academic Press, Inc., New York, 1962.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Степаненко Б. Н., Углеводы. Успехи в изучении строения и метаболизма, М.,
1968.

Глава XI
ОБМЕН УГЛЕВОДОВ
НЕСКОЛЬКО ЗАМЕЧАНИЙ ОТНОСИТЕЛЬНО ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
Обмен веществ в клетке или в организме можно определить как
совокупность всех химических процессов, которые могут в них протекать.
Поэтому обмен веществ даже у простого одноклеточного организма не
представляет собой чего-то неизменного — в любой данный момент времени
реализуются только одни какие-то его возможности, а другие остаются
невыраженными. Естественно возникает вопрос о факторах,
контролирующих выражение обмена веществ. Этим факторам, т. е. проблеме регуляции
обмена, уделяется в современной биохимии очень большое внимание как
в области эксперимента, так и в области теоретических исследований.
Регуляция обмена осуществляется с помощью чувствительной системы
взаимосвязанных механизмов слежения и настройки, в которую входят и
внутренние компоненты (наследственные, генетические) и внешние (обусловленные
средой, физиологические). Поскольку все процессы обмена веществ
взаимосвязаны во времени и пространстве, образуя единое целое, любые
воздействия затрагивают весь обмен в целом, хотя для удобства мы можем в
первом приближении сосредоточить наше внимание на какой-либо одной
реакции и ее участниках. Считается аксиомой, что весь обмен веществ и его
регуляцию можно прямо или косвенно объяснить, исходя из
ферментативного оснащения организма.
В этой главе мы впервые рассмотрим метаболические пути, т. е. цепи
или последовательности катализируемых ферментами химических реакций,
в результате которых осуществляются превращения определенных
органических соединений, жизненно важных для организма. Вовлекаемые
в такие реакции соединения называются метаболитами. В классической
биохимии метаболические пути разделяются на два типа — катаболические
и анаболические.
МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПУТИ
Катаболические пути — это процессы деградации, в ходе которых
крупные органические молекулы, поступающие часто в организм в качестве
пищи, разрушаются (обычно в окислительных реакциях) до простых
клеточных компонентов с одновременным выделением свободной химической
энергии. Эта энергия используется затем организмом для поддержания
жизнедеятельности, для роста и репликации, а также цреобразуется в другие
формы энергии — механическую, электрическую и тепловую. Анаболические
пути — это процессы синтеза. В ходе этих процессов из относительно
простых предшественников строятся сложные органические компоненты
клетки; синтез часто включает восстановительные этапы и сопровождается
затратой свободной химической энергии. Изучение обмена веществ у самых
различных организмов показало, что метаболические системы отличаются
поразительной упорядоченностью и простотой, несмотря на широчайшее

Обмен углеводов 273
разнообразие метаболитов, как потребляемых, так и образующихся. Особенно
важное значение имеет открытие центральных путей обмена, которые
примыкают и к катаболическим и к анаболическим путям, т. е. непосредственно
связывают между собой те и другие.
ЦЕНТРАЛЬНЫЕ ПУТИ
На начальных стадиях катаболизма, каждая из которых для данного
вида пищевых веществ вполне специфична, крупные молекулы, разрушаясь,
образуют очень ограниченное число небольших органических молекул (не
считая СО2 и Н2О). Этот процесс сопровождается освобождением примерно
1/3 всей доступной свободной энергии. При разрушении углеводов
образуются триозофосфаты и (или) пируват; при разрушении жиров — ацетил-КоА
(см. гл. XIII), пропионил-КоА и глицерин; при разрушении белков — аце-
тил-КоА, оксалоацетат, сс-кетоглутарат, фумарат и сукцинат. Те же
соединения образуются и тогда, когда организм — как это бывает у бактерий —
использует не совсем обычные источники углерода, например некоторые
ароматические соединения (бензойная или миндальная кислота),
алифатические (у-аминомасляная или итаконовая кислота) и гетероциклические
(пурины или мочевая кислота) (фиг. 84).
Одним из важных открытий современной динамической биохимии,
унифицировавшим и упростившим схему обмена веществ, было обнаружение
того факта, что одни и те же реакции (их можно объединить в одно
понятие — центральные пути обмена) протекают на всех трех ключевых
этапах обмена веществ. Эти этапы таковы: 1) взаимопревращение различных,
упомянутых выше продуктов катаболизма, что делает их в смысле обмена
веществ равноценными; 2) полное окисление этих продуктов до СО2 и H2Oi
дающее возможность организму использовать оставшиеся 2/3 запаса энергии;
3) обеспечение биосинтетических (анаболических) процессов наиболее
важными промежуточными продуктами.
Центральные пути обмена веществ включают относительно небольшое
число превращений. В основном это следующие реакции: триозофосфат ^
"^ пируват; пируват ^ ацетил-КоА; оксалоацетат ^ аспартат; а-кето(оксо)-
глутарат ^ глутамат, а также циклическая система реакций, в ходе
которых ацетил-КоА (С2 на фиг. 84) окисляется полностью до СО2 и Н2О.
Последний механизм, известный под названием цикла лимонной кислоты (ЦЛК),
играет столь важную роль в организме, что описанию его посвящена особая
глава (гл. XIV).
АНАБОЛИЗМ И КАТАБОЛИЗМ
Соотношение анаболизма и катаболизма хорошо охарактеризовал
Г. Корнберг: «В ходе катаболических процессов из пищевых источников
углерода образуются взаимопревращаемые промежуточные продукты
центральных путей обмена; анаболические же пути представляют собой
последовательности ферментативных реакций, в процессе которых из этих
промежуточных продуктов образуются строительные блоки, входящие в состав
макромолекул. Таким образом, в то время как катаболические'пути имеют
совершенно определенные исходные вещества, но не имеют однозначно
идентифицируемых конечных продуктов, анаболические пути, начинаясь"от
неопределенных рубежей, ведут к ясно различимым конечным продуктам».
Есть и еще одно важное различие: оно заключается в том, что**анаболиче-
ские и катаболические пути очень редко повторяют друг друга *в деталях.
Это совершенно очевидно, когда продукт катаболизма не идентичен тому
источнику углерода, который используется в процессе анаболизма. Так,
в частности, обстоит дело при синтезе многих аминокислот. При распаде
18—246

Углеводы
лроАіатические адюнокисяоты
/
Жирные кислоты
НДДФ
I
I
Тре
С*
Шеи'
~-ШримиЪипы | "f '—
/ І Про
Гцс
Ароматические аминокислоты
А. >
Б. — ^^^
В CD I |>
Д-
Б'
В'
Ґ
і. НАДФ
АДФ или АМФ

Обмен углеводов 275
ароматических аминокислот образуются ацетил-КоА и фумаровая или
янтарная кислота, тогда как для синтеза тех же аминокислот исходными
продуктами служат фосфоенолпировиноградная кислота и альдотетрозофосфат.
Подобным же образом серии и цистеин в процессе катаболизма легко
превращаются в пировиноградную кислоту, в то время как их синтез начинается
соответственно с глицерофосфата и аспарагиновой кислоты.
Несколько иной представляется картина для жирных кислот. Здесь
катаболизм завершается образованием ацетил-КоА, а биосинтез начинается
с того же самого промежуточного продукта и идет по пути, который на
первый взгляд представляется простым повторением катаболической
последовательности реакций в обратном порядке. Однако более подробное изучение
процесса показывает, что это далеко не так. Во-первых, ацетил-КоА должен
сначала превратиться в более реакционноспособный малонил-КоА, который
не является промежуточным продуктом при катаболизме; во-вторых, весь
набор ферментов, ответственных за превращение малонил-КоА в ацилпроиз-
водные с более длинной цепью (предшественники соответствующих жирных
кислот; см. гл. XVI), отличается от набора ферментов, участвующих в
катаболизме, и наконец, в-третьих, эти ферменты локализованы совсем в другом
участке клетки.
Даже при биосинтезе глюкозы, который протекает в основном по пути
обращения целого ряда легко обратимых ферментативных реакций, синтез
отличается от распада (как мы увидим далее) в двух наиболее критических
точках всей последовательной цепи реакций, а именно в начале и конце.
Так, например, в процессе катаболизма глюкоза превращается в глюкозо-6-
фосфат посредством реакции трансфосфорилирования с участием АТФ;
однако при анаболизме она образуется из фосфорного эфира путем простого
гидролиза. Пировиноградная кислота образуется катаболически из фос-
фоенолпирувата путем трансфосфорилирования — переноса фосфатной
группы на АДФ; в анаболических же процессах она используется у большинства
организмов благодаря двум связанным реакциям: сначала пировиноградная
кислота карбоксилируется до щавелевоуксусной кислоты и только потом
превращается в фосфоенолпируват. В клетках Escherichia coll, где указанное
превращение происходит непосредственно, прямая и обратная реакции все
же различаются. Они протекают следующим образом:
Фосфоенолпируват-)-АДФ —> Пируват + АТФ (прямое направление)
И
Пируват+АТФ —> Фосфоенолпируват+ АМФ + ФН (обратное направление).
Фиг. 84. Общие принципы обмена.
Приняты следующие обозначения:
Слева. А. Катаболические реакции и цепи реакций. Б. Анаболические реакции и цепи реакций.
Б. Анаилеротические реакции и цени реакций. Г. Активация конечными продуктами. Д. Ингибиро-
вание конечными продуктами. Область, соответствующая центральным путям обмена, обозначена
пунктирным контуром.
Справа. А'. Специфический катаболический этап или цепь реакций. Б'. Специфический анаболический
этап или цепь реакций: 1—отдельная цепь реакций, 11—отдельная начальная точка (петля),
III — отдельный начальный и завершающий этап.
В'. Обратимые, узловые этапы. Г'. Регуляторпый пункт (регуляция может осуществляться путем
воздействия па синтез или на активность ферментов, а также путем изменения доступности субстратов
и кофакторов).
Нише сформулированы некоторые общие принципы, иа которых основывается регуляция обмена.
1. Термодинамически или кинетически необратимая стаг.ия чаето выступает как первая реакция в цепи
или в точке разветвления; нередко и последняя реакция в цепи является необратимой. 2. Эти
необратимые реакции представляют собой наиболее чувствительные места, на которые направлено действие
перечисленных выше регуляторних механизмов. 3. Для того чтобы направить всю цепь реакций
в обратную сторону, необходимо участие одного или нескольких отдельных необратимых этапов,
которые дают начало частично пли полностью самостоятельным путям деградации (катаболизм) или синтеза
(анаболизм). 4. Связь между анаболизмом и катаболизмом обеспечивается: а) общими цепями реакций,
б) рибоиуклеозидтрифосфатами (главным образом АТФ) и восстановленными пиридиннуклеотидами —
соединениями, которые генерируются в процессе катаболизма и утилизируются в процессе анаболизма.
5. Один и тот же набор реакций и ферментов может участвовать в нескольких метаболических процессах.
18*

276 Г л а в а XI
Эти примеры служат для доказательства еще одного положения.
Начальная и завершающая реакции во многих метаболических цепях реакций
(анаболических или катаболических) часто являются фактически
необратимыми по термодинамическим соображениям; иными словами для них
AG0' <C —4 ккал/молъ (напомним, что символ AG0' обозначает стандартное
изменение свободной энергии при pH 7). С точки зрения целесообразности
причину этого понять нетрудно. Это обеспечивает свободное превращение
промежуточных продуктов и сводит к минимуму возможность возникнове-
вия заторов на протяжении метаболического пути. О ферментах,
ответственных за эти по существу необратимые и единственные в своем роде стадии,
часто говорят, что они задают скорость данного метаболического
процесса.
Означает ли это, что между анаболизмом и катаболизмом не существует
никакой связи? Отнюдь нет. Связь существует и притом очень тесная.
Проявляется эта связь на трех уровнях:
1. На уровне источников углерода. Как уже упоминалось, продукты
катаболизма через посредство центральных путей становятся субстратами
анаболических реакций.
2. На уровне снабжения энергией. В процессе катаболизма вырабатывается
метаболическая энергия в форме АТФ или соединений, легко
превращающихся в АТФ; анаболические процессы нуждаются в энергии и
потребляют АТФ.
3. На уровне восстановительной способности. Процессы катаболизма
являются в основном окислительными; они нуждаются в окислительной
способности и служат источником восстановительной. Обратное справедливо
для анаболизма. Значительная часть восстановительной способности,
возникающейв ходе катаболизма и используемой при анаболизме,
обеспечивается пиридин(никотинамид)нуклеотидами, а именно НАД/Восст. НАД
и НАДФ/Восст. НАДФ (см. гл. VIII). Существенное различие состоит в
следующем: при катаболизме образуются восстановленные формы НАД и НАДФ,
а при анаболизме потребляется почти исключительно восстановленный
НАДФ.
АНАПЛЕРОТИЧЕСКИЕ ПУТИ
Г. Корнберг указал также на существование еще одного, четвертого
типа метаболических путей и предложил для него название. Известно, что
конечные стадии катаболизма приводят обычно к полному удалению с общих
метаболических путей большинства метаболитов (в виде СО2, Н2О, NH+
(или мочевины) и некоторых других азотсодержащих оснований); при
анаболизме также происходит постоянная утечка запасов промежуточных
продуктов и удаление их с общих путей. Поэтому необходим механизм, который
обеспечивал бы пополнение этих запасов. Вспомогательные
последовательности реакций, осуществляющие эту функцию, называются анаплеротиче-
скими. Обычно в ходе этих реакций в общий фонд метаболитов включаются
одноуглеродные фрагменты (в виде СО2) или двууглеродные (в виде ацетил-
КоА).
РЕГУЛЯЦИЯ ПОТОКА МЕТАБОЛИТОВ
Поток веществ, идущий по различным путям обмена, не носит
случайного характера: он очень точно «настроен» и приспособлен к потребностям
организма (см. фиг. 84). Эти потребности в значительной мере определяются
составом среды, в которой находится данный организм; кроме того, у высших
организмов они определяются также сигналами, которые данная клеточная

Обмен углеводов 277
популяция (или ткань) получает от всех остальных клеточных популяций
(или тканей) либо непосредственно, либо косвенным путем — через лимфу
и кровь, нервную систему и т. д. Регуляция может осуществляться на
многих уровнях, но главную роль играют регуляторные механизмы двух типов.
Один из них основан на том, что состав окружающей среды влияет на
скорость и интенсивность синтеза различных ферментов. Этот механизм,
относительно медленно действующий и грубый, регулирующий обмен путем
индукции и репрессии, описан в последних главах нашей книги.
Другой механизм, значительно быстрее «срабатывающий» и тонко
сбалансированный, заключается в воздействии на скорость и интенсивность
одной или нескольких чувствительных ферментативных реакций. Иными
словами, это механизм, действующий на уровне обмена веществ в
собственном смысле слова. Обычно особенно чувствительны к этому общему
регуляторному механизму начальные и завершающие реакции специфических
метаболических цепей, т. е. те «задающие скорость» ферменты, о которых
мы говорили выше. Часто бывает также, что эта регуляция, которая может
быть как положительной (активация), так и отрицательной (ингибирование),
осуществляется одним из конечных продуктов данной цепи реакций. По этой
причине ингибиторный тип регуляции, который был открыт первым —
при изучении торможения одного из начальных этапов биосинтетической
цепи реакций конечным продуктом этой цепи,— был назван ингибированием
по типу обратной связи, или ретроингибированием. Поскольку такое
ингибирование первых этапов катаболизма (или противоположный процесс —
активация) вызывается веществами, весьма далекими как в метаболическом,
так и в структурном отношении от субстратов ингибируемых реакций,
то можно предположить, что здесь имеют место аллостерические эффекты,
т. е. конформационные изменения соответствующих ферментных белков,
обусловленные наличием второго контактного участка, независимого от
активного центра фермента.
ПРИМЕНЕНИЕ ОПИСАННЫХ ПРИНЦИПОВ К УГЛЕВОДНОМУ ОБМЕНУ
Некоторые из принципов, с которыми мы познакомились выше, могут
быть применены к рассмотрению специфических проблем углеводного обмена.
На первой стадии катаболизма (стадия I) сахара мобилизуются для
последующих превращений путем образования фосфорилированных гексоз. Это
осуществляется либо посредством простого (но практически необратимого)
фосфорилирования свободных гексоз за счет АТФ, либо посредством фосфо-
ролиза олиго- или полисахаридов, в результате чего образуются продукты
того же типа. На стадии I никакой доступной энергии не образуется;
наоборот, часто происходит потребление энергии, источником которой служит
АТФ. Как фосфорилирование, так и обратный процесс — дефосфорилиро-
вание — термодинамически по существу необратимы и идут со сколько-
нибудь значительной скоростью только в одном направлении.
На второй стадии катаболизма (стадия II) происходит неполный распад
промежуточных продуктов, образовавшихся на стадии I. Этот процесс
сопровождается выделением приблизительно V3 всей свободной энергии,
потенциально доступной при полном окислении этих продуктов. При таком
частичном распаде образуются трех- и двууглеродные соединения (триозы,
пировиноградная кислота, ацетил-КоА), которые одновременно являются
метаболитами центральных путей, включающих цикл лимонной кислоты
и некоторые вспомогательные реакции. Полное окисление промежуточных
продуктов, образовавшихся на стадии // (или образование каких-нибудь
других конечных продуктов, в частности спирта, что имеет место при ана-

278 Г л а в а XI
эробном брожении у микроорганизмов), происходит в ходе реакций, из
которых слагаются центральные пути обмена. Все вместе эти реакции составляют
третью стадию обмена углеводов {стадия III).
ГЛИКОЛИТИЧЕСКИЙ ПУТЬ
ЗНАЧЕНИЕ ГЛИКОЛИЗА
Основной ' путь катаболизма глюкозы в большинстве клеток состоит
из ряда реакций, в результате которых глюкоза превращается в пируват
СНзСОСО^- Этот путь используется в таких различных процессах, как обра-
зовавие АТФ, обеспечивающее энергией сокращение скелетных мышц в
анаэробных условиях; синтез АТФ для удовлетворения постоянной острой
потребности в энергии сердечной мышцы, работающей в строго аэробных
условиях (при которых происходит полное сгорание глюкозы); многие виды
брожения, вызываемого микроорганизмами, — сбраживание глюкозы до
этанола, молочной кислоты, глицерина, гликолей и ряда других продуктов, что
обеспечивает эти организмы всеми промежуточными продуктами и почти
всей энергией, необходимой для их роста. Нетрудно понять, почему именно
этот путь был первым полностью описан на уровне взаимодействия
гомогенных ферментов, их субстратов и кофакторов.
ОБЩАЯ СХЕМА ГЛИКОЛИТИЧЕСКОГО ПУТИ
(СХЕМА ЭМБДЕНА ~ МЕЙЕРГОФА - ПАРНАСА)
Мы ограничимся здесь рассмотрением только того ряда реакций, для
которого была впервые разработана эта схема (сокращенно ее называют
схемой ЭМП). Речь идет о превращении глюкозы в этанол и СО2 при спиртовом
брожении в дрожжевых клетках и о превращении глюкозы или остатка
глюкозы (происходящего из гликогена) в молочную кислоту (точнее, в ее соль —
лактат) в мышцах животных. Ни тот, ни другой процесс не требуют
кислорода. Оба они могут происходить в полностью анаэробных условиях и в этих
условиях обеспечивать клетку всей необходимой энергией-
Последовательность реакций гликолиза и промежуточные продукты этого процесса
показаны на фиг. 85, а некоторые характеристики реакций, в том числе их
термодинамические параметры и свойства соответствующих ферментов,
суммированы в табл. 33 и 34. Прежде чем перейти к рассмотрению индивидуальных
реакций, отметим наиболее важные особенности общей схемы.
1. Оба пути превращения глюкозы используют одни и те же реакции,
начиная от глюкозо-6-фосфата и кончая пируватом. Единственное различие
между ними связано с конечной судьбой пирувата и, следовательно, также
с тем, каким путем происходит регенерация НАД+ из восстановленного
НАД (см. ниже, пункт 3). Сказанное относится и ко всем прочим
метаболическим цепям реакций, в которых остаток гексозы вначале превращается
« две молекулы пирувата. При гликолизе в мышцах пируват и
восстановленный НАД непосредственно взаимодействуют друг с другом в присутствии
лактатдегидрогеназы, следствием чего является образование лактата и
регенерация НАД+ (табл. 33, реакция 13). При спиртовом брожении пируват
сначала декарбоксилируется до ацетальдегида (табл. 33, реакция 14), а
затем последний восстанавливается восстановленным НАД с образованием
спирта.
2. Единственной реакцией расщепления С — С-связи является в
данной схеме реакция 6, катализируемая альдолазой фруктозофосфата (или

Обмен углеводов
279
фруктозодифосфата); в результате этой реакции кетогексозодифосфат
превращается в две молекулы триозофосфата.
3. Единственной окислительно-восстановительной реакцией схемы
является реакция 8, катализируемая D-глицеральдегид-З-фосфатдегидроге-
назой. Для этой реакции необходимы НАД+ и неорганический фосфат,
продуктами же ее являются 1,3-дифосфоглицерат (соединение с большим
отрицательным значением AG0' гидролиза) и восстановленный НАД. Обратите
(Глюкозил)л \
D-глюкоза
la
~~?0глюкозо-1-фосфат^^0-глюкозо-6-фосфат
(Глюкозил)піі '
D -фруктозо - 6-фосфат
5а
П-фруктозо-1,6-Ьифосфат
4г
Диоксшщєтонфосфат
16
L-a-глицерофосфат^
: В-глицеральдегид-З-фасфат
Фи
\5-дифосфоглицерат
ААФ
3-фосфоглицерат
4
2-фосфоглицерат
4
Фосфоенолпируват
Восст.НАА Ацетальдегид
18
I
СО2
АТФ
АТФ
2 АТФ
2А1Ф
2х
Ацетат
Фат. 85. Схема гликолиза Эмбдена — Мейергофа — Парнаса.
2Лактат + 2АТФ (классичесиий пример: мышцы
млекопитаюа-Глицерофосфат + Пируват (летательные мышцы насекомых:

ГлюГликолиз'. Глюкоза + 2ФД + 2АДФ
щих или ткань мозга). Глюкоза +Ф
Н
2 Этанол + 2СО2 + 2АТФ + 2Н2О (первая форма);
поперечнополосатые мышцы),
Брожение: Глюкоза + 2ФН + 2АДФ
коза + HSOi—>-Глицерин + Ацетальдегид-HSO, + СО2 (вторая форма; АТФ не образуется);
2 Глюкоза —>- 2 Глицерин + Этанол + Ацетат + 2СО2 (третья форма; АТФдіе образуется); Глюкоза +
+ (Ф ) _^_ а-Глицерофосфат + Ацетальдегид + СО2
н'
Глицерин + Ф (третья форма; АТФ не образуется).
внимание на то, что благодаря реакции 7, в которой осуществляется
взаимопревращение двух триозофосфатов, оба продукта реакции 6 могут быть
направлены по пути реакции 8.

Таблица 33
Последовательность реакций и термодинамика гликолиза и спиртового брожения *)
Уравнение (косубстраты или
коферменты укаэаны над
стрелкой, активаторы под стрелкой)
Наэвание фермента
Характерный
ингибитор
AGO',
ВКал/АШАЬ
Глюкоза + АТФ >¦ Глю-
Козо-6-фосф'ат + АДФ
Глюкозо-6-фосфат +
+ Н2О ¦
- Глюкоза+Фн
п Глю-
Глюкоэо-
Гликогец + геФн —;
козо-1-фосфат
Глюкозо-1-Фосфат
1,6-дифосфат
>- Глюкозо-6-
фосфат
Глюкозо-6-фосфат
тозо-В-фосфат

ФрукФруктозо - 6 - фосфат + АТФ
(АДФ, АМФ), К+
—*- Фруктозо-1,6-ди-
фосфат+АДФ + Н+
Фруктозо- 1,6-дифосфат +
+ Н2О——> Фруктозо-6-
фосфат + Фн
Фруктозо-1,6-дифосфат ^
^± Диоксиацетонфосфат+
+ Глицеральдегид-3-фос-
фат
Диоксиацетонфосфат ^
^І Глицеральдегид-3-
фосфат
2 X (Глицеральдегид-3-фос-
дифосфоглицерат+НАД •
•Н + Н+)
2 х A,3-дифосфоглицврат +
+ АДФ+Н+ у- 3-фосфо-
глицерат + АТФ)
2,3-ди-
2 х C-фосфоглицврат ~ ^
фоофоглицерат
~ rz^r 2-фосфо-
глицерат)
2 х B-фосфоглицерат
или Мп.2+
-— Фосфоенолпиру-
ват)
2 х (Фосфоенолпируват +
+ АДФ+Н+-
К+ (Rb+, Сз+)
Пируват + АТФ)
2 х (Пируват + НАД • H +
+Н+ -^ Лактат + H АД+)
2 х (Пируват + Н+ ->• Ацв-
тальдогид+С О2)
Гексокиназа
Глюкокиназа

Глюкозо-6-фосфатаза
Неспецифические
фосфатазы
а-1,4-глюканфос-
форилаза
Фосфоглюкомутаза
Фосфоглюкозо-
изомераза
Фосфофруктоки-
наза
Фруктозодифосфа-
таза
Нес пециф иче ские
фосфатазы
Фруктозофосфат-
апьдолаза
Триозофосфатизо-
мераза
Глицераяьдвгид-
фосфатдегидро-
геназа, триозо-
фосфатдвгидро-
геназа
Фосфоглицератки-
наза
Фосфоглицератму-
Енолаза (фосфо-
пируватгидра-
таза)
Пируваткиназа
Лактатдвгидроге-
наза
Пируватдекар-
боксилаза
Глюкоза, ориназа
F~, фосфороргани-
чвские
ингибиторы
2-дезоксиглюкозо-
6-фосфат
АТФ, цитрат
АМФ, фруктозо-
1,6-дифосфат,
Хелато
образующие агенты
(только для
микробных фар-
ментов)
IGH2COR, D-трео-
зо-2,4-дифосфат
Ca2+
Ca2+ шш M
Na+ или К+
Оксамат
-3,42
-4,02
+0,73
-1,74
+0,50
-3,4
-4,0
+5,73
+1,83
2 X A,50)
2 X (-?,78)
2 х (+1,06)
2 X (+0,44)
2 X (-5,72)
2 X (-6,00)
2х(-4,72)

Продолжение табл. 33
Номер

реакции
15.
Уравнение (косубстраты или
коферменты указаны над
стрелкой, активаторы под стрелкой)
2 X (Ацетальдегид-|-
+НАД • H + Н+ ^ Этанол +
+ НАД+)
Название фермента
Алкогольдегидро-
геназа
Суммарные реакции:
(Глюкоза)„ + нг0 ->- 2 Лактат + 2Н+(Глю-
коза)ге_і
(Глюкоза^ + ЗФН + 3АДФ -> 2 Лактат +
+ ЗАТФ+ (Глюкоза)„_і
Глюкоза —> 2Лактат + 2Н+
Глюкоза + 2ФН + 2АДФ -> 2 Лактат + 2АТФ
Глюкоза —> 2Этанол -f- СО2
Глюкоза+ 2ФН + 2АДФ ->2 Этанол -f- 2CO2 +
+ 2АТФ
Характерный
ингибитор
(HSOa)
Гликолиз (мышцы)
Гликолиз или
молочнокислое
брожение
Спиртовое
брожение
AGO',
ккал/моль
2х(-5,15)
-52,43 2)
-27,32 3)
-47,42)
-29,74 3)
-56,12)
-37,48 3)
1) Величины AGO' относятся к реакциям, протекающим при pH 7,0 в условиях, когда активность
всех участников реакций, включая ЬгО. равна единице; большая часть данных взята из работы
Джонсона. Свободная энергия образования глюкозы в водном растворе равна 217,56 ккал/моль, AGO'
окисления глюкозы до СОа + НаО равно 686 ккал/моль, a AGO' для реакции (Глюкоза)^ + НгО —> (Глю-
коза)^ * равно —5,03 ккал/моль.
2) Получено исходя из значений AGO.
3) Получено на основании данных этой таблицы.
Таблица 34
Молекулярные свойства гликолнтпческих ферментов
Номер
реакции
1
2
3
4
5
6 v
7
8
Q
У
10
11
12
13
Фермент
Гексокиназа
Фосф'орилаза а
Фосфорилаза Ъ
Фосфорилаза
Фосфоглюкомутаза
Фосфоглюкозоизомераза
Фосфофруктокиназа
Альдолаза
Триозофосфатизомерзза
Триозофосфатдегидрогеназа
Фосфоглицеромутаза (типа
фосфотрапсферазы)
Фосфоглицеромутаза (типа
мутазы)
Енолаза
Пируваткипаза
Лактатдегидрогеназа
Источник
Дрожжи
Мышцы
Мышцы
Печень
Дрожжи
Мышцы
E. coli
Дрожжи
Мышцы
Мышцы
Печень

Микроорганизмы
Мышцы
Мышцы
Мышцы
Дрожжи
Зародыши
пшеницы
Мышцы
Дрожжи
Мышцы
Ткани
позвоночных
Мол. вес
96 600
500 000
250 000
200 000
112 000
62 000
60 000
145 000
380 000
150 000
150 000
~ 60 000
43 000
140 000
57 000
112 000
30 000
85 000
64 000
250 000
140 000
Примечания
Тетрамер
Димер
Димер (активный)
Димер
Тетрамер
Отличается от
мышечного фермента
Активируется ионами
металлов
Тетрамер
(Димер?)
Димер
Мономер (?)
Полимор
Тетрамеры различной
структуры

282 Г л а в а XI
4. На каждую молекулу свободной глюкозы в процессе гликолиза две
молекулы АТФ расходуются (в реакциях 1 и 5) и четыре образуются
(по одной на молекулу триозы в реакциях 8—9 и 11—12 соответственно).
Если путь начинается с гликогена, то на одну молекулу гексозы
расходуется только одна молекула АТФ (для реакции 2 АТФ не требуется). Таким
образом, в первом процессе образуется две молекулы АТФ на гексозу,
а во втором — три молекулы.
5. При катаболизме свободной глюкозы потребляются две молекулы
неорганического фосфата, а при катаболизме остатка гексозы (из
гликогена)—три (это естественным образом вытекает из пункта 4).
6. Суммарные уравнения, подводящие баланс рассматриваемых
процессов, приведены в табл. 33. Величину AG0' для реакции АТФ ->¦ АДФ +
-\- НгО принимают в настоящее время равной приблизительно
—7,5 ккал/молъ. Мы можем поэтому сделать три вывода: а) лишь весьма
незначительная часть всей свободной энергии, заключенной в молекуле гексозы,
становится доступной в результате осуществления двух описанных
анаэробных процессов; б) это отчасти объясняется тем, что как лактат, так
и этанол представляют собой соединения, в которых углерод все еще
находится в относительно восстановленном состоянии; в какой-то мере, однако,
столь низкий выход энергии можно объяснить и малой эффективностью
самих процессов; в) величины AG0', принятые для индивидуальных реакций,
по-видимому, близки к истинным, так как их сумма, прибавленная к
соответствующей кратной величине AG0' гидролиза АТФ, почти точно равна
значениям, рассчитанным из суммы AG0' для образования АТФ и AG0' для
его гидролиза.
7. Оба конечных продукта (лактат или этанол -f- СО2) накапливаются
в анаэробных условиях. Наиболее эффективным способом удаления этих
двух органических соединений является их полное окисление до СО2 и Н2О.
Для осуществления этого процесса необходимы аэробные условия, которые
могут быть созданы либо тогда, когда одна и та же клетка способна
взаимодействовать с разным физиологическим окружением и функционировать
в нем (таковы, например, дрожжи и некоторые клетки млекопитающих),
либо в том случае, когда, как у высших организмов, для разных
физиологических условий существуют разные, специализированные клетки
(например, когда лактат, образовавшийся в скелетных мышцах, уносится кровью
и транспортируется в печень для окисления).
ПРЕВРАЩЕНИЕ D-ГЛЮКОЗЫ В D-ГЛЮКОЗО-б-ФОСФАТ (РЕАКЦИЯ XI.1)
Поскольку глюкозо-6-фосфат является «мобилизованной» формой
глюкозы, т. е. той формой, в которой этот сахар вступает не только на путь
гликолиза, но и на все остальные пути углеводного обмена, ферменты,
катализирующие реакцию
Гексоза + Mg-АТФ —> Гексозо-б-фосфат-f Mg-АДФ, (XI. 1)
чрезвычайно широко распространены во всей живой природе.
Специфичность этих ферментов весьма сильно варьирует. Некоторые
из них, которые следует называть гексокиназами, относительно
неспецифичны и способны катализировать фосфорилирование целого ряда гексоз
соответствующей конфигурации, в том числе D-фруктозы, D-маннозы,
2-дезокси-Ь-глюкозы и D-гліокозамина. Кристаллический фермент из дрож-

Обмен углеводов 283
жей реагирует, например, со всеми сахарами, имеющими общую формулу
Н2СОН
Й^
На а-пиранозную форму альдоз он действует несколько более
эффективно, чем на ?-аномер.
Ферменты из других клеток и тканей обладают, видимо, высокой
специфичностью в отношении глюкозы, и поэтому их правильнее называть
глюкокиназами. Печень содержит и гексо- и глюкокиназу.
Все киназы (фосфотрансферазы) этого типа, т. е. ферменты,
катализирующие образование обычных О-фосфатных эфиров, используют в качестве
донора фосфата какой-нибудь нуклеозидтрифосфат (по большей части АТФ)
и нуждаются в катионе двухвалентного металла (обычно Mg2+). Данные
кинетических исследований и спектры магнитного резонанса показывают,
что ионы металла, играющие роль кофактора, сначала взаимодействуют
с АТФ и образуют двойной комплекс. Именно этот комплекс служит
истинным субстратом реакции и связывается с ферментом. Эксперименты с
субстратом, меченным с помощью О18, показали, что реакция переноса фосфата
протекает в действительности следующим образом:
,Ме
0 чо
ААФ-О*-1~-^Ф + -*-:О—R
1 о н
ГИДРОЛИЗ D-ГЛІОКОЗО-б-ФОСФЛТА (РЕАКЦИЯ XI. 1А)
Гидролиз глюкозо-6-фосфата, приводящий к образованию глюкозы
и Фн,
Mg2+
Глюкозо-6-фосфат + Н2О >¦ Гпюкоза+Фн, (XI.1а)
является ключевой реакцией не только в глюконеогенезе, т. е. в образовании
глюкозы de novo, но также и в ее образовании из гликогена,
депонированного в печени. Реакция катализируется ферментом D-глюкозо-б-фосфатазой.
Этот фермент обнаруживает довольно высокую специфичность в отношении
углеводной части молекулы субстрата: помимо глюкозо-6-фосфата
единственным субстратом, который быстро гидролизуется под действием этого
фермента, является D-глюкозамин-б-фосфат.
ПРЕВРАЩЕНИЕ ГЛИКОГЕНА И КРАХМАЛА В D-ГЛЮКОЗО-І-ФОСФАТ
(РЕАКЦИЯ XI.2)
Превращение крахмала и других сходных с ним глюкозосодержащих
полисахаридов, например гликогена, катализируется фосфорилазами (более
точное название — ос-1,4-глюканфосфорилазы), широко
распространенными в природе. Уравнение (XI.2) изображает реакцию, катализируемую

284
Г л
а XI
фосфорилазой:
СН2ОН
СН2ОН
Фосфат + Амилоза(п + 2) =
oc-D-глюк опиранозил -1- фосфат
( глюкозо-1-фосфат)
Амилоза(п + 1) и т.д.
1X1.2)
В таком виде эта реакция представляет собой фосфоролиз, который
начинается со стороны свободного нередуцирующего конца амилозной цепи
(см. стр. 268) и продолжается до тех пор, пока в результате
последовательного отщепления остатков глюкозы не образуется в общей сложности
(п -f 1) молекул глюкозо-1-фосфата плюс одна молекула свободной
глюкозы, т. е. до тех пор, пока реакция не достигнет редуцирующего конца.
Если субстратом является амилопектин (см. стр. 268), то фосфоролиз
продолжается только до точек ветвления и продуктом реакции является
остаточный декстрин. Амило-1,6-глюкозидаза может расщепить A —*¦ 6)-
связь у точки ветвления с образованием свободной глюкозы, после чего
фосфорилаза вновь получает возможность действовать до тех пор, пока
не дойдет до следующей точки ветвления, и т. д. Фосфорилазы играют
ключевую роль в процессе мобилизации углеводов: они переводят углеводы
из запасной формы в форму метаболически активную. Естественно
допустить поэтому, что, будучи первым звеном в катаболической цепи реакций,
фосфорилазы являются объектом воздействия разнообразных регулятор-
ных механизмов.
Ферменты из печени и скелетных мышц млекопитающих хорошо
изучены. Фосфорилаза мышц представляет собой тетрамер, состоящий из
четырех идентичных субъединиц. Каждая такая субъединица содержит один
остаток серина, связанный сложноэфирной связью с ортофосфатом, а
также одну молекулу пиридоксальфосфата (и тот и другой компонент имеют
существенное значение для ферментативной активности). Эта активная
форма фосфорилазы называется фосфорилазой а. Когда фосфат фосфосери-
нов отщепляется под действием специфичного фермента, называемого фос-
фатазой фосфорилазы, фосфорилаза а распадается на димерные молекулы.
Димер называется фосфорилазой Ъ. В этой форме фермент неактивен в
условиях, в которых обычно действует фосфорилаза а. Его активность можно,
правда, частично восстановить добавлением 5'-АМФ, но этот эффект не имеет
отношения к физиологическому механизму активации фосфорилазы Ъ,
т. е. к превращению ее в фосфорилазу а. Физиологический механизм
активации состоит в фосфорилировании фосфорилазы Ъ четырьмя молекулами
АТФ в присутствии специфичного фермента — киназы фосфорилазы. Этот
фермент в свою очередь существует как в активной, так и в неактивной

Обмен углеводов
285
форме. Для превращения неактивной формы в активную необходимо
присутствие особого фермента, а также Mg2+ и аденозин-3',5'-фосфата
(циклического аденилата; см. гл. V). Образование аденозин-3',5'-фосфата из АТФ
катализируется специфичным ферментом аденилциклазой, активность
которого стимулируется адреналином — гормоном, представляющим собой
катехоламин. Известно, что адреналин является мощным стимулятором
катаболизма гликогена in vivo; он вызывает превращение гликогена в
глюкозу, которая поступает в кровь; избыточное поступление глюкозы в кровь
ведет к гипергликемии. Фиг. 86 поясняет все эти превращения.
Хотя реакция, катализируемая фосфорилазой, легко обратима
(Кед = [С6Н10О6]га+1[Фн]/[С6Н10О5]п [Глюкозо-1-фосфат] ~ 3 при pH 7
Гликоген
2 [Мономер-О-Ф^ (?) (активированная форма)
Мономер-О-Ф 1 ¦*
ГсЯЮКОЗО-1-Ф
'* Фосфорилаэа а
Фосфатаза
2 Г Мономер-ОН J
"Фосфорилаза Ь"
АААФ
Кииаза
(активная)
ААТФ
4
M«2*
активная
конформация
-* Киназа фосфорилазы
— (неактивная)
АЬенозин-3',5'-фосфат
СН— CHi—NH
ОН СНз
АЬреналин (эпишфрт)
Фпг. 86. Ферменты, участвующие в превращении гликогепа в глюкозо-1-фосфат.
и 25°), она происходит только при распаде гликогена и не связана с глико-
генезом, т. е. с процессом ресинтеза гликогена. Гликогенез происходит
и тогда, когда отношение [Фн]/[Глюкозо-1-фосфат] достигает 300, а также
при некоторых наследственных нарушениях обмена, при которых фосфори-
лаза вообще отсутствует. Кроме того, в присутствии адреналина, который,
как только что упоминалось, стимулирует активность фосфорилазы,
происходит распад, а не синтез гликогена. В настоящее время благодаря работам
Лелуара и других исследователей окончательно доказано, что синтез
гликогена идет по пути полимеризации не самого глюкозо-1-фосфата, а смешанного
ангидрида этого соединения и УМФ, так называемой УДФ-глюкозы, или
УДФГ (см. гл. VIII). В этой реакции участвует специфичный фермент—
гликогенсинтетаза.
ВЗАИМОПРЕВРАЩЕНИЕ D-ГЛЮКОЗО-І-ФОСФАТА И D-ГЛЮКОЗО-б-ФОСФАТА
(РЕАКЦИЯ XI.3)
Эта реакция играет важную роль не только в гликолизе, но и вообще
в обмене олиго- и полисахаридов (см. стр. 310). Она катализируется
ферментом фосфоглюкомутазой, который содержит один остаток серина с ОН-

286
Глава XI
группой, имеющей существенное значение для ферментативной активности.
В качестве кофермента фосфоглюкомутазе необходим глюкозо-1,6-дифосфат;
кроме того, реакция требует присутствия Mg2+ (a фтор-ион действует как
ингибитор). Серин-ОН фосфорилируется и дефосфорилируется в цикле
реакций, описываемом уравнением (XI.3):
СН2ОН
СН2ОР*О|"
°\
E-O-P*Of-
(Х1.3а)
(ХІ.Зб)
Глюкозо-1-фосфат(t)
Е| Mg
Глюкозо-б-фосфат^
К^К^ = П(рассч.)
19(измер.) (XI.3)
Необходимый кофермент образуется в реакции (XI.Зв), катализируемой
фосфозлюкокиназой
Глюкозо-1-фосфат + Mg-АТФ —> Глюкозо-1,6-дифосфат + М§-АДФ. (XI.Зв)
ВЗАИМОПРЕВРАЩЕНИЕ D-ГЛЮКОЗО-б-ФОСФАТА И D-ФРУКТОЗО-б-ФОСФАТА
(РЕАКЦИЯ XI.4)
Реакция
D-глюкозо-б-фосфат ^ D-фруктозо-б-фосфат (XL4)
катализируется фосфоглюкозоизомеразой. Фермент высокоспецифичен, поскольку
аналогичная изомеризация
Маннозо-6-фосфат ^Z^ Фруктозо-6-фосфат,
столь легко осуществляющаяся под влиянием разбавленной щелочи,
катализируется другим ферментом — фосфоманнозоизомеразой,— также
присутствующим в мышцах. Названные ферменты, очевидно, избирательно
активируют два атома водорода, связанные с первым углеродом фруктозофосфата.
Это следует из того, что глюкозо-6-фосфат, меченный »дейтерием в
положении 1, не обменивает свой дейтерий с Н2О в присутствии глюкозоизомеразы,
тогда как в присутствии обоих ферментов такой обмен происходит.
ОБРАЗОВАНИЕ Б-ФРУКТОЗО-1,6-ДИФОСФАТА ИЗ ФРУКТОЗО-6-ФОСФАТА;
РЕГУЛЯТОРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГЛИКОЛИЗА (РЕАКЦИЯ XI.5)
Реакция катализируется высокоспецифичным ферментом фосфофрукто-
киназой и обладает всеми остальными свойствами киназных реакций,
т. е. для нее необходимо присутствие АТФ (который в данном случае может
быть заменен УТФ или ИТФ) и Mg2+, a величина AG0' для нее отрицательна:
Б-фруктозо-6-фосфат+М§-АТФ —> Б-фруктозо-^б-дифосфат-^^-АДФ. (XI.5)
Поскольку все прочие пути превращения гексоз начинаются с других
гексозофосфатов, о которых мы говорили выше, реакцию (XI.5) можно
рассматривать как первую реакцию, характерную именно для гликолитической
цепи реакций. Это важный пункт разветвления метаболических путей,

Обмен углеводов
287
на который воздействуют многочисленные регуляторные механизмы.
Фермент, катализирующий эту реакцию в организме млекопитающих, с трудом
поддается очистке, что, по-видимому, вообще характерно для большинства
(если не для всех) аллостерических ферментов. Высокие концентрации АТФ
резко ингибируют этот фермент, тогда как АДФ и АМФ его активируют.
Кроме того, фермент ингибируется также цитратом. Эти различные
регуляторные механизмы обеспечивают фактическую блокировку гликолиза и
благоприятствуют синтезу глюкозы во всех тех случаях, когда отношение
[АТФ]/[АДФ + Фн] велико, т. е. когда лактат и пируват аэробно
окисляются до СО2 в цикле лимонной кислоты (см. гл. XIV). Обратная ситуация
также может иметь место: если гликолиз абсолютно необходим для
генерации энергии, т. е. если соотношение [АТФ]/[АДФ + Фн] резко снижается,
то тем самым создаются условия, благоприятствующие гликолизу, а синтез
углеводов выключается.
Полная надежность этого регуляторного механизма и аналогичное
регулирование обратного (биосинтетического) процесса обеспечиваются тем, что
большинство фруктозо-1,6-дифосфатаз, специфичных ферментов,
катализирующих гидролитическое превращение фруктозо-1,6-дифосфата во фруктозо-
6-фосфат (реакция XI.5а), ингибируется высокими концентрациями
субстрата, а также АМФ (последнее в результате аллостерического эффекта).
ПРЕВРАЩЕНИЕ ФРУКТОЗО-1,6-ДИФОСФАТА В ДВЕ МОЛЕКУЛЫ
ТРИОЗОФОСФАТА И ВЗАИМОПРЕВРАЩЕНИЕ АЛЬДО-
И КЕТОТРИОЗОФОСФАТОВ (РЕАКЦИИ XI.6 И XI.7)
Альдолаза
и (ХІ.7)
и триозофосфатизомераза катализируют реакции (XI.6)
Нч
он н н,
О-фруктоза-ір-дифосфат
н—с=о
н—с—он
I
Н2СОРОз"
с=о
(XI.6)
CHjOPOf Н2СОН
D-глицераль-
дегид-о-фосфот
Диоксшщетон-
фосфат
Г 10-'
Г
(pH = 7,8; 25°)
Лиоксиацетонфосфат^=±0-глииералі}аегиа-3-фосфат КЄу=4*Ю~ (те же условия) (ХІ.7)
Из разных клеток были выделены и очищены альдолазы нескольких
различных типов и свойства их были изучены. Наиболее тщательно
исследована альдолаза из скелетных мышц кролика. Активная форма фермента
представляет собой тример, состоящий из трех полипеитидных цепей.
Известно, что этот фермент в отсутствие альдотриозы катализирует обмен
водорода в Н2С — ОН-группе диоксиацетонфосфата и проявляет стереоспеци-
фичность, противоположную стереоспецифичности триозофосфатизомеразы,
которая обладает такой же стереоспецифичностыо и таким же механизмом
действия, как и глюкозофосфатизомераза (реакция XI.4). Специфичность
альдолазы из скелетных мышц кролика в отношении возможных субстратов
свидетельствует о том, что диоксиацетонфосфат (и соответствующая часть
молекулы гексозы) взаимодействует с ферментом высокоизбирательным

288
Глава XI
способом. Образование соответствующего комплекса может быть
продемонстрировано с помощью спектрофотометрического метода. Как было
показано, структура комплекса включает образование шиффова основания
в результате реакции между карбонильным углеродом субстрата и е-амино-
группой остатка лизина в молекуле фермента (см. гл. VII). Восстановление
и гидролиз дают на один моль фермента один моль производного, которое
было идентифицировано как
Н2СОН
I
НС — NH(CH2L—СН — СО2Н
Н2СОН NH2
Вместе с тем в реакции (как это видно из фиг. 87) может участвовать целый
ряд'различных альдегидов. Во всех случаях в образовавшейся кетозе гидро-
ксилыдпри а- и ?-углеродах имеют т.ракс-конфигурацию (см. схему в левом
верхнем углу фиг. 87).
Совершенно другой тип альдолаз (альдолазы класса II) выделен из
микроорганизмов. Ферменты этого типа проявляют субстратную специфичность,
СН2ОРОз
=О
Активная конфигурация
D-фруктозо-і-фосфат (R-н)
D-фруктозо-l?-дифосфат (R=POl~)
(такие же реакции с
соответствующими тетрозами дают
CH,OR вующими тетроэами дают
производные О-седогептулозы)
/ снюя СН2ОРО3
г -| L-сореозо-і-фосфат (R=H)
сно -|
' (Lr CH2OR
с=о
I
СН2ОН
О-ксилулозо-І-фоофат (R=OH)
Вксилулозо-І,5-диф[)сфат (R=OPO\')
5-дезокси-О-ксилулозо-1-
фосфат (R=H)
Фиг. 87. Схема, поясняющая реакции (XI.6) И (XL7).
сходную со специфичностью мышечной альдолазы, но в то время как
фермент из мышц не нуждается в кофакторе и не ингибируется хелатообразую-
щими агентами, микробным ферментам для проявления полной активности
необходимо присутствие двухвалентных металлов. Возможно, что при этом
между карбонильной группой или иминогруппой и свободной а-ОН-группой
образуется с помощью металла комплекс, как это показано ниже.
(NH)
HV°
Ферменты этого типа для проявления полной активности нуждаются также
в ионах К4.

Обмен углеводов 289
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ АДФ ЗА СЧЕТ ДЕГИДРИРОВАНИЯ
ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИДФОСФАТА (РЕАКЦИИ XI.8 и XI.9)
Б-глицеральдегид-3-фосфат + НАД+ + Фн ^ Б-1,3-дифосфоглицерат-|- НАД¦ Н+-(- Н+
^~ (XI.8)
1,3-дифосфоглицерат + АДФ + Н+ ^ Б-3-фосфоглицерат +АТФ (XI.9)
D-гпицерапьдегид-З-фосфат -f- HАД+ + АДФ + Фн ^
^ Б-3-фосфоглицерат + АТФ + НАД-Н + Н+ (XI.8) + (XI.9)
В большинстве клеток образовавшийся на предшествующих стадиях
триозофосфат превращается в 1,3-дифосфоглицерат (реакция XI.8). Для
этого превращения необходимы НАД+ и Фн в стехиометрических
количествах. В результате образуется продукт, который, будучи смешанным
ангидридом карбоновой и ортофосфорной кислот, обладает очень большой
отрицательной величиной свободной энергии гидролиза (AG0' ~ —14 ккал).
Именно за счет этого создается движущая сила не только для реакций
(XI.8) и (XI.9) (AG0' = —5,3 ккал на 1 моль триозофосфата), но и для всего
процесса превращения гексозодифосфата в фосфоглицерат (реакции
XI.6 — XI.9; AG0' ~—3 ккал на 1 моль гексозодифосфата).
Фермент, катализирующий реакцию (XI.8),— глицеральдегидфосфат-
дегидрогеназа (ГАФД) — распространен чрезвычайно широко. Для
проявления его активности необходимы свободные SH-группы (на молекулу
фермента приходится 14 титруемых групп). Мышечная ГАФД связывает
кофермент (НАД+) настолько прочно, что он не отделяется от фермента
даже при повторной кристаллизации или при диализе. Для полного
удаления кофермента применяют адсорбцию на колонке из активированного угля.
При этом освобождается четыре молекулы НАД+, так что для регенерации
голофермента к апоферменту должны присоединиться четыре молекулы
пиридиннуклеотида. В образовании этого комплекса, спектр поглощения
которого отличается от спектра поглощения свободного кофермента,
по-видимому, принимает участие такое же число цистеиновых остатков белка. Было
показано, что как в прямой, так и в обратной реакции в качестве
обязательного промежуточного продукта образуется ацилфермент, имеющий
следующую структуру (представлена неполностью):
—Цис —S —С —R
U
Дегидрогеназа специфична в отношении таких субстратов, как D-глицераль-
дегид-3-фосфат, свободный дефосфорилированный альдегид и ацетальдегид;
Б-треозо-2,4-дифосфат резко ее ингибирует.
Реакция (XI.9) катализируется фосфоглицераткиназой. Для этого
фермента, так же как и для других ферментов того же типа, абсолютно
необходим кофактор, роль которого играет ион двухвалентного металла (Mg2+,
Мп2+ или Са2+); металл взаимодействует с аденозиндифосфатом или адено-
зинтрифосфатом и образует реакционноспособный комплекс.
ИЗОМЕРИЗАЦИЯ ФОСФОГЛИЦЕРАТА (РЕАКЦИЯ XI.10)
Обратимая реакция превращения первичного фосфорного эфира 3-фосфо-
D-глицерата в соответствующий вторичный эфир, 2-фосфо-Е)-глицерат,
g
2,3-дифосфоглицерат
D-3-фосфоглицерат ^ D-2-фосфоглицерат, (XI.10)
катализируется ферментом фосфоглицеромутазой.
19—24 6

290Глава XI
Для реакции абсолютно необходимы два кофактора: Mg2+ и диэфир
2,3-дифосфоглицерат. Механизм реакции, вероятно, очень сходен с
механизмом, установленным для более тщательно изученной фосфоглюкомутазной
реакции (реакция XI.3). В зародышах растений и в животных тканях
обнаружен другой фермент, для которого, очевидно, не требуется никаких
кофакторов.
ПРЕВРАЩЕНИЕ 2-ФОСФОГЛИЦЕРАТА В ПИРУВАТ
И ОБРАЗОВАНИЕ ВТОРОЙ МОЛЕКУЛЫ АТФ
(РЕАКЦИИ XI.11 и XI.12):
СОг О СО^ О
H —С —О—Р —О- "ЗІ С —О —Р —O-+II2O; (XI. 11)
I I " II I
н2сон о- йен о
(XI. 12)
HCH 0-
Реакция (XI.И) представляет собой дегидратацию фосфатного эфира
диоксикислоты. Ее можно также рассматривать как внутримолекулярное
окисление G-2 и восстановление G-3. Процесс происходит фактически без
изменения энергии, и значение Кед для этой реакции в том виде, как она
представлена выше, при физиологических условиях равно 3. С другой
стороны, правильнее причислить образовавшийся эфир к классу смешанных
ангидридов, поскольку дефосфорилированный продукт (енолпировиноград-
ная кислота) является а-карбоксиенолом. AG0' для гидролиза фосфоенол-
пировиноградной кислоты равно приблизительно —12,8 ккал/молъ; часть
этой энергии следует отнести за счет того, что продукт реакции образует
две таутомерные формы — енольную и кетонную — и что равновесие между
ними в случае пирувата при pH ~ 7 сильно сдвинуто в сторону кетоформы.
Енолаза — фермент, катализирующий реакцию (XI.11),—
распространена очень широко. Для ее действия абсолютно необходимы двухвалентные
катионы (Mna+, Mg2+, Zn2+ или Gda+), антагонистами которых могут быть
другие катионы (Са2+ или Sr2+). Ион F" является эффективным ингибитором
при низкой концентрации A0~2 М), особенно в присутствии Фн, что,
вероятно, следует приписать образованию метафторфосфата, связанного с активным
центром фермента.
Пируваткиназа — фермент, катализирующий реакцию (XI.12),— также
нуждается в Mg2+ или Мп2+ (Са2+ выступает как конкурентный антагонист
этих ионов). Кроме того, для максимальной активности фермента необходимо
также присутствие одновалентных катионов (К+, Rb+ или Cs+), которые,
вероятно, оказывают стабилизирующее действие на конформацию фермента
(антагонистами являются Na+ и Li+). Таким образом, пируваткиназа ведет
себя как типичный легко деформируемый белок, способный к аллостериче-
ским взаимодействиям. Равновесие реакции (XI.12), весьма невыгодное для
ее обращения (при котором роль субстрата играет пировиноградная кислота),
и низкое число оборотов фермента в обратной реакции (всего 12, тогда как
при образовании пировиноградной кислоты оно равно 6-Ю3) обеспечивают
мощную термодинамическую и кинетическую блокировку, препятствующую
использованию этой реакции в синтезе углеводов.

Обмен углеводов
291
КОНЕЧНЫЙ ЭТАП ГЛИКОЛИЗА В МЫШЦАХ
И ГОМОФЕРМЕНТАТИВНОЕ МОЛОЧНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ (РЕАКЦИЯ XI.13)
Обратимое восстановление пирувата в лактат за счет восстановленного
НАД
^ СН3СНОНСО;Г+НАД+ (XI.13)
является конечным этапом гликолиза в мышцах позвоночных, отличающим
этот процесс от многих других видов анаэробного сбраживания углеводов.
Эта же реакция, однако, характерна и для так называемого гомофермен-
тативного молочнокислого брожения, т. е. для брожения, единственным
продуктом которого является молочная кислота (лактат). Оно осуществляется
большой группой микроорганизмов —«молочнокислыми бактериями», к
числу которых относятся различные виды родов Lactobacillus, Bacillus,
Streptococcus, Clostridium и некоторых других. В то время как лактат, образующийся
под действием фермента из животных источников (L-лактатдегидрогеназы,
см. гл. IV), неизменно имеет L (-^-конфигурацию, некоторые из
бактериальных клеток и ферменты, выделенные из них, проявляют, по-видимому,
противоположную стереоспецифичность. Встречаются, однако, и такие случаи,
когда оба вида активности присутствуют, как можно думать, в одной и той
же клетке (пример: L. plantarum = L. arabinosus).
КОНЕЧНЫЕ ЭТАПЫ СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ (РЕАКЦИИ XI.14 И XI.15)
У некоторых микроорганизмов, среди которых наибольшее значение
имеют пивные дрожжи, выращиваемые в анаэробных условиях, судьба
пирувата отличается от описанной выше. В этом случае первым этапом
является реакция (XI. 14), катализируемая пируватдекарбоксилазой (карбо-
ксилаза 2-оксокислоты, раньше называвшаяся пируваткарбоксилазой).
В результате этого фактически необратимого декарбоксилирования пирувата
образуется ацетальдегид. Для реакции необходимо участие тиаминпиро-
фосфата (ТПФ, кокарбоксилаза) и Mg2+ в качестве обязательных
кофакторов. В настоящее время известно, что реакция идет через образование 2-а-
лактил- и 2-а-оксиэтилтиазолового производного кофермента ([А] и [Б]
соответственно в уравнении XI. 14).
Е-ТЛФ+ СН3СНО
H
о
II 1
+ CHj-C-COj-'
E-+N .
Vs
+
H+
H+
[SI
н-с-0
I
сн.
(XI.П)
Общий механизм реакций с участием ТПФ обсуждался на стр. 225.
Ферменты, способные катализировать реакцию (XI.14), в ходе которой из
комплекса (В) (см. уравнение XI.14) выделяется свободный ацетальдегид,
были получены в высокоочищенном виде из дрожжей, а также из
зародышей пшеницы и других растительных тканей. Потребность в металлах в этом
19*

292 Г л а в а XI
случае может быть удовлетворена не только за счет обычных
двухвалентных ионов, но также и за счет трехвалентных (Al3+, Fe3+).
На последнем этапе спиртового брожения ацетальдегид, образовавшийся
в реакции (XI.14), восстанавливается в этанол (реакция XI.15):
Н*
_^ I
СН3СНО + НАД-Н* + Н+ ^ СНз —СОН + ИАД+. (XI.15)
H
Фермент, ответственный за эту реакцию, называется алкоголъдегидрогена-
зой. Дрожжевая алкогольдегидрогеназа имеет молекулярный вес 151 000
и содержит четыре независимых друг от друга каталитических центра; в тоже
время из печени млекопитающих получен аналогичный фермент с
приблизительно вдвое меньшим молекулярным весом и двумя каталитическими
центрами. В молекулах этих ферментов присутствует также Zn, число атомов
которого равно числу каталитических центров. Ферменты стереоспецифичны
в отношении переноса водорода как в молекуле спирта, так и в никотин-
амидном кольце (см. стр. 230), но проявляют сравнительно малую
специфичность в отношении структуры субстратов — спиртов и карбонильных
соединений.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПУТИ ГЛИКОЛИЗА И БРОЖЕНИЯ
Схема ЭМП, несомненно, представляет собой основной путь катаболизма
глюкозы в большинстве клеток, за исключением нескольких видов
бактерий. В дрожжевых клетках можно наблюдать несколько различных
вариантов брожения в зависимости от используемых условий.
Первая форма брожения уже описана нами выше — это та форма, в
которой брожение протекает у дрожжей, растущих и размножающихся в
анаэробных условиях.
Вторая форма приводит к образованию глицерина. Для
получения такого результата необходимо связать образующийся ацетальдегид
с. помощью какого-либо реактива на карбонильные группы, например
бисульфита, замещенных гидразинов и т. д. В этих условиях не происходит
восстановления ацетальдегида в этанол и из каждого моля триозофосфата в ходе
реакций (XI..16) и (XI.17) образуется моль глицерина:
СН2ОН
Диоксиацетонфосфат+ Восст. НЛД ^ НОС—H + шД
1 (XI.16)
СН2ОРОз
н2о
(XI 17) і \^Мд-АТФ (XI.17а)
Фн+Глицерин
Реакция (XI.16) катализируется растворимым (цитоплазматическим)
ферментом, L-глицерол-З-фосфат-дегидрогеназой, а реакция (XI.17) —
специфической фосфатазой. Для обратной реакции (XI.17а), как всегда,
требуется АТФ-зависимая киназа (фосфотрансфераза). Как видно из
изложенного, восстановленный НАД, образовавшийся в реакции (XI.8), потребляется
в реакции (XI.16), а каждая молекула триозы координированным образом
участвует в реакциях обеих ветвей гликолиза, т. е. в реакциях (XI.16) -|-
(XI.17), с одной стороны, и в реакциях (XI.8) — (XI.14) — с другой.
В результате этого ни одно из реагирующих веществ не накапливается и не

Обмен углеводов
расходуется (в том числе и АТФ). Суммарное уравнение, отражающее
стехиометрию этой формы брожения, приведено в подписи к фиг. 85.
Реакции (XI.16) и (XI.17) вместе с описанными выше реакциями,
приводящими к образованию триозофосфатов, ответственны также за
образование важных промежуточных продуктов липидного обмена (см. гл. XVI)
из углеводных предшественников. В летательных мышцах насекомых
глюкоза не превращается в молочную кислоту. Здесь фермент, катализирующий
реакцию (XI.16), работает в сочетании с другой L-a-глицерол-З-фосфат-
дегидрогеназой, которая представляет собой флавопротеид,
локализованный в митохондриях этой ткани и катализирующий реакцию (XI. 166).
Вне митохондрий: Диоксиацетонфосфат + Н+ + НАД-Н ^
** НАД+ + а-Глицерофоофат (XI. 16а)
Внутри митохондрий: а-Глицерофосфат-]-Е-ФАД+
^ Диоксиацетонфосфат + Е-ФАД-Н (XI.166)
Е-ФАД-Н + О2 + 2АДФ + 2ФН —> Е-ФАД+ + 1/г Н2О + 2 АТФ (ХІ.Ібв)
Суммарная реакция (в клетке): НАД• И-f О2 -|- 2АДФ-|-2Фн + Н+ —=*
(ХІ.Ібг)
Приведенная цепь реакций играет важную роль (в качестве своего рода
челнока) при окислении восстановленного НАД также и в ряде других
тканей, например в ткани мозга, в гладких мышцах и т. д.
Третью форму дрожжевого брожения можно наблюдать в щелочной
среде. В этих условиях две ветви схемы ЭМП вновь оказываются тесно
связанными друг с другом, вследствие чего не остается восстановленного НАД,
который мог бы использоваться для восстановления ацетальдегида в этанол.
Вместо этого происходит другая реакция, посредством которой удаляется
ацетальдегид, являющийся чрезвычайно токсичным метаболитом. Это
реакция (XI.18а), катализируемая НАД-зависимой алъдегиддегидрогеназой:
СН3СНО + НАД+ + ОН- ^ СНЗСО2+НАД.Н + Н+. (XI. 18а)
Сходный фермент обнаружен и в печени млекопитающих. Общий баланс этого
ряда реакций также приведен в подписи к фиг. 85.
У бактерий может протекать еще одна реакция (XI.186), представляющая
собой вариант реакции (XI.18а). В ней принимает участие кофермент А.
Поскольку ацетил-SKoA (ацилированный тиоэфир) имеет большую
отрицательную величину AG0' гидролиза (—7,7 ккал/молъ), он может быть связан
с системой синтеза АТФ в реакциях (XI.19) и (XI.20), катализируемых
фосфотрансацетилазой и ацетаткиназой:
СНзСІЮ + НАД+4-KuASH ^ СН3СОЗКоА + НАД-Н + Н+ (ХІ.186)
СНзСОЗКоА + Ф^- ^ CH3COPO§--j-KoASH (XI.19)
СН3СОРО|-+АДФ ^ СН3СО^+АТФ (XI.20)
Суммарная реакция: СН3СНО4-НАД+
°'=— 5,5 ккал/молъ (XI.21)
Общий баланс для этого гетероферментативного брожения может быть
выражен следующим уравнением:
2 Глюкоза + АДФ -\- Фн —* 2 Глицерин + Этанол + Ацотат + 2 СО2 + АТФ.

294 Глава XI
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПУТИ ПРЕВРАЩЕНИЯ ПИРУВАТА
Образование пирувата из гексоз или гексозных остатков свойственно
всем клеткам, использующим путь ЭМП для катаболизма углеводов и
производства АТФ. Напомним, что суммарные реакции в этих двух случаях
описываются следующими уравнениями:
2АДФ + 2Фн —> 2 СН3СОСО^ + 2 НАД-Н + 2 АТФ
AG°'= —18 ккал/молъ (XI.22а)
[С6НПО8]+2НАД+ + ЗАДФ + ЗФН —* 2 СН3СОСОг + 2ДІАД-Н + 3 АТФ
AG°'= —15 ккал/молъ. (XI.226)
[СбНцОві означает здесь остаток гексозы, связанный гликозидной связью
и способный при фосфоролизе давать глюкозо-1-фосфат. Различные пути
катаболизма углеводов отличаются тем, как на этих путях используются
восстановленный НАД и пируват, образовавшиеся в ходе реакций. Этим
определяется и положение тех точек, в которых пути обмена разветвляются
(фиг. 88).
ПРОЧИЕ ВИДЫ БРОЖЕНИЯ; ВСТРЕЧАЮЩИЕСЯ У МИКРООРГАНИЗМОВ
Реакции с участием «активного ацетальдегида». 2-оксиэтильное
производное ТПФ (структура [В] в уравнении XI.14) является чрезвычайно реак-
ционноспособным соединением; его можно рассматривать как метаболически
«активную» форму ацетальдегида. Характерной реакцией этого типа является
ацилоиновая конденсация — так называемая карболигазная реакция
(реакция XI.23), катализируемая ферментами, которые были выделены из
дрожжевых клеток и из высших растений. Эти ферменты, очевидно, либо
исключительно прочно связаны с декарбоксилазой, либо тождественны ей.
g
CH3COCOj+H+ +Е-ТПФ > СО2 + Е-ТПФ —СНОНСНз, (XI.14а)
Е-ТПФ —СНОНСНз ^ Е-ТПФ + СНзСНО, (XI.146)
Е• ТПФ —СНОНСНз+ СН3СНО ^ Е.ТПФ + СН3СНОНСОСН3, (XI.23)
Е-ТПФ
СН3СНОНСОСН3 + СО2 (XI.24)
Ацетоин [уравнения
(Х1.14а) +
(XI.23)]
В то время как при использовании ферментов из растительных тканей
реакция (XI. 146) является легко обратимой, ферменты из некоторых
бактерий или выделенный пируватдегидрогеназный комплекс (см. стр. 296)
не катализируют образования свободного ацетальдегида, и это соединение
может играть роль только акцептора, но не донора карбонильной группы.
Ацетоин в присутствии соответствующей дегидрогеназы может служить еще
одним акцептором электронов и обеспечивать реокисление восстановленного
НАД через реакцию
СН3-СО —СНОН —СНз + НАД-Н+Н+^СНз-СНОН—СНОН—СН3 + ИАД+. (XI.25)
В типичном случае брожение, включающее описанные реакции (его
осуществляют некоторые виды бактерий), может быть выражено следующим
суммарным уравнением:
ЗГлюкоза + 4АДФ + 4Фя —» 2 2,3-бутандиол + 2 Глицерин+4СО2 4 АТФ. (XI.26)

2COZ
i
ЦЛК 4
Ь/глеводы
Восст.Н/ІД
НДД
(їф + od
CUsCOS-KoA —
Ацетил-КоД
,-t
Ацвтат
) ТПФ-СН СН,
ОН
"Ї0-І4С
СЩСНО CHjCHOHCOCHj
/Іцєтольдегид
^-?occm.HM^v
"О2ССН2СНОНСО2
L-малат
CHjCHOHCO^
Лактат+
НСО"
Формиот
СН3СН2ОН СН3СНОНСНОНСН3
Этанол''' 2,5-6утаидиол+
ЦЛК —
Фиг. 88. Обмен пирувата.
Метібо-шческие пути свойственные преимущественно млекопитающим, показаны жирными стрелками. Крестиком отмечены соединения, образующиеся при
микробном б ожении.

296
Г л а в а XI
Реакции с прямым образованием ацетил-КоА и ацетилфосфата (класти-
ческая реакция). Высокая плотность электронов при углеродном атоме,
связанном с тиазоловым кольцом в оксиалкилпроизводных ТПФ
(структуры [Б] и [В] в уравнении XI.14), делает эти промежуточные продукты
чрезвычайно реакционноспособными не только в реакциях замещения, но также
и в реакциях окисления (уравнение XI.27)
E-+N
ОН
[Акцептор]
E-+N
+ [Акцептор]
r_X-hI
(XI.27)
R—X—С—СН3 + Е-ТЛФ
О
Большинство бактериальных клеток использует KoASH (в
уравнении XI.27 R — X — H означает KoASH) в качестве акцептора ацетильной
группы. Продуктом таких реакций является ацетил-КоА, который может
быть превращен сначала в ацетилфосфат посредством так называемой фосфо-
рокластической реакции, а затем в уксусную кислоту -f- АТФ
[реакции (XI.19) -|- (XI.20)]. Кроме того, он может, будучи сам метаболически
«активной» формой уксусной кислоты, участвовать и в ряде других реакций.
Именно этот путь использует большое число микроорганизмов, растущих
в анаэробных условиях. Вторым продуктом ([акцептор]2" в уравнении XI.27)
является либо Н2 (из Н+), либо муравьиная кислота (из СО2).
Каждая молекула пирувата, превращающаяся посредством кластиче-
ской реакции в муравьиную кислоту или СО2 -f H2, способна генерировать
одну дополнительную молекулу АТФ. Таким образом, мы можем подвести
следующий баланс типичным видам брожения:
Г ЗЛДФ + ЗФН
коза+| 2АДФ + 2ФН
Лактат + Формиат + Ацетат + 3 АТФ
Лактат+ Формиат+(Ацетил)+ 2 АТФ
(XI.28а)
(XI.286)
Глюкова + < 2 АДФ + < 2 Фн -> 2,3-бутандиол + СО2+
2 АТФ
Пируватдегидрогеназные системы, связанные с НАД и липоевой
кислотой. Основной путь превращения пирувата в большинстве животных клеток
и у аэробных микроорганизмов — это его окисление до ацетил-КоА,
катализируемое мультиферментными пируватдегидрогеназными комплексами
(ПДК), которые связаны с определенными клеточными элементами —
с митохондриями животных и растительных клеток и с клеточными
мембранами бактерий (см. гл. IX). Пируватдегидрогеназные комплексы были
выделены в чистом виде и охарактеризованы как многокомпонентные агрегаты
определенного состава с молекулярным весом 10-Ю6 (ПДК из сердца свиньи)
или 4,8-106 (ПДК из клеток Е. coli). Последний комплекс, был разделен на
субъединицы, обладающие характерным набором ферментативных
активностей (уравнение XI.30): 1) 16 молекул пируватдекарбоксилазы (Еа) (мол.
вес = 183 000; содержит стехиометрические количества связанного с
ферментом ТПФ); 2) один агрегат редуктазо-трансацетилазы липоевой кислоты
(Еь) (мол. вес = 1,6-10е; состоит из 64 субъединиц, каждая с молекулярным
весом 25 000; содержит стехиометрические количества остатков липоевой
кислоты (см. гл. VIII), связанных амидной связью с е-аминогруппами остат-

Обмен углеводов
297
ков лизина в белке); 3) восемь молекул дегидрогеназы дигидролипоевой
кислоты (Ес) (мол. вес = 112 000; содержит стехиометрические количества
ФАД, связанного с ферментом, а именно 2 молекулы ФАД на 1 молекулу
фермента). На электронных микрофотографиях комплекс имеет форму моно-
гранника диаметром 350 ± 50 A и высотой 225 ± 25 A (см. гл. IV).
Пируватдегидрогеназные комплексы катализируют следующие реакции
(обратите внимание на то, что реакция XI.30а сходна с реакцией XI.14а
и катализируется очищенной декарбоксилазой):
Mg 2+
"Z^ Еа-ТПФ —СНОН —СН3 + СО2
(XL30a)
ОН
Н
Eb-NHCO(CH2M—
КНСО(СН2M
S —S
Tf KoASII -^ Eb-NHCO(CH2M—i^N + CHsCOSKoA
CH3COS SH
Eh-NH-CO(CH2M-
SH SH
CH3COS SH
(XI.306-1)
(XI.306-2)
3H SH
Eb-NH-CO(CH2M-
/\ + Ес.Восст. ФЛД
S-S
(ХІ.ЗОв-1)
Ес-Восст. ФАД + НАД+
ЕС-ФЛД + НАД-ГІ + Н+
(ХІ.ЗОв-2)
Суммарная реакция: CH3COCOa
ТПФ,
-Mg2+
= —9,38 ккалімоль
(XI.31)
Или в присутствии О2:
Как указано выше+Перенос электронов
AG°'= —61,8 ккалімоль
(XI.32)
СН3СОСОа +1/2 О2H- KoASH + З АДФ+ 3 Фн
Как указано выше+Окислительное
фосфорилирование
ДС°'= —39,3 ккалімоль
(XI.33)
Основной путь использования ацетил-КоА, образовавшегося при
окислении пирувата, состоит в его полном окислении до СО2- Этот процесс также
происходит в митохондриях и, как мы увидим в гл. XIV и XV, приводит
к образованию 12 молекул АТФ на молекулу CH3GOSKoA или 24
на молекулу глюкозы. Если учесть, что четыре молекулы восстановленного
НАД, образовавшиеся в процессе катаболизма глюкозы (две — в реакции
XI.8 и две — в реакции XI.31), окисляются и что это сопровождается фос-
форилированием (см. реакцию (ХІ.Ібг), осуществляющую челночный перенос
электронов от экстрамитохондриального восстановленного НАД в
митохондрии), то мы получим еще максимум 12 молекул АТФ на молекулу глю-

298 Г л а в а XI
козы. Таким образом, полное превращение глюкозы описывается следующим
уравнением:
<38АТФ. (XI.34)
РЕАКЦИИ КАРБОКСИЛИРОВАНИЯ
Для непрерывного окисления ацетил-КоА в цикле лимонной кислоты
(ЦЛК) необходимо постоянное присутствие оксалоацетата. Это обычно
обеспечивается циклической природой самого процесса; однако из сказанного
следует также, что если компоненты цикла — все или только некоторые
из них — расходуются на синтетические процессы (биосинтез аминокислот,
пуринов, пиримидинов, пентозных предшественников нуклеиновых кислот
и коферментов, порфиринов и т. д.), то должны существовать какие-то
способы для возмещения расхода. У животных эти анаплеротические цепи
реакций обеспечиваются реакциями карбоксилирования, посредством
которых происходят взаимопревращения пирувата и дикарбоновых кислот цикла.
Еще один процесс, в котором используется предварительное карбоксилиро-
вание,— это превращение пировиноградной кислоты в пропионовую кислоту
при брожении у пропионовокислых бактерий. Этот процесс служит как бы
обходным путем для того, чтобы преодолеть препятствие в виде пируватки-
назной реакции на пути синтеза углеводов. В конечном итоге оксалоацетат
легко декарбоксилируется ферментативным и неферментативным путем.
В превращевии С3 -j- Cj = С4 участвуют главным образом следующие
реакции:
CH3COGO54-BOCCT. НАД(Ф) + НСОа — Ц^ -О2ССН2СНСОі-
ОН (L-малат)
AG°' = 0,36 ккал/молъ (XI.35)
Mg2+, Ацетил-КоА
+ АТФ + СО2(НСО^) ** Е• биотинил• N — СО^ + АДФ + ФН
(ХІ.Зба)
Е• биотинил-N—СОіЧ-СНзСОСОі" ^ Биотинил-Е + -О2ССН2СОСО8- (XI.366)
Mga+, Ацетил-КоА
AG0' ~ —0,5 ккал/молъ (XI.36)
Mg2+
СН2 = С—
О
РО23-
AG0' --= — 1 ккал/молъ (XI.37)
Mg2+
СН2 = С —СОа- + Фа + НСОз+Н+ ~^ -О2ССН2СОСО^Ч-ФФН + Н2О
РО2-
°'~ —2 ккал/молъ (XI.38)
С
О
ССО
ОРО2-
^+ Фн
AG0' =— 6,8 ккал/молъ (XI.39)
Реакция (XI.35) катализируется ферментом [малик-фермент, или малатде-
гидрогеназа (декарбоксилирующая)], который обычно специфичен в отноше-

Обмен углеводов 299
ний НАДФ, особенно у высших организмов. Ввиду очень низкого сродства
этого фермента к HCOg и относительно малой доступности восстановленного
НАДФ в митохондриях полагают, что основной его функцией является
окисление малата с превращением в пируват, ацетил-КоА и другие близкие
к ним метаболиты, а также обеспечение запаса восстановленного НАДФ.
Реакция (XI.36) катализируется А ТФ-зависимой пирувапгкарбоксилазой —
ферментом, локализованным в митохондриях. Этот фермент проявляет
большое сродство к НСО~; карбоксилирование биотина, связанного с ферментом,
аллостерически активируется под действием ацетил-КоА, вследствие чего
равновесие реакции сдвинуто в сторону образования оксалоацетата. В силу
этого пируваткарбоксилаза представляется весьма вероятным кандидатом
на роль важнейшего катализатора в синтезе дикарбоновых кислот (и
углеводов). Фермент наиболее активен в условиях, когда организм нуждается
в максимальной окислительной активности и в производстве энергии.
Фермент, катализирующий реакцию (XI.37),— карбоксикиназа фосфоенол-
пирувата — взаимодействует преимущественно с системами ГДФ/ГТФ или
ИДФ/ИТФ. Именно ГТФ или ИТФ образуются в процессе окислительного
фосфорилирования на субстратном уровне во время действия цикла
лимонной кислоты при окислении ос-кетоглутарата (см. гл. XIV).
Взаимопревращения различных нуклеозидтрифосфатов происходят посредством реакции,
катализируемой нуклеозиддифосфаткиназой (трансфосфорилазой):
ГДФ (или ИДФ) + АТФ = ГТФ (или ИТФ) + АДФ.
В реакции (XI.37), в реакции (XI.38), катализируемой карбокситрансфосфо-
рилазой, и в практически необратимой реакции (XI.39), катализируемой
карбоксилазой фосфоенолпирувата (присутствующей в зеленых растениях
и у Enterobactericeae), может участвовать нестабильный промежуточный
продукт — фосфооксалоацетат
-О2С~СЫ2 —СО —С —ОРО|+
&
Этот промежуточный продукт может затем либо гидролизоваться в реакции
(XI.39), либо передать свой фосфат ГДФ в реакции (XI.37) или
неорганическому фосфату (с образованием неорганического пирофосфата) в реакции
(XI.38). Реакция (XI.39) в тех клетках, где она происходит, играет,
возможно, важную роль в фиксации СОг! в то же время реакция (XI.37) выполняет,
по-видимому, противоположную функцию: реакции (XI.36) и (XI.37),
катализируемые митохондриальными ферментами и действующие согласованно,
при протекании справа налево обеспечивают образование
фосфоенолпирувата, необходимого для синтеза углеводов:
со2
Пируват+АТФ + ГТФ = Фосфоенолпируват + Г ДФ + АДФ. (XI .40)
2 АТФ 2 АДФ
СИНТЕЗ ГЛЮКОЗЫ ИЗ ПИРУВАТА [ГЛЮКО(НЕО)ГЕНЕЗ]
При наличии метаболической энергии в печени и почках млекопитающих
из предшественников с короткими углеродными цепями может
синтезироваться глюкоза, а следовательно, пентозы, гликоген и другие
полисахариды. Предшественниками могут быть: 1) пируват или лактат; 2) так
называемые гликогенные аминокислоты (см. гл. XVII); 3) любой другой компонент,
который в процессе катаболизма может быть превращен в пируват или один
из метаболитов цикла лимонной кислоты. В покоящейся скелетной мышце
(но не в сердечной и не в гладкой мышце) фосфорилированные трехуглерод-
ные соединения, в особенности ос-глицерофосфат, снова превращаются в гли-

ЖЮ Глава XI
коген за счет креатинфосфата (запасной формы метаболической энергии
в этой ткани). Этот ресинтез глюкозы из других источников удовлетворяет
Потребности в энергии и имеет существенное значение для
жизнедеятельности некоторых типов клеток, особенно клеток крови и: нервной ткани
у животных. Аналогичным образом обстоит дело у микроорганизмов;
из углеродных источников, содержащих четыре и три углеродных атома, у них
синтезируются гексозы, пентозы и структурные полисахариды. Итак, вопрос
сводится по существу к тому, каким образом осуществляется биосинтез;
глюкозы или гексозофосфата из пирувата. Суммарная реакция имеет сле-
дуюпщй вид:
2СН3СОСОіЧ~ 2 НАД • H + 6 АТФ + 4 Н+== С6Н12О6 + 2 НАД+4-6 АДФ + 6 Фн,
AG0' = —7 ккал/моль. (XI.41)
Уравнение (XI.42) описывает последовательность отдельных ее этапов:
н2о
Малат Ц^ Фумарат
АТФ II/ ГТФ или АТФ
2- (Пируват > Окоалоацетат >
Восст. НАД
—> ФЕП —> Фоофоглидерат > Триозофоофат) »
н2о нао
—> Гсксозодифоофат > Гекеозофоофат > Гексоза. (XI.42}
И здесь регуляторные и не имеющие обходных путей реакции находятся
в начале и в конце цепи. Это и есть основной путь биосинтеза гексозы.
Подтверждается это тем, что если ввести голодавшему животному пируват,
меченный по второму или по третьему атому углерода, то гликоген,
образовавшийся после того, как синтез в течение некоторого времени продолжался,
будет содержать остатки гексозы, равномерно меченные по положениям 1,
2, 5 и 6. Такое распределение метки указывает на существование
симметричного предшественника, который мог бы образоваться при указанном выше
взаимопревращении дикарбоновых кислот (ниже, в гл. XIV, мы еще к нему
вернемся). Как уже упоминалось, у Е. coli начальный этап иной; пируват
превращается в этом случае в енолфосфатное производное без какого бы то
ни было участия дикарбоновых кислот.
РЕГУЛЯТОРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ОБМЕНА ГЛЮКОЗЫ
Быть может, уместно именно здесь рассмотреть те факторы, которые
(в животных клетках) играют главную роль в регулировании распада
и ресинтеза глюкозы (и гликогена), иными словами, факторы, регулирующие
обмен этих соединений. В общем можно считать, что во всех клетках,
способных расщеплять глюкозу как в присутствии, так и в отсутствие
кислорода, этот углевод исчезает (а лактат или же любой другой продукт
анаэробного гликолиза или брожения накапливается) в анаэробных условиях быстрее,
чем в аэробных. Это торможение гликолиза кислородом, впервые
подмеченное Пастером, а впоследствии подтвержденное Мейергофом и Варбургом,
известно под названием эффекта Пастера. Другое явление было открыто
А. Хиллом в экспериментах с мышцей. Хилл обнаружил, что ресинтез
гликогена и вообще углеводов протекает быстрее в аэробных условиях. Позднее
это было доказано и для других тканей и клеток.
Из сказанного выше мы знаем, что в аэробных условиях значительно
эффективнее, чем в анаэробных, происходят удаление Фн и АДФ, генерация
АТФ, удаление восстановленного НАД, а также образование СО2, ди- и три-

Обмен углеводов
301
карбоновых кислот и ацетил-КоА (более подробно об этом будет рассказано
в гл. XIV). Рассмотрение суммарных уравнений [реакции (XI.22а), (XI.226)
и (XI.41)] и соответствующих цепей реакций позволяет понять, каким
образом этот комплекс условий влияет на весь ход превращения: глюкоза (или
гликоген) -»- пируват -> глюкоза (или гликоген).
Уменьшение количества Фн и АДФ и соответствующее увеличение
количества АТФ ведут к подавлению гликолиза и ускорению глюконеогенеза.
Что касается судьбы восстановленного НАД, то в аэробных клетках
он окисляется с помощью цепи переносчиков электронов, локализованной
в митохондриях (см. гл. XV); в клетках, по преимуществу анаэробных,
окисление происходит в результате ряда связанных между собой реакций,
из которых наибольшее значение в обмене веществ у животных имеет
реакция
Пируват+ Восст. НАД —> Лактат + НАД.
Помимо этих стехиометрических и кинетических регуляторных механизмов
мы обсудили также и некоторые другие, специфичные регуляторные
механизмы. Они перечислены в табл. 35.
Таблица 35
Некоторые регуляторные механизмы
Процесс
Распад
Сиптоз
Ферментативная реакция
Гликоген —> Глюкозо-1-фосфат
Фруктозо-6-фосфат—> фруктозо-1,6-
дифосфат (ФДФ)
ФЕП—> Пируват
Пируват —> Оксалоацетат —> ФЕП
Фруктозо-1,6-дифосфат —> Фрукто-
зо-6-фосфат
Глюкозо-6-фосфат —> Глюкоза
Глюкозо-1-фосфат —> УДФГ —> Гли-
когеи
Активаторы
АМФ
АДФ, АМФ, ФДФ
Ацотил-КоЛ, СО2
Глюкозо 6-фосфат
Ингибиторы
АТФ,
АТФ
АМФ,
ФФН,
цитрат
ФДФ
Глюкоза
Следует упомянуть здесь также и о том, что глюконеогенез в печени
подчиняется определенному гормональному контролю и что наиболее резко
выраженное повышение содержания было отмечено для таких ферментов,
как фруктозо-1,6-дифосфатаза, глюкозо-6-фосфатаза и пируваткарбоксилаза.
БИОСИНТЕЗ УГЛЕВОДОВ ИЗ ДВУУГЛЕРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
У высших растений и микроорганизмов происходит иногда превращение
жиров или двууглеродных метаболитов (а следовательно, и ацетил-КоА)
в углеводы и другие клеточные компоненты. Этот процесс протекает,
например, у растений во время прорастания семян, содержащих большое
количество липидов (которые играют роль запасных веществ), или в клетках
микроорганизмов, выращиваемых на среде, в которой единственным источником
углерода служит этанол или ацетат. Превращение осуществляется с помощью
координированного ряда реакций, представленного на фиг. 89 и называемого
глиоксилатным циклом. В животных клетках отсутствуют два ключевых
фермента этого цикла — изоцитратаза, или лиаза изолимонной кислоты
(реакция XI.43; см. фиг. 89), и малат-синтаза (реакция XI.44), а потому
.в них этот цикл осуществляться не может.

302
Глава XI
Помимо этих двух новых реакций для осуществления цикла необходимо
еще и одновременное участие трех ферментов цикла лимонной кислоты
(см. гл. XIV): цитрат-конденсирующего фермента, аконитазы и малат-
дегидрогеназы. Необходимо также наличие цепи переносчиков электронов
для окисления восстановленного НАД молекулярным кислородом — этот
процесс вместе с реакцией, катализируемой малат-синтазой, служит
«движущей силой» цикла. В результате одного оборота цикла окисляются две
молекулы ацетил-КоА и образуется одна молекула сукцината. Одновременно
происходит удаление двух восстановительных эквивалентов.
Образовавшийся таким путем сукцинат может быть затем превращен в углевод в цепи
реакций, показанных в правой части фиг. 89. Эта цепь включает две
дополнительные реакции, катализируемые ферментами цикла лимонной кислоты —
сукцинатдегидрогеназой и фумаразой; кроме того, в ней также принимает
участие малатдегидрогеназа. Другие клеточные компоненты, метаболически
связанные с промежуточными продуктами ЦЛК, могут образоваться
в результате второй реакции конденсации ацетил-КоА с оксалоацетатом
ЦЛК
снгсо;
СНгСОг
Сущинат
-Е-ФАА
сукцитт-
Кйезиарогеназа
Е-Восст.ФАЛ
НССОг
ОгС СН
Фумарат
Восст.НАД
і—НАД
Ь—Восст.НАД
Оксолоацетат
І^-ГТФ
Ь~ГЛФ, Ф„,С02
Фосфоенолпируоат
Гексоза
Фиг. 89. Глиоксилатный цикл.

Обмен углеводов 303
и последующих реакций. Таким образом, глиоксилатный цикл (или цикл
Кребса — Корнберга) представляет собой пример анаплеротической цепи
реакций. Из всех различных ферментов, участвующих в цикле, по-видимому,
только изоцитратаза, действующая в точке разветвления двух метаболических
путей, чувствительна к аллостерическому контролю: у Е. coli этот фермент
ингибируется фосфоенолпируватом.
ГЕКСОЗОМОНОФОСФАТНЫЙ (ПЕНТОЗНЫЙ) ПУТЬ
Вторую группу путей катаболизма гексоз исследовали главным образом
Варбург, Дикенс, Липман, С. Коэн, Хореккер, Рэккер и их сотрудники.
Эти цепи реакций получили несколько различных наименований. Так,
например, поскольку один из путей ответвляется от гликолиза на уровне
глюкозо-6-фосфата, он получил название гексозомонофосфатпый шунт.
На этом же самом пути два из трех первых этапов представляют собой реакции
дегидрирования, а пентозы играют роль катализаторов, и это дало повод
назвать данную последовательность реакций окислительным путем обмена
гексоз и пентозным циклом. Поскольку фосфоглюконовая кислота является
ключевым промежуточным продуктом этого пути, некоторые авторы
называют его также фосфоглюконатным путем. Следует, однако, помнить, что
разные ферменты одного и того же комплекса, действующие как сами по себе,
так и вместе с ферментами других комплексов, могут использоваться одной
и той же клеткой или различными клетками для выполнения множества
разнообразных функций. Это, по-видимому, особенно верно для данного
случая, и потому в настоящем разделе мы познакомимся с несколькими
метаболическими путями, на которых можно проиллюстрировать это
положение. Другим очень важным примером является фиксация СО2 в цикле
фотосинтеза (см. гл. XII). Ферменты, принимающие участие в этом процессе,
локализованы обычно в цитоплазме.
ДЕГИДРОГЕНАЗЫ (РЕАКЦИИ ХІ.45 И XI.47)
Первая окислительная стадия — реакция (XI.45) — катализируется глю-
козо-6-фосфат-дегидрогеназой. Этот фермент имеет очень болЫпое значение
и распространен весьма широко. Для большинства ферментов такого типа
специфичным коферментом служит НАДФ. Реакция в том виде, как она
изображена на фиг. 90, т. е. с б -лактоном в роли продукта или субстрата,
легко обратима, так как величина AG0' равна для нее —100 кал/моль.
Поскольку фермент из дрожжей действует также и на свободную глюкозу,
оказалось возможным установить, что его стереоспецифичность направлена
на ?-D-глюкопиранозную конфигурацию.
Гидролиз лактона до 6-фосфорного эфира глюконата (реакция XI.46)
происходит с выделением значительного количества свободной энергии
(AG0' = — 5000 кал/моль) и с большой скоростью (h/2 составляет величину
порядка нескольких минут в физиологических пределах pH). Тем не менее
специфические ферменты (лактоназы) были идентифицированы в растениях
и у многих видов бактерий. Для второй окислительной стадии (реакция
XI.47), катализируемой 6-фосфоглюконат-дегидрогеназой, необходимо
присутствие кофактора — катиона двухвалентного металла (Mg2+ или Мп2+).
Эта реакция представляет собой обратимую реакцию окислительного декар-
боксилирования, аналогичную реакциям, катализируемым НАДФ-зави-
симой малатдегидрогеназой (см. стр. 298) и изоцитратдегидрогеиазой.
В качестве промежуточного продукта в реакции участвует, вероятно, 3-пето-
гексоновая кислота.

CHiOPOj"
ЕАА(Ф) Восст.ИАД(Ф)
снгороГ
(ХІ.4Б)
D-глюкозо-б-фосфат
(ХІ.45)
Ъглшот-Ь-лактан-Ь-фосфат
І
но-сн
нс-он
І
нс-он
І
сн2орог
З-фОСфо-В-глюконат
\^ НААФ
(ХІ.47) Г MgZ*
р- Восст.ИДАФ
со2
+
СН2ОН
$> CH2OPOZ2'
D-глицеральаегиїі-
c=o
I
нс-он
І
нс-он
D-pu6yjiO3D-5-0Octpam
у А
.HS" VA'
не—он
не—он
I
CHjOPOf
В-фруктозо-6-фосфат,
H—С—ОН
CH2OPOf"
В-ксилулоэо-Вфосфат
нс=о
I
нс-он
I
НС—ОН
I
нс-он
CH2OPOf
В-рибозо-5-фосфат
(ХІ.51)
сно
не—он
СН2ОРОз"
В-глицеральдегид-3-фОсфат
+
СН2ОРОГ
В-сеЬогептцлозо-7-фосфат
чі)иг. 90. Ферменты, участвующие в превращениях гексозофосфатов и пептозофосфатов.
Реакция (XI.45) — глюкозо-6-фосфат-дегидрогеиаза. Реакция (XI.46) — глюкополактопаза. Реакция
(ХІ.47) — фосфоглюкоыатдегидрогепааа. Реакция (XI.48) — рибулоаофосфат— 3-эпимерааа. Реакция
.{XI.49) — рибозофосфатизомераза (фосфорибозоизомераза). Реакция (XI.50а и б) — транскетолаза.
Реакция (XI.51) — траисальдолаза.

Обмен углеводов 305
ИЗОМЕРИЗАЦИЯ ПЕЫТОЗОФОСФАТОВ (РЕАКЦИИ XI.48 И XI.49)
Две реакции изомеризации пентозо-5-фосфатов составляют
неотъемлемую часть всех цепей реакций, в которых используется эта метаболическая
схема. В одной из них (реакция XI.49) происходит простое
взаимопревращение фосфокетопентозы и ее альдозофосфатной формы. Эта реакция,
следовательно, полностью аналогична реакции (XI.4) гексозного ряда (глю-
козо-6-фосфат +± Фруктозо-6-фосфат); показано, что и механизмы их
идентичны. В другой реакции (XI.48) происходит эпимеризация по третьему
положению; следовательно, промежуточным продуктом здесь может быть
ендиол.
ПЕРЕСТРОЙКА УГЛЕРОДНОГО СКЕЛЕТА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ТРАНСКЕТОЛАЗЫ
И ТРАНСАЛЬДОЛАЗЫ (РЕАКЦИИ XI.50а, XI.506 И XI.51)
Транскетолазная реакция (реакции XI.50а и XI.506). Фермент,
катализирующий эту реакцию, нуждается в кофакторах — тиаминпирофосфате
и катионах двухвалентных металлов. Реакцию можно рассматривать как
обратимый перенос гликоальдегидного остатка от донора кетозы на акцептор
альдозу. Специфичность фермента требует, чтобы кетоза имела L-конфигу-
рациго при сс-углеродном атоме; для следующих двух углеродных атомов
предпочтительна торакс-конфигурация:
снаои
с = о
I
но—сн
ПС—ОН
I
R
На схеме фиг. 90 транскетолаза фигурирует дважды: в первый раз в
реакции (XI. 50а), при образовании глицеральдегидфосфата и седогептулозо-
фосфата из двух молекул пентоз, а затем снова — в реакции (XI.506), при
образовании фруктозофосфата и триозофосфата в результате взаимодействия
второй молекулы ксилулозофосфата с тетрозофосфатом.
Траисальдолазная реакция (реакция XI.51). Трансальдолаза —
второй фермент, характерный для неокислительного этапа этого
метаболического пути. Она катализирует перенос остатка диоксиацетона (но не
свободного диоксиацетона) от донора кетозы, в типичном случае представленной
о-седогептулозо-7-фосфатом или D-фруктозо-б-фосфатом, на акцептор
альдозу, например на D-глицеральдегид-З-фосфат или Б-эритрозо-4-фосфат.
Исходя из специфичности фермента, из природы катализируемой реакции
и, наконец, из очевидного отсутствия потребности в каком бы то ни было
кофакторе, можно думать, что механизм действия трансальдолазы сходен
с механизмом действия альдолазы в реакции (XI.6). Действительно,
активным промежуточным продуктом, связанным с ферментом, и в этом случае
является шиффово основание кетозы, соединенное с е-аминогруппой лизи-
нового остатка фермента.
ПЕНТОЗНЫЙ ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ ЦИКЛ
Было выдвинуто предположение, что описанные выше реакции вместе
с некоторыми реакциями гликолитического ряда могут приводить к
окислению глюкозы либо до триозофосфата, либо до СО2. Ниже показана последо-
20—246

306 Глава XI
вательность этапов такого превращения.
З Глюкозо-6-фосфат+ ЗНАДФ+ —> 3 6-фосфоглюконат+З НАДФ-Н+ЗН+ (XI.45)
3 6-фосфоглюконат + З НАДФ+ —> 3 Рибулозо-5-фосфат + З НАДФ-Н+3 СО2 + 3 Н+
(XI.47)
2 Рибулозо-5-фосфат —-» 2 Ксилулозо-5-фосфат (XI.48)
Рибулозо-5-фосфат —-> Рибозо-5-фосфат (XI.49)
Ксилулозо-5-фосфат + Рибозо-5-фосфат —-> Седогептулозо-7-фосфат + Триозофосфат
(XI. 50а)
Седогептулозо-7-фосфат + Триозофосфат ¦—> Эритрозо-4-фосфат+ Фруктозо-6-фосфат
(XI.51)
Эритрозо-4-фосфат+ Ксилулозо-5-фосфат —> Фруктозо-6-фосфат + Триозо-3-фосфат
(XI.506)'
Фруктозо-6-фосфат —-» Глюкозо-б-фосфат (XI.4)
Суммарная реакция: 3 Глюкозо-6-фосфат+ 6 НАДФ+ ¦—>
—> 2 Глюкозо-6-фосфат + Триозофосфат+ 3 СО2 + 6 НАДФ-Н + 6 Н+ (XI.52а)
Если эта цепь реакций повторяется дважды плюс следующие
превращения:
н2о
2 Триозофосфат ¦—> Фруктозо-1,6-дифосфат ¦>
—-> Фн-Ь Фруктозо-6-фосфат —-> Глюкозо-6-фосфат,
то суммарная реакция имеет вид:
6 Глюкозо-6-фосфат +12 НАДФ+ —>
-^ 5Глюкозо-6-фосфат+6СО2 + 12НАДФ-Н + 12Н++Фн (ХІ.526)
или
6 Глюкозо-6-фосфат + 6 О2 —> 5 Глюкозо-6-фосфат+ 6 СО2 + 6ЫаО + Фн. (XI.53)
Поскольку клетка способна окислять (с помощью О2) образовавшийся
восстановленный НАДФ и таким образом регенерировать окисленную
форму НАДФ, теоретически схема обеспечивает полное окисление одной
молекулы глюкозофосфате до 6СО2 + 6Н2О в реакции (XI.53). Это влечет
за собой каталитическое участие пяти дополнительных молекул глюкозо-
фосфата со всеми указанными промежуточными продуктами и реакциями.
Суммарное уравнение не дает никакого ключа к разгадке механизма
реакции. Существенное значение имеет тот факт, что все три образовавшиеся
молекулы СО2 (реакция XI.52а) или все шесть (реакция XI.53) ведут свое
происхождение от С-1 глюкозы.
НЕОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ВЗАИМНЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ГЕКСОЗО- И
ПЕНТОЗОФОСФАТОВ
Описанный окислительный путь не является единственным путем,
который ведет от гексозофосфатов к пентозофосфатам при участии данного
набора ферментов. Рассмотрим следующую схему теперь уже знакомых нам
реакций:
2 Рибулозо-5-фосфат ^ 2 Рибозо-5-фосфат
4 Рибулозо-5-фосфат 3ZU 4 Ксилулозо-5-фосфат
2 Ксилулозо-5-фосфат+ 2 Рибозо-5-фосфат ^^
^ 2 Седогептулозо-7-фосфат+ 2 Триозо-3-фосфат

Обмен углеводов
307
2 Седогептулозо-7-фосфат-|-,2Триозо-3-ф.осфат ^
2 Фруктозо-6-фосфат~)-2 Эритрозо-4-фосфат
2 Эритрозо-4-фосфат-|-2 Ксилулозо-5-фосфат 2 Фруктозо-6-фосфат + 2 Триозофосфат
2 Триозофосфат Ц^ Фруктозо-1,6-дифосфат
Фруктозо-1,6-дифосфат + Н2О —> Фруктозо-6-фосфат + Фн
или
Фруктозо-1,6-дифосфат -|- А ДФ
5 Фруктозо-6-фосфат ~
^ Фруктозо-6-фосфат + АТФ
5 Глюкозо-6-фосфат
Суммарные реакции: 6 Пентозо-б-фос
6 Пентозо-5-фосфат + АДФ
5 Глюкозо-6-фосфат + ФЯ (XI.54а)
5 Глюкозо-6-фосфат+ АТФ (XI.A6)
Ясно, что перед нами механизм взаимопревращений и перестановок
углеродных атомов гексоз и пентоз. Было показано, что этот неокислительный
путь образования рибозы из гексозы, а также сопутствующая ему
перестройка углеродного остова гексозы встречаются в целом ряде клеток.
ВЗАИМОПРЕВРАЩЕНИЯ ГЕКСОЗ
Простейшей реакцией взаимопревращения или изомеризации гексоз
является реакция, приводящая к обратимому равновесию между a-D-
и ?-D-формами обычных гексоз, например глюкозы (см. гл. X). Этот
процесс апомеризации протекает при физиологических значениях pH с очень
большой скоростью. Тем не менее существуют специфичные ферменты (мута-
ротазы, альдозоэпимеразы), еще более его ускоряющие. Эти ферменты были
выделены из почек млекопитающих и из некоторых плесеней; показано,
что они катализируют мутаротацию D-глюкозы, D-галактозы, D-ксилозы,
L-арабинозы, мальтозы и лактозы.
Помимо D-глюкозы, следует рассмотреть и некоторые другие обычные
гексозы, а именно две альдозы — D-маннозу и D-галактозу — и две кето-
зы — D-фруктозу и L-сорбозу. Они отличаются друг от друга только
конфигурацией одного из шести атомов углерода, как показано ниже (черным
кружком обозначен атом углерода, при котором происходит эпимеризация).
НС=О
' СН2ОН
D-галактоза
НС=О
СН2ОН
D-глюкоза
НС=О
СН2ОН
В-матоза
СН2ОН
=о
СН2ОН
D-фруктоза
CHjOH
СН2ОН
L-сорбоза,
Фруктоза и манноза фосфорилируются неспецифичной гексокиназой
с образованием соответствующих 6-фосфатов. Механизм взаимопревращения
маннозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата уже обсуждался выше.
D-галактоза фосфорилируется в присутствии галактокиназы в положении 1 с
образованием галактозо-1-фосфата.
20*

308 Г л а в а XI
ОБРАЗОВАНИЕ ГЛЮКОЗАМИНА
Различные гексозамины, входящие в состав многих мукополисахаридов
и глюкопротеидов, а также полисахаридов оболочки бактериальных клеток,
в процессе метаболизма берут свое начало от D-фруктозо-б-фосфата. Это
соединение превращается в a-D-гліокозамин при взаимодействии с амидной
NHo-группой глутамина, играющей роль источника азота:
D-фруктозо-б-фосфат -|- Глутамин —> В-глюкозамин-б-фосфат+Глутамат. (XI.55)
Удаление NH3, приводящее к регенерации кетозофосфата, катализируется
другими специфичными дезаминазами. Большая часть природных продуктов
содержит N-ацетилглюкозамин. Это соединение образуется в реакции,
катализируемой специфичной N-ацетилазой, с ацетил-КоА в качестве донора
ацетильной группы:
D-глюкозамин-б-фосфат + Ацетил-Ко А —>
—=* КІ-ацетил-В-гліокозаміщ-б-фосфат + КоАЗН. (XI.56)
Ниже изображена структура ІЧ-ацетил-О-глюкозамин-б-фосфата:
СН2ОРО|"
ОБРАЗОВАНИЕ И ВЗАИМОПРЕВРАЩЕНИЕ НУКЛЕОЗИДДИФОСФАТСАХАРОВ
Важной вехой в развитии биохимии углеводов явилось открытие
аргентинского ученого Лелуара и его сотрудников, которые обнаружили, что
во многих реакциях взаимопревращения углеводов, а также в процессах
их синтеза принимают обязательное участие в качестве промежуточных
продуктов С-1(гликозильные)-эфиры альдоз и нуклеозидди-(а иногда моно-)
фосфатов. Эти промежуточные соединения занимают место сахарофосфатов,
столь хорошо изученных на одном из более ранних этапов биохимии
углеводов. Нуклеозиддифосфатсахара образуются с помощью
специфических пирофосфорилаз. Уравнение (XI.57), где H означает нуклеозйд,
описывает эту реакцию в общем виде:
о н дс,=г е-о н
О—РОГ "" ¦*—' О—Р— О—Р—О-НукшэиЬ+ФФИ
о- о- Нг°
Пирифоаратаза
(XI.57)
2Ф„
Сахар-ос-1-фосфат Щ.Ф-Сахар (замещенный а-фосфат)
Классическим примером такой реакции является синтез уридиндифос-
фатглюкозы (УДФ-глюкоза, УДФГ) (уравнение 57а). В настоящее время
известно, что ряд Сахаров и их производных вместе с УТФ, АТФ (только
для глюкозо-1-фосфата), ГТФ, ЦТФ и дТТФ способны вступать в
реакцию (XI.57). Продукт этой реакции — нуклеозиддифосфатсахара — может
претерпевать описанные ниже превращения.

Обмен углеводов
309
Эпимеризация галактозо-1-фосфата и глюкозо-1-фосфата. Эта цепь
реакций состоит из следующих этапов:
Галактозо-1-фосфат + УТФ ^^ УДФ-галактоза + ФФп
УДФ-галактозо — пирофосфорилаза (галактозо-1-фосфа,т—-уридилилпіранефераза) XT.576)
УДФ-галактоза ^^ УДФ-глюкоза
УДФ-глюкозо — эпимераза (X ' .58)
УДФ-глюкоза+ Галактозо-1-фосфат ^ УДФ-галактоза+Глюкозо-1-фосфат
Гексозо-1-фосфат — уриоилилтрапсфераза (XI.59)
Глюкозо-1-фосфат + УТФ ^ УДФ-глюкоза+ ФФН
УДФ-глюкозо — пирофосфорилаза (глюкозо-1-фосфат-— уридилилтрансфераза) (XI.57а)
После того как производное УДФ и сахара образовалось в реакциях (XI.576)
или (XI.57а), реакции (XI.58) и (XI.59), действующие согласованно,
осуществляют эпимеризацию. Реакция эпимеризации в собственном смысле
(реакция XI.58) происходит на уровне НДФ; в качестве обязательного кофактора
в ней участвует связанный с ферментом НАД+ (одна молекула НАД+ на
молекулу фермента).
У микроорганизмов и человека встречаются случаи наследственпой
недостаточности некоторых ферментов этой группы; например, галактоземия
у грудных детей вызывается отсутствием фермента, катализирующего
реакцию (XI.59), что обусловливает неспособность метаболизировать галактозу,
образующуюся из лактозы (?-D-галактозид) молока.
Окисление НДФ-альдоз в НДФ-уроновые кислоты. Окисление нуклео-
тидсахаров с участием четырех восстановительных эквивалентов приводит
к образованию уроновых кислот:
СН2ОН
О.
СО2Н
'-ФФУ 4- 2НАА+ + Н2О—> НО
.ОН
О-ФФУ+2НАА • Н+2Н+
ОН
(XI. 60)
Типичная реакция катализируется УДФ-О-глюкозо-дегидрогеназой с
образованием УДФ-Б-глюкуроновой кислоты. Реакция необратима и требует
участия двух молекул НАД+; не имеется никаких данных об участии какого-
либо наполовину окисленного (двухэквивалентного) промежуточного
продукта.
щтаминовая
Гщтамин кислота
im
> УАФ-Ы-щетилглтозамин
[ ГликопротеийЩ
Auflmun-KoA Ко ASH
УТФ ФФ„
АТФААФ
Ы-ацетшматозамип ^S > Ы-ацетилманнозамин-б-фасфат
L Фосфоенолпируват
ЦМФ-яацетилнеираминат4-
ФФ„ ЦТФ
а-ъ места иигибироваиия по принципу обратной связи
Г
N-au,emvjmeSpaMUHam< /*¦< N-ацетилнейрамииат-Э-фосфат
Фн Нго
(XS.61)

310 Г лава XI
Образование сиаловых кислот. Си адовые кислоты встречаются в составе
многих гликопротеидов млекопитающих, а также в клеточных оболочках
бактерий. В печени млекопитающих они, по-видимому, синтезируются
сложным путем [см. последовательность реакций (XI.61)].
БИОСИНТЕЗ ГЛИКОЗИДНЫХ СВЯЗЕЙ
Наиболее важная функция нуклеозид(ди)фосфатсахаров заключается
в том, что'они играют роль доноров гликозильных групп в ряде различных
реакций, каждая из которых приводит к образованию новой гликозид-
ной связи. Поскольку AG0' гидролиза таких связей составляет около
—3000 кал/молъ, легко понять, что для их эффективного образования
требуется затрата метаболической энергии; поэтому образование таких
связей происходит преимущественно посредством реакции
HДФ-сахар + Акцептор ^ Сахар A _>) акцептор-J- HДФ. (XI.62)
Таким^образом, синтез гликозилированного продукта из НТФ и сахара
представляет собой экзергонический процесс:
Сахар + 2АТФ + Акцептор —¦> Сахар-акцептор+ 2АДФ + ФФН
AG0 'c^L — 3,5 икал/моль
Сахар + 2АТФ+Акцептор —> Сахар-акцептор+ 2АДФ+2ФН
AGa'~—12 ккал/моль
СИНТЕЗ ПРОСТЫХ ГЛИКОЗИДОВ И ДИСАХАРИДОВ
Простейшей реакцией общего типа, которую мы здесь рассмотрим,
является образование гликозида в реакции (XI. 62а):
НДФ-caxap + R —ОН —> R —О —С-1-сахар + НДФ. (XI.62а)
Ферменты, ответственные за эту реакцию, называются гликозилтрансфераза-
ми. При образовании простых глюкозидов, т. е. таких соединений, в которых
глюкоза (или остаток глюкозы в дисахариде) связывается со спиртом,
фенолом или амином и которые легко получить с помощью ферментов,
выделенных из растений и беспозвоночных, AG0' составляет приблизительно
—35U0 кал/молъ, а нуклеозид представлен уридином.
Показано, что препараты из животных и растительных тканей
катализируют очень сходные реакции, в которых донором служит УДФ-О-глюкуро-
вовая "кислота. В других вариантах той же реакции используется УДФ-
1)-галактоза для галактозилирования липидов с образованием галактолипи-
доп, например цереброзидов нервной ткани животных; дТДФ-рамноза
участвует у бактерий в образовании рамнолипидов, а УДФ-глюкоза
является донором глюкозы при глюкозилировании оксиметилцитозина в
фаговой ДНК.
Если образовавшаяся связь является О-гликозидной связью сахара,
то в этом случае реакция (XI.626) ведет к образованию дисахарида. Наиболее
интересный пример представляет синтез сахарозы в зеленых растениях,
направленный в основном по следующему пути:
УДФ-глюкоза
Фруктозо-6-фосфат > Сахарозо-6-фосфат —> Сахароза. (XI.826)

Обмен углеводов
311
В этом случае на стадии конденсации AG0' составляет всего лишь около
—1000 кал/молъ, что объясняется необычным свойством сахарозы —
наличием связи между двумя аномерными атомами углерода, для которой AG0'
(гидролиза) ~ —660O кал/молъ. Однако общее равновесие реакции все же
благоприятствует образованию сахарозы, так как за счет гидролиза на
втором этапе образуется дополнительная энергия.
БИОСИНТЕЗ ПОЛИСАХАРИДОВ
В синтезе полисахаридов (табл. 36) основная реакция модифицирована
следующим образом:
Полисахарид (затравка) + НДФ-сахар ^ Полисахарид (затравка)-сахар + НДФ, (Х1.62в)
Полисахарид (затравка)-сахар-|-HДФ-сахар ^^ Затравка-сахар-сахар + IIДФ и т. ц.
Таблица. 36
Биосинтез ди-, олиго- и полисахаридов
Образовавшиеся
олиго- или
полисахариды
Источник
ферментной системы
Акцептор или
повторяющаяся единица
Мономерный нуклео-
тид-гликозильный
донор
Сахароза (-Ф)
Лактоаа (-Ф)
а-1,4-глюкан
(амилоза
крахмала)
ос-1,4-гшокан
(амилоза
гликогена)
]3-1,4-глюкан
(целлюлоза)
.?-M-ксилан
Хитин
Гиалуроновая
кислота
Хондроитин
Хопдроитинсуль-
фаты
Гепарин
Растеция
Млекопитающие
Растения
Печень
млекопитающих
Phaseolus aureus
Roxb., бактерии
Растения
Neurospora cras^a
Бактерии,
животные (пуповина,
стекловидное
тело и т. д.)
Роговица
млекопитающих
Соединительные
ткаяи
млекопитающих
Печень, легкое,
стенки артерий
млекопитающих
D-фруктоза (-6-Ф)
D-глюкоза (-1-Ф)
D-глюкоза
D-глюкоза
D-глюкоза
D-ксилоза
]\т-ацетіш-О-гліо-
козамип
D-глюкуроновая
кислота
N-ацетилглюкоз-
амин
D-глюкуроновая
кислота, N-аца-
тил-О-галак-
тозамин
D-глюкуроновая
кислота; N-аце-
тил-D-ranaKTo-
замия-4(или
-бисульфат
2-сульфат D-глю-
куроновой
кислоты, D-галак-
TO3aMHH-N,C-6-
дисульфат
а, 1-
?, I"
а, 1 ¦
а, 1-
?, 1-
?, l-
а, 1-
?, l-
?, 1-
?, 1-
?, 1-
?, 1-
?, 1-
а, 1-
а, І ¦
УДФ-О-глюкоза
УДФ-О-галактоза
АДФ-О-глюкоза
УДФ-О-глюкоза
УДФ-О-глюкоза
УДФ-О-ксилоза
УДФ-К-ацетил-О-
глюкозамип
У ДФ-D -г люк уро-
новая кислота
УДФ-К-ацетил-О-
глкжозамин
УДФ-О-глюкуро-
новая кислота
УДФ-К-ацетил-О-
галактозамин
УДФ-производные
УДФ-производные
AG0' реакции (ХІ.62в) составляет приблизительно —3000 кал на каждый
присоединенный остаток. Классическим примером синтеза полисахаридов
является биосинтез амилозы гликогена с помощью УДФ-глюкоза-гликоген-
глюкозилтрансферазы (гликогенсинтетазы), открытой Лелуаром только

312 Глава XI
в 1957 г. Из написанного уравнения видно, что в результате реакции
происходит только удлинение цепи, т. е. что реакция требует присутствия поли-
глгокозиой затравки (самого гликогена, амилозы, амилопектина или какого-
либо глюкозного олигосахарида с более длинной цепью, чем мальтотетраоза)
в качестве акцептора глюкозных остатков и приводит к образованию
линейного полимера а-1 ->- 4-глюкана.
У растений донором глюкозильных групп при синтезе крахмала служит
АДФ-Ь-глюкоза, а не УДФ-производное.
Ветвление цепей гликогена в результате образования а-1,6-связей
(по одной на каждые 8—12 остатков, соединенных а-1,4-связями)
катализируется другим ферментом — а-глюкан-ветвящей глюкозилтрансферазой
(известной также под названием «разветвляющий фактор»). Этот фермент
отщепляет небольшие фрагменты цепи 1,4-глюкана (две или три моиомерные
единицы) и переносит их па ут же самую (или другую аналогичную) цепь, но в
положение 6, в результате чего образуется 1,6-связь.
О
1
O-O-O—О-С
О—»4-О- О— О—О—0-» = О—О—О—О—0->
Ряд других примеров синтеза полисахаридов приведен в табл. 36. Если
в образовании полисахарида участвует более одного вида моиомерных
единиц (т. е. если образуется не гоыо-, а гетерополисахарид), то можно
представить себе два возможных пути синтеза — либо регулируемое
чередование последовательно присоединяемых мономерных единиц, либо
предварительный синтез ди- или олигосахаридов, все еще присоединенных по
положению С-1 к нуклеозиддифосфату, а на втором этапе процесса —
полимеризация этих более сложных единиц.
ЛИТЕРАТУРА
Л s h w о 1 1 G., Carbohydrate Metabolism, Ann. Rev. Biochem., 33, 101 A964).
Atkinson D. E., Regulation of Enzymo Activity, Ann. Rev. Biochem., 35, 85 A966),
A x с 1 г о A В., Glycolysis, in D. M. Greenborg (ed.), «Metabolic Pathways», vol.
1, p. 97, Academic Press, New York, I960.
A x о 1 г о d В., Other Pathways of Carbohydrate Metabolism, in D. M. Greenherg (ed.),
«Metabolic Pathways», vol. 1, p. 205, Academic Press, New York, 1960.
G і es b u r g V., Sugar Nuclootidos and the Synthesis of Carbohydrates, Advan. Enz.v-
mol.,26, 35 A964).
G u n s a 1 и s I. C, S h u s t e r C. W.. Energy-yielding Metabolism in Bacteria, in
I. C. Gimsalus and R. Y. Stanier (eds.), «The Bacteria», Academic Press, New York'.
vol. 2, p. 1,'J, 1961.
J о h ns о n M. J., Enzymic Equilibria and Thermodynamics, in P. D. Boyer, 11. Lardy,
and K. Myrback, (ods.), «The Enzymo», 2nd ed., vol. 3, p. 407, Academic Pros,1-, N>-\v
York, 1960.
К о r n b с r g 1-І. L., The Coordination of Metabolic Routes, Symp. Soc. Gon. Microbio]..
15, 8 A965).
К о r n b с r g H. L., Anaplerotic Sequences and Their Role in Metabolism, in P. N.
Campbell and G. D. Groville (eds.), «Essays in Biochemistry», vol. 2, Academic Pres?, New
York, 1966.
К r о h s E. G., F і s с h e r E. H., Molecular Properties and Transformations of Glycogen
Phosphorylaso in Animal Tissue, Advan. Enzymol., 24, 268 A962).
К г о h s П. А., К о r n b e r g H. L., Energy Transformations in Living Matter, Springer,
Berlin, 1957.
Loloir L. F., Nuclooside Diphosphate Sugars and Saccharide Synthesis, Biochem. J.,
91, 1 A964).
McGilvery R. W., Pogoll B. M., Friictose-l,6-diphosphatase and Its Role in
Gluconeogenesis, American Institute of Biological Sciences, Washington, 1964.

Обмен углеводов 313
N о г t h с о t е D. Н., Polysaccharidos. Aim. Rev. Biochcm., 33, 51 A964).
Sharon N., Polysaccharidos, Ann. Rev. Biochem., 35, 485 A966).
W ood II. G., S t j e г n h о 1 m H. L., Assimilation of Carbon Dioxide by Hoterotrophic
Organisms, in T. C. Gunsalns and H. Y. Stnnior (cds.), «The Bacteria», vol. 3, p. 41,
Academic Press, New York, 1962.
Wood H. G., Utlc г M. F., The Role of C02 Fixation in Metabolism, Essays in
Biochem., 1, 1 A965).
Wood W. A., Carbohydrate Metabolism, Ann. Rev. Biochom., 35, 521 A966).
Д0ТТ0ЛНИТЕДЫ1 АЯ ЛИТЕРАТУРА
Стопанепкс) Б. FL, Углеводы. Успехи п изучении строения и метаболизма, М., 1968.
Механизмы интеграции клеточного обмена, сб. статей под род. С. А. Неііфаха, изд-во
«Наука», .ТТ., 1967.
К о с о в е р 0., Молекулярная биохимия, изд-во «Мир», М., 1964.

Глава XII
ФОТОСИНТЕЗ
Вся жизнь на Земле {биосфера планеты) в конечном счете зависит от
Солнца. Энергия солнечного света используется для синтеза органических
соединений из двуокиси углерода — процесса в высокой степени эндергонического.
Сложная система реакций, ответственных за превращение энергии фотонов
в химическую энергию, называется фотосинтезом, а организмы, в которых
эти реакции происходят,— фотосинтезирующими. К ним в первую очередь
относятся представители растительного мира: высшие растения,
папоротники, мхи и водоросли (диатомовые, зеленые, сине-зеленые, красные и бурые),
а также некоторые микроорганизмы — простейшие (Euglena) и ряд
бактерий, в том числе пурпурные серные бактерии (Thiorhodaceae), пурпурные
несерные бактерии (Athiorhodaceae) и зеленые серные бактерии (Chlorobac-
teriaceae). Эти организмы получают за счет фотосинтеза все необходимые
для их роста и обновления органические вещества. В то же время сами
они или продукты их жизнедеятельности служат пищей для всех остальных
членов биосферы.
Однако значение фотосинтеза этим еще не исчерпывается. Роль его
гораздо шире.
1. Чтобы жить, организмы должны расходовать запасенную энергию.
Это|достигается путем деградации питательных веществ, по преимуществу
окислительной (катаболизм). Катаболические процессы требуют наличия
окислительной среды и ведут в конечном итоге к превращению всех
углеродных соединений в наиболее окисленную форму — двуокись углерода.
Фотосинтез способствует сохранению равновесия как путем восстановления СО2
до органических соединений, так и благодаря тому, что этот процесс
сопровождается выделением в атмосферу молекулярного кислорода.
2. Хотя клетки используют освобождающуюся в процессе катаболизма
энергию в сопряженных эндергонических процессах синтеза (анаболизм),
а также запасают ее в синтезированных продуктах, все же какая-то часть
энергии непрерывно рассеивается в виде тепла вследствие неидеального
сопряжения между биохимическими реакциями, при переходе химической
энергии в другие формы энергии (например, в механическую или
электрическую) и т. д. В результате энтропия биосферы возрастает. Это — следствие
второго закона термодинамики для любой замкнутой системы. Таким
образом, жизнь на Земле неизбежно должна была бы прекратиться, не будь
непрерывного притока лучистой энергии извне и фотосинтеза, который
использует эту энергию.
3. Вполне вероятно, что предшественники первых живых существ
на Земле — так называемые протобионты — появились в то время, когда
земная атмосфера еще не содержала кислорода. Только в результате
появления организмов, способных производить кислород, могла возникнуть
среда, пригодная для существования всех тех форм жизни, которые
развились позднее. Первые фотосинтезиругощие организмы, жившие около трех

Фотосинтез 315
миллиардов лет назад, почти наверняка представляли собой примитивные,
протокариотические клетки, а их фотосинтез напоминал, вероятно, процесс,
который мы находим у современных бактерий, только в упрощенной форме.
Спустя один или два миллиарда лет некоторые из этих организмов дали
начало древним формам сине-зеленых водорослей. С этого момента
атмосфера стала обогащаться кислородом, что в конце концов привело к появлению
(в начале кембрийского периода, т. е. около 600 млн. лет назад) эукариоти-
ческих организмов.
ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ
У растений фотосинтез происходит внутри высокоспециализированных
органелл, называемых пластидами. Если клетки разрушить и выделить
из них чистую фракцию пластид, то оказывается, что пластиды в присутствии
соответствующих субстратов и кофакторов способны осуществлять все
реакции фотосинтеза. В зеленых растениях, в том числе и в зеленых
одноклеточных организмах, например у водорослей Chlorella и Scenedesmus,
а также у простейшего Euglena, пластиды содержат хлорофилл и называются
хлоропластами. Число, размеры и форма хлоропластов у разных
организмов различны. В клетках хлореллы, например, имеется только одна
пластида чашеобразной формы; большинство же других водорослей, а также
зеленые клетки высших растений содержат много хлоропластов.
Исследуя тонкие срезы пластид под электронным микроскопом, можно
убедиться в том, что они имеют весьма сложное строение (фиг. 91). Прежде
всего бросается в глаза наличие множества мелких темных мембранных
образований (так называемых гран), обладающих четкой слоистой (ламеллярной)
структурой. У эвглены эта темная слоистая структура заполняет весь ее
хлоропласт, который, таким образом, представляет собой как бы одну
грану; у большинства других клеток каждый хлоропласт содержит от 10
до 100 гран. Фотосинтетические пигменты локализованы главным образом
в ламеллах или вокруг них. Выделенные из разрушенных пластид и очищен-
аые ламеллы чрезвычайно богаты фосфолипидами и липопротеидами.
Оказалось, что они способны катализировать некоторые высокоспецифичные
реакции фотосинтеза, а именно фотолиз воды в присутствии внешнего
окислителя (реакция Хилла; см. ниже), и реакции, связанные с переносом
электронов.
Если добавить к ламеллам минимальный набор кофакторов и растворимых
ферментов, выделенных из пластид, то такая система будет катализировать
восстановление пиридиннуклеотидов с одновременным образованием АТФ.
В присутствии более полного набора растворимых ферментов хлоропласта
удается продемонстрировать протекание всех реакций фотосинтеза.
Парк и его сотрудники обнаружили в очищенных препаратах мембран
из хлоропластов шпината повторяющиеся субъединицы, которые могут
образовывать разнообразные решетчатые структуры (фиг. 92). Отдельная
субъединица, которая, как считают эти авторы, является морфологической
структурой, соответствующей физиологической единице фотосинтеза, имеет
форму сплющенной сферы диаметром 155 —185 А и толщиной 100 А. Ее
молекулярный вес равен 2-Ю6, и она содержит 230 молекул хлорофилла
A60 принадлежат хлорофиллу а и 70 — хлорофиллу Ь), 48 молекул каро-
тиноидов, 46 молекул хинонов, 116 молекул фосфолипидов, 500 молекул
галактозилглицеридов, 48 молекул сульфолипидов, стероиды и другие липи-
ды. Таким образом, общий молекулярный вес липидов составляет около 106,
и на долю белков приходится также около 10е. Кроме того, в состав
повторяющейся единицы входят: 1 молекула цитохрома Ьв, 1з:молекула цитохрома /,
10 атомов негеминового железа, 2 иона марганца и 2 иона"меди.

A
^ЩР^^^^зр*
* -•'
#"-'
¦wuhu«:
Б
Фнг. 91. Структура хлоропласта (электронные микрофотографии).
ормирование ламе.ттл у Chloropliytinn поя действием света; снимок показывает образование слоистой
туры в пропластидс— предшественнике хлоропласта; х 50 000. -Б. Полностью развившийся
хлоропласт листа Etndea canadenis', X 24 000.
а. а
текстуры

Фотосинтез
317
У бактерий и сине-зеленых водорослей структуры, ответственные за
фотосинтез, по-видимому, устроены несколько проще. Из этих клеток
можно получить интенсивно окрашенные частицы (так называемые хро-
матофоры) приблизительно сферической формы, диаметром около 300 A.
Фиг. 92. Препарат мембран из хлоропластов шпината, содержащий квантосомы; X 71 000.
Обратите внимание на расположение структурных единиц, кваптосом A85-100 A), напоминающее
решетку кристалла. Сравните со структурой, изображенной па фиг. 91.
Молекулярный вес такой частицы равен примерно 107. Хроматофор
содержит бактериохлорофилл, ряд других пигментов (каротиноиды), фосфолипиды
и весь набор ферментов, необходимых для бактериального фотосинтеза.
ОБЩАЯ СТЕХИОМЕТРИЯ ФОТОСИНТЕЗА
В своей классической форме фотосинтез сводится к следующей реакции:
или точнее
Ферменты и т. д.
{СІІ2о}_|_о2,
6СО2 + 6Н2О + 6nhv
Ф
С6Н12О6 + 6
(XII.la)
(XII.16)
Ферменты и т. д.
Символом {СН2О} обозначено здесь некое органическое соединение, которое
по степени окисления может быть причислено к углеводам, а С6Н12О6
означает гексозу.

318 Глава XII
Что касается бактериального фотосинтеза, при котором кислород не
образуется, то, как показали Клюйвер и Ван-Ниль, ему соответствует следующее
общее уравнение:
Бактериохлорофилл
СО2 + 2Н2Д + пМ> > {СН2О} + Н2О + 2Д, (XII.2)
Ферменты и т. д. an
где НгД — окисляемый донор водорода, например для серных бактерий H2S,
тиосульфат или соединения селена, а для некоторых других видов бактерий —
простые органические соединения вроде изопропанола, молочной или
яблочной кислот, жирных кислот и т. п. Ван-Ниль высказал блестящую догадку:
отметив, что менеду реакциями (XII.2) и (XII.1а) нет существенного различия,
если переписать уравнение (XII.1а) в виде
Хлорофилл
> {CH2O} + H2O+Of,
Ферменты и т. д.
он предположил, что вода, входящая в левую часть уравнения (XII.3),
функционирует как окисляющийся до О2 донор водорода [это отмечено
знаком *; ср. с 2Д уравнения (XII.2)], тогда как вода, входящая в правую
часть обоих уравнений, является одним из продуктов восстановления CO2L.
Правильность этого предположения была позднее доказана с помощью
реагентов, меченных О18. Как вытекает из уравнения, весь выделяющийся
молекулярный кислород происходит от кислорода Н2О, в то время как два
кислородных атома, входившие в СО2, делятся поровну между углеводом,
представляющим собой продукт фотосинтеза, и молекулой воды, выходящей
в окружающую среду.
Ван-Ниль, кроме того, предположил, что первичная реакция фотосинтеза
во всех организмах одинакова. Реакция эта — фотолиз воды, приводящий
к одновременному образованию окислителей (YOH) и восстановителей (ХН)
Хлорофилл
> 4XH + 4YOH.
д
Ферменты и т. д.
В зеленых растениях четыре молекулы YOH вступают в реакцию,
приводящую к образованию О2 и воды, которая является продуктом реакции
(уравнение XII.5); в бактериальных клетках протекает аналогичная реакция
с участием Н2Д (уравнение XII.6):
Ферменты
4YOH + 2H2O : ^4H2O + 4Y + O2, (XII.5)
Ферменты
4НО 4У 2Д (XII.б)
В то же время в клетках всех организмов фотосинтетический восстановитель
используется для превращения СО2 в углевод:
Ферменты и т. д.
4ХН + СО2 > {CH2O> + 2HjO + 4X. (XII.7)
Суммируя реакции (XI 1.4), (XII.5) и (XII. 7), мы получаем уравнение (XII. 3) —
общее стехиометрическое уравнение для фотосинтеза зеленых растений.
1 В связи с этим постулатом Ван-Ниля интересно отметить, что в природе существует
связующее звено между бактериальным фотосинтезом и фотосинтезом в зеленых
растениях. Один из видов зеленых водорослей в анаэробных условиях способен фиксировать
СО2, причем восстановителем служит водород. Уравнение реакции можно записать
в следующем виде:
СО2 + 2Н2 + пЬ —*1{СНаО> + Н2О. (XII.1в)
В то же время эта водоросль ие теряет способности к аэробной фиксации С02 по
классической схеме фотосинтеза (реакция XII.1а).

Фотосинтез 319і
Аналогичное уравнение для бактериального фотосинтеза (уравнение ХП.12)
получают суммированием реакций (XII.4), (XII.6) и (XII.7).
Из такого представления вытекает несколько важных следствий.
Прежде всего из него следует, что можно отделить, во-первых, фотохимические
процессы, в которых участвуют фотосинтетические пигменты, от системы
темновых реакций и, во-вторых, реакции, относящиеся к ферментативному
восстановлению СО2 (в растениях и бактериях), от реакций, приводящих
к образованию кислорода (растения) или к окислению субстрата (бактерии).
И действительно, уже давно известно, что препараты отмытых хлоропластов
на свету способны катализировать выделение кислорода в присутствии
большого числа разнообразных акцепторов электронов (цитохромы, хиноны,
красители ряда индофенола, феррицианид, НАД" и т. д.):
Хлоропласты
> 4AH + OS. (XII.8)
Очевидно, что эта реакция является суммой реакций (XII.4), (XII.5) и (XII.9)
ХН + А —> Х + АН. (XII.9).
Для зеленых растений, у которых фотоокисление и фотовосстановление
катализируются двумя разными системами, приведенные реакции следует
несколько видоизменить, чтобы они соответствовали этому условию.
Напишем уравнения (XII.10) и (XII.11) вместо уравнения (XII.4); уравнение
(ХП.12) вместо (XII.5); (XII.13) вместо (XII.6) и (XII.14) вместо (XII.7):
Система I ,
1
(образуется восстановитель и слабый окислитель
Система II ,,
4X' + 4Y'+n/iv =» 4X7 ;
(образуется окислитель и слабый восстановитель
4Y;I + 2H2O -» O2 + 4Y' + 4H+
(окисление донора в растениях)
(XII. 13)
(окисление донора в бактериальных клетках)
АТФ
4Х™г + СО2 + 4Н+ > {НСИО} + 2НаО + 4Х (XII.14).
(ассимиляция углерода)
АЛФ Фн АТФ
4Yfx+4X'red система^ереиоса 4У+ДХ' (XII.15)
электронов
(метаболическая энергия (АТФ) образуется при рекомбинации слабого
окислителя и слабого восстановителя).
Единственная новая реакция (уравнение XII. 15) — это регенерация
тех двух компонентов, которые не участвуют ни в восстановлении СО2,
ни в окислении Н2О (или Н2Д). Именно эта реакция обеспечивает третье
необходимое условие для последующей фотосинтетической ассимиляции —
запасенную в форме АТФ биохимическую энергию [фотосинтетическое фос-
форилирование; см. ниже). Напомним, что первые два условия определяются
потребностью в окислительных и восстановительных агентах. Правильную'
стехиометрию фотосинтеза в зеленых растениях получают, суммируя урав-

320
Глава XII
нения (XII.10), (XII.И), (XII.12) и (XII.14). В случае фотосинтезирующих
бактерий система II отпадает и остается сумма реакций (XII. 10), (XII. 13)
и (XII.14). Схемы такого рода имеют одно важное отличие от схемы Ван-
Ниля: расщепление воды рассматривается в них как следствие, а не как
предпо ыдка фотохимического образования окислителей и восстановителей.
ГЛАВНЫЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПИГМЕНТЫ
Самым важным фотосиптетическим пигментом у всех растений является
хлорофилл а (Хл а); в бактериях ему соответствует бактериохлорофилл
(БХл). Кроме того, фотосинтезирующий аппарат всех клеток содержит ряд
пигментов, обычно называемых дополнительными или вспомогательными.
Нам теперь ясно, что функции этих компонентов не менее существенны, чем
функция обычного хлорофилла а. У всех зеленых растений, включая
водоросли, к такого рода пигментам относится также особая форма хлорофилла а
(поглощающая в более коротковолновой области спектра) и хлорофилл Ь.
Ряд других вспомогательных пигментов указан в табл. 37.' Среди них
особенно важную роль играют каротиноиды и фикобилины (фикоцианин
и фикоэритрин). На фиг. 93 показано строение некоторых фотосинтетических
пигментов.
Таблица 37
Важнейшие фотосинтетические пигменты
(при названиях пигментов указаны длины волн главных максимумов поглощения в ммк)
Организм
Многоклеточные
зеленые растения
Зеленые водоросли
Бурые водоросли
Диатомовые иодорос-
ли, жгутиковые
Красные водоросли
Пурпурные бактерии
(как серные, так и
несерные)
Зеленые серные бак-
тории
Основной хлорофилл
Хл о: 683 F80—685)
Хл а: 695 F95—700,
6601 >)
То же
Хл а
Хл а
Хл а
БХл (800, 850, 870—
8902>, 77311)
Хл из Chlorobium 660
G25, 6501>) + Хл из
Chlorobium 650
G47,6601>) + слоды
БХл (810,770D)
Хл
Хл
То
Хл
Хл
Хл
Вспомогательный
хлорофилл
Ъ:
а
Ж
с
с:
d
560, 480
670 F70—673)
е
620,470
F801>)
Другие
вспомогательные пигменты
Каротиноиды D81)
Преимущественно
?-каротин
То же
?-Каротип
?-Каротип
?-каротин;
фикоэритрин E70,550 495) и
один из фикоциа-
нипов F25)
Различные каротипо-
иды (родопсин,
ликопин, спирил-
локсаитии и т. п.)
То же
і) В эфире (аморфные монослои хлорофилла а поглощают при 675 ммк, кристаллические — при
735 ммк).
2) Зависит от вида (890 ммк у Rliodospirillum rubrum и Chromalium; 870 ммк у Rhodopseudomo-
nas sp/ieroides).
Функция фотосинтетических пигментов заключается в аккумуляции
энергяи света и высокоэффективной передаче этой энергии в фотохимический
реакционный центр. Фотосинтетические пигменты, очевидно, не могли бы
осуществлять эту функцию, если бы они свободно плавали в итоплазме.

Фотосинтез
321
В действительности они упакованы строго упорядоченным образом по несколь«»
ку сотен молекул. В таком «пакете» квант света поглощается одинаково
эффективно любой отдельной молекулой. Поглощенная энергия затем быстро
А.~Хпорофимы
сн=сн2
Хлорофилла: Х= — СН3
Хлорофилл Ъ: Х=—С НО
СНз
СИ,
СН3
Б. Примеры сопцгпсгпортщих пигмящоа
Н3С СН,
СН,
СН3
СН3
р-Каротин(полностью транс-изомер)
Фиг. 93. Строение фотосинтотпческих пигментов.
Хлорин (порфин, восстановленный по кольцу IV) представляет собой систему из четырех пиррольных
колец (I—TV) и одного циклоггентанонового кольца (V). Полная исходная циклическая система I—V
называется феопорфирином. У бактсриохлорофилла кольцо II также восстановлено, т. е. система связей
при атомах углерода в положениях 3 и 4 имеет вид — СН. Соединение с разомкнутой тетрапиррольной
системой (в нижней части фигуры) ковалентно связано с белком (X), вероятно, через ОН-групну (или
группы). Такой комплекс называется фикоэритрином.
делокализуется (г ^ 10~10 сек) и может быть передана любым молекулам
агрегата, включая минорные компоненты. К последним относится, вероятно,
и молекула, входящая в состав реакционного центра.
ДОКАЗАТЕЛЬСТВА СУЩЕСТВОВАНИЯ ДВУХ СВЕТОВЫХ РЕАКЦИЙ
Многочисленные данные показывают, что фотосинтез в растениях
осуществляется путем совместного действия двух различных систем. Ниже
приводятся некоторые из этих данных.
1. Качественное сопоставление спектра действия со спектром
поглощения in vivo привело к выводу, что эффективным для фотосинтеза (измерялся
по выделению Ог или поглощению СО2) является свет, поглощенный не
только главными, но также и вспомогательными пигментами. Однако когда Эмер-
21-246

322 Глава XII
сон и Льюис сравнили эффективность света различных длин волн, чтобы
охарактеризовать фотосинтез количественно (т. е. определили
относительный квантовый выход фотосинтеза), они обнаружили, что, хотя квантовый
выход в максимуме поглощения вспомогательных пигментов столь же высок,
как и в максимуме поглощения хлорофилла а при 675 ммк, при больших
длинах волн (~700 ммк) он заметно снижается («красное снижение»),
несмотря на то что поглощение света хлорофиллом в этой области остается
еще достаточно высоким.
2. Гаксо и Блинке, усовершенствовав методику, определили квантовый
выход у больЕіого числа водорослей. Они обнаружили, что у красных
водорослей выделение кислорода становится относительно слабым при длинах
волн, превышающих 600—675 ммк. Таким образом, в этом случае «красное
снижение» совпадает с максимумом поглощения хлорофилла а. В тех же
самых экспериментах свет, поглощаемый вспомогательными пигментами,
был в 2—3 раза более эффективным, чем свет, поглощенный хлорофиллом а.
3. Низкий квантовый выход в дальней красной области (А, > 680 ммк)
резко возрастает под действием света с иной длиной волны. Этот эффект
усиления наблюдается независимо от того, как проводится облучение светом
с разными длинами волы — одновременно или последовательно (вспышки
могут быть даже отделены одна от другой темновыми промежутками
в несколько секунд).
4. Эффект усиления молено проследить также и в реакции Хилла
(уравнение XI 1.8).
5. При первом включении (или выключении) света обнаруживается
появление или исчезновение определенных короткоживущих промежуточных
продуктов, выявляемых спектрофотометрически. Один из таких коротко-
живущих промежуточных продуктов (Р700) обесцвечивается (вероятно,
окисляется) на свету с длиной волны 700 ммк, а другой (цитохром /) окисляется
либо одновременно с ним, либо сразу же вслед за ним. Эту
последовательность событий вызывает поглощение света дальней красной области спектра
(;> 680 ммк). Восстановление окисленной формы Р700 может быть ускорено,
и цитохром в свою очередь может быть восстановлен, если подвергнуть
систему действию света с более короткой длиной волны (/~652 ммк).
6. Для фотофосфорилирования (см. ниже) достаточно длинноволнового
красного света G00—710 ммк). Только для выделения кислорода требуется
присутствие ионов Мна+, и только этот процесс ингибируется гербицидом
ДХММ (дихлорметилмочевина). Ни фотофосфорилирование, ни
восстановление НАДФ+ не зависят от ионов Мп2+ и не подавляются в присутствии
ДХММ.
7. У микроорганизмов, способных к обычному фотосинтезу
(уравнение XII. 1), были получены мутанты, лишенные либо системы I, либо
системы II. Мутанты второй группы (лишенные системы II) оказались
неспособными выделять кислород, но могли ассимилировать СО2 в присутствии
окисляемого субстрата, ДН2; таким образом, фотосинтез протекал у них
по бактериальному типу.
СУЩНОСТЬ ДВУХ СВЕТОВЫХ РЕАКЦИЙ ФОТОСИНТЕЗА
Схема, изображенная на фиг. 94, подразумевает совместное,
последовательно осуществляемое действие двух различных фотохимических систем.
Фотосинтетическая единица системы I состоит из 300—400 молекул
нефлуоресцирующего Хл а. Главный максимум поглощения такой единицы
расположен в дальней красной области (см.. табл. 37). С фотосинтетической
единицей связана одна молекула специализированного фотоокисляющегося
пигмента Р700 (i.moi = 700—705 ммк; Е' = 0,430 в), непосредственно уча-

Фотосинтез
323
ствующего в первичной фотохимической реакции. Вероятно, это какая-то
молекула хлорофилла, находящаяся в необычном окружении и, быть может,
связанная с цитохромом /. В зеленых растениях эта система содержит также
примерно одну молекулу цитохрома / на реакционный центр. Цитохром /
(h-max = 556,3 ммк; Е'о = 0,365 в) напоминает цитохром с (см. гл. XV).
Другие фотосинтезирующие растения и бактерии содержат аналогичные цито-
хромы с высоким окислительно-восстановительным потенциалом. Помимо
перечисленных выше компонентов фотосинтетическая единица содержит
еще и некоторые другие, связанные, видимо, менее прочно. К ним относятся
в первую очередь ферредоксин (см. стр. 326) и цитохром 66 — аутоокисляю-
Е,
-0,4
-0,2
0,0
+ 0,2
+ 0.4-
+ 0.6-
+ 0,8-
Kea
(пх-н-)
Ьу(<680мяо()
Система 1 \ху\
hv(dajibHua красный)
ДТФ
Х'Т
Система U
Шастоцианин
\
Uum.f
\
ox
(P7QQ+)
Н2О
Мп
Cl (P680+)
Фиг. 94. Системы реакций фотосиптоза у зеленых растений.
У бактерий система II отсутствует и роль Xred берет на себя окисляемый субстрат. Кроме того,
различны и переносчики электронов; у бактерий вместо пластохинонов используются убихипоны, а пласто-
цианин отсутствует; функции цитохромов Ьв и / выполняют другие цитохромы — типа Ъ и с
соответственно. Стрелки указывают направление потока электронов. ПХ — пластохипон; ПХ-Н-
продукт восстановления с переносом одного электрона: 'А — переносчик электронов в циклическом
потоке электронов и фосфорилиропании. Плаетоцианип и цитохром / могут меняться местами.
21*

324 Глава XII
щийся цитохром (см. гл. XV), найденный в зеленых растениях Сктах =
= 563 ммк; Е'о = —0,06 в). Оба эти соединения присутствуют
приблизительно в той же концентрации, что и цитохром /. Далее следует отметить
наличие еще примерно 10 молекул пластоцианина — медьсодержащего белка
B атома Си на молекулу; мол. вес 20 000) и приблизительно такое же (или
несколько большее) количество нафтохинонов (витамин К) и бензохинонов
(разнообразные пластохиноны; см. гл. XV), а также НАДФ и флавины (см.
гл. VIII). К системе I относятся, кроме того, каротиноиды. Поглощаемая
ими световая энергия с высокой эффективностью передается хлорофиллу.
Основная функция системы I заключается в том, чтобы обеспечивать
одновременное образование восстановительного агента и слабого окислителя,
т. е. в осуществлении реакции (XII. 10). Система I, функционирующая при
наличии окисляющегося субстрата ДН2, сама по себе, без системы II,
осуществляет реакцию фотовосстановления (фоторедукция) подобно тому, как
это происходит у водорослей, нуждающихся в доноре водорода.
Система II является «вспомогательной пигментной системой». Она состоит
примерно из 100 молекул Хл а 670, представляющего собой
флуоресцирующую форму хлорофилла а, поглощающую в более коротковолновой
области, чем Хл а системы I. Кроме того, она содержит хлорофилл Ъ и ряд
других вспомогательных пигментов (хлорофиллы с и ri, a также фикобили-
новые пигменты — фикоэритрин или фикоцианин, в зависимости от вида
организма). Функция системы II состоит в образовании окислительного
агента, необходимого для выделения кислорода под действием света
(реакции XII.11 и XII.12). Рассматриваемая реакция (или реакции) требует Мп2 +
и Cl" и специфически ингибируется гербицидом ДХММ в чрезвычайно низких
концентрациях (~10~7 М). Функционирование системы II, по-видимому,
тесно связано с системой I, так как система II производит слабый
восстановитель (Xr7d — по всей вероятности, восстановленный пластохинон или
какой-нибудь другой хинон; см. гл. XVI), способный регенерировать Y из
Yox, образуемого системой I. Изолированно действующая система II
осуществляет реакцию Хилла (реакция XII.8).
Выделение кислорода под действием света происходит только у зеленых
растений; данные, которыми мы в настоящее время располагаем,
свидетельствуют о том, что у бактерий имеется только система I. Фотосинтетическая
единица бактерий содержит одну молекулу специализированного фотоокис-
ляющегося пигмента Р890 (или Р870, в зависимости от вида бактерий),
вероятнее всего представляющую собой какую-то молекулу бактериохло-
рофилла (БХл), находящуюся в особом окружении (ситуация совершенно
та же, что и у зеленых растений). Эта особая молекула приходится на 30—
50 молекул обычного БХл. Реакционный центр, возможно, содержит
также (наряду с молекулой Р890) одну молекулу цитохрома с2 —
специализированного цитохрома, родственного цитохрому / зеленых растений; его
характеристики: Хтах = 551—553 ммк; Е'о = 0,29—0,33 в. Кроме того,
в систему входят и другие переносчики электронов. К настоящему времени
установлена функциональная роль ферредоксина, НАД, убихинона и цито-
хромов типа Ъ.
1. В реакции (или реакциях), катализируемой системой I, роль
фотосенсибилизатора играет Хл а. При поглощении этим пигментом кванта
длинноволнового красного света образуются гипотетические соединения —
восстановитель Xred и окислитель Yox- Свободный электрон, возникающий
в ходе этого фотохимического акта и первоначально локализованный на
короткоживущем промежуточном продукте X^ed (Е'о ^ —450 мв),
передается сначала переносчику — ферредоксину (Фд), а от него (в паре с другим
электроном) пиридиннуклеотиду, который, таким образом,
восстанавливается.

Фотосинтез 325
Пиридиннуклеотиды (НАД у бактерий и НАДФ у зеленых растений)
в своей восстановленной форме служат стабильным источником
восстановительной силы, необходимой для фиксации С02- С фиксацией СО2
конкурирует ПереХОД ЭЛекТрОНОВ ОТ ВОССТаНОВЛеННЫХ переНОСЧИКОВ [ФДгеа ИЛИ
восстановленного НАД(Ф)] в цепь переноса электронов (ЦПЭ).
Изображенная на фиг. 94 в виде сплошных диагональных стрелок, эта цепь
реакций завершается в конце концов циклическим восстановлением Ytx в Y.
2. Окисляющий член пары (дырку) можно представить себе в виде
неустойчивого состояния Ytx с потенциалом Е'о ~ 400—500 же. Скорее всего
это Р700 (или Р870 — в случае бактерий).
а) При бактериальном фотосинтезе он восстанавливается (тем самым
регенерирует Y) за счет поступающего извне фотовосстановителя ДН2,
который одновременно окисляется до Д (уравнение ХП.13). По-видимому,
в процессе этого окисления, проходящего через ряд стадий с участием
физиологических переносчиков электронов (диагональная линия), и образуется
фонд АТФ.
б) У зеленых растений Ytx восстанавливается в конечном итоге корот-
коживущим: восстановителем X«d, образующимся в системе II (см. ниже).
Для этого процесса необходима цепь переноса электронов, состоящая из ряда
ферментов и промежуточных переносчиков. В зеленых растениях
необходимый для ассимиляции углерода фонд АТФ производится, по-видимому,
в ходе именно этой реакции (уравнение XII. 15). Что касается фотосинтези-
рующих бактерий, то у них может отсутствовать значительная часть ЦПЭ,
особенно в области низких значений потенциала.
3. В реакциях, катализируемых системой II, в качестве
фотосенсибилизаторов используются вспомогательные пигменты. Поглощение кванта света
приводит в этом случае к образованию восстановителя X'nd и сопряженному
образованию окислителя Y'o%. В этом смысле положение полностью
аналогично тому, что мы имеем в системе I. Однако есть и одно важное отличие;
оно заключается в том, что уровни потенциалов системы II лежат в области
существенно более положительных значений, чем уровни потенциалов
системы I: величина Е'о для Yoi> 840 мв, а для Х^ы ~ 0,0 же.
а) Единственная функция Y'oi заключается в окислении воды (или
гидроксильных ионов) до молекулярного кислорода. Таким образом,
именно от Y'ot: зависит протекание реакций фотосинтеза, связанных
с выделением О2.
б) Роль X«d состоит в подаче электронов к ЦПЭ для регенерации
соединения Y системы I (см. выше, пункт 26).
ОБРАЗОВАНИЕ ВОССТАНОВИТЕЛЕЙ
Для того чтобы фотосинтетическая ассимиляция углерода могла
происходить, необходимо постоянно восполнять запасы стабильного
биохимического восстановителя. Было показано, что фиксация двуокиси углерода,
по-видимому, характеризуется следующей стехиометрией:
6 Рибулозо-1,5-дифосфат + 6СОа+18 АТФ + 12 Восст. НАДФ —>
—> 6 Рибулозо-1,5-дифосфат + Гексозофосфат+18 АДФ+17 Фв+12 НАДФ. (XII.16)
Таким образом, для работы углеродного цикла (см. стр. 328), т. е. для
серии темновых реакций, необходимы восстановленный НАДФ (или
восстановленный НАД — У бактерий) и АТФ, образующиеся в ходе световых
стадий фотосинтеза. Ранее было показано, что восстановленный НАДФ
образуется в реакции Хилла, катализируемой хлоропластами:
НАДФ+ n'/iv+ H2O —> НАДФ-Н+1/2 О2 + Н+. (XII.17а)

326 Глава XII
В 1958 г. Арнону с сотрудниками удалось показать, что эта реакция может
сопровождаться фосфорилированием АДФ:
НАДФ + и'Мі + Н2О + АДФ + Фн —> Восст. НАДФ + 1/2 О2 +АТФ. (XII.176)
С тех пор появляется все больше и больше данных в пользу того, что
восстановленные пиридиннуклеотиды производятся в одной из реакций,
протекающих в системе I, и что именно они являются теми необходимыми
стабильными восстановителями, которые образуются в стехиометрических
количествах во всех клетках, где идет фотосинтез.
Не так давно было идентифицировано еще одно соединение, служащее
переносчиком электронов между Xred и пиридиннуклеотидом. Этим
переносчиком оказался сравнительно низкомолекулярный железосодержащий
белок, названный ферредоксином (Фд). Сначала было обнаружено, что он
участвует в другой важной биосинтетической системе реакций —
превращении атмосферного азота в NH3 азотфиксирующими бактериями
(см. гл. XVII). Позже выяснилось, что сходные пигменты присутствуют
у самых разнообразных анаэробных и фотосинтезирующих бактерий, у сине-
зеленых и зеленых водорослей и в клетках высших растений. Фд бактерий
представляет собой белок с молекулярным весом 5,5- 1СK и очень низким
окислительно-восстановительным потенциалом (Е'о ~ —0,425 в). Он обладает
характерным спектром поглощения с максимумом в области 390 ммк,
который исчезает при химическом или фотохимическом восстановлении.
Исследованные ферредоксины содержат от 3 до 8 атомов железа на молекулу,
в зависимости от вида организма (8 у Clostridia, 3 у Chromatium). Эти атомы
железа, вероятно, связаны с таким же числом цистеиновых остатков белка.
Кроме того, ферредоксин содержит такое же число отщепляемых кислотой
атомов серы. Это либо неорганический сульфид, либо очень лабильные
органические остатки, разлагающиеся о образованием H2S в кислой среде.
Аминокислотный состав ферредоксина необычен: в нем нет таких
аминокислот, как гистидин, метионин и триптофан. Хотя железо в молекуле
ферредоксина может существовать как в двухвалентном, так и в трехвалентном
состоянии, все же нельзя утверждать с уверенностью, что окислительно-
восстановительные свойства этого белка (известно, что ферредоксин — одно-
электронный переносчик) связаны с изменением валентности иона железа.
Мысль об участии ферредоксина в реакциях системы I возникла, когда
выяснилось, что неизвестный растворимый фактор, требующийся для
фотовосстановления НАДФ хлоропластами, может быть заменен бактериальным
ферредоксином и что хлоропласти на свету могут катализировать
восстановление (обесцвечивание) бактериального ферредоксина. Ферредоксин из
листьев шпината отличается от своего бактериального аналога по ряду
характеристик: его молекулярный вес вдвое выше (~13 000); он содержит
только два иона железа и два кислоторастворимых серусодержащих остатка
на молекулу белка; наконец, его спектр поглощения совершенно не похож
на спектр поглощения бактериального ферредоксина. Тем не менее оба
соединения имеют сходные низкие окислительно-восстановительные
потенциалы.
Восстановление НАД(Ф) ферредоксином можно записать в виде
следующих двух реакций:
2Xred + 2 Фдох ^ 2Х + 2 Фдге(г (ХП.18а)
(где форма Фд,.ей имеет на один электрон больше, чем Фдож),
Трансгидро гснаоа
Н+ + 2 Фдгесг + НАД(Ф)+ ' 2 Фдох + Восст. НАД(Ф). (XI 1.186)
Фд-НАДФ—редуктаза

Фотосинтез 327
У бактерий и адаптированных к водороду водорослей Н+ сам по себе в
присутствии фермента гидрогеназы способен функционировать в качестве
акцептора электронов, результатом чего является образование
молекулярного водорода:
Трансгидрогепаза
2Н+ -|- 2ФдГе(і ~' Н2 -1-2 Фдож (XII. 18в)
Гидрогеиаза
ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ
(ФОТОФОСФОРИЛИРОВАНИЕ)
Френкель впервые показал на фрагментах бактериальных хроматофоров,
что световая энергия, поглощенная фотосинтезирующей системой, может
вызывать этерификацшо неорганического фосфата с образованием АТФ.
Арнону и его сотрудникам удалось осуществить эту же самую реакцию
с препаратами хлоропластов. С тех пор факт фосфорилирования при
переносе электронов в процессе фотосинтеза (фотофосфорилирование) установлен
не менее надежно, чем фосфорилированио при переносе электронов в
процессе биологического окисления (окислительное фосфорилирование, см. гл. XV).
Самым важным процессом из тех, которые имеют отношение к запасанию
биохимической энергии в молекуле АТФ, является система реакций с
участием цепи переноса электронов (хиноны, цитохромы и т. д.). С помощью
этого процесса осуществляется сопряжение восстановления окислителя
Y?x, образующегося в системе I фотохимическим путем, с окислением
восстановителя, т. е. либо Xred, образующегося у высших растений в системе II,
либо экзогенного донора водорода ДН2 — в случае бактерий (реакция
XII.15). Суммарная реакция образования восстановленного НАДФ с
одновременным фосфорилированием выглядит так:
Полная система
НАДФ + л'АДФ + п'Ф і reftv > Восст. НАДФ + га'АТФ+Оа-Ь («' — 2I1,0.
+ЦПЭ+фосфат
(XII.19)
В анаэробных условиях, а также в случаях, когда система II не
функционирует вследствие мутации или ингибирования (действие ДХММ),
добавление таких переносчиков электронов (X), как Фд, хинон и т. п. (см. фиг. 94),
позволяет связать восстановители, образующиеся при световой реакции,
т. е. Xredi ФДгей или восстановленный НАД(Ф), с системой переноса
электрона. Таким образом, мы получаем реакцию (XII.20а):
_ , Переносчики электронов
Хгей+^ож + ге'АДФ+и'Фц ^ X+Y + га'АТФ. (XII.20а)
Далее, суммируя реакцию (XII.20а) и реакцию (ХИЛО), которая приводит
к образованию Xred и YJX, мы получаем уравнение (XII.206):
Система I
га'АДФ + га'Фн-f-ra/iv > я'АТФ. (XII.206)
Переносчики электронов, '
ферменты и т. п.
Это — уравнение циклического фосфорилирования, при котором поглощение
световой энергии приводит лишь к синтезу АТФ; ни восстановитель, ни
окислитель при этом не образуются.
Все имеющиеся сейчас данные указывают, что необходим перенос двух
электронов для образования пары: восст. НАДФ и АТФ, т. е. что п' = п/2.
Учитывая наряду со стехиометрическим фосфорилированием также
фосфорилирование циклическое, можно объяснить стехиометрию уравнения
фиксации СО2 (уравнение XII. 16), по которому на одну молекулу
восстановленного НАДФ и одну молекулу связанного СО2 требуется 1,5 молекулы
АТФ.

328 , Глава XII
ПРИРОДА РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ
Напомним, что реакционный центр состоит из 300 молекул Хл а на
молекулу Р700 в системе I у растений и из 50 молекул БХл на молекулу Р870
(или Р890) у фотосинтезирующих бактерий. Помимо этого, с реакционным
центром могут быть непосредственно связаны: какой-то цитохром типа с
(в растениях — цитохром /) с высоким потенциалом и один из хинонов
с низким потенциалом, оба в количествах, эквивалентных количеству
первичного восстановителя. Возможно, что Y и X на фиг. 94 соответствуют
именно этим соединениям. Наиболее вероятная последовательность событий
такова;
/IV
Х[Хлп-Хл]Цит.(Рв2+) —» Х[Хл?.Хл]Цит.(Ре2+) —> {Хті[Хл„-Хл+]Цит.(Ре2+)} —>
—>gX;«i[Xnn-Xfl]IJiiT.(Fe3+). (ХИ.21)
В фигурные скобки заключена нечувствительная к температуре часть
системы. Хл„ обозначает агрегат молекул хлорофилла; Хл (Р700 или Р870) связан
с донором электрона — цитохромом / (или его аналогом); X — акцептор
электрона. Фотохимическая реакция приводит к образованию окисленного
хлорофилла и восстановленного акцептора. Позднее цитохром окисляется
снова и хлорофилл возвращается в своеобычное, восстановленное состояние.
ПУТЬ УГЛЕРОДА В ФОТОСИНТЕЗЕ
Темновые реакции, связанные с ассимиляцией 4СО2 у зеленых растений,
были детально изучены прежде всего in vivo с помощью радиоактивной
метки (работы Кальвина, Бенсона и Бассама), а потом in vitro — в
хлоропластах и препаратах из них, содержащих очищенные растворимые
ферменты. Все эти исследования привели к созданию общей гипотетической схемы,
известной под названием цикла Кальвина — Бассама (фиг. 95 и 96).
Полагают, что этот цикл состоит из следующих реакций (названия ферментов даны
курсивом; перестройки углеродного скелета отмечены скобками):
6 Рибулозо-1,5-дифосфат + 6СО2 + 6Н2О —> 6 продукт ~~* 12 3-фосфоглицерат
[6G5-f-6C1 = 12G3] Карбоксидисмутаза (КД) (XII.22}
12 3-фосфоглицерат-(-12АТФ ^^ 12 1,3-дифосфоглицврат + 12АДФ
[12Сз —> 12Сд] Фосфоглицераткиназа (XII.23)
12 1,3-дифосфоглицерат+12 Восст. НАДФ ^
^^ 12 Глицеральдегид-3-фосфат + 12НАДФ + 12Фи
[12Сз —> 12CJJ] D-глщералъдегидфосфат-дегидрогеназа [НАДФ-зависимая) (XII.24)
5 Глицвральдвгид-З-фосфат ^^ 5 Диоксиацетонфосфат
[5Сз ' 5G™] Триозофосфатизомераза (XII.25)
3 Глицеральдогид-3-фосфат-|-3 Диоксиацвтонфосфат ^~~ 3 Фруктозо-1,6-дифосфат
[ЗСз + ЗСJ = ЗС0] Альдолаза (XII.26)
3 Фруктозо-1,6-дифосфат-|-3 Н2О —> 3 Фруктозо-6-фосфат-|-ЗФи
[ЗСв = ЗСв] Фосфатаза (специфичная?) (XII.27)
2 Фруктозо-6-фосфат-|-2 Глицеральдвгид-3-фосфат ^^
2 Эритрозо-4-фосфат + 2 Ксилулозо-5-фосфат
^ Транскетолаза (ТК) (ХИ.28)

Восст.НААФ АТФ Триазы АяьЪояаза СН2ОН
СНО СН2ОН
и
=0
АТФ
Гсно
тк і
¦^ сн2ош
СНгОРОз
РиВулозо-
фосфат
(Пентозо-
фосфат)
СН2ОРОз
Гептулозо-
фосфатп
> Сахароза
CHjOPOf CH2OPOf CHjOPOf
ФГК у^ФТА \ Диоксиацетон- СН2ОРОз~
Фосфат ^—-- Гексазофосфат
н?он
Тликолат
Фиг. 95. Распределение метки в опытах с кратковременной фиксацией С02-
ЗАТФ
Ксияцлозо-
фосфат
-rf-Рибулозофосфат ¦
-^•Рибулозофосфат ¦
Рибулозофосфат ¦
Рибазо-
' фосфат
ЗСО2
„ Ри6улозо-_
Ьифосфат ~
^Рибулозо- _
дифосфат
^Рибулозо-
дифосфат
ФГК ФГК ФГК ФГК ФГК ФГК
ААФ
I %
6Н/1ДФ-*.
¦6АГФ
-БВосст.НААО*
[~ФГ/]| ФТА ФТА ФТА ФТА ФГД
\
Диоксисщетонфосфат -
Фруктозофосфат-
Диоксиацетон-
фосфтп
Фиг. 96. Путь углерода в фотосинтезе.

330 Глава XII
2 Эритрозо-4-фосфат + 2 Диоксиацетонфосфат ^^ 2 Седогептулозо-1,7-дифосфат
[2C4 + 2CJ' = 2C7] Альдолаза (XII.29)
2 Седогептулозо-1,7-дифосфат + 2Н2О —> 2 Седогептулозо-7-фосфат + 2Фи
[2С7 ^ 2CJ] Фосфатаза (специфичная?) (XI 1.30)
2 Седогептулозо-7-фосфат + 2 Глицеральдегпд-3-фосфат ^]
_^ 2 Рибозо-5-фосфат-{-2 Ксилулозо-5-фосфат
[2С; + 2Сз = 2Cj + 2Cj;] Транскетолаза (ГА) (XII.31)
2 Рибозо-5-фосфат ^ 2 Рибулозо-5-фосфат
[2С5 = 2Са"] Фосфопешпозоизомерава (XI 1.32)
4 Ксилулозо-5-фосфат 4 Рибулозо-5-фосфат
[4С5 = 4С"'] Фосфокетопептозоэпимераш (XII.33)
6 Рибулозо-5-фосфат + 6АТФ —> 6 Рибулозо-1,5-дифосфат + 6АДФ
[6С(," = 6С5] Фосфопентокиназа (XII.34)
Суммарная реакция:
6 Рибулозо-1,5-дифосфат-]-6С02 + 18АТФ-Ь12 Восст. НАДФ —>
—> 6 Рибулозо-1,5-дифосфат + Фруктозо-6-фосфат+18АДФ+17ФП + 12ПАДФ
(Н2О не показана) (XII. 16а)
То же после гидролиза гексозофосфата:
СО2 + ЗАТФ + 2 Восст. НАДФ-(-ЗН2О —>¦ i/в Гексоза + ЗАДФ + ЗФн + 2НАДФ (XII.166)
Суммарная реакция (уравнение XII. 16а) приводит к. образованию одной
молекулы гексозофосфата или (после гидролиза, которому может
предшествовать изомеризация гексозы) одной молекулы гексозы на шесть
оборотов цикла, представленного уравнением (XII.166). Сам цикл состоит
из одной затравочной стадии (реакция XII.34), для которой необходим АТФ;
одной стадии собственно карбоксилирования (реакция XII.22),
приводящей к первому идентифицируемому продукту — фосфоглицериновой
кислоте; еще одной затравочной стадии (реакция XII.23) и стадии
восстановления (реакция XII.24). Все последующие реакции (XII.25—XII.33) —
просто перестройки, предназначенные для того, чтобы, во-первых, воссоздать
исходные вещества и, во-вторых, удалить продукт. Все эти стадии, включая
реакцию (XII.23), катализируются ферментами, которые присутствуют
не только в зеленых растениях, но и во всех живых организмах (см. гл. XI).
Резюмируя, перечислим необходимые условия для осуществления
фотосинтеза в зеленых растениях (уравнения XII.35а — XII.35г; суммарное
уравнение XII.36).
Часть I. Система переноса фотоэлектронов
Световые стадии:
Система І і
2 Восст. НАДФ + ^ае (XII.35а)
Фд
Система II
> O2 + 4X«d+4H+ (XII.356)
Темновые стадии:
Система переноса
электронов
? 4Х'4У + 'АТФ ге'Н,О (XII.35в)
2 '
и фосфорипирования

Фотосинтез 331
Часть II. Система ассимиляции С02
Система
СО2 + 2 Восст.
цикла Кальвина
—> !/в ГексозаН-2НАДФ + ЗАДФ + ЗФН (XII.35г)
Самое общее уравнение:
Хлоропласт
2nhv + СО2 + (п' — 3) АДФ + (ге' — 3)ФН + 5Н2О *¦
1 v ^ m rv ; н і z -(-вспомогательные
системы
—> і/б Гексоза+ О2 +(га' —3)АТФ+(га' —3)Н2О (XII.36)
Сравните это уравнение с уравнением (XII.3) и примите во внимание, что
АДФ + Фи = АТФ + Н2О. Тогда вы снова придете к выводу, что если
п'In действительно равно 0,5, то существует дефицит по АТФ, который
должен быть скомпенсирован! при помощи циклического фосфорилирования
(см. уравнение XII.206).
КВАНТОВЫЙ ВЫХОД И ЭНЕРГЕТИКА
Вопрос о величине квантового выхода, т. е. о значении п в уравнении
(XII.3), долгое время вызывал споры. Варбург, Бёрк и их сотрудники
считали квантовый выход равным 4, тогда как Эмерсон и большинство
других исследователей неизменно получали значения, близкие к 8. В механизме,
состоящем из двух связанных световых реакций (XII.35), величина n/i,
очевидно, не может быть меньше единицы. Отсюда следует, что 2п = 8,
а это согласуется с результатами огромного числа работ.
Если 8 моль квантов света с длиной волны 700 ммк используются с
эффективность«^ 70 %, то это соответствует примерно] 205 ккал. Для реакции
-» {СН20} + 02
AG°' = H4 ккал, а для реакции
АДФ + Фн —>|АТФ + Н2О
AG0' ~ +7,5 ккал.
Можно, следовательно, подсчитать, что для суммарного процесса
коэффициент полезного действия равен 122/205 ~ 0,60. Из «потерянных» примерно
75 ккал не менее 6-3 = 18 ккал рассеиваются на стадиях гидролиза
(XII.27) и (XII.30) и при гидролизе гексозофосфата, а 6-7 = 42 ккал
затрачиваются при образовании рибулозодифосфата (уравнение XII.34). В сумме
это составляет около 60 ккал. Эта величина выражает энергию,
расходуемую на поддержание однонаправленного потока углерода в
биосинтетической последовательности реакций. Мы видим, что «истинный» к.п.д.
процесса по существу равен 190/205, т. е. 0,92. Таким образом, лишь 8%
поступающей энергии растрачивается непроизводительно с биохимической точки
зрения.
ДРУГИЕ ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ,
ПРОИСХОДЯЩИЕ ПОД ДЕЙСТВИЕМ СВЕТА
В организмах, содержащих фермент гидрогеназу, т. е. у фотосинтези-
рующих бактерий и у адаптированных к водороду водорослей, ФдГе(г —
первичный стабильный восстановитель, образующийся под действием света,—
может вызывать фотовыделение водорода (уравнение XII. 18в). С другой
стороны, Фд может быть использован теми же самыми организмами для

332
Глава XII
обращения кластической реакции с участием пирувата (см. гл. XI):
СНзСОСОг + Фн —> Ацетилфосфат+СО2+Н2, (XII.37)
СНзСОСОг+Фн + 2 Фдож ^ Ацетилфосфат + СО2+2 Фдге<г. (XII.38)
Так как пируват (благодаря существованию дополнительных стадий кар-
боксилирования; см. гл. XI) является предшественником различных ди-
и трикарбоновых кислот цикла лимонной кислоты, а следовательно, и всех
тех углеводов и аминокислот, которые происходят от этих соединений,
то реакция (XI 1.38) служит для фотосинтезирующей клетки ключевой
стадией в процессе восстановительного синтеза важнейших соединений.
Открыта еще одна функция восстановленного ферредоксина — участие
в фиксации азота. В реакции, катализируемой АТФ-зависимым ферментом
(ферментами) нитрогеназой и приводящей к превращению N2 в NH3, в
качестве восстановителя может использоваться либо молекулярный водород,
либо ФДге<г (см- гл- XVII). На схеме (XII.39) показаны все эти различные
пути использования восстановленного ферредоксина (некоторые из них.
обратимы):
NH3
Восст.ИАЛ(Ф)
hv
(XII.39)
гкПіщват
NH,
Кроме того, ФдГе(г участвует либо совместно с восстановленными пири-
диннуклеотидами, либо без них в процессах ассимиляции окисленных
соединений азота и в восстановлении нитратов до нитритов, а также в
полном восстановлении последнего до аммиака (см. гл. XVII).
ЛИТЕРАТУРА
В ass h am J. A., Photosynthesis, Energetics and Related Topics, Advan. Enzymol.,
25, 39 A963).
В a s s h a m J. A., Calvin M., The Path of Carbon in Photosynthesis, Prentice-Hall,
Englewood Cliffs, N. J., 1957.
Brookhaven Symposia in Biology, The Photochemical Apparatus: Its Structure and Function,
li A959).
Calvin M., В a s s h a m J. A., The Photosynthesis of Carbon Compounds, Benjamin,
New York, 1962.
Clayton В. К., Molecular Physics in Photosynthesis, Blaisdell, New York, 1965.
Clayton R. K., Photosynthesis, Primary Physical and Chemical Processes, Ann. Rev.
Plant. Physiol, 14, 159 A963).
D u y s e n s L. N. M., Photosynthesis, Progr. Biophys. Mol. Biol., 1.4, 3 A964).
G e s t H., San Pietro A.,Vernon L. P. (eds.), Bacteria] Photosynthesis, Anti-
och Press, Yellow Springs, Ohio, 1963.

Фотосинтез 333
G і b b s M., Photosynthesis, Ann. Rev. Biochem., 36, 757 A967).
G і e s e A. С. (ed.), Photophysiology, Academic Press, New York, 1964.
Hill R.,Whittingham СР., Photosynthesis, Wiley, New York, 1957.
Jagendorf A., Photosynthesis, Surv. Biol. Progr., 4, 183 A962).
Kamen M. D., Primary Processes in Photosynthesis, Academic Press, New York, 1963.
Kok В., Jagendorf A. (eda.), Photosyntlietic Mechanisms of Green Plants.
Publication 1145, National Academy of Sciences, National Research Council, Washington,
1963.
M с Е 1 г о у W. D., Glass В. (eds.), Symposium on Light and Life, Johns Hopkins,
Baltimore, 1961.
San Pietro A. (ed.), Non-heme Iron Proteins, Role in Energy Conversion, Antioch
Press, Yellow Springs, Ohio, 1965.
Smith J. H. C, French C. S., The Major and Accessory Pigments in Photosynthesis,
Ann. Rev. Plant Physiol., 14, 181 A963).
V e r n о n L. P., Bacterial Photosynthesis, Ann. Rev. Plant Physiol., 15, 73 A963).
V e r n о n L. P., A v г о n M., Photosynthesis, Ann. Rev. Biochem., 34, 269 A965).
Vishniac W., Horecker B. L, Ochoa S., Enzymatic Aspects of
Photosynthesis, Advan. Enzymol., 19, 1 A957).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Г од н е в Т. И., Фотосинтез, Минск, 1961.
Кондратьева Е. Н., Фотосиптезирующие бактерии, Изд-во АН СССР, М., 1963.
Шлык А. А., Метаболизм хлорофилла в зеленом растении, Минск, 1965.
Сборник «Механизм дыхания, фотосинтеза и фиксации азота», изд-во «Наука», М., 1967.

Глава XIII
ОКИСЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
И РАСЩЕПЛЕНИЕ СЛОЖНЫХ ЛИПИДОВ
Липиды — это разнородный класс веществ, характеризующихся
различной растворимостью в органических растворителях и, как правило,
нерастворимых в воде. К основным подклассам сложных липидов относятся
нейтральные жиры и масла, фосфолипиды (производные фосфатидной
кислоты), сфинголипиды и стероиды. Химия липидов рассматривается в
соответствующих обзорах, и наш главный интерес заключается не в этом. Мы
коснемся ее здесь лишь в той мере, в какой это необходимо для понимания
обмена липидов.
ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ
Наименования наиболее распространенных (а также нескольких редких)
жирных кислот приведены в табл. 38. В природе чаще всего встречаются
жирные кислоты с насыщенной или ненасыщенной неразветвленной цепью,
содержащей четное число атомов углерода. Среди них преобладают
пальмитиновая, стеариновая и олеиновая кислоты. Кислоты с насыщенной
неразветвленной цепью, содержащей нечетное число атомов углерода, редко
встречаются в больших количествах, но в малых, по-видимому,
распространены повсеместно. Жирные кислоты с разветвленной цепью обнаружены
лишь в немногих природных источниках. У трех организмов были найдены
жирные кислоты, содержащие циклопропановое кольцо: ^мс-11,12-метилен-
октадеканоевая (лактобацилловая) кислота является главным липидным
компонентом у Lactobacillus и Agrobacterium tumefaciens, а і^мс-9,10-метилен-
гексадеканоевая кислота выделена из Е. coll. Жирные кислоты, содержащие
циклопропеновое кольцо (стеркуловая кислота) и циклопентеновое кольцо
(хаульмугровая кислота) выделены из растений.
Таблица 38
Некоторые жирные кислоты, встречающиеся в природе
Название
Формула
Масляная
Капроновая
Каприловая
Каприновая
Лауриновая
Миристиновая
Пальмитиновая
Стеариновая
Лрахигювая
Лигноцериновая
Насыщенные жирные кислоты
СН3(СН2JСО2П
СН3(СН2LСО2Н
С[13(СН2NСО2Н
СНз(СН2)8СО2Н
Щ3(СН2I0СО2Н
С[13(СН2I2СО2Н
СИ3(Ш2I4СО2Н
СН3(СН2)ібСО2Н
CH3(CH2ISCO2H
СН(СН)СОН

Окисление
Название
жирных
кислот
и
расщепление
сложных
Формула
липидов
Продолжение
табл.
335
38
Кротоновая
Пальмитолеиновая
Олеиновая
Линолевая
Линоленовая
Арахидоновая
Ацетэруковая
Ксимэниниевая
Микомицин
Лактобацилл овая
Стэркуловая
Хаульмугровая
Ненасыщенные жирные кислоты
сн3сн=снсо2н
СН3(СЦ2MСН = СН(СН2OСО2Н
СНз(СЦ2OСП = СЫ(СН2OСО2Н
СН3(СН2)з(СН2СН = СНJ(СН2OСО2Н
СН3(СН2СН = СНK(СН2OСО2Н
СНз(СН2)з(СН2СН=СНL(СН2KСО211
СН3(СН2OСН = CH(CII2I3CO2H
СН3(СН2MСН = СН —С=С —(CII2OCO2H
нс=с—с=с— сн = с=сн—си = сн—сн=снсн2со2н
Некоторые другие жирные кислоты
(СН2MСН3
(СН2)9_СО2Н
(сн2O-сн3
(СН,),—СО2Н
'(СН2I2СО2Н
Свободные жирные кислоты составляют лишь небольшую часть всех
жирных кислот, содержащихся в пище. Основная часть жирных кислот
пищи входит в состав более сложных липидов, главным образом
триглицеридов и фосфатидов.
РАСЩЕПЛЕНИЕ ТРИГЛИЦЕРИДОВ
Триэфиры глицерина и жирных кислот — триглицериды — образуют
два важных класса сложных липидов: класс жиров и класс масел.
Разграничение между ними основывается на физическом состоянии триглицерида
при комнатной температуре: масла остаются жидкими, а жиры —
твердыми. Температура плавления триглицеридов определяется природой
жирных кислот, входящих в их состав. Как правило, чем выше содержание
кислот с короткой цепью или ненасыщенных кислот, тем ниже точка
плавления.
Гидролиз триглицеридов, входящих в состав пищи, происходит у высших
животных преимущественно в тонком кишечнике и катализируется липо-
литическими ферментами, вырабатываемыми поджелудочной железой. Эти
панкреатические липазы (гидролазы эфиров глицерина) бывают,
по-видимому, двух типов — одни из них специфичны в отношении эфирных связей
в а-положении триглицерида, а другие гидролизуют связи в ?-положении.
Полный гидролиз триглицеридов происходит постадийно: сначала быстро
гидролизуются а и а'-связи, a потом уже идет медленный гидролиз ?-моно-
глицерида (фиг. 97). Протекание этих реакций ускоряется под действием
солей желчных кислот — таурохолата и гликохолата натрия, что следует
объяснить повышением растворимости липидов в результате образования

336
Глава XIII
эмульсии.
но
I
CONH-CHz-COjH
но'
CONH(CH2JSO3H
Гяикохолввая кислота
Тацрохослєвая кислота
Соли желчных кислот содержатся в желчи, которая выделяется печенью
и поступает в кишечник из желчного пузыря. Поступление желчи в кишеч-
о
II
О СН2ОС—R,
л R2COC-H V.
о сн2он
R 2-СОС—H
СН2ОС—R3
II
о
СН2ОС—R3
о
о сн2он
II I
R2—COC--H
СН2ОН
о
О СН2ОС—R,
R2COC—H
І
СН2ОН
-r2co2h M +r2co1h
CH2OH
HO-C—H
І
CHjOH
Фиг. 97. Предполагаемая схема реакций полного гидролиза триглицеридов.
ник стимулируется гормоном холецистокинином, который синтезируется
в тонком кишечнике и выделяется в кровоток в ответ на появление жира
в двенадцатиперстной кишке.
Заметим, что гидролиз триглицеридов, катализируемый липазами, в
принципе обратим, так что обратная реакция является возможным путем
биосинтеза этих соединений.
і і Как свободные жирные кислоты, так и в разной степени этерифициро-
ванные глицериды всасываются в тонком кишечнике. Жирные кислоты
с короткой цепью и глицерин переносятся затем кровью в печень, а жирные
кислоты с длинной цепью и глицериды снова превращаются в триглицериды
в слизистой кишечника, передаются в лимфу и попадают в кровь через
лимфатическую систему. Триглицериды переносятся лимфой и кровью в виде

Окисление жирных кислот и расщепление сложных липидов 337
так называемых хиломипронов — микроскопических липопротеидных частиц
размером около 50 мк. Хиломикроны состоят в основном из триглицеридов
с добавлением некоторого количества других липидов и белка (липидное
содержимое хиломикрона окружено белковой оболочкой). Такие липопро-
теидные комплексы, как хиломикроны, служат субстратами одной
своеобразной липазы, присутствующей в некоторых тканях, а именно липопро-
теидлипазы. Этот фермент катализирует гидролиз только тех триглицеридов,
которые связаны с белком. В процессе такого гидролиза (в отличие от
гидролиза, катализируемого панкреатической липазой) моно- и диглицериды
не образуются.
РАСЩЕПЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ
Несколько очень важных классов сложных липидов образованы
производными фосфатидной кислоты. К ним относятся фосфатидилхолины,
называемые также лецитинами, фосфатидилэтаноламины и
фосфатидилсерины. Главную роль играют первые два класса. Фосфатидилсерины
распространены гораздо менее широко; их значение определяется в основном
тем, что они участвуют в синтезе фосфатидилэтаноламинов (см. гл. XVI).
Фосфатидилэтаноламины и фосфатидилсерины объединяют иногда под общим
названием кефалины. Отдельные представители каждого из названных
классов различаются между собой природой этерифицированных жирных кислот.
Большинство фосфатидилхолинов содержит одну насыщенную жирную
кислоту, этерифицированную в а'-положении, и одну ненасыщенную
жирную кислоту, этерифицированную в ?-положении.
В производных фосфатидных кислот имеется центр асимметрии при
?-углеродном атоме. Показано, что встречающиеся в природе производные
стереохимически сходны с L-a-глицерофосфатом (см. гл. XI).
Свободная фосфатидная кислота также встречается в природе, хотя
и в относительно небольших количествах (по сравнению с другими фосфо-
липидами). Лецитины и кефалины чрезвычайно распространены: во многих
тканях именно они составляют основную часть липидов.
О
II
О СН2ОС — Ri
II I
R2—COC — H О- СНз
I I I
СН2—О —Р —ОСН2СН2 —+N —СН3
II I
О СН3
Фосфатидилхолин
О
О CI-IoOC —Ri
II !
R2 —COC— H 0-
-O — P — O —CH2—CH2 —+NH3
CHo —(
Фосфатидилэтаполамин
О
O:CH2OC — Rj
R2—COC —H OH +NH3
CHo —О —Р —0 —CHo—С—СО;
!! I
о н
Фосфатидилсерин
22—246

338 Глава XIII
Ферментативное расщепление лецитинов и кефалинов изучено
недостаточно. Известно пять ферментов, способных расщеплять одну или несколько
эфирных связей в молекуле фосфатида: четыре фосфатидазы (А, В, С и D)
и лизофосфатидаза.
Фосфатидаза А содержится в ядах змей, пчел и ос, а также в тканях
животных и, возможно, в растениях и бактериях. Фермент отщепляет от
молекулы фосфатида одну жирную кислоту, что приводит к образованию лизо-
фосфатида:
Фосфатидаза А
Фосфатид > RCO2H+ Лизофосфатид. (XIII.1)
Разрыв связи происходит специфически, в ?-положении.
Лизофосфатидаза завершает отщепление жирных кислот из фосфатидов,
катализируя превращение лизофосфатидов в соответствующие глицеро-
фосфорильные производные:
О
II
СНзОС —Rt СН2ОН
НО —СН О- + Н2О —> НО — СН О- -f-RiCO2H (XIП.2)
СНоОР —OR СН2ОР —OR
а л
Фосфатидаза В совмещает функции фосфатидазы А и лизофосфатидазы.
Этот фермент катализирует разрыв обеих ацилэфирных связей, что
непосредственно приводит к образованию глицерофосфорильного основания:
О СН2ОС — Щ СН2ОН
Е2-СОСН О- +2Н2О -> НО-СН О- -f-RiCO2iH+R2CO2H (XtII.3)
СН2 —OP —OR СН2 —О —Р —OR
Фосфатидаза С катализирует гидролиз фосфодиэфирных связей между
L-a-фосфатидной кислотой и азотистым основанием (реакция XIII.4), а
фосфатидаза D — между а,р-диглицеридом и фосфорилированным основанием
(реакция XIII.5).
О
О СН2ОС — Ri
R2-GOCH О-
I | U2U
СН2—О —Р —О —СН2СН2 —N+(R'K >
О СН2ОС —Rj
R2 — СОСН О- +НО-СН2СН2— N+(R'}3
СН2 — О— Р — ОН
о1

Окисление жирных кислот и расщепление сложных липидов 339
О
О CHoOC-R,
II I
COCH
н2о
о-
СН2 — О — Р — ОСН2СНа — N+(R'K
О
О СН2ОС — Rj
H +-НО3Р —ОСНгСНа —N+(R'K
аОН
СН2С
Последовательность реакций расщепления фосфатидов на отдельные
компоненты, т. е. реакций, катализируемых упомянутыми (или
родственными) ферментами, неизвестна.
ОКИСЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
Окислительное расщепление жирных кислот — универсальный
биохимический процесс, протекающий во всех живых организмах. У
млекопитающих этот процесс происходит во многих тканях, в первую очередь в
печени, почках и сердце. В i клетке окисление жирных кислот локализовано в
митохондриях.
РАННИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Первые предположения о путях окисления жирных кислот высказал
Кноп еще в 1904 г., а вскоре вслед за ним — Эмбден и Дакин. Однако прошло
почти 50 лет до того, как блестящие догадки Кнопа получили полное
экспериментальное подтверждение. Кноп выдвинул свою гипотезу «?-окисления»
на основе опытов по скармливанию животным жирных кислот, концевой
фрагмент которых был помечен фенильной группой. Это давало
возможность идентифицировать конечные продукты превращения жирных кислот
в моче подопытных животных. При скармливании ?-фенилжирных кислот
с неразветвленной цепью и четным числом атомов углерода в моче
накапливалась фенилацетуровая кислота, образующаяся in vivo путем
конденсации фенилуксусной кислоты и глицина:
О H
/ Ч—CH2CO2H+H2N — СН2 — СО2Н —> ^ Ч— СН2 — С — NCH2CO2H. (XIII.G)
Фенилацетуровая кислота
Если же скармливались меченые жирные кислоты с нечетным числом
углеродных атомов в неразветвленной цепи, то в моче накапливалась гиппуро-
вая кислота, образующаяся in vivo путем конденсации глицина с бензойной
кислотой:
О H
/—V_iJ_]
|| |
/ _ cOaH + UjaN —CHnCOjjU —> / Ч—С—NCH2CO2H (XIII.7)
Гиппуровая кислота
Это именно те результаты, которых следовало ожидать, если деградация
жирных кислот происходит путем последовательного отщепления двуугле-
22*

340
Глава XIII
родных?фрагментов от исходной молекулы. Отдельные реакции, ведущие
к отщеплению двууглеродных фрагментов от молекул жирных кислот,
были записаны в том виде, как они изображены на фиг. 98.
1
UCHOHCHaCOjjH ^ RCH = CHCO2H ?-Окисление до нояасьтщенной
45 или ?-OH-кпслоты
Окисление до ?-кетокислоты
Отщепление двууглеродного
фрагмента, приводящее к
жирной кислоте с цепью,
укороченной на два атома
углерода
Фиг. 98. Последовательность реакций окисления жирных кислот (по Кнону).
Одно из главных затруднений, на которые наталкивалась гипотеза
Кнопа, Эмбдена и Дакина, заключалось в том, что требовалось объяснить,
каким образом окисление жирных кислот приводит к образованию
ацетоуксусной кислоты и других кетонных тел, например оксибутирата и
ацетона (образующихся из ацетоуксусной кислоты). Эмбден и Дакин
предполагали, что концевой четырехуглеродный фрагмент обычных жирных кислот
не окисляется дальше стадии ацетоуксусной кислоты. Отсюда следовало,
что ацетоуксусная кислота должна образовываться в стехиометрических
количествах при окислении «четных» жирных кислот. По тем же причинам
«нечетные» жирные кислоты должны были давать стехиометрические
количества пропионовой кислоты без какого-либо образования кетонных тел.
В ходе дальнейших экспериментальных исследований была выявлена
несостоятельность этих предположений, что потребовало видоизменения теории
окисления жирных кислот. В 1940 г. Маккей, Уик и Барнум предложили
теорию «?-окисления — конденсации», которая включала в себя большую
часть исходных посылок Кнопа, но в которой предполагалось, что
ацетоуксусная кислота образуется посредством конденсации двух ацетатных
фрагментов по схеме (XIII.8),
СН3СН2СН2СН2СН2СН2СН2СО2Н —> 4"СН3СО2Н"
СН3СН2СН2СН2СН2СН2СО2Н —> 2"СН3СО2Н" -
> 2СН3СОСН2СО2Н
СН3СОСН2СО2Н
сн3сн2соан —» сн3сосо2н
(XIII .8
Из этой схемы однозначно следует, что и карбонильный и карбоксильный
атомы углерода ацетоуксусной кислоты происходят от карбоксильных
углеродных атомов исходной жирной кислоты. Этот вывод полностью
подтвердился в последующих экспериментах с радиоактивной меткой.

Окисление жирных кислот и расщепление сложных липидов
341
ПУТЬ ОКИСЛЕНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
После работы Кнопа главную роль в установлении путей окисления
жирных кислот сыграли два события: 1) изучение окисления жирных кислот
в бесклеточных препаратах печени морских свинок, проведенное Лелуаром
и Муньосом в 1939 г., и 2) выяснение природы «активации» жирных кислот
АТФ KoASH АМФ ФФН
/Уиокиназа
СН3(СНгСНг)П_|СНгСНіСО2Н-^Іктивцро8Шше'р: СН3(СНгСН2)л_,СН2СН2СО5КсМ
\
\Гиофораза/ Е-ФАЛ"—-
Аирлдегиорогеипза
Е-Восст.ФДД-*—•
R,COSKo/1 R,CO2
СН3(СНгСН2)л_,СН =CHCOSKoA
\
HzO --J Еноилгидратаза
CH3(CH2CH2)„_,CHOHCH2.COSKo/1
НАЛ*
ШД-Н+ Н4
CH3(CH2CH2)„_,COCH2COSKu/1
?-OH-ацшідсгидроганаза
^ KoASH
?-Кетотисмаза
CH3COSKo4
Паследовотелыюсть
тех же самых реакций
CH3(CH?CH2)n_2cOSKo4
Последовательность [
тех же самых реакции" [
CH^COSKOA
CH5CH2CH2COSKo4
CH3COSKo4
Последовательности I
тех же самых реакций Г
СНьСОЗКоА
Фиг. 99. Схема окис.чеїшя жирпъгх кислот.
CHjCOSKO/l
в работах Линена и Рейхерта, которые в 1951 г. показали, что
активированные жирные кислоты представляют собой ацилпроизводные кофермента А.
Использование бесклеточных препаратов позволило идентифицировать
отдельные ферменты, участвующие в окислении жирных кислот, и изучить
свойства катализируемых ими реакций. Открытие ацилпроизводпых KoASH
(после того как Липманом был открыт сам кофермент А)*дало возможность
решить наиболее запутанный вопрос в проблеме окисления жирных
кислот — оно позволило понять, почему, несмотря на все попытки, не
удавалось обнаружить постулированных промежуточных продуктов и свободных
жирных кислот с короткой цепью, которые должны возникать в ходе
окисления более длинных молекул. Теперь ясно, что все эти промежуточные про-

342 Глава XIII
дукты и образующиеся в процессе окисления жирные кислоты с короткой
цепью встречаются лишь в виде ацилпроизводных KoASH.
Схема окисления жирных кислот приведена на фиг. 99. Исходная
молекула жирпой кислоты активируется путем превращения в
соответствующее ацилпроизводное KoASH, окисляется до а, ?-ненасыщенного
соединения, 'їгидратируется, окисляется до ?-кетопроизводного и, наконец,
подвергается тиолизу с образованием ацетил-SKoA и ацилпроизводного KoASH,
в; котором остаток жирной кислоты имеет на два атома углерода меньше.
Образовавшийся ацил-SKoA в свою очередь претерпевает те же самые
превращения. Рассмотрим теперь каждую стадию отдельно.
АКТИВАЦИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
Превращение жирных кислот в ацилпроизводные KoASH может
осуществляться разными путями. К ним относятся реакции, катализируемые
ацетаттиокиназой, тиокиназами жирных кислот с длинной цепью и цепью
средней длины, тиофоразами, а также ГТФ-зависимой тиокиназой.
Ацетаттиокиназа. Широко распространенный фермент; катализирует
следующую суммарную реакцию:
О
||
^ CH3G — БКоА+АМФ + ФФн. (Х1И.9)
В присутствии приблизительно эквимолярных концентраций ионов Mg2 +
и АТФ константа равновесия реакции (XIII.9) близка к единице. Такой
результат указывает, что стандартная свободная энергия гидролиза АТФ
до АМФ и ФФН и энергия гидролиза ацетил-SKoA близки друг к другу.
Ацетаттиокиназа активируется ионами К+, Rb+ и NH^; ионы Na+ и Li+ ее
ингибируют. Фермент активирует уксусную, пропионовую и акриловую
кислоты, но не действует на жирные кислоты с длинной цепью. Ацетаттио-
киназная реакция (уравнение XIII. 10) в действительности состоит из двух
реакций; в обеих этих реакциях участвует промежуточный продукт —
ациладенилат — прочно связываемый на поверхности фермента:
о'
е+сн3со2н+атф тг^; Lch3—с—амф_|«е+ффн,
(XIII.10)
О~1 О у '
СН3 —С —АМФ_]-E+HSKoA ^ СН3 — С— SKoA+АМФ+Е.
Тиокиназа жирных кислот с цепью средней длины. Широко
распространенный фермент; катализирует образование KoASH-производных
насыщенных жирных кислот, содержащих от 4 до 12 атомов углерода. Если отвлечься
от природы субстратов, то эта реакция весьма напоминает реакцию,
катализируемую ацетаттиокиназой (уравнения XIII.9 и XIII.10). Наряду с
насыщенными жирными кислотами фермент активирует также бензоаты,
ненасыщенные кислоты, оксикислоти, пиколиновую кислоту и некоторые другие.
Вместе с тем фермент абсолютно специфичен в отношении АМФ и HSKoA,
играющих роль акцепторов ацильной группы.
Тиокиназа жирных кислот с длинной цепью. В печени млекопитающих
была обнаружена тиокиназа, способная активировать жирные кислоты,
содержащие до 22 атомов углерода. Реакция, по-видимому, весьма сходна
с теми, которые обсуждались выше.
Тиофоразы. Катализируют взаимопревращение свободных кислот и
соответствующих ацилпроизводных KoASH:
О О
R1 —С—S
SKoA+R2CO3H "^ RjCOaH + Ra —С — SKoA (XIII.11)

Окисление жирных кислот и расщепление сложных липидов
343
Тиофоразы можно разбить на два класса: 1) ферменты, катализирующие
перенос HSKoA от ацетил-SKoA на алифатические кислоты, и 2) ферменты,
катализирующие перенос HSKoA от сукцинил-SKoA на ацетоуксусную
и другие ?-кетокислоты.
ГТФ-зависимая шиокиназа. Из митохондрий печени крупного рогатого
скота была выделена ацилтиокиназа, которой в качестве кофермента
необходим ГТФ. Суммарная реакция, катализируемая этим ферментом,
имеет вид
о
м^ л
RCO2H4-HSKoA + rT<D —^ R— С —SKoA + ГДФ + Фц. (XIII.12)
Фосфотрансацетилаза. У некоторых микроорганизмов ацетил-SKoA
может быть получен из ацетата в двустадийной реакции (уравнение XIII.13)
без образования в качестве промежуточного продукта ацетиладенилата.
Начальная реакция, катализируемая ацетаткиназой, заключается в
образовании ацетилфосфата из ацетата и АТФ. Вторая реакция катализируется
фосфотрансацетилазой и состоит в переносе ацильной группы от фосфата
па HSKoA:
О
СН3СО3Н +
О
СН3 —С—ОРО3Н2-1-АДФ,
О
СН
— С-
Разнообразные пути образования
в табл. 39.
(XIII.13)
ug-f-HSKoA ^І GH3C —SKoA + Фн.
ацилпроизводных Ко AS H сведены
Таблица 39
Пути образования ацилпроизводных KoASII
Реакция
RC02H -f АТФ-\-HSKoA ^±
О
1|
^ RC — SKoA -1- ЛМФ ~ ФФ„
RCOoH + ГТФ + іISKoA -^
^ RCOSKoA-1- ГДФ -f Фц
RiC— SKoA + R2CO2H ^±
0
0
II
^rRiC02H + R2CSKoA
0
1!
RCO2H-f АТФ -^ RCOPO3II3 +
-f-АДФ
0
II
RCO PO3H2 + HSKoA -^
0
II
^t R—C —SKoA + H3PO4
Ферменты
Ацетаттиокияаза
Тиокиназа жирных
кислот
Тиокиназа жирных
кислот
ГТФ-завислшая
тиокиназа
Ацетаттиофораза
Бутират-сукцинат-
тиофораза
Ацетоацетат-сук-
цинат-тиофораза
Ацилкпназы
Фосфотрансаци-
лазы
Длина углеродной
цепи субстрата
С2-С3
с4—сіі
Сю —Gig
?
Ri^CI-Із
R2 = G2 —C5
U1 = GH,CH,CO21I
Rz-Ca-Cs"
Ri = ClI2CHoCO2H
R2-RCOCU2
G2; C4 (порознь)
C3; C4 (порознь)
Где протекает
реакция
Дрожжи, высшие
организмы
Печень
Мпкро организмы
Сердце, печень
Различные ткани
мле копитающих
(не печень!)
Микроорганизмы
Микроорганизмы

344 Глава XIII
Дегидрогеназы Ко ASH-производных жирных кислот. Четыре дегидроге-
назы такого типа были выделены в очищенном виде из митохондрий печени
млекопитающих. Каждый из этих ферментов катализирует реакцию
(XIII. 14) с ФАД в качестве кофермента:
О НО
il! _^ I II
Е.ФАД + R —СН2 —СН2 —С —SKoA^E-BocoT. ФАД + R — С=С — С — SKoA. (XIII.14)
H
Ферменты различаются по своим физическим свойствам и по субстратной
специфичности, особенно в отношении длины углеродной цепи субстратов.
Еноилгидратазы. Митохондрии печени млекопитающих содержат еиоил-
гидразу (кротоназу), которая катализирует превращение транс-2-еиоял-
производных KoASH в соответствующие L-?-оксиацильные соединения:
H О ОН О
I ill .1 II
R-C —C = C-SKoA + H2O —" R—С —СН2 —С—SKoA. (XIII. 15)
і " і
(L-конфигурация)
Как следует из этого уравнения, присоединение молекулы воды является
стереоспецифичным, причем образуются только L-?-оксиацилпроизводные
KoASH. Этот фермент катализирует также гидратацию zfuc-изомера,
по-видимому, без изменения стереоспецифичности, что приводит к D-?-оксиацил-
производным KoASH.
ft-Оксиацил-S Ko A-дегидрогеназы. Из митохондрий печени крупного
рогатого скота и сердца свиньи были выделены в высокоочищенной форме
ферменты, которые специфически катализируют окисление L-?-оксиацилпроиз-
водных KoASH. Ферменты, вероятно, неспецифичны в отношении длины
цепи субстрата и катализируют реакцию, суммарное уравнение которой
имеет вид
ОН О 0 0
CHa —С—SKoA + IIAfl+ ^ R —С-СН2— С — SKoA + НАД.Ц + Н+ (ХШ.16)
H
Вследствие того что эта реакция сопровождается выходом протона в среду,
равновесие сильно зависит от pH: при pH 7 оно сдвинуто в сторону
образования р-оксиацил-SKoA, а в более щелочной среде — при pH 9 — в сторону
образования р-кетоацил-SKoA.
fi-Кетотиолаза. Фермент катализирует тиолиз ?-кетоацилпроизводных.
KoASH
О О
II II
R — С — СН2 С — SKoA + 1-ISKoA R —С—SK.0A + CH3 —С —SKoA (ХШ.17)
II II ^
О О
Равновесие сильно сдвинуто в сторону расщепления. Высокоочищеняый фор
мент этого типа из митохондрий печени крупного рогатого скота
катализирует расщепление субстратов, содержащих от 4 до 12 атомов углерода.
Поэтому, по крайней мере в тех тканях, где происходит окисление жирных
кислот с длинной цепью, необходимо присутствие нескольких различных.
?-кетотиолаз.
Суммируя все предыдущие реакции, получаем полную реакцию
окисления жирных кислот с четным числом атомов углерода до ацотил-SKoA. Пол-

Окисление жирных кислот и расщепление сложных липидов 345
ное уравнение баланса реакции имеет следующий вид:
СН3 (СН2СН3)„СО2Н + АТФ + (га + l)KoASI-I-f гаНАД+ -\-nE-ФАД + пН2О =
Фн
= (n+l)CII3COSKoA + ( ^Ф+ н І+лНАД-Н-І-геЕ-Восст. ФЛД+ге1І+. (ХШ.18)
\ АМФ + ФФН /
Приведенная выше последовательность реакций окисления жирных кислот
позволяет объяснить явление так называемого инициирования. Для того чтобы
окисление жирных кислот могло начаться, необходимо присутствие
каталитических количеств некоторых ди- и трикарбоновых кислот. Дело в том, что
в процессе окисления этих кислот образуется АТФ (сы. гл. XIV и XV),
который в свою очередь необходим для активации жирпых кислот. Другая
роль инициирующего субстрата заключается в том, чтобы служить партнером
для конденсации с продуктом окисления жирных кислот, т. е. с ацетил-SKoA.
Эта конденсация обеспечивает последующую деградацию двууглеродных
фрагментов в цикле лимонной кислоты (который детально рассматривается
в гл. XIV).
Известно, что карнитин (у-триметиламино-р-оксибутират) стимулирует
в разнообразных тканях окисление жирных кислот с длинной цепью.
Например, KoASH-производные жирных кислот, присутствующие в клетке в
растворенном виде, вступают в реакцию трансацилирования, причем акцептором
ацильной группы служит карнитин. Предполагается, что ацилированные
карнитины проходят сквозь митохондриальную мембрану (непроницаемую
для эфиров кофермента А) и'внутри митохондрий снова, превращаются в
соответствующие производные HSKoA (см. гл. XVI). Таким образом, реакции
с участием карнитина дают возможность KoASH-производным жирных
кислот, находящимся вне митохондрий, проникать к окислительным
ферментам, локализованным внутри митохондрий.
ОБРАЗОВАНИЕ КЕТОННЫХ ТЕЛ
При некоторых нарушениях обмена, например при диабете, в крови
накапливаются кетонные тела: ацетоацетат, ?-оксибутират и ацетон. Все эти
вещества образуются в процессе обмена ацетоацетил-SKoA. Основной путь
превращения ацетоацетил-SKoA в печени заключается в соединении его
с ацетил-SKoA, что приводит к образованию важного предшественника
холестерина — р-окси-р-метилглутарил-ЭКоА (см. гл. XVI)
О СН3 О
ІГ I II
СН3С - СН2 - С — SKo А + СН3С — SKo А —> НО2С — СНо — С — Що — С — SKo A -f- HSKoA.
Il II I
О О ОН
(XIII.19)
Обычно этот промежуточный продукт практически целиком расходуется
на синтез холестерина. В некоторых случаях особый фермент, отличный
от тех, которые участвуют в синтезе холестерина, катализирует расщепление
Р-окси-Р-метилглутарил-ЭКоА на ацетил-8!Ї.оА и ацетоуксусную кислоту
СНз О О О,
I 11 11 il
НО2С —СН2 —С —СН2—С—SKoA —> СН3С —SK0A + CH3G — СН2 — СО2Н. (XIII.20)
он
Уравнение, получаемое суммированием реакций (XIII 19) и (X1IL20),
представляет собой основной путь образования свободной ацетоуксусной кислоты

346 Глава XIII
в печени. Кроме того, свободная ацетоуксусная кислота может образоваться
при действии фермента деацилазы, который, по-видимому, тоже локализован
в печени:
Н2О
ClLjC — СН2 — С — SKoA > СН3С —СН2 —CO2H + IISKOA. (XIII.21)
О О О
?-Оксибутират получается в результате восстановления свободной ацето-
уксусной кислоты. Эта реакция (уравнение XIII.22) катализируется
ферментом, который был получен в высокоочищенном виде из растворимой цито-
плазматической фракции печени
ОН
-^ СН3-С-С112-СО2Н+ПАД+. (ХШ.22)
Восстановление стереоспецифично: образуется только D-(—)~р-оксибутират.
Ацетон тоже является одним из продуктов обмена свободной ацетоуксус-
ной кислоты. Механизм действия декарбоксилазы ацетоуксусной кислоты —
фермента, ответственного за данное превращение,— тщательно исследовали
Вестхеймер с сотрудниками.
О
II
СН3С — СН2—СО2Н —*• СН3 —С —СН34-СО2. (ХШ.23)
о
Реакция (XIII.23) протекает путем образования шиффова основания между
ферментом и. субстратом с последующим декарбоксилированием и
гидролизом по схеме (XI11.24)
О
II
СНзС—СН2—СО2Н + H2N—E ^
СНз—С
г/
H
сн
1
(+
\
Е
з—С—СН
N
\
Г
\~
СО2
^ * СН3—С=СН2
N
/ \
H E
О
II
зССНз + E—NH2
(XIII.
21)
ОКИСЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ С НЕЧЕТНЫМ ЧИСЛОМ АТОМОВ
УГЛЕРОДА. СУДЬБА ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ
Рассмотренная выше последовательность реакций окисления «четных»
жирных кислот справедлива и для процесса окисления жирных кислот,
содержащих нечетное число атомов углерода в цепи. Основное различие
заключается в продуктах. В первом случае конечная стадия — расщепление
ацетоацетил-SKoA — приводит к образованию двух молекул ацетил-SKoA;
во втором случае расщепление р-кетовалерил-ЗКоА дает одну молекулу аце-
тил-SKoA и одну молекулу пропионил-SKoA. Дальнейший обмен пропио-
нил-SKoA может идти несколькими путями. Важнейший из них — метил-
малониловый путь (уравнения XIII.25 — XIII.27) — включает АТФ-зави-

Окисление жирных кислот и расщепление сложных липидов 347
симое карбоксилирование пропионил-SKoA. Продукт карбоксилирования
сначала превращается в свой энантиомер, а затем изомеризуется в сукди-
нил-SKoA в процессе реакции, катализируемой метилмалонилмутазой
с участием В12-ко фермента:
О Биотин • Е НО2С
)| Mg2+ |
+ ATO+C02 ' СЯ3 —С—С —SKoA+АДФ + ФН, (XIII.25)
і О
H
1
i-
co
IIO2C
СНз-С-'
1
A
О
II
II
-С —SKoA
oH
0
h
C —SKoA ^ CII3-
Ві2-кофермеит 2
H
1
-i-
1
co2
c-c
0
11
II
с
H
— SKoA
0
11
II
;— CH2C — SKoA
(XIII
(XIII
.26)
.27)
Дальнейшие превращения сукцинил-SKoA связаны с последовательностью
реакций цикла лимонной кислоты (см. гл. XIV). Превращения пропионовой
кислоты, описываемые уравнениями (XIII.26) и (XIII.27), протекают в
различных тканях млекопитающих, а также в клетках некоторых
микроорганизмов, в том числе у бактерий, осуществляющих пропионовокмслое брожение.
ОКИСЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ С РАЗВЕТВЛЕННОЙ ЦЕПЬЮ
Пути окисления главных жирных кислот с разветвленной цепью — изобу-
тирата, а-метилбутирата и изовалерата — очень сходны с путями окисления
валина, изолейцина и лейцина соответственно. Эти процессы рассматриваются
в гл. XVII.
ЛИТЕРАТУРА
Davidson F. M., Long С, P e n n y I. F., Biochemical Problems of Lipids, But-
terworths, London, 1956.
Deucl 1-І. J., The Lipids, Interscienco, Now York, 1951.
Green D. E., Fatty Acid Oxidation in Soluble Systems of Animal Tissues, Biol. Rev.
Cambridge Phil. Soc. 20, 330 A954).
Green D. E., W a k і 1 S. J., Enzymatic Mechanism of Fatty Acid Oxidation and.
Synthesis, in K. Bloch (ed.), Lipide Metabolism, Wiley, Now York, 1960.
H a n a h a n D. J., T h о m p s о n G. A., Jr., Complex Lipids, Ann. Rev. Biochem., 32,
215 A963).
И ana h an D. J., Gurd F.R.N., Zahin I., Lipide Chemistry, Wiley, New York,
1960.
.1 a e n і с k e L., L y n e n F., С о о n z y m e A., in P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myr-
back (eds.), «The Enzymes», 2nd ed., vol. 3, p. 3, Academic Press, New York, 1960.
J e n с k s W. P., Acyl Activation, in P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (ods.), «The
Enzymes», 2nd od., vol. 6, p. 373, Academic Press, New York, 1962.
К a t о s M., Lipolytic Enzymes, in K. Bloch (od.), «Lipide Metabolism», Wiley, New York,
1960.
L о v e. г n J. A., Tho Chemistry o{ Lipids of Biochemical Significance, Metbucn, London,
1955.
L у л о n F., Lipide Metabolism, Ann. Rev. Biochem., 24, 654 A955).
Mali) er H. R., Biological Oxidation of Fatty Acids, in K. S. Markley (ed.), «Fatty Acids»,
2nd ed., Part 3, p. 1487, Intorscienco, New York, 1964.

Глава XIV
ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ
Цикл лимонной кислоты (синоним: цикл трикарбоновых кислот), часто
связываемый с именем Кребса х,— это, образно говоря, та главная ось,
вокруг которой вертится метаболизм почти всех существующих клеток.
Естественно поэтому, что он займет центральное место и в нашем обсуждении.
Значение этого цикла, первоначально постулированного для объяснения
полного сгорания пирувата (и, таким образом, углеводов), а также дву- и трех^
углеродных конечных продуктов окисления жирных кислот, вышло далеко
за рамки этих и им подобных чисто катаболических функций, связанных
с выработкой энергии. Цикл Кребса является «фокусом», и котором сходятся
все метаболические пути (см. гл. XI). Поэтому его реакции и субстраты играют
решающую роль в биосинтезе (анаболизме) множества важных соединений,
начиная от аминокислот, пуринов и пиримидинов и кончая жирными
кислотами с длинной цепью и порфиринами.
ЦИКЛИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ АЦЕТИЛ-SKoA
ИСТОРИЯ ВОПРОСА
Исследования по окислению ряда органических соединений, в том числе
некоторых моно-, ди- и трикарбоновых кислот, препаратами из тканей
животных (грубо измельченные ткани, разного рода экстракты, гомогенаты и,
наконец, разделенные и очищенные фракции) были начаты свыше пятидесяти лет
назад Тунбергом, а также Бателли и Л. Штерн. Эти ученые обнаружили, что
из многих опробованных субстратов лишь сукцинат, фумарат, малат и цитрат
окислялись препаратами из мышцы лягушки со скоростью, достаточно
большой для соединений, претендующих на роль промежуточных продуктов
окисления жиров и углеводов. В 1936 г. Марциус и Кноп высказали
предположение, что цитрат превращается в сукцинат указанным ниже путем
(структуру промежуточных продуктов этой цепи реакций см. на фиг. 100):
Цитрат —-* Изоцитрат —> Оксалосукцииат —> а-Кетоглутарат —> Сукцинаг.
В следующем году Крсбс на основе установленного им факта образования
лимонной кислоты (в грудной мышце голубя) из пирувата и оксалоацетата
пришел к заключению, что если упомянутые реакции изобразить в виде
цикла, то можно объяснить полное окисление пировиноградной кислоты
до трех молекул СО2:
-2Н
Пируват + Оксалоацетат —-—?¦ Цитрат —> г^ис-Акопитат —>
—СОа
-2Н -2Н
—-> Изоцитрат —г—> а-Кетоглутарит —-—> Сукцинат —^ Фумарат *
—СОа —СО2
-2Н
-—¦- Малат —*¦ Оксалоацетат.
1 Ганс Кребс— выдающийся английский биохимик, родившийся в Германии,—
получил в 1953 г. Нобелевскую премию но физиологии и медицине аа работу по
промежуточному метаболизму.

Цикл лимонной кислоты
349
Ниже перечислены наблюдения, убедительно свидетельствующие о том,
что эта последовательность реакций (вместе со всеми ее модификациями,
которые мы обсудим пиже) действительно представляет собой главный путь
распада пировиноградной и уксусной кислот (вовлекаемых в цикл в виде
ацетил-КоА) в тканях всех животных, начиная с человека и кончая
парамецией, а также в тканях высших растений и многих микроорганизмов.
1. Было показано, что предполагаемые промежуточные продукты цикла
действительно присутствуют в большинстве исследованных тканей. Кроме
того, скорости окисления этих соединений оказались достаточно высокими,
т. е. вполне соответствующими скоростям превращений участников цикла.
2. Добавление какой-либо из ди- и трикарбоновых кислот сильно
увеличивает интенсивность эндогенного дыхания. При этом поглощение кислорода
во'много раз превышает количество, которое потребовалось бы для окисления
Углеводы •
-СЩСОСОг
S КоА
Жирные кислоты
mpeo-Ds-Ls- изоцитрот
СО,
со;
^¦v© НСН
Сцщанат /^"^-^ I
/ГТФ ) НСН
Ko^SH / г
ГАФ
О
/Sr
НСН
I
со2-
сс-Кетоглутарат
СО;,
2[Н]
Ko^SH
Сцкцітил-KoA
Фиг. 100. Цикл лнмоиноіі кислоты.

350 Глава XIV
самого добавленного соединения. Именно этот последний факт наиболее
убедительно указывает на циклическую природу процесса окисления, ибо если
добавленные субстраты действуют каталитически, а не стехиометрически,
то они должны (хотя бы частично) регенерироваться в ходе реакции. Сходные
эффекты наблюдаются также, если вместо эндогенного дыхания мы изучаем
процесс дыхания при окислении глюкозы, пирувата, лактата, а также жирных
кислот.
3. Малоновая кислота в малых концентрациях (< 0,01 М) является высо-
косиецифичным ингибитором одной из стадий постулированной схемы
реакций, а именно стадии превращения янтарной кислоты в фумаровую.
Введение малоновой кислоты в «дышащую» дыхательную систему приводит к
уничтожению отмеченного каталитического эффекта и накоплению янтарной
кислоты.
4. Распределение С1* в различных промежуточных продуктах,
возникающих при окислении таких типичных субстратов, как глюкоза или жирная
кислота, полностью согласуется с данной схемой.
5. Удалось продемонстрировать протекание отдельных постулированных
реакций в грубо измельченных тканях и гомогенатах, в которых другие
реакции были заблокированы с помощью селективных ингибиторов, а также
в высокоочищенных ферментных системах, выделенных из таких грубых
препаратов.
6. Можно показать, что в клетках животных и растений все реакции
цикла протекают в одной и той же клеточной органелле — митохондрии.
Более того, ферменты, катализирующие отдельные реакции цикла,
присутствуют в митохондриях различных клеток хотя и в неодинаковых
количествах, но примерно в одном и том же соотношении.
ОТДЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ ЦИКЛА
Цикл, каким он представляется нам сейчас, показан на фиг. 100
и в табл. 40.
Мы видим, что собственно цикл объединяет восемь реакций. Одна из них
(реакция 1) приводит к образованию С—¦ С-связи между дикарбоновой
кислотой и производным мюнокарбоновой кислоты (оксалоацетат и ацетил-КоА).
Четыре реакции являются реакциями дегидрирования. Из них две реакции
C и 4) — это реакции окислительного декарбоксилирования, приводящие
к образованию С4-дикарбоновой кислоты из Ce-трикарбоновой, и две (реакции
6 и 8) в совокупности окисляют насыщенную С4-дикарбоновую кислоту
до а-кетодикарбоновой, которая необходима для того, чтобы
последовательность реакций цикла могла быть повторена снова. Из оставшихся реакций
две — 2-я и 7-я — являются реакциями гидратации — дегидратации
(причем реакция 2используется для изомеризации), а последняя (реакция 5)
приводит к фосфорилированию (т. е. включению неорганического фосфата Фн
в нулеозидтрифосфат) за счет окисления субстрата, образованного в ходе
предшествующей реакции.
ФЕРМЕНТЫ, КАТАЛИЗИРУЮЩИЕ ОТДЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ ЦИКЛА
РЕАКЦИЯ (XIV.1)
Реакция 1 катализируется ферментом, сменившим за свою короткую
историю большое число различных названий. Простейшее его тривиальное
название, мало что, впрочем, говорящее,— конденсирующий фермент.
Называют его также цитратконденсирующим ферментом и цитрогеназой.
В табл. 40 приведены оба названия, рекомендованных Комиссией по фер-

Реакции цикла лимонной кислоты
Номер
реакции
XIV. 1
XIV.2а
XIV.26
XIV 9n
Л.1 V . Дії
XIV.35>
XIV.4
XIV.5
XIV.6
XIV.7
XIV.8
Уравнение 2)
Ацетил-SKoA-- Оксалоаце-
тат2~+Н2О—»Цитрат3-+
+ SHKoA + H+
Fo2+, GSH
ТТттттпт^"" > ТТпп
1 1 XX 1 І/ЦІ * \ \-Ct\J
цитрат3""
Fe2+, GSH
ТТттттт^~ > une
1 1 XX ірці * tsy Ы/ls
Аконитат3"
LyUL s\txUtlxxi a. I — т^
—>- Изоцитрат3"
Изоцитрат3" + НАД + —>-
Мп2+, АДФ6)
V ff ТГ р Т Г\ і Г1 ГугЯ
—^- СХ JTltj lU^U UtV
со)глутарат2- f НАД• Н+
І TJJ. 1 /~1 (~\
—[— XT. ~]~ uUn
а-Кетоглутарат2~ +
+ SHK о А + НА Д + —>
ТПФ, Лип-Sa
¦ *- Сукцинил-
Mg2+
SKoA-+ СО2 + НАД • H +
1 JT-f-
Сукцинил-SKo А- + ГДФ +
+ Фн + Н2О > Сукци-
Мр2Ч-
нат + ГТФ + SIIKoA
ГЄ2 +
Сукцинат2~ + (ФАД)і°) ^t:
"^ Фумарат2" + (Восст.
ФАД)
Фумарат2" + Н2О ^± L-ма-
лат2~
Ь-малатат2~ + НАД+ ^
"Т^" Оксалоацетат2~ +
+ НАД • H + Н+
Сумма реакций
{XIV.1—Х/Т.?):Ацетил-8КоА + ЗНАД
XIV.9а
—> 2CO2+SHKoA + a
Зх (НАД-Н + 0,502 + Н+->-
—*¦ НАД + + Н2О)
Название фермента
Цитратконденси-
рующий
фермент [цитрат-
сиптаза,
цитрат — оксалоаце-
тат-лиаза (аце-
тилирующая
КоА), цитроге-
наза]
Аконитаза (акони-
тат-гидратаза)
Акої-титячя ^якотти-
^ XXI VjiJ-жХ X *Д *ДД \ 4Л llvl I -1-І.
тат-гидратаза)
Аконитаза (акони-
тат-гидратаза)
Изоцитратд егидро-
геназа (Ds-ii30-
цитрат: НАД —
оксидоредук-
J. ctdd. 1
а-Кетоглутарат-
дегидрогеназа
(комплекс
ферментов)
Сукцинат-тиоки-
наза [сукциБил-
КоА — синтета-
за, сукцинат:
КоЛ —лигаза
(ГДФ)]
Сукцинатдегидро-
геназа [ — :
(акцептор) —окси-
доредуктаза]
Фумараза (фума-
рат-гидратаза)
Малатдегидроге-
паза (L-малат:
НАД — оксидо-
редуктаза)
Типичный
ингибитор 3)
Неизвестен
Фторцитрат *
траис-Акони-
тат *
АТФ
Арсенит, парапи-
руват * 7)
NH2OHS)
Малонат *
Оксалоацетат *
Мезо-тартрат *
(мезовинная кп-
CJIOT3.J
?-F-оксалоацетат*
Фтормалат *
Цикл
+ + (ФАД) + ГДФ +ФП + 2Н2О >
НАД-Н+(Восст. ФАД) + ГТФ+ЗН+
Цепь переноса
электронов
(ветвь
восстановленного НАД)
Барбитураты
Ротенон
Ацтимицин А
Цианид
AGO',
пкал/моль '1)
-9,08
+ 1,59
( V-2 04\
( 0 45)
1,70
—8,82
—2,12 э>
ОН)
—0,88
+6,69
—14,32
—52,4

352
Г лава XIV
Продолжение табл. 40
Номер
реакции
XIV. 96
XIV. LOa
XIV. 106
Общая
сумма:
Уравнение 2)
Зх(НАД-Н-!--0,502-Ь
-:-ЗАДФ4-ЗФи-|-Н+-^
—> НАД+ 4- ЗАТФ+4Ы2О)
(Восст. ФАД) -| 0,502—>
—>(ФАД) + Ы2О
(Восст. ФАД) + 0,502 +
2АДФ+2ФП->(ФАД) +
--2АТФ--ЗН3О
Адотил-SKoA -|- ЗО2 —>
—> ЗСО2 + 2Н2О + SHKoA
Ацетил-SKoA 4- ЗО2 4-
11АДФ -f- ГДФ 4- 12ФН —»
—->ЗСО24-2Н,О4-ИАТФ 4-
+ ГТФ4-8НКоА
Название фермента
То же плюс
окислительное фос-
форилирование
Цепь переноса
электронов
(ветвь сукцината)
То же плюс
окислительное фос-
форипирование
Цикл 4- перенос
электронов
Цикл + перенос
электронов 4-
+
окислительное фосфорипи-
рование
Типичный
ингибитор 3)
Динитрофонол
Олигомицин
Тиенилтрифтор-
ацетон
Антимицип А
Цианид
Динитрофенол
Олигомицин
AGO',
ккал/люль 4)
—30
—36,2
—21
—215,2
— 125,3
1) Приведены реакции, катализируемые митохондриальными ферментами из разнообразных
животных тканей (сердце, печень млекопитающих, грудные мышцы птиц, летательные мышцы насекомых
и т. д.). Внемитохондриальныо ферменты из этих источников, а также ферменты из микроорганизмов
часто имеют характеристики, отличные от приведенных здесь.
2) Дополнительные кофермент или косубстрат показаны над стрелкой; кофакторы или
активаторы — под стрелкой,
3) Конкурентные ингибиторы отмечены звездочкой.
4) Большинство приведенных величин AGO' рассчитано для 25°, pH 7,0, ионной силы 0,15, одно-
молярных концентраций всех реагентов, включая НгО, и давления газов 1 атм.
5) Важный щгемитохондриальный фермент. Катализирует реакцию с обязательным участием НАДФ
в качестве кофермента.
«I АМФ является специфическим кофактором для митохондриального фермента из дрожжей и фер-
мепта из Aspergillus niger.
7) Димер пирувата, накапливающийся при длительном хранении. Имеет следующую структуру:
ОН
t
-О2СС(СНз)СН2СОСО-
8) Действует посредством образования производного гидроксамовои кислоты и субстрата сукци-
нил-КоА.
S) Для реакции сукцинил-КоА-+ Мё»ГДФ-+ Фн~= сУкЧинат2~
= — 0,8 ккал/моль.
10) Скобки обозначают, что флавин прочно связан с белком,
її) Установлено на основе легкой обратимости реакции.
AG0'
ментам: систематическое (цитрат — оксалоацетат-лиаза) и тривиальное
(цитрат-синтаза); ими, очевидно, и следует пользоваться. Цитрат-синтаза
чрезвычайно устойчивый фермент с очень крупной молекулой. Его
специфичность в отношении упомянутых субстратов, по-видимому, близка к
абсолютной: помимо этих субстратов известно лишь одно соединение, с которым
он может реагировать,— монофторацетил-КоА. В присутствии оксалоацетата
монофторацетил-КоА превращается во фторцитрат со скоростью примерно
в 10 раз меньшей, чем скорость реакции с природным субстратом. Известен
фермент, так называемый цитратрасщепляющий фермент (цитрат-лиаза,
нуждающаяся в АТФ), который катализирует сходную реакцию. В процессе
этой реакции (уравнение XIV. 1а), так же как и при реакции (XIV.1,)
по-видимому, образуется в качестве промежуточного продукта связанный с фермен-

Цикл лимонной кислоты 353
том цитрил-КоА:
Цитрат -І-АТФ + SHKoA |Е ^ [Е.Цитрил
н2о|
Ацетил-Ко А + Оксалоацетат + Е (XIV. 1 а)
В реакции (XIV. 1) этот промежуточный продукт самопроизвольно ж
необратимо гидролизуется с образованием цитрата, тогда как в реакции (XIV. 1а)
для его образования из цитрата требуется активация молекулой АТФ.
РЕАКЦИЯ (XIV.2)
Фермент аконитаза (аконитат-гидратаза) катализирует обратимые
реакции гидратации — дегидратации между цитратом и ifwc-аконитатом, а также
между (+)-изоцитратом и г^мс-аконитатом (реакции XIV.26 и XIV.2b;
см. табл. 40). Специфичность его в отношении этих трех субстратов,
по-видимому, абсолютна. Существуют убедительные доводы в пользу того, что обе
реакции катализируются одним и тем же ферментом. При диализе активность
фермента утрачивается, но может быть восстановлена добавлением ионов Fe2+
в присутствии восстановителя. Вопрос о том, является ли образование
tywc-аконитата в качестве промежуточного продукта необходимым условием
взаимопревращений цитрата и изоцитрата, долгое время вызывал споры.
Ясно, что одновременное протекание двух частных реакций (XIV.26)
и (XIV.2в) также могло бы привести к изомеризации. Вопрос, следовательно,
заключается в том, каким путем идет процесс на самом деле. Совокупность
имеющихся экспериментальных данных, по-видимому, исключает второй
путь г.
РЕАКЦИЯ (XIV.3)
В большинстве животных и растительных клеток содержится два
фермента, способных окислять (-|-)-изоцитрат — вещество, весьма
распространенное в природе. Один из них использует ИАДФ, а другой — НАД. Долгое
время полагали, что первый фермент, существенно более активный в
гомогенатах клеток или экстрактах, и есть тот самый фермент, который
непосредственно участвует в цикле лимонной кислоты. Правда, было одно смущающее
обстоятельство, состоявшее в том, что основная ферментативная активность
почти всегда оказывалась связанной с растворимой фракцией цитоплазмы,
хотя уже в то время считалось общепринятым и отмечалось в качестве
наиболее характерной особенности цикла, что все ферменты цикла локализованы
в митохондриях. Положение прояснилось, когда было показано, что мито-
хондриальные ИАД-зависимые ферменты неустойчивы и обладают довольно
своеобразными молекулярными и кинетическими характеристиками. Однако
эти свойства были как раз такими, которых и следовало ожидать от фермента,
выполняющего ключевую регуляторную роль в столь важном участке
метаболизма, каким является цикл лимонной кислоты. Оказалось, что в
присутствии АДФ фермент становится гораздо устойчивее. Более того, АДФ
требуется ферменту для проявления полной активности при малых
концентрациях субстрата. Это обусловлено резким влиянием АДФ на К3 для
изоцитрата. Таким образом, АДФ действует как аллостерический активатор.
Существуют веские основания считать, что кроме АДФ фермент может акти-
1 Недавно опубликована детальная стореохимическая модель функционирования
активного центра аконитазы (J. P. Glusker, J. Mol. Biol., 38, 149, 1968).— Прим. перев.
23-246

354 Глава XIV
вироваться еще таким соединением, как (+)-изоцитрат. Ингибирующее
действие АТФ частично объясняется образованием хелатных комплексов с
двухвалентными ионами металлов (Mg2+ или Мп2+), которые необходимы как
кофакторы. Ферменты грибов имеют несколько отличные свойства; так,
фермент из дрожжей активируется 5'-АМФ (или АДФ — при более высоких
концентрациях).
Ферменты, использующие НАДФ, не проявляют ни одной из этих
особенностей. Кроме того, они отличаются от ферментов, использующих НАД,
размером молекул, локализацией в клетке и природой катализируемой
реакции. В настоящее время нет экспериментальных данных, которые
показывали бы, что в процессе реакции, катализируемой НАД-зависямыми
ферментами, образуется в качестве промежуточного продукта оксалосукцинат,
будь то в свободном или в связанном с ферментом виде. Напротив, для
НАДФ-ферментов существуют убедительные доказательства в пользу
протекания следующих частных реакций:
+НАДФ+
Изоцитрат + Е ^ [Е-Изоцитрат] ^ [Е-Оксалосукцпна^ + ЫАДФЛ + П'1".
^ "'-НАДФ+
(XIV.3a)
Оксалосукцинат + Е ^ [Е-Оксалосукцинат]. (XIV.36)
[Е-Оксалосукцинат] ~^ [Е-а-Кетоглутарат] + СО2
1 \ (XIV.3B)
а-Кетоглутарат -\- Е
Следует заметить, что свободный оксалосукцинат может реагировать с
ферментом, образуя соответствующий комплекс, но он не способен легко
освобождаться с поверхности фермента, и, таким образом, не является
промежуточным продуктом.
Суммарная реакция (реакция XIV.3 табл. 40), т. є. сумдіа реакций
(XIV.За) и (XIV.Зв), требует ионов Мп2+, так же как и восстановительное
карбоксилирование а-кетоглутарата (XIV.Зв + XIV.3a)j и декарбоксили-
рование оксалосукцината (XIV.36 -\- XIV.3b).
РЕАКЦИЯ (XIV.4)
Одна из особенностей обсуждаемого цикла заключается в том, что в нем
имеются две последовательные реакции окислительного декарбоксилирова-
ния, совершенно различные по механизму (реакции XIV.3 и XIV.4, табл. 40).
Реакция (XIV.4) катализируется а-кетоглутарат-дегидрогеиазным
комплексом ферментов (а-КДК), поразительно сходным с комплексом, ответственным
за аналогичные реакции пирувата (ПДК) (см. гл. XI). а-КДК, выделенный
из сердца свиньи, имеет несколько меньший молекулярный вес, чем ПДК
из того же источника C,3-10е и 10-10е соответственно). Комплекс состоит
примерно из інести молекул связанной с белком липоевой кислоты, восьми
молекул ФАД и шести молекул ТПФ. Отдельные его компоненты
катализируют следующие реакции:
ОП
Mg2+ |
^ZZU Еа-ТПФ—CLJ(CH2JCO2+CO2 (XlV/ia)
а-окси-7-карбоксиііропил-ТПФ

Цикл лимонной кислоты
Зо5
ОН
Еа-ТГ1Ф —CH
f-Eb-NH —СО —(СН2M —
S S
—> Еа-ТПФ + Еь-NH —СО —(CII2M — //Х-
-О2С(СИ3J —СО—S SH
(XIV.46-1)
E(,-NHCO(CHaM—
-O2C(C1I2J —СО —S SH
Eb-NHCO(CH2M—
IIS SU
Eb-NHCO(CH2M —
IIS SH
E(,-NIICO(CH2M —
S —S
Сукцинил-8КоА (XIV.46-2)
. ФАД (XIV.4b-1)
+ Н+ (XIV.4b-2)
Ea означает здесь а-кетоглутарат-декарбоксилазу, Еь — редуктазу-транс-
ацетилазу липоевой кислоты и Ес — дегидрогеназу дигидролипоевой кислоты.
Отметим, что а-КДК отличается от ПДК лишь ферментом Еа и общей
стехиометрией комплекса. Суммарная реакция, катализируемая комплексом
[(XIV.4a) + (XIV.46-1) + (XIV.46-2) + (XIV.4b-1) + (XIV.4b-2)], показана
в табл. 40.
РЕАКЦИЯ (XIV.5)
В то время как ацетил-КоА участвует во многих разнообразных обменных
реакциях, роль сукцинил-КоА, образующегося в реакции (XIV.4),
значительно более ограничена. Его основное назначение — обеспечить
непрерывность цикла. Так как данная стадия — превращение сукцинил-КоА
в сукцинат — высокоэкзерогонична, то энергия тиоэфирной связи,
образованной на стадии 4, запасается в виде синтезированного нуклеозидтрифос-
фата. Реакция катализируется сукцинат-тиокиназой и выглядит следующим
образом:
Сукцинил-8КоА + М§
Сукцинат + Mg-Г ТФ + SHKoA. (XIV.5)
В этой реакции в качестве косубстратов могут участвовать ди- и трифосфаты
как гуанозина, так и инозина. ГТФ находится в равновесии с фондом макро-
эргических соединений (в основном АТФ) благодаря существованию
реакции, катализируемой нуклеозиддифосфаткиназой:
ГТФ (или ИТФ п общем случае) +АДФ "Z^ АТФ+ГДФ (или IIДФ)
РЕАКЦИЯ (XIV.6)
Эта главная окислительная стадия цикла катализируется ферментом
сукцинатдегидрогеназой, который прочно вмонтирован в специфические
органеллы аэробных клеток — в митохондрии животных и растений или
в окислительные мембраны бактерий (вследствие чего его часто используют
как специфическую метку такого рода частиц.) Не удивительно поэтому, что
некоторые наиболее важные особенности фермента в его нативиом
физиологическом состоянии все еще остаются для нас непонятными; не выяснены,
в частности, истинная природа акцептора электронов, переносимых от вос-
23*

856 Глава XIV
становленного ФАД, и роль негеминового железа, связанного с ферментом.
Эти вопросы будут обсуждаться в гл. XV.
Гомогенный солюбилизированный фермент имеет мол. вес ~1,75-105
и содержит прочно связанные с белком 4 г-атом негеминового железа и 1 моль
ковалентно связанного (по-видимому, амидной связью) ФАД. Одна из
трудностей в ранних работах по изучению этого фермента касалась определения
его активности после отделения от других компонентов цепи переноса
электронов. Если в своей нативной структурированной форме фермент без труда
реагирует с многочисленными акцепторами и в качестве «сукциноксидазы»
или «редуктазы красителей» (реакции XIV.6a и XIV.66) использует в той
или иной степени всю дыхательную цепь, то солюбилизированный фермент
может реагировать лишь с весьма ограниченным числом акцепторов
электронов, способных окислять флавин (реакция XIV.6в):
Сукцинат + Ев-ФАД ^ Фумарат + Es-Восст. ФАД(ФП8Н2), (XIV.6)
Митохондриальная
Es-Bocct. ФАД + і/2О2 > Е8-ФАД(ФП„)+На0, (XIV.6a)
цепь переноса влектронов "
С 2 Краситель (le-акцептор) -ч компоненты цепи
Е„.Восст. ФАД+ ' —-¦ '
•-Краситель Bе-акцептор) J переноса электронов
-^ Е.-ФАД+ {I КРаситель" +2Ы+1 (XIV.66)
I Восст. краситель J
^ т, л.тг , f2 Краситель (le-акцептор) "І Непосредственно
Е.-Восст. ФАД + S т, /о ч г >
I Краситель Bе-акцептор) J
-> Е..ФАД+ il КРаситель" +2Н+j (XIV.6B)
1_ Восст. краситель J '
iis означает здесь апофермент сукцинатдегидрогеназы, а ФП8 — флавопро-
теид сукцинатдегидрогеназы.
Для растворенного фермента лишь феназинметасульфат (N-метилфена-
зинийметасульфат) и феррицианид калия представляют практический
интерес как акцепторы электронов. Реакция (XIV.6) легко обратима и
обеспечивает полное восстановление фумарата до сукцината, если используемый
краситель обладает достаточно низким окислительно-восстановительным
потенциалом (восстановленный ФМН, виологеновые красители и т. п.),
дающим возможность реакциям (XIV.66) и (XIV.6b) протекать справа
налево.
РЕАКЦИЯ (XIV.7)
Обратимая реакция гидратации — дегидратации фумарат ^ малат
катализируется ферментом фумаразой. Были тщательно исследованы кинетика
и механизм действия кристаллической фумаразы, выделенной из сердца
свиньи. Этот фермент с молекулярным весом 2,2-105 состоит из четырех
одинаковых полипептидных субъединиц (мол. вес. 48,5- 10s). Для
протекания реакции никаких кофакторов не требуется, но эксперименты четко
указывают на участие в реакции кислого (т. е. протонированного) и
основного (депротонированного) остатков. Их значения рК при ионной силе
0,01 равны 6,2 и 6,8 соответственно; по-видимому, это либо два гистидино-
вых остатка, либо один остаток гистидина и один остаток аминодикарбоновой
кислоты. Реакция стереоспецифична в обоих направлениях. Добавление
или отщепление элементов молекулы воды осуществляется только в траис-
конформации. Это было показано в опытах, где использовали D2O и
анализировали продукт реакции L-малат как химическими, так и физическими

Цикл лимонной кислоты
357
методами (ЯМР, дисперсия оптического вращения):
со;
1}П И-
н пп*-|
/
Медлен *Н
H ПП+-
НПП
сог-
Промежуточный продушСПП) Е Фумарат
[— ПІГ-D]
Существуют следующие различные способы изображения 3-мо
L-малата (эритро-Ьа~малит-3-с1), показанного в скобках слева:
cor
со?
¦—н
I
со2
одеитеро-
со?
РЕАКЦИЯ (XIV.8)
Окисление L-малата L-малатдегидрогеназой является зав
реакцией цикла, в процессе которой вновь образуется исходное в
оксалоацетат. Фермент использует НАД и обладает строгой
ностью по отношению к малату в Ь-(Г1)-конфигурации и направ
соединения водорода, которое происходит только с а (А)-стороіфі
нового кольца. В клетках млекопитающих обнаружены две изофо
дегидрогеназы, одна из которых, вероятно, локализована в митс
СУММАРНАЯ РЕАКЦИЯ
Мы только что проследили, как за один оборот цикла,
из восьми ферментативных реакций, происходит деградация о; ной
молекулы ацетил-КоА или одной молекулы пирувата (если учесть, чт
дегидрогеназный комплекс катализирует реакцию: Пируват"
НАД+->Ацетил-8КоА
К
до СО2 и Н2О. Обпая
стехиоД Д )
метрия для ацетил-КоА приведена в табл. 40. Для пируват
со стехиометрическими коэффициентами выглядит следующий
Пируват- +2,5О2 + Н+
ЗСО2 + 2Ы2О.
ршающеи
!ЩЄСТВО —
специфич-
нию при-
пириди-
мы малат-
хондриях.
остоящего
пнруват-
SHKoA +
реакция
образом:
Отсюда следует, что для непрерывной работы цикла — этого
метаболического механизма, предназначенного для полного окисления пирувата
или ацетил-КоА,— коферменты, перешедшие в восстановленное состояние,
должны снова окислиться. Окисление осуществляется совокупностью
переносчиков электронов, которая в агрегированном виде называется цепью
или системой переноса электронов ЦПЭ). Системы переноса электронов

358 Глав а. XIV
размещены главным образом в тех же самых частицах, которые ответственны
за процессы окисления, происходящие в цикле на уровне субстратов. Таким
образом, одна из важнейших функций цикла лимонной кислоты в составе
клеточных структур заключается в обеспечении взаимодействия
разнообразных дегидрогеназ с молекулярным кислородом. Основное назначение
цикла состоит не столько в «перемалывании» до СО2 и Н2О всех тех
соединений, которые могут образовать ацетил-КоА или любой другой член
цикла, сколько в превращении потенциальной химической энергии в
метаболическую энергию, запасенную в форме молекул АТФ. Поэтому цикл
должен также обеспечивать условия для образования этих молекул за счет
окислительных реакций. Только в одной из реакций цикла, а именно в
реакции 5, эта задача выполняется непосредственно, на субстратном уровне.
При этом в энергию макроэргических связей переходит лишь
незначительная часть общей потенциальной энергии, примерно 215 ппал на 1 моль аце-
тил-КоА или 275 ппал на 1 моль пирувата. Практически вся эта энергия
(конкретно - И из 12 моль АТФ при окислении 1 моль ацетил-КоА или 14
из 15 моль АТФ при окислении 1 моль пирувата и соответственно 34 из
38 моль при окислении 1 моль глюкозы; см. гл. XI) запасается в процессе
окислительного фосфорилирования, сопровождающего перенос электронов
в митохондриях. Подробнее эти вопросы будут рассмотрены в гл. XV.
Итак, цикл лимонной кислоты — это каталитический механизм, при
помощи которого осуществляется полное сгорание не только ацетил-КоА
и всех соединений, способных его образовать, но также любого компонента
цикла или любого соединения, способного превратиться в один из
компонентов цикла. Как же работает этот механизм? Ясно, что реакции 2—7 или
2—8 (см. фиг. 100) сами по себе могут осуществлять дегидрирование (а при
сопряжении с системой переноса электронов — также аэробное окисление)
любой ди- и трикарбоновой кислоты цикла лишь до малата или оксало-
ацетата, но но дальше. Проблема, следовательно, сводится к тому, как
получить ацетил-КоА из малата или оксалоацетата. Зная решение этой
проблемы, мы можем рассматривать последующие стадии просто как
превращения оксалоацетата, продолжающиеся до тех пор, пока не останутся
лишь каталитические количества этого соединения:
Малат (или оксалоацотат) —> Ацетил-КоА+ 2СО2, (XIV.11)
Лцетил-КоЛ f Оксалоацотат —> Цитрат —> 2СО2 + ЯаО-{- Оксалоацетат. (XIV.12)
Стадии, непосредственно ответственные за протекание реакции (XIV. 11),
по-видимому, катализируются двумя ферментами, работаЕОщими сообща, —
малатдегидрогеназой (декарбоксилирующей) и пируватдегидрогеназой 1.
Напомним, что первый из них — это внемитохондриальный фермент,
использующий НАДФ (см. гл. XI) и осуществляющий превращение малата в пиру-
ват. Он же способен катализировать необратимое декарбоксилирование ОА '¦
МП2+
+ Т-ТАДФ+ ~ZU Пируоат-+ СОа + НАДф.Н + Н+, (XIV.13а)
ОА2- -^ Пирупат- + НСОз. (XIV.136)
1 В бактериальных клетках реакция может иметь иной механизм:
-со2 -фн -co2
ОА ¦*¦ ФЕП ¦> Пируват > Ацетил-КоА.
-СО2

Цикл лимонной кислоты 359
В заключение еще раз рассмотрим кратко путь превращений пирувата.
Это соединение образуется в цитоплазме либо из углеводов, либо из
молочной кислоты. Далее оно попадает в митохондрии, где сначала превращается
в ацетил-КоА, а затем «сгорает» при условии, если присутствует в
достаточном количестве одна из кислот цикла для инициирования начальной
конденсации.
Если эта возможность но реализуется, например из-за постоянного
расхода на другие метаболические нужды одного или нескольких членов
цикла, то пируват прежде всего карбоксилируотся до С4-дикарбоновой
кислоты в ходе анаплеротической реакции. У животных наиболее вероятным'
кандидатом на роль катализатора этой стадии является пируваткарбокси-
лаза, использующая АТФ (см. стр. 299). У Е. coli пируват превращается
прямо в фосфоенолпируват (ФЕП) за счет энергии АТФ. При этом
освобождаются АМФ и Фн. Затем ФЕП-карбоксилаза карбоксилирует ФЕП до ОА
(см. стр. 299).
РОЛЬ ЦИКЛА В КАТАБОЛИЗМЕ И В ГЕНЕРАЦИИ ЭНЕРГИИ
Мы уже отметили, что цикл лимонной кислоты (вместе с
вспомогательными ферментами) представляет собой в высшей степени эффективное
каталитическое устройство, обеспечивающее полное сгорание углеводов, ацетил-КоА
и всех компонентов самого цикла (с одновременным образованием на каждый
оборот цикла 12 молекул АТФ). Отсюда ясно, что любой метаболит,
способный распадаться до одного из упомянутых соединений, может
«поддерживать огонь» в этой метаболической топке (фиг. 101).
Большинство органических соединений относится к одному из трех
основных классов, представители которых образуют обычное метаболическое
«топливо»,— к углеводам, липидам или белкам. Мы ужеобсуждали в гл. XI
окисление углеводов и показали, каким образом из данных метаболитов
образуется ацетил-КоА и такие связанные с ним соединения, как лактат,
ацетат, ацетальдегид и этанол. Жирные кислоты, в которых сосредоточен
основной запас энергии липидов, также производят ацетил-КоА в
результате реакций ферментативного ?-окисления, катализируемых группой мито-
хондриальных ферментов (см. гл. XIII). При этом в наиболее часто
встречающемся случае — когда жирная кислота содержит четное число атомов
углерода в неразветвленной цепи — ацетил-КоА является единственным
продуктом. Окисление других жирных кислот приводит наряду с ацетил-КоА
к пропионил-КоА. Из фиг. 101 видно, что ацетил-КоА и сукцинил-КоА
поставляют основную массу атомов углерода, вовлекаемых в цикл. О первом
пути уже было сказано достаточно; поэтому стоит здесь кое-что сказать
о втором. У «формы а» метилмалонил-КоА, т. е. у той его формы, которая
является продуктом окисления жирных кислот с нечетным числом атомов
углерода, жирных кислот с разветвленной цепью и алифатических
аминокислот, конфигурация при асимметрическом ато діє углерода не
соответствует специфичности метилмалонил-КоА — мутазы (этот фермент
способен превращать в сукцинил-КоА только «форму &»). Сначала, следовательно,
должна сработать метилмалонил-КоА — рацемаза, катализирующая
взаимопревращение обоих стереоизомеров.
Катаболизм различных аминокислот будет рассмотрен в гл. XVII. Здесь
мы хотим подчеркнуть только следующее. Вообще говоря, существует два
основных пути превращения ос-аминокислот в соответствующие сс-кето-
кислоты, т. е. того превращения, которое составляет первый шаг в
катаболизме большей части соединений этого класса. Один путь — это окисле-

Лизин Триптофан
Жирные кислоты
Пропиоиил-КоА
Углеводы
Алании \\ Лактат
Серии
Фенилаланин
Урацил
СНъСОСНгСО5 КоА
Ацетоацетил-КОА
COS.KOA
Малонил-КоА
Ацетил-КоА
Аспартат \
О
Фумарилацеюо-
ацетат
t
Тирозин
Фетлалтшн
у-Амитбутират
Timm
СОг~
СемиальЬегиЬ СН3— С—H
янтарной кислоты
L-глутамот
COS КоД
СемиальЬегиЬ
Метилмалонил-КоА ("Ь") «
к ' глутаминовоикислоты
Валин
\уА
Прапиопил-КаА ос-Метилацетоацетил-
Орнишин
X
Пропионат \ Изолеицин
Жирные Кислоты сс-Кетабутират
fo V\ Аргинин -*. Цитрулин
Метиотн Триптофан
Фиг. 101. Цикл лимонной кислоты и катаболические процессы.
Многостадийные реакции отмечены крупными (двойными) отрепками. Подчеркнуты названия общих
промежуточных продуктов.

Углеводы
CH,(CH,)eCOf-
Жирные кислоты
НААФ
Терпены
Полиизонреноиды
CH2SKoA
І Восст.НААФ
— С—СН
Cmepoiraw
Аспартилфосфат *
Восст.ИААФ
- Семиальдегид аспарагинопой
кислоты
'U \восст.ШАФ
RCO" а-Кетоглутарат
\\дтф
IL
^иаминопителат*
* Треонин
//
IU3UH*'
іп. Н4ЛФ
Метионин *
Шзолейцип
АТФ
L- глцтамат Ъ> Глцтамин
!4^
j
ГТФ J Сі(кцинил-Ко4
ГЛ Ф,ФН
у- Глицин
^Ко ASH
H3N +
І |п|ч"г DТф)
Сг*- (СНг)гСОСНСОг Семиальдегид глута-
a-amuno?-Kemoadunam тиковой кислоты ==J> пролий-
І ' Восст.НЛАФ
Орншии
"О2С —(CH?JCOCH2NH2
o- аминолевулинат
Порфирины
Цитрцллин
Аргинин
Фиг. 102. Биосинтотичоскио и другие реакции, сопутствующие циклу лимонной кислоты.
Аминокислоты, отмеченные звездочкой, в организме высших животных, вероятно, не синтезируются.
Крестик означает, что соответствующий фермент скорее всего находится в митохондриях. Сплошные
стрелки соответствуют впутримитохопдриальным ферментам, прерывистые — вномитохондриальным.

362 -Глава XIV
ниє аминокислоты флавиновьтм ферментом оксидазой по уравнению (XIV.14):
Флапопротеид
R —СИ —СО^Ч-Оо =» R — С — COj + H2O2+I-I+ (XIV. 14)
I II
+NH3 NH
[ Катализа
г і
N4]3-І-И — С — СО^ П2О |- i/2O2
11
Другой путь — трансаминирование с сс-кетоглутаратом при помощи ряда
пиридоксальфосфатсодержащих трансаминаз (аминотрансфераз) :
R —СИ—COa + E-Пир-СПО "^ R —С —СОа + Е-Пир-СІьАИз, (XJV.lSa)
I ""II
+N1-I3 . О
-О2С(СГІ2JСОСО^+Е-Г]ир-СІІ2Ш-І3 ^ -O2C(CH2J — СИ — СОгН-Е-Пир-СНО.
+NH3
(XIV.156)
Пир-СНО обозначает здесь пиридоксалевую форму кофермента, а Пир-
CII2NH3 — пиридоксаминовую.
По крайней мере у млекопитающих для всех природных L-аминокислот
(исключая L-пролин) преобладает реакция (XIV.15). Такой путь обмена
через трансаминирование сам по себе, очевидно, ведет к тупику, поскольку
аминогруппа не отщепляется, а лишь переносится с одной молекулы на
другую. Должна, следовательно, существовать какая-то реакция, переводящая
связанную аминогруппу в свободную форму — NH3 или NH+. Б такой
реакции участвует L-глутамат, вследствие чего этому соединению принадлежит
совершенно особая роль. Взаимопревращение L-глутамат " сс-кетоглутарат
катализируется L-глутаматдегидрогеназой:
L-глутамат" Ндд?1}+Н„О ^ а-Котоглутарата-+ ндд^ц } H-NHJ + H+,
ДСО'^7,63 ккал/молъ. (XIV.16)
Ферменты DToi^o типа чрезвычайно широко распространены в живой природе,
что свидетельствует об их большом значении в метаболизме (см. также
фиг. 101 и 102). Фермент из тканей позвоночных представляет собой полимер
(дгол.вес. около 10°), сравнительно легко диссоциирующий на субъединицы
с сильно пониженной ферментативной активностью. На активность
фермента влияют многие соединения — аллостерические регуляторы; в
основном это пуриновые нуклеозиддифосфаты. С обоими никотинамидными кофер-
ментаыи активность фермента практически одинакова. Иными свойствами
обладает фермент, выделенный из микроорганизмов: он специфичен в
отношении либо НАД, либо НАДФ и сравнительно малочувствителен к
действию аллостерических регуляторов.
БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ЦИКЛА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ
От цикла лимонной кислоты берут свое начало многие биосинтетические
реакции, в силу чего ему принадлежит центральная роль также и в этой
сфере метаболизма (фиг. 102). Следует особо подчеркнуть, что, когда какие-
нибудь промежуточные продукты уходят из цикла, их недостаток должен
быть восполнен с помощью тех или иных анаплеротических реакций, иначе
стационарное состояние цикла будет нарушено.

Цикл лимонной кислоты 363
УГЛЕВОДЫ
У большинства клеток (исключая те виды бактерий, которые способны
расти за счет органических соединений, содержащих только два атома
углерода, а также клетки некоторых растительных тканой) синтез углеводов
невозможен без присутствия стехиометрических количеств одной из ди- или
трикарбоновых кислот цикла или же соединений, способных превращаться
в какой-либо из таких промежуточных продуктов (см. фиг. 101 и
предыдущий раздел). Поскольку пируват в присутствии АТФ и пируваткарбокси-
лазы ассимилирует двуокись углерода с образованием оксалоацетата
(см. гл. XI), клетка может использовать для синтеза углеводов любое из
многих промежуточных органических соединений, содержащих не менее трех
атомов углерода. Из фиг. 102 следует (более подробно об этом говорилось
в гл. XI), что синтез углеводов из таких соединений начинается с двух
реакций, протекающих в митохондриях и не похожих ни на одну реакцию,
происходящую при расщеплении углеводов:
Пируват + АТФ+ СО2 —> Оксалоацетат І- АДФ-|-Фн,
Окоалоацетат + ГТФ —> Фосфоополшіруват -|- ГДФ-'-- Фа-\ СО2.
I
Углеводы
Клетки, содержащие оба специфических фермента глиоксилатного цикла
(ответвления цикла лимонной кислоты), а именно изотцитрат-лиазу и малат-
синтазу (см. гл. XI), способны синтезировать четырехуглеродныо дикарбо-
новыо кислоты, а следовательно, и углеводы, из двууглеродных
предшественников. Биосинтез углеводов из жиров, а точнее из ацетил-КоА, может
происходить лишь в таких клетках. Животный организм не способен
осуществлять это превращение.
ЛИПИДЫ
Биосинтез липидов обсуждается в гл. XVI. Здесь нам хотелось бы
остановиться только на следующих моментах. Ключевой промежуточный
продукт всех этих, реакций — ацетил-КоА (см. фиг. 102) — может
синтезироваться, в сущности, лишь двумя путями (см. фиг. 101): в реакции тиолитиче-
ского расщепления ацотоацетил-КоА. (образованного при окислении жирных
кислот или определенных аминокислот) и в реакции окислительного декар-
боксилирования пирувата. Оба процесса локализованы в митохондриях
или их аналогах. В то же время биосинтез жирных кислот начинается с
обязательной стадии карбоксилирования ацетил-КоА с образованием мало-
ыил-КоА, а эта реакция, так же как и все последующие стадии,
катализируется, по-видимому, внемитохондриалышм комплексом ферментов. Как
это согласовать? Диффундирует ли ацетил-КоА из митохондрий сам по себе
или же для его переноса необходим более сложный процесс, требующий
энергии извне? Недавние исследования показали, что, вероятно,
справедливо второе предположение: ацетил-КоА внутри частицы сначала
превращается в цитрат путем конденсации с оксалоацетатсш; затем образованный
таким путем цитрат выходит в цитоплазму, где снова расщепляется на ОА
и ацетил-КоА под действием цитрат-лиазы, использующей АТФ
(уравнение XlV.la). Количество этого фермента в сильной степени зависит от
генетических, факторов и от условий окружающей среды, например от питания;
кроме того, на него могут сильно влиять такие патологические состояния,
как диабет или ожирение. Процесс синтеза жирных кислот в отличие от
синтеза углеводов нуждается лить в каталитических количествах ОА (или
пирувата -[- СО2); таким образом, чотырехуглеродные дикарбоновые
кислоты для него не нужны.

364 Глава XIV
БЕЛКИ
Для осуществления белкового синтеза, так же как и для других
синтетических процессов, о которых мы говорили выше, необходима энергия
в форме АТФ. Цикл лимонной кислоты поставляет эту энергию. Кроме
того, синтез белка требует запаса мономерных единиц (или их
предшественников) — приблизительно двадцати видов природных аминокислот.
Большинство высших животных, включая человека и крысу, синтезируют
в достаточном количестве лишь около половины этих аминокислот; остальные
аминокислоты — аргинин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин,
фенилаланин, треонин, триптофан и валин — не могут быть синтезированы
в самом организме; они должны поступать с пищей и потому называются
незаменимыми. Растения и большинство микроорганизмов, напротив,
способны синтезировать все или почти все аминокислоты. Незаменимые
аминокислоты помечены на фиг. 102 звездочкой. Предшественники для синтеза
соединений обеих групп — заменимых аминокислот у животных и большей
части аминокислот у других организмов — опять-таки поставляются
циклом лимонной кислоты.
Синтез белка подробно рассматривается в гл. XVII, но некоторые
моменты уместно отметить и здесь. Существует три семейства аминокислот,
представители которых являются производными трех а-кетокислот (пирувата,
оксалоацетата и а-кетоглутарата) и соответственно трех а-аминокислот
(аланина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты). Группа,
связанная с а-кетоглутаратом и глутаминовой кислотой, синтезируется всеми
живыми организмами; из числа аминокислот, происходящих от пирувата,
высщие организмы способны синтезировать только часть, и наконец,
аминокислоты, углеродный скелет которых образуется из ОА и Асп, совсем не
синтезируются в организме млекопитающих, а быть может, и вообще у
животных.
ПУРИНЫ И ПИРИМИДИНЫ
Синтез этих важнейших соединений, входящих в состав нуклеиновых
кислот и некоторых коферментов, рассматривается в гл. XVIII. Процесс
тесно связан с функционированием цикла лимонной кислоты: углеродный
скелет пиримидинов происходит от аспартата, а атомы азота шестичленных
колец пуринов, так же как и атомы азота аминогрупп аминопуринов и ами-
нопиримидинов, ведут свое происхождение от аспартата и глутамина.
ПОРФИРИНЫ
Порфирины жизненно необходимы для клетки, так как они являются
основными компонентами дыхательных пигментов и ферментов (см. гл. VIII,
XII и XV). Их биосинтез подробно обсуждается в гл. XVII. Исходным
соединением для этого процесса, начинающегося в митохондриях, является сук-
цинил-КоА, что также обусловливает весьма значительный и постоянный
отток вещества из цикла.
НЕКОТОРЫЕ ФАКТОРЫ,
ВЛИЯЮЩИЕ НА АКТИВНОСТЬ ЦИКЛА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ
КОНЦЕНТРАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
Соотношение концентраций ряда митохондриальных ферментов, в том
числе типичных дегидрогеназ цикла лимонной кислоты и переносчиков
электронов в дыхательной "цепи, остается неизменным в митохондриях

Цикл лимонной кислоты 365
самого различного происхождения — от летательных мышц саранчи до
различных тканей крыс. К таким ферментам относятся цитохромы (см. гл. XV),
сукцинатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа и глицерофосфатдегидрогеназа.
Должен, следовательно, существовать какой-то (скорее всего генетический)
механизм, который управляет синтезом или, быть может, интеграцией
ключевых митохондриальных ферментов в ходе образования митохондрий
(митохондриогенезе).
КОНЦЕНТРАЦИЯ СУБСТРАТОВ
Любой процесс, состоящий из последовательных реакций, можно
регулировать путем изменения концентрации исходных субстратов.
Метаболическую активность удобно характеризовать концентрацией субстратов
в стационарном состоянии или же временем их полупревращения. В тканях
печени и почки крысы время полупревращения всех метаболических
субстратов имеет порядок нескольких секунд. Исключение составляет лишь
оксалоацетат, у которого время полупревращения по крайней мере на
порядок меньше. Для Е. сой все эти величины следует уменьшить приблизительно
в 10 раз. Эти данные указывают на высокую потребность в оксалоацетате
и на то, что это соединение играет важную роль в регулировании мито-
хондриального метаболизма (см. фиг. 101 и 102).
КОНЦЕНТРАЦИЯ КОФЕРМЕНТОВ
Рассмотрение фиг. 101 и 102 приводит к выводу, что, по крайней мере
у высших организмов, катаболические процессы, связанные с выделением
энергии, как правило, нуждаются в НАД+, а биосинтетические процессы,
требующие внешней энергии, почти неизменно зависят от НАДФ-Н.
Эффективность поддержания стационарного состояния зависит от тонкой
сбалансированности биосинтетических и катаболических процессов в клетке,
что и находит свое отражение в упомянутой закономерности.
РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЦЕССА ДЫХАНИЯ (ДЫХАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ)
Наблюдаемая интенсивность митохондриального дыхания зависит
не только от природы и концентрации субстрата, подвергающегося
окислению, но и от эффективности сопряжения процессов дыхания и фосфорили-
рования. В интактных митохондриях эти процессы обычно «накрепко»
сцеплены друг с другом (если только количества субстрата и Фн не
лимитированы), так что скорость дыхания фактически регулируется величиной
отношения [АДФ]/[АТФ.] Когда это отношение достаточно велико
(«состояние 3»), большая часть внутримитохондриального адениннуклеотида
находится в форме АДФ и дыхание протекает весьма интенсивно. Напротив,
если за счет АДФ накапливается АТФ (т. е. в условиях, когда скорость
дефосфорилирования АТФ в процессах, требующих энергии или фосфата,
отстает от скорости его образования), дыхание ослабевает («состояние 4»).
Добавление АТФ может даже ингибировать дыхание вследствие обращения
потока электронов 1. Все эти явления составляют то, что принято называть
дыхательным контролем.
1 Это понятие используется для описапия определенных окислительно-восстанови-
телъных реакций, которые обычно не происходят из-за неблагоприятного положения
равновесия. Однако равнод^сие может быть изменено добавлением АТФ. Например:
НАД-H + 2 Цит. с (Fe3+) ~-v НАД++2 Цит. с (Fe2+) + H+, но НАД-H + 2 Цит.с (Fe3+) +
-!- 2АДФ + 2ФН з± НАД+ + 2 Цит. с (Fe2+) + 2 АТФ (более подробно об этом см.
на стр. 299).

Процессы регулирования в цикле лимонной кислоты
Таблица 41
Номер

гулируемой
реакции
1
2
2а
3
4
ira
6
7
8
Название
фермєнта(ов)
Ферменты,
сопрягающие перенос
электронов с
дыханием
НАД-зависимая
изоцитратдегпд-
рогеназа
НАДФ-завпспмая
изоцитратдсгпд-
рогепаза
Глутаматдегидро-
гоназа (а-кето-
глутарат ^z Глу-
тамат)
Пируваткарбокси-
лаза
Ацетпл-КоА — кар-
боксилаза
Цитрат-лпаза
(нуждается в
АТФ)
Конденсирующий,
фермент
Изоцитрат-лиаза
Локализация
Митохондрии
*
Митохондрии и
цитоплазма
(два типа
ферментов)
Митохондрии
Цитоплазма
Митохондрии
Цитоплазма
Что требуется
ЛДФ
Фн
НАД+
НАДФ+
Восст. НАД
ИЛИ ПОССТ.
НАДФ
NH3
АТФ
со2
АТФ
со2
Цитрат (из
ацетпл-КоА)
Ацетпл-КоА
ОА
Цптрат (пз аце-
тпл-КоА)
Что
образуется
АТФ, СО2
(путем
дыхания)
Восст. НАД
СО2
Восст.
НАДФ
со2
НАДФ+ или
НАД+
АДФ
АДФ
Ацетил-КоА
OAD
Цитрат
КоА
С4-кпслоты

Активаторы
АДФ
ОА ?
АДФ

Ацетил-
КоА

Цитрат
и т. д.
¦—
Ингибиторы
Разобщающие
агенты, АТФ
АТФ
Восст. НАД
ГДФ +Восст.
НАД
КоА-производ-
ные жирных
кислот с
длинной цепью
КоА-пропзвод-
ные жирных
кислот с
длинной
цепью, АТФ ч
Фосфоеполпп-
руват
Другие факторы,
влияющие на
активность
Состояние частиц,
присутствие
катионов и т. д.
р
Гормоны,
генетические факторы,
состояние
питания
Состояние
питания, другие
факторы (например,
ожнренне)
—
Примечание
Разнообразные
соединения могут вызывать
разобщение, что
приводит к окислению без
образования АТФ
При высоком уровне
активности цикла изоци-
трат, вероятно,
окисляется по реакции 2а.
Производит
восстановленный НАДФ в
соответствующей части
клетки для нужд
биосинтеза
Механизм
регулирования еще не известен
Регулирует синтез
углеводов (НАД-зависимые
реакции)
Регулирует синтез
жиров (НАДФ-зависимые
реакции)
Дает возможность вне-
мптоходриальному
ацетпл-КоА
участвовать в синтозе лппидов
Регулирует
распределение ацетил-КоА по
разным реакциям
Присутствует только в
бактериях и растениях
«то дтФ tojk(i уменьшает сподство фумавазы к фумарату и, таким образом, снижает эффективность превращения фумарат-шалат.

Цикл лимонной кислоты 367
ПРОНИЦАЕМОСТЬ
Уже само существование митохондриальной мембраны обеспечивает
доступность одних субстратов и недоступность других. Например, интакт-
ная митохондрия просто не пропускает восстановленного НАД, и этот
важный метаболит, образовавшись вне митохондрии, не может быть
непосредственно в ней окислен. Вместо этого он участвует в связанных с субстратом
«челночных» реакциях, как показано ниже:
Окисленный її Окисленный
ВосстИАД -у субстрат 4- II субстрат <—-у—> НгО
НАЛ 4 ^—* Восстановлен II -> Восстановлен -*4— !^О2
^ ный субстрат II ный субстрат
Цитоплазма („снаружм») Митохондрии („внутри")
Известны и другие примеры такого рода разделения внутриклеточного
пространства на отдельные «отсеки». Внутримитохондриальный аце-
тил-КоА, сам по себе диффундирующий наружу с большим трудом, сначала
превращается в цитрат, а затем последний в цитоплазме расщепляется
с образованием ацетил-КоА, который теперь может быть использован для
реакций, происходящих в этой части клетки. Добавленные извне сукцинат
и малонат свободно поступают к митохондриальной сукцинатдегидрогеназс.
Совсем не так обстоит, однако, дело с фумаратом и оксалоацетатом. Мито-
хондриальная фумараза также непосредственно недоступна для
добавленного фумарата.
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
В табл. 41 суммированы некоторые факты, относящиеся к регулированию
активности ключевых и вспомогательных ферментов цикла различными
метаболитами.
ЛИТЕРАТУРА
AI bort у R. A., Fumarase, in P. D. Boyor, H. Lardy, and K. Myrback (eda.), «The
Enzymes», 2nd ed., vol. 5, p. 531, Academic Press, Now York, 1961.
Atkinson D. E., Regulation of Enzyme Activity, Ann. Rev. Biochom., 35, 85 A966).
D і с k m a n S. R., Aconitase, in P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), «The
Enzymes», 2nd ed., vol. 5, p. 495, Academic Press, New York, 1961.
Krebs H. A., L о w e n s І є і n J. M., The Tricarboxylic Acid Cycle, in D. M. Groen-
berg (ed.), «Metabolie Pathways», vol. 1, p. 129, Academic Press, New York, 1960.
К u n E., Malato Dehydrogenase, in P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), «The
Enzymes», 2nd ed., vol. 7, p. 149, Academic Press, New York, 1963.
Lehningor A. L., The Mitochondrion, Benjamin, New York, 1964. (Лешшджер А.,
Митохондрия, изд-во «Мир»,. 1966).
Plant G. W. E., Isocitrato Dehydrogenasos, in P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrbiick
(eds.), «The Enzymes», 2nd ed., vol. 7, p. '105, Academic Press, New'York, 19(>3.
S a n a d і D. R., Pyruvate and oc-Ketoglutarato Oxidation Enzymes, in P. D. Boyer, П.
Lardy, and K. Myrback (ods.), «The Enzymes», 2nd ed., vol. 7, p. 307, Academic Press,
New York, 1963.
Singer T. P., К e a r ri e y E. В., Succinato Dehydrogenase, in P. D. Boyor, H. Lardy,
and K. Myrback (eds.), «The Enzymes», 2nd od., vol. 7, p. 383, Academic Press, Now
York, 1963.
Stern J. R., Oxaloacetate Transacotase. in P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrhack (ods.),
«The Enzymes», 2nd ed., vol. 5, p. 367, Academic Press, New York, 1901.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Гул ііт и M. Ф., Основные метаболические циклы, изд-гю «Наукова Думка», Клев, 1968.
К о с о n e р Э., Молекулярная биохимия, и:щ-во «Мир», М., JOGI.

Глава XV
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
Окислительные реакции используются в клетке для обеспечения ее
энергетических потребностей. Существует четыре типа окислительных процессов,
которые в свою очередь можно подразделить на две основные группы 1:
А. Реакции дегидрирования:
1. В качестве акцептора используется О2- Эти реакции
катализируются аэробными дегидрогеназами или оксидазами (субстрат:
О2 — оксидоредуктазы).
2. Используются другие акцепторы.
Эти реакции катализируются дегидрогеназами, содержащими
кофермент [субстрат: (акцептор) — оксидоредуктазы].
Б. Реакции, связанные с включением в субстрат кислорода:
1. Реакции, приводящие к образованию диоксипроизводных.
Катализируются оксигеназами.
2. Реакции, приводящие к образованию монооксипроизводных.
Катализируются гидроксилазами.
Реакции, относящиеся к группе А, по-видимому, более древние в
эволюционном отношении. В клетках с анаэробным обменом протекают только
такие реакции, а в аэробных клетках именно они производят большую часть
энергии. Простые каталитические реакции дегидрирования были,
вероятно, с самого начала присущи древним живым формам, возникшим задолго
до появления кислорода в земной атмосфере. Важная роль дегидрирования
в биохимических процессах впервые была отмечена Виландом B0-е годы);
Вилапд основывался в своих выводах на исследованиях, в которых было
показано, что коллоидный палладий действует как катализатор реакций
дегидрирования (переносчик водорода) при окислении разнообразных
органических соединений акцептором А, например молекулярным кислородом,
бензохиноном, метиленовым синим и т. д.
X
R —С —OI-l + (Pd) ^ RXC = O + (Pd)Ha (XV.ia)
H
Спирт: Х=Н
Гидратированный
альдегид: Х=0Н
ИЛИ
(XV.16)
(Pd)H2 + A —> Pd + AH
Pd
______ > Д + АН2 (XV.Ib)
1 Мы будем применять обозначение ДН2 для восстановленного и Д — для
окисленного субстрата. Аналогично символы А -*¦ АН2 или А" -*¦ А" будут использованы
для обозначения окислителей или акцепторов, отдающих или принимающих два или
один электрон.

Биологическое окисление 369
Явное сходство этих реакций с реакциями биохимическими навело
Биланда на мысль, что кислород просто является «наиболее
физиологическим» из многих возможных акцепторов водорода и что все биологические
окислительные процессы протекают путем дегидрирования с участием одного
или большего числа промежуточных переносчиков водорода (А' и т. д.),
называемых также переносчиками электронов. Последовательность
протекающих при этом превращений можно изобразить следующим образом
(этот весьма удобный способ заимствован, с некоторыми изменениями,
у Болдуина):
Л
или
У- A'J \-А (XV.2a)
А'Н2 + А ^А\\г + А' (XV.26)
В последующих работах (это главным образом исследования Тунберга
и Кейлина) было показано, что живые клетки и экстракты из них способны
осуществлять дегидрирование таких метаболически важных соединений,
как глюкоза, лактат, сукцинат, разнообразные аминокислоты и т.д.,—
либо аэробно (в присутствии кислорода), либо анаэробно (в присутствии
искусственных акцепторов электронов, например метиленового синего).
Результатом этих исследований явился постулат, согласно которому
процессы биологического окисления протекают в соответствии с уравнением
(XV.2в). Иными словами, дегидрирование субстратов катализируется дегид-
рогеназалш (теперь их называют оксидоредуктазами), способными переносить
электропы на некий промежуточный переносчик А'.
Отсюда, естественно, следовало, что если первый акцептор А'
(восстановленный до А'Н2 первой дегидрогеыазой) может в свою очередь служить
субстратом для какого-то второго фермента, то несколько таких
переносчиков, действуя последовательно, могут образовать цепь, называемую
дыхательной цепью или системой (цепью) переноса электронов. Эта система
вклинивается между субстратом и его первичной дегидрогопазой, с одной
стороны, и конечным (терминальным) акцептором (на нашей схиме это
кислород) — с другой:
(XV.3)
Далее, еслиі?один переносчик может вклиниться между двумя дегидро-
геназами, использующими два разных субстрата (ДН2 и Д'Ы2), то должны
наблюдаться сцепленные реакции такого типа:
(XV Л)
Таким образом, есть два различных способа превращения
восстановленного промежуточного переносчика обратно в окисленную форму: окисление
24—246

370
Глава XV
с помощью других переносчиков (в конечном итоге — с помощью
терминального акцептора) или же окисление вторым субстратом, который при этом
восстанавливается.
В гл. VIII мы уже рассмотрели два основных переносчика такого рода —
никотинамидный и флавиннуклеотидный коферменты; примеры сцепленных
реакций при гликолизе и брожении обсуждались в гл. XI. В митохондриях
между флавином и конечным акцептором (кислородом) вклиниваются
кофермент Q, цитохромы, негеминовое железо и медь. Терминальным звеном
этой цепи служит цитохромоксидаза —«дыхательный фермент»
(Atmungsferment) Варбурга.
Мы начнем с краткого рассмотрения реакций, протекающих с участием
кислорода и катализируемых оксидазами или гидроксилазами; затем мы
перейдем к рассмотрению различных дегидрогеназ, цитохромов и других
гемопротеидов. В заключение мы опишем дыхательные цепи и окислительное
фосфорилирование.
ОКСИГЕНАЗЫ И ГИДРОКСИЛАЗЫ
ОКСИГЕНАЗЫ
Оксигеназы представляют собой ферменты, катализирующие включение
обоих атомов молекулы кислорода в субстрат'.
Оксигеназа
Д(О"НJ.
(XV.5)
Первичный продукт, который бывает стабильным или нестабильным, можно
рассматривать как диоксипроизводное субстрата. Свойства некоторых
хорошо изученных оксигеназ сведены в табл. 42.
Таблица 42
Оксигеназы
Фермент
Пирокатехаза (ка-
техол — 1,2-ок-
сигеназа)
Гомогентизатокси-
геназа
З-Оксиантранилат-
оксигеназа
Триптофаноксиге-
наза
жио-Инозитол—
оксигеназа
Липоксигеназа
Источник фермента
Pseudomonas
Печень, почки,
бактерии
Печень, почки
Ткани животных,
бактерии
Почки
Растения
Простетиче-
ская группа
[Fe2+p
[Fe-порфи-
рии] (гем)
[Fe2+]
Субстрат
Катехин
Гомогентизат
З-Оксиантранилат
L-Триптофан
жио-Инозит
Ненасыщенные
карбоновые
кислоты
Продук г
цис, tyuc-Муконат
4-малеилацото-
ацетат
Пиколинат 2>
Хинолинат
L-формилкинуре-
нии
D-гліокуронат
Перекиси
соответствующих
жирных кислот
1) Квадратные скобки означают, что существуют косвенные данные о наличии Fe2+ в каталитическом
центре.
2) Первичным продуктом является семиальдегид 2-амино-З-карбоксимукоповой кислоты A-амшю-
4-формил-1,3-бутадиен-1,2-дикарбоновая кислота).
Размыкание ароматических"колец. Многие оксидазы расщепляют
двойные связи, расположенные между двумя фенольними группами, рядом
с единственной фенольной группой или в индольном кольце. При этом обра-

Биологическое окисление
371
зуются дикарбоновая кислота, семиальдегид и формиламинокетон:
,он
(xv.6a)
(xv.ee)
Некоторые другие реакции, катализируемые оксигеназаыи, приведены
в табл. 42.
ГИДРОКСИЛАЗЫ
Гидроксилазы катализируют включение в субстрат одного атола
кислорода. При этом субстрат сначала превращается в соответствующее моно-
оксипроизводное:
Гидроксилаза
ДНОі8Ц+Х + Н2Оі8. (XV.7)
Включение меченого кислорода в Н2О и необходимость второго,
окисляемого субстрата (ХНг) отличают гидроксилазные реакции как от оксигеназ-
ных, так и от дегидрогеназных [ср. реакцию (XV. 7) с реакциями (XV.5)
H(XV.la) или (XV. 16].
Следовательно, речь должна идти не только о субстрате, но также о косуб-
страте (табл. 43). Ферменты этой группы катализируют самые
разнообразные превращения. Рассмотрим одно из таких превращений, осуществляемое
медьсодержащими ферментами растений. Они превращают монофенолы
в дифенолы и окисляют последние до о-хинонов (XV.8). Эти ферменты
известны под общим названием фенолазного комплекса.
ОН -f
он
Н2О* (XV.
Здесь косубстрат сам является продуктом реакции. Итак, суммарная
реакция, катализируемая фенолазой, заключается в превращении одной
молекулы монофенола в о-хинон. Молекула кислорода в ходе реакции
расщепляется; один атом кислорода при этом восстанавливается до Н2О*
а другой включается в ароматическое кольцо. Такие восстановители, как
аскорбиновая кислота или гидрохинон, могут заменять о-дифенол в
качестве косубстрата.
Дофамингидроксилаза млекопитающих представляет собой
медьсодержащий белок, косубстратом которого может служить только аскорбиновая
кислота.
Другая важная гидроксилаза была выделена из печени крысы; она
катализирует превращение L-фенилаланина в L-тирозин. Природным
косубстратом в этом случае служит 5, 6, 7, 8-тетрагидроптеридин, который окис-
24*

372
Глава XV
Таблица 43
Некоторые гидрокенлазы
Фермент
Фополаза (мо-
иофенолокси-
даза)
Пероксидаза
А рил — 4-гидро-
ксилаза
Фенилалапин —
4-гядрокси-
лаза
Алкоксиарил-
гидроксилаза
Арилалкил-
амингидро-
кснлаза
Стороид — 2-ги-
дроксилаза
Стероид — 11-?-
гидроксилаза
Стороид—17-сс-
гидроксплаза
Скшлея-цикло-
гидроксилаза
Гпдроксилаза
жирных
кислот
Десатураза
жирных
кислот
Кішуренатпід-
роксплаза
Октапгидроксн-
лаза
Источник
фермента
Растения
Хроп
Почоиь
Печень,
растения
Печень
Почепь
Печень
Надпочечники
(печень)
Надпочечники
Почопь
Печень
Самые разные
Pseudomonas
Бактерии
Простети-
ЧЄСІШЯ
группа
[Cul
Гом
»
?
Гем
»
?
Гем
(Р450)
Гом
(Р450)
?
?
?
?
Субстрат
Замещонпый
фонол
Салициловая
кислота
Анилин, ацет-
анилид
L-фенилаланин
НСНоОАгП'
BNllAr
Эстрнол
11-дозоксикор-
тикостерон
Прогестерон
Сквален
Жирные
кислоты
КоА-прошшод-
ныо насы-
ЩОЯИЫХ ИЛИ

ненасыщенных жирных
кислот
Кнііуропат
Октаи
Продукт
Замощолцый
цатохин
Гонтизиноиая
кислота
4-оксиариль-
ные соеди-
ТТ J"^ J-T ГТ Г-Г
ниция
L-тирозин
НСНО +
-LHOArlV
N-окііси
2-оксиэстриол
Кортякосте-
рон
Дезоксикорти-
костерон
Ланостерин
/КирНЫО (Й-ОК-
сикнелоты
КоА-производ-
ние неиасы-
|Г\ОНПЫХ ИЛИ
полинепасы-
Щ01ШЫХ
;кприых і.'пс-
7,8-дпокспкн-
пуропат
Октанол
Косубстрат
Заяещопный
катохпн
Диоксифумаро-
вая кислота

Восстановленный НАДФ
5,6,7,8-тетра-
гидроптери-
дия

Восстановленный НАДФ

Восстановленный НАДФ

Восстановленный НАДФ

Восстановленный НАДФ

Восстановленный НЛДФ

Восстановленный ПАДФ

Восстановленный ПАДФ
?
Восстапонлон-
ішіі НАД
лястея до дигидроптеридина (см. гл. XVII); регенерация в исходную форму
происходит при участии восстановленного НАДФ в присутствии второго
фермента:
Тстрагидроптсридип
Н+І-Восст. НАДФ f ФонплалаяшН-О2 ^ ИАДФ-(-Тирозин ~ Н2О
(XV. 9)
<(Микросомные>> гидроксилазы. Превращение, описываемое
уравнением (XV.9), служит примером многочисленных реакций, катализируемых
ферментными системами, локализованными преимущественно в микросомной
фракции таких органов, как печень, надпочечник и женские половые железы.
Из данных, приведенных в табл. 43, следует, что ферменты печени участвуют
в обмене и обезвреживании целого ряда ароматических соединений,
представляющих фармакологический интерес, и, кроме того, ответственны за
ключевые стадии метаболизма липидов. Особо следует отметить
многочисленные близкие по механизму реакции, приводящие к включению гидро-

Биологическое окисление 373
ксильных групп или кетогрупи в стероидное кольцо, — таким путем
синтезируются многие стероидные гормоны. Некоторые из этих реакций
катализируются ферментами печени и женских половых желез, но больше всего
таких ферментов обнаружено, как этого и следовало ожидать, в коре и
мозговом веществе надпочечников. Стероидные ядра способны гидроксили-
роваться по многим положениям. В некоторых случаях между
восстановленным НАДФ и стероидом вклинивается ферредоксиноподобный
переносчик (см. гл. XII), а за взаимодействие с кислородом ответствен специальный
цитохром (так называемый Р450), способный взаимодействовать с СО.
ДЕГИДРОГЕНАЗЫ
КЛАССИФИКАЦИЯ И ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Дегидрогеназы (Международная комиссия по ферментам рекомендует
название «оксидоредуктазы» х) подразделяются па три группы в
зависимости от природы акцептора электронов (водорода) и типа катализируемой
реакции: ферменты, использующие в качестве кофактора никотинамидну-
клеотид; флавопротеидьт; медьсодерзкащие белки. Некоторые характеристики
этих дегидрогеназ представлены на фиг. 103. Можно видеть, что
медьсодержащие ферментіл имеют самый высокий окислительно-восстановительный
потенциал. Они способны окислять субстраты, обладающие высоким
потенциалом, используя в качестве акцептора кислород. Поэтому медьсодержащие
ферменты идеально подходят для того, чтобы служить конечным звеном
дыхательных цепей. Уже упомянутая цитохромоксидаза, играющая именно
эту роль в клетках животных и растений, содержит наряду с железом пор-
фирина также медь, которая, вероятно, и взаимодействует с О2.
Никотиыамиднуклеотидные ферменты катализируют перенос двух вос-
станавительных эквивалентов от субстрата к коферменту, который, как
правило, представляет собой легко диссоциирующий переносчик. Именно
этим обусловлена их роль катализаторов начальной реакции в цепи переноса
электронов — реакции дегидрирования субстрата. Образовавшийся в
результате восстановленный кофермент способен далее взаимодействовать с
активным центром другого фермента; при этом он может быть использован либо
для восстановления второго субстрата, либо в процессах восстановления,
необходимых для протекания биосинтетичееких процессов, либо, наконец,
он может быть окислен дыхательной цепью, что сопровождается
превращением АДФ в АТФ.
Что касается флавопротеидов, то они занимают промежуточное
положение между этими двумя классами белков. Они катализируют окисление
субстратов, обладающих промежуточным окислителыю-восстаповительньш
потенциалом, и взаимодействуют как непосредственно с кислородом, так
и с другими акцепторами.
МЕДЬСОДЕРЖАЩИЕ ФЕРМЕНТЫ
Свойства некоторых медьсодержащих ферментов представлены в табл. 44.
Многие из этих белков содержат четное число атомов Си на молекулу и
обладают характерной голубой окраской (Л//;„т>580 ммк), обусловленной
наличием тетрагональных комплексов ионов Си2+ с, азотсодержащими лиган-
дами (боковые амино-, имино- и имидазольиые группы аминокислот).
Все медьсодержащие белки, за исключением пластоцианина (см. гл. XJT),
используют в качестве акцептора только О2- Эта особенность, возможно,
1 Это название охватывает также гидроксила.ш и окспгена.чи.— Прим. ред.

374
Глава XV
отражает существование специфичного структурного соответствия,
определяющего столь высокое сродство к О2, однако ее можно объяснить и тем,
что из-за большой отрицательной величины Е'о, характерной для субстратов,
использование других акцепторов оказывается затруднительным.
Известно, что о-хиноны, ге-хиноны и дегидроаскорбиновая кислота
восстанавливаются растительными ферментами в присутствии
восстановленного НАД(Ф); эти соединения вместе с фенолазой или аскорбатоксидазой
образуют в растениях добавочную дыхательную цепь — от
восстановленного пиридиннуклеотида до Оа,— не содержащую цитохромов и цитохром-
0,82— :
+ 0,70
-0,00
+ 0,50
0,42-
+ 0,40
0,35-
+ 0,30
0,28—
+ 0,20
0,10
0,080-
000
-0,031-
-0,10
-0,130-
-0,140-
-030
-0,29-
-0,33-
-0,40
-Ц42-
-0,50
-O?O
Субстраты и акцепторы
ИгО/УгОг
-noz-/noi
- Ьифенол/о-хтон
- n-гидрохинон/хинон
- бутирил-КоА/ кротоная-КоА
- аскорбат /' Ьегидроаскорбат
- сукцинат/фуморат
- алтан/пищват + NH4+
- гаутамш/ а-кетоглугапрйШ + NHj
- лактат /nupyeam
- этанол /ацетамдегид
- ЗФГ/1,3-дифосфоглицерииовая
кислота
- малйт/пирцват + СО2
- ксан/шн/лгачевая кислота
а-кеттшс/іота/а-кетосіцші-КоА+
+ СОг + Ko/ISH
ацетальдег ид /ацетат
Коферменты,простетические гриппы,
переносчики
Си *-белок/Сиг- белок
Си+ (вада)/Сиг\вааа) '
ufim.a (Fez*)/i(um.Q (Fe3*) —
цат.с (Fe2t-)/uum.c (Fe3*)
цит.с, (Fezt)/4um.c, (Fe3*) ¦
НЬ (Fe
цит.Ьг ?єгі/
BDccm.KoQ/KoQ
цит.Ь (Fe2*)/num:b(Fe3*)
(Fe2*)/uum.b5(Fe3*)
дигиЬро-Кг/Кг ¦/-
восст. флавапратецд/флавопротеид
восст.флавин/фла- ч
вин fCSDO.) \
восст.НАА(Ф)/НАД(Ф)
0,10 соответствует AG'=4600kq^ho 2е~или 2300кол на 1 е-перенесенного эквивалента
Фиг. 103. Шкала окислительно-восстановительных потенциалов (Е'о) различных кофер-
ментов, переносчиков и субстратов B5°, pH 7).

Биологическое окисление
375
Таблица 44
Свойства некоторых медьсодержащих белков
Белок
Аскорбатоксидаза
Урпказа
Цитохромоксидаза i>
Цитохромоксидаза
(медьсодержащий белок)
Галактозооксидаза
Фенолаза 2>
Пласт оцианин
Голубой пигмент Pseudomonas
aeruglnosa
Аминоксидаза (сиермин)
Дофамин-Р-гидроксилаза
Источник
фермента
Растения
Животные (иечень,
почки)
Животные, грибы
Сердечная мышца
Плесневые грибы
Растения
Хлоропласты
растений
Ps. aeruginosa
Плазма
млекопитающих
Надпочечники

Молекулярный вес
150 000
120 000
200 000
25 000
42 500
34 000
21000
16 600
225 000
290 000
Содержание
меди на
1 МОЛЬ
фермента
6
1
2
1
1
1
2
1
4 ?
4-7
ммк
606
330 ?
820 ?
820 ?
р
340 ?
597
630
380
480
!) Содержит также железопорфирин.
2) Известна также под названиями: катехолоксидаза, тирозиназа, монофенолоксидаза, дифенолокси-
даза. Систематическое название этого фермента — о-дпфенол: Оа — оксидоредуктаза.
оксидазы:
Дегидрогеназа Хинонредуктаза Си-фермент
ДН2 => НАД(Ф) * Хинон > О2 (XV.10)
ФЛАВОПРОТЕИДЫ
Флавопротеиды участвуют по преимуществу в следующих трех важных
процессах окислительного метаболизма: 1) дегидрирование определенных
субстратов, например аминокислот, с участием О2; 2) дегидрирование|при
участии цитохромов в митохондриях (или их аналогах) начальных
компонентов дыхательной цепи, таких, как НАД и сукцинат (большинство
клеток), а-глицерофосфат, холин, саркозин, КоА-производные жирных
кислот (в митохондриях различного происхождения), D- и L-лактат (дрожжи,
растущие в аэробных условиях) и т. д.; 3) дегидрирование с участием НАД(Ф)
некоторых субстратов с низким окислительно-восстановительным
потенциалом (например, дигидролипоевой и дигидрооротовой кислот и
восстановленного ферредоксина). Ферменты, катализирующие процессы,
относящиеся к первой из трех перечисленных групп, содержат, как правило,
только флавиновую простетическую группу. Ферменты второй группы
часто содержат дополнительные компоненты (обычно металлы). Что же
касается ферментов третьей группы, то они могут содержать ионы металла
(например, дигидрооротатдегидрогеназа), а могут и не содержать их
(липоилдегидрогеназа).
Катализ простыми флавопротеидами. Оба флавиновых кофермента —
ФМН и ФАД (см. гл. VIII) — прочно связываются с ферментными белками,
выступая, таким образом, в качестве простетических групп, а не свободно
диссоциирующих коферментов (табл. 45). Повышая ионную силу и
одновременно понижая pH, флавины в протонированной форме можно отделить
от белка, так что образуется соответствующий апофермент. Вообще говоря,
этот метод с большим успехом применим для простых флавопротеидов, чем
для более сложных металлсодержащих флавопротеидов. Одна из наиболее

376
Глав
XV
Таблица 46
Свойства флавопротеидов
Фермент
Окег(да:іа D-амшю-
кислот
Окспдаза Ь-амппо-
к не л от
Глюкозооксидаза
Глпколатокоидана
Люцифсраяа
Лцил-КоЛ — догид-
роїенача (іютієст-
но три
различных фермента)
Э л eif троїте peiio-
сяіций флаію-
иротеид
Фор])ЄДОКСИН-
НАДФ —редук-
таза
Лшкшлдегидро-
гопаза
Ц If ТО V рОМ &5 — ро-
дуктаза .
Восст. ЦАДФ-
цптохром с — ре-
дуктаиа
Восст. ЦЛДФ-глу-
татпон —родук-
іаза
Источник фермента
Печень, почкті
Почки, змеиный
ЯД
Плесневые грибы
Растения
PhotobacU'1'іипг
fisheri
Печень,
митохондрии сердечной
мыщпы
Почоыь,
митохондрии сордочноіі
МЫТЛЦЫ
Растения, микро-
сомы
надпочечник ou
Дыхательные
частицы
Микросомы и
митохондрии ЦЄЧО-
ни
Микросомы
Дрож/кн
Escherichia coli,
растения

Молекулярный вес
— 100 000
138 000
-140 000
154 000
—100 000
76 000
200 000 (?)
70 000
35 000
100 000
40 000
68 000
78 000
Простетические группы
флавин
2 (?)ФЛД
2ФМИ
2ФАД
2ФЛД
ФМН
ФМН
2ге ФАД
<Г>АД
ФАД(?)
2ФАД
ФЛД
ФАД
ФМН
ФАД
прочие
_
—
—
—
—
—
—
— S — S —
2Mg2+ (не
для
переноса
электронов)
_
Физиологический
акцептор
о2
о2
о.
о,
О 9
Ог
Элоктроппсре-
НОСЯ11ШІІ
фланопрото-
11 д (Э11Ф)
Дыхательная
цент,
ІІАДФ
1ГАД
Цптохром 1>:
Цптохром с
Цптохром с
ОКІ1СЛЄ11ІІ1,1 ІІ
глутатшш
характерных особенностей флавинов — их спектр поглощения с
максимумами при 260, ~370 и ~450 ммк. Восстановление флавинов боргидридом,
дитионитом или ферментативным путем в присутствии разнообразных
субстратов приводит к резкому уменьшению двух последних пиков.
Коэффициент поглощения при 450 ммк уменьшается до величины, составляющей
-<^10°(] от значения, характерного для окисленной формы. Флавнны также
обнаруживают интенсивную желто-зеленую флуоресценцию (Я„шж ~ oQQm.uk).
Из-за внутримолекулярного тушения кольцом адепина интенсивность
флуоресценции ФАД составляет лишь 10% флуоресценции витамина рибофлавина
или же ФМН. После связывания с белком оптические свойства флавинов
реитсо изменяются: максимум поглощения сдвигается довольно далеко
в длинноволновую область и наблюдается тушение флуоресценции.
Флавины можно восстановить «наполовину« (присоединение одпого
электрона) или полностью (присоединение пары электронов). Таким образом,
флавопротоид, содержащий одну молекулу флавинового кофермента,
способен участвовать в каталитическом цикле, обратимо переходя из
окисленного в полностью восстановленное, из окисленного в сомихиноиное н из
сомихинонного в полностью восстановленное состояние.
Различные семихинонные формы (II, III, VI, VII) флавопротеидов удается
обычно наблюдать с помощью абсорбционной и ЭПР-спектроскопии (фиг. J04 .

Окисленная
350
400
457 500
Л-яина волны, ммк
550
Фиг. 104. Спектры поглощения тт ЭЛР различных флаиопротемдов.
А. Спектр поглощения, голуооіі ссміїхиігонной формы флапоиритопдов (тип А, по классификации Пал-
мера и Мнсси) Раствор ф.шшоп])отеида в 0,03 M фосфатном буфере (pH 7,4) и концентрации (по ев;
ла'іщому флавмпу) 5,7 • 11)-5 M восстанавливали и аппирооиых условиях «птиопитом до ссмихиііопі
Избыток цитионитп окисляли кислородом. Спектр очеш. Олиаок к спектру чистого семихипопа. Ьолі-
чество окнелеппой формы не upon
1І. Спектр поглощения красной с
мера и Массп). Раствор оксипитр
заппому фланину) Т, в ri • 11)—"' M
до семи^итюпа кис/юродом. H
количества восстановленной и okl:
топи я красной семихинояной фо-
ыптает 8% общего количества флаиппа.
й ф ф (
ыптает 8% общего олче ф
имііхиііоііпой формы флаг.опротеидов (тип В, по классифика
ялалы и 11,02 M фосфатом буфере (pH 7,4) в концентрации
О нитом и далее
классификации 11;и
ялалы и ,02 M фофа уфр (p ,) и (но ста
;осота[іаплива.пи ті аяаароОяоп c]ie;fe дитионитом и далее окисляли
иной случае в равновесии с семихкнопом находятся значительные
сленной форм. Тем не
мы отчетливо видны.
арактерпыс особенное-™ спектра иогло-
В ОНР-спеитры флавоіфотеидон, полученные при — 1Г>()°. Верхпіці і;]нтан — голуиуя семмхитіоіша«
форма ф.павопротеида Azotobarler; пйжііші кривая — красная ссадихппоппая форма оксипнтрплааы.

378
Глава XV
ФлН
ФлН
1
\
,ФлН-
\
•НА
Фл
\
Е
\
НгД
Фл
. V
,ФлНг
чФлН-
VI
ФлН-
ФлН-
III
Р
дн2
д
IV
•НД
.ФлН-
/
НгД
ФлН •
V/I
\
vm
Металлсодержащие флавопротеиды. Известен целый ряд флавопротеи-
дов, которые в высокоочищенном состоянии содержат дополнительные
простетические группы (табл. 46) — обычно это ионы металлов. Роль этих
металлов до сих пор еще точно не установлена.
Сложность проблемы состоит в данном случае в том, что многие из этих
ферментов, если даже в изолированном состоянии они отличаются высокой
степенью чистоты и содержат простетические группы в определенных
постоянных пропорциях, первоначально входили в состав более сложных
надмолекулярных структур. Для того чтобы перевести фермент в растворимую форму,
эти структуры приходится разрушать ферментативными, химическими или
физическими воздействиями. В ходе такой обработки свойства ферментов
могут измениться.
Лучше обстоит дело с такими флавопротеидами, как ксантиндегидро-
геназа и дигидрооротатдегидрогеназа, которые, по-видимому, не связаны
прочно более крупными структурными или функциональными единицами.
Оба фермента содержат негеминовое железо и равное количество лабильного
сульфида. Дигидрооротатдегидрогеназа проще по составу и катализирует
более простую реакцию. Фермент этот необычен в том отношении, что
содержит сразу оба флавина — на одну молекулу белка приходится одна
молекула ФАД и одна молекула ФМН. Возможно, что каждый из флавинов
ответствен за начальное взаимодействие с одной из двух пар субстратов —
НАД/Восст.НАД и дигидрооротат/оротат.
БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ НЕГЕМИНОВОЕ ЖЕЛЕЗО (НГЖ)
Некоторые белки — переносчики электронов (существующие либо как
независимые единицы, либо как компоненты более сложных структур)
содержат четное число атомов железа, связанных с белком необычным
образом — с помощью остатков цистеина. К числу белков такого типа (в скобках
показано число атомов железа) относятся бактериальный ферредоксин F—8),
ферредоксин растений B); дигидрооротатдегидрогеназа B); ксантинокси-
даза (8); альдегидоксидаза печени (8); восст. НАД-дегидрогеназная система
дыхательной цепи (8) (комплекс I, см. стр. 390) и различные связанные
с ней растворимые ферменты, окисляющие восстановленный НАД D или 2);
сукцинатдегидрогеназная система дыхательной цепи (комплекс II) вместе
с растворимыми ферментами (8, 4 и 2); участок дыхательной цепи,
содержащий восстановленный кофермент Q и цитохром с B) (комплекс III,
см. стр. 390), и, наконец, ферредоксинподобный пигмент, образующий
комплекс с цитохромом с и Р450-редуктазой микросом (см. стр. 387). Таким
образом, негеминовые белки широко распространены в природе и, по-види-

Биологическое окисление
379
(
Фермент
Ксантинокси-
даза (дегид-
рогеназа)
Дигпдрооро-
татдегидро-
гоназа
Восст. НАД-
дегидрогена-
за
€укцинатде-
гидрогеназа
Холиндегидро-
геназа]
а-Глицерофос-
фатдегидро-
геназа
Нитратредук-
таза
L-лактатде-
гпдрогеназа
D-Лактатдегид-
рогоназа
Свойства очищенных металлсодержащих
Источник фермента
Молоко
Печень
млекопитающих
Печень или почки
птиц
Zymobacterium oro-
ticum
Митохондрии
сердечной мышцы
Митохондрии сер-
дечпой мыщцы
быка
Митохондрии
сердечной МЫШцЫ
быка, дрожжи
Митохондрии
клеток печени
млекопитающих
Митохондрии
мозга свиньи
Neurospora crassa
Дыхательные ча-
стИцы аэробных
дрожжей
То же

Молекулярный вес
300 000
125 000
~ 200 000

(нерастворимая)
~ 250 000
80 000
~ 300 000
250 000
800 000
2-108 (!)
200 000
?
Таблица 46
флавопротеидов
Простатическая
группа
Флавии
2ФАД
2ФАД
2ФАД
1ФАД +
+ 1ФМН
1ФМН
1ФМН
1ФМН
1ФАД 3)
1ФАД 3)
1ФАД
1ФАД
?ФАД
2ФМН
?ФМН
прочие
8FeD, 2Мо
8Fei\2Mo
16Fei),4Mo
2FeD
8Fei>
2 —3Foi'
4Fei>
8Fei>
4Fe i)
4Fe i'
lFei)
?Mo
ІГем
?Zn2+
Физиологический
акцептор
O2 (цитохром с)
О2 (цитохром с),
НАД
НАД
О2, НАД (для ди-
гидрооротовой
кислоты)
О2, оротовая
кислота (для
восстановленного
ТТ А ТТ\
НАД)
Дыхательная цопь
(не цитохром с!)
Феррицианид,
Цитохром с 2>
Дыхательная цепь
ФМС,
феррицианид
ФМС
Феррицианид,
ФМС
NC-3
Дыхательная цепь,
через цитохром с
То же
1) Негеминовое железо в этих ферментах, вероятно, связано со стехиометрическими количествами
кислоторастворимой серы, как это показано для ферредоксина. Многие из этих ферментов также дают
характерный сигнал ЭЙР (g =1,94). Как правило, при растворении митохондриальных ферментов
сигнал пропадает.
2) После того как эти ферменты переведены в раствор, их можно испытывать только с
искусственными акцепторами, такими, например, как феррицианид или ФМС (феназинметосульфат).
3) ФАД связан с белком ковалентно и может быть удален только при обработке протеолитиче-
скими ферментами.
мому, играют ключевую роль в процессах переноса электронов, идущих
при участии флавинов в качестве доноров или акцепторов, на участках
дыхательной цепи, сильно различающихся по своему
окислительно-восстановительному потенциалу.
КОФЕРМЕНТЫ ХИНОИЫ
Другую группу переносчиков, способных взаимодействовать с флавопро-
теидами дыхательной цепи (см. стр. 389), составляют производные бензо-
хинона — коферменты Q (KoQ), или убихиноны (УХ), имеющие следующую

380 Глава XV
структуру:
<ГНэ
С
(СН2—СН=С—СН2)ЛН
Убахаион
где п варьирует от 6 (в коферыентах некоторых микроорганизмов) — и тогда
их обозначают как KoQ6 или УХ30 —до 10 (в митохондриях большинства
млекопитающих). В последнем случае коферменты обозначают как KoQ]0
или УХ50.
Близкие к убихинонам пластохиноны, выполняющие аналогичные
функции переносчиков при транспорте электронов в процессе фотосинтеза,
отличаются от убихинонов алкильпьши заместителями в бензольном кольце.
Пластохиноны. содержат две СН3-грушш вместо двух ОСН3-груип и II тюсто
СНз-грушш. Пластохиноны В и С имеют, кроме того, по одной оксигрутше
в боковой цепи.
ДЕГИДРОГЕНАЗЫ, СВЯЗАННЫЕ С ПИКОТИПАМИДНЫМИ КОФЕРМЕ1ІТАШ1
В гл. VIII мы уже обсуждали структуру и функцию обоих никотинамид-
пуклеотидных коферментов — НАД и НАДФ. Эти коферменты, как правило,
легко отщепляются от соответствующих апоферментов. Восстановленные
коферменты часто бывают связаны с белком более прочно, чем окисленные.
Ионы Zn2+ могут участвовать в связывании кофермента с белком, как это
было доказано для нескольких высокоочищенных дегидрогеназ.
Взаимодействие фермента с субстратами во многих случаях происходит при участии
тиоловьіх групп.
Поскольку восстановленные никотинамиднуклеотидные коферменты
имеют максимум поглощения при 340 ммк и обнаруживают сильную
флуоресценцию при 440 ммк, реакции, катализируемые зависящими от них
ферментами, удобно изучать оптическими методами. Процесс идет путем
обратимой, протекающей с большей скоростью реакции образования четырех
двойных (т. е. фермент — субстрат и фермент — кофермент) и двух тронных
(фермент — кофермент — субстрат) комплексов. При этом нередко
образование бинарных комплексов происходит в определенной
последовательности, и существует принудительно действующая цепь реакций, в которых
кофермент играет роль «ведущего!) субстрата (см. гл. VI). Окислительно-
восстановительный этап имеет место на стадии тройного комплекса и, но всей
вероятности, заключается в переносе гидрид-иона (или протона п двух
олектропов):|
(Ф) + + П2О ^ ИДОП-|-НАД(Ф)-11* + Н+, (XV.На)
!-НАД(Ф)+ ~„1 Д + НЛД(Ф)-Н + Н+. (XV.J16)
Перенос водорода, согласно уравнению (XV.11а), является обратимым,
стереоспецифичным как в отношении субстрата, так и в отношении
кофермента, а также прямым (т. е. он происходит без участия растворителя или
какого-нибудь компонента, принадлежащего белку и способного
обмениваться протоном с растворителем со скоростью, превосходящей скорость
стадии переноса водорода). Если окисленный субстрат (В.ДОН) содержит
атом кислорода, отсутствующий у восстановленного (ЇЩН), то кислород

Биологическое окисление 381
и свободный протон должны поставляться растворителем. В обеих
реакциях (XV. 11а) и (XV. 116) освобождается протон, и поэтому окислению
субстрата благоприятствуют высокие значения pH.
К настоящему времени выделено несколько сот дегидрогеназ,
различающихся по субстратной специфичности и характеристикам белковой молекулы.
Однако, несмотря на это пугающее разнообразие, число типов реакций
относительно невелико:
R' R'
R" —С — ОН + НАД(Ф) + ^ R" —С = О •-НуЧД(Ф)-Т-1-1-Н+, (XV. 12)
H
H О
R — С = О-!-НЛД(Ф)+ ; -А- ^ R —С —А-|-НЛД(Ф)-гІ + И+,
A- — OII-, РО3П-, KoAS-, (XV.13)
11СО2Н + НАД(Ф)+ —> СО2 + НАД(Ф).Ц-|-Ы+, (XV.14)
U' —СМ —N11 —11"' + НАД(Ф)+ ^ И' — C=N —Rw-f НЛД(Ф)-11-[-Н+. (XV.15)
І ^~~ і
R" R"
ГЕМОПРОТЕИДЫ
ПРОСТЕТИЧЕСКИЕ ГРУППЫ И РЕАКЦИИ
В природе гомопротеиды распространены повсеместно. Они участвуют
в реакциях переноса О2, восстановления перекисей и переноса электронов
между дегидрогеназами и акцепторами. Простетические группы всех этих
белков представляют собой Рс2+-хелатпроизводпыс нротопорфирина IX,
который называют также протогемож или просто земом. Его структура
приведена на фиг. 105. На отой фигуре изображены также другие важнейшие
простетические группы гемопротеидов.
Гсмът представляют собой хелатпые комплексы железа с плоской
квадратной .молекулой, в которых металл способен присоединить еще два лиганда.
При этом связывание с одним из лигандов существенно облегчает
взаимодействие с другим. Такие октаэдрмческие комплексы с шестью
координационными связями называют гемохромами.. У многих гемопротеидов по
крайней мере одно из этих положений занято гистидиновым остатком белка. Если
шестая координационная связь занята лигандом, обладающим сравнительно
слабым поледі (Н2О, Ci", — GOO"), как это имеет место в миоглобнпе и
гемоглобине, то такой лиганд может быть замещен на другой, способный
образовывать с центральным атомом металла более прочную связь. Особенно ярко
это проявляется, когда этот второй лиганд может образовывать я-связи
(О2, GO, CN~, N-гетероциклы). Таким путем высокоспиповые комплексы
могут превращаться в низкоспиновые.
Гемы окисляются молекулярным кислородом или другими окислителями
до соответствующих Ре3+-ироизводкьтх, называемых феррипротопорфири-
нами или геминалш. Эти ферри-ко.мплексьт имеют дополнительный
положительный заряд; этот заряд при работе с изолированным комплексом должен
быть нейтрализован каким-нибудь анионом. Если в качестве аниона
используется хлорид-ион, то такой комплекс с пятью координационными связями,
направленными из центра квадратного основания пирамиды к ее вершинам,
называется геминхлоридом или хлоргемипом. В щелочтгом растворе ион
хлора замещается ионом ОН" и образуется соединение, называемое
гематином. Го мины легко образуют с некоторыми лигапдами октаэдрические ком-

CH3
Дсн=сн2
н3с
сн2 сн2
-О2С-СН2 СН2-СО2-
Лротопорфирин IX
н=сн2
н3с
сн2
-O2C-CH2 СН2—СО2-
Ферропротопорфцрин IX
(прото) гем (IX)
Простетическая группа
гемоглобина,
миоглобина,
эритрокруорииа,
каталазы,
пероксидазы
цитохромов класса В
Н3С
сн2
-OjC-CHj
Гелі С
Лростетическйя группа,
цитохромов класса С
СН3 снз CHs
CH2-CH-(CH2),-CH-(CH2K-CH
НО-СН
СН=СН2
Гем A
Простетическая группа
цитохромов класса А
СН,
н,с=
ч3с-Ч;
(
н,с-<
нн
-о2с-
=сн
1
У-N
Y
CHj
СН2
К
Y
N
Ij
CH3
V
~/
J
J>-
сн2
сн,-
CHa
-сн
1
он
-сн.
-со,-
Простетическая принца
цитохромов класса aa
Гем
+2X
иХ \ У
N-
\
-Fe"
Фиг. 105. Простетическіїе группы гемопротеидов.
Хпорокруорогеы, простетическая группа хлорокруорина, отличается от гема только формильной
группой в положении 2.

Биологическое окисление
383
плексы с шестью координационными связями. Эти соединения называют
гемихромами.
Одно из наиболее примечательных свойств гемопротеидов — их спектр
поглощения (фиг. 106). Низкоспиновые ферро-комплексы имеют
характерный спектр, состоящий из трех полос. Спектры высокоспиновых ферро-
комплексов состоят только из двух полос: так называемой полосы Соре
вблизи 420 ммк и полосы при 550 ммк. Спектры ферри-комплексов не столь
единообразны. Так, для порфирина характерны две основные области
поглощения — полоса Соре и полоса, расположенная между 540 и 570 ммк,
которая интенсивна лишь у низкоспиновых комплексов. Кроме этих полос,
имеются еще две — вблизи 600 ммк и более слабая, при 500 ммк.
15
0,20 г,0
OJO
0,5
-л
1
* 1 0,3
1 0,2
\.o,/
— Hb
»•UuwoxpoM
A
¦ J
! !
t
\
250 500 350 400 450 500 550
Длина волны, ммк
A
450 500 550
Алина волны, ммк
Б
Фиг. 106. Спектры поглощения
соединений, содержащих гем.
А. Спектр поглощения типичного цитохро-
ма Ъ (цитохром Ь5 из дыхательных частиц
печени). Спектр восстановленной формы
можно получить либо после обработки ди-
тионитом, либо ферментативным путем с
участием восстановленного НАД. Б.
Спектры пиридиновых комплексов гемохромов
(гемоглобина и цитохрома, того же, что и
в предыдущем случае). Комплексы
получены добавлением основания пиридина к
данным соединениям с последующим
восстановлением дитиопитом. В. Спектры
поглощения гемоглобина (Н), окспгемоглобина
(О) и комплекса гемоглобина с окисью аяо-
та (N). По оси ординат отложены
значения оптической плотности 0,1%-пт.и
растворов в одноеантиметровой кювете.
O?
0,6
0,4
0,2
A
'1 \/^
r\
ні a
Щ
M
////
of
N \
Л I*
/\ \\
\
0 j
V „
1
600 550 500
Алина волна,
В

384 Г л а о а XV
ГЕМОГЛОБИН И ДРУГИЕ ДЫХАТЕЛЬНЫЕ ПИГМЕНТЫ
Гемоглобин, представляющий собой тетрамер с молекулярным весом
04 450, является важнейшим дихателышм пигментом высших позвоночных.
Структура гемоглобина уже была рассмотрена в этой книге. Этот ферро-
комгглекс в своей свободной от кислорода форме отличается от остальных
гемопротеидов в том отношении, что он. представляет собой высокоспиновый
Fo2+-KOAiimeKC с крайне низким окислительно-восстановительным
потенциалом. В этом соединении центральный атом железа образует плоский
квадратный комплекс с порфириновым кольцом и вдобавок имеет
координационные связи с одним сильнопольньш лигандом (гистидин) и одним
слабопольным (молекула воды). Только благодаря тодіу, что железо
соединено координационной связью с гистидином, который прочно связан с белком,
данное соединение вообще может существовать. Этим удается объяснить
сильно выраженную способность гемоглобина образовывать я-комплоксы
с такими лигандами, как О2, СО или CN~.
СО и CN~ связываются с гемоглобином во много раз прочнее, чем
кислород, и образуют с ним комплексы, распадающиеся под действие.« света.
Замена этих лигандов на молекулу воды по шестой координационной связи
приводит к глубокой структурной перестройке, в результате которой
комплекс становится низкоспиновым. Свободный гемоглобин легко окисляется
разнообразными агентами до ферри-формы, называемой метгемозлобином.
Все четыре гомогруппы в гемоглобине способны связывать кислород,
по соответствующие константы устойчивости не являются независимыми;
присоединение каждой молекулы О2 влияет на связывание последующих.
Эти четыре константы связывания относятся друг к другу примерно как
1 : 4 : 24 : 9. Взаимодействие такого рода называют кооперативным; в этом
случае график зависимости количества связанного О2 от напряжения
кислорода будет иметь форму сигмоидной кривой, а не гиперболы (фиг. 107).
Сходные кривые получаются также для процесса образования комплекса
гемоглобина с СО, с той литі і г. разницей, что константы связывания здесь
примерно в сто раз больше.
У позвоночных гемоглобин не просто растворен; он сильно
сконцентрирован в эритроцитах. В мышечных клетках содержится очень похожий на
гемоглобин пигмент — миоглобин. Структура миоглобина изучена гораздо более
подробно, чем структура гемоглобина. Этот белок (мол. вес 17 000)
представляет собой почти копию мономерной единицы гемоглобина. Поскольку он
содержит только одну простетическую группу гема на молекулу, кривая
кислородного насыщения имеет вид гиперболы. Близки к миоглобину гемо-
глобины, найденные в клетках кроврг некоторых примитивных
позвоночных, например миног. Эти белки имеют молекулярный вес 17 500 и содержат
только один гем на молекулу. Разнообразные дыхательные пигменты
обнаружены у беспозвоночных. К ним относятся эритрокруорины — высокопо-
лимерпые гемоглобиноподобные молекулы, которые присутствуют но в
форменных элементах, а в жидкой фазе крови некоторых кольчатых червей
(полихет и олигохет) и моллюсков. Молекулярный вес эритрокруоринов
колеблется в пределах от 4-Ю5 до 6,7-106; эти белки содержат от 30 до
400 гемогрупп на молекулу. В кроврг других кольчатых червей (например,
у Splrographis) содержатся зеленые гемопротеиды, называемые хлорокруо-
ринами. Их молекулярный вес равен 3,5• 106; каждая молекула содержит
190 групп хлорокруорогема (см. фиг. 105). Независимо от размера все эти
гемопротеиды связывают по одной молекуле О2 на каждую группу гема.
Гемеритрини и гемоциаиины — дыхателъпше пигменты,
присутствующие в форменных элементах крови некоторых червей (Sipunculiclae)
и в плазме ряда моллюсков и ракообразных,— не содержат гомогрупп.

Биологическое окисление
385
Гемеритрин у Sipunculus содержит 16 атомов негеминового железа, по всей
вероятности связанного с белковой молекулой таким же образом, что
и в структуре, обнаруженной в других негеминовых белках. Для связывания
одной молекулы кислорода здесь используются два атома металла. Это
справедливо и для гемоцианинов — высокомолекулярных медьсодержащих
Давление Ог,мм рт.ст.
Ш 20 30 40 50 60 10
SO 90
О 0,05 0,Ш 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50
Давление С0,% от атмосферного
0,05 0,70 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35
АавлениеСО, мм рт.ст.
Фиг. 107. Кривые насыщения гемоглобина кислородом и СО.
Равновесные кривые СО-гемоглобина (сплошные линии) и О2-гемоглобина (крестики) при давлении
СО», равном 0, 19, 41 и 79 мм рт. ст. соответственно (слева направо). По оси абсцисс — давление
СО (две нижние шкалы) и 02 (верхняя шкала); по оси ординат— процент насыщения.
белков, которые у омара, например, содержат 20 атомов меди на молекулу
белка (мол. вес 780 000). Известны гемоцианины (например, у улиток),
молекулы которых имеют примерно в 10 раз большие размеры.
ГИДРОПЕРОКСИДАЗЫ
К гидропероксидазам относятся ферменты каталаза и пероксидазы.
Каталаза чрезвычайно широко распространена в природе; она
присутствует в печени и крови позвоночных и у разнообразных микроорганизмов.
Пероксидазы имеются у растений, а также содержатся в лейкоцитах и молоке.
Каталаза и пероксидазы ускоряют реакцию одного и того же типа:
(XV.16a)
В случае каталаз в качестве субстрата-окислителя наиболее
эффективным является Н2О2 (R = Н). Но этот фермент функционирует также с алкил-
25—246

386 Глава XV
гидроперекисями, в которых R имеет небольшую длину и представляет
собой одну из следующих простых групп (эти группы расположены здесь
в порядке убывания эффективности катализа): H ^> СН3 > С2Н5.
Наилучший донор электронов (ковосстановитель) — это вторая молекула
Н2О2(Х = О2). В этом случае и если R = H уравнение (XV. 16а)
представляет собой уравнение «каталазной» реакции:
2Н2О2 —> 2Н2О + О2. (XV.166)
В остальных случаях реакция будет «пероксидазного» типа. Н2Х или Хп
может представлять собой аскорбиновую кислоту или ферроцианид, какой-
либо фенол, спирт с короткой цепью или муравьиную кислоту, нитрат
натрия и, наконец, азид или гидроксиламин. Если в процессе какой-либо
реакции образуется перекись водорода in situ (например, в реакции,
катализируемой флавинсодержащей дегидрогеназой), то в присутствии каталазы
и соответствующего ковосстановителя уравнение реакции будет выглядеть
следующим образом:
Флавопротеид+Каталаза
ДН2 + ХН2 + О2 > Д + Х+2Ы2О. (XV.17)
Хотя пероксидазы и способны катализировать реакцию (XV. 166), однако
наиболее эффективно они катализируют реакцию (XV. 16а). Косубстратами
пероксидаз служат фенолы, алифатические и ароматические амины,
восстановленные формы красителей (лейкоформы), ендиолы, а также цито-
хром с. Рассмотренные факты, а также наличие общей простетической группы
(все каталазы и большинство пероксидаз, по-видимому, содержат ферри-
протопорфирин IX в высокоспиновом состоянии), которая сама обладает
слабой каталазной и пероксидазной активностью, — все это позволяет
отнести эти ферменты к одному классу ферментов — к гидропероксидауам.
ЦИТОХРОМЫ
У гемоглобина и родственных ему пигментов функция простетической
группы состоит в переносе О2, причем присоединение и отщепление
кислорода не влияет на валентность иона железа, которое во всех случаях
остается в двухвалентном состоянии. У гидропероксидаз простетическая
группа переносит и разлагает перекиси, RO — ОН, сохраняя при этом свой
ион железа в окисленном состоянии (Fe3+). В противоположность этому
цитохромы не связывают никаких субстратов, но зато атом железа у них
постоянно переходит из двухвалентного в трехвалентное состояние и обратно.
Именно поэтому цитохромы способны служить переносчиками электронов.
Они выполняют свою «челночную» функцию, «снуя» между дегидрогена-
зами, с одной стороны, и конечными акцепторами — с другой. В
зависимости от величины потенциала конечного акцептора (от —0,20 до 0,80 в)
число таких переносчиков в дыхательной цепи (цепи переноса электронов)
может меняться. Мы рассмотрим этот вопрос в следующем разделе.
Табл. 47 иллюстрирует многообразие свойств известных в настоящее
время цитохромов. Будущее сулит еще большие осложнения. Так, цито-
хром с дрожжей существует по крайней мере в двух различных изофер-
ментных формах, и такое положение, по-видимому, справедливо также
в отношении других клеток. Что касается простетической группы и ее связи
с белком, то здесь как будто существует почти безусловное единообразие.
В самом деле, за исключением цитохромов типа а (класс А), все остальные
представляют собой производные гема. Основная структура простетиче-

Таблица 47
Свойства цитохромов
Класс
А
А2
В
В420
С

Название
а
а3
а1
пп
Ъ
h
b&
h
0
с
cl
C2
C3
ck
C5
C554
C555
или/
C556
или h
Источник
Митохондрии !)
Митохондрии *• 3)
Бактерии
Pseudomonas *)
Митохондрии *> 5)
Escherichia coli "')
Другие бактерии
Дрожжи
Микросомы растений
Микросомы, митохондрии
печени
Хлоропласты
Початок Arum
Микросомы 9)
Acetobacter, Е. coli
Митохондрии !)
Митохондрии 1> 5)
Депитрпфицпругощие
бактерии
Desulfovibrio desulfuricans
Azotobacter 1°)
Azotobacter l")
Солоустойчивые бактерии И)
Хлоропласты
Г снатопанкроас
брюхоногих моллюсков
Хтах' лшк С8 мМ]
восстановленная форма
а
600 [23]
603,5
[19,4]
590
652
563 [21]
560
559
557 [33]
559
556 [26]
563
560
—
568 (СО)
550 [27,7]
554 [24,1]
550—552
552
551
555
554
555
556
?
— 2)
—
629
532
530
528
528 [17]
529
526 [13]
529
—
521 [15,9]
524 [11,6]
522—525
522
522
524
521
525
527
V
439 [94]
443 [79]
430 (СО)
460
429 [114]
426
426
424 [198]
425
423 [171]
420
450 (СО)
415 [125]
418 [116]
416—418
418
414
418
415
423
422
окисленная
форма
V
425 [76]
412
415
415
413 [117]
413 [115]
407
407
410
410—412
410
414
414
413
408
-'о
т-0,28
@,30)
0,05«)
0,250
0,02
—0,06
—0,03
0,254
0,220
0,25
-0,205
0,30
0,32
0,365

Молекулярный вес
М' 103
240
90
30
170»)
40
14
13
37
32
11,3 е)
НО9)
18,5
ческий
восстановитель
с
с-\-а
С
С551
KoQ, НГЖ
ФП?
ФП
ФП
ФП
ФП
ФП?
Ь
?>5
Гицроксилаза
С
с,
Ъ
ФП?
ФП?
в
С4
frg?
?
ческий
окислитель
аз
о2
о2
О9
С1
Qi. Q2
NO3
cj или с
?
с, Р450
р
о2?
о2
о2
а
с
NO~^
SOj
С5
?
Хл а
?
і) Данное соединение было обнаружено (а в некоторых случаях и выделено) в митохондриалыюй цепи переноса электронов у животных, растений, дроік-
жей и плесневых грибов (Neurospora). 2) Черта указывает, что компонент или реакция отсутствует; пустое пространство означает, что сведений о данном
компоненте или реакции не имеется. З) Определяется как элемент цитохромоксидазы, который реагирует с СО в восстановленном состоянии и с HCN, HNO2, a
также, вероятно, Оа — в окисленном состоянии. Мономерная цитохромоксидаза имеет мол. вес ==240 000 и содержит 2 гемогруппы на 1 молекулу [а-Си : аз-Си=
= 1]. Минимальный размер функциональной единицы втрое больше (==700 000). 4) Цитохромоксидаза Pseudomonas и конечная оксидаза некоторых бактерий
не содержат цитохрома а3. Изолированный белок содержит 1 моль гема с и 1 моль а%. Его систематическое название — цитохром CD. ») Чистые препараты
этих цитохромов, обладающие ферментативной активностью, из митохондриальпых источников до сих пор еще не получены. 6) Указанная величина определена
для нативной формы, находящейся в митохондриях. Для фермента в изолированном виде, т. е. в растворимой форме, характерны значительно меньшие
величины, Точно так щ; частично дзнгтурчровшиаз фэрмзигы, находящиеся в составе частиц, имеют измененные значения E'q и становятся аутоокисляемыми.
') Цитохром, присутствующий во многих бакгерчях и сходный с цитохромом Ь. 8) Компонент Ь-лактатдегидрогепазного комплекса. Приведенный в таблице
молекулярный взс опрэдзлэн для дямерной фэзчы, содержащей 2 гемогруппы и 2 ФМН. 9) Две гемогруппы на молекулу. Ю) Возможно, является конечной
оксидазойв микрооомнойцепипзрзноеа элзкгроал; донором а лек грона можзт б ыгь либо цягохром Ьъ, либо микросомная гидроксилаза. В спектре явно выражен только
Y-пик. Данный цитохроі также иногда называют? 450, что объясняется совпадением X СО-комплекса этого белка с Р450. И) Ранее его называли цитохромом Ь4.

388
Глава XV
400
500 ' 600
Л,ммк
ской группы изменена, и то незначительно, только в цитохромах С, в
молекулах которых цистеиновые остатки белка соединены с винильными
боковыми цепями гема; в результате простетическая группа оказывается
связанной с белком как через ион металла, так и через эти дополнительные
ковалентные связи.
Цитохромы были открыты в 1886 г. шотландским врачом Мак-Мунном,
который наблюдал их характеристические спектры поглощения с помощью
примитивного спектроскопа и обнаружил, что эти вещества присутствуют
в самых различных тканях. Он назвал их «гистогематином» и «миогемати-
ном», так как считал, что они родственны гему
и гемину. Таким образом, Мак-Мунн четко
представлял себе их химическую природу.
Более того, он предположил, что они
выполняют дыхательную функцию, связанную с
переносом кислорода,— никаких других форм
дыхательной активности в то время еще не
было известно. В 1925 г. Д. Кейлин, изучая
дыхание у вощинной моли, а также у пчел и
других насекомых, обнаружил, что эти пигменты
присутствуют повсеместно, и дал им общее
название «цитохром». Он быстро установил, что
700 обратимые окислительно-восстановительные
изменения лежат в основе функции цитохрома,
получил данные, согласно которым этот
пигмент относится к гемохромогенам, и показал,
что дыхательные яды, введенные в
употребление Варбургом, т. е. цианиды и наркотики
(уретан и барбитураты), сильно действуют на
«цитохром». При этом их действие было
противоположным: в то время как первые подавляли
окисление, вторые блокировали
восстановление. К 1930 г. Кейлин уже установил, что
«цитохром» состоит из трех различающихся по
— своим спектрам компонентов, которые он
назвал цитохромами а, Ъ и с; из них компонент
а поглощает в самой длинноволновой, а
компонент с —в самой коротковолновой области
спектра (см. табл. 47). Кроме того, он
получил данные, говорящие о том, что цитохром Ь
расположен ближе других цитохромов к
субстратному «краю» цепи, и предположил, что
существует чувствительный к GO,KCN и H2S
компонент, связывающий цитохромы с О2- Кейлин
назвал его «цитохромоксидазой» (подчеркнув
тем самым, что не считает его цитохромом или
хотя бы гемопротеидом) и полагал, что этот
посредник содержит медь. Тем временем Варбург,
изучая спектры действия, получил четкие
доказательства того, что его чувствительный к GO Atmungsi'erment
представляет собой гемопротеид (фиг. 108). Затем Кейлин и Хартри показали в 1939 г.,
что цитохромоксидаза и цитохром а3 — это одно и то же и что цитохромы,
вероятно, функционируют в качестве переносчиков электронов, образуя не-
разветвленную цепь; они же установили, что терминальный участок цепи
состоит из цитохрома с, тесно связанного с оксидазой.
АО
3.0
2,0
3,0
0
3?
2,0
400
500
600
Фиг. 108. Спектры действия
фотохимической реакции
дыхательного фермента Варбурга
и цитохромоксидазы.
А. Цитохромоксидаза
(млекопитающие). Б. Дыхательный фермент
(дрожжи). Спектры получили,
измеряя эффективность, с которой
свет различных длин волн снимал
вызванное окисью углерода ингиби-
рование поглощения О2 в целых
клетках (В) и в ферментных
препаратах (А). По оси ординат—
отношение эффективности света с
данной длиной волны к эффективности
света с к = 436 ммк.

Биологическое окисление 389
МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ЦЕПЬ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Современное состояние наших знаний в этой области достигнуто
благодаря использованию целого ряда экспериментальных подходов. К ним
относятся: 1) применение более совершенного спектроскопического
оборудования для измерения содержания переносчиков (НАД, флавопротеидов,
цитохромов) и кинетики их восстановления и окисления в разнообразных
дыхательных органеллах; 2) использование разнообразных методов,
позволяющих удалять из митохондрии ферменты, участвующие в окислении
субстратов, окислительном фосфорилировании и других реакциях, связанных
с дыханием, с тем чтобы можно было исследовать лишь те реакции, которые
ответственны за перенос электронов; 3) дальнейшее дробление митохондрий
и дыхательных субчастиц для получения комплексов дыхательных
ферментов, свободных от структурных белков; эти комплексы можно подвергать
дальнейшей очистке для получения гомогенных препаратов и исследования
свойств, функций и взаимосвязи их компонентов; 4) воссоздание цепи
переноса электронов с использованием вышеупомянутых препаратов совместно
с растворимыми ферментами; 5) использование ингибиторов дыхания.
ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ В МИТОХОНДРИЯХ СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ БЫКА
По ряду причин митохондрии из сердечной мышцы быка особенно удобны
для изучения переноса электронов, т. е. окисления кислородом
восстановленного НАД и сукцината. Именно из этой ткани удалось впервые
выделить модифицированную дыхательную частицу («препарат Кейлина —
Хартри», впервые описанный в 1940 г.). Система переноса электронов в
митохондриях из сердечной мышцы быка отличается особенно высокой
стабильностью, что зависит, возможно, от чрезвычайно низкого содержания про-
теолитических ферментов. Кроме того, здесь с дыхательной цепью связано
минимальное количество других дегидрогеназ. Наконец, эти митохондрии,
по-видимому, не имеют других систем, окисляющих восстановленный НАД,
в отличие от митохондрий печени млекопитающих.
Грин и его сотрудники воспользовались митохондриями сердечной
мышцы для получения различных субмитохондриальных частиц,
осуществляющих перенос электронов. В конце концов они получили четыре
комплекса, каждый из которых был способен катализировать какую-либо
одну реакцию переноса электронов. Объединяя эти комплексы в различных
комбинациях, они наблюдали катализ двух или большего числа реакций.
Основные компоненты дыхательной цепи митохондрий, а' также кинетика
соответствующих реакций в разных клетках весьма схожи:
Субстрат —> НАД —> Флавопротеицд —> Цитохром Ъ —>
I
Сукцинат —> Флавопротеидя 1
—> Цитохром с4 —> Цитохром с —> Цитохромы (а + а3) —> О2 (XV. 18)
КОМПЛЕКСЫ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ
Четыре упомянутых выше комплекса осуществляют следующие реакции
(фиг. 109):
Комплекс I
>, НАД+4-Восст. KoQ Восст. НАД.-KoQ —окспдоредуктаза
(XV.19)

390
Г л'а в а XV
Сз'кцинат -
Комплекс II
-KoQ > ФумаратЦ-Восст. KoQ
Сукцинат:КоС> —оксидоредуктаза
(XV.20)
Восст. KoQ+ 2 Цитохром c(Fe3+)
Комплекс III
KoQ+ 2 Цитохром >(Fe2+)
Восст.KoQ:rriiToxpoM с—оксидоредуктаза (XV.21)
Комплекс IV
4 Цитохром c(Fea+) + O2 > 4 Цитохром c(Fe3+)+H3O
Цитохромоксидаза (цитохром с:О2 — оксидоредуктаза) (XV.22)
Ясно, что если учесть еще присутствие двух подвижных переносчиков,
KoQ и цитохрома с (они почти полностью отделяются при выделении
комплексов), то этого достаточно, для того чтобы полностью описать все
окислительно-восстановительные реакции митохондриальной системы переноса
электронов. Так, объединение комплекса I с комплексом III позволяет
получить митохондриальную НАД-Н: цитохром с — оксидоредуктазу.
Комплексы II и III в сочетании дают митохондриальную сукцинат : цитохром с —
оксидоредуктазу, а комплексы I + III + IV — митохондриальную
НАД-Н-оксидазу, комплексы II + III + IV — митохондриальную сукцин-
оксидазу и, наконец, совокупность комплексов I, II, III и IV — всю цепь
переноса электронов, т. е. НАД-Н- и сукциноксидазу вместе (XV.18). Для
того чтобы такая реконструированная цепь эффективно работала,
необходимо все эти комплексы смешать друг с другом в стехиометрических
соотношениях, взяв их в довольно высокой концентрации вместе с цитохромом с
и коферментом Q. Последние два компонента представляют собой
подвижные, жирорастворимые переносчики, способные связывать между собой
различные процессы как в реконструированных системах, так и в целых
электронпереносящих частицах (ЭПЧ) или митохондриях. Кофермент Q
благодаря своей длинной алифатической боковой цепи хорошо растворим
в лшшдах, а цитохром с, который представляет собой водорастворимый
белок, становится жирорастворимым, соединяясь с митохондриальными
фосфолипидами. Наиболее убедительные доказательства того, что
реконструированная из четырех комплексов цепь переноса электронов точно
воспроизводит цепь интактной митохондрии, были получены в опытах
с использованием ингибиторов.
Лируват
/З-Окси-
бутират
Субстраты
Прочие митохонари-
альные ФП-дегидро~
ганазы
Стрикпщрныеипрочие белки
VST J/IV \
НГЖги/яп.с, е+Цитсиш+(Циг.а)лCum (Цит.а3)„, Сип*
Фосфо^ичиды
Фиг. 109. Система переноса электронов в митохондриях лз сердечной мышцы быка.
Д— НАД-зависимая дегидрогеназа; ДК — НАД-зависимый дегидрогеназный комплекс; ФП— флавопро-
теид; ФП».— НАД.Н-дегидрогеназа; ФПд-сукцинатдегидрогсназа; І1ГЖ — негоминовоо железо.
Жирными линиями отмечена митохондриальная система, содержащая ферменты и другие компоненты,
локализованные на наруяшой и внутренней мембранах и в матрмксо митохондрии. Системы, связанные
с наружными мембранами, могут быть удалены, и тогда впутримитохоидриальное содержимое
освобождается. При этом получают электроппереиосящие частицы, которые все еще способны
катализировать ключевые реакции: восст. НАД -t> O2 и сукцинат —>- О2: иногда сохраняется также способность
к окислительному фосфорнлировашпо. при дальнейшем «дроблении» можно получить электропперено-
сящую едипи у, которая состоит из четырех комплексов (I—IV).

Биологическое окисление
391
ИНГИБИТОРЫ ДЫХАНИЯ
Ингибиторы, в особенности цианид, СО и некоторые наркотики, сыграли
важную роль в формировании наших представлений о клеточном дыхании.
В дальнейшем в подобного рода исследованиях были использованы
некоторые другие ингибиторы, что в сочетании со спектрофотометрическими
методами дало в руки исследователей ценный инструмент для разрыва цепи
Таблица 48
Ингибиторы дыхания
Класс

ингибиторов
А
В
С
D
Е
F
G
Ингибиторы
HCN, HN3, CO
Антиміщин А х)
N-окись 2-алкил-4-
оксихинолина
3B-метилоктил)-наф-
тохинон
БАЛ2 _|_ Q
Ротонон 3)
Барбитураты (амитал,
секонал)
Теноилтрнфтораце-
ТОН 4)
Олпгомицин б)
Атрактплат в)
Разобщающие агенты
(замещенные
фенолы, фенилгидразо-
ны, грамицидин,
арсенат, дикумарол)
Арсенит, Cd3+
Комплекс или реакция, на которую
воздействует данный ингибитор
IV Цитохром e(Fe3+)—> О3
III Цитохром fc(Fo2+)—> Цитохром
c-t(Fe3+) (возможно, негеминовое
железо)
III То же
III?
III?
I ФМН —> Кофермент Q п(пли)
цитохром 6(Fo3+)
І То же
II Поптид-ФАД —^ Кофермент Q
и(или) цитохром Ь
Ингибируют дыхание, сопряженное
с фосфорилированием (Восст.
НАД —> О2 или Сукципат —> О3)
Стимулируют дыхание, когда его
скорость лимитируется
фосфорилированием или когда оно
блокировано олигомицином
Ингибпруют дыхательные реакции
с участием ос-котоглутарата и пи-
рувата путем блокирования дигид-
ролипоплдегидрогеназы.
Ингибируют фосфорилирование,
по-видимому, в точке 3 или перед ней
Применяемые
концентрации
< 10-* M (CN-)
Стехиометриче-
ская по
отношению к цитохро-
мам
— ю-« м
- lu M
- Ю-з м
Стехиомотриче-
ская по
отношению к флавопро-
ггіл 1ТТТЛ7
їв ид у
> Ю-з м
> 10-4 м
1) Антибиотик, вырабатываемый одним из видок Streptomyces.
2) Сокращение от «Британский антилюизит» — синтетический комплекоон.
3) Яд, особенно сильно действующий на рыб. Выделен из корней некоторых растений. Имеет
следующую структуру:
4) 4,4,4-трифтор-1 B-тиенил)-1,3-бутандііоіг,
5) Антибиотик, получаемый из актицомпцетов; представляет собой полипептид.
<3) N-глюкоЗид, выделенный из растения Atractylus.

392 Г лав а XV
в разных точках Ч Благодаря этому удалось установить последовательность
компонентов цепи и способ их взаимодействия. Специфические ингибиторы,
используемые в таких исследованиях, приведены в табл. 4.8. Вообще говоря,
некоторая целостность структуры комплекса, видимо, необходима для того,
чтобы он мог взаимодействовать с большинством ингибиторов, так как
с растворимыми, не содержащими фосфолипида ферментами характерной
картины ингибирования наблюдать не удается.
РОЛЬ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЛИПИДОВ;
Митохондрии содержат довольно большое количество липидов. Из них
более 90% составляют фосфолипиды — неотъемлемая часть мембранных
систем. Даже выделенные субмитохондриальные частицы и очищенные
комплексы сохраняют липидный компонент.
Липиды митохондрий сердечной мышцы состоят примерно из равных
количеств фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина — на долю каждого
из этих соединений приходится приблизительно по 35% общего количества
липидов; около 16% составляет кардиолипин.
Митохондриальные фосфолипиды характеризуются особенно высокой
степенью ненасыщенности: в сердечной мышце на каждый атом фосфоли-
пидного фосфора приходится в среднем 3,2 двойной связи. Эта
ненасыщенность, видимо, имеет определенное функциональное значение, так как
каталитическая активность любого из четырех комплексов при экстракции
липидов жировыми растворителями резко снижается, а при добавлении
ненасыщенных фосфолипидов (например, липидов из митохондрий, лецитина
из яиц, мяса и сои или же синтетического олеиллецитина) снова
восстанавливается. При этом чем больше степень ненасыщенности добавляемых
липидов, тем резче выражен их активирующий эффект. Роль фосфолипидов,
по-видимому, двояка: 1) они стабилизируют активные конформации белков^
дыхательной цепи, как каждого в отдельности, так и их комплексов, и 2) они
способствуют взаимодействию активных белков с другими важнейшими
компонентами — коферментом Q, факторами, необходимыми для
окислительного фосфорилирования, а также со структурными белками.
ДРУГИЕ КОМПОНЕНТЫ
Кроме уже описанных компонентов, в большинстве митохондрий
содержится также витамин К и родственные ему нафтохиноны, а также витамин Е
или родственные соединения.
Хотя было достоверно показано, что митохондрии (или эквивалентны©
им частицы) могут взаимодействовать с экзогенными нафтохинонами, гидро-
хинонами и некоторыми производными витамина Е, остается неясным, как
это связано с функциями^дыхательных частиц.
СНз СН3
(СН2)зСН(СН2KСН(СН2)зСНСНз
1 Витамин Е (?-токоферол)
1 Определение места действия ингибитора облегчается «правилом перекреста»,,
установленным Чансом и Уильямсом; это правило гласит, что если некоторый ингибитор
добавить к находящейся в стационарном состоянии системе взаимодействующих друг
с другом переносчиков электронов, то переносчики с большим
окислительно-восстановительным потенциалом (слева от точки действия ингибитора) восстанавливаются, а
переносчики, расположенные справа,— окисляются.

Биологическое окисление
393.
СН3 СН3 СН3 CH,
К,: R = СН=С(СН2)зСН(СН2)зСН(СН2).іСНСНз
I |
К2: R =СН=ССН2(СН2СН=СLСН2СН =
Кз: R = H (мепадиші)
Витамин К
3
ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ
В период с 1937 по 1941 г. Белицер и Цыбакова, а также Калькар провели
целый ряд экспериментов, которые сделали очевидным, что энергия,
выделяющаяся в огромном количестве при полном окислении метаболитов в цикле
Пируоат
Липоат
КоА-произоодные
сс-Кетоглутарат се-Плицеро- жирных
Сикцинат фосфат кислот Оскорбит
1 і і
Цит.с,~
тмфд 7Т*
I © ' I
-Uumc^r--(u,uni.alu5) ¦
Ye
С"~П
p.
x~r]
-1"
Осмотическая работа,
механическая работа,
реакции, нуждающиеся
а энергии
-АДФ
И
AIФ (внутри)
\—*~ААФ
-АДФ
(E) Атрактилат АТФ(вне)
I Субстрат
Фосфорилированный или
модифицированный субстрат
Фиг. 110. Связь дыхательной цепи и фосфорилирования в митохондриях.
і 2 и S точки фосфорилирования, А, В, С, D и Е — точки приложения действия ингибиторов
дыхания (см. табл. 48). БОБ — D-?-оксибутират; БОА — L-?-оксиацил; ФПр — дегидрогеназа
жирных кислот; ФПЭ — флавиновый переносчик электронов; ТМФД — тетраметил-п-фенилендиамин;
ТХГХ — тетрахлоргидрохинон; С » I и т. п.— промежуточные продукты процесса окислительного
фосфорилирования с AG0'« 0 в реакции С - I -4- С_+ I; Е — разобщители типа дипитрофенола;
As,-
¦ HAsO|-.
лимонной кислоты, используется клеткой для синтеза АТФ. Этот процесс
называют окислительным фосфорилированием. Исследования были затем
продолжены в нескольких лабораториях. В результате к 1950 г. выяснилось,

394 Г лав а XV
что способность осуществлять окислительное фосфорилирование присуща
исключительно митохондриям, что дыхание (т. е. окисление) и
фосфорилирование могут быть разобщены с помощью определенных соединений, таких,
как 2,4-динитрофенол, что подавляющее число точек фосфорилирования
свяаано с цепью переноса электронов, а не с окислением на уровне
субстрата \ и что число молей АТФ, образующегося на 1 г-атом поглощенного
кислорода, т. е. отношение Р/О для различных субстратов, подвергающихся
одностадийному окислению, весьма близко к целым числам. Так, для
превращения а-кетоглутарата в сукцинат было получено значение Р/О ~ 4;
для превращения малата в оксалоацетат, глутамата в а-кетоглутарат
и ?-оксибутирата в ацетоацетат отношение Р/О равно 3; для превращения
сукцината в фумарат или малат это отношение равно 2.
Для последующего обсуждения нам удобнее преобразовать
уравнение (XV. 18), а также схему, приведенную на фиг. 109, к такому виду, как
это изображено на фиг. 110 (вверху); в этой второй схеме отображено также
окислительное фосфорилирование (внизу).
ТОЧКИ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ И ОТНОШЕНИЕ Р/О
Число точек фосфорилирования и их локализация в цепи переноса
электронов были установлены с помощью целого ряда прямых и косвенных
методов. Прямые измерения обычно проводят с помощью полярографического
метода, определяя поглощение кислорода, или же используют изотопную
метку (Р32), или, наконец, определяют образование АТФ или убыль АДФ
с помощью ферментативных методов. Сравнение полученных при этом
значений для отношения Р/О показало, что для истинного фосфорилирования,
обусловленного реакциями в дыхательной цепи, отношение Р/О равняется 3
(окисление восстановленного НАД и субстратов НАД-дегидрогеназы) и 2 (для
субстратов флавиновых ферментов, например для сукцината). Поскольку
стадии, следующие за реакциями, которые протекают с участием флавопро-
теидов, для всех субстратов одинаковы, одна из точек фосфорилирования
должна быть локализована в пределах комплекса I. Оставшиеся две точки,
таким образом, должны быть расположены на коротком отрезке цепи между
коферментом Q (цитохром Ь) и О2. Одна из них (точка 2), вероятно,
локализована между коферментом Q и цитохромом сі (или с), т. е. в пределах
комплекса III. Такое заключение подтверждается тем, что в системе, в которой
цитохромоксидаза блокирована с помощью HGN, для окисления
восстановленного НАД или D-?-оксибутирата при добавлении цитохрома с величина
Р/2е' (то же, что и Р/О) оказывается равной 2. О локализации третьей точки
фосфорилирования в области цитохромоксидазы можно судить по
результатам только что описанных экспериментов, а также исходя из того факта,
что окисление аскорбиновой кислоты — переносчика, способного отдавать
электроны только цитохрому с,— в присутствии тетраметил-га-фениленди-
амина (ТМФД) характеризуется отношением Р/О, равным единице.
Ни скорость, ни стехиометрия этой реакции не изменяются в присутствии
антимицина А. В основном к тем же выводам пришли Чане и Уильяме,
исходя из своих экспериментов с использованием ингибиторов (см. стр. 392).
Когда к интактным митохондриям добавляют субстрат и Фн, наблюдается
явление, получившее название дыхательного контроля; при этом в
отсутствие АДФ скорость дыхания становится очень низкой (так называемое
состояние 4). После добавления АДФ система возвращается в состояние 3.
1 Среди всех субстратов цикла лимонной кислоты лишь а-кетоглутарат способен
осуществлять истинное фосфорилирование на субстратном уровне, приводящее к
образованию одной молекулы АТФ на молекулу окисленного субстрата (см. гл. XIV).

Биологическое окисление 395
Таким образом, состояние 4 можно рассматривать как ингибированное
состояние цепи, а переход из состояния 3 в состояние 4 аналогичен
переходу, который происходит, когда к дыхательной системе, находящейся
в стационарном состоянии, добавляют какой-либо ингибитор дыхания.
Поэтому, сравнивая с помощью спектрофотометрических методов степень
окисленности различных переносчиков после этого перехода, можно
определить те пары переносчиков, которые взаимодействуют с АДФ в точке
фосфорилирования. Результаты таких экспериментов приводят к выводу,
что процессы фосфорилирования сопряжены с реакциями
восстановленный НАД -> ФПд , цитохром 6-»-цитохром ci и цитохром а->-цито-
хром аг. Наконец, если предположить, что каждый акт фосфорилирования
требует взаимодействия между восстановленным переносчиком и соседним
окисленным переносчиком, то придется признать, что эффективное
сопряжение возможно лишь тогда, когда разность свободных энергий между
такими парами переносчиков превышает свободную энергию реакции
АТФ + Н2О-^- АДФ + Фн. Отсюда следует, что фосфорилирование
возможно лишь в той реакции с участием данного комплекса, для которой
АС ^ —10 ккалімоль или АЕ'О ~ 250 мв. Как явствует из схемы,
приведенной на фиг. 103, возможными кандидатами в качестве точек
фосфорилирования могут быть только следующие пары: восст. НАД/ФП, ФП/цитохром Ъ
(кофермент Q), цитохром Ъ (кофермент Qj/цитохром Су и цитохром а/цито-
хром а3 (или О2). Полная энергия окисления восстановленного НАД
кислородом достигает 1,14 в или 51,3 ккалімоль. Так как при физиологических
концентрациях образование трех молекул АТФ (Р/О = 3) связано с
затратой 30 ккалімоль, к. п. д. этого процесса превышает 50%.
Для осуществления окислительного фосфорилирования со столь высокой
эффективностью природе пришлось создать весьма сложное
многокомпонентное устройство, составные части которого связаны с митохондриальной
мембраной и расположены строго упорядоченным образом. У бактерий, которые
отличаются более простой организацией дыхательной цепи, отношение Р/О
обычно ниже величины, наблюдаемой для соответствующих реакций в мито-
хондриальных системах.
ЧАСТНЫЕ РЕАКЦИИ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ
Общие модели. Разгадать загадку окислительного фосфорилирования —-
значит выяснить, каким образом свободная энергия, выделяемая в
окислительно-восстановительных реакциях дыхательной цепи, используется для
создания химической связи, которая в конечном счете после целой серии
последовательных изоэнергетических реакций замещения соединяет АДФ
с Фн, в результате чего и образуется молекула АТФ. Такие связи Липман
предложил обозначать символом ~, например АДФ ~ Ф или, в общем
случае, А ~ В1.
Основываясь на существовании реакций, рассмотренных выше,
большинство исследователей придерживается мнения о наличии прямого
химического сопряжения с участием общих промежуточных соединений. Однако
были также предложены модели, согласно которым предполагается создание
градиента по обе стороны митохондриальной мембраны. Рассмотрим одну
из моделей, предложенную Митчеллом, который постулирует хемо-осмоти-
ческий механизм сопряжения. По этой модоли происходит направленное
1 Раньше эти связи" пазьівалп «макроэргичееюшн», но теперь этот термин почти
но употребляется: соединение А ~ В само обладает высокой величиной отрицательной
свободной энергии гидролиза (^ — 7 ккалі моль) или через посредство изоэпергетических
реакций находится в равновесии с соединениями, характеризующимися высокой
свободной энергией гидролиза (см. гл. II).

396 Глава XV
окисление некоторого переносчика Tired: локализующегося по одну сторону"
мембраны (двойная черта со стрелкой, указывающей направление «внутрь»),
с помощью второго переносчика П'ох, связанного на другой стороне мембраны::
Н2О + Яге(г(р7^+ Н2О ^ ОН" + НПІ^-П^,- ОН + Н+ (XV.23а)
или
Г|П (XV. 236)
Если мембрана непроницаема для малых ионов, в частности для Н+
и ОН", то непосредственным следствием такой
окислительно-восстановительной реакции будет создание градиента pH. Далее можно представить
себе, что этот градиент используется для направленного обращения
некоторой реакции, характеризующейся высокой отрицательной свободной
энергией гидролиза, причем движущей силой для этого служит образование Н2О
из ионов — эта реакция идет с выделением большого количества энергии.
В поисках соответствующих химических моделей исследователи
основывались в основном на аналогиях с достоверно установленными реакциями
окислительного фосфорилирования на субстратном уровне:
Глицеральдегид-3-фосфат+НАД+ + Фн ^ 1,3-Дифосфоглицерат + НАД-Н +Н+, (XV.24a>
1,3-Дифосфоглицерат + АДФ ^ 3-Фосфоглицерат +АТФ. (XV.246)
а-Кетоглутарат + НАД+ + КоА8Н ^ Сукцинил-КоА + НАД-Н + Н+, (XV.25a>
Сукщшил-КоА + ГДФ + Фн ^ Сукцинат+ГТФ. (XV.256)
Реакции (XV.24, а и б) и реакции (XV.25, а и б) различаются между
собой. Первые приводят к непосредственному включению неорганического»
фосфата в один из продуктов окислительно-восстановительной реакции.
В то же время в реакциях (XV. 25) окисление приводит к образованию реак-
ционноспособного промежуточного соединения — сукцинил-КоА, не
содержащего ни Фн, ни АДФ; далее из сукцинил-КоА посредством ряда реакций
замещения получается ГТФ (эквивалент АТФ). Поэтому было предложено
два механизма фосфорилирования, сопряженного с реакциями дыхательной
цепи. Согласно первому механизму, при этом используется какое-то нефос-
форилированное промежуточное соединение (аналогия с реакциями XV. 25);
согласно второму механизму, нефосфорилированное соединение не
используется (аналогия с реакциями XV.24):
Механизм
Механизм
I:
ІГ.
(Tired, По*) + І
(пох, Tired) ~ :
(ПгеЛ ПОх) + <
(П0Х1 Bred) ~ <
^ (Похі П;
[ + ФН + АДФ
ї>а ^ (Пох,
D + АДФ —"
-ed) ~ І,
»7^ (Tin
Tl'red) ~
х, п;
ф,
Ґгеа)-і,
е<г)+АТФ + І.
(XV.26a>
(XV.266)
(XV.27а)
(XV.276)
В этих парах уравнений каждая индивидуальная реакция (а и б) может
в свою очередь состоять из нескольких стадий точно так же, как и
реакции (XV.24а) и (XV.25а), в которых образуются промежуточные
соединения — ацилированный фермент и ациллипоат. По-видимому, реакция
XV.256) тоже включает промежуточную стадию: Ацилфермент -у Ацил ~Ф„

Биологическое окисление 397
В приведенных уравнениях мы обозначили реакционноспособное
промежуточное соединение таким образом: ( ) ~ /, не определяя точно природу
связи / с Пох, il'red или с комплексом в целом. Возможно, I — это белок,
а -~1 — некоторая его особая конформация. В настоящее время более
вероятным представляется механизм I. Известно, что в присутствии динитрофе-
нола (ДНФ) (см. далее), подавляющего фосфорилирование, дыхание не
нарушается, причем Фн не требуется даже в малых концентрациях. Этот
результат согласуется с механизмом, описываемым уравнением (XV.26а), но не
(XV.27а). Кроме того, с механизмом I согласуется кинетика перехода
из состояния 4 (АДФ ограничивает дыхание) в состояние 3 (норма).
АТФ-аза. Митохондрии и фосфорилирующие частицы обладают
способностью осуществлять быстрый гидролиз АТФ на АДФ и Фн- В'отличие
от подобных реакций, катализируемых другими мембранными системами,
эта реакция сравнительно мало чувствительна к ионам Na+ и К+, а также
к специфическому ингибитору уабаину. Активность митохондриальной
АТФ-азы, низкая в эффективно функционирующих частицах, когда скорость
дыхания контролируется фосфорилированием, становится высокой, когда
нарушается согласованность обоих процессов в результате старения
митохондрий или их частичного разрушения, а также в присутствии так
называемых разобщающих агентов (к их числу относится, например, ДНФ).
Это явление объясняют обращением процесса синтеза АТФ в результате
усиления гидролиза какого-то нестойкого промежуточного продукта.
Дыхательный контроль. Наблюдения, которые привели к идее
дыхательного контроля в частицах, функционирующих с максимальной
эффективностью («прочное сопряжение»), были описаны на стр. 394. Общий
механизм этого явления удается понять исходя из обратимости соответствующих
реакций (фиг. 110).
Обращение потока электронов. Обращение процесса переноса электронов
справа налево (фиг. 110) можно осуществить, добавляя АТФ. Таким
способом были продемонстрированы следующие реакции: ТМФД -> Цитохром с—>-
-> НАД -> Окисленный субстрат (например, ацетоацетат, а-кетоглутарат
и т. д.) и Сукцинат -> НАД -> Субстрат.
ПРИМЕНЕНИЕ РАЗОБЩАЮЩИХ АГЕНТОВ И ИНГИБИТОРОВ » -
Разобщающие агенты окислительного фосфорилирования. Эти
соединения (табл. 48, класс F) характеризуются следующими свойствами:
1) они стимулируют дыхание в отсутствие как промежуточного продукта
(АДФ), так и акцептора концевого фосфата (глюкоза плюс гексокиназа);
2) для этой стимуляции не нужен Фн, причем она сопровождается
подавлением фосфорилирования, сопряженного с дыханием;
3) дыхательная активность частиц, которая еще сохранила чувствительность
к действию «истинных» ингибиторов фосфорилирования (соединения,
относящиеся к классу Е, табл. 48), может быть восстановлена до
нормального уровня;
4) разобщающие агенты стимулируют АТФ-азу в частицах или растворимых
препаратах, но ингибируют обращение потока электронов как в
митохондриях, так и в субмитохондриальных частицах, независимо от того,
добавляется ли АТФ извне или образуется в самих частицах, in situ
(при участии а-кетоглутаратдегидрогеназы и сукцинат-тиокиназы).
Классическим примером разобщающих агентов этого рода служит
2,4-динитрофенол (ДНФ), введенный в практику эксперимента Лумисом
и Липманом. Оказалось, что аналогичным образом ведет себя целый ряд
других соединений. К ним относятся разнообразные замещенные фенолы

398 Глава XV
(в частности, пентахлорфенол), антибиотик грамицидин, дикумарол 1
(сильный антикоагулянт, выделенный из гниющего донника) и различные
замещенные фенилгидразоны (например, л-хлоркарбонилцианидфенилгидразон),
а также арсенат. Согласно гипотезе Митчелла, разобщающие агенты
разрушают «векторную», анизотропную структуру мембраны, вследствие чего
исчезает градиент pH.
Ингибиторы переноса электронов, связанного с запасанием энергии.
Соединения этой группы (класс Е) являются истинными ингибиторами
дыхания; они ингибируют дыхание в интактных фосфорилирующих
частицах, в которых имеет место «прочное сопряжение». Эти соединения
неэффективны в отношении таких дыхательных частиц, которые не обладают
достаточной структурной целостностью, даже если последние и способны
производить АТФ. Кроме того, эти вещества в отличие от соединений класса F
ингибируют, а не стимулируют АТФ-азу частиц. Если дыхание блокировано
под действием ингибиторов класса Е, его можно полностью восстановить
с помощью разобщающих агентов (класс F). Напротив, АТФ-азная
активность стимулируется разобщающими агентами (класс F) и угнетается
ингибиторами (класс Е). Обращение потока электронов и другие протекающие
в митохондриях процессы, идущие с потреблением энергии, ингибируются
лишь в том случае, когда источником энергии служит экзогенный АТФ
или какое-либо другое эквивалентное соединение. Ингибирования не
происходит, если энергия поступает от высокоэнергетических промежуточных
соединений, непрерывно образующихся in situ в процессе дыхания.
Ингибиторы класса Е можно разбить на две группы. Ингибиторы первой группы,
представителем которой служит олигомицин, блокируют одну из первых
стадий фосфорилирования. Атрактилозид, называемый также атрактила-
том,— представитель второй группы — блокирует систему, только когда
используется экзогенный АТФ. Это соединение ингибирует поступление АДФ
и АТФ в митохондрии и включение метки (Р32) во внемитохондриальный
(но не во внутримитохондриальный) АТФ при окислительном фосфорили-
ровании. Таким образом, атрактилозид ингибирует какую-то последующую
стадию, а именно стадию, связанную с перемещением АДФ/АТФ в
митохондрии и из них наружу.
ДРУГИЕ РЕАКЦИИ, ОБЕСПЕЧИВАЕМЫЕ ЭНЕРГИЕЙ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ
Производство АТФ — отнюдь не единственный процесс, непосредственно
зависящий от переноса электронов в митохондриях. Большинство процессов,
протекающих с потреблением энергии и происходящих в этих частицах,
может быть осуществлено за счет энергии АТФ, добавленного в среду,
за счет АТФ, образующегося в результате дыхания, или же за счет энергии
самих реакций сопряжения. Эти процессы «прямого сопряжения»
подавляются ингибиторами дыхания и ДНФ, но практически нечувствительны
к олигомицину и атрактилозиду (иногда эти последние оказывают даже
стимулирующее действие). Известен целый ряд эндергонических (идущих
с потреблением энергии) реакций, которые могут протекать непосредственно
за счет реакционноспособных промежуточных продуктов, образующихся
1 Структурная формула дикумарола имеет следующий вид:
он сн2

Биологическое окисление 39!>
в процессе сопряжения. К ним относятся: 1) обращение потока электронов;
2) накопление ионов — как катионов (Mg2+ или Са2+), так и анионов
(фосфат) — внутри частицы против осмотического градиента (актиьный перенос,
транслокация); 3) сокращение митохондрий, т. е. производство
механической работы; 4) восстановление окисленного НАДФ при расходе
восстановленного НАД; 5) образование КоА-производных жирных кислот,
предшествующее процессу ?-окисления, 6) синтез митохондриальных белков.
ЛИТЕРАТУРА
В einer t H., Flavin Coenzymes, in P. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), «The
Enzymes», 2nd ed., vol. 2, p. 339, Academic Press, New York, 1960.
Chance B. (ed.), Energy-linked Functions of Mitochondria, Academic Press, New York,
1963.
Chance B. (ed.), Williams G. R., The Respiratory Chain and Oxid alive Phosp-
horylation, Advan. Enzymol., 17, 65 A956).
Ehrenberg A., Flavin Free Radicals, in B. Pullman (ed.), «Electronic Aspects of
Biochemistry», p. 379, Academic Press, New York, 1964.
Ernster L, Lee C.P., Biological Oxidoreductions, Ann. Rev. Biochom., 33, 729'
A964).
F a 1 k J. E., Porphyrins and Metalloporphyrins, Elsevicr, New York, 1964.
Frieden E., Osaki S.,Kobayashi H., Copper Proteins and Oxygen, J. Gen.
Physiol., 49, 213 A965).
George P., Griffith J. S., Electron Transfer and Enzyme Catalysis, in P. Boyer,
H. Lardy, and K. Myrback (eds.), «The Enzymes», 2nd ed., vol. 1, p. 347, Academic
Press, New York, 1959.
Griffiths D. E., Oxidativo Phosphorylation, in P. N. Campbell and G. D. Groville
(eds.), «Essays in Biochemistry», p. 91, Biochemical Society, Academic Press, Now
York, 1965.
Haurowitz F., The Chemistry and Function of Proteins, pp. 256—279, Academic
Press, New York, 1963. (Ф. Гауровиц, Химия и функция белков, изд-во «Мир», М.,
1965.)
H a y a s h і О., Direct Oxygenation by O2, Oxygonases, in p. Boyer, H. Lardy, and K.
Myrback (eds.), «The Enzymes», 2nd ed., vol. 8, p. 353, Academic Press, New York, 1963.
Lehninger A. L., The Mitochondrion, Benjamin, New York, 1964. (A. Лспинджер,
Митохондрия, изд-во «Мир», M., 1966.)
Mahler H. R., Nature and Function of Metalloflavoproteins, Advan. Enzymol., 17,
233 A956).
Mal kin R., Rabinowitz J. C., Non-home Iron Electron-Transfer Proteins, Ann.
Rev. Biochem., 36, 113 A967).
Mason И. S., M orris on M. (eds.), Oxidascs and Related Redox Systems, Wiley,
New York, 1965.
Massey V., V о e g о г С, Biological Oxidations, Ann. Rev. Biochem., 32, 579 A963).
Mitchell P., The Chemiosomlic Hypothesis and Oxidative Phosphorylation, Biol.
Rev. Cambridge Phil. Soc. A967).
Nie h oils P., Cytochromes, A Survey, in P. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.),
«The Enzymes», 2nd ed., vol. 8, p. 3, Academic Press, New York, 1963.
Racker E., Mechanisms in Bioenergetics, Academic Press, New York, 1965. (Э. Рэкор,
Биоэнергетические механизмы, изд-во «Мир», M., 1967.)
San Pietro A. (ed.), Non-heme Iron Proteins, Role in Energy Conversion, Autioch
Press, Yellow Springs, Ohio, 1965. ,
Singer T. P., Flavoprotein Dehydrogenases of the Respiratory Chain, A Survey, in
P. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), «The Enzymes», vol. 7, p. 345, Academic
Press, New York, 1963.
Singer T. P. (ed.), Biological Oxidations, Wiley, New York, 1966.
Sund H., Diekman H., Wallenfels К., Die Wasserstoffubertragung mit
Pyridinnucleotiden, Advan. Enzymol., 26, 115 A964).
Williams R. J. P., Coordination and Catalysis, in P. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback
(eds.), «The Enzymes», 2nd ed., vol. 1, p. 391, Academic Press, New York, 1959.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Скулачев В. П., Аккумуляция энергии в клетке, изд-во «Наука», М., 1969.
Механизмы интеграции клеточного обмена, сб. статей, под ред. С. А. Нейфаха, изд-во
«Наука», Л., 1967.

Глава XVI
БИОСИНТЕЗ ЛИПИДОВ
Биосинтез липидов в значительной степени отражает многообразие тех
путей, с помощью которых многократно повторяемая конденсация дву-
углеродных фрагментов (имеющих своим источником ацетат) может
приводить к построению природных соединений. Таким способом могут возникать
жирные кислоты, многие ароматические и гетероциклические соединения,
стероиды и терпены. В этой главе рассматривается биосинтез некоторых
типичных представителей этих структурных классов природных
соединений, а также сложных липидов, образующихся в ходе дальнейших
превращений жирных кислот.
БИОСИНТЕЗ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
Основные классы природных жирных кислот были описаны в гл. XIII
(см. табл. 38). Здесь мы рассмотрим биосинтез жирных кислот каждого
из этих структурных классов. В первую очередь будут рассмотрены
насыщенные кислоты с неразветвленной цепью, содержащие четное число атомов
углерода.
Любая стадия пути ферментативного окисления жирных кислот сама
по себе обратима (см. гл. XIII). Это позволило выдвинуть предположение,
что биосинтез жирных кислот, возможно, представляет собой процесс,
обратный окислительному расщеплению. Действительно, при инкубации
ацетил-SKoA с очищенными окислительными ферментами, с
восстановленными НАД и НАДФ и с ферментом, необратимо восстанавливающим
ненасыщенные ацил-SKoA в насыщенные, происходит синтез жирных кислот.
Кроме того, в ряде работ было продемонстрировано включение ацетильного
остатка ацетил-SKoA в жирную кислоту в митохондриальных системах,
содержавших восстановленный НАД, восстановленный НАДФ и АТФ.
Теперь, однако, ясно, что существует по крайней мере два пути биосинтеза
жирных кислот в митохондрии. Первый подобен процессу, происходящему
в цитоплазме; это синтез жирных кислот de novo. Второй процесс состоит
в удлинении цепи предобразованной * жирной кислоты путем конденсации
с ацетил-SKoA. Только этот второй процесс напоминает обратную реакцию
окисления жирных кислот.
Хотя окисление жирных кислот протекает главным образом, а быть может
и исключительно, в митохондриях или в других клеточных частицах, синтез
этих соединений может катализироваться растворимыми экстрактами печени
голубя или экстрактами грудной железы. Вакил и его сотрудники выяснили,
какие именно коферменты необходимы для этого процесса. Оказалось, что
для синтеза жирных кислот, катализируемого растворимыми клеточными
экстрактами, абсолютно необходимы бикарбонат, АТФ, Мп2+ и
восстановленный НАДФ. Эти данные позволяют четко отличить «синтетический» путь
от «окислительного», так как известно, что на окисление жирных кислот

Биосинтез липидов 401
бикарбонат не оказывает никакого влияния и что функцию окислительно-
восстановительного кофермента в процессе окисления жирных кислот
выполняет НАД, а не НАДФ.
Главным продуктом синтеза жирных кислот, катализируемого
растворимыми клеточными экстрактами, является пальмитиновая кислота. Кроме
того, в меньших количествах образуются и другие кислоты, содержащие
от 10 до 14 атомов углерода.
Основным строительным блоком для синтеза жирных кислот служит
ацетил-SKoA. Это соединение, как известно, образуется в клетке
преимущественно в процессе внутримитохондриального окисления пирувата.
Поскольку митохондриальная мембрана непроницаема для ацетил-SKoA,
естественно возник вопрос, что же является источником того цитоплазма-
тического ацетил-SKoA, который используется при синтезе жирных кислот.
Известны лишь две реакции, ведущие к внемитохондриальному
образованию ацетил-SKoA- Это АТФ-зависимое расщепление цитрата
Цитрат + АТФ-Mg + HSKoA ^ Ацетил-SKoA+Оксалоацетат + АДФ-Mg+ФН (XVI.1
и реакция с участием ацетаттиокиназы
Ацетат+ АТФ-Mg+ HSKoA ^ Ацетил-вКоА + АМФ-ЬФФц-Мд. (XVI.2)
Субстраты для обеих этих реакций могут образоваться из
внутримитохондриального ацетил-SKoA. Последний либо расщепляется до ацетата
и в таком виде диффундирует в цитоплазму, либо вступает в реакцию
конденсации с оксалоацетатом и диффундирует в виде продукта этой
конденсации — цитрата. Эти процессы, а также участие ацетаттиокиназы и
фермента, расщепляющего цитрат, обеспечивают перенос ацетил-SKoA через
митохондриальную мембрану. Ввиду того что внемитохондриальныи цитрат
стимулирует синтез жирных кислот и играет в нем роль предшественника,
именно его следует, по-видимому, считать основным источником ацетил-SKoA
для этого синтеза. Известно также, что цитрат активирует фермент,
ответственный за первую стадию синтеза жирных кислот.
Есть и еще один путь, связывающий внемитохондриальныи ацетил-SKoA
с внутримитохондриальным. Путь этот — перенос через митохондриальную
мембрану при помощи карнитина. Выше мы уже указывали (см. гл. XIII),
что карнитин
(CHsbN—СН2 —СН —Clla-COa
I
он
Карнитин
может играть роль переносчика ацильных групп из цитоплазмы в
митохондрии при окислении жирных кислот. По-видимому, столь же хорошо
он может выполнять эту роль и в обратном процессе. Действительно,
карнитин стимулирует включение в цепь жирной кислоты тех соединений,
которые могут служить источником внутримитохондриального ацетил-SKoA
(к таким соединениям относятся, как известно, нируват, ацетат и глюкоза).
На фиг. 111 изображена схема, поясняющая роль карнитина (в качестве
переносчика ацетильных групп) при синтезе жирных кислот.
Ключом к современному пониманию биосинтеза жирных кислот явились
работы Вакила, а позднее Формика и Брэди, в результате которых был
открыт фермент ацетил-КоА — карбоксилаза. Этот сложный фермент,
содержащий биотин (см. гл. VIII), катализирует АТФ-зависимьтй синтез мало-
нил-SKoA из СО2 и ацетил-SKoA
О О
II Mg2+ II
СНз —С—SKoA + СОг + АТФ > НО2С — СН2 — С — SKoA + АДФ-|-Фн. (XVI.3)
26-246

402
Глава XVI
Именно малонил-SKoA представляет собой первый специфический
промежуточный продукт биосинтеза жирных кислот. В присутствии растворимых
ферментов малонил-SKoA быстро превращается в жирные кислоты. Для
этого превращения необходим ацетил-SKoA.
Многие исследователи наблюдали заметное ускорение синтеза жирных
кислот in vitro в присутствии цитрата, изоцитрата и сходных ди- или три-
карбоновых кислот. Было показано, что данный эффект связан не с
образованием восстановленного НАДФ при окислении этих кислот в цикле
лимонной кислоты, а с синтезом малонил-SKoA. Таким образом, ацетил-КоА —
Глюкоза
Мигпохондриальная
' мембрана
пируват
I Карнитип
Ацепшл-SKoA -щ^^-^^у Ацетилкарнитин
1 X « HSKoA
Внутримитохондриальная
область
Ацетилкарнитин
HSKoA^J
N— Карнитин
Лцетил-SKoA
Биосинтез
Жирные кислоты
Внемитохондриальная
область
Фиг. 111. Схематическое изображение функции карнитина как переносчика ацетильной
группы через митохондриальную мембрану.
карбоксилаза активируется цитратом, изоцитратом и в меньшей степени
другими многоосновными кислотами. В то же время продукты
биосинтетической цепи реакций — КоА-производные жирных кислот с длинной
цепью,— по-видимому, ингибируют этот фермент.
Более или менее детально исследованы три системы, синтезирующие
жирные кислоты. Система из Е. coli изучена Вагелосом, из дрожжей —
Линеном и из печени голубя — Вакилом. На фиг. 112 представлен наиболее
вероятный путь синтеза жирных кислот. Суммирование уравнений фиг. 112
приводит к следующему стехиометрическому уравнению для синтеза
пальмитиновой кислоты из ацетил-SKoA и малонил-SKoA:
CH3COSKo А + 7HO2CCH2COSKoA + 14НАДФ • H + 14Н+ —>
—> СН3(СН2I4СО2Н + 7СО2 + 8HSKoA + 14НАДФ+ -f 6H2O.
(XVI.4)
Если же исходить только из ацетил-SKoA, то уравнение будет иметь вид
|+14НАДФ.Н-)-7АТФ-|-14Н+ —>
з( . (XVI.5)
COj входит в обе половины уравнения, поскольку это необходимый
участник реакции, который, однако, полностью регенерируется в ходе

Биосинтез липидов
403
процесса (см. ниже).
о о
СНз —С —SKoA + HS —АПБ ^ СН3 —С—S —АПБ + HSKoA
НО2С О НО2С О
СП2—С —SKoA + HS —АПБ ^
2С О
СН2 —С —S —АПБ + HSKoA
О
НО2С О
СНз-C-S —АПВ + СНа-С-Э-АПВ
О О
__ II II
^ СН3-С-СН2 - C-S-
0 О
JJ II
СНз-С-СНа —C-S-i
ОН О
_^ I II
^ СНз-С-СНа —С-8-АПБ + НАДФ+ (D-изомор)
H
ОН О О
-С —СН2—С —S —АПБ ^ СН3 —СН = СН —С —S—АПБ + Н2
H
о
C)
D)
E)
СН3 —СН = СН-С-8-
О
II
—> СН3СН2СН2—С —S —АПБ + НАДФ+
О О
аСНз —С—S —АПБ + HSKoA ^ СН3СН2СН2С —SKoA + HS —АПБ
__ _ _
[ II II
СП2 — С — SKoA + СН3 — С — SKoA + 2НАДФ- H + 2Н+ —>
О
F)
G)
(I
> СН3СН2СН2С —
Фиг. 112. Схема биосиптеза жирных кислот у Е. coll.
(8)
Приведенная на фиг. 112 схема биосинтеза подтверждается следующими
важными наблюдениями.
1. Синтезирующая система из Е. coli является растворимой и была
разделена на несколько компонентов. В нее входят: ацетилтрансфераза,
малонилтрансфераза, конденсирующий фермент, ?-кетоацетил-АПБ — редук-
таза и еноил-АПБ — гидраза (уравнения 1—5 на фиг. 112). Кроме того,
система содержит белок — переносчик ацильных групп (ацилпереносящий
белок, АПБ) с молекулярным весом 9600, к которому присоединяются
образующиеся в ходе синтеза промежуточные продукты — ацилпроизводные.
Это присоединение осуществляется путем образования тиоэфирной связи.
Специфическая сульфгидрильная группа АПБ, как было установлено
недавно, входит в состав 4'-фосфопантотеновой простетической группы. Послед-
26*

404Глава XVI
няя, вероятно, ковалентно связана с гидроксильной группой сорина АПБ
посредством фосфодиафирной связи.
2. При избытке малонил-SKoA ацетил-SKoA включается только в
положения 15 и 16 пальмитиновой кислоты. Именно такого результата и следует
ожидать, исходя из предположения о первоначальном взаимодействии
ацетил-SKoA и малонил-SKoA, за которым следует удлинение цепи путем
конденсации образующейся жирной кислоты со следующей молекулой
малонил-SKoA. Иными словами, ацетил-SKoA действует как затравка
в синтезе жирных кислот.
3. С14О2 не включается в жирную кислоту. Этот факт подтверждает
каталитическую функцию СО2: при конденсации ацетил-SKoA с малонил-
SKoA освобождается ровно столько же СОг, сколько было использовано
в ацетил-КоА — карбоксилазной реакции.
4. Малонил-SKoA связан с синтезирующим жирные кислоты
комплексом (из печени голубя) при помощи сульфгидрильной группы, и его
конденсация с ацетил-SKoA сопровождается декарбоксилированием.
5. Продукт конденсации в синтезирующей системе из Е. coli был
идентифицирован как ацетоацетил-ЭАПБ. Аналогичные результаты получил Линен
для дрожжевой системы.
6. Из Е. coli была выделена еноил-гидраза, специфичная в отношении
тиоловых эфиров АПБ. Этот фермент катализирует обратимое
присоединение воды к кротонил-БАПБ с образованием D-(—)-р-оксибутирил-8АПБ.
7. В растворимых системах из мозга крысы и из жировой ткани КоА-
производные предполагаемых промежуточных продуктов — ацетоацетил-
SKoA, D-(—)-р-оксибутирил-8КоА и кротонил-SKoA — включаются в
пальмитиновую кислоту. В соответствии со схемой фиг. 112 эти субстраты
предварительно подвергаются восстановлению.
8. Тритий из восстановленного меченого НАДФ также включается
в пальмитиновую кислоту. При этом он оказывается связанным только
с нечетными атомами углерода, начиная с третього. Поскольку для
восстановления а,р-ненасыщенных соединений требуется в качестве кофермента
ФМН, включение трития, вероятно, объясняется прямым переносом
водорода от восстановленного меченого НАДФ к ?-кетоацильным производным.
При этом образуется ?-оксиацилсоединение.
9. В дрожжевой синтезирующей системе наличие каждой из
постулированных ферментативных активностей может быть продемонстрировано
с помощью модельных субстратов.
10. Все попытки обнаружить свободные промежуточные продукты
биосинтеза жирных кислот оказались безуспешными. Это также является
весьма убедительным доводом в пользу того, что различные промежуточны-
щюдукты достаточно прочно связаны с соответствующей ферментной си стемой
Ферментные системы, участвующие в синтезе жирных кислот,
существенно различаются у разных видов живых организмов. Так, высокоочи-
щенная синтетаза жирных кислот из дрожжей ведет себя как отдельная
частица, обладающая всеми необходимыми ферментативными активностями.
Молекулярный вес этого мультифермента равен 2 300 000. В то же время
синтетазы из печени птиц и из клеток Cl. kluyveri состоят из двух
компонентов, а система из Е. coli, как указывалось вьште, была разделена на
несколько компонентов.
Поскольку пропиопил-SKoA может в какой-то степени заменять ацетил-
SKoA на стадии конденсации последнего с малонил-SKoA, приведенная
выше схема биосинтеза жирных кислот хорошо объясняет также синтез
кислот с нечетным числом атомов углерода.
Перечислим теперь особенности, которые отличают биосинтез жирных
кислот от процесса их окисления, ибо, хотя ерментативные реакции, состав-

Биосинтез липидов 405
ляющие катаболическую последовательность, в принципе обратимы на
каждой отдельной стадии, в действительности путь биосинтеза не является
простым обращением катаболического пути. (Вероятно, сходные выводы
могут быть сделаны при сравнении биосинтеза и деградации также и
некоторых других соединений.)
1. Часть ферментов биосинтеза или все они локализованы не в тех
клеточных компонентах, где происходит процесс распада жирных кислот.
2. Обычно одна или несколько ключевых реакций завершают
катаболическую цепь (а это соответствует началу биосинтеза). По этой причине
последовательность реакций, по существу, необратима. В данном случае
такими стадиями являются реакции, катализируемые ?-кетотиолазой и аце-
тил-КоА — карбоксилазой. Первая приводит к образованию ацетид-SKoA,
а вторая связана с его использованием.
3. Активность фермента, отвечающего за инициирование
биосинтетического пути, регулируется посредством обратной связи или при помощи
других регуляторных механизмов.
4. Катаболические процессы являются энергодающими процессами; они
производят АТФ и восстановленные пиридипнуклеотиды. Наоборот,
анаболические процессы требуют притока энергии; они используют АТФ и
восстановленные пиридиннуклеотиды. Различен и тип пиридиннуклоотида:
НАД" участвует в процессах деградации, восстановленный НАДФ — в
биосинтезе (см. также гл. XI).
5. Внептне сходные реакции и промежуточные продукты |в нашем случае
Ь-(+)~р-оксиацил-8КоА при деградации и D-(—)-энантиомер при
биосинтезе] стереохимически различны.
Метаболические процессы, приводящие к образованию ненасыщенных
жирных кислот, пока недостаточно изучены. Предположение об участии
молекулярного кислорода в процессах образования двойной связи было
впервые высказано, когда выяснилось, что в анаэробных условиях дрожжам
в качестве ростового фактора необходима олеиновая кислота, хотя в
присутствии кислорода они такой потребности но обнаруживают. Позднее это
предположение было подтверждено в работах на очищенной дрожжевой
системе. Оказалось, что в анаэробных условиях синтезируются только
насыщенные кислоты; в присутствии же кислорода предельные и
непредельные соединения образуются приблизительно в равных количествах. Эта
система при наличии О2 и .восстановленного НАДФ катализирует
превращение ранее синтезированных пальмитиновой и олеиновой кислот в
соответствующие ненасыщенные соединения. Субстратами реакции служат либо
ацил-SKoA, либо ацил-ЭАПБ; в окислении предобразовапных жирпых кислот,
по-видимому, участвует ферредоксин. Внутриклеточпые системы,
осуществляющие аэробное образование двойной связи в жирных кислотах,
сосредоточены главным образом в микросомной фракции. Необходимо еще раз
подчеркнуть характерную особенность гидроксилировапия, образования
двойной связи и других окислительных процессов: для протекания этих
процессов требуется одновременное присутствие О2 и какого-либо
восстановительного агента, например восстановленного НАДФ (оксидаза со
смотанной функцией, см. гл. XV). Происходящая при этом реакции
описывается следующим уравнением:
ШІ + НАДФ- H -Ь Of + 211+ —> П+-|-ЛЛДФ+ + 2ЯаО*
или
ПО*Н + НАДФ+ -1-НаО*. (XVI.6)
Локализация в микросомных мембранах характерна не' только для
указанных реакций, но также для большинства реакций биосинтеза липидов
исключение составляют начальные стадии синтеза жирных кислот). В этих

406 Глава XVI
реакциях участвуют именно мембранные компоненты микросом,
происходящие из эндоплазматической сети, а не рибосомы (см. гл. IX).
Анаэробные организмы могут, очевидно, либо осуществлять образование
ненасыщенных кислот тем же путем, до без участия кислорода, либо
использовать другой путь. В пользу второй альтернативы свидетельствует тот
факт, что некоторые анаэробные организмы не способны вводить двойную
связь в предобразованные жирные кислоты.
Ненасыщенные жирные кислоты могут возникать при конденсации
непредельных КоА-производных — промежуточных продуктов синтеза —
с новыми молекулами малонил-SKoA. Двойная связь в этом случае не
восстанавливается, как это происходит при синтезе насыщенных кислот. В
процессе роста цепи она как бы отодвигается от карбоксильной группы. Если
судить по положению двойной связи в ненасыщенных жирных кислотах
бактерий, то для объяснения наблюдаемых явлений достаточно допустить
?-дегидрирование G-10 и С-12 оксиацил-SKoA. Например, синтез пальмит-
олеиновой и вакценовой кислот из октановой кислоты можно представить
себе так, как это изображено на фиг. 113. Приведенную схему подтверждает
СН3 - (СН2M - СН2 - СО2Н
!+с2
О
СНз - (СН2M - СН, - С - СН2 — СО2Н
1
ОН
СН3 - (СН2M - СН2 - С - СН2 - СО2Н
H
I
СН3(СН2M-СН = СН-СН2
СН3(СН2M - СН = СН - (СН2O - СО2Н
Пальмитолеиновая кислота
СН3(СН2M — СН = СН — (СН2)9 — СО2Н
Вакценовая кислота
Фиг. 113. Анаэробпыи путь синтеза пальмитолеииовои и вакцеповой'кислот из октановой
кислоты.
тот факт, что синтетаза из Е. coli содержит дегидразу, специфичную в
отношении D-(—)^-оксидекановой кислоты. Эта дегидраза, возможно, играет
роль ключевого фермента в синтезе ненасыщенных жирных кислот у
организмов подобного типа.
СИНТЕЗ ТРИГЛИЦЕРИДОВ
Биосинтетический путь образования триглицеридов в печени изучили
в 1956 г. Вейсс и Кеннеди. Свободный глицерин фосфорилируется по а-окси-
групно в присутствии глицерокиназы и АТФ с образованием L-глицеро-
фосфата. Другим источником L-глицерофосфата может служить процесс
восстановления диоксиацетонфосфата. Образовавшийся L-глицерофосфат
ацилируется двумя молями КоА-производного жирной кислоты, образуя
фосфат а,6-диглицерида, называемый фосфатидной кислотой. Фосфатидные

Биосинтез липидов
407
СН2ОН
I
НО-С-Н + АТФ
CHjOH
СН2ОН
Mg2* I
> НО-С—H
CH2OPO3H-
o
II
О CH2O-C—R,
II I
R2_C—O-C—H
CH2OPO3H-
I
R2_C— O-C—H
Jn-нроГ
CH,O-C—R,
I
KoASU
CH2OH
о
II
+ R5C— sKoA
о
СН2ОН
I
С=О +Восст.НАД
СН2ОРО3Н-
о
II
+ R2-C-SKo/i
О CH2OC—R,
II I
R2-C—O-C—H О
I II
CH2-O-C—R3
Фиг. 114. Биосинтетический путь образования триглицеридов.
кислоты, как будет показано ниже, являются ключевыми промежуточными
продуктами в синтезе нескольких классов сложных липидов. Биосинтез
триглицеридов заканчивается дефосфорилированием и последующей этери-
фикацией образующегося а,р-диглицерида третьим молем КоА-проиввод-
ного жирной кислоты. На фиг. 114 приведена суммарная схема биосинтеза
триглицеридов
БИОСИНТЕЗ ФОСФОЛИПИДОВ
Биосинтетические процессы, приводящие к образованию фосфатидил-
холина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина, представлены на
фиг. 115. Первые два продукта получаются при взаимодействии Б-а,р-дигли-
церида с ЦДФ-холином и ЦДФ-этаноламином (см. гл. VIII). Фосфатидил-
этаноламин может также возникать при декарбоксилировании
фосфатидилсерина. Кроме того, он может превращаться в фосфатидилхолин в реакции
метилирования с участием S-аденозилметионина. Фосфатидилсерин
образуется в печени в результате обменной реакции между фосфатидилэтанол-
амином и свободным L-серином:
Фосфатидилэганолаиин + Ь-сврин ^ Фосфатидилсерин+ Этаноламин. (XVI.7)
Другой путь образования фосфатидилсерина — это конденсация
свободного серина с ЦДФ-диглицеридом, представляющим собой продукт взаимо-

408
Глава XVI
L-oc- глицерофосфат
о
I!
, +2R-C-SKoA
Фосфатидная кислота
ІІАФ-xojuh
S аЬетзал-
Лецитин J"™uulluu фосфатидилэтаноламии
/|L-— Серин
—со2 г
|p->- Этаноламин
Фосфатидилсерин -«
Фосфатиоимнозит
'•ЦАФ-глицерид —*-Фосфатидил -
глицерофосфат
Серии
Фосфатидиілглицерин
:
і
Кардиомтин
Фиг. 115. Схема биосинтеза лоцитинов и кефалипов.
действия ЦТФ и фосфатидной кислоты. Эта реакция катализируется
ферментом, выделенным из Е. со И.
Природные фосфатиды состоят главным образом из лецитинов, кефали-
нов и фосфатидилглицерина. Однако существует и ряд других классов
фосфатидов, встречающихся в природе в довольно значительных
количествах. К ним относятся фосфатидилинозиты, плазмалогены, производные
а-глицериновых эфиров и ряд других.
Было показано, что простейший инозитовый липид —
фосфатидилинозит — представляет собой 1-фосфатидил-Ь-лшо-инозит следующей структуры:
СН2-О—С—R
1-фосфатидил-Ь-Аіао-анозит
Фосфатидилинозит образуется при взаимодействии ЦДФ-диглицерида со
свободным инозитом (сходно с тем, как образуется фосфатидилсерин):
ЦДФ-диглицерид-f Инозит —> і-фосфатидил-Ь-.мио-инозит + ЦМФ. (XVI.8)
Плазмалогены известны с 1924 г., с того времени, когда Фёльген открыл
в фосфатидной фракции продукт, обладающий альдегидными свойствами.
Однако истинная структура соединений этого класса установлена лишь
недавно. Теперь ясно, что своими альдегидными свойствами плазмалоген
обязан остатку винилового эфира, находящемуся в а-положении (?-поло-
жение занято остатком яшрной кислоты).
RCOO
СИ2 —О—СН = СН —К
-il
j — GH2CH2N(RK
Плазмалоген А

Биосинтез липидов 409
Были обнаружены плазмалогены, содержащие холин или этаноламин и
поэтому близкие по структуре к лецитинам и кефалинам. Биосинтез плазмалоге-
нов изучен довольно слабо, однако ряд наблюдений позволяет считать, что
плазмалогены синтезируются в принципе тем же путем, что и лецитин или
кефалины. Соответствующие насыщенные соединения, очевидно, являются
при этом прямыми предшественниками плазмалогенов.
Широко распространены в природе некоторые простые эфиры
глицерина, в частности кимиловый, батиловый и селахиловый спирты
С1{2 — О — (СН2I5СН3 СН2 — О — (Cl [гI7СЫ3
снон сном
I I
снаон сн2ои
Кимиловый спирт Батиловый спирт
СП2 — О — (СН2)8 — Щ = СН — (СНгOСМ3
I
сноп
СН2ОН
Селахиловый спирт
Был идентифицирован ряд соединений, относящихся к классу липидов,
которые содержат такую а-эфирную группировку. В их число входят
структурные аналоги фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина. Пути
биосинтеза этих сложных липидов в настоящее время неизвестны.
Фосфатиды распространены в природе почти повсеместно. В клетке они
сосредоточены главным образом в ядре и в митохондриальиых и микросом-
ных мембранах. Считается, что они выполняют структурные функции,
а также участвуют в переносе ионов и регулировании проницаемости
мембран. О важной роли фосфатидов и других липидов в поддержании мито-
хондриальных процессов окислительного фосфорилироваыия уже
говорилось в гл. XV.
БИОСИНТЕЗ СФИНГОЛИПИДОВ
Сфинголипиды представляют собой гетерогенную группу липидов, для
которых характерно наличие аминоспирта с длинной углеродной цепью,
так называемого сфингозина или близкого к нему соединения
H H
СН3—(CI-I2I2 —СН = С11—С—С —СН2ОН
ОН NH2
Сфиигозиы
Работы, проведенные рядом исследователей, позволили установить
стереохимию природного сфингозина. Он является эритгаро-изомером с
D-конфигурацией при втором атоме углерода и терякс-конфигурацией при двойной
связи. Таким образом, сфингозин представляет собой транс-В-эритро-1,3-
диокси-2-аминооктадецен-4. Эта структура подтверждена встречным
синтезом. Помимо самого сфингозина в образовании сфинтолипидов могут
участвовать такие его структурные аналоги, как дигидросфингозии, в котором
отсутствует двойная связь, фитосфингозин, представляющий собой 4-окси-
производное дигидросфингозина A,3,4-триокси-2-аминооктадекан), и дегид-
рофитосфингозин — ненасыщенное производное фитосфингозина. Первые два
аминоспирта образуют сфинголипиды, которые встречаются в тканях
животных; два последних — сфинголипиды растительного происхождения.

410 Глава XVI
Сфингозин не встречается в природе в свободном виде в больших
количествах. Он и подобные ему соединения входят в состав таких лиоидов,
как сфингомиелины, цереброзиды и ганглиозиды.
Сфипгомиелины дают при полном гидролизе эквимолярные количества
сфингозина, холина, фосфорной кислоты и жирной кислоты. Ранние
исследования показали, что жирная кислота образует амидную связь с первичной
аминогруппой сфингозина. Среди продуктов частичного гидролиза сфинго-
миелина были обнаружены фосфорилхолин и сфингозинфосфат. Это
указывало на два возможных места присоединения фосфорилхолина — в
положениях 1 и 3 сфингозина. В конце концов сфингомиелин был
идентифицирован как 1-фосфорный эфир сфингозина со следующей структурой:
II H О- СН3
СНз —(СН2I2 —СН = СН —С —С —СН2 —О—Р—ОСН2СН2—N+—СНз
ОН NH О СН3
L,
Сфингомиелин
При полном гидролизе цереброзидов получают сфингозин (или дигидросфин-
гозин), жирную кислоту и сахар — обычно галактозу. Структурные
исследования позволили установить формулу цереброзидов
4-f
ОН NH
\
CH2-O
со
R
Церсброзиа
Гликозидная связь с галактозой обычно имеет ?-конфигурацию. Хотя
основным углеводным компонентом цереброзидов является галактоза, при
некоторых патологических нарушениях, в том числе при болезни Гоше,
цереброзиды, выделенные из мозга и селезенки человека, содержат большие
количества глюкозы.
Цереброзиды различаются природой жирной кислоты. Так, керазин
содержит лигноцериновую кислоту СВ^СНзЬгСОгН, френозин — церебро-
новую кислоту СН3(СН2J1СНОНСО2Н, нервон — ацетэруковую кислоту
СН3(СН2OСН = СН(СН2I3СО2Н и т. д. Родственное цереброзидам
соединение — сфингозингалактозид, в котором отсутствует остаток жирной
кислоты,— называется психозином.
Ганглиозиды представляют собой сложные сфинголипиды. В их состав
входят сфингозин, жирная кислота, один или несколько углеводов и, что
особенно характерно, нейраминовая кислота
О НО H H ОМ ОН
НО2С—С—СН2 —С —С С —С—С —СН2ОН
II III
H NH2OH H H
Нейраминовая кислота
Установлена структура лишь немногих ганглиозидов. Чистый
кристаллический ганглиозид из эритроцитов лошади содержит эквимолярные
количества сфингозина, жирной кислоты, глюкозы, галактозы и N-ацетилнейра-
миновой кислоты (сиаловая кислота, см. гл. XI . Результаты, полученные

Биосинтез липидов
411
при метилировании и деградации этого соединения, хорошо согласуются
с представленной ниже структурой.
СН3—(СН2J2
о
-С(Н
—(СН2I
СН=СН-СН—СН—СН2О
НС
он
НС—ОН
но—с—н
НС
НС
-о—і
-о
СН2ОН
СО2Н
-с—
НО—СН
12ОН
-о
-о
о
сн2
НО—CH
H
о
СНзС—N—СН
СН
НС—ОН
I
НС—ОН
СН2ОН
Гаиглиозид из лошадиных эритроцитов
Изучение in vivo с использованием меченых субстратов позволило
установить, что первый и второй атомы углерода и азот аминогруппы сфинго-
зина происходят из серина, а остальные 16 атомов углерода — из уксусной
кислоты, вероятно через какой-то промежуточный продукт,
представляющий собой С1в-соединение. Было показано, что ферментативная система
из мозга крысы синтезирует сфингозин из пальмитил-SKoA и серина. Эти
данные согласуются с результатами, полученными in vivo. Биосинтез сфин-
гозина можно представить в виде следующей последовательности реакций:
Пальмитил-SKoA -f- Вогст. НАДФ
Пальмитиновый альдегид 4- НАДФ -f- KoAHS,
(XVI. 9)
Пальмитиновый альдегид + Ь-серин —> Дигидросфингозин-f-CO21 (XVI. 10)
Окисление
Дигидросфингозин > Сфингозин. (XVI.11)
Конденсация пальмитинового альдегида и L-серина, вероятно, требует
присутствия пиридоксальфосфата и иона Mg2+.
В качестве промежуточного продукта при биосинтезе сфингомиелина,
возможно, образуется N-ацилсфингозин (церамид):
Сфипгозин + R —СО —SKoA —> N-ацилсфингозин. (XVI.12)
Церамидтрансфераза катализирует синтез сфингомиелина из N ацилсфингозина
и ЦДФ-холина:
N-ащілсфпнгозин + ЦДФ-холин —> Сфингомиелин. (XVI.13)

412 Глава XVI
Интересно, что этот фермент специфичен в отношении mpaHc-mpeo-N-аіщл-
сфингозина и образует /прео-сфингомиелин. Однако, как указывалось выше,
встречающийся в природе сфингомиелин является эрмигро-изомером. Этот
факт не нашел еще должного объяснения.
Существует также и вполне реальная возможность синтеза
сфингомиелин а путем ацилирования сфингозинфосфорилхолина. Мозг
млекопитающих содержит ферменты, необходимые для включения галактозы или
глюкозы в цереброзиды (они локализуются в микросомной фракции). Сахара
переносятся к сфингозину от УДФ-производных (см. гл. VIII).
Сфингозип-]-УДФ-галактоза —> Психсшш+УДФ. (XVI.14)
Последовательность реакций биосинтеза ганглиозидов в настоящее время
неизвестна.
Сфинголипиды наряду с фосфатидами составляют основную массу липи-
дов в таком богатом липидами органе, как мозг. Кроме того, сфинголипиды
являются главным компонентом миелиновой оболочки нерва.
БИОСИНТЕЗ СТЕРОИДОВ
Рассмотренные выше типы липидов относительно легко подвергаются
омылению, превращаясь при этом в водорастворимые продукты. Однако
еще в 1812 г. Шеврёль установил, что гидролизоваться способны не все
липиды. К негидролизующимся соединениям относятся
стероиды—биохимически чрезвычайно важный класс. Структурной основой стероидов является
скелет циклопентанпергидрофенантрена
Циклопентатергидрофенонтрен
Живые организмы вырабатывают большое число стероидов, участвующих
в самых разнообразных биохимических и физиологических процессах.
В организме человека первое место среди стероидов занимает
ненасыщенный спирт холестерин
Холестерин играет роль ключевого промежуточного продукта в синтезе
других стероидов.
Важное физиологическое значение имеют желчные кислоты, адренокор-
тикостероиды, андрогены и эстрогены. Из желчных кислот в организме
человека в наибольших количествах присутствуют холевая, дезоксихолевая

Биосинтез липидов
413
и хенохолевая кислоты, структура которых показана ниже.
СО2Н
НО * * ОН
Холевая
кислоти
НО
COjH
Дезоксихолевая
кислота
Хенохолевая
кислота
Желчные кислоты находятся в желчи не в свободном виде, а в виде амидов.
Амид, образующийся при соединении желчной кислоты с глицином,
называется гликохолевой кислотой, а продукт ее соединения с таурином —
таурохолевой кислотой.
О
II
С23Нзб(ОНK - С - NHCH2CO2II
Гликоходевая кислота
О
С231130(ОН)з— С — NHCH2CH2SO3II
Таурохолевая кислота
Соли желчных кислот ускоряют гидролиз нейтральных жиров в
кишечнике, действуя как эмульгаторы и солюбилизирующие агенты.
Стероиды, вырабатываемые корой надпочечников,— адренокортикосте-
роиды — чрезвычайно важны для поддержания баланса электролитов,
а также для регулирования скорости углеводного и азотного обмена. Эти
функции выполняют альдостерон, кортикостерон, дезоксикортикостерон
и кортизон.
но
CHjOH
снос=о
о
AjibdocnwpoH
СН2ОН
С=О
Дезоксикортикостерон
Кортикосптрои
СН2ОН
:=о
о.
.он
Кортизон
Все они являются производными С21-углеводородов.
Эстрогены — гормоны, ответственные за развитие вторичных признаков
женского пола,— вырабатываются в яичниках. Наиболее мощным
гормоном этой группы является эстрон. Аидрогены — в первую очередь
тестостерон и андростерон — вырабатываются з семенниках и определяют раз-

414 Глава XVI
витие вторичных признаков мужского пола.
ОН
H
Эстрон Тестостерон Лноростерон
Исследования в области биосинтеза стероидов — одна из наиболее ярких
страниц в современной биохимии. В 40-х годах Блох с сотрудниками
показали, что меченый ацетат включается в холестерин как in vivo, так и в
срезах ткани печени. Позже было установлено, что оба атома углерода ацетата
участвуют в построении молекулы холестерина и что вся молекула
холестерина образуется из ацетата. Анализ продуктов распада холестерина,
синтезированного (в срезах печени) из ацетата, меченного как по метальной
группе, так и по карбоксилу, позволил установить точную локализацию
метки в этой молекуле. Ниже изображена молекула холестерина, в которой
атомы углерода, происходящие от метильной группы ацетата, обозначены
буквой м, а атомы, происходящие от карбоксильной группы, буквой к.
* г ? *
м \ I [
l Ж M
После того как были получены эти сведения, можно было уже попытаться
наметить какую-то схему биосинтеза холестерина, которая объясняла бы
указанный способ включения ацетата. Ряд данных наводил на мысль, что
главными промежуточными продуктами в биосинтезе холестерина из
ацетата являются мевалоновая кислота и сквален. Процесс биосинтеза удобнее
рассматривать по отдельным стадиям. Таких ключевых стадий три: 1)
превращение ацетата в мевалонат, 2) синтез сквалена из малоната и 3) переход
от сквалена к холестерину. Биосинтез мевалоната из ацетата был впервые
продемонстрирован в опытах с бесклеточными препаратами из печени крысы.
Реакция протекает в присутствии растворимых ферментов, микросом, KcASH5
АТФ, глутатиона, восстановленного НАДФ и ионов Mg2+:
Мевалоновая
кислота
Видимо, имеется два сходных пути биосинтеза мевалоновой кислоты.
Первый путь включает в качестве промежуточных продуктов ацетоацетил-SKoA
и З-окси-З-метилглутарил-SKoA. Второй путь недавно открыт в печени

Биосинтез липидов
415
СНз-C-SKo/i
о
СНз-C-S
' /Е
CH2-C-S/
СО2Н
HSKaA
СО,
^Жирные-
кислоты
О
II
'CHs-C-SKoA
HS-E
О О
II II
СНз-С-СНг-C-S-E
О
II
^ СНзС-SKo/«
hSKoA
СН
'HS Ко А
О
г-С- SKO/b
ОН
HS-E
HO2C-CH2-C-CH2-C-S-E
ОН
СН3 ОН
HO2C-CH2-C-CH2-C-S-E
ОН H
¦ ИАЛФ
Сквален
СН3
-HOsC-CHj-C-CHz-CHjOH + HS-E
ОН
Фиг. 116. Превращение ацетил-SKoA в мевалоновую кислоту.
голубя; в этом случае те же самые промежуточные продукты связаны с сульф-
гидрильными группами фермента.^ Схема' биосинтеза мевалоновой кислоты
приведена на фиг. 116.
Еще в 1932 г. Робинсон выдвинул предположение, что промежуточным
продуктом биосинтеза холестерина является сквален
Сквален

416
Глава XVI
В дальнейшем Блох и его сотрудники продемонстрировали как синтез сква-
лена из ацетата, так и превращение его в холестерин в печени живой крысы,
тем самым сильно подкрепив вывод о том, что именно сквален играет роль
промежуточного продукта на пути от ацетата к холестерину. Исходя из
характера распределения метки в холестерине разумно предположить, что
связующим звеном между холестерином и его предшественником служит дигид-
ротритерпен сквален. Изопреноидная единица
м
>К — M — К
обнаруживается в трех местах молекулы холестерина, и это позволяет
считать, что последний образуется (через сквален) именно из таких струк-
но
V ,-сн,
сн2 сн2
сн2он со2-
но
АТФ
-HOjPo)
CH2
сн2 0*
ОР2О6Нг
сн,
СЩ^'
I
сн2
ОРО,Н-
сн3
сн2
со2-
А1Ф
со,-
СН3
сн2
/>-снч
1 С02,
СН2ОР2О6Нг
Изопешепилпирафасфат
СН3
\=сн
сн/ сн2ор2о6н2
Диметилаллилпирофоарат
A>иг. 117. Превращение мов ал on ов ой кислоты в изопонтенилпирофосфат и димстилал-
лилнирофосфат.
турных единиц. Следовательно, мевалоновая кислота должна сначала
трансформироваться в изопреноидную структуру, после чего шесть изопреноид-
ных единиц образуют молекулу сквалена.
Метаболический путь превращения мевалоновой кислоты в
предшественник сквалена — изопентенилпирофосфат — представлен на фиг. 117.
Мевалоновая кислота предварительно фосфорилируется по гидроксилу в
положении 5 под действием мевалонаткиназы — фермента, выделенного в чистом
виде из нескольких источников. Полученный фосфат превращается затем
в 5-гшрофосфомевалонат. Последнее соединение, подвергаясь
согласованному дегидроксилированию — декарбоксилированию, образует
изопентенилпирофосфат. Возможно, что при этой реакции в качестве промежуточного
продукта образуется 5-пирофосфат 3-фосфомевалоновой кислоты. Наконец,

Биосинтез липидов 417
изопентенилпирофосфат обратимо превращается в диметилаллилпирофосфат
в ферментативной реакции, описываемой уравнением (XVI.15):
™ н+
СНз
-CHj—ОР2О6Нг" (XVI.15)
Образование сквалена из изопреноидных пирофосфатов протекает через ряд
последовательных конденсаций, как это показано на фиг. 118. Конденсация
изопентенилпирофосфата с диметилаллилпирофосфатом дает монотерпен —
тракс-геранилпирофосфат. Последний в свою очередь конденсируется со
следующей молекулой диметилаллилпирофосфата, что приводит к образованию
Y
сн сн
Диметилаллил- і _„ |
пирофосфат CH2i-OP2O6Hz" > СН2
нЛ СИ, °^J
у^ Гераииа- ІЇ
тт_^ри пирофосфат СН
Шапентенил- і
пирофосфат СН2ОРО6Нг-
Изапеитенімпирафасфат
CHj.СН3 СНз СНз
Y Sr
CH сн
Cri2 PH^
СНзСНз ^ сНг
f * CH2
С^СНз СН, СНз
сн с-н
н2с-ор2о6н2- сн2
Фарнезімпирофосфат HвpoлaдoлI^vpoфocфam
Фиг. 118. Предполагаемая схема биохимического превращения изопентил- и диметилал-
лилпирофосфата в фарнезил- и неролидолппрофосфат.
сесквитерпена — ттгракс-тпракс-фарнезилпирофосфата. Фарнезилпирофосфат
может частично изомеризоваться в другой сесквитерпен — неролидолпиро-
фосфат. Однако это последнее соединение не является промежуточным
продуктом биосинтеза сквалена.
Две молекулы фарнезилпирофосфата, конденсируясь друг с другом,
образуют дегидросквален, который затем восстанавливается до сквалена
под действием дегидрогеназы.
27—246

418
Глава XVI
три окислительные
стадии)
Холестерин Десмостерин
Фиг. 119. Биосинтетический путь образования холестерина из скваленав организме крысы.
Превращение сквалена в холестерин протекает в организме крысы
по схеме, представленной на фиг. 119. Ключевой стадией в этом процессе
является образование ланостерина из сквалена. Было постулировано, что
циклизация сквалена сопровождается миграцией двух метильных групп
к соседнему атому углерода [A : 2)-миграции]. Блох, Корнфорт и их
сотрудники при помощи метода меченых атомов подтвердили это предположение.
В изящных опытах с меткой они показали, что циклизация сквалена
действительно включает последовательные A : 2)-миграции метальных групп,
а не одну A : 3)-миграцию:

Биосинтез липидов
419
Каучук
( поли- цис- изопрен)
Ацетат -^Мевшіоиат
— ж-Шопентетмирофосфат
. Даметиаамилшрофосфат
ґератлпирофосфат (С,в)
+ С5
Г" Фарнезилпцрофосфі
Тераюлееранияпирофосфат (С20)
Дитерпены
Аимеризация
до С/іо
Димеризация
Каротиноиды
Монотерпены
< Сесквитерпеиы
-*¦ Гуттаперча
(пом-тронс-изопреп)
. yduxuHufrbr
Скважн (Сзо)
Тршперпень; (Лангостерии-^Стероиды)
Фиг. 120. Схема, иллюстрирующая превращения изоиентеншширофосфата.
В заключение следует отметить, что изопреноидная структура дает начало
не только стероидам, но и целому ряду других важных природных
продуктов. Обобщенная схема, характеризующая участие изопентенилпирофосфата
в метаболизме, представлена на фиг. 120. Многократная конденсация изопен-
тенильной единицы приводит к образованию поли-^ис-изопрена (каучук).
В противоположность этому при взаимодействии транс-транс-фарв.езмппя-
рофосфата с изопреноидными единицами получается поли-пгранс-изопрен
(гуттаперча) — материал, лишенный эластических свойств.
ЛИТЕРАТУРА
В 1 о с h К., Biological Synthesis of Cholesterol, Harvey Lectures, 48, 68 A952).
В loch K., Biogenesis and Transformations of Squalene, Ciba Found. Symp., Biosyn.
Terpenes Sterols, p. 4, Little, Brown, Boston, 1959.
Clayton R. В., Biosynthesis of Sterols, Steroids, and Terpenoids, Quart. Rev, 19
168 A965).
Cornforth J. W., С or nf or t h R.H., Horning M. G.,Pelter A., Pop-
j a k G., The Mechanism of a Rearrangement Occurring During Biosynthesis of
Cholesterol, Ciba Found. Symp., Biosyn. Terpenes Sterols, p. 119, Little, Brown Boston
A959).
Davidson P. M., L о n d C., P e n n y I. F., Biochemical Problems of Lipids, Butter-
worths Scientific Publications, London, 1956.
Fieser L. F., F і e s e r M., Steroids, Reinhold, New York, 1959.
Folk ers K., S h u n k С H., Linn B. 0., Robinson F. M.,
Wittreich P. E., Huff J. W., G Ш ill an J. L., S k eg g s H. R., Discovery and
Elucidation of Mevalonic Acid, Ciba Found. Symp., Biosyn. Terpenes Sterols p 119
Little, Brown, Boston A959).
Frantz I. D., Jr., Shroepf er G. J., Sterol Biosynthesis, Ann. Rev. Biochem
ЗО, 691 A967).
H a n a h a n D. J., T h о m p s о n G. A., Jr., Complex Lipids, Ann. Rev. Biochem ,
32, 215 A963).
7*

420 Глава XVI
Kennedy Е. P., Biosynthesis of Complex Lipids, Federation Proc, 20, 934 A901).
Lynen F., Acetyl Coenzyme A and the Fatty Acid Cycle, Harvey Lectures, 48, 210 A952).
Lynen F., Biosynthesis of Saturated Fatty Acids, Federation Proc, 20, 941 A961).
Lynen F.,Eggerer H.,Henning U.,Knappe J.,Kessel I., Ringcl-
man E., New Aspects of Acetate Incorporation into Isorpenoid Precursors, Ciba
Found. Symp., Biosyn. Terpenes Sterols, p. 95, Little, Brown, Boston A959).
Rapport M. M., N о r t о n W. T., Chemistry of the Lipids, Ann. Rev. Biochem., 31
103 A962).
Richards J. H., Hendrickson J. В., The Biosynthesis of Steroids, Terpenos,
and Acetogenins, Benjamin, New York, 1964.
R о s s і t e r P. I., in К. А. С Elliott, I. H. Page, and J. H. Quastel (eds.),
«Ncurochemistry», p. 10, С. С. Thomas, Springfield, Illinois, 1955.
Shapiro В., Lipid Metabolism, Ann. Rev. Biochem., 36, 247 A967).
V a g e 1 о s P. R., Lipid Metabolism, Ann. Rev. Biochem., 33, 139 A964).
W а к і 1 S. J., Mechanism o? Fatty Acid Synthesis, J. Lipid Res., 2, 1 A961).
W ale і 1 S. J., Lipid Metabolism, Ann. Rev. Biochem., 31, 369 A962).
Wright L. D., Biosynthesis of Isoprenoid Compounds, Ann. Rev. Biochem., 30, 525 .A961 .

Глава XVII
ОБМЕН АМИНОКИСЛОТ
В этой главе мы рассмотрим обмен аминокислот — всего класса в целом
и кагйдой из аминокислот в отдельности. Предстоит обсудить следующие
пять вопросов: 1) ассимиляция неорганического азота; 2) разрыв
пептидных связей; 3) биосинтез аминокислот; 4) общие аспекты обмена
аминокислот; 5) специальные аспекты обмена аминокислот.
Тесно связанный с предметом этой главы вопрос о синтезе белков из
аминокислот рассматривается в гл. XXI.
АССИМИЛЯЦИЯ НЕОРГАНИЧЕСКОГО АЗОТА
ФИКСАЦИЯ АЗОТА
Говоря о неорганическом азоте, который может быть превращен в аммиак,
а затем в органические продукты, мы имеем в виду главным образом
молекулярный азот и соли азотной кислоты (нитраты).
Первичным источником азота для построения органических азотистых
соединений служит атмосферный азот. Повсюду в царстве растений и в
царстве микроорганизмов встречаются виды, обладающие способностью
восстанавливать азот до аммиака. Они называются азотфиксирующими
организмами. К числу таких организмов относятся некоторые виды гетеротрофных
бактерий, как аэробных (Azotobacter vinelandii), так и анаэробных (Clostri-
dium pasteurianum); фотосинтезирующие бактерии (Rhodospirillum rubrum);
некоторые водоросли, и, наконец, симбиотические системы, состоящие
из бактерий рода Rhizobium и некоторых растений, в основном
представителей семейства бобовых. В последнем случае ни бактерии, обитающие
в корневых клубеньках растения, ни само растение не обладают способностью
фиксировать азот, и только их симбиоз приводит к возникновению весьма
эффективной и важной «кооперативной» системы фиксации азота.
Восстановление атмосферного азота чрезвычайно наглядно
демонстрирует поразительную мощность биохимических процессов. Молекулы азота
крайне стабильны, о чем свидетельствует величина 225 ккал/молъ,
характеризующая прочность тройной связи в N2 (соответствующая величина
для ацетилена составляет всего 110 ккал/молъ); поэтому для восстановления
азота в лаборатории требуются весьма энергичные воздействия. Тем не менее
ежегодно перечисленные выше азотфиксаторы и другие, родственные им
организмы в очень мягких условиях переводят в аммиак несколько
миллионов тонн азота.
Последовательность событий, приводящих к фиксации азота, во многом
еще не ясна. Важнейшим шагом вперед на пути познания механизма
фиксации азота явилась разработка метода получения азотфиксирующих
бесклеточных препаратов из различных организмов. Благодаря этому стали
возможными фракционирование, очистка и в конечном счете идентификация
тех клеточных компонентов, которые участвуют в фиксации азота.
Поскольку многочисленные азотфиксирующие организмы обладают
самыми разнообразными свойствами, не удивительно, что и бесклеточные азот-

422
Глава XVII
фиксирующие системы из различных источников далеко не одинаковы.
Их индивидуальные особенности проявляются в том, что они по-разному
реагируют на присутствие кислорода, на изменение давления азота и на
колебания pH и концентрации субстратов. Лучше других исследована система,
выделенная из Clostridium pasteurianum.
Продукт реакции. Конечным продуктом фиксации азота является аммиак.
Попытки обнаружить возможные промежуточные продукты на пути от N2
к NH3, в частности NH = NH, гидразин и гидроксиламин, не дали
результатов. По-видимому, либо время существования промежуточных продуктов
реакции очень мало, либо эти промежуточные продукты прочно связаны
с соответствующими ферментами.
Роль пирувата. Для фиксации азота совершенно необходим пируват
(у некоторых растений вместо пирувата используется а-кетобутират).
он
о
СНз-С-СО2-+ТЛФЕ
[ob-
С=ТЛФЕ
О
+ Ф„
?
СН3-С-ОРО3Н-
ОН О
I II
СН3-С С-СН3 + СО2
H
+2Н+
Н2 + 2 Ферредоксин
Фиг. 12J. Окисление ішрувата у Clostridium pasteurianum.
ТПФ-Е — ферментный комплекс, содержащий тиаминпирофосфат.
На каждый моль фиксированного азота окисляется приблизительно 100 моль
пирувата. Эги количественные соотношения показывают, что процессы
фиксации азота и окисления пирувата сопряжены лишь отчасти.
Окислительное превращение пирувата может служить источником электронов
и АТФ для восстановления азота; по крайней мере о первой функции можно,
по-видимому, говорить почти с полной уверенностью. Путь окисления
пирувата у С. pasteurianum представлен на фиг. 121. Функцию акцептора
электронов, ферредоксина, мы обсудим ниже. Роль АТФ в фиксации азота еще
точно не выяснена. Возможно, что АТФ составляет часть системы, служащей
донором водорода (см. ниже).
Роль ферредоксина. Изучение фиксации азота непосредственно привело
к открытию нового электронпереносящего фермента — ферредоксина. О фер-
редоксине Clostridium сказано подробно в гл. XII и XV. Оказалось, что
ферредоксин широко распространен среди выделяющих водород анаэробов,
но отсутствует у аэробов. Из фиг. 121 видно, что ферредоксин может
служить акцептором электронов при окислении пирувата. Восстановленный

Обмен аминокислот 423
ферредоксин способен затем обратно окисляться в системах,
восстанавливающих нитрит и гидроксиламин до аммиака и НАДФ+ до НАДФ-Н(-|-Н+).
Ферредоксин абсолютно необходим для фиксации азота у С. pasteurianum.
Таким образом, есть основания утверждать, что ферредоксин является
важным электронпереносящим агентом, обеспечивающим сопряжение
процессов окисления пирувата и восстановления азота.
Разделение системы. Азотфиксирующие экстракты из С. pasteurianum
удалось разделить на два компонента (каждый из которых представляет
собой сложную смесь); один компонент — это «система, активирующая азот»,
другой —«система, служащая донором водорода».
Метаболический контроль. «Нитрогеназа» С. pasteurianum, по-видимому,
находится под метаболическим контролем и репрессируется ионом аммония.
АССИМИЛЯЦИЯ НИТРАТА
Восстановление нитрата растениями и микроорганизмами служит двум
целям: с одной стороны, из нитрата образуется аммиак, который
используется в реакциях синтеза, с другой — нитрат служит конечным
акцептором электронов. В последнем случае продуктом восстановления может быть
N2, N2O или NO — в зависимости от вида организма, у которого такое
восстановление наблюдается. Эти вещества уже более не вовлекаются в
метаболизм клетки, и, следовательно, ассимиляции нитрата при этом не
происходит.
Ассимиляция нитрата осуществляется в два этапа: сначала нитратредук-
таза катализирует превращение нитрата в нитрит, а затем нитритредуктаза
катализирует реакцию нитрит —> аммиак. У некоторых видов
осуществляются обратные реакции: Nitrosomonas превращает аммиак в нитрит,
a Nitrobacter окисляет нитрит в нитрат.
Нитратредуктаза, встречающаяся у многих высших растений, грибов
и микроорганизмов, представляет собой связанный с пиридиннуклеотидом
молибдофлавопротеид. В качестве первичного донора электронов
используется либо восстановленный НАДФ, либо восстановленный НАД. Для
нитратредуктазы из Neurospora выяснено, в какой последовательности
вступают в реакцию отдельные электронпереносящие агенты на всем пути
переноса от восстановленного пиридиннуклеотида до нитрата:
I Флавопротеид ty
ФДт-ed > Восст. НАДФ -> ФАД —> Mo —> NOr (XVII.1)
Нитритредуктазы — это обычно связанные с пиридиннуклеотидом метал-
лофлавопротеиды. Однако для восстановления нитрита в аммиак
используются разнообразные первичные источники электронов, в том числе
восстановленный НАДФ, Н2и фотовосстановление. При восстановлении нитрита,
как и в случае фиксации азота, ферредоксин играет, по-видимому,
центральную роль в качестве электронпереносящего агента. Очевидно, ферредоксин
восстанавливается указанными выше агентами, а затем отдает электроны
нитриту либо непосредственно, либо через посредство какого-либо иного
промежуточного переносчика.
РАЗРЫВ И ОБРАЗОВАНИЕ ПЕПТИДНЫХ СВЯЗЕЙ
У млекопитающих главным источником азота в ш'ще служит белок.
Сложные белковые молекулы должны расщепиться в процессе
переваривания пищи до составляющих их аминокислот. Последние могут быть
непосредственно использованы для синтеза специфических белков или же они

424 Глава XVII
могут, как это будет показано ниже, подвергнуться дальнейшим
превращениям, в ходе которых образуется ряд разнообразных продуктов.
Роль протеолитических ферментов никоим образом не ограничивается
их участием в пищеварительном процессе у млекопитающих. Эти ферменты
встречаются у всех живых существ и выполняют многие различные функции.
Мы начнем с того, что рассмотрим пищеварительные ферменты человека,
а затем перейдем к пищеварительным ферментам из других источников.
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО
ТРАКТА
Пепсин. Именно пепсин был, вероятно, тем веществом, которое
обнаружил Спалланцани в 1783 г., так что его можно считать первым известным
белком. В 1930 г. Нортроп получил пепсин в кристаллическом виде.
Этот главный протеолитический фермент желудочного сока встречается,
по-видимому, у всех позвоночных, хотя свойства ферментов из разных
источников могут несколько различаться. Наиболее детально изучен
фермент свиньи. Поскольку pH желудочного сока, как правило, близок к 1
или 2, пепсин должен обладать необычно большой устойчивостью в сильно
кислых растворах. Действительно, он характеризуется изоэлектрической
точкой <1, проявляет максимальную каталитическую активность в
умеренно кислых растворах и денатурируется при значениях pH > 5. В этом
смысле пепсин, возможно, уникален или, во всяком случае, резко
отличается от всех других известных ферментов.
Подобно протеолитическим ферментам поджелудочной железы, пепсин
синтезируется в форме предшественника пепсиногена (общее название всех
подобных предшественников —- зимоген). Пепсиноген — белок, полученный
в кристаллическом виде,— содержится в слизистой желудка; его
молекулярный вес равен приблизительно 42 000, а изоэлектрическая точка лежит
при pH 3,7. Превращение пепсиногена в пепсин катализируется ионами
водорода; поэтому можно полагать, что оно осуществляется после перехода
пепсиногена в сильно кислый желудочный сок. Роль катализатора в этой
реакции играет, по-видимому, сам пепсин. Реакция активации является,
таким, образом, аутокаталитической. Поскольку молекулярный вес пепсина
равен 35 000, превращение пепсиноген—»- пепсин связано со значительным
укорочением полипептидной цепи. Оно происходит за счет отщепления
N-концевого участка пепсиногена, в котором сосредоточены все основные
аминокислоты. Среди продуктов отщепления обнаруживается ингибитор
пепсина с молекулярным весом 3242 и пять более мелких фрагментов, в сумме
отвечающих молекулярному весу около 4000. Связи, по которым атакует
пепсин, показаны на фиг. 122.
Как видно из фиг. 122, молекула пепсина состоит из одной
полипептидной цепи с N-концевым изолейцином и С-концевым аланином. В молекуле
имеются три дисульфидных мостика (образованных за счет всех наличных
остатков цистеина). Два из них необходимы для ферментативной активности.
Гидродинамические измерения показывают, что молекула пепсина обладает
весьма компактной структурой, хотя в ней, по-видимому, имеется лишь
небольшое число а-спиральных участков.
Пепсин следует считать ферментом, разрывающим связи избирательно,
поскольку не все их типы одинаково доступны его действию. Атакуемость
субстрата пепсином определяется следующими условиями: 1) субстрат должен
содержать пептидные связи; 2) обе аминокислоты, участвующие в образовании
пептидной связи, должны иметь L-коифигурацию; З) наиболее доступны
аминокислотные остатки, содержащие ароматические боковые цепи хотя

Обмен аминокислот
425
¦и
соон
Фиг. 122. Структура пепсиногена.
лтлкя ттрпсином по связям, обозначенным буквой Л, приводит к освобождению смеси пептидов (.4).,
иигибитпоа пепсина (В) и активного пепсина (Б). Протяженность неизученных последователыюстеи
по отношению к изученным фактически значительно больше, чем это показано на схеме. Положение
остатка серина относительно дисульфидных групп точно не установлено.
частично атакуются также и связи, в образовании которых участвуют остатки
цистина и цистеина).
Пепсин принадлежит к числу эндопептидаз, т. е. он расщепляет
пептидные связи внутри полипептидных цепей.
Реннин. Реннин, фермент из четвертого отдела сложного желудка
жвачных, по своим свойствам близок к пепсину. Молекула реннина состоит
из одной полипептидной цепи с молекулярным весом около 40000. Изоэлек-
трическая точка реннина лежит при pH 4,5. По специфичности этот фермент
почти идентичен пепсину. Только после получения реннина в
кристаллическом виде и определения его аминокислотного состава и других свойств
было установлено, что это белок, отличный от пепсина.
Химотрипсин. Процесс переваривания белков, начинающийся в желудке
под влиянием пепсина, продолжается в двенадцатиперстной кишке (самая
верхняя часть тонкого кишечника) под действием ферментов,
присутствующих в секрете поджелудочной железы. Ферменты эти — трипсин и химотрип-
сии __ очень сходны по своим свойствам.

12 3 4 5 6 7 8 9 lu 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Химотрипсиноген Цис-Гпи-Вал-Про-Ала-Илей-Глун-Про-Вал-Лей-Сер-Г ли-Лей-Сер-Арг-ИЛЕЙ-ВАЛ-ГЯИ-Асп-Глу-Глу-Ала-Вал-Про-Гли- Сер- Три-ПРО-Три-ГЛУН-
Трипсиноген Вал-Аеп-Асп-Асп-Асп-Лиз-ИЛЕЙ-ВАЛ-ГЛИ-Гли-Тир-Тре-Цис-Гли-Ала-Аепн-Тре-Вал-ПРО-Тир-ГЛУН-
12 3 4 5 o 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
31 32 33 34 35 36 37 38 39 4U 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
ВАЛ-СЕР- ЛЕЙ-Глун-А en- Лиз-Тре-ГЛИ-Фен-ГИС-ФЕН-ЦИС-ГЛИ-ГЛИ- СЕР- ЛЕЙ-ИЛЕЙ-АСПН-Глу-Аеші-ТРИ-ВАЛ-ВАЛ-Тре-АЛІ-АЛА-ГИС-ЦИС-Гли-Вал-
ВАЛ-СЕР-ЛЕЙ-Аепн- -Сер-ГЛИ-Тир-ГИС-ФЕН-ЦИС-ГЛИ-ГЛИ-СЕР-ЛЕЙ-ИЛЕЙ-АСПН-Сер-Глуи-ТРИ-ВАЛ-ВАЛ-Сер-АЛА-АЛА-ГИС-ЦіІС-Тир-Лиз-
22 23 24 25 26 27 28 29 3U 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
61 62 63 64 65 66 67 68 69 7U 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92
Тре-Тре-Сер- Асп- ВАЛ-Вал-Вал-Ала-Гли-Глу-Фен- Аеп- Глуи-Гли-Сер- Сер- Сер-Глу-Лиз-Илей-Глун-Лиз- Лей-Лиз-Илей-Ала-Лиз-Вал- Фен-Лнз-Аегш-СЕР-
Сер-Гли-Илей-Глун-ВАЛ-Арг-Лей- Гли-Глу-Асп-Аспн-Илей-Аспи- Вал-Вал-Глу-Гли-Аеп-Глу-Глун-Феи- Идей-Сер-Ала-Сер- Лиз-Сер-Илей-Вал-Гис-Про- СЕР-
5U 51 52 53 54 55 56 57 58 59 6U 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81
93 94 95 96 97- 98 99 100 101 182 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122
Лиз-ТИР-АСПН-Сер-Лей-Тре-Илей- АСПН-АСПН-Аспн-ИЛЕЙ-Тре-ЛЕЙ-Лей- ЛИЗ-ЛЕЙ-Сер-Тре-АЛА-АЛА-СЕР-Фен-Сер- Глун-Тре-ВАЛ-Сер-Ала-Вал- Пис-
-ТИР-АСПН(Про,Лей, Тре, Acn^AGTIH-ACnH-Acn- ИЛЕЙ-Мет-ЛЕЙ-Илей-ЛИЗ-ЛЕЙ-Лиз-Сер-АЛА-АЛА-СЕР-Лей-Аспн-Сер- Арг-ВАЛ-Ала-Сер-Илей-Сер-
82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 НО
123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 .137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154
ЛЕЙ-ПРО-Сер-Ала-Сер-Асп-Асп-Фен-Ала-АЛА-ГЛЙ-ТРЕ-Тре- ЦИС-Вал- Тре- Тре-ГЛИ-ТРИ-ГЛИ-Лей- ТРЕ-Арг-Тир-Тре-Аелн-Ала-Аепн-Тре-ПРО-АСП-Арг-
ЛЕЙ-ИРО-Тре-Сер-Цис- -Ала-Сер-АЛА-ГЛИ-ТРЕ-Глун-ЦИС-Лей-Илеі^Сер-гЧЩ-ТРИ-ГДИ-Аспн-ТРЕ-Лиз-Сер-Сер-Гли- Тре-Сер- Тир-ПРО-АСЛ-Вал-
111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140
155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185
ЛЕЙ-Глун-Глун-Ала-Сер-Лей-ПР.О-Лей- ЛЕЙ-СЕР-Аспн-Тре-Аепн-ЦИС-ЛИЗ-Лиз-Тир-Три-Гли-Тре-Лиз- ИЛЕЙ-Лиз-Асп-Ала- МЕТ-Илей-ЦИС-АЛА-ГЛИ-Ала-
ЛЕЙ-Лиз- Цис- Лей-Лиз-Ала-ПРО-Илей-ЛЕЙ-СЕР-Асп- Сер-Сер- ЦИС-ЛИЗ-Сер-Ала-Тир-Про-Гли-Глун-ИЛЕЙ-Тре-Сер-Аепн-МЕТ-Фен-ЦИС- АЛА-ГЛИ-Тир-
141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171
186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214
Сер- Г ли-Вал- Сер- -СЕР-ЦИС-Мет- ГЛИ-АСЛ-СЕР-ГЛИ-ГЛИ-ПРО-Лей- ВАЛ-ЦИС-Лиз-Лиз-Аспн-Гли-Ала-Три-Тре-Лей-Вал-ГЛЙ-йЛЕЙ-ВАЛ-Сер-
Лей-Глу-Гли-Гли-Лиз-4спн-СЕР-ЦИС-Глуіі-ГЛИ-АСП-СЕР-ГЛИ-ГЛИ-ПРО-Вал-В4Л-ЦИС-Сер-Гли-Лиз- Лей-Глун- -ГЛИ-ИЛЕЙ-ВАЛ-
172 173 174 175 176 177 178 179'180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197
215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244
СЕР-ТРЙ-ГЛИ-СЕР-Сер-Тре- Цис-Сер- Тре-Сер- Тре-ПРО-ГЛИ-ВАЛ-ТИР-Ала-Арг-ВАЛ-Тре-Ала- Лей-ВАЛ-Аспн-ТРИ-Вал- Глун-ГЛУН-ТРВ-Лей-АЛА-
СЕР-ТРИ-ГЛИ-СЕР-Гли-Цис-Ала-Глун-Лиз-Аспн-Лиз-ПРО-ГЛИ-ВАЛ-ТИР-Тре-Лиз-ВАЛ-Цис-Аспн-Тир-ВАЛ-Сер- ТРИ-Илей-Лиз- ГЛУН-ТРЕ-Илей-АЛА-
198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227
245 246
Ала-АСПН-
Сер- АСПН-
228 229
Фиг. 123. Сходство структуры трнпсиногена п химотрипсиногена.
Последовательность 84—87 в молекуле трипсиногена еще точно не определена. Пропуски в последовательностях сделаны с целью привлечь внимание к областям
гомологии. Гомологичные аминокислотные остатки в двух цепях выделены крупным шрифтом.

Обмен аминокислот 427
Химотрипсин обнаруживается в панкреатическом соке в виде смеси
двух зимогенов — химотрипсиногена А и химотрипсиногена В. Первый
яз этих белков детально охарактеризован. Его молекулярный вес равен
приблизительно 25 000, а изоэлектрическая точка лежит при pH 9,1.
Молекула химотрипсиногена А состоит из одной полипептидной цепи;
последовательность аминокислот в этой цепи вместе с соответствующей
аминокислотной последовательностью в полипептидной цепи трипсиногена представлена
на фиг. 123.
Превращение химотрипсиноген А -»¦ химотрипсин представляет собой
сложный процесс, приводящий фактически к образованию семейства химо-
трипсинов — a, O, я и т. д. Все эти реакции катализируются трипсином
и химотрипсином. Поскольку молекулярный вес химотрипсина близок
к 25 000, активация зимогена должна быть сопряжена с относительно
небольшим укорочением полипептидной цепи. Общая схема активации
химотрипсиногена А представлена на фиг. 124. Катализируемое трипсином
расщепление одной пептидной связи между аргинином и изолейцином
приводит к образованию я-химотрипсина. Последующий разрыв второй
пептидной связи: с отщеплением дипептида сериларгинина дает
o-химотрипсин.
Катализируемая химотрипсином элиминация дипептида треониласпараги-
новой кислоты от o-химотрипсина дает а-химотрипсин. Тот же продукт
может получиться при обратном порядке отщепления дипептидов; в
качестве промежуточного продукта в этом случае образуется неохимотрипсино-
ген.
а-Химотрипсин, подобно пепсину, принадлежит к числу эндопептидаз.
Он обладает способностью катализировать гидролиз эфиров, амидов, гид-
роксаматов и других ацилпроизводиых. Однако, хотя химотрипсин и
катализирует гидролиз (а также аминолиз и алкоголиз) широкого спектра
субстратов, активность его оказывается максимальной лишь в том случае,
когда карбоксильная группа, участвующая в образовании пептидной связи,
принадлежит ароматической аминокислоте. Каталитическое действие
химотрипсина изучено лучше, чем действие какого-либо иного фермента; мы
обсудили его довольно подробно в гл. VII.
Трипсин. Доказательством структурного сходства между трипсином
и химотрипсином служит поразительная гомология последовательностей
аминокислот в молекулах зимогенов (см. фиг. 123).
Общими для двух ферментов являются также следующие их
характеристики: 1) локализация; 2) скорость синтеза; 3) характер активности (оба
фермента являются эндопептидазами). Что касается последнего пункта, то
большая часть соображений, высказанных относительно механизма действия
химотрипсина, приложима в равной мере и к трипсину. Главное различие
между трипсином и химотрипсином касается их субстратной
специфичности.
Трипсин проявляет наибольшую активность по отношению к пептидам,
у которых карбоксильная группа принадлежит остатку основной
аминокислоты.
Превращение трипсиноген -> трипсин осуществляется проще, чем
соответствующее превращение химотрипсииогеиа, поскольку здесь образуется
только один продукт. Активация может катализироваться как самим
трипсином, так и ферментом энтерокиназой, а также некоторыми протеиназами,
выделенными из плесеней. При активации происходит отщепление от
полипептидной цепи N-концевого гексапептида, как это схематически показано
на фиг. 125. Важную роль в процессе активации играет ион кальция,
специфически ускоряющий расщепление по определенной пептидной связи и
одновременно тормозящий разрыв связей в других местах (при расщеплении

428 Глава XVII
других пептидных связей образуются продукты, лишенные ферментативной
активности).
Энтерокиназа — протеолитический фермент, вырабатываемый слизистой
двенадцатиперстной кишки. Она представляет собой гликопротеид;
полностью еще не охарактеризована.
Тир Шеи
Тре 'Арг
I ' I
Исп* Сер
і L
Ала Леи
^
¦Асп Цін,— ч
/ \
РХТ хтг РТ
\
( . Г „
Тор- Илей Тир Имеи+
Арг Тре
I » *
Сер Асп
Ала+ \ (Пей Ала Лей"
{-Асп* +Цис~У V—Асп* +U.UC—/
Нео-ХТГ \ / Ь-ХТ
+ Тре-^сп* v / Л-Сер-
Тир- ?
\/ -
^—Асп*
сс-ХТ
Фиг. 124. Общая схема активации химотрипсиногена А.
ХТГ — химотрипсиноґен А; Нео-ХТГ—неохимотрипсиноґен; 6-ХТ и (Х-ХТ—соответственно S-
и а-химотрипсин; РТ — реакции, катализируемые трипсином; РХТ — реакции, катализируемые
химотрипсином; «4-» и «—» соответственно N- и С-концевые остатки; А, В ж С — А-, В- п С-цспи а-химо-
трлпеиня; Асп* — остаток аспарагина. Две цепи в молекулах неохимотрипсиноґена и б-химотриисиня
и три цепи в а-химотрипсине связаны между собой дисульфидными мостикаші.
Карбоксипептидаза. Трипсину и химотрипсину в соке поджелудочной
железы сопутствует экзопептидаза карбоксипептидаза. Этот фермент (или,
точнее, семейство ферментов) расщепляет полипептиды, осуществляя
ступенчатый гидролиз связей начиная с С-конца. О применении карбоксипеп-

Обмен аминокислот
429
тидазы для определения последовательности аминокислот говорилось
в гл. IV.
Две карбоксипептидазы — А и В — участвуют в переваривании белков
в двенадцатиперстной кишке. Карбоксипептидаза А проявляет
максимальную каталитическую активность в отношении ароматических С-концевых
аминокислот, а карбоксипептидаза В специфична в отношении основных
С-концевых аминокислот.
Как и другие протеолитические ферменты, карбоксипептидаза А
поступает в панкреатический сок в виде зимогена — прокарбоксипептидазы А-
Препарат этого фермента, полученный из природных источников,
представляет собой цинк-протеид, содержащий один атом металла на молекулу
белка. Связь между ионом металла и белком осуществляется частично через
посредство специфической сульфгидрильной группы. Цинк-карбоксипепти-
даза А обладает как пептидазной, так и эстеразной активностью, причем
эта двойственная специфичность чувствительна к малейшим структурным
изменениям молекулы фермента. Если ион цинка заменить на ион кальция
Электростатическое
взаимодействие
или наличие
водородных связей
l_-(A~
mue ;т і її ^ Kz;^\
\ І
І Трипсиноген
Активный центр
Пептид,
освобождающийся
при октивации
Трипсин
Фиг. 125. Схема механизма активации трипсиногена быка.
А — аспарагин; В — валин; Г — гистидин; Гл — глицин; И — изолейцин; Л — лизин; Сер — серии.
или ртути, то эстеразная активность карбоксипептидазы усилится, а пепти-
дазная, наоборот, снизится до нуля. Сходным образом влияет ацетилиро-
вание двух остатков тирозина с помощью ацетилимидазола или уксусного
ангидрида: оно приводит к исчезновению пептидазной активности и
одновременно к приблизительно шестикратному повышению эстеразной
активности. Ни ацетилирование, ни замена одного иона металла на другой не
вызывают сколько-нибудь заметных изменений в третичной структуре молекулы
карбоксипептидазы. Следовательно, мы вправе сделать вывод, что на
пептидазной и на^эстеразной активностях сказываются, и притом совершенно
различно, самые минимальные изменения архитектуры молекулы
фермента.
Карбоксипептидаза В, специфичная в отношении концевых пептидных
связей, образованных остатками лизина или аргинина, также, вероятно,
представляет собой металлопротеид. Это заключение вытекает из того факта,
что карбоксипептидаза В ингибируется хелатообразугощими агентами,
например 1,10-фенантролином.

430
Глава XVII
Природа иона металла, присутствующего в молекуле карбоксипепти-
дазы В, еще не установлена.
Лейцинаминопептидаза. Лейцинаминопептидаза — фермент, найденный
в слизистой кишечника и в других ткаиях — принадлежит к числу экзопеп-
тидаз; она катализирует ступенчатое расщепление полипептидных цепей
начиная с N-конца (см. гл. IV). Фермент был получен из почек свиньи
в высокоочищенном виде (в кристаллическом виде получить его пока не
удалось).
Лейцинаминопептидаза, активируемая ионами магния или марганца,
обладает эстеразной и пептидазной активностями и гидролизует большое
число субстратов. Субстраты, в молекуле которых имеется асимметрический-
а-углеродный атом, должны иметь L-конфигурацию. Как показывает само
название фермента, гидролиз протекает наиболее быстро, когда N-концевое
положение в молекуле субстрата занимает лейцин. Относительные скорости
расщепления разных субстратов мало зависят от природы активирующего
иона.
В слизистой кишечника содержатся помимо лейцинаминопептидазы
и карбоксипептидаз также и некоторые другие пептидазы. Многие из них,
в особенности дипептидази и трипептидазы, проявляют специфичность
в отношении длины цепи субстрата. Функция таких ферментов заключается,
по-видимому, в завершении процесса переваривания белков, начинающегося
под влиянием ферментов, рассмотренных выше. Некоторые сведения о
ферментах, участвующих в процессе пищеварения у человека, суммированы
в табл. 49.
Таблица 49
Протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта млекопитающих
Источник
Секрет желудка
Секрат
поджелудочной железы
Секрет кишечника
Фермент
Пепсин
Реннин
Трипсин
Химотрипсин
Карбоксипептидаза
Аминопептидаза
Пролидаза
Трипептидаза
Дипептидази
Примечание
Протеиназа; найден также в
желудочном соке птиц, рептилий и рыб
Фермент, вызывающий свертывание
молока; присутствует в соке
четвертого отдела сложного желудка
жвачных
Протеиназа
»
Пептидаза
Л
\ Пептидазы
J
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ЖИВОТНЫХ ТКАНЕЙ
Группа протеолитических ферментов — катепсинов — обнаружена в
почках, селезенке, печени и легочной ткани, а также в некоторых других
тканях. Катепсины локализованы внутриклеточно; это эндопептидазы, гидро-
лизующие как белки, так и низкомолекулярные синтетические
субстраты.
Субстратная специфичность катепсинов А, В и С сходна со специфичностью
соответственно пепсина, трипсина и химотрипсина. Катепсины еще не
получены в достаточно чистом виде, а потому их химические и каталитические
свойства пока не изучены.

Обмен аминокислот 43І
РАСТИТЕЛЬНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ
Папаин. Папаином называют протеолитический фермент из плодов
тропического дынного дерева Carica papaya. В латексе С. papaya папаин
присутствует в высоких концентрациях, и его можно получить из этого
источника в кристаллическом виде в больших количествах. Молекула папаина
состоит из одной полипептидной цепи, аминокислотная последовательность
которой уже расшифрована. Молекулярный вес фермента близок к 21 000,
а его изоэлектрическая точка лежит при pH 8,75.
Папаин проявляет широкую субстратную специфичность: он
катализирует гидролиз пептидов, амидов, эфиров и тиоэфиров. Акцепторами ациль-
ных групп могут при этом служить помимо воды также и различные нуклео-
фильные агенты. Пептиды, содержащие в своем составе разнообразные
аминокислоты, эффективно расщепляются папаином при условии, что эти
аминокислоты имеют L-конфигурацию. На основании ряда данных можно
полагать, что для каталитической активности папаина существенное значение
имеет тиоловая группа цистеина.
Фицин. Этот фермент, выделенный из растений семейства тутовых,
представляет собой эндопептидазу, сходную с папаином. Фицин — сульфгидриль-
ный фермент с молекулярным весом около 26 000. Исходя из кривых
зависимости скорости реакции от pH, можно полагать, что в реакции,
катализируемой фицином, участвует также карбоксилатный ион или его кинетический,
эквивалент. Фицин проявляет максимальную активность в отношении
субстратов, содержащих L-аргинин, но его каталитическое действие
распространяется на широкий спектр субстратов.
К числу других важных протеолитических ферментов растений
относятся бромелин из ананаса, химопапаин из латекса Carica papaya и аскле-
паин из корней и латекса молочая.
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ
Из бактериальных источников было выделено много протеолитических
ферментов. Среди них встречаются как эндопептидазы, так и экзопептидазы.
Все эти ферменты характеризуются поразительно широкой специфичностью
или даже полным отсутствием какой бы то ни было специфичности.
Некоторые бактериальные протеиназы расщепляют до 80% всех пептидных
связей, имеющихся в белке.
БИОСИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ
Организмы заметно различаются по своей способности синтезировать
de novo аминокислоты, из которых строятся их белки. Большинство
микроорганизмов и растений синтезируют все необходимые им аминокислоты,
но животные по большей части около половины необходимых им
аминокислот синтезировать не способны. Поэтому применительно к животным
можно разбить аминокислоты на две группы: заменимые и незаменимые.
Разграничение заменимых и незаменимых аминокислот возможно на оспове
различных экспериментальных критериев. Исходя из обычных критериев,
аминокислоту можно считать незаменимой, если ее приходится включать
в состав пищи для обеспечения оптимального роста или для поддержания
азотистого баланса. В норме у взрослого животного количество азота,
выводимого из организма за сутки, должно быть равно количеству азота,
поступившему в организм за тот же период. Классическими исследованиями Розе
было показано, что для белых крыс незаменимыми являются следующие
аминокислоты: лейцин, изолейцин, валин, лизин, метионин, фенилаланин,
триптофан, треонин, гистидин и аргинин. Первые восемь из перечисленных

432 Глава XVII
аминокислот оказались незаменимыми также и для всех других изученных
видов высших животных. Что же касается гистидина, то, например,
организм человека способен синтезировать эту аминокислоту (или получать ее
из продуктов распада белков) в количестве, достаточном для обеспечения
оптимального роста и поддержания азотистого баланса. Углеродные цепи
аргинина и треонина — двух незаменимых аминокислот — могут, вообще
говоря, синтезироваться в организме крысы; просто этот синтез протекает
настолько медленно, что он не обеспечивает оптимального роста. Иначе
обстоит дело со всеми остальными незаменимыми аминокислотами, так как
организм крысы совершенно утратил в ходе эволюции способность
синтезировать их углеродные цепи.
Пищевая потребность в определенных аминокислотах зависит от ряда
условий, в том числе от наличия или отсутствия в нище метаболически
близких соединений. Так, например, тирозин снижает количество
требующегося фенилаланина, а глутаминовая кислота подобным же образом может
«замещать» аргинин. У крысы потребность в метионине можно покрыть
гомоцистеином с добавлением адекватного количества доноров метильной
группы. Таким образом, для суждения о «незаменимости» аминокислоты
необходимо не просто исходить из указанных выше критериев, но и
учитывать другие компоненты пищи. Кроме того, потребность в аминокислотах
меняется в зависимости от физиологического состояния животного
(например, во время беременности, лактации или болезни), от его возрастай,
возможно, от состава его кишечной флоры.
Следует подчеркнуть, что «незаменимым» у незаменимых аминокислот
является их углеродный скелет; большинство таких аминокислот может
образоваться из соответствующих им кетокислот путем трансаминирова-
ния (см. стр. 446).
АССИМИЛЯЦИЯ АММИАКА.
СИНТЕЗ ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ГЛУТАМИНА
¦ Как уже отмечалось выше, при ассимиляции молекулярного азота и
нитратов — главных источников минерального азота — в качестве первого
продукта реакции образуется аммиак. Каким же образом аммиак включается
в органические азотистые соединения? Это включение может происходить
многими различными путями. Однако у большинства видов наиболее
важными в количественном отношении являются, по-видимому, реакции,
катализируемые тремя ферментами — глутаматдегидрогеназой, глутаминсин-
тетазой и карбамоилфосфатсинтазой.
Глутаматдегидрогеназа катализирует образование глутамата из а-кето-
глутарата и аммиака при участии пиридиннуклеотида:
Восст. НАД -> т _^ НАД -і
} +«КетоглутаРат+№+ ^ } + Ь-глутаМаТ+Н2О. (XVII.2)
Восст. ЦАДФ
Этот фермент широко распространен в живых системах. В качестве
кофермента используется восстановленный НАДФ или НАД — первый
обычно в тех случаях, когда глутаматдегидрогеназа функционирует как
биосинтетический агент, а второй — когда она выполняет преимущественно
катаболическую функцию. Некоторые аспекты структурной организации
этого интересного фермента рассмотрены в гл. IV, а его связь с циклом
трикарбоновых кислот — в гл. XIV.
Другой возможный путь биосинтеза глутамата — это зависимое от пири-
доксальфосфата трансаминирование с использованием а-кетоглутарата (см.
в гл. VIII обсуждение механизмов реакций трансаминирования):
Пиридоксальфосфат
а-Кетоглутарат + Аминокислота *~ Ь-глутамат-f-Кетокислота. (XVII.3)

Обмен аминокислот 433
Взаимопревращение а-кетоглутарата и глутамата служит важным звеном,
непосредственно связывающим обмен аминокислот с обменом углеводов.
Эта реакция обеспечивает включение углерода, происходящего из глюкозы,
в глутамат, а через него — в другие аминокислоты.
Второй важной реакцией, приводящей к включению аммиака в
органические соединения, является зависимое от АТФ образование глутамина:
Ь-Глутамат + ІШз + АТФ ~ZZl Ь-глутампн + АДФ + Фн. (XVII.4)
Наконец, большое значение имеет реакция, катализируемая карбамоил-
фосфатсинтазой и приводящая к включению аммиака в некоторые
биосинтетические продукты, особенно в пиримидины и мочевину. Стехиометрия
этой реакции (с участием фермента млекопитающих) описывается
уравнением (XVI 1.5)
О
Ацилглутамат [(
> NH2—С —ОР03Н-+2АДФ + ФН. (XVII.5)
Ацилглутамат необходим в качестве кофактора для ферментов
млекопитающих. В реакции, катализируемой бактериальными ферментами,
участвует только АТФ.
АМИНОКИСЛОТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ГЛУТАМАТА
Путь превращения глутамата в нролин представлен на фиг. 126.
В животных тканях 4-окси-Ь-пролпн содержится главным образом
коллагепе. Биосинтез оксипролина еще полностью не изучен, однако можно,
CHj—CHj
НО2С С-СО-г (+Посст.ИАД+ДТФ)
H3N \н
Г
ДегиЪрогеиаза у-семиамдегиеа
гіщтамитвай кислоты
сн2 —сн2
ОНС Я-СОг
Ввгхт.
НАЛФ
сн2—сн, ШФ снг—сиг
т—> не C-4JU,-
aoasa ^ /I
х?2 S;i f, т—
\№''Н iipsJiuusiiaaoasa
нхн й+ н
їіролин ь}-тірролин-5-кар6онаван кислота
Фиг. 126, Биосинтез пролина у Е. coll.
по-видимому, считать установленными следующие важные для понимания
этого процесса факты. Во-первых, кислородный атом гидроксильной группы
оксипролина происходит из атмосферного кислорода, как это показано в
опытах с изотопной меткой. Во-вторых, предшественником оксипролина,
входящего^ в^состав коллагена, служит пролин. Этот вывод следует из опытов
28-246

434
Глава XVII
СО2Н
сн2
I
сн2
H-C-NH3+
со,-
Глутатиновая
кислота
CHj—C—SKoA
CO2H
{н2
СН2 О атф
I H || —up*
H-C-N-C-СНз
I
co2-
N-ацетимглутаминовая
кислота
CH2-NH3+
О
II
С-ОРО3Н-
CH2
сн2 о
I H 11
H-C-N-C-СНз
cor
у-СемиальЬегиЬ
гяцтпамиповой кислоты
у-Семиальаегид N-ацетил-
глутаминоаои кислоты
СО2Н
NH3+ CH2
НІ |
CH2-N-C=N-CH
І І
сн2 со2-
сн2
І
C-NH3*-
2
Аргининосущинат
Фиг. 127. Биосинтез аргинина у микроорганизмов.
по введению крысам меченого пролина; в тканевых белках у подопытных
животных после такого введения обнаруживается оксипролин с высоким
содержанием метки. В-третьих, свободный пролин не может быть
использован как субстрат для реакции гидроксилирования; это означает, что
свободный оксипролин не является промежуточным продуктом в синтезе
коллагена. В опытах с бесклеточной микросомнои системой из куриных эмбрионов,
включавшей меченый пролин в пептидный оксипролин, было показано, что
образование оксипролина сильно отстает от включения пролина. Эти данные
свидетельствуют о том, что фактическим субстратом в реакции
гидроксилирования служит пролин, уже связанный пептидной связью. В-четвертых,
синтез оксипролина, входящего в состав коллагена, катализируется фермент-
вой системой, ассоциированной с рибосомной фракцией клетки.

Обмен аминокислот 435
Путь превращения глутамата в аргинин представлен на фиг. 127. Роль
ключевого промежуточного продукта в этом превращении играет орнитин —
аминокислота, не встречающаяся в белках, но теснейшим образом связанная
с синтезом мочевины (см. стр. 459). Орнитин может образоваться: 1) из
Y-семиальдегида глутаминовой кислоты путем трансаминирования или
2) из Y-семиальдегида N-ацєтилглутаминовой кислоты путем
трансаминирования с последующим деацетилированием или переносом ацетильной
группы на глутаминовую кислоту. Последняя альтернатива открывает
возможность для циклических превращений, в которых ацетильная группа
используется повторно.
БИОСИНТЕЗ АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ И АСПАРАГИНА
Пути биосинтеза аспарагиновой кислоты очень сходны с путями
образования глутаминовой кислоты. Так, аспарагиновая кислота может возникать
из щавелевоуксусной кислоты в результате трансаминирования:
Пиридоксапьфосфат
Щавелевоуксусная кислота + Аминокислота °*
__ Ц^ Ь-аспартат+ Кетокислота. (XVII.6)
Подобные реакции служат еще одним важным связующим звеном между
обменом аминокислот и углеводным обменом. Помимо этого, аспартат может
образоваться в результате прямого аминирования фумарата:
СО^
-О2С—СН СН2
НС- СО^ + NH3 -^ HJN-C-COi- (XVII.7)
^ і
Эта реакция катализируется аспартазой — одним из первых исследованных
бактериальных ферментов.
Синтез аспарагина у микроорганизмов и животных еще не вполне изучен.
Аспарагинсинтетаза микроорганизмов катализирует конденсацию аммиака
и аспартата, сопровождающуюся превращением АТФ в АМФ и ФФН
(напомним, что при реакции, катализируемой глутаминсинтетазой, образуются
АДФ и Фн). У растений аспарагин возникает в результате ферментативного
гидролиза ?-цианаланина.
АМИНОКИСЛОТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ АСПАРТАТА
При биосинтезе треонина, метионина и лизина возникат общий для
всех этих трех процессов промежуточный продукт — ?-семиальдегид
аспарагиновой кислоты. Это соединение образуется из аспартата в
результате двух последовательно протекающих реакций. Сначала аспартилкиназа
катализирует образование ?-аспартилфосфата, а затем, на следующем этапе,
осуществляемом при участии пиридиннуклеотида, ?-аспартилфосфат
восстанавливается до альдегида (фиг. 128).
При синтезе треонина из ?-семиальдегида аспарагиновой кислоты
промежуточным продуктом служит аминокислота гомосерин, как это показано
на фиг. 128. Из гомосерина и АТФ при участии фермента гомосеринкиназы
синтезируется О-фосфогомосерин. Заключительный этап синтеза
треонина — очень интересная реакция, в которой треонин-синтаза, фермент,
28*

436
Глава XVII
нуждающийся в пиридоксальфосфате, превращает О-фосфогомосерин
в треонин.
СОг О '
Н-
сн2
-С—NHJ
со,-
АсБарагиновая
кислота
Аспартил- С—ОРО3Н~ Восст. НАДФ
киназа і или
АТФ Д восст. НАД
і. СІГІ2 =-
Н— С — NH+ "Г~
со
?-Аспартил-
фосфат
АДФ
СНз
НО —С—II
Н—С—NH+
I
Треонин
Треонин-синтаза
Пиридоксальфосфат
сн2оро3н-
сн2
I
И —С—NH+
Гомоссрин-
киназа
АТФ
сно
сы2
II-С—NH+
?-Семиальдегид
аспарагиновой
кислоты
Восст.
НАД
НАД
Гомосеринде-
гидрогеназа
СН2ОН
СН2
I
О-фосфогомосерин Гомосерин
Фиг. 128. Биосинтез гомосерипа п треонина.
Треонин может синтезироваться еще и другим путем — при участии
фермента треонипалъдолазы:
СН3СЫО + H3N+—CH2—CU2
ГЛИЦИ7І
снон
I
H3N+—CH-COS
Треонин
(XVII.8)
Этот фермент, активный при наличии пиридоксальфосфата, встречается
у некоторых микроорганизмов и в некоторых тканях млекопитающих.
У последних, в частности, треонинальдолаза, вероятно, выполняет в первую
очередь не биосинтетическую, а катаболическую функцию.
Метионин синтезируется в клетках микроорганизмов ил цистеина
и гомосерина. Весь процесс, включающий ряд промежуточных стадий,
можно расчленить на три основных этапа: 1) синтез цистатионина из
гомосерина и цистеина, 2) превращение цистатионина в гомоцистеин и 3)
превращение гомоцистеина в метяолип. Схема этого процесса представлена
на фиг. 129.
Включение одноуглеродного фрагмента в гомоцистеин приводит к
образованию метионина. Такое включение может происходить как в результате
синтеза метильных групп de novo, так и в результате переноса предобразован-
ных метильных групп. Первый тип превращений исследован более детально
у микроорганизмов, хотя он существует также я в животных тканях.
У Е. coli выявлены два пути превращения гомоцистеина в метионин. Более
простой путь — это непосредственный перенос на гомоцистеин метилъной
труппы от №-метилтетрагидроптероилтриглутамата
№-метилтетрагидроптероилтриглутамат -\- Гомоцистеин —^
—> Метионин -\- Тетрагидроптероилтриглутамат. (XVII.9)
М5-метилтетрагидрофолат (№-метил-ТГФ) в этой реакции неактивен.

Обмен аминокислот
437
Второй путь довольно сложен; в этом случае для превращения гомоцис-
теина в метионин требуются восстановленный НАД, ФАД, S-аденозилметио-
нин (см. стр. 455), №-метил-ТГФ и В12-фермент:
Восст. НАД, ФАД
М5-метил-ТГФ -j- Гомоцистеня > Метионин + ТГФ.
S Вф
S-адепозилметиояин,
(XVII.10)
Детали этой реакции еще далеко не ясны. Установлено, что метильная
группа S-аденозилметионина на гомоцистеин не переносится и что это
соединение действует каталитически. В недавно проведенных экспериментах
получены указания на возможность участия в биосинтезе метионина новой
ТГФ
нї su форменій*"-
Восст.-H A A
ФАЛ ¦
s
I
сн
I "
сн2
H—С—NH3+
со2-
Метиоиин ,
Ns-jKcmuMtnempaeubpo-
Тетрагидратпераил-
тривяуталіат
Трансмгпшлщюааиае
SH
І
снг
Серия
NH3
H-C-NH3+ H-C-NH,+
і !
co2- co2-
Цистсипионан
Сущинат ¦
Aaiapmam
Гомосєріт О-сущииилгамосерии
Фиг. 129. Взаимопревращение цистепна и метионина.
(Микроорганизмы)
SH
сн2
H._C-NH3+
СО2-
Цистеин
(Со1) формы кобаламинового иофермента. Метилирование этого полностью
восстановленного кобаламипа приводит к метильному аналогу кобаламиновых
коферментов (метильная группа заменяет собою дезоксиаденозильную
в структуре, представленной на стр. 237). Метилкобаламин передает свою
метильпую группу на гомоцистеин как нефермеятативным путем, так и
ферментативным — с большей скоростью в присутствии В12-апофермента.
В системах млекопитающих №5-метил-ТТФ служит донором метильной
группы при биосинтезе метионина в реакции, протекающей с участием
каталитических количеств S-аденозилметионина. Необходимость участия
в этой системе В12-коферментов но установлена.
Метиоиин может образоваться не только в реакциях, протекающих
с участием ТГФ-коферментов, но и в результате непосредственного переноса

co2-
сн2
сн2 ——==-
с=о
со2-
а- Кетощтаровая
кислота
со2-
сн2
> сн2 —
но—с—сн2—со2-
со2-
Гомалимонная
COr
H2O
н,о
сно
I
сн2
!
сн2
I <
сн2
H-C-NH3+
со2-
АТФ
Мдг+
Восст.ШАФ
?2-
сн2
CH2
CH2
Трансаминирование
H—С—NH3+
CO2-
-—> сн2
С=СН—СО2-
со2-
Тамоакоттовая
со2-
сн2
І
сн2
сн2
є-Семаемдегид а-амшоаЬц- а- Амтюадипиповая
пшювой кислоты
Тлцяышл I
й \ ВосапША
кислота
со2-
сС-Кєтоадипиноаая
кислота
со.
со,-
сн2
¦ сн2 он
І /
н-с-сн--со2-
со2-
Томоизолимонная
кислота
2|Н]
о2
сн2
СН2О
і II
н—с-с—со2-
І
со2-
Оксалоглутаровая
кислота
H
СН2—N-CHCOj-
I H '
а- кетоглутаровая
кислота
Сахаропон
CH2-NH}+
СН2
сн2
Н—С—NH3+
СО2-
Лтіт
СО,
со2-
H-C-NH3+
сн,
и
H-C-NH}+
СО2~
ліезо-а,Е-диаминопишпиновая
кислота
Отімераза
со2-
с=о
І
сн2
сн,
Трансаминоза
co2-
Нз+N-C—H
СН,
Сукцинат
Нз+N-C-H
сн2
I
сн2 о
I H II
Н-С—N—С-СН2-СН2-СО2-
I
со2-
И-сцкцииил-е-кето-Ь-а-аминопишлиновая Н-сцщипил-и-а^-Ъиамтюпимелитвая
кислота кислота новая пислота
сн2 о
І H II
И—С—N-C-CH2-CH2-CO2-
co,-
CH2
CHZ
H—C-NHS+
co2-
-№КоА
Сунщтл-SKoA
~- н2о
НААФ Восст.ЯААФ
СНО
2Н2О Пирувот
А''-пиперидин-2,0-дикарбонавая 2,3-дигидроаитікоЛиновая
кислота кислота
Н-С—NH3+
I
Й-СемиалъдвгиЪ
acnapasueoeoii кислоты
Фиг. 130. Два пути биосинтеза лизина.

Обмен аминокислот
439
метальной группы от самых разнообразных донорных молекул. Эти реакции
рассматриваются подробнее на стр. 455.
Поскольку животные ткани лишены способности синтезировать
углеродную цепь гомоцистеина, у млекопитающих синтез метионина de novo не
осуществляется, но, как отмечено выше, в их организме может происходить
превращение гомоцистеина в эту аминокислоту.
Биосинтез лизина особенно интересен тем, что для этой цели
используются две самостоятельные и различные последовательности реакций.
У бактерий, высших животных и у некоторых водорослей и грибов
углеродный скелет лизина возникает из пирувата и аспартата с промежуточным
образованием а,е-диаминопимелиновой кислоты. У других водорослей
и грибов источником для синтеза углеродного скелета лизина служат ацетат
и а-кетоглутарат, а роль промежуточного продукта в реакции играет
а-аминоадипиновая кислота. Общая схема, включающая обе
последовательности реакций, представлена на фиг. 130.
БИОСИНТЕЗСЕРИНА, ГЛИЦИНА И ЦИСТЕИНА
Серии, важное промежуточное звено во взаимопревращениях цистеина
и метионипа (фиг. 129), а также в синтезе цистеина и глицина, возникает
из углеродной цепи D-3-фосфоглицериновой кислоты, как показано
на фиг. 131, или же из глицина в реакции, катализируемой сериноксимети-
лазой (см. гл. VIII). Дегидрогеназа фосфоглицернновой кислоты
катализирует НАД-зависимое окисление 3-фосфоглицериновой кислоты с
образованием 3-фосфооксипировияоградной кислоты. Синтез серина завершается
трансаминированием и гидролизом фосфорного эфира.
В присутствии ТГФ в реакции, катализируемой сериноксиметилазой
(пиридоксальфосфат-зависимым ферментом), сернн легко превращается
в глицин (фиг. 131).
Глюкоза —>
СН2ОРО3Н-
|
|
ОН —С —H
I
СО;-
З-фосфо-D-
глицериновая
кислота
сн2он
H_i_NHJ
I
НАД
Восст. НАД
СН2ОРО3Н-
|
С==О
I
COj
3-фосфоокси-
пировиноград-
ная кислота
Траисащшаза
-фн
сн2оро3н-
H-C-NHJ
I
СО
СН2ОН
|
L-серип
З-фосфо-L-cepnH
|
Н —С —NHJ + ТГФ
І Пиридоксаль-
СО фф
Серипокси- NHJ
метилаза |
—^ CH2 + N5, Nio-метилен-ТГФ
рд
фосфат
L-серин
СО|Г
Глицин
Фиг. 1.31. Биосинтез серина и глицина.
Цистеин может синтезироваться из серина и гомоцистеина, как
показано на фиг. 129. Известен также альтернативный путь синтеза цистеина:

440 Глава XVII
сн2он
HJN —G —COj-l
H
Серии
- h2s ^
GH2-SH
ll+IM с СС\—Л
H
Цистеин
серинсульфгидраза, ниридоксальфосфат-зависимый фермепт, катализирует
синтез цистеина из серина и H2S:
(XVII. 11)
Дисульфидные мостики белков возникают в результате окисления
(которое происходит после включения цистеина в яолипептидные цепи), а не
в результате непосредственного включения цистина в белок.
СИНТЕЗ АЛЛНИІІА
Известно несколько путей биосинтеза аланина. Так, например, в
некоторых организмах обнаружены трансаминазы, превращающие лируват
в алаиин:
Пиридокеалъфосфат
Пируват + Аминокислота > L-алапии + Кетокислота. (XV ! С. 12)
Кроме того, фермент из Bacillus subtilis катализирует прямое
восстановительное аминирование пирувата с образованием аланина. Наконец,
известен фермент (также микробного происхождения), катализирующий ?-докар-
боксилирование аспарагиловой кислоты с образованием аланина:
CH2 СНз
I !
H+N — С — СОі" —> HJN — С — СОг + СО2 (XV 11.13)
I !
H H
L-аопартат L-аланин
БИОСИНТЕЗ ГИСТИДИНА
Ключом к пониманию путей синтеза гистидина послужило открытие,
сделанное благодаря использованию метода меченых атомов: оказалось,
что N-1 и G-2 имидазольного кольца происходят из N-1 и С-2 пуринового
ядра.
N
H
Позднее Мойед и Магазаник показали, что вытяжки из бактерий с
добавлением АТФ и рибозо-5-фосфата способны катализировать синтез
соединения III — важного промежуточного продукта в синтезе имидазольного кольца.
Соединение III было идентифицировано как ЇЧ-E'-фосфо-В-Г-рибулозил-
формимипо)-5-E"-фосфорибозил)-4-имидазолкарбоксамид, продукт копденса-
ции рибозо-5-фосфата и N-1-производного АМФ с раскрытым кольцом
(фиг. 132). Присоединение амидного азота глутамипа к соединению III с
замыканием имидазольного кольца приводит к образованию имидазолгли-
церофосфата и б-аминоимидазол-'і-карбоксамидрибонуклеотида,
используемого для ресинтеза пуринов.

Обмен аминокислот
441
ОРО3Ы-
-НО3РОСН2
ОР2О6Н2-
W
он он
ФРПФ
АТФ
I I
НОРОРОРОСН2^ О
I I I \s^
-о-о о- К А
V-r
он он
Я'-E'-фосфориоозил)-/1ТФ
сн2
|
CONH2
H-С-ОН Ы1-<*
H-С—ОН
I
СН2ОРО3Н-
рибюафаарат
Ы(И'-фосфо-В-1'-ри6уиозилфартимино) -5-амано-Ь(
фосфорц6озш!)-4-имиепзоліЩ}(ктсамиа
Ы1-(У-фосфори6озал)-АМФ
I
СОМН2
t
NH
H—С-ОН НС\
Н-С-ОН I
! Рибаэофосфат
СН,ОРО3Н-
Ы-E'-фи?фо-П-1'-риоумзилф01жимино-5-амш10-1-
E"-фосфорибозил)-4-имидазвлкарбоксакшд
H
,N
О
ur xi Н-С-ОН
+ н—С-ОН --І
І" Рибозофосфат СН2-ОРО3Н-
В-зритро-имидазолглицерофосфпт
Н2О
9
СК2
І
C -О
СН2ОРО3Н-
И/иийазалацешол-
СН2
Н—С—NH?
со2-
L-зисілиді-іи
сн2
=4°H-C_NHj^
І
СН2ОРО3Н-
L- гистігдииолфікфат
СН2
Н_С—NH3+
СНгОН
Ь-гистндикал
Фиг. 132. Биосинтез гистидипа у микроорганизмов.
СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ С РАЗВЕТВЛЕННОЙ ЦЕПЬЮ
Пути синтеза валила, лейцина и изолейцила, как и следовало ожидать,
очень сходны. В ходе биосинтеза валяна и лещина образуется общий для
обоих процессов промежуточный продукт — а-кетоизовалерьяновая
кислота. На фиг. 133 представлена схема этого биосинтеза. Зависимая от тиа-
минпирофосфата конденсация пирувата с двууглеродным фрагментом
приводит к образованию ацетомолочной кислоты (см. гл. XI), которая в резуль-

442
Глава XVII
тате весьма интересной реакции непосредственно превращается в а,Р~ди-
оксиизовалерьяновую кислоту. Это превращение, очень сходное с
классической пинаколиновой перегруппировкой, катализируется изомероредукта-
зой ацетооксикислот, нуждающейся в присутствии Mg2+ и
восстановленного пиридиннуклеотида. Дегидратаза диоксикислот катализирует
дегидратацию а,р-диоксиизовалерьяновой кислоты до а-кетоизовалерьяновой
кислоты, которая после трансаминирования превращается уже непосредственно
в валин.
а-Кетоизовалерьяновая кислота конденсируется с ацетил-SKoA, что
дает Р-окси-р-карбоксиизокапроновую кислоту. Это вещество превра-
О CHj
Д '
0 Ї "Г Миграция те-
1 „- Тиамитирофасфат » І „л тльтй
„—СО2~ ^> *¦ СНз—С—С—LUj,~
Пировиноградная ^в^глврооиьш ОН
кислота фрагмент
кислота
ОН О
CHj-C
-COj-
сн3
ІВассшМАЛФ
ила
wccm.WAA
з V
>-с-со2-
Диоксакаслотл
а-Кетоизовалерьяновая
кислота
Трансаманаза/
+ СНзС-КоЛ
- HSKoA
НО ОН
I I
сн,—с—с—сог-
I I
Н3С H
Л,р-Аи изоаалерьяяо-
вая кислота
СНз Г>*
>тс-сог-
Валин
н
С
Н-С(СН3J
Лейцин
I
но-с-
ni
СН2-СО2-
-со2-
(СН3J
J3- Окси-?- карбоксиизокап-
роновая кислота
о=с-со2-
if_ сн2 7С0;
Н-С(СНЭJ
а-Кстоизокалронооая
кислота
нс-со2-
С
цис-Аиметилцитракоиовая
кислота
\\
НАЛ*
ОН
н-с-со2-
н-с-со2-
Н-С(СН3J
ос-Окси-?карбоксиизокап-
ронооая кислота
Фиг. 133. Биосинтез валила и лейцина у микроорганизмов и растсший.
щается в а-окси-Р-карбоксиизокапроновую кислоту в результате двух
последовательно протекающих реакций — дегидратации и регидратации —
совершенно аналогично тому, как это происходит при превращении цитрата
в изоцитрат под действием аконитазы. Однако, когда шшмераза ?-oncn-?-
карбоксиизокапроата была очищена, оказалось, что она отлична от
аконитазы. Окислительное декарбоксилирование и трансаминирование
завершают процесс синтеза лейцина.
Треонин-дегидратаза катализирует превращение треонина в а-кето-
бутират. Последнее соединение конденсируется с «активным ацетальдеги-
дом», в результате чего образуется а-ацето-а-оксимасляная кислота —
ключевой промежуточный продукт в синтезе изолейцина. Синтез изолей-
цина из этого промежуточного продукта протекает очень сходно с синтезом

CH3
C
н_с-он , T"f™- сн2
H—C-NH^
СОг"
Треонин
Лвууглеродный
і фрагмент
^ c==0
Пиридаксаль- '
фосфат СО;~
Тиаминпирофосфат
Т3
О СН2
II I
CHj-C-C-OH
а-Кетомасляная
кисяата
co2-
ot-Au,emo-(X- оксимосляная
кислата
Восст.НААФ
(миграция
СНз О
СН3-СН2-СН-С-СОГ
oc-Kemo-?-меітілвалерьяновая
кислота
СН3 H
CH3-CH2-C~C-COr
а^-Аиокси-р-метилвалерьяновая
кислота
СН3 NH3+
I I
CH3CH2—CH—С—CO2-
н
Изолейцин
Фиг. 134. Биосинтез изолейцина у микроорганизмов и растений-
сно
I
H-С-ОН
I
Н—С-ОН
I
сн2оро3н~
Эритрозо-4-фосфат
со2-
C-OPOjH"
СН,
Фаароенолпируват
сог-
с=о
сн2
но-с—н
I
H-С—ОН
н-с-он
I
СН2ОРО3Н"
7-фосфо-З-дезокои-В-араоино-
гептумозтювая кислота
Восст.
НАДФ
CO2-
Н.
HO-J
H X H
H ОН
Щикимовая
киаюта
ЛТФ
со2-
5 -аегиЬрошикимоаая
НО СО2-"
H \/ H
5-аегиЪрохшщая
кислота
СОп-
н
5- фосфошикимовая кислота
Фиг. 135. Биосинтез б-Жосфошикимовой кислоты.

444
Глава XVII
валина из ацетолактата; по-видимому, на конечном этапе — в реакции
трансаминирования — в обеих последовательностях реакций участвуют одни
и те же ферменты. Для синтеза валина, однако, используются две транс-
аминазы, а для синтеза изолейцина — только одна. Это объясняет
существование мутантов, нуждающихся в изолейцине и не нуждающихся в вали-
не. Последовательность реакций, приводящих к образованию изолейцина,
показана па фиг. 134.
БИОСИНТЕЗ ФЕНИЛАЛАНИНА, ТИРОЗИНА И ТРИПТОФАНА
Начальные этапы синтеза фенилалатша, тирозина и триптофана
совпадают. Эти реакции приводят к образованию 5-фосфошикимовой кислоты
сог-
OPOjH
н" х н
H ОН
5-фосфошикимовая
кислота
H ОН
5 -фосфо-3-енолпирувилшикимо~
оая кислота
ОН
Хоризмовая
кислота
Глутамин
СО,
-о2с
Лрвфеновая
кислота
п-Оксифеиилпироаиноградная
каслота
hpamamumn
ОН
Тирозин
Фєншіпировииоградная
кислота
Антраниловая
кислота
Фенилаланин
Флг. 136. Превращение 5-фосфопшкимовой кислоты в тирозин, февилалашш^и аптранп-
ловую кислоту.
(фиг. 135). Ключевая роль шикимовой кислоты как промежуточного
продукта при синтезе ароматических аминокислот из D-глюкозы была вскрыта
Дэвисом. Ход синтеза от D-глюкозы до шикимовой кислоты удалось частично

Обмен аминокислот
445
изучить методом меченых атомов с использованием глюкозы, различным
образом меченной С14. Последующими экспериментами было установлено,
что фосфоенолпируват конденсируется с эритрозо-4-фосфатом, образуя семи-
углеродный предшественник пшкимовой кислоты — 7-фосфо-3-дезокси-Б-
арабиногептулозоновую кислоту. Циклизация дает 5-дегидрохинную
кислоту, из которой после дегидратации, окисления и фосфорилирования
образуется 5-фосфошикимовая кислота (фиг. 135). Большинство ферментов,
участвующих в этой последовательности реакций, еще не очищено и не
охарактеризовано.
З-енолпирувилшикимат-5-фосфат-синтетаза катализирует конденсацию
фосфоенолпировиноградной кислоты и 5-фосфошикимовой кислоты, как это
фф„
+ ФРПФ
НО3РОСН
он он
П-E-фосфориаозил)-ащпраніиговая
СН—СН—СН2—О—РО3Н-
он он
Ындол-З-глицерофосфат
- Серии
СНг—ОРО3Н-
p
фосфат
Енол-і-(о-карбоксифвяиаамино)-'
-і-дєзоКСирибулозо-5-фосфат
^* ТлщерадъдегиЪ-З-фосфат
L-їїіриптпофаи
Фпг. 137. Биосинтез триптофана.
показано на фиг. 136. Продукт конденсации, З-енолпирувилшикимат-5-фос-
фат, превращается в хоризмовую кислоту, которая после перестройки дает
антраниловую кислоту (предгаественник триптофана) и ирефеповую кислоту
(предшественник фенилаланина и тирозина). Декарбоксшінрование или
восстановительное декарбоксилИрование префоновой кислоты приводит
к непосредственным предшественникам соответственно тирозина и
фенилаланина. Завершающим этапом синтеза является трансаминированме (фиг. 136).
Превращение антраниловой кислоты в триптофан у дрожжей и у Е. coli
происходит, как показано на фиг. 137. Завершающей этап катализируется
.триптофансингп-етазой (см. гл. XIX) — очень интересным ферментом,
изученным Яновским и Боннером.
ОБЩИЕ АСПЕКТЫ ОБМЕНА АМИНОКИСЛОТ
Общими для аминокислот являются реакции трансамииироваиия, декар-
боксилирования, рацемизации и дезаминирования (окислительного или
неокислительного). Реакции трех первых типов обычно (но ие всегда)
требуют участия пиридоксальфосфата. Их механизм уяш обсуждался в гл. VIII.
поэтому ниже мы рассмотрим эти реакции только в метаболическом аспекте.

446 Глава XVII
ТРАНСАМИНИРОВАНИЕ
Биологическое трансаминирование включает в себя широкий круг
реакций. В ранних работах изучались реакции, протекающие с участием дикар-
боновых кислот, например глутамат-оксалоацетат-трансаминазная реакция.
Затем были обнаружены аналогичные реакции с участием других амино-
и кетокислот. В настоящее время известны трансаминазные реакции с
участием почти всех L-аминокислот. Кроме того, выявлено много таких реакций
с участием D-аминокислот, ш-аминокислот и альдегидов.
В обмене веществ реакция трансаминирования играет важную и
разнообразную роль. От нее зависят такие процессы, как 1) биосинтез
аминокислот (трансаминированием завершается синтез не менее чем одиннадцати
аминокислот); 2) распад аминокислот (см. ниже); 3) объединение путей
углеводного и аминокислотного обмена и 4) синтез некоторых специфических
соединений, в том числе мочевины и у-аминомасляной кислоты.
ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ
Декарбоксилазы аминокислот распространены в природе весьма широко.
По большей части они катализируют а-декарбоксилирование L-аминокислот.
Интересное исключение составляют декарбоксилазы D-лизина и L-?-acnapa-
гиновой кислоты, имеющиеся у некоторых микроорганизмов. Существуют
декарбоксилазы, отличающиеся весьма узкой специфичностью, и другие,
способные атаковать ряд различных субстратов.
РАЦЕМИЗАЦИЯ
У бактерий найдены ферменты, катализирующие рацемизацию ала-
нина, метионина, глутамата, пролина, лизина и серина, а также эпимери-
зацию оксипролина и диаминопимелата. Последний фермент, как точно
известно, участвует в биосинтезе L-лизина. Кроме того, в обмене пролина
и аланина у некоторых организмов участвуют D-формы, а не L-изомеры.
Метаболическая роль других ферментов не столь ясна; можно думать, что
они участвуют в синтезе D-аминокислот, используемых для построения
клеточных оболочек.
ДЕЗАМИНИРОВАИИЕ
Ферменты, катализирующие реакцию (XVII.14), называются оксидазами
аминокислот
[[
R-CH-GO7 |-О2 + Н2О —> R—С—COi- + NHJ + H2O2. (XVII. 14)
Под действием каталазы перекись водорода, образующаяся в этой
реакции, распадается на кислород и воду. В отсутствие каталазы перекись
водорода взаимодействует с образовавшейся кетокислотой неферментативным
путем, вступая в реакцию окислительного декарбоксилирования
О
II
R —G—GOi- + H2O2 —> RGOi- + GO2 + H2O. (XVII.15)
В определенных условиях реакция (XVII.15) протекает намного
медленнее, чем реакция (XVII.14), так что а-кетокислота может накапливаться
даже в отсутствие каталазы.

Обмен аминокислот 447
Оксидазы аминокислот распадаются на две большие группы: 1) оксидазы,
катализирующие окислительное дезаминирование L-аминокислот, и 2)
оксидазы, выполняющие ту же функцию, но использующие в качестве субстрата
D-изомеры. Ферменты обоих классов довольно широко распространены
в живых организмах. Оксидазы L-аминокислот обнаружены в яде почти
всех ядовитых змей, в печени птиц, в плесневых грибах и у бактерий.
Соответствующие оксидазы D-аминокислот имеются в почках и печени
млекопитающих, у птиц, амфибий, насекомых, у бактерий и плесеней. Если не
считать специфичности в отношении конфигурации при сс-углероде субстрата,
то можно сказать, что большинство оксидаз аминокислот проявляет довольно
широкую специфичность. Для типичной оксидазы субстратами могут служить
около десятка различных аминокислот. Разумеется, скорость реакции
с участием разных аминокислот различна.
Глицин окисляется оксидазой D-аминокислот, содержащейся в печени
и почках млекопитающих. Продукты реакции — аммиак и глиоксиловая
кислота:
О
И
H3N+—CH2—CO? + O2 + H2O —> H — С — СОз+ГШ? + Н2О2. (XVII. 16)
У оксидаз L-аминокислот из яда различных змей молекулярный вес
равен приблизительно 150 000. На 1 моль ферментного белка приходится
2 моль ФАД.
Метаболическая роль ферментов, катализирующих дезаминирование
L-аминокислот, в основных чертах ясна. Эти ферменты (независимо от
характера дезаминирования — окислительного или неокислительного)
осуществляют перераспределение аминогрупп между различными углеродными
скелетами. Благодаря этому аминогруппа аминокислоты, поступившей
с пищей, может использоваться для биосинтеза другой аминокислоты
in vivo. В большинстве случаев неспособность организма осуществлять
синтез какой-либо аминокислоты de novo обусловлена тем, что организм
не может построить углеродный скелет этой аминокислоты, а не тем, что он
не способен ввести аминогруппу в готовый углеродный скелет.
СПЕЦИАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ОБМЕНА АМИНОКИСЛОТ
Помимо тех превращений, которые мы рассмотрели выше и которые
свойственны всем или почти всем аминокислотам, имеются еще и
последовательности реакций, характерные для каждой данной аминокислоты.
Важнейшие из таких реакций заслуживают того, чтобы остановиться на них
подробнее. Мы разберем сначала реакции распада некоторых отдельных
аминокислот, а затем обратимся к обсуждению особых аспектов их
метаболических взаимопревращений.
РАСПАД АМИНОКИСЛОТ С РАЗВЕТВЛЕННОЙ ЦЕПЬЮ
На фиг. 138—140 показаны пути окислительного распада валина, лейцина
и изолейцина. Первые три этапа этих путей совпадают. Затем пути
расходятся, но во всех случаях на более поздних этапах наблюдается отчетливое
сходство с реакциями окисления жирных кислот. Отметим образование
р-окси-р-метилглутарил-БКоА при окислении лейцина. Это соединение —
важный промежуточный продукт в синтезе холестерина и других стероидов
из ацетил-SKoA (см. гл. XVI).
Еще в ранних работах было принято делить аминокислоты
млекопитающих на кетогенные и гликогенные. Аминокислоты, поступающие с пищей.

CH3 СН3 Трткамтюрошие
ВосшМАА
ch-nh;
со2-
Bajim
VH'
I
со,-
Ko/ISH
а-Кетоизовалеръятвая
кислота
СО2
c=o
SKoA
Шойитирил-SKoA
HOCH, CHj
СОг Ko/ISI/
?-Оксиизомасляпая
кислота
HOCH;
Н,О
SKoA
р-Оксаизобутирил-ЬКоА
SKo/l
Метакрил-SKoA
С HO
¦CH3
co2-
Н/1Д Boccm.i/ЛД СО,- СО,-
у / В«? - кофермент '
^-^_ н, H-4-CHj -!2—— > СНг
СО—SKo4 СН2
СО—SKo/l
Семиамдегид лгегаил-
малоновой кислоты
KoASU
Метилмалонал-ВКоА
Фпг. 138. Путь распада валина
НАД Вомт.ИАД
Сукцииил-SKoA
сн2
Н-С—N
COj.-
-о2с
ониеСНз СН
сн2
с=о
I
со2-
ос-Кеиюизокапролоаая
кислоти
~о,с
сн, сн,
со2
сн2
JC—SKoA
О
Мзовалерид-$КоА
Аегайрарованае
СН
HON^
сн,
.сн.
COSKoA
?-Oкcu-?-мemuлглцmapuл¦SKaA ?-M?mujizjiymaxOHUJi-SKoA ?-Memujmpomonun-SKoA
О О
о
СН3ССН2С—О- + СН3С—SKoA
чил-SKaA
Фиг. 139. Путь распада лейцина.
Ацетоикщсная Ацетил-БКвА
кислота

Обмен аминокислот
449
относят к тому или иному классу в зависимости от того, образуются ли
из них в организме кетонные тела — ацетоуксусная кислота, ацетон
и т. п.— или глюкоза (соответственно гликоген). (Различие это, между
прочим, часто определяется самими условиями эксперимента.) Согласно такой
классификации, валин — гликогенная аминокислота, лейцин — кетогенная,
а изолейцин — одновременно и кетогенная и гликогенная. Это легко понять,
если учесть химическую природу конечных продуктов распада этих
аминокислот. Валин дает сукцинил-SKoA, который через цикл лимонной кислоты
сн5
снг
Трансашпированає
ch,
сн2
НАЛ Восап.ЯАЛ
сн3
сн3
сн
2 с
H-C-NH3+
СО2-
Изолейцин
СН3
ВасстМАА
c=o /
I KoASH
co2-
X- Kemo-?-мвтилвалеръ-
яновая кислота
СНз
снон сн3
г СН3
?"
с=о
SKoA
COSKoA COQKoA
а-Мєтилацетоацєтал-SKoA a-Memuji-?-oKcuoymupaj-SKoA
co2
a -Memujioymupuji-SKoA
І АггаЬрцроаание
H20 H-C CH3
— 1
c=o
I
SKoA
TaeJlUiH-SKoA
Au,emaJi-SKoA Пропионил-SKoA
Фиг. 140. Путь распада изолейцина.
0 при участии некоторых других ферментов может превратиться в пировино-
градную кислоту и затем в глюкозу (см. гл. XI). В то же время лейцин дает
непосредственно кетопродукт — ацетоуксусную кислоту — и, кроме того,
ацетил-SKoA. Из последнего, естественно, также может образоваться
ацетоуксусная кислота (см. гл. XIII). Изолейцин дает ацетил-SKoA и пропионил-
SKoA. Пропионил-SKoA через метилмалонил-SKoA превращается в сук-
цинил-SKoA (см. гл. XIII), и, следовательно, его надлежит считать глико-
генным, а так как ацетил-SKaA — кетогенное соединение (см. выше),
то изолейцин можно (и должно) отнести одновременно к обеим категориям.
Классификация всех аминокислот по признаку кетогенности или гликоген-
ности приведена в табл. 50.
Таблица 50
Гликогенные и кетогенные аминокислоты
Гликогенные
Алании
Аргинин
Аспарагиновая
кислота
Цистин
Глутамиповая
кислота
Глицин
Гистидин
Оксипролин
Метионин
Пролип
Серии
Треонин
Триптофан
Валин
Кетогенные
Лейцин
Гликогенные
и кетогенные
Иаолейцин
Лизин
Фенилаланин
Тирозин
29-246

н
Триптофан
+Алании
OH
З-пксикинуренин
СО2+
о-Амииофенол З-оюіаитраииловая
кислота
'СО--
Ксаитуреиовая 8 ¦ оксихииальаиновая
кислота кислота
20O Несколько
стадий
со2-
Пикомновая
кислота
Фиг. 141. Некоторые последовательности реакций иа пути окисления триптофана.
СО,-
NH,
?0,-
он
З-Оксиаитранимвая
кислота
OCH/4^
2-Акралеил-5-аліинофумарат Хпналииовая
.со,-
РибодП-5-фосфат
Рибоиуклеотчд хит) -
" кислоты
,СО2-
Рибозо-Ф-Ф-рибозо
Аезамидо-НАД
.С02-
vomo-5-фосфат

Рибониклеотидникотиновой кислоты
Фиг. 142. Синтез некоторых производных никотиновой кислоты пз 3-окслантраядловой
кислоты.

Обмен аминокислот 451
ОБМЕН ТРИПТОФАНА
Метаболические превращения триптофана приводят к образованию
различных интересных и важных соединений, в том числе серотонина —
вещества, присутствующего в нервной, а также в пекоторых других тканях
млекопитающих, обладающего мощным вазопрессорным действием; индо-
лилупсусной кислоты — ростового вещества растений (типа ауксина);
глазного пигмента (у некоторых насекомых) и витамина ниацина (никотиновой
кислоты). Связь между обменом триптофана и образованием никотиновой
кислоты была выявлена много лет назад в результате изучения пищевых
потребностей млекопитающих. Было показано, что потребность в
никотиновой кислоте может быть покрыта введением избытка триптофана. Путь
метаболического превращения триптофана в никотиновую кислоту очень
сложен, и только в самое последнее время его удалось изучить подробно.
Первые этапы этого превращения, включающие образование из триптофана
3-оксиантраииловой кислоты, известны уже в течение нескольких лет; они
схематически представлены на фиг. 141.
Окисление триптофана начинается с реакции, катализируемой ферментом
триптофанпирролазой. Этот фермент, в нростетическуто группу которого
входит железопротопорфирин IX (см. гл. VIII), осуществляет превращение
триптофана в L-N-формилкинуретшн с использованием молекулярного
кислорода в качестве окислителя. Триитофаннирролаза — индуцибельный
фермент, содержание которого в тканях млекопитающих повышается при
скармливании триптофана, а-метилтриптофана или глюкокортикоидов.
Оксидаза 3-оксиантраниловой кислоты — фермент, нуждающийся в ионах
двувалентпого железа,— катализирует окгісление молекулярным
кислородом 3-оксиантраниловой кислоты до 2-акролеил-З-аминофумарата,
претерпевающего спонтанное замыкание кольца с образованием хинолиновой
кислоты (фиг. 142).
Другие важные метаболические превращения триптофана суммированы
на фиг. 143.
РАСПАД ФЕНИЛАЛАИИП А И ТИРОЗИНА
Окислительный обмен фенилаланипа и тирозина особенно интересен
в двух отношениях: во-первых, многие заболевания, возникающие в
результате «врожденных нарушений обмена», связаны именно с этими
превращениями и, во-вторых, ферменты, участвующие в обмепе этих двух
аминокислот, нуждаются иногда в совершенно необычных коферментах. Основные
пути окислительного распада фенилаланипа и тирозина показаны на фиг. 144.
В нормальных физиологических условиях большая часть фенилалашша
превращается в тирозин. Фермент, ответственный за эту реакцию,— фенил-
аланин-гидроксилаза — напоминает другие типичные гидроксилазы
(см. гл. XV) тем, что в реакцию вовлекаются молекулярный кислород и
восстановленный НАДФ. Этот фермент локализуется в микросомной фракции
клетки. Необычная особенность катализируемой им реакции состоит в том,
что для нее в качестве кофермента нужен птеридин, имеющий следующую
структуру:
H
f
H н N N NH Восст. H H N N x
\ \ fX Y am н н f X У
\ fX Y am
CH3-C—C-l^A^N ИА&Ф
OH OH OH
|
OH OH
Биоппшриц
20*

-NHj
м-Пир)Hат
NH3
I
СНг-С-СОг
5- окситриптофая
1
-CH2CH2-NHS+
5-окситриптамин (серотонин)
|
|
CH2 —С—СОг- -СО;
І '
N H
H
Триптофан
I
_со
-CH2CH2-NH3+
H
Триптамин
ШЬолилпаровиноградиая кислота ЩЬолилуксусиая кислота
Фиг. 143. Некоторые метаболические превращения триптофана.
СН2
H_C-NH3+
СО2-
Фенилалаиин
СН2
С = 0
со2-
Фенилпировиноградная
кислота
сн2
со2-
Фенилуксусиая кислота
s L-
її ГН2
СН2
CH2 сн2
H |
) = C-N-CH-CO2-
-О.С
он он
Трансамииирооате і
СН2
H-C-NH3+
со2-
Тирозин
CH2
с=о
.1
со2-
п-иксифенштировиноградная
кислота
СО2-
А.-малеімацетоцквцсиая Гомогентчзиновая
кислота кислота
-О2С
:о2-
со2-
j - Фумаровая
кислота
4-фцтарилацетоуксусиая
кислота
СН3-С-СН2-С
Ацетоуксусная
кислота
Фиг. 144. Основные пути метаболических превращений фенилаланина и тирозина.

Обмен аминокислот 453
Функция восстановленного НАДФ в этой реакции состоит, очевидно,
в том, чтобы поддерживать птеридин в хиноидной дигидроформе.
Распад тирозина точно так же, как и распад некоторых других
аминокислот, начинается с трансаминирования, приводящего в данном случав
к образованию /г-оксифенилпировиноградной кислоты. Этот промежуточный
продукт подвергается дальше очень интересным (и в смысле механизма
загадочным) превращениям. По-видимому, лишь один-единственный
фермент — оксидаза п-оксифенилпировиноградной кислоты (медьсодержащий
белок) — катализирует превращение своего субстрата в гомогентизиновую
кислоту, причем реакция эта включает в себя декарбоксилирование,
окисление, гидроксилирование ароматического ядра и миграцию боковой цепи.
Для реакции необходима аскорбиновая кислота, функция которой остается
невыясненной. Оксидаза гомогентизиновой кислоты — фермент,
нуждающийся в ионах двувалентного железа,— катализирует образование из
гомогентизиновой кислоты малеилацетоуксусной кислоты. Эта последняя
превращается в соответствующее траис-соединение, фумарилацетоуксусную
кислоту, в результате реакции, катализируемойизомеразой малеилацетоуксусяой
кислоты, для которой необходим глутатиои (один из немногих известных
случаев, когда глутатион функционирует как кофермент). Расщепление
фумарилацетоуксусной кислоты приводит к образованию, во-первых, фума-
ровой кислоты, которая подвергается дальнейшим превращениям при
участии ферментов цикла лимонной кислоты, и, во-вторых, ацетоуксусной
кислоты, которая может либо войти в цикл лимонпой кислоты (в форме аце-
тил-SKoA), либо превратиться в жирные кислоты.
В гл. IV было отмечено, что гемоглобин больных серповидно клеточной
анемией отличается по своей структуре от гемоглобипа здоровых людей.
Серповидноклеточная анемия, сопровождающаяся изменением
гемоглобина,— наследственное заболевание; это означает, что генетическая
информация, передаваемая от родителей потомству, не содержит в этом случае
правильных указаний, которые обеспечивали бы синтез нормальных молекул
гемоглобина (см. обсуждение генетических проблем в гл. XIX). Заболевание
это — одно из тех, которые объединяются под общим названием врожденных
нарушений обмена. Эту группу заболеваний выделил много лет назад Гэррод.
Он рассматривал, например, цистинурию, алкаптонурию и альбинизм как
результат неспособности организма осуществлять определенные
метаболические превращения в их нормальной последовательности. Это
представление полностью подтвердилось в результате дальнейших
исследований.
Во многих случаях удалось показать, что врожденные нарушения обмена
связаны с полным или частичным отсутствием определенных
ферментативных активностей. Организм либо вообще не способен синтезировать данный
фермент, либо он синтезирует его недостаточно, либо образуемый им
фермент неактивен вследствие каких-то структурных изменений. Некоторые
такие врожденные нарушения касаются обмена аминокислот. Мы рассмотрим
три вида нарушений, связанных с обменом фенилаланина и тирозина,—
альбинизм, алкаптонурию и фенилкетонурию.
Альбинизм характеризуется отсутствием пигментов в коже, волосах
и сетчатке. Этот синдром наблюдается в различных формах: альбинизм
может быть полным (в таких случаях пигмента нет совсем) или неполным
(пигмент отсутствует только в определенных областях). Меланин — пигмент
волос, кожи и глаз — представляет собой полимер неизвестного строения,
образующийся при окислении тирозина. Единственный фермент,
участвующий в образовании меланина из тирозина,— это тирозиназа,
медьсодержащий белок, катализирующий превращение тирозина в диоксифеннлаланин,

454
Глава XVII
а затем в диоксифенилаланинхиион, как показано ниже (см. также гл. XV):
НО
СН2СНСОО
NH3+
СОО-
Тирозин
3,4- д иоксифенилажтт
(ЛОФА)
СНгСНСОО- °<
NH3+ О"'
Фенилаланин-ЗЛ-хинон
COO
но-
З-караокаи-г^-дигидро^б- 2-кар6окси-2,3-Ьигидроцу<Ъол- 5,6-диоксииндол
аиоксииндол 5?-xuH0H
її i
(XVII. 18)
Иидоп-5,6-хшюн
Мелапин
Превращение последнего субстрата в меланин протекает, по-видимому,
спонтанно. Альбинизм — это результат отсутствия нормальной тирозиназной
активности.
Фенилкетопурия наблюдается при отсутствии нормальной фенилалаиин-
гидроксилазной активности. Б этих условиях фенилаланнн не может
превращаться в тирозин (см. фиг. 144), а потому фенилпировиноградная и фенил-
молочная кислоты образуются из него в избыточных количествах и, как
показывает само название болезни, выделяются с мочой. Это очень серьезное
нарушение обмена; оно приводит к резкому замедлению умственного
развития детей. Заболевание можно предупредить, если с самого рождения
ребенка ограничить поступление фенилаланина с пищей.
Алкаптонурия 'характеризуется выделением гомогентизиновой кислоты
с мочой. Такая моча на воздухе быстро темнеет в результате окисления
гомогентизиновой кислоты, приводящего к образованию темного пигмента
алкаптона. Заболевание вызывается врожденным отсутствием оксидазьт
гомогентизиновой кислоты. В молодом возрасте у больных алкаптонурией
не наблюдается никаких других симптомов, кроме потемнения мочи. Позднее
отмечается пигментация соединительной ткани, часто сопровождающаяся
развитием артрита.|
Щ МЕТИОНИН И БИОЛОГИЧЕСКОЕ^ТРАНСМЕТИЛИРОВАНИЕ
Как отмечепо выше, синтез метильных групп de novo происходит путем
восстановления 1Ч5,1Ч10-метилен-ТГФ до 1Ч5-метил-ТГФ (см. стр. 228 и 437).
М5-метил-ТТФ служит донором метильных групп только в одной известной
реакции: при биосинтезе мотиоиина (см. стр. 437). В других реакциях
трансметилирования в качестве донора метильнои группы обычно
используется метиопин. Для переноса метильных групп от метионина требуются АТФ
и Mg2+. Это легко попять, если учесть, что в качестве промежуточного
соединения при этом образуется S-аденозилметионин — фактический донор

Обмен аминокислот
455
метилышх групп:
NH,
кХУ
сн,
сн2
сн2
+ А1Ф
H_C-NH3+
со2-
I
+ь ~ с н 2
+ сн2
+ I
сн2
H—С—NH3+
I
co2-
S-abeno3UcfMemuotum
Ф„
(XVII.19)
OH OH
Напомним, что это соединение относится к rjjynne макроэргических
метаболитов. Синтез S-аденозилдіетионжиа занимает особое пополнение среди
АТФ-зависимых реакций, поскольку при этом синтезе три фосфатные группы
А.ТФ превращаются в связаинг.тй с ферментом триметафосфат,
расщепляющийся затем на ферменты с образованием фосфата и пирофосфата.
Число известных реакций траисметилирования достаточно велико.
Участие S-аденозилметионина в некоторых из них установлено с несомненностью
или представляется весьма вероятным. Отдельные примеры этих реакций
Таблица 51
Некоторые реакции траисметплиронашш, протекающие с участием
S - адеііозіїлметиоїшпа
Фермент
Реакция
Источник
Норадреналин—метилтранс-
фераза
Катехол — метилтрапсфераза
Ацетилсеротонин — О-метил-
трансфораза
2,6-диаминоыурин —
метилтрапсфераза
Полинуклеотид — метилтранс-
фераза
Гуапидинацетат—метилтраые-
феразв
Никотинамид— метилтранс-
Фосфатндилэтаноламин —
метилтрапсфераза
Норадреналин —> Адреналин
Катохин и его производные —>
—?- З-метоксикатехипы
Ацетилсеротонин —> Мелатонин
2,6-диампнопурин — ^ 2-метилами-
но-6-аминопуриы
Полипуклсотнды —> Мотилиро-
вашсыс полицуклеотиды
Гуанидинацетат —> Креатин
Никотинамид —> N-метилникотин-
амид
Фосфатидил— этаполамин —>
—^ Фосфатидилхолин
Мозговое вещество
надпочечника быка
Печеыь
Нервная ткань и
эпифиз
Е. coli
Е. coli; печень
Печень
Печень
Печень
приведены в табл. 51. В общем виде эти реакции описываются следующим
уравнением:
S-аденозилметионин + Субстрат —> Адснозплгомоцистеип + Метилсубстрат, (XVII.20)
Аденозилгомоцистеип —> Гомоцистеин -)- Аденозин.
Продукт реакции, гомоцистеин, может превратиться обратно в метионин
в результате переноса метильной группы от ]М5-метил-ТГФ или от некоторых
других соединений, служащих донорами метильных групп. Существуют
соединения, способные поставлять метилъные группы только для метили

456
Глава XVII
рования гомоцистеина. К ним относятся диметилтетины, метилметионив
и бетаин. Суммарная реакция метилирования представлена ниже.
СН3
СН3 СН3
S+
I
сн2
Диметил-
тетин
н-
SH
I
сн2
СН2
-C-NHt
СЫ3
S
сн2
I
сн2
сн2
H—С —NH?
I
+ Н+
(XVII. 21)
1 _ Диметилтетин-гомоцистеин — метилтрансфераза — широко
распространенный фермент. Его удалось получить в гомогенном состоянии;
по-видимому, он отличается от фермента, катализирующего синтез метионина
с использованием бетаина в качестве донора метильной группы.
ГЛИЦИН И СИНТЕЗ ТЕТРАПИРРОЛОВ
В гл. VIII мы уже указывали, что структуры, содержащие тетрапирроль-
ное ядро, выполняют в живом организме разнообразные важные функции.
Большинство организмов способны синтезировать эти сложные молекулы
сн=сн2
•сн
I
СН2СООН
Фиг. 145. Метаболические источники отдельных атомов протопорфирина IX, выявленные
в опытах с изотопами.
Все четыре атома азота происходят из глицина; атомы, помеченные звездочками, происходят из
углерода метиленовой группы глипина; атомы, помеченные зачерненными кружками, происходят из
углерода метильной группы ацетата, светлыми кружками — главным образом из того же источника, но
в небольшой части также из углерода карбоксильной группы ацетата; никак не помеченные углеродные
атомы СООН-групп происходят исключительно из СООН-групп ацетата.
de novo. Биохимические реакции, в результате которых простые
предшественники превращаются в тетрапирролы, оставались совершенно
неизвестными до тех пор, пока для их изучения не стали применять изотопные
методы. С помощью изотопных методов Шемин и его сотрудники в серии
изящных экспериментов выявили наиболее существенные особенности этих
реакций. Главными строительными блоками: для синтеза тетрапирролов
оказались глицин (важнейший предшественник пуринов; см. стр. 461)
и серии (см. стр. 439). В опытах с мечеными атомами было показано, что
как in vivo (человек, крыса), так и in vitro (эритроциты утенка) ацетат и
глицин включаются в ядро протопорфирина IX простетической группы гемо-

Обмен аминокислот 457
глобина. Достаточно осторожно разрушить меченый материал, чтобы
установить источник каждого атома в молекуле протопорфирина IX. Результаты
такого рода опытов представлены на фиг. 145. Важнейшие выводы,
сделанные на основании этой работы, сводятся к следующему: 1) глицин служит
донором атомов азота для всех пиррольных колец, а также донором атомов
углерода для метиленовых мостиков; 2) остальные атомы происходят либо из
метильной, либо из карбоксильной группы ацетата; 3) все кольца включают
метку одинаковым образом, что свидетельствует об использовании
одинаковых предшественников для всех колец; 4) характер распределения метки
показывает, что для обеих сторон каждого из пиррольных колец существует
общий предшественник; 5) распределение метки, происходящей из ацетата,
говорит о том, что этот субстрат в ходе превращений вовлекается в цикл
лимонной кислоты. Все эти выводы вполне согласуются с
последовательностью реакций (XVII.22), доказанной совершенно однозначно.
со2- f-
сн2 сн2 ^Нг
I I г=о
О=С—SKaA CO2- |
H-C-NH3+
СО2-
а-Амино-?- кетоадипиновая
пг. кислота (XVII.22}
сн2 co2-ch2-co2-
1
c2c
сн2 сн2
г—
сн2
Амшюлевулинавая Лорфооилияоген
кислота
Первичная реакция — это конденсация глицина с сукцинил-SKoA (воз-
никшим**из ацетата в цикле лимонной кислоты). В результате этой реакции
(для которой требуется пиридоксальфосфат) образуются о-аминолевулино-
вая кислота и двуокись углерода. Затем две молекулы o-амино леву липовой
кислоты конденсируются с отщеплением двух молекул воды, образуя
ключевой промежуточный продукт — порфобилиноген. Эта реакция
катализируется o-аминолевулинат-дегидратазой. Порфобилиноген служит, очевидно,
непосредственным предшественником тетрапирролов.
Общая схема реакций, в результате которых из порфобилиногена синте-
вируются различные тетрагидропирролы, имеющие биохимическое
значение, представлена на фиг. 146.
АРГИНИН И БИОСИНТЕЗ МОЧЕВИНЫ
Конечные продукты азотистого обмена у разных биологических видов
весьма заметно различаются. У человека и других наземных позвоночных
(уротелических организмов) конечным продуктом азотистого обмена является
мочевина. Хотя в моче человека помимо мочевины обнаруживаются и другие
азотсодержащие вещества, в количественном отношении мочевина, несом-

458
Глава XVII
сн.со сосн.сн,
СН,СН2С0
со2-
сн2 со2-
сн2 сн2
СІ
^N CH2—NH,+
H 3 СН3СО
Порфобилиноген
\Урапорфирин0ген-1-сиитетаза+ 3 2 3
Уропорфирин ї
СН3С0 С0СН2СН3
^уропорфарииоет-Ш-косчитетаза УроТюрфиринозен 1
УрапорфирииогеиЪетрбоксалпш
СН3 С0СНаСН3
.со —
СН3
Копропорфириц 1
5сн;со
CHjCHjCO
СН3СН2С0 CHjCO
Уропорфириногеп Ш
Урапорфирин Ш
Копропорфцриноген I
СН3 C0GH2GHj СН3СНгСН
сн3снгсо
Копропорфцрцноген Ш
СН3СНгС0 СН3
Прототрфириноген IX
Копропорфирин Ш Вротапорфирин IX
Фиг. 146. Превращение порфобилипогепа в разные порфириіш.
ненно, главный продукт. Об основных источниках аммиака для биосинтеза
мочевины говорилось выше. Аммиак образуется при окислительном и
неокислительном дезаминировании аминокислот и при гидролизе амидов глута-
ыиновой и аспарагиновой кислот.
Общая схема синтеза мочевины из двуокиси углерода и аммиака
представлена на фиг. 147. Первый этап этой последовательности реакций —
образование карбамоилфосфата — является в то же время и первым этапом
синтеза пиримидинов (см. гл. XVIII). Орнитинтранскарбамилаза (карба-
моилфосфат: L-орнитин — карбамоилтрансфераза) катализирует
конденсацию карбамоилфосфата и орнитина с образованием цитруллина. Этот фермент
обнаруживается в печени млекопитающих, у высших и низших растений
и у некоторых микроорганизмов. У птиц он отсутствует. Превращение
цитруллина в аргинин осуществляется в результате двух последовательно
протекающих реакций, чрезвычайно сходных с реакциями, приводящими
к синтезу адениловой кислоты (см. гл. XVIII). Аргининосущинат-синтетаза

Обмен аминокислот
459
катализирует АТФ-зависимое образование ацилгуанидиниевой связи между
аспарагиновой кислотой и цитруллином. Продукт — аргинипсукцинат —
распадается на фумарат и сукцинат в результате реакции, которая
катализируется аргшшносущиназой (L-аргининосукцинат — аргинин-лиазой)
и которая формально сходна с реакцией, катализируемой аспартазой
(см. стр. 435). Конечная стадия образования мочевины — это гидролиз
СО
Фумарат
Аспартат
А7Ф
Фиг. 147. Цикл мочевины.
аргинина, катализируемый аргиназой и приводящий к отщеплению
мочевины и к регенерации орнитина, способного в дальнейшем повторно
конденсироваться с новой молекулой карбамоилфосфата. Таким образом,
образование мочевины представляет собой циклический процесс. Двуокись углерода
и аммиак вступают в цикл на одном его участке, а мочевина выходит из цикла
на другом.
ЛИТЕРАТУРА
А е Ь і H. Е., Inborn Errors of Metabolism, Ann. Rev. Biochem., 36, 271 A967).
В о g о г a d, L., Enzymatic Mechanisms in Porphyrin Syntheses, Ann. N.Y. Acad Sei.,
104, 67E A963).
f5 о v e y F. A., Y a n а г і S., Pepsin, in P. Boyer, II. Lardy, and K. Myrbaok (eds.),
«The Enzymes», 2nd ed., vol. 4, p. 63, Academic Press, New York, 1960.
Carnahan J. E., Castle J. E., Nitrogen Fixation, Ann. Rev. Plant Physiol., 14,
125 A963).
Davis B. D., Intermediates in Amino Acid Biosynthesis, Advan. Enzymol., 16, 247
A955).

460 Глава XVII
Desnuelle P., Chymotrypsin, in P. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), «The
Enzymes», 2nd ed., vol. 4, p. 93, Academic Press, New York, 1960.
Desnuelle P., Trypsin, in P. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), «The
Enzymes», 2nd ed., vol. 4, p. 119, Academic Press, New York, 1960.
F r u t о n I. S., Cathepsins, in P. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.), «The Enzymes»,
2nd ed., vol. 4, p. 233, Academic Press, New York, 1960.
Greenberg D. M., Biological Methylation, Advan. Enzymol., 25, 395 A963).
G r e e n b e r g D. M., Amino Acid Metabolism, Ann. Rev. Biochem., 33, 633 A964).
L a r n e r J., Inborn Errors of Metabolism, Ann. Rev. Biochem., 31, 569 A962).
Meister A., Amino Group Transfer, in P. D. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback (eds.),
«The Enzymes», 2nd ed., vol. 6, p. 193, Academic Press, New York, 1962.
Meister A., Biochemistry of the Amino Acids, 2nd ed., Academic Press, New York,
1965. (Есть перевод первого издания: Биохимия аминокислот, ИЛ, М., 1961.)
Mortenson L. Е., Inorganic Nitrogen Assimilation and Ammonia Incorporation,
in I. C. Gunsalus and R. Y. Stanier (eds.), «The Bacteria», vol. Ill, p. 119, Academic
Press, New York, 1962.
Mortenson L. E., Nitrogen Fixation, Role of Ferredoxin in Anaerobic Metabolism,
Ann. Rev. Microbiol., 17, 115 A963).
Moyed H. S., Umbarger H. E., Regulation of Biosynthetic Pathways, Physiol.
Rev., 42, 444 A962).
N as on A., Enzymatic Pathways of Nitrate, Nitrite, and Hydroxylamine Metabolism,
Bacteriol. Rev., 26, 16 A962).
N e u r a t h H., Carboxypeptidases A and B, in P. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback
(eds.), «The Enzymes», 2nd od., vol. 4, p. 11, Academic Press, New York, 1960. '
N e u r a t h H., Structure and Function of Proteolytic Enzymes, in M. Sela (ed.), «New
Perspectives in Biology», p. 28, Elsevier, New York, 1964.
S a k a m і W., Harrington 1-І., Amino Acid Metabolism, Ann. Rev. Biochem.,
32, 355 A963).
Smith E. L., Kimm el J. R., Papain, in P. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback
(eds.), «The Enzymes», 2nd ed., vol. 4, p. 133, Academic Press, New York, 1950.'
S p r і n s о n D. В., The Biosynthesis of Aromatic Compounds from D-Glucose, Advan.
Carbohydrate Chem., 15, 235 A960).
Umbarger E., Davis B. D., Pathways of Amino Acid Biosynthesis, in I. C.
Gunsalus and R. Y. Stanier (eds.), «The Bacteria», vol. Ill, p. 167, Academic Press, New
York, 1962.
Wellner D., Flavoproteins, Ann. Rev. Biochem., 36, 669 A967).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
Косовер Э., Молекулярная биохимия, изд-во «Мир», Мм 1964.

Глава XVIII
ОБМЕН НУКЛЕОТИДОВ
Многие аспекты обмена нуклеиновых кислот имеют самое
непосредственное отношение к важнейшим проблемам биологии. В числе этих
проблем — расшифровка молекулярных механизмов, определяющих синтез
различных макромолекуляриых структур, изучение законов передачи
биохимической специфичности от родителей к потомству, проблема клеточной
дифференцировки и, наконец, выявление механизма действия некоторых
соединений, способных избирательно подавлять рост опухолей и бактерий.
В этой главе мы будем говорить о синтезе и распаде нуклеотидов —
предшественников нуклеиновых кислот. В следующих главах будут
рассмотрены: роль нуклеиновых кислот как генетического материала (гл. XIX),
биосинтез нуклеиновых кислот (гл. XX) и участие нуклеиновых кислот
в биосинтезе белка (гл. XXI).
БИОСИНТЕЗ НУКЛЕОЗИДТРИФОСФАТОВ
ПУРИНЫ
Способность синтезировать кольцевую систему пуринов de novo присуща
почти всем живым существам; лишь немногие организмы должны получать
готовые пурины с пищей. ^
Первым значительным успехом в изучении путей биосинтеза пуринов
явилось выяснение происхождения каждого из атомов этой кольцевой
системы. Опыты с применением меченых атомов, проведенные главным образом
Авуокись углерода
Аспартат _/ ,--'Л—
л І2 , У і 98/ ~~~\ .
Формиат- ^^г.-іг.Учч Формант
Амидныи азот гяутамина
Фиг. 148. Основные предшественники пуринового скелета.
в лаборатории Быокенена, показали, что С-2 и С-8 происходят из формиата,
С-6 — из СО2, а С-4 и С-5 — соответственно из карбоксильной и метилено-
вой групп глицина. Глицин поставляет также и N-7. Данные такого рода
для пурина гипоксантина представлены схематически на фиг. 148. Несколько
позже было показано, что N-1 происходит из аспарагиновой кислоты, a N-3
и N-9 — из амидных групп глутамина. Существенное значение для
выяснения путей биосинтеза пурин-нуклеотидов имело установление Гринбергом
того факта, что первым продуктом этого синтеза, содержащим полностью
готовую пуриновую кольцевую систему, является нуклеотид — инозиновая
кислота.

462
Глава XVIII
Биосинтез пурин-нуклеотидов начинается с АТФ-зависимого пирофос-
форилирования рибозо-5-фосфата, приводящего к 5-фосфорибозил-1-пиро-
фосфату (ФРПФ):
оро3н-
сн2
• о-
ОРО3Н-
сн2
-f/ІТФ-Мі:
ОН
он он
-О.
+ ДМФ (XVIII. 1)
OP2O„HMg
он он
ФРПФ
Эта реакция интересна как один из немногих известных случаев переноса
интактпой. пирофосфатной группы от АТФ.
На втором этапе биосинтеза ФРПФ амилируется с образованием кислото-
лабильного аминосахара 5-фосфорибозил-1-амипа. В этой реакции участвует
глутамші:.
Мд-З-фосфорибозил-і-пирафосфат+Глутамин
+ Глутамапи-Мд
(XVIII.
ОН ОН
5-фосфориоозим-1-амин
Таким образом, итогом двух первых этапов является АТФ-зависимое
аминировапие рибозо-5-фосфата. При переносе аминогруппы происходит
инверсия при С-1 рибозы, так что образующийся аминосахар имеет ?-кон-
фигурацин). Это означает, что N-гликозидная связь соответствующей
конфигурации возникает в цепи реакций, приводящих к синтезу пуринов,,
на одной из самых ранних стадий.
Затем 5-фосфорибозил-1-амин конденсируется с глицином путем
образования амидной связи. Для этой реакции необходим АТФ:
ОРО3Н-
СН2
NH2
+Гшщин + Mg-АТФ
ОН ОН
о
HN-C-CH2-NH, (XVIII.3),
ОН ОН
Глициипмид-рибонуклеотиа
Глицинамид-рибопуклеотид, продукт реакции (XVIII.3), форматируется
с образованием N-формилглицинамид-рибопуклеотида. Коферментом в этой

Обмен нуклеотидов 463-
реакции служит ]Ч5,К10-метонилтетрагидрофолат (см. гл. VIII):
f0'»" OHcf
"О (XVIII.4)
+ ТГФ+Н*
OH OH
а-Ы-формилглицинашд-рибануклеатид
Второе А.ТФ-зависммое аминирование с глутамииоы в качестве донора
аминогрупп приводит к превращению ^формилглицинаммд-рибонуклеотида
в N-формилглицинаммдми-рибопуклеотид:
а-Г^-формплглшцшамид-рибоиуклеотид -|- Глуташш -\- 1^2^ + Mg-АТФ —^
H
/—К\
—> С СІЮ + Глутампношш кислота + Mg-АДФ + Ф„ (XVIII.5)
У\
HN N11
Рпбозофосфат
N-формилглицинамидни-
рибопуклсотнд
N-формилглицмнамидин-рибонуклеотид содержит все структурные
компоненты имидазольного кольца пуринов. Это кольцо замыкается в
результате АТФ-зависимой дегидратации, приводящей к образованию 5-амино
имидазол-рибонуклеотида:
H
С СНО + [Mg-АТФ —> || 7 +Мй-АДФ + Фн (XVIII.ti)
\
/\ /
HN NHJ H2N
І
Рибозофосфат Рлбозофосфат
5-аминоимидаоол-
рибонуклеотид
Амлноимидазол-рнбонуклеотид — карбоксилаза катализирует карбоксн-
лированио непосредственного продукта реакции замыкания кольца с
образованием рибонуклсотида 5-амипоимидазол-4-карбоновой кислоты:
5-амішоішпдазол-ріібопуклеотид + СО2 ^J^ , (XVIII.7)
Рибозофосфат
Рибопуклеотид
5-аминоиммл,нзол-4-Ксірбоновой
кислоты
Бикарбонат в равновесии со свободной двуокисью углерода служит
источником карбоксильной группы.
Превращение рибонуклеотида 5-амииоиммдазол-4-карбоноіюй кислоты
в соответствующий амид, Г)-аминоимидазол-4-карбоксамид-рибонуклсотид,
осуществляется в два этапа. Сначала в результате АТФ-зависимой реакции
образуется амидная связь между субстратом и аспарагиновой кислотой;
продуктом этой реакции является о-аминоимидазол^-ІМ-сукцинокарбокс-

464 Глава XVIII
амид-рибонуклеотид:
Рибонуклеотид 5-аминоимидазол-4-карбоповой кислоты -\-
4- Аспарагиновая кислота + Mg-АТФ "^
СО2Н
сн2
1 H
H-C-N
1
CO2H
:
0
— С N
Y X
/\ /
H2N N
1
Рибозофосфат
5-аминоимидазол-4-К-сукцинокарбоксамид-
рибопуклеотид
Этот продукт вступает затем в реакцию элиминации, при которой
происходит отщепление фумаровой кислоты:
5-амшюимпдазол-4-^сукцинокарбоксамид-рибонуклеотид "^
О
I!
С N
H2N |j ^7 + фУмаРат (XVIII 9)
H2N/XN
I
Рибозофосфат
5-аминоимидазол- 4-карбокс-
амид-рибонуклеотид
Наконец, в виде формильной группы, связывающейся с 5-аминогруппой
имидазолкарбоксамид-рибонуклеотида, вводится еще один атом углерода —
последний необходимый элемент кольцевой системы пуринов:
к+
5-аминоимидазол-4-карбоксамид-рибонуклеотид -\- №°-формпл ТГФ >
О
II
С N
-> ^„р II / + ТГФ (XVII 1.10)
N N
н і
Рибозофосфат
5-формамидоимидазол-4-карбоксамид-
рибонуклеотид
В этой реакции, как и в первой реакции формилирования на пути
биосинтеза пуринов, участвует ТГФ-кофермент, но не ]Чб,]Ч10-метенил-ТГФ,
а 1Ч10-формил-ТГФ.
Замыкание кольца с одновременной дегидратацией приводит к
образованию инозиновой кислоты, чем и завершается синтез кольцевой системы
пуринов:
5-формамидоимидазол-4-карбоксамид -рибонуклеотігд ^
О
HN її X _(_ н2О (XVIII. 11)
Рибозофосфат
Инозиновая кислота

Обмен нуклеотидов
465
Инозиновая кислота может превратиться затем в адениловую и гуанило-
вую кислоты. Вся последовательность реакций, приводящих от рибозо-5-фос-
фата к инозиновой кислоте, изображена на фиг. 149. Источники различных
атомов кольцевой системы пуринов, указанные на фиг. 148, находят себе
в этой общей схеме соответствующее место.
На фиг. 150 показаны биохимические превращения, в результате
которых из инозиновой кислоты возникают адениловая и гуаниловая кислоты.
АТФ АМФ
Mg2*
ор2о„нг-
ОН ОН \T~JiyWQMUH9 HjO
H
сн2 сно
с
0
О" ^NH /^
і тгф
Рибозофосфат ТГФг Н2О
. Глутаіиан,АТФ, і
MB*
H2-NH2
Глицин
J -HOjPOCHj^-0
,NH2
Рибозофосфат
^ф,ф„ лтф он он
Фн
H
"НО
/ТФ
А
HN*
N
б
H2N
НО.С
х>
Рибозофосфат
Рибозофосфат
Аспартат
H2N | ч /
\
со2н
сн2
I Н^
о
.N
/^
№
H2N
CO2H
„7
Рибозофосфат
$
Рибозофосфат
Фумарат
Рибозофосфат
Рибозофосфат
Инозиновая кислота
Фиг. 149. Метаболический путь, приводящий к синтезу инозиновой кислоты.
Аминирование инозиновой кислоты с образованием адениловой протекает
в два этапа, очень сходно с синтезом Б-аминоимидазол^-карбоксамид-рибо-
нуклеотида (уравнения XVIII.8 и XVIII.9). Весьма вероятно, что фермент,
катализирующий отщепление фумаровой кислоты от аденилосукцината,—
аденилосукциназа — катализирует также и аналогичную реакцию,
описываемую уравнением (XVIII.9). Существенно, что для реакции образования
аденилоянтарной кислоты (на пути синтеза аденин-нуклеотидов) в качестве
кофермента требуется ГТФ. В то же время при синтезе гуанин-нуклеотидов,
как мы увидим ниже, роль кофермента играет АТФ. Отсюда естественно
следует вывод о регуляторной функции этих соединений: ясно, что избыток
ГТФ должен сдвигать синтез в сторону образования АТФ и, наоборот,
при избытке АТФ должно синтезироваться больше ГТФ.
30 —246

466
Глава XVIII
Превращение инозиновой кислоты в гуаниловую также протекает в два
этапа. Сначала в результате окислительной реакции, в которой коферментом
служит НАД+, образуется ксантиловая кислота, а затем ксантиловая
кислота превращается в гуаниловую в результате АТФ-зависимой реакции ами-
со2н
снг
HN
^+ Дспяртягп
ГТФ ТАФ.Фи
СО2Н
ч
VN
Рибозофосфат
Шозиновая кислота
НАД
Ваост.
НАД
0A.n>-n
H I
Рибозофосфат Глутамин
Ксонтиловая ^^ | АТФ, Н20
кислота
Рибозофосфйт
АаенилоянторнпЯ
кислота
¦-к
.N
Ч
Рибозофосфат
Адвниловая
кислота
Гщтамат,
' АМФ,ФФ„
Рибозофосфат
Гуаниловая
кислота
Фиг. 150. Превращение инозиновой кислоты в адениловую и гуашглосую кислоты.
нирования. Донорами аминогруппы служат либо глуталган, либо аммиак,
в зависимости от того, в каком организме протекает данная реакция.
Фактические пуриновые предшественники РНК, нуклеозидтрифосфаты,
образуются из монофосфатов в результате двух последовательно
протекающих киназных реакций:
НМФ
ААФ
АТФ
-НАФ
ААФ
НТФ
(XVIII.12)
Киназы, катализирующие эти реакции, не проявляют специфичности
в отношении оснований и фосфорилируют аденин-, гуанин-, урацил- и цито-
зин-нуклеотиды. При таких реакциях общее содержание АТФ, естественно,
не увеличивается. Этот трифосфат образуется, как известно, в результате
экзергонических окислительных реакций, как конечный их продукт.
ПИРИМИДИНЫ
Метаболические пути, ведущие к образованию пуринових и
соответственно пиримидиновых нуклеотидов, различаются в основном тем, на каком
этапе синтеза возникает N-гликозидная связь. При синтезе пуринов эта

Обмен нуклеотидов 467
связь возникает на очень раннем этапе и кольцевая система строится уже
после того, как связь образовалась. В отличие от этого синтез пиримидино-
вого ядра завершается еще до образования связи между этим ядром
и рибозо-5-фосфатом. В качестве ключевого промежуточного продукта,
участвующего в образовании N-гликозидной связи, выступает здесь орото-
вая кислота, уже содержащая пиримидиновое ядро:
О
HN
H
Оротовая кислота
Биосинтез пиримидинов начинается с синтеза карбамоилфосфата,
промежуточного продукта, важного и в других отношениях. Из всех известных
путей образования карбамоилфосфата наибольшее значение имеет,
безусловно, синтез его из аммиака, двуокиси углерода и АТФ. Известны два типа
таких реакций. У микроорганизмов карбаматкиназа катализирует
следующую реакцию:
О
NH2COa+ATO ^ H2N —С-ОРО3Н2 +АДФ ' (XVIII. 13)
Карбамоилфосфат
Положение равновесия в этой реакции сильно сдвинуто влево в
соответствии с макроэргической природой ангидрида фосфорной и карбоновой
кислот. Присутствие ацилглутамата не влияет на скорость реакции.
В отличие от этого синтез карбамоилфосфата, катализируемый карбамо-
илфосфагпсинтазой (единственный путь синтеза у млекопитающих),
протекает согласно следующему уравнению:
О
Ацетилглутамат ||
СО2-|-Шз4-2АТФ > H2N —С —ОРО3Н2Ч-2АДФ + ФН. (XVIII.14)
Эта реакция практически необратима; для нее необходим в качестве
кофермента N-ацетилглутамат или родственное ему соединение.
Аналогичная реакция встречается и у микроорганизмов, но в этом случае активатором
служит глутамин, превращающийся в ходе реакции в глутамат.
На втором этапе биосинтеза пиримидинов карбамоильная группа
переносится от карбамоилфосфата на а-аминогруппу аспартата; эта реакция
катализируется аспартат — карбамоилтрансферазой:
СН2 H2N
¦H ^ С С —COj-f<DH (XVIII.15)
И
Карбамоиласпартат
30*

468
Глава XVIII
Карбамоиласпартат превращается в дигидрооротовую кислоту в
результате обратимой циклодегидратации, катализируемой дигидрооротазой:
со2н
H2N \
1
С
^ \ /\
Э N СО2Н
H
/ч
—-=- HN
^~ 1
H а
Дигидрооротовая
кислота
+ н2о
(XVIII.16)
Затем этот субстрат окисляется в оротовую кислоту дигидрооротатдееидро-
геназой (флавопротеидный фермент; см. гл. XV). Реакция протекает с
участием пиридинового кофермента:
' О О
(XVIII.17)
Синтез пиримидинового кольца завершается на этом этапе. Следующий
шаг — присоединение рибозо-5-фосфата. Оно осуществляется при
взаимодействии оротовой кислоты с ФРПФ в реакции, катализируемой оротидин-
5'-фосфат — пирофосфорилазой:
HN
|
О
> /
N
H
+НАД+ ;
Ч
-^ HN
— |
У'\ /Ч
О N СС
H
Оротовая
+ НАД
)-
кислота
•Н + Н+
Оратат+ФРПФ ¦ Mg
(XVIII. 18)
он он
Оротиаии-5'-фосфат .
Фермент специфичен в отношении оротовой кислоты; ни ее
предшественники, ни родственные пиримидииы не могут служить для него субстратом.
Синтез уридиловой кислоты (УМФ) завершается путем необратимого
дскарбоксилирования оротидин-5'-фосфата соответствующей декарбокси-
лазой:
О N
0ротидин-5'-фосфат-
+ coz
ОН ОН
Уридиловая кислота
(XVIII.19)

Обмен нуклеотидов 469
Изотопная метка оротовой кислоты включается in vivo в урацил РНК
значительно быстрее, чем в цитозин РНК. Из этого следует, что уридиновые
нуклеотиды служат промежуточными продуктами при превращении оротовой
?\ со2н ср2н
.С. I -Ф„ H2N > -нго
H2N ^ОРО3Н2 + СН2 ^=± Y I =5=
H_c|-NH2 O^CO2H
со2н нлл
Васст.ВАД
ФФН ФРПФ
. --.- ° N СО2Н
. І І н
Риоозофосфат Рибозафосфат
° АТФ АЛФ 9 AT* АЛФ,Ф„ ^Н
¦j п і п +NHj
O^-N^ O^^N^ (ГТФ)
Рибозодифосфат Рибозотрифосфат Рибазотрифосфат
Фиг. 151. Метаболические пути, приводящие к сиптезу уридин- и цитидин-нуклоотидов.
кислоты в цитидиновые нуклеотиды. Действительно, известен только один
путь образования цитидиновых нуклеотидов, а именно аминирование УТФ:
УМФ
1 О О
ГТФ " " "' +Мс-4ЛФ + Фи
+ S HAV " (XVIII.20)
ОН ОН
11 итидинтрифосфат
УТФ образуется из УМФ в результато последовательных киназных реакций
(см. уравнения XVIII. 12). Реакции, приводящие к образованию уридиновых
и цитидиновых нуклеотидов, суммированы на фиг. 151.
БИОСИНТЕЗ ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИДТРИФОСФАТОВ
Естественно было предположить, что дезоксинуклеозидтрифосфаты
возникают либо путем непосредственного восстановления соответствующих
рибонуклеозидполифосфатов, либо в результате метаболических
превращений, параллельных описанным выше, но при этом протекающих с участием
восстановленного сахарного компонента. Доказательство правильности пер-

470 Глава XVIII
вого предположения (отнюдь не исключавшее некоторого значения и
второго пути) было впервые получено в следующем эксперименте. Крысам
инъецировали цитидин, равномерно меченный С14 по всем атомам углерода,
и через определенное время выделяли и исследовали цитидин ДНК.
Оказалось, что соотношение радиоактивности основания и сахара @,80) в
выделенном дезоксицитидине было таким же, как и во введенном цитидине.
Из этого следовало, что цитидин включается в ДНК без расщепления гли-
козидной связи и, значит, восстановление цитидина в дезоксицитидин
должно происходить на нуклеозидном или нуклеотидном уровне, а не на
уровне сахара.
Рейхард и его сотрудники детально изучили процесс ферментативного
восстановления рибонуклеотидов экстрактами из Е. coli. Основные выводы
из этой работы сводятся к следующему.
1. Субстратами для восстановления служат дифосфаты.
2. Для реакции требуются АТФ, Mg2+, восстановленный НАДФ, два
фермента и сульфгидрильный белковый кофактор.
3. Непосредственным донором водорода служит в реакции
восстановленная (сульфгидрильная) форма белкового кофактора, так называемого
тиоредоксина. В ходе восстановления тиоредоксин переходит в дисульфид-
ную форму.
4. Восстановленная форма тиоредоксина регенерируется из дисульфид-
ной формы в результате НАДФ-Н-зависимой реакции, катализируемой
тиоредоксинредуктазой.
Эти взаимопревращения могут быть представлены в следующем виде:
.... АТФ,Щ*\ два фермента
ЦДФ 'J>i «ZL >¦ деэокси-ПАФ
ff l
Тиоредоксин(SHJ TuopeooKcmC-S-S— ) (XVIII 2
НАДФ+-* ^-~ «-""^ НДДФН+НҐ
Тиоредоксинредушат
БИОСИНТЕЗ ТИМИДИЛАТА
Мы'>:уже говорили о метаболических путях образования нуклеогидов
и дезоксинуклеотидов аденива, гуанина, урацила и цитозина. В дополнение
нужно рассмотреть вопрос о биосинтезе тимидиловой кислоты — основного
компонента почти всех ДНК — и 5-оксиметилцитидиловои кислоты,
заменяющей цитидиловую в ДНК всех Т-четных бактериофагов.
A priori можно допустить, что тиыидиловая кислота образуется из
уридиловой кислоты либо в результате восстановления с последующим
метилированием, либо в результате метилирования с последующим восставовле-
нием. Тот факт, что дезоксиуридин значительно легче превращается в гими-
диловую кислоту в составе ДНК, чем уридин, свидетельствует о
правильности первого предположения. Весь путь синтеза тимидиловой кислоты
de novo можно представить следующим образом: ЦМФ —*¦ ЦДФ —>- дЦДФ ->-
¦-* дЦМФ -> дУМФ -^ дТМФ.

Обмен нуклеотидов
All
Тимидилатсинтаза из Е. coli катализирует синтез тимидиловой кислоты
при участии различных кофакторов, как это показано в уравнении (XVIII.22)
'-метилен-ТГФ
О
(XVIII.22)
-НОзРОСН
W
он н
+АигиЬрофолат
В этой реакции ТГФ выполняет двойную функцию, служа одновременно
переносчиком одноуглеродного фрагмента и редуцирующим агентом.
Перенос водорода от птеридинового кольца ТГФ на метильную группу тимиди-
лата осуществляется непосредственно; об этом говорит включение в
метильную группу одного атома трития при использовании в качестве кофермента
тритиированного ТГФ
он
СН2
+Аигидпофолат
(XVIII.23
Дезоксирибозо- Дезопсирибозо-
фосфат фосфат
Оксиметилдезоксицитидиловая кислота образуется из своего
предшественника]^ результате реакции, в которой донором одноуглеродного
фрагмента также служит N5, №°-метилен-ТГФ:
NH2
NH2
N
+ N5 Л10-метилен-ТГФ
+ ТГФ (XVIII.24)
О
N
I
О
Дезоксирибозофоофат
N
Дезокоирибозофосфат
В этом случае перенос углерода не сопровождается восстановлением.
Риботимидиловая кислота встречается в качестве «минорного»
компонента в s-PHK. Ее синтез осуществляется на уровне целой молекулы
s-PHK. S-аденозилметионин (см. гл. XVII) служит донором метальных
групп для содержащихся в s-PHK остатков урацила, которые в результате
метилирования превращаются в остатки тимина. Аналогичные реакции
протекают в большинстве случаев и приметилировании других оснований как
в РНК, так и в ДНК.

472 Глава XVIII
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПУТИ БИОСИНТЕЗА НУКЛЕОТИДОВ
Можно почти с уверенностью сказать, что описанные выше реакции
представляют собой основные пути синтеза пуриновых и пиримидиновых
нуклеотидов. Известны, однако, и другие реакции, приводящие к
образованию этих структур. Их, по-видимому, следует рассматривать как реакции
«сбережения», с помощью которых для синтеза нуклеотидов могут быть
использованы предобразованные основания из экзогенных, а также
эндогенных источников.
В печени специфическая пирофосфорилаза катализирует образование
пуриновых нуклеотидов из свободного основания и ФРПФ:
Пурин + ФРПФ i~*¦ Пурин-рибонуклеотид + ФФв. (XVIII.25)
Соответствующая реакция, в которой субстратом служит урацил, обнаружена
у микроорганизмов:
Урацил + ФРПФ ^ Уридиловая кислота-(-ФФ,,. (XVIII.26)
Кроме того, нуклеозидфосфорилазы катализируют образование
нуклеотидов из оснований и рибозо-1-фосфата:
СНгОН СН2ОН Основание
Основание+\z ^Й '^ IX yl +Ф" (XVIII.27)
Nj/OPOjH- N Y
он он он он
Нуклеозиды превращаются в нуклеотиды при действии соответствующей
киназы:
Рибонуклеозид + АТФ —> Рибонуклеотид + АДФ. (XVIII.28)
РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ПИРИМИДИНОВ И ПУРИНОВ
Как синтез" пиримидинов, так и синтез пуринов находятся под
метаболическим контролем, основанным на ингибирующем действии конечных
продуктов или на репрессии, вызываемой конечными продуктами (механизм
обратной связи).
Первым контролируемым пунктом при биосинтезе пиримидинов служит
тот начальный этап процесса, который катализируется ферментом аспар-
тат — карбамоилтрансферазой. Тип и специфичность контроля
обнаруживают интересные вариации в зависимости от вида: аспартат — карбамоил-
трансферазы из Escherichia coli, Aerobacter aerogenes и Serratia marcescens
ингибируются по принципу обратной связи в присутствии ЦТФ, тогда как
фермент из Pseudomonas fluorescens сильнее всего реагирует на УТФ, а
фермент из проростков латука наиболее чувствителен к УМФ. Далее,
аспартат — карбамоилтрансфераза из Bacillus subtilis, по-видимому, не инги-
бируется, а репрессируется по принципу обратной связи. Эти данные,
безусловно, свидетельствуют о многообразии и о видовой специфичности
регуляторных механизмов клетки.
Регуляция синтеза пуринов одновременно сложна и изящна.
Установлены следующие интересные факты. Во-первых, ИМФ-дегидрогенеза,
участвующая в превращении ИМФ в ГМФ (фиг. 150), ингибируется ГМФ и
репрессируется гуанином. Таким образом, превращение ИМФ в ГМФ
задерживается или совсем прекращается в условиях, когда г анин-нуклеотиды

Обмен нуклеотидов 473
поступают в достаточных количествах. Во-вторых, система ГМФ-редуктазы,
катализирующая восстановление ГМФ до ИМФ и обеспечивающая
использование ГМФ для синтеза АМФ, ингибируется АТФ. Следовательно, при
достаточном поступлении аденин-нуклеотидов синтез этих соединений
подавляется за счет гуанин-нуклеотидов. В-третьих, как отмечалось выше,
образование АМФ и ГМФ находится под контролем еще и потому, что для
синтеза ГМФ требуется АТФ, а для синтеза АМФ требуется ГТФ. Благодаря
/ АМФ —* —»- А7Ф
ФРПФ -/+-»• - —> —> —¦* ИМФ С
ГМФ —V —-* ГТФ
Фиг. 152. Схема регулирования биосинтеза пуринов.
Прерывистыми линиями показано место приложения дейстпия регуляторних факторов. 1 — глутамин-
фосфорибозилпирофосфат — амидотрансфераза; г — ИМФ-дсгидрогеназа; 3 — ГМФ-редуктазная
система.
наличию всех этих регуляторных механизмов превращение ИМФ в аденин-
или гуанин-нуклеотиды осуществляется в точном соответствии с
потребностями клетки. Если в клетке содержится в избытке какое-либо из этих
соединений, то необходимость в синтезе пуринов de novo вообще полностью
отпадает, поскольку аденин- и гуанин-нуклеотиды способны к
взаимопревращениям. В этой ситуации действует другой регуляторныи механизм,
основанный на том, что аденин- и гуанин-нуклеотиды служат ингибиторами
глутамин-фосфорибозилпирофосфат — амидотрансферазы, катализирующей
начальный этап синтеза пуринов. Схема действия этих регуляторных
механизмов представлена на фиг. 152.
КАТАБОЛИЗМ ПУРИНОВ
Глубина деградации кольцевой системы пуринов сильно варьирует
от вида к виду. У человека и других приматов главным выводимым с мочой
продуктом катаболизма пуринов является мочевая кислота, в которой
кольцевая система пуринов остается интактной; в то же время у некоторых
морских беспозвоночных роль соответствующих конечных продуктов играют
аммиак и двуокись углерода.
Важным промежуточным продуктом катаболизма пуринов служит ксан-
тин. После расщепления N-гликозидной связи гуанин превращается в ксан-
тин в результате одностадийной реакции, катализируемой
гидролитическим ферментом гуаназой:
HN
H2/N
о о
" II
.N Jl .N
_^ HN
/ +NH3 (XVIII.29)
0g
Ксантин
Распад производных аденина протекает у млекопитающих и птиц через
дезаминирование аденозина и адениловой кислоты с последующим превра-

474
Глава XVIII
щением в гипоксантин:
NH2
N
Рибоза
Рибоза
о
II
NH3
N
" H
Гипоксантин
(XVIII.ЗО)
Гипоксантин превращается в ксантин, а затем — в мочевую кислоту
при действии фермента ксантиноксидазы
Гипоксантин
Ксантин
Ксантин +Н2О2,
HN
+ Н2О
2О2
(XVIII.31)
(XVIII.32)
Мочевая кислота
Подагра — болезнь, которой страдают преимущественно мужчины,—
развивается, по-видимому, в результате избыточного образования мочевой
кислоты. Это приводит к отложению в хрящах кристаллов
труднорастворимой соли — мочекислого натрия, что сопровождается резкими болями
в суставах.
У большинства видов, у которых мочевая кислота не является конечным
продуктом пуринового обмена, это соединение окисляется до аллантоина
с отщеплением двуокиси углерода:
О
HN
н
H
°V/N
NH2
«Va
Аллантоин
= O + CO2
(XVIII.33)
Уриказа — фермент, ответственный за это каталитическое
превращение, — представляет собой медьсодержащий белок (см. гл. XV). Аллантоин,
выводимый с мочой продукт катаболизма пуринов у всех млекопитающих,
за исключением человека, и у некоторых пресмыкающихся, дает при
гидролизе, катализируемом аллантоиназой, аллантоиновую кислоту:
H2N
H
N N
H H
¦ о+нго
H2N
a NH2
О N N Xo
H H
Аллантоиновая кислота
(XVIII.34)
Этот продукт экскретируется некоторыми видами костистых рыб (Teleostei),
но у большинства видов он гидролизуется дальше до мочевины и глиоксило-

Обмен нуклеотидов
475
вой кислоты под действием фермента аллантоиказы:
NH2 CO2H NH2 О
/\
о
>= О + Н20 —> 2 С +
H2N NH2 H CO2H
(XVIII.35)
N
H H
У большинства рыб и амфибий распад пуринов останавливается на этой
стадии. В некоторых случаях, как отмечено выше, мочевина распадается
о
NH,
Ал
Т
-N
Рибозофосфат
Аденозин или AMФ
н2о
¦NH3
ГУ>
анин
Рибозо-
кмлу * Чг-V
O2,H2O H2O2 О
\ +
HN
Рпбазофасфат
H
Гипоксонтин
h2n Yv
H H
Аллантоїт
-Н20
С02 о2
-Т JO
H H
Ксанішн
Ь-О2,Н2О
9 H
HN
H H
Мочевая кислота
H2N CO2HNH2
H H
Алантоиновая
кислота
2HuN-C-NH2 + H-C-CO2H
Гидролиз
окисление
4NH3 + 2CO2 CO2 + HCO2H
Фиг. 153. Метаболический путь распада пуринов.
дальше с образованием двуокиси углерода и аммиака. Метаболический
путь, приводящий к полному распаду пуринов, показан на фиг. 153.
ЛИТЕРАТУРА
Brachet J., The Biological Role oi' Riboimcleic Acids, Elsovior, New York, 1960.
Buchanan J. M., Hartman S. С, Enzymatic Reactions in the Synthesis of the
Purines, Advan. Enzymol., 21, 199 A959).
Davidson J. N., The Biochemistry of the Nucleic Acid, Methuen, London, 1960.
Progress in Nucleic Acid Research, Academic Press, New York. A continued series of volumes
containing review articles pertinent to the nucloic acids.
Reichard P., Advan/ Enzymol., 21, 263 A959).
Schmidt G., Metabolism of Nucleic Acids, Ann. Rev. Biochem., 33, 667 A964).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
К о с о в е р Э., Молекулярная биохимия, и;ід-во «Мир», М., 1964.

Глава XIX
СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ ГЕНА
Что представляет собой вещество (или вещества?), ответственное за
передачу генетической информации от родителей потомкам, и как оно
организовано в клетках? Каков механизм самоудвоения генетического материала?
Как возникают мутации? Каким образом генетические детерминанты
определяют все химические, метаболические и морфологические особенности
любой клетки, любого организма? Вот те вопросы, которые издавна
интересовали генетиков.
В этой главе мы кратко рассмотрим экспериментальные факты, из
совокупности которых следует, что генетическим материалом всех живых
организмов служит ДНК, содержащая информацию о структуре белков
организма, а передача информации от ДНК к белоксинтезирующим структурам
клетки осуществляется с помощью молекул РНК трех различных типов.
Таким образом, для удвоения гена необходим синтез ДНК, а для действия
гена — синтез РНК и белка. Биосинтез нуклеиновых кислот обсуждается
в гл. XX; в гл. XXI рассматривается биосинтез белков.
Прежде чем перейти к краткому изложению основных идей
молекулярной (биохимической) генетики, рассмотрим некоторые аспекты классической
генетики. Нашей целью при этом будет лишь объяснение смысла
генетических терминов, используемых в дальнейшем обсуждении.
КЛАССИЧЕСКАЯ ГЕНЕТИКА
Менделизм. Основоположник генетики Грегор Мендель в своих
классических экспериментах по скрещиванию использовал чистые сорта гороха
(Pisum sativum). Если скрещивать растения одного и того же сорта, то
потомки от такого скрещивания не будут отличаться от родительских форм
по своим внешним признакам (т. е. по фенотипу). Рассмотрим теперь, что
получится, если, как это делал Мендель, скрещивать два сорта с различной
генетической конституцией (т. е. с различным генотипом). Допустим,
скрещивают растение, образующее пурпурные цветки, с растением, образующим
белые цветки. Оказывается, все потомки от этого скрещивания (первое
поколение, или Ft) образуют только пурпурные цветки (а вовсе не розовые
или пестрые). В таких случаях говорят, что пурпурная окраска цветков
является доминантным признаком, а белая окраска, наоборот, рецессивным
признаком. Именно такой тип наследования наблюдал Мендель для семи
изученных им пар признаков: растения поколения Fj всегда походили па
какого-либо одного из родителей. Гибридный фенотип отсутствовал.
А что произойдет, если скрестить между собой два растения,
принадлежащие к поколению F^ Оказывается, что во втором поколении (F3)
наблюдается расщепление, или сегрегация, по двум данным признакам, причем
в среДнем У 75% потомков проявляется доминантный признак (в пашем
примере— пурпурная окраска цветков), а у 25%—рецессивный признак (белая
окраска цветков). Усредненное отношение тем ближе к 3 : 1, чем больше
растений используется в эксперименте по скрещиванию. Как объяснить эти

Структура и функция гена ill
результаты? Мендель предположил (и его интерпретация, как было
показано в дальнейшем, оказалась совершенно правильной), что имеет место
следующая последовательность событий:
1. У родительских особей наследственные детерминанты, определяющие
окраску цветков, существуют в двух устойчивых альтернативных формах,
или аллелях. Пурпурной окраске соответствует гомозиготная пара аллелей
РР, а белой окраске — также гомозиготная пара аллелей pp. При
образовании гамет (половых клеток) эти аллели распределяются независимо
друг от друга; при оплодотворении аллели рекомбинируют.
2. В гибридном поколении Ft возникают гетерозиготные, т. е.
содержащие гибридную пару аллелей (Рр), формы. Поскольку аллель Р
доминантен, а аллель р рецессивен, все растения поколения Fj имеют пурпурные
цветки и, следовательно, не отличаются по этому признаку от
родительских форм, несущих аллели PP.
3. Различие между гетерозиготными формами (Рр) и родительскими
формами (РР) выявляется в экспериментах по скрещиванию. Если
гетерозиготные формы поколения F.j скрестить друг с другом или с родительской
формой (возвратное скрещивание), имеющей белые цветки, то среди
потомков будут встречаться как растения с пурпурными цветками (pu), так
и растения с белыми цветками (w).
_J p I р
рр рр = Рр ,
(pu)A(w) (pu)"
рР
(pu)
PpX
РР
(pu)
рр= p
p
pP
(pu)
p
Pp (pu)
PP (W)
p
p
1
1
1
1 -PP(pu)
1 PP (Pu)
p
Pp (pu)
PP (w)
Pp
PP
(PU)
(W)
PpXPP^
1
p
p\
p 1
PP (pu)
pP (pu)
p
PP (pu)
PP (pu)
Аналогичным образом можно скрещивать сорта, различающиеся не
по одному, а по двум признакам. Рассмотрим, что при этом получится. Пусть
первый признак, допустим желтые цветки уе, определяется аллелем Y,
доминирующим над аллелем у, который определяет зеленые цветки (gr), a второй
признак, допустим гладкие семена sm, определяется аллелем S,
доминирующим над аллелем s, который определяет морщинистые семена wr.
Первое поколение Fj от скрещивания особей, имеющих генотип YYSS, с
особями, имеющими генотип yyss, будет однородным — оно будет состоять из
гибридов с желтыми цветками и гладкими семенами — генотип YySs.
Скрещивание особей поколения Fj даст второе поколение F2, в котором на одно
растение с зелеными цветками и морщинистыми семенами будет приходиться
три растения с желтыми цветками и морщинистыми семенами, три
растения с зелеными цветками и гладкими семенами и девять растений с желтыми
цветками и гладкими семенами. Наблюдаемое в эксперименте соотношение
между фенотипами A:3:3:9) полностью соответствует ожидаемому,
если исходить из предположения о независимом и случайном распределении
наследственных детерминантов :
I YS Ys y S ys
YS
Ys
ys
ys
YSYS (ye-sm)
YsYS v'ye-sm)
ySYS (ye-sm)
ysYS (yc-sm)
YSYs (ye-sm)
YsYs (уо-луг)
ySYs (ye-sm)
ysYs (ye-wr)
YSyS (ye-sm)
YsyS (yo-stn)
ySyS (gr-sm)
ysys (gr-wr)
YSys (ye-sm)
Ysys (ye-wr)
ySys (gr-sm)
ysys (gr-wr)
В формальной статистической модели, вытекающей из приведенных
выше опытов, элементарные факторы наследственности рассматриваются
как независимые, неделимые единицы расщепления, способные существовать
в двух или нескольких строго определенных аллельных формах. Эти
элементарные факторы наслодствеппости передаются, распределяются и реком-

478 Глава XIX
бинируют независимо друг от друга. По предложению Иогансена A911)
они были названы генами.
Сцепление. Результаты Менделя были в дальнейшем проверены в
экспериментах с другими организмами, в особенности с плодовой мушкойDrosophila
melanogaster (работы Моргана). Было показано, что выводы Менделя должны
быть несколько модифицированы. Оказалось, что многие гены передаются
не независимо друг от друга, а распределяются так, словно они связаны
между собой. Изучение распределения генов в потомстве показало, что
различные гены объединяются в несколько групп (группы сцепления). Гены,
локализованные в разных группах сцепления, передаются независимо друг
от друга, тогда как гены, локализованные в одной и той же группе
сцепления, обычно (но далеко не всегда) передаются вместе. Совокупность генов,
принадлежащих к данной группе сцепления, можно линейно упорядочить,
т. е. построить одномерную генетическую карту, в которой расстояние
между двумя произвольно выбранными генами прямо пропорционально
частоте рекомбинации этих генов, определяемой как отношение числа
случаев совместного появления данной пары генов в потомстве к числу всех
исследованных потомков. Малые расстояния на карте соответствуют низкой,
а большие расстояния — высокой частоте рекомбинации. Таким образом,
генетическая карта представляет собой линейную последовательность
генетических локусов. Положение каждого нового локуса на карте определяется
с помощью дифакториальных скрещиваний, т. е. скрещиваний, в которых
прослеживается судьба двух генетических маркеров (назовем их А ж В),
причем положение этих маркеров на карте известно. Очевидно, что
построенная таким способом карта (фиг. 154) должна быть внутренне
непротиворечивой, т. е. если маркер X расположен между маркерами А и В, то сумма
расстояний 4^-Іиї^-й должна быть равна расстоянию А ->¦ В. Таким
образом, гены можно определить как единицы рекомбинации,
локализованные в определенных участках линейной генетической карты.
Мутации. В классической генетике мутация определяется как резкий
переход одной аллельной формы в другую, приводящий к явному
изменению фенотипа (фиг. 154, Б). Мутации впервые наблюдал де Фриз. Они могут
возникать спонтанно и могут быть индуцированы различными агентами
(мутагенами), например определенными химическими соединениями или
рентгеновским излучением. Результаты исследования мутаций составляют
фундамент генетики.
Физические основы классической генетики. Хромосомы как группы
сцепления. Эксперименты Моргана привели его еще к одному очень важному
выводу. Оказалось, что число групп сцепления у Drosophila в точности
равно числу хромосом, содержащихся в ядрах соматических клеток
этого организма.
Далее было показано, что во многих случаях мутации, первоначально
определявшиеся чисто операционально как дискретные фенотипические
признаки, обязанные своим существованием конфигурационным изменениям
аллелей различных гипотетических генов, сопровождаются наблюдаемыми
структурными изменениями небольших, но вполне определенных участков
хромосом. Наконец, оказалось, что порядок расположения таких
морфологически различающихся участков на хромосоме совпадает с порядком
расположения мутантных локусов на генетической карте (фиг. 155).
Все эти наблюдения позволили установить приблизительное соответствие
(коллинеарность) между генетической и хромосомной картами, т. е.
показать, что генетическая карта — это, по существу, аналог хромосомной
карты. Заслуга Моргана состояла также в том, что он дал физическое
объяснение сцепления генов, введя для этого такие понятия, как кроссинговер-
и хиазма.

7
yellow (y)-j.JS~o
scute (se) 7'- -\o+
hairy wing (Hw) /,' ~\o+
white (w) /r ~\l,5
focet(ta)/'\3,O
echinus (ec) / \5,5
ruby(rb) 7,5
crossueinless (со) - - 13,7
и
111
cut (cf)
singed (sn)
lozenge (Іг)
vermilion (p)
miniature (w)
sable (s)
garnet(a)
forked (f)^
bar(B)'
carnation (car)
bobbed (bb)
20,0
21,0
27,7
33,0
36,1
43,0
44.4
/56,7
^¦57,0
62,5
66,0
arisfafess (al) т О rouahoid (ru) ^ о
star (s) - - 1,3
dumpy (dp) - - 73,0
clot (cl) - - Щ5
dachs(d) - 31,0
jammed (J) - ¦ 4i?
black (b) N
reduced (rd)
purple (pr) ^
bristle (Bl)^
light (It)'
cinnabar (en ) '
engrailed (en)
vestigial (од) -¦ B7,0
lobe (L)
curoed(c)
humpu (hy) - - 93,3
A
/48,5
54,5
//54,8
4 55,0
V 57,5
62,0
72,0
75.5
veinlet (ue) -
javelin (ju) -- 19,2
sepia (se) -- 26,0
tiairu(h)
" 26.5
dichaete (D)
glued (G) s
thread (th) :
scarlet (st)
deformed (D) '
pink (p) /.
curled (cu)
stubble (sb)
spineless Es) X;
bithorai (bx) '
stripe [sr)
glass Cl) '
delta (Dl)
hairless (H) v
ebony (e)
cardinal (cd) -- 74,7
uyh(ro) - - 91,1
plexus (pi) ¦ ¦ 100,5 claret(ca) -j- ;00,7
brown (hw) ¦ - ioo,7
speck (sp) x 707,0
minuie-g(Mg) -L @6,2
4 0,2
IV
bent (bt) — 3; - 0
cubit, /l \~Ъ
inter (сі) І у
shaven (so)/ \o,1i
eyeless (eu) 0,1 і
41,0
43,2
v44,0
^47,5
4 48,0
V50,0
58,2
58,5
4 58,7
62,0
66,2
70,7
Long
aristae
hong leys
Five
hong tarsi
wings
Аикии тип
Red
eyes
Gray
Straight
wings
Ahstaeiess
(short aristae)
Б
Dumpy
wings
Black
Dachs body Purple
eyes
Мутант
Фиг. 154.
(short legs)
Four tarsi
Brown
eyes
А. Карта сцепления Drosophila, на которой показаны четыре группы сцеплешш (хромосомы). Б. Участок
генетической карты (хромосома II).

480
Глава XIX
Гаплоидные организмы. Классическая генетика имела дело с высшими
организмами — животными (например, плодовая мушка) и растениями
(например, кукуруза). Однако новейшие достижения в этой области,
вызвавшие подлинную революцию в биологии, стали возможны благодаря
исследованиям, проводившимся на одноклеточных организмах — грибах
и бактериях,— а также на вирусах. Чаще других в качестве объектов
исследования использовались хлебная плесень Neurospora crassa, гриб Aspergillus
0,0++ 0,6 1,5 2,6 4,6 6,9 11,0 15,0 18,9 21,0 24,3 27,7
0,0 0,0+ 0,1 0,8 1,7 3,0 5,5 7,5 13,7 17,8 20,0 23,0 27,5 32,8
у ас sc sorjbr pnwrst со fadm ее Ы rb гд сотих shf cm et sn oc dd і Iz ras
Карта ^^і
сцепления
Хромосомная
карта
33,0 36,2 41,9 44,4 45,2
32,8 56,7 58,3 43,0 44,5 41,9
ras и m dy fut wy s ff ty na pl
54,1 54,5 57,0 59,4 62,5 B4,0
5/,5 54,4 56,7 59,2 59,5 62,7 66,0 ?70±
sd mean r f В odBxfucarMn swbb sp-a
Фиг. 155. Расположение генетических локусов в хромосомах слюнных желез Drosophila.
niger, бактерии Salmonella typhimurium и Escherichia coli, a также некоторые
бактериофаги, заражающие Е. coll. Все эти организмы гаплоидны, т. е. в
нормальном вегетативном состоянии содержат только один набор хромосом
(у вирусов и бактерий гаплоидный набор состоит всего из одной хромосомы,
а у плесневых грибов — из нескольких хромосом).
Как происходит обмен генетическим материалом в популяции таких
гаплоидных организмов, размножающихся простым делением? У одного
из штаммов Е. coli, а именно у штамма К12, был обнаружен процесс,
в результате которого образуется смешанное потомство; это своеобразный
аналог полового процесса, характерного для высших организмов. Он был
назван конъюгацией. У Е. coli K12 имеются клетки двух типов: F+
(мужские, или донорные) и F~ (женские, или реципиентные). Мужские клетки
F+ содержат доминантный половой фактор, или F-фактор, который может
быть передан Р~-клеткам при непосредственном контакте. Р~-клетка,
получившая F-фактор, превращается в донорную Р+-клетку. Возможен также
процесс, в результате которого в клетку-реципиент F~ переносится часть
хромосомы клетки-донора F+. Передача участка хромосомы происходит
значительно реже, чем передача F-фактора; отношение соответствующих
вероятностей составляет примерно 10~4. Однако были обнаружены мутант-
ные штаммы Е. coli, y которых мужские клетки передают свою хромосому
женским клеткам с высокой частотой. Эти штаммы были названы Ніг (от
английского high frequency of recombination — рекомбинация с высокой
частотой). У штаммов Hfr F-фактор, как правило, не передается клеткам-
реципиентам и конъюгация не приводит к превращению клеток F~ в F+.

Структура и функция гена
481
Процесс конъюгации, т. е. процесс переноса генов от клеток Hfr к
клеткам F~, можно остановить в любой момент интенсивным перемешиванием
культуры клеток в гомогенизаторе Уоринга. В образовавшихся зиготах
присутствует вся хромосома клетки-реципиента и часть хромосомы клетки-
донора, в чем можно убедиться, исслодуя фенотипы этих зигот (см.
стр. 476). Эти эксперименты позволяют установить последовательность
о <с ад о
Ни
Фиг. 156. Генетическая карта Е. coll.
Карта разбита па i-минутныо интервалы (всего 89 мин). В скобках показаны маркеры, локализованные
ориентировочно. Точную последовательность маркеров в участках с высокой их концентрацией не везде
удалось установить. Генетическая карта, построенная в единицах частот рекомбинации, хорошо
согласуется с этой картой, построенной в единицах времени. Одна единица времени (соответствующая
приблизительно 106 иуклеотидныш парам) равна 22 единицам рекомбинации.
генов (А, В, С и т. д.) в бактериальной хромосоме. Определение времени
проникновения генетических маркеров в зиготу дает независимый метод
составления генетической карты. Генетические карты, построенные с
помощью этого метода, совпадают с обычными генетическими картами,
полученными путем измерения частоты рекомбинации (фиг. 156).
У Е. coli K12 были обнаружены еще два механизма передачи
генетической информации. Первый из них, получивший название сексдукции, состоит
в переносе небольшого числа генетических детерминантов F-фактором. При
31-240

482
Глава XIX
этом F-фактор ведет себя так, как если бы он первоначально составлял одно
целое с хромосомой Р+-клетки, но обладал способностью отделяться вместе
с небольшим участком хромосомы и переноситься в клетку-реципиент.
Таким образом, этот фактор может существовать как в интегрированном,
так и в полуавтономном состоянии. По предложению Жакоба, Вольмана
и Моно подобные генетические элементы были названы эписомами.
Другой, значительно более распространенный механизм обмена
генетической информацией у бактерий, состоящий в переносе генетического мате-
Первоя стадия размножения фага —
адсорбция на оболочке плетки-хозяина
Оболочка "^^
Хромосома (Ял)
Проникновение
фаговой хромасо
мы в клетки
Литическии иркл
(при 57° длится
15-60мин)
Освобождение
новых фаговых частий?
в результате лизиса
клетки-хозяина
Хромосомы фага
окружаются новообразованными
белковыми оболочками
Освобождение хромосомы
/фага
Размножение
хромосомы фага
Лизогенная бактерия
обычна делится с той лее.
скоростью, что и
нормальная клетка
Профаг} включенный g
бактериальную хромосому
Фиг. 157. Жизиеииый цикл умереииого (лизогеииого) бактериофага.
После проникновения хромосомы умеренного фага в клетку-хозяина либо немедленно начинается
размножение фага (литический цикл), либо фаг переходит в состояние профага. Литическая фаза
жизненного цикла умеренного фага соответствует?.полному жизненному циклу литического фага. Литические
фаги названы так потому, что их размножение приводит к разрушению (лизису) бактериальной плетки.
риала с помощью умеренных бактериофагов, получил название транс-
дукции (фиг. 157 и 158).
Наконец, у бактерий имеется еще один механизм обмена генетической
информацией — прямой перенос генетического материала от донора
к реципиенту. Этот механизм носит название трансформации. Если
бесклеточный экстракт, полученный из бактерий (например, Diplococcuspneumoniae,
Haemophilus influenzas, Bacillus subtilis), несущих какой-либо характерный
генетический маркер (это может быть, например, устойчивость к тому или
иному антибиотику, специфическая структура клеточной оболочки или
потребность в каком-либо факторе роста), добавить к растущей культуре
другого штамма бактерий того же вида, лишенного этого маркера, то
некоторые клетки этого второго штамма включают данный маркер в свой геном.
Таким образом, вследствие передачи генетического маркера из экстракта
клеток-доноров клеткам штамма-реципиента эти последние претерпевают
трансформацию. В результате трансформации чувствительная к
стрептомицину клетка может стать стрептомициноустойчивой; приобретенный путем
трансформации признак сохраняется и передается от поколения к
поколению. Было показано, что трансформирующим фактором является
просто ДНК.
Происходит ли обмен генетической информацией у бактериофагов —
гаплоидных организмов, которые в отсутствие клетки-хозяина не способны

Структура и функция гена
483
даже к вегетативному размножению, не говоря уже о том, что у них вообще
отсутствует половой процесс? Было показано, что при одновременном
заражении одной и той же бактериальной клетки двумя фаговыми частицами,
различающимися по одному или нескольким генетическим маркерам,
происходит обмен генетической информацией, который можно уподобить
рекомбинации при половом процессе. В потомстве, полученном при таком
«скрещивании» двух фагов, встречаются как частицы с родительскими геноти-
Заражение
Г
Хромосома фага (отмечены /ларпсры)
временно ассоциирована с
бактериальной хромосомой (маркер р - специальный
локус для присоединения)
Кроссипговер
Интеграция
Заражение
Много
Мало \t
Нормальные
фаговые
частицы
Аефектиые частицы,
несущие аактериаль~
ныв маркеры (и
потерявшие чосоть
фаговых маркеров)
Вторичное заражение
популяции бактерии^
которых отсутсювиют
некоторые бактериальные
марперы
Фиг. 158. Лизогенпя и транедукция.
Вверху — включение профага в бактериальную хромосому; внизу — перенос генетического материала
бактерии дефектными фагами-переносчиками.
31*

484 Глава XIX
нами, так и частицы с различными рекомбинантными генотипами. Определяя
частоту появления рекомбинантных генотипов, можно построить одномерную
генетическую карту фага. Оказалось, что в случае Е. coli К12, а также
в случае бактериофагов Т2 и Т4 экспериментальные данные удается
интерпретировать только с помощью представления о кольцевой структуре
генетической карты (см. фиг. 156).
Высокая вероятность генетической рекомбинации у фагов и большое
число потомков, получаемых в каждом опыте, обусловили широкое
использование бактериофагов в генетических экспериментах. Именно на
бактериофагах были сделаны многие важные открытия в молекулярной генетике.
Особенно возросла роль бактериофагов как объектов исследования после
работы Херши и Чейз, впервые показавших, что при заражении
бактериальной клетки в нее проникает только ДНК (но не белок) фага (см. фиг. 157,
литический цикл).
ДНК КАК ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ
Ниже мы приводим наиболее важные экспериментальные факты,
из которых следует, что носителем генетической информации во всех живых
клетках служит ДНК.
1. Доказано, что в процессах генетического обмена у микроорганизмов
передается чистая ДНК, не содержащая примесей других макромолекул.
Передаваться могут: а) отдельные генетические маркеры (трансформация);
б) связанные группы маркеров (трансдукция или сексдукция); в) все
маркеры хромосомы (конъюгация бактерий и заражение фаговой ДНК). При
этом всегда имеет место четкая корреляция между длиной (или весом) ДНК
и длиной генетической карты.
2. В неделящихся диплоид ых соматических клетках высших
организмов количество ДНК и ее нуклеотидный состав постоянны (для данного
вида). Количество ДНК возрастает в процессе митотического деления,
но возвращается к исходной величине в дочерних клетках. Гаплоидные
половые клетки (гаметы) содержат половинное количество ДНК того же
нуклеотидного состава.
3. Генетическое сходство между различными видами макро- или
микроорганизмов коррелирует с нуклеотидным составом их ДНК и со степенью
гомологии нуклеотидных последовательностей в молекулах ДНК этих
организмов.
4. Известны физические и химические агенты (мутагены), эффективно
индуцирующие мутации; было показано, что эффективность действия
данного мутагена коррелирует с интенсивностью химических изменений,
которым подвергается ДНК под его влиянием (см. гл. V).
Модель структуры ДНК, предложенная Уотсоном, Криком и Умлкин-
сом (см. гл. V), прекрасно объясняет эти и многие другие экспериментальные
факты; трудно переоценить значение этой модели для создания новых
гипотез и постановки новых экспериментов в современной генетике.
Таким образом, из двух главных компонентов хромосомы — ДНК и
белка — только ДНК является носителем генетической информации. В
классической генетике гены не отождествлялись с какими-либо конкретными
химическими соединениями; теперь мы знаем, что они представляют собой
определенные участки молекулы ДНК, т. е. последовательности нуклеоти-
дов в двухцепочечном полидезоксирибонуклеотиде. Вопрос об удвоении
хромосом рассматривается в следующей главе. Рекомбинация, по крайней
мере у гаплоидных организмов, происходит, по-видимому, путем разрыва
и воссоединения хромосом.

Структура и функция гена
485
МОЛЕКУЛЯРНАЯ (БИОХИМИЧЕСКАЯ) ГЕНЕТИКА.
ОДИН ГЕН — ОДИН ФЕРМЕНТ
Первые аргументы в пользу гипотезы, согласно которой фенотипическое
выражение генных мутаций обусловлено изменениями определенных
белков-ферментов, были получены в 1908 г. Гэрродом, изучавшим различные
врожденные заболевания человека (так называемые врожденные нарушения
обмена), в частности алкаптонурию. Это заболевание наследуется как
простой рецессивный менделирующий признак. При алкаптонурии клетки
организма утрачивают способность окислять гомогентизиновую кислоту —•
продукт метаболизма фенилаланина (см. гл. XVII). В настоящее время
известно большое число наследственных заболеваний, обусловленных
недостаточностью того или иного белка (табл. 52).
Таблица 52
Некоторые наследственные нарушения обмена у человека, обусловленные утратой
того или иного ферментного или неферментного белка
Нарушение
Акантоцитоз
Акаталаземия
Афибриногенемия
Агаммаглобулинемил
Альбинизм
Алкаптонурия
Анальбуминемия
Аргининосукцинатацидемия
Галактоземия
1 "П ТТ IIі С\ "Р U ИГ С\ Q ХЛ
L Л111чU 1 UrlUoU
Тип I (Гирке)
Тип Ш
Тип IV
Тип V (Мак-Ардл)
Тип VI (Гере)
Зоб (семейный)
Гемоглобинопатии
Гемофилия А
Гемофилия В
Гистидипемия
Гомоцистинурия
Гипербилирубинемия (болезнь
Гильберта)
Гипофосфатазия
Лейципоз
Мастоцитоз
УІетгемоглобинемия
Оротатурия
Парагемофилия
Пентозурия
Фенилкетонурия
Пролинемия
Тирозиноз
Недостаточность витамина В12
Болезнь Вильсона
Ксаптинурия
Затронутый белок
?-Липопротеиды
Катала за
Фибриноген
¦у-Глобулин
Тирозиназа
Оксидаза гомогептизиновой кислоты
Сывороточный альбумин
Аргининосукциназа
Галактозо-1-фосфат— уридилтрансфераза
Глюкозо-6-фосфатаза
Лмило-1,6-глтокозпдаза
Амило-A,4 —> 1,6)-трансгликозилаза
Фосфорилаза мышц
Фосфорилаза печени
Иодтирозиндегалогеназа
Гемоглобины
Аптигемофильный фактор А
Антигемофильный фактор Б
Гистидаза
Цистатионинсинтотаза
Уридиидифосфат — глюкуронаттрансфераза
Щелочная фосфатаза
Форменты, декарбокешшрующие разветвленные
а-кетокислоты
Гистидиндекарбоксилаза (избыток)
Метгемоглобинредуктаза
Оротидин-5 '-фосфат — пирофосфорилаза
Ак-глобулин
L-ксилозодегидрогеназа
Фенила л анингидроксилаза
Пролиноксидаза (в некоторых случаях)
Оксидаза ге-оксифенилпировиноградной кислоты
Метилмалонил-КоА — изомераза
Церулоплазмин
Ксантиноксидаза
Очень важные работы в этой области были выполнены Бидлом и Тату-
мом, которым удалось выделить и исследовать большое число мутантов
нейроспоры, утративших способность синтезировать какое-либо из таких

486 Глава XIX
биохимически важных соединений, как аминокислоты, пурины, пиримиди-
ны, сахара, витамин В и т. д. Такие ауксотрофные мутанты возникают из
прототрофных клеток дикого типа; они способны расти на минимальной среде
только при условии, что в нее добавлен соответствующий недостающий
компонент, который служит в данном случае фактором роста.
Анализ большого числа ауксотрофных мутантов, различающихся по
потребностям в индивидуальных факторах роста, позволяет не только
изучать метаболизм, но и судить о генотипе данного организма. Допустим,
что мы выделили мутант (назовем его z), для роста которого на
минимальной среде необходим один-единственный фактор роста — соединение Z.
В большинстве случаев удается найти второй мутант, у, для роста которого
на минимальной среде необходимо или соединение Z, или соединение Y.
Иногда можно выделить третий мутант, х, который также является
ауксотрофом по веществу Z, но способен расти не только в присутствии Z, но также
в присутствии X или Y. Пусть, далее, мы получили мутант w — четвертый
ауксотроф по Z, который может расти в присутствии любого из четырех
соединений — W, X, Y или Z. Допустим, что вещество W — хорошо
известный промежуточный продукт обмена. Совершенно очевидно, что путь
12 3
от W к Z идет через стадии W —^Х—>Y—>Z. На этом примере видно, что
ауксотрофные мутанты могут оказаться исключительно полезными для
выяснения неизвестных путей метаболизма.
Естественно предположить, что у мутанта z «заблокирована» стадия
превращения Y в Z, т. е. этот ауксотрофный мутант не способен синтезировать
в достаточных количествах активный фермент 3, ответственный за
превращение Y —> Z. Дальнейшие исследования показали, что мутация гена дикого
типа 1 может привести к одному из следующих фенотипов: а) полное
отсутствие фермента 3 или другого белка, необходимого для превращения Y в Z;
б) нормальный фермент 3 синтезируется, но в слишком малых количествах;
в) синтезируется дефектный фермент 3, т. е. полностью неактивный или
с резко сниженной ферментативной активностью (этот дефектный фермент
по своим структурным характеристикам и иммунологическим свойствам
может быть очень близким к нормальному ферменту). Исследуя вещества,
образуемые мутантом z в отсутствие вещества W и после его добавления,
можно показать, что в клетках накапливаются вещества Y, X и W и что
экстракты из клеток этого мутанта катализируют стадии 1 и 2, но не
катализируют (или катализируют с гораздо меньшей эффективностью) стадию 3;
аналогичные эксперименты с мутантами х и у обнаруживают недостаточность
соответственно ферментов 1 и 2. Таким образом, мы приходим к следующей
схеме:
Ген A) B) C)
Мутационный блок \ х J, у I z
Фермент 12 3
Прсмежуточный продукт W—> X—> Y—> Z
Пример Глутамат Орпитин Цитруллин Аргинин
Используя стандартные генетические методики, удалось установить
локализацию большого числа мутаций и построить соответствующие
линейные генетические карты для семи групп сцепления нейроспоры. После
открытия конъюгации у Е. coli K12 и разработки методов с использованием
трансдукции, позволяющих осуществлять частичный обмен генами, удалось
1 Обозначения организма дикого типа и соответствующего мутанта различны у
разных авторов. Так, например, для дикого типа приняты обозначения х, х+ или просто
(-)-), а для мутанта соответственно, х~, х или просто (—). Иногда для обозначения дикого
типа пользуются символом X, а для мутанта — х.

Структура и функция гена 487
построить генетическую карту этого организма с помощью тех же типов
ауксотрофных мутантов 1. Оказалось, что и для бактериального объекта ход
рассуждений будет тем же; следовательно, у бактерий существует такая же
связь между генами и ферментами, как и у нейроспоры. У Е. coli K12 имеется
только одна группа сцепления, и расстояния на карте в этом случае можно
сопоставить, во-первых, со временем проникновения мужской хромосомы
в клетку-реципиент (см. фиг. 156) и, во-вторых, с общей длиной хромосомы,
равной, как мы уже знаем, общей длине молекулы ДНК. Оказалось, что
время проникновения, измеренное просто по времени физического контакта
клеток, соответствует времени появления маркеров в клетке-реципиенте
и количеству меченной Р32 ДНК, переносимой из клетки-донора в клетку-
реципиент.
У вирусов бактерий (бактериофагов) были получены мутации
нескольких типов. Мутантный фаг, как правило, отличается от фага дикого типа
спектром литического действия (круг возможных хозяев) или морфологией
стерильных пятен. Недавно были обнаружены другие мутанты (так
называемые условно летальные); отбор этих мутантов основан на их
чувствительности к повышенной температуре (такие ts-мутанты способны расти, скажем,
при 30, но не при 40°) или на их способности размножаться в клетках какого-
то одного определенного типа и неспособности размножаться на
близкородственных бактериальных штаммах. Мутанты этой последней группы
называются amber-мутантами или просто am-мутантами. Было показано, что
у фагов Т2 и Т4 как мутации am, так и мутации ts локализованы в
различных участках хромосомы. Известно, что эти участки контролируют синтез
не только обычных фаговых белков, но и других белков, которые
вырабатываются зараженной бактериальной клеткой и необходимы для синтеза
компонентов фага, в особенности его ДНК. Анализ всех этих мутантов
позволил построить детальные генетические карты для нескольких вирусов
бактерий.
Итак, многочисленные экспериментальные данные самого различного
характера подтверждают справедливость гипотезы «один ген — один
фермент», впервые четко сформулированной Н. Горовицем. Эти данные в
сочетании с некоторыми дополнительными соображениями, о которых будет
сказано ниже, приводят к двум важным выводам:
1) часто (но не всегда) гены, контролирующие определенный
метаболический путь, например
12 3
ф v ф
W > X > Y > Z,
тесно связаны друг с другом и расположены в одном и том же участке
хромосомы;
2) во многих случаях синтез набора ферментов (например,
ферментов 1, 2, 3), определяемых соответствующим набором генов, координирован-
но «включается» {индукция) или «выключается» (репрессия) в зависимости
от физиологического состояния клетки и условий среды.
Из множества возможных примеров рассмотрим только два. Гены,
контролирующие метаболизм галактозы, расположены по соседству друг с
другом в участке Gal А —D (фиг. 156). Эти гены определяют синтез ферментов
1 Отбор бактерий-ауксотрофов существенно упростился благодаря открытию Ледер-
берга. Он показал, что если популяцию, содержащую прототрофные и ауксотрофные
бактерии и растущую на минимальной среде, обработать пенициллином, то выживают
только ауксотрофи, поскольку пенициллин убивает лишь растущие клетки. Последующее
перенесение клоток на минимальную среду, в которую добавлен соответствующий фактор
роста, завершает отбор ауксотрофов.

488
Глава XIX
(см. гл. XI), катализирующих показанную ниже последовательность реакций:
+УТФ -ФФН
Галактоза *¦ Галактозо-1-фосфат
Галактокиназа
I
Gal A
Галактозо-1-фосфат—уридилтрансфераза
I
Gal В
УДФ-галактоза
Эпимераза
-> УДФГ
Gal С
Второй пример — группа генов, связанных с биосинтезом изо лейцина
и в а лина (Ни А, В, С, D) и контролирующих ферменты, ответственные
за различные этапы биосинтеза этих аминокислот:
Пируват
і
Ацетолактат а, ?-Оксивалерат сс-Кетолзовалерат Валин
Редуктоизомераза Дегидрогеназа Трансаминаза
J
Ацетокси-
бугират
а, ?-Оксиметил-
валерат
i Ilv A, D
1
О-Кетобутират <— Треонин
Дезаминаза
t
Ilv В
а-Кето-?-
метилвалерат
Ilv
Изолейцин
с
Ilv A
ГЕН КАК ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ЕДИНИЦА.
ОДИН ГЕН — ОДНА ПОЛИПЕПТИДНАЯ ЦЕПЬ
Тонкая структура гена. Единицы рекомбинации и мутации. До сих пор
мы пользовались классическим определением гена, которое в течение
длительного времени казалось достаточным для объяснения большинства
известных фактов. Согласно этому определению, ген представляет собой
дискретную, практически неделимую единицу, способную мутировать в
альтернативные аллельные состояния, рекомбинировать с другими генами и
контролировать определенную функцию, т. е. синтез специфического
клеточного компонента, а именно специфического белка.
Начало исследованиям тонкой структуры гена было положено в 1955 г.
работой Бензера, который провел анализ области rll бактериофага Т4
(и Т2). Фантастическая разрешающая способность, достигнутая с этой
системой, объясняется тем, что на одном штамме бактерии-хозяина, а именно
Е. coli В, мутанты rll дают стерильные пятна иной морфологии, нежели фаг
дикого типа (фенотип г), тогда как на штамме Е. coli K12 (точнее, на штамме
Е. coli K12, лизогенном по фагу X) они вообще не размножаются и,
следовательно, не образуют стерильных пятен. Таким образом, если скрещивать
два различных мутанта по области rll на штамме Е. coli В, то образующиеся
рекомбинанты дикого типа (г+) можно выявить, делая посев на культуре
штамма К12 (X), на котором размножаются только фаги дикого типа (г+).
Чувствительность этого метода позволяет легко выявлять рекомбинанты
дикого типа, присутствующие в популяции в соотношении 1 : 106. Используя

Локцс
M с Л
I H КІП
Хромосома (сегмент)
h r m rll
ri
Л m hl Ы lu lu ht
ИІГТГI
Типы
лпрантоэ
/IJ
/12
/13
A4 І /15 |
Сегдтент
г
Сегмент
А 5а
J
I A5b T
А 5с
2SSZ3
W?s^tay»
TZ1
І В Г
l
Линии
тип
rl272
ГІ247
rPTl
rPB242
гЛІ05
r63o
1
1
1
1
1
1
I
1
1
I 1
' 1 ,м, II
' 1 mm
I
A5d
J L
Н605
ГІ589
гРВ230
Сег/иен/п
r
/15с!
Ш
\ A5c2a1 1 Л5с2о2 Г A5c2b I
Участок ¦*
w
1
CM
J r/993
3 г/695
З гТГбв
Фиг. 159 Генетичоская карта области rll.
Область rll составляет всего лишь несколько процентов от всей длины молекулы ДНК фага Т4. Для
локализации мутаций на карте скрещивают вновь полученный мутант ПІ с известным мутантом,
имеющим делецию в области rll. Порядок и расположение семи мутационных участков (внизу) определены
ориентировочно. Каждый такой участок соответствует, вероятно, наименьшей мутирующей единице
в молекуле ДНК — одной паре оснований. Изображенный в самой нижней части фрагмент молекулы
ДНК содержит около 40 нуклеотидных пар.

490 Глава XIX
этот метод, а также мутанты с перекрывающимися делециями (т. е. мутанты,
у которых участки гена утрачены), Бензер построил детальную карту
генетического локуса rll. Он показал, что ген rll содержит большое,
но конечное число рекомбинирующих друг с другом участков, которые
можно линейно упорядочить, исходя из данных о частоте рекомбинаций. Итак,
Бензеру впервые удалось изучить тонкую структуру гена, который содержит
большое число аллелей, и построить его детальную карту (фиг. 159). Как
велико число этих аллелей? Минимальная частота появления рекомбинан-
тов г+, наблюдавшаяся в скрещиваниях между различными независимо
полученными мутантами rll (спонтанными, или индуцированными),
составляла приблизительно 0,01% (этот результат вполне достоверен; ведь
описанный метод выявления рекомбинантов, как указывалось выше, позволяет
регистрировать даже существенно меньшие частоты рекомбинации). Зная
минимальпуго частоту рекомбинации, можно рассчитать размер
наименьшего способного к рекомбинации участка, названного Бензером реконом.
Длина генетической карты фага Т4 составляет приблизительно 700 единиц
рекомбинации, где одна единица соответствует частоте рекомбинации (для
обоих рекомбинирующих признаков), равной 1% в стандартном
скрещивании, в котором взяты строго равные количества родительских форм.
Частота 0,01% соответствует 2-0,01 : 700 = 3-Ю длины хромосомы фага.
Если считать, что в ДНК исследуемого фага Т4 отсутствуют негенетические
участки и что вероятность рекомбинации одинакова по всей длине
молекулы, то минимальный размер рекомбинирующего участка составляет
3-10~5-2-105 = 6 нуклеотидных пар. Следовательно, «рекон» состоит
из очень небольшого числа нуклеотидных пар, возможно даже из одной
нуклеотидной пары. Таким образом, очевидно, что ген нельзя считать
дискретной единицей рекомбинации.
ПРИРОДА МУТАЦИЙ
А можно ли считать ген единицей мутации (Бензер предложил для такой
единицы название мутон)! Если ген представляет собой участок молекулы
ДНК, то можно было бы ожидать, что мутон, так же как и рекон, состоит
всего лишь из одной нуклеотидной пары.
Независимо от конкретного механизма «перевода» нуклеотидной
последовательности в аминокислотную последовательность
соответствующего полипептида {трансляция) изменение даже одного основания {точковая
мутация) может привести к образованию измененного белка. В рамках
модели, постулирующей существование кодирующих групп (небольших
групп расположенных рядом дезоксирибонуклеотидных пар), которые
предопределяют положение отдельных аминокислотных остатков в белке,
возможны по крайней мере четыре варианта фенотипа (фиг. 160). Рассмотрим
подробнее вариант 4, считая, что кодовое отношение равно 3, т. е. что число
нуклеотидных пар 1 в кодирующей группе равно 3. В этом случае
последовательность нуклеотидных пар (x^Zj) (x2y2z2) . . .(x„y„z„) (xn+1yn+1zn+1) . . .
. . .(xfJygZg) разбивается на первую, вторую, п-ю, (и + 1)-ю и q-io
кодирующие группы гена а. Последовательность кодирующих групп с помощью
некоторого механизма однозначно определяет последовательность аминокис-
1 Поскольку в нормальной двухцепочечной молекуле ДНК обе цени комалемен-
тарны друг другу, в данном случае безразлично, рассматриваем ли мы
последовательность пуклеотидных пар в двойной цепи или последовательность единичных
нуклеотидных остатков в каждой из цопей. Химическое изменение одного нуклеотидного остатка
в данной паре может привести к образованию гетерозиготи (т. е. среди потомков будут
как особи с родительским, так и особи с мутантным генотипом). Это предположение
было доказано экспериментально.

Структура и функция гена
491
лотных остатков Ав^Ака . . . АкпАкп+1. . . . Ак5 в белке А. Предположим
теперь, что процесс считывания и трансляции начинается с кодирующей
группы 1, а в ней — с нуклеогида х^. Что произойдет, если мы удалим один
нуклеотид (нуклеотидную пару) в одной из групп, например у„? Трансляция
будет происходить так же, как и раньше, только до ге-й кодирующей группы,
после чего весь «текст» разбивается уже на «неправильные» нуклеотидные
тройки, т. е. происходит сдвиг в считывании генетического сообщения:
. . . (x^Xn+i) (yn+iZn+iXn+г) (Уп+гЯп+гХп+з) (Уп+з2п+зХп+4) ¦ • ¦ (У<г-іг<г-іх<г) Уд2д-
Мутации этого типа были названы мутациями со сдвигом рамки. Они
обусловливают ошибочную трансляцию кодовых групп, следующих за
лнк
Аикии тип
Белок А
п-2
п- 1
п+ 1
л П4-2
Кодирующие группы
У Трансляция (/иного стадий)
N-г N
Ы-1
N+2
Аминокислоты
Миташач
az
Мутант az az
\ Код
ппа
Мутация с изменением смысла, приводящая к
синтезу измененного белка, сохранение активности
которого зависит от влияния перехода N-*-X va
структури белка
I Кодирующая группа
f
у у
eu бессмысленна
... дг-2 д,_(
Бессмысленная мутация: образование белка
блокируется после N-1, так как бессмысленный
прерывает трансляцию
п-2 а-1 п
("Сдвиг
рампи"
Ы-2 N-t X X' X"
или
N-2 N-1
изменение смысла или прекращение трансляции
Замещение одной из
приводит к замене
^»окисош, N
но амцнокислотц X
Замещение ту
Вопавяя ми ймвцщ
тклеотидиои пары
Фиг. 160. Феиотипические последствия точкових мутаций.

492
Глава XIX
п-ш группой, в которой произошло выпадение (делеция) нуклеотидной пары
или, напротив, добавилась лишняя пара (вставка). Мутация со сдвигом
рамки приводит к искажениям смысла, т. е. к синтезу дефектного белка;
кроме того, выпадение или вставка нуклеотидной пары могут привести
к появлению «бессмысленной» последовательности.
Можно ли считать, что большинство мутантов rll несет точковые
мутации? Если это так, то должны соблюдаться следующие два условия: 1)
скрещивание любого мутанта rll по крайней мере с одним из двух других неал-
лельных мутантов rll, дающих при скрещивании друг с другом рекомбинанты
дикого типа (г+), должно также приводить к образованию рекомбинантов
дикого типа (г+); 2) мутанты rll должны с измеримой частотой
возвращаться (ревертироватъ) к дикому типу, особенно если частоту мутирования
(в данном случае речь, естественно, идет о превращении rll -у г+) повышают
с помощью специальных воздействий. Оказалось, что большинство
исследованных мутантов rll ведет себя именно таким образом; при этом частота
обратных мутаций различна для разных мутантов rll. Большинство
индуцированных мутаций можно разбить на два класса (табл. 53): 1) мутации,
Таблица 53
Типы точковых мутаций
Мутаген (механизм действия)
Пара

оснований

Продукт
Последствия
Конечный
результат
(замена одной
нуклеотидной пары на
другую)
5-Бромурацил (в кето-фор-
ме образует пару с А,
в енолыгой форме — с Г)
2-аминопурин (АП) (обычно
образует пару с Т, но
может также спариваться
с Ц)
Азотистая кислота (деза-
міширует А в И, ГвК1)
Ц в У)
Гидроксиламин (превращает
—ГШ2-группу цитозина в
группу —NHOH;
модифицированное основание
образует пару только с А)
Акридины (профлавин, ак-
рнфлавин, хинакрин и
т- Д-)
А — Т
Г-Ц
А —Т
Г-Ц
А —Т
Г-Ц
г-ц
А —Т

Любая
А —БУ
Г —БУ
АП —Т
АП—Ц
И —Т
К —У
БУ может образовать пару с Г
Г-БУ —Г-Ц
БУ может образовать пару с А
Г —БУ—*А —БУ—>А—Т
АП образует пару с Ц
АП — Т—^АП — Ц—>Г — Ц
АП образует пару с Т
АП —Ц-^АП —Т—>А —Т
И образует пару с Ц
И—Т—>И —Ц—>Г —Ц
К образует пару так же, как
Г; У « Т;
К —У—>А —У—>А—Т
Действия но оказывает
Локальное нарушение
двойной спирали, что приводит
к вставке или выпадению
одного или нескольких
оснований
AT —> ГЦ
ГЦ —* AT
AT —>ГЦ
ГЦ -:> AT
AT — > ГЦ
ГЦ—>АТ
ГЦ —> AT
Индукция
мутаций со
сдвигом
рамки
і) К — к сангин.
возникшие в результате замещения оснований; их получают путем
воздействия 5-бромурацилом, 2-аминопурином, а также гидроксиламином,
азотистой кислотой и этилметансульфонатом (о механизме действия см. гл. V);
в присутствии этих же соединений возрастает число ревертантов, тогда как
обработка таких мутантов акридиновыми красителями никогда не приводит
к повышению частоты реверсий; 2) мутации, полученные в результате
обработки акридиновыми красителями; эти мутанты, так же как и некоторые.

Структура и функция гена
493
спонтанно возникшие мутанты, ревертируют в присутствии акридинов,
но никогда не ревертируют при обработке указанными выше соединениями,
вызывающими замещения оснований (табл. 54).
Таблица S4
Реверсия мутаций (главным образом в области rll) при воздействии
Агент, индуцировавший
исходную мутацию
5-бромурацил
2-аминопурин
Азотистая кислота
Гидроксиламия
Акридины
различными

5-бромурацил
і:

2-аминопурин
А
мутагенами L)

Азотистая
кислота
++ +
Гидро-
ксиламин
f

Акридины
•4>
Пара оснований,
предположитель-
но затронутая
исходной
мутацией
ГЦ (реже AT)
AT (реже ГЦ)
AT или ГЦ
ГЦ
Обе
1) Обозначения:
+++ = почти количественная реверсия,
++ = реверсия в большинстве случаев,
4- = реверсия в немногих случаях,
± = реверсия происходит редко,
— = реверсия практически отсутствует.
Был сделан вывод, что мутации первого типа возникают в результате
переходов А — Т ^ Г — Ц или Т — А ЦІ Ц — Г, а мутации второго типа
обусловлены вставками или делециями единичных нуклеотидных пар.
Для реверсии мутаций первого типа необходимо второе замещение в том
же месте с возвратом к исходному состоянию, например А — Т -»- Г — Ц->
->¦ А — Т; в случае мутаций второго типа для реверсии необходимо, чтобы
сначала произошла вставка, а затем делеция, или наоборот.
Мутации, не являющиеся точковыми, представляют собой делеции,
захватывающие участки хромосомы различной длины. Делеции
исследовались на многих системах. Так, например, у бактериофага % была изучена
делеция kcb2, в результате которой длина молекулы фаговой ДНК
оказывается меньше на целых 3 микрона A4,3 вместо 17,3), что соответствует
уменьшению молекулярного веса на 6-10е, или уменьшению длины
приблизительно на 1000 нуклеотидных пар (см. фиг. 51).
ЕДИНИЦА ФУНКЦИИ
Исследование мутантов rll. Было показано, что все мутанты rll можно
разбить на два класса, используя следующий простой тест. Бактериальную
клетку одновременно заражают двумя различными фагами — это могут быть
фаг дикого типа и мутантный фаг или же два мутантных фага,— причем
в качестве бактерии-хозяина используется не штамм В, а штамм К (см. выше).
Но характерным свойством мутантов rll является их неспособность
размножаться на штамме К, что обусловлено, по-видимому, невозможностью
синтеза в клетках этого штамма какого-то активного фагоспецифичного белка,
необходимого для размножения фага. Какого результата можно было бы
ожидать от такого эксперимента? Естественно предположить, что в случае
комбинации дикий тип/мутант активный белок будет синтезироваться г
и оба фага должны, следовательно, дать потомство; в то же время
комбинация мутант/мутант окажется в этом смысле недееспособной, активный
1 Это означает, что дикий фенотип, т. е. способность синтезировать необходимый
белок,— доминантный признак.

494 Глава XIX
белок не будет синтезироваться и, следовательно, размножение фага (на
штамме К) будет невозможным. Однако на практике эти предсказания сбылись
не вполне. Некоторые комбинации мутант/мутант действительно не дают
потомства, но многие другие комбинации мутант/мутант потомство
образуют, т. е. мутанты оказываются способными как бы взаимно дополнят], друг
друга (комплементация). Таким образом, все мутанты rll можно разбить
на два класса — Л и В', причем между любым мутантом класса А и любым
мутантом класса В комплементация оказывается весьма эффективной, тогда
как в пределах одного и того же класса комплементации почти или совсем
не наблюдается 1. Возможны следующие комбинации генотипов: A?/Ab
(потомство образуется); АВ/аВ (потомство образуется); AB lab (потомство
образуется); АЬ/аВ (потомство образуется); аВ/АЪ (потомство образуется); аВ/аВ
или Ab/Ab (нет потомства). [AB означает здесь дикий тип; аВ — мутант
класса А; Ab — мутант класса В]. Итак, в данном случае имеется две ком-
плементационные группы (мутации классов А и В); соответствующие этим
группам участки хромосомы фага называют цистронами, поскольку
рассмотренный выше тест известен в генетике под названием цис —
транстеста. (В комбинации АВ/аЬ два маркера а и b находятся в ifMc-конфмгура-
ции, а в комбинациях АЬ/аВ и аВ/АЪ— в траке-конфигурации.)
Таким образом, аллели А я В доминируют над своими мутантными
аллелями а и Ь. Функционально активная генетическая единица в данном
случае состоит из двух сегментов, или цистронов,— А и В,— которые
располагаются рядом на генетической карте. Каждый цистрон в отдельности
контролирует синтез специфической молекулы, которая, однако, сама по себе
неактивна даже будучи абсолютно неповрежденной. Продукты
цистронов А и В должны объединиться для того, чтобы возникла активная
структура. Мутации в каком-либо из двух цистронов приводят к синтезу дефектной
молекулы, не способной к образованию активного продукта при
взаимодействии с нормальным продуктом второго цистрона. Естественно
предположить, что генетическая единица функции — ген или цистрон — кодирует
субъединицу белка — индивидуальную полипептидную цепь. Допустим,
что функционально активный белок состоит из п полипептидных цепей
(субъединиц), связанных друг с другом ковалентными или другими связями.
Для кодирования такого белка необходимо п цистронов. Поэтому мы и
предполагаем' существование двух полипептидных цепей, соответствующих
двум цистронам области г//. Если активный белок состоит из одной
полипептидной цепи, то ген, кодирующий этот белок, эквивалентен цистрону. Если
даже мутация A -v а или В ->¦ b приводит к полному отсутствию
соответствующего полипептида или к образованию совершенно искаженного
полипептида, несомненно, что до тех пор, пока в клетке имеются нормальные
аллели, детерминирующие полипептидные субъединицы А и В,
внутриклеточный фонд будет содержать некоторое количество этих субъедивиц.
Различие между цистроном и геном как единицей функции, в сущности,
уловить трудно. В клетках человека два гена, детерминирующие а- и ?-цепи
молекулы гемоглобина, не сцеплены и даже могут быть локализованы в
разных хромосомах. Как мы увидим в следующем разделе, два гена,
контролирующие синтез триптофансинтетазы у Е. coli, очень тесно сцеплены, но тем
не менее обособлены. Напротив, у нейроспоры синтез фермента, очень
сходного по функции, механизму действия и даже по молекулярному весу с трип-
тофансинтетазой Е. coli, детерминируется двумя цистронами одного и того
* Заметим, однако, что для некоторых других систем наблюдается комплементация
в пределах одного и того же класса. Ото оказывается возможпым в том случае, если
активный белок состоит из двух или пескольких идентичных полинептидных субъодиниц
и если эти субъединицы, будучи поврежденными в разных местах, сохраняют способность
агрегировать с образованием более или менее активного белка.

Структура и функция гена 495
же гена. Во всяком случае, в настоящее время установлено (в большинстве
случаев при помощи цис—транс-теста), что синтез многих белков зависит
более чем от одного гена или цистрона.
Супрессия. При исследовании реверсии к дикому типу (т. е. возврата
к прототрофности) в различных системах было показано, что в
действительности повторная мутация происходит не в месте первичной мутации, а в
другом участке хромосомы. В результате этой так называемой супрессориой
мутации также наблюдается реверсия. Некоторые случаи такой
«псевдореверсии» можно объяснить исходя из уже рассмотренных нами
представлений. Возвратимся к фиг. 160 (вариант 4) и к обсуждению вопроса об
ошибках в трансляции, вызванных мутациями со сдвигом рамки (стр. 491).
Посмотрим, что произойдет, если вблизи первичной делеции нуклеотида
возникнет вторая делеция (или вблизи первичной вставки нуклеотида
возникнет вторая вставка)? Легко видеть, что последовательность, возникающая
после выпадения второго нуклеотида, например ул+1, остается все еще
дефектной:
Но если происходит третья делеция (например, выпадает нуклеотид
х„), то возникающая при этом последовательность, начиная с кодирующей
группы п -\- 2, становится опять «осмысленной»:
Таким образом, если ошибки, обусловленные изменением нескольких
кодирующих групп [в рассмотренном нами случае кодирующая группа п
выпала, а группа (п -\- 1) превратилась в (z„x„+1zn+1)], не слишком
существенны, то иногда удается наблюдать появление активного белка в
результате г последовательных мутаций 1.
Мы помним, однако, что г равно кодовому отношению, т. е. числу нуклео-
тидов (нуклеотидных пар) в ДНК, необходимых для того, чтобы
кодировать одну аминокислоту.
Эта модель была проверена, экспериментально на мутантах
бактериофага Т4, индуцированных акридиновыми красителями, в опытах Крика
и его сотрудников A961). Так было получено доказательство того, что
кодовое отношение равно (или кратно) 3.
Оказалось, что внутривенные супрессорные мутации возможны не только
в случае делеций или вставок, но и в тех случаях, когда исходная мутация
обусловлена заменой основания, что, как мы помним, приводит к синтезу
дефектного белка, в полипептидной цепи которого какая-то одна
аминокислота заменена на другую. Вторая, независимая мутация в том же самом
гене приведет к замене еще одной аминокислоты в другом участке
полипептидной цепи, причем эта вторая мутация может частично или полностью
компенсировать дефект от первой мутации, так что функциональная активность
белка будет восстановлена. Известно, что замена остатка глицина на остаток
глутаминовой кислоты в одном положении белка А триптофансинтетазы
может быть компенсирована второй заменой (которая сама по себе также
приводит к инактивации белка) — тирозина на цистеин (расстояние между
этими двумя точками равняется 36 аминокислотным остаткам).
Внегенная супрессия бывает по крайней мере двух типов: 1) когда фено-
типическое выражение исходной мутации компенсируется специфической
супрессорной мутацией, возникающей в том же самом геноме; 2) когда
супрессорная мутация неспецифична и влияет на мутации в различных
генах, восстанавливая (в большей или в меньшей степени) активность
соответствующих белков. Супрессорная мутация второго типа и исходная
1 Фактически п X г, где п -—малое яисло.

496
Глава XIX
Аминокислотная последовательность, свойственная дикому типи
Тре-^Тис)-Л™-^Гео).Сер-/1рг-Лла-Глц-Вял-^Тре)-Глц-/Іла-Глі/-/Іспн- Арг-Ала -Ала- (Про, Лей)-Аспн-Гис-Лей-( Аларал)-Лів-Лей-Лиз-Гщ-7ир-Аст-Алі
Has Арг
MB 487
+0,04*- <¦
-0,3-
¦ 0А5 ¦
Расстояние на генетической карте
Фиг. 161. Коллинеарность генетической и поли-
(супрессируемая) мутация могут присутствовать в разных организмах.
Например, было показано, что способность условно летальных мутантов
фага заражать определенные бактериальные штаммы обусловлена
присутствием супрессора в геноме такого чувствительного штамма, причем введение
этого супрессора нечувствительным штаммам приводит к тому, что они
приобретают утраченную ранее способность синтезировать активные белки
(например, щелочную фэсфатазу). Возможный молекулярный механизм
супрессии рассматривается в гл. XXI.
Исследования триптофансинтетазы из JE. coli. Результаты изящных
опытов Бензера не могли быть проверены непосредственным анализом
структуры белка (белков?), кодируемого геном ill, так как до настоящего
времени определить функцию гена rll и выделить, а тем более проанализировать
белок, кодируемый этим геном, не удалось. К счастью, в результате
замечательных работ Яновского и его сотрудников была открыта аналогичная
система у Е. coli — мы имеем в виду систему генов, контролирующих синтез
триптофансинтетазы.
У Е. coli и других организмов конечной реакцией биосинтеза триптофана,
катализируемой триптофансинтетазой, является реакция B) (см. стр. 445):
Индол-З-глицер*
Глицеральдегид-3-фосфат+Триптофан
C)
у Индол

Структура и функция гена
497
22 1
^
Вал Единичные замены аминокислот -
187 точковые мутации
(указано число выделенных мутантов;
несколько независимо полученных
мутантов указано над диким талом)
Обратные мутации
ИИ Частичная активность
Рекомбинация с возвратом
к дикоми типу
а
E8x78)
0,002
¦ 0,50 -
<0,01 0,015
пептидной карт для белка А триптофансинтетазы.
Фермент, выделяемый обычными методами, катализирует не только
реакцию G), но также реакции B) и E); однако свободный индол в качестве
промежуточного продукта в реакции G) не образуется. Сейчас известно, что
чистый фермент (мол. вес 105 000) представляет собой|комплекс, который
можно разделить хроматографическими методами на две белковые ;
фракции А и В. Белок А состоит из одной полипептидной цепи с молекулярным
весом 29 500. Цепь построена из 272 аминокислот (и не содержит
триптофана). Остальную часть комплекса составляет белок В. Ни белок А,
ни белок В в отдельности реакцию A) не катализируют;
реконструированный фермент (молекула которого состоит из одной молекулы А и одной
молекулы В) вновь приобретает способность осуществлять свою] функцию.
Белок А хотя и слабо, но все же катализирует реакцию B), а белок В —
реакцию E), что позволяет определять эти компоненты триптофансинтетазы
в экстрактах; другой, более удобный способ основан на определении
недефектного белка А внутриклеточно, с помощью теста на комплементацию,
или вне клетки — по ферментативной активности.
КОЛЛИНЕАРНОСТЬ КАРТ
Используя эти способы определения белков А и В триптофансинтетазы,
генетические методы (разрешающая способность рекомбинационного
анализа, как мы знаем, соответствует отдельным нуклеотидным парам), а также
метод «отпечатков пальцев» и определение аминокислотной
последовательности белка А, Яновский и его сотрудники однозначно показали, что
генетическая и полипептидная карты коллинеарны, т. е. что существует четкая
корреляция между последовательностью нуклеотидов в некотором участке
32-246

498
Глава XIX
ДНК и последовательностью аминокислотных остатков в соответствующем
полипептиде. Молекулярную основу такой корреляции составляет
соответствие определенных последовательностей нуклеотидов различным
аминокислотам, т. е. генетический код, тогда как ее функциональное проявление
определяется механизмом трансляции генетической информации. На фиг. 161
приведены две карты, на которых указаны характерные частоты
рекомбинации и аминокислотные замещения, соответствующие определенным
аллелям. Легко видеть, что относительное расположение аминокислотных
замещений в полипептидных фрагментах, выделенных из мутантных клеток,
идентично относительному расположению соответствующих мутантных
участков на генетической карте цистрона А. Результаты этого и других
аналогичных экспериментов позволили сделать дополнительные важные выводы.
1. Отношение масштабов генетической и полипептидной карт
приблизительно постоянно (>0,01); сказанное означает, что если частота
рекомбинации <0,01, то это соответствует, вероятно, замене одной аминокислоты.
2. Рекомбинация между различными мутациями, расположенными в
одном и том же участке генетической карты (например, мутации А23 и 446
или А58 и А78) и приводящими к замене различных аминокислот (фиг. 162),
Номер

аминокислоты
27
6
Номер
мутации
23
46
58
78

Генетическое
скрещивание
58X78

Предполагаемый кодон
для Гли
ГГА/Г
ГГУ/Ц
«Мутантний»
КОдОН
АГА/Г
(Apr)
ГАА/Г
(Глу)
ГАУ/Ц
(Асп)
УГУ/Ц
(Цис)
«Ревертантные»
кодоны
ГГА/Г
АЦА/Г (Тре)
АГУ/Ц (Сер)
ГГА/Г
ГЦА/Г (Ала)
ГУА/Г (Вал)
ГГУ/Ц
ГЦУ/Ц (Ала)
ГГУ/Ц
«Рекомби-
нантный»
кодон
ГГУ/Ц
Фиг. 162. Кодоны, соответствующие аминокислотам, показанным на фиг. 161.
возможна только в тех случаях, если соответствующие кодирующие единицы
(кодоны) различаются более чем по одному нуклеотиду.
3. Код вырожден, т. е. одна аминокислота может кодироваться более
чем одним кодоном.
4. Точковые ревертанты дикого типа, т. е. ревертанты, способные
синтезировать нормальный активный белок, можно разбить на две группы: а)
ревертанты, у которых в соответствующем участке полипептидной цепи вновь
появилась исходная аминокислота, и б) ревертанты, у которых произошла
замена не на исходную, а на какую-то другую (вернее, третью)
аминокислоту, в результате чего активность белка тем не менее восстанавливается.
Так, например, мутация последовательности -Гли-Фен-Гли в -Глу-Фен-Гли
может быть обращена в результате мутации -Глу-Фен-Гли ->¦ -Вал-Фен-Гли.
Реверсия в случае мутанта -Вал-Фен-Вал происходит в результате мутаций
к -Ала-Фен-Вал или -Вал-Фен-Ала.

Структура и функция гена 499
Эти и аналогичные данные сыграли весьма значительную роль в
установлении природы генетического кода. Однако наиболее важные факты о
составе и нуклеотидных последовательностях в различных кодонах были
получены в биохимических экспериментах с бесклеточными белоксинтезирующи-
ми системами. Ниже суммируются основные данные о природе кода.
ХАРАКТЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА
Кодовое отношение. Кодовое отношение (г) можно определить как число
нуклеотидов в подане. Мы уже упоминали об изящных опытах Крика с
акридиновыми мутантами фага Т4, в которых индуцировались три
последовательные точковые мутации (делеции или вставки) в определенном гене. Из этих
опытов следовало, что кодовое отношение равно или кратно трем.
Наиболее просто кодовое отношение можно было бы установить, измерив
длину участка ДНК, кодирующего полипептид с известным числом
аминокислотных остатков. Однако определить величину г таким способом пока
не удается; согласно приблизительным оценкам, эта величина безусловно
меньше 10 и, вероятно, меньше 5. Так, например, РНК вируса — сателлита
вируса некроза табака содержит 1200 нуклеотидов, а число аминокислотных
остатков в белковой субъединице его оболочки равно 400; отсюда г = 3.
Аналогичные оценки величины г были сделаны для большого числа
различных белков. Другие доказательства триплетности кода были получены
с помощью бесклеточных систем. Было показано, что: 1) тринуклеотиды
эффективно связывают специфические аминоацил-s-PHK с рибосомами;
2) набор кодирующих триплетов, полученный исходя из данных по
включению аминокислот и связыванию тринуклеотидов in vitro, хорошо
согласуется с результатами генетических экспериментов по аминокислотным
замещениям в белках in vivo; 3) регулярные полинуклеотиды типа АВАВАВАВ...
кодируют гетерополимеры, в которых регулярно чередуются два различных
аминокислотных остатка, что указывает на нечетность величины г; 4)
регулярные полинуклеотиды типа АВСАВСАВС... могут кодировать ровно три
различных гожополипептида; 5) «магическое» число аминокислот, входящих
в состав белков, равно 20, а число различных оснований в ДНК равно 4;
следовательно, если г = 2, то с помощью четырех букв кода можно
закодировать лишь 42 = 16 аминокислот, так что двухбуквенный код не проходит.
Если г = 3, то с помощью четырех букв кода можно закодировать 43 = 64
аминокислоты. Исходя из соображений «экономии», можно предположить,
что кодовое отношение равно как раз этому минимальному из возможных
чисел. Таким образом, из совокупности данных самого различного
характера четко следует вывод о триплетности кода.
Универсальность кода. Было показано, что почти все 64 триплета при
их испытании в бесклеточных системах несут какую-то смысловую нагрузку.
Это делает естественным предположение, согласно которому какие-то черты
генетического кода носят универсальный характер. Более того, гетерологич-
ные бесклеточные системы (т. е. системы, содержащие рибосомы из
организма одного вида, а транспортные РНК и активирующие ферменты — из
организма другого вида) способны синтезировать полипептиды так же
эффективно, как и соответствующие гомологичные системы, что опять-таки
свидетельствует об универсальности кода. Имеются также косвенные данные,
говорящие о том, что «смысл» данного кодона сохраняется неизменным для разных
систем. Наконец,, было показано, что белоксинтезирующая система из Е. coli
способна транслировать информацию, содержащуюся в РНК из вируса
растений. Данные, полученные в опытах на Е. coli и других бактериях,
на вирусах, дрожжах, проростках растений, ретикулоцитах кролика, печени
крысы, гемоглобине человека и т. д., убедительно подтверждают предполо-
32*

500 Глава XIX
жение об универсальности кода. Заметим, однако, что видовая специфичность
биосинтеза белка тем не менее существует; проявляется она в различном
узнавании аминоацилсинтетазами (ферментами, активирующими
аминокислоты) транспортных РНК; такая специфичность обусловлена, по-видимому,
присутствием различных необычных оснований в s-PHK разных видов.
Вырожденность и неоднозначность. Как мы увидим дальше, код сильно
вырожден в том смысле, что почти все аминокислоты кодируются более
чем одним кодоном.
Вырожденность имеет очевидные биологические преимущества. Так,
например, благодаря вырожденности микроорганизмы с различным нукле-
отидным составом ДНК могут синтезировать практически одни и те же
наборы ферментов и других белков. В результате возможность
максимального сохранения относительного постоянства внутриклеточного состава при
изменениях внешней среды не должна приноситься в жертву генетической
индивидуальности, и наоборот. Далее, небольшие «случайные» мутации при
наличии вырожденности кода гораздо менее опасны и легче ревертируют,
чем в случае невырожденного кода, особенно если вырожденность такова,
что более вероятными являются мутации, приводящие к. «эквивалентным»
заменам аминокислот (т. е. к заменам алифатических аминокислот на
алифатические, кислых на кислые, основных на основные и т. п.). Таким образом
вырожденность кода повышает генетическую стабильность.
При некоторых условиях, например в присутствии высоких
концентраций Mg2+ и других катионов и особенно в присутствии стрептомицина или
органических растворителей, генетический код как in vitro, так и in vivo
является неоднозначным, т. е. один и тот же триплет кодирует более чем
одну аминокислоту. Предполагают, что именно на этом может быть основан
эффект супрессии. В результате мутации X -> Y происходит замена одной
аминокислоты (х) на другую (у) или обрыв)'процесса трансляции вследствие
возникновения бессмысленного кодона. Благодаря неоднозначности код
может считываться неправильно и^притом так, что аминокислота х (или
эквивалентная ей аминокислота х') будет с некоторой вероятностью
включаться вместо аминокислоты у. Действительно, супрессия редко бывает
полной. Во многих случаях удается показать, что супрессированные мутанты
содержат оба белка—мутантный белок (соответствующий исходной мутации,
т. е. несущий аминокислоту"!/) и белок дикого типа или сходный с ним (т. е.
несущий вместо аминокислоты у аминокислоту х или х').
Запятые и перекрывание. Если между соседними кодирующими
группами данного кода имеются промежутки, то говорят о коде с запятыми. В
случае генетического кода это означало бы, что в генах нормальных организмов
имеются нуклеотиды, не являющиеся составной частью ни одного из кодо-
нов, т. е.
- . . (XYZ)n a {XYZ)n^ ab (XZY)^ ...(a, ab — запятые)
Код называется перекрывающимся, если элементы одной кодирующей группы
входят в другую кодирующую группу, т. е. если
. . .W\ XY \ Z .. . кодирующие группы (WXY) CXYZ) перекрываются
Согласно имеющимся данным, генетический код не содержит запятых
и перекрывающихся участков, т. е. является неперекрывающимся кодом без
запятых 1.
1 Этот вывод, безусловно, справедлив, по крайней мере для структурных генов,
т. е. для генов, кодирующих отдельные полипептидные цепи.

Структура и функция гена
501
Общие свойства кода. В табл. 55 приводен современный вариант
генетического словаря, т. о. перечень кодонов для 20 аминокислот, составленный
главным образом на основании результатов исследований групп Нирен-
берга и Кораны. Нуклеотидные последовательности читаются слова направо,
т. о. XYZ означает (ф)ХфУфХ. По-видимому, в том же направлении эти
последовательности считываются (транслируются) и in vivo.
Из данных, приведенных в табл. 55, явствует, что, во-первых,
большинство триплетов «осмысленны», т. е. кодируют определенные
аминокислоты, и, во-вторых, что код сильно вырожден.
Таблица 55
Словарь генетических символов Ц
Первый
иуклсотид
У
ц
А
г
Второй нуклеотид
У
Феи
Лей *
Лей *
Лей
Лей *
Илей
Илей
Мет (Иниц.)
Вал
Вал
Вал или Мет
Ц
Сер
Сер
Про
Про
Тре
Тре
Ала
Ала
А
Тир
Ochro
Amber
Гяс
Глун
Аспн
Лиз
Асп
Глу
Г
Цис
(Бессмысл.)
Три
Арг
Арг *
Сор
Apr *
Тли
Тли
Третий
нуклеотид
У
Ц
А
г
У
Ц
А
Г
У
Ц
А
Г
У
ц
А
Г
1) Почти во всех случаях замена пиримидина на другой пиримидин или пурина на другой пурин
(трапзиция) в третьем положении кодона не влечет за собой изменения кодируемой аминокислоты.
В восьми случаях (отмечено курсивом) не оказывает влияния и замена любого пурина на любой
пиримидин и наоборот (трансеерскя), т. е. и в этих случаях основания в третьем положении,
по-видимому, не важны. По меньшей мере в двух случаях (Лей, Apr и, вероятно, Цис) могут,
очевидно, иметь место и траняиции и трансверсии в первом положении (отмечено авездочкой).
Amber означает подои (УАГ), не соответствующий ни одной из s-PHK нечувствительных
штаммов. В чувствительных штаммах, содержащих мутацию SuA, образуются молекулы сериповой s-PHK,
которые могут узнавать втот триплет. Триплет УАА (Ochre) соответствует аналогичной супресспру-
еиой мутации. Триплет УГА (Бессмысл.) служит сигналом окончания, а триплет АУГ (Иниц.) —
сигналом начала синтеза; последний кодоп соответствует молекулам метііошіл-s-PHK, способным
формилироваться до формил-ЇЧ-метионил-в-РНК.
Вырожденность кода означает, что для узнавания многих кодонов
достаточны лишь два нуклоотида, т. о. что на одном из концов у многих кодонов
(особенно на З'-конце и реже на 5'-конце) находятся пуклеотиды, замена
которых не приводит к изменению смысла кодона. Возникает, естественно,
вопрос о механизме считывания кодонов и о надежности этого механизма.
Процесс считывания должен включать, по-видимому, стадию узнавания
(но принципу комплементарное™) кодона информационной РНК (см. ниже)
антикодоном транспоріной РНК (см. гл. XXJ). В группе «сиионшшческих»,
т. е. кодирующих одну и ту жо аминокислоту, кодонов векоторые
комплементарные триплеты могут быть менее стабильными, чем другие. Кроме
того, доступность (концентрация) разных s-PHK, соответствующих одной
и той же аминокислоте, может быть различной. Эти, а возможно также
и другие, факторы могут определять эффективность считывания и, вероятно,
видовую специфичность трансляции. Генетические механизмы и факторы
внешней среды могут контролировать точность реализации генетической

502 Глава XIX
информации. Заметим еще, что, согласно последним данным, одна и та же
s-PHK может узнавать, по-видимому, более чем один кодон.
В последние годы была определена первичная структура ряда
индивидуальных s-PHK из разных организмов (см. гл. V). Выяснилось, что
взаимодействующие триплеты (антикодон — кодон) имеют следующее строение:
в случае аланина — фИфГфЦ: фГфЦфЩУ, А); в случае фенилаланина —
фОМеГфУфЦ: фУфУфУ(А); в случае серина - фИфГфА: фУфЦфЩУ, А);
в случае тирозина — фГфг|;фА: фУфАфЦ(У).
ИНФОРМАЦИОННАЯ (МАТРИЧНАЯ) РНК
История вопроса. Необходимость существования особых
информационных, или матричных, РНК, т. е. молекул РНК, переносящих информацию
о синтезе специфических полипептидов, непосредственно следует из того,
что местом белкового синтеза служат рибосомы, находящиеся в цитоплазме,
тогда как хранение и воспроизведение генетической информации
осуществляется с помощью ДНК, которая локализована в ядре. Кроме того, высокая
химическая и метаболическая стабильность ДНК, столь необходимая для
осуществления ее генетической функции, делает малоправдоподобной
гипотезу о синтезе белков непосредственно на генах. Все эти соображения
привели к формулировке одного из основных положений молекулярной
биологии, согласно которому поток информации идет в направлении ДНК ->
->¦ РНК ->¦ белок. Первый этап переноса информации, на котором не
происходит перекодирования, носит название транскрипции, а второй этап,
на котором имеет место перекодирование, называется трансляцией. Другими
словами, нуклеотидные последовательности ДНК и РНК либо идентичны,
либо комплементарньґ'друг другу, тогда как аминокислотная
последовательность в белке представляет собой лишь аналог нуклеотидных
последовательностей ДНК или РНК. До 1961 г. многие исследователи полагали, что
рибосомная РНК !— это и есть информационная РНК, т. е. что каждому
гену соответствует определенный тип рибосом, функционирующих в
качестве устойчивых матриц для синтеза специфического белка. В пользу этой
модели свидетельствовал тот факт, что часть рибосомной РНК
синтезируется с высокой скоростью, в то время как основная ее часть
метаболически весьма стабильна. Обнаруженная в дальнейшем инфекционность
очищенных РНК из некоторых вирусов 'растений также рассматривалась
рядом исследователей как подтверждение 'этой ^модели. Однако вскоре было
установлено большое число фактов, сделавших неприемлемой гипотезу
о матричной функции рибосомной РНК. Приведем некоторые из них.
1. Размеры и состав белковых молекул сильно варьируют. В то же
время изолированные рибосомы и рибосомные РНК характеризуются весьма
высокой степенью гомогенности состава, и это справедливо не только для
данной популяции клеток, но и для разных видов (см. табл. 23). В связи
с этим, естественно, возникал вопрос, каким образом гомогенная популяция
рибосомной|РНК может определять синтез гетерогенной популяции белков.
2. Аминокислотный состав всех белков клетки должен как-то зависеть
от нуклеотидного состава клеточной ДНК. Нуклеотидный состав ДНК
в пределах данного вида строго постоянен, но может сильно различаться
у разных видов (ХА + Хт варьирует от 0,25 до 0,75). Что же касается
рибосомной РНК, которая, согласно предположениям, служит
промежуточным звеном между ДНК и белком и должна была бы, следовательно,
так же сильно варьировать по составу в зависимости от вида, то она в
действительности не обнаруживает такой вариабельности.
3. Вскоре после заражения бактериальной клетки бактериофагом
клетка теряет способность синтезировать бактериальные белки и приблизитель-

Структура и функция гена 503
но через 1 мин после заражения начинает синтезировать белки,
необходимые для размножения фага.
4. Существуют так называемые мутации оператора (см. гл. XXI),
приводящие к включению (или выключению) целой группы генов (оперона),
причем влияние таких мутаций проявляется только в уие-конфигурации.
Это означает, что комбинации Oabclo' и o'abc/0 по-разному влияют на синтез
белков А, В и С. Первая из этих комбинаций возникает при введении о'
в генотип ОаЪс, а вторая — при введении О в генотип о'аЪс. Переход О -> о'
может приводить либо к инактивации всех генов оперона (мутанты 0°),
либо к их одновременной активации в отсутствие внешнего индуктора
(мутанты 0°).
В случае комбинации Oabc/00 белки А, В и С синтезируются, тогда
как при комбинации О°аЪсЮ синтез этих белков не идет. Все эти факты
легко объяснить исходя из предположения, что регуляция происходит
на уровне транскрипции, а не на уровне трансляции, а это указывает на
существование какой-то нестабильной матрицы.
Гипотеза матричной (информационной) РНК (т.-РНК), четко"
сформулированная Жакобом и Моно в! 1961 г., базировалась именно на этих
генетических экспериментах.
ДОКАЗАТЕЛЬСТВА СУЩЕСТВОВАНИЯ т-РНК
1. Сразу же после заражения клетки бактериофагом в ней с высокой
скоростью синтезируется нестабильная РНК, которая составляет лишь
незначительную часть (не более 5%) общего количества РНК.
Аналогичная фракция ДНК-подобной РНК обнаруживается в незараженных
бактериях и в растущих дрожжах. В то же время можно показать, вводя
в систему на очень короткое время радиоактивную метку, что значительная
часть новообразованной РНК будет представлять собой, вероятно, именно
m-PHK.
2. Эта новообразованная РНК (предположительно Ш.-РНК) эффективно
и специфически гибридизуется с соответствующей «родительской» ДНК;
так, например, т-РНК, синтезируемая после заражения фагом Т2,
гибридизуется с гомологичной фаговой ДНК, но не гибридизуется с гетерологич-
ными фаговыми или бактериальными ДНК (в данном случае даже ДНК
бактерии-хозяина не составляет исключения).
3. Можно показать, что рибосомы не могут самостоятельно
осуществлять трансляцию. Для синтеза специфического белка на рибосоме
необходимо, чтобы к ЗОЭ-субчастице (или 408-субчастице у высших организмов)
активной 70S-(или 80S) рибосомы присоединилась молекула специфической
m,-PHK, a к 50S- (или 60S) субчастице присоединились молекулы
транспортной РНК. После заражения фагом Т2 новые рибосомы не образуются и
новообразованная Ш.-РНК присоединяется к предшествующим бактериальным
рибосомам.
4. Если освободить рибосомы от присоединенных к ним «природных»
Ш.-РНК, синтезированных in vivo (т. е. от всей информации, которую они
несли), а затем поместить такие рибосомы в бесклеточную систему и
добавить к ним другие природные матрицы, то синтез белков (или точнее
включение аминокислот) будет происходить по новой программе — в
соответствии с информацией, содержащейся в этих новых матрицах. Рибосомы
могут также синтезировать гетеро- и гомополипептиды в присутствии
синтетических полинуклеотидов.
5. Вирусная РНК может функционировать в качестве матрицы для
синтеза вирусоспецифичных белков даже и тогда, когда синтез всех кле-

504 Глава XIX
точных РНК (включая рибосомную РНК) полностью подавлен актиномици-
ном D. В отдельных случаях фаговая РНК оказывается способной
индуцировать синтез фагоспецифичных белков даже in vitro. В определенных
условиях удается выделить т.-РНК, образованную после введения
трансформирующей ДНК и дублирующую функцию этой последней.
6. Известно, что в присутствии соответствующих индукторов
специфически индуцируется биосинтез полицистронных матриц.
7. Разными методами было показано, что время полужизни т-РНК
у различных бактерий составляет при 37° приблизительно 90 сек. Сколь
ни мало это время, оно все же примерно на один порядок величины больше
того, какое необходимо для синтеза в той же системе законченной
полипептидной цепи средних размеров (около 10 сек). Это дает основание
предположить, что отдельная матрица может принимать участие более чем в одном
цикле трансляции.
8. Из клеток различного типа был выделен и подвергнут тщательной
очистке растворимый фермент, катализирующий транскрипцию ДНК
с образованием комплементарной РНК (см. гл. XXI).
НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА т-РНК
1. Время полужизни. Стабильность молекул РНК может варьировать
в широких пределах. У высших организмов она в среднем намного выше,
чем у бактерий. Такое различие, очевидно, частично обусловлено тем, что
биосинтез белков у высших организмов протекает более медленно (при
37° в ретикулоцитах кролика за одну секунду включаются в белок 2
аминокислоты, а у Е. coli — 100 аминокислот). Стабильность различных молекул
771-РНК может заметно варьировать даже в пределах одной и той же клетки.
Молекулы РНК некоторых РНК-содержащих фагов могут непосредственно
выполнять роль т-РНК, не разрушаясь в течение жизненного цикла фага
в зараженной бактериальной клетке C0—55 мин при 37°). У высших
организмов т-РНК еще более стабильна. Активный цитоплазматический
комплекс, состоящий из т-РНК, рибосом и s-PHK, может, вероятно,
функционировать непрерывно в течение нескольких дней; в некоторых случаях синтез
белка на стабильных РНК-матрицах происходит даже в отсутствие ядерной
ДНК (эритроциты млекопитающих) и без сколько-нибудь заметного
обновления РНК.
2. Размеры. С усовершенствованием методов выделения РНК оказалось,
что константы седиментации (а следовательно, и размеры) молекул РНК,
идентифицируемых как т-РНК (на основании седиментационных и хрома-
тографических данных), гораздо выше, чем предполагалось вначале.
Действительно, если матрицы, как полагают в настоящее время, являются обычно
полицистронными, т. е. содержат полную информацию о белках какого-либо
одного оперона, то длина таких молекул т,-РНК может быть весьма
значительной.
Было, например, показано, что т-РНК, соответствующая His-one-
рону Е. coli (который включает около полутора десятков цистронов),
содержит приблизительно 13 000 нуклеотидов, а ее константа седиментации
равна 30^S (мол. вес 4-Ю6). Длина такой молекулы в развернутом состоянии
достигает 30 000 А. Аналогичные данные были получены и для Lac-оперона.
3. Комплементарность по отношению к ДНК. В настоящее время можно
считать твердо установленным, по крайней мере для микроорганизмов, гот
факт, что только одна из двух цепей ДНК (но ДНК при этом должна
обязательно иметь двухцепочечную структуру) транскрибируется в РНК. Таким
образом, транскрипция происходит асимметрично и избирательно, на одной

Структура и функция гена 505
из цепей г. Так же обстоит дело и при синтезе РНК in vitro с участием ДНК-
зависимых РНК-полимераз, если ДНК высокомолекулярна и сохраняет
свою нативную конформацию, а катализирующий реакцию фермент выделен
в достаточно мягких условиях.
Из признания симметричности транскрипции вытекает важный вывод,
касающийся в первую очередь тех молекул m-PliK, которые синтезируются
на отдельных гонах или отдельных оперонах. Естественно, у нас нот
никаких оснований считать, что нуклеотидный состав одной из цепей ДНК
в каком-либо гене или в небольшой совокупности рядом расположенных
генов близок к суммарному нуклеотидному составу двухцепочечных молекул
ДНК всего организма. Иными словами, индивидуальные молекулы то-РНК
по своему нуклеотидному составу не должны быть сходны с ДНК.
Далее, все клеточные РНК, т. е. два вида рибосомной РНК и все виды
s-PHK, видимо, должны быть комплементарны каким-то участкам
гомологичной ДНК. Отсюда следует вывод о наличии в ДНК специфических цистро-
нов для синтеза этих различных видов РНК, которые, таким образом,
представляют собой не промежуточные, а конечные продукты генов, ибо сами
они не детерминируют уже никаких других молекул. Мы вправе,
следовательно, сказать, что комплементарность по отношению к определенным
нуклеотидным последовательностям ДНК не является специфическим
свойством одной только то-РНК.
4. Способность выполнять роль матрицы при синтезе белка. Молекулы
то-РНК характеризуются в первую очередь способностью служить
матрицами при белковом синтезе, т. е. направлять процесс включения
аминокислот в синтезируемые полипептидные цепи в соответствии с генетическим
кодом. На протяжении ряда лет считалось, что ни другие виды самой РНК,
ни ДНК не могут выполнять эту роль. Теперь выяснилось, что свойство
это в значительной степени определяется отсутствием выраженной вторичной
структуры у молекул то-РНК.
5. Регуляция синтеза иг-РНК. A priori ясно, что транскрипция должна
по времени предшествовать трансляции (во всяком случае, транскрипция
какой-то первой группы нуклеотидов, пусть даже эта группа очень мала).
Таким образом, на этом уровне транскрипция, безусловно, может
лимитировать трансляцию. Неясно, однако, можем ли мы считать, что в
дальнейшем эти два процесса протекают независимо как во времени, так и в
пространстве. Нетрудно, например, представить себе, что если реакционно-
способная неустойчивая молекула /п-РНК почему-либо не включится в
работу трансляционной системы, то транскрипция сразу же прекращается или
продукт транскрипции инактивируется (скажем, вследствие гидролиза,
фосфоролиза или взаимодействия с другими компонентами клетки).
Недавние эксперименты, проведенные на различных бактериальных системах,
показывают, что транскрипция и трансляция — тесно связанные процессы.
Одной интересной особенностью синтеза РНК у бактерий является
зависимость этого синтеза (у так называемых «жестко» контролируемых штаммов)
от присутствия в среде полного набора всех аминокислот. Если отсутствует
хотя бы одна аминокислота, необходимая для роста данного ауксотрофа,
то синтеза РНК не происходит. Такой «жесткий» контроль определяется
наличием особого гена (RCst), место которого на генетической карте можно
определить с помощью обычных методов. Мутации в этом гене (RCrel)
приводят к появлению штаммов, у которых уже не наблюдается столь четкой
зависимости между содержанием аминокислот в среде и синтезом РНК.
На уровне транскрипции действуют, вероятно, и такие регуляторные меха-
1 Мы не знаем, однако, всегда лп это одна и та же цепь или разпые цели для разных,
генов и оперонов.

506 Глава XIX
низмы, как индукция и репрессия, хотя действие их, несомненно,
определяется событиями, совершающимися на уровне трансляции.
ЛИТЕРАТУРА
См. гл. XX и XXI, стр. 517 и 539.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
А л и х а н я н СИ., Современная генетика, изд-во «Наука», М., 1967.
Медведев Ж. А., Молекулярно-генетические механизмы развития, изд-во
«Медицина», М., 1968.
Общая генетика, сб. статей под ред. Н. И. Шапиро, изд-во «Наука», М., 1965.
Р а т н е р В. А., Генетические управляющие системы, изд-во «Наука», Новосибирск,
1966.
Л о б а ш е в M. E., Генетика, изд. 2-е, ЛГУ, Л., 1967.
M ю и т ц и п г А., Генетика, изд-во «Мир», М., 1967.
У о т с о н Дж., Молекулярная биология гена, изд-во «Мир», М., 1967.

Глава XX
БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
В гл. XVIII подробно обсуждался биосинтез непосредственных
предшественников нуклеиновых кислот — нуклеозидполифосфатов, а в гл. XIX
рассматривались генетические функции нуклеиновых кислот. Располагая
такой информацией, можно перейти к обсуждению способа сборки
нуклеозидполифосфатов в нуклеиновые кислоты. В конце этой главы будет
затронут еще один вопрос — о подавлении биосинтеза нуклеиновых кислот с
помощью различных химических соединений.
ПОЛИКОНДЕНСАЦИЯ НУКЛЕОЗИДПОЛИФОСФАТОВ
БИОСИНТЕЗ ДТІК
Поскольку ДНК — главный носитель генетической информации,
определяющей биохимическую специфичность клетки, а эта генетическая
информация передается интактной от родителей к потомкам, центральной
проблемой в биосинтезе ДНК является, очевидно, механизм само удвоения этой
молекулы. Как можно представить себе синтез ДНК, направляемый самой
ДНК? Комплементарное спаривание оснований в двухцепочечной молекуле
прямо указывает на возможный механизм ДНК-зависимого синтеза ДНК,
в котором ДНК служит матрицей для собственного воспроизведения. Были
предложены две гипотезы о матричной роли ДНК. Уотсон и Крик на основе
структурных данных предположили, что каждая цепь двухцепочечной
молекулы ДНК служит матрицей для синтеза комплементарной цепи. Этот
механизм был назван полуконсервативной редупликацией, так как в
результате одного цикла редупликации каждая из двух новообразованных
дочерних молекул получает ровно половину исходной (матричной) молекулы
ДНК. Согласно другому механизму — консервативной редупликации,—
сначала удваивается только одна из двух цепей ДНК (причем роль матрицы
в этом процессе играет двухцепочечная молекула ДНК), а затем уже эта
новообразованная цепь ДНК служит матрицей для синтеза комплементарной
ей цепи. В этом случае после одного цикла редупликации исходная молекула
ДНК должна остаться интактной и синтезированная молекула ДНК будет
состоять только из новообразованных цепей. Механизмы
полуконсервативной и консервативной редупликации ДНК схематически представлены
на фиг. 163.
Классический эксперимент Меселсона и Стали четко показал, что,
по крайней мере в некоторых случаях, процесс, протекающий in vivo,
действительно обнаруживает существенные особенности полуконсервативной
редупликации. В этом эксперименте клетки Е. coli выращивались на среде,
содержавшей изотопно чистый N15H4C1 в качестве единственного источника
азота. Следовательно, ДНК, синтезированная в процессе размножения
клеток, была «тяжелой», т. е. содержала N15 вместо N14. Такую «тяжелую»
ДНК нетрудно отличить от «легкой» ДНК, подвергнув ее ультрацентрифуги-

508
Глава XX
рованию в градиенте плотности хлористого цезия (см. гл. V). Клетки,
выращенные на среде с N15H4C1, быстро переносили в среду, содержавшую
обычный (N14) хлористый аммоний, а затем исследовали, как меняется во времени
соотношение между легкой и тяжелой ДНК этих клеток. Первоначально
(т. с. сразу после переноса в среду с N14H4G1) в градиенте плотности, как
и следовало ожидать, получалась только одна полоса с плотностью,
характерной для тяжелой ДНК. После одной генерации в среде, содержащей N14,
ДІ1К из Е. coli опять давала всего лишь одну полосу. Однако на этот раз
Исходная
родительская
молекула
Дочерние молекулы
первого поколения
Аочериие молекулы
второго поколения
А Б
Фиг. J 63. Схема редупликации ДНК, изображающая механизмы нолуконсерватпвноіі
(^4) и консервативной (Б) редупликации.
плотность была равна полусумме плотностей тяжелой и легкой ДНК.
Следовательно, после одного цикла редупликации ДНК образовавшиеся
гибридные молекулы содержали одну цепь исходной тяжелой молекулы ДНК
и одну новообразованную легкую цепь. Полученный результат, как
это нетрудно видеть, в точности согласуется с картиной распределения
метки, которой следовало ожидать исходя из механизма полуконсервативной
редупликации. После двух генераций в среде с N14 в градиенте плотности
получались две полосы одинаковой интенсивности: одна — с плотностью,
равной плотности легкой ДНК, и одна — с плотностью, равной плотности
гибридной молекулы ДНК (легкая -f- тяжелая цепи), т. е. той, какую
получают после одной генерации. Легко видеть (см. фиг. 163), что этот
результат также следует из механизма полуконсервативнои
редупликации ДНК.
Эти изящные опыты ясно показывают, что во всех изученных случаях
распределение метки при редупликации ДНК находится в соответствии
с предположением Уотсона и Крика; однако опыты не дают ответа на вопрос
о том, вся ли двойная спираль ДНК раскручивается перед редупликацией.
Действительно, такое раскручивание при pH и температуре, характерных
для внутриклеточной среды, должно, по-видимому, происходить слишком
медленно для обеспечения наблюдаемой скорости биосинтеза ДНК.
Естественно поэтому предположить, что раскручивание двухцепочечной матрицы
и спирализация новообразованных молекул ДНК происходят синхронно
и поддерживаются ферментативными реакциями, ответственными за синтез
полинуклеотидов.

Биосинтез нуклеиновых кислот 509
Весьма интересны ферментативные аспекты редупликации ДНК. Первый
фермент, превращающий дозоксинуклеозидполифосфаты в полимерные
соединения, был открыт в экстрактах из Е. coli A. Корнбергом и его
сотрудниками. Фермент был назван ДНК-полимеразой. Уравнение (XX. 1)
описывает суммарную реакцию, катализируемую этим ферментом:
гс2дГТФ днк
+ ^_ ~t днк
п2дЦТФ
-дАМФ-|
Рассмотрим наиболее важные особенности реакции, катализируемой ДНК-
полимеразой.
1. Субстратами реакции являются дезоксинуклеозидтрифосфаты; дифос-
фаты не вступают в реакцию поликонденсации. Для реакции необходимы
все четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (известны исключения); в
отсутствие хотя бы одного из этих субстратов образование полимера почти
полностью прекращается.
2. Суммарная реакция в заметной степени обратима: инкубация ДНК
с ДНК-полимеразой в присутствии высоких концентраций пирофосфата
приводит к частичной деполиконденсации ДНК. »Количество пирофосфата,
выделяющегося в процессе поликонденсации, соответствует стехиометриче-
скому (см. уравнение XX. 1).
3. Для реакции необходимо присутствие ионов двухвалентного металла,
обычно магния. При замене "ионов магния ионами марганца специфичность
реакции существенно изменяется: в присутствии Mg2+ субстратами могут
служить только дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, в присутствии же Мп2 +
в реакцию вступают также рибонуклеозидтрифосфаты. Таким образом,
в системе, содержащей Мп2+, могут синтезироваться смешанные рибо-
и дезоксирибонуклеиновые кислоты.
4. Для ДНК-полимеразной реакции необходима ДНК-затравка; РНК
служить затравкой в этой реакции не может. Этот факт, представляющий
большой интерес, подробно обсуждается ниже.
5. В результате ДНК-полимеразной реакции из дезоксинуклеозидтри-
фосфатов образуются ДНК-подобные молекулы, причем количество
новообразованной ДНК может более чем в 20 раз превосходить количество
внесенной ДНК-затравки.
Насколько близка структура продукта, образующегося в
ДНК-полимеразной реакции, к структуре ДНК-затравки? Ответ на этот вопрос
служит одновременно и ответом на вопрос о роли ДНК-затравки. Затравка
может просто инициировать удлинение предсуществующих полинуклеотид-
ных цепей или она может использоваться в качестве матрицы для фермента,
катализирующего удвоение матрицы. Физические свойства
синтезированного продукта явно противоречаттпервому из этих двух предположений.
Исследование в ультрацентрифуге показало, что синтезированный продукт
полидисперсен и что среднее значение его константы седиментации
приблизительно равно константе седиментации ДНК-затравки. Молекулярные веса
и характеристические вязкости синтетической и затравочной ДНК
приблизительно одинаковы. Наконец, присутствие 3',5'-фосфодиэфирных связей
в динуклеотидах, полученных при неполном ДНК-азном гидролизе
синтезированного полимера, а также тот факт, что синтезированный полимер
гидролизуется ДНК-азой, в свою очередь указывают на близость структур
синтетической и затравочной ДНК. Таким образом, синтезированный поли-

510
Глава XX
мер представляет собой ДНК, близкую по своим физическим свойствам
к ДНК-затравке.
Еще одно доказательство того, что затравка служит матрицей для
собственной редупликации, получено при сравнении нуклеотидных составов
ДНК-затравки и синтетической ДНК. В табл. 56 нуклеотидные составы
нескольких образцов синтетической ДНК сравниваются с нуклеотидными
составами соответствующих ДНК-затравок. Легко видеть, что для всех
синтетических продуктов выполняются правила Чаргаффа (А = Т, Г = Ц)
и что нуклеотидные составы продукта и затравки практически одинаковы.
Таблица 56
Нуклеотидный состав продукта ДНК-полимеразной реакции
ДНК
Mycobacterium phlei
Затравка
Продукт
Escherichia coli
Затравка
Продукт
Тимус теленка
Затравка
Продукт
Бактериофаг Т2
Затравка
Продукт
А
0,65
0,66
1,00
1,04
1,14
1,12
1,31
1,33
т
0,66
0,65
0,97
1,00
1,05
1,08
1,32
1,29
г
1,35
.1,34
0,98
0,97
0,90
0,85
0,67
0,65
Ц
1,34
1,37
1,05
0,98
0,85
0,85
0,701)
0,701)
(А + Г)/(Т + Ц)
1,01
0,99
0,98
1,01
1,05
1,02
0,98
1,02
(А + Т)/(Г + Ц)
0,49
0,48
0,97
1,02
1,25
1,29
1 92
1,90
1) Оксиметилцитозин.
Ясно, что наиболее надежным доказательством идентичности структур
продукта и затравки явилось бы установление идентичности нуклеотидных
последовательностей в молекулах этих соединений. Однако, поскольку
определение нуклеотидных последовательностей длинных отрезков ДНК —
все еще нерешенная экспериментальная задача, приходится полагаться
на менее прямые способы доказательства. Корнбергом был разработан
новый подход к этой проблеме — так называемый метод определения частот
ближайших соседей. Очевидно, что для нуклеиновой кислоты, содержащей
четыре разных основания, существует шестнадцать возможных динуклеотид-
ных комбинаций (последовательностей). «Метод ближайших соседей» состоит
в определении абсолютной частоты, с которой каждый из этих динуклеоти-
дов встречается в исследуемом образце ДНК. Результат такого анализа
приведен в табл. 57.
Таблица 57
Результаты анализа частот ближайших соседей для ДНК
из Mycobacterium phlei (получены в опытах с радиоактивной меткой)

Последовательность
ТфА.
АфА.
ЦфА
ГфА
Частота
0,012
0,024
0,063
0,065

Последовательность
ТфТ
АфТ
ЦфТ
ГфТ
Частота
0,026
0,031
0,045
0,060

Последовательность
ТфГ
АфГ
ЦфГ
ГфГ
Частота
0,063
0,045
0,139
0,090

Последовательность
ТфЦ
АфЦ
ЦфЦ
ГфЦ
Частота
0,061
0,064
0,090
0,122.

Биосинтез нуклеиновых кислот
511
Совокупность этих и аналогичных данных позволяет сформулировать
три важных вывода: 1) в молекулах ДНК встречаются все 16 динуклеотид-
ных последовательностей, но частота, с которой они встречаются,
существенно зависит от источника ДНК; 2) частота, с которой отдельные динуклеотид-
ные последовательности встречаются в ДНК-продукте, практически не
отличается от соответствующих частот для ДНК-затравки, что служит еще
одним доказательством матричной роли затравки в ДНК-полимеразиой
реакции; 3) в результате ДНК-полимеразной реакции образуется продукт,
в котором цепи ориентированы противоположно (антипараллелъно), что
согласуется с моделью структуры ДНК, предложенной Уотсоном и Криком.
т
А
Г
А
А
Т
и
т
ТфА @,012) =ТфА @,012)
АфГ @,045)= ИфТ@,045)
А ГфА @,065) = ТфЦ @,061)
ТфА @,012) = АфТ @,031)
АфГ (О,ОІ5) = ТфЦ @,06])
б ГфА @,065) = ЦфТ @,045)
Фиг. 164.
А. Антипараллельная ориентация цепей ДНК (модель Уотсона— Крика), Б. Модель ДНК, в которой
цепи ориентированы параллельно.
Ввиду существования комплементарного спаривания оснований некоторые динуклеотидные
последовательности должны встречаться одинаково часто. Равенство или неравенства частот данных динуклео-
тидных последовательностей зависит от того, как ориентированы цепи: параллельно или антішараллсль-
но. Величины в скобках — экспериментально определенные частоты указанных дипуклеотидпых
последовательностей в ДНК из Ы. phlei.
Третий вывод вытекает из следующих соображений. В силу
комплементарного спаривания оснований некоторые динуклеотидные
последовательности должны встречаться одинаково часто; равенство или неравенство
частот данных последовательностей зависит от того, как ориентированы
две цепи: параллельно или антипараллельно. Например, при
антипараллельной ориентации цепей в ДНК из M. phlei частота динуклеотидной
последовательности АфГ @,045) должна быть равной частоте ЦфТ @,045),
тогда как при параллельной ориентации цепей она должна быть равной
частоте ТфЦ @,061). Экспериментальные данные показывают, что в
действительности реализуется первая из двух возможностей, схематически
представленных на фиг. 164.
Сравнение частот «ближайших соседей» и нуклеотидных составов ДНК-
затравки и ДНК-продукта ясно указывает на матричную роль затравки.
Однако из приведенных выше данных не следует, что молекулы продукта
и затравки полностью идентичны. Действительно, по крайней мере в
условиях реакции in vitro, структуры продукта и затравки, по-видимому,
неодинаковы. Как было отмечено выше, физические' свойства ДНК-продукта
близки, но не идентичны физическим свойствам ДНК-затравки. Кроме того,
электронно-микроскопическое исследование ДНК, синтезированной в
присутствии нативной двухцепочечной ДНК-затравки, показало, что в синте-

512 Глава XX
тичсской ДНК (в отличие от нативной ДНК) часто встречаются точки
ветвления. Таким образом, фермент не копирует цепь ДНК от начала до
конца. Возможно, что разветвления возникают, когда сначала копируется
одна цепь ДНК, а затем в результате перекреста начинается копирование
комплементарной цепи-партнера. Имеются, однако, и другие объяснения.
В присутствии ДНК-затравки, содержащей одноцепочечные участки, ДНК-
полимераза служит репарирующим ферментом, восстанавливающим двух-
цсчючечную структуру. Дальнейший синтез на двухцепочечной
ДНК-затравке приводит, как указано выше, к образованию разветвленных структур.
Таким образом, возможно, что и in vivo ДНК-полимераза играет роль
репарирующего фермента, т. е. что функция ее сводится к исправлению
повреждений в ДНК. Однако не исключено также, что in vivo этот фермент
участвует и в репарации повреждений, и в редупликации ДНК.
БИОСИНТЕЗ РНК
Обнаружено несколько ферментов, способных катализировать
поликонденсацию рибонуклеозидполифосфатов, приводящую к образованию
РНК. Эти ферменты отличаются друг от друга природой используемых
субстратов и затравок. Полинуклеотидфосфорилаза была открыта первой —
ее выделили жз экстрактов Azotobacter vinelandii Грунберг-Манаго и Очоа.
Этот фермент (нуждающийся в затравке) катализирует образование РНК
из рибонуклеозиддифосфатов:|!
PHK1 ' щф
™4УДФ]
Продукт полинуклеотидфосфорилазной реакции представляет собой
линейный сополимер со случайной последовательностью рибонуклеотидных
мономеров, связанных между собой 3',5'-фосфодиэфирными связями (что
было доказано путем химической и ферментативной деградации этого
продукта). Таким образом, продукт полинуклеотидфосфорилазной реакции
химически идентичен природным рибонуклеиновым кислотам.
Биологическая функция полинуклеотидфосфорилазы неизвестна.
Маловероятно, чтобы этот фермент участвовал в синтезе различных типов
клеточной РНК, так как, во-первых, при характерных для внутриклеточной
«реды концентрациях рибонуклеозиддифосфатов и неорганического фосфата
положение равновесия реакции сдвинуто в сторону фосфоролиза, а не в
сторону поликонденсации и, во-вторых, первичные структуры затравки и
продукта различны. Последний аргумент особенно важен, так как
специфичность нуклеотидных последовательностей раздичных типов клеточной РНК
может быть обеспечена (как и в случае ДНК) только управляемым
синтезом. Возможно, что полинуклеотидфосфорилаза функционирует как
расщепляющий фермент, разрушая ненужную РНК и освобождая рибонуклеозид-
дифосфаты, которые могут, например, использоваться как предшественники
дезоксирибонуклеозидов (и, следовательно, ДНК).
Специфический РНК-синтезирующий фермент, механизм действия
которого во многом сходен с механизмом действия ДНК-полимеразы, был открыт
Вейссом и его сотрудниками в печени крысы. Этот фермент — РНК-поли-
мераза, или транскриптаза,— катализирует образование полимера из рибо-

Биосинтез нуклеиновых кислот 513
нуклеозидтрифосфатов:
ге4АТФ
ІЧУТФ днк Г
L ЦМФ _
1 ге2)ФФи (ХХ.З)
ге2ЦТФ
Позднее подобные ферменты были выделены из ряда других источников.
Полимерный продукт РНК-полимеразной реакции химически идентичен
природной РНК. Реакция (ХХ.З), подобно реакциям, катализируемым
ДНК-полимеразой и полинуклеотидфосфорилазой, в заметной степени
обратима и нуждается в присутствии ионов двухвалентного металла, обычно
магния. Для РНК-полимеразной реакции необходимо присутствие всех
четырех рибонуклеозидтрифосфатов. Особенно интересна потребность
в ДНК-затравке. Естественно, возникает вопрос о соотношении между
структурами ДНК-затравки и РНК-продукта. Ниже приводятся
экспериментальные факты, четко подтверждающие матричную роль ДНК-затравки в
синтезе РНК, а также тот факт, что нуклеотидная последовательность в ДНК-
затравке точно транскрибируется в комплементарную нуклеотидную
последовательность РНК.
1. Нуклеотидный состав продукта почти идентичен нуклеотидному
составу затравки (с учетом замены тимина па урацил). Если в качестве затравки
используется одноцепочечная ДНК фага срХ174, то нуклеотидный состав
образующейся РНК, как и следует ожидать, оказывается комплементарным
нуклеотидному составу ДНК. Аналогичная ситуация имеет место при
использовании в качестве матрицы сополимера дАдТ (с регулярным чередованием
А и Т), образующегося в ДНК-полимеразной реакции в присутствии
соответствующих трифосфатов и в отсутствие затравки. В этом случае в РНК-
продукт включаются только УМФ и АМФ, причем включение каждого
из них зависит от присутствия второго трифосфата.
2. Частоты «ближайших соседей» для продукта идентичны
соответствующим величинам для затравки. В случае дАдТ-затравки с регулярным
чередованием А и Т такая идентичность свидетельствует о полной компле-
ментарности структур.
3. С помощью метода гибридизации (см. гл. V) можно показать, что
ДНК-затравка образует специфические комплексы с РНК-продуктом.
Существование специфических комплексов РНК — ДНК также указывает на
комплементарность обширных участков продукта и затравки.
4. Было показано, что после заражения Е. coll бактериофагом Т4 на
фаговой ДНК-матрице начинает синтезироваться фагоспецифичная РНК,
которую можно отличить от бактериальной РНК. Оказалось, что в РНК,
синтезируемой на мутантной Т4-ДНК, в которой один из участков выпал (деле-
ция), отсутствует специфическая нуклеотидная последовательность,
имеющаяся в РНК фага дикого типа. Этот результат также можно расценивать как
доказательство комплементарного спаривания оснований при синтезе РНК.
5. Вся клеточная РНК в клетках, не зараженных вирусом,
синтезируется in vivo на ДНК-матрицах.
6. Антибиотик актиномицин, прочно связывающийся с ДНК, действует
как мощный ингибитор синтеза РНК (см. ниже).
Таким образом, РНК-полимераза транскрибирует нуклеотидную
последовательность ДНК-матрицы в комплементарную нуклеотидную
последовательность РНК. В следующей главе будет показано, что транскрипция
тесно связана с проблемой информационной (или матричной) РНК (т-РНК),
33—246

514 Глава XX
а также с общей проблемой образования специфических полипептидов под
управлением ДНК.
Из идєнтрічности нуклеотидных составов и частот «ближайших соседей»,
а также из того, что значительная часть ДНК-затравки может образовывать
специфические комплексы с РНК-продуктом, с большой долей вероятности
следует, что in vitro обе цепи ДНК транскрибируются в РНК. Справедливо
ли это также и для синтеза РНК in vivo? Далее, нам різвєстно, что в
пробирке как одноцепочечная, так и двухцепочечная ДНК может служить
матрицей в РНК-полимеразной реакции. Вправе ли мы считать, что так
же обстоит дело и in vivo? Рассмотррім первый вопрос. Согласно имеющимся
данным, в интактной клетке копируется только одна из двух цепей ДНК.
Баутц и Холл нашли, что нуклеотидный состав Т4-специфичной РНК.
выделенной из клеток, зараженных бактериофагом Т4, не согласуется
с предположением о копировании обеих цепей Т4-ДНК. В дальнейшем
Сяигелманом и его сотрудниками было показано, что в случае фага срХ174
копируется только одна цепь двухцепочечной репликативной формы его
ДНК, а именно цепь, комплементарная исходной одноцепочечной ДНК
этого фага. Двухцепочечные ДНК некоторых бактериофагов удалось раз-
дєлріть на отдельные цепи; оказалось, что то-РНК, синтезріруемая вскоре
после зараженрш, комплементарна только одной різ двух цепей
соответствующей фаговой ДНК. Даже in vitro очищенная РНК-полимераза
транскрибирует (в определенных условиях) только одну из двух цепей
двухцепочечной ДНК.
Кроме ДНК-зависимого срштеза РНК, известны также РНК-зависимые
РНК-полимеразные реакцрш. РНК-полимеразы из М. lysodeikticus и Azoto-
bacter используют в качестве затравки как РНК так и ДНК, причем в обоих
случаях затравки служат матрицами. РНК-полимераза різ Е. coli может
использовать в качестве затравки (в присутствии Мп2+) не только ДНК,
но и РНК с большой долей двухспиральных структур, например РНК
из некоторых врірусов животных (реовирусы). Таким образом, для
транскрипции и в этом случае необходршы двухцепочечные спиралрі, а ионы
Мп2+ и здесь, как мы видим, уменьшают специфичность реакции. Поли-
нуклеотидная цепь РНК in vivo и in vitro растет в направлении 5'-->- 3':
Заражение бактериальной клетки РНК-содержащим фагом, например f2
(или родственным фагом MS2) или фагом Q?, индуцирует образование РНК-
зависимых РНК-полимераз. Эти ферменты ответственны за воспроизведение
фаговой РНК в клетке-хозяине. Было показано, что РНК-полимеразы,
индуцируемые фагами MS2 и Q?, в отличие от других полимераз
используют в качестве затравки только РНК из того же вида фага. Другими
словами, фермент фага Q? не способен использовать в качестве затравки РНК
из фага MS2, pi наоборот. РНК из других источников также не могут
служить затравкой для этих ферментов. Такая специфичность весьма
существенна для размножения фага, так как подавляющее большинство молекул
внутриклеточной РНК — это РНК клетки-хозяина. С помощью фермента
з фага Q? Спигелману удалось синтезировать in vitro биологрічески
активную, т. е. инфекционную, РНК этого фага. Заметим, что и в этом случае

Биосинтез нуклеиновых кислот
515
высокая специфичность и селективность РНК-полимеразной реакции
проявлялись лишь в присутствии Mg2+, но не в присутствии Мп2+.
Таблица 58
Ферменты, катализирующие синтез полинуклеотидов
Название
ДНК-полиме-
раза (душш-
каза)

ДНК-зависимая РНК-по-
лимераза
(транскрип-
таза)

РНК-зависимая РНК-по-
лимераза
(репликаза)
Полинуклео-
тидфосфо-
рилаза
Поли-А-поли-
мераза 3)
Источник
Е. coli,
животные клетки

Микроорганизмы,
животные и
растительные
клетки

Микроорганизмы (особенно
клетки,
зараженные
вирусом)

Микроорганизмы
Тимус теленка,
куриный
эмбрион
Субстрат
Все четыре
дезоксинук-
леозидтри-
фосфата
Все четыре
рибонуклео-
зидтрифос-
фата
То же
Один, два, три
или четыре
рибонуклео-
зиддифосфа-
та
АТФ
Продукт
ДНКі)
(двухце-
почеч-
ная)
РНК (одно-

цепочечная)
РНК
РНК (го-
мополи-
мер или

сополимер)
Поли-А
Затравка
Днк
ДНК 2)
РНК
Олигорибо-
нуклео-
тиды и
полири-
бонуклео-
тиды
РНК (по-
ли-А?)
Функция
затравки
Матрица
»
»
Начальная
точка
удлинения цепи;
не
исключены и другие
функции
Вероятно,
матрица
і) В отсутствие затравки (после продолжительного периода индукции) фермент катализирует
также образование упорядоченных сополимеров (например, дАдТ-сополимера) и двухцепочечного гомо-
полимера дГ : дЦ.
2) Некоторые РНК-полимеразы в определенных условиях могут также использовать в качестве
затравки РНК.
3) Было обнаружено несколько ферментов, катализирующих реакции этого типа.
В табл. 58 перечислены основные типы ферментов, ответственных за
образование полинуклеотидов.
ХИМИЧЕСКОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА НУКЛЕИНОВЫХ
КИСЛОТ
Интерес к химическому ингибированию биосинтеза нуклеиновых кислот
обусловлен главным образом двумя причинами. Во-первых, такие
ингибиторы — весьма удобный «инструмент» для исследования взаимосвязей в
синтезе ДНК, РНК и белка. Во-вторых, они представляют большой интерес
как антиметаболиты, и в особенности как противоопухолевые агенты. Это
связано с тем, что без синтеза нуклеиновых кислот и зависимого от него
синтеза белка деление клетки невозможно. Наиболее очевидное
биохимическое отличие бактериальных и раковых клеток от нормальных
соматических клеток взрослого животного состоит в том, что бактериальные и
раковые клетки делятся гораздо чаще, чем нормальные соматические клетки *.
Следовательно, антиметаболитное действие ингибиторов синтеза
нуклеиновых кислот в отношении бактерий и раковых клеток должно быть более
1 Этот критерий, однако, примепим не ко всем раковым клеткам.— Прим. ред.
33*

516 Глава XX
эффективным, чем в отношении нормальных соматических клеток организма-
хозяина. Именно на такой частичной избирательности токсического действия
этих агентов основано их применение в медицине.
Большинство химических ингибиторов синтеза нуклеиновых кислот
являются структурными аналогами соединений, обычно используемых для этого
синтеза, причем в некоторых случаях такие антиметаболиты представляют
собой мощные конкурентные ингибиторы ферментов, катализирующих
отдельные этапы синтеза. К этой группе веществ-антиметаболитов относятся
некоторые аналоги пуринов, пиримидинов, глутамина и фолиевой кислоты.
АНАЛОГИ ПИРИМИДИНОВ
Механизм ингибирующего действия аналогов пиримидинов сходен с
механизмом, рассмотренным выше. Наиболее мощные ингибиторы этого
типа, 5-фторпиримидины (в особенности 5-фтордезоксиуридин),
специфически иигнбируют синтез ДНК, подавляя тимидилатсинтетазную реакцию.
В некоторых случаях 5-фторпиримидины включаются в РИК, что приводит
к синтезу измененных фермептов. Такие ферменты обычно (но не всегда)
каталитически менее "активны, чем нормальные, не измененные ферменты.
Включение 5-фторпиримидинов в ДНК, по-видимому, не имеет места. Однако
соответствующие хлор-, бром- и иодпроизводные легко включаются в ДНК,
замещая тимин, в результате чего образуются дефектные молекулы ДНК.
Особенно эффективен 5-бромдезоксиуридин, обладающий сильным
мутагенным действием (см. гл. XIX). Отличие 5-фторпиримидинов от других
5-галоидниримидинов обусловлено тем, что вандерваальсовы радиусы хлора,
брома и иода достаточно близки к вандерваальсовому радиусу метильной
группы — заместителя в положении 5 тимина. Что же касается атома фтора,
то он слишком мал'и его радиус ближе к радиусу водорода (заместителя
в положении 5 урацила), чем к радиусу метильной группы тимина. Именно
поэтому фторпроизводные, но не другие галоидпроизводные могут
конкурировать с производными урацила в тимидилатсинтетазной реакции, а хлор-,
бром- и иод (но не фтор-)производные конкурируют с тимином при синтезе
ДНК.
HOCH
он
Б-фтордезоксиуридин
АКТИНОМИЦИН D
Актиномицин D — это антибиотик, выделенный из Strepiomyces. Его
молекула имеет довольно сложную структуру: она построена из двух коротких
пептидных цепей, связанных амидной связью с производным феноксазина.
',..,) In vivo актиномщин D в низких концентрациях ингибирует синтез РНК,
но не ингибирует синтеза ДНК. Было показано, что этот антибиотик прочно
связывается с ДНК, но не взаимодействует с РНК. Естественно
предположить, что связывание актиномицина D с ДНК препятствует синтезу РНК
на ДНК-матрице, но не препятствует синтезу самой ДНК. Если эта гипо-

Биосинтез нуклеиновых кислот
517
H
H
I
СН3-С-СН3 CH3-C-CH3 О
СНт- НС
CH-CHj
"О
СН3
СН3
Актиномицин D
теза правильна, то весь (или почти весь) сиитез РНК в клетке должеп быть
ДНК-зависимыы, так как после введения актиномицина D синтез РНК
почти полностью прекращается. Выяснилось, что ДНК-зависимая РНК-
полимераза очень сильно ингибируется актиномицином, причем это миги-
бирование уменьшается при добавлении избытка ДНК. В то же время ДНК-
полимераза ингибируется актиномициноы в гораздо меньшей степени, чем
ДНК-зависимая РНК-полимераза, а РНК-зависимая РНК-полимераза и по-
линуклеотидфосфорилаза вообще не ингибируются этим антибітотиком. Легко
видеть, что эти результаты согласуются с рассмотренной выше гипотезой,
основанной на связывании актиномицина с ДНК. Было высказано
предположение, что антибиотик образует водородные связи с гуанинами ДНК
и что боковые группы его пептидных цепей размещаются при этом в глубокой
бороздке двухцепочечной молекулы ДНК (см. гл. V).
ЛИТЕРАТУРА
Brockman R. W., Anderson E. P., Biochemistry of Cancer, Aun. Rev. Biochem.,
32, 463 D963).
Chargalf E., Essays on Nucleic Acids, Elsevier, New York, 1963.
Cliargaff E., Davidson I. N. (eds.), The Nucleic Acids, vols. I, II A955), and
III A960), Academic Press, New York. (Нуклеиновые кислоты, ИЛ, M., 1962.)
Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, Synthesis and Structure of Mac-
romolecules, vol. XXVIII A963).
G e о г g і є v G. P., The Nature and Biosynthesis of Nuclear Ribonucleic Acids, Progr.
Nucleic Acid Res. in Mol. Biol., 6, 259 A967).
Grunberg-Manago M., Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids, Ann. Rev. Bioc-
hem., 31, 301 A962).
H 0 r s h e y A. D., in D. E. Green (ed.), «Currents in Biochemical Research», p. 1, lnter-
scionce, New York, 1956.
Karnofsky D. A., Clark son B. D., Cellular Effects of Anti-cancer Drugs, Ann.
Rev. Pharm., 3, 357 A963).
Perutz M. F., Proteins and Nucleic Acids, Structure and Function, Elscvicr, New York,.
1962.
S і n s h є і m e r R. L., First Stops Toward a Genetic Chemistry, Science, 125, 1123 1957),.

518 Глава XX
Stevens A., Ribonucleic Acids, Biosynthesis and Degradation, Ann. Rev. Biochem
32, 15 A963).
Taylor J. H. (ed.), Molecular Genetics, Academic Press, New York, 1963. (В кн.
«Молекулярная генетика», изд-во «Мир», 1964, стр. 72.)
Weis s man С, Ochoa S., Replication of Phage RNA, Progr. Nucleic Acid Res. in
Mol. Biol., 6, 353 A967).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ^ЛИТЕРАТУРА
И н г р э м В., Биосинтез макромолекул, изд-во «Мир», М., 1966.
Форменты и синтез биополимеров, сб. статей, изд-во «Мир», М., 1967.
Биосинтез белка и нуклеиновых кислот, сб. статей под ред. А. С. Спирина, изд-во «Наука»,
М., 1965.
Нуклеиновые кислоты, сб. статей, изд-во «Мир», М., 1966.
Дэвидсон Дж., Биохимия нуклеиновых кислот, изд-во «Мир», М., 1968

Глава XXI
БИОСИНТЕЗ БЕЛКА
БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ
Крупные успехи в понимании биохимических аспектов синтеза белка
были достигнуты главным образом благодаря тому, что исследователи
научились воспроизводить большинство наиболее важных этапов этого процесса
в бесклеточных системах; использование различных методов, основанных
на применении бесклеточных систем, является одной из наиболее
характерных черт современной биохимии. Первая бесклеточная система,
предложенная в 1952 г. Сикевицем (работавшим тогда в лаборатории Замечника в
Гарвардском университете), содержала микросомную фракцию печени крыс.
В последующие три года в лаборатории Замечника и одновременно в
нескольких других лабораториях были сделаны важные открытия. Было
показано, во-первых, что в микросомной фракции за синтез белка
ответственны рибосомы; во-вторых, что аминокислоты, принимающие участие
в биосинтезе белка, активируются АТФ в реакции, катализируемой
специфическими активирующими ферментами (аминоацилсинтетазами или
ацилазами), которая приводит к образованию неорганического пирофосфата,
и, в-третьих, что природными акцепторами для этих аминокислот служат
особые разновидности низкомолекулярной РНК, получившие позднее
название транспортных РНК (s-PHK).
В дальнейшем для проведения большинства наиболее важных
исследований использовались две бесклеточные системы:
1. Система из ретикулоцитов (незрелых эритроцитов) кролика, впервые
изученная Швитом в 1958 г. В этой системе происходит синтез (или, во
всяком случае, завершение синтеза) цепей гемоглобина — хорошо изученного
растворимого белка, первичная структура которого в настоящее время
точно известна (см. гл. IV).
2. Аналогичная система из Е. coli, впервые изученная в 1960 г. Ламбор-
гом и Замечником, а также Тиссиером с сотрудниками. Эта система
обладает тремя важными преимуществами: а) активность ее значительно выше,
чем у всех других исследованных систем; б) в определенных условиях она
сохраняет большую часть свойств, присущих системе in vivo, в том числе
способность передавать информацию в последовательности ДНК -> РНК -*¦
белок, т. е. стимулировать включение аминокислот в белок при добавлении
ДНК и, следовательно, обеспечивать активный синтез РНК; в) система
может в высшей степени специфически реагировать на внесение очищенных
олиго- и полирибонуклеотидных матриц (как природных, так и
синтетических). Это последнее свойство бесклеточной системы из Е. coli, впервые
обнаруженное Ниренбергом и Маттеи в 1961 г. и несколько позднее Очоа
и его сотрудниками, особенно важно. Именно оно позволило вплотную
подойти к расшифровке генетического кода.
Исследования, проведенные с использованием описанных бесклеточных
систем, а также большого числа систем другого происхождения, позволили
выяснить общую картину белкового синтеза и установить, что для этого
процесса необходимы следующие компоненты (фиг. 165):

7OS-puoocoMa
Полимераза
n НТФ
І(фффН1ф---Нг-і *фффИг
»фффН,ф---Нг.,Нг)
Связывание первой
au-s-РНК
Первый комплекс
aa-s-PHK/m-PHK
движется к "активному '
центри, связывается
вторая aa-s-PHK
Образована первая пептидная
связь- первая aa-s-PHK
готова к уходи с рибосомы
Второй комплекс
aas-РІЩ/т-РНК
движется к "активному"
центру
Полисома,состоящая ш
нескольких (в данном случае трех)
рибосом + т-РНК; одновременно
синтезируются три идентичные
полипетпианые цени;
первая цель (на рибосоме А )
близка к завершению,
вторая цепь (на рибосоме В)
находится в стадии расти ;
третья цепь (на рибосоме С)
только начинает расти
Начало освобождения т-РНК
и завершенной полипептиднои
цепи
RSH 1 К', ТФ2
1
1Р~- ОЬ
+
С-СН—NH,
О Я,
-O-CO-CHNHC0CH+NHj
I I
R, R,
О-С — CHNHCO—CH + NH3
І І
о R. R,
У
NH-CU-CH*NH,
R,
-О-С—СИ—NH-CO-CH-NH-CO-CHNH COCH'NH,
I I
ОСО— СИ—NHj,
ОСО—CH —NH —CO-
ОСО—СН—NH2
L OCO-CH — NH-
I
OCOCH-NH2
OCOCH —NHCO ¦
Rie
NHCOCH'NHj
I
R ,
NHCOCH-iNHj
I
R,
Фиг. 165. Отдельные стадии бпосіштеза белка.

Биосинтез белка 52I
1. Двадцать обычных аминокислот в достаточных количествах.
2. Не менее 20 ферментов, активирующих аминокислоты, плюс
соответствующее количество АТФ.
3. От 20 до 50 (?) различных видов молекул s-PHK — по числу
смысловых кодонов или групп эквивалентных кодоиов (синонимов),
соответствующих отдельным аминокислотам. Такой фонд молекул s-PHK
представляет собой, по существу, «генетический словарь», обеспечивающий переход
от полинуклеотида к полипситиду в соответствии с кодом.
4. Молекулы, способные выполнять функцию матрицы. При синтезе
специфического полипептида, являющегося структурной частью
биологически активного белка, роль такой матрицы играет полирибонуклеотид,
в котором полностью и точно транскрибирована нуклеотидная
последовательность соответствующего генетически активного участка ДНК.
5. Активные, неповрежденные TOS-рибосомы (или SOS-рибосомы в случае
высших организмов), каждая из которых содержит функциональные 30S-
и бОЭ-субчастицы.
6. Не менее двух ферментных компонентов (так называемых
трансферних факторов), присутствие которых необходимо для образования
полипептида.
7. Фонд ГТФ, восстановитель (глутатион, меркаптоэтанол и т. д.),
а также ионы К+ и Mg2+, без которых не могут идти указанные ниже
процессы.
8. Система или системы, обеспечивающие инициирование роста и
освобождение готовой полипептидной цепи.
Все эти компоненты принимают участие в серии последовательно
протекающих реакций, указанных на фиг. 165. Процесс в целом состоит из
следующих стадий:
а) активация аминокислот и образованріе молекул аминоацил-s-PHK;
б) образование специфического комплекса между рибосомами и
информационной РНК (тте-РНК);
в) связывание аминоацил-s-PHK с этим комплексом;
г) инициирование роста пептидной цепи и образование пептидных связей;
д) отделение готовых полипептидных цепей от комплекса.
Ниже все эти стадии рассмотрены по отдельности.
АКТИВАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ И ОБРАЗОВАНИЕ АМИПОАЦИЛ-к-РНК
Активирующие ферменты (синтетазы). Эти ферменты обладают высокой
степенью специфичности в отношении отдельных аминокислот и
катализируют следующие реакции:
Аминокислота^.-!- АТФ + ЕЖ ~IZl (АмипоацплжАМФ-Еж) -|- ФФ„ (а)
Me 2 +
(АминоадилжАМФ-Еж) + А-РНКя ^Ш^ Амігаоацилх.5-РНК:х:-)-Ех +АМФ (б)
Еж ^
АТФ-(- Аминокислота^ -\- s-PIIK^ ^ Лмішоацилж-8-РНКж + АМФ + ФФ„
Реакция а имеет много общего с первой стадией ферментативной
активации ацетата и высших жирных кислот (см. гл. ХШ). Для обеих реакций
(а и б) характерна субстратная специфичность, однако «отбраковка»
неподходящих партнеров осуществляется более строго в реакции б. Этого,
собственно, и следовало ожидать, поскольку на стадии б происходит взаимное
узнавание двух специфических макромолекул. Вероятность активирования
неподходящей природной аминокислоты (вместо подходящей для данной

522 Глава XXI
реакции) оценивается величиной 0,0001. Столь высокая степень
специфичности имеет исключительно важное значение: она сводит к минимуму
ошибки при синтезе белка, т. е. обеспечивает чрезвычайно высокую точность
процесса трансляции. После того как надлежащая аминоацил-s-PHK
образовалась, единственным фактором, направляющим (в соответствии с кодом)
дальнейший процессе, является нуклеотидная последовательность матрицы;
другими словами, на более поздних стадиях отсутствуют какие бы то ни было
дополнительные механизмы, обеспечивающие «отбраковку» неподходящих
аминокислот. В этом состоит сущность предложенной Криком в 1958 г.
адаптпорной гипотезы. Согласно этой гипотезе, «адапторные» молекулы (роль
которых, как нам сейчас известно, выполняют молекулы s-PHK) служат
посредниками между аминокислотами и полинуклеотидом, так как они
обладают способностью связываться одним своим участком со
специфической кодирующей единицей полинуклеотида, а другим — с аминокислотой,
соответствующей этой кодирующей единице.
Адапторная гипотеза объясняет также два важных экспериментальных
факта. С одной стороны, для любого полипептида, однозначно
определяемого соответствующим геном, включение природных, но неподходящих для
данного места аминокислот — крайне редкий факт. С другой стороны,
многие аналоги аминокислот, например такие, как селенометионин (аналог
метионина), гс-фторфенилаланин или тиенилаланин (аналоги фенилаланина),
5-окситриптофан или азатриптофан (аналоги триптофана) и ряд других,
легко включаются в места, предназначенные для тех аминокислот,
аналогами которых они являются. Таким образом, аминокислоты могут
включаться в места, предназначенные для их природных аналогов, только в том
случае, если им удастся «обмануть» активирующий фермент.
Транспортные РНК. Большое внимание, которое привлекают к себе
в последние годы транспортные РНК, обусловлено тем, что они представляют
собой, по существу, отдельные элементы, составляющие генетический
словарь. Интерес к ним особенно усилился после выдающейся работы Хол-
ли, которому в 1965 г. удалось полностью расшифровать первичную струк-
ТУРУ (т- е- нуклеотидную последовательность) одной из аланиновых s-PHK
дрожжей1. Суммируя вкратце некоторые наиболее важные структурные
характеристики молекул s-PHK (см. гл. V), можно сказать, что эти
сравнительно небольшие и поэтому легко растворимые в воде полирибонуклеотиды
весьма однородны по своим размерам (приблизительно 70—80 нуклеотидных
остатков). Помимо четырех обычных оснований они содержат также в
относительно большом количестве редкие, или минорные, основания, в
частности различные метилированные основания и псевдоуридин. Модификация
обычных оснований происходит, по-видимому, уже после их включения
в полимерную структуру. Несмотря на присутствие редких оснований, для
молекул s-PHK характерны высокая степень комплементарности и
выраженная вторичная структура, особенно в присутствии ионов Mg2+.
Возможно, что число различных видов s-PHK совпадает с числом смысловых
кодонов. В некоторых случаях (например, в случае лейцина) оказалось
возможным приписать те или иные фракции s-PHK к отдельным кодоыам:
выяснилось, что данная фракция s-PHK поставляет активированную
аминокислоту только в ответ на совершенно определенный кодон и ни на какой
другой.
Препараты s-PHK из различных источников обнаруживают
значительную видовую специфичность. Характерно, однако, что любому изменению
в структуре s-PHK соответствует надлежащее изменение в структуре а,кти-
1 Вскоре после этого группой советских ученых (А. А. Баев, А. Д. Мирзабеков,
Т. В. Венкстерн и др.) была расшифрована первичная структура одной из валиновых
транспортных РНК.— Прим. ред.

Биосинтез белка 523
вирующего фермента. Эти соображения в сочетании с данными об
универсальности кода и с результатами экспериментов по химической
модификации оснований убедительно подкрепляют предположение о том, что
молекула s-PHK содержит два автономных и структурно разделенных активных
участка. Один из них — антикодон — необходим для взаимодействия
с те-РНК, а другой — для взаимодействия с активирующим ферментом.
Присутствие минорных оснований в s-PHK создает предпосылки для
большого структурного разнообразия во втором из этих участков, что позволяет
объяснить видовую специфичность молекул s-PHK, соответствующих одним
и тем же аминокислотам.
Наряду с выраженной специфичностью различных типов s-PHK для
всех этих молекул характерны также и некоторые общие свойства,
касающиеся как их структуры, так и функции. Структурное сходство видно
из общей формулы всех s-PHK (см. гл. V):
фГф.. .ГфТфУфЦфГф.. .фЦфЦфА.
Молекулы всех s-PHK содержат на одном конце (в «хвосте») остаток
5'-гуаниловой или 5'-цитидиловой кислоты, ближе к середине —
указанную пентануклеотидную последовательность, а на другом конце (в
«голове») — последовательность фЦфЦфА, завершающуюся свободным остатком
З'-аденозина. Именно к этому остатку присоединяется аминокислота, и,
следовательно, все молекулы аминоацил-s-PHK представляют собой ацильные
эфиры, содержащие эфирную группу в положении 2' (или 3'?) концевого
аденозина.
ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСА МЕЖДУ РИБОСОМОЙ И т-РНК
Активный комплекс. Рибосомные частицы из Е. coli, способные
осуществлять синтез белка,— это очастицы с константой седиментации 70 S
и средним диаметром около 180 А. Они состоят из двух неодинаковых C0 S-
и 50 S-) субчастиц, образующих активную рибосому в присутствии
сравнительно высоких концентраций ионов Mg2+ (>10~3 М). Каждая из таких
частиц (молекулярный вес их равен соответственно 9-105 и 1,8-106) состоит
приблизительно на одну треть из белка и на две трети из РНК. Константы
седиментации РНК, содержащейся в этих субчастицах, равны соответственно
16 S и 23 S (мол. вес ~ 6-Ю5 и 1,2-106). 16S- и 23S-PHK отличаются одна
от другой, вероятно, не только по молекулярному весу, но также по нуклео-
тидному составу и по нуклеотидной последовательности.
В системах, способных к эффективному синтезу белка in vivo или in
vitro, единичные 70S- или SOS-рибосомы присоединяются к одноцепочечной
молекуле wi-PHK, образуя комплексы, называемые полирибосомами или
просто полисомами (фиг. 166). В процессе белкового синтеза размер этих
компонентов сохраняется приблизительно постоянным. По мере образования
пептидных связей каждая из рибосом перемещается от одного конца
молекулы wi-PHK к другому ее концу вдоль всей цепи. Когда рибосома
переместится на достаточно большое расстояние, освобождается место для
присоединения другой рибосомы, и так продолжается до тех пор, пока
рибосома, присоединившаяся первой, не достигнет противоположного конца
матрицы или по крайней мере конца данного цистрона. После
присоединения последнего (га-го) аминокислотного остатка более или менее
одновременно происходят следующие два события: готовая полипептидная цепь
отделяется от рибосомы, а та рибосома, которая была ответственна за
процесс удлинения цепи от первого до га-го остатка, либо отсоединяется от
матрицы и пополняет собою фонд свободных рибосом, либо начинает
трансляцию следующего цистрона. Таким образом, средний размер полисомы остается
более или менее постоянным и зависит от размера матрицы. Действительно,

л
Фиг. 166. Электронные микрофотографии полисом.
А. Электронная микрофотография очищенной фракции полисом из мозга крысы. На снимке видны
линейные пентасомы и шаровиднью агрегаты; X 63 000. В. Цитоплазма нейрона Дейтерса из ыозга
кошки. Видно, что 'некоторые рибосомы располагаются вдоль мембраны эидоплазматической сети,
тогда как другие сгруппированы в полисомы; х 52 500.

Биосинтез белка
525
если полисомы, осуществляющие синтез гемоглобина (одна из
полипептидных цепей которого содержит 140 аминокислотных остатков и имеет
молекулярный вес 16 000), или же полисомы нормальных клеток млекопитающих
содержат в среднем 5—6 частиц и их константа седиментации равна
приблизительно 200 S, то у полисом с очень большими нолицистронными матрицами
(например, такими, как РНК вируса полиомиелита) число частиц достигает
16—18, а средняя величина константы седиментации составляет около
600 S; сывороточный альбумин E75 аминокислотных остатков) кодируется
цепью та-РНК длиной 6000 А, вдоль которой располагается 20 рибосом,
a lac- и /iis-матрицы достигают еще больших размеров. Имеющиеся данные
позволяют считать, что в среднем на одну рибосому приходится
приблизительно 30—-35 аминокислот (т. е. около 100 нуклеотидиых остатков).
Образование полисом как in vivo, так и in vilro можно наблюдать не
только с природными молекулами »г-РНК, но также с различными полирибо-
и полидезоксирибонуклеотидами, в том числе с синтетическими гомо- и гете-
рополимерами. Если ввести в бесклеточную систему смесь s-PHK, ацилиро-
ванных соответствующими аминокислотами (или s-PHK -f- свободные
аминокислоты-[-аминоацил-s-PHK—синтетазы-)-АТФ), трансферные и
инициирующие ферменты, ГТФ, а также ионы Mg2+ и К+, то в системе будет
происходить синтез активного белка или полипептида. Именно эти факты,
обнаруженные в опытах по синтезу полипептидов на полинуклеотидпых
матрицах, о которых сообщили в 1961 г. Ииренбсрг и Маттеи, а затем Ленгиел,
Спейер и Очоа, позволили окончательно расшифровать генетический код.
Результаты 'опытов с синтетическими матрицами. Состав триплетов.
Наиболее важную роль в выяснении состава триплетов сыграли следующие
наблюдения. Инкубируя частично очищепную бесклеточную систему из
Е. coli с гомо полимером поли-У (его получали из УДФ при помощи поли-
нуклеотидфосфорилазьт) и с различными смесями аминокислот, в каждой
из которых была помечена только одна аминокислота, Ниренберг и Маттеи
обнаружили включение одного только фелилаланина. Им удалось показать,
что образующийся в этих условиях очень плохо растворимый продукт
представляет собой полифенилаланил. Отсюда вытекало, что поли-У и,
следовательно, триплет (ф)УфУфУ(ф) «кодирует» фенилаланин. Дальнейшие
работы в этом направлении с применением сначала гомополимеров, а затем
различных нерегулярных (статистических) гетерополимеров
(синтезированных в бесклеточной системе с помощью полинуклеотидфосфорилазы) быстро
привели к выяснению нуклеотидного состава — но не нуклеотидной
последовательности — других кодирующих единиц (предположительно их
считали триплетами). Было показано, что поли-Ц кодирует пролин, а поли-А —•
лизин. В опытах с нерегулярными гетерополимерами удалось установить
корреляцию между относительным содержанием гипотетических кодиру-
Таблица 59
Включение аминокислот в бесклеточной системе, содержащей
нерегулярные гетерополимеры
Полимер
Состав триплета
Относительное содержание
данного триплета
(рассчитано в предположении
о случайном распределении
нуюгеотидов)
Относительная частота 1)
включения аминокислот
УГ E : 1)
УУУ
У2Г (УУГ, УГУ,
ГУУ)
УГ2(УГГ, ГУГ,
ГГУ)
ггг
100
20
Фэн A00)
Цпс B0); Вал B0)
Гли D); Три E)
0,8 (очень мало)

526
Глава XXI
Продолжение табл. 59
Полимер
У А E: 1)
АЦ E : 1)
АУ E : 1)
ЦГ E : 1)
Состав триплета
У2А
УА2
ААА
Л2Ц
АЦ2
А2У
АУ2
ЦЦЦ
Ц2г
ЦГ2
Относительное содержание
данного триплета
(рассчитано в предположении
о случайном распределении
нуклсотидов)
20
4
100
20
4
20
4
100
20
4
Относительная частота 1)
включения аминокислот
Тир B5); Илей B0)
Лей A4)
Лиз C); Аспн G)
Лиз A00)
Аспп(ЗО); Тре B3); Глуп D4
Про E)
Илей B0); Аспн B8)
Лей C); Тир C)'
Про A00)
Ала B2); Apr A9)
Гли E)
1) За 100 принято включение фенилаланина при использовании в качестве матрицы чистого гомо-
полимера поли-У (УУУ).
ющих единиц и относительной частотой включения данной аминокислоты.
В табл. 59 приведены результаты одного из таких опытов.
Заключительной частью этой серии исследований явились работы Кораны
и его сотрудников, в которых использовались полимеры с известной нукле-
отидной последовательностью, например АВАВАВ... или АВСАВСАВС...
Эти работы внесли полную ясность в вопрос о структуре кодирующих
триплетов (см. стр. 528).
НАПРАВЛЕНИЕ СЧИТЫВАНИЯ
Еще в ранних исследованиях было показано, что в молекулах белка,
синтезированных при кратковременной инкубации с меченой
аминокислотой, метка распределяется неодинаково. Эти результаты можно
интерпретировать исходя из модели, приведенной на фиг. 167. Согласно этой модели.
синтез полипептидных цепей начинается с одного конца и далее рост цепи
происходит последовательно, путем присоединения одной аминокислоты
за другой до тех пор, пока вся цепь не будет готова. Таким образом, в любой
данный момент в системе присутствуют в разной степени завершенные
полипептиды. Если в какой-то момент добавить к системе меченую аминокислоту
на очень короткое время, не больше того, какое необходимо для завершения
синтеза цепи, то содержание метки в различных цепях, синтез которых
успеет завершиться за время инкубации с меткой, будет прямо
пропорциональным числу остатков этой аминокислоты, включившихся в
достраиваемые цепи. Поэтому радиоактивность отдельных участков полипептидных
цепей должна быть тем выше, чем дальше отстоит этот участок от того конца
цепи, с которого начинается синтез. Исходя из данных по включению,
можно было, следовательно, надеяться однозначно установить этот конец.
Эта модель проверялась на разных системах. Весьма изящные опыты
были проведены, в частности, Динцисом (фиг. 168). В этих опытах ретику-
лоциты инкубировались при 15° с Н3-лейцином в течение различных
промежутков времени (от 4 до 60 мин). Оказалось, что удельная активность
лейцинсодержащих пептидов (семь лейциновых остатков имеется в а-цепи
и восемь — в ?-цепи) возрастает по мере их удаления от N-конца. При
увеличении времени инкубации эта зависимость проявляется слабее.
Во всех изученных системах полипептидная цепь строится путем
последовательного образования пептидных связей, начиная с N-конца. Время,

Рибосомы
Растворимый гемоглобин
Начало
Конец Начало
Конец,
a I J с
Начало
Конец
JTenmuOM
Пептиды
Фиг. 167. Схема последовательного роста полипептидной цепи.
Прямыми линиями обозначены немеченые полипептидные цепи; волнистыми — меченые полипептидные
цепи, образовавшиеся после добавления меченой аминокислоты в момент времени tlP Группы пептидов,
обозначенные через R,— незавершенные полипептидные цепи, соединенные в данный момент с
рибосомами. Считается, что цепи, доетигшие конечной длины, переходят во фракцию растворимого
гемоглобина. В момент времени f2 (левая часть фигуры) две верхние волнистые линии соответствуют
пептидным цепям, целиком образовавшимся из аминокислот за промежуток времени между ^ и t2, две
средние линии — цепям, которые синтезировались в течение этого те промежутка времени, но еще не
достигли конечной длины и остались поэтому присоединенными к рибосомам, и две нижние линии —
цепям, которые достигли к моменту времени 1.г конечной длины, отделились от рибосом и смешались
с другими молекулами растворимого гемоглобина.
I
§
25
(Х-Цепь
Номер аминокислоты
50 75 100
125
р-Цепь
Номер аминокислоты
25 50 75 100

Положение в про-21 Ю
странстве \ \
Время 1 2
Номер пептида
Номер пептида
Фиг. 168. Распределение Г13-лейцина между пептидами, полученными при триптическом
гидролизе растворимого гемоглобина кролика, после того как гемоглобин инкубировался
с меткой (при 15°) в течение разных промежутков времени.
Птш установлении места пептида в полипептидной цепи гемоглобина исходили из того, что остатки
лейцина в гемоглобине кролика расположены так же, как и в гемоглобине человека. Если в даггном
пептиде из гемоглобина человека содержится больше одного остатка лейцина, то для выяснения
положения пептида рассчитывают арифметическое среднее. Последовательность разных пептидов вдоль цепи
определяется положением данного пептида в пространстве, считая с N-конца. После четырехминутной
инкубации метка включается только в пептиды, расположенные близко к С-концу. При более
продолжительной инкубации метка начинает постепенно появляться в пептидах, более близких к N-концу.
Полученные в этих опытах данные позволяют расположить пептиды в той последовательности, в которой
они синтезируются.

-528 Глава XXI
необходимое для полного завершения синтеза полипептидной цепи,
содержащей около 150 аминокислотных остатков, составляет в бесклеточных системах
из тканей позвоночных при 37° приблизительно 3 мин, а при 15° — 7 мин.
В бактериальных системах синтез происходит намного (приблизительно
на один порядок величины) быстрее.
СВЯЗЫВАНИЕ АМИІЮАЦИЛ-s-PHK С КОМПЛЕКСОМ т-РНК—РИБОСОМА
Взаимное узнавание т-РНК и аминоацил-а-РНК. При добавлении олиго-
или полинуклеотидов к рибосомам в бесклеточной системе из Е. coli
создаются условия, в которых может происходить взаимное узнавание и
специфическое связывание кодирующей единицы лг-РНК {кодона) с соответствующей
кодирующей единицей (антикодопом) молекулы s-PHK, несущей
аминокислоту 1. Поли-У индуцирует специфическое связывание фенилаланил-s-PIIK,
и то же самое действие оказывают, как показали Ниренберг и Ледер,
короткие уридин-олигонуклеотиды. Это важное наблюдение и очевидные
следствия, вытекающие из него, позволили Нирепбергу и Ледеру поставить
дальнейшие опыты, с другими олигонуклеотидами, и получить ответы иа три
весьма важных вопроса:
1) каково истинное число нуЕ-елеотидных остатков в кодоне и отличается
ли оно от предполагаемого;
2) все ли кодоны, характеризующиеся одним и тем же нуклеотидным
составом и одинаковой нуклеотидной последовательностью, действуют
одинаково;
3) какова истинная нуклеотидная последовательность в разных кодонах.
Ответы оказались следующими:
1. Минимальная длина цепи олигонуклеотидных матриц, при которой
они еще могут специфически связываться с s-PHK, равна трем. Иными
словами, такие тринукдеотиды, как (фУK, (фАK и (фЦK, еще могут связываться
соответственно с Фен-s-PHK, Лиз-s-PHK и Про-s-PHK, тогда как динуклеоти-
ды (фН)п уже не обладают такой способностью.
2. Существует три возможных способа распределения фосфатных групп
в триплете при данной нуклеотидной последовательности, а именно фХфУф2,
ХфУфгф и ХфУфг, т. е. свободные 3' (и 2')-ОН-группы (а), свободная 5'-
ОН-грулпа (?) и свободные ОН-грунпы в обоих положениях/у). Триплеты,
принадлежащие к этим разным типам, существенно различаются по своей
эффективности. Наиболее эффективен тип а; тип ? практически совсем,
неэффективен, а тип 7 характеризуется промежуточной эффективностью.
Эти результаты позволяют предположить, что считывание триплетов
происходит, как показано ниже, либо начиная со свободного 3' B')-конца
(сплошные линии), либо, наоборот (прерывистые линии), с 5'-конца (в этом случае
\ф^ <pY <pZ,-OH
5'-ОН-групиа должна быть этерифицирована фосфорной кислотой).
Полученные в последнее время данные свидетельствуют о том, что более вероятной
является вторая из этих двух альтернатив 2. Так, например, полинуклеотиды,
1 В литературе принято обычно считать кодовые группы т-РНК первичными
кодирующими единицами, или кодонами. Соответствующие им комплементарные участки
s-PHK называют поэтому антикодонами. Следует, однако, иметь в виду, что в клетках
подлинными первичными кодирующими единицами, безусловно, являются нуклеотид-
нме последовательности в ДНК. Кодоны т-РНК комплементарны этим первичным
кодирующим единицам ДН К, а антикодони s-PHK эквипалентны пм.
2 Образование m-PTIK также начинается с 5'-коица (исходной точкой для полиме-
разы служит фффХ), так что оба процесса — и транскрипция и трансляция —
начинаются с одного и того же коні а цепи.

Биосинтез белка 529
имеющие структуру А(фА)пфЦ, кодируют полилизин с аргинином на С-конце.
Это легко понять, если считывание происходит слева направо; в результате
такого процесса действительно должен получаться полипептид H2N-JIh3-
(Лиз)п/з-і-Аспн-СООИ.
3. Отбор триплета в процессе узнавания осуществляется с высокой
степенью специфичности; при этом существенна не только нуклеотидная
последовательность этого триплета, но и то, на каком из концов триплета
находится данный нуклеотидный остаток. Так, например, введение в
бесклеточную систему ГфУфУ приводит к связыванию Вал-s-PHK, тогда как
УфУфГ пе связывает Вал-s-PHK, но связывает Лей-s-PIiK. Эти и
аналогичные данные в сочетании с фактами, о которых говорилось выше, позволили
в конечном, счете расшифровать структуру всех кодонов (см. табл. 55).
ОШИБКИ ПРИ СЧИТЫВАНИИ КОДА, НЕОДНОЗНАЧНОСТЬ, СУПРЕССИЯ
Из всех рассмотренных результатов, по-видимому, вытекает, что
специфическое взаимодействие между тге-РНК и s-PHK, которое можно назвать
трансляцией на уровне кода, предшествует собственно образованию
пептидной связи и не зависит от этого последнего. Поэтому многие случаи
включения неправильных аминокислот следует, вероятно, объяснить ошибками
именно на этом уровне.
Большой интерес представляют опыты, указывающие на связь между
неточным кодированием и супрессией 1. Напомним, например, наблюдение,
которое упоминалось выше (фиг. 161). Мутация, приводящая к замене Гли-э-
Apr, обусловливает образование неактивного А-белка. Введение в геном
другой, супрессорной мутации, не сцепленной с первой, приводит к тому,
что клетка оказывается способной синтезировать два разных вида А-белка;
большая часть молекул А-белка все еще содержит Apr вместо Гли, но наряду
с этим образуется и некоторое количество молекул, характерных для дикого
типа, что указывает на обратную замену (Арг->- Гли).
Из табл. 55 видно, что Гли соответствует ко дон ГфГфУ(Ц), a Apr —
ЦфГфУ(Ц). Незначительное изменение в структуре глициновой s-PHK или
в рибосомах (см. ниже) или даже в условиях внутриклеточной среды может
привести к тому, что с кодоном ЦГУ(Ц) в тге-РНК свяжется вместо
соответствующего ему комплекса Apr-s-PHK [предполагаемый антикодон в s-PHK —
ГЦА(ГI комплекс Гли-s-PHK [антикодон ЦЦА(Г)].
Условия внутриклеточной среды также могут влиять на взаимодействие
менаду рибосомами, то-РНК и s-PHK. При повышении концентрации Mg2 +
или при понижении температуры в системе с поли-У усиливается включение
лейцина и в то же время уменьшается включение фенилаланина (напомним,
что в обычных условиях эта система осуществляет синтез полифенилаланина;
включение же лейцина — результат неоднозначности кода — бывает в ней
весьма незначительным). Можно предположить, что при определенных
условиях взаимодействие между то-РНК и s-PHK становится менее
специфическим и степень неоднозначности тех или иных кодонов возрастает. Эти
эффекты, наблюдавшиеся in vitro, могут иметь место также и in vivo.
Неспособность гІІ-мутантов фага Т4 размножаться в клетках штамма К12 (К)
можно преодолеть, повысив концентрацию Mg2+ в среде. Избыток лейцина
подавляет рост Aspergillus, но этот эффект можно снять, добавив в среду
1 Молекулярные основы мутации amber (см. табл. 55) и ее супрессии заключаются
в следующем. Исходная мутация может состоять, например, в переходе от ЦАГ (Глун)
или УГГ (Три) к бессмысленному amber-кодону У А Г. При наличии супрессорной
мутации А этот кодов будет восприниматься как код он для серина, так как у штаммов,
несущих такую мутацию, имеется новый тип серияовой s-PHK. Сходным образом обстоит
дело и с двумя другими бессмысленными кодонами —• УАА (ochre) и УГА.
34-246

530 , Глава XXI
фенилаланин. Еще нагляднее следующий факт. Известно, что лейцин
губителен для штамма К12 Е. coli, нуждающегося в фенилаланине, пролине
и гистидине, в том случае, если в питательной среде отсутствует
фенилаланин; однако в отсутствие пролина или гистидина летального действия
лейцина не наблюдается. Наконец, как in vitro, так и in vivo было показано,
что действие некоторых супрессоров, обеспечивающее возможность синтеза
определенных белков, зависит от их способности вызывать неправильную
трансляцию, при которой бессмысленный кодон приобретает несвойственный
ему «смысл»— выполняет функцию триплета, кодирующего требуемую
аминокислоту. Вопрос о природе действия различных супрессоров
рассматривался более подробно в гл. XIX.
ОБРАЗОВАНИЕ ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ И РОСТ ЦЕПИ
1. На каждую рибосому, входящую в состав полисомы, приходится
одна растущая полипептидная цепь.
2. Каждая из рибосом несет не менее двух и не более трех молекул s-PHK.
Считается, что в любой данный момент одна из этих молекул связана с
растущей полипептидной цепью сложноэфирной связью (по 2' (или 3')-положению
концевого аденозина), тогда как другая находится в форме свободной
аминоацил-s-PHK, содержащей аминокислотный остаток, предназначенный для
включения в полипептидную цепь.
3. Энергия, необходимая для передвижения wi-PHK относительно
рибосомы и для помещения молекул аминоацил-s-PHK в требуемое положение,
освобождается, по-видимому, в процессе гидролиза ГТФ.
4. Для образования пептидной связи необходим лабильный сульфгид-
рильный фермент (трансферний фактор 2 или пептидсинтетаза) и ионы К+
(в роли активатора).
Фиг. 165 и 169 поясняют все эти взаимоотношения. Поступающая
молекула аминоацил-s-PHK устанавливается сначала на бОЭ-субчастице
рибосомы в таком положении, чтобы ее кодирующий участок (антикодон) мог
по возможности точно опознать комплементарный кодирующий участок
(кодон) W--PHK, соответствующий N-концевой аминокислоте синтезируемого
полипептида. Затем эта аминоацил-s-PHK перемещается к тому участку
рибосомы, где происходит поликонденсация (участок поликонденсации).
Одновременно т-РНК перемещается на один триплет вдоль рибосомы.
Необходимая для этих перемещений энергия поставляется за счет гидролиза одной
молекулы ГТФ (известно, что в ретикулоцитах для этого гидролиза
требуется фермент — трансферний фактор 1). В результате перемещения
освобождается первый из участков рибосомы (участок опознавания), так что
теперь к нему может присоединиться аминоацил-s-PHK, несущая
аминокислоту 2. Затем остаток аминокислоты 1 присоединяется к свободной
NH2-rpynne аминоацил-s-PHKa с образованием пептидной связи
II
RHN—CH(Ri)C
\ X H \
га—s-PHK,.: О—.?-
Теперь уже к участку поликонденсации перемещается дипептидил-s-PHK,
и это также сопровождается сдвигом щ-РНК относительно рибосомы, после
чего участок опознавания может быть занят новой молекулой аминоацил-s-
PHK. В результате взаимодействия между аминогруппой аминоацил-s-
РНК3 и атомом кислорода эфирной группы дипептидил-s-PHK образуется
новая пептидная связь и растущая полипептидная цепь удлиняется еще

Биосинтез белка
531
ГТФ ГЛФ,Ф„
1 с
і
>
г,
:=o
———
a.
C = O N
;
і
'І'Г
W1 /
Связывание
А
Активация
Б
К*
ПС
ГТФ
ит.д.
Образование первой Активация
пептидной связи j-
В
Фиґ. 169. Детальные схемы первых четырех стадий процесса биосинтеза белка (см. стадии
А — Г на фиг. 165).
ТФ — трансферний фактор; ПС — пептидсинтетаза.
на один аминокислотный остаток. Остается неизвестным, как отделяется
от рибосомы освободившаяся от аминокислоты s-PHK — одновременно
с прибытием новой аминоацил-s-PHK или же через некоторое время (в этом
случае она должна, очевидно, сначала попасть на какой-то участок ухода).
ОТДЕЛЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ ОТ ПОЛИСОМЫ
Факторы, от которых зависит отделение завершенной полипептидной
цепи от полисомы, изучены слабо. Согласно одной из предложенных моделей,
это отделение происходит после того, как через участок поликонденсации
пройдет кодон, соответствующий С-концевому аминокислотному остатку
полипептида; одновременно от полисомы отделяется и рибосома, на которой
произошло это событие. Для полицистронных матриц эта простая модель,
очевидно, не подходит. В этом случае должен, по-видимому, существовать
какой-то сигнал, который вынуждал бы готовую полипептидную цепь
отделяться от рибосомы, а рибосому — приступать к трансляции следующего
цистрона с определенной стартовой точки, или же это должен быть сигнал
для одновременного отделения готовой полипептидной цепи и рибосомы
(несмотря на то что считана еще не вся иг-РНК). В последнем случае
необходим, очевидно, еще один сигнал в начале следующего цистрона, который
служил бы указанием другой, присоединяющейся рибосоме, с какого места
34*

532 Глава XXI
должна снова начинаться трансляция матрицы. Несомненно, что такие
сигналы, позволяющие опознавать конец одного цистрона и начало другого
(или же участки пг-РНК, отделяющие один цистрон от другого),
действительно существуют. Какие структурные элементы могли бы играть эту роль?
Результаты проведенных исследований позволяют указать в качестве
возможных кандидатов бессмысленные триплеты. У Е. coli, например, эту
функцию с успехом мог бы выполнять триплет Ochre (УфАфА).
ИНИЦИИРОВАНИЕ СИНТЕЗА ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ
Точно так же, как необходим сигнал об окончании синтеза
полипептидной цепи, необходим и сигнал относительно начала этого синтеза. Недавние
исследования обнаружили удивительный факт: оказалось, что почти у всех
(а может быть, и у всех) белков Е. сой, по крайней мере в самый момент
их синтеза, на N-конце имеется одна и та же последовательность аминокислот.
Формил-
-NH—Мет-\- АлаА- Сер -\
Позднее формильная группа и остатки метионина, аланина и серина
удаляются (полностью или частично — в зависимости от структуры
конкретного белка). Вполне можно думать поэтому, что именно кодон,
детерминирующий метионин, точнее — узнающий ]М-формилметионил-5-РНК, является
инициирующим. Формилирование 1 происходит на уровне
специфической метионил-s-PHK в результате переноса формильной группы от N10-
формил-ТГФ. Таким образом, инициирование трансляции, а вместе с тем
и транскрипции (поскольку эти два процесса, как известно, тесно связаны
между собой) зависит от наличия ацилированной s-PHK, т. е. в конечном
счете от обмена одноуглеродных соединений.
РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКА
Мы рассмотрим теперь регуляцию биосинтеза белка как в качественно™,
так и в количественном аспекте. Иными с і вами, мы попытаемся ответить
на вопрос, какие факторы определяют, сколько именно данного белка
должно синтезироваться в тот или иной момент жизни клетки. При рассмотрении
этого вопроса нам придется ограничиться в основном данными,
касающимися бактериальных систем, поскольку факторы, регулирующие синтез белка,
изучались преимущественно на этих системах.
ИНГИБИТОРЫ СИНТЕЗА БЕЛКА
Один из подходов, наиболее широко используемых при исследовании
этой проблемы (как, впрочем, и многих других биохимических проблем),
основан на применении специфических ингибиторов, т. е. соединений,
активно вмешивающихся в процесс биосинтеза белка на отдельных его
этапах. Считается, что каждый из таких ингибиторов обладает вполне опре-
1 Необходимость формилирования (или вообще ацилирования) N-концевой
аминокислоты можно понять исходя из механизма, представленного на стр. 530. Очевидно,
что участок поликонденсации должна занимать молекула, у которой R Ф И. Благодаря
ацилированиго реакция образования первой пептидной связи (п = 1) оказывается
по своему механизму экпипалонтной образованию всех последующих пептидных связей
(п ф П.

Биосинтез белка 533
деленным механизмом действия, что и дает возможность выделить некоторые
из промежуточных стадий сложного процесса биосинтеза и изучить каждую
из них в отдельности.
5-метилтриптофан. В отличие от большинства других аналогов
аминокислот 5-метилтриптофан
+NH3
N
H
не включается в белок; он подавляет биосинтез всех триптофансодержащих,
полипептидов, конкурируя с триптофаном за аминоацилсинтетазу, т. е.
препятствуя образованию молекул Три-s-PHK.
Хлорамфеникол. Из различных оптических изомеров этого соединения
только D (— )-трео-форма
H NHCOCHC1,
, і І
ОН H
в сильной степени подавляет как синтез белка и рост бактерий in vivo,
так и синтез полипептидов в бесклеточных системах. Антибиотик
эффективен в концентрациях от 10 до 20 мкг/мл. Его ингибирующее
действие носит многообразный характер. Под действием хлорамфеникола
накапливаются, например, предшественники рибосом. В этом случае
перед нами, по существу, вторичный эффект: нормальный синтез белка
тормозится просто из-за нехватки функционально полноценных рибосом.
Известно также и более прямое действие хлорамфеникола на синтез белка,,
которое определяется тем, что антибиотик обладает способностью
связываться с SOS-субчастицами рибосом. Чувствительностью к хлорамфениколу
отличаются, однако, рибосомы не всех, а только некоторых штаммов
бактерий.
Актидион. Актидион, или циклогексимид
Н3С-
по своему действию как бы дополняет хлорамфеникол. Этот антибиотик
подавляет синтез белка в бесклеточных системах из дрожжей, мицелиаль-
ных грибов и из тканей всех, высших организмов, не оказывая практически
никакого влияния на бактериальные системы. По механизму действия
актидион, по-видимому, очень близок к хлорамфениколу.
Пуромицин. Пуромицин обладает явным структурным сходством с
аминоацил-s-PHK. Он блокирует белковый синтез, функционируя как аналог
аминоацил-s-PHK. Специфическое действие пуромицина основывается на
том, что он заменяет собой вновь поступающую аминоацил-s-PHK,
служащую акцептором активированного пептида, и сам связывается с пептидом
(атака по атому азота, указанному стрелкой). Образовавшийся в результате
этого пептидилпуромицин не может быть переброшен на следующую
аминоацил-s-PHK по связи, указанной волнистой линией, трансацилирование

534
Глава XXI
невозможно), так что рост полипептидной цепи на этом обрывается.
Пурсшицин
О=С—СН—R
NH2
I
Концееой аденозин
аминаацил (или пептидил) -s-PHK
Таким образом, действие пуромицина приводит к тому, что от рибосом
отделяются недостроенные пептиды разной длины. У всех таких пептидов
на N-конце находится соответствующая аминокислота, а на другом конце —
остаток пуромицина (вместо С-концевой аминокислоты).
Стрептомицин, канамицин и родственные аминогликозидные антибиотики.
Эти антибиотики связываются с 50Б-субчастицами рибосом и нарушают
считывание информационной РНК.
¦> ФАКТОРЫ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ СИНТЕЗ БЕЛКА
В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ
Условимся сначала относительно терминов и рассмотрим некоторые
экспериментальные данные, породившие те или иные понятия (см. также
гл. XIX).
Оперон. Бактериальная хромосома подразделяется на ряд оперонов.
Каждый такой оперон представляет собой совокупность генов,
объединенных общим регулированием их выражения, а также тем, что эти гены
контролируют синтез белков, функционально связанных друг с другом.
Особенно подробно изучены опероны, контролирующие у Е. coli и Salmonella
обмен лактозы (локус Lac), биосинтез гистидина (His), обмен галактозы
(Gal), биосинтез лейцина (Leu), биосинтез изо лейцина и валина (Ival) и обмен
арабинозы (Ara). Число генов, составляющих эти опероны, варьирует от трех
(Gal- и Lac-опероны) до девяти (Яії-оперон). В состав Яи-оперона входят
15 цистронов, кодирующих синтез в общей сложности девяти ферментов
(на три фермента приходится по два цистрона, на один — четыре и на
каждый из остальных пяти — по одному цистрону). Общая длина iTjs-оперона
соответствует 13 000 нуклеотидов.
Полицистронная иг-РНК. Хромосомной единицей транскрипции следует
считать, по-видимому, не индивидуальный цистрон или ген, а весь оперон
в целом. При транскрибировании оперона образуется полицистронная
матрица. Для His- и Lac-оперонов были получены доказательства
образования матриц, комплементарных по отношению к ДНК и по своим
размерам соответствующих этим оперо нам. Полицистронные матрицы очень
больших размеров характерны также и для вирусов. Эти матрицы либо
вновь синтезируются (у ДНК-содержащих вирусов), либо используются
уже готовыми (РНК-вирусы).
Оператор. Функционирование отдельных структурных генов,
составляющих оперон, контролируется небольшим участком, расположенным

Биосинтез белка
535
на одном из концов оперона, так называемым оператором. Мутации в
операторном участке затрагивают все гены оперона. Согласно гипотезе Жако-
ба и Моно, операторы осуществляют свое действие на уровне транскрипции,
а не на уровне трансляции. Ниже схематически изображен оперон.
Участки от 1 до л представляют здесь цистроны данного оперона, а
участок О — оператор.
Типы регуляции: репрессия и индукция. Репрессия означает подавление,
а индукция, напротив, усиление синтеза одного или нескольких
специфических белков в результате действия на клетку какого-либо вещества,
играющего регуляторную роль. Такие вещества — это низкомолекулярные
соединения, часто являющиеся структурными аналогами либо конечного
продукта (репрессия), либо субстрата (индукция) данного метаболического пути.
Ропрессибельность и индуцибельность также контролируются на
генетическом уровне. Соответствующие гены {гены-регуляторы) не обязательно
располагаются рядом с теми оперонами, которые они контролируют.
Ген-регулятор контролирует синтез особого продукта — (апо)репрессора,
взаимодействующего с оператором либо позитивно, либо негативно (фиг. 170). В пер-
Типы взаимодействия
Позитивный
Негативный
Типы
регуляции
репрессаро прессора
Добавление
(ana)
индуктора
или каре-
Состояние оперона

Транскрипция
Состояниеоперона
Траис-
крипция
О 1 2 3
О 7 2 3
Шйущия
У/////Л
¦Л—I-
0 1 2 3
Репрессия
WZ& ^й
і ДНК и гены оперона
(Апо)репреаюр (различные конфирмации)
Комплементарнім т-РНК
Индиктор
Репроссир
Фиг. 170. Регуляция выражения генов.

536 Глава XXI
вом случае репрессор включает транскрипцию, во втором он ее выключает.
Это взаимодействие в свою очередь контролируется аллостерическим
взаимодействием с низкомолекулярным соединением, играющим регуляторную
роль. «Негативный» апорепрессор может, например, инактивироваться под
действием индуктора или активироваться под действием корепрессора.
Следовательно, индукция и дерепрессия как формально, так и в смысле
механизма, по существу, эквивалентны. Индукция и репрессия ферментов
у микроорганизмов — широко распространенные явления. Из шести
указанных выше оперонов три, относящиеся к обмену Сахаров, индуцируются
субстратами ферментов или структурными аналогами этих субстратов (как
это и следует ожидать исходя из приведенных выше определений); опероны,
контролирующие биосинтез аминокислот, репрессируются самими этими
аминокислотами.
Репрессия под действием конечных продуктов характерна для процессов
биосинтеза (анаболизма) аминокислот, витаминов, пуринов и пиримиданов;
индукция же, как правило, имеет место при распаде (катаболизме)
источников углерода и энергии 1. Совершенно очевидно, что регуляция
необходима для обеспечения экономичности работы белоксинтезирующей системы.
Синтез ферментов любого метаболического пути включается или
выключается в зависимости от того, сколь велика в данный момент потребность
клетки в этом пути. Зачем синтезировать белки, если они не нужны?
Особенно ярким примером того, как с помощью индукции и репрессии
обеспечивается строгий контроль над синтезом определенной группы белков, может
служить регуляция образования ферментов, катализирующих распад
миндальной кислоты (точнее ее солей — манделатов) у Pseudomonas. Ниже приведена
предполагаемая последовательность реакций распада.
а Ь cd
Маыделат (А) —> Бешоилформиат (В) —> Бензальдэгид (С) —> Бензоат (D) —> Катехин (Е
g
Ацетат + Сукцинат (/) <— <— ?-Кетоадипинат (G)
Прежде всего, все эти ферменты индуцибельны, причем индукция
носит последовательный характер, т. е. добавление вещества А индуцирует
синтез ферментов а, Ъ и т. д., и только с появлением промежуточных
продуктов, например D и Е, может быть индуцирован синтез ферментов d и е. Более
тщательное изучение этого процесса показывает, что все ферменты данной
метаболической последовательности кодируются тремя оперонами, которые
мы обозначим через /, // и ///. Оперон / кодирует синтез ферментов а, Ь и с;
он индуцируется первым субстратом — соединением А — и репрессируется
промежуточным продуктом — соединением D, накапливающимся в
результате работы оперона, а также продуктами, образующимися на более поздних
стадиях, — соединениями Е и /. Оперон // кодирует фермент d; он
индуцируется соединением D и репрессируется соединениями Е и /.
Наконец, оперон /// соответствует ферментам є и /, а также, вероятно,
остальным ферментам; он индуцируется соединением Е и репрессируется
только одним соединением /.
1 Напомпим обобщение, приведенное в гл. XI. Мы указывали там, что ферменты,
задающие скорость анаболических процессов, ингибируются конечными продуктами
данной последовательности реакций, тогда как соответствующие ферменты катаболпчо-
ских путей иногда активируются своими субстратами или продуктами.

Биосинтез белка 537
Вернемся теперь к наиболее подробно исследованному оперону, а именно
к Хас-оперону Е. coll. Этот оперон
Р\
состоит из нескольких тесно сцепленных генов: ген а кодирует тиогалак-
тозид-трансацетилазу, ген у — пермеазу (фермент, обеспечивающий
активный перенос галактозидов в клетку), а ген z — саму ?-галактозидазу.
Обнаружено большое число конститутивных мутантов, способных синтезировать
значительные количества ферментов Z?c-оперона в отсутствие индуктора,
тогда как исходный, дикий тип в отсутствие индуктора практически не
синтезирует этих ферментов. Поскольку индуцибельность определяется геном-
регулятором, который принято обозначать через г, для дикого типа
используют обозначение i+, а для конститутивных мутантов — i~. Если с помощью
конъюгации, трансдукции или секедукции получить ^«с-диплоид z+i+/z~i~,
содержащий обе аллельные формы гена і, то он окажется индуцибельным.
Следовательно, аллель і+ доминирует над аллелем і~, т. є. і+ контролирует
синтез продукта, отсутствующего в і~-клетке. Этот продукт находится
в цитоплазме, так как то/жкс-диплоид z~i+/z+i~ также индуцибелен, и,
следовательно, ген i+ контролирует активность обеих хромосом.
Какова природа вещества (апорепрессора), синтез которого
контролируется геном г? Недавние эксперименты показали, что Lac-penpeccop
представляет собой белок, способный специфически взаимодействовать с /^ас-
операторным участком в ДНК. Функция репрессора заключается в
блокировании транскрипции. Удаление репрессора (обычно в результате
взаимодействия с индуктором) инициирует транскрипцию. Участок, служащий
началом координированного синтеза /п-РНК, расположен рядом с
операторным участком и носит название промотора (р) г. В результате мутации
гена і образуются мутантные репрессоры различных типов; 1~-штаммы либо
вообще не синтезируют Lac-penpeccopa, либо синтезируют дефектный репрес-
сор, не способный блокировать транскрипцию Lac-оперона; іа-штаммьі
синтезируют молекулы репрессора, не способные эффективно
взаимодействовать с индуктором, вследствие чего в этих клетках Lac-оперон выключен
всегда — как в отсутствие индуктора, так и в его присутствии; наконец,
Г-штаммы синтезируют репрессор, которому для соединения с оператором
необходим индуктор. У этих штаммов ферменты Lac-оперона
-синтезируются в отсутствие индуктора, а введение индуктора в среду ингиби-
рует их синтез.
Координация. У любого штамма отношение количества какого-нибудь
одного фермента данного оперона к количеству другого фермента того же
оперона остается постоянным независимо от степени индукции или
репрессии. Это означает, что все белки данного оперона синтезируются в неких
постоянных пропорциях (хотя индукция и репрессия могут в некоторых
случаях повышать или понижать интенсивность их синтеза в 100 и даже
в 1000 раз).
Полярность. Некоторые мутации в структурных генах оперона
оказывают двоякое влияние на синтез белка: они не только приводят к изменению
структуры соответствующего полипептида, но и обусловливают уменьшение
скорости синтеза тех ферментов, которые кодируются генами, расположен-
1 По-видимому, промотор — место подхода молекул РНК-полимеразы к ДНК.-
Лрим. ред.

538 Глава XXI
ными дальше от оператора, чем мутантный ген. Так, например, в
приведенной ниже схеме
мутация в гене 3 влияет на количества ферментов, синтезируемых под
контролем генов 4, 5 я 6. В общем случае мутация в гене п влияет на уровень
синтеза продуктов, контролируемых генами (п + 1), (п + 2) и т. д. Для
белков 1—6 соотношения в уровнях синтеза могут быть, например, следующими:
Репрессия Дерепрессия (индукция)
Дикий тип 10:5:2:1 :1 :0,5 100:50:20:10:10:5
Полярный мутант 3 10:5:0:0,5:0,5:0,25 100:50: 0: 5: 5:2,5
Полярные мутации часто приводят к появлению бессмысленного кодоиа
(прерывающего трансляцию); поэтому они часто являются супрессибель-
ными. Количество синтезируемой иг-РНК зависит от положения полярной
мутации в пределах оперона: чем дальше от оперона находится мутантный
участок, тем большая часть оперона транскрибируется.
Мутации оператора. Первоначально оператор определяли как локус,
мутации в котором (Ос) приводят к конститутивному синтезу всех ферментов
данного оперона. Мутации 0е фенотипически эквивалентны мутациям i~
в том смысле, что в отсутствие внешнего индуктора они обусловливают
некоторое повышение уровня всех ферментов оперона. Их можно, однако,
отличить от мутаций і~ по следующим четырем признакам: 1) мутации 0е
локализуются на одном из концов оперона, тогда как мутации і~
локализуются вне оперона; 2) диплоиды Ос/О+ конститутивны, тогда как диплоиды
і~/і+ индуцибельны; 3) мутация 0е затрагивает только гены одной и той
же хромосомы (цис-конфигурация): диплоид y+z~0ci+/y+z+0+i+
конститутивен по пермеазе, но индуцибелен по jj-галактозидазе; 4) все
мутации О° представляют собой делеции; поэтому они не могут быть супрес-
сированы.
Возможные модели. Эймс, Хартман и Мартин предложили простую
и очень правдоподобную модель, согласующуюся с большинством
имеющихся данных. Согласно этой модели, весь оперон транскрибируется в одну
непрерывную полицистронную молекулу иг~РНК, причем как транскрипция,
так и трансляция начинаются с операторного конца или с какого-то участка,
расположенного вблизи этого конца (с промотора?). Этим же участком
определяется и место присоединения рибосом. В каждый данный момент
тп-РНК транслируется одновременно несколькими рибосомами. Когда
рибосома достигает конца первого цистрона, она может либо оторваться от
матрицы, либо начать транслировать второй цистрон; та же ситуация
возникает у конца второго цистрона и т. д.
Если рибосома доходит до кодона, для которого нет (или слишком мало)
соответствующей s-PHK, то синтез полипептида замедляется или
прекращается. Одновременно замедляется и перемещение рибосомы вдоль иг-РНК,
подобно тому, как это происходит в конце какого-нибудь цистрона. В
результате возрастает вероятность того, что эта рибосома отделится от иг-РНК,
раньше чем ей удастся достичь другого участка матрицы, пригодного для
инициации цепи. За ней могут последовать другие рибосомы и может
начаться разрушение иг-РНК. Индукция на этой стадии способна обеспечить
продолжение синтеза иг-РНК и белка, тогда как репрессия вызывает
противоположный эффект.

Биосинтез белка 539
Эта модель (и другие ей подобные) основывается на экспериментах с
ограниченным числом бактериальных систем. В какой мере такого рода
результаты можно распространить на высшие организмы, пока еще не известно.
ЛИТЕРАТУРА
Ames В. N., Martin R. G., Biochemical Aspects of Genetics: The Operon, Ann. Rev.
Biochem., 33, 235 A964).
Anfinsen C, The Molecular Basis of Evolution, Wiley, New York, 1959. (Анфинсен,
Молекулярные основы эволюции, ИЛ, M., 1962.)
В с с k w і t h J. R., Regulation of the Lac Operon, Science, 156, 597 A967).
Bennett J. CDreyer W. J., Genetic Coding for Protein Structure, Ann. Rev.
Biochem., 33, 205 A964).
В e n z e r S., Genetic Fine Structure, Harvey Lectures, 56, 1 A961).
Bonner D. M., Mills S. E., Heredity, 2nd od., Prentice-Hall, Englewood Cliffs,
N. J., 1964.
С a m p b e 1 1 P. N., The Biosynthesis of Proteins, Progr. Biophys. Mol. Biol., 15, 3 A965).
С о h n N. S., Elements of Cytology, Harcourt, Brace and World, New York, 1964.
Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, vol. 26, Cellular Regulatory
Mechanisms, 1961. (Регуляторные механизмы клетки, изд-во «Мир», M., 4 964.)
Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, vol. 28, Synthesis and Structure
of Macromolecules, 1963.
Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, vol. 31, The Genetic Code, 1966.
Crick F. H. C, The Recent Excitement in the Coding Problem, in J. N. Davidson and
W. E. Cohn (eds.), Progr. in Nucleic Acid Res. and Mol. Biol., 1, 164 A963).
F r e e s e E., Molecular Mechanism of Mutations, in J. H. Taylor (ed.), «Molecular
Genetics», vol. 1, p. 207, Academic Press, New York, 1963. (В кн. «Молекулярная генетика»,
изд-во «Мир», M., 1964, стр. 226.)
Hayes W., The Genetics of Bacteria and Their Viruses, Wiley, New York, 1964.
Horowitz N. H., Metzenberg R. L., Biochemical Aspects of Genetics, Ann.
Rev. Biochem., 34, 527 A965).
M с E 1 г о y W. D., Glass В. (eds.), The Chemical Basis of Heredity, Johns Hopkins
Press, Baltimore, 1957. (Химические основы наследственности, ИЛ, M., 1960.)
Moldave K., Ann. Rev. Biochem., 34, 419 A965).
M о n о d J., J а с о b F., G г о s F., Structural and Rate-determining Factors in the
Biosynthesis of Adaptive Enzymes, in «The Structure and Biosynthesis of
Macromolecules», Biochem. Soc. Symp. (Cambridge, Eng.), vol. 21 A962).
Nirenberg M., Protein Synthesis and the RNA Code, Harvey Lectures, 59, 155 A964).
S a g e r R., R y a n F. J., Cell Heredity, Wiley, New York, 1961. (P. Сэджер и Ф. Райн,
Цитологические и химические основы наследственности, изд-во «Мир», М., 1964.)
Schweet R., Arlinghaus R., Heintz R., Shaeffer J., Mechanism of
Peptide Bond Formation in Protein Synthesis, in Developmental and Metabolic
Control Mechanisms in Neoplasia, 19th Annual M. D. Anderson Symposium on Fundamental
Cancer Research, University of Texas Press, Austin, 1966.
Schweet R., Heintz R., Protein Synthesis, Ann. Rev. Biochem., 35, 723 A966).
Singer M. F., L e d e r M. F., Ann. Rev. Biochem., 35, 195 A966).
Stanbury J. В., Wyngaarden J. В., Frederickson D. S. (eds.), The
Metabolic Basis oE Inherited Disease, McGraw-Hill, New York, 1960.
Steiner R. F., The Chemical Foundations of Molecular Biology, especially chaps.
1 and 11, Van Nostrand, Princeton, N. J., 1965.
S t en t G. S., Molecular Biology of Bacterial Viruses, especially, chaps. 8—10, 13—15,
Freeman, San Francisco, 1963.
(Г. Стент, Молекулярная биология вирусов бактерий, изд-во «Мир», М., 1965.)
Thomas С. A., Recombination of DNA Molecules, in Progr. Nucleic Acid Res. in Mol.
Biol., 5, 315 A967).
Watson J. D., Molecular Biology of the Gene, Benjamin, New York, 1965.
(Молекулярная биология гена, изд-во «Мир», M., 1967.)
Z a m e n h о f S., in Progr. Nucleic Acid Res. in Mol. Biol., 6, 1 A967).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
И н г р э м В., Биосинтез макромолекул, изд-во «Мир», М., 1966.
Биосинтез белка и его регуляция, сб. статей, изд-во «Мир», М., 1967.
Биосинтез белка и нуклеиновых кислот, сб. статей, под ред. А. С. Спирина, изд-во «Наука»,
М., 1965.
Ферменты и синтез биополимеров, сб. статей, изд-во «Мир», М., 1967.
Спирин А. С, Г а в р и л о в а Л. П., Рибосомы, изд-во «Наука», М., 1968.
Боннер Дж., Молекулярная биология развития, изд-во «Мир», М., 1967.

УКАЗАТЕЛЬ АВТОРОВ
Альберти (Alberty) 178
Анфинсен (Anfinsen) 94
Арно (Arnott) 134
Арнон (Arnon) 326, 327
Баркер (Barker) 237
Барнум (Barnum) 340
Бассам (Bassham) 328
Бателли (Batelli) 348
Баутц (Bautz) 514
Белицер 393
Бензер (Benzer) 488, 489, 496
Бенсон (Benson) 328
Бернар (Bernard) 10
Бертло (Berthelot) 9, 25
Берцелиус (Berzelius) 9—11
Бёрк (Burk) 331
Бидл (Beadle) 485
Блайф (Blyth) 230
Блинке (Blinks) 322
Блох (Bloch) 11, 414, 415, 418
Блумфельд (Bloomfield) 178
Болдуин (Baldwin) 369
Бомонт (Beamont) 10
Боннер (Bonner) 445
Браунштейн 221
Бренсон (Branson) 98, 101
Бреслоу (Breslow) 224
Брэди (Brady) 401
Бьюкенен (Buchanan) 461
Бэбкук (Babcook) 11
Бэрк (Burk) 168
Бюхнер (Buchner) 10, 11
Вагелос (Vagelos) 402
Вагнер-Яурегг (Wagner-J auregg) 231
Вакил (Wakil) 400—402
Ван-Ниль (van Niel) 318, 320
Варбург (Warburg) 11, 228, 231,300,303,
331, 370, 388
Вейсс (Weiss) 214, 406, 512
Веннесланд (Vennesland) 229, 230
Вестхеймер (Westheimer) 229, 230, 346
Вёлер (Wohler) 9, 10
Виланд (Wieland) 368, 369
Вилыптеттер (Willstatter) 11
Виноград (Vinograd) 138
Вирхов (Virchow) 240
Вольман (Wollman) 482
Гаксо (Нахо) 322
Гарден (Harden) 228
Гейдушек (Geiduschek) 150
Гёрд (Gurd) 108
Гилес (Giles) 25
Гопкинс (Hopkins) 11, 218
Гэррод (Garrod) 453, 485
Гофмейстер (Hofmeister) 49
Грин (Green) 11, 389
Гринберг (Greenberg) 461
Грунберг-Манаго (Grunberg-Manago) 512
Горовиц (Horowitz) 487
Дакин (Dakin) 339, 340
Дальзиель (Dalziel) 178
Де Дюв (De Duve) 250, 251
Де Фриз (De Vries) 478
Дженкс (Jencks) 35
Джосс 136
Джукс (Jukes) 159
Дикенс (Dickens) 303
Диксон (Dixon) 205
Динцис (Dintzis) 526
Донат (Donath) 223
Дьёрди (Dyorgy) 219
Дэвис (Davis) 11, 444
Дю Виньо (du Vigneaud) 12, 53, 243
Жакоб (Jacob) 482, 503, 535
Замечник (Zamecnik) 519
Ингрэм (Ingram) 96
Иогансен (Iohansen) 478
Ионг (Young) 228
Йенсен (Jansen) 223
Кальвин (Calvin) 328
Калькар (Kalckar) 393
Каплан (Kaplan) 117
Kappep (Karrer) 231
Кейлин (Keilin) 369, 388, 389
Кендрью (Kendrew) 12, 50, 104—106, 111
Кеннеди (Kennedy) 11, 214, 406
Кёгль (Kogl) 234
Клайн (Cline 223

Указатель авторов
541
Клейншмидт (Kleinschmidt) 143
Клеланд (Cleland) 178
Кпюйвер (Kluyver) 318
Кноп (Кпоор) 339—341, 348
Козмен (Kauzmann) 114
Коповик (Colowick) 229
Копьбо (Kolbe) 9
Конингсберг (Koningsberg) 87
Корана (Khorana) 158, 501, 526
Кори (Corey) 98, 99, 101, 106
Корнбсрг (Kornberg) 136, 273, 276, 509,510
Корнфорт (Cornforth) 418
Кошланд (Koshland) 200
Коон (Cohen) 303
Кребс (Krebs) 11
Крик (Crick) 133, 134, 484, 495, 499, 507,
508, 511, 522
Кристиан (Christian) 228, 231
Кун (Kuhn) 231
Кунитц (Kunitz) 12
Кэрнс (Cairns) 143
Лавуазье (Lavpisiei) 10
Лайнуивер (Lineweaver) 168
Ламборг (Lamborg) 519
Левинталь (Levinthal) 143
Ледер (Leder) 528
Ледерберг (Lederberg) 487
Лейн (Lane) 235
Лепуар (Leloir) 11, 285, 308, 311, 340
Ленгиел (Lengyel) 525
Либих (Liebig) 9, 10
Линен (Lynen) 11, 216, 235, 341, 402
Липман (Lipmann) 209, 303, 341, 395, 397
Ломан (Lohmann) 223
Лумис (Loomis) 397
Лыопс (Lewis) 322
Магаааник (Magasanik) 440
Маккей (МасК.ау) 340
Мак-Коллум (McCollum) 11
Мак-Мунн (MacMunn) 388
Мак-Хатти (McHattie) 143
Маркерт (Markert) 117
Мартин (Martin) 538
Марциус (Martins) 348
Маттеи (Matthei) 519, 525
Мейергоф (Meyerhof) 300
Мендель (Mendel) 11, 476—479
Меррифилд (Merrifield) 52
Меселсон (Meselson) 138, 507
Митчелл (Mitchell) 395, 398
Мишер (Miescher) 10
Мойед (Moyed) 440
Моно (Monod) 482, 503, 535
Морган (Morgan) 478
Мёрфи (Murphy) 236
Моффит (Moifitt) 101
Мунъос (Munoz) 341
Мур (Moore) 12, 94
Мэдисон (Madison) 158
Мэсси (Massey) 377
Мюльдер (Mulder) 10
Ниренберг (Nirenberg) 501, 519, 525, 528
Нортроп (Northrop) 12, 424
Осборн (Osborne) 11
Очоа (Ochoa) 512, 519, 525
Палмер (Palmer) 377
Пастер (Pasteur) 10, 300
Перутц (Perutz) 12, 50, 104, 105, 108
Полинг (Pauling) 98, 99, 101, 106
Пулмен (Pullman) 229
Рейхерт (Reichert) 470
Реомюр (Reaumur) 10
Робинсон (Robinson) 415
Розо (Rose) 431
Рэккер (Racker) 303
Самнер (Sumner) 11, 12
Сан Пьетро (San Pietro) 229
Сведберг (Svedberg) 64, 116
Сент-Дьізрдьи (Szont-Gyorgyi) 11
Сёренсен (Soerenson) 116
Сикевиц (Siekevitz) 519
Смит (Smith) 236
Снелл (Snell) 219, 221
Соссюр (Saussure) 10
Спалланцани (Spallanzani) 10, 424
Спейер (Speyer) 525
Спигелман (Spiegelman) 514
Сталь (Stahl) 138, 507
Стинбок (Steenbock) 11
Суэока (Suooka) 137
Сэнгер (Sanger) 12, 89, 96
Татум (Tatum) 485
Теорелл (Theorell) 231
Тиссиер (Tissieres) 519
Тодд (Todd) 231, 236
Томас (Thomas) 143
Тунберг (Thunberg) 348, 369
Уик (Wick) 340
Уилкинс (Wilkins) 12, 133, 223, 484
Уильяме (Williams) 392, 394
Уотсон (Watson) 133, 134, 484, 507, 508, 511
Уэбб (Webb) 205
Фёльген (Feulgen) 407
Филлипс (Phillips) 50, HO
Фишер (Fischer) 10, 49, 200, 256, 260
Фолкерс (Folkers) 236
Формика (Formica) 401
Фриден (Frieden) 117
Функ (Funk) 11
Хартман (Hartman) 538
Хартри (Hartree) 388, 389
Херши (Hershey) 484
Xeyopc (Haworth) 258, 259
Хилл (Hill) 87, 300
Хире (Hirs) 94
Ходжкин (Hodgkin) 236
Холл Hall) 514

542
Указатель авторов
Холли (Holley) 158, 522
Хореккер (Horecker) 303
Хофсти (Hofstee) 168
Хугстин (Hoogsteen) 134
Цахау (Zachau) 158
Цыбакова 393
Чане (Chance) 392, 394
Чаргафф (Chargaff) 12, 133
Чейз (Chase) 484
Шахман (Schachman) 65
Шванн (Schwann) 10, 240
Швит (Schweet) 519
Шееле (Scheele) 9
Шемин (Shemin) 456
Шемякин 221
Шерман (Sherman) 11
Шеврёль (Chevreul) 10, 412
Шлейден (Schieiden) 240
Штейн (Stein) 12, 94
Штерн (Stem) 348
Шустер (Schuster) 223
Шютценбергер (Schutzenberger) 10
Эди (Eadie) 168
Эймс (Ames) 538
Эльвейем (Elvehjem) 11
Эмбден (Embden) 339, 340
Эмерсон (Emerson) 322, 331
Югаи (Ugai) 224
Янг (Yang) 101
Яновский (Yanofsky 445, 496

предметный указатель
Агаммаглобулинемия 485
Аглюкон 262
Адапторная гипотеза 523
Адениловая кислота 465, 466
Аденилосукциназа 465
Аденилциклаза 285
Аденилоянтарная кислота 465
Аденин 123—125
S-аденозилметионин 28, 437, 454, 455, 471
Аденозин 125, 126
Аденозиндифосфат 127;, см. также АДФ
Аденозинтрифосфат 208—213, см. также
АТФ
Аденозин-3',5'-фосфат циклический 127,
285
АДФ 212, 213
— как активатор НАД-зависимых
ферментов 353
АДФ-Б-глюкоза 312
Адреналин (эшгаефрин) 44, 285
Адренокортикостероиды 413
Адренокортикотропный гормон (АКТГ)
53, 54
Азагуанин 123, 124
Азасерин см. 0-диазоацетилсерин
Азатршггофан 522
Азот, фиксация 326, 332, 421—423
Азотистая кислота как мутаген 145, 492,
493
Азотистые основания, изменения при
мутациях 145
Азотфиксирующие организмы 326, 421
Акабори метод 88
Акантоцитоз 485
Акаталаземия 485
Акридины 148, 492, 493
Акрилонитрил 89
Аконитаза 206, 302, 351
і^ие-Аконитат 349, 350
і^ио-тракс-Аконитат 351, 353
Активация продуктом реакции 277
Актидион (циклогексимид) 533
Актиномицин 503, 513, 516
Алании 41, 44, 45, 449
— биосинтез 440
— рацемизация 446
Алиэстераза 198
Алкаптон 454
Алкаптонурия 453, 454, 485
Алкогольцегидрогеназа 292
Алкоксиарил-гидроксилаза 372
Аллантоиказа 475
Аллантоиназа 474
Аллантоин 474
Аллантоиновая кислота 474, 475
Аллели 477
Аллостерические эффекты 277, 287
Альбинизм 453, 454, 485
Альбумин сывороточный 60, 70, 74, 89, 103
Альдаровые кислоты 260
Альдегиддегидрогеназа 293
Альдегидоксидаза 378
Альдогексозы 256
Альдозоэпимеразы 307
Альдозы 256—259
Альдолаза 116, 117, 202, 206, 280, 281,
287, 328-330
Альдолазы класса II из микробных
клеток 288
Альдольное расщепление 220
Альдоновые кислоты 260, 261
Альдопентозы 256, 259
Альдостерон 413
Альдотетрозы 256
Альдуроновые кислоты 260, 261
Амидная связь см. Пептидная связь
Амилоза крахмала 268, 284, 311
— гликогена 311
Амилопектин 268, 284
Аминоадшшновая кислота, формула 438
Аминоацил-s-PHK 521—523
— узнавание кодонов т-РНК 528
Аминоацилсинтетатаза 519
п-аминобензойная кислота 226
5-аминоимидазол-4-карбоксамид-рибону-
клеотид 463, 464
5-аминоимидазол-4-карбоновая кислота 463
5-аминоимидазол-рибонуклеотид 463
Аминоимидазол-рибонуклеотид — карбо-
ксилаза 463
5-аминоимидазол-4-К-сукцинокарбоксамид-
рибонуклеотид 463, 464
Аминокислотная последовательность
пептидов 91
Аминокислотный анализ 56—59
Аминокислоты, активация 521
— биосинтез 431—445
— гликогенные и кетогенные 447, 449
— дезаминирование 446
— декарбоксилирование 446
— заменимые и незаменимые 364, 431, 432
— изоэлектрическая точка 46, 47
— как структурные элементы белков 40
— классификация 41—44
— С- и N-концевые, методы определения
86—88, 91

544
Предметный указатель
Аминокислоты, методы определения 47
— обмен 359, 362, 421—459
— образование хелатных комплексов
с ионами металлов 23, 24
— оптическая активность 45
— протолитнческое равновесие 20
— рацемизация 446
— с разветвленной цепью, распад 447
— — — — синтез 441—444
— строение 41—47
— траисаминирование 446
а-Аминолевулиновая кислота 457
¦у-Аминомасляная кислота 44
Аминоксидаза 375
Аминопептидаза 430
2-аминопурин 492, 493
Аминосахара 261
Аминоферазы см. Трансферази
Амитал 391
Аммиак 473, 475
— ассимиляция 432, 433
— как продукт фиксации азота 422
— образование и превращения 458
Анаболизм (анаболические пути) 272—
275, 314
Анальбуминемия 485
Анаплеротические реакции (цепи) 275,
276, 298, 302, 362
Аягиотоииноген 54
Ангиотонины 54
Андрогены 412, 413
Андростерон 413, 414
Анемия серповидяоклеточная 96, 453
Аномеризация 307
Аясерин, формула 53
Антикодон 501, 502, 520, 523, 528, 530
Антимицин А 352, 391
Антраниловая кислота 444, 445, 450
Апиримидиновые кислоты 131
Апорепрессор 535—537
Ануриновыо кислоты 131
Арахидоновая кислота 335
Арахиновая кислота 334
Аргиназа 459
Аргинин 42, 431, 449, 457
— биосинтез 434, 435
Аргивиносукциназа 459
Аргивиносукцинат 459
Арпшиносукцинатацидемия 485
Аргинипосукцинат-синтетаза 458
Аргининфосфат как высокоэнергетическое
соединение 37
Арилалкиламингидроксилаза 372
Арил-4-гидроксилаза 372
Арсенит 351, 391
Арчибальда метод 69
Асклепаин 431
Аскорбатоксидаза 374, 375
Аскорбиновая кислота 371
Аспарагин 41
— биосинтез 435
— формула 436
Аспарагиновая кислота 41, 440, 449, 453
— биосинтез 435
Аспарагиновой кислоты семиальдегид 435
—- — — формула 436
Аспартаза 435
Аспартат — карбамоилтрансфераза 467
— видовая специфичность 472
Аспартилкиназа 435, 436
?-Аспартилфосфат 435, 436
Атрактилат 391
Атрактилозид 398
АТФ 209—212, 342, 343, 401; см. также
Аденозинтрифосфат
— в реакциях карбоксилирования 298, 299
— — цикле мочевины 459
— генерация при окислительных
процессах 279, 293—297, 319, 345
— как ингибитор ферментов 354
кофермент 208, 286, 292
— — макроэргическое соединение, 35, 209
— превращение в адепозин-3',5'-фосфат
циклический 285
— при фотосинтезе 319, 325—331
— роль в фиксации азота 422
— термодинамические характеристики 27,
28, 36, 282, 395
АТФ-аза 397
АТФ-зависимые реакции 209—213, 216
Ауксотрофпые организмы 486, 487
Афибриногенемия 485
Ацетальдогид 279, 291—295
— «активный» 294
Ацетат 279, 295
— включение в холестерин 414
Ацетаткиназа 293
Ацетаттиокиназа 342, 343, 401
Ацетаттиофораза 343
Ацетиладенилат, стандартная свободная
энергии гидролиза 28
N-ацетилаза 308
Ацетилглутамат в синтезе пиримидинов 467
N-ацетилглюкозамин 308
N-ацетилглюкозаминфосфат 309
Ацетилимидазол 28
Ацетил-SKoA 218, 273, 295, 298, 301, 302,
342—346
— в синтезе жирных кислот 400—402, 404
— — цикле лимонной кислоты 349, 350,
355, 357, 359—361, 363
— образование при обмене вещестп 275,
296, 297, 302, 363
— циклическое окисление 348—359
Ацетил-БКоА-карбоксилаза, 234, 366, 401
N-ацетилманнозамиН'-б-фосфат 309
N-ацетилнейраминат-Э-фосфат 309
N-ацетилнейраминовая кислота 309, 410;
см. также Сиаловые кислоты
Ацетилтиоловые эфиры 28
Ацетилтрансфераза 403
Ацетилфосфат 28, 296, 343
Ацетилхолинэстераза 198
Ацетоацетил-SKoA 28, 345, 346
Ацетоин 224, 225, 294, 295
Ацетомолочная кислота, образование 441
— — формула 442
Ацетон 345, 346
а-Ацето-а-оксимасляиая кислота,
образование 442, 443
— — формула 443
Ацетоуксусная кислота 19, 340, 345, 346,
449
Ацетэруковая кислота 335, 410
Ациладенилат, структура 212
Ацилазы 510, 520
Ацилглутамат как кофактор для карбамо-
илфосфатсинтазы 433, 467

Предметний указатель
545
Ацилкиназы 343
Ацил-SKoA 216, 217, 341—343
Ацилоин 224
Ацилоиновая конденсация 294; см. также
Карболигазпая реакция
Ацилпереносящий белок (АПБ) 403
Ацилпроизводпые KoASH 341—344
Ацилфермент 203
Ацилфосфаты, стандартная свободная
энергия гидролиза 37
Бактерии, рибосомы 245
— строение клетки 248
— фотосинтез 314, 316, 318—320, 323—
326, 328, 331
Бактериофаг(и) 387, 431, 482, 484; см.
также Вирусы
— ДНК и ее особенности 133, 136—138,
160, 161
— электронная микрофотография 62
Бактериохлорофилл 317—321, 324
БАЛ 391
Барбитураты 351
Батиловый спирт 409
Белки, аминокислотный состав 56—60
— асимметрия и гидратация молекул 67
— биосинтез 364, 502, 503, 519—539
— — в бесклеточном системе 519
— — регуляция 532, 534
— — у бактерий 534
— взаимодействие с ионами 73
— видовая специфичность 96
— врожденные аномалии 485
— вязкость 103, 104
— гидролиз 40, 50, 57
— денатурация 35, ИЗ, 115
¦— дисульфидные мостики 88, 89, 113, 114
— идентификация и количественное
определение 55
— изоионная точка 72
— изоморфные производные 105
— изоэлектрическая точка 72
— как полиэлектролиты 70—79
¦— классификация, свойства, очистка 40—
83
— конформация 103, 114
— С- и N-концевые остатки 86
— коэффициенты диффузии 68
— медьсодержащие 375
— «метод отпечатков пальцев» 96
— методы исследования аналитические 61
— — очистки 79—83
— молекулярные веса 40, 59—69
— — — минимальные 61
— мутации 96
— полярные взаимодействия 111, 112
— растворимость 73, 75
— ренатурация ИЗ
— рентгеноструктурный анализ 103—106
— связи водородные 98—101, 110, 111
— — ионные и неполярные (гидрофобные)
110, 111
— — пептидные 49—51
— седиментограмма 66
— спектр поглощения 55, 56
— а-спираль 99—103, 106
— структура 40, 85—119
— — вторичная 85, 98, 110
1/2 35—246
Белки, структура первичная 85, 86, 94,
110, 112,'ИЗ
— — типа складчатого слоя 99, 101
— — третичная 86, 103, 114
— — четвертичная 86, 116—119
— титрование 70
— трансконформации ИЗ, 114
— удельные парциальные объемы 68
— физические свойства 68
— фрикционное отношение 68
— число полипептидных цепей в молекуле
89
— электронная микроскопия 61
— электрофорез 76
Бенедикта раствор 259
Бензохиноны 324
Бера — Ламберта уравнение 56
Бери-бери 11, 223
Бетаин 44, 456
Бимолекулярная реакция 164, 165
Биокатализаторы 11, 12; см. также
Ферменты
Биоптерин 451
Биотин 234—236, 298, 299, 347, 401;
см. также Витамин H
e-N-биотиниллизин (биоцитин) 235
Бисубстратные реакции, кинетика 177
Биуретовая реакция 56
Боргидрид натрия 89
Брадикинин 54
Брёнстеда кислоты 22
Брожение, альтернативные пути 292
— в дрожжевых клетках, формы 292, 293
— гетероферментативное 293
— гомофермептативное молочнокислое 291
— история изучения 10, И
— спиртовое 280—292
ингибиторы 280, 281
— у пропионовокислых бактерий 298
5-бромдезоксиуридин 516
Бромелин 431
Бромурацил 123
2,3-бутандиол 294—296
Бутират-сукцинат-тиофораза 343
Бутирилхолинэстераза 198
Буферная емкость 20
Буферное число 20
Буферы 20
Вазопрессин 53, 96
Вакуоли аутофагирующие 247
Вакценовая кислота 406
Валии 41, 431, 449
— биосинтез 441, 442
— распад 447, 448
— формула 443
Вант-Гоффа уравпение 34, 63
Вариабельный субстрат 176—178
Вильсона болезнь 485
Вирпоп 131
Вирусы 160; см. также Бактериофаги
— ДНК-содержащие 162
— нуклеиновые кислоты 160, 161
— основные классы 160—162
— размножение 160
— РНК, нуклеотидный состав 154, 155
— РНК-содержащие 160—162
Вискозиметр капиллярный 140

546
Предметный указатель
Витализм 9, 10
Витамин В2 231; см. также Рибофлавин
— В6 (пиридоксол) 219
— Віз 236; см. также Кобаламин и Циан-
кобаламин
— — недостаточность 485
В12-кофермепты 237, 347
— Е (сс-токоферол) 392
— H 234; см. также Киотин
— К 324, 392, 393
Витамины, открытие 11
Водород, образование при расщеплении
пирувата 296, 332
— — — фотосинтезе 327
Водородные связи в белках 98, 110, 111
— — — нуклеиновых кислотах 135, 146
— — при денатурации 151
Водородный электрод 30—32
Водоросли, фотосинтез 314, 316, 320, 32б',
331
Врожденные нарушения обмена 485
Вспомогательные пигменты 320; см. также
фотосинтез, пигменты
Вставки 148, 492, 499
Вторичная структура белков 85, 98, 110
Вторичные прямые 178
Вырожденность кода 498, 500
Высаливания константа 75
— эффект 73, 75
Высокоэнергетические соединения 35, 36;
см. также Макроэргические соединения
Вязкость 140
— белков 103, 104
— нуклеиновых кислот 103, 140
— относительная и удельная 140
— характеристическая 104, 140
Галактоза 257, 307
Галактозамин 261
Галактоземия 309, 485
?-Галактозидаза, кодирование 537
Галактозооксидаза 375
а-галактозо-1 -фосфат 307
— эшшеризация 309
D-галактозо-і-фо'сфат — уридилтрансфера-
за 309
Галактокиназа 307
Ганглиозиды 410
Гаплоидные организмы 480
ГДФ 216, 299
Гекситы 260
Гексозомонофосфатный шунт 303; см.
также Иептозный цикл и Фосфоглюконат-
пый путь
Гексозофосфат(ы) 325, 329
— неокислительные превращения 306, 307
— пути превращений 303—310
Гексозофосфатизомераза 304
Гексозо-1-фосфат — уридилтрансфераза 309
Гексозы, взаимопревращения 307
— структура 255
Гексокиназа 89, 280—282
Гем(ы) 106, 233, 381, 382
Гематин 233, 381
Гемеритрини 384, 385
Гемин 381
Геминхлорид 381
Гемихром 381, 382
Гемоглобин 60, 89, 96, 97, 233, 234, 384
385
— аномалии 96
— гены 494
— модель 109
— молекулярный вес 108
— мутации 96, 453
— пептидные карты 96, 98
— растворимость 74
— синтез в бесклеточной системе 519
— строение 108—110, 384
— а- и ?-цеіш 97, 109, НО
Гемоглобинопатии 485
Гемопротеиды 381—392
— простетические группы 381—385
— спектры поглощения 382
Гемофилия А 485
— В 485
Гемохром(ы) 381, 382
Гемоцианин 384
Гемсодержащие коферменты 232 — 234; см.
также Цитохромы
Ген 478, 494
— выражение, регуляция 535
— как функциональная единица 488—499
— природа 484
— структура и функция 477—505
— — тонкая 488
Гендерсона — Хассельбаха уравнение 18—
20
Генетика 476
— молекулярная 485
Генетическая карта 478—481, 487, 496, 497
— — кольцевая структура 484
— — области rll 489
Генетические локусы 478, 480
Генетический код 498—502, 529
— — считывание 526, 529
— словарь 500, 501, 519; см. также Ко-
дон(ы)
Генотип 476
Ген(ы)-регулятор(ы) 535, 537
Генцианоза 263
Гепарин 270
— синтез 311
Гептулозофосфат 329
Геранилпирофосфат 417
Гетерозиготи 477, 490
Гетерополипептиды, синтез 52
Гетерополисахариды 265
Гиалуроповая кислота 268, 269
— — синтез 214, 311
Гиббса — Доннана эффект 64, 73
Гибридизация ДНК и РНК 153
Гидантоин 87
Гидразин, определение С-концевых
остатков 88
Гидрогеназа 327
Гидроксилазы 368, 370—373
— жирных кислот 372
— «микросомные» 372
Гидроксиламин 147, 492, 493
Гидролазы 190, 192, 194
Гидролиз белков 57
— нуклеиновых кислот 128, 129
— различных соединений,
термодинамические характеристики, 25—28, 36,
37
— химотриптический 203, 204

Предметный указатель
547
Гидропероксидаза 234, 385. 386
Гидрофобные связи 110; см. также Непо-
лярпые связи
Гильберта болезнь 485
Гипергликемия 285
Гшгоксантин 123, 124, 474, 475
Гипотеза «один ген — один фермент» 485,
487
— «один ген — одна полипептидная цепь»
488
Гипофосфатазия 485
Гипохромизм 144
Гиппуровая кислота 339
Гистамин 44
Гистидин 42, 442, 449
— биосинтез 440
Гистидинемия 485
Гистидинол 441
Гистогематин 388
Гистон(ы), 60, 159
— взаимодействие с нуклеиновыми
кислотами 121
— регуляция белкового синтеза 160
Гликоген 264
— ветвление цепей 312
— превращения 283—285
— ресинтез 300
— строение и молекулярный вес 268
Гликогенез 285
Гликогенные аминокислоты 299
Гликогенозы 485
Гликогепсинтетаза 285, 311; см. также
УДФ-глтокоза-гликоген — глюкозил-
трансфераза
Гликозидные связи, биосинтез 310
Гликозиды 262, 310
— стандартная свободная энергия
гидролиза 28
Гликозилтрансферазы 310
Гликолат 329
Гликолиз, альтернативные пути 292
— в мышцах, конечные этапы -291
— значение 278
— ингибиторы и регуляция 280, 281, 286,
287, 300, 301
— реакции и термодинамика 280—282,
289, 290, 297
— схема 279, 290
— фосфорилированные продукты 277, 289,
294
Гликолитические ферменты 281
Гликолитический путь, общая схема 278—
282
Гликопротеиды 309
Гликохолат натрия 335
Гликохолевая кислота 413, 436
Глиоксалаза 218
Глиоксалат 302
Глиоксилатный цикл (цикл Кребса —
Корнберга) 301, 302
Глиоксиловая кислота 474, 475
сс-Глицеральдегид, пространственная
конфигурация 45
Глицеральдегид(-3-)фосфат 279, 287, 289,
304, 305, 328, 330
— и фосфорилирование АДФ 289
Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа 280,
289, 328
Глицерин 279, 294, 336, 408
Глицерин, образование при брожении 292,
293
— фосфорилирование 205
L-a-глицерол-З-фосфат-дегидрогеназа 292,
293
Глицерокиназа 205
L-cc-глицерофосфат 205, 337
— образование и превращения 406, 408
Глицерофосфатдегидрогеназа 365, 379
Глицин 41, 413, 436, 449, 456
— биосинтез и формула 439
— синтез пиррольных колец 457
Глицинамид-рибонуклеотид 462
Глутамат 308; см. также Глутаминовая
кислота
— рацемизация 446
— роль в катаболизме аминокислот 362
Глутаматдегидрогеназа 262, 366, 432
— структура 116, 117
Глутаматмутаза 237
Глутамин 42, 308, 309, 432—435, 449
— АТФ-зависимое образование 433
— в синтезе пиримидинов и пуринов 462,
463, 467
— превращение в аргинин 435
Глутаминовая кислота 42, 226, 309, 432;
см. также Глутамат
— — биосинтез 432
Глутаминсинтетаза 432
Глутамин-фосфорибозилгшрофосфат — ами-
дотрапсфераза 473
Глутатион 53, 218, 219
— как кофермент 453
Глюкагон 60
а-Глюкан-ветвящая глюкозилтрансфераза
312
а-1,4-глюканфосфорилаза 280, 283
Глюканы 267
Глюкоза 256, 258—260, 307
— обмен, регуляция 300, 301
— пути превращения 278—282
— синтез и ресинтез 299—303
Глюкозамин, образование 261, 308
Глгокозамин-6-фосфат 283, 308, 309
О-глюкозо-1,6-дифосфат 286
Глюкозо-1-фосфат 279, 283-285, 306, 307
— и глюкозо-6-фосфат,
взаимопревращения 285
— эпимеризация 309
Глюкозо-6-фосфат 279, 282, 283, 286,
303—307
Глюкозо-6-фосфатаза 280
Глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа 303
— стереоспецифичность 303
Глюкокиназа 280, 283
Глюконеогенез 283, 285, 299—303
— метаболический контроль 300, 301
Глюконовая кислота 261
Глюконолактоназа 304
Глюконо-о-лактон-6-фосфат 304
сс-глюкогшраноза 258
Глюкуроновая кислота 261
ГМФ-редуктаза 473
Голубой пигмент 375
Гольджи аппарат (комплекс) 241, 242,
244-247 ¦ .
— — индикаторы 251, 252
Гомоаконитовая кислота, формула 438
Гомогентизат 370
35*

548
Предметный указатель
Гомогентизатоксигеназа 370; см. также
Оксидаза гомогентизиновой кислоты
Гомогептизиновая кислота 453, 454, 485
Гомозиготы 477
Гомоизолимонная кислота, формула 438
Гомолимонная кислота, формула 438
Гомополипептиды, синтез 52
Гомополисахариды 265, 267
Гомосерин 44
— биосинтез 436
Гомосериндегидрогеназа 436
Гомосеринкиназа 435, 436
Гомоцистеин 436, 437, 439, 455
Гомоцистинурия 485
Гопкинса — Кола реакция 47
Гормоны 53, 54
— стероидные 373
Гоше болезнь 410
Грамицидин 391, 398
Граны 315
ГТФ 215, 216, 298, 299, 355
— роль в белковом синтезе 530
Гуанаяа 473
Гуанидиния соли как денатурирующие
агенты 116
Гуанидинфосфаты, стандартная свободная
энергия гидролиза 37
Гуаниловая кислота 465, 466; см. также
Гуанозии-5-фосфат
Гуанин и аналоги 123—125
Гуанозин 126
Гуанозиновые нуклеотиды 215; 216
Гуанояин-5-фосфат 127; см. также
Гуаниловая кислота
Гуттаперча 419
Дальтон (единица) 244
Деацилаза 346
Дебая — Хгоккеля эффект 75
Дегидраза, синтез жирных кислот 406
Дегидрирование, роль в биологических
процессах 368, 369
Дегидроаскорбиновая кислота 374
Дегидрогеназы (оксидоредуктазы) 190,
303, 304, 368, 369, 380
— классификация и общие сведения 373—
381
— KoASH-производных жирных кислот
. 344
— механизм действия 180
Дегидрофптосфиигозиц 409
Дегидрохинная кислота 445
Дезаминирование 446
Дезоксиаденозин 126
б-дезокси-Б-глюкоза 261
Дезоксикортикостерон 372, 413
Дезоксинуклеозидтрифосфаты, биосинтез
469-472
З-дезокси-Б-рнбоза 121
Дезоксирибонуклеазы I и II (ДНК-азы)
129, 131
Дезоксирибонуклеиновая кислота 121; см.
также ДНК; Дезоксирибонуклеотиды;
Полидезоксирибоиуклеотиды
Дезоксирибонуклеотиды 126; см. также
Дезоксирибонуклеиповая кислота; ДНК;
Полидезоксирибонуклеотиды
Дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) 309
Дозоксихолевая кислота 412, 413
Декарбоксилази 346, 446
Декарбоксилирование 354, 446
— аминокислот 220, 224, 356
Декстрин 284
Делеции 148, 492, 499
Денатурация нуклеиновых кислот 151
— белков 35, ИЗ, 114
— — методы исследования 115
— — термодинамические параметры 35
— обратимая 152
— природа стабилизирующих сил 150
Денатурирующие агенты (факторы) 115,
116, 148, 151, 196
Дсрепрессия 538
Дерматансульфат (Хопдроитинсульфат В)
269
Десатураза жирных кислот 372
Десмосомы 241, 246
Досмостерин 418
Дефектный белок 492
О-диазоацотилсерин (азасерин) 44
Диализ 81
— равновесный 73
Диаминопимолиповая кислота 439
— формула 438
2,6-дйаминопурин 123
Диастаза 11
Дигидролипоевая кислота 218
Дигидролппоевой кислоты дегидрогеназа
297
Дигидрооротаза 468
Дигидрооротатдегидрогеназа 378, 379. 468
Дигидрооротоиая кислота 468
Дигидропиколиновая кислота 438
Дигидроурацил 123
Дигидрофолат 226
а^-Диглицорид 408
Диизопропилфторфосфат (Дфф) 198
Дикарбоновые кислоты в углеводном
обмене 300
Дикумарин 391, 398
Диметилаллилпирофосфат 416, 417
2,2-диметиламипо-6-оксипурии 123, 124
6,6—диметиламинопурин 123, 124
Диметилтотии 456
Диметилтстин-гомоцистеин — метилтранс-
фераза 456
Дииитрофонол 352, 394
Диоксиацетон 279, 287, 292, 305, 328—330
a-?-Диоксиизовалсрьяновая кислота 442
Диолдегидраза 237
Дипептидаза 430
Дисахарид(ы) 263, 264
— синтез 310
Дисперсия оптического вращения 101
Дисульфиднью мостики 91, 94
в белках 94, 103, ИЗ, 114
— — расщепление 88, 89
1,3- и 2,3-дифосфоглицерат 279, 289, 290.
328
Дифосфопиридшшуклеотид (ДПН) 228; см.
также Никотинамидадениидинуклсотид
Диффузия, законы Фика 67
— коэффициент 68
Дихлорметилмочевина 323
ДНК 121 — 123; см. также
Дезоксирибонуклеиновая кислота;
Дезоксирибонуклеотиды; Полидезоксирибонуклеотиды

Предметный указатель
549
ДНК, антипараллельная ориентация цепей
134, 136, 511
— бактериальные 123, 131, 136
— бактериофагов и других вирусов 123,
131, 133, 136—138, 470
— — Т-четных 470
— — электронные микрофотографии 136,
143
— биосинтез 507 — 512
— взаимодействие с малыми молекулами
и ионами 147
— видовая специфичность 502
— водородные связи 135, 146
— высокомолекулярная, физическая
химия 137—144
— вязкость 103, 140
— гибридизация с РНК 131, 153
— гидродинамические данные 140-—142
— гидролиз 129
— гипохромизм 144
— денатурация 148—152
— и плоидность клеток 131
— как генетический материал 484
матрица 160, 507, 511, 512, 514
— кольцевая 136, 147
— комплементарность цепей 134, 136
— В-конфигурация 133, 134
— конформационные изменения 148, 151
— локализация в клетке 131, 243
— модель Уотсона — Крика 133
— молекулярный вес 142
— — — определение 140—144
— нуклеотидный состав 132, 133, 510
— одноцопочечная 137
— оптические свойства 144, 145
— основания 123, 124
— плавучая плотность 139
— плектонемическая спираль 133, 134
— подавление синтеза 147
— постоянство состава 485, 502
— протонирование 147
— радиоавтография 143
— размеры и форма 136
— распространение 132
— редупликация консервативная и
полуконсервативная 507, 508
— — ферментативные аспекты 509
— светорассеяние 142
— седиментация в гомогенной среде 137
— спаривание оснований 134, 135, 146, 147
— спектр поглощения 145
— сшивание цепей 145, 146
— транскрипция цепей 504, 514
— трансформирующая 503
— фосфодиэфирная цепь 134
— химические реакции 145
— центрифугирование в градиенте
плотности 138, 139
— частота ближайших соседей 136
ДНК-аза 122, 131; см. также Дезоксири-
бонуклеазы
ДНК-полимераза 137, 500, 515
— как репарирующий фермент 512
-2,4-ДНФ как разобщающий агент 397
Додецил(лаурил)сульфат натрия как
денатурирующий агент 121; см. также
Лаурилсульфат натрия
Доминантные признаки 476
Дофамингидроксилаза 371, 375
Дрожжи, брожение 10, 292
Дупликаза 515
ДХММ 322, 324, 327
Дыхание 10
Дыхания ингибиторы 391, 394, 395, 398.
Дыхательная цепь 369, 389, 390
Дыхательные пигменты 384, 385
Дыхательный контроль 365, 395, 397
— фермент (Atmungsferment) 370, 389
Единица расщепления 477
— функции 493, 494
Епоил-АПБ — гидраза 403
Еноил-гидраза 404
Еноилгидратаза 344
Енолаза 280, 281, 290; см. также Фосфо-
пируватдегидрогеназа
— дрожжевая 89
Енолфосфаты как высокоэнергетические
соединения 37, 38
Железо негоминовое 315, 378
— ферредоксина 326
Железопорфирин 375
Жолезопротопорфирин 451
Желтый пигмент 31
Желчные кислоты 412
Желчных кислот соли 335, 336, 413
«Жизненная сила» 9
Жирные кислоты, активация 341, 342
— — биосинтез и окисление 363, 404—406
— — — У Е. coll, схема 403
— — метаболизм 273, 274
— — наименования и формулы 334, 335
— — ненасыщенные, биосинтез 405, 406
— — окисление 335—347
— — с нечетным числом атомов углерода
346, 347
— — — разветвленной цепью 347
— — — четным числом атомов углерода,
окисление 345
— — цикл лимонной кислоты 349
Жирных кислот гидроксилаза 372
Жиры нейтральные 334, 335
Закон действия масс 164
Зимогеиоиые гранулы 245, 246
Зимогены 424, 425
Зимостерин 418
Зоб 485
Изоаллоксазин 231
Изовалорат 347
Изоионная точка белков 72
Изолойцин 41, 431, 449
— биосинтез 441, 443
— распад 447, 448,
— формула 443
Изомеразы 190, 193
Изоморфные производные белков 105
Изопентенилпирофосфат 416—418
Изопреноидная единица 416
Изофермеиты 117 — 119
Изоцитрат 302, 348, 349, 351, 354, 402
Изоцитратаза 301, 302

Предметный указатель
Изоцитратдегидрогеназа 303, 351, 366
— активация металлом 181
Изоцитрат-лиаза 363, 366
Изоэлектрическая точка аминокислот 46,
47
— — белков 72
Иаоэлектрическое осаждение белков 80
Имидазолацетолфосфат 440, 441
Имидазолглицерофосфат 441
Имииокислоты 40, 43
ИМФ-дегидрогонааа 472
Ингибирование бесконкурентное 182, 183
— конкурентное 173, 182, 183, 185
— ноконкурептное 175, 182, 183, 185
— по принципу обратной связи 277, 309
— продуктом реакции 172, 185
— субстратом 182
— ферментов 182, 183, 185
Ингибиторы 182
— гликолиза и брожения 280, 281
— дыхания 391, 394, 395, 398
— необратимые 183
Ипдолилуксуснан кислота 451
Индукция 227, 487, 505, 535, 536, 538
Иидуцибельность 535, 537
Инициирование при окислении жирных
кислот 345
Инициирующий субстрат 345
Ипояиновая кислота (иноаин-5'-фосфат,
ИМФ) 123, 461, 464, 465
— — синтез 464, 465
Инозиновые нуклеотиды 215, 216
Инозит 407
Инсулин 60, 87, 89, 96
—• молекулярный вес 87
— структура 91—93
Иптрацистернальное пространство 244
Иодацетат 89
Ионизации энергия 29
Ионная сила и растворимость белков 73—76
Ионные связи в белках 110, 111
Иприт, азотные аналоги 147
ИТФ 216
Кадаверин 121
Каллидин 54
Каллидиноген 54
Калышна —• Бассама цикл 328
Камплопый спирт 409
Канамицин 534
Каприловая кислота 334
Каприновая кислота 334
Капроновая кислота 334
Капсиды 161, 162
Каисомеры 161, 162
Карбаматкиназа 467
Карбамоиласпартат 467, 468
Карбамоилфосфат 458, 467
Карбамоилфосфатсиптаза 432, 433, 467
Карбоангидраза, активация металлом 181
Карбоксибиотин 236
Карбоксигемоглобин, растворимость 74
Карбоксидпсмутаза 328
Карбокснкипаза фосфоенолпируната 299
Карбоксилаза фосфоенолпирувата 299
Карбоксилирование пируиата 359
Карбоксилирования реакции 298, 299,
354
Карбоксипептидазы А и В 89, 429
— активация металлом 181
— определение 0-концйвых остатков 88
Карбокситрансфосфорилаза 299
Карболпгазная реакция 294; см. также-
Ацилоиновая конденсация
Кардиолипин 253, 408
Карнитип 345, 401, 402
— роль в окислении жирных кислот 345>
Карнозин 53
?-Каротин 320
Каротиноиды 315, 320, 321, 324
Катаболизм 314
Катаболические нуги, определение 272,
273
Каталаза 234, 385, 446
— молекулярный вес 138
Катализ И, 164—167
— роль белков 40
Катспсииы 430
Катехии 370, 372
Каучук, образование 419
Квазисубстраты 198
Квантовый выход фотосинтеза 322, 33 f
Кейлипа — Харти препарат 389
Ксразин 410
Коратосульфат 270
?-Кєтоадшшнат 536
?-Кетоацетил-АПБ — редуктаза 403
?-Кєтоацилнроизводїше Ко AS H 344
?-KeTOBaflepnn-SKoA 346
Кетоглутарат 349, 351, 354, 432; см. также
Кетоглутаровая кислота
Кетоглутарат-дегидрогеназа 351
а-Кетоглутарат-дегидрогопазный комплекс
354
а-Кетоглутарат-декарбоксилаза 355
Кетоглутарован кислота, формула 438;
см. также Кетоглутарат
Кетозы 259
а-Кетоизовалерьиповая кислота 441, 442
— — формула 442
а-Кетомасляная кислота, формула 443
Кетопные тела 340, 345, 346
?-Кетотиолаза 344
Кефалины 337, 408
Кипазы 194, 284
Кинга и Альтмана метод 174
Кинетика реакций, протекающих без
катализатора 164, 165
— — протекающих в присутствии
катализатора 165—167
— — ферментативных 164—187
— — — первичные и вторичные прямые
177, 178
Кинетическое уравнение 184 — 166
Кинурепат (кинуреновая кислота) 372
Кинуренатгидроксилаза 372
Кинуренин 450
Кислород, выделение при фотосинтезе 318,
319, 322, 323, 325
— молекулярный, участие в образовании
двойной связи 405
Кислота слабая, титрование 18
Кислоты Брёнстета 22; см. также
Протонные кислоты
— двухосновные 20
Кластическая реакция 296, 332; см. также
Фосфорокластическа а реакция

Предметный указатель
551
Клеланда правила 184, 185
Клетка, органеллы 239—248
— организация и внутриклеточные
частицы 239—254
— структура 240—249
Клеточные компоненты,
фракционирование 249, 250
Кобаламин 237; см. также Витамин В12
и Цианкобаламин
Кобальт в молекуле витамина В12 237
Кобамидные коферменты 236, 237, 437
Кодирующие единицы 498; см. также
Кодоны
— триплеты 499; см. также Кодоны
Кодовое отношение 490, 495, 499
Кодон(ы) 498, 500—502, 528, 530, 531;
см. также Кодирующие единицы;
Генетический словарь
— инициирующий 532
— синонимические 501
Козимаза 228
Кокарбоксилаза 223
Коллаген 60, 433
— вязкость 103
Коллинеарность карт (генетической и по-
липептидпой) 497
Комплекс ионов металла с белками 22, 23
Комплементарность оснований 134
Комплементация 494
Копденсярутощий фермент 366, 403; см.
также Цитратконденсирующий фермепт
Конкурирующий резонанс 36
Константа Михаэлиса 199
— равновесия 25—28
— — влияние денатурации 115, 151
— — обозначения 178
— седиментации 66, 137, 138
— скорости 164, 165
— — обозначения 165
Константы ассоциации 23
— диссоциации 19, 20, 22
— — обозначения 178
Конъюгация 480, 481
Кооперативное взаимодействие 384
Копропорфириноген 458
Копропорфирины 233, 458
Корепрессор 536
Кортизон 413
Кортикостерон 372, 413
Кофеин 123, 124
Кофермент(ы) 202—238, 374
— АТФ 208—212
— биотин 234—236
— гемсодержащие 232—234
— глутатиоп 218, 219
— гуанозиновые и мнозиновые нуклеотиды
215—217
— кобамидные 236, 237
— липоевая кислота 217, 218
— окислительно-восстановительные
потенциалы 374
— пиридиновые нуклеотиды 228—230
— пиридоксальфосфат 219—223
— синтеза жирных кислот 400
— тетрагидрофолиевая кислота 226—228
— тиаминпирофосфат 223—225
— уридииовые нуклеотиды 213, 214
Кофермент(ы) флавиновые 230—232
— хиноны 379
Кофермеит(ы) цитидиновые нуклеотиды
214, 215
Кофермент А (КоА) 216, 345
— акцептор ацетильной группы 296
— Q 378—380, 389, 390, 391, 394; см.
также Убихиноны
— I (Kol) 228; см. также Никотинамид-
адениндинуклеотид
— II (KoII) 228; см. также Никотин-
амида дениндинуклеотидфосфат
Коэффициент пропорциональности 164
«Красное снижение» 322
Крахмал 268, 283, 284
— синтез у растений 312
Креатинкиназа, механизм действия 181
Креатинфосфат 28, 37
Кребса — Корнберга цикл 302; см. также
Глиоксилатный цикл
Кребса цикл. см. Цикл лимонной кислоты
Кристаллизация белков 81, 82
Кристы 240, 243
Кроссинговер 478, 483
Кротоназа 344
Кротоновая кислота 335
Ксантиловая кислота 123, 466
Ксаитин 124, 473—475
Ксантиноксидаза (ксантиндегидрогеназа)
378, 379, 474
Ксантинурия 485
Ксантопротеиновая реакция 47
Ксантуреиовая кислота 450
Ксилан(ы) 267
?-l,4-KCMan, синтез 311
D-ксилулоза 259
Ксилул'озо-5-фосфат 304, 306, 307, 328—
330
Ксимениниевая кислота 335
Лайнуивера — Бэрка уравнение 168
Лактат 279, 291, 295
Лактатдегідрогеназа 280, 281, 379
— изоіерментьт 117, 118
Лактобацилловая кислота 334, 335
?-Лактоглобулин 70, 75, 101
Лактоза, синтез 311
Лактоиазы 303
Лактофлавин 231
Лактохром 231.
Ланостерин, формула 418
Лаурилсульфат натрия 117; см. также
Додецилсульфат натрия
Лауриновая кислота 334
Лейкса ангидриды 49
Лейцин 41, 431, 449
— биосинтез 441, 442
— распад 447, 448
— формула 442
Лейцинаминоиоптидаза 87, 88, 430
Лейциноз 485
Лоцитии(ы) 214, 337, 408
Лиазы 190, 193
Лигазы 190, 194, 211
Лиганды 22—24
Лигноцериновая кислота 334, 410
Лизин 42, 431, 449
— биосинтез 435, 436, 439
— рацемизация 446
— формула 438

552
Предметний указатель
Лизогения 438
Лизосомы 246, 251
Лизофосфатид 338
Лизофосфатидаза 338
Лизоцим 89, 110, 138
Ликопин 320
Лимонная кислота, константа
диссоциации 19
Линолевая кислота 335
Лішоленовая кислота 335
Лиофилизация 81
Липазы 335, 336
Липидеый обмен, роль углеводных
предшественников 293
Липиды, биосинтез 363, 400—419
— митохондриалыше, роль 392
— подклассы 334
— сложные, расщепление 335—347
Липоепая кислота (липоат) 217, 218, 224,
297, 298, 354
Липоксигеназа 370
Липопротеиллипаза 337
Макро- и микроконстанты диссоциации 21
Макроэргические соединения 34, 35, 208,
455; см. также Высокоэнергетические
соединения
Малат 302, 348, 349; см. также Молочная
кислота
— окисление 299, 357
Малатдегидрогеназа 302, 303, 351, 358, 365
— активация металлом 181
Малатдегидрогеназа (декарбоксилирую-
щая) 298; см. также Малик-фермеит
Малат-моноанион, константа диссоциации
19
Малат-синтаза 301,- 302, 363
Малеилацетоуксусная кислота 453
Малеилацетоуксусной кислоты изомераза
453
Малик-фермент 298; см. также
Малатдегидрогеназа (декарбоксилиругощая)
Малонат 351
Малопил-SKoA 402, 404, 406
Малонилтраисфераза 403
Малоиовая кислота как ингибитор
дыхания 350
Мапнаны 267
Машгат 260
D-манноза 260, 307
D-маннозо-б-фосфат 286
Марганец (Мп2+) 315, 322, 324, 354
— как кофермент 400
Масла 334, 335
Масляная кислота 334
Мастоцитоз 485
Магрикс цитоплазмы 248; см. также Цито-
плазматическая жидкость
Мевалонаткиназа 416
Мевалововая кислота 414—416
— — биосинтез, схема 415
Медьсодержащие белки 474
Мезопорфирины 233
Меланин 453, 454
а- и ?-Меланоцитстимулирующие гормо-
вы 53, 96
Мембраны клетки 243, 246, 248
— митохондриальные 243
Меркаптоэтанол 89
Метаболизм (обмен), общие принципы и
регуляция 272, 274—277
Метаболические пути, определение 272
— — связь менаду анаболизмом и
катаболизмом 276
Металлов ионы, участие в
неферментативных реакциях 221
— — — — синтезе нуклеиновых кислот
509
— — образование комплексов 22. 23
Металлопротеиды 22
Металлсодержащие флавопротеиды 378
Металлы как активаторы и ингибиторы
ферментов 181, 290, 342, 354
— комплексы с порфиринами 233
Метгемоглобин 233, 384
Метгемоглобияемия 485
2-метиламшто-6-оксипурин 123, 124
6-метиламинопурин 123, 124
а-Метилбутират 347
Мотилгуанин 123
S-метилизотиомочевина как
денатурирующий агент 116
Метилированные основания 123
?-Метилкротонил-КоА-карбоксилазная
реакция 235
Метилмалонил-КоА 360, 448
Метилмалонил-КоА-мутаза 237, 359
Метилмалоиил-КоА — рацемаза 359
Метилмалонилмутаза 347
Метилметионин, роль в обмене веществ 456
]М6-метилтетрагидроптероилтриглутамат
436
Метилтрансфераза 456
5-метилтринтофан 533
5-метилцитозин 123, 124, 132
Метильных групп доноры 455
Метионин 43, 89, 431, 436, 437, 449, 454, 455
— аналоги 522
— биосинтез 228, 435, 439
— рацемизация 446
— формула 437
Метод ближайших соседей 510
— звезд 143
Микомицин 335
Микроворсинки 246
Микроорганизмы, брожение 294
— фотосинтез 314
Микросомная фракция 251—253
— — маркеры 251, 252
«Микросомпые» гидроксилазы 372
Микросомы 405, 412, 518
— выделение и свойства 251—253
Микротельца 239, 251
Миллона реакция 47
Минорные основания 123, 522, 523
РНК 158, 159
Миогематин 388
Мпоглобин 89, 108, 110, 234, 384
— полярные и неполярные взаимодействия
в молекуле 111
— растворимость 74
— рентгенограмма 105
— структура 106—108
Миозин, физические свойства 68
лшо-Инозит 260, 370
лшо-Инозитол-оксигиназа 370
Миристимовая кислота 334

Предметный указатель
553
Митомицин С, .подавление синтеза ДНК
147
Митохондрии 154, 241—246, 248, 251 —
253, 389—392
— АТФ-аза 397
— выделение 249
— липидный обмен 339, 345, 392, 400,
401
— окислительное фосфорилированпе 297,
394
— перенос электронов 389—390
— проницаемость мембраны 367
— свойства и состав 253
— синтез углеводов 363
— содержание ДНК 131
— у бактерий 248
— ферменты 251, 252, 293, 296, 299, 301,
367
— цикл лимонной кислоты 350, 353, 355,
357, 363, 365
— цитохромы 387
Митохондриогенез 365
Михаэлиса константа 170
Михаэлиса — Ментен механизм и
уравнение 167, 170, 176
Молекулярные сита 80
Молекулярный вес как критерий чистоты
препарата 83
— — по данным светорассеяния 142
— — средний, средневссовой и средне-
численный 63, 69, 141
— — флавопротеидов 376, 379
— — цитохромов 387
Молочная кислота, константа диссоциации
19; см. также Малат
— — у насекомых 293
Моносахариды 255—263
Моносубстратные реакции 170
Монофторацетил-КоА 352
Мочевая кислота 124, 473—475
Мочевина 457
— биосинтез 9, 457—459
— как денатурирующий агент 115—117
Мочевины цикл 459
Мукополисахариды 267
Мультиферментные комплексы 119
Мутагенез in vitro 145
Мутагены 147, 148, 478, 484, 492, 493
Мутазы 194
Мутанты ауксотрофные 486
— конститутивные 537
— условно летальные 487, 496
— Амбер и Ochre 501
Мутаротазы 307
Мутаротация 261, 262
Мутации 145, 159, 160
— бессмысленные 491
— в генах, контролирующих синтез трип-
тофансинтетазы 494
— индуцированные и спонтанные 478, 492
— и структура белков 96
— оператора 503, 538
— полярность 537
— природа 490—493
— реверсия 4iJ3
— со сдвигом рамки 491, 492, 495
— супрессорные вне- и внутригонные 495,
529
— типы 492
36—246
Мутации точковые 490, 491, 499
— am и ts 487
Мутон 490
НАД 228—231, 278, 279, 293, 380; см.
также Никотинамидадениндинуклеотид
— в гликолизе 278—281, 301
— — реакциях окисления и
восстановления 229
— — синтезе жирных кислот 401
углеводном обмене 274, 276, 289,
291-304, 306, 309
— — фосфорилировании 289
фотосинтезе 319, 324—331
— и регуляция метаболизма 365
— коферментная функция 229, 380
— спектр поглощения 229
— стереоизомеры 229
НАД-дегидрогенеза 379
НАД-зависимые ферменты 353, 354
Надмуравьиная кислота 88, 89
НАДФ 228—231, 380; см. также Нико-
тинамидадениндинуклеотидфосфат
— и регуляция метаболизма 365
— как субстрат гидроксилазной реакции
372
— коферментная функция 229, 380
— при фотосинтезе 325—331
НАДФ-глутатионредуктаза 376
НАДФ-зависимые ферменты 354
НАДФ-цитохром с-редуктаза 376
Наследственность 477
Нафтохинон(ы) 324, 391
Начальная скорость реакции 165
Нейраминовая кислота 410
Неоднозначность кода 500
Неохимотрипсиноген 427
Непоиярные связи в белках 110, 111;
см. также Гидрофобные связи
Неравновесное состояние 25
Нервон 410
Неролидолпирофосфат 417
Несслера реактив 56
Ниацин (никотиновая кислота) 451
Низкоэнергетические соединения 35
Никотинамидадениндинуклеотид 228; см.
также НАД
Никотинамидадениндинуклеотидфосфат
228; см. также НАДФ
Никотинамидные коферменты, спектр
поглощения и флуоресценция 380
Никотиновая кислота (ниацин) 451
Никотиновой кислоты производные,
синтез 451
Нингидрин и нингидриновая реакция 48,
58
Нитрат(ы), ассимиляция 421, 423
Нитратредуктаза 379
Нитрит, восстановление 423
Иитритредуктаза 423
Нитрогеназа 332, 423
Нитропруссидная реакция 47
Носитель при зонном электрофорезе
Иуклеазы 129, 131
Нуклеиновые кислоты 121—163; см.
также ДНК; Полидезоксирибонуклеотиды;
Полирибонуклеотиды; РНК

Предметный указатель
Нуклеиновые кислоты, биологическая роль
121
— — биосинтез 507—517
— — — ингибиторы 515—517
— — взаимодействие с красителями 148
— — водородные связи 135
— — выделение фенолом 121
— — гибридизация 153
— — гидролиз 127
__ _ _ методы 128—131
-- — локализация в клетке 131—133
— — метод выделения 121
— — мономерныо единицы 122, 123
— — нагревание 131
— — оптические свойства 144
— — основания 123
— — свойства 121
— — связь с катионами 148
— — состав и спектр поглощения 121, 122
— — спаривание оснований 134, 135
— — функция 121
— — электронная микроскопия 143
Пуклеозиддифосфаткиназа 299, 355
Нуклеозидполифосфаты, поликонденсация
507—515
Нуклеозидтрифосфаты, биосинтез 461
Нуклеозидфосфорилазы 472
Нуклеозиды 125, 126
Нуклеоплазма 243
Нуклеопротеиды 159
Пуклеотиды 123, 126, 127
— биосинтез, альтернативные пути 472
— обмен 461—475
— строение оснований 127
Обмен, врожденные нарушения 453
Овалъбумин 68, 70
Овофлавин 231
Озазоны 360
Окисление биологическое 369—399
?-Окисление 339, 340, 359, 399
Окислительно-восстановительные
потенциалы 30—34
— — коферментов 374
— реакций, изменение свободной энергии
3U-34
Оксалоацетат 299, 302, 351—353, 357
— декарбоксилирование 298
— как регулятор митохондриального
метаболизма 365
— при обмене пирувата 295
Оксалоглутаровая кислота, формула 438
Оксалосукцинат 348—351, 354
3-оксиантранилат 370
3-оксиантранилат-оксигеназа 370
3-оксиантраниловая кислота 450
З-оксиацил-БКоА-дегидрогеназа 344
? Оксиацилпроизводные KoASH 344
?-Оксибутират 345, 346
Оксигемоглобин 233
— модель 109
Оксигеназы 198, 368, 370
— свойства и источники 370
Оксидаза гомогентизиновой кислоты 453;
см. также Гомогентизатоксигепаза
— ге-оксифенилиировиноградной кислоты
453
Оксидазы 190, 368
— аминокислот 376, 446, 447
Оксидоредуктазы 190, 191, 368, 369, 373;
см. также Дегидрогеназы
3-оксикинуренин 450
Оксилизин 42
Р-Окси-Р-метилглутарил-вКоА 345
Оксиметилдезоксицитидиловая кислота 47 I
5-оксиметилтиоурацил 123
5-оксиметилурацил 123
5-оксиметилцитозин 123, 124
— фаговой ДНК, глюкозилпрование 310
Оксшгролин 43, 433, 449
— биосинтез 434
— эпиморизация 446
Окситоцин 53
5-окситриптамин 44; см. также Серотошш
ге-Оксифенилпировиноградпая кислота 453
2-оксиастриол 372
Октапгидроксплаза 372
Олеиновая кислота 334, 335, 405
Олигомицин 352, 391, 398
Олигосахариды 255, 262—264
— биосинтез 311
Омыления реакция 10
Оператор 534, 535
— мутации 503, 538
Оперон 503, 504, 537
— репрессия 536
— Lac 537
Орнитин 44, 435. 459
Орнитинтранскарбамилаза 458
Оротидин-5'-фосфат 468
Оротидин-5'-фосфат — ппрофосфорилаза
468
Оротовая кислота 123, 124, 467—469
Осмотическое давление 62
Основания нуклеиновых кислот,
таутомерия 123—125
Отжиг 153
Пальмитил-SKoA 411
Пальмитиновая кислота 334, 401, 402,
/05
Пальмитиновый альдегид 411
Пальмитолеиновая кислота 335, 406
Папаин 89, 431
Парагемофилия 485
Пастера эффект 300
Паули реакция 47
Пеллагра 11, 228
Пеницилламин 44
Пентиты 260
Пентозный цикл 303, 305, 306; си. также
Гексономонофосфатыый шунт п Фосфо-
глюконатиып путь
Пентозофосфат(ы) превращения 305—
307
Пентозурия 485
Пентози, пути превращений 303
Пепсин 90, 424, 425, 430
Пепсина ингибитор 424, 425
Пепсиноген 424, 425
Пептидная (амидная) связь, определение
49-51
— — разрыв и образование 423, 424
Пептидные карты 96, 98

Предметный указатель
555
Пептиды 49—55
— аминокислотная последовательность 91
— С- и N-концевой остаток 86
— синтез 51, 52
Первичная структура белков 85, 86, 94,
110, 112, ИЗ
— — полинуклеотидов 127—131
Первичные прямые 178
Перекодирование 502
Перекрывание (кода) 500
Пермеаза, кодирование 537
Пероксидазы 234, 385
Пероксидосомы 251
Печень, роль в обмене 373
Пигменты фотосинтетичоские 320, 321;
см. также Фотосинтез, пигменты
Пиколиновая кислота 450
Пинаколиновая перегруппировка 442
Пинг-понга механизм 179
Пиноцитоз 247
Пиран 258
Пиридиннуклеотиды при фотосинтезе 324—
326
Пиридиновые нуклеотиды 228—230
Пиридоксаль(пиродоксіш) 219—222
Пиродоксальфосфат 219—223, 227
Пиридоксальфосфатсодержащие транс-
аминазы 362
Пиродоксамин 219, 221
Пиридоксин см. Пиридоксаль
Пиридоксол 219; см. также Витамин Бе
Пиримидипы 125, 466—469
— аналоги как ингибиторы синтеза пук-
леиновых кислот 516, 517
— биосинтез 364, 467, 472
— — регуляция 472
— в нуклеиновых кислотах 123
— структура 124
— таутомерия 123, 124
Пировиноградная кислота, константа
диссоциации 19; см. также Пируват
превращения 275
— — распад 349
Пирокатехаза 370
5-пирофосфомевалонат 416
Пирофосфорилазы 308, 309, 472
Пируват 279, 290, 332, 349—351, 403; см.
также Пировиноградная кислота
— декарбоксилирование 223, 224
— превращения 294, 295, 299, 300
— — в цикле лимонной кислоты 357, 359
— роль в фиксации азота 422
Пируватдегидрогеназа 358
— как мультиферментный комплекс 119
Пируватдегидрогеназный комплекс, 118,
294, 296, 297
Пируватдекарбоксилаза 280, 291, 299, 359,
366
Пируваткиназа 280, 281, 290
Плазмалогены 408, 409
Пластиды 315
Пластохиноны 323, 324, 380
Пластоцианин 324, 373, 375
Плектонемическая спираль 133, 134
Плоидность клеток и содержание ДНК 131
Подагра 474
Поли-А-полимераза 515
Полидезоксирибонуклоотиды 131—153;
см. также Дезоксирибонуклеиновая
кислота; Дезоксирибонуклеотиды; ДНК
— биосинтез, ферменты 515
in vitro 137, 159
— локализация и функция 131—137
Полидезоксирибопуклеотиды, нагревание
131
— необычного строения 137
Полинуклеотиды, денатурация и
рекомбинация цепей 152
— первичная структура 127—131
Полииуклеотидфосфорилаза 512, 515
— биологическая функция 512
Полипептидная цепь, инициирование
синтеза 532
— — направление синтеза 527, 528
— — отделение от рибосомы 531
— — рост на полисоме 530
Полипептидные гормоны 53, 54
— карты 495
Полипептиды 40; см. также Белки
— расщепление специфическое 90
— спиральные структуры и структуры
типа складчатого слоя 85
Полирибонуклеотиды 153—159; см. также
Рибонуклеиновая кислота,
Нуклеиновые кислоты; РНК
— локализация и функция 153—155
— синтетические 159
Полирибосомы 523; см. также Полисомы
Полисахариды 255, 262, 264—270
— биосинтез 311
Полисомы 153, 244, 523—525, 530; см.
также Полирибосомы
— электронная микрофотография 524
Полифенилалашш 525
Половой фактор (F-фактор) 480
Полуэлектроды 30, 31
Полярность мутаций 537
Полярные взаимодействия 111, 112
Порфирины 232, 233, 364, 381, 456
Порфобилиноген 457
Потенциал
окислительно-восстановительный 30—34
— — коферментов 374
— электродный, зависимость от pH 32—34
Потенциометр 31
Правило перекреста 392
Префеновая кислота 444, 445
Прогестерон 372
Прокарбоксипептидаза А 429
Пролидаза 430
Пролип 43, 433, 449
— биосинтез 433
— рацемизация 446
— формула 443
Пролинемия 485
Промотор 537
Пропионил-SKoA 346, 347, 359
Пропионил-ЗКоА-карбоксилазная
реакция 234
Пропионовая кислота, константа
диссоциации 19
— — превращения 346, 347
Простетическая группа 208
Протамины 160
Протеаза 198
Протеиназы, активация трипсиногена 427
— бактериальные 431
— растительные 431

556
Предметный указатель
Протобионты 314
Протогем 381
Протолитическое равновесие 17—22
— — аминокислот 20
Протон, реакции присоединения и
отщепления 147
Проектирование нуклеиновых кислот и
оснований 147
Протонные кислоты 22; см. также Кислоты
Брёнстеда
Протопорфирин IX, метаболические
источники 382, 456, 457
Протопорфирины 233, 381, 456
Прототрофные клетки 486, 487
Псевдоглобулин, растворимость 74
Псевдомономолекулярные реакции 165
Псевдоуридин 126, 522
Психозин 410, 412
Птеридин 226, 451, 453
Пурин-нуклеотиды, биосинтез 461, 462
Пуриновые нуклеотиды, образование 472
Пурины 123—125, 440
Аналоги 123, 124
— биосинтез и предшественники 364, 461,
466, 467, 472
— — регуляция 465—472
— катаболизм 473—475
— структура 124
— таутомерия 123, 124
Пуромицин 533, 534
Путресцин 121
pH, влияние на стандартную свободную
энергию гидролиза 28—30
— — — ферментативную активность
185—187, 204
— — — электродные потенциалы 32—34
— и растворимость белков 75
— определение и вычисление 17
pH-шкала 17
Р450 373
Р700 322
Р870 324, 328
Р890 324, 328
Равновесие ион металла — лиганд 22—24
Радиоавтография 143
Разобщающие агенты, механизм действия
394, 395, 398
Рамноза 261, 310
Растения, фотосинтез 314, 316, 319, 320,
326—328, 330
Расщепление признаков 476
Рафиноза 264
Рахит 11
Рацемизация аминокислот 220, 222, 446
Реакции неферментативные 222
Реакция второго порядка 164
— двойного замещения 203
— нулевого порядка 166
— первого порядка 164
Реверсия 495
— мутаций, молекулярные основы 492
Ревертанты 493, 498
«Редуктаза красителей» 356
Редуктаза-трансацетилаза липоевой
кислоты 355
Редуктазы 190
Редупликация консервативная и
полуконсервативная 507, 508
Резонанс 36, 38
Резонанс конкурирующий 36
Резонанса энергия 36—38
Рекомбинации единицы 488, 490
Рекомбинация 497, 498
— аллелей 477
— полинуклеотидных цепей 152, 153
— с высокой частотой 480
— у гаплоидных организмов 484
— — фагов 484
Рекон 490
Ренатурация белка 113
Реннин 425, 430
Рентгеноструктурный анализ белков 103—
106
Реовирусы 514
Репарирующий фермент 512
Репликаза 515
Репликативная форма ДНК 136, 137
Репликация 145
Репрессибельность 535
Репрессия 277, 487, 505, 534—538
Lac-penpeccop 537
Ретроингибирование 277
Рецессивные признаки 476
Рибит 260
Рибозофосфат в синтезе нуклеотидов 463—
466, 469, 475
Рибозо-5-фосфат 306, 329, 330
— образование при синтезе пуринов 462
Рибозофосфатизомераза 304
Рибонуклеаза 89, 103; см. также РНК-аза
— денатурация и ренатурация 113, 114
— молекулярный вес 70
— панкреатическая 129, 131
— структура 94, 95
— титрование 71
Рибонуклеиновая кислота 153; см. также
РНК
Рибонуклеозидполифоефаты,
поликонденсация 512
Рибосомы 153, 241—246, 502—504, 519, 530
— индикаторы 251, 252
— синтез белка 519, 523
— электронная микрофотография 241
Риботимидиловая кислота 471
Рибофлавин 230, 231; см. также Витамин В2
Рибулоза 259
Рибулозодифосфат 329, 330
Рибулозо-1,5-дифосфат 325
Рибулозофосфат 329, 330
Рибулозофосфат-3-эпимераза 304
Рибулозо-5-фосфат 305, 306, 329, 330
РНК 122, 153—159
— биосинтез 512—515
— — ДНК-зависимый (на ДНК-матрице)
513—515
— — ингибиторы 513
— — РНК-зависимый (на РНК-матрице)
514, 515
— вируса-сателлита, кодовое отношение
499
— вирусная 154, 155, 161
— — как матрица 503
— внутриклеточное распределение 153,
154
— гибридизация с ДНК 131, 153, 513

Предметный указатель
557
РНК гидролиз 129
— гипохромизм 155
— двусгшральная 161,- 514
РНК, денатурация и точка перехода 155
— ДНК-подобная 503
— информационная (от-РНК; матричная
РНК) 121, 153, 154, 502—505, 513, 514
— — время полужизни 504
— — гибридизация с ДНК 503
— — синтез, регуляция 505
— — свойства 504
— локализация в ядрышке 243
— матричная см. Информационная РНК
— «минорные» основания 158, 159
— нуклеотидные последовательности 157
— нуклеотидный состав 154, 155
— образование пуриновых
предшественников 466
— основания 123, 124
— полицистронная 534
— рибосомная 153, 155, 502, 505
— — константы седиментации 523
— спиральные участки 157, 158
— структура и свойства 155—159
— транспортная (s-PHK) 123, 159, 504,
505, 521—523
— — активные участки 523
— — видовая специфичность 522
— — константа седиментации 138
состав 126, 155—159
структура 155—159, 522
— — — первичная и вторичная 144, 158
РНК-адаптор 154; см. также РНК
транспортная
РНК-аза 122; см. также Рибонуклеаза
РНК-полимераза 512—515
— — ДНК-зависимая 515, 517
РНК-зависимая 514, 515, 517
Родопсин 320
Ротенон 351, 391
Сакагуши реакция 47
Салливана реакция 47
Саркозин 44
Сахарная кислота 261
Сахароза 263, 329
— молекулярный вес 70
— синтез 310, 311
— стандартная свободная энергия
гидролиза 28
Сахарошш, формула 438
Сведберг (единица) 66, 137
Сведберга уравнение 66
Световые реакции фотосинтеза 321—325,
331
Светорассеяние 142
Свободная энергия гидролиза высоко-
и низкоэнергетических соединений 35
— — изменение 24—35
— — — зависимость от pH 27
— — стандартная; см. Стандартная
свободная энергия
Седиментации константа 66, 137
— скорость 64, 138
Седиментационное равновесие 68, 69, 138
Седиментограмма белка 66, 83
Седогептулозо-1,7-дифосфат 330
Седогептулозо-7-фосфат 304—307, 330
Секонал 391
Сексдукция 481, 484
Селахиловый спирт 409
Селенметионин 522
Семиальдегид а-аминоадипиновой кислоты,
формула 438
— аспарагиновой кислоты, формула 438
Серии 41, 285, 439, 449
— альдольное расщепление 220
— биосинтез 439
— рацемизация 446
— синтез сфингозина 411
— формула 439, 440
Сериноксиметилаза 439
Серинсульфгидраза 440
Серотонин 451; см. также 5-окситриптамин
Сиаловые кислоты 310; см. также N-аце-
тилнейраминовая кислота
Синаптические пузырьки 249
Синонимы 521
Синтетазы 194, 521
— из разных источников 304
Сквален 372, 414, 419
— синтез холестерина 417
— формула 418
Сквален-циклогидроксилаза 372
Скрещивание 476, 477
— возвратное 477
— дифакториальное 478
— у фагов 483
D-сорбит 260
L-сорбоза 307
Соре полосы 381
Спаривание оснований 134, 135
Спектр поглощения азотистых оснований
125
— — аминокислот 55, 56
— — белков 55, 56
— — гемопротеидов 382
НАД 229
— — флавопротеидов 376
цитохромов 382, 388
Спермидин 121
Спермин 121
В-спираль 160
а-Спираль 99—101, 106, 107, 160
Спиральные структуры белков 99—103,
106, 108
— — нуклеогистонов 160
— — нуклеиновых кислот 134, 157, 158
Спириллоксантин 320
Спирты многоатомные 260
Стандартная свободная энергия гидролиза
важнейших биохимических соединений
28, 36, 37
— — — зависимость от pH 28—30
— — — изменения 25—27
— — — окислительно-восстановительные
реакции 33, 34
Стационарное состояние 166
Стеариновая кислота 334
Стеркуловая кислота 334, 335
Стероид-гидроксилазы 372
Стероиды 334, 412—419
— биосинтез 400, 412
Стрептомицин 534
Структура вторичная 98—102, 110
— первичная 112
— третичная 103—110
— четвертичная 86, 116—119

558
Предметный указатель
Структуры спиральные и типа складчатого
слоя 85, 99, 100
Стэкинг-взаимодействие 151
Субти лизин 198
Сукцанат 351, 355, 438, 439; см. также
Янтарная кислота
— образование при углеводном обмене 302
Сукцинатдегидрогеназа 302, 351, 355, 365,
365, 379
Сукцинат-тиокиназа (сукцинил-КоА —
синтетаза) 351, 355
Сукцинил-КоА 349, 351, 355, 359—361, 457
«Сукциноксидаза» 356
Супрессия 495, 500, 529
— вве- и внутригепная 495
Супрессорные мутации 495, 529
Супрессоры 529, 530
Сфингозин 409—412
— биосинтез 411
Сфингозинфосфат 410
Сфинголипиды 334, 412
— биосинтез 409—412
Сфингомиелины 410
— биосинтез 411, 412
Сцепления группы 478
— карты 479
Спиллит 260
Сэагера реактив 87
Такаамилаза 89
Такадиастаза 129
жезо-Тартрат 351
Таурин 44, 413
Таурохолат натрия 335
'Гаурохолевая кислота 336, 413
Таутомерия азотистых оснований 123—125
ТГФ 226—228; см. также Тетрагидрофолат
ТГФ-кофермент в синтезе пуклеотидов 464
Темновые реакции 319, 325, 328
Теобромин 123, 124
Теофиллин 123
Термодинамика гексозомонофосфатного
шунта 303
— гликолиза и спиртового брожения 280 —
282, 293, 297, 298, 300
— глюкопеогонеза 300
— образования АТФ 395
— — гликозидных связей 310
— фотосинтеза 331
— цикла лимонаой кислоты 351, 358, 362
Термодинамические характеристики
биохимических процессов 17—39
— — реакции гидролиза 27—30
— — химических реакций 24
Терпены, биосинтез 400
Тестостерон 413, 414
5,6,7,8-тотрагидроптеридин 371
Тетрагпдрофолат (ТГФ) 226—228, 471
Тотрапироллы 232
— синтез 456
Тетрозофосфат 329
Тиамин 223
Тиамин-зависимые реакции, механизм 325
Тиамшширофосфат (ТПФ) 223—225, 291,
354
Тиенилтрифторацетон 352, 391
Тизелиуса прибор 76
Тимидилатсинтаза 471
Тимидиловая кислота (тимидилат),
биосинтез 470, 471
Тимидин 126
Тимидин-З'-фосфат 127
Тимин 123, 124
— аналоги 123, 124
— спектр поглощения 125
Тиогалактозид-трапеацетилаза,
кодирование 537
Тиогликолевая кислота 89
Тиокиназы 194, 342, 343, 351
— жирных кислот 341—343
Тиоредоксин 470
Тиоредоксинредуктаза 470
Тиоурацил 123
Тиофоразы 342, 343, 431
Тирозин 43, 372, 432, 436, 451—453
— биосинтез 444, 445
Тирозиназа 453
Тирозиноз 485
Тироксин 43
Титрование белков 71
— кислот 18, 19
а-Токоферол (Витамин Е) 392
Толленса реактив 259
Трансальдолаза и трансальдолазная
реакция 304, 305
Трансаминазы (Амипотрансферазы), 438,
446
— механизм действия 179
Трансаминнровашге 220, 222, 223, 362,
433, 435, 438, 446
Трансгидрогоназа 326
Трансдукция 482—484
Транскарбоксилазные реакции 235
Транскетолаза 224, 225, 228, 304, 305, 330
Трансконформации 113, 482, 484
Транскриитаза 515; см. также РНК-поли-
мераза
Транскрипция 502, 505, 538
— инициирование 533
— направление 516, 528
— роль гистонов 160
Трансляция 490, 491, 502, 505, 529, 530
— инициирование 533
— направление 528
— ошибки 495—530
Трансмотипирование 454, 455
Трансферазы 190, 191, 194
Трансферные факторы 521, 530
Трансформирующая ДИК 503
Трансформирующий фактор 482
Треонин 41, 45, 443, 449
— олло-формы 45
— биосинтез 435, 43G
— формула 443
Треопинальдолазы 436
Троошш-дегидратаза 442
Треодин-синтаза 436
Третичная структура белков 86, 103, 108
110, 114
Триглицериды 335—337, 406
— биосинтез 406, 407
— расщепление 335—337
Триозофосфатдегидрогеиаза 281
Триозофосфатизомераза 280, 281, 287, 304,
328
Триозофосфаты 287, 306, 307
— взаимопревращения: 287

Предметный указатель
559
Трпозы 329
Трипептидаза 430
Триплетность кода 499; см. также Кодовое
отношение
Триплеты 499, 501, 502
— состав 525
Трипсин 89, 90, 198, 425, 430
Трппсиноген 427
— активация 429
— структура 426
Триптофан 43, 220, 370, 431, 449—451
— аналоги 522
— биосинтез 444, 445
— — гепы 496
— окисление 450
Триптофаноксигепаза 370
Триитофанпирролаза 451
Триптофансиптетаза 445, 496
— гены, контролирующие биосинтез 496
— мутации гонов 494, 495
Трисахариди 263, 264
Трпхлоруксусная кислота, константа
диссоциации 19
Тромбин 198
Убихшюиы 324, 379, 380; см. также Кофер-
менты Q
— строение 380
Углеводы, биосинтез из двууглеродных
соединении 301—303
— обмен 272—313
— — в анаэробных и аэробных условиях
300
— — стадии 277
— оптическая изомерия 256
— синтез 363
— структура 257
— D- и L-формы 256
— химия 255—271
Углерод, превращения в процессе
фотосинтеза 318, 328, 329
Углерода двуокись (СО2), ассимиляция
(фиксация) при фотосинтезе 322, 325,
327—331
— окпсь (СО) 391
Углеродный цикл 325
Удельный парциальный объем 66, 68
УДФ-і\т-ацетилгліокозамип 309
УДФ-Б-галактоза 214
УДФ-галактозо — пирофосфорилааа 309
УДФ-Б-глюкоза (УДФГ) 213, 285, 308
— синтез 308
УДФ-глюкояа-гликоген — глюкозилтранс-
фераза 311; см. также Гликогенсинтетаза
УДФ-глюкозо — пирофосфорилаза 309
УДФ-глюкуроновая кислота 214, 309
УДФ-оахара 213, 214
УДФГ-4-эшщераза (УДФ-глгокозо — 4-
эшшераза) 214, 309
Уксусная кислота 349
— — константа диссоциации 19
— — кривая титрования 20
Ультрацентрифуга 64 — 66
Улмрацентрифугирование 66, 68, 70, 83,
137
— в градиенте плотности 70
УМФ 468
Уотсина — Крика модель 136, 137, 511
Уравнение баланса \ 66
Урацил 123, 124, 472
— аналоги 123, 124
— производные 123, 124
— спектр поглощения 125
Уреаза, работы Самнера 12
Уридиловая кислота, формула 468; см.
также УМФ
Уридилтрапсферазы 213
Уридии 126
Уридиндифосфатглюкоза, стандартная
свободная энергия гидролиза 28
Уридин-нуклеотидиые коферменты 213
Уридиновые нуклеотпды 213, 214
Уриказа 375, 474
Уроновые кислоты 309
Уропорфирин I 458
Уропорфириногеи 458
Уротелические организмы 457
УТФ 309
Участок опознавания 530
— поликопдеисации 530
— ухода 531
Фагп, скрещивание 483
— Т-четпые 123, 471
Фагоцитоз 247
ФАД 354, 375; см. также Флавинадешш-
дянуклеотид
— как простетическая группа 375
Фактор антиапемическпй 236
Фарнезшширофосфат 417
Фенилаланин 42, 431, 451, 452, 485
— аналоги 522
—- биосинтез 444, 445
L-фенилаланин, превращение в L-тиро-
зин 371
Фенилаланин — 4-гидроксилаза 372
Фенилацетуровая кпслота 339
Фенилгидразоны 391
Фенилжирные кислоты 339
Фенилизотпоцпанат, реакция с
аминокислотами 49, 87
Фенилкотопурия 453, 454, 485
Фенилмолочная кислота 454
Фенюшировиноградная кислота 454
Фепилтиогидаптоип и фенилтиогидантои-
новая кислота 49
Фонол, выделение нуклеиновых кислот 121
Фенолаза (моиофенолоксидаза) 372, 374,
375
— комплекс 371, 374
Фенотип 476
— варианты 490, 491
Феопорфирин 321
Фермент(ы), И, 189—206
— активаторы и активация 181
— активирующие амипокпслоты 521
— активность, единица 168
—- — удельная ц суммарная 169
— активные цоптры 181, 195—200, 204
— — — конформацяя 200
— белковая природа 189
— влияние pli 185—187, 204
— врожденное отсутствие 485
— выход 169
— гибридные 119
— гипотеза ключа и замка 200
— г ибов 354

560
Предметный указатель
Фермент(ы), ингпбирование, типы и
характеристики 182, 183, 185
— каталитическая константа 169
— классификация и номенклатура 190—
195
— локализация внутриклеточная 250, 251
339
— — в митохондриях 244, 303, 350, 353,
357, 363, 365, 367
— — — рибосомах 247
— — — цитоплазмо 303
— медьсодержащие 373—375
— моносубстратные и бисубстратные
реакции 170
— НАД-зависимые 380
— образование комплексов, кинетические
уравнения 173, 174
— окислительно-восстановительный
потенциал 373
— печени 372, 373
— протеолитические в
желудочно-кишечном тракте 424—431
— специфичность 200, 204
— стабилизация конформации 181
— степень очистки 169
— стерео-специфичность 230
— субъединицы 116, 169
— теория индуцированного соответствия
200
— число оборотов 169
Ферментативные реакции,
«беспорядочный» механизм 180
— — бисубстратные, кинетика 177
— — ведущие реагенты 180
— — ингибирования типы 172, 173, 175,
201
кинетика 164, 167—170
— — механизм типа «пинг-понг» 179
— — пути и механизмы 200—202
— — упорядоченный механизм 180
— — участие АТФ 210, 211
Фермент-субстратный комплекс 170, 180
Ферменты-индикаторы 251 —253
Ферредоксин 323, 324, 326, 332, 378, 405
— и фиксация азота 422
— как акцептор электронов 422
Ферредоксин-НАДФ — редуктаза 326,
376
Ферредоксиноподобный переносчик 373
Форрипротоиорфирины 381
Ферропроторорфирин IX 382
Фибриноген, растворимость 74
Фика законы диффузии 67
Фикобилины 320
Фикоцианин 320, 324
Фикоэритрин 320, 321, 324
Фикоэритробилин 321
Фитосфингозин 409
Фицин 431
Фишера — Гофмейстера гипотеза 50
Флавин(ы) 324, 376
— спектр поглощения 376
Флавинадениндпнуклеотид 231; см. также
ФАД
Флавинмононуклеотид 231, 375; см. также
ФМН
Флавиновые коферменты 230—232
Флавопротеиды 373, 375—378
— свойства и источник 376
ФМН как простетическая группа 375; см.
также Флавинмононуклеотнд
Фолиевая кислота 226
Фолина—Чиокалтоу реакция 47
Формальдегид, реакция с полинуклеоти-
дами 145
Формиат 226, 295
N-формилглицинамид-ріібонуклеотіщ 462,
463
N-формилглицинамидин-рибонуклеотггд 463
L-N-формилкинуренин 451
ТЧ-формилметионин-я-РНК 532
Фосген 49, 52
Фосфатаза фосфорилазы 284
— щелочная 89, 198
Фосфатазы 194, 201, 304, 330
— неспоцифические 280
Фосфатидааы А, В, G и D 338
Фосфатидилглицсрин 408
Фосфатидилинозиты 407, 408
1-фосфатидил-Ь-лгио-иноант 408
Фосфатидилсерины 337, 407, 408
Фосфатидилхопин(ы) 337, 392, 407
— митохондрий 392
Фосфатидилэтаноламин 337, 392, 407, 408
Фосфатидная кислота 406—408
— производные 337
Фосфатиды 338, 339, 412
Фосфоглицерат 279, 289, 328; см. также
Фосфоглпцериновая кислота
— изомеризация 289
Фосфоглицераткиназа 280, 289, 328
Фосфоглицератмутаза 280, 281, 289
Фосфоглицериновая кислота (ФГК) 289,
329, 439; см. также Фосфоглицерат
Фосфоглицериновый альдегид (ФГА) 329
Фосфоглюкозоизомераза 280, 281
Фосфоглюкокиназа 286
Фосфоглюкомутаза 198, 280, 281, 285
6-фосфоглюконат 304
6-фосфоглюконат-дегидрогоиаза 303, 304
Фосфоглюконатный путь 303; см. также
Гексозомонофосфатнъш шунт и Пентоз-
ный цикл
О-фосфогомосерин 435, 436
— формула 436
Фосфодиэстеразы 129, 131
Фосфодиэфирная цепь 134
Фосфоенолпировиноградная кислота (фос-
фоенолпируват), термодинамика
гидролиза 279, 290, 299, 302, 309
Фосфокетопентозоэпимераза 330
Фосфолипиды 315, 334
— биосинтез 407
— митохондрий 392
— расщепление 337—339
Фосфоманнозоизомераза 286
Фосфомоно- и фосфодиэфиры, стандартная
энергия гидролиза 28
Фосфооксалоацетат 299
Фосфопентозоизомераза 330
Фосфопентокиназа 330
3-фосфопировиноградная кислота 439
Фосфопируватдегидрогепаза 280; см.
также Енолаза
5-фосфорибозил-1-амин и биосинтез
пуринов 462
5-фосфорибоаил-1-пирофосфат и биосинтез
пуринов 462

Предметный указатель
561
Фосфорилазы 194, 198. 201, 281—284
Фосфорилирование АДФ 289
— окислительное 358, 393—399
— — дыхательный контроль 395, 397
ингибиторы 391, 394, 395, 398
модели 395—397
— — схема 393
— — точки фосфорилирования и
отношение Р/О 394, 395
— — частные реакции 395—397
— отношение Р/О 394
— при гликолизе 289
фотосинтезе 319, 323, 327, 330; см.
также Фотофосфорилирование
— циклическое 327
Фосфорилхолин 410
Фосфорной кислоты ангидрид как
высокоэнергетическое соединение 36
Фосфорокластическая реакция 296; см.
также Кластическая реакция
Фосфотрансацетилаза 293, 343
Фосфотрансфераза 292
Фосфотрансферазы, механизм действия
181
Фосфофруктокиназа 280, 281, 286
5-фосфошикимовая кислота, биосинтез и
формула 443—445
Фотовосстановление (фоторедукция) 319,
324
Фотолиз воды 315, 318
Фотоокисление 319
Фотосинтез 314—333
— ассимиляция СО2 322, 325, 327—331
— восстановители 318, 325, 326
— доноры водорода 318
— значение 314, 315
— квантовый выход и энергетика 331, 332
— «красное снижение» 322
— окислители 318
— перенос электронов 325—327, 330—332
— пигменты главные и вспомогательные
320, 32-1, 324, 325
— — локализация 315
— поглощение света 321, 322
— путь углерода 328
— световые реакции 321—325, 331
— системы реакций 323, 324
— стехиометрия 317—320
— у бактерий 318, 323—328, 331
водорослей 324, 326, 331
— — зеленых растений, системы реакции
323
— эффект усиления 322
Фотосинтезирующая система, локализация
315
Фотосинтезирующие организмы 314, 320,
321
Фотофосфорилирование 322, 327
Фотоэлектроны, перенос 330, 331
Френозин 410
Фрикционное отношение 67, 68
D- и L-фруктоза 259, 260, 307
Фруктозилдифосфатаза 280, 287
Фруктозо-1,6-дифосфат 279, 286, 287, 306,
307, 328
— получение из глицерина 205
Фруктозофосфатальдолаза 280
Фруктозо-6-фосфат 279, 286, 304—309,
328—330
5-фтордезоксиуридин 516
1-фтор-2,4-динитробензол 48, 86
Фтормалат 351
5-фто рпиримидины 516
Фторурацил 123
га-фторфенилаланин 522
Фторцитрат 351, 352
Фукоза 261
Фумараза 302, 351, 356
Фумарат 302, 348, 349
— дегидратация 356
Фумарат-моноанион, константа
диссоциации 19
Фумарилацетоуксусная кислота 453
Фуран 258
Фуранозная конфигурация 125
Хаульмугровая кислота 334, 335
Хелатные комплексы 24, 28
Хенохолевая кислота 413
Хиазма 478
Хилла реакция 315, 322, 325
Хиломикроны 337
Химопапаин 431
Химотрипсин 89, 90, 198, 203, 204, 425,
430
— механизм действия 203, 204
Химотрипсиноген 427
— активация 427
— структура 426
Хинальдиновая кислота 450
Хинолиновая кислота 450
Хиноны 315, 327, 374
Хитин 266
Хлорамфеникол 533
Хлоргемин 381
Хлорин 321
Хлоркруорин 381, 384
Хлорокруорогем 381
Хлоропласты 248, 315—317, 325, 387
— содержание ДНК 131
— электронная микрофотография 316,
317
Хлорофиллы 315, 320—322, 324, 328
Хлоруксусная кислота, константа
диссоциации 19
Холдейна соотношение 172
Холевая кислота 412, 413 .
Холестерин, биосинтез 345, 412, 414—416
— формула 414, 416
Холецистокинин 336
Холин 408, 409
Холиндегидрогеназа 379
Хондроитин, синтез 311
Хондроитинсульфаты 269, 311
Хоризмовая кислота 444, 445
Хроматин 243
Хроматография адсорбционная 80, 81
— двумерная 58, 59
— ионообменная 57, 80
— на бумаге 58
— определение гомогенности препарата 83
Хроматофоры 317
Хромонемные организмы 248
Хромосома бактериальная 534
— фага 483
Хромосомы 243
— как группы сцепления 478, 479

562
Предметный указатель
Цвиттерион 46
Цвиттерионная форма аминокислоты 22
ЦДФ 214, 215
ЦДФ-холин 214
ЦДФ-этанолаыин 214
Целлюлоза 264, 265
Центральные пути обмена 273
Центрифугирование 138, 139, 249, 250
Центросомы (центросферы) 246
Церампд (N-ацилсфиптозин) 411
Церамидтрансфераза 411
Цереброзиды 310, 410
— биосиптез 412
Цереброновая кислота 410
Цианат калия и определение N-концевых
аминокислот 87
Цианид 351, 352
Цианкобаламин 237; см. также Витамин
В12 и Кобаламлн
Цикл лимонной кислоты (ЦЛК; Цикл три-
карбоновых кислот; Цикл Кребса) 273,
298, 301, 302, 332, 348—367
— — — биосинтетические функции 362 —
364
— — — история вопроса 348—350
— — — обмен аминокислот 449, 453
— — — — жирных кислот 345, 347
— — — роль в катаболизме и в генерации
энергии 358—362
— — — — митохондрий 349, 353, 355,
357, 363, 365
— — — стехиометрия 357
— — — суммарная реакция 357—359
— — — схема 349
— — — термодинамика 351, 358, 362
— — — ферменты, ингибиторы и
регуляция 351, 364—367
— трикарбоновых кислот см. Цикл
лимонной кислоты
Циклогексимид (актидион) 533
Циклопентанпергидрофенантрен 414
Цинга 11
Цинк-карбоксипептидаза А 429
Цпстатионин 436
Цистеин 43, 436, 437
— биосинтез 439, 440
— формула 440
— формулы хелатных комплексов 24
Цистеиновая кислота 88
Цистин 43, 46, 449
Цистинурия 453
цис-транс-Тест 494, 495
Цпстроны 494
Цитидин 126
— включение в ДНК 470
Цитидиновыо пуклеотиды 214, 215
— — образование 469
Цитозин и его аналоги 123—125
Цитоплазматическая жидкость 248; см.
также Матрикс цитоплазмы
Цитохром(ы) 373, 386—389
— бактериальные 387
— перенос электронов 234, 327, 365
— простетические группы 381
— свойства 387
— а 381, 388
— b 324, 381, 388, 399
— Ьь 387
— Ь6 315, 323
Цитохром(ьт) с 60, 96, 387, 390, 391
— сі 323, 328, 378, 386, 388, 391
— с2 324, 387
— / 315, 322—324, 328
Цитохромоксидаза 375, 388, 390
Цитохром Ьь — редуктаза, свойства 376
Цитохром с — редуктаза 370
Цитрат 302, 348, 349, 402
— и изоцитрат, взаимопревращения 353
Цитраткондепспрующий фермент 302, 327,
350; см. таюке Конденсирующий
фермент
Цптрат-лиаза 363, 366; см. также Цитрат-
расщеиляющий фермент
Цитрат — оксалоацетат-лиаза 352
Цитратрасщеиляющий фермент 352; см.
также Цитрат-лпаза
Цитрат-синтаза 352
Цитрил-КоА 353
Цитрогеназа см. Цптратконденсирующпй
фермент
Цитруллин 44, 459
ЦМФ-Г^-ацетилнейраминат 309
Чаргаффа правила 133, 137
«Челночные» реакции (челночный перенос)
293, 297, 367, 386; см. также Электронов
перенос.
Четвертичная структура белков 86, 116—
119
Число оборотов 178
Шераги и Манделькерна уравнение 141
Шикимовая кислота 443, 444
Шиффовы основания 145, 221—234, 288,
305, 346
Эди — Хофсти уравнение 168
Эдмана реактив 87, 88, 91
Экзонуклеаза I, 131
Экзопептидазы 428
Эластаза 198
Электродный потенциал 32—34; см. также
Окислительно-восстановительный
потенциал
Электронейтральность растворов [18
Электронов акцепторы 319
Электроны, перенос 297, 351, 352, 357,
369, 389, 390, 394, 397; см. также
Дыхательная цепь и «Челночные» реакции
— — при фотосинтезе 319, 323—327,
330—332
— — роль ферредоксина 422, 423
— — сцепленпые реакции 369
Электрофорез 80
— аминокислот 59
— белков 76
— зонный и фронтальный 76—78
— очистка белков 80
— прибор Тизелиуса 76
a,?- и ?,Y-3nHMHHau,nfl 220
Эмбдеиа — Мейергофа — Парнаса схема
(ЭМП) 278—282, 294; см. также Гликолиз
Эндергонические реакции 398
Эндонуклеазы 129, 131
Эндопептидазы 425, 427, 430

Предметный указатель
563
Эндоплазматическая сеть 153, 241, 242,
244—246, 248, 251—253
— — индикаторы 251, 252
Энергетический баланс дегидрирования 303
— — карбоксипирования 298
— — образования гпикозидных связей 310
— — углеводного обмена 277, 297, 300
— — фотосинтеза 331, 332
— — цикла лимонной кислоты 351, 358,
362
Энергия ионизации 29
— резонанса 36
Энтальпия 34, 35
Энтерокиназа 428
Энтропия 34, 35
Эпимеризация гексоз 307, 309
Эпинефрин см. Адреналин
Эписомы 482
Эргосомы 153, 244; см. также Полисомы
Эритрозо-4-фосфат 305—307, 328—330
Эритрокруорин 381, 384
Эрлиха реакция 47
Эстрогены 412, 413
Эстрон 413, 414
Этанол 279, 293, 295
Этаноламин 408, 409
Этиопорфирины 233
Эукариотические организмы 240, 315
Эффект усиления 322
Яблочная кислота, константа
диссоциации 19
Ядерная мембрана 240, 244
Ядро 240—243, 245, 248, 251—253
— индикаторы 251, 252
Ядрышко 243
Янтарная кислота 349; см. также Сук инат

ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие к русскому изданию
Из предисловия авторов
Глава I. краткая история и предмет биохимии
Исторические сведения
Предмет биохимии
Биохимическая литература
Принятые в биохимии сокращения
Литература
Глава II. термодинамические характеристики биохимических
ПРОЦЕССОВ
Протолитичоское равновесно
Равновесие ион металла — лигаыд
Изменение свободной энергии. Реакции, но сопровождающиеся
окислением и восстановлением
Изменения свободной энергии. Реакции окисления —
восстановления
Изменения стандартной энтальпии и энтропии
Богатые энергией (макроэргические) соединения
Литература
Глава III. белки, классификация, свойства, очистка
Аминокислоты — структурные элементы белков
Пептидная (амидная) связь
Синтез пептидов
Природные пептиды
Идентификация и количественное определение белков ....
Анализ аминокислотного состава белков
Определение молекулярного веса макромолекул
Белки как полиэлектролиты
Очистка белков
Критерии чистоты
Литература
Глава IV. СТРУКТУРА БЕЛКОВ
Уровни структурной организации
Первичная структура белков
Вторичная структура белков
Третичная структура белков
Силы, участвующие в поддержании вторичной и третичной
структур
Соотношение между первичной структурой п структурами более
высокого порядка
Денатурация белков
Четвертичная структура белков
Литература
Глава V. нуклеиновые кислоты
Общие положения
Мономерные единицы

Оглавление 565
Полинуклеотиды 127
Полидезоксирибонуклеотиды 131
Полирибонуклеотиды 153
Нуклеопротеиды 159
Литература 163
Глава VI. кинетика ферментативных реакций 164
Химическая кинетика 164
Кинетика реакций, катализируемых ферментами 167
Бисубстратные реакции 176
Литература 187
Глава VII. ферменты 189
Классификация и номенклатура реакций, катализируемых
ферментами 190
Активный центр фермента 195
Пути и механизмы ферментативных реакций 200
Механизм действия химотрипсина 203
Проблема специфичности ферментов 204
Литература 207
Глава VIII. коферменты 208
Аденозинтрифосфат 208
Уридиновые нуклеотидьг 213
Цитидиновые нуклеотиды 214
Гуанозиновые и инозиновые нуклеотиды 215
Кофермент А 216
Липоевая кислота 217
Глутатион 218
Пиридоксальфосфат 219
Тиаминпирофосфат 223
Тетрагидрофолиевая кислота 226
Пиридиновые нуклеотиды 228
Флавиновые коферменты 230
Гемсодержащие коферменты 232
Виотин 234
Кобамидные (витамин В12-) коферменты 236
Литература 238
Глава IX. организация клетки и внутриклеточные частицы ... 239
Структура клетки 240
Методы фракционирования клеточных компонентов 249
Определение внутриклеточной локализации ферментов и
биохимических активностей 250
Литература 254
Глава X. химия углеводов 255
Моносахариды 255
Олигосахариды 263
Полисахариды 264
Литература 270
Глава XI. обмен углеводов 272
Несколько замечаний относительно обмена веществ 272
Гликолитический путь 278
Альтернативные пути превращения пирувата 294
Реакции карбоксилирования 298
Синтез глюкозы из пирувата [глюко(нео)генез] 299
Гексозомонофосфатный (пентозный) путь 303
Биосинтез гликозидных связей 310
Литература 312
Глава XII. фотосинтез 314
Локализация фотосинтезпрующей системы 315
Общая стехиометрия фотосинтеза 317
Главные фотосинтетичеекпе пигменты 320

566
Оглавление '
Доказательства существования двух световых реакций .... 321
Сущность двух световых реакций фотосинтеза 322
Образование восстановителей 325
Фотосинтетическое фосфорилирование (фотофосфорилирование) 327
Природа реакционных центров 328
Путь углерода в фотосинтезе 328
Квантовый выход и энергетика 331
Другие восстановительные реакции, происходящие иод действием
света 331
Литература 332
Глава XIII. ОКИСЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И РАСЩЕПЛЕНИЕ СЛОЖНЫХ
липидов 334
Жирные кислоты 334
Расщепление триглицеридов 335
Расщепление фосфолипидов 337
Окисление жирных кислот 339
Образование кетонных тел 345
Окисление жирпых кислот с почетным числом атомов углерода.
Судьба пропионовой кислоты 346
Окисление жирных кислот с разветвленной цепью 347
Литература 347
Глава XIV. цикл лимонной кислоты 348
Циклическое окисление ацстпл-SKoA 348
Ферменты, катализирующие отдельные реакции цикла .... 350
Роль цикла в катаболизме и в генерации энергии 359
Биосинтетические функции цикла лимонной кислоты 362
Некоторые факторы, влияющие па активность цикла лимонной
кислоты 364
Литература 367
Глава XV. биологическое окисление 368
Оксигеназы п гидроксилазы 370
Дегидрогеназы 373
Гемопротеиды 381
Митохондриальная цепь переноса электронов 389
Окислительное фосфорилирование 393
Литература 399
Глава XVI. БИОСИНТЕЗ Липидов 400
Биосинтез жирных кислот 400
Синтез триглицеридов 406
Биосинтез фосфолипидов 407
Биосинтез сфинголипидов 409
Биосинтез стероидов 412
Литература 419
Глава XVII. обмен аминокислот 421
Ассимиляция неорганического азота 421
Разрыв и образование пептидных связей 423
Протеолитическпе ферменты желудочно-кишечного тракта . . . 424
Биосинтез аминокислот 431
Общие аспекты обмена аминокислот 445
Специальные аспекты обмена аминокислот 447
Литература 459
Глава XVIII. обмен нуклеотидов 461
Биосинтез нуклеозидтрифосфатов 461
Биосинтез дезоксинуклео:шдтрифосфатов 469
Регуляция биосинтеза пирпмидинов и пуринов 472
Катаболизм пуринов ^З
Литература 475

Оглавление 567
Глава XIX. структура и функция гена 476
Классическая генетика 476
Молекулярная (биохимическая) генетика. Один ген—один фермент 485
Ген как функциональная единица. Один ген—одна полипситпдная
цепь 488
Характерные особенности генетического кода 499
Информационная (матричная) РНК 502
Литература 506
Глава XX. биосинтез нуклеиновых кислот 507
Поликопденсация пуклеозидполнфосфатоп 507
Химическое ингибярованис биосинтеза нуклеиновых кислот . . 515
Литература 517
Глава XXI. биосинтез белка . 519
Бесклеточпыс системы 519
Регуляция синтеза белка 532
Литература 539
Указатель авторов 540
Предметный указатель 543

Г. Малер, Ю. Кордес
ОСНОВЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ
Редактор М. Д у н и н а
Художник Н. Мануйлова
Художественный редактор Ю. Максимов
Технический редактор И. Д е р в а
Корректор О. Румянцева
Сдано в производство 20/IV—1970 г.
Подписано к печати 15/IX—1970 г.
Бумага M 2, 70х 108і/іб=17,75 бум. л.
49,7 усл. печ. л.
Уч.-изд. л. 48,59. Изд. M 4/5181
Цена 3 р. 53 к. Зак. 246
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
Москва, 1-й Рижский пер., 2
Московская типография M 16
Главполиграфпрома Комитета по печати
при Совете Министров СССР
Москва, Трехпрудный пер., 9

ИЗДАТЕЛЬСТВО
«M И Р»