Фосфолипиды растительных масел: Состав, структура, свойства, получение и применение - Арутюнян Н.С., Корнена Е.П.

Автор: Арутюнян Н.С. Корнена Е.П.

Теги: масла, жиры и воски растительного происхождения растительные фосфолипиды химия растительные ресурсы пищевая промышленность жиры

Год: 1986

Похожие

Жиры и масла. Производство, состав и свойства, применение

Технология переработки жиров

Основные процессы производства растительных масел

Силикагель, его получение, свойства и применение

Текст

Н.С. Арутюнян
Е.ПКорнена
Фосфолипиды
растительных
масел
Состав, структура, свойства, получение и применение
нейший
цельное
гств пи-
граммы
!вляется
работки
рактери-
1и кото-
юл ипид-
оей при-
гни, про-
перера-
но выве-
последу-
< отделе-
1 пробле-
цироким
гурового
масле да-
гические
(ЬЮ полу-
концент-
атидного
и легкой
1ят широ-
>аститель-
Ф МОСКВА
АГРОПРОМИЗДАТ
юсвящен-
екоторые
методам
□вой про-
зеработке
содержат-
9 И ЛИШЬ
геханизме
В книгах
биохимия
составе и
□липидов,
гброзидов
(итехниче-
3
<3
УДК 665 37 „2
А
Арутюияй Н. С., КорненаЕ. П. Фосфолипиды растительных масел. -
М.: Агропромиздат, 1986. — 256 с.
На основании отечественных и зарубежных исследований в книге даны общая
характеристика и классификация фосфолипидов и их роль в растительной клетке.
Изложены основные методы исследования фосфолипидов. Приведены характеристика
состава фосфолипидного комплекса, выделенною из масличных семян, изменение
фосфолипидов в процессе хранения, сушки и переработки масличных семян.
Представлены результаты работ, выполненных авторами и сотрудниками ка-
федры технологии жиров и Отраслевой лаборатории Краснодарского ордена Трудо-
вою Красного Знамени политехнического института по выяснению химической струк-
туры индивидуальных ipynu фосфолипидов, особенностей поведения фосфолипидов
в неполярных растворителях (триаицлглицеринах и др); материалы исследований
основных свойств фосфолипидов и факторов, определяющих устойчивость сложной
системы триацилглицерины — фосфолипиды. Описана технология выведения фосфо-
липидов из растительных масел с целью получения двух высококачественных про
дуктов - гидратированного масла и фосфатидного концентрата. Рассмотрено при-
менение фосфолипидов в пищевой промышленности, медицине, сельском хозяй-
стве и др.
Книга предназначена для научных и инженерно-технических работников
Табл. 105. Ил. 40. Библиография - 385 названий
Рецензенты; д-р техн. наук. проф. В Г, Щербаков, д-р техн наук, проф
А П Нечаев
Норайр Степанович Арутюнян
Елена Павловна Корнена*
фосфолипиды растительных масел
Зал редакцией ЛМ Богатая
Ролек юр НН Кобчикова
ХудоЖрОТИчнный pP/WKTop В,А, Чуракова
(панические редакторы Л. С Гладкова, М.Б. Терентьева
Корреи юры М И. ItuenfHM, НВ, /1/имина
III-8*441
lloHlHH-MH* И 01 I) Hn, Т J2-U4. Формат 60 X 90*/1б. Бумага офсетная № 1.
Ilmiik нфмонаи I ||>ИН1УРЯ IIрвы Ромм, Уол, и. л. 16,0. Усл. кр.-отт. 16,0.
Уй Мй Й, IIJl Hui.N* 17Л I Ира* 1000 акз. Заказ 727. Цена Зр. Юк.
О|щ»И* 1|1»й>ио1м кроною 1нам<Н1и Но "Агропромиздат”, 107807, ГСП
М>> и» h l b <'ал>'пйн1'па> ‘ийи. |Ц.
MiifWiBt-HM Миография N* И С|)ктшмграф||р11М1 при Государственном комитете
• м г .и. nxiiwM издателььтп.
. . ..к, инй |нф., 7
аЧОИММИЮО 827
х1 нъ
I а к о у 5
[|(>Hllipai|aiH Н ь1|н«>1оЯ 'Н>р1и>вли. 10J 898, Москва,
ПРЕДИСЛОВИЕ
В плане развития народного хозяйства предусматриваются дальнейший
рост производства продукции пищевой промышленности, значительное
повышение качества, биологической ценности и вкусовых достоинств пи-
щевых продуктов Одной из важных задач Продовольственной программы
СССР, утвержденной майским (1982 г.) Пленумом ЦК КПСС, является
увеличение производства растительных масел, продуктов их переработки
при комплексном использовании масличного сырья.
Вырабатываемые промышленностью растительные масла характери-
зуются присутствием многообразных сопутствующих веществ, среди кото-
рых особое место занимают фосфолипиды. Состав и свойства фосфолипид-
ного комплекса характеризуются наличием веществ, близких по своей при-
роде, и зависят от качества исходного масличного сырья и изменений, про-
исходящих как в процессе извлечения, так и при последующей перера-
ботке масел.
Опыт показывает, что фосфолипиды должны быть максимально выве
дены из масел, так как они оказывают отрицательное влияние на последу-
ющие процессы рафинации растительных масел, их гидрирования и отделе-
ния катализатора от гидрированных жиров. Особенно острой стала пробле-
ма выведения фосфорсодержащих веществ из масел в связи с широким
применением для гидрогенизации промышленных никель-кизельгурового
и стационарного катализаторов, чувствительных к присутствию в масле да-
же незначительных количеств фосфолипидов.
Кроме того, учитывая полезные физиологические и биологические
свойства фосфолипидов, необходим-' сохранить их качество с целью полу-
чения полноценного самостоятельного продукта - фосфатидного концент-
рата. Необходимость получения фосфолипидов в виде фосфатидного
концентрата диктуется потребностями многих отраслей пищевой и легкой
промышленности, медицины и сельского хозяйства, где они находят широ-
кое применение
В настоящее время литература по технологии фосфолипидов раститель-
ных масел ограничена.
Так, в отечественной литературе отсутствуют монографии, посвящен-
ные технологии и химии фосфолипидов растительных масел Некоторые
общие данные по фосфолипидам приводятся в ’’Руководстве по методам
исследований, технохимическому контролю и учету в масло-жировой про-
мышленности” и в ’’Руководстве по технологии получения и переработке
растительных масел и жиров”. Однако в основном в этих книгах содержат-
ся практические рекомендации по исследованию фосфолипидов и лишь
краткие теоретические представления о химии фосфолипидов и механизме
их извлечения Данные руководства имеют прикладное значение. В книгах
Ь. Н. Тютюнникова ”Химия жиров” и В. Г Щербакова ’’Химия и биохимия
переработки масличных семян” приведены кратко данные о составе и
свойствах фосфолипидов и не рассмотрены вопросы химии фосфолипидов
Фундаментальная работа Г. Тирфельдера и Е. Кленка ’’Химия цереброзидов
и фосфатидов” уже устарела.
В Краснодарском Ордена Трудового Красного Знамени политехниче-
з
ском ИИ' гитуто в течение последних 15 лет проводятся исследования в
области изучения состава, структуры, свойств фосфолипидов, а также в
области разработки современных способов выведения фосфолипидов
из масел Исссоюзным научно-исследовательским институтом жиров
(ВНИИЖем), в также его Московским, Харьковским и Северо-Кавказским
филиалами также ведутся работы в этой области.
Авторы I тавят перед собой основную задачу - использовать накоплен-
ные материалы для теоретического объяснения поведения фосфолипидов в
гриищин пиперинах и сформулировать перспективные направления со-
uopiiiciH ТВО1ШНИЯ технологии выведения фосфолипидов из растительных
масел, обеспечивающие высокую эффективность процесса и качество
получаемых продуктов - гидратированного масла и фосфатидного кон-
центрата.
ВВЕДЕНИЕ
Фосфолипиды издавна привлекают внимание широкого круга исследо-
вателей. Первые сведения о фосфолипидах относятся к 1812 г., когда Во-
келен открыл фосфор в составе головного мозга*. В 1846 г. Гоблей выде-
лил из яичного желтка и мозга липид, содержащий фосфор, который позже
назвал лецитином*. Он также показал, что в составе лецитина содержится
глицеринфосфорная кислота. Первые исследования структуры глицерин-
фосфа гидов были проведены С. Дьяконовым, который изучал лецитин,
полученный из яичного желтка*. В 1868 г. он установил в составе лецитина
холин и вместе со Щтрекером предложил структурную формулу лецитина,
в которой холин соединен с остальной частью фосфолипида эфирной
связью*.
Дальнейшему развитию химия фосфолипидов обязана главным обра-
зом Тудихуму, известному своими фундаментальными работами по хими-
ческому строению мозга, проводимыми в период с 1874 по 1901 г.*. Р
процессе исследования мозга он изолировал ряд фосфолипидных фракций,
ввел новые термины, привел первую классификацию этих соединений, а
также указал на отличие лецитина от кефалина, который оказался фрак-
ционной смесью нерастворимых в теплом этаноле фосфолипидов Ренолл
и Бауман в 1913 г. одновременно показали, что одной из основных фрак-
ций кефалина является этаноламин*, а в 1941 г. Фолч открыл во фракции
кефалина серин, а затем инозит [355] Тудихум выдрлил и сфингомиелин,
а затем Левин провел обширные исследования по отделению и очистке этой
группы фосфолипидов и впервые получил относительно чистый сфинго-
миелин*. Большие исследования в области растительных фосфолипидов
этой группы приведены Каргером и его сотрудниками.
Совершение очевидно, что развитие наших познаний в области фосфо-
липидов было бы невозможно без хроматографического разделения натив-
ных фосфолипидов и продуктов их гидролиза.
Впервые хроматография для исследования фосфолипидов была при-
менена в 1936 г., а позднее Ли (Англия), группа Маринетти (США) при-
менили для этих целей хроматографию на бумаге.
Благодаря хроматографическим и спектральным методам стало воз-
можным выделить и идентифицировать отдельные группы фосфолипидов,
а использование изотопов в сочетании с хроматографией позволило рас-
ширить познания в области биосинтеза фосфолипидов.
За последние 30 лет благодаря органическому синтезу получено мно-
жество индивидуальных фосфолипидов. Большой вклад в эту область внес-
ли известные ученые. Н. А. Преображенский с сотрудниками, Малкин (Ан-
глия) , Баер (Канада), Ван Диенен (Нидерланды).
Особый интерес к фосфолипидам возник в связи с открытием их зна-
чительной роли в клетке Издаются монографии, посвященные химии и
технологии фосфолипидов (Г. Тирфельдера и Е. Кленка). Начиная с 30-х
годов фосфолипиды становятся объектом многочисленных исследований
* Тирфелвдер Г., Клен к Е. Химия цереброзидов и фосфатидов М.; Л., 1937,
236 с.
5
ж
в масло-жировой отрасли Впервые технология гидратации и получения
фосфатидных концентратов из растительных масел была разработана
и внедрена в Англии и Германми в 1937 г.
В период с 1950 по 1980 г известны многочисленные работы А. Г, Сер-
геева, А. А. Шмидта, В. П. Ржехина, А. Якубовского, Б Н. Тютюнникова,
Б. А. Стерлин, А. И. Скипина, А. И Глушенковой, А. Л. Маркмана.
У. И. Тросько, С. Н. Волстовской, В. Н Поповой, В. В. Ключкина и др. в
области механизма процесса и технологии гидратации фосфолипидов.
В промышленности гидратация фосфолипидов из масел стала обяза-
тельной операцией в обшей схеме рафинации растительных масел. Совер-
шенствование процесса позволило после гидратации получить качественно
новый ноодукт - фосфатидные концентраты.
1 ХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ. КЛАССИФИКАЦИЯ
И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФОСФОЛИПИДОВ
Фосфорсодержащие вещества являются ценной группой веществ, вхо-
дящих в химический состав масличных семян. Все фосфорсодержащие
вещества масличных семян подразделяются на соединения липидного и не-
липидного характера (схема 1) [58] .
Количественное соотношение фосфорсодержащих веществ для наибо-
лее изученной масличной культуры сои (в % от сухого вещества семян)
приведено ниже [255]
Группа фосфорсодержащих
веществ
Фосфолипиды
Эфиры фосфорной кислоты
фитины
Нуклеиновые кислоты
Неорганические фосфаты
Общий суммарный фосфор
Содержание фосфора,
%
0,074-0.091
и 0,426-0,444
0,024-0.037
0,026 -0,02Я
0,550-0,600
Фосфорсодержащие вещества липидного характера в маслах представ-
ляют фосфолипиды. Фосфорсодержащие соединения нелипидного характе-
Схема 1
ра в маслах обнаруживаются лишь в небольших количествах, несмотря на
значительное содержание их в масличных семенах. Попадание в масло фити-
нов возможно [58, 255] только благодаря механическому внесению их с
обрывками клеточных тканей из маслосодержащего материала, так как яр-
ко выраженные полярные свойства этой группы веществ обусловливают их
нерастворимость в масле.
Фосфолипиды являются важнейшими фосфорсодержащими соединени
ями липидного характера, входящими в состав растительных тканей. Од-
нако, несмотря на то что фосфолипиды представляют собой важнейший
класс фосфорсодержащих соединений, единой классификации для них до
сих пор нет.
1.1 ХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ И СОВРЕМЕННАЯ
КЛАССИФИКАЦИЯ
Фосфолипиды можно рассматривать как несимметричные диэфиры
фосфорной кислоты [163]:
О
RO—OR1
О"
где R - ацильные, ьлкилъные и алкенильноэфирные производные глицерина, диолов,
аминодиолов; Я - азотистые основания, аминокислоты, миоинозит, глицерин и т. д.
Общность в строении глицерофосфатидов позволяет рассматривать их
как производные 1,2-диацил-ли-глицеро-3-фосфата и представить структур-
ную формулу таким образом [96, 232] :
П2С—О—COR,
RjOC—О—СИ 0
Н2С—О—OR + ,
О"
где Я j и Я2 - насыщенные или ненасыщенные углеводородные остатки жирных кис-
лот; Я’ - азотистые эснования (этаноламин, диэгилэтаноламин. триметилэтанола-
мин). аминокислоты (серин!, остаток полиола (глицерол, инозитол)
Существует несколько классификаций фосфолипидов [56,96, 163]
Наиболее удачной считается классификация, предложенная М. Кейт-
сом, по которой природные фосфолипиды можно разделить на две боль
шие группы: глицерофосфатиды и сфингозинфосфа гиды Вторая группа
обнаружена только в составе фосфолипидов животного происхожде-
ния [96].
Согласно современной классификации глицерофосфатиды подразде-
ляют на два класса: содержащие азотистые основания (кислоты) и поли-
олсодержащие.
В табл. 1.1 приведены основные группы фосфолипидов, содержащие
остатки аминоспиртов (азотистых оснований) и аминокислот.
6
Таблица 1.1
tJi ГН*ок (R+) аминоспиртов
Название фосфолипидов
Сокращенное
обозначение
• llj' II (Nil,) COOH (серин)
< II j< lIjNII] (этиноламин)
i И|( IljNlllCUj) (метилэтаио-
памин)
Ht('lljN(CHj)i (диметилэта-
на намин)
111,1 П,МСНэ)з (холин)
Фог фа тили перин Ф<-
Фосфатидилэганоламим ФЭА
Фосфатидил-Н-метилэтаноламин ФМЭА
Фосфатидил-N. N-лиметилэгано- ФДЭА
ламин
Фосфатидилхолин ФХ
В том случае, когда отсутствует один радикал жирной кислоты, обра-
зе к я подгруппа лизоформ* вышеуказанных фосфолипидов; при удале-
нии обоих радикалов жирных кислот в зависимости от содержащегося в
их молекуле азотистого основания остаются глицерилфосфорилхолин
(ГФХ), глицерилфосфорилсерин (ГФС), глицерилфосфорилэтаноламин
(ГФЭА) и др
При отсутствии в такой молекуле азотистого основания образуется
глицеринфосфорная кислота
Полиолсодержашие фосфолипиды в свою очередь подразделяются на
полиглицерофосфолипиды и фосфатидилинозитолы.
К полиглицерофосфолипидам относятся
а) фосфатидилглицерины (ФГ)
3-»и фосфатидил-1-тл-глицерин;
б) фосфатидил-О-аминоацилглицерины (ФаАГ)
II I ’
Р—о— СИ, Н,С—0—СО— СП—В
О I I
II I I
в—с—О— СП нс—он
о
II I
Н5С—о—Р—О—СП,
он
(2)
’ При сокращенном обозначении фосфолипидов впереди ставится буква ’'Л",
например ЛФХ - лизофосфатидилхолин.
8
где R - остаток лизина, аланина, аргинина, 3-$п-фосфатндил-1 -(З-О-аминсацил)-ги-
глииерин;
в) фосфагидилглицерофосфат (ФГФ) [96]
Н
(3)
3-аи-фосфатидил-1'-ги-глицеро-3' -фосфат;
г) дифосфатадилглицерины (ди-ФГ) [96]
Н2С
(4а)
1', 3' -ди-0- (З-sn -фосфа гадил) -sn -глицерин,
(46)
9
IHt I* aifiwwa кислоты; R| - витамин A; R2 - остаток жирной кислоты с раза ст-
>11 •hithi
” «коп
К фн^фимдилинозитолам относятся соединения со следующими струк-
I I 11ИДИЛ ИНОЗИТЫ (мокофосфоинозитиды, ФИ)
1 -1 ||><>< фйТИДкЛ тя- Г миоинозит;
п> ||н)сфп1ИЛМлинозитфосфаты (дифосфоинозитиды. ФИФ)
3-SM ф(>сф||ТИДЮг VI Г МИОИНОЗИТ-4'фосфат,
10
в) фосфатидилинозитдифосфаты (трифосфоинозитиды, ФИдиФ)
З-sn -фосфатид ил-хи-1 -миоинозит -4’, 5'-дифосфат;
г) дифосфатидилинозиты
(8)
3-$л-фосфатидил-$и -1 -мио инозит-5 '-фосфатидил.
Кроме вышеуказанных соединений к фосфоинозитолам относятся бо-
лее сложные соединения, в состав которых входят серин, этаноламин, глю-
коза и сахароза, например [345] :
,ОН
о—р=о
\н
ОСОЙ,
ОСОЙ,
но—сн
ОСН—СН( ОН)— СН( ОН)—СН( ОН)—сн—сн,он
I------------О------------1
(9)
CONHGHj-fiHj-^OH
гДе R| и R, — остатки жирных кислот.
11
Н2С—О—C—R,
(10)
В составе растительных фосфолипидов обнаружены также плаэмалоге-
ны. Плазмалогены (ацетальфосфолипиды) относятся к эфирным фосфо-
липидам.
Известны плазмалогенные формы фосфатилилхолинов, фосфатидил эта-
ноламинов, фосфатидилсеринов [321]
В настоящее время предполагается наличие нескольких структур аие-
тальфосфолипидов [163,226]:
Н2С—
CHR
НС--с/
У ; (12)
Н,с—О— Р—о—( h2ch2nh2
дн
12
Н2С—о—сноп—CH,R,
НС—О—С—Rj
10
п II
х — о—р—он
О—CHjCHjNHj
(13)
(14)
1.2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
Структура и состав молекул фосфолипидов в значительной степени
обусловливают ряд их важнейших свойств.
Фосфолипиды, как и нейтральные липиды, существуют в нескольких
полиморфных формах (А, В, С) [163] . Полиморфные переходы наблюда-
ются при кристаллизации фосфолипидов из различных растворителей
[163]. Установлено, что фосфолипиды плавятся в две стадии Это явле-
ние обусловлено тем, что углеводородная часть молекул расплавляется
при более низкой температуре, чем вся молекула, так как силы взаимо-
действия между углеводородными цепями более слабы по сравнению с си-
лами взаимодействия между полярными группами [163] . Относительно
температур плавления природных фосфолипидов нет единого мнения, что,
по-видимому, связано с различной степенью чистоты исследуемых объек-
тов, а также обусловлено большим разнообразием жирно кислотного сос-
тава даже однотипных фосфолипидов. Так, дипальмитоилфосфатидилхо-
лин, выделенный из подсолнечного масла, плавится при 75°С, а дистеароил-
фосфатидилхолин — при 90°С. Синтетические насыщенные фоефатидилхо-
лины имеют температуру плавления в пределах 230-240°С, фосфатидил-
зтаноламины - 170-220, а фосфат идилсерины - 159- 162°С [2711.
Фосфолипиды хорошо растворимы в алифатических и ароматических
углеводородах и их галогенопроизводных Отдельные группы фосфолипи-
дов различаются растворимостью в растворителях. Например, в метиловом
и этиловом спиртах фосфатидил холины и фосфатидные кислоты хорошо
растворимы, фосфатидилэтаноламины — мало растворимы, фосфатидил-
серины почти не растворяются, фосфатидилхолины плохо растворяются в
ацетоне, а фосфатидные кислоты отличаются хорошей растворимостью в
13
этом растворителе [2t>4]. Это свойство при определенных условиях исполь-
зуют для разделения сложной смеси фосфолипидов на индивидуальные
группы. Различие растворимости в значительной степени обусловлено стро-
ением алифатических цепей фосфолипидов, колебаниями температуры,
содержанием влаги в растворителях 1262] На растворимость фосфолипи-
дов влияет также окислительная поляризация ненасыщенных алифагиче-
ск их цепей.
Молекулы фосфо л инидм ч характеризуются наличием неполярных
(гидрофобных) и полярных (гидрофильных) участков, что и определяет
их поведение в водных растворах. В зависимости от концентрации моле-
кулы фосфолипидов образуют различные упорядоченные структурные
элементы при низкой концентрации — сферические мицеллы, в которых
полярные части молекул образуют внешний слой, а гидрофобные — внут-
ренний; при повышенной концентрации мицеллы группируются в длин-
ные цилиндры (гексагональная кристаллическая структура), а далее — об-
разуется специфический тип жидкокристаллической структуры - ламел-
лярная (слоистая), состоящая из бимолекулярных слоев липидов, раз-
деленных слоями водь» Переход от одной формы мицеллы к другой обус-
ловлен составом фосфолипидов, температурой, составом водной фазы
и пр. [376]
Фосфолипиды, выделенные из природных объектов, являются аморф-
ными веществами. Для синтетических фосфолипидов при медленной крис-
таллизации последних из диэтилового эфира были получены хорошо види-
мые под микроскопом кристаллы 1286]
Фосфолипиды оптически активны. Так, фосфатидил холины имеют угол
вращения плоскости поляризованного светового пучка от 6,25 до 7,10
в зависимости >т способов их получения и природы объектов выделе-
ния [337].
Общие свойства фосфолипидов в значительной степени обусловлены
природой жирных кислот, входящих в их состав: фосфолипиды, которые
содержат в основном ненасыщенные жирные кислоты, имеют мазеобраз
ную консистенцию, в то время как фосфолипиды, содержащие насыщен
ные жирные кислоты, — твердую консистенцию.
Фосфолипиды обладают чрезвычайно вЛсокой способностью солюби-
лизировать липидные (свободные жирные кислоты, красящие вещества
и др.) и нелипидные вещества (углеводы, аминокислоты, неорганические
ионы и даже металлы) [144, 345] . Кроме того, фосфолипиды обладают
взаимной солюбилизирующей способностью [294] .
Фосфолипиды склонны к порошкосбразованию. что объясняют значи-
тельным содержанием в них углеводов [286] .
Физические и химические свойства фосфолипидов определяются не
только дифильным характером их молекул, но и являются функцией
структурных особенностей последних
Фосфолипиды, содержащие первичную или вторичную фосфатные труп
пы, являются сильными кислотами. Так, фосфатидная кислота имеет
рКх 3,9 и рК2 8,3, а у фосфатидилинозитолов и дифосфатидилтлицеринов
рК<2.
В зависимости иг pH среды фосфолипиды существуют в различной
14
ионной форме, Фосфатидил этаноламины имеют отрицательный заряд При
pH 7,5, изоэлектрическая точка фосфатидилходина и лизофосфатидилхо-
лина располагается в области pH 3,5 -10 [ 163]
Фосфатидные кислоты, фосфатидилсерины и фосфатидилинозитолы
способны соединяться со щелочными, щелочноземельными и тяжелыми
металлами вследствие ярко выраженных кислотных свойств [113, 116,
148,210]
Фосфагидилсерины и фосфатидилэтаноламины в условиях получения
и переработки масел взаимодействуют с редуцирующими углеводами и
продуктами их распада (фурфуролом и иксиметилфурфуролом). Эта реак-
ция приводит к образованию гаммы разнообразных темноокрашенных со-
единений - меланофосфатидов [114. 181] .
Фосфолипиды в определенных условиях взаимодействуют с белками
На кинетику и прочность связывания фосфолипидов с белками может
влиять структура молекулы фосфолипида, обусловленная компонентами,
входящими в ее состав, а также различная степень ненасыщенности жир-
ных кислот [54, 177].
Установлен уровень активности взаимодействия отдельных групп
фосфолипидов с белками (по возрастанию): фосфатидные кислоты —
инозиголфосфолипиды — фосфатидилсерины — фосфатидилхолины [177].
Фосфолипиды способны гидролизоваться растворами щелочей и кислот
с образованием тех или иных составляющих, причем глубина гидролиза
зависит от условий гидролитического расщепления [299|.
2 РОЛЬ ФОСФОЛИПИДОВ В РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКЕ
В семенах масличных культур фосфолипиды локализованы преиму-
щественно в гелевой фазе и находятся в связанном состоянии в виде комп-
лексов [255].
Биологическая роль фосфолипидов в растительной клетке определя-
ется теми Функциями, которые выполняют фосфолипиды в мембранах:
принимают участие в активном и пассивном транспорте веществ, пиноци-
тозе и фаюцитозе, регулировании активности ферментов, проведении
биопотенциалов [48.68, 133, 232]
По современным представлениям фосфолипиды локализованы в расти-
тельной клетке в клеточных или плазматических мембранах, лишь незна
чительная их часть обнаружена в липидных гранулах и в белково-липидных
комплексах, не входящих в состав мембран [19, 63, 67, 255] . Роль преоб-
ладающего компонента фосфолипидов во всех мембранах играют фосфа
тидилхолины [19,48]. Количество фосфатидилхолинов широко варьирует
от 40% в липидах мембран митохондрий и мембран, из которых сложены
гранулы хлоропластов, до 60% в липидах мембран, эндоплазмагической
сети |25].
Из существующих моделей биологических мембран наибольшее приз-
нание получила динамическая мозаичная (жидкостно-мозаичная) модель
(рис. 2.1) 119, 67] . Согласно этой модели белки ’’плавают в липидном
море” Их молекулы погружены с двух сторон мембраны на разную глуби-
ну в двойной слой подвижных углеводородных ’’хвостов” фосфолипидов,
15
это
зук
гру
ени
сод
ДО1
CKI
(гн
их
куг
ЭЛ с
по;
рет
ны
раз
ЛЯ|
дел
лов
И IT
НЫ1
тал,
мы
вра
в 3
НИЯ
при
сод
нуц
ньн
ЛИЗ
и д
ион
вза
тел
TOJ
стр
пы
рХ
р/С
и
Рис. 2.1. Динамическая мозаичная мо-
дель биологической мембраны:
а, б, в, г, д, е - различные белковые мо-
лекулы
Рис. 2.2. Структура бимолекулярного
липидного слоя:
а — полярные ’’головы” фосфолипидов;
б - алкильные цепи
имеются белки, проходящие через всю мембрану. Строение мембраны ас-
симетрично; значительная часть поверхности мембраны свободна от бел-
ков.
Структурной основой мембран служит бимолекулярный слой фосфо-
липидов. Молекулы фосфолипидов ориентированы таким образом, что их
гидрофобные углеводородные цепи направлены внутрь мембраны, а по-
лярные части — наружу. Схема бимолекулярного слоя липидов приведена
на рис. 2.2 [19].
Фосфолипиды в мембранном бислое динамически подвижны и обпадя-
ют сравнительно высоким коэффициентом диффузии; взаимодействие
фосфолипидов между собой в мембране обусловлено прежде всего гидро-
фобным взаимодействием алкильных цепей и межионным электростатиче-
ским взаимодействием полярных группировок [ 19, 87]. Вопрос о связи
молекул фосфолипидов с белком в мембранах окончательно не решен.
Взаимодействие между белками и фосфолипидами может осуществляться
за iчет электростатического, полярного и гидрофобного взаимодействий
[ 133] . Единичные водородные связи при образовании комплексов между
белками и фосфолипидами не играют существенной роли, в то время как
главный вклад вносят полифункциональные водородные связи, которые
благодаря кооперативному характеру взаимодействия обеспечивают струк-
туру с минимальной свободной энергией [ 19].
Периферические белки биологических мембран связаны с фосфоли-
пидами бислоя исключительно электростатическими взаимодействиями,
в том числе и координационными. Координационные комплексы вклю-
чают отрицательно заряженные группы белков, фосфолипидов и ионы
двухвалентных металлов; эффективность ионов в образовании коорди-
национных комплексов убывает в следующем ряду: Са*2, Mg*2, Мп*2,
Zn , Ba* , Cd*2 [87]. К фосфолипидам мембран, гидролизуемых фосфо-
липазами, относятся фосфатидилхолины и сфингомиелины. Эти группы
фосфолипидов не образуют межмолекулярную водородную связь с бел-
ками, поэтому не входят в непосредственное микроокружение интеграль-
16
ных белков и сохраняют высокую подвижность*. Интегральные белки не-
возможно выделить из мембраны без ее разрушения, так как они сохра-
няют свою нативную конформацию только в присутствии фосфолипи-
дов [19, 87] .
2.1. БИОСИНТЕЗ ФОСФОЛИПИДОВ
Механизм биосинтеза фосфолипидов на первых стадиях (до стадии
образования фосфатидных кислот) не отличается от синтеза триацилгли-
церинов. Установлено, что основную роль в биосинтезе фосфолипидов
выполняют цитидиновые нуклеотиды, с помощью которых осуществляется
построение фосфатидэфирных связей в растительной клетке [361] .
Фосфатидные кислоты и цитидиновые нуклеотиды в эндоплазматиче-
ском ретикулуме клетки образуют цитициндифосфатдиацилглицерин
Цитидиндифосфатная (ЦЦФ) часть его молекулы является переносчи-
ком фосфатидной кислоты. Затем цитидинмонофосфат (ЦМФ) вытесня-
ется из молекул ЦЦФ-диацилглицерина одним из спиртов — серином, ино-
зитолом или глицерофосфатом.
При вытеснении серином ЦМФ образуется фосфатидилсерин [315] :
н,с—OCOR
н'осо—сн
Н21—О—Р—OCHjCH—NH3*
J" iooH
где R - остаток цитидина.
Декарбоксилирование остатка серина в молекуле фосфатидилсерина
при участии фосфатидилсериндекарбоксилазы приводит к образованию
фосфатидилэтаноламина, который является предшественником фосфати-
дилхолина. Образование фосфатидилхолина происходит через промежу-
точные стадии образования N-метил- и N, N-диметилфосфатидилэтанолами-
нов. В ферментной системе, необходимой для этого превращения (фосфат-
♦ Интегральные белки погружены в мембрану так, что тольког*ег’Пдпярнь1е
части находятся снаружи. В некоторых случаях интегральные белк^пересекайт
толщину мембраны.
s
If
2-727
131095
идилэтаноламинэтилтрансфераза;, в качестве донора метильных группи-
ровок выступает S-аденозилметионин [359 J :
Фосфатид илеерин
3-аде пилил
гомоцистеин
Фосфатидил этаиоламин
Фосфатидитхолин
Биосинтез родоначальника фосфатидилинозитолов — фосфатидйпмио-
инозига осуществляется путем переноса фосфатидильной группы от НПФ-
диацилглиперина к свободному миоинозиту [274]
Фосфатидилинозит является основой для синтеза двух производных*
фосфатидилинозитмонс фосфата и фосфатидилинозитдифосфата, которые
образуются при последовательном фосфорилировании аденозинтрифосфа-
том свободных гидроксильных групп остатка инозита
Биосинтез полиглицерофосфатидов осуществляется также при участии
ЦДФ-циадилглиперина.
Биосинтез фосфатидалглицерина осуществляется в два этапа. Первый
включает взаимодействие ЦДФ-диацилглицерина и sn-глицеро-З-фосфэта,
приводящее к фосфатидилглицерофосфагу. На втором этапе биосинтеза
осуществляется ферментативное дефосфорилирование фосфатидилглинеро-
фосфата в фосфатидил! лицерин. По-видимому, ферменты, катализирующие
эти реакции, локализованы главным образом в митохондриях. Фосфати-
дилглииерофосфат обнаружен в ряде природных источников, что служит
18
косвенным подтверждением указанного пути биосинтеза фосфатидилгли-
церина [360]. Переход от фосфатидилглицерина к кардиолипину осуществ-
ляется повторной реакцией с ЦДФ-диацил глицерином:
ЦДФ-диацилглицерин
Фосфата ди лг ли це рофосфат
ЦДФ-днацн.тглицерпн
ЦМФ
Фосфатидил гл ицерин
19
2 2. БИОСИНТЕЗ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРИНОн
Ключевым соединением в биосинтезе триацилглицеринов является sn-nnme-
ро-3-фссфат, который образуется либо путем фосфорилирования глицерина АТФ в
присутствии фермента глицерокиназы (2.7 1.30), либо восстановлением Дчокска-
цетонфосфата (полупродукт процесса гликолиза), катализируемым глицерофосфатде-
гидрогеназой (1.1 99,5) [342]
Образование триацилглицеринов начинается с ацилирования свободных гидро-
ксильных групп глицерофосфата последовательно двумя молекулами Кол-производ-
ного жирной кислоты с образованием фосфатидных кислот Реакция ацилирования
протекает в две ступени: первая ступень - катализируется глицерофосфат - ацил-
трансферазой (2.3.1.15), а вторая - ацилглицерол - пальмитилтрансферазой
(2.3.1.22). Затем фосфатидные кислоты под действием специфических фосфатаз
гидролизуются с образованием 1,2-диацил-гп-гпицеринов. Далее 1,2-диадип-сл-гли-
церины тарифицируются Кол-производными высших жирных кислот в присутст-
вия ацил-КоА 1,2-диглицерид-0-ацилтрансфераз (2.3.1.20) в триацилгпицерины [381].
Современные представления о биосинтезе гриацилгпиперинов основаны на фер
иснтагирных реакциях, представленных на следующей схеме | 342]
н,с—осой
в’осо—ун
11,(1—<он
Н.С—ОСОП
В'ОСО— ( н
II,' —OCOR"
Достоверные данные по вопросу, в каких участках клетки осуществляется
биосинтез триацилглицеринов, отсутствуют По мнению одних авторов, основные
участки биосинтеза триацилглицеринов локализованы в митохондриях [243, 283]
Это положение базируется прежде всего на гом. что ферменты, о гветственные за их
синтез, наивысшую активность проявляют именно в микросомальных функциях.
Другие авторы считают, что синтез триацилглицеринп* протекает пластидах
эндосперма (199] Так, в работе 1199) было поканко, что и клетках созревающих
масличных семян триацилглицерины появляются я первую очередь пластидах эндо
сперма. Изучение клеток алгйропипоп, поя зерновки ри а| алек тронном мн крое ко
пе показало, что капли синтезируемого жира нентм«нн,> связываются пузырьками
эндоплазматической сети (ргОжгЛгМы (нме><|иМ иснояной объем клетки алейро
НОВОГО СЛОЯ II ClOillt НИМ бы.>.> ГЛЯПЫШ IfpwilK ||ПМ*НИ1 я МИ11'Х|>Ш1|>ИЯХ проио*
20
ходит лишь синтез жирных кислот. А. Г. Верещагин [ 25 ] считает митохондриальный
синтез триацилглицеринов маловероятным и полагает, что образование триацилгли-
церинов связано с мембранами эндоплазматического ретикулума, усеянными рибо-
сомами.
Основная функция триацилглицеринов состоит в том, что они служат компакт-
ной формой хранения энергии в растительных организмах. Они рассматриваются как
динамические элементы клетки в отличие от фосфолипидов, которые являются "по-
стоянными’’ компонентами клеточных структур.
2.3. ФЕРМЕНТЫ В ПРЕВРАЩЕНИЯХ ФОСФОЛИПИДОВ
Одними из основных ферментов, катализирующих биохимические реакции в
превращениях фосфолипидов, являются фосфолипазы.
В молекулах фосфолипидов имеется несколько типов связей, которые могут
подвергаться действию ферментов класса гидролаз: эфирные связи жирных кислот,
фосфатидные диэфирные связи, одна из которых образована первичной спиртовой
группой глицерина, другая - заместителем R' (см. табл. 1.1). В 1933 г. Контарди и Эр-
коли впервые пришли к заключению, что различные связи в фосфолипидах гидроли-
зуются разными ферментами |21|. Существует несколько типов фосфолипаз (dj,
Аг, В\, В г, С, D), различающихся характером действия на субстрат. В растительных
объектах обнаружены почти все формы фосфолипаз, гидролизующих фосфолипиды
(21, 65]. Для всех без исключения фосфолипаз специфичным субстратом является
фосфатидилхолин. Принципиальная схема воздействия фосфолипаз на фосфолипиды
приведена ниже.
21
2.3.1. ФОСФОЛИПАЗЫ - ГИДРОЛАЗЫ ЭФИРОВ
КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
К фосфолипазам - гидролазам эфиров карбоновых кислот относятся фосфоли-
пазы Ai ] фосфатид-1-ацилгидролаза (3.1.1.32)], А2 (фосфатид-2-ацилгидролаза
(3.1.1.4)| и лизофосфолипаза В [ лиэолецитин-ацилгидролаза (3.1.1.5)] (68].
Из всех фосфолипаз наиболее изучена фосфолипаза А 2 - фермент, гидроли-
зующий эфирную связь в 0-положении молекулы фосфолипида. Впервые фосфолипаза
А 2 была обнаружена в яде змей.
Фосфолипаза Ai была открыта Ханаханом в 1960 г. [ 21). Фосфолипаза
А] - фермент, гидролизующий эфирную связь в а-попожении молекул различных
классов фосфолипидов. Существует большое количество методов выделения фос-
фолипазы А\ из яда змей, из тканей животных и микроорганизмов. Методы выде-
ления фосфолипазы A t из масличных семян в литературе мы не встречали.
Фосфолипаза А2 проявляет высокую стереоспецифичность, расщепляя
только производные З-т-глицерофосфата, что используется в структурном анализе
фосфолипидов; фосфолипаза А2 проявляет стереоспецифичность, аналогичную фос-
фо ли пазе Л;.
Прямые данные о наличии фосфолипаз А; и А2 в масличных семенах практически
отсутствуют. Имеются лишь некоторые сведения об активности фосфолипаз А] иА2 в
семенах подсолнечника (62, 162], которые косвенно подтверждают присутствие этих
ферментов в масличных семенах. В работе [62] изучено изменение активности фос-
фолипаз А) и А; в семенах подсолнечника в зависимости от химического состава
семян, температуры и влажности, а в работе (162] приведены данные по изменению
активности фосфолипаз А и В в процессе послеуборочного дозревания и хранения
семян подсолнечника.
Активность фосфолипаз, как и других ферментов, зависит от ряда факторов
температуры, pH среды, содержания влаги, наличия в реакционной среде ингибиторов
и активаторов ферментов.
Ввиду большой сложности раздельного определения активности фосфолипаз
At и Аг существующие методики предполагают одновременное определение актив-
ности указанных ферментов.
Методика определения активности фосфолипаэА] и А2
( 246]. 170 мг нативных фосфатидилхолинов, выделенных из масел или из масличных
семян, растворяют в 34 мл диэтилового эфира; отдельно растворяют 3 мг змеиного
яда в 0,44 мл 0,1 М раствора триглицероксиметиламинометана (Триса) (pH 10,15). В
семь конических колб вместимостью 10 мл вносят по 4 мл первого и по 0,05 мл
второго раствора, а в ьосьмую колбу - 4 мл первого раствора и 0,05 мл 0,1 М раст
вора (Триса), не содержащего змеиного яда (контрольная проба). Пробы перемеши-
вают встряхиванием. Гидролиз прекращают добавлением 2 мл метанола: в первую
пробу сразу же после внесения второго раствора и перемешивания, а в остальные -
после гидролиза в течение 5, 10,15, 20, 25 и 30 мин. Контрольную пробу выдерживают
в течение 30 мин до прибавления метанола.
Содержимое колб упаривают до постоянной массы. Остаток растворяют в 2 мл
хлороформа, аликвотную часть раствора (0,1 мл) каждого образца наносят в виде
полоски шириной 1 см (с интервалом между полосками по 1,5 см) на тонкослойные
пластинки размером 18X24 см для хроматографического разделения продуктов
гидролиза в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (65:25:4). После
развития хроматограммы пластинки высушивают на воздухе, далее подвергают дейст-
вию паров йода и обнаруживают пятна жирных кислот (Rf = 0,85), непрореагировав-
ших фосфатидилхолинов (Rf = 0,40) и лиэофосфатидилхолинов (Rf = 0,16). Пятна,
соответствующие жирным кислотам, обкалывают и после испарения избытка йода
счищают в колбочки. Для холостого опыта очищают чистый участок силикагеля
подобного размера Жирные кислоты элюируют 4 раза (по 3 мл диэтилового эфира)
Элюаты упаривают, растворяют в 5 мл смеси диэтиловый эфир-спирт (2:1) и кисло-
ты нейтрализуют 0,01 н. раствором гидроксида калия.
Количество лиэофосфатидилхолинов и непрореагировавших фосфатидилхоли-
нов определяют по содержанию фосфора в каждом из них по отношению к суммар-
НЬму содержанию его в обоих.
22
Для этого пластинки после снятия пятен жирных кислот опрыскивают 50%-ной
HjSCU и обугливают в течение 40-50 мин при 150°С; пятна, соответствующие опре-
деляемым продуктам гидролиза, очищают и обрабатывают для определения содер-
жания фосфора микрометодом.
Лиэофосфолипазы, к которым относятся фосфолипаза В, гидролизуют
единственную жирную кислоту в лизофосфолипидах. Поскольку лизофосфолипиды
обладают литическими свойствами, т. е. способны разрушать биологические мембра-
ны, лиэофосфолипазы, очевидно, обладают защитными функциями, предотвращаю-
щими возможность накопления этих соединений в растительной клетке. Лиэофосфо-
липазы широко распространены в растительных клетках, причем их активность намно-
го превышает активность фосфолипаз A i и A 2, поставляющих токсические субстраты.
Поскольку в клетках имеются два типа липидов - а-ацил и 0-ациллизофосфолипиды,
предполагается существование двух различных Лиэофосфолипаз В\ и В2 [21). В на-
стоящее время нет никаких экспериментальных данных, доказывающих присутствие
двух различных типов фермента. Фосфолипазная и лизофосфолипазная активности
масличных семян до сих пор не разграничены. В связи с этим активность лиэофосфо-
липазы определяют н сумме с активностью фосфолипаз A i и А2.
Методика определения активности фосфолипаз Л и л и-
зофосфолипаэыВ следующая 1 62 Г к 5 мл 0,5%-ного раствора фосфатидилхо-
лина в диэтиловом эфире добавляют 5 мл ацетатного буфера (pH 5,6), 1,2 мл 22%-но-
го водного раствора СаС12, 0,25 мл 25%-ного водного раствора гликохолата натрия и
0,1 г обезжиренного материала исследуемых семян.
Обезжиренный материал исследуемых семян готовят следующим образом: семе-
на освобождают от оболочки и измельчают. Затем 10 г тонкоизмельченного ядра за-
ливают 50 мл охлажденного до 5“С 85%-ного водного раствора ацетона (d = 0,8553)
и оставляют на 30 мин в холодильном шкафу для настаивания, периодически переме-
шивая. Через 30 мин раствор масла в ацетоне декантируют, а ядро вновь заливают
50 мл 85%-ного водного раствора ацетона и оставляют на 30 мин в холодильном
шкафу. Декантируют снова растворитель и ядре заливают 50 мл сухого ацетона. Эту
операцию повторяют дважды, после чего к обезжиренному ядру приливают 50 мл сме-
си диэтилового эфира и сухого ацетона (1:1) Этот растворитель меняют также 2 раза.
Все операции проводят в холодильном шкафу. Полностью обезжиренный материал
подсушивают на воздухе, просеивают через сито (D = 0,2 мм).
Смесь инкубируют в течение 1 ч при температуре 30°С, периодически перемеши-
вая. Через 1 ч к пробе приливают 20 мл спирто-эфирной смеси и определяют кислотное
число стандартным методом [ 193].
Активность фосфолипаз А и В (в мкмоль) олеиновой кислоты в расчете на 1 мг
обезжиренного вещества в 1 мин вычисляют по формуле
X = (И - Ко)К/г,
где - количество 0,1 н. КОН, пошедшее на титрование основной пробы, мл; Ио -
количество 0,1 н. КОН, пошедшее на титрование контрольной пробы, мл; К - поправ-
ка к титру 0,01 н. КОН; t - время инкубирования, мин.
2.3.2. ФОСФОЛИПАЗЫ - ГИДРОЛАЗЫ ФОСФОДИЭФИРОВ
Фосфолипазы С (3.1.4.3) гидролизуют эфирную связь между диацилглице-
рином и замещенной фосфорной кислотой. Индивидуальные ферменты этой группы
обладают строгими требованиями к структуре гидрофильного спирта, с которым фос-
фат образует вторую эфирную связь, не гидролизуемую в ходе реакции [ 68].
Известные в настоящее время фосфолипазы С разделяют на две подгруппы:
1) фосфатидилхолин-холинфосфогидролазы - ферменты, гидролизующие фос-
фатидилхолин, а также фосфатидилсерин и фосфатилидэтаноламин;
2) фосфатидалинозит-инозитфосфогидролазы — ферменты, катализирующие
гидролиз фосфатидалинозита или моно- и дифосфатов фосфатидилиноэита.
В растительных объектах, в том числе и в масличных семенах, фосфолипазы С
до настоящего времени не обнаружены 1211.
Фосфолипазы С обычно являются экзогенными бактериальными ферментами.
23
У
В работе ) 107] приведена методика определения активности фосфолипазы С на
основании количественного определения фосфсхолина
Фосфолипаза D (3.1.4.4) 1идролизуег эфирную связь между фосфатной
группой и спиртом I68]. Этот фермент впервые был обнаружен в корнеплоде морко-
ви и листьях шпината, с тех пор его находят во многих растениях' I 68] Найдена фос-
фолипаза D в семенах хлопчатника (21, 24, 144. 168, 170] и подсолнечника (62]
Установлено, что н семенах хлопчатника, хранящихся и коло одного года, активность
фосфолипазы D уменьшается на одну треть, хотя остается достаточно значительной по
отношению к обезжиренному материалу [126’. Для семян подсолнечника показано,
что максимальная активность фермента проявляется при влажности семян 14-15% и
температуре 50°С (62] В работе ( 162] установлено, что в период послеуборочного
дозревании (2о дней) увеличивается активность фосфолипазы Л, при дальнейшем хра-
нении активность фермента резко падает и достигает уровня активности фосфолипазы
в свежеубранных семенах.
В работах [ 169, 170] показано, что фосфолипаза D может функционировать
не только как гидролитический фермент, но и катализировать реакцию, приводящую
к образованию новых фосфолипидов (ускорять реакцию трансалкилирования) Вы-
вод, приведенный в указанной работе, по нашему мнению, сделан из-за возможной
методической ошибки - результат недостаточной чистоты препарата фермента, с кото-
рым работали авторы.
Методика выделения фосфолипазы Д из семян хлопчат-
ника (168] *. Измельченные семена хлопчатника сбезжириьяют экстракцией ацето-
ном и диэтиловым эфиром по методике, 11риведенной для обезжиривания семян под-
солнечника при определении активности фосфолипаз А и В. Обезжиренный материал
суспендируют в 0,1 М натрийацетатном буфере (pH 5,6), охлажденном до температуры
0 - +4°С в соотношении 1: 1С Суспензию центрифугируют в течение 30 мин при 25 тыс.’
)б;мин, надосадочную жидкость нагревают в течение 15 мин при 50°С. После отделе-
ния центрифугированием выпавшего .-садка к раствору добавляют твердый сульфат
аммония до 60% от насыщения при 4°С. Надосадочную жидкость после центрифугиро-
вания в течение 15 мин при 25 тыс. об/мин подвергают диализу с целью -чистки
против дистиллированной воды в течение 12 ч. Очистку выделенного препарата фосфо-
липазы Г> можно проводить хроматографированием на колонке, наполненной се-
фадексом G25. Для этою надосадочную жидкость после осаждения сульфатом аммо-
ния в количестве 50-100 мл адсорбируют на колонке и элюируют 0,1 М нагрийаце-
татным буфером. Выделенные элюаты хранят при температуре минус 10°С.
Методика определения активности ф'. с фс- липазы D \ 62].
Семена подсолнечника измельчают и обезжиривают по ранее указанной методике.
К 5 мл 0.5%-ного раствора фосфатидилхолина в диагилоеом эфире добавляют 5 мл
ацетатного буфера (pH 5,6), 1,2 мл 22%-ного водного раствора CaClj, 0,25 мл 25%-но-
го водного раствора гликохолата натрия и 0,1 г обезжиренного материала исследуе-
мых семян. Обезжиренный материал исследуемых семян получают по методике, опи-
санной при определении активности фосфолипаз А и В Смесь инкубируют в течение
1 ч при ЧО°С, периодически перемешивая.
Полученную смесь подкисляют 10%-ным раствором соляной кислоты до pH 5,6 и
переносят в делительную воронку. Приливают 15 мл диэтилового эфира и экстраги-
руют жирные кислоты. Эфирный слой удаляют и обработку эфиром повторяют еще
2 раза. В водном растворе определяют содержание холина с применением соли Рей-
неке 1195] Для этого водный раствор фильтруют и ,-саждают из него холин, приливая
2 мл свежеприготовленного 2%'Ного раствора рейнекага аммония в обезвоженном ме-
таноле. Для тючною осаждения холина анализируемый раствор выдерживают 15 ч в
холодильнике при 5°С. Выпавший осадок холинрейнекага фильтруют при 5°С через
фильтр с пористой пластинкой № 3, на которую кладут фильтроьальную бумагу. Оса-
док на фильтре промывают охлажденным метанолом, растворяют в перегнанном аце-
тоне, смывая им осадок с фильтра в колбу. Раствор собирают в мерную колбу вмес-
тимостью 25 мл и колориметрируют на фотоэлектрокэлориметре с фильтром, имею-
щим X= 550 нм относительно ацетона. По калибровочной кривой находят содер
• А.с. 353726 (СССР) - Б И., 1972, № 30.
жание холина в 1 мл раствора в микрограммах. Активность фосфолипазы D рассчи-
тывают в микромолях холина, освободившегося при действии 1 мг обезжиренного
материала в 1 мин.
X = ОД04Л60.100/А V,
где А - количество холина, найденное по калибре точной кривой, мкг; V - лбъем
анализируемого раствора, мл; Р - навеска лецитина, мг; 0,104 - переводной коэф-
фициент микрограмм в микромоли холина; 60 - время инкубации, мин; 100 - на-
веска обезжиренного материала семян, мг.
Построение калибровочной кривой. Калибровочную кривую
строят по рейнекату холина, который получают из 20%-ного водного раствора меди-
цинского холинхлорида путем осаждения рейнекатом аммония. Для этого к 570 мл
2%-ного раствора рейнеката аммония в метаноле приливают 1 мл 20%-ного водного
раствора холинхлорида в 10 мл воды. Выпавший осадок отделяют на фильтре с порис-
той пластинкой № 3 и промывают три раза по 5 мл охлажденного метанола. Осадок,
полученный после промывки, сушат в вакуум-сушильном шкафу при 20° С- Растворя-
ют 1 г рейнеката холина в 250 мл ацетона, что соответствует содержанию 1106 мкг
холина в 1 мл раствора. Путем разбавления приготовленного раствора получают
ряд образцов для построения калибровочной кривой, определяет оптическую плот-
ность полученных ацетоновых растворов рейнеката холина по отношению к чистому
ацетону. Определение проводят на фотоэлектроколориметре со светофильтром
(\пах =550 нм) . Полученные величины оптической плотности наносят на ось орди-
нат; на оси абсцисс откладывают содержание холина в соответствующих пробах
(мкг/мл).
3. ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ИЗВЛЕЧЕНИЯ
И ВЫДЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ
Успехи в изучении состава и свойств многокомпонентной смеси фосфо-
липидов за последнее время можно объяснить широким внедрением в ис-
следовательскую практику новых методов анализа. Значительные труд-
ности в изучении природы и поведения фосфолипидов растительных масел
сопряжены зачастую со сложностью их выделения, обусловленной лабиль-
ностью фосфолипидов, сродством строения их молекул с триацилглицери-
нами, а также малым их содержанием в объектах исследования, например
в гидратированных и рафинированных маслах.
Фосфолипиды, обладая ярко выраженной реакционной способностью,
гигроскопичностью, неустойчивостью, в процессе выделения могут пре-
терпевать значительные изменения. Поэтому при выборе метода их выделе-
ния из масел необходимо по возможности обеспечить условия, исключаю-
щие изменение нативных свойств. Из существующих методов этим требо-
ваниям наиболее полно отвечают диализ и хроматография.
3.1. МЕТОДЫ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ
ИЗ МАСЛИЧНЫХ СЕМЯН
Для извлечения фосфолипидов применяют разнообразные раствори-
тели (углеводороды, диэтиловый эфир, хлороформ, спирты). Среди них
важную роль играют спирты как таковые или спирты в смесях с растворите-
лями иной природы. Обязательное участие спирта обусловливается тем, что
он приводит к разрыву водородной связи между фосфолипидами и белка-
25

ми, углеводами и способствует более полному извлечению фосфорсодер-
жащих компонентов растительных клеток.
В работе [58] при изучении фосфорсодержащих соединений ядра се-
мян подсолнечника проводили ступенчатую обработку его эфиром для
извлечения свободных липидов и кипячение со спиртом, а затем с бензо-
лом для извлечения связанных липидов (фосфолипидов).
Авторы работы [245] , исследуя фосфолипиды ядра семян хлопчат-
ника, отделение свободных липидов и обезвоживание ядра проводили
ацетоном, а связанные фосфолипиды извлекали по методу [58].
В работе [262] рекомендуется вести извлечение свободных липидов
из растительного сырья петролейным, диэтиловым эфиром или ацетоном,
а извлечение связанных фосфолипидов — методом спиртовой экстракции.
Для извлечения фосфолипидов используют смеси хлороформ-метанол
в соотношении 2:1 или 1:1 [75, 294] .
Для предотвращения перехода фосфолипидов в ацетон при отделении
нейтральных липидов из масличного материала ацетоном рекомендуют
добавлять к ацетону водный раствор MgCl2 и далее извлекать фосфолипиды
двукратным настаиванием материала со смесью хлороформ - метанол
(1:1), а затем с чистым метанолом в течение 30 мин при 35°С [346] .
В работе [346] отделение нейтральных липидов из семян сои проводи-
ли гексаном, а фосфолипиды экстрагировали смесью гексан — абсолютный
этанол (4:1), а в работе [349] после извлечения нейтральных липидов из
семян ацетоном фосфолипиды экстрагировали в аппарате Сокслета смесью
хлороформ-метанол (2:1) в течение 8 ч.
Из приведенных работ видно, что при исследовании масличных семян
из них предварительно выделяют нейтральные липиды, а затем извлекают
связанные липиды, в том числе и фосфолипиды. Применение для более
полного извлечения связанных липидов жестких условий (кипячение,
подкисление и т. д.) приводит к нежелательным изменениям, связанным с
окислением и гидролизом исследуемых веществ, а также к потерям фос-
фолипидов. Использование для отделения нейтральных липидов диэтило-
вого эфира, активизирующего фосфолипазу D, повышает содержание
фосфатидных кислот. Кроме того, экстракция липидов эфиром может
привести к значительным потерям фосфатидилинозитолов и фосфатидил-
серинов, которые лучше извлекаются хлороформом.
В экстракты вместе с липидами переходят и нелипидные компоненты
(углеводы, аминокислоты и другие гидрофильные вещества), от которых
освобождаются различными методами. Исходные хлороформметанольные
экстракты промывают водой [294] , 0,29%-ным или 0,9%-ным раствором
NaCl [280, 294], 0,1%-ным раствором СаСЦ [163] Установлено [163,
294], что прибавление минеральных солей, содержащих Na-, К-, Са- или Mg-
ионы, способствует снижению потери липидов (в частности, липидов более
кислого типа) в промежуточном слое или в водной фазе. После экстракции
растительных липидов экстракт упаривают и из остатка извлекают липиды
хлороформом, затем промывают их водой; при этом возможны потери
фосфолипидов [ 163].
Для большей достоверности результатов исследования химического
состава и свойств фосфолипидного комплекса масличного сырья необхо-
26
димо вести исчерпывающую его экстракцию и последующую очистку от
сопутствующих компонентов в мягких условиях, исключающих изменения
исследуемых веществ. Наиболее мягкие условия выделения фосфолипи-
дов из масличных семян приведены в работах [82,125,294].
Схема фракционного выделения липидов приведена на рис. 3.1 [82].
Методика извлечения свободных липидов (моно-,
ди- и триацилглицеринов, жирных кислот и других веществ). Ядро семян
после отделения оболочки (лузги) измельчают на мельнице и подсушивают
в вакуум-сушильном шкафу (3 ч), затем настаивают с петролейным эфи-
Ядро
пг - 1
Обезжиренный материал
измельчение
экстракция петролейным эфиром
Трехкратная экстракция
спесью хлороформ-метанол (2 >)
Свободные липиды
(глицериды, жирные кислоты-
и др. вещества)
| Фильтрация |-----------
Мисцелла
\0тстаивание (+<>'С) и фильтрация [
Фильтрат
| Упаривание |
Связанные липиды (фосфолипидно-
углеводный концентрат),
глицериды
Шрот
Углеводы,
Овраоотка петролейным
эфиром и хлороформом
Петролейно - хлороформный
| раствор
| Промывка водой 1--------
пг
| Упаривание раствора |
„Сырые” фосфолипиды
^Обработка ацетоном (-fQ,-f2*C) |
Водора створи мые
вещества
| Фильтрация J
Ацетононерастворимая
фракция
Фосфолипидный
комплекс
---------1
Ацетонорастворимря
фракция
Связанные липиды
(глицериды, следы
жирных кислот и др)
Рис. 3.1. Схема извлечения фосфолипидов из масличных семян
27
Р°м (гкип = 40-60°С) в соотношении 300 мл эфира на 50 г ядра при посто-
янном взбалтывании на лабораторном встряхивателе в течение 1,5 ч при
комнатной температуре. Для лучшего контактирования мятки с эфиром в
колбу добавляют стеклянные бусинки.
После экстракции мисцеллу фильтруют, обезжиренный материал триж-
ды промывают петролейным эфиром (по 50 мл). Объединенные фильтраты
упаривают в токе азота и получают фракцию свободных липидов.
Методика извлечения связанных липидов. Основ-
ные растворители, применяемые для экстракции фосфолипидов из расти-
тельных объектов, следующие: 95%-ный метанол, 95%-ный этанол, этанол -
диэтиловый эфир (3:1), этанол-бензол (4:1), хлороформ-метанол (2:1),
Семена (ядро семян)
[изпвльчвпив |
Экстракция хлороформнетанолъной
смесью (г-1)
--------- у---------------------
Фильтрация)
Фильтрат
Остаток
Филыпрат
| Экстракция хлороформметанольной сиесью(2/){
---------{Фильтрация)--------।
Остаток
------------- -------------______________
| Добавление ацетона. Отстаивание |
Ацетоновая
фракция
Остаток
Экстракция хлороформ -
метанольной спесью (2-1)
| Фильтрация |
Отгонка
растворителя
Добавление
ацетона
Фильтрат
Липиды
{Отгонка ,
------- •гильт)
___________ — -1 1
гд растворителя) ’
Остаток
Экстракция хлорофорн-
петанальнои спесью/? 1)
| Ф-льтрация I
—I
Фильтрат Остаток
♦ ____________
[Отгонка растворителя |
Фосфолипиды
Рис. 3.2. Схема извлечения фосфолипидов из масличных семян
28
изопропанол-хлороформ (1:1), бензол-метанол (1:1), хлороформ-ме-
танол (1:1).
Наиболее эффективным растворителем является система хлороформ-
метанол (2:1). Поэтому для извлечения из обезжиренного материала свя-
занных липидов, в том числе и фосфолипидов, чаще всего применяют хло-
роформ-метанол (2:1).
В этих целях обезжиренный материал освобождают от остатков петро-
лейного эфира, для чего выдерживают в вакууме в течение 1 ч, затем берут
навеску 50 г, подвергают настаиванию в течение 16-18 ч с 300 мл смеси
хлороформ-метанол (2:1) в колбе при температуре 25°С в затемненном
месте, взбалтывают содержимое колбы в течение 1,5 ч на встряхивателе и
Пятка.
Рис. 3.3. Схема извлечения фосфолипидов из масличных семян
29
фильтруют через пористый фильтр № 4 или воронку Бюхнера (фильтр сред-
ней плотности). Исходный материал еще дважды обрабатывают 300 мл
растворителя при взбалтывании в течение 1 ч на встряхивателе, после
третьей экстракции остаток на фильтре трижды промывают смесью хлоро-
форм-метанол (по 25 мл).
Методика освобождения от углеводов. Фильтраты от
трех экстракций выдерживают раздельно при +4°С для освобождения от
большей части углеводов. Выпавшие кристаллические углеводы отделяют
фильтрацией. Раствор упаривают досуха и обрабатывают дважды петролей-
ным эфиром по 20 мл, а затем дважды по 10 мл хлороформа. Петролей-
ные и хлороформные растворы от трех экстракций объединяют, промыва-
ют водой (20% по объему) для удаления водорастворимых примесей и
упаривают досуха, получают фракцию ’’сырые” фосфолипиды.
Методика очистки фосфолипидного комплекса.
’’Сырые” фосфолипиды растворяют в хлороформе до 25%-ной концентра-
ции и обрабатывают 20-кратным объемом ацетона, выдерживают в течение
14—16 ч при t = — 10°С. Осадок отфильтровывают, промывают трижды
охлажденным ацетоном по 15 мл, растворяют в хлороформе, упаривают и
сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 45—5О°С до постоян-
ной массы. Полученный таким образом фосфолипидный комплекс не со-
держит нейтральных липидов, а выход липидного фосфора составляет
97% от его исходного содержания в ’’сырых” фосфолипидах.
Методика извлечения фосфолипидов, предложен-
ная в литературе [294]. Масличные семена подвергают сублимаци-
онной сушке с целью максимально возможного удаления влаги, растирают
в порошок, просеивают через сито 40 меш, встряхивают с 5 объемами
смеси хлороформ—метанол (2:1) в течение 3 ч при комнатной температу-
ре и фильтруют. Остаток на фильтре вновь экстрагируют пятикратным
(по объему) количеством того же смешанного растворителя. К фильтрату
добавляют 2 объема ацетона, перемешивают и оставляют для отстаивания.
Остаток промывают 15 объемами ацетона, после полного удаления раство-
ригеля добавляют 15 объемов смеси хлороформ-метанол (2:1) и остав-
ляют на 12 ч при комнатной температуре. Нерастворившуюся часть экстра-
гируют еще 5 раз по аналогичной методике. Все экстракты объединяют,
выпаривают досуха под вакуумом и получают фосфолипиды. Схема извле-
чения фосфолипидов из масличных семян приведена на рис. 3.2.
Методика извлечения фосфолипидов (рис 3.3) по
методу, предложенному в литературе [ 125] . 100 г из-
мельченного ядра (мятки) помещают в аппарат Сокслета, снабженный во-
дяной рубашкой, подсоединенной к термостату. Исчерпывающую экстрак-
цию проводят ацетоном при температуре 20°С, контролируя полноту извле-
чения масла. Мисцеллу выпаривают на водяной бане под вакуумом при
температуре 25°С, доводят до постоянной массы и определяют выход
липидов. В процессе экстракции на дне колбы-приемника образуется оса-
док; этот осадок отделяют (образец 2), а липиды без осадка (образец 1)
исследуют. Обезжиренную ацетоном мятку высушивают до полного уда-
ления растворителя и экстрагируют хлороформом для выделения свобод-
ных фосфолипидов. Растворитель отгоняют и определяют выход (образец
зп
3), а остаток в патроне экстрагируют смесью этанола и бензина (2:8),
позволяющей более полно извлечь связанные фосфолипиды из липопроте-
идных комплексов. Экстракцию проводят настаиванием при температуре
65°С с трехкратной сменой растворителя. Экстракты собирают вместе,
растворитель отгоняют под вакуумом, содержимое доводят до постоянной
массы и определяют выход (образец 4). Остаток в патроне для вытеснения
кислых форм фосфолипидов из комплексов с металлами экстрагируют
ацетоном, подкисленным 0,1 н. НС! (образец 5). Экстракцию проводят
настаиванием так, как описано в предыдущем опыте. Остаток в патроне для
извлечения остальных фосфолипидов экстрагируют смесью хлороформа и
метанола (3:2). Растворитель меняют три раза через 12 ч, температура
извлечения 20 С, удаление растворителя производят так, как указано ранее
(образец 6).
3.2. МЕТОДЫ ПРЕПАРАТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ
ФОСФОЛИПИДОВ ИЗ МАСЕЛ
3.2.1. ДИАЛИЗ
Диализ является одним из перспективных методов для выделения
фосфолипидов и отделения их от нейтральных липидов, отличается просто-
той, мягкими условиями проведения процесса и позволяет извлечь до 90-
98% фосфолипидов. Диализ можно использовать для выделения фосфоли-
пидного комплекса из нерафинированных масел, для выделения негидра-
тируемых фосфолипидов из гидратированных и нейтрализованных ма-
сел, а также для отделения из фосфатидных концентратов нейтральных
липидов.
В основу выделения фосфолипидов из липидной смеси этим методом
положено их свойство образовывать ассоциаты в неполярных растворите-
лях [106, 262, 388] . Однако склонностью к ассоциации обладают не только
фосфолипиды, но и другие липиды, причем чем ниже полярность, тем ближе
их дисперсность в неполярном растворителе к молекулярному состоянию,
и наоборот, с увеличением полярности возрастает их степень ассоциации:
фосфолипиды в неполярных растворителях могут образовывать даже кол-
лоидные мицеллы. Размер ассоциатов существенно зависит от природы
растворенного вещества и растворителя, а также от концентрации раствора.
Для выделения фосфолипидов лучшим был признан петролейный эфир с
температурой кипения 40-60°С [301] . Показано, что природа изученных
растворителей (гексан, петролейный эфир и бензин) не оказывает значи-
тельного влияния на выход фосфолипидов и переход их в диализат [125] .
В качестве мембраны для диализа используют резину марки М, предва-
рительно проэкстрагированную в аппаратах Сокслета диэтиловым эфиром
в течение 3 ч, а затем петролейным эфиром также в течение 3 ч. Проэкстра-
гированные мембраны хранят в петролейном эфире (срок хранения не бо-
лее одного месяца). Использование обработанных таким образом мембран
упеличивает их активную поверхность, а это ускоряет диализ. Увеличение
градиента концентрации (изменение концентрации на единицу расстояния)
достигается частотой смены растворителя в диализаторе и постоянным
3J
<
I
1
<!
i
н
н
к
у
”.
11
1
о}
9
н<
д<
9'
н
он
в
см
Ре
(п
до
ос
ри
ля
ГИ|
вы
чец
м
ме
Дя
ци
че1-
тел
ЛИ1
док
исс.
лен
ны>
30
Рис. 3.4. Диализатор для выделения фос-
фолипидов :
1 - диализационная камера; 2 - шток
для крепления камеры; 3 - емкость для
диализата; 4 - емкость для слива диали-
зата
Рис. 3.5. Установка для диализа в непре-
рывном потоке:
1 - диализаторы; 2 - емкость для пода-
чи растворителя; 3 - мембраны; 4 -
электромешалки; 5 - втулка-затвор;
6 - приемник диализата; 7 - термо-
статируемая рубашка
перемешиванием содержимого диализационной камеры. Ниже приведены
наиболее распространенные методики диализа.
Предложено проводить диализ в диализаторе (рис. 3.4), который
представляет собой трехгорлую круглодонную колбу вместимостью 100 мл
с краном внизу для слива диализата [125]. Два отверстия (боковые)
служат для заполнения диализатора растворителем, а в третье (среднее)
помещена диализационная камера (резиновая мембрана) с исследуемым
раствором (образцом). Диализационная камера крепится на стеклянном
штоке, с помощью которого можно периодически перемешивать со-
держимое.
Методика. В диализационную камеру вносят навеску 2-6 г липи-
дов (фосфатидного концентрата - 2-3 г, масла - 5-6 г), растворенных в
6-8 мл растворителя. Диализатор заполняют свежеперегнанным раствори-
телем, сменяя его через каждые 8 ч.
Кинетика диализа была исследована на образцах подсолнечных ма-
сел [125] . Показано, что в зависимости от вида масла в начале процесса
переход фосфолипидов в диализат составляет 3—10%, в дальнейшем пере-
ход фосфолипидов в диализат не наблюдается, а происходит их диалити-
ческая очистка за счет удаления других составляющих масла. Извлечение
фосфолипидов после первого периода составляет 90-97%. Длительный
диализ (более 80 ч) приводит к потере фосфатидных кислот.
Для выделения фосфолипидов из подсолнечных масел оптимальным
временем диализа является 72 ч при семикратной смене растворителя,
для соевых масел — 56 ч при пятикратной смене (при первой смене через
каждые 24 ч), для фосфатидных концентратов - 72 ч при смене раство-
рителя через каждые 24 ч. Однако при проведении диализа в периодиче-
ском варианте даже при оптимальной длительности и мягких условиях про-
цесса потери фосфолипидов в диализат достигают 25%. Снизить потери фос-
фолипидов, сократить расход растворителя возможно при осуществлении
диализа в непрерывном потоке. Такая методика диализа была разработана
авторами (рис. 3.5) [212] .
Методика. В две диализационные камеры вносят навески липидов
по 2-6 г, растворенных в 6-8 мл растворителя. Диализаторы быстро за-
полняют свежеперегнанным растворителем (гексаном, бензином или
петролейным эфиром). Диализат поступает в приемную колбу. Процесс
осуществляют в непрерывном потоке при постоянном перемешивании
содержимого диализационных камер: в верхнем диализаторе — при часто-
те вращения мешалки 40 об/мин, а в нижнем — 60 об/мин. Растворитель
подают в диализаторы и отводят непрерывно со скоростью 5—6 мл/мин;
из верхнего диализатора растворитель поступает непрерывно в нижний,
а затем в приемную колбу. Первые 3-4 ч свежий растворитель подают в
один диализатор, а затем в другой. По такой методике диализ осуществля-
ют при расходе растворителя 2-3 л; при этом потери фосфолипидов в диа-
лизат составляют менее 1%. После завершения диализа содержимое диали-
зационной камеры переносят в темную склянку и хранят в холо-
дильнике.
Для изучения влияния температуры, при которой осуществляется диа-
лиз, на полноту выделения фосфолипидов из масел и <]юсфатидных кон-
центратов диализатор (см. рис. 3.5) снабжен рубашкой с целью поддержа-
ния необходимой постоянной температуры. Диализ можно проводить при
температуре от 0 до 50°С.
Установлено, что полный переход триацилглицеринов в диализат при
температуре 50°С наступает через 48 ч, при 20°С - через 72 ч, при 0°С - че-
рез 110 ч; при повышении температуры диализа увеличивается переход в
диализат веществ неомыляемой фракции, а при температуре 0°С практи-
чески не наблюдается перехода указанных веществ.
Выявленная закономерность позволяет диализом выделять фосфоли-
пиды с минимальным содержанием триацилглицеринов, неомыляемых ли-
пидов и др.
3.2.2. РАЗДЕЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ ПО РАСТВОРИМОСТИ
Применение этого метода основано на различной растворимости отдель-
ных типов липидов в полярных и неполярных растворителях.
Для отделения фосфолипидов от нейтральных липидов обычно приме-
няют осаждение ацетоном. Большинство фосфолипидов, в частности кис-
лые фосфолипиды (в виде солей), совершенно не растворяются в холодном
»
33
3-727
32
ацетоне, в то время как ди-, моно- и триацилглицерины и другие нейтраль-
ные липиды хорошо растворяются в ацетоне на холоду [70, 71, 262, 345,
388 J - Однако этот способ не обеспечивает полноты разделения, а также при
водит к некоторому изменению структуры фосфолипидов [125] Нами
модифицирован метод осаждения ацетоном фосфолипидов [7О|, в резуль-
тате чего увеличивается выход фосфолипидов до 87—90%, а также макси-
мально исключаются изменения их структуры.
Методика К 50%-ному хлороформному раствору масла прибавля-
ют семикратное количество ацетона, содержащего 1,5% воды. Полученную
миспеллу тщательно перемешивают на механическом встряхивателе в те-
чение 1 ч, затем выдерживают 72 ч при температуре 5°С. Выпавший светлый
осадок отделяют при температуре 5°С фильтрацией и высушивают под ва-
куумом при 30—35°С. Суммарный выход фосфолипидов составляет 95—
98%. В том случае, если необходимо отделить фосфолипиды от нейтраль-
ных липидон в фосфатидных концентратах, процесс осаждения ацетоном
проводится в соответствии с методикой, описанной ниже [262]
Методика 15г высушенного под вакуумом и доведенного до до-
стоянной массы фосфатидного концентрата растворяют в 20 мл диэтилово-
го эфира (свободного от перекисей) и центрифугируют для отделения
взвешенных частиц. Прозрачный раствор переносят в делительную ворон-
ку, из которой раствор медленно подают в стакан с ацетоном при энергич-
ном перемешивании. При этом начинает выпадать осадок нерастворимых в
ацетоне фосфолипидов, В процессе осаждения часть кадосадочной жид-
кости сливают с осадка и заменяют свежей порцией ацетона. Осадок промы-
вают несколько раз ацетоном (декантацией), затем отсасывают раствори-
тель на воронке Бюхнера, вновь растворяют в диэтиловом эфире и повто-
ряют осаждение, Операцию переосаждения повторяют до полного отделе-
ния нейтральных липидов, о чем судят по обесцвечиванию промывной жид-
кости. Полученный осадок сушат под вакуумом при температуре 25°С.
Разделение фосфолипидов на фракцию, обогащенную фосфатидил-
холинами, и фракцию, состоящую из фосфагидилэтаноламина, фосфатидил-
серина и фосфатидилинозитола, осуществляют, используя растворимость
первой фракции в 95% ном этиловом спирте [ 161, 163.262].
Методика. 20%-ный раствор фосфолипидов в петролейном эфире,
предварительно очищенных от нейтральных липидов, приливают медленно
при энергичном перемешивании в стакан с 95%-ным спиртом (содержимое
стакана защищают от света). Периодически сливая жидкость с осадка и
прибавляя новые порции спирта, добиваются полного осаждения фракции.
Спиртовый раствор фракции I собирают, а фракцию И промывают де-
кантацией чистым спиртом, отсасывают на воронке Бюхнера и повторяют
операцию переосаждения. Очищенную фракцию П высушивают под
вакуумом при температуре 25°С- Спиртовый раствор и промывную жид-
кость после отделения фракции 11 собирают и концентрируют под вакуу-
мом при температуре 205С Полученный осадок растворяют в небольшом
количестве петролейного эфира и снова переосаждают в спирте для уда-
ления примеси фракции 11. После отделения фракции 11 осадок еще раз ие-
реосаждают в ацетоне, предварительно растворив его в петролейном эфи-
34
ре. Получают мелкодисперсный осадок фракции I, затем проводят сушку
его в темном сосуде под вакуумом при температуре не более 25°С,
Для фракционирования фосфолипидов на группы ведут разделение
фракции II по методике, приведенной в работе [294]. Данный метод
основан на различной растворимости отдельных фракций фосфолипидов
(ФИ, ФС, ФЭА) в смеси хлороформ-этанол.
Методика. 1г фракции II растворяют в 8 мл хлороформа, добав-
ляют 9,1 мл этилового спирта и получают осадок 1. К надосадочной жидкос-
ти добавляют 2,7 мл этилового спирта, в результате чего образуется оса-
док И. Затем к надосадочной жидкости добавляют 25 мл этилового спирта
и получают осадок III. Надосадочную жидкость упаривают вдвое под ва-
куумом и выдерживают в течение 72 ч в холодильнике, в результате чего
выпадает осадок IV. После этого надосадочную жидкость упаривают до
объема 1 мл, добавляют 5 мл ацетона, выдерживают в течение 24 ч в холо-
дильнике и получают осадок V. Осадок 1 — фосфатидилинозитолы (ФИ),
осадок Ill - фосфатидилсерины (ФС), осадок V - фосфатидилэтаноламины
(ФЭА), осадок II и IV - смесь фосфатидилсеринов и фосфатидилэтано-
л аминов.
3.2.3. РАЗДЕЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ ПРОТИВОТОЧНЫМ
РАСПРЕДЕЛЕНИЕМ
Метод распределения веществ между несмешивающимися раствори-
телями, или метод противоточного распределения, основан’на различном
распределении компонентов смесей липидов между двумя несмешивающи-
мися растворителями [262, 296].
Для выделения фосфолипидов из масел наиболее эффективной явля-
ется методика, предложенная в работе [296] . Распределение проводится
в двух делительных воронках способом удаления элюата с применением
системы растворителей: петролейный эфир (температура кипения 40-
70°С) - 87%-ный этанол.
Методика выделения заключается в следующем. 10 г масла (или 5 г
фосфолипидов) растворяют в 45 мл верхней фазы, полученной при смеши-
вании равных объемов петролейного эфира и 87%-ного этанола. Перено-
сят раствор в делительную воронку и встряхивают с 15 мл нижней этаноль-
ной фазы. Через 3—4 мин отделившуюся нижнюю фазу переносят во вто-
рую воронку, содержащую 45 мл верхней фазы, а в первую воронку до-
бавляют 15 мл нижней фазы. Встряхивают обе воронки и через 3—4 мин пе-
реносят нижнюю фазу из второй воронки в колбу, а из первой воронки —
во вторую. Повторяют такое распределение шесть раз. На последней стадии
распределения в первую воронку уже не добавляют нижнюю фазу. Объе-
диненные этанольные фазы (8x15 мл) разбавляют бензолом и упаривают в
вакууме на роторном испарителе. Выход полярных липидов (фосфолипи-
дов) составляет более 97% (примесь нейтральных липидов 0,02-0,03%).
Основную массу нейтральных липидов получают упариванием объединен-
ной верхней фазы (петролейный эфир).
35
•4
3.2.4. ГИДРАТАЦИЯ ФОСФОЛИПИДОВ ИЗ МАСЕЛ
Для выделения фосфолипидов из масел применяют гидратацию водой,
которую проводят на лабораторной установке по методике ВНИИЖа
[ 193]. Методика заключается в следующем В гидрататор вместимостью
0,8 л наливают 500 г масла, при медленном перемешивании нагревают
его до 45—51 V, затем при увеличении частоты врашекия мешалки до
2000 об/мин вводят в количестве 1—47с к массе масла дистиллированную
воду, нагретую до температуры масла. После ввода воды снижают частоту
вращения мешалки до 100 об/мин и перемешивают в течение 15 мин. Пос-
ле гидратации масло отстаивают в течение 4-5 ч, осадок отделяют на цент-
рифуге при частоте вращения 110-120 с-1 в течение 5 мин. Масло удаляют
с осадка декантацией, а осадок (фосфолипиды) сушат под вакуумом
при температуре 50гС до постоянной массы.
3.2.5. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Наиболее распространенным методом выделения фосфолипидов из
смесей липидов и разделения их на отдельные фракции и группы в насто-
ящее время является хроматография, представляющая собой один из со-
временных физико-химических методов разделения и анализа сложных
смесей веществ. При правильно и рационально подобранных условиях чув-
ствительность и разрешающая способность этого метода высоки. Хрома-
тография широко используется как при качественных, так и при количе-
ственных определениях Для получения индивидуальных групп фосфоли-
пидов целесообразно использовать сочетание описанных нехромагографи-
ческих методов с хроматографическими.
Для выделения, разделения и анализа сложных смесей фосфолипидов
применяются бшеизвестные методы хроматографии: колоночная, бумаж-
ная, тонкослойная и др.
3.2.5.1. Колоночная хроматография
Хроматография липидов на колонке с адсорбентом представляет собой
эффективный метод отделения нейтральных липидов от фосфолипидов и
последующего предварительного разделения фосфолипидов на фракции.
При разделении методом колоночной хроматографии анализируемые
вещества образуют с твердым адсорбентом водородные или ионные связи,
обусловленные действием ван-дер-ваальсовых сил. Разделение липидных
смесей происходит в соответствии с относительной полярностью их компо-
нентов, которая определяется числом и типом полярных групп в молеку-
ле, а также числом и типом неполярных или гидрофобных групп [96] .
Обычно, если используют системы растворителей с возрастающей поляр-
ностью, липидные смеси разделяются в следующей последовательности,
насыщенные углеводороды, ненасыщенные углеводороды, воски, сложные
эфиры стеринов, высшие жирные альдегиды, триацилглицерины, высшие
спирты, свободные жирные кислоты, сгерины, диапилглицерины, моноацил-
глицерины, церебпозиды, гликозилдиацилглицерины. сульфолипиды, кис-
36
лые глицерофосфолипиды. фосфягидилэтаноламины, лизофосфатидилэта-
ноламины, фосфатидилхолины, лизофосфатидилхолины [96, 372}. При
разделении фосфолипидных комплексов на отдельные группы веществ ко-
лоночной хроматографией надо учитывать, что каждая индивидуальная
фракция представляет собой целое семейство родственных фосфолипидов,
разделение которых в свою очередь может быть осуществлено специаль-
ными методами
Для колоночной хроматографии в качестве адсорбентов чаще всего
применяют кремневую кислоту (силикагель), отмытую от железа, что
повышает ее адсорбционные свойства и устраняет каталитическое дейст-
вие железа на процесс окисления радикалов ненасыщенных жирных кис-
лот [262] . Иногда для фракционирования фосфолипидов, извлеченных из
растительных тканей, также используют окись алюминия. В последнее вре-
мя все чаще применяют хроматографирование на колонках, заполненных
ионообменной смолой - диэтиламиноэтилцеллюлозой (ДЕАЕ). и реже —
молекулярными ситами - сефадексами. В качестве элюентов применяют
смеси хлороформа и метанола, а также смеси других органических раст-
ворителей (96. 98]
Наиболее простыми и достаточно эффективными являются методики
отделения фосфолипидов от других групп липидов, приведенные ниже
М етодика. Для отделения фосфолипидов применяют силикагель
марки КСК, предварительно обработанный соляной кислотой и отмытый
от ионов хлора. Силикагель, просеянный через сито 50—60 меш, с целью
улучшения дренажных свойств взмучивают с большим количеством воды,
отстаивают в течение 1 ч, высушивают и активируют в течение 5 ч при
150°С. Разделение липидов проводят на хроматографической колонке
диаметром 18-20 мм и высотой 400 мм, снабженной тефлоновым кра-
ном. С помощью шлифа верхнюю часть колонки соединяют с делительной
воронкой вместимостью 250 или 500 мл, которая служит разервуаром для
растворителя. В нижнюю часть колонки плотно набивают небольшое коли-
чество стекловолокна пирекс для удерживания адсорбента (рис. 3.6)
[372]
Методика В химическом стакане на 100 мл приготовляют одно-
родную суспензию, состоящую из 15 г силикагеля и 30-50 мл хлорофор-
ма, и переносят ее в хроматографическую колонку. Открывают кран и слег-
ка постукивают по спускной трубке для удаления пузырьков воздуха и
равномерного оседания адсорбента в колонке. После этого уровню раство-
рителя дают опуститься до верхней границы столбика силикагеля и дваж-
ды промывают хлороформом в объеме, равном объему колонки (~ 45 мл).
Высота слоя сорбента в колонке составляет 12-16 см. Совместив уровень
растворителя с верхней границей адсорбента, осторож»' по стенкам колон-
ки добавляют пипеткой раствор (0.15-0,2 г липидов в 5 мл хлороформа).
Раствору дают распределиться по адсорбенту, а колбу, в которой перво-
начально находилась смесь, промывают 1-2 мл хлороформа; этот раствор
также вводят в колонку. При скорости элюирования 3 мл/мин колонку
промывают следующими растворами 10объемов хлороформа (~ 175 мл),
40 объемов ацетона (~ 700 мл) и 10 объемов метанола (~ 175 мл). Хло-
роформные элюаты содержат нейтральные липиды (углеводороды, каро-
37
Рис. 3.6. Хроматографическая колонка
для выделения фосфолипидов:
1 - емкость для растворителя (250 или
500 мл); 2 — краны; 3 — колонка;
4 - фильтр из стекловолокна
Рис. 3.7- Хроматографическая колонка
для выделения фосфолипидов:
1 — колонка (Н = 150 мм; d = 18 мм);
2 - водяная рубашка; 3 - трубка для
подачи растворителя; 4 — воздушная
рубашка; 5 ~ резервуар для раствори-
теля (V = 500 мл); 6, 9 - краны; 7 -
сливная трубка; 8 - приемная емкость;
10 - пористая пластинка
тиноиды, стерины и их эфиры, триацилглицерины, воски, альдегиды, жир-
ные кислоты и спирты), ацетоновые элюаты содержат кардиолипины и не-
много фосфатидной кислоты, а метанольные элюаты — фосфолипиды и
следы гликолипидов.
Предложена несколько иная методика разделения фосфолипидов на
колонке, в которой в качестве адсорбента применяется силикагель (100-
200 меш), подготовленный следующим образом [262]. Сорбент суспен-
дируют в метиловом спирте. Мутный надосадочный слой удаляют декан-
тацией или центрифугированием. Эту операцию повторяют до тех пор, пока
надосадочный слой не станет прозрачным. Осадок отделяют на центрифуге,
сушат на воздухе, выдерживают в течение 4 ч при температуре 110—120 С и
хранят в эксикаторе. 6 качестве хроматографических колонок используют
стеклянные трубки длиной 50 см и внутренним диаметром 0,5; 0,7; 1,0;
2,3; 3,3 и 5,0 см. Длина адсорбционной части колонки — от 10 до 15 см.
Оптимальные количества фосфолипидов для разделения на колонке были
приняты равными соответственно 25 мг, 50 мг. 100 мг, 500 мг, 1 г и 2,5 г.
Ниже приведена методика для колонки с внутренним диаметром 1 см.
Методика. Подготовленный силикагель суспендируют в метиловом
спирте (1:4), полученную суспензию заливают в колонку. Для полного
удаления воздуха из колонки открывают кран и выпускают небольшое
количество жидкости.
После отстаивания жидкости в верхний слой сорбента вливают хлоро-
форм для промывки; обычно для промывки берут количество хлорофор-
ма, в 2—3 раза превышающее объем колонки. Затем из колонки сливают
избыток жидкости, закрывают кран и осторожно вводят 5 мл хлороформа,
содержащего до 100 мг фосфолипидов. Открыв кран, опускают уровень
раствора до верхнего края слоя сорбента и вновь закрывают кран. После
этого* осторожно вводят часть первого растворителя для вымывания
(40 мл) таким образом, чтобы были промыты стенки колонки. Уровень
жидкости опускают до верхнего края слоя сорбента, закрывают кран и
вводят остальную часть растворителя. Открыв кран, собирают элюат пор-
циями по 5 или 10 мл. После пропускания первого растворителя в объеме
50 мл последовательно вводят второй (50 мл), третий (50 мл) и т. д. Ре-
зультаты хроматографического разделения, полученные авторами для фос-
фолипидов, выделенных из подсолнечных масел, представлены в табл. 3.1.
В табл. 3.2 приведены условия выделения и разделения фосфолипидов
хлопкового и рапсового масел колоночной хроматографией [354, 387,
389].
Необходимо отметить, что для всех указанных методик дальнейшее вы-
деление отдельных групп фосфолипидов из полученных на колонке фрак-
Таблица 3.1
Результаты колоночной хроматографии фосфолипидов
Объемное соотношение хлороформ-метанол
Группа фосфо- липидов 100 98 95 90 80 75 60 50 50 50 0
0 2 5 10 20 25 40 50 50 50 100
Неполярные ли- +
ПИДЫ
Жирные кислоты +
Кардиолипины
(ди фосфатидил-
глицерины)
Фосфатидные
кислоты
Фосфатидил-
серины
Фосфатидилэта-
нол амины
Фосфатидилгли-
церины
Фэсфатидилино-
титолы
Лиэофосфати-
дилэтаноламины
Фосфатидилхо-
лины
Лйзофосфати-
дилхолины
s

00
IC
s
8
x
5
s
§ 4
x‘
e
СП
I
s
X
s s
2 Э
s x
eg
g £ x
§i!
X
g
S
s
X
X
e
й
i
4)
«
i
I
s
a
s.
8.
eu
e
<3
I
•a
s
8
О
i
I
X
3
«
S
e
8.
x
X
3
®
g
ft
о
5
<0
о
ej
B I
X
X
X
g
i
□
s
§
m
x
x
§
e
d
m
X
X
о
c
5
О
+£
X
X
X
2
s
e
x
о
5
fc
X
I
X
&
§
S
a
I
J
&
3
&
з
X
I
S
g
c
5
§
5
S

i
Д
S8
§*
e
0
x
3
V
a
i
e
о
5
§
5
5
X
2
о
x
& -
£ 5
a
E
X
I
X
H
i
s
a>
"8.
1
c
Й
2.
S
о
I
° 5
c_ *

3
e
S
3
&
40
ций проводят методом препаративной ТСХ или хроматографией на плас-
тинах в слое силикагеля
Выделение фосфолипидов из искусственных смесей липидов на колон-
ке с силикагелем по методике, описанной в работе [20], не эффективно
при делении природных липидов. Кроме того, применение малых навесок
липидов (менее 50 мг) не позволяет получать фракции фосфолипидов в
количествах, необходимых для анализа. Поэтому для хроматографического
разделения применяют колонку, представленную на рис. 3.7 [125].
Методика. Колонку заполняют специально приготовленным сили-
кагелем, который перед работой промывают последовательно 60 мл обезво-
женных и очищенных растворителей (метанолом и ацетоном). Навеску
предварительно высушенного масла (2—4 г) растворяют в 30 мл хромато-
графически обезвоженного ацетона и осторожно вливают в колонку. Элюи-
руют вначале порциями ацетона (50 мл) до полного вымывания триацил -
лицериков. Для установления чистоты фракций триацилглицеринов и
фосфолипидов каждую порцию элюатов контролируют при помощи ТСХ
Для элюирования триацилглицеринов из навески обычно достаточно ис-
пользовать 200 мл ацетона. Элюирование фосфолипидой проводят абсо-
лютным метанолом порциями по 100 мл (всего 600-800 мл). Этот метод
позволяет получить достаточно чистую фракцию фосфолипидов с выходом
92- 95% и используется для выделения суммарной фракции фосфолипидов.
При осуществлении метода колоночной хроматографии необходимо со-
блюдать следующие соотношения: масса адсорбент а — масса липидов как
75:1; высота колонки с адсорбентом - площадь ее сечения как 5 1 [262].
3.2.5.2. Бумажная хроматография
3.2.5.2.1. Разделение фосфолипидов
Этот вид хроматографии является распространенным и доступным ме-
тодом разделения фосфолипидов на отдельные фракции. Развитие хромато-
грамм обычно проводят восходящим способом, так как при нисходящем
способе величины Rf для многих фосфолипидов имеют близкие значения
[339]. Чаше всего разделение проводят на бумаге, импрегнированной
кремниевой кислотой [205,339,386]. Для удовлетворительного разделения
фосфолипидов на непропитанной бумаге последнюю перед применением
необходимо промывать уксусной кислотой, водой и метанолом, а во избе-
жание окисления хроматографирование проводить в атмосфере инертного
газа 1205] .
Методика разделения заключается t следующем [96, 205]. В ка-
честве носителя применяют фильтровальную бумагу ватман 1, которую раз-
резают на полоски 11,5x45 см, затем на расстоянии 2 см от одного из по-
перечных краев карандашом наносят линию, отделяющую область, за ко-
торую бумагу можно брать руками. Для пропитки бумаги готовится раст-
вор силиката натрия: 310 г чистой кремниевой кислоты (100 меш) мед-
ленно при перемешивании добавляют к 1 л 7,2 н. раствора гидроксида нат-
рия (228 г NaOH в 1 л воды). Когда кремниевая кислота растворится,
смеет охлаждают до комнатной температуры и разбавляют до 1500 мл во-
41
стартовую линию, на
Рис. 3.8. Хроматографическая камера для разделения фос-
фолипидов методом восходящей хроматографии:
1 - притертая крышка; 2 - зажим из нержавеющей стали;
3 - резиновые трубки-наконечники; 4 - стеклянный стер-
жень (0,7*13 см); 5 - система растворителей (Р= 200 мл)
дой. Приготовленным раствором можно пропи-
тать 48 листов бумаги. Фильтровальную бумагу
погружают на 5 мин в приготовленный раствор
(силикат натрия — вода как 1:1), затем подвешива-
ют на 5 мин для стекания избытка раствора и по-
гружают на 30 мин в разбавленную соляную кисло-
ту (концентрированная НС1 - вода как 1:5). Пос-
ле этого для удаления кислоты бумагу 5 раз погру-
жают в водопроводную воду и один - в дистиллиро-
ванную (по 5 мин), оставляют на 8 ч на воздухе,
сушат в течение 1 ч при температуре 110° С и хранят
в эксикаторе н , силикагелем.
Нанесение образца фосфолипидов на бумагу
проводят следующим образом [262]: на расстоя-
нии 5 см от проведенной ранее линии отмечают
которую наносят пробы так, чтобы пятна были уда-
лены одно от другого на 1,5 см, растворы фосфолипидов готовят в хлоро-
форме, концентрация липидного фосфора 0,5—1 мкг/мл. Микропипеткой
на 25 мкл с делением через 3 мкл наносят 5—10 мкл этого раствора (диа-
метр пятна должен составлять 5—6 мм). При нанесении образца необходимо
подсушивать пятна слабым током азота. Снизу у листа отрезают полоску
длиной 2 см и немедленно начинают развитие хроматограммы.
Разделение фосфолипидов проводят при комнатной температуре в
. Таблица 3.3
Значения Rf фосфолипидов на бумаге, пропитанной кремниевой кислотой
Группа фосфолипидов Система растворителей
Д-ЛУ-В (см. табл. 3.4) Х-М (см. табл. 3.4)
1 2 3 4
Лизофосфатидилхолины 0,11 0,20 0,27
Лизофосфатидилэтаноламины — — 0,44
Фосфатидилинозитолы 0,20 0,17 —
Фосфатидилхолины 0,33 0,31 0,63
Фосфатидилсерины 0,40 0,51 0,70
Фосфатидилглицерины 0,50 0,57 —
Фосфатидилэтаноламины 0,56 0,42 0,80
Дифосфатидилглицерины 0,60 0,65 —
Фосфатидные кислоты 0,72 0,78 —
Примечание. В графе 2 - данные, полученные в работе ( 262], в графе 3 -
данные, полученные авторами для фосфолипидов подсолнечных масел.
42
Система растворителей и разделяемые вещества при бумажной хроматографии фосфолипидов
хроматографической камере (рис. 3.8), которая представляет собой ци-
линдрический сосуд (15x45 см) из стекла пирекс с притертой крышкой.
В камеру наливают 200 мл растворителя и оставляют на 18-20 ч для того,
чтобы в камере установилось равновесное давление паров. Хроматограмму
в камере подвешивают с помощью специального держателя таким образом,
чтобы ее нижний конец был погружен в растворитель на 1-2 см. Продол-
жительность хроматографирования 3,5-4,5 ч [339].
В табл. 3.3 приведены значения Лу для различных групп фосфолипи-
дов, а в табл. 3.4 - условия разделения фосфолипидов методом бумажной
хроматографии. Необходимо помнить, что величина Rf зависит от способа
приготовления бумаги, от температуры хроматографического разделения,
количества, состава и степени очистки фосфолипидов, содержащихся в
образце.
3.2.5.2.2. Обнаружение и идентификация фосфолипидов
на бумажных хроматограммах
Родамин 6Ж. Это наиболее широко распространенный обнаружитель для фос-
фолипидов, впервые был предложен в работе 1339].
Методика. Растворяют 1,2 г родамина 6Ж в 1 л дистиллированной воды и
получают 0,12%-ный раствор красителя, который нужно хранить в темной посуде. Пе-
ред использованием 5 мл этого раствора разбавляют до 500 мл дистиллированной во-
дой, получают 0,0012%-ный раствор и наливают его в стеклянную кювету (23x35 см).
Для проявления бумажную хроматограмму высушивают в вытяжном шкафу в тече-
ние 0,5-1 ч и погружают в разбавленный раствор родамина на 1-3 мин. Избыток кра-
сителя смывают водой и влажную хроматограмму просматривают в ультрафиолето-
вом свете (366 нм), обводя флуоресцирующие пятна карандашом. Кислые фосфоли-
пиды дают голубые, пурпурные пятна, а пятна нейтральных липидов и фосфолипи-
дов - желтые или оранжевые.
Нингидрин. Этот реагент используется для обнаружения фосфолипидов,
имеющих свободные аминогруппы, а также для фосфатидилэтаноламинов и фосфата-
дилсеринов. В работах [276, 339] предложена наиболее эффективная методика обна-
ружения нингидрином на бумажных хроматограммах.
М етодика. 0,25 г химически чистого нингидрина растворяют в 100 мл аце-
тона. Высушивают хроматограмму в вытяжном шкафу в течение 12 ч и протягивают
ее через 100 мл раствора, налитого в чашку Петри диаметром 15 см. Спустя 3-4 ч
на хроматограмме при комнатной температуре проявляются розовато-лиловые пятна
аминофосфолипидов. Проявившиеся пятна обводят карандашом и хроматограмму
обрабатывают родамином, чтобы обнаружить другие фосфолипиды
Фосфорномолибденовая кислота. Широко используется для об-
наружения холинсодержащих липидов, тем не менее этот реактив недостаточно специ-
фичен. Однако с помощью этого реактива можно получить достоверные результаты,
если предварительно хроматограмму обработать нингидрином. Обработанные нингид-
рином хроматограммы промывают дистиллированной водой, после чего проявляют
их, как ойисано в работе [329].
Методика. Хроматограмму (предварительно проявленную нингидрином и
хорошо промытую водой в течение 10 мин) быстро высушивают и погружают в раст-
вор фосфорномолибденовой кислоты (5 г растворяют в 500 мл дистиллированной во-
ды) на 5-10 мин. Раствор сливают и промывают хроматограмму сначала в кювете тре-
мя порциями бутанола по 50 мл (5-10 мин каждый раз), затем под струей воды и,
наконец, дистиллированной водой для удаления следов реагента. Далее протягивают
бумагу через разбавленный раствор хлористого олова (40 г SnCI2 растворяют в 100 мл
концентрированной соляной кислоты, затем 1 мл этого раствора разбавляют водой до
100 мл), после чего холинсоцержашие компоненты обнаруживаются в виде голубых
пятен на белом фоне.
44
Реактив Драгендорфа] 96, 388]. Применяют для обнаружения холин-
содержащих фосфолипидов. Раствор 1: 1,7 г основного азотнокислого висмута
растворяют в 100 мл 20%-ной уксусной кислоты. Раствор 2: 10гК1 растворяют
в 25 мл воды.
Перед использованием 20 мл раствора 1 смешивают с 5 мл раствора 2 и добав-
ляют 70 мл воды.
Методика. Высушенную хроматограмму опрыскивают раствором Драген-
дорфа, через несколько минут холинсодержащие липиды обнаруживаются в виде
оранжевых пятен.
Обнаружитель фосфолипидов, со де рж ащих NH-группы. При-
меняется для идентификации N-ацилфосфатидилэтаноламина, N-метилфосфатидил-
этанопамина и т. д., а также для липидов, содержащих первичные аминогруппы (96].
Методика. Трет-бутилгипохлорит, 1%-н ы й: 1 г трет-бутилгипо-
хлорита растворяют в 100 мл циклогексана; йодокрахмальный раствор,
1%-ный: 1 г KI и 1 г растворимого крахмала растворяют в 100 мл дистиллированной
воды, доводят смесь до кипения и охлаждают до комнатной температуры. Высушен-
ную хроматограмму равномерно опрыскивают 1%^ным раствором трет-бутилгипохло-
рита, после чего подвешивают в вытяжном шкафу и выдерживают в течение 1 ч при
комнатной температуре. После этого хроматограмму опрыскивают 1%-ным йодокрах-
мальным раствором. Фосфолипиды, содержащие NH-группы и первичные аминогруп-
пы, дают голубые или пурпурно-голубые пятна на белом или слабо-голубом фоне.
Чувствительность метода - 5-10 мкг фосфолипида.
Перйода тр е « к т и в Шиффа. Это специфический реагент на гликолипи-
ды (цереброзиды, гликозилдиацилглицерины и т. д.) и фосфолипиды, содержащие
вицинальные гидроксильные группы (например, фосфатидилглицерин и фосфатидил-
инозитол). Метод основан на расщеплении перйодатом соединений, содержащих ви-
цинальные гидроксильные группы, и обнаружении фуксинбисульфитным реагентом
образовавшихся альдегидолипидов. Наиболее эффективной является методика (96).
Методика. 0,25%-н ый перйодат: 0,25 г метаперйодата натрия раство-
ряют в 100 мл воды и наливают в чашку Петри диаметром 15 см. Раствор готовят не-
посредственно перед употреблением. Метабисульфит натрия, 1%-н ы й: 5 г
NajSjOj растворяют в 500 мл воды, раствор готовят перед употреблением. Реак-
тив Шиффа: 1г фуксина (основания) и 10 г метабисульфита натрия растворяют в
смеси 10 мл концентрированной соляной кислоты и 100 мл воды. Раствор фильтруют
и разбавляют дистиллированной водой до объема 500 мл Приготовленный запасной
раствор должен бьугь бесцветным, его можно хранить 5-6 мес. Перед использованием
запасный раствор разбавляют 1%-ным раствором метабисульфита в соотношении
1:2 (по объему).
Высушенную хроматограмму обрабатывают раствором метаперйодата натрия до
тех пор, пока выделившийся йод не обесцветится. Погружают хроматограмму в раз-
бавленный раствор реактива Шиффа, через несколько минут фосфолипиды обнаружи-
ваются в виде розово-сиреневых пятен на белом фоне.
Для обнаружения фосфатов обычно применяют три наиболее известных метода -
метод Хека [ 300], метод Бейса [ 2681 и метод Розенберга ] 367].
Методика Хека. Для определения фосфатов по этому методу необходимы
следующие реагенты. 2,5%-ный молибдат аммония (1,25 г молибдата аммония раство-
ряют в 500 мл воды), 0,85%-ный раствор хлористого натрия (0,85 г NaCIрастворяют
в 100 мл воды), 40%-ное хлористое олово (в 50 мл концентрированной соляной кис-
лоты растворяют 20 г хлористого олова). Перед использованием запасный раствор
разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:10.
Обнаружитель для фосфата готовится следующим образом: 12 мл раствора мо-
либдата аммония смешивают с 10 мл раствора хлористого натрия и 2 мл концентри-
рованной соляной кислоты (раствор готовится перед употреблением).
Для идентификации опрыскивают сухую хроматограмму обнаружителем для
фосфатов и нагревают в течение 1,5 мин при 100°С, после этого опрыскивают раз-
бавленным раствором хлористого олова и выдерживают при комнатной температу-
ре - фосфаты проявляются голубыми пятнами.
Методика Бейса. Для определения фосфатов по этому методу готовят
45

реактив: в 100 мл воды растворяют 6,85 г дигидрата молибдата натрия Na2MoO4.2H2O
и 400 мг гидразинсульфата, добавляют 250 мл концентрированной серной кислоты,
охлаждают и разбавляют водой до объема 600 мл. Раствор наливают в стеклянную
кювету. Высушенную хроматограмму погружают на 3-5 мин в этот реактив. Избы-
ток реагента отмывают водой и метанолом и высушивают хроматограмму. Фосфаты
обнаруживаются в виде голубых пятен.
Методика Розенберга. Для определения фосфатов по этому методу
готовят следующие реагенты: молибдатный реактив (3 мл 5%-ного раствора молиб-
дата аммония и 7 мл 5 н. соляной кислоты разбавляют ацетоном до объема 100 мл);
запасный раствор хлористого ванадия (в 20 мл кипящей концентрированной соляной
кислоты растворяют 2 г пятнокиси ванадия V2Os, кипятят в течение 10 мин, затем
разбавляют его сначала 6 н. HCI до объема 37 мл, а затем водой до 400 мл); восста-
навливающий реактив (разбавляют 20 мл запасного раствора хлористого ванадия в
30 мл ацетона, добавляют 250 мл порошкообразного цинка, встряхивают смесь в
течение 10-20 с, после осаждения цинка прозрачный раствор удаляют декантацией).
После приготовления реагентов протягивают сухую хроматограмму через восста-
навливающий реагент и снова высушивают, через 2 мин появляются голубые пятна
фосфатов (глицерофосфат, диглицерофосфат, фосфатидилглицерофосфат, фосфати-
дилинозитолфосфат и др.) на белом фоне. Чувствительность обнаружителя около
0,1 мкг липидного фосфата. Неорганический ортофосфат и алкилпирофосфаты также
дают голубые пятна.
Для обнаружения ненасыщенных фосфолипидов хроматограмму обрабатывают
парами йода или пропускают ее через 1%-ный раствор КМпО4 (марганцовокислого
калия) с последующей промывкой в проточной воде. Получают пятна коричневого
цвета на бесцветном фоне [ 233].
3.2.5.2.3. Количественное определение фосфолипидов
с бумажных хроматограмм
Для количественного анализа липидного фосфора в компонентах смеси фосфоли-
пидов, разделенных хроматографией на бумаге, пропитанной кремниевой кислотой,
можно использовать метод, приведенный в работе [ 279].
Методика. 100-200 мкг фосфолипидов, растворенных в хлороформе, нано-
сят в виде пятна на бумагу, обработанную кремниевой кислотой, и проводят разделе-
ние в системе растворителей диизобутилкетон-уксусная кислота - вода (40:25:5)
при температуре 20°С нисходящим способом. Затем бумагу обрабатывают раствором
родамина 6Ж и измеряют величину Яу у пятен, обнаруживающих красно-фиолетовую
флуоресценцию в ультрафиолетовом свете. Каждое пятно вырезают и трижды экстра-
гируют, используя каждый раз 5 мл 1 н. раствора соляной кислоты в метиловом
спирте. Экстракцию проводят в колбе с обратным холодильником в течение 30 мин
при 60-70°С. Экстракт фильтруют через стеклянный фильтр и количественно пере-
носят в колбу Кьельдаля.
Параллельно проводят холостой опыт. Бумагу без нанесения образцов помещают
в систему растворителей, после чего в тех местах, где в реальном опыте обнаружива-
ются пятна, вырезают кусочки такой же величины и проводят их экстракцию в соот-
ветствии с описанной выше методикой. Экстракты выпаривают досуха на кипящей
водяной бане, после чего для полного удаления влаги и соляной кислоты колбу осто-
рожно нагревают на газовой горелке. К остатку добавляют 0,9 мл 70%-ной хлорной
кислоты и две капли концентрированной азотной кислоты, нагревают осторожно
со стеклянными бусинками на газовой горелке в течение 15 мин и после охлаждения
добавляют 7 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5%-ного раствора молибдата аммония
и 1 мл 10%-ного раствора аскорбиновой кислоты. Колбу плотно закрывают фольгой,
выдерживают в течение 1,5 ч при температуре 37°С и затем с помощью спектрофото-
метра измеряют светопоглощенис при 820 нм. Содержание фосфора определяют по
кривой поглощения, полученной для эталонных растворов фосфора.
46
3.2.5.2.4. Разделение лизопроизводных фосфолипидов
Для разделения лизопроизводных форм фосфолипидов используют
формальдегидную бумагу, позволяющую обнаружить вещества, присутст-
вующие даже в виде следов (305] . Бумагу для хроматографического
разделения готовят таким образом: разрезают на полоски размером
20x40 см, сворачивают в ролик, заворачивают в фильтровальную бумагу и
помещают в стакан на фарфоровую решетку, промывают смесью фор-
мальдегида, ледяной уксусной кислоты, роданистого аммония (100:5:0,2).
После выдерживания в течение 1 ч бумагу заливают этой смесью, нагревают
в течение 3 ч при 20°С в термостате. Для удаления смеси бумагу промывают
в течение 1 ч и сушат при комнатной температуре.
Хроматографирование осуществляют в системе растворителей: и-бу-
танол—ледяная уксусная кислота - вода (40:10:50) нисходящим спосо-
бом. Полученные хроматограммы высушивают на воздухе и проявляют
0,05%-ным водным раствором малахитового зеленого. Лизосоединения про-
являются при медленном высушивании в виде белых пятен на светло-зе-
леном фоне. В табл. 3.5 приведены значения Rf лизосоединений, получен-
ные в работах (116, 305].
Таблица 3.5
Значения Rj лизосоединений фосфолипидов
Группа фосфолипидов Литературные дан- ные
| 3891 11281
Лизофосфатидилинозитолы 0,30 0,28
Лизофосфатидилсерины 0,39 0,33
Лизофосфатидилэтаноламины 0,51 0,50
Лизофосфатидилхолины 0,55 0,55
Лизофосфатидные кислоты 0,78 0,80
3.2.5.2.5. Разделение продуктов гидролиза фосфолипидов
Продукты кислотного и щелочного гидролиза фосфолипидов получают
по методикам, описанным в разделах 4.2.1 и 4.2.2. Для разделения продук-
тов кислотного гидролиза на хроматографической бумаге, пропитанной
кремниевой кислотой, чаще всего применяют систему растворителей: я-про-
панол-концентрированный аммиак-вода. В качестве свидетелей исполь-
зуют водные растворы аминов: холина, моноэтаноламина и серина; для по-
лиолов - растворы этиленгликоля, глицерина и инозита. Контрольное про-
явление хроматограмм осуществляют: для обнаружения аминов — реак-
тивом Драгендорфа и нингидрином (см. с. 44), для обнаружения полио-
лов — щелочным раствором нитрата серебра (см. с. 45), 0,5%-ным вод-
ным раствором КМпО4 [318] и перйодатом калия-бензидином [233] .
Хроматограмму опрыскивают насыщенным водным раствором метапер-
йодата калия и выдерживают в течение 6 мин. Затем применяют 0,1 М
раствор бензидина в смеси [50%-ный раствор метанола - ацетон - 0,2 н.
47
*
ре
и
ОХ
3
od
да
за
К1
Р«
ш
3(
тс
П
HI
Ф
д
О
д
П1
к
ш
3
с1
раствор соляной кислоты (10:2:1)]. При обнаружении перйодатом калия
полиолы проявляются в виде грязно-желтых пятен на малиновом фоне, а
при обнаружении перйодатом калия — бензидином в виде белых пятен на
синем фоне.
В табл. 3.6 приведены значения Rf продуктов кислотного гидролиза
фосфолипидов для системы растворителей и-пропанол—концентрирован-
ный аммиак-вода (60:30:10).
Для разделения продуктов мягкого щелочного гидролиза (деацили-
рования) применяют чаще всего систему растворителей бутанол-уксус-
ная кислота-вода (5:4:1) [71, 98] . Обнаружение фосфорных эфиров про-
водят реактивом Драгендорфа, раствором нингидрина, щелочным раство-
ром нитрата серебра, смесью бутанола и 10%-ной уксусной кислоты
(95:5), перйодатом калия - бензидином и реагентом на фосфат.
В табл. 3.7 приведены значения Rf продуктов мягкого щелочного гид-
ролиза фосфолипидов для системы н -бутанол—уксусная кислота-вода
(5:4:1).
В табл. 3.8 приведены условия хроматографического разделения про-
дуктов гидролиза фосфолипидов, приведенные в работах [70, 366, 370] .
Таблица 3.6
Значения Rf продуктов
кислотного гидролиза
п
X
С
н
и
р
с
п
н
Амины, ПОЛИОЛЫ Литературные данные
1116) 171)
Этаноламин 0,20 0,19
Инозитол 0,31 0,27
Серин 0,40 0,39
Глицерол 0,78 0,78
Таблица 3.7
Значения Rf продуктов щелочного гидролиза
к Фосфорные эфиры Литературные данные
{70] I 116)
Г Глицерилфосфорил- Ч инозитол 0,05-0,10 0,10
Ч Триглицсродифосфат 0,24 —
Д Глицерилфосфорил- И серин 0,33 0,33
в Глицерилфосфорил- Ч холин 0,49 0,44
ч Глицерил фосфорил эта- нол амин 0,72 0,68
Глицерофосфат 0,98 0,88
48
Условия бумажной хроматографии продуктов гидролиза фосфолипидов
00
СП
R
Ю
rt
Н
X
s
<p
*
R
О
El
О
О-
E
i
S’
о
i
%
4
?
£
к
I
G
t-
S
e
%
§
§
s
6
«
* g
S = g
.< e e
3
X
5 .
It
= i
R
X
&
4
3.2.5.2.6. Разделение углеводов, выделенных из фосфолипидов
Для разделения углеводов, выделенных гидролизом из фосфолипидов
(см. раздел 4.1 9), применяют систему растворителей и-бутанол-ледяная
уксусная кислота-вода (40:12:35). Развитие хроматограммы -сушествля-
ют двукратно или трехкратно нисходящим способом, Пятна обнаруживаю!
4%-ным спиртовым раствором анилина, 4%-ным спиртовым раствором ди-
фениламина в смеси с ортофосфорной кислотой (5:5; 1).
Для отличия кетоз и аминосахаров от всех остальных углеводов хрома-
тограмму обрабатывают 0,1 М этанольным раствором бензидина с 0,8 н.
раствором соляной кислоты в соотношении 1:1 с последующим нагревани-
ем до 110°С в течение 1 мин. При этом все углеводы, кроме аминосахаров
и кетоз, обнаруживаются в виде пятен синего цвета на белом фоне.
Ниже приведены значения Rf углеводов на бумажных хроматограм-
мах, полученных в исследованиях [114,116).
Углеводы Рафиноза Величина Rf 0,18 '
Мальтоза 0,25
Сахароза 0,35
Гаьиктоза 1,45
Глюкоза 0,55
Манноза 0,58
Фруктоза 0,70
Арабиноза 0.78
Ксилоза 0,85
Бумажная хроматография позволяет относительно быстро разделять
сложные смеси веществ и требует малого количества образца Этот метод
по чувствительности и возможности идентификации разделяемых веществ
доминирует над многими другими приемами аналитической химии.
К недостаткам метода относятся зависимость процесса разделения ис-
следуемых смесей веществ от свойств и структуры бумаги и длительность
анализа Бумажная хроматография не дает возможности применения ряда
агрессивных реагентов для идентификации и фиксации пятен веществ, а
также связана с большой трудностью при препаративном выделении отдель-
ных фракций
3.2.S.3. Тонкослойная хроматография
В последнее время все шире используют метод хроматографии в тон-
ком слое для разделения сложных смесей фосфолипидов и продуктов их
гидролиза.
современных исследованиях тонкослойная хроматография (ТСХ)
считается одним из наиболее универсальных и эффективных способов
фракционирования смесей липидов (нейтральных липидов, фосфолипи
дов, гликолипидов и т. д.). Одним из преимуществ ТСХ является возмож-
ность работать в слоях неорганических веществ, на которых почти все
соединения можно проявлять агрессивными фиксаторами [98, 382J
51
50
Разделение липидов методом ТСХ проводится обычно на силикагеле,
однако можнс использовать окись алюминия, ионообменную целлюлозу,
сефадекс, целлюлозу и т. д. Подобно хроматографии на бумаге, пропитан-
ной силикагелем, ТСХ отличается простотой, высокой разрешающей спо-
собностью и требует малых количеств вещества. К преимуществам ТСХ
относятся быстрота разделения, возможность проводить препаративное
разделение. Кроме того, достоинство ТСХ состоит также и в том. что повы-
шение разрешающей способности хроматографии, в частности проявление
в двух направлениях и многократное проявление в одном направлении,
можно осуществлять быстро без специального оборудования
Методика приготовления тонкослойных плас-
тинок. Применение в качестве сорбента силикагеля марки КСК требует
предварительной его обработки, повышающей сорбционные свойства. Та-
кую обработку проводят в соответствии с методиками [96, 98] . Для тон-
кослойной хроматографии необходимо применять адсорбент, который не
содержал бы тяжелых металлов и органических веществ Примеси железа
в силикагеле катализируют окисление жирных кислот, производят изо-
меризацию некоторых органических соединений. Примеси железа удаляют
кипячением силикагеля с соляной кислотой в колбе с обратным холодиль-
ником, а также экстракцией железа в аппарате Сокслета. Незначительные
примеси железа с тонкослойных пластинок удаляют фронтом растворителя.
В работе [96] фракцию силикагеля, необходимую для ТСХ, кипятят
в течение 2 ч с концентрированной НС1, с обратным холодильником, меняя
кислоту через каждые 30 мин Кислоту декантируют, силикагель отмывают
на стеклянном фильтре № 2 от ионов СГ 3,5 л дистиллированной воды, про
мывают 600 мл метанола и 600 мл диэтилового эфира. Из силикагеля уда-
ляют пары растворителя в вытяжном шкафу, сушат его в течение 2 ч при
100йС и хранят в склянке с притертой пробкой.
Для очистки методом экстракции [98] 150 г силикагеля требуемой
фракции насыпают в двухслойный патрон из стеклянной ткани, который
затем пинцетом помешают в экстрактор аппарата Сокслета № 1. В колбу
этого аппарата вносят 70и мл соляной кислоты Колбонагреватель с по-
мощью регулятора напряжения устанавливают на температуру 12о°С.
Экстракция ионов железа заканчивается через 30 ч. Затем экстрактор с
патроном переносят в колбу аппарата Сокслета № 2, содержащую 700 мл
50%-ного раствора NaOH в воде, и экстрагируют кислоту при 100°С в те-
чение 30 ч, меняя раствор через каждые 6 ч. Окончание экстракции НС1
устанавливают при помощи реакции на ионы СГ с 1%-ным водным раство-
ром AgNO3 Отсутствие помутнения и опалесценции указывает на то,
что силикагель отмыт от кислоты и содержание СГ в нем ниже
1,0 Ю г-ион/л. Для удаления содержащихся в адсорбенте воды и части
органических веществ силикагель экстрагируют эфиром в течение 6 ч при
температуре 37°С, а затем метанолом в течение 6 ч при температуре 64dC.
По окончании экстракции патрон вынимают из экстрактора пинцетом и вы-
держивают в вытяжном шкафу до удаления растворителя, затем силика-
гель извлекают из патрона, помешают на стекло слоем 1 см и сушат в тер-
мостате при температуре 1 ]0°С в течение 2 ч.
О наличии ионов тяжелых металлов в неочищенном и очищенном си-
52
ликагеле судят по реакции с железосинеродистым калием K3Fe(CN)e
(обнаружение ионов Fe+I) и с роданистым калием ’ KCNS (обнаружение
ионов Fe+3) [98]
Для обнаружения Fe*'2 на кончик скальпеля берут очищенный и неочи-
щенный силикагель, помешают его на стеклянную пластинку, добавляют
5 капель 2 н раствора H2SOi и 5 капель 4,8%-ного раствора K3Fe(CN)6
и перемешивают стеклянной палочкой. При наличии в силикагеле ионов
Fe+2 появляется темно-си нее окрашивание. Для обнаружения Fe+3 к сили-
кагелю добавляют 5 капель 1,6%-ного раствора KCNS. Темно-красный цвет
силикагеля указывает на присутствие в нем ионов Fe+3. Допустимое со-
держание железа в силикагеле до С,0015%.
Для проверки силикагеля на содержание органических веществ на
пластинку (20x20 см) наносят слой силикагеля 0,5 мм Пластинку поме-
щают в камеру, в которую предварительно наливают 5 мл 1%-ного раство-
ра уксусной кислоты в метаноле. После подъема фронта растворителя плас-
тинку вынимают из камеры, удаляют растворитель, поворачивают против
часовой стрелки на 90’ и повторяют экспозицию с тем же растворителем
в той же камере В результате возможные загрязнения концентрируются в
левом верхнем углу пластинки на площади 1 см2. Силикагель с этого
участка соскабливают и чистую пластинку используют для разделения
веществ.
Методика приготовления пластин, к с закреп-
ленным слоем. Такие пластинки готовят в соответствии с рекомен-
дациями [96, 98, 262]. В качестве связывающего вещества используют
гипс или крахмал. Для получения сорбционной массы смешивают сорбент,
содержащий 5% гипса, с дистиллированной водой в соотношении 1:2. Для
этого сорбент и гипс растирают сначала с 70% необходимой воды в фарфо-
ровой ступке до получения однородной пасты, не содержащей пузырьков.
Только после этого к пасте добавляют при размешивании остальные 30%
воды. Полученную смесь наносят аппликатором с винтом, позволяющим ре-
гулировать толщину слоя, на пластинки, которые сушат на воздухе при
комнатной температуре в течение 1 ч и непосредственно перед работой ак-
тивируют в течение 1 ч при 120°С .
Методика приготовления пластинок с незакреп-
ленным слоем. Для приготовления хроматографических пластин с
незакреплзнным слоем применяют методику, предложенную в работе
[151]. С этой целью готовят сорбент следующим образом: измельченный
силикагель КСК в количестве 200 г переносят в сосуд, заполненный водой
до уровня 30 см, тщательно взмучивают и осаждают суспензию в течение
15 мин. Надосадочную жидкость сливают в другой сосуд, добавляя в него
воду доводят толщину ее до 30 см. Тщательно взмучивают смесь и про-
водят ее седиментацию в течение 10 мин, затем, сливая надосадочную
жидкость, получают в осадке фракцию сорбента с размерами частиц от
0,045 мм (45 мкм) до 0,032 мм (32 мкм), что соответствует 330-
460 меш. Эту фракцию тщательно очищают от органических примесей и же-
леза. Очищенный осадок взмучивают с дистиллированной водой (2 мл на
1 г геля), отстаивают и декантируют. Эту операцию повторяют 3 раза,
после чего силикагель отсасывают на стеклянном фильтре и последова-
53
тельно промывают сначала водой до отрицательной реакции на ионы СГ,
а затем однократно этанолом и бензолом (по 0,6 мл каждого на 1 г геля).
Очищенный сорбент сушат при 120°С в течение 24 ч. Нанесение слоя сили-
кагеля методом осаждения проводят таким образом: в специальную кю-
вету (5x22x28 см) помещают параллельно одна другой две стеклянные
палочки, которые должны плотно прилегать к ее дну. В двухлитровом ста-
кане готовят разбавленную суспензию очищенной фракции сорбента, содер-
жащей 4,5 г геля в 1 л воды. Для этого 8 г геля помещают в стакан, куда
предварительно наливают 1800 мл воды. Тщательно перемешивают содер-
жимое стеклянной палочкой, добиваясь равномерной суспензии. Затем ее
быстро сливают в кювету, в которую вносят две стеклянные пластинки
(9x24 см), располагая их рядом на палочках. Толщина слоя жидкости над
пластинами составляет 2,3 см. В течение 10 мин происходит полное осажде-
ние частиц силикагеля. При этом количество силикагеля, оседающего на
1 см2 поверхности пластинки, соответствует приблизительно 8,5 мг. По ис-
течении 10 мин жидкость отсасывают с помощью сифонного устройства.
Пластинки, не вынимая из кюветы, сушат на воздухе до тех пор, пока
слой силикагеля не потеряет прозрачности. Пластины, нанесенные этим
способом, различаются равномерностью распределения частиц сорбента
по поверхности, однородностью слоев сорбента. Приготовленные пластинки
перед работой активируют в течение 1 ч при 120°С.
Готовые пластинки хранят в специальном шкафу. Перед использова-
нием пластинки необходимо вновь выдержать в течение 1 ч при 120°С.
Перед употреблением, чтобы удалить возможные следы липидов, пластин-
ки промывают в хроматографической камере смесью хлороформ—мета-
нол (1:1), фронт растворителя должен дойти до верхнего края пластинки.
После этого пластинки высушивают на воздухе и снова активируют при
120°С.
Методика нанесения пробы. На стандартную стеклянную
пластинку (20x20 см) можно нанести одновременно пять-шесть проб ве-
щества при разделении в одномерной системе. Проба наносится на рассто-
янии 1,5 см от нижнего края пластинки при помощи микрошприца. Рас-
стояние между пробами должно быть не менее 1,5 см.
В качестве подвижной фазы используют системы различных органи-
ческих растворителей, предварительно обезвоженных и очищенных. Хро-
матографические камеры подбирают минимально по размеру, обклеивают
их черной бумагой, чтобы исключить влияние света. При зарядке камеры
строго соблюдают отношение объема камеры и растворителя - 100:1 [96] .
Для устранения краевых эффектов и равномерного насыщения камеры
парами растворителя в нее помещают фильтровальную бумагу, смоченную
растворителем.
3.2.5.3.1. Разделение фосфолипидов на группы
Для разделения фосфолипидов на отдельные фракции исследуемые
пробы в виде 1%-ных хлороформных растворов наносят на пластинки в ко-
личестве 2-6 мкл [116, 125, 212] .
54
При разделении фосфолипидов применяют различные системы раство-
рителей как в одномерной, так и в двумерной хроматографии (табл. 3.10).
Вариант двумерной ТСХ широко применяется при исследовании фосфо-
липидов. Первыми двумерное элюирование (разделение) в ТСХ применили
в работе [98]. Согласно разработанному методу пробу наносят на угол
Таблица 3.10
Растворители для разделения фосфолипидов ТСХ
Система растворителей Соотношение объемов Литературный источник
Одномерная хроматография
1. Хлороформ-метанол-вода 65:25:4 1125,212, 345, 382]
2. Хлороформ—метанол-уксусная кислота 65:25:8 70:20:2 ( 344]
3. Хлороформ-метанол-25%-ный аммиак 65:25:5 1 96]
4. Хлороформ-метанол-7н. NH4OH 65:35:5 1344]
5. Изопропанол-уксусная кислота-вода 3:1:1 ( 382)
6. Хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода 65:25:8:4 (344]
7. Тоже 25:15:4:2 (96]
8. 50:25:8:4 1343]
9. 25:15:4:2 (343)
10. Изобутанол-25%-ный аммиак-вода 50:7:15 1247]
11. Хлороформ-ацетон-метанол-уксусная кис- лота-вода 65:20:1^:10:3 [338]
12. Тоже 6:8:2:2:1 [96]
13. 5:2:1.1:0,5 1344]
14. Диизобуталкетон-уксусная кислота-вода 80:50:10
15. То же 40:25:5 (344]
Двумерная хроматография
Направление I Хлороформ-метанол-7н. аммиак 60:35:5 (382]
Направление II Хлороформ-метанол-7 н. NH<OH 35:60:5 (3821
Направление I Хлороформ-мет анол-аммиак 65:35:5 (343]
Направление II Хлороформ-ацетон-метанол-уксусная кислота-вода 5:2:1:1:03 ( 3281
Направление I Хлороформ-метанол-вода 65:25:4 [328]
Направление II Диизобутилкетон-уксусная кислота-вода 80:50:10 [328)
Направление I Хлороформ-метанол-вода 65:25:4 ( 212,3281
Направление II Гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота 90:10:1 [212,328]
Направление I Хлороформ-метанол-вода 65:35:4 ( 3431
Направление II Бутанол-уксусная кислота-вода 40:20:20 ( 343]
Направление I Хлороформ-метанол-вода Направление II 65:25:4 [245,246]
Хлороформ-метанол-25%-ный аммиак , 14:6:1 [245,246]
55
квадратной хроматографической пластинки и развитие хроматограммы
осуществляют обычным способом (направление I). После этого извлекают
пластинку из камеры, дают растворителю испариться и помещают в другой
растворитель таким образом, чтобы развитие хроматограммы шло в на-
правлении, перпендикулярном первому (направление И) ч Необходимо об-
ратить внимание на то, чтобы линия пятен, разделенных при первом разви-
тии после поворота пластинки на 90°С, не оказалась ниже уровня первой
системы растворителей.
Идентификация фосфолипидов. После разделения исследуемой смеси
веществ хроматограммы вынимают из камеры и помещают в вытяжной
шкаф, а затем в термостат на 5 мин при 110°С для удаления растворителей.
Для идентификации фосфолипидов используют метчики: фосфатидную кис-
лоту, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фос-
фатидилинозитол и др. Метчики наносят в две точки, расположенные на
краях пластинки.
Ниже приведены основные универсальные индикаторы для обнаруже-
ния фосфолипидов.
Родамин 6Ж, 0,01%-н ы Й раствор (способ приготовления см. в разд.
3.2.5). Пластинки опрыскивают и во влажном состоянии просматривают в УФ-свете
(366 нм); видны желтые и голубые флюоресцирующие пятна.
Пары йода. Помещают пластинку на несколько минут в закрытый сосуд,
насыщенный парами йода; на хроматограмме появляются желтые или коричневые
пятна.
Раствор фосфорномолибденовой кислоты. 5г фосфорномо-
либденовой кислоты растворяют в 100 мл 96%-ного этанола. Пластинки после опрыс-
кивания нагревают в течение 20 мин при 110°С. На зеленом фоне появляются темно-
синие пятна.
Обработка хроматограмм серной кислотой. Обработка
ведет к обугливанию пятен фосфолипидов. Хроматограммы опрыскивают 50%-ным
раствором серной кислоты и выдерживают в течение 20 мин при 180°С. На белом
фоне появляются черные пятна, причем ненасыщенные липиды дают более темную
окраску, чем насыщенные.
Обработка хроматограмм хромовой смесью. Пластинки оп-
рыскивают насыщенным раствором К2Гг2О7 в 80%-ной серной кислоте и нагревают
до 180°С в течение 25 мин. Появляются черные пятна липидов на белом фоне. Можно
растворять К2Сг2О7 в концентрированной серной кислоте.
Обнаружение фосфолипидов по неорганическому фосфору. Реактив для
обнаружения [339]. 16 г молибдата аммония растворяют в 120 мл дистилли-
рованной воды (раствор 1), 40 мл концентрированной НО и 10 мл ртути растворяют
в 30 мл раствора 1 в течение 30 мин и затем фильтруют (раствор 2). 200 мл концент-
рированной H2SO* осторожно добавляют к раствору 2, а затем полученную смесь при-
ливают по каплям к остатку раствора 1. Охлажденную смесь доводят дистиллирован-
ной водой до 1 л. Пластинки с разделенными фосфолипидами опрыскивают этим
раствором, и сразу же без нагревания получаются голубые пятна на белом фоне.
Реактив молибдат аммония-хлорная кислота (98]. 3 г
молибдата аммония растворяют в 24 мл дистиллированной воды, добавляют 30 мл
1 н. НС1 и 15 мл 60%-ной хлорной кислоты. После опрыскивания пластинки помешают
на 20 мин в сушильный шкаф при 105’С. После этого проявляются темно-синие пятна
на слабом сером фоне.
Обнаружение фосфатидилхолинов и лиэофосфатидилхолинов. Реактив Дра-
гендорфа [339]: раствор 1:1,7 г основного нитрата висмута растворяют в 100 мл
20%-ной уксусной кислоты.
Раствор 2:40 г йодистого калия (KI) растворяют в 100 мл дистиллированной во-
ды. Для приготовления реактива смешивают 20 мл раствора / с 5 мл раствора 2 и
56
добавляют 70 мл Н2О. Оранжевые или красно-оранжевые пятна фосфолипидов наблю-
даются сразу или после незначительного нагревания.
Реактив Драгендорфа [ 242]. 8,0 г нитрата висмута растворяют в 20 мл
25%-ной азотной кислоты. К раствору медленно при перемешивании добавляют смесь
20 г KI с 1 мл 6 н. HCI и 5 мл Н2О. К темному осадку приливают воду до появления
оранжево-красной окраски (общий объем не более 95 мл). При образовании осадка
его отфильтровывают и добавляют воду до 100 мл. Реактив для идентификации гото-
вят в следующей последовательности'. 20 мл Н2О, 5 мл 6 н. НС1, 2 мл исходного раст-
вора и б мл 6 н. NaOH. Если при встряхивании не вся гидроокись висмута растворит-
ся, то добавляют еще несколько капель 6 н. НС1. Реактив выдерживают в холодильни-
ке в течение 10 дней. Фосфатидилхолины и лизофосфатидилхолины обнаруживаются
в виде оранжевых пятен на белом фоне.
Фосфорномолибденовая кислота - хлорид олова(5пС12)
[242]. Раствор 1:1 г фосфорномолибденовой кислоты растворяют в 100 мл смеси
равных объемов этанола и хлороформа. Раствор 2:1г хлорида олова (SnC)2) раство-
ряют в 100 мл 3 и. HCI. Хроматограмму опрыскивают раствором 1 и сушат в течение
3 мин, а затем раствором 2 и вновь сушат в течение 10 мин
Обнаружение лизо- и фосфатидилсеринов, лизо- и фосфатидилэтаноламинов ( 96].
0,3 г нингидрина растворяют в 100 мл н-бутанолаи добавляют 3 мл ледяной уксусной
кислоты, нагревают в течение 30 мин при 110°С ЛФС, ФС, ЛФЭА, ФЭА обнаруживают-
ся в виде розовых пятен на белом фоне.
Обнаружение фосфолипидов, содержащих вицинальные гидроксильные группы
(фосфатидилглицерин, фосфатидилинозитол и др.). Перйодат - реактив
Шиффа (см. раздел 3.2.5). Аммиачный раствор азотнокислого
серебра. Реактив готовят смешиванием эквивалентных количеств 0,1 н. водно-
го раствора азотнокислого серебра и 7 н. водного раствора аммиака. После опрыски-
вания пластинку нагревают при 110°С (коричневая окраска).
Обнаружение фосфатидилинозитолов. Аммиачный раствор азотно-
кислого серебра. Этот раствор приготовляют несколько иначе, чем в п. 2.
Реактив готовят смешением 0,1 н. водного раствора AgNOs, 5 н. водного раствора ам-
миака и 2 н. водного раствора NaOH в соотношении 1:1:2 (образуется черная ок-
раска) ( 98].
Обнаружение фосфатидных и полифосфатидных кислот, дифосфатиднлглице-
рннов. 0,1 н. водный раствор AgNOj и 7 н. водный раствор а м-
Значения Rf фосфолипидов при тонкослойной хроматографии Таблица 3.11
Rf в системах растворителей
Фосфолипиды 1 3 8 13 15 (см. табл. 3.10)
Лизо фо сфати дил холины — 0,08 0,10 0,15 —
Фосфатидилинозитолы 0,23 0,11 0,47 0,42 0,14
Фосфатидилхолины 0,33 0,33 0,31 0,40 0,25
Лизофосфатидилэтаноламины — 0,20 — 0,40 —
Фосфатидилглицерины 0,48 0,37 — 0,75 0,30
Фосфатидил этаноламины 0,62 0,41 0,83 0,65 0,35
Фосфатидилсерины 0,55 0,05 0,55 0,44 0,06
N,-N-ди метил фо сфати дил эта- ноламины 0,52 — 0,66 — —
N-метилфосфатидилэтаноламины 0,83 — 0,62 — —
Кардиолипины 0,71 0,38 — 0,85 0,41
Фосфатидилглицеро фосфат — 0,06 — — —
Лизофосфатидная кислота 0,70 0,05 — — 0,75
Фосфатидная кислота 0,74 0,05 — 0,66 0,79 57
*
м и а к а. Соотношение компонентов 1:1 (по объему) - на сером фоне обнаружива-
ются коричневые >1ятна | 2421.
В табл 3.1.1 приведены значения Rf фосфолипидов для некоторых систем раст-
ворителей (см. табл. 3.10).
Приведенные в табл. 3.11 данные следует использовать только как справочный
материал показывающий соотношение между значениями Лу различных липидов, а
не как абсолютное значение згой вдшчины, так как на значение Л, фосфолипидов в
каждом конкретном случае влияют разные факторы.
3.2.5.3.2. Разделение неомыляемых липидов,
выделенных из фосфолипидов
Для разделения неомыляемых липидов на отдельные фракции исследу-
емые пробы наносят на хроматографические пластинки в виде 1%-ного раст-
вора в хлороформе в количестве 2-6 мкл. В качестве подвижной фазы
используют гексан—диэтиловый эфир - ледяную уксусную кислоту в соот-
ношении 70:30:1 |96. 98]. Хроматограммы проявляют 5%-ной фосфорно-
молибденовой кислотой в этаноле, пэрами йода, 50%-ной фосфорной кисло
той, анисовым реагент'-м, состоящим из анисового альдегида, серной кис-
лоты, 95%-ного этанола и ледяной уксусной кислоты (5:5:90:1), и реакти
вом Эмери-Энгеля, состоящим из 0,25%-ного спиртового раствора а-, с^ -
дипиридила и С, 1%-ною спиртового раствора хлорною железа (1:1). Кроме
цветных реакций для идентификации используют метчики: стигмастерол,
омыленный о-токоферол, кристаллический (3-каротин, хлорофиллы и ксан-
тофиллы, углеводороды, предельные алифатические спирты.
Значения Rf неомыляемых липидов, выделенных из фосфолипидов
подсолнечного масла, приведены ниже [96, 116, 125] .
Группа неомыляемых липидов
Стеролы
Алифатические спирты
Ксантофиллы
Каротины
Токоферолы
Углеводороды
Величина Rf
0,33
0,43
0,55
0,60
0,68
0,82
3.2.5.3.3. Разделение углеводов, выделенных из фосфолипидов,
на отдельные группы
Для разделения углеводов ТСХ на хроматографическую пластинку на-
носят спиртовой раствор углеводов в таком количестве, чтобы содержание
в нем составляло 20 мкг углеводов. Хроматографию ведут в системе
н -буганол—ацетон-вода (7:2:1) или в системе бутанол-уксусная кислота-
вода (4:5:1) [242] Полученные хроматограммы проявляют 4%-ным спир
товым раствором дифениламина, 4%-ным спиртовым раствором анилина и
концентрированным раствором ортофосфорной кислоты в соотношении
J0 10:2. Для идентификации пятен, полученных на хроматограммах, ис-
пользуют свидетели - 0,1%-ные спиртовые растворы моно- ди- и три-
сахаридов.
58
.2.5.3.4. Количественный анализ фосфолипидов с ТСХ
1. Денситометрическче определение с предварительным обугливанием
пятен на хроматограммах приведено в литературе [Зб9] .
На пластинку размером 20x20 см для ТСХ наносят образец фосфоли-
пидов (100-600 мкг). Разделение проводят в соответствующей системе
растворителей, затем хроматографическую пластинку вынимают из камеры
и оставляют в вытяжном шкафу до полного высыхания. После этого хрома-
тограмму опрыскивают раствором бихромата калия в серной кислоте
(1,2 г К2Ст2 О-, растворяют в 200 мл 55%-ной серной кислоты), нагревают
в течение 30-60 мин при 180сС. Пластинку охлаждают на воздухе и поме-
щают в денситометр, устанавливая фон прибора на нуль, используя область
хроматограммы между пятнами в качестве холостого опыта. Сканируют
каждое пятно с интервалом в 1 мм. Записывают показания фотометра для
каждой точки, общую площадь окраски пятна определяют как сумму пока
зателей каждой его точки Средние показатели могут быть затем выражены
как абсолютное количество вещества в микрограммах, или содержание
компонента в процентах от массы смеси липидов
2. Наиболее точным методом количественною анализа фосфолипидов
ТСХ является метод, описанный в литературе [371].
На пластинке после опрыскивания 0.6%-ным раствором К2Ст2О7 в
55%-ной серной кислоте и эбутливания обводят пятна. Каждое пятно пере-
носят в колбу Кьельдаля вместимостью 30 мл, содержащую 0,9 мл 72%-
ного раствора хлорной кислоты, затем содержимое колбы сжигают на ус-
тановке Кьельдаля в течение 20 мин При сжигании следят, чтобы потери
хлорной кислоты были минимальными. Для этого смывают стенки колбы
5 мл воды и добавляют 1 мл 2,5%-ного раствора молибдата аммония Со-
держимое колбы перемешивают и добавляют 1 мл 10%-ного раствора ас-
корбиновой кислоты и 2 мл воды. Полученную смесь переносят пипеткой
в центрифужную пробирку вместимостью 15 мл, нагревают на кипящей
водяной бане в течение 5 мин, охлаждают и отделяют осадок центрифугиро-
ванием. Прозрачный слон помещают в кювету и определяют при X = 820 нм
поглощение относительно холостого опыта. Для холостого опыта с пластин
в колбу Кьельдаля переносят чистый силикагель, взятый в правом верхнем
углу пластины.
3 Наряду с описанными методами широко применяется и метод Розен-
таля [368].
Проявленную парами йода хроматограмму г-ставляют на ночь для ис-
парения йода. Затем силикагель в пределах каждого пятна соскабливают
и помешают в пробирки. Параллельно проводят холостой опыт - в пробир-
ки помещают чистый силикагель, находящийся между пятнами. К силика-
гелю в пробирки приливают 1 мл смеси, состоящий из Юн. раствора сер-
ной кислоты, 0,1 М водного раствора перйодной кислоты Н1О4 -2Н2 О и
96%-ного этилового спирта в соотношении 3:1:6 (по объему). Пробы на-
гревают на кипящей водяной бане в течение 60—75 мин до исчезновения
розовой окраски. Для получения окрашенного комплекса фосфорномо-
либденовой сини к минерализованной пробе приливают 0,3 мл 2,5%-ного
водного раствора гидразинсульфата и доводят объем до 5 мл водой. Для
59
развития колориметрической реакции смесь нагревают на кипящей водя-
ной бане в течение 10 мин, затем центрифугируют для отделения силика-
геля. Жидкость над осадком сливают в кювету толщиной 1 см и измеряют
оптическую плотность при длине волны 830 нм по отношению к контроль-
ной пробе. Относительная ошибка определения фосфора в каждом пятне
ТСХ составляет 15—20% при содержании его не менее 0,5 мкт.
Градуировочную кривую строят следующим образом. Стандартные
растворы с известным содержанием фосфора (10 мкг/мл) готовят разве-
дением исходного раствора, содержащего 0,04394 г КН2РО<, в 100 мл
воды (0,1 мг Р в 1 мл). В пробирку отмеривают от 0,1 до 1 мл такого раст-
вора, добавляют 0,3 мл 10 н. раствора H2SO4, 0,3 мл 2,5%-ного раствора
молибденовокислого аммония. 0,5 мл 0,25%-ного раствора гидразинсуль-
фата и воду до 5 мл. Смесь нагревают на кипящей водяной бане в течение
10 мин, охлаждают и измеряют оптическую плотность в кювете толщиной
1 см при длине волны 830 нм по отношению к контрольной пробе. Конт-
рольная проба состоит из 0,3 мл 10 н. раствора H2S04, 0,3 мл 2,5%-ного
водного раствора молибденовокислого аммония. 0,5 мл 0,25%-ного раст-
вора гидразинсульфата и воды до объема 5 мл. Градуировочную кривую
строят в координатах оптическая плотность - количество фосфора (в
микрограммах).
3.25.3.5. Препаративная хроматография на пластинках
в слоях силикагеля
Препаративная хроматография в настоящее время проводится на хро-
матографических пластинках в тонком слое силикагеля и используется
для отделения нейтральных липидов от фосфолипидов и выделения их
индивидуальных групп Однако количество фосфолипидов, выделенных
данным способом, ичень незначительно. Для получения больших коли-
честв исследуемых образцов нами разработана препаративная хромато-
графия в незакрепленных слоях силикагеля 3-20 мм [212].
Для приготовления такого слоя (незакрепленного) 40 -80 г силикаге-
ля (КСК, 150 меш) смешивают в фарфоровой ступке со 100— РО мл во-
ды, Полученную суспензию выливают на пластинку (12x16 см), помещен-
ную в специально приготовленный каркас. Легким постукиванием с обрат-
ной стороны пластинки слой сорбента распределяют по всей ее поверх-
ности. Пластинки помещают на ровную поверхность и высушивают сначала
в течение 16—24 ч при комнатной температуре и активируют 2—3 ч в су-
шильном шкафу при медленном повышении температуры от комнатной
до 120-130°С.
Перед нанесением пробы в нижней части пластинки (на месте старто-
вой линии) делают канавку шириной З-Д мм, глубиной 2—15 мм, в кото-
рую пипеткой вносят пробу 0,3—2,5 мл 50%-ного раствора липидов в хлоро-
форме (количество пробы вносят с учетом содержания фосфолипидов
в липидах).
Пластинки с нанесенной пробой после полного испарения растворителя
помешают в хроматографическую камеру со смесью растворителей гек-
сан-диэтилсвый эфир - ледяная уксусная кислота (80 20'1). В данной
60
Рис. 3.9. Пластинка для дву-
мерного хроматографирования
в комбинированном слое:
I - направление - гексан - ди-
этиловый эфир - ледяная ук-
сусная кислота (80:20:1); II-
направление - хлороформ -
метанол - вода (65 :25:4)
120
Система!
Толстый
слой
системе фосфолипиды остаются на старте. Для более полного отделения
нейтральных липидов проводят многократное развитие хроматограмм. Для
проверки полноты отделения нейтральных липидов от фосфолипидов
пластинку на короткое время помещают в камеру с йодом. Оставшиеся
на старте фосфолипиды элюируют смесью хлороформ-метанол (2:1),
растворитель отгоняют под вакуумом и полученные образцы фосфолипи-
дов исследуют.
3.2.5.3.6. Двумерная хроматография на пластинках
с комбинированным слоем силикагеля
Двумерная хроматография используется для одновременного отделе-
ния нейтральных липидов и разделения фосфолипидов на фракции. Извест-
но, что этот метод хроматографии фосфолипидов не всегда приносит удов-
летворительные результаты разделения из-за низкого содержания отдель-
ных групп фосфолипидов в исходном растворе.
Возможность совмещения концентрирования и последующего разделе-
ния смеси на отдельные компоненты становится реальной, если для этой
цели использовать комбинированный слой: отделение нейтральных липи-
дов производить в слое силикагеля (система I - гексан: диэтиловый
эфир-ледяная уксусная кислота), а непосредственное фракционирова-
ние — ТСХ (система II - хлороформ-метанол-вода) по общепринятой
методике [242] .
Слой силикагеля 3-20 мм готовят шириной в 25 мм по методике
[212], а на остальную часть пластинки наносят тонкий слой по обычной
методике (рис. 3.9). Непосредственно перед хроматографированием плас-
тинки с комбинированным слоем активируют, дятем на старте в нижнем ле-
вом углу делают лунку диаметром 4 мм глубиной 1-15 мм, в которую
заливают 0,01-0,25 мл 10-30%-ного раствора масла в хлороформе. Берут
раствор концентрацией не выше 30%, так как возникают трудности равно-
мерного распределения раствора, что в значительной степени может по-
влиять на четкость разделения. После испарения растворителя пластинку
61
помещают в систему I для отделения нейтральных липидов. После разви-
тия хроматограммы и удаления растворителя толстый слой до лунки сни-
мают, а пластинку с оставшимся тонким слоем помещают в другую камеру
с системой II. Расход растворителя в камере необходимо варьировать с
учетом толщины слоя и объема камеры.
Такую технику одновременного отделения нейтральных липидов и раз-
деления фосфолипидов можно применять для масел с незначительным со-
держанием фосфолипидов и для фосфатидных концентратов.
4. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ
4.1. ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
После разделения и предварительной идентификации фосфолипидов
хроматографическими методами необходимо подтвердить правильность
идентификации методом химического анализа. Для этого проводят элемен-
тарный анализ (Р, N, Me и Н), а также анализ на аминный азот, азотистые
основания, аминокислоты, сложноэфирные группы, альдегиды, вициналь-
ные ОН-группы, глицерол, инозитол, неомыляемые и др., а затем подсчи-
тывают молярные соотношения компонентов.
Для расчета содержания элементов в молекуле фосфолипида сначала
определяют методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) жирные кис-
лоты, альдегиды или другие группы с длинной углеводородной цепью и
по полученным данным рассчитывают среднюю молекулярную массу фос-
фолипидов. Если фосфолипиды содержат только ацильные группы, сред-
нюю молекулярную массу липидов определяют, основываясь на данных
ГЖХ, входящих в состав жирных кислот.
Средняя молекулярная масса жирных кислот М~ рассчитывается
так [96] :
_ ЛГК1М, ЖК2М2 _ „ ЖКпМп
Мср “ 100 Лоо- — 100 ’
где ЖК\ — содержание жирной кислоты, %; М\, М2,...,Мп - молекулярная масса жир-
ных кислот; 1, 2.л — индексы кислот в фосфолипидах.
Для окончательной идентификации фосфолипидов необходимо приме-
нять химические реакции или ферментативные процессы расщепления и
идентифицировать продукты этих реакций.
4.1.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА
Жирнокислотный состав фосфолипидов определяют методом газожид-
костной хроматографии. Этот метод основан на распределении компонен-
тов смесей, находящихся в парообразном состоянии, между подвижной
газовой фазой и неподвижной нелетучей жидкой фазой, нанесенной на
инертный носитель. Для определения жирнокислотного состава фосфолипи-
дов выделяют жирные кислоты, а затем получают метиловые эфиры жир-
ных кислот этерификацией их метанолом в кислой среде [233].
Методика заключается в следующем. Отдельные группы фосфопипи-
62
дов собирают с нескольких ТСХ-пластин (обычно с 5 пластин), на каждую
из которых наносят 0,2 мл раствора фосфолипидов в 1 мл раствора, или
собирают с одной пластины со слоем адсорбента 10-15 мм [212] .
Образцы нагревают с 10 мл 10%-ного (по объему) раствора H2SO4
в абсолютном метаноле в колбочке с обратным холодильником, снабжен-
ным хлоркальциевой трубкой, в течение 3 ч на песчаной бане при 80°С.
После охлаждения до комнатной температуры добавляют полуторный объ-
ем воды и экстрагируют метиловые эфиры низкокипящим петролейным
эфиром 3 раза по 3 мл. Собранные экстракты промывают водой до нейт
ральной реакции по универсальной индикаторной бумаге, сушат над без
водным сульфатом натрия, фильтруют, затем растворитель отгоняют под
вакуумом. Полученные метиловые эфиры разделяют на хроматографе, ис-
пользуя в качестве газа-носителя азот, твердого носителя - хромосорб и
жидкой фазы — полиэтиленгликольсукцинат. Детектор - пламенно-ио.:и-
зационный, температура разгонки 180°С. Метиловые эфиры жирных кислот
идентифицируют по величинам численных значений относительных удержи-
ваемых объемов. Подробно расчет относительных удерживаемых объемов
приведен в работе [96]. Количество индивидуальных жирных кислот оп-
ределяют графически по площадям пиков, вычисленных с учетом коэффи-
циента пересчета (стандартное отклонение). По данным [96] площадь
пика S пропорциональна произведению высоты пика /1 на его ширину а,
измеренную на половине высоты. Высоты пиков и ширину измеряют в мил-
лиметрах. Содержание жирной кислоты X, соответствующей первому пи-
ку, вычисляют по формуле
X = h lOi 1001‘Т h„an,
i=l
где h - высота пика, мм; а - ширина пика, измеренная на половине высоты, мм.
4.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФОРА
Фосфор определяют микрометодами, описанными в разд. 3.2.
4.1.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО И АМИННОГО АЗОТА
Определение суммарного азота микрометодом Кьельдаля [324] . Пи-
петкой отбирают 10—25 мл раствора фосфолипидов в хлороформе, содер-
жащих 0,1-1,5 мг азота, переносят раствор в колбу Кьельдаля вмести-
мостью 30 мл. Растворитель удаляют током воздуха, прибавляют 3 мл сме-
си для сжигания и нагревают колбу до тех пор, пока раствор не станет
прозрачным и бесцветным. Смесь для сжигания состоит из 2,0rCuSO45H2O
и 1,0 г SeO2, растворенная в смеси 100 мл концентрированной H2SO4 и
100 мл воды. Содержимое колбы переносят в прибор для микроперегон-
ки по методу Кьельдаля, используя для ополаскивания 5 мл воды. К раст-
вору прибавляют 10 мл 50%-ного раствора гидроксида натрия и отгоняют
аммиак в колбу Эйленмейера вместимостью 50 мл, в которую предвари-
тельно помешают 15 мл 2,5%-ного водного раствора борной кислоты с ин-
дикатором.
63
-Ж
В качестве индикатора для определения конечной точки титрования
применяют 0,1%-ные растворы метилового красного и метилового голу-
бого в абсолютном этаноле в соотношении 10:3; 1 мл смешанного индика-
тора прибавляют к 100 мл раствора борной кислоты. Полученный дистил-
лят титруют 0,01 н. раствором соляной кислоты до появления серого окра-
шивания. Параллельно проводят холостой опыт.
Содержание азота X (в мг) рассчитывают по формуле
X = РГ14.0,
где V - объем кислоты, пошедшей на титрование образца (с поправкой на холостой
опыт), мл; С - концентрация кислоты, гэкв./л.
Содержание азота (в %) рассчитывают по формуле
X’ = %/Р100,
где Р — масса образца, мг.
Определение аминного азота [266] . Раствор фосфолипидов в количест-
ве 10-15 мл (содержащий 1-5 мкг или 0,07-0,4 мкмоль аминного азота)
переносят в пробирку вместимостью 25 мл с пришлифованной стеклянной
пробкой. Растворитель удаляют в токе азота, остаток растворяют в 1,0 мл
90%-ного водного перегнанного над хлористым оловом монометилового
эфира этиленгликоля, прибавляют 1,0 мл нингидринового реагента и нагре-
вают смесь в течение 20 мин на кипящей бане. Для приготовления нингид-
ринового реагента 2,0 г нингидрина и 3,0 г гидриндантина растворяют в
75 мл монометилового эфира этиленгликоля, к полученному раствору
прибавляют 25 мл буферного раствора ацетата натрия (pH 5,5), смесь пе-
реливают в склянку из темного стекла и хранят в атмосфере азота. Буфер-
ный раствор ацетата натрия 4 н. (pH 5,5) готовят следующим образом:
54,5 г ацетата натрия растворяют в 40 мл воды, прибавляют 10 мл ледя-
ной уксусной кислоты и разбавляют водой до объема 100 мл.
После нагревания смесь охлаждают, прибавляют 5,0 мл 90%-ного мо-
нометилового эфира этиленгликоля, содержимое пробирки перемеши-
вают и измеряют поглощение полученного раствора и раствора холостого
опыта при X = 575 нм в кюветах со слоем толщиной 1 см.
В качестве стандартов используют растворы глицина, содержащие от
0,05 до 0,4 мкмоль вещества (молярный коэффициент экстинции прибли-
зительно равен 19 000).
Содержание аминного азота (в %) рассчитывают по формуле:
У___Додет100
где До - поглощение образца; яст - количество аминного азота в стандарте, мг;
Р — навеска фосфолипидов, мг; Дст - поглощение стандарта.
4.1.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕРИНА И ЭТАНОЛАМИНА [264]
Реактивы:
раствор динитрофторбензола (0,1 мл динитрофторбензола растворяют
в 2 мл 99%-ного этанола, раствор готовят непосредственно перед употреб-
лением) ;
64
раствор бикарбоната натрия 2,5%-ный (5 г NaHCO3 растворяют в
200 мл воды);
соляная кислота: 1,0, 2,0 и 5,0 и.;
гидроксид натрия, 0,1 н.;
метилизобутилкетон (реактив перегоняют непосредственно перед
употреблением);
стандартные растворы серина (0,4 мМ) и этаноламина (0,4 мМ). Для
приготовления растворов указанной концентрации необходимо 10 мл
10 мМ растворов разбавить водой до 250 мл (10 мМ растворы готовят
растворением 122 мг этаноламина в 100 мл воды или 105 мг серина в
100 мл воды).
М етодика. Аликвотные части хлороформных растворов суммар-
ных фосфолипидов или хроматографически однородных фракций фосфо-
тидилэтаноламина или фосфатидилсерина (содержащие 1—4 мкмоль ами-
нов) помещают в колбочку с боковым отростком. Растворитель выпари-
вают в токе азота, прибавляют 4,5 мл 5%-ного раствора НС1 в метаноле и
кипятят смесь в течение 1 ч. После охлаждения продукты метанолиза раз-
бавляют 0,5 мл воды и экстрагируют метиловые эфиры жирных кислот
и неомыляемые липиды тремя-четырьмя порциями по 5 мл низкокипяще-
го (гкип = 30-60°С) петролейного эфира. Водно-метанольный слой сначала
упаривают в токе азота или воздуха при 40-50°С до небольшого объема,
затем высушивают в вакуум-эксикаторе над КОН при остановочном дав-
лении 5—6 кПа. К остатку прибавляют 2 мл 0,1 н. раствора NaOH. Смесь
нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане, нейтрализуют 0,2 мл
1,0 н. НС1 и разбавляют 10 мл воды. В пробирку на 15 мл с пришлифован-
ной стеклянной пробкой помещают 2,0 мл водного гидролизата, 0,1 мл
раствора динитрофторбензола и 1,0 мл 25%-ного раствора NaHCOj, плот-
но закрывают пробирку пробкой и нагревают на водяной бане в течение
1 ч при 75—80°С. Охлажденную смесь разбавляют 10 мл хлороформа, ин-
тенсивно встряхивают в течение 10 мин и центрифугируют при большой час-
тоте вращения (более 3 тыс. об/мин), чтобы разделить хлороформный и
водно-метанольный слой.
Определение серина. 2,0 мл водного слоя, полученного, как описано
выше, переносят в пробирку вместимостью 15 мл со стеклянной пришли-
фованной пробкой, прибавляют 1,0 мл 1 н. раствора соляной кислоты и
10 мп метилизобутилкетона. Смесь интенсивно встряхивают в течение
10 мин, слои разделяют центрифугированием и 5,0 мл метилизобутилкето-
нового раствора помещают в другую пробирку вместимостью 15 мл, содер-
жащую 4,0 мл 0,1 н. раствора NaOH. Содержимое пробирки интенсивно
встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют, органический слой удаляют
с помощью пипетки. 3,0 мл водного слоя смешивают с 0,5 мл 2 н. раствора
соляной кислоты, помещают в кювету длиной I = 12 мм и измеряют погло-
щение при 420 нм по сравнению с раствором холостого опыта. Содержание
серина (в %) рассчитывают по формуле
где До — коэффициент поглощения образца; аС1 - количество серина в стандарте, мг;
Р - навеска фосфолипидов, мг; Дст - коэффициент поглощения стандарта.
5 - 727
65
Определение этаноламина. 5,0 мл хлороформного слоя (см. выше)
переносят в центрифужную пробирку вместимостью 40 мл с притертой
стеклянной пробкой, растворитель выпаривают в токе азота при 40°С
досуха К остатку прибавляют I1 мл низкокипящего пег релейного эфира и
5,0 мл 5 н раствора соляной кислоты, смесь встряхивают в течение 5 мин.
центрифугируют, слой петролейного эфира удаляют отсасыванием или де-
кантацией 3 мл кислого водного слоя помешают в круглую кювету длиной
I = 12 мм и измеряют поглощение при длине волны X = 420 нм по сравне-
нию с поглощением холостого опыта Калибровочную прямую строят по
аликвотным частям стандартных растворов этаноламина и серина (от 0,2
до 0,8 мкмоль). При проведении калибровочных опытов определение на-
чинают непосредственно с реакции с динитрофторбензолом
Содержание этаноламина (в %) рассчитывают по формуле
= 100/Л5сг >
где До - коэффициент поглощения образца; ост -- количество этаноламина > образ-
це, мг; Р - навеска фосфолипидов, мг; Дст - коэффициент поглощения стандарта.
Определение этаноламина по методу, приведенному в литературе
[101] Реактивы:
щелочной раствор бората (8,25 г Н3 ВО3 растворяют в 100 мл 1,0 н.
NaOH);
перйодат натрия, 0,2 М (4.28 г NaI04 растворяют в 100 мл воды);
раствор индикатора с борной кислотой для определения азота по мик-
рометоду Кьельдаля (см. разд. 4.1.3);
стандартный раствор этаноламина, 10 мМ (122 мг этаноламина раство-
ряют в 100 мл воды).
Методика. Аликвогную часть водно-метанольного гидролизата
суммарных фосфолипидов или хроматографически однородных липидных
фракций, содержащую 5—50 мкмоль u-аминоспиргов (см. разд. 4.2.2),
упаривают в токе азота до полного удаления ме1 анола. Остаток разбавляют
5 мл воды, в случае необходимости нейтрализую! несколькими каплями
1 н. раствора NaOH и переносят в прибор для микроперегонки по Кьель
далю, используя для поласкивания 1 мл воды. Прибавляют 3,5 мл щелоч-
ного раствора бората и 2,0 мл 0,2 М раствора перйодата (pH смеси должно
быть около 9,6) и в течение 7 мин пропускают через смесь ток азота, а за-
тем отгоняют аммиак и виду в приемник. содержащий 15 мл раствора бор-
ной кислоты с индикатором. Отгонку ведут до тех пор, пока объем жид-
кости в приемнике не увеличится вдвое. Дистиллят титруют 0,01 н. раст-
вором соляной кислоты до появления серого окрашивания. Холостой
опыт проводят по той же методике, но без а-аминоспиртоь
Калибровочную кривую строят по аликвотным частям (5 мл) стандарт-
ных растворов сернна или этаноламина. Если в исследуемом растворе при-
сутствует холин, то при проведении холостого опыта перйодат заменяют
2 мл воды. Расчет содержания этаноламина X (в мкмоль) проводят но
формуле
X = (Гр - Рх) 1000/С,
66
где V„ — объем кислоты, пошедшей на титрование в рабочем опыте, мл; Fx - объем
кислоты, пошедшей на титрование в холостом опыте, мл; С - концентрация кислоты,
г-экв./л.
4.1.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛИНА
Наиболее широко применяемыми методами определения холина явля-
ются рейнекатный и перйодатный, описанные в работах [265,295].
Рейнекатный метод [295]. Реактивы:
гидроксид натрия, 2 н. раствор, стандартный раствор холина, 8,25 мМ
(1,150 г хлоргидрата холина, высушенного над концентрированной серной
кислотой Н2 SO4, растворяют в 1 л воды, 1 мл полученного раствора содер-
жит 1 мг холина); раствор фенолфталеина, 1%-ный [0,5 г фенолфталеина
растворяют в 50 мл смеси вода-этанол (1:1 по объему)]; метанольный
раствор рейнеката аммония, 2%-ный (в 50 мл метанола растворяют 1,0 г
NH4 [Cr(NH3)2(SCN)4 J, если раствор мутный, его центрифугируют).
Методика. Аликвотную часть гидролизата (гидролиз ведут, как
описано в разделе 4.2.2), содержащего 0,5-2,0 мг (4-16 мкмоль) холина,
помещают в градуированную центрифужную пробирку вместимостью
15 мл. К раствору прибавляют 2 капли фенолфталеина, подщелачивают его
2 н. раствором NaOH и разбавляют водой до объема 5 мл, прибавляют
2,5 мл метанольного раствора рейнеката аммония, тщательно перемешива-
ют и оставляют на 2 ч при 5°С. Розовые кристаллы осаждают центрифуги-
рованием при частоте вращения 3000 об/мин, центрифутат осторожно сли-
вают, кристаллы рейнеката холина дважды промывают н-пропанолом
(порциями по 1 мл). Затем отделяют кристаллы центрифугированием и ак-
куратно удаляют центрифугат с помощью пипетки. Промытый рейнекат
холина растворяют в 5,0 мл ацетона, раствор центрифугируют для удаления
мути и измеряют поглощение при X = 526 нм по сравнению с раствором хо-
лостого опыта (проведенного без холина). Калибровочную кривую строят
по аликвотным частям стандартного раствора холина, содержащим 0,5-
2,5 мг вещества.
Расчет содержания холинаZ (в %) ведут по формуле
X - Довст100/Р-Дст,
1 1» >4О коэффициент поглощения образца; аст ~ количество холина в стандарте, мг;
г навеска фосфолипидов, мг; - коэффициент поглощения стандарта.
Перйодатный метод [265, 295] Реактивы:
перйодатный реактив (15,7 г кристаллического йода и 20 г KI раство-
ряют в 100 мл воды, раствор сохраняет устойчивость при+4°С); дихлор-
>1вп (растворитель встряхивают с 2% к массе растворителя 2 М раствора
карбоната калия, сушат безводным Na2SO4 и фильтруют); стандартный
pai тор хлоргидрата холина (10,0 мл 8,25 мМ раствора хлоргидрата холина
разбавляют водой до объема 50 мл).
М о т о д и к а. Аликвотную часть гидролизата, содержащую 10-
fU mki , или 0,08 0.6 мкмоль холила (гидролиз ведут, как описано в раз-
дела 4 2) переносят в коническую центрифужную пробирку вмести-
м»оью 3 мл и подкислян» 1 каплей 1 н. раствора соляной кислоты Раст-
воритель выпари лаю । под вакуумом, к остатку прибавляют 0,5 мл во-
67
ды, перемешивают, прибавляют 0,2 мл перйодатного реактива, снова пере-
мешивают и выдерживают на ледяной бане при 0°С в течение 20 мин. Смесь
центрифугируют, центрифугат отделяют пипеткой, а кристаллы перйодата
холина растворяют в 10 мл дихлорэтана и измеряют поглощение получен-
ного раствора при 365 нм в кювете толщиной 1 см. Калибровочную кри-
вую строят по аликвотным частям стандартного раствора холина, содержа-
щим от 0,08 до 0,6 мкмоль вещества.
Расчет содержания холина (в мкмоль) проводят по формуле
% ~ ^оаст/Дст,
где До - коэффициент поглощения образца; аст - количество холина в стандарте,
мкмоль; Дст — коэффициент поглощения стандарта.
Определение холина с бумажных хроматограмм [284]. Реактивы.
Системы растворителей для хроматографии:
и-бутанол-диэтиленгликоль-вода (4:1:1); н-пропанол-этанол-вода
(5:3:2); и-пропанол-концентрированный аммиак-вода (6:6:1); 2%-ный
раствор фосфорномолибденовой кислоты в воде (2 г фосфорномолибде-
новой кислоты (ФМК) растворяют в 100 мл дистиллированной воды);
0,4%-ный раствор хлористого олова в 3 н. растворе соляной кислоты.
Методика. Образец фосфолипидов подвергают гидролизу 6 н. раст-
вором НС1 при температуре 80°С в течение 48 ч, жирные кислоты удаляют
фильтрацией и экстракцией петролейным эфиром, водный раствор выпа-
ривают под вакуумом с повторным добавлением воды или этанола. Оста-
ток растворяют в 5 мл воды, наносят аликвотную часть на фильтроваль-
ную бумагу (ватман № 1) и хроматографируют нисходящим способом в од-
ной из систем растворителей. После развития (20—45 ч) хроматограммы
высушивают в течение 3-5 ч при температуре 20-25°С, затем хроматограм-
му погружают на 1 мин в 2%-ный раствор ФМК, промывают ее в течение
5 мин последовательно и-бутанолом и водой, а далее выдерживают в тече-
ние 1 мин в растворе 0,4%-ного хлористого олова с последующим высуши-
ванием на фильтровальной бумаге в течение 30 мин при 20-25°С. Холин
обнаруживается в виде голубого пятна. Пятно с хроматограммы элюируют
метанолом, а далее ведут определение рейнекатным методом.
Для построения калибровочной кривой из 20%-ного холинхлорида
осаждением 2%-ным раствором рейнеката аммония в метаноле получают
осадок рейнекатхолина, осадок промывают на фильтре холодным метано-
лом, высушивают под вакуумом при 40°С, берут навеску для стандартно-
го раствора в ацетоне и разбавлением готовят другие стандартные раство-
ры. Измеряют поглощение при X = 526 нм по сравнению с ацетоном.
Содержание холина X (в %) рассчитывают по формуле
X = Доаст100/РДст,
где До - коэффициент поглощения образца; ест - количество холина в стандарте, мг;
Р - навеска фосфолипидов, мг; Дст - коэффициент поглощения стандарта.
4.1.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛИЦЕРИНА [363]
Для определения глицерина в фосфолипидах образцы подвергают жест-
кому кислотному гидролизу, как описано в разделе 4.2.2.
68
Реактивы: соляная кислота, 2 н. раствор; серная кислота, 10 и
24 и. раствор; перйодат натрия, 0,1 М (2, 14 г NaI04 непосредственно перед
употреблением растворяют в 100 мл воды); бисульфит натрия, 10%-ный
(10.г NaHSO3 растворяют в 100мл воды); хромотроповая кислота, 0,18%-
ная (100 мг 1,8-диоксинафталин-3,6-дисульфокислоты растворяют в 100 мл
воды и разбавляют 45 мл 2 н. раствором серной кислоты); стандартный
раствор глицерина, 0,25 мМ (250 мг глицерина растворяют в 100 мл воды,
затем 1,0 мл этого раствора разбавляют водой до конечного объема
100 мл; 1 мл такого раствора содержит 25 мкг или 0,25 мкмоль,
глицерина).
Методика. Водный раствор гидролизата переносят в пробирку с
притертой стеклянной пробкой, добавляют 2,0 мл хлороформа, встряхи-
вают и центрифугируют. Пипеткой отбирают 2,0 мл водного слоя и перено-
сят в другую пробирку с притертой стеклянной пробкой, добавляют 0,1 мл
10 н. раствора серной кислоты и 0,5 мл 0,1 М раствора перйодата натрия,
перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 мин. Затем
прибавляют 0,5 мл 10%-ного NaHSO3, содержимое пробирки перемешива-
ют, 0,5 мл полученного раствора (аликвотная часть) переносят в пробирку
с притертой стеклянной пробкой, прибавляют 5 мл раствора хромотропо-
вой кислоты, плотно закрывают пробирку стеклянной пробкой, в течение
135 мин нагревают на кипящей водяной бане, охлаждают и измеряют коэф-
фициент поглощения при 570 нм.
Калибровочную кривую строят по аликвотным частям стандартного
раствора глицерина (0,1—0,5 мкмоль).
В кюветах толщиной / = 12 мм 0,6 мкмоль глицерина дают коэффици-
ент поглощения, приблизительно равный 0,44.
Содержание глицерина (в %) рассчитывают по формуле
X = CV0 = 100/ V\P,
где С - содержание глицерина по калибровочной кривой, мг/мл; Уо - объем водного
раствора гидролизата, мл; Уу - объем водного раствора гидролизата, взятого для ре-
акции с серной кислотой и перйодатом натрия, мл; Р - навеска образца фосфолипи-
дов, взятого для гидролиза, мг.
4.1.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНОЗИТОЛА
Наиболее широко применяемым в настоящее время является метод оп-
ределения инозитола с помощью бумажной хроматографии [283] .
Реактивы. Система растворителей н-пропанол-концентрированный
аммиак-вода (6:3:1); НО, 6 н.; 0,01 н.раствор NaOH; этиленгликоль;
0,25 М раствор перйодата натрия (NaIO4 -ЗН2О).
Методика. Образец фосфолипида подвергают жесткому кислотно-
му гидролизу (см. разд. 4.2.2). Остаток, полученный в результате гидро-
лиза, растворяют в воде и доводят до метки в пикнометре на 5 мл. Али-
квотную часть водного раствора наносят на хроматографическую бумагу
Рядом с рабочей пробой наносят контрольную пробу, которую получают
при осуществлении режимов жесткого кислотного гидролиза без исследуе-
мого образца. Развитие хроматограммы проводят в системе растворителей
69
«•пропанол—концентрированный аммиак—вода. После высушивания хрома-
тограммы в течение 3 ч при комнатной температуре и проявления конт-
рольной полосы последовательным обнаружением 1%-ным раствором
нитрата серебра в ацетоне и 2%-ным раствором гидроксида натрия в эта-
ноле соответствующая часть хроматограммы элюируется водой (как конт-
рольная, так и рабочая пробы). К каждому элюату добавляют 2 мл 0,25 М
раствора перйодата натрия, растворы нагревают на кипящей бане в течение
30 мин. После охлаждения до комнатной температуры к растворам добав-
ляют 0,2 мл этиленгликоля, чтобы прореагировал избыток- перйодата нат-
рия. Смесь отстаивают в темноте в течение 30 мин и выделившуюся муравь-
иную кислоту оттитровывают 0,01 н. раствором NaOH. Вычисляют содер-
жание инозитола с учетом того, что количество образовавшейся при окисле-
нии кислоты составляет 75% от ее теоретического значения:
X , 00018(^)1,33^.
где У, - количество 0,01 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование рабочего раство-
ра, мл; - количество 0,01 и. раствора NaOH, пошедшего на титрование контроль-
ного раствора, мл; 0,0018 - количество инозитола, соответствующее 1 мл 0,01 н.
раствора NaOH; К - поправка к татру 0,01 н раствора NaOH; Р - навеска фосфолипи-
дов, взятая на гидролиз, г; А, - аликвотная часть водного раствора гидролизата, мл;
А а - общий объем водного раствора гидролизата (5 мл); 1,33 - коэффициент, учи-
тывающий образование теоретического количества муравьиной кислоты.
4.1.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЛОЖНОЭФИРНЫХ ГРУПП
Для определения сложноэфирных групп в липидах применяют методы,
основанные на реакции образования гидроксамовых кислот, дающих с
трехвалентным железом красно-фиолетовый окрашивающий комплекс
[248].
Р еактивы: диэтиловый эфир; спирт-диэтиловый эфир (3:1);
соляная кислота, 4 н. раствор; едкий натрий, 3,5 н. раствор; железо хлор-
ное 0,37 М раствор; гидроксиламин солянокислый, 2 М раствор (два по-
следних раствора хранят при +4°С).
Методика. Исходный стандартный раствор готовят растворением
триацилглицеринов масла в спирто-эфирной смеси (3:1). Для построения
калибровочной кривой 3,4 мл исходного стандартного раствора доводят
спирто-эфирной смесью до 20 мл, получают рабочий раствор, содержащий
2 мг-экв. сложного эфира в 1 мл спирто-эфирной смеси. К рабочему раст-
вору 0,5-2,5 мл прибавляют по 0,5 мл эфира, 3 мл спирто-эфирной смеси,
после этого добавляют 0,5 мл раствора гидроксиламина и 0,5 мл раствора
NaOH, перемешивают и выдерживают 30-40 мин при 40°С. После термо-
статирования приливают 0,5 мл соляной кислоты, взбалтывают, а затем
добавляют 0,5 мл раствора хлорного железа и вновь перемешивают. Опти-
ческую плотность измеряют через 15—20 мин против контрольного опыта
при толщине слоя 0,10 см и длине волны 535 нм. Контрольный опыт про-
водят без рабочего раствора.
Навеску образца фосфолипида, содержащую 3-5 мг экв. сложно-
эфирных групп, помещают в коническую градуированную пробирку на
70
10 мл и растворяют в 0,5 мл диэтилового эфира при осторожном взбалты-
вании и легком подогревании (30—34°С), затем добавляют 3 мл спирто-
эфирной смеси и те же реактивы в такой же последовательности и коли-
честве, как и для построения калибровочной кривой.
Количество миллиграмм-эквивалентов сложноэфирных групп опреде-
ляют по калибровочной кривой.
В работах [96, 364] приводится другая методика определения сложно-
эфирных групп в фосфолипидах.
Реактивы: исходный раствор перхлората железа [5 г Fe(C104)3X
X 6Н2О растворяют в смеси 10 мл 70%-ной хлорной кислоты и 10 мл воды
и разбавляют полученный раствор холодным абсолютным этанолом до
конечного объема 100 мл]. Исходный раствор можно хранить при 4° С в те-
чение нескольких месяцев; разбавленный раствор перхлората железа, све-
жеприготовленный (смесь 4 мл исходного раствора перхлората железа и
3 мл 70%-ной хлорной кислоты разбавляют абсолютным этанолом до
100 мл); щелочной раствор гидроксиламина готовят непосредственно
перед употреблением: для этого смешивают равные объемы 4%-ного эта-
нольного раствора хлоргидрата гидроксиламина (2 г растворяют в 2,5 мл
воды и разбавляют абсолютным этанолом до объема 50 мл) и 8%-ного эта-
нольного раствора гидроксида натрия (4 г растворяют в 2,5 мл воды и
разбавляют абсолютным этанолом до объема 50 мл). Осадок отделяют
центрифугированием, для анализов используют прозрачный центрифугат;
стандартный раствор сложного эфира (29,8 мг метилстеарата растворяют
в 100 мл хлороформа; раствор содержит 1 мкмоль сложного эфира
в 1 мл).
Методика. В пробирку вместимостью 15-20 мл с пришлифован-
ной, пробкой переносят раствор фосфолипидов, содержащий 0,2—2 мкмоль
сложноэфирных групп. Растворитель удаляют в токе азота. К остатку при-
бавляют 1,0 мл щелочного раствора гидроксиламина, пробирку закрывают
пришлифованной пробкой и нагревают в течение 2 мин на водяной бане при
65°С. Дают пробирке охладиться (5 мин), прибавляют 5,0 мл разбавлен-
ного раствора перхлората железа, перемешивают, оставляют на 30 мин и
измеряют поглощение розовато-лилового раствора при X = 530 нм по
сравнению с раствором холостого опыта. Калибровочную кривую строят по
аликвотным частям стандартного раствора метилстеарата, содержащим
0,5; 1,0; 2,0 мкмоль метилстеарата. Закон Бера соблюдается при содержа-
нии сложного эфира до 4 мкмоль; 1 мкмоль в кювете толщиной / = 1 см
дает поглощение, приблизительно равное 0,24.
4.1.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ
Для определения суммарных углеводов проводят гидролиз в мягких
условиях (0,6 н. НС1 в течение 7 ч при 80°С), но обеспечивающих высво-
бождение связанных углеводов и частичный гидролиз полисахаридов
[377] . Полученные гидролизаты освобождают от ионов хлора и жирных
кислот (см. раздел 4.2.2) и доводят водой в пикнометре до объема 5 мл.
Определение углеводов проводят по методике, описанной в литературе
[378] . Реактив ы: 5%-ный раствор фенола (5 г фенола растворяют в
71
100 мл воды); концентрированная серная кислота; 0,222 мМ стандартный
раствор углеводов — 100 г глюкозы растворяют в 250 мл воды (перед
употреблением этот раствор разбавляют водой в соотношении 1:10), 1 мл
раствора содержит 40 мкг (0,222 мкмоль) глюкозы.
Методика. Пипеткой отбирают 1 мл водного раствора гидролизата
и переносят в пробирку вместимостью 25 мл, растворитель удаляют под
вакуумом. К остатку прибавляют 2,0 мл воды, содержимое пробирки тща-
тельно перемешивают, прибавляют 1,0 мл 5%-ного раствора фенола, пере-
мешивают, прибавляют 5,0 мл концентрированной серной кислоты, еще раз
тщательно перемешивают, оставляют на 30 мин и измеряют поглощение
полученного оранжевого раствора при X = 490 нм относительно контроль-
ного. Калибровочную кривую строят по аликвотным частям стандартного
раствора.
Содержание углеводов X вычисляют по формуле
X = СГоЮ0/НР,
где С - содержание углеводов, определенное по калибровочной кривой, мкг/мл;
Ио - объем водного раствора гидролизата (5 мл); k'l - объем водного раствора
гидролизата, взятого для реакции с фенолом и концентрированной серной кислотой
(1 мл); Р - навеска фосфолипидов, мг.
Определение углеводов антроновым методом (377]. Реактивы.
Антроновый реактив (0,1 г антрона растворяют в 100 мл концентрирован-
ной серной кислоты, после полного растворения антрона вливают в полу-
ченный раствор 15 мл дистиллированной воды; реактив готов к употреб-
лению через 1 ч).
Методика. Гидролиз фосфолипидов осуществляют так же, как
описано выше. Отбирают пипеткой из пикнометра 1 мл водного раствора
гидролизата и переносят в пробирку вместимостью 25 мл, добавляют 10 мл
свежеприготовленного антронового реактива, перемешивают и нагревают
в течение 10 мин на кипящей водяной бане. Затем раствор охлаждают до
комнатной температуры и через 5 мин измеряют оптическую плотность
окрашенного раствора относительно контрольного при X = 620 нм в кювете
толщиной / = 2 см. Контролем служит раствор, состоящий из 1 мл дистил-
лированной воды и 10 мл антронового реактива, предварительно прогретый
на кипящей водяной бане в течение 10 мин.
Содержание углеводов X (в %) определяют по калибровочным кри-
вым и вычисляют по формуле
X = СКоЮ0/ИЛ
где С - содержание углеводов, определенное по калибровочной кривой, мг/мл;
VQ - объем водного раствора гидролизата (5 мл); - объем водного раствора
гидролизата, взятого для реакции с антроновым реактивом (1 мл); Р - навеска об-
разца фосфолипида, взятого на гидролиз, мг.
4.1.10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕОМЫЛЯЕМЫХ ЛИПИДОВ (96)
Реактивы: 0,3 н. раствор гидроксида натрия в 90%-ном метаноле
(10 мл 3 н. водного раствора NaOH разбавляют метанолом до 100 мл);
петролейный эфир (Г^,,, = 30-60°С); 1%-ный раствор фенолфталеина
(1 г фенолфталеина растворяют в 100 мл 90%-ного этанола).
72
Методика. В колбу пипеткой переносят аликвотную часть раство-
ра, содержащую 15-30 мг фосфолипидов, растворитель удаляют под ваку-
умом, к остатку немедленно прибавляют 5,0 мл метанольного раствора
NaOH. Смесь кипятят в течение 1—2 ч, прибавляют несколько капель фенол-
фталеина и добавляют 10 мл 90%-ного метанола. Содержимое колбы пере-
носят в делительную воронку, в которой неомыляемые липиды экстраги-
руют петролейным эфиром 3—4 раза порциями по 5 мл. Экстракты неомы-
ляемых липидов упаривают и доводят до постоянной массы под вакуумом.
Содержание неомыляемых липидов (в %) вычисляют по формуле
X = Т’нЮО/Р,
гдеРн - масса неомыляемых липидов, мг; Р - навеска фосфолипидов, мг.
Неомыляемые липиды можно далее разделить тонкослойной хромато-
графией (см. разд. 4.2.5). Выделение неомыляемых липидов по данной ме-
тодике позволяет исключить переход в них жирных кислот, присутствие ко-
торых мешает хроматографическому разделению неомыляемых липидов.
4.1.11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ МЕТАЛЛОВ
Наиболее точными и требующими малых количеств исследуемого вещества яв-
ляются метод пламенной фотометрии и метод атомно-абсорбционной спектроско-
пии [ 165, 358].
Метод пламенной фотометрии [ 165]. Принцип метода пламенной фотометрии сос-
тоит в том, что анализируемый раствор солей металлов в виде аэрозоля вводят специ-
альным распылителем в пламя пламенного фотометра. Возникающее в пламени излу-
чение определяемого элемента выделяется с помощью светофильтров или монохрома-
тора, попадает на фотоэлемент, вызывая в нем фототок, который измеряется гальва-
нометром. Работа с пламенным фотометром требует обязательной градуировки по
стандартным смесям, близким по составу к раствору солей анализируемой пробы.
Аналитическими линиями являются: для натрия - резонансная (X = 589,0-
589,6 нм); для калия - резонансная (X = 766,5- 769,3 нм); для кальция - молеку-
лярная полоса гидроксида кальция (X = 622 нм).
Ниже приведена методика определения содержания калия, натрия и кальция,
усовершенствованная применительно к фосфолипидам. Образец фосфолипида 40-
50 мг помещают в колбу Кьельдаля вместимостью 25 мл, добавляют 1 мл 75%-ной
хлорной кислоты, 1-2 капли концентрированной азотной кислоты и сжигают при
слабом нагревании, избегая разбрызгивания и вспенивания. Если при указанных
условиях не наступает полного осветления раствора, колбу слегка охлаждают, добав-
ляют в нее еще несколько капель азотной кислоты и продолжают сжигание. Прозрач-
ный раствор солей переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем
до метки дистиллированной водой. Приготовленный раствор анализируют на пламен-
ном фотометре. В качестве горючего газа используют пропан-бутан. Анализируемый
раствор помещают в чашечку прибора. Проба в пламя подается сжатым воздухом с
помощью компрессора под давлением. Сжигание ведут до стабилизации показаний от-
счетной шкалы. Определение выполняют несколько раз и среднее значение измерений
подставляют в формулу для расчета.
Содержание элемента X (в % к массе фосфолипидов) рассчитывают по формуле
X = в И00/1000/»,
где а - найденное по градуировочному графику содержание элемента в растворе,
мкг/мл; V - объем используемого раствора, мл; Р - навеска фосфолипидов, мг.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое не менее трех па-
раллельных определений. Относительная ошибка определения составляет 2-5%.
Построение градуировочных г р а ф и ко в. Градуировочные гра-
73
'9
фики строят на основании результатов анализа стандартных растворов с известным
содержанием элементов.
Условия анализа стандартных и исследуемых растворов должны быть одинако-
выми. Градуировочные графики строят в координатах: показания гальванометра -
содержание элемента в микрограммах в 1 мл анализируемого раствора.
Приготовление стандартных растворов. Стандартные раст-
воры готовят из хлоридов натрия, калия и кальция с содержанием основной соли
не менее 95%, предварительно высушенных до постоянной массы при 110°С
Вначале готовят водные растворы с содержанием элементов 1 мг/мл, из которых
разбавлением получают растворы с содержанием элемента от 1 до 100 мкг/мл.
В каждый приготовленный таким образом раствор добавляют 1 мл 72%-ной хлор-
ной кислоты и 1 мл водного раствора, содержащего по 50 мкг/мл Си, Al, Ni и по
150 мкг/мл Fe, Mg, и доводят объем раствора до 50 мл дистиллированной водой.
Кроме того, в стандартные растворы для определения натрия добавляют по 1 мл
раствора, содержащего 250 мкг/мл Са, 500 мкг/мл К; для определения калия добав-
ляют по 1 мл раствора, содержащего 250 мкг/мл Са, 300 мкг/мл Na; для определе-
ния кальция добавляют по 1 мл раствора, содержащего 300 мкг/мл Na и 500 мкг/мл
К, а также соль фосфора в количестве, близком к содержанию фосфора в фосфоли-
пидах (содержание фосфора в фосфолипидах должно быть определено заранее).
Метод атомно-абсорбционной спектроскопии [299, 355]. Атомно-аб-
сорбционная спектроскопия - аналитический метод определения содержа-
ния элементов, в частности катионов, основанный на поглощении света
свободными атомами. К достоинствам этого метода анализа относятся вы-
сокая селективность, низкий предел обнаружения, определение нескольких
элементов из одного и того же раствора, возможность преобразования ана-
литического сигнала в конечную форму, выраженную в единицах концент-
рации, не требует при подготовке образцов длительных по времени опе-
раций [165].
Точность метода составляет 1% отн., а чувствительность при определе-
нии натрия и калия 1-10~12%, кальция и магния 1Л0-11%, меди, железа,
никеля, алюминия 1.10~|0% [355].
Основной задачей для определения катионов металлов является их
экстракция и получение раствора, который может быть использован в аппа-
ратуре атомной абсорбции. Возможны различные методы приготовления
этого раствора: минерализация, экстракция, использование непосредствен-
но образца или его эмульсии и, наконец, применение раствора в органиче-
ском растворителе. Наибольшим преимуществом из всех методов обладает
метод применения органических растворов (самая простая техника при на-
личии подходящего растворителя). Растворитель должен отвечать следую-
щим требованиям: полностью растворять фосфолипиды, если возможно
при температуре 25°С; содержать минимальное количество ионов метал-
лов; растворять какую-либо соль металла для эталона.
а) Определение кальция, магния, натрия, калия [298, 358]. М е т о д и-
к а. Готовят 0,01%-ный раствор фосфолипидов в смеси растворителей аце-
тат изоамила-метанол (85:15). Полученные растворы подвергают атоми-
зации. 3 качестве смеси для сгорания применяют ацетилен-воздух. Изме-
рения производят на спектрофотометре двойного лучевого атомного по-
глощения типа "Перкин Эльмер”, снабженном полными катодными лам-
пами высокой частоты.
Приготовление стандартных р а с т в о р о в. Для опре-
делен! т Mg 1,666 г окиси магния растворяют в 2 мл соляной кислоты и до-
74
водят дистиллированной водой до 1 л в мерной колбе. Помещают 1 мл это-
го раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл и дополняют смесью
ацетат изоамила—метанол (85:15). Стандартные растворы получают разбав-
лением этого раствора смесью ацетат изоамила-метанола. Абсорбцию из-
меряют при длине волны X = 285 нм.
Для определения Са 2,497 г карбоната кальция растворяют в 2 мл соля-
ной кислоты и доводят дистиллированной водой до 1 л в мерной колбе.
Данный раствор имеет 0,1%-ную концентрацию Са. Помещают 1 мл этого
раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки смесью
растворителей ацетат изоамила-метанол. Стандартные растворы получаю!
разбавлением этого раствора. Абсорбцию измеряют при длине волны
X = 422 нм.
Для определения Na или К 2,542 г хлористого натрия (или 1,905 г хло-
ристого калия) растворяют в 2 мл соляной кислоты и доводят до метки
дистиллированной водой до 1 л в мерной колбе. Данный раствор имеет
0,1%-ную концентрацию Na или К. Помещают 1 мл этого раствора в мерную
колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки смесью ацетат изоамила-
метанол (85:15). Стандартные растворы получают разбавлением этого раст-
вора смесью ацетат изоамила-метанол. Для определения Na абсорбцию из-
меряют при длине волны 589 нм, а для К - при X = 766,49 нм.
б) Определение никеля и алюминия [ 165, 355] . Методика. К об-
разцу 250—300 мг фосфолипидов добавляют 0,25-0,30 г дихлоруксусной
кислоты, разбавляют полученную смесь 20 мл метилизобутилкетоном и на-
гревают до 50°С в течение 5 мин. Раствор охлаждают до температуры 25°С,
доводят метилизобутилкетоном до метки 50 мл и анализируют прямым
методом. Абсорбцию измеряют для определения А1 при X = 484 нм, а для
Ni'-npnX = 232 нм.
Приготовление стандартных растворов. Для опреде-
ления А1 1,000 г металлической алюминиевой фольги растворяют в 5 мл
концентрированной соляной кислоты и добавляют 25 капель концентриро-
ванной азотной кислоты, а затем доводят до объема 1 л дистиллированной
ведой. Данный раствор имеет 0,1%-ную концентрацию по А1. Далее 1 мл
полученного раствора помещают в колбу вместимостью 100 мл и добавля-
ют до метки метилизобутилкетон.
Для определения Ni 4,033 г NiCl2.6H2O растворяют в 2 мл соляной
кислотой и доводят до объема 1 л в мерной колбе дистиллированной во-
дой. Полученный раствор имеет 0,1%-ную концентрацию по Ni. Далее 1 мл
раствора переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки метили-
эобутилкетоном. Стандартные растворы готовят разбавлением данного
раствора.
в) Определение железа и меди [165, 291]. Готовят 1%-ный раствор
образца фосфолипидов в метилизобутилкетоне и анализируют прямым ме-
тодом. Стандартные растворы готовят на основе метилизобутилкетона.
Кроме того, широко применяется методика определения содержания
Fe и Си, приведенная в работе [303] . Определение содержания меди и же-‘
леза в биологических объектах чаще проводят, готовя образец для атоми-
зации методом экстракции исходных объектов кислотой. Однако простая
экстракция кислотами при работе с фосфолипидами приводит к образо-
75
ванию труднорасслаивающихся эмульсий. Поэтому предложено применять
для экстракции растворы фосфолипидов. Применение четыреххлористого
углерода позволяет растворить органическую фазу без образования эмуль-
сий и сформировать нижний слой. Верхний водный слой, содержащий экст-
рагированные элементы, может непосредственно распыляться в пламя.
М етодика. Навеску образца фосфолипидов 100 мг растворяют в
5 мл четыреххлористого углерода, помещают в колбу вместимостью 50 мл
и обрабатывают в 5 мл 10%-ной азотной кислоты при 61°С в течение 30-
60 мин. Содержимое переносят в делительную воронку. Собирают верхний
слой, распыляют его в пламя и измеряют абсорбцию. Стандартные растворы
в этом случае готовит на основе 10%-ного раствора азотной кислоты. Опре-
деления выполняют в пламени воздух-ацетилен. Абсорбцию измеряют для
определения Fe при длине волны X = 371 нм, а для Си - при X = 327 нм.
Приготовление стандартных р а с т в о ро в. Для опре-
деления железа и меди 1,000 г железа или меди (в виде металла) растворя-
ют в 5 мл концентрированной соляной кислоты, добавляют 2-3 капли кон-
центрированной азотной кислоты и доводят до объема 1 л дистиллирован-
ной водой. Полученный раствор имеет 0,1%-ную концентрацию по содер-
жанию Fe или Си. 1 мл данного раствора переносят в мерную колбу вмес-
тимостью 100 мл и доводят до метки метилизобутилкетоном. Данный
раствор применяют дня разбавления и последующего построения калиб-
ровочной кривой.
4.2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ
Для изучения и определения химической структуры фосфолипидов
применяют комплекс химических, ферментативных и физико-химических
методов анализа.
4.2.1. МЯГКОЕ ЩЕЛОЧНОЕ ДЕАЦИЛИРОВАНИЕ
Наиболее широко применяемым методом деацилирования фосфолипи-
дов мягким щелочным гидролизом являются метод, описанный в работе
[283], и его модификации [70, 71]. Сущность этих методов заключается
в том, что диацильная форма легко гидролизуется под действием щелочи,
расщепляясь на свободные жирные кислоты и водорастворимые эфиры
фосфатов, которые могут быть легко идентифицированы хроматографиче-
скими методами.
Методика заключается в следующем. Образец фосфолипида, содержа-
щий около 300 мкг липидного фосфора, растворяют в 0,8 мл четыреххло-
ристого углерода, затем прибавляют 7,5 мл этанола, 0,65 мл воды и
0,625 мл водного 1 н. раствора NaOH. Реакционную смесь осторожно пере-
мешивают и выдерживают в течение 20 мин при 37°С; проверяют pH инди-
каторной бумагой (должна быть щелочная реакция). Для нейтрализации
избытка щелочи прибавляют 0,4 мл этилформиата, перемешивают и допол-
нительно термостатируют раствор в течение 6 мин при 37°С. После этого
гидролизат осторожно упаривают под вакуумом. Затем 5 мл воды взбал-
тывают в течение 5 мин с двойным объемом смеси иэобутанол - хлоро-
76
форм (1:2) в делительной воронке, после отстаивания 1 мл верхнего вод-
ного слоя и 2 мл нижнего слоя добавляют к гидролизату. Колбочку встря-
хивают и слегка нагревают до полного растворения продуктов гидролиза и
щелочеустойчивых фосфолипидов. Эмульсию количественно переносят в
центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при частоте
вращения 4000 об/мин.
После центрифугирования верхний слой осторожно отбирают пипеткой
и хроматографируют нисходящим способом на бумаге в системе раство-
рителей (см. разд. 3.2.5), используя в качестве свидетелей глицерофос-
фат и деацилированные индивидуальные фосфатидилхолин, фосфатидил-
серин и фосфатидилэтаноламин яичного желтка. Монофосфоииозигиды и
фосфатидные кислоты идентифицируют по значениям продуктов их деа-
цилирования, приведенным в литературе (70, 71]. Для обнаружения фос-
форных эфиров на параллельных хроматограммах используют реактив
Драгендорфа, нингидрин, перйодат калия-бензидин и реагент на фосфат.
4.2.2. ЖЕСТКИЙ КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ
Для более полного структурного анализа индивидуальных фосфоли-
пидов проводят жесткий кислотный гидролиз с последующей идентифика-
цией образовавшихся водорастворимых продуктов методами хромато-
графии. Наиболее простой является методика кислотного гидролиза, опи-
санная в работе [345].
Методика заключается в следующем. Образец фосфолипидов в коли-
честве 20—50 мг нагревают с 3 мл 6 н. раствора соляной кислоты при тем-
пературе 80° С в течение 48 ч в запаянной ампуле. Жирные кислоты отделя-
ют фильтрацией с последующим экстрагированием фильтрата диэтиловым
»фиром, соляную кислоту выпаривают под вакуумом. Полученные осад-
ки растворяют в воде и хроматографируют на бумаге (см. разд. 3.2.5).
4.2.3. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ
Этот метод имеет большое значение в структурном анализе фосфоли-
пидов, так как фосфолипазы А2, А2, В, С и D, проявляя специфическое
действие на молекулу, отщепляют определенный фрагмент, в результате
чего образуются продукты реакции, идентификация которых позволяет
определить структуру фосфолипида. На рис. 4.1 и 4.2 приведены для приме-
ра схемы воздействия фосфолипаз на фосфатидилхолин.
Стереоспецифичность указанных ферментов позволяет также устано-
нить конфигурацию липидов. В табл. 4.1 приведены продукты гидролиза
p.i 1 личных фосфолипидов [22, 96, 282]. При исследовании структуры фос-
<|юлипидов чаще всего применяют фосфолипазы А 2, В, Си D.
Фосфолипаза А2 [21, 99] специфически гидролизует сложноэфирную
। вязь во втором положении глицерофосфолипидов, в результате чего обра-
зуются жирные кислоты и лизофосфолипиды [65,99].
Ниже приведена методика ферментативного гидролиза фосфолипазой
4 1 на примере фосфатидилхолина [244]. В качестве буфера применяют
водные растворы тригидроксимотиламинометаиа (трис). Для приготов-
77
но—эн
Лиаофосфатпднлхилин
Рис. 4.1. Схема воздействия фосфолипаз A j, А 2 и В на фосфатидил холин
о
о
II Ф
—Hi )—Р—О— СН2—CHjN (CH j>3
и,с—о-
О
Фосфольпса» С
' "2 ‘
О®
НС—о
r2
Н2С-ОН
а,-р-дпглпцерид
н2с-
Ф
•о—CH 2—CH—N( CH,)
О
Н2
©
—ни—СП2—СН2—N (CH ,)
11><>сфо.Г И ПII3 л Д
НС—О—C—R,
О
6s
Фосфатидная
кислота
Рис. 4.2 Схема воздействия фосфолипаз С и D на фосфатидилхэяик
пения раствора буфера с pH 7,45 используют смеси 0,1 М раствора триса и
0,1 и. раствора HCI. Буфер с pH 10,15 соответствует 0,1 М раствору триса-
Методика заключается в следующем. Раствор (152 mi фосфатидии-
холинов в 30 мл диэтипового эфира) вносят в двухгорлую колбу вмес-
тимостью 50 мл, прибавляют 2,7 мг яда змеи Crotalus adamantheus, раство-
ренного в 0,4 мл раствора буфера; колбу соединяют с обратным холодиль-
ником. Содержимое колбы тщательно перемешивают с помощью мешалки.
Реакционную смесь выдерживают в течение 4 ч при комнатной т емнерату ре,
причем перемешивают содержимое колбы через каждые 30 мин, По истече
нии указанного времени раствор, содержащий большую часть свободных
жирных кислот, осторожно декантируют. Промывают два раза (каждый раз
по 5 мл диэтилового эфира) осадок в реакционной колбе, содержащий в
основном лизофосфатидилхолины, частично жирные кислоты и, возможно,
неизменные фосфатидилхолины. растворяют в 2-3 мл метанола, отделяют
от осадка фильтрацией или центрифугированием, упаривают фильтрат до
суха в токе азота под вакуумом, растворяют остаток в 5 мл хчорсформаи
разделяют продукты гидролиза хроматографией на колонке (рис. 4.3).
Объединенные эфирные вытяжки три раза промывают (но 5 мп воды),
сушат нал Na2SO4, упаривают в токе азота и получают таким образом
фракцию жирных кислот.
79
Л
Е
X
X
ко
са
Н
*
£
I
о
3
5
X

&
с
Продукты ферментативного гидролиза глицерофосфолипидов
СО
3
3
е-
g
X
с;
QQ
л
8
са
8
05
3
я
=
. g..
о о и о
Е
X
X
S
се
К
о
S
5
й
с
х
л
3
Е
X
«»
«5
Q
с
X
11 ##
о
е
е
о
е
О
е
О
е
X
ЕСЕ
_ S S §
Я §• -В*
о и и и
Е
X
Q
са
я
1Й
03
Я
Е
X
П
с
80
Для разделения продуктов гидролиза в стеклянную колонку диамет-
ром 15 мм и высотой 450 мм вносят 4 г силикагеля, суспендированного в
20 мл хлороформа, промывают колонку еше 10 мл этого растворителя и
разделяют продукты гидролиза, для чего элюируют жирные кислоты 30 мл
смеси хлороформ—метанол (9:1); непрореагировавшие фосфагидилхоли-
ны вымывают 30 мл смеси тех же растворителей в соотношении 1:1, лизо-
фоефатидилхолины - 50 мл метанола [244],
Жирные кислоты, выделенные колоночной хроматографией, объеди-
няют с жирными кислотами, выделенными из эфирных растворов. Жирные
кислоты из лкзофосфатидилхолинов высвобождают щелочным гидроли-
гм
р. » Л/г)
Рис. 4.3. Схема разделения продуктов ферментативного гидролиза фосфатидилхоли-
нон фосфолипазой А ?:
ФХ — фосфатидилхолины: пизо-ФХ; ЖК - жирные кислоты: а=ЖК - жирные кисло-
ты a-положения; 0=ЖК — жирные кислоты 3-положения; ТСХ - качественная хрома-
тография в тонком слое силикагеля, система хлороформ - метанол - вода (65:25 4)
6 - 727 8J
зом (см- разд. 3.2.2). Обе фракции жирных кислот метилируют и анализи-
руют газожидкостной хроматографией
Фосфолипаза В наряду с лизофосфолипазой содержит фосфолипазы
А, и Она эффективно катализирует гидролиз обеих сложноэфирных
связей фосфатидилхолина и фосфатидилэтансламина, в результате которо-
го образуются свободные жирные кислоты и соответствующий водораст-
воримый глицерофосфорный эфир (см. табл. 4.1) ,
Методика разделения заключается в следующем. К 0,4 мл суспензии,
содержащей 2,5—2,8 мкмоль фосфолипида в 0,5 М буферном растворе аце-
тата (pH 4,0), добавляют 0,4 мл препарата фермента [244] из Penicilhum
notatum, полученного диализом против дистиллированной воды за 2 ч до
использования, встряхивают реакционную смесь и выдерживают ее в тече-
ние 2 ч при 37°С Охлажденную смесь разбавляют 2,0 мл метанола и 1.0 мл
хлороформа, смешивают в течение 1 мин и снова разбавляют 1,0 мл хло-
роформа и 1,0 мл воды. Фазы разделяют центрифугированием, во дно-мета
вольную фазу упаривают до небольшого объема в токе азота. Водораствори-
мые продукты идентифицируют хроматографией на бумаге ватман № 1 ив
соответствующих системах растворителей (см. разд. 3.25). Свободные жир-
ные кислоты, находящиеся в хлороформной фазе, метилируют и анали-
зируют ГЖХ.
Фосфолипаза С катилизирует гидролиз диглицеридфосфатидных связей
в глицерофосфолилидах- В результате ферментативного гидролиза освобож-
даются водорастворимые фосфорилаты, перечисленные в габл- 41,
Источником фосфолипазы С является культура Clostridium welshia или
CLperfrmgens фильтрованного токсина типа А или чистая фосфолипаза С
Cl.petfringens [70].
Методика [367] заключается в следующем. К раствору 5 мл (6-
7 мкмоль) глицерофосфолипида в 1 мл смеси этиловый эфир-этанол
(98:2) добавляют 0,3 мл неочищенною ферментного препарата из С1.
perfringens в 0,1 М трис-буфере (pH 7,2) с содержанием и.02 моль/л СаС12.
Смесь встряхивают, выдерживают при комнатной температуре в течение
3 ч, упаривают в токе азота, остаток растворяют в 2,0 мл метанола и 2,0 мл -
хлороформа, добавляют 1,8 мл воды, смешивают и центрифугируют Про-
дукты, растворимые в хлороформе, разделяют методом ТСХ в системе хло-
роформ-этиловый эфир (9:1) и идентифицируют 1,2-диацилглицерины. Во-
дорастворимые продукты гидролиза идентифицируют хроматографией на
бумаге в смесях фенол-воца (100:38) или бутанол-уксусная кислота-во-
да (5:3 1) (см. разд. 3.2.5)
Фосфолипаза D катализирует гидролиз глицерофосфолилидов в резуль-
тате которого образуется фосфатидная кислота и соответствующие азотис-
тые основания или другие фрагменты.
Методика [314] заключается в следующем. К суспензии 5—6 мкмоль
глицерофосфолипидов в 0,5 мл 0,2 М буферного раствора ацетата добавля-
ют 0,1 мл 1 М раствора хлористого кальция, 0,4 мл раствора фермента (не-
очищенный препарат капустных листьев, 20 мг/мл) [218] и 0,4 мл диэти-
лового эфира. Смесь энергично встряхивают и выдерживают при комнат-
ной температуре в течение 3—4 ч. Большую часть эфира упаривают в токе
азота, добавляют еще 1,25 мл хлороформа и 1,25 мл воды, смешивают и за-
82
гем разделяю! центрифугированием. Растворимые в хлороформе продукты
разделяют методом хроматографии на бумаге, кропиганной кремниевой
кислотой, или тонкослойной хроматографией и идентифицируют фосфатид-
ную кислоту. Используя хроматографию на бумаге ватман N° 1 в соответст-
вующем растворителе, идентифицируют свободные основания, глицерин,
глицерофосфаты и т, д. (см. разд. 3.2.5).
4.3. СПЕКТРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Спектральные методы анализа, такие, как ИК-, УФ-, ЯМР- и масс-
спектрометрия являются эффективными при идентификации фосфолипи-
дов и в настоящее время широко применяются при изучении структурных
особенностей этих соединений.
4.3.1. УФ-СПЕКТРОСКОПИЯ (92,379]
Поглощение в улирафиилеювой области спектра обусловлено воз-
буждением валентных электронов и переходом их на более высокие энерге-
тические уровни. Функциональные группы, содержащие агомы с неподе-
ленной парой электронов (карбонильные группы, нитрогруппы), а также
двойные и тройные связи, сопряженные двойные связи, сильно поглощают
в ультрафиолетовой области спектра. Максимумы поглощения соответ
ствуют характеристическим длинам волн Х1Пах и определяют коэффициен-
ты молярной экстинкции етах.
Образец фосфолипидов сушат под вакуумом при температуре С45°С,
взвешивают и готовят раствор известной концентрации (обычно 1%-ной)
в гекс'аие или в свежеперег нанном 95%-ном этаноле [96, 379]. С помощью
двухлучевого записывающего спектрофотометра записывают спектр (180-
400 нм) вещества (~-3 мл), помещенного в кварцевые кюветы (толщиной
I ~ 1,0 см), по отношению к растворителю, помещенному в стандартную
кювету. В табл. 4.2 приведены некоторые полосы поглощения в Уф-об-
Таблица 4.2
Максимальное поглощение A.mtx некоторых хромофорных групп
в УФ-спектрах [257, 2881
Хромофорные группы ^•maxr нм Растворитель
Ненасыщенные углеводороды
-С = С - 177 1 сП1ал
-с-с- 178 *»
196 »»
_ С = С-С = с - 217 Гексан
-С = С-С = С-С = С- 247 Хлороформ
- <С=ОП- 217+30 (п—2) Гексан
Карбонильные соединения
о
- С? 290

">С = О 275 Зганол
83
пасти спектра, по которым можно идентифицировать фосфолипиды [96] .
Следует заметить, что значение Хтах для того или иного соединения может
меняться в зависимости от применяемого растворителя. В большей степени
это относится к полярным соединениям и в меньшей - к неполярным. Если
системы содержат сопряженные двойные связи, на величину Хтах влияет
число двойных связей, алкильных и циклоалкильных заместителей.
4.3.2. ИК-СПЕКТРОСКОПИЯ
Поглощение веществом инфракрасного излучения вызывает переход
между колебательными уровнями основного электронного состояния [92,
257] . Существуют два основных вида молекулярных колебаний: валент-
ные и деформационные. Частота поглощенного излучения равна характе-
ристической частоте валентных и деформационных колебаний соответст-
вующей связи. Таким образом, при облучении молекулы ИК-светом будут
поглощаться только кванты, частоты которых соответствуют частотам ва-
лентных или деформационных колебаний связей этой молекулы.
ИК-спектры фосфолипидов снимают в виде пленки (предварительно
растворив образец в вазелиновом масле) на пластинке из материала, про-
зрачного в исследуемой области (например, КВг, NaCl, CsI, КО).Необходи-
мо помнить, что вазелиновое масло сильно поглощает при частоте 3000-
2800 см'1, 1460 и 1380 см"1; ИК-спектры фосфолипидов могут быть
сняты и в виде растворов [92, 193] . Для этого готовят 1-2%-ный раствор
исследуемого образца фосфолипида (10-20 мг/мл) в четыреххлористом
углероде и помещают в сдвоенные кюветы из NaCl толщиной 0,2 мм.
В табл. 4.3 приведены некоторые характеристические частоты погло-
щения в ИК-спектрах, по которым можно идентифицировать фосфолипи-
Рис. 4.4. ИК-спектры фосфолипидов, вы-
деленных иэ подсолнечных масел:
а - фосфатидилхолины; б - фосфатидил-
этанол амины; в - фосфатидилсерины
84
ды [13, 116, 193, 263]. ИК-спектры некоторых фосфолипидов приведены
на рис. 4.4. Необходимо помнить, что на частоту поглощения, соответст-
вующую фосфатным группам, влияет ионная форма фосфолипидов, внут-
римолекулярные и межмолекулярные взаимодействия [263].
Таблица 4.3
Характеристика полос поглощения в ИК-спектрах функциональных групп
фосфолипидов, растворенных в четыреххлористом углероде,
или снятых в пленке
Функциональные группы Тип колебаний Частота, см"1 Интенсивность
-СН3 СН, валентные 2962 и 2872±10 Сильная
СН, деформационные (симм.) 1375*10 Средняя
(асимм.) 1450±20
-СН2 СН, валентные 2926 и 2853110 Сильная
СН, деформационные 1465*10 Средняя
(СН2)4, скелетные 750-720
-с=с С=С, валентные 1680-1620 Переменная
несопряженные С=С, валентные 1600*20 »»
-сн=сн- сопряженные СН, валентные 3040-3010 Средняя
(транс) СН, внеплоскостные 970-960 Сильная
деформационные СН, плоскостные 1310-1295 Сильная-
-СН=СН- деформационные Слабая
СН, внеплоскостные 690 Средняя
(цис) деформационные С=О, валентные 1740-1750 Сильная
О-Н, деформационные 1420 Средняя
^ОН С-О, валентные 1200 »»
СОО 1610-1620 Сильная
Сложные С=О, валентные 1750-1730
эфиры RCO-CR насыщенные С=О, валентные 1730-1717
-nh2 а, 0-ненасыщенные NH, валентные 3500-3300 Средняя
NH, деформационные (две полосы) 1650-1590 Сильная-
-NH NH, валентные 3500-3300 средняя Средняя
NH, деформационные (одна полоса) 1650-1550 Очень слабая
Фосфаты Р=О, валентные 1300-1200 Сильная
R-O-PO-O" (свободная) Р=О, валентные 1200-1150 Очень сильная
О" (связанная) Р-О-С 1070-1050 То же
Р-О" 1110-1090 Сильная
Р-ОН 1040-1000
Z0H 9 2700-2560 Слабая
R—О—Р = О -Р-ОН 1240-1180 Сильная
'ЧЮН 1 960
85
4.3.3. СПЕКТРОСКОПИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО
РЕЗОНАНСА (ЯМР)
Метод ЯМР основан на индукции резонанса в определенных атомных
ядрах, чаще всего в протонах, при облучении их радиоволнами в сильном
магнитном поле [92, 257] . Положение полос поглощения или химических
сдвигов измеряется относительно произвольно взятого стандарта, обычно
Рис. 4.5. ЯМР-спектры фосфолипидов:
а - фосфа ти ди л холины; б - фосфатида лэтано ламины; в - фосфатидилсерины
86
тетраметилсилана (ТМС), и выражается в миллионных долях напряжен-
ности магнитного поля (млн. доли или млн.-1):
g =___________АД 106_________
частота магнитного поля, МГц ’
где Дй- разность величин частот поглощения исследуемого образца и стандарта, Гц.
Если за стандарт принимать тетраметилсилан, то значение его полосы
поглощения удобно принять за 10 и выразить поглощение исследуемого
образца значением т (мд.), причем т = 10—6.
Образец готовят так же, как и при получении ИК-спектра. Снимают
ЯМР-спектры концентрированных растворов индивидуальных групп фосфо-
липидов (35-50 мг/мл). В качестве растворителей в ЯМР-спектре при-
меняют апротонные растворители: четыреххлористый углерод, дейтеро-
хлороформ, сероуглерод или дейтериевая вода.
В качестве внутреннего стандарта к исследуемому раствору добавляют
5-10% тетраметилсилана. Минимальное количество раствора, необходимое
для получения спектра, составляет 0,3-1,0 мл; в связи с этим для снятия
ЯМР-спектра требуется как минимум 10-25 мг фосфолипидов.
Ниже приведены принципиальные структурные формулы фосфатидил-
этаноламинов (1), фосфатидилхолинов (2) и фосфатидилсеринов (3).
(е) (в) (а) (с) (в) (а)
(d) СН2ОСОСН2 (СН2) 5 СН2 СН=СНСН2 (СН2) 6СН3
(0 СНОСОСН2(СН2)5СН2СН=СНСН2(СН2)6СНз (I)
(h) СН2ОРО2 - осн2 - сн2 - ьГн3
(h) (1) 0)
87
СН2 -ОССКСНПиСНз
СНОСО(СН2)1«СНз (2)
СН2ОРО2 - OCH2CH2N+(CH3)3 H2O
CHjOCOR,
CHOCOR2 (3)
<!:н2 - opo2 - осн2 - ch - coo'
N*H3
Для примера в структурной формуле фосфатидилэтаноламина (1)
буквами обозначены протоны, обусловливающие появление пиков в ЯМР-
спектре. Ряд характерных ЯМР-спектров фосфолипидов показан на
рис. 4.5,а, б, в [70, 92, 340, 357]. Для проведения количественного анали-
за этим методом площади пиков суммируют; при этом полученная вели-
чина пропорциональна суммарному числу протонов в молекуле. Число про-
тонов в любой данной функциональной группе выражают отношением пло-
щади данного пика или группы пиков к суммарной площади.
Комбинированное применение ИК- и ЯМР- спектроскопии является наи-
более эффективным методом исследования структуры фосфолипидов.
Ниже приведен перечень сигналов протонного резонанса, по которым
можно идентифицировать основные группы фосфолипидов [76, 92, 267;
297, 298, 340].
Соединение или группа
СН3 (о)
СН2 (/>)
-СН2СН= (d)
-СН2СО- (е)
-СН=СН- (с)
CH2NH2(i)
—CH2N+ (СНз) 3
-N+(CH3)3
-СН2ОСО (d)
-СН2ОРО- (й)
-СНОСО- (/)
-+NH3(/)
Значение химического
сдвига 6, млн. доли
9,00-9,12
8,7-8,74
7,95-8,08
7,66-7,74
4.60-4,63
6,70-6,85
6,0-6,18
6,54-6,77
5,87-5,99
5,64-5,85
4,78-4,80
1,50—1,67
4.3.4. МАСС-СПЕКТРОСКОПИЯ
Масс-спектроскопию применяют для получения окончательных дан-
ных, необходимых для идентификации фосфолипидов.
Масс-спектр любого соединения состоит из характерных пиков, соот-
ветствующих молекулярным фрагментам с разными соотношениями масс
к заряду электрона (т/е), образовавшимися в результате бомбардировки
вещества электронами в ионизационной камере и (или) в результате ’’кре-
кинга” во время испарения вещества [22, 92, 375 ] .
Методика приготовления образца зависит от способа его введения в
масс-спектрометр. Существуют 3 способа введения образца:
а) с помощью делителя потока, установленного на выходе газожид-
88

100
Рис. 4,7 Масс-спектры продуктов пиролиза:
а - фосфатидилхолина; б - 1,3-ди пальмитина
костного хроматографа, который направляет часть потока газа-носителя
с веществом прямо в масс-спектрометр [92] . Этот метод применяется
только при работе с приборами, объединяющими масс-спектрометр и га-
зожидкостный хроматограф. В этом случае образец, как только он элюи-
руется с колонки хроматографа, автоматически вводится в спект-
рометр;
б) непосредственное введение в спектрометр: несколько миллилитров
(3—5) концентрированного 15—20%-ного раствора образца в летучем инерт-
ном растворителе, например гексане, диэтиловом эфире (свободном от пе-
90
(KO f 128)
367
(4-18)
li . 550
*1 - , -Ц—1 J—*•—t------------i--------U-------‘ J
320 360 500 550 № 520 560 m/e
a
(RCO+128)
367
1(4-18)
550
----т--------r-*-i-*—1-<
280 320 360 500 550 580 520 560m/e
s
Продолжение рис. 4.7.
рекисей) или бензоле вводят микропипеткой в стеклянную пробирку с
внутренним диаметром 2 мм или в капилляр и упаривают почти досуха в
токе азота. Образец помешают в ампулу, которую вводят в вакуумную
систему масс-спектрометра. Систему вакуумируют для удаления следов
растворителя Вводят ампулу через вакуумный шлюз в ионный источник.
Такая методика применяется при работе с веществами, обладающими от-
носительно низкой летучестью; масса образца должна составлять 0,1—
0,2 мг [22];
в) раствор образца (0,2—1 мг) в одном из перечисленных выше раст-
91
Phi 4.К Фрагментация о-ет тарой" глицерила -фо\ф>риmолиьл под электронным ударом
верителей помещают в круглодонную колбу объемом 10 мл со стандарт-
ным шлифом и упариваю г в тике азота, колбу соединяют с внешним вы-
водом масс-спектрометра В течение определенного времени снижают дав-
ление и постепенно нагревают колбу с образцом (до 300°С и выше). В
результате испаряющийся образец через тонкий капиллярный накопитель
поступает в масс-спектрометр.
Масс-спектрометрический метод для анализа продуктов распада син-
тетических фосфолипидов после пиролизной газовой хроматографии опи-
сан впервые в работе [352] (рис. 4.6) Данные масс-спектрометрии для
анализа синтет ических фосфатидил холинов получены в работе [320].
Были использованы масс-спектрометры с высоким разрешением масс;
прямой ввод пробы при температуре источника 250° С и потенциале иони-
зации 70 ev. Были идентифицированы ионы, связанные с углеводородными
цепями, эфирами глицерина, фосфорилхолина. Молекулярный ион был
предположительно идентифицирован только в случае диолеоилглицерил-
фосфорилхолина. На рис. 4.7 приведена схема фрагментации синтетическо-
го фосфатидил холина.
Масс-спектр лизофосфатидилхилинив, выделенных из подсолнечных
масел, приведен в литературе [246, 247, 321]. Условия опыта: температу-
ра источника 140°С; потенциал ионизации 40 ev (рис. 4.8).
Молекула лизофосфатидилхолина имеет много гетероатомов, способ-
ных инициировать распад молекулы при электронном ударе, однако в этом
соединении имеется четвертичный агом азота, который делает молекулу
термически неустойчивой, поэтому сразу же после ввода пробы она под-
вергается распаду с преимущественным отщеплением от четвертичного азо-
та алкила и аниона [275] в виде молекулы СН3ОН. Оставшаяся часть моле-
кулы лизофосфатидилхолина после электронного удара превращается в
ион Ш. На рис. 4.9 представлена фрагментация основного компонента
смеси а-стеароил-глицерил-о -фосфорилхолина. Приводим интерпретацию
масс-спектров на примере лизофосфатидилхолина,
В масс-спектре происхождение основного пика IV с т/е 58 (100%) •бъясняегся о-
разрыном аминоспиртовой часта иона III.
Фрагмент V с т/е 71 (62,5%) отождествлен также с амин содержащей частью
молекул за счет 0-разрыва с миграцией атома водорода к ближайшему кислороду
фосфорной кислоты. Этот фрагмент может соответствовать составу CjHji (22, 320]
Ионы, связанные с жирнокислотными радикалами и их эфирами с глицерином,
представлены целой серией пиков в результате отрыва от исходного иона III фосфо-
рилхолина с миграцией одного атома водорода образуется ион VI с т/е 340 (5,6%),
стабилизирующийся в кетоформе
'сн2ососпнй
С-ОН
I
_сн2
Ион с т/е 327 (6,6%) отождествлен со структурой XII
НОТ=СН-СН2 -СО-СпНЭ5.
СН2ОСОС 1?Нз5
с=о
I
сн3
Наличие этого фрагмента подтверждает, что исследуемый образец - тазофосфа-
гидилхолин, содержащий свободную вторичную спиртовую группу.
Ион-радикал VIII с т/е 297 (9,3%) имеет структуру
93
(СН2-О-СО-С17Н35] **•
Это подтверждает то, что жирная кислота этерифицирована с а-С-атомом
глицерина.
Молекулярный ион стеариновой кислоты Villa соответствует т/е 284 (12,5%),
фрагмент ацила X - т/е 267 (31,0%) и ион-радикал IX - т/е 239 (12,5%).
В полученном масс-спектре наблюдаются интенсивные пики VII с т/е 98 (50%) и
XI - с т/е ,129 (46,9%). Такие фрагменты были обнаружены в работе (3201 при
измерении спектров высокого разрешения для одно- и разнокислотных фосфатидилхо-
линов; для иона с т/е 98 найден состав С^ИщО, этот ион имеет циклоалкеновую
структуру
Н2С- (СН3)П
Н2С СН
VII,т/е 98, п = 2
Данный пик соответствует молекулярному иону ортофосфорной кислоты
О
НО - Р - ОН
6н
т/е 98
Ион XI с т/е 129 соответствует эмпирической формуле C7Hi3O3 (320). Мож-
но предположить, что он имеет структуру радикального иона, который стабилизиру-
ется ионом XI,
В масс-спектре лизофосфатидилхолинов интенсивный фрагмент с т/е 169
(56,2%) и пик с т/е 199 (3,8%) аналогичны тем, которые наблюдали в работе [ 320]
при измерении масс с высоким разрешением и идентифицировали как фосфорсодер-
жащие фрагменты.
94
CH2-0-C0-R
297 *-|-
носн
X-CtgHji
Продолжение рис. 4.9.
34)
-------г-
350 350
»5
-I----------J---1
*00 150 т/е
Для пика с т/е 169, соответствующего эмпирической формуле С4НЮО5Р, пред-
ложена структура [ 320)
СН-ОН
I ♦ ,О-СН2СН2-,
СН2 - О - Р - ОН
4 ОН
которая также стабилизируется циклом, отраженным ионом XIV,
т/е 159
Этот фрагмент позволяет предположить, что фосфорная кислота этерифицирует
крайний углеродный атом глицериновой часта молекулы как в фосфатадилхолинах,
так и в лиэофосфатидилхолинах. Отмечен также менее интенсивный ион XIII с т/е
199 (3,8%), который может быть подобен фрагменту, обнаруженному в работе (320)
для синтетических фосфатидилхолинов. Этот фрагмент с импирической формулой
CjHnOe Р согласуется со структурой бирадикального нона, стабилизирующегося
ионной формой XIII,
т/е 199
При отщеплении аминсодержащего фрагмента от исходного иона III возможно
образование иона с т/е 437, но в спектре обнаружен ион с т/е 435 (3,6%); этот фраг-
мент имел максимальную массу, зарегистрированную прибором в условиях опыта (ве-
роятно, в этом ионе была потеря двух атомов водорода в процессе перегруппировок).
Кроме пиков, общих для структур 1 и II, идентифицированы ионы, связанные
95
С наличием радикала ClsH3i (И) с т/е 313 (5,0%), 299 (3,7%), 269 (3,8%), 256
(4,4%), 239 (12.5%) и 210 (16,6%); фрагмент со стру ктурой
НО’=СН - СН2 - О - СО - R
характерен для лизофосфатидип*олинов содержащих свободную вторичную
спиртовую группу у 0-С-атома глицериновой молекулы
5. СОСТАВ И СТРУКТУРА ФОСФОЛИПИДОВ
РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ
Основными масличными культурами, используемыми в мировом про-
изводсгве для получения растительных масел, являются соя, подсолнеч-
ник, арахис, хлопчатник, рапс, кунжут, клещевина, лен и некоторые др
В СССР растительные масла в основном получают из семян подсолнечника,
хлопчатника, сои, рапса, клешевины и льна.
В связи с этим в данном разделе и последующих разделах книги при-
ведены сведения о фосфолипидах перечисленных масличных семян и ма-
сел, извлекаемых из них.
При переработке масличных семян прессовым или экстракционным
способом под влиянием тепловых воздействий, влаги или растворителя
фосфолипиды переходят в масло. Содержание фосфолипидов в извлекае-
мых .маслах колеблется в широких пределах и зависит прежде всего от
общего количества фосфолипидов в семенах.
Ниже приведены данные по содержанию фосфолипидов в масличных
семенах в % от их массы [58. 208, 254, 255, 283] .
Подсолнечник
Соя
Хлопчатник
Рапс
Лен
Клещевина
0,3-0,8
1,6-2,9
1,0-1,8
0.20-0,80
0,4-0,75
0,25-0,30
В вырабатываемых промышленностью растительных маслах содер-
жание фосфолипидов зависит не только от общего содержания их в маслич-
ных семенах, степени созревания и условий хранения, но и от способов и
технологических режимов извлечения маспа. Так, содержание фосфолипи-
дов колеблется, %: в подсолнечном масле от 0,52 до 1,15, соевом от 1,07—
3,90, хлопковом от 1,06 до 1,21, льняном от i"i,47 до 1,25, касторовом
масле до 0,1, а в рапсовом от 0 30 до 0,95 [ 193, 240, 362] -
Фосфолипидный комплекс растительных масел имеет очень сложный
состав. В табл, 5 1 и 5.2 приведен групповой состав фосфолипидов, выде-
ленных из нерафинированных растительных масел колоночной хромато-
графией или метолом диализа.
Расхождения в данных различных авторов по составу фосфолипидов,
по-видимому, связаны как с природой исследуемых масел, так и с приняты-
ми методами выделения и исследования фосфолипидов.
Для получения самостоятельного продукта - фосфатидного концент
рата выделение фосфолипидов из растительных масел осуществляют путем
гидратации фосфолипидов водой, которая, однако, не обеспечивает доста-
96
«п
я
и
X
с?
ю
я
н
Состав фосфолипидов подсолнечных, соевых и хлопковых масел
7-727
сч
Л
я
X
я
<0
й
Состав фосфолипидов льняных, рапсовых и костровых масел
in I
e-
I I
I I
I I
точного отделения фосфорсодержащих веществ. В связи с этим в последнее
время фосфолипиды растительных масел принято подразделять на гидра-
тируемые фосфолипиды, которые выводятся из масла при гидратации во-
дой, и так называемые негидратируемые, остающиеся в масле после осуще-
ствления процесса гидратации. Работы последних лет показывают, что де-
ление фосфолипидов на гидратируемые и негидратируемые является услов-
ным. Однако в нашей работе использован термин ’’негидратируемые фос-
фолипиды”, так как он принят и исследователями, и производственниками.
5.1. ГИДРАТИРУЕМЫЕ ФОСФОЛИПИДЫ, ИХ СОСТАВ
И СТРУКТУРА
Групповой состав гидратируемых фосфолипидов, выделенных из не-
которых растительных масел, приведен в табл 5.3, а общая характеристика
гидратируемых фосфолипидов подсолнечного, соевого и хлопкового ма-
сел — в табл. 5.4.
В составе гидратируемых фосфолипидов обнаружены свободные и
связанные углеводы, а также неомыляемые липиды Наличие свободных
углеводов в гидратируемых фосфолипидах объясняется тем, что отдель-
ные группы фосфолипидов находятся с углеводами не только в химиче-
ской связи, но и в виде смешанных ассоциатов, образованных в результате
возникновения межмолекулярных водородных связей между группами
Р=О, Р-ОН, NH2-молекул фосфолипидов и С=О, С-ОН-молекул уг-
леводов.
Э процессе отделения фосфолипидов от нейтральных липидов методом
диализа против гексана ассоциаты не разрушаются, однако при последую-
щей экстракции углеводов полярным растворителем (водой) происходит
разрыв водородных связей, в результате чего углеводы легко экстраги-
руются [114].
В табл. 5.5 приведены средние данные по содержанию отдельных групп
неомыляемых липидов в гидратируемых фосфолипидах [ 118,156].
Высокое содержание золы (см. табл. 5.4) свидетельствует о наличии
ионов металлов в фосфолипидах.
Минеральный состав гидратируемых фосфолипидов представлен метал-
лами К*,Na+, Mg+2, Са*2, Си , Fe*2, Fe+3 (табл 5.6) [113,118].
Общие свойства фосфолипидов обусловлены природой жирных кислот,
входящих в их состав. В табл. 5.7 приведен жирнокислотный состав гидра-
тируемых фосфолипидов подсолнечных, соевых, льняных и хлопковых ма-
сел [118, 125, 161, 210, 244], а в табл. 5.8 - средние данные по жирно-
кислотному составу отдельных групп гидратируемых фосфолипидов,
выделенных из подсолнечного и соевого масел [118].
Жирнокислотный состав подсолнечных и соевых фосфолипидов отли-
чается от жирнокислотного состава триацилглицеринов масел более высо-
ким содержанием насыщенных кислот.
Необходимо отметить, что увеличение насыщенных кислот в фосфоли-
пидах обусловлено значительным повышением пальмитиновой кислоты.
Фосфолипиды соевых масел содержат больше насыщенных кислот, чем фос-
фолипиды подсолнечных масел.
99
Состав гидратируемых фосфолипидов, выделенных из растительных масел
Таблица 5.3
Фосфолипиды Масла
подсолнечное соевое
1 2 3 4 5 6 7
Неидентифицированные - - _ 1,0-2,0 1610 5 117 Фосфолипиды, дающие реакцию на N и — 10,0-12,0 - _ _ инозитолы Фосфатидилхолины | 27,0-30,0 29 0_30 Д 24 0-29 0 1 26-5±3>8 24 181 Лизофосфатидилхолины ’ J 1,0-2,0 J j- _ 24,] Фосфатидилинозитолы 13,0 28,0-35,0 5,0-6,0 3,0-5,0 _ 1 7,13 Фосфатидилсерины 14,0 2,0-4,0 11,5-14,5 2 ,6±2,4j ’ - Лизофосфатидилсерины - - _ 15,0-16,0 J _ 15,97^ Фосфатидилэтаноламины 24,0 10,0-13,0 19,5-22,5 „ 1 19 8110 1 Лизофосфатидилэтаноламины - _ _ 18,0- 0,0 J _ 17,88 J Фосфатидные кислоты 7,0 2,0-3,0 6,0-10,0 3,0-5,0 28,512,5 5,38 Полифисфатидные кислоты 10,0 - 21 0-25 о\ 9,0-11,0 - 11,14 Дифосфатидилглицерины 16,0 - ’ ’ J 18,0-20,0 - 17,15
Неидентифицированные' 11,5-9,3 1,0-5,0 5,0 16,0 5,0-7,0 11,0-13,0
Фосфолипиды, дающие реакцию на N и — — —
инозитол 21,5-24,8 1,0-4,0
Фосфатидилхолины Лизофосфатидилхолины 23,0-25,7] 30,0-35,0 20,0 11,0 22,0 32,0-38,0 4,0-5,0
Фосфатидилинозитолы 37,3-36,4 17,0-20,0 8,0 18,0 5,9-9,0 3,0-6,0
Фосфатидилсерины 5,0-8,0 — — 12,0-14,0 16,4—17,6
Лизофосфатидилсерины 28,2-28,6 — — —
Фосфатидилэтаноламины 27,0-29,0 16,0 15,0 23,0-25,0 25,9-29,8
Лизофосфатидилэтаноламины — — — —
Фосфатидные кислоты - 11,0-12,0 } — — 7,0-14,0 • 11,0-15,0
Полифосфатидные кислоты — J — -
Дифосфатидилглицерины — — —
Фосфогликолипиды — — 11,0 9,0 ==
Нейтральные липиды — — 29,0 20,0 — —
Примечание. В графах 2,5, 7,9,11,12 - данные, взятые соответственно из литературы 11251, [210J, 1156], 1161], I 327],
] 354]; в графах 3,6 - данные МФ ВНИИЖа; в графах 4,10, 13, 14 - данные, полученные авторами.
Таблица 5.4
Общая характеристика гидратируемых фосфолипидов растительных масел
Показатели Масла
подсолнечные соевые хлопковые
1 2 3 4
Кислотное число, мг КОН/г Содержание, % 18,49-21,73 16,72-22,16 9,78-15,42
ЗОЛЫ 4,08-4,92 4,75-5,08 1,48-3,17
азота 0,96-1,15 1,15-1,20 1,12-1,20
фосфора 3,26-3,48 3,95-4,08 3,57-3,79
углеводов (общее) в том числе 5,89-6,67 8,05-10,38 3,45-4.08
свободных 5,50-6,15 7,35-9,28 1,28-1,51
связанных 0,39-0,52 0,70-1,10 2,17-2,57
неомыляемых липидов 1,85-2,30 2,25-2,49 4,29-4,83
госсипола — — 2,17-3,08
Примечание. В графах 2, 3 — данные, взятые соответственно из литературы
I 125), [ 210); в графе 4 - данные, полученные авторами.
Таблица 5.5
Содержание (в %) неомыляемых липидов,
выделенных из гидратируемых фосфолипидов
Фосфолипиды Стеролы Алифатиче- ские спир- ты Углеводо- роды
Подсолнечные 2,01 0,29 Hei
Соевые 1,97 0,97 Следы
Содержание (в %) металлов гидратируемых фосфолипидов
Таблица 5.6
Фосфолипиды К* Na* Mg*2 Са*2 Си*2 1'с (общее) Сумма
Подсолнечные 0,472 0,072 0,371 0,209 0,3-10~3 0,035 1,159
Соевые 0,951 0,011 0,012 0,021 0,9-Ю-3 0,015 1,011
По степени увеличения ненасыщенности гидратируемые фосфолипиды
(соевые и подсолнечные) образуют ряд: фосфатидилсерины — фосфати-
дилинозитолы — дифосфатвдилглицерины — фосфатидные кислоты — поли-
фосфатидные кислоты — фосфатидилэтаноламины — фосфатидилхолины.
Химические структуры отдельных групп гидратируемых фосфолипи-
дов изучены с помощью гидролиза и подтверждены методом ИК-спектро-
скопии. Для примера приводим данные этих анализов для гидратируемых
фосфолипидов, выделенных из соевых масел.
102
К

Жирнокислотный состав (в %) гидратируемых фосфолипидов
00
В табл. 5.9 приведены данные идентификации продуктов кислотного
гидролиза фосфолипидов, в табл. 5.10 - данные идентификации продуктов
их щелочного гидролиза, а в табл. 5.11 - молярные соотношения компо-
нентов.
По степени убывания гидратируемости отдельные группы фосфолипи-
дов подсолнечных масел располагаются в следующем порядке: фосфати-
Дйлхолины — фосфатидилэтаноламины - фосфатидилинозитолы — фосфа-
тидные кислоты [5] . Аналогичная зависимость установлена авторами для
фосфолипидов соевых масел.
Высокая степень гидратируемости фосфатидилхолинов объясняется
особенностью структуры их молекул. Показано, что фосфатидилхолины
имеют структуру 1,2-диацил-гл-глицерил-3-фосфорилхолинов:
О—СН
N(CII.)
Наличие в молекуле фосфатидилхолина одновременно кислой и основ-
ной групп приводит к тому, что в присутствии воды фосфатидилхолины
полностью или почти полностью переходят в ионную форму, несущую одно-
временно положительный и отрицательный заряды, т. е. образуют цвиттер-
ион [313] . Способность фосфатидилхолинов образовывать цвиттер-ион-
ную структуру доказана реакцией диазометанолиза фосфолипидов [266].
Такая структура превращает холинсодержащие фосфолипиды в форму,
хорошо растворимую в воде и мало или совсем не растворимую в неполяр-
ных (малополярных) растворителях - триацилглицеринах растительных
масел. Кроме того, высокую гидратируемость фосфатидилхолинов можно
объяснить отсутствием в их молекулах внутримолекулярных водородных
связей. Методом ИК-спектроскопии доказано, что для фосфатидилхолинов
в отличие от фосфатидилсеринов и фосфатидилэтаноламинов образование
внутримолекулярных водородных связей является невозможным вследст-
Таблица 5.9
Значения Rf продуктов кислотного гидролиза гидратируемых фосфолипидов
Группа Глицерол Инозитол Серин Этанол- амин Холин
Фосфатидилинозитолы 0,75 0,27 — 0,33 —
Фосфатидилхолины 0,73 — — — 0,13
Фосфатидилсерины 0,75 — 0,39 — —
Фосфатидилэтаноламины 0,75 — — 0,35 —
Полифосфатидные кислоты 0,78 — — .•W —
Дифосфатидилглицерины 0,78 - — — -
104
Результаты идентификации продуктов деацилирования
гидратируемых фосфолипидов
Таблица 5.10
Группа Продукт гидролиза
Фосфатидилинозитолы Глицерилфосфорилинозитол 0,10
Фосфатидилхолины Г лицерилфосфорилхолин 0,49
Фосфатидилсерины Г лицери лфосфорилсерин 0,38
Фосфатидилэтаноламины Глицерилфосфорилэтаноламин 0,72
Полифосфатидные кислоты Триглицероди фосфат 0,24
Дифосфатидилглицерины То же 0,24
Фосфатидные кислоты Глицерофосфат 0,98
Молярные соотношения компонентов фосфолипидов
Таблица 5.11
Группа Фосфор Жирно- кислот- ный оста- ток Глицерол Холин Амино- группа
Фосфатидилинозитолы 2,05 1,98 0,98 1,02
Фос фатидилхо лины 1,15 1,80 0,95 1,06 —
Фосфатидилсерины 1,15 1,88 0,98 — 1,05
Фосфатидилэтаноламины 1,05 1,78 0,91 — 1,05
Полифосфатидные кислоты 2,00 6,11 2,98 —
Дифосфатидилглицерины 2,03 3,98 2,95 — —
Фосфатидные кислоты 1,01 1,98 0,95 — —
вие полной трансформации протона от группы Р-ОН к более сильной ос-
новной группе аммония, в результате чего высвобождается молекула воды,
ионизируется фосфатная группа [263].
Исследования строения молекулы фосфатидилхолинов позволили ус-
тановить [427], что она состоит из трех диполей, где две эфирные связи
жирных кислот образуют два идентичных диполя, в которых кетонная
группа С(5+=О(5~) имеет отрицательную компоненту. Третий диполь состо-
105
ит из третьего углеродного атома глицерина, фосфатной и триметиламмо-
яийной группы. Суммарный заряд молекул фосфатидилхолина в области
pH 3—8 равен нулю. Это объясняется электростатическим взаимодействи-
ем фосфатной и триметиламмонийной групп в одной молекуле [380].
На основании данных ренгеноструктурного анализа [263] определено
распределение плотности зарядов третьего диполя молекулы фосфатидил
холина [351] (рис. 5.1). Приведенная структура молекулы фосфатидил-
холина показывает, что эта группа фосфолипидов полярна.
Изучение структуры фосфатмдилхолинов. выделенных из подсолнеч
ных и соевых масел методом ИК-спектроскопии, показало, что эта группа
фосфолипидов представляет собой вещества с характерными полосами
поглощения в области "790,810,1 380, 1 470, 2 860, 2 935, 2 960, 3 010 см-1,
Н
-0 2923
-0,3135
(-0,3200)
-0.0058
-0 05ч
Ь(-0.0*70)
++0-0578
с<+0.О5ЧЗ)
' +U.800IJ
Р (+0.7954)
О
-0.6932
О
-0,5557
' < +0,0754
L (+0,0713)
сн3
х +0,1656
- (+0.1642)
сн3
(-0 6954) (-0,56*2)
«. +0,0600
Н (+0,0680)
Рис. 5.1. Распределение плотности зарядов третьего диполя молекулы фосфатидил
долина (в скобках приведена ыютноегь зарядов одиночных атомов)
*0t
обусловленными деформационными и валентными колебаниями групп СН,
СН2, СН3; при 3 380 см'1, характеризующими СН-группу; при 1750 см'1,
соответствующими С=О-связи в сложноэфирной группировке; при 1 140
и 1 070 см'1 - связи P-О—С (С-О-С). Кроме того, наблюдается интенсив-
ная полоса поглощения при частоте 1 250 см-1, соответствующая группе
Р=О; полоса при 1 040 см'1, характерная для Р-ОН-группы, и специфи
веская полоса поглощения, характерная только для фосфатидилхолинов
при частоте 975 см'1, соответствующая группе N(CH3)3 [116, 119, 193] .
При рассмотрении структуры фосфатидилэтаноламинов (1,2-диацил-$п-
глицерил-3-фосфатидилэтано ламины)
СН,—(СН2)Л—С—О—СН2
О
СН,—(СН, )„—(!—О—С11
О
Н,С—О—р—О—СН— СИ,—NH,
"О
можно также предположить, что молекула фосфатидилзтаноламина состо-
ит из трех диполей такого же вида, как и молекула фосфатидилхолина.
Однако распределение зарядов в третьем диполе молекулы фосфатидил-
этаноламина несколько иное [351] и представлено на рис. 5.2.
Структура гидратируемых фосфатидилэтаноламинов, выделенных из
подсолнечных и соевых масел, изучена методом ИК-спектроскопии [ 16,
119] . Анализ спектрограмм показал, что эти фосфолипиды представляют
собой вещества с характерными полосами поглощений: при 1 750 см"1
(С=О, сложноэфирная), 1 588 см'1 (NH2), при 1 650 см'1 (C=N), при
770, 815, 1 382, 1 460, 2 872, 2 815, 3 012 см'1 (СН, СН2, СН3), при
1 250 см'1 (Р=О), при 1 070 и 1 140 см'1 (Р-О-С и С-О-С). Кроме то-
го, наблюдается интенсивное поглощение при 1 020 см'1 (Р-ОН) и незна-
Рис. 5.2. Распределение плотности зарядов третьего диполя молекулы фосфатидил-
этаноламина
107
чительное — при 1100 см-1, соответствующее Р—O'-ионам, связанным
с катионами металлов. Полоса поглощения при 1650 см-1 указывает на
образование химической связи C=N между NH2 -группой этаноламина и
карбонильной группой (С-О) углеводов
Молекулу фосфатидилсеринов (1,2-диацил-«п-глицерип-3-фосфорилсе-
ринов)
также можно представить в виде трех диполей. Опнако структура третьего
диполя сложнее, а распределение зарядов в нем отличается от распределе-
ния в третьем диполе фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов
(рис. 5 3) [351].
Снижение гидратируемости фосфатидилэтаноламинов и фосфагидил-
серинов но сравнению с фосфатидил холинами можно объяснить образова-
нием внутримолекулярных водородных связей [263] , препятствующих
свободному проникновению воды к полярным группам молекул этих
фосфолипидов В работе [263] приведены предполагаемые структуры
молекул фосфатидилэтаноламинов (1) и фосфатидилсеринов (2):
В молекулах фосфатидилэтаноламинов и фосфатидилсеринов группа
Р—ОН не полностью трансформирует свой протон к более слабой основе,
в результате чего формируется сильная внутримолекулярная вчдородная
связь.
Структура гидратируемых фосфатидилинозитолов, выделенных из под-
солнечных и соевых масел, определена методом ИК-спектроскопии [116,
119J и ИК-спектрограммах обнаружены полосы поглощения при частотах
1 6J0 и 1 510 см ‘.обусловленные колебаниями кольца инозитола; полосы
поглощения 3200-3400 см-1 (ОН); 2 960 2 932, 2 860, 1 470. 1380,
108
*0.270
(-0.258)
0.224
*0.093 *0,555
r0 217
(-0,094) (-0 561)
(+0-226)
Рис. 5.3. Распределение плотности зарядов третьего диполя молекулы фисфатидилсе-
рина
725 см-1 (СН, СН2, СН3), 1 732 см-1 (С=О, сложноэфирная), 1 240 см-1
(Р=О) (самая интенсивная из всех групп фосфолипидов), 1 120 см'1 и
1 075 см"1 (Р—О—С, С-О—С). Кроме этих характерных полос поглощений
отмечены полосы при 1 588 см-1, характеризующие наличие этаноламина, и
полоса при 1 650 см-1, соответствующая связи C=N между карбонильной
группой С=О и группой NH, этаноламина. Полоса поглощения при
1000 см’1, специфическая для углеводов, подтверждает возможность обра-
зования связи C=N, гак как углеводы являются поставщиками карбониль-
ной группы В спектре также обнаружена полоса поглощения при 3 300
3 320 см-1, соответствующая координационной связи между металлом и
аминогруппой (NH2) или группой C=N, причем на основе специальных
опытов авторами было установлено, что указанная координационная связь
является межмолекулярной [92] .
Фосфатидные кислоты имеют характерные полосы поглощения при
3 400 см 1 (ОН); 2 9Ь5, 2 935, 2 860, 1 465, 1 380, 810, 730 см"1 (СН, СН2,
СНЭ); интенсивную полосу при 1 740 см-' (С=О, сложноэфирная), при
1 120 см-1 (Р—О—С и С—О-С), при 1 250 см-1 (Р=О), полосу при
1 020 см-1, соответствующую фосфат-иону Р—О", связанному с катиона-
ми металлов. ,
Дифосфатидилглицерины и полифосфатидные кислоты представляют
собой вещества с полосами поглощения, характерными для фосфатидных
кислот; кроме того, для дифосфагидилглицеринов отмечено очень сильное
по сравнению с фосфатидными и лолифосфатидными кислотами поглоще-
ние при 3 400 см"1 характеризующее ОН-группу.
109
5.2 НЕГИДРАТИРУЕМЫЕ ФОСФОЛИПИДЫ. ИХ СОСТАВ
И ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ
В гидратированных традиционными способами растительных маслах
содержание негидратируемых фосфолипидов колеблется в широких пре-
делах и зависит от природы и качества масличного сырья, способов получе-
ния гидратированных масел и др. Ниже приведены данные по содержанию
негидратируемых фосфолипидов в растительных маслах, % к массе масла.
Подсолнечное 0,10-0.20
Соевое 0,20-0,30
Льняное 0,30- 0,45
Хлопковое 0.20-0,50
Рапсовое 0,20-0,30
Содержание негидратируемых фосфолипидов во всех указанных расти-
тельных маслах значительное В связи с этим возникла актуальная необхо-
димость детального изучения состава и химической структуры негидрати-
руемых фосфолипидов с целью разработки способов их удаления из расти-
тельных масел и получения гидратированных масел, соответствующих стан-
дарту по остаточному содержанию фосфолипидов.
В табл. 5.12 приведен групповой состав негидратируемых фосфолипи-
дов растительных масел. Сопоставление состава гидратируемых и негидра-
тируемых фосфолипидов показывает,что хочинсодержащие в негидратиру
емых фосфолипидах практически не обнаруживаются [124, 146, 156, 210,
212], другие же группы фосфолипидов обнаружены как в составе гидрати-
руемых, так и в составе негидратируемых фосфолипидов
Некоторые расхождения между данными исследований, проведенных
авторами [156, 210, 212J, и данными, приведенными в работе [346],
можно объяснить не только природой исследуемых масел, но и тем, что
для выделения негидратируемых фосфолипидов указанный автор приме-
нял методику осаждения их из ацетонивоти раствора масла в присутствии
ледяной уксусной кислоты, что неизбежно приводило к глубокому гидро-
лизу фосфолипидов вплоть до образования глицерофосфорной и накоп-
лению фосфатидной кислот.
В табл. 5 13 приведена общая характеристика негидратируемых фос-
фолипидов [156,2)0,212,346] ,
Соотношение содержания азота по сравнению с содержанием фосфора
в негидратируемых фосфолипидах указывает на преобладание в составе
негидратируемых фосфолипидов безазотистых соединений. Высокое содер-
жание золы по сравнению с азотом свидетельствует о наличии солей, кото-
рые способны образовывать кислые формы фосфолипидов. Достаточно вы-
сокое кислотное число негидратируемых фосфолипидов объясняется при-
сутствием свободных кислых форм фосфолипидов.
В составе негидратируемых фосфолипидов, как в составе гидратируе-
мых, обнаружены углеводы и неомыляемые липиды, причем содержание
неомыляемых липидов в негидратируемых фосфолипидах в 6-8 раз выше,
чем в гидратируемых. В табл 5.14 приведены средние данные по содержа
нию неомыляемых липидов, выделенных из негидратируемых фосфолипи-
110
Состав (в %) негидратируемых фосфолипидов выделенных из растительных масел
| 234), [ 148], ( 1241, [212]; в графе 8 - данные, полученные авторами
Т аблица 5.13
Общая характеристика негидратируемых фосфолипидов
Фосфолипиды масел
Показатели подсолнечных соевых льняных
1 2 3 4
Кислотное число, мг КОН/г Содержание, % 25,85-28,70 25,89-27,17 20,13-22,49
ЗОЛЫ 9,52-10,31 12,80-13,42 7,70-8,51
азота 0,37-0,42 0,25-0,32 0,45-0,68
фосфора 2,26-2,41 2,78-2,91 3,15-3,42
углеводов (связанных) 0.045-0,055 0.050-0,058 0,90-1,15
неомыляемых липидов 12.11-12,98 15.16-16,08 1,48-2,15
Примечание. В графах 2, 3 - данные, взятые соответственно из литерату-
ры 1 153), 1 195, 198), в графе 4 - данные авторов
Таблица 5.14
Содержание (в %) неомыляемых липидов, выделенных из негидратируемых
фосфолипидов
Фосфолипиды Стеролы Алифатические спирты Углеводороды
Подсолнечные 9,57-10,08 2,74-3,01 Нет
Соевые 11,58-11,90 2,38-2,56 1,20-1,31
Льняные 0,45-0,78 Нет Нет
дов [124, 116], а в табл. 5.15 — средние данные по содержанию углеводов
[ 114, 158]. 'Содержание углеводов в негидратируемых фосфолипидах
льняных масел на два порядка выше, чем в фосфолипидах соевых и под-
солнечных масел.
Содержание золы в негидратируемых фосфолипидах в 2—2,5 раза вы-
ше, чем в гидратируемых. Это свидетельствует о более высоком содержа-
нии ионов металлов в негидратируемых фосфолипидах. В табл. 5.16 при-
ведены качественная и количественная характеристика металлов [113,
210].
Качественный состав ионов металлов негидратируемых и гидратируе-
мых фосфолипидов идентичен, однако негидратируемые фосфолипиды
содержат в 2-4 раза больше металлов, чем гидратируемые; для негидрати-
руемых фосфолипидов подсолнечных и льняных масел значительную долю
составляют кальций и магний, а для соевых — калий, магний и кальций.
В табл. 5.17 приведен жирнокислотный состав негидратируемых фос-
фолипидов, а в табл. 5.18 — жирнокислотный состав их индивидуальных
групп [118] .
Жирнокислотный состав негидратируемых фосфолипидов отличается
от жирнокислотного состава гидратируемых фосфолипидов более высоким
«.одержанием насыщенных кислот. Такая закономерность подтверждает
•«иные о более высоком содержании ионов двухвалентных металлов в не-
112
8 - 727'
Содержание (в %) углеводов, выделенных из негидратируемых фосфолипидов
Таблица 5 17
Жирнокислотный состав (в %) негидратируемых фосфолипидов
Образцы ZS Жирные кислоты
низкомоле- кулярные пальми- тиновая стеари- новая Е(Л$ пальмит- олеиновая олеино- вая линоле- вая линоле- новая
Подсолнечные
масло 12.60 0.90 7.40 4 30 87.40 — 30.40 56,50
фосфолипиды Соевые 31.60 — 19.70 11,90 68,40 4.00 21,60 42,80 —
масло 15,20 0.58 9,40 5.22 84.80 — 24,95 51,61 8.24
фосфолипиды Льняные 35 87 0,10 29,18 6,59 64.13 16.55 40.79 6.79
масло 10.46 — 5,87 4,59 89.54 — 28,47 3.48 57,59
фосфолипиды 24,57 — 15,43 9,14 75,43 3.15 31,18 5.41 35,69
Т а б л и ц а 5.18
Жирнокисаотный состав (в % от суммы) негидратируемых фосфолипидов
Группа фосфолипидов Жирны г км с поты
С14.0 С16:0 С18 0 SS С|6:1 с18:2 С|Я:3 ZUS
Подсолнечные фосфолипиды
Фосфа гидилинозитилы Нет 26.55 7,70 34,25 1,71 15,14 48,90 65,75
Фосфатидилэтаноламины Нет 13 86 8.45 22.31 0,21 21,58 55.90 77,69
Фосфаталилсерины Her 28.50 8,10 36,60 1,30 15,20 46.90 63.40
Фосфатидные кислоты Нет 24,50 6,20 30,70 1,70 17,20 50,40 69,30
Фосфатидил! пиперины Нет 25,06 6,34 31,40 0,40 17,80 50.40 68,60
Полифосфатидные Нет 19,20 6.80 26,00 1,34 19.11 53.55 74,00
кислоты фосфатидилинозитолы 0,20 31,24 Соевые фосфолипиды 6,50 37.94 17,42 38,19 6,45 62,06
Фосфатадилсерины 0,20 30,80 8,23 39,23 16,40 38,19 6,18 60,77
Фос фата дил этанол амины Нет 19.85 6,50 26,85 17,73 49,40 6,52 73.65
Фосфатидные кисло гы Нет 29,75 6.45 36.20 18,55 39,28 5,97 63 80
Дифосфатидилглице- Нет 30,15 5,95 36,10 17,49 39.56 6,85 63,90
рины Полифосфатидные Нет 25,73 6,32 32,05 16,95 44,30 6,70 67,95
кислоты
Таблица 5.19
Значения Rf продуктов кислотного гидролиза
негидратируемых фосфолипидов
Группа фосфолипидов Глицерол Инозитол Серин Этанола- мин
Фосфатидилинозитолы 0.75 0,27 0,40 0,33
Фосфатидилсерины 0,75 0.39
Фосфатидилэтаноламины 0,75 0,35
Полифосфатидные кислоты 0.78
Дифосфатидилглицерины 0.78 —
Фосфатидные кислоты 0,78 — — —
Примечание. Система растворителей и-пропанол-концентрированный ам-
миак-вода (60:30:10).
гидратируемых фосфолипидах, так как известно, что уменьшение степени
ненасыщенности (увеличение содержания остатков насыщенных жирных
кислот) жирных кислот в молекулах фосфолипидов способствует более
активному их взаимодействию с ионами металлов [380] .
По степени увеличения ненасыщенности негидратируемые фосфоли-
пиды располагаются следующим образом: фосфатидилсерины, фосфатидил-
инозитолы, фосфатидные кислоты, дифосфатидилглицерины, полифосфа-
тидные кислоты, фосфатидилэтаноламины.
Химические структуры отдельных групп негидратируемых фосфоли-
пидов определены с помощью мягкого щелочного и кислотного гидроли-
зов и подтверждены методом ПК-спектроскопии [116, 119].
В табл. 5.19 для примера приведены результаты идентификации про-
дуктов кислотного гидролиза негидратируемых фосфолипидов (соевых),
в табл 5.20 — результаты идентификации продуктов их щелочного гид-
ролиза [119], а в табл. 5.21 - молярные соотношения компонентов
Гидролизаты негидратируемых фосфатидилсеринов и фосфатидилэтанола-
минов представлены наряду с глицеролом аминосоединениями - серином и
этаноламином соответственно, а группы фосфатидных кислот, полифосфа-
тидных кислот и дифосфатидилглицеринов - только глицеролом. Гидро-
Таблица 5.20
Результаты идентификации продуктов деацилирования негидратируемых
фосфолипидов
Группа фосфолипидов Продукт гидролиза
Фосфатидилинозитолы Г лицсрилфосфорилинозитол 0,05
Фосфатидилсерины Г лицери лфосфори лссрин 0,30
Фосфатидилэтаноламины Глицерил фосфорилэтаноламин 0,70
Полифосфатидные кислоты Т риглицсродифосфат 0,20
Дифосфатидилглицериды ♦» . 0,20
Фосфатидные кислоты Глицерофосфат 0,90
Примечание. Система растворителей бутанол-ледяная уксусная кислота-
вода (50:40:10).
116
Таблица 5.21
Молярные соотношения компонентов
Группа фосфолипидов Фосфор Жирнокис- лотный остаток Глице- рол Амино- группа
Фосфатидилинозитолы 2,03 1,98 0,98 1,00
Фосфатидилсерины 1,10 1.78 0,98 1,00
Фосфатидилэтаноламины 1,10 1.73 0,91 1,01
Полифосфатидные кислоты 2,02 5,13 2,98 —
Дифосфатидилглицерины 2,03 3,98 2,95 —
Фосфатидные кислоты 1,05 1,78 0,98 —
лизаты фосфатидилинозитолов имеют более сложный состав и представле-
ны инозитолом, глицеролом, этаноламином и серином. На сложность фос-
фатидилинозитолов гидратируемой и негидратируемой фракций указывают
также величины Яу фосфорных эфиров глицерина (см. табл. 5.20). Так,
в данном случае снижается величина Rf для глицерилфосфорилинозитола
(для негидратируемой - от 0,15 до 0,05) [71] . Кроме того, величины Rf
фосфорных эфиров глицерина, выделенных из негидратируемых групп,
несколько ниже, чем значения Rf эфиров для гидратируемых (см.
табл. 5.9), что в свою очередь косвенно подтверждает более сложный сос-
тав фосфатидилинозитолов негидратируемой фракции.
Для фосфатидилсеринов, фосфатидилэтаноламинов и фосфатидных
кислот (см. табл. 5.21) отмечено снижение отношения P:COOR, что объ-
ясняется присутствием в этих группах фосфолипидов их лизопроизвод-
ных форм.
На основании анализа ИК-спектрограмм [116, 119] определены воз-
можные химические структуры отдельных групп фосфолипидов.
В инфракрасных спектрах негидратируемых фосфатидилинозитолов
(рис. 5.4), как и в инфракрасных спектрах гидратируемых фосфатидил-
инозитолов, обнаружены полосы поглощения при частотах 1 610 и
1 510 см-1, обусловленные колебаниями кольца инозитола, полосы по-
глощения при частотах 3 400-3 200 см-1 (ОН), 2 960, 2 932, 2 860, 1 470,
1 380, 725 см“’ (СН, СН2, СН3), 1 732 см-' (С=О, сложноэфириая),
1 240 см’1 (Р=О) (самая интенсивная из всех групп фосфолипидов),
1 170 и 1 075 см" (Р—О—С) Кроме этих полос отмечены полосы погло-
щения при частоте 1 588 см"1, характеризующие наличие этаноламина,
полоса поглощения при частоте 1 650 см-1, которая указывает на образова-
ние связи C=N между карбонильной группой С=О углеводов и группой
NHj этаноламина (менее интенсивная по сравнению с фосфагидилсерина-
ми) , полоса поглощения при частоте 1 000 см-1, обнаруженная в исследу-
емых образцах и специфическая для углеводов, подтверждает наличие их
остатков в молекуле фосфатидилинозитолов. В ИК-спектре негидратируе-
мых фосфатидилинозитолов отмечены очень сильное поглощение при час-
тоте 1 ПО см-1, характеризующее группу Р-О” (фосфа т-ион), связанную с
металлом, поглощения при частотах 1 560 и 87Uсм-1 .обусловленные коле-
баниями карбоксил-иона СОО", и связи ею с металлами. Необходимо отме-
тить, что в спектре негидратируемых фосфатидилинозитолов обнаружена
полоса поглощения при частотах 3 300-3 320 см-1, соответствующая коор-
динационной связи между металлом и аминогруппой NH2 или группой
C=N. Установлено, что для негидратируемых фосфатидилинозитолов с
уменьшением концентрации полоса поглощения, характеризующая коор-
динационную связь, не сдвигается в область более низких частот и соот-
ветствует частоте 3 300 см-1. Это свидетельствует о том, что координаци-
онная связь в негидратируемых фосфатидилинозитолах является внутри-
молекулярной 113].
Показано, что негидратируемые фосфатидилинозитолы представляют
собой вну грикомплексные соединения с металлами и углеводами и осно-
вой их структуры является фосфатидилмоноиноэитфосфат, связанный с
серином или с этаноламином [119] -
(О
118
CI12OH(CHOH)4HC=N—gii2—си
о
119
где Ме1 - К4. Na4; М<?2 - Са42, Mg42, Си42, Fe42 R - остаток углевода (.глюкоза -
(СНОН)4СН2ОН; арабиноза - (СНОН) 3СН2ОН и др.).
Инфракрасные спектры негидратируемых фосфатидилсерннов
(рис. 5.5) показывают, что эти фосфолипиды представляют собой вещества
с характерными полосами поглощений: при частотах 1 750 см-1 (С=О,
сложноэфирная), 1 588 см*1 (NH2), 1 650 см-1 (C=N), 730, 815, 1 382,
1 460, 2 872, 2 915, 3 012 см"1 (СН, СН2, СН3), 1 250см*1 (Р=О), 1 140и
1 070 см’ ’ (P-О—С и С-О-С). Для негидратируемых фосфатидилсеринов
поглощение при 1 040 см"1, обусловленное группой Р-ОН, исчезает, и по-
является новое интенсивное поглощение при 1 110 см"1, соответствующее
Р- О "-иинам, связанным с ка гионами. а также при 1 490 и 870 см *1 - погло-
щение карбоксилиона СОО", связанного с катионом металла, и поглощение
при 3 320 см”1 — внутримолекулярная координационная связь между ме-
таллами, аминогруппой NH2 или группой - C-N - (установлено, как и
Рис 5.5 ИК-сгектры негидратируемых фосфатидилсеринов
120
для фосфатидилинозитолов). Таким образом, негидратируемые фосфати-
дилсерины представляют собой внутрикомплексные соединения с метал-
лами и углеводами, а фосфолипидный остаток представляет собой триден-
татный лиганд - P-О-, COO-, NH2(C=N) [ 16, 119].
Рис. 5.6. ИК-спектры негидратируемых фосфатидилэтаноламинов
121
Анализ спектрограммы подсолнечных негидратируемых фосфати-
дилэтаноламинов (рис. 5.6) показывает, что для этих групп и для фосфа-
тидилсеринов, за исключением полосы поглощения, характеризующей —
СООН-группу, характерны такие же полосы поглощения. В группе гидрати-
руемых фосфатидилэтаноламинов имеется интенсивное поглощение при
1020 см-1 (Р-ОН) и незначительное при 1 100 см-1 (Р -О-). Это свиде-
тельствует о том, что в молекуле фосфатидилэтаноламинов находится
металл. При анализе спектрограммы негидратируемых фосфатидилэтанола-
минов наблюдаются интенсивное поглощение при 1 110 см-1 (интенсив-
ность на таком уровне, как и для негидратируемых фосфатидилинозито-
лов) и отсутствие поглощения при 1 020 см-1. Кроме того, в спектре не-
гидратируемых фосфатидилэтаноламинов наблюдается самое сильное (по
сравнению с фисфатидилсеринами и фосфатидилинозитолами) поглощение
при 1 680 cm-1(C=N). Полоса поглощения при 3 320 см-1 в спектре этой
группы отсутствует, т. е. в молекулах фосфатидилэтаноламинов нет коор-
динационной связи между металлом и группами -NH2, —C=N. Это связа-
но с тем, что фосфатидилэтаноламины способны взаимодействовать только
с одновалентными металлами (К* и Na+), а по литературным данным, эти
металлы не способны образовывать координационные связи (13]. Ниже
приведены возможные структуры фосфатидилэтаноламинов [116, 119].
На основании данных ИК-спектров (рис. 5.7) показано, что фосфатид-
ные кислоты представляют собой вещества с характерными полосами по-
глощений при 3400 см-* (ОН), 2 965, 2 935, 1 465, 1 380, 810, 730 см-1
(СН, СН2, СНз ), интенсивная полоса при 1 740 см-1 (С=О), 1 120 (Р-О-С
и С—О—С), 1 250 см-1 (-Р=О). В негидратируемых фосфатидных кисло-
тах не обнаружена полоса поглощения при 1 020 см-1, характерная для
122,
Пропускание, i
SS S S S
°*0 X 32 28 Л 2020 № 16 W 12 Юсп~ Ю'
Рис. 5.7. ИК-спектры негидратируемых
фосфатидных кислот
Рис. 5.8. ИК-спектры негидратируемых
полифосфатидных кислот
Р-ОН-группы, однако выявлена интенсивная полоса поглощения при
1 100 см"’, обусловленная Р—О', связанной с катионами металлов. Возмож-
ные структуры молекул негидратируемых фосфатидных кислот приведены
ниже [116, 119].
где Мв| - Na+, К+; Мс2 - Са42, Mg42; Мс3 - Fc43, Al43; R3 - алифатические спирты;
R.4 - стеролы.
ИК-спектры полифосфатидных кислот, выделенных из подсолнечных
негидратируемых фосфолипидов, аналогичны ИК-спектрам фосфатидных
123
кислот (рис. 5.8). Структуры молекул негидратируемых полифосфат идных
кислот можно представить в следующем виде.
Анализ ИК-спектров дифосфатидил глицеринов позволяет отметить,
что эта группа фосфолипидов представляет собой вещества с полосами
поглощения, характерными как для фосфатидных, гак и для полифосфа-
тидных кислот; также отмечено очень сильное поглощение при 3 400 см-1
(ОН-группа). Кроме того, интенсивность полосы поглощения при
1 100 см-1' (P-О-) в негидратируемых дифосфатидилглииеринах менее
значительна по сравнению с другими группами. Наряду с этим поглощением
обнаружено поглощение при 1 040 см-1 (Р-ОН). Ниже приведены возмож-
ные структуры молекул негидратируемых дифосфатидилглиперинов.
124
6. ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФОСФОЛИПИДОВ
Физические свойства фосфолипидов растительных масел обусловлены
структурными особенностями их молекул и составом.
К наиболее важным свойствам фосфолипидов, обусловливающим их
поведение на отдельных этапах переработки масличных семян и раститель-
ных масел, а также характеризующим их потребительские свойства как
самостоятельного продукта - фосфатидного концентрата, относятся по-
верхностно-активные свойства, полярность, поляризуемость, а также спо-
собность к ассоциации и мецеллообразованию в неполярных и малополяр-
ных растворителях.
6.1 ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ СВОЙСТВА
Фосфолипиды растительных масел способны изменять фазовые и энер-
гетические взаимодействия на поверхностях раздела полярной и неполяр-
ной фаз. Наличие такой активности для фосфолипидов обусловлено их хи-
мическим строением, полярностью и поляризуемостью, а также внешними
факторами; температурой, характером среды (растворителя), концентра-
цией и особенностью (видом) фаз на границе раздела [5, 129, 130, 136,
290] .
Обычно поверхностно-активные вещества (ПАВ) — это органические
соединения, содержащие в молекуле углеводородные, радикалы и одну или
несколько полярных (активных) групп [46, J06] .
Из особенностей состава и структуры молекул фосфолипидов (см.
разд. 5) следует, что их углеводородная часть состоит из одной (для лизо-
форм) или двух радикалов жирных кислот, отличающихся в основном
молекулярной массой и степенью ненасыщенности, а полярные (активные)
группы состоят из кислородсодержащих - эфирных, гидроксильных, кар-
боксильных; азотсодержащих - амино- и фосфорсодержащих групп В
составе этих активных групп могут быть и металлы [116, 119] .
Особенностью фосфолипидов, растворенных в малополярном раство-
рителе, в частности в триацилглицеринах растительного масла, является
то. что они практически не проявляют поверхностной активности на гра-
нице раздела фаз. растворитель - воздух [8, 9, 14]. Поверхностная
активность их в неполярных растворителях ярко проявляется на границе
раздела с водой. Такая особенность свойств растворов фосфолипидов в
масле позволяет отнести их к группе ПАВ. образующих в маслах мицел-
лярные растворы [1, 175, 239] .
Как и для других ПАВ, поверхностная активность растворов фосфоли-
пидов в неполярном растворителе может косвенно характеризоваться
соотношением углеводородной (гидрофобной) и активной (гидрофиль-
ной) частей молекул — гидрофильно-липофильным балансом (ГЛБ), ко-
торый для ряда веществ может быть рассчитан на основе групповых чисел
гидрофильной и гидрофобной частей молекул по известному уравне-
нию [1]
125
ГЛБ ^^гидроф ~ ”^CHj + ?>
где ^А/гидроф - сумма групповых чисел гидрофильных групп; п - число групп -
СН2 - в молекуле или число углеродных атомов в гидрофобной 1 руппе; N - группо-
вое число для СН2.
Для расчета ГЛБ можно также использовать уравнение
ГЛБ - 7 = 0,361п (Св/См),
где Св и См - равновесная концентрация, при которой ПАВ растворяется в воде и
масле соответственно
Используя уравнение Шишковского [ 1], описываюшее изменение меж-
фазного натяжения в зависимости от концентрации ПАВ в одной из фаз
о0 -о = ЯТГтах]п(С/А + 1),
где R - универсальная газовая постоянная |Я=8,31 Дж/(моль-К)); Т~ температу-
ра. К, о„ - межфазное натяжение чистого компонента, Н/м; С - концентрация ПАВ
ь фазе, моль/л; о - межфазное натяжение при концентрации ПАВ равной С, Н/м;
А - константа, моль/л; Гтах - максимальная адсорбция, моль/м2,
можно определить поверхностную активность данного ПАВ, вычислить
работу выхода ПАВ на границу раздела фаз, найти геометрические харак-
теристики межфазного слоя толщину межфазного слоя, площадь поляр-
ной части молекулы ПАВ.
В табл. 6.1 приведены полученные авторами значения поверхностной
активности молекул гидратируемых фосфолипидов - (<Эо/<ЭС)с-о> пло-
щадь полярной части молекулы (50) и толщина межфазного слоя (5),
вычисленные по формулам:
-(^/дОс^=ЛГГтах/Д;
5° ~ ' ^max-^AJ
5 = ГтахЛ//р-1000.
Где 'А “ число Авогадро GVa = 6,02-10 моль-1). Л/- молекулярная масса фосфо-
липидов; р - плотность ПАВ, кг/м3
Таблица 6.1
Показатели межфазного слоя "раствор фосфолипидов
в масле - вода" (1391
Образец системы Площадь полярной части молекулы, м2-1019 Поверхностная ак- тивность, Н/м / моль/л Толщина межфазного слоя, м • 1О10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Масло-гидра- тируемые фос- фолипиды- вода 13,45 19,07 24,62 472 755 604 7,27 5,197 4,058
Масло-негид- ратируемые фосфолипиды - вода 14,36 21,55 29,02 101 137 225 8,00 5,38 4,04
Примечание. В графах 2, 5, 8 при t = 45 С; в графах 4, 7, 10 при Г = 60 - данные при t = 20°С; в графах 3,6, 9 - С.
126
Таблица 6.2
Значения &Еа (в кДж]моль) фосфолипидов
на межфазной границе масло-вода
в зависимости от температуры
Температура приведения опытов, С Фосфолипиды
гидратируе- мые негидратируе- мые
20 47,2 43,7
45 53,2 48,6
60 55,5 52,9
Поверхностная активность гидратируемых и негидратируемых фосфо-
липидов зависит от температуры системы. Эта зависимость описывается
уравнениями вида:
для гидратируемых
-(да/дС) с-»о = -0,534г2 + 46,03г - 235;
для негидратируемых
-(да/дС)с-о = О,11Пг -5,75/+ 172.
Максимальная поверхностная активность гидратируемых фосфолипидов
(757 Н/м/ моль/л) отмечена при температуре 43°C. Наблюдаемый максимум
поверхностной активности, вероятно, можно объяснить фазовым перехо-
дом гидратируемых фосфолипидов при 43°С, который был определен для
раствора, дипальмитоил-а-фосфатидилхолина при 41°С [48] При темпе-
ратуре 70°С поверхностная активность гидратируемых и негидратируемых
фосфолипидов одинакова и равна 326 Н/м / моль/л. Зависимость поверх-
Таблица 6.3
, . . Н/м
Значения поверхностной активности (в '
отдельных групп фосфолипидов, выделенных из масла,
в зависимости от температуры [ 144]
Группа фосфолипидов Температура, °C
20 45 60
Гидратируемые фосфолипиды
Фосфатидилинозитолы 430 710 690
Фосфатидилхолины 581 878 905
Фосфатидил этаноламины 515 801 860
Фосфатидилсерины 480 755 710
Фосфатидные кислоты 405 650 630
Негидратируемые фосфолипиды
Фосфатидилинозитолы 88 105 148
Фосфатидилэтаиоламины 180 215 245
Фосфатидилсерины 135 159 178
Фосфатидные кислоты 75 95 130
127
ностной активности от температуры является следствием перестройки мо-
лекул ПАВ на границе раздела фаз [256] .
Для энергетической характеристики этой перестройки в табл. 6.2 при-
ведены значения работы адсорбции Д£а межфазного слоя фосфолипидов,
рассчитанные по формуле [256].
Из табл. 6.2 следует, что более прочно на межфазной поверхности при
температуре 20-60°С адсорбируются гидратируемые фосфолипиды, менее
негидратируемые формы фосфолипидов.
В табл. 6.3 приведены полученные авторами значения поверхностной
•активности отдельных групп подсолнечных фосфолипидов, растворенных в
масле на границе с водой.
Из всех групп фосфолипидов наибольшей поверхностной активностью
обладают фосфатидилхолины. По величине поверхностной активности
фосфолипиды образуют ряд (по убыванию): фосфатидилхолины - фосфа-
тидилэтаноламины - фосфатидилсерины - фосфатидилинозитолы - фос-
фатидные кислоты. Отметим, что ряд гидратируемости фосфолипидов со-
гласуется и совпадает с указанным выше рядом изменения поверхностной
активности.
Таким образом, гидратируемость фосфолипидов из растительных ма-
сел обусловлена прежде всего поверхностной активностью молекул фосфо-
липидов, растворенных в масле, на границе с водой.
6.2. ПОЛЯРНОСТЬ, ПОЛЯРИЗУЕМОСТЬ И ДИПОЛЬНЫЕ МОМЕНТЫ
Наряду с химической структурой полярность и поляризуемость моле-
кул фосфолипидов обусловливают их объемные и поверхностные свойства,
а также позволяют объяснить механизм растворения и поведение фосфо-
липидов в растительных маслах.
Под полярностью понимают стационарное смешение электронов от-
дельных атомов или групп атомов, в результате чего появляется электро-
магнитный дипольный момент. В таких молекулах центр тяжести положи-
тельных зарядов не совпадает на определенную величину с центром отрица-
тельных зарядов [10, 135].
В табл. 6.4 приведены значения дипольных моментов индивидуальных
групп фосфолипидов, выделенных из гидратируемых и негидратируемых
фосфолипидов подсолнечных и соевых масел [69].
Гидратируемые фосфолипиды подсолнечных и соевых масел имеют бо-
лее высокий дипольный момент, чем негидратируемые, и по полярности
их можно расположить в ряд (по убыванию): фосфатидилхолины-фосфа-
тидилэтаноламины-фосфатидилсерины-фосфатидилинозитолы-фосфатид-
ные кислоты — дифосфатидилглицерины. Для негидратируемых фосфоли-
пидов ряд полярности отличается от гидратируемых и представлен следую-
щим образом (по убыванию): фосфатидные кислоты-фосфатидилэтано-
ламины-фосфатидилинозитолы-фосфатидилсерины-дифосфатидилглице-
рины.
Дипольные моменты отдельных групп гидратируемых и негидратируе-
мых фосфолипидов подсолнечных масел несколько выше, чем соевых.
128
Таблица 6.4
Значения дипольных моментов фосфолипидов и (в Клм-1030)
Группа фосфолипидов Фосфолипиды
гидратируемые негидратируемые
Подсолнечные
Фосфатидилхолины 23,11-23,84 —
Фосфатидилинозитолы 18,04-18,67 14,50-15,27
Фосфатидилсерины 19,94-20,44 13,84-14,37
Фосфатидил этаноламины 21,17-21,94 15,84-16,57
Фосфатидные кислоты 18,90-19,84 21,51-21,94
Дифосфатидилглицерины 16,76-17,60 13,00-13,60
Соевые
Фосфатидилхолины 21,91-22,77 —
Фосфатидилинозитолы 16,74-17,60 13,84-14,37
Фосфатидилсерины 19,24-20,04 13,23-13,74
Фосфатидилэтаноламины 19,90-20,47 15,60-16,41
Фосфатидные кислоты 17,44-18,44 21,44-21,67
Дифосфатидилглицерины 16,24-17,07 12,73-13,21
Характерный дипольный момент в молекулах фосфолипидов объясня-
ется смещением центра тяжести заряда электронов к более электроотрица-
тельным атомам (N, О, Р), т. е. обусловлен электронными эффектами ак-
тивных групп фосфолипидов [ 10, 239].
Ввиду того что молекулы фосфолипидов в неполярных растворителях
участвуют в межмолекулярных взаимодействиях между собой и средой и
энергия этого взаимодействия может быть весьма значительна, для общей
характеристики полярности системы неполярный растворитель-фосфоли-
пиды, как и для других масло растворимых ПАВ, можно применять пока-
затель относительной полярности (ОП) в %, определяемый по формуле
[1, Ю6]
ОП = (ci - ее) 100/ее,
где €] — диэлектрическая проницаемость бензольного раствора фосфолипидов опре-
деленной концентрации; еб - диэлектрическая проницаемость чистого бензола.
Молекулы фосфолипидов, растворенные в неполярном растворителе,
характеризуются поляризуемостью, т. е. способностью приобретать или
увеличивать свою полярность под действием внешних факторов [10, 135] .
В работах [88, 117] показано, что фосфолипиды под действием хими-
ческого агента и электромагнитного воздействия поляризуются, в резуль-
тате чего увеличивается величина их дипольного момента.
Химическая поляризация негидратируемых фосфолипидов осущест-
влялась путем обработки гидратированного масла раствором электролита
при рН=3, состоящим из лимонной кислоты, однозамещенного лимонно-
кислого натрия и хлористого натрия [88] . В табл. 6.5 и 6.6 приведены
данные по изменению полярности негидратируемых фосфолипидов под-
солнечных и соевых масел в результате химической поляризации; для
сравнения приведены величины дипольных моментов гидратируемых
9 - 727 129
Таблица 6.5 Изменение дипольных моментов м (в Клм 1О30 ) фосфолипидов, выделенных из подсолнечных масел
Группа фосфолипидов Фосфолипиды
гидрата- руемые негидратируемые
до поля- ризации после по- ляризации
Фосфатидилинозитолы 18,61 14,74 18,60
Фосфатидил холины 23,68 —
Фосфатидилсерины 20,11 14,34 20,51
Фосфатидилэтанола- мины 21,58 15,90 21,51
Фосфатидные кислоты 19,44 18,24 19,57
Дифосфатидилглице- рины 17,21 13,27 17,40
фосфолипидов, выделенных из исходных масел. Как показано в работе
[88], химическая поляризация негидратируемых фосфолипидов под дей-
ствием указанного раствора с рН=3 осуществляется в результате реакции
замещения между сложными комплексными соединениями негидратируе-
мых фосфолипидов с металлами и цитрат-ионом (Na-цитрат-ионом)
MeR + Cit-3 ч* MeCit" + R"2, (1)
или
MeR + NaCit’2 # MeNaCit + R.'2, (2)
где Me — ионы двухвалентных металлов, входящие в комплексное деединение моле-
кулы фосфолипида; R - остаток фосфолипидного комплекса; Cit-3 - лиганд (цит-
рат-ион) лимонной кислоты; NaCit - лиганд одноэамещенного лимоннокислого
натрия.
В том случае, когда в комплексном соединении фосфолипида находят-
ся ионы трехвалентных металлов, реакция идет по уравнению (3).
Таблица 6.6 Изменение дипольных моментов и (в Кл-м- 1О30) фосфолипидов, выделенных из соевых масел
Группа фосфолипидов Фосфолипиды
гидрата- руемые негидрат до поля- ризации ируемые после по- ляризации
Фосфатидилинозитолы 17,37 13,98 18,07 Фосфатидилхолины 22,51 - - Фосфатидилсерины 19,77 13,90 19.94 Фосфатидилэтанола- 20,24 16,34 17,10 мины Фосфатидные кислоты 18,24 16,90 18,57 Дифосфатидилглице- 16,50 13,07 16,44 1зо рины
Таблица 6.7
Изменение дипольных моментов и (в Кл-м- 1О30)
фосфолипидов, выделенных из подсолнечных масел
Группа фосфолипидов Фосфолипиды
гидрати- руемые негидра- таруе- мые гидрати- руемые негидра- тируе- мые
до ЭМ поляри- зации после ЭМ поляри- зации
Фосфатидилинозитолы 19,78 14,44 21,74 17,04
Фосфатидилхолины 24,74 22,84 — 27,18 —
Фосфатидилэтаноламины 16,17 25,27 17,94
Фосфатидилсерины 21,37 15,07 23,64 17,07
Фосфатидные кислоты 20,17 17,74 22,04 18,77
MeR + Cit-3 з* MeCit + R-3. (3)
Кроме приведенных выше уравнений реакций (1), (2) и (3) возможна
и реакция с образованием биядерных цитратных комплексов
NaRi + CaRj + Cit-3 # NaCaCit + Rj + Rj2,
где Ri и Rj - остатки фосфолипидных металлокомплексов.
В работе [117] электромагнитная поляризация растворов фосфолипи-
дов осуществлялась под действием переменных электромагнитных полей.
В табл. 6.7 и 6.8 приведены данные по изменению полярности фосфолипи-
дов под действием электромагнитной поляризации (ЭМ) [117].
Таким образом, маслорастворимые поверхностно-активные соедине-
ния, к которым относятся фосфолипиды, под действием электромагнит-
ных полей способны увеличивать свою полярность [ 135, 239]. Диполь-
ный момент молекулы фосфолипидов, растворенной в растворителе, пос-
ле воздействия ЭМ поля можно рассчитать по формуле [238]
Таблица 6.8
Изменение дипольных моментов (в Кл-м-10*°)
фосфолипидов, выделенных из соевых масел
Группа фосфолипидов Фосфолипиды
гидрати- руемые иегидра- тируе- мые гидрати- руемые неги дра- гируе- мые
до ЭМ поляри- зации после ЭМ поляри- зации
Фосфатидилинозитолы 17,30 14,17 20.27 17,67
Фосфатидилхолины 23,17 Чг 25,31 —
Фосфатидилэтаноламины 21,04 16,10 23,01 18,37
Фосфатидилсерины 19,94 13,34 22,51 17,27
Фосфатидные кислоты 18,74 17,20 22,61 19,44
131
Дфл = Me + Дд> = До + Е™ = до + а(£^п + £^п) = До + 3/4яР,
где Мфл - общий (индуцированный) момент молекулы фосфолипида; до — исход-
ный дипольный момент молекулы фосфолипида; а — поляризуемость молекулы, за-
висящая от динамических электронных эффектов активных групп фосфолипидов;
глок
£ эмп ~ напРяженность локального поля, состоящая из макроскопического внешнего
^эмп^ и внУтРеннеГ0 (^мп) поля> обусловленного электростатическим межмоле-
кулярным взаимодействием и пропорционального поляризации молекулы фосфоли-
пида; Р - поляризация молекул фосфолипида.
6.3. ЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ ПРОВОДИМОСТЬ ФОСФОЛИПИДОВ
В НЕПОЛЯРНЫХ РАСТВОРИТЕЛЯХ
В настоящее время в масло-жировой промышленности ведутся работы по созда-
нию высокоэффективного оборудования для очистки масел, мисцелл и саломаса в
электростатическом поле (43, 80, 131, 234, 260]. В связи с этим в работах (39, 43]
приведены сведения о влиянии электростатического поля на фосфолипиды, раство-
ренные в маслах и мисцеллах. В табл. 6.9 приведены данные по влиянию фосфолипи-
дов на величину силы тока модельных бензиновых мисцелл 20%-ной концентрации;
для сравнения приведены также данные по изменению электропроводности мисцелл
при введении в них воскоподобных веществ, свободных жирных кислот и неомыляе-
мых липидов (43).
В отличие от свободных жирных кислот, неомыляемых липидов и воскоподоб-
ных веществ фосфолипиды существенно изменяют электропроводность мисцелл.
Аналогичные результаты были получены и при определении электропроводности
реальных образцов производственных мисцелл [ 43]. Значительное влияние фосфо-
липидов на электропроводность авторы цитируемой работы объясняют способностью
фосфолипидов к ассоциации и мицеллообразованию в неполярных растворителях.
В этом случае ток возрастает за счет электрофоретической проводимости, которая
в жидких диэлектриках по величине значительно превосходит ионную проводимость.
В работе | 39] показано влияние гидратируемых и негидратируемых фоефолипи-
дов на удельную электропроводность масел в интервале температур 20-220°С. Для
масел, содержащих гидратируемые и негидратируемые фосфолипиды, удельная элект-
ропроводность возрастает с повышением температуры и увеличением концентрации
фосфолипидов в масле.
Гидратируемые фосфолипиды участвуют в проводимости в большей степени,
чем негидратируемые. При температуре 180-190°С в маслах, содержащих гидратируе-
мые фосфолипиды, наблюдается резкий спад проводимости системы. Негидратируе-
Таблица 6.9
Влияние сопутствующих триацилглицеринам веществ на злектрическую
проводимость 20%-ных мисцелл
Вещества Концентрация веществ, % Сила тока, 1Ю®А
Фосфолипиды 0,12-1,50 2,40-100,0
Воскоподобные вещества 0,02-0,30 0,48-0,49
Олеиновая кислота 0,18-4,27 0,48-0,50
Сумма жирных кислот из подсолнечного 0,16-3,80 0,48-0,50
масла
Неомыляемые липиды 0,69-1,20 0,48-0,49
Примечание. Величина сиды тока 20%-ной мисцеллы рафинированного
подсолнечного масла в бензине соответствует 0,48.10“® А.
132
мые фосфолипиды (0,1-0,2% к массе масла) не оказывают существенного влияния
на электропроводность масел.
Ниже приведены данные по электропроводности основных груди фосфолипидов
в мисцеллах [43].
Группа фосфолипидов Удельная электрическая
проводимость, См/м
Фосфатидилхолины (3-7)-ЮГ4
Фосфатидилэтаноламины (3-8). 10~4
Фосфатидилсерины (3-6) 10^4
Фосфатидилинозитолы (3-8) ДО-6
Примечан и е. Удельная электрическая проводи-
мость гексана 3-10 См/м, а удельная электрическая
проводимость 20%-ноЙ мисцеллы подсолнечного масла
(3-4) ДО-9 См/м.
Электропроводности основных групп фосфолипидов - величины одного порядка.
Близкие значения этих величин, характеризующих электрокинетические свойства
фосфолипидов, отличающихся химическим строением, позволяют отвергнуть ионный,
электрохимический характер переноса тока фосфолипидами. Предложен механизм
переноса тока в неполярных растворителях, который обусловлен электрофоретиче-
ским переносом мицеллами фосфолипидов электронов, эмитируемых из металла
электродов 139, 43).
6.4. ОБРАЗОВАНИЕ АССОЦИАТОВ И МИЦЕЛЛ
ФОСФОЛИПИДОВ В НЕПОЛЯРНЫХ РАСТВОРИТЕЛЯХ
В неполярных растворителях фосфолипиды находятся в виде ассоциа-
тов, мицелл и других фазовых образований [4, 34, 221, 256]. Процесс
ассоциации и мицеллообразования поверхностно-активных веществ в не-
полярных растворителях происходит, как правило, вследствие межмоле-
кулярного взаимодействия полярных групп их молекул [1, 150]. При
этом возникают водородные и другие виды связей, энергии которых зани-
мают промежуточное положение между энергиями химических связей, с
одной стороны, и ван-дер-ваальсовыми — с другой. Эти формы межмолеку-
лярного взаимодействия фосфолипидов сосуществуют, а при изменении
таких факторов, как концентрация фосфолипидов, температура и др.,
возможны их взаимные превращения [1, 175, 176, 239] . Для неионноген-
ных ПАВ, к которым можно отнести фосфолипиды растительных масел, в
неполярных и малополярных растворителях характерны следующие типы
межмолекулярных взаимодействий [1,34,72, 150,175] :
слабое химическое, обусловленное образованием водородных связей
и комплексов (комплексоподобное взаимодействие) [72, 150, 175];
молекул с постоянным жестким диполем (ориентационный эффект);
молекул с постоянным диполем и молекул с индуцированным дипо-
лем (индукционный эффект);
мгновенных диполей, образованных благодаря определенному поло-
жению электронов в молекуле (дисперсионный эффект).
Последние три типа характеризуются в основном ван-дер-ваальсовыми
силами. Ориентационные и индукционные силы обычно не разделяют, на-
зывая их сумму полярными электростатическими силами. Под полярны-
ми силами понимают силы, обусловленные наличием дипольного момента
133
у молекул фосфолипидов. Под дисперсионными силами понимают универ-
сальные силы, обусловленные флуктуацией электронной плотности и в
чистом виде проявляющиеся у неполярных молекул (гексан, четырех-
хлористый углерод) и малополярных молекул (триацилглицеринов).
Рассмотрим более подробно указанные виды межмолекулярного взаи-
модействия для системы фосфолипиды—неполярный растворитель.
Взаимодействия, обусловленные образованием ассоциатов фосфоли-
пидов вследствие возникновения водородных связей. Процесс ассоциации
молекул фосфолипидов в неполярных растворителях изучен методом
ИК-спектроскопии [3] . Концентрация ассоциированных и индивидуаль-
ных молекул определялась по интенсивности поглощения при частоте вол-
ны 1180 см-1, характеризующей группу —Р=О и участвующую в межмоле-
кулярных водородных связях, и при частоте — 1250 см-', соответствующей
группе -Р=О в индивидуальных молекулах фосфолипидов [13, 141].
На процесс ассоциации фосфолипидов в неполярных растворителях вли-
яют такие факторы, как концентрация и структура фосфолипидов,темпера-
тура системы и природа растворителя.
Ниже приведены зависимости концентрации ассоциированных молекул фосфо-
липидов Са от общей концентрации молекул фосфолипидов Со и температуры в че-
тыреххлористом углероде и в модельном масле* * Са=/(С0) [3,157].
Подсолнечные фосфолипиды:
а) в четыреххлористом углероде:
для гидратируемых фосфолипидов
С,= -0,03083 + 0,61000Co(20°C);
Са = -0,04330 + 0,60666Со (35°С);
Са = -0,04083 + 0,51037Со (45’0;
для негидратируемых фосфолипидов
Са = -0,14187 + 0,40590Со (20°О;
Са = -0,13951 + 0,38752Со(35°С);
Сл = -0,13152 + 0,35545Со (45’С);
б) в модельном масле:
для гидратируемых фосфолипидов
Са = -0,01999 + 0,66666Сп (20°С);
Са = - 0,02666 + 0,63999С„ (40°С);
Са = -0,04060 + 0,60666Со (60°С);
для негидратируемых фосфолипидов
Сл - -0,15135 + 0,44514Со(20°С);
Са = -0,14187 + 0,40590Со (40°С);
са = -0,14015 + 0,38998Со(60°С).
Соевые фосфолипиды:
а) в четыреххлористом углероде:
для гидратируемых фосфолипидов
Са = -0,08166 + 0,58000Со (20°С);
Са = -0,10249 + 0,53214Со (35°С);
Са = -0,10333 + 0,47857Со (45°С);
I
* В системах четыреххлористый углерод-фосфолипиды и модельное масло-
фосфолипиды влага аналитически отсутствовала.
134
для негидратируемых фосфолипидов
С, = -0,27385 + 0,45284Со (20°С);
Сл = -0,25617 + 0,41317СО(35°С);
С, = -0,25522 + 0,40511СО (45°С);
б) в модельном масле:
для гидратируемых фосфолипидов
С, = -0,08357 + 0,68571Со(20°О;
С, = -0,10999 + 0,63999Со (40°О;
С, = -0,14128 + 0,61428Со (60“С);
для негидратируемых фосфолипидов
С, = -0,27019 + 0,47307Со (20°С);
С = -0,25000 + 0,42000Со (40°С);
С. = -0,23807 + 0,38928Со (60°С).
С увеличением общей концентрации фосфолипидов увеличивается кон-
центрация их ассоциированных молекул; с повышением температуры сис-
темы фосфолипиды-неполярный растворитель концентрация ассоцииро-
ванных молекул снижается. При одних и тех же концентрациях фосфоли-
пидов, температурах системы и растворителях наиболее склонны к ассоци-
ации гидратируемые фосфолипиды. В модельном масле концентрация ас-
социированных молекул фосфолипидов выше, чем в четыреххлористом
углероде.
Процесс ассоциации фосфолипидов в неполярных растворителях харак-
теризуется следующими основными показателями: критическая концент-
рация ассоциации (ККА), критическая температура деассоциации (КТД)
и критическая температура индивидуализации (КТИ).
Под ККА понимают минимальную концентрацию фосфолипидов в раст-
ворителе, выше которой наблюдается образование ассоциатов за счет воз-
никновения межмолекулярных водородных связей.
В табл. 6.10 приведены значения критической концентрации ассоциации
фосфолипидов, растворенных в четыреххлористом углероде и в модельном
Таблица 6.10
Влияние температуры на критическую концентрацию ассоциации (ККА)
фосфолипидов в четыреххлористом углероде и в модельном масле
Фосфолипиды ККА (в %) при t, °C
20 35 45 20 45 60
В четыреххлористом углероде В модельном масле
Соевые
гидратируемые 0,14 0,19 0,21 0,12 0,17 0,23
негидратируемые 0,60 0,62 0,63 0,57 0,60 0,61
сумма 0,25 0,30 0,33 0,21 0,26 0,34
Подсолнечные
гидратируемые 0,05 0,07 0,08 0,03 0,05 0,07
негидратируемые 0,35 0,37 0,38 0,34 0,35 0,36
сумма 0,07 0,09 0,10 0.04 0,07 0,09
135
-60 -W -20 -0 20 W 60 60 t,V
Рис. 6.1. Зависимость критической кон-
центрации ассоциации (ККА) соевых фос-
фолипидов от температуры:
а - в четыреххлористом углероде; б - в
модельном масле; 1 - суммы; 2 - гидра-
тируемых; 3 - негидратируемых
масле [3, 4, 34, 157]. Для гидратируемых фосфолипидов ККА ниже, чем
для суммы и негидратируемых фосфолипидов; ККА изученных фракций
фосфолипидов подсолнечных масел ниже, чем ККА фракций фосфолипи-
дов соевых масел.
Таким образом, наиболее склонны к образованию ассоциатов за счет
возникновения межмолекулярных водородных связей гидратируемые
фосфолипиды, причем фосфолипиды подсолнечных масел более склонны
образовывать ассоциаты по сравнению с фосфолипидами соевых масел.
ККА молекул всех фракций (гидратируемая, негидратируемая, сумма)
фосфолипидов, растворенных в четыреххлористом углероде и модельном
масле, увеличивается при повышении температуры.
Анализ зависимости ККА от температуры позволяет оценить граничные
температуры, при которых растворенные молекулы фосфолипидов перехо-
дят в ассоциированное и неассоциированное (индивидуальное) состояние.
Первая температура соответствует началу распада ассоциатов (деассоциа-
ция) — критическая температура деассоциации (КТД), а вторая - завер-
шению распада ассоциатов, т. е. соответствует полной индивидуализации
молекул (КТИ). С повышением температуры от КТД до КТИ доля неас-
социированных молекул возрастает от 0 до 1.
Ниже приведены зависимости ККА от температуры, а из данных зави-
симостей и графика (рис. 6.1) определены КТД [34, 221].
Подсолнечные фосфолипиды:
а) в четыреххлористом углероде:
для суммы фосфолипидов
ККА = 0,05041 + 0.00099Г;
для гидратируемых фосфолипидов
ККА = 0,02578 + 0,0012t;
б) в модельном масле:
для суммы фосфолипидов
ККА = 0,01833 + 0.00125Г;
для гидратируемых фосфолипидов
ККА = 0,01899 + 0,00154г;
136
Соевые фосфолипиды:
а) в четыреххлористом углероде:
для суммы фосфолипидов
ККА = 0,19001 + 0,00322г;
для гидратируемых фосфолипидов
ККА = 0,08119 + 0,00309г;
б) в модельном масле:
для суммы
ККА = 0,13000+ 0,00362г;
для гидратируемых фосфолипидов
ККА = 0,60111 + 0,003011.
В табл. 6.11 приведены значения КТД для фосфолипидов, растворенных
в четыреххлористом углероде и модельном масле [34,221].
КТД фосфолипидов, растворенных в четыреххлористом углероде, ни-
же, чем в модельном масле; для суммы фосфолипидов КТД более низкая,
чем для гидратируемых фосфолипидов. Указанные зависимости отмечены
как для подсолнечных, так и для соевых фосфолипидов [34] . При сравне-
нии КТД подсолнечных и соевых фосфолипидов выявлено, что КТД для со-
евых фосфолипидов более низкая, чем для подсолнечных, т. е. для соевых
фосфолипидов необходима более низкая температура для того, чтобы все
молекулы находились в ассоциированном состоянии.
Верхние температурные пределы индивидуализации (КТИ) зависят от
концентрации фосфолипидов в растворах [3, 34, 157, 221]. Для нахожде-
ния КТИ определяется зависимость отношения концентрации индивидуаль-
ных молекул фосфолипидов Си к общей концентрации фосфолипидов в
растворителях Со от температуры. Эта зависимость имеет линейный харак-
тер в координатах V^h/Co — температура (рис. 6.2).
В табл. 6.12 приведены зависимости КТИ от концентрации фосфолипи-
дов в четыреххлористом углероде и модельном масле [221].
Таблица 6.11
Влияние состава фосфолипидов и природы
растворителя на критическую температуру
деассоциации (КТД)
Фосфолипиды КТД (в “О в растворителе
четыреххло- ристый угле- род модельное масло
Соевые сумма -59 -36
гидратируемые -26 -20
Подсолнечные сумма -50 -15
гидратируемые -20 -12
137
Рис. б 2. Зависимость степени деассоциа-
ции от температуры для растворов сое-
вых фосфолипидов в модельном масле
а - суммы; б - гидратируемых: 1 — кон-
центр алией 0.5%; 2 - концентрацией 1.09 :
3 - концентрацией 1,25%; в — дегидрати-
руемых , 1 - концентрацией 1,0%; 2 - кон-
центрацией 1,25%; 3 - концентрацией 2,0%
Данные табл. 6.12 и рис. 6.1 показывают, что с увеличением темпера--
туры уменьшается прочность связи фосфолипидов в ассоциатах С увели-
чением концентрации фосфолипидов как в четыреххлористом углероде,
так и масле КТИ повышается. Для гидратируемых фосфолипидов, раство-
ренных как в четыреххлористом углероде, так и масле, значение КТИ при
всех изученных концентрациях самое высокое. Это свидетельствует о том,
что молекулы гидратируемых фосфолипидов образуют наиболее прочные
ассоциаты в результате возникновения межмолекулярных водородных
связей Фосфолипиды, выделенные из подсолнечных масел, образуют бо-
лее прочные ассоциаты по сравнению с фосфолипидами, выделенными
из соевых масел. На это указывает более высокая КТИ для одних и тех
же концентраций фосфолипидов в изучаемых растворителях.
Зависимость критической температуры индивидуализации /КТИ)
от концентрации подсолнечных и соевых фосфолипидов
в неполярных растворителях
Таблица 6 12
Концент- рация рас- творов, % КТИ (в °C) подсолнечных фосфолипидов Концент- рация рас- творов, % КТИ (в °C) соевых фо.'фол И ПИДОВ
сумма гидрати- руемые негидра- тируемые сумма гидрати- руемые негидра- тируемые
0.5 0 105 В четыреххлористом углероде 157 90 0.5 80 100
1.25 119 168 100 1,0 95 130 85
2,00 130 190 110 1,25 105 140 95
0,50 116 165 2,00 В модельном масле 100 0,5 90 124 115
1.25 136 178 110 1,0 ill 152 г2
2.00 158 198 121 1,25 120 164 100
2,00 — — 125
138

Способность фосфолипидов к ассоциации обусловливается уменьше-
нием свободной энергии системы, которая определяется энтальпийными и
энтропийными факторами [1, 239] . Энтропийная часть системы обуслов-
лена главным сбразом свойствами молекул фосфолипидов, а энтальпий-
ный вклад - межмолекулярными взаимодействиями (внутримицеллярны-
ми, взаимодействиями растворитель — растворитель, взаимодействиями
растворитель — молекулы фосфолипидов) [1, 106, 136]
В работах [34, 221] с помощью уравнения изобары ассоциации [1,
75]
dhtKKA/dT = - -Ц-; AS = ДЯ/Г,
яг
где ККА - критическая концентрация ассоциации, моль/л; ДЯ — изменение энталь-
пии, кДж/моль; - изменение энтропии, кДж/ (моль-Ю; Т - температура, К,
определены термодинамические характеристики процесса ассоциации фос-
фолипидов (табл.6 13).
Энергия взаимодействия фосфолипидов в ассоциатах изменяется в со-
ответствии со структурными особенностями фосфолипидов (сумма, гидра-
тируемые, негцдратируемые), их природой (подсолнечные, соевые) и тем-
пературой системы.
Для всех фракций фосфолипидов ассоциация протекает с экзотерми-
ческим тепловым эффектом, однако энергия ассоциации для гидратируе-
мых фосфолипидов и суммы фосфолипидов соответствует энергии водо-
родной связи, т. е. 12 кДж/моль < Д// < 52кДж/мо.ль; для негидратируе-
мых фосфолипидов энергия связи в ассоциатах меньше 12 кДж/моль. Это
свидетельствует о том, что ассоциация для молекул негидратируемых фос-
фолипидов осуществляется в основном в результате ван-дер-ваальсовых
сил. Энергия связи в ассоциатах, образованных молекулами подсолнечных
фосфолипидов, несколько выше, чем для соевых фосфолипидов. Это еще
раз подтверждает тот факт, что подсолнечные фосфолипиды более склонны
к ассоциации, чем фосфолипиды, выделенные из соевых масел.
На процесс ассоциации фосфолипидов наряду с такими факторами, как
концентрация и структура молекул фосфолипидов, температура системы и
природа растворителя, значительно влияют внешние воздействия механи-
ческие, электромагнитные и др.
В работах [4, 36] показали влияние переменных электромагнитных
(ЭМ) полей на процесс ассоциации фосфолипидов в четыреххлористом уг-
лероде. В табл. 6 14-6.16 приведены данные по изменению основных по-
казателей процесса ассоциации фосфолипидов после воздействия ЭМ поля.
Воздействие переменного ЭМ поля приводит к увеличению ККА для
всех фракций фосфолипидов, т. е. к снижению интенсивности процесса
ассоциации молекул фосфолипидов в неполярных растворителях.
КТД и КТИ фосфолипидов после воздействия ЭМ поля также снижа-
ются, что указывает на уменьшение прочности связи в ассоциатах.
В табл. 6.17 приведены термодинамические характеристики (энталь-
пия, энтропия) процесса ассоциации фосфолипидов в четыреххлористом
углероде после воздействия ЭМ поля, В результате воздействия перемен-
ною ЭМ поля на систему фосфолипиды - неполярный растворитель наблю-
дается снижение интенсивности процесса образования ассоциатов молекул
140
Таблица 6.14
Влияние ЭМ поля на критическую концентрацию ассоциации (ККА)
фосфолипидов в четыреххлористом углероде
Фосфолипиды Критическая концентрация ассоциации (в %) при температуре, °C
20 35 45
1 2 3 4 5 6 7
Подсолнечные
гидратируемые 0,05 0,20 0,07 0,25 0,08 0,28
негидр атиру емые 0,35 0,45 0,37 0,47 0,38 0,48
сумма Соевые 0,07 0,23 0,09 0,28 0,10 0,30
гидратируемые 0,14 0,30 0,19 0,35 0,21 0,40
негидратируемые 0,60 0,75 0,62 0,77 0,63 0,78
сумма 0,25 0,41 0,30 0,45 0,33 0,48
Примечание. В графах 2, 4, 6 - данные, полученные до воздействия ЭМ
поля, а в графах 3, 5, 7 - после воздействия.
фосфолипидов. Это подтверждается снижением значений энтальпий обра-
зования ассоциатов и увеличением энтропии системы.
Наряду с взаимодействиями, обусловленными образованием межмо-
лекулярных водородных связей в системе фосфолипиды - неполярный
растворитель, обнаружено комплексоподобное взаимодействие, которое
осуществляется в результате возникновения межмолекулярных координа-
ционных связей типа C=N...Me, H2N..,.Me и др. Наиболее характерен такой
тип взаимодействия для суммы фосфолипидов; для гидратируемых фосфо-
липидов такой тип взаимодействия обнаружен в меньшей степени; для не-
гидратируемых фосфолипидов характерно в основном образование внутри-
молекулярных координационных связей.
Взаимодействия, обусловленные возникновением ван-дер-ваальсовых
сил. Такие взаимодействия приводят к образованию мицелл фосфолипи-
Таблица 6.15
Влияние ЭМ поля на критическую температуру
деассоциации (КТД) фосфолипидов
в четыреххлористом углероде
Фосфолипиды Критическая температура деассоциации, °C
1 2 3
Подсолнечные
сумма -50 -60
гидратируемые Соевые -20 -40
сумма -59 -90
гидратируемые -26 -55
Примечание. В графе 2 - данные, полученные
до воздействия ЭМ поля, в графе 3 - после воздействия.
141
Таблица 6.16
Влияние ЭМ поля на критическую температуру
индивидуализации (КТИ) фосфолипидов
в четыреххлористом углероде
Коноешрация фосфолипидов, % Критическая температура индивидуализации (в °C) фосфолипидов
сумма гидратиру- емые негидрати- руемые
1 2 3 4 5 6 7
Подсолнечные 0,50 105 65 157 70 90 55 1,00 ПО 85 165 90 95 75 1,25 119 100 168 110 100 85 2,00 130 120 190 145 110 90 Соевые 0,50 80 50 100 60 1,00 95 72 130 78 85 50 1,25 1 05 82 140 88 95 60 2,00 - 90 - 95 115 75 Примечание. В графах 2, 4, 6 - данные, полу- ченные ди воздействия ЭМ поля, а в графах 3, 5, 7 - после воздействия.
дов в неполярных растворителях более высокого порядка, чем в результа-
те образования ассоциатов за счет межмолекулярных водородных связей.
Процесс мицеллообразования фосфолипидов в неполярных раствори-
телях изучался многими исследователями [289, 290, 311], однако и до
настоящего времени этот процесс изучен недостаточно. Были предложены
многочисленные модели равновесия; в основе их лежит динамическая мо-
дель, согласно которой между молекулами поверхностно-активных ве-
ществ в мицеллах и в растворе существует подвижное равновесие (1, 65,
271]. Мицеллообразованию фосфолипидов в неполярных растворителях
способствует наличие малых количеств воды [290]. Для мицеллообразо-
вания в неполярных средах характерно образование предмицеллярных
структур из двух-шести молекул [289].
Характер мицеллообразования зависит от полярности растворителя:
с увеличением полярности растворителя устойчивость мицелл снижается,
повышается истинная растворимость фосфолипидов, уменьшаются числа
агрегации мицелл. Затем наступает обращение мицелл, проходящее через
фазу полного растворения.
Необходимо отметить, что в основном процесс мицеллообразования
фосфолипидов в неполярных растворителях изучался на фосфатвдилхо-
линах, выделенных из желтков яиц [290]'.
Для фосфатидилхолинов, выделенных из желтков яиц, показано, что
при диэлектрической проницаемости е « 29 эти фосфолипиды находятся в
142
143

в,Н1н-10}
Рис. 6.4. Изотермы межфазного натяже-
ния растворов подсолнечных фосфоли-
пидов в модельном масле на границе
с водой при температуре 60°С:
1 - гидратируемых; 2 - негидратируе-
мых; 3 - суммы
Рис 6.3. Изотермы межфазного натяже-
ния растворов подсолнечных фосфоли-
пидов в модельном масле на границе с
водой:
1 - гидратируемых; 2 - негидратируе-
мых; 3 - суммы: 1, 2,3 - при темпера-
туре 20°С; ] , 2', З' - при температу-
ре 45°С
мономерном состоянии [289, 290, 373, 385 J . Изучению процесса мицелло-
образования фосфолипидов, выделенных из растительных масел, посвящено
лишь несколько работ [129, 130] . Так, в работе [129] на основании из-
мерения межфазного натяжения растворов фосфатидилхолина в гексане на
границе с водой определена критическая концентрация мицеллообразова-
ния (ККМ) фосфатидилхолинов в гексане 0,36-10~*%.
ККМ определяли как точку перелома кривой зависимости а = /(IgC)
на основании измерения межфазного натяжения на границе раздела фаз
раствор фосфолипидов в неполярном растворителе - вода (рис. 6.3 и 6.4).
Исследованиями авторов показано, что для процесса мицеллообразо-
вания фосфолипидов, выделенных из растительных масел, в неполярных
растворителях характерно два значения KKM-KKMi и ККМ2. Под KKMi
понимают ту минимальную концентрацию, при которой начинается образо-
вание ассоциатов молекул фосфолипидов за счет возникновения межмо-
лекулярных водородных связей, а под ККМ2 - концентрацию, при которой
начинается образование молекулами фосфолипидов мицелл за счет меж-
молекулярных ван-дер-ваальсовых сил.
В табл. 6.18-6.20 приведены значения KKMi и ККМ2 фосфолипидов
в четыреххлористом углероде, гексане и модельном масле.
Наиболее склонны к мицеллообразованию в изученных растворителях
молекулы гидратируемых фосфолипидов, причем способность к мицел-
лообразованию более выражена для подсолнечных фосфолипидов по срав-
нению с соевыми.
Процесс мицеллообразования молекул гидратируемых и суммы фосфо-
липидов характеризуется двумя ККМ, а процесс мицеллообразования не-
гидратируемых фосфолипидов - только одним ККМ; при этом темпера-
тура и природа неполярного растворителя практически не влияют на вели-
чину ККМ негидратируемых фосфолипидов.
144

Таблица 6.19
< ритические концентрации мицеллообразования (ККМ j и KKMi) молекул фосфолипидов в четыреххлористом углероде
Фосф^тапилы ККМ] при/, °C KKMj при г, °C
20 35 45 20 35 45
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 | 13
Подсолнечные гидратируемые 0.04 8.11 0,06 12,17 0,07 1 4,20 0,07 16,23 0.10 20,28 0 15 30 4 9 негидрагируемые 0,30 57,70 0,3<- 57.70 0,30 57,70 - - - сумма 0,06 11.87 0,07 13.85 0,09 17.81 0,15 29,68 0,20 39.58 0.23 45 52 Соевые гидратируемые 0,13 24,82 0,17 32,46 0,22 42.00 0,20 38,18 0 23 43 91 0 25 47 73 негидратируемые 0.55 97,33 0,55 97,38 0.55 97 Зм - - 2 сумма 0,23 42,66 0,27 50.08 0.32 59,35 0.30 55.64 0,35 64,92 0,40 74,19
Примечание. В графах 2,4. 6, 8, 10. 12 размерность дана в %, а в графах J. 5. 7. 9, 11, 13 - в моль/л-КГ*
Критические концентрации мицеллообразования (ККМ\ и KKM-i) молекул фосфолипидов
в модельном масле
Таблица 6.20
Фосфолипиды KKMi при Г. °C ККМ2 при г, °C
20 45 60 20 45 60
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Подсолнечные гидратируемые 0,01 1,22 0,03 2,67 0,05 6,12 0,04 4,60 0,07 8,05 0,10 11,50 негидратиру емые 0,30 32,68 0,30 32,68 0,30 32,68 суммл 0,03 3.58 0,05 5,97 0,07 8,36 0,10 11,22 0,20 16,82 0,35 20,19 "драгируемые 0,10 11,58 0,15 17,30 0,20 23,06 0,15 16,23 0,20 21,64 0,25 21,09 негидрагируемые 0,55 56,76 0,55 56.76 0.55 56,76 сумма 0,20 22,40 0,25 28,10 0,30 33,61 0,25 26,28 0,35 36,80 0,40 42.05 Примечание. В графах 2,4, 6, 8,10.12 размерность дана в %, а в графах 3, 5, 7,9. 11,13 - в моль/л-10 ‘
Для гидратируемых и суммы фосфолипидов при изученных температу-
рах наблюдается следующая закономерность значения ККМ фосфолипидов
в гексане несколько ниже, чем в четыреххлористом углероде. Это можно
объяснить некоторым различием в полярности данных растворителей-
диэлектрическая проницаемость гексана (е = 1,890) ниже, чем диэлектриче-
ская проницаемость четыреххлористого углерода (е = 2,238).
Для гидратируемых фосфолипидов и суммы фосфолипидов наблюда-
ется увеличение значений как ККМ,, так и ККМ2 с повышением темпера-
туры. Несмотря на более высокую диэлектрическую проницаемость модель-
ного масла (е = 2,9-гЗ.О), значения ККМ фосфолипидов, растворенных в
модельном масле, ниже, чем в гексане и в четыреххлорисгом углероде.
Для выяснения механизма мицеллообразования и природы сил, возни-
кающих в мицеллах на отдельных стадиях процесса, необходимо знать тер-
модинамические характеристики этого процесса.
В табл. 6.21-6.23 представлены данные, полученные авторами с исполь
зованием уравнений изобар мицеллообразования (1,72]
Энергия взаимодействия молекул фосфолипидов в процессе мицелло-
образования зависит от их химической структуры, температуры, при кото-
рой протекает процесс, а также от природы растворителя и степени его по-
лярности. Это подтверждает величина Д/7, которая зависит не только от
температуры и природы растворителя, но и от химической структуры мо-
чекул фосфолипидов. При различных температурах в изученных раствори-
телях наиболее высокий уровень энергии мицеллообразования имеют гид-
ратируемые фосфолипиды (подсолнечные и соевые) как на! стадии мицеп-
лообразоьания, так и на II. При этом энергия мицеллообразования для гид-
ратируемых фосфолипидов примерно равна энер1ии водородной связи
(12-52 кДж/моль) [1,72]; энергия мицеллообразования суммы фосфо-
липидов на I стадии соответствует энергии водородной связи, а на II — энер
гии ван-дер-ваальсовых сил. Для негидратируемых фосфолипидов крити-
ческая концентрация мицеллообразования (ККМ) практически не зависит
от температуры Такая картина наблюдается для всех изучаемых раство-
рителей При сравнении энергий мицеллообразования (в изученных интер-
валах температур) для молекул гидратируемых фосфолипидов и суммы
(подсолнечных и соевых) можно отметить, что более высокая энергия
мицеллообразования характерна для системы фосфолипиды - масло, при-
чем такая закономерность наблюдается в основном на 1 стадии процесса
Энергия мицеллообразования на 11 стадии указанных систем (фосфолипи-
ды-масло, фосфолипиды-гексан, фосфолипиды-четыреххлористый уг-
лерод) практически одинакова.
Процесс мицеллообразования фосфолипидов растительных масел в
неполярных растворителях является двухстадийным процессом; при
этом 1 стадия характеризуется образованием мицелл в результате воз-
никновения межмолекулярных водородных связей с энергией 12—
52 кДж/моль, а II — образованием мицелл в основном в результате возник-
новения ван-дер-ваальсовых сил.
При сравнении энергии ассоциации молекул фосфолипидов (см.
табл- 6.13) для систем фосфолипиды - четыреххлористый углерод, фосфо-
липиды — модельное масло и энергии мицеллообразования фосфолипидов
148
с
и
х
R
ю

Д51 [в Дж/(моль-К) ] при г, °C I I Д5Яв Дж/(моль-кл прт,
В образовании комплексов фосфолипиды — белки существенное зна-
чение имеют силы ван-дер-ваальса; несмотря на то. что они обладают малой
энергией, с помощью этих сил возможно активное взаимодействие благо
даря большому количеству одновременных взаимодействий (коопера-
тивности) .
Сведения о роли тех или иных взаимодействий при построении фосфо
липопротеидных комплексов отраничены Для митохондриальных мембран
установлено электростатическое (ионное) взаимодействие фосфолипид-
ных и белковых молекул.
Аналогичны по характеру связи между белком - цитохромом С и фос-
фолипидами, имеющими избыток отрицательных зарядов ‘ 1 фосфатидил-
инозиты, фосфатидилглицерины), связи азотсодержащих фосфолипи-
дов (фоссратидилхолины, фосфатидил этаноламины) с белками, также
несущими избыток отрицательных зарядов [191] Наряду с ионными
взаимодействиями важную роль играют неионные (гидрофобные) взаимо-
действия; при этом жирнокисло гные остатки фосфолипидов взаимодей-
ствуют с теми аминокислотными остатками белков, в которых преобла-
дают гидрофобные белковые цели [272].
Наряду с указанными комплексами фосфолипидов с белками, образо-
вание которых обусловлено жизнедеятельностью клетки масличных се-
мян, известны фосфолипопротеиды, возникающие под влиянием техноло-
гических процессов и прежде всего под действием тепла в присутствии
влаги.
В связи с этим особое значение белково-липидные взаимодействия
приобретают в технологии получения растительных масел.
В. П. Ржехиным [180. 191] предложена классификация взаимодейст-
вия липидов с белковыми веществами применительно к технологии расти-
тельных масел
Возможные типы связей между фосфолипидами и белками представ-
лены ниже (1 — аргинин, 2 — лизин, 3 — глютелиновая кислота).
152
Сорбционное взаимодействие Это взаимодействие, обусловливающее
селективность извлечения липидов из семян при прессовании и экстракции
органическими гидрофобными растворителями маслосодержащих мате-
риалов. При сорбционном взаимодействии соединения получаются непроч-
ные и распадаются при экстракции липидов из измельченных семян и жмы-
хов под действием неполярного органического растворителя Из всех
групп липидов наибольшая энергия сорбционного взаимодействия с бел-
ками отмечена для фосфолипидов [174], что обусловлено повышенной
полярностью их молекул.
Взаимодействие, приводящее к образованию липопротеидных комп-
лексов. Из таких комплексов липиды могут быть высвобождены горячим
этиловым спиртом. Устойчивые липопротеидные комплексы такого типа
образуются при интенсивных тепловых и влажно-тепловых воздействиях
на измельченные масличные семена и продукты их переработки. Извлече-
ние фосфолипидов из комплексов возможно этиловым спиртом и другими
полярными растворителями, например смесью хлороформ -метанол (2:1).
Взаимодействие, приводящее к образованию особо прочных фосфо-
153
липопротеидных соединений- Из таких соединений липиды могут быть вы-
свобождены лишь после разрушения их растворами щелочей.
В работа?. [174, 188, 190] показана возможность образования комп-
лексов фосфолипидов различных масел с изолированными белками мас-
личных семян. Установлена активность взаимодействия отдельных групп
фосфолипидов с белками (по возрастанию): фосфатидные кислоты - фос-
фатидилинозитолы — фосфатидилсерины - фосфатидилэтаноламины - фос-
фатидилхолины [189].
7.2 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С МЕТАЛЛАМИ
В разд. 5 было показано, что в фосфолипидах растительных масел при-
сутствует значительное количество ионов металлов (кальций, магний,
калий, нагрий, железо и др.), так как отдельные группы фосфолипидов
растительных масел способны взаимодействовать с ионами металлов.
В работах [286, 304] установлено, что соединения с металлами обра-
зуют только фосфолипиды, обладающие ярко выраженными кислотными
свойствами, т. е. фосфатидилсерины, фосфатидные кислоты, дифосфати-
дил- и трифосфатидилинозиголы.
В работе [304] отмечена высокая комплексообразующая способ-
ность фосфатидилсеринов и приведена возможная структурная формула
комплекса
Н2С
О
—В
R—С—О—СН
О
нг
На
содержатся
следующая
[286]
в масле в
структура
основании того, что фосфатидные и полифосфатидные кислоты
виде кальциевых и магниевых солей, предложена
соединения фосфатидилинозитолов с металлами
Ca^Mg*2)
Л
154
B табл. 7.1 приведена количественная характеристика металлов в от-
дельных группах гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов под-
солнечных и соевых масел [113, 210] . Во всех группах фосфолипидов,
как гидратируемых, так и негидратируемых, обнаружены металлы. От-
мечена избирательность отдельных групп негидратируемых фосфолипидов
к взаимодействию с металлами. Так, фосфатидилинозитолы образуют
комплексы со всеми изученными металлами; фосфатидилсерины и фосфа-
тидные кислоты в основном взаимодействуют с двух- или трехвалентными
металлами, полифосфатидные кислоты и дифосфатидил глицерины взаи-
модействуют только с представителями щелочноземельных металлов; для
фосфатидилэтаноламинов характерно взаимодействие с одновалентными
металлами — калием и натрием. Содержание металлов в отдельных группах
негидратируемых фосфолипидов, выделенных из соевых масел, значи-
тельно выше, чем для подсолнечных. Это является одной из причин боль-
шего содержания негидратируемых фосфолипидов в соевых маслах. Ниже
приведены некоторые возможные структурные формулы молекул отдель-
ных групп фосфолипидов, содержащих металлы [116, 119, 120].
Фосфатидилэганолами ны
Rf
О—СН3
H2-
О—СН
,ONa(K+)
OCH2CH2NH2
Фосфатидилсерины
157
156
(2)
где Me -Na*, K+;Me2-Ca+2, Mg+2, Fe*2, Си*2; Ме3-А1+3, Fe+3
Фосфатидные кислоты
(i)
(2)
158
Фосфатидилинозитолы
7.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С НЕОМЫЛЯЕМЫМИ ЛИПИДАМИ
В фосфолипидах, извлекаемых из растительных масел, содержится
значительное количество неомыляемых липидов, присутствие которых
объясняется наличием химических или адсорбционных связей [5, 79, 123,
236]. В составе дегидратируемых фосфолипидов подсолнечных и соевых
масел обнаружены неомыляемые липиды, которые находятся в химиче-
ской связи с фосфолипидами.
Наличие неомыляемых липидов в группах гидратируемых фосфолипи-
дов обусловлено образованием в растительных маслах смешанных мицелл
фосфолипидов, в состав которых с молекулами гидратируемых фосфоли-
пидов входят молекулы их дегидратируемых форм, связанных с неомыля-
емыми липидами. В результате воздействия воды или другого поляризую-
щего соединения такие мицеллы теряют свою устойчивость в масле и об-
разуют осадок гидратируемых фосфолипидов-
Сложные соединения с неомыляемыми липидами способны образовы-
вать фосфатидные кислоты, дифосфатидилглицерины и полифосфатидные
кислоты [118, 236]. В табл. 7.2 приведена характеристика неомыляемых
липидов, выделенных из отдельных групп гидратируемых фосфолипидов.
В фосфолипидах льняных масел химически связаны только стеролы, в фос-
фолипидах подсолнечных масел — стеролы и алифатические спирты, а в
фосфолипидах соевых масел — в основном стеролы и алифатические спир-
ты и в менее значительных количествах - углеводороды.
Установлено, что фосфатидные кислоты, выделенные из соевых масел,
образуют соединения со стеролами, алифатическими спиртами и углеводо-
родами, полифосфатидные кислоты — со стеролами и алифатическими спир-
тами, а дифосфатидилглицерины — с углеводородами; фосфатидные и по-
лифосфатидные кислоты, выделенные из подсолнечных масел, взаимодей-
ствуют только со стеролами и алифатическими спиртами.
Предположительно химическую структуру соединения фосфатидной
кислоты со стеролами можно представить в виде [123, 124]
159

а соединение дифосфатвдной кислоты с алифатическим спиртом следую-
щим образом:
где R-з - алифатический спирт.
7.4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С УГЛЕВОДАМИ
В процессе получения и переработки растительных масел фосфолипиды
взаимодействуют не только с металлами, неомыляемыми липидами, но и с
углеводами. В результате этой реакции образуются меланоидиновые соеди-
нения — продукты сахароаминного взаимодействия аминоалкоголей фос-
фолипидов с углеводами, так называемые меланофосфатиды [181, 191].
Меланофосфатиды могут образовываться при извлечении масла прес-
сованием, дистилляции мисцеллы, хранении масла и сушке фосфатидных
концентратов, так как фосфолипиды нерафинированных масел способны
удерживать в сорбированном состоянии от 4,0 до 12,0% к массе свободных
углеводов [188].
Взаимодействию фосфолипидов с углеводами посвящены работы
В. П. Ржехина и его учеников [84, 181, 187, 191]. Было установлено, что
присутствие кислорода существенно не влияет на скорость накопления
меланофосфатидов, так как интенсивность окраски образцов, прогретых
в углекислом газе и воздухе, почти совпадает [181, 187]. Интенсивность
окраски масла и растворенных в нем фосфолипидов сильно увеличивает-
ся с повышением температуры (при 105—110°С в 5—6 раз) [223].
Особенно благоприятные условия для образования меланофосфати-
дов возникают при дистилляции мисцеллы вследствие перехода значитель-
ного количества углеводов из экстрагируемого материала в мисцеллу и
проведении процесса при повышенных температурах. Предотвратить мела-
ноидинообразованне можно путем предварительного удаления углеводов
11 - 727 161
Таблица 73
Содержание углевооов /в %; в негиоратируемых соевых
и подсолнечных фисфолипиоах
Группа фос фолили дов Араби- ноза Ман- ноза Галак- тоза Глюко- за Маль- тоза Рафи- ноза Н виден- инфици- рован- ный уг- левод
Соевые фосфолипиды
Фосфатидилино- зитолы U,049 0-045 0,04о 0,(М5 Нет Не-Г Нет
Фосфатидиле ерины 0.065 0.075 0.070 0,016 Нет Нет Нет
Фосфатидилэтано- ламины 0,076 0.087 0,083 0,и40 Подсолнечные фосфолипиды Нет 0,040 0,018
Фосфатидилино- зитолы Следы Нет 0.022 0.017 Нет Нет Нет
Фосфатидилсерины Нет Нет 0,020 0.009 Hei 0.008 0,и04
Фосфатидилэтано- ламины Нет Нет 0,035 0,025 0,015 0,00ft 0,002
и других веществ, содержащих альдегидные группы, из мисцеллы перед
ее дистилляцией. Такое удаление может быть достигнуто с помощью про-
мывки мисцеллы растворами электролитов [11, 125, 191] *
В табл. 7.3 приведены данные по содержанию отдельных представите-
лей углеводов в индивидуальных группах негидратируемых фосфолипи-
дов подсолнечных и соевых масел [114,158,191J.
В негидратируемых фосфолипидах в химической связи с углеводами
находятся группы фосфатидилинозитолов, фосфатидилсеринов и фосфа-
тидилэтаноламииив. В группах фосфатидных кислот, дифосфатидилгли-
церинов и полифосфатидных кислот углеводы не идентифициро-
ваны.
Наблюдается селективность во взаимодействии отдельных трупп фос-
фолипидов с углеводами. Так, фосфатидилинозитолы и фосфагидилиери-
ны, выделенные из соевых масел, образуют соединения только с моноса-
харидами (арабиноза, глюкоза, галактоза, манноза), а фосфатидилэтано-
ламины - с моносахаридами и трисахаридами (рафиноза); фосфатидилино-
зитолы, выделенные из подсолнечных масел, взаимодействуют только с
моносахаридами (глюкоза, галактоза, арабиноза), в то время как фосфа-
тидилсерины и фосфатидилэтаноламины образуют соединения с моносаха-
оидами, дисахарндами (мальтоза) и трисахаридами (рафиноза). Наличие
углеводов в составе фосфатидилинозитолов можно объяснить, во-первых,
тем, что углеводы могут быть структурными элементами этой группы фос-
фолипидов
* А с. 861397 (СССР). - Б И., 1981, № 33.
162
i во вторых, реакцией меланоидинообразования
Соединения фосфатидилсеринов и фосфатидилэтаноламинов с угле-
водами образуются только за счет реакции меланоидинообразования. В
работе [181] показано, что наряду с собственно мелано фосфатидами
[структуры (1), (3), (6)] могут образовываться и более сложные соеди-
нения (структуры (2), (4), (5), (7)]
Для фосфатидилэтаноламинов и пентоз
О
п4-
О— СН
,он
‘г
(3)
'OCH2CH2N
НС(СНОН),СН2ОН
Для фосфатидилэтаноламинов и гексоз
163
он
(4)
-)СН2СН2
Hl
О
R.
Н,
он
(5)
OCH2CH2NH'
НОЮр-^НСНдОН
Для фосфатидилсеринов и гексоз
О
(»)
R—С—О—СН.
О
R;
О—СИ
СН2СП—N=CH(CHOH)4CH,OH
соон
,0Н
о
Н2С-
НС---СП
'ОСН2СН—№СП—С^ ^С—СН,ОН
О
164
По способности к взаимодействию с теми или иными представителями
углеводов дегидратируемые фосфолипиды соевых и подсолнечных масел
можно расположить в следующий ряд (по убыванию): фосфатидилэтано-
ламины-фосфатидилсерины- фосфатидилинозитолы [114,158] (табл, 7.3).
7.5 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С КИСЛОРОДОМ
Фосфолипиды под действием кислорода, тепла, лучистой энергии и
других воздействий легко окисляются. Окисление фосфолипидов связано
п основном с окислением входящих в их состав жирных кислот [259].
Наличие в молекуле фосфолипидов ненасыщенных кислот позволяет
заключить, что на первых стадиях процесс окисления подобен окислению
непредельных липидов.
Согласно перекисной теории первичными продуктами окисления
липидов являются перекисные соединения различных типов |258, 259].
Цепной свободнорадикальный механизм включает в себя несколько ста-
дий элементарных реакций; зарождение, продолжение, разветвление и об-
рыв цепи. Процессы окисления протекают при участии валентно-ненасыщен-
ных осколков молекул, которыми являются свободные радикалы, обла-
дающие высокой химической активностью. Причиной возникновения сво-
бодных радикалов могут быть в первую очередь сами молекулы кислоро-
да, которые при комнатной температуре являются активными бирадика-
лами, способными отрывать от жирных кислот атомы водорода (особен-
но легко это происходит с атомами водорода, находящимися в а-положении
к двойной связи)
и качестве факторов, инициирующих радикалообразование, могут быть
ионы металлов переменной валентности, различные металлоорганические
соединения, действие тепла, лучистой энергии и др.. [27, 259].
В результате свободнорадикальных реакций, а также сложных превра-
щений перекисей образуются соединения с сопряженными двойными свя-
зями, энокиси, различные карбонильные соединения, кислоты и их произ-
водные с различной длиной углеводородной цепочки [200] . Механизм
образования многих продуктов окисления изучен недостаточно, а имею-
щиеся схемы носят гипотетический характер [259] .
На скорость окисления липидов, и в частности фосфолипидов, влияют
строение радикалов жирных кислот, температурные условия процесса,
катализаторы и ингибиторы.
Рассмотрим более подробно влияние каждого из указанных факторов
на процесс окисления.
Жирнокислотный состав фосфолипидов и исходных масел, как прави-
ло, близок и включает почти те же насыщенные и ненасыщенные жирные
кислоты [ 118] Однако суммарное содержание Насыщенных кислот в фос-
фолипидах больше, чем в триацил глицеринах. В составе фосфолипидов
иногда присутствуют жирные кислоты, которые в исходном масле не обна-
руживаются Имеются сведения, что в подсолнечных фосфолипидах нахо-
дятся полиненасыщенные жирные кислоты с 20—26 углеродными атомами
[254]. Отмечено, что окисление фосфолипидов происходит именно в ре-
зультате воздействия кислорода воздуха на ненасыщенные связи жирных
165
кислот [325]. Кроме того, ненасыщенные жирные кислоты не только
увеличивают склонность к окислению фосфолипидов, но и дополнительно
ведут к образованию одорирующих веществ из продуктов распада на от-
носительно ранних стадиях окислительного процесса.
Изучено сравнительное окисление фосфатидилхолина и фосфатидил-
этаноламина [26] . Фосфатидилхолины более стойки к окислению [напри-
мер, в 100 раз по сравнению с фосфатидилэтаноламинами, потому что в
составе последних обнаружены жирные кислоты (до 18% от общего содер-
жания фосфолипидов), имеющие высокую ненасыщенность] .
Отмечено влияние жирнокислотного состава фосфолипидов подсол-
нечных масел на их окислительные свойства [26, 142].
При окислении фосфолипидов происходит снижение содержания нена-
сыщенных жирных кислот в результате образования по месту двойных
связей первичных, а затем вторичных продуктов окисления. Хотя жирно-
кислотный состав фосфолипидов отличается высоким содержанием насы-
щенных кислот, как показывают данные табл. 7.4, однако содержание пе-
рекисей в них в 6 раз, а карбонильных соединений в 8 раз больше, чем в
исходном масле (табл. 7.5). Это объясняется высокой реакционной способ-
ностью жирных кислот фосфолипидов за счет катализирующего действия
аминогрупп [356], а также ионов металлов, содержание которых в фос-
фолипидах значительно выше, чем в маслах [113,119] .
В процессе окисления в фосфолипидах наблюдается сначала некото-
рый рост, а затем снижение перекисных соединений; при этом содержание
карбонильных соединений вначале увеличивается, а затем остается при-
Табл и ц а 7.4
Изменение жирнокислотного состава подсолнечных фосфолипидов
при нагревании
Образцы Содержание жирных кислот, %
низко- молеку- лярные С16:0 С18:0 с v20:0 ES С16:1 С18:1 С18:2 EUS
Фосфоли-
пиды
исход- 0,32 15,97 5,32 2,04 23,65 1,81 13,15 61,39 76,35
ные прогре- тые при 80°Св течение време- * ни, ч 1 0,58 16,32 5,44 2,09 24,43 1,17 14,14 59,56 75,57
2 0,61 17,33 5,79 2,08 25,81 0,98 14,42 58,89 74,19
3 0,64 18,57 6,30 2,00 27,51 0,92 14,48 58,01 72,49
5 0,52 18,71 6.38 1,92 27,53 0,81 14,51 57,15 72,47
7 0,69 18,92 6,72 2,12 28,45 0,70 14,35 56,50 71,55
Исходное — 5,90 3,90 — 9,80 — 21,10 69,1 90,20
масло
166
Таблица 7.5
Изменение продуктов окисления и цветности фосфолипидов
при нагревании
Образцы Перекисное число, % Ij Содержание карбонильных соединений, мк моль/г Цветность, мг72
Фосфолипиды исходные 0,60 12,6 7,1
прогретые при 80°С в течение времени, ч 1 0,68 14,9 8,0
2 0,48 13,5 9,4
3 0,47 14,2 12,1
5 0,46 14,5 14,2
7 0,42 14,6 15,3
Исходное масло 0,11 0,51 6,3
мерно на одном уровне. При окислении фосфолипидов наблюдается резкое
повышение цветности, что объясняется образованием меланофосфатидов,
а также взаимодействием карбонильных соединений с аминогруппами
фосйюлипидов, в результате чего образуются коричневые пигменты [265].
В связи с тем что жирнокислотный состав фосфолипидов существенно
влияет на окислительные свойства последних, проводятся работы по из-
менению их жирнокислотного состава в сторону насыщения. Отмечена
возможность гидрирования фосфолипидов в растворителях на стацио-
нарных и суспендированных катализаторах [55,57,142].
Изучены свойства нативных и гидрированных фосфолипидов разной
степени насыщенности [26]. В табл. 7.6 приведено изменение жирнокис-
лотного состава и качественных показателей нативных и гидрированных
фосфолипидов.
Качественные показатели гидрированных фосфолипидов существенно
отличаются от исходных, полученных в лабораторных условиях, и от про-
мышленного образца. Незначительное изменение жирнокислотного состава
фосфолипидов в сторону насыщения значительно увеличивает их устойчи-
вость к окислению, снижает содержание каротиноидов и коричневых пиг-
ментов, а также цветность.
Таким образом, гидрированные фосфолипиды выгодно отличаются
от исходных фосфолипидов стабильностьк, а также вкусом, цветом, вместе
с тем не теряют своих основных специфических свойств.
Температура существенно влияет на скорость окисления фосфолипи-
дов. Повышение температуры на 10°С приводит к увеличению скорости
кисления в 2-3 раза. Повышение температуры ускоряет реакцию развития
.епей, а также реакцию разложения гидроперекисей, вызывая т»ким обра-
зом увеличение концентрации свободных радикалов, способных иницииро-
вать и разрывать цепи [257] .
Особенно велико влияние температуры на системы с сопряженными
двойными связями, возникающими из различных промежуточных продук-
167
сч
00
иг
Качественные показатели и жирнокислотный состав фосфолипидов разной степени насыщенности
1,% —
5 Й 8 1 «н X и“
Жирно ИИ спот О X и

6"
Устойчи- вость к окислению, мин
жание коричне- вых пиг- ментов, мг/г
&
кароти- ноидов, мкг/г
в ? < * 6 ss 1 §
О § о ние вох
ё
! а S
1 1
i
СП 00 СП хо m СП XJ" VJ vy ''Ч. СП Xt Tfr «zj С1 «л О см тг оо че ГЧ сч М СО г* сч сч о? чб —
00 04 00 О*
б е 3

2 £ 3
н
s “ в 3 —< (N
в I S g ₽
3 2 В » £ S
2 о Q. Q*
. Й g- Ю ID
& | s S & 0 о
d
1 м «
S & S с
то в, особенно из высших ненасыщенных кислот, которые при высокой
температуре легко вступают в реакцию полимеризации [262] . В связи
с этим снижение воздействия на масло высоких температур позволяет
значительно уменьшить степень окисленности фосфолипидов.
Скорость окисления фосфолипидов зависит также от содержания в них
окислителей и антиоксидантов Особенно чувствительны фосфолипиды к
металлам переменной валентности [215 , 228 , 293, 294, 332], которые
являются инициаторами цепных реакций автоокисления липидов [235,
259,312].
В составе гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов обнару-
жены соединения со щелочными ~л щелочноземельными металлами, а так-
же с ионами тяжелых металлов, таких, как Fe*2, Fe*3, АГ3, Си*2 и т. д.
На скорость окисления фосфолипидов особенно влияют ионы меди и
железа, действие ионов других металлов менее значительно, так как они
обладают слабым проокислителъным действием.
Известно, что в снижении окислительной стойкости липидов медь более
активна, чем железо, ни, так как содержа ие железа в десятки раз больше,
чем содержание меди, влияние их на процессы окисления почти одинаково
[333, 334].
Приведены сведения о влиянии металлов на окисление отдельных
групп чистых фосфолипидов, а также о том, что фосфатидилэтаноламины и
фосфатидилсерины окисляются быстрее, чем фосфатидилхолины [334].
При изучении действия меди на скорость окисления соевых и рапсовых
фосфолипидов установлено, что ионы меди оказывают катализирующее
воздействие, особенно на фосфолипиды семян сои, вероятно, из-за более
высокого содержания в них линолевой кислоты (в сравнении с фосфолипи-
дами из семян рапса) [332].
Процессы окисления фосфолипидов могут катализировать и амино-
алкоголи, входящие в их состав. Установлен.! [ 187], что скорость окисле-
ния жирнокислотных радикалов фосфолипидон до вторичных продуктов
окисления в жидкофазном состоянии значительно выше скорости окис-
ления жиркокислотных радикалов триацилглицеринов соответствующих
масел при совместном их присутствии. Этот вывод был подтвержден в даль-
нейшем исследованиями других авторов [374] .
В промышленных фосфатидных концентратах скорость окисления фос-
фолипидов зависит от количества антиоксидантов, переходящих в фосфа-
тидный концентрат при его получении. Так, отмечено, что скорость накоп-
ления первичных и вторичных продуктов окисления в фосфолипидах за-
висит от содержания в них токоферолов [334].
На окислительные процессы ненасыщенных жирных кислот фосфоли-
пидов большое влияние оказывает присутствие в них таких красящих ве-
ществ, как пигменты группы хлорофиллов и каротиноидов. Добавление
хлорофилла к раствору фосфолипидов способствует более интенсивному
протеканию окисления ненасыщенных жирных кислот, ведущего наряду
с сахароаминной реакцией к образованию коричневых пигментов [84].
Так, в литературе [378] указывается на то, что даже полное удаление
свободных углеводов из масла не предотвращает образования коричневых
пигментов. Было сделано предположение, что развитие коричневого цвета
169
может быть связано с присутствием ненасыщенных жирных кислот, при
окислении которых образуются альдегиды, способные вступать в аминокар-
бонильную реакцию Этот факт подтвержден в литературе [323-325],
где установлено, что даже при полном отсутствии редуцирующих сахаров
происходит карбониламинное покоричневение из-за большого количества
реакционноспособных карбонильных компонентов, участвующих в реак-
ции самоокисления ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов.
Исследования [81) показали, что для протекания реакции окислитель-
ного покоричневения требуются более низкие температуры и влажность,
чем для протекания сахароаминной реакции. Найдено, что реакция окис-
лительного покоричневения имеет низкую энергию активации
(44 кДж/моль), протекает с достаточно большой скоростью при сравни-
тельно невысоких температурах (начиная с 37°С) в безводной среде, в го
время как сахароаминная реакция имеет более высокую энергию актива-
ции - 112 кДж/моль, и для ее протекания требуются более высокая темпе-
ратура (80сС) и водная среда [ 191J .
На основании экспериментов с окислением водных растворов фосфа-
тидилхолинов сделан вывод, что сахароаминная реакция является домини-
рующей при содержании влаги выше 5% [277, 278 J . Когда же продукт ста-
новится сухим, преобладают окислительные реакции образования корич
невых пигментов.
Скорость окислительного покоричневения отдельных фракций фосфо-
липидов зависит от их жирнокислотного состава. Так. фосфа гидилэтано-
ламины окисляются быстрее по сравнению с фосфатидилхолинами вследст-
вие брлее высокого содержания ненасыщенных жирных кислот [261].
Аналогичные результаты получены при изучении окисления эмульсии
фосфолипидов [278]
Гидроперекиси, образующиеся в качестве первичных продуктов окис-
ления ненасыщенных жирных кислот, нестабильны в фосфолипидах вслед-
ствие образования комплексов гидроперекиси и аминогруппы фосфати-
дил этаноламина, которые разлагаются с образованием имина [261 ]
+ д,он + н,и
Наличие иминовых связей установлено по характерной полосе мак-
симумом частоты (1655 см’1), свидетельствующей о наличии группы C=N
в cneKipe меланифосфагидов [191] Имины легко подвергаются реакции
присоединения и полимеризации, в результате которых возникают макро-
молекулярные коричневые продукты Последние могут образовываться
также в результате реакции альдольного уплотнения [223] . Установлено,
что в роли катализаторов этой реакции выступают имеющиеся в структуре
фосфатидилхолина фосфатная и холиповая группы.
170
--OCOR
(Г
RCOO—
СН — СН2— (СН,)
нсои--
—сн—с—сн=сн—
—с—сн=сн—
о
О
Термическое окисление
СО( СН,С-СН=СН—СН=СН—(< 112)<—CI1.,
RCOO—
о
—О СО—(CI12)С11=СН—СН—СН—'у
о
—OCOR
0-
сн2—CHjMCIL,),
Альдольное уплотнение
—СН—С—СН=СН—
сн=сн—
X- I
, -осок
RCOu--
О"
О
Д—иН=СН—
н„о
' 'RCOu-
О—CH?CH?N(CH,).
о
о
£-гидроксикетон
:н-
RCOu—
О"
I
О
t
о
Коричневые пигменты
Рис 7 I Механизм реакции покоричневения фоефатидилхолина
Механизм покоричневения нагретого фосфатидилхолина представлен на
рис. 7.1 [223].
Таким образом, коричневые пигменты могут образовываться не только
в результате взаимодействия свободных углеводов или продуктов распада
сложных углеводов с аминогруппами фосфолипидов (сахароаминная реак-
ция), но и вследствие взаимодействия аминогрупп фосфолипидов с про-
дуктами окисления ненасыщенных жирных кислот — перекисями, альде-
гидами и пр., а также в результате внутримолекулярной альдольной кон-
денсации ненасыщенных жирных кислот.
По мнению некоторых исследователей [307, 308], фосфолипиды об-
ладают антиокйслительными и ингибирующими свойствами, поэтому они
предлагались для стабилизации растительных масел и животных жиров
[330, 332]. Однако до сих пор нет четкого представления о механизме
действия фосфолипидов как антиокислителей. По мнению одних авторов
[330] , механизм антиокислительного действия можно объяснить инакти-
вацией а-метиленовой группы кислотными фосфатидными группами про-
дуктов расщепления фосфолипидов; другие указывают на инактивацию
гидроперекисей путем комплексообразования их с продуктами мелано-
идинообразования (меланофосфатидами) [ 179, 341, 342] . Некоторыми ис-
следователями [261, 385] отмечено, что эффект синергизма обнаружен у
кислых форм фосфолипидов, другими же — синергетическая активность оп-
ределена только для азотсодержащих групп фосфолипидов [433] . В лите-
ратуре [334] не установлен настоящий синергетический эффект фосфоли-
пидов, т. е. не обнаружена регенерация фенольных антиоксидантов. Фосфо-
липиды лишь замедляют расходование токоферола путем конкурентной
реакции с перекисными или другими радикальными соединениями. В ли-
тературе, посвященной изучению влияния фосфолипидов на поглощение
кислорода метиловым эфиром линолевой кислоты, установлено, что инги-
бирующее действие фосфолипидов объясняется не структурой их молекул,
а наличием таких сопутствующих веществ, как токоферолы, аминокислоты
или меланофосфатиды [422] . Очищенные фосфолипиды не проявляли
антиокислительную активность.
Некоторые авторы объясняют антиокислительные действия фосфоли-
пидов инактивацией ионов тяжелых металлов, ссылаясь на способность
фосфолипидов к комплексообразованию и солеобразованию [261, 262,
333] Противоречивость имеющихся данных, по мнению В. П. Ржехина,
можно объяснить тем, что в некоторых работах не учитывалась легкая
окисляемость фосфолипидов при их извлечении, либо не принималась во
внимание избирательность действия, вследствие чего один и тот же инги-
битор может обнаружить больцфю эффективность на одних веществах и
не проявляет ее совсем на других [191].
7.6 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ГОССИПОЛОМ
В процессе хранения хлопковых семян и извлечения масла происхо-
дит образование целого ряда интенсивно окрашенных соединений фосфо-
липидов с госсиполом и госсипурпурином [ 182-185, 191].
Во взаимодействие с госсиполом вступают фосфолипиды, содержащие
172
в своем составе первичную аминогруппу — фосфатидипсерины и фосфати-
дилэтаноламины.
При изучении структуры фосфатидилэтаноламинов, выделенных из
хлопковых масел методом ИК<пектроскопии, обнаружена полоса погло-
щения при частоте 1650 см'1, соответствующей образованию связи C=N
между NH2-группой этаноламина и карбонильной группой госсипола; при
частоте 2940 см'1 - полоса, характеризующая ароматическое (нафтиль-
ное) ядро, при 3550 см'1 - полоса, соответствующая фенольным гидро-
ксилам, и при 3400 см'1 - межмолекулярным водородным связям
[179, 191].
В зависимости от соотношения фосфолипиды: госсипол в масле могут
образовываться одно- или двузамещенные госсифосфолипиды.
Структуры одно- или двузамещенных госсифосфатидилэтаноламинов
можно представить в виде монофосфатид но го (1) и дифосфатидного (2)
комплексов [128, 191].
Однозамещенные госсифосфолипиды (1), в которых сохранена сво-
бодная альдегидная группа, могут дальше взаимодействовать с фосфоли-
пидами. Скорость реакции образования госсифосфолипидов зависит от кон-
центрации реагентов, температуры, присутствия влаги, растворенного кис-
лорода. В масляной среде реакция может проходить в отсутствии кислоро-
да воздуха в атмосфере инертного газа [128, 184, 191].
173
Госсифосфолипиды могут существовать в нескольких формах гидро-
лизуемых (кислотами и щелочами) и негидролизуемых (кислотами и
щелочами) [184,191].
Госсипол, высвобожденный из госсифосфолипидов при действии на них
горячего анилина или растворов щавелевой кислоты, определяется как
связанный [184, 191J .
Отмечено, что при нагревании госсипола с фосфолипидами в присутст-
вии воды образуются соединения, некоторые из которых склонны к обра-
тимым таутомерным превращениям при изменении pH среды [187. 230].
Госсифосфолипиды хорошо растворимы в теплом масле, бензиновых
мисцеллах, зтиловом эфире и галогенированных углеводородах, но не-
растворимы в ацетоне.
Одни типы госсифосфолипидов не удаляются из масла под действием
воды, другие наоборот, при действии воды выводятся из масла, сообщая
эмульсии фосфолипидов интенсивную окраску
Реакция взаимодействия госсипола с фосфолипидами в присутствии
воды имеет отчетливый температурный порог при 105—110°С, за пределом
которого ее скорость резко возрастает, Реакция в масляной среде не имеет
такого отчетливого порога; она с заметной скоростью начинается уже при
60°С и с наибольшей скоростью проходит в интервале 80-120°С. Процесс
может проходить со значительной скоростью в атмосфере инертных га-
зов [184].
Госсифосфолипиды образуются в различных количествах в зависимос-
ти от температуры и времени воздействия при жарении мезги, дистилляции
мисцеллы, а также при хранении нерафинированных масел Образование
госсифосфолипидов приводит к ухудшению качества нерафинированных
масел и кормовых хлопковых фосфатидных концентратов. Поэтому про-
цесс образования госсифосфолипидов при переработке хлопковых семян
подлежит максимальному ограничению путем снижения тепловых воздей-
ствий при жарении прессовании мезги, дистилляции Необходимо иметь з
виду, что образование госсифосфолипидов, как и окисление госсипола,
происходит с заметной скоростью и при хранении нерафинированных ма-
сел [128, 184, 191].
7 7 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СО ЩЕЛОЧАМИ И КИСЛОТАМИ
Под воздействием щелочей и кислит фосфо чипвды подвергаются гид-
ролизу [163, 187]. Мягкий щелочной гидролиз (см. разд. 4.2.1) приводит
к образованию жирных кислот и замешенных глицерофосфатов. Однако в
последних фосфодиэфирная связь с гидрофильной компонентой X неустой-
чива к гидролизу и в более шелочной среде расщепляется с образованием
пятичленного циклического фосфата, при раскрытии цикла которого полу-
чается смесь 2-глицерофосфага и 3-глицерофосфата в соотношении при-
мерно 1:1.
Атака ОН'по асимметрическому' центру при втором атоме углерода,
приводящая к глицеро-3-фосфату, может сопровождаться инверсией
конфигурации [303].
174
3-фосфат
2-фосфат
В кислой среде равновесие между 2- и 3-фосфатами смещено в сторону
3-фосфата.
Отмечено, что в условиях [377] мягкого кислотного гидролиза (2н,
раствор НС1, температура 98°С, продолжительность 5 мин) фосфатидил
инозитол разлагается до диацилглицерина и монофосфата инозитола
[368,382]
Показано, что кислотный гидролиз фосфатидилинозитола протекает
с образованием инозитол-1, 2-фосфэта и глицерина (а) и глицеро-1-, 2-фос-
фата и инозитола (0) по схеме [163, 277] .
175
Авторами цитируемых работ показано, что соотношение инозитол- и
глицерофосфатов в гидролизате зависит от ряда причин, а главное - от
способности этих компонентов к циклизации с гидроксилами. Фосфоино
зитолы из соевых масел в процессе мягкого кислотного гидролиза дают
35% инозитолфосфата и 65% глицеролфосфата.
В процессе жесткого кислотного гидролиза фосфолипиды гидролизуют-
ся с образованием жирных кислот, глицерола, гидрофильного заместите-
ля X (этаноламина, серина, холина, инозитола и др.) и фосфорной кисло-
ты [337] :
:н—он + н^оон + н5соон + х + н,ро.
СН,—он
8. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ПОСЛЕУБОРОЧНОЙ ОБРАБОТКИ,
ХРАНЕНИЯ И ПЕРЕРАБОТКИ МАСЛИЧНЫХ СЕМЯН
НА СОСТАВ И СВОЙСТВА ФОСФОЛИПИДОВ
Состав и свойства фосфолипидов, извлекаемых вместе с маслом при
переработке растительного масличного сырья, прежде всего обусловлены
их состоянием в масличных семенах, качеством перерабатываемых семян,
зависящих от их степени зрелости, дефектности, условий послеуборочной
обработки и хранения, а также применяемыми способами и режимами по-
лучения растительных масел.
176
8.1. СОСТОЯНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ В СЕМЕНАХ
И ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА ИХ СОСТАВ
И СВОЙСТВА
8.1.1. ГИДРАТИРУЕМОСГЬ ФОСФОЛИПИДОВ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ
ПРОЧНОСТЬЮ СВЯЗЕЙ С ГЕЛЕВОЙ ЧАСТЬЮ СЕМЯН
Ранее отмечалось, что значительная часть фосфолипидов в масличных
семенах находится в связанном состоянии и трудно извлекается гидро-
фобными растворителями. Прочность связей зависит от состава и свойств
фосфолипидов и влияет на полноту извлечения растворителями. Отдель-
ные группы фосфолипидов различаются по своим гидрофильным свойст-
вам, т. е. гидратируемости, а следовательно, имеют различную энергию
связи с гелевой частью семян и фракционно извлекаются в процессе полу-
чения масла в зависимости от характера внешних воздействий на маслосо-
держащий материал [5]. В табл. 8.1 приведен групповой состав фосфоли-
пидов в зависимости от энергии их связи с материалом семян.
Состав фосфолипидов в свободных и связанных липидах практически
не различается, однако количественно в свободных липидах отмечается бо-
лее высокое содержание фосфатидилэтаноламинов и суммы фосфатидных
кислот, в то время как в связанных - больше холин-, инозитол- и серин-
содержащих.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что в мятке здоровых, вы-
сохших на корню семян, не подвергавшихся каким-либо внешним воздей-
ствиям, содержится некоторое количество фосфолипидов, которые обла-
дают низкими гидрофильными свойствами и плохо гидратируются [191].
Таблица 8.1
Групповой состав (в %) свободных
и связанных фосфолипидов
Показатели Фосфолипиды
свободные связанные
Содержание фосфолипидов, %
до гидратации 0,38 0,21
после гидратации 0,04 —
Гидратируемость, % 89,0 —
Содержание, %
фосфатидилхолинов 17,0 36,0
фосфатидилэтаноламинов 39,0 16,0
фосфатидилсеринов 23,0 26,0
фосфатидилинозитолов 6,0 17,0
суммы фосфатидных и 15,0 5,0
полифосфатидных кислот
Примечание. Свободные липиды получали
исчерпывающей экстракцией диэтиловым эфиром мятки
здоровых, высохших на корню семян подсолнечника;
связанные липиды извлекали из обезжиренного матери-
ала после его обработки этанолом [ 5].
12 - 727
177
Показана зависимость гидратируемости фосфолипидов от степени их
связанности с гелевой частью подсолнечных семян (рис. 8.1) (табл. 8.2).
Наиболее высокой гидратируемостью обладает осадок II (экстракция мят-
ки ацетоном), содержащий в основном фосфатидилхолины и фосфатидил-
этаноламины [5, 252]. Фосфолипиды, полученные экстракцией обезжирен-
ной ацетоном мятки хлороформом, представлены фосфатидилхолинами, а
фосфолипиды, извлеченные этанолбензиновой смесью, представлены почти
всеми группами, однако основную массу представляют фосфатидилхоли-
ны и фосфатидилэтаноламины. Фосфолипиды, извлеченные подкислен-
ным ацетоном и смесью хлороформ—метанол, имеют идентичный состав и
содержат фосфатидные и полифосфатидные кислоты, фосфатидилинозито-
лы и фосфатидилсерины (5, 252].
Пятка
Обезжиривание ацетоном
Ацетоновой писцелла
♦
Отделение осадка, отгонка
______растворителя
Обезжиренная пятна
♦ ’
Экстракция хлороформом
Осадок Л-(0,7%) Пасло 1-(55,2Щ)
Отгонка растворителя
Остаток
в патроне
Фосфорсодержащие
вещества
Экстракция смесью этанола и
бензина (20:60)
Остаток
в патроне
Отгонка растворителя
Фосфорсодержащие
вещества V-(0,Z5W)
Экстракция подкисленным (0,/н.НСв') ацетоном
Остаток
в патроне
Отгонка растворителя
Фосфорсодержащие
вещества Х-(0,2Ч '/•)
Экстракция смесью хлороформа и метанола
ta
чрителя
Рис. 8.1. Схема выделения фосфорсодержащих веществ
178
Таблица 8.2'
Зависимость гидратируемости фосфолипидов от степени их связанности
с гелевой частью семян .
Образец Содержание фосфора, % Гидрата- руемость, %
в осадке ДО после
гидратации, % 103
Масло, экстрагированное ацетоном (об- — 6,5 4,7 27,7
разец I) Осадок, образовавшийся в процессе отде- 0,32 — — —
ления нейтральных липидов ацетоном (образец II) Масло модельное с образцом II 30,1 2,73 90,9
Фосфолипиды, извлеченные хлорофор- 0,21 — — —
мом (образец ИГ) Масло модельное с образцом III — 25,8 4,6 82,2
Фосфолипиды, извлеченные смесью эта- 0,26 — — —
нола и бензина (20:80) (образец IV) Масло модельное с образцом IV — 6,1 1,19 80,5
Фосфолипиды, извлеченные подкислен- 0,34 — — —
ным ацетоном (образец V) Масло модельное с образцом V Образец в масле нерастворим
Фосфолипиды, извлеченные смесью хло- 0,61 — — —
роформа и метанола (3:2) (образец VI) Масло модельное с образцом VI * Образец в масле нерастворим
8.1.2. ФОРМИРОВАНИЕ СВОЙСТВ ФОСФОЛИПИДОВ
В ПРОЦЕССЕ ПОДГОТОВКИ СЕМЯН К ИЗВЛЕЧЕНИЮ МАСЛА
Влияние степени зрелости семян. Определение оптимальных сроков
уборки масличных семян должно прежде всего зависеть от состава и качест-
ва фосфолипидного комплекса на отдельных стадиях зрелости, так как он
предопределяет не только товарные свойства масла, но и качество второго
продукта — фосфатидного концентрата.
Исследования по этому вопросу освещены в литературе [12, 42, 252,
254[ . Как при созревании семян сои, так и при созревании семян подсол-
нечника авторами наблюдалось уменьшение перехода количества фосфоли-
пидов в получаемые масла. Однако в отношении изменения свойств фос-
фолипидов существуют большие разногласия.
Если при исследовании масел из семян сои было установлено, что по
мере созревания последних гидрофильные свойства извлекаемых фосфо-
липидов значительно повышаются [12] , то такие же опыты, проведенные
другими авторами с семенами подсолнечника, не подтвердили эти выводы
[252]. Получены результаты, позволившие сделать заключение, что неза-
висимо от степени зрелости семян содержание дегидратируемых фосфоли-
пидов в маслах составляет 40—60% [252] .
Безусловно, особенности каждой культуры накладывают определен-
ный отпечаток на характер тех или иных процессов, протекающих в семе-
179
нах, но это не может быть объяснением такого видимого противоречия.
Причинами таких несоответствий являются, по-видимому, особенности
методического подхода к изучению этих групп веществ. В табл. 8.3 приве-
дены данные по изменению качества масла и гидратируемости фосфолипи-
дов, полученных из семян различной степени зрелости. При сравнении каче-
ства масел из семян различной степени зрелости отмечено, что кислотные
и перекисные числа, содержание неомыляемых липидов и продуктов окис-
ления несколько выше в семенах физиологической зрелости. Масла из се-
мян уборочной зрелости по этим показателям практически не отличаются
от полностью созревших. Количество фосфолипидов, извлекаемых с мас-
лом, снижается от физиологической к полной зрелости. Такие закономер-
ности были также отмечены и в литературе [127, 252]. Несмотря на различ-
ное содержание фосфолипидов в маслах из семян разной степени зрелости,
остаточное содержание фосфолипидов после гидратации масла водой сос-
тавляет 0,03-0,06%.
Таким образом, степень зрелости семян не влияет существенно на со-
держание дегидратируемых фосфолипидов в маслах, извлеченных в мяг-
ких условиях.
Влияние степени дефектности семян. В общей массе сырья, поступаю-
щего на переработку, возможно присутствие семян различной степени
дефектности. В связи с этим необходимо знать, как влияет порча семян на
формирование гидрофильных свойств фосфолипидов.
В табл. 8.4 приведены данные по влиянию неблагоприятных условий
хранения семян подсолнечника на формирование гидрофильных свойств
фосфолипидов [29].
Таблица 8.3
Показатели качества масла и гидратируемости фосфолипидов
из семян различной степени зрелости
Показатели Количество дней от конца цветения Двухфазная уборка
25 (стадия физи- ологической зрелости) 35 (стадия убо- рочной зре- лости) 56 (дозревание на корню)
Содержание, %
фосфолипидов
до гидратации 0,53-0,60 0,34-0,40 0,27-0,31 0,23-0,28
после гидратации 0,02-0,03 0,04-0,05 0,04-0,05 0,05-0,06
неомыляемых ли- 0,70-0,71 0,50-0,54 0,40-0,43 0,43-0,46
ПИДОВ продуктов окис- ления 1,06-1,02 0,75-0,82 0,82-0,84 0,80-0,86
Кислотное число, мг КОН/г 0,70-0,74 0,52-0,56 0,56-0,61 0,51-0,66
Перекисное число, %12 0,82-0,86 0,44-0,45 0,56-0,61 0,85-0,90
П римечание. Извлечение масла из семян проводили в мягких условиях
при температуре 30°С экстракцией диэтиловым эфиром.
180
Таблица 8.4
Содержание в маслах фосфолипидов (в %) в зависимости
от условий и продолжительности хранения семян
Характеристика семян и условия их хранения Продолжительность хранения, дни
0 10 30 90 180
Семена физиологической зрелости 0,31 0,75 0,07 —
0,07 0,21 0,01 — —
Семена уборочной зрелости 0,25 0,32 0,47 0,06 —
0,03 0,07 0,20 следы —
Зрелые семена, хранившиеся при 0,26 0,30 0,36 0,34 0,21
Ф воздуха 80% 0,02 0,05 0,09 0,13 0,05
Зрелые семена, хранившиеся при 0,25 0,32 0,49 0,36 0,06
♦ воздуха 90% 0,02 0,09 0,23 0,19 0,03
Примечание. Первая строка цифр - до гидратации масла, вторая - после
гидратации.
Для первых этапов хранения семян физиологической и уборочной зре-
лости характерно повышение содержания в масле как гидратируемых, так
и дегидратируемых форм фосфолипидов. С увеличением срока хранения
семян наблюдается снижение содержания фосфолипидов и тем интенсивнее,
чем выше исходная влажность семян. В полностью созревших семенах, име-
ющих небольшую влажность, но хранившихся в неблагоприятных условиях,
наблюдается закономерность, описанная выше, с той лишь разницей, что
процессы протекают с меньшей скоростью [29].
В табл. 8.5 приведены данные по влиянию степени дефектности подсол-
нечных семян на качество масла [29]. Степень извлечения фосфолипидов
из семян и гидратируемость фосфолипидов с увеличением дефектности
семян снижаются.
Влияние условий послеуборочной обработки семян. Обязательным про-
цессом послеуборочной обработки семян является их тепловая сушка
[37, 178, 380] .
Показатели качества масел в зависимости от содержания
дефектных семян
Таблица 8.5
Показатели Содержание дефектных семян, %
0 5 15 40 100
Содержание
фосфолипидов
до гидратации 0,25 0,17 0,14 0,10 0,07
после гидратации 0,02 0,05 0,06 0,09 0,05
неомыляемых липидов 0,88 0,89 0,80 0,75 0,71
продуктов окисления 0,36 0,39 0,41 0,57 0,65
Кислотное число, мг КОН 1,19 1,60 4,15 9,92 24,39
Перекисное число, % 0,54 1,00 1,27 1,31 1,38
Степень гидратации, % 92,00 70,58 57,14 30,00 28,57
181
Многочисленными исследованиями установлено, что температура нагре-
вания семян при тепловой сушке в значительной степени обусловливает
переход сопутствующих веществ в масло [37, 178, 380]. Так, минимум
содержания перекисей при нагревании семян до 79°С объясняется накопле-
нием в масле фосфолипидов [253]. По этим же данным сушка подсолнеч-
ных семян всех зон соцветия приводит к увеличению содержания фосфоли-
пидов в масле тем интенсивнее, чем ниже влажность семян [253]. Повыше-
ние перехода фосфолипидов в масло после сушки семян отмечено также в
литературе [37, 249-251, 253] .
Сушка семян значительно влияет и на соотношение отдельных групп
извлекаемых фосфолипидов. Исследованиями [250, 253] установлено, что
при интенсификации процессов сушки наблюдается снижение в масле фос-
фатидных кислот и возрастание фосфатидилэтаноламинов и фосфатидил-
холинов, что связано, по мнению авторов, с ослаблением связей менее
полярных фосфолипидов с гелевой частью семени в результате быстрого
испарения влаги. Отмечено влияние тепловой обработки семян подсол-
нечника на качество масел и гидратируемость фосфолипидов [40, 41] .
Тепловая обработка недозрелых и полностью созревших семян приводит
к увеличению перехода фосфолипидов в масла и к их гидратируемости.
На основе этих данных определена та минимальная температура, при ко-
торой фосфолипиды в извлекаемых маслах обнаруживают высокую гид-
ратируемость. Так, для зрелых свежеубранных семян лучшие результаты
достигаются при нагревании до 75-80°С, зрелых хранившихся — до 85—
90°С (табл. 8.6).
Отмечено, что наиболее эффективна тепловая обработка масличных
семян, осуществляемая в две ступени: кратковременный предваритель-
ный нагрев и последующая сушка (табл. 8.7) [37].
Для масел, полученных из семян, высушенных с применением предва-
Влияние тепловой обработки семян
на гидратируемость фосфолипидов
Таблица 8.6
Температу- ра нагрева- имя семян, °C Содержание фосфолипидов в масле, % Гидратируе- мость, %
до гидрата- ции после гидра- тации
Зрелые свежеубранные семена
0,40-0,45 0,18-0,21 55-60
70 0,63-0,66 0,05-0,08 88-90
72 0,66-0,71 0,03-0,04 94-95
75 0,72-0,75 0,04-0,06 92-84
80 0,78-0,80 0,03-0,05 93-96
Зрелые хранившиеся семена
— 0,37-0,40 0,15-0,17 57-59
80 0,59-0,61 0,03-0,04 93-95
85 0,64-0,67 0,03-0,05 93-95
90 0,69-0,72 0,03-0,05 93-95
182
Таблица 8.7
Влияние тепловой обработки семян подсолнечника на качество
извлекаемого масла и гидратируемость фосфолипидов
Образцы Влаж- ность семян до суш- ки, % Кислотное число, мг КОН/г Перекисное число,% Содержание фос- фолипидов, % Гидра- тируе- мость, %
до гид- рата- ции после гидра- тации до гид- рата- ции после гидра- тации до гид- рата- ции после гидра- тации
Исходный 13,5 2,85 2,60 0,62 0,65 0,32 0,17 46,87
Сушка 13,5 ‘2,28 2,01 0,54 0,56 0,47 0,13 72,34
Сушка с предвари* тельным на- гревом 13,5 2,18 1,71 0,45 0,48 0,64 0,05 92,18
Исходный 29,0 3,34 3,49 0,67 0,69 0,29 0,19 34,48
Сушка 29,0 3,61 3,39 0,57 0,57 0,40 0,13 67,50
Сушка с 29,0 3,41 3,01 0,48 0,49 0,55 0,06 89,09
предвари-
тельным на-
гревом
Примечание. Сушка семян осуществлялась при температуре сушильного
агента 160°С; предварительный нагрев производился в течение 3,5 мин при темпера-
туре сушильного агента 230-240°С.
Таблица 8.8
Влияние тепловой обработки семян подсолнечника на групповой состав
фосфолипидов, извлекаемых с маслом
Группа фосфолипидов Содержание фосфолипидов, %
образец 1 образец 2 образец 3
Неидентифицированные 1,0 1,0 1,0
Фосфатидилинозитолы 5,0 5,5 6,0
Фосфатидилхолины 20,0 26,8 30,5
Лизофосфатидилхолины 7,9 3,2 0,5
Фосфатидилсерины 14,8 20,2 20,9
Лизофосфатидилсерины 6,5 1,8 0,6
Фосфатидилэтаноламины 14,7 18,5 23,0
Лизофосфатидилэтаноламины 5,5 2,5 Ы
Полифосфатидные кислоты 10,5 10,7 10,5
Фосфатидные кислоты 10,8 8,8 6,0
Лиэофосфатидные кислоты 3,3 1,0 —
Примечание. Образец 1 - масло, выделенное из исходных семян (влаж-
ность семян 13,5%); образец 2 - масло, выделенное из семян, подвергнутых сушке;
образец 3 - масло, выделенное из семян, подвергнутых предварительному нагреву
и последующей сушке.
183
Таблица 8.9
Влияние режимов предварительной тепловой обработки семян
на активность фосфолипаз
Влажность, семян, % Темпера- тура су- шильного агента, °C Продолжи- тельность обработки, мин Темпера- тура нагре- вания се- мян, °C Активность фо:<ро..’ир.аэ
(Л+В) мкмоль Г1 Я (мг-мин) D мкмоль холина (мг-мин)
- 0 22 U,025 0,003 1 0 «5 0,030 0,009 29.0 230-240 2.0 60 0,050 0,005 3,0 75 0,010 0,002 3,5 80 0,005 0,001 ригельного нагрева, степень извлечения фосфолипидов выше, чем для
масел, полученных из семян, высушенных без предварительного нагрева
Наряду с большей степенью извлечения фосфолипидов из семян, высушен
ных с предварительным нагревом, наблюдается также более высокая сте-
пень их гидратации из масел Например, для масел из семян, высушенных
с предварительным нагревом, степень гидратации составляет 92,18%, а для
масел из семян, высушенных без предварительного нагрева, - 72,34%.
Проведение двухстадийной тепловой обработки семян по сравнению с
обычной сушкой приводит к снижению содержания лизоформ фосфолипи-
дов, а также к некоторому снижению содержания фосфатидных кислот,
т. е. групп фосфолипидов, которые понижают общий эффект гидратации
(табл. 8.8). Полученную закономерность можно объяснить инактивацией
фосфолипаз.Л, В и D. которые приводят к образованию лизоформ фосфо-
липидов (фосфолипазы А и В) и к гидролизу таких групп фосфолипидов,
как фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфа гидилсерины с
образованием фосфатидных кислот (фосфолипаза D) (табл. 8.9).
Влияние условий хранения семян ь литературе [121, 150J отмечено,
что динамика перехода фосфолипидов из хранившихся масличных семян
в масло зависит от класса семян (т. е, от исходного кислотного числа масла
в семенах, определяющего принадлежность их к определенному классу) и
от температуры семян
При хранении семян всех классов отмечается два четко выраженных
периода перехода фосфолипидов в масло: первый период — увеличение
перехода фосфолипидов в масло; второй - снижение. Повышение влажнос-
ти и температуры приводит к более резкому переходу от одного периода
хранения к другому. С повышением температуры и влажности уменьшает-
ся продолжительность первого периода с увеличением общего содержания
фосфолипидов в масле, одновременно происходит увеличение интенсив-
ности второго периода. Кроме того, при снижении классности семян возрас-
тает неблагоприятный эффект от действия повышенных влажностей и тем-
ператур. Хранение неклассных семян при повышенных температурах и
влажности приводит к резком} снижению перехода фосфолипидов в масло
вс втором периоде [121].
184
Изучено влияние продолжительности хранения семян, доведенных до
оптимальной влажности (7%), на активность гидролитических ферментов
и переход фосфолипидов в масло (табл. 8.10) [121, 152].
При продолжительном хранении семян (более 120 дней) наблюдается
снижение перехода фосфолипидов в масло, что, по мнению авторов, связа-
но не только с деятельностью фосфолипаз, но и с увеличением прочности
связей фосфолипидов с белками [162] Приведенные в литературе данные
позволяют только судить о динамике перехода фосфолипидов в масла в
процессе хранения семян, одНако они не дают информации о степени гид-
ратируемости и составе фосфолипидов [121, 162] .
Изучено влияние продолжительности хранения семян подсолнечника
на состав фосфолипидов и их свойства (табл. 8.11) [40,41].
Способ подготовки семян к длительному хранению существенно влияет
на характер извлечения фосфолипидов. Так, если из семян физиологиче-
ской и уборочной степени зрелости, прошедших тепловую обработку (вы-
сокотемпературную сушку), независимо от сроков хранения, количество
извлекаемых фосфолипидов (% к массе масла) не меняется, то из тех же
семян, но высушенных холодным воздухом, извлечение фосфолипидов на
первых этапах хранения несколько возрастает, а далее снижается. Из семян
полной зрелости в процессе хранения характер извлечения фосфолипидов
такой же, как и для семян, высушенных холодным воздухом. Необходимо
отметить, что независимо от продолжительности хранения семян разных
сроков уборки в мягких условиях из них извлекаются масла с содержа
нием дегидратируемых фосфолипидов не более 0,03-0,05%.
Т а б л и ц а 8.10
Влияние длительности хранения семян подсолнечника
на переход фосфолипидов в масло
Продолжи- тельность хранения, дни Содержа- ние фосфо- липидов, % Содержание ненасыщенных жирных кислот, %
олеиновая кислота линолевая кислота
Семена сорта Передовик
0 0,22 34,7 53,2
22 0,29 32,3 55,0
46 0,36 31,2 55,1
68 0,39 — —
120 0,36 31,9 55,0
225 0,24 32,3 54,2
Семена сорта Первенец
0 0,29 77,3 15,2
12 0,36 79,1 14,2
24 0,39 79.3 14.1
60 0,42 78,3 14,7
120 0,38 79,/ 14.5
240 0,25 81.4 13,1
185
Таблица 8.11
Изменение гидратируемости фосфолипидов масел, полученных из семян
в процессе их хранения
Показатель Длитель- ность хране- ния на корню, ДНИ Семена
физиологической зрелости уборочной зре- лости полной зре- лости
после сушки воздухом двух- фазная уборка дозрева- ние на корню
горя- чим холод- ным горя- чим холод- ным
Содержание
фосфолипи-
дов, %
до гидра- тации > Исходные ' 0,78 0,65 0,59 0,40 0,23 0,27
после гид- ратации 0,04 0,05 0,03 0,05 0,05 0,04
до гидра- тации h 30 ‘ 0,68 — 0,54 0,47 0,45 0,40
после гид- ратации j 0,01 — 0,02 0,02 0,02 0,03
до гидра- тации * 60 ' 0,62 — 0,57 0,36 0,44 0,27
после гид- ратации 0,01 — 0,05 0,03 0,02 0,03
до гидра- ' тации к 90 < 0,67 0,38 — — 0,39 0,26
после гид- ратации 0,03 0,03 — — 0,03 0,02
до гидра- * тации ► 150 4 0,67 — 0,54 0,36 0,36 0,19
после гид- ратации < L 0,05 — 0,02 0,05 0,03 0,01
до гидра- тации • 210 < 0,67 0,13 0,54 0,19 0,23 0,17
после гид- ратации t 0,03 0,04 0,02 0,03 0,03 0,04
8.2. ВЛИЯНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ СТАДИЙ ПЕРЕРАБОТКИ
МАСЛИЧНЫХ СЕМЯН НА СОСТАВ И СВОЙСТВА
ИЗВЛЕКАЕМЫХ ФОСФОЛИПИДОВ
По литературным данным, в ходе технологического процесса происхо-
дит как связывание, так и высвобождение отдельных групп фосфолипидов
(например, при измельчении ядра происходит их частичное высвобождение,
а при прессовании и экстракции - связывание) [85, 231]. Преобладание
того или иного процесса зависит от многих факторов: степени дисперсности
материала, его влажности и особенностей подготовки к прессованию и
экстракции, от давления и температуры при прессовании.
Особенно интенсивные изменения в масличной и гелевой частях семян
186
наблюдаются при влажно-тепловой обработке. Вопросам влияния влажно-
тепловой обработки маслосодержашего материала на состав и свойства
извлекаемых фосфолипидов посвящено много исследований [32, 38, 66,
77,85, 103, 155,211,231] .
Увеличение перехода фосфолипидов в масло из материала (мезги),
предварительно прошедшего влажно-тепловую обработку (табл. 8.12),
сопровождается значительным снижением их гидратируемости (содержание
негидратируемых фосфолипидов возрастает от 0,03-0,05 до 0,15-0,22%).
Низкая гидратируемость была также установлена для прессовых и экст-
ракционных Масел, полученных из материала, прошедшего влажно-тепло
вую обработку: содержание негидратируемых фосфолипидов в этих маслах
достигло 0,20-0,28% (см. табл. 8.12).
При увлажнении и медленном нагревании измельченных льняных и
подсолнечных семян [ 155, 231] в первых чанах жаровень форпрессовых аг-
регатов в масле обнаружено высокое содержание негидратируемых форм
фосфолипидов.
Для инактивации фосфолипаз и липазы предложено проводить крат-
ковременный и интенсивный нагрев подсолнечной мятки перед жарением
до 80-85°С и влажности 8,5-9,0%. После такой инактивации содержание
негидра1ируемых фосфолипидов в масле не превышает 0,02%, одновремен-
но уменьшается и кислотное число масла. Однако позже был сделан вывод
о том, что фосфолипаза D в процессе влажно-тепловой обработки подсол-
нечной мятки не влияет существенно на гидратируемость фосфолипидов,
извлекаемых с маслом [218]. Необходимо отметить, что такой вывод яв-
ляется не совсем точным, так как в качестве фермента, добавляемого в
мятку перед влажно-тепловой обработкой, авторы цитируемой работы при-
меняли фосфолипазу D, выделенную из листьев белокочанной капусты, а
не из семян подсолнечника. Это могло повлиять на достоверность резуль-
татов. Действительно, было показано, что фосфолипаза D, выделенная из
хлопковых семян, принимает активное участие во взаимопревращениях
фосфолипидов, что, по мнению авторов, приводит к изменению соотноше-
Таблица 8.12
Влияние влажно-тепловой обработки на гидратируемость фосфолипидов
Показатель Масло, полученное
экстракцией ди эти л о- вым эфиром из мезги
прямой экстракци ей бензи- ном прессо- ванием экстрак- цией бен- зином жмыха
МЯТКИ мезги
Содержание фосфоли-
пидов, %
дегидратации 0,33-0,35 0,45-0,50 0,36-0,40 0,29-0,35 0,74-0,82
после гидратации 0,03-0,05 0,15-0,22 0,20-0,25 0,23-0,25 0,25-0,28
Примечание. Мезгу получали из мятки, увлажняя последнюю до 9,0-9,5%,
и выдерживали при 100-105°Св течение I ч.
187
ния между гидратируемыми и негидра тируемыми фосфолипидами и влияет
на их гидратируемость из масел [ 170]. Необходима отметить, что прямого
ответа на поставленный вопрос, влияет ли собственно фосфолипаза D на
гидратируемость фосфолипидов, нет [170].
В литературе [32] приведены данные п' изменении активности фер-
ментов (липазы, липоксигеназы и фосфолипазы D), а также по изменении
выхода фосфолипидов при влажно-тепловой обработке материала перед
прямой экстракцией. Показано, что наибольший переход фосфолипидов в
масло (до 0,9-1,2%) наблюдается в процессе кондиционирования дроблен-
ии (влажно-тепловой обработки) при температуре острого пара 110,7°С и
продолжительности обработки 9 мин (табл. 8.13).
В литературе отмечено влияние режимов влажно-тепловой обработки
на состав и свойства фосфолипидов, извлекаемых из масла методом
прямой экстракции материала лепестковой структуры, а также фосфолипи-
дов, извлекаемых из масел после жарения ядра в чанных аппаратах
(табл, 8.14) [66, 146| . Влажно-тепловая обработка материала перед извле-
чением масла прямой экстракции приводит к переходу в масло меньшего
количества фосфатидилинозитолов, одновременно происходит некоторое
снижение содержания лизофосфатидилхолинов и фосфатидил этанолами-
нов и увеличивается содержание полиглицерофосфолипидио Масло после
(идратании содержит следы фосфолипидов.
В литературе приведены данные по изменению состава фосфолипидов
подсолнечных семян на отдельных стадиях его переработки (табл. 8.15)
[ 146] Анализ приведенных в табл. 8 15 данных показывает, что при из-
мельчении ядра на пятивальцовых станках не происходит изменения общего
количества извлекаемых фосфолипидов, но наблюдаются изменения в их
составе: увеличение содержания фосфатидилинозитолов и фосфатидилхо-
линов, а также уменьшение фосфатидных кислот. Влажно-тепловая обра-
ботка мятки приводит к некоторому увеличению выхода фосфолипидов и
I аблица 8.13
Влияние оптимальных режимов влажно-тепловой обработки семян
подсолнечника на активность ферментов и выход фосфолипидов
Показатель Целые: семена Лепесток из дроблении ядра
без влаж- но-тепло- вой обра- ботки влажно-теп- ловая обра- ботка в жа- ровне кондицио= нирование .дробленки
Активность фермейил
липазы 0,007 0,008 0.003 0,001
липоксигеназы (J.007 0.008 0.008 0.008
фосфолипазы D 0,016 0,029 0,016 0.012
Количество фосфолипидов в — 0.14 0,59 0,68 0,92-1,18
извлеченном растворителем
масле, %
П р и меч ан и е Размерность активности липазы - мкмоль С.\/(мг-мин);
липокси геназы - мэкв О2/ (мт-мин); фосфолипазы D - мкмоль холина > (мг- мин).
188
Таблица 8.14
Влияние влажно-тепловой обработки материала на состав фосфолипидов,
извлеченных с маслом
Показатель Форпрессование - экстракция Прямая экстрак- ция
липиды (хлоро- форм+ме- танол) экстрак- ционное масло липиды (хлоро- форм+ме- танол) экстрак- ционное масло
Содержание фосфолипидов, % к массе извлеченного масла Состав фосфолипидов, % к сумме 0,95 0,56 1.21 1,02
фосфатидилинозитолы (форма 1) 8,0 16,4 2,0 14,8
фосфатидилинозитолы (форма 2) 10,0 40,0 — —
лизофосфатидилхолины 1.5 1,5 0,4 0,3
фосфатидилсерины 2,0 1,5 3,1 14,3
фосфатидилхолины 26,0 20,6 22,0 20,5
фосфатидилэтаноламины 14,0 11,8 10,5 8,8
лизофосфатидилэтаноламины — — 18,8 6,3
фосфатидные кислоты 35,0 1.0 0,6 0,3
неидентифицированные 1.5 4,2 11,0 5,0
поли фосфоглицериды 2,0 3,0 31,6 29,7
Таблица 8.15
Изменение состава фосфолипидов при подготовке семян к прессованию
и б процессе прессования
Содержание фосфолипидов, %
Состав фосфолипидов в липидах в нерафини- рованном масле
ядра мятки мезги
Фосфолипиды, дающие реакцию на 7,5 8,7 6,9 13,2
N и инозитол
Лизофосфатидилхолины 4,0 3,2 3,7 6,3
Фосфатидилсерины 3,5 4,2 4,2 2,8
Фосфатидилинозитолы 9,0 19,7 23,7 38,5
Фосфатидилхолины 26,0 29,3 35,2 22,7
Фосфатидилэтаноламины 14,0 13,1 17,2 12,2
Фосфатидные кислоты 34,0 19,8 6,0 1,0
Полифосфоглицериды 1,4 1,2 1,5 0,7
Вещества, даюшие реакцию на Р, 1,0 1,0 1.4 2,2
NHj-группу и холин
Содержание фосфолипидов в мае- 0,93 0,99 1,09 0,57
лах, %
Примечание. Липиды из ядра, мягки и мезги извлекали смесью раство-
рителей диэтиловый эфир - петролейный эфир - этиловый спирт, смешанных в рав-
ных количествах по объему (146].
189
к дальнейшему изменению их состава: снижается доля фосфатидных кис-
лот, увеличивается содержание фосфатидилхолинов, а также содержание
одной из форм фосфатидилинозитолов. Содержание фосфатидилэтанола-
минов, фосфатидилсеринов, лизофосфатидилхолинов и полифосфатидил-
глицеридов практически не меняется. Значительные изменения состава фос-
фолипидов происходят на стадии прессования (температура мезги, направ-
ляемой на прессование, 105—110°С). При этом в масло переходит только
50% фосфолипидов. В фосфолипидах масла резко увеличивается содержа-
ние фосфатидилинозитолов и уменьшается содержание фосфатидилхоли-
нов. Сравнение данных по содержанию и составу фосфолипидов форпрес-
сового масла, извлекаемого бензином из таким же образом подготовлен-
ных семян методом прямой экстракции, показало, что они практически
одинаковы.
Таким образом, существующие в настоящее время режимы влажно-
тепловой подготовки материала к извлечению масла приводят к накопле-
нию в свободном состоянии трудно гидратируемых фосфолипидов. В свя-
зи с этим основные работы направлены на разработку способов подготовки
маслосодержащего материала к извлечению масла на основании создания
более мягких режимов влажно-тепловой обработки и в первую очередь
исключения влияния высоких температур.
Приведенные выше данные относятся в основном к фосфолипидам,
извлекаемым из подсолнечных семян. Влияние отдельных стадий перера-
ботки семян сои на состав и свойства фосфолипидов достаточно полно
освещено в литературе [81, 101, 198, 201, 211] . В литературе приведены
данные по влиянию влажно-тепловой обработки материала (семян сои)
сухим насыщенным паром на выход и состав фосфолипидов (табл. 8.16)
[211].
Влажно-тепловое воздействие на соевый лепесток приводит как к уве-
личению выхода фосфолипидов, так и к лучшей их гидратируемости.
Таблица 8.16
Влияние влажно-тепловой обработки на гидратируемость фосфолипидов,
извлекаемых с соевым маслом
Масло из образцов
Показатель автоклавированной
целой сои | дроблении лепестка
Содержание фосфолипидов в мас- ле, % до гидратации после гидратации Содержание отдельных групп фос- фолипидов, % фосфатидилхолины фосфатидил этаноламины фосфатидные кислоты инозитолсодержащие неидентифицированные 3,35 0,07 28 32 6 24 10 4,47 4,80 0,02 0,01 41 33 27 25 9 5 19 31 4 6 5,28 0,02 38 20 8 34
190
Качество экстракционного масла в значительной степени зависит от
глубины экстракции [15—18, 198, 219] . Большое влияние на качество мас-
ла оказывают и режимы дистилляции мисцеллы [16-18, 83, 86, 100, 192,
231]. Применение пониженных температур на окончательной ступени
дистилляции способствует снижению окислительной порчи фосфолипидов,
уменьшению разрушения каротиноидов и образования меланосоединений,
что в конечном итоге увеличивает степень гидратируемости фосфолипидов
из масел [207].
В литературе отмечено, что при прямой экстракции подсолнечных и сое-
вых семян при различной глубине извлечения полученные экстракционные
масла по своим химическим показателям мало различаются: наблюдается
лишь некоторое увеличение количества извлекаемых фосфолипидов, гид-
ратируемость которых находится практически на одном уровне [198,
219].
Отмечено также, что в процессе дистилляции происходит разрушение
каротиноидов и одновременное накопление меланофосфатидов и негидра-
тируемых фосфолипидов (табл. 8.17) [ 100] .
В последнее время все более актуальным становится вопрос о выборе
оптимальной лузжистости перерабатываемого ядра в связи с усовершенст-
вованием сортов семян подсолнечника, которое привело к изменению их
Таблица 8.17
Влияние промышленной и лабораторной дистилляции на качество
соевого масла
Образцы Цвет, МГ/j Содержание
пигментов фосфолипидов
мелано- фосфа- тидов, мг/г кароти- ноидов, мкг/г до гид- рата- ции после гидра- тации
Исходная промышленная мис- целла образец 1 58,3 0,8. 66,8
” 2 65,5 0,0 63,5 — —
” 3 52,1 0,0 64,2 — —
Масло из мисцеллы, получен- ное при лабораторной дистил- ляции образец 1 54,3 1,1 63,5 1,69 0,03
" 2 64,0 1,3 62,7 1,69 0.03
” 3 47,0 1,6 61,2 1,56 0,05
Масло из мисцеллы, получен- ное при промышленной дистил- ляции образец 1 41,0 2,2 56,1 1,56 0,13
,, 2 54,7 3,2 53,0 1,82 0,10
3 42,9 2,1 54,6 1,56 0,31
Примечание. Все показатели даны в пересчете на масло.
191
химического состава. Изменился и качественный состав оболочки; одно-
временно с этим уменьшилась ее толщина, она стала плотнее прилегать к
ядру и даже срастаться с ним. Такие изменения свойств лузги создали оп-
ределенные трудности при обрушивании семян, отделении ее от ядра и
вызвали значительное увеличение масличности отходящей лузги [155].
Определенный интерес имеют исследования процесса прямой экс-
тракции необрушенных семян, особенно в случае переработки их мелких
фракций, оболочка которых имеет наибольшую масличность и труднее от-
деляется [155].
В литературе приведены данные по влиянию лузжистости на качество
масел и свойства фосфолипидов [30, 219, 256] . В маслах, извлеченных из
ядра с различным содержанием лузги, отмечена определенная тенденция к
изменению некоторых показателей, характеризующих качество масла: на-
блюдается увеличение кислотных чисел, содержания неомыляемых липи-
дов, суммарного количества продуктов окисления. Количество извлекае-
мых фосфолипидов по мере увеличения лузжистости ядра несколько
возрастает. Характер извлечения из образцов ядра с различной лузжис-
тостью негидратируемых фосфолипидов соответствует характеру извлече-
ния суммарных фосфолипидов [30] .
В результате исследований и практического опыта установлено, что
качество исходного масличного сырья значительно влияет не только на
состав и качество вырабатываемых масел, но и на состав и качество полу-
чаемых из них фосфатидных концентратов. Имеющиеся требования к ка-
честву сырья, рекомендуемые безопасные режимы его хранения соответ-
ствуют сохранению качественных показателей масла и фосфолипидов.
Для максимального извлечения как масла, так и фосфолипидов, прояв-
ляющих высокие гидрофильные свойства, а следовательно, и гидратируе-
мость, рекомендуется осуществлять быстрый нагрев материала и проведе-
ние последующей влажно-тепловой обработки при температурах, обеспечи-
вающих максимальное подавление деятельности ферментов — фосфолипаз
и способствующих высвобождению связанных форм фосфолипидов. В
этих условиях получаемые фосфолипиды имеют оптимальный состав,
обогащены наиболее ценными фракциями - фосфатидилхолинами, фосфа-
тидилинозитолами и фосфатидилэтаноламинами.
9. ВЛИЯНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ НА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ
Фосфолипиды, остающиеся в гидратированных маслах, отрицательно
влияют на последующие процессы рафинации масел, такие, как вымора-
живание, нейтрализация, промывка, сушка, дезодорация, а также на про-
цессы гидрирования и отделения катализатора от гидрированных жиров.
Рассмотрим более подробно влияние фосфолипидов на отдельные ста-
дии промышленной переработки растительных масел.
192
9.1 . ВЛИЯНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ НА ОТДЕЛЬНЫЕ
ПРОЦЕССЫ РАФИНАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ
Удаление воскоподобных веществ из масел. В литературе отмечено,
что фосфолипиды препятствуют образованию и росту кристаллов в процес-
се низкотемпературного фракционирования хлопкового масла в мисцелле
[285] и отрицательно влияют на процесс вымораживания (удаления вос-
ков) масел [384] . Фосфолипиды адсорбируются на поверхности мелких
ядер кристаллов и тем самым препятствуют дальнейшему росту кристал-
лов, что ведет к образованию мелких кристаллов, которые проходят че-
рез фильтрующие поверхности и не удаляются из масла [322] .
В табл. 9.1 приведены данные лабораторных исследований по влиянию
фосфолипидов на процесс удаления воскоподобных веществ (выморажи-
вание) из масел по режимам, принятым в промышленности (температура
процесса t = 8-12°С). Время экспозиции 3-4 ч, отделение осадка - фильт-
рацией при t = 18-20°С [194] .
Отмечено, что эффект удаления воскоподобных веществ путем обра-
ботки масел при t = 18-20°С гелем кремниевой кислоты, образованной в
результате взаимодействия силиката натрия и фосфорной кислоты, снижа-
ется после увеличения содержания фосфолипидов в обрабатываемом мас-
ле (табл. 9.2)*. Эффективность выведения воскоподобных веществ из ма-
сел при увеличении содержания в них фосфолипидов с 0,10 дв 0,30% снижа-
ется со 100% до 68%.
В табл. 9.3 приведены данные по влиянию» фосфолипидов на процесс
выведения воскоподобных веществ раствором кислых мыл* **.
По данным табл. 9.3 можно сделать выводы, аналогичные выводам
по табл. 9.2.
Таким образом, на процесс выведения воскоподобных веществ из
масел фосфолипиды оказывают отрицательное влияние независимо от тех-
нологии осуществления процесса. Необходимо также отметить, что присут-
ствие фосфолипидов в маслах, направляемых на удаление воскоподобных
веществ, снижает не только эффективность процесса, но и увеличивает
содержание жира в мыльно-восковых осадках (табл. 9.4).
Влияние фосфолипидов на щелочную нейтрализацию масел. Влияние
фосфолипидов на эффективность процесса щелочной нейтрализации масел
отмечено в литературе [6, 23,31,44,47, 149, 173, 174,322, 331] . Особенно
детально этот вопрос изучен для хлопковых масел [23,174]. Отрицательное
влияние фосфолипидов на процесс щелочной нейтрализации объясняется
тем, что фосфолипиды, являясь поверхностно-активными веществами,
проявляют эмульгирующее действие и стабилизируют эмульсии, а также
повышают солюбилизацию масла и способствуют упрочнению мыльных
структур в соапстоках, образующихся при нейтрализации. В результате
этого увеличивается содержание мыла в нейтрализованном масле, уве-
личивается содержание жира в соапстоках и усложняется процесс разло-
жения соапстоков.
♦А.с. 806750 (СССР). - Б.И., 1981, № 7.
** А.с. 992564 (СССР). - Б.И., 1983, № 4.
13-727
193
Таблица 92
Влияние фосфолипидов на процесс выведения воскоподобных веществ
из подсолнечных масел гаем кремниевой кислоты
Гидратированное масло
Показатель исходное после обработки
1 2 3 4 1 2 3 4
Содержание, % фосфо 0,10 0,18 0.25 0,30 Нет 0,05 0,07 0.09
липидов воскопо- 0.047 0,047 0.047 0,047 Hei 0,005 0,009 0,015
добных веществ неомы- 0,52 0,52 0 52 0,52 0.25 0,29 0,39 0,45
ляемых липидов Степень вы- 100,0 89,3 80,8 68,0
гезения вос- коподобных веществ, %
Таблица 9.3
Влияние фосфолипидов на процесс выведения воскоподобных веществ
из подсолнечных масел раствором кислых мыл
Гидратированное масло
Показатель исходное после обработки
12 3 4 12 3 4
Содержание,
%
фосфо- липидов 0.10 0,18 0,25 0,30 Нет 0,03 0,05 0,08
воскопо- добных веществ 0,047 0,047 0.047 0,047 Нет 0,006 0,008 и,018
неомы- ляемых липидов 0,52 0,52 0,52 0,52 0,25 0,30 0,39 0.45
Степень вы- — — — — 100,0 87,2 82,9 52,3
ведения нос-
копопобных
веществ, %
Примечание. В табл 9.2 и 9.3 1, 2, 3,4 - образцы масел.
195
194
Таблица 9.4
Состав мыльно-восковых осадков
Показатель Обработка гелем кремниевой кислоты Обработка раствором кислого мыла
1 2 3 4 1 2 3 4
Содержание, % общего жира 24,6 28,5 31,7 34,5 36,0 40,5 42,0 43,9
жирных кислот 11,7 13,0 13,8 14,5 15,6 16,8 16,9 17,0
нейтрального жира 12,9 15,5 17,9 20,0 20,4 23,7 25,1 26,9
Соотношение нейтраль- 1,1:1,0 1,2:1,0 1,3:1,0 1,4:1,0 1,3:1,0 1,4:1,0 1,5:1 1,6:1
ный жир и жирные кис-
лоты
Примечание. Осадок получен при обработке соответствующих образцов
масла 1, 2, 3, 4 (см. табл. 9.3).
Так, для хлопковых мисцелл образование стабильных эмульсий наблю-
дается при рафинации мисцелл как разбавленными, так и концентрирован-
ными растворами щелочей; при этом потери хлопкового масла при щелоч-
ной нейтрализации в присутствии фосфолипидов составляют 25-50%
[149, 174] . Фосфолипиды не позволяют повышать интенсивность контак-
тирования мипеллы- с раствором щелочи, и этим ограничивается возмож-
ность эмульсионного способа щелочной нейтрализации хлопковых масел
[ 173, 285] . Поведение фосфолипидов в процессе щелочной рафинации ми-
целлы хлопкового масла было изучено с помощью микрофотосъемки
[285] . Мицеллы мыла образуются с начального момента смешивания
мисцеллы с раствором щелочи, увеличиваются в объеме с течением време-
ни и через несколько секунд образуют агломераты, между которыми нахо-
дится масло. Затем наступает фаза адсорбции фосфолипидов на мыльной
массе; этот процесс начинается раньше, чем заканчивается химическое вза-
имодействие красящих веществ хлопковой мисцеллы со щелочью. Блоки-
рование соапстока фосфолипидами затрудняет сорбцию красящих веществ
в процессе щелочной обработки [238; 240, 285].
При использовании метода пассивного эксперимента на основании
анализа производственных данных были выявлены зависимости влияния
фосфолипидов на процесс нейтрализации подсолнечных масел в мыльно-
щелочной среде [6]. Схема рафинации масел включала обработку гидра-
тированного масла при температуре 70-79°С концентрированным раство-
ром фосфорной кислоты в количестве 0,1% к массе масла и последующую
нейтрализацию обработанного масла в мыльно-щелочной среде. В резуль-
тате математической обработки производственных данных работы нейтра-
лизационной установки и расчета были получены уравнения множествен-
ной регрессии.
Анализ полученных уравнений позволил сделать следующие выводы:
кислотное число рафинированного масла зависит от температуры
процесса, исходного кислотного числа, концентрации щелочи в нейтрали-
заторе;
содержание нейтрального жира в соапстоке зависит от температуры, ис-
ходного кислотного числа, содержания фосфолипидов в масле;
196
Влияние фосфолипидов на нейтрализацию подсолнечного масла
содержание мыла в масле зависит от температуры, кислотного числа
масла, концентрации щелочи, подаваемой в нейтрализатор, содержания фос-
фолипидов в исходном масле.
Таким образом, с увеличением содержания фосфолипидов в масле, на-
правляемом на нейтрализацию, увеличивается содержание мыла в нейтра-
лизованном масле, а также повышается содержание нейтрального жира
в мыльно-щелочном растворе (соапсток).
В табл. 9.5 приведены данные лабораторных исследований по влиянию
фосфолипидов на процесс нейтрализации подсолнечных масел (модельных
масел с различным содержанием фосфолипидов) в мыльно-щелочной сре-
де без предварительной обработки фосфорной кислотой.
Приведенные в табл. 9.5 данные также подтверждают, что увеличение
содержания фосфолипидов р масле при нейтрализации в мыльно-щелочной
среде приводит к возрастанию содержания мыла в нейтрализованном мас-
ле, а также нейтрального жира в мыльно-щелочном растворе.
При нейтрализации масел с содержанием фосфолипидов 0,05-0,10%
в нейтрализованном масле содержатся ’’следы” мыла. В связи с этим после-
дующую водную промывку нейтрализованного масла можно исключить.
При нейтрализации масел с содержанием фосфолипидов более 0,1% наблю-
дается повышение содержания мыла и последующая водная промывка яв-
ляется обязательной.
Повышение содержания фосфолипидов в масле при нейтрализации на
сепарационных линиях, в том числе и оснащенных саморазгружающимися
сепараторами, приводит к значительному увеличению отходов на стадии
промывки, а остаточное содержание мыла в промытом масле при однократ-
ной промывке*превышает допустимую норму [31] . При переработке масел
на сепарационной линии с повышенным содержанием фосфолипидов (на-
пример, гидратированных соевых с содержанием фосфолипидов 0,5—0,6%)
увеличение концентрации щелочного раствора позволяет несколько улуч-
шить соотношение нейтрального жира и жирных кислот в соапстоке, одна-
ко содержание мыла в нейтрализованном масле остается высоким
(табл. 9.6).
Таблица 9.6
Влияние концентрации раствора щелочи
на эффективность нейтрализации соевого масла
Содержание фосфолипи- дов в масле, % Концентра- ция раство- ра щелочи, г/л Концентра- ция соап- стока, % Соотно- шение Ж.К.:Н.К. в соапстоке Содержание мыла в нейт- рализованном масле, %
0,50 21,90 1,3 0,30
0,70 110 23,70 1.2 0,35
1,00 24,20 1,2 0,38
0,50 24,10 1,5 0,35
0,70 130 24,80 1,4 0,38
1,00 25,70 1,3 0,40
0,50 24.10 1,6 0,30
0,70 140 24,50 1,5 . 0,38
1,00 24,80 1,4 0,40
198
Влияние фосфолипидов на сорбционную очистку масел и мисцелл.
Отмечено, что нежелательным побочным процессом, происходящим при
адсорбционной очистке растительных масел, является удаление из масла
наряду с пигментами и фосфолипидов [83 , 91, 102, 153 , 227 , 238 , 317,
322, 331].
Установлено, что легче адсорбируются сорбентами гидратируемые фос-
фолипиды, чем негидратируемые; фосфолипиды, остающиеся в нейтрали-
зованных маслах, также в значительной мере влияют на степень снижения
цвета растительного масла; негидратируемые фосфолипиды больше сни-
жают степень отбеливания, чем гидратируемые [322] . Кроме того, выявле-
но еще одно отрицательное влияние фосфолипидов на процесс отбели-
вания: в присутствии фосфолипидов сорбент удерживает большее количе-
ство растительного масла, чем когда они отсутствуют; при этом адсорби-
рованное масло не может быть удалено из сорбента даже после обработки
его паром или воздухом и масла в нем остается до 30—35%.
При изучении процесса поглощения отдельных сопутствующих три-
ацилглицеринам хлопкового масла веществ Ангренским адсорбентом пока-
зано, что самую высокую относительную скорость адсорбции по сравнению
с другими веществами имеют фосфолипиды (табл. 9.7) [91,153] .
Сравнение осветляющего эффекта при адсорбционной очистке соевых
мисцелл показало, что более высокий эффект достигается при адсорбцион-
ной очистке гидратированных мисцелл [102, 227] . Кроме того, с увеличе-
нием концентрации мисцеллы и температуры обработки степень поглоще-
ния сорбентом фосфолипидов возрастает. Увеличение количества до-
бавляемого для обработки мисцеллы сорбента сопровождается посте-
пенным ростом адсорбции фосфолипидов; при этом наиболее существен-
ные изменения в адсорбции последних наблюдаются лишь при продолжи-
тельности обработки более 15 мин. Таким образом, адсорбция фосфолипи-
дов сорбентами при отбелке мисцелл зависит прежде всего от концентра-
ции мисцеллы и температуры процесса. Так, повышение температуры от
20 до 70°С вызывает снижение содержания фосфолипидов в мисцелле на
30%, а увеличение концентрации мисцеллы от 20 до 80% - на 60—70%.
Таблица 9.7
Характеристика процесса поглощения сопутствующих хлопковому маслу
веществ Ангренским адсорбентом
Количество адсорбируемых индиви-
дуальных веществ из раствора
Адсорбент г/г ммоль/г относитель- ная ско- рость ад- сорбции, %
Пальмитиновая кислота (в гексане) 0,014 0,057 57,0
Линолевая кислота (в гексане) 0,014 0,051 44,4
Линолевая кислота (в хлороформе) 0,010 0,036 31,5
Фосфолипиды (в хлороформе) 0,027 0,036 75,0
Госсипол (в хлороформе) 0,012 0,058 55,5
199
В связи с этим слгимальными параметрами для адсорбционной очистки
соевых мисцелл являются температура 35—40°С, концентрация мисцеллы
16—20%, время обработки 8-10 мин, количестве сорбента 1% к массе мас-
ла [22]. Однако даже при этих параметрах наблюдается снижение содержа-
ния фосфолипидов в отбеленной мисцелле в среднем на 10%. В табл. 9.8
показано изменение содержания отдельных групп фосфолипидов после ад-
сорбционной о чистки мисцеллы соевогомасла [227]
Наиболее активно адсорбируются фосфатидилхолины и фосфатидил-
этаноламины, адсорбция фосфатидилинозитолов незначительна.
Отмечено, что наибольший осветляющий эффект при адсорбционной
очистке хлопкового масла можно получить лишь при обработке гидрати-
рованных мисцелл с минимальным содержанием фосфолипидов [238]
Таким образом, фосфолипиды, содержащиеся в маслах и в мисцел-
лах растительных масел, направляемых на адсорбционную очистку, сни-
жают эффективность этого процесса, а также увеличивают отходы и потери
масла при осуществлении процесса.
Влияние фосфолипидов на дезодорацию масел. Для выявления влияния
фосфолипидов, остающихся в рафинированных маслах, на процессы высо-
котемпературной переработки масел (дезодорация, гидрогенизация) изу-
чены их изменения при воздействии температур в интервале 100-240°С
[112,212].
Отмечено, что посте воздействия на рафинированные масла в течение
2. мин температур в интервале 180-220°С и последующего центрифугиро
вания масел содержание Фосфолипидов практически не изменяется. Однако
в фосфолипидах, выделенных из рафинированного масла после воздейст-
вия температуры 240°С, наряду с группами, идентифицированными в ис-
ходном масле (инозитолсодержащие, фосфатидилсерины, фосфатидилэта-
ноламины, фосфатидные и полифосфатидные кислоты), былс обнаружено
вещество (Rf = 0,56), которое идентифицировано как глицерофосфат.
Сложные соединения фосфолипидов с металлами и неомыляемыми липи-
дами (стеролами, алифатическими спиртами), обнаруженные в исходном
рафинированном масле, остаются в масле и после воздействия температур
220— 240°С.
Таким образом, фосфолипиды, остающиеся в рафинированных маслах,
подвержены лишь частичном, и. ’действию высоких температур (220-
2*0°C), в результате чете они разрушаются до глицерофосфата Так как
Таблица 9.8
Результаты адсорбции фссфолипидое, при осветлении
соевой мисиеллы ”
Образцы мисцелл Фосфолипиды, % к общем) фосфору
фосфатидил- холины фосфатидил- этанол амины фосфатидил- инозитолы
33,0
28,0
17,0
13,7
14,0
13,2
ИСХОДНаЯ
Отбеленная
200
процесс гидрирования рафинированных масел осуществляется не только
при высоких температурах, но и в присутствии катализатора, то поведе-
ние фосфолипидов в этих условиях должно быть иное, чем при воздействии
температур 220-240°С.
9.2 ВЛИЯНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ НА ГИДРОГЕНИЗАЦИЮ
РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ И ОТДЕЛЕНИЕ КАТАЛИЗАТОРА
ОТ ГИДРИРОВАННЫХ ЖИРОВ
В литературе отмечено, что фосфолипиды, содержащиеся в маслах,
затрудняют процесс гидрирования, неблагоприятно влияя на качество
гилрогенизата (саломаса), на процесс отделения последнего от катализа-
тора, а также на активность катализатора [33, 73, 74, 78, 104, 112, 132,
222, 225, 226, 231] .
Было сделано предположение, что процесс гидрогенизации тормо-
зится в результате образования на катализаторе пленок фосфолипидов, а
также вследствие гидрирования собственно фосфолипидов [225] .
Поведение фосфолипидов в процессе гидрирования было детально изу-
чено [112,212]
Рафинированное подсолнечное масло с остаточным содержанием фос-
фора 0,22-Ю-2 % и не содержащее мыла подвергали гидрированию в при-
сутствии свежего медно-никелевого катализатора в лабораторном авто-
клаве при 180°С. Саломас и отработанный катализатор исследовали по схе-
ме, приведенной на рис. 9.1 (табл. 9.9).
Показано, что в липидной фракции, полученной при обезжиривании ка-
тализатора. фосфора содержится 14,50-10-2%,чтов66 раз больше, чем в ис-
ходном масле. Это указывает на то, что значительная часть фосфорсодержа-
щих веществ активно адсорбируется катализаторами и при обеэжирива
нии его на фильтре хлороформметанольной смесью переходит в липидную
фракцию Содержание фосфора в саломасе снизилось до0,05.1(Г2%,что в
4 раза ниже содержания его в исходном масле. Это также свидетельствует
о сорбции фосфорсодержащих веществ на катализаторе.
При обезжиривании катализатора на фильтре хлороформметанольной
смесью экстракт после фильтрации имел интенсивное зеленое окрашива-
ние и содержание никеля в нем составляло 0,62%. Это позволяет предпо-
ложить, что при фильтрации часть никеля находится в коллоидно-раствори-
мом состоянии 1 жире и вымывается растворителем.
Значительное количество фосфорсодержащих веществ с металлами
прочно адсорбируется на катализаторе и не вымывается при обработке хло-
роформмеганольной смесью. На это указывает содержание фосфора в
обезжиренном отработанном катализаторе 3,9010-2%.
При диализе липидной фракции с катализатора фосфорсодержащие
вещества, находящиеся в связанном состоянии с металлами, преимущест-
венно остаются в диализа ционной камере и незначительно переходят в диа-
лизат. В случае диализа саломаса фосфорсодержащие вещества практически
не переходят в диализат.
Установлено, что фосфолипиды нейтрализованного масла (инозитол-
содержащие, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилсерины, фосфатидные и
201
ff

Рис 9 1. Схема выделения фосфолипидов из саломаса и лтрабстанного катализатора
полифосфатидные кислоты) претерпевают значительные изменения в про-
цессе гидрирования. В фосфорсодержащих веществах, выделенных из са-
ломаса и липидной фракции отраиотанного катализатора, хроматографией
обнаружено только стартовое пятно, что позволяет предположить полное
деструктурирование фосфолипидов Таким образом, при контакте с
катализатором фосфолипиды, находящиеся в рафинированном масле, пре-
терпевают глубокие изменения.
Разрушение комплексных соединений фосфолипидов с металлами объ-
ясняется тем, что находящиеся в них в качестве центрального атома катио
ны ряда металлов (Са+2, Mg*2, К+, Na*) вытесняются катионом NT2 из
катализатора, причем образуются комплексы, неустойчивые в саломасе.
Сложные соединения фосфорсодержащих с неомыляемыми липидами так-
же разрушаются в процессе гидрирования. Большая часть фосфорсодержа-
щих веществ адсорбируется на поверхности катализатора, образуя новые
соединения. Основная часть этих веществ прочно удерживается на катали-
заторе даже при экстракции его растворителем.
В литературе приведены сравнительные данные поведения фосфолипи-
дов при высокотемпературной гидрогенизации рафинированного подсол-
нечного масла и при низкотемпературной гидрогенизации разбавленных
гексановых мисцелл подсолнечного масла ‘[74].
203
Отмечено, что при высокотемпературном гидрировании масел проис-
ходит необратимая адсорбция фосфолипидов из масел на поверхность
катализатора, сопровождающаяся значительным снижением гидрирующей
активности и стабильности катализатора. Содержание фосфолипидов в про-
бах гидрогенизатов по ходу процесса соответствовало 0,01% и не зави-
село от их начального содержания в масле (следы; 0,09%; 0,25%); для ра-
финированных масел с содержанием фосфолипидов 0,09% катализатор де-
зактивировался через 8 ч, а с содержанием 0,25% - через 2 ч. По-иному
ведут себя фосфолипиды в разбавленных масляных мисцеллах: общая кон-
центрация фосфолипидов в гидрогенизатах при низкотемпературном гид-
рировании снижается лишь в первые 3-4 ч с начала реакции гидрирования.
В дальнейшем в процессе адсорбция - десорбция фосфолипидов с поверх-
ности катализатора устанавливается равновесие (содержание фосфолипи
дов в гидрогенизатах, отобранных после 4 ч гидрирования, практически
соответствует их содержанию в исходной мисцелле). Такие особенности по-
ведения фосфолипидов в разбавленных мисцеллах в процессе низкотемпе
ратурного гидрирования объясняются:
структурированием (образованием мицелл) фосфолипидов в неполяр-
ной среде с низкими диэлектрическими свойствами. В этом случае радика-
лы жирных кислот фосфолипидов пространственно располагаются ’’на-
ружу” и подход к поверхности катализатора этими частями молекул наи-
более вероятен;
влиянием растворителя, способствующего большей легкости отвода
фосфолипидов с поверхности катализатора в раствор;
соотношением между компонентами гидрируемой системы масло-
растворитель - фосфолипиды (например, 3:1:0,02); в единицу времени
поверхность катализатора и его активные центры заняты веществами в за-
висимости от их концентрации в растворе.
Предложен возможный механизм дезактивации катализаторов гидри-
рования на примерах гидрирования подсолнечного масла, содержащего
синтетические оксифосфаты триаципглицеринов [74] . Опыты проводили
на образцах масла с содержанием оксифосфатных производных триацил-
глицеринов концентрацией (1+2)-10'2% в барботажном реакторе в интерва-
ле температур 20-220°С в присутствии 0,3% пассивного никель-киэельгуро-
вого катализатора при барботаже азота или водорода. Динамика хемосорб-
ции оксифосфатов триаципглицеринов на никель-кизельгуровом катализа-
торе приведена в табл. 9.10.
Таблица 9.10
Степень извлечения оксифосфатов из масла, %
t,°C Газовая среда Продолжительность опыта, ч
0,1 0,25 0,50 0,75 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
100 Азот п 13 15 22 32 26 21 14 9 200 ” 13 13 27 9 8 7 6 7 6 100 Водород 34 27 27 31 28 34 25 32 37 200 ” 26 21 26 22 29 23 30 24 31
204
Таблица 9.11
Остаточное содержание никеля (в мг/кг) в фильтратах
гидрированного подсолнечного масла (200°С)
Начальное содержание оксифосфатов в масле в пересчете на фосфор Р Ю4, % Продолжительность опыта, ч
0,1 0,25 0,5 0,75 1,0
6 6 7. 9 9
5,6 7 8 11 13 14
Оксифосфаты триаципглицеринов хемосорбируются на никелевом
катализаторе. При 100—200°С максимум хемосорбции соответствует извле-
чению из масла примерно 30% фосфорных производных. Активное взаимо-
действие оксифосфатов с поверхностью катализатора и быстрая десорбция
никелевых производных объясняют периодичность максимумов и миниму-
мов содержания оксифосфатов на гидрирующем катализаторе. Эрозия
каталитической поверхности оксифосфатами приводит не только к сниже-
нию гидрирующей активности катализатора, но и к накоплению в жидкой
фазе неотфильтровывающихся от гидрогенизатов частиц никеля и фосфа-
тов никеля (табл. 9.11).
Таким образом, хемосорбция фосфорных производных на катализато-
ре и последующее образование фосфатов никеля объясняют дезактивацию
катализатора при гидрировании масел, а также увеличение содержания ни-
келя в отфильтрованном гидрогенизате. Предложенный механизм хорошо
согласуется с данными, полученными авторами [112] .
Отмечено, что фосфолипиды приводят не только к дезактивации ката-
лизатора, но и к накоплению никеля в саломасе, а следовательно, снижают
его фильтруемость [74].
Влияние фосфолипидов на фильтруемость саломаса рассмотрено в лите-
ратуре [33, 78, 93, 104, 222, 226] . Так, в литературе показано, что фосфо-
липиды (0,05-0,10% к массе саломаса) снижают скорость фильтрации са-
ломаса в 3,5—5 раз [33, 131, 222] . Установлено отрицательное влияние
фосфолипидов на процесс отделения катализатора от гидрированного жи-
ра и в электростатических полях (табл. 9.12).
Из приведенных в табл. 9.12 данных видно, что с увеличением содержа-
ния фосфолипидов в масле, направляемом на гидрирование, повышается
содержание никеля в саломасе. Для снижения остаточного содержания ни-
келя в саломасе перед осаждением катализатора необходимо вводить в са-
ломас инициирующие добавки, количество которых устанавливается в за-
висимости от содержания никеля и фосфора в гидрированном жире до
электроосаждения. В табл. 9.13 приведены сравнительные данные при от-
делении никеля обычным фильтрованием и методом электроосаждения от
саломаса, полученного при гидрировании модельных подсолнечных масел
с содержанием в них негидратируемых фосфолипидов 0,05 -0,25%.
Таким образом, степень отделения катализатора от саломаса при обыч-
ной фильтрации и электрофильтрации определяется содержанием фосфоли-
пидов в гидрируемом масле.
205
X
о
X
S'
g
Q
*
a
s
s
c
§.
e
s.
*
к
<©
&
3
О
g
<»
§
i
1
Й
Й
I 5 -M
CX. Cm
s § s
О
s =
S. a и
I s J
о
о
?
о
£
° о
5 bi
<8
з
E
3
I
•&
3
3t
5
<§
£
<*>
8.
Й
3
к
CJ
rt
о
5
и
206
Таблица 9.13
i, nnnunnpyiuuAcn прицепи jJicKipuQiaJKutHUM кагализатора, применяли лимонную кислоту.
Влияние фосфолипидов на фильтруемость саломаса
Содержание фосфолипи- дов в масле до гидриро- вания, % Содержание никеля, мг/кг Содержание фосфолипи- дов, %
после обыч- ного фильт- оования после отде- ления ката- лизатора ме- тодом элект- ро осаждения после обыч- ного фильт- рлеаник после.отде- ления ката- лизатора ме- тодом элект- роосаждения
Нет 8,7 1,1 Hei Нет
0,05 10.3 1,8 0,037 0.016
0,10 14,7 3,0 0,082 0,034
0 15 22,6 9,7 0,120 1’041
0,25 37,5 20,5 0,181 0,065
В заключение можно отметить, что многочисленные исследования и
опыт работ однозначно свидетельствуют о том, что присутствующие в мас-
лах фосфолипиды приводят .к снижению эффективности основных этапов
рафинации: нейтрализации, сорбционной очистки, дезодорации. Фосфоли-
пиды снижают также активность катализаторов гидрирования и затрудня-
ют отделение катализатора от пщрогенизата. Особенно следует отметить,
что бесщелочная рафинация (дистилляционное удаление свободных жирных
кислот) становится возможной только при глубоком удалении фосфоли-
пидов [189] . Поэтому предварительное, наиболее полное, удаление фос-
фолипидов на начальной стадии рафинации масел не имеет альтернативы.
10. СПОСОБЫ ВЫВЕДЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ
ИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ
В современных технологических схемах рафинации растительных
масел важнейшей операцией наряду с удалением свободных жирных кислот
с является гидратация, позволяющая извлечь из масел фосфолипиды и под-
Р готовить тем самым масла к последующим этапам рафинации Извлечен-
з ные фосфолипиды в виде фосфатидного концентрата широко применяются
j в отдельных отраслях пищевой промышленности, медицине, сельском хо-
зяйстве и в др.
» Основным способом выведения фосфолипидов из растительных масел
а является гидратация их водой.
= 10.1. ВЫВЕДЕНИЕ ГИДРАТИРУЕМЫХ ФОСФОЛИПИДОВ
ИЗ МАСЕЛ
г
' В основе процесса гидратации фосфолипидов из растительных масел
I лежит наиболее важное из всех свойств фосфолипидов - их отношение
> • к действию воды.
: Несмотря на то что гидратация применяется в промышленности уже
давно, сущность этого процесса не изучена в достаточной степени, не пол-
207
ностью выяснен механизм взаимодействия фосфолипидов с водой. Сущест-
вует ряд более или менее обоснованных теорий объяснения процесса гидра-
тации, которые исходят из коллоидной природы растворов фосфолипидов
в неполярных растворителях [5, 240. 308, 109].
Распространенное мнение о химическом присоединении воды к фос-
фолипидам как объяснение механизма гидратации не отражает существа
протекающих процессов [240].
Основываясь на экспериментальных данных, изложенных в разделе 6,
можно предположить, что в сухом масле фосфолипиды присутствуют
в молекулярно-растворимом состоянии, это в основном сложные сое-
динения фосфатидных, попифосфатидных кислот и дифосфатидилглицери-
нов со стеролами, алифатическими спиртами;
в молекулярно-растворимом состоянии в виде комплексов, образо-
вавшихся за счет внутримолекулярных водородных связей (фосфзтидил-
этаноламины. фосфатидилсерины и фосфатидные кислоты) и внутримоле-
кулярные координационных связей (соединения фосфатидилсеринов, фос-
фагидилэтаноламинс.п и фосфатидилинозитолов с двух-, трехвалентными
металлами и углеводами);
в виде ассоциатов низкого порядка типа димеров (фосфатидные кис-
лоты) , суммарный дипольный момент которых близок к нулю;
в виде ассоциатов более высокого порядка, образованных за счет меж-
молекулярных водородных связей;
в виде мицелл различного порядка, образованных под влиянием меж-
молекулярных ван-дер-ваальсовых сил.
Процесс гидратации фосфолипидов из масел предусматривает введе-
ние в масло гидратирующего агента, чаще всего воды, при интенсивном
контактировании.
При малых количествах гидратирующего агента, когда на поверх-
ности водной фазы образуется насыщенный слой адсорбированных фосфо-
липидов, вода прочно удерживается в объеме масла. Образовавшаяся при
этом система достаточно стабильна и агрегативно устойчива. Образование
осадка наблюдается только при снижении температуры или при длитель-
ном хранении.
С увеличением же количества гидратирующего агента в образовании по-
верхностных слоев одновременно с фосфолипидами участвуют уже и мп
лекулы триацилглицеринов; максимум энергии взаимодействия в таком
смешанном поверхностном слое наступает при соотношении фосфолипи-
ды — триацилглицерины (70:30) [308] . В результате образуется термоди-
намически неустойчивая система, происходит коагуляция фосфолипидов
и выпадение их в осадок, т. е. гидратация.
Фосфолипиды, находящиеся в масле только в виде ассоциатов, образо-
ванных межмолекулярными водородными связями и проявляющих высо-
кую гидрофильность, активно сорбируются на поверхности водной фазы.
К ним относятся фоефатидилхолины, не способные к образованию внутри-
молекулярных водородных связей, в меньшей мере соединения фосфати-
дилэтаноламинов с одновалентными металлами и др., они легко гидрати-
руются и достаточно полно выводятся из масла.
208
Молекулы фосфолипидов, такие, как соединения с неомыляемыми
липидами, молекулярно-растворимые в масле, в образовании поверхност-
ных смешанных слоев практически не участвуют и не выводятся при гид-
ратации
Мала вероятность подхода к поверхности воды и участия в образова-
нии поверхностных слоев и тех молекул фосфолипидов, которые нахо-
дятся в виде ассоциатов низкого порядка типа димеров в результате
диполь-дипольного взаимодействия.
Соотношение фосфолипидов и триацилглииеринов (70:30) в насыщен-
ном поверхностном слое при оптимальном количестве введенного гидра-
тирующего агента определяет и их соотношение в образовавшейся фосфа-
тидной эмульсии, а следовательно, и н фосфатидном концентрате. Решаю-
щим фактором в получении оптимального соотношения фосфолипиды—
триацилглицерины в фосфатидной эмульсии являются также условия раз-
деления фаз системы масло—фосфатидная эмульсия.
Если количество гидратирующего агента введено больше оптималь-
ного. возможно образование эмульсии типа жир в воде; в результате об-
ращения фаз и стабилизации ее фосфолипидами такая система трудно раз-
деляется даже в поле центробежных сил.
Значительное влияние на процесс гидратации фосфолипидов из масел
оказывает температура. Повышение температуры системы до критической
температуры индивидуализации и введение в этих условиях гидратирующе-
го агента (воды) позволяет увеличить вероятность участия в образовании
поверхностных слоев фосфолипидов, находящихся в масле в молекуляр-
но-растворимом состоянии в виде внутренних комплексов, а также в виде
димеров Последующее охлаждение полученной смеси создает благоприят-
ные условия коагуляции и повышает эффективность процесса в целом.
Снижение температуры до критической температуры деассопиэции.
когда практически все молекулы фосфолипидов независимо от их струк-
туры находятся в виде мицелл высоких порядков, вызывает даже при не-
значительном введении гидратирующих агентов интенсивную агрегацию
фосфолипидов, которые осаждаются в виде крупных агрегатов. Такие аг-
регаты содержат в своем составе значительное количество триацилгли-
перинов.
Для повышения эффективности процесса гидратации необходимо
учитывать природу, состав и качество масел, поэтому целесообразно для
каждой партии определять оптимум температуры и количества гидрати-
рующего агента.
Приведенный механизм гидратации фосфолипидов, базирующийся на
особенностях их структуры в масле, объясняет наличие в гидратирован-
ных маслах и некоторого количества так называемых дегидратируемых
форм фосфолипидов.
Как уже отмечалось, ,-одная гидратация не позволяет полностью вы-
вести из масла фосфолипиды, поэтому возникает необходимость дальней-
шего совершенствования технологии гидратации и разработки высоко
эффективных способов выведения негидратируемых фосфолипидов из
гидратированных масел.
14 - 727
209
10.2. ВЫВЕДЕНИЕ НЕГИДРАТИРУЕМЫХ ФОСФОЛИПИДОВ
ИЗ МАСЕЛ
Способы удаления негидратируемых фосфолипидов из растительных
масел основаны на обработке их минеральными и органическими кислота-
ми, буферными растворами, растворами комплексообразователей, водны-
ми растворами аммиака и солей, растворами ПАВ и адсорбентами [45,
52, 53, ПО, 115, 147, 196, 197, 310 и др.].
Рассмотрим способы выведения негидратируемых фосфолипидов,
в которых в качестве гидратирующего агента для негидратируемых фосфо-
липидов применяются концентрированные кислоты или их водные
растворы.
По литературным данным, наиболее полное удаление фосфолипидов
достигается при воздействии на масла концентрированных кислот и щело-
чей (pH 1—3 и pH 13—14) [345] . В таком масле фосфолипиды либо отсут-
ствовали, либо их содержание составляло 0,02%. Предполагается, что при
обработке масел реагентами с pH 1—3 образуются диссоциированные фор-
мы фосфатидной кислоты, которые вымываются при последующей про-
мывке масла. Когда же масла обрабатываются реагентом с pH 13—14, про-
исходит омыление фосфатидных кислот до СА- и Mg-солей лизофосфатид-
ных кислот и далее - до Са- и Mg-солей глицеро-фосфорной кислоты, ко-
торые растворяются в воде и также удаляются при последующей обра-
ботке водой [345].
Обработка масел малеиновой, пропионовой, янтарной кислотами и их
ангидридами заключалась в том, что масло сначала смешивали с 0,1—1,0%
уксусного ангидрида при температуре 60°С, после чего промывали 1,5%
воды для удаления следов кислоты и центрифугировали*. В результате та-
кой обработки содержание фосфолипидов в масле снижалось до 0,005-
0,01%. Однако такой результат имел место только в случае обработки вы-
сушенного масла. В противном случае, влага, присутствующая в маслах,
превращала ангидрид в уксусную кислоту, которая менее эффективна при
удалении фосфолипидов. Необходимость предварительной сушки масла, ис-
пользование коррозионно-устойчивой аппаратуры, а также сложности, воз-
никающие при дальнейшем отбеливании масла, не позволили этому способу
найти широкое применение в промышленности.
В Японии в качестве гидратирующего агента предлагается применять
щавелевую, высококонцентрированную серную и соляную кислоты. По-
добная обработка масел сопровождается рядом отрицательных явлений —
частичной этерификацией, потемнением масел, изомеризацией, растущей с
* Патент Англии № 1509543, 1978; Патент Англии, № 1509664, 1978; Патент
США, № 2783260, 1957; Патент США, № 2754309, 1956; Патент США, №4154750,1959;
Патент Франции, № 2188612, 1974; Патент Англии, № 887885, 1953; Патент США
№ 2782216, 1957; Патент США № 2881195, 1959; Патент Японии № 5034758, 1976;
Патент США № 2410926, 1946; Патент США № 2666074, 1954; Патент Англии
№ 1511953, 1978; Патент США № 3226407, 1978; А.с.489782 (СССР). Б.И., 1975,
№ 40; Патент ФРГ № 1214818, 1963; Патент США № 3354188, 1967; Патент США
№ 3895042, 1975; Патент Франции № 2191560,1974.
210
увеличением концентрации, поэтому не представляет практического ин-
тереса.
Наибольшее практическое применение получила концентрированная
фосфорная кислота [269, 335, 336] . Обработка концентрированной фос-
форной кислотой перед щелочной нейтрализацией предусматривается в
схемах рафинации фирм ’’Альфа-Лаваль”, ’’Зенит” и ’’Шарплесс”, а также
перед нейтрализацией подсолнечного масла в мыльно-щелочной среде.
Некоторые авторы рекомендуют концентрированную фосфорную кис-
лоту вводить в смеси с эмульгаторами, в качестве которых используют
моно- и диацилглицерины натуральных масел, жиров и восков.
В США после кислотной обработки пальмовых и рапсовых масел
предусматривается их адсорбционная очистка. Сорбент и адсорбированные
продукты затем удаляются фильтрацией, а масло подвергается непосред-
ственно дезодорации или гидрированию. Количество фосфорной кислоты
составляет 1,0-1,6%, количество активированной глины в зависимости
от ее адсорбционной способности и природы обрабатываемого масла -
0,1—6,0% к массе масла.
Во ВНИИЖе показана возможность применения такой технологии для
льняного и подсолнечного масел, используемых для производства лакокра-
сочной продукции или как подготовительный этап перед дистилляционным
удалением свободных жирных кислот [45,46, ПО, 147] .
Механизм кислотного удаления фосфолипидов сложен и до настоящего
времени до конца не выяснен. В зависимости от состава, структуры и
свойств фосфолипидов механизм действия фосфорной кислоты рассматри-
вается-в двух направлениях. Ряд авторов считает, что действие фосфор-
ной кислоты заключается в разрушении кальциевых и магниевых производ-
ных фосфатидных кислот и других кислых эфиров фосфорной кислоты
[298, 299]. В результате реакции негидратируемых фосфолипидов с кон-
центрированной фосфорной кислотой кальций и магний переходят в хоро-
шо растворимые и извлекаемые водой дигидрофосфаты, а образующиеся
свободные от ионов металлов фосфатидные кислоты и другие кислые
формы фосфорной кислоты удаляются из масел адсорбционной очисткой
или в виде динатриевых солей при последующей обработке щелочью.
Другие авторы высказывают предположение, что действие фосфорной
кислоты выражается в ее присоединении к фосфатидилинозитолам и по-
вышении вследствие этого их гидрофильности [110,147, 276, 395].
Отмечено, что в льняном масле фосфорная кислота взаимодействует
с фосфогликолипидами, отщепляя молекулу углеводов от сложных фос-
фолипидов, тем самым способствуя их выведению из масел при последую-
щей обработке водой [ 110, 147, 299] .
Как показала практика, обработка масел концентрированной фосфор-
ной кислотой приводит к увеличению кислотного числа масла (при вводе
в масло 0,1%-ной концентрированной фосфорной кислоты кислотное число
возрастает на 1,7—1,8 мг КОН), что влечет за собой увеличение расхода ще-
лочи при нейтрализации, а также дополнительные отходы нейтрального
жира. В большинстве случаев происходит заметное увеличение цветности
масел, что связано с протеканием побочных нежелательных процессов
[ПО]. Одним из таких нежелательных процессов является взаимодейст-
211
вие концентрированной фосфорной кислоты с эпоксисоединениями расти-
тельных масел [145, 216] :
-CH-CH- +Н3РО4----->—сн-сн-
О ОН ОРО3Н2
Эпоксигруппа Оксифосфат,
Образующиеся оксифосфаты могут быть удалены только при обработ-
ке концентрированными растворами щелочей [ 110]. В связи с этим спо-
соб обработки масел концентрированной фосфорной кислотой перед
нейтрализацией в мыльно-щелочной среде не эффективен, так как образу-
ющиеся оксифосфаты не удаляются из масел ни при обработке их разбав-
ленными растворами щелочи (15-20 г/л), ни при последующей промыв-
ке. Они устойчиво остаются в маслах и приводят к отравлению катализа-
торов гидрирования.
Учитывая указанные недостатки способов, в МФ ВНИИЖа предложен
способ кислотной обработки растительных масел с применением фосфор-
ной кислоты на носителе. При такой обработке независимо от содержа-
ния влаги и продуктов окисления в масле, направляемом на обработку,
фосфолипиды в обработанном масле отсутствуют.
Наряду с использованием концентрированных кислот показана воз-
можность применения разбавленных растворов таких кислот, как лимон-
ная, муравьиная и др. [45,46,356,362] ♦.
Обработка гидратированного масла 20%-ным раствором лимонной
кислоты в количестве 0,1% (в пересчете на сухое вещество) к массе масла
позволяет вывести до 20% негидратируемых фосфолипидов от их исход-
ного содержания [46].
Установлена возможность применения для удаления негидратируемых
фосфолипидов 5%-ной азотной кислоты в количестве 3-5% к массе масла
[299]. Недостатком такого способа является образование эмульсионного
слоя, что ведет к дополнительным потерям нейтрального жира. Кроме то-
го, использование разбавленных растворов азотной кислоты ставит проб-
лему защиты от коррозии оборудования как для процесса обработки ма-
сел, так и для обработки образующихся эмульсий.
Отмечено, что обработка подсолнечных масел 5%-ным водным раст-
вором фосфорной кислоты приводит к снижению содержания фосфолипи-
дов-до 0,04—0,10% и последующей более стабильной нейтрализации масел
в мыльно-щелочной среде [5].
Перспективным направлением в области удаления негидратируемых
фосфолипидов является применение буферных растворов, растворов
комплексообразователей, а также поверхностно-активных веществ
[52,64,216] * **.
Показано, что обработка гидратированного масла буферным раствором
* Патент США № 2792111, 1957.
Патент Франции № 1388671, 1965.
** А.с. 757591 (СССР) - Б.И., 1980, № 31.
А.с. 806750 (СССР). - Б.И., 1981, № 7.
А.с. 992564 (СССР). - Б.И., 1983, № 4.
212
pH 3—4, в состав которого входят лимонная кислота, хлористый натрий и
однозамещенный лимоннокислый натрий, приводит практически к полно-
му выведению и? масел негидратируемых фосфолипидов, ионов металлов,
а также к увеличению стойкости масел к окислению в 1,5-2 раза [52].
В работах, проведенных на кафедре технологии жиров Краснодарско-
го политехнического института, установлена эффективность выведения не-
гидратируемых фосфолипидов из гидратированных масел в результате
обработки масел растворами поверхностно-активных веществ*. Особенно
такая обработка эффективна в том случае, когда поверхностно-активные
вещества образуются непосредственно в системе масло - негидратируемые
фосфолипиды. Такая закономерность была положена в основу разработки
авторами некоторых способов рафинации масел. Отмечено, что последова-
тельная обработка гидратированных масел разбавленным раствором фос-
форной кислоты и силиката натрия приводит к образованию поверхност-
но-активного вещества - геля кремниевой кислоты, который адсорбирует
на своей поверхности негидратируемые фосфолипиды**. Кроме того, по-
вышается в 1,2-2,0 раза стойкость масла к окислению и снижается цвет-
ность масла. В другом способе гидратированное масло обрабатывается
раствором щелочи**. При этом образуются кислые мыла, обладающие
высокой поверхностной и адсорбционной активностью.
10.3. ОСОБЕННОСТИ ВЫВЕДЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ
ИЗ МИСЦЕЛЛ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ
В соответствии с основными направлениями развития масло-жировой
промышленности в нашей стране предусматривается дальнейшее увеличе-
ние переработки масличных семян экстракционным способом и переход
на методы прямой экстракции.
Получение масла прямой экстракцией или экстракцией в сочетании с
предварительным съемом масла в мягких условиях приводит к переходу
основной массы сопутствующих веществ, в первую очередь фосфолипидов,
в экстракционное масло. В связи с этим вопросы рафинации масел в раст-
ворителе, и в частности гидратации, приобретают особый интерес.
Следует отметить следующие работы по рафинации масел в мисцелле
[285 , 306], а также исследования, проведенные во ВНИИЖе [86, 214] ,
в которых впервые было отмечено специфическое поведение фосфолипи-
дов в разбавленных мисцеллах. Гидратации подвергалась хлопковая мис-
целла после предварительного дистиллятора с содержанием гексана 8%.
Фосфатидная эмульсия отделялась на герметических сепараторах и направ-
лялась в шрот, а гидратированная мисцелла подавалась в окончательный
дистиллятор для удаления остатков гексана и влаги. Автор указанной
работы отмечает, что наиболее экономичным является сочетание гидратации
мисцеллы с ее последующей рафинацией.
При изучении гидратации фосфолипидов из мисцелл подсолнечных
и соевых масел указывается, что при концентрации мисцелл 20-30% гидра-
* А.с. 992564 (СССР) - - Б.И., 1983, №4.
♦ А.с. 757591 (СССР) .-БИ.. 1980, № 31.
213
Таблица 10.1
Показатели качества подсолнечных масел, гидратированных в мисцелле
Показатель Исходное масло (эк- стракцион- ное) Гидратация
масла мисцеллы
Кислотное число, мг КОН/г Содержание фосфолипидов. % 2.69 2,44 2,37
0,78 0.24 0.23
Цветность, мг 15 10 8
Содержание коричневых пигментов, мг/г 0,190 0,158 0,085
Содержание продуктов окисления, нераствори- мых в петролейном эфире, % 0,45 0,43 0.29
тация их 2-3% воды (к массе мисцеллы) не приводит к выведению фос-
фолипидов [214] При концентрации мисцеллы 80% для соевого и 85%
для подсолнечного масел гидратацией было выведено соответствен^
фосфолипидов 78 и 80% от их начального содержания.
В более поздних работах изучение гидратации фосфолипидов из под-
солнечных мисцелл показало, что при концентрации мисцелл ниже 35--40%
гидратация фосфолипидов практически не наблюдается, при концентрации
мисцелл более 50% степень гидратации возрастает, достигая максимума
при 90% |5, 56,138]
Методом математического планирования определены оптимальные ре-
жимы гидратации фосфолипидов из мисцелл подсолнечного масла — кон-
центрация мисцеллы 90—92%, температура 5О-55°С, количество воды
2,0-2,5% к массе мисцеллы [1801 Показано, что масла и фосфатидные
концентраты, полученные гидратацией мисцеллы, имеют более высокое ка-
чество по сравнению с маслами и фосфатидными концентратами, получен-
ными гидратацией экстракционного масла (табл. 10.1 и 10.2). Это объяс-
няется исключением температурного воздействия на фосфолипиды в про-
цессе окончательной дистилляции мисцеллы, которое приводит к обра-
зованию нежелательных соединений (меланофосфатидов, продуктов окис-
ления и др.), снижающих качество фосфатидного концентрата.
Особенность фосфолипидов проявлять устойчивость к воде и к слабым
водным растворам щелочей в разбавленных бензиновых и гексановых мис-
целлах использована для разработки способа нейтрализации подсолнечных
масел в мисцелле*.
Необходимо отметить, что в отечественной и зарубежной практике
промышленные способы удаления фосфолипидов из мисцеллы отсутст-
вуют Одной из причин является особенное поведение фосфолипидов в мис-
целлах по сравнению с их поведением в маслах [214, 224, 241]
Повышение устойчивости фосфолипидов в мисцеллах некоторые ав-
торы объясняют снижением общей концентрации фосфолипидов в системе,
а также изменением мицеллярной структуры фосфолипидов в системе с
более низкой диэлектрической проницаемостью (триацилгпиперины мас-
* А.с 384850 (СССР). - Б.И , 1973. №25.
214
Таблица 10.2
Показатели качества подсолнечных фосфатидных концентратов
Показатели Г и дратация
масла мисцеллы
Кислотное число, мг КОН/г 9,45 7,11
Цветность, мг 13,00 8,00
Содержание, % фосфолипидов 50,03 57,15
масла 43.72 41,18
влаги 0,92 0,92
продуктов окисления, нерастворимых в петролейном 2,15 1,23
эфире Содержание коричневых пигментов, мг/г 0,168 0,108
ла — растворитель) по сравнению со структурой мицелл, образованных в
масле [5,138] .
Авторами данной книги показано, что основными причинами, опре-
деляющими устойчивость фосфолипидов в мисцеллах, являются сле-
дующие:
снижение энергии взаимодействия фосфолипидов с растворителем за
счет неполярного апротонного растворителя (гексана, бензина) и усиление
в результате этого внутримицеллярного взаимодействия фосфолипидов;
уменьшение числа агрегации мицелл фосфолипидов в результате повы-
шения энергии межмолекулярного взаимодействия;
возрастание межфазного натяжения на границе фаз мисцелла-вода по
мере снижения концентрации мисцеллы.
На основании выявленных закономерностей разработан способ гидра-
тации фосфолипидов из мисцелл растительных масел (концентрация мис-
целл 50—55%) с использованием в качестве гидратирующего агента водных
растворов мыл. Дальнейшие исследования, выполненные авторами данной
книги в этом направлении, показали, что наиболее целесообразной являет-
ся обработка мисцелл водными растворами щелочи концентрацией 20—
50 г/л в количестве, необходимом для снижения кислотного числа мис-
целлы на 0,6-1,0 мг КОН. В результате указанной обработки образуются
”кислые”мыла непосредственно в системе, которые в момент образования
обладают максимальной активностью по отношению к фосфолипидам.
. 10.4. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ВЫВЕДЕНИЯ
ФОСФОЛИПИДОВ
Ранее было показано, что свойства фосфолипидов и их поведение в
растительных маслах объясняются не только химическим строением их мо-
лекул, но и значительно зависят от состояния фосфолипидов в маслах, ха-
рактера образующихся ассоциатов и мицелл.
Для совершенствования способов выведения фосфолипидов, в том
числе и их негидратируемых форм, из растительных масел систему масло—
фосфолипиды следует рассматривать как раствор фосфолипидов в трианил-
215
глицеринах. Естественно, на растворимость и особенность взаимодействия
фосфолипидов с триацилглицеринами оказывают влияние и другие ком-
поненты масла, но степень такого влияния менее существенна.
Растительные масла (подсолнечные, соевые, хлопковые, льняные и др.)
и их триацилглицерины по важнейшему физическому свойству - диэлект-
рической проницаемости (е = 2,9-3,4) относятся к растворителям с низкой
величиной е; в обычных условиях они не способны к образованию водород-
ных связей ни в качестве доноров, ни в качестве акцепторов водорода
(исключением является касторовое масло).
По этому признаку как было отмечено ранее, триацилглицерины расти-
тельных масел относятся к апротонным растворителям с низкой диэлект-
рической проницаемостью к малым дипольным моментом [240, 268, 272} .
Поверхностная активность растворов фосфолипидов в растительных
маслах ярко проявляется на границе раздела с водой. Такая особенность по-
верхностно-активных свойств указанных растворов позволяет отнести
фосфолипиды к группе маслорастворимых ПАВ, образующих в маслах
мицеллярные растворы [ 175 , 239] .
Растворы фосфолипидов в малополярных растворителях (маслах)
представляют собой коллоидную мицеллярную структуру с фазовыми
границами раздела мицелла - среда и характеризуются такими показате-
лями, как критическая концентрация мицеллообразования (ассоциация)
(ККМ или ККА), критические температуры индивидуализации и деассоци-
ации (КТИ и КТД)
Особенность химического состава, строения, полярности и поверх-
ностных свойств фосфолипидов позволяет распространить общую теорию
ПАВ акад II А. Ребиндера на растворы фосфолипидов в мало- или непо-
лярных растворителях (триацилглицеринах, гексане, бензоле, четырех-
хлористом углероде и др.). Такой подход позволил авторам определить
основные направления широких исследований с целью изучения особен-
ностей поведения фосфолипидов в масле, степени воздействия внешних
факторов на изменение их свойств и установление возможных приемов
такого воздействия, с одной стороны, для стабилизации их в масле, с дру-
гой — для глубокой дестабилизации с целью полного выведения фосфо-
липидов из масел.
Молекулы фосфолипидов в масле существуют в истинно растворенном
виде в виде ассоциатов - димеров, мицелл различной формы и размеров с
образованием полярного ядра из определенным ;бразом ориентированных
к центру полярных частей молекул фосфолипиде в; ядро может быть пред-
ставлено микрикапельками воды и др. [5, 106]. Такая структура, как бы-
ло показано, определяется межмолекулярными взаимодействиями, в ко-
торых участвуют все без исключения силы; химические, ван-дер-ваальсовые
взаимодействия, внутри- и межмолекулярные водородные, координацион-
ные и другие формы связи
Кроме указанных межмолекулярных сил взаимодействия с такой
системе участвуют и действуют силы на фазовых границах раздела между
средой и воздухом (поверхностное натяжение), средой и мицеллами, меж-
ду самими мицеллами и т.д.
Из всех форм взаимодействий в системе масло - фосфолипиды опре-
216
РИс. 10.1. Схема мицеллы фос-
фолипидов -. масляной непо-
лярной среде
1 - ядро; 2 - оболочка; 3 -
среда
деляющими являются энергия взаимодействия фосфолипидов со средой и
между собой. Так как молекулы фосфолипидов более полярны, ч^м моле-
кулы триацилглицеринов, то.
~ Ф ф Л’ф.с > £с.с,
т. е. энергия связи фосфолипидов между собой 2Гф ф больше, чем энергия
фосфолипидов со средой Е$ с, и больше, чем энергия молекул среды между
собой Ес с. В результате того, что взаимодействие фосфолипидов в милел
пах больше, чем взаимодействие молекул неполярного растворителя, по-
верхностная активность этих ПАВ на границе раздела с воздухом не прояв-
ляется.
Такая особенность молекулярных взаимодействий фосфолипидов меж-
ду собой в неполярной среде и приводит, как уже отмечалось, к образо-
ванию ассоциатов и мицелл.
Упрощенно схема мицеллы фосфолипидов в масляной фазе может быть
представлена как схема, состоящая из ядра и оболочки (рис. 10 1).
Необходимо отметить, что диэлектрическая проницаемость ядра ея ми-
целлы выше диэлектрической проницаемости оболочки еоб и выше ди-
электрической проницаемости среды ес
€я > С об > ес
В связи с низкой диэлектрической проницаемостью среды (масла)
фосфолипиды в такой среде не диссоциируют, поэтому мицеллы не несут
зарядов [ 106]. Это доказано прямыми опытами в работе [43]
Особую роль при формировании системы масло — фосфолипиды игра-
ет дипольная ассоциация фосфолипидов как наиболее универсальный вид
межмолекулярных взаимодействий. Для негидратируемых форм фосфоли-
пидов вероятно образование устойчивых димеров типа квадруполей, пол-
ный электрический заряд и электрический дипольный момент которых ра-
вен нулю [135].
Особенности химического состава и строения тдельных форм фосфо-
липидов, состав среды (масла) влияют на механизм мицеллообразования,
определяют число агрегации, критическую концентрацию ассоциации, ми-
целлообразования, критическую температуру ассоциации и мицеллообра-
зования и др.
Полярность среды в целом может колебаться в зависимости от влаж-
ности и присутствия, других сопутствующих маслу веществ Эти компонен-
ты масла могут участвовать во внутримолекулярной, межмолекулярной и
межмицеллярной солюбилизации и таким образом вклиниваться в ядро
217
мицеллы, его оболочку, изменяя форму, характер и энергию связей внут-
ри и между мицеллами, вплоть до образования с ними водородных, коор-
динационных и других видов связей.
С учетом свойства молекул фосфолипидов изменять свою полярность
под действием химических реагентов, электромагнитных полей, а также
свойства ассоциатов и мицелл фосфолипидов изменять устойчивость при
температурных, механических и электромагнитных воздействиях (см.
разд. 6.7) авторами данной книги сформулированы основное направле-
ния совершенствования технологии выведения фосфолипидов из расти-
тельных масел (направления воздействия на систему масло — фосфолипи-
ды) [7, 120] : термическая активация; химическая поляризация; химиче-
ская поляризация с применением поверхностно-активных веществ; элект-
ромагнитная активация; механическая активация, а также совокупность
этих методов воздействия.
Метод термической активации системы масло - фосфолипиды. Метод
основан на изменении устойчивости этой системы при воздействии тем-
ператур.
Установлено (см. разд. 6.4), что прочность ассоциатов молекул фосфо-
липидов в неполярных растворителях изменяется в интервале температур
от КТД до КТИ; учитывая это, устойчивость системы масло - фосфоли-
пиды можно нарушить, во-первых, снижением температуры, а во-вторых,
увеличением температуры выше КТИ. В первом случае следует увеличить
размеры ассоциатов (мицелл), а следовательно, повысить их агрегативную
неустойчивость под воздействием внешних факторов, а особенно гидрати-
рующего агента; во втором - разрушить ассоциаты до индивидуальных
молекул и таким образом повысить вероятность взаимодействия их с гид-
ратирующим агентом.
Первое направление осуществлено при низкотемпературных процес-
сах удаления фосфолипидов [194]. Известно, что процесс выморажива-
ния масел, осуществляемый в промышленности при температурах 8-12°С,
экспозиции в течение 3—4 ч и последующей фильтрации, позволяет полу-
чать масла, не содержащие фосфолипиды [194]. Отмечено, что низкотем-
пературное удаление фосфолипидов эффективно осуществлять из мис-
целл растительных масел концентрацией 85-90% и влажности мисцеллы
0,3-0,4% при температуре—8-5-—10°С и экспозиции в течение 4 ч [237].
Однако промышленное внедрение данного способа сложно в связи с вы-
сокими энергозатратами для производства холода, а также значительной
величиной отходов и потерь масла.
Второе направление в настоящее время используется в промышлен-
ном масштабе при осуществлении высокотемпературной гидратации фосфо-
липидов паром под давлением [51] . Технология гидратации фосфолипидов
из масел включает нагрев масла до температуры выше КТИ при вводе в
масло пара температурой 200-250°С, давлением 0,6-1,8 МПа, последующее
охлаждение полученной смеси, коагуляцию и разделение фаз на сепарато-
ре *. Температура, до которой нагревается масло, колеблется в зависимос-
ти от природы его (подсолнечное, соевое), а также от исходного содержа-
* А.с. 1093693 (СССР). - Б.И., 1984, № 19.
218
Таблица 10.3
Показатели качества подсолнечных масел
Показатель Образец масла
исходное гидратированное
водой паром под давлением
Кислотное число, мг КОН/г 3,58-3,80 3,88-3,56 3,02-3,28
Цветность, мг 7-j 20-25 15-20 15-20
Содержание, %
фосфолипидов 0,57-0,60 0,26-0,30 0,13-0,15
неомыляемых 0,87-0,95 0,75-0,80 0,70-0,75
ЭОЛЫ 0,11-0,13 0,09-0,10 0,07-0,08
углеводов 0,050-0,058 0,040-0,050 0,035-0,042
продуктов окисления 3 0,40-0,44 0,35-0,40 0,30-0,32
Содержание металлов, %.1(Г
железа 0,38-0,40 0,34-0,36 0,30-0,32
меди 0,05-0,09 0,04-0,08 0,03-0,06
ния фосфолипидов в масле и соответствует интервалу 95—135°С. В табл. 10.3
и 10.4 приведены сравнительные данные по гидратации фосфолипидов
из подсолнечных масел паром (под давлением) и водой (данные Винниц-
кого МЖК).
Приведенные в табл. 10.3 данные показывают, что гидратация фосфо-
липидов из масел паром под давлением позволяет получать масла с низ-
ким содержанием фосфолипидов и других сопутствующих веществ, а так-
же фосфатидные концентраты высокого качества по сравнению с гидрата-
цией водой.
Метод химической поляризации. Метод основан на воздействии на фос-
фолипиды водных растворов поляризующих соединений (ПС), т. е. соеди-
нений, способных изменять химическую структуру и состав фосфолипидов.
Под химической поляризацией понимают повышение полярности
ПАВ под воздействием на их молекулы поляризующих соединений с за-
Таблица 10.4
Показатели качества фосфатидных концентратов
Показатель Фосфатидный концентрат, выделенный гидратацией
водой паром под давлением
Содержание, %
фосфолипидов 52,41-55,89 57,74-60,95
масла 42,31 -45,84 37,06-40,29
Цветность, мг /j 15-20 13-15
Кислотное число масла, выделенное из 13,71-22,18 14,80-17,51
фосфолипидного концентрата, мг КОН/г Содержание коричневых пигментов, мг/г 16,80-18,95 14,91-15,32
219
креплением эффекта поляризации в результате изменения энергии меж-
молекулярного и межфазного взаимодействия (239] .
При этом химические процессы сопровождаются коллоидными, физи-
ко-химическими явлениями, поэтому термин ’’химическая поляризация”
включает более широкое понятие.
Поляризующими соединениями являются вещества, способные поля-
ризовать молекулы ПАВ вследствие химического взаимодействия, а также
межмолекулярных взаимодействий, таких, как сольватация, солюбилиза-
ция, образование сложных комплексов на основании водородных, коор-
динационных и других связей, образование смешанных мицелл и ассоциа-
тов [52, 115].
В технологии гидратации в качестве поляризующего соединения чаще
всего используют воду или разбавленные водные растворы электролитов.
Во всех случаях, как правило, поляризующее соединение остается в конеч-
ном продукте. Вода после выполнения поляризующих функций вследствие
сольватации и перестройки мицелл с образованием ядер из ее макрочасти-
чек остается в основном в составе коагулированного осадка фосфоли-
пидов. ,
Учитывая особенности химической структуры и состава негидратируе-
мых фосфолипидов подсолнечных и соевых масел, в качестве поляризую-
щего соединения предложен водный раствор реагента с pH 3, состоящий
из лимонной кислоты, хлористого натрия и однозамещенного лимоннокис-
лого натрия, действие которого заключается в переводе негидратируемых
фосфолипидов в их гидратируемые формы в результате реакции между
сложными комплексными соединениями фосфолипидов с металлами и
другими веществами — с цитрат-ионами лимонной кислоты и Na-цитрат-
ионами однозамещенного лимоннокислого натрия [50,52, 115]*
В табл. 10.5. и 10.6 приведены показатели качества масел и фосфатид-
ных концентратов, полученных водной гидратацией и гидратацией раство-
ром реагента с pH 3 [50, 115] .
При использовании реагента значительно улучшается качество гидрати-
рованного масла: уменьшается содержание золы, неомыляемых и продук-
тов окисления, снижается кислотное число масла. Некоторое повышение
содержания антиоксидантов в масле можно объяснить значительным умень-
шением содержания ионов металлов, а также синергетическим действием
лимонной кислоты [50, 115] .
Использование реагента в качестве гидратирующего приводит к значи-
тельному снижению цветности фосфатидного концентрата. Это можно
объяснить переходом в фосфатидный концентрат лимонной кислоты, сни-
жающей скорость протекания окислительных реакций, в результате чего
предотвращается образование коричневых пигментов. Кислотность фос-
фатидного концентрата несколько увеличивается за счет более высокого
содержания в его составе фосфатидных и полифосфатидных кислот. Одна-
ко в масле, выделенном из концентрата, отмечено снижение кислотного
числа [50, 115].
* А.с. 905269 (СССР). - Б.И., 1982, № 6.
А.с. 745923 (СССР). - Б.И., 1980, № 25.
220
Таблица 10.5
Показатели качества масел
Показатель 1 Подсолнечное масло Соевое масло
ИСХОД- ное гидратированное ИСХОД- ное гидратированное
водой реагентом водой реагентом
Кислотное число, 2,93 2,58 2,36 3,78 3,61 3,43 мг КОН/г Цветность, мг/j 17,8 14,5 13,7 70 60 55 Содержание, % фосфолипидов 0,61 0,20 0,09 2,13 0,40 0,18 неомыляемых 0,78 0,65 0,51 1,25 1,03 0,91 золы 0,110 0,095 0,064 0,160 0,130 0,090 продуктов окис- 0,38 0,32 0,30 0,48 0,41 0,30 ления лимонной кисло- - - 3,2.10*3 - - 2,6-10 3 ты Содержание металлов, %-ю’ железа 0,34 0,28 0,12 0,58 0,49 0,15 меди 0,03 0,02 0,01 0,05 0,04 0,01 Суммарное содержат 1,22 0,81 * 1,15 1,38 0,93 1,25 ние антиоксидантов, (моль/л)-103 Устойчивость к окис- 275 250 265 280 255 275 лению, мин
Таким образом, использование реагента с pH 3 в качестве поляризую-
щего соединения в процессе гидратации значительно повышает качество
масел и выделяемых из них фосфатидных концентратов, увеличивает их
стойкость к окислению при хранении.
Метод химической поляризации с применением поверхностно-актив-
ных веществ. С учетом особенностей системы масло - фосфолипиды и ха-
Таблица 10.6
Показатели качества фосфатидных концентратов
Показатель Соевые фосфатиды, выделенные из мас- ла гидратацией Подсолнечные фос- фатиды, выделенные из масла гидратацией
водой реагентом водой реагентом
Содержание, % фосфолипидов 54,36 63,67 53,18 62,83
масла 44,71 35,45 45,01 36,11
влаги 0,48 0,38 0,50 0,45
Цветность, мг /j 10,80 8,20 13,5 9,6
Кислотность концентрата, мг КОН/г 10,42 11,-14 / 13,25 13,91
Кислотное число масла, выделенного из 11,75 10,12 12,78 10,05
фосфатидного концентрата, мг КОН/г
Содержание коричневых пигментов, мг/г 10,22 8,34 15,39 11,82
Устойчивость к окислению, мин 257 315 260 315
221
рактера образующихся в ней связей прежде всего внутри мицелл между
молекулами фосфолипидов перспективным является также использова-
ние в качестве поляризующих соединений водных растворов ПАВ, т. е. ис-
пользование взаимной химической поляризации ПАВами. В этом случае
поляризующее соединение вклинивается в мицеллу фосфолипидов, об-
разуя смешанные мицеллы, и способствует проникновению воды внутрь
мицеллы [53, 350].
В этом направлении работы проводятся по двум вариантам: первый —
увеличение общей концентрации ПАВ в масле за счет введения в него мас-
ляных растворов ПАВ (собственно фосфолипидов, моно-и диацилглицери-
нов и др.); второй — использование в качестве гидратирующего агента вод-
ных растворов ПАВ.
В первом случае добавление ПАВ приводит к образованию смешанных
мицелл из ПАВ, растворенных в масле и введенных в него, снижается ККМ,
увеличивается число агрегации молекул фосфолипидов, т. е. возрастает
вероятность образования неустойчивых мицелл при последующем воздейст-
вии воды; снижается межфазное натяжение на границе раздела фаз мас-
ло — вода* *. Во втором случае процесс образования смешанных мицелл и
взаимодействия системы с водой осуществляется одновременно; в связи
с этим второй вариант является более эффективным [53, 350] **.
Первый вариант осуществлен авторами данной книги при разрабоичс
способа гидратации*. По второму варианту разработан способ**, включаю-
щий обработку масла водно-фосфатидной эмульсией. В литературе отмече-
но использование в качестве гидратирующих агентов водных растворов
мыла, а также приведены данные по гидратации масел растворами кислых
мыл, образующихся непосредственно в системе в результате обработки мас-
ла водным раствором щелочи (10—50 г/л) в количестве, недостаточном для
нейтрализации свободных жирных кислот [53].
Магнитная и электромагнитная активация. Метод является более уни-
версальным и достаточно широко применимым для целей активации систе-
мы неполярный растворитель — ПАВ.
В зависимости от частоты и напряженности поля метод влияет на все
виды поляризации от электронной до мицеллярной и структурной [239].
Напряженность электромагнитного поля
^эмп = /г^э.п +
где е - диэлектрическая проницаемость; Д - магнитная проницаемость; Е3 п и Н -
соответственно напряженность электрического и магнитного полей 1122]. м,п
По данным Лоренца, на молекулу ПАВ в электромагнитном поле по-
мимо внешнего электромагнитного поля действует и внутреннее, образо-
ванное электростатическим взаимодействием между молекулами, в резуль-
тате чего возникает локальное поле. Именно возникающее локальное поле
и поляризуемость активных групп фосфолипидов, зависящая от динами-
ческих электронных эффектов этих групп, определяют общую поляриза-
цию фосфолипидов под действием электромагнитного поля [122, 134,239].
j
* А.с. 1071631 (СССР).- Б.И., 1984, №> 5.
**А.с. 1011681 (СССР).-Б.И., 1983, № 14.
222
Из приведенных сведений [88] видно, что наложение электромагнит-
ного поля влияет на ассоциацию и мицеллообразование фосфолипидов в
маслах: происходит изменение основных показателей процесса - ККА,
ККМ, КТИ, КТД и др. При этом поле влияет на все виды межмолекуляр-
ных взаимодействий: ван-дер-ваальсовые силы, водородные связи и др.
[36, 88] . Снижается межфазное натяжение на границе раздела фаз мас-
ло - вода после воздействия на систему электромагнитного поля [36] .
В случае воздействия электромагнитного поля на молекулы фосфоли-
пидов, особенно на их негидратируемые формы, по-видимому, можно ожи-
дать изменения структуры молекул, ослабление или даже частичный разрыв
водородных или координационных связей, которые приводят, как отмече-
но в литературе [129] , к увеличению полярности фосфолипидов после воз-
действия электромагнитного поля.
С учетом приведенных выше закономерностей изменения свойств фос-
фолипидов, растворенных в масле, под воздействием электромагнитного
поля разработаны способы гидратации фосфолипидов из растительных ма-
сел с применением метода электромагнитной активации [35] .
Отмечено, что предварительное воздействие электромагнитного поля
на масло и гидратирующий агент приводит к интенсификации процесса
гидратации*, а применение вращающихся переменных полей позволяет
повысить эффективность процесса. Дальнейшие исследования в этой об-
ласти показали, что наиболее эффективен процесс гидратации, когда кон-
тактирование масла с водой осуществляется непосредственно в эоне враща-
ющегося электромагнитного поля [35]. В табл. 10.7 и 10.8 приведены дан-
ные по гидратации масел водой во вращающемся электромагнитном поле в
сравнении с классической водной гидратацией [35] .
Показатели качества масел, гидратированных в электромагнитном по-
ле, лучше по сравнению с маслами, гидратированными водой; фосфатидные
концентраты, полученные по разработанному способу, имеют более низкие
кислотное и цретное числа, меньше содержат масла наряду с большим коли-
чеством фосфолипидов.
Влажность концентратов, полученных по разработанной технологии, в
4—5 раз ниже, чем влажность концентратов, полученных при обычной гид-
ратации. Это, по-видимому, можно объяснить снижением энергии связи
воды с молекулами фосфолипидов в результате электромагнитной
обработки.
Методом ИК-спектроскопии и ЯМР показано, что электромагнитные
поля применяемой напряженности не вызывают каких-либо нежелательных
изменений масла невыделенных фосфолипидов [90] .
Методы механической и акустической активации фосфолипидов, раст-
воренных в масле. Методы рассмотрены в литературе [44, 54, 60] . Так,
отмечено, что интенсификация механического фактора в процессах обыч-
ной гидратации повышает эффективность процесса [44] . В производствен-
ных условиях установлено, что применение ультразвука (частота 22 кГц)
также повышает эффект гидратации фосфолипидов [60] .
Эти виды воздействия особенно эффективны на стадии гомогениза-
' * А.с. 745923 (СССР). - Б.И., 1980, № 25.
223
Таблица 10.7
Показатели качества масел
Показатель Исходное масло Гидратированное масло
контроль в электромаг- нитном поле
Соевое масло
Кислотное число, мг КОН/г 3,85 3,61 3,15
Цветность, мг /2 90 80 70
Содержание, %
фосфолипидов 2,45 0,54 0,15
влаги 0,20 0.10 0,03
неомыляемых 1,15 0,99 0,82
продукте мк (сления (общее) 0,45 0,40 0,35
углеводов (i нее) 0,095 0,060 0,045
Содержание коричневых пигментов, мг/г 0,65 0.58 0,50
Подсолнечное масло
Кислотное число, мг КОН/г 2,58 2,32 2,01
Цветность, мг/2 25 20 15
Содержание, %
фосфолипидов 0.75 0.29 0.05
влаги 0,15 0,10 0,03
неомыляемых 0,95 0,89 0,81
продуктов окисления (общее) 0,32 0.30 0,27
углеводов (общее) 0,043 0.031 0,015
Содержание коричневых пигментов, мг/г 0,28 0.23 0.15
Таблица 10.8
Показатели качества фосфатидных концентратов
Показатель Фосфатидный концентрат
контроль полученный в электромагнит- ном поле
* Из подсолнечного масла
Цветность, мг /2 12,89 8,14
Содержание, %
фосфолипидов 53.98 59,75
масла 45,08 39,11
влаги и летучих веществ 0,85 0,18
Кислотное число масла, выделенного из фосфатидного 14,85 9,18
концентрата, мг КОН/г
Содержание коричневых пигментов, мг/г 13,89 10,15
Из соевого масла
Цветность, мг /2 18 14
Содержание, %
фосфолипидов 55,90 63,15
масла 43,15 35,18
влаги и летучих веществ 0,91 0,14
Кислотное число масла, выделенного из фосфатидного 18,28 14,85
концентрата, мг КОН/г
Содержание коричневых пигментов, мг/г 18,98 11,25
224
Таблица 10.9
Показатели качества подсолнечных масел
Показатель Масло
исходное гидратированное
термическая активация термическая и химическая активация
Кислотное число, мг КОН/г 3,56-3,80 3,02-3,28 2,65-2,80
Цветность, мг /2 Содержание, % 20-25 15-20 10-15
фосфолипидов 0,57-0,60 0,13-0,15 0,05-0,07
неомыляемых 0,87-0,95 0,70-0,75 0,60-0,68
золы 0,11-0,18 0,07-0,08 0,05-0,06
углеводов 0,050-0,058 0,035 - 0,042 0,010-0,015
продуктов окисления Содержание металлов, %-103 0,40-0,44 0,30-0,32 0,25-0,28
железа 0,38-0,40 0,30-0,32 0,21-0,24
меди 0,05-0,09 0,03-0,06 0,01-0,02
Устойчивость к окислению, 270 260 285
мин
ции системы масло - вода, что способствует структурной и мицеллярной
ее активации [239].
Необходимо отметить, что наряду с использованием того или иного
метода активации системы большую эффективность имеет применение
для этой цели воздействия на систему масло — фосфолипиды совокуп-
ности указанных выше методов.
Так, в литературе рассмотрена возможность применения одновре-
менно двух методов воздействия на систему — термического и химиче-
ского [51, 172] . Нагрев масла проводят до 210-230°С в присутствии
смеси лимонной кислоты и уксуснокислого натрия (соотношение этих
компонентов составляет 1:1) в количестве 0,02—0,04% к массе масла
[172]. Однако, на наш взгляд, такая высокотемпературная обработка
приводит к ухудшению других качественных показателей масла и сниже-
нию его пишевой ценности. Кроме того, фосфолипиды, выделенные при
обработке, теряют свои нативные свойства.
Наиболее перспективной является гидратация фосфолипидов паром
под давлением с одновременным вводом в систему раствора реагента с
pH 3 [51], включающая взаимодействие масла с раствором реагента и
последующую обработку полученной смеси паром температурой 200—
250°С под давлением. В табл. 10.9 и 10.10 приведены данные, получен-
ные при осуществлении гидратации подсолнечного масла по указанной
технологии в производственных условиях Винницкого МЖК [51] .
Применение реагента с pH 3 в процессе паровой гидратации (т. е. сово-
купность термического и химического воздействий на систему масло —
фосфолипиды) приводит к значительному улучшению качественных пока-
15 - 727
225
Таблица 10.7
Показатели качества масел
Показатель Исходное масло Гидратированное масло
контроль в электромаг- нитном поле
Соевое масло
Кислотное число, мг КОН/г 3,85 3,61 3,15
Цветность, мг /2 90 80 70
Содержание, %
фосфолипидов 2,45 0,54 0,15
влаги 0,20 0,10 0,03
неомыляемых 1,15 0.99 0,82
продукте vK <сления (общее) 0,45 0,40 0,35
углеводов (i цее) 0,095 0,060 0,045
Содержание коричневых пигментов, мг/г 0,65 0.58 0,50
Подсолнечное масло
Кислотное число, мг КОН/г 2,58 2,32 2,01
Цветность, мг /2 25 20 15
Содержание, %
фосфолипидов 0.75 0.29 0,05
влаги 0,15 0,10 0,03
неомыляемых 0,95 0.89 0,81
продуктов окисления (общее) 0,32 0.30 0,27
углеводов (общее) 0,043 0.031 0,015
Содержание коричневых пигментов, мг/г 0,28 0.23 0,15
Таблица 10.8
Показатели качества фосфатидных концентратов
Показатель Фосфатидный концентрат
контроль полученный в электромагнит- ном поле
* Из подсолнечного масла
Цветность, мг /2 Содержание, % 12,89 8,14
фосфолипидов 53,98 59,75
масла 45,08 39,11
влаги и летучих веществ 0,85 0,18
Кислотное число масла, выделенного из фосфатидного концентрата, мг КОН/г 14,85 9,18
Содержание коричневых пигментов, мг/г Из соевого масла 13,89 10,15
Цветность, мг /2 Содержание, % 18 14
фосфолипидов 55,90 63,15
масла 43,15 35,18
влаги и летучих веществ 0.91 0,14
Кислотное число масла, выделенного из фосфатидного концентрата, мг КОН/г 18,28 14.85
Содержание коричневых пигментов, мг/г 18,98 11,25
224
Таблица 10.9
Показатели качества подсолнечных масел
Показатель Масло И Л-
исходное гидратированное
термическая активация термическая и химическая активация
>•
Кислотное число, мг КОН/г 3,56-3,80 3,02-3,28 2,65-2,80 >
Цветность, мг I 20-25 15-20 10-15 ы
Содержание, % 3-
фосфолипидов 0,57-0,60 0,13-0,15 0,05-0,07 1-
неомыляемых 0,87-0,95 0,70-0,75 0,60-0,68 I**
золы 0,11-0,18 0,07-0,08 0,05-0,06
углеводов 0,050-0,058 0,035-0,042 0,010-0,015 и
продуктов окисления Содержание металлов, %Ю3 0,40-0,44 0,30-0,32 0,25-0,28 - 1-
железа 0,38-0,40 0,30-0,32 0,21-0,24 я
меди 0,05-0,09 0,03-0,06 0,01-0,02
Устойчивость к окислению, 270 260 285
МИН >-
ции системы масло - вода, что способствует структурной и мицеллярной
ее активации [239].
Необходимо отметить, что наряду с использованием того или иного
метода активации системы большую эффективность имеет применение
для этой цели воздействия на систему масло — фосфолипиды совокуп-
ности указанных выше методов.
Так, в литературе рассмотрена возможность применения одновре-
менно двух методов воздействия на систему — термического и химиче-
ского [51, 172]. Нагрев масла проводят до 210-230°С в присутствии
смеси лимонной кислоты и уксуснокислого натрия (соотношение этих
компонентов составляет 1:1) в количестве 0,02—0,04% к массе масла
[172]. Однако, на наш взгляд, такая высокотемпературная обработка
приводит к ухудшению других качественных показателей масла и сниже-
нию его пищевой ценности. Кроме того, фосфолипиды, выделенные при
обработке, теряют свои нативные свойства.
Наиболее перспективной является гидратация фосфолипидов паром
под давлением с одновременным вводом в систему раствора реагента с
pH 3 [51], включающая взаимодействие масла с раствором реагента и
последующую обработку полученной смеси паром температурой 200—
250°С под давлением. В табл. 10.9 и 10.10 приведены данные, получен-
ные при осуществлении гидратации подсолнечного масла по указанной
технологии в производственных условиях Винницкого МЖК [51] .
Применение реагента с pH 3 в процессе паровой гидратации (т. е. сово-
купность термического и химического воздействий на систему масло —
фосфолипиды) приводит к значительному улучшению качественных пока-
15 - 727 225
Таблица 10.10
Показатели качества фосфатидных концентратов
Показатель Фосфатидный концентрат, выделен- ный гидратацией
термическая активация термическая и хи- мическая акти- вации
Содержание, %
фосфолипид< г 57,74-60,95 63,17-65,00
масла 37,05-40,29 33.60-35,87
влаги Цветность, мг?2 0.58-0,65 0.55-0,67
Кислотное числе масла, выделенного из фосфа- тидного концентрата, мг КОН/г 14,80-17,51 13,05-14.32
Содержание токоферолов, мт % Содержание 59,8-61,8 65,7-69,8
коричневых пигментов, мг/г 14,91-15.32 10,39-11.87
каротиноидов, мкг/г 42.68-45,18 38,09-40.51
Устойчивость к окислению, мин 265 320
зателей гидратированного масла: снижаются остаточное содержание фос-
фолипидов, кислотное число, уменьшается содержание золы, продуктов
окисления, а также содержание неомыляемых липидов и углеводов; возрас-
тает устойчивость гидратированного масла к окислению.
Использование для получения фосфатидных концентратов термической
и химической активации системы приводит к значительному снижению
цветности фосфатидного концентрата (снижению содержания коричневых
пигментов), кислотного числа фосфатидного концентрата,полученного ме-
тодом химической и термической активации системы, и к повышению ус-
тойчивости его к окислению.
Таким образом, совокупность методов химической и термической ак-
тивации системы масли — фосфолипиды в процессе гидратации позволяет
значительно повысить качество гидратированных масел и фосфатидных
концентратов.
Авторами отмечено, что эффективным является одновременное при-
менение методов химической, электромагнитной и механической актива-
ции системы масло — фосфолипиды.
Анализ перспективных направлений совершенствования процесса гид-
ратации фосфолипидов из растительных масел показывает, что в настоящее
время уже накоплен достаточный научный и практический опыт для созда-
ния новых технологических схем и борудования гидратации, обеспечива-
ющих высокую технико-экономическую эффективность процесса в целом
и значительное улучшение качества гидратированных масел и фосфатидных
концентратов
226
11. ПРОМЫШЛЕННЫЕ СПОСОБЫ ГИДРАТАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ
МАСЕЛ И ПРИМЕНЕНИЕ ФОСФАТИДНЫХ КОНЦЕНТРАТОВ
В НАРОДНОМ ХОЗЯЙСТВЕ
11.1. ПРОМЫШЛЕННЫЕ СПОСОБЫ И СХЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ
ГИДРАТИРОВАННЫХ МАСЕЛ И ФОСФАТИДНЫХ КОНЦЕНТРАТОВ
В настоящее время на предприятиях масло-жировой промышленности
для получения гидратированных масел и фосфатидных концентратов при-
меняются линии гидратации с разделением фаз в отстойниках непрерывно-
го действия, на сепараторах (отечественная линия с сепараторами А1-МСЛ;
зарубежные схемы гидратации фирмы ’’Лурги” и схемы рафинации фирмы
"Альфа-Лаваль” с узлом гидратации). На некоторых предприятиях установ-
лены периодические линии, на которых процессы обработки масел гидра-
тирующими агентами, коагуляция и последующее разделение фаз отстаи-
ванием осуществляются в одном аппарате-гидрагаторе, а процесс сушки
гидратированного масла — в периодическом вакуум-сушильном аппа-
рате [194].
Гидратация с разделением фаз в отстойниках непрерывного действия
(рис. 11.1) [194] Исходное масло, взвешенное на автоматических ве-
сах 1, поступает в бак 2 и насосом 3 поцается через теплообменник 4 и ро-
таметр 5 в струйный смеситель б эжекционного типа. Гидратацию фосфоли-
пидов производят конденсатом, который готовится в конденсаторе и со-
бирается в сборнике 7, откуда через ротаметр 5 поступает в струйный
смеситель 6. Увлажненное масло из смесителя направляется в коагуля-
тор Я,.где происходят коагуляции хлопьев фосфолипидов и формирова-
ние фосфатидной эмульсии, последующее отделение которой от масла про-
изводится в отстойнике непрерывного действия 9. Мутные порции масла на-
Рис. 11.1, Линия гидратации с разделением фаз в отстойниках непрерывного действия
227
правляются из отстойника в бак 2, из которого насосом 3 вновь подаются
на гидратацию. Масло после полного отделения фосфатидной эмульсии
поступает в сборник 12, из которого масло насосом 13 подается на щелоч-
ную рафинацию, если она проводится на этом же предприятии. Масло, пред-
назначенное непосредственно для пищевых целей, направляют на вымора-
живание и последующую фасовку или отгрузку потребителям. При отсут-
ствии установки для вымораживания масло из сборника 12 направляют для
высушивания в непрерывный вакуум-сушильный аппарат.
Фосфатидная эмульсия из отстойника 9 через смотровой фонарь и про-
межуточную емкость 10 шестеренчатым насосом 11 непрерывно подается
через бачок с мешалкой в ротационно-пленочный сушильный аппарат (на
схеме не показан).
Конструкция, принцип действия, техническая характеристика основно-
го оборудования, применяемого в линии, детально описаны в литерату-
ре [ 194]. -s
Гидратация с разделением фаз на сепараторах (отечественная линия)
(рис. 11.2) [194, 203 , 206] . Нерафинированное растительное масло пода-
ется насосом 1 через фильтры тонкой очистки 2 в подогреватель масла 3.
Нагретое масло насосом 4 через регулятор расхода 5 перекачивается в сме-
ситель лопастного типа 6. Гидратация фосфолипидов производится кон-
денсатом, который через ротаметр подводится к трубопроводу подачи
масла в лопастной смеситель.
В смесителе нагретое масло интенсивно смешивается с конденсатом,
после чего передается на разделение в сепаратор 7 герметического типа.
Мутное масло из сепаратора возвращается в бак исходного масла, посту-
пающего на гидратацию. Влажное гидратированное масло из сепаратора 7
Рис. 11.2. Линия гидратации с разделением фаз на сепараторах
228
подается в подогреватель 8, откуда направляется на сушку или рафинацию
(в системе предприятия).
Сушка масла проводится в вакуум-сушильном аппарате 9 форсуночно-
го типа. Вакуум в аппарате создается трехступенчатым пароэжекторным
блоком (на схеме не показан). Высушенное гидратированное масло насо-
сом 10 после охлаждения передается на отгрузку или на выморажива-
ние (для реализации гидратированного масла в торговую сеть).
Фосфатидная эмульсия из сепаратора 7 самотеком поступает в сбор-
ник 11, откуда насосом 12 подается на сушку в горизонтальный ротаци-
онно-пленочный аппарат 13. Высушенный фосфатидный концентрат слива-
ется в сборник 14. а по заполнении его — в сборник 15. Из сборника 14 (в
период заполнения сборника 75) фосфатидный концентрат поступает на
фасовку и взвешивание на весах 16.
В рубашки сборников 11, 14 и 15 из специальной установки для подо-
грева воды насосом подается горячая вода, Вакуум в ротационно-пленоч-
ном аппарате 13 и сборниках фосфатидного концентрата 14 и 15 создается
пароэжекторным вакуум-насосом (на схеме не показан).
На Евдаковском масло-жировом комбинате были проведены испыта-
ния узла гидратации на сепарационной линии, предусматривающей рафи-
нацию масел. Для разделения фаз использован герметический сепаратор
модели А1-МСЛ, разработанный ВНИЭКИпродмашем.
Вторым важным аппаратом в отечественной линии гидратации явля-
ется аппарат для сушки фосфатидной эмульсии. На отечественных пред-
приятиях применяются разработанные ВНИИЖем вертикальные ротаци-
онно-пленочные аппараты с площадью поверхности нагрева 0,7 м2 [202,
213]. На таких аппаратах успешно осуществляется сушка фосфатидных
эмульсий с исходной влажностью до 35%. При сепарационном методе
гидратации влажность фосфатидных эмульсий значительно выше. В связи
с этим ВНИИЖем разработаны конструкции ротационно-пленочных аппа-
ратов горизонтального типа с площадью поверхности нагрева 2,5 и 4,5 м2
Аппарат с плошадью поверхности нагрева 2,5 м2 позволяет осуществлять
сушку эмульсий с исходной влажностью до 75%. Такой пленочный аппарат
рекомендован для комплектации сепарационных линий производитель-
ностью 100 т/сут 1217]
Горизонтальный ротационно-пленочный аппарат с площадью поверх-
ности нагрева 4,5 м2 был испытан на Черновицком масло-жировом ком-
бинате (производительность линии гидратации 120 т/сут) и показал высо-
кую эффективность работы [202].
Гидратация с разделением фаз на сепараторах (линия фирмы ’’Лурги”)
(рис,, 11.3). В настоящее время фирмой разработано две линии гидратации
производительностью 100 и 250 -300 т/сут. В нашей стране в основном экс-
плуатируются линия производительностью 100 т/сут, линий производитель-
ностью 250-300 т/сут установлена на Славянском и Кировоградском мас-
ло-жировых комбинатах Ниже приведено описание технологической схемы
гидратации фирмы ’’Лурги” (производительность 100 т/сут) [206].
Нерафинированное масло подается в сборник 7, объем которого рас-
считан на поступление в него масла в течение не более 30 мин. Из сборни-
ка 7 масло откачивается насосом 6.
229
Рис. 11.3. Линия гидратации фирмы "Лурги” с разделением фаз на сепараторах:
1, 2(1 - вакуум-насосы; 2, б, 9,11, 15, 21 - насосы; 3, 4 - ротаметры; 5,19 - конден-
саторы; 7 - сборник нерафинированного масла; 8 — коагулятор; 10 - ротационно-
пленочный аппарат; 12 — сепаратор; 18 - сборник фосфатидной эмульсии; 14 - сбор-
ник фосфатидного концентрата; 16 - сборник гидратированного влажного масла;
17 - сушильный аппарат; 18 - подогреватель масла
Гидратирующий агент насосом 2 через ротаметр 3 подается в масляную
линию насосом б. Полученная в насосе б смесь через ротаметр 4 направля-
ется в коагулятор 8 (экспозигор) для формирования фосфатидной эмуль-
сии; пребывание в нем смеси масла и фосфатидной эмульсии предусмотре-
но в течение 20 мин. Для предупреждения возможного осаждения хлопьев
фосфолипидов коагулятор снабжен пропеллерной мешалкой с частотой
вращения 40 об/мин.
Из коагулятора масло с хлопьями фосфолипидов ротационным насо-
сом 11 передается в герметический саморазгружающийся сепаратор 12.
Насос 11 снабжен вариатором скоростей, позволяющим синхронизировать
поступление смеси на сепаратор и постоянную ее выдержку в коагуляторе.
Кроме того, конструкция насоса предусматривает сохранение агрегирован-
ных частиц фосфолипидов в масле перед сепарированием.
В барабане сепаратора смесь разделяется на три фазы: очищенное мас-
ло, фосфатидная эмульсия и шлам — осадок, который скапливается в гря-
зевом пространстве барабана сепаратора. Первые две фракции из сепарато-
ра выводятся непрерывно, а шлам выгружается (автоматически) периоди-
чески по мере накопления.
Фосфатидная эмульсия, а также шлам самотеком отводятся в сбор-
ник 13 и далее винтовым насосом 15, снабженным вариатором скоростей,
направляются на сушку. Для промывки сепаратора и подводящих комму-
никаций предусматривается подача в них горячей воды (конденсата) от
насоса 2. Для смачивания и охлаждения к верхним уплотнительным узлам
сепаратора подводится холодная вода.
* Очищенное влажное масло из сепаратора под давлением отводится в
сборник 16, из которого самотеком и с помощью вакуума через подогре-
ватель 18 поступает в сушильный аппарат 17. Разрежение в сушильном
аппарате форсуночного типа создается водокольцевым вакуум-насосом 20,
с помощью которого соковые пары засасываются в поверхностный конден-
сатор 19, где осуществляется их конденсация холодной водой, подаваемой
230
в трубное пространство. Конденсат соковых паров самотеком отводится
в барометрический колодец.
В период пуска и наладки линии первые порции масла из сепаратора
могут быть возвращены в коагулятор.
Высушенное гидратированное масло из сушильного аппарата 17 непре-
рывно откачивается насосом 21 и передается ра реализацию.
Фосфатидная эмульсия из сборника 13 винтовым насосом 15 с вариа-
тором скоростей подается на сушку в ротационно-пленочный аппарат ко-
нического типа 10. Перед сушкой нагрев эмульсии предусматривается с по-
мощью паровых рубашек, имеющихся в сборнике 13 и в коммуникациях
подачи эмульсии от н?соса до пленочного аппарата. На трубопроводе после
насоса 15 установлен специальный пружинный регулирующий клапан, ко-
торый не допускает падения разрежения в пленочном аппарате в случае
прекращения подачи эмульсии на сушку. В пленочном аппарате предус-
мотрена возможность регулирования толщины высушиваемой пленки, что
достигается передвижением конического ротора в неподвижном корпусе.
Охлаждение сальниковых узлов пленочного аппарата производится с по-
мощью циркулирующей в специальных бачках жидкости. Высушенный фос-
фатидный концентрат из пленочного аппарата насосом 11 передается в про-
межуточный сборник 14, из которого осуществляется фасовка концент-
рата.
Разрежение в пленочном аппарате, конденсация и отвод соковых паров
осуществляются аналогично узлу сушки масла на соответствующем обо-
рудовании' вакуум-насос 1 и конденсатор 5.
Технологические параметры процесса:
исходное масло температурой 60-65°С подается в сборник;
смешивание масла с гидратирующим агентом происходит в насосе
при температуре 60—65°С, температура подаваемого гидратирующего
агента 70-80°С;
смесь масла и фосфатидной эмульсии направляется в коагулятор (тем-
пература масла в коагуляторе 55—60°С, время коагуляции 20 мин);
отделение фосфатидной эмульсии от масла осуществляется на сепара-
торе при температуре 55—60°С и противодавлении 0,15 МПа;
гидратированное масло из сепаратора нагревается в подогревателе до
85—90°С и сушится в вакуум-сушильном аппарате при 85—90°С и остаточ-
ном давлении не более 6-7 кПа;
фосфатидная эмульсия нагревается в сборнике до 60—65°С и сушится
в горизонтальном пленочном аппарате при температуре 85-90°С и оста-
точном давлении не более 6—7 кПа.
Для интенсификации процесса гидратации фосфолипидов из масел и
повышения качества фосфатидною концентрата в схеме гидратации фирмы
’’Пурги” предложено осуществлять контактирование масла в гидратирую-
щим агентом непосредственно в электромагнитном активаторе ЭМА-9, а
также в качестве гидратирующего раствора использовать реагент с pH 3
(см. разд. 10.4) [50, 52] . Для этого необходима дополнительная уста-
новка насоса для подачи гидратирующего агента в ЭМА-9.
Линия гидратации фирмы ’’Пурги” с ЭМА-9 прошла испытания и в на-
стоящее время внедрена на ряде предприятий: Краснодарском масло-жи-
231
ровом комбинате, Лабинском, Оренбургском и Кропоткинском маслоэкст-
ракционных заводах.
Гидратация паром под давлением с разделением фаз на сепараторе
(рис. 11.4). На Винницком масло-жировом комбинате в 1981 г. внедрена
технология гидратации фосфолипидов паром под давлением с разделением
фаз на сепараторе фирмы ’’Альфа-Лаваль” [51, 154] .
Исходное масло из баков сливной станции или маслоэкстракционного
завода, взвешенное на автоматических весах 1, поступает в емкость для не-
рафинированного масла 2. Масло из емкости 2 насосом 4 через фильтры
грубой и тонкой очистки 3 подается в теплообменник 5 для подогрева мас-
ла. Подогретое масло через ротаметр 6 подается на паровой гидрататор
эжекционного типа 7. Для лучшего выведения фосфорсодержащих веществ
из масла в гидрататор эжекционного типа подается пар температурой 200-
250°С и с давлением выше давления масла в технологической линии не ме-
нее чем на 0,1 МПа. Масло, прошедшее обработку паром, для формирова-
ние. 11,4. Линия гидратации растительных масел паром под давлением с разделением
1 - весы автоматические; 2 - емкость для нерафинированного масла; 3, 32 - фильт-
7 - паровой эжектор; 8 - ресивер; 9 - охладитель для масла; 10 - коагулятор-экс-
масла; 16 - каплеуловитель; 17 - каплесборник; 18 - конденсатор; 19 - сборник
22 - аппарат для подготовки к сушке; 23 - сушка фосфатидной эмульсии; 24 -
концентрата; 26 - весы; 27 — конденсатор; 28 — промежуточная емкость конденса-
34 — емкость жирной воды; 35 - насос жирной воды; 36 — емкость влажного масла;
2'- холодная вода; 3' -пар; 4'- вакуум-
мутное масло; ---------. 7'- промывная вода; 8'____________________________-
фосфатидный концентрат; К. С. - конденсатная система; О. В. - оборотное водо-
232
йия фосфатидной эмульсии проходит ресивер 8 и охлаждается в охладите-
ле 9. Охлажденная смесь масла с частично сформировавшейся фосфатидной
эмульсией подается на коагуляцию в коагулятор 10. Вместимость коагу-
лятора обеспечивает время коагуляции не менее 15 мин. Разделение смеси
на масло и фосфатидную эмульсию осуществляется в сепараторе 11. Влаж-
ное гидратированное масло через теплообменник 12 подается в вакуум-
сушильный аппарат 13. Вакуум в вакуум-сушильном аппарате создается
водокольцевым вакуум-насосом 20. Для конденсации паром применяется
конденсатор 2S; конденсат собирается в сборнике 19. Улавливание масла,
уносимого соковым паром, происходит в каплеуловителе 16 и собирается
в каплесборнике 17. Гидратированное масло насосом 14 направляется
на промышленную переработку или в торговую сеть.
Фосфатидная эмульсия из сепаратора 11 при помощи насоса 21 пода-
ется в аппарат подготовки перед сушкой 22, откуда поступает на сушку в
ротационно-пленочный аппарат 23.
фаз на сепараторе:
ры; 4, 14, 33 - насосы для масла; 5,12 - подогреватели для масла; 6 - ротаметр;
поэитор; 11 — сепаратор; 13 - вакуум-сушильный аппарат; 15 — теплообменник для
конденсата; 20 — вакуум-насос; 21 — насос фосфатидной эмульсии перед сушкой;
промежуточный бачок для накопления фосфатидов; 25 - емкость для фосфатидного
та соковых паров; 29 — вакуум-насос; 30 - жироловушка; 31 - бак мутного масла;
37 - насос влажного масла; - масло:-----------------1' - горячая вода; ------
ная линия; 5' - конденсат соковых паров; ---------------------------6'-------
конденсат; 9’— фосфатидная эмульсия; ---------------------------10'---------—
снабжение.
233
Высушенный фосфатидный концентрат через промежуточный ба-
чок 24 сливается в емкость 25. В период заполнения промежуточного бач-
ка 24 из емкости 25 осуществляется фасовка фосфатидного концентрата.
Вакуум в ротационно-пленочном аппарате создается волокольцевым
вакуум-насосом 29. Для конденсации применяется конденсатор 27; кон-
денсат собирается в сборнике 28
Технологические параметры процесса
нерафинированное масло нагревают до температуры 80—100°С и на-
правляют в эжекционный смеситель, куда подают перегретый пар давлени-
ем 0,6—1,5 МПа и температурой 200—250°С в количестве, в 1,5—2 раза пре-
вышающем содержание фосфолипидов в исходном масле; процесс ведут
непрерывно при давлении 0,4-0,5 МПа;
водомасляная смесь после эжектора температурой 100-125°С и давле-
нием не менее 0,4 МПа поступает в теплообменник для охлаждения до тем-
пературы бО-^О^С, а затем в коагулятор (время коагуляции не менее
10 мин);
разделение фаз проводят на сепараторе при температуре 60-65°С
При более низкой температуре вязкость масла высока и эффективность
разделения масла от фосфолипидов ниже, если температура выше 65°С, от-
деление фосфолипидов будет неполным, так как часть их перерастворяется
в масле; противодавление на сепараторе должно быть в пределах 0,23-
0,26 МПа;
гидратированное масло после отделения фосфатидной эмульсии нагре-
вают в теплообменнике до 95—]00°С, а затем сушат при температуре 95—
*Ю0&С и остаточном давлении 13,3 кПа,
фосфатидную эмульсию предварительно нагревают в тонкий пленке до
температуры 70-90 С (остаточное давление 15,9 кПа) в зависимости от
кислотного числа исходного масла [154, 194] , а затем направляют в гори-
зонтальный ротационно-пленочный аппарат.
Для интенсификации процесса гидратации и увеличения стойкости к
окислению гидратированных масел и фосфатидных концентратов целесо-
образно в масло непосредственно перед подачей пара под давлением ввести
при перемешивании раствор реагента с pH 3 в количестве < ',1—0,5% к мас-
се масла [51]
11.2 ПРИМЕНЕНИЕ ФОСФАТИДНЫХ КОНЦЕНТРАТОВ
В НАРОДНОМ ХОЗЯЙСТВЕ
Фосфолипиды растительных масел находят широкое применение в пи-
щевой промышленности, медицине, сельском хозяйстве Фосфатидные кон-
центраты используются также в фармацевтической, текстильной, кожевен-
ной, лакокрасочной промышленности и др.
Рассмотрим более подробно области применения фосфолипидов, вы-
рабатываемых предприятиями масло жировой промышленности в виде фос-
фатидных концентратов (пищевых и кормовых).
В состав фосфатидных концентратов входит ряд биологически ценных
веществ. По литературным данным [193, 342] , в фосфатидных концентра-
тах содержится холина — 29,3 мг/г, инозитола —30 мг/г, токоферолов —
234
1,3 мг/г, биотина - 0,42 мкг/г, фолиевой кислоты - 0,60 мкг/г, тиамина -
0,115 мкг/г, рибофлавина - 0,33 мкг/г, пантотеновой кислоты - 5,59 мкг/г,
пиридоксина - 0,29 мкг/г, лизина — 3,12 мкг/г.
По рекомендации института питания АН СССР взрослый человек при
сбалансированном питании должен ежесуточно потреблять по 5 т фосфоли-
пидов. В питании человека они важны как основной источник фосфора, не-
обходимого для построения костей и ткани [319] . Фосфолипиды активно
участвуют в процессах жирового обмена, влияют не только на интенсив-
ность всасывания жиров, но и способствуют их окислению в печени и ис-
пользованию в тканях; ограничивают отложение жира в организме, предох-
раняют печень от жировой инфильтрации, а также способствуют лучшему
использованию белка. В этой связи ввод фосфолипидов в пишевые про-
дукты приводит к обогащению последних дефицитными биологически
ценными компонентами [3191 •
В фармацевтической промышленности фосфолипиды применяются в
качестве компонента различных лекарственных форм для общего укреп-
ления нерв,ной системы. Он оказался также пригодным при лечении диа-
бета, туберкулеза, рахита и болезней пищеварительных органов [319].
Известно применение фосфолипидов при приготовлении водно-жиро-
вых эмульсий для внутривенного введения [ 209] .
Использование фосфолипидов (.фосфатидных концентратов) в от-
дельных отраслях пищевой промышленности основано на одном из важ-
нейших их свойств - поверхностной активности, которая обусловливает
высокую эмульгирующую, разжижающую способность и др.
Фосфатидные концентраты широко применяются в хлебопекарной,
кондитерской и маргариновой отраслях пищевой промышленности [8,
9, 28, 90,105, 143, 164- 167, 204, 220, 270, 305, 353, 374].
В хлебопечении фосфатидный концентрат добавляется для улучшения
качества теста хлебобулочных изделий и печенья [ 164, 166, 220].
Добавление фосфатидного концентрата вызывает в тесте изменение
степени дисперсности и структурно-механических свойств дисперсных
структурных элементов теста, обусловливающее изменение упругопластич
но-вязких свойств теста и в результате этого - объема и структуры хле-
ба [9,61, 166,353].
Особенно эффективность добавления фосфатидных концентратов
проявляется для сдобных изделий увеличивается их обьем, регулируется
пористость, улучшается окрашивание корочки [9, 220]. В специальной
литературе отмечено, что фосфолипиды ускоряют сбраживание теста, спо-
собствуют улучшению его пышности и большему .«ыходу. При этом вкус
продукта не изменяется. В тесто фосфолипиды вводят в виде водной эмуль-
сии концентрацией 20- 30% [9].
Опыты, проведенные в нашей стране и за рубежом, показали, что фос-
фатидный концентрат заменяет меланж при получении сдобного теста,
не изменяя его качества [9, 143, 166] .
Так как фосфатидные концентраты по своим свойствам относятся к
классу липидов, они действуют на тесто как жиры и частично могут их за-
менять; однако по сравнению с жирами они обладают преимуществом
эффективно диспергироваться в тесте, Важным результатом использова-
235
ния фосфолипидов является такое свойство, как способность дольше удер-
живать мягкость теста, в результате чего в хлебобулочных изделиях доль-
ше сохраняется свежесть [61] .
Фосфатидный концентрат оказался пригодным также и в производстве
сухарей, где было отмечено такое же его действие, как описанное выше.
Хорошие результаты были получены и при изготовлении сахарного пе-
ченья и макаронных изделий. В обоих случаях используют эмульсии фос-
фолипидов с водой [9]. В технологии изготовления вафель добавка фос-
фатидных концентратов является обязательной [ 143, 220] . Фосфатидные
концентраты способствуют отделению вафельных листов от форм и умень-
шают количество оттеков при выпечке таких листов.
Фосфатидный концентрат является основным компонентом улучши-
телей выпекаемости муки [270, 347] . Такие препараты выпускаются в ви-
де сухого порошка (смеси) или в виде пасты.
При приготовлении летних кремов (кремов с добавкой фруктовых
наполнителей) фосфатидные концентраты применяют в качестве компо-
нента для связывания сахарного раствора, содержащего 35% воды, со взби-
тым маргарином [ 149, 220, 319].
Отмечено, что при прибавлении фруктовых пюре в сливочный крем
последний оседает [319]. Это препятствует возможности повысить в кре-
ме содержание фруктов. При добавлении в такой крем до 0,5% фосфатид-
ных концентратов крем впитывает на 30% больше фруктового пюре, чем
это принято в стандарте, и при этом остается гладким без признаков
оседания.
Широкое применение в кондитерской промышленности нашел фосфа-
тидный концентрат в производстве шоколадных масс. Шоколадная масса,
обладающая высокой вязкостью, разбавляется дефицитным какао-маслом.
Использование фосфатидного концентрата в качестве разжижителя, су-
щественно снижающего вязкость шоколадной массы, является удачной за-
меной какао-масла. Оптимальное количество фосфатидного концентрата
без изменения характерного вкуса шоколада соответствует 0,3-0,4%. Это
позволит снизить расход какао-масла на 3,0-5,0% [28, 90, 220, 305, 374] .
Шоколадная масса представляет собой смесь жира и твердой фазы (дис-
пергированные частицы какао-масла и микрокристаллы сахара). При вве-
дении в массу фосфатидных концентратов последние адсорбируются моно-
молекулярным слоем на границе раздела жир - твердая фаза, снижая по-
верхностную энергию частиц, препятствуя их сцеплению, а следовательно,
и структурообразованию. Нарушение процесса структурообразования при-
водит к снижению вязкости, а также обеспечивает однородность шоколад-
ной массы [220,305,353].
Потребителем фосфатидных концентратов является также и масло-
жировая промышленность, где они широко применяются при производстве
маргарина и майонеза [ 197, 342, 347].
Фосфатидный концентрат применяется в производстве маргарина
как эмульгатор и как самостоятельная добавка для повышения пищевой
ценности отдельных видов маргарина [197, 342]. Фосфатидные концентра-
ты могут использоваться в виде отдельного эмульгатора, а также для при-
готовления эмульгатора Т-Ф, который представляет собой смесь эмульга-
236
тора Т-I и фосфатидов (ГЗ). В некоторые виды маргаринов в зависимости
от рецептурного состава вводят до 0,3-0,5% фосфатидных концентратов
(для шоколадных, молочных - до 0.08%.) [197,347] Присутствие фосфо-
липидов в маргарине ослабляет действия факторов, неблагоприятно влия-
ющих на его структуру и свойства. Снижается разбрызгивающая способ-
ность маргарина, увеличивается стойкость к окислению при хранении, по-
вышаются его упругопластичные свойства и однородность [197,342. 347].
К непищевым отраслям промышленности, использующим фосфатид-
ный концентрат, относятся текстильная и кожевенная промышленность
Здесь его используют для аппретирования тканей и шерсти. В кожевенной
промышленности фосфатидный концентрат также используется для приго-
товления эмульсий, которыми обрабатывают кожу. Обработка кожи
такими эмульсиями повышает эластичность ее [319] .
Фосфатидный концентрат является компонентом лаксв и красок, он
способствует повышению глубины оттенков краски. Кроме того, введение
фосфатидного концентрата при растирании красок сокращает длительность
процесса при одновременном повышении диспергирования и распределе-
ния красителей [319].
В нефтяной промышленности фосфатидные концентраты применяют
ири производстве смазочных масел для гомогенного распределения их сос-
тавных частей; прибавление фосфатидных концентратов предотвращает
образование нежелательных продуктов полимеризации при хранении сма-
зочных масел.
В производстве резиновых изделий фосфатидные концентраты приме-
няют для смазки изделий, а также как смачиватель красителей [319]
Кормовой фосфатидный концентрат является важным компонентом
заменителей цельного молока для телят, где фосфолипиды играют роль
физиологически ценного вещества и эмульгатора [137] Кроме того, фос-
фолипиды входят в состав рационов кормления свиней, молодняка круп-
ного рогатого скота, овец, цыплят, кур и др [2, 94, 137, 159. 160].
В заключение следует отметить, что возрастающие потребности народ
ною хозяйства в фосфатидных концентратах масло-жировая промышлен-
ность нашей страны удовлетворяет не полностью. Это связано с тем, что не
весь объем вырабатываемых масел подвергается гидратации и выделению
фосфатидных концентратов.
Между тем, имеющиеся ресурсы масличного сырья и объем вырабаты-
ваемых масел позволяют при осуществлении гидратации всего объема
значительно увеличить выработку фосфатидных концентратов. Задача за-
ключается в обеспечении в ближайшие годы гидратации всех видов ма-
сел и производства фосфатидных концентратов высокого качества на
базе передовой техники и технологии.
Необходимо провести также работы по облаг ораживанию фосфолипи-
дов хлопковых масел с целью доведения их до требований кормовых, а
возможно, и пищевых.
Кроме того, в связи с намеченным увеличением производства семян
paiica, сурепицы и других нетрадиционных для нашей страны масличных
культур необходимы глубокие исследования состава и пищевых дос-
тоинств фосфолипидов, выделенных из масел указанных культур.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1-Абрамзон А. А. Поверхностно-активные вещества, свойствам примене-
ние. - Л.: Химия, 1975. - 246 с.
2. А л и е в А. А. Липидный обмен. - М.: Колос, 1980. - 381 с.
3. Ассоциация фосфолипидов соевых масел в четыреххлористом углеро-
де/! Н. С. Арутюнян, Е. П. Корнена, Н. А. Пономарева и др.). - Известия вузов СССР.
Пищевая технология, 1984, № 6, с. 58-60.
4. Ассоциация фосфолипидов в неполярных растворителях/! Е. П. Корне-
на, Н. А. Пономарева, Н. С. Арутюнян и др-1. - Масло-жировая промышленность,
1984, №6, с. 15-16.
5. Арутюнян Н. С. Состав и свойства фосфолипидов подсолнечного мас-
ла. - Масло-жировая промышленность, 1974, № 3, с. 11-15.
6. А р у т ю н я н Н. С., Косачев В. С., Янова Л. И. Интенсификация
процесса щелочной рафинации масла на гидрозаводе Краснодарского МЖК. - В сб.:
О передовом опыте интенсификации отдельных процессов рафинации растительных
масел. Краснодар, 1980, с. 3-6.
7. А р у т ю н я н Н. С. Некоторые особенности системы глицериды — фосфати-
ды и факторы, определяющие нарушение ее устойчивости. - Труды ВНИИЖ, 1980.
с. 3-12.
8- Ауэрман Л. Я., Пучкова Л. И., Прокушенкова Л. И. Иссле-
дование поверхностно-активных свойств фосфатидного концентрата. — Известия ву-
зов СССР. Пищевая технология, 1960, № 5, с. 75-79.
9. А у э р м а н Л. Я. Технология хлебопекарного производства. - М.: Легкая
и пищевая промышленность, 1984. - 415 с.
10 Б а ц а н о в С. С. Электроотрицательность элементов и химические свойст-
ва. - Новосибирец,- Изд-в о СО АН СССР, 1962. - 144 с.
11. Безуглов И. Е., Ржехин В. П. Поведение нежировых веществ и
продуктов окисления при переработке семян арахиса по схеме форпрессование - экст-
ракция на установке ДС-70. - Труды ВНИИЖ, 1969, вып. 19, с. 296-299.
12. Беликов И. Ф„ Ключ кин В. В., Моисейченко Л. М. Техно-
логическая оценка семян сои в зависимости от степени их зрелости. - Масло-жировая
промышленность, 1968, № 8, с. 7-10.
13. Беллами Л. Новые данные по ИК-спектрам сложных молекул. - М.:
Мир, 1970 -268 с.
14. Б е л о б и р о д о в В. В. Основные процессы производства растительных
масел. - М.; Пищевая промышленность, 1966. - 478 с.
15. Белобородов В В., Дементий В. А. Глубина извлечения и ка-
чество подсолнечного масла при противоточной многоступенчатой экстракции. - Мас-
ло-жировая промышленность, 1969, № 3, с. 8-11.
16. Б е л о б о р о д о в В. В., Ржехин В. П., Брик В. Н. Исследование
влияния основных факторов системы процессов экстракция - дистилляция на качест-
в.-. подсолнечного экстракционного масла. - Масло-жировая промышленность, 1970,
№8, с. 4-8.
17. Белобородов В. В., Брик В. Н. О влиянии основных факторов
системы экстракция - дистилляция на рафинируемость подсолнечного масла. - Из-
вестия вузов СССР. Пищевая технология, 1972, № 2, с. 76-79.
18. Белобородов В. В., Дементий В. А., Чудновская А. М.
Изучение рафинируемости подсолнечного масла в зависимости от режимов бесступен-
чатой экстракции и дистилляции. - Масло-жировая промышленность, 1972, № 4,
с. 12-14.
19. Б е р г е л ьс о н Л. Д. Мембраны, молекулы, клетки - М.: Наука, 1982. -
245 С.
20. Берчфильд Г., Сторре Э. Газозая хроматография в биохимии. -
М.:Мир, 1964.-619 с.
21. Брокерхоф X., Дженсен Р. Липолитические ферменты. - М.;
Мир, 1978. - 396 с.
22. Будэикевич Г., Джерасси К., Ульямс Д. Интерпретация
масс-спектров органических соединений. - М.: Мир, 1966. - 323 с.
238
23. Бурнашева С. Н., Стер л ин Б. Я. Поведение различных нежиро-
вых веществ хлопкового масла при щелочной рафинации. - Труды ВНИИЖ, 1961;
вып. 21, с. 162-177.
24. В а с ь к о в с к и й В. Е., С у н н е с Э. С., Горовой И. Г. О распро-
странении фосфолипазы Db растениях. - Эволюция биохимии и физиологии, 1973,
вып. 9, № 3, с. 294-298.
25. В е р е щ а г и н А. Г. Биохимия триглицеридов. - М.: Наука, 1972. -
308 с.
26. В и н ю к о в а Н. П., Ж и д е н к о В. П., Проценко О. А. Сравни-
тельная оценка свойств нативных и гидрированных фосфатидов. - Труды ВНИИЖ,
1980, с. 94-97.
27. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липи-
дов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972. - 276 с.
28. Влияние технологии получения фосфатидных концентратов на эффек-
тивность их действия при производстве шоколадных масс/) Ю. В. Антипова,
Г. М. Кпешко, Е. П. Корнена и др.). - Известия вузов СССР. Пищевая технолошя,
1986, № 4, с. 127.
29. В л и я н и е степени дефектности семян подсолнечника на гидратируемость
фосфатидов/(Н. С. Арутюнян, В. М. Копейковский, Е. А. Аришева и др.). - Масло-
жировая промышленность, 1973, № 9, с. 3-6.
30. В ли я н и е лузжистости ядра на качественные показатели подсолнечного
масла/) Н. С. Арутюнян, В. М. Копейковский, Е. А. Аришева и др.). - Масло-жировая
промышленность, 1973, № 5, с. 15-20.
31. В л и я н и е состава и качества масел на величину отходов и потерь в про-
цессе сепарационной рафинации/) А. И. Аскинази, Р. С. Махсон, И. И. Губман и др.). -
ЦНИИТЭИпищепром, 1981, № 1, с. 2-5.
32. В л и я н и е влаго-тепловой обработки семян подсолнечника на подавление
активности ферментов и переход фосфатидов в масло/) П. П. Демченко, Т. А. Данило-
ва, В. В. Ключкин и др.]. - Труды ВНИИЖ, 1980, с. 72-76.
ЗХ Влияние состава масла и катализатора на процесс электроосаждения ка-
тализаторов из гидрированных жиров/) В. Т. Золочевский, Т. В. Мгебришвили,
В. Т. Есипов и др.). - Масло-жировая промышленность, 1973, № 5, с. 23-25.
34. В л и я н и е температуры на ассоциацию фосфолипидов соевых масел в не-
полярных растворителях/) Е. П. Корнена, В. С. Косачев, Н. С. Арутюнян и др.). - Из-
вестия вузон СССР. Пищевая технология, 1983, № 6, с. 19-22.
35. В ы в е д е и и е фосфолипидов из растительных масел/) Е. П. Корнена,
Н. А. Пономарева. Н. С. Арутюнян и др.]. - Масло-жировая промышленность, 1984,
№ 4, с. 10-13.
36. В л и я н и е ЭМ поляризации на термодинамические характеристики ассо-
циации фосфолипидов в неполярных растворителях/) Е. П. Корнена, Н. С. Арутюнян,
В. С. Косачев и др.]. - Известия вузов СССР. Пищевая технология, 1985, № 6,
с. 100-101.
37. В л и я н и е режимов тепловой обработки семян подсолнечника на техноло-
гические свойства масел/) Ю. В. Костенко, Е. П. Корнена, В. М. Копейковский и др.). -
Масло-жировая промышленность, 1986, № 7, 8-10.
38. Влаго-тепловая обработка подсолнечной мятки перец жарением/) Ю. П. Ма-
цук, Б. А. Семенов, И. Е. Безуглов и др.). - Труды ВНИИЖ, 1972, вып. 29, с. 23-32.
39. В л и я н и е гидратируемых и негидратируемых фосфорсодержащих ве-
ществ на электропроводность подсолнечного масла/) Т. В. Мгебришвили, В. И. Мар-
товщук, В. Н. Артюшков и др.). - Масло-жировая промышленность, 1976, № 2,
с. 13-15.
40. В л и я н и е способа подготовки семян подсолнечника к переработке на гид-
ратируемость фосфатидов в извлекаемых маслах/) Л. А. Мхитарьянц, Е. А. Аришева.
В. М. Копейковский и др.).-Масло-жировая промышленность, 1975. № 12. с. 6-9.
41. В л и я н и е сушки и последующего хранения семян подсолнечника разных
сроков уборки на качество масла/) Л А. Мхитарьянц, В. М Копейковский, Н. С. Ару-
тюнян и др.]. - Масло-жировая промышленность, 1973, N* 10, с. 5-8.
42. в л и я н !' • степени зрелости семян сои на качество масла/) А. И. Сибирцев,
Л. М. --йченко, Ю П. мацук и др.]. - Труды ВНИИЖ, 1967, вып. 26, с. 28-31.
239
43. В л и я н и е веществ, сопутствующих растительному маслу, на электропро-
водность мисцелл/] О. Ф. Эфендиев, Т. В. Мгебришвили, В. Т. Золочевский и др.]. —
Масло-жирсвая промышленность, 1976, № 12, с. 9-12.
44. Болотовская С. Н., Стерлин Б. Я., Игнатьева Л. М. Вли-
яние режима смешения масла с водой на степень выведения фосфорсодержащих ве-
ществ. - Масло-жировая промышленность, 1973, № 1, с. 16-18.
45. В о л о т о в с к а я С. Н., Стерлин Б. Я., Залевская Л. М. Не-
которые аспекты применения фосфорной и лимонной кислот при рафинации расти-
тельных масел. - Труды ВНИИЖ, 1974, вып. 32, с. 24-29.
46. Болотовская С. Н., Ко й ф м ан Т. Ш., Криштофович С. Н.
Рафинация подсолнечного масла без применения раствора щелочи. - Масло-жировая
промышленность, 1976, № 2, с. 15-17.
47. Болотовская С. Н., Кузнецова Н. В., Майорова Н. Н. По-
тери при рафинации хлопкового масла. - Масло-жировая промышленность, 1980, № 3,
с. 25-28.
48. Волькенштейн М. В. Биофизика. - М.; Наука, 1981. - 575 с.
49. В о ю ц к и й С. С. Курс коллоидной химии. - М.: Химия, 1976. - 512 с.
50. Г и д р а т а ц.и я растительных масел растворами поляризующих соедине-
ний (сообщение 1)/( Н. П. Винюкова, Е. П. Корнена, Н. С. Арутюнян и др.]. - Масло-
жировая промышленность, 1984, № 2, с. 12-15.
51. Г идратация фосфолипидов из подсолнечных масел методом термиче-
ской и химической активации/] Б. А. Дехтерман, Н. С-. Арутюнян, Е. П. Корнена и
др.]. - Масло-жировая промышленность, 1986, № 2, с. 12-14.
52. Гидратация растительных масел растворами поляризующих соедине-
ний (сообщение 2)/[ Е. П. Корнена, Н. П. Винюкова, Н. С. Арутюнян и др.]. - Масло-
жировая промышленность, 1984, № 3, с. 15-17. (
53. Гидратация фосфолипидов из растительных масел с применением раст-
воров поверхностно-активных веществ/] Е. П. Корнена, Н. С. Арутюнян, Л. А. Тара-
баричева и др.]. - Известия вузов СССР. Пищевая технология, 1986, № 4, с. 128.
54. Г и дратация фосфолипидов из растительных масел методом механо-
химической активации/] Т. В. Мгебришвили, В. И. Мартовщук, Е. П. Корнена и
др.]. - Известия вузов. Пищевая технология, 1985, № 5, с. 128.
55. Гидрирование фосфатидов подсолнечного масла на суспендирован-
ных катализаторах/] Н. Л. Меламуд, Г. В. Чеботарева, Т. А. Данилова и др.). - Труды
ВНИИЖ, 1970, вып. 26, с. 295-303.
56. Г идратация фосфолипидов из подсолнечных мисцелл/] А. К. Мосян,
Е. А. Аришева, Е. П. Корнена, Т. А. Заднепрянская]. - Известия вузов СССР. Пище-
вая технология, 1985, № 2, с. 118.
57. Гидрирование фосфатидов в растворах. - В кн.: Каталитические ре-
акции в жидкой фазе/] Г. В. Чеботарева, Н. Л. Меламуд, Э. М. Майоров и др.]. -
Алма-Ата: Наука, 1967, с. 58-62.
58, Голдовский А. М. Теоретические основы производства растительных
масел. - М : Пищепромиздат, 1958. - 448 с.
59. Голдовский А. М., Мирзоев А. М. О возможности присутствия
белковых веществ в растительных маслах. - Масло-жировая промышленность, 1978,
№8, с. 13-15.
60. Г о р о д е н к о П. Г., С о т н и к Б. Ф„ П а с к а р ь Ф. Л. Применение
ультразвука для интенсификации очистки подсолнечного масла. - Масло-жировая
промышленность, 1978, № 9, с. 6-7.
61. Горячева А. Ф., Кузьминский Р. В. Сохранение свежести хле-
ба. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. - 240 с.
62. Г р и г о р ь е в а В. Н., М и р о н о в а А. Н., Петрова Л. Н. Изуче-
ние гидролитических ферментов масличных семян. - Труды ВНИИЖ, 1977, вып. 33,
с. 3-12.
63. Д а в и д Р. Введение в биофизику. - М.: Мир, 1982. - 207 с.
64. Д а н и л ь ч у к С. И., К а м ы ш а н М. А., Уманская А. Н. Фрак-
ционирование фосфорсодержащих веществ подсолнечного масла буферными раст-
ворами. - Труды ВНИИЖ, 1980, с. 85-88.
240
65. Девис Д„ Джованелли Дж., Рис Т. Биохимия растений. - М.:
(Мир, 1966. - 512с.
I 66. Демченко П. П., Данилова Т. А., Ключкин В. В. Влияние
влаго-тепловой обработки на состав фосфолипидов подсолнечного масла. - Масло-
жировая промышленность, 1980, № 4, с. 23-25.
67. Д ж о у н с М. Биохимическая термодинамика. - М.: Мир, 1982. - 440 с.
68. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. — М.: Мир, 1982, т. 1, 2, 3. — 1118 с.
69. Д и п . л ь н ы е характеристики фосфолипидов растительных масел/
[ Н. А. Пономарева, Е. П. Корнена, Н. С. Арутюнян, Л. Е. Ниворожкин) - Известия
вузов СССР. Пищевая технология, 1982, № 4, с. 106-108.
70. Д я т л о в и ц к а я Э. В., Грешных К. П„ Б е р г е л ь с о н Л. Д.
Фосфолипиды дрожжей, выращенных на н-алканах. - Биохимия, 1968, т. 33, вып. 1,
с. 83-88.
71. Д я т л о ь и ц к а я Э. В., Торховская Т. И., Бергельсон Л. Д.
Липиды опухолей. Исследование фосфолипидов саркомы Йенсена. - Биохимия, 1969,
т. 34, вып. 1, с. 174-182.
72. Е р е м и и В. Н. Основы химической термодинамики. - М.: Высшая шко-
ла, 1974, с. 142-145.
73. Жиденко В. П., Казарян Р. В., Арутюнян Н. С. Оценка гид-
рируемое™ растительных масел. — Масло-жировая промышленность, 1980, № 9,
с. 18-20.
74. Жиденко В. П., Винюкова Н. П., Арутюнян Н. С. Поведе-
ние фосфатидов в зависимости от условий гидрогенизации растительных масел -
Масло-жировая промышленность, 1980, № 1, с. 18-20.
75 Ж у к о в А. В., Верещагин А. Г. О суммарном содержании поляр-
ных липидов в семенах сои. - Биохимия, 1975, т. 40, вып. 5, с. 899-908.
76. Ж у н к е А. ЯМРв органической химии. - М.: Мир, 1974. - 176 с.
77. Зависимость качества подсолнечного масла от температуры прессуе-
мой мезги/) Л. П. Зозуля, Н. С. Арутюнян, В. М. Копейковский и др.). - Известия
вузов СССР. Пищевая технология, 1972, № 5, с. 69-71.
78. Золочевский ВТ., Стерлин Б. Я. К вопросу о влиянии ве-
ществ, сопутствующих триглицеридам, на фильтруемость гидрированных жиров. -
Труды ВНИИЖ, 1967, вып. 26, с. 459-463.
79. Золочевский В. Т., Стерлин Б. Я. Исследование восков, выде-
ленных из масел семян высокомасличного подсолнечника. - Труды ВНИИЖ, 1967,
вып. 26, с. 433-439.
80. 3 о л о ч е в с к и й В. Т., Титова Т. Г. Исследование влияния силь-
ных электрических полей на качество гидрированных жиров. - Масло-жировая про-
мышленность, 1974, № 12, с. 17-18.
81. 3 у е ь Э. И. Экстрагируемость фосфатидов семян сои. - В сб.: Всесоюз-
ное совещание по вопросам биологии и возделывания сои в Советском Союзе. Влади-
восток: СО АН СССР ДВФ, 1967, с. 155-158.
82. 3 у е в Э. И., Р ж е х и н В. П. Влияние недозрелости семян сои на состав
и свойства сопутствующих глицеридам веществ. - Масло-жировая промышленность,
1969, №9, с. 7-9.
83. 3 у е в Э. И., Ключкин В. В. К вопросу о целесообразности отбелива-
ния соевой мисцеллы перед дистилляцией. - Труды ВНИИЖ, 1970, вып. 27, с.108-116.
84. 3 у е в Э. И., Ключкин ч. В. Влияние нежировых веществ соевого
маслена качество фосфатидов. - Труды ВНИИЖ, 1970, вып. 27, с. 136-141.
85. 3 у е в Э. И., Р ж е х и н В. П. Состав и выход фосфолипидов в зависи-
мости от условий извлечения масла из семян сои. - Труды ВНИИЖ. 1970, вып. 27,
с. 3-10.
86. Зуев Э. И., Ключкин В. В., Ржехин В. П. Влияние интенсив-
ности прогревания мисцеллы на качество соевых масел и фосфатидов. - Труды
ВНИИЖ, 1970, вып. 27, с. 117-120-
87. И в е н с И., С к е й л а к Р. Механика и термодинамика биологических
мембран. - М.: Мир, 1982. - 304 с.
88. Изменение полярности фосфолипидов растительных масел/) Е. П Кор-
йена, Н- С. Арутюнян, Н. А- Пономарева, Н. П. Винюкова). - Масло-жировая про-
мышленность. 1983. №4, с. 22-25.
89 Изучение неоднородности семян подсолнечника/! С. Ю. Ксандопуло,
В. М. Копейковский, В. В Ключкин и др ] - Масло-жировая промышленность, 1982,
№ 8, с. 4-7.
90. Исследование влияния подсолнечных фосфатидных концентратов,
полученных методом ЭМ активации, на реологические свойства шоколадных масс/
(Ю. В. Антипова, Г. М. Клешко, Е. П. Корнена и др.]. - Известия вузов СССР. Пище-
вая технология, 1986. №4, с. 127-128.
91. Использование синтетических сорбентов для выведения из хлопково
го масла сопутствующих веществ/] а. А Шмидт, А И. Аскянази, И. И. Губман и
др.] - Масло-жировая промышленность, 1977, № 7, с. 21 -23
92. К а з и ц и н э Л, А., Куплет ска я М. Б. Применение УФ-, ИК-, ЯМР-
и масс-спектроскопии в органической химии - М Изд во МГУ, 1979. - 238 с.
93. К а м ы ш а н М. А., Деревянко Е. А Влияние содержания приме
сей в саломасе на скорость его фильтрации. - Масло-жировая промышленность. 1970,
№ 1, с, 17-18.
94. Карибаев К. К., Попова В Н. Использование хлопкового обезжи-
ренного высушенного фосфатида ири откорме .>вец - Груды Узбекского НИИ живот
новоцства, 1973, вып. 18, с. 189-194
95К аршиев X., Шустанова Л. А., Акрамов С. Т Фосфолипи-
ды. - Химия природных соединений, 1976, N? 4, с. 535-536
96. К е й т с М. Техника липидологии.'- М.: Мир, 1975. - 322 с.
97. К t с с л ер И. Методы ИК-спекгроскопии в химическом анализе. - М.:
Мир, 1964. - 149 с.
98. К и х н е р Ю. Тонкослойная хроматография - М.: Мир, 1981, т. 1, 615 с.
99. Классификация и номенклатура ферментов/под ред. А. К. Браун-
штейна. - М : ИЛ, 1962. - 200 с.
100 К л ю ч к и н В. В., Зуев Э. И., Лосев- В. Л. Изучение влияния
режимов дистилляции мисцеллы на качество соевого масла и фосфатидов. - Груды
ВНИИЖ, 1970. вып. 27, с. 99- 104
101 Ключкин В В., Каэаджан ЗМ Влияние влаго-тепловой обра-
ботки на степень и состав извлекаемых липидов. - Труды ВНИИЖ. 1972, вып. 29,
с. 33-36
102 Ключкин В. В., Уманская А. Н. Поглощение пигментов и фосфо-
липидов в зависимости от температуры адсорбционной рафинации соевой мисцеллы -
Масло-жировая промышленность, 1973, № 8, с. 13-15.
103. Ключкин В. В., Демченко П. П., Брик В. П. Подготовка
семян подсолнечника к прямой экстракции масла. - Масло-жировая промышленность
1980, №8, с. 12-17.
104. К вопросу отделения катализатора в электростатических полях/
[ Т. Г Титова, Т. В Мгебришвили, В. Ф. Есипов, О. А Проценко]. - Масло-жиро-
вая промышленность, 1975, № 10, с. 19-20
105-Ксзин НИ Применение эмульсий в пищевой промышленности. - М.:
Пищевая промышленность, 1966. - 135 с.
106 К 'ллоидные поверхностно-активные вещества, физико-химические
свойства/] К. Шинода, Т. Накагава, Б. Тамомуси, Т. Иесимура]. - М-’ Мир, 1966. —
250 с.
107 Количественное определение фосфохолина и активности фосфоли-
пазы С/1 Э. В. Дятловицкая, В. И Волкоьа, р. м. Исполаговскад и др ]. - Химия при-
родных соединений, 1966, т. 3, с. 233-235.
108. Кой фм ан Т. Ш.. Ь о л о 1 с в с к а я С. Н., Кузнецова Н. В.
Изучение фракционного состава фосфатидов льняных семян и масла. - Труды ВНИИЖ,
1977, вып 33, с. 86-90.
ЮУ.Койфман Т. М-. Волотовская С. Н., Фальк Е. Ю. О взаимо-
действии фосфорной кислоты с фосфолипидами льняного масла. - Масло-жировая
промышленность, 1978, № 3, с. 20-23.
110. Койфман Т 111 О роли фосфорной кислоты в процессах рафинации
растительных масел. - Труды ВНИИЖ, 1980, с. 53-57-
242
111. К о н еь а Я А., Т р о с ь к о У. И. Поведение фосфатидов при влаго-
тепловой обработке хлопковых семян и мятки - Масло-жировая промышленность,
1972. №3, с 17-19
112. Корнена Е П., Литвинова Е. Д.. Арутюнян Н. С. Поведе-
ние фосфорсодержащих веществ рафинированных масел в процессе гидрирования -
Масло-жировая промышленность. 1978, № 4, с. 18-21.
113. Корнена Е. П., Литвинова Е. Д., Арутюнян В С. Слож-
ные соединения фосфолипидов подсолнечного масла с металлами. - Масло-жировая
промышленность, 1978, № 5, с. 16-19
114. К о р н е н а Е. П., Арутюнян Н. С. О составе углеводов негидрати-
руемых фосфолипидов подсолнечных масел - Известия вузов СССР. Пищевая техно-
логия, 1979. №3, с. 32-36.
115. К о р н е н а Е. П., Арутюнян НС. Исследование в области количе-
ственною выведения фосфорсодержащих веществ. - Труды ВНИИЖ, 1980, с. 57-63.
116. Кор иен а Е. П., Арутюнян Н. С Исследование структуры непщ-
ратирусмых фосфолипидов подсолнечных масел. - Труды ВНИИЖ. 1980. с. 25-32.
117. Корнена Е. П., Пономарева НА., Арутюнян НС. Изме-
нение дипольных характеристик фосфолипидов растительных масел. - Масло-жиро-
вая промышленность. 1983. № 10, с. 27-29
118. К о р н е н а Е. П., Пономарева И. А. Характерно гика жирных
кислот и неомыляемых веществ фосфолипидов растительных масел. - Известия
вузов СССР Пищевая технология, 1984, № 2, с. 19-21.
119. Корнена Е. П., Пономарева Н. А.. Арутюнян Н. С. Изу-
чение структуры фосфолипидов соевых масел методом ИК-спектроскопии - Извес-
тия вузов СССР. Пищевая технология, 1984, № 3, с. 19-21.
120. Корнена Е П., Арутюнян Н. С. Современное представление о
структуре фосфолипидов растительных масел. - Масло-жировая промышленность,
1985, №8, с. 14-18.
121. Ксандопуло С. Ю., Копейковский В. М. Исследование ди-
намики перехода фосфатидов в масло из семян подсолнечника различных классов. -
Труды ВНИИЖ, 1980, с 36-41.
122. Л а н д а у Л. Д.. Дымшиц Е. М. Теория ноля. - М Наука, 1960.—
400 с.
123. Литвинова Е. Д, Аришева Е. А., Арутюнян Н.С. О сос-
таве веомыляемых веществ, извлекаемых из подсолнечного масла вместе с фосфаты
нами. - Масло-жировая промышленность, 1971, № 11, с. 18-19.
124. Л и т в и н с в а Е.Д., Арутюнян Н. С., Аришева Е. А. Состав
неТидратируемых фосфолипидов попсолнечного масла - Масло-жироь ая промыш-
ленность, 1972, № 1, с. 13-15.
125. Литвинова Е. Д., Арутюнян Н. С., Аришева Е. А. Гидра-
тируемость фосфатидов подсолнечных семян. — Масло-жировая промышленность,
1973, №8, с. 15-17.
126, Липолитические ферменты семян хлопчатника и их стабильность
[ Ш. Р Мадьяров, Н. Р. Джанибаева, 4. X. Атаулаев и др. ]. - Прикладная биохимия
и микробиология, 1975, т. II, вып. 3, с. 437-442.
127 Малышева А. Г. Накопление веществ, сопутствующих жирам, при
созревании семян льна и подсолнечника- - Маслобойно жировая промышленность,
1961, №9, с. 7-8.
128. Маркман А. Л., Ржехин В П. Госсипол и его производные. -
М.: Пищевая промышленность, 1965. - 243 с.
129. Мартовщук В. И., Мгебришвили Т. В. Поверхностная ак-
тивность сопутствующих веществ в гексановых мисцсллах подсолнечного масла. -
Масло-жировая промышленность. 1978, №6, с. 14-16.
130. М а р т о в щ у к в И., Мгебришвили Т. В., Паукова А. В.
О межфазной активности и мицеллообразовании лецитина в неполярных жидкос-
тях. - Труды ВНИИЖ. 1980, с. 41-45.
131. Мгебришвили ТВ. Сильные электрические ноля > технологиче-
ских процессах масло-жирового производства. — Масло-жировая промышленность,
1973. № 7, с. 5-7.
243
132. Me лам уд Н. Л., Стопский В. С., Чеботарева Г. В. О ме-
ханизме дезактивации катализаторов гидрирования фосфолипидами. - Труды
ВНИИЖ, 1980, с. 46-48.
133. М е ц л е р Д. Биохимия. - М.: Мир, 1980, т. 1 - 408 с., т. 2 - 606 с.,
т. 3 - 488 с.
134. М и и е и к о В. И. Магнитная обработка воды. - Харьков: Техника,
1962. - 40 с.
135. Минкин В. И., Осипов О. А., Жданов Ю. А. Дипольные мо-
менты в органической химии. - Л : Химия, 1968. - 248 с.
136. Мицеллообразование, солюбилизация и микроэмульсии. - М .
Мир, 1980. - 597 с.
137. М о р о з 3. М. Использование отходов подсолнечника на корм скоту. -
Л.: Колос, 1979.- 79 с.
138. М ося н А. К., Аришева Е. А., Свечник А. Н. Влияние раство
рителя на степень гидратируемости фосфатидов в масле. - Масло-жировая промыш-
ленность, 1971, № 9, с. 15-18.
139- М одель межфазного слоя трех компонентов: жирные кислоты, гидра-
тируемые и негидратируемые фосфолипиды в системе масло - вода/1 В. С. Косачев,
Е. П. Корнена, Л. И. Янова, Н. С. Арутюнян). - Масло-жировая промышленность,
1986. №3, с. 18-21.
140. Мухамедов X. С., Акрамов С. Т. Исследование фосфолипидов
семян хлопчатника. - Химия природных соединений, 1976, №2, с. 128-130-
141. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических соеди-
нений. - М.: Мир, 1965. - 235 с.
142. Низкотемпературное гидрирование обогащенных фосфатидами
мисцелл подсолнечного масла/) В. П. Жиденко, Н. П. Винюкова, А. К. Мосян и
ДР-] - - Труды ВНИИЖ, 1980, с. 89-98.
143. Новое в технике и технологии кондитерского производства/под ред.
М. М. Истоминой. - М.: Пищевая промышленность, 1972. - 190 с.
144. Обнаружение и свойства двух форм фосфолипазы D растений/
| М. М-Рахимов, Ш. Р. Мадьяров, М. С. Зинвиддинов и др ]. - Биохимия, 1977, т. 42,
вып. 5, с. 788-789.
145. О взаимодействии фосфорной кислоты с эпоксисоединениями
растительных масел/) Н. Л. Меламуд, В. С. Стопский, А. И. Аскинази, Н. А. Каташе-
ва]. - Труды ВНИИЖ, 1980, с. 16-20.
146. Об изменении состава фосфолипидов семян подсолнечника при под-
готовке к прессованию, & процессе прессования и очистки форпрессового мас-
ла/) Т. А. Данилова, А. Н. Миронова, Ф. Б Эстрина и др.) - - Труды ВНИИЖ, 1980,
с. 67-72.
147. Опыт рафинации льняного масла без применения щелочи/) Т. Ш. Койф-
ман, Н. С. Болотовская, Б. Я. Стерлин и др.]. - Масло-жировая промышленность,
1976, №1, с. 36-38.
148. О состаье и некоторых свойствах фосфолипидов форпрессовых под-
солнечных масел/) Т. А. Данилова, А. Н. М и р о н о в а, Ф. Б. Эстрина и др.). - Труды
ВНИИЖ, 1974, вып. 32, с. 13-15.
149. Основные закономерности процесса сепарационной рафинации жи-
ров/) В. X. П а р о н я н, А. И. Аскинази, И. И. Губман и др.]. - Масло-жировая про-
мышленность, 1984, № 12, с. 16-17.
150. Пим ент ел л Дж., Мак-Клеллан О. Водородная связь. - М.:
Мир, 1964.- 318 с.
151. Покровский Е. А., Каргополов Д. В. Модификация метода
ТСХ фосфолипидов. - Лабораторное дело, 1972, №6, с. 337-341.
152. Подготовка масел к дистилляционной нейтрализации/) В X. Паронян,
А. И. Аскинази, И. И. Губман и др.]. - Масло-жировая промышленность, 1985, № 2,
с. 12-18.
153. Подбор и исследование природных сорбентов для процесса адсорбцион-
ной рафинации хлопкового масла/) А. А. Шмидт, И. И. Губман, А. И. Аскинази и
др.]. - Масло-жировая промышленность, 1975, № 1, с. 13-16.
244
154. Получение фосфатидного концентрата высокого качества/J Б. А. Дех-
терман, А. Э. Кушнир, К. С. Демец и др.). - Масло-жировая промышленность, 1977,
№ 7, с. 24-26.
155. Получение легкогидратируемого подсолнечного масла/t Ю. П. Мацук,
В. В. Белобородов, Е. А. Семенов и др.]. - Труды ВНИИЖ, 1971, вып. 28, с. 41-48.
156. Пономарева Н. А. Некоторые характеристики и состав фосфолипи-
дов соевых масел. — Труды ВНИИЖ, 1980, с. 32-36.
157. Пономарева Н. А., Корнена Е. П., Арутюнян Н.С. Ассо-
циации фосфолипидов подсолнечных масел в неполярных растворителях. - Известия
вузов СССР. Пищевая технология, 1981, № 3, с. 82-85.
158. П о н о м а р е в а Н. А., Корнена Е. П., Арутюнян Н. С. Состав
углеводов фосфолипидов соевого масла. - Известия вузов СССР. Пищевая техноло-
гия, 1981, №4, с. 118-120
159. Попова В. Н. Хлопковые фосфатиды и их применение в животновод-
стве. - Труды ВНИИЖ, 1963, вып. 23, с. 110-112.
160. Попова В. Н., Тросько У. И., Верченко Р. В. Получение
хлопкового шрота, обогащенного хлопковыми фосфатидами и использование его в
животноводстве. - Труды ВНИИЖ, 1965, вып. 25, с. 190-197.
161. По по в а В. Н., Юсупова И. У., Ржехин В. П. К изучению фрак-
ционного и жирнокислотного состава фосфатидов хлопкового масла. - Масло-жиро-
вая промышленность, 1966, № 6, с. 17-19.
162. II ослеуборочное дозревание и хранение высокомасличного под-
солнечника/! В. В. Ключкин, С. Ю. Ксандопуло, Н. С. Арутюнян и др.]. - Масло-жиро-
вая промышленность, 1980, № 11, с. 12-17.
163. Преображенский Н. А., Евстигнеева Р. П. Химия биоло-
гически активных природных соединений. - М.; Химия, 1976. - 456 с.
164. Прокопенко А. Д., Ройтер И.М. Влияние фосфатидных кон-
центратов на свойства эмульсий для сахарного печенья. - Известия вузов СССР.
Пищевая технология, 1969, № 8, с. 41-43.
165. Прайс В Атомно-адсорбционная спектроскопия. - М.: Мир, 1976. -
355 с.
166. Пучкова Л. И., К о р я ч к и и а С. Ф., Леонова О. Я. Влияние
ПАВ на структурно-механические свойства теста и качество хлеба. - Известия вузов
СССР. Пищевая технология, 1975, № 2, с. 35-37.
167. Пучкова Л. И., Сидорова О. Г. Эффективность применения
поверхностно-активных веществ в хлебопечении. - Реферативный сборник Хлебо-
пекарная и макаронная промышленность. - М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1974. - 33 с.
168. Рахимов М. М., Мадьярке Ш. Р., Абду мал и ков А. X. Не-
которые свойства фосфолипазы D из семян хлопчатника. - Биохимия. 1976, т. 41,
вып. 3, с. 454-457.
169. Рахимов М. М., Мадьяров Ш Р., Бабаев МУ. Фермента-
тивный синтез фосфолипидов на границе раздела фаз. - Узбекский биологический
журнал, 1979, № 3, с. 6-9.
170. Р а х и м о в М. М., Бабаев М. У., Р а д ж а п о в а В. Р. Изменение
фосфолипидного состава семян хлопчатника. - Масло-жировая промышленность,
1982, №1, с. 9-13.
171. Райд К. Курс физической органической химии. - М.: Мир, 1972. -
575 с. '
172. Рафинация растительных масел с применением термокоагуляции/
[Т. В. М г е б р и ш в и л и, Е. С. Коваленко, В. Н. Артюшков и др. ]. - Масло-жиро-
вая промышленность, 1980, № 9,- с. 13-18.
173. Рафинация хлопкового масла эмульсионным методом/! В. Н. Попо-
ва, А. И. Ахундажнов, Л. М. Тучкова и Др.]. - Масло-жировая промышленность,
1980, № 3, с. 22-25.
174. Рафинация хлопкового масла в мисцелле/1 А. Г. Сергеев, Б. Я. Стер-
линг, У. И. Тросько и др.]. - Масло-жировая промышленность, 1960, № 1, с. 30-32.
175. Ребиндер П. А. Поверхностные и объемные свойства растворов по-
верхностно-активных веществ. - Журнал ВХО им. Д. И. Менделеева, 1966, т. XI,
вып. 4, с. 362-387.
245
176. Ребиндер Г). А. Взаимосвязь поверхностных и объемных свойств
растворов поверхностно-активных вешсств. - В сб. Успехи коллоидной химии. М.,
1973,- 98 с
177. Р ж е х и н В П., Погонкина НИ Взаимодействие липидов с бел-
ковыми веществами масличных семян в процессе маслодобывания - Масло-жиро
вая промышленность, 1957, № 1, с. 11-14
178 Р ж е х и н В. П. Влияние интенсивности тепловой обработки семян на ка
чество масла и жмыха. - В кн Пути повышения качества и расширения ассортимен-
та продукции масло-жировой промышленности. Л , 1959, с. 114-138
179- Ржехин ВП., Преображенская И. С. К вопросу об антиокис-
лительной активности фосфолипидов растительных масел. - Масло-жировая промыш-
ленность, 1959, № 7, с. 10- 24.
д 180. Ржехин В. П., Погонкина Н И. К вопросу о взаимодействии ли-
пидов с белковыми веществами масличных семян при извлечении из них масла. - Мас-
лобойно-жировая промышленность, I960, № 7, с. 17-19.
181. Ржехин ВП., Преображенская И. С Взаимодействие фосфа-
тидов с сахарами. - Труды ВНИИЖ. 1960. вып. 20, с 75-89.
182 Ржехин В.П., Преображенская И. С. взаимодействие фосфа-
тидов с госсиполом в присутствии воды. - Маслобойно-жировая промышленность,
1960, №8, с. 3-5.
183. Ржехин ВП., Погонкина НИ. Соловьева И. А. Методы
определения нежелательных изменений фосфатидов Рефераты работ ВНИИЖа за
1960 г. - Л.: ВНИИЖ. 1961, с. 186-187
1S4 Ржехин ВП., Преображенская И. С. Взаимодействие фосфа-
тидов С госсиполом. - Труды ВНИИЖ, 1961, вып. 21, с. 13-30.
185 Ржехин В. П., Преображенская И. С. Взаимодействие фосфа-
тидов с госсиполом в бензиновых и масляных средах - Маслобойно-жировая про-
мышленность, 1961, №2. с 9-12.
186. Ржехин В. П., Погонкина Н. И, Соловьева И. А. Жирно-
кислотный состав фосфолипидов подсолнечных и соевых масел. - Масло-жировая
промышленность, 1964, №12, с. 11-13.
187. Ржехин В. П. Исследование важнейших химических процессов при пе-
реработке масличных семян и некоторые новые режимы в области улучшения ис-
пользования масличного сырья и качества продукции Доклад по совокупности вы-
полненных работ на соискание ученой степени д-ра техн. наук. - М., МТИПП, 1964. -
55 с.
188. Ржехин В. П., Красильников В. И К изучению образования
фосфатидно-протеиновых комплексов. - IX Менделеевский съезд по обшей и при-
кладной химии. - М Наука, 1965, с. 58
1X9. Ржехин В. П.. Красильников В. И. К изучению взаимодейст-
вия липидов с белковыми веществами. — Прикладная биохимия и микробиология,
1965- т. 1, вып. 6, с. 658-663
190. Ржехин В. П. Изменение белковых веществ масличных семян при
действии на них тепла. - Трупы ВНИИЖ, 1969. вып. 19, с. 311-323
191 Р ж е х и н В. П. Некоторые химические и биохимические процессы при
переработке масличных семян и пути дальнейшего повышения качества раститель-
ных масел и протеина - Журнал ВХО им. Д. И. Менделеева 1969, т 14, № 2,
с. 140-145
192. Ржехин В П., Миронова А.Н., Морозова ТБ. Измене-
ния происходящие в фосфатидах в процессе извлечения масел. - Труды ВНИИЖ,
1970, вып 27, с. 169-1 74.
193 Руководство по методам исследования, технохимическому конт-
рил» и учету производства в масло-жировой промышленности/под общ. ред.
В П. Ржехина и др - Л НМИИЖ. 1967. т 1 3.
194. Ру кот здетво по технологии получения и переработки растительных
масел и жиров/под общ. ред А Г. Сергеева. - Л ВНИИЖ. 1973, т. 2. с. в 48
195. Руководство по методам исследования, технохимическому контро-
лю и учету производства б масло-жировой промышленности/под общ. рец А Г. Серге-
ева - Л . ВНИИЖ. 1974, т. 6
246
196. Руководство по технологии получения и переработки растительных
масел и жиров.'под общ. ред. А Г. Сергеева и др. - Л.: ВНИИЖ, 1975, т. 1, кн. 1.
197. Руководство по гехнолшии получения и переработки растительных
масел и жиров/под общ. ред. А. Г. Сергеева. - Л.: ВНИИЖ, 1975, т. 3.
198. С а в е л ь е в я ВЛ., Ключкин В. В. Состав фосфолипидов и кине-
тика их экстрагирования совместно с соевым маслом. — Масло жировая промыш-
ленность, 1979, № 10, с. 17-19.
199. Свешникова И. Н. О повелении крахмала и плодах масличных рас-
тений -Изд ЛАН СССР, 1958, т. 118. №3. с. 604-606
200. С Во бо дно р а див апьное окисление липидов в биологических мем-
бранах/! Ю II Козлов- В. С. Данилов, В. Е. Коган и др.]. - М.: Изд-во МГУ. 1972. -
83 с.
201. Семенов Е. А. Исследование некоторых химических изменении, про-
исходящих в льняной мятке при различной влаго-тепловой обработке. - Труды
ВНИИЖ, 1965. вып. 25, с. 100-105-
202. Сергеев АГ., 'Исилинец И-М., Кириевский Б. Н. Рота-
ционный пленочный аппарат для сушки фосфатидов — Масло-жировая промышлен-
ность, 1966, № 5, с. 40- 42
203. Сепарационная линия гидратации растительных масел/] Г. Я. Смир-
нов, С. Н. Болотовская. Н. Н. Иванов и др ]. - Масло-жировая промышленность.
1976. № 3, с. 26-28.
204, С и б и р ц е в А. И., Фокша А. Г. Соевые фосфатиды в кондитер
ской промышленности. — Хлебопекарная и кондитерская промышленность, 1966,
№3,С. 25-26
205 Смирнов А. А.. Чиркояская Е. В Изучение фосфолипидов раз-
ных отделов мозга крысы с применением метода хроматографии на бумаге. - Биохи-
мия, 1961, т. 26, вып. 6, с. 1027-1031
206. Смирнов Г Я. Непрерывнодействующая линия по т-идратации масел. -
Масло-жировая промышленность, 1978, № 3, с. 43.
207. Совершенствование технологии дистилляции соевой мисцеллы'
[ В. В. Уточкин, В Л. Савельева. Э. И. Зуев и др.]. - Труды ВНИИЖ, 1972, вып. 29,
с. 76-81.
208. Содержание фосфолипидов в семенах сои новых селекционных сор-
тов/] В В. Ключкин. Л М Заводцова, В. Л. Савельева и др.]. - Труды ВНИИЖ, 1977.
зып. 32, с. 72-77.
209. Соевое масло как компонент жировой эмульсии/] С. Н Болотовская,
Н. В. Кузнецова, Л. М. Зелевская и др ]. - Масло-жировая промышленность, 1981,
№ 12, с. 16-18
210. Состав и свойства фосфолипидов соевых масел/1 Н А. Пономарева,
Е. П Корнена, Н. С. Арутюнян, Ц. Т. Хаджийски]. - Известия bv3ob СССР. Пищевая
технология, 1981, № 5, с. 34-36.
211. Состав и выход экстрагируемых липидов и фосфолипидов семян сои.
подвергнутых влаго-тепловой обработке/] 3. М. Казаджан В В Ключкин, Э. И. Зуев
и др.]. - Труда ВНИИЖ, 1974, вып. 32, с. 112-116.
212. Состав и некоторые свойства фосфолипидов наделенных из нейтрали
зованного подсолнечного масла/] Е. П. Корчена. И. В Шведов, Е. Д. Литвинова.
Н С. Арутюнян]. — Масло-жировая промышленность, 1976. № 11, с. 16-19
213. Стам Г. Я., Паскарь Ф Л. Усовершенствование схемы непрерыв-
ной сушки фосфатидного концентрата. - Масло-жировая промышленность, 1979.
№11, с. 40-41.
214. Стерлин Б Я Рафинация экстракционных масел в мисцелле. - Обзор
литературы и неопубликованных экспериментальных работ. - Л. ВНИИЖ, 1959. -
25 с.
215. Стефанов К., Гърдев М., Палавеева Ц Промяна на съдъг
рканието на захари в мисцелли на сиънчотлецови масла след промыванее с раствор на
натри ев хлорид — Масло-сопунена промышленность, 1978, т. 14. № 4, с. 1-7.
216. С то некий В. С., Ас киназ и А. И., Калаше в а Н. А. Влияние
pH среды н? гидратацию и гидролиз оксифосфатов триглицеридов. - Труды ВНИИЖ,
1980 с. 20-25.
247
217. Сушка гидратационного осадка на горизонтальном пленочном аппарате/
(С. А. Иванова, Г. Я. Смирнов, И. М. Игнатьева и др.]. - Масло-жировая промышлен-
ность, 1974, № 2, с. 34-36.
218. ТарабаричеваЛ. А., Аришева Е. А. Роль фосфолипазы Db
формировании гидрофильных свойств подсолнечного масла. - Масло-жировая про-
мышленность, 1976, № 12, с. 12-14.
219. Т а р а б а р и ч е в а Л. А., Белобородов В. В., Арутюнян Н. А.
О качестве подсолнечного масла при прямой экстракции сырой мятки гексаном. -
Известия вузов СССР. Пищевая технология, 1974, № 5, с. 62-65.
220. Технология кондитерских изделий/под ред. Г. А. Маршалкина. -
М-: Пищевая промышленность, 1978. - 446 с.
221. Т емпературные зависимости ассоциации фосфолипидов подсолнеч-
ных масел в неполярных растворителях/] Е. П. Корнена, В. С. Косачев, Н. С. Арутю-
нян и др.]. - Известия вузов СССР. Пищевая технология, 1983, № 3, с. 18-21.
222. Т и т о в а Т. Г., Золочевский В. Т., Проценко О. А. Влия-
ние фосфорсодержащих веществ на отделение катализатора от гидрированных жиров
в электростатическом поле. - Масло-жировая промышленность, 1976, № 1, с. 16-17.
223. Томиока Ф. Исследование побурения фосфолипидов при нагревании.-
Юкагаку, 1976, т. 25, № 11, с. 784-788.
224. Турсунов М. Исследование влияния некоторых факторов на процесс
гидратации хлопкового масла в мисцелле..Депонированная рукопись в Узбекском
химическом журнале. - Ташкент, 1979. - 6 с.
225. Тютюнников Б. Н., Каракузаки Л. Фосфатиды как причина
торможения гидрогенизации жиров. - Маслобойно-жировое дело, 1936, № 11, с. 37-39.
226. Тютюнников Б. Н. Химия жиров. - М.: Пищевая технология, 1974. -
448 с.
227. Уманская А. Н., Ключкин В. В. Изучение кинетики процесса ад-
сорбции пигментов соевого масла. - Труды ВНИИЖ, 1972, вып. 29, с. 101-103.
228. Уоллинг Ч. Свободные радикалы в растворах. - М.: ИЛ, 1960, с. 116-
121.
229. Ф и а л к о в Ю. Я., Житомирский А. Н., Тарасенко Ю. А.
Физическая химия неводных растворов. - Л.: Химия, 1973. - 376 с.
230. Фосфолипиды зерна кукурузы и овса/] Г. Н. Новожилова, С. С. Мхи-
тарьян, Н. А. Богословский и др.). - Прикладная биохимия и микробиология, 1969,
№ 5, вып. 1, с. 111-114.
231. Фракционный состав фосфатидов высокомасличных семян подсол-
нечника и его изменение в процессе получения масел и фосфатидных концентратов/
|М. Г. Маринов, В. П. Ржехин, А. Н. Маринован др.]. - Труды ВНИИЖ, Л., 1970,
вып. 27, с. 210-215.
232. Фрей-ВисслингА., МюлеталерК. Ультраструктура раститель-
ной клетки. - М.: Мир, 1968. - 453 с.
233. X а й с П., М а ц е к М. Хроматография на бумаге. — М.: ИЛ, 1962. -
851 с.
234. Хачатуров В. О возможности электростатической очистки раститель-
ных масел. Материалы краевого научно-технического совещания: Применение сильных
электрических полей в промышленности и сельском хозяйстве. - Краснодар, 1969,
с. 5-6.
235. Хомутов Б. И., ЛовачевЛ. Н. Хранение пищевых жиров. - М.:
Экономика, 1972. - 160 с.
236. Ц ы п л е н к о в а И. Л., Тарабаричева Л. А., Арутюнян Н. С.
О связи восков с фосфолипидами в гидратированных маслах. - Масло-жировая про-
мышленность, 1981, № 5, с. 44-45.
237. Шведов И. В., Корнена Е. П., Арутюнян Н. С. Выделение
фосфолипидов методом низкотемпературного фракционирования. - Масло-жировая
промышленность, 1985, №6, с. 19-22.
238. Шведов И. В, Казарян Р. В., By Тхи Дао. Сорбционная
очистка хлопкового масла в мисцелле. - Масло-жировая промышленность, 1983,
№ 11,с. 16-18.
248
239. Hi ex тер Ю. H., КрейпС. Э., Теберина А. Л. Маслораствори-
мые поверхностно-активные вещества. - М.: Химия, 1970. - 302 с.
240. Шмидт А. А. Теоретические основы рафинации растительных масел. -
М.: Пищепромиздат, I960. - 340 с.
241. Шмидт А. А., А с к и н а з и А. И., Г у б м а н И. И. Выведение
фосфолипидов из мисцеллы растительных масел. - Труды ВНИИЖ, 1980, с. 63-67.
242. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. - М., Мир, 1965. - 508 с.
243. Ш т у м п ф П. К. Взаимосвязь между обменом липидов и структурными
компонентами растительной клетки. - Труды Международного биохимического кон-
гресса. Функциональная биохимия клеточных структур. Симпозиум II, 1982, с. 70-73.
244. Шустанова Л. А., Умаров А. У., Маркман А. Л. Фосфоли-
пиды ядра семян подсолнечника. - Химия природных соединений, 1970, № 3, с. 292-
296.
245. Шустанова Л. А., Умаров А. У., Маркман А. Л. Структур-
ные исследования фосфолипидов подсолнечника. - Химия природных соединений,
1971, № 1, с. 3-7.
246. Ш у с т а н о в а Л. А., Умаров А. У., Маркман А. Л. Определе-
ние позиционного распределения жирных кислот в природных фосфатидилхолинах. -
Химия природных соединений, 1971, № 2, с. 137-141.
247. Ш у с т а н о в а Л. А., Умаров А. У., Маркман А. Л. Фракцио-
нирование фосфолипидов Helianthus annuus. - Химия природных соединений, 1971,
№7, с. 518-519.
248. Шустанова Л. А. Определение сложноэфирных групп в фосфолипи-
дах. - Химия природных соединений, 1975, с. 655-656.
249. Щербаков В. Г., Малышев А. М. Жирнокислотный состав масел
высокомасличного подсолнечника при созревании. - Масло-жировая промышлен-
ность, 1967, №12, с. 18-22.
250. Щ е р б а к о в В. Г., Малышев А. М. Изменение липидов подсолнеч-
ных семян при тепловой сушке. - Известия вузов СССР. Пищевая технология, 1968,
№ 5, с. 34-36.
251. Щер баков В. Г., Малышев А. М. Липидный состав подсолнеч-
ного масла в зависимости от некоторых параметров влаго-тепловой обработки мят-
ки и лузжистости ядра. - Масло-жировая промышленность, 1968, № 10, с. 7-9.
252. Щербаков В. Г., Малхасьян Р. Б. Группы фосфолипидов соз-
ревающих подсолнечных семян. - Известия вузов СССР Пишовая технология, 1969
№4, с. 16-17.
253. Щ е р б а к о в В Г., Малхасьян Р Ь Фосфолипиды подсолнечных
семян при тепловой сушке. Известия вузов СССР Нишевая техноло1ия, 1969
№5,'с. 21-23.
254. Щербаков В Г. Химия и биохимия переработки масличных । «мин
М.: Пищевая промышленность, 1977. - 168 с.
255. Щербаков В. Г. Биохимия и товароведение масличного сырья М
Пищевая промышленность, 1979. - 336 с.
256. Щукин Е. Д., Перцев А. В., Амелина Е. А. Коллоидная хи-
мия. - М.: Изд-во МГУ, 1982, с. 60-61.
257. Экспериментальные методы химической кинетики/под ред.
Н. М. Эмануэля. - М.: Высшая школа, 1971. - 171 с.
258. Эмануэль Н. М., Ласков скал Ю. Н. Торможение процессов
окисления жиров. - М.: Пищепромиздат, 1961. - 20 с.
259. Э м а н у э л ь Н. М., Денисов Е. Г., Майдус 3. К. Цепные ре-
акции окисления углеводородов в жидкой фазе. - М.: АН СССР, 1965. - НО с.
260. Эфендиев О. Ф.. Мгебришвили Т. В. Исследование кинетики
процесса очистки мисцеллы в электростатическом поле. - Известия Северо-Кавказ-
ского научного центра высшей школы. Технические науки, 1974, № 4, с. 24-26.
261. Яничек Г., Покорни Я., Кондратенко С. С. Окислитель-
ные изменения липидов в пищевых продуктах при хранении и переработке (обзор) -
М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1976. - 56 с.
262. Ясудо и Оно. Выделение и количественное определение фосфолипи-
дов. — Томпакусиду какусон косо. Специальный выпуск, 1967, с. 84-105.
249
263. Abramson M В, Norton W. Т., Katzman R Study of ionic
structures in phospholipids by infrared spectra. - J Biol. Chem., v. 240 No. 6, pp 2389—
2395.
264 Ansell GVB., Mamthorne J H Phosphatides. - Amsterdam-Lon-
don-New York. 1964. - 125 p.
265. Ansell G. B., Spanner S. Studies on the origin of choline in the brain
of rat. - Bioshem J , 1971, v. 122, pp. 741-750
266 Baer F.., Maurukas J The diazomctanulysis of glyccrophospnatidcs.
A novel method of determining the configuration of phosphatidylscnncs and cephalins. -
J. Biol. Chem., 1955, v. 212, Nc 1, pp. 39 -48
267 В a r c z a S. Molecular Weight Determination by NMR Spectroscopy. - Orga-
nic Chemistry, 1963, v. 28, No. 7, pp 1914—1915.
268, В e i s s V Zur papicrchromatographischcn Auftrennung von Pflanzcnlipi-
den. - J. Chiomatogr., 1964, v. 13, No, 1, pp. 104-110.
269 Bergman L. 0., Sohnson A Einc neue Raffinations-Methode fur
Speiseole und Speisefette. Das Zenit Verfahren. - Fette, Scifen Anstr., 1964, N 3. S. 203-
206
270. Benko C. Emulgaton u poslasticarstvu sa posebnim osvrtom na izradu do-
da*ka za biskvitne proizvode. - Zito-chleb, 1982, v. 9. N 3-4, c. 3-9.
271 Bevan T., Malkin T, Tiplady I. The Structure and Properties
of Phosphatides. - I. chem. Soc., 1957, v. 30, No. 1, pp. 8b-89.
272. Braun P Les antioxygens dans les matieres grasses mccanisme d’action ct
roile physiologique eventuel. - Res. Franc. Coips. Gras., 1957, No. 4, pp. 207-210.
273, Brockcrhoff H., В allo » С. E. The structure of the phosphoion-
sitide complex of Beek Brain - J. Biol. Chem., 1961, v. 236, No. 7, p. 1907.
2’4. В г о с к e r h о f f H., Ball о w С. E. Phosphate Incorporation in Brain
Phospholipids. - J. Biol. Chem., 1962, v. 237, No. 1. pp. 49-52
275 Budzikiewicz H.. Djerassi C.. Williams D. H. Mass Spec-
trometry of Organic Compounds. - San Francisko Holden-Day, 1967, pp. 330 -338
276. Bunton C. A., Lewelly n L R., О 1 dh a n K. G., Vernon C. A.
The reactions of organic phosphates. - J. Chem. Soc., 1958, pp. 3574-3594
277. В u r t о n H. S., McWeeny D. 1., Biltechiffe D. O. Sulphites
and aldose-amino reaction. - Chemistry &. Industry, 1962, Feb. 3, pp. 219-223.
278. Burton H. S., McWeeny DI, Role of phosphatides ih nunenzimatic
browning. - Nature, 1963, March 16, v. 197. No. 4872, pp. 1086-1087.
279. Collins F. D. A complex phospholipid from sheep brain, - Biochcm. I.,
1959, v 72, No. 3, pp. 532-537.
280. Courtade S., Marinetti G. V., StotzE. The structure and
abundance of rat tissue cardiolipids - Biochem, Biophys. Acta, 1967, v. 137, No. 1,
pp. 121-134.
281. Cowan G. C., Cooney M. P., Evans C. D., Schwab A. W
Influence of heat on Oxidative Stability and on effectiveness of metal-inactivating agents
in vegetable oils. - J. Amer. Oil Chem. Soc.. 1958, v. 35, No. 4, pp. 152-156.
282. Dawsun R. MC. The identification of Two Lipid Components in Liver
wich enable Penicillium notatum Extracts to hydiolise Lecithin. - Biochcm. J., 1958, v. 68,
No 4, pp 353-358.
283. Dawson R. M. C., F r e i n к e 1 N. The Distribution of Free mesoino-
sitol in mammalian tissues including some observations on the lactating rat. - Biochem.
I., 1961, v 78, No. 3, pp. 606-610.
284. Dawson R. M. C. Lipid Chromatographic Analysis. - Dekker Inc. New
York, 1967, v. 1, pp. 163-189
285. Defrosount C., Douard F. Du raffinade des huiles et graisser sur
miscella — Rev. Franc. Corps. Gras., 1967, No. 10, pp. 581-587.
286 Dcsnuclle P. Structure and properties ot phospharides. Progress in the
chemistry of fats and other lipids. - London, 1952, pp. 70- 103.
287. D u b о 1 s M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P, A.,
Smith P A Colorimetric Method foi Determination of Sugars and Related Substances. -
Anal. Chem., 1956, v. 28. No. 3, pp. 350-356.
250
288. Dyer J. R. Applications of Absorption Spectroscopy of Organic Compo-
unds. - Prentice-Hall, Inc. Englewood Clift'ts. N.Y., 1965. - 244 p
289. Elworthy P. H The structure of Lecithin Micelles in Benzene Solution. -
J. Chem. Soc., 1959, No. 6, pp. 1951-1957.
290. Elworthy P. H., McIntosh D. S The Interaction of water with Le-
citin Micelles in Benzene. — H. Phys. Chem., 1964, v. 68, No. 12, pp, 344 8—345 2.
291. Evans CD., List G. R.. Black L. T. Char-Ashing of Glyceride Oils
Preliminary to lhe Atomic Absorption Determination of rheir coppei and iron contents. -
J. Amer. Oil Chem Soc., J971,v 48, No. 12, pp. 84u-842
292. Faure M., Morelec--Coulon M. J. Chimie biologique - Isolement
d’um acide glycercwnostio-phosphatidique contenu le germe de ble. - Compt. Rent. Acad.,
1953,1. 236, pp. 1104-llCo.
293. F 1 i d e r F. J., Orthoefer F. T. Metals in soybean oil. - J. Amer. Oil
Chem. Soc., 1981, v. 58, No. 3, pp. 270 -272.
294. F о 1 c h L, Lees M Stanley G. H. S. A simple method for the isola-
tion and purification of total lipids from animal tissues. - J. Biol. Chem., 1957 v. 226,
pp. 497-509.
295. Glick D. Concerning the reineckate method for the determmation of cho-
line. - J Biol. Chem., 1944, v.ys6, pp 643 -651.
296. Goldfine H., Panas C. Phospholipids of Clostridium butyncum.
IV. Analysis of the postional isomeis of monounsaturated and cyclopropane fatty acids
and alk-Г- enyl ethers by capillary column chromatography. - J. Lipid Res., 1971, v 12,
No. 2, pp. 214-220.
297. G о 1 d о n L. lendrasiak. Halide interaction with phospholipids, Proton Mag-
netic Resonance Studies. — Chem Phys. Lipids, 1972, v. 9, pp 133- 146
298. Guillaumin R, Drouin M. Calcium and magnesium in vegetable
oils and animal fats: Effect of refining. - Rev. Franc. Corps. Gras., 1966, v. 13, N 33,
pp. 185-193.
249. Guillaumin R„ Drouhin N. Dosage de calcium et du magnesium
dans les matieres grasses vegetales et animals par absorption atomique. — Rev. Franc. Corps.
Grass,, 1965, v. 12, N 12, pp 735-742.
300. Hack M. H.. F e r r a n s V. J. Papierch roman igraphische Analyse von
Plasm alogenen. - Z. Physiol. Chem.. 1959. Bd. 315. N 2, S 157-162.
301. Hakomorie S,, Ishimoda T., Kawauchi M., Nakamu-
ra K. On the ptiysically homogenoux metal-bound Lipid Complex of Ox Brain. - J Bio-
chemistry, 1963, v, 54, Ni- 5, p. 458
302. Hanahan D., Wercamer R. Chromatographic separation of acetone
soluble lipid. - J. Amer. Oil Chem. Soc., 1954, v 76, pp. 1804-1810.
303. Hanahan D, J., О 1 1 e у LN. Chemical nature of monophosphoinosi-
tides. - J Biol. Chem., 1958, v. 231, No, 2 pp. 813-828.
3u4. Hendrickson H S., Fullington LG. Stabilities metal complex
of phospholipids; Са (II), Mg (II), Ni (II) complexes of plosphatidylserin- and fyiphospho-
inositide. - Biochemistry, 1965, v. 4, No. 8, pp. 1599-1605
305. H о w a t I. R. A new emulsifier for chocolate. - Rev. intern, chololat, 1-70,
v. 25, No. 2, pp. 58-60.
306. Hudson E. D. Miscella refining. - Oil mill Gazctecr, 1957, an 61, N 7,
s. 30-31.
307. Ivanov St. A., Petrov As., Popov E„ Iljitscheva A. Untcr-
suchungen uber den Oxydationsgrad bei dcr S-mnenhlumenolgewinnung und Raffination
nach der in Bulgarien iibblichen technologischen Verfahren. - Nahrung, 1971, Bd. 15, Hf. 3.
s. 289-294
308 Jakubowski A. Sur 1'hudratation des phospholipides du Soja. — Oleogi-
neux, 1962. v. 17. No. 3, pp. 201 - 205.
309. Jakubowski A. La hidratazione dei fosfolipid di soja. - La Riv Ital
Sost. Gras., 1962, an 39, N. 10, s. 512-516
310 J a m c s K., Sikes G. K. An Evaluation of Continuous degumming of
Cottonseed oil. — J. Amer. Oil ('hem. Soc., 1958, v. 35, No 9, pp. 445 -448
311 Janson JP.M., Kunst M., Rip A., Bordenijk P. Aggregate
251
size and dielectric behaviour of phosphatidylcholine in non-polai solvents. - Chem. Phys.
Lipids, 1972, v. 9, No. 1, pp 147-157.
312. J e w e 1 1 N. E., N a w a r W. W. Thermal oxidation of phospholipids in
l,2-dipaImitoy]-Sn-glycerol-3-phosphoethanolamine. - J. Amer. Oil Chem. Soc., 198u,
v. 57, No.12. pp. 398-402.
313. Jukes T. H. The electrometric titration of lecitin and cephalin. - J. Biol.
Chem., 1934, v. 107, No. 2-3, pp. 783-787
314. Kates M., S a s t г у P. S. Methods in Enzymology. - Academic Press,
New York, 1969, v. 14, pp. 197-203.
315. Kates M. Lipid Metabolism. - Ed. Bloch К - New York - London, 19^9. -
411 p.
316. Kaufmann H. P Neuzeltliche Technologie det Fette und Fettproducte.
XX. Die Lagerung dcr Bohstoffe. - Fette, Seifen Anstr , 1955, Hf. 12, S. 1040-1046
317 К au fm an n HP Neuzeltlich Technologie det Fette und Fettproducte.
ХХХШ. Die Trocknung aer Bohstoffe. - Fette, Seifen. Anstr., 1957. Hf. 1, Bd. 1, S. 47-52.
318. К a u f m a n n H. P., Wessels H.. Bondopadhyaya C. Dunn-
sicht-Chroinatographie aud dem Fettgebiet XI Die Analyse dcr Lecithine und der hydro-
lytischen Spaltprodukte der Phosphatide. - Fette, Seifcn Anstr., 1963, Bd. 64. Hf. 7,
S. 543- 544.
319. К 1 a n V Lecitin a vyznam einulgatoru vseobecnc. - Mlynskopekarensky
Prumysl, 1966. N 4. c. 175-177.
320. Klein R A. Mass spectrometry cf the phosphatidylcholines dipalmitoyl,
dioleoyl and stearoyloleoyl glycerylphosphorylclioiines, - J. Lipid Res., 1971 v. 12, No. 1-2,
pp 123-131.
321 KIcnk E., Debush H. Zur Kenntnis dcr Acctalphosphatide. - Hoppe -
Seylcrs Zeitschrift fur physiologische Chemie, 1964, Bd, 296. Hf. 3-4. S. 179-188.
322. L a c h a m p M., Naudct M. Sur la decoloration des huiles par les agents
physiques d'adsorpticn. IV Influence des phosphatides. - Ver. Franc. Corps. Gras., 1963.
v. 10, N 6, pp. 341-346.
323. Lea С. H. Some aspects of the autooxidation of edible fats and food lipids. -
Chemistry & Industry. London, 1966, v. 1, No. J, pp. 35-36.
324. L e a C. H„ Rhodes D. N. The ninhydrin reaction of unhydrolascd phos-
pholipids. - Biochim Biophys. Acta 1955, v. 17, pp- 416-423.
325. Lea С. H, Deteriorative reactions involving phospholipidsand lipoproteins. -
J. Sci. Food & Agric., 1957, v. 8, No 1, pp, 1-13.
326. L e с о с о ' J., Ballou С. E. On the stiucture of cardiolipin. - Biochemi-
stry, 1964, v 3, No. 7, pp. 976-980.
327. Lejac M., Nicwiadomski H Composition of lipids in the rapeseed
oil hydration sludges. - Acta Alimentana Polonica, 1975, v. 1, No I, pp. 63-70.
328 Lepage M Isolation and characterization of an cstcrificd lorm of steryl
glucoside. - J Lipid Res., 1964, v. 5, No. 5, pp. 587-592.
329. Levine C., Chargaff I.. Procedures foi the microcstimation of nitro-
genous phosphatide constituents. - J Biol Chem., 1951, v. 192, No. 2, pp. 465-479
330, Lew Y. T., Tappcl A. C, Antioxidant and Synergist inhibitin of meta-
iin-cataiyzed oxidative fat rencidity. - Food Technology, 1956, v. 10, No. 6, pp. 285-289.
331. L c z a j i c J., M c z c i J., D о r d c v i c N. Uticaj fosfatidc na proccs
rafinaeije ulja. - Biltcn Bilja i Masri, 1973, N 1, s. 3-5.
332. L i n о w F., Mieth G. Zur fettstabilisiercndcn Wirkung von Phosphatidcn.
I. Mitt. Verhalten ausgcnahetci Phosphatide gegenuber Saucrstoff. - Nahrung. 1975. Bd. 19,
Hf. 7,S. 569-576.
333. L i n о w F., Pohl I. Zum Umsatz von a, a, -Diphcnyl-0-picryl-hydrazyl
mit olefinischen Felten. 2. Mitt. Modcllvcrsuche zui Bcstimmung dcr Vcidcrbsbcrcitschaft
von olefinischen Fetrsubstatcn. I mahrungsforschung, 1970, Bd. 15, Hf 4, S. 381-392.
334. L i n о w F., Mieth G. Zur fettstabilisiercndcn Wirkung von Phosphati-
den 3 Mitt. Synergistisehc Wirkung ausgcwahltci Phosphatide. - Nahrung, 1976, Bd. 20,
Hf. l.S. 19-24.
335. List G. R . Mounts T. L., Warner К,, H с a к i n A. J. Steam-
refined Soybean Oil; Effect of Refining and Degumming Methods on Oil Quality. - J. Amer.
Oil Chem. Soc., 1978, v. 55, No. 2, pp, 277-279
252
336. List G. R„ M unts I. L., Ha akin A J. Steam-refined Soybean
Oil: Effect of Degumming Methods on Removal of Prooxidanrs and Phospholipids. - J. Amer.
Oil Chem. Soc., 1978, v. 55, No. 2, pp. 280-284.
337. L r> n g C„ Penny I. Г. The Structure ot the Naturally Occurring Phospho-
glycerides. - Biochem. J., 1957, v. 65, No 2, pp. 382-389.
338. M a 1 i n s D S-, Mangold H, K. Analysis of Complex Lipid Mixtures
by Thin-Layer Chromatography and complementary Methods. - J. Amer. Oil Chem. Soc..
I960, v. 37, No. 11. pp. 576 -578
339. M a r i n e i t i G. V., Er bl an о I L, Kochen I. Qu amative chroma-
tography of phosphatides. _ Federation Proceedings, 1967, v. 16, No. 3, pp 837-844
340. Metcalfe J. C. JC-NMR studies of lipids on bylayers and membranes. -
Chem. Phys. Lipids, 1972,v. 8, No. 4, pp. 333—340.
341 Mieth G.. Linow F. Zur fettstabilisierenden Wirkung von Phosphati-
den. 2. Mitt. Antioxydative Wirkung ausgewehter Phosphatide. — Nahrung, 1975, Bd. 19,
Hf. 7, S. 577-581
34?. M i n i f i e B. W. Lecithin, recent development in the preparation and app-
lication of phospholipids with special reference to G.N. - Manufactur. Confectioner, 1969,
v. 45. N5. pp. 51- 57.
343. Nelson G. I. The Phospholipids and Phospnolipids fatty acid composition
of human serum lipoprotein fraction. - J. Bio'. Chem,, 1960. v. 235. No 3, pp 578-580.
344. Nichols B. W. New Biochemical Separation Van Nostrand. Princeton,
New Yoik, 1964, p. 321,
345. Nielsen K. Studies on the Non-Hydratable Soybean Phosphatides. - Copen-
hagen-London, 1956. - 258 p.
346. Nielsen K. The composition of the difficulty extractable phosphatides. -
J. Amer. Oil Chem. Soc., I960, v. 37, No. 1, pp. 217-221.
347. Nieuwenhuyzen W. The industrial uses of special lecithins. - J. Amer
Oil Chem. Soc., 1981, v. 58, No, 10, pp. 886-888.
348. Olcott H. S., VanderVeen J. Role of individual phospholipids
as antioxidants. - J. FoodSci., 1963, v. 28, No. 3, pp. 313-315.
349. Osman F., A ch о u r A. E., G a d. A. M. Phospholipid Constitutuin
of Eguption Vegetable Oils. I. Safflower, Groundnut and Chufa Oils. - Fette, Seifen. Anstr.,
1969. Bd 71, N 1,S. 264-270-
350. Palit S. R, V enkatesw a rly V. Solubilization of water in non-polai
solvents by cationic detergents. - Proc. Rov. Soc., 1951, v. A 208, pp. 542-551.
35L P e i n e 1 G. Quantum-chemical and empirical calculations on phospholipids. -
J. Chem. Phys. Lipids., 1975, v. 14. No. 4, pp. 268-273.
352. Perkins E. G., Johnston P. V. Pyrolysis - Gas Chromatography of
Phosphoglycerides: A mass spectral study of the products. - Lipids, 1969, v. 4, Nc 4,
pp. 301 -303
353. Perry F. Development of Lecithin Usage over the Years. - Confect. Pro-
duct,. 1968, v. 34. No. 2, pp. 92-93,131.
354, Persmark U. Main Constituents of Rapeseed Lectithin. - J. Amer. Oil
Chem. Soc., 1968. v. 45, No 11, pp. 742- 743.
355, Persmark U„ Toregard B. Metal Analyses of Edible Fats and Oils
by Atomic Absorption spectrophotometry. - J. Amer. Oil Chem Soc., 1971, v. 48, No. 11,
pp, 650-652.
356. P о p a v A., M i z e v J. Observations sur i'acide citnque comme anti - oxygene
de 1’huile de toumesoL - Rev. Franc. Corps. Gras., 1967, N. 7, pp. 445-447
357. P r e s s K., Sheeley R. M., Hurst W. J., Martin R A. ACompa-
rtson of High-Performance Liquid Chromatography and Proton Nuclear Magnetic Resonance
in Deteimining the Phospnatidylcholine Content in Soy Lecithin. - J. Agric. Food Chem.,
1981, v 29, pp. 1096-1098.
358. P r e v о t A. Methodes recentes de dosage des traces de metaux Incidents de
ces traces sui la stabilite des huiles. - Rev. Franc. Corps. Gras.. 1971, N 11, pp 655- 668
359. P r i v e t t 0. S., Nutter L. J. Determination of the Structure Lecithins
via the formation of Acetylated 1,2-DigIycerides. - Lipids, 1967, v. 2, No. 1-2, pp. 149-
156.
253
360. Р г о t t е у С., В а 11 о w С. Е. Diacyl myoinositol monomannoside from
propionibacteium shermani. - J. Biol. Chem., 1968, v. 243, No. 23, pp. 6196-6201.
361. R а о К. S., Wenger D. A., P e i r i n g e r R. A. The Metabolism of
Clyceride Glycolipids. - J. Biol. Chem., 1970, v, 245. No. 10, pp. 2550-2554.
362. Recent progress achieved in soybean oil processing/M. R. Guillaumin. -
Rev. Franc. Corps. Gras., 1964, N 12, pp. 655-665.
363. Renkonen O. Determination of glycerol in phosphatides. - Biochim. Bio-
phys. Acta, 1961, v. 56, pp. 367-369.
364. Renkonen O, A note on spectrophotometric determination of acyl ester
groups in lipids. - Biochim. Biophys. Acta, 1961, v. 54, pp. 361-362.
365. Robbelen G. Analitatsbestimmende Eigenschaften bei der Verarbeitung
von Rapssaat. - Fette. Seifen. Anstr., 1978, Hf. 80, Bd. 3, S. 99-103.
366. Rose U. G. Studies on the molecular structure of rat liver cardiolipin. -
Biochem. Biophys. Acta, 1964, v. 84, No. 2, pp. 109-127.
367. Resenberg H. The detection of phosphates on chromatograms. - J. Chro-
matogr., 1959, v. 2, No. 5, pp. 487-489.
368. Resenthal A. F., Ching-Hsien HanC. Phosphorous determi-
nation of phosphoglycerides from thin-layer chromatograms. - J. Lipid Res., 1969, v. 10,
No. 2, pp. 243-245.
369. Rouser G., Calli C., Lieber E., Blank M. L., Privett O.S.
Analytical Fractionation of Complex Lipid Mixtures. DEAE Cellulose Column Chromato-
graphy combined with quantitative Thin-Layer Chromatography. - J. Amer. Oil Chem.
Soc., 1964, v. 41, No. 12, pp. 836-840
370. R о u s e г G., Marinetti G. V., Witter R. F., Berry J. F.,
S t о t z E. Paper chromatography of phospholipids. - J. Biol. Chem., 1956, v. 223, No. 1,
pp. 485-497.
371. Rouser G., Siakotos An. N., F 1 e i s c h e r S. Analytical Fracti-
onation of Complex Lipid Mixtures. - Lipids, 1966, v. 1, No. 1, pp. 85-96.
372. Rouser G., Kritchevsky G., Yamamoto A. Lipid Chroma-
tographic Analysis. - Dekker, Inc., New York, 1967, v, 1, pp. 99-162.
373. R у d h a g L. The importance of the phase behavior of phospholipids for emul-
sion stability. - Fette, Seifen Anstr., 1979, No. 4, S. 87-96.
374. R u d h a g L., Wilton 1. The function of phospholipids of soybean lecithin
emulsions. - J. Amer. Oil.Chem. Soc., 1981, v. 58, No. 8, pp. 830-837.
375. Ryhage R., Stenhggcn E, Mass spectrometry in lipid research. -
J. Lipid Res., 1960, v. 1, No. 5, pp. 361-390.
376. S c h i n о d a K., Nakagawa L, Jamamushi B.. Iscmura I.
Colloidal surfactants. - New Yotk-London, 1963, pp. 72-81.
377. S c h о 1 f i e 1 d C. R., Dutton M. L, D i m 1 e r R. I. Carbonhydratc
constituents of soybean ’’Lecithin”. - J. Amer, Oil Chem. Soc., 1952, v. 30, No. 7,
pp. 293-298.
378. S c h о I f i с I d C. R„ Sutton M. I. Sources of color in soybean ’’Le-
cithin". - J. Amer. Oil Chem. Soc., 1954, v. 31, No. 6, pp. 258-261.
379, Scott A. J. The Interpretation of Ultraviolet Spectra of Natural Products. -
Pcrgamon Press, Oxford, 1963. - 215 p.
380. Shan D. O., S c h u z m a n I. H. Binding of metal ions to monolayers of
lecitins, plasmologen, cardiolipin and diacetylphosphatc. - J. Lipid Res., 1965, v. 6,
pp. 344-348.
381. Shapiro D. Lipid metabolism. - Ann. Rev. Biochem., 1967, v. 36, No. 1,
pp. 247-270.
382. Skidmore W. D., Entcnman C. Two-dimensional thin-layer chro-
matography of rat liver phosphatides. - J. Lipid Res., 1962, v. 3, No. 4, pp. 471-475.
383. Stein J., Shapiro B. The synthesis of neutral glycerides by fractions
of rat liver homogenates. - Biochem. Biophys. Acta, 1972 No. 24, pp. 286.
384. Sullivan F. E. Sunflower Oil Processing from Grade to Salad Oil. - J. Amer
Oil Chem. Soc., 1980, v. 57, No. 7, pp. 845-847 A.
385. Urakami C., Karp ejama H. Antioxygcnic activity of lecithin and
its hydrolysis products. III. Lecithin, glycerophosphorylcholinc and glycerol. - Bull. Chem.
Soc. Japan, 1960, v. 33, No. 1, pp. 29-33.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие............................................................ 3
Введение..................................'............................ 5
1. Химическое определение, классификация и общая характеристика фосфо-
липидов ............................................................... 6
1.1. Химическое определение и современная классификация............. 7
1.2. Общая характеристика.......................................... 13
2. Роль фосфолипидов в растительной клетке........................... 15
2.1. Биосинтез фосфолипидов........................................ 17
2.2. Биосинтез триацилглицеринов................................... 20
2.3. Ферменты в превращениях фосфолипидов.......................... 21
2.3.1. Фосфолипазы - гидролазы эфиров карбоновых кислот........... 22
2.3.2. Фосфолипазы - гидролазы фосфодиэфиров ..................... 23
3. Лабораторные методы извлечения и выделения фосфолипидов........... 25
3.1. Методы извлечения фосфолипидов из масличных семян............. 25
3.2. Методы препаративного выделения фосфолипидов из масел ........ 31
3.2.1. Диализ..................................................... 31
3.2.2 Разделение фосфолипидов по растворимости.................... 33
3.2.3. Разделение фосфолипидов противоточным распределением.... 35
3.2.4. Гидратация фосфолипидов из масел......................... 36
3.2.5. Хроматографические методы.................................. 36
3.2.5.1. Колоночная хроматография............................... 36
3.2.5.2. Бумажная хроматография................................. 41
З.2.5.2.1. Разделение фосфолипидов............................. 41
3.2.5.2.2. Обнаг 'Жение и идентификация фосфолипидов на бумажных
хроматограммах................................................. 44
3.2.5.2.3. Количественное определение фосфолипидов с бумажных хро-
матограмм ..................................................... 46
3.2.5.2.4. Разделение лизопроизводных фосфолипидов............. 47
3.2-5.2.5. Разделение продуктов гидролиза фосфолипидов ........ 47
3.2.5.2.6. Разделение углеводов, выделенных из фосфолипидов.....51
3.2.5.3. Тонкослойная хроматография.............................. Л
3.2.5.3.1. Разделение фосфолипидов на группы .................. 54
3.2.5.3.2. Разделение неомыляемых липидов, выделенных из фосфо-
липидов 58
3.2.5.3.3. Разделение углеводов, выделенных из фосфолипидов, на от-
дельные группы................................................. 58
3.2.5.3.4. Количественный анализ фосфолипидов с ТСХ............ 59
3.2.5.3.5. Препаративная хроматография на пластинках в слоях сили-
кагеля 60
3.2.5.3.6. Двумерная хроматография на пластинках с комбинирован-
ным слоем силикагеля .......................................... 61
4. Методы исследования фосфолипидов................................. 62
4.1. Химический анализ............................................. 62
4.1.1. Определение жирнокислотного состава........................ 62
4.1.2. Определение фосфора........................................ 63
4.1.3. Определение суммарного и аминного азота.................... 63
4.1.4. Определение серина и этаноламина........................... 64
4.1.5. Определение холина......................................... 67
4.1.6. Определение глицерина...................................... 68
4.1.7. Определение инозитола.................................... 69
4.1.8. Определение сложноэфирных групп . ......................... 70
4.1.9. Определение углеводов...................................... 7)
4.1.10. Определение неомыляемых липидов........................... 72
255
prop
Clyd
Rev
phy
groi
von
Biod
mat
nati
No.
Ana'
grap
Soc.
S t j
PP-1
onat
togr
sion
emu
J. L
Coll
coni
pp-1
cith
Perg
lecit
PP-
pp.
mat
of r
Oil»
its 1
Soc,
4.1.11. Определение содержания металлов ......................... 73
4.2. Методы определения химической структуры...................... 76
4.2.1. Мягкое щелочное деацилирование............................ 76
4.2.2. Жесткий кислотный гидролиз................................ 77
4.2.3. Ферментативный гидролиз................................... 77
4.3. Спектральные методы анализа.................................. 83
4.3.1. УФ-спектроскопия.......................................... 83
4.3.2. ИК-спекгроскопия.......................................... 84
4.3.3. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса............... 86
4.3.4. Масс-спектроскопия........................................ 88
5. Состав и структура фосфолипидов растительных масел .............. 96
5.1. Гидратируемые фосфолипиды, их состав и структура............. 99
5.2. Негидратируемые фосфолипиды, их состав и особенности структуры . . 11 о
6. Физические свойства........................................... 125
6.1. Поверхностно-активные свойства.............................. 125
6.2. Полярность, поляризуемость и дипольные моменты.............. 128
6.3. Электрическая проводимость фосфолипидов в неполярных раствори-
телях ........................................................... 132
6.4. Образование ассоциатов и мицелл фосфолипидов в неполярных раст-
ворителях ....................................................... 133
1. Химические свойства................................... 151
7.1. Взаимодействие с белками.................................... 151
7.2. Взаимодействие с металлами................................ 154
7.3. Взаимодействие с неомыляемыми липидами...................... 159
7.4. Взаимодействие с углеводами................................. 161
7.5. Взаимодействие с кислородом................................ 165
7.6. Взаимодействие с госсиполом................................. 172
7.7. Взаимодействие со щелочами и кислотами ..................... 174
8. Влияние условий послеуборочной обработки, хранения и переработки мас-
личных семян на состав и свойства фосфолипидов ..................... 176
8.1. Состояние фосфолипидов в семенах и влияние внешних факторов на
их состав и свойства............................................. 177
8.1.1. Гидратируемость фосфолипидов, различающихся прочностью связей
с гелевой частью семян.......................................... 177
8.1.2. Формирование свойств фосфолипидов в процессе подготовки семян
к извлечению масла.............................................. 179
8.2. Влияние отдельных стадий переработки масличных семян на состав и
свойства извлекаемых фосфолипидов................................ 186
9. Влияние фосфолипидов на технологические свойства растительных масел 192
9.1. Влияние фосфолипидов на отдельные процессы рафинации раститель-
ных масел........................................................ 193
9.2. Влияние фосфолипидов на гидрогенизацию растительных масел и от-
деление катализатора от гидрированных жиров...................... 201
10. Способы выведения фосфолипидов из растительных масел............ 207
10.1. Выведение гидратируемых фосфолипидов из масел.............. 207
10.2. Выведение негидратируемых фосфолипидов из масел ........... 210
10.3. Особенности выведения фосфолипидов из мисцелл растительных
масел............................................................ 213
10.4. Теоретические основы выведения фосфолипидов ............... 215
11. Промышленные способы гидратации растительных масел и применение
фосфатидных концентратов в народном хозяйстве....................... 227
11.1. Промышленные способы и схемы получения гидратированных масел 227
и фосфатидных концентратов....................................... 234
11.2. Применение фосфатидных концентратов в народном хозяйстве.. 234
Список использованной литературы................................. 238