Автор: Мосичев М.С. Складнев А.А. Котов В.Б.
Теги: микробиологические производства пищевое производство химия биология микробиология
Год: 1982
Текст
М.С. Мосичев
А.А.Скпаднев
В. Б. Котов
ОБЩАЯ
ТЕХНОЛОГИЯ
МИКРО-
БИОЛОГИЧЕСКИХ
ПРОИЗВОДСТВ
ББК 36.87
М81
УДК 663.1 (075.8)
Мосичев М. С., Складнев А. А., Котов В. Б.
М 83 Общая технология микробиологических произ-
водств.— М.: Легкая и пищевая пром-сть. 1982. —
264 с.
Дана общая характеристика процессов микробиологических произ-
водств. Описана технология получения продуктов микробиологического
синтеза: органических кислот, аминокислот, ферментных препаратов, кор-
мовых дрожжей, антибиотиков, витаминов и бактериальных препаратов.
Рассмотрены контроль производства и очистка сточных вод.
Для студентов вузов, готовящих специалистов для пищевой и микро-
биологической промышленности.
М
2910000000- 083
044(01)—82
ББК 36.87
6П8.5
Рецензенты: кафедра микробиологии МГУ (проф. Н. С.ЕГО-
РОВ н проф. Л. И. ВОРОБЬЕВА) н проф. С. А. КОНОВАЛОВ
(ВНИИ биотехника)
© Издательство «Легкая н пищевая
промышленность», 1982 г.
ВВЕДЕНИЕ
^Микробиологическая промышленность — одна из новых и
быстро развивающихся отраслей народного хозяйстваЗОснов-
ная задача микробиологической промышленности — ооестгЕЧить"
народное хозяйство кормовыми белками, ферментами, антибио-
тиками, витаминами, аминокислотами, бактериальными удоб-
рениями, средствами защиты растений и т. д. В одиннадцатой
пятилетке намечено осуществить мероприятия по ускоренному
развитию производства продукции микробиологического син-
теза, обеспечив ее рост в 1,8—1,9 раза.]
Промышленное производство"продуктов на основе микро-
биологического синтеза имеет ряд преимуществ. Микроорга-
низмы в сотии раз продуктивнее животных и растений. На-
пример, дрожжи, микроскопические грибы, бактерии имеют
скорость роста почти в 500 раз большую, чем сельскохозяйст-
венные культуры, и в 1000 раз большую, чем крупный рогатый
скот. Так, за 1 ч выращивания в 1 м3 питательной среды
можно собрать около 3 кг кормовых дрожжей в пересчете на
сухое вещество. Это означает, что с 1 м3 аппаратуры за одни
сутки можно получить около 30 кг белков. Для получения та-
кого количества растительного белка из гороха потребовалось
бы 18 га посевов этой культуры, а для получения в сутки та-
кого количества животного белка необходимо содержать 100
коров.
Микробиологическим синтезом получают продукты, произ-
водство которых химическим путем либо невозможно, либо
сложно и дорого. Например, при микробиологическом произ-
водстве ферментов, антибиотиков, витаминов все процессы про-
текают достаточно быстро при сравнительно низких темпера-
турах (20—60 °C) без использования высокого давления и
глубокого вакуума. При этом значительно упрощается техноло-
гия производства, уменьшаются капиталовложения и эксплу-
атационные расходы.
Исходным материалом микробиологического синтеза может
быть доступное и дешевое сырье. Например, для производства
гидролизных дрожжей, а также продуктов, образующихся в ре-
зультате комплексной переработки сырья (фурфурол и его
1* з
производные, гидролизный спирт и т. д.), служат отходы лес-
ной и деревообрабатывающей промышленности.
\рт применения продуктов микробиологического синтеза
в народном хозяйстве получают большой экономический эф-
фект. Включение в кормовые рационы аминокислот, фермен-
тов, витаминов и других продуктов метаболизма способствует
значительному увеличению привеса сельскохозяйственных жи-
вотных и птиц, сокращению расхода корма на единицу про-
дукции, ускорению откорма, снижению затрат труда.| Микро-
биологические средства защиты растений позволяют" уберечь
урожай от вредителей, от различных заболеваний и дополни-
тельно получить тысячи тонн сельскохозяйственных продуктов.
Практическое использование биохимической деятельности мик-
роорганизмов имеет многолетнюю историю. Такие традицион-
ные производства, как хлебопечение, пивоварение, виноделие,
приготовление уксуса и разнообразных молочных продуктов,
основаны иа процессах бактериального брожения. В качестве
других примеров крупных производств, основанных на процес-
сах микробного брожения, следует отметить получение спирта
из углеводов, а также производство ацетона и бутанола. Для
промышленного производства индивидуальных метаболитов
микроорганизмы применяются недавно — всего несколько де-
сятилетий. Уже в наше время было создано производство ан-
тибиотиков, витаминов, аминокислот, ферментов, бактериаль-
ных препаратов для защиты растений от вредителей и т. д.
(развитию микробиологической промышленности способст-
вовало создание в 1966 г. Главного управления микробиологи-
ческой промышленности при Совете Министров СССР._Впер-
вые была организована промышленность, построенная на иных
основах, чем бродильная — на основах синтеза специфических
молекул микроорганизмами. Следует отметить, что отдельные
соединения могут быть получены как микробиологическим, так
и органическим синтезом. В этой конкуренции более эффек-
тивным оказался микробиологический синтез. Поэтому в те-
чение многих лет достаточно сложные молекулы ферментов,
антибиотиков, витаминов получают при помощи микроорга-
низмов.!
ТеЯйология микробиологических производств — наука о про-
цессах и методах переработки различных видов сырья в ко-
нечные продукты с помощью микроорганизмов. Основой тех-
нологии являются два процесса: культивирование микроорга-
низмов на питательных средах с целью получения микробной
массы или метаболитов, а также физико-химические методы
выделения и очистки целевых продуктов для получения стан-
дартных препаратов.
Научные основы переработки сельскохозяйственного сырья
в белковые корма были заложены в годы первых пятилеток.
Основной сырьевой базой для производства кормовых дрож-
4
жей являлись барда гидролизных и сульфитно-спиртовых за-
водов, щелоки целлюлозно-бумажных комбинатов, гидроли-
заты древесины и растительных сельскохозяйственных отходов.
На первых этапах развития гидролизной промышленности
было налажено производство этилового спирта. Когда была
доказана эффективность скармливания дрожжей различным
видам животных и птиц, потребность в этом продукте значи-
тельно возросла, так как дрожжи — наиболее ценный источник
протеина. Это заставило ученых искать новые виды сырья для
производства кормовых дрожжей. Было рекомендовано исполь-
зовать гидролизаты слаборазложившегося торфа, отходы кап-
ролактамового производства, содержащие моио- и дикарбоно-
вые кислоты, спирты и другие соединения.
[В Советском Союзе успешно решена сложная проблема
икробиологического синтеза белково-витамииных концентра-
тов (БВК) из жидких очищенных парафинов. Это позволило
начать строительство заводов по производству БВК большой
единичной мощности. Большая заслуга в этом принадлежит
Н. Д. Иерусалимскому, Г. К. Скрябину, А. Д. Гололобову,
Н. Б. Градовой, М. Н. Мейселю, А. А. Покровскому и др., ру-
ководившим разработкой научных основ и технологии получе-
ния и применения белковых веществ из углеводородов нефти.
За решение этой проблемы в 1971 г. этим ученым была при-
суждена Государственная премия CCCPJ
В настоящее время большую часть вырабатываемых про-
мышленностью кормовых дрожжей составляют дрожжи, полу-
чаемые на средах с углеводородами. Всесоюзным научно-ис-
следовательским институтом биосинтеза белковых веществ
(ВНИИсинтезбелок) разрабатывается технология получения
белковых веществ на основе микробиологической переработки
природного газа, синтетического метилового и этилового спир-
тов, смеси кислот и т. д.
Большие заслуги в развитии микробиологической промыш-
ленности, несомненно, принадлежат современной генетике.
В природе пока ие удалось обнаружить микроорганизмы, спо-
собные к биосинтезу аминокислот в больших количествах.
Только в результате селекционно-генетических исследований
были созданы высокопродуктивные бактериальные штаммы —
продуценты аминокислот, а иа их основе — промышленное про-
изводство. Большая работа в этом направлении проведена Все-
союзным иаучно-исследовательским институтом генетики и се-
лекции промышленных микроорганизмов (ВНИИгенетика),
а также лабораториями селекции многих отраслевых институ-
тов и институтов системы Академии наук СССР.
Основной удельный вес в промышленном производстве ами-
нокислот занимает А-лизин. Аминокислоту используют для
сбалансирования рационов сельскохозяйственных животных и
птиц, что позволяет снизить содержание растительных белков
5
в кормах. Активный продуцент лизииа Brevibacterium sp. 22
получен в Институте биохимии им. А. Баха АН СССР под ру-
ководством В. Н. Букина. Внедрению этого штамма в промыш-
ленность способствовали технологические разработки Инсти-
тута микробиологии им. А. Кирхенштейиа АН Латвийской
ССР.
В процессе культивирования продуцентов в среде накапли-
вается непосредственно А-аминокислота, при этом промышлен-
ное производство малостадийное и не требует сложной аппа-
ратуры.
Производство органических кислот — лимонной, молочной,
уксусной, итаконовой и глюкоиовой — относится к старейшим
микробиологическим процессам, которые основаны иа способ-
ности микроорганизмов к неполному окислению субстрата.
В нашей стране разработки по технологии производства орга-
нических кислот, в частности лимонной кислоты, были начаты
в 20—30-х годах под руководством В. С. Буткевича и С. П.
Костычева. Были выяснены физиолого-биохимические особен-
ности некоторых культур микроскопических грибов—активных
кислотообразователей, а также обоснованы выходы лимонной
кислоты в зависимости от количества сброжеииых сахаров. На
основе лабораторных исследований была разработана техно-
логия промышленного производства лимонной кислоты. В даль-
нейшем работа была направлена на замену сахара другими
источниками сырья в производстве лимонной кислоты. В на-
стоящее время на отечественных предприятиях лимонную кис-
лоту получают путем сбраживания сахаров мелассы.
В 20—30-х годах В. Н. Шапошников с сотр. изучали осо-
бенности питания молочнокислых бактерий и химизм образо-
вания молочной кислоты. На этой основе была разработана
первая технологическая схема производства молочной кислоты
и предложены методы получения концентрированных раство-
ров ее. Существующие в настоящее время технологические
схемы производства молочной кислоты мало отличаются от
схемы, предложенной В. Н. Шапошниковым.
Из органических кислот, получаемых микробиологическим
синтезом, большое внимание уделяется итаконовой кислоте,
которая в последнее время находит широкое применение в про-
изводстве нитронного волокна. Первые сообщения об образо-
вании итаконовой кислоты микроскопическими грибами рода
Aspergillus (Asp. itaconicus, Asp. terreus) появились в 30-х го-
дах. Было иайдеио, что эти микроорганизмы способны синтези-
ровать итаконовую кислоту в значительных количествах при
росте иа средах, содержащих сахарозу или глюкозу.
Промышленное производство итаконовой кислоты из саха-
розы с помощью культуры Asp. terreus было разработано уче-
ными Института микробиологии им. А. Кирхенштейна АН Лат-
вийской ССР.
6
В условиях дальнейшей интенсификации сельского хозяй-
ства важной задачей является защита растений от вредителей,
болезней и сорняков. В СССР реализуется обширная программа
по производству и применению микробных патогенов для
борьбы с насекомыми — вредителями растений. Первые ра-
боты по выделению и изучению патогенных микроорганизмов
относятся к 40-м годам. В 1949 г. Е. В. Талалаев выделил вы-
сокоэффективный возбудитель септицемии гусениц сибирского
шелкопряда, который был назван Вас. dendrolimus. На основе
этой культуры была разработана технология получения эито-
мопатогеиного препарата — деидробациллииа. В 1956 г. во
Всесоюзном институте защиты растений (ВИЗР) была разра-
ботана технология производства первого отечественного бакте-
риального препарата энтобактерина на основе культуры Вас.
thuringiensis var. galleriae.
Работа с культурами Вас. thuringiensis ведется во многих
научных учреждениях страны. Исследуются условия образо-
вания и эффективность действия токсинов иа различные виды
насекомых. Для защиты растений используются не только
бактерии, но и другие микроорганизмы — грибы и вирусы.
В Украинском институте защиты растений (УкрИЗР) под
руководством проф. М. А. Телеиги получен на основе Beauveria
bassiana первый грибной препарат боверин. Он эффективен
в борьбе с вредителями полевых и садовых культур.
В комплексе биологических средств борьбы с вредными на-
секомыми особое место занимают вирусные препараты. Это
в настоящее время важно, так как примерно 300 видов насеко-
мых выработали устойчивость к инсектицидам. В настоящее
время известно свыше 400 вирусов насекомых и клещей, кото-
рые способны вызывать массовые эпидемии среди чрезмерно
разросшихся популяций насекомых.
В связи с охраной окружающей среды и заботой о здоровье
человека в СССР поставлена задача исключить примеиеиие
химических инсектицидов, когда борьбу с вредителями можно
вести с неменьшим эффектом другими методами.
Микробиологический синтез широко используется в произ-
водстве кормовых препаратов витаминов В2 и Bi2. Особое ме-
сто занимает цианкобаламин (витамин В]2). Он практически не
встречается в растительных и животных организмах и является
специфическим продуктом жизнедеятельности микроорганиз-
мов. Для животноводства кормовой концентрат витамина Bj2
получают путем метанового брожения, используя в качестве
субстрата барду ацетонобутиловых и спиртовых заводов, пере-
рабатывающих зерно и мелассу. Такой способ производства
кормового препарата витамина Bi2 исключает применение
сложных питательных сред, вредных химических веществ, до-
рогостоящей антикоррозийной аппаратурными существенно уп-
рощает технологию. г
7
Разработку промышленных методов получения кормового
препарата витамина Bi2 осуществили в Институте биохимии
нм. А. Н. Баха АН СССР В. Н. Букин, В. Я. Быховский,
Е. С. Панцхава и др.
Получение пенициллина положило начало промышленному
производству ие только медицинских, ио и кормовых препара-
тов антибиотиков. Микробиологическая промышленность СССР
вырабатывает специальные формы кормовых антибиотиков,
предназначенные только для скармливания животным и со-
вершенно ие используемые в медицине и ветеринарии (гризнн,
бацитрацин и др.). В растениеводстве антибиотики применя-
ются в качестве гербицидов, инсектицидов, стимуляторов роста.
Эти препараты не загрязняют окружающую среду.
В нашей стране первые работы по использованию препара-
тов антибиотиков для защиты растений относятся к 50-м годам.
Фитобактериомицин (ФБМ)—первый отечественный антибио-
тик, вырабатываемый специально для защиты растений от бо-
лезней. Выделение микроорганизма-продуцента (Act. lavendu-
lae), изучение его физиолого-биохимических свойств и биосин-
тез ФБМ осуществили сотрудники Всесоюзного научно-иссле-
довательского института антибиотиков (ВНИИА) В. А. Семе-
нова, Н. К- Соловьева и др. Технологическая схема производ-
ства препарата ФБМ была разработана сотрудниками Всесо-
юзного научно-исследовательского института бактериальных
препаратов (ВНИИбакпрепарат). С 1965 г. антибиотик реко-
мендован для использования в борьбе с бактериозами фасоли,
сои и другими заболеваниями растений. Проводимые в насто-
ящее время исследования направлены на совершенствование
уже разработанных препаратов и создание новых, более эф-
фективных.
В 30-х годах в нашей стране было начато систематическое
изучение ферментов микроскопических грибов и бактерий, ста-
вившее вполне определенную практическую задачу — примене-
ние ферментов микроорганизмов для усовершенствования мно-
гих технологических процессов в пищевой и легкой промыш-
ленности.
Промышленное производство ферментных препаратов
в СССР было начато в 1951—1952 гг. по инициативе Всесоюз-
ного иаучио-исследовательского института ферментной и спир-
товой промышленности (ВНИИФС) и Украинского научно-ис-
следовательского института пищевой промышленности (Укр-
НИИПП), впервые разработавших технологические схемы
культивирования микроскопических грибов, которые составили
основу для проектирования первых ферментных цехов.
Первые производственные установки для получения фер-
ментных препаратов при культивировании микроскопических
грибов рода Aspergillus в поверхностных условиях были соз-
даны под руководством Л. И. Чекана. Получаемые препараты
8
ферментов использовали для осветления соков. С 1942 г.
Р. В. Фениксова занимается разработкой технологии поверх-
ностного культивирования микроскопических грибов иа твер-
дых питательных средах. Полученный комплексный препарат
амилолитических ферментов применяли для осахаривания
крахмалсодержащего сырья при производстве спирта.
В УкрНИИПП под руководством Е. Я- Калашникова и
Д. Б. Лившиц была освоена технология получения ферментов
для обработки несоложеного сырья в пивоваренном произ-
водстве. В результате этих исследований в 1951 г. на Львов-
ском пивоваренном заводе был введен в действие специальный
цех по производству поверхностной культуры гриба Asp. oryzae.
В 60-х годах начинают действовать крупные цехи и пред-
приятия по производству ферментных препаратов. На Москов-
ском опытном заводе ферментных препаратов и Вышневолоц-
ком заводе ферментных препаратов на основе научных ис-
следований ВНИИФС (Р. В. Феииксова, К- А. Калуияиц,
С. П. Колосков, Л. И. Голгер и др.) была освоена технология
получения очищенных ферментов микробного происхождения.
В 1970 г. вводится в строй Вильнюсский опытно-промыш-
леииый завод ферментных препаратов, а в 1974 г. начинают
выдавать продукцию новые цехи Вышневолоцкого завода фер-
ментных препаратов, оснащенные механизированными установ-
ками, в комплекс которых входят камеры с вертикальными ка-
налами.
Большой вклад в разработку технологических схем произ-
водства ферментных препаратов поверхностным и глубинным
способом внесли сотрудники Всесоюзного научно-исследова-
тельского биотехнического института (ВНИИбиотехника)
К. А. Калуняиц, С. А. Коновалов, Л. И. Голгер и др. Разрабо-
таны способы выращивания микроорганизмов иа твердых сы-
пучих средах методом объемной аэрации, новые методы непре-
рывного культивирования микроорганизмов—продуцентов пек-
толитических, гемицеллюлазиых и протеолитических ферментов,
промышленные способы концентрирования, очистки и сушки,
а также технологические схемы получения технических, очи-
щенных и кристаллических ферментов из культур микроорга-
низмов, выращенных в глубинных условиях и др.
В настоящей книге авторы ставили задачу наряду с неко-
торыми специальными знаниями дать инженеру-технологу те
сведения, которые составляют основу общей технологии мик-
робиологических производств.
Глава 1. МИКРООРГАНИЗМЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ
В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ
ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Область практического использования микроорганизмов
чрезвычайно многообразна — от переработки сельскохозяйст-
венных продуктов до катализа сложных химических превра-
щений. С незапамятных времен человек использовал деятель-
ность микроорганизмов в самых разнообразных традиционных
процессах. Возбудители спиртового брожения — дрожжи ши-
роко применялись в виноделии, хлебопечении, пивоварении; ук-
суснокислые бактерии — для получения уксуса; молочнокис-
лые бактерии (иногда одновременно с дрожжами)—при про-
изводстве кисломолочных продуктов и в сыроделии. Прошло
три столетия с тех пор, как впервые удалось увидеть бактери-
альную клетку. Одиако потребовалось еще много времени,
прежде чем удалось определить ту огромную практическую
роль, которую выполняют микроорганизмы. Этому способство-
вало бурное развитие технической микробиологии и биохимии.
Особенность микроорганизмов состоит в том, что при опре-
деленных условиях оии могут осуществлять биосинтез различ-
ных метаболитов. Одноклеточным микроорганизмам присущ
простой и интенсивный способ размножения. Этим в значи-
тельной степени и определяется их синтетическая деятельность.
Микроорганизмы растут во много раз быстрее, чем самые уро-
жайные сельскохозяйственные культуры, и чем самые быстро-
растущие породы сельскохозяйственных животных. За 1 с рас-
тущая бактериальная клетка может создать до 150000 пеп-
тидных связей. Другой пример: для получения микробной
массы чаще используются дрожжевые микроорганизмы, кото-
рые при определенных условиях способны синтезировать до
40—50 % белка от своей массы, некоторые бактериальные
культуры образуют 60—70 % белка.
Успехи научных исследований и открытий позволили в те-
чение нескольких десятилетий значительно усовершенствовать
и интенсифицировать многие производства, связанные с жиз-
недеятельностью микроорганизмов. Появились новые виды
производств — получение антибиотиков, ряда витаминов, не-
заменимых аминокислот, стимуляторов роста растений, бакте-
риальных препаратов для защиты растений от вредителей.
В пищевой, легкой и медицинской промышленности широко ис-
пользуются ферментные препараты, получаемые с помощью
бактериальных и грибных культур микроорганизмов. В меди-
цине широко применяются кровезаменители, вырабатываемые
с помощью микроорганизмов. Последние принимают также
участие в синтезе новых лекарственных препаратов — стероид-
ных гормонов. Во многих странах организовано микробиоло-
10
гическое производство лимонной, молочной, коевой, фумаровой
и других кислот.
Следует также отметить, что встречающиеся в природе
в больших количествах некоторые виды сырья — целлюлоза,
нефть, природный газ — могут использоваться только микро-
организмами и превращаются либо в клеточное вещество, либо
в промежуточные продукты обмена, выделяемые в среду.
Вполне естественно поэтому, что точное знание основ жиз-
недеятельности микроорганизмов является важнейшим усло-
вием рациональной постановки технологических процессов, ле-
жащих в основе этих производств.
1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О МИКРООРГАНИЗМАХ,
ИХ СТРОЕНИИ И ФОРМЕ
К микроорганизмам, широко используемым в микробиоло-
гической промышленности для получения микробной массы и
продуктов метаболизма, относятся бактерии (роды Micrococ-
cus, Bacillus, Nocardia, Brevibacterium, Pseudomonas, Mycobac-
terium, Corinebacterium, Aerobacter, Achromobacter), микроско-
пические грибы (роды Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Cla-
dosporium, Penicillium), актнномицеты (роды Streptomyces, Acti-
nomyces) и дрожжи (роды Candida, Torulopsis, Rhodotorula,
Hansenula, Pichia).
Типичные бактерии представляют собой одноклеточ-
ные организмы (рис. 1.1). За немногими исключениями они
имеют форму шарообразную (кокки) или цилиндрическую (па-
лочки, прямые или изогнутые). Диаметр кокков от 0,5 до
4 мкм, размер палочек от 0,5 до 20 мкм в длину и от 0,5 до
4 мкм в ширину. Размножаются бактерии, как правило, путем
бинарного деления клетки. В природе при наличии воды бак-
терии могут существовать в аэробных н анаэробных условиях.
По типу питания бактерии делятся иа автотрофы, гетеро-
трофы и фототрофы. Автотрофы получают энергию за счет
окисления неорганических (NH3, NOz-, Fe2+, Н2, H2S) веществ,
гетеротрофы для построения веществ своего тела получают
энергию в процессе окисления или сбраживания органических
(сахара, спирты, органические кислоты, углеводороды и т. д.)
веществ, фототрофы, например сииезеленые водоросли, в ка-
честве источника энергии используют свет.
Микроскопические грибы рода Penicillium и Asper-
gillus (рис. 1.2), а также дрожжеподобные грибы рода Endo-
mycopsis и Endomyces являются продуцентами многих биоло-
гически активных веществ: ферментов, аминокислот, витами-
нов, органических кислот, антибиотиков, средств защиты
растений, бактериальных удобрений и др.
Плодовое тело микроскопических грибов состоит из сильно
разветвленных, длинных, диаметром от 1 до 5 мкм грибных
11
л <Л ® « ®
® *® ®
® ® •
а
(? ®в «р
ъ* *
**
& в» ъ
6
3
е
tn
Рнс. 1.1. Бактерии:
а —микрококки; б — стрептококки; в —
сардины; г — диплококки и тетракокки;
д — стафилококки; е — палочки; ж — спо-
роносные палочки
нитей (гиф), образующих грибницу или мицелий (рис. 1.3).
У микроскопических грибов различают три типа размноже-
ния — половое, бесполое и вегетативное.
Половое размножение встречается редко и протекает в не-
благоприятных условиях, например при недостаточном доступе
кислорода. В основном грибы — это свободиоживущие сапро-
фиты, ио некоторые из иих паразитируют иа животных, а мно-
гие являются серьезными вредителями растений. Для своего
роста, развития н синтеза метаболитов микроскопические
грибы требуют наличия кислорода в среде.
Актииомицеты, или лучистые грибы, как и бак-
терии — одноклеточные организмы, ие имеющие дифференци-
рованного ядра (рис. 1.4). Подобно грибам они образуют длин-
ный (свыше 600 мкм), ветвистый и очень тонкий мнцелий,
ширина гиф которого 0,8—1,4 мкм. На питательных средах акти-
12
Рнс. 1.2. Плесневые грибы. Конидиеносцы и плодовые тела грибов:
а — Aspergillus; б— Penicillium; в, г--плодовые тела (общий вид и разрез)
номицеты образуют мицелий на самом субстрате, а также дру-
гой— воздушный мицелий, на кончиках которого в особых спо-
роносных ветках образуются споры.
Актииомицеты могут также размножаться вегетативным
путем. Подобно многим бактериям актииомицеты не перено-
сят кислых условий среды. В отличие от истинных грибов не-
которые представители актиномицетов являются анаэробами.
Рнс 1.3. Мицелий микроскопических
грибов:
а — одноклеточный; б — многоклеточный
Рис. 1 .4. Актииомицеты:
а — мицелий; б — актииомицеты иемице-
лиальные; в — споры
13
растает в дочернюю клетку и,
отделяется от нее. Особенность
Рис. 1.5. Дрожжи
Дрожжи представляют
собой одноклеточные микро-
организмы, по морфологиче-
ским признакам относящиеся
к простейшим сумчатым гри-
бам. Форма дрожжевых кле-
ток чаще всего округлая или
эллипсоидальная, но вообще
она непостоянна и в зависи-
мости от условий культивиро-
вания может меняться (рис.
1.5). Средние размеры дрож-
жевой клетки составляют
3—5 и 8 -15 мкм. Дрожжи
размножаются, как правило,
вегетативно, почкованием,
когда на материнской клетке
образуется почка, которая вы-
достигнув объема материнской,
дрожжей и их отличие от мно-
гих других микроорганизмов заключаются в том, что они про-
являют свою жизнедеятельность как в анаэробных, так и
в аэробных условиях. В анаэробных условиях дрожжевые
клетки, сбраживая сахар, получают необходимую им энергию
и промежуточные продукты обмена, используемые клеткой для
всех жизненных процессов. В противоположность этому
в аэробных условиях дрожжи не сбраживают, а окисляют угле-
воды до диоксида углерода (углекислого газа) и воды. Спирт
при этом почти ие образуется, ио резко ускоряется процесс раз-
множения дрожжей, в результате их накапливается значитель-
но больше, чем при нх размножении в анаэробных условиях.
1.2. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ
ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Существует определенный параллелизм между жизнедея-
тельностью микроорганизмов и факторами окружающей среды.
Чем благоприятнее этн условия для данного микроорганизма,
14
тем иитеисивнее ои развивается и тем выше темп его жизне-
деятельности. Связь микроорганизмов с окружающей средой
проявляется в течение всего периода индивидуального разви-
тия, причем она имеет многосторонний характер. При ассими-
ляции питательных веществ микроорганизм растет, развива-
ется и выделяет в окружающую среду определенные продукты
обмена. На изменение условий питания он отвечает приспосо-
бительной перестройкой своего обмена веществ. При измене-
нии реакции среды, температуры, концентрации питательных
веществ, давления, радиации и т. д. нарушается обмен веществ,
прекращаются или ограничиваются рост и размножение мик-
роорганизма. Иными словами, происходят все те морфологи-
ческие и физиологические изменения, которые объединяются
в понятие жизнедеятельность.
Обмен веществ у микроорганизмов ие сводится только к по-
строению веществ тела, к размножению. Одновременно осуще-
ствляются различные процессы, приводящие к улучшению са-
мими микроорганизмами условий внешней среды для дальней-
шего размножения. Естественно, пи влажность, ни температура
не зависят от микроорганизма. К ним ои может только пас-
сивно приспосабливаться. Микроорганизмы могут приспосабли-
ваться к своим потребностям и активно изменять при помощи
ферментных систем химические условия. Например подщела-
чивание среды автоматически активирует ферменты, способ-
ные вызывать кислотообразованне, интенсивная аэрация вызы-
вает образование защитных восстановительных соединений,
снижающих окислительно-восстановительный потенциал гНг-
Все факторы внешней среды, оказывающие большое влия-
ние на развитие микроорганизмов, можно разделить на три ос-
новные группы: физические, химические и биологические. Из
физических факторов наиболее важное значение имеют влаж-
ность, концентрация веществ, температура, радиация, свет; из
химических — реакция среды и окислительно-восстановитель-
ные условия в ней; из биологических — антимикробные веще-
ства. Необходимо помнить, что существует тесная взаимосвязь
между многими факторами окружающей среды и что измене-
ние одного из них часто меняет реакцию микроорганизма на
действие других факторов.
Физические факторы. л аж ноет ь. В клетках микроор-
ганизмов протекает множество различных биохимических про-
цессов. Одни сложные вещества разлагаются, другие образу-
ются из более простых соединений. Вода же является той не-
обходимой средой, в которой только и могут осуществляться
все эти химические реакции. Микробная клетка на 65—85 %
состоит из воды, и вся ее жизнедеятельность связана с нали-
чием влаги (табл. 1.1).
Без предварительного растворения в воде многие питатель-
ные вещества не могут проникнуть внутрь микробной клетки,
15
Таблица 1.1. Содержание воды в некоторых микроорганизмах, %
Микроорганизмы Вода Сухие вещества
Escherichia coli 73,3 26,7
Proteus vulgaris 80,0 20,0
Serrata marcescens 75—90,6 25—9,4
Mycobacterium tuberculosis 83,1—88,8 16,9—11,9
Плесени До 85 30—15
Дрожжи 63—83 32—17
и жизнь ее становится невозможной. Большое влияние оказы-
вает наличие влаги на микробные клетки, находящиеся в ста-
дии роста, хотя между ними и в этом отношении наблюдаются
значительные различия. Микроскопические грибы могут расти
н иа твердых питательных субстратах с минимальным содер-
жанием воды. Микроорганизмы в природе находятся в непре-
рывно изменяющихся условиях, сильно колеблется и содержа-
ние влаги. Многие представители хорошо приспособились
к высушиванию. Например, некоторые бесспоровые бактерии
переносят высушивание и остаются жизнеспособными иногда
в течение нескольких лет. Особенно хорошо приспособились
к высушиванию споры различных грибов и бактерий. Споры,
находящиеся в течение многих лет в сухом месте, при у вл аж- О
нении начинают прорастать. Однако, как бы стойки ии были
вегетативные клетки микроорганизмов к высушиванию, в вы-
сушенном состоянии они остаются бездеятельными, так как от-
сутствие влаги препятствует процессам их питания, а следова-
тельно, росту и размножению. В этом состоянии, что особенно
важно, они только сохраняются, хотя их жизнедеятельность
заметно приостанавливается.
Концентрация веществ.'Ла рост и жизнедеятель-
ность микроорганизмов большое влияние оказывает концентра-
ция различных веществ. Высокие концентрации любых ве-
ществ, в том числе питательных, создают высокое осмотическое
давление во внешней среде, превышающее внутреннее осмоти-
ческое давление в клетке. Вода при этом выходит наружу,
клетки обезвоживаются и начинается плазмолиз. Из-за невоз-
можности поступления в микробную клетку питательных ве-
ществ прекращается нормальный обмен с внешней средой.
Благодаря тому что цитоплазматическая мембрана имеет вы-
сокую избирательную проницаемость, клетки приспосаблива-
ются к изменению осмотического давления в окружающей
среде. В этих условиях может иметь место даже накопление
в цитоплазме или минеральных солей (если они могут прони-
кать в клетку), илн осмотически активных веществ, образую-
щихся в результате гидролиза резервных веществ цитоплазмы.
16
Таблица 1.2 Концентрация минеральных солей, необходимая для
нормального роста микроорганизмов, г/л
Солн Бактерии Грибы и актиномицеты
ZnSO4-7HjO 0,02—0,1
КН2РО« 0,2—0,5 1—2
К8НРО4 0,2—0,5 1—2
CuSO4-5HgO 0,001—0,005 0,01—0,05
MgSO4-7H2O 0,1—0,2 0,2—0,5
MgSO4-4H2O 0,005—0,01 0,05—0,2
FeS04-7H8O 0,005—0,01 0,05—0,2
CaCl, 0,01—0.03 0,02—0,1
Na2MoO4 0,001—0,005 0,01—0,02
CoCls До 0,03 l До 0.06
В последнем случае можно говорить даже об определенной
способности к осморегуляции.
Концентрация питательного вещества должна быть опти-
мальной, т. е. достаточной для обеспечения максимального ро-
ста. Для различных веществ оптимальные концентрации раз-
личны. Так, минеральные соли, содержащие Р, S, Са, Mg, Zn,
Na и другие элементы, требуются в небольших количествах.
Концентрации минеральных солей, необходимые для нормаль-
ного роста различных микроорганизмов, приведены в табл. 1.2.
Концентрация в среде источников углерода (углеводы, кис-
лоты, спирты, углеводороды и др.)» которые чаще всего одно-
временно являются н источниками энергии, т. е. окисляемыми
или сбраживаемыми веществами, может изменяться от деся-
тых долей процента до 15—20 %. Абсолютное содержание ис-
точника углерода для обеспечения нормальной жизнедеятель-
ности микроорганизма и получения необходимого количества
метаболита рассчитывают, используя экспериментально уста-
новленные экономические коэффициенты выхода.
Температура/ Жизнь и размножение микроорганизмов
зависят от многих физических факторов. Наиболее существен-
ным фактором является прежде всего температура окружаю-
щей среды. Как и все факторы внешней среды, температурная
зависимость характеризуется тремя кардинальными точками
(минимум, оптимум, максимум), которые различны для от-
дельных микроорганизмов (табл. 1.3). Все микроорганизмы по
их отношению к температуре делят на три основные группы;
психрофилы, мезофилы и термофилы (рис. 1.6).
Температурный оптимум психрофилов находится в преде-
лах 0—15 °C. Сюда относятся преимущественно представители
микрофлоры северных морей./Д^Я. психрофилов характерна
небольшая скорость роста. К4 вторбй группе относится боль-
шинство используемых в промышленности бактериальных и
грибных культур микроорганизмов, температурный оптимум
17
5 10 15 20 25 30 3540 45 50 55 60 65 70 ‘С
Рнс, 1.6. Зависимость накопле-
ния микроорганизмов от тем-
пературы культивирования:
/ — психрофилы; 2 — мезофилы; 3 —•
термофилы
развития которых находится в пределах 25—37 °C. К термо-
фильным микроорганизмам относятся формы, температурный
оптимум которых 50—60°C, крайние пределы 30—70 °C. Тер-
мофильные микроорганизмы .представляют особый интерес дли
промышленного использования, так как культивирование их
при высоких температурах создает селективные условия н доз-
воляет снизить требования к стерильности процесса.
Высокие и низшие температуры неодинаково влияют иа
микроорганизмы. Наиболее губительны для ннх высокие тем-
пературы, вызывающие коагуляцию белков клетки и наруше-
ние активности ферментов. При повышении температурного
максимума жизнедеятельность микроорганизмов резко снижа-
ется. Так, гибель бесспоровых бактерий при температуре 60 °C
наступает через 30 мин, при 70 °C —через 10—15 мии, а при
Таблица 1.3. Кардинальные точки температуры для некоторых
микроорганизмов, °C
Микроорганизмы Минимум Оптимум Максимум
Бактерин
Streptococcus lactis 8—10 30—35 40—45
Streptococcus diacetilactis 5 25 40
Lactobacillus bulgaricus 20 40-42 50
Escherichia coli 10 37 50
Acetobacter orleanense 8 30 36—39
Acetobacter aceti 4 34 42
Pseudomonas fluorescens От 2 до —2 20—25 63
Mycobacterium tuberculosis 29 — 41
Bacillus subtilis 5-8 30-45 55—60
Bacillus calfactor 30 80 70
Clostridium botulinum 10—12 30—35 55
Грибы
Phytophthora infestans 2 18—21 26
Botrytis cinerea От —5 до 2 22—25 30—33
Penicillium puberulum От —5 до 1 24—25 30—32
Penicillium viridicatum От —3 до 2 22—24 33—34
Aspergillus niger 7—10 33—37 40-43
Aspergillus candidus 5—6 30—35 40-43
Aspergillus flavus 6—8 30—35 40—44
Aspergillus repens 4—6 24—26 36—38
Mukor racemosus 4 22—25 33
Дрожжи (различные виды) 0.5—5 20—30 40—50
18
80—100° — через 1 мин. Изменение температуры в сторону ми-
нимума сказывается меиее рдзко, чем повышение в сторону
максимума. Например, количество биомассы Asp. niger сни-
жается в десятки, сотни раз при повышении температуры от
минимума 35 °C на 7 °C, в то время как при понижении тем-
пературы иа 15 °C от оптимума количество биомассы умень-
шается только в 8—10 раз. На губительном влиянии высоких
температур основаны приемы уничтожения микробов — пасте-
ризация и стерилизация. При пастеризации погибают вегета-
тивные клетки, ио остаются жизнеспособными споры. При
стерилизации происходит полное уничтожение всех жизнеспо-
собных клеток и их спор. Низкие температуры хорошо перено-
сятся микрооргаиизмамн. Некоторые бактерии могут перено-
сить температуру —190 °C (температура жидкого воздуха) и
даже температуру жидкого водорода —252 °C. При заморажи-
вании наибольшую опасность представляет ие сама низкая
температура, а мелкие кристаллы льда, образующиеся внутри
клетки, которые могут ее повредить механически.
Свет. На развитие микроорганизмов большое влияние
оказывают солнечный свет и другие формы лучистой энергии.
Наиболее сильным действием обладает коротковолновая ульт-
рафиолетовая часть спектра (200—300 нм) с ярко выражен-
ным фотохимическим эффектом. Большой активностью обла-
дают также рентгеновские лучи (ионизирующее излучение
с длиной волны 0,005—1 нм), у-лучи (коротковолновые рент-
геновские лучи), а-, 0-частицы, нейтроны. Действие всех этих
форм лучистой энергии иа микроорганизмы зависит от дозы,
а также от физиолого-биохимического состояния микроорга-
низма. Есть все основания полагать, что действие различного
рода излучений связано в первую очередь с изменением струк-
туры ДНК. Во многих случаях спектр действия УФ-лучей со-
ответствует спектру их поглощения нуклеиновыми кислотами.
При изучении механизма действия УФ-лучей иа молекулярном
уровне было обнаружено, что при денатурации ДНК, облучен-
ной высокими дозами УФ-лучей (порядка Ы0-2 Дж), возни-
кают разрывы между нуклеотидами, а также образование по-
перечных сшивок между комплементарными нитями молекулы
Действие рентгеновских лучей также связано с ДНК- Наблю-
дения показали, что рентгеновские лучи, а также некоторые
продукты, возникающие под их действием (Н+ и ОН-, ради-
калы, перекиси), разрушают ДНК-
Следует отметить, что на влиянии различного рода излуче-
ний на микроорганизмы основаны приемы стерилизации воды
и некоторых других продуктов.
Давление. Микроорганизмы устойчивы к давлению в 500
и даже 1000 кПа, что, по-видимому, связано с малой чувстви-
тельностью белков к его денатурирующему влиянию. Для боль-
19
Таблица 1.4. Значении pH среды дли некоторых микроорганизмов
Микроорганизм Минимум Оптимум Максимум
Streptococcus lactis 4—4,7 6—6,5 7,9—8,5
Lactobacillus acidophilus 4—4,6 5,8-6,6 6,8
Lactobacillus casei 3—3,9 7,1
Escherichia coli 4,4—5 6,5—7,5 7,8—9
Proteus vulgaris 4,4—4,9 6,5—7,5 8,4—9
Salmonella enterjtidis 5 7—8 8,5
Pseudomonas aeruginosa 5,5 6,6-7 8,5—9
Erwinia carotovora 5,6 7,1 9,3
Bacillus subtilis 4,5 6,7 8,5
Bacillus mesentericus 5,3 6,8 8,5
Clostridium putrificum 4,2 7-8 8,5—9,4
Clostridium perfrlngens 5-5,8 6—7,6 8,5—9
Clostridium amylobacter 5,7 6,9—7,3 8,5
Clostridium botulinum 5 6,5—7,5 9
Микроскопические грибы (различные 1,5 4—6 9-11
Дрожжи (различные виды) 3—3,5 4,5—6 8,5
шинства микроорганизмов давление 100 МПа приводит к ле-
тальному исходу.
Химические факторы. Концентрация ионов водо-
рода. Большое влияние на развитие микроорганизмов ока-
зывает такой химический фактор внешней среды, как кон-
центрация ионов водорода илн pH. Каждый микроорганизм
имеет свой максимум и минимум pH, в пределах которых он
может развиваться (табл. 1.4).
Как свидетельствуют данные таблицы, есть и некоторые
общие закономерности. Бактериальные микроорганизмы хо-
рошо развиваются при pH, близком к нейтральному — от 6,5
до 7,5. У микроскопических грибов и различных видов дрож-
жей оптимум pH в кислой зоне — от 4 до 6. Концентрация во-
дородных нонов в среде оказывает большое влияние на разви-
тие микроорганизмов и на нх физиологическую активность.
Это положение можно подтвердить ходом процесса брожения.
Например, при спиртовом брожении, протекающем при pH 4,
образуются диоксид углерода н этиловый спирт. При сдвиге
pH в щелочную сторону (до 7,5) брожение также происходит,
но в этом случае кроме диоксида углерода и спирта образуется
еще и уксусная кислота.
Окислнтельно-восстановнтельиый потен-
циал. Выражают через гН2. Если pH выражает степень кис-
лотности и щелочности, то гН2 — степень аэробности. И. Л.
Работнова (1958) показала, что в водном растворе, насыщен-
ном кислородом, гНг=41, а в условиях насыщения водоро-
дом— гН2=0. Шкала от 0 до 41 характеризует любую степень
аэробности. По отношению к этому фактору внешней среды
все микроорганизмы подразделяются на следующие основные
20
1
Рис. 1.7. Кривые размножения и изменения гН2 для культуры аэробов (а)
и анаэробов (б):
1 — количество клеток; 2 — гН2
группы: аэробы, анаэробы и факультативные анаэробы. Аэ-
робы содержат в своих клетках систему дыхательных фермен-
тов н в качестве акцепторов водорода при окислительно-вос-
становительных процессах используют молекулярный кисло-
род. Для аэробных микроорганизмов, например для дрожжей,
гН2=10-^30 (рис. 1.7, а). Анаэробы получают энергию без
участия кислорода воздуха за счет сопряженного окисления —
восстановления веществ субстрата. Эти микроорганизмы жиз-
недеятельны прн гНг не выше 20. Рис. 1.7, б свидетельствует,
что размножаются анаэробы только прн крайне низких значе-
ниях гН2 — не выше 3—5. Для представителей этой группы
микроорганизмов молекулярный кислород не только не нужен,
ио в ряде случаев и ядовит.
Микроорганизмы, для которых кислород ие обязателен, так
как они живут за счет сопряженного окисления — восстановле-
ния без вовлечения кислорода, называются факультативными
анаэробами. Они живут в широком диапазоне гНг—от 0 до
30. Кислород для них ие ядовит нли слабо ядовит.
Биологические факторы (антимикробные вещества).
Различные вещества, находящиеся в окружающей среде, могут
служить источником питания микроорганизмов н способство-
вать росту и развитию, а могут н ингибировать рост микроб-
ной клетки, не оказывая иа нее летального действия. Наибо-
лее известными антимикробными веществами являются анти-
биотики, которые даже в небольших концентрациях угнетают
рост н активность микробов. Антибиотики образуют главным
образом актиномицеты, а также некоторые грнбы и бактерии.
21
Механизм действия антибиотиков состоит в том, что одни из
иих нарушают процессы деления бактериальной клетки, дру-
гие изменяют отдельные процессы метаболизма, мешают ис-
пользованию витаминов, конкурируют с отдельными фермен-
тами, нарушают процессы дыхания, способствуют образованию
перекисей, лизнсу клеток, оказывают депрессирующее дейст-
вие на поверхностное натяжение и т. д.
1.3. ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Непропорционально большие количества различных ве-
ществ, перерабатываемых ничтожно малыми по величине мик-
роорганизмами, позволили еще Пастеру говорить о «беско-
нечно большой роли бесконечно малых существ». Бактериаль-
ная клетка может потреблять за сутки количество пищи,
превышающее в 30—40 раз ее собственную массу. Поступление
питательных веществ и выделение продуктов жизнедеятельно-
сти осуществляются с большой скоростью всей поверхностью
(диффузия) микробной клетки. Происходит интенсивный обмен
между клеткой н внешней средой. Этот обмен состоит из двух
процессов: получение необходимых для роста питательных ве-
ществ нз окружающей среды, синтез из ннх структурных ча-
стей клетки (питание) и выделение в окружающую среду ко-
нечных продуктов метаболизма. В табл. 1.5 приведены состав
микробной клетки, а также вещества и системы, ответственные
за образование структурных элементов.
Возможность использования микроорганизмами для пита-
ния различных химических соединений определяется двумя ос-
новными факторами. Первый из ннх — способность вещества
проникать внутрь клетки через цитоплазматическую мембрану.
Механизм, с помощью которого осуществляется перенос рас-
творенных веществ через мембрану, отличается высокой изби-
рательностью.
Молекула растворенного вещества может проникать через
липопротеидную мембрану путем пассивной диффузии нли как
большинство растворенных веществ с помощью специфических
механизмов переноса. Считают, что макромолекулы-перенос-
чнкн расположены в мембране. Они захватывают молекулу рас-
творенного вещества н переносят ее к внутренней поверхности
мембраны, где высвобождают ее в цитоплазму. Такие связан-
ные с мембраной молекулы-переносчики называются пермеа-
зами. В настоящее время считают, что пермеазы — это веще-
ства ферментной природы.
Многие микроорганизмы непроницаемы для органических
кислот трикарбонового цикла, в то время как сахара обычно
проникают в клетку достаточно легко. Важным фактором,
влияющим на способность молекулы проникать внутрь клетки,
является ее размер. Для многих высокомолекулярных соедине-
22
Таблица 1.5. Структурные элементы клетки и их характеристика
Структурные элементы Биохимическая активность Функционально важные вещества и системы, образующие соответствуют» ft элемент
Ядро и его аналоги Хранение генетической инфор- мации. Репликация ДНК- Об- разование информационных РНК (транскрипция) ДНК» белки и фер- менты, Связанные с образованием ДНК и РНК
Митохондрии и их Энергетический центр клетки. Мембраны, ферменты цикла Кребса и ды- хательной цепи
аналоги Образование АТФ. Дыхание. Окисление питательных ве- ществ и др.
Рибосомы Трансляция. Синтез белка РНК, белки
Лизосомы Разрушение биополимеров Мембраны, ферменты
Комплекс Гольджи Экскреция, образование мем- бран и, возможно, оболочки клетки То же
Вакуоли Накопление резервных и не- нужных клетке веществ >
Гранулы Резервные вещества Волютин (РНК, бел- ки, полифосфаты, гликоген, липиды)
Эндоплазматическая сеть Синтез липидов, углеводов и других веществ Мембраны, ферменты
Ц итоп ла зматическ а я мембрана (плазмо- лемма) Транспорт и проницаемость веществ То же
Клеточная стенка Механический барьер Транспорт веществ Полисахариды, бел- ки, липиды и др.
иий цитоплазматическая мембрана оказывается непроницае-
мой. Однако это не означает, что все высокомолекулярные со-
единения не могут быть использованы микроорганизмами в ка-
честве питательных веществ.
Многие микроорганизмы выделяют различные экзогенные
ферменты, вызывающие гидролиз молекул, размеры которых
слишком велики для проникновения через цитоплазматическую
мембрану. Наиболее широко распространены ферменты, ката-
лизирующие гидролиз таких полимеров, как полисахариды и
белки, а также молекул, имеющих тенденцию к агрегации
в крупные мицеллы (липиды, фосфолипиды). Не все гидроли-
тические ферменты, выделяемые микроорганизмами, диффун-
дируют в среду. Некоторые из иих остаются тесно связанными
с микробной клеткой, находясь либо внутри клеточной стенки,
либо на внешней стороне цитоплазматической мембраны. Хи-
мические соединения, которые способны проникать внутрь мик-
роорганизма, могут быть использованы только как питательные
вещества, когда этот микроорганизм синтезирует ферменты,
необходимые для нх метаболизма.
23
Анаболизм
Катаболизм
мономеры
(строительные
блоки):
аминокислоты
сахара
нуклеотиды
полцмщь!
(макромолекулы} -
полисахариды
белки
полинуклеотиды
Рис. 1.8. Пути обмена веществ
у микроорганизмов:
/ — фруктозо-1,6-дифосфатный
путь; 2 — пентозофосфатный путь;
3 — 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюко-
натный путь окислительного рас-
щепления глюкозо-6-фосфата; 4 —
цикл трикарбоновых кислот; 5 —
дыхательная цепь; б — фосфорили-
» роваиие на уровне субстрата; 7 —
Н2О) окислительное фосфорилирование в
X__У дыхательной цепи; 8 — синтез мо-
номеров; 9— синтез полимеров
Обмен веществ у микроорганизмов. Превращение любого
питательного вещества у микроорганизмов проходит по одному
нз двух направлений: анаболизму или катаболизму. Реакции
протекают в строгой последовательности одна за другой, так
как продукты реакции предыдущей стадии процесса, как пра-
вило, служат субстратом для последующей.
На рис. 1-8 представлен путь обмена веществ у микроорга-
низмов. Он состоит нз реакций, которые поставляют клеткам
строительный материал, и реакций, которые обеспечивают все
превращения в клетке, т. е. реакций, ответственных за конст-
руктивный и энергетический обмены.
При анаболических превращениях обычно наблюдают син-
тез новых клеточных компонентов, тогда как результатом ка-
таболизма является образование низкомолекулярных соедине-
ний. Одни из этих соединений — некоторые продукты обмена—•
выделяются нз клетки, другие служат предшественниками для
биосинтетических реакций и, таким образом, включаются в ана-
болические пути. Катаболические превращения часто служат
также источником необходимой для метаболизма клетки энер-
гии в форме АТФ или некоторых других богатых энергией сое-
динений, которые могут быть использованы в реакциях био-
синтеза. Все это еще раз свидетельствует о существующей тес-
ной связи между анаболическими и катаболическими путями
метаболизма.
Основным условием для биосинтеза клеточных компонентов
является снабжение клетки соответствующими низкомолеку-
24
Таблица 1.6. Состав клеточного вещества микроорганизмов,
% на сухое вещество
Элементы и форма их учета Бактерии Дрожжи Микроскопические грибы (мицелий со спорами)
Углерод 50,4 49,8 47,9
Азот 12,3 12,4 5,24
Кислород 30,5 31,1 40,16
Водород 6,78 6,7 6,7
Р2О6 4,95 3,54 4,85
к2о 2,41 2,34 2,81
so3 0,29 0,04 0,11
Na2O 0,07 1,12
MgO 0,82 0,42 0,38
CaO 0,89 0,38 0,19
Ре2Оя 0,08 0,035 0,16
SiO2 0,03 0,09 0,04
лярнымн соединениями (сахарами, аминокислотами), которые
служат предшественниками, или «сырьем» для биосинтетиче-
ских процессов. Этн соединения могут присутствовать в окру-
жающей клетку среде и тогда они непосредственно вовлека-
ются организмом в те или иные пути биосинтеза. Окружающая
среда не может снабдить микроорганизмы всеми низкомо-
лекулярными соединениями, которые необходимы для биосин-
тетических реакций, поэтому некоторые, а часто н все подоб-
ного рода соединения бактериальная клетка должна «вырабо-
тать» из питательных веществ, имеющихся в ее распоряжении.
В процессе роста наряду с клеточными компонентами микро-
организм образует в незначительных количествах вещества
сложной молекулярной структуры — различные ферменты, ан-
тибиотики, витамины и другие биологически активные веще-
ства.
Микроорганизмам для формирования новой клетки необхо-
димо поступление нз окружающей среды различных питатель-
ных компонентов в доступной форме в определенных качест-
венных н количественных соотношениях. Все элементы, входя-
щие в состав клеточного вещества (табл. 1.6), должны находиться
в питательной среде.
Без наличия хотя бы одного из указанных элементов рост
будет незначительным нли его совсем не будет. Например,
если нз полноценной питательной среды полностью изъять
цинк, то Asp. niger образует только 0,5 мг сухой массы мице-
лия. При наличии цинка грибная пленка достигает нескольких
граммов. Синтез клеточного вещества ускоряется во много раз
потому, что цинк, как и многие другие микроэлементы, входит
в состав ферментов и без него становится невозможной нор-
мальная физиологическая активность клетки.
25
Роль воды. Для нормального роста и размножения микро-
организмов необходимо присутствие воды в окружающей среде.
Потребность в воде можно выразить количественно — в форме
активности воды асо окружающей среды нли субстрата; она
равна р/ро (р — давление пара раствора н р0 — давление во-
дяного пара). Значения асо могут быть найдены из уравнения
In асо = —nmY/55,5,
где п — число ионов, образованных каждым растворенным веществом; tn —
молярная концентрация растворенного вещества; Y — молярный осмотический
коэффициент.
Для воды а© ==1,00. Это значение уменьшается при растворе-
нии в ней различных веществ. Микроорганизмы могут расти на
средах со значениями асо = 0,99-ь 0,63. В целом для бактерий
требуются питательные среды с более высокими значениями
асо (0,99—0,93), чем для дрожжей и микроскопических грибов.
Значения асо, оптимальные для роста дрожжей, варьируют, но
минимальные величины для этих организмов (0,91—0,88) ниже,
чем для большинства бактерий. Микроскопические грнбы,
в общем, более способны переносить высушивание, чем другие
микроорганизмы, и для некоторых штаммов, например для
представителей группы Asp. glaucus, ннжний предел значения
асо около 0,60.
Источники углерода. Среди всех элементов, используемых
микроорганизмами в качестве питательных веществ, наиболее
важное значение имеет углерод, содержание которого в пере-
счете на сухую массу микроорганизмов составляет примерно
50 % (см. табл. 1.6). Микроорганизмы могут использовать са-
мое простое углеродное соединение — диоксид углерода. Для
некоторых из ннх СО2 является единственным источником уг-
лерода. Такие микроорганизмы носят название автотрофов.
Микроорганизмы, которым помимо диоксида углерода необхо-
димо присутствие в среде некоторых органических источников
углерода, называются гетеротрофами.
Количество органических соединений, используемых гете-
ротрофными микроорганизмами в качестве источников угле-
рода, чрезвычайно велико. Наиболее доступными являются по-
луокисленные атомы углерода: —СН2ОН, —СНОН—,
= СОН—. Поэтому различные сахара, глнцернн, маннит, орга-
нические кислоты характеризуются высокой питательной цен-
ностью. Плохо усваиваются микроорганизмамн более окислен-
ные (группа —СООН) соединения. Какое бы углеродное сое-
динение ни использовалось микробной клеткой, оно сначала
расщепляется до низкомолекулярных веществ, которые затем
вовлекаются в тот илн иной биосинтетический процесс. Во
время процесса расщепления из химических соединений извле-
кается энергия, которая в форме АТФ может использоваться
микроорганизмами.
26
К наиболее доступным для микроорганизмов источникам
углерода относятся углеводы, прежде всего моносахариды, осо-
бенно гексозы. Среди пеитоз наиболее широко потребляемым
сахаром, по-видимому, является ксилоза. Источником углерода
часто могут служить многоатомные спирты. Маннит, например,
легко потребляется многими микроскопическими грибами и
актиномнцетами, хотя в целом он плохо используется фикоми-
цетами и дрожжами. Для актиномнцетов наиболее подходя-
щий источник углерода — глицерин.
Микробная клетка часто непроницаема для некоторых ор-
ганических кислот, особенно кетокислот, поэтому эти соедине-
ния в ряде случаев не могут быть использованы в качестве
источников углерода. Следует отметить, что использование ней-
тральных органических кислот вызывает увеличение pH в про-
цессе роста, что также неблагоприятно сказывается на росте
культуры. Некоторые органические кислоты (например, ли-
монная и винная) являются хелатными агентами, и, таким об-
разом, недостаток иоиов металла может влиять на рост микро-
организмов.
Известны некоторые микроорганизмы, например предста-
вители рода Pseudomonas, для которых источником углерода
служат лнпиды. В результате гидролиза липндов ферментом
липазой образуются глицерин н жирные кислоты. Оба эти
компонента или одни из иих могут быть источником углерода.
Некоторые микроорганизмы (род Candida, Torulopsis, Rho-
dotorula н др.), объединяемые в отдельную физиологическую
группу — углеводородные микроорганизмы, способны окислять
углеводороды. Последовательность этапов окисления пред-
ставлена на рнс. 1.9.
Катаболические превращения н-алканов начинаются с окис-
ления их по конечной метильной группе при участии молеку-
лярного кислорода и фермента оксидазы смешанных функций,
в результате образуется первичный спирт, который в процессе
реакции окисляется до жирной кислоты.
Дальнейшее превращение жирных кислот может протекать
различными путями:
1) 0-окнсление (отщепление двух углеродных атомов с од-
ного конца);
2) окислительное декарбоксилирование (а-окисленне);
3) си-окнслеиие (окисление второй метильной группы моле-
кулы жирной кислоты с образованием дикарбоновой кислоты).
Химнзм р-окисления высокомолекулярной жирной кислоты
заключается в последовательном отщепленнн двух углеродных
атомов с образованием уксусной кислоты и новой жирной кис-
лоты, которая подвергается 0-окислению.
Окисление жнриой кислоты возможно только после ее ак-
тивации путем этерификации с образованием соответствующих
КоА-эфнров в присутствии АТФ.
27
глюкоза
глюкоза- 6- росфат
I
дзрумпозо-з.б'-юосрат
I
глииера/пбегиЗ-З-дхниршп
глалолйз
ФОсрознолпОрубагп
nupySam
оксалоаЦетат
!2Н)
Малат
н-парафины
сн3(сн2)псн3
CH/CHsVHjpH
СНзОДпСНО
СЩСН^СООН
(HCCHaV/tt-S-KtfA
CHjfcH^CO-S-KoA
ацетил-У&К [
ifilmpam
цас-аконФлапт
—глиоксилам^
фумарат
—азоцитрат
оксилосукианат
.21
цтк
со2
сс -кетовлутаршп
сдкццнил-К&К
ФАД-Н
НАД-Н
klXUHQH—+-S*+-O)
Рис. 1.9. Пути окисления н-парафинов и глюкозы
р-окнсленне — последовательное окислительное отщепление
молекул ацетил-КоА от КоА-эфнров насыщенных жирных кис-
лот— осуществляется в митохондриальном матриксе.
Согласно современным представлениям, отщепление каж-
дой молекулы ацетнл-КоА включает четыре стадии:
28
1) дегидрирование по атомам углерода в положениях 2 н
3, катализируемое ФАД-зависимой ацил-КоА-дегидрогеназой;
2) гидратация образующейся иа первой стадии 2,3-транс-
двойной связи, катализируемая эионлгидратазой;
3) дегидрирование образующегося на второй стадии КоА-
эфнра L-p-оксикнслоты, катализируемое НАД-завнсимой де-
гидрогеназой;
4) расщепление (тиолиз) образовавшегося на третьей ста-
дии КоА-эфнра р-кетокислоты, протекающее в присутствии
КоА н приводящее к образованию ацетил-КоА и КоА-эфнра
жирной кислоты, укороченной по сравнению с исходной на два
атома углерода.
Далее укороченный КоА-эфир жирной кислоты становится
исходным соедниением для аналогичной последовательности
реакций, в результате которой образуется еще одна молекула
ацетил-КоА-эфнра жирной кислоты, укороченная еще иа два
атома углерода. Этот цикл реакций повторяется до полного
окисления исходной жирной кислоты.
Таким образом, в результате р-окисления жирной кислоты,
полученной при первичном окислении н-алкана, образуется
ацетил-КоА, который далее подвергается окислению до СОг и
Н2О согласно циклу трикарбоновых кислот.
Источники азота. Для развития микроорганизмов, а следо-
вательно, синтеза белковых веществ и построения протоплазмы
живой клетки необходимы различные источники азота.
На рнс. 1.10 представлены пути метаболизма соединений
азота у мнкроорганнзмов, в частности у микроскопических гри-
бов. Наиболее доступными из них являются ноны аммония
NH4+ и аммиак NH3. Они проникают в бактериальную клетку,
где сравнительно легко преобразуются в имиио-(—NH—) и
аминогруппы (—NH2) в молекулах аминокислот, гетероцикли-
ческих оснований и других химических соединений, входящих
в состав протоплазмы. Наиболее универсальным источником
азота для микроорганизмов является аммоний. Как источник
азотного питания свободный аммиак обычно непригоден для
микроорганизмов, так как при его накоплении наступает от-
равление клетки. Микроорганизмы используют аммонийные
соли, например (NH4)2SO4, NH4CI, которые по мере потребле-
ния иона аммония при отсутствии нейтрализующего агента
подкисляют среду, что не способствует нормальному развитию
клеток. Микроскопические грибы, актииомицеты, водоросли
усваивают нитраты. Азот нитратов должен быть предвари-
тельно восстановлен до аммиака н только после этого он ас-
симилируется микроорганизмами. Нитраты необходимы тем
микроорганизмам, которые боятся подкисления, так как при
использовании NO3“ остаются ионы металлов Na+ и К+, кото-
рые создают щелочные условия среды. Микроорганизмы в ка-
честве источника азота могут также использовать белки, ами-
29
Рис- 1.10. Метаболизм соединений азота у микроорганизмов
нокислоты, пептон, пептиды. Белкн усваивают только те мик-
роорганизмы, которые выделяют в среду ферменты, расщепля-
ющие белковую молекулу до пептидов и аминокислот. Неко-
торые аминокислоты необходимы самим микроорганизмам,
другие—являются стимуляторами роста, присутствие третьих
вовсе необязательно: микробная клетка синтезирует нх сама
из безазотистых органических веществ н аммиака. Например,
для роста микроскопических грибов наилучшнми источниками
азота являются кислоты аспарагиновая, глутаминовая и их
амиды, глицин; менее пригодны серосодержащие аминокис-
лоты (цнстин, цнстеин, метионин) н циклические (триптофан).
Особым случаем азотного питания является использование не-
которыми видами сннезеленых водорослей, бактериями, акти-
номнцетами, микроскопическими грибами газообразного азота,
состояние окисленности которого равно 0.
Источники фосфора. Фосфор необходим всем живым клет-
кам микроорганизмов. Фосфор входит в состав наиболее важ-
ных соединений протоплазмы (фосфолипидов, коферментов,
нуклеиновых кислот), определяющих ее структуру и функции.
В отличие от других элементов (азота и серы) фосфор входит
в состав органического вещества клетки только в окисленном
(в форме Р2О5) состоянии. Фосфор не вступает в соединения
с углеродом, а образует с ним связи (при большой затрате
энергии в АТФ) только через атомы азота или кислорода.
В связи с этим некоторые органические соединения фосфора
используются микроорганизмами как аккумуляторы энергии,
освобождающейся при окислительных процессах. Для нор-
мального роста и жизнедеятельности микробной клетки в ок-
ружающей среде должны присутствовать фосфаты, обычно не-
органические одно- или двузамещенные фосфаты калия или
натрия. В некоторых питательных средах источником фосфа-
тов могут служить нуклеиновые кислоты.
Источники серы. Они играют большую роль в структуре
клеток, так как входят в состав белков в виде серосодержащих
аминокислот: цистнна, цистеина, метионина. Для большинства
микроорганизмов хорошим источником серы служат сернокнс-
зо
лые соли, которые в процессе ассимиляции восстанавливаются
и используются в синтезе аминокислот, содержащих серу.
Аминокислота цистеин, которая присутствует в форме ами-
нокислотного остатка в белках, является наиболее важным
серосодержащим компонентом клетки. Атом серы в цистеине
входит в состав тиоловой (—SH) группы. Атомы серы в боль-
шинстве других серосодержащих компонентов клетки (метио-
нин, бнотин, тиамин, глутатион) образуются из —SH-группы
цистеина. Сера входит в состав биотина и тиамина, а также
коэнзима А, участвующего в обмене жирных кислот и липидов
в цикле Кребса. Другая функция серы состоит также в стиму-
ляции протеолитических ферментов. Возможно, что воздействие
иа этн ферменты состоит в участии содержащихся —SH-rpynn
сульфгидрильных соединений в процессах деления клеток.
Этих соединений обычно бывает очень много в молодых, ра-
стущих клетках. Большинство микроорганизмов используют
серу из окружающей среды в форме сульфат-нона, в котором
атом серы находится в окисленном состоянии (+6) и должен
быть восстановлен клеткой до состояния —2 (как в группе
SH). Для многих микроорганизмов единственным источни-
ком серы может служить тиосульфат-ион (S2O3-2). Некоторые
микроорганизмы, утратившие способность восстанавливать
сульфаты, нуждаются в соединениях, содержащих атом серы
в восстановленной форме, как, например, сероводород, цистеин.
Факторы роста. Микроорганизмы, лишенные способности
синтезировать некоторые органические соединения (аминокис-
лоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины), необ-
ходимые для построения нового клеточного материала, назы-
ваются ауксотрофами. Ауксотрофные свойства микроорганиз-
мов связаны с нарушением нормальных биосинтетических
процессов. Последние в свою очередь связаны с блокирова-
нием специфических химических реакций превращения веществ
вследствие нарушения активности соответствующих фермент-
ных систем. Для нормального роста и жизнедеятельности
ауксотрофов соединения (факторы роста), синтез которых нару-
шен, необходимо вводить в питательные среды. Следует отме-
тить, что одно и то же вещество для различных микроорганиз-
мов может быть необязательным, нли действовать как стиму-
лятор, или быть необходимой составной частью питательной
среды. Факторы роста микроорганизмов нельзя рассматривать,
как катализаторы процессов роста. Эти соединения необхо-
димы клеткам в малых дозах и используются для синтеза фи-
зиологически активных веществ, регулирующих внутриклеточ-
ный метаболизм. Потребность микроорганизмов в факторах
роста не является постоянной, оиа может меняться в зависимо-
сти от условий нх культивирования.
Микроорганизмы могут быть ауксотрофными по одной или
более из 20 аминокислот, которые входят в состав белков (рис.
31
L-аланин
L-валин
Н Н
О
н сн
На
к-изолейцин
СН3
L-лизин
L-агларагиновая
кислота
к-глутамшоСая
кислота
L -серин
Н—N-C—С'
Н-
О
Z -Лейцин
н н о
V । \
II сн2 о
сн
н8с/Хчсн3
11
Н СН2
он
Н СН2 О"
СН,
СН2
н,мт—сн2
L-аргинин
НН О
|+ I //
-N1
I
н
HN
. и
L-треонин
L -цистеин
Н Н О
L- пролин
Z -метионин
НН О
L -аспарагин
НН о
L ।
И—)|Г-С—С\
Н СН, от
• С—nh2
о
L-глутамин
О
н
П Н
Ц I 4
? I с\
н сн2 о
-N— С—С
сн2
с—nh2
II
о
Н С112 о~
Ан
И СН,
сн.
s—сн3
L-гистидин
НН р
1.1
II— N-C—С.
Н СН.
e-N
II >н
НС~
ХН
32
1.11). Обычно микроорганизмы нуждаются в £-аминокисло-
тах, но для некоторых нз них характерна потребность в D-ала-
нине, необходимом, вероятно, для синтеза гликопептида кле-
точной стенки. Концентрации аминокислот, обеспечивающие
максимальный рост ауксотрофов, обычно находятся в пределах
20—50 мкг иа 1 мл.
Некоторые микроорганизмы нуждаются в пуриновых и пи-
римидиновых основаниях или их производных, входящих в со-
став нуклеиновых кислот. Эти вещества нужны в основном
в качестве строительного материала для нуклеотидов. Одно из
пуриновых оснований—аденин — входит не только в нуклеино-
вые кислоты, ио и в состав коэнзимов, в частности коэнзима
А (КоА). Концентрации пуринов и пиримидинов, необходимые
для максимального роста микроорганизмов, обычно состав-
ляют 10—20 мкг/мл.
Витамины группы В были первыми факторами роста, по-
требность в которых была обнаружена у микроорганизмов.
Каждый из витаминов выполняет определенную биохимиче-
скую функцию в микробной клетке. Почти все витамины
группы В являются активными группами ферментов (играют роль
коферментов или входят в их состав), участвующих в переносе
атомов водорода, остатка фосфорной кислоты нлн групп СНз
и т. д. Отдельные витамины не только выполняют в жизни ми-
кроорганизмов биохимические функции, но и используются для
синтеза нуклеопротеидов. В связи с этим отсутствие витаминов
в микробной клетке приводит к нарушениям обмена веществ и
делает рост микроорганизмов невозможным. Известно около
15 витаминов, по которым микроорганизмы могут быть ауксо-
трофными. Концентрации витаминов, необходимые для макси-
мального роста микроорганизмов, различны, но довольно низки
(обычно 1—50 мкг/мл).
Для синтеза клеточных компонентов необходимы различные
вещества. В питательной среде должны присутствовать все эле-
менты, из которых строится клетка, и притом в таких количе-
ствах и форме, которые микроорганизмы способны усваивать.
Количество минеральных веществ, содержащихся в бактери-
альных клетках, составляет 2—14 % к их сухой массе. В боль-
ших количествах (около 10 3 -IO-4 М) необходимы углерод,
водород, кислород, азот, фосфор, сера, калий, кальций, же-
лезо, магний.
Многим микроорганизмам необходимы также н микроэле-
менты (около 10~6—IO 8 М): медь, цинк, кобальт, никель, хлор,
натрий, кремний, молибден, марганец и др. Элементы -мине-
рального питания выполняют не только структурную, но и
функциональную роль. Железо, например, необходимо для
синтеза пероксидазы, каталазы, тогда как цинк способствует
превращению продуктов расщепления углеводов в составные
части клетки. Магний активирует целую группу ферментов,
2 Заказ № 1536 33
ответственных за процессы брожения н дыхания. Кальций мо-
жет влиять на избирательную сорбцию клеток, снижая прони-
цаемость протоплазмы.
Глава 2. ТИПОВАЯ СХЕМА
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО
ПРОИЗВОДСТВА
В микробиологической практике для культивирования аэ-
робных микроорганизмов применяют поверхностный нли глу-
бинный способы.
Прн поверхностном способе микроорганизмы культивируют
на твердых (увлажненные отруби) или жидких питательных
средах. Твердые среды распределяют слоем 18—20 см в спе-
циальных кюветах. Процесс культивирования начинается с за-
сева стерильной питательной среды посевным материалом и
заканчивается накоплением максимального количества про-
дукта. Засеянные кюветы выдерживают в специальных рас-
тильных камерах при определенной температуре и аэрации.
Глубинный способ выращивания применим как для аэробных,
так и для анаэробных микроорганизмов. Культуры при этом
развиваются во всей толще жидкой питательной среды в фер-
ментаторе.
Выращивание микроорганизмов глубинным способом можег
быть периодическим или непрерывным (проточным). Прн пе-
риодическом способе в ферментатор загружают весь объем пи-
тательной среды. После стерилизации и охлаждения в нее вно-
сят посевной материал. Выращивание происходит при опти-
мальных условиях, обеспечивающих накопление необходимого
количества микробной массы (например, кормовые дрожжи)
или определенного продукта метаболизма (ферменты, амино-
кислоты, антибиотики). Прн периодическом процессе изменя-
ется скорость роста, физиолого-биохнмическне и морфологиче-
ские показатели культуры, состав питательной среды (умень-
шается концентрация питательных веществ), увеличивается
содержание продуктов метаболизма.
Любое микробиологическое производство можно предста-
вить в виде последовательно выполняемых технологических
стадий или этапов. Общим для всех производств являются
стадии подготовки питательной среды, получения посевного
материала, выращивания производственной культуры в по-
верхностных или глубинных условиях и выделения конечного
продукта. В каждом конкретном микробиологическом произ-
водстве есть свои отличительные особенности. Они выражаются
в составе используемых питательных сред и способах их при-
готовления, условиях культивирования производственной куль-
34
туры н методах выделения конечного продукта. Однако эти
особенности ие меняют общую схему микробиологического про-
изводства.
В этой главе будут рассмотрены отдельные технологические
стадии типового микробиологического производства.
2.1. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Одним нз основных факторов, влияющих иа быстрый рост
микроорганизмов и максимальный синтез ими различных био-
логически активных веществ, являются питательные среды.
При подборе питательной среды следует учитывать ее полно-
ценность, т. е. обоснованный и сбалансированный набор раз-
личных питательных соединений, необходимых микроорганизму
для построения растущей клетки н синтеза конечного целевого
продукта.
Для нормального роста и развития микроорганизмов в пи-
тательной среде должны присутствовать все элементы, нз ко-
торых формируется клетка. Многим микроорганизмам для ро-
ста в той или иной питательной среде необходим целый ряд
дополнительных условий: определенные концентрации водород-
ных ионов, окислительно-восстановительный потенциал среды,
требуемые соотношения различных нонов. Некоторые микро-
организмы с нарушенными наследственными признаками (аук-
сотрофные мутанты) нуждаются в отдельных факторах роста,
которые они сами синтезировать не могут: аминокислотах, пу-
ринах, витаминах и др.
Для получения продуктов микробиологического синтеза
в зависимости от мнкроор га низма-пр оду цента и технологии
производства используются отличные по составу питательные
среды. В одном технологическом процессе для получения и
размножения посевного материала и для стадии производ-
ственного культивирования могут применяться питательные
среды различного состава.
Основными компонентами питательной среды являются ис-
точники углерода и азота.
Углеродсодержащее сырье. Наиболее характерным углерод-
содержащнм сырьем являются углеводы. Углеводы — одна нз
важнейших составных частей питательной среды для выращи-
вания микроорганизмов. Они используются для синтеза кле-
точных структур и одновременно служат источником энергии.
Для промышленного биосинтеза наиболее часто применяют
глюкозу нли крахмал. В среды для культивирования вводят
техническую глюкозу или маточник (гндрол), остающийся по-
сле выделения кристаллической глюкозы. Гндрол содержит до
50 % редуцирующих сахаров (в пересчете на глюкозу).
При введении в среду технических продуктов их количе-
ство рассчитывают по содержанию редуцирующих веществ
2* 35
в пересчете иа чистые углеводы. Так, в частности, поступают при
нспользоваини в составе сред гидролизатов различных отхо-
дов переработки сельскохозяйственного сырья (подсолнечная
лузга, кукурузные кочерыжки, древесная щепа и др.).
Крахмал, на 96—97,5 % состоящий нз полисахаридов, кото-
рые образуют при кислотном гидролизе глюкозу, может быть
использован теми микроорганизмами, которые способны к био-
синтезу амилолитических ферментов.
Азотсодержащее сырье. Биосинтез многих биологически ак-
тивных веществ осуществляют иа питательных средах слож-
ного, а зачастую непостоянного химического состава. В них
различные источники азота могут быть представлены белками,
пептидами или свободными аминокислотами. При промышлен-
ной ферментации используют кукурузный экстракт, соевую
муку или гидролизаты дрожжей. Кукурузный экстракт содер-
жит весь комплекс аминокислот, ио нх количественный состав
может значительно изменяться от партии к партии. Пример-
ный химический и аминокислотный состав кукурузного экст-
ракта представлен ниже.
Химический состав кукурузного экстракта, % к СВ
Белки 40-52
Общий азот Около 10
Аминный азот (определенный медным способом) 3
Крахмал 0,5 % об.
Растворимые углеводы 22—27
Молочная кислота 0,7 % об.
Зола 15—25
в том числе калий 3,5—5
Прочие вещества 4,6
Биотнн 1000—2000 мг/т
Содержание СВ в экстракте должно быть не меиее 48 %.
Аминокислотный состав кукурузного экстракта, г/кг СВ
Глиции 18,17
Аланин 24,70
Валин 19,64
Лейцин 35,38
Изолейции 6,57
Серии 17,65
Треонии 14,05
Аспарагиновая кислота 26,88
Глутаминовая кислота 64,95
Лнзии 16,72
Аргинин 14,81
Цистин 0,26
Метионин 6,60
Фенилаланин 12,77
Пролин 33,08
Тирозин 8,28
Гистидин 14,36
Белковыми веществами богата соевая мука. Она так же, как
и кукурузный экстракт, содержит все распространенные амино-
кислоты, однако в основном онн связаны в виде белков. При
оценке природных веществ (соевая мука, кукурузный экстракт
н т. п.) следует принимать во внимание, что их воздействие па
направленный процесс обмена веществ микроорганизмов обус-
ловливается не только наличием белков и аминокислот, но и
присутствием наряду с ними углеводов, нуклеиновых кислот,
36
жиров, микроэлементов, органических кислот и других соеди-
нений.
Из минеральных азотсодержащих веществ наиболее часто
применяют аммонийные соли серной, соляной или азотиой
кислот. Как показала практика, сульфат аммония оказался
пригодным для биосинтеза многих соединений.
В веществах, содержащих аммонийный азот, иои аммония
находится в сочетании с анионом какой-либо кислоты, например
серной или фосфорной. Потребность микроорганизмов в сере и
фосфоре меньше, чем в азоте, поэтому прн использовании азота
в среде будут накапливаться анионы и будет повышаться кис-
лотность среды. Во избежание этого в процессе культивирова-
ния микроорганизмов в среду добавляют мел или ведут подтит-
ровку щелочью.
Влияние источников азота на биосинтез зависит непосред-
ственно ие только от самого источника азота, но и от общего
состава среды. Существенное значение имеет соотношение коли-
честв присутствующих в среде азота и углерода. Их дозировку
необходимо регулировать в соответствии с оптимальными гра-
ницами концентрации наиболее важных веществ для данной
культуры. Для каждого штамма-продуцеита эта величина будет
различной.
Приготовление и стерилизация питательных сред. Для при-
готовления производственной питательной среды предвари-
тельно растворяют сахара и солн, тщательно суспендируют та-
кие нерастворимые компоненты, как соевая мука или мел. Крах-
малсодержащее сырье предварительно клсйстеризуют. Для
ускорения эти процессы проводят в небольших аппаратах с ме-
шалками (реакторы), а затем растворы смешивают в закры-
том смесителе-реакторе с плоским диом, снабженным барбо-
тажным устройством для ввода пара. Концентрат среды, состав-
ляющий около одной трети необходимого объема, для оконча-
тельного растворения и суспендирования нагревают острым
паром до 70—80 °C. При этой температуре не происходит раз-
ложения термолабнльиых компонентов среды. Приготовление
более концеитрироваииых сред дает возможность использовать
смесители меньшей вместимости.
Необходимое условие успешной стерилизации питательной
среды — тщательная гомогенизация ее твердых компонентов.
Длительность выдержки (при температуре стерилизации) круп-
ных частиц, медленно прогревающихся при стерилизации, бы-
вает меньше расчетной, и в них сохраняется посторонняя микро-
флора, способная инфицировать культуральную жидкость.
Результаты исследований процесса перемешивания свиде-
тельствуют о том, что скорость растворения вещества в жидко-
сти пропорциональна мощности мешалки, приходящейся на еди-
ницу объема жидкости. В связи с этим реакторы для приготов-
ления питательной среды должны быть снабжены достаточно
37
w Таблица 2.1 Характеристика перемешивающих устройств
Типы перемешивающих устройств Схема Вместимость вертикаль- ных аппаратов, м3 Вязкость перемеши- ваемой среды. Па-с Окружная скорость концов ло- пастей, м/с Область применения
Лопастные =ф= 1-50 0,001—0,5 0,05-3 1,5-5,0 1,5-3,2 Перемешивание взаиморастворяющихся жидкостей средней вязкости; грубое эмуль- гирование; взвешивание твердых частиц в жидкой среде при их концентрации до 90 %; взвешивание волокнистых частиц; взмучивание легких осадков; медленное растворение кристаллических, аморфных и волокнистых веществ; выравнивание тем- пературы среды; перемешивание при крис- таллизации
Листовые ° i о „о О о о 1—50 0,001—0,05 0,5-5,0 Растворение жидкостей малой вязкости; взвешивание твердых частиц в жидкой сре- де; растворение кристаллических веществ; интенсификация теплообмена
Якорные
обычные
1—10 0,001—10 0,5-4,0
Перемешивание вязких и тяжелых жидкос-
тей; интенсификация теплообмена; предот-
вращение выпадения осадков на стенках
н днище при опасности их пригорания;
взвешивание твердых частиц в вязких
средах
с подъемом сту-
пицы
с перекладиной
1-10 0,001-10 0,5—4,0 Перемешивание вязких и тяжелых жидкос-
10-50 [0,001—10 0,5-4,0 тей; интенсификация теплообмена; предот- вращение выпадения осадков на стенках и днище при опасности их пригорания; взвешивание твердых частиц в вязких средах То же
с подъемом сту-
пицы и с пере-
кладиной
Рамные
обычные
10-50 0,001—10 0,5—4,0
1-50 0,001—10 0,8-7,0 э
с подъемом сту-
пицы
1-50
0,001-10 0,8-7,0
10-40 0,8-4,0
о
Продолжение
Рамные
для аппаратов
с коническим
днищем
Пропеллерный
обычные
с направляю-
щей трубой *
или диффузо-
ром
Типы
перемешивающих
устройств
Схема Вместимость вертикаль- ных аппаратов, м;| Вязкость перемеши- ваемой среды. Па'С Окружная скорость концов ло- пастей, м/с
Область применения
1-12,5
0.001-10
10-40
0,8—7,0
0,8—4,0
Перемешивание вязких и тяжелых жидкос-
тей; интенсификация теплообмена; предот-
вращение выпадения осадков на стейках
и днище при опасности их пригорания;
взвешивание твердых частиц в вязких средах
с направляющей
разъемной тру-
бой *
Турбинные
закрытого типа
открытого типа
1—50
0,001—1
1-25
2,5—12,0
2,5-7,5
1—50 0,001 — 10 2,5—10,0
10—40 2.5—7,0
1—50
0,001—0,1
0,1—4
0,001-0,1
0,1—4
Растворение и эмульгирование жидкостей
(в том числе существенно различающихся
по плотности); взвешивание кристалличес-
ких и аморфных твердых частиц прн их
концентрации до 80 %; взвешивание волок-
нистых частиц при их концентрации
до 5 %; интенсификация теплообмена; пе-
ремешивание при растворении газа в жид-
кости и при экстракции
Растворение и эмульгирование жидкостей;
взвешивание кристаллических и аморфных
твердых частиц при их концентрации
до 80 %; взвешивание волокнистых частиц
при их концентрации до 5 %; взмучива-
ние твердых частиц размером до 1,5 мм
при их концентрации до 60 %; выравни-
вание температур; перемешивание вязких
жидкостей
3,8—16,0 Растворений и эмульгирование жидкостей;
3,8—10,0 взвешивание твердых частиц при их кон-
центрации до 50 %; взмучивание шламов
твердых частиц размером до 0,1 мм при
концентрации до 10 %; перемешивание
волокнистых материалов; выравнивание
температур; интенсификация теплообмена
3,8-16,0
3,8—10,0
То же
1—50 0,1^1 3,8-10,0
* Пропеллерные мешалки с направляющей трубой рекомендуется использовать при удлиненной форме аппарата
(Яап/Пап > I »5).
Рис. 2.1. Нагрев и охлаждение пита-
тельной среды в процессе периодиче-
ской стерилизации:
П — пар: К — конденсат; ХВ — холодная
вода
Рис. 2.2. Изменение температуры эле-
ментарного объема жидкости при
стерилизации:
1 — непрерывной; 2 — периодической
мощными мешалками, а также перегородками-отражателями,
ие допускающими завихрения и вращения жидкости в аппаратах
(табл. 2.1).
В табл. 2.1 приведены основные типы перемешивающих уст-
ройств и указаны области их применения. Состав используемых
в производстве питательных сред обусловливает применение
определенных типов перемешивающих устройств как в аппара-
тах для подготовки отдельных видов сырья (разбавление ме-
лассы и клейстер изация крахмала), так и в самом реакторе
(смесителе) для приготовления питательной среды. Если необ-
ходимо среду подвергнуть циклической стерилизации, то эту
операцию можно осуществить в ферментаторе. При этом среда
и оборудование стерилизуются одновременно (рис. 2.1).
На рис. 2.1 приведены возможные схемы нагрева и охлажде-
ния ферментатора. Чаще всего используют комбинированный
нагрев острым паром и через рубашку или змеевик. Для цикли-
ческой стерилизации, как правило, установлено, что наиболее
удобно и экономически выгодно поддерживать температуру
121 °C, что соответствует давлению насыщенного пара 100 кПа.
В обычных условиях питательные среды выдерживают при тем-
пературе стерилизации от 30 до 40 мин. Полный цикл нагрева-
ния, выдержки и охлаждения для крупных ферментаторов
(63 м3) исчисляется несколькими часами (рис. 2.2).
Метод циклической стерилизации среды в аппарате очень
прост. Однако ои имеет существенные недостатки по сравне-
нию с непрерывным методом. Во-первых, ухудшается качество
питательной среды из-за более длительного воздействия высокой
температуры, чем при непрерывной стерилизации, что наглядно
видно из рис. 2.2. Во-вторых, требуется повышенный расход
пара в период нагрева среды, и, в-третьих, циклический процесс
труднее поддается автоматизации. Поэтому в настоящее время
его применяют для стерилизации среды только в аппаратах ма-
лого объема.
Тепловая стерилизация приводит к определенным химиче-
ским изменениям в составе питательной среды. Некоторые иа
42
них сводятся к разложению нестойких к нагреванию соединений,
что приводит к потере необходимых для питания микроорга-
низма веществ. При других изменениях происходит взаимодей-
ствие различных компонентов среды, в частности между аммо-
нийными или аминосоедииеииями и углеводами, что приводит
к образованию продуктов, ингибирующих рост микроорганизмов.
Большинство изменений химических ингредиентов среды воз-
никает при температурах выше, чем температура стерилизации.
Следовательно, эффективная стерилизация в сочетании с ми-
нимальными изменениями среды может быть достигнута путем
применения более высокой температуры, а также быстрого на-
гревания и охлаждения. В циклических системах это обеспечи-
вается с помощью глухого пара, проходящего через змеевики
или нагревающие рубашки, и с помощью острого пара, инжекти-
руемого через штуцера для засева, подачи воздуха и взятия проб.
В результате такого приема вся арматура, соединенная с фер-
ментатором, стерилизуется проходящим острым паром. Обра-
ботка острым паром приводит к образованию конденсата.
В связи с этим необходимо заранее учитывать разбавление
среды конденсатом и вносить соответствующую поправку в про-
пись первоначально приготавливаемого состава среды. Тогда
к концу стерилизации среда будет иметь необходимую концент-
рацию всех питательных компонентов. Если стерилизацию уг-
леводов проводить отдельно, а затем добавлять их асептически
к остальной заранее простерилизоваиной среде, то можно пре-
дотвратить реакцию между углеводами и другими составными
компонентами среды. Те компоненты, которые в высшей степени
чувствительны к воздействию тепла, также могут быть просте-
рнлизованы раздельно. При этом для стерилизации может при-
меняться облучение или фильтрация через обеспложивающие
фильтры.
Ранее нами были отмечены преимущества высокотемператур-
ной кратковременной стерилизации как приема, позволяющего
свести к минимуму ухудшение питательных качеств среды без
снижения эффективности самой стерилизации. Такой прием наи-
более результативно может быть реализован при использовании
системы непрерывной стерилизации в потоке (рис. 2.3). Среда
готовится в отдельной емкости /, а затем насосом 2 прокачива-
ется через установку для стерилизации в заранее простерилизо-
ваниый ферментатор. Установка непрерывной стерилизации
состоит из последовательно соединенных секций (аппаратов):
нагревателя 3, выдерживателя 4 и холодильника 5. В такой си-
стеме можно применять более высокие температуры, чем те,
которые могут считаться экономичными при циклической стери-
лизации. В результате продолжительность выдерживания среды
при максимальной температуре резко сокращается, а периоды
нагревания и охлаждения ие превышают нескольких секунд
(см. рис. 2.2).
43
Рис. 2.3. Схема уста-
новки для стерилизации
питательной среды
Для среды, свободной от суспендированных твердых частиц,,
поддержание температуры на уровне 150—160 °C обеспечивает
мгновенную стерилизацию. При этом химические изменения, ко-
торые происходят в среде, настолько несущественны, что ими
можно пренебречь. Если в среде присутствуют твердые суспен-
дированные частицы, то оптимальная для стерилизации темпе-
ратура должна иметь более низкое значение, поскольку требу-
ется дополнительное время для проникновения тепла внутрь
таких частиц. Это значение будет определяться природой суспен-
дированных частиц, а также допустимой в каждом отдельном
случае степенью начального изменения состава среды. Наиболее
распространенной в таких случаях считается температура сте-
рилизации, равная 135 °C, а длительность выдерживания от 5-
до 15 мин. Во всех случаях непрерывной стерилизации охлажде-
ние среды практически осуществляется в теплообменниках типа
труба в трубе или в противоточных пластинчатого типа, а нагре-
вание— путем инжектирования острого пара.
Различные типы секций, используемые в системе непрерыв-
ной стерилизации, представлены на рис. 2.4. Экономичное по-
требление пара может быть достигнуто включением в систему
специальной регенеративной ступени для предварительного по-
догрева холодной нестерильной среды. Непрерывная стерилиза-
ция дает возможность воспроизвести одинаковую степень хими-
ческих изменений среды при различных масштабах производ-
ства. Кроме того, на предприятии резко снижаются колебания
в потреблении пара и воды.
К каждому из аппаратов системы стерилизации предъявля-
ются различные технологические требования, и в зависимости
от режима и масштабов производства конструкция каждого из
этих аппаратов может быть неодинаковой.
Основное требование, предъявляемое к нагревателю,— бы-
стрый нагрев до температуры стерилизации при наименьшей
затрате пара.
Нагреватель (рис. 2.5) обычно представляет собой ко-
лонку, изготовленную из двух труб. Наружная труба является
корпусом. Пар подается сверху по внутренней трубе 5 со щеле-
видиыми прорезями, через которые он поступает в среду, и за
44
Рис. 2.4. Типы секций непрерывных сте-
рилизаторов:
С — стерилизуемая среда; П — пар; К — кон-
денсат; В- вода; а — секция нагрева; б —
секция выдержки: в — секция охлаждения
Рис. 2.5. Схема нагревательной колонны
для стерилизация питательной среды
Пар
10—15 с нагревает каждый объем ее. Питательная среда пода-
ется снизу через штуцер 4, нагретая среда до температуры сте-
рилизации выходит через штуцер 2. Движение среды происходит
по спирали благодаря наличию винтовых направляющих Л При
остановке колонки сброс конденсата проводят через патрубок 5
при открывании крана 6. Аппарат отличается простотой и ма-
лыми размерами, но работа его -сопровождается гидравличе-
скими ударами при конденсации пара и потерей конденсата.
В струйном нагревателе интенсивная турбулентность потока
среды и пара предотвращает гидравлические удары и отложе-
ние осадков.
Основное требование, предъявляемое к выдержива-
телю,— постоянство длительности пребывания в нем каждого
объема среды при определенной температуре стерилизации.
Чтобы продолжительность выдержки была постоянной, несте-
рильная среда, поступающая в аппарат, не должна смешиваться
со стерильной средой, выходящей из него. Иными словами, вы-
держиватель должен работать по принципу полного вытеснения.
На рис. 2.6 показан трубчатый выдерживатель (стерилизатор).
Он имеет входной штуцер 1 и состоит из трех труб 2, соединен-
ных последовательно переходными штуцерами 3. На выходной
45
Рис. 2.6. Схема выдерживателя
Рис. 2.7. Теплообменник типа труба
в трубе
трубе установлен автоматический регулятор давления 5 в вы-
держивателе в соответствии с температурой стерилизации. Вы-
держиватель оборудован манометром 4 и термометрами 6. Для
опорожнения труб предусмотрены пробки 7.
Холодильник — наиболее крупногабаритный и дорогой
аппарат в системе непрерывной стерилизации. Температура сре-
ды поддерживается на нужном уровне с помощью водопровод-
ной воды, которая циркулирует в рубашке, поэтому малейшее
нарушение герметичности стенки, через которую происходит
теплопередача, может вызвать инфицирование питательной
среды.
Герметичной, хорошо сохраняющей стерильность конструк-
цией является двухтрубный теплообменник (типа труба в трубе)
сварной конструкции (рис. 2.7). Для большей гарантии герме-
тичности среда подается по внутренней трубе теплообменника.
Теплообменник пластинчатого типа в отличие от двухтрубного
более компактен. Он также отличается хорошей герметичностью,
высоким коэффициентом теплопередачи, наряду с этим имеет
большую поверхность теплообмена на единицу объема аппарата.
2.2. ОЧИСТКА И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ВОЗДУХА
Методы очистки и стерилизации воздуха. Культивирование
микроорганизмов — продуцентов биологически активных ве-
ществ в глубинных условиях помимо собственно биосинтеза
включает ряд вспомогательных технологических операций.
Прежде всего это получение сжатого стерильного воздуха, по-
даваемого на аэрацию, приготовление и стерилизация питатель-
ной среды, подготовка оборудования. Эти операции во многом
определяют качественные и количественные показатели про-
цесса биосинтеза, поэтому к их аппаратурному оформлению
и режиму работы предъявляют повышенные требования.
При выращивании микроорганизмов в глубинных условиях
требуется непрерывная подача стерильного воздуха в фермен-
46
таторы, на аэрацию культуральной жидкости. Воздух, подавае-
мый в ферментатор, не только снабжает растущую культуру
кислородом, но и отводит газообразные продукты обмена и
физиологическое тепло, выделяемое микроорганизмами в про-
цессе развития, позволяет достигать однородности микробной
суспензии, увеличивает скорость массопередачи и перемешива-
ния жидкой питательной среды.
V Очистка и стерилизация воздуха достигаются различными
способами, предусматривающими прежде всего уничтожение
микроорганизмов или их отделение. Используются методы га-
зовой очистки или применение антисептиков (фенол- и ртуть-
содержащих соединений), повышенные или пониженные темпе-
ратуры, ультрафиолетовые облучения, ионизирующие излучения.
Примеры промышленного использования антисептиков, повы-
шенных или пониженных температур и других факторов свиде-
тельствуют о их ненадежности. Более того, эти сложные приемы
мало экономичны из-за высокой устойчивости спор и конидий
к высоким температурам и ионизирующим излучениям. В про-
цессах микробиологического синтеза воздух, подаваемый на
аэрацию, должен быть очищен на 99,9999999 % от примесей
и микроорганизмов размером до 1 мкм. Это требование застав-
ляет отказаться от многих методов газовой очистки (седимен-
тация, механическая фильтрация, инерционные и центробежные
методы, аппараты мокрой очистки) как неэффективных, обеспе-
чивающих удаление только грубых частиц.
Применение электрофильтров дает возможность очистить
воздух только и а 85—99 %.
Наибольшее распространение получил метод фильтрации
воздуха через волокнистые (маты, бумага, картон), пористые
(полимеры, металлокерамика) или зернистые материалы,. Та-
кие материалы недорогостоящи в изготовлении и обладают вы-
сокой эффективностью стерилизации. Несмотря на то что волок-
нистые фильтры имеют диаметр ие менее 5 мкм н слабое уплот-
нение (промежутки не менее 50 мкм), они легко задерживают
большинство микроорганизмов со средним размером около 1 мкм.
Обработку технологического и вентиляционного воздуха необ-
ходимо рассматривать как элемент технологии, играющий суще-
ственную роль в обеспечении выпуска продукции высокого ка-
чества. _
Системы стерилизации воздуха классифицируются по техно-
логическим признакам:
1) подготовка и подача воздуха или смеси газов на аэрацию
культуральной жидкости в ферментаторах при аэробном куль-
тивировании;
2) подготовка и подача инертных газов (диоксид углерода,
азот или их смеси) для «отдувки» из культуральной жидкости
газообразных продуктов, ингибирующих рост микроорганизмов
при анаэробном культивировании;
47
Рис. 2.8. Технологическая схема очистки воздуха:
/ — фильтр предварительной очистки воздуха; 2 — турбокомпрессор; 3 — теплообменник-
охладитель; 4— влагоотделитель; 5— теплообменник-нагреватель; б—головной фильтр;
7 — индивидуальный фильтр
3) подготовка и подача (транспортного) сжатого воздуха и
обеспечение вакуума для передачи микробных суспензий и
стерильных жидкостей из одной емкости в другую (фермента-
торы, дозаторы, мерники н т. д.) или в аппараты для дальней-
шей обработки (центрифуги, сепараторы, отстойники, испари-
тели, флотаторы);
4) очистка воздуха или смеси газов, отводимых от всех ви-
дов технологического оборудования.
Каждая из этих систем имеет свои особенности, но процессы
стерилизации связаны общей теоретической основой.
Технологическая схема очистки и стерилизации воздуха для
аэрации. В настоящее время широко применяется технологиче-
ская схема получения, очистки и стерилизации сжатого воздуха,
включающая следующие стадии: предварительную (грубую)
очистку от механических примесей, сжатие, охлаждение, отделе-
ние сконденсированных паров влаги и масла (при поршневых
компрессорах), стерилизацию (рис. 2.8). Для защиты компрес-
сора атмосферный воздух предварительно очищают от крупных
частиц пыли, а затем сжимают до требуемого давления. При
сжатии воздух нагревается до температуры 100—200 °C, поэтому
его необходимо охладить до оптимальной температуры культи-
вирования микроорганизма-продуцента. Температура воздуха,
подаваемого на аэрацию, оказывает существенное влияние на
накопление конечного продукта. Например, микроорганизмы-
продуценты антибиотиков снижают продуктивность при тем-
пературе воздуха, поступающего в аппарат, выше 40 °C. Опти-
мальная температура роста этих микроорганизмов 27 —28 °C. * г
Получение сжатого, очищенного от микроорганизмов воздуха /
определенной температуры и влажности — сложная технологи-
ческая задача, осуществляемая в специальной системе. Система
состоит из трех частей, соединенных последовательно: в первой
части происходят очистка атмосферного воздуха от пыли и его
сжатие, во второй — подготовка н поддержание воздуха в опти-
48
мальмом термодинамическом состоянии по влажности и темпе-
ратуре, в третьей — окончательная очистка воздуха (в фильтрах
тонкой очистки) перед подачей в ферментаторы. Поддержание
определенной температуры сжатого воздуха обусловливается
не только самой культурой микроорганизма, но и высоким вла-
госодержанием атмосферного воздуха. При охлаждении сжатого
воздуха выпадает 50—70 % исходной влаги, которая увлажняет
волокна аэрозольных фильтров, и эффективность их действия
резко снижается. Чтобы насадкн аэрозольных фильтров не
увлажнялись, воздух после компрессора охлаждают до 25—
30 °C. После отделения влаги воздух нагревается до темпера-
туры культивирования. Окончательное подсушивание воздуха
может проводиться в сушилке между головным и индивидуаль-
ными фильтрами.
*На предприятиях микробиологической промышленности очи-
стка и стерилизация воздуха осуществляется с помощью си-
стемы различных фильтров: предварительной очистки периоди-
ческого или непрерывного действия, грубой и тонкой, очистки.
Фильтры предварительной о ч и с т к и. у Фильтры
такого типа устанавливают на всасывающей линии перед ком-
прессором. Путем инерционного осаждения очищают воздух от
крупных частиц размером более 5 мкм.^В фильтрующих ма-
териалах предусматриваются большие промежутки между улав-
ливающими элементами для максимального снижения сопротив-
ления потоку при высокой скорости фильтрации воздуха — 1,5—
3,0 м/с.|1Чтобы сухие частицы после осаждения при такой скоро-
сти потЪка ие выносились из фильтра, слои его промасливают.
Фильтры этого класса часто называют масляными,-^или висци-
л оными.
К фильтрам периодического действия относятся кассетные
регенерируемые масляные фильтры н кассетные фильтры сухого
типа.
Кассетные регенерируемые масляные фильтры различаются
по размерам, форме и виду фильтрующей среды. Наибольшее
распространение получили сеточные фильтры типа ФЯР. Такие
фильтры просты, надежны в эксплуатации, улавливают микро-
организмы и частицы пыли размером более 5 мкм. Кассетные
регенерируемые масляные фильтры работают с номинальной
производительностью при запыленности воздуха ие более
5 мг/м3. Такой фильтр задерживает на поверхности насадки
92—99 % воздушной пылн. Продолжительность его эксплуата-
ции без регенерации зависит от степени загрязненности воздуха.
Если содержание пыли возрастает от 0,5 до 5,0 мг/м3, то дли-
тельность работы фильтра сокращается с 800 до 80 ч.
| Кассетные фильтры сухого типа состоят из 10—15 слоев пер-
форированных металлических и винипластовых листов. Площадь
рабочего сечення 0,22 м2, производительность 0,43 м3/с, скорость
фильтрации 117 м/мин, начальное сопротивление фильтра 49 Па,
49
Рис. 2.9. Самоочищающийся мас-
ляный фильтр:
1—механизм промывки сеток; 2 —
сетки; 3 — маслосъемник; 4 — система
Подогрева масла; 5 — бак; 6 — шнек
Рис. 2.10. Рулонный автоматиче-
ский фильтр:
/—камера для чистого рулона; 2—
мат; 3 — предохранитель, предотвра-
щающий выход мата на пазов; 4 —
блок управления; 5 — электродвига-
тель с редуктором; 6 —опорная сетка
пылеемкость 400—450 г/м2, эффективность очистки 70 %, масса
фильтра 5 кг. В кассетных сменных фильтрах сухого типа в ка-
честве фильтрующего материала можно применять пенополиуре-
тан, стеклянное или химическое волокно, маты из нетканых ма-
териалов. Эти фильтры свободны от недостатков, которые при-
сущи масляным фильтрам,— запах, унос масла. Эффективность
очистки воздуха в таких фильтрах составляет 70—85 %, пыле-
емкость 200—400 г/м2, производительность 0,43—0,610 м3/с.
<Фильтры непрерывного действия существуют трех типов:
самоочищающиеся масляные с непрерывной регенерацией фильт-
рующей поверхности в ванне с маслом; рулонные (катушечные),
в которых чистый фильтрующий материал непрерывно поступает
с одной катушки, а использованный наматывается на другую;
волокнистые, промываемые водой из форсунок.
/Масляные самоочищающиеся фильтры состоят из непре-
рывно движущейся в вертикальной плоскости фильтрующей бес-
конечной панели и масляной ванны (рис. 2.9). При прохожде-
нии через ванну загрязненные участки отмываются от пыли и
вновь промасливаются, а пыль оседает на дне ванны в виде
шлака. При начальной концентрации пыли 1—2 мг/м8 степень
очистки составляет 90—98 %, пылеемкость фильтра исчерпы-
вается через 300—500 ч работы. Производительность таких
фильтров 100—400 тыс. м3/чф
Рулоиные автоматические фильтры имеют производитель-
ность 20, 40, 80 и 120 тыс. м3/ч. На рис. 2.10 приведена схема
работы такого фильтра. Фильтрующим материалом служат уп-
ругие маты из стеклянных синтетических волокон, склеенных
связывающими материалами. Срок непрерывной работы одного
рулона 1 год.
В волокнистых фильтрах используются объемные маты из
волокон полимеров. В результате электростатического притяже-
ния на волокнах улавливаются субмикронные частицы. Фильтры
получили широкое распространение для предварительной очи-
стки и стерилизации приточного воздуха. Производительность
волокнистого фильтра 555 м3/мии.
Фильтры грубой пчистк и \Пр ед назначены для улав-
л нв а1шя-хм^новней^м«ееы---за1^явнеадй, по павшихвТгпетему после
прохождения фильтров предварительной очиеткнчмсомпрессора,
а также для удлинения срока службы фильтров тонкой очистку
выполняющих основной процесс стерилйзациЁГна 'Стадии фильт-
рацииУКак правило, это фильтры большой емкости. Они обслу-
живают несколько ферментаторов и называются головными.
Головной фильтр дублирует работу индивидуальных фильтров
и повышает степень очистки и стерилизации воздуха.
Головной фильтр (рис. 2.11) обычно представляет собой
вертикальный сосуд с решеткой у днища. На решетку уклады-
вают слой стекловаты, а затем слой гранулированного актив-
ного угля высотой 0,8—1,0 см и еще слой ваты. На микробио-
логических предприятиях применяют головные фильтры кассет-
ного типа производительностью 110, 380 и 550 м3/мин. В качестве
фильтрующего материала используют стекловолокно с волок-
нами диаметром 6, 12 и 21 мкм. Головные фильтры стерили-
зуют острым паром в течение 4 ч при давлении 0,12—0,15 кПа,
а затем просушивают сухим воздухом. Головные фильтры
обычно имеют низкое сопротивление (100—200 Па) и высокую
пылеемкость.
Фильтры тонкой очистки. Фильтры тонкой очистки
и стерилизации необходимы для улавливания загрязнений, про-
пущенных другими фильтрами, а также всех возможных за-
грязнений, попавших в систему по случайным причинам. Ра-
бота этих фильтров должна быть особенно надежной, так как
это последняя ступень очистки и стерилизации воздуха иа пути
к ферментатору. Конструктивно фильтры тонкой очистки во
многом похожи иа фильтры грубой очистки, только они зиачи-
я
Рис. 2.11. Головной аэ-
розольный фильтр:
/ и 2 — штуцера выхода и
входа воздуха; 3—штуцер
выхода пара из рубашки;
4 — патрубок для слива
конденсата; 5 — обечайка
фильтрующего элемента;
6 — штуцер для входа па-
ра в рубашку; 7 — уплот-
нительные плнты
Рис. 2.12. Схема аэрозольных фильтров,
изготовленных из волокнистых материалов.
Аппараты конструкции фланцевой Ф1 и Ф2
(о и б) и патронной П (в)
тельно меньше размерами и в них используются более эффек-
тивные фильтрующие материалы (табл. 2.2). В настоящее
время разработано несколько конструкций фильтров тонкой
очистки различной производительности.
На рис. 2.12 представлены схемы фильтров со сменными
фильтрующими элементами из нетканых материалов. В кон-
струкции фильтра тонкой очистки Ф1 и Ф2 используется гото-
вый сменный фильтрующий элемент из базальтового супертон-
кого волокна. Наибольшее распространение для очистки и сте-
рилизации воздуха находят конструкции, в которых использу-
ются быстро заменяемые готовые стандартные фильтрующие
патроны (рис. 2.12, б).
В микробиологической промышленности для очистки и сте-
рилизации воздуха применяют также фильтры марки ФТО. Эти
фильтры набиваются особой устойчивой гидрофобной тканью,
которая полностью очищает воздух от микроорганизмов. Филь-
тры выпускаются различных типов — от ФТО-60 до ФТО-1000.
Цифры означают производительность по воздуху в м3/ч. Марку
фильтра выбирают в зависимости от производительности фер-
ментатора. Фильтрующий элемент фильтра ФТО-750 имеет
диаметр 360 мм и высоту 600 мм. При нагрузке 750 м3/ч сопро-
тивление фильтра составляет 274—294 Па. На рис. 2.13 пред-
ставлена схема фильтра тонкой очистки ФТО-60. В i/атронных
52
фильтрах могут быть использованы бумага
из базальтовых супертонких волокон, гофри-
рованный базальтовый картон и различные
фторопластовые элементы. ^Фильтры тонкой
очистки воздуха практически обеспечивают
100 %-ную очистку и стерилизацию воздуха.
Они стерилизуются острым паром в техноло-
гической обвязке с ферментатором без извле-
чения фильтрующих элементов из корпуса
фильтра. Фильтрующие элементы — пластины
и цилиндрические патроны — служат 1,5—
2 года.
Системы очистки и стерйлизации
в’оздуха. Для надежной работы всей тех-
нологической схемы очистки и стерилизации
воздуха и ее отдельных узлов необходимы
соблюдение определенных требований к тех-
нологической обвязке фильтров, поддержание
♦
Рис. 2.13 Фильтр
тонкой очистки
ФТО-60:
/ — фильтрующий
элемент; 2 — крыш-
ка; 3 — фланец; 4 —
патрубок для прове-
дения стерилизации
определенного термодинамического режима воздуха в системе.
Принципиальная технологическая схемЪ очистки и стерили-
зации воздуха представлена иа рнс. 2.8. Воздух из воздухораз-
борника поступает в фильтр предварительной очистки /. Сжа-
тие воздуха до 350—500 кПа осуществляется в компрессоре 2,
охлаждение до температуры 30—40 °C в холодильнике 3 с по-
следующим отделением образующегося аэрозоля во влагоотде-
лителе 4. На входе и выходе из холодильника температура воз-
духа контролируется приборами. Относительная влажность воз-
духа и температура определяются после выхода из нагревателя
5 термодатчиком. Принцип действия автоматического контроля
параметров воздуха заключается в следующем. Если приборы
регистрируют отклонение температуры от заданной на входе
в фильтр 6, то специальные регуляторы будут воздействовать
на подачу пара в нагреватель таким образом, чтобы изменить
температуру воздуха до величины, определяемой регламентом.
Окончательная стерилизация воздуха осуществляется в инди-
видуальном фильтре тонкой очистки 7. Для оценки эффектив-
ности работы схемы очистки и стерилизации воздуха применя-
ется метод улавливания искусственных аэрозолей. При этом
используются аэрозоли жидкие — масляный туман (0,3 мкм) и
твердые—бактериальный, бихромат калия (0,6—0,8мкм), кра
сители метиленового синего (0,5 мкм).
Контроль эффективности действия фильтров, особенно ин-
дивидуальных, записывается анализатором запыленности очи-
щенного воздуха типа АЗ-З и АЗ-5. Имея высокую чувстви-
тельность— 2—3 тыс. частиц размером 0,3 мкм в 1м3, прибор
позволяет проводить контроль микробиологической обсеменен-
ности воздуха. Для стерилизации фильтров и воздушных линий
применяют чаще всего острый пар. Этот метод создает очень
55-
Таблица 2.2 Характеристика фильтров тонкой очистки с фильтрующими материалами ФП
Марка фильтра Фильтрующая поверхность, м* Наибольшая производи- тельность, м’/с Фильтрующий материал Размеры фильтра, мм Предель- ная тем- пература примене- ния Назначение
дк-о,11 0,11 0.047 1-я ступень — лавсан, 2-я ступень — ФПП-15, ФПП-25, ФПА-15 176X159X 270 60
ДК-0,24 0,24 0,097 То же 355X159X240 60
ДК-0,25 0,25 0,1 > 160X160X308 60
дк-о,б 0,6 0,025 > 355X159X339 60
ДК-0,8 0,785 0,03 > 210x218x378 60 Для очистки воздуха
ДК-1,4 1,38 0,058 > 350x350x300 60 защитных камер, боксов и т. д.
ДК-4,5 4,6 0,19 500X645X350 60
в-о,1 0,1 0,003 ФПГГ-15, ФПП-25, Диаметр 154, 40
ФПА-15 длина 130
В-0,4 0,4 0,017 То же Диаметр 148, длина 198 40
В-0,5 0,5 0,02 » 224X254X160 40
В-1 1,0 0,04 » 250X266X310 40
В-2 2,0 0,11 224X334x504 40
ФБ-0,5 0,5 0,02 ФПП-25 235X235X256 60 Для очистки и стерили-
зации технологических
сдувок (предусматри-
вается возможность бы-
строй смены фильтра)
ФБ-2 2,0 0,06 То же 330X300X390 60 То же
ФБ-Ю 10,0 0,285 > 510X510X552 60 >
ФБ-17 17,0 0,7 ФПП-15, ФПП-25, ФПА-15 610X620X572 60 Для приточной и вы- тяжной вентиляции
ДУ-200 5,3 0,28 ФПП-15, ФПА-15 502 X 516 X 705 60 Для местной вентиляции
ДУ-350 17,0 0,98 > > 764 X 593X 870 90 > > >
МН-2733-61* 0,01 0,002 ФПП-15 (стекловолокно) Диаметр 100, длина 146 60 Для окончательной очи- стки сжатого воздуха
ЛАИК-СП-6/15 15,1 0,625 > 565 X 735X 780 60 Для приточной и вытяж- ной вентиляции, стери- лизации воздуха
ЛАИК-СП-3/17 17,5 0,71 > 615X995X355 60 То же
ЛАИК-СП-6/15 15,1 0,625 » 565X735X760 60 »
ЛАИК-СП-6/17 17,5 0,71 > 615X995X355 60 >
ЛАИК-СП-3/21 21 0,875 » 650X690X625 60 >
ЛАИК-СП-6/21 21 0,875 > 650X690X625 60 >
ЛАИК-СП-3/26 26 1,0 > 660 X 665X 750 60 >
ЛАИК-СП-6/26 26 1.0 » 660X665X750 60 »
ЛАИК-СЯ 16,0 0,67 « 550x680x310 60 Для приточной и вы
тяжной вентиляции воз
духа
Рассчвтен на работу под избыточном давлением до 0,5 МПа.
жесткие условия для выбора фильтрующих материалов, так
как через фильтр под давлением пропускается большое коли-
чество острого пара, часто загрязненного и с большим содер-
жанием конденсата. Поэтому более рациональна двусторонняя
стерилизация фильтров паром. При этом пар подают в воз-
душный трубопровод до и после фильтра одновременно. Для
этого в фильтр прокладывают обводную линию для пара, ко-
торая соединяет вход и выход воздушного трубопровода. Пар
должен поступать чистый и сухой температурой 120 °C при
стабилизированном давлении. Длительность стерилизации ко-
леблется от 30 до 60 мии в зависимости от вида фильтрующего
материала.
Стерилизация воздуха, выходящего из ферментатора. Это
одна из основных ступеней технологического процесса биосин-
теза. Воздух, удаляемый из ферментатора, содержит большое
количество микроорганизмов. Так, среднее количество клеток
дрожжей в 1 м3 отработанного воздуха составляет 3,4—3,6 X
ХЮ6. Выбрасываемый из ферментаторов воздух имеет высокую
влажность. Для отделения влаги используют жалюзийные кон-
струкции, отличающиеся низким гидравлическим сопротивле-
нием. Весьма эффективны при этом вязаные и тканевые сетки
из нержавеющего материала или термостойкого пластика. На
них сепарируется около 99 % влаги.
В зарубежной практике для очистки и стерилизации воз-
духа, выходящего из ферментаторов, широко используют филь-
трующие элементы нз микроволокон боросиликатного стекла,
связанных эпоксирезииой. Фильтр-патроны из такого материала
имеют высокую стерилизующую способность (до 99,9999%) и
хорошо улавливают частицы размером более 0,6 мкм. Стерили-
зация таких фильтров осуществляется текучим паром. Большое
распространение получили фильтры из пористой нержавеющей
стали, никеля илн бронзы. Эти элементы очень прочны и устой-
чивы к воздействию высоких температур и влаги. В начале экс-
плуатации их сопротивление не более 0,07 МПа, а в процессе
фильтрования оно возрастает до 0,5 МПа.
Глубинное культивирование микроорганизмов проходит в ап-
паратах с давлением 0,02—0,06МПа. Пористые материалы, как
правило, имеют большое сопротивление, что затрудняет их
применение в схеме очистки и стерилизации воздуха, выходя-
щего из ферментатора. Специфичность этого процесса требует
применения как минимум двухстадийной очистки воздуха на
выходе из ферментатора. На первой стадии производится вла-
гоотделение, на второй — доочистка воздуха.
2.3. ПОЛУЧЕНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА
Для получения посевного материала используют исходную
музейную культуру продуцента, которая поступает в заводскую
.лабораторию из научно-исследовательского института илн
56
с посевной станции. Как правило, посевной материал, содер-
жащий молодые, растущие клетки микроорганизмов из началь-
ной стадии спорообразования (споры, конидии), поступает
в пробирках на скошенных агаризованных средах, в виде чи-
стых культур в ампулах. Каждая производственная культура
имеет паспорт, в котором указаны продуцент и его коллекци-
онный номер, серия и дата изготовления, средняя активность
серии и срок годности. В паспорте представлена характери-
стика среды для выращивания и хранения культуры. Получен-
ный посевной материал подвергают тщательному микробиоло-
гическому и биохимическому контролю, так как от его актив-
ности и чистоты зависит дальнейший производственный цикл.
В зависимости от вида продуцента, его физиолого-биохими-
ческих особенностей приготовление посевного материала (до
стадии производственной ферментации) проходит в несколько
этапов: исходная культура->скошенная агаризованная среда—>-
-^-выращивание на качалке в колбах на жидкоу питательной
среде (одна-две стадии)-нпосевные аппараты (одна — не-
сколько стадий)-^стадия производственной ферментации.
Исходную культуру при оптимальных температурах выра
щивают в пробирках на скошенной агаризованной питательной
среде. Для микроскопических грибов, актнномицетов выращи-
вание длится до наступления обильного (72—120 ч) спорооб-
разования, для бактериальных культур наиболее благоприят-
ный возраст устанавливают экспериментально.
Выращенную культуру (1—5% к объему) с поверхности
скошенной агаризованной среды стерильно смывают водой и
переносят в колбы Эрленмейера на 750 мл, содержащие 50—
100 мл жидкой питательной среды. Засеянные колбы выращи-
вают на качалке (120—240 об/мин) при температуре 28—30 °C
в течение 18—36 ч. Выращивание на качалке при перемешива-
нии (встряхивании) увеличивает скорость роста культуры, что
связано с интенсификацией массообмена. Эту стадию выращи-
вания контролируют по морфологическим показателям микро-
организма. Наилучшие результаты дает культура, которая
находится в стадии физиологической зрелости в конце логариф-
мической фазы роста. Для повышения титра клеток в иноку-
ляте и увеличения количества посевного материала культуру
выращивают в несколько стадий.
Готовую культуру стерильно переносят в посевной аппарат
(малый инокулятор) с предварительно простерилизованной пи-
тательной средой. Посевной аппарат оснащен мешалкой, аэри-
рующим устройством, а также контрольно-измерительной аппа-
ратурой для регулирования температуры, pH среды, уровня цено-
образования ит. д. Вместимость посевного аппарата может быть
различной (0,1—10 м3), а количество стадий выращивания оп-
ределяется объемом производства и нормой расхода посевного
материала для каждого продуцента.
57
Ниже приведены характеристики типовых аппаратов с ме-
ханическим перемешиванием, используемых в качестве по-
севных.
Вместимость, м8
Диаметр, м
Поверхность теплообмена, м1
-Электродвигатель
мощность, кВт
частота вращении, об/мин
Частота вращения мешалки, об/мин
0,63 2,0 5,0 10
0,9 1,2 1,6 2,0
2.5 6,9 — —
1,7 7 10 20
1500 1500 1500 1530
270 270 180 180
Большое значение имеет качество посевного материала. Пе-
ренос микробных клеток из одной стадии выращивания в дру-
гую желательно осуществлять тогда, когда рост популяции про-
исходит с максимальной скоростью, т. е. в фазе так называе-
мого экспоненциального роста. Коэффициент перехода от одного
аппарата к другому будет зависеть от конкретных условий выра-
щивания каждого микроорганизма. Если этот переход осущест-
вляется в фазе экспоненциального роста, то типичным коэффи-
циентом перехода по отношению к объему последующей ис-
пользуемой аппаратуры для практических расчетов следует
принимать величину, равную 10
2.4. ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
Оборудование. Получение конечного продукта метаболизма
в производственном ферментаторе составляет основную и часто
самую длительную стадию во всем технологическом цикле вы-
ращивания. Одно из основных требований, которое предъявля-
ется к ферментатору,— сохранение стерильности при интенсив-
ной аэрации питательной среды во время всего периода куль-
тивирования. Ферментатор (рис. 2.14) представляет собой
герметичную цилиндрическую емкость со сферическими крышкой
и днищем. Объем аппарата может быть от 0,01 до 100 м3. Вы-
сота ферментаторов в 2—2,5 раза превышает диаметр. Лучший
материал для изготовлеиня ферментатора — нержавеющая
сталь.
Ферментатор снабжен термостатирующим, перемешиваю-
щим, аэрирующим и регулирующим pH среды устройствами,
оборудован системой подачи питательной среды, пеногасителя,
воды, пара и т. д. Тепло, выделяемое в период роста микроор-
ганизмов, отводится с помощью различных теплообменных кон-
струкций. Это прежде всего внутренние, спиральные, трубчатые
змеевики (рис. 2.15). С помощью змеевиков стерилизуют также
ферментаторы, пропуская пар вместо охлаждающей воды. Для
термостатирования процесса культивирования технологически
наиболее выгодно использование теплоизоляционных материа-
лов. Введение внутрь ферментатора дополнительных змеевиков
затрудняет его стерилизацию и мойку.
58
Рис. 2.14. Схема ферментатора:
1 — штуцер для слива; 2—штуцер для
отбора проб; 3 — рубашка; 4 — змеевик;
5 — барботер; 6— линия подачи титрую-
щего раствора; 7 — линия подачи пенога-
сителя; 8 — линия загрузки; 9 — мешалка
с приводом; 10 — люк-лаз; it—лестница;
12 — отбойник: 13 — опорная царга
К Ж IS
в
Рис. 2.15. Теплообменные конструк-
ции ферментаторов:
а —рубашки: I — обычная; Ц—секцион-
ная; III—со спиральной перегородкой;
IV — в виде наружных приваренных зме-
евиков различного типа;
б—внутренние змеевики: I — спиральный
с диаметром спирали, близким к диа-
метру резервуара; II—трубчатый секци-
онный (4 секции); III — спиральный со
спиралью диаметром в 5—10 раз меньше
диаметра ферментатора (4 секции); IV —
змеевиковый пакет
Производственное культивирование проводят в стерильных
условиях. Перед заполнением ферментатора питательной сре-
дой его моют9 проверяют на герметичность, стерилизуют. Одно-
временно с ферментатором паром стерилизуют также всю си-
стему трубопроводов. В ферментатор, заполненный стерильной
питательной средой (объем обычно ие превышает 70 % общего
объема аппарата)Р вводят посевной материал. Предварительно
температуру и pH питательной среды доводят до оптимальных
значений для данного микроорганизма-продуцента.
Стадия производственного культивирования для большин-
ства микроорганизмов длится 48—72 ч. Одиако имеются бакте-
риальные культуры, длительность выращивания которых не
превышает 24 ч; продолжительность культивирования некото-
59
A-A
Рис. 2.16. Барботеры ферментаторов:
« — труба; б — квадратный; в — лучевой
рых актиномицетов и микроскопических грибов длится 12 сут.
На протяжении всего этого периода растущую глубинную куль-
туру необходимо снабжать кислородом. Микроорганизмы могут
использовать только растворенный кислород. Насыщение кис-
лородом питательной среды осуществляется путем аэрации,
обеспечивающей контакт между воздушной и жидкой фазами.
Наибольшее распространение в микробиологической промыш-
ленности получили аэрирующие устройства барботажного типа
(рис. 2.16).
Для успешного выращивания производственных культур
большое значение имеет предотвращение пенообразования. Все
ферментаторы снабжены устройствами для введения пеногаси-
теля и контроля высоты пены в аппарате. Для снижения пено-
образования используют химические (растительные и животные
масла, различные силиконы) и механические (циклоны, вра-
щающиеся в верхней части ферментатора лопасти) средства
пеногашения,,'' Применение противопенных агентов следует рас-
ценивать" как неотъемлемую часть аэробного выращивания
микроорганизмов. Характер вводимых пеногасителей и перио-
дичность их подачн в ферментатор должны строго контроли-
роваться. Излишнее добавление пеногасителя или излишнее
внесение его иа заключительной стадии культивирования мо-
жет осложнить процесс выделения конечного продукта и свести
к минимуму то дополнительное количество продукта, которое
было получено во время производствеииого культивирования.
Характеристика некоторых натуральных пеногасителей при-
ведена в табл. 2.3.
В процессе культивирования ведется постоянный контроль
за состоянием культуры и накоплением продуктов биосинтеза,
фиксируется потребление основных компонентов среды (угле-
воды, азот, фосфор), контролируется pH культуральной
жидкости.
Методы культивирования. В микробиологической промыш-
ленности для выращивания микроорганизмов применяют по-
верхностный и глубинный методы. В общем виде их можно
представить как ряд стадий, приводящих к получению из по-
севного материала (малое количество биомассы микроорганиз-
ме
Таблица 2.3 бсновнЫё свойства натуральных пеногасителей
основной пред- Рициноле- Линолевая — — Олеино-
61
мов) значительного количества биомассы или биомассы и про-
дуктов метаболизма.
Поверхностный метод выращивания применим только для
аэробных культур, причем их можно вырастить на твердой сы-
пучей питательной среде или на поверхности тонкого слоя
жидкой среды. Во всех случаях, где первоначально поверхност-
ный метод давал большие выходы продуктов при подборе оп-
ределенных условий, в конечном счете глубинный метод оказы-
вался более выгодным в промышленности.
Глубинный метод выращивания микроорганизмов может
быть периодическим и непрерывным (проточным).
При периодическом процессе изменяются скорость роста,
физиолого-биохимические и морфологические показатели куль-
туры. Развитие культуры при периодическом способе выращи-
вания начинается с лаг-фазы, длительность которой зависит
от условий выращивания посевного материала. Обычно проис-
ходит перепад концентраций элементов питания — снижение
в выросшей культуре, т. е. в готовом посевном материале, и
повышение в засеваемой среде. Клетки посевного материала
должны перейти из состояния голодания или отравления (на-
пример, продуктами метаболизма) в состояние, соответствую-
щее способности к размножению.
Затем следует экспоненциальная фаза, характеризующая
способность культуры к размножению. В этой фазе сведено
до минимума влияние лимитирующих и ингибирующих факто-
ров. Компоненты питательной среды имеются в избытке, про-
дукты обмена еще не накопились. Рост культуры идет с макси-
мально возможной скоростью, генетически заложенной в клетке.
Эта фаза не может быть длительной, так как со временем по-
пуляция начинает испытывать недостаток в одном или несколь-
ких элементах питания либо ингибирующее рост влияние на-
капливающихся в среде продуктов обмена.
Фаза замедления роста может быть очень разнообразной и
самой сложной. Она может полностью отсутствовать иа про-
стых синтетических средах, когда рост сразу прекращается
из-за отсутствия одного элемента питания, в особенности ис-
точника углерода и энергии. На сложных средах, содержащих
несколько источников углерода, может происходить поочеред-
ное их потребление и постепенное замедление роста культуры.
При избытке источников питания рост культуры замедляется
из-за накопления продуктов метаболизма.
Токсичные продукты метаболизма у микроорганизмов очень
разнообразны.
После прекращения по той или иной причине роста клеток
наступает стационарная фаза. В этой фазе в популяции могут
присутствовать разные клетки: живые, но голодающие, живые,
но ингибированные, отмирающие по причине голодания или
отравления.
Таким образом, микробные клетки при периодическом куль-
тивировании претерпевают значительные изменения в течение
всего периода роста, обусловленные непрерывными измене-
ниями окружающей среды и быстрой реакцией на них клеток.
Совсем другие условия развития культуры наблюдаются
при непрерывном (проточном) культивировании, варианты ко-
торого различаются по способу по ержания культуры в дина-
мическом равновесии.
Различают открытые и замкнутые системы непрерывного
культивирования. *
В открытых системах клетки постоянно вымываются выте-
кающей жидкостью со скоростью образования в системе новых
клеток; в этих условиях легко достигается их устойчивая кон-
центрация.
В замкнутых системах клетки в какой-то мере задержива-
ются в системе и их количество все возрастает. В этих усло-
виях одни лимитирующие факторы сменяют другие, наконец,
большая часть клеток отмирает, и такая система не в состоя-
нии достигнуть установившегося динамического равновесия.
Замкнутые системы значительно менее пригодны, чем откры-
тые для осуществления точного регулирования всех условий
культивирования, управления ими и автоматизации процесса.
Непрерывный процесс может быть гомогенно- и гетероген-
но-непрерывным. При гомогенно-непрерывном процессе в фер-
ментаторе с интенсивным перемешиванием все параметры (кон-
центрация питательных веществ, скорость роста микроорганиз-
мов) постоянны во времени. При гетерогенно-непрерывном про-
цессе несколько ферментаторов соединяют в батарею. При
этом ие обеспечиваются постоянные условия роста клеток, так
как в каждом ферментаторе поддерживаются постоянные усло-
вия культивирования, но отличные от условий в другом фер-
ментаторе.
Метод проточного культивирования может быть организо-
ван как процесс полного вытеснения и как процесс полного
смешения.
При процессе полного вытеснения сосуд для выращивания
микроорганизмов представляет собой трубку (тубулярный фер-
ментатор), в который подается питательная среда и посевной
материал и из которого вытекает культура (рис. 2.17). Переме-
шивания культуры не производится. Этот процесс применим
для культивирования анаэробных микроорганизмов. Когда
среда и посевной материал поступают в ферментатор, клетки
находятся в начале своего развития. По ходу трубки происхо-
дит развитие культуры, выражающееся в использовании суб-
страта, накоплении продуктов метаболизма, и перед вытека-
нием культура находится в состоянии, аналогичном стационар-
ной фазе роста периодической культуры. Можно сказать, что
в трубке воспроизводится полная кривая роста, ио не во времени,
63
Рис 2.17. Схема процессов непрерывного
культивирования:
а — тубулярный ферментатор полного вытесне-
ния; б — ферментатор полного смешения;
So — концентрация субстрата в поступающей
среде; S — концентрация субстрата в фермента-
торе; Si — концентрация субстрата в вытекаю-
щей среде; — плотность подаваемой популя-
ции; X — плотность популяции в ферментаторе;
Xi — плотность популяции и вытекающей куль-
туре
а в пространстве. Подобная картина наблюдается в батарее
проточных ферментаторов.
В процессе полного смешения рост культуры происходит
в емкости-фермеитаторе при интенсивном перемешивании, до-
стигаемом продуванием воздуха и работой мешалки. Во всей
массе культуры, условия выращивания должны быть одинако-
выми (гомогенно-нецрерывный процесс).
При гомогенно-непрерывном процессе в ферментаторе могут
быть созданы условия, соответствующие любой точке кривой
роста культуры выращиваемой периодическим способом. При
быстром протоке среды эти условия близки к условиям экспо-
ненциального роста, при медленном — приближаются к усло-
виям стационарной фазы. В установившемся режиме удельная
скорость протока среды равна удельной скорости роста куль-
туры. При этом культура находится в состоянии динамического
равновесия и обладает способностью автоматически подстраи-
ваться к изменениям условий. Если условия изменяются так,
что рост ускоряется, то в ферментаторе повысится плотность
популяции и установится новое стационарное состояние. Если
рост замедлится, плотность популяции понизится. Если изме-
нение условий будет временным, то при возвращении к исход-
ным условиям установится первоначальное стационарное со-
стояние.
При таком способе культивирования нельзя получить устой-
чивого состояния только при максимальной скорости роста. Не-
значительное повышение скорости протока или воздействие,
замедляющее рост, приводят к тому, что скорость роста ока-
жется меньше скорости протока и культура быстро вымоется
из ферментатора.
Хорошо отработанный периодический процесс выращивания
экономически выгодно воспроизводить проточным методом
культивирования, так как культура непрерывно находится в со-
стоянии максимальной активности и не тратится время на под-
готовку ферментатора, его заполнение, слив и иа лаг-фазу.
64
Рис. 2.18. Варианты хемостатиого культивирования:
а. б — батареи из двух ферментаторов; в — ферментатор с возвратом микробной массы;
г — ферментатор с фильтрующим устройством; 1 сепаратор; 2 — фильтр; So — кон-
центрация субстрата в поступающей среде; S—концентрация субстрата в фермента-
торе; Si — концентрация субстрата во втором ферментаторе; X — плотность популяции
в первом ферментаторе; X, — плотность популяции во втором ферментаторе; Ха — плот-
ность популяции в вытекающей среде
При гомогенно-непрерывном культивировании можно осу-
ществить недоступное при периодическом культивировании ог-
раничение роста культуры одним элементом питания прн не-
лимитируемых количествах остальных элементов. При медлен-
ном протоке ограничение роста будет сильным, при быстром —
слабым. Такое непрерывное культивирование называется хемо-
статным (или хемостат), так как рост микроорганизмов регу-
лируют химические факторы среды. При хемостатном культи-
вировании соблюдаются два условия: 1) гомогенно-непрерыв-
ное культивирование ведется с определенной заданной ско-
ростью протока среды; 2) компоненты среды подбираются
таким образом, чтобы один элемент питания был в недостатке,
тогда плотность популяции определяется его концентрацией.
Все остальные элементы питания даются в избытке, а усло-
вия культивирования (температура, pH, аэрация) поддержи-
ваются на оптимальном уровне.
, Хемостатиый метод имеет большое число вариантов. Приме-
нение одностадийного культивирования позволяет воспроизве-
сти любую скорость роста, кроме максимальной. Двухстадий-
иое культивирование в двух последовательно соединенных фер-
ментаторах позволяет достичь максимальной скорости роста и
даже превзойти ее. Для этого в первом ферментаторе батареи
ведется нормальное культивирование при скорости протока,
меиьшей максимально возможной скорости роста в одном ап-
рате, а во второй — подается культура из первого и свежая
среда (рис. 2.18, а). Во втором ферментаторе повышается ско-
рость протока вплоть до превышения максимально возможной
скорости роста, а вымывания не происходит, так как из пер-
вого ферментатора непрерывно поступает культура.
Максимальная скорость роста может быть достигнута при
турбидостатном культивировании (в режиме турбндостата),при
котором контроль за процессом осуществляется с помощью из-
мерения концентрации микроорганизмов. Для этого фермента-
тор должен иметь устройство для нефелометрического измере-
3 Заказ № 1536 65
ния мутиости, характеризующей концентрацию популяции в
ферментаторе. Чтобы плотность (популяции) оставалась посто-
янной, регулируют скорость протока среды. Этот метод культи-
вирования применим для выращивания микроорганизмов на
прозрачных средах.
В двухстаднйном культивировании можно повысить синтез
вторичных метаболитов (антибиотиков, ферментов н т. д.) по
сравнению с одностадийным хемостатным. В первом фермен-
таторе ведется выращивание культуры при большой скорости
роста, что соответствует логарифмической фазе периодической
культуры. Второй ферментатор используется большего объема
(рис. 2.18, б), поэтому культура, поступающая из первого ап-
парата, оказывается в условиях замедленного роста в такой
степени, в какой второй ферментатор содержит больше среды,
чем первый. Это соответствует условиям стационарной фазы.
При низких концентрациях субстрата и невысокой плотно-
сти популяции можно возвратить в ферментатор часть клеток
вместе с вытекающей из него культуральной жидкостью, чтобы
повысить концентрацию клеток и ускорить процесс. Существует
несколько вариантов возврата, например, сепарируют выте-
кающую культуру и сгущенную часть культуральной жидкости
подают в ферментатор (рис.2.18,в).После ферментатора можно
установить фильтрующее устройство, позволяющее вытекать
культуральной жидкости, но задерживающее клетки (рис. 2.18, г).
Известны методы культивирования, занимающие промежу-
точное положение между непрерывным и периодическим:
1) отъемно-долнвной — среда порциями подается в аппарат
и также порциями отбирается из него;
2) добавление питания к периодической культуре без от-
бора культуры. Этот метод удлиняет время культивирования,
но приводит к более полному использованию всех имеющихся
в среде элементов питания, если постепенно добавлять, напри-
мер, источник углерода.
2.5. КИНЕТИКА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ
Основной стадией любого микробиологического производства
является производственное культивирование соответствующего
микроорганизма, проводимое либо с целью увеличения микроб-
ной массы — биомассы, либо для получения продуктов мета-
болизма растущей популяции микроорганизмов.
Под биомассой понимают общую массу особей одного вида,
группы видов илн сообщества микроорганизмов в целом. Ее вы-
ражают в массе сырого или сухого вещества (г/м2, г/м3). От-
сюда ясно, что задача ннженера-техиолога — создание условий,
обеспечивающих максимальную утилизацию компонентов пита-
тельной среды и накопление целевого продукта с заданными
свойствами. Естественно, теоретической основой для этого яв-
66
Рис. 2.19. Кинетика роста микроорга-
низмов при периодическом культиви-
ровании:
J —лаг-фаза; II—переходная фаза;
/// — экспоненциальная фаза; IV — фаза
затухающего роста; V — стационарная
фаза; VI — фаза отмирания; Xi- . .Xs —
плотность популяции; . .. тв— время
ляются закономерности, определяющие рост популяции микро-
организмов в зависимости от условий его осуществления.
Знание количественных закономерностей роста популяций микро-
организмов в реальных условиях его осуществления в емкост-
ной аппаратуре, выраженных в виде соответствующей матема-
тической модели, во многом определяет переход от эмпириче-
ского поиска к строгому решению задачи оптимизации техно-
логических режимов получения продуктов микробиологического
синтеза.
Периодическое культивирование. В процессе культивирова-
ния микроорганизмов периодическим способом, как указыва-
лось ранее, можно выделить несколько периодов роста
(рис. 2.19).
В первый период, после внесения в среду посевного мате-
риала (лаг-фааа), происходит процесс приспособления посев-
ной культуры к новой среде. Численность популяции в это
время ие увеличивается (а в некоторых случаях даже снижа-
ется). Состояние популяции в лаг-фазе формально можно опи-
сать так:
X=Xt; dX/d-r=O (2.1}
(для т, лежащего между 0 и tj).
Предполагается, что в период л аг-фазы микробные клетки
не потребляют субстрата, но метаболическая активность кле-
ток проявляется в повышении содержания белка и РНК (при
постоянстве содержания ДНК), а также в увеличении объема
клеток, который в общем виде может быть выражен с помощью
уравиеиия
V=Voe^ (2.2)
где К — исходный объем отдельной клетки; с—постоянная скорость роста-
клетки.
По достижении определенных соотношений между величи-
нами поверхности клетки и ее объема происходит деление
клетки, вследствие чего численность популяции начинает
3* 6Т
увеличиваться с возрастающей скоростью, которая для данной
фазы роста культуры, называемой переходной, описывается
соотношением
dX/dt = qpXX, (2.3)
где q> — параметр, принимающий значения от О до 1 в интервале времени
Ti—т2; К — константа скорости роста популяции.
Интегральная зависимость, описывающая участок кинетиче-
ской кривой роста между Т| и т2, имеет вид
Х=Х,+(X, —X,) [ (г-т/^-т,)]*. (2.4)
Увеличение скорости роста популяций в переходной фазе
идет до предела, определяемого формально достижением пара-
метром <р величины, равной единице, после чего скорость роста
начинает выражаться зависимостью
dX/dx=KX (2.5)
(для т между т2 и тз), откуда интегральная форма представ-
ляет экспоненциальную функцию
X = Х3ек (2.6)
Эта фаза роста носит название экспоненциальной, или фазы
логарифмического роста. Для оценки скорости роста биомассы
часто пользуются величиной удельной скорости роста р,
р, = dX/dx — d In Xldx. (2.7)
В качестве характеристики растущей культуры, находящейся
в этой фазе, используют термины «время удвоения» и «время
генерации» q, рассчитываемое по уравнению
q =-----, (2.8)
3,32(IgX" —IgX') v '
где т' и х"— некоторые моменты времени; X'— концентрация биомассы
в момент времени х'; X"— концентрация биомассы в момент времени т".
Одиако такой характер роста популяции, который в первом
приближении может быть описан экспоненциальной зависимо-
стью, наблюдается в течение ограниченного периода времени,
так как по мере увеличения биомассы все отчетливее прояв-
ляется тенденция к замедлению скорости роста. Для такого
участка кинетической кривой роста популяции, называемого
фазой затухающего роста культуры, может быть использовано
дифференциальное уравнение для скорости роста
dXldz = KXBX^L (2.9)
Х4 — ха
48
и его интегральная форма для описания изменения концентра-
ции биомассы во времени
X = X,— (X,—Xs) е" Iк <м,‘ I • <2-10)
(для интервала времени между т3 и т4).
Снижение скорости роста по мере приближения X к значе-
нию X* происходит вплоть до достижения нулевого значения,
которое характеризует вступление популяции в стационарную
фазу: X=Xif
dXldx=0 (2.11)
(для т, лежащих между Т4 и т$).
По завершении фазы стационарного роста начинается фаза
отмирания, или фаза дегенерации, культуры, характеризую-
щаяся уменьшением численности популяции.
Приведенная выше система уравнений может быть исполь-
зована только для описания конкретной кинетической кривой
роста, полученной в результате эксперимента, ио ие в состоянии
служить основой для прогнозирования процесса, так как в при-
веденных зависимостях в качестве параметров (Хь Х4;
ть .... Т5) вводятся конечные значения концентрации биомассы
и времени. В настоящее время еще иет общепринятой матема-
тической модели роста популяции, которая достаточно точно
описывала бы кинетику накопления биомассы в условиях пе-
риодического культивирования и содержала бы минимальное
число эмпирических коэффициентов. В наибольшей степени этим
требованиям отвечает модель Н. И. Кобозева, использование
которой при изучении кинетики роста популяции дает обнаде-
живающие результаты. Интегральная форма предложенного нм
уравнения, описывающего кинетическую кривую роста популя-
ции, имеет вид
где X — концентрация микроорганизмов в момент времени т; К — константа
равновесия процесса размножения (K^Pi/Pz); Хь и Мо — концентрация мик-
роорганизмов и субстрата в начальный момент культивирования; ₽| и 0ц—
константы скорости образования и отмирания микроорганизмов (синтеза и
деструкции биомассы).
Это уравнение является наиболее общим выражением для
роста популяции, и в зависимости от частных условий (обра-
тимое или необратимое размножение, рост популяции с исчер-
пыванием субстрата или при поддержании его количества на
69
постоянном уровне) уравнение приобретает соответствующую
форму и дает различное выражение для величины концентра-
ции биомассы.
Основной недостаток периодического способа — цикличность
и постоянное изменение условий культивирования, что затруд-
няет контроль и регулирование параметров процесса.
Большие возможности для повышения эффективности про-
изводства заложены в непрерывном способе выращивания.
Непрерывное культивирование. Сущность метода заключа-
ется в поддержании постоянных условий среды, а тем самым
и микроорганизма-продуцента в определенном физиологическом
состоянии. При непрерывном методе в образовании конечного
продукта в течение всего ферментационного процесса участвует
практически вся популяция микроорганизмов, чему способ-
ствуют оптимальные условия культивирования.
При непрерывном культивировании возникает открытая ди-
намическая система, в которой микроорганизмы непрерывно
размножаются со скоростью, зависящей от притока питатель-
ных веществ и других условий питания. Часть объема культу-
ральной жидкости непрерывно вытекает с той же скоростью»
с какой подается среда в аппарат, и количество микроорганиз-
мов, поддерживающее непрерывный процесс, остается в фермен-
таторе постоянным. В стерильных условиях непрерывный ме-
тод обеспечивает сохранение культуры в физиологически актив-
ном состоянии длительное время.
Скорость увеличения биомассы в протоке выражается урав-
нением
dX/dx = (iL—D)X, (2.13)
где ц — удельная скорость роста, ч”1; D —скорость разбавления культуры
потоком среды, ч_|; X— концентрация биомассы, г/л(мг/мл) или число кле-
ток в 1 мл.
Значение D=F]V известно как скорость разбавления. Оно
характеризует скорость потока на единицу объема. F—скорость
протока среды, мл/ч (м3/ч); V —объем ферментатора, мл (м3).
Если в стационарном состоянии dX/tfr=O, то fi=D. Это оз-
начает, что концентрация клеток неизменна. Чаще всего это
бывает при £>=0,01-^0,25.
В условиях непрерывного культивирования, когда культура
находится в состоянии динамического равновесия (при р.=£>),
различают турбидостатиый и хемостатный процесс.
При турбидостатном культивировании скорость про-
тока среды регулируют так, что концентрация клеток остается
постоянной. При хемостатном культивировании постоян-
ная концентрация клеток в среде поддерживается при помощи
постоянной концентрации химических соединений, в частности
лимитирующего субстрата (например, источников углерода,
азота, витаминов и др.),
70
Зависимость удельной скорости роста культуры от концен-
трации субстрата определяется уравнением Моио
P = JAm8kcS/(Ks4-S), (2.14)
где (Амане — максимальная величина удельной скорости роста, ч-1; S — кон-
центрация субстрата, %; /С. — концентрация субстрата, при которой удельная
скорость роста равна У2 максимальной скорости. В реальном процессе она
недостижима, но когда S»/C«, (л стремится к (Амакс.
В полноценной питательной среде Ка по отношению к S-ве-
личииа незначительная и ею можно пренебречь, тогда из урав-
нения ц=рмакс£/£~цмакс видно, что в полноценной питатель-
ной среде удельная скорость роста культуры не зависит от
концентрации лимитирующего фактора. Для бактерий, расту-
щих в питательной среде с углеводами, величина Кв составляет
несколько десятых миллиграмма на 1 л среды, а для микро-
организмов, растущих на средах с аминокислотами, несколько
микрограммов на 1 л, a S составляет несколько граммов на
I л. Низкие значения Ке получены для дрожжей, выращивае-
мых иа глюкозе. Следует отметить, что значение S/(K«+S)
близко к единице до тех пор, пока концентрация субстрата
не слишком мала. Ввиду того что необходимая концентрация
источника углерода для большинства ферментационных про-
цессов выражается в г/л, то в 10—100 мг/л сахара может
вызвать снижение удельной скорости роста только на несколько
процентов по сравнению с рмакс- В связи с этим величина удель-
ной скорости роста в этих условиях не должна снижаться ниже
90 % максимальной скорости роста.
Концентрация субстрата не является единственным факто-
ром, лимитирующим скорость роста микроорганизмов.
Н. Д. Иерусалимский пришел к заключению, что удельная
скорость роста зависит от плотности популяции и что при вы-
сокой концентрации клеток задерживать рост могут продукты
обмена веществ. Удельную скорость роста можно рассчитать
по уравнению
И = Рмакс - К Lp ’ (2-15)
Арт'
где /Ср — константа Иерусалимского, равная концентрации продукта, при ко-
торой удельная скорость роста замедляется вдвое, при----— = const;
/С® -J- S
Р — концентрация продукта — метаболита, г/л.
Для поддержания культуры в состоянии максимальной ско-
рости размножения необходимы постоянный приток свежего
субстрата и вывод продуктов обмена веществ.
Прн определении прироста микроорганизмов в период куль-
тивирования предполагается, что содержимое ферментатора хо-
рошо аэрируется и перемешивается, что популяция микроорга-
низмов однородна и свойства ее практически постоянны при
высокой концентрации субстрата, лимитирующего рост, т. е. при
• 71
S>Ke. Другие вещества, влияющие на рост, также находятся
в постоянном избытке. Тогда удельную скорость роста р сле-
дует СЧИТаТЬ блиЗКОЙ К Цмакс-
При периодическом культивировании микроорганизмов за-
висимость изменения концентрации микроорганизмов во вре-
мени описывается дифференциальным уравнением
dX/dz=nX. (2.16)
После интегрирования это уравиеиие принимает вид
Х=Хоецх, (2.17)
где Хо— концентрация микроорганизмов в момент времени т==0.
Для понимания условий, регулирующих этот процесс, всю
микробную биомассу в ферментаторе после удаления исполь-
зованной среды можно выразить следующим уравнением:
XVP = XZVP -VX^T, (2.18)
общее прирост от на- унос
количество чального количе-
ства
где Хо— концентрация
Это уравнение представляет собой материальный баланс
непрерывного процесса по биомассе.
Если выведенный объем V выразить за время т=1 ч, а ско-
рость протока через D, то
Х=Хоецт(1 — D), (2.19)
где D — скорость протока среды, выведенной за 1 ч из общего объема фер-
ментатора с размерностью, 1/ч.
В системе стабильного режима изменение концентрации ли-
митирующего фактора может быть выражено уравнением
^- = DS._DS-^A(_£_) = 0> (2.20)
где So — концентрация субстрата в протекающей среде; S — фактическая
концентрация субстрата в ферментаторе и в вытекающей среде; X — коли-
чество биомассы в жидкости оттока, мг/мл (г/л); Y — экономический коэф-
фициент (выход биомассы), т. е. dXIdS нли dP[dS.
Экономический коэффициент выражает количественные по-
требности микроорганизмов в питательных веществах. Если
система находится в равновесии, то ц,=О. Равновесие можно
нарушить, изменяя скорость протока р>О или р<Д, или из-
меняя концентрацию субстрата среды S. Так как выход Y
определяется из соотношения между образовавшейся биомас-
сой и потреблением субстрата, то уравнение принимает вид
Y=dXldS. (2.21)
При установившемся режиме
X = Y(S0— S) и Y — X/(S0—S), (2.22)
где X—количество биомассы в жидкости оттока, мг/мл (г/л); So и S— кон-
центрация питательных веществ в среде и в культурральной жидкости.
72
Следует отметить, что продуктивность процесса определяется
произведением скорости разбавления иа концентрацию микро-
организмов DX, т. е. количеством биомассы, получаемой с еди-
ницы объема ферментатора в единицу времени. Максимальная
продуктивность процесса всегда связана с повышенной кон-
центрацией субстрата в вытекающей среде.
Продуктивность непрерывного процесса выращивания мо-
жет быть выражена уравиеиием
= ^г)Х- (2.23)
где DX — максимальное содержание биомассы, мг/мл (г/л); п — количество
уносов биомассы, мг/мл (г/л) за единицу времени; X — конечная концентра-
ция биомассы, мг/мл (г/л).
Сравнивая продуктивность периодического и непрерывного
процессов культивирования в производстве кормовых дрожжей,
предположим, что периодический процесс закончится за 10 ч,
поэтому п=1/10. Для выбранной величины ц=0,3 получаем
0 = 1/10 (1—1/3) =0,095. При непрерывном производстве D=
=0,3. Из этого следует, что при одинаковой концентрации мик-
роорганизмов продуктивность процесса периодического куль-
тивирования втрое ниже, чем непрерывного. Когда цель куль-
тивирования — получение продуктов метаболизма Р, для опи-
сания процесса и определения биосинтетической активности К
микроорганизма используют уравнение:
dP]di=KX. (2.24)
Это свидетельствует о том, что скорость биосинтеза мета-
болита за время dx прямо пропорциональна количеству био-
массы и удельной активности К микроорганизма. К можно оп-
ределить по уравнению
dP I
di ' X
или К =-----------------
(Tj — т0) тсР
(2.25)
где Р — количество продукта, полученного за время Тх — т0.
Если биомасса увеличивается не больше чем в 2—3 раза,
то тср определяют как среднеарифметическое
тср = + гп0){2, (2.26)
где /Пер — средняя величина биомассы за данный период времени.
Если прирост биомассы велик, как это бывает в фазе ло-
гарифмического роста, то
т0
2,3 (In mt— In т0)
(2.27)
При непрерывном культивировании могут образовываться
мутации. Если количество мутаций в течение одной генерации
выразить через Q, число генераций в час Dlln2, удельную
73
скорость размножения мутантов через и их концентрацию
в ферментаторе через Хт, то уравнение примет вид
DQX/In 2 + pmXm = DXm + dXJdx. (2.28)
Если цт равняется скорости разбавления D, то концентра-
ция мутанов в ферментаторе растет с линейной скоростью
(2.29)
dt In 2 ' '
Если Цш меньше, чем скорость разбавления, то Хт прибли-
жается к пределу выражения
limX-” = -£r(n ° У (2.30)
«-►оо In 2 у D — рт /
По этому уравнению можно вычислить концентрацию му-
тантов в ферментаторе.
В основе биологического синтеза лежат ферментативные
процессы. Зависимость скорости ферментативной реакции от
субстрата выражается согласно уравнению Михаэлиса-Мен-
теи
^ = ^bkcS/(Xs+S), (2.31)
где S — концентрация промежуточного продукта реакции; К, — константа
Михаэлиса для даииой реакции; А —скорость ферментативной реакции.
При непрерывном процессе [i=D. Для образования продукта
необходимо установить лимитирующий фактор и факторы, ог-
раничивающие рост культуры (температура, pH, репрессоры,
ингибиторы и т. д.).
При гомогенно-непрерывном процессе, где p=D
X = pP/X = DP/X; P = KX!D. (2.32)
Из этого следует, что количество продукта зависит от кон-
центрации биомассы, активности культуры и скорости разбав-
ления D.
Материальный баланс гомогенно-непрерывного процесса по
субстрату выражается уравнением
DS0 = (p/d) X + DS, (2.33)
где d — выход биомассы из данного компонента.
Можно допустить, что выход биомассы ие зависит от кон-
центрации компонента. Тогда по уравнению S = S0----------можно
а
определить концентрацию субстрата в вытекающей культураль-
ной жидкости. С уменьшением величины скорости разбавления
D увеличивается разница между концентрацией субстрата в при-
токе и оттоке, так как возрастает концентрация биомассы
в среде.
74
2.6. ВЫДЕЛЕНИЕ КОНЕЧНОГО ПРОДУКТА
После стадии культивирования микроорганизма-продуцента
следующим технологическим этапом является выделение н
очистка конечного продукта из культуральной жидкости. Для
многих микробиологических производств эта стадия начина-
ется с разделения двух фаз, так как конечный продукт может
содержаться либо в нативном растворе, либо в микробной
массе.
Процесс выделения и очистки представляет собой ряд по-
следовательных технологических операций, количество которых
возрастает с повышением желаемой чистоты конечного продукта.
Большая лабильность многих продуктов микробиологического
синтеза, возможные потери их активности на стадии выделения
и очистки привели к преимущественному использованию прие-
мов разделения, которые не сопровождаются резкими химиче-
скими воздействиями иа выделяемое вещество.
Выделение конечного продукта из культуральной жидко-
сти. Большинство микрорганизмов-продуцеитов биологически
активных веществ накапливают основную часть синтезируемых
ими продуктов в культуральной жидкости.
Культуральная жидкость представляет собой сложную мно-
гофазную систему, содержащую (от 1 до 5 % и более сухого
вещества) отдельные микробные клетки или мицелий, про-
дукты биосинтеза и остатки питательной среды. Как правило,
выделение конечного продукта из такой сложной смеси свя-
зано с определенными трудностями и в основном зависит от
предварительной очистки нативного раствора.
Первой стадией подготовки культуральной жидкости для
дальнейшей переработки является отделение взвешенной
фазы—-или микробной массы, в состав которой входят в основ-
ном непосредственно микроорганизмы, продукты их жизнедея-
тельности, а также остатки неиспользованной питательной
среды. Свойства микробной массы неидеитичны свойствам соот-
ветствующей чистой культуры микроорганизма.
В производственных условиях технологическая стадия отде-
ления микробной массы от культуральной жидкости связана
с обработкой больших объемов труднофильтруемых суспензий и
потерями основного конечного продукта. Для улучшения филь-
труемости и повышения качества фильтратов — нативных рас-
творов с целью упрощения выделения и очистки получаемых
продуктов проводится предварительная обработка культураль-
ной жидкости электролитами, тепловая и кислотная коагуля-
ция, фильтрующими порошками, флокулянтами и др.
Для выделения и очистки метаболитов применяются экстрак-
ционные и ионообменные методы. Отличительная особенность
всех этих методов — большое число технологических стадий:
фильтрация культуральной жидкости, концеитрироваиие полу-
75
ченных растворов, экстрагирование целевого продукта, кристал-
лизация и т. п. Выбор конкретного метода в каждом случае
будет зависеть от природы выделяемого продукта, его стабиль-
ности к различным внешним воздействиям, а также от требуе-
мой избирательности процесса в связи с наличием других про-
дуктов в нативном растворе.
Для отделения микробной массы от культуральной жидкости
применяют фильтр-прессы, сепараторы, вакуум-фильтры, цен-
трифуги различной производительности (рис. 2.20—2.23).
Как уже отмечалось, культуральная жидкость, отделенная
от микробной массы, содержит продукты биосинтеза, органи-
ческие и неорганические соединения, в том числе белки в раст-
воренном и коллоидном состояниях. Культуральную жидкость
следует рассматривать как коллоидную систему, коагуляцию
части балластных веществ который можно вызвать добавлением
различных электролитов, изменениями температуры, механиче-
скими воздействиями и т. д.
Так, прн выделении некоторых антибиотиков балластные
белки нативного раствора сначала коагулируют, а затем от-
деляют фильтрацией или центрифугированием. Если при сепа-
рировании в растворе остается до 50—70 % неотделившейся
взвеси, то фильтрация позволяет полностью отделить примеси.
В последне время для выделения, очистки и фракционирова-
ния физиологически активных веществ широко используются
полимерные соединения — флокулянты. Оин позволяют прово-
дить предварительную очистку культуральных жидкостей в более
мягких условиях по сравнению с обработкой неорганическими
электролитами или тепловой обработкой. В производстве ан-
тибиотиков в результате применения флокулянтов иа 40—-45 %
уменьшается содержание белка в растворе, в 2—2,5 раза сни-
жается его пигментация, увеличивается выход антибиотика
(например, для неомицина иа 10—12%). При обработке куль-
туральной жидкости флокулянтами исключается применение
Рис. 2.20. Рамиый фильтр-пресс:
1, 9 — опорные стойки: 2 — упорная плита; 3 — фильтровальные плиты; 4 — фильтро-
вальные рамы; 5 — зажимная плита; 6 — прогоны; 7 — шпренгельная форма; 8 — меха-
низм для зажима плит
76
хлорида кальция, иа 15—
20 % сокращается расход
тринатрий-фосфата.
При выделении фер-
ментных препаратов к ста-
дии предварительной обра-
ботки культуральной жид-
кости относится процесс
осаждения нуклеиновых
кислот. Они повышают вяз-
кость обрабатываемых рас-
творов, а также затруд-
няют фракционирование
белка. Термообработка су-
спензии разрушенных дрож-
жей при температуре 50е С
в течение 20 мин приводит
к удалению до 85 % нукле-
иновых кислот. Их можно
в дрожжевом сепараторе:
/ — сопло; 2 — мундштук
осаждать также неоргани-
ческими солями. Например, добавление к суспензии разрушен-
ных (дезинтегрированных) клеток Acetobacter suboxydans
0,1 М раствора сернокислого марганца с последующим переме-
шиванием в течение 10—12 мии способствует удалению в оса-
док от 50 до 64 % нуклеиновых кислот.
Схема получения продуктов микробиологического синтеза
и последовательность стадий обработки культуральной жидко-
сти приведены ниже.
Культуральная
жидкость
-------1
Отделение-------> Фильтрат
микробной массы I
Микробная Предварительная
масса обработка —►
| растворов
I I
1 | Дезинтеграция
Обезвожи-
вание j
Отделение
клеточной-------► Фильтрат
суспензии
Концент-
ратные
формы
I
Микробная масса
(белковый
концентрат)
Методы концентри-
рования и очистки:
Вакуум-выпаривание
Вымораживание
Мембранные процессы
Осаждение
Сорбционные процессы
Кристаллизация
Сушка
I
Биологически активные
вещества различной
степени очистки
77
Рис. 2.22. Схема работы барабанного
вакуум-фильтра:
Выделение конечного
продукта из микробной мас-
сы. Для извлечения внутри-
клеточных биополимеров —
белков, нуклеиновых кис-
лот, ферментов, липидов —
широко используется метод
дезинтеграции. Дезинтегра-
ция, или разрушение, кле-
точных оболочек микроорга-
низмов осуществляется
несколькими способами: хи-
мическими, биологическими,
физическими (механиче-
скими) .
Химические спосо-
/ —барабан фильтра; 2 — ванна для суспен- бы ДеЗИНТСГрацИИ.
В — сжатый воздух; Г — фильтр; Д — пере- ОСНОВЗНЫ НЗ ДССТруКЦИИ
лив упорядоченных структур
клеточной стенки микроор-
ганизмов. В результате
сильного увеличения проницаемости клеточной стенки биопо-
лимеры с большой молекулярной массой выводятся через
барьеры. Наиболее известные химические способы: обработка
клеточной суспензии непосредственно щелочью, мочевиной,
глицерином, аммиаком, перекисью водорода. Химические спо-
собы предназначены в основном для выделения суммарных
белков пищевого иазиачеиия и не иашли широкого распро-
странения в микробиологической промышленности. Последнее
объясняется, вероятно, нежелательными эффектами, возникаю-
щими при химической дезинтеграции. Так, при обработке сус-
пензии клеток микроорганизмов щелочью в определенных ус-
Рис. 2.23. Центрифуга:
/ — многоступенчатый ротор; 2 — шнек; 3 — кожух; 4 — подшипник; 5 — привод с турбо-
муфтой; б, 7 — трубы для подачи суспензии и промывной жидкости; S — планетарный
редуктор
78
ловиях образуется лизин — аланин, или лантионин, из-за чего
снижаются количество доступного лизииа и питательная цен-
ность получаемого белка.
Биологические способы. Относятся к наиболее мяг-
ким способам разрушения клеточной оболочки и выделения
внутриклеточных метаболитов. В качестве примера можно при-
вести автолиз клеток или расщепление клеточной стенки при
помощи литических ферментов. Автолиз клеток под действием
внутриклеточных гидролитических ферментов проводится
в кислой среде при температуре 30 -35 °C в течение нескольких
часов или суток с добавлением различных бактерицидных ве-
ществ. В результате получают смесь продуктов гидролиза —
аминокислоты, пептиды, полипептиды и др. Процесс автолиза
дрожжей осуществлен в промышленных условиях на установке
мощностью 800 т в год пищевого белкового экстракта.
Литические ферменты, содержащие р-глюкоиазы, растворяют
клетки дрожжей, микроскопических грибов, грамотрицательных
и грамположительиых бактерий. Лизис клеточной стенки микро-
организмов способствует увеличению перевариваемости микроб-
ной массы животными и выделению белков для пищевых целей.
С помощью иммобилизованных иа коллагеновых пленках
лизирующих ферментов из Streptomyces sp. можно разрушить
клеточные стенки высушенных и интактных живых кормовых,
хлебопекарных и пивных дрожжей. Развитие методов фермента-
5 тивиой дезинтеграции сдерживается сравнительно высокой стои-
мостью ферментных препаратов и отсутствием высокоочищен-
ных литических ферментов.
Ферментативные реакции обычно осуществляются в специ-
альных реакторах с рабочей поверхностью 120 и 1800 см2.
Полученные дезиитеграты освобождают от оболочек разру-
шенных клеток и от неразрушенных клеток, а осветленный рас-
твор обрабатывают так же, как культуральную жидкость.
Физические способы. Физическая дезинтеграция —
это процесс, происходящий при высоких скоростях и сопровож-
дающийся быстрым перемещением разрушаемого материала
в зоне действия дезинтегрирующих сил. Физическую дезинтег-
рацию можно проводить в непрерывном режиме с автоматиза-
цией процесса. Наиболее известные способы разрушения
биологического материала —замораживание и оттаивание, уль-
тразвуковые воздействия, истирание клеток, экструзия и др.
При использовании некоторых из способов, основанных на
воздействии ультразвуковых колебаний, экструзии, декомпрес-
сии, созданы установки, которые применяются в практике для
дезинтеграции различных видов микроорганизмов. Например,
установки Муллард и Биосония (ультразвук), пресс Хьюза и
Фреич-пресс (экструзия), дезинтегратор Микля и Брауиа
(встряхивание со стеклянными бусами), а также «азотная бом-
ба» (декомпрессия).
79
2.7. КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВА ПРОДУКТОВ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА
Понятие контроль производства включает весь комплекс
химических, биохимических и микробиологических анализов и
измерений по учету качественных и количественных показа-
телей технологического режима на всех этапах производства,
начиная с определения качества сырья и кончая оценкой каче-
ства готовой продукции. Весь указанный объем работ выпол-
няется сотрудниками центральной заводской лаборатории
(ЦЗЛ) и цеховых лабораторий. Контроль за производством
осуществляется путем отбора проб н проведения соответству-
ющих анализов, а также при помощи контрольно-измеритель-
ных приборов.
Проследим основные этапы производства, подлежащие кон-
тролю:
анализ сырья и вспомогательных материалов, поступающих
на завод, с целью определения соответствия нх требованиям
стандартов и сопроводительной документации;
проверка исправности, надежности, герметичности н дру-
гих показателей оборудования, аппаратуры и коммуникацион-
ных линий перед началом технологического процесса.
На каждом участке производства ведут оперативный кон-
троль за соблюдением установленных технологическим регла-
ментом параметров процесса. Контроль проводится путем вы-
полнения экспресс-анализов и постоянного наблюдения за по-
казаниями контрольно-измерительных приборов.
Приведем несколько примеров использования контрольно-
измерительных приборов на стадии культивирования микроор-
ганизмов. Одним из важнейших факторов, влияющих на био-
синтез и рост клетки, является pH среды. Этот показатель
особенно резко изменяется в процессе выращивания микроорга-
низмов глубинным способом. В зависимости от состава среды
и продуктов метаболизма pH может сдвигаться как в кислую,
так и в щелочную сторону.
С появлением стерилизуемых электродов появилась воз-
можность непрерывно н автоматически осуществлять в фер-
ментаторе контроль за изменением pH среды (рис. 2.24). При
изменениях pH возникающий сигнал передается на прибор са-
мописца-регулятора 3, после чего срабатывает клапан 2, обе-
спечивающий корректировку pH среды. Практически всегда
оказывается, что достаточно добавить кислоту или щелочь для
получения нужного pH среды. Электроды 5 и 7 pH-метра мо-
гут размещаться в выносном устройстве или непосредственно
в корпусе ферментатора.
Для успешного выращивания микроорганизмов большое
значение имеет предотвращение образования пены. Наиболее
часто пенообразование наблюдается в процессах ферментации,
80
Рис. 2.24. Контроль pH в промыш-
ленном ферментаторе:
/— емкость для кислоты или щелочи; 2 —
соленоидный клапан; 3 — рН-нзмеритель
и самописец; 4 — соединительная короб-
ка; 5 — стеклянный электрод; 6 — темпе-
ратурный компенсатор; 7 — вспомогатель-
ный электрод
в которых используются ес-
тественные питательные
среды, например содержащие
кукурузный экстракт и сое-
вую муку. Интенсивное пено-
образование увеличивает ско-
рость растворения кислорода
воздуха в среде (образуется
большая поверхность массооб-
мена), вызывает увлажнение £
нарушает герметизацию и стерильность процесса, затрудняет
максимальное использование емкости ферментатора и тем са-
мым снижает выход конечного продукта. Для предотвращения
выброса пены из ферментатора применяют механические, хими-
ческие, физические, комбинированные и другие методы пенога-
шения. В настоящее время все ферментаторы снабжают специ-
альными автоматическими устройствами для введения пенога-
сителя и контроля высоты пены в аппарате.
В системе автоматического пеногашения, разработанного
Всесоюзным научно-исследовательским институтом антибиоти-
ков (ВНИИА), высота подъема пены в ферментаторе контро-
лируется на трех заданных уровнях, т. е. применяются три
контактных электрода, которые соединяются с электронно-ме-
ханическим программным устройством.
При достижении пеной нижнего электрода происходит им-
пульсная подача химического пеногасителя. Когда пена до-
стигает среднего электрода, перекрывается выхлопная воздуш-
ная линия, при этом давление в аппарате повышается и цено-
образование резко уменьшается. Если пена достигнет верхнего
электрода, то отключится электродвигатель мешалки. При спа-
де пены система приводится в первоначальное состояние.
Хорошо зарекомендовала себя комбинированная система
пеногашения, разработанная в Институте микробиологии им.
А. Кирхенштейна АН Латвийской ССР (рис. 2.25).
Сигнал от электрода приводит в действие усилитель У, ко-
торый замыкает контакты реле времени Р\ для включения
первого регулятора, приводящего в действие исполнительный
механизм М (механический пеногаситель).
При срабатывании первого регулятора импульс поступает
также иа реле времени Р2, которое по истечении заранее
установленного промежутка приводит в состояние готовности
81
----------— —-----------1 ПАП-2 ”!
ПАП-1 или ПАП-3 ।
Рис. 2.25. Комбинированная система автоматического пеногашения (ПАП)-
И—индикатор пены у датчика; У — усилитель; Pi, Pt. Р3 —реле времени; УС — уст-
ройство сброса; ИГ\, ИГЯ — импульсный генератор; ПУ — пересчетное устройство; СП —
следящий повторитель; БП — блок питания; Д — электрод—датчик уровня пены; М —
механический Пеногаситель-ротор; Xt, Х2 — исполнительный механизм химического пено-
гашения
второй регулятор ИГ] (усилитель и импульсный генератор),
предназначенный для запуска исполнительного механизма хи-
мического пеногашения Xi, Х2 (соленоидный клапан или пери-
стальтический насос). Если уровень пены не снижается ниже
контрольного электрода, то сигнал вызывает повторное дей-
ствие второго регулятора. При срабатывании этого регулятора
сигнал поступает в следующий, третий, регулятор СП и ИГ2
(следящий повторитель, импульсный генератор), который в слу-
чае необходимости запускает другой, более эффективный в дей-
ствии механизм Х2 (соленоидный клапан) химического пено-
гашения.
В значительной степени эффективность микробиологиче-
ского производства зависит от постановки микробиологического
контроля. Контролируются музейная культура микроорганиз-
ма-продуцента, посевной материал, питательные среды, воздух,
культуральная жидкость, а также готовая продукция. В за-
висимости от назначения микробиологической продукции (для
пищевой, медицинской промышленности, сельского хозяйства)
предъявляются различные требования к ее обсемененности. На-
пример, продукты, используемые в медицинской промышленно-
сти, должны быть практически свободны от микроорганизмов.
Одна из главных задач службы микробиологического кон-
троля —- поддержание в активном состоянии производственного
штамма. В процессе неоднократных пересевов микроорганиз-
мов, а также длительного воздействия условий культивирова-
ния с течением времени могут возникнуть спонтанные мута-
ции, которые приводят к снижению продуктивности производ-
82
ственной культуры. В связи с этим периодически, два раза
в год, а в отдельных случаях и чаще, проводят рассев произ-
водственного штамма и отбор вариантов с наиболее высокой
л родукти вностью.
Биохимический контроль количества и специфической ак-
тивности продуктов микробиологического синтеза позволяет про-
следить за выходом промежуточных и конечного продуктов. Этот
вид контроля обеспечивает выпуск продукции, отвечающей тре-
бованиям стандартов.
Глава 3. КОРМОВЫЕ БЕЛКОВЫЕ
ПРОДУКТЫ
Одной из основных задач микробиологической промышленности является
обеспечение сельского хозяйства полноценным кормовым белком. Потребно-
сти животноводства и птицеводства в кормовом белке удовлетворяются в ос-
новном за счет растениеводства. Однако белок основных растительных кор-
мов (зерновые культуры, картофель, сахарная свекла, кормовые травы и др.)
содержит недостаточное количество витаминов, ферментов, микроэлементов,
а главное таких незаменимых аминокислот, как лизин, метионин, триптофан.
В результате при использовании иеполноцеииого белка замедляется рост
животных, в 1,5—2 раза повышаются затраты корма на единицу животно-
водческой продукции. Для улучшения качественного состава растительных
кормов их обогащают такими белковыми добавками, как рыбная и мясо-
костная мука, жмых, шрот, обезжиренное молоко и т. д. Уровень производ-
ства этих кормовых белковых продуктов не удовлетворяет потребностей сель-
ского хозяйства. Возможности расширения объемов их производства для
полной ликвидации дефицита кормового белка ограничены.
В 1975 г. белковый дефицит в мире, по данным ФАО ООН составил
только по развивающимся странам 2,4 млн. т животного и 1,45 млн. т расти-
Таблица 3.1. Сравнительная характеристика различных кормов
по содержанию белка, незаменимых аминокислот и витаминов
Состав Рыбная мука Мясокост- ная мука Подсолнеч- ный шрот Горох г а. 1 £ Кормовые дрожжи из парафинов нефти
Протеин 47—63 30—50 31—46 23 5 48—63
Липиды 2—11 11—18 3 2 I 1.0- 5.0
Лизин. % к сырому про- 9 5.4 3—4 6.5 6,1 6— 1П
теину Метионин, % к сырому про- 3 1.5 1.3 1.4 л 0.5— 1.5
Триптофан, % к сырому 1 0,8 1.0 0,8 2.0
протеину Витамины, мг/кг: В, 0,9 0.1—0.2 з—зл 1с
В 5—12 5.7 0,2 0.9-1.5 8—20 8
в. 0,6 6-8 — — 20—23 7
в. 3290 —. — — 576—115 4000
в 79 56—67 — — 9 400
в» — 1.5 — 0,3 5-6,5 1Е
вт — 0.2 — 0.02 0.05 -0.1 1 5
В, — — — — 3000
83
тельиого белка. Согласно официальным прогнозам, общая потребность в жи-
вотном белке в 1980 г. составила 42,5 млн. т, а к 2000 г. дли 6,5—7 млрд,
жителей Земли необходимо будет как минимум 160 млн. т протеинов. Ми-
ровая потребность в животном белке удовлетворяется в среднем на 40%,
в то время как ежегодный прирост его производства достигает лишь 2—3 %.
Для решения проблемы ликвидации «белкового голода» перспективным яв-
ляется промышленное производство кормовых дрожжей методом микробио-
логического синтеза. Кормовые дрожжи, получаемые в промышленности, по
качеству белка (составу незаменимых аминокислот), комплексу витаминов,
липидов и других биологически активных веществ ие уступают белкам ра-
стительного и животного происхождения, а по отдельным показателям пре-
восходят их (табл. 3.1).
Сельское хозяйство с 1 млн. т кормовых дрожжей может получить около
500 тыс. т переварнмого протеина, содержащего свыше 220 тыс. т незаме-
нимых аминокислот, в том числе более 30 тыс. т лизина, 7,5 тыс. т метио-
нина, 9 тыс. т цистина, 12,5 тыс. т триптофана, около 9 тыс. т витаминов
группы В н D. Введение в кормовые рационы для птицы 1 т дрожжей по-
зволяет получить дополнительно 1,5—2,5 т мяса (в пересчете на живую
массу) или 30 тыс. шт. яиц. В свиноводстве и птицеводстве пополнение кор-
мовых рационов 1 т дрожжей улучшает использование белка и других ве-
ществ основного корма, сокращает иа 3,5—5 т расход фуражного зерна.
При выпаиванин телят 1 т дрожжей заменяет до 8,4 т цельного мо-
лока.
3.1. СУБСТРАТЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ
Микробиологический способ производства кормового белка в отличие от
производства растительного н животного белков ие зависит от природно-
климатических условий и основывается иа использовании различных видов
технического сырья, запасы которого в природе велики.
Для производства кормовых дрожжей применяют культуры Candida
scottii, Candida tropicalis, Candida utilis, в качестве основного сырья исполь-
зуют отходы различных производств, содержащие сахара — глюкозу, кси-
лозу, мальтозу, сахарозу, галактозу, арабинозу, а также уксусную кислоту,
этиловый спирт и другие органические соединения.
Все используемые в производстве кормовых дрожжей отходы можно
разделить иа три группы: 1) отходы от переработки растительного сырья
(древесина, кукурузная кочерыжка, подсолнечная лузга, рисовая шелуха,
хлопковая шелуха, сульфитный щелок и отчасти предгидролизат сульфат-
целлюлозного производства); 2) отходы пищевой промышленности (барда
спиртовых заводов, перерабатывающих зерно, картофель и мелассу, соковые
воды крахмальных заводов и молочная сыворотка); 3) продукты перера-
ботки нефти (жидкие очищенные парафины, нефтяные дистилляты, гачн и
т. д).
Производство кормовых дрожжей иа основе двух первых видов сырья
можно считать традиционным, так как оно существует уже ие один десяток
лет. Промышленное производство кормовых дрожжей из углеводородов нефти,
созданное в Советском Союзе впервые в мире, уже имеет значительный
удельный вес в общем объеме производимых в стране кормовых дрож-
жей.
В зависимости от вида используемого сырья дрожжи имеют определен-
ный состав. Наиболее ценным компонентом их является протеин. Содержа-
ние его в дрожжах одного и того же рода, вида и даже штамма, ио выра-
щенных на различных средах и по разным режимам, колеблется в значи-
тельных пределах — от 35 до 55 %.
Несмотря на существенное различие в составе исходного сырья техно-
логия производства кормовых дрожжей ие имеет значительных отличий н
может быть представлена в виде следующей схемы.
84
Получение субстрата
I
Подготовка субстрата
к выращиванию дрожжей Размножение засевных дрожжей
I 1
I
Выращивание дрожжей
I
Выделение и сгущение дрожжей
I
Сушка дрожжей
I
Кормовые дрожжи (товарные)
3.2. ПОДГОТОВКА СУБСТРАТОВ
К ВЫРАЩИВАНИЮ ДРОЖЖЕЙ
Подготовка мелассной барды. Мелассная барда яаляется отходом спир-
тового производства. Ее получают после переработки на спирт зернового,
картофельного сырья, свеклосахарной мелассы.
Состав мелассной барды непостоянен и зависит в основном от каче-
ства мелассы и технологии ее получения.
Обычно мелассиая барда содержит 7—10 % сухих веществ. Органи-
ческие вещества составляют около 70 - 74 %, а неорганические соединения —
20—30 % общего содержания сухих веществ. По содержанию азотистых ве-
ществ барда является неполноценной. Большая часть общего азота при-
ходится на бетаин. В мелассной барде в небольших количествах содержатся
многие усваиваемые дрожжами аминокислоты. Однако преобладает среди
них пирролидоикарбоиовая кислота, которая не ассимилируется дрожжами.
В небольших количествах в барде содержатся глюкоза, фруктоза, араби-
ноза, мелибиоза и другие сахара. Глицерин и небольшое количество эти-
лового, изоамилового и некоторых других высших спиртов остаются в ней
при перегонке бражки.
Остаток иесброжеиных спиртовыми дрожжами свободных редуцирующих
веществ (РВ) ие превышает 1,5—6,6 %, общих — 2,2—9,7 %. Из общего ко-
личества РВ немногим больше половины приходится иа сахар, остальную
часть составляют иесбраживаемые гуминовые, мелаиондиновые и глюкозид-
ные соединения, ие усваиваемые дрожжами.
Наиболее ценными в барде являются органические кислоты, состоящие
иа Чз из летучих (муравьиная и уксусная) и иа 2/з из нелетучих кислот
(молочная, глюконовая, яблочная, винная, янтарная).
На долю зольных элементов приходится примерно 30 % сухих веществ
барды, из которых 36—55 % КгО и 6,5—7,5 % Na2O. Остальные элементы
содержатся в небольшом количестве. В барде присутствуют также микро-
элементы (в мг % на СВ): марганец 0,3—9,0; никель 0,5—1,9; титан 0,3—
5,9; медь 0,3—18,3; ванадий 0,3—6,0; кобальт 0,06—0,64; барий 0,3—12,7
и др.
Для производства кормовых дрожжей практическое значение имеют
лишь те вещества барды, которые усваиваются дрожжами рода Candida:
моно- и дисахара, карбоновые кислоты и оксикислоты, спирты, аминокис-
лоты, глюкозиды, органические и иеоргаиические азотистые соединения, соли
калия, магния, фосфора и железа, микроэлементы, витамины.
Недостатками барды являются низкое содержание фосфора и высокое
количество зольных элементов и других не усваиваемых дрожжами веществ
85
Повышенная концентрация сухнх веществ барды обусловливает увеличенное
осмотическое давление, тормозящее жизнедеятельность дрожжей.
Во избежание развития посторонней микрофлоры, в процессе культиви-
рования кормовых дрожжей горячую барду, поступающую на производство,
направляют в стерилизатор-выдерживатель, рассчитанный по вместимости
иа 45—60-минутную производительность цеха.
При переработке барды, содержащей клетки дрожжей сахаромицетов,
стерилизатор обязательно должен быть снабжен мешалкой. В стерилизаторе
барда освобождается от спорообразующих микроорганизмов и твердых при-
месей, периодически удаляемых при чистке аппарата.
Если барда содержит значительное количество СаО (более 0,3 %), то
выделение гипса проводят в отстойниках, предварительно подкисляя барду
до pH 3,5—3,8 серной кислотой.
Для приготоалеиия питательной среды охлажденную до нужной темпе-
ратуры барду смешивают с растворами солей, содержащих азот и фосфор
в таком количестве, чтобы обеспечить содержание в сухих дрожжах 8 %
N2 и 4,0—4,5 % Р2О5. Соли могут быть добавлены к барде в различных
соотношениях (в кг/мэ): ортофосфориая кислота 70%-иая 1,0 и карбамид
1,1 или диаммоиийфосфат 1,3 и карбамид 0,5. Эта операция осуществляется
в смесителях (сусловых чанах), вместимость которых соответствует 30-минут-
ной производительности цеха. В смеситель непрерывно поступают охлажден-
ная барда и растворы солей. Готовая питательная среда непрерывно пере-
качивается в дрожжерастильные аппараты.
Гидролиз растительного сырья. Производство белковых кормовых дрож-
жей из непищевого растительного сырья является важным источником сни-
жения дефицита кормового белка. В Советском Союзе значительное коли-
чество таких дрожжей вырабатывается иа гидролизных предприятиях, пере-
рабатывающих отходы лесопиления, древесину и непищевые отходы сель-
ского хозяйства (кукурузную кочерыжку, подсолнечную лузгу, хлопковую ше-
луху, рисовую лузгу, солому и т. д.). Схема технологического процесса про-
изводства гидролизных дрожжей состоит из следующих основных стадий:
подготовка и складирование сырья, гидролиз сырья, подготовка к очистка
субстрата, ферментация, выделение дрожжей и их сгущение, сушка дрожжей,
упаковка и хранение готового продукта.
Перед подачей иа производство сырье измельчают до определенных раз-
меров и освобождают от металлических примесей.
В процессе гидролиза полисахариды, содержащиеся в растительной
ткаии, превращаются в моносахариды. Для ускорения растворения полиса-
харидов растительной ткани гидролиз проводят разбавленной (0,4—0,6 %-
ной) серной кислотой. В результате получают гидролизат, содержащий са-
хара в виде гексоз и пентоз (ксилоза, арабиноза). В процессе гидролиза
часть моносахаридов разрушается и в гидролизат переходят продукты их
распада, которые являются ингибиторами роста дрожжей. К таким веще-
ствам относятся фурфурол, оксиметилфурфурол, уроновые кислоты, а также
декстрины и коллоидные вещества.
Содержание фурфурола в гидролизатах колеблется в пределах 0,03—
0,05 %, оксиметилфурфурола 0,08—0,2 %, содержание остальных соединений
изменяется в широких пределах. Гидролиз разбавленной серной кислотой
может быть осуществлен периодическим или непрерывным способом. Прн
периодическом способе гидролиза сырье остается в неподвижном состоянии.
Периодические способы гидролиза по взаимодействию твердой и жидкой
фаз подразделяют иа стационарный, оросительный и перколяционный. В по-
следнем, получавшем широкое промышленное применение, жидкая фаза про-
ходит через слой неподвижной твердой фазы, при этом обязательно полное
погружение твердой фазы в жидкость. В зависимости от направления дви-
жения жидкой фазы существует несколько модификаций перколяционного
гидролиза.
В Советском Союзе большинство гидролизных заводов использует верти-
кальную перколяцию, где жидкая фаза передвигается сверху вниз и отбор
гидролизата осуществляется снизу. Результаты гидролиза обычно оценивают
86 ж
Рис. 3.1. Гидролиз-аппарат вместимостью
SO мя (без футеровки):
/ — загрузочный люк; 2 — удлиненные трубы
(лучи) для отбора гидролизата при горизонталь-
ной перколяции; 3 — короткие трубы (лучи) для
отбора гидролизата при вертикальной перколя-
ции; 4— клапан для выгрузки лигнина; 5 —кор-
пус с термоизоляцией; 6— лаз; 7 — труба для
подачи воды н кислоты (через смеситель) при
горизонтальной перколяции; 8 — штуцер для по-
дачи кислоты; 9 — штуцер для подачи воды
по количеству редуцирующих веществ
(РВ). Выход РВ выражают в процентах
к массе абсолютно сухого сырья, направ-
ленного иа гидролиз. Применяемые в на-
стоящее времн режимы перколяционного
гидролизата дают возможность получать
следующие выходы РВ (в %): из древе-
сины — 45—48, из кукурузной коче-
рыжки—50—52, из подсолнечной лузги —
37—39, и в зависимости от принятого ги-
дромодуля концентрация РВ в гидроли-
зате колеблется от 2 до 3 %.
Технический прогресс в гидролизной
промышленности связан с внедрением не-
прерывного способа гидролиза. Его преи-
мущества — высокая удельная производи-
тельность с единицы объема аппарата, рав-
номерное потребление пара и сырья,
а также стабильная нагрузка иа вспомогательное оборудование. Непрерывный
способ ие требует времени иа подготовительно-заключительные операции, по-
зволяет максимально автоматизировать всю технологическую линию производ-
ства кормовых дрожжей. Гидролизаты, получаемые при непрерывном про-
цессе, имеют хороший качественный состав и более постоянную концентрацию
редуцирующих веществ. Эксплуатация опытных гидролизацнонных аппаратов
непрерывного действия показала возможность получения выхода РВ от аб-
солютно сухой древесины (АСД) 53,5—55 % при концентрации сахара в ги-
дролизате 3,55—4,i2 %. По данным ВНИИгидролиза, оснащение гидролизно-
дрожжевого завода мощностью 50 тыс. т дрожжей в год аппаратами непре-
рывного действия (производительность 2 т АСД/ч) позволяет получить
годовую экономию около 1,9 мли. руб. Действующие предприятия Советского
Союза оснащены гидролиз-аппаратами периодического действия вмести-
мостью 18, 30, 37, 50, 70 м3. Увеличение объемов аппаратов периодического
действия свыше 50 мэ считается нецелесообразным, так как уменьшается
производительность 1 м3 емкости, снижается скорость перколяции, сокраща-
ется выход РВ от АСД. Для поддержания высокой скорости выдачи гидро-
лизата требуются дополнительные устройства внутри аппарата для осущест-
вления горизонтальной н горизонтально-вертикальной перколяции.
В настоящее время в гндролиз-аппаратах вместимостью 70 м3 и более
осуществляется гидролиз древесных отходов, в аппаратах вместимостью
до 40 № — отходов древесных и сельского хозяйства. Вместимость аппарата
не влияет на его конструкцию. На рнс. 3.1 представлен гидролиз-аппарат
вместимостью 80 м3. Корпус его сварной изготовлен из листовой котельной
стали марки 20К. Толщина стенок обечайки 34 мм, конусов — 28 мм. К кор-
пусу приварены стальные литые горловины (верхняя н нижняя). Через
верхнюю горловину диаметром 800 мм загружается сырье. Горловина закрыва-
ется механической крышкой с полукольцевым захватом. К нижней горло-
вине с_ помощью переходного фланца присоединен быстродействующий вы-
грузной клапан, который открывается при выгрузке лигнина. Для уменьше-
87
ния потерь тепла наружную поверхность аппарата снабжают теплоизоля-
цией. Внутренняя поверхность защищена шамотным кирпичом.
При вертикальной перколяции раствор кислоты подают сверху, а гидро-
лизат отбирают через фильтр, расположенный в нижнем конусе. Для гори-
зонтальной перколяции верхний конус снабжен штуцером для подачи рас-
твора кислоты в трубу, расположенную вертикально и закрепленную на
внутренней стенке аппарата. На поверхности трубы, выходящей внутрь ап-
парата, имеются отверстия для распределения жидкости выше уровня сырья,
а также на участках, погруженных в сырье (лигнин). На противоположной
стенке расположен трубчатый фильтр для отбора гидролизата. Высоту лу-
чей фильтра подбирают таким образом, чтобы их заглушенный верхний ко-
нец не выступал из слоя лигнина.
При помощи описанных устройств может осуществляться вертиквльный,
горизонтальный или комбинированный поток жидкости Гидролиз-аппарат
снабжен необходимым количеством штуцеров (продуктовый, сдувочный и
др.). К корпусу аппарата приварены сварные конструкции, при помощи ко-
торых его ставят иа опорные балки. Конструкция одной из лап приспособ-
лена для установки под нее прибора измерения массы аппарата. Для
ремонта и осмотра аппарата в цилиндрической части обечайки предусмотрен
лаз диаметром 500 мм.
ч Продолжительность оборота гидролнз-аппарата вместимостью 70—80 м3
при переработке древесных отходов составляет по стадиям (в мин); за-
грузка — 35—40, подогрев — 50, перколяция — 140, промывка — 25—30,
осушка (отжим) —40,- выстрел (выгрузка) — 10.
яСырье в аппарат подают через загрузочные устройства траспортером.
Одновременно с сырьем подают воду и кислоту. Смачивание увеличивает
плотность загрузки. После загрузки верхнян крышка гидролнз-аппарата за-
крывается н через нижний штуцер для подогрева древесной массы подается
пар. В период подогрева давление поднимается до 500 кПа и проводится
в течение 2—3 мин сдувка воздуха, отводимого через верхний вентиль. При
сдувке частично удаляются скипидар, метанол, фурфурол и другие вещества,
присутствие которых нежелательно при выращивании дрожжей.
Начальный период перколяции проводится в мягких условиях — при по-
ниженной (около 150 °C) температуре. Температуру воды, подаваемой в гид-
ролиз-аппарат, постепенно повышают со 175 °C в начале до 188—190 СС
в конце процесса гидролиза. Соответственно этому изменяется и темпера-
тура внутри аппарата. В начальный период истинная температура гидро-
лиза намного ниже температуры подаваемой воды. Вначале содержимое ап-
парата имеет температуру 145—150 °C, в то время как поступающая вода —
175 °C. При мягком прогреве температура выравнивается примерно в тече-
ние часа.
Вертикальная перколяция осуществляется путем подачи воды н кислоты
через верхний штуцер аппарата. Кислота проходит через весь слой сырья.
Гидролизат отводится через фильтрующие трубы, расположенные в нижнем
конусе аппарата. В течение процесса гидролиза по мере его углубления
фильтрационная способность сырья ухудшается. К этому времени темпера-
тура содержимого аппарата уже близка к температуре подаваемой воды.
Кипящая жидкость фильтруется через слой лигиииа в 2—2,5 раза медлен-
нее, чем иекипящая. Для улучшения фильтрации изменяют направление
перколяции и ведут ее в горизоитдльиом иаправленнн. Воду и кислоту
в этом случае подают в вертикальную перфорированную трубу, а отбор
гидролизата проводят через фильтрующие трубы в цилиндрической части
аппарата.
Промывку лигнина водой проводят, подавая ее сверху вниз и продол-
жая отбирать гидролизат. Этот период называется сушкой. Получение гид-
ролизата для производства дрожжей при гидролизе древесины проводят,
используя гидромодуль отбора 15—17, т. е. гидролизата отбирают в 15—i7
раз больше, чем весят абсолютно сухая древесина, загруженная в аппарат.
Затем проводят выгрузку иепрогидролизованиого остатка лигиииа. Для
этого сдувают пары из аппарата и прн достижении давления 600—700 кПа
88
открывают быстродействующий клапан, установленный иа нижнем конусе.
В специальные устройства сцежи (циклоны) выгрузка (выстрел) длится не-
сколько секунд. После самоиспарения лигнин оседает иа дно циклона, от-
куда удаляется с помощью выгребного устройства.
В настоящее время разрабатываются противоточные аппараты непре-
рывного действия с нижней и верхней подачей сырья. Необходимым усло-
вием правильного ведения процесса гидролиза в аппаратах непрерывного
действия является противоточное перемещение сырья по отношению к пода-
ваемому раствору кислоты. Благодаря этому материал, содержащий труд-
иогидролиз уемые полисахариды, соприкасается со свежей, наиболее кон-
центрированной кислотой. В результате происходит более глубокий процесс
гидролиза с образованием дополнительного количества моносахаридов. Кроме
того, свежезагруженное сырье, соприкасаясь со значительно менее кислым
раствором, подвергается более легкому гидролизу, что позволяет сохранить
от разложения легкогидролизуемую часть сахара, который быстро выводится
из зоны реакции. Процесс диффузии и отмывкви сахара от лигнина при про-
тивотоке протекает также значительно полнее. Лигнин подвергается про-
мывке чистой водой, благодаря чему создается благоприятный перепад кон-
центрации. Принцип противотока обеспечивает получение гидролизата с по-
вышенной концентрацией сахара и постоянного состава, что положительно
сказывается иа его биохимической переработке.
Подготовка гидролизатов. Схема подготовки гидролизата к выращива-
нию дрожжей представлена иа рис. 3.2.
Из аппарата ‘2 гидролизат поступает на трехступенчатую испаритель-
ную установку для охлаждения. Давление в испарителяк понижается от сту-
пени к ступени; иа первой — 500, иа второй — 200—250 и иа третьей — около
100 кПа. Соответственно этому уменьшается и температура гидролизата:
150; 130—135 и 100—103 СС. Пары с каждой ступени испарения поступают
на конденсацию в соответствующую группу теплообменников (решоферов)
и далее иа выделение фурфурола сырца.
Охлажденный гидролизат подвергается инведсин обычно при атмосфер-
ном давлении н температуре 100 °C. Инверсия осуществляется непрерывно
в течение 6—8 ч в футерованном цилиндрическом аппарате с коническим
днищем. Гидролизат из испарителя поступает в инвертор 13, где за счет
гидролизата олигосахаридов образуется дополнительное количество моиоса-
харов, стабилизируется коллоидный состав гидролизата и выпадает осадок,
содержащий смолистые вещества. Гидролизат из инвертора отводится через
штуцера, расположенные в верхней цилиндрической части аппарата. Осадок,
образующийся в нижней части конуса, периодически выводится из аппарата.
Гидролизаты, поступающие на подготовку к выращиванию дрожжей,
имеют следующий состав (в %):
Общие РВ
в том числе
гексозы
пентозы
иесахара
2,5-3,5
70—80
30—20
0,10—0,16
Органические кислоты
Серная кислота
Фурфурол
Оксиметилфурфурол
До 0,40 1
0,5—0,6
0,05-0,06]
До 0,20
Подготовка гидролизата к выращиванию дрожжей складывается из сле-
дующих операций: освобождение его от серной кислоты (нейтрализация),
снижение температуры до 25—40 °C, уменьшение содержания фурфурола до
0,03—0,04 %, максимальное удаление коллоидных и взвешенных веществ.
Нейтрализация серной кислоты, содержащейся в гидролизате, обычно
проводится непрерывно в двух или трех последовательно соединенных ней-
трализаторах 15 известковым молоком или аммиачной водой. В первый
нейтрализатор подают гидролизат и известковое молоко с добавкой суль-
фата аммония (0,25 г иа 1 м3), что приводит к образованию кристаллов
гипса. Вместе с гипсом из раствора выделяется часть содержащихся в гид-
ролизате коллоидных и взвешенных веществ. Нейтрализацию проводят при
температуре 75—85 °C. При нейтрализации серной кислоты аммиачной водой
89
.4
ч
90
Таблица 3.2. Продукты, получаемые на 1 т абсолютно сухой древесины
Продукты Этиловый спирт и дрожжи Только дрожжи
Этиловый спирт, абс. л 175—182 —
Дрожжи (влажность 10%), кг 32 225—235
Метанол, кг 2,0 2,0
Сивушные масла, кг 0,3 —
Фурфурол (94%-ный), кг 5,6 5,6
Лигнин (абс. сухой), кг 380 380
Углекислота (жидкая), кг 70 —
Гипс, кг 225 225
образуется сульфат аммония, который ие образует осадка. Нейтрализован-
ный гидролизат называется иейтрализатом, pH его обычно имеет значение
4,2—4,6. Осветление иейтрализата проводится в непрерывно действующих
отстойниках 16, откуда он направляется в сборник 17.
Температура иейтрализата перед выращиванием дрожжей должна быть
снижена до 25—40 °C 'в вакуум-охладительной установке 19 и в теплооб-
меннике 21. Кроме охлаждения при самоиспарении под вакуумом обеспечи-
вается дополнительное выделение Других летучих веществ с парами, напри-
мер фурфурола.
Кроме таких обязательных приемов подготовки гидролизатов, как ин-
версия, нейтрализация, отстой и вакуум-охлаждение, в настоящее время
используют два новых метода облагораживания гидролизатов. По первому
способу гидролизат продувается ларом при атмосферном давлении в аппа-
рате колонного типа. При этом удаляется 95 % фурфурола, терпеновые сое-
динения и происходит коагуляция коллоидов. По второму методу, более
простому в исполиеиии, гидролизат, прошедший стадии нейтрализации, от-
стоя и охлаждения, подвергается продувке воздухом, в результате проис-
ходят частичное удаление летучих примесей, окисление нелетучик компонен-
тов и коагуляция коллоидов. Технологический .регламент гидролизно-дрож-
жевого производства предусматривает получение выхода дрожжей 46—
48 % в зависимости от содержания РВ и суммарный выход товарных Дрож-
жей 10 %-иой алажиости с учетом производственных потерь в пределах
225—235 кг из 1 т абсолютно сухой древесины (табл. 3.2).
Получение и подготовка сульфитного щелока. Для получения кормовых
дрожжей могут быть использованы все виды сульфитных щелоков после
соответствующей обработки. На предприятиях целлюлозно-бумажной промыш-
ленности иа первых этапах варки сульфатной целлюлозы получают так назы-
ваемый предгидролизат. Это жидкость, содержащая сахара различного со-
става, которые после инверсии можно использовать для получения дрожжей.
Варку целлюлозы из древесины или других видов сырья проводят в кис-
лоте при температуре 140—160 °C при соответствующем давлении в течение
определенного времени. Варочная кислота представляет собой водный рас-
твор сернистой кислоты, в который введено какое-либо основание: нераство-
римое СаО, полурастворимые (NH^O и Na2O, смесь СаО+(NHOsO и др.
Основание связывает часть сернистой кислоты с образованием соответству-
ющей кислой соли (бисульфита). Концентрация всего SO2, в варочной кислоте
обычно колеблется от 5 до 10 %, а концентрация SO2, связанного в виде би-
сульфита, составляет 0,8—1,5%.
Процесс сульфитной варки делится иа два периода: заварку и варку.
В течение первого периода кислота проникает в растительную ткаиь, вызывая
в ней процесс сульфитироваиия лигнина с образованием твердой кальциевой
соли лнгиосульфоновой кислоты. Заварка проводится при температуре ПО—
115 °C. Второй период — собственно варка — осуществляется прн температуре
91
130—140 °C. На этой стадии растворяются твердая лигносульфоновая кислота
и гемицеллюлозы, происходит гидролиз гемицеллюлозы до моносахаров.
В зависимости от выхода из древесины различают следующие виды суль-
фитной целлюлозы: целлюлоза нормального выкода (до 50 % от массы
древесины), целлюлоза высокого выхода (до 65 %) и полуцеллюлоза (70—
75%). С увеличением выхода целлюлозы уменьшается выход сахаров, со-
ставляющий 15—16 % от массы хвойной древесины; целлюлозы высокого
выхода 12—13 %, причем прирост РВ после инверсии составляет примерно
10 %.
Во время сульфитной варки целлюлозы из хвойной древесины происходит
значительный распад сахаров (до 40 % и более). В результате образуются
фурфурол и оксиметил фур фу рол. На распад сахара влияет температура
варки: чем она выше, тем больше степень его разрушения. С увеличением
выхода целлюлозы количество моносахаров уменьшается и возрастает со-
держание олигосахаридов, перед использованием которых необходимо про-
вести инверсию. С уменьшением выхода целлюлозы увеличивается коли-
чество глюкозы и галактозы.
На выход РВ влияют главным образом порода древесины, выход цел-
люлозы, способ варки и в некоторой степени природа основания варочной
кислоты.
Во время варки протекают также побочные процессы и образуются раз-
личные органические соединения: метаиол, фурфурол, муравьиный вльдегид,
триозы (глицериновый альдегид, метилглиоксаль, диоксиацетои), уксусная и
муравьиная кислоты. Фурфурол и муравьиная кислота ингибируют процесс
выращивания дрожжей.
В варочном котле щелок находится в двух состояниях: в свободном
(около 50—60%) и внутри волокон и в клеточных стенках. После отделе-
ния свободного щелока оставшийся связанным с целлюлозой щелок может
быть отделен только методом диффузии водой Применяют несколько спосо-
бов отбора щелока: нз котла или сцежи, отбор крепкого щелока из котла,
а слабого — из сцежн.
Хорошие результаты обеспечивают отбор свободного щелока, а затем
промывка всей массы в сцеже сначала оборотным щелоком, а потом горячей
водой. При этом съем сахара иа 1 т целлюлозы составляет 210—220 кг РВ
и выше. Количество отделяемого сульфитного щелока в расчете на 1 т воз-
душио-сухой целлюлозы составляет примерно 8,5 м®.
Щелок, поступающий на подготовку, содержит включения волокон цел-
люлозы, повышенное количество SOa и имеет высокую температуру. Подго-
товка щелока к выращиванию дрожжей предусматривает проведение следу-
ющих операций:
очистку щелока от волокон целлюлозы;
инверсию олигосахаридов в сульфитном щелоке;
отдувку сульфитного щелока паром для удаления летучих соединений
(фурфурол, сернистый ангидрид и др.), а также продувку щелока воздухом
с целью окисления сульфитов в сульфаты, исключающие образование сахаро-
бисульфитных соединений;
нейтрализацию сульфитного щелока;
очистку нейтрализованного сульфитного щелока от взвешенных веществ:
подачу питательных солей в нейтрализованный сульфитный щелок;
охлаждение сульфитного щелока до температуры, необходимой для вы-
ращивания дрожжей.
Очистка щелока от целлюлозного волокна проводится, если концентра-
ция волокна достигает более 50 мг/л. Это следствие недостаточно хорошей
фильтрации через ложное дно сцежи и фильтрующую сетку котла. Если
концентрация волокна в щелоке достаточно высока, то его пропускают че-
рез различные фильтрующие устройства. Содержащиеся в щелоке олиго-
сахариды необходимо перевести в мономеры. Инверсия позволяет макси-
мально полно освободить сахара от связанной формы. Инверсию можно
проводить под давлением в закрытых емкостях при температуре 130—140 °C
92
и открытым способом при температуре около 100 °C. Основными факто-
рами, влияющими на процесс инверсии, как и иа гидролиз, являются тем-
пература, концентрация кислоты и время.
Наиболее целесообразно проводить инверсию под давлением. По срав-
нению с открытым способом продолжительность операции сокращается при
этом в несколько раз. При температуре 130 °C н концентрации кислоты
0,1 % длительность инверсии кальциевых щелоков составляет 3—4 ч, а при
150 °C — около 30 мин.
Удаление летучих веществ из щелока, в первую очередь свободной SO2
является важной операцией, так как S02 ингибирует рост дрожжей и сни-
жает их выход. Для удаления из щелока летучих веществ очень важной опе-
рацией является сдувка пара из варочных котлов. Простой и доступный
прием удаления SO2— продувка сульфитного щелока воздухом в течение
1—1,5 ч при температуре ие ниже 80 °C, при этом температура щелока сни-
жается, а это в свою очередь повышает растворимость SO2. Наилучшнм
способом признана паровая обработка. Она проводится методом продувки
щелока паром в колоииых аппаратах, при этом удаляется до 50 % соедине-
ний SO2. При продувке щелока паром снижается кислотность. Считается
нормальным, если pH щелока имеет значение до 3,5—4,0. Щелок с таким
pH может передаваться на производство дрожжей. При необходимости ней-
трализации щелока чаще всего используется известковое молоко. После этой
стадии сульфитный щелок освобождается от образовавшегося шлама раз-
шчиыми способами (очистка в отстойниках, гидроциклонах, фильтрах).
По своему солевому составу сульфитный щелок — очень сложный суб-
страт. Его качество определяется качеством перерабатываемой древесины,
основанием варочной кислоты, режимом варки и способом нейтрализации.
Для обеспечения нормального развития дрожжей в щелок добавляют до-
полнительные питательные вещества— азот, фосфор, калий. Азот вводят
в виде сульфата аммония или аммиачной воды, которая одновременно яв-
ляется регулятором pH в дрожжерастильном аппарате; фосфор — в виде
суперфосфата, калий — я виде хлорида калия.
Щелок. как и гидролизат, перед подачей иа выращивание дрожжей дол-
жен быть охлажден до 32—35 °C иа многоступенчатой вакуум-охладительной
установке. При этом вследствие самоиспареиия дополнительно удаляется
значительное количество летучих веществ.
Использование углеводородного сырья. Способность микроорганизмов
окислять и ассимилировать углеводороды нефти была известна уже давно.
Однако интенсивные научные исследования, направленные на практическое
использование микроорганизмов для получения белковых продуктов иа ос-
нове углеводородов иефтн, были начаты в 50—60-х годах.
Микробиологический метод получения белка имеет практически неогра-
ниченные источники сырья. Наиболее дешевым сырьем могут служить пря-
могонные дизельные фракции парафинистых нефтей (нефтяные дистилляты)
с последующим их использованием в качестве компонентов товарного ди-
зельного топлива, а также очнщеииые жидкие парафины, масляные дистил-
ляты и другие продукты, содержащие н-алканы.
Механизм, обеспечивающий проникновение углеводородов в клетку, окон-
чательно ие выяснен. Однако установлено, что при росте дрожжей иа среде
с углеводородами последние проникают через липидную фракцию клеточной
стенки, имеющей гидрофобную структуру, до цитоплазматической мембраны
по градиенту концентрации. Попадая в клетку, углеводороды окисляются до
спиртов по уравнению
R—(СН2)„—СН, |-О, ; НАД R-(CH,)„-CH,OH+
+Н2о+НАДН,.
Спирты при_ помощи алкогольдегидрогеназы окисляются до альдегидов,
которые под действием альдегиддегидрогеиазы окисляются до нислот.
Дальнейшее превращение нислот протекает по пути р-окисления. В ре-
зультате реакции окисления радикала, находящегося а p-положении по отно-
93
тению к карбоксильной группе, углеродная цепь с каждым циклом окисле-
ния укорачивается иа два атома углерода. При участии ацетил-КоА обра-
зуются соответствующие ацетил-КоА производные кислот, при окислении ко-
торых под действием фермента ацетилгидрогеназы образуются соединения
с двойной углеродной связью
R—СНа—СН2—СО—S—КоА——- R—СН =
=СН—СО—S— КоА.
К ненасыщенному соединению под действием фермента эиоилгидратазы
присоединяется молекула воды
R — CH = CH—CO—S— КоА R — СНОН—СНа—
—CO—S—КоА.
Под действием p-оксиацетнлдегидрогеиазы р-оксикислота восстанавлива-
ется до кетокислот
R—СНОН— СН2—СО—S—КоА R CO—СН2—
—СО—S—КоА.
Реакция р-окисления заканчивается при участии р-кетоацетилтиолазы
R—СО—СН2—СО—S—KoA-j-HS—КоА--------------------
-----> R — СО—S—КоА + СНа—СО—S—КоА.
В результате этих реакций образуются ацетил КоА и жирная кислота,
содержащая на два атома углерода меньше, чем исходная жирная кислота.
Ацетил-КоА-эфир жирной кислоты повторно вступает в реакцию р-окислеиия.
После включения ацетильного радикала в цикл Кребса, ацетил-КоА возвра-
щается в виде кофермента А в цикл реакций р-окисления, где играет роль
катализатора.
Проведенные исследования по изучению книетики потребления дрожжами
индивидуальных алканов показали, что легче всего потребляются низко-
молекулярные алканы Си—Сц. Среднее положение занимают алканы Cts—
С is н труднее всего потребляются более высокомолекулярные алкаиы.
Жидкие парафины (Си—Си), содержащие нормальные алканы, наибо-
лее легко окисляются и поэтому используются для микробиологического син-
теза белка кормовых дрожжей. Указанные парафины выкипают в основной
в интервале температур 200—820 °C. При использовании таких парафинов
с помощью специальных технологических приемов («дозревание» биомассы;
гидротермическая обработка и др.) получают кормовые дрожжи с содер-
жанием не более 0,1 % остаточных углеводородов. Это достигается более пол-
ным и равномерным потреблением дрожжевыми клетками н-парафниов и
снижением конечной температуры выкипания применяемых углеводородов.
Содержание остаточных углеводородов в дрожжевых клетках, полученных
на очищенных жидких парафинах, выкипающих при 240—360 °C, снижа-
ется в 3—5 раз, а в биомассе иа Си—Cie, выкипающих при 200—320 °C,—
в 20—30 раз. В исходных парафинах могут находиться циклические и аро-
матические углеводороды. Чтобы значительно снизить в массе дрожжевых
клеток количество углеводородов, содержание их в исходном сырье не дол-
жно превышать 1,5%. Если ароматические углеводороды необходимо пол-
ностью исключить из товарных дрожжей, то их в исходном сырье должно
быть не более 0,01 %.
На отечественных предприятиях используют высокоочищенные жидкие
парафины, представляющие собой смесь углеводородов нормального строе-
ния, выкипающие при температуре 200—320 °C. Исходное сырье должно
содержать н-парафпнов ие меиее 99 %, ароматических углеводородов ие бо-
лее 0,01 %. До недавнего времени существовало мнение, что в дрожжах,
получаемых на средах с углеводородами, больше канцерогенных веществ.
94
Таблица 3.3 Содержание полициклических ароматических
углеводородов в дрожжах, ироизведенных в различных странах
(в пересчете иа сухой продукт), мкг/кг
Дрожжи 3,4-вензпиреи Бекзпирнлен Дебензантрацен Всего
Хлебопекарные
Франция 12,1 5,1 0,0 17,2
ФРГ 13,2 9,7 0,0 22,9
Шотландия 40,4 16,7 0,0 58,0
СССР 8,7 6,0 0,0 14,7
Диетические
Франция 0,5 0,0 0,0 0,5
ФРГ 0,5 0,0 о.о 0,5
Из газойля 0,6 0,0 0,1 0,7
чем в дрожжах, выращиваемых на других питательных субстратах. Однако
оказалось, что кормовые дрожжи, получаемые иа средах с «-парафинамн
нефти, содержат меньше канцерогенных соединений, чем дрожжи, выра-
щенные на других питательных средах, включая пищевые (табл. 3-3). По
содержанию белка и наличию в нем незаменимых аминокислот, комплексу ви-
таминов, липидов и других биологически активных соединений кормовые
белковые продукты, получаемые микробиологическим синтезом из углеводо-
родов нефти, ие уступают белку растительного и животного происхождения.
3.3. ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА
КОРМОВЫХ ДРОЖЖЕЙ
Выращивание посевных дрожжей. Для производства кормового белка
в настоящее время использут дрожжи в основном семейства Gryptococcaceae
рода Candida. Оии способны расти иа разнообразных субстратах и давать
высокий выход биомассы. В отличие от бактерий и грибов, выращивание
которых проводится в стерильных условиях, производство кормовых дрож-
жей— процесс нестерильный. На большинстве заводов внедрены промышлен-
ные штаммы дрожжей — Candida tropicalis (Гб-1 и КД-14), обеспечивающие
выход биомассы 46—48 % от содержания РВ, Candida scottlii (Кр-9, Тул-1,
СД-10), дающие выход биомассы 55—56 % от содержания РВ. В результате
селекционно-генетических исследований были получены быстрорастущие
дрожжи Candida guiltier niondii, устойчивые к вытеснению другими видами
в нестерильных промышленных условиях и позволяющие получать выход био-
массы 90—120 % от потребляемых н-алкаиов.
Практикой дрожжевого производства установлено, что при выращивании
одной и той же культуры дрожжей получают различные результаты, даже
если питательные среды по составу сравнительно мало различаются между
собой. В производственных условиях под влиянием различных факторов об-
разуются новые штаммы, которые наиболее полно адаптируются к суще-
ствующим условиям.
Для получения посевного материала питательную среду засевают чистой
культурой из расчета, чтобы биомасса засевных дрожжей влажностью 75 %
ие превышала 20—30 % суммы углеродсодержащих соединений среды.
Наращивание биомассы чистой культуры дрожжей, необходимой для засева
дрожжерастильного аппарата, осуществляется в несколько стадий. На
первой стадии чистую культуру дрожжей размножают в лаборатории за-
вода в несколько приемов в колбах, а затем последовательно в трех илн
четырех^ аппаратах всевозрастающего объема. Каждый аппарат снабжен
системой воздухораспределеиия, змеевиком для охлаждения питательной
95
среды и барботером для пропарки аппарата. Первый аппарат установки для
получения засевных дрожжей засевается культурой, выращенной в лабора-
торных условиях, все последующие аппараты — дрожжами, получаемыми на
предыдущих стадиях. Как правило, выращивание дрожжей иа первых ста-
диях периодическое, а иа последней — непрерывное.
Число стадии н объемы используемых дрожжерастильиых аппаратов оп-
ределяется производительностью предприятия, перерабатываемым сырьем н
принятой схемой производства. Так, для линии производства кормовых дрож-
жей иа основе высокоочищениых жидких парафинов производительностью
60 тыс. т в год предусмотрено выращивание чистой культуры в трн стадии
в аппаратах вместимостью (в м3): 0,3; 3 и 50. Аппараты 1 н II стадий рабо-
тают по периодическому режиму, а аппарат III стадии может работать как
по периодическому, так и по непрерывному режиму. Концентрация перера-
батываемых парафинов 7 %. На всех стадиях температуру питательной среды
поддерживают иа уровне 33—35 °C, pH устанавливают раствором аммиака
в пределах 4,0—4,2. Конечная концентрация биомассы на всех стадиях со-
ставляет 43—54 г/л (АСД). Длительность выращивания посевных дрожжей
как иа I, так и иа П стадии 15—18 ч, на Ш —5 ч. Из аппарата III стадии
засевиые дрожжи перекачиваются в производственные дрожжерастильные
аппараты.
Выращивание кормовых дрожжей. Получение биомассы является основ-
ным процессом в технологической схеме производства кормовых дрожжей.
Для получения высоких выходов требуются непрерывный равномерный при-
ток питательной среды и отбор дрожжевой бражки, интенсивная аэрация,
строгое соблюдение температурного режима и поддержание оптимального pH
среды. Постоянный приток питательной среды и отбор бражки из дрожже-
растильного аппарата должны обеспечивать постоянный объем среды в ап-
парате. В зависимости от качества перерабатываемого сырья скорость по-
дачи питательной среды может быть различной.
Все питательные вещества, в том числе и кислород, используются мик-
роорганизмами в растворенном состоянии. Для удоалетвореиия потребности
микроорганизмов в кислороде необходимо создать определенную концентра-
цию его в среде. Кислород относится к труднорастворимым газам и при
прохождении через жидкость только некоторая часть его переходит в рас-
твор, а остальное количество ие используется. Потребность растущей куль-
туры в кислороде в основном определяется составом среды. Чем богаче
среда питательными веществами, тем больше воздуха необходимо подавать
в аппарат и возможно лучше его диспергировать.
В дрожжерастильиых аппаратах для диспергирования воздуха применя-
ются различные воздухораспределительные и перемешивающие устройства.
Расход воздуха колеблется от 20 до 50 м3 иа 1 кг абс. сухих дрожжей. Сле-
дует отметить, что переработку субстрата с высокими (3—5 %) концентраци-
ями РВ или парафинов лимитирует содержание растворенного кислорода
в среде. При использовании существующих конструкций дрожжерастильиых
аппаратов наблюдается неполная ассимиляция микроорганизмами углеводо-
родов нефти. В ряде случаев оказывается возможным повысить степень ути-
лизации углеводородов в результате выращивания дрожжей при относи-
тельно низких концентрациях парафинов в среде с возвратом культуральной
жидкости (после отделения дрожжей) до полного использования всех пара-
финов.
Нормальный рост и развитие дрожжевых клеток в значительной мере за-
висят от сбалансированности источников азота, фосфора, серы, калия, же-
леза и др., т. е. от минерального питания. Известно, что недостаток или
избыток некоторых ингредиентов среды приводит к снижению жизнедеятель-
ности дрожжей.
В зависимости от используемой в производстве культуры дрожжей вы-
ращивание проводят при температуре 32—36 °C. С понижением температуры
замедляется жизнедеятельность дрожжей, а при повышении температуры
выше 38—40 °C резко уменьшается активность поглощения кислорода, сии-
96
жаются выход дрожжей и содержание белка в клетках. Прн выращивании
дрожжей выделяется от 2500 до 3500 кал тепла на 1 кг сухих дрожжей. До
40 % тепла, образующегося в процессе роста дрожжей, уносится продувае-
мым воздухом, а остальное количество отводится с помощью охлаждающих
устройств. С этой целью в дрожжерастильный аппарат встраиваются раз-
личные теплообменники, а также используется метод орошения наружных
стенок аппарата. Для снятия части избыточного тепла питательную среду, по-
даваемую в аппарат, необходимо охлаждать ниже оптимальной температуры
на 10—12 °C.
Важным фактором при выращивании дрожжей является оптимальное
значение pH среды. Различные штаммы дрожжей нормально развиваются
в слабокислой среде при pH 3,5—5,5. В зависимости от состава питатель-
ной среды pH в процессе роста культуры может сдвигаться как в щелоч-
ную, так н в кислую сторону, тем самым нарушая оптимальные условия
выращивания дрожжей. Для поддержания pH иа оптимальном уровне
в процессе роста дрожжей среду подкисляют соляной кислотой либо под-
щелачивают аммиачной водой.
Эффективность процесса культивирования определяется выходом био-
массы с единицы полезной емкости дрожжерастильного аппарата. Выход био-
массы — так называемый экономический коэффициент — представляет собой
отношение количества синтезированной абсолютно сухой биомассы к потреб-
ленным питательным веществам среды. Экономический коэффициент может
быть определен по формуле у_____x/(S __S )
где х — концентрация дрожжей в среде, г/л; So — концентрация питательных
веществ в исходной среде; Si — концентрация питательных веществ иа вы-
ходе из аппарата.
Дрожжи рода Candida относятся к небродящим дрожжам. В связи
с этим основное количество источников углерода среды расходуется иа об-
разование биомассы, что н обеспечивает высокий экономический коэффици-
ент— до 50 %, а при использовании очищенных жидких парафинов—90—
120 %.
Максимальный выход дрожжей возможен лишь в том случае, если сред-
няя длительность т пребывания среды и дрожжевых клеток в аппарате
равна геиерациоиному периоду g, т. е. когда справедливо равенство Г=£=
= 1/ц. Если t<g, концентрация клеток в среде уменьшается. Если T>g,
выход биомассы снижается, так как увеличивается время пребывания среды
в аппарате. При непрерывном культивировании производительность Q аппа-
рата определяется как произведение скорости разбавления D на концентра-
цию биомассы х в среде. Но поскольку jr— (So—S)V или x=SiK, то Q=
=DSiY [кг/(м3-4)J.
Для получения оптимального выхода дрожжей и обеспечения необхо-
димой производительности аппарата необходимо подобрать такие условия
процесса выращивания, при которых скорость протока соответствовала бы
скорости роста дрожжей и ассимиляция имн питательных веществ среды.
Иными словами, важно правильно определить длительность т пребывания
в аппарате среды н дрожжевых клеток. Т (оборот аппарата) является ве-
личиной, обратной D, а следовательно, и ц. 7'=1/р=1/£>. Если дрожжевые
клетки равномерно распределены и концентрация их в аппарате и иа выходе
одинакова, то продолжительность пребывания дрожжей в аппарате равна
пребыванию в нем среды.
Непрерывное культивирование кормовых дрожжей может осуществляться
по различным технологическим схемам. Прн выращивании дрожжей в одно-
членной батарее в аппарат непрерывно подаются основное углеродсодержа-
щее сырье, питательные соли и отводится дрожжевая суспензия. Отбор дрож-
жей полностью компенсируется их приростом. Это достигается при условии,
что удельная скорость роста дрожжей Ц равна скорости разбавления среды
Максимальная утилизация питательных веществ среды происходит в одном
аппарате (рис. 3.3). По этой технологической схеме работают многие заводы
в Советском Союзе и за рубежом.
4
Заказ № 1536
97
гтонышаяоил v
к
ш г е-о
При переработке очищенных
жидких парафинов облегченной
фракции в технологическую схему
включается процесс «дозревания»
биомассы. Он предусматривает
выдержку биомассы дрожжей в
аппарате, в который поступление
питательных веществ прекращено.
Жизнедеятельность клеток осуще-
ствляется за счет эндогенных ис-
точников питания, при этом ис-
пользуются остаточные углеводо-
роды. После стадии «дозревания»
упрощается выделение дрожжей
и исключается необходимость их
экстрактивной очистки. Это обе-
спечивает высокое качество про-
дукта и более полное использо-
вание парафинов.
Двухступенчатое культивиро-
вание (двухчленная батарея) при-
меняют пои переработке концен-
трированных сред и сред слож-
ного состава (рнс. 3.4). При по-
следовательном перетекании среды
из аппарата в аппарат в голов-
ном обычно утилизируется 70—
80 % углеродсодержащнх ве-
ществ, остальные — в хвостовом.
П роизводител ьность многосту пен -
чатой дрожжерастпльной уста-
новки меньше, чем одноступенча-
той (в расчете иа один аппа-
рат), но выход дрожжей больше
из единицы перерабатываемого
сырья. Практика показала, что
I кажД0Я из схем имеет свои пре-
«I имущества и недостатки и может
быть реализована с использова-
нием дрожжерастильиых аппа-
ратов различных конструкций. Как
правило, выращивание кормовых
дрожжей на действующих пред-
приятиях, перерабатывающих ги-
дролизные среды и мелассно-
спиртовую барду, осуществляется
в эрлифтных аппаратак кон-
струкции Лефрансуа — /Марине
(рис. 3.5) и Гппробпоспнтеза вме-
стимостью 300 п 600 м3. На гидро-
лнзнодрожжевых заводах боль-
шой мощности работают аппараты
вместимостью 1300 м3 с многозон-
иым воздухораспределением. За-
ф воды, работающие иа жидких
О g’gg I парафинах, оснащены аппаратами
го gf |Ь: Б-50, позволяющими совместить
стадии выращивания п дозревания
биомассы в одном аппарате
(рис. 3.6).
Гитатшнм
Рис. 3-4. Батарея из двух аппаратов
Рис. 3.5. Дрожжерастильный аппарат
Лефраисуа—Марийе объемом 320 м* 1 * 3 * * * * В:
1 — корпус; 2 — диффузор; 3 — кювета-
Аппарат представляет собой тор, выполненный нз нержавеющей стали,
диаметром 17 м, разделенный вертикальными перегородками иа 12 секций.
Внутренний диаметр тора равен 6 м. На верхней крышке корпуса установ-
лены пеногасители и двигатели аэрационных турбин, смонтированных в каж-
дой секции. Аэрацноииая турбина является вращающимся эжектором и слу-
жит для подачи воздуха в культуральную среду и для ее перемешивания.
Вращающийся эжектор представляет собой двухъярусную самовсасывающую
мешалку турбинного типа, снабженную эжекциониыми устройствами. Воздух
к вращающемуся эжектору подводится по трубе, соединенной с турбиной
через вставку, обеспечивающую герметичность.
Для создания необходимой циркуляции культуральной жидкости в сек-
циях установлены диффузоры, перегородки и конические вставки.’На диф-
фузорах установлены змеевики теплообменных устройств, предназначенных
для снятия избытка тепла при выращивании дрожжей. Система охлаждения
ферментатора состоит из 24 спаренных теплообменников наружного кон-
тура и 12 — внутреннего контура.
Выделение дрожжевых клеток. В готовой бражке, поступающей иа вы-
деление дрожжей, обычно содержится от 20 до 40 г/л дрожжей влажно-
стью до 75 %. Для обезвоживания дрожжевой массы используются различ-
ные методы: флотация, сепарация, выпаривание и сушка. Последовательность
операций удалении излишней влаги иа действующих предприятиях различна:
флотация, сепарирование, выпаривание, сушка;
флотация, сепарирование, сушка;
сепарирование, выпаривание, сушка.
В процессе обезвоживания дрожжевые клетки часто подвергают обра-
ботке, ие связанной с удалением влаги, а способствующей повышению ка-
чества сухих кормовых дрожжей? промывка дрожжей на стадии сепариро-
вания с целью отмывки от остатка среды; облучение дрожжевой суспензии
ультрафиолетовыми лучами для превращения содержащегося в дрожжах
эргостерина в витамин .D2 и т. п.
Флотация. Особого внимания заслуживает флотационный способ вы-
деления и сгущения дрожжевых клеток. Одиако не все культуры микро-
организмов имеют достаточную флотирующую способность, которая в зна-
чительной степени зависит от физиологического состояния дрожжевых кле-
4* 99
Рис. 3.6. Аппарат для выращивания дрожжей на углеводородах нефти:
/— турбина; 2 — теплообменник; 3— электродвигатель; 4— скруббер; / — питательная
среда; // — воздух; /// — вода на охлаждение; IV — дрожжевая суспензия; I' —вода
из теплообменника
ток. Для получения хорошего эффекта от флотационного выделения необ-
ходима большая поверхность контакта фаз (дрожжевые клетки—воздух),
для чего требуется очень мелкое диспергирование воздуха. Флотационный
способ выделения дрожжей имеет ряд преимуществ перед сепарационным:
значительно сокращаются число сепараторов, сумма капиталовложений, что
является экономически выгодным для предприятий большой (240 тыс. т/год)
мощности. На флотационную способность дрожжей влияют раса дрожжей,
размер клеток, наличие конгломератов. Одиночные клетки флотируются
хуже, чем ветвистые дрожжи.
Флотационные аппараты, применяемые в микробиологической промыш-
ленности, выполняются в нескольких вариантах: горизонтальные конические,
вертикальные цилиндрические, одноступенчатые с внутренним стаканом и
двухступенчатые. Наиболее простой конструкцией ивляется типовой односту-
пенчатый флотатор системы Гнпрогидролиза (рис. 3.7). Аппарат состоит из
наружного корпуса I с плоским днищем и внутреннего стакана 2, являю-
щегося пеносборником. Кольцевое пространство между корпусом аппарата
и пеносборником делится на ряд секций (7—V) с помощью перегородок.
В секциях II—V установлены аэраторы 4. Пена гасится механическим спо-
собом. Отработанная культуральная жидкость выводится через встроенный
карман, служащий гндрозатвором.
Исходная дрожжевая суспензия нз дрожжерастильного аппарата через
патрубок 6 поступает в I секцию флотатора, где извлекается до 80 %
дрожжей. Далее она проходит через нижнюю часть перегородок, не дохо-
дящих до дна II—V секций. В этих секциях извлекается соответственно 10,5
и 2 % Дрожжей. Образовавшаяся прн этом пена также поступает во внут-
ренний пеносборннк. Концентрат из пеносборника центробежным насосом
подается на сепарацию.
В секции I флотация осуществляется за счет газосодержания дрожже-
вой суспензии, выходящей нз дрожжерастильного аппарата, в последую-
щих секциях — путем барботажа. Потерн дрожжей с отработанной бражкой
составляют 3 %. Производительность флотатора по исходной суспензии 40—
70 №/ч; время исчерпывания — 10 мии. Коэффициент флотации равен 5—6.
Одноступенчатая флотация имеет существенный недостаток — не позво-
ляет получать концентрированные дрожжи с минимальными потерями Более
100
Концентрированная Зрожжейая
суспензия
Рис. 3.7. Одноступенчатый флотатор конструкции Гипрогидролиза:
/ — корпус; 2 — внутренний стакан; 3 — встроенный карман; 4 — аэраторы; 5, 8—меха-
нический пеногаситель; 6— патрубок ввода дрожжевой суспензии; 7—насос
с содержанием 8—10 г/л
концентрат
' аро*-
жедоя
Рнс. 3.8. Схемы узлов флотации
дрожжей?
/ — дрожжерастнльный аппарат: 2 — фло-
татор I ступени; 3—флотатор II ступени;
4. 5 — насосы
I III П-‘®?йж*ййгУ
‘ l?l 11 суспензия на
рсепашро-
‘^Оание
5 Отработанная
жидкость 6 кана-
лизацию
суслен-
J зия
воздух
эффективной является двухступенчатая флотация кормовых дрожжей
(рис, 3.8).
* Согласно схеме, приведенной на рнс. 3.8, с, дрожжевая суспензия на
I ступени флотации концентрируется от 35 (исходная) до 90—120 г/л (23—
30 г/л абс. АСВ), остаточная концентрация дрожжей в культуральной жид-
кости 2—3 г/л. Обедненная дрожжевыми клетками культуральная жидкость
подвергается флотации на II ступени, ---« «« _»_
дрожжей направляется на I ступень.
Остаточное содержание дрожжей в
отработанной культуральной жид-
кости после II ступени не превы-
шает 0,2—0,3 г/д.
Г По схеме на рнс. 3.8, б на I сту-
пени флотации концентрация дрож-
жей повышается с 30 до 60 г/л (до
15 г/л абс. АСВ). На II ступени
флотации просходнт дальнейшее по-
вышение концентрации с 60 до
120 г/л, а отработанная культураль-
ная жидкость с содержанием 3—
4 г/л дрожжей возвращается на
I ступень флотацнн.
Схема, приведенная на рис.
3.8, в, не отличается от схемы, пока-
занной на рнс. 3.8, а, только II сту-
пень флотации конструктивно впи-
сана в корпус флотатора в виде кар-
мана, не доходящего до дна.
Сепарация. Перед сепариро-
ванием для снижения потерь дрож-
жевую бражку (концентрат) обе-
спеннвают. Механическое пеногаше-
ние является наиболее эффективным
средством ожижения пены. Для этих
целей используют лопастные нли
другие виды мешалок. При необхо-
димости промывать дрожжевую
101
tm gкаиамзщшг
‘ Сгг^аботанноя jkutira
Рнс. 3.9. Схема узла сепарирова-
ния дрожжей, полученных на гид-
ролизном сусле:
/ — флотатор; 2 — сепаратор I группы; 3 —
лоток с приемным бачком; 4— водоструй-
ный насос; 5 — сепаратор II группы; б —
сборник концентрированных дрожжей- 7 —
насосы
Рис. 3.10. Схема узла сепарирова-
ния без промывки дрожжей во-
дой:
I — флотатор; 2 — сепаратор I группы;
3 — сборник; 4— сепаратор II группы,
S — сборник концентрированных дрожжей;
б— насосы
суспензию в верху деэмульгатора монтируют распылительное устрой-
ство типа оросителя. Прн сепарнрованнн происходит быстрое выделение
дрожжей. Продолжительность пребывания дрожжевой бражки в барабане
сепаратора 2—5 с. Прн нормальной работе сепараторов объем дрожжевого
концентрата обычно составляет 10—25 % объема бражки. Чем больше кон-
центрация н вязкость бражки, тем меньше фактор разделения. Большие по-
терн наблюдаются при сепарнрованнн сильно пенящейся бражки. Метод се-
парирования применяют для выделения нефлотнруемых дрожжей и для
дальнейшего сгущения концентрата после флотатора.
Обычно сепарирование дрожжей проводится на двух-трех группах се-
параторов.
.'Получение доброкачественного продукта обеспечивает трехкраткое се-
парирование с двумя промывками дрожжевой массы водой. На I группе
сепараторов получают концентрат с содержанием дрожжей 120—160 г/л.
Концентрат, разбавленный водой (80—100 г/л), на II группе сепараторов
концентрируется до 230—300 г/л; повторно разбавленный водой до 150—
200 г/л на III группе сепараторов сгущается до 500—600 г/л. Промывка
дрожжевой массы может быть осуществлена подачей воды в сборник дрож-
жевого концентрата нлн с помощью водоструйного насоса (рис. 39). На мно-
гих заводах используются различные схемы сепарирования дрожжей: дву-
кратное сепарирование с частичной отмывкой дрожжей прн расходе воды
5—7 %; двукратное сепарирование без промывки после флотатора и др. (рис.
3.10). Прн нормальной работе сепараторов общие потерн дрожжей прн сепа-
рнрованнн бражки н промывке суспензии не должны превышать 7 %. Для
выделения кормовых дрожжей методом сепарирования широко используют
сепараторы ДСГ-35 (рнс. 3.11) н сепараторы фирмы «Де Лаваль» (Швеция).
Обогащение кормовых дрожжей витамином D2. Дрожжи рода Candida,
выращенные на средах различного состава, содержат 0,2—0,6 % эргостерина.
Под влиянием ультрафиолетовых лучей он превращается в витамин D2.
В производственных условиях дрожжи облучают в сухом н в жидком виде.
Сухие дрожжи облучают в тонком слое (1—1,5 мм) на движущейся ленте
транспортера (рнс. 3.12). Превращение эргостерина в вктамнн D2 проходит
через ряд изомерных продуктов и поэтому прн неравномерном облучении
могут образоваться вредные соединения. Суспензию дрожжей, прокачивае-
мую по кварцевым трубкам, облучают кварцевыми лампами. Дрожжевая
суспензия должна быть достаточно хорошо отмыта от окрашенных про-
дуктов среды. Кормовые дрожжи после облучения обычно содержат около
4000 международных единиц (м. е.) витамина D2. 1 мг чистого вита-
мина- D2 соответствует 40000 м. е. Содержание витамина Ds в кормовых
дрожжах можно довести до 8—10 тыс. м. е., но в этом иет необходимости,
.4ак как возникают трудности с дозированием. Для удовлетворения суточной
102
Рнс. 3.15. Рнбозофосфатный цикл фиксации формальдегида
избытке азота в растущей метанокнсляющей культуре химические превраще-
ния выражаются реакцией
ОН, О" 2Н—»СН,ОП—2-—>СН,О 60-90 ж-►фосфотриоза
--->НСООН-=^—►С0„
60—90 % образовавшегося формальдегида фиксируется в данном слу-
чае в виде углерода клеток, а остальное количество окисляется до муравьи-
ной кислоты, а затем до диоксида углерода.
Процесс культивирования можно проиллюстрировать на примере выра-
щивания метанокнсляющих бактерий рода Methanonionas. В ферментатор
с замкнутой системой циркуляции газовой смеси (по периодической схеме
выращивания) через культуральную жидкость пропускают непрерывно га-
зовую смесь следующего состава (в %): кислород 8—11, метан 10—15, ди-
оксид углерода 5, азот 77—69.
Давление в начале процесса ферментации 4МПа (40 кгс/см2, в конце —
0,1 МПа (1 кгс/см2), температура выращивания 30 еС. При таком режиме за
2 сут достигается концентрация биомассы около I г на 1 л культуральной
жидкости.
По составу микробная масса, полученная из газа, не отличается от
микробной массы, выращенной на углеводах, спиртах, н-парафннах. В ее
элементном составе (в %); кислород 30—31, водород 6, 5—7, углерод 47—
48, азот 7—10, зола 5—-8. Микробная масса метанокнсляющих микроорга-
низмов содержит до 75 % неочищенного белка, большое количество вита-
минов (В12—42 мг/г, бнотина—1,3 мг/г, рибофлавина — 20 мг/г), амино-
кислот (табл. 3.4). По содержанию этих биологически активных соединений
белок из газа не уступает рыбной и соевой муке.
107
Таблица 3.4. Аминокислотный состав белка различного происхождения
(в г/100 г белка)
Аминокислота Казеин Хлорелла Метанокнсляющая культура бактерий
Алании
Аргинин
Аспарагиновая
Валин
Г петидин
Глутаминовая
Глицин
Изолейцин
Лейцин
Лнзин
Метионин
Пролин
Серни
Тирозин
Треонин
Триптофан
Фенилаланин
3,4 7,1
3,9 4,1
7,6 7,8
5,7 3,4
2,6 1,2
20,3 9,6
2,1 4 7
5,8 6,8
7,1 5,3
8,1 5,7
2,3 1,8
6,9 3,6
5,7 3,5
7,3 2,9
4,4 4,1
1,5 1,3
4,1 3,0
7,3
5,1
9,1
6,2
1,6
13,8
5,8
5,0
7,9
5,3
3,0
3,8
3,9
3,8
4,9
2,7
5,2
Глава 4. ОРГАНИЧЕСКИЕ КИСЛОТЫ
Несмотря на значительный прогресс в области органиче-
ского синтеза многие кислоты (лимонная, молочная, итаконо-
вая, уксусная и др.) получают в настоящее время микробиоло-
гическим синтезом. Органические кислоты находят широкое
применение в фармацевтической, химической, текстильной и
других отраслях промышленности. Пищевая промышленность
традиционно основной потребитель лимонной, уксусной и мо-
лочной кислот. Считают, что продукты естественного броже-
ния более предпочтительны, чем синтетические кислоты, так
как присутствующие в них следы различных примесей могут
быть безвредны для организма.
4.1. ЛИМОННАЯ КИСЛОТА
Лимонная кислота СН2СООН—СОНСООН— СН2СООН яв-
ляется трехосновной оксикислотой, кристаллизующейся из вод-
ных растворов с одной молекулой воды в виде бесцветных,
прозрачных ромбической формы кристаллов.
Моиогидратиая форма лимонной кислоты имеет молекуляр-
ную массу 210, плотность 1,54 и температуру плавления 70—
75 °C. При хранении и особенно быстро при нагревании до
40—50 °C теряется кристаллизационная вода, при температуре
100 °C кристаллизационная вода теряется полностью.
108
При температуре кристаллизации 36,6 °C и выше выделя-
ется безводная (температура плавления 153 °C) лимонная ки-
слота с молекулярной массой 192. При нагревании до 175 °C
кислота разлагается.
Лимонная кислота широко распространена в плодах и яго-
дах. Оиа находит применение в ряде отраслей пищевой про-
мышленности (производство кондитерских изделий н напит-
ков), химической и текстильной промышленности (окраска
тканей, приготовление светочувствительных фотоэмульсий),
медицине и т. д.
Мировое производство лимонной кислоты в настоящее
время составляет около 130 тыс. т в год. При культивировании
на углеводах в качестве продуцентов лимонной кислоты ис-
пользуют мутантные штаммы Asp. niger, на н-парафинах—
дрожжи Candida lipolitica, Candida guilliermondii, Candida ole-
ophila и бактериальные штаммы нз рода Corynebacterium, Ar-
throbacter.
В Советском Союзе лимонную кислоту получают из ме-
лассы микробиологическим синтезом, применяя главным обра-
зом микроскопические грибы Asp. niger, выращиваемые по-
верхностным или глубинным способом. Производство лимонной
кислоты включает следующие основные технологические ста-
дии: получение посевного материала, подготовку мелассы
к сбраживанию, сбраживание растворов мелассы в лимоиную-
кислоту с последующим отделением мицелия, выделение из
сброженных растворов лимонной кислоты и получение ее в кри-
сталлическом виде.
Химизм образоваиия лимонной кислоты. Синтез лимонной
кислоты связан с циклом дикарбоновых кислот и происходит
в результате конденсации какой-либо кислоты, содержащей
четыре атома углерода и две карбоксильные группы, с кисло-
той, имеющей два атома углерода н одну карбоксильную груп-
пу. Химизм образоваиия лимонной кислоты представлен на
рнс. 4.1. В результате гликолиза глюкозы образуется пирови-
ноградная кислота. На следующем этапе происходит фермен-
тативное связывание пировиноградной кислоты с диоксидом
углерода. Образовавшаяся шавелевоуксусная кислота всту-
пает далее в реакцию с уксусной кислотой и образуется лимон-
ная кислота Таким образом, химизм образоваиия лимонной
кислоты включает реакции гликолиза и ряд реакций, замкну-
тых в цикл Кребса. При каждом обороте этого цикла моле-
кула щавелевоуксусной кислоты вступает во взаимодействие
с молекулой уксусной кислоты, образуя лимонную кислоту.
Получение посевного материала. Для производства лимон-
ной кислоты поверхностным и глубинным способами исполь-
зуют отселекцнонированные штаммы Asp. niger. Исходные
культуры хранят в виде сухих спор (конидий) в смеси с актив-
ным углем. Тщательно проверенная на микробиологическую
109
С6Н12О6
I
сн,сосоон
CIUCOOH
I ~
COHCOOH
СНгСООН
Рис. 4.1. Химизм образования лимонной кислоты
ЛИМ0НН3.9
KUC/W.TJ
чистоту и биохимическую активность музейная культура ис-
пользуется для приготовления посевного материала. Посевной
материал размножают в пробирках с агарнзованной средой
(сусло-агар, среда Журавского и др.), а затем в колбах и кю-
ветах — на твердой питательной среде. Длительность каждой
стадии 2—7 сут, оптимальная температура выращивания 32 °C.
В процессе выращивания иа поверхности твердой среды раз-
вивается плотная мицелиальная пленка, которая затем покры-
вается конидиямй. На последней стадии (нз кювет) зрелые ко-
ниДин собирают при помощи специального вакуумного устрой-
ства. Для. удлинения срока хранения кониднн подсушивают
при 32 °C, смешивая со стерильным наполнителем — активным
углем или тальком в соотношении 1 : 2. Обработанные таким
способом коиидии можно хранить 1—2 года. С 10 дм2 площади
кювет получают 3—4 г сухих коиидий (площадь одной кюветы
8,5 дм2). Готовый посевной материал фасуют в стерильные
стеклянные колбы или банки вместимостью от 0,5 до 1 л. По-
севной материал хранится при комнатной температуре и отно-
сительной влажности воздуха 70 %. Гарантированный срок
годности конидий ие менее 6 мес со дня выпуска.
Подготовка мелассы к сбраживанию. Многие органические
вещества, главным образом сахара, сбраживаются с образова-
нием лимонной кислоты. Хороший выход получают обычно,
110
если используют в качестве источника углерода глюкозу, фрук-
тозу, сахарозу, мальтозу. Для промышленного производства
лимонной кислоты в качестве субстрата применяют обычно ме-
лассу— отход сахарного производства.
Меласса — нестандартное сырье, ее химический состав за-
висит от качества сахарной свеклы, технологии переработки
и условий хранения. Пригодность. мелассы для производства
лимонной кислоты определяют на основе предварительных био-
химических испытаний. Растворы мелассы сбраживают поверх-
ностной и глубинной культурой соответствующего штамма
грнба Asp. niger. Меласса считается пригодной для производ-
ства лимонной кислоты поверхностным способом, если съем
лимонной кислоты при контрольном сбраживании составляет
ие менее 1,25 кг/(м2-сут), глубинным способом—-10—
12 кг/(м3-сут).
Хорошо сбраживаемые мелассы обычно содержат ие бо-
лее 1,0 % инвертного сахара, 1 % СаО, 0,06 % SO2 прн общем
содержании сухнх веществ не менее 75 % и сахара более 46 %.
В зависимости от способа сбраживания мелассу разбавляют и
готовят растворы с различной концеитрацней сахара: для по-
верхностного выращивания Asp. niger до. 13—15%, для глу-
бинного культивирования — 3—4% и 25—28 %. В приготовлен-
ных растворах серной кислотой доводят pH до 6,8—7,5. Необ-
работанная меласса плохо ассимилируется н сбраживается
микроорганизмом-продуцентом, так как наряду с веществами,
необходимыми для нормального роста гриба и активного кис-
лотообразоваиия, в ией содержатся минеральные и ограниче-
ские прнмеси, тормозящие рост гриба и подавляющие процесс
образования лимонной кислоты. Это ноны тяжелых металлов,
в первую очередь железа.
Меласса, как было сказано выше, ие единственный источник
сырья для получения лимонной кислоты. За последние годы
в различных странах мира запатентованы способы получения
лимонной кислоты путем культивирования микроорганизмов,
в основном дрожжей рода Candida, на средах, содержащих
в качестве источника углерода н-парафины, глицерин, этанол,
кислоты уксусную, масляную, животные или растительные
жнры.
Сбраживание растворов мелассы. Поверхностный
способ. При поверхностном способе сбраживания подготов-
ленная меласса подается в варочный котел, где разбавляется
кипящей водой в соотношении 1:1, pH раствора доводится до
значения 6,8—7,2. При кипячении вводится раствор желтой
кровяной соли для осаждения железа и солей тяжелых метал-
лов с таким расчетом, чтобы избыток свободного ферроциа-
нида, поскольку он угнетает развитие микроорганизма, не пре-
вышал 10 мг %. В раствор мелассы при температуре 60—70°C
последовательно добавляют источники фосфора (обычно сте-
111
риальный раствор фосфата калия) и другие минеральные веще-
ства, например сульфат цннка, стимулирующий биосинтез ли-
монной кислоты и рост мицелия. Для активного биосинтеза
лимонной кислоты в питательной среде кроме сахара должны
содержаться 0,07 % азота, 0,016—0,021 % Р2О5, цинк, магний,
калий и другие элементы в небольших количествах. Готовая
среда температурой 45—50 °C передается в бродильные ка-
меры. Культивирование грнба осуществляется в кюветах из
нержавеющей стали толщиной 2 мм или из алюминия марки
АО-МО толщиной 4—5 мм, установленных иа стеллажах. По-
сле предварительной стерилизации камер парами формалина,
дегазации газообразным аммиаком и охлаждения до 30—40 °C
воздухом производится (начиная с верхних) заполнение кювет
питательной средой. В зависимости от высоты борта кювет пи-
тательный раствор наливают слоем от 8 до 18 см. В камере
предусмотрена система вентиляции для подачи нагретого (до
30—32 °C) стерильного кондиционированного воздуха нз рас-
чета 3—18 м3/ч иа 1 м2 поверхности кювет. В питательную
среду через воздуховоды с помощью специального устройства
для распыления вносят посевной материал из расчета 50—75 мг
конидий на 1 м2 площади кювет.
При поверхностном способе различаются 3 режима культи-
вирования: бессменный, бессменный с доливами и односмен-
ный.
При бессменном режиме гриб Asp. niger культивируется на
одной и той же питательной среде до окончания процесса кис-
лотообразовання. Прн односмеииом режиме культивирования
примерно через 7 сут сброженный раствор мелассы сливается
и после промывки пленки стерильной водой заливается новый
раствор. Наиболее эффективным режимом культивирования яв-
ляется так называемый бессменный способ с доливом. Суть
его заключается в том, что раствор мелассы в количестве 30—
35 % начального объема вводится под пленку гриба. Долив
питательной среды производится один или несколько раз, на-
чиная с 4—5-х суток роста, через каждые 36—48 ч. Добавляе-
мый раствор мелассы содержит 8,5—11,0% сахара и не имеет
в своем составе питательных солей и антисептиков. Такой ре-
жим обеспечивает увеличение съема лимонной кислоты с 1 м2
бродильной поверхности иа 15—20 % и снижает удельный рас-
ход мелассы на 10—15 % по сравнению с другими методами.
В первые 24—36 ч, когда происходит интенсивный рост ми-
целия гриба, температуру поддерживают в пределах 34—36 °C.
Для аэрации на каждый квадратный метр растущего мицелия
подают 3—4 м3/ч воздуха. В период активного кислотообразо-
вания температуру раствора снижают до 32—34°C, а подачу
воздуха увеличивают до 15—18 м3/(м2-ч). По мере снижения
интенсивности кнслотообразования и уменьшения количества
выделяемого тепла подачу воздуха в камеру постепенно сни-
112
Рнс. 4.2. Технологическая схема получения лимонной кислоты глубинным
способом:
/ — бак с мелассой; 2 — приемный бак; 3 — весы; 4 — варочный котел; 5 — центробеж-
ный насос; 6 — промежуточная емкость; 7 — стерилизационная колонка; 8 — выдержи-
оатель; 9 — холодильник; 10 — посевной ферментатор; 11 — производственный фермен-
татор; 12 — противобактернальные фильтры; 13 — промежуточный сборник; 14—емкость
для хранения мелассы; /5 — барабанный вакуум-фильтр; 16^ приемник мицелия;
17 — вакуум-сборник для мнцелия; 18 — вакуум-сборник фильтрованного (сброженного)
раствора
жают. Ежедневно, начиная с 5-х суток, отбирают пробы для
определения титруемой кислотности и остаточного сахара. Бро-
жение прекращают, когда в растворе остается 1—2 % сахара
и общая титруемая кислотность в сброженном растворе дости-
гает 12—20 %. Сброженный раствор сливают в сборник. Для
промывки мицелия под грибную пленку подливают горячую
воду. После слнва промывных вод мицелий по вакуум-линии
транспортируют в запарник, где мицелнй отмывают от кислоты
горячей водой. Кислые растворы (концентрация 2,5—6,0%),
собранные нз-под ложного днища запарника, подают на
фильтр-пресс. Выгруженный из запарника с помощью шнека
мицелий используется на корм скоту.
При поверхностном способе брожения основные растворы
содержат от 12 до 20 % органических кислот в пересчете на
лимонную кислоту, 0,5—2,0 % несброжеиных сахаров и другие
продукты метаболизма. Лимонная кислота в сброженных ра-
створах составляет 94—98 %.
Глубинный способ. При глубинном способе сбражи-
вания меласспых ръ"0 ров процесс ведут в ферментаторах
вместим п, do м4, разовая загрузка —38 м3 (рис. 4.2). Ко-
нидии проращивают в посевных аппаратах вместимостью 5 м3
из
с рабочим объемом 3 м3. Все аппараты должны быть выпол-
нены из нержавеющей стали Х18Н9Т.
Раствор мелассы, содержащий 3—4 % сахара, для посев-
ных аппаратов готовят в варочном котле. Мелассу разбавляют
кипящей водой, устанавливают pH 7,0—7,2. Для удаления же-
леза при кипячении добавляют желтую кровяную соль. Раст-
воры хлорида аммония и сульфата магния вводят в регламен-
тированных количествах. Подготовленный раствор стерилизуют
прн 128--130°С в течение 12—15 мни. В раствор мелассы, ох-
лажденный в посевном аппарате до 35—36 °C, добавляют сте-
рильные растворы К2НРО4 и MgSO4-7H2O. Для производст-
венного ферментатора раствор мелассы готовят в той же
последовательности. Растворы питательных солей готовят от-
дельно и стерилизуют при температуре 123—125 °C. Воду сте-
рилизуют при 128 -130 °C.
Подливной раствор должен иметь 25—28 %-иую концент-
рацию по сахару и температуру 34—36 °C, как и основной сбра-
живаемый раствор. Подливной раствор направляют в сборник.
Посевной аппарат засевают предварительно подготовленной
суспензией коиидий (3 г сухих конндий замачивают в 2—3 л
стерильного раствора мелассы или питательной среды). Куль-
туру выращивают при 34—35 °C прн постоянном перемешива-
нии, дробной аэрации и избыточном давлении в аппарате 10—
20 кПа.
Режим аэрации посевного аппарата
Рост, ч Пода- ваемый воздух, м3,ч Рост, ч Пода- ваемый воздух. м Зч
0—6 10 16—20 45
7—12 18 (20—24) 4- (24—30) 70—72
12—16 36 (24—30) — до конца 90—100
ферментации
В период интенсивного вспенивания среды (12—24 ч) не-
большими порциями подают пеногаситель (олеиновая кис-
лота). Процесс подращивания мицелия заканчивается к 30—
36 ч. Общая титруемая кислотность культуральной жидкости
составляет 1,0—2,0%. Подращенный мицелий передают для
засева среды производственного ферментатора.
Процесс кислотообразоваиия продолжается 5—7 сут при
температуре 31—32 °C, непрерывном перемешивании и дроб-
ной аэрации.
Режим подачи воздуха в производственный ферментатор
Рост, ч Пода- ваемый воздух, мэ ч Рост, ч Пода- ваемый воздух.
0—3 100 13—16 600—700
3—6 100—400 17—24 700—800
7—12 400—600 24 — до конца процесса 800-1000
114
Рис. 4.3. Технологическая схема химического цеха производства лимонной
кислоты:
1— сборник сброженных растворов; 2 —насос; 3— сборник известкового молока; 4 —
нейтрализатор; 5 — нутч-фильтр для отделения цитрата кальция; 6 — реактор; 7 — ба-
чок-мерник серной кислоты; 8 — промежуточный сборник; 9 — ленточный вакуум-
фильтр для отделения гипса; 10— вакуум-сборник; 11—вакуум-насос; 12— насос; IS —
сборник раствора лимонной кислоты; 14 — барометрический конденсатор с ловушкой;
15—вакуум-аппарат первой упарки; 16— пароструйный компрессор; 17— барометриче-
ский ящик; 18 — вакуум-насос; 19 — монтежю; 20 — фильтр-пресс; 21 — кристаллизатор;
22 — вакуум-аппарат второй упорки; 23— промежуточный сборник; 24 — центрифуга;
25 — сборник маточного раствора; 26 — барабанная сушилка; 27 — трясоснто; 28 — упа-
кованная лимонная кислота
Начиная со 2-х суток после посева по мере снижения кон-
центрации сахара в растворе проводят 2—3 подкормки. Дроб-
ное введение подливного 25—28 %-ного раствора обычно про-
водят нз расчета доведения конечной концентрации сахара
в сбраживаемом растворе до 12—15 %- Контроль за нараста-
нием титруемой кислотности и расходом сахара позволяет во-
время определить конец процесса и получить наибольший съем
лимонной кислоты с 1 м3 ферментатора в сутки (не ниже
7,5 кг/м3). После окончания процесса сброженный раствор на-
гревают острым паром до 60—65 °C и сливают в сборник, от-
куда его подают на вакуум-фильтр для отделения и промывки
мицелия горячей водой. Отделенный и промытый мицелий на-
правляется иа корм скоту. Основной раствор лимонной кислоты
вместе с промывными водами передается в химический цех.
При глубинном способе сбраживания основные растворы
содержат от 5 до 12 % органических кислот, 0,2 —1,5-% сахара,
а лимонная кислота составляет 80—98 % от суммы всех кис-
лот. Схема выделения лимонной кислоты из сброженных рас-
творов представлена иа рис. 4.3.
115
Получение цитрата кальция. Сброженные растворы пред-
ставляют собой смесь лимонной, глюконовой и щавелевой кис-
лот, иесброженного сахара и минеральных примесей. Лимон-
ную кислоту из раствора выделяют путем связывания ее
катионами кальция с образованием слаборастворимой соли нит-
рата кальция.
Нейтрализацию осуществляют в нейтрализаторах, снабжен-
ных мешалками и паровыми барботерами. Сброженный раст-
вор нагревают в нейтрализаторе до кипения, после чего в него
при непрерывном перемешивании вводят известковое или ме-
ловое молоко. Полноту нейтрализации определяют с помощью
индикатора. Она считается законченной при pH 6,8—7,5. При
нейтрализации сброженного раствора образуются кальциевые
соли лимонной, глюкоповой и щавелевой кислот.
2С6Н8О7 + ЗСа (ОН)2 =Са3 (СвНБО7)2 6Н2О
цитрат кальция
2С6Н]2О, + Са (ОН)а=Са (ОДиО,),+2НгО
глюконат кальция
ОДО. + Са (ОН)а = СаОД+2НаО
оксалат кальция
Кальциевые соли лимонной и щавелевой кислот выпадают
при этом в осадок, а кальциевая соль глюкоиовой кислоты и
основная часть органических и минеральных веществ мелассы
остаются в растворе. Для отделения образовавшегося осадка
горячую реакционную массу передают на вакуум-фильтры. По-
сле отделения маточного раствора осадок на фильтре промы-
вают горячей водой (температура около 95 °C). Об окончании
промывки судят по отсутствию в промывных водах сахара.
Для подсушивания через осадок в течение некоторого времени
пропускают воздух.
Перевод лимонной кислоты в свободное состояние и отде-
ление ее от оксалата кальция достигается обработкой осадка
серной кислотой с последующим фильтрованием. Разложение
цитрата кальция осуществляют в реакторе, снабженном ме-
шалкой и паровым барботером. В реактор подают воду из
расчета 0,25—0,5 м3 иа 1 т лимонной кислоты и при работаю-
щей мешалке загружают туда цитрат кальция с таким расче-
том, чтобы после его разложения концентрация лимонной кис-
лоты в растворе была не меньше 25 %. В качестве осветлителя
в реактор вводят активный уголь (2 % к массе лимонной кис-
лоты), содержимое реактора нагревают до 60 °C н при пере-
мешивании подают из мерника серную кислоту (плотность
1,80—1,84) из расчета 0,425 л на 1 кг лимонной кислоты в ци-
трате. Смесь кипятят в течение 10—20 мин.
Разложение цитрата кальция серной кислотой протекает по
уравнению
Ca8(CeH6O7)t+3HaSO4=2CeHA 1 3CaSO<
не
После полного разложения цитрата кальция (контролируют
по отсутствию в среде цитрата кальция и серной кислоты)
в реактор вводят гранулированный сернистый барий (из рас-
чета 0,10—0,15 кг на 100 кг лимонной кислоты) для осаждения
тяжелых металлов. Для отделения раствора лимонной кис-
лоты от осадка, содержащего гипс, оксалат кальция, уголь,
сернистые соединения тяжелых металлов и берлинскую лазурь,
горячую реакционную смесь направляют из реактора иа ва-
куум-фильтр. Отфильтрованный раствор передают иа дополни-
тельное упаривание, а осадок на фильтре промывают горячей
водой (90°C). Промывку осадка прекращают при содержании
лимонной кислоты в промывной воде 0,1 %• Средняя концент-
рация раствора лимонной кислоты (вместе с промывиымн во-
дами) должна быть не ниже 16 %.
Упаривание раствора лимонной кислоты. Упаривание осу-
ществляют в вакуум-аппаратах и проводят в две стадии с про-
межуточным освобождением раствора от осадка гипса. В пер-
вом аппарате раствор упаривают до плотности 1,24—1,26 (под
остаточным давлением 0,021 МПа), осадок отделяют на
фильтр-прессе. Во втором аппарате прозрачный раствор упари-
вают (под остаточным давлением 0,021 МПа) до плотности
1,35—1,36, что соответствует концентрации лимонной кислоты
80 % (около 1070 г моногидрата в 1 л).
Кристаллизация и сушка лимонной кислоты. Из вакуум-
аппарата вторично упаренный раствор температурой 70 °C пе-
редают на кристаллизацию.
Режим'кристаллизации лимонной кислоты
Температура,
СС
70—37
37—27
Скорость
охлаждения, °С;ч
20
10
Температура,
27—22
22—8
Скорость
охлаждения, сС/ч
5
3
После заполнения кристаллизатора раствор охлаждают до
35—37°C и вносят в него затравку — кристаллы лимонной кис-
лоты, Кристаллизацию проводят при непрерывном перемеши-
вании н медленном охлаждении до температуры 8—10 °C, При
конечной температуре кристаллизации раствор выдерживают
не менее 30—45 мин. Кристаллы отделяют в центрифуге, про-
мывают их небольшим количеством холодной воды, затем кри-
сталлы влажностью 2—3 % передают иа сушку.
Сушку проводят в ленточных или барабанных пневматиче-
ских сушилках прн температуре воздуха ие более 35 °C. При
более высокой температуре происходит разрушение кристал-
лов вследствие потери ими кристаллизационной воды. В то-
варном продукте должно содержаться не менее 99.5 % лимон-
ной кислоты (в пересчете на моногидрат), зольность не более
0,1 % для высшего сорта и 0,35 % для 1 сорта.
117
4.2. МОЛОЧНАЯ КИСЛОТА
Молочная кислота СНзСНОНСООН образуется в резуль-
тате анаэробного превращения углеводов молочнокислыми бак-
териями. Молочная кислота представляет собой органическую
одноосновную оксикислоту. Гидроксильная группа этой кис-
лоты может находиться в двух (а и £) положениях углеродной
цепи. Поэтому различают два вида молочной кислоты; а-окси-
пропионовая СН3СНОНСООН и p-оксипропиоиовая СН2ОНСН2
СООН. Промышленное значение имеет а-оксипропиоиовая кис-
лота, продуцируемая в процессе молочнокислого брожения.
Молочная кислота находит широкое применение в химиче-
ской, пищевой, фармацевтической промышленности. В СССР
в промышленных условиях пищевую молочную кислоту полу-
чают методом глубинного культивирования с помощью бакте-
рий Bacterium delbriickii (сииоиим Lactobacillus delbriickii),
которые относятся к гомофермеитативиым термофильным бак-
териям с оптимумом развития 48—50 °C. Производственная
ценность этих микроорганизмов заключается еще в том, что
температурный максимум для их развития находится в интер-
вале 54—56 °C, а интенсивное кислотообразование обеспечива-
ется при относительно высокой температуре — 50 °C. Такая
температура создает элективные условия. Большинство микро-
организмов при этом ие развиваются, так как указанные тем-
пературы находятся далеко за пределами оптимума и макси-
мума для их развития. Производство молочной кислоты вклю-
чает следующие основные технологические стадии: молочнокис-
лое брожение, обработка сброженного раствора и фильтрова-
ние, расщепление лактата кальция, упаривание молочной кис-
лоты.
Образование молочной кислоты из глюкозы при сбражива-
нии гомофермеитативнымн молочнокислыми бактериями проис-
ходит согласно уравнению
СеН12Ов------ гСН^СНОНСНО----------2СН8СОСНО -} 2Н2О
глицеральдегид метилглноксаль
СН3СОСНО + Н2О СНзСНОНСООН
метилглноксаль молочная кислота
Суммарное уравнение превращения глюкозы в молочную
кислоту с помощью ферментной системы молочнокислых бак-
терий можно представить в таком виде:
QHMOe-------- 2CHSCHOHCOOH +75,36 кДж.
Расщепление глюкозы происходит по ФДФ-пути, бактерии
имеет для этого все необходимые ферменты, включая альдо-
лазу. Водород, отщепляющийся прн дегидрировании триозофос-
118
фата, передается к пирувату. Схема биосинтеза молочной кис-
лоты представлена ниже.
С6Н12Ое
ферме.нтf гпико/наа
2 HA IT
2СНтСНОН-СООН-
2НАД-Н(+1Г)
2СНгСО-СООН
лактатдсгидрогеназа
Другой вариант схемы молочнокислого брожения включает
распад глюкозы до пировиноградной кислоты н восстановле-
ние пировиноградной кислоты до молочной
СН3СОСООН+2Н------------ СН8СНОНСООН
пировиноградная молочная кислота
кислота
Молочиая кислота — нестойкое химическое соединение, и
в зависимости от условий производства и хранения она легко об-
разует продукты дегидратации, называемые ангидридами мо-
лочной кислоты.
Кристаллы молочной кислоты при атмосферном давлении
быстро плавятся с образованием бесцветной сиропообразной
жидкости удельного веса 1,21 без запаха с резко кислым вку-
сом.
Молочнокислое брожение. Для производства молочной ки-
слоты используют самые различные углеводы. В промышлен-
ности кислоту обычно получают из таких видов сырья, в ко-
торых содержатся глюкоза, сахароза и мальтоза. Таким сы-
рьем может служить рафинадная патока, меласса, крахмал
(кукурузный, картофельный), предварительно осахаренный со-
лодом. Концентрация сахара в сбраживаемой среде в зависи-
мости от вида сырья и условий брожения может колебаться
от 5 до 18 %. Для сбраживания сульфитных щелоков можно
использовать молочнокислые бактерии вида L. plantarum. Они
сбраживают гидролизаты, содержащие пентозы (ксилозу, ара-
бинозу) с примерно одинаковым выходом уксусной н молочной
кислот. Разделение этих образовавшихся кислот осуществляют
способом отгонкн из сброженных растворов.
В промышленных условиях молочную кислоту получают
глубинным способом с помощью культуры L. delbriickii. В ка-
честве основного сырья используют мелассу, сахарозу, гидро-
лизаты крахмала. Концентрация сахара в среде составляет
5—20 %, pH 6,3—6,5. Во время ферментации pH среды поддер-
живают при помощи мела, который добавляют 3—4 раза
в сутки. Молочнокислое брожение проводят при строго посто-
янной температуре 50 °C. Снижение температуры до 46 —48 °C
вызывает резкое ослабление биохимической активности куль-
11?
туры и способствует развитию посторонней микрофлоры. По-
вышение температуры, например до 53—55 °C, также вызывает
инактивацию культуры и замедление брожения.
Схема производства молочной кислоты
размножение чистой культуры
I
молочнокислое брожение прн 49—50 °C
I
обработка сброженного раствора
гашеной известью (80—90 OQ
I
фильтр ац н к
I
кристаллизация лактата кальция
I
расщепление лактата кальция серной кислотой
i
обработка сырой молочной кяслоты
желтой кровяной солью и активным углем
I
фильтрация
I
I упаривание до 50 %-ной концентрации
фильтрации
I
II упаривание до 60 %-ной концентрации
I
фильтрация
I
розлив
Положительное влияние на молочнокислое брожение ока-
зывают биологически активные вещества. С этой целью к пи-
тательной среде добавляют вытяжку из солодовых ростков.
При нормальном брожении за сутки бактериями сбраживается
1—1,5 % сахара, и весь цикл брожения заканчивается за 7—
11 сут. При этом количество несброжеиного сахара составляет
0,5—0,7%, а концентрация лактата кальция — 10—15%.
Обработка сброженного раствора и фильтрование. Для от-
деления мела и коллоидов сброженный раствор нагревают до
80—90 °C, а затем обрабатывают гашеиой известью до слабо-
щелочной реакции и отстаивают в течение 3—5 ч. Для удале-
ния грубой взвеси и твердых частиц декантируют отстояв-
шийся слой раствора лактата кальция. Раствор насосом пере-
120
качивают и а фильтр-пресс. Фильтрацию проводят при темпе-
ратуре раствора лактата кальция 70—80 °C через предвари-
тельно прогретый фильтр-пресс. Полученный фильтрат упари-
вают до концентрации 27—30 %, затем охлаждают до темпе-
ратуры 25—30 СС и выдерживают 36—48 ч в кристаллизаторе.
Кристаллизация считается законченной, если в маточном
растворе остается не более 5—6 % растворенного лактата
кальция.
Расщепление лактата кальция. Промытый холодной водой
лактат кальция отделяют иа центрифуге и расплавляют. С це-
лью предохранения лактата от обугливания расщепление лак-
тата кальция серной кислотой с выделением свободной молоч-
ной кислоты проводят при 60—70 °C. Эта реакция проходит
в соответствии с уравнением
Са (С3Н6О3)2 ~г H2SO4---* CaSO4 2C3HfiO3.
Для отделения иоиов железа полученную сырую молочную
кислоту при температуре 65 °C обрабатывают желтой кровя-
ной солью. В осадок выпадает берлинская лазурь. Тяжелые
металлы н мышьяк осаждают сульфатом натрия и сернистым
барием. С целью освобождения молочной кислоты от крася-
щих веществ используют активный уголь. После обработки по-
лученную смесь фильтруют, а осадок гипса промывают для из-
влечения оставшейся молочной кислоты.
Упаривание молочной кислоты. После расщепления кри-
сталлического лактата кальция и последующей обработки по-
лучают сырую молочную кислоту 18—20 %-ной концентрации,
которую для достижения 40 %-ной концентрации упаривают.
Упаривание кислоты производят в вакуум-аппаратах при оста-
точном давлении 10—15 кПа и давлении пара 0,2 МПа. Упа-
ренную до 40 % молочную кислоту осветляют активным углем
и обрабатывают желтой кровяной солью. После осветления мо-
лочной кислоты активный уголь отделяют на фильтр-прессе.
Отфильтрованную 40 %-ную молочную кислоту сливают в сбор-
ник готовой продукции, а из него подают иа фасовку.
Для получения 70 %-ной кислоты 40 %-ную молочную кис-
лоту вторично упаривают при большом разрежении в вакуум-
аппаратах. 70 %-ную молочную кислоту сливают в емкость, а
затем подают на фильтр-пресс для окончательного фильтрова-
ния. Отфильтрованную кислоту сливают в сборник, откуда по-
дают на розлив или иа приготовление 70 %-ной пастообразной
кислоты, которую получают внесением в нее небольших коли-
честв мела (4 % к массе кислоты). При этом происходит ча-
стичное замещение иоиов Н+ молочной кислоты иоиом Са2+ и
около 10 % кислоты превращается в кристаллический лактат,
который связывает молочную кислоту.
121
4.3. УКСУСНАЯ КИСЛОТА
Уксусная кислота СНзСООН — бесцветная жидкость с рез-
ким запахом. В результате перегонки перебродившего спирто-
вого раствора получают 70—80 %-ный раствор уксусной кис-
лоты, известный под названием уксусной эссенции. Из товар-
ных форм уксусной кислоты известны чистая пищевая (70—
80 %-ная), чистая уксусная (70—80 %-иая), безводная, или ле-
дяная (98—99,8 %-ная), уксусная кислота, выпадающая в оса-
док при охлаждении в виде кристаллов.
Уксусная кислота широко используется в пищевой, химиче-
ской, микробиологической промышленности, в медицине.
Уксуснокислое брожение. Уксуснокислое брожеине осно-
вано на способности уксуснокислых бактерий рода Acetobacter
окислять этиловый спирт в уксусную кислоту. Реакцию обра-
зования уксусной кислоты катализирует окислительный фер-
мент алкогольоксидаза. Окисление этанола в уксусную кислоту
можно представить уравнением
СН8СН2ОН + О2 = СН3СО0Н + Н2О-1-490 кДж.
Для этого процесса благоприятны температуры 28 °C для
культуры Bact. schiitzenbachii и 35°C для культуры Bact.
curvum, а также кислая реакция среды. Уксуснокислые бак-
терии хорошо развиваются при pH 3.
В промышленных условиях уксуснокислое брожеине прово-
дят непрерывным способом прн глубинном проточном культи-
вировании уксуснокислых бактерий в батарее последовательно
соединенных аппаратов (рис. 4.4). Схема производства вклю-
чает следующие основные технологические стадии: получение
посевного материала, подготовку сырья, уксуснокислое броже-
ние, розлив готового продукта.
Способностью превращать этиловый спирт в уксусную кис-
лоту обладают различные виды уксуснокислых бактерий. В
уксуснокислом брожении используют в основном два вида бак-
терий: Bact. schiitzenbachii н Bact. curvum. Это грамотрицатель-
ные спорообразующие палочки, снабженные жгутиками, раз-
мером 0,4—0,8 мкм.
Культуру уксуснокислых бактерий поддерживают наагари-
зоваиной среде Лайценской, содержащей (NH4)3PO4 -ЗН2О,
MgHPO4 • ЗН2О, КН2РО4.
Для получения посевной культуры уксуснокислые бактерии
выращивают в колбах иа жидкой питательной среде, а затем
в 30-литровом лабораторном аппарате.
Наилучшим сырьем для уксуснокислого брожения является
этиловый спирт, полученный из зерио-картофельного сырья.
Для переработки используют как ректификат, так и спирт-сы-
рец. Но при повышенном содержании сивушного масла в спир-
122
Рнс. 4.4. Схема установки для культивирования уксуснокислых бактерий:
1 — компрессор; 2 — ресивер; 3 — баллон со сжатым воздухом; 4 — фильтр (бактери-
цидный); 5 — реометр; 6— сосуд уровнительный; 7 — культиватор МИХМ-1-30 л; 8—
мерник этанола; 9 — мерник исходной питательной среды; 10 — бак напорный для ис-
ходной питательной среды; 11 — бак напорный для этанола; 12 — термостат; 13 — тер-
мометр; 14 — колба отбора проб; 15 — сборник готового уксуса
те-сырце производственный процесс нарушается, так как выс-
шие спирты угнетают развитие уксуснокислых бактерий.
На жизнедеятельность уксуснокислых бактерий большое
влияние оказывает реакция среды. Принято считать, что оп-
тимальный pH для их развития находится в пределах 3—3,2,
однако избыток уксусной кислоты в сбраживаемой среде уг-
нетает жизнедеятельность бактерий-продуцентов. После накоп-
ления 8 % уксусной кислоты развитие бактерий замедляется и
при содержании 12—14 % кислоты полностью прекращается.
Для сохранения естествеииой чистоты бактериальной популя-
ции оптимальной считается концентрация кислоты около 10 %.
Важным показателем является и предельная концентрация
спирта в сбраживаемой среде. Для Bact. schiitzenbachii она со-
ставляет 6—7 об. %, для Bact. curvum — 9—14 об. %. В про-
мышленности уксуснокислое брожение проводят в батарее, со-
стоящей из пяти последовательно соединенных ферментаторов.
Все аппараты выполнены из нержавеющей стали Х18Н10Т
и снабжены мешалкой, барботером и змеевиковым теплообмен-
ником. Первый аппарат батареи является генератором уксус-
нокислых бактерий н непрерывно снабжает все последующие
аппараты активной культурой. В нем создаются условия, спо-
собствующие быстрому размножению уксуснокислых бакте-
рий. Кроме того, в аппарате происходит интенсивное окисление
этанола в уксусную кислоту. Для осуществления этих процес-
сов в первый аппарат непрерывно подается среда, суммарная
концентрация этанола и уксусной кислоты в которой 6,4—
6,7 %.
123
Культуральная жидкость нз аппарата в аппарат переда-
ется воздухом. В каждом аппарате системы поддерживаются
свой постоянный температурный режим и оптимальные усло-
вия аэрации. Температура от 6 до 10°C является минимальной,
ниже ее прекращается жизнедеятельность всех уксуснокислых
бактерий. При температуре 12—15 сС у уксуснокислых бакте-
рий размножение замедляется, нормальное развитие происхо-
дит в интервале температур 15—34 °C. В производственных ус-
ловиях температуру брожения поддерживают на уровне 28—
25 °C. Следует отметить, что окисление спирта в уксусную кис-
лоту происходит только при интенсивной аэрации — теоретиче-
ски необходимое количество кислорода составляет 32 части иа
46 частей безводного спирта по массе, или 2.3 м3 воздуха и а
1 кг безводного спирта.
В процессе уксуснокислого брожения температура от фер-
ментатора к ферментатору снижается. Если в первом она равна
28 сС, то в последнем •—25 °C. Уменьшается также и аэрация
с 0,35—0,40 м3/(м3-мии) в первом ферментаторе до 0,1—
0,15 м3/(м3-мин) в последнем ферментаторе. В каждом фер-
ментаторе создаются условия, способствующие интенсивному
окислению этанола в уксусную кислоту. Для поддержания
во втором, третьем н четвертом аппаратах заданной концентра-
ции спирта в иих подают среду с 40 % -иым этанолом. Процесс
ведут таким образом, чтобы из пятого аппарата выводилась
культуральная жидкость с концентрацией уксусной кислоты
ие ниже 9 % и ие выше 9,2—9,3 %. Из 100 л безводного спирта
получают 75—90 кг уксусной кислоты.
Розлив готового продукта. Перед розливом 9 %-ной уксус-
ной кислоты (столового уксуса) ее осветляют бентонитом с до-
бавлением небольшого количества лимонной кислоты. После
перемешивания раствор уксусной кислоты подают на фильтр-
пресс. Отфильтрованный раствор поступает в сборник готового
продукта, а затем иа розлив.
4.4. ИТАКОНОВАЯ КИСЛОТА
Итаконовая кислота С5Н6О4 является ненасыщенной двух-
основной кислотой. Наличие в молекуле двух карбоксильных
групп и активной метиленовой группы определяет высокую ак-
тивность полимеризации итаконовой кислоты н участие в раз-
личных реакциях присоединения.
Итаконовая кислота представляет собой белый кристалли-
ческий порошок, хорошо растворимый в воде и некоторых ор-
ганических растворителях, имеет молекулярную массу 130,1,
плотность 1,63 и температуру плавления 167—168 °C.
Итаконовая кислота находит применение в производстве
синтетических волокон и смол, поверхиостно-активных веществ,
124
глюком
I
Рис. 4.5. Пути образования органических кислот у микроскопических грибов
красителей и ряда других сложных органических соединений.
Итаконовую кислоту могут синтезировать некоторые штаммы
микроскопических грибов рода Aspergillus (Asp. terreus, Asp.
itaconicus), выращиваемые глубинным или поверхностным спо-
собами на питательных средах, содержащих сахарозу, мелассу
и даже продукты гидролиза древесины.
Производство итаконовой кислоты включает следующие ос-
новные технологические стадии: получение посевного матери-
ала, культивирование продуцента глубинным способом, выде-
ление итаконовой кислоты.
Биосинтез итаконовой кислоты связан с реакциями цикла
Кребса (рис. 4.5). Прн декарбоксилировании исходного про-
дукта— цис-аконитовой кислоты — образуется итаконовая кис-
лота. Во время реакции в углеродном скелете происходит пе-
ремещение электронов, в результате двойная связь переходит
из положения 2,3 в положение 3,4
Н2С—соон Н2С
I -со II
с—соон^=^-> с—соон
нс—соон Hji—соон
125
Получение посевного материала. Для производства итако-
новой кислоты поверхностным н глубинным способами исполь-
зуют отселекционированные штаммы Asp. terreus и Asp. ita-
conicus. Посевной материал размножается в пробирках с ага-
ризоваиной средой (сусло-агар), а затем в колбах на жидкой
питательной среде. Длительность каждой стадии 2—6 сут, оп-
тимальная температура культивирования 30—32°C.
Культивирование Asp. terreus глубинным способом. При по-
лучении итаконовой кислоты глубинным способом культивиро-
вания продуцента для подращивания мицелия и на стадии
производственной ферментации может быть использована
среда одинакового состава, но с различной концентрацией вхо-
дящих в ее состав компонентов (табл. 4.1).
Таблица 4.1 Среды для культивирования
Компонент среды Для подращивания мнцелия. г/л Для производственного культивирования, г/л
Сахароза 60 60—70
MgSO4-7H2O 6,0 2,0
(NH.),SO. 2.7 2,7
Кукурузный экстракт 5,5 1,6
pH (HNOa или_Н25О4) 2,7—2,9 2,1—2,3
Меласса 60-70 180—200
NaNO3 1,0-2,0 1,0—1,5
pH (HNOS или H2S04) 6,0—7,0 4,5-5,0
Сахар-сырец (тростниковый) 60 60
MgSO4-7H2O 4,0 1,0—3,0
(NH^SO. 3,0 3,0
Кун ур узныйгэкстракт 1,0 0,5
pH(HNO3 или HES04) 2,1—2,2 2,0—2,1
(CeHi2Oe)8 NaCl - НЙО 70 70
MgSO4-7H2O 4,0 4,0
(NHJ.SO. 4,0 4,0
Кукурузный экстракт 5,0 1,5
pH (HNO8 или H2SO4) 4,6—4,8 4,8—5,0
Питательную среду для подращивания мицелия целесооб-
разно засевать предварительно (за 10—12 ч) замоченными
в среде кониднямн из расчета 0,75 г конидий на 1 м3 среды.
Биосинтез итаконовой кислоты протекает наиболее интен-
сивно при засеве производственного ферментатора культурой,
находящейся в конце логарифмической фазы роста, что соот-
ветствует примерно 30 ч роста.
Процесс образования кислоты в ферментаторе протекает
при постоянном перемешивании и аэрации среды при темпера-
туре 33—36 °C в течение 72 ч. К концу процесса ферментации
содержание итаконовой кислоты составляет 37—38 г/л прн об-
щем содержании кислот в сброженном растворе 38,5—39,0 г/л.
126
Рис. 4.6. Технологическая схема получения итаконовой кислоты глубинным
способом:
1— смеситель; 2— сетчатый фильтр; 3—центробежный насос; 4 — стерилизационная
колонка; 5 — выдержнватель; 6 — охладитель; 1 — сборник; 8 — ферментатор для под-
ращивания; 9 — ферментатор производственный; 10 — компрессор; И— ресивер; 12— хо-
лодильник; 13 — фильтр групповой; 14 — сборник; 15 — барабанный вакуум-фильтр; 16 —
сборник-монтежю; 17— сборник мицелия; 18 — сборник-осветлитель: 19— барабанный
вакуум-фильтр; 20 — сборник растворов; 21 — вакуум-аппарат; 22 — кристаллизатор;
23 — центрифуга-, 24 — сборник фильтрата; 25 — растворитель кристаллов; 26 — друк-
фильтр; 27—сборник маточных растворов; 28 ~ мерник соляной кислоты; 29 — мерник
раствора аммиака; 30 — реактор для разбавления; 31 — аниоиитовый фильтр; 32 — сбор-
ник растворов; 33 — сушилка; 34 — готовая продукция
В условиях поверхностного способа сбраживания раствора
сахарозы (слой 12 см) культурой Asp. terreus за 10—12 сут
образуется 56—58 % итаконовой кислоты в пересчете на сахар,
причем итаконовая кислота составляет 94—97 % от суммы всех
образовавшихся кислот (фумаровой, щавелевой, янтарной).
Технологическая схема получения итаконовой кислоты глу-
бинным способом представлена на рис. 4.6.
В сброженных растворах в среднем содержится от 3 до 6 %
итаконовой кислоты, 0,5—1,5 % несброженных сахаров, 0,3—
0,6 % других органических кислот и небольшое количество
различных солей и красящих веществ.
Выделение итаконовой кислоты. Кипящий сброженный ра-
створ, освобожденный от грибного мнцелия, обрабатывают ак-
тивным углем (0,3—0,5 %) и фильтруют. Фильтрат упаривают
при температуре 50—60 °C до */4—*/ю первоначального объема.
Упаренный раствор подается в кристаллизатор, где охлажда-
ется до 13—15 °C. Кристаллизуется итаконовой кислоты 75—
80 % от ее содержания в растворе.
Техническая итаконовая кислота отделяется на центрифуге.
Она содержит 3—6 % влаги, 1—3 % других органических кис-
127
лот и 2—5 % различных примесей. Для очистки техническую
итаконовую кислоту растворяют в горячей воде до 25 %-иой
концентрации и осветляют активным углем (5—8 % по массе
кислоты). Горячий раствор фильтруют, а затем кристаллизуют.
В процессе центрифугирования кристаллы кислоты промывают
дистиллированный водой. Высушенные кристаллы имеют сле-
дующий состав и свойства (в %):
Итаконовая кислота, не менее 99
Оптическая плотность менее 0,02
Сульфаты 0,21
Хлориды, железо и тяжелые ме- 0,005
таллы
Зола, не более 0,02
Маточный раствор после перекристаллизации упаривают до
30—40 % первоначального объема и кристаллизуют вторично.
С этой целью горячий раствор вновь фильтруют и концентри-
руют. Концентрат медленно охлаждают, а затем центрифуги-
руют. Выпавшие кристаллы итаконовой кислоты промывают
дистиллированной водой, сушат. Третья стадия очистки пре-
дусматривает совместную обработку маточных и сброженных
растворов в указанной последовательности.
При повышенном содержании остаточных сахаров н других
примесей в сброженных растворах рекомендуется проводить
выделение итаконовой кислоты с помощью ионообменных смол.
Использование анионита ЭДЭ-10П позволяет выделить 94—
100 % итаконовой кислоты от ее количества, содержащегося
в сброженном растворе при расходе 5—8 г анионита на 1 г
очищенной кислоты.
Регенерация отработанного нонита осуществляется соляной
кислотой, а перевод в основную форму — раствором аммиака.
4.5. ПРОПИОНОВАЯ КИСЛОТА
Пропионовая кислота СНз—СН2—СООН синтезируется
грамположительными, неподвижными, не образующими спор
факультативно анаэробными бактериями, принадлежащими
к роду Propion {bacterium. Большинство видов пропионовокис-
лых бактерий были выделены из микрофлоры сыра, рубца и
кншечннка жвачных животных. Пропионовокислые бактерии
при производстве сыра способствуют образованию специфиче-
ского вкуса и запаха. Пропионовая кислота находит примене-
ние в парфюмерной и химико-фармацевтической промышлен-
ности.
Пировиноградная кислота карбоксилируется в щавелево-
уксусную кислоту при участии бнотина и диоксида углерода.
Затем щавелевоуксусная кислота через яблочную и фумаровую
кислоты восстанавливается до янтарной кислоты, которая при
участии АТФ и КоА превращается в сукциннл-КоА. Сукцинил-
128
Рис. 4.7. Схема образования пропионовой кислоты из молочной пропионово-
кислыми бактериями (Propionibacterium pentosaceum)
КоА под действием метилмалоиил-КоА-изомеразы и при уча-
стии кофермента Bi2 превращается в метнлмалонил-КоА. Это
последнее соединение декарбоксилируется, после чего пропио-
нил-КоА расщепляется иа КоА и пропионовую кислоту.
Среди многих бактерий для промышленного получения про-
пионовой кислоты используются виды Рг. shermanii, Рг. rub-
rum, Pr. arabinosum и др. Пропионовокислые бактерии полу-
чают энергию в результате брожения. Они растут и синтези-
руют пропионовую кислоту на питательных средах с лактозой,
глюкозой, мальтозой, сахарозой, глицерином, яблочной и мо-
лочной кислотами и др.
Пропионовокислые бактерии сбраживают различные са-
хара с образованием пропионовой и уксусной кислот и выде-
лением диоксида углерода. Но наиболее характерной их осо-
бенностью является способность сбраживать молочную кис-
лоту, которая затем частично имн восстанавливается до пропи-
оновой кислоты, частично дает начало образованию уксусной
кислоты н диоксида углерода. Синтез пропионовой кислоты из
молочной пропионовокислыми бактериями представлен на рис.
4.7.
В промышленных условиях пропионовую кислоту получают
методом анаэробного глубинного культивирования на пита-
5 Заказ № 1536 129
тельных средах, содержащих глюкозу (2%), источники орга-
нического азота, например дрожжевой экстракт (0,4%),
а также соли молочной кислоты. Процесс протекает 7 -12 сут
при pH 6,8—7,2 и температуре 30 °C. Более 75 % сброженного
сахара превращается в пропионовую и уксусную кислоты (5 :
: 1), менее 20 % расходуется на образование диоксида угле-
рода.
4.6. ГЛЮКОНОВАЯ КИСЛОТА
Глюконовая кислота СбН^Оу представляет собой одноос-
новную пентаоксикнслоту, получаемую при ферментативном
окислении глюкозы. Превращение глюкозы в глюконовую кис-
лоту представляет собой простую реакцию окисления альдегид-
ной группы сахара в карбоксильную
но—С—н гг СООН
н—с—он н—С—ОН н—с- он
но—i н с ( глюкозооксидаза ? НО—С Н 1 -Щ?-> но—С—н
Н—С- он н—С—ОН н—С—ОН
1 н с н с н с он
СН2ОН т CHjOH СН8ОН
p-D-глюкоза глюконо л актон глюкононая кислота
Промышленное производство глюконовой кислоты предназ-
начено главным образом для получения кальциевой соли, ис-
пользуемой в медицинской промышленности. Продуцентами
глюконовой кислоты служат микроскопические грибы родов
Aspergillus и Penicillium. Глюконовую кислоту можно полу-
чать как при поверхностном, так и при глубинном культивиро-
вании, применяя прн этом концентрированные (30—35 %) ра-
створы глюкозы. Кроме глюкозы сбраживаемая среда обычно
содержит MgSO4-7H2O, КН2РО4, (NH4)2 НРО4 и СаСО3. Среда
засевается проросшей культурой гриба Asp. niger. Брожение
заканчивается, когда содержание сахара в среде становится
меньше I %.
Чаще всего готовый продукт получают в виде соли каль-
ция. Сброженный раствор фильтруют и нейтрализуют свобод-
ную глюконовую кислоту. Кристаллизация глюконата кальция
проводится при температуре ниже 20 °C в течение 24—48 ч.
Кристаллы глюконата кальция отделяются от маточного раст
вора на центрифуге и дважды промываются холодной водой,
а затем высушиваются при температуре не выше 80 °C.
ВО
Глава 5. АМИНОКИСЛОТЫ
Аминокислоты являются основой всех природных белков и
служат незаменимой составной частью пищи человека и кор-
мовых рационов животных.
Известно, что природные белки состоят из 20 аминокислот.
Физиологическое значение аминокислот неодинаково. Одни из
них не синтезируются с достаточной скоростью и в необходи-
мом количестве в организме человека и животных, а потому
должны поступать вместе с продуктами питания. Это так назы-
ваемые незаменимые аминокислоты. К ним относятся валин,
аргинин, гистидин, лизин, лейцин, изолейцин, метионин, трео-
нин, триптофан, фенилаланин. Другие синтезируются в орга-
низме— аспарагиновая, пролии, аланин, глутаминовая, серии,
тирозин, цистин, цистеин. Нормальный обмен веществ в орга-
низме человека и животных протекает только при поступлении
в него незаменимых аминокислот в достаточном количестве
в определенном соотношении. Изменение требуемого соотноше-
ния аминокислот в пище может стать фактором, лимитирую-
щим рост и развитие организма. Суточная потребность чело-
века в незаменимых аминокислотах приведена в табл. 5.1.
Основным способом повышения полноценности пнщн явля-
ется обогащение продуктов питания дефицитными аминокисло-
тами. Добавление к рациону животных нескольких десятых до-
лей процента недостающей аминокислоты приводит к повыше-
нию ценности белка пищи более чем в 2 раза.
Аминокислоты можно получать из кислотных и щелочных
гидролизатов природных белков и из продуктов нх фермента-
тивного расщепления. Однако высокая себестоимость и дефи-
цитность исходного сырья (отходы мясной промышленности,
яичный белок, казеин молока, клейковина пшеницы), а также
многоступенчатая химическая обработка, связанная с выделе-
нием аминокислот н их очисткой, не позволяют широко исполь-
зовать этот способ в промышленности. В процессе кислотного
гидролиза белков наблюдается разрушение большей части
триптофана, цистеин при этом окисляется в цистин, распада-
ются треоиин и серин. Определенные недостатки имеет и метод
ферментативного гидролиза. В частности, гидролиз может быть
неполным, и сам фермент с освобождением аминокислот спо-
собен распадаться.
Аминокислоты можно получать химическим синтезом, од-
нако основной недостаток этого способа — образование раце-
матов (за исключением глнцина), состоящих из равновесной
смеси D- и L-форм аминокислот. Биологически активными и
потому используемыми в питании животных и человека явля-
ются L-аминокислоты, исключение составляет метионин.
В настоящее время в СССР освоен промышленный способ
получения ZJL-метионина химическим способом. Органический
5* 131
Таблица 5.1 Суточная потребность организма человека в незаменимых аминокислотах
синтез метионина — сложный и многостадийный процесс. Для
проведения реакций необходимы различные реагенты и тща-
тельная очистка от нежелательных соединений. Схема органи-
ческого синтеза ZZL-метиоиииа из акролеина в качестве основ-
ного сырья приведена ниже. Следует отметить, что для полу-
чения 1 т аминокислоты необходимо всего 580 кг акролеина.
Р-метилмеркаптоэтилгидаито ни
| №ОН
DL-CH 3SCH аСН2СНСООН
NH.
метионин
Наиболее рентабельно и экономически выгодно получение
аминокислот микробиологическим способом. Микробиологиче-
ский процесс свободен от недостатков химического синтеза, и
прежде всего от образования рацематов аминокислот.
Мировой уровень производства аминокислот постоянно воз-
растает и в настоящее время составляет 300 тыс. т в год. Боль-
шая часть этого количества аминокислот вырабатывается мик-
робиологическим синтезом с помощью высокопродуктивных
штаммов микроорганизмов, полученных в результате селекци-
онно-генетических исследований. Очень редко активные штамм-
133
продуценты выделяются непосредственно из природных источ-
ников. Для большинства аминокислот применяют ауксотроф-
ные мутанты, т. е. культуры, утратившие способность в связи
с нарушением нормальных биосинтетических процессов (от
воздействия мутагенов физической и химической природы) са-
мостоятельно синтезировать необходимые для роста н развития
те или иные аминокислоты, например треонин, гомосернн,
а с другой стороны приобрели способность к сверхсинтезу дру-
гой аминокислоты — лизина, глутаминовой кислоты. Это зна-
чит, что такие микроорганизмы для своего роста н развития
требуют наличия в питательной среде аминокислот (треонина
и гомосерина), синтез которых блокирован. Например, интен-
сивное накопление L-лизина отмечалось у культур Corynebacte-
rium glutamicum, дефицитных по гомосерину и требующих для
роста таких аминокислот, как треонин, метионин. Прн соответ-
ствующих условиях микроорганизм синтезировал до 40 г/л L-
лизина.
Биосинтез аминокислот проходит через ряд превращений,
катализируемых различными ферментами. Блокирование од-
ной химической реакции сопровождается изменениями в ходе
других реакций, связанных так или иначе с первой. Например,
если в результате нарушений микробная клетка не может син-
тезировать фермент гомосериндегидрогеназу, катализирующий
превращение полуальдегнда аспарагиновой кислоты в гомосе-
рин, то клетка может синтезировать необходимые для жизне-
деятельности белки только при наличии готового гомосерина
в питательной среде. Аспарагиновая кислота является исход-
ной для биосинтеза гомосерина, метионина, лнзнна, треонина,
изолейцииа, и с прекращением синтеза гомосерииа одновре-
менно прекращается синтез всех этих аминокислот. Эти ами-
нокислоты также должны содержаться в питательной среде.
5.1. ЛИЗИН
Лизин (а, е-диаминокапроновая кислота) известен в виде
двух оптически активных D- и L-форм и рацемической DL-
формы. Эмпирическая формула C6Hi2N2O2. Молекулярная масса
146,19. Лизии хорошо растворим в воде, кислотах, основаниях;
трудно растворим в спирте и нерастворим в эфире. Аминокис-
лота при температуре 224—225 °C разлагается. Кристаллизу-
ется лизин в виде бесцветных игл или гексагональных пласти-
нок.
Установлено, что в организме лизин определяет ие только
биологическую ценность белка. Аминокислота выполняет много
н других биохимических функций — оиа способствует секреции
пищеварительных ферментов и транспорту кальция в клетки,
улучшает общий азотный баланс в организме. Применение ли-
зниа в хлебопекарной промышленности повышает биологиче-
134
скую ценность и улучшает качество изделий. От добавления ли-
зина в рационы животных (0,1—0,4%) значительно увеличи-
вается коэффициент использования белка, н тем самым сни-
жается расход кормов иа единицу продукции.
Биосинтез лизина. Он осуществляется при помощи ауксо-
трофных мутантов микроорганизмов рода Micrococcus, Brevi-
bacterium, Corynebacterium и др. Питательные среды, исполь-
зуемые для выращивания микроорганизмов и биосинтеза
аминокислоты, содержат в качестве источника углеводов свекло-
вичную мелассу, кукурузный экстракт или белковые гидроли-
заты— источники аминокислот. Источниками азота могут слу-
жить соли аммония, мочевина. При биосинтезе лизииа важную
роль играет концентрация факторов роста в среде — биотнна и
необходимых аминокислот — метионина, гомосерина, треонина.
Для роста и биосинтеза лизниа культурой Brevibacterium sp.22
оптимальной считается следующая концентрация на 1 л пита-
тельной среды: метионина 200 мг, треонина 800 мг, биотина
15—20 мкг. При уменьшении концентрации биотина (иа I л)
до 1—4 мкг культура Brevibacterium sp. 22 синтезирует глута-
миновую кислоту, при увеличении до 2,5 мг образуется молоч-
ная кислота — явление, известное как механизм обратного дей-
ствия.
Биосинтез лизина микроорганизмами (диаминопимелиновый
путь) начинается с аспарагиновой кислоты и проходит че-
рез диаминопимелииовую кислоту. Один путь биосинтетических
превращений аспарагиновой кислоты приводит к синтезу ли-
зина, другой — к синтезу гомосерина. Гомосерин — промежу-
точный продукт для синтеза треонина и изолейцина, с одной
стороны, и метионина — с другой. При нарушении биосинтеза
треонина, метионина и нзолейцина на стадии образования го-
мосерина ход реакций превращения аспарагиновой кислоты
сдвигается в сторону образования лизииа.
Следует отметить, что в синтезе лизина ключевым фермен-
том является аспартаткииаза. При синтезе лизина повышен-
ные концентрации треонина ингибируют аспартаткиназу. Этот
эффект усиливает присутствие лизииа. Треонин у бактерий (Е.
coli, Micrococcus glutamicus) ингибирует дегидрогеназу полу-
альдегида аспарагиновой кислоты н гомосериндегидрогеназу.
Метионин по отношению к гомосериндегидрогеназе является
репрессором. Треоииндегидрогеназу ингибирует изолейции. Та-
ким образом, продукты обмена веществ, угнетающие различ-
ные ферменты и участвующие в синтезе лизина, должны быть
выведены из реакции. Именно поэтому ауксотрофные микроор-
ганизмы являются наиболее удобными для производства. На-
пример, культура, лишенная активности гомосериндегндроге-
назы, обеспечивает достаточно высокие выходы лизииа.
На рис. 5.1 приведена схема биосинтеза лизина в бактери-
альных клетках, на которой показаны промежуточные метабо-
135
кислота
мезо-се. е-оиамино-
пимелиноЗая
Рнс. 5.1. Схема образования лизина,
треоиииа, метионина из аспарагино-
вой кислоты
литы, синтезируемые по общему с лнзином пути из аспараги-
новой кислоты.
Технологические схемы производства L-ли-
з и н а. Технология получения кристаллического £-лизииа, раз-
работанная Всесоюзным научно-исследовательским институтом
генетики и селекции промышленных микроорганизмов, состоит
из двух основных стадий: культивирования продуцента и вы-
деления конечного продукта. На стадии культивирования про-
изводится двухступенчатое выращивание посевной культуры
Micrococcus glutamicus в ииокуляторах и посевных аппаратах.
Предварительно выраженной культурой засевается фермента-
тор, в котором в стерильных аэробных условиях при непрерыв-
136
ном перемешивании и термостатированин (30—33 °C) осуще-
ствляется биосинтез. При ферментации в течение 50—70 ч при
pH 7,4 концентрация лизина в растворе достигает 40 г/л.
Полученная после биосинтеза культуральная жидкость на-
правляется на осветление, в результате отделяется биомасса.
Осадок отделяют фильтрацией, сушат, размалывают и исполь-
зуют как кормовой продукт, содержащий около 40 % белковых
веществ.
Очищенный раствор с pH 7,0 пропускают через катионит
марки КУ-2 нли КБ-4П-2 в NHt-форме. Каждые 100 г ка-
тионита сорбируют 6—8 г лизина. После промывки ионообмен-
ника водой проводится десорбция лизина 0,5—5,0 %-иой амми-
ачной водой, получаемый раствор содержит 80—90 % лизина
от сорбированного количества. Элюат упаривается в вакууме
при 60 СС до 30—50 %-кого содержания аминокислоты. При
помощи соляной кислоты устанавливают pH 4,9, раствор упа-
ривают и кристаллизуют аминокислоту при охлаждении до
12—14 °C. Кристаллы монохлоргидрата лизииа отделяют на
нутч-фильтре, промывают этиловым спиртом и высушивают
при 60 °C. Форма готового продукта: £-лизин монохлоргндрат,
содержание основного вещества 97—98 %, влажность 0,5 %,
зольность до 0,3 %, температура плавления 210°C. Выход ли-
зина на стадии выделения 76—78 %.
Для животноводства Институтом биохимик им. А. Баха
АН СССР совместно с Институтом микробиологии им. А. Кир-
хенштейиа АН Латвийской ССР на Ливанском опытном биохи-
мическом заводе было налажено производство кормового кон-
центрата лизииа—ККЛ (рис. 5.2). Технологический процесс
получения ККЛ включает следующие основные производствен-
ные стадии: выращивание посевного материала и приготовле-
ние питательной среды, производственное культивирование,
выпаривание и сушка культуральной жидкости, фасовка и
упаковка готового продукта.
Культура Brevibacterium sp. 22 представляет собой грампо-
ложительные неподвижные бактерии, имеющие форму клеток
от овальных до кокков. Продуцент лизина — ауксотроф — нуж-
дается в биотине, тиамине, треонине и метионине. Исходную
культуру размножают на агаризоваииой среде (2 %-ный мясо-
пептонный агар) и культивируют при 29—30 °C. Один раз
в два месяца культуру рассевают на агаризованные среды.
Активность выросших колоний проверяют на жидкой питатель-
ной среде следующего состава (в %): меласса 3—5, кукуруз-
ный экстракт 2,5—3,5, хлорид натрия 0,3. pH среды доводится
Д° 7—7,2 добавлением 20 %-кого раствора гидроксида натрия.
Часть активных колоний высушивают (лиофилизируют),
а часть пересевают на мясопептоииый агар. Выросшие куль-
туры служат в качестве исходных для производства лизнна.
Проверенный на активность посевной материал выращивают
137
Стерильный fostyx
иа мел ассно-кукурузной среде в колбах (на 750 мл) в течение
24 ч при pH 6,9—7,0 н температуре 29—30°C. Посевной мате-
риал характеризуется титром клеток 2,0—108 в 1 мл среды. Для
выращивания культуры-продуцеита в посевном аппарате гото-
вят среду следующего состава (в %);
Меласса (содержание сахара 46 % от СВ) 16,3
Кукурузный экстракт (содержание СВ 50 %) 2
Сульфат аммония 2
Калий фосфорнокислый
одиозамещен ный 0,05
двухзамещеииый 0,05
Мел 1
pH среды 6,9—7,0
Среду стерилизуют 1 ч при температуре 126 °C. В посевной
ферментатор иа 250 л вносят 3—5 % (от объема среды) по-
севного материала. Коэффициент заполнения посевного аппа-
рата равен 0,5. Культуру выращивают при 29—30 °C, непре-
рывной аэрации (1 объем на 1 объем среды в минуту) и пере-
мешивании (мешалка турбинного типа, 300 об/мин) в течение
24 ч. Для пеногашения добавляют 0,3 % (от объема среды)
простерилнзованного (в течение 1 ч при температуре 120 °C)
каталогового жира.
Производственное культивирование проду-
цента. Производственное культивирование осуществляется
в ферментаторах вместимостью 50 н 100 м3. До засева посев-
ным материалом ферментатор промывается и стерилизуется
в течение 1 ч при 0,1 МПа. Культура выращивается на среде
следующего состава (в %):
Меласса 7—12 (по содержанию сахара)
Кукурузный экстракт 1.2—1,5 (по содержанию СВ)
Сульфат аммония 2
Калий фосфорнокислый
одиозамещеииый 0,05
двухзамещеиный 0,05
Мел 1
Пеногаситель (кашалодовый жир) 0,3
Рис. 5.2. Принципиальная технологическая схема производства кормового кон-
центрата L-лизнна:
1 — реактор с мешалкой для стерилизации пеногасителя; 2 — насос; 3 — реактор с ме-
шалкой для растворения бисульфита; 4 — весы для мелассы; 5 — сборник для раствора
бисульфита; 6— сборник для стерильного пеногасителя; 7 — аппарат с мешалкой для
предварительного разбавления мелассы водой; в — стерилизационная колонка; 9 — ре-
актор для выдержки предварительно разбавленной мелассы; 10 — реактор с мешалкой
для приготовления питательной среды; 11 — теплообменник для выдержки питатель-
ной среды; 12—теплообменник для охлаждения питательной среды; 13—мерник;
14 — весы для кукурузного экстракта; 15—реактор с мешалкой для растворения пита-
тельных солей; 16 — посевной ферментатор; 17 — воздушный фильтр индивидуальный; 18 —
производственный ферментатор; 19 — реактор для стабилизации культуральной жид-
кости; 20 — сборник культуральной жидкости; 21 — решофер-подогреватель; 22 — вы-
парной аппарат; 23— пеноловушка; 24— барометрический конденсатор; 25 — баромет-
рический ящик; 26— сборник концентрата; 27 — сборник конденсата; 28— сборник упа-
ренного концентрата; 29—сушильная камера; 30 — резервуар воды; 31— отсасываю-
щий вентилятор; 32 — циклонная батарея; 33 — шлюзовый затвор; 34 — циклон пневмо-
транспорта; 35—автоматические весы; 36 — зашивочная машина с транспортером меш-
ков готового продукта; 37 — смеситель; 38 — питательный насос; 39 — нагнетательный
вентилятор; 40 — мазутная точка с огневым калорифером
139
Питательная среда стерилизуется прн температуре 130—
132 °C в течение 10—15 мнн. После охлаждения до 30—32 °C
среду подают в ферментатор. По стерильной посевной линии
в ферментатор поступает посевной материал в количестве
5—6 % от объема питательной среды. Коэффициент заполнения
ферментатора составляет 0,75. Процесс ферментации продол-
жается 48—72 ч при температуре 29—30 °C, непрерывном пере-
мешивании и аэрации среды стерильным нагретым воздухом
(до 50 °C) из расчета 1 объем на 1 объем среды в минуту при
избыточном давлении воздуха в ферментаторе 20—30 кПа. Пе-
ногашение осуществляется стерильным кашалотовым жнром,
подаваемым из мерника пеногасителя. Общий расход пеногаси-
теля составляет 0,5 % от объема среды, причем 0,2 °/о пе-
ногасителя вносят в момент приготовления питательной
среды.
Выпаривание н сушка культуральной жид-
кости. Стабилизированная 0,15 %-ным бисульфитом натрия
культуральная жидкость с pH 5,0—6,0 выпаривается на вакуум-
выпарной установке. Начальная концентрация сухих веществ
в жидкости, поступающей иа выпарку, составляет 10—15 %, ко-
нечная — около 40 %. Упаренная культуральная жидкость высу-
шивается нагретым воздухом и а распылительной сушилке с ди-
сковым распылителем при 300/90 °C.
Фасовка и упаковка готового продукта. Высу-
шенный до остаточной влажности 4—8 % ККЛ фасуется по
20 кг в крафт-мешки с полиэтиленовым вкладышем. При пра-
вильном соблюдении технологического режима выход лизина
на стадии ферментации составляет 23—26 % от содержания
усвоенного сахара, а в культуральной жидкости накапливается
до 20—25 г/л £-лизина. Общие потери лнзииа на стадии выпа-
ривания и сушки не превышают 15 %.
Сухой концентрат кормового лизина, получаемый высушива-
нием стабилизированной и сконцентрированной жидкости, имеет
существенный недостаток. Он очень гигроскопичен и при хране-
нии слеживается крупными комками. Гигроскопичность препа-
рата может быть снижена в результате дображиваиия остаточ-
ных сахаров специальной культурой дрожжей или добавлением
в процессе сушкн ККЛ костной муки, бентонита, аэросила. Один
из вариантов получения сухого препарата. ККЛ заключается
в том, что жидкий концентрат лизина смешивается с пшенич-
ными отрубями до получения смеси влажностью около 70 % и
после гранулирования высушивается на конвективных сушил-
ках. Готовый препарат ККЛ содержит до 7—10 % лизина, ои
сыпуч и иегигроскопичен.
Согласно ТУ 59-72—74 сухой ККЛ должен содержать моно-
хлоргидрат £-лизина в пересчете на сухое вещество не менее
10 % и иметь влажность ие более 10 %. Химический состав су-
хого вещества концентрата лнзина приведен ниже.
140
оде р н н , % Состав %
пиридоксин (Вв) 200—340
15,0—20,0 никотиновая кислота 8,0—10,0
2,5-3,7 (РР)
Различные органиче-
1,2—4.8 ские вещества
1,3—3,1 бетаин 6.0—13,0
0,8—1,4 редуцирующие ве- 4.6—12.7
щества
0,6— 1,1 жиры 1.3
0,3—2,8 клетчатка 0,3
0,6—0,9 Минеральные вещества
0.3—0.8 зола в пересчете на 19,0—28,0
0,4—0,7 СВ
0,4—0,6 кальций в пересче- 5,2—12,5
0,4—0,6 те на золу
0,2—0,6 кальций в пересче- 28,6—33.6
0,5-0,6 те на калий
0,4 -0,6 кальций в пересче- 0,8
0,3—0,6 те на натрий
0,2—0,3 кальций в пересче- 0,1—0,25
0,2—0,3 те на железо
До 43,5 кальций в пересче- 1,1—1,5
те иа магний
5,2—7,9 кальций в пересче- 2,2—4,4
37,5—49,4 те на фосфор
1,9—3,6 кальций в пересче- 10,9—11,5
0,9—2,0 те иа кремний
0,3—1,4 Микроэлементы, мкг %
0,82—1,66 цинк 1821,0
кобальт 67,8
1,7—9,7 кадмий 476,7
84,2—160 молибден 545,2
30—60 марганец медь 3071,0 280,0
10—20
Состав
Аминокислоты
лизин
глутаминовая кис-
лота
валин
аланин
аспарагиновая кис-
лота
лейцин
пролии
глицин
аргинин
тирозин
метионин
изолейцин
фенилаланин
триптофан
серии
треоиии
гистидин
цистин
Всего
Азотистые вещества
общий азот
протеин (Nx6,25)
белковый азот
аминный азот
аммиачный азот
азот бетаина
Витамины, мкг/г
тиамин (Bj)
рибофлавин (В2)
пантотеновая кис-
лота (В3)
фолиевая кислота
(В<)
Комбинированный, или энзиматический, способ производства
лизина. Японская фирма «Тойо Рейон» («Торей») предложила
в 1973 г. принципиально новый способ получения £-лизнна, пре-
имущество которого состоит в том, что конечный продукт отли-
чается высокой концентрацией и чистотой. В ходе реакции
не возникает опасности заражения посторонней микрофлорой.
Отпадает необходимость разделения аминокислоты на оптиче-
ские изомеры. Возможно также создание непрерывного процесса
с использованием совместного действия иммобилизованных фер-
ментов в одном реакторе.
Процесс состоит из стадий органического синтеза и фермен-
тативного гидролиза. Исходным сырьем для получения этой
аминокислоты служит циклогексан. В результате химических
реакций из циклогексана получается циклический ангидрид ли-
зина (£>£-а-амнно-е-капролактам), который на стадии фермен-
тативного гидролиза превращается в £-лизии.
141
При этом производят разделение оптических изомеров, яв-
ляющееся сложным и дорогостоящим процессом при синтезе
не только L-лизина, но и других аминокислот. Разделение опти-
ческих изомеров DA-a-амино-е-капролактама осуществляется
при использовании микробных ферментов. При этом происхо-
дит асимметрический гидролиз с помощью гидролазы амнно-
капролактама с образованием £-лизина.
Схема получения £-лизина, разработанная фирмой «Торей»,
представлена ниже.
сна HN С=О HNC=O
I ЬС<>СНа г ^с/ \cH-NH, ---------Н2С( \cH-NHa
wOch, -^.н-^сн/снд-сн-соон+ нА^сн,
сн“ CH, Ml, сн«
циммексин DL-ct-пмино-е- L-лизин D-се-амино
килролампам капроиатам
Помимо лизнна в реакционной смеси содержится D-a-амино-
е-капролактам, который с целью увеличения выхода £-лизииа
подвергают рацемизации. Для выявления преимущества рас-
сматриваемого процесса необходимо, чтобы одновременно с гид-
ролазой £-а-амино-е-капролактама действовал фермент, раце-
мизующий D-a-амино-е-капролактам. Только совместное дей-
ствие этих двух ферментов обеспечивает превращение DL-a-
амиио-е-капролактама в £-лнзин почти со 100 %-иым выходом.
Содержание аминокислоты в реакционной смеси может дости-
гать 200 г/л.
Установлено, что способностью синтезировать гидролазу
£-а-амино-е-капролактама обладают дрожжи родов Cryptococ-
cus, Candida, Trichosporon. Активаторами этого фермента слу-
жат ионы Мп2+, Mg2+, Zn2+, ингибитором — этнлендиаминтетра-
уксусная кислота. Фермент рацемазу а-амино-е-капролактама
получают при выращивании бактерий, относящихся к родам
Achromobacter, Flavobacterium и др. Ингибирующее действие
иа этот фермент оказывает гидроксиламин. Принцип действия
рацемазы а-амино-е-капролактама, по-видимому, такой же, как
и рацемаз других аминокислот, требующих в качестве кофак-
тора пиридоксаль-5'-фосфат.
Совместное действие двух ферментов на субстрат дости-
гается введением в водный раствор £>£-аминокапролактама
определенного количества биомассы или сухих клеток дрожжей,
обладающих гидролазной активностью, и бактерий с рацемаз-
ной активностью аминокапролактама. В результате реакции
1)£-аминокапролактам количественно переходит в £-лизин. Опти-
ческая чистота получаемой аминокислоты более 99 %.
Новый способ получения лнзина интересен еще и тем, что
£-гидролазу и рацемазу аминокапролактама можно получать
в иммобилизованной форме, что дает большие преимущества
142
по сравнению с использованием растворимых ферментов. Для
этого раствор П£-амниокапролактама, полученный химическим
способом, пропускают через колонку, содержащую два иммоби-
лизованных фермента микробного происхождения. Первый из
них гидролизует амидную связь в £-амннокапролактаме, ие за-
трагивая D-изомера, второй фермент — рацемаза с высокой
скоростью превращает D-изомер в рацемат. При правильно по-
добранных условиях н режиме работы колонки единственным
продуктом процесса является £-лнзин, его выход составляет
95%.
5.2. ГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА
И ГЛУТАМАТ НАТРИЯ
Глутаминовая кислота (а-аминоглутаровая)
НООС—СН2—СН2—СООН
I
nh2
является одной из важнейших аминокислот растительных и жи-
вотных белков. Не являясь незаменимой, она тем не менее слу-
жит основой для синтеза многих физиологически активных со-
единений, необходимых для нормальной жизнедеятельности че-
ловеческого организма.
Важной особенностью глутаминовой кислоты является спо-
собность служить защитным фактором при различных отравле-
ниях печени и почек, усиливать фармакологическое действие
одних и ослаблять токсичность других лечебных средств, под-
держивать наряду с другими аминокислотами постоянную реак-
цию среды. На этих свойствах и основано лечение ряда заболе-
ваний путем введения в организм глутаминовой кислоты.
Не меньшее значение имеет и мононатрневая соль этой ами-
нокислоты — глутамат натрия. Это соединение усиливает вкус
многих пищевых продуктов, а также способствует длительному
сохранению вкусовых качеств консервированных продуктов. Это
обстоятельство позволяет широко использовать моиоглутамат
натрия в консервной промышленности, особенно при консерви-
ровании овощей, рыбы, мясных продуктов. Во многих зарубеж-
ных странах глутамат натрия добавляют абсолютно во все про-
дукты при консервировании, замораживании или просто при
хранении. В Японии, США и других странах глутамат натрия
является такой же обязательной принадлежностью стола, как
соль, перец, горчица и другие приправы. Он повышает не только
вкусовую ценность пищевых продуктов, но и стимулирует дея-
тельность пищеварительных желез. В настоящее время произ-
водство глутаминовой кислоты стало очень крупным. Ведущее
место в этом производстве занимают Япония и США.
143
Известно несколько способов получения глутаминовой кис-
лоты: гидролиз различных белков, синтез химический, фермен-
тативный из а-кетоглутаровой кислоты и микробиологический.
Получение глутаминовой кислоты гидролизом белков. Гидро-
лиз протеинов является классическим методом получения ами-
нокислот из природных источников. Для выработки глутамино-
вой кислоты и ее натриевой соли используются животные и
растительные белки: казеин молока, клейковина пшеницы, ку-
курузный глютен, отходы мясокомбинатов, свеклосахарных (се-
парационный щелок) н спиртовых заводов (барда).
Метод гидролиза малопроизводителен и довольно дорог
из-за значительного образоваиия побочных продуктов и необхо-
димости тщательной очистки глутаминовой кислоты.
Комплексная переработка мелассы позволяет получить на-
ряду с высококачественными сахарными снропамн глутамино-
вую кислоту, бетаин, холин и другие ценные продукты.
Химический синтез глутаминовой кислоты. Средн методов
химического синтеза наиболее перспективным является исполь-
зование в качестве исходного сырья акрилонитрила. Согласно
этому методу акрилонитрил в результате реакции гидроформи-
лирования превращается в p-формилпропноннитрнл и последний
через стадию образования а-амнноглутардиннтрила переводится
в Р£-глутаминовую кислоту.
СН2 = СН—CN — —СНО—СН2—СН2—CN
акрилонитрил 0-формилпропионнмтрил
nh2
NaOH-H.O
CN—СН2—СН2—CH—CN -----------------ь
сс-а м и и огл ута рд и н итр и л
NH,
NaOH-HjO
--------> соон—сн2—сн2—сн—соон
PL-глутаминовая кислота
Основным недостатком химического синтеза является полу-
чение рацематов аминокислот. Разделение D- и £-нзомеров
является довольно сложной операцией и требует больших за-
трат,
Ферментативный синтез глутаминовой кислоты. Получение
L-глутамнновой кислоты нз а-кетоглутаровон возможно пере-
аминнрованием аминокислот (I) и восстановительным аминиро-
ванием (II):
- тркисамидаза
I. а-кетоглутаровая кислота -р аминокислота------------*
£-глутамнновая кислота + а-кетокнслота.
II. а-кетоглутаровая кислота 4- NH4+ + НАДН -----------
гидрогеназа £-глутаминовая кислота +Н2О + НАД+
144
со2 изолимонная изоцитратдегидрогеназа
глюкоза * кислота ’"S. . 1 * 11 * . i+л ос-кстоглутароВая НАДФ НАДФ*Н(+Н ) кислота
I -мутиминоВая
кислота глутаматдегидрогвназа nh;
Рис. 5.3. Схема биосинтеза глутаминовой кислоты
В обоих случаях а-кетоглутаровая кислота является пред-
шественником L-глутаминовой (рис. 5.3).
Многие микроорганизмы (Pseudomonas, Escherichia) спо-
собны продуцировать значительное количество а-кетоглутаро-
вой кислоты. Так, прн использовании в качестве продуцента
Kluyverd citrophila а-кетоглутаровая кислота была получена
с 57 %-ным выходом.
Дрожжи рода Candida также способны синтезировать а-кето-
глутаровую кислоту вместе с небольшим количеством пировино-
градной (обычно в соотношении 85: 15) прн культивировании
на н-парафннах. Выход а-кетоглутаровой кислоты достигает
90 % от количества использованных углеводородов.
Для проведения реакции I можно использовать Е. coli и дру-
гие микроорганизмы. Донором аминогруппы может быть аспа-
рагиновая кислота нлн аланин.
Восстановительное аминирование (II)—более сложный
процесс. Прн использовании Pseudomonas ovalis выход амино-
кислоты составляет 60 % В ряде случаев прн получении L-глу-
тамнновон кислоты с помощью Pseudomonas или Aeromonas
а-кетоглутаровую кислоту можно заменить на £>£-а-окснглута-
ровую кислоту, получаемую синтетическим путем.
Микробиологический синтез глутаминовой кислоты. Наибо-
лее перспективным и широко используемым способом производ-
ства глутаминовой кислоты является микробиологический син-
тез. Впервые о возможности получения /.-глутаминовой кислоты
непосредственно из углеводов с помощью микроорганизмов ме-
тодом глубинного культивирования сообщили в 1957 г. японские
ученые Кнноснта, Асаи и др.
К настоящему времени выяснено, что способностью проду-
цировать глутаминовую кислоту обладают некоторые расы
Дрожжей, микроскопические грибы, бактерии. Однако практи-
чески только бактерии могут синтезировать глутаминовую кис-
лоту с выходом не менее 40 % относительно исходного сахара
или другого сырья. Поэтому промышленное значение имеют
пока только бактерии, относящиеся к родам Micrococcus, Вге-
vibacterium, Microbacterium, Corynebacterium.
145
Это главным образом палочковидные, грамположнтельные,
неподвижные бактерии, не образующие спор. Специфической
для них является обязательная потребность в биотине либо
в биотине и тиамине. Сырьем для получения глутаминовой кис-
лоты кроме углеводов могут быть также различные углеводо-
роды, начиная от природного газа (метан, этаи) и кончая
«-парафинами нли ароматическими соединениями (бензиловый
спирт,.пирокатехин и пр.). Могут быть также использованы га-
зойль, уксусная, амнномасляная, фумаровая кислоты н ряд дру-
гих продуктов.
Схема производства глутаминовой кислоты.
Имеет много общего со схемой производства лизина. Последова-
тельность этапов и требования, предъявляемые к процессу в це-
лом, очень близки. Основные различия заключаются в свойст-
вах микроорганизма-продуцента, условиях его культивирова-
ния, составе среды, стадии очистки.
Схема получения глутаминовой кислоты при использовании
в качестве источников углерода глюкозы или гидролизата крах-
мала представлена ниже.
Прнготовлеиие питательной среды Приготовление исходной
из гидролизованиого крахмала и посевной культуры
или глюкозы
I
Стерилизация
4______________________________________________
I
Выращивание продуцента в ферментаторе
I
Отделение биомассы от культуральной жидкости
центрифугированием
I
Вакуум-выпаривание фильтрата до содержания
сухих веществ 40—50%
I
Кристаллизация глутаминовой кислоты. Подкисление концентрата
соляной кислотой до pH 3,2, охлаждение до 15 °C и выделение
кристаллов глутаминовой кислоты со степенью
чистоты 80 %
I
Растворение кристаллов глутаминовой кислоты
в воде (1 : 5), фильтрация
I
Повторная кристаллизация. Получение глутаминовой
кислоты со степенью чистоты 99%
I
Сушка кристаллов
I
Готовый продукт (99% глутаминовой кислоты)
146
Для нормального роста культуры н синтеза ею глутаминовой
кислоты в качестве источника азота применяют мочевину в ко-
личестве до 1,5—2,0 %, жидкий аммиак и аммиачную воду,
часто используют различные соли аммония, например NH4CI,
(NH4)2SO4. В качестве вспомогательных материалов в состав
питательных сред вводят сернокислый магний, марганец, же-
лезо и другие соединения. В питательные среды наряду с источ-
никами углерода и азота вносят также различные биостимуля-
торы, например кукурузный, дрожжевой и солодовый экстракты,
пептон, витамины, аминокислоты. Из витаминов обычно исполь-
зуются тиамин и биотин. Высокие концентрации биотина —
более 5 мкг на 1 л питательной среды, как правило, способ-
ствуют росту биомассы, но снижают выход глутаминовой
кислоты.
При получении глутаминовой кислоты из мелассы основная
трудность заключается в снижении высокого содержания био-
тина. Это достигается, например, добавлением в культуральную
жидкость некоторых спиртов для ингибирования действия био-
тина или поверхностно-активных веществ (ПАВ). Так, при ис-
пользовании этого метода культура Microbacterium ammoniaphi-
lum на питательной среде, содержащей 7,0 г/л тростниковой
мелассы, обеспечивала выход глутаминовой кислоты более
70 г/л.
Некоторые антибиотики (пенициллин, тетрациклин, окситет-
рациклнн) снимают тормозящее действие избытка биотина и
могут быть использованы прн получении глутаминовой кислоты,
например с помощью штамма Brevibacterium 22, применяемого
в производстве лизина. Продуцент активно развивается на среде
следующего состава (г/л): мелассы 15; К2НРО4 0,05; КН2РО4
0,05 и мочевины 0,8.
Переключение биосинтетической способности культуры с ли-
зина на глутаминовую кислоту может быть достигнуто добавле-
нием в обычную кукурузно-мелассную среду через 4—5 ч от
начала культивирования небольших количеств (2—4 ед. иа 1 мл
среды) пенициллина, изменяющего проницаемость клетки. Обра-
зующиеся при этом протопласты обладают высокой биосинтети-
ческой активностью, превращая до 89 % потребленного сахара
в глутаминовую кислоту.
За 30 ч культивирования прн 2 г/л растворенного кислорода
по сульфитному числу в среде накапливалось около 30 г/л глу-
таминовой кислоты. Следует отметить, что примерно половина
сахара, содержащегося в исходиой среде, остается неиспользо-
ванной. В связи с этим данный способ целесообразно приме-
нять в сочетании с другим микробиологическим производством,
в котором утилизируются остаточные сахара, например с про-
изводством лизина.
Для получения глутаминовой кислоты по методу, разрабо-
танному в Институте микробиологии им. А. Кирхенштейна
147
АН ЛатвССР, культуру Micrococcus glutamicus размножают
в лаборатории — в пробирках, затем в колбах на качалке. Пи-
тательная среда имеет следующий состав (в %): сахарозы 5.
мочевины 1, мелассы 1,5, сульфата магния 0,1, одно- и двухза-
мещенного фосфата калня 0,1. Температура культивирования
28—30 °C, pH 6,8—7,5, длительность выращивания 24 ч. Иноку-
лят готовят в аэробных условиях на среде такого же состава
в ферментаторах вместимостью 2 и 5 м3 до получения 6—8 г/л
сухой биомассы. Инокулят в количестве 5—6 % (от объема
среды) вносят в ферментаторы на 50 м3. Коэффициент заполне-
ния аппарата 0,7.
Производственное культивирование проводят на среде сле-
дующего состава (в %): сахарозы 8,5—10, мелассы 1,2, моче-
вины 0,5, одно- и двухзамещенного фосфата калия 0,01, суль-
фата марганца н сульфата циика 0,005. Интенсивность аэрации
составляет 40—45 мг О2 л/мнн, pH 7,8—8,0, температура
28—30 °C. Процесс культивирования длится 48 ч. За это время
в среде накапливается до 50 г/л глутаминовой кислоты. Био-
массу отделяют от культуральной жидкости центрифугирова-
нием.
Глутаминовую кислоту выделяют нз фильтрата культураль-
ной жидкости сорбцией на смоле КУ-2 в КН+4-форме. Сорбци-
онная емкость катноннта составляет 0,08—0,1 г глутаминовой
кислоты на 1 г абсолютно сухого катноннта. После промывки
колонки 0,001 н. серной кислотой элюцня проводится 0,2 н. рас-
твором аммиака, прн этом выход глутаминовой кислоты на ста-
дии элюцин составляет более 99 %.
Собранные элюаты обрабатывают активным углем н сгу-
щают под вакуумом при 40 °C в 3—5 раза. После подкисления
соляной кислотой до pH 3,2 при 4 °C выкристаллизовывалось
около 77 % глутаминовой кислоты. Повторная обработка ма-
точника повышала выход глутаминовой кислоты до 87 %, чи-
стота получаемых кристаллов составляла 99,2 % • После пере-
кристаллизации чистота повышается до 99,6%, что удовлетво-
ряет требованиям фармакопии.
Получение глутамата натрия. Глутамат натрия
НООС—СН2—СН2—CH(NH2)—COONa-H2O получают нз тех-
нической глутаминовой кислоты. Водный раствор ее обрабаты-
вают активным углем до полного обесцвечивания прн темпера-
туре 60—70 СС н введении NaOH, pH раствора доводят до
6,8—6,85, после чего фильтруют. Раствор глутамата натрия упа-
ривается под вакуумом прн 40—50 °C до содержания сухих ве-
ществ примерно 60 %, а затем передается на кристаллизацию.
Кристаллизация проводится в течеине 3 сут прн плавном сни-
жении температуры. Кристаллы глутамата натрия отделяют от
маточного раствора на центрифуге и высушивают нагретым
воздухом до остаточной влажности 0,05—0,1 %.
148
В соответствии с требованиями МРТУ 18/210—68 глутамат
натрия пищевой должен иметь следующий состав (в %):
Общий азот, ие менее 7,02
Основное вещество, не меиее 94,0
NaCl, не более 5,0
Влага, ие более 1,0
5.3. ТРИПТОФАН
Триптофан (а-амнно-р-нидолнлпропионовая кислота) отно-
сится к незаменимым аминокислотам.
СООН
I
Н
Помимо обязательного присутствия в полноценных белках
триптофан н его производные входят в состав многих важней-
ших продуктов обмена, имеющих циклическое строение. Отсут-
ствие этой кислоты или нарушение процессов ее синтеза при-
водит к тяжелым заболеваниям (пеллагра, диабет, туберку-
лез), Триптофан применяется как реагент в биохимических ис-
следованиях, в небольших количествах он используется в жи-
вотноводстве.
Продуцентами триптофана могут быть дрожжи (Candida
utilis), бактерии (Е. coli, Вас. subtilis и др.).
Триптофан получают двумя способами. Первый предусмат-
ривает микробный синтез L-трнптофана с помощью мутантов
Е. coli и A. aerogenes, дефицитных по тирозину н фенилаланину.
В общем виде последовательность превращений следую-
щая: эритрозо-4-фосфат+фосфоеноилпнровнноградная кнсло-
та->7-фосфо-3-дезокси-Е>-арабнногептулозовая кнслота->5-де-
гидрохинная кнслота->-5-дегндрошнкнмовая кнслота->шикнмо-
вая кислота->хорнзмовая кислота->антраниловая кислота—>
-^триптофан.
Основным промежуточным продуктом является шикимовая
кислота, из которой через 5-фосфо-З-енолпнрувилшнкимовую
кислоту образуется хоризмовая кислота. Эта стадия наиболее
важна на пути синтеза тирозина, фенилаланина и триптофана.
Второй путь микробного синтеза E-триптофана — трансфор-
мация предшественника аминокислоты с помощью ферментных
систем микроорганизмов до L-трнптофана. В качестве пред-
шественника используется антраниловая кислота. Дрожжи
Candida utilis, синтезируя молекулу триптофана, освобождают
клетки от вредного действия антраниловой кислоты, превращая
ее сначала в нндол, а затем с участием серина в присутствии
пнрндоксальфосфата — в триптофан.
149
-CH2OPOaH3 1ут1таралеиитаза
серин . ,
rnnit
। '-" t j-<pocipam
HOCHsCHNHj
триптофан
Рис 5.4. Трансформация антраниловой кислоты в триптофан
ногаснтеля используют кашалотовый жнр н различные крем-
ннйорганнческне соединения (ПМС-200, А-154). На втором
этапе через 24 ч роста в культуральную жидкость небольшими
порциями добавляют антраниловую кислоту (5%-ный спирто-
вой раствор) и мочевину (50 %-ный раствор). Уровень аэрации
снижается вдвое — до 3—4 г О2/(л-ч). Через 4 ч после внесе-
ния антраниловой кислоты н мочевины добавляют 25 %-ный
раствор мелассы. Во время выращивания микроорганизма-про-
дуцента антраниловую кислоту и мочевину вносят через каж-
дые 6 ч, мелассный раствор—через каждые 12 ч. Культивиро-
вание длится 144 ч, выход триптофана составляет 6 г/л.
Из культуральной жидкости можно получить две формы
препарата: кормовой концентрат триптофана и очищенный пре-
парат А-триптофана. Для получения очищенного препарата
триптофана используют фильтрат культуральной жидкости,
а для кормовых целей получают кормовой концентрат, в кото-
рый входит биомасса продуцента.
Глава 6. АНТИБИОТИКИ НЕМЕДИЦИНСКОГО
НАЗНАЧЕНИЯ
Схема конденсации серина с индолом, разработанная
А. Е. Брауиштейном и М. ЛЬ Шемякиным, предполагает обра-
зование триптофана в присутствии фермента трнптофаисннтазы.
Механизм трансформации антраниловой кислоты в трипто-
фан представлен на рис. 5.4.
Технология получения А-трнптофана при помощи дрожжей
Candida utilis шт. 295 разработана Институтом микробиологии
АН СССР совместно с Институтом микробиологии им. А. Кнр-
хенштейна АН Латвийской ССР.
Для получения посевного материала продуцент триптофа-
на— дрожжи Candida utilis шт. 295 размножают на питатель-
ной среде следующего состава (в г/л): мелассы 104, мочевины
5,0, К2НРО4 0,1, MgSO4 0,05, СаС12 0,1. pH среды 7,5—8,0.
Культуру выращивают на качалке прн температуре 28—30 °C
в течение 24 ч, для чего стерильно переносят в колбы на 750 мл,
содержащие по 100 мл питательной среды указанного состава.
Через 24 ч выращивания биомассу дрожжей используют для
засева производственных ферментаторов.
Производственная питательная среда имеет следующий со-
став (в г/л): мелассы 62,3, мочевины 5,0, К2НРО4 0,1, СаС12 0,1,
MgSO4 0,05. После стерилизации прн 0,1 МПа (1 кгс/см2) в те-
чение 30 мин питательную среду охлаждают до 30 °C н в сте-
рильных условиях засевают посевным материалом, который со-
держит 5 г/л сухой биомассы.
На первом этапе дрожжи выращивают в ферментаторе 24 ч
при интенсивной аэрацнн не менее 7 г О2/(л-ч). В качестве пе-
Антибиотики или антибиотические вещества—это продукты обмена мик-
роорганизмов, способные избирательно подавлять рост или убивать бакте-
рии, микроскопические грибы, вирусы и др., а также задерживать или пол-
ностью подавлять развитие некоторых злокачественных новообразований.
Образование антибиотиков — одна из форм проявления антагонизма.
К настоящему времени известно более 3000 антибиотических веществ, одна ко
практическое применение нашли около 150. Несмотря иа большое число
открытых антибиотиков, до настоящего времени нет их общепризнанной
классификации. Делались попытки классифицировать антибиотические веще-
ства по признаку происхождения, т. е. различали антибиотики, образуемые
бактериями, микроскопическими грибами, актииомицетами и т. д. Одиако
было обнаружено, что один и тот же антибиотик может продуцироваться
различными микроорганизмами. Микроорганизмы, принадлежащие к одной
группе, образуют самые разнообразные по химическому строению антибио-
тики.
Наиболее правильной многие исследователи считают классификацию, ос-
нованную иа химическом строении этих веществ. По этому признаку разли-
чают антибиотики ациклическою, алициклического строения, хиноны, поли-
пептиды и др.
По спектру биологического действия антибиотики делятся иа несколько
групп.
1. Антибактериальные антибиотики, обладающие сравнительно узким
спектром действия, подавляют развитие различных грамположительных мик-
робов (стафилококки, стрептококки, пневмококки и др.). К этой группе от-
носятся пенициллин, эритромицин, грамицидин, бацитрацин и др. Антибак-
териальные антибиотики с широким спектром действия подавляют развитие
как грамположительных, так и грамотрицательиых микробов (кишечной па-
лочки, дифтерии или брюшного тифа и др.). К этой группе относятся стреп-
томицин, хлоромицетии, тетрациклины, иеомиции и др.
2. Противогрибковые антибиотики, действующие на микроскопические
грибы, группа полиеновых антибиотиков (нистатин, гризеофульвии и ряд
других).
151
150
3. Противоопухолевые антибиотики, действующие как на микроорга-
низмы, так и на опухолевые (раковые) клетки человека и животных,— акти-
номицины, митомицин С и др.
При взаимодействии с микробной клеткой антибиотик может вызывать
определенные нарушения процесса ее жизнедеятельности.
Некоторые антибиотики (пенициллины, иовобиоции и некоторые другие)
подавляют синтез оболочки бактериальной клетки в период размножения,
другие (стрептомицин, полимиксин и др.) действуют иа цитоплазматическую
мембрану бактериальной клетки, изменяя ее проницаемость. Ряд антибиоти-
ков является ингибиторами реакций обмена веществ микроорганизмов, свя-
занных, в частности, с синтезом белка клетки (тетрациклины, эритромицины
и др ).
Образование антибиотиков микроорганизмами — это процесс, обуслов-
ленный определенным характером обмена веществ, возникший и закреплен-
ный в процессе эволюции организма.
Биосинтез антибиотиков — наследственная особенность организмов, про-
являющаяся в том, что каждый вид способен образовывать один или не-
сколько вполне определенных, строго специфичных для него антибиотических
веществ. Характерной особенностью развития большинства микроорганиз-
мов— продуцентов антибиотических веществ является двуфазность. В пер-
вой фазе развития культуры наблюдается интенсивное накопление биомассы
продуцента, во второй — замедление накопления биомассы или даже ее
уменьшение. В этот период происходит максимальное накопление антибио-
тика. В большинстве случаев максимум накопления антибиотика в среде
наступает после максимума накопления биомассы.
Широко известно применение в медицине антибиотиков с бактерицид-
ным и бактериостатическим действием, однако несмотря иа интенсивное изу-
чение механизма действия этих препаратов иа бактериальную клетку для
многих антибиотиков еще не установлено их влияние на обмен веществ
в клетках бактерий.
В течение многих лет антибиотики используются как стимуляторы роста
сельскохозяйственных животных, консерванты пищевых продуктов, средства
борьбы с заболеваниями растений, а также для борьбы с посторонней мик-
рофлорой в некоторых бродильных производствах.
Широкое использование антибиотиков в сельском хозяйстве основано на
их способности подавлять развитие болезнетворных микроорганизмов и тем
самым снижать заболеваемость и смертность, а также ускорять рост и раз-
витие животных и птиц.
Применение антибиотиков в птицеводстве за период выращивания поз-
воляет получить дополнительный привес 200—250 г на каждого цыпленка и
до 350 г на каждого утенка. При добавлении антибиотиков в корм кур-несу-
шек резко увеличивается их яйценоскость: от 1000 кур можно получить до-
полнительно до 15 тыс. яиц в год. От применения антибиотиков в свино-
водстве дополнительный прирост массы при откорме составляет 100—120 ц
ст каждой тысячи животных, при этом расход кормов снижается иа 5—
Ю %.
Антибиотики для кормовых целей используют в рецептуре премиксов,
в виде неочищенных препаратов, представляющих собой высушенную био-
массу продуцента, которая помимо самого антибиотика содержит различные
аминокислоты, ферменты, витамины группы В и другие ценные биологиче-
ски активные вещества.
В различных странах вырабатывается несколько видов кормовых анти-
биотических добавок. Это препараты, содержащие либо собственно антибио-
тик, либо антибиотик с витамином Bi2. В качестве наполнителей для кор-
мовых добавок используются, как правило, отруби, жмых и другие органи-
ческие или неорганические вещества.
Антибиотики, используемые в качестве кормовых добавок, как правило,
отвечают следующим требованиям:
не используются в терапевтических целях и не вызывают перекрестной
резистенции бактерий к антибиотикам, применяемым в медицине;
152
не всасываются или всасываются в очень незначительных количествах
нз пищевого тракта;
не изменяют своей структуры в организме;
не обладают антигенной природой, способствующей возникновению ал-
лергии.
Одна из проблем, возникающих при длительном использовании анти-
биотиков в качестве кормовой добавки,— непостоянство получаемого поло-
жительного результата. От длительного применения одного и того же анти-
биотика эффективность его использования резко снижается. Для поддержа-
ния первоначального высокого эффекта действия от применения антибиотиков
необходимо менять нх нли использовать смесь антибиотиков, по отноше-
нию к которой чувствительность микробов не изменяется или изменяется
в меньшей степени. В настоящее время уже созданы антибиотические пре-
параты, которые добавляют исключительно в корм животным. Предполага-
ется, что использование таких препаратов позволит сохранять и поддержи-
вать высокий ростовой эффект, а также устранит или уменьшит возмож-
ность возникновения антибиотикоустойчивых микроорганизмов.
В Советском Союзе в течение многих лет в животноводстве использу-
ются кормовые препараты на основе хлортетрациклина — биовнт, с раз-
личным содержанием антибиотика. В настоящее время производство анти-
биотиков для животноводства базируется на препаратах немедицинского наз-
начения, таких, как бацитрацин, грнзин, гигромицин Б и др.
В последнее десятилетие антибиотики применяются как средство для
борьбы с фитопатогеиными болезнями, наносящими большой ущерб сель-
скому хозяйству. Источниками заражения фитопатогеиными организмами ра-
стений, находящихся в полевых условиях, в садах нли в теплицах и оранже-
реях, могут быть семена, посадочный материал, растительные остатки, почва.
Методы применения антибиотических веществ основаны на том, что ве-
щество, нанесенное на поверхность листьев, ствола, семян или внесенное
в почву, задерживает рост нли убивает фитопатогеиные микроорганизмы,
находящиеся как на поверхности, так и внутри органов н тканей растений.
Препараты, применяемые для борьбы с фитопатогеиными организмами,
должны отвечать следующим требованиям: антибиотик должен быть акти-
вен против возбудителя заболевания, легко проникать в ткани растений,
в применяемых дозах должен быть безвредным для растения, длительное
время не инактивироваться, ие терять антибиотической активности внутри
тканей.
По литературным данным, более 30 различных антибиотиков были ис-
пытаны в качестве препаратов для борьбы с заболеваниями растений, вызы-
ваемыми фитопатогеиными бактериями и микроскопическими грибами. Наи-
более эффективным оказались препараты стрептомицина, грнзеофульвина. те-
трациклина н др.
Антибиотические вещества иашлн широкое применение в консервной
промышленности при сохранении свежего мяса, рыбы, птицы, при хранении
сыров и молочных продуктов, фруктов и овощей. Применение антибиотиков
при консервировании продуктов питания позволяет значительно снижать
длительность термообработки последних, что дает возможность предотвра-
щать разрушение витаминов, изменение вкусовых качеств, консистенции про-
дукта и т. п., а также обеспечивать гибель клостридиальных и термофиль-
ных бактерий, устойчивых к нагреванию.
Наиболее эффективным антибиотиком при консервировании овощей за-
рекомендовал себя инзии. Он подавляет развитие ряда термофильных бак-
терий, ие токсичен для человека и позволяет уменьшить продолжительность
термообработки продуктов в 2 раза.
Применение антибиотиков в животноводстве, растениеводстве, в пищевой
и консервной промышленности тщательно контролируется соответствующими
государственными организациями, чтобы предотвратить попадание незначи-
тельных концентраций антибиотиков с продуктами питания в организм
человека и вызвать у него появление резистентных форм микроорга-
низмов.
153
6.1. ПРЕПАРАТЫ ТЕТРАЦИКЛИНА
К числу получивших практическое применение тетрацикли-
новых антибиотиков как медицинского, так и немедицннского
назначения относятся 7-хлортетрациклин (I) н 5-окснтетрацнк-
Тетрациклиновые антибиотики
(I) c22h23cin2o8
R=C1, R'=CH3, R =H
(II) C22H24N2Ob
R=H, R=CHa, R=OH
представляют собой амфо-
терные соединения, способные образовывать соли как с кисло-
тами, так н с основаниями. Онн плохо растворяются в воде и
водных растворах прн pH 4,5—7,5. Прн pH ниже 2,0 н выше
8,0 можно приготовить водные растворы антибиотиков высокой
концентрации. Тетрациклиновые антибиотики неустойчивы
к действию окислителей, в том числе воздуха. Характерной осо-
бенностью всех тетрациклиновых антибиотиков является спо-
собность флуоресцировать в УФ-свете, что позволяет применять
их в аналитических целях.
В качестве продуцентов хлортетрацнклнна широко исполь-
зуют штаммы культуры Act. aureofaciens, окситетрацнклнна —
Act. rimosus.
Для животноводства окснтетрациклин предложен в форме
терравита Р—растворимый н терравнта К —кормовой
(табл. 6.1).
В качестве посевного материала для биосинтеза используют
споры продуцента, которые при температуре 4—6 °C можно
Таблица 6.1. Основные требования, предъявляемые к качеству
препаратов окситетрациклина
Показатели
Терравит Терравит
Р-20 Р-40
Терравит
К-40
Степень измельчения
Цвет
Содержание окситетра-
циклина, ед./мг
Влажность, %, ие более
Безвредность при тест-
дозе на одну мышь
мл
мг
Однородный порошок Мелкий порошок Средней крупности
Светло-коричне- вый 5+0,5 10±1 50+5 Корич- невый 20±2 Светло- желтый 40+3 порошок Коричне- вый 40+3
10 10 8 10 10 10
0,5 0,5 0,5 100 100 100
154
хранить до 3 мес. Размножение посевного материала (получе-
ние мицелиальной массы) проводят в две генерации в колбах
(на 750 мл с 200 мл питательной среды) иа качалке (160—
180 об/мнн) и в посевном аппарате. Длительность каждой ге-
нерации 2—3 сут, температура выращивания 26—28 °C.
Мицелиальная масса, полученная после второй генерации,
служит для засева питательной среды посевных аппаратов из
расчета 600—800 мл на 1 м3. Далее посевной материал размно-
жается в посевных аппаратах (при постоянной аэрации, тем-
пературе 26—28 °C, в течение 45—50 ч) до количества, равного
10—12 % рабочего объема основного ферментатора. Для этих
целей используется питательная среда следующего состава
(в %): кукурузная мука 6, кукурузный экстракт 1,5, сернокис-
лый аммоний 0,6, поваренная соль 0,4, мел 0,8, жнр кашалоте
вый 1,5—2,0.
Производственное культивирование проводится на среде
того же состава, только для повышения содержания витамина
В12 в нее добавляют хлорид кобальта из расчета 1 г на 1 м3
среды. Выращивание культуры длится 100—120 ч при темпера-
туре 26—28 °C, постоянном перемешивании н аэрации. Ввиду
сильного пенообразовання степень заполнения аппарата не
должна превышать 50 %.
Биосинтез тетрациклинов протекает прн культивировании
продуцентов в сравнительно широких интервалах pH и темпе-
ратуры прн различной интенсивности аэрацнн. Накопление ан-
тибиотика происходит только в строго определенных условиях.
Образование тетрациклинов связано с определенным периодом
жизнедеятельности культуры. В первый период наблюдается
интенсивный рост мнцелня, происходит быстрое потребление
источников углерода, азота, фосфора н активно используется
растворенный кислород. Антибиотик в этот период практиче-
ски не образуется. В культуральной жидкости в незначитель-
ных количествах накапливаются пировиноградная н уксусная
кислоты, которые в последующем используются клеткой для
биосинтеза тетрациклинов. Во второй период развития куль-
туры снижается интенсивность роста продуцента, скорость по-
требления питательных веществ и кислорода. Накопления пи-
ровиноградной н уксусной кислот не наблюдается. Происходит
активный биосинтез тетрациклинов.
В целях уменьшения объема высушиваемого материала
культуральную жидкость предварительно упаривают под ва-
куумом прн температуре 50—60 °C с 4,5 %-ного до 12—15 Но-
вого содержания сухих веществ.
Распылительная сушка осуществляется теплоносителем, по-
ступающим прн температуре 160—200 °C и выходящим из су-
шильной башнн с температурой 70—80 °C.
В некоторых случаях рекомендуется сушка культуральной
жидкости с наполнителем. В сборник культуральной жидкости
155
подают наполнитель — сушеный свекловичный жом — в таком
количестве, чтобы в течение часа набухания он поглотил всю
культуральную жидкость, примерно 250 кг на 1 м3 культураль-
ной жидкости. Набухший жом высушивают в сушилках си-
стемы пкс.
Терравит. Он представляет собой высушенную культураль-
ную жидкость, полученную в результате выращивания куль-
туры Act. rimosus. Терравит Р (растворимый) получают путем
высушивания фильтрата культуральной жидкости в распыли-
тельной сушилке. В результате высушивания в калориферной
сушилке остатка после фильтрования культуральной жидкости
получают терравит К (кормовой).
Препараты терравита стандартизуются кукурузной мукой и
свекловичным жомом.
Терравнт-5, 10, 50 и терравит К используются вместе с кон-
центрированными кормами в целях профилактики желудочно-
кишечных и легочных заболеваний, лучшего развития и повы-
шения продуктивности животных н птнц. Телятам и поросятам
раннего возраста терравит Р дается в виде водных растворов
или растворенным в молоке.
Бмовит. Длительное время в животноводстве использова-
лись препараты хлортетрацнклнна, обладающие широким ан-
тибактериальным спектром по отношению к грамположнтель-
иым и грамотрнцательным микроорганизмам. В зависнмостн от
содержания в препарате антибиотического вещества различают
бновнт-20, 40 и 80 (табл. 6.2).
Кроме антибиотика и витамина В12 препараты бновнта со-
держат микроэлементы, белок, жиры и минеральные соли.
Технология производства бновита мало чем отличается от
производства терравита. Споровой материал производственных
штаммов Act. aureofaciens выращивают на пшене на посевных
станциях и рассылают по заводам. Активность посевного мате-
Т а б л и ц а 6.2. Характеристика бновита
Показатели Биовит-20 Биовит-40 Биовит-80
Внешний вид Содержание влаги, %, ие более Крупность помола, остаток на сите, %, не более из проволочной сетки № 056 из шелковой ткани № 27 Содержание витамина В12, мкг/г, ие менее Содержание хлортетрациклина, г/кг Безвредность при тест-дозе иа одну мышь, мг Однородный порошок от светло-ко- ричневого до коричневого цвета 8 8 8 20 20 20 10 10 10 3 5 8 20+2 40+4 80+8 100 100 100
156
риала при проверке в лаборатории должна быть не менее
3000 ед./мл. Посевной материал размножают в колбах (на
750 мл с 200 мл питательной среды) на качалке (160—
180 об/мии) прн температуре 26—28 °C в течение 24—30 ч
в одну илн две стадии. Для этого готовят среду следующего
состава (в %): зерно-картофельная барда 40 илн кукурузный
экстракт 3, мука 3. pH среды доводят 30 %-ным раствором
NaOH до 6,7—6,9. Для засева в посевном аппарате на 1 м3
питательной среды необходимо 600 -800 мл посевного мате-
риала. Культура в посевном аппарате выращивается на среде
указанного состава. Для пеногашения добавляют 0,5—1,0 %
кашалотового жира. При постоянной аэрацнн н перемешива-
нии прн температуре 27—28 СС продолжительность культивиро-
вания составляет 30—40 ч. Технологическая схема производ-
ства биовнта представлена на рнс. 6.1.
Производственное культивирование проводят на среде бо-
лее сложного состава (в %): барда зерно-картофельная 10,
мука (крахмалистость 51 %) 5,0, NH4NO3 0,7, СаСОз 0,5, NaCl
0,3, жир кашалотовый 0,2, СаС1г 0,0001, бензил роданистый
0.0001.
Оптимальное значение pH должно быть 6,6—6,7. Простери-
лизоваиную и охлажденную до 27—29 °C среду засевают посев-
ным материалом в количестве 10 % от объема среды в фермен-
таторе. Длительность выращивания культуры составляет 60—
70 ч. Температура среды на протяжении всего процесса куль-
тивирования поддерживается в пределах 26—28 °C. Среду по-
стоянно аэрируют и перемешивают. Конец культивирования и
прекращение накопления хлортетр а цикл ин а характеризуется
незначительным повышением pH среды — до 6,9—7,2. Актив-
ность глубинной культуры продуцента к концу процесса дости-
гает более 3000 ед./мл.
При небольшой производительности цеха культуральную
жидкость можно сразу подвергать высушиванию в распыли-
тельной сушилке. При значительной производительности цеха
культуральную жидкость с содержанием сухих веществ около
3 % упаривают под вакуумом прн 50—55 °C до 10—12%-иого
содержания сухих веществ.
Концентрат высушивают в сушилках с дисковым распыле-
нием. Температура теплоносителя на входе в сушильную ка-
меру составляет 200 —220, на выходе — 80—90 °C. Сухой про-
дукт нагревается несколько ниже температуры теплоносителя
на выходе нз сушилки, что обеспечивает сохранение активно-
сти. В процессе сушки рекомендуется также добавлять консер-
вант— пиросульфат натрия в количестве 2—3 кг на 1 м3 куль-
туральной жидкости. В зависимости от активности культуры и
режима культивирования в 1 кг сухого препарата содержится
90--150 г антибиотика. По требованиям технических условий
содержание антибиотика в препарате должно быть 80 г/кг. Это
157
достигается путем стандартизации, смешивания препаратов
с различной активностью или введения специальных наполните-
лей. Необходимое количество наполнителя для стандартизации
100 кг нативного препарата можно определить по формуле
Хо = (Ля-Лх)/(ЛЛ-Ло),
где Хо — количество наполнителя, кг; Ая — активность нативного препарата,
г/кг; .4© — активность наполнителя, г/кг; Ах — активность стандартного пре-
парата, г/кг.
Прн стандартизации бновита по активности в качестве на-
полнителя используют тонконзмельченные отруби, муку обез-
жиренную, кукурузную и соевую нлн свекловичный жом. Бно-
вит применяется для профилактики желудочно-кишечных н ле-
гочных заболеваний, лучшего развития и повышения продук-
тивности молодняка сельскохозяйственных животных н птиц.
6.2. ПРЕПАРАТЫ БАЦИТРАЦИНА
Бацитрацины—полнпептидные антибиотики, выделенные из
культуры Вас. licheniformis. Бацнтрацнн был получен в 1945 г.
Позднее методом хроматографии было идентифицировано де-
сять индивидуальных форм его: А, Аь В, С, D, Е, Fb F2, F3 hG.
Главной составной частью препарата является бацитрацин А,
составляющий до 37 % выделенных фракций. Суммарная фор-
мула антибиотика CeeHiosNnOie.
В состав бацитрацина А входят трн остатка £-нзолейцина
и по одному остатку следующих аминокислот: £-лейцнна, £-ци-
стейна, £-гистндина, £-лнзина, £-аспарагнновой кислоты, D-
фенилаланина, D-орнитнна, D-аспарагиновой кислоты н D-глу-
тамииовой кислоты. Прн гидролизе кроме этих аминокислот
выделяется одна молекула аммиака.
В-аспарагинодая
кислота
kZ -аспарагиноСая~
г кислота
•L -гистидин
L -лизин
В -орнитин-
L -изолеицин
-глртаминодая
кислота
L-изолейцин
-лейцин
бацитрацин А
В-фенилаланин
L-изолейцин
L-цистеин
S
Т а б л и ц а 6.3. Требовании к качеству препаратов бацнлмхкиа
Показатели Бацал ихин-10 Бацал ихин-20 Бацнлихин-30
Внешний сид Однородный порошок от светло-ко- ричневого до коричневого цвета Содержание влаги, %, ие более 10 10 10 Степень измельчения — остаток иа 5 5 5 сите № 067, %, ие более Содержание бацитрацина, г/кг (1 мг 10±2 20±3 30±4 содержит 42 ед.) Проверка на подлинность методом Наличие фиолетовых пятен при хроматографии на бумаге /?f = 0,5-^0,7 Реакция с нингидрином Окрашивание раствора в темно- вишневый цвет
Антибиотик представляет собой серовато-белый гигроско-
пичный порошок, горький на вкус. Препараты бацитрацина
имеют активность 45—60 ед./мг, наиболее чистые — 74 ед./мг.
Бацитрацин обладает высокой антибиотической активностью
против грамположнтельных аэробных и анаэробных бактерий.
Он проявляет определенное синергидное действие с другими
антибиотиками н оказывает стимулирующее рост действие при
скармливании молодняку животных.
Для животноводства препараты бацитрацина выпускаются
промышленностью в форме бацнлихнна-10, 20, 30 (табл. 6.3).
Для стандартизации по активности используют кукурузную и
соевую муку, отруби и свекловичный жом.
Технология производства бацитрацина принципиально не
отличается от таковой большинства кормовых антибиотиков
(табл. 6.4).
Биосинтез бацитрацина культурой Вас. licheniformis осуще-
ствляется прн высоком соотношении углерода и азота в пита-
тельной среде. Образование бацитрацина связывают со споро-
образованием культуры. Ингибирование процесса спорообразо-
вания тормозит биосинтез бацитрацина. Концентрация его
в спорах достигает 15 % от общего количества образовавше-
гося антибиотика. Считают, что биосинтез антибиотика проис-
ходит в конечную стадию развития бактерий. Активность куль-
туральной жидкости составляет 4000 ед./мл. Перед дальнейшей
обработкой бацитрацин, содержащийся в культуральной жидко-
сти, переводят в цинковую соль — цинкбацитрацнн. Культу-
ральную жидкость подкисляют концентрированной соляной кис-
лотой и вносят окись цинка в количестве 0,28 % к объему
культуральной жидкости. Перед упариванием pH ее доводят
до 5,4—5,5. Культуральная жидкость упаривается в 2 раза при
температуре 40—50 °C, а затем высушивается в распылитель-
160
Таблица 6.4. Состав среды и технологические параметры процесса
биосинтеза бацитрацина
Показатели Стадии выращивания
споровой культуры посевного в колбах материала в аппа- рате в фермен- таторе
Состав среды, %
крахмал 2,0 1,8 1,8 2,0
лимонная кислота 0,03 — — —
сульфат магния 0,1 — — 0,33
соль Мора 0,025 — — —
сульфат марганца 0,006 — — —
хлорид натрия 0,4 — — —
хлорид калия 0,4 — — —
фосфат калия однозамещенный 0,45 — — —
мука соевая — 7,5 7,5 7,5
карбоксид кальция — 0,2 0,2 1,0
сульфат аммония — 0,2 0,2 —
каталоговый жир — — 0,2 0,2
pH стерильной среды 7.0
Температура выращивания, °C 30 30 30—32 37
Аэрация, л/л среды в минуту — — 1,0 1,0
Длительность процесса, ч 120 16—18 16—18 30—40
ной сушилке с температурой на входе 140, на выходе 75—80 °C
Общий выход бацитрацина с учетом потерь на стандартизации
и фасовке 45 % от содержания его в культуральной жидкости.
6.3. ПРЕПАРАТЫ ГРИЗИНА
Грнзии — полнфракционный антибиотик, относящийся к группе
стрептотрицннов, различающихся лишь количеством а, 0-лизина.
Строение стрептотрнциновых антибиотиков можно предста-
вить следующей структурной формулой:
нд nh[cocii2cikch2)3nh пн
п — количество а,р-лнзнна (может быть от 1 до 6). Анти-
биотики этой группы построены из остатков двух основных
аминокислот а, 0-лнзнна и стрептолидина и одного амниосахара
a-D-гулозалина.
6 Заказ № 1536 161
Антибиотик, продуцируемый культурой Act. griseus, пред-
ставляет собой серовато-белый порошок, обладающий основ-
ными свойствами. Он гигроскопичен, хорошо растворим в воде,
ацетоне, эфире и спирте. Активность чистых препаратов дости-
гает 1000 ед./мг. Грнзин активен против грамположительных н
грамотрицательных бактерий, микроскопических грибов н ока-
зывает стимулирующее рост действие при скармливании мо-
лодняку животных, повышает их плодовитость.
Препарат грнзнна в форме кормогрнзина предложен Все-
союзным институтом животноводства и Институтом микробио-
логии АН СССР. Кормогрнзнн представляет собой высушенную
в распылительной сушилке культуральную жидкость Act. gri-
seus. Препарат выпускается в форме кормогризина-5, 10, 40.
Основные требоваиня, предъявляемые к качеству кормогри-
зина, приведены ниже.
Показатели К<>Р3™Г‘ КХ“°Г’ К°3Р“7о"’
Внешний вид Однородный порошок от светло-
желтого до темпо-бурого цвета
Содержание влаги, %, не более 10
Степень измельчения препарата (оста- 5
ток иа сите № 067), %, не более
Содержание гризина, г/кг 5±0,5 10±1 40±4
Безвредность в тест-дозе иа одну 100
мышь, мг
Подлинность а) иингидрииокрашеииые полоски,
хроматограммы испытуемого образ-
ца совпадают с полосками стандарта
гризина;
б) зоны подавления роста тест-мик-
роба совпадают с зонами стандарта
гризина
В качестве наполнителя прн стандартизации препарата мо-
гут быть использованы кукурузная мука, отруби, гидролизные
дрожжи, сухой свекловичный жом.
Исходная культура Act. griseus штаммы 70 н 12 сохраня-
ется на агаризованных средах илн в виде спорового материала,
выращенного на пшене. Размножение посевного материала
предусматривает выращивание культуры в колбах на качалке
в две генерации и в посевном аппарате. Культура в колбах вы-
ращивается на среде следующего состава (в %): крахмал 1,5,
кукурузная мука 2,0, селитра аммиачная 0,5, соль поваренная
0,2, фосфат кал ня однозамещенный 0,02, мел 0,3, pH среды
6,8—7,3. Длительность культивирования на первой и второй
стадиях прн температуре 26—28 °C 24 ч.
Посевной материал второй генерации после проверки мор-
фологического состояния культуры, отсутствия свободного фага
и посторонней микрофлоры используется для засева питатель-
ной среды посевного аппарата в количестве 0,05—0,1 % от его
объема. Питательная среда для посевного аппарата имеет сле-
162
дующий состав (в %): кукурузная мука 2, крахмал картофель-
ный 1,5, селитра аммиачная 0,7, мел 0,3, поваренная соль 0,2,
фосфат калия однозамещенный 0,02, сульфат магния 0,05, жнр
кашалотовый 0,2, pH среды 6,8—7,3. Культура выращивается
при температуре 26—28 °C, постоянном перемешнваннн и аэра-
ции 1 л/(л-мни) в течение 20—26 ч.
Производственное культивирование проводится на среде
следующего состава (в %): мука кукурузная 2,0, крахмал кар-
тофельный 1,8, сульфат аммония 0,6 илн нитрат аммония 0,7,
соль поваренная 0,2, мел 0,5, фосфат кал ня однозамещенный
0,02, сульфат магния 0,05, жнр кашалотовый 0,15—0,2, среда
имеет pH 6,5—7,3. Культивирование ведется прн температуре
26—28 °C, постоянном перемешивании н аэрации в течение
48—60 ч. Культуральную жидкость активностью ие менее
1000 мкг/мл прн температуре 50 °C упаривают в 3—4 раза под
вакуумом. Активность получаемого концентрата должна быть
не ниже 3000 ед./мл при выходе 85 % от культуральной
жидкости.
Прн распылительной сушке температура воздуха, поступаю-
щего в сушильную башню, составляет 150° С, а выходящего —
65 °C. Из 1 м3 концентрата культуральной жидкости получают
85—100 кг сухого продукта. Потери на стадии сушки состав-
ляют 10—11 %.
6.4. ПРЕПАРАТЫ ГНГРОМИЦИНА Б
Впервые антибиотик гнгромнцин Б был описан в 1958 г.
Это полигндрокснльиое двухзарядное основание. В состав мо-
лекулы входит углеводный фрагмент а-талоза н Ы-метнл-2-де-
зокснстрептанин. Структурная формула антибиотика установ-
лена не полностью, эмпирическая формула C15H30N2O10.
Гнгромицин Б—-аморфный гигроскопичный порошок белого
цвета со слабокнслымн свойствами, растворим в воде. Актив-
ность очищенных образцов 1000 ед./мг. Гнгромицнн Б обладает
противогельминтными свойствами н применяется с лечебной н
профилактической целью против аскаридоза свиней и кур. Для
животноводства предложен в форме кормового препарата ги-
гроветнна Ленинградским научно-исследовательским институ-
том аитнбнотиков. Гнгроветин готовится путем орошения пше-
ничных отрубей концентратом гнгромицина Б. Основные требо-
вания, предъявляемые к гигроветнну, приведены ниже.
Внешний вид Сыпучий продукт светло-коричневого
цвета
Содержание гнгромицина Б, ед./г (15±2) • 103
Влажность, %, не более 15
Безвредность для животных в тест-дозе, 200
ед. на одну мышь
Подлинность (нингидриновая проба) Фиолетовый цвет с синим оттенком
вверху и розовым внизу
6* 163
Технологическая схема производства препарата гигроветина
представлена ниже.
Соевая мука, кукуруз- Приготовление и стерв- Исходная культура
ный экстракт, лнзация питательной Act. hygroscoplcus,
(NH4)aSO4, NaCl, СаСОз,—*среды выращенная на ага-
кашалотовый жяр I_____________ ризованной среде или
| пшене
I I
Выращивание культуры
в колбах на качалке
при температуре
2/°C 72 ч
I
Выращивание культу-
ры в посевном аппара-
те при температуре
28 °C 72 ч, избыточное
давление 50 кПа
I______________
Соевая мука, яукуруз- Приготовление и стери-
ный экстракт, пивные лнзация питательной
дрожжи, (NH4)aSO4, —>среды для фермента-
NaCl, СаСО3, кашало- тора
товый жир |
Производственное куль-
тивирование при тем-
пературе 28'С, 192—
216 ч, избыточном дав-
лении 50 кПа *“
Серная кислота, ща- —>Обработка культураль-
велевая кислота, ще- ной жидкости
лочь |
Мицелий <—Фильтрация —>Нативиый
активностью
20%-ный раствор NaOH—>Подтитровка нативного ^000 ед./мл
раствора до pH 6,5—7,0 <------------------------------1
I
Фильтрации через ко-
лонку со стекловатой
I
Сорбция гигромицина Б
на колонке со смолой
КБ-4П-2 в №+-форме
I
Промывные воды иа Промывка смолы Обессоленная
сорбцию КБ-4П-2 обессоленной
раствс р
1500-
вода
НОДОЙ
Смола КБ-4П-2 иа ре- «—Десорбция гигромицн- <—1 и. раствор NH4OH
генерацию на Б со смолы
164
Конденсат
Подсушенные отруби,
влажность 1 %
*—Упаривание элюатов «—Аммиачные элюаты
под вакуумом прн 45— активностью 10—
60 °C 15 10s ед./мл
I_______________________
4
Фильтрация концентра- -«—Водный концентрат
та на нутч-фильтре гигромицина Б ак-
тивностью 15—25 X
Х10* ед./мл
Смешивание концентра-
та с отрубями
I
Фасовка и упаковка
гнгроветииа
Исходная культура Act. hygroscopicus штамм 200/10 сохра-
няется на агаризованной среде при комнатной (20—21 °C)
температуре в течение 1,5—2 мес нли на пшене в течение
6 мес без пересева. Посевной материал для засева среды
в ферментаторе размножается в две стадии: вначале
выращивается в колбах на 750 мл со 100 мл питательной
среды на качалке, а затем в посевном аппарате. При этом ис-
пользуется среда одного н того же состава (в %): соевая мука
1,5, кукурузный экстракт 0,2 (по сухой массе), (NH4)2SO4 0,2,
NaCl 0,5, СаСО3 0,3, кашалотовый жир 2. Среда в посевных
колбах должна иметь pH 7,2—7,4, для посевных аппаратов pH
доводят до 7,7—7,9. Количество материала, необходимое для
засева питательной среды в посевном аппарате, составляет
1,5—3 % от ее объема.
Культивирование продуцента проводится при температуре
28 °C, постоянном перемешивании (250—300 об/мин) и пере-
менной аэрации. В первые сутки поддерживается аэрация
I объем воздуха на 0,5 объема среды в минуту, во вторые —
I 1 и в третьи— 1: 1,5. Избыточное давление в аппарате со-
ставляет 50 кПа. Для засева ферментатора используется по-
севного материала 5—10 % от объема среды. Основная стадия
культивирования проводится на среде следующего состава
(в %): соевая мука 1,5, кукурузный экстракт 0,2 (по сухой
массе), (NH4)sSO4 0,2, NaCl 0,5, СаСОз 0,3, кашалотовый жир
2, сепарированные пивные дрожжи 5. Культура выращивается
при 28—30 °C в течение 192—216 ч при pH 7,6—7,8, постоян-
ном перемешивании и аэрации (1 : 1,5). При вспенивании куль-
туральной жидкости небольшими порциями подается стериль-
ный пеногаситель. К концу процесса культивирования (192—
216 ч) уровень активности гигромицина Б составляет 1500—
2000 ед./мл.
165
С целью освобождения от ионов кальция культуральную
жидкость подкисляют H2SO4 до pH 4,0—4,5, затем добавляют
щавелевую кислоту. При полном осаждении ионов кальция
культуральная жидкость поступает иа фильтрацию. В натив-
ном растворе перед сорбцией гнгромицина Б 20 %-иым раство-
ром гидроксида натрия устанавливают pH в интервале 6,5—7,0.
Сорбция гнгромицина Б из нативного раствора проводится
на батарее ионообменных колонн открытого типа со смолой
КБ-4П-2 в №+-форме. Сорбционная емкость катионита по ан-
тибиотику составляет в среднем 500—700 тыс. ед./г смолы. Мо-
гут быть использованы также карбоксильная смола КБ-2 и во-
фатит СР-300, имеющие большую сорбционную емкость по ги-
громицииу Б. Подача нативного раствора иа колонки осущест-
вляется снизу вверх. На смоле сорбируется 95 % гнгромицина
Б от его содержания в иативиом растворе. Перед десорбцией
колонку промывают обессоленной водой — сначала снизу вверх,
а затем наоборот, до получения бесцветных промывных вод.
Десорбция гнгромицина Б проводится 1 н. водным раствором
аммиака, раствор подают иа колонку сверху вниз, и заканчи-
вается процесс при активности элюатов не более 400—500 ед./мл.
Количество гнгромицина Б, десорбированного со смолы, со-
ставляет 90—100 % от сорбированного. Средняя активность
элюатов около 10000—15000 ед./мл. После упаривания она воз-
растает до 150—250 тыс. ед./мл. Перед смешиванием с подсу-
шенными отрубями концентрат гнгромицина Б фильтруется иа
нутч-фильтре через шелк этуаль (нижиий слой) и бязь (верх-
ний слой). Отфильтрованный концентрат смешивается с отру-
бями нз расчета 80—100 мл на 1 кг отрубей в зависимости от
активности концентрата. Готовый продукт фасуют по 50 г в по-
лиэтиленовые пакеты, которые обязательно этикетируются.
6.5. НИЗИН
Низии — один из немногих антибиотиков, в небольших до-
зах разрешенный для использования в пищевой промышленно-
сти. Ои быстро разрушается ферментами пищеварительного
тракта до аминокислот.
Впервые низин был получен в Англии фирмой «Эплин эид
Баррет» и получил коммерческое название ннзаплии.
Низии — антибиотик полипептидного типа с молекулярной
массой около 7000. В состав его входят аминокислоты лизин,
гистидин, аспарагиновая кислота, лаитионин, р-метиллантно-
нин, пролин, глицин, алании, валин, метиоиии, изолейцин, лей-
цин, дегидроаланин и p-метилдегндроаланин. Характерной осо-
бенностью низина является наличие в его составе двух серо-
содержащих аминокислот: лаитиоиииа и р-метиллантнонина,
редко встречающихся в природе. В каждой молекуле иизииа
содержится два остатка лантиоиииа н 8-р-метиллаитионина.
166
По химической структуре иизии представляет собой два
идентичных спаренных кольца, каждое из которых состоит из
13 атомов, в том числе одного атома серы.
Особенности химического состава и структуры низина обус-
ловливают его антибактериальное действие. Международная
единица активности низииа равняется его количеству в 0,001 мг
эталонного препарата, хранящегося в Центральной ветеринар-
ной лаборатории в г. Вейбридже (Англия). Отечественная про-
мышленность выпускает препараты низина в виде сухого мел-
кого порошка. В таком виде низин сохраняет активность в те-
чение нескольких лет при температуре 18—22 °C.
Низин продуцируется штаммами Str. lactis, которые широко
распространены в природе. В сравнении с другими антибиоти-
ками он ие обладает широким спектром действия на микро-
организмы. Подавляет развитие стафилококков, стрептококков,
сарцин, бацилл и клостридий, прорастание спор. Механизм
действия низииа на микроорганизмы до конца не выяснен.
Объединенный комитет Международной пищевой организа-
ции и организации здравоохранения (FAO/WHO) по пищевым
добавкам установил суточную дозу низина, равную 33 тыс. ед.
Наиболее благоприятной средой для биосинтеза низина яв-
ляется обезжиренное молоко. При использовании сыворотки
выход низина в 2 раза меньше, чем при использовании молока.
Но добавление к сыворотке 25 % пепсинового гидролизата мо-
лочнокислых бактерий, картофельной патоки или глюкозы
(2,5—5 %) способствует повышению выхода низина до 90 %.
Аминный азот гидролизатов казеина, пептонов, дрожже-
вого автолизата стимулирует образование низина, а соли ам-
мония не усваиваются низииобразующими молочнокислыми
стрептококками и не влияют на выход низииа.
В заводскую лабораторию культура низниобразующих бак-
терий поступает в л иофил изирова ином состоянии. Производст-
венный посевной материал готовится в три стадии. Культура
выращивается сначала в обезжиренном молоке (его берется
300 мл) с содержанием до 8 % сухих веществ в течение 24 ч,
167
на второй стадии —в 4000 мл обезжиренного молока 22—24 ч,
иа третьей — в ииокуляторе с 80 л обезжиренного молока
(pH 6,8—6,9) в течение 18—20 ч. Перемешивание среды произ-
водится только в момент засева и перед подачей посевного ма-
териала в ферментатор. Избыточное давление в ннокуляторе
поддерживается иа уровне 30—50 кПа.
Готовый посевной материал представляет собой густую
взвесь дипло- и стрептококков в свернувшемся обезжиренном
молоке с pH 4,5—4,7, активность не ниже 50—60 мкг/мл.
Производственное культивирование ведется иа смеси гидро-
лизата с творожной или сырной сывороткой в соотношении 1 :2.
Гидролизат получают в результате гидролиза обезжиренного
молока с 6%-ным содержанием сухих веществ протеолитиче-
ским ферментом панкреатином при температуре 45 °C и pH
смесн 8,1 в течение 24 ч.
В ферментаторе на питательной среде происходят рост и
развитие низинобразующего молочнокислого стрептококка.
При этом образуется молочная кислота, которая, закисляя
среду, тормозит развитие микроорганизма и биосинтез низина.
В связи с этим основным условием при выращивании культу-
ры— продуцента низина является поддержание pH питательной
среды в пределах 6,8—6,9. Это достигается введением в куль-
туральную жидкость прн температуре 28—30 °C и перемеши-
вании 20 %-иого раствора Na ОН.
Об окончаннн процесса культивирования судят по замед-
ленному изменению pH среды, состоянию культуры и уровню
ее активности. Обычно выращивание культуры заканчивают
за 14—15 ч. При этом активность должна быть не ниже
100 мкг/мл.
Культуральную жидкость подкисляют соляной кислотой до
pH 1,8—2,0 и кипятят 3—4 мии. После охлаждения до 40 °C на
сепараторе отделяют микробную массу и нерастворимые белкн.
Низнн, содержащийся в нативном растворе, концентрируют
флотационным методом. Для этого иатнвный раствор подщела-
чивают 20%-ным раствором NaOH до pH 4,5—4,7, добавляют
поверхиостно-активное вещество типа твин-80 и через раствор
пропускают воздух в течение 2—2,5 ч при температуре 20—
25 °C. Большая часть низина (от 50 до 100%) выходит в пену.
Собранную пену разбивают, в образующейся жидкости pH до-
водят до 1,8—2,0. Антибиотик высаливается сухой повареииой
солью (25 % к объему жидкости) и ацетоном (5 % к объему
жидкости).
Высоленный иизин отделяют в виде пасты иа сепараторе
или в центрифуге и высушивают в сублимационной сушилке
до остаточной влажности 3,5—4 %. Пасту можно сушить в рас-
пылительной сушилке, если приготовить раствор с 4,5—5,0 %-
иым содержанием сухих веществ. Потери активности при
сушке незначительны.
168
После сублимационной сушки препарат измельчают до со-
стояния пудры н стандартизуют хлоридом натрия до стандарт-
ной активности 0,6-106 ед./г*. Препарат слабо растворяется
в воде и хорошо растворяется при подогреве до 80 °C в 0,02 н.
соляной кислоте.
Препарат фасуют в полиэтиленовые темные или матовые
банки вместимостью 250—500 г, которые упаковывают в кар-
тонные коробки и хранят в сухом прохладном помещении.
В большинстве консервированных продуктов микроорга-
низмы уничтожаются при тепловой обработке. Одиако тепло-
вую обработку, достаточную для уничтожения всех спор мик-
роорганизмов, выдерживают без снижения вкусовых и пита-
тельных свойств ие все продукты.
В присутствии низииа терморезистентность спор микроорга-
низмов уменьшается, следовательно, можно понижать темпе-
ратуру или продолжительность стерилизации продукта.
6.6. ТРИХОТЕЦИН
Трихотеции — антибиотик с широким протнвогрибным и ан-
тивирусным действием—образуется одним из штаммов микро-
скопического гриба Trichothecium roseum, широко распростра-
ненного в природе. Антибиотик принадлежит к группе соедине-
ний, содержащих в своем составе несколько о-гетероциклов,
имеет эмпирическую формулу С19Н24О5. Его структурная фор-
мула может быть представлена в следующем виде.
ооснс=снсн3
Трихотеции
Трнхотеции — кристаллическое вещество с точкой плавле-
ния 118 °C, молекулярная масса 332. Он представляет собой
сложный эфир изокротоновой кислоты и непредельного спирта
трихотеколона. Антибиотик устойчив к температурным воздей-
ствиям и кислотности среды, в воде слаборастворим.
Препарат, выпускаемый промышленностью (10%-ный сма-
чивающийся порошок трнхотецииа), представляет собой одно-
родный порошок кремового цвета, содержит 10% трихотенина.
* За единицу Ридинга условно принято такое количество низина, кото-
рое при определенных стандартных условиях задерживает рост Str. agalactiae.
В 1 г препарата содержится 1 млн. ед.
16?
87 % каолииа и 3 % эмульгатора ОП-7. Основные требования,
предъявляемые к трихоцетииу, изложены ниже.
Внешний вид и свойства Однородный порошок кремового цвета
Содержание влаги, %, не более 5
Активность, мкг/г 1 000 000
Степень измельчения (остаток иа сите 1
с сеткой № 009), %, не более
Примечание. Допускается отклонение активности не более ±10 %.
Биосинтез трихотецина осуществляется культурой Тг. ro-
seurn L. Прн многостадийном получении посевного материала
(маточные и посевные колбы, посевной аппарат) используется
одни и тот же состав питательной среды (в %): сахар-песок—
1,0, кукурузный экстракт — 1,0, аммоний сернокислый — 0,12, ка-
лий фосфорнокислый двухзамещенный — 0,1. После стерилиза-
ции pH питательной среды должен быть 5,0—5,2. Выращива-
ние культуры в колбах в первую и вторую генерации прово-
дится при температуре 24—26 °C в течение 36—48 ч.
Мицелиальная масса из колб в количестве 1—3 % от объ-
ема среды используется для засева посевного аппарата. Про-
цесс выращивания культуры в нем производится при непрерыв-
ном перемешивании и аэрации 1 л/(л-мин). Готовый посевной
материал в количестве 8—10 % от объема питательной среды
используется для засева среды в основном ферментаторе.
Для производственного культивирования готовят среду сле-
дующего состава (в %): мука кукурузная 1, глицерин 1, КН2РО4
(или К2НРО4) 0,24, KNO3 (или (NH4)2SO4) 0,06, СаСО3 и
MgCl2 по 0,02, жир кашалотовый 0,1. Соляной кислотой дово-
дят pH среды до 5,3—5,6.
Культивирование проводится при 24—26 °C в течение 64—
90 ч прн непрерывном перемешивании и аэрации [1 л/(л-мин)].
К концу процесса выращивания содержание сахара уменьша-
ется до 0,1—0,2 %, pH среды находится в пределах 6,4—6,8,
активность антибиотика составляет 300—380 мкг/мл.
После фильтрации культуральной жидкости трихотеции из-
влекается из нативного раствора экстракцией хлороформом,
расход которого составляет 4 % от объема нативного раствора.
Выход трихотецина на стадии экстракции 84—85 % от содер-
жания его в культуральной жидкости. Экстракт трихотецина
упаривают под вакуумом, смешивают с этиловым спиртом из
расчета 10 л спирта иа 1 кг трихотецина и направляют на при-
готовление пасты. Для приготовления трнхотецииовой пасты на
1 кг спиртового концентрата добавляют 0,6 кг эмульгатора
ОП-7 н 8,5 кг каолииа н тщательно перемешивают. Сушка па-
сты проводится в калориферной сушилке при температуре 65—
70 °C. Готовый продукт фасуется по 2—5 кг в 4-слойные бумаж-
ные мешки с полиэтиленовыми вкладышами.
Общий выход трихотецина от его содержания в культураль-
ной жидкости составляет 70 %.
170
6.7. ФИТОБАКТЕРИОМИЦИН
Фитобактериомиции — первый отечественный антибиотик,
вырабатываемый специально для защиты растений от болез-
ней. Он принадлежит к антибиотикам стрептотрицииового ряда
и как большинство из иих является многокомпонентным, содер-
жит семь компонентов. Является типичным осиоваиием, обра-
зует соли с сильными кислотами. В чистом виде фнтобактерио-
миции — аморфный порошок кремового цвета, хорошо раствор
римый в воде, хуже — в этаноле и метаноле и нерастворимый
в большинстве других органических растворителей. Обладает
высокой бактерицидной активностью против многих грамполо-
жительиых и грамотрицательных бактерий и микроскопических
грибов.
Продуцентом фитобактериомицина является Act. lavendu-
lae, штамм 696, выделенный в 1953 г. из почв Степного Крыма.
Препарат в виде дуста и суспензий различных концентраций
эффективен в борьбе с фитопатогениымн бактериями и микро-
скопическими грибами. Разработанная технология производ-
ства предусматривает получение сульфата фитобактериомн-
цииа. Биосинтез антибиотика осуществляется по следующей
схеме: выращивание Act. lavendulae в пробирках, колбах, по-
севном аппарате, ферментаторе. Исходную культуру поддер-
живают иа агаризованиой среде с глюкозой (1 %)- На всех
стадиях выращивания микроорганизма используется питатель-
ная среда одного н того же состава (в %): глюкоза 1, крахмал
1,5, кукурузный экстракт 0,5 (по массе сухих веществ), NaCl
0,5, (NH4)2SO4 0,35, СаСОз 0,5. Оптимальная температура вы-
ращивания 26—28 °C.
При культивировании продуцента в посевном аппарате и
в ферментаторе в питательную среду для пеиогашеиия добав-
ляют кашалотовый жир или растительное масло в количестве
ие более 0,5 % от объема среды.
Выделение и очистка фитобактериомицина проводится ионо-
обменным способом. Культуральную жидкость обрабатывают
щавелевой кислотой для осаждения иоиов кальция, которые
при сорбции могут конкурировать с ионами фитобактериоми-
цина. Нативный раствор пропускают через колонку с катиони-
том КБ-4П-2 в ИН^-форме, иа котором сорбируется анти-
биотик.
Элюция антибиотика со смолы проводится 0,6 и. раствором
серной кислоты. Со смолы в среднем десорбируется 95 98 %
антибиотика. Средняя активность элюатов 50—450 тыс. ед./мл.
Элюаты сульфата фитобактериомицина с pH 1,0—2,0 обраба-
тывают анионитом ЭДЭ-10 в ОН_-форме, 80—90 г на 1 л
элюата в статических условиях до pH раствора 6,0. После об-
работки анноиит отделяют фильтрованием, а элюаты высуши-
вают под вакуумом при температуре 70—80 °C. Выход фито-
171
бактериомицина составляет 70—80 % от сорбированного на ка-
тионите. Сухой продукт — сульфат фнтобактериомииииа —
имеет активность 3000—4000 ед./мг.
Глава 7. МИКРОБНЫЕ ПАТОГЕНЫ
И БАКТЕРИАЛЬНЫЕ УДОБРЕНИЯ
В борьбе с вредными насекомыми используется множество патогенных
микроорганизмов — бактерий, микроскопических грибов, вирусов. Изучаются
возможности применения для этих целей нематод и простейших. Особое вни-
мание к биологическим средствам защиты от вредных насекомых возникло
после длительного применения стойких органических (химических) инсекти-
цидов. В процессе их использования проявлялись отрицательные побочные
явления. Ни один инсектицид не обладает стопроцентной эффективностью,
и после каждой обработки всегда выживает несколько вредных насекомых,
которые затем дают следующее поколение, обладающее унаследованной от
родителей пониженной чувствительностью к ядовитым веществам. В добавок
ко всему полностью уничтожались полезные насекомые.
Инсектициды остаются долгое время в среде и могут попасть в пищу
животных и человека. Выяснилось также, что оии токсичны для птни рыб
н диких животных.
Основным положительным свойством биологических средств борьбы с на-
секомыми является специфичность — способность поражать определенные
виды насекомых, оставаясь при этом безвредными для человека, теплокров-
ных животных, птиц н полезных насекомых.
Практически микроорганизмы, выделяемые из естественных условий и
вносимые опять в естественные условия в качестве микробных патогенов,
позволяют избежать нежелательных нзмененнй в биоценозах, сохраняя энто-
мофагн и другие полезные организмы, а также устранить загрязнение воз-
духа, почвы, воды и растений стойкими соединениями.
За последнее десятилетие в Советском Союзе, а также за рубежом —
в США, Франции, ФРГ н Японии было освоено промышленное производство
бактериальных, грибных н вирусных препаратов для сельского и лесного
хозяйства, для нспользоваиня их в системе мероприятий по защите расте-
ний. Оно основано на селекционных приемах н отборе наиболее активных
штаммов микроорганизмов, изучении их физиологических н биохимических
особенностей, разработке технологии массового размножения н концентриро-
вания инфекционного начала, приготовлении стандартных препаратов и вы-
яснении нх активности на насекомых-тестах.
В настоящее время для защиты растений выпускаются энтобактерин-3,
дендробациллин, инсектин, токсобактерин, боверив, вирнн-ЭКС, вирин-ЭНШ.
Промышленные формы микробных патогенов производятся в основном в виде
смачивающихся порошков или пасты, реже — в виде дустов. В настоящее
время разработаны новые формы — гранулы н инкапсулированные порошки,
а также стабилизированная эмульсия спор и кристаллов.
Применение в полевых условиях различных форм препаратов требует
определенных добавок — растворителей, прнлипателей, смачивателей, эмуль-
гаторов и т. п., повышающих нх эффективность.
7.1. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ
ЭНТОМОПАТОГЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ
Бактериальные энтомопатогенные препараты занимают доминирующее
положение среди микробных патогенов. Потенциально полезные энтомопа-
тогенные микроорганизмы должны удовлетворять следующим требованиям.
172
1. Микроорганизм должен быть высоковнрулентным для насекомого-ми-
шенн н ие должен проявлять большую изменчивость.
2. Должен быть безопасным для всех других живых организмов, в том
числе полезных насекомых, растений и позвоночных. Не должен поражать
паразитов н хищников, нападающих на вид-мишень.
3. Должен быть экономичным прн выращивании, выдерживать длитель-
ное хранение, не теряя жизнеспособности и вирулентности, чтобы можно было
создать большие запасы.
4. Должен действовать быстро, чтобы насекомое до прекращения пита-
ния нлн гибели не успело нанести серьезного ущерба.
Многим нз этих жестких требований отвечают бактериальные эитомо-
патогенные культуры.
В настоящее время бактериальные препараты используются для борьбы
более чем со 160 видами вредных насекомых. Наиболее широко для полу-
чения энтомопатогенных препаратов применяется спорообразующая грампо-
ложительная бактерия Bacillus thuringiensis. Впервые она была выделена
Берлинером в 1915 г. нз больных гусениц мельничной огиевкн. Штаммы Ba-
cillus thuringiensis кроме образования спор, вызывающих септицемию на-
секомого прн попадании внутрь его тела, в процессе культивирования син-
тезируют ряд токсичных компонентов, которые могут накапливаться как
в бактериальной клетке, так н в культуральной жидкости.
Токсичные продукты Bacillus thuringiensis. В соответствии с правилом
называть токсины по порядку их открытия фосфолипаза С (лецитиназа С)
была названа а-экзотоксином. Он является продуктом растущих клеток
бактерий. Предполагается, что этот фермент вызывает распад незаменимых
фосфолипидов в тканях насекомых, приводя их к гибели. Фосфолипаза С
активна при pH кишечника в пределах 6,6—7,4 и повреждает у восприим-
чивых насекомых клетки кишечника, способствуя проникновению бактерий
в полость тела.
Второй токсин — р-экзотоксин, нли термостабильный экзотоксин, получил
свое название за сравнительно хорошую стабильность прн высокой темпера-
туре: активность сохраняется прн автоклавировании в течение 15 мин при
121 °C. Токсин накапливается в 'культуральной жидкости, его образование
совпадает с динамикой роста бактериальной культуры. В состав токсина
входят аденин, рибоза и фосфор в соотношении 1:1:1. Предполагают, что
молекула р-экзотоксина состоит нз нуклеотида, сложно связанного через
рибозу и глюкозу с аллослнзевой кислотой. Действие р-экзотоксииа, по-видн-
мому, обусловлено ингибированием нуклеотидазы и ДНК зависимой РНК-
полимеразы, связанных с АТФ, из-за чего прекращается синтез РНК-
Третий токсин — у-экзотоксин — мало изучен. Это пока неидентифнциро-
ванный фермент (нлн группа ферментов). Предполагают, что он относится
к фосфолипидам. Еще не доказано, что у-экзотоксин действительно токси-
чен. о »
Четвертый токсин—^-эндотоксин, или параспоральвыи кристаллический
эндотоксин, образуется одновременно со спорой в противоположной части
бактерии. Вначале ои имеет форму бесформенного комочка, постепенно прев-
вращающегося в правильный восьмигранник. У большинства разновидностей
Вас. thuringiensis образование споры и кристалла сопровождается распадом
стенки клетки, в результате споры и кристаллы освобождаются н раздельно
поступают в культуральную среду. Кристаллы по своему химическому строе-
нию представляют собой белковое соединение, в состав которого входят
17,5 % азота и почти отсутствует фосфор. Структурная целостность кристалла
обусловливается, видимо, связями белка с кремнием. Кристаллический бе-
лок по химической природе очень сходен с белком оболочки споры. Наиболее
вероятно предположение, что кристалл образуется в результате перепроиз-
водства белка в оболочке споры. Кристаллы слабоустойчнвы к действию
температуры. Прогревание прн температуре 80—100 °C в течение 30
40 мин разрушает его структуру и инактивирует токсические свойства.
В связи с этим 6-эндотоксин часто называют термолабильным. Белок кри-
сталла переходит в раствор при высокой щелочности среды (pH 11,0 12.5).
173
В кишечнике чешуекрылых, для которого характерен высокий pH, в щелоч-
ной среде токсичные компоненты кристалла высвобождаются.
Ферменты насекомого превращают протоксин кристалла в непосред-
ственно действующий настоящий токсин. Разница в восприимчивости раз-
личных видов насекомых к действию кристалла связана со специфичностью
кишечных протеаз, контролирующих гидролиз кристаллов in vivo. Этнмн про-
теазами обладают не все насекомые, с чем и связана избирательность дей-
ствия токсина.
Типичными симптомами действия кристаллического эндотоксина на вос-
приимчивых насекомых являются паралич кишечника, прекращение питания
в течение нескольких минут после заглатывания токсина и развитие общего
паралича, приводящего к гибели насекомого.
В настоящее время известно 12 серотипов н 15 вариантов этого вида
эндотоксина, принадлежащего к группе кристаллоиосных бактерий. Из них
наибольшее практическое значение для получения бактериальных препаратов
имеют следующие варианты: тюрингиензис, илн берлниер, относящийся к 1,
а лести — к III, деидролнмус — к IV и галлер ня — к V серотипам. Следует
еще раз подчеркнуть, что характерная особенность кристаллоносных бак-
терий— образование помимо эндоспор параспоральных белковых кристаллов
Образование споры у видов группы Bacillus thuringiensis происходит
после интенсивного роста культуры. Она формируется вблизи одного нз кон-
цов тела и выходит наружу. У различных вариантов бактерий наблюдаются
некоторые различия во времени образования спор. В высушенном состоянии
при комнатной температуре споры сохраняются без существенных измене-
ний в течение 10 лет и более. Прн высокой влажности споры погибают
прн температуре 100 °C через 5—10 мин. Споры, проглоченные восприимчи-
вым хозяином, прорастают в его кишечнике. Вегетативные клетки проникают
в полость тела, где они быстро размножаются, разрушают определенные
ткани и вскоре заполняют значительную часть полости. Данная стадия за-
ражения носит название септицимии. Бактерии этой группы могут уничто-
жить 130 видов насекомых, в том числе вредителей полевых, овощных, пло-
довых культур, виноградников и леса. Самый высокий эффект получают
прн использовании Вас. thuringiensis против листогрызущих вредителей.
Характеристика бактериальных препаратов. Промышленность, исполь-
зуя способность различных штаммов Вас. thuringiensis образовывать ток-
сичные вещества, споры и кристаллы, выпускает на этой основе различные
бактериальные препараты (табл, 7.1).
Энтобактерин предложен ВНИИ защиты растений, создан на основе
Вас. thuringiensis var. galleriae. Может выпускаться в виде порошка, жид-
кости в смеси с прилипателем 2-05 и в виде пасты.
Инсектин предложен Красноярским институтом леса СО АН СССР,
создай на основе спор и кристаллов Вас. thuringiensis var. insectus.
Алестнн создан во ВНИИбакпрепарате на основе спор н кристаллов
третьего серотипа var. alesti. Может выпускаться в виде порошка или ста-
билизированной пасты.
Экзотоксин создай во ВНИИбакпрепарате на основе культуральной
жидкости Вас. thuringiensis var. insectus. Выпускается в виде порошка с со-
держанием 3,3 % экзотоксина.
Токсобактерин получен иа основе спор, кристаллов н экзотоксина Вас.
thuringiensis var. insectus. Представляет собой смачивающийся порошок
влажностью 5 % в смеси с прнлнпателем 4-10, содержит 30 млрд, спор н
яристаллов н 0,025 г экзотоксина в 1 г.
Дендробациллин предложен Иркутским университетом, создай иа ос-
нове спор и кристаллов Вас. thuringiensis var. dendrolimus. Представляет
собой смачивающийся порошок с титром не менее 30 млрд, жизнеспособ-
ных спор в 1 г.
Битоксибациллин, ялн БТБ-202, создан во ВНИИ сельскохозяйствен-
ной микробиологии. Состоит яз спор и метаболитов Вас. thuringiensis var
thuringiensis. Препарат готовят двумя способами: распылительной сушкой
культуральной жидкости; сепарированием культуральной жидкости до
174
Таблица 7.1. Характеристика препаратов
Пре- парат Основа Форма Титр, млрд, спор г Условия хранения Спектр действия Дози- ровка
Энто- Споры, Смачи- 30 1 год пря Листогрызу- 1—5
бактерии кри- сталлы Баю- щийся поро- шок температуре от —15 до 30 °C щие чешуе- крылые иа овощных, плодовых, хлопчатнике кг/га
То же Жид- кость * 30 1 год Капустная моль, яблон- ная плодо- жорка и пи- лильщик , моль-яиамотка 2—5 л/га для плодо- вых, 1—3 л/га для ка- пусты
> Паста ** 20 1 год Листогрызу- щие на ка- пусте 2—5 кг/га
Дендро- бациллин > Смачи- ваю- щийся поро- шок 30 1 год пря температуре от —15 до 30 °C Вредители хлопчатника, плодовых 2-5 кг/га
Иисектии » То же 30 То же Вредители леса: сибир- ский н непар- ный шелко- приды, зеле- ная дубовая листовертка 2—2,5 кг/га, 50 л/га
Алестии » Смачи- ваю- щийся поро- шок •• 30 Капустная моль, яблон- ная плодо- жорка *•
Экзо- токсин Токсин ВТ То же** 3,3 % концент- рата токсина 1,5 года Двукрылые жесткокры- лые— коло- радский жук, хлопковая совка 0,05—0,1 кг/га
Бито- ксиба- цнллии Споры, кристал- лы, экзо- токсин > 30 1 год Капустнаи муха, совка, белянка, тля, колорадский жук, яблон- ная плодо- жорка 1,5 кг/га
• Полевые испытания.
** Опытный образец.
175
получения пасты н последующим выпариванием фугата. объединением пасты
с концентрированным фугатом и лиофильной сушкой смесн. Последний спо-
соб дает возможность регулировать количество экзотоксина в готовом
препарате. В 1 г препарата содержится 30 млрд, спор н кристаллов.
Технология производства бактериальных препаратов. Всякое производ-
ство микробных патогенов на основе эитомопатогенных бактерий предусмат-
ривает глубинное культивирование с целью достижения максимального титра
клеток в культуральной жидкости или накопления токсниа. Затем споры
к кристаллы отделяют сепарированием для дальнейшего обезвоживания. До
последнего времени основной формой выпускаемых микробиологической
промышленностью бактериальных энтомопатогеиных препаратов являлись
смачивающие порошки. Эта форма хорошо зарекомендовала себя, т. к. она
удобна прн транспортировке и хранении. Однако прн производстве значи-
тельное время требуется на процессы сушки, помола, стандартизации н фа-
совки. При приготовлении водных суспензий они долго набухают и после
перемешивания быстро оседают на дно емкостей. Это приводит к забива-
нию распыляющих устройств. В настоящее время наиболее перспективной
формой бактериальных препаратов считается стабилизированная паста. Ее
производство в значительной степени позволило упростить и удешевить тех-
нологию производства вследствие ликвидации процессов сушки н помола
Бактериальный патоген в форме стабилизированной пасты представляет
собой вязкую жидкость консистенции густой сметаны, кремового или свет-
ло-серого цвета, однородную по составу, не распыляющуюся и не замерза-
ющую при хранении, без резкого или неприятного запаха, не подвергаю-
щуюся гниению или брожению.
Технологию производства бактериальных эитомопатогенных препаратов
возможно проиллюстрировать иа примере энтобактерина. Схема производства
энтобактернна приведена ниже.
Компоненты
ной среды
питатель- Приготовление и сте-
—►рилизация питательной —
Стерильный
тель-----
Стернльиый воздух
среды
I
пеногасн- —►Выращивание
----------->в посевном
I
__________ Выращивание
* в ферментаторе
1
культуры
аппарате
Культура нз ап-
—“парата Боброва
культуры^_
Культуральная
жидкость
I —
Фугат <—Сепарирование культу—>Паста--------
ральной жидкости |
I !
Теплоноситель—► Распылитель- Стабилизирующие—► Стабилизация
на я сушка добавки пасты
I I
I I
Каолин —► Стандартизация <—Сухой концентрат Розлив
н фасовка Л
Г отовый Г отовы й
препарат
препарат
176
Технология производства энтобактерина предусматривает все последо-
вательные стадии, характерные для любого микробиологического производ-
ства, основанного на глубинном культивировании микроорганизмов; выращи-
вание посевного материала в лаборатории, выращивание посевного материала
в аппарате, выращивание культуры в ферментаторе, концентрирование куль-
туральной жидкости, сушка пасты, усреднение и фасовка препарата.
Для успешного производства бактериальных препаратов в промышлен-
ности используют штаммы, отвечающие следующим требованиям; принад-
лежность к определенному серотипу, высокая вирулентность, высокая про-
дуктивность на промышленных средах, средняя чувствительность к комплексу
фагов, сохранение активности в технологическом процессе, отсутствие ток-
сичности для теплокровных животных и человека, эффективность применения.
Энтобактерин готовят на основе споровой энтомопатогенной культуры
Вас. thuringiensis var. gallerie. В лаборатории завода производственный
штамм Вас. thuringiensis var. galleriae рассевают на твердую среду мясо-
пептонный агар (МПА). Культура контролируется на чистоту, отсутствие
фага, продуктивность н вирулентность культуральной жидкости.
В начальной стадии приготовления посевного материала культуру вы-
ращивают в конических колбах на 3 л. На всех стадиях производства для
выращивания бактерий используют дрожжеполнеахарндную среду (ДПС)
следующего состава (в %): кормовые дрожжи 2—3, кукурузная мука 1—
1,5, кашалотовый жнр до 1 При выращивании культуры в посевном аппа-
рате засев стерильной среды осуществляют посевным материалом, получен-
ным в лаборатории в количестве 0,05 % от объема засеваемой среды (титр
посевного материала не менее 1,7-109 спор в 1 мл). Рост культуры длится
35—40 ч прн непрерывном перемешивании и аэрации (0,2 л/л среды в ми-
нуту), температуре 28—30 °C и избыточном давлении в аппарате 40—
50 кПа.
При использовании полученного посевного материала для засева пита-
тельной среды в ферментаторе среду проверяют на наличие посторонней
микрофлоры н фага. Посевной материал, выращенный в течение 35—40 ч,
представляет собой споровую культуру, которая устойчива в течение конт-
рольного времени хранения.
Если ранее рекомендовали устанавливать pH питательной среды рас-
твором щелочи до 7,8—8,2, то в последнее время считают целесообразным
оставлять pH естественным после добавления компонентов (6,2—6,4). Не-
прерывная стерилизация питательной среды проводится при температуре
140—145 °C, и, если поддерживается слабощелочная реакция среды, это при-
водит к разрушению витаминов группы В.
Количество посевного материала для засева питательной среды фермен-
татора составляет 0,0012 % прн титре 1,7 -109 спор в 1 мл. Выращивание
культуры в ферментаторе ведется в течение 35—40 ч при тех же техноло-
гических параметрах процесса, что и в посевном аппарате. Процесс закан-
чивается тогда, когда в культуральной жидкости содержится не менее 5—
10 % свободных спор н кристаллов от их общего количества, прн этом титр
культуры должен составлять ие менее 1 млрд, спор в 1 мл. Готовую куль-
туральную жидкость передают в предварительно простерилизованные сбор-
ники. К концу выращивания значение pH находится в пределах 8,0—8,5.
При такой щелочной реакции кристаллы частично дробятся на более мел-
кие. Это приводит к выносу их с фугатом в канализацию, что ведет к неко-
торой потере активности. Для предотвращения этого целесообразно перед
сепарацией снижать pH культуральной жидкости до 6,0—6,2.
Прн сепарировании выход пасты с 1 м3 культуральной жидкости состав-
ляет около 100 кг прн влажности 85 % и титре порядка 20 млрд, спор в 1 г.
В процессе сепарирования происходит дальнейшее освобождение спор и
кристаллов от клеточных оболочек. Собранную в сборнике пасту перемеши-
вают в течение 30 мни, после чего отбирают пробу на проверку титра,
влажности, вирулентности, наличия фага. Фугат может быть вторично ис-
пользован для приготовления питательной среды Длительное использование
фугата невозможно, т. к. происходит накопление веществ, которые после
177
3—4 циклов культивирования тормозят развитие культуры, в результате
происходит значительное снижение титра и заспорованиостн.
Последующее использование фугата также возможно, но только для вы-
ращивания дрожжей. Многократное использование фугата ие только сокра-
щает промышленные стоки и снижает расход воды, ио и приводит к значи-
тельной экономии сырья.
После проверки паста подается на распылительную сушку. Температура
воздуха иа входе в сушильную камеру 120 °C, иа выходе 60 °C. Из сушилки
поступает продукт влажностью не более 10 %. Выход сухого продукта
с 1 м3 культуральной жидкости 12—13 кг с титром 100—150 млрд, спор
в 1 г.
Усреднение препарата проводят каолином, доводя в смесителе титр
готового продукта до 30 млрд, спор в 1 г. Готовый энтобактерни фасуют
по 20 кг в четырехслойиые крафт-мешки с полиэтиленовым вкладышем и
маркируют. При производстве стабилизированной пасты после сепарации
стабилизация проводится путем внесения в пасту карбоксиметилцеллюлозы
(КМЦ). Имея высокую сорбционную способность, молекулы КМЦ в период
смешивания со спорокрнсталлическим комплексом сорбируют белковые кри-
сталлы и споры и заряжают их отрицательно. В результате нативные ча-
стицы препарата располагаются яа равном расстоянии одна от другой, об-
разуя так называемую трехмерную сетчатую структуру в пасте. Такое рас-
положение частиц позволяет консервантам в равной степени проникать
между ними, обеспечивая препаратам длительную сохранность.
Одним нз «узких мест> в технологии производства эитобактернна, как
и других бактериальных препаратов, остается борьба с фаголизисом куль-
тур Bacillus thuringiensis. Ряд исследователей считает, что существует обрат-
ная зависимость между вирулентностью н фагоустойчивостью штаммов, и
высказывает предположение о невозможности сочетания этих свойств в од-
ном штамме в связи с образованием токсина по принципу фаговой конвер-
сии. Так, устойчивые к фагу культуры (var. berliner) не образовывали кри-
сталлов ии при поверхностном, ни прн глубинном культивировании.
Механизм действия фага, как принято считать, связан с прекращением
синтеза ДНК в бактерии-хозяиие. Однако считают, что одним из путей
борьбы с фаголизисом является получение фагоустойчивых штаммов. В Ин-
ституте микробиологии АН Армянской ССР селекционированы фагоустойчи-
вые штаммы Вас. thuringiensis, которые отнесены к новой разновидности
var. caucasicus. На их основе получены препараты БИП-805, БИП-811 в
БИП-837, по спектру и характеру действия близкие к энтобактерину. Экспе-
риментально показана возможность блокирования развития фага путем до-
бавления к культуре различных соединений (аитнфаговых факторов): р-про-
пнолактона, препаратов нуклеиновых кислот, Л^-лаурол-А-валина, М-пальми-
тол-А-глутамата и др. Все перечисленные соединения ввиду сложности по-
лучения н высокой стоимости не находят в настоящее время широкого при-
менения.
По-вндимому, кроме селекционных приемов для повышения устойчиво-
сти к фагам необходимо регулярно производить смену штаммов и препа-
ратов, что даст возможность избежать фаголизиса в производстве.
В соответствии с ГОСТ 21108—75 готовый препарат энтобактерин со-
держит в 1 г не менее 30 млрд, спор бактерий и примерно столько же бел-
ковых кристаллов эндотоксина, влажность ие более 5%. Препарат предназ-
начен для борьбы с насекомыми — вредителями садовых, огородных и пар-
ковых культур. В настоящее время выявлено более 60 видов насекомых,
в борьбе с которыми энтобактерин эффективен.
Энтобактерин применяется путем опрыскивания растений, зараженных
вредителями, 0,5—1 %-иой водной суспензией в период активного питания
вредителя. В значительной степени эффективность препарата зависит от
температуры. Чем выше температура в момент применения и в последую-
щие 1—2 сут, тем выше эффективность энтобактерина и тем скорее насту-
пает гибель насекомых. Обычно основная масса вредителей погибает за
2—10 сут.
178
С целью повышения эффективности применения энтомопатогеиных пре-
паратов в нх состав нли в водные разбавители добавляют специальные веще-
ства, предназначенные для поддержания всех ингредиентов препаратов
в форме однородной суспензии: антниспарителн, снижающие испарение жид-
кости прежде, чем она достигнет поверхности растения; смачиватели, спо-
собствующие формированию устойчивой поверхности раздела жидкость—
твердое тело; прнлипатели, повышающие стойкость пленки препарата к внеш-
ним воздействиям среды (дождя, росы); защитные вещества, уменьшающие
воздействие солнечного излучения на споры и кристаллы.
Важно, чтобы эти соединения не стимулировали преждевременное про-
растание нлн рост и не препятствовали успешному закреплению патогена.
Развивается направление по использованию бактериальных препаратов в виде
приманок. С этой целью в препарат добавляют различные привлекающие
насекомых вещества, что приводит к повышению поедаем ости листьев ра-
стения, обработанного энтомопатогевным препаратом.
7.2. ЭНТОМОПАТОГЕННЫЕ ГРИБЫ
Энтомопатогенные грибы способны поражать большое количество насе-
комых. Возникающие в результате этого инфекции называют микозами. Ми-
козы насекомых вызывают грибами нескольких классов: Phycomycetes,
Ascomycetes, Basidiomycetes н Deuteromycetes (Fungi Imperfecti). Хотя из-
вестны сотии видов энтомопатогеиных грибов, в основном внимание при-
влечено к родам Beauveria (возбудитель белой мускардины), Metarrhizium
(возбудитель зеленой мускардины) и Enthomophthora.
И. И. Мечников открытием возбудителя зеленой мускардины у хлеб-
ного жука и применением препарата из гриба Metarrhizium anisopliae поло-
жил начало новому направлению в защите растений. У большинства гри-
бов инфекционной единицей являются конидии. Особенность микроскопиче-
ских грибов состоит в том, что в отличие от бактерий н вирусов грибы
проникают в тело насекомого не через пищеварительный тракт, а непосред-
ственно через кутикулу. Это происходит с помощью физических (аппрессо-
рии) и биологических средств (ферменты). При прорастании конидий на
кутикуле ростовые трубки могут расти иа поверхности или сразу начать про-
никать в тело насекомого. Аппрессорни — вздутия на концах коротких росто-
вых трубок, прикрепляющиеся к кутикуле и посылающие в хозяина мице-
лиальные ростки. В большинстве случаев сначала образуются фрагменты
мнцелня, похожие на дрожжевые клетки, так называемые гифальные тельца,
которые циркулируют в гемолимфе, а потом в насекомом начинается разви-
тие гриба. На этой стадии некоторые штаммы вырабатывают токсины в ко-
личествах, способных вызвать гибель хозяина, хотя ни одни из важных
органов тела ие бывает ннвазироваи. Например, Beauveria bassiana проду-
цирует токсии боверицин.
У штаммов, слабо продуцирующих токсии, нитевидный мицелий запол-
няет все тело насекомого. Прежде всего гряб заселяет мышечную ткаиь.
После этого образуются коиидиеиосцы, яоторые прорывают кутикулу н пол-
ностью покрывают мертвую личинку. У несовершенных грибов коиидиеиосцы
н конидии ие образуются, если только мертвое насекомое не находится во
влажной среде.
Грибы могут заражать насекомых в фазе куколки и имаго, которые
обычно этим путем ие поражаются другими видами микроорганизмов. Гри-
бам свойственна большая скорость роста и огромная репродуктивная
способность. Они имеют покоящиеся споры, способные сохраняться в при-
роде прн неблагоприятных условиях. Спектр действия у энтомопатогеиных
грибов неодинаков, и даже в пределах одного вида существуют штаммы,
которые различаются по вирулентности для одного и того же вида насеко-
мого. Особое внимание в настоящее время обращено на возбудителя мус-
кардины. Название этого заболевания насекомых происходит от француз-
ского слова, обозначающего засахаренный фрукт. Возбудителем белой мус-
179
кардины является Beauveria bassiana Vuill, поражающая 60 видов насеко-
мых в СССР. Другим практически важным видом рода Beauveria является
В. ten ell a Del. Это более специфичный паразит и поражат около 10 видов
насекомых, преимущественно жуков.
Большой интерес представляют грибные патогены на основе энтомофто-
ровых грибов (класс Phycomycetes), поражающих сосущих насекомых. Эти
препараты перспективны в борьбе с различными видами тлей и других со-
сущих насекомых в открытом и закрытом грунтах. В пораженных насеко-
мых мицелий распадается на отдельные фрагменты — гифальные тела, име-
ющие неправильную форму н различные размеры. Эти фрагменты разносятся
гемолимфой по телу хозяина и постепенно заполняют его, замещая разру-
шенные ткани. Рост грнба продолжается до тех пор, пока все внутренние
органы н ткани не будут разрушены.
Продолжительность периода от прорастания конидий до гибели у круп-
ных насекомых (саранча) составляет 5—8 сут, у мелких (тли) — 2—3 сут.
Летальный эффект наступает вследствие нарушения циркуляции гемолимфы
и от выделения грибом токсинов и ферментов.
Промышленное производство препаратов на основе грибов рода Entho-
mophtora пока невозможно, т. к. до сих пор не найдены условия культиви-
рования представителей этого рода на искусственных средах.
Боверин. В Советском Союзе осуществляется промышленное производ-
ство грибного препарата бовернна на основе конндиоспор гриба Beauveria
bassiana (Bals.) Vuill. Препарат выпускается в виде порошка с титром 2—
6 млрд. В качестве инсектицидной добавки можно использовать севин, хло-
рофос, фозалон и др. в количестве 10 % от принятой для данного района
нормы расхода. В. bassiana может хорошо расти при поверхностном способе
культивирования как на жидкой питательной среде, так и иа полутвердой
среде, основой которой служат пшеничные отруби. Производство боверииа
основано на глубинном методе выращивания гриба.
Для промышленного производства бовернна глубинным методом важ-
ным является вопрос получения посевного материала.
Исходный штамм хранят на косяках агаризованного пивного сусла или
среде Сабуро Исходный посевной материал получают выращиванием куль-
туры в колбах с жидкой питательной средой глубинным способом в течение
72—96 ч при температуре 25—28 °C. Засев питательной среды качалочных
колб осуществляют смывом культуры с косяков. Полученные в результате
выращивания конидиоспоры высушивают лиофильио. Этот посевной мате-
риал в течение года сохраняет исходные жизнеспособность я вирулентность.
Посевной материал для засева питательной среды ферментатора может быть
получен двумя методами: первый — выращивание в качалочных колбах,
а затем в ннокуляторе; второй — выращивание культуры сразу в ннокуля-
торе. Необходимо получить посевного материала не менее 2 % от объема пи-
тательной среды ферментатора. Для размножения посевного материала мо-
жет быть использована среда, содержащая сухне кормовые дрожжи, куку-
рузную муку н соли магния, калия, натрия
Прн культивировании грнба в ферментаторе большое значение имеет
поддержание оптимальной температуры, обеспечивающей получение актив-
ной культуры с высоким выходом конндиоспор. Следует отметить, что каж-
дый штамм Beauveria Bassiana имеет свой определенный температурный оп-
тимум развития.
При выращивании культуры кроме конндиоспор могут образовываться
бластоспоры, что резко снижает активность культуры. Развитие гриба за-
висит от количества аминного азота в среде. Недостаток его приводит к сла-
бому росту н конидиеобразованню. Чрезмерное содержание аминного азота
в среде вызывает обильное образование бластоспор. Оптимальной концент-
рацией амнниого азота в среде является 10—15 мг%. Помимо высокого
титра конидноспор при глубинном культивировании важно, чтобы получен-
ный материал был устойчив к высушиванию и другим внешним воздействиям.
Это достигается тем, что в питательную среду прн начальном значении pH
4,5—5,6 наряду с источниками азота, углерода н минеральных солей вводят
180
хлорид кальция в количестве 0,75—5,0 % от массы среды. Прн незначи-
тельной интенсивности аэрации к 72—88 ч роста культуры титр достигает
(34-4) • 109. После фильтрации получают пасту влажностью 70—80 % с тит-
ром 6—8 млрд, прн незначительных потерях энтомопатогенного материала.
Максимальное сохранение жизнеспособных спор (до 90 %) обеспечивает
лиофильная сушка, при распылительной сушке сохраняется до 50—60 %
(иногда до 80%) жизнеспособных спор. Как правило, чем выше процент
оставшихся после сушки жизнеспособных спор, тем выше нх вирулентность.
Обычно с 1 м3 культуральной жидкости получают около 4 кг препарата
влажностью около 10 % и титром 8•109 в 1 г. После определения JIKso
(летальная концентрация, вызывающая 50 % -ную гибель тест-объекта) про-
водят стандартизацию препарата каолином.
Боверин рекомендуется применять против листогрызущих вредителей
сада, а также против яблонной и восточной плодожорки и личинок коло-
радского жука на картофеле.
7.3. ПАТОГЕННЫЕ ВИРУСЫ
Вирусы-—наиболее интересная и многообещающая группа патогенных
микроорганизмов. К настоящему времени описано более 450 вирусов, вы-
явленных примерно у 500 видов членистоногих. Все вирусы насекомых раз-
делены на шесть групп на основании таких особенностей внриона (вирусной
частицы), как форма, очертания, симметрия, тип, процентное содержание,
число цепей и молекулярная масса нуклеиновой кислоты, места репликации
вируса, его чувствительности к химическим препаратам, а также на основа-
нии серологии и вызываемых ими симптомов болезней. К наиболее изучен-
ным относятся вирусы ядерного полиэдроза и гранулеза. Обе группы весьма
перспективны в качестве агентов, подавляющих жизнедеятельность вредных
насекомых. Вирусы ядерного полиэдроза развиваются в ядрах клеток хо-
зяина, а их вирноны поодиночке или группами заключены в полиэдрические
тельца-включения. Диаметр полиэдрических телец-включеннй колеблется от
0,2 до 15 мкм. Палочковидные вирионы содержат двухцепочечную ДНК и
имеют длину 230—420 нм.
Вирусы гранулеза развиваются в ядре нлн цитоплазме жировых, тра-
хейных н эпидермальных клеток хозяина. Каждый вирион (редко — пару)
окружает так называемая капсула, в результате чего образуется тельце-
включение. Палочковидные вирионы содержат ДНК н сходны с вирионами
вируса ядерного полиэдроза. Размер овальных телец-включеннй примерно
200X400 нм.
Вирусы насекомых проявляют свою активность только при проглатыва-
нии их хозяевами. Процесс поражения насекомого вирусом ядерного поли-
эдроза протекает следующим образом. Поглощенные насекомым тельца-вклю-
чения растворяются в кишечнике хозяина прн щелочной реакции среды.
Заключенные в тельца-включения вирионы освобождаются. Затем они про-
никают через стенку кншки в восприимчивые клетки, в ядрах которых про-
исходит репликация вирусов. Эти вирусы, высвобождаясь, заражают другие
клетки, н личинки погибают.
Многие вирусы насекомых высокоспецифичны по отношению к хозяину
и поражают обычно не более одного вида в комплексе вредителей. С одной
стороны, это преимущество, но с другой — недостаток. Этот недостаток
можно преодолеть, сочетая действие вируса с другими средствами борьбы.
Основными преимуществами вирусных препаратов перед химическими и
бактериальными являются ярко выраженная видоспецнфичиость и вытекаю-
щая отсюда безвредность для насекомых, птиц, млекопитающих н человека,
сохранение вируса в течение длительного времени вне насекомых (до 10—
15 лет), устойчивость к температурным воздействиям окружающей среды,
колебаниям влажности в почве н т. п.
Вирусы размножаются только в живой ткани, и это создает определен-
ные трудности.
181
Производство вирусных препаратов основано на размножении вирусов
на насекомых-хозяевах. Затем мертвых я отмирающих насекомых измель-
чают, выделяют вирус часто с последующей очисткой.
В Советском Союзе получены н проходят государственные испытания
трн вирусных препарата: вирин-ЭКС (против капустной совки), вирин-ЭНШ
(против непарного шелкопряда) и АББ (против американской белой ба-
бочки).
Производство вирусных препаратов начинается с массового разведении
насекомого-хозяина на искусственных средах. На определенной стадии раз-
вития насекомых заражают, добавляя вирусную суспензию к корму. Ино-
кулят для начала производства получают от нескольких больных личинок.
Через 7—9 сут собирают погибших гусениц и подсушивают их при темпера-
туре 33—35 °C. После измельчения к полученной массе добавляют физиоло-
гический раствор илн дистиллированную воду из расчета не более 1 мл иа
гусеницу. Взвесь измельченных тканей фильтруют. При получении внрнн-
ЭКС полиэдры осаждают из фильтрата центрифугированием. Осадок суспен-
дируют в небольшом количестве физиологического раствора н заливают гли-
церином. После проверки титра разводят до содержания 1 млрд, полиэдров
в 1 мл. Разливают во флаконы в количествах, соответствующих одной или
нескольким га-нормам.
Описанная технология позволяет получать в 5—10 тыс. раз больше ви-
руса, чем было израсходовано для заражения. Одна зрелая гусеница дает
около 36 млрд, телец-включений, что составляет примерно 30 % ее сухой
массы.
Вирусные препараты могут быть приготовлены в форме дустов, суспен-
зий и масляных форм.
Прн производстве внрин-ЭНШ в фильтрат добавляют лактозу, а после
перемешивания — ацетон в соотношении 4 : 1 к объему суспензии. После от-
стаивания надосадочиую жидкость сливают, а осадок подсушивают до пол-
ного испарения ацетона.
Прн получении дуста высушенный осадок смешивают с каолином до по-
лучения титра 1 млрд, полиэдров в 1 г.
Для получения масляной формы препарата осадок смешивают
с 50 %-иым глицерином и доводит титр до 2 млрд, в 1 мл, после чего сме-
шивают с равным объемом солярового масла и после перемешивания раз-
ливают во флаконы. Масло в глицерин должны быть предварительно про-
стерилнзованы.
В настоящее время предлагается два метода использования вирусных
препаратов:
интродукция вируса в плотные популяции насекомых на ограниченном
пространстве. Прн этом достаточно однократного внесения небольших коли-
честв вируса в популяцию для возникновения эпизоотии (вспышка болезни,
прн которой наблюдается множество случаев заболевания). Эффект наблю-
дается в том случае, если энтомопатогенный вирус не встречается в попу-
ляции насекомого;
обработка зараженных участков путем опрыскивания нлн опыления в пе-
риод отрождеиия личинок или на ранних фазах их развития. Эффект при
этом наблюдается при массированном покрытии защищаемых растений илн
в результате повторных обработок.
7.4. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ УДОБРЕНИЯ
В повышении плодородия почвы большая роль принадлежит различным
почвенным микроорганизмам, которые в процессе своего роста и развития
улучшают структуру почвы, накапливают питательные вещества для расте-
ний, способствуют повышению коэффициента использования минеральных
и органических удобрений, и тем самым повышению урожая. Деятельность
почвенных микроорганизмов стимулирует применение различных бактериаль-
ных удобрений, которые обогащают почву н особенно ризосферу растений
182
полезной микрофлорой. В почве связанный азот представлен в основном че-
тырьмя видами соединений: азотом аммонийных солей азотом ни-
тратов (NO^), органическим азотом белков и продуктов их расщепления —
аминокислот, пептидов, аминов и амидов, а также азотом гумуса.
Аммонийный н нитратный азот лучше усваиваются растениями, чем его
органические соединения, за исключением мочевины, аспарагина и глутамина,
т/е. соединений, от которых легко отщепляется аммонийный азот. Поэтому
в природных условиях большое значение для питания растений азотом имеют
почвенные микроорганизмы, которые минерализуют содержащийся в почве
органический азот, превращая его в конечном счете в аммиак, являющийся
тем исходным соедниением, которое используют растения для синтеза амино-
кислот н белков.
С. Н. Виноградский в 1893 г. впервые выделил почвенную анаэробную
спороносную бактерию, способную фиксировать молекулярный азот, и на-
звал ее в честь великого естествоиспытателя Л. Пастера — Clostridium pasteu-
rianum. Позднее, в 1901 г„ Бейеринк открыл вторую свободножнвущую азот-
фиксирующую бактерию Azotobacter. Аэробный характер обмена Azotobac-
ter обусловливает более высокую продуктивность азотофиксации, чем у С1.
pasteurianum, поэтому практическое применение иашли представители рода
Azotobacter.
Практическое применение нашли также симбиотические бактерии рода
Rhizobium, поселяющиеся в клубеньках корней некоторых растений. Способ-
ность бобовых растений усваивать азот атмосферы обусловлена именно жизне-
деятельностью этих симбиотических азотофиксаторов.
В практике сельского хозяйства широкое распространение получили сле-
дующие бактериальные удобрения: нитрагин, азотобактерин, фосфоробак-
терин.
Нитрагин. Представляет собой препарат клубеньковых бактерий рода
Rhizobium, которые в симбиозе с бобовыми растениями фиксируют азот
атмосферы, обеспечивая тем самым азотное питание растений. Чистая куль-
тура клубеньковых бактерий была выделена Бейерииком в 1888 г. Клубень-
ковые бактерии — аэробные, мелкие иногда подвижные, бесспоровые, грам-
отрицательные палочки, размером (0,54-0,9) xl,2X3,0 мкм. Прн старении они
теряют подвижность н приобретают вздутые, грушевидные илн ветвистые
изогнутые формы, называемые бактероидами. Существует связь между на-
личием бактероидов в клубеньках растений и интенсивностью фиксации азота.
По скорости роста на питательных средах клубеньковые бактерия делят на
быстрорастущие и медленнорастущие.
Различают активные, малоактивные и неактивные культуры клубенько-
вых бактерий. Под активностью клубеньковых бактерий понимают способ-
ность нх в симбиозе с бобовым растением усваивать атмосферный азот и
снабжать этим азотом растение. Необходимо подчеркнуть, что активность
клубеньковых бактерий непосредственно связана со специфичностью. По ряду
признаков клубеньки, образованные активными культурами Rhizobium, отли-
чаются от клубеньков, сформированных неэффективными штаммами. В част-
ности, активные формы окрашены в розовый тон благодаря наличию в ннх
пигмента леггемоглобина, близкого по составу к гемоглобину крови живот-
ных. Неэффективные клубеньки имеют зеленоватую окраску.
Процесс азотофиксации протекает только в клубеньках на корневой си-
стеме бобовых растений, образуемых под влиянием проникающих в корень
бактерии. Как правило, проникновение клубеньковых бактерий в корни бо-
бовых происходит через корневые волоски. Взаимоотношения бобовых рас-
тений с клубеньковыми бактериями зависят от условий роста растений н их
физиологического состояния, а также определяются основными свойствами
бактерий — вирулентностью и активностью. Под вирулентностью понимают
способность бактерий проникать через корневые волоски внутрь корня бобо-
вого растения и вызывать образование клубеньков. Большое значение имеет
скорость этого проникновения. Клубеньковые бактерии обладают избира-
тельной способностью в отношении инфицирования растений, которая поло-
183
жена в основу классификации этих бактерий внутри рода Rhizobium. Эта
классификация бактерий представлена ниже.
Вид бактерий
Rh. leguminosarum Горох,
Rh. phaseoli
Rh. japonicum
Rh. vigna
Rh. cicer
Rh. lupini
Rh. trifolii
Rh. moliioti
Rh. simplex
Rh. lotus
Rh. robini
Растение-хозяин
вика, кормовые бобы, чина, чечевица
Фасоль
Соя
Вигна, мане, арахис
Нут
Люпин, сараделла
Клевер
Люцерна, донник, тригонелла
Эспарцет
Лядвенец
Акация
Согласно современным представлениям процесс азотофнксации — это вос-
становительный процесс превращения газообразного азота в аммиак и даль-
нейшая его ассимиляция. Микроорганизмы, фиксирующие азот, синтезируют
специальный фермент нитрогеназу, в активном центре которого к происхо-
дит активирование чрезвычайно инертной молекулы N=N и восстановление
ее в NH3.
У большинства азотофиксаторов главную роль в ассимиляции образовав-
шегося аммиака играют ферменты (глютаминеннтетаза, глютаматсинтаза,
глютаматдегидрогеназа). Результатом их действия является образование из
аммиака глутамина и глутаминовой кислоты, которые в дальнейшем ис-
пользуются клеткой для биосинтеза белка.
Для роста и развития клубеньковые бактерии требуют наличия в пи-
тательной среде различных источников углерода (сахароза, декстрины, маль-
тоза, левулеза и др.), органических и минеральных форм азота, в том числе
аминокислот (пролии, аланин, цистин, цистеин, глицин, аспарагиновая). Клу-
беньковые бактерии хорошо растут на средах, содержащих отвар семян бо-
бовых растений, а также кукурузный и пшеничный экстракты. Большое зна-
чение в питании клубеньковых бактерий имеют калий, кальций, фосфор,
магний н некоторые микроэлементы (железо, марганец, молибдеи и др).
Оптимальиые температуры для развития клубеньковых бактерий 26—
28 °C, pH в интервале 6,5—7,5.
Микробиологическая промышленность Советского Союза выпускает нит-
рагин двух видов: почвенный и сухой. Почвенный нитрагин — культура клу-
беньковых бактерий, размноженная в стерильиой почве. В 1 г препарата
содержится ие менее 300 млн. клубеньковых бактерий. Технология произ-
водства почвенного нитрагина недостаточно совершенна, а поэтому не всегда
обеспечивается высокое качество препарата. Такие процессы, как приготов-
ление и дозировка среды, инокуляция субстрата, не механизированы. Много
осложнений вызывают заготовка плодородной почвы, ее стерилизация, транс-
портировка препарата. При длительных перевозках резко снижается количе-
ство клубеньковых бактерий, необходимых для эффективной инокуляции.
Почвенный препарат также неудобен в применении. При влажной нитраги-
низации увлажняется, перелопачивается и подсушивается большое количе-
ство семенного материала.
Сухой нитрагин представляет собой порошок клубеньковых бактерий
с наполнителем (бентонит, торф). Влажность препарата 5—7 %. В 1 г его
содержится в среднем не менее 9 млрд, жизнеспособных клубеньковых бак-
терий. По эффективности действия сухой нитрагин не уступает почвенному,
а в ряде случаев превосходит его. После обработки семян гороха сухим
нитрагином в 3—4 раза увеличивались число клубеньков на корнях и одно-
временно количество азота в растениях, а также повышалось содержание
белка в зерие, что способствовало получению полноценного урожая.
_ Следует отметить, что если одна гектарная порция (500 г почвы, засеян-
ной клубеньковыми бактериями) почвенного нитрагина вместе с бутылкой
184
весит 1 кг, то одна гектарная порция сухого нитрагина в 2,5 раза меньше
по массе. Сухим нитрагином семена опыляют, причем этот процесс можно
механизировать. Прн получении сухого препарата в промышленном масштабе
применяют лиофильный способ высушивания клубеньковых бактерий, что
позволяет длительное время сохранять жизнеспособность клеток.
Для получения в промышленных условиях сухого иитрагниа высокого
качества (основной показатель — число жизнеспособных клеток в 1 г пре-
парата) проводится предварительная оценка штаммов на нх продуктивность
и устойчивость к высушиванию. Для каждой культуры бобовых растений
нитрагин готовят из проверенных соответствующих культур группы клубень-
ковых бактерий, которые мик^юбиологи получают в результате тщательного
отбора, исходя из способности фиксировать азот и интенсивности проникно-
вения в корневую систему растений. Например, семена фасоли обрабатывают
нитрагином для этой культуры, семена гороха — нитрагином для гороха.
Ниже приведена технология производства сухого нитрагина.
Размножение посевной культуры на агаризованных средах
Размножение посевной культуры в колбах
I
Подготовка инокуляторов и стерилизация питательной среды
I
Выращивание посевного материала в инокуляторе
i
Подготовка ферментатора и стерилизация питательной среды
I
Выращивание культуры в ферментаторе
Сепарирование культуральной жидкости, получение и смешивание
пасты с защитными средами
I
Высушивание
1
Размалывание и смешивание культуры с наполнителем
I
Фасовка и упаковка продукта
Для получения посевного материала исходную культуру клубеньковых
бактерий, выращенную иа агаризованных средах (отвар семян бобовых,
1 % сахарозы, 2 % агара), культивируют в жидкой питательной среде в те-
чение 24—48 ч при температуре 28—30 °C и pH 6,5—7,5. На всех этапах
производства сухого нитрагина жидкие питательные среды содержат веще-
ства минеральные — NaHCOa, (NH4)iSO4, MgSO4, К2НРО4, NaCl н др.—
и органические — мелассу, кукурузный экстракт. Выросшей культурой, содер-
жащей до 8—10 млрд, клеток в 1 мл, засевают 100—250-лнтровые посевные
ннокуляторы. Культивирование при температуре 30 °C продолжается 18—
24 ч, титр клеток возрастает до 2 млрд./мл. Из инокулятора готовая посев-
ная культура клубеньковых бактерий передается для засева производствен-
ных ферментаторов. Культивирование продолжается при температуре 28—
30 °C в течение 48—72 ч при pH 6,5—7,2, а также интенсивном перемеши-
вании и аэрации (1 :0,8). После стадии ферментации титр клеток возра-
стает до 10 млрд./мл. Биомассу от культуральной жидкости отделяют на
сепараторах (частота вращения 4500—10 000 об/мин). Получаемую пасту 70—
80%-иой влажности смешивают с защитной средой, содержащей 20 % ме-
185
лассы и 1 % тиомочевииы. Обезвоживание или сублимация клубеньковых
бактерий (до 2—5 % остаточной влажности) проводится под вакуумом
(остаточное давление 10—13 кПа) при 30—35 °C. Высушенную биомассу
размалывают иа шаровых мельницах и смешивают с наполнителем (каолин,
торф, бентонит) до получения препаратов, содержащих в среднем не менее
9—10 млрд, клубеньковых бактерий. Препарат сухого нитрагина фасуют и
герметизируют в полиэтиленовых мешках, хранят при температуре ие выше
15 сС.
Азотобактерии. Представляет собой препарат аэробной бесспоровой
культуры свободноживущего почвенного микроорганизма Azotobacter chro-
ococcum, способного фиксировать (до 20 мг/г использованного сахара) атмо-
сферный азот.
Молодые клетки Azotobacter имеют вид коротких палочек с закруглен-
ными концами размером (2,0-j-7,0) X 1,0x2,5 мкм. При старении клетки ста-
новятся округлыми, покрываются слизью, которая уплотняется и превраща-
ется в защитную капсулу.
Для роста и развития культуры в качестве источника углерода приме-
няются спирты, в частности маиинт, кислоты, лактоза и др. При наличии
в питательной среде нескольких источников углерода сии используются азо-
тобактером в порядке доступности. Среди источников азота микроорганизм
ассимилирует соли аммония, азотистой и азотной кислот, мочевину и не
усваивает моиокарбоновые аминокислоты (лизин, аргинии, гистидин, алаиин,
глицин), производные пурина и пиримидина. Азотобактер особенно чувстви-
телен к содержанию в среде фосфора, источником которого могут быть
органические и неорганические фосфорсодержащие соединения. Отсутствие
его резко замедляет развитие бактерпй и снижает азотофиксацию. Стимули-
рующее действие иа азотофиксирующую активность микроорганизма оказы-
вают соединения молибдена, поэтому его соли всегда добавляют в пита-
тельную среду.
Технология производства сухого азотобактерина аналогична таковой су-
хого нитрагина. Готовый препарат фасуют в полиэтиленовые мешки, которые
герметизируют в связи с гигроскопичностью препарата. Сухой азотобактерин
хранят при температуре не выше 15 °C.
В практике встречаются и другие виды азотобактерина, например почвен-
ный и торфяной. Для их приготовления используют богатую перегноем почву
или разлагающийся торф с нейтральной реакцией среды. К просеянной
почве или торфу добавляют 1—2 % извести и 0,1 % суперфосфата. Затем
по 500 г этой смеси переносят в бутылки иа 0,5 л, увлажняют водой до
40—60 % (по объему), закрывают ватными пробками и стерилизуют. На
агаровых средах, содержащих 1—2 % сахарозы и минеральные соли, выра-
щивают посевной материал. Культуру выращивают при температуре 26—
27 °C около 72—120 ч до тех пор, пока поверхность агара не покроется
слизистой массой. Массу клеток стерильно смывают водой и переносят
в стерильную почву или торф. Содержимое тщательно перемешивают, а за-
тем термостатируют при 25—27 °C. В каждом грамме почвы или торфа
должно быть не меиее 50 мли. клеток. Длительность хранения препарата
2—3 мес. На обработку семяи для засева 1 га пашни требуется 3—6 кг
почвенного азотобактерина.
С начала 30-х годов азотобактерии применяли как аналог азотных удоб-
рений. Позднее выяснилась способность Azotobacter продуцировать биологи-
чески активные вещества, и его действие иа растение стали связывать ие
только с процессом азотофиксации и улучшения азотного питания растений,
но и с поступлением в растения вырабатываемых им биологически активных
соединений. Азот, фиксируемый Azotobacter, существенно повлиять иа вели-
чину урожая не может. Вместе с тем ои иесомиеино в определенных усло-
виях улучшает рост растений. Последнее объясняется еще и тем, что данный
микроорганизм синтезирует комплекс биологически активных вешеств: нико-
тиновую и пантотеновую кислоты, пиридоксин, биотин, гетероауксин, гиббе-
реллин н, возможно, другие соединения. Комплекс этих соединений способен
стимулировать прорастание семян растений и ускорять их рост. Установлено,
186
что Azotobacter способен выделять фунгицидные вещества, относящиеся
к группе анисомицнна. Поэтому при бактеризации в ризосфере угнетается
развитие микроскопических грибов, многие из которых задерживают рост
растений. Эти бактерии весьма требовательны к условиям среды и активно
развиваются лишь в плодородных почвах. Эффект азотобактерина определя-
ется численностью клеток даже в плодородной почве.
Фосфоробактерин. Препарат содержит споры культуры Bacillus mega-
terium var. phosphaticum, которые превращают сложные фосфорорганиче-
ские соедииеиня (нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды и др.) и трудио-
усвояемые минеральные фосфаты в доступную для растений форму. По мор-
фологическим и культуральным признакам Вас. megaterium представляет со-
бой мелкие, аэробные, спорообразующие палочки размером (54-6) X (1»8-=-
4-2) мкм. Бактерии размножаются иа питательных средах с глюкозой, саха-
розой, мальтозой, которые служат источником углерода. В качестве источ-
ника азота используют аспарагин, пептон, сульфат аммония. На средах
с нитратами растут хуже, восстанавливая нитратный азот до нитритов и
аммиака. В присутствии серосодержащих аминокислот бактерии выделяют
сероводород.
Фосфоробактерин — бактериальное удобрение, широко применяемое
в сельском хозяйстве Советского Союза. Считается, что фосфоробактерин
более эффективен при использовании иа черноземных почвах, где запас
фосфорооргаиических соединений особенно велик.
Фосфоробактерин нельзя сопоставить по эффективности с минеральными
фосфорными удобрениями. Он не может заменить фосфорные удобрения и
не действует без них. Эффективность фосфоробактерииа иа почвах, удобрен-
ных суперфосфатом, повышается, что до известной степени зависит от дозы
нанесенного иа семена фосфоробактерииа. Это, видимо, связано с биологи-
чески активными веществами вырабатываемыми Вас. megaterium,— тиамином,
пиридоксином, биотином, пантотеновой и никотиновой кислотами, витами-
ном В12 и др.
Биологически активные вещества при бактеризации попадают иа семя
растения, а затем и в его ткаии, оии благоприятно действуют иа первых эта-
пах роста и развития растений. Это способствует улучшению ие только фосфор-
ного, но и азотного питания растений, т. е. усиливается усвоение всех пита-
тельных элементов.
В целом можно считать, что фосфоробактерин является препаратом сти-
мулирующего действия. Технология производства фосфоробактерииа суще-
ственно ие отличается от таковой, применяемой для получения сухого нитра-
гина и азотобактерина.
Лиофилизированная культура Вас. megaterium размножается в глубин-
ных условиях иа среде следующего состава (в %): кукурузный экстракт
1,8, меласса 1,5, сульфат аммония 0,1, мел 1,0. Выращивание проводят
в ферментаторах при температуре 28—30 СС в течение 30—48 ч прн pH
6,5—7,5 иа той же среде в аэробных условиях до стадии образования спор.
Многие штаммы Вас. megaterium чувствительны к действию бактериофагов
поэтому иа стадии ферментации может возникнуть фаголизис. В одних слу-
чаях лизируется вся бактериальная масса, в других снижается число бакте-
риальных клеток. Причина фаголизиса — инфицирование культуры извне илн
образование специфических форм бактериофагов иа различных этапах про-
изводства. В комплексе мероприятий по борьбе с фаголизисом особое вни-
мание уделяется стерильности процесса на всех этапах производства бакте-
риальных препаратов, а также селекции и отбору устойчивых к фагам про-
изводственных культур. От культуральной жидкости выросшую биомассу
отделяют центрифугированием. Затем ее высушивают при 65—75 СС в су-
шилках распылительного типа. Остаточная влажность препарата 2—3 %
При высушивании ои относительно стабилен в отличие от сухого нитрагина
и азотобактерина. Сухой фосфоробактерин хранят при комнатной температуре,
в течение года жизнеспособность теряют ие более 20 % клеток. В 1 г препа-
рата должно быть ие меиее 8 млрд, жизнеспособных клеток.
187
Глава 8. ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
Ферменты — органические катализаторы белковой природы,
обладающие большой специфичностью к субстрату. Оин обес-
печивают последовательность н взаимосвязанность многих
сложных биохимических превращений в клетках растений, жи-
вотных и микроорганизмов. Успехи в исследовании структуры
ферментов — а известно их в настоящее время более 1000—
позволили установить, что многие из них являются двухкомпо-
нентиыми, т. е. состоят из белкового компонента (апофер-
мента) и связанного с ним кофермента. Коферментами (коэн-
зимами) принято называть органические соединения небелко-
вой природы, участвующие в катализируемых ферментами
превращениях в качестве обязательных кофакторов.
Каталитическое действие ферментов отличается исключи-
тельной эффективностью, не имеющей себе равных при иефер-
ментатнвиом катализе. Сложнейшие химические реакции бла-
годаря ферментам протекают в водных растворах при обычной
температуре и давлении в течение секунд и даже долей се-
кунд, не требуя сильнодействующих кислот и щелочей.
В биологии и медицине трудно назвать такие теоретические
и практические разработки, в которых существенную роль не
играли бы ферменты. Мы знаем теперь, что генетические струк-
туры, ответственные за передачу наследственной информации,
контролируются и управляются путем прямых или косвенных
воздействий на ферменты и катализируемые имн реакции.
В тонких различиях химического строения и свойств опреде-
ленных ферментов мы находим выражение видовых особенно-
стей организмов, в нарушениях биосинтеза илн действия фер-
ментов — исходное звено в патогенезе многих наследственных
и других заболеваний.
Ферментные препараты в качестве биокатализаторов мно-
гих биохимических реакций и процессов находят самое широ-
кое применение в различных отраслях промышленности. Од-
ними нз основных потребителей ферментных препаратов явля-
ются пищевая промышленность н сельское хозяйство.
Основные источники ферментов — тканн и органы живот-
ных, различные растения, микроорганизмы. Особенно большое
количество ферментов синтезируют дрожжи, микроскопические
грибы, актииомицеты, бактерии. Преимущество микроорганиз-
мов заключается в том, что они быстро растут на дешевых пи-
тательных субстратах.
Для промышленного производства ферментных препаратов
используют микроорганизмы, выделенные из природных источ-
ников, и мутантные штаммы, полученные в результате дейст-
вия мутагенов физической н химической природы. В резуль-
тате селекционных исследований получены микроорганизмы,
способные синтезировать одновременно комплекс различных
188
ферментов, но среди мутантных штаммов встречаются и такие,
которые продуцируют в наибольших количествах только один
промышленно важный фермент. Активными продуцентами ами-
лолитических ферментов являются микроскопические грибы
рода Aspergillus (Asp. usamii, Asp. oryzae, Asp. awamori, Asp.
batatae) н Rhizopus (Rh. neveus, Rh. delemar, Rh. japonicum,
Rh. tonnensis), а также отдельные представители Mucor. Боль-
шое количество амилолитических ферментов синтезируют спо-
роносные бактерии Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Ba-
cillus macerans и др.
Средн микроорганизмов — продуцентов протеолитических
ферментов практический интерес представляют микроскопиче-
ские грнбы рода Aspergillus (Asp. terricola, Asp. awamori. Asp.
oryzae, Asp. sojae, Asp. flavus, Asp. saitoi), Rhizopus (Rh. de-
lemar, Rh. niveus, Rh. chinensis), Penicillium (Pen. notatuni,
Pen. chrysogenum, Pen. janthinellum). Известно много споро-
носных бактерий рода Bacillus, способных образовывать боль-
шое количество протеолитических ферментов: Вас. subtilis,
Вас. mesentericus, Вас. megaterium, Вас. brevis, Вас. amylo-
liguefaciens, Вас. fusiformis и др.
Протеолитические ферменты образуют также бактерии Вас.
felseneus, Вас. polymyxa и дрожжи Saccharomyces fragilis.
Продуцентами пектолитнческих ферментов являются аэ-
робные микроорганизмы—бактерии, микроскопические грибы,
дрожжи. Наибольшая продуцирующая способность обнару-
жена у микроскопических грибов рода Aspergillus (Asp. foeti-
dus, Asp. awamori, Asp. saitoi, Asp. terreus, Asp. niger) и Pe-
nicillium (Pen. citrinum, Pen. glaucum, Pen. expansum). Про-
дуцентами пектиназы могут быть строгие анаэробы рода Clos-
tridium. Штамм Cl. pectinofermentans 15 был получен селек-
ционным путем в результате комбинированного действия му-
тагенов физической и химической природы.
Активными продуцентами целлюлолитических ферментов яв-
ляются представители многих родов микроорганизмов: Asper-
gillus (Asp. flavus, Asp. terreus, Asp. fumigatus, Asp. oryzae),
Trichoderma (Tr. lignorum, Tr. viride, Tr. roseum), Penicillium
(Pen. notatum, Pen. variabile), Fusarium (F. solani, F. culmo-
rum) н др.
6.1. НОМЕНКЛАТУРА
ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Препараты ферментов, вырабатываемые промышленностью,
кроме основного активного белка — комплекса ферментов со-
держат и различные балластные вещества. Наименование пре-
парата складывается из сокращенного названия основного фер-
мента н видового названия микроорганизма-продуцента. Напри
мер, препарат, содержащий в своей основе протеолитические
ферменты («прот») и полученный при помощи культуры Asp.
189
oryzae (измененное видовое название продуцента «орнзин»), на-
зывается проторизии. В наименовании препарата отражаются
также способы культивирования микроорганизмов. Препарат,
полученный в результате поверхностного культивирования,
обозначается индексом «П>, при глубинном — индексом «Г».
Например, поверхностная культура гриба Asp. awamori — про-
дуцента глюкоамилазы называется глюкавамории Пх, глубин-
ная— глюкавамории Гх. Индексом «х» обозначается количе-
ство фермента в стандартной (культура продуцента с опреде-
ленной активностью на единицу массы) глубинной или
поверхностной культурах. Цифра перед индексом «х» указы-
вает на степень концентрирования и очистки ферментного пре-
парата.
Препараты ферментов, полученные в виде концентрирован-
ных снропов, освобожденных от нерастворимых веществ, обо-
значаются индексами П2х и Г2х. Для поверхностной культуры
это концентрат с содержанием 50 % СВ, для глубинной — кон-
центрат с содержанием не более 40 % СВ. Сухие ферментные
препараты, получаемые высушиванием путем распыления экст-
ракта поверхностной культуры илн концентрирования фильт-
рата культуральной жидкости, полученного при глубинном
культивировании в вакуум-выпарных установках с последую-
щей сушкой концентратов на распылительных сушилках имеют
соответственно индексы ПЗх и ГЗх. Ферментные препараты
с индексом 2х и Зх относятся к техническим.
Препараты очищенных ферментов, в технологической схеме
производства которых использованы различные методы очи-
стки и фракционирования, обозначаются соответственно ПЮх,
ГЮх, П15х и Г15х.
Высокоочищеиные, но ие кристаллические ферментные пре-
параты, содержащие до 20—25 % балластных веществ, полу-
ченные методом концентрирования и очистки диффузионных
экстрактов или культуральной жидкости на ультрафильтраци-
онных установках с последующей сушкой концентратов на рас-
пылительных сушилках, в зависимости от степени очистки
обозначаются индексами П20х, ПЗОх, Г20х и т. Д. (табл. 8.1)
Любой ферментный препарат должен быть охарактеризо-
ван по его ферментативной активности, которая обычно выра-
жается в стандартных единицах. За стандартную единицу ак-
тивности любого фермента принимается такое его количество,
которое катализирует превращение одного микромоля
(1 мкМоль) субстрата за одну минуту при заданных стандарт-
ных условиях. Содержание ферментов в препаратах условно
выражается в стандартных единицах активности на 1 г сухого
препарата или на 1 мл раствора. Для определения активности
ферментов применяются различные методы — химические, внс-
кознметрические, хроматографические, газометрические, поля-
риметрические и спектроскопические.
190
Таблица 8.1 Характеристика ферментных препаратов
Название препарата Краткая характеристика и способы получения Продуцент
Амилоризин
Пх
Глюкавамории
Пх
Пектавамории
Пх
Мальтава-
морин П2х
Амилоризин
ПЮх
Проторизии
Амилоризин
П20х
Глюкавамо-
рин ПЮх
Прототерри-
зни ПЮх
Пектавамо-
рии ПЮх
Пектофоети-
дни ПЮх
Протосубти-
лни ГЗх
Амилосубти-
лин ГЗх
Протосубти-
лнн ГЮх
Амилосубти-
лии ГЮх
Высушенная поверхностная культу-
ра гриба, выращенная иа пшенич-
ных отрубях. Содержит главным об-
разом амилолитические ферменты
То же
Высушенная поверхностная культу-
ра гриба, выращенная на свекло-
вичном жоме и пшеничных отрубях.
Содержит главным образом пектоли-
тические ферменты
Препарат в виде сиропа из поверх-
ностной культуры. Получается кон-
центрированием диффузионной вы-
тяжки в вакуум-выпарном аппарате.
Содержит в основном мальтазу и
гиалуронидазу
Препарат в виде порошка из поверх-
ностной культуры. Получается оса-
ждением этанолом из диффузионной
вытяжки. Содержит в основном ами-
лазу и протеазу
То же. Содержит в основном про-
теазу
То же. Содержит в основном ами-
лазу
То же. Содержит в основном амило-
литические ферменты
То же. Содержит в основном нейт-
ральную протеазу
То же. Содержит в основном пекто-
литическне ферменты и кислото-
устойчивую протеазу
То же. Содержит в основном пекто-
литические ферменты и кислото-
устойчивую протеазу
Препарат в виде порошка из глу-
бинной культуры. Получается вы-
сушиванием концентрата культу-
ральной жидкости в распылитель-
ной сушилке. Содержит в основном
протеолитические ферменты
То же. Содержит в основном амило-
литические ферменты
Препарат в виде порошка глубинной
культуры. Получается осаждением
ацетоном или этанолом из концент-
рата культуральной жидкости. Содер-
жит в основном протеолитические
ферменты
То же. Содержит в основном амило-
литические ферменты и 0-глюканазу
Asp. oryzae 740-А-2
Asp. awamori 22
Asp. awamori 16
Asp. awamori 22
Asp. oryzae 740-A-2
Asp. oryzae КС
Asp. oryzae КС
Asp. awamori 22
Asp. terricola 3374
Asp. awamori 16
Asp. foetidus 45
Вас. subtilis 103
Вас. subtilis 103
Вас. subtilis 103
Вас. subtilis 103
191
Продолжение
Название препарата Краткая характеристика и способы получения Продуцент
Протосубти-
лин ГЮх (щ)
Пектаваморин
ГЗх
Пектофоети-
дин ГЗх
Пектокло-
стридин ГЗх
Ксилавамо-
рин ГЗх
Глюкоз ндоми-
копсин ГЗх
Пектаваморин
ГЮх
Пектофоети-
дии ГЮх
Пектокло-
стрндин ГЮх
Амиломезен-
терин Г5х
Протомезен-
терин Г5х
Реннииоме-
зентерин ГЮх
Протомезеи-
терин ГЮх
Амиломезеи-
терии Г15х
Амилосубти-
лии Г15х
Препарат в виде порошка нз глу-
бинной культуры. Получается осаж-
дением этанолом нз концентрата
культуральной жидкости. Содержит в
основном щелочную протеазу
Препарат в виде порошка нз глу-
бинной культуры. Получается высу-
шиванием концентрата культураль-
ной жидкости в распылительной су-
шилке. Содержит в основном пекто-
литические ферменты
То же. Содержит в основном пекто-
литическне ферменты
То же. Содержит пектиназы и пек-
ти нтрансэл ими в а зу
То же. Содержит в основном геми-
целлюлазу
То же. Содержит в основном амило-
литические ферменты
Препарат в виде порошка. Полу-
чается осаждением этанолом из кон-
центрата культуральной жидкости.
Содержит в основном пектолитические
ферменты
То же. Содержит в основном пекто-
литическне ферменты и кислото-
устойчивую протеазу
То же. Содержит в основном пекти-
назы и пектинтрансэлнминазу
Препарат в виде порошка. Полу-
чается высушиванием в сублима-
ционной сушилке сорбата после
сорбции амилазы на модифициро-
ванном крахмале. Содержит в ос-
новном амилолитические ферменты
То же. Получается высушиванием
в распылительной сушилке после
отделения амилазы сорбцией
То же. Содержит в основном моло-
косвертываюший фермент и протеазу
То же. Содержит в основном ней-
тральную протеазу
Препарат в виде порошка. Полу-
чается осаждением сульфатом аммо-
ния из концентрата культуральной
жидкости. Содержит в основном
амилолитические ферменты
То же. Содержит в основном амило-
литические ферменты
Вас. subtilis 72
Asp. awamori 16
Asp. foetidus 45
Cl. pectinoferinen-
tans 15
Asp. awamori 16-4E
End. species
Asp. awamori 16
Asp. foetidus 45
Cl. pectinoferme fl-
tans 15
Вас. mesentericus ПБ
Вас. mesentericus ПБ
Вас. mesentericus ПБ
Вас. mesentericus ПБ
Вас. mesentericus ПБ
Вас. subtilis 103
192
Продолжение
Название препарата Краткая характеристика и способы получения Продуцент
Дмилоризни Них Препарат в виде порошка. Полу- чается осаждением ацетоном или эта- нолом нз концентрата культураль- ной жидкости. Содержит в основном амилолитические ферменты Asp. oryzae 3-9-15
Прототерри- зин ГЮх Препарат в виде порошка. Полу- чается осаждением этанолом из кон- центрата культуральной жидкости. Содержит в основном протеолитиче- ские ферменты Asp. tern col а 3374
Целловири- днн ГЗх Препарат в виде порошка. Полу- чается высушиванием концентрата культуральной жидкости в распы- лительной сушилке. Содержит в ос- новном целлюлолитические ферменты Tr. viride
Целловири- дии П10х Препарат в виде порошка. Полу- чается осаждением этанолом из диф- фузионной вытяжки поверхностной культуры. Содержит в основном целлюлолитические ферменты » »
Целловирн- дин Пх Высушенная поверхностная культу- ра гриба, выращенная иа пшенич- ных отрубях и свекловичном жоме. Содержит в основном целлюлолити- ческие ферменты
Амилорнзин П20х Препарат в виде порошка из поверх- ностной культуры. Получается высу- шиванием ультраконцентрата диф- фузионного экстракта в распыли- тельной сушилке. Содержит в ос- новном амилолитические ферменты Asp. oryzae 740-A2
Протосубти- лии Г20х Препарат в виде порошка из глу- бинной культуры. Получается высу- шиванием ультракоицеитрата куль- туральной жидкости в распылитель- ной сушилке. Содержит в основном протеолитические ферменты Вас. subtilis 103
Ранив иомезеи терии Г20х - То же. Содержит молокосвертываю- щий фермент и протеазу Вас. mesentericus ПБ
Пектавамо- рнн Г20х То же. Содержит в основном пекто- литические ферменты Азр. awamori 16
Пектокло- То же. Содержит в основном пекти- Q. pectinofermen-
стридин Г20х и азы и пектинтрансэлимииазу tans 15
7 Заказ № 1536
193
8.2. ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА
ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Производство ферментных препаратов осуществляется
двумя способами — поверхностным и глубинным. Поверхност-
ный способ в основном применяется для культивирования мик-
роскопических грибов. В его основе выращивание микроорга-
низмов на твердых (реже жидких), рыхлых питательных сре-
дах; при глубинном культивировании микроорганизмы выра-
щивают в толще жидких питательных сред. В этих условиях
можно культивировать как аэробные, так и анаэробные мик-
роорганизмы.
Поверхностный способ. Технологический процесс производ-
ства ферментных препаратов при поверхностном культивирова-
нии мнкрооргаиизмов-продуцентов состоит из следующих ос-
новных стадий: получение посевного материала, приготовление
питательной среды, выращивание культуры микроорганизма»
сушка культуры или выделение из культуры очищенных пре-
паратов ферментов.
Получение посевного материала. Для промыш-
ленного получения ферментных препаратов из микроорганиз-
мов, выращиваемых в поверхностных условиях, в качестве по-
севного материала используют культуру микроскопических
грибов, выращенную на твердой питательной среде, а также
споры (коиидии) и мицелиальную массу продуцента, выращен-
ного в глубинных условиях на жидкой питательной среде. Для
получения посевной культуры иа твердой питательной среде ис-
пользуют увлажненные пшеничные отруби. Среда должна быть
рыхлой. С этой целью к пшеничным отрубям добавляют 5—
10% древесных опнлок или 15—20 % солодовых ростков. По-
сле стерилизации в течение часа при 0,15 МПа влажность пи-
тательной среды должна составлять 35—60 %.
Питательную среду, охлажденную до 35 °C, засевают сус-
пензией конидий (500—600 тыс. конидий в 1 мл на 10—15 г
отрубей), а затем раскладывают слоем 10 — 15 см по стериль-
ным посевным кюветам. Закрытые кюветы со средой помещают
в растильные камеры, где поддерживают определенную влаж-
ность и температуру. Для большинства микроскопических гри-
бов в первые сутки роста поддерживается температура 28—
32 °C, влажность 70—95%; во вторые — 26—30 °C, влажность
60—85%, в третьи — 24—26 °C, влажность 55—64 %. Макси-
мум образования конидий обычно приходится на 72—85-й часы
роста. После этого посевные кюветы выдерживают еще 72—
96 ч при температуре 8 — 10 °C. Подсохшая культура может
сохранять способность к прорастанию конидий в течение 15—
20 сут.
Споровый посевной материал может быть получен из под-
сушенной культуры. Для этого культура гриба подается в внб-
194
росепаратор, где отделяются споры (конидии). С помощью ва-
куума они поступают в приемник, предварительно проходя че-
рез сетчатый фильтр. Такой споровый материал может хра-
ниться в течение 1,5 лет при температуре 8—24 °C. Культиви-
рование посевного материала, например Aspergillus terricola,
глубинным способом проводится в ферментаторах на 8—10 л,
которые заполняют 3 л питательной среды, в течение 24—30 ч
при температуре 30 °C. Полученный посевной материал — глу-
бинную культуру гриба — вносят в стерилизатор со стериль-
ными, охлажденными до температуры 33—34 °C увлажненными
отрубями из расчета 1—2 % исходного глубинного посевного
материала к массе воздушно-сухнх отрубей. Влажность пита-
тельной среды после внесения посевной культуры должна быть
не ниже 58—60 %-
Приготовление питательной среды. Основным
компонентом питательной среды для выращивания микроско-
пических грибов рода Aspergillus поверхностным способом слу-
жат пшеничные отруби, для Tr. roseum — продуцента цитоли-
тических ферментов — зерновая шелуха и солодовые росткн.
Для штамма Asp. awamori 16 при получении пектолитических
ферментов необходим свекловичный жом. Используется смесь,
состоящая из 70 % свекловичного жома (источник пектина)
и 30 % пшеничных отрубей. Нередко используются картофель-
ная мезга и пивная дробииа — отходы предприятий пищевой
промышленности. Для получения рыхлой структуры к средам
добавляют древесные опилки (5—10%), за исключением дубо-
вых, солодовые ростки (15—20%), овсяную шелуху. Пшенич-
ные отруби содержат необходимые для роста н развития мик-
роорганизмов питательные вещества, в том числе незаменимые
аминокислоты метионин (19 %), триптофан (0,3 %) и лизии
(0,6 %), 16—20 % крахмала, 10—12 % белка, до 4 % жира, раз-
личные фосфорные соединения, минеральные соли, микроэле-
менты и некоторые другие вещества.
Подготовка твердых питательных сред для выращивания
микроорганизмов состоит в том, что пшеничные отруби, соло-
довые ростки, опилкн, как правило, смешивают в стерилиза-
торе (50—60 % по объему) н полученную смесь перед стери-
лизацией увлажняют до 20—40 %-ной влажности. Стерилиза-
торы рассчитаны для работы при температуре от 104 до 140 °C
при избыточном давлении до 0,03 МПа. Вместимость стерили-
заторов колеблется от 300 до 500 кг.
Для получения высокоактивных культур существенное зна-
чение имеет начальная влажность питательной среды. Она
обычно колеблется в пределах 58—60 %. Прн повышении
влажности среды ухудшается аэрация растущей культуры,
а при понижении замедляется рост мицелия н снижается ак-
тивность синтезируемых ферментов. В производственных усло-
виях к концу цикла выращивания влажность снижается до
7* t95
35—40 % даже несмотря на поддержание относительной влаж-
ности воздуха, близкой к 100 %.
Выращивание культуры-продуцента в про-
изводственных условиях. В простерилнзованную и ох-
лажденную до температуры 40 °C питательную среду прн не-
прерывном перемешивании вносят посевной материал н сте-
рильную воду с таким расчетом, чтобы конечная влажность
подготовленной среды была 58—60 %- Засеянную конидиями
чистой культуры грибов нли глубинной посевной культурой пи-
тательную среду раскладывают слоем 2—3 см в кюветы или
в вертикальные кассеты толщиной 4—5 см. Выдерживают
обычно прн температуре 28—32 °C в течение 22—40 ч в специ-
альных растильных камерах нлн на механизированных уста-
новках. Готовая культура в кюветах подается к дробилке.
В растильных камерах на 1 м3 объема приходится (по су-
хой массе) от 8 до 18 кг отрубей. Микроорганизмы культиви-
руют при строго определенных температуре, аэрации, влажно-
сти (табл. 8.2).
Таблица 8.2. Параметры культивирования по стадиям роста
Время культивиро- вания, ч Стадия роста Температура. °C Влаж- ность воздуха, %
воздуха среды
8—12 Прорастание конидий 30—32 30—32 98—99
12—24 Образование мицелия 27—28 30—32 99—100
24—30, 36—48 Готовая культура 28—30 28—30 92—94
Общая длительность культивирования составляет, напри-
мер, для Asp. oryzae 30—36 ч, для Asp. awamori (продуцент
амилазы) —36—42 ч, для Asp. awamori (продуцент пекти-
назы) — 46—48 ч, для Asp. terricola — 44—48 ч, для Asp. foeti-
dus — 48—52 ч.
Кондиционирование воздуха, идущего на аэрацию, осуще-
ствляется в кондиционерах. В главном кондиционере воздух,
забираемый из атмосферы, подогревают нли охлаждают в за-
висимости от времени года до температуры 22—24 °C. Затем
последовательно частично воздух обеспложивается на внсцино-
вом н ватиом фильтрах и поступает в индивидуальные конди-
ционеры. В них очищенный воздух подогревается в калори-
фере до температуры 30 °C и увлажняется паром до влажно-
сти, близкой к 100 %.
Рециркулирующий в системе воздух проходит следующую
обработку: забранное воздухом тепло при прохождении через
камеру (установку для выращивания) снимается на воздухо-
охладителе, затем воздух пз главного кондиционера смешива-
ется с 10 % свежего воздуха, доводится до требуемых пара-
метров и вновь поступает в камеру или установку для выра-
196
щивания. Отработанный воздух выбрасывается в атмосферу,
предварительно пройдя масляные н бактериальные фильтры.
Для предохранения растнльной камеры от проникновения не-
обеспложенного воздуха в ней создается небольшое избыточное
давление.
В процессе роста микроскопические грибы потребляют 25—
35 % сухих веществ среды и в результате диссимиляции выде-
ляют в окружающую среду большое количество тепла и диок-
сида углерода. Если избыточное тепло не удалять из растиль-
ных камер, культура подсыхает, снижается ее ферментативная
активность и даже прекращается развитие. Максимальное теп-
ловыделение растущей культурой длится 1—2 ч и составляет
к массе исходных отрубей 335—377 кДж/кг.
Для отвода такого большого количества тепла проводят ин-
тенсивное вентилирование растильных камер кондиционирован-
ным воздухом. Кондиционирование воздуха преследует не-
сколько целей: очистку от пыли и посторонней микрофлоры,
поддержание определенной температуры, насыщение влагой до
содержания, близкого к 100 %. Проходя через растильные ка-
меры, воздух контактирует с растущей культурой гриба, при
этом нагревается на 2—3°С н становится менее насыщенным
влагой, поэтому он способен поглощать воду нз более нагретой
массы растущей культуры, вызывая подсыхание питательной
среды.
Сушка культуры. Выгружаемая из растильней камеры
или установки для выращивания готовая культура микроско-
пических грибов представляет собой брикет (корж) влажно-
стью от 35 до 58 %, в котором частицы питательной среды (от-
руби, зерновая шелуха) связаны мицелием. Это неустойчивый
продукт, в результате выделяющегося тепла ферменты почти
полностью могут инактивироваться в течение 3 ч. Для сохра-
нения культуры в активном состоянии в течение длительного
времени ее необходимо высушить до влажности 10—13 %. Для
интенсификации процесса сушки культуру гриба измельчают
на различных дробилках, дезинтеграторах до частиц разме-
ром 2—3 мм. К этим машинам предъявляются особые требо-
вания. При дроблении культура гриба во избежание инакти-
вации ферментов не должна разогреваться, распыление ее
должно быть минимальным, и получаемые гранулы должны
иметь определенную величину.
Для сушки культуры используют сушилки ленточные, шахт-
ные, вибрационные, прямоточные непрерывного действия и др.
Скорость сушки зависит от многих факторов: химического со-
ства среды, влажности, температуры, скорости движения су-
шильного агента (обычно воздуха), разности температуры на
входе и выходе из сушилки и др. Основным условием успеш-
ного высушивания является максимальное сокращение дли-
тельности пребывания культуры гриба в сушилке до 5—8 мии
197
Рис. 8.1 Технологическая схема установки для выращивания микроскопических грибов в вертикальном слое:
1 — приемный бункер; 2 — шнек-дозатор; 3 — бункер; 4,5 — нории; 6 — стерилизатор; 7 — увлажнитель; 8 — маточник чистой культуры:
воздушный фильтр; 10 — смеситель; 11 — дозатор; 12 — распределительный механизм; 13 — растильная камера; 14 — стол загрузки;
траверзная тележка; 16 — стол выгрузки с вибратором; 17 — качающийся конвейер; 18 — шнековый измельчитель: 19 - сборник;
сборник; 21 камера мойки и стерилизация растильных камер; 22 — распылительная сушилка; 23 — циклоны, 24 — вентилятор
при температуре продукта иа выходе не выше 40—42 °C, что
снижает потерн активности до минимума. Высушенную
культуру гриба фасуют в крафт-мешки по 18—30 кг. Сухая
культура микроскопических грибов товарный продукт.
Технологическая схема получения культуры микроорга-
низма, выращенной поверхностным способом на твердой пита-
тельной среде, представлена на рис. 8.1.
Глубинный способ. Данный способ выращивания микроор-
ганизмов имеет ряд преимуществ по сравнению с поверхност-
ным: позволяет изменять состав питательной среды, обеспечи-
вая максимальный выход того нлн иного фермента, исключает
тяжелый малопроизводительный ручной труд, упрощает меха-
низацию и автоматизацию различных устройств, контролирую-
щих параметры процесса в динамике.
Процесс производства ферментных препаратов прн глубин-
ном культивировании состоит из следующих технологических
стадий: пдУгучение посевного материала, приготовление пита-
тельной среды и ее стерилизация, стерилизация воздуха, выра-
щивание микроорганизмов-продуцентов в производственных
ферментаторах, отделение биомассы от культуральной жидко-
сти, очистка и выделение ферментов.
Получение посевного материала. Для получе-
ния посевного материала микроорганизм-продуцент пересе-
вают в пробирки на скошенную агаризованную питательную
среду. Микроскопические грибы при температуре 28—32 °C вы-
ращивают до обильного коннднеобразования, для бактериальных
культур наиболее благоприятный возраст посевного материала
устанавливают экспериментально. Водную суспензию куль-
туры, выращенной на твердой питательной среде, из расчета
1—5 % пересевают на жидкую питательную среду (50—
100 мл) в колбы иа 750 мл. Культивирование микроскопиче-
ских грибов проводится при температуре 28—32 °C, бактерий—
прн температуре 32—37 °C в течение 30—40 ч иа качалке при
180 200 об/мин. Чтобы обеспечить посевным материалом
большие объемы засеваемой производственной среды, куль-
туру, выросшую в колбах, стерильно переносят в малый, а за-
тем в большой инокулятор. Вместимость больших ниокулято-
ров составляет 10 % от объема производственного фермента-
тора.
Выращивание проводят при указанных выше температурах
Для микроскопических грибов и бактерий при непрерывном пе-
ремешивании и аэрации стерильным воздухом. Расход воздуха
на 1 м3 аэрируемой жидкости обычно составляет 60 м3/ч. Не-
обходимое количество посевного материала зависит от физио-
логических показателей микроорганизма-продуцента. Напри-
мер, если продуцент обильно образует споры, расход посев-
ного материала уменьшается и, наоборот, увеличивается, если
микроорганизм размножается вегетативно. Для актиномицетов
199
расход посевного материала может быть 5—20 %, для споро-
носных бактерий — около 1 %.
Приготовление питательных сред. При глубин-
ном способе культивирования состав питательных сред подби-
рают в зависимости от физиолого-биохимических особенностей
микроорганнзма-продуцеита и того фермента или ферментного
комплекса, который необходимо получить в производственных
условиях. Для приготовления питательных сред для глубин-
ного культивирования основным сырьем служат кукурузная
мука, крахмал пшеничный и картофельный, кукурузный экст-
ракт, свекловичный жом. Источником азота могут быть мине-
ральные солн NaNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3, (NH4)HPO3,
ЫН^НгРОд, (NH4)2HPO4 и азот органических соединений, гид-
ролизаты казеина и дрожжей. В качестве источника углерода
используют различные углеводы, наиболее легко усваиваемые
микроорганизмом,— крахмал, глюкоза, декстрины, мальтоза
и др. •
При биосинтезе целлюлозолитических ферментов источни-
ком углерода в среде может быть целлюлоза (в виде древе-
сины), хлопок, солома; при биосинтезе липолитических фермен-
тов источником углерода служат лнпиды. В состав питатель-
ной среды должны входить такие минеральные вещества, как
фосфор, сера, железо, цинк, калий, кальций, магний н др. Пи-
тательные среды готовят на водопроводной воде. В зависимо-
сти от микроорганизма-продуцента содержание сухих веществ
в средах колеблется от 1,5 до 10 % н более.
Приготовление и стерилизация питательной среды для глу-
бинного культивирования микроорганизмов-продуцентов фер-
ментов не отличаются от общепринятых приемов, применяемых
в производстве других продуктов микробного синтеза.
Технологическая схема культивирования
микроорганизмов-продуцентов ферментов.
Схема представлена на рис. 8.2.
Приготовление питательной среды для выращивания посев-
ного материала и производственного культивирования осу-
ществляется в смесителях. Стерилизацию проводят на уста-
новках типа УНС. Посевной материал, выращенный в инокуля-
торе, подается для засева питательной среды ферментатора.
Для аэрирования растущей культуры в1ииокуляторе и фермен-
таторе воздух проходит подготовку и очистку в аппаратах:
в фильтре предварительной очистки 10, воздуходувке 12, го-
ловном фильтре 11 и индивидуальных фильтрах 8, установлен-
ных у ииокулятора и у каждого ферментатора. Готовая куль-
туральная жидкость насосом 6 перекачивается в сборник 13,
из которого поступает на выделение ферментного препарата.
Производство технических и очищенных ферментных препа-
ратов. Технические и очищенные ферментные препараты пред-
ставляют собой либо жидкости с концентрацией сухих веществ
200
Рис. 8.2. Технологическая схема выращивания микроорганизмов глубинным
методом:
I — смеситель питательной среды; 2 — стерилизатор; 3 — выдерживатель; 4 — редукци-
онный клапан; 5 — теплообменник; 6 — центробежный насос; 7 — инокулятор (маточ-
ник);* S — индивидуальный воздушный фильтр; 9 — ферментатор; 10 — воздушный
фильтр; 11— общий воздушный фильтр; 12 — воздуходувка; /3 —сборник готовой куль-
уры
не менее 50 %, либо порошки различного цвета с определенной
стандартной активностью. Иногда онн содержат один фермент,
по чаще — комплекс ферментов. Технические н очищенные фер-
ментные препараты имеют целый ряд преимуществ по сравне-
нию с сухой культурой грибов. Онн содержат ферменты в бо-
лее концентрированном виде, способны дольше сохраняться без
потерь активности. Кроме того, очищенные ферментные препа-
раты не содержат спор микроорганизмов — продуцентов фер-
ментов.
Технологическая схема получения очищенных ферментных
препаратов при поверхностном илн глубинном способе культи-
вирования состоит из следующих стадий: получение посевного
материала, подготовка и стерилизация питательной среды,
стерилизация воздуха, засев питательной среды, культивиро-
вание микроорганизмов-продуцентов в ферментаторах, рас-
гильных камерах иа кюветах или механизированных растиль-
ных установках, отделение биомассы от культуральной жидко-
сти, экстракция ферментов из культуры гриба, выращенной
поверхностным способом на твердых питательных средах, кон-
центрирование культуральной жидкости, стандартизация фер-
ментных препаратов, сушка стандартизованных ферментных
растворов в распылительных сушилках.
Очищенные ферментные препараты получают из водных ра-
створов ферментов. Для очистки от балластных веществ при-
меняют различные методы: диализ, осаждение органическими
растворителями и нейтральными солями, извлечение фермен-
тов нз сложных комплексов методом их иммобилизации. Фер-
ментные осадки, полученные осаждением органическими раст-
ворителями и солями, растворяют в воде и стандартизуют до
20>
необходимой активности, а затем сушат в распылительных су-
шилках.
Получение препаратов с индексом П2х и Г2х, ПЗх и ГЗх.
Для получения технических ферментных препаратов культуру
продуцента освобождают от нерастворимых балластных ве-
ществ, т. е. остатков твердой питательной среды и мицелия.
Так как ферменты относятся к водорастворимым белкам, то
лучший экстрагент для них— вода.
Для извлечения эндоферментов из дрожжей и бактерий
клеточные стенки микроорганизмов подвергают механическому
или литическому разрушению. Внешние оболочки грибного ми-
целия имеют меньшее диффузионное сопротивление, чем обо-
лочки дрожжевых или бактериальных клеток, и тем не менее
влажную культуру микроскопических грибов перед экстрак-
цией подвергают предварительному дроблению на частицы раз-
мером 3—10 мм. В силу большой молекулярной массы фер-
менты медленно растворяются и медленно диффундируют из
поверхностной культуры микроскопических грибов в экстраги-
рующую жидкость. Лабильность ферментов вынуждает прово-
дить процесс при температуре 27—30 °C, а это увеличивает
длительность экстракции, приводит к инфицированию куль-
туры н инактивации ферментов.
Культура микроскопических грибов, выращенная в поверх-
ностных условиях на твердом питательном субстрате, содержит
около 50—55 % сухих веществ. Если общее количество СВ
культуры принять за 100%, то только 25—30 % составляют
водорастворимые соединения, в состав которых входят белки,
ферменты, аминокислоты, углеводы, минеральные соли. Нера-
створимая часть (70—75 % СВ) в основном содержит клет-
чатку, гемицеллюлозу и др. Таким образом, экстрактивная об-
работка культуры гриба водой позволяет избавиться на 70—
75 % от балластных веществ и повысить концентрацию фер-
ментов (по отношению к сумме СВ, содержащихся в растворе)
в 3,5—4 раза. Основной движущей силой экстракции является
разность концентраций извлекаемого вещества в смачивающей
культуру жидкости н в экстрагирующей жидкости. Процесс
диффузии прекращается при выравнивании концентраций.
Растворимые вещества, перешедшие в экстракт, на 50 %
состоят из азотистых соединений, из которых 0,5 % составляют
ферменты, около 29,5 % — углеводы, а остальные 20 % — мине-
ральные вещества.
Наиболее эффективной является противоточная экстракция.
В промышленности для экстракции ферментов нз поверхност-
ных культур микроскопических грибов применяют специальные
8-секцнонные диффузионные батареи Роберта, в которых также
используется этот принцип (рис. 8.3).
Все диффузоры батареи унифицированы и имеют форму
вертикального цилиндра с откидной герметически закрываю-
202
Рис. 8.3. Диффузионная батарея
щейся крышкой и коническим днищем. В верхней части на рас-
стоянии 150—200 мм от переливного штуцера расположена
двойная сетка с ребрами жесткости. Все диффузоры соединены
коммуникациями таким образом, что в каждый аппарат можно
подавать как свежий растворитель, так и вытяжку из предыду-
щего диффузора. Любой аппарат можно отключить, не нару-
шая работы всей батареи. В процессе работы все восемь диф-
фузоров заполнены культурой. Один из аппаратов находится
под разгрузкой, а другой под загрузкой. В каждый из диффу-
зоров вместимостью 300 л загружают 54—60 кг культуры по
абс. СВ. Вода температурой 25—27 °C с небольшим количест-
вом антисептика (0,02 %-ный раствор формалина) поступает
в первый (хвостовой) диффузор. После его заполнения воду7
перекрывают и массу выдерживают 30 мин. Затем возобнов-
ляют подачу воды и жидкая среда из первого диффузора пе-
реходит во второй. Массу во втором аппарате также выдержи-
вают 30 мни. Процесс продолжается до головного — восьмого—
диффузора, из которого вытяжка собирается в сборник. По-
лученная вытяжка содержит 10—12% СВ. Выход ферментов
в экстракт в значительной степени зависит от количества
отобранной вытяжки по отношению к культуре, находящейся
в диффузоре. Например, полное извлечение амилолитических
и протеолитических ферментов из культуры Asp. oryzae дости-
гается при отборе экстракта не менее 220 % к абсолютно су-
хой массе загруженной культуры, а пектолитических фермен-
тов нз культуры гриба Asp. awamori — при отборе 350 % экст-
ракта к загружаемой массе. Полнота извлечения амилолитиче-
ских ферментов из культуры гриба Asp. awamori достигается
при отборе экстракта 400 % к загруженной культуре.
Полученную диффузионную вытяжку направляют на ва-
куум-выпарную установку, где концентрация сухих веществ
повышается до 50 %. Вытяжка концентрируется в вакуум-вы-
203
парной установке пленочного типа прн температуре упарива-
ния 30—32 °C и температуре греющего пара 80—85 °C. Полу-
ченный препарат в виде снропа стандартизуют хлоридом нат-
рия, так как содержание СВ должно быть не ниже 50 %, н на-
правляют потребителю. Номенклатура препарата П2х.
Для получения технических препаратов культуральную
жидкость освобождают от биомассы и концентрируют в ва-
куум-выпарных аппаратах при температуре 25—30 °C, что со-
ответствует остаточному давлению в аппарате 3—4 кПа. При
концентрировании до 50 % СВ веществ образуется нераство-
римый неактивный осадок. В количественном отношении он
составляет около 10 % от содержания СВ. Осадок отделяют се-
парированием. Потерн ферментативной активности в процессе
концентрирования могут достигать 10 %. Для стандартизации
препарата также используют хлорид натрия. Полученный
стандартный сироп с индексом Г2х разливают в емкости по
40—50 кг.
Прн высушивании в распылительной сушилке диффузион-
ной вытяжки и концентрата глубинной культуры с содержа-
нием 10—12 % СВ получают препараты с индексом ПЗх и
ГЗх. В процессе сушкн большое количество сахаров в диффу-
зионной вытяжке н в концентрате глубинной культуры приво-
дит к налипанию препарата на внутреннюю поверхность су-
шилки. Для предотвращения этого к диффузионной вытяжке
добавляют хлорид натрия из расчета 50 %-ного содержания
СВ, а к концентрату культуральной жидкости— 200 кг/м3. Вы-
сушенный препарат стандартизуют по активности хлоридом
натрия и фасуют в крафт-мешкн с полиэтиленовыми вклады-
шами.
Получение препаратов с индексом ПЮх и ГЮх. В качестве
примера можно представить технологический процесс получе-
ния препарата прототерризина ПЮх. Готовую культуру Asp.
terricola штамм 3374 для очистки от балластных веществ на-
правляют на диффузионную батарею. Получаемая диффузион-
ная вытяжка содержит около 10 % СВ, концентрация протео-
литических ферментов составляет 0,25—0,28 ед./мл.
Процесс экстракция в диффузионной батарее проводят в та-
ком режиме, чтобы отбор вытяжкн составлял примерно 300 %
от массы абсолютно сухой культуры гриба, предназначенной
для экстракции. Потери протеолитических ферментов не пре-
вышают 25 %. Очистку ферментного экстракта от балластных
веществ проводят на непрерывно действующих сепараторах.
Перед подачей на сепаратор в вытяжку добавляют раствор
аммиака н доводят pH до 8,4—8,6. На стадии сепарирования
удается отделить до 6 % балластных веществ от общего содер-
жания СВ в вытяжке, потери протеолитических ферментов со-
ставляют не более 1 %. Из сепаратора фугат направляют на
непрерывно действующую установку, где к нему добавляют
204
уксусную кислоту с тем, чтобы pH осветленной вытяжки дове-
сти до значения 6,0—6,2, н этанол концентрацией 96 % об. Для
осаждения ферментов могут быть использованы и другие орга-
нические растворители: метанол, ацетон, изолропанол.
Способ выделения ферментов нз водных растворов органи-
ческими растворителями принято считать более эффективным
по сравнению с высаливанием, т. к. он менее сложен, а раст-
ворители легко регенерировать перегонкой. Действие органиче-
ских растворителей основано на снижении диэлектрической
постоянной среды. Известно, что силы электростатического
притяжения и отталкивания обратно пропорциональны ди-
электрической постоянной. При смешнванни водной вытяжкн
ферментов со спиртом происходит уменьшение этой постоян-
ной, что способствует взаимодействию белковых молекул. Они
теряют растворимость, образуют агрегаты н выпадают в оса-
док.
Осаждение ферментов проводят либо в реакторах периоди-
ческого действия, либо в непрерывном потоке, регулируя рота-
метрами объемы смешиваемых жидкостей. Чтобы сократить
потерн ферментов прн смешиваннн экстракта с растворителем,
осаждение проводят при пониженных температурах. Этанол
перед подачей в установку охлаждают до —5-J—8 °C, а водную
вытяжку—до 5—6 °C. Для отделения ферментного осадка от
водно-спиртовой смеси применяют центрифугирование. Полу-
ченный осадок смешивают в смесителе с двумя объемами 96 %-
ного этанола на единицу массы осадка с целью промывки и
дальнейшего обезвоживания. После центрифугирования оса-
док влажностью 30—35 % направляют на сушку, которая ве-
дется в вакуум-су шильных аппаратах периодического действия
или в распылительных и сублимационных сушилках. Длитель-
ность периодической сушкн (8—16 ч) зависит от температуры
сушки н конечной влажности осадка. По достижении осадком
влажности 10—13 % сушку прекращают. Сухой продукт из-
мельчают, смешивают с наполнителем до получения стандарт-
ной активности. Стандартный препарат фасуют по 0,5 кг в по-
лиэтиленовые мешкн, которые укладывают в жестяные ко-
робки.
Для получения очищенных ферментных препаратов с индек-
сом ГЮх (на примере получения препарата пектаваморнна
ГЮх) культуральную жидкость отделяют от биомассы. Био-
масса поступает на сушку при температуре греющего воздуха
300—350 °C. Выход биомассы нз 1 м3 культуральной жидкости
составляет 100 кг прн содержании сухнх веществ 15 %. Потерн
ферментов на этой стадии не превышают 5%. Полученный
фильтрат культуральной жидкости упаривают до V? первоначаль-
ного объема, в результате содержание СВ в концентрате уве-
личивается с 2 до 12,5 %. Прн концентрнрованин раствора фер-
ментов наблюдается выпадение неактивного осадка. Потери
205
ферментов на этой стадии не превышают 10%. Концентрат
культуральной жидкости освобождают от неактивного осадка
на сепараторах. Для осаждения пектолнтнческнх ферментов
используют охлажденный до 4—6 °C фугат концентрата с со-
держанием 12,5 % СВ- В качестве осадителя ферментов при-
меняют охлажденный до температуры —4-=.—10 °C этанол.
Осаждение проводится прн концентрации спирта в смесн 76 %
об. прн соотношении объемов концентрата культуральной жид-
кости н этанола 1 :4,5. Полученная водно-спиртовая смесь по-
дается на сепаратор. Ферментный осадок, полученный после
сепарации, растворяют в трех объемах воды, а затем стандар-
тизуют бентонитом нлн желатином, применяемыми в качестве
наполнителя. Количество наполнителя рассчитывают с учетом
активности концентрата, готового продукта и потерь в процессе
сушкн стандартизованного ферментного раствора.
Полученный полупродукт направляют в распылительную су-
шилку. Ферментный осадок сушат при температуре теплоноси-
теля на входе в сушилку 160 °C н на выходе из сушилки
60—75 °C. Режимы сушки обеспечивают достижение 8 %-ной
влажности материала. На этой стадии потерн ферментов со-
ставляют 5—8 %.
Высушенный и стандартизованный до пектолитической ак-
тивности 3000 ед./г (по медному методу) препарат фасуют по
0,5 кг в полиэтиленовые мешки, которые упаковывают в же-
стяные коробки. Отделенный на сепараторе отработанный эта-
нол направляют на ректификацию, где его крепость доводят
до 96,5 % об. Потери спирта прн ректификации составляют
1 %•
Выделение препаратов с помощью органических раствори-
телей в ряде случаев позволяет фракционировать комплекс
ферментов. Например, разработан способ разделения амило-
литического и протеолитического комплекса грнба Asp. oryzae
методом фракционного осаждения диализованных ферментных
экстрактов органическими растворителями.
Наиболее четкое разделение амилазы и протеазы происхо-
дит прн температуре 0°С, pH 5,1. При концентрации этанола
в смеси 48—52 % протеаза осаждается почти полностью, а ами-
лаза— только иа 10 %• После отделения осадка протеазы кон-
центрацию этанола повышают до 70—74 %, прн этом выпадает
амилаза со следами протеазы. Освобождение второй фракции
от остатков протеазы проводят обработкой 5 % бентонита при
pH раствора 4,5. Из таких высокоочнщенных препаратов
можно получать кристаллические ферменты.
Получение кристаллических ферментных препаратов. Тех-
нологическую схему получения кристаллических ферментов
можно проиллюстрировать на примере выделения а-амнлазы
Asp. oryzae. Схема очнсткн н кристаллизации представлена
ниже.
206
Комплексный препарат
Растворение в воде
Центр ифугнрова н ие
Надосадочная жидкость (1)
Диализ
Осветление 10%-ным раствором ацетата свиица
Центрифугирование
Надосадочиаи жидкость (2)
Добавление 0,25 М раствора ацетата кальция
Высаливание сульфатом аммония (0,75 от пол-
ного насыщения)
Центр ифуг и рова и ие
4.
Осадок
Растворение в воде
Центрифугирование
Диализ
4
Диализованный раствор
Первое осаждение риванолом (0,04 от объема
раствора)
Центрифугирование
4
Надосадочная жидкость
Второе осаждение риванолом (0,07 от объема
раствора)
Центрифугирование
4
Осадок
Растворение в 0,5 М ацетатном буфере с pH 5,8
Осветление бентонитом
Фильтрование
4
Фильтрат
Осаждение ацетоном (концентрация в смеси 55%)
Центрифугирование
Осадок
Растворение в 0,02 М растворе ацетата кальция
Фильтрование
4
Фильтрат
Добавление ацетона до 25—30%-иой концентра-
ции
Выдерживание раствора при температуре 2—3°С
Доведение концентрации ацетона в растворе
Отделение кристаллов
4
Кристаллы а-амилазы
207
Выделение а-амнлазы проводилось из комплексного фер-
ментного препарата, полученного из поверхностной культуры
грнба Asp. oryzae фракционным осаждением этиловым спиртом.
Ферментный раствор освобождали от большей части пиг-
ментов обработкой 10%-ным раствором ацетата свинца. Пер-
вичное выделение а-амнлазы проводилось высаливанием суль-
фатом аммония. После растворения полученного осадка и
освобождения от примеси аммония а-амилазу осаждали ривано-
лом в две стадии. Первыми в осадок выпадали различные при-
меси, которые удаляли центрифугированием. Прн повторном
добавлении риванола в количестве 0,07 % от объема раствора
а-амилаза выпадала в осадок. После перерастворення осадка
и осветления полученного ферментного раствора бентонитом
а-амнлазу осаждали ацетоном. Осадок, растворенный в 0,02 М
растворе ацетата кальция, фильтровали, а затем фильтрат на-
сыщали ацетоном до 25—30 %-ной концентрации, а-Амилаза
Asp. oryzae хорошо кристаллизуются прн концентрации аце-
тона 35—45 % и выдерживании раствора прн температуре
2—3°С. Отделенные н лнофнльно высушенные кристаллы имели
активность 25000 ед./г.
83. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ
В настоящее время ферментные препараты широко приме-
няют в пищевой н легкой промышленности. Однако использо-
вание обычных растворимых ферментов ограничено из-за от-
носительно высокой стоимости чистых препаратов, большой ла-
бильности и сложности отделения ферментов от реагентов н
конечных продуктов реакции. Таким образом, этн дорогостоя-
щие биологические катализаторы обычно находят однократное
применение. Прн использовании растворимых ферментов не-
возможно перевести многие периодические процессы на непре-
рывный технологический режим, а также трудно приостановить
ферментативную реакцию на нужной стадии.
Иммобилизованные ферменты сохраняют специфичность н
активность типичных биокатализаторов, они более термоста-
-бильны н устойчивы к реакции среды, в которой происходит
модификация субстрата, н могут быть применены в непрерыв-
ных процессах. Иммобилизованные ферменты представляют со-
бой нерастворимые биокатализаторы, в которых фермент ко-
валентными связями или силами адсорбции связан с каким-
либо носителем нлн заключен в матрицы либо мнкрокапсулы.
Носители для иммобилизации ферментов. К носителям предъ-
являются особые требования. Все онн должны быть полностью
нерастворимыми, отличаться высокой гидрофильностью, хими-
ческой и биологической стойкостью, иметь высокую механиче-
скую прочность (несжимаемость), их физическая природа не
должна вызывать сильных конформационных изменений моле-
208
кулы фермента. Носители должны быть достаточно проница-
емы как для самого фермента, фиксируемого по всему объему
носителя, так н для соответствующих субстратов. Носители
должны легко переводиться в реакционноспособную форму
(активироваться) прн нспользованин их для ковалентного свя-
зывания. Зернистые носители должны иметь однородную форму
н большую удельную поверхность, что позволяет нормализо-
вать гидродинамические свойства в установках колонного типа
с иммобилизованными ферментами.
Применяемые в настоящее время носители не отвечают пол-
ностью всем перечисленным требованиям. Для получения им-
мобилизованных ферментов наиболее широко используются
полимерные носители на основе природных (производные цел-
люлозы, агарозы, декстрана) н синтетических (полистирол, ак-
риламид, нейлон, полнаминокнслоты) полимеров. Следует от-
метить, что полимерные материалы гораздо легче подвергаются
химической модификации, т. е. введению реакционноспособных
группировок для ковалентного связывания ферментов. В каче-
стве носителей применяют также пористое стекло и окисленные
металлы, глнны и силикагель, ткань, бумагу, пленки н др.
Природные полимеры подразделяются на две группы: поли-
сахаридные носители и белковые носители. Синтетические по-
лимеры классифицируются по химическому строению основной
цепи макромолекулы. По этому принципу различаются полн-
метнленовые, полиамидные н полиэфирные носители. В каче-
стве носителей для нммобнлнзацнн ферментов используют
чаще всего природные полисахариды, затем синтетические но-
сители полиметиленового типа, остальные типы полимеров при-
меняют довольно редко.
В реакции с ферментами природные полисахариды, исполь-
зуемые для нммобнлнзацнн, сами по себе не вступают, по-
этому нх активируют. Гидроксильные группы полисахаридов
дают возможность вводить в ннх различные функциональные
остатки, удобные для последующего ковалентного связывания
ферментов. Кроме того, природные полисахариды используют
для включения ферментов в гелн. Для этих целей применяют
агар, который способен к образованию механически достаточно
прочных гелей даже прн малых концентрациях в растворе. По-
мимо высокой механической прочности агар устойчив к нагре-
ванию в щелочной среде н практически нерастворим прн зна-
чении pH выше 3,0. Наличие большого количества окснгрупп
делает возможным иммобилизацию на агаре самых различных
ферментов. Целлюлозные носители иашлн широкое применение
в промышленном производстве иммобилизованных ферментов.
Так, в ФРГ фирма «Серва» выпускает носители под названием
«Сервахром», ароматические аминогруппы у которых могут
быть активированы непосредственно перед иммобилизацией
фермента. Носитель марки «Сервахром» получают взаимодей-
1 '/в8 Заказ 7* 1536 209
ствием 3,3-днамнноднпропнламнноагарозы с азидом п-нитро-
бензонной кислоты и последующим восстановлением продукта
реакции.
(р)—NH(CH2)3NH(CH2)3NHCO—nh2
Известная английская фирма «Майлз Сервак» производит
фиксированные ферменты под названием энзнт (enzite). В ка-
честве носителя используются карбоксиметилцеллюлоза н мик-
рокристаллическая целлюлоза. Связывание ферментов осуще-
ствляется через амиды кислот или дназопронзводные.
Прн использовании целлюлозы и ее производных в каче-
стве носителей были получены иммобилизованные ферменты:
трипсин, папаин, химотрипсин, глюкозооксндаза, каталаза, пе-
роксидаза, пнруваткнназа, лактатдегидрогеназа, проназа, про-
теаза, амнлаза, глюкоамилаза, аспарагиназа, фосфатаза ще-
лочная н кислотоустойчивая, амнноацнлаза, рибонуклеаза, де-
зоксирибонуклеаза н др.
Белковые носители содержат функциональные группы, ко-
торые используются для связывания ферментов. Коллаген
в составе волокон соединительной тканн не растворяется
в воде. В его составе значительное количество аспарагиновой
(7%) и глутаминовой (11 %) аминокислот, но относительно
мало (4 %) лнзнна. Способ иммобилизации на коллагене пре-
дусматривает электроосаждение фермента на коллагеновой
пленке. Для иммобилизации могут быть применены и другие
белки: эластин, глютенин (растительный белок).
Синтетические полимерные носители используются для по-
лучения ковалентно связанных иммобилизованных ферментов.
Для сорбционной иммобнлнзацнн применяются в гранулиро-
ванном виде мнкро- и макропористые материалы (сополимеры
стирола, днвнннлбензола, акриловой кислоты, аминокислот,
нейлон н др.) с повышенной механической прочностью, стойко-
стью к химическим воздействиям и диаметром пор от 20 до
1000 нм. Такне носители остаются стабильными в органиче-
ских растворителях — ацетоне, этаноле, этнлацетате, диоксане
и др.
В настоящее время английская фирма «Кох Лайт лэборато-
риз» выпускает в промышленном масштабе носители типа эн-
закрнл (enzacryl), которые являются гидрофильными сополи-
мерами акриламида и его производных и содержат функцио-
нальные группы. У носителей типа энзакрнл-АА и энзакрнл-АН
реакционно-способной группой являются соответственно аро-
матические аминогруппы C6H4NH2 н гндразнновые CONHNH2-
группы. Средн носителей типа энзакрнл наибольший интерес
с экономической точки зрения представляет энзакрнл полнтол,
210
который может быть регенерирован для повторного использо-
вания. Это сополимер акриламида и акрнлонлцнстенна, сульф-
гидрильные группы которого взаимодействуют с сульфгидриль-
ными группами фермента в присутствии окислителя, например
ферроцианида калия. Для регенерирован ня носителя связан-
ный фермент отмывают раствором цистеина.
Для иммобилизации различных ферментов широко исполь-
зуется нейлон. Для связывания молекулы фермента с поверх-
ностью носителя его гидролизуют концентрированной соляной
кислотой, затем обрабатывают глутаровым альдегидом для по-
лучения активной поверхности, взаимодействующей с амино-
группами фермента. Особый интерес представляет то, что в ка-
честве носителя может применяться нейлон различной формы —
в виде гранул, волокон, тканей, сеток и др. Последнее позво-
ляет использовать этот носитель для создания проточных ре-
активов.
Заслуживают внимания разработки, проведенные в Таллин-
ском политехническом институте под руководством Кестнера,
по заключению фермента инвертазы в пространственную ре-
шетку полимера. Было найдено, что иммобилизация ферментов
гелевнднымн структурами обеспечивает равномерное распре-
деление связанного фермента в носителе и больший выход. Вы-
деления фермента в раствор в процессе его использования
обычно не наблюдалось.
Неорганические носители не подвергаются биологической
атаке, химически инертны к большинству растворителей, меха-
нически прочны, имеют жесткую основу, структура которой не
зависит от природы растворителя. К такому типу адсорбентов-
носителей относятся каолнн, кварц, диатомиты, макропористые
силикагели, аэросилогели (снлохромы), макропористые стекла
н др. В последнее время все большее значение в качестве но-
сителей приобретают пористые стекла. Их высокая прочность и
надежность связывания ферментов открывают большие пер-
спективы применения этого носителя для промышленной им-
мобилизации. Пористые стекла — сильные адсорбенты, н основ-
ная причина такой способности в том, что их макропористая
поверхность состоит нз силанольных (Si—ОН)-групп, которые
в водных растворах имеют отрицательный заряд. Таким обра-
зом, основные н некоторые нейтральные белки сорбируются на
поверхности носителя, тогда как кислые белки элюируются.
Образующаяся связь между белком н матрицей бывает очень
прочной, что позволяет использовать адсорбцию для иммоби-
лизации ферментов на стекле. С применением пористых стекол
были получены следующие иммобилизованные ферменты: ри-
бонуклеаза, протеиназа, глюкозооксндаза, каталаза, перокси-
даза, глюкоамнлаза и др.
Методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация фер-
ментов может быть осуществлена двумя принципиально раз-
211
Рис. 8.4. Методы иммобилизации:
а — включение фермента в структуру геля; б — микрокапсулирование
личными способами: без образования ковалентных связей
между матрицей и белковой молекулой (физические методы
иммобилизации) и с образованием ковалентной связи (химиче-
ские методы).
Физические методы. Для получения относительно ста-
бильных нерастворимых форм ферментов широко используется
способность белков адсорбироваться на различных поверхно-
стях вследствие электростатических, гидрофобных н дисперси-
онных взаимодействий. Метод адсорбции несмотря на некото-
рые недостатки, связанные с легкой десорбцией ферментов,
подкупает своей простотой. Существуют способы иммобилиза-
ции, прн которых исключено всякое взаимодействие фермента
с носителем, например метод включения. Фермент может быть
заключен в поры поперечно сшитого геля совместной полиме-
ризацией белка и мономера — включение в гель (рис. 8.4, а)
нли в полупроницаемую мнкрокапсулу — микрокапсулирование
(рнс. 8.4, б). Однако этот метод малопригоден в тех случаях,
когда субстратами фермента являются высокомолекулярные
вещества.
На нерастворимых носителях может быть осуществлена им-
мобилизация адсорбцией как нативных ферментов, так н пред-
варительно модифицированных белков. В последние годы для
этой цели широко применяют силикагели, стекло, целлюлозы и
нейлон. Часто сорбция ферментов на нонообменннках бывает
малоэффективной из-за того, что изоэлектрическая точка и оп-
тимум каталитической активности близки. В связи с этим проч-
ная сорбция наблюдается лишь в областях pH, где каталити-
ческая активность мала. Чтобы преодолеть эту трудность, был
предложен метод иммобилизации ферментов, предварительно
модифицированных введением ноногенных групп. Модификация
фермента приводит к сдвигу его изоэлектрической точки, а ка-
талитические свойства такого фермента мало отличаются от
свойств нативного. В результате модифицированный фермент
достаточно хорошо сорбируется на многих нонообменннках.
212
При иммобилизации ферментов путем включения в гель не
происходит химической модификации молекул фермента, а на-
блюдается простое включение их в пространственную сетку ге-
лей. Для иммобилизации применяют такие гели: полиакрил-
амидный, полнэтнленглнкольметакрнлатный, снластик, крахмаль-
ный, агаровый, гель кремниевой кислоты и др. Наиболее часто
используют полиакриламидный гель. Он представляет собой
гель сополимера акриламида и М.М'-бнс-метнлен-акрнламид
(сшивающий агент). Благодаря образованию поперечных свя-
зей между растущими соседними полиакриламидными цепями,
возникающими в результате полимеризации винильных групп,
такой гель имеет структуру трехмерной сетки.
Химические методы. Иммобилизация ферментов пу-
тем образования новых ковалентных связей является в настоя-
щее время доминирующим способом получения биокатализато-
ров пролонгированного действия. Преимущество этого способа
в том, что фермент, как правило, не переходит в раствор даже
прн очень длительном использовании.
Химическая иммобилизация ферментов может быть осуще-
ствлена как на полимерном носителе, так и за счет поперечной
сшивки молекул белка без использования носителя. Последняя
позволяет получать обычно нерастворимые препараты с высо-
кой удельной активностью, однако технологические свойства
делают их малоперспективными для практического использова-
ния. Метод образоваиия ковалентной связи между носителем и
белком обычно классифицируют по типу происходящей при
этом химической реакции.
Наиболее часто используемыми прн получении иммобилизо-
ванных ферментов являются реакции ацилирования и амино-
ацилирования, алкилирования, азосочетання, образования ими-
нов и в меньшей степени — окислительно-восстановительные и
радикальные.
Сложность строения белков и разнообразие молекулярных
взаимодействий, проявляющихся при построении молекулы
фермента, требуют индивидуального подхода к иммобилизации
каждого отдельного фермента.
Наряду с иммобилизацией ферментов возможна также им-
мобилизация целых клеток микроорганизмов. Среди различных
матриц для иммобилизации клеток микроорганизмов наиболее
подходящими являются полимеры — производные акриловой
кислоты. Онн механически устойчивы и инертны к разложению
под действием микроорганизмов. Метод основан на механиче-
ском заключении клеток в пространственную решетку поли-
мера.
Иммобилизованные клетки уже применяются для осущест-
вления процессов трансформации органических соединений, на-
пример для разделения рацемических смесей на оптические
изомеры, инверсии сахарозы, дегидрирования, восстановления
8 Заказ № 1536 213
и гидроксилирования стероидных соединений и других про-
цессов.
При иммобилизации, как правило, наблюдаемая каталити-
ческая активность ферментов уменьшается. Это явление обус-
ловлено рядом причин:
1) в результате иммобилизации может нарушиться целост-
ность вторичной, третичной н четвертичной структур фермента;
2) при больших степенях заполнения поверхности носителя
инактивация фермента может быть вызвана белок-белковыми
взаимодействиями;
3) при химических методах нммобнлнзацнн происходит мо-
дификация молекулы фермента, что также может привести
к уменьшению его активности;
4) прн иммобилизации может произойти изменение микро-
окружения фермента, что оказывает влияние как на собствен-
ную его реакционную способность, так и на локальную кон-
центрацию различных веществ, принимающих участие в фер-
ментативном процессе (нонов водорода, субстратов, кофакторов,
эффекторов);
5) при реакции иммобилизованного фермента с высокомо-
лекулярными субстратами могут иметь место стернческие за-
труднения для подхода к молекуле биокатализатора, обуслов-
ленные носителем.
Несмотря на все сказанное в большинстве случаев иммоби-
лизация приводит к стабилизации ферментов. В результате
химического присоединения к носителям возрастает термоста-
бнльность некоторых ферментов. Так как это явление харак-
терно для различных ферментов при нспользованнн разнооб-
разных носителей н методов прншивкн, полагают, что главной
причиной стабилизации является образование связей между
ферментом и носителем. Чем больше образовано связей между
ферментом и носителем, не затрагивающих активного центра,
тем выше стабильность. В этом случае происходит фиксация
каталитически активной конформации фермента, препятствую-
щей разворачиванию ферментной глобулы, т. е. денатурации.
Большинство ферментов теряет каталитическую активность
под действием так называемых денатурирующих агентов,
а также прн резком отклонении pH среды от оптимума. Пола-
гают, что механизм стабилизации ферментов в результате при-
шивки против термоинактивации и против инактивации под
действием денатурирующих агентов одинаков и обусловлен по-
вышением жесткости молекул.
При иммобилизации в пористых носителях ферменты ста-
новятся недоступными для действия микроорганизмов ввиду
того, что размеры пор носителя меньше размеров микроорга-
низмов.
Важной характеристикой иммобилизованных ферментов яв-
ляется нх стабильность при хранении.
214
Глава 9. КОРМОВЫЕ
ПРЕПАРАТЫ ВИТАМИНОВ
И ПРЕМИКСЫ
9.1. КОРМОВЫЕ ПРЕПАРАТЫ ВИТАМИНОВ
Средн биологически активных веществ, повышающих пита-
тельную ценность рационов животных н птнцы. важное значе-
ние имеют витамины. Онн принимают активное участие в ряде
энзиматических превращений, протекающих в цикле трикарбо-
новых кислот, например в разложении пировиноградной кис-
лоты до диоксида углерода н воды. Обязательным участником
этих реакций являются витамины Bi, В2, Вз, РР(Вь), лнпоевая
кислота. Прн распаде и синтезе жирных кислот и жнров ос-
новным катализатором служит производное пантотеновой кис-
лоты коэнзнм А (КоА), а при синтезе многих аминокислот —
витамин Вб- Витамин Вс принимает участие в синтезе пуринов
н пиримидинов и, следовательно, в обмене нуклеиновых кислот,
а вместе с витамином В12 участвует в процессах метилирова-
ния, имеющих фундаментальное значение.
В сложной сети обменных реакций витамины оказывают
воздействие на разнообразные физиологические процессы. Для
нормальной деятельности организма животных и птиц необхо-
димо включать в рационы витамины A, D3, Кз, Вь В2, Вз, В4,
В5д В6, Вс, В]2, С и др.
"В настоящее время в микробиологической промышленности
СССР организовано производство кормовых препаратов вита-
минов В12 н В2, технология получения которых будет рассмот-
рена ниже.
Витамин В12 (цианкобаламнн). Данный витамин отсутствует
в растительных кормах и дрожжах, а корма животного проис-
хождения содержат его в незначительных количествах. Недо-
статок витамина В12 в кормовых рационах приводит к заболе-
ванию н снижению продуктивности животных. Витамин Bt2
в связи со способностью повышать усвоение белка из расти-
тельных кормов и приближать нх по питательной ценности
к белку животного происхождения рассматривают как ос-
новной компонент так называемого «фактора животного
белка».
Витамин В12 участвует также в диссимиляции избытка таких
незаменимых аминокислот, как метионин, валин, треонин, изо-
лейцнн, распад которых происходит через образование пропио-
новой и метилмалоновой кислот. В практических условиях
всегда имеется несбалансированность той или иной нли даже
нескольких аминокислот. Кроме того, по этому пути распада-
ются пиримидины и жирные кислоты с нечетным числом угле-
родных атомов. В этих реакциях витамин В12 принимает уча-
8* 215
стне в виде коэнзимной формы, которая входит в состав фер-
мента метилмалоннл-КоА-мутазы.
Витамин В12 в кристаллическом виде был выделен из пе-
чени животных в 1948 г. Его сложная структура была расшиф-
рована в 1955 г. Она напоминает гемнн кровн, только в центре
молекулы вместо железа находится кобальт. Эмпирическая
фор гл ул а витамина СвзНввСОНнОцР, молекулярная масса
Кристаллы витамина В12 имеют красный цвет вследствие
наличия в его молекуле кобальта. Этот витамин объединяет
целую группу веществ, которые являются комплексными со-
единениями трехвалентного кобальта. Кроме истинного вита-
мина В12 нз ряда природных источников было выделено боль-
шое число аналогов, в нуклеотидную часть которых входят дру-
гие азотистые основания бензимндазольного илн пуринового
ряда. Общим для данной группы веществ является то, что все
они неактивны для человека н животных н могут использо-
ваться лишь некоторыми видами микроорганизмов.
Единственным способом получения витамина B!2 в промыш-
ленных условиях является микробиологический синтез. Сотруд-
никами Института бнохнмин нм. А. Н. Баха АН СССР под ру-
ководством В. Н. Букина был разработан и внедрен в промыш-
ленность метод получения витамина В12 путем термофильного
214
метанового сбраживания барды — отхода ацетонобутилового
производства.
Производство кормового концентрата витамина Bi2 состоит
нз следующих основных стадий: сбраживание барды, стабили-
зация метановой бражки, сгущение, высушивание, получение
продукта.
Витамин В12 способны синтезировать некоторые бактерии
и актииомицеты: Propionibacterium shermanii, Р гор ion i bacte-
rium fleudenreichii, Pr. technicum, Вас. megaterium, Str. griseus,
Act. olivaceus, Pseudomonas denitrificans и др., а также био-
ценоз бактерий, осуществляющих термофильное метановое
сбраживание сточных вод. Биоценоз бактерий состоит нз че-
тырех культур, ведущих взаимосвязанный и сложный процесс
расщепления органических веществ до диоксида углерода и
метана; углеводсбраживающих, аммонифицирующих, сульфат-
восстанавлнвающнх и собственно метанобразующнх бактерий,
завершающих разложение органических соединений.
Декантат ацетонобутиловой барды (2—2,5 % СВ и 97,5—
98 % воды), освобожденный от взвешенных частиц, подается
в нижнюю часть ферментатора. Отбор готовой бражки произ-
водится с верхнего уровня ферментатора. Непрерывное термо-
фильное метановое брожение осуществляется смешанной куль-
турой анаэробных бактерий. Метановое брожение проходит
в две фазы, в нестерильных условиях при температуре 55—
57 °C В первой фазе происходит образование жирных кислот
и аммиака, во второй — метана, диоксида углерода и витамина
В12. Для увеличения выхода витамина Bi2 к декантату барды
добавляют 4 г/м3 хлорида кобальта н 5 л/м3 метанола. Для
получения нормального выхода витамина продолжительность
брожения прн сбраживании в одном ферментаторе составляет
2,5—3,5 сут, в двух последовательно соединенных аппаратах —
2,0—2,5 сут. При использовании принципа рециркуляции уда-
ется значительно увеличить производительность ферментато-
ров. Концентрация витамина В12 в метановой бражке повы-
шается примерно на 25 %, достигая 850 мкг/л.
В процессе метанового брожения выделяется значительное
количество газов — около 20 м3/м3, в том числе около 65 % ме-
тана н 30 % углекислоты. Метановая бражка имеет щелочную
реакцию (pH 7,5—8,0). Прн тепловой обработке в щелочной
среде витамин В12 разрушается, в кислой (прн pH 5,5—6,5) он
термоустойчив.
Стабилизация метановой бражки осуществляется подкисле-
нием ее до pH 6,3—6,5 соляной нлн фосфорной кислотой (0,6—
0,8%) с добавлением сульфита натрия (0,2%). При дегазации
бражки перед стадией упарнвання (проводится простым нагре-
ванием прн атмосферном давлении) вследствие выделения газа
происходит обильное ленообразование. Для пеногашения при-
меняют пеногаситель. Сгущение метановой бражки до 20 % -
217
кого содержания сухих веществ проводят в выпарном аппа-
рате. Сгущенную бражку высушивают в распылительной су-
шилке. В качестве теплоносителя используют газы, получаемые
при сжигании природного газа н газов метанового брожения.
Полученный сухой концентрат витамина В12 должен удовлет-
ворять требованиям ГОСТ 18663 —78.
Однородный порошок коричневого
цвета
Кисловатый
Свойственный для данного продукта
100
Внешний вид
Вкус
Запах
Содержание витамина В12, мкг/г, не
менее
Влажность, %, не более
Содержание сухого протеина, %, не
менее
Безвредность для животных при тест-
дозе, мг иа одного цыпленка
10
25
800-1200
Сухой кормовой концентрат витамина В12 фасуют по 15 кг.
Срок хранения 12 мес. Технологическая схема получения пре-
парата представлена ниже.
Вода
Хлорид кобальта
4 г/м3
Метанол 0,5%
Соляная кислота 0,7% 1
Сульфит натрия 0,2% /
Пеногаситель
Пар
Воздух
Ацетонобутиловая барда (декантат) 2,2 % СВ
Охлаждение
I
Метановое брожение, f = 55—57 °C
I
Метановая бражка 1,1 % СВ
I
Стабилизация 1,3 % СВ
I
Стабилизированная метановая бражка
I
Подогревание
I
Выпа рива н ие---------»-Кон денсат
Сгущенная метановаи бражка 20 % СВ
i
-Сушка распылительная, /=>280—90°,
94 % СВ
I
Сухой кормовой концентрат витамина
В13 100 мкг/г
I
Фасовка
Витамин Вг (рибофлавин). Получил свое название от сахара
рибозы, входящего в состав молекулы витамина в виде много-
218
атомного спирта D-рибнта. Эмпирическая формула рибофла-
вина C17H20N4O6, молекулярная масса 376,4.
ОН ОН ОН
С Н-Cl I—CFI-сн-с Н2ОН •
Витамин В2 (рибофлайин)
Витамин В2 входит в структуру многих ферментов, в со-
ставе которых участвует в клеточном дыхании, синтезе белков
н жнров, регулировании состояния нервной системы, функции
печени, слизистых оболочек и т. д. Рибофлавин широко распро-
странен в природе. Он входит в состав животных и раститель-
ных клеток. Довольно большое количество рибофлавина содер-
жат зерновые культуры. Среди тканей животного организма
наиболее высокое содержание рибофлавина в печени, почках.
Животные неспособны к синтезу рибофлавина и должны полу-
чать его с пищей. Изучение обмена рибофлавина в организме
показало, что прн его недостатке резко замедляется рост, на-
рушается белковый обмен. Суточная потребность в витамине
В2 определяется для свиней 10—15 мг на 100 кг живой массы,
для птиц — 3—4 г (в пересчете на кристаллический препарат)
на 1 т корма.
К образованию больших количеств рибофлавина способны
некоторые виды дрожжей (Candida guilliermondii, Candida fla-
reri), бактерий (Brevibacterium ammoniagenes, Micrococcus glu-
tamicus) и микроскопических грибов (Ashbya gossypii, Eremo-
thecium ashbyii). Производство рибофлавина включает следу-
ющие основные технологические стадии: ферментацию, упари-
вание н высушивание концентрата, получение готового продукта.
Микробиологический способ получения кормового препа-
рата витамина В2 привлекает своей простотой. В качестве про-
дуцента используют микроскопический гриб Eremothecium ash-
byii. Микроорганизм культивируют в глубинных условиях
в ферментаторе при температуре 28—30 °C, постоянном пере-
мешивании и аэрации в течение 80- 84 ч.
Наилучшими источниками углерода для гриба являются
глюкоза и мальтоза, поэтому рекомендуют использовать в со-
ставе питательной среды ферментативные гидролизаты куку-
рузной муки. Прн культивировании Eremothecium ashbyii на
среде, состоящей из глюкозной патоки (2,5 % по РВ), источ-
ника азота в форме NH4NO3 и карбоксида кальция (0,5%)
уровень накопления рибофлавина составлял 1250 мкг/мл (рис.
9.1).
219
Рис. 9.1. Динамика потребле-
ния питательных веществ и
биосинтез витамина В2 грибом
Er. ashbyii:
I — витамин В2; 2 — pH среды;
Л — РВ
Культуральная жидкость после термической обработки упа-
ривается под вакуумом до содержания 30—40 % СВ и высуши-
вается в распылительной сушилке. Влажность сухого препа-
рата составляет не более 10 %.
Готовый продукт представляет собой порошок желто-бурого
цвета, содержащий не менее 10 мг/г рибофлавина, до 20 %
сырого протеина. Кормовой препарат витамина Вг содержит
также витамины Вь Вз, Вб, В12 и никотиновую кислоту.
р-Каротин (провитамин А), Интерес к 0-каротину, как про-
дукту микробиологического синтеза, понятен из его роли в ка-
честве предшественника витамина А. p-Каротнн становится ак-
тивным только после превращения в витамин А. В настоящее
время более вероятным следует считать гидролитический путь
распада p-каротнна на две молекулы витамина А-альдегнда.
Реакция носнт диоксигеназный характер н происходит между
молекулярным кислородом и двумя углеродными атомами
p-каротина в положении 15—15' с последующим разрывом
центральной двойной связи. Катализирует этот процесс каро-
тнндиокснгеназа, обнаруженная в слизистой оболочке кишеч-
ника.
ЦС СН, (Нз сн, сн, сн,
Н2с^ ''С - СН=СНС=С1 КН=СНС=СНСН=СНСН=С(П=СНСН=ССН=СН- С ^СНг
I П II I
Н2С\ СН3 Н3С С\ ^сн2
СН2 Каротин
Витамин А выполняет многие функции в организме. Он не-
обходим, например, для поддержания нормального состояния
слизистых оболочек дыхательного и пищеварительного тракта
животных. Недостаток витамина А в рационах птнц резко за-
держивает их рост. Основным источником каротина для живот-
ных являются растительные корма, однако в них витамин А
содержится в незначительных количествах. В настоящее время
разработаны микробиологические методы получения 0-каро-
тина. Выделены микроорганизмы — активные продуценты, от-
носящиеся главным образом к низшим грибам. Технологнче-
220
ская схема производства аналогична таковой получения вита-
мина В2. Так, при глубинном культивировании гриба Bl. tri-
spora на среде, содержащей муку нз семян хлопка, мелассу,
соевое масло, кукурузный экстракт, выход каротиноидов через
72 ч роста при pH 6,2—6,7 и температуре 28—30 °C составлял
1 г/л среды, причем 0-каротнна выделялось 92 % от суммы
пигментов. Прн испытании микробного каротина на цыплятах
было найдено, что он обладает высокой биологической актив-
ностью, превосходящей активность каротина из моркови и
тыквы.
9.2. ПРЕМИКСЫ
Для достижения высокого уровня биологической полноцен-
ности кормов для сельскохозяйственных животных решающее
значение имеет обогащение нх комплексом специальных доба-
вок нз физиологически активных веществ—премиксов. Составы
премиксов и комбикормов разрабатываются на основе совре-
менных научных представлений о потребности организма живот-
ного в энергии, белке, аминокислотах, витаминах, макро- и
микроэлементах, ферментах н других элементах питания. В ка-
честве основных компонентов для изготовления премиксов ис-
пользуют наполнитель (продукты переработки зерна, кормовые
дрожжи н др.), препараты биологически активных веществ (ан-
тибиотики, ферменты, витамины и др-), а также вспомогатель-
ные материалы (адсорбенты, стабилизаторы, жидкие связую-
щие добавки и др,).
Витамины. Для производства полноценных сбалансирован-
ных кормов применяют витамины A, D2, D3, Е, Кз, Bi, B2, В3,
В4, РР, Вб, В9, В12, С н Н.
Витамин А (ретинолы). Относится к группе жирорас-
творимых. Способствует росту н обмену веществ, повышает
устойчивость к инфекционным заболеваниям, участвует в адап-
тации глаз позвоночных животных к темноте, а также высту-
пает в качестве регулятора желез внутренней секреции. Недо-
статок витамина А сказывается на росте н функциональной
деятельности растущих клеток эпителия, железистой части ги-
пофиза, надпочечников, щитовидной железы. Недостаток рети-
нолов у племенной птицы сопровождается высокой эмбрио-
нальной смертностью, снижением нлн полным прекращением
яйцекладки.
В растительных зеленых кормах, особенно в люцерне, мор-
кови и тыкве, содержится 0-каротнн — важнейший нз провита-
минов А. Содержащиеся в кормах каротиноиды природного
происхождения способствуют усилению окраски желтка яип и
пигментации кожи птицы. Для витаминизации премиксов и
кормов применяют сухой стабилизированный сантохином (ста
бнлнзатор жирорастворимых витаминов) — сыпучий препарат
p-каротина. Его содержание в готовой продукции составляет
не менее 2000 мкг/г. Повышение сверх нормы количества вво-
димого в корма p-каротнна вызывает быстрое падение его
усвояемости. В противоположность p-каротину синтетические
ретинолы всасываются и усваиваются значительно лучше.
В связи с этим для обогащения премиксов и кормов широко
применяют ретинолы, суточная потребность в которых состав-
ляет 100—200 м. е. на 1 кг массы тела и зависит от возраста
и условий содержания животных и птицы. Одна международ-
ная единица (м. е.) А-витаминной активности равна 0,00055 мг
ретинола пальмитата СзбН6о02 нлн 0,000344 мг ретинола аце-
тата С22Н32О2-
Для животноводства применяют готовые формы препарата:
масляные растворы, солюбилизированные водные эмульсин и
сыпучие порошкообразные.
Микровит А представляет собой микрогранулнрованную
стабилизированную форму ретинола. Для производства микро-
гранул используют ретинола ацетат, содержащий около
2600 тыс. м. е./г. В качестве основных структурообразующих
веществ мнкровнта применяют декстрин (30—35%), лактозу
(20—25%) и поливиниловый спирт (15—20%). Содержание
витамина в микровите может быть 250, 325 и 400 м. е./г.
Витамин D (кальциферолы). Группа витамина D
является основным противорахнтичным препаратом. Участвуя
в процессах обмена и ускоряя всасывание кальция и фосфора
нз кишечника, кальциферолы регулируют содержание этих хи-
мических элементов крови. Способствуют росту костей, в осо-
бенности у молодых животных, регулируют содержание солей
кальция в молоке, способствуют образованию скорлупы яиц.
В кормах растительного и животного происхождения кальци-
феролы встречаются в небольшом количестве. Сравнительно
много витамина D в печени морских животных. При круглого-
дичном содержании животных и птицы в закрытых помещениях
вся потребность организма в кальциферолах должна покры-
ваться за счет витаминных добавок. Ориентировочная потреб-
ность животных в витамине в зависимости от вида н продук-
тивности составляет от 10 до 50 м. е. на 1 кг массы животного
в сутки.
Витамин D2 (эргокальциферол) получают в ре-
зультате ультрафиолетового облучения эргостерина, извлечен-
ного нз хлебопекарных дрожжей.
Биологическая активность кальциферолов неодинакова по
отношению к различным видам животных. Наиболее широкое
применение имеет холекальцнферол (витамин D3), который
в 30 раз превосходит протнворахитичную активность эргокаль-
циферола. Содержание активного начала в готовых формах вы-
ражается в единицах D-внтамннной активности — 50 000,
100 000, 200 000 и 400 000 м. е./г.
222
Витамин Е (токоферол). В значительной мере влияет
иа обмен веществ в организме, участвует в переносе водорода
в окислительно-восстановительных реакциях, протекающих
в организме животных и птиц. Токоферол действует в качестве
стабилизатора в обмене углеводов, а также является факто-
ром, поддерживающим функции печени. Недостаточность вита-
мина Е приводит к высокой смертности эмбрионов и низкой
плодовитости животных. В природе токоферол синтезируется
только растениями, поэтому в течение всего года животным
и птице необходимо систематически давать его. Средняя суточ-
ная потребность животных в витамине Е находится в пределах
1—2 мг на 1 кг их массы.
В СССР выпускают сыпучие формы (кормовнт Е-25 и гра-
нувит Е-25) с содержанием витамина Е 10, 25, 50 % к массе
готового препарата.
Витамины К (нафтохиноны). Необходимы для под-
держания нормальной свертываемости крови. Полагают также,
что онн являются активной группой ферментов, принимающих
участие в синтезе протромбина, способствующего превращению
фибриногена в фибрин. В продуктах животного происхождения
витамин К практически отсутствует, и для обогащения комби-
кормов нафтохннонамн используется травяная мука. В высу-
шенной травяной муке их содержится до 25 мг/кг.
Витамин Кз (менадион) представляет собой произ-
водное нафтохннона с химической формулой СцН8О2. Витамин
получают путем химического синтеза. Минимальная активная
доза менадиона 0,3 мкг.
Витамины группы В. Витамин В2 входит в состав фла-
виновых ферментов. Осуществляет в организме реакции де-
гидрирования, которые являются важным звеном в общей
цепи окислительно-восстановительных процессов, протекающих
в организме животных н птнц. Имеются данные о воздействии
рибофлавина на усвоение н синтез жнров. Известно также, что
обмен его тесно связан с усвоением организмом белков, что
оказывает влияние иа рост молодняка. В среднем в премиксы
и корма рибофлавин вводят в количестве 4—8 мг на 1 кг.
Пантотеновая кислота (витамин Вз) способствует лучшему
усвоению в организме протеинов н жнров. Необходима для нор-
мального размножения свиней, способствует повышению при-
роста птнцы н увеличению яйценоскости. Пантотеновая кис-
лота, являясь составной частью кофермента А, играет основ-
ную роль в таких биохимических процессах, как окисление н
биосинтез жирных кислот, синтез лимонной кислоты, а также
в образовании фосфолипидов. В среднем потребность животных
в витамине в сутки составляет 0,1—2,5 мг на 1 кг массы. В 1 кг
сухого корма должно быть около 10—15 мг витамина Вз-
Холнн (витамин В4) относится к незаменимым аминоспнр-
там. Входит в состав лецнтнна. В качестве регулятора способ-
223
ствует образованию тканей организма и необходим для жиро-
вого обмена, в частности для распределения жнров в орга-
низме. Оказывает положительное влияние на обмен в орга-
низме каротина н ретинолов. Входит в состав почти всех кор-
мовых продуктов. Богаты витамином В4 зеленые листья, сухие
кормовые дрожжи, некоторые шроты. Установлено, что холнн
необходим всем животным и птицам. В среднем 1 кг полиора-
цнонного корма для свиней, телят илн птнцы должен содер-
жать 800—2000 мг холина.
Ннкотниовая кислота (витамин РР, илн В5) находится
в клетках преимущественно в виде никотинамида. Необходима
для нормальной жизнедеятельности всех животных и птиц. Яв-
ляясь составной частью коферментов НАД н НАДФ, участвует
в каталитических окислительно-восстановительных реакциях
клеточного обмена веществ. Недостаточность витамина РР
приводит к заболеванию пеллагрой. Относительно много нико-
тиновой кислоты содержится в сухнх кормовых дрожжах,
шроте подсолнечника и арахиса.
Потребность в никотиновой кислоте существенно зависит от
состава рационов кормления, особенно от количества в нем
триптофана. В среднем должно содержаться около 20—50 мг
витамина в I кг корма. В СССР в премиксы н корма вводят
препарат никотиновой кислоты, который содержит ие менее
99,5 % активного начала в пересчете на СВ.
Пиридоксин (витамин В6) входит в состав многих клеточ-
ных ферментов, обеспечивает многочисленные био ката литиче-
ские реакции, протекающие в организме животных и птиц. За-
нимает центральное место в белковом обмене. Играет важную
роль в превращениях аминокислот, осуществляя реакции их
переаминнрования и декарбоксилирования. Пиридоксин важен
для жирового и углеводного обмена и необходим для нормаль-
ной функции центральной нервной системы.
Фолиевая кислота (птеронл-Ь-глутаминовая кислота, вита-
мин Вс илн В9) необходима для кроветворения. Наряду с аскор-
биновой кислотой и цианкобаламнном участвует в формирова-
нии красных кровяных телец крови и гемоглобина, а также
оказывает активное противоаиемическое действие. Фолиевая
кислота в большом количестве содержится в зеленой люцерно-
вой муке, соевом шроте, рыбной муке. Особенно богаты этим
витамином сухие кормовые дрожжи. Количество фолиевой кис-
лоты, добавляемой в корма птицы, составляет примерно 50 %
от общей потребности организма в этом препарате.
В СССР в премиксы и корма этот витамин вводят в виде
чистого препарата, содержащего не менее 95 % фолиевой кис-
лоты в пересчете на СВ.
Цианкобаламин (витамин В12) воздействует на рост живот-
ных, кроветворную функцию организма, а также на обмен ве-
ществ, в частности белка. Принимает участие в регулировании
224
оптимального содержания в организме метионина, валииа,
треонина, лейцина и нзолейцииа. Особенно это важно при не-
сбалансированности рационов питания животных по аминокис-
лотному составу. Цианкобаламин связан также с обменом жи-
ров. Совместно с холииом и метионином он обладает липотроп-
ным действием, предотвращая отложение жнра в печени.
Цианкобаламин содержится в кормах животного происхож-
дения, в частности в мясокостной муке. Основными продуцен-
тами цианкобаламнна являются микроорганизмы — бактерии,
актнномицеты, одноклеточные водоросли.
Цианкобаламин активен в небольших количествах. Норма
содержания витамина в полноценном рационе должна состав-
лять 10—30 мкг/кг.
Витамин С. Способствует образованию основного веще-
ства соединительной ткани, участвует в углеводио-фосфорном
обмене. Предотвращает возникновение цинги, повышает сопро-
тивление организма инфекционным заболеваниям. Является
переносчиком водорода в некоторых ферментативных реакциях.
В природе синтезируется растениями н может вырабатываться
в организме подавляющего большинства животных. Одиако
содержание витамина С в естественных кормах неодинаково.
Особенно чувствительны к недостатку аскорбиновой кислоты
жеребята и поросята.
Витамин Н (биотин). Входит в состав ферментных си-
стем, является биокатализатором реакций переноса двуокиси
углерода, а также стимулирует синтез углеводов, пуриновых со-
единений, нуклеиновых н ненасыщенных жирных кислот и дру-
гие реакции обмена веществ. Биотин содержится во всех ви-
дах животного и растительного корма, а также в дрожжах.
Мало биотина в продуктах переработки зерна. Для витамини-
зации премиксов и кормов биотин добавляют в количестве 60—
200 мкг на 1 кг корма.
Поливитаминные препараты. Применяются для
витаминизации кормов и премиксов. В СССР хорошо зареко-
мендовал себя поливитаминный препарат пушиовит. Это по-
рошкообразный препарат, содержащий витамины токоферол,
тиамин, рибофлавин, аскорбиновую и пантотеновую кислоты.
Поливитаминные препараты удобны для применения
в крупных хозяйствах и на фермах. На 1 т корма добавляют
около 10 кг смеси.
Ферментные препараты. Для обогащения комбикормов и
рационов сельскохозяйственных животных широко используют
ферментные препараты микробного происхождения: глюкавамо-
рин, амилорнзин, пектаваморин, пектофоетидни, амилосубти-
лин, протосубтилин, лизосубтилин. Оии выпускаются в виде
очищенных и технических препаратов.
Глюкавамории Пх представляет собой технический ком-
плексный ферментный препарат, получаемый из поверхностной
225
культуры плесневого гриба Asp. awamori. Препарат содержит
а-амилазу, мальтазу, глюкоамилазу, декстрнназу, кислую про-
теазу и гемицеллюлазу. Стандартизуется по глюкоамилазе
(50 ед./г препарата). Оптимум действия глюкоамилазы:
pH 4,5—4,7, температура 35—40 °C. Очищенный препарат стан-
дартизуют по декстриназе 2,4 ед./г.
Амилоризин Пх представляет собой высушенную поверх-
ностную культуру гриба Asp. oryzae 467. Препарат содержит
амилазу, мальтазу, декстриназу, глюкоамилазу и протеазу.
Стандартизуется по а-амилазе (150 ед. АС на 1 г препарата).
Оптимум действии а-амилазы: pH 5,6, температура 35—40 °C.
Пектаваморин Пх представляет собой высушенную поверх-
ностную культуру гриба Asp. awamori 22. Препарат содержит
полиметнлгалактуроиазу, полигалактуроназу, пектин метил эсте-
разу, кислую протеазу, гемицеллюлазу, целлюлазу. Стандарти-
зуют препарат по пектолитическому комплексу. В 1 г препа-
рата содержится 800, 1600 и 2400 ед. ПкС/г по йодометриче-
скому методу. Оптимальные условия действия препарата:
pH 3,5—4,5, температура 37—40 °C.
Пектофоетидин ПЮх или ГЮх получают при выращивании
гриба Asp. foetidus поверхностным или глубинным способом.
Препарат содержит пектинметилэстеразу и гемицеллюлазу,
а при глубинном культивировании — кислую протеиназу. Пре-
парат стандартизуют по общей пектолитической активности.
В 1 г его содержится 600 ед. ПкС/г по йодометрическому ме-
тоду.
Амилосубтилии ГЗх получают при глубинном выращивании
бактериальной культуры Вас. subtilis 103. Препарат содержит
а-амилазу, 0-глюкоиазу, слабощелочную протеазу. Стандарти-
зуют по амилазной активности. В 1 г препарата содержится
600 ед. АС. Оптимальные условия действия препарата: pH 6,0.
температура 50—55 °C.
Протосубтилин ГЗх получают при глубинном выращивании
бактериальной культуры. Вас. subtilis 103. Содержит нейтраль-
ную и кислую протеазы, а-амилазу, 0-глюконазу. Препарат
стандартизуют по нейтральной протеазе. В 1 г препарата со-
держится 200 ед. ПС. Оптимальные условия действия препа-
рата: pH 6,0, температура 50—55 °C.
Лизосубтилин ГЗх получают при глубинном выращи-
вании бактериальной культуры. Вас. subtilis 402. Препарат со-
держит нейтральную и щелочную протеазы, а-амилазу. Стан-
дартизуется по литической активности. В 1 г препарата содер-
жится 50 тыс. ед. ЛА.
Микроэлементы. Микроэлементы входят в структуру многих
витаминов, гормонов, ферментов и других органических ве-
ществ, участвующих в регулировании жизненных процессов.
Так, йод является частью молекулы гормонов щитовидной же-
лезы тироксина и трийодтнронина; кобальт входит в молекулу
226
витамина В12. Микроэлементы входят в состав ферментов. В со-
став молекулы каталазы, пероксидазы и цитохромов входит
железо; цитохромоксидазы, тирозиназы и уриказы — медь; кар-
богидразы и карбоксипептидазы — цинк; аргиназы и пируват-
карбоксилазы — марганец и др. Поэтому многие функции фер-
ментов хорошо коррелируют с содержанием микроэлементов
в кормах.
В настоящее время к незаменимым для организма живот-
ных и птиц относят 14 микроэлементов: железо, йод, медь,
цинк, марганец, кобальт, молибден, селен, хром, никель, олово,
кремний, фтор, ванадий.
В СССР в состав премиксов (иа 1 т) в зависимости от вида
животных, их продуктивности, условий содержания вводят
(в кг): железа 1—50, меди 0,5—4, йода 0,5, цинка 0,5—50, мар-
ганца 25, кобальта 1.
Аминокислоты. Аминокислоты являются основными струк-
турными элементами белковой молекулы. Велика их роль
в биосинтезе физиологически активных веществ и соединений:
нуклииовых кислот, пуриновых и пиримидиновых оснований,
гормонов, креатина, витаминов и др. Аминокислоты выполняют
роль транспортных систем в организме и определяют актив-
ность многих ферментов.
Главным и основным источником аминокислот для сельско-
хозяйственных животных и птицы являются естественные корма.
Недостаточное количество в корме аминокислот и прежде всего
лизииа, метионина, триптофана может быть причиной наруше-
ния деятельности желез внутренней секреции, что неблагопри-
ятно отражается иа обмене белков, жиров и углеводов, на ис-
пользовании корма животными, на их продуктивности.
Лизин (а, е-днамннопимелниовая кислота) входит в состав
всех белков. Являясь предшественником оксилизина, он участ-
вует в образовании коллагена. Как предшественник карнитниа—
вещества витаминной природы — влияет иа энергетический и ли-
пидный обмен. Определяя активность многих ферментов, лизни
влияет иа окислительно-восстановительные реакции в орга-
низме, катализирует процессы переамннирования и дезаминиро-
вания. Лизнн связан с минеральным обменом, способствуя ус-
воению кальция и фосфора.
Тщательное балансирование рационов по лизину является
необходимым условием для обеспечения нормального воспроиз-
водства, роста животных, молочной продуктивности, формиро-
вания костей.
Метионин (а-амиио-у-тиометилмасляная кислота) содержит
серу, необходимую не только как структурный материал для
синтеза белка, ио и как донор метильных групп для реакций
метилирования при синтезе гуанндилуксусной кислоты (синтез
креатина), этаноламина (образование холина), норадреналина
и адреналина н различных азотсодержащих веществ для их
227
выделения (например, амнд инкотиновой кислоты). Метионин
может быть предшественником глутатиона, активизирующего
окислительно-восстановительные процессы в организме, и тауро-
холевой кислоты, влияющей на обмен н использование жиров.
Метильные группы метионина используются для обезврежива-
ния в печени ядовитых веществ, вводимых в организм животного
нзвне.
Триптофан (а-амино-р-индолпропионовая кислота) из-за на-
личия индольного кольца ие синтезируется в организме живот-
ных, поэтому аминокислота должна поступать с кормом в коли-
честве, достаточном для удовлетворения потребности в ией.
Триптофан является предшественником многих физиологически
активных соединений, содержащих кольцо индола — серотонин
(ней рогу моральный фактор) н кольцо пиридина — никотниовая
кислота (относится к витаминам группы В). Триптофан необ-
ходим для нормального воспроизводства, для роста и продук-
тивности животных.
Аргинин (а-амино-б-гуаниднл-Н-валериановая кислота) яв-
лиется донором амидиновых групп (NH2—C = NH), которым при-
надлежит важная физиологическая роль в обмене азотистых
веществ. Отщепление этой группы в процессе гидролиза в при-
сутствии фермента аргиназы сопровождается образованием мо-
лекулы мочевины. При перенесении амидиновой группы с ар-
гинина на глицин образуется гуаиидинуксусная кислота —
предшественник креатина. Аргинин является составной частью
важных для воспроизводства функций белков— протаминов.
Гистидин (а-амиио-0-амидазолилпропионовая кислота)-—не-
заменимая аминокислота. Имеет в своем составе имидазольную
группу, которую организм сам не синтезирует. В процессе об-
мена гистидина в организме образуются активные соединения.
Так, при декарбоксилировании гистидина образуется гистамин,
который в небольших количествах содержится в различных тка-
нях. Гистамин понижает кровяное давление и стимулирует функ-
ции желез внутренней секреции. Гистидин соединяется с ала-
нином в мышечной тканн и образует карнозин — соединение,
играющее важную роль в химизме мышц и влияющее иа
восстановление функций при переутомлении животных.
Валнн (а-амииоизовалериановая кислота), лейцин (а-амино-
изокапроновая кислота), изолейцнн (а-амиио-р-этилпропионо-
вая кислота) относится к незаменимым аминокислотам. Все три
аминокислоты необходимы для построения белков ткани. Валин
поддерживает деятельность нервной системы в нормальном со-
стоянии. Конечным продуктом обмена изолейцина и валина ив-
ляется янтарная кислота, которая используется организмом
в цикле трикарбоиовых кислот, а также для образования в ге-
моглобине пиррольных колец.
Треонин (а-амиио-0-оксимасляная кислота) в организме жи-
вотных участвует в ряде превращений, свойственных глицину.
228
Организм животных нуждается в постоянном поступлении трео-
нина с белками пищи. В процессе обмена аминокислота пре-
вращается в глицин н уксусную кислоту. Используется, напри-
мер, для синтеза холестерина, жирных кислот, углеводов, про-
топорфирииа.
Феиилалаиии (а-амнно-р-фенил пропионовая кислота)
и тирозин (а-амино-р-оксифенн л пропионовая кислота) близки
по своей химической природе. Оии служат предшественниками
гормонов: тироксина — гормона щитовидной железы и гормо-
нов иадпочечииков — иорадреиалииа и адреналина. Недостаточ-
ное содержание в кормах феиилалаиина и тирозина может быть
основной причиной нарушения деятельности желез внутренней
секреции, что в свою очередь неблагоприятно отражается иа
обмене белков, жиров и углеводов, на использовании корма
животными и на их продуктивности. Для сельскохозяйственных
животных и птицы естественные корма рационов являются глав-
ными и основными источниками этих аминокислот.
Кормовые антибиотики. В СССР для стимуляции роста жи-
вотных и повышения усвояемости питательных веществ корма
используются кормовые формы антибиотиков — тетрациклинов,
гризина, бацитрацина, витамицина.
Тетрациклины представляют собой группу антибиотиков тет-
рациклинового ряда, объединяющую несколько близких по хи-
мическому строению и биологическим свойствам антибиотиков.
В связи с широким антибиотическим спектром действия широко
используются ие только в медицинской и ветеринарной прак-
тике, но и животноводстве в качестве стимуляторов роста жи-
вотных и птицы. В животноводстве нашей страны разрешено ис-
пользовать следующие промышленные кормовые формы хлор-
тетрацикл ииа: биовит 20, биовит 40, биовит 80 и бнотетракорм
100. В состав этих препаратов, кроме антибиотиков, входят дру-
гие побочные продукты биосинтеза (ферменты, витамины, ами-
нокислоты, иеидентифицированные факторы роста), а также ос-
татки мицелия н компонентов питательной среды, на которой
культивировался микроорганизм — продуцент антибиотика. Жи-
вотноводство также широко использует кормовые формы окси-
тетрациклина: терравитии, терравит Р, терравит К и биотетра-
корм 100.
Биотетракорм 100 представляет собой порошок желто-бурого
цвета. В 1 г препарата содержится 75—80 мг (75—80 тыс. ед.)
хлортетрациклииа и 20—25 мг (20—25 тыс. ед.) тетрациклина
основания.
Гризии (синонимы — гризимин и антибиотик № 15) обла-
дает широким спектром антимикробного действия, угнетает ряд
грамположительиых и грамотрицательиых бактерий, некоторые
формы сапрофитных и патогенных микроскопических грибов.
В животноводстве нашей страны используются промышленные
формы гризииа — кормогризии 5 и кормогризии 10.
229
Бацитрацины представляют собой полипептидные антибио-
тики, обладающие по отношению к грамположительным бакте-
риям высокой антибиотической активностью и почти совсем не
действующие иа грамотрнцательные бактерии.
В животноводстве СССР разрешено использовать следующие
промышленные кормовые формы бацитрацина: бациллихнн 10,
бациллихин 20 и бациллихин 30. В 1 г препарата содержится со-
ответственно 10, 20 и 30 мг бацитрацина влажностью не более
Ю %.
Витамицнн обладает небольшой антибиотической актив-
ностью, которая определяется по витамнцину А. Влажность пре-
парата 8 %. В 1 г препарата содержится 3 мг витамицина А.
Транквилизаторы. У животных каждое явление, вызванное
повышенным чувством страха, связывается с нарушением мно-
гих физиологических функций в организме, а в конечном итоге—
с уменьшением нх продуктивности и ухудшением качества про-
дукции.
Применение транквилизаторов (франц, tranguilliser — успо-
каивать) позволяет повысить устойчивость животных к воздей-
ствию неблагоприятных факторов. Использование транквилиза-
торов в составе премиксов способствует увеличению прироста
массы у чувствительных к стрессу животных: у свиней — на
Ю—12,5 %, у птицы — иа 1—25 %, у крупного рогатого скота —
на 9—18 %. К используемым в животноводстве транквилизато-
рам относится ряд препаратов.
Хлорпромазин, или аминазин, принадлежит к группе препа-
ратов фенотиозинового ряда. Оказывает успокаивающее дей-
ствие, которое сопровождается снижеинем двигательной актив-
ности, ослаблением скелетной мускулатуры, угнетает терморе-
гуляторные функции.
Ацетпромазин и промазин также относятся к фенотиазино-
вым препаратам, по характеру действия сходны с аминазином.
Резерпин — алкалоид. У животных резко уменьшает нервное
напряжение, снижает артериальное давлеине.
Метосерпата гидрохлорид — аналог резерпина, по характеру
действия сходен с ним, но препарат менее токсичный.
Мепробамат — производное этилуретниа. Препарат характе-
ризуется продолжительным успокаивающим действием, которое
наступает от блокирования межреберных мышечных волокон.
Применение транквилизаторов в животноводстве зависит от
физико-химических свойств препарата. Как правило, успокаи-
вающие вещества вводят в премиксы, и премиксы скармливают
в смеси с концентрированными кормами.
Нитрофураны. К интрофуранам относятся нитрированные
производные фураиа. Применяются в лечении и профилактике
инфекционных и инвазионных болезней молодняка сельскохо-
зяйственных животных н птицы. Механизм действия нитрофу-
раиов сходен с таковым антибиотиков, но их преимущество со-
230
стоит в том, что оин способны задерживать рост микробов, ре-
зистентных к антибиотикам и сульфаниламидам. Нитрофураны
обладают широким спектром действия. Они подавляют разви-
тие грамположительных и грамотрицательных бактерий, неко-
торых простейших и микроскопических грибов. Невысокая ток-
сичность позволяет использовать их в животноводстве в каче-
стве терапевтических и профилактических средств. К числу
наиболее широко применяемых ннтрофурановых препаратов от-
носятся фуразолидон п нитрофуразои.
Фуразолидон эффективен при энтеритритах, вызываемых па-
тогенными штаммами Salmonella и Е. coli. Препарат резко сни-
жает падеж животных и облегчает течение болезни при пара-
тифе. В зависимости от степени заражения среды фуразолидон
прн применении в профилактических дозах (50—150 мг/кг
корма) способствует увеличению прироста у свиней и птнцы на
3-15%.
Нитрофуразои используется главным образом для лечения
и профилактики кокцидиоза, который вызывается различными
видами простейших рода Eimeria. Препарат нарушает фер-
ментно-метаболические процессы в клетках микробов и тем
самым предотвращает их размножение. Профилактические дозы
препарата не должны превышать 0,005 % к массе комбикорма.
Кокцидиостаты. Кокцидиозы — инвазионные заболевания,
приносящие большой ущерб хозяйствам, поскольку смертность
птицы может достигать 50—70 % н более. Одной из профи-
лактических мер является применение специальных кокцидио-
статических средств, подавляющих рост и развитие возбудителя
заболевания. К таким препаратам, помимо описанных выше
нитрофуранов, относятся сульфаниламиды: сульгин, сульфади-
мезин, дисульфан и фталазол. Эти кокцидностаты подавляют
развитие не только кокцидий, но и сопутствующей микрофлоры.
Препараты добавляют в корма из расчета 125 г иа 1 т пол-
норациониого корма.
Антиоксиданты и консерванты. Антиоксиданты — стабилиза-
торы химической природы, которые вводят в состав премиксов
для снижения скорости деструкции и повышения стабильности
биологически активных веществ — витаминов, антибйотнков,
гормонов и др. Наиболее широкое использование в качестве ан
тиоксидантов в составах премиксов нашли: бутилоксианизол
СцН1бО2 и бутилоксилотолуол С15Н24О, сантохин C14H19ON, дн-
лудин Ci3Hi9NO4, тиосульфат натрия Na2S2O3 • 5Н2О, бикарбо-
нат натрия NaHCO3.
В ряде случаев для стабилизации биологически активных ве-
ществ вводят в премикс два или несколько аитиоксндантов. Их
общее максимальное количество строго регламентируется.
Консерванты в премиксах и кормах снижают общую микро-
биологическую зараженность, предотвращают самопроизвольное
повышение влажности, плесневение, ухудшение сыпучести и
231
образование токсичных продуктов обмена веществ, например
митотоксина, выделяемых многими микроорганизмами. Предот-
вращение всех этих процессов достигается при добавлении в про-
дукты 0,3 % лупрозила (3 кг на 1т корма). Лупрозил выпус-
кается в виде жидкой 100 %-иой пропионовой кислоты С3Н6О2,
кальция пропионата (75—80 % пропионовой кислоты).
Наполнители. Оии составляют основную массу премикса.
Биологически активные вещества и сопутствующие им компо-
ненты (антиоксиданты, кокцидиостаты и другие микродобавки)
вводятся в премикс в количестве 10—30 % от массы. Основное
назначение наполнителя — обеспечить оптимальное перемеши-
вание и равномерное распределение биологически активных ве-
ществ в объеме корма. Оптимальный объем премикса может со-
ставлять от 0,2 до 1 % массы корма.
В качестве наполнителя могут быть использованы: мука
пшеничная, соевая, кукурузная, рисовая, ячменная, различные
отруби, жмыхи и кормовые дрожжи. Реже в качестве наполни-
телей применяют корма животного происхождения (муку рыб-
ную, мясокостную), что объясняется неустойчивостью находя-
щихся в них жиров. В последнее время в качестве наполнителей
премиксов стали шире использоваться отходы и побочные про-
дукты некоторых микробиологических процессов: высушенный
мицелий продуцентов антибиотиков, сухие кубовые остатки.
Технологическая схема производства премиксов. Включает
следующие основные операции: прием, размещение и хранение
сырья, дозирование биологически активных компонентов, дози-
рование микрокомпонентов, смешивание нх с наполнителем, из-
мельчение, получение премикса.
Основная задача специализированных предприятий — изго-
товление премиксов, точно соответствующих рецептуре и обес-
печивающих получение максимального эффекта при скармлива-
нии животным комбикормов. С учетом этого создается техноло-
гическая схема производства и подбирается соответствующее
оборудование, а также учитывается характер наполнителя, ка-
чество и физико-химические свойства препаратов биологически
активных добавок, наличие жидких компонентов, состав ре-
цептур.
На рис. 9.2 представлена технологическая схема завода пре-
миксов мощностью более 70 тыс. т. Для обогащения промыш-
ленных комбикормов используют премиксы 1 %-ной концентра-
ции. На завод поступает большое количество сыпучих и жидких
компонентов в различной упаковке — мешках, ящиках, пакетах.
Пшеничные отруби, используемые в качестве наполнителя, пред-
варительно взвешиваются и загружаются пневмотранспортом
в силосные хранилища.
Отруби поступают иа завод влажностью 12—15 % и содер-
жат до 20 % крупной фракции зерновых оболочек. Для получе-
ния продукта, удовлетворяющего требованиям стандарта, иа-
232
ж
Ряс. 9.2. Технологическая схема специализиро-
ванного производства премиксов:
1 — узел приема наполнителя; 2 — силосные храни-
лища; 3 — сушилка наполнителя; 4 — бункера для
высушенного наполнителя; 5 — просеивающие на*
шины; 6 — дробилка; 7 — бункера высушенного и
дробленого наполнителя; в — узел загрузки и хра-
нения макрокомпонентов; 9 — нагрузочное устрой-
ство для солей микроэлементов; 10 — смеситель солей с наполнителем; 11 — бункера
для солей микроэлементов; 12 — смеситель предварительной минеральной смеси; 13 —
дробилка тонкого помола солей; 14 — смеситель; 15 — бункера минеральной смеси; 16 —
загрузка и хранение средних компонентов; 17 — смеситель мнкрокомпонентов; 18 — бун-
кера витаминной линии; 19 — смеситель витаминной смеси; 20 — бункера витаминной
смеси; 21 — ввод жидкого холинхлорида; 22 — главный смеситель; 23 — весовыбойный
автомат; 24 — штабелеформнрующая машина
полиитель для премиксов подсушивают в сушилке до 7—8 °/о-
ной влажности, а затем просеивают через сито с отверстиями
диаметром 2 мм. Просеянные отруби (проход) направляются
в производственные бункера готового наполнителя, а крупные
частицы (отход) дробятся на дробилке до необходимой степени
измельчения. Узлы приема, хранения и дозирования биологиче-
ски активных компонентов группируются по весовым признакам
и совместимости компонентов. Так, макрокомпоиеиты, не тре-
бующие предварительной подготовки, например кормовые пре-
параты ферментов, метионин, дозируемые в количествах от 20
до 100 кг на 1 т премикса, загружаются в систему бункеров над
весами.
Кормовые антибиотики, витамины Bi2 и В2, дозируемые
в сравнительно небольших количествах — от 5 до 20 кг на 1 т
премикса, загружают в буикер с многокомпонентными весами
9 Заказ № 1535 233
грузоподъемностью 50 кг. Соли микроэлементов подаются в спе-
циальное загрузочное устройство одиовремеиио с некоторым ко-
личеством наполнителя, смешиваются, измельчаются в дробилке
грубого помола и поступают в соответствующие бункера над си-
стемой многокомпонентных весов. Отвешенные для приготовле-
ния премикса порции солей поступают в предварительный сме-
ситель, смешиваются и измельчаются в дробилке тонкого по-
мола до частиц размером 60—100 мкм, после чего подаются
в наддозаториые бункера системы основного смешивания с ве-
сами грузоподъемностью 50 кг. * •
Узел дозирования микро компонентов, вводимых в состав пре-
миксов в количествах от 50 г до 2—3 кг иа I т (высокоактивные
витамины, антибиотики), предусматривает при необходимости
их предварительное смешивание с наполнителем в смесителе
и загрузку в бункера над системой многокомпонентных весов.
Здесь также предусматриваются изготовление предварительной
витаминной смеси в смесителе и загрузка ее в наддозаторные
бункера системы основного смешивания над весами со шкалой
на 20 кг. В этой же системе предусмотрено введение солей йода
(после предварительного смешивания со стабилизаторами—тио-
сульфатом и бикарбонатом натрия, наполнителем). Таким об-
разом, непосредственно в главном смесителе дозируются на-
полнитель (1000 кг), макрокомпонеиты (200 кг), компоненты,
•содержание которых не превышает 50 кг, предварительная ми-
неральная смесь (50 кг) и предварительная витаминная смесь
(20 кг). Сюда же вводятся жидкие компоненты — холиихлорид
и сантохии. Управление работой всех многокомпонентных весов,
процессом изготовления предварительных и окончательной смеси
происходит автоматически. Готовый премикс разгружается в под-
•смесительный бункер, откуда поступает на весовыбойный авто-
мат,. отвешивающий по 20—25 кг продукта в мешки. Зашитые
мешки с премиксом подаются на штабелеформирующую ма-
шину, а затем направляются на склад готовой продукции.
Гарантийный срок хранении премиксов устанавливают бмес
со дия изготовления.
В СССР утверждено и централизованно выпускается в на-
стоящее время более 30 композиций премиксов комплексного со-
става для различных видов и возрастных групп скота и птицы.
Кроме того, в отдельных республиках разработаны рецептуры
и выпускаются премиксы, учитывающие специфические условия
данной зоны.
Научно-технический прогресс в области производства пре-
миксов направлен иа постоянное повышение качества этих пре-
паратов, вырабатываемых микробиологической промышлен-
ностью. Совершенствование технологии премиксов невозможно
без постоянной работы над улучшением их рецептуры с учетом
последних достижений науки и практики в области кормления
•сельскохозяйственных животных.
234
Глава 10. ОЧИСТКА СТОЧНЫХ ВОД
И ГАЗОВЫХ ВЫБРОСОВ
10.1. ОЧИСТКА СТОЧНЫХ ВОД
Большое количество продуктов, используемых и получаемых
в процессах микробиологического синтеза, обусловливает обра-
зование сточных вод, загрязненных всевозможными органиче-
скими и неорганическими соединениями. Сточные воды — это
воды, отводимые после использования в бытовой и производ-
ственной деятельности человека (табл. 10.1).
Состав сточных вод микробиологической промышленности
зависит от профиля предприятия, вида перерабатываемого
сырья и климатических условий района размещения завода. По-
этому и концентрация веществ, входящих в состав стоков, ко-
леблется в значительных пределах. Различия физико-химиче-
ских показателей состава сточных вод возможно проиллюст-
рировать иа примере гидролизно-дрожжевого производства
и производства антибиотиков.
Таблица 10.1 Характеристика сточных вод
Показатели Гидролизно- дрожжевое производство Производство антибиотиков
pH 5,5 6,5
БПК6, мг/л 2400 1000—7000
3000 1400—9000
Взвешенные вещества, мг/л 950 2000—5000
Азот аммонийный, мг/л 150 100—200
Фосфаты, мг/л 40 3—150
Фурфурол, мг/л 50 —
Из всего количества воды, забираемой из водоемов, про-
мышленные предприятия и коммунальное хозяйство расходуют
безвозвратно только 5—10 %, остальное количество воды сбра-
сывается обратно в водоемы в загрязненном состоянии. Сбрасы-
ваемая вода в той или иной степени затрудняет правильное ис-
пользование водных бассейнов для народного хозяйства, а в от-
дельных случаях полностью выводит их нз строя.
В каждом водоеме, куда поступают промышленные стоки,
будь тв море, большая или малая река, озеро, пруд, существует
жизнь. В водоемах живут рыбы, водоплавающие животные:
и птицы. В толще воды находится планктон, состоящий нз взве-
шенных в воде мельчайших низших организмов (водоросли, ин-
фузории, рачки, личинки, насекомые и др.), составляющие ос-
новную пищу для рыбы. На дне водоемов обитают дониые ор-
ганизмы, составляющие так называемый бентос. Это водоросли,
9* 23S
моллюски, цветковые растения и многие другие организмы,
также необходимые для питания рыб.
Между составными частями гидросферы существует опреде-
ленное для каждого водоема биологическое равновесие, которое
резко нарушается при сбросе в водоемы неочищенных сточных
вод. Сброс сточных вод в водоем прежде всего сказывается на
содержании в воде растворенного кислорода. Это происходит за
счет окисления нестойких органических веществ, содержащихся
в сточных водах. Последствия сброса сточных вод могут про-
явиться и в увеличении интенсивности окраски, снижении pH
воды водоема и оседании иа дно взвешенных веществ. Все это
угнетает развитие планктона и донных организмов (бентоса),
являющихся кормовой базой для рыб. Снижение содержания
в воде растворенного кислорода и уменьшение кормовой базы
приводят к уменьшению запаса рыбы в водоеме, а иногда и к ее
гибели. Продукты гнилостного распада отравляют воду, делая
ее непригодной для питья. Поэтому установлены специальные
Правила охраны поверхностных вод от загрязнения сточными
водами. Этими правилами водоемы разделены иа две катего-
рии. Первая из них объединяет водоемы или отдельные их уча-
стки, используемые для централизованного или нецеитрализо-
ванного хозяйственно-питьевого водоснабжения и обеспечения
пищевой промышленности; ко второй относятся участки водое-
мов, предназначенные для купания, спорта и отдыха населения,
а также расположенные в черте населенных пунктов.
Правила нормируют показатели загрязнения в водоеме после
смешения сточных вод с водами водоема. К ним относятся: ко-
личество растворенного в воде кислорода после смешения, ко-
торое должно быть не менее 4 мг/г; биохимическая потребность
в кислороде (ВПК); содержание взвешенных веществ в воде
(оно не может увеличиваться после спуска сточных вод более
чем на 0,25 и 0,75 мг/л для водоемов соответственно первой и вто-
рой категорий); минеральный осадок, который ие может быть
•более 1000 мг/л, в том числе хлоридов 350 и сульфатов 500 мг/л.
Вода ие должна иметь запахов и привкусов и придавать их мясу
рыбы, кислотность воды должна находиться в пределах 6,5^
=^рН^8,5; иа поверхности воды не должно находиться пла-
вающих примесей (пленок, пятен минерального масла); не до-
пускается содержание ядовитых веществ в коицеитрацнях, ока-
зывающих вредное влияние на людей и животных, и др. Во всех
случаях категорически запрещается сбрасывать в водоемы ра-
диоактивные сточные воды; они уничтожаются захоронением
в специально отведенных местах.
Как мы уже отмечали, сбрасываемые в водоемы промышлен-
ные стоки нарушают биологическое равновесие водоема.
Органические вещества, содержащиеся в сточных водах, окис-
ляются до диоксида углерода и воды, являющихся безвредными
.для водоема веществами. В этом проявляется так называемая
236
способность самоочищения водоема. Для этого расходуется кис-
лород водоема, причем его расходуемое количество для различ-
ных органических веществ различно. Количество кислорода,
которое поглощают при окислении различные вещества, в оп-
ределенный отрезок времени называется биохимической потреб-
ностью в кислороде — БПК — и выражается в миллиграммах
кислорода на одии грамм окисляемого вещества (мг О2/г),
а в растворах — в мг О2 иа литр раствора (мг О2/л). Различают
БПКб (пятидневный), БПК20 (двадцатидиевиый), БПКполн (пол-
ный), когда все вещество окисляется полностью. Чаще всего
сточные воды представляют собой сложные системы, содержа-
щие смеси различных веществ, и БПК их составляет от 200 до
3000 мг О2/л. По санитарным нормам БПКполн ие должно пре-
вышать в водоемах первой категории 3 мг О2/л, а второй кате-
гории — 6 мг О2/л. Очевидно, что при сбросе таких неочищенных
стоков количество имеющегося в водоеме кислорода значительно
уменьшится либо ои израсходуется полностью.
Следовательно, необходима очистка стоков до такой степени,
чтобы при сбросе их в водоемы и смешении с водой водоема
БПК оказался в пределах нормы, установленной санитарными
правилами.
Очистка сточных вод — это разрушение или удаление из ннх
определенных веществ. Обеззараживание сточных вод преду-
сматривает удаление из них патогенных микроорганизмов. Сте-
пень очистки рассчитывают в зависимости от расхода воды в во-
доеме: очевидно, что чем меньше в реке секундный расход воды
(дебит), тем большая степень очистки стока требуется, и наобо-
рот. Установлены предельно допустимые концентрации (ПДК)
вредных веществ (их насчитывают более 400) в водоемах саии-
тарно-бытового водоиспользоваиия. Превышение их концентра-
ции в стоках оказывает вредное действие на человека и живот-
ный мир. Зная содержание вредных веществ в стоках, можно
рассчитать, до какой степени их следует очистить (или разба-
вить), чтобы при смешении с водой водоема предельно допусти-
мые концентрации не были превышены.
Поступающие в водоем загрязнения в большинстве случаев
способны к разрушению: их физико-химические свойства, струк-
тура, концентрация подвергаются изменениям во времени
и в пространстве, и от постоянного протока вода приобретает
прежние свойства. Этот процесс называется самоочищением.
Процесс очень сложный и происходит вследствие уменьшения
концентрации загрязняющих веществ в результате их разбавле-
ния, выпадения осадков; основным же фактором самоочищения
является биохимический распад органических соединений под
действием микроорганизмов. Самоочищение — важное явление,
облегчающее поддержание нормального санитарного режима
в водоеме. Но при этом получается, что водоем выполняет на
некотором протяжении роль очистного сооружения, что затруд-
237
няет недопотребление н водопользование на этом участке. Ха-
рактер и состав сточных вод, сбрасываемых предприятиями»
весьма разнообразны, различны и методы очистки их от за-
грязнений.
Выбор схемы очистки зависит от многих факторов: количе-
ства различных видов сточных вод, их расходов, возможности
и экономической целесообразности извлечения примесей из сточ-
ных вод, требований к качеству очищенной воды с целью ис-
пользования ее в системах повторного и оборотного водоснаб-
жения, качества свежей воды, мощности водоема, наличия рай-
онных или городских очистных сооружений.
Схема очистки сточных вод должна обеспечивать минималь-
ный сброс сточных вод в водоем, максимальное использование
очищенных сточных вод в технологических процессах и систе-
мах оборотного водоснабжения, более полное извлечение цен-
ных примесей.
£дДля очистки применяют три основных типа очистных соору-
жений: локальные (цеховые), общие (заводские) н районные
(городские).
Локальные очистные сооружения предназначены для обез-
вреживания сточных вод непосредственно после технологиче-
ских установок и цехов. Локальная система очистки являетси
продолжением технологического процесса производства. На ло-
кальных установках очищаются сточные воды, которые без очи-
стки не могут быть направлены в системы повторного и оборот-
ного водоснабжения или иа общие заводские или районные (го-
родские) очистные сооружения.
Применяются регенерационные методы очистки: отстаивание,
флотация, экстракция, ректификация, адсорбция, ионный обмен,
обратный осмос и др. В ряде случаев используют установки тер-
мического обезвреживания сточных вод — огневой метод.
Общие (заводские) очистные сооружения могут включать со-
оружения первичной (механической), вторичной (биологиче-
ской) и третичной (доочистки) очистки сточных вод. На многих
предприятиях имеются сооружения первичной и вторичной очи-
стки. Установки доочистки необходимо применять для получе-
ния воды, которая может быть использована повторно в техно-
логических процессах или в системах оборотного водоснаб-
жения.
Районные (городские) очистные сооружения предназначены
в основном для механической и биологической очистки бытовых
сточных вод.
Производственные сточные воды, подлежащие совместному
отведению и очистке с бытовыми сточными водами населенного
пункта, не должны нарушать работу сетей и сооружений, т. е.
не должны содержать: более 500 мг/л взвешенных и всплываю-
щих веществ; веществ, способных засорять или отлагаться на
стенках канализационных труб; веществ, оказывающих разру-
238
шающее действие на материал труб и элементы сооружений ка-
нализационной сети; горючих примесей и растворенных газооб-
разных веществ, способных образовывать взрывоопасные смеси
в канализационных сетях и сооружениях, н вредных веществ
в концентрациях, препятствующих биологической очистке сточ-
ных вод или сбросу их в водоем.
Температура этих вод ие должна превышать 40 °C. Очистка
сточных вод на крупных районных (городских) очистных стан-
циях экономически более целесообразна, чем на местных менее
крупных.
Применяются пять основных видов очистки: механическая,
физико-химическая, химическая, биологическая, термическая.
Механическая очистка. Используется для выделения из сточ-
ных вод иерастворенных грубодисперсиых примесей методом
процеживания, отстаивания, фильтрования. Для задержки круп-
ных загрязнений вода процеживается через решетки. Частицы
минерального происхождения, главным образом песок, выделя-
ются осаждением в устройствах, называемых песколовками.
Для освобождения сточных вод от очень мелких частиц приме-
няются фильтры, чаще всего из слоя зернистого материала, на-
пример песчаные фильтры. Отстойники применяются как для
предварительной очистки сточных вод перед биологической очи-
сткой, так и как самостоятельные сооружения, если по сани-
тарным условиям вполне достаточно выделить из сточных вод
только механические примеси. В зависимости от назначения от-
стойники подразделяются иа первичные и вторичные. Первич-
ные отстойники устанавливаются до сооружений биологической
обработки сточных вод, вторичные — после этих сооружений.
По конструктивным признакам отстойники подразделяются иа
горизонтальные, вертикальные и радиальные.
Очистка механическими способами обычно применяется в ка-
честве первой стадии в общей системе очистки сточных вод.
Физико-химическая очистка. Методы такой очистки весьма
разнообразны и в большинстве случаев требуют применения
различных реагентов. Многие из них основываются на измене-
нии физического состояния загрязнений, которое облегчает их
удаление из стоков: коагуляция, флотация, эвапорация. В по-
следнее время широко используется иоииый обмен. Методы фи-
зико-химической очистки требуют использования дорогостоящих
реактивов, одиако ввиду их эффективности, а иногда невозмож-
ности решить задачу очистки другим способом, их широко ис-
пользуют в промышленности, особенно для очистки многоком-
понентных сточных вод с малой концентрацией загрязнителей.
Химическая очистка. Применяется когда выделение загряз-
нителей возможно только в результате химических реакций.
При Химической очистке протекают реакции конденсации, окис-
ления, нейтрализации, в результате которых получаются неток-
сичные или менее токсичные вещества, растворимые в воде сое-
239
динения переходят в нерастворимые и легко отделяются, кислые
и щелочные стоки нейтрализуются. Этот метод очистки требует
большого расхода реагентов и, как правило, после химической
очистки требуется очистка другими методами. Одиако в ряде
случаев применение химического метода очистки является не-
обходимым.
Биологическая очистка. Получила широкое распространение
для очистки сточных вод различных производств. Биологический
способ очистки стоков является также основным для предприя-
тий микробиологической промышленности. Этот метод основы-
вается иа способности микроорганизмов использовать в каче-
стве питательного субстрата многие органические и неорганиче-
ские соединения, содержащиеся в сточных водах.
Широкое использование биологического метода обусловлено
его достоинствами: возможностью удалять из сточных вод раз-
нообразные органические соединения, в том числе токсичные;
простотой аппаратурного оформления; относительно невысо-
кими эксплуатационными расходами. К недостаткам метода сле-
дует отнести высокие капитальные затраты, необходимость стро-
гого соблюдения технологического режима очистки, токсичное
действие иа микроорганизмы ряда органических и неорганиче-
ских соединений; необходимость разбавления сточных вод при
высоких концентрациях примесей.
Биологическая очистка сточных вод может производиться
в аэробных и анаэробных условиях. Аэробные методы, получив-
шие наибольшее распространение, основываются иа использо-
вании аэробных микроорганизмов, для жизнедеятельности кото-
рых необходимо присутствие в 'воде свободного кислорода. При
анаэробной очистке, т. е. без доступа кислорода воздуха, орга-
нические вещества разрушаются анаэробными микроорганиз-
мами. Анаэробный метод (сбраживание) редко применяется
для очистки производственных сточных вод, а используется в ос-
новном для сбраживания осадков и в ряде случаев для дени-
трификации сточных вод.
В процессе биологической очистки сточных вод часть окис-
ляемых микроорганизмами веществ используется в процессах
биосинтеза (образование биомассы — активного ила или био-
пленки), а другая часть превращается в безвредные продукты
окисления: Н2О, СО2, Ь1О2 и др.
Принцип действия современных аппаратов и сооружений био-
логической очистки сточных вод основывается на методах не-
прерывного культивирования микроорганизмов.
Процесс изъятия и потребления микроорганизмами органи-
ческих примесей сточных вод состоит в основном из трех ста-
дий: массопередачи органического вещества и кислорода из жид-
кости к поверхности клетки; диффузии вещества и кислорода
через полупроницаемую мембрану клетки и метаболизма
диффундированиых продуктов, который сопровождается прнро-
240
стом биомассы, а также выделением энергии, диоксида угле-
рода и т. д. Основная роль в процессе очистки принадлежит
процессам превращения вещества внутри клетки. Интенсивность
и эффективность биологической очистки сточных вод определя-
ются скоростью размножения бактерий. Когда в очищаемых
сточных водах остается мало органических веществ, то наступает
вторая фаза биологической очистки — нитрификация.
В этой фазе азотсодержащие вещества вначале окисляются до
нитритов, а затем до нитратов. Таким образом, биологическая
очистка состоит из двух фаз: минерализации, или окислении уг-
леродсодержащих веществ, н нитрификации. Появление в очи-
щенных сточных водах нитритов и нитратов свидетельствует
о глубокой степени очистки.
Большинство биогенных элементов: углерод, водород, кисло-
род, серу и микроэлементы микроорганизмы извлекают из раз-
рушаемых органических веществ. Недостающие для построения
биомассы элементы, чаще всего азот, фосфор, калий, прихо-
дится добавлять в очищаемые стоки в виде солей или вводить
вместе с бытовыми сточными водами. В процессах биологиче-
ской очистки кроме бактерий участвуют одноклеточные орга-
низмы— водные грнбы, простейшие организмы (амебы, жгути-
ковые и ресничные инфузории), микроскопические животные
(коловратки, круглые черви — нематоды, водные клещи) и не-
которые другие.
Микроорганизмы, которые участвуют в процессе биологиче-
ской очистки, формируются в виде активного ила или био-
плеики. Активный ил имеет вид буро-желтых мелких
хлопьев размером 3—150 мкм, взвешенных в воде и представ-
ляющих собой колонии живых микроорганизмов, в том числе
бактерий, образующих слизистые капсулы — зооглеи. Б и о -
пленка—это слизистые обрастания (толщиной 1—3 мм) жи-
выми микроорганизмами фильтрующего материала очистных со-
оружений.
Биологическую очистку проводят иа биофильтрах или
в аэротенках.
Биофильтры представляют собой прямоугольные или
круглые сооружения со сплошными стенками и двойным дном:
верхним в виде колосниковой решетки и иижиим сплошным.
Дреиажиое дио состоит из железобетонных плит с площадью
отверстий ие меиее 5—8 % площади поверхности фильтра.
Схема биофильтра представлена иа рис. 10.1.
Фильтрующим материалом могут служить щебень, галька
горных пород, керамзит, шлак. Нижний поддерживающий слой
во всех типах биофильтров должен применяться с размерами
60—100 мм. Водораспределительное устройство обеспечивает
равномерное с небольшими интервалами орошение фильтрую-
щей массы. При контакте сточной воды с биопленкой, образую-
щейся иа поверхности фильтрующего материала, происходит
241
Рнс. 10.1 Биофильтр
сорбция органических загрязнений поверхностью микробных
клеток. Во время паузы между орошениями сорбированные за-
грязнения окисляются и сорбционная активность биопленки вос-
станавливается. Прошедшая через толщу биофильтра вода вы-
текает через отверстия в дренажном дне и поступает на днище,
с которого стекает в отводные лотки. Для поддержания окисли-
тельного процесса в фильтр снизу подается воздух: в неболь-
ших фильтрах путем естественной вентиляции, в более совер-
шенных — вентиляторами.
В биофильтре происходят непрерывный прирост и отмирание
биоплеики. Омертвевшая биопленка смывается протекающей
сточной водой и выносится из биофильтра. Очищенная вода по-
ступает во вторичные отстойники, где осаждаются вынесенные
частицы биоплеики, после чего вода может быть спущена в во-
доем. Эффект очистки нормально работающих биофильтров до-
статочно высок и может достигать по БПК5 90 %.
Вследствие того что биохимические процессы происходят
с выделением тепла, биофильтры сами себя обогревают, а круп-
ные установки, защищенные от потери тепла, работают при не-
больших морозах, однако при температуре внутри фильтра
менее 6 °C деятельность микроорганизмов прекращается. Био-
фильтры имеют много недостатков и управлять процессом очи-
стки в них можно, только меняя подачу воды. Несовершенство
описанных биофильтров привело к созданию более совершен-
ных типов биофильтров: например, высокоиагруженные с повы-
шенной скоростью подачи очищаемой воды и большим воздухо-
обменом, башенные фильтры с большой пропускной способ-
ностью, фильтры с рециркуляцией очищаемой воды, двухступен-
чатые и др.
Аэротенк типовой конструкции представляет железобе-
тонный герметичный сосуд, имеющий прямоугольное сечение.
242
Аэротенк разделяется про-
дольными перегородками иа
несколько коридоров (3—4).
Сточные воды иа аэротенка?
очищаются теми же микро-
организмами, что и иа био-
фильтрах. Очистка состоит
в обработке стоков в энер-
гично аэрируемом резервуа-
ре, где они контактируют с
илом. Схема аэротенка пред-
ставлена иа рис. 10.2.
Биохимическое окисление
органических веществ в аэротен-
ках также происходит в две основные стадии: на первой — ад-
сорбция загрязняющих веществ микроорганизмами, иа второй—
микроорганизмы завершают их окисление и восстанавливают
свою способность к окислению; обе стадии начинаются одно-
временно, ио вторая заканчивается позднее первой. Поэтому
первый коридор аэротенка используется как регенератор, в него
поступает только ил, возвращаемый из отстойников. Здесь он
продувается воздухом и восстанавливает свою активность. Очи-
щаемые сточные воды поступают в начало второго коридора
и, смешиваясь с активным илом, проходят по стальным коридо-
рам аэротенка. Для предупреждения оседания взвешенных ве-
ществ коридоры продуваются воздухом. Подача воздуха осу-
ществляется либо через пористые плиты, либо через пористые
керамические трубы. Воздухораспределительные устройства раз-
мещаются ие по центру, а около одной из стен коридора. Бла-
годаря этому в аэротенке образуются циркуляционные потоки
в поперечном направлении. В результате этого сточные воды не
только двигаются вдоль коридора, но и закручиваются по спи-
рали. Тем самым увеличивается интенсивность перемешивания,
а следовательно, улучшаются условия очистки.
При процессах, протекающих в аэротенках, количество ила
вследствие его прироста увеличивается. Если ил из системы не
отбирается, то его концентрация будет постепенно возрастать.
Однако в иле будут накапливаться старые ослабевшие клетки
микроорганизмов и активность ила будет снижаться, ил будет
«стареть», поэтому возвращают ие весь ил, часть его выводится
из системы. Обычно концентрация активного ила поддержива-
ется в пределах 2-4 г/л. Оптимальное значение pH при биохи-
мической очистке обычно 6,5—8,5. Необходимое количество био-
генных элементов зависит от БПК стоков. Так, при БПКполч
500 мг Ог/л соединений фосфата должно быть не менее 3, а ус-
вояемого азота — ие менее 15 мг/л. Концентрация минеральных
солей в смеси сточных вод, поступающих в аэротенки, должна
быть не более 10 г/л, а количество взвешенных веществ—не
более 150 мг/л. Наилучшие результаты достигаются прн БПК
243
сточных вод на входе около 200 мг Ог/л. Тогда прн интенсивно-
сти подачи воздуха 5 м3/(м2-ч) БПКпОЛН очищенной воды
можно снизить до 15 мг Ог/л.
Как показывает опыт эксплуатации аэротенков, наличие
более 1000 мг/л органических веществ в сточной воде перед
аэротенком недопустимо. Сточные воды находятся в аэротенках
обычно 8—12 ч. Одиако при большом содержании в воде мед-
ленно окисляющихся соединений контакт активного ила с водой
возрастает до 18—20 ч, что существенно увеличивает стоимость
очистки. Процесс очистки сточных вод в аэротенках весьма
сложный и им необходимо повседневно управлять, т. е. изме-
нять концентрацию активного нла регулированием отбора из-
лишней биомассы, режимом аэрации, поддержанием оптималь-
ной концентрации загрязняющих веществ в очищаемых сточных
водах, подачей в стоки недостающих для развития микроорга-
низмов биогенных веществ и многими другими путями.
Все время идет усовершенствование аэробной очистки сто-
ков. В настоящее время, например, разработана и начинает при-
меняться очистка сточных вод в окситенках с использованием
вместо воздуха чистого кислорода и активного ила высоких кон-
центраций. Концентрацию кислорода в воде окситенков доводят
до 10—12 мг/л (вместо 2—-4 мг/л в аэротенках), а дозу актив-
ного нла до 15 г/л (в аэротенках — 2—4 г/л); при этом окисли-
тельная мощность окситенков оказывается выше, чем у аэро-
тенков, в 5—6 раз.
Аэротенки технологически связаны с вторичными отстойни-
ками. Они служат для отделения активного ила от очищенной
в аэротенке сточной воды. Они используются также как кон-
тактные резервуары, перед которыми в сточную воду подается
хлорный раствор. В настоящее время обеззараживаются сточ-
ные промышленно-бытовые воды как после механической, так
и после биологической очистки. Дезинфицируются воды жид-
ким хлором. Доза активного хлора после механической очистки
должна быть не менее 30 мг/л, после неполной биологической —
15 мг/л, после полной искусственной биологической очистки —
10 мг/л. Продолжительность контакта хлора с жидкостью дол-
жна быть не менее 30 мнн. Сточная жидкость хлорируется в спе-
циальных контактных резервуарах, подобных горизонтальным
или вертикальным отстойникам.
Биологические, илн очистные, пруды используются как са-
мостоятельные биологические очистные устройства или в каче-
стве конечного пункта очистки сточных вод, предварительно об-
работанных нз биофильтрах или аэротенках.
Если пруды являются самостоятельными очистными соору-
жениями, сточные воды после отстойников разбавляются до по-
ступления в пруды трех- или пятикратными объемами техниче-
ской илн хозяйственно-питьевой воды. Для отстоенных сточных
вод без разбавления нагрузка на пруды составляет до250м3/га
244
в сутки, для биологически очищенных вод—-до 500 м3/га в сутки.
Средняя глубина в биологических прудах должна быть не менее
0,5 м и ие более 1 м. Срок «созревания» прудов для средней по-
лосы СССР ие менее одного месяца.
Термическая очистка. Заключается в полном окислении сточ-
ных вод при высокой температуре (прн сгорании) загрязняю-
щих веществ с получением нетоксичных продуктов сгорания
и твердого остатка. Этот метод эффективен для обезврежива-
ния производственных сточных вод, содержащих токсичные ор-
ганические и минеральные вещества. Возможны различные ва-
рианты применения термического способа, начиная от полного
уничтожения стоков с небольшим количеством твердого остатка
и до значительного уменьшения (упаривания) их, после чего
концентрированные растворы можно либо захоронить в от-
валах, либо использовать для получения ценных продуктов. Эта
очистка исключает загрязнение стоками водоемов. При терми-
ческой очистке приходится испарять огромные количества воды,
поэтому при больших объемах сточных вод и при малых кон-
центрациях загрязнителей этот способ экономически нецелесо-
образен.
Механобиологическая очистка. На многих предприятиях
используется механобиологическая очистка сточных вод, схема
которой представлена ниже.
Промышленные стоки
Нейтрализации и добавление биогенных
элементов
Песок и другие тяжелые при- *---------Песколовки
меси |
Ил из первичных отстойников*----------Первичные отстойники
Биологическая очистка *_
I I
Ил из вторичных отстойнн- *-----------Вторичные---»-Циркуляция
ков отстойники ила
I
Очищенные сточные воды
При механобиологической очистке получается три вида осад-
ков: отбираемых из песколовок, первичных н вторичных отстой-
ников. В настоящее время применяется подсушивание осадков
очистных сооружений на иловых площадках. Подсушивание
осадка на иловых площадках состоит из двух последовательных
этапов: первый этап — удаление гравитационной иловой воды
путем отстаивания и фильтрации через естественное или искус-
ственное основание (дренаж) карт иловых площадок; второй
этап — естественное подсыхание осадка после обезвоживания,
245
происходящее главным ооразо^
за счет испарения и небольшой
фильтрации. Осадки, поступаю-
щие иа нловые площадки, имеют
влажность от 90 до 97 %- Их
подсушивают в среднем до влаж-
ности 75 %, вследствие чего
объем осадков уменьшается
в три—восемь раз.
Иловые площадки представ-
ляют собой участки земли, окру-
женные со всех сторон земля-
ными валиками и разделенные
на прямоугольные части —
карты. Иловые площадки устраи-
вают на естественном илн искус-
Рнс. 10.3. Метантенк:
1 — электродвигатель; 2 — газоотвод-
ная трубка; 3 — трубопровод горячей
воды
ственном основании с дренажем. Подсохший ил после двух-трех
напусков на площадки убирают.
Если основную массу очищаемых стоков составляют хозяй-
ственно-бытовые стоки, то образуется осадок/ имеющий не-
приятный запах, плохо отдающий воду при подсушивании и
представляющий опасность по санитарным нормам. Ои содер-
жит большое количество яиц гельминтов и различные патоген-
ные микроорганизмы.
Обработка осадков направлена иа доведение нх до состоя-
ния, при котором исключается загрязнеине окружающей среды.
Эти осадки подвергаются обработке в специальных сооруже-
ниях (метантенках), где происходит микробиологическое раз-
ложение органического вещества в анаэробных условиях.
Метантенки представляют собой железобетонные герме-
тически закрытые резервуары с коническим днищем (рис. 10.3).
Интенсификация распада органической части осадка достига-
ется искусственным подогревом и перемешиванием. Метантенки
эксплуатируются в условиях мезофильного (30—35 °C) н тер-
мофильного (50—55 °C) сбраживания осадка. Термофильное
сбраживание отличается большей интенсивностью распада ор-
ганического вещества и заканчивается примерно в 2 раза ско-
рее, чем мезофильное. Среди анаэробов термофилов имеются
аммонифицирующие бактерии, денитрифицирующие и десульфи-
рующие, сбраживающие углеводы, разлагающие клетчатку и
жирные кислоты, т. е. все те физиологические группы микробов,
которые в условиях мезофильного брожения участвуют в раз-
ложении осадка. Степень распада органических веществ в ме-
тантенках составляет в среднем 40 %- Предел сбраживания за-
висит только от химического состава осадка. Термофильное
сбраживание осадка приводит к более глубокому _ распаду,
а также к уничтожению гельминтов, что имеет большое сани-
тарное значение. Одиако термофильное сбраживание имеет н
246
недостатки. Здесь увеличенный расход тепла по сравнению с ме-
зофильным режимом работы. Кроме этого, сброженный в тер-
мофильных условиях осадок хуже обезвоживается.
Прн сбраживании выделяется смесь газов, состоящая из
СО—65 % метана, 16—34 % диоксида углерода, 0—3 % азота, 0 —
3 % водорода и следов сероводорода. Образующийся газ по-
ступает на сжигание для получения пара, используемого для
поддержания нужной температуры в метантенке. В результате
сбраживания количество осадков уменьшается примерно вдвое,
так как вследствие разложения часть органического вещества
минерализуется и переходит в растворенное н газообразное со-
стояние, а несброднвший осадок приобретает однородную зер-
нистую структуру, лучше отдает при сушке воду, теряет гнило-
стный запах. Сброженный осадок широко используется как
удобрение. Кроме того, подсушенный иа иловых площадках и
сформованный в виде брикетов сброженный осадок может слу-
жить топливом.
В настоящее время широкое распространение получает до-
очистка сточных вод с последующим использованием их в про-
изводственном водоснабжении. Доочистка вод перед повторным
использованием их бывает вызвана повышенным содержанием
солей, биологически неокисляемых органических веществ, кан-
церогенных веществ и др. Методы доочистки выбираются в за-
висимости от характера остаточного загрязнения.
Повторное использование доочищенных сточных вод резко
сокращает (в 20—25 раз) потребление свежей воды из источ-
ников и сброс сточных вод в канализацию.
Наиболее радикальным решением проблемы предотвраще-
ния загрязнения водоемов сточными водами считается создание
безотходных технологических процессов. Безотходная техноло-
гия развивается несколькими путями:
1. Создание различных типов бессточных технологических
систем н водооборотных циклов иа базе существующих, внед-
ряемых и перспективных способов очистки сточных вод.
2. Разработка и внедрение систем переработки отходов про-
изводства и потребления, рассматриваемых как вторичные ма-
териальные ресурсы .
3. Создание и внедрение принципиально новых процессов
получения традиционных видов продукции, позволяющих ис-
ключить или сократить технологические стадии, дающие основ-
ное количество отходов.
4. Создание территориально-промышленных комплексов
(ТПК) с замкнутой структурой потоков сырья и отходов.
10.2. ОЧИСТКА ГАЗОВЫХ ВЫБРОСОВ
Особенностью предприятий микробиологической промыш-
ленности является использование жизнедеятельности различных
микроорганизмов (микроскопические грибы, дрожжи, бактерии,
247
актнномнцеты, вирусы). В результате на предприятиях отрасли
имеется постоянный контакт обслуживающего персонала с раз-
личными микроорганизмами и продуктами их жизнедеятельно-
сти. Наряду с возможностью поступления микроорганизмов
в производственные помещения (в зависимости от характера
технологического процесса) может иметь место и одновременно
загрязнение окружающей атмосферы. Если при совершенство-
вании технологических процессов, оздоровительном действии
санитарно-защитных зон, увеличении высоты труб, отводящих
выбросы, и других мероприятий, уменьшающих выбросы в атмо-
сферу, не снижается содержание загрязнений в воздухе до пре-
дельно допустимых концентраций (ПДК), то выбросы подвер-
гаются очистке до такой степени, чтобы в конечном результате
ПДК не превышали допустимых норм. Очистка воздуха от при-
меси представляет собой процесс получения этой примеси в чи-
стом илн хотя бы в концентрированном виде. Способы очистки
выбросов зависят от фнзико-химнческнх свойств загрязняющего
вещества, его агрегатного состояния и концентрации. Выбросы
мнкробнологических производств в основном загрязнены пылью
и микроорганизмами-проду-
центами.
Наиболее распространен-
ными видами очистки явля-
ются: устройства для механи-
ческой очистки, в которых ча-
Рис. 10.4. Циклон;
1 — корпус; 2 — центральная труба; 3 —
отводная улитка для очищаемого газа;
4 — штуцер для подачи запыленного га-
за; 5 — приемный бункер для пыли; 6 —
затвор для вывода пыли «мигалка»; 7 —
контргруз мигалки
Рнс. 10.5. Схема рукавного филь-
тра:
1 — штуцер для подачи запыленного га-
за; 2 — корпус; 3 — штуцер для подачи
воздуха для продувки рукавов; 4 — уст-
ройство, встряхивающее рукава; 5 — шту-
цер для выхода очищенного газа; 6 —
фильтрующие рукава; 7 — шнек для уда-
ления пыли
248
стицы пыли оседают под действием собственной силы тяжести
или вследствие изменения направления движения, или от про-
явления центробежной силы; устройства для мокрой очистки—
орошение очищаемого воздуха жидкостью нлн пропусканием
его через слой жидкости; фильтры, в которых воздух пропу-
скается через различные пористые материалы, задерживающие
пыль и микроорганизмы.
Широко распространенным устройством для механического
пылеулавливания является циклон, действие которого основано
на использовании центробежной силы (рис. 10.4). Последняя
создается путем ввода запыленного воздуха в корпус циклона
через патрубок, ось которого направлена по касательной к кор-
пусу циклона. Эффективность очистки увеличивается прн умень-
шении размеров циклона, так как величина центробежной силы
обратно пропорциональна расстоянию частиц пыли от оси цик-
лона. Поэтому применяются батарейные циклоны — несколько
циклонов (до восьми), установленных параллельно, вместо од-
ного циклона большого размера. В батарейных циклонах вра-
щательное движение создается направляющим аппаратом, вы-
полненным в виде винта или розетки. Аппарат устанавливается
в каждый циклонный элемент. Уловленная пыль удаляется че-
рез пылевыпускное отверстие в нижней части циклона в сбор-
ный бункер, а очищенный воздух выводится через патрубок, ось
которого совпадает с осью корпуса циклона. Циклон является
эффективным пылеочистительным устройством, коэффициент
улавливания пыли с размером частиц 5 мкм достигает 85 %,
с размером частиц 10 мкм — 95 %, а с размером частиц
20 мкм — даже 99 %.
Применяются мокрые скрубберы, представляющие собой
вертикальные цилиндрические колоииы, в которые запылен-
ный воздух вводится по касательной к стенке аппарата, а в по-
ток воздуха через форсунки впрыскивают распыленную жид-
кость. На каплях жидкости происходит осаждение пылевых
частиц. Очищенный воздух отводится нз верхней части
аппарата, вода с уловленной пылью собирается внизу скруб-
бера.
Устройства мокрой очистки расходуют большое количество
воды, н прн сбросе ее в водоемы попадают дополнительно за-
грязняющие вещества. Поэтому, как правило, используется
принцип циркуляции воды. Вода из очистного аппарата вместе
со шламом подается в отстойники и после отстоя снова на очи-
стные установки, а шлам, если его нельзя использовать, уда-
ляется в отвалы. •
Фильтры — устройства, в которых воздух пропускается че-
рез пористые материалы, способные задерживать или осаждать
пыль. Для освобождения воздуха от микроорганизмов исполь-
зуются те же фильтры, что н при его подготовке перед подачей
в ферментатор.
249
Из аппаратов фильтрующего типа для очистки от пыли наи-
большее распространение получили тканевые рукавные фильтры
(рис. 10.5). Корпус фильтра 2 представляет собой металличе-
ский шкаф, разделенный вертикальными перегородками на ряд
секций, в каждой из которых помещена группа рукавов из
фильтрующего материала (лавсан). Верхние концы рукавов
заглушены н подвешены к раме, соединенной с устройством 4,
встряхивающим рукава; нижние концы рукавов открыты и
в них входит обеспыливаемый воздух, поступающий в корпус
через штуцер /. Обеспыливаемый воздух проходит через ткань
рукавов, и пыль задерживается на внутренней их поверхности.
Через определенные промежутки времени подачу запыленного
воздуха переключают на другую секцию, включают встряхи-
вающее устройство 4, кроме того, подают сильную струю чи-
стого воздуха через штуцер 3 и рукава освобождаются от нако-
пившейся пыли, которая попадает в бункер и выводится шне-
ком 7. Переход от рабочего периода к периоду продувки во
многих фильтрах автоматический. Коэффициент улавливания
при правильной эксплуатации фильтра достигает 99 %.
Глава 11. ОХРАНА ТРУДА И ТЕХНИКА
БЕЗОПАСНОСТИ
Государственные организации Советского Союза (Госстрой
СССР, Госгортехнадзор СССР, Министерство здравоохранения
СССР н др.) уделяют постоянное внимание вопросам улучше-
ния охраны н условий труда. Существующие положения об ох-
ране труда изложены в Конституции СССР, а также в кодексах
законов о труде союзных республик (КЗоТ). Большое значе-
ние для создания здоровых и безопасных условий труда имеют
нормы н правила техники безопасности. С учетом особенностей
отдельных отраслей промышленности разработаны и постоянно
совершенствуются этн правила и нормы техники безопасности
для проектирования, эксплуатации и реконструкции предприя-
тий. В частности «Правила безопасности для производств
микробиологической промышленности» утверждены Госгортех-
надзором СССР 25 марта 1975 г.
Проектирование, строительство и реконструкция предприя-
тий согласно правилам безопасности проводятся в соответствии
со строительными нормами и правилами (СНиП).
Компоновка цехов и участков разрабатывается не только
с учетом специфики технологического процесса, но и с обяза-
тельным созданием безопасных условий труда и устранения
причин, вызывающих пожары иа предприятиях. Для ликвида-
ции пожаров, возникновение которых возможно в результате
аварий, все производственные, складские и другие подсобные
помещения и сооружения обеспечиваются первичными сред-
ствами пожаротушения. В производственном здании всегда изо-
250
лируют более опасные участки от меиее опасных. Изолируют
от остальных помещений цеха: отделения чистой культуры, уча-
стки экстракции, кислотные станции и некоторые другие. В от-
дельных звукоизолированных помещениях размещают обору-
дование, которое в процессе работы создает сильный шум
(сепараторы, центрифуги, турбовоздуходувки и др.). При раз-
мещении оборудования в производственных помещениях преду-
сматривают обеспечение безопасности, удобство обслуживания,
а также возможность проведения ремонтных работ. В местах
постоянного обслуживания н между рядами установленного
оборудования (например, между группами сепараторов)
должны быть проходы не менее 2 м, а для оборудования и при-
боров, требующих периодической проверки н осмотра, не менее
0,8 м. Обслуживающие площадки, переходы и лестницы обору-
дуют прочными перилами, защитными бортиками и рифлеными
ступенями. Рабочие места должны быть хорошо освещены.
Ответственность за соблюдение правил охраны труда воз-
лагается на непосредственных руководителей подразделений,
а в целом по предприятию ответственность несут директор и
главный инженер.
Каждый рабочий, поступающий на предприятие, проходит
инструктаж по технике безопасности, а рабочие, обслуживаю-
щие оборудование (гидролизаппараты, турбовоздуходувки
и пр.), к которому предъявляются повышенные требования,
проходят специальное обучение н сдают экзамен на право ра-
боты на этом оборудовании. Периодически проводится проверка
знаний правил безопасности и противопожарных мероприятий.
Для обеспечения безопасности труда в микробиологической
промышленности в ряде случаев применяют индивидуальные
средства защиты. Спецодеждой разного покроя и изготовленной
из различных материалов в соответствии с назначением обеспе-
чиваются работающие на производственных участках и в лабо-
раториях для защиты от производственных вредностей. Персо-
нал, обслуживающий кислотные станции, участки приготовле-
ния известкового молока и др., обеспечивается специальной
обувью. На отдельных участках производства с целью за-
щиты глаз от механических повреждений, опасного воздействия
кислот, щелочей, ряда раздражающих веществ (хлор, аммиак
и др.), а также ультрафиолетовых лучей применяют различные
защитные очки. Для защиты кожных покровов рук рабочих,
контактирующих с водными растворами кислот, щелочей, солей,
органических растворителей и т. п., помимо рукавиц рекомен-
дуется использовать защитные мази.
На участках сушки, измельчения, стандартизации н фасовки
готовой продукции в воздухе могут содержаться антибиотики,
ферменты, витамины и другие биологически активные веще-
ства, которые у лиц с повышенной чувствительностью способны
вызывать разного рода аллергические реакции. Чаще всего
251
основной причиной возникновения аллергии бывает длительное
воздействие иа работающих биологически активных веществ,
попадающих в организм через дыхательные пути. При работе
на вышеуказанных участках необходимо использовать респира-
торы. Для защиты от поражающего действия паров метилового
и этилового спиртов, фурфурола, аммиака и ряда других хи-
мических веществ применяют противогазы н кислородные при-
боры.
На предприятиях микробиологической промышленности, где
в результате аварии возможно выделение взрывоопасных или
ядовитых газов и паров, предусматривают организацию газо-
спасательной службы (ГСС).
Производство любых продуктов организуется на основании
технологического регламента, в обязательном порядке вклю-
чающего раздел «Основные правила безопасного ведения про-
цесса». Для каждого аппарата в цепи технологической схемы
разрабатываются инструкции по технике безопасности и выве-
шиваются на видном месте.
Сырье и конечные продукты микробиологического производ-
ства хранят иа складах с учетом удобства и безопасности по-
грузо-разгрузочиых работ. Склады некоторых видов сырья и
продуктов микробиологического синтеза относятся к пожаро- и
взрывоопасным помещениям. Это склады дрожжей, метилового
н этилового спиртов, ацетона и т. д. Безопасность хранения
легковоспламеняющихся и горючих жидкостей обеспечивается
за счет установки в резервуарах и цистернах дыхательного
клапана и огнепреградителя.
С особой осторожностью необходимо подходить к хранению
веществ, оказывающих /вредное действие на здоровье рабо-
тающих. Это в первую очерттПГотноснтся к сильнодействующим
ядовитым веществам (СДЯВ), кислотам, шелочам и ряду дру-
гих веществ.
При транспортировке сырья, полуфабрикатов и готовой про-
дукции также необходимо соблюдать правила техники безопас-
ности. Трубопроводы по своей конструкции, материалам и ме-
ханической прочности должны отвечать условиям работы и спе-
цифическим свойствам транспортируемых по ним продуктов.
Для удобства ориентации трубопроводы окрашиваются в раз-
личные цвета согласно ГОСТ 14202—69; вода — зеленый;
пар — красный; воздух — синий; газы горючие и негорючие
(включая сжиженные) — желтый; кислоты — оранжевый; ще-
лочи— фиолетовый; жидкости горючие и негорючие — коричне-
вый; прочие вещества (питательная среда, культуральная
жидкость и др.) — серый. Противопожарные трубопроводы
окрашиваются в красный цвет. Прн прокладке трубопроводов
учитывают необходимость наблюдения за их исправностью, про-
верку герметичности и тем самым снижают опасность их по-
вреждения.
252
Разъемные части трубопроводов н аппаратов соединяются
при помощи фланцевых соединений. Герметичность фланцевых
соединений достигается за счет шлифованных, плотно приле-
гающих поверхностей или за счет прокладочных материалов.
Основным требованием для прокладочных материалов является
устойчивость к агрессивным средам и температурным воздей-
ствиям. Например, под действием органических растворителей
прокладки нз резины набухают н могут явиться причиной про-
пуска газов и даже аварии. Наиболее устойчивыми в условиях
работы с агрессивными продуктами являются прокладки из
фторопласта.
При транспортировке отдельных продуктов принимаются
специальные меры безопасности. Например, при транспорти-
ровке сухих продуктов пневмотранспортом трубопроводы осна-
щаются противовзрывными клапанами или разрывными мем-
бранами.
При возникиовенни хлопков с разрывом предохранительных
клапанов останавливают работу пневмотранспорта, проводят
осмотр н выясняют причины. После устранения неполадок пла-
стины взрывных предохранительных клапанов заменяют.
В технологических процессах широко используют оборудова-
ние, работающее под высоким давлением, при повышенной тем-
пературе, с высокой скоростью вращения деталей, вибрации,
шума и т. д.
Основными условиями по обеспечению безаварийной работы
оборудования являются правильная установка, эксплуатация н
своевременное проведение планово-предупредительного ремонта
(ППР).
Перенесение сроков проведения текущего ремонта, установ-
ленных месячным графиком ППР, как правило, запрещается;
отклонение от двух суток по технологическим причинам допу-
скается только с разрешения главного инженера предприятия
н оформляется специальным актом. Отсрочка проведения сред-
него ремонта нли замена его ремонтом низшей категории (те-
кущий ремонт) в зависимости от технического состояния агре-
гатов должны оформляться актом, который утверждается: для
основного оборудования (по перечню, утвержденному отрасле-
вым управлением), директором нли главным инженером пред-
приятия; для остального оборудования — главным механиком.
К ремонту оборудования приступают после его очистки, про-
мывки и отключения от коммуникаций. Оборудование, в кото-
ром производилась обработка агрессивных или вредных для
здоровья веществ передается в ремонт только после нейтрали-
зации. До начала ремонтных работ проверяют надежность от-
ключения механизмов и вывешивают надпись: «Не включать —
работают люди». После выполнения ремонтных работ обору-
дование сдают в эксплуатацию предварительно проверив его
иа холостом ходу.
253
На предприятиях, по возможности, должно применяться обо-
рудование, исключающее использование ручного труда и кон-
такт работающих с вредными веществами, используемыми
в технологическом процессе. Это достигается применением ма-
шин и аппаратов с дистанционным управлением, герметизацией
оборудования н арматуры для ядовитых, вредных, взрыво- и
пожароопасных веществ. Емкостная аппаратура должна снаб-
жаться уровнеуказателями и сигнализаторами предельных уров-
ней. На резервуарах с парафином не допускается установка
мерных стекол и пробных кранов. Замеры уровней должны про-
изводиться указателями уровней, безопасными в пожарном от-
ношении.
Емкостная аппаратура из-под горючих жидкостей взрыво-
опасна нз-за возможности образования взрывоопасной смеси.
Для исключения возможности взрыва ее необходимо тщательно
промыть после опорожнения и проверить на отсутствие взрыво-
опасных паров.
Особенностями технологии производства продуктов микро-
биологического синтеза обусловлено применение большого числа
аппаратов, работающих под давлением, к которым относятся
гидролнзаппараты, установки непрерывной стерилизации, фер-
ментаторы и пр. Эксплуатация подобных аппаратов, работаю-
щих при избыточном давлении более 67 кПа, должна соответ-
ствовать требованиям Правил устройства и безопасной экс-
плуатации сосудов, работающих под давлением. Безопасность
работы сосудов под давлением обеспечивается запорными при-
способлениями для отключения сосуда от трубопроводов, под-
водящух пар, газ или жидкость; приспособлением для удале-
ния находящихся в сосуде газа илн жидкости; манометром и
приспособлениями для установки контрольного манометра и за-
щиты рабочего манометра от непосредственного воздействия
среды; предохранительным клапаном. Как правило, повышение
давления сопровождается повышением температуры. Темпера-
тура нагретых поверхностей оборудования и трубопроводов на
рабочих местах ие должна превышать 45 °C. Для предотвраще-
ния ожогов и уменьшения тепловыделения применяется тепло-
изоляция. Почти на всех участках микробиологического произ-
водства эксплуатируется электротехническое оборудование, по-
этому большое значение придается снижению опасности пора-
жения обслуживающего персонала электрическим током. Осо-
бое внимание уделяется электрическим приборам, устанавли-
ваемым в пожаро- и взрывоопасных помещениях. Это
оборудование должно удовлетворять требованиям Правил уст-
ройства электроустановок (ПУЭ).
Металлические части оборудования н механизмов, не нахо-
дящихся под напряжением, но могущих оказаться под напря-
жением прн повреждении изоляции, заземляются.
Большую опасность иа производстве представляет статиче-
254
ское электричество, образующееся в результате сложных про-
цессов, связанных с перераспределением электронов или ионов
при соприкосновении двух разнородных веществ. Искры, обра-
зующиеся при разрядах статического электричества, хотя и об-
ладают незначительной силой тока, ио уже при сравнительно
небольшой разности потенциалов способны воспламенить боль-
шую часть горючих газов и пылей. Одним из наиболее простых
методов защиты является заземление технологического обору-
дования, связанного с приемом, переработкой и перемешива-
нием жидкостей, паров, газов, сыпучих веществ, являющихся
диэлектриками. Это исключает возникновение и накопление за-
рядов статического электричества.
Статическое электричество образуется особенно интенсивно
в сушилках со взвешенным слоем материала за счет трения
частиц друг о друга и стенки аппарата. Величина образую-
щихся при этом зарядов зависит от природы материала н гид-
родинамических условий в аппарате. Наибольшие заряды обра-
зуются при сушке в кипящем слое. Они могут достигать
десятков тысяч вольт.
Защита от разрядов статического электричества может быть
признана удовлетворительной, если исключена возможность по-
явления искровых разрядов с энергией, превышающей 0,4—0,5
минимальной энергии воспламенения.
В воздухе производственных помещений вместе с пылью
могут содержаться споры различных микроорганизмов, которые
бывают причиной заболевания обслуживающего персонала
Уменьшение запыленности производственных помещений дол-
жно достигаться в первую очередь в результате улучшения
герметизации оборудования и выбора системы вентиляции. Если
герметизация затруднительна или невозможна, машины и обо-
рудование следует укрывать кожухами с аспирацией этих уз-
лов. Производственные процессы, сопровождающиеся значи-
тельным пылевыделением, необходимо проводить в изолирован-
ных помещениях, механизировать их и по возможности выпол-
нять без непосредственного участия людей.
Во взрывоопасных помещениях нельзя применять аппараты,
отдельные детали которых в процессе работы могут нагреваться
до температуры воспламенения газов и особенно паров. Ин-
струменты и приспособления необходимо применять из метал-
лов и материалов (медь, алюминий, бериллиевая нли фосфо-
ристая бронза, пластмассы), не образующих искр при соударе-
нии или при ударе о бетон и т. п. Персонал должен находиться
во взрывоопасных помещениях только в мягкой обуви или
в обуви без металлических гвоздей.
На микробиологических производствах предусмотрено про-
ведение самых различных мероприятий, максимально исклю-
чающих непосредственный контакт работающих с микроорга-
низмами-продуцентами и продуктами их жизнедеятельности.
255
К основным источникам загрязнения производственных поме-
щений следует отнести отделения чистой культуры, флотации,
сепарации гидролизно-дрожжевых заводов и БВК, цехи сушкн,
стандартизации н упаковки заводов кормовых антибиотиков,
энтомопатогенных препаратов и бактериальных удобрений.
В этих цехах огромное профилактическое значение имеет улуч-
шение общих санитарно-гигиенических условий труда.
Вентиляция занимает одно нз ведущих мест в обеспечении
нормальных санитарных условий в производственных помеще-
ниях в соответствии с действующими санитарными нормами.
Кроме обеспечения оптимальной температуры воздуха в произ-
водственных помещениях вентиляция обеспечивает нормируе-
мую чистоту воздушной среды. Для большинства производствен-
ных помещений используют приточную вентиляцию. Технологи-
ческие узлы, где возможны выделения больших количеств пыли,
оборудуются системой местной вытяжной вентиляции. Воздух,
подаваемый приточной вентиляцией, подвергается очистке. Воз-
духообмен, создаваемый вентиляцией, должен обеспечивать
требуемые параметры воздушной среды в рабочей зоне. Приня-
тая кратность воздухообмена должна обеспечивать разбавление
вредностей в рабочей зоне до допустимых концентраций.
Предельно допустимые концентрации (ПДК) некоторых ве-
ществ в рабочей зоне представлены ниже.
ПДК
в воздухе
Наименование вещества рабочей
воны.
МГ/М3
I. Аммиак 20
2. Ацетон 200
3. Бензин— растворитель 300
4. Дрожжи кормовые 6
5. Гидроксид натрия 0,5
6. Известь негашеная 6
7. Изопропиловый спирт 3
8. Лигиин 6
9. Метиловый спирт 5
10. Озон 0,1
11. Окислы азота 5
12. Пыль стеклянного и 3
минерального волокна
Наименование вещества
13. Ртуть металлнческан
14. Серная кислота
15. Соляная кислота
16. Суперфосфат
17. Углеводороды
18. Уксусная кислота
19. Формалин (по формаль-
дегиду)
20. Фурфурол
21. Четыреххлористый уг-
лерод
22. Этиловый спирт
ПДК
в воздухе
рабочей
зоны,
мг м3
0,01
I
5
6
300
5
0,5
10
20
1000
Кратность воздухообмена рассчитывается, а минимальная
величина регламентируется; так, например, для отделения чи-
стой культуры, бродильного, флотационного, сепараторного и
подобного нм — не менее 3, слнвные отделения и склады
спирта — 8, ректификационное отделение — 8, фурфурольное от-
деление—10, насосная азотиой кислоты —12, насосная серной
или соляной кислоты—14. На особо трудных участках работы
(варочная площадка гидролнз-аппарата) подачу воздуха осуще-
ствляют с помощью душирующнх патрубков от самостоятельной
приточной системы.
256
Кроме постоянно действующей механической вентиляции
в ряде отделений (ректификации, фурфурольном, экстракцион-
ных цехах, отделениях осаждения ферментных препаратов) не-
обходимо устройство аварийной вентиляции, обеспечивающей
8-кратный обмен воздуха (по внутреннему объему помещения).
Важной задачей является также полноценная очистка вы-
брасываемого в атмосферу воздуха. Это достигается установкой
высокоэффективных фильтров. Для создания нормальных ус-
ловий работы вентиляционные системы должны работать бес-
перебойно н безаварийно. Для этого за системой вентиляции,
как и за контрольно-измерительными приборами, автоматиче-
скими регуляторами, производственной сигнализацией и ди-
станционным управлением должен быть установлен постоянный
надзор, гарантирующий нх безотказную и правильную работу.
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Андреев А. А., Брызгалов Л. И. Производство кормовых дрож-
жей.— М.: Лесная промышленность, 1970.— 296 с.
Бекер М. Е. Введение в биотехнологию.— М.: Пищевая промышлен-
ность, 1978.— 225 с.
Бондаренко Н. В. Биологическая защита растений.— Л.: Колос,
1978,— 254 с.
Грачева И. М. Технология ферментных препаратов.— М.: Пищевая
промышленность, 1975.— 392 с.
Грачева И. М., Гаврилова Н. Н., Иванова Л. А. Технологии
микробных белковых препаратов аминокислот и жиров.— М.: Пищевая про-
мышленность, 1980.— 448 с.
Евилевич М. А., Брагинский Л. Н. Оптимизация биохимической
очистки сточных вод.— Л.: Стройиздат, 1979.— 160 с.
Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках.— М.: Высшая школа,
1979.— 455 с.
К а л у и я н ц К. А., ГолгерЛ. И. Микробные ферментные препараты.—
М: Пищевая промышленность, 1979.— 303 С.
Карклиньш Р. Я., ПробокА. К. Биосинтез органических кислот.—
Рига: Зииатие, 1972.— 198 с.
Мишустин Е. Н. Микроорганизмы н продуктивность земледелия,—
М.: Наука, 1972.— 342 с.
Непрерывное культивирование микроорганизмов, теоретические и
методологические основы/Под ред. М. Малека, 3. Фенцеля.— М.: Пищевая
промышленность, 1968.— 546 с.
Немыря В. И., Влодавец В. В- Охрана окружающей среды от вы-
бросов предприятий микробиологической промышленности.— М.: Медицина,
1979.— 141 с.
Очистка производственных сточных вод/С. Л. Яковлев, Я. А. Каре-
лин, Ю. М. Ласков, Ю. В. Воронов/.— М.: Стройнздат, 1979.— 320 с.
Производство антибиотиков/Под ред. С. М. Навашииа.— М.: Ме-
дицина, 1970.— 368 с.
Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток.—
М: Мнр, 1978 —331 с.
Стайниер Р., Эдельберг Э., И играм Дж. Мир микробов
в 3-х т.— М.. Мир, 1979. Т. 1 — 312 с. Т. 2 — 331 с. Т. 3 — 464 с.
Шлегель Г. Общая микробиология.— М_: Мир, 1972.— 480 с.
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Автолиз 79
Автотрофы II, 26, 106
Азотобактерин 186—187
Азотфиксация 183, 184
Актиномнцеты II, 12, 29, 151, 199
Аланин 33, 131
Алестии 174, 175
Активный ил 240—241, 243, 244
Аминокислоты 30, 95, 107—108, 131—
151, 159, 166, 215, 227—229
Анаболизм 24
Анаэробы 13, 21, 63
Антибиотики 21, 22, 76, 147
— кормовые 151—172, 229—230
Антиоксиданты 231—232
Ауксотрофы 31, 35, 134, 137
Ацетил-КоА 28, 94, 215
Аэрация 60, 96, 114, 124, 196
Аэробы 13, 21
Аэротенк 241—244
Бактерии 11, 20, 119, 122, 128—129,
137, 142, 145, 151, 219
— азотфиксирующие 183—184
Бактериальные удобрения 172, 182—
187
Барда 144, 157
Бацитрацин 153, 159—161, 230
Бацилихии 160
Белок кормовой 83
Биовит 153, 156—159
Биологические пруды 244
Биомасса 62, 66, 70, 94, 97, 99, 102,
107
(см. также микробная масса)
Биоплеика 240—241
Биосинтез 24, 136—137
Биотетрокорм 229
Бнотин 31
Биофильтр 241—242
Биохимическая потребность в кисло-
роде (БПК) 235, 236
Битоксибациллии 174, 175
Боверия 172, 180—181
Брожение 113, 216, 217
Валин 131, 228
Бирин ЭКС 172, 182
— ЭНШ 172, 182
— АББ 172, 182
Вирулентность 177, 183
Вирусы
— патогенные 181, 182
Витамины 84, 95, 102, 103, 107, 215—
225
А 220
Ва 218—220
В12 215—218
Выдержнватель 45, 86
Гетеротрофы II, 26, 166
Гигроветин 163, 164
Гигромиции Б 153, 163—166
Гидрол 35
Гидролиз 86, 142, 143
(6) — ферментативный 141
(I) —непрерывный 86, 141
(3) — периодический 86
(5) — стационарный 86
(2) — оросительный 86
(4) — перколяционный 86, 88
Гидролиз-аппарат 87
Гидролизаты 36, 86, 87, 89, 119, 131
Гистидин 131, 228
Глутамат натрия 143, 148
Грнбы
— микроскопические II, 16, 29,
57, 109, 130, 145, 151, 219
— энтомопатогенные 179—181
Гризнн 153, 161—163, 229
Гифы 11, 12
Дезинтегратор 197
Дезинтеграция
(3) — химическая 78
(I) — биологическая 79
(2) — физическая 79
Декаитат 217
Дендробацилл ин 172, 174, 175
Доочистка сточных вод 247
Дрожжи 13, 83, 86, 94, 102—106, 145,
219
259
Защитная среда 185
Изолейции 131, 134
Иловые площадки 245
Иммобилизация
— клеток 213
— ферментов 143, 211—214
Инверсия 89, 92, 93
Инсектин 172, 174, 175
Камеры растнльные 196
Катаболизм 24, 27
Кислота
— антраниловая 149, 151
— аспарагиновая 30, 131, 134
— винная 27, 85
— глутаминовая 131, 134, 143—
149, 184
— глюконовая 85, 130
— итаконовая 124—128
— лимонная 27, 108, III—117
— липоевая 215
— молочная 85, 118—121
— муравьиная 92
— пантотеновая 223
-пировиноградная 109, 119, 128,
155
— уксусная 84, 85, 92, 122—124,
155
— фолиевая 224
— фумаровая 127, 128
— щавелевая 127, 171
— щавелевоуксусная 128
— яблочная 85, 128
— янтарная 85, 127, 128
Кокцидиостаты 231
Кондиционирование воздуха 196, 197
Кониднн 57, 109, 110, 179, 194
Кормовой концентрат
— витамина В|2 217, 218
— лнзина 137, 139, 140
Кормогризии 162, 229
Кристаллизация 117, 127, 130, 148,
206
Кукурузный экстракт 36
Культивирование микроорганизмов
-------глубинное 34, 56, 60, 113,
125, 126, 199—201
— — непрерывное 34, 62, 97
-------поверхностное 34, 60, III,
112, 125, 194—199
-------периодическое 34, 62
Культуральная жидкость 75, 76
Лейцин 131
Лигнин 87, 88, 89, 105
Лизин 84, 131, 134, 142, 161, 227
Липиды 27, 84, 95
Мезофилы 17, 18
Меласса 111, 139
Мембрана цитоплазматическая 16, 23
Метаболизм 29, 30
260
Метантенк 246
Метионин 30, 84, 131, 133, 134, 227
Микробиологический контроль 82
Микробная масса (см. также биомас-
са) 10, II, 75
Микробные патогены 172
Микроскопические грибы II, 16, 29,
57, 109, 130, 145, 151, 219
Мицелий 12, 25, 112, ИЗ, 126, 179
Мутанты 35, 134
Нагреватель 44
Наполнитель 155, 157, 232
Низии 153, 166—169
Нитрагин 183—186
Нитрификация 241
Нитрофураны 230, 231
Окислительно-восстановительный по-
тенциал 20
Оксиметнлфурфурол 92
Окснтенк 244
Окситетрациклин 154
Отстойники 243—245
Очистка воздуха 47, 247—250
Очистка сточных вод 235—247
------биологическая 240—245
------механическая 239
------термическая 245
------•—фнзико-химическая 239
------химическая 239
Пастеризация 19
Пеногашение 60, 81, 101, 114, 140
Пенообразование 60, 80
Перемешивающие устройства 42
Пермеазы 22
Питательная среда 35, 37
Посевной аппарат 57, 113—114
Посевной материал 56, 126, 137, 139
Предельно допустимые концентрации
вредных веществ (ПДК) 237, 248, 255
Премиксы 221—234
Производственная культура 57
Пролин 131
Психрофилы 17
Распылительная сушка 99, 104, 105,
140
Растильная камера 196
Рибофлавин (см. витамин В2)
Самоочищение воды 237
Сепарирование 99
Серин 131, 149
Скруббер 249
Споры 16, 57, 179, 194
Стабилизаторы 217
Стерилизатор 195
Стерилизация
— воздуха 47, 53
— непрерывная 43, 44
— фильтров 51, 53
— циклическая 42
Сточные воды 235
Сушка культуры грнба 197
Сушка распылительная 99, 104, 105,
140
Термофилы 17, 18
Терравит 154
Тетрациклин 153—155, 229
Тиамин 31
Тирозин 131
Токсины 173, 174, 179, 180
Токсобактерии 172, 174, 175
Транквилизаторы 230
Треоиин 131» 134, 228
Триптофан 84, 131, 149, 228
Трихотецин 169, 170
Турбидиостат 65, 70
Углеводороды 93, 94, 96
Удобрения бактериальные 182—187
Фаг 177, 187
Фазы роста микроорганизмов 57, 58,
62, 67—69
Факторы внешней среды
------биологические 21
------физические 15
------химические 20
Фенилаланин 131, 229
Ферментатор 42, 58, 113—115, 123,124,
139, 142
Ферменты 15, 23, 134, 188
— иммобилизованные 208—211
Ферментные препараты 225—226
----номенклатура 189—193
----высокоочищениые 206—208
— — очищенные 200, 204—206
----технические 200, 202—204
Фильтры 47—56
Фитобактериомицин 171
Флокулянты 76
Флотация 99—101
Фосфоробактерин 187
Фототрофы 11
Фурфурол 86, 91, 92
Хемостат 65, 70
Холодильник 46
Целлюлоза 91, 92
Циклоны 248, 249
Цистеин 30, 131
Цистии 30, 131
Цитоплазматическая мембрана 16,23
Щелок сульфитный 91—93, 119
Экстракция 2
— ферментов 201—203
Энтобактерин 172, 174—178
Эитомопатогеиные препараты
----бактериальные 172—179
--------грибные 179—181
Эргостерин 102
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение . 3
Глава I. Микроорганизмы, используемые в микробиологической про- мышленности . . ... ... 10 1.1. Общие сведения о микроорганизмах, нх строении и фор- ме 11 1.2. Влияние факторов внешней среды иа жизнедеятельность микроорганизмов .... .14 1.3. Питание микроорганизмов ... . 22
Глава 2. Типовая схема микробиологического производства 34 2.1. Питательные среды 35 2.2. Очистка и стерилизация воздуха 46 2.3. Получение посевного материала 56 2.4. Производственное культивирование 58 2.5. Кинетика роста микроорганизмов . . 66 2.6. Выделение конечного продукта 75 2.7. Контроль производства продуктов микробиологического синтеза 80
Глава 3. Кормовые белковые продукты 83 3.1. Субстраты для выращивания дрожжей .... 84 3.2. Подготовка субстратов к выращиванию дрожжей 85 3.3. Технология производства кормовых дрожжей .... 95 3.4. Производство белковых продуктов из природного газа . 104
Глава 4 Органические кислоты ... . . . 108 4.1. Лимонная кислота 108 4.2. Молочная кислота . 118 4.3. Уксусная кислота . . 122 4.4. Итаконовая кислота 124 4.5. Пропионовая кислота . 128 4.6 Глюкоиовая кислота 130
Глава 5. Аминокислоты 131
5.1. Лизин............................................ 134
5.2. Глутаминовая кислота и глутамат натрия 143
5.3. Триптофан .... ..... 149
Глава 6. Антибиотики немедицинского назначения 151
6.1. Препараты тетрациклина . . 154
6.2. Препараты бацитрацина . . . 159
6.3. Препараты гризина ................................161
6.4. Препараты гигромицина Б 163
262
6.5. Низин . .
6.6. Трихотенин
Глава 7. Микробные патогены и бактериальные удобрения 172
7.1. Бактериальные энтомопатогенные препараты - 172
7.2. Энтомопатогенные грибы . ... . . 179
7.3. Патогенные вирусы ... .181
7.4. Бактериальные удобрения - - 182
Глава 8. Ферментные препараты ............................... .188
8.1. Номенклатура ферментных препаратов.............. 189
8.2. Технология производства ферментных препаратов . 194
8.3. Иммобилизованные ферменты...................... • 208
Глава 9. Кормовые препараты витаминов и премиксы .
9.1. Кормовые препараты витаминов
9.2. Премиксы .....
Глава 10. Очистка сточных вод и газовых выбросов .
10.1. Очистка сточных вод ...
10.2. Очистка газовых выбросов . .
Глава П. Охрана труда и техника безопасности
Список рекомендуемой литературы
Предметный указатель
. 215
. 221
235
. 235
. 247
. 250
. 258