Биотехнология. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов. Автоматизация биотехнологических исследований. В 8-ми книгах. Том 6 - Егоров Н.С., Самуилов В.Д.

Автор: Егоров Н.С. Самуилов В.Д.
Теги: общая экология биоценология гидробиология биогеография общетехнические дисциплины автоматизация учебное пособие биотехнология
Год: 1987
Похожие
Биотехнология. Производство белковых веществ. Автоматизация биотехнологических исследований. В 8-ми книгах. Том 5
Биотехнология. Иммобилизованные ферменты. Автоматизация биотехнологических исследований. В 8-ми книгах. Том 7
Биотехнология. Проблемы и перспективы. Автоматизация биотехнологических исследований. В 8-ми книгах. Том 1
Биотехнология. Автоматизация биотехнологических исследований. В 8-ми книгах. Том 4
Текст
                    ТЕННОЛОША
ВА Быков
И.А.Крылов
МНМанаков
Н.СМарквичев
ЛМОрлова
Н.В.Тарасова
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ПРОИЗВОДСТВО
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
ВЕЩЕСТВ И ПРЕПАРАТОВ
шотеннолоша
упюиомяэюлд

в 8-ми книгах
бМОТЕННОЛОША
Под редакцией Н.С. Егорова
ВДСамуилова
В.АБыков
ИАКрылов
МНМонаков
НСМорквичев
ЛМ.Орлово
НВ.Тарасова
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ПРОИЗВОДСТВО
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
ВЕЩЕСТВ И ПРЕПАРАТОВ
Москва «Высшая школа» 1987
ББК 30.16
Б 63
УДК 574.6
Рецензенты:
кафедра биотехнологии Московского института тонкой химической
технологии им. М. В. Ломоносова (зав. кафедрой проф. В. И. Швец) и
академик Г. К- Скрябин (Институт биохимии и физиологии микроорга-
низмов АН СССР)
Допущено Министерством высшего и среднего специального образо-
вания СССР в качестве учебного пособия для студентов биологических
специальностей высших учебных заведений
Биотехнология: Учеб, пособие для вузов. В 8 кн./Под
Б 63 ред. Н. С. Егорова. В. Д. Самуилова. Кн. 6: Микробиоло-
гическое производство биологически активных веществ и
препаратов/Быков В. А., Крылов И. А., Манаков М. Н.
и др. — М.: Высш. шк„ 1987. — 143 с.: ил.
Изложены основные принципы промышленных биотехнологических процес-
сов. Рассмотрены микробиологический синтез аминокислот, антибиотиков,
средств защиты растений и препаратов для растениеводства, промышленные
методы микробиологической трансформации органических соединений. Освещены
экологические проблемы промышленной биотехнологии. Показаны перспективы
использования биотехнологических процессов в промышленности и сельском
хозяйстве.
2010000000(4309000000)—362	ББК 30.16+28.07
Б-------------------------КБ—53—8—86
—87	605
© Издательство «Высшая школа», 1987
ПРЕДИСЛОВИЕ
Микробиологическое производство биологически активных ве-
ществ и препаратов является важным направлением промышлен-
ной биотехнологии, обеспечивающим народное хозяйство такими
ценными продуктами, как аминокислоты, антибиотики, микро-
биологические удобрения и средства защиты растений и т. п.
В книге 6 серии «Биотехнология» рассмотрены основные законо-
мерности микробиологического синтеза биологически активных
веществ, принципы технологического и аппаратурного оформле-
ния этих процессов, а также даны характеристики продуктов,
выпускаемых промышленностью.
Книга 6 может рассматриваться как самостоятельное учеб-
ное пособие, однако следует отметить, что она тесно связана с
предыдущей книгой 5, поскольку только обе эти части совместно
дают более или менее полное представление о современной про-
мышленной биотехнологии. Действительно, в предыдущей книге
изложены общие проблемы технологии микробиологического син-
теза и даны сведения о сырьевой базе отрасли. В книге 6 воп-
росы эти не рассматриваются, но даны основные сведения об
экологических проблемах промышленной биотехнологии, касаю-
щиеся не только производств, описанных в этой книге, но и
промышленного биосинтеза белковых веществ и ферментов, ко-
торым было уделено внимание в книге 5.
В. А. Быковым кроме общего редактирования книги 6 напи-
саны введение, гл. 5 и заключение; И. А. Крыловым и Н. В. Тара-
совой — гл. 1, 2, 3; М. Н. Манаковым — введение, гл. 5 и заклю-
чение; Н. С. Марквичевым — гл. 5; Л. М. Орловой — гл; 4.
Авторы выражают благодарность проф. В. И. Швецу, ака-
демику Г. К. Скрябину и д-ру биол. наук Е. Л. Головлеву за
ценные замечания, направленные на улучшение книги.
Авторы
ВВЕДЕНИЕ
Промышленный синтез биологически активных веществ —
продуктов жизнедеятельности микроорганизмов — приобрел в
последнее время большое народнохозяйственное значение и про-
должает развиваться чрезвычайно быстрыми темпами.
Наряду с биосинтезом многие биологически активные вещест-
ва могут быть получены методами тонкого органического син-
теза, поэтому выбор конкретного пути получения продукта опре-
деляется сравнительной экономической эффективностью био-
логического и химического способов производства. Во многих
случаях на практике используют технологию, включающую и
химические, и биологические стадии, которые взаимно допол-
няют друг друга. В результате промышленный биосинтез про-
дуктов микробного метаболизма немыслим без применения (как
на стадиях подготовки, так и при переработке продуктов) мето-
дов химической технологии, опробованных и нашедших широкое
распространение в тонком органическом синтезе. В свою оче-
редь последний все чаще не может обойтись без некоторых
технологических стадий, осуществляемых с помощью микроорга-
низмов или выделенных из них ферментов и ферментных систем.
Наиболее наглядно вышесказанное может быть проил-
люстрировано на примере технологии аминокислот. Все 20
представителей этого класса органических соединений, являющих-
ся мономерами для построения природных полипептидов и белков,
достаточно глубоко изучены в химическом смысле, а методы их
синтеза описаны во всех учебниках органической химии. Давно об-
наружена и способность этих и многих других органических
соединений существовать в виде оптических изомеров, т. е. вы-
зывать вращение плоскости поляризации света влево или вправо
при прохождении его через раствор данного вещества. Явление
это, открытое еще Л. Пастером (1848), исчерпывающе объяснено
в рамках теории строения органических соединений А. М. Бут-
лерова наличием в молекуле так называемого асимметричного
атома углерода, имеющего четыре разных заместителя, взаим-
ное расположение которых и определяет направление и степень
вращения плоскости поляризации света.
Известно также, что, в частности, белки млекопитающих по-
етроены исключительно из одного типа аминокислот, так назы-
ваемых левовращающих, обозначаемых буквой L. Таким обра-
6
зом, упоминавшаяся в книге 5 данной серии задача получения
пищевых смесей или кормов, сбалансированных по аминокис-
лотному составу, т. е. имеющих такое относительное содержание
аминокислот, которое было бы оптимальным с точки зрения по-
требителя, вне зависимости от того, будет ли это человек или
сельскохозяйственное животное, сводится в конце концов к син-
тезу и смешению в заданных пропорциях всех 20 аминокислот,
составляющих белки млекопитающих.
Решение такой задачи упрощается еще и тем, что в кормо-
производстве нет необходимости использовать исключительно
/.-формы всех аминокислот, поскольку некоторые из них усваи-
ваются живыми организмами и из смесей с противоположной
/5-формой — так называемых рацематов. Это относится в первую
очередь к одной из важнейших дефицитных аминокислот — метио-
нину СНз8СНгСН2СН(КН2)СООН, О-форма которого усваи-
вается человеком и животными и не ядовита для них. К сожа-
лению, подавляющее большинство /)-аминокислот не только ока-
зывает отрицательное действие на млекопитающих, но и просто
ядовиты.
Современными методами тонкого органического синтеза мож-
но синтезировать D- и /.-формы аминокислот в любых количест-
вах, однако все реальные способы их производства приводят
лишь к образованию рацематов. Например, с помощью неслож-
ных химических превращений получают рацематы лизина, глу-
таминовой кислоты и триптофана — важнейших аминокислот, в
которых наиболее нуждаются животноводство и пищевая про-
мышленность. Смесь D- и /.-форм лизина является продуктом
последовательного действия на циклогексанон нитрозирующей
смеси (NO+NO2), уксусного ангидрида, водорода и воды (гид-
ролиз). Рацемат глутаминовой кислоты с высоким выходом по-
лучается из акрилонитрила путем гидроформилирования с пере-
водом образующегося альдегида под действием HCN, NH3 и во-
ды в целевой продукт. При синтезе триптофана исходный индол
обрабатывают смесью формальдегида с диметиламином и далее
иитроуксусным эфиром, после чего продукт гидрируют и омы-
ляют.
Несмотря на очевидную простоту и технологичность опи-
санных последовательных превращений, их не удается реализо-
вать в промышленных условиях, поскольку последующая задача
разделения рацематов с выделением практически 100%-ной
/.-формы оказывается непомерно сложной, а все известные ее
решения — экономически неэффективными.
Альтернативой химическому синтезу оказывается микробиоло-
гический процесс, в котором специально подобранные, отселек-
ционированные, а иногда и сконструированные методами генети-
ческой инженерии штаммы-продуценты в процессе жизнедея-
тельности, обычно на поздних стадиях развития, осуществляют
так называемый сверхсинтез аминокислот, т. е. производят
их в количествах, намного превышающих потребности самих
7
клеток. Избыточные количества Л-лизина, Л-глутаминовой кис-
лоты, /.-триптофана, L-треонина или любых других Л-амино-
кислот эскретируются в культуральную среду, которая при этом
будет содержать от 4—5 до 100 и более граммов целевой амино-
кислоты в 1 л жидкой фазы. При биосинтезе аминокислот, осу-
ществляемом ферментными системами микроорганизмов, получа-
ются исключительно /.-формы и полностью отсутствуют О-изо-
меры. На сегодня это является решающим обстоятельством и
все аминокислоты, £)-изомеры которых не приемлемы для упо-
требления, получают в промышленном масштабе только био-
технологическими методами.
Необходимо отметить, однако, что промышленный биосинтез
аминокислот требует их выделения из весьма сложных по составу
и разбавленных растворов, получающихся после отделения кле-
точной биомассы. Здесь и находит применение совокупность
приемов, характерных для тонкого органического синтеза и
предназначенных для получения товарных форм /.-аминокислот,
пригодных для кормового, пищевого или медицинского при-
менения.
Похожая ситуация сложилась и в области производства
антибиотиков. Несмотря на точное знание структуры практически
всех известных веществ, обладающих антибиотическим дейст-
вием, их чисто химический синтез громоздок и неэффективен.
В промышленности получают антибиотики медицинского или ве-
теринарного назначения, используя способность соответствую-
щих штаммов — продуцентов — генерировать данный антибио-
тик в определенной фазе роста и заданном режиме культивиро-
вания.
Однако за несколько десятилетий медицинского применения
антибиотиков накопилось большое количество болезнетворных
микроорганизмов, приобретших наследственную устойчивость к
препаратам, ранее вызывавшим их гибель. Выход из этой ситуа-
ции был достигнут путем химической трансформации природных
антибиотиков: стали получать так называемые полусинтетиче-
ские препараты, в структуру которых внесены некоторые из-
менения, не затрагивающие основной группировки атомов, от-
ветственной за антибиотический эффект. Таким образом, с по-
мощью химических и биохимических (ферментативных) методов
удается трансформировать природные пенициллины, цефалоспо-
рины и т. п., опережая приспособление болезнетворных микро-
организмов к новым лекарственным препаратам.
Применение бактериальных препаратов, таких, как удобре-
ния и средства защиты растений, также представляет собой аль-
тернативу химическим веществам, используемым в земледелии,
однако здесь взаимоотношения биотехнологии и химической тех-
нологии оказываются иными. В отличие от минеральных удоб-
рений и химических средств защиты растений, представляющих
при неправильном или неумеренном потреблении очевидную
опасность для окружающей среды, бакпрепараты значительно
8
менее опасны, характеризуются более высокой избирательностью
и, как правило, эффективностью действия. Таким образом, в
этом вопросе речь идет о принципиально ином подходе к реше-
нию проблемы повышения урожайности сельскохозяйственных
растений за счет применения биологических, а не химических
методов обогащения почвы азотом и фосфором или устранения
вредителей. Однако в этом случае оказывается, что оптимальное
сочетание биологических и химических средств позволяет до-
биться синергизма — усиления суммарного результата — и на-
дежно избавить земледелие от целого ряда проблем.
Все сказанное иллюстрирует сложную систему взаимосвязи
и конкуренции, установившуюся к настоящему времени между
промышленной биотехнологией и химической технологией. На-
глядное представление о современных биотехнологических ме-
тодах получения биологически активных веществ — продуктов
микробного метаболизма — дают изложенные в этом пособии
основы технологии отдельных биопрепаратов.
Глава
1 ТЕХНОЛОГИЯ
БИОСИНТЕЗА АМИНОКИСЛОТ
Производству аминокислот в СССР после кормового белка
уделяется наибольшее внимание. Это обусловлено прежде всего
высокой питательной ценностью получаемых на их основе кормов
и отдельных продуктов питания. Недостаток в рационе (дефицит)
отдельных аминокислот, особенно незаменимых, которые не
синтезируются в достаточном количестве и с необходимой ско-
ростью в организме животного или человека, отрицательно
сказывается на росте и развитии, может привести к различного
рода заболеваниям. (К незаменимым аминокислотам относятся
валин, аргинин, гистидин, лизин, лейцин, изолейцин, метионин,
треонин, триптофан, фенилаланин.) Добавка к рациону живот-
ных несколько десятых долей процента дефицитной аминокис-
лоты может повысить кормовую ценность белка более чем в
2 раза.
Производство аминокислот в мире постоянно возрастает и в
настоящее время составляет около 400 тыс. т в год. Мировой
уровень производства в год для глутаминовой кислоты 200 тыс. т,
для метионина 160 тыс. т, для лизина 50 тыс. т, для глицина
7 тыс. т, для триптофана 100—200 т, хотя потребность в послед-
нем оценивается в 30 тыс. т в год. В меньших масштабах орга-
низовано производство лейцина, изолейцина, пролина, треонина
(потребность в нем составляет около 130 тыс. т в год) и ряда
других аминокислот, необходимых для получения кормовых пре-
паратов и специальных продуктов питания. Только для нужд
сельского хозяйства расходуется практически весь производимый
в мире лизин и половина мирового производства метионина.
Среди возможных способов получения аминокислот в про-
мышленном масштабе наибольшее значение имеют микробиоло-
гический и химический. В современной мировой практике с по-
мощью микробиологического синтеза получают около 60% всего
объема производимых аминокислот. И, видимо, в дальнейшем
с ростом мощности предприятий и номенклатуры выпускаемых
готовых Л-форм препаратов отдельных аминокислот доля микро-
ю
биологического способа производства будет увеличиваться. Зна-
чительный интерес, проявляемый к данному способу получения
аминокислот, обусловлен прежде всего его высокими технико-
экономическими показателями по сравнению с другими способа-
ми, а также возможностью организовать в пределах одного
предприятия получение как кормовых препаратов, так и особо
чистых индивидуальных аминокислот, пригодных к использова-
нию в пищевой и медицинской промышленности.
К настоящему времени разработаны и реализованы в про-
мышленном масштабе производства многих аминокислот методом
органического синтеза. С его помощью производят D,/.-метио-
нин, глутаминовую кислоту, лизин, триптофан, треонин, глицин
и ряд других. По современным технологиям осуществляют
синтез индивидуальных аминокислот с высоким выходом и вы-
сокой степенью химической очистки. Однако данный способ
имеет ряд существенных недостатков, не позволяющих рекомен-
довать его для создания многотоннажного производства. Выпуск
продуктов кормового и пищевого назначения возможен только на
основе биологически активных /.-форм аминокислот. В резуль-
тате химического синтеза всегда образуются рацематы — равно-
весные смеси L- и D-форм аминокислоты, требующие в даль-
нейшем достаточно сложной и (или) дорогостоящей очистки.
Присутствие D-формы в готовом продукте всегда нежелательно
не только потому, что она представляет собой балласт, поскольку
не усваивается организмом человека и животного, повышает
расходные коэффициенты используемого сырья на 1 т продукции,
но у некоторых аминокислот она обладает токсичными свойства-
ми. Исключение составляют глицин и метионин. Для первого
не существует оптически активных изомеров. У второго D,/.-фор-
мы усваиваются организмом человека и животного в равной
мере.
Поскольку содержание данного пособия не предполагает рас-
смотрение технологии получения аминокислот методом органи-
ческого синтеза, ниже будут рассмотрены только возможные
химические схемы производства наиболее важных из них.
Производство аминокислот химическим синтезом. 1. Получе-
ние D,/.-метионина из акролеина достаточно сложный и много-
стадийный процесс. В СССР его осуществляют в соответствии
со следующей схемой основных химических превращений:
СН3СН=СН2	|----СНзОН 4- H2S
I +о2	I
СН2=СНСНО + CH3SH----. CH3SCH2CH2CHO >
CH3SCH2CH2CHCH—CO.	D, Z.-CH3SCH2CH2CHCOOH
I >NH	I
NH—CO/ .	NH2
D. /.-метионин
11
По этому способу на получение 1 т О,Д-метионина расходу-
ется около 0,6 т акролеина, а разделение рацемата не предусмат-
ривается.
2.	Получение О,/.-триптофана из индола и нитроуксусного
эфира
СН2СН—СООСНз NH,
NaOH
- СИ,ОН
D, /.-триптофан
При использовании получаемого по этой схеме 2),£-трипто-
фана для кормовых целей разделения рацемата можно не про-
водить.
3.	Получение Л-глутамата натрия из акрилонитрила
NC—СН=СН2	NC—СН2—СН2—С^°
-->- NC—СНг—СНг—CH—CN	NC—СН2СН2СН—CN
|	160°С
ОН	NH2
D, £=НООС—СН2—СН2—CH—СООН
NH,
D,/.-глутаминовая кислота
Образующийся рацемат растворим лучше, чем каждый из
оптических изомеров в отдельности, поэтому выделение /.-формы
из насыщенного раствора осуществляют добавкой кристаллов
/.-глутамата натрия.
4.	Получение /,-лизина из циклогексанона
О
HON=i
N°2 + NO^
Y
о
СНзСООИа (катализатор)
1 и гу В Среде УКСУСНОГО
f=NOH y н2о ------------------------------>
ангидрида, растворен-
ного в спирте
-Ь СНзСООН 4- NC—СН2—СН2—СН2—С— COOR (100%) *	° ~ V
||	МНз, н2
NOH
12
ROH + H2O + H2N—CH2—CH2—СНг—CH2—CH—C^°	(90%)
J,h. 4nh-
HN—CH2—СНг—СНг—CH2—CH—COOH + NH3
I
NH2
D, Д-лизии
Разделение образовавшихся D- и A-форм лизина основано
на различной растворимости солей, получаемых при взаимодей-
ствии рацемата с А-винной кислотой. Соль D-лизина и винной
кислоты наименее растворима. После разделения D- и A-изоме-
ров лизина соли разрушают, A-форму освобождают от А-винной
кислоты с помощью ионного обмена на колоннах, а А)-лизин
через стадию образования аддукта с салициловым альдегидом
направляют на рацемизацию.
5.	Комбинированный, или энзиматический, способ получения
А-лизина. Предложен в 70-е годы японской фирмой «Тойо Рейон»
(«Торей»). С его помощью получают с 95%-ным выходом и
99%-ной оптической чистотой А-лизин, причем содержание ами-
нокислоты в реакционной смеси может достигать 200 г/л, что
практически более чем вдвое выше его содержания в культу-
ральной жидкости, получаемой в одну стадию при направленном
микробиологическом синтезе в наилучших производственных
ферментациях. Технология процесса включает в себя органиче-
ский синтез А>,А-а-амино-е-капролактама из циклогексана и его
ферментативный гидролиз. Химическая схема получения A-ли-
зина по этой технологии следующая:
13
рацемаза
ж	H,N—СН2—(СН2),—СН—СООН
L -I и дролаза
nh2
L -лизин
+
D - а -ам и но- Е -капролактам
Данная схема производства предполагает использование двух
ферментов — L-гидролазы и рацемазы. Первый селективно гид-
ролизует ДД-а-амино-е-капролактам, получаемый в процессе ор-
ганического синтеза, второй осуществляет рацемизацию неза-
трагиваемой L-гидролазой D-формы в L-форму. Максимально
возможная эффективность такого производства будет наблюдать-
ся в том случае, когда скорости обоих ферментативных процессов
достаточно высоки, причем скорость рацемизации должна быть
не ниже скорости гидролиза амидной связи в L-a-амино-е-капро-
лактаме.
Необходимые для осуществления процесса ферменты имеют,
видимо, микробное происхождение. Известно, что гидролазу
L-u-амино-е-капролактама продуцируют штаммы дрожжей родов
Cryptococcus, Candida, Trichosporon, активаторами этого фер-
мента являются двухвалентные ионы марганца, магния и цинка.
Фермент рацемазу D-a-амино-е-капролактама возможно полу-
чить при культивировании бактерий родов Achromobacter, Flavo-
bacterium и др.
Совместное воздействие обоих ферментов на субстрат
/ДА-ц-амино-е-капролактам рационально проводить в аппарате
непрерывного действия, содержащем оба фермента в иммобили-
зованном виде.
Примеры вышеприведенных химических схем показывают, что
производство аминокислот методом органического синтеза пред-
полагает осуществление большого количества технологических
операций. Реализация практически каждой из них требует соот-
ветствующей аппаратуры и наличия вспомогательного оборудо-
вания для организации контроля за ее работой. Технология
такого производства в большинстве случаев направлена на ис-
пользование достаточно токсичных соединений, высокоочищен-
ных реагентов и осуществление стадии разделения образующих-
ся рацематов. Для преодоления недостатков химического спо-
соба производства аминокислот постоянно ведется поиск новых,
более рациональных путей их синтеза и совершенствования тех-
нологических приемов очистки отдельных компонентов, разделе-
ния рацемических смесей и способов превращения D-формы в
I -форму, чго, видимо, позволит снизить себестоимость готовой
продукции и стать ей конкурентоспособной по отношению к
микробиологическому 'способу производства.
Производство аминокислот из белковых гидролизатов. Дру-
гим возможным способом получения аминокислот является гид-
14
ролиз (кислотный, щелочной, ферментативный) некоторых наи-
более доступных природных белков. К их числу относят отходы
мясной промышленности, казеин молока, клейковину пшеницы и
др. Однако такой способ имеет ряд существенных недостатков,
которые не позволяют использовать его для организации крупно-
тоннажного промышленного производства. Наиболее существен-
ные из них — это ограниченность и нестандартность источников
сырья, многоступенчатая химическая обработка, связанная с вы-
делением аминокислот и их очисткой. Кроме того, гидролиз
под действием минеральных агентов приводит к частичному раз-
рушению таких ценных аминокислот, как триптофан, треонин,
цистеин, серин, а применение существующих протеолитических
ферментов не обеспечивает полноты гидролиза всех пептидных
связей.
Производство L -аминокислот микробиологическим синтезом.
Из всех возможных способов получения аминокислот микробио-
логическому синтезу в настоящее время отдается явное пред-
почтение. Хотя организацию процесса биосинтеза аминокислот
(особенно при использовании ауксотрофных мутантов) в произ-
водственных условиях нельзя назвать простой, все же микро-
биологическое производство лишено практически всех недостат-
ков, присущих химическому синтезу. Его очевидное преимущест-
во состоит в том, что используемые микроорганизмы образуют
аминокислоты в биологически активной L-форме. Последнее обес-
печивает их выделение и очистку, выпуск технических препара-
тов для обогащения кормов с доступной для животноводства
ценой.
Организацию промышленного производства /.-аминокислот с
помощью микроорганизмов возможно осуществить по двум тех-
нологическим схемам. Они различаются, в основном, стадйей
получения культуральной жидкости. В первой предполагается
производство культуральной жидкости в две ступени (двухсту-
пенчатый способ), во второй — в одну ступень (одноступенчатый
способ).
Двухступенчатый способ основан на использовании в ка-
честве источника сырья одного из предшественников протекаю-
щего в клетке биосинтеза необходимой аминокислоты, получен-
ного химическим или биологическим методом. Образование и
подготовка необходимого предшественника здесь является пер-
вой ступенью производства. К ней же относят и биосинтез фер-
ментного препарата (как правило, микробного происхождения),
при участии которого будет осуществляться трансформация
предшественника в целевую аминокислоту. При этом в произ-
водственных условиях выращивают продуцент ферментов (био-
массу микроорганизма). Биомассу отделяют от культуральной
жидкости и употребляют либо непосредственно для трансфор-
мации, либо после предварительного разрушения клеток различ-
ными доступными способами (механическими, физико-химиче-
скими, химическими). Вторая стадия представляет собой собст-
15
венно процесс трансформации предшественника в аминокислоту
с помощью ферментных систем микроорганизма, выращенного
на первой стадии.
Выбор предшественника для конкретного производства осу-
ществляют на основе современных научных представлений о
биосинтетических путях образования необходимой аминокислоты
микроорганизмами, потенциально возможных источников полу-
чения его как субстрата и оценки его стоимости. Вышепри-
веденную химическую схему производства Л-лизина из D,L-a-
амино-в-капролактама (процесс фирмы «Торей») можно рас-
сматривать как типичный пример двухступенчатого способа по-
лучения L-аминокислот.
Одноступенчатый способ синтеза аминокислот с помощью
микроорганизмов получил наибольшее распространение, особен-
но в СССР. Он основан на культивировании строго определен-
ного штамма — продуцента целевой аминокислоты на среде за-
данного состава при соответствующих параметрах процесса
ферментации. Используемый штамм обладает способностью к
сверхсинтезу необходимой аминокислоты. Для этой цели, как
правило, выбирают полиауксотрофные мутанты, т. е. те клетки
микроорганизма, которые, с одной стороны, утратили способ-
ность самостоятельно синтезировать необходимые для роста и
развития различные аминокислоты, а с другой — приобрели спо-
собность к сверхсинтезу целевой аминокислоты. Такие мутанты
возможно получить либо путем воздействия различных мутаге-
нов физической и химической природы на исходную культуру
микроорганизма с последующей селекцией штамма, по заранее
заданным признакам, либо методом генной инженерии.
§ 1. Биосинтез аминокислот клетками микроорганизмов
В состав белка микробных клеток входят все 20 аминокислот,
биосинтез которых у прототрофных культур осуществляется из
углерод-, азот- и серусодержащих компонентов среды. В ка-
честве источников углерода могут быть углеводы, углеводороды
и продукты их неполного окисления.
Несмотря на многообразие источников углерода в результате
функционирования таких метаболитных последовательностей, как
гликолиз, пути Энтнера—Дударова и пентозофосфатный, а также
цикл трикарбоновых кислот, почти всегда образуются одни и те
же углеродные предшественники аминокислот и лишь синтез
гистидина имеет несколько обособленный путь. В табл. 1 при-
ведены все известные предшественники и образующиеся из них
аминокислоты.
Для некоторых микроорганизмов, однако, возможны исклю-
чения, когда одна и та же аминокислота образуется из разных
предшественников. Так, лизин может быть синтезирован как из
щавелево-уксусной кислоты, так и из а-кетоглутаровой.
В зависимости от таксономической принадлежности микро-
16
Таблица 1. Предшественники для биосинтеза аминокислот
Предшественник	Аминокислота
Пируват З-Фосфоглицерат Щавелево-уксусная кислота а-Кетоглутаровая кислота Фосфоенолпируват 4- эритрозо-4- фосфат 5-Фосфорибозил- 1-пирофосфат+ +АТФ	Аланин, валин, лейцин Серин, глицин, цистеин Аспартат, аспарагин, метионин, лизин, треонин, изолейцин Глутамат, глутамин, аргинин, пролин Фенилаланин, тирозин, триптофан Гистидин
организмов к той или другой физиологической группе источниками
азота для аминирования углеродного скелета могут быть аммо-
нийные соли, нитраты или молекулярный азот. Поскольку сте-
пень окисления атома азота в аммиаке соответствует его сте-
пени окисления во всех органических веществах клетки, соли
аммония предпочтительно усваиваются большинством бактери-
альных и дрожжевых культур. Ассимиляция NH3, приводящая
к образованию аминогруппы глутаминовой кислоты, может осу-
ществляться как путем восстановительного аминирования а-кето-
глутаровой кислоты
О
НООС—(СН2) 2—С—СООН + NH3 + NADH г-гл>'тамЛтдег"дРог('иаз>а
а-кетоглутаровая кислота
nh2
I
-» НООС—(СН2)2—СН—СООН + NAD+ + Н2О
глутаминовая кислота
так и через глутаматный цикл
Глутаматный цикл включает согласованное действие двух
ферментов глутаминсинтетазы и глутаматсинтазы и является бо-
лее энергоемким, так как на 1 моль синтезируемого глутамата
расходуется 1 моль АТР. Установлено, что механизм восстано-
вительного аминирования функционирует при избытке в среде
ионов аммония; напротив, при низких концентрациях (<1
17
ммоль) аммиака, а также при использовании в качестве источ-
ников азота нитратов, молекулярного азота или азотсодержащих
органических соединений функционирует глутаматный цикл.
Глутаминовая кислота — основной донор аминогрупп для
других, синтезируемых клеткой аминокислот: с помощью транс-
аминаз возможно образование более чем 10 аминокислот из соот-
ветствующих кетокислот.
Две другие реакции, приводящие к включению NH3 в амино-
кислоты, идут с образованием глутамина и аспарагина:
nh2
НООС(СН2)2(!н—СООН + NH3 4- ATP .£-глУУами-"сиитетаз>а
О	NHj
II	I
->-NH2—С — (СН2)2СН—СООН + АДР + Р,
глутамин
nh2
НООС—СН2—СН—СООН 4- NH3 + ATP £;аспаРагиаснитетаз>а
аспарагиновая кислота
о	nh2
II	I
NHs—С—СН2—СН—СООН + АМР + Р,Р(
аспарагин
Нитраты как источники азота употребляются целым рядом
микроорганизмов, в основном это микроводоросли, грибы, не-
которые виды бактерий. Прежде чем азот нитратов включится
в аминокислоты, ион NO“3 должен быть восстановлен путем
превращения в аммиак:
нитратредуктаза . т__ нитритредуктаза
INU3 ---------*• InU2 --------► INг!з
Этот процесс, называемый ассимиляционным восстановлением
нитрата, осуществляется с помощью растворимых ферментных
систем, не чувствительных к кислороду и не сопряженных с
реакциями, генерирующими АТР. Нитратредуктаза — молибден-
содержащий фермент, поэтому присутствие молибдена в средах
с нитратами обязательно. Аммиак репрессирует синтез фермен-
тов ассимиляционного восстановления нитрата.
Небольшая группа прокариот — свободноживущие и симбио-
тические азотфиксаторы — способна включать в аминокислоты
азот атмосферы, при этом N2 восстанавливается до NH3. Вос-
становление осуществляется сложной ферментной системой —
нитрогеназой, состоящей из двух белковых субъединиц, азо-
ферредоксина и молибденоферредоксина. Нитрогеназная реакция
идет в присутствии восстановленных форм ферредоксина или
флаводоксина, являющихся источниками электронов для нитро-
геназы, и с затратой АТР, необходимой для активации связи ато-
18
мов в молекуле азота. Поскольку не удается выделить проме-
жуточных продуктов реакции, полагают, что они остаются свя-
занными с ферментом, и восстановление идет через следующие
промежуточные стадии:
Н Н
2,>	I I 2<?
фермент • N^N —фермент • N=N —-j»
Н Н
।	। 2е~
фермент-N—N	фермент + 2NH3
Н Н
Восстановление Ns до аммиака также осуществляется лишь
в присутствии источника молибдена в среде.
Для биосинтеза серусодержащих аминокислот большинство
микроорганизмов употребляют сульфаты, предварительно осу-
ществляя ассимиляционное восстановление до сульфидов. Так
как H2S токсичен для микробной клетки (кроме серобактерий),
он немедленно включается в ацетилсерин согласно реакции
СООН	СОО.Н
H2NCH --------„ HNCH -ЬСНзСООН
I	I
CHz—О—СО—СНз CH2SH
ацетилсерин	L-цнстеин
Образовавшийся продукт — L-цистеин служит предшествен-
ником всех серусодержащих компонентов клетки.
Пути биосинтеза отдельных аминокислот у микроорганизмов
были изучены после внедрения в микробиологическую практику
способов получения ауксотрофных мутантов и применения изотоп-
ных меток. Для установления последовательности в путях
биосинтеза отдельных аминокислот мутанты используют следую-
щим образом:
1.	Определяют число различных генов, мутации в которых
вызывают потребность в одном и том же факторе роста. Таким
путем устанавливают число реакций, а следовательно, и число
ступеней в синтезе одного вещества. Так, было обнаружено, что
мутации восьми различных генов вызывают ауксотрофность по
аргинину, следовательно, его биосинтез включает 8 реакций.
2.	Генетическое блокирование пути биосинтеза обычно при-
водит к выделению в среду интермедиата, предшествующего
блокированной реакции, идентификация которого химическими
методами также служит для расшифровки пути биосинтеза.
3.	Данные о последовательности реакций в биосинтезе от-
дельных аминокислот могут быть получены при изучении влияния
предполагаемых интермедиатов на рост мутантных штаммов.
Так, внесение цитруллина и орнитина в среды для аргининза-
19
висимых мутантов позволяет сделать вывод, что это промежу-
точные продукты биосинтеза аргинина.
Метод изотопной метки основан на том, что к растущей куль-
туре прибавляют интермедиат, например меченую глутаминовую
кислоту. Она препятствует своему эндогенному синтезу и вклю-
чается в биосинтез белка. Затем, выделяя и фракционируя белок
клеточной популяции, обнаруживают метку и в других амино-
кислотах, в частности в пролине и аргинине, следовательно,
глутаминовая кислота — их предшественник.
Таким образом, получение продуцентов аминокислот пред-
полагает обеспечение клетки всеми необходимыми компонента-
ми для их биосинтеза и знание путей биосинтеза целевых амино-
кислот.
§ 2. Пути биосинтеза и методы селекции продуцентов
отдельных аминокислот
Микроорганизмы обычно синтезируют каждую из аминокис-
лот в определенных количествах, обеспечивая тем самым синтез
специфических белков. Это объясняется тем, что контроль за
скоростью биосинтеза каждой аминокислоты осуществляется по
принципу обратной связи как на уровне генов, ответственных
за синтез соответствующих ферментов (репрессия), так и на уров-
не самих ферментов, способных под действием избытка образую-
щихся аминокислот изменять свою активность (ретроингибиро-
вание). Такой контроль исключает перепроизводство аминокис-
лот, и выделение их из клетки возможно лишь у микроорганиз-
мов с нарушенной системой регуляции. Такие культуры иногда
выделяют из природных источников. Так, известны штаммы
дикого типа, накапливающие в среде глутаминовую кислоту,
пролин или валин. Однако основной путь селекции продуцентов
аминокислот — получение ауксотрофных и регуляторных мутан-
тов. Ауксотрофные мутанты отбирают на селективных средах
после воздействия на суспензии бактериальных культур физи-
ческими (например, ультрафиолетовое или рентгеновское излуче-
ние) и химическими (этиленимин, диэтилсульфат, нитрозоэтил-
мочевина и т. д.) факторами. У таких мутантов появляется де-
фектный ген, детерминирующий фермент, без которого не может
осуществляться биосинтез определенной аминокислоты. Получе-
ние ауксотрофных мутантов — продуцентов аминокислот — воз-
можно только для микроорганизмов, имеющих разветвленный
путь биосинтеза, по крайней мере, двух аминокислот, образую-
щихся из одного предшественника. Их биосинтез контролиру-
ется на уровне первого фермента общего участка согласованным
ингибированием конечными продуктами (ретроингибирование).
У таких ауксотрофных мутантов избыток одной аминокислоты
при дефиците другой не приводит к подавлению активности
первого фермента. Аминокислота, биосинтез которой блокиро-
ван в результате мутагенного воздействия, должна добавляться
в ограниченном количестве.
20
Регуляторные мутанты отбирают среди культур, устойчивых
к аналогу целевой аминокислоты. С этой целью исходный штамм
(часто это ауксотроф) высевают газоном на минимальную среду,
содержащую источник углерода, неорганические соли и аналог
целевой аминокислоты. Последний действует на регуляторную
систему клеток, имитируя избыток соответствующей природной
аминокислоты, антагонистом которой он является; обычно вклю-
чаться в белок аналог не может, и, следовательно, рост куль-
туры прекращается. Этот метод позволяет отобрать мутанты,
у которых имеются нарушения в системе регуляции образования
целевой аминокислоты, а некоторые из них оказываются способ-
ными к ее повышенному синтезу и выделению из клетки.
За последние годы в селекции продуцентов аминокислот ак-
тивно начали использовать методы генной инженерии, позволяю-
щие повышать дозу генов биосинтеза аминокислот путем их
клонирования на плазмидах. Трансформируя гибридные плазми-
ды в клетки, удается повысить дозу генов и, следовательно, ко-
личество ферментов, ответственных за биосинтез соответствую-
щей аминокислоты.
Рассмотрим биосинтез отдельных аминокислот и способы се-
лекции некоторых культур, приводящих к сверхсинтезу целевых
продуктов.
L-Глутаминовая кислота — первая аминокислота, полученная
на основе промышленного микробиологического синтеза. В ка-
честве продуцентов брали дикие штаммы глутаматпродуцирую-
щих коринебактерий. В условиях, обеспечивающих нормальный
рост этих культур, сверхсинтеза этой аминокислоты не проис-
ходит. «Перепроизводство» этого продукта дикими штаммами
коринебактерий вызывается особыми физиологическими условия-
ми, когда рост клеток тормозится, а в клеточной мембране
происходят структурные и функциональные изменения, приво-
дящие к проницаемости ее для глутаминовой кислоты. Такие
условия создаются при лимите в среде биотина (1—5 мкг/л).
Подобный эффект наблюдается при добавлении к среде куль-
тивирования некоторых антибиотиков и детергентов. В резуль-
тате интенсивного выделения из клетки образуемой глутамино-
вой кислоты ее внутриклеточная концентрация резко снижается
и регуляция синтеза конечным продуктом ослабевает. В таких
условиях даже дикие штаммы способны превращать в глутами-
новую кислоту до 50% используемого источника углерода.
Селекционная работа с продуцентами этой аминокислоты
идет главным образом в направлении получения ауксотрофных
мутантов, отличающихся слабой активностью а-кетоглутарат-
дегидрогеназы (фермента, включающего предшественник глут-
аминовой кислоты в цикл трикарбоновых кислот), регуляторных
мутантов, характеризующихся слабой чувствительностью L-глу-
таматдегидрогеназы к ингибированию конечным продуктом, и му-
тантов, способных ее продуцировать в присутствии увеличенных
количеств биотина. Основной селекционный прием — ступенча-
21
тый отбор после мутагенного воздействия и оценка мутантов
на средах с повышающимся содержанием биотина (до 30 мкг/л).
Такие штаммы необходимы в связи с применением в производст-
ве мелассных сред, содержащих высокие концентрации биотина.
Один из полученных в СССР мутантов способен накапливать
в культуральной жидкости свыше 50 г/л глутаминовой кислоты,
используя мелассу как единственный источник углерода, и не
требует введения поверхностно-активных или других веществ,
повышающих проницаемость биомембран.
Японские исследователи проблему получения глутаминовой
кислоты на мелассных средах решают другим путем — получе-
нием мутантов, у которых накопление аминокислоты контроли-
руется температурным режимом. ТемпературочувствитЬльные му-
танты имеют нарушения в структурах клеточной мембраны,
проявляющиеся при повышении температуры культивирования до
40°С и приводящие к выделению глутаминовой кислоты из
клетки. Температурозависимые мутанты накапливают 20—26 г/л
глутамата на средах с мелассой.
L-Пролин относится к семейству глутаминовой кислоты и
образуется в результате АТФ-зависимого восстановления послед-
ней с дальнейшей циклизацией полуальдегида глутаминовой
кислоты и превращения его в пролин путем восстановления:
nh2	nh2
НООС—(СН2)—СН—СООН NA°™>+ НОС— (СН2)2—СН—соон—*
АТФ	HjO
Н2с — сн2 NADPH н2с---------сн2
ООС—СН	С	-ООС—СН	сн2
\n^	\n/
Н+	Ht
L-пролин
Получение пролина микробиологическим синтезом возможно
следующими способами.
1.	Применение найденных в природе мутантов. Так, японские
исследователи выделили культуру Coryn, glutamicum АТС 21144,
способную на средах с глюкозой накапливать более 18 г/л
пролина.
2.	Использование прототрофных штаммов глутаматпродуци-
рующих коринебактерий. В этом случае применяют фермента-
ционные среды, на которых выделение глутамата и пролина
из внутриклеточного пула изменено в сторону предпочтительного
получения пролина. Это достигается тем, что при повышении
содержания в среде биотина глутаминовая кислота не выделяет-
ся из клеток, а превращается в пролин. Примером могут слу-
жить данные, полученные для культуры Coryn, glutamicum
АТС 21157:
Содержание биотина в среде,	Продукция, г)л,
мкг!л	глутаминовой к-ты пролина
5	23,4	2,6
1000	1,9	27,3
22
3.	Получение ауксотрофных мутантов. Так, гистидиновые, ме-
тиониновые, лейциновые, изолейциновые ауксотрофы Brev.sp.
образовывали на средах с глюкозой 20—25 г/л пролина. Это
возможно, если у таких ауксотрофов ингибированы или репрес-
сированы активности ключевых ферментов соответствующих пу-
тей, что создает избыток в клетке как углеродных предшествен-
ников, так и АТФ, повышающего активность глутаматкиназы —
первого фермента пути биосинтеза пролина, что и приводит к
выделению его в среду. Такие ауксотрофы накапливают до
15 г/л пролина.
Повышение выхода пролина у подобных ауксотрофов воз-
можно путем отбора мутантов, резистентных к сульфагуанидину
и 3,4-дегидропролину. Эти мутанты способны накапливать до
40 г/л пролина.
Следует отметить, что все ауксотрофные мутанты требуют
высокого содержания в среде биотина и повышенной концентра-
ции ионов аммония.
4.	Получение продуцентов пролина методами генной инжене-
рии. Этот метод пока опробован на одном объекте — Е. coli. На
первом этапе получают мутантные штаммы, устойчивые к ана-
логам пролина, которые используют в качестве доноров ДНК-
Затем пролиновый оперон, содержащий три гена, клонируют
на плазмиду и гибридную плазмиду вводят в реципиентный
штамм. Полученные плазмидные штаммы продуцируют в 2—3
раза больше пролина, чем соответствующие бесплазмидные му-
танты. Продукция пролина может ,достигать у плазмидных
продуцентов 27 г/л за 48 ч.
L-Лизин синтезируется микроорганизмами двумя принципи-
ально различными путями. Микроводоросли, грибы, дрожжи син-
тез лизина осуществляют рз а-кетоглутаровой кислоты через
а-аминоадипиновую кислоту (АА путь) (схема 1). Регуляция
активности ферментов этого пути исследована еще недостаточно,
поэтому получение мутантов, способных к сверхпродукции лизина
среди культур, синтезирующих его через аминоадипинатный путь,
пока не осуществляется. Для бактериальных культур, высших
растений, некоторых водорослей характерен другой путь био-
синтеза лизина — через а-диаминопимелиновую кислоту (ДАП-
путь), начинающийся с аспарагиновой кислоты. Кроме лизина
по разветвленной схеме биосинтеза из аспартата образуются
также метионин, треонин и изолейцин. Установлено, что конт-
роль биосинтеза аминокислот семейства аспартата осуществля-
ется на уровне первого фермента fJ-аспартокиназы (АК)- Про-
дуценты лизина — глутаматпродуцирующие коринебактерии
Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum — имеют
единственную АК, активность которой регулируется путем со-
гласованного ингибирования по принципу обратной связи трео-
нином и лизином (схема 2). Синтез треонина зависит от актив-
ности гомосериндегидрогеназы (ГД), синтез лизина катализи-
руется первым ферментом лизиновой ветви пути — дигидродипи-
23
СХЕМА 1
Аминоалипатный путь (А А)
О
НООС—CHj-CH—соон
а-кетоглутаровая кислота
С Ацетил СоА
СоА
Диаминопимелиновый путь (ДАП)
НООС—СН-СН—СООН
NH2
аспарагиновая кислота
ATP
ноос—i—сн—сн—соон
Н2О3Р—О—<
АДР
‘Н—СООН
-аспартил фосфат
гомолимонная кислота
НООС—CH—CHj-CHO
соон
СН
НООС—(}—СНт-СНу-СООН
nh2
-аспартатполуаль дегид
пируват —I
цис-гомолимойная кислота
,сн
СООН
неон
НООС—сн с—соон
НООС—CH—CHj-C Hj-COOH
дигидропиколиновая кислота
гомоизолимонная кислота
КАДР4-
СООН
№ДР’
ИАДРН
с=о
NAHPH
НООС—СН—СНч-СНч-СООН
сн2
н2с'' ^сн2
щавелевоглутаровая кислота
НООС—С Н С—СООН
СО2
ноос—с—сн—сн—сн—соон
а-кетоадипиновая кислота
пиперидин-2,6-ди карбоксил ат
глутамат
Сукцинил СоА
СоА
nh2
НООС—CH—CHj-CHy-CHy-COOH
а-кетоглутарат
НООС—СО—СН—СН— СН^-СН—СООН
HN—СОСН2СН2СООН
N-сукцинил -2-амино-оксо-Ь-пнмелиновая кислота
а-аминоадипиновая кислота
I АТР + МАДРН
nh2
АДР+Р, + КАДР
глутамат
а- кетоглутарат
НООС—CH—СН5—СНч—СНт-СН—СООН
НООС—СН—СН—СН^-СН—СНО
а-аминоадипиновый полуальдегид
nh2
СООН
глутамат
ИАДН
NAH
HN—СОСНу-СН,-
Uooh
N-сукцинил- L -2,6-диаминопимелиновая кислота
сукцинат
NH—CH—CHj—СНт-СООН
СН^-СНр—СНч—сн,—СН—СООН
nh2
сахаропин
NAД
ЯАДН
NH2
L. L-2,6-диаминопимелиновая кислота
nh2 I	nh2
НООС—CH—CH—CHy-CH—сн—соон
мезо-2,6-диаминопимелиновая кислота
и -кетоглутарат
О
nh2
н оос—сн—с н—С Н—С Н—С Н—N Н-
ЛИЗИН
24
СХЕМА 2
колинат синтетазой (ДДПС). Общий предшественник в синтезе
лизина и треонина — полуальдегид аспарагиновой кислоты —
у диких штаммов коринебактерий расходуется преимущественно
на синтез треонина, так как активность ГД в 15 раз выше, чем
ДДПС-активность, т. е. фактически биосинтез лизина начинается
после насыщения клетки треонином, метионином и изолейцином.
В связи с этим для получения сверхпродукции лизина необхо-
димо заблокировать биосинтез этих метаболитов, что возможно
путем подавления активности ГД или гомосеринкиназы (ГК).
У глутаматпродуццрующих культур это достигается воздействием
мутагенных факторов на прототрофные штаммы. Известны три
класса лизинпродуцирующих мутантов:
1.	Ауксотрофы по гомосерину с отсутствием активности ГД
или по треонину, у которых подавлена активность ГК- Наиболее
высокий уровень накопления лизина (до 40% от потребленного
25
углевода) у ауксотрофов по гомосерину, поскольку генетическое
блокирование ГД прекращает у таких мутантов синтез треонина
и позволяет путем ограничения в среде гомосерина (или трео-
нина) снять ингибирование АК- В этом случае полуальдегид
аспарагиновой кислоты расходуется только на синтез лизина.
Ауксотрофы по треонину менее продуктивны, так как часть
общего предшественника идет на синтез гомосерина, поскольку
у них сохраняется активность ГД. Гомосерин- и тренионин-за-
висимые мутанты культуры Coryn, glutamicum получены под
действием ряда мутагенов (УФ-излучение, диэтилсульфат, нитро-
зоэтилмочевина) ступенчатым отбором и являются основным
фондом для дальнейших селекций по принципу ступенчатого
отбора.
2.	Метионин- и треонинчувствительные штаммы Brev. flavum,
у которых активность ГД снижена в 20—50 раз, но тем не
менее этот фермент обеспечивает потребности клетки в гомосери-
не и его внесение в среду не требуется. Такие мутанты накапли-
вают до 20 г/л лизина.
3.	Аналогорезистентные прототрофные продуценты лизина.
Их получают, используя в качестве селективного метода аналог
лизина — аминоэтилцистеин (АЭЦ), который совместно с трео-
нином ингибирует рост коринебактерий. Устойчивые к АЭЦ и
треонину мутанты имеют генетически измененную АК, которая
становится нечувствительной к согласованному ингибированию
лизином и треонином. Такие мутанты накапливают до 15 г/л ли-
зина.
В СССР основные работы по селекции лизинпродуцирующих
культур проводятся с культурами Brev. sp. и Coryn, glutamicum.
Имеются мутанты, совмещающие аналого-резистентность и аук-
сотрофность, способные накапливать на мелассных средах более
40 г/л, а на средах с уксусной кислотой — более 70 г/л лизина.
L-треонин синтезируется по той же схеме, что и лизин. Селек-
ционная работа по выделению продуцентов треонина проводится
со штаммами, относимыми к двум семействам — коринебакте-
рий и энтеробактерий. Системы контроля биосинтеза аминокис-
лот у этих микроорганизмов принципиально различны. У кори-
небактерий, как это показано на схеме 2, регуляция осуществля-
ется по принципу согласованного ингибирования, а это значит,
что недостаточность по изолейцину, метионину или лизину не
может вызвать сверхсинтеза треонина, так как он ингибирует
ГД, предотвращая этим свой сверхсинтез.
Единственный путь получения мутантов — продуцентов трео-
нина из семейства коринебактерий — это селекция регуляторных
мутантов, у которых ГД стала бы нечувствительной к треонину.
В качестве селективных агентов используют аналоги треонина,
чаще всего 0-оксинорвалин, 2-амино-З-оксивалериановую кис-
лоту (АОВ). Мутанты Brev. flavum, устойчивые к АОВ, как
правило, имеют две регуляторные мутации, нарушающие ретро-
ингибирование как ГД, так и АК- У таких штаммов в среду
26
выделяются одновременно и треонин, и лизин. С очень малой
частотой удается выделить мутанты, у которых десенсибилизиро-
вана только ГД, накапливающие в среде 10—12 г/л треонина
без примеси лизина.
Система регуляции биосинтеза аминокислот у энтеробактерий
основана на принципе дифференциальной регуляции изофермен-
тами (схема 3). У. Escherihia coli выявлены три аспартокиназы
и две гомосериндегидрогеназы. АК ингибируется и репресси-
руется треонином, АКг репрессируется метионином, АКз инги-
бируется и репрессируется лизином. Аналогично AKi и АК 2 ре-
гулируется активность и у ГД1, и у ГДг- При такой системе
регуляции получение мутантов — продуцентов треонина — воз-
можно лишь при введении мутаций недостаточности по амино-
кислотам, являющимся конечными продуктами биосинтеза, т. е.
необходимо получать тройные ауксотрофы. В литературе описано
выделение таких мутантов на основе штамма Escherichia coli.
Тройной ауксотроф (ДАП-, метионин-, изолейцинзависимый)
синтезировал 15—20 г/л треонина при наличии в среде пред-
шественника лизина ДАП, метионина и изолейцина в количест-
вах, обеспечивающих минимальный рост. Это усложняет подбор
производственных сред для таких мутантов.
СХЕМА 3
Для культуры Е. coli установлено, что гены, кодирующие
синтез АКь ГК и треонинсинтазы (ТС), составляют треонино-
вый оперон, поливалентно репрессируемый треонином и изо-
лейцином. Оперонная организация структурных генов позволяет
применять культуру Е. coli для получения сверхпродуцентов
треонина с использованием методов генной инженерии. На ос-
нове мутантов, выделенных из исходной культуры Е. coli К-12,
в СССР получен сверхпродуцент треонина, не требующий вне-
сения каких-либо аминокислот в среду. Этапы конструирования
штамма продуцента сводились к следующему:
1)	селекция с аналогами и получение мутаций, снимающих
подавление синтеза избытком треонина и препятствующих де-
градации треонина в клетке (получение АОВ — резистентных
мутантов);
2)	введение мутации, обеспечивающей общеклеточную поло-
жительную регуляцию сверхсинтеза аминокислот (одноступенча-
тый отбор с использованием нитрозогуанидина в качестве мута-
гена);
3)	амПликация генов треонинового оперона на многокопий-
ной плазмиде. Полученной гибридной плазмидой трансформиро-
вали реципиентный штамм; это позволило увеличить уровень
синтеза ферментов, кодируемых треониновым опероном. Накоп-
ление треонина у таких трансформантов возросло в 3—4 раза
и в лабораторных условиях достигало 40—50 г/л, причем коэф-
фициент конверсии источника углерода превышал 40%, а время
ферментации сократилось до 30—40 ч.
Ароматические аминокислоты. За последние годы все большее
практическое значение приобретает селекция штаммов микро-
организмов — продуцентов ароматических аминокислот — трип-
тофана, фенилаланина и тирозина. В микробной клетке синтез
этих соединений идет по общему пути до хоризмовой кислоты,
а дальше разветвляется на две ветви, одна из которых ведет
к синтезу триптофана, а вторая, через префеновую кислоту —
к тирозину и фенилаланину (схема 4).
Селекционная работа по выделению мутантов — продуцентов
ароматических аминокислот — проводится с представителями
трех семейств: коринебактерий (Brev. flavum, Coryn, glutami-
cum), бацилл (Вас. subtilis) и энтеробактерий (Е. coli). Для
этих микроорганизмов регуляция общего участка пути сосредо-
точена на первом ферменте — З-дезоксиарабиногептулозо-7-фос-
фатсинтетазе (ДАГФ), однако механизмы регуляции активности
этого фермента отличаются.
У коринебактерий активность ДАГФ подвержена согласован-
ному ингибированию фенилаланином и тирозином. Такой тип
регуляции предполагает, что при селекции продуцентов арома-
тических аминокислот на первом этапе должны быть выделены
штаммы-ауксотрофы, у которых общий предшественник — хо-
ризмовая кислота — расходовалась бы в основном на синтез
целевого продукта. В работе по селекции продуцентов трипто-
28
СХЕМА 4
СНО
I
снон
снон
СН2ОРО3Н2
эритрозо-4-фосфат
ДАГФ
СООН
I
с—О—РО3Н2
II
сн2
фосфоеиолпируват
Н2О3РОСН2
О. ^СООН
х
у I
НОСН | (1/СН2
I он
он
фана используют ауксотрофные по фенилаланину и тирозину
мутанты; при выделении продуцентов фенилаланина работу про-
водят с ауксотрофом по тирозину. Дальнейшее повышение
29
продуктивности таких мутантов достигается получением на их
основе регуляторных мутантов, у которых были бы десенси-
билизированы первые ферменты собственного участка биосин-
теза. Для продуцентов триптофана это возможно путем выделе-
ния мутантов, резистентных к его аналогам (5-метилтриптофан,
6-фтортриптофан и др.)., у которых десенсибилизируется антра-
нилатсинтетаза (АС). Такие мутанты могут осуществлять пря-
мое превращение глюкозы в триптофан с выходом 10—12 г/л.
Продуценты фенилаланина, выделенные путем ступенчатого отбо-
ра и устойчивые к аналогам (^-фторфенилаланин, /?-аминофени-
лаланин и др.), накапливают на сахаросодержащих средах
более 20 г/л целевого продукта.
Успешно применяемая в селекционной работе культура Вас.
subtilis также имеет одну ДАГФ, синтез которой репрессируется
тирозином и фенилаланином, а активность ингибируется хориз-
мовой и префеновой кислотами. Такая сложная система регу-
ляции предполагает при выделении продуцента триптофана вве-
дение множественных мутаций, приводящих к дерепрессии
ДАГФ, десенсибилизации АС к ингибированию триптофаном, де-
репрессии ферментов триптофанового оперона, десенсибилизации
префенатдегидратазы (ПДТ) фенилаланином. Многоступенчатый
отбор, проведенный с использованием соответствующих анало-
гов, позволил выделить мутант Вас. subtilis, образующий из
глюкозы 10—12 г триптофана.
У Е. coli ДАГФ представлена системой из трех изофермен-
тов, которые ингибируются своими конечными продуктами —
фенилаланином, тирозином, триптофаном. Основной путь полу-
чения ароматических аминокислот — выделение регуляторных
мутантов, резистентных к аналогам соответствующей амино-
кислоты. Однако высоких концентраций целевых продуктов такие
мутанты не образуют и в настоящее время используются как
объекты для дальнейшей селекционной работы с применением
методов генной инженерии.
Таким образом, селекционная работа по поиску продуцентов
аминокислот базируется в настоящее время в основном на полу-
чении регуляторных мутантов, штаммов с множественными му-
тациями, обеспечивающими сверхсинтез целевых аминокислот
представителями трех семейств — коринебактерий, энтеробакте-
рий и бацилл.
§ 3. Производство L -аминокислот
микробиологическим синтезом
Производство аминокислот в виде высокоочищенных кристал-
лических препаратов строится по схеме, типичной для получения
и выделения вторичных метаболитов. Наиболее распространен-
ный одноступенчатый микробиологический синтез любой амино-
кислоты предполагает размножение в несколько стадий исходной
30
культуры продуцента на агаризованной среде, выращивание в
маточных колбах, размножение культуры в системе инокуля-
торов и посевных аппаратах. В дальнейшем осуществляют
выращивание культуры в производственных ферментерах. После
завершения ферментации проводят, как правило после предва-
рительной обработки культуральной жидкости с целью улуч-
шения фильтруемости, отделение клеток продуцента. Полученный
таким образом нативный раствор подвергают предварительной
очистке от окрашенных примесей с использованием сорбционных
методов. Целевую аминокислоту выделяют с помощью ионного
обмена или методом осаждения. Элюаты, или маточные раство-
ры, концентрируют вакуум-выпаркой, образующиеся технические
кристаллы готового продукта очищают путем перекристаллиза-
ции из насыщенного раствора. Завершается процесс получения
кристаллического препарата, как правило, вакуум-сушкой очи-
щенных кристаллов и их упаковкой.
Побочными продуктами такого производства могут быть раз-
личные кормовые препараты, производимые на основе неутили-
зируемых маточных растворов выделяемой аминокислоты и от-
работанной биомассы продуцента, предварительно объединенной
с обедненными стоками ионообменных колонн производства, про-
мывными водами, идущими на очистку технологического обору-
дования, а затем высушенной до остаточной влажности около
10%.
При выпуске кормовых препаратов аминокислот с невысоким
содержанием основного вещества (не более 10%) технология
их производства предусматривает только стабилизацию раствора
культуральной жидкости перед вакуум-упариванием, концентри-
рование сухих веществ культуральной жидкости на вакуум-
выпарной установке, стандартизацию упаренного раствора пу-
тем добавки соответствующего количества наполнителя, сушку
готового продукта и его упаковку.
При получении технических или кормовых препаратов с по-
вышенным содержанием основного вещества дополнительно
осуществляют отделение клеток продуцента и частичное кон-
центрирование аминокислоты в нативном растворе методом ион-
ного обмена или осаждения.
Поскольку в одноступенчатом способе производства амино-
кислот в качестве продуцентов используются ауксотрофные
мутанты, требующие для своего роста и биосинтеза вторичных
метаболитов среды, содержащие легкоусваиваемые источники
углерода, азота и такие биологически активные вещества, как
витамины, его организация возможна только в строго асепти-
ческих условиях. При этом особое внимание обращается не
только на стерилизацию используемых питательных сред и по-
даваемого воздуха, всего технологического оборудования и ком-
муникаций, но и на строжайшее соблюдение всех регламентных
требований, обеспечивающих строго асептическое промышленное
культивирование данного микроорганизма.
31
§ 4. Технология получения L-лизина
и кормовых препаратов на его основе
Лизин (а, Е-диаминокапроновая кислота) имеет молекуляр-
ную массу 146,19. Хорошо растворим в воде, кислотах, основа-
ниях; трудно растворим в спирте и нерастворим в эфире. Раз-
лагается при температуре 224—225°С. Кристаллизуется в виде
гексагональных пластинок или бесцветных игл. Структурная
формула:
СН2—(СН2)3—СН—СООН
I	I
nh2	nh2
В организме человека и животных определяет биологическую
ценность перевариваемого белка, способствует секреции пищева-
рительных ферментов и транспорту кальция в клетки, улучшает
общий азотный баланс в организме. При добавлении лизина в
рационы животных (0,1—0,4%) значительно увеличивается ко-
эффициент использования кормового белка, что приводит к сни-
жению расхода кормов.
Приготовление и стерилизация питательной среды, технологи-
ческого оборудования и коммуникаций. Процесс биосинтеза в
производственных условиях начинают с получения посевного
материала в инокуляторах и (или) посевных аппаратах. Пита-
тельная среда для культивирования продуцентов лизина содер-
жит в качестве основного источника углерода мелассу, уксусную
кислоту или их смеси. Среди источников азота наиболее часто
используют соли аммония и мочевину, а также кукурузный
экстракт, гидролизаты кормовых, пекарских дрожжей и казеина.
Последние играют, кроме того, роль ростовых факторов: содер-
жат в себе дефицитные для ауксотрофного мутанта аминокис-
лоты и витамины. Нормальное течение процесса биосинтеза обес-
печивается добавками солей макроэлементов: калия, фосфора,
магния. Добавок микроэлементов, как правило, не производят,
они содержатся в достаточном количестве в кукурузном экст-
ракте и гидролизатах дрожжей.
Меласса, являющаяся отходом переработки сахарной свеклы
или тростника, включает до 50% сахарозы от сухих веществ
(СВ); кукурузный экстракт—не менее 48% сахаров от СВ,
оба они представляют собой нестандартное сырье, которое от
партии к партии может в значительной степени различаться.
Все компоненты питательных сред имеют практически полный
набор аминокислот и биотин, т. е. среды оказываются богатыми
и вполне пригодными для роста не только основного штамма,
но и всевозможных примесных (диких) культур. Это и застав-
ляет вести процесс биосинтеза в условиях строжайшей асеп-
тики.
Подготовку ферментеров (инокуляторов) к работе начинают
с промывки использованного оборудования горячей и холодной
водой с последующей обработкой аппаратов и коммуникаций
32
острым паром. Установлено, что наибольшая эффективность сте-
рилизации наблюдается при применении острого пара, имеющего
температуру 135—140°С. Однако выбор режима стерилизации
зависит от материала, из которого изготовлено оборудование
и его отдельные узлы. Если какая-то часть его не может быть
подвержена тепловому воздействию, например датчики измери-
тельных приборов, то применяют «холодные» способы стерилиза-
ции, предполагающие обработку растворами различных бактери-
цидных агентов (формальдегид, некоторые производные фенола,
хлорорганические соединения, (J-пропиолактон). После проведе-
ния «холодной» стерилизации оборудование промывают стериль-
ной водой до полного удаления остатков химических реагентов.
Стерилизацию питательных сред осуществляют традиционным
способом, так же как и подготовку технологического воздуха.
Растворяемые компоненты среды нагревают до определенной
температуры, затем выдерживают при этой температуре с по-
следующим охлаждением до температуры ферментации. Термо-
лабильные компоненты среды, например мелассу, стерилизуют
отдельно, предварительно нагревая при перемешивании до 80°С
с периодическим добавлением к раствору определенного коли-
чества воды. Собственно стерилизацию осуществляют путем
быстрого разогрева полученного раствора глухим паром до 120—
122°С и выдерживают минимально необходимое время. Охлаж-
денный раствор сжатым стерильным воздухом передают в пред-
варительно подготовленный ферментер. Все остальные компонен-
ты среды перед подачей в ферментер стерилизуются последо-
вательно в том же аппарате или параллельно в отдельном реак-
торе с мешалкой, нагреванием до необходимой температуры и
выдерживанием в течение 1 ч.
Пеногаситель (как правило, синтетического происхождения),
используемый на стадиях культивирования продуцента в посев-
ном аппарате и основном ферментере, стерилизуется отдельно
в более жестком режиме (температура и длительность), чем
это принято для стерилизации любых питательных сред.
Получение Посевного материала в производственных инокуля-
торах или посевных аппаратах. Эта важная технологическая
операция, состоящая в обеспечении основного производства
достаточным количеством высококачественной биомассы клеток
продуцента для засева промышленных ферментеров.
Начало процесса ферментации в посевных аппаратах, как и в
основных ферментерах, начинается с засева их производствен-
ным штаммом, выращенным в необходимом количестве на пре-
дыдущих стадиях культивирования. В зависимости от продуцен-
та количество посевного материала, передаваемого в посевной
аппарат, может варьировать в широких пределах от 1 до 20%
(обычно 3—5%) по объему. Коэффициент заполнения посевного
аппарата в зависимости от конструкции его отдельных узлов
(способ перемешивания, наличие эффективных механических пе-
ногасителей и др.) составляет 0,5—0,7. Перемешивание среды
33
достигается либо в результате барботажа стерильного воздуха,
либо турбинной мешалкой со скоростью вращения 300 об/мин.
При выращивании культуры продуцента состав питательных
сред может несколько меняться в зависимости от употребляемо-
го штамма и основного источника углерода. Например, при куль-
тивировании продуцента лизина в посевном аппарате может
быть применена питательная среда следующего состава (в %):
Меласса (по содержанию сахара) ....	7,5
Кукурузный экстракт (содержание СВ 50%)	2
Сульфат аммония ......	2
Калия фосфат:
однозамещенный	0,05
двухзамещенный ........................ ...	0,05
Мел..................... 1
Пеногаситель	синтетический	0,1
Вода .............. остальное
pH среды..................................... .	6,9—7,0
Посевную культуру выращивают при температуре 28—32°С в
течение 18—24 ч и расходе воздуха 1 объем на 1 объем жидкос-
ти в 1 мин. В течение всего процесса культирования pH среды
поддерживают на уровне 7,0—7,2. Об окончании процесса судят
по оптической плотности культуральной жидкости и морфологи-
ческим признакам выросших клеток.
Культивирование продуцентов лизина на ацетатной среде ха-
рактеризуется рядом особенностей. Поскольку присутствующий в
среде ацетат угнетает биосинтез ферментов цикла трикарбоновых
кислот, предельно допустимое содержание субстрата не должно
превышать 2%. Поэтому при культивировании осуществляют его
дробную подачу. Установлено, что наилучших результатов в
производстве биомассы удается достичь при использовании в
качестве источника углерода смеси уксусной кислоты с ацета-
том аммония, взятых в. определенном соотношении, устанавли-
ваемом для каждого штамма экспериментально. При этом в
пересчете на уксусную кислоту общая концентрация ацетат-
ионов не должна превышать 1,5—2,0%. Наиболее перспектив-
ным не только для роста клеток, но и для биосинтеза лизина
оказалось применение в качестве субстрата смеси ацетата с
легкоусвояемым углеводом — сахарозой или глюкозой. Источ-
ником последних обычно служит та же меласса или гидрол,
в исходной питательной среде их количество должно быть срав-
нимо с ацетатом.
По завершении процесса ферментации в посевных аппара-
тах готовая культура не должна содержать фагов, посторонней
микрофлоры и иметь титр около 109 клеток на 1 мл. После
проведения микробиологического контроля выращенный проду-
цент передают на стадию производственной ферментации.
Культивирование продуцента и биосинтез лизина в промыш-
ленных -ферментерах. Проводят в стандартных биореакторах
объемом 50, 63 и 100 м3. Такие аппараты должны обеспечить
нормальный рост и развитие промышленного продуцента в асеп-
34
тических условиях; они снабжены необходимыми коммуникация-
ми, теплообменниками, перемешивающими устройствами, штуце-
рами для подачи питательной среды и соответствующим обору-
дованием для ввода в нее стерильного воздуха, дополнительных
питательных ингредиентов, растворов кислот и щелочей для под-
держания pH среды на необходимом уровне, системами ввода
стерильного пеногасителя и передачи культуральной жидкости
на дальнейшую переработку. Перед началом культивирования
ферментеры промывают и стерилизуют паром в течение 1 ч при
0,1 МПа.
Стерильная питательная среда в момент введения в биореактор
имеет температуру , близкую к среде выращивания продуцента
(32—35°С), или около 80°С. В последнем случае для достиже-
ния температуры проведения процесса культивирования жидкую
фазу охлаждают подачей холодной воды в рубашку аппарата
или в теплообменники, расположенные внутри самого фермен-
тера.
Состав питательной среды для различных штаммов-проду-
центов может также различаться, как и при выращивании культу-
ры в посевных аппаратах. Некоторые отличия могут наблюдаться
в составах мелассных сред на стадиях получения продуцента в
посевных аппаратах и основных ферментерах. Например, выше-
указанному составу среды для посевного аппарата будет со-
ответствовать следующее содержание основных компонентов
(в %) питания для промышленных ферментеров:
Меласса (по содержанию сахара) ....
Кукурузный экстракт (по содержанию СВ) .
Сульфат аммония .	.	.
Калия фосфат:
однозамещенный
двухзамещенный
Мел......................................
Пеногаситель синтетический
Вода . .
pH среды .	.	.	. .
7 12
1,2—1,5
2
0,05
0,05
1
0.1
остальное
7,0—7,2
Посевной материал в количестве 5—10% от объема питатель-
ной среды поступает в ферментер. Коэффициент заполнения
последнего в зависимости от интенсивности пенообразования
составляет 0,6—0,75. Процесс ферментации продолжается от
55 до 72 ч при интенсивном перемешивании и аэрации (0,8—
1,0 объем воздуха на объем питательной среды в 1 мин), повы-
шенном давлении 0,02—0,03 МПа, постоянной температуре
28—32°С и контролируемом значении pH, которое в течение
культивирования поддерживается на уровне 7,0—7,5; периоди-
чески производится подача стерильного пеногасителя.
В первые сутки культивирования продуценты ассимилируют
около 25% углеводов и общего азота среды, в том числе почти
все аминокислоты, в этот период образуется практически вся
биомасса. Вторая стадия роста культуры сопровождается резким
снижением скорости накопления биомассы и самыми высокими
О*
35
скоростями биосинтеза лизина — 0,8—1,0 г/(л- ч). Питательная
среда сильно истощается, возможно значительное изменение
pH раствора. На данном этапе осуществляют подтитровывание
среды 25%-ным раствором аммиака. Последняя стадия культи-
вирования может сопровождаться некоторой убылью биомассы
за счет небольшого автолиза клеток и резким снижением ско-
рости образования лизина.
Контроль за ходом процесса биосинтеза осуществляют на раз-
ных этапах его проведения по оптической плотности раствора куль-
туральной жидкости (по содержанию клеток продуцента), по
содержанию субстрата в смеси или по сигналам датчиков pH и
растворенного кислорода в ферментационной среде. К концу про-
цесса биосинтеза содержание лизина в культуральной жидкости
достигает не менее 40 г/л, концентрация оставшегося субстрата
не более 0,5—1,0%.
Количество накапливаемого лизина удается повысить, если по
мере исчерпания источников углерода и азота в среду по ходу
процесса дополнительно вводить небольшие количества этих пи-
тательных веществ. Организация дробной «подпитки», общий
объем которой не превышает 10% объема исходной жидкой фа-
зы, приводит к активизации биосинтетической деятельности мик-
роорганизмов. На мелассной среде осуществление дробной «под-
питки» позволяет увеличить концентрацию образующегося в
культуральной жидкости лизина до 50 г/л. Экономический ко-
эффициент по потреблению сахара в пересчете на лизин состав-
ляет 35%.
На ацетатной среде из-за токсичности субстрата биосинтез
лизина возможен только при применении дробной подачи уксус-
ной кислоты. Как и при получении посевного материала, содер-
жание уксусной кислоты в жидкой фазе не должно превышать
2%. Введение в среду небольшого количества сахара, например
глюкозы в количестве до 1,5%, способствует повышению выхода
лизина на 30—50%. Экономический коэффициент по потребле-
нию ацетата в пересчете на лизин достигает 27%. Использование
такой среды позволяет снизить потребность продуцента в биоти-
не до 1 мкг на 1 л среды, однако при этом предполагается соблю-
дение определенного соотношения дефицитных аминокислот. Так,
при культивировании штамма Brevibacterium sp. 22Л на среде
следующего состава (в %):
Ацетат аммония	1,5
Глюкоза..................... .................. 1,0
Калия фосфат однозамещенный	.	0,02
Сульфат магния .	.	.	0,04
Сульфат аммония........... 3,0
Гидролизат соевой муки	(по	СВ)	1,5
Вода	.	остальное
соотношение треонина к метионину должно быть равно 3:1, со-
держание тиаминхлорида — 0,04 мг/л, а биотина — 0,05 мг/л.
Уксусная кислота подавалась непрерывно в виде смеси
36
1 моль/л уксусной кислоты и 0,25 моль/л ацетата аммония с
такой скоростью, чтобы концентрация ацетат-иона не превышала
1,5%.
К концу 72-го часа культивирования концентрация лизина
составляет 34 г/л. Однако использование более высокопродук-
тивных штаммов-продуцентов и выбор оптимальных условий про-
ведения процесса биосинтеза в реальном производстве позволяют
за то же время культивирования достичь концентрации лизина
50 г/л.
Технология получения лизина, как и других аминокислот,
одноступенчатым микробиологическим синтезом в зависимости
от источника углерода предполагает использование специально
подобранных штаммов-продуцентов. Количество субстрата, тех-
нология внесения его в среду, степень утилизации определяются
физиологическими особенностями выбранного продуцента и
адаптацией его к взятому источнику углерода.
Поскольку большинство промышленных продуцентов лизина
обладает уреазной активностью, помимо традиционных источ-
ников азота в виде солей аммония возможно использование
мочевины. Однако для каждого штамма выбор соли осуществ-
ляют экспериментально по наибольшему образованию лизина.
На течение процесса биосинтеза оказывает влияние соотношение
концентраций углерода и азота в среде, для каждого штамма
существует свой оптимум. Например, для продуцента Coryn,
glutamicum 95 соотношение C:N= 11:1, при его увеличении
падает выход лизина, при уменьшении — вместо лизина накап-
ливается аланин. Недостаточная аэрация в ходе ферментации
приводит к образованию молочной кислоты.
Для нормального роста и развития продуцента необходимо
присутствие в среде фосфора. Его включают в состав питатель-
ных сред в виде калиевых солей фосфорной кислоты. Однако
количество фосфора в среде регламентировано в пределах
8—20 мг %. Увеличение данной концентрации на один порядок
для продуцента Coryn, glutamicum почти наполовину снижает
выход лизина.
Все продуценты лизина в той или иной степени испытывают
потребность в ряде макро- и микроэлементов: магнии, железе,
меди, марганце. Эти металлы вводят в среду в виде солей
серной кислоты; сульфат магния задают на уровне 0,03—0,05%,
остальных солей берут меньше — от 0,0008 до 0,001%. Железо,
медь и марганец специально в среды не вносят, если они при-
сутствуют в достаточном количестве в кукурузном экстракте,
мелассе и других компонентах среды.
Выход лизина тесно связан с основными параметрами про-
цесса ферментации: температурой, концентрацией растворенного
кислорода, длительностью культивирования, дозой и возрастом
посевного материала.
Для продуцентов лизина температурный оптимум роста, раз-
вития и биосинтеза аминокислоты 28—30°С. Повышение темпе-
37
ратуры культивирования на 5° приводит к быстрому автолизу
клеток, и в среде накапливается значительно меньше лизина.
Снижение температуры на 5° от оптимальной, хотя и не снижает
выхода лизина, однако отрицательно сказывается на экономике
процесса биосинтеза, поскольку время культивирования удли-
няется в среднем на 12—20 ч. pH среды культивирования бак-
териальных штаммов-продуцентов 6—8,5. Для промышленных
штаммов, используемых в настоящее время, оптимум значения
pH 7,0—7,5.
Различные продуценты лизина испытывают неодинаковую
потребность в кислороде, но поскольку процесс биосинтеза пред-
полагает высокую активность дегидрогеназ цикла трикарбоновых
кислот и ферментов глиоксалатного цикла, производственное
культивирование должно проводиться при интенсивной аэрации.
Количество растворенного в жидкой фазе кислорода необходимо
поддерживать на оптимальном уровне. Недостаточная аэрация
приводит к образованию аланина и молочной кислоты за счет
снижения выхода лизина. Слишком интенсивная аэрация спо-
собствует усиленному росту биомассы, выход лизина при этом
также начинает снижаться. В процессе культивирования кон-
центрацию растворенного кислорода контролируют по его пар-
циальному давлению (рОг). В момент наибольшей скорости об-
разования биомассы и начала активного биосинтеза лизина
(в период от 16 до 20 ч роста культуры) величина (рОг) резко
снижается, что может отрицательно сказаться на биосинтезе
аминокислоты. Показано, что в момент критического снижения
парциального давления в ферментер требуется подать такое ко-
личество воздуха, чтобы концентрация растворенного кислорода
не оказалась ниже 20—30% значения, соответствующего насы-
щению культуральной жидкости в данных условиях.
Количество подаваемого на. производственную ферментацию
посевного материала обычно колеблется в пределах 1—5%, с
повышением дозы посевного материала выше экономический ко-
эффициент, короче лаг-фаза и меньше время получения произ-
водственной культуры. Поскольку скорость роста клеток и мак-
симум скорости биосинтеза лизина между собой не совпадают,
практически вся биомасса образуется в первые 12—18 ч, а лизин
начинает синтезироваться в заметных количествах лишь тогда,
когда рост биомассы замедляется. С началом образования ли-
зина связано уменьшение в размере клеток продуцента. Наи-
более характерным признаком начала биосинтеза лизина явля-
ется почти полное потребление из среды дефицитных для ауксо-
трофного мутанта аминокислот, например треонина. Эти факторы
могут учитываться при организации микробиологического и био-
химического контроля процесса ферментации.
Готовая культуральная жидкость помимо лизина и других
продуктов метаболизма содержит биомассу продуцента и остатки
непотребленных питательных веществ среды. В зависимости от
конкретных целей производства на основе культуральной жид-
38
кости можно получить технические препараты в виде жидкого
концентрата лизина (ЖКЛ) и сухого кормового концентрата
лизина (ККЛ), а также высококонцентрированные кормовые
и высокоочищенные кристаллические препараты для пищевой
и медицинской промышленности. Производство каждого из этих
препаратов осуществляется по своей технологии.
Поскольку практически весь £-лизин, производимый в мире
микробиологическим синтезом, расходуется на обогащение кор-
мов сельскохозяйственных животных и птицы, основное внима-
ние далее будет уделено рассмотрению технологических осо-
бенностей получения кормовых препаратов.
В СССР широкое распространение имеют кормовые препара-
ты лизина в виде ЖКЛ и ККЛ. Технико-экономические показате-
ли производства таковы, что существующая технология поз-
воляет получать ценные кормовые добавки по приемлемой для
сельского хозяйства стоимости. Его отличительной особенностью
является получение технических препаратов лизина на основе
всей суммы веществ, присутствующих в культуральной жидкости,
включая биомассу продуцента и твердые нерастворимые частицы
исходной среды. Помимо лизина товарные формы ЖКЛ и ККЛ
содержат большое количество других соединений, повышающих
ценность кормовой добавки, например витамины Вц Вг, Вз, В4,
РР и др.
Производство кормового препарата ЖКЛ (жидкого концент-
рата лизина). Технология производства ЖКЛ основана на упа-
ривании готовой культуральной жидкости до содержания 40%
АСВ. Для этого предварительно нагретую до температуры
95—100°С культуральную жидкость направляют на многокор-
пусную вакуум-выпарную установку и упаривают в 3,5—4 раза.
При длительном нагревании возможны потери лизина, связанные,
в основном, с процессами окисления и конденсации е-амино-
групп лизина с редуцирующими веществами, сопровождающими-
ся появлением окрашенных продуктов (пигментов), ухудшаю-
щих качество готового продукта. Поэтому исходную культураль-
ную жидкость предварительно стабилизируют 25%-ным раство-
ром гидросульфита натрия в количестве 0,4% от объема жидкой
фазы, а затем подкисляют концентрированной соляной кислотой
до pH 4,5—5,0. Образующийся при этом монохлоргидрат лизина
более устойчив к термическому воздействию. Проведение опера-
ций стабилизации и подкисления позволяет снизить потери ли-
зина до 5—15%.
Полученный по такой технологии препарат ЖКЛ имеет вяз-
кость 0,65-10-3 кг/(м-с), температуру замерзания около —18°С,
удельную массу 1,15—1,30, pH 4,5—5,0, сохраняет свои свойства
без изменения в течение 3 мес. Считают, что он обладает боль-
шей биологической ценностью, чем сухой ККЛ. Готовый продукт
передают в железнодорожные цистерны и направляют потребите-
лю.
Производство препарата ККЛ (кормового концентрата лизи-
39
на). Препарат ККЛ производят на основе ЖКЛ. Для этого
жидкий концентрат высушивают на распылительной сушилке
горячим воздухом при температуре не выше 90°С до остаточной
влажности 4—8% и фасуют по 20 кг в крафт-мешки с полиэти-
леновым вкладышем. Такой концентрат содержит (в %) до
15—20 монохлоргидрата лизина, до 14 других аминокислот,
15—17 белка, 10—13 бетаина и 20—25 зольных веществ. По
своему составу он практически не отличается от ЖКЛ.
Однако производимый по данной технологии ККЛ очень
гигроскопичен, при хранении слеживается крупными комками,
что затрудняет приготовление из него комбикормов. Устранение
данного недостатка достигается введением в упаренную культу-
ральную жидкость наполнителей в виде костной муки, негашеной
извести, бентонита, пшеничных отрубей. Применение последних
имеет наибольшее распространение. Для этого к сконцентриро-
ванной до 35—40% АСВ культуральной жидкости добавляют
отруби из такого расчета, чтобы влажность смеси была около
70% и образовалась масса, способная к формированию в гра-
нулы. Полученная таким образом паста высушивается конвек-
тивным способом на вальцово-ленточной сушилке до гранул
необходимого размера. Произведенный с этими наполнителями
ККЛ содержит до 7—10% лизина, он сыпуч и негигроскопичен.
Производство высококонцентрированных кормовых препара-
тов. При получении высококонцентрированных кормовых препа-
ратов лизина готовую культуральную жидкость предварительно
подкисляют серной кислотой до pH 1,6—2,0. При этом молекула
лизина переходит в форму двухвалентного катиона, что спо-
собствует в дальнейшем более эффективной его сорбции на иони-
те. Подкисленный раствор направляют на батарею ионообмен-
ных колонн, заполненных сульфокатионитом КУ-2-8 в аммо-
нийной форме. После проведения стадии адсорбции сорбат
промывают водой. Технологические стоки, содержащие клетки
продуцента и другие неадсорбировавшиеся компоненты культу-
ральной жидкости, поступают на утилизацию. С ионообменных
колонн лизин элюируют (80—90% от адсорбированного коли-
чества) 0,5—5,0%-ным раствором аммиака, элюат упаривают
под вакуумом при температуре 60°С до 30—50% содержания
СВ и подкисляют концентрированной соляной кислотой до pH 4,9.
Образовавшийся монохлоргидрат лизина поступает на сушку,
конечный продукт производства — кормовой препарат монохлор-
гидрата лизина — содержит не менее 70% основного вещества.
Технологические стоки и промывные воды, включающие клет-
ки продуцента, аминокислоты и другие компоненты культураль-
ной жидкости, а также следовые количества лизина, объединяют,
упаривают и сушат с наполнителем до остаточной влажности
10%. Получают препарат, который используют как кормовой
продукт, он содержит до 40% белковых веществ.
Производство кристаллических высокоочищенных препаратов
лизина. Такие препараты, как и другие аминокислоты, получают
40
на основе осветленных нативных растворов, т. е. тех же куль-
туральных жидкостей, но, как правило, свободных от клеток
продуцента и окрашенных соединений. Культуральная жидкость
после биосинтеза без дополнительной стабилизации поступает
на фильтрационную установку, где отделяются биомасса проду-
центра и присутствующие в среде карбонаты и фосфаты каль-
ция. Влажный осадок направляют в отдельный сборник, а оттуда
на сушку. Сухой биошрот используют как обогатительную до:
бавку в корма сельскохозяйственных животных.
Тщательно очищенный от взвеси фильтрат освобождают от
присутствующих пигментов путем адсорбции на активированном
угле или на анионитах. Полученный раствор с pH 7,0 поступает
на ионообменное выделение. В дальнейшем основные стадии
производства кристаллического лизина совпадают с рассмотрен-
ной технологией получения высококонцентрированных препара-
тов лизина, различие наблюдается лишь на стадии получения
монохлоргидрата лизина. Раствор монохлоргидрата лизина после
дополнительного вакуум-упаривания при 60°С охлаждают до
12—14°С, образовавшиеся кристаллы лизингидрохлорида от-
фильтровывают под давлением азота на нутч-фильтре, маточный
раствор возвращают на стадию вакуум-упаривания. Если, вы-
павшие кристаллы окрашены пигментами, то их с нутч-фильтра
направляют в кристаллизатор, где при 70°С растворяют в 3—4
объемах деионизованной воды, охлаждают, подвергают очистке
на сорбенте от пигментных примесей и возвращают на стадию
вакуум-упаривания. К очищенному концентрату лизина добавля-
ют 3—4-кратное количество этанола и осуществляют кристалли-
зацию из водно-спиртового раствора. Выпавшие кристаллы от-
фильтровывают и промывают чистым этанолом. Водно-спиртовые
маточники направляют на регенерацию. Кристаллический про-
дукт высушивают под вакуумом при 60°С.
Выход лизина на стадии выделения составляет 75%. Гото-
вый продукт представляет собой L-лизин монохлоргидрат с со-
держанием основного вещества 97—98%, имеет влажность 0,5%,
зольность 0,3%, температуру плавления 210°С.
Завершает процесс производства фасовка, упаковка и скла-
дирование готового продукта. Фасуют препарат в полиэтилено-
вые мешки, которые герметизируют и упаковывают в картонные
коробки.
§ 5. Технология получения L-глутаминовой кислоты
микробиологическим синтезом
Глутаминовая кислота (а-аминоглутаровая) имеет структур-
ную формулу
НООС— СП,—( II СН -СООН
I
NH.
В значительном количестве входит в состав растительных и
животных белков. Не относится к числу незаменимых, однако
41
на ее основе осуществляется синтез многих физиологически
активных соединений, необходимых для нормальной жизнедея-
тельности организма человека.
Находит широкое применение в пищевой промышленности
и медицине при лечении заболеваний, связанных с отравлением
печени и почек. В виде глутамата натрия (мононатриевая соль
глутаминовой кислоты) применяется как добавка в пищу для
усиления вкусовых качеств приготовленных продуктов питания
и сохранения их в изделиях, предназначенных для длительного
хранения, в частности в консервированном и замороженном со-
стоянии.
В промышленности глутаминовую кислоту и на ее основе
глутамат натрия получают несколькими способами: многоста-
дийным химическим синтезом из акрилонитрила, микробиологи-
ческим синтезом по одноступенчатой и двухступенчатой техно-
логии, выделением из свекловичной мелассы или из белковых
гидролизатов. Наибольшее распространение получили способы
выделения глутаминовой кислоты из свекловичной мелассы и
одноступенчатого микробиологического синтеза. Последний счи-
тается самым перспективным.
В промышленном биосинтезе L-глутаминовой кислоты исполь-
зуются те же микроорганизмы, что и в микробиологическом про-
изводстве L-лизина, т. е. Coryn, glutamicum и Brev. flavum.
Кроме них, промышленными продуцентами могут быть некоторые
штаммы бактерии Micrococcus и Microbacterium.
Для осуществления процесса биосинтеза глутаминовой кисло-
ты с высоким выходом используют мутанты с нарушенной фер-
ментативной системой превращения а-кетоглутаровой кислоты в
янтарную. При этом, если культура обладает недостаточностью
по биосинтезу аланиндегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, то
выход глутаминовой кислоты будет увеличиваться за счет от-
сутствия расхода углеводов среды на биосинтез аланина и мо-
лочной кислоты.
При промышленном культивировании в качестве источника
углерода используют легкоассимилируемые углеводы (сахарозу
и глюкозу), содержащиеся в свекловичной мелассе, гидроле,
гидролизатах крахмала. Источником азота являются мочевина,
реже хлорид и сульфат аммония, кукурузный экстракт, причем
последний применяют только на стадиях получения инокулята
и посевного материала, в основном по причине большого со-
держания в нем биотина. Повышенное содержание биотина в
мелассе также может ограничить использование ее как основного
источника сырья для биосинтеза.
Все продуценты глутаминовой кислоты биотинзависимые, а
некоторые из них и тиаминзависимые, однако содержание био-
тина регламентировано и не должно превышать 2—5 мкг на 1 л
среды. Более высокая концентрация этого витамина излишне
стимулирует рост клеток продуцента, способствует повышенному
образованию, аланина, молочной, янтарной, аспарагиновой кис-
42
лот, а выход глутаминовой кислоты при этом значительно сни-
жается.
Ингибирующее влияние биотина удается снизить при включе-
нии в состав питательных сред различных добавок в виде не-
которых спиртов, ПАВ, антибиотиков (пенициллинов, тетрацик-
линов). Добавки в среду ПАВ в количестве 0,01—0,2% или
калиевой соли бензилпенициллина (4—6 тыс. ед. на 1 л среды)
повышают биосинтетическую способность продуцента на 15—
45% и выход глутаминовой кислоты достигает 50 г/л. Действие
антибиотиков, по-видимому, связано с ингибированием синтеза
липогликопротеинового комплекса клеточной оболочки продуцен-
та, что приводит к увеличению проницаемости клеточных мем-
бран для глутаминовой кислоты.
В зависимости от особенностей используемого штамма коли-
чество азота в виде мочевины, включаемого в питательные
среды для осуществления процесса биосинтеза, составляет
1,0—2,0%. Для создания оптимальных условий биосинтеза и
увеличения количества производимой глутаминовой кислоты в
единице объема культуральной жидкости процесс по завершению
накопления основной массы клеток проводят с подпиткой раст-
вором мочевины. Содержание ее в культуральной жидкости не
должно превышать 0,8%, а pH раствора должно быть в пределах
6,8—7,8. Недостаток азота в среде снижает выход глутаминовой
кислоты, способствуя накоплению повышенных количеств а-кето-
глутаровой кислоты.
Одноступенчатый способ получения. Принципиальная техно-
логическая схема культивирования продуцента и биосинтеза
глутаминовой кислоты практически полностью повторяет схему
микробиологического производства L-лизина. Поэтому будут рас-
смотрены только некоторые отличия, наблюдаемые на стадиях
культивирования продуцента и проведения биосинтеза.
Посевной материал на каждой из стадии его получения (от
пробирок до посевного аппарата) выращивают в строго асепти-
ческих условиях по 24 ч. Состав питательных сред незначи-
тельно меняется при переходе от одного штамма к другому и
практически остается постоянным на каждой из промежуточных
стадий получения посевного материала. Только при выращива-
нии продуцента в посевном аппарате в питательную среду вно-
сят до 0,1 % стерильного синтетического пеногасителя.
Для промышленных штаммов Coryn, glutamicum питательные
среды при производстве посевного материала, как правило, со-
держат следующие компоненты (в %):
Меласса ....	8
Кукурузный экстракт	0,3
Хлорид аммония.............0,5
Калия фосфат двухзамещенный 0,05
Сульфат магния .	0,03
Вода.............. остальное
pH среды	7,0—7,2
Питательные среды на стадии биосинтеза содержат те же
компоненты и в том же количестве, только вместо кукурузного
экстракта и сульфата аммония присутствует до 2% мочевины,
43
содержание мелассы увеличивают до 20%, дополнительно вводят
мел до 1% и 0,1% синтетического пеногасителя.
Накопление биомассы до 6—8 г АС В на 1 л среды производят
в аэробных условиях сначала в инокуляторах объемом 2 м3, по-
том в посевных аппаратах объемом 5 м3. Полученный посевной
материал в количестве 5—6% (от объема среды производствен-
ных аппаратов) стерильно передают в основные фермен-
таторы.
Процесс биосинтеза осуществляют в строго асептических ус-
ловиях в ферментаторах объемом 50 м3 с коэффициентом за-
полнения аппарата 0,7 в течение 48—52 ч и интенсивной аэрации
[80—85 мг Ог/(л-мин)], что соответствует расходу 1 объема
воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Температуру культивирования
на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28—30°С.
В конце процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость
содержит до 45 г/л глутаминовой кислоты. Выход глутаминовой
кислоты по отношению к потребленным сахарам составляет 45—
50%.
Поскольку производство глутаминовой кислоты направлено
на получение высокоочищенных препаратов, последующая техно-
логическая схема предусматривает производство продуктов, под-
готовленных непосредственно к применению в качестве пищевых
добавок и в виде лекарственных форм.
Выделение глутаминовой кислоты из культуральной жидкости
и последующая очистка ее в соответствии с требованиями фарма-
копеи предполагает такую последовательность проведения техно-
логических операций.
Предварительная обработка культуральной жидкости. Осу-
ществляется в результате добавления к ней определенного
количества негашеной извести (или известкового молока) с по-
следующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кис-
лотой. Образующийся при этом осадок способствует лучшему
отделению клеток продуцента и других балластных примесей.
Отделение осадка. Проводят центрифугированием или фильт-
рованием под давлением.
Осветление фильтрата. Состоит в очистке его от пигментных
примесей, окрашивающих нативный раствор в темный цвет.
Для этого обрабатывают фильтрат активированным углем или
подвергают его ионообменной сорбции на анионите ИА-1.
Концентрирование осветленного раствора глутаминовой кис-
лоты. Проводят путем его вакуум-выпаривания при температуре
40—60°С, при этом из исходного раствора глутаминовой кислоты
отгоняют от 50 до 80% воды.
Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты в изоэлектри-
ческой точке. Эта стадия осуществляется путем подкисления
полученного на предыдущем этапе концентрата соляной кислотой
до pH 3,2 (изоэлектрическая точка глутаминовой кислоты) и ох-
лаждения раствора до 4—15°С. Однократное проведение опера-
ции обеспечивает кристаллизацию 77% глутаминовой кислоты;
44
при повторном ее проведении выход возрастает до 87%. Чистота
получаемых кристаллов достигает 88%.
В результате последующей перекристаллизации чистоту по-
лучаемых кристаллов можно увеличить до 99,6%; что удовлет-
воряет требованиям фармакопеи.
Отделение кристаллов глутаминовой кислоты от маточника.
Это достигается центрифугированием с последующей декантаци-
ей и возвратом маточника на стадию вакуум-выпаривания. По-
лученные кристаллы промывают обессоленной водой и направ-
ляют на сушку.
Сушка кристаллов глутаминовой кислоты. Проводится в ва-
кууме или в токе нагретого воздуха при 60—70°С.
Получение глутамата натрия HOOCCH2CH2CH(NH2)COONa-
•Н2О). Процесс осуществляется обработкой влажных кристал-
лов неперекристаллизованной глутаминовой кислоты гидрокси-
дом натрия. Для этого влажные кристаллы растворяют в опре-
деленном количестве воды и нейтрализуют 45—50%-ным раст-
вором едкого натра, pH раствора доводят до 6,8, после чего
его фильтруют. Осветленный раствор глутамата натрия упари-
вают под вакуумом до содержания сухих веществ около 60%
и передают на кристаллизацию. Ее проводят в течение
трех суток при постепенном снижении температуры. Кристаллы
глутамата натрия отделяют от маточного раствора центрифу-
гированием и сушат в токе горячего воздуха.
В соответствии с требованиями МРТУ 18/210—68 глутамат
натрия пищевой должен иметь следующий состав (в %):
Основное вещество, не менее . 94	Влага, не более . .	1
Хлорид натрия, не более .	5	Общий азот, не менее	7,02
Двухступенчатый способ получения. Его возможно осущест-
вить из а-кетоглутаровой кислоты с помощью ферментов транс-
амилазы или глутаматдегидрогеназы в результате следующих
превращений:
I вариант — переаминирование аминокислот
а-кетоглутаровая кислота + аминокислота трансамидаза. t
----------- L-глутаминовая кислота + а-кетокислота;
II вариант — восстановительное аминирование
а-кетоглутаровая кислота + NH^-|- НАДН глутаматдегидрогеназа
---------«-L-глутаминовая кислота + Н2О + НАД+
В каждом из этих процессов а-кетоглутаровая кислота иг-
рает роль предшественника.
Для осуществления любого из этих превращений необходимы
источники а-кетоглутаровой кислоты и соответствующей фер-
ментной системы. Первую из этих задач решают с помощью
подбора микроорганизмов, способных продуцировать значитель-
ное количество а-кетоглутаровой кислоты из доступных источ-
ников сырья. Продуцентами а-кетоглутаровой кислоты могут
быть Pseudomonas и Escherichia, & при культивировании про-
45
дуцента Kluyverd citrophila а-кетоглутаровая кислота была по-
лучена с 57%-ным выходом. Дрожжи рода Candida при выра-
щивании на н-парафинах продуцируют а-кетоглутаровую кислоту
совместно с пировиноградной в соотношении 6:1. Экономиче-
ский коэффициент процесса биосинтеза достигает 90% от коли-
чества потребленных углеводородов.
В роли продуцента фермента трансамидазы могут выступать
различные микроорганизмы, например Е. coli. Донором амино-
групп может быть аспарагиновая кислота или аланин.
Восстановительное аминирование возможно осуществить с по-
мощью Pseudomonas (при использовании Ps. ovalis выход L-
глутаминовой кислоты составляет 60%) или Aeromonas, причем
некоторые штаммы этих микроорганизмов в качестве субстрата
могут использовать Д,£-а-оксиглутаровую кислоту, производи-
мую химическим синтезом.
§ 6. Технология получения L-триптофана
микробиологическим синтезом
Триптофан (а-амино-р-индолилпропионовая кислота) отно-
сится к незаменимым аминокислотам. Имеет структурную фор-
мулу
---J-C112— С I I—COO II
Его содержание в растительных белках невелико. Хотя по-
требность в нем значительно ниже, чем в лизине и глутамино-
вой кислоте, тем не менее в виде кормовой добавки он обеспе-
чивает полноценность рационов сельскохозяйственных животных.
Кроме того, высокоочищенные препараты L-триптофана с содер-
жанием основного вещества не менее 99% нашли применение
в медицине в производстве компонентов лечебного питания и в
различных биохимических исследованиях.
Разработке промышленных способов производства L-трипто-
фана как незаменимой аминокислоты в СССР уделяется боль-
шое внимание. Разработаны и освоены технологии получения
L-триптофана с различной степенью его очистки, предназначен-
ные для использования в медицине, сельском хозяйстве и прак-
тике научных исследований. Промышленные способы микробио-
логического производства состоят в проведении процесса био-
синтеза как с помощью бактериальных штаммов-мутантов, не-
достаточных по тирозину и фенилаланину, так и путем транс-
формации различных предшественников в L-триптофан под дей-
ствием ферментных систем некоторых дрожжей.
Одноступенчатый способ биосинтеза осуществляют с по-
мощью спороносных штаммов-мутантов бактерий Вас. subtilis,
синтезирующих до 10 г триптофана в 1 л культуральной жид-
кости. Двухступенчатый способ основан на проведении в про-
мышленных масштабах трансформации антраниловой кислоты
46
под действием ферментных систем С. utilis в L-триптофан и по-
лучении культуральной жидкости с содержанием его до 6 г/л.
Одноступенчатый способ биосинтеза L-триптофана. Его ос-
новные стадии — культивирование исходного штамма продуцен-
та, выделение и очистка полученного триптофана, производство
на его основе кормовых и высокоочищенных препаратов —
практически те же самые, что и для микробиологического про-
изводства L-лизина. Поэтому рассмотрим только некоторые осо-
бенности проведения основных технологических операций.
Культивирование продуцента обычно проводят на среде, со-
держащей следующие основные компоненты (в%):
Сахароза (техническая) .	10
Кукурузный экстракт	2
Мочевина ............. 0,5
Сульфат магния .	0,1
Калия фосфат:
однозамещенный	0,06
двухзамещенный	0,14
Хлорид натрия .	0,05
Вода	остальное
pH среды .	7,0—7,2
На стадиях получения посевного материала в инокуляторе
и посевном аппарате используют среду, содержащую те же
самые компоненты и в том же количестве, кроме сахарозы,
которой берут вдвое меньше. Как и при производстве других
аминокислот, применяют стерильный пеногаситель в количестве
до 0,1%. Время и температура культивирования на каждой
из стадий размножения культуры одинаковы и составляют соот-
ветственно 20 ч и 37°С. Количество готового посевного материа-
ла, передаваемого на основную ферментацию, не превышает
5—10%. Продолжительность процесса биосинтеза при темпера-
туре 37°С не превышает 48 ч. Степень аэрации среды 3,6—
4,0 г О2/(л-ч).
Кормовой концентрат триптофана (ККТ) можно получать
без отделения биомассы продуцента путем вакуум-упаривания
культуральной жидкости до 30—40%-ного содержания сухих
веществ с последующим высушиванием на распылительной су-
шилке при температуре входящего теплоносителя ПО—120°С.
Высококонцентрированные препараты триптофана получают
из фильтрата культуральной жидкости после отделения клеток
продуцента и нерастворимых примесей. Последовательность ос-
новных технологических операций такова:
1) отделение биомассы продуцента фильтрованием или
центрифугированием; 2) подкисление фильтрата соляной кисло-
той до pH 1,0 и отделение выпавшего осадка; 2) адсорбция
триптофана в колонных аппаратах, заполненных сульфокатио-
нитом КУ-2-8 в Н-форме; 4) десорбция триптофана 5%-ным
водно-изопропанольным раствором аммиака, при этом элюирует-
ся до 90% и более сорбированного триптофана; 5) концентри-
рование элюата вакуум-выпаркой при 60—70°С (отгоняется
47
80—90% водно-спиртовой фракции) и охлаждение концентрата
до 4—6°С; 6) кристаллизация триптофана из водно-спиртового
раствора; 7) отделение полученных кристаллов от маточника,
который возвращают на стадию вакуум-выпарки; 8) промывка
кристаллов этанолом и вакуум-сушка при 60°С.
По такой схеме получают технический препарат триптофана.
Выход по целевому продукту — около 45% от его содержания
в культуральной жидкости.
При получении высокоочищенного препарата триптофана с
содержанием основного вещества 99% промытые этанолом кри-
сталлы растворяют и перекристаллизовывают из 65%-ного вод-
ного этанола или из 60%-ного водного изопропанола. Маточ-
ный раствор возвращают на вакуум-выпарку, а полученные
кристаллы высушивают в вакууме при 60°С.
Отходы при производстве очищенных препаратов триптофана,
такие, как биомасса продуцента, маточные растворы со стадий
кристаллизации, содержащие значительное количество трипто-
фана, могут быть объединены с исходной культуральной жид-
костью для получения кормового концентрата.
Двуступенчатый способ биосинтеза L-триптофана. Он пред-
полагает на первом этапе размножение в асептических условиях
штамма дрожжей С. utilis по традиционной схеме от пробирок
до основного ферментатора с целью накопления максимально
возможного количества биомассы используемого микроорганизма,
а на втором — проведение в том же биореакторе трансформации
предшественника с помощью накопленной биомассы.
Выращивают исходную культуру при 28—30°С в течение
24 ч в каждом пассаже. Для культивирования продуцента фер-
ментных систем С. utilis в посевных колбах применяют следующий
состав питательной среды (в %):
Меласса ...	10,4
Мочевина........................ .	0,5
Калия фосфат двухзамещенный .	...	0,01
Кальция хлорид .	.................... 0,01
Магния сульфат ...	0,005
Вода ...	.	. . . остальное
pH среды . .	.	.	.	7,5—8,0
Выращенную биомассу, содержащую 3—5 г дрожжей в 1 л
среды, употребляют для засева производственных ферментеров.
Производственная питательная среда имеет тот же качест-
венный и количественный состав основных компонентов, что и для
получения посевного материала, кроме мелассы, концентрацию
последней снижают до 6,2%. На первом этапе культивирования
в течение первых 24 ч дрожжи выращивают при интенсивной
аэрации, подавая не менее 7 г О2/(л-ч) с применением синтети-
ческого пеногасителя. На втором этапе (после 24 ч роста) в
культуральную жидкость небольшими порциями вносят 5%-ный
спиртовой раствор антраниловой кислоты и 50%-ный раствор
мочевины. Уровень аэрации снижают вдвое — до 3 г О2/(л-ч).
48
Через 4 ч после внесения антраниловой кислоты и мочевины
начинают добавлять 25%-ный раствор мелассы, в ходе культиви-
рования антраниловую кислоту и мочевину добавляют через каж-
дые 6 ч, мелассу — через 12 ч. Полное время культивирования
составляет 144 ч, при этом первые 24 ч отводятся на выращивание
продуцента, т. е. на накопление необходимых ферментных систем,
вторые 120 ч составляют собственно время проведения транс-
формации антраниловой кислоты. Концентрация триптофана в
готовой культуральной жидкости 6 г/л, содержание сухих
веществ 8—13%. Последующую переработку культурной жид-
.кости производят по вышеприведенной схеме. Неочищенный
препарат ККТ, получаемый в результате такой переработки
культуральной жидкости процесса биосинтеза триптофана из антра-
ниловой кислоты, имеет следующий состав (в %): белковые
вещества — 48—54; общий триптофан — 1—3; другие аминокис-
лоты — 6; влага — 10; витамины (в мг/кг): Bi — 15—18,5; В2 —
24,5 — 32,6; РР — 620—680.
___9.21
Глава
ТЕХНОЛОГИЯ БИОСИНТЕЗА
	ПРЕПАРАТОВ АНТИБИОТИКОВ
La ДЛЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
Традиционные представления об антибиотиках, или антибио-
тических веществах, связаны с их широким применением в совре-
менной медицине и ветеринарии. Некоторые антибиотические
препараты применяют как стимуляторы роста животных, в борь-
бе с болезнями растений, при консервировании пищевых продук-
тов и в научных исследованиях (в области биохимии, молекуляр-
ной биологии, генетике, онкологии).
Современное определение термина «антибиотик» принадлежит
М. М. Шемякину и А. С. Хохлову (1961), которые предложили
считать антибиотическими веществами все продукты обмена
любых организмов, способные избирательно убивать или подав-
лять рост и развитие микроорганизмов (бактерии, грибы, вирусы
и др.), а также некоторых злокачественных новообразований.
В соответствии с классификацией, в основе которой лежит
химическое строение, все описанные антибиотики можно разделить
на следующие группы: 1) ациклические соединения (исключая
жирные кислоты и терпены); 2) алициклические соединения
(в том числе тетрациклины); 3) ароматические соединения;
4) хиноны; 5) кислородсодержащие гетероциклы; 6) азотсодер-
жащие гетероциклические соединения; 7) пептиды.
Полностью химическая структура установлена для одной
трети известных антибиотиков и только половина из них может
быть получена химическим путем. Поэтому микробиологический
способ получения антибиотических средств очень актуален.
Синтез микроорганизмами антибиотиков — одна из форм
проявления антагонизма; связан с определенным характером
обмена веществ, возникшим и закрепленным в ходе его эволю-
ции, т. е. это наследственная особенность, выражающаяся в
образовании одного и более определенных, строго специфичных
для каждого вида антибиотических веществ. Воздействуя на
постороннюю микробную клетку, антибиотик вызывает значи-
тельные нарушения в ее развитии. Некоторые из антибиотиков
50
способны подавлять синтез оболочки бактериальной клетки в
период размножения, другие воздействуют на ее цитоплазмати-
ческую мембрану, изменяя проницаемость, часть из них является
ингибиторами реакций обмена веществ.
Несмотря на интенсивное изучение механизма действия раз-
личных антибиотиков, далеко не полностью выявлено их влияние
на обмен веществ даже в клетках бактерий, которые являются
основными объектами исследования.
В настоящее время описано более 3000 антибиотиков, но
только 150 из них нашли практическое применение. Ниже будет
рассмотрена технология производства тех из них, которые отно-
сятся к продуктам метаболизма микроорганизмов и нашли при-
менение в сельском хозяйстве в виде соответствующих добавок
к кормам (кормовые антибиотики) и в качестве средств защиты
растений.
В течение многих лет антибиотики используют как стимуля-
торы роста сельскохозяйственных животных и птицы, как средст-
ва борьбы с заболеваниями растений и посторонней микрофлорой
в ряде бродильных производств, как консерванты пищевых про-
дуктов. Их применение в сельском хозяйстве приводит к сниже-
нию заболеваемости и смертности, прежде всего молодняка, и к
ускорению роста и развитию животных и птицы, способствует
сокращению количества потребляемых кормов в среднем на
5—10%. При применении антибиотиков в свиноводстве от каж-
дой 1000 свиней дополнительно получают 100—120 ц мяса, от
1000 кур-несушек — до 15 тыс. яиц в год.
Механизм стимулирующего действия антибиотических ве-
ществ также нельзя считать полностью выясненным. Видимо,
стимулирующий эффект воздействия низких концентраций анти-
биотиков на организм животного связан, в основном, с двумя
факторами: воздействием на микрофлору кишечника или непо-
средственным влиянием на организм животного. В первом случае
антибиотики способствуют увеличению числа полезных микроор-
ганизмов, синтезирующих витамины и преобладающих над пато-
генными формами. Они снижают число вредных для организма
животного, микробов, использующих биологически активные
вещества и образующих токсины, имеющие патогенные или
условно патогенные формы. Антибиотики оказывают влияние на
микроорганизмы, присутствующие в кишечнике, способствуя
созданию устойчивых штаммов, менее вредных для животного,
изменяют метаболизм присутствующих микробов. Они вызывают
перемещение микроорганизмов в кишечнике животного; под их
влиянием наблюдается снижение субклинических инфекций,
часто замедляющих развитие молодняка, снижение pH содержи-
мого кишечника, уменьшение поверхностного натяжения клеток
организма, что способствует ускорению их деления.
Во втором случае в организме животного наблюдается синер-
гизм действия гормонов, растет количество ростовых гормонов,
ускоряется процесс потребления пищи, растет приспособляемость
51
организма к неблагоприятным условиям. Под влиянием антибио-
тиков снижается потребность животного в витаминах, увеличива-
ется синтез витаминов тканями, стимулируется синтез сахаров
и витамина А из каротина, растет скорость синтеза ферментов,
образуется меньше побочных продуктов. Кроме того, растет
абсорбционная способность тканей, стимулируется потребление
метаболитов.
Кормовые антибиотики применяют в виде неочищенных пре-
паратов, которые представляют собой высушенную биомассу
продуцента, содержащую помимо антибиотика аминокислоты,
ферменты, витамины группы В и другие биологически активные
вещества. Получаемые препараты стандартизуют по активности
или количеству входящего в их состав основного вещества, учи-
тывая или не учитывая присутствие в нем витамина В12. Все
производимые кормовые антибиотики: а) не используются в
терапевтических целях и не вызывают перекрестной резистенции
бактерий к антибиотикам, применяемым в медицине; б) практи-
чески не всасываются в кровь из пищевого тракта; в) не меняют
своей стуктуры в организме; г) не обладают антигенной приро-
дой, способствующей возникновению аллергии.
При длительном применении одного и того же препарата суще-
ствует опасность возникновения антибиотикоустойчивых микро-
организмов. Для ее предупреждения периодически меняют ис-
пользуемые антибиотические вещества или применяют смесь
антибиотиков, позволяющую поддерживать первоначально до-
стигнутый эффект на необходимом уровне.
В СССР уже в течение нескольких десятков лет выпускаются
кормовые препараты на основе хлортетра циклина — биовит,
или биомицин кормовой с различным начальным содержанием
антибиотика и витамина В12- В настоящее время производство
кормовых антибиотиков основывается и на других препаратах
немедицинского назначения, таких, как бацитрацин, гризин,
гигромицин Б и др.
В течение последних 20 лет антибиотики используют как
средство борьбы с различными фитопатогенами. Источники
заражения растений фитопатогенными микроорганизмами раз-
личны. Не составляют исключения и семена самого растения,
идущие на посев. Воздействие антибиотического вещества сво-
дится к задержанию роста или гибели фитопатогенных микроор-
ганизмов, находящихся в семенах и вегетативных органах расте-
ния.
Получаемые препараты должны быть высокоактивными про-
тив возбудителя заболевания в окружающей растение среде,
безвредными в применяемых для растения дозах, способными
сохранять антибиотическую активность в течение необходимого
времени и легко проникать в соответствующие ткани растения.
К числу антибиотических веществ, нашедших наиболее широ-
кое применение в борьбе с фитопатогенами, относятся прежде
всего фитобактериомицин, трихотецин и полимицин.
52
Применение антибиотиков в пищевой промышленности позво-
ляет в значительной степени снизить длительность термообра-
ботки различных продуктов питания при их консервировании.
А это, в свою очередь, обеспечивает большую сохранность при-
сутствующих в них биологически активных веществ, вкусовых
качеств, консистенции продуктов. Используемые антибиотики
воздействуют в основном на клостридиальные и термофильные
бактерии, устойчивые к нагреванию. Наиболее эффективным
антибиотиком при консервировании овощей общепризнан в
СССР и за рубежом низин. Он не токсичен для человека и позволя-
ет вдвое уменьшить время термообработки овощей.
Технология производства любых антибиотиков немедицинско-
го назначенйя, кроме тех, что используются в пищевой и кон-
сервной промышленности, строится по единой схеме, пре-
дусматривающей все стадии асептического промышленного куль-
тивирования штамма-продуцента и биосинтез антибиотика, пред-
варительную обработку культурной жидкости, ее вакуум-упари-
вание, сушку и стандартизацию готового продукта путем смеше-
ния с необходимым количеством наполнителя. В качестве послед-
них обычно используют отруби, жмыхи различных культур и
другие вещества органической и неорганической природы.
Динамика накопления антибиотика в культуральной жидко-
сти в подавляющем большинстве случаев имеет типичный вид
зависимости, характерный для биосинтеза вторичных метаболи-
тов, т. е. максимум образования биомассы во времени предшест-
вует максимуму антибиотикообразования. Поэтому на первых
этапах культивирования целью производства является накопле-
ние необходимого количества биомассы (антибиотик при этом
практически отсутствует). Биосинтез антибиотика происходит на
второй стадии производственного культивирования в основных
ферментерах, причем время биосинтеза может в 2—3 раза превы-
шать время, затрачиваемое на культивирование штамма-проду-
цента.
§ 1. Технология получения препаратов тетрациклина
Тетрациклины нашли широкое применение как в медицине,
так и в производстве кормовых препаратов. Среди них для сель-
ского хозяйства промышленность выпускает ряд препаратов на
основе 7-хлортетрациклина (I) и 8-окситетрациклина (II):
Тетрациклиновые антибиотики имеют следующую структур-
ную формулу:
(I) С22Н2зСИЧ2Ов
где R = Cl; R' = Н
(II) C22H24N2O9,
где R = Н; R' = ОН
53
Это амфотерные соединения, способные образовывать соли с
кислотами и основаниями, плохо растворимы в водных растворах
в интервале pH от 4,5 до 7,5, но хорошо растворимы при pH
ниже 2,0 и выше 8,0. Неустойчивы к воздействию окислителей,
в том числе и кислорода воздуха.
В качестве промышленных продуцентов хлортетрациклина
используют штаммы несовершенного гриба Actinomyces aurefli-
stens, а окситетрациклина — Actinomyces rimosus.
Промышленность выпускает кормовые препараты хлортетра-
циклина в виде биовита-20, биовита-40 и биовита-80, содержа-
щие соответственно чистого антибиотика 20, 40 80 г в 1 кг пре-
парата и одновременно 3, 5, 8 мкг витамина В12 в 1 г препарата.
Кроме того, препараты содержат микроэлементы, белок, жиры
и минеральные соли. При введении биовита в рационы в количе-
стве 15—20 г антибиотика на 1 т корма прирост в массе живот-
ных увеличивается до 30%, а расход кормов в среднем снижает-
ся иа 5—10%. Препараты применяются как стимуляторы роста
молодняка сельскохозяйственных животных и птицы, способствуя
их лучшему развитию и увеличению продуктивности, а также
для профилактики желудочно-кишечных и легочных заболеваний.
Они обладают широким антибактериальным спектром действия
по отношению к грамположительным и грамотрицательным
микроорганизмам, по внешнему виду представляют собой одно-
родный порошок от светло-коричневого до коричневого цвета.
Окситетрациклин для животноводства выпускается в форме
терравита Р (растворимый) и терравита К (кормовой). Препара-
ты терравит-5, терравит-10, терравит-50 представляют собой
однородный порошок светло-коричневого цвета с горьким вкусом
и плесневым запахом, содержащий соответственно 5, 10, 50 г
чистого антибиотика в 1 кг препарата. Препарат терравит Р-20 —
мелкий порошок коричневого цвета, обладает активностью
20 ед/мг; терравит Р-40 — мелкий порошок светло-желтого
цвета, содержит антибиотик в количестве 40 ед/мг; терравит
К-40 — средней крупности порошок коричневого цвета, содержа-
щий антибиотика до 40 ед/мг. Помимо антибиотика в состав
препаратов входит витамин В12, однако содержание его не нор-
мируется.
При введении 15—20 г антибиотика на 1 т корма привес
животных увеличивается на 10—15%, одновременно в такой же
степени снижаются затраты корма.
Терравит-5, -10, -50 и терравит К-40 используются совместно
с концентрированными кормами для тех же целей, что и биовит.
Телятам и поросятам раннего возраста терравит-Р дается в виде
водных растворов или растворенным в молоке.
Технологии получения кормовых препаратов 7-хлортетрацик-
лина и 8-окситетрациклина во многом очень близки. Поэтому
будут рассмотрены их общие черты и некоторые наиболее суще-
ственные различия.
Для биосинтеза окситетрациклина посевной материал исполь-
54
зуется в виде спор со сроком хранения при температуре 4—6°С
до 3 мес. В заводских условиях его размножают при температуре
26—28°С в три генерации. Длительность каждой из них состав-
ляет 2—3 сут. Культуру продуцента сначала дважды, размножа-
ют в колбах на 750 мл с 200 мл питательной среды на качалке
(160—180 об/мин), затем в посевном аппарате. Мицеллиальной
массой, полученной в колбах, засевают посевные аппараты из
расчета 700 мл на 1 м3 аэрируемой жидкой фазы (1 объем воздуха
на 1 объем среды в 1 мин). Выращивание продуцента обычно осу-
ществляют на среде, имеющей следующий состав (в %):
Кукурузная мука .	6	Натрия хлорид .	0,4
Кукурузный экстракт	1,5	Мел .	.	0,8
Аммония сульфат	0,6	Вода......	остальное
На стадии основной ферментации используют питательную
среду того же состава, только для повышения выхода витамина
В12 в нее добавляют хлорид кобальта из расчета 1 г на 1 м3
среды.
Полученный посевной материал передают на стадию основной
ферментации в количестве 10—15% от объема среды основных
ферментеров. Технологические параметры проведения процесса
производственной ферментации остаются практически теми же,
что и на стадии культивирования в посевном аппарате. На всех
этапах культивирования поддерживаются строго асептические
условия.
В течение биосинтеза практически всегда наблюдается значи-
тельное пенообразование, поэтому степень заполнения ферменте-
ров редко превышает 50%, а в посевной и основной аппараты
предусматривается периодическая подача стерильного синтети-
ческого пеногасителя.
Процесс выращивания’ клеток продуцента возможно прово-
дить в широком интервале значений pH однако накопление анти-
биотика в зависимости от используемого штамма-продуцента
осуществляется в строго контролируемых условиях: при опреде-
ленных значениях pH среды, температуре и аэрации. Полное
время биосинтеза окситетрациклина при 26—28°С составляет
100—120 ч.
В первый период наблюдается интенсивный рост мицелия,
быстро потребляются источники углерода, азота и фосфора,
требуется повышенная аэрация. Образование антибиотика на
этой стадии практически не происходит. В культуральной жид-
кости в небольших количествах накапливаются пировиноградная
и уксусная кислоты, которые в дальнейшем клетка использует
в биосинтезе тетрациклина. Во втором периоде наблюдается
резкое снижение скорости роста клеток и потребления питатель-
ных веществ, накопления пировиноградной и уксусной кислот
не происходит, осуществляется активный биосинтез антибиотика.
Готовую культуральную жидкость, содержащую до 4,5 %
сухих веществ, направляют на вакуум-упаривание, которое осу-
55
ществляют при 50—60°С до содержания СВ 12—15%. Сконцен-
трированная культуральная жидкость поступает на распылитель-
ную сушилку и высушивается при температурах входящего и
выходящего теплоносителя соответственно 160—200 и 70—80°С.
В некоторых случаях сушку культуральной жидкости осущест-
вляют совместно с наполнителем, в качестве которого берут су-
шеный свекловичный жом из расчета 250 кг на 1 м3 культураль-
ной жидкости. Получаемую при этом пастообразную массу
высушивают на вальцово-ленточной сушилке или на сушилке
с псевдокипящим слоем.
Препараты терравит-5,-10,-50 представляют собой высушен-
ную культуральную жидкость, полученную в результате выращи-
вания продуцента Act. rimosus и стандартизованную по анти-
биотику необходимым количеством наполнителя. Препарат тер-
равит Р представляет собой высушенный в распылительной
сушилке фильтрат культуральной жидкости, а высушенный после
фильтрования культуральной жидкости нерастворимый остаток
является основой для производства препарата терравит К-
До необходимой активности все препараты терравита стан-
дартизуют свекловичным жомом или кукурузной мукой. Готовые
препараты расфасовывают в бумажные мешки по 20 кг, хранят
в темных помещениях при температуре не выше 20°С и относи-
тельной влажности не более 75 %. Срок годности препаратов
6 мес со дня изготовления.
При производстве биовита споровый материал выращивают
на пшене на посевных станциях и рассылают по заводам. Его
активность при проверке не должна быть менее 3000 ед/мл.
В условиях предприятий его также размножают сначала в кол-
бах (1—2 генерации) при температуре 26—28°С в течение
24—30 ч на среде, включающей в свой состав' (в %): зерно-
картофельную барду — 40, кукурузный экстракт — 3, муку — 3.
Доводят 30%-ным раствором едкого натра pH среды до значения
6,7—6,9.
Для засева посевного аппарата на 1 м3 среды берут около
0,7 л полученного посевного материала. Культивирование про-
дуцента осуществляют на среде того же самого состава при
температуре 27—28°С в течение 30—40 ч, при постоянном пере-
мешивании, аэрации с добавкой стерильного пеногасителя.
Биосинтез хлортетрациклина в основных ферментерах прово-
дят на среде, содержащей (в %):
Зерно-картофельную барду . .	10	Натрия хлорид .	0,3
Муку (крахмальность 51%)	5	Кобальта хлорид	0,0001
Аммония нитрат .	0,7	Пеногаситель	до 0,2
Мел .	0.5		
В качестве предшественника добавляют 0,0001 % роданистого
бензила. Перед началом культивирования значение pH устанав-
ливают на уровне 6,6—6,7.
Промышленное культивирование проводят при постоянном
56
перемешивании и аэрации в течение 60—70 ч. Температуру среды
в ходе всего процесса роста культуры и биосинтеза антибиотика
поддерживают постоянной на уровне 26—28°С. Об окончании
биосинтеза судят по незначительному повышению pH среды до
6,9—7,2.
Полученную культуральную жидкость направляют на даль-
нейшую переработку по одному из двух способов. Первый из
них аналогичен используемому в производстве терравита: куль-
туральную жидкость, содержащую около 3 % сухих веществ,
концентрируют вакуум-упариванием до содержания СВ 10—
12%; в полученный концентрат добавляют консервант — пиро-
сульфат натрия из расчета 2—3 кг на 1 м3 культуральной жид-
кости и высушивают в распылительной сушилке. Если содержа-
ние антибиотика в 1 кг сухого препарата оказывается более
высоким, чем это установлено техническими условиями (обычно
оно колеблется в пределах 90—150 г/кг), то получаемый продукт
подлежит стандартизации путем смешения с соответствующим
количеством наполнителя. При стандартизации биовита по ак-
тивности в качестве наполнителей используют тонкоизмельчен-
ные отруби, муку обезжиренную, кукурузную или соевую либо
свекловичный жом.
Другой способ предполагает проведение следующих техноло-
гических операций:
1.	Культуральную жидкость в отдельном сборнике обрабаты-
вают раствором гашеной извести с целью перевода растворен-
ного в воде хлортетрациклина в осадок в виде кальциевой соли.
Полученный осадок направляют на фильтр-пресс.
2.	Осадок с фильтр-пресса выгружают в бункер и с помощью
шнекоразгрузочного механизма он идет на грануляцию, а потом
на сушку.
3.	Высушенные гранулы по трубопроводу пневмотранспортом
собирают в отдельный сборник и далее поступают на стадии
дробления и измельчения. Полученный продукт стандартизуют
также путем смешения с необходимым количеством наполнителя.
Препараты биовита расфасовывают по 10—20 кг в двухслой-
ные бумажные-мешки, помещенные в бязевые. Хранят в сухих
затемненных помещениях при температуре не выше 25°С. Срок
хранения биовита-20 установлен в 6 мес, биовита-40 и -80 —
1 год со дня выработки.
§ 2.	Технология получения препаратов бацитрацина
Кормовые препараты антибиотика бацитрацина, имеющие
название бацилихины, представляют собой высушенную куль-
туральную жидкость, полученную в результате глубинного выра-
щивания продуцента Вас. licheniformis, содержащую цинкбаци-
трацины и различные биологически активные вещества. Бацитра-
цины — полипептидные антибиотики, среди которых выделено
10 индивидуальных форм: A, Ai, В, С, D, Е, Fi, F2, F3 и G.
57
Готовый препарат на основе бацитрацинов на 37% представлен
бацитрацином А, суммарная формула которого CeeHioeNuOie-
Полипептид бацитрацин А состоит из остатков 10 аминокислот,
связанных между собой в такой последовательности:
D- аспарагиновая
кислота
L-аспарагиновая ------- £-гистидин
кислота
D -фенилаланин
£-лизин	£-изолейцин	£-изолейцин
Л-глутаминовая кислота ----- £-лейцин
При гидролизе полипептида кроме указанных аминокислот
выделяется одна молекула аммиака.
Кормовые препараты бацитрацина выпускаются под назва-
ниями бацилихин-10, бацилихин-20, бацилихин-30 и содержат
соответственно 10, 20, 30 г чистой цинковой соли антибиотика
в 1 кг препарата. Готовый продукт — гигроскопичный порошок
от серовато-белого до светло-коричневого цвета, горький на вкус.
Обладает высокой антибиотической активностью от 45 до
74 ед/мг (1 мг должен содержать не менее 42 ед) против грам-
положительных аэробных и анаэробных бактерий. Проявляет
синергетическое действие с другими антибиотиками, в частности
с хлортетрациклином. Назначение его такое же, как и биовита:
добавка от 5 до 15 г чистого антибиотика на 1 т корма для жи-
вотных и птицы повышает привесы на 15—17 % и снижает за-
траты корма и падеж молодняка на 5—10%.
Бацитрацины получают при глубинном или поверхностном
росте бактерий на соответствующих средах, содержащих глю-
козу, лактат аммония и неорганические соли или соевую муку и
глюкозу. Весьма важно при развитии Вас. licheniformis и образо-
вании бацитрацина наличие в среде определенного соотношения
углерода к азоту. Высокое значение этого показателя приводит
к преимущественному появлению бацитрацина, при снижении
соотношения наблюдается выход, в основном, другой группы
антибиотиков — лихениформинов.
Биосинтез бацитрацина связывают со спорообразованием
культуры. Считают, что антибиотик образуется только при таких
условиях развития бактерий, которые способствуют их споруля-
ции. Ингибирование процесса спорообразования тормозит био-
синтез бацитрацина.
58
Технология производства бацилихина по способу глубинного
культивирования в целом мало отличается от вышерассмотрен-
ных производств терравита и биовита.
Исходная культура продуцента поступает на завод в виде
спор. При глубинном культивировании получение посевного ма-
териала начинают с проращивания спор при температуре 30°С на
среде, содержащей (в %): крахмал — 2,0; лимонная кислота —
0,03; сульфат магния — 0,1; соль Мора — 0,025; сульфат марган-
ца — 0,006; хлориды калия и натрия — по 0,4; фосфат калия
однозамещенный — 0,45.
Продолжительность выращивания споровой культуры око-
ло 120 ч.
Размножение производственной культуры осуществляют в
колбах и посевных аппаратах при той же температуре на среде,
содержащей (в %): крахмал—1,8; мука соевая — 7,5; карбо-
ксид кальция — 0,02; сульфат аммония — 0,2. Длительность про-
цесса получения посевного материала на каждой из стадий —
16—18 ч.
Основную ферментацию проводят при температуре 37°С в те-
чение 30—40 ч на среде, включающей (в %): крахмал — 2,0;
сульфат магния — 0,33; муку соевую — 7,5; карбоксид каль-
ция—1,0. На стадиях культивирования продуцента в посевном
аппарате и основном ферментере процесс проводят в условиях
принудительной аэрации (1 объем воздуха на 1 объем среды
в 1 мин) и перемешивания с добавкой стерильного пеногасителя
до 0,2 %. На рсех этапах выращивания продуцента pH среды
поддерживают на уровне 7,0 и обеспечивают асептические
условия проведения процесса.
Активность получаемой культуральной жидкости составляет
около 4000 ед/мл. Образующийся в ходе биосинтеза бацитрацин
на 85 % переходит в раствор, а оставшиеся 15% находятся в
спорах бактерий продуцента. Для получения более устойчивых
форм антибиотика его переводят в цинковую соль — цинкбацит-
рацин. Для этого культуральную жидкость подкисляют концен-
трированной соляной кислотой и вносят оксид цинка в количест-
ве около 0,3 % к его объему. Перед последующей стадией упари-
вания pH полученного раствора доводят до 5,4—5,5. Упаренную
в 2 раза при пониженном давлении и 40—50°С культуральную
жидкость высушивают в распылительной сушилке, а сухой про-
дукт стандартизуют до требуемой активности с помощью тех же
наполнителей, что используются в производстве терравита и био-
вита. В сухом состоянии при температуре 18—20°С препараты
могут сохранять свою первоначальную активность достаточно
длительное время—до 2 лет. Гарантийный срок хранения пре-
паратов бацилихина установлен в 1 год.
Предлагаемый вариант технологии переработки культураль-
ной жидкости производства бацилихина не является единственно
возможным. Иной способ ее переработки аналогичен описанному
при производстве биовита.
59
§ 3.	Технология получения препаратов гризина
Антибиотик гризин относится к группе стрептотрицинов,
структурную формулу которых можно представить в виде
H2COCONH2
NH [СОСН2СН (СН2) 3NH] „Н
nh2
где п — количество аминокислотных остатков, изменяющееся от
1 до 6.
В состав этой группы антибиотиков входят остатки двух ос-
новных аминокислот 0, е-диаминокапроновой и стрептолидина
и одного аминосахара а-О-гулозалина.
Продуцентом антибиотика является культура гриба Act. gri-
seus. Антибиотик представляет собой серовато-белый порошок,
очень гигроскопичный, легко растворимый в воде и органических
растворителях. По своим химическим свойствам относится к
основаниям. Активен в отношении грамположительных и грам-
отрицательных бактерий, микроскопических грибов. При добавке
в корма оказывает стимулирующее воздействие на рост молодня-
ка животных. Активность чистых препаратов гризина достаточно
высока, достигает 1000 ед/мг.
Как кормовой препарат выпускается в форме кормогризина-5,
-10, -40, имеющих вид однородных порошков от желтого до
темно-бурого цвета и представляющих собой высушенную куль-
туральную жидкость продуцента Act. griseus, содержащую соот-
ветственно 5, 10 и 40 г чистого антибиотика в 1 кг готового пре-
парата.
Исходную культуру продуцента хранят на агаризованных
средах или в виде спорового материала, выращенного на пшене.
Посевной материал получают путем последовательного размно-
жения культуры сначала в колбах на качалке в две генерации
при температуре 26—28°С в течение 24 ч на среде, имеющей
pH от 6,8 до 7,3 и содержащей следующие компоненты (в %):
крахмал—1,5; кукурузная мука — 2,0; нитрат аммония — 0,5;
хлорид натрия — 0,2; фосфат калия однозамещенный — 0,02;
мел — 0,3.
Полученный в колбах 2-й генерации посевной материал после
проверки морфологического состояния культуры, отсутствия сво-
бодного фага и посторонней микрофлоры передается в количест-
ве до 0,1 % на засев питательной среды посевного аппарата
(3-я ступень генерации продуцента). Среда в посевном аппарате
содержит те же самые компоненты и в том же количестве, что
и в посевных колбах, в качестве макроэлемента в нее дополни-
тельно вводят 0,05 % сульфата магния и добавляют до 0,2 %
стерильного пеногасителя. Культивирование осуществляют в
60
условиях принудительного перемешивания и аэрации (1 объем
воздуха на 1 объем среды в 1 мин). Основные параметры про-
цесса — температура, pH среды и длительность культивирова-
ния — являются такими же, как и при выращивании продуцента
в посевных колбах.
При тех же параметрах процесса осуществляют и производ-
ственное культивирование, но при этом несколько изменяют ко-
личество отдельных компонентов питательной среды. Так, содер-
жание (в %) крахмала снижают до 1,8, мела увеличивают
до 0,5. Продолжительность культивирования за счет биосинтеза
антибиотика возрастает до 50—60 ч. Получаемую культуральную
жидкость подвергают вакуум-упариванию в 3—4 раза при тем-
пературе не выше 50°С до активности концентрата не ниже
3000 ед/мл. При этом выход антибиотика снижается не более
чем на 15% от его первоначального содержания в культураль-
ной жидкости. Концентрат высушивают на распылительной су-
шилке в условиях, при которых потери антибиотика не превы-
шают 11 %. При этом с 1 т концентрата получают до 100 кг
сухого продукта.
Готовые препараты кормогризина получают путем стандарти-
зации при смешении с одним из вышеназванных наполнителей,
используемым в производстве кормовых антибиотиков, взятом
в количестве, необходимом для получения заданной активности.
§ 4.	Технология получения препаратов гигромицина Б
Структурная формула гигромицина Б установлена не полно-
стью, однако известно, что в состав молекулы входит углеводный
фрагмент а-талоза и 1Ч-метил-2-дезоксистрептанин. По внешнему
виду представляет собой аморфный гигроскопичный порошок
белого цвета со слабокислыми свойствами, растворимый в воде.
Обладает противогельминтным действием. Активность его очи-
щенных препаратов достигает 1000 ед/мг. Применяется в про-
филактических целях против аскаридоза свиней и кур. Для этого
его выпускают в форме кормового препарата гигроветина, пред-
ставляющего собой сыпучий продукт светло-коричневого цвета
с влажностью не более 15%, содержащего 13—17 ед. гигроми-
цина Б в 1 мг препарата.
Исходной культурой является гриб Act. hydroscopicus. Ее хра-
нят при комнатной температуре (20—21 °C) на агаризованной
среде до 2 мес или на пшене до 6 мес, не подвергая дополни-
тельному пересеву.
Посевной материал для засева основного ферментера готовят
в две стадии: сначала его размножают в посевных колбах на
качалке, затем в посевном аппарате. При этом используют пи-
тательную среду одного и того же состава (в %): соевая мука —
1,5; кукурузный экстракт — 0,2 (по сухой массе); сульфат ам-
мония — 0,2; хлорид натрия — 0,5; карбоксид кальция — 0,3;
кашалотовый жир — 2, вода — остальное. В посевных колбах
61
продуцент выращивают при pH 7,2—7,4 и 27°С в течение трех
суток. Полученный мицелий гриба передается в посевной аппарат
в количестве 1,5—3% от объема среды. В нем осуществляют
культивирование на среде, имеющей более высокое значение
pH 7,7—7,9, при 28°С, постоянном перемешивании и переменной
аэрации. В первые сутки аэрацию поддерживают на уровне
1 объем воздуха на 0,5 объема среды в 1 мин, во вторые— 1 : 1,
а в третьи— 1 : 1,5. Готовый посевной материал передают в ос-
новной ферментер в количестве до 10 % от объема среды.
Производственное культивирование продуцента и биосинтез
антибиотика ведут при температуре 28°С, постоянном перемеши-
вании среды, имеющей pH 7,6—7,8, и аэрации (1 объем воздуха
на 1 объем среды в 1 мин) в течение 8—9 сут, на среде того
же самого состава, но с добавкой 5 % сепарированных пивных
дрожжей. Для предупреждения значительного пенообразования
в ферментер периодически добавляют раствор стерильного пено-
гасителя. К концу процесса биосинтеза активность гигромицина
в культуральной жидкости достигает 1500—2000 ед/мл.
Полученную культуральную жидкость подвергают предвари-
тельной обработке с целью удаления ионов кальция. Для этого
ее сначала подкисляют серной кислотой до pH 4,0—4,5, затем
добавляют ^щавелевую кислоту. Образовавшийся осадок сульфа-
та и оксалата кальция вместе с мицелием гриба отфильтровы-
вают, а полученный нативный раствор гигромицина Б после до-
ведения pH 20 %-ным раствором гидроксида натрия до значения
6,5—7,0 направляют на стадию ионообменной сорбции антибио-
тика. Процесс сорбции осуществляют в батарее колонн открыто-
го типа, заполненных одним из следующих сорбентов: КБ-4П-2
в натриевой форме или КБ-2, СР-300. Условия сорбции обеспечи-
вают выделение гигромицина Б на 95 % из нативного раствора.
По завершении процесса сорбции содержимое колонн сначала
промывают обессоленной водой до бесцветного раствора, а затем
проводят элюацию 1 М раствором гидроксида аммония. Средняя
активность получаемых элюатов составляет не менее 10000 ед/мл.
Элюат направляют на вакуум-выпарку, которую ведут при
45—60°С до получения концентрата гигромицина Б активностью
150—250 тыс. ед/мл. Перед смешением с сухими отрубями кон-
центрат фильтруют на нутч-фильтре через слой бязи и шелка
этуаля. Образующийся фильтрат смешивают с наполнителем из
расчета 80—100 мл на 1 кг отрубей. Готовый продукт фасуют
по 50 г в полиэтиленовые пакеты.
§ 5.	Технология получения фитобактериомицина
Антибиотик фитобактериомицин относится к стрептотрицино-
вому ряду и как большинство из них отличается многокомпонент-
ностью. В его состав входит 7 компонентов. По своей химиче-
ской природе является типичным основанием, образует соли с
сильными кислотами. В чистом виде аморфный порошок кремо-
62
вого цвета, хорошо растворим в воде, малорастворим в этаноле
и метаноле и практически нерастворим в большинстве органиче-
ских растворителей. Обладает высокой бактерицидной активно-
стью в отношении многих грамположительных и грамотрица-
тельных бактерий и микроскопических грибов. Продуцентом
фитобактериомицина является гриб Actinomyces lavendulae. Тех-
нология получения антибиотика предусматривает выделение его
в виде сульфата. Препараты на основе фитобактериомицина про-
изводятся в виде дустов и суспензий различных концентраций,
которые применяют в борьбе с фитопатогенными бактериями и
микроскопическими грибами,"в частности с бактериозами фасоли
и сои, заболеваниями хлопчатника и против корневой гнили
пшеницы. Он стимулирует рост растений, ускоряет их развитие
и способствует тем самым повышению урожайности на 10—15%.
Исходную культуру продуцента поддерживают на агаризован-
ной среде, содержащей до 1 % глюкозы. Размножение культуры
гриба осуществляют сначала в пробирках, потом в посевных кол-
бах и посевном аппарате. На всех этапах культивирования ис-
пользуют питательную среду одного и того же состава (в %):
глюкоза—Г, крахмал— 1,5; кукурузный экстракт — 0,5 (по
массе сухих веществ), хлорид натрия — 0,5; сульфат аммония —
0,35; карбоксид кальция — 0,5, вода — остальное. Оптимальная
температура выращивания принята 26—28°С. При культивиро-
вании продуцента в посевном аппарате и производственном фер-
ментаторе для предотвращения пенообразования предполагается
введение пеногасителя, в качестве которого может быть исполь-
зован кашалотовый жир или растительное масло в количестве
до 0,5 %.
Выделение и очистку фитобактериомицина проводят ионо-
обменным способом. Для этого культуральную жидкость предва-
рительно обрабатывают щавелевой кислотой с целью удаления
ионов кальция, препятствующих нормальному проведению про-
цесса ионообменной сорбции. Образовавшийся осадок оксалата
вместе с мицелием отфильтровывают, а полученный нативный
раствор направляют на ионообменные колонны, заполненные ка-
тионитом КБ-4П-2 в аммонийной форме.
Адсорбированный на смоле антибиотик элюируют 0,3 М рас-
твором серной кислоты. Средняя активность получаемых элюатов
составляет 50—60 тыс. ед/мл. Элюаты сульфата фитобактерио-
мицина, имеющие pH от 1,0 до 2,0, обрабатывают анионитом
ЭДЭ-10 в гидроксильной форме в статических условиях до pH
раствора 6,0. При этом расход смолы составляет 80—90 г на 1 л
элюата. Отработанный анионит отделяют фильтрованием, а
элюаты высушивают под вакуумом при 70—80°С. Выход фито-
бактериомицина составляет 70—80 % от сорбированного на ка-
тионите. Сухой продукт — сульфат фитобактериомицина — обла-
дает активностью 3—4 тыс. ед/мг.
Помимо фитобактериомицина промышленность освоила вы-
пуск другого антибиотика — полимицина, предназначенного для
63
тех же целей, что и фитобактериомицин. Он относится к той же
группе стрептотрицинов и продуцируется культурой гриба Acti-
nomyces polimicini.
Готовые препараты выпускаются в виде чистого антибиотика,
расфасованного по 50—200 г в стеклянные банки с притертой
пробкой, или в виде 5 %-ного дуста, полученного в результате
смешения антибиотика с каолином и расфасованного по 50—
200 г в герметичные полиэтиленовые пакеты.
Применяются препараты при обработке семян перед посевом
путем замачивания последних.в 0,005—0,01 %-ном растворе ан-
тибиотика в воде или для опрыскивания растений.
§ 6.	Технология получения трихотецина
Антибиотик трихотецин относится к группе соединений, содер-
жащих кислородные гетероциклы. Обладает широким фунги-
цидным действием и малой токсичностью. Имеет эмпирическую
формулу С19Н24О5. Структурную формулу можно представить
в виде
Трихотецин является сложным эфиром изокротоновой кисло-
ты и непредельного спирта трихотеколона. Малорастворим в
воде, хорошо растворим в органических растворителях, устойчив
к нагреванию и воздействию кислот.
Продуцентом антибиотика являются штаммы плесневого гри-
ба Trichothecium roseum L. В производственных условиях гриб
размножают в несколько стадий: сначала в маточных колбах,
затем в посевных колбах и посевном аппарате. На каждом из
этапов получения посевного материала используют одну и ту же
питательную среду, содержащую (в %): сахар—1,0; кукуруз-
ный экстракт—1,0; сульфат аммония — 0,12; калий фосфат
двухзамещенный — 0,1. Культивирование проводят при pH 5,0—
5,2 и температуре 24—26°С, длительность получения посевного
материала в колбах 1-й и 2-й генерации составляет от 1,5 до
2 сут.
Выращенную в колбах мицелиальную массу, составляющую
1—3 % от объема среды посевного аппарата, используют для'его
засева. Культивирование продуцента в посевном аппарате
осуществляют при той же температуре 24—26°С, постоянном
перемешивании и аэрации (1 объем воздуха на 1 объем среды
в 1 мин). Готовым посевным материалом в количестве до 10%
от объема среды основного аппарата засевают производственный
ферментер.
Для производственного культивирования используют пита-
64
тельную среду следующего состава (в %): мука кукурузная — 1;
глицерин— 1; фосфат калия однозамещенный или двухзамещен-
ный — 0,24; нитрат калия или сульфат аммония — 0,06; карбо-
ксид кальция и хлорид магния — по 0,02; жир кашалотовый —
0,1, вода — остальное. Подтитровыванием среды соляной кисло-
той pH поддерживают вначале на уровне 5,3—5,6, в остальном
культивирование продуцента осуществляют при тех же парамет-
рах процесса, что и в посевном аппарате. Длительность биосин-
теза равна 64—90 ч. Процесс заканчивают, когда концентрация
сахара снизится до 0,1—0,2 %, pH среды повысится до уровня
6,4—6,8, а активность антибиотика в культуральной жидкости
достигнет 300—400 мкг/мл.
Полученную культуральную жидкость подвергают фильтрова-
нию от мицелия и присутствующих в ней взвешенных частиц,
а из образовавшегося нативного раствора экстракцией хлоро-
формом извлекают антибиотик. Расход хлороформа на данной
стадии составляет около 40 л на 1 м3’ нативного раствора. Выход
трихотецина 85% от его содержания в нативном растворе.
Экстракт упаривают под вакуумом, смешивают с этанолом
из расчета 10 л на 1 кг антибиотика и направляют на приготов-
ление пасты. Ее готовят путем тщательного перемешивания спир-
тового концентрата с эмульгатором ОП-7 и каолином в массовом
соотношении 1:0,6:8,5. Полученную пасту высушивают в калори-
ферной сушилке при температуре 65—70°С. Готовый продукт
фасуют по 2—5 кг в 4-слойные бумажные мешки с полиэтиле-
новыми вкладышами. Общий выход трихотецина составляет 70 %
от его содержания в культуральной жидкости.
Готовый препарат (смачивающийся порошок трихотецина)
представляет собой однородный порошок кремового цвета, содер-
жит 10% трихотецина, 3% эмульгатора ОП-7 и 87 % каолина.
Применяют трихотецин в борьбе с мучнистой росой табака,
огурцов, плодовых, винограда и корневыми гнилями зерновых.
Против мучнистой росы его применяют путем опрыскивания
0,001—0,002%-ным раствором антибиотика. Против корневой гни-
ли зерновых используют 1 %-ный дуст для опудривания семян.
Такая обработка семян пшеницы увеличивает урожайность на
25—30 %.
Глава
ТЕХНОЛОГИЯ
БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
ДЛЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
Помимо ряда антибиотиков, используемых в качестве средств
защиты растений от болезней, микробиологическая промышлен-
ность освоила выпуск препаратов на основе патогенных микро-
организмов (бактерий, микроскопических грибов и вирусов) для
борьбы с вредными насекомыми.
Убытки сельского и лесного хозяйства от насекомых-вреди-
телей ежегодно исчисляются в мире цифрой около 100 млрд. долл.
Развившаяся устойчивость у насекомых-вредителей к ядохимика-
там привела к необходимости поиска новых эффективных средств
борьбы. Оказалось перспективным использование собственных
природных патогенов — микроорганизмов, вызывающих гибель
насекомых-вредителей в их природных условиях. В настоящее
время в различных странах мира производят более 30 микро-
биологических энтомопатогенных препаратов. Они характеризу-
ются высокой специфичностью поражения определенных видов
насекомых и практически полной безвредностью для человека,
теплокровных животных, птиц и полезных насекомых.
Энтомопатогенные препараты, получаемые иа основе микро-
организмов, выделенных из естественных условий и внесенных
вновь в те же естественные условия в виде микробных патогенов,
не вызывают нежелательных изменений в биоценозах и не на-
рушают экологического состояния в регионе. Это делает их более
перспективными по сравнению с традиционно используемыми
химическими инсектицидами.
Отечественная микробиологическая промышленность выпус-
кает три группы энтомопатогенных препаратов:
I. Бактериальные препараты на основе Bacillus thuringien-
sis — энтобактерин-3, дендробациллин, инсектин, токсобактерин.
И. Грибной препарат боверин на основе гриба Beauveria
bassiana.
III. Препараты на основе вирусов ядерного полиэдроза (вирин-
ЭНШ, вирин-ЭКС).
66
Все микробные патогены выпускают в виде смачивающихся
порошков или паст, реже дустов, гранул, инкапсулированных по-
рошков, стабилизированной эмульсии спор и кристаллов. При не-
посредственном применении различных форм препаратов предпо-
лагается использование различных добавок в виде растворителей,
прилипателей, эмульгаторов, способствующих повышению их
эффективности.
§ 1.	Технология получения бактериальных
антомопатогенных препаратов
Среди всех промышленно выпускаемых микробных патогенов
бактериальные препараты получили наибольшее распростране-
ние. Их отличают высокая вирулентность по отношению к насеко-
мому-вредителю, безопасность для окружающей флоры и фауны,
достаточно высокая скорость воздействия на вредителя и т. д.
В мировой практике используются бактериальные энтомопатоген-
ные препараты для борьбы более чем со 160 видами вредных
насекомых.
Из всех энтомопатогенных бактерий наиболее полно исследо-
вана с точки зрения применения грамположительная бактерия
Вас. thuringiensis, которая помимо образования спор, вызываю-
щих септицемию насекомого при попадании внутрь его тела,
в ходе культивирования продуцирует ряд токсичных соединений,
повышающих эффективность приготовленных на ее основе пре-
паратов. Среди таких токсичных продуктов, вырабатываемых
этой бактерией, выделяют четыре компонента:
1)	а-экзотоксин, или фосфолипаза С, — продукт растущих
клеток бактерий. Токсическое воздействие фермента связывают
с индуцируемым им распадом незаменимых фосфолипидов в тка-
нях насекомого, что приводит к гибели последнего;
2)	ft-экзотоксин, или термостабильиый токсин. Накапливается
в культуральной жидкости симбатно росту клеток. В состав ток-
сина в одинаковом соотношении входят аденин, рибоза и фосфор.
Считают, что молекула 0-экзотоксина состоит из неуклеотида,
связанного через рибозу и глюкозу с аллослизевой кислотой.
Его действие, видимо, обусловлено ингибированием нуклеоти-
дазы и ДНК-зависимой РНК-полимеразы, связанных с АТФ, что
приводит к прекращению синтеза РНК. Токсин обладает широ-
ким спектром действия на насекомых, особенно в ранней стадии
его развития. По сравнению с другими токсинами, продуцируе-
мыми Вас. thuringiensis, действие его протекает медленнее и,
как правило, при-переходе от одного цикла развития насекомого
к другому. Отравление сублетальными дозами отмечено для мно-
гих видов насекомых, имеющих полный цикл развития: яйцо —
личинка — гусеница — куколка — бабочка. На основании наблю-
дений по стадиям развития насекомого делается вывод о том,
что 0-экзотоксин является мутагеном, поражает генетический
67
аппарат особей. Последнее связывают с появлением уродливых
особей у потомства;
3)	у-экзотоксин. Пока малоизученный компонент, неиденти-
фицированный фермент (или группа ферментов). Достоверно
токсичность его пока не доказана;
4)	fi-эндотоксин, или параспоральный кристаллический эндо-
токсин. Образуется в процессе споруляции бактерии в противопо-
ложной от формирующейся споры части бактерии. На завершаю-
щей стадии спорообразования этот токсин приобретает, как пра-
вило, форму правильного восьмигранного кристалла. Синтез
кристаллов протекает приблизительно за 3 ч в стационарной
фазе развития культуры. В клетке может образовываться и не-
сколько кристаллов разной формы (от правильных бипирами-
дальных, ромбических, кубических до овальных). Размер их мо-
жет меняться от 0,5X1,3 до 1X3,5 мкм и даже до величины
субмикроскопических. Они нерастворимы в органических раство-
рителях, однако, будучи отделенными от спор, хорошо растворя-
ются в условиях сильнощелочных значений pH (выше 11,5) и в
присутствии восстановителей в щелочных буферах (pH 7,9—9,5)
их растворимость повышается. Кристаллы при нагревании до
100°С через 30—40 мин разрушаются и теряют свои токсичные
свойства.
Химический состав кристаллов, кроме традиционных элемен-
тов: углерода, азота, водорода, кислорода, серы, входящих в
состав аминокислот, включает еще 19 элементов. Причем в зна-
чительных количествах обнаружены кальций, магний, кремний,
железо, в меньших — никель, титан, цинк, алюминий, хром, медь,
марганец; почти отсутствует фосфор. Было показано, что крис-
таллы состоят из белка, причем его аминокислотный состав для
различных штаммов очень близок.
Структурная целостность кристалла, обеспечивается, по-ви-
димому, связями белка с кремнием. Кристаллический белок по
химической природе близок к белку оболочки споры. Существует
предположение, что кристалл образуется в результате перепроиз-
водства белка в оболочке споры.
В настоящее время можно считать доказанным, что кристал-
лический белок в кишечнике восприимчивых насекомых распа-
дается на молекулы протоксина, которые под действием про-
теиназ расщепляются на токсические фрагменты. Молекулой
протоксина большинство исследователей считают фрагмент с мо-
лекулярной массой 230 000 в кишечнике чешуекрылых, в котором
отмечается высокое значение pH, необходимое для высвобожде-
ния токсичных компонентов. Под действием протеолитических
ферментов пищеварительного тракта насекомого протоксин
может превращаться в непосредственно воздействующий
токсин.
Различие в восприимчивости некоторых видов насекомых к дей-
ствию кристалла, по-видимому, связано с присутствием специ-
фичных кишечных протеаз, осуществляющих гидролиз кристал-
68
лов in vivo. Такими протеазами обладают не все насекомые, что
и объясняет избирательность действия 6-токсина.
Чтобы насекомое погибло, кристаллы должны попасть в его
организм. После поглощения кристаллов гусеницы прекращают
питаться. При некоторых индивидуальных различиях насекомых
первичным местом действия 6-токсина всегда является средний
отдел кишечника. В зависимости от реакции на кристаллы все
насекомые делятся на три группы, для которых: I) характерен
общий паралич; 2) паралич среднего отдела кишечника; 3) на-
секомые вообще не восприимчивы к кристаллам, а реагируют на
весь препарат в целом. Большинство насекомых относится к этой
третьей группе: они погибают не от эндотоксина, а в результате
прорастания спор и последующего размножения бактерий, при-
водящего к септицимии.
В настоящее время установлено 12 серотипов и 15 вариантов
6-эндотоксина. Из них практическое значение в производстве
энтомопатогенных бактериальных препаратов имеют четыре ва-
рианта: турингиензис, или берлинер, относящийся к I, алести —
к III, дендролимус — к IV и галлерия — к V серотипам.
Известно, что бактерии группы Вас. thuringiensis антагони-
стичны к 130 видам насекомых, среди которых вредители поле-
вых, овощных, плодовых культур, виноградников и леса. Наи-
больший эффект достигается при применении данной группы пре-
паратов в борьбе с листогрызущими вредителями.
Способность Вас. thuringiensis образовывать различные ток-
сические продукты, споры, кристаллы используется в промыш-
ленности при производстве на основе этого микроорганизма
широкого круга различных энтомопатогенных препаратов. Рас-
смотрим некоторые из них. Энтобактерин на основе Вас. thurin-
giensis var. galleriae выпускается в виде порошка, жидкости в
смеси с прилипателем и в виде пасты. Инсектин вырабатывается
на основе спор и кристаллов Вас. thuringiensis var. insectus.
Алестин получают из спор и кристаллов Вас. thuringiensis var.
alesti в виде порошка или стабилизированной пасты. Экзотоксин
содержит культуральную жидкость Вас. thurin giensis var.
insectus, имеет вид порошка, содержащего 3,3% экзотоксина.
Токсобактерин производится на основе спор, кристаллов и
экзотоксина Вас. thuringiensis var. insectus, выпускается в виде
смачивающегося порошка в смеси с прилипателем, содержит
в 1 г 30 млрд, спор и кристаллов и 0,025 г экзотоксина. Дендро-
бациллин включает споры и кристаллы Вас. thuringiensis var.
dendrolimus, употребляется в виде смачивающегося порошка,
содержащего не менее 30 млрд, спор в 1 г. Битоксибациллин,
или БТБ-202, готовится на основе спор и метаболитов Вас.
thuringiensis var. thuringiensis в виде порошка, содержащего
в 1 г препарата 30 млрд, спор и кристаллов.
Промышленное производство энтомопатогенных бактерий.
Оно предполагает глубинное культивирование с целью получе-
ния максимального титра клеток в культуральной жидкости и
69
накопления токсина. Промышленные штаммы должны отвечать
высоким требованиям, так как от результатов культивирования
зависит качество готового продукта. Среди этих требований от-
метим прежде всего принадлежность штамма к определенному
серотипу, высокие вирулентность и продуктивность на промыш-
ленных средах, среднюю чувствительность к комплексу фагов,
сохранение активности на каждой из последующих стадий пере-
работки культуры, эффективность применения препарата.
При промышленном производстве энтомопатогенных штаммов
Вас. thuringiensis приходится сталкиваться с таким трудно-
преодолимым явлением, как фаголизис производственной куль-
туры. Для его предупреждения на каждом предприятии кроме
традиционных приемов, общепринятых в организации асептиче-
ских микробиологических производств, стараются использовать
фагоустойчивые варианты штаммов и регулярно проводить их
смену вплоть до изменения в номенклатуре выпускаемых энто-
мопатогенных препаратов.
Все бактериальные энтомопатогенные препараты на основе
Вас. thuringiensis производят по одной и той же технологической
схеме. Ниже, в качестве иллюстрации, будет рассмотрена техно-
логия получения энтомопатогенных бактериальных препаратов на
примере энтобактерина. Технология производства включает все
стадии, типичные для любого микробиологического производства,
основанного на глубинном способе получения микроорганизмов:
выращивание посевного материала в лаборатории и в посевном
аппарате, промышленное культивирование в ферментере, концен-
трирование культуральной жидкости, сушка, стандартизация и
фасовка готового препарата.
В условиях предприятия производственный штамм Вас. thu-
ringiensis var. galleriae предварительно пересевают на мясо-
пептонный агар и проверяют его на отсутствие свободного фага,
продуктивность и вирулентность. Посевной материал получают
в виде стадии: сначала выращивают культуру в конических кол-
бах на 3 л; полученным посевным материалом, имеющим титр
не менее 1,7-109 спор в 1 мл, в количестве 0,05% от объема
среды засевают посевной аппарат и проводят культивирование
при объемной аэрации 0,2 л воздуха на 1 л среды в 1 мин. По-
севной материал с тем же титром спор в количестве 0,0012%
от объема среды основного аппарата передают в ферментер.
Температуру культивирования на всех стадиях выращивания
поддерживают постоянной (28—30°С). Продолжительность фер-
ментации в посевном аппарате и производственном ферментере
составляет 35—40 ч. Остальные параметры производственной
ферментации остаются теми же, что и при выращивании в по-
севном аппарате.
Если посевной материал получают в виде спор, то на всех
стадиях производственного культивирования используют пита-
тельную среду одного и того же состава. Как правило, это
дрожже-полисахаридная среда, содержащая (в %): кормо-
70
вые дрожжи — 2—3; кукурузную муку—1 —1,5; кашалотовый
жир — 1. Если при выращивании посевного материала не пред-
полагается доведение его до стадии образования спор, то в по-
севном аппарате применяют более концентрированные среды,
чем в производственных ферментерах. В зависимости от состава
среды могут несколько изменяться и параметры основной фер-
ментации, в частности степень аэрации может возрасти до
1 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Кроме того, состав
используемой среды может оказывать влияние на соотношение
образующихся спор и кристаллов. Например, при одних и тех же
параметрах процесса культивированиё на среде, содержащей
(в %): глюкозу техническую — 0,7; кукурузный экстракт — 4;
хлорид натрия — 0,2, соотношение спор к кристаллам составля-
ет 1:1, а на среде, содержащей (в %): кукурузный экстракт — 4,
отруби — 2, то же соотношение равно 1 : 1,7.
Перед началом культивирования pH среды не регулируют,
оставляя тем, которое естественным образом устанавливается
после добавления всех компонентов, обычно около 6,3. К концу
ферментации оно повышается до 8,0—8,5. Естественное защела-
чивание среды может привести к разрушению кристаллов на
более мелкие фрагменты, что затрудняет цх выделение на после-
дующих стадиях технологического процесса. Для предотвраще-
ния этого получаемую культуральную жидкость перед переработ-
кой подкисляют до pH 6,0—6,2.
Процесс культивирования заканчивают при степени спору-
ляции культуры 90—95 % и титре спор не менее 109 в 1 мл.
Готовую культуральную жидкость перекачивают в отдельный
простерилизованный сборник; подкисляют до pH 6,0—6,2 и пе-
редают на стадию сепарации. В результате сепарации получают
пасту влажностью 85 % с выходом около 100 кг в 1 м3 культу-
ральной жидкости и титром порядка 20-109 спор в 1 г. Ее соби-
рают в отдельном сборнике, а фугат при необходимости можно
еще один или два раза употребить для приготовления питатель-
ной среды.
Многократное использование фугата невозможно, так как в
культуральной жидкости происходит накопление веществ, тормо-
зящих развитие культуры. Однако он находит применение в ка-
честве сырья для производства кормовых дрожжей. Это обеспе-
чивает сокращение объемов промышленных стоков, снижает рас-
ход воды, что существенно повышает экономичность процесса.
Поскольку на заключительном этапе промышленного культи-
вирования и на стадии сепарации в той или иной степени воз-
можно освобождение кристаллов и спор от клеточных оболочек,
собранную в отдельном сборнике пасту перемешивают в течение
30 мин до однородного распределения спор и кристалов и отби-
рают пробы на проверку титра, влажности, вирулентности, на-
личия фага.
Подготовленную таким образом и отвечающую всем требова-
ниям пасту направляют на получение готового препарата энто-
71
бактерина. Конечным продуктом производства может быть либо
смачивающий порошок, либо стабилизированная паста. Первый
получают путем предварительного увлажнения пасты с последую-
щим высушиванием на распылительной сушилке до остаточной
влажности 10% и смешением (стандартизацией) с каолином до
титра 30- 10е спор в 1 г. Готовый препарат фасуют по 20 кг в
4-слойные крафт-мешки с полиэтиленовым вкладышем и марки-
руют. Вторую — внесением в пасту карбоксиметилцеллюлозы
(КМЦ). При смешении молекулы КМЦ сорбируют белковые
кристаллы и споры, заряжая их отрицательно, что способствует
более равномерному распределению активного начала по всему
объему пасты и позволяет консервантам с одинаковой плотно-
стью распределиться между частицами. Последнее значительно
увеличивает срок хранения препарата. Готовый продукт в этом
варианте представляет собой вязкую жидкость кремового или
светло-серого цвета, однородную по составу, не распыляющуюся
и не замерзающую при хранении, без запаха, не подвергаю-
щуюся гниению или брожению.
Производство препарата в такой форме оказывается наиболее
предпочтительным, прежде всего по ряду экономических показа-
телей: снижаются затраты энергии и времени на проведение про-
цессов сушки и фасовки готового продукта, улучшаются условия
труда. Для повышения эффективности применения препарата в
него могут вводить различные ингредиенты: антииспарители,
предупреждающие испарение жидкости до того, как препарат до-
стигнет поверхности растения; смачиватели, обеспечивающие
формирование устойчивой поверхности раздела жидкость — твер-
дое тело; прилипатели для повышения стойкости пленки препа-
рата к внешним воздействиям среды (дождя, росы); защитные
вещества, снижающие воздействие солнечной радиации на споры
и кристаллы; различные привлекающие насекомых приманки,
способствующие повышению поедаемости листьев растения, об-
работанного энтомопатогеном.
Препарат предназначен для борьбы с насекомыми-вредителя-
ми садовых, огородных и парковых растений. Эффективен в борь-
бе с более чем 60 видами насекомых. Применяют его путем
опрыскивания растений в виде водной эмульсии в период актив-
ного питания вредителя. При опрыскивании в неблагоприятных
погодных условиях (дождь, низкая температура, повышенная
солнечная радиация) концентрацию препарата удваивают. Чем
выше температура в момент применения и в последующие двое
суток, тем выше эффективность энтобактерина и тем скорее на-
ступает гибель насекомых. Как правило, основная масса вреди-
телей погибает в течение 2—10 дн. На опрыскивание 1 га овощ-
ных культур расходуют 1—3 кг препарата, садовых — 3—5 кг,
прибавка урожая от применения энтобактерина соответственно
достигает 50 и 5 ц с 1 га.
§ 2.	Технология получения грибных
энтомопатогенных препаратов
Энтомопатогенные препараты на основе микроскопических
грибов способны поражать большое количество насекомых-вре-
дителей, вызывая у последних заболевание — микоз.
По сравнению с энтомопатогенными бактериями и вирусами
грибы обладают рядом особенностей: а) поражение происходит
не через пищеварительный тракт, а непосредственно через кути-
кулу; б) насекомые поражаются в фазе развития куколки и
имаго, что не наблюдается при взаимодействии с другими видами
микроорганизмов; в) грибы характеризуются относительно боль-
шой скоростью роста и огромной репродуктивной способностью,
в виде спор могут длительное время находиться в природных ус-
ловиях без заметного снижения энтомопатогенной активности;
г) высокая специфичность в поражении отдельных видов насе-
комых, причем вирулентность в значительной степени зависит
от штамма используемого гриба.
Воздействие грибного препарата на насекомое начинается
с проникновения споры в полость его тела через кожные по-
кровы. Наиболее интенсивно такое проникновение осуществляет-
ся через промежутки между сегментами.
Попав в тело насекомого, грибная спора прорастает в гифу,
затем разрастается в мицелий, от которого отчленяются гифаль-
ные тельца — конидии, составляющие инфекционную единицу
энтомопатогенных грибов. При благоприятных условиях образо-
вание конидий происходит на поверхности кутикулы. Выросшие
на кожном покрове конидии своими апрессориями (вздутиями
на концах ростовых трубок) прикрепляются к кутикуле и пус-
кают мицелиальные ростки в тело насекомого. Оказавшись в
теле насекомого, конидии циркулируют в его гемолимфе, начинает-
ся развитие гриба. Уже на этой стадии возможно его поражение
вследствие выделения некоторыми штаммами значительного ко-
личества токсинов. Как правило, летальный исход наблюдается
вследствие нарушений циркуляции гемолимфы и от выделения
грибом токсических веществ.
В отсутствие или недостатке токсина постепенно нитевидный
мицелий заполняет все тело насекомого. Прежде всего гриб по-
ражает мышечную ткань. Его рост продолжается до тех пор,
пока все внутренние органы и ткани не будут разрушены. Впос-
ледствии могут образовываться конидиеносцы, которые проры-
вают кутикулу и полностью обволакивают мертвую личинку.
Продолжительность периода от прорастания конидий до гибели
для различных по своим размерам насекомых оценивается от 2
до 8 сут.
Перспектива применения грибных энтомопатогенов определя-
ется в основном возможностями создания необходимой сырьевой
базы для их промышленного производства (преимущественно
73
способом глубинного культивирования) и разработкой техноло-
гии получения посевного материала.
Основное внимание привлечено к организации промышленно-
го производства препаратов на основе отдельных штаммов гри-
бов из следующих родов: Beauveria (возбудитель белой мускар-
дины), Metarrhizium (возбудитель зеленой мускардины) и Entho-
mophthora (поражающий сосущих насекомых).
Производство препаратов на основе гриба рода Beauveria
основывается на промышленном культивировании таких его ви-
дов, как В. bassiana Vuill, поражающих 60 видов насекомых,
В. tenella Del., способного уничтожать до 10 видов насекомых,
преимущественно жуков.
В СССР освоено промышленное получение грибного энтомо-
патогенного препарата боверина, включающего конидиоспоры
гифомицета В. bassiana (Bals.) Vuill. Готовый препарат вы-
пускается в виде порошка белого или кремового цвета, содер-
жащего в 1 г от 1,5 до 6 млрд, конидиоспор. Помимо спор актив-
ным началом боверина считается продуцируемый грибом ток-
син — боверицин. Для достижения показателя ЛКыо (летальная
концентрация, вызывающая 100%-ную гибель тест-насекомого)
в качестве инсектицидной добавки употребляют севин, хлорофос,
фозалон и другие в количестве 10% от принятой для данного
региона нормы расхода. Это позволяет на 90 % сократить внесе-
ние ядохимикатов в зону активного земледелия.
Препарат безвреден для теплокровных животных и человека,
не вызывает ожогов у растений.
Получение боверина может быть организовано как по способу
глубинного культивирования, так и с применением поверхност-
ного культивирования промышленного штамма гриба. Технико-
экономические показатели производства конидиоспор глубинным
способом превосходят аналогичные показатели с использованием
поверхностного способа. Однако производство конидиоспор гриба
при выращивании его в объеме жидкой фазы непростая задача.
При глубинном способе культивирования гриб В. bassiana Vuill
размножается вегетативно, образуя гифальные тельца, которые
в отличие от воздушных конидиоспор называют гонидиями
(бластоспорами, цилиндроспорами). По своему воздействию на
насекомых гонидии приближаются к конидиям, но в производ-
ственных условиях получить высоковирулентные препараты на
основе гонидий не удается, так как они в значительно большей
степени, чем конидии, неустойчивы при воздействии высоких тем-
ператур на стадии их высушивания. Использование традицион-
ной распылительной сушилки в производстве боверина приводит
к 90% гибели гонидиоспор и 20—50% конидиоспор. Поскольку
существует корреляция между количеством, оставшимся после
сушки жизнеспособных спор, и их вирулентностью, промышлен-
ное производство боверина направлено на получение максималь-
но возможного количества конидиоспор.
Проблему промышленного получения конидиоспор гриба
74
В. bassiana Vuill методом глубинного культивирования удалось
решить путем подбора питательной среды и условий фермента-
ции, обеспечивающих переход 90—92 % выращенных клеток в
конидиоспоры, причем их вирулентность не ниже, чем у конидио-
спор, образуемых при поверхностном способе культивирования.
Технология получения боверина методом глубинного культи-
вирования. Производство боверина методом глубинного культи-
вирования осуществляют в строго асептических условиях. Одной
из наиболее важных стадий его является выбор технологии по-
лучения посевного материала.
Исходный штамм, хранящийся на косяках агаризованного
пивного сусла или среде Сабуро, сначала размножают при тем-
пературе 25—28°С в течение 3—4 сут культивированием в ка-
чалочных колбах на жидкой питательной среде. Полученные
конидиоспоры лиофильно высушивают. Такой посевной материал
может храниться на предприятии в течение. 1 года, сохраняя
свою жизнеспособность и вирулентность.
Посевной материал для засева питательной среды фермен-
тера получают в 1—2 стадии: путем размножения культуры сна-
чала в колбах, потом в инокуляторе или сразу в инокуляторе.
Для засева основного аппарата требуется посевной материал
в количестве 2—10 % от объема питательной среды.
На всех стадиях производственного культивирования исполь-
зуется питательная среда одного и того же состава и поддержи-
вается постоянной оптимальная для каждого штамма темпера-
тура. В состав питательной среды обычно входят следующие
компоненты (в %): дрожжи кормовые нелизированные — 2;
крахмал — 1; хлорид натрия — 0,2; хлорид марганца — 0,01;
хлорид кальция — 0,05. Содержание последнего может сильно
варьировать вплоть до 0,75—5%, поскольку его значительная
добавка обеспечивает большую устойчивость образующихся ко-
нидиоспор к различным неблагоприятным воздействиям. В част-
ности, к температуре pH среды культивирования, как правило,
специально ие устанавливают, выращивание проводят при значе-
нии pH, которое наблюдается после добавления всех компонентов
питания (обычно оно находится в пределах от 4,5 до 5,6). Про-
должительность культивирования спорового посевного материала
составляет 25—28 ч при температуре 25—28°С, а длительность
культивирования в основном ферментере при той же темпера-
туре достигает 3—4 сут. Выращивание гриба в посевном аппа-
рате (инокуляторе) и в производственном ферментере проводят
в условиях постоянного перемешивания и принудительной аэра-
ции, причем в зависимости от используемого штамма количество
подаваемого воздуха значительно меняется, достигая 2,5 объемов
на 1 объем среды в 1 мин.
На производительность основного аппарата большое влияние
оказывает содержание в среде аминного азота, его дефицит
сильно снижает скорость роста культуры и процент образования
конидиоспор, избыток способствует значительному образованию
75
гонидий. Оптимальной концентрацией аминного азота в среде
является 10—15 мг %.
В ходе глубинного культивирования гриба в течение первых
1^1,5 сут кормовые дрожжи полностью лизируются, а гриб за
это время проходит все фазы своего роста (мицелиальную, го-
нидиальную, конидиальную). В средах, содержащих нативные
белковые вещества, создаются наиболее благоприятные условия
для образования конидий. К концу полного созревания гриба
выделяется максимальное количество ферментов, что ведет к
лизису мицелия и способствует накоплению конидий.
Титр образовавшихся конидиоспор в культуральной жидкости
в зависимости от природы штамма-продуцента и условий его
культивирования может варьировать от 0,3 до 1,3 млрд, в 1 мл.
При этом культура на 90—92% представлена конидиоспорами,
количество гонидий не превышает 3—5%, мицеллий полностью
отсутствует.
Готовую культуральную жидкость подвергают сепарации или
фильтрации. После фильтрования получают пасту влажно-
стью 70—80% с титром спор 6—8 млрд., которую направляют
на распылительную сушилку. Высушенные споры представляют
собой мелкодисперсный порошок влажностью 10%, имеющий
титр до 8- 10е клеток в 1 г.
После определения показателя JlKso (летальная концентра-
ция, вызывающая 50%-ную гибель тест-насекомого) полученный
порошок стандартизуют необходимым количеством каолина.
Иногда в качестве добавок в готовый препарат вводят смачива-
тель и прилипатель.
Технология получения боверина методом поверхностного
культивирования гриба. Другой возможный способ получения
боверина основывается на технологии получения спороносных
пленок гриба методом поверхностного культивирования; он более
длителен и трудоемок, поэтому имеет ограниченное значение.
Ниже будут рассмотрены только некоторые наиболее важные
особенности в организации такого промышленного и полупро-
мышленного производства.
Поверхностное культивирование гриба проводят как в жидкой
питательной среде, так и на полутвердой, на этих средах гриб
обладает хорошей скоростью роста. Его микробиологическое
производство завершается на стадии получения спороносной
пленки, которую впоследствии снимают, высушивают, измель-
чают и при необходимости стандартизуют соответствующим
количеством наполнителя. Среди возможных приемов, исполь-
зуемых в производстве боверина поверхностным культивирова-
нием, различают: 1) культивирование гриба на жидких средах
без автоклавирования, перемешивания, аэрации; 2) культивиро-
вание на твердых и жидких автоклавированных средах без
перемешивания и принудительной аэрации; 3) комбинированный
способ выращивания пленки гриба.
Первые два приема основаны на том, что гриб хорошо растет
76
на различных растительных субстратах — отходах сельско-
хозяйственной продукции. И поскольку температурный оптимум
развития гриба находится в пределах 18—28°С, в южных реги-
онах сезонное культивирование гриба возможно проводить при
температуре окружающего воздуха.
Культивирование гриба на жидких средах без автоклавирова-
ния, перемешивания и принудительной аэрации проводят без
предварительной стерилизации среды, ее просто нагревают до
кипения, разливают в деревянные каркасы, покрытые изнутри
полиэтиленовой пленкой. Среду, охлажденную до 35—40°С,
засевают сухими спорами. Сверху каркасы закрывают полиэтиле-
новой пленкой, которую после образования спороносной пленки
гриба снимают.
В качестве сред используют всевозможные отвары, например
из сахарной свеклы, картофеля, тыквы, зерна, муки.
В процессе культивирования гриба на твердых и жидких
автоклавированных средах без перемешивания и принудительной
аэрации предусматривается стерилизация размещенных по от-
дельным емкостям питательных сред; твердых — сусло — агар,
картофель, морковь, кукуруза, корки арбуза, иногда зерна
пшеницы и кукурузы — в течение 40 мин при 112°С и жидких —
сусло с содержанием сахаров около 7% — в течение 20 мин
при 110°С. В стерильный субстрат вносят сухие споры или
их суспензию, емкости с субстратом встряхивают до однород-
ного распределения посевного материала и оставляют стоять
при температуре окружающего воздуха 18—23°С.
На твердых субстратах образование конидиоспор заверша-
ется к концу 12—15 сут. Культуру гриба с остатками субстрата
извлекают из емкостей и высушивают на стеллажах при 25—
28°С. Получение готового препарата завершают размолом мате-
риала до мелкодисперсного порошка. На жидких субстратах
через 7—10 сут наблюдается образование спор, а на 18—25-е сут
снимают образовавшуюся, спороносную пленку. Ее высушивают
на стекле, снимают, размалывают и смешивают с торфом или
тальком.
Оба эти способа имеют местное значение. Производитель-
ность таких цехов достигает 750—800 кг препарата в 1 мес
с титром спор 1,5- 109 в 1 г.
Более производительным считается комбинированный способ
выращивания пленки гриба. Он включает: а) получение маточ-
ных культур на зерне; б) выращивание инокулята (проращива-
ние спор) в колбах на жидкой питательной среде в течение
12—17 ч; в) выращивание и накопление вегетативной культуры в
ферментере с принудительной аэрацией и перемешиванием в течение
22—28 ч; г) разлив культуральной жидкости по кюветам и
выращивание спороносных пленок; д) съем, дозревание и сушку
спороносных пленок; е) стандартизацию препарата каолином.
Питательной средой для культивирования гриба является
смесь, содержащая (в %): мелассу — 6; кукурузный экс-
77
тракт— 1; сульфат магния — 0,05; фосфат калия однозамещен-
ный — 0,2.
Культивирование проводят при 24—26°С. Титр гонидий на
стадии инокулирования составляет 0,5—2 млн. в 1 мл посевного
материала. Количество инокулята, передаваемого на засев основ-
ного ферментера, 2—4% от объема среды. Готовая культураль-
ная жидкость имеет титр 50—100 млн. клеток в 1 мл.
Кюветы для выращивания пленок устанавливают в верти-
кальные камеры (в каждую по 35—70 шт.). Культивируют при
25—26°С. Через 16—18 ч наблюдают появление пленки, че-
рез 3—4 сут происходит спороношение, на 4—5-е сут — массовое
образование конидий. В этот период пленку снимают, помещают
в сухие кюветы, которые закрывают крышками и оставляют
на 2—3 сут для дозревания. После, чего их вынимают и сушат
при 28°С в токе воздуха. Высушенные пленки спор помещают
в полиэтиленовые мешки и хранят в сухом месте при 18—20°С.
Перед приготовлением боверина готовый споровый материал
размалывают в шаровой мельнице и просеивают через ряд сит.
Определяют титр приготовленного материала и перемешивают
его в течение 15—20 мин с необходимым количеством каолина.
Готовый-препарат имеет титр не ниже 1,5 млрд, конидиоспор в 1 г.
Весь производственный цикл занимает 11—12 сут, в том
числе получение инокулята 1 сут; выращивание в ферментере —
1 —1,5; выдерживание в шкафах — 5; дозревание пленок — 2;
сушка пленок — 2—3 сут.
Боверин применяют против листогрызущих вредителей сада,
а также против яблонной и восточной плодожорки, вредителей
леса. Наибольший эффект дает применение боверцна против
личинок колорадского жука на картофеле. С добавками химиче-
ских инсектицидов применение препарата приводит к 100,%-ной
гибели личинок всех возрастов. Норма расхода боверина 1—2 кг
на 1 га.
Растения обрабатывают препаратом путем опрыскивания.
Смешение с ядохимикатами осуществляют за 2 ч до применения.
§ Э.	Технология получения вирусных
«нтомопатогенных препаратов
Из всех энтомопатогенных препаратов вирусные обладают
наиболее высокой специфичностью по отношению к насекомому-
хозяину. Они поражают обычно не более одного вида. Их ярко
выраженная видоспецифичность обусловливает практически пол-
ную безвредность вирусных препаратов для человека, флоры
и фауны. Вирусы отличает высокая устойчивость к неблагоприят-
ным воздействиям окружающей среды (температуре, влаж-
ности), они способны сохранять свою активность в течение 10—
15 лет, находясь вне насекомого.
Заражение насекомого вирусом происходит при питании
78
вредителя. Попавшие в кишечник тельца-включения при щелоч-
ных значениях pH разрушаются. Освобожденные вирионы про-
никают через стенку кишечника в восприимчивые клетки, в ядрах
которых осуществляется репликация вирусов. Высвободившиеся
вирусы заражают другие клетки, что в итоге приводит к гибели
личинок насекомого.
Отличительной особенностью вирусов является то, что они
могут размножаться только в живой ткани. Это создает опреде-
ленные трудности в организации промышленного производства
таких энтомопатогенов, так как технология размножения вирусов
должна быть связана с использованием живых насекомых-хо-
зяев. Последнее представляет собой достаточно трудоемкий про-
цесс.
В СССР осуществляется выпуск трех вирусных Энтомопато-
генных препаратов: вирии-ЭКС (против капустной совки), ЭНШ
(против непарного шелкопряда) и АББ (против американской
белой бабочки).
Производство любого из вирусных препаратов начинают с
разведения насекомого-хозяина на искусственных питательных
средах, обеспечивающих их физиологически здоровое состояние.
На определенной стадии развития (обычно на стадии гусеницы)
насекомых заражают, добавляя вирусную суспензию к корму.
При этом инокулят предварительно получают от нескольких
больных личинок.
После заражения насекомых выдерживают в строго опреде-
ленных условиях, обеспечивающих максимальное накопление
вируса в его тканях. Через 7—9 сут собирают мертвые и отмира-
ющие личинки, подсушивают их при 33—35°С, измельчают меха-
ническим способом для вывода телец-включений из тканей.
К полученной массе добавляют физиологический раствор или
дистиллированную воду из расчета 1 мл на гусеницу, взвесь
измельченных тканей фильтруют.
При производстве препарата вирин-ЭКС полиэдры осаждают
из фильтрата центрифугированием. Осадок суспендируют в
минимальном количестве дистиллированной воды и добавляют
предварительно простерилизованный глицерин до титра 1 млрд,
полиэдров в 1 мл. Готовый препарат разливают во флаконы
в количестве, соответствующем одной или нескольким гектарным
нормам.
Данная технология позволяет увеличить количество полиэд-
ров в 5—10 тыс. раз по сравнению с расходом инокулята.
С одной гусеницы в среднем удается получить до 36 млрд,
полиэдров, что составляет около 30% ее сухой массы.
При производстве препарата вирин-ЭНШ в фильтрат добав-
ляют лактозу, а после перемешивания ацетон в соотноше-
нии 4:1 к объему суспензии. После отстаивания надосадочную
жидкость сливают, а осадок подсушивают до полного удаления
ацетона. При изготовлении готовой формы препарата в виде
дуста сухой осадок смешивают с мелкодисперсным наполни-
те
телем — каолином или бентонитом — до получения титра 1 млрд,
полиэдров в 1 г. Масляную форму препарата готовят путем
диспергирования осадка в предварительно простерилизован-
ном 50%-ном растворе глицерина до титра 2 млрд, полиэдров
в 1 мл, потом стерильно добавляют равный объем солярового
масла, перемешивают и разливают во флаконы.
Вирусные энтомопатогенные препараты применяют путем вне-
сения полиэдров в плотные популяции насекомых с целью воз-
никновения в этой популяции эпизоотии. Эффект от применения
препарата может быть значительным, если энтомопатогенный
вирус отсутствует в популяции. Данный способ обработки пред-
полагает внесение небольших количеств препарата.
В другом случае путем опрыскивания или опыления про-
водится массированная обработка растений на зараженных уча-
стках в период рождения личинок или на ранних стадиях их
развития. Эффект достигается после внесения значительных
количеств препарата в результате однократной или повторной
обработки защищаемых растений.
Если требуется защита не от одного, а от нескольких вреди-
телей, то действие вирусных энтомопатогенных препаратов соче-
тают с другими средствами борьбы.
§ 4.	Технология производства бактериальных удобрений
Присутствующая в почве микрофлора оказывает непосред-
ственное влияние на ее плодородие, а следовательно, и на повы-
шение урожайности сельскохозяйственных культур. Почвенные
микроорганизмы в процессе роста и развития улучшают струк-
туру почв, накапливают в них питательные вещества, минерали-
зуя различные органические и неорганические соединения,
например азота и фосфора, превращают их в итоге в легко-
усвояемые растением компоненты питания.
С целью стимулирования деятельности почвенной микро-
флоры применяют различные бактериальные удобрения, которые
обогащают ризосферу растений полезными микроорганизмами.
В практике сельского хозяйства нашли применение такие бак-
териальные удобрения, как нитрагин, азотобактерин и фосфоро-
бактерин.
Технология получения сухого нитрагина. Нитрагин бактери-
альное удобрение, приготовленное на основе активных жизне-
способных клубеньковых бактерий из рода Rhizobiutn и предна-
значенное для повышения урожая бобовых растений: гороха,
фасоли, сои, кормовых бобов, клевера, люцерны, люпина и ряда
других.
Бактерии рода Rhizobiutn в симбиозе с бобовыми культурами
способны фиксировать свободный азот атмосферы, превращая
его в соединения, легкоусвояемые растением. Эти бактерии
являются строгими аэробами. Среди бактерий рода Rhizobiutn
80
различают активные, малоактивные и неактивные культуры.
Критерий активности клубеньковых бактерий связан с их способ-
ностью в симбиозе с бобовым растением фиксировать атмосфер-
ный азот и использовать его в виде соединений для корневого
питания растения.
Фиксация атмосферного азота 'Возможна только в образу-
ющихся в корневой системе растения клубеньках. Их возник-
новение связано с инфицированием корневой системы бобового
растения бактериями из рода Rhizobium. Заражение корневой
системы происходит только через молодые корневые волоски;
после внедрения бактерии прорастают внутри них до самого
основания в виде инфекционной нити. Выросшие нити проникают
сквозь стенки эпидермиса в кору корня, разветвляются и рас-
пределяются по клеткам коры. При этом индуцируется деление
клеток хозяина и разрастание тканей. В месте локализации
бактерий на корне растения-хозяина образуются клубеньки, в
которых они быстро размножаются и располагаются по от-
дельности или группами в цитоплазме растительных клеток.
Сами бактериальные клетки увеличиваются в объеме в 10—12
раз и меняют свою форму. Если такие клубеньки имеют красно-
ватую или розовую окраску, обусловленную наличием пигмента
легоглобина (леггемоглобина) — аналога гемоглобина крови жи-
вотных, то они способны фиксировать молекулярный азот.
Неокрашенные («пустые») или имеющие зеленоватую окраску
клубеньки не фиксируют азот.
Бактерии, находящиеся в клубеньках, синтезируют фермент-
ную систему с нитрогеназной активностью, восстанавливающую
молекулярный азот до аммиака. Ассимиляция аммиака про-
исходит, в основном, путем вовлечения его в ряд ферментативных
превращений, приводящих к образованию глутамина и глутами-
новой кислоты, которые в дальнейшем идут на биосинтез белка.
Помимо критерия активности в характеристике клубеньковых
бактерий используют критерий вирулентности. Он характеризует
способность микроорганизма вступать в симбиоз с бобовым
растением, т. е. проникать через корневые волоски внутрь корня
и вызывать образование клубеньков. Большое значение имеет
скорость такого приникновения. При условии взаимной толерант-
ности партнеров создается симбиотический комплекс растение —
Rhizobium. Растение обеспечивает бактерии необходимыми пи-
тательными веществами и создает для них оптимальные условия
существования. Бактерии же, находясь в клубеньках, снабжают
растение азотистым питанием. Ни растение, ни бактерии сами
по себе не могут фиксировать азот.
С вирулентностью связано понятие видовой избирательной
способности микроорганизма, характеризующей возможность
данного вида бактерий вступать в симбиоз с соответствующим
ему растением. Поэтому современная классификация различных
видов Rhizobium учитывает растение-хозяина, например: Rh.
phaseoli — для фасоли; Rh. vigna— для вигны, маиса, арахиса;
4—233
81
Rh. lupini — для люпина, сараделлы и др. Вирулентность и видо-
вая избирательная способность взаимосвязаны и не являются
постоянными свойствами штаммов. Поэтому селекцию промыш-
ленных микроорганизмов осуществляют по обоим этим при-
знакам.
Задачи конкретного производства бактериальных удобрений
на основе клубеньковых бактерий сводятся к максимально
возможному накоплению жизнеспособных клеток, сохранению их
жизнеспособности на всех стадиях технологического процесса,
приготовлению на их основе готовых форм препаратов с сохра-
нением их активности в течение гарантийного срока хранения.
В СССР налажено производство двух видов нитрагина:
почвенного и сухого. Почвенный нитрагин представляет собой
культуру клубеньковых бактерий, выращенную в стерильной
почве. 1 г такого препарата должен содержать не менее
0,3 млрд, жизнеспособных клеток. Технология его производства
ввиду сложности и трудоемкости в выполнении отдельных опера-
ций имеет ограниченное значение. Нельзя считать достаточно
совершенной и технологию применения такого препарата; она
предполагает проведение влажной нитрагинизации семенного
материала с последующим перелопачиванием и подсушиванием
значительных количеств полученной смеси. Более перспективной
представляется технология производства сухого нитрагина.
Сухой нитрагин порошок светло-серого или коричневого цве-
та, содержащий в 1 г не менее 9 млрд, жизнеспособных клеток
бактерий в смеси с наполнителем (бентонитом, каолином, ме-
лом). Количество влаги в порошке не превышает 5—7%.
Промышленное производство нитрагина построено по типич-
ной схеме асептического микробиологического предприятия.
Поскольку «узким» местом производства является стадия высу-
шивания живых клеток, то каждый из вновь используемых штам-
мов оценивается не только с точки зрения его продуктивности,
но и на устойчивость к температурным воздействиям.
Для производства посевного материала исходную культуру клу-
беньковых бактерий выращивают сначала на агаризованной среде,
содержащей, например, отвар семян бобовых растений, 2% ага-
ра и 1% сахарозы, затем полученную культуру размножают
в колбах на жидкой питательной среде в течение 1—2 сут
при 28—30°С и pH 6,5—7,5. На всех этапах промышленного
культивирования применяют питательную среду одного и того же
состава, включающую такие компоненты, как мелассу, кукуруз-
ный экстракт, минеральные соли в виде сульфатов аммония
и магния, мел, хлорид натрия и двухзамещенный фосфат калия.
Готовую культуру, содержащую до 10 млрд, клеток в 1 мл в
количестве — 3—5% от объема питательной среды инокулятора,
передают в посевной аппарат и продолжают выращивание в
нем при той же температуре в условиях постоянного перемеши-
вания и принудительной аэрации (1 объем воздуха на 1 объем
среды в 1 мин). Если по истечении 1 сут титр посевного мате-
82
риала достигнет 2 млрд, клеток в 1 мл, культивирование закан-
чивают, а полученным посевным материалом в количестве 3 5%
от объема среды посевного аппарата засевают производственный
ферментер. Основную ферментацию проводят в течение 2—3 сут
при той же температуре и pH среды, что и в инокуляторс, но
при более высоком объемном расходе воздуха (до 1,3 объема
на 1 объем среды в 1 мин). К концу процесса культивирования
штамм находится в стадии «опоясанных» палочек, титр клеток
достигает 10 млрд, в 1 мл. Готовую культурную жидкость на-
правляют на сепарацию, в результате которой отделяется био-
масса в виде пасты влажностью 70—80%. Пасту смешивают
с защитной средой, имеющей различный состав, но всегда содер-
жащую мелассу и тиомочевину, например, в соотношении 20:1,
и направляют на высушивание. Процесс сушки осуществляют
в вакуум-сушильных шкафах при 30—35°С и остаточном
давлении 10—13 кПа. Высушенную биомассу размалывают в
штамм находится в стадии «опоясанных» палочек, титр клеток
10 млрд, клеток в 1 г. Более производительным является процесс
высушивания в распылительных сушилках, однако при этом
до 75% клеток теряет жизнеспособность.
Препараты сухого нитрагина фасуют и герметизируют в поли-
этиленовые пакеты по 0,2—1 кг, хранят при 15°С не более 6 мес.
На упаковочной этикетке обязательно указывают дату выпуска
препарата и перечень бобовых растений, для которого он пред-
назначен.
Препараты нитрагина применяют на фоне фосфорно-кали-
евых и органических удобрений, которые повышают активность
клубеньковых бактерий. Нитрагин способствует увеличению уро-
жайности бобовых на 15—25%, а в районах, где бобовые высе-
ваются впервые, — на 100%. Вносят препараты путем опудрива-
ния семян сухим нитрагином непосредственно перед посевом,
для механизации процесса используются машины для протрав-
ливания семян, предварительно очищенные от ядохимикатов.
Технология получения сухого азотобактерина. Азотобакте-
рин — бактериальное удобрение, приготовленное на основе куль-
туры свободноживущсго почвенного микроорганизма Azotobacter
chroococcum, способного фиксировать до 20 мг атмосферного
азота на 1 г использованного сахара. Более того, внесенные
в качестве удобрения бактерии выделяют в почву биологически
активные вещества (никотиновую и пантотеновую кислоты, пири-
доксин, биотин, гетероауксин, гибберелин и др.), стимулирующие
прорастание и развитие растений, а продуцируемые ими фунги-
цидные вещества из группы анисомицина угнетают развитие
некоторых нежелательных микроскопических грибов в ризосфере
растения.
Все виды азотобактера — строгие аэробы. Микроорганизмы
особенно чувствительны к наличию в среде фосфора в виде
органических и неорганических соединений и развиваются при
высоком содержании его в питательной среде. Недостаток фос-
83
4*
фора замедляет развитие бактерий и снижает азотфиксирующую
способность. Многие виды азотобактера фиксируют азот только
в среде, обедненной или вовсе лишенной связанного азота.
Азотфиксирующая способность культуры подавляется аммиаком,
стимулирующее воздействие на азотфиксацию оказывают соеди-
нения молибдена (иногда ванадия).
Установлено, что при фиксации азота процесс его восстанов-
ления протекает целиком на одном и том же синтезируемом
азотобактером ферментном комплексе и лишь конечный продукт
(аммиак) отделяется от фермента. Ответственная за фиксацию
нитрогеназная система представляет собой мультиферментный
комплекс, содержащий не связанное с геном железо, молибден
и SH-группы.
Микробиологическая промышленность выпускает несколько
видов азотобактерина: сухой, почвенный и торфяной.
Технология получения сухого азотобактерина имеет много
общего с технологией производства сухого нитрагина, поэтому
будут рассмотрены только наиболее существенные отличия в
его технологии.
Азотобактерин сухой представляет собой активную культуру
высушенных клеток азотобактера с наполнителем. В 1 г сухого
препарата должно содержаться не менее 0,5 млрд, жизнеспособ-
ных клеток.
Культуру микроорганизма выращивают методом глубинного
культивирования на среде, содержащей все те же компоненты,
что и при культивировании клеток Rhizobium. Дополнительно
вводят сульфаты железа и марганца, а также сложную соль
молибденовой кислоты. pH среды культивирования 5,7—6,5,
аэрация — 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 мин.
Процесс ферментации проводят до начала стационарной
фазы роста культуры, так как в этой стационарной фазе биологи-
чески активные вещества выделяются из клетки и остаются
в культуральной жидкости. При этом существует опасность,
что с их выходом клетки могут утратить способность фиксировать
атмосферный азот после внесения в почву.
Биологически активные вещества полностью или частично мо-
гут теряться и в процессе высушивания клеток, однако оставши-
еся жизнеспособными клетки после выведения азотобактера из
анабиоза восстанавливают способность продуцировать биологи-
чески активные вещества. Высушенную культуру стандартизуют
путем добавок необходимого количества наполнителя и фасуют
в полиэтиленовые пакеты по 0,4—2 кг. Пакеты герметизируют
и хранят при температуре не выше 15°С в течение не более 3 мес.
Технология получения азотобактерина почвенного и торфя-
ного. Эти виды азотобактерина представляют собой активную
культуру азотобактера, размноженную на твердой питательной
среде, и содержат в 1 г не менее 50 млн. жизнеспособных
клеток.
Для их приготовления берут плодородную почву или разла-
84
гающийся торф с нейтральной реакцией среды. К просеянному
твердому субстрату добавляют до 2% извести и 0,1% суперфос-
фата. По 500 г полученной смеси переносят в бутылки емкостью
по 0,5 л, увлажняют на 40—60% по объему водой, закрывают
ватными пробками и стерилизуют.
Посевной материал готовят на агаровых средах, содержащих
до 2% сахарозы и минеральные соли. Культуру выращивают
при 27°С около 3—5 сут. Об окончании процесса судят по
полному покрытию поверхности агара слизистой массой коричне-
вого цвета. Полученный посевной материал стерильно смывают
с поверхности агара водой и переносят на подготовленный суб-
страт. Содержимое бутылок тщательно перемешивают, а затем
термостатируют при 25—27°С. Культивирование продолжают до
тех пор, пока в 1 г почвы или торфа количество бактерий
достигнет 50 млн. Полученные таким образом препараты сохра-
няют свою активность в течение 2—3 мес.
Использовать препараты азотобактерина рекомендуется лишь
в плодородных почвах, содержащих фосфор и микроэлементы
(молибден, ванадий, бор и др.). Отсутствие последних отрица-
тельно сказывается на жизнедеятельности вносимых бактерий.
Наибольший эффект достигается при правильном сочетании
азотобактерина с органическими и минеральными удобрениями.
Применяют азотобактерин для бактеризации семян, рассады,
компостов. При этом улучшается корневое питание растений
и на 10—15% повышается урожайность зерновых, технических
и овощных культур.
Способ применения сухого азотобактерина зависит от особен-
ностей посевного материала. Семена зерновых опудривают сухим
препаратом механизированным способом из расчета 100 млрд,
клеток на одну гектарную порцию семян. Картофель, корневую
систему рассады овощных культур равномерно смачивают водной
суспензией бактерий. Для получения суспензии одну гектарную
норму препарата (300 млрд, клеток) последовательным разведе-
нием суспендируют в 15 л воды.
При обработке почвенным или торфяным азотобактерином
семена перемешивают («перелопачивают») с увлажненным пре-
паратом и для равномерного высева подсушивают. При высадке
фассады корневую систему растений смачивают приготовленной
.суспензией с необходимым титром клеток или вносят последнюю
в достаточном количестве в заранее подготовленные лунки.
, Фосфоробактерин — бактериальное удобрение, содержащее
споры микроорганизма Bacillus megaterium var. phosphaticum.
Однородный порошок светло-серого или желтоватого цвета.
Бактерии обладают способностью превращать сложные фосфор-
органические соединения (нуклеиновые кислоты, нуклеопроте-
иды и др.) и трудноусвояемые минеральные фосфаты (пиро-
фосфаты, полифосфаты) в доступную для растений форму.
Кроме того, бактерии вырабатывают биологически активные
вещества (тиамин, пиридоксин, биотин, пантотеновую и нико-
85
тиновую кислоты, витамин B!2 и др), стимулирующие рост
растения, особенно на ранних- стадиях его развития.
Фосфоробактерин не заменяет фосфорные удобрения и не
действует без них. Относится к числу препаратов, обладающих
стимулирующим эффектом.
По морфологическим признакам Вас. megaterium var.
phosphaticum представляет собой мелкие, грамположительные,
аэробные спорообразующие палочки размером (1,8—2,0) X
X (5—6) мкм. Клетки содержат значительное количество соеди-
нений фосфора. В ранней стадии развития это подвижные оди-
ночные палочки, которые в процессе роста утрачивают свою
подвижность, а при старении образуют эндоспоры разме-
ром 0,7X1,2 мкм, локализующиеся к одному из концов клетки.
Поскольку используемый микроорганизм — спорообразующая
культура, технология выращивания микробных клеток сводится
к получению спор. Однако технология производства фосфоробак-
терина в целом мало отличается от таковой для сухого нитра-
гина и азотобактерина.
Технология получения фосфоробактерина. Культуру Вас.
megaterium var. phosphaticum на всех стадиях производствен-
ного культивирования выращивают глубинным способом. Исход-
ную лиофильно высушенную культуру размножают; на одной
из сред следующего состава (в %):
(1) Кукурузный экстракт	1.8	(2) Кукурузная мука .	2
Меласса	.	.	1,5	Меласса .	1,5
Сульфат аммония .	0,1	В-комплекс (отход	
Мел	1	производства вита-	
Вода .	остальное	мина D)	 Фосфат калия . двухзамешеннын . . Карбоксид кальция Вода . .	. .	2 0,01 0,3 остальное
Культивирование проводят в ферментере в строго асептиче-
ских условиях при постоянном перемешивании и принудительной
аэрации до стадии образования спор. Основные параметры про-
ведения процесса: температура 28—30°С, pH среды 6,5—7,5,
длительность культивирования 1,5—2 сут. При выращивании
на 1-й среде титр клеток в готовой культуральной жидкости
составляет 2,7—3 млрд, спор в 1 мл, на 2-й — 4,3 млрд, в 1 мл.
Полученную в ходе культивирования биомассу клеток от-
деляют центрифугированием и высушивают в распылительной
сушилке при 65—75°С до остаточной влажности 2—3%.
Высушенные споры смешивают с наполнителем (каолином).
Приготовленный таким образом готовый препарат должен со-
держать в 1 г не менее 8 млрд, клеток. Его расфасовывают
по 50—500 г во влагонепроницаемые пакеты и герметизируют.
В отличие от нитрагина и азотобактерина фосфоробактерин
обладает большей устойчивостью при хранении. Потеря жизне-
способности клеток после 1 года хранения не превышает 20%.
При промышленном производстве фосфоробактерина при-
86
ходится сталкиваться с такими факторами, отрицательно влия-
ющими на процесс получения бактериального удобрения, как
фаголизис культуры и непрорастаемость спор. Фаголизис куль-
туры объясняют тем, что, с одной стороны, штаммы Вас. mega-
terium чувствительны к действию бактериофагов и причина
фаголизиса — инфицирование культуры извне, а с другой —
исходная культура сама по себе является мутагенной, содержит
в себе профаг, который в определенных условиях активируется.
В комплексе мероприятий по борьбе с фаголизисом в произ-
водстве особое внимание уделяют достижению и поддержанию
асептических условий на всех стадиях промышленного
культивирования, селекции и отбору устойчивых к фагам
штаммов, введению добавок солей органических кислот в среду
для выращивания микроорганизма в концентрациях, не оказы-
вающих отрицательного воздействия на культуру (обычно в пре-
делах 0,075—0,1%).
Непрорастаемость спор выражается в резком снижении коли-
чества прорастаемых клеток посевного материала; в нормальных
условиях споровый посевной материал прорастает на 90—95%;
этот показатель может снизиться до 10—15%. Данное явление
связывают с тем, что при прохождении фаз прорастания споры
в среде должно находиться определенное количество фосфатов
и сульфатов. Всякое отклонение от требуемого соотношения
отрицательно сказывается на прорастании спор. Для устранения
этого явления осуществляют постоянное совершенствование
технологии приготовления питательных сред, анализируя состав
нестандартных источников сырья.
Фосфоробактерин рекомендуют применять на черноземных
почвах, которые содержат наиболее значительное количество
фосфорорганических соединений. Он необходим для повышения
урожайности зерновых, картофеля, сахарной свеклы и других
сельскохозяйственных растений.
При внесении препарата в почву семена растений обрабаты-
вают механизированным способом в машинах для сухого про-
травливания семян смесью фосфоробактерина с наполнителем
(глиной, почвой или просеянной золой) в соотношении 1:40.
На одну гектарную порцию семяи требуется 5 г препарата
и 200 г наполнителя. Клубни картофеля, равномерно увлажняют
суспензией спор, приготовленной из расчета 15 г препарата
на 15 л воды. Это количество расходуется на одну гектарную
норму посадочного материала. Применение фосфоробактерина
повышает урожай на 10%.
Глава
ШГ\ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ
ТРАНСФОРМАЦИИ
ОРГАНИЧЕСКИХ
I СОЕДИНЕНИЙ
Область синтетического применения микроорганизмов можно
условно разделить на два направления:
1) полный биосинтез микроорганизмами важных биологиче-
ски активных веществ и продуктов (антибиотиков, ферментов,
витаминов, стеринов, аминокислот и др.), осуществляемый
клетками с помощью компонентов питательной среды;
2) микробиологические трансформации, т. е. совместное ис-
пользование отдельных химических и микробиологических стадий
в многостадийном целенаправленном синтезе лекарственных
препаратов и других ценных для народного хозяйства продуктов.
Применение микроорганизмов в качестве носителей активных
полиферментных систем, способных переводить экзогенные орга-
нические соединения в разнообразные полезные продукты и фи-
зиологически активные вещества основано на том, что они могут
осуществлять в одну стадию важнейшие превращения, требу-
ющие при синтезе 20 химических стадий. Кроме того, удается
легко проводить реакции, трудно или пока совсем не осуществи-
мые методами чисто химического синтеза.
В последние десятилетия ярко продемонстрированы преиму-
щества метода микробиологических превращений перед химиче-
скими реакциями: возможность тонких перестроек сложных
молекул, удобство и экономичность технологических процессов.
Преимущества этих методов особенно ярко проявились в области
химии стероидов. Дело в том, что сложность и громоздкость
молекул стероидов затрудняет даже незначительные модиорика-
ции их химическим путем. Микроорганизмы могут осуществлять
уникальные реакции в синтезе лекарственных препаратов стеро-
идной природы, а именно 1,2-дегидрирование, 1 lp-гидроксилиро-
вание. Промышленный синтез таких важнейших лекарств, как
гидрокортизон, преднизон, преднизолон, дексаметазон стал воз-
можен только после разработки микробиологических способов
их получения. Эти препараты широко применяются при лечении
88
тяжелых ревматических заболеваний, бронхиальной астмы, вос-
палительных процессов и хронических кожных заболеваний.
В последние годы рядом исследований показано, что микро-
биологические превращения более простых по строению орга-
нических веществ, чем стероиды, также представляют практиче-
ский интерес. Описаны типовые ферментативные и микробные
превращения для основных классов органических соединений.
Большинство процессов микробиологической трансформации
приводит к незначительной перестройке молекулы субстрата,
осуществляемой одним или несколькими ферментами. Однако
имеются микробиологические процессы, существенно изменя-
ющие структуру трансформируемого соединения. Общей чертой
всех процессов микробиологической трансформации является то,
что их результат — изменение молекулярной структуры тран-
сформируемого вещества, а не синтез молекулы de novo.
К микробиологическим трансформациям относится также
синтез метаболитов из предшественников, если при этом струк-
тура продукта реакции определяется, в основном, структурой
молекул предшественников (например, синтез некоторых нукле-
отидов из гетероциклических оснований, пентоз и фосфатов).
В настоящее время принята классификация микробиологиче-
ских трансформаций по типу возникновения и отщепления
функциональных групп. Основные процессы микробиологической
трансформации: окисление, восстановление, декарбоксилирова-
ние, дезаминирование, образование гликозидов, гидролиз, мети-
лирование, этерификация, дегидрирование, диспропорционирова-
ние, конденсация, аминирование, ацетилирование, амидирование,
деметоксилирование, нуклеотидация, галогенирование, демети-
лирование, асимметризация, рацемизация, изомеризация.
§ 1. Микробиологические трансформации стероидов
В области превращений стероидных соединений достоинства
биологических катализаторов проявляются наиболее ярко.
Долгое время микробиологическая трансформация считалась
специфическим методом химии стероидов.
Первые сообщения о трансформации стероидов микроорганиз-
мами появились задолго до того, как было установлено строение
основных представителей стероидов. Еще в конце XIX в. было
известно, что бактериальная флора кишечника млекопитающих
превращает холестерин в копростерин, а холевую кислоту — в
дезоксихолевую. К 1913 г. относится открытие полного расщеп-
ления холестерина микобактериями. И лишь в 30-х годах, когда
была установлена структура основных стероидных гормонов,
известных к тому времени, начались попытки применять тран-
сформирующую способность микроорганизмов для препаратив-
ного получения этих соединений. В 1948 г. впервые осуществлено
введение гидроксильной группы в молекулу стероида микроби-
логическим путем. Но только после получения 11а-гидроксипро-
89
гестерона из прогестерона при ферментации последнего с куль-
турой Rhizopus nigricans микробиологические трансформации
стероидов привлекли широкое внимание:
Данная трансформация ярко продемонстрировала преимуще-
ства микробиологических методов перед химическими: введение
кислородной функции в определенное положение молекулы сте-
роида (С-ll) в случае химического синтеза представляло не-
обычайно трудную задачу и требовало многочисленных химиче-
ских операций, здесь же оно заменялось единственной стадией
ферментативного гидроксилирования. Открытие в эти же годы
терапевтической ценности кортизона наряду с указанными успе-
хами микробиологического процесса гидроксилирования при-
влекло огромное внимание микробиологов, химиков и врачей
к данной области. Внедрение микробиологического синтеза
в процессы получения стероидных гормональных препаратов
вызвало переворот в фармацевтической промышленности, по-
зволив сразу во много раз удешевить ценные препараты.
Природные стерины — сырье для получения ценных лекар-
ственных препаратов.
Большой класс стероидов характеризуется наличием в моле-
куле специфического циклического скелета — циклопентанпер-
гидрофенантрена, построенного из четырех колец, три из которых
шестичленные (А, В и С) и одно — пятичленное (D). Для
обозначения различных положений этого кольца принята следу-
ющая нумерация. К стеринам (стеролам) относятся стероиды,
несущие в положении С-3 гидроксильную группу:
Одним из наиболее важных и хорошо изученных стеринов
является холестерин (класс зоостеринов), имеющий брутто-
90
формулу С27Н46О. Он обнаруживается почти во всех органах
и '^канях животных и человека. Холестерин принимает участие
в физиологических процессах, происходящих в живой клетке,
без] его участия не может развиваться растущий организм.
Желчные камни человека на 99% состоят из холестерина, богаты
этим соединением надпочечники и другие органы. Спинной мозг
и мозг рогатого скота представляет собой наилучший материал
для промышленного получения холестерина. Он считался специ-
фическим животным стерином до тех пор, пока он не был обна-
ружен в некоторых растениях и в морских красных водорослях.
Точная структурная формула этого соединения была установлена
лишь в 1932 г., хотя впервые он был выделен из желчных
камней в 1782 г.
холестерин
Другие стерины встречающиеся в природе, отличаются от
холестерина или по длине боковой цепи, или по степени на-
сыщенности.
Стерины растений (фитостерины). Очень важный класс
соединений, они служат источником получения многих ценных
стероидных препаратов.
Эргостерин по структуре отличается от холестерина дополни-
тельной метильной группой в боковой цепи при С24. а также
имеет две дополнительные двойные связи: одна из них при
С-7, другая в боковой цепи при 22 и 23- углеродных атомах.
Эргостерин является провитамином витамина D. Строение
эргостерина было установлено в 1934 г.:
[20	23
эргостерин
Он встречается у многочисленных представителей раститель-
ного мира, а также у грибов, микроорганизмов и других пред-
ставителей живого мира. Особенно велико содержание эргостери-
на у дрожжевых микроорганизмов. Для промышленного получе-
ния эргостерина чаще всего используются пекарские дрожжи,
содержание эргостерина в них колеблется в зависимости от
91
расы, питательной среды и культивирования от 0,2 до 15%
на сухую массу.	/
Стигмастерин С29Н48О — один из наиболее распространенных
фитостеринов, он содержится в большом количестве в соевом
масле и сахарном тростнике. По структуре стигмастерин обли-
чается от холестерина наличием двойной связи между 22й и
23-углеродными атомами и наличием этильной группы в поло-
жении 24:
С2Н5
стигмастерин
Другим широко распространенным растительным стерином
является ^-ситостерин С29Н5оО. По строению он сходен со стиг-
мастерином, отличаясь от него лишь отсутствием двойной связи
в боковой цепи:
С2Н5
Н3С\/\/*\/СНз
Р-ситостерин
Ситостерины встречаются в хлопковом и талловом маслах, в
зародышах пшеницы и натуральном каучуке, в сахарном трост-
нике и другом растительном материале. Коммерческим источ-
ником ситостеринов чаще всего являются тростник и хлопковое
масло. Ситостерины и стигмастерин — наиболее перспективные и
дешевые исходные продукты для получения стероидных гормо-
нов.
Стерины необходимы для осуществления физиологических и '
биохимических функций живого организма. Предполагается, что
стерины требуются для образования мембранных систем, клеточ-
ных оболочек и других структурных образований клетки. Есть
данные о том, что стерины являются защитным фактором против
токсического действ'ия многих природных соединений.
Основные пути биосинтеза стероидных гормонов из холесте-
рина. В организме животных и человека из холестерина обра-
зуются три важные группы гормонов: прогестины, половые гор-
моны и гормоны коры надпочечников (кортикостероиды). Ос-
новные пути биосинтеза этих гормонов показаны на схеме 5.
92
СХЕМА 5
кортизол
(гидрокортизон)
эстрон
При образовании стероидных гормонов из холестерина сначала
образуется прегненолон — основной промежуточный продукт
биосинтеза стероидов и кортикостероидов. Окисление ЗОН-груп-
пы прегненолона в С=О сопровождается перемещением двойной
связи; продуктом этой кетостероидизомеразной реакции является
прогестерон — гормон плаценты и желтого тела.
Прегненолон является также предшественником мужских
93
половых гормонов (тестостерона) и женских половых гормонов
(эстрогенов эстрона, эстрадиола). В коре надпочечников про-
гестерон превращается в кортикостерон и кортизол (гидрокор-
тизон),: секреция кортизола достигает у взрослого человека
15—30 мг в день. Эти вещества были первоначально выде. и
из коры надпочечников в кристаллическом виде.
Кортизол (гидрокортизон) и его синтетические аналоги
кие, как преднизолон или дексаметазон, принадлежит к числу
современных средств экстренной терапии, благодаря их уникаль-
ному противовоспалительному, десенсибилизирующему и пр
вошоковому действию. По своему химическому строению
могут быть разделены на 11-дезоксистероиды, 11-гидроксиЬге-
роиды, 11,17-дигидроксистероиды
зон и гидрокортизон):
1ены
та-
эти-
они
(к последним относятся корти-
ц<>р« ИЗОН
гидрокор!изон
Основные микробиологические превращения стероидов. Про-
мышленный синтез названных выше ценных лекарственных пре-
паратов стал возможен только с развитием методов микробио-
логической химии и, в частности, метода микробиологической
трансформации. В качестве сырья для получения указанных
лекарственных средств используется диосгенин (из растения
диоскореи), стигмастерин из соевых бобов, в последние годы
интенсивно изучается p-ситостерин как потенциально дешевый
и доступный источник. В табл. 2 приведены некоторые трансфор-
мации стероидов, имеющие промышленное значение.
Таблица 2. Микробиологические трансформации стероидов, имеющие про-
мышленное применение
Реакция	Субстрат	Продукт	Микроорганизм трансформатор
11а-Гидроксил И рование	1 Iporci герои	11а-Гидрокси- прогес герои	Rhizupus nigri- cans
11 (Г Гидроксили- рован не	Вещество S	Г идрокортизон	Carvularia lu- nata
16а Гидроксили рование	9а-Фгоркортизол	9а Фтор-16а-гид- рокси корги юл	Streptomyces roseochromogenus
1,2 Дегидриро- вание	Г идрокоргизои	Предни голон	Arlhrobacter simplex
Ра< щен лен не бо- ковой цепи	р-Ситостерин	Андростаднен- диои и (или) анд- ростендион	Mycobacterium spp.
94
.Модифицированные тем или иным способом стероиды сами
могут служить субстратами для проведения соответствующих
целенаправленных трансформаций. Так, например, ключевым
веществом в синтезе гидрокортизона, кортизона и преднизолона
служит вещество S Рейхштейна (4-прегнен-17а, 21-диол-3,20-
дио«), которое для краткости принято называть «вещество S».
Онс, в свою очередь, является модифицированным продуктом
био рансформации моноацстата «вещества R» (21-ацетат-5-прег-
нен ЗР, 17а, 21-триол-20-он) с помощью культуры Corynebacterium
mediolanum:
вещество R
Процесс ферментативного превращения моноацетата веще-
ства R в вещество S Рейхштейна с помощью культуры Coryn,
mediolanum состоит из гидролиза 21-ацетогруппы и окисления
Зр-гидроксигруппы в 3-кетогруппу с одновременной мйграцией
двойной связи из А5 в А4. Трансформация заканчивается прак-
тически количественным выходом вещества S Рейхштейна,
поскольку для культуры Coryn, mediolanum нехарактерны реак-
ции расщепления стероидной молекулы. Это имеет принципиаль-
ное значение в производстве кортикостероидных препаратов,
поскольку стадия получения вещества S Рейхштейна является
ключевой и в значительной степени определяет конечный выход
готовых продуктов следующих трансформаций.
Введение гидроксильной группы. Микробиологическое гидро-
ксилирование — это наиболее важный и часто применяемый
метод. Наличие гидроксильных групп в 3, 11, 16, 17 положениях
молекулы стероида, как правило, обусловливает физиологиче-
скую активность большинства гормональных стероидных пре-
паратов.
Гидроксилирование стероидов осуществляется очень многими
микроорганизмами, чаще всего грибами, даже конидии некото-
рых грибов обладают гидроксилирующей активностью. Гидрокси-
лирование стероидов при помощи гриба Rh. nigricans — яркий
пример сочетания, специфичности и разнообразия действия
микроорганизмов.
1 la-Гидроксилирование как один из важнейших путей полу-
чения кортизона изучено наиболее детально и давно применяется
в промышленности, выходы продуктов трансформации очень
высоки. Многие микроорганизмы образуют смесь На- и lip-
эпимеров, соотношение которых существенно завиСйт от фазы
95
развития культуры, как было показано в случае гидроксилиро-
вания вещества S Рейхштейна грибом Tieghemella orchidis. /
Разработан метод получения гидрокортизона культурой
Т. orchidis из вещества S Рейхштейна в условиях глубинного
культивирования. Наибольшей трансформирующей способностью
обладает 17-часовая культура, за 10 ч она трансформируе до
70% вещества S Рейхштейна, выход гидрокортизона при том
составляет 52%.
Наличие в молекуле стероидов 110-гидроксильной, грушы
обусловливает физиологическую активность гидрокортизона
(кортизола) и преднизолона. Гидроксилированию подвергаются
субстраты самого различного строения — от производных эсттра-
на до сложных молекул стеринов, сапогенинов и т. п. Причина
этого — очень широкая субстратная специфичность гидроксилаз,
которую демонстрируют многие микроорганизмы. Так опицан
штамм Cunninghamella blakesleeana, который вводит оксигруггпу
в 110-положение обширного набора стероидов — различных
производных эстрана, тестостерона, кортексолона, прогестерона
и т. д.
Получение 14а-гидроксипрогестерона при помощи Bacillus
cereus является одним из немногих примеров гидроксилирования
при помощи бактерий. 15а-Гидроксилирование осуществляется
также многими микроорганизмами, основное место среди кото-
рых занимают Fusarium и Penicillium.
Главным препятствием, стоящим на пути дальнейшего раз-
вития промышленного микробиологического гидроксилирования
стероидов, так же как и вообще микробиологических трансфор-
маций этих соединений, является низкая производительность
ферментаций, несмотря на высокий процентный выход по суб-
страту. Это обусловлено, с одной стороны, нерастворимостью
стероидных субстратов в воде, с другой — токсичностью раство-
рителей, применяемых при внесении стероида и невозможно-
стью использования высоких концентраций субстрата.
Дегидрогенизация стероидов. Наличие двойных связей корен-
ным образом влияет на физиологическую активность препаратов.
Используя эту реакцию, получают такие эффективные препа-
раты, как преднизолон. Чаще всего микроорганизмы дегидри-
руют положения 1,2 и 4,5, но описано и введение двойной связи
в положения 7,8; 8,9; 9,11; 16,17; 17,20. Реакции дегидрогени-
зации осуществляют бактерии и актиномицеты, особенно часто
это микоформы Arthrobacter, Corynebacterium, Nocardia. Широ-
кая субстратная специфичность дегидрогеназ показана на боль-
шом экспериментальном материале; она позволяет использовать
в качестве субстратов ацетаты стероидов, которые являются
полупродуктами во многих технологических схемах получения
стероидов. Например, Mycobacterium globiforme 193, дегидри-
рующая 1,2-связь в кортизоне, так же эффективно превращает
и кортизонацетат в преднизонацетат с выходом 86%. Исследо-
вание показало, что для этой культуры характерна максималь-
96
ная удельная трансформирующая активность в период снижения
удельной скорости роста.
Реакция дегидрогенизации позволяет получать преднизолон
из кортизона, дианабол из метилтестостерона, преднизолон из
гидрокортизона. Продукты 1,2-дегидрирования образуются с вы-
сокими выходами — до 86%. Распространенность этой реакции
объясняется не только наличием соответствующих дегидрогеназ
у большого числа микроорганизмов, но и химическими свой-
ствами данного участка стероидной молекулы, ее нестабиль-
ностью, особенно при наличии кетогруппы в 3-м положении и
(или) двойной связи 4,5. Этими свойствами стероидной молекулы
объясняется и доступность связи 1,2 для микробных оксидоре-
дуктаз. Во многих случаях показана обратимость реакций
дегидрогенизации и восстановления.
Микробиологическое восстановление. Этот процесс использу-
ется в меньшей степени, чем дегидрирование. Он осуществляется
главным образом дрожжами и анаэробными бактериями, пред-
ставителями микрофлоры кишечника млекопитающих, осущест-
вляющими превращение холестерина в копростерин:
холестерин	копростерин
Описаны процессы насыщения двойных связей также и аэроб-
ными культурами, широко известными как окислители — актино-
мицетами, микоформами и даже грибами. Например, культура
Aspergillus flavus восстанавливает ароматическое кольцо неко-
торых стероидов;
17 а-этннилэстраднол	10₽-окси-}9-норэпистерон
Окисление гидроксильной группы в кетогруппу — одна из
наиболее частых реакций, осуществляемых микроорганизмами
(бактериями, актиномицетами, грибами). Наибольший практиче-
ский интерес представляют окислительные превращения гидро-
ксильных групп у 3,17 и 20-го атомов стероидной молекулы.
Окисление гидроксила в 3-м положении легко осуществляется
у соединений с ненасыщенным кольцом А, а также при наличии
двойной связи в положении 4. К этому же типу окислительных
превращений относят введение кетогруппы в молекулу стероида.
97
Гидролиз эфиров стероидов. Проводится с помощью микро-
организмов. Имеет практическую значимость. Ацилированные
стероиды являются обычными промежуточными продуктами
химического синтеза, в котором используется ацильная защита
функциональных групп. Хотя гидролиз ацильной группы легко
осуществим химическим путем, он часто приводит к побочным
нежелательным продуктам. Микробиологическое расщепление
эфирной связи осуществляется представителями различных
таксономических групп, в частности флавобактериями. Культура
Вас. megaterium обладает специфической активностью по отно-
шению к 21-ацетатам стероидов с диоксиацетоновой цепочкой:
ацетат кортизона
СН2ОН
о
кортизон
Дезацилирующая способность часто встречается среди
микоформ, мукоровых и несовершенных грибов, актиномицетов.
Особенность приведенной реакции состоит в том, что она про-
водится обычно одновременно с другими процессами — гидрокси-
лированием, дегидрогенизацией. Ценность представляют как
культуры, избирательно отщепляющие ацильную группу, так и
микроорганизмы, способные наряду с гидролизом эфирной связи
осуществлять еще какую-либо практически важную реакцию.
Отщепление боковых цепей стероидов. Представляет огром-
ный интерес как путь получения ценных продуктов из относитель-
но дешевых природных стероидов животного и растительного
происхождения — стеринов, желчных кислот, сапогенинов.
Возрастающая потребность в производстве стероидных пре-
паратов, а также истощение сырьевой базы делает все более
актуальным поиск новых источников сырья. Стоимость диосге-
нина, получаемого из различных видов диоскореи, за последние
годы возросла более чем в 10 раз в результате истощения запа-
сов этих растений. В связи с этим возрос интерес к более доступ-
ным природным стеринам.
Основная трудность при использовании фитостеринов заклю-
чается в необходимости селективного удаления насыщенной
алифатической боковой цепи с сохранением целостности стероид-
ного скелета. Удовлетворительных методов химического расщеп-
ления до сих пор не удалось разработать, перспективными счи-
таются лишь микробиологические способы. Однако промышлен-
ный интерес представляют только процессы расщепления боко-
вой цепи, не затрагивающие стероидного ядра.
98
Проблема расщепления боковой цепи стеринов с сохранением
стероидного скелета может быть решена следующими способами:
1) синтезом модифицированных стеринов, заместители в коль-
це А или В которых не позволяют микроорганизмам осуще-
ствлять 1,2-дегидрирование или 9а-гидроксилирование; 2) инку-
бацией стеринов в присутствии соединений, ингибирующих дей-
ствие ферментов Эа-гидроксилазы или 1,2-дегидрогеназы,
3) получением мутантных штаммов, не способных осуществлять
определенные стадии расщепления самого стероидного ядра.
Эти три способа, а иногда и их комбинации в сочетании с опти-
мальными условиями режима ферментации позволили получить
из ряда стеринов большой спектр промежуточных соединений,
применяемых для химического синтеза высокоактивных стероид-
ных препаратов.
§ 2. Методы проведения процессов
микробиологических трансформаций
Несмотря на разнообразие биотраисформаций стероидов, ме-
тоды проведения микробиологических реакций довольно едино-
образны. При поисковых работах, где не требуется или нет
возможности применять большие количества вещества, ограни-
чиваются проведением реакции в колбах на качалках, загрузка
стероида в колбу составляет 100—200 мг. Для загрузок порядка
1—2 г стероида применяют стеклянные ферментеры. В промыш-
ленности и на опытных установках применяют стальные аппара-
ты, оборудованные аэрирующими и перемешивающими устрой-
ствами.
Собранный стеклянный ферментер стерилизуют и загружают
стерильной питательной средой с заранее внесенной в нее в
асептических условиях трансформирующей культурой. Особое
внимание уделяют соблюдению асептики во всех операциях.
Стерилизацию в зависимости от объекта осуществляют автокла-
вированием питательной среды при ПО—120°С в боксах,
освещаемых бактерицидными лампами. Операции по загрузке,
отбору проб проводят в пламени газовой горелки. Загрузка пита-
тельной среды в ферментер, как правило, осуществляется
передавливанием стерильным сжатым воздухом. Время роста
культуры микроорганизма-трансформатора определяется появле-
нием максимальной трансформирующей активности и может
колебаться от нескольких часов для одних культур до нескольких
суток для других. Для многих культур-трансформаторов характерна
максимальная трансформирующая активность в период снижения
удельной скорости роста культуры.
Растворимость стеринов в воде очень низка. В настоящее
время стерины, предназначенные для окисления, в небольшой
концентрации (порядка 1 г/л) вносят растворенными в мало-
токсичном, смешивающемся с водой растворителе (ацетоне,
спирте, диметилформамиде). При более высоких концентрациях
99
стеринов (выше 1 г/л) их вносят в среду в виде мелкоизмельчен-
ной пудры; для этого кристаллы стерина растирают в специаль-
ной аппаратуре или разрушают ультразвуком.
Другой способ внесения стеринов для биотрансформации
состоит в том, что стерин, например 0-ситостерин, растворяют
в смеси гептан/этиленхлорид, добавляют при перемешивании
воду и отгоняют растворитель нагреванием смеси до 95°С. При
таком методе концентрация ситостерина в водной суспензии
может достигать 140 г/л.
Трансформация стеринов микроорганизмами основана на их
использовании в качестве источника углерода, поэтому стиму-
ляция роста трансформирующих штаммов должна приводить
к увеличению выхода продуктов расщепления стеринов. Процесс
стимулируется насыщением среды кислородом. Добавление в пита-
тельную среду некоторых масел в количестве 1—3 мае.% (сое-
вого, арахисового, рапсового, оливкового) повышает выход
продукта трансформации. Аналогичные результаты получены с
применением глицеридов животного и растительного происхож-
дения (тристеарин, триолеин, трипальмитин). Механизм стимуля-
ции роста глицеридами, вероятно, состоит в устранении гидрофоб-
ности стеринов, т. е. глицериды действуют так же, как неионные
ПАВ (твин), обычно применяемые для микробиологических про-
цессов трансформации. Температурный режим микробиологиче-
ских трансформаций стероидов не отличается от принятых для дру-
гих микробиологических процессов и составляет 24—33°С. Усло-
вия pH определяются при отборе штамма культуры-трансформато-
ра и колеблются в широком интервале.
Микробиологический контроль осуществляется только на
стадии выращивания трансформирующей культуры. Аналитиче-
ский контроль реакции трансформации ведется путем отбора
проб через определенные временные интервалы и анализа их
методом тонкослойной хроматографии на силуфоле в присут-
ствии «свидетелей» — исходного стероида, целевого продукта
трансформации и некоторых промежуточных и побочных про-
дуктов, если они участвуют в данном процессе.
После завершения трансформации культуральная жидкость,
отделенная от мицелия (или другой биомассы),-экстрагируется
несмешивающимся с водой органическим растворителем, пригод-
ным для растворения соответствующего стероида (этилацетат,
метиленхлорид или хлороформ). Экстракт, отделенный от вод-
ной фазы, проходит требуемую очистку (окрашенные примеси
обычно отделяют обработкой с активированным углем, затем
уголь отфильтровывают); далее его концентрируют в вакууме
и полученный осадок стероида перекристаллизовывают из подхо-
дящего растворителя. В препаративных целях при работе с не-
большими количествами стероидов очистку продукта трансфор-
мации можно проводить методом колоночной хроматографии.
Специфической особенностью процесса микробиологических
трансформаций является использование чистых культур микро-
100
организмов-трансформаторов. Поэтому необходимым условием
технологического режима является соблюдение мер для предот-
вращения развития посторонней микрофлоры. Последняя по-
стоянно присутствует в воздушных потоках, циркулирующих
в производственных помещениях, и представлена в основном
мезофильными микроорганизмами, оптимальная температура
развития которых находится в пределах 24—30°С. Такой же
температурный оптимум характерен, как правило, и для микро-
организмов-трансформаторов.
Все операции по подготовке и выращиванию трансформи-
рующих культур проводят в стерильных условиях с соблюде-
нием правил и норм, разработанных и утвержденных для произ-
водств микробного синтеза. Однако внесение стероидного суб-
страта на трансформацию (в растущую на полноценной пита-
тельной среде культур при использовании бактерий или в водную
суспензию неразмножающихся клеток — в случае применения
грибного мицелия) и сам процесс трансформации, как правило,
проводят не стерильно. Для уменьшения вероятности загрязне-
ния используют стерильную воду при приготовлении суспензии
стероидных субстратов, поскольку сами стероиды обычно не-
устойчивы в условиях автоклавирования. Одним из вариантов
решения этой проблемы может служить способ внесения стероид-
ного субстрата в питательную среду до засева ее трансформи-
рующей культурой в момент, когда температура среды после
автоклавирования снизится до 80°С и безопасна для субстрата.
После выдержки в течение 30 мин среду со стероидом охлаждают
до 33°С и в нее стерильно вносят трансформирующую культуру.
Используют культуру-трансформатор в стадии замедления
роста, когда питательные компоненты среды в значительной
степени израсходованы, а сильно разросшаяся культура подав-
ляет рост других микроорганизмов. Однако и эти меры не пол-
ностью предохраняют трансформационную среду от загрязнения
посторонней микрофлорой. В последней могут оказаться виды,
способные отрицательно влиять на ход трансформации.
Применяемая в лабораторных условиях стерилизация суспен-
зий стероидов ультразвуком неприемлема для промышленных
масштабов.
Примеры промышленного использования микробиологических
трансформаций. Получение гидрокортизона (кортизола) из ве-
щества S осуществляется с помощью С. linata. Процесс
включает следующие стадии:
сн2он	СН2ОН
С=о	С=о
101
1.	Выращивание трансформирующей культуры (I стадия)
производят путем трех последовательных генераций на питатель-
ной среде, содержащей сахарозу, дрожжевой автолизат и слож-
ный набор неорганических солей:
лабораторный инокулят	инокулят	инокулят
1-	генерации	----- 2-й генерации --- 3-й генерации
Крышку инокулятора перед засевом обрабатывают водным
раствором формалина, аппарат и все помещение облучают бак-
терицидной лампой и весь процесс выращивания трансформи-
рующей культуры проводят в стерильных условиях. Далее
полученная трансформирующая культура поступает в сепаратор,
откуда отделенный мицелий в виде водной суспензии передается
в ферментер для проведения основной реакции трансформации
вещества S.
2.	Трансформация вещества S (II стадия) также начинается
со стерилизации ферментера и воздушного фильтра водным
раствором формалина. Особое внимание уделяется размолу сте-
роида на микромельнице и получению суспензии его в стериль-
ной воде с содержанием стероида 1 г/л. Для предотвращения
развития посторонней микрофлоры используется добавка анти-
биотика. Перемешивание и аэрация осуществляются, как и на
предыдущей стадии, так же используются и пеногасители.
3.	Выделение продукта трансформации — гидрокортизона
(III стадия). Культуральная жидкость вместе с мицелием после
П-й стадии поступает на сепарацию. Отделенный мицелий про-
мывается, промывные воды присоединяются к основной культу-
ральной жидкости. Далее производится экстракция-сепарация
продукта трансформации из водной среды органическим раство-
рителем. Осветленный активированным углем экстракт подверга-
ется многократному упариванию с различными растворителями,
осветлению, снова упариванию досуха и промывке подходящим
растворителем. Последние приемы обработки готового техниче-
ского продукта обычны для технологии получения многих орга-
нических веществ и лекарственных препаратов. Получение чис-
тых лекарственных форм гидрокортизона проводится традицион-
ными методами.
Трансформация гидрокортизона в преднизолон:
сн2он
I
гидрокортизон
Mycobacterium
globiforme
CHsOH
102
Выращивание трансформирующей культуры М. globiforme
осуществляется такими же последовательными этапами и в тех
же аппаратах при тех же условиях аэрации и перемешивания,
далее проводится трансформация гидрокортизона с помощью
названной дегидрирующей культуры. Выделение готового про-
дукта — преднизолона, осуществляется также путем экстракции-
сепарации из культуральной жидкости, отличаясь лишь набором
растворителей.
В настоящее время интенсивно разрабатываются методы
использования мелкокристаллических стероидных субстратов.
Микронизация субстрата до размеров частиц в несколько микро-
метров и внесение в ферментационную среду без растворителя
позволяет повысить исходную концентрацию стероидного суб-
страта до 20—50 г/л.
Описан процесс, получивший название «псевдокристаллфер-
ментации»: дегидрирование измельченного порошка кортизона с
помощью культуры Arthrobacter simplex в течение 5 дн. Получен
кристаллический преднизолон с выходом 93%. Загрузку стеро-
идного субстрата удается при этом довести до 500 г/л. Дегидри-
рование микрокристаллического гидрокортизона происходит по
схеме:
гидрокортизон (кристаллы)—гидрокортизон (раствор) —
— преднизолон (раствор)—преднизолон (кристаллы)
В ходе реакции кристаллический гидрокортизон переходит в
растворенное состояние и трансформируется внутри клеток в
преднизолон, который накапливаясь, кристаллизуется в виде игл.
Отмечено также постоянное остаточное количество гидрокорти-
зона при проведении «псевдокристаллферментации». Предпола-
гают образование при этом «смешанных» кристаллов, состоя-
щих из молекул гидрокортизона и преднизолона, соединенных
в определенном соотношении (8:92) в осадок. Однако этот про-
цесс до настоящего времени не получил широкого практического
применения.
Пути интенсификации микробиологических трансформаций.
Одним из путей интенсификации процессов трансформации
является предварительное индуцирование растущей культуры —
трансформатора, соответствующим субстратом или его аналогом.
Этот прием связан с индуцированием биосинтеза соответствую-
щих ферментных систем культуры и особенно широко приме-
няется в процессах микробиологической дегидрогенизации.
Наиболее перспективным считается применение закрепленных
(иммобилизованных) живых клеток микроорганизмов. Преиму-
щества использования иммобилизованных клеток в технологии
очевидно:
отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов; более
высокая активность и стабильность по сравнению с иммобили-
зованными ферментами -и свободными клетками; уменьшение
затрат на выделение и очистку продуктов реакции, так как они
изолированы от биомассы и некоторых продуктов обмена; по-
103
явление возможности создания непрерывных автоматизирован-
ных процессов; способность к длительному функционированию
полиферментных систем и регенерации кофакторов.
Методы иммобилизации клеток: адсорбция, ковалентное и
поперечное связывание, метод включения в различные полимеры,
микрокапсулирование. Метод включения, в частности, в целлю-
лозные волокна или мембраны весьма технологичен и является
перспективным для проведения одностадийных процессов. Одним
из наиболее экономичных носителей для иммобилизации клеток
является каппа-каррагинан, полисахарид из морских красных
водорослей Rhodophyceae, Ginartinaceae, применяемых как пи-
щевая добавка. Интактные клетки, введенные в гель, интенсивно
размножаются на питательной среде и могут многократно
использоваться как полиферментные системы.
Включение в альгинатные гели относится к мягким методам
иммобилизации, т. е. клетки после иммобилизации остаются
жизнеспособными и могут осуществлять полиферментные про-
цессы. Положительным качеством геля является возможность
размножения в нем клеток, а также его способность к раство-
рению при изменении pH и температуры, что позволяет выделять
жизнеспособные клетки и облегчает изучение их физиологии
и морфологии. Во многих случаях включение клеток в альгинат
приводит к лучшим результатам по сравнению с каррагинаном.
Преимущества иммобилизованных клеток делают их весьма
перспективными, в частности, для трансформации стероидных
соединений. Именно стероиды были одними из первых субстра-
тов, которые удалось трансформировать с помощью иммобили-
зованных клеток. В настоящее время достаточно досконально
изучены закономерности процесса трансформации стероидных
соединений живыми иммобилизованными клетками, исследованы
пути направленного изменения ферментативной активности и ее
стабилизации. В нашей стране впервые осуществлены следую-
щие процессы трансформации стероидных соединений с помощью
живых иммобилизованных клеток микроорганизмов: 1,2-дегидри-
рование, 1,2-восстановление, 20-восстановление (Arthobacter glo-
biforme), стереоспецифическое 170-восстановление (Sacch. cere-
visiae), 20a- и 200-восстановление (В. megaterium), 11a- и 110-
гидроксилирование (Tieghemella orchidis).
§ 3. Микробиологические трансформации углеводов
Углеводы являются естественными и основными, почти уни-
версальными субстратами для большинства микроорганизмов.
Ферментативное превращение углеводов дает преобладающему
большинству микроорганизмов энергию и материал для построе-
ния внутриклеточных структур.
Микроорганизмы при контакте с углеводами могут осуще-
ствлять необычайно широкий набор реакций. Ферментативное
воздействие на углеводы характеризуется особенной интенсив-
104
ностью, что обусловливает и обеспечивает рентабельность многих
микробиологических трансформаций углеводов. Наконец, для
многих микроорганизмов характерно накопление больших ко-
личеств продуктов частичного превращения углеводов в обычных
условиях культивирования. Уксуснокислые бактерии, некоторые
грибы и псевдомонады очень хорошо служат практическим
целям трансформации углеводов. Все это обусловило исполь-
зование ферментативной активности микроорганизмов для препа-
ративного получения многих производных углеводов.
Превращения углеводов, осуществляемые микроорганизмами,
можно разделить на несколько основных типов: окислительные
трансформации углеводов (окисление полиолов, получение аль-
доновых кислот), восстановление углеводов и изомеризация
углеводов.
Окислительные трансформации углеводов распространены
очень широко и детально изучены, особенно подробно изучен
и имеет промышленное применение процесс окисления полиспир-
тов (полиолов).
Окисление полиолов впервые описано в классических рабо-
тах Брауна (1886) и Бертрана (1896); было проведено окисление
маннита в фруктозу и сорбита в сорбозу в помощью микроорга-
низмов Acetobacter aceti и Acetobacter xylinum. Позднее были
обнаружены культуры, которые ведут этот процесс намного
интенсивнее (Acetobacter suboxydans). Окислению подвергаются
все полиолы, обладающие двумя вторичными гидроксилами в
цис-положении, прилежащими к терминальной первичной спир-
товой группировке, причем окисляется атом углерода, смежный
с терминальным. Это явление получило название правила Берт-
рана—Хадсона по имени первых его исследователей: было уста-
новлено, что Ac. suboxydans окисляет лишь структуры, где упо-
мянутые два гидроксила имеют /^-конфигурацию. Долгое время
считалось, что это свойство Ac. suboxydans, однако позже было
установлено, что эта закономерность сохраняется для других
микроорганизмов.
Окисление полиспиртов в кетозы получило название процесса
кетогенной ферментации. В основе всех этих процессов лежит
следующая реакция:
—С—ОН----------. С=О
I	I
Продукт реакции определяется исходным субстратом и специфи-
ческой ферментной системой используемых культур микроорга-
низмов.
Примеры трансформации углеводов. В промышленном масш-
табе применяются два процесса окисления полиолов: 1) превра-
щение глицерина в диоксиацетон и 2) превращение D-сорбита
в L-сорбозу. Особый интерес представляет окисление D-сорбита
в L-сорбозу, как одна из стадий синтеза аскорбиновой кислоты.
105
Превращение глицерина в диоксиацетон происходит в соот-
ветствии со следующей схемой:
СНг—СН—СН2 ,	,	СН2—С—СН2
।	। Ac. suboxydans ।	ц
ОН он он	он о он
Диоксиацетон — ценное органическое соединение, широко приме-
няемое в медицине, парфюмерной и фармацевтической про-
мышленности. В последние годы его получают из глицерина
методом микробиологического окисления с помощью клеток
Ac. suboxydans. Разработан метод с многократным использо-
ванием неразмножающихся клеток (в том числе иммобилизо-
ванных в гелях) в среде, содержащей глицерин, монокалийфос-
фат и 10% по объему дрожжевой воды (концентрация дрож-
жей 10%), процесс идет при 28°С в течение 36 ч.
Главное требование этих ферментаций — высокое содержание
кислорода в растворе, питательная среда должна содержать
витамины В комплекса, водный экстракт пекарских дрожжей,
дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт и СаСОз для ней-
трализации.
Превращение D-сорбита в L-сорбозу происходит в соответ-
ствии со следующей схемой:
н—СН—он	СН2ОН
I	I
н—с—он	н—с—он
1	I
НО—С— Н -----------. НО—С—н
н—ОН	Н—С—он
н—с—он	с=о
С^НгОН	СН2ОН
D-сорбит	£-сорбоза
В производстве применяется метод глубинного культивиро-
вания. Инокулят — суспензия клеток Ac. suboxydans — выращи-
вается на среде, включающей сорбит, глюкозу, дрожжевой
экстрат и СаСО3. В 15—20%-ные растворы D-сорбита, содер-
жащие трансформирующую культуру и необходимые для ее рос-
та витамины, пропускают воздух через распылительные системы.
При i = 30°С через 24 ч L-сорбоза получается с 93%-ным вы-
ходом в растворе.
В конце процесса ферментации раствор, содержащий сор-
бозу (культуральную жидкость), обесцвечивается активирован-
ным углем, фильтруется, затем еще раз фильтруется на фильтр-
прессе; фильтрат концентрируют в вакууме до сиропообразной
массы, которая кристаллизуется при 15°С. Кристаллы отделяют
центрифугированием, промывают ледяной водой и сушат. Вторая
порция L-сорбозы получается из маточника и промывается.
Весьма успешной была попытка применить для непрерывной
106
трансформации сорбита двухстадийную систему; получен
96%-ный выход L-сорбозы при 20% сорбита в исходной среде.
Дальнейшее совершенствование этих процессов связано с
сокращением времени инкубации и повышением эффективности
самого процесса.
Сейчас значительное внимание уделяется исследованиям воз-
можности проведения окислительных трансформаций клетками
уксуснокислых бактерий, иммобилизованными в геле. Показана
способность иммобилизованных клеток Gluconobacter oxydans
окислять глицерин в диоксиацетон. Кроме того, эти иммобили-
зованные клетки окисляют многие углеводы, например маннозу,
арабинозу, и такие спирты, как рибит, маннит, сорбит. Однако
отмечается значительное снижение скорости окислительных про-
цессов при использовании иммобилизованных в гелях клеток.
Окисление D-сорбита в L-сорбозу. Это ключевая стадия син-
теза L-аскорбиновой кислоты (витамина С). Процесс имеет
большое промышленное значение и проводится по схеме 6.
СХЕМА 6
н2
(катализатор)
D-глюкоза
СН2ОН
Н—С—ОН
I
НО—с—н
I
н—с—он
Н—С—IOHJ
(!:н2он
Aceiobacler
suboxydans
t-3O°C
24 ч
D-сорбит
CH2OH
r
H—C—OH
I
HO—c—H
I
---H—C—OH
I
c=o
CH2OH
L-сорбоза
Основное исходное сырье в синтезе аскорбиновой кислоты
D-глюкоза. Наиболее простым и экономичным синтезом аскорби-
новой кислоты из D-глюкозы, по которому ведется производство
ее в разных странах, является синтез через L-сорбозу и диаце-
тон-2-кето^-гулоновую кислоту. Этот синтез включает следую-
щие промежуточные вещества: D-глюкоза-► D-сорбитL-cop-
боза -► диацетон^-сорбоза -► диацетон-2-кето^-гулоновая кис-
107
лота -► 2-кето-£-гулоновая кислота —► L-аскорбиновая кислота.
Первая стадия — восстановление £)-глюкозы в D-сорбит ка-
талитическим гидрированием — протекает как обычный химиче-
ский процесс. Следующая стадия — окисление D-сорбита в
L-сорбозу — представляет собой микробиологическую трансфор-
мацию с помощью уксуснокислых бактерий Acetobacter (или
Gluconobacter suboxydans). Способность окислять сорбит в сорбо-
зу установлена у ряда представителей уксуснокислых бактерий:
Ac. melanogenum, Ac. ketogenum, Ac. gluconicum, а также у дру-
гих микроорганизмов Bacterium orleanense, Bacterium xylinoides
и др.
Следующая стадия — введение диацетоновой (диизопропили-
деновой) защиты гидроксильных групп, не подлежащих даль-
нейшему окислению, также является химической стадией, как и
последующее каталитическое окисление первичной спиртовой
группы при С-1 в карбоксильную группу (таким образом,
L-сорбоза превращается далее в аскорбиновую кислоту химиче-
ским путем).
Практический интерес представляет и обратный окислению
процесс микробиологического восстановления углеводов, заклю-
чающийся в превращении альдегидной или кетонной группы в
спиртовую. Именно эта реакция необходима для превращения
ксилозы в ксилит.
Восстановление ксилозы в ксилит. Химический ксилит полу-
чают гидрированием ксилозы под высоким давлением; микробио-
логическая трансформация более предпочтительна, хотя выходы
еще недостаточно высоки.
Ксилит — ценный продукт, широко использующийся в различ-
ных видах пищевой промышленности; кроме того, он служит
заменителем сахара при диабете. Потребность в нем очень
высока. Превращение ксилозы в ксилит протекает следующим
образом:
С^°	СН2ОН
1ХН	|
НО—С—н	но—с—н
I	I
Н—С—ОН-----------. н—с—он
I	I
НО—с—н	но—с—н
I	I
СН2ОН	СН2ОН
/.-ксилоза	ксилит
В промышленности применяют- дрожжи С. utilis, восстанавли-
вающие ксилозу в ксилит. Дрожжи культивируют на солевой
среде с ксилозой, которая служит источником углерода и энер-
гии. В процессе метаболизма она восстанавливается в ксилит,
который накапливается в среде. Восстановление ксилозы в
ксилит осуществляют и отмытые клетки дрожжей, предваритель-
но выращенные на среде с ксилозой и инкубированные в фосфат-
108
ном буфере (pH 7,0). Максимальный выход ксилита 60%. Ин-
тенсивно ведутся работы по восстановлению ксилозы в ксилит
иммобилизованными в геле клетками. Выход ксилита при
33°С — 92%, при 29°С — 60%. Разработаны пути внедрения
этого процесса в промышленность.
§ 4. Микробиологические трансформации
гетероциклических соединений
Биохимическая активность микроорганизмов широко ис-
пользуется и для превращения некоторых гетероциклических
соединений, в частности соединений индольного ряда. Среди
индольных соединений особый интерес представляют продукты
метаболизма триптофана: триптамин, серотонин, их замещенные
аналоги, а также триптофол и индолил-3-уксусная кислота. Эти
соединения играют важную роль в процессах обмена веществ и
интенсивно исследуются с биохимической и медицинской точек
зрения.
Пути метаболизма триптофана и его производных микроор-
ганизмами изучены довольно полно, работы же по трансформа-
ции соединений индольного ряда немногочисленны.
Микробиологическая трансформация производных индола.
Эти трансформации представлены в основном гидроксилирова-
нием. Так, главным продуктом окисления индолил-3-уксусной
кислоты (ИУК) грибами Claviceps purpurea является 5-оксиин-
долил-3-уксусная кислота:
НО
СНзСООН а. purpurea
СНзСООН
Н	Н
ИУК гидроксилируется грибом Asp. niger в положении 5.
Однако при проведении трансформации этим грибом всего ряда
индолилжирных кислот — индолил-3-пропионовой, индолил-3-ва-
лериановой, индолил-3-капроновой, индолил-3-энантовой — не
были обнаружены соответствующие 5-оксипроизводные, что свиде-
тельствует о специфичности его гидроксилирующей системы.
Была изучена и схема превращения триптамина грибами
Asp. niger (схема 7). Как видно из схемы, начальным этапом
превращения Триптамина является реакция дезаминирования.
Продукт этой реакции — индолил-3-уксусный альдегид выделить
не удалось. Одновременное образование ИУК и триптофола
дает возможность предположить, что индолил-3-ацетальдегид
подвергается реакции дисмутации, окисляясь до кислоты и вос-
станавливаясь до спирта. Следующий этап — окисление ИУК с
образованием 5-оксииндолилуксусной кислоты и неидентифици-
рованного индола. Эти соединения были получены и при тран-
сформации кристаллической ИУК- Дальнейшее превращение не
обнаружено. Видимо, таким путем микроорганизмы проводят
109
СХЕМА 7
<H2CH2NH2
триптамин
индолил-3-уксусный
альдегид
реакция дисмутации
5-окси-ИУК
детоксикацию гетероауксина. 5-Гидроксилирование индольной
молекулы большим числом культур Asp. niger и Asp. awamori
говорит о широком распространении этой реакции среди грибов.
Процесс легко осуществляется на обычных питательных средах
в сравнительно короткий срок. Это дает возможнось использо-
вать гидроксилазную активность грибов для синтеза трудно-
доступных 5-оксииндолов. Asp. niger осуществляет также окисли-
тельное дезаминирование N-замещенных аналогов триптамина.
Процессу предшествует отщепление замещенных групп, что уве-
личивает время ферментации. Продуктами превращения являют-
ся 5-оксииндолилуксусная кислота и неидентифицированная ин-
дольная оксикислота.
Микробиологические трансформации производных пиридина.
Никотиновая кислота и ее амид (витамин РР или Bs) обычно
получают химическим синтезом, однако уже разработаны пути
микробных трансформаций соответствующих субстратов:
СНЭ
Arthrobacter
aurescens 11
Nocardia
coral Una 11A
COOH
a
З-метилпнриднн
никотиновая кислота
по
Mycobacterium
bovis
3-пкрмднлкарбннол	никотиновая кислота
никотинамид
Ftavobacterium
peregrinum
Методом последовательной индукции было установлено, что
происходит окисление субстратов. Так, превращение 3-метил-
пиридина культурой Nocardia происходит через стадию образо-
вания соответствующего спирта (3-оксиметилпиридина):
СООН
З-Оксиметнлпиридин окислялся клетками и бесклеточными
экстрактами культуры N. corallina, выращенной на любых ис-
точниках роста. Видимо, окисление спирта осуществляется
обычными дегидрогеназными системами.
Хотя эти процессы еще не нап!ли промышленного применения,
можно утверждать, что и в этом случае разработка соответ-
ствующей технологии приведет к замене, хотя бы частичной,
химической трансформации на микробиологическую.
ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ
ПРОМЫШЛЕННОЙ
БИОТЕХНОЛОГИИ
Биотехнология, как всякое направление промышленной дея-
тельности человека, создает определенные экологические пробле-
мы. Однако тот факт, что период резкого расширения промыш-
ленного использования микроорганизмов совпал по времени с
периодом пристального внимания человека к экологии и охране
окружающей среды, а также ряд принципиальных особенностей
промышленной биотехнологии, обсуждаемых ниже, позволяют
отнести микробиологическую промышленность к одной из наибо-
лее экологически безопасных отраслей народного хозяйства, ко-
торая, возможно, станет первым типом производств, действи-
тельно не имеющих отходов.
Экологические проблемы промышленной биотехнологии опре-
деляются тем, что эта область производства связана с исполь-
зованием огромных масс технологической воды и воздуха, т. е.
потенциально могла бы стать источником большого количества
воздушных и водных выбросов. Экологическая опасность этих
выбросов определяется, в первую очередь и почти исключитель-
но, присутствием в них живых или убитых клеток микроорга-
низмов. Хотя в биотехнологии, как видно из изложенного мате-
риала, дело имеют только с непатогенными формами микроор-
ганизмов, но даже их попадание в окружающую среду может,
в принципе, вызвать в ней нежелательные и неконтролируемые
изменения.
Следствием выброса живых клеток продуцентов из аппара-
тов, где протекает микробиологический синтез или идет перера-
ботка его продуктов, может быть изменение структуры экологи-
ческих ниш в окружающей заводы почве, воде и т. д. и как
результат — нарушение состава сообществ микроорганизмов,
взаимодействующих в этих нишах, а значит, и иная роль в круго-
вороте веществ в природе. Хотя опыт эксплуатации микробио-
логических производств, даже на ранних стадиях их развития,
не обнаружил этого явления, его нельзя считать абсолютно не-
возможным.
112
Другим нежелательным последствием, связанным с выбросом
клеток или продуктов их лизиса, может быть прямое или косвен-
ное воздействие на человеческий организм, т. е. влияние на
здоровье обслуживающего персонала и окружающего населения.
Здесь речь может идти не о заражении, поскольку штаммы-
продуценты заведомо непатогенны, а о повышенной индиви-
дуальной чувствительности в форме аллергии или сенсибилиза-
ции к другим неблагоприятным факторам внешней среды (SOj,
СО и т. под влиянием клеток или продуктов их распада.
Все это накладывает на микробиологические производства
жесткие требования относительно охраны окружающей среды
и загрязненности выбросов и заставляет постоянно проводить
микробиологический контроль воздуха, воды и почвы в окружаю-
щей местности. Результатом этого стало практическое отсутствие
каких-либо нежелательных воздействий со стороны предприятий
микробиологической промышленности на окружающую среду.
При рассмотрении связанных с биотехнологией экологиче-
ских проблем необходимо учитывать, что важной составной
частью современной биотехнологии является очистка воды от
загрязнений и утилизация всевозможных отходов агропромыш-
ленного комплекса. Несмотря на постоянное совершенствование
методов химической очистки сточных вод, абсолютно исключена
возможность слива в водоемы промышленных и сельскохозяй-
ственных сточных вод без их предварительной биологической
очистки. Методы такой очистки основаны на использовании
специфических биологических сообществ, носящих общее назва-
ние активного ила, для глубокой утилизации как органических,
так и неорганических загрязнений, оставшихся в воде после
осуществления всех других возможных вариантов ее очистки.
Необходимо подчеркнуть, что применение живого консор-
циума— активного ила — для удаления примесей из воды осно-
вано на уникальной способности микроорганизмов утилизиро-
вать не только те субстраты, которые для них оптимальны и та-
ким образом привычны, но и огромное количество других ве-
ществ, в том числе, что особенно важно, синтетических, создан-
ных человеком искусственно и поэтому отсутствовавших ранее в
природе. Понятно, что из-за часто меняющегося состава сточных
вод необходимо использовать для их очистки сложные сообще-
ства микроорганизмов, включающие бактерии, водоросли, про-
стейшие и т. д., которые путем согласованного метаболизма с
большей или меньшей скоростью поглощают примеси из воды.
Следствием этого, в частности, является и необходимость адап-
тации к составу воды и даже к микрофлоре окружающей среды.
Поэтому в каждых конкретных очистных сооружениях эксплуа-
тируется активный ил определенного индивидуального состава.
В технологической воде любого биотехнологического пред-
приятия не содержится ничего, кроме клеток продуцента и
продуктов метаболизма. Они легко утилизируются активным
илом, поскольку в природе существует много видов одноклеточ-
113
5—233
них, перерабатывающих подобные отходы. Это позволяет ставить
и практически решать задачу замкнутого цикла водоиспользо-
вания на предприятиях микробиологической промышленности.
Показана, например, возможность полного возврата в техноло-
гический процесс воды после ее биоочистки в таких крупно-
масштабных производствах, как получение белка одноклеточ-
ных (БВК).
Несмотря на реальность осуществления замкнутого водообо-
рота в микробиологических производствах, включающего стадию
биологической очистки воды, можно утверждать, что для про-
мышленной биотехнологии это не окончательное решение, так
как существует принципиальная возможность решить эту задачу
значительно эффективнее.
Перед промышленной биотехнологией стоит задача активного
использования симбиоза и кометаболизма и создание метаболи-
чески замкнутых технологических циклов. Действительно, какой
бы ни была конкретная цель данного процесса культивиро-
вания, получающаяся после выделения целевого продукта (био-
масса, метаболит) остаточная культуральная жидкость сама по
себе или после определенного регулирования ее состава может
стать питательной средой для роста соответствующего нового
продуцента. Ее можно применять до тех пор, пока на очередной
стадии она станет вновь подходящей или даже лучшей (за счет
стимуляторов) питательной средой для проведения исходного
основного процесса. В таком метаболическом цикле на каждом
этапе будут получаться полезные продукты и уже нельзя будет
выделить основную и вспомогательные стадии.
В настоящее время метаболически замкнутые процессы био-
синтеза находятся в стадии разработки, их реализация — дело
недалекого будущего. Однако полностью безотходными они могут
стать только при рациональном решении проблемы воздушных
выбросов. Абгазы микробиологических производств состоят из
отработанного воздуха, выходящего со стадии посевной и основ-
ной ферментации, а также из потоков влажного воздуха после
использования его в сушилках. Отработанный воздух со стадии
ферментации в простейшем случае очищается водой в трубе
Вентури, обеспечивающей хорошее смешение потоков за счет
разрежения в сопле, создаваемого потоком очищающей воды.
Выбросы из сушилок очищаются от пылевидного продукта в
последовательно установленных циклонах, что позволяет однов-
временно увеличить выход продукта.
В последнее время требования к очистке абгазов биотехно-
логических производств значительно возросли. Это связано с об-
щим стремлением к повышению чистоты воздушного бассейна
и полностью отвечает решениям директивных органов по оздо-
ровлению экологической обстановки, особенно в промышленных
регионах. Поэтому на всех основных заводах отрасли воздушные
потоки из сушилок теперь направляются на стадию сжигания
топлива в печах, обеспечивающих сушилки горячими дымовыми
114
газами для сушки. Несмотря на некоторое возрастание расхода
топлива по этой схеме вследствие необходимости нагревать в
топке водяной пар, содержащийся во влажном воздухе после
сушилок, такое решение безусловно прогрессивно, поскольку пол-
ностью исчерпывает проблему удаления органических веществ
из абгазов. Аналогичные решения принимаются в проектируе-
мых заводах и в отношении воздуха со стадии ферментации,
хотя в этом случае, возможно, потребуется кооперирование с
другими предприятиями, использующими топочные устройства,
например с ТЭЦ.
Таким образом создание метаболически замкнутых биотехно-
логических процессов в сочетании с полной очисткой газовых вы-
бросов от биологического органического материала позволяет
создать экологически чистые, действительно безотходные техно-
логические процессы микробиологического синтеза.
Ниже рассмотрены важнейшие с точки зрения очистки
характеристики сточных вод и описана технология использования
биообъектов — ила, пленок и т. п. — для доведения воды до за-
данной степени чистоты, допускающей ее повторное техноло-
гическое применение или даже сброс в природные водоемы.
$ 1. Общие показатели загрязненности сточных вод
Под качеством воды понимают совокупность ее характеристик
и свойств, обусловленных природой и концентрацией содержа-
щихся в ней примесей. В связи с невозможностью индивидуаль-
ного аналитического определения всех присутствующих в сточ-
ной воде соединений прибегают к суммарной оценке их содержа-
ния. К общим показателям загрязненности сточных вод следует
отнести те, которые характеризуют общие свойства воды — орга-
нолептические, физико-химические, содержание нерастворимых
примесей (содержание взвешенных веществ или зольность),
концентрацию растворенных веществ (общее содержание органи-
ческих и неорганических примесей, «органический» углерод), пер-
манганатную и дихроматную окисляемость (химическое потреб-
ление кислорода — ХПК), биохимическое потребление кислорода
(ВПК). Совокупность этих показателей позволяет оценить общее
состояние сточных вод и предложить наиболее эффективный
способ их очистки.
Следует, однако, помнить, что часто в сточных водах могут
присутствовать химические соединения, которые даже в незна-
чительных количествах сильно влияют как на свойства- воды,
так и на возможность очистки данного вида стоков. В таких
случаях необходим более детальный анализ состава сточной
воды с выяснением не только концентраций тех или иных соеди-
нений, но и более полное определение качественного и количе-
ственного состава загрязнений.
Определение таких показателей, как органолептические
(цвет, вид, запах, прозрачность, мутность), оптическая плот-
115
ность, цветность, pH, температура и т. д. не вызывает каких-либо
трудностей экспериментального и методического характера. Зна-
чительно сложнее определить общее содержание органических
веществ в сточной воде, которое необходимо знать для контроля
работы очистных сооружений, повторного использования сточных
вод в технологических процессах, выбора метода очистки и
доочистки, определения окончания процесса очистки, а также
для оценки возможности сброса воды в водоемы.
Из большого числа способов, применяемых для определения
содержания органических веществ, более подробно будут опи-
саны два, наиболее широко используемые при проведении про-
цессов биологической очистки.
Химическое потребление кислорода (ХПК). Методика осно-
вана на окислении веществ, присутствующих в сточных водах,
0,25%-ным раствором дихромата калия при кипячении пробы в
течение 2 ч в 50%-ном (по объему) растворе серной кислоты.
Для полноты окисления органических веществ применяется ката-
лизатор — сульфат серебра. Многочисленные исследования пока-
зали, что большинство органических соединений в таких усло-
виях окисляются до Н2О и СО2, однако ряд соединений (пиридин,
бензол и его гомологи, нафталин) в этом режиме окисляется не
полностью. Тем не менее, дихроматный способ имеет широкое
применение из-за его простоты и возможности автоматизации
при проведении эксперимента.
Биохимическое потребление кислорода (БПК). Измеряется
количеством кислорода, которое расходуется микроорганизмами
при аэробном биологическом разложении веществ, содержа-
щихся в сточных водах при стандартных условиях за определен-
ный йнтервал времени. Определение БПК требует применения
специальной аппаратуры; при манометрических способах измеря-
ется уменьшение давления в аппарате за счет потребления кис-
лорода. Исследования проводят в аппарате Варбурга или в спе-
циально разработанном респирометре (рис. 1). Измерения БПК
/ — ферментер; 2 - емкость с газовой смесью; 3 — ре-
гистрирующий прибор; 4 — адсорбер
116
выполняют следующим образом: в герметичный ферментер
помещается определенное количество исследуемой сточной воды,
которую засевают микроорганизмами; в процессе культивирова-
ния регистрируется изменение количества кислорода (или кисло-
рода воздуха), пошедшего на окисление соединения, присут-
ствующего в сточных‘водах. Второй, кулонометрический способ
определения ВПК более сложен в аппаратурном оформлении,
он основан на компенсации объема кислорода, потребленного
микроорганизмами, за счет электролиза соответствующего коли-
чества воды, при этом объем выделившегося кислорода опре-
деляется по затратам электричества.
Особую важность при определении ВПК имеет вопрос стан-
дартизации условий проведения эксперимента: в зависимости от
длительности культивирования различают биохимическое потреб-
ление кислорода за 5, 20 сут и полное окисление; эти показатели
условно обозначаются через БПКв, БПК20, БПКп. Измерение
БПКб целесообразно проводить для стоков, содержащих легко-
усвояемые загрязнения — углеводы, низшие спирты. Для стоков
химических производств, включающих большой спектр органиче-
ских загрязнений, лучше определять БПКп- Однако это опреде-
ление может быть затруднено тем, что по мере снижения кон-
центрации органических загрязнений начинают, протекать про-
цессы нитрофикации, для предотвращения которых используют
различные ингибиторы типа этилтиомочевины.
Стоки кислой и щелочной природы перед определением БПК
необходимо нейтрализовать. Высоко концентрированные стоки
перед анализом разбавляют, так как возможно ингибирование
повышенными концентрациями загрязнений.
Особое значение при измерении БПК имеет количество и
качество микрофлоры. Оптимальным вариантом при этом являет-
ся использование микрофлоры из уже работающих биологи-
ческих систем, адаптированной именно к данному спектру
загрязнений. Количество вносимой микрофлоры должно соответ-
ствовать ее концентрации в работающих очистных соору-
жениях.
Корректное соблюдение этих требований часто затруднено и
результаты измерений показателя БПК могут изменяться для
одной и той же группы сточных вод в зависимости от конкретных
условий проведения эксперимента.
Определение лишь одного из показателей качества сточной
воды (ХПК или БПК) не всегда позволяет оценить ее доступ-
ность для биологической очистки. Имеется целая группы соеди-
нений, определение ХПК для которых невозможно, хотя эти
соединения вполне доступны для биологического окисления, и
наоборот, для целого ряда стоков низкое значение ХПК еще не
гарантирует, что удастся полностью удалить загрязнения путем
биологической очистки. Ниже приводятся данные о доступности
некоторых органических соединений биологическому окислению
(мг О2/1 мг вещества) :
117
Органические соединения	ХПК	БПКь	БПК„
Метиловый спирт .	1,5	1,19	1,2
Этиловый спирт .	2,08	1,25	1,85
Бутиловый спирт . .	2,95	1,2	1,25
Муравьиная кислота	0,35	0,12	0,28
Уксусная кислота	1,07	0,77	0,86
Масляная кислота .	1,82	1.4	1,4
п-Аминофенол ...	1,0	0,0	0,0
Оксиметилфурфурол	0,0	0,71	1,0
Бензол ....	2,38	1,1	1,1
Целью очистки производственных сточных	ВОД	является	уда-
ление из них взвешенных и растворимых органических и неорга-
нических соединений до концентраций, которые не превышают
заранее регламентированные (ПДК). В зависимости от характе-
ра загрязнений и их концентраций возможно применение раз-
личных способов очистки сточных вод. Наиболее распространены
механические (отстаивание, фильтрация), механофизические
(коагуляция, нейтрализация с последующим отстаиванием),
физико-химические (ионный обмен, сорбция), термические и био-
химические методы. Каждый из перечисленных способов имеет
свои преимущества и недостатки, свои области применения, по-
этому чаще всего пользуются несколькими способами очистки,
что позволяет более полно извлекать загрязнения.
Биохимические способы очистки относятся к процессам био-
технологии, они получили широкое распространение в тех отрас-
лях промышленности, где в сточных водах содержится значи-
тельное количество разных загрязнений, каждое из которых при-
сутствует в небольших концентрациях. Главным действующим
началом биохимической очистки являются микроорганизмы,
использующие в качестве питательных веществ и источников
энергии органические и неорганические соединения, содержа-
щиеся в сточных водах. Микроорганизмы разрушают эти соеди-
нения до диоксида углерода и воды и создают в процессе минера-
лизации соли азотистой и азотной кислот.
Широкое использование биохимических способов очистки
сточных вод обусловлено следующими достоинствами метода:
а) возможностью удаления из сточной воды широкого спектра
органических загрязнений; б) самоподстраиваемостью системы к
изменению спектра и концентраций органических загрязнений;
в) простотой аппаратурного оформления; г) относительно невы-
сокими эксплуатационными затратами. К недостаткам следует
отнести: а) высокие капитальные затраты, идущие на сооруже-
ние очистных систем; б) необходимость строгого соблюдения
технологических режимов очистки; в) токсичность некоторых
органических соединений для биоценоза активного ила; г) не-
обходимость предварительного разбавления высококонцентриро-
ванных токсичных стоков, что приводит к увеличению потока
сточной воды.
Несмотря на недостатки, присущие биохимической очистке,
она достаточно широко распространена, и в последние годы по-
118
являются все новые разработки по интенсификации этого спо-
соба. В зависимости от того, в каких условиях — аэробных или
анаэробных — проводится обработка сточных вод, разработаны
два принципиально различных способа.
§ 2. Аэробные процессы биохимической очистки
сточных вод
Существуют две большие группы аэробных процессов био-
очистки — экстенсивные и интенсивные. К экстенсивным относят-
ся методы, непосредственно не связанные с управляемым культи-
вированием микроорганизмов — это поля орошения, поля филь-
трации, биопруды. Микроорганизмы, находящиеся в верхних
слоях почвы полей орошения и фильтрации или воде биопрудов,
образуют ценозы, за счет деятельности которых и происходит
очистка воды.
В основе интенсивных способов лежит деятельность актив-
ного ила или биопленки, т. е. естественно возникшего биоценоза,
формирующегося на каждом конкретном производстве в зависи-
мости от состава сточных вод и выбранного режима очистки.
Формирование биоценоза — процесс достаточно длительный и
идущий постоянно в ходе очистки сточной воды в промышленных
аппаратах — аэротенках или биофильтрах.
Активный ил представляет собой темно-коричневые хлопья,
размером до нескольких сотен микрометров; микроскопия показа-
ла, что он состоит на 70 % из ж-ивых организмов и около 30 %
составляют твердые частицы неорганической природы. Живые
организмы вместе с твердым носителем, к которому они прикреп-
лены, образуют зооглей — симбиоз популяций организмов, по-
крытый общей слизистой оболочкой. Причины возникновения
хлопьев активного ила не совсем понятны, зооглей может форми-
роваться за счет флокуляции или адгезии клеток на поверхности
носителя. Взаимодействие микроорганизмов в пределах одного
зооглея достаточно сложно и основой его служит по всей види-
мости, симбиотические взаимосвязи организмов разных популя-
ций.
Соотношение капсульных и бескапсульных форм клеток в иле
называется коэффициентом зооглейности kz.
Микроорганизмы, выделенные из активного ила, относятся
к различным родам: Actinomyces, Arthrobacter, Bacillus, Bacte-
rium, Corynobacterium, Desulfotomaculum, Micococcus, Pseudo-
monas, Sarcina и др.
Наиболее многочисленны бактерии рода Pseudomonas. Они
окисляют спирты, жирные кислоты, парафины, ароматические
углеводороды, углеводы и другие соединения. Широко представ-
лены в активном иле и бактерии рода Bacterium (выделено
более 30 видов), которые осуществляют деградацию нефти, пара-
финов, нафтенов, фенолов, альдегидов и жирных кислот. Алифа-
тические углеводороды окисляются представителями рода Bacil-
119
lus. Окислительная способность перечисленных микроорганизмов
для различных органических, соединений различна, и лишь для
бактерий рода Pseudomonas она практически одинакова для раз-
ных видов загрязнений (табл. 3).
В зависимости от внешней среды, которой в данном случае
является сточная вода, та или иная группа бактерий может ока-
заться преобладающей, а остальные становятся спутниками
основной группы.
Таблица 3. Скорость окисления органических веществ, мг/(гАСВ-ч ')
Группа микроорганизмов	Примеси в воде		
	алканы	спирты	жирные кислоты
Pseudomonas	12—22	16—20	20—30
Bacillus	8—16	10—16	12—20
Bacterium	10—16	12—18	16—30
При изменении состава сточной воды может увеличиться чис-.
ленность одного из видов микроорганизмов, однако другие куль-
туры, проигрывающие в конкурентной борьбе за субстрат, все
равно остаются в составе биоценоза. На взаимоотношения ми-
кроорганизмов ила влияют и продукты биосинтеза различных
групп: возможен не только симбиоз или антогонизм микроорга-
низмов, но также и взаимодействие их по принципу аменсализма,
комменсализма, нейтрализма. На формирование ценозов актив-
ного ила могут оказывать влияние сезонные колебания темпера-
туры (ведущие к преобладанию психрофильных форм микроор-
ганизмов в зимний период), обеспеченность кислородом и присут-
ствие в сточных водах минеральных компонентов. Роль всех этих
параметров при формировании активного ила делает процесс
достаточно сложным и практически невоспроизводимым: даже
для стоков, имеющих одинаковый состав, но возникающих в
разных регионах, невозможно получить одинаковые биоценозы
активного ила.
Существенная роль в создании и функционировании консор-
циума клеток принадлежит простейшим. Функции простейших
достаточно многообразны; сами они не принимают непосредст-
венного участия в потреблении органических веществ, но регули-
руют видовой и возрастной состав микроорганизмов в активном
иле, поддерживая его на оптимальном уровне. Поглощая боль-
шое количество бактерий, простейшие способствуют выходу зна-
чительного количества бактериальных экзоферментов, которые
могут концентрироваться в слизистой оболочке и принимать
участие в деструкции загрязнений.
В активных илах встречаются представители четырех классов
простейших: саркодовые (Sarcodina), жгутиковые инфузории
120
(Mastigophora), реснитчатые инфузории (Ciliata), сосущие инфу-
зории (Suctoria). Простейшие выбирают из смешанной культуры
бактерий лишь те виды, которые они усваивают. Одна инфузория
пропускает через свой организм от 20 до 40 тыс. бактерий за
сутки. Поедание старых ослабленных форм облегчает размноже-
ние оставшихся и приводит к появлению большого количества
молодых, биологически активных особей. При хорошей работе
очистных сооружений представители класса саркодовых (амебы
рода Amoeba) развиваются в активных илах в незначительных
количествах.
В активных илах высокого качества на 1 млн. бактериальных
клеток должно быть 10—15 простейших организмов, это соотно-
шение называется коэффициентом протозойности kp. Скорость
биохимического окисления растет с увеличением значения коэф-
фициентов зооглейности и протозойности. Следует отметить, что
простейшие очень чувствительны к присутствию в сточных водах
небольших концентраций определенных органических соедине-
ний; так, фенол и формальдегид уже в незначительных концен-
трациях угнетают их развитие.
Несколько иную картину представляет биоценоз, возникаю-
щий в биофильтрах. На поверхности загрузочного материала
биофильтра происходит образование биологической пленки: ми-
кроорганизмы прикрепляются к носителю и заполняют его по-
верхность. В отличие от биоценоза активного ила, количествен-
ный и видовой состав которого практически одинаков во всей
системе очистки, на разных уровнях биофильтра создаются свои
ценозы микроорганизмов, которые порой резко отличаются не
только количественно, но и качественным составом. Это вызвано
тем, что по мере прохождения сточной воды через биофильтр
за счет жизнедеятельности предыдущего ценоза меняется харак-
теристика органических загрязнений воды, попадающей на сле-
дующий уровень. При этом, естественно, сначала потребляются
более легкоусвояемые загрязнения и, следовательно, преимущест-
венно развивается микрофлора, усваивающая эти соединения
с большей скоростью. В свою очередь, сточная вода обогащается
продуктами жизнедеятельности этого ценоза. По мере дальней-
шего продвижения воды происходит потребление все более труд-
но усвояемых компонентов смеси и, следовательно, развиваются
другие микроорганизмы, способные их усваивать. В нижней
части таких биоценозов в большом количестве скапливаются
простейшие и другие организмы, которые функционируют за счет
потребления части биологической пленки, оторвавшейся с по-
верхности носителя. Созданный таким образом биоценоз спо-
собен практически полностью извлечь из сточной воды все орга-
нические примеси. Распределение основных групп микроорганиз-
мов по высоте биофильтра показано на рис. 2.
Формирование биоценозов очистных сооружений — процесс
достаточно длительный, протекающий практически независимо от
условий проведения очистки. Заселение очистных сооружений,
121
бактерии
(органический азот)
бактерии (ксилоза)
бактерии
(уксусная кислота)
плесени (ксилоза)
плесени
(уксусная кислота)
дрожжи
дрожжи
бактерии (уксусная кислота)
бактерии (ксилоза)
бактерии (органический азот)
плесени (ксилоза)
плесени (уксусная кислота)
расстояние от поверхности биофильтра, см
5-15	40-50
Рис. 2. Распределение микрофлоры в биофильтре при
очистке сточных вод гидролизного производства
работающих под открытым небом, происходит постоянно. Микро-
флора, содержащаяся в воде, воздухе, земле, при попадании в
очистные сооружения вступает в конкуренцию за субстрат с
представителями находящихся там других форм микроорганиз-
мов. В первую очередь, в биологических системах накапливаются
микроорганизмы, которые способны утилизировать данное орга-
ническое соединение или несколько органических соединений с
большей скоростью и при более низких концентрациях. Особое
место при этом занимает способность группы микроорганизмов
образовывать совместные популяции, объединенные общей обо-
лочкой. При работе очистных сооружений накапливаются микро-
организмы, возвращаемые в аэротенки из вторичных отстойни-
ков. Адаптация активного ила происходит постоянно, возникают
все новые и новые формы микроорганизмов, способные утилизи-
ровать данный спектр загрязнений.
В том случае, когда в очищаемых водах присутствует всего
несколько органических компонентов, изначальный активный ил
удается сформировать в лабораторных условиях. Но возникшие
таким образом ценозы микроорганизмов, состоящие, как пра-
вило, из небольшого количества отдельных видов, неустойчивы
при работе в естественных условиях и служат лишь начальным
звеном для образования естественного биоценоза очистных
сооружений.
В технологическом аспекте для образования естественных
ценозов систем очистки можно употреблять активный ил с уже
работающих очистных сооружений с аналогичным спектром за-
грязнений. При отсутствии действующих систем формирование
активного ила следует проводить с применением сточной воды,
значительно разбавленной водами местных хозяйственно-быто-
вых предприятий или водой из реки, при этом накопление естест-
венного ценоза происходит при постоянно увеличивающейся
концентрации основных загрязнений.
Как уже отмечалось, многие химические соединения могут
оказывать токсическое воздействие на микроорганизмы актив-
122
ного ила, нарушая их жизнедеятельность. Значительные кон-
центрации фенола, формальдегида и других антисептиков в сточ-
ных водах денатурируют белки протоплазмы, приводят к разру-
шению клеточной стенки. Особенно токсичны соли тяжелых ме-
таллов; по степени токсичности их можно расположить в следую-
щем порядке: Sb>Ag>Cu>Hg>Co>Ni>Pb>Cr>Cd>
>Zn>Fe.
Отрицательное воздействие на развитие активного ила ока-
зывает и повышенная концентрация неорганических солей в сточ-
ных водах. Например, концентрация хлоридов до 30 г/л резко
снижает качество очистки сточной воды.
Эффективного управления процессом биологической очистки
можно достичь лишь при правильном подборе параметров про-
цесса, обеспечивающих необходимую полноту извлечения загряз-
нений. Основными параметрами, влияющими на биологическую
очистку, являются: температура, pH, концентрация растворенно-
го кислорода, уровень перемешивания, концентрация и возраст
циркулирующего в очистных системах активного ила, наличие в
воде токсичных примесей.
Температура. Большинство очистных сооружений аэробного
типа работают под открытым небом и не предусматривают систе-
мы регулирования температуры. Изменение температуры в них
происходит циклически, в зависимости от времени года и кли-
матических условий температура может колебаться от 2—5 до
25—35°С. Эти колебания в первую очередь влияют на состав
биологического ценоза — с понижением температуры до 10—15°С
происходит преимущественное развитие психрофильных форм
микроорганизмов, снижается общее количество представителей
микрофлоры и микрофауны. Скорость процессов очистки также
существенно уменьшается: снижение температуры от 20 до 6°С
приводит к падению скорости очистки в 2 раза; одновременно
с этим снижается и флокулирующая способность микроорганиз-
мов, что приводит к вымыванию активного ила из систем вторич-
ных отстойников. Для интенсификации работы очистных соору-
жений в зимнее время необходимо повысить концентрацию ак-
тивного ила в сточных водах, а также увеличить время пребыва-
ния сточных вод в системе очистки.
Изменение температуры от 20 до 37°С повышает скорость
очистки в 2—3 раза, в биоценозе преимущественно развиваются
мезофильные и термофильные формы микроорганизмов, воз-
растает и полнота очистки. Однако излишний нагрев очистных
сооружений приводит не только к интенсификации процессов
очистки, но и к одновременному снижению растворимости кисло-
рода в воде, что заставляет интенсифицировать процесс аэрации.
Снижение температуры, наоборот, позволяет несколько умень-
шить аэрирование сточных вод.
Значение pH. Бактериальные формы лучше растут в ней-
тральной или слабо щелочной среде, для большинства грибов и
дрожжей оптимальное значение pH 5,0—6,5. Так как в ценозах
123
активного ила в основном присутствуют бактерии, то соответ-
ственно и значение pH в воде очистных сооружений должно быть
близким к оптимальному для этой группы микроорганизмов.
Наилучшим значением pH для систем биологической очистки
считается область от 5,5 до 8,5, увеличение или снижение кон-
центрации ионов водорода приводит к резкому снижению эффек-
тивности работы очистных сооружений. Однако, как правило,
при проведении биологической очистки не регулируется pH. Это
объясняется, в первую очередь, большими объемами очищаемой
воды и тем, что микроорганизмы способны к авторегулирова-
нию pH. При создании систем биологической очистки рекомен-
дуется использовать сточные воды с различными значениями pH
так, чтобы после их смешения суммарное значение pH оказалось
бы в области, близкой к оптимуму.
Концентрация растворенного кислорода. Скорость растворе-
ния кислорода в сточной воде не должна быть ниже скорости
его потребления микроорганизмами активного ила. Это требова-
ние обусловлено тем, что для кислорода, как и для всякого суб-
страта, наблюдается влияние его концентрации на скорость роста
микроорганизмов, описываемое зависимостью, аналогичной урав-
нению Моно. Снижение концентрации растворенного кислорода
ниже некоторого предельного значения приводит к снижению
скорости роста ила и, следовательно, к снижению скорости
очистки. Трудность регулирования аэрации заключается в том,
что в данном случае приходится иметь дело не с отдельным
микроорганизмом, а с целым консорциумом, дыхательные харак-
теристики которого могут меняться в зависимости от -того, какие
формы микроорганизмов преобладают в нем в данных условиях.
Исследования показали, что при концентрации растворенного
кислорода до 1 мг/л не происходит существенного изменения
скорости очистки, однако при концентрации до 0,5 мг/л процесс
очистки ухудшается. Поэтому рекомендуется поддерживать коли-
чество растворенного кислорода в интервале от 1 до 5 мг/л.
Уменьшение концентрации растворенного кислорода в воде
приводит не только к ухудшению потребления органических за-
грязнений, но и вызывает накопление продуктов жизнедеятель-
ности микроорганизмов. Одновременно в активном иле могут раз-
виваться и нитчатые формы бактерий Sphaerotilus nataus, кон-
центрация которых при нормальной работе очистных сооружений
невелика. Их развитие приводит к ухудшению седиментации
активного ила во вторичном отстойнике и выносу его из системы
очистки, т. е. к снижению общего количества активного ила,
функционирующего в очистных сооружениях.
Перемешивание сточной воды и активного ила в аэратенке.
Этот процесс обеспечивает поддержание активного ила во взве-
шенном состоянии, создает благоприятные условия для массопе-
реноса компонента питания и кислорода. Интенсификация пере-
мешивания (до известных пределов) приводит к разрушению
слишком крупных хлопьев активного ила на более мелкие, что
124
в целом способствует увеличению поверхности контакта микро-
организмов со средой. При этом уменьшение размеров хлопьев
не сказывается отрицательно на скорости осаждения, хотя коли-
чество свободных клеток и простейших становится меньше.
Биогенные элементы. Кроме углерода микроорганизмам для
нормального функционирования необходимы азот и фосфор. Оба
этих элемента являются составными частями при построении кле-
точного материала и играют существенную роль в энергетиче-
ских процессах, протекающих в клетках. Недостаток азота или
фосфора резко снижает эффективность процесса очистки и так
же, как и дефицит кислорода, приводит к накоплению нитчатых
форм бактерий. Количество азота и фосфора, необходимое ми-
кроорганизмам для нормального функционирования, определя-
ется видом органических соединений, присутствующих в сточ-
ных водах, его можно рассчитать теоретически.
Наряду с азотом и фосфором микроорганизмы нуждаются в
других биогенных элементах, которые, как правило, присутствуют
в сточных водах в достаточном количестве; к ним относятся
магний, калий, натрий и др. Ниже приведены данные о потребно-
сти в биогенных элементах, полученные при эксплуатации очист-
ных сооружений некоторых предприятий:
Производство — источник стоков	Соотношение БПК:М:Р
Производство: синтетических жирных кислот поливинилацетатных пластмасс изопренового каучука . . синтетического глицерина целлюлозно-бумажное нефтеперерабатывающий завод нефтехимический завод . нефтемаслозавод	100:3:0,8 100:3,9:0,8 100:3,3:0,9 100:5:1,2 100:5:1 100:1:1 100:5.1,3 100:7:1,5
Приведенное соотношение биогенных элементов отражает
только то их количество, которое тратится клетками при потреб-
лении указанного типа органических загрязнений. Здесь не учте-
но то, что и азот, и фосфор в недостаточных концентрациях так
же, как и кислород, могут лимитировать скорость процесса
очистки и, следовательно, их концентрация в среде должна быть
несколько выше той, которая рассчитана, исходя из структуры
и концентрации загрязнителя. В случае нехватки биогенных эле-
ментов в очищаемых сточных водах необходимо добавлять раз-
личные водорастворимые соли, содержащие эти элементы. Как
правило, для этих целей применяют сульфат и нитрат аммония,
мочевину, аммиачную воду, аммофос, суперфосфат, ортофосфор-
ную кислоту и т. д. Соли, используемые в качестве добавок
биогенных элементов, не должны образовывать между собой
нерастворимые в воде соединения и не должны резко менять зна-
чение pH.
125
В качестве добавок биогенных элементов при очистке произ-
водственных стоков можно использовать также фекальные сточ-
ные воды, содержащие азот и фосфор в большом избытке, при
этом снижается концентрация синтетических органических за-
грязнений, что целесообразно, если они являются ингибиторами
роста активного ила.
Доза и возраст активного ила. Эффективность работы очист-
ных сооружений зависит не только от условий обитания микро-
организмов, но и от их концентрации в сточных водах и от воз-
раста активного ила. В обычных очистных сооружениях типа
аэротенка текущая концентрация активного ила не превышает
2—4 г/л. Увеличение концентрации активного ила в сточной воде
приводит к росту скорости очистки, но требует усиления аэра-
ции для поддержания концентрации кислорода на нелимитирую-
щем уровне. Создание повышенных концентраций активного ила
возможно путем его частичного возврата из вторичных отстой-
ников, однако удобнее использовать другие системы концентри-
рования, например флотацию. Если определение концентрации
активного ила не вызывает каких-либо затруднений, то возраст
активного ила экспериментально оценить затруднительно. Под
возрастом активного ила Т понимают время его рециркуляции
в системе очистных сооружений, которое можно найти по фор-
муле
т . КЛср
где V — объем аэратенка, м3; Хср — средняя концентрация актив-
ного ила, кг/м3; QCT — расход сточной воды, м3/ч;	— скорость
прироста активного ила, кг/(м3-ч).
Уменьшение среднего возраста активного ила в очистных со-
оружениях приводит к возрастанию эффективности их работы:
«молодой» активный ил более'рыхлый, он имеет хлопья меньшего
размера, более низкое содержание простейших; одновременно с
этим осаждаемость «молодого» активного ила в системах вто-
ричных отстойников несколько лучше.
Техническая реализация аэробных способов очистки. Аэроб-
ный способ очистки сточной воды основан на использовании си-
стемы аппаратов аэротенк — вторичный отстойник. Аэротенк
представляет собой открытое железобетонное сооружение, через
которое пропускается сточная вода, содержащая органические
загрязнения и активный ил. Суспензия ила в сточной воде на
протяжении всего времени нахождения в аэротенке подвергается
аэрации воздухом. В зависимости от способа смешения суспензии
активного ила с очищаемой водой и гидродинамического режима
движения суспензии активного ила аэротенки делятся на аэро-
тенк-вытеснитель, аэротенк-смеситель и аэротенк сложного типа.
Появившиеся недавно аппараты аэробной очистки с использова-
нием иммобилизованных клеток активного ила будут рассмотре-
ны отдельно.
126
В аэротенке-вытеснителе (рис. 3, а) свежая порция активного
ила и очищаемая вода одновременно подаются в аппарат и далее
происходит движение суспензии активного ила по аппарату в
режиме, приближающемся к идеальному вытеснению. В аэро-
тенке-смесителе (рис. 3, б) активный ил и очищаемая сточная
вода поступают по всей длине аппарата одновременно и в аппа-
рате создается режим, близкий к полному смешению, одновре-
менно из- аппарата отводится суспензия активного ила. В аппа-
ратах сложного типа (рис. 3, в) на разных этапах очистки одно-
временно реализуются и режим смешения, и режим вытеснения.
Различия в гидродинамических режимах аэротенков в первую
очередь влияют на физиологическое состояние популяции микро-
организмов и, следовательно, на скорость и глубину потребления
субстрата, которым являются загрязнения, из сточной воды.
иловая
смесь
Рис. 3. Схемы аэротенков:
а — вытеснения; б — смешения; в —с рассредоточенной подачей сточной воды
и с регенератором активного нла
127
Развитие популяции микроорганизмов в аэротенке-вытесните-
ле происходит по законам тубулярной культуры. Если предполо-
жить, что каждая порция суспензии активного ила мало смеши-
вается с предыдущей и последующей порциями, можно выделить
элементарный объем суспензии активного ила, который движется
по аэротенку-вытеснителю. Развитие микроорганизмов в этом
объеме определяется законами периодического роста. Но надо
учитывать, что активный ил представляет собой сложный кон-
гломерат микроорганизмов и на каждом участке скорость его
развития и физиологическое состояние будут определяться со-
ставом культуральной среды, которая образовалась к данному мо-
менту. Поступивший из вторичного отстойника активный ил
имеет определенный исходный состав популяции; в начале, после
контакта с очищаемой водой, развиваются те формы микроорга-
низмов, которые потребляют наиболее легко усвояемые компо-
ненты загрязнения. В результате концентрация загрязнений в
сточной воде по мере ее продвижения по аппарату снижается
и одновременно в активном иле увеличивается концентрация
соответствующих клеток.
Остальные формы микроорганизмов на .данной стадии либо
продолжают оставаться в лаг-фазе, либо потребляют субстрат,
но с меньшей скоростью. При достижении концентраций легко-
усвояемого компонента, лимитирующих рост, начинают потреб-
ляться другие типы субстратов. Преимущество в развитии по-
лучают другие группы микроорганизмов; первая группа перехо-
дит из экспоненциальной фазы развития в стационарную. При
снижении концентраций всех компонентов сточной воды до мини-
мальных процесс развития популяции останавливается; видовой
и количественный состав активного ила, если не учитывать по-
стоянно идущую автоселекцию, возвращается к начальному со-
стоянию.
К достоинствам этого аппаратурного решения следует отнести
то, что такой процесс при его достаточной длительности позво-
ляет практически полностью извлечь все загрязнения из сточной
воды. К недостаткам относится то, что микроорганизмы актив-
ного ила в начальный момент очистки контактирует со сточной
водой, содержащей максимальное количество органических за-
грязнений. Это заставляет использовать сточную воду с невысо-
кими начальными концентрациями загрязнений (как правило,
ХПК не должно превышать 200—400 млг/л). По этой же причине
очистная система крайне чувствительна к резким увеличениям
или колебаниям начальной концентрации загрязнений.
Этих недостатков лишен аэротенк-смеситель, поскольку сточ-
ная вода, попадая в аэротенк, практически мгновенно распре-
деляется по объему, при этом концентрация загрязнений снижа-
ется до стационарных значений. Развитие популяции микро-
организмов в аэротенке-смесителе происходит по тем же законам,
что и развитие микроорганизмов в хемостате. В данном слу-
чае активный ил не ингибируется повышенными концентрациями
128
загрязнений, но и остаточная концентрация вредных веществ
всегда будет оставаться на каком-то определенном уровне. Все
микроорганизмы, находящиеся в аэротенке-смесителе, работаю-
щем в стационарном режиме, находятся в фазе лимитирован-
ного роста.
В аэротенках сложного типа сочетаются оба способа прове-
дения процесса. В первой зоне аппарата, где происходит кон-
такт высококонцентрированных стоков с активным илом, доби-
ваются режима, приближающегося к полному смешению, во вто-
рой части — для достижения большей полноты извлечения
загрязнений из сточной воды — создают режим потока, прибли-
жающийся к идеальному вытеснению. К аппаратам такого типа
относится, в частности, аэротенк с рассредоточенной подачей
сточной воды и сосредоточенной подачей активного ила.
Технологические схемы очистки сточной воды с использова-
нием системы аэротенк — вторичной отстойник могут быть раз-
личными, но многие их элементы являются обязательными. Вы-
бор конкретной схемы определяется рядом факторов: расходом
сточной воды, составом и концентрацией загрязнений, требова-
ниями к качеству очищенной воды и т. п.
Как правило, схема аэробной биологической очистки вклю-
чает в себя следующие стадии: а) усреднение и осветвление сточ-
ных вод от механических примесей (усреднители, песколовки,
отстойники); б) аэробная биологическая очистка осветленных
сточных вод (аэротенки, регенераторы активного ила, вторичные
отстойники); в) доочистка сточных вод (биологические пруды,
фильтровальные станции); г) обработка осадков (иловые пло-
щадки, сушилки, печи и т. д.).
На практике применяются одноступенчатые и многоступенча-
тые системы биологической очистки. Одноступенчатая схема
очистки сточной воды представлена на рис. 4. Сточные воды
аммиак
вода на разбавление
осадок
возвратный А И
избыточный
биологически
очищенная
вода
Рис. 4. Принципиальная схема очистных сооружений:
/ — песколовки; 2 — усреднитель; 3 — первичные отстойники; 4 — аэротенк; 5 — вторич-
ные отстойники; 6 — биологические пруды; 7 — осветление; 8— реагентная обработка
129
предприятия поступают в усреднитель, где происходит интенсив-
ное перемешивание стоков с различным качественным и коли-
чественным составом. Перемешивание, как правило, осуществля-
ется за счет барботажа воздуха. В случае необходимости в
усреднитель также подаются биогенные элементы в нужных
концентрациях и аммиачная вода для создания определенного
значения pH. При концентрации в сточной воде примесей выше
предельно допустимой по данным соединениям в усреднитель
дополнительно подают биологически очищенную воду. Время
пребывания сточной воды в усреднителе определяется эмпириче-
ски и, как правило, составляет несколько часов.
При очистке фекальных стоков и отходов нефтепереработки
необходимым элементом очистных сооружений является система
механической очистки — песколовки и первичные отстойники.
В них происходит отделение от очищаемой воды грубых взвесей
и нефтепродуктов, образующих пленку на поверхности воды.
При очистке стоков химических предприятий с небольшим ко-
личеством такого рода загрязнений эта стадия очистки необя-
зательна. Напротив, в некоторых других случаях для интен-
сификации процессов механической очистки воду перед подачей
в первичные отстойники дополнительно аэрируют в пред-
аэраторах.
Стадия собственно биологической очистки происходит в аэро-
тенках, хотя частичное изменение ХПК и БПК наблюдается уже
и на предшествующих этапах. К системе биологической очистки
относятся не только аэротенк и вторичный отстойник, но и реге-
нератор активного ила, который представляет собой часть аэро-
тенка, куда подается только суспензия возвратного активного
ила и не подается вода. Интенсивная аэрация суспензии актив-
ного ила кислородом в этой зоне приводит к восстановлению
его способности сорбировать органические примеси, которые
трудно утилизируются микроорганизмами активного ила. Объем
регенератора при совмещении его с аэротенком, как правило, не
превышает трети объема основного аппарата.
Очищенная вода и активный ил из аэротенка подаются во
вторичный отстойник, где происходит отделение активного ила
от воды. Часть активного ила вновь возвращается в систему
очистки, а избыточный активный ил, образовавшийся в резуль-
тате роста микроорганизмов, поступает на иловые площадки с
последующим вывозом его после обезвоживания на поля. В по-
следнее время разрабатываются и другие способы использования
активного ила.
Система более полной биологической доочистки может состо-
ять из множества элементов, которые определяются дальнейшим
назначением сточной воды. Возможно применение биологических
прудов, где биологически очищенная вода проходит дальнейшее
осветление и насыщается кислородом. Часто вода осветляется
с помощью различных механических систем, например песчано-
гравийных фильтров. В некоторых случаях воду после биологи-
130
ческой очистки подвергают реагентной обработке — хлорирова-
нию или озонированию.
Общее время пребывания сточной воды в системах биологиче-
ской очистки складывается из времени нахождения непосредст-
венно в аэротенке и во вторичном отстойнике. Для определения
продолжительности этих периодов существует целый ряд эмпири-
ческих формул, которые, как правило, не отражают всего много-
образия процессов, протекающих в аэротенке. Достаточно хоро-
шей математической модели биологической очистки сточной воды
пока не создано ввиду сложности симбиотического взаимодейст-
вия микроорганизмов активного ила, а также сложности и
невоспроизводимости состава сточных вод.
Интенсификацию процессов биологической очистки можно
проводить путем аэрации суспензии активного ила чистым кисло-
родом, так как экспериментально было показано, что при прове-
дении большинства аэробных процессов именно этот компонент
питания является лимитирующим. Применение это позволяет
увеличить эффективность процесса биологической очистки и сни-
зить время пребывания сточной воды в системе. Однако реали-
зация такой схемы ставит вопрос полноты использования кисло-
рода. Для его решения были разработаны аппараты закрытого
типа — окситенки, с принудительной аэрацией сточной воды.
Отмечено, что одновременно с повышением эффективности при-
менения кислорода происходит избыточное накопление в среде
культивирования СО2, который необходимо периодически отду-
вать. Схема окситенка представлена на рис. 5.
Увеличение скорости окисления органических соединений в
системах биологической очистки с использованием чистого кис-
лорода достигается не только за счет создания условий, когда
он перестает быть лимитирующим фактором процессов роста, но
и за счет увеличения концентраци активного ила в аппарате
и интенсификации ферментативных процессов деструкции с учас-
тием экзоферментов, находящихся в слизистой оболочке клеток
и хлопьев.
Рис. 5. Окситенк
131
Усложнение аппаратурного оформления процесса компенси-
руется при этом резким сокращением площадей, занимаемых
системой водоочистки, что является существенным преимущест-
вом окситенков. В целом схема очистки стоков в окситенках
практически не отличается от рассмотренной общей схемы
аэробной очистки сточной воды.
Очистка сточной воды с использованием биофильтров. В от-
личие от аэротенков в биофильтрах клетки микроорганизмов
находятся в неподвижном состоянии, так как прикреплены к по-
верхности пористого носителя. Образовавшуюся таким образом
биопленку можно отнести к иммобилизованным клеткам. Хотя в
этом случае иммобилизована не монокультура, а целый консор-
циум, неповторймый по своему качественному и количественному
составу и различающийся в зависимости от места его нахожде-
ния на поверхности носителя. Это, главным образом, и обуслов-
ливает те закономерности, по которым протекает процесс извле-
чения загрязнений из сточной воды. Очищаемая вода контакти-
рует с неподвижным носителем, на котором иммобилизованы
клетки, и за счет их жизнедеятельности происходит снижение
концентрации загрязнителя. Существенной проблемой при реали-
зации процесса водоочистки с использованием биофильтров яв-
ляется то, что проконтролировать содержание кислорода на каж-
дом уровне биофильтра не представляется возможным, поэтому
нельзя с определенностью говорить о строго аэробном способе
очистки.
Преимущество применения биофильтров состоит в том, что
формирование конкретного биоценоза приводит к практически
полному удалению всех органических примесей. Недостатками
этого метода можно считать: нереальность использования стоков
с высоким содержанием органических примесей (начальное зна-
чение по ХПК не должно превышать 500—550 млг/л, в против-
ном случае возможно полное или частичное уничтожение актив-
ной пленки); необходимость равномерного орошения поверхности
биофильтра сточными водами, подаваемыми с постоянной ско-
ростью; сточные воды перед подачей на биофильтры должны
быть очищены от взвешенных частиц, в противном случае капил-
лярные каналы биофильтра очень быстро забьются и произойдет
заиливание.
В качестве загружаемого твердого материала можно исполь-
зовать керамику, щебень, гравий, керамзит, металлический или
полимерный материал с высокой пористостью. Классификация
биофильтров производится в зависимости от способа и вида за-
грузочного материала и от режима подачи жидкости.
Существенным признаком конструкции является и режим
аэрации воды, по которому все биофильтры можно разделить
на аппараты с принудительной и естественной циркуляцией.
В обоих случаях в биофильтрах наблюдается режим противо-
тока воды, которая поступает сверху вниз, и воздуха, который
поступает снизу вверх. К сожалению, наличие такого режима не
132
способствует процессам очистки, так как наиболее интенсивно
развивающиеся микроорганизмы, потребляющие легкоусвояемые
субстраты, контактируют с воздухом, обедненным по кислороду
и насыщенным СОг. Схема биофильтра показана на рис. 6.
Технологические схемы с использованием биофильтров мало
отличаются от схем очистки с применением аэротенков, главное
различие заключается в том, что оторвавшиеся частицы микроб-
ной пленки после отделения их во вторичном отстойнике не воз-
вращаются обратно в биофильтр, а отводятся на иловые пло-
щадки.
Принцип вытеснения жидкости с одновременной фиксацией
клеток микроорганизмов в иммобилизованном состоянии положен
и в основу работы аэротенков-вытеснителей с применением стек-
лоершей. Стеклоерши погружают в аэрируемую сточную воду и
на их поверхности происходит накопление биоценоза активного
ила. Последний при этом так же, как и при работе с биофильт-
рами, развивается на каждом участке ершей неодинаково и изме-
няется в объеме как по количественному, так и качественному
составу.
Существенным отличием системы с иммобилизованными на
стеклоершах клетками от биофильтров является то, что в этом
случае можно интенсифицировать процесс массопереноса кисло-
рода. Предполагается, что такая система найдет широкое приме-
нение в очистке локальных стоков, под которыми понимают стоки
производств с узким спектром загрязнений. Их целесообразно
очищать в самостоятельных биологических системах, не смеши-
вая со стоками других производств. Это позволяет получать в
биологических системах очистки биоценозы микрооорганизмов,
адаптированные именно к данному узкому спектру загрязнений;
при этом скорость очистки и ее эффективность резко возрастают.
Несмотря на очевидную необходимость создания интенсивных
методов биологической очистки водных выбросов, до сих пор
широко применяются и экстенсивные способы. К ним относятся
биологические пруды, поля орошения, поля фильтрации.
Пруды с искусственной или естественной аэрацией также
относятся к сооружениям биологической очистки, в которых
под воздействием биоценоза активного ила происходит окисле-
133
ние органических примесей. Формирование биоценоза происходит
при этом в известной мере аналогично формированию их в
очистных сооружениях интенсивной очистки, однако во многом
их формирование специфично. Состав биоценозов биологических
прудов определяется глубиной нахождения данной группы ми-
кроорганизмов. Так, в верхних слоях, где насыщение воды кисло-
родом максимально, развиваются, в основном, аэробные культу-
ры; в придонных слоях преобладают факультативные аэробы,
могут здесь развиваться и анаэробные формы микроорганизмов,
способные осуществлять процессы метанового брожения или вос-
становление сульфатов.
Насыщение воды кислородом происходит, в основном, за счет
процессов фотосинтеза, осуществляемых водорослями, из кото-
рых особенно широко представлены Chlorella, Scenedesmus,
Ankistrodesmus, встречаются представители эвгленовых, воль-
воксовых и др. Помимо водорослей и бактерий в прудах в
той или иной степени представлены и микро- и макрофауна:
простейшие, черви, коловратки, насекомые и другие ор-
ганизмы.
Особую роль играют биопруды в процессах окончательной
очистки стоков после очистных сооружений, когда остающиеся
примеси осложняют процесс дальнейшей утилизации вод. При-
менение биологических прудов позволяет практически полностью
удалять остаточные количества многих соединений. Использу-
ются пруды и непосредственно для очистки без предварительных
стадий, причем качество очистки воды и в этом случае очень вы-
соко; хорошо удаляются нефтепродукты, фенолы и другие орга-
нические соединения из воды.
Существенным недостатком биологических прудов, кроме пол-
ной неуправляемости процесса, является то, что скорость окисле-
ния органических соединений в них очень незначительна. Это
приводит к тому, что время пребывания воды в биологических
прудах составляет несколько суток и при очистке только этим
способом сточных вод крупнотоннажных производств пришлось
бы Занимать огромные площади очистными водоемами.
Поля фильтрации и орошения также используются для очист-
ки сточных вод, при этом первые служат только для целей очист-
ки, на них подается максимально возможное количество жидко-
сти. Поля орошения предназначены для выращивания сельско-
хозяйственных продуктов, и вода на них подается по мере необ-
ходимости.
Процесс самоочищения воды осуществляется в этих случаях
за счет жизнедеятельности различных групп почвенных организ-
мов — бактерий, грибов, водорослей, простейших, червей и чле-
нистоногих; на поверхности почвенных комочков образуется био-
логическая пленка.
Решающим фактором, влияющим на формирование почвен-
ного биоценоза, является структура почвы. Расположение микро-
организмов на поверхности почвенных комочков должно, в прин-
134
ципе, приводить к тому, что максимальное удельное количество
микрофлоры будет в тех почвах, размер частиц которых меньше.
На практике это не так, уменьшение размера частиц почвы за-
трудняет диффузию кислорода из воздуха, а других способов
обогащения среды кислородом нет. Проникновение кислорода
в почву ограничивается 20—30 см, поэтому самая интенсивная
минерализация органических соединений наблюдается только в
поверхностных слоях.
Существенную роль в процессах очистки сточных вод на по-
лях фильтрации и орошения играют нитрифицирующие бактерии.
В летний период на 1 га площади образуется до 70 кг нитратов,
которые с током жидкости поступают в нижние горизонты, где
господствуют анаэробные условия. Кислород нитратов у денитри-
фицирующих бактерий идет на окисление сохранившихся в воде
органических соединений. Хотя дефицит площадей не позволяет
в настоящем и будущем широко использовать поля орошения
и фильтрации, этот экстенсивный способ очистки сточных вод
еще находит применение из-за своей простоты.
$ 3. Анаэробные процессы переработки отходов
Анаэробные способы очистки применяются, как правило, для
сбраживания высококонцентрированных стоков и осадков, со-
держащих большое количество органических веществ. Процессы
брожения осуществляются в специальных аппаратах — метан-
тенках.
Для описания процесса распада органических веществ ис-
пользуется схема, предложенная Баркером. По этой схеме про-
цесс брожения состоит из двух стадий — кислой и метановой.
Каждая из этих стадий осуществляется определенной группой
микроорганизмов, кислая — органотрофами, метановая — лито-
трофами. Обе эти группы присутствуют в метантенке одновре-
менно, поэтому кислото- и газообразование протекают парал-
лельно. В нормально работающем метантенке появляющиеся
при кислом брожении продукты успевают переработаться бак-
териями второй фазы, и в целом процесс протекает в щелочной
среде.
Формирование микрофлоры метантенка происходит за счет
микроорганизмов, попавших вместе со сточными водами или
осадком. По видовому составу биоценоз метантенков значительно
беднее аэробных биоценозов, из них выделено лишь около 50 ви-
дов бактерий, способных осуществлять первую стадию расщеп-
ления загрязнений — стадию кислотообразования. Среди них
присутствуют представители бацилл (Вас. cereus, Вас. megate-
rium, Вас. subtilis), псевдомонад (Ps. aeraginosa, Sarcina).
Наряду с облигатными анаэробами в метантенке могут встре-
чаться и факультативные анаэробы. Общее количество бактерий
в осадке колеблется от 1 до 15 млг/мл. Конечным продуктом про-
цесса брожения этой группы микроорганизмов являются низшие
жирные кислоты, диоксид углерода, ионы аммония, сероводород.
135
Образовавшиеся на первой стадии продукты брожения под-
вергаются дальнейшим превращениям, в результате которых в
значительном количестве образуются метан и диоксид углерода.
Основная роль во второй стадии брожения принадлежит метан-
образующим бактериям, которые относятся к строгим анаэробам.
Морфологически метанобразующие бактерии весьма разнообраз-
ны, среди них есть кокки, сарцины, палочки (Methanococcus,
Methanosarcina, Methanobacterium). Процесс образования мета-
на необходим бактериям для получения энергии, другие способы
получения энергии у них неизвестны.
В результате жизнедеятельности биоценоза метантенка
происходит снижение концентрации органических загрязнений
в отходах или сточных водах с одновременным образованием
биогаза. В состав биогаза входят метан и диоксид углерода,
общее количество и процентное соотношение компонентов био-
газа во многом определяется исходным составом сбраживаемой
среды. Так, при распаде 1 г жироподобных веществ в среднем
образуется 1200 мл газа состава (в %): СН4— 68, СО2— 32.
При распаде углеводоподобных соединений образуется около
800 мл газа из одного грамма, состав газа при этом (в %):
СН4— 50, СО2— 50. Различным является и предел сбраживания
различных органических соединений, например жироподобные
вещества сбраживаются на 70, а углеводоподобные на 62,5 %.
Предел сбраживания был найден экспериментально, по-видимо-
му, если дальнейшее разложение органического вещества и имеет
место, то оно не приводит к образованию газа.
Как и при проведении процессов аэробной очистки сточных
вод, содержание многих компонентов в среде метантенка не
должно превышать определенных концентраций, выше которых
происходит ингибирование процессов брожения. Предельно до-
пустимые значения концентраций токсичных веществ приведены
ниже (мг/л):
Ацетон	800	Свинец	50
Бензол	200	Медь	25
Толуол ...	200	Хром III .	25
Амиловый спирт .	100	Хром VI .	3
Существенную роль в интенсивности газообразования и уве-
личении скорости деградации отходов играет перемешивание. Так
как в большинстве своем сбраживаемые жидкости содержат в
большом количестве взвешенные вещества, то при определенных
режимах перемешивания возможно частичное оседание их на дно
метантенка. При увеличении интенсивности перемешивания с
3 до 5 об/мин увеличение выхода биогаза незначительно, в сред-
нем на 12—15 %, при полностью отключенном перемешивании
выход биогаза за сутки снижается почти в 3 раза.
Существенную роль при проведении метанового брожения
играет и температурный режим; различают мезофильный
(30—35°С) и термофильный (50—60°С) режимы сбраживания.
136
В последнем случае скорость распада органических соединений
увеличивается и, как следствие, возрастает доза суточной загруз-
ки в метантенк. Трудность технологического осуществления
процесса получения биогаза определяется, в первую очередь, тем,
что метановое брожение, как и всякий анаэробный процесс,
практически неуправляем и идет с очень низкой скоростью,
а расход энергии, потребляемой клеткой на биосинтез, практи-
чески постоянен как в аэробных, так и в анаэробных условиях.
Конструктивное оформление метантенков весьма разнообраз-
но; в общем случае это строго герметичный ферментер объемом
до нескольких кубических метров с перемешиванием и рубашкой
для обогрева. Метантенк обязательно должен быть оборудован
газоотделителями с противопламенными ловушками. Как прави-
ло, метантенки работают в периодическом режиме загрузки отхо-
дов или сточных вод с постоянным отбором биогаза и выгрузкой
твердого осадка по мере завершения процесса. С осадком из
метантенка удаляется и часть имеющихся в нем микроорганиз-
мов. Это приводит к увеличению времени сбраживания следую-
щей порции. Обеспечение задержки клеток в объеме аппарата
при его разгрузке позволяет значительно интенсифицировать
процесс и увеличить выход газа. Для этого используются спе-
циальные конструкции метантенков, одна из которых показана
на рис. 7.
Рядом работ показана целесообразность применения метан-
тенков не только для сбраживания осадков и избыточного актив-
ного ила, но и в качестве первой ступени очистки высококон-
центрированных стоков, с последующей их аэробной доочисткой.
В целом, активное использование метаногенеза при сбражива-
нии органических отходов является, по современным представле-
ниям, одним из наиболее перспективных путей совместного реше-
ния экологических и энергетических проблем, который позволяет,
например, агропромышленным комплексам перейти на практиче-
ски полностью самостоятельное энергоснабжение. Интенсифика-
ция и оптимальное технологическое оформление процессов ме-
таногенеза — одна из важных задач современной промышлен-
ной биотехнологии.
137
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Завершая рассмотрение технологических процессов промыш-
ленной биотехнологии, целесообразно остановиться на наиболее
перспективных путях развития этой отрасли народного хозяйст-
ва. Изложенные выше, в том числе и в книге 5, основы промыш-
ленного оформления процессов микробиологического синтеза
иллюстрируют не только очевидные достоинства новых методов
производства, основанных на применении биологических объек-
тов, "но и целый ряд недостатков и трудностей.
Само появление промышленной биотехнологии как новой от-
расли промышленности, с одной стороны, явилось результатом
научно-технического прогресса, а с другой — в огромной степени
стимулировало развитие нового поколения научных и технологи-
ческих направлений. Промышленное применение биологических
способов производства основано на фундаментальных достиже-
ниях биохимии и микробиологии, которые позволили обеспечить
надежную эксплуатацию клеточных популяций и биополимеров—
ферментов для производства необходимых человеку продуктов,
прежде всего биологически активных веществ. Как уже отмеча-
лось, колоссальные и во многом непредсказуемые' перспективы
открываются в этой области в связи с интенсивной разработкой
методов генетической и клеточной инженерии, эффективность
которых для практики уже доказана.
Вместе с тем использование биообъектов в столь широком
промышленном масштабе поставило большое количество разно-
образных задач, часть из которых требует разработки специфи-
ческих подходов для их решения. Прежде всего отметим, что
опыт создания, пуска и эксплуатации промышленных биотехно-
логических процессов показывает необходимость качественно
нового уровня знаний о физиологии одноклеточных и свойст-
вах клеточных популяций, потребность в которых просто не воз-
никала до начала промышленного производства антибиотиков,
белка, аминокислот и т. д. По существу, речь идет о разработке
теоретических основ промышленной биотехнологии, включающих
в себя качественные и количественные закономерности роста и
развития отдельной клетки и популяции в целом.
Создание и ввод в действие крупнотоннажных биотехнологи-
ческих производств неизбежно связаны с масштабным перехо-
138
дом, т. е, с необходимостью реализовать резработки, проведен-
ные в лабораторных и опытных условиях, в промышленных аппа-
ратах объемом в сотни кубических метров, выпускающих десятки
и сотни тысяч тонн продукции в год. Опыт химической техноло-
гии, да и собственный положительный и отрицательный опыт,
накопленный в биотехнологии за последние годы, неопровержимо
доказывают, что реализация лабораторных исследований в за-
водском масштабе возможна только при условии понимания био-
логических и физико-химических основ протекающих процессов
и при наличии адекватного математического описания кинетики
основных и побочных процессов. При этом главное внимание
должно быть уделено созданию достаточно полной математиче-
ской модели процесса, связывающей его результаты с условиями
проведения и таким образом позволяющей оптимизировать ре-
жим и разрабатывать действенную систему управления как
основу дальнейшей автоматизации и .компьютеризации произ-
водства.
К сожалению, до настоящего времени даже применение из-
вестных законов химической термодинамики и кинетики к ми-
кробным популяциям встречает значительные трудности, которые
еще усугубляются тем, что микробная клетка, как и все живое,
обладает изменчивостью и способностью постепенно приспосаб-
ливаться к условиям внешней среды. Это делает принципиально
неверным механическое применение известных законов термоди-
намики и кинетики к микробиологическим процессам и требует
скорейшей разработки проблем количественного описания био-
технологических процессов. Особенно важно, что эти исследова-
ния должны проводиться применительно к разным типам идеаль-
ных биореакторов, что позволяет выбрать и обосновать требова-
ния к аппаратурному оформлению, обеспечивающему воспроиз-
ведение достигнутого в лаборатории результата.
Большие возможности совершенствования промышленной
биотехнологии заключены в развитии и интенсификации не толь-
ко основной стадии — ферментации, но и последующих этапов
разделения, очистки и получения товарных форм препаратов.
Здесь прогресс крупнотоннажного микробиологического синтеза
связан с грамотным применением и модификацией известных
процессов химической технологии, таких, как разделение суспен-
зий, выпарка, сушка, ионный обмен, кристаллизация, экстракция
и особенно мембранные методы ультрафильтрации, обратного
осмоса, диализа и т. п. Отметим, однако, что биотехнология
должна и уже начала развивать свои специфические методы
выделения биологически активных веществ, основанные на би-
ологических взаимодействиях. Например, чрезвычайно перспек-
тивна хроматография культуральных жидкостей на носителях,
несущих антитела к имеющемуся в растворе антигену, что позво-
ляет выделить чистый биопрепарат из растворов практически
любой концентрации и сложности.
Несмотря на отмеченные во введении элементы конкуренции
139
между биотехнологическими и химическими методами производ-
ства ряда веществ, безусловно актуальным и выгодным для на-
родного хозяйства было бы создание производств, сочетающих
в себе достоинства обоих подходов. Хорошей иллюстрацией этого
является материал главы 4 настоящей книги, который показы-
вает, как последовательное применение химических и микробио-
логических методов трансформации органических веществ позво-
ляет создавать высокоэффективные процессы производства
биологически активных веществ и лекарственных средств.
Возможности дальнейшего развития этого подхода очень ве-
лики. Мы уже отмечали, что создание полусинтетических анти-
биотиков в определенной мере изменило стратегию медицины в
борьбе с инфекционными болезнями. Отметим, что крайне
интересным и полезным было бы и сочетание химических методов
синтеза аминокислот с биотехнологией разделения их рацематов,
поскольку микробиологический синтез /.-аминокислот трудоемок,
требует, как правило, дефицитного сырья и сложен технологи-
чески из-за необходимости соблюдения строгой асептики. Не-
смотря на интенсивное развитие химических методов стереоспе-
цифического синтеза, представляется, что разработка эффектив-
ного пути 100 %-ного разделения рацемата с помощью микро-
организмов или их ферментных систем в сочетании с химическим
синтезом смеси изомеров дали бы вполне конкурентоспособный
промышленный метод получения £-аминокислот во всем необхо-
димом ассортименте.
В настоящей книге не затронуты многие другие биотехноло-
гические процессы, которые внедряются или уже внедрены в
народнохозяйственную практику, но выходят за рамки рассмат-
риваемых в книгах 5 и 6 данной серии вопросов. Можно лишь
упомянуть об огромном значении таких микробиологических
процессов, как выщелачивание металлов из руд, в особенности
забалансовых, обессеривание угля и нефти, повышение питатель-
ной ценности кормов путем поверхностного культивирования
дрожжей и грибов на отходах земледелия, получение пище-
вого белка из растительной, микробной и грибной биомассы,
борьба с метанообразованием в угольных пластах и т. д.
Уже этот далеко не полный перечень показывает какое разно-
образие и эффективное применение может найти биотехнология
и сколь неожиданны результаты, которые она позволяет полу-
чить.
Анализ современного состояния промышленной биотехнологии
полностью подтверждает правильность и дальновидность реше-
ний партии и правительства о возможно более широком внедре-
нии биологических методов в промышленное производство и
обеспечении приоритетного развития биотехнологии как науки и
отрасли промышленности в текущей и последующих пятилетках.
ЛИТЕРАТУРА
Биотехнология микробного синтеза/Под ред. М. Е. Бекера. — Рига: Зинатне,
1980. 287 с
Грачева И. М., Гаврилова Н. Н., Иванова Л. А. Технология
микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. — М.: Пищевая про-
мышленность, 1980. 448 с.
М ос и че в М. С., С к л а д н е в А. А., К о т о в В. Б. Общая технология
микробиологических производств. — М.: Легкая и пищевая промышленность,
1982. 264 с.
Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках.—М.: Высшая школа,
1986. 448 с.
Скрябин Г. К., Головлева Л. А. Использование микроорганизмов
в органическом синтезе. — М.: Наука, 1976. С. 153—190, 264—282.
Гапонов К. И. Процессы и аппараты микробиологических произ-
водств.— М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. 240 с.
Голубовская Э. К. Биологические основы очистки воды. — М.: Выс-
шая школа, 1978. 270 с.
ПРЕДМЕТНЫЙ
УКАЗАТЕЛЬ
Аминокислоты 8
— биосинтез 8, 16—20
--- пути 20
— методы селекции их продуцентов
20—30
— способы получения из белковых
гидролизатоа 14, 15
---— микробиологический 10, 15,
16, 30, 31
-----------химический 10—14
Антибиотики 8, 50—66
— бацитрацин 57—59
------кормоаые препараты 57—59
— — ---- технология получения
57—59
—	кормовые препараты гигромицииа Б
61, 62
-----------получение 61, 62
—	— — гризина 60, 61
—	— — — получение 60, 61
—	тетрациклина 52—57
-----------биосинтез 52—57
—	микробиологический способ полу-
чения 50
—	промышленное получение 8
—	трихотеции 64, 65
—	— получение 64—65
—	фитобактериомиции 62—64
—	— получение 62—64
Аэротенки схема 127*
Бактериальные препараты 8
—	— применение 8
—	удобрения 80, 85
—	— технология производства 80—87
— — — — азотобактерина почвенно-
го и торфяного 84—85
—	—------сухого азотобактерина 83,
84
—	— — — — нитрагина 80—83
—	— — — фосфоробактерина 85—
87
Биологически активные вещества 5, 6
— — — биосинтез 5, 6, 8
— — — получение 5—9
— —--------методами тонкого органи-
ческого синтеза 6—8
Биофильтры 133*
L-Глутамииовая кислота 41, 42, 45, 46
— — способы получения 43—46
£-Лизии 32
—	кормовые препараты на его основе
32, 39—41
—	технология получения 32—39
Метантенк 137
Микробиологическая трансформация
гетероциклических соединений 109—
111
—	— стероидов 88—104
-------методы 99—104
—	— — пути интенсификации 103,
104
—	— углеводов 104—109
—	— — примеры 105—109
		— твпы 105
Очистные сооружения принципиаль-
ная схема 129*
Переработка отходов 135
—	анаэробные процессы 135—138
Промышленная биотехнология 5, 112,
114, 139, 140
—	— и химическая технология взаимо-
связь 9
— — перспективные пути развития
139
—	— экологические проблемы, 5, 112,
113
—	—------создание безотходных
технологических процессов микро-
биологического синтеза 115
Пути биосинтеза стероидных гормо-
нов из холестерина 92—94
Сточные воды 115, 135
—	— аэробные процессы биохимиче-
ской очистки 118—135
—	— — — — — распределение мик-
рофлоры в биофильтре 122*
---общие показатели 115—119
/.-Триптофан 46, 48
—	способы биосинтеза 46—49
Энтомопатогеииые препараты 66, 67,
69, 70, 73, 74, 78, 80
—	— бактериальные 67—72
—	— —’технология получения 67—72
—	— вирусные 78, 80
—	— — получение 78—80
—	— грибные 73
—	— — получение 73—78
* Звездочкой отмечены страницы, на которых помещены рисунки или таблицы.
142
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие . . .	.	5
Введение ............................................................. 6
Глава 1. Технология	биосинтеза	аминокислот....................... 10
§ I.	Биосинтез аминокислот	клетками микроорганизмов.............. 16
§ 2.	Пути биосинтеза и методы селекции продуцентов отдельных ами-
нокислот .......................................................... 20
$ 3.	Производство /.-аминокислот микробиологическим синтезом . .	30
§ 4.	Технология получения /.-лизииа и кормовых препаратов иа его
основе............................................................ 32
§ 5.	Технология получения /.-глутаминовой кислоты микробиологиче-
ским синтезом..................................................... 41
§ 6.	Технология получения L-триптофана микробиологическим син-
тезом	. • .	................. .... .	46
Глава 2. Технология биосинтеза препаратов антибиотиков для сель-
ского хозяйства...................................................... 50
§ 1.	Технология получения препаратов тетрациклина................ 53
§ 2.	Технология	получения	препаратов бацитрацина	.	......	57
§ 3.	Технология	получения	препаратов гризина..................... 60
§ 4.	Технология	получения	препаратов гигромицина	Б	.	.	61
§ 5.	Технология	получения	фитобактериомицииа .	62
§ 6.	Технология получения трихотецииа .	.	64
Глава 3. Технология бактериальных препаратов для сельского хозяй-
ства ............. ....	................. .	66
§ 1.	Технология получения бактериальных энтомопатогенных препа-
ратов ............... ...	....	67
§ 2.	Технология получения грибных энтомопатогенных препаратов . .	73
§ 3.	Технология получения вирусных энтомопатогенных препаратов 78
§ 4.	Технология производства бактериальных удобрений ............ 80
Глава 4. Микробиологические трансформации органических	соединений	88
§ 1.	Микробиологические трансформации стероидов.................. 89
§ 2.	Методы проведения процессов микробиологических трансфор-
маций ............................................................ 99
§ 3.	Микробиологические трансформации углеводов . ......	104
§ 4.	Микробиологические трансформации гетероциклических соеди-
нений	.	109
Глава 5. Экологические проблемы промышленной биотехнологии	112
§ 1.	Общие показатели загрязиеииости сточных вод . .	.	115
§ 2.	Аэробные процессы биохимической очистки сточных вод ...	119
§ 3.	Анаэробные процессы переработки отходов .	135
Заключение	138
Литература.......................................................... 141
Предметный указатель..............................................   142
Учебное издание
БИОТЕХНОЛОГИЯ. В 8-ми ин.
Валерий Алексеевич Быиов, Игорь Алексеевич Крылов,
Михаил Николаевич Манаков, Николай Семенович Марквичев,
Людмила Михайловна Орлова, Нина Васильевна Тарасова
Книга 6.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
И ПРЕПАРАТОВ
Заведующий редакцией А. Г. Гаврилов
Редактор М. М. Пенкина
Младший редактор И. М. Павлова
Художественный редактор Т. А. Коленкова
Художник В. В. Стоноженко
Технический редактор Н. А. Битюкова
Корректор Р. К- Косинова
ИБ № 6702
Изд. № Е-556. Сдано в набор 23.03.87. Поди, в печать 09.06.87. Т-10188. Формат
60х901/|б- Бум. офсетная №-1. Гарнитура литературная. Печать офсетная. Объем 9
усл. печ. л. 18,5 усл. кр.-отт. 9,9 уч.-изд. л. Тираж 30 000 экз. Зак. № 233. Цена 35 коп.
Издательство «Высшая школа», 101430, Москва, ГСП-4, Неглинная ул., д. 29/14.
Ярославский полиграфкомбинат Союзполиграфпрома при Государственном комитете
СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. 150014, Ярославль,
ул. Свободы, 97.
35 коп.
ПРОБЛЕМЫ
И ПЕРСПЕКТИВЫ
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ
СОЗДАНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ
ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
в
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
qqqdbi
АВТОМАТИЗАЦИЯ
БИОТЕЖЧЬДСГИ^Е М*
ИССЛЕДОВАНИЙ
ПРОИЗВОДСТВО
БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ПРОИЗВОДСТВО БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕШЕСТВ И ПРЕПАРАТОВ
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ
ФЕРМЕНТЫ
ИНЖЕНЕРНАЯ
ЭНЗИМОЛОГИЯ