Автор: Егоров Н.С.   Самуилов В.Д.  

Теги: общая экология   биоценология   гидробиология   биогеография   общая технология   основы промышленного производства   автоматизация   учебное пособие   биотехнология  

Год: 1987

Похожие

Биотехнология. Проблемы и перспективы. Автоматизация биотехнологических исследований. В 8-ми книгах. Том 1

Инженерная энзимология. Автоматизация биотехнологических исследований. В 8-ми книгах. Том 8

Биотехнология . Клеточная инженерия. Автоматизация биотехнологических исследований. В 8-ми книгах. Том 3

Биотехнология. Производство белковых веществ. Автоматизация биотехнологических исследований. В 8-ми книгах. Том 5

Текст
                    бШОТЕННОЛОШб
бЦОТЕННОЛОШЯ

в 8-ми книгах
бИОТЕННОЛОПЛб
Под редакцией Н.С.Егорова
ВДСамуилова

ИВ.Березйн|
НЛКлячко
АВЛевашов
КМартинек
ВВМожаев
ЮЛ.Хмельницкий
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ
ФЕРМЕНТЫ
Москва «Высшая школа» 1987

ББК 30.6
Б63
УДК 574.6
Рецензенты:
кафедра биотехнологии микробного синтеза Московского технологиче-
ского института пищевой промышленности (зав. кафедрой проф. Кан-
тере В. М.) и д-р техн, наук Попов В. Г. (ПО «Биопрепарат»)
Допущено Министерством высшего и среднего специального образо-
вания СССР в качестве учебного пособия для студентов биологических
специальностей высших учебных заведений.
Биотехнология: Учеб, пособие для вузов. В 8 кн./Под
Б63 ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн. 7: Иммобили-
зованные ферменты/|И. В. Березин], Н. Л. Клячко, А. В. Ле-
вашов и др. — М.: Высш, шк., 1987. 159 — с.: ил.
Рассмотрены неорганические и органические носители (подложки), хими-
ческие и физические способы связывания белков (ферментов). Проанализиро-
ваны кинетико-термодинамические особенности катализа иммобилизованными
ферментами, их стабильность и другие физико-химические свойства.
2010000000(4309000000)— 510	п ос
---	•  ...-	—— КБ-—53—У—со
001(01)—87
ББК 30.6 + 28.07
605
© Издательство «Высшая школа», 1987

ПРЕДИСЛОВИЕ
В последние 10—15 лет на стыке ряда химических и биологи-
ческих дисциплин сформировалось новое научно-инженерное на-
правление — химическая энзимология. Стремительное развитие
химической энзимологии обусловлено созданием нового типа ге-
терогенных биоорганических катализаторов — иммобилизован-
ных ферментов. Целесообразность исследований в этом направ-
лении и важность внедрения иммобилизованных ферментов в
практику подчеркнуты постановлением ЦК КПСС и Совета Ми-
нистров СССР «О дальнейшем развитии физико-химической био-
логии и биотехнологии и использовании их достижений в меди-
цине, сельском хозяйстве и промышленности» (1981), а также
в последующих постановлениях.
Проблема создания промышленных образцов иммобилизо-
ванных ферментов объединяет необычайно широкий круг спе-
циалистов самого разного профиля. Это, в свою очередь, ставит
перед высшей школой задачу подготовки таких специалистов.
К настоящему времени в мировой и советской научной ли-
тературе имеются десятки обзоров, сборников и монографий,
посвященных получению, свойствам и использованию иммобили-
зованных ферментов. Однако, как правило, эти издания рассчи-
таны на узкий круг специалистов, имеющих соответствующее
образование в области физической химии ферментов или инже-
нерной энзимологии. Учебных пособий для более широкой ауди-
тории в отечественной литературе нет.
Цель настоящего учебного издания состоит в том, чтобы по
возможности в общедоступной форме рассмотреть современное
состояние проблемы иммобилизованных ферментов, наметить пу-
ти решения ее ключевых вопросов и дать верную ориентацию в
этой области.
В составлении настоящего учебного пособия принимали учас-
тие И. В. Березин (предисловие, . введение, заключение),
Н. Л. Клячко (гл. I, VI), А. В. Левашов (гл. III), К. Мартинек
(предисловие, введение, заключение), В. В. Можаев (гл. IV, V,
VI), Ю. Л. Хмельницкий (гл. II). Редактирование этой книги
проведено И. В. Березиным и А. В. Левашовым.
Авторы выражают глубокую благодарность рецензентам: д-ру
техн, наук В. Г. Попову и кафедре биотехнологии микробного
синтеза Московского ордена Трудового Красного знамени тех-
нологического института пищевой промышленности (зав. кафед-
рой проф. В. М. Кантере) за ценные замечания и советы.
Авторы

ВВЕДЕНИЕ
Ферменты и ферментативные системы традиционно приме-
няются в самых различных областях практической деятельности:
в пищевой, фармацевтической, текстильной, кожевенной и других
отраслях промышленности, в медицине, сельском хозяйстве, орга-
ническом синтезе, химическом анализе и т. д. Тем не менее раз-
витие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось доро-
говизной или полным отсутствием на мировом рынке нужных
ферментов, особенно их чистых препаратов. Очевидно, можно
ожидать в недалеком будущем благодаря успехам микробиоло-
гии коренного решения вопроса производства соответствующих
ферментов в достаточном количестве.
Возможности применения ферментов осложнены, кроме того,
еще, по крайней мере, двумя причинами. Во-первых, ферменты
неустойчивы при хранении, а также при различных воздействиях,
особенно тепловых. Во-вторых, многократное использование фер-
ментов затруднено из-за сложности их отделения от реагентов
и продуктов реакции. По этим причинам практическое использо-
вание ферментов могло быть ограничено, но уже на сегодняшний
день найдены пути решения и этих проблем.
Принципиально новые перспективы открылись перед приклад-
ной энзимологией в результате создания иммобилизованных фер-
ментов. Дж. Нельсон и Е. Гриффин еще в 1916 г. показали,
что инвертаза, адсорбированная на угле (т. е. иммобилизован-
ная), сохраняет каталитическую активность. В 20—30-х годах
работы по изучению адсорбции белков и ферментов были про-
должены, однако исследования этого периода представляли глав-
ным образом академический интерес и не преследовали практи-
ческих целей. В 1939 г. Дж. Пфанмюллер и Г. Шлейх получили
первый патент на применение адсорбированных на древесных
опилках протеолитических ферментов для обработки шкур. Прин-
ципиально важный шаг в направлении создания прочных конъ-
югатов ферментов с носителями был сделан в 1953 г. Н. Груб-
хофером и Д. Шлейтом, впервые применившими метод ковалент-
ного связывания.
Для исследований 50—60-х годов характерна уже достаточно
четкая осознанность практической значимости развиваемого на-
правления. Немалая заслуга в этом принадлежит группам
6

Г. Манеке и Э. Канальского. В результате связывания фермента
на носителе были созданы гетерогенные катализаторы, для кото-
рых сравнительно недавно, на первой конференции по инженер-
ной энзимологии в Хенникере (США) в 1971 г., был узаконен
термин «иммобилизованные ферменты». В литературе все еще
встречаются и другие термины, например «нерастворимые фер
менты», «матрицированные ферменты» и т. п., смысл которых
достаточно конкретен: ими обозначают препараты ферментов,
связанных на нерастворимых носителях. Однако понятие «иммо-
билизация» можно и нужно понимать шире, а именно, как любое
ограничение свободы движения белковых молекул (или их фраг-
ментов!) в пространстве. Помимо связывания с нерастворимым
носителем этого можно также достичь, например, путем внутри-
молекулярной или межмолекулярной «сшивки» белковых молекул
низкомолекулярными бифункциональными реагентами или же
присоединением фермента к растворимому полимеру. Такие пре-
параты иногда называют ферментами, модифицированными
«сшивающими» или, соответственно, полимерными реагентами.
Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом
существенных преимуществ при использовании их в прикладных
целях по сравнению с нативными предшественниками. Во-пер-
вых, гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной
среды, что дает возможность: а) остановить в нужный момент
реакцию; б) использовать катализатор повторно; в) получать
продукт, не загрязненный ферментом. Последнее особенно важно
в ряде пищевых и фармацевтических производств.
Во-вторых, использование гетерогенных катализаторов поз-
воляет проводить ферментативный процесс непрерывно, напри-
мер в проточных колоннах, и регулировать скорость катализи-
руемой реакции, а также выход продукта путем изменения ско-
рости потока.
В-третьих, иммобилизация или модификация фермента спо-
собствует целенаправленному изменению свойств катализатора,
в том числе его специфичности (особенно в отношении к макро-
молекулярным субстратам), зависимости каталитической актив-
ности от pH, ионного состава и других параметров среды и, что
очень важно, его стабильности по отношению к различного рода
денатурирующим воздействиям. Отметим, что крупный вклад в
разработку общих принципов стабилизации ферментов был сде-
лан советскими исследователями.
В-четвертых, иммобилизация ферментов дает возможность
регулировать их каталитическую активность путем изменения
свойств носителя под действием некоторых физических факто-
ров, таких, как свет или звук. На этой основе создаются механо-
и звукочувствительные датчики, усилители слабых сигналов и
бессеребряные фотографические процессы.
В результате внедрения нового класса биоорганических ката-
лизаторов—иммобилизованных ферментов, перед прикладной
энзимологией открылись новые, ранее недоступные пути разви-
7

тия. Одно лишь перечисление областей, в которых находят при-
менение иммобилизованные ферменты, могло бы занять немало
места. Однако в этом нет необходимости, поскольку прикладным
аспектам и достижениям инженерной энзимологии целиком по-
священа книга 8 серии «Биотехнология». Здесь важно лишь от-
метить, что успех практического использования препаратов им-
мобилизованных ферментов в значительной степени определяется
подготовительным этапом работы — выбором подходящего носи-
теля и метода иммобилизации, а также знанием кинетико-термо-
динамических особенностей катализа иммобилизованными фер-
ментами. Именно рассмотрению этого круга вопросов посвящено
данное учебное пособие. Кроме того, уделено внимание пробле-
мам стабильности ферментов вообще и иммобилизованных в
частности, а также сформулированы общие принципы стабилиза-
ции. Специальная глава отведена способам регенерации компо-
нентов систем с иммобилизованными ферментами.

Глава
НОСИТЕЛИ
ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ
ФЕРМЕНТОВ

Для получения иммобилизованных ферментов используется
огромное число носителей, как органических, так и неорганиче-
ских. Основные требования, предъявляемые к материалам, кото-
рые могут быть применены для иммобилизации ферментов, сле-
дующие (Дж. Порат, 1974): 1 — высокая химическая и биологи-
ческая стойкость; 2 — высокая механическая прочность (в пер-
вую очередь, по отношению к истиранию); 3 — достаточная про-
ницаемость для фермента и субстратов, большая удельная по-
верхность, высокая вместимость, пористость; 4 — возможность
получения в виде удобных в технологическом отношении форм
(гранул, мембран, труб, листов и т. д.); 5 — легкое переведение
в реакционноспособную форму (активация); 6 — высокая гидро-
фильность, обеспечивающая возможность проведения реакции
связывания фермента с носителем в водной среде; 7 — невысо-
кая стоимость. Отсутствие носителей, удовлетворяющих одно-
временно всем этим требованиям, и разнообразие задач, стоя-
щих перед экспериментаторами, обусловливают широкий набор
применяемых для иммобилизации материалов.
ОРГАНИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРНЫЕ НОСИТЕЛИ
Существующие в настоящее время органические полимерные
носители можно разделить на два класса: 1 — природные поли-
меры, 2 — синтетические полимерные носители. В свою очередь
класс природных полимеров можно подразделить на группы в
соответствии с их биохимической классификацией: полисахарид-
ные, белковые и липидные носители. Синтетические полимеры
также могут быть подразделены на группы, например, в соот-
ветствии с химическим строением основной цепи макромолекул:
полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные носители.
К рассматриваемым носителям предъявляется ряд дополни-
тельных требований, обусловленных методом иммобилизации,
свойствами иммобилизуемого фермента и способом дальнейшего
9

использования препарата: 1 — при ковалентной иммобилизации
носитель должен связываться только с теми функциональными
группами на белке, которые не являются ответственными за
катализ, и 2 — они не должны оказывать ингибирующего дей-
ствия на фермент. При проведении иммобилизации необходимо
также учитывать, что наличие противоположных знаков заряда
на носителе и ферменте облегчает связывание фермента, одно-
именных — затрудняет; уменьшение размера частиц носителя
способствует увеличению количества связанного препарата.
Наиболее широко используются для иммобилизации фермен-
тов природные полисахариды и синтетические носители поли-
метиленового типа. Остальные типы носителей применяются зна-
чительно реже.
Рассмотрим основные классы полимерных носителей.
§ 1.	Природные носители
Большое значение природных полимеров в качестве носите-
лей для иммобилизации объясняется их доступностью и нали-
чием реакционно-способных функциональных групп (в исходном
или модифицированном препарате), легко вступающих в раз-
личные химические реакции, а также высокой гидрофильностью.
К недостаткам природных носителей можно отнести неустойчи-
вость к воздействию микроорганизмов и относительно высокую
СТОИМОСТЬ МНОГИХ из них.
Полисахариды. Наиболее часто для иммобилизации исполь-
зуют целлюлозу, декстран, агарозу я их производные.
-•олоза представляет собой поли- 1.4-0-2)-глюкопиранозил-
Целлюлоза отличается высокой степенью гидрофильности, а
наличие большого числа гидроксильных групп дает возможность
ее легко модифицировать путем введения различных заместите-
лей. Препараты целлюлозы для придания им химической устой-
чивости «сшивают» эпихлоргидрином. Для увеличения механиче-
ской прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидро-
лиза, в результате которого разрушаются ее аморфные участки.
На их место для сохранения пористости между кристаллическими
участками вводят химические сшивки. Гранулированная целлю-
лоза благодаря простоте получения, сравнительно низкой стои-
мости относится к удобным носителям для иммобилизации
ферментов и аффинной хроматографии.
Гранулированную целлюлозу довольно легко превращают в
Ю

Таблица 1. Целлюлоза и некоторые ее производные
Заместитель по ОН группе	Название препарата	Фирма
O(CH2)2NH2 ОРОзН O(CH2)2N(C2H5)2 ОСН2СООН O(CH2)2NH2	Целлюлоза Аминоэтилцелл юлоза Фосфорил целл юлоза (Р-Ю) Целлюлоза —»— Диэтил а миноэтил цел - люлоза Ка рбокс иметил целлю- лоза Аминоэтил целл юлоза	«Whatman» (Англия) То же —»— «Sigma» (США) «Bio-Rad-Labs» (США) —»— —»—
осо-<^> NH2 — »— ОСОСН2Вг jO(CH2)2N(C2H5)2 |осо-<2>	и-Аминобензонл целлю- лоза —»— Брома цетил целлюлоза Бензоилдиэтила мино- этил целл юлоза	— »— «Serva» (ФРГ) «Reanal» (ВНР) То же — »—
OCH2CONHNH2 ОСОСН2Вг ОСН2ОСН2^<^>	Г ндразидкарбоксиметил- целлюлоза Брома цетил цел л юлоза л-Аминобензилоксиме- тилцеллюлоза	«Miles Labs» (Англия) То же То же
nh2 O(CH2)2N(C2Hs)2 ОСН2СООН	ДЭАЭ-целлюлоза КМ-целл юлоза	НПО «Бнохим- реактив» То же
ОСН2^^-МН2	n-Аминобензнл целлюлоза	— »—
O(CH2)2SO3H О(СН2)2Й(С2Н5)з	Сульфоэтилцелл юлоза Триэтил аммонийэтил - целлюлоза	— »— —»—
различные ионообменные производные. В табл. 1 приведены
основные промышленные марки целлюлозы, выпускаемые различ-
ными фирмами.
Недостатком целлюлозы как носителя можно считать ее не-
устойчивость к воздействию сильных кислот, щелочей и окисли-
телей.
Хитин — природный аминополисахарид. Его можно рассмат-
ривать как целлюлозу, в которой СНгОН-группа заменена ацет-
амидным остатком:
11

AtljnnC *\-
XCH3
в хитозане R=—H)
R	R
Хитин — основной компонент наружного скелета ракообраз-
ных, насекомых, а также клеточных оболочек некоторых грибов.
Это соединение является отходом промышленной переработки
креветок и крабов, поэтому доступно в больших количествах
при относительно низкой стоимости.
Хитин обладает пористой структурой, не растворяется в воде,
разбавленных кислотах и щелочах, а также в органических
растворителях. Для переведения в реакционноспособную форму
он может быть модифицирован глутаровым альдегидом, а также
солями тяжелых металлов [например, Ti(IV)].
Обработка хитина концентрированными растворами щелочей
(деацилирование) приводит к образованию хитозана. Хитозан,
имеющий свободные аминогруппы, может использоваться для
ковалентной иммобилизации ферментов с помощью таких би-
функциональных реагентов, как диальдегиды, диизоцианаты (см.
гл. Ш). В отличие от хитина хитозан растворяется в минераль-
ных и органических кислотах, поэтому для иммобилизации он
часто применяется в виде растворов (pH 3—7).
Употребление хитозана в качестве носителя дает хорошие
результаты, так как полученные препараты иммобилизованных
ферментов обладают высокой каталитической активностью и ус-
тойчивостью к микробному воздействию; наблюдается также су-
щественное повышение термостабильности белков, иммобилизо-
ванных на хитозане.
Декстран — поли-1,6-а-Д-глюкопиранозил-/)-глюкопирано-
за — разветвленный полисахарид из бактериальных источников,
содержащий остатки глюкозы, связанные, в основном, 1,6-глюко-
зидными связями (а также, 1,2-, 1,3- и 1,4-связями):
12

Гели на основе декстрана, сшитые эпихлоргидрином, вы-
пускаются фирмой «Pharmacia» (Швеция) под названием «сефа-
декс» и «Reanal» (ВНР) под названием «молселект». При вы-
сушивании сефадексы легко сжимаются, а в водных растворах
сильно набухают. Эти качества выражены тем сильнее, чем
меньше процентное содержание сшивки. Изменением доли сшив-
ки регулируется средний размер пор, образуемых пространст-
венной сеткой геля.
Следует отметить, что продажные препараты сефадексов со-
держат небольшое количество карбоксильных групп, что придает
им некоторое сродство к катионам. Этот факт необходимо учи-
тывать при иммобилизации металлозависимых ферментов.
Обращают на себя внимание такие свойства гелей на основе
декстрана, как высокая химическая стойкость и гидрофиль-
ность (из-за наличия большого количества гидроксильных
групп). Сефадексы G-типов различаются по степени сшитости и,
следовательно, по степени набухания и по пористости. Сущест-
вуют разновидности модифицированных сефадексов для исполь-
зования в органических растворителях (LH-20 и LH-60).
Фирмы «Pharmacia» и «Reanal» выпускают также ряд полив-
водных декстрана, содержащих различные функциональны
пы (табл. 2).
К группе декстранов можно отнести крахмал, являющийся
смесью полисахаридов, основным компонентом которой является
амилоза — поли-1,4-а-£)-глюкопиранозил-£)-глюкопираи '
амилопектин — разветвленный полисахарид, состоящий и?
ков £)-глюкозы, связанной 1,4-а-глюкозидными связями се-
тах разветвлений— 1,6-а-глюкозидными связями.
Химической модификацией крахмала сшивающими агентами,
такими, как формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид, по-
лучен новый носитель — губчатый крахмал, обладающий повы-
шенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизую-
Таблица 2. Коммерческие препараты производных декстрана
Функциональная группа	Название и марка	Ф и рма
ОСНгСООН	Карбокси метил сефадекс	«Pharmacia»
	(СМ)	(Швеция)
O(CH2)3SO3H	Сульфопропилсефадекс (SP)	— »—
О (СН2) 2N (С2Нб)2	Диэтил аминоэтилсефа- декс (DEAE)	—»—
OCH2CH2N (С2Н5)2СН2 — —СН(ОН)СНз	Длэтил- (2-оксипропил) аминоэтилсефадекс (QAE)	—»—
ОСН2СООН	Молселект (СМ)	«Reanal» (ВНР)
O(CH2)2SO3H	Молселект (SE)	— »—
О (СН2) 2N (С2Н5) 2	Молселект (DEAE)	—»—

щим полисахариды. Введение диэтанол- и триэтаноламинных
групп дает возможность применять губчатый крахмал для им-
мобилизации различных ферментов.
На основе декстранов могут быть получены водораствори-
мые препараты с различными функциональными группами, при-
меняемые в медицине как носители лекарственных веществ. Вы-
бор носителей на основе декстрана для медицинских целей обус-
ловлен, в частности, тем, что они легко подвергаются биодегра-
дации.
Агароза — поли-Р-галактопиранозил-3,6-ангидро-а-Л-галакто-
пираноза:
Она широко используется как носитель для иммобилизации.
Однако стоимость агарозы довольна высока, поэтому разраба-
тываются различные методы ее модификации с целью получения
легко регенерируемых форм. При охлаждении горячего 2—6%-
иого водного раствора агарозы до температуры ниже 45°С
образуются прочные крупнопористые гели, представляющие со-
бой сложную смесь из заряженных и нейтральных полисахари-
дов. В процессе образования геля индивидуальные полисаха-
ридные цепи образуют двойные спирали, которые далее агре-
гируют с образованием «узлов». При температуре около 100°С
гель агарозы плавятся, поэтому в отличие от сефадексов его
нельзя автоклавировать. Высушивание агарозы приводит к необ-
ратимой деструкции геля, поэтому его необходимо хранить в
виде водной суспензии.
Гели на основе агарозы производятся фирмами «Pharmacia»
(Швеция) и «Bio-Rad Labs» (США) и выпускаются под назва-
ниями «сефароза» и «биогель А» соответственно (табл. 3),
а также «LKB» (Швеция) и «IBF» (Франция) — под названием
«ультрогель А». При производстве сефарозы агароза подверга-
ется специальной обработке, в частности, из нее удаляются
заряженные полисахариды. Различают 3 типа сефарозы и 6 ти-
пов биогеля А в зависимости от концентрации агарозы (табл. 3).
Для придания большей химической и термической стабиль-
ности препараты сефарозы обрабатывают 2,3-дибромпропанолом
в сильно щелочных условиях. В результате такой обработки по-
лучается поперечносшитый гель агарозы — сефароза CL (препа-
рат фирмы «Pharmacia»).
Агар выделяют из клеточных мембран некоторых красных
морских водорослей. Точный состав его не известен. Однако
установлено, что он содержит, по крайней мере, два полисаха-
14

Таблица 3. Агароза и некоторые ее производные
Функциональная группа (заместитель по ОН-группе)	Название и марка	Концентра- ция агарозы, %	Фирма
__	Сефароза 6В	6	«Pharmacia» (Швеция)
—	Сефароза 4В	4	То же
+	Сефароза 2В	2	— »—-
—O(CH2)2NH(C2Hs)2Cr	ДЭАЭ-сефароза CL-6B	6	— »—
—ОСН2СООН	КМ—сефароза CL-6B	6	—»—.
—OCN	Бромциансефароза 4В	4	—
—ОСНг— СН—сн,—о— 1 он — (СН2)7—СНз	Октилсефароза CL-4B	4	—»—
—ОСН2—СНОН—СНг—О—	Фенил сефароза CL-4B	4	——
	Биогель А-0.5	10	«Bio-Rad . Labs» (США)
	Биогель А-1,5	8	—»—
	Биогель А-5	6	——
	Биогель А-15	4	-—
	Биогель А-50	2	— »—
	Биогель А-150	1	—»—
—O(CH2)2N (C2Hs)2	ДЭАЭ-биогель А	—	— —
—NH—(СН2)5—COO—	Активированная СН—сефароза 4В	4	«Pharmacia» (Швеция)
—[			
—О—CH2CH—сн2— (!)Н —О(СН2)4—О—СН2— —СН—сн2	Эпоксиактивиро- ванная сефароза 6В	6	То же

рида: агарозу и агаропектин. Гели агара образуются аналогично
агарозным при охлаждении горячего водного раствора до темпе-
ратуры 38°С. После высушивания гель агара превращается в
прозрачную пленку, что позволяет использовать для изучения
иммобилизованного в геле фермента оптические методы иссле-
дования. К преимуществам агара следует отнести его низкую
стоимость и нетоксичность. Отличительной особенностью этого
носителя является способность формировать механически проч-
ные гели даже при малых концентрациях в растворе.
Существенного улучшения свойств агара можно достичь сши-
ванием эпихлоргидрином, диэпоксидными соединениями и т. д.
Сшитый агар с регулируемой проницаемостью устойчив к на-
греванию даже в щелочной среде, обладает высокой механиче-
ской прочностью, а наличие большого количества оксигрупп поз-
воляет легко модифицировать носитель. Это дало основания
Дж. Порату (1976) считать агар почти идеальным носителем.
Альгиновые кислоты и их соли — это полисахариды бурых
морских водорослей, состоящие из связанных |3- 1,4-связями
остатков /)-маннуроновой кислоты:
Характерным свойством этих носителей является резкая за-
висимость их растворимости от температуры и pH раствора.
Так, альгиновые кислоты хорошо растворимы в горячей воде
и плохо — в холодной. Альгинаты кальция обладают способ-
ностью образовывать гели, поэтому они используются для иммо-
билизации ферментов, клеток и органелл путем включения.
Гепарин представляет собой кислый полисахарид, содержа-
щий чередующиеся звенья сульфатированной £)-глюкуроновой
кислоты (или L-идуроновой) и сульфатированного глюкозамина
(или jV-ацетил-глюкозамина):
Гепарин успешно применяется для получения водорастворимых
препаратов иммобилизованных ферментов, используемых в меди-
цине для введения in vivo.
Белки. Использование белков в качестве носителей для им-
16

мобилизации ферментов представляет интерес как для фунда-
ментальных биохимических исследований, так и для практиче-
ских целей, в частности для медицины. Этот интерес обусловлен
тем, что многие ферменты в клетке функционируют в тесном
контакте с другими ее компонентами, в частности с липидами
и белками. Поэтому полагают, что изучение поведения фермен-
тов, иммобилизованных на белковых матрицах, позволит понять
закономерности функционирования ферментов in vivo. С точки
зрения практической значимости важными свойствами этих но-
сителей являются высокая вместимость по отношению к фер-
ментам и способность к биодеградации, а также возможность
применения большинства из них (благодаря фибриллярной при-
роде) в виде тонкой толщиной 80 мкм пленки (мембраны).
Иммобилизацию на белковых носителях можно проводить как в
отсутствие, так и в присутствии сшивающих агентов.
К недостаткам белков как носителей медицинских препаратов
для использования in vivo следует отнести высокую иммуно-
генность (исключение составляют коллаген и фибрин).
Наиболее часто в качестве носителей применяются структур-
ные белки, такие, как кератин, фиброин, коллаген; двигательные
белки, в частности миозин, а также транспортные белки, напри-
мер сывороточный альбумин.
Коллаген — фибриллярный белок группы склеропрстеидов,
основной компонент хрящей и сухожилий, обладает высокой
прочностью на разрыв. Особенностью этого белка является его
высокая гидрофильность. Так, коллаген способен сорбировать
от 1 до 5 г воды на 1 г белка, оставаясь в нерастворенном виде
и сохраняя волокнистую структуру.
Коллаген — самый распространенный белок высших живот-
ных. Легкость выделения коллагена из ряда биологических
источников в сочетании со свойственным белкам наличием боль-
шого числа групп — участков для связывания ферментов — при-
влекает внимание к коллагену как к носителю для иммобилиза-
ции ферментов. Коллаген используют и в виде модифици-
рованных производных, придавая матрице широкий набор же-
лаемых свойств. Так, блокированием амино- или карбоксильных
групп можно изменить поверхностный заряд носителя и, соответ-
ственно, гидрофильно — гидрофобный баланс; с помощью сшива-
ющих агентов можно получить сжатую микроструктуру. Наибо-
лее часто коллаген употребляется в азидной форме. Для этого
карбоксильные группы коллагена (н) * этерифицируют с последу-
ющей обработкой гидразином и азотистой кислотой:
(Н>—СООН НС! * ®—СООСНз	®—CONHNHj — N^HC‘*. (Н>—CON3
Продуктом переработки коллагена является желатина. Спо-
соб ее получения весьма прост— коллаген длительно обрабаты-
*3десь и далее символом (ТГ) обозначается носитель
17

вается кипящей водой, в ходе чего гидролизуются некоторые
ковалентные связи коллагена. В результате волокнистый, нераст-
воримый коллаген превращается в растворимую смесь полипеп-
тидов, называемую желатиной. Ценность этого носителя, облада-
ющего гелевой структурой, заключается в его нетоксичности,
легкости биодеградации, что позволяет применять желатину
в фармацевтической и пищевой промышленностях.
Другим весьма распространенным фибриллярным белком
группы склеропротеидов является кератин. Из кератина почти
полностью состоят шерсть, волосы, роговые покровы, шелк и т. д.
Как правило, кератин получают при переработке перьев (побоч-
ный продукт птицеперерабатывающих фабрик). Таким образом,
кератин дешев и доступен в больших количествах, что немало-
важно при использовании белков в качестве носителей.
Существуют две формы кератина — аир. Важной особен-
ностью а-кератина является высокое содержание цистеина, что
представляет особый интерес для иммобилизации ферментов, со-
держащих свободные SH-группы. fJ-Кератины, в частности фиб-
роин (белок шелка и паутины), не содержат остатков цистеина,
но в них очень высокое содержание глицина и аланина, что необ-
ходимо для образования вытянутой зигзагообразной конформа-
ции полкпептидной цепи. Для ^-конформации хгфактерны меж-
цепочечные водородные связи, в образовании которых участвуют
все пептидные группы p-кератина, что придает значительную
устойчивость p-структуре. Молекулярные отличия влияют на
механические свойства. Так, нити p-кератина обладают мяг-
костью, гибкостью и нерастворимостью, однако уступают по
прочности а-кератину. Выбор той или иной формы кератина для
иммобилизапии определяется конкретной задачей, стоящей перед
едователем.
При иммобилизации ферментов на носителях белковой при-
роды нельзя не считаться с появлением диффузионных ограни-
чений, определяемых гелевой структурой матрицы. Интересное
решение проблемы диффузионных ограничений было найдено
в случае использования в качестве носителей белков-глобулинов
хлопчатника. Так как комплекс фермент-носитель способен на-
ходиться как в растворимой, так и в нерастворимой форме
в зависимости от ионной силы раствора, то, изменяя последнюю,
можно переводить комплекс в растворимую форму и облегчать,
например, переработку нерастворимых в воде субстратов. Здесь
укажем также, что подобным свойством обладают и некоторые
синтетические полимеры, в частности полиэлектролиты и их
комплексы, находящие все более широкое применение для иммо-
билизации 'ферментов.
§ 2. Синтетические полимерные носители
Огромное разнообразие доступных синтетических полимеров
обеспечило их широкое использование в качестве носителей для
иммобилизации ферментов. Вводя в полимерные молекулы раз-
18

личные функциональные группы, можно в широких пределах
варьировать физические свойства носителя и создаваемое им мик-
роокружение для иммобилизованных молекул фермента. Синте-
тические полимеры применяются как для ковалентной иммоби-
лизации ферментов, так и для сорбционной, для получения гелей,
микрокапсул.
Полимеры на основе стирола. Они являются основой многих
промышленных марок ионообменных материалов. Для сорбцион-
ной иммобилизации применяются как микропористые, так и мак-
ропористые (размер пор 10—1000 нм) материалы. Сополимеры
стирола в виде сферических частиц с различными сшивающими
агентами можно получить гранульной полимеризацией. Наиболее
часто в качестве сшивающего агента используется дивинилбен-
зол. Структурный фрагмент с дивинилбензолом можно предста-
вить так:
сн2	сн—сн2—сн—сн2—сн—сн2~
г г I
с6н5
Геометрическая структура таких макропористых носителей
(размер пор, удельная поверхность) варьируется в широких пре
делах при изменении количества сшивающего агента и концент
рации растворителя мономеров в реакционной среде. Пористость
сополимеров стирола регулируют также тем, что проводят поли-
меризацию в присутствии порообразователей, например добавок,
разлагающихся при нагревании с выделением газообразных ве-
ществ (NH4CI).
Носители на основе сополимеров стирола и дивинилбензола
выпускаются в промышленном масштабе в виде ионообменников
марок Дауэкс и Амберлит.
В последние годы стали применяться также носители, име-
ющие макросетчатую, изопористую и гетеропористую структуры.
Макросетчатые полистиролы подобны стеклам, они имеют ста-
бильную структуру пор, не набухают в воде, отличаются повы-
шенной механической прочностью. Получают их эмульсионной
сополимеризацией стирола с дивинилбензолом в присутствии
осадителя.
Изопористый макросетчатый полистирол не обладает порис-
тостью в сухом виде, образуется он при сшивании стирола в ди-
хлорэтане, содержащем п-ксилилендихлорид.
Под действием монохлордиметилового эфира и порообразо-
вателя можно получить гетеропористый полистирол с диаметром
пор ~ 1 мкм. Применение гетеропористых носителей обеспечи-
вает для различных по размерам ферментов сохранение высокой
19

остаточной активности, по-видимому, за счет структурного соот-
ветствия молекулы белка и матрицы.
Немодифицированные полистирольные носители гидрофобны.
Присоединением ионогенных групп в параположение бензольных
радикалов можно придать ему некоторую гидрофильность, хотя,
в целом, сохраняется склонность полимера к гидрофобным
взаимодействиям. Это свойство может оказаться полезным при
хроматографии гидрофобных белков мембран.
Широкие возможности для разработки новых видов носителей
открывает введение реакционноспособных ангидридных групп
в состав синтетических полимеров. В этой связи отметим новый
тип носителя, полученного сополимеризацией эквимолярных ко-
личеств стирола и малеинового ангидрида:
с6н5
~сн—сн2—сн—сн~
о
Как правило, используют сополимер, сшитый гексаметилендиа-
мином. В присутствии избыточного количества диметилендиами-
на получают носитель, содержащий аминогруппы:
csHs
Сн—СН5—СН-—СН
i I
о==с zc=o
(СНД (ins)s
NH NH
O=C c=o
—CH3—CH----CH~
c6Hs
Такие носители обладают довольно высокой вместимостью по
отношению к белкам, могут применяться как для нековалентной,
так и ковалентной иммобилизации ферментов.
Другие способы активации носителей, в том числе модифи-
кация бензольного ядра матрицы, будут рассмотрены ниже.
Полимеры на основе производных акриловой кислоты. Одним
из многочисленных производных акриловой кислоты, широко
применяющихся для получения полимерных гидрофильных носи-
телей, является акриламид. Широкое распространение получил
метод включения ферментов и клеток в полиакриламидный гель
(ПААГ), получающийся при сополимеризации акриламида со
сшивающим агентом N, N'-метилен-бис-акриламидом (МБАА).
20

Нити линейного полимера акриламида, сшитые МБАА, образуют
пространственную сетку геля, относительно жесткую, стойкую
к химическим воздействиям. Процентное содержание полимера
определяет пористость и жесткость геля.
ПААГ выпускается рядом фирм, например, «Bio-Rad Labs»
(США) производит ПААГ и его производные под названием
«биогели» типа Р, «Koch-Light» (Англия) — «энзакрилы»,
«Reanal» (ВНР) — «акрилексы». Ниже приведены функцио-
нальные производные на основе энзакрила:
Функциональная группа
Название
—CONH-^	^>-NH2
—CONHNH2	-CON3
—CONHCH(OCH3)2
—conhch2sh
—CONH------=0
I I
1
Энзакрил AA
Энзакрил AH
Энзакрилполиацеталь (сополимер N-акри-
лои л аминоацетальдегидди метилацеталя и
МБАА)
Энзакрилполитиол (сополимер акрилами
да и акрилоилцистеина)
Энзакрилполитиолактон
Фирмы «LKB» (Швеция) и «IBF» (Франция) выпускают так-
же носители смешанного типа на основе ПААГ и агарозы под
названием «ультрогели» типа АсА. Они представляют собой
жесткую матрицу, создаваемую агарозой, с контролируемой
пористостью, обеспечиваемой ПААГ. Носители выпускаются
в виде водной суспензии сферических гранул, применяются для
синтеза аффинных сорбентов и нековалентной иммобилизации
ферментов.
Для целей ковалентной иммобилизации ферментов полиакри-
ламидный носитель активируют одним из способов: либо в го-
товый полимер вводят функциональные группы методом хими-
ческой модификации, либо полимеризуют соответствующее
функциональное производное мономера.
В качестве примера приведем реакцию сополимеризации ак-
риламида и п-нитрофенилакрилата:
сн2=сн
I +
conh2
сн2=сн
Способ полимеризации соединений, содержащих реакционноспо-
собные группы, более удобен, так как позволяет избежать неже-
лательного изменения свойств (набухаемости, проницаемости)
геля, возможного при модификации готового полимера.
В настоящее время создано большое число носителей на осно-
ве сополимеров акриламида с различными функциональными
21

Таблица 4. Мономеры, применяемые для получения сополимеров
акриламида
Мономеры	Активирующий агент	Функциональная группа активированного носителя
2-Оксиэтилметакрилат >О	BrCN	>C=NH
СН2=С—С< i	Х)СН2—сн2 СНз	| он Акриловая кислота ,0	R'—N=C=	—oz /NH—R' —COO—CC
СН2=СН—	=N—R"	H—R"
ХОН Метакриловая кислота СН2=С— i	Х)Н СНз п-Аминофенилакриламид X) С Нт—СН—С\	<—	ч-?.;	+ —CONH—
\\Н-< V-NH, N-Акрилокс #О О;. CH2r=CH—(Z	'>с—сн2		— —N=NC1
ХО—N< V—сн2 г 1 лицндилакрилат или метакрилат /Оч СНг==СН—С<	/ \		
X)—СН,—СН— сн2 Малеиновый ангидрид нс—сХ н£>°	—	—
1 -Акрил оиламиио-2- (4-нитробеи- зоиламино)этаи СНг=СН—cZ°	0^ ХЗН—СН—С— nh2 nh2 -no2	1. Na2S2O4, KOH 2. HNO2	+ — —N=NC1
22

реакционноспособными группами. Некоторые примеры представ-
лены в табл. 4.
Из других производных акриловой кислоты, применяющихся
для получения полимерных носителей, следует назвать хлоран-
гидрид метакриловой кислоты. При его взаимодействии, напри-
мер, с ванилином образуется мономер, дающий при полимериза-
ции соединение с высокореакционноспособными альдегидными
группами (так называемый «ванакрил»):
Большинство полимеров на основе акриловой кислоты не от-
личаются устойчивостью к воздействию многих химических реа-
гентов, а также сильно набухают в воде и органических раствори-
телях. Поэтому в некоторых случаях возникает необходимость
в полимерных материалах, имеющих более жесткую структуру.
Примером жесткого носителя смешанного типа на основе синте-
тического и природного полимеров является ультрогель типа
АсА; к синтетическим полимерам с жесткой структурой относятся
сополимеры производных акриловой кислоты, в частности
,0
СН2=С—СГ
|	ХО—СНг—СН2
СН3	|
ОН
2-оксиэтил метакрилата
о.
СН2=С—cZ	/С—с=сн2
I	О—СН2—СН2—Сх	I
СНз	СН3
этилендиметакрилата
23

Макропористые полимерные гели на основе мономеров та-
кого типа получаются обычно в виде сферических гранул. Важ-
ными характеристиками этих материалов служат их гидрофиль-
ность, механическая прочность, химическая и биологическая
стойкость, возможность использования органических растворите-
лей. Такие носители под названием «сферон» выпускаются фир-
мами «Lachema» (ЧССР) и «Realco Chem. Со» (США). Сфероны
можно получить гетерогенной суспензионной сополимеризацией
мономеров акрилата или метакрилата, содержащих гидроксиль-
ные группы, с диакрилатами и диметилметакрилатами в присут-
ствии инертного растворителя. Схематически фрагмент структу-
ры сополимера 2-оксиэтилметакрилата, сшитого этилендимета-
крилатом, можно представить следующим образом:
СНз
СООСН2СН2ОН
СНз
~С—СНа—С—СНа—С(СНз)—СН2—С
С—О
СНз
СООСН2СНаОН
С==О
На
Н2
СНа
СНа
:О
СООСНаСНаОН СН3
С=О
С—СН2—С—СНа-
СНа-
СНЭ
СНз
COOCHjCH?OH СН3
О
О
О
О
Изменяя соотношение концентраций исходных мономеров, можно
в широких пределах изменять пористость, удельную поверхность
и число активных гидроксильных групп сферона. Структура твер-
дого макросетчатого геля сферона похожа на структуру силикаге-
ля (гидрофобные углеводородные группы обращены внутрь поли-
мера). В то же время наличие гидроксильных групп на поверх-
ности придает матрице сходство с сефарозой и позволяет исполь-
зовать разработанные для сефарозы методы активации носителя.
Типы гелей «сферон», содержащих различные функциональные
группы, выпускаемые фирмой «Lachema» (ЧССР), приведены
ниже:
Функциональная Название
группа	(тип геля)
ОН Сферон 40, 100, 300,
1000, 100 000
СООН Сферон С 1000
(CH2)2N(C2H5)2 Сферон ДЭАЗ 1000
Функциональная Название
группа	(тип геля)
СОО
—NO2
Сферон Аг А 1000
Сферон CNP
24

OSO2OH Сферон S 1000
ОРО (ОН) >	Сферон Fostat
1000
CONHNH2 Сферон CH
Полиамидные носители. Это группа различных гетероцепных
полимеров с повторяющейся амидной группой —С (О)—NH—.
Один из способов их получения основан на гомополиконденсации
аминокарбоновых кислот, например е-аминокапроновой кислоты
или ее лактама (найлон-6, капрон):
Помимо найлона-6 для иммобилизации используются поли-
изонитрилнайлон, полиаминоарилнайлон и др. Амидные группы
придают полимерам гидрофильность.
Для использования в качестве носителей полиамиды активи-
руют, частично гидролизуя, с последующей обработкой, напри-
мер глутаровым альдегидом:
онс-(сн;),-сно *	СНО
^^СООН
Главным'достоинством носителей этого типа является то, что
они могут быть созданы в различной физической форме: в виде
гранул, порошков, волокон, мембран, трубок и т. д.
К группе полиамидных носителей следует отнести полимеры
на основе N-винилпирролидона:
СН2=СН
N
/Z4p=Q
Широкое применение этих носителей, прежде всего для меди-
цинских целей, обусловлено их биологической инертностью и
стойкостью к воздействию биологической среды. При использо-
вании поливинилпирролидона и сополимеров на его основе полу-
чаются препараты иммобилизованных ферментов, способные
25

медленно распадаться в организме, причем скорость распада
зависит от природы второго мономера и концентрации сшива-
ющего агента в смеси. Например, радикальная сополимеризация
винилпирролидона с акриловой кислотой в присутствии азо-
бисизобутиронитрила дает водорастворимый полимер, содержа-
щий карбоксильные группы, а сополимеризация с глицидилакри-
латом — водорастворимый полимер с альдегидными группами.
Носители на основе поливинилового спирта. Эти носители,
предложенные Г. Манеке и Г. Фогтом (1980), обладают высокой
реакционной способностью. Соответствующая обработка позво-
ляет вводить в них различные функциональные группы: диазо-,
изотиоцианатные, альдегидные, хлоротриазиновые, дисульфидные
и др. Для получения гидрофильных гелей носители могут быть
сшиты глутаровым альдегидом в кислой среде, а в щелочной —
эпихлоргидрином или п-ксилилендихлоридом:
К достоинствам носителей на основе поливинилового спирта
следует отнести, помимо высокого содержания реакционноспо-
собных групп, большую вместимость по отношению к белкам.
Полиуретаны. Гидрофильные полиуретановые полимеры, со-
держащие группировку —NH—С—О—, — достаточно удобные
О
материалы для включения ферментов в гель; процедура иммо-
билизации в этом случае заключается в простом смешении
компонентов.
Полиуретаны образуются при взаимодействии изоцианатов
(например, 2, 4- и 2, 6-толуилен-, гексаметилен- или дифенил-
метандиизоцианатов) с полиолами (гликолями, триолами, про-
стыми или сложными олигоэфирами, содержащими ОН-группы).
Структуру одного из полимеров для получения полиуретанового
геля можно представить в следующем виде:
СНз N=C=О
26

При полимеризации может происходить частичный гидролиз
изоцианатных групп с выделением диоксида углерода. Образу-
ющиеся аминогруппы взаимодействуют с изоцианатными груп-
пами, поперечно сшивая полимер. Суммарную реакцию можно
представить следующим образом:
2R—NCO + Н2О —R—NHCONH—R + СО2
Полиуретаны обладают большей стойкостью по отношению
к воде и окислителям, чем полиамиды.
§ 3. Активация полимерных носителей
Активация гидроксильных и аминогрупп носителя. Под акти-
вацией матрицы понимают проведение химической реакции с
активатором, в результате которой на ее поверхности образу-
ются электрофильные группы, обладающие высокой реакцион-
ной способностью по отношению к нуклеофильным группам на
белке (например, амино- и SH-группам). В числе наиболее
эффективных электрофильных групп можно назвать следующие
(Дж. Порат, 1976):
имидокарбонаты
карбонаты
эпоксиды
азиридины
активированные двойные связи, напри- СН2=СН—SO2—
мер	—С=СН—-С (О)—
активированные атомы галогена, на- Вг—СН2—С (О) —
пример	С1—C=NH
Вг—С (О)— СН2—
Реакции взаимодействия электрофильных групп носителя с
нуклеофильными группами белка будут рассмотрены в гл. III.
Здесь остановимся на способах получения самих активиро-
ванных полимерных матриц.
Имидокарбонаты. Получение этих производных основано на
реакции полимеров с циангалогенами. Взаимодействие BrCN в
водной или смешанной водно-органической среде с двумя сосед-
ними гидроксильными группами носителя приводит к образова-
нию через неустойчивый цианат активного имидокарбоната (I)
и неактивного карбамата (II):
27

Как правило, этот прием используется для активации полисаха-
ридов. Синтетические полимеры активируют этим способом зна-
чительно реже.
При температуре ^20°С оптимальное значение pH этой
реакции 11,0—12,5. Реакция в этих условиях крайне нерацио-
нальна. Дело в том, что создание сильно щелочной среды
обусловлено необходимостью повышения нуклеофильности носи-
теля, например полисахарида (за счет частичной ионизации
ОН-группы). Однако здесь неустойчив как сам BrCN, так и
образующийся эфир, который гидролизуется с образованием
неактивного карбамата. Поэтому более 80% эфира цианата
трансформируется по пути (II). Эффективность этой реакций
можно повысить, увеличив электрофильность циановой группи-
ровки. Такая возможность была реализована путем промежуточ-
ного переноса этой группировки на триэтиламин:
N(Et)3 +BrCN-№s=C—NT(Et)3Br-
(н)—ОН + №С—ЬГ (Et)3Br--V— (ну-0—C=5=N + HN(Et)3Br
Реакция активации идет при pH 7—8 через образование очень
реакционноспособного комплекса триэтиламмонийнитрила (более
реакционноспособного, чем BrCN), который атакует неионизо-
ванные ОН-группы полисахарида. При снижении pH с 12 до 7
в 20 раз снижается расход BrCN, вместо 4 включается до 24%
от внесенного азота (причем 98% оказывается в составе актив-
ных групп матрицы вместо 10% по старой методике). Эффек-
тивность включения повышается до 50%, а токсичность снижа-
ется практически до нуля, если вместо BrCN использовать
1-циан-4-диметил аминопиридинтетрафторборат.
Эпоксиды (оксираны). Например, 1,4-бис (2,3-эпоксипро-
покси)бутан часто используют для модификации и активации
гидроксилсодержащих полимеров:
(н>—ОН + сн2—сн—сн2—о—(сн2)4—о—сн2—сн— сн2 »-
хо/	xZ
сн—СН2—О—(СН2 )4—о—сн2—сн—сн2
I
Реакция протекает в щелочной среде (pH 8,5—11,0), реакцион-
ная способность образующегося эфира в отношении нуклеофиль-
28

ных групп белков проявляется в обычном порядке: SH > NH2 >
> ОН. Попутно может протекать реакция сшивки матрицы:
:н—СНа-
н
В результате матрица становится нерастворимой в кипящей воде
и более устойчивой к кислотам.
Для получения эпоксиактивированной матрицы вместо бис-
оксирана можно употреблять эпихлоргидрин. Преимущество
носителей, эпоксидированных длинноцепочечными соединениями
типа диглицилового эфира 1,4-я-бутандиола, по сравнению с носи-
телями, обработанными эпихлоргидрином, и в целом преиму-
щества метода эпоксидирования перед другими, в частности,
бромциановым, заключаются в том, что он дает возможность
получать длинную «ножку», отделяющую фермент от носителя. Это
обстоятельство может иметь значение для уменьшения потери
ферментативной активности из-за стерических затруднений, возни-
кающих в процессе иммобилизации.
Соединения с активированными двойными связями. В поли-
меры, содержащие гидроксильные или аминогруппы, можно ввес-
ти винилсульфонильные группы. Для этого матрицу обрабаты-
вают дивинилсульфоном в сильнощелочной среде:
(н)—ОН + СНа=СН—SOa— СН=СН2  *«•- (Й)--О—СН3—СН2—SO2~-СН™СН2
Этот метод активации используется редко ввиду токсичности
дивинилсульфона.
Весьма эффективными агентами для активации полисахари-
дов оказались ароматические хиноны, в частности бензохинон:
Реакция протекает легко с высоким выходом, в широком интер-
вале pH (от 3 до 10).
Соединения с активным атомом галогена. Хлортриазины (на-
пример, цианурхлорид) легко реагирует с гидроксильной и ами-
ногруппой полимера в щелочной водно-органической среде:
(где R = — Cl; —NH2; — NHR')
29

Наиболее часто этим способом активируют полисахариды и
их аминопроизводные, хотя используются и белковые носители
(коллаген, кератин, фиброин). Среди синтетических полимеров
аминированный полистирол и поливиниловый спирт также могут
быть успешно активированы хлортриазинами.
Эффективным реагентом, позволяющим проводить реакцию
в мягких условиях (pH 7,5), является трезилхлорид (трифтор-
этилсульфонилхлорид):
(н)—СН2ОН + C1~SO2—СН2—CF3 •- ®—СН2—О—SO2—СН2—CF3 + НС1
Альдегидные группы. Введение реакционноспособных альде-
гидных групп может быть осуществлено несколькими путями.
Полимеры, имеющие гидроксильные группы, например полисаха-
риды, могут быть окислены под действием перйодата натрия.
В качестве примера можно привести структуру звена диальде-
гидцеллюлозы:
HjC—i
Применение альдегидных производных полисахаридов часто обе-
спечивает меньшую потерю активности фермента, чем, например,
хлортриазильны.х производных.
Введение альдегидных групп в полимеры, содержащие амино-
группы, можно проводить с помощью диальдегидов, например
глутарового альдегида. Таким способом можно активировать
а ми поэт ил целлюлозу, аминополистирол, ПААГ, полиамиды, бел-
ковые носители и т. д. Реакцию активации аминогрупп можно
представить так:
(н)—nh2 + нос—(СН2)3—сно *- ®—N=CH—(СН2)3—сно
И наконец, введение альдегидной группы можно осуществить
при полимеризации, подбирая соответствующий мономер, на-
пример аддукты полиакролеина и гидросульфита натрия, сопо-
лимеры ненасыщенных альдегидов и винилпирролидона и т. д.
Один из процессов разобран выше (получение ванакрила).
-Ь
Имидоэфирные группы (—С — NH—). Введение этих групп
OR
применяется как один из способов активации полиамидных но-
сителей. Схему реакции с диметилсульфатом можно представить
следующим образом:
30

—C—NH------—C=NH—
II	I
О	ОСНз
Полимерные нитрилы обработкой хлорводородом в среде ме-
танола также можно активировать до имидопроизводных:
—Н2С—СН	н2с—СН—
C=N	C=NH
ОСНз
+
Диазогруппы (—N^NCl). Их введение — весьма широко
применяемый способ активации носителей, содержащих амино-
группы в ароматических радикалах. В качестве примера можно
назвать n-аминобензилцеллюлозу, поли-п-аминостирол, наиболее
часто активируемые этим путем. К аминопроизводным также от-
носятся ароматические аминопроизводные шелка, шерсти, хи-
тина, частично гидролизованный полиамид и др.
Довольно сложная схема активации сефарозы с целью вве-
дения реакционноспособных диазогрупп предложена С. Икедой
и С. Фукуи (1973):
N>CO—^"”4—NO,
(Й)—OH + H2N(CH2)6NH2	®—NH(CH2)6NH2 --—----►
(н)—NH(CH2)eNHCOC4H,\'O2
(н>—NH(CH2)sNHCO
Аминогруппы. Введение этих групп (с последующим диазотиро-
ванием) в носители, содержащие ОН-группы, может осуществ-
ляться различными способами. Полисахариды, как правило, об-
рабатывают хлорангидридом я-нитробензойной кислоты, далее
МОг-группы восстанавливают до NHo-rpynn:
ОН-группы поливинилового спирта активируют взаимодейст-
вием с 2-(ле-аминофенил)-1,3-диоксоланом (а) или п-нитрофе-
нилхлорметаном (б):
NH;
•n2ci
(«9
31

Активация карбоксильных групп носителя. Введение азидной
группы — это один из наиболее старых способов активации но-
сителей. Чаще всего для этой цели используют карбоксильные
производные полисахаридов — целлюлозы, декстрана. Модифи-
цированный препарат этерифицируют, переводят в гидразид, а
затем в азид:
c,hsoh, на
ОСН2СООС2Н5
он
NHjNH3  н2о
^^/OCH2CONHNH2 NaNOj/HCi
---------------------------
хон
OCH2CON3
он
В качестве источника для получения азида можно применять
и полимеры, не имеющие карбоксильных групп. Например, поли-
акриламид, обработанный гидразином («энзакрил АН»), легко
превращается в азид непосредственно перед иммобилизацией
фермента:
NH,NH,	NaNOj/HC! z—
(h}—CONH2  —-(H>—CONHNHj---------(h>—CON3
В последнее время азидный метод применяется редко из-за одно-
временного протекания ряда побочных реакций, приводящих к
образованию неактивных амидных и карбамидных групп на носи-
теле.
Широкое распространение получил метод ацилирования в
присутствии карбодиимидов. В качестве карбоксилсодержащих
полимеров могут быть использованы производные полисахари-
дов, различные полимеры на основе акриловой кислоты, сополи-
меры N-винилпирролидона и ненасыщенных кислот и др.:
NH—R
И наконец, весьма эффективным методом активации носите-
лей, содержащих карбоксильные группы, является ацилирова-
ние, в присутствии реактива Вудворда (М-этил-5-фенилоксазо-
лий-З'-сульфоната):
CL...
32

Этот процесс характеризуется такими положительными качест-
вами, как быстрота, мягкие условия протекания и, что очень
важно, возможностью легко контролировать количество введен-
ных активированных групп.
Модификация амидных групп (на примере полиакриламида).
Как правило, первая стадия активации полимера, содержащего
амидную группу, — это проведение реакции переамидирования:
I
Н2С
HaN— (СНг) г—NHg
Г 4xnh2	1Г X
нс-с<
.1	XNH— (СН2)2— NH2
Образовавшаяся функциональная группа требует дополни-
тельного активирования. Оно может быть проведено различны-
ми путями. Один из них — формирование стабильного диокси-
производного с последующим окислением до альдегида непосред-
ственно перед взаимодействием с ферментом:
,0	гК ю
(Hbcf	—
XNH—(CH2)2—NH2 2- NaBH.	XNH--(CH2)2—ХНС!ЬСВ—(H,он
NalO. Z-X	' Н
----®—С
XNH—(СН2)2—NHC11X
Другой путь последующей активации полиакриламида это
введение диазогруппы:
CONH(CH2)6—nh2 NjC0C‘Hj-n0^ » (н}_CONH(CH2)6—-NHCO—с6н4—n:o2— —
—*- ®—CONH(CH2) —NHCO—с6н,—nh2 NaN0*;HC‘ ».
---»- (н)—CONH(CH2)6—NHCO— C6H4——№NCI
Модификация бензольного ядра (на примере полистирола).
Наиболее распространенными из реакций модификации поли-
стирольных матриц являются хлорметилирование и нитрование.
Хлорметилирование может быть проведено различными способа-
ми, например под действием монохлордиметилового эфира в
присутствии SnCl4:
I	I
Н2С	Н2С
hc-Z"\	hc-Z'Vch-ci
Хлорметильное производное может быть промодифицировано
дальше избытком амина по отношению к хлорметильным груп-
пам (для предотвращения сшивания полистирольных цепей):
2—133

Н2С
Н2С
НС
СН2С1 НС
Nal ।
ch2nhr
(R = —(CH2)2NH2; —(CH2)2NH(CH2)2NH2)
Схема процесса нитрования с последующим восстановлени-
ем нитрогруппы может быть представлена так:
н2с	н2с	Н2С
НС-хАЛ	HC-^X-NCb	hc-ZA^nh2 -
\—/ н2ьо4 ।	\ /	KOh ।	\	/
H2C
та. нс
N(CI)
Кроме этих, наиболее известных способов модификации бен-
зольного ядра полимера используют также методы, основанные
на вг.- альдегид карбоксильных групп:
§ 4. Биодеградация полимерных носителей
Проблема биодеградации полимерных носителей приобретает
серьезное значение в связи с применением иммобилизованных
ферментов в медицине. Полимеры, имеющие высокую молеку-
лярную массу, могут накапливаться в организме, поэтому воз-
никает необходимость создания таких синтетических полимеров
(или выбора природных), которые будут расщепляться с обра-
зованием нетоксичных продуктов обмена. В этом отношении
предпочтение отдается природным полимерам, которые гидро-
лизуются в организме ферментами. Так, например, в качестве
носителя лекарственных препаратов наиболее широко приме-
няют декстран — нетоксичный, с малой иммуногенностью, спо-
собный к биодеструкции полисахарид. В свою очередь отметим,
что химическая модификация природных полимеров может су-
щественно снизить скорость их деструкции.
34

Среди синтетических полимерных материалов наибольшее
применение в качестве носителей лекарственных препаратов име-
ют полимеры на основе N-винилпирролидона. Проводятся также
попытки целенаправленного синтеза биодеградируемых полиме-
ров, в частности полиуретанов, содержащих в основной цепи
дипептидные фрагменты; поливинилпирролидона со звеньями
эфиров щавелевой кислоты и др.
Дополнительными факторами, играющими существенную роль
в длительности действия препаратов и в снижении их токсич-
ности, являются молекулярная масса и степень неоднородности
полимера. Так, молекулярная масса полимера не должна быть
слишком высокой. Например, установлено, что материалы на
основе поли-М-винилпирролидона, имеющие молекулярную массу
более 20 000, не спосс'Т-.ы вызолиться из организма. Важную
роль здесь играет и молекулярно-массовое распределение; по-
вышение неоднородности по молекулярной массе приводит к
увеличению токсичности материала.
ОРГАНИЧЕСКИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ НОСИТЕЛИ
§ 5. Природные носители (липиды)
Вопросы белок-липидных взаимодействий давно привлекают
внимание исследователей, так как in vivo большинство фермен-
тативных реакций протекает вблизи или на поверхности бйомем-
бран. Поэтому иммобилизация ферментов на природных ли-
пидных носителях (конструирование ансамблей белок-липид) мо-
жет рассматриваться как наиболее близкое приближение к ус-
ловиям функционирования ферментативных систем в живой
клетке.
Для целей такой иммобилизации, как правило, используются
природные липиды — компоненты биомембран. Структуры наибо-
лее распространенных природных липидов изображены на
рис. 1.
Обычно липидные носители применяются в виде монослоев
на различных поверхностях или бислоев (как правило, сфериче-
ской формы).
Монослои липидов на поверхности воды. Липиды, имеющие
в своем составе хотя бы небольшую полярную «голову», спо-
собны образовывать мономолекулярные пленки на границе
раздела фаз (вода и воздух или вода и неполярный раствори-
тель). Липидные молекулы в монослое расположены таким обра-
зом, что их полярные головные группы погружены в водную
фазу, а углеводородные части направлены в воздух или погру-
жены в органический растворитель. Такая пленка способна сор-
бировать белковые молекулы. Изучение монослоев липидов,
содержащих белок, помогает понять природу взаимодействия
липидов и белков в биологической мембране (сорбцию белка
на липидной поверхности, электростатические и гидрофобные
2*
35

j t	А V с- -С- А	д 'С'
£ v	-с- ”9* С' ЧЙ	-с- j с- -.9
9-) 'с- -с-	.А. с £	-с- »'9» с- t
< Z -ё- С- А -С- ’	£ 1 О’ О ОС с^°'	<• £ с -с- .-С. I 9 /
сАо * с сс °'		с '9* О" о ОС
-с-	-с-	-с-
о	6	о
О-Р-О	О-Р-О	О-Р-О
о	0	д
-с-	с	о ю
’С-	н. о. .о	Н С С Нг 0^'С^'0
HN-H	H-N С'	
н	н д	он н
Фосфатидил -
-этаноламин  серин -инозит
Сс- с-	1 I	-с- > -
	< £ <	с-	-с- ’9'
.-с- -9’ i -с-			с- '9” ' £ 1 -с- 9
,-сд < 9- (-с- '9 •с- < £ г V О' О О=с	с- -ё- 9> с- с‘	с -С-1 А >с- t -с- *'9'
	-О’ 1 А?	-9‘ 'а
	О'^ О < с	с ' "9" О' о о=с
6:cd	СС'°	
-с-	<	н ’9"
д	д	° . °
О Р-О	О Р-О <	5-с-с о-р-о
д	д	д
с н С*н *	Кардиолипин	
HC-N-CH		
НАН ННН		
- холин (лецитин)
О
О-Р-О
о
-с-
-с-
н М ’
НС'1!4 с
ннСнн
н
н
сн

Н С'
ОС С
°н с с-
он
Цереброзид
Сфингомиелин
н
Рис. I. Основные типы мембранных липидов:
а — глицеролипиды; б — сфинголипиды, в — холестерин; черточки — атомы водорода; полуокружности — объемы,
занимаемые неполярными хвостами(/) и полярными головами липидов (//)

взаимодействия этих соединений, влияние поверхности на кон-
формацию белка).
Получение монослоев липидов на поверхности воды требует
специальной техники и является весьма трудоемкой процедурой,
что ограничивает их применение.
Монослои липида на твердой поверхности. Эти системы в
качестве носителей были предложены О. М. Полтораком и
Е. С. Чухрай (1966). Суть метода состоит в нанесении липидного
монослоя на твердую подложку (силикагель, сажа, аэросил)
с последующей адсорбцией белка из водного раствора. В качест-
ве липидной матрицы используют обычно лецитин, фосфатидил-
этаноламин и холестерин. Разработан также метод получения
искусственных смешанных лецитин-холестериновых слоев.
Возможность варьировать структуру и ориентацию молекул
в липидных слоях достигается подбором полярности носителя
и природы используемого растворителя липида. Если липид
с молекулами дифильной природы, растворенный в неполярном
органическом растворителе (бензол, гептан), адсорбировать на
полярном силикагеле, то в монослое липида углеводородные цепи
будут ориентированы наружу. При адсорбции липида из по-
лярного растворителя на неполярной графитовой саже можно
получить гидрофильный монослой, в котором полярные голов-
ные группы ориентированы в сторону растворителя.
Липосомы. Впервые липосомы были описаны А. Бэнгэмом
в 1964 г. Для их приготовления наиболее часто используются
фосфатидилхолины (лецитины), фосфатидилэтаноламин, фосфаг-
идилсерин, кардиолипин, сфингомиелин, причем они образуются
как из чистых липидов, так и смесей.
Существует три различных типа липосом: мультиламелляр-
ные, моноламеллярные и макровезикулярные. Мультиламелляр-
ные липосомы представляют собой замкнутые упорядоченные
структуры, состоящие из нескольких концентрических липидных
бислоев, отделенных один от другого водной средой. Расстояние
между соседними липидными бислоями равно 7,5 нм, диаметр
центрального водного ядра равен приблизительно 0,15 мкм, а
суммарный диаметр мультиламеллярных липосом колеблется, от
1—2 до 50 мкм.
Ультразвуковая обработка мультиламеллярных липосом при-
водит к трансформации их в простые, или моноламеллярные.
При такой обработке размеры частиц уменьшаются; диаметр
моноламеллярных липосом составляет от 20,0 до 50,0 нм.
Третий тип липосом — макровезикулярные липосомы, обра-
зующиеся, например, путем слияния малых липосом, индуцируе-
мого ионами Са2+, а также присутствием фосфолипидов с от-
рицательно заряженными головными группами. Такие липосомы
состоят из одного бислоя и могут иметь диаметр от 60,0 нм до
100 мкм.
Размер и форма липосом зависят от способа их приготовле-
ния, а также от таких факторов, как кислотность среды, при-
37

сутствие неорганических солей и природы используемого липида.
Широкое применение липосом как носителей для ферментов
и лекарственных препаратов обусловлено простотой получения,
легкостью регенерации иммобилизованного материала, а также
возможностью использования in vivo благодаря близости свойств
этих липидов носителей и природных биомембран.
§ 6. Синтетические аналоги липидов
(поверхностно-активные вещества)
Поверхностно-активные вещества (ПАВ) состоят из молекул
дифильной природы, имеющих в своем составе как полярную
головную группу, так и неполярную углеводородную часть.
В принципе уже рассмотренные природные липиды также от-
носятся к ПАВ. Синтетические ПАВ — это соединения, многие
из которых являются продуктами крупнотоннажного произ-
водства.
В зависимости от того, какие группы присутствуют в головной
части молекулы, все ПАВ можно разделить на четыре основ-
ных типа: анионные, катионные, неионные и цвиттерионные.
В качестве примеров можно назвать следующие:
О	О
I!	II
НзС— (Н2С) 3—сн—сн2—о— с—сн—сн2—с—
I	J
НзС—СН2	SO3 Na
—О—СН2—СН—(СН2)з—СНз
Н2С—СНз
био-2-этилгексиловый эфир натриевой соли сульфоянтарной кислоты — анионное ПАВ
СНз
H3C-±N— (СН2) is—СНзВг-
СНз
цетилтриметиламмонийбромид — катионное ПАВ
НО— [СН2—СН2—О]9	(СН2)7~СНз
поли (9—10) оксиэтилена октилфениловый эфир (тритон X-100 — неионное ПАВ)
+N(CH3)2CH2COO-,
алкилдиметилкарбоксибетаин — цвиттерионное ПАВ,
где п = 10—18,
Приведенные примеры не исчерпывают всего многообразия
промышленных ПАВ. Так, например, фирмой '«Serva» выпуска-
ется более 30 наименований только неионных ПАВ различного
38

Таблица 5. Неионные ПАВ, выпускаемые фирмой «Serva»
Типы структур ПАВ
НО—[ Et—О] ---------
(простые эфиры полиоксиэтилена)
НО—[Et—О] д—СО'
(сложные эфиры полиоксиэтилена)
/СН2—СН—О—[ Et—О] —Н
О
\н—снон
I
снон
сн2—о—со—-------
(оксиэтилированные эфиры ангид-
росорбита и жирных кислот)
(полиоксиэтиленалкилфениловые
эфиры)
п	Углеводородныг фрагмент	।	Название
1	Гексадецил	Бридж 52
3	Додецил	Бридж 30
9	Гексадецил	Бридж 56
20	Гексадецил	Бридж 58
20	Додецил	Бридж 35
8	Стеароил	Мирдж 45
40	Стеароил	Мирдж 52
100	Стеароил	Мирдж 59
0	Триолеоил	Спан 85
0	Тристеароил	Спан 65
0	Олеоил	Спан 80
0	Стеароил	Спан 60
0	Пальмитоил	Спан 40
0	Лауроил	Спан 20
5	Стеароил	Твин 61
20	Тристеароил	Твин 65
20	Триолеоил	Твин 85
20	Стеароил	Твин 60
20	Олеоил	Твин 80
20	Пальмитоил	Твин 40
20	Лауроил	Твин 20
1	Октил	Тритон Х-15
3	Октил	Тритон Х-35
5	Нонил	Тритон N-57
5	Октил	Тритон Х-45
8-9	Октил	Тритон Х-114
9—10	Октил	Тритон Х-100
12—13	Октил	Тритон Х-102
16	Октил	Тритон Х-165
30	Октил	Тритон Х-305
40	Октил	Тритон Х-405
строения (табл. 5). Список промышленных ПАВ с обсуждением
их свойств можно найти в справочнике «Поверхностные явле-
ния и поверхностно-активные вещества» (под ред. А. А. Абрам-
зона и Е. Д. Щукина, 1984).
Рассмотрим некоторые примеры использования ПАВ в качест-
ве носителей для ферментов.
Обращенные мицеллы ПАВ в органических растворителях.
Они представляют собой ассоциаты, в которых полярные го-
ловные группы молекул ПАВ образуют ядро мицеллы, а угле-
водородные остатки этих молекул направлены в органический
растворитель. В полярную внутреннюю полость обращенной ми-
целлы может быть включено (солюбилизовано) значительное
количество воды (до нескольких десятков молекул воды на
каждую молекулу ПАВ) и других полярных веществ. Размеры
внутренней полости обращенных мицелл можно целенаправленно
39

и в широких пределах варьировать (от 1 до 20 нм), изменяя
содержание воды в системе.
Обращенные мицеллы образуются ПАВ различного типа, как
синтетическими, так и природными. Наиболее полно изученным
по физико-химическим параметрам и представляющим большой
интерес для целей иммобилизации ферментов является бис-2-
этилгексиловый эфир натриевой соли сульфоянтарной кислоты
(аэрозоль ОТ) — продукт, выпускаемый фирмами «Merck»
(ФРГ), «Sigma» (США), «Serva» (ФРГ). Обращенные мицеллы
аэрозоля ОТ в органическом растворителе (например, октане)
характеризуются весьма узким распределением по размерам, т. е.
каждому значению содержания воды в системе соответствует
определенный диаметр агрегатов аэрозоля ОТ.
Синтетические моющие средства с биодобавками. Синтетиче-
ские моющие средства (СМС) на основе ПАВ используются
в практике очень давно. В последние годы все шире начинают
применяться СМС с биодобавками — ферментами. В качестве
ПАВ в таких композициях применяются обычно смеси синтети-
ческих жирных кислот (Си—С20), оксиэтилированных жирных
спиртов, алкиларилсульфонаты и др. Такие ПАВ входят в по-
рошкообразные моющие средства «Ока» и «Био», содержащие
в своем составе протеолитические ферменты Средство для чист-
ки ковров и удаления различных пятен включает смесь натрие-
вых солей производных сульфоянтарной кислоты в качестве
носителей для высокоактивных биодобавок на основе смеси липо-
литических, протеолитических и амилолитических ферментов.
Носители из полимеризованных ПАВ. Г. Рингсдорфом
(1977—1978) был предложен метод модификации сферических
липидных агрегатов, заключающийся в их полимеризации.
В этом случае для получения липосом используются липиды, мо-
лекулы- которых модифицированы путем введения групп, содер-
жащих кратные углерод-углеродные связи. В результате поли-
меризации происходит ковалентная сшивка липосомальной обо-
лочки, приводящая к ее ужестчению. Помимо модифициро-
ванных природных липидов для приготовления полимерных липо-
сом применяются также синтетические мономерные ПАВ.
Основные типы функциональных групп, вводимых в молекулы
синтетических ПАВ и липидов, и способы их полимеризации при-
ведены в табл. 6.
В зависимости от вида функциональной группы полимериза-
цию проводят различными способами. В большинстве случаев
полимеризация представляет собой радикальную реакцию, ини-
циируемую химически и (или) облучением ультрафиолетовым
светом. Наиболее широко в качестве инициатора радикальной
полимеризации используют азо-бис-изобутиронитрил. Эффектив-
ность полимеризации увеличивается при переходе от моноламел-
лярных липосом к мультиламеллярным. Легкость и глубина
протекания полимеризации зависят также от положения крат-
ной связи в молекуле мономерного ПАВ (липида). Чем ближе
40

Табл и и а
6. Способы получения
полимерных липосом в зависимости от
типа мономера
Функциональная группа
Сопряженные тройные связи
Ri—С=С- CSC-R2
Сопряженные двойные связи
R!—СН=СН—СН=СН—R-
Двойные связи
Rf—СН=СН—R,
Тройная связь
R—N==C
SH -группа
Амидная и эфирная группы
(поликонденсация)
Схема реакции
* Ri, Rz — фрагменты молекулы липида или ПАВ. не принимающие участия в поли-
мериза нии
двойная связь к полярной «голове» молекулы, тем «труднее»
проходит полимеризация.
По сравнению с обычными полимерные липосомы гораздо
более стабильны по отношению к механическим и химическим
воздействиям и сохраняют форму и размеры в течение несколь-
ких месяцев.
В настоящее время усилия исследователей направлены на
создание с использованием полимерных липосом носителей для
лекарственных препаратов.
НЕОРГАНИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ —
НОСИТЕЛИ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ
Для иммобилизации ферментов используются различные типы
неорганических носителей, такие, как матрицы на основе сили-
кагеля, глины, керамика, природные минералы, графитирован-
41

ная сажа, металлы и их оксиды. Основными качествами, обус-
ловливающими широкое внедрение неорганических материалов
в промышленные процессы, являются легкость их регенерации,
возможность придания им любой конфигурации. Носители при-
меняются как в виде порошков, шариков, так и монолита. Не-
органические носители могут быть как пористыми, так и непо-
ристыми.
§ 7. Макропористые кремнеземы
К носителям этого типа относятся силикагели, силохромы
и макропористые стекла. К достоинствам кремнеземных носи-
телей следует отнести механическую прочность, химическую
инертность ко многим растворителям, наличие жесткого скелета
с заданным размером пор, устойчивость к воздействию микро-
организмов.
Силикагель — аморфное вещество с обшей химической фор-
мулой xSiO2«z/H2O. Получают его в процессе «старения» (поли-
конденсации) ортокремниевой кислоты (S1O2-2H2O). Схемати-
чески процесс поликонденсации выглядит следующим образом:
I	|
ОН	—О—Si—О—Si—О—...
НО—Si—ОН—>0	О
ОН	—О—Si—О—Si—О—...
I	I
Поверхность частиц силикагеля и других кремнеземов покры-
та гидрофильными гидроксильными группами, обладающими сла-
бовыраженными кислотными свойствами. В щелочной среде си-
ликагель постепенно разрушается:
2>Si—О—Si<^+ FW^^SiOH + НО—Si^
Недостатки кремнеземных носителей связаны с использова-
нием их в ограниченном диапазоне pH, с некоторой неспецифиче-
ской сорбцией на их поверхности. Последнюю можно устранить
путем модификации поверхности кремнеземов. Модификацию
обычно проводят одним из двух способов. Для снижения раст-
воримости и повышения стабильности носителей их покрывают
различными материалами, например пленкой оксида металла
(алюминия, циркония, титана), полимеров (полиэтиленимина),
или обрабатывают солями переходных металлов.
Можно химически модифицировать кремнеземы путем введения
различных реакционноспособных групп (—CN; —NO2, —NH2
и др.) или гидрофобизовать поверхность, например хлорангидри-
дами замещенных бензойных кислот или стеароил хлоридом.
Среди методов химической модификации кремнеземов наибо-
42

лее распространенным является обработка носителя кремний-
органическими веществами. Так, взаимодействие с у-амино-
пропилтриэтоксисиланом приводит к появлению на поверхности
носителя аминогрупп
^>Si—OH ^jH^sycHdaN^ ^Si_0—Si(CH2)3NH2
что позволяет использовать такие носители для иммобилизации,
а также модифицировать аминопропилкремнеземы различными
реакционноспособными производными кислот (хлорангидридами,
ангидридами, азидами и т. д.). Другие силанольные производные,
применяемые для модификации кремнеземов, приведены ниже:
(СНзО) 3Si (СН2) 3CN	(СНзО) 3Si (СН2) 3ОСН2СН—СН2
у-цианопропилтримето-	^'О/^
ксисилаи	у-глицидоксипропилтриметоксисилан
(CH3O)3Si(CH2)3—SH
V-меркаптолропилтриметоксисилан
Широко распространен метод обработки кремнеземов гало-
геналкилсиланами, например хлорметилтриэтоксисиланом, при-
водящий к образованию реакционноспособных галогеналкильных
групп:
_\gj____QJ-j jLCjtbOlSjCHjCI^
К другим модификаторам, позволяющий: получать .активи-
рованные производные кремнеземов, относятся сложные эфиры
силилкарбоновых кислот. Сложноэфирные производные кремне-
земов легко могут быть переведены в реакционноспособную
гидразидную или азидную формы:
^>Si—ОН (c^5oi3^.-co2si1cH^^si—О—-Si—RCO2Si(CH3)3
n2j
SiOSi—R—CONH—NH2	\Si_o_Si„.R_CoN3
I	НС| /	I
Таким образом, применение различных модифицирующих
агентов дает возможность целенаправленного изменения свойств
поверхности кремнеземных носителей. Однако стоимость кремне-
земных носителей относительно высока, а модификация еще
выше поднимает их цену, что является существенным ограни-
чением во внедрение кремнеземов в промышленности.
$ 8. Другие неорганические носители
Более пригодными для промышленного использования могут
оказаться природные алюмосиликаты — глины, цеолиты, а также
пористая керамика, в состав которой, помимо алюмосиликатов,
43

входят оксиды титана, циркония, или другие добавки. Поверх-
ность таких носителей аналогично кремнеземным может быть
модифицирована различными органическими веществами, напри-
мер замещенными силанами (у-аминопропилтриэтоксисиланом).
Важной характеристикой силикатных и алюмосиликатных но-
сителей является высокая плотность поверхностных групп, свя-
зывание белковых молекул на которых может осуществляться
как за счет электростатических взаимодействий, так и водород-
ных связей. Это имеет немаловажное значение для эффективной
иммобилизации ферментов.
Следует также отметить широко распространенные носите-
ли— уголь и графитированную сажу. Уголь может быть ис-
пользован в качестве носителя как для адсорбционной, так и
для ковалентной иммобилизации (после предварительной акти-
вации поверхностных оксидных групп).
К достоинствам графитированной сажи можно отнести высо-
кую однородность и электрическую проводимость ее поверхности.
Последнее свойство важно при создании биоэлектрокатадитиче-
ских систем на основе иммобилизованных ферментов. Серьезным
недостатком этого носителя является низкая механическая проч-
ность, что ограничивает его применение. Отложением углерода
на гранулированной саже бы.-:	таn |’«>Р5-;п носитель — карбо-
хром, в котором высокая .	чность сочетается
с достоинствами графитированной сажи.
Весьма перспективными представляются носители на основе
металлов и их оксидов. Эти носители характеризуются высокой
механической прочностью, относительной дешевизной, стабиль-
ностью, хорошими гидродинамическими свойствами. На практике
чаще всего употребляются носители на основе оксида алюминия
и титана. В промышленном масштабе их получают обычно в
виде макропористых порошков, однородных по форме и размеру.
Применение матриц этого тина позволяет проводить иммобили-
зацию ферментов как ковалентным связыванием с носителем,
так и адсорбцией на нем. Для ковалентной иммобилизации но-
ситель предварительно активируют у-аминопропилтриэтоксиси-
ланом.
Металлические поверхности, используемые в качестве носите-
лей (Al, Ni, Ti), как правило, модифицируют, либо создавая
оксидную пленку на поверхности матрицы, либо покрывая их
слоем полимера (производные полистирола, целлюлозы и т. д.).
Это позволяет значительно повысить сорбционную вместимость
носителя.
Таким образом, рассмотрение основных типов носителей сви-
детельствует о широких возможностях, предоставляемых химией
инженерной энзимологии. Наиболее полный перечень неорганиче-
ских и органических носителей для иммобилизации, вырабаты-
ваемых промышленностью многих стран мира, приведен в спра-
вочнике А. А. Лурье «Хроматографические материалы» (1978).

Глава
МЕТОДЫ ФИЗИЧЕСКОЙ
Lk иммобилизации ферментов
Согласно одному из принятых определений, которое вытекает
из более общего определения иммобилизации, сформулирован-
ного во Введении, под иммобилизацией фермента понимается
его включение в какую-либо изолированную фазу, которая от-
делена от фазы свободного раствора, но способна обмениваться
с находящимися в последней молекулами субстрата или эффек-
тора. Иными словами, иммобилизация представляет собой вклю-
чение фермента в такую среду, в которой для него доступной
является лишь ограниченная часть общего объема. На основании
этого определения все существующие методы физической иммо-
билизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соеди-
нен с носителем ковалентными связями) можно разделить на
четыре группы: 1) адсорбция на нерастворимых носителях;
2) включение в поры геля; 3) пространственное отделение фер-
мента от остального объема реакционной системы с помощью
полупроницаемой перегородки (мембраны); 4) включение в двух-
фазную реакционную среду, где фермент растворим и может
находиться только в одной из фаз.
Сущность перечисленных подходов иллюстрируется рис. 2.
Приведенная классификация условна, поскольку не всегда
возможно провести четкую границу между различными спо-
собами иммобилизации. Например, при иммобилизации путем
включения в гель последний можно рассматривать как полу-
проницаемую мембрану, отделяющую фермент от раствора суб-
страта. Тем не менее использование такой классификации по-
лезно в том отношении, что она позволяет систематизировать
существующие методы физической иммобилизации и помогает
ориентироваться в их огромном многообразии.
В задачу настоящей главы не входит подробное описание
носителей, применяющихся для иммобилизации, и рассмотрение
конкретных примеров иммобилизации различных ферментов.
Сведения такого рода содержатся, соответственно, в первой гла-
45

полимерная
полупроницаемая
мембрана
ве этой книги и в работах
включенных в список ре-
комендуемой литературы,
В последующем изложе-
нии конкретные данные
привлекаются лишь в тех
случаях, когда это необ-
ходимо для более ясного
понимания общих принци-
пов и закономерностей.
Ниже более подробно
рассмотрены четыре под-
хода к физической иммо-
билизации ферментов, со-
ставляющие основу клас-
сификации.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
ПУТЕМ АДСОРБЦИИ,
НА НЕРАСТВОРИМЫХ
НОСИТЕЛЯХ
Адсорбционная иммо-
билизация является наи-
более старым из всех
существующих сейчас спо-
собов иммобилизации
ферментов. Еще в 1916 г.
успешную иммобилизацию
Рис. 2. Способы физической иммобилизации
ферментов:
а — адсорбция на нерастворимых носителях; б
включение в поры геля; в — отделение фермента
с помощью полупроницаемой мембраны; г — ис-
пользование двухфазной реакционной среды
Дж. Нельсон и Э. Гриффин провели
инвертазы путем адсорбции на активированном угле и геле гид-
роксида алюминия. Этот же метод был использован для получе-
ния первого технологического иммобилизованного ферментного
препарата в 1969 г., когда И. Шибата с сотрудниками осуществи-
ли гидролиз М-ацетил-/),Л-аминокислот под действием адсорбци-
онно иммобилизованной L-аминоацилазы. В настоящее время
адсорбционная иммобилизация благодаря целому ряду преиму-
ществ является наиболее широко распространенным способом
получения иммобилизованных ферментных препаратов промыш-
ленного значения.
§ 1.	Носители для адсорбционной иммобилизации
Носители для адсорбционной иммобилизации можно разде-
лить на два основных класса — неорганические и органические.
В качестве неорганических носителей главным образом исполь-
зуются кремнезем, оксиды алюминия, титана и других металлов,
различные природные алюмосиликаты (глины), пористое стекло,
керамика, активированный уголь и др. Среди органических
носителей наибольшее распространение получили различные по-
лисахариды и полимерные ионообменные смолы, коллаген.
46

Обычно носители применяются в виде порошков, мелких
шариков и гранул. Иногда для снижения гидродинамического
сопротивления носители изготавливают в форме монолитов, про-
низанных большим числом узких параллельных каналов, раз-
деленных тонкими стенками. Важнейшими характеристиками
носителей являются удельная поверхность, размер пор, механиче-
ская прочность и химическая стойкость.
§ 2.	Методика адсорбционной
иммобилизации
Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нераствори-
мых носителях отличается исключительной простотой и достига-
ется при .контакте водного раствора фермента с носителем.
После отмывки неадсорбировавшегося фермента препарат иммо-
билизованного биокатализатора готов к использованию. На
практике для получения адсорбционно-иммобилизованных
ферментов применяются следующие методические подходы
(рис. 3).
Статический способ (рис. 3,с) наиболее прост и состоит в
том, что носитель вносят в водный раствор фермент-- и полу-
ченную смесь оставляют на некоторое время без перемешивания.
Иммобилизация достигается за счет самопроизвольной диффу-
зии фермента к поверхности носителя с последующей адсорб-
цией. Недостатком метода является то, что для получения пре-
парата с высоким содержанием адсорбированного фермента и
равномерного заполнения поверхности носителя последний при-
ходится выдерживать в контакте с раствором фермента в течение
длительного времени (несколько суток).
В лабораторной практике чаще всего применяется способ
с перемешиванием (рис. 3,6), при котором носитель суспенди-
руется в растворе фермента и полученная смесь непрерывно
перемешивается с помощью магнитной или механической мешал-
ки или на лабораторной качалке. Этот способ гораздо эффек-
тивнее статического и обеспечивает более равномерное запол-
нение поверхности носителя адсорбированным ферментом.
Иногда для проведения адсорбционной иммобилизации при-
меняют метод электроосаждения (рис. 3, в). В этом случае в
раствор фермента погружают два электрода, на поверхность
одного из которых помещают слой носителя. При включении
электрического тока молекулы фермента благодаря имеющимся
на их поверхности заряженным группам начинают перемещаться
в растворе в направлении соответствующего электрода и осаж-
даются на поверхности носителя.
Для технологического использования наиболее удобен метод
нанесения в колонке. Существует две модификации этого метода’.
В одной из них через колонку, заполненную носителем, с по-
мощью насоса прокачивают в направлении сверху вниз раствор
47

водный раствор
фермента
электроды
колонка с
носителем
Рис. 3. Способы адсорбционной
иммобилизации ферментов
фермента в режиме непрерывной циркуляции (рис. 3,г). В дру-
гом варианте метода направление потока изменено на противо-
положное, т. е. раствор фермента подается в нижнюю часть
колонки (рис. 3, д), причем скорость потока подбирается так,
чтобы частицы носителя оставались во взвешенном состоянии,
образуя «кипящий слой». Метод нанесения в колонке обладает
тем преимуществом, что позволяет проводить нанесение фермен-
та, промывку, а затем и сам ферментативный процесс в одной
и той же колонке без дополнительных манипуляций с носи-
телем.
48

§ 3.	Природа адсорбционных взаимодействий фермента
с носителем
Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверх-
ности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических
ван-дер-ваальсовых взаимодействий, электростатических взаимо-
действий, водородных связей и гидрофобных взаимодействий
между носителем и поверхностными группами белка. Относи-
тельный вклад каждого из типов связывания зависит от хими-
ческой природы носителя и функциональных групп на поверх-
ности молекулы фермента. В большинстве случаев основную роль
в связывании фермента играют электростатические взаимодейст-
вия и водородные связи. Взаимодействия с носителем могут
оказаться настолько сильными, что сорбция биокатализатора
будет сопровождаться разрушением его структуры. Например,
при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах
цитодекса клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф
поверхности частиц носителя.
§ 4.	Влияние различных факторов
на адсорбцию ферментов на носителе
Протекание процесса адсорбции и прочность связывания фер-
мента с носителем в значительной степени зависят от условий
проведения иммобилизации. Основными факторами, влияющими
на адсорбцию фермента, являются удельная поверхность и по-
ристость носителя, значения pH и ионной силы раствора фер-
мента, его концентрация и температура проведения процесса
адсорбции.
Удельная поверхность и пористость носителя. Сорбционная
емкость носителя пропорциональна его удельной поверхно-
сти. В приложении к белкам (ферментам) эта закономерность,
однако, действует только в том случае, когда носитель непорис-
тый или когда диаметр пор намного превосходит размер бел-
ковых молекул. Если же поры настолько малы, что не могут
вместить молекулу фермента, то для белка оказывается доступ-
ной только часть общей поверхности, т. е. сорбционная ем-
кость носителя по отношению к ферменту небольшая, несмотря
на очень большую общую удельную поверхность. Критерий для
определения оптимального размера пор носителя для адсорбци-
онной иммобилизации ферментов был предложен Р. Мессингом
(1976), который изучал адсорбцию различных ферментов на по-
ристом стекле и керамических носителях с калиброванным
размером пор. В соответствии с этим критерием диаметр пор
должен приблизительно в два раза превосходить размер мо-
лекулы белка в направлении ее максимального удлинения. При
этом предполагается,', что молекулярные размеры субстрата на-
много меньше, чем фермента, так что молекула субстрата за-
ведомо способна проникнуть в пору, где находится сорбирован-
49

ный фермент. В том случае, если субстратом является вещество
с очень большой молекулярной массой, выбор диаметра пор
носителя может диктоваться уже размерами молекулы субстрата.
Более того, высокомолекулярный субстрат сам может служить
носителем для иммобилизации фермента. Например, для адсорб-
ционной иммобилизации ферментов целлюлазного комплекса был
успешно использован его субстрат — целлюлоза.
Значение pH. Реакция среды оказывает очень сильное влия-
ние на эффективность сорбции фермента на поверхности носи-
теля, особенно, если сорбция осуществляется главным образом
за счет электростатических взаимодействий. Причина этого
влияния состоит в том, что при изменении pH меняется состоя-
ние ионизации ионогенных групп носителя и белка, ответствен-
ных за связывание. При использовании носителей, не являю-
щихся ионообменниками, максимальная адсорбция обычно дости-
гается в изоэлектрической точке белка. Иными словами, рН-за-
висимость адсорбции должна иметь вид кривой с одним макси-
мумом, соответствующим значению изоэлектрической точки. Од-
нако известны случаи, когда это правило нарушается. Напри-
мер, pH-зависимость эффективности адсорбции альбумина на ла-
тексе имеет внд W-образной кривой, а значение pH, при кото-
ром достигается максимальная адсорбция этого белка на угле,
изменяется от 3 до 6 в зависимости от типа последнего.
Ионная сила. Значение этой величины оказывает влияние
на прочность связывания фермента с носителем. При высокой
концентрации солей присутствующие в растворе ионы вытесняют
с поверхности носителя связанные за счет электростатических
взаимодействий белковые молекулы. Иными словами, возраста-
ние ионной силы вызывает десорбцию фермента. Однако иногда
эта закономерность не действует, и увеличение концентрации
соли, наоборот, способствует адсорбции фермента на носителе.
В таких случаях принято говорить об эффекте «высаливания»
белка из раствора.
Концентрация фермента. При возрастании концентрации
фермента в растворе, из которого происходит адсорбция, коли-
чество сорбировавшегося на носителе фермента увеличивается
и соответственно растет удельная каталитическая активность
иммобилизованного препарата. Зависимость удельной каталити-
ческой активности от исходной концентрации фермента, как пра-
вило, имеет вид кривой с насыщением, что свидетельствует
о существовании лишь ограниченного числа центров связывания
фермента на поверхности носителя, которые к тому же обла-
дают неодинаковым сродством по отношению к белку. При
дальнейшем повышении концентрации фермента в растворе мо-
жет происходить образование поверх первого слоя адсорбиро-
ванного фермента второго и последующих слоев. Наибольшей
каталитической активностью обладают верхние слои адсорбиро-
ванного фермента, где ограничения, накладываемые на скорость
реакции диффузией субстрата, минимальны. Поэтому излишняя
50

«перегрузка» носителя ферментом приводит к тому, что более
глубоко расположенные слои адсорбированного биокатализатора
исключаются из сферы реакции, и в результате общая эффек-
тивность использования фермента снижается.
Температура. Повышение температуры оказывает двоякое
воздействие на процесс адсорбционной иммобилизации. С одной
стороны, сильное нагревание приводит к потере ферментативной
активности вследствие тепловой денатурации белковой глобулы.
С другой стороны, рост температуры обычно обеспечивает уско-
рение процесса благодаря повышению скорости диффузии мо-
лекул фермента в порах носителя. Следовательно, должна су-
ществовать некоторая оптимальная температура для проведе-
ния адсорбционной иммобилизации. Точное значение оптималь-
ной температуры зависит от природы адсорбируемого фермента
и поверхности носителя.
Таким образом, эффективность адсорбционной иммобилиза-
ции ферментов определяется тонким балансом целого ряда фак-
торов. Нарушение этого баланса вследствие изменения (порой
незначительного) какого-либо из внешних условий может при-
вести к резкому ослаблению взаимодействия фермента с носи-
телем и, следовательно, к его десорбции. Чтобы избежать этого
нежелательного явления, на практике используется ряд методи-
ческих приемов, некоторые из которых рассмотрены в следую-
щем разделе.
§ 5.	Способы увеличения эффективности
связывания фермента с носителем
Иммобилизация на предварительно модифицированных но-
сителях. Предварительная модификация носителя во многих
случаях позволяет существенно повысить прочность связывания
адсорбционно-иммобилизованного фермента. Следует подчерк-
нуть, что помимо увеличения эффективности сорбции модифика-
ция носителя нередко обеспечивает также улучшение каталитиче-
ских свойств иммобилизованного фермента благодаря созданию
для его молекул благоприятного микроокружения. Более того,
без предварительной модификации носителя иногда вообще не
удается сохранить каталитическую активность фермента при ад-
сорбционной иммобилизации. Например, если фермент обладает
низкой стабильностью в кислой области pH, то при его адсорб-
ции на силикагеле может произойти потеря каталитической
активности, поскольку поверхность этого носителя имеет кислый
характерен ~4). Для предотвращения инактивации фермента
силикагель перед проведением иммобилизации необходимо вы-
держать некоторое время в буферном растворе с таким значе-
нием pH, которое является оптимальным для данного фермента.
Аналогичная проблема часто возникает при адсорбционной им-
мобилизации ферментов, которым для нормального функциони-
рования необходимо присутствие в активном центре иона ме-
51

талла. Дело в том, что большинство носителей способны селек-,
тивно и прочно сорбировать ионы металлов, поэтому при ад-
сорбционной иммобилизации металлозависимых ферментов мо-
жет происходить частичная или полная потеря каталитической
активности, обусловленная выходом иона металла из активного
центра фермента и его связыванием на поверхности носителя.
Это нежелательное явление можно устранить, если до прове-
дения иммобилизации обработать носитель избытком раствора,
содержащего ионы соответствующего металла, и тем самым на-
сытить центры сорбции ионов металла на носителе.
Предварительная обработка носителя ионами металлов при-
меняется также и для повышения прочности связывания ад-
сорбционно-иммобилизованных ферментов. Увеличение эффек-
тивности сорбции достигается в этом случае за счет образо-
вания комплекса белка с ионами переходных металлов (таких,
как Ti, Sn, Zr, V, Fe), которые, в свою очередь, прочно связаны
с поверхностью носителя (рис. 4,а). Иными словами, ион метал-
ла выступает в роли мостика, соединяющего молекулу фермента
с носителем. Этот метод дает хорошие результаты при иммоби-
лизации различных ферментов на таких носителях, как, на-
пример, целлюлоза, найлон, стекло, фильтровальная бумага
и т. д.
Способ, основанный на обработке носителя ионами металлов,
может служить хорошей иллюстрацией одного из главных прин-
ципов, лежащих в основе применения модифицированных носи-
телей: модификация должна придавать носителю такие свойства,
благодаря которым усиливается его способность к связыванию
ферментов.
Один из возможных путей достижения этой цели состоит,
помимо использования ионов металлов, в обработке носителя
веществами, молекулы которых содержат большое число функ-
циональных групп, способных взаимодействовать $ группами
на поверхности ферментной глобулы за счет электростатических
и водородных связей (рис. 4,6). Например, полимеризация на
поверхности силохрома акриловой кислоты, винилацетата и т. п.
с последующей химической модификацией полимера приводит к
образованию носителя, характеризующегося высокой поверхност-
ной концентрацией функциональных групп (гидроксильных,
аминоалкильных, аминоарильных и гидразидных). В качестве
модификатора часто используется также альбумин, который на-
носится на носитель путем адсорбции, а затем подвергается
денатурации нагреванием. Слой денатурированного альбумина
образует на поверхности носителя «мягкую» подложку с боль-
шим числом функциональных групп, способную прочно связы-
вать молекулы фермента, одновременно обеспечивая для них
благоприятное микроокружение. В результате во многих случаях
при обработке альбумином удается добиться повышения эффек-
тивности сорбции и улучшения каталитических характеристик
иммобилизованного фермента.
52

б
Рис. 4. Адсорбционная иммобилизация ферментов на предвари-
тельно модифицированных носителях
Для повышения эффективности сорбции может быть также
использована модификация носителя гидрофобными соединения-
ми. Связывание фермента с такими носителями обеспечивается
за счет гидрофобных взаимодействий между модификатором и
неполярными участками на поверхности белковой глобулы.
При этом способе иммобилизации применяются те же носители,
которые используются при гидрофобной хроматографии белков.
В первую очередь к ним относятся различные агарозы, ковалент-
но модифицированные гидрофобными группами (алкильными,
фенильными и т. п.). На конце такой гидрофобной «ножки» мо-
жет присутствовать также и заряженная группа, благодаря
чему обеспечивается взаимодействие с ферментом одновременно
за счет электростатических и гидрофобных сил (рис. 4, в).
При таком «многоточечном» связывании сорбция многих
ферментов протекает практически необратимо. Эффект много-
точечного связывания достигается также при использовании
полисахаридных носителей, модифицированных танином — при-
родным дубящим веществом, содержащим большое число фе-
нольных групп. Танин может быть либо адсорбирован на носи-
теле, либо связан с ним химически. Удерживание фермента на
53

поверхности обработанных танином носителей обеспечивается за
счет электростатических, водородных и гидрофобных взаимодей-
ствий.
Эффективность сорбции фермента может быть увеличена
также при использовании носителей, предварительно модифици-
рованных путем адсорбции монослоя липида (см. гл. 1). Ис-
пользуя носители с той или иной ориентацией липидных моле-
кул в адсорбированном монослое, можно добиться максималь-
ной эффективности сорбции как гидрофильных (рис. 4, г), так
и гидрофобных (рис. 4,д) ферментов.
Модификацию носителя иногда проводят путем ковалентной
пришивки к его поверхности молекул, являющихся специфиче-
скими лигандами иммобилизуемого фермента. Иммобилизация
с использованием таких носителей достигается за счет образо-
вания прочного нековалентного комплекса между ферментом и
связанным с носителем лигандом. Этот метод иммобилизации,
получивший название аффинной сорбции, широко используется
в лабораторной практике, например, для избирательного выде-
ления ферментов из сложных смесей (аффинная хроматогра-
фия) .
Иммобилизация предварительно модифицированных фермен-
тов. При адсорбционной иммобилизации на ионообменниках час-
то возникают затруднения, связанные с тем, что для многих
ферментов изоэлектрическая точка и pH-оптимум каталитиче-
ской активности очень близки. Поэтому прочная сорбция наб-
людается лишь в областях
pH, далеких от изоэлектри-
ческой точки, где каталити-
ческая активность мала. Что-
бы преодолеть это препят-
ствие, был разработан ме-
тод иммобилизации фер-
ментов, предварительно мо-
дифицированных введением
ионогенных групп (поли-
кислоты, карбо кси метил цел-
люлоза, остатки янтарной
кислоты и т.п.). Например,
при модификации а-химо-
трипсина хлортриазиновым
красителем (активным ярко-
оранжевым КХ) изоэлек-
трическая точка фермента
сдвигается в щелочную об-
ласть. В результате этого
модифицированный ахимо
трипсин достаточно хорошо
сорбируется на многих ионо-
обменниках с сохранением
Рис. 5. Адсорбционная иммобилизация
предварительно модифицированных
ферментов
54

каталитической активности. Другой пример — модификация
а-химотрипсина растворимой карбоксиметилцеллюлозой, в ре-
зультате которой он приобретает способность прочно свя-
зываться с ДЭАЭ-целлюлозой и ДЭАЭ-сефадексом при ней-
тральных значениях pH. Принцип, лежащий в основе этого
способа иммобилизации, иллюстрируется схематическим
рис. 5, а.
При иммобилизации на гидрофобных носителях эффектив-
ность связывания можно увеличить, если промодифицировать
молекулу фермента гидрофобными группами (рис. 5,6).
Другие способы увеличения прочности связывания фермента
с носителем. Для предотвращения смывания иммобилизованного
фермента с носителя часто используют прием, при котором слой
адсорбированного фермента обрабатывают бифункциональным
сшивающим агентом. В результате на поверхности носителя
образуется как бы сплошная пленка из сшитых между собой
молекул фермента. В качестве сшивающего агента чаще всего
применяется глутаровый альдегид.
Оригинальный способ, позволяющий существенно повысить
количество сорбционно иммобилизованного фермента был
предложен К. Мартинеком с сотр. (1976), которые использо-
вали для иммобилизации найлоновые волокна, подвергнутые
частичной химической деструкции. Волокна помещают в раствор
фермента (рис. 6, а) и подвергают механическому растяжению,
Рис. 6. Иммобилизация ферментов путем механического за-
хвата в порах найлоновой нити при ее растяжении
в
55

в результате чего размер пор на их поверхности увеличивается.
Молекулы фермента получают благодаря этому возможность
проникнуть внутрь пор и там адсорбироваться (рис. 6, б). Через
некоторое время растягивающее усилие снимают, волокно
сжимается и размер пор возвращается к исходному значению.
При этом молекулы фермента, оказавшиеся внутри пор при
растяжении волокна, уже не могут покинуть их. Иными словами,
происходит механический захват молекул фермента порами
носителя (рис. 6, в).
Сравнительно новым методом является электроудерживание,
при котором иммобилизация ферментов, осуществляется под
действием электрического поля на коллекторах, отделенных от
электродов мембранами. В качестве коллектора могут исполь-
зоваться силикагель, ионообменники, минералы и другие носи-
тели. Фермент удерживается на коллекторе за счет электро-
статических и диполь-дипольных взаимодействий между поляри-
зованными частицами коллектора и молекулами белка. Недостаток
этого метода состоит в том, что система должна постоянно
находиться под напряжением, поскольку в противном случае
фермент будет смываться с носителя.
§ 6.	Преимущества и недостатки
адсорбционной иммобилизации
К числу основных преимуществ метода адсорбционной иммо-
билизации следует отнести доступность и дешевизну сорбентов,
выступающих в роли носителей, которым к тому же можно
придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую порис-
тость. Не менее важным фактором является также простота
применяемых методик. Кроме того, при адсорбционной иммоби-
лизации нередко удается одновременно решить и проблему очист-
ки фермента, поскольку связывание белка с носителем во многих
случаях достаточно специфическое. Действительно, многие из но-
сителей для адсорбционной иммобилизации применяются также
и при очистке ферментов.
Применение метода ограничивается недостаточно высокой
прочностью связывания фермента с носителем. Как уже указы-
валось, при изменении внешних условий может происходить
десорбция фермента с носителя, что ведет к потерям дорогостоя-
щего биокатализатора и загрязнению конечного продукта. К не-
достаткам метода адсорбционной иммобилизации следует отнести
также отсутствие общих рекомендаций, позволяющих заранее
сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий
проведения иммобилизации конкретного фермента. Эту задачу
приходится каждый раз решать заново, используя метод проб
и ошибок.
Некоторых из перечисленных затруднений удается избежать
при иммобилизации ферментов путем включения в гели.
56

ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ПУТЕМ ВКЛЮЧЕНИЯ В ГЕЛИ
Суть этого метода иммобилизации состоит в том, что моле-
кулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно пере-
плетенных полимерных цепей, образующих гель (см. рис. 2,6).
Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше
размера молекулы включенного фермента, поэтому он не может
покинуть полимерную матрицу и выйти в окружающий раствор,
т. е. находится в иммобилизованном состоянии. Дополнительный
вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также
ионные и водородные связи между молекулой фермента и ок-
ружающими ее полимерными цепями.
Пространство между полимерными цепями в геле заполнено
водой, на долю которой обычно приходится значительная часть
общего объема геля. Например, широко применяемые гели по-
лимеров производных акриловой кислоты в зависимости от кон-
центрации полимера и его химической природы содержат от 50
до 90% воды.
Для иммобилизации ферментов в геле существует два ос-
новных способа. При одном из них фермент помещают в вод-
ный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в ре-
зультате которой образуется полимерный гель с включенными
в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добав-
ляют также бифункциональные (т. е. содержащие в молекуле
две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают об-
разующемуся полимеру структуру трехмерной сетки (рис. 7,а).
дисфункциональны й
сшивающий агент
полимер
Рис. 7. Иммобилизация ферментов путем включения в гель,
полученный путем полимеризации низкомолекулярного моно-
мера (а) и готового полимера (б)
57

Впервые этот способ был использован П. Бернфельдом и Дж.
Уэном (1963), которые осуществляли иммобилизацию ряда фер-
ментов (таких, как трипсин, рибонуклеаза и 0-амилаза) в геле,
полученном радикальной полимеризацией М,М'-метилен-бис-ак-
риламида.
Альтернативный способ состоит в том, что фермент вносят
в раствор уже готового полимера, который затем каким-либо
образом переводят в гелеобразное состояние (рис. 7,6). Рас-
смотрим эти подходы подробнее*.
§ 7.	Иммобилизация ферментов в гелях,
полученных полимеризацией мономеров
Органические гели. Суть методики. Для проведения иммо-
билизации готовят реакционную смесь, главными компонентами
которой являются фермент, мономер, сшивающий агент (если
это необходимо) и водный буферный раствор. Иногда в смесь
для полимеризации вводят также добавки, предохраняющие
фермент от инактивации при гелеобразовании. Для получения
геля готовую смесь подвергают воздействию какого-либо факто-
ра, инициирующего процесс полимеризации мономера.
Полимеризация. При проведении полимеризации обычно ис-
пользуемые концентрации мономера и сшивки составляют, соот-
ветственно, 30—60% и приблизительно 5% от общей массы
реакционной смеси. Полимеризация протекает по радикальному
механизму. Источниками радикалов, являющихся инициаторами
процесса полимеризации, могут служить некоторые окислитель-
но-восстановительные и фотохимические реакции, в ходе кото-
рых в качестве промежуточного продукта образуются свободные
радикалы. Наиболее широко применяется окислительно-восста-
новительная пара персульфат калия (или аммония) — N,N,N',N'-
тетраметилэтилендиамин. Инициирование полимеризации дости-
гается при внесении этих веществ в раствор мономера. В ка-
честве фотохимического инициатора обычно используется рибо-
флавин; в этом случае полимеризация происходит при облучении
реакционной смеси мощным источником света. Свободные
радикалы, необходимые для начала полимеризации, мбгут гене-
рироваться также при воздействии на раствор мономера у-из-
лучения или потока электронов. Преимущество этого способа
состоит в том, что он не требует введения инициаторов в исход-
ную смесь.
* В принципе, иммобилизацию путем включения в гель можно осуществить
также, пропитывая уже готовый гель раствором фермента. Этот способ, однако,
не имеет широкого практического применения, поскольку получаемые с его по-
мощью препараты иммобилизованных ферментов характеризуются низкой удель-
ной активностью, а сам процесс иммобилизации занимает длительное время
из-за низкой скорости диффузии фермента в порах геля. Одно из немногих
исключений составляет описанная ниже иммобилизация на коллагеновых
мембранах путем их импрегнирования водным раствором фермента.
58

При проведении иммобилизации могут возникать затрудне-
ния, обусловленные некоторыми особенностями протекания реак-
ции полимеризации. Так, например, полимеризация ингибируется
присутствующим в растворе молекулярным кислородом, и во
многих случаях для его удаления рабочий раствор предвари-
тельно насыщают инертным газом — азотом или аргоном. Кроме
того, в ходе полимеризации выделяется значительное количество
теплоты, что приводит к повышению температуры внутри обра-
зующегося полимерного блока до 75°С. Такое сильное нагрева-
ние вызывает инактивацию ферментов, поэтому полимеризую-
щийся раствор необходимо охлаждать так, чтобы его темпера-
тура не превышала 20—25°С.
Осложнений, связанных с ингибирующим действием кисло-
рода и нагреванием, можно избежать, если проводить полиме-
ризацию путем у-облучения замороженного и охлажденного до
—80°С рабочего раствора.-
После окончания полимеризации, которая в зависимости от
условий (природа мономеров, количество инициатора, темпера-
тура и т. п.) может продолжаться от нескольких минут до не-
скольких часов, образуется блок полимерного геля, содержащий
иммобилизованный фермент. Следует учитывать, что в геле мо-
гут оставаться примеси неизрасходованных при полимеризации
мономеров и инициаторов. Чтобы избавиться от них, гель обычно
механически измельчают и тщательно промывают буферным
раствором. При необходимости длительного хранения измельчен-
ные частицы подвергают лиофильной сушке.
Инактивация фермента при полимеризации. В процессе об-
разования полимерного геля фермент подвергается различным
денатурирующим воздействиям, в результате чего может проис-
ходить его инактивация, вплоть до полной потери каталитиче-
ской активности. Помимо уже упоминавшегося возможного разо-
грева при полимеризации денатурацию фермента могут вызывать
компоненты реакционной смеси, в первую очередь мономер. На-
пример, акриламид по своему денатурирующему воздействию
на ферменты близок к мочевине. С другой стороны, полиакрил-
амид этим свойством не обладает. Именно поэтому обязательной
стадией иммобилизации является тщательная промывка поли-
мерного геля от оставшихся примесей мономера и инициатора.
Инактивация фермента может происходить под действием
свободных радикалов, образующихся при радикальной полиме-
ризации. Для защиты фермента от неблагоприятных воздействий
в реакционную смесь иногда вводят стабилизирующие до-
бавки. В роли таких добавок могут выступать, например, инерт-
ные белки (обычно альбумин) или вещества, являющиеся суб-
стратами или продуктами реакции, катализируемой данным фер-
ментом.
Неорганические гели. Для иммобилизации ферментов может
быть использован гель поликремниевой кислоты (силикагель),
который представляет собой продукт поликонденсации монокрем-
59

ниевой кислоты Si (ОН) 4. Методика иммобилизации состоит в
том, что в золь кремниевой кислоты (полученный, например,
путем гидролиза кремнийорганического соединения) добавляют
раствор фермента. Через несколько часов в результате само-
произвольной полимеризации образуется гель, представляющий
собой трехмерную сетку из атомов кремния, соединенных кисло-
родными мостиками. Полученный гель высушивают, измельчают
и отмывают от невключившегося фермента.
Иногда для иммобилизации ферментов применяют гель фос-
фата кальция. В этом случае образование пространственной
сетки обусловлено не ковалентными, а ионными связями.
§ 8.	Иммобилизация ферментов в гелях,
полученных из готовых полимеров
Несшитые полимерные гели. Этот способ иммобилизации
основан на свойстве природных полисахаридов, таких, как крах-
мал, агар агар, каррагинан и агароза, образовывать гели при
охлаждении их горячих водных растворов. Методика состоит в
том, что водную суспензию полисахарида нагревают до темпе-
ратуры 80—90°С, добиваясь его полного растворения, и полу-
ченный горячий раствор медленно охлаждают. Непосредственно
перед началом гелеобразования (обычно между 30 и 50°С) в
систему добавляют водный раствор фермента. При дальнейшем
охлаждении образуется гель, содержащий иммобилизованный
фермент. Для улучшения механических свойств иммобилизован-
ного препарата процесс гелеобразования иногда проводят в по-
рах вспененного полиуретана.
Другим природным полимером, широко применяемым для
иммобилизации ферментов, является коллаген — фибриллярный
белок соединительной ткани животных. Существует три основ-
ных способа иммобилизации ферментов с помощью коллагена:
макромолекулярное комплексообразование, импрегнирование и
электроосаждение. При макромолекулярном комплексообразова-
нии коллаген диспергирует в водном растворе при низких (2,0—
4,5) или высоких (8,5—12,0) значениях pH, вносят фермент
и инкубируют смесь в течение 15—20 ч. Затем раствор выливают
тонким слоем на инертную подложку и высушивают. В результа-
те получается ферментсодержащая белковая мембрана, имею-
щая структуру трехмерной сетки из переплетенных фибрилл кол-
лагена. Способ макромолекулярного комплексообразования не-
применим для иммобилизации ферментов, неустойчивых в кис-
лых или щелочных растворах, поскольку он требует длительной
инкубации фермента в среде с экстремальными значениями pH.
Этого затруднения можно избежать, если проводить иммобили-
зацию методом импрегнирования, при котором раствором фер-
мента пропитывают уже готовую коллагеновую мембрану.
При иммобилизации методом электроосаждения смесь дис-
персии коллагена и раствора фермента помещают между элект-
60

родами и включают электрический ток. Под действием электри-
ческого поля молекулы коллагена и фермента мигрируют в на-
правлении одного из электродов (в зависимости от pH раствора)
и осаждаются на его поверхности в виде мембраны. Этот спо-
соб удобен тем, что позволяет получать мембраны заданной
толщины и конфигурации при высокой общей скорости процесса.
Последнее обстоятельство особенно важно, поскольку снижает
вероятность инактивации фермента под действием неблагопри-
ятных значений pH.
Сшитые полимерные гели. Введение ковалентных сшивок поз-
воляет добиться повышения механической прочности полимерных
матриц и более прочного удерживания включенного в них фер-
мента. Образование сшивок между полимерными цепями дости-
гается, например, при обработке бифункциональными реаген-
тами, способными взаимодействовать с функциональными груп-
пами полимера. Так, для обработки коллагеновых мембран при-
меняется глутаровый альдегид, который используется также
при получении сшитых матриц для иммобилизации на основе
других белков. Обработке бифункциональными сшивающими
реагентами могут подвергаться и полисахаридные гели, рас-
смотренные ранее.
Существует также способ включения ферментов в сшитую
белковую матрицу, основанный на использовании системы фиб-
риноген-тромбин. При этом способе иммобилизации к раствору
фибриногена и фермента в водном буфере добавляют белок
тромбин, под действием которого фибриноген превращается в
фибрин — полимерный белок, образующий трехмерную простран-
ственную сетку. Стоимость иммобилизованного таким образом
препарата фермента слишком высока, чтобы его можно было
рекомендовать для технологических целей, однако он пред-
ставляет значительный интерес для медицины из-за отсутствия
токсичности и антигенности.
Образование прочных связей между полимерными цепями
геля может достигаться также за счет электростатических взаи-
модействий. Например, в присутствии ионов кальция альгинат
натрия дает прочный гель, который широко применяется для
иммобилизации ферментов. В этом случае в роли «мостиков» меж-
ду полимерными цепями выступают ионы кальция, формирующие
ионные связи с карбоксильными группами альгината. На способ-
ности полиэлектролитов образовывать гели в присутствии поли-
валентных катионов основан также метод иммобилизации с ис-
пользованием синтетического полиэлектролита — сополимера ма-
леинового ангидрида и метилового эфира винилового спирта.
Интересный способ иммобилизации, основанный на употреб-
лении полиэлектролитных комплексов, был предложен в 1980 г.
В этом случае фермент модифицируют путем ковалентной при-
шивки положительно заряженного N-алкилированного поливинил-
пиридина и вносят в водный раствор полиметакриловой кислоты,
несущей отрицательный заряд. В зависимости от ионной силы
61

и pH среды противоположно заряженные полиэлектролиты могут
либо сосуществовать в растворе, либо образовывать прочный
нерастворимый комплекс, увлекающий фермент в осадок, причем
переход между растворимым и нерастворимым состояниями яв-
ляется обратным и осуществляется в очень узком диапазоне ион-
ной силы или pH. После завершения ферментативной реакции,
протекающей в гомогенном растворе, фермент переводят в осадок
путем изменения ионной силы или pH и отделяют маточный раст-
вор, содержащий продукты реакции. Затем осадок вновь пере-
водят в раствор и повторяют весь процесс сначала.
Сшитые гели для иммобилизации могут быть получены на
основе других синтетических полимеров. Например, при воздейст-
вии на водные растворы поливинилового спирта или поливинил-
пирролидона у-излучением или потоком электронов на полимер-
ных цепях возникают свободные радикалы, при последующем
взаимодействии которых между цепями образуются ковалентные
сшивки. Сшитая полимерная матрица для иммобилизации может
быть получена на основе кремнийорганического полимера поли-
диметилсилоксана. Образование твердого геля происходит в этом
случае при введении в систему, содержащую полимер и фермент,
вулканизирующего агента, в качестве которого применяется окта-
ноат двухвалентного олова.
В последнее время все более широкое распространение находит
новый метод иммобилизации ферментов путем их включения в
полимерную матрицу из фотополимеризующихся смол, которые
представляют собой олигомеры или полимеры (макромономеры),
содержащие фоточувствительные функциональные группы. При
проведении иммобилизации раствор, содержащий смолу, фермент
и инициатор, в течение нескольких минут облучают ультрафио-
летовым светом. Активированные облучением фоточувствительные
группы образуют между собой ковалентные связи, в результате
чего возникает сшитая трехмерная полимерная сетка с включен-
ными в нее молекулами фермента. Этот способ иммобилизации
обладает тем преимуществом, что свойства получаемых поли-
мерных гелей можно целенаправленно и в широких пределах
варьировать, подбирая соответствующие макромономеры.
§ 9.	Влияние различных факторов
на каталитическую активность ферментов, иммобилизованных
путем включения в гель
Содержание фермента в геле. Каталитическая активность им-
мобилизованного препарата возрастает с увеличением количества
включенного фермента. Такого увеличения можно добиться, оче-
видно, повышая концентрацию фермента в исходной смеси, ис-
пользуемой для приготовления геля. Следует, однако, иметь в виду,
что растворимость белков в гелеобразующих системах может
быть существенно ниже растворимости в водном буферном раст-
воре.
62

Друган важный фактор, определяющий содержание фермента
в геле, — это структура самого геля, точнее, размер имеющихся
в нем пор. Чем меньше диаметр пор, тем более эффективно фер-
мент удерживается в матрице геля, а значит, тем выше будет
каталитическая активность иммобилизованного препарата. Порис-
тость геля можно регулировать, изменяя состав исходной смеси
для его получения. Например, плотность гелей, получаемых поли-
меризацией производных акриловой кислоты, возрастает с увели-
чением исходной концентрации мономера. (Следует помнить, од-
нако, что слишком высокая концентрация мономера может вызы-
вать денатурацию фермента, поэтому зависимость удельной ка-
талитической активности иммобилизованного препарата от исход-
ной концентрации мономера часто проходит через максимум,
который обычно лежит в интервале концентраций мономера
30—60%.) Размер пор сильно зависит также от концентрации
добавляемого в раствор мономера сшивающего агента. В случае
акриловых полимеров эта зависимость имеет вид кривой с миниму-
мом при концентрации сшивки около 5%. При этой же концентра-
ции сшивки достигается максимальная активность включенного
фермента.
Эффективность включения повышается не только при умень-
шении диаметра пор геля, но и при увеличении размеров фермент-
ной глобулы. Поэтому для предотвращения вымывания из геля
ферменты с небольшой молекулярной массой иногда перед прове-
дением иммобилизации подвергают обработке глутаровым альде-
гидом, в результате которой получаются крупные ковалентно
сшитые белковые агрегаты, прочно удерживаемые полимерной
матрицей.
Размеры гелевых частиц. Увеличение концентрации фермента
в геле» не всегда приводит к соответствующему повышению ката-
литической активности иммобилизованного препарата. Дело в том,
что при высокой концентрации фермента весь субстрат перера-
батывается уже в поверхностном слое гелевой частицы, не дости-
гая молекул фермента, расположенных в ее глубине. В результате
каталитический потенциал системы используется не полностью и
общая наблюдаемая удельная активность фермента снижается.
(Более подробное обсуждение этого вопроса см. в гл. IV.) Оче-
видно, что влияние этого неблагоприятного эффекта можно осла-
бить, если использовать мелкоизмельченный препарат иммоби-
лизованного в геле фермента. Действительно, скорость реакции,
катализируемой р-галактозидазой, иммобилизованной в геле поли-
оксиэтилметакрилата, возрастает при измельчении геля и дости-
гает максимального значения при уменьшении диаметра гелевых
частиц до 120 мкм, оставаясь затем неизменной. Рассмотрим
некоторые способы получения иммобилизованных в геле фермен-
тов в форме мелких частиц.
Наиболее простой метод заключается в механическом измель-
чении блока полимерного геля путем растирания, продавливания
через мелкое сито, а также гомогенизации (рис. 8, а). Этот метод,
63

гелевый блок
средний
диаметр
частиц
1-1000
мкм
эмульсия вода/масло
средний
диаметр
частиц
001-005
мкм
Рис. 8. Способы получения иммобилизованных в геле ферментов
в форме мелких частиц
однако, имеет ряд существенных недостатков. Получаемые части-
цы обладают низкой механической прочностью, являются крайне
неоднородными по форме и размерам. Кроме того, молекулы фер-
мента, оказавшиеся при измельчении геля на поверхности частиц,
легко с нее смываются, что приводит к потерям биокатализатора.
Перечисленные недостатки в значительной степени удается
64

преодолеть при использовании эмульсионного способа получения
гелевых частиц (рис. 8,6). В этом случае водный раствор, содер-
жащий фермент, мономер и инициатор полимеризации, немедлен-
но после приготовления вносят в неполярный органический раст-
воритель (например, смесь толуола с хлороформом), содержащий
поверхностно-активное вещество (ПАВ), и полученную смесь ин-
тенсивно перемешивают. В результате образуется эмульсия, со-
стоящая из диспергированных в органической среде капель вод-
ного полимеризующегося раствора, стабилизированных ПАВ. Пос-
ле окончания полимеризации полученные частицы геля сфериче-
ской формы отфильтровывают и отмывают водой от непрореаги-
ровавшего мономера и ПАВ. В зависимости от условий проведе-
ния процесса (концентрация мономера, скорость перемешивания
и т. д.) размер получаемых частиц колеблется от нескольких
единиц до сотен микрометров. Одно из преимуществ эмульсион-
ного способа состоит в том, что благодаря интенсивному тепло-
переносу в мелкодисперсной системе устраняется опасность ин-
активации фермента под действием теплоты, выделяющейся при
полимеризации. Сферические гелевые частицы характеризуются
узким распределением по размерам (отклонение от среднего диа-
метра составляет ±10%) и высокой механической прочностью,
которая может быть в 10 раз выше, чем в случае частиц, получен-
ных путем механического измельчения гелевого блока. При исполь-
зовании эмульсионного способа необходимо иметь в виду, что не-
которые ПАВ, применяемые для получения стабильных эмульсий,
могут вызывать денатурацию фермента.
Полимерные частицы геля еще более мелких размеров (нано-
частицы), могут быть изготовлены путем полимеризации в так
называемых микроэмульсиях (рис. 8, в). Здесь используется свин-
ство некоторых ПАВ образовывать в неполярных органических
растворителях обращенные мицеллы, способные солюбилизовать
(растворять) водные растворы мономера и фермента. В результате
солюбилизации формируется микроэмульсия, состоящая из мель-
чайших капелек водного раствора, стабилизированных ПАВ.
Размер этих капелек и, соответственно, размер наночастиц, об-
разующихся в процессе полимеризации, инициируемой облуче-
нием ультрафиолетовым светом, изменяется в зависимости от ко-
личества добавленной воды в пределах от нескольких единиц до
нескольких десятков нанометров. Полученные наночастицы осаж-
дают из органического растворителя ацетоном, отделяют центри-
фугированием и высушивают.
Однако применение в технологических реакторах мелких час-
тиц иммобилизованного биокатализатора не всегда рационально.
Например, излишне мелкие частицы оказывают сильное гидро-
динамическое сопротивление потоку при эксплуатации реакторов
проточного типа, а в реакторах периодического действия их трудно
отделить от реакционной смеси. Поэтому в каждом конкретном
случае оптимальный размер частиц определяется с учетом таких
3—133
65

факторов, как количество и активность включенного фермента,
скорость диффузии субстрата в геле и конструкция реактора.
С практической точки зрения удобен метод так называемой
двойной иммобилизации, при котором в гель включается фермент,
предварительно иммобилизованный путем адсорбции на твердом
носителе, или же получение полимерного геля с включением фер-
мента проводится в присутствии такого носителя. Приготовленный
таким образом иммобилизованный препарат состоит из частиц
твердого носителя, покрытых слоем ферментсодержащего геля.
Метод двойной иммобилизации сочетает преимущества твердой
матрицы (большая удельная поверхность, механическая проч-
ность, пористость, заданная текстура и форма частиц) и поли-
мерных гелей.
Природа полимерной матрицы. Полимерные гели, применяе-
мые для иммобилизации, способствуют созданию оптимального
микроокружения включенного фермента, что позволяет добиться
высокой каталитической активности иммобилизованных препа-
ратов. Оптимизация микроокружения достигается за счет подбо-
ра соответствующей гелеобразующей системы. Особенно удоб-
ными с этой точки зрения являются гели на основе сополиме-
ров производных акриловой кислоты. Варьируя химическую
природу исходных мономеров и их соотношение, можно полу-
чать полимерные матрицы с наиболее подходящими для дан-
ной ферментативной реакции характеристиками. В частности,
при введении в состав полимера мономерных звеньев, несущих
электрический заряд, повышается каталитическая эффектив-
ность иммобилизованного препарата в реакциях с участием за-
ряженных субстратов. Например, скорость реакции гидролиза
положительно заряженного субстрата этилового эфира a-N-бен-
зоил-Д-аргинина под действием трипсина, иммобилизованного в
геле полиакриламида, возрастает при введении в полимерную
цепь путем сополимеризации отрицательно заряженных мономер-
ных звеньев акриловой кислоты. Увеличение скорости фермента-
тивной реакции объясняется повышенным сродством положи-
тельно заряженного субстрата к отрицательно заряженной
полимерной матрице.
Аналогичный эффект влияния полимерной матрицы на рас-
пределение субстрата между гелем и окружающим его раство-
ром наблюдается также в реакциях с участием гидрофобных
субстратов. В этом случае увеличение каталитической эффектив-
ности иммобилизованного фермента достигается при использо-
вании геля, полученного путем сополимеризации с участием
неполярных мономеров. Более того, применение гелей на основе
полимеров, обладающих высокой гидрофобностью, позволяет
получать иммобилизованные ферментные препараты, способ-
ные работать в среде неполярных органических растворителей.
Введение в полимерные цепи геля ионных групп создает
вокруг включенных молекул фермента среду, обладающую бу-
ферными свойствами. В результате значение pH, при котором
66

функционирует иммобилизованный фермент, может отличаться
от pH окружающего частицу геля раствора, что на опыте прояв-
ляется в виде сдвига наблюдаемого pH-оптимума ферментатив-
ной реакции. Таким образом, варьируя содержание в геле за-
ряженных групп, можно создать вблизц фермента наиболее
благоприятное для него значение pH, не меняя pH внешнего
раствора.
Более подробно эффекты микросреды (влияние заряда,
гидрофобности носителя и т. п.) в катализе иммобилизован-
ными ферментами рассмотрены в гл. IV.
§10	. Преимущества и недостатки иммобилизации ферментов
путем включения в гель
Способ иммобилизации ферментов путем включения в поли-
мерный гель отличается простотой применяемых методик, поз-
воляет создавать иммобилизованные препараты любой геомет-
рической конфигурации (сферические частицы, пленки и т. п.),
обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализа-
тора в объеме носителя. Многие полимерные гели обладают
высокой химической, механической и тепловой стойкостью, что
дает возможность многократного использования иммобилизован-
ных препаратов на их основе. Метод универсален, поскольку
применим для иммобилизации практически любых ферментов,
а также полиферментных систем, клеточных фрагментов и даже
клеток. Важное преимущество метода состоит в том, что но
многих случаях иммобилизация в геле приводит к значитель-
ной стабилизации ферментов. Наконец, фермент, включенный в
гель, надежно защищен от инактивации вследствие бактериаль-
ного заражения, поскольку крупные клетки бактерий не могут
проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу.
Основным недостатком этого метода является то, что поли-
мерная матрица создает значительные препятствия для диффу-
зии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффектив-
ность иммобилизованного препарата. Если в роли субстрата
выступает высокомолекулярное соединение, то этот способ им-
мобилизации вообще неприменим.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛУПРОНИЦАЕМЫХ ОБОЛОЧЕК (МЕМБРАН]
Общий принцип, лежащий в основе этого способа иммоби-
лизации, состоит в том, что водный раствор фермента отделяется
от водного раствора субстрата полупроницаемой мембраной,
которая легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но
представляет собой непреодолимый барьер для крупных молекул
фермента (см. рис. 2, в). Существующие . модификации этого
метода различаются лишь способами получения полупроницае-
мой мембраны и ее природой.
3*
67

§	11. Микрокапсулирование
Этот способ иммобилизации ферментов разработан Т. Чан-
гом (1964). Суть его состоит в том, что водный раствор фермента
включают внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые
сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (мембра-
ной) (рис. 9, а). В зависимости от условий получения размер
микрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких
сотен микрометров, а толщина мембраны составляет сотые —
десятые доли микрометра при диаметре пор порядка нескольких
нанометров. Существует два основных способа получения микро-
капсул. В первом из них водный раствор фермента сначала
диспергируется при энергичном перемешивании в диэтиловом
эфире, содержащем ПАВ, которое выступает в роли эмульга-
тора. К полученной эмульсии, не прекращая перемешивания,
добавляют эфирный раствор полимера, обычно нитрата целлю-
лозы. При соприкосновении с поверхностью эмульсионных ка-
пель этот полимер, будучи нерастворимым в воде, образует
тонкую оболочку-микрокапсулу. Готовые микрокапсулы
отделяют центрифугированием или фильтрованием и про-
мывают.
При втором способе микрокапсулирования образование мемб-
раны на поверхности водных микрокаиель достигается за счет
реакции межфазной поликонденсации двух компонентов, один из
которых растворен в водных каплях эмульсии, а другой —
в объеме органической фазы. Наиболее распространенными яв-
ляются полиамидные микрокапсулы, получаемые, например, пу-
тем поликонденсации 1,6-гексаметилендиамина (водная фаза) и
хлорангидрида себациновой кислоты (органическая фаза). Этот
способ применим только для тех ферментов, которые не инак-
тивируются при высоких значениях pH, существующих в водных
растворах диамина.
Водный раствор фермента, использующийся для получения
микрокапсул, должен содержать инертный белок (обычно ге-
моглобин) в концентрации около 10%, который обеспечивает в
микрокапсулах необходимое внутреннее давление и стабилизиру-
ет фермент. Для повышения стабильности микрокапсулирован-
ного фермента его нередко подвергают также обработке глу-
таровым альдегидом, приводящей к образованию внутри
микрокапсул белковых полимеров. Кроме того, более высокой
стабильности можно добиться, если перед микрокапсулированием
фермент предварительно иммобилизовать путем адсорбции на
носителе, включения в гель или другим способом. J
В некоторых случаях для иммобилизации применяются
микрокапсулы, мембрана которых образована ковалентно сши-
тыми между собой молекулами инертного белка. Такие микро-
капсулы можно получить, если в методе с применением поликон-
денсации в систему не вводить диамин. Тогда хлорангидрид
дикарбоновой кислоты (или другой используемый органораство-
68

Рис. 9. Иммобилизация ферментов с использованием полу-
проницаемых оболочек (мембран):
а—микрокапсулирование; б—двойное эмульгирование; в—
включение в волокна; г — включение в полые волокна с полу-
проницаемыми стенками; д—включение в липосомы; точками
обозначены молекулы фермента; символами S и Р — субстрат
и продукт ферментативной реакции соответственно
69

римый бифункциональный сшивающий агент) будет образовывать
ковалентные сшивки между молекулами инертного белка,
располагающимися на поверхности водной микрокапли.
§	12. Двойное эмульгирование
При иммобилизации методом двойного эмульгирования
(Т. Чанг, 1965) сначала готовят эмульсию водного раствора
фермента в органическом растворе полимера, точно так же, как
было описано для случая получения микрокапсул первым спо-
собом. Готовую эмульсию вновь диспергируют, на этот раз в
воде. В результате получается водная эмульсиая из капель
органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь,
еще более мелкие включенные капли водного раствора фермен-
та (рис. 9,6). Через некоторое время органический раствор
затвердевает, образуя полимерные сферические частицы с им-
мобилизованным в них ферментом.
С. Мэй и Н. Ли (1972) предложили модификацию этого
спосс>ба иммобилизации, в котором в качестве материала для
образования мембраны вместо водонерастворимого отверждаю-
щегося полимера используются жидкие углеводороды с большой
молекулярной массой. Этот метод получил название иммобилиза-
ции путем включения в жидкие мембраны.
§13	. Включение в волокна
Ог микрокапсулирования этот способ иммобилизации, пред-
ложенный Д. Динелли (1972), отличается главным образом
формой получаемых препаратов: в первом случае образуются
сферические микрокапсулы, а во втором — нити. Суть состоит в
том, что эмульсию водного раствора фермента в органическом
растворе волокнообразующего полимера (производные целлю-
лозы, поливинилхлорид, поли-Г-метилглутамат) продавливают
через фильеры в жидкость (например, толуол), вызывающую
коагуляцию полимера. Полученные волокна представляют собой
пористые полимерные гели, содержащие гомогенную дисперсию
небольших капель водного раствора фермента размером около
1 мкм (рис. 9, в). Ферментсодержащие волокна обладают вы-
сокой механической прочностью; например, из них можно изго-
товить ткань, которая будет обладать ферментативной актив-
ностью. Для дополнительного повышения механической проч-
ности волокна иногда заключают в тонкую полиамидную обо-
лочку.
Для иммобилизации ферментов можно использовать также
производимые промышленностью готовые полимерные полые
волокна, которые применяют для очистки белков методом диа-
лиза (рис. 9, г). Полые волокна изготавливают из природных
или синтетических полимеров (целлюлоза, поливинилхлорид,
полисульфон, полиакриламид); они имеют внешний и внутрен-
70

ний диаметр порядка нескольких сотен микрометров при толщи-
не мембраны в несколько десятых микрометра. Для проведения
ферментативной реакции волокна, по которым циркулирует ра-
створ фермента, погружают в сосуд с раствором субстрата,
диффундирующим через мембрану внутрь волокон.
§	14. Включение в липосомы
Впервые липосомы были использованы для включения фер-
ментов Дж. Сесса и Дж. Вайсманом (1970). Значительный
вклад в развитие этого направления принадлежит также Г. Гре-
гориадису. Существует несколько способов получения липосом,
содержащих включенный фермент (рис. 9, д). В одном из них
раствор липида (обычно лецитина) в органическом растворителе
(например, в хлороформе) упаривается в вакууме, и липид оста-
ется на стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу
вносят водный раствор фермента, встряхивают до полного уда-
ления пленки липида со стенок колбы и оставляют на некоторое
время. В полученной таким образом дисперсии липида проис-
ходит самопроизвольное образование (самосборка) мультила-
меллярных липосом, содержащих включенный фермент. Во из-
бежание окисления липида все операции необходимо проводить
в атмосфере инертного газа.
В другом варианте метода раствор липида в органическом
растворителе наслаивают на поверхность водного раствора фер-
мента, после чего органический растворитель удаляют путем
испарения в токе инертного газа, а образовавшуюся липидную
пленку диспергируют в водном растворе. Недоела л к него спо-
соба состоит в том, что контакт с органическим раствори гелем
может вызвать инактивацию фермента.
Для удаления невключившегося фермента липосомы отделяют
центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном
растворе. В случае моноламеллярных липосом, получаемых путем
ультразвуковой обработки, разделение проводят методом гель-
фильтрации на колонке.
Ферменты, иммобилизованные путем включения в липосомы,
применяются главным образом в медицинских целях, а также
при проведении фундаментальных исследований, поскольку такие
системы близки к природным мембранам и их изучение может
дать полезную информацию о ферментативных процессах в клет-
ках.
Недавно был предложен новый способ иммобилизации фер-
ментов путем включения их в полимерные липосомы. Для полу-
чения липосом в этом случае используются липиды, модифициро-
ванные путем введения в их молекулу кратной связи (см. гл. 1).
После включения фермента в липосомы, приготовленные из
модифицированного липида обычным способом, их подвергают
облучению ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора.
При этом происходит полимеризация мономерных молекул липи-
71

да с образованием ковалентно сшитой замкнутой липидной
бислойной мембраны. Полимерные липосомы обладают гораздо
более высокой стабильностью по сравнению с обычными.
§15	. Преимущества и недостатки иммобилизации
с использованием полупроницаемых оболочек
К числу основных достоинств этого метода иммобилизации
можно отнести его простоту и универсальность (возможность
включения не только индивидуальных ферментов, но и поли-
ферментных систем, клеток и клеточных фрагментов, ферментов,
предварительно иммобилизованных каким-либо иным спосо-
бом, и т.п.). Применение систем мембранного типа позволяет
получать иммобилизованные препараты с высоким содержанием
включенного фермента; например, в каждый грамм волокон,
изготовляемых методом влажного прядения, можно включить
свыше 200 мг фермента. Иммобилизованные в мембранных си-
стемах ферменты в значительной степени сохраняют свою ката-
литическую активность, а их стабильность часто существенно
возрастает. Эффект стабилизации обеспечивается, в частности,
за счет исключения деградации ферментов под действием микро-
организмов, которые не могут проникнуть сквозь мембрану.
Кроме того, благодаря высокому отношению поверхности к объе-
му и малой толщине мембраны удается избежать значительных
диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций.
Основным недостатком мембранных систем, как и систем
на основе полимерных гелей, является невозможность фермента-
тивного превращения высокомолекулярных субстратов, для ко-
торых мембрана создает непреодолимый диффузионный барьер.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМ ДВУХФАЗНОГО ТИПА
Отличительная черта этого способа иммобилизации состоит
в том, что ограничение свободы перемещения фермента в объеме
системы достигается не за счет его взаимодействия с жестким
носителем (адсорбентом, гелем или мембраной), а вследствие
его способности растворяться только в одной из фаз двухфазной
системы. Что касается субстрата и продукта ферментативной ре-
акции, то они распределены между обеими фазами в соответ-
ствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбира-
ется таким образом, что продукт накапливается в той из них,
где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу
отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую
фермент, вновь используют для проведения очередного цикла
процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного
типа является то, что они позволяют осуществлять ферментатив
ные превращения макромолекулярных субстратов, которые не-
возможны при применении жестких носителей с ограниченным
размером пор.
72

§	16. Двухфазные системы типа
«вода — несмешивающийся с водой органический растворитель»
В таких системах фермент присутствует только в водной
фазе, поскольку белки, как правило, нерастворимы в неполярных
органических растворителях, выступающих в роли второй фазы.
Субстрат, введенный в двухфазную систему, перерабатывается
под действием фермента в водной фазе, а образующийся про-
дукт экстрагируется в фазу органического растворителя (рис.
10, а). Объем водной фазы составляет обычно 1—2% от общего
объема системы. В ходе процесса реакционную смесь осторожно
перемешивают, чтобы ускорить диффузию субстрата и продукта
через границу раздела фаз.
Основные недостатки этого способа иммобилизации — низкая
скорость процесса вследствие небольшой площади поверхности
раздела фаз, через которую осуществляется перенос субстрата
и продукта, и возможность инактивации фермента при его ад-
сорбции на границе раздела фаз. Именно последнее обстоя-
тельство не позволяет применять интенсивное перемешивание
системы для увеличения скорости процесса за счет возрастания
поверхности раздела, поскольку в образующейся эмульсии фер-
мент быстро теряет активность. Чтобы преодолеть это затрудне-
ние и добиться увеличения поверхности раздела, в качестве
ферментсо держа щей фазы часто применяется крупнопористый
неорганический носитель (например, пористое стекло), частицы
которого пропитаны водным раствором фермента (рис. 10. б).
§17	. Микроэмульсии
Проблема увеличения поверхности раздела фаз может быть
решена при использовании в качестве среды для ферментативных
реакций уже упоминавшихся выше микроэмульсий типа «вода
в масле» (см. рис. 8,в), введенных в арсенал энзимологии
К. Мартинеком с сотр. (1977). Методика получения фермент-
содержащих микроэмульсий состоит в том, что фермент в виде
водного раствора (в количестве нескольких объемных процентов
от общего объема системы) или лиофилизованного порошка вно-
сят в раствор ПАВ в неполярном органическом растворителе
и энергично перемешивают в течение нескольких минут (при вве-
дении фермента в сухом виде для обеспечения его солюбилизации
в систему необходимо заранее добавить нужное количество вод-
ного буферного раствора). В результате образуется полностью
прозрачный гомогенный раствор, в котором молекулы фермента
включены внутрь гидратированных обращенных мицелл ПАВ,
или микроэмульсионных капель, причем в каждой белоксодер-
жащей мицелле присутствует обычно только одна молекула фер-
мента (рис. 10, в). Диаметр сферических капель в зависимости
от ряда факторов (природа органического растворителя и ПАВ.
количество добавленной воды и т. п.) колеблется от нескольких
единиц до 20 нм.
73

Рис. 10. Иммобилизация ферментов с использованием
систем двухфазного типа:
а —двухфазная система типа «вода — несмешивающиися с во-
дой органический растворитель», б — частица крупнопористого
неорганического носителя, пропитанная водным раствором фер-
мента, в органическом растворителе; в — фермент, включенный
в гидратированную обращенную мицеллу ПАВ в органическом
растворителе, г — фермент, включенный в водную микрокаплю
бездетергентной микроэмульсии
г
Ограничения, накладываемые на скорость ферментативной
реакции диффузией субстрата и продукта, в микроэмульсиях
практически отсутствуют из-за огромной удельной поверхности
раздела между водными микрокаплями и органическим раство-
рителем. Дополнительное преимущество таких систем состоит в
том, что фермент, находящийся внутри микроэмульсионной
капли, защищен от денатурирующего воздействия органического
растворителя слоем молекул ПАВ, как это показано на рис. 10, в.
Микроэмульсии представляют собой универсальную микрогетеро-
генную среду для ферментативных реакций: практически все из
нескольких десятков ферментов различных классов, изученных
в микроэмульсионных системах, полностью сохраняют, а иногда
74

даже приобретают более высокую каталитическую активность
по сравнению с водным раствором.
После завершения ферментативной реакции в микроэмульсии
фермент можно регенерировать для повторного использования,
например, путем добавления в систему избытка ацетона. Фермент
при этом выпадает в осадок в виде так называемого ацетонового
порошка, сохраняя каталитическую активность, тогда как основ-
ная доля ПАВ вместе с продуктом реакции остается в растворе.
Последнее обстоятельство является одним из основных недостат-
ков микроэмульсий как среды для проведения ферментативных
реакций, поскольку отделение продукта от примеси ПАВ нередко
представляет собой весьма трудную задачу.
Затруднений такого рода можно избежать, если использовать
так называемые бездетергентные микроэмульсии, для образова-
ния которых вообще не требуется введения ПАВ. Бездетергент-
ные микроэмульсии образуются в тройных системах типа гек-
сан — изопропиловый спирт — вода или толуол — изопропило-
вый спирт — вода. При определенном соотношении компонентов
вода в таких системах существует в виде сферических капель
размером от 5 до 30 нм, стабилизированных адсорбированными
на их поверхности молекулами изопропилового спирта. При ра-
створении в бездетергентной микроэмульсии молекулы фермента
оказываются включенными в водные микрокапли, как это показа-
но на рис. 10,г, причем их каталитическая активность сохра-
няется. Для отделения фермента от реакционной смеси после
завершения реакции можно просто изменить состав системы
путем добавления одного из компонентов, в результате чего
произойдет ее расслоение на водную и органическую фазы,
содержащие, соответственно, фермент и продукт реакции.
Важнейшим преимуществом системы двухфазного типа на
основе воды и неполярного органического растворителя явля-
ется то, что они дают возможность легко осуществлять фермен-
тативные превращения соединений, нерастворимых в воде, но
растворяющихся в органической фазе. Кроме того, благодаря
низкому содержанию воды в таких системах удается проводить
реакции, равновесие которых в водном растворе по термодинами-
ческим причинам почти полностью сдвинуто в сторону исходных
веществ. Речь идет прежде всего о реакциях, протекающих с
образованием воды в качестве одного из продуктов, таких, как
синтез пептидов, сложных эфиров и т. п.
§18	. Двухфазные водные системы
В основе этого способа иммобилизации, предложенного Б. Ма-
тиассоном (1982), лежит тот факт, что водные растворы некото-
рых полимеров (полиэтиленгликоля, декстрана, поливинилового
спирта и других) обладают свойством не смешиваться между
собой или с концентрированным водным раствором электролита,
образуя системы двухфазного типа. Обычно используемые кон-
75

центрации полимеров в обеих фазах лежат в интервале от 5
до 15%. Наибольшее распространение получили системы, со-
стоящие из несмешивающихся между собой водных растворов
полиэтиленгликоля и декстрана, один из которых диспергирован
в другом в виде мелких капель. Варьируя природу входящих
в систему компонентов и объемное соотношение фаз, можно
подобрать условия, при которых фермент и продукты реакции
находятся преимущественно в разных фазах, что позволяет
отделять продукты реакции от биокатализатора. Примером ис-
пользования этого подхода может служить гидролиз крахмала
под действием смеси а-амилазы и амилоглюкозидазы в двух-
фазной системе, состоящей из несмешивающихся друг с другом
водных растворов крахмала и полиэтиленгликоля.
Наряду с рядом важных достоинств, к числу которых можно
отнести почти полное отсутствие диффузионных ограничений
при протекании реакции, простоту приготовления и доступность
необходимых компонентов, двухфазные водные системы имеют
однако, серьезные недостатки. Главный из них — это то, что
вследствие эффектов распределения часть фермента, хотя и не-
большая, всегда переносится в фазу, содержащую продукты
реакции. Это приводит к загрязнению продуктов и потерям
дорогостоящего катализатора. Чтобы избежать этого нежела-
тельного явления, приходится применять дополнительные устрой-
ства, например мембранные ультрафильтры, что приводит к за-
медлению и удорожанию всего процесса.

Глава
ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
mJ иммобилизации ферментов
Главным отличительным признаком химических методов им-
мобилизации является то, что путем химического воздействия
на структуру фермента в его молекуле создаются новые кова-
лентные связи, в частности между белком и носителем.
Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с при-
менением химических методов, обладают по крайней мере двумя
важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермен-
та с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося
конъюгата. Иными словами, при достаточно широком варьиро-
вании условий, таких, как pH и температура, фермент не десор-
бируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катали-
зируемой им реакции. Это особенно важно при реализации
процессов медицинского и пищевого назначения, а также для
обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в анали-
тических системах. Во-вторых, химическая модификация
ферментов способна приводить к существенным изменениям их
свойств, таких, как субстратная специфичность, каталитическая
активность и стабильность. Именно химическими методами,
путем многоточечного ковалентного закрепления белковой струк-
туры удается достигнуть наибольших эффектов стабилизации
ферментов.
§ 1. Основные принципы конструирования препаратов
ковалентно иммобилизованных ферментов
Для целей иммобилизации существует буквально неогра-
ниченный набор различных материалов: неорганических (стекла,
керамйка, оксиды металлов и т. д.), природных полимеров
(целлюлоза, хитин, агароза, крахмал и другие полисахариды) и,
конечно, синтетических полимеров и сополимеров (см. гл. 1).
Одни из этих веществ могут быть использованы непосредственно
в качестве носителей, другие предварительно должны быть под-
77

вергнуты специальной химической обработке активаторами или
модифицирующими агентами. Иными словами, «химическая
методология» иммобилизации не испытывает недостатка ни в вы-
боре исходных материалов, ни в способах их трансформации.
Однако все это составляет предмет и задачи тактики. Что же
касается стратегической линии, то она базируется на принципах
конструкции конечного препарата, а таких принципов всего три.
Дело в том, что независимо от числа и химической
природы компонентов, вовлеченных в процесс иммобилизации,
числа и сложности отдельных стадий этого процесса, принци-
пиально различающихся элементов-блоков химических конструк-
ций не более трех: собственно молекула фермента (Ф), но-
ситель (Н) и сшивающий би- или полифункциональный реа-
гент (С), называемый также «сшивка», «вставка», «ножка»,
«спейсер» и т. п.
Таким образом, ковалентная иммобилизация ферментов под-
разумевает создание конструкций из связанных химическими
связями трех элементов: Н — С — Ф (как максимум) и (или)
двух, Н — Ф и С — Ф (как минимум). В свою очередь прин-
ципы конструирования соответствующих конъюгатов можно на-
глядно обозначить терминами «пришивка» (для Н — Ф), «сшив-
ка» (для Н — С — Ф) и «вшивка» (для С — Ф).
Рассмотрим эти принципы более подробно. При наличии на
поверхности носителя функциональных групп, способных всту-
пать в химические реакции с функциональными группами фер-
мента с образованием ковалентных связей: получение иммобили-
зованного фермента сводится к исключительно простой про-
цедуре, аналогичной используемой для физической адсорбции
фермента на носителе. Методических различий здесь действи-
тельно нет: в раствор фермента вводится носитель и фермент
на нем адсорбируется, однако адсорбция при химической
иммобилизации необратимая — фермент пришивается к носителю
одной или несколькими ковалентными связями (рис. 11, а).
Тесный контакт белка с носителем может оказаться нежелатель-
ным, например, из-за неблагоприятного изменения микросреды
фермента, стерических и диффузионных ограничений. Выходом
из такой ситуации становится отдаление молекулы иммобилизо-
ванного фермента от поверхности носителя на некоторое рас-
стояние. Для этой цели применяются сшивающие реагенты раз-
личной длины. Они могут быть как простыми бифункциональ-
ными (т. е. с двумя одинаковыми или различными по химиче-
ской природе реакционноспособными группировками), так и весь-
ма сложными полифункциональными реагентами, в том числе
построенными из отличающихся по химической природе звеньев
с различными по прочности связями между ними. Тем не менее
здесь используется один общий принцип ковалентной иммобили-
зации — сшивка фермента с носителем посредством сшивающего
агента (рис. 11,6).
По разнообразию методических приемов, по крайней мере
78

(Н)
(ф)
а
Рис. 11. Блок-схемы ковалентной иммобилизации фер-
ментов
за счет сшивающегося агента, этот способ несравнимо богаче
и гибче предыдущего. Во-первых, подбором длины сшивающего
агента (или подбором оптимальной смеси сшивающих агентов
различной длины) можно изменять каталитические характе-
ристики иммобилизованного фермента. Во-вторых, можно спе-
циально конструировать сшивку так, чтобы она содержала
связь, лабильную в определенных условиях или специфически
расщепляемую определенными реагентами (в частности, фер-
ментативно) . Это дает ключ к контролируемому отделению им-
мобилизованного фермента от носителя, например, при решении
проблем направленного транспорта ферментов в живом ор-
ганизме.
Целый ряд разнообразных решений задачи ковалентной им-
мобилизации ферментов дает использование систем, изначаль-
но не содержащих носителя, а только фермент и сшивающие
агенты, где носитель (как твердое тело) формируется непосред-
ственно в процессе иммобилизации или же сам фермент служит
одновременно и носителем. Речь, таким образом, пойдет здесь о
ковалентном вшивании молекулы фермента в различные типы
сеток (рис. 11, в). Идея конструирования ферментных сеток
(ретикуляция ферментов) вытекает из полифункциональной при-
роды самой молекулы фермента, имеющей на поверхности по-
79

мимо активного центра достаточно большое количество реак-
ционноспособных групп. При введении в раствор фермента би-
функционального сшивающего агента отдельные молекулы фер-
мента сшиваются друг с другом и образуют более или менее
сложные агрегаты сетчатой структуры, в которой узлами служат
сами молекулы фермента. В зависимости от природы и количе-
ства сшивающего агента можно получить как водорастворимые,
так и водонерастворимые препараты.
Другой прием ретикуляции основан на использовании фер-
ментов, предварительно ковалентно модифицированных реаген-
том, содержащим двойную связь, например акрилоилхлоридом.
В этом случае при сополимеризации белкового макромономера
с низкомолекулярными мономерами (например, с акриламидом)
образуются сетчатые полимерные гели, сшитые белком или
дополнительным сшивающим мономером (например, N, N-мети-
лен-бис-акриламидом). В рассматриваемой системе исходное
состояние — жидкий раствор, а конечное (после полимериза-
ции) —твердое тело (гель), причем, естественно, оно приобре-
тает форму того сосуда (реактора), в котором проводится поли-
меризация. Целенаправленное использование этого явления
положено в основу целого ряда оригинальных способов им-
мобилизации. Сшивкой белка в объеме растворителя (сополи-
меризацией) получают трехмерный гель (рис. 12, а) в виде
крупного однородного блока, который можно механически
измельчать и использовать в виде более или менее мелких частиц
в зиях. Трехмерный гель можно готовить и непосредст-
венно в виде мелких частиц сферической формы путем эмульси-
онной полимеризации. Эмульсии получают диспергированием
водного раствора, содержащего мономеры, в несмешивающемся
с водой органическом растворителе. Предельный вариант таких
систем — микроэмульсии, или гидратированные обращенные ми-
целлы поверхностно-активных веществ (ПАВ) в органических
растворителях. В мицеллярных системах размеры «капелек», со-
держащих модифицированный фермент и мономеры, можно
варьировать и даже получать их близкими к собственным разме-
рам молекул ферментов. Это новое качество иммобилизации —
молекулярный уровень. Иными словами, при использовании
систем обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях,
можно обшивать отдельные молекулы фермента полимерной
оболочкой заданной толщины, т. е. в полном смысле одеть фер-
мент в «рубашку, сшитую по мерке» (рис. 12,6).
Процесс ретикуляции может быть реализован не только в
растворе фермента, но и при использовании его иммобилизован-
ных препаратов. Так, в случае фермента, предварительно иммо-
билизованного на химически инертном носителе путем физиче-
ской адсорбции, дополнительная обработка сшивающим агентом
приведет к повышению прочности (задубливанию) препарата.
Носитель здесь непосредственно не принимает участия в хими-
ческой реакции — он служит лишь матрицей для организации
80

а
сополимеризация в
однородном растворе
6
сополимеризация в
микроэмульсионной
системе
введение в
молекулу фермента
„химических скобок*
г
Рис. 12. Типы ретикуляции ферментов:
а — межмолекулярная трехмерная сетка; б — сетчатая оболочка вокруг
молекулы фермента (молекулярно иммобилизованный фермент); в —
межмолекулярная двумерная сетка; г — внутримолекулярная сетка из
полипептидных цепей белка и химических «скобок»
слоя (монослоя) адсорбированного фермента и обусловливает
двумерную направленность ретикуляции. Более того, носитель
может быть вообще удален (например, нитроцеллюлозу раство
ряют в метаноле) и, таким образом, получится сшитая фермент-
ная пленка (рис. 12, в).
В принципе можно представить себе «нульмерную» ретикуля-
81

цию, поскольку являющаяся узлом ферментной сетки молекула
фермента — это не условная точка, а довольно-таки крупный
объект. Иными словами, от сеток межмолекулярых перейдем
к внутримолекулярным, составленным из полимерных цепей бел-
ка и химических сшивок. Один из примеров такого рода был
уже рассмотрен (рис. 12,6). Добавим, что препараты молеку-
лярно иммобилизованных ферментов могут быть получены, если
обе группы бифункионального сшивающего реагента провзаимо-
действуют с одной и той же молекулой белка. В таком случае
(рис. 12, г) речь идет о наложении «химических скобок», внутри-
молекулярно закрепляющих структуру фермента. Практическая
реализация этого подхода в гомогенном растворе затруднена
из-за образования наряду с внутримолекулярными межмолеку-
лярных сшивок. Исключить межмолекулярные взаимодействия
можно путем перехода от гомогенных к микрогетерогенным сис-
темам с пространственно изолированными молекулами фермента,
например солюбилизацией ферментов в органических растворите-
лях с помощью гидратированных обращенных мицелл ПАВ.
§ 2. Химическая структура ферментов
и их функциональные группы
Основой любого фермента я	. .... як, представляющий
собой компактную конструкцию ной или нескольких поли-
пептидных цепей, ковалентно связанных (сшитых) дисульфид-
ными мостиками. Помимо белка ферменты иногда могут содержать
и небелковые компоненты: простетические группы неорганиче-
ской и органической природы, липиды (в липопротеидах) и угле-
воды (в гликопротеидах). Конечно, в общем случае химические
методы иммобилизации нацелены на модификацию функциональ-
ных групп в белковой части молекулы фермента. Однако при вы-
боре процедуры иммобилизации для конкретного фермента целе-
сообразно учитывать и специфические особенности строения его
молекулы. В этой связи укажем на хорошо известный и яркий
пример ковалентной иммобилизации гликопротеидов. Относитель-
но простым методом — окислением перйодатом натрия в мягких
условиях — в полисахаридную часть фермента вводятся альде-
гидные группы, посредством которых на следующем этапе и осу-
ществляется химическое взаимодействие с носителями или сши-
вающими агентами, содержащими аминогруппы (образованием
азометиновых связей, оснований Шиффа).
Белковые части ферментов построены (рис. 13) из ~20 ами-
нокислот, соединенных между собой пептидной связью. Количе-
ство аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков
составляет от нескольких десятков до тысяч. Однако качествен-
ный состав белков (содержание тех или иных аминокислотных
остатков) оказывается весьма сходным. Почти половину всех
аминокислотных остатков белка составляют аминокислоты с не-
полярными или слабополярными боковыми группами. В резуль-
82

арпшин
(3-5)
глутаминовая
кислота (8 - 12)
аспарагиновая
кислота (8 - 12)
NH
НС—(СН,),—С ООН
NH
НС—СН1—СООН
:=о
лизин
(5-8)
цистеин
(1-4)
концевая
амино
группа
серин
(6-7)
треонин
(5-7)
глутамин
аспарагин
глишш, аланин,
валин, лейцин,
кэолейиим,
фенилаланин и пр.
(40-50)
NH
нс—сн,—он
NH
НС—СН (СНз)—он
NH
НС—(СН, )1—с(О) NH,
NH
НС—СНа—С(0)М1а
NH
НС—R
tOOH
концевая
карбоксильная
группа
Рис. 13. Полипептидная цепь. Условно составлена из аминокислот в порядке
убывания числа химических реакций, в которых способны принимать участие
функциональные группы их боковых радикалов; в скобках при названиях амино-
кислот указано среднее процентное содержание в белках
тате этого за счет гидрофобных взаимодействий полипептидные
цепи сворачиваются в глобулярные структуры, ядро которых
и составляют неполярные фрагменты полипептидных цепей, а
наружный слой образуют звенья с полярными и ионогенными
группами, такими, как —SH, —ОН, —СООН, —NH2. Конечно,
некоторое количество гидрофобных группировок также может
оказываться на поверхности; из них на глобуле формируются
контактные участки для связывания субстратов и(или) для
межсубъединичных взаимодействий. Ароматические аминокисло-
тные остатки (тирозина и триптофана) распределены между
внутренними областями и наружным слоем так, что лишь часть
из них оказывается доступной растворителю и, следовательно,
растворенным в нем химическим реагентам.
83

Таким образом, с точки зрения возможностей ковалентной
иммобилизации ферментов белковые молекулы удобно предста-
вить в виде своеобразных шариков с экспонированными наружу
функциональными группами: тиольными (цистеина), гидроксиль-
ными (алифатическими — серина и треонина, ароматическими —
тирозина), карбоксильными (глутаминовой и аспарагиновой кис-
лот, а также С-концевыми), гуанидиновыми (аргинина), имида-
зольными (гистидина) и аминогруппами (е-лизина и а-, Лекон-
цевыми). Оценку количества тех или иных групп в различных
белках в первом приближении можно сделать по данным, при-
веденным на рис. 13. Например, в таком небольшом белке, как
трипсин или химотрипсин, с молекулярной массой около 25 000,
должно быть до 10 остатков цистеина, около 30 алифатических
ОН-групп, 3—7 остатков тирозина, 7-—12 остатков аргинина,
свыше 10 аминогрупп и 40 карбоксильных групп. Результаты
такой оценки соответствуют известным экспериментальным
данным.
Но, конечно, нет правил без исключений. В природе встре-
чаются белки, вообще не содержащие некоторых из приведен-
ных на рис. 13 аминокислотных остатков, например цистеина.
В пепсине, протеолитическом ферменте с молекулярной массой
около 35 000 имеются не два десятка, как этого можно было бы
ожидать, а всего лишь две аминогруппы: одна е-лизина и одна
М-концевая. Но недостаток одних групп на поверхности белко-
вой молекулы компенсируется другими. В общем, количество
функциональных групп в белках, доступных модифицирующим
агентам, достаточно велико и, казалось бы, нет особых проблем
для ковалентной иммобилизации белковой молекулы с использо-
ванием хотя бы одной из этих групп. Тем не менее проблемы
существуют и не малые. Дело в том, что в процессе ковалентной
иммобилизации должны участвовать только те группы молекулы
белка, которые не существенны для его функции (в нашем
случае — катализа). С этой позиции попытаемся выявить в белке
группы-мишени, наиболее предпочтительные для целей ковалент-
ной иммобилизации. Для этого используем следующие критерии.
Во-первых, группы-мишени должны быть высокореакционноспо-
собными, чтобы по возможности обеспечить избирательность
реакции модификации, а также ее протекание в мягких недена-
турирующих условиях. Во-вторых, таких групп в белке должно
быть достаточно много, чтобы обеспечить широкие возможности
для введения новых химических связей в белковую молекулу
с регуляцией их числа и локализации и снизить таким образом
вероятность модификации активных центров ферментов. Данные
о сравнительной реакционной способности и относительному
содержанию аминокислотных остатков приведены на рис. 13..
Самыми реакционноспособными группами в белках являются
SN-группы цистеина. Они способны принимать участие в раз-
нообразных химических реакциях: окисления, ацилирования,
алкилирования и т. д. Однако собственные тиольные группы бел-
84

ка не очень подходят на роль мишеней для ковалентной иммоби-
лизации. Дело не только в том, что содержание цистеина в бел-
ках в обтем-то невелико. Очень часто в белках вообще нет сво:
бодных SH -групп: они участвуют в образовании дисульфидных
мостиков, стабилизирующих структуру ферментов. В тех же слу-
чаях, когда такие группы в белке есть, они, как правило, необхо-
димы для каталитической активности. Тогда при иммобилизации
возникает задача защитить SH-группы. Решить ее можно раз-
личными приемами, например обработкой белка п-оксимерку-
рибензоатом: после окончания иммобилизации защитная группа
отщепляется в слабокислой среде. Несмотря на указанные
осложняющие обстоятельства использование SH-групп для кова-
лентной иммобилизации ферментов остается привлекательным
и в ряде случаев может быть осуществимо. Разработаны также
методы, позволяющие вводить в молекулу белка экзогенные
SH-группы, например, модификацией аминогрупп белка подходя-
щими реагентами, в частности ацилирование^ *гиолактоном гомо-
цистеина.
Аминогруппы белка наиболее часто используют для различного
рода химических модификаций и для целей ковалентной иммоби-
лизации ферментов. Это обусловлено рядом причин. Во-первых,
их в белке достаточно много (см. рис. 13). Во-вторых, аминогруппы
высокореакционноспособны и уступают лишь SH-группам по числу
и разнообразию реакций, в которых они могут принимать участие.
В-третьих, в большинстве своем аминогруппы играют второсте-
пенную роль в поддержании структуры и функции ферментов.
Важное свойство аминогрупп — способность протонироваться
(рК 9—10), обеспечивает в физиологических условиях наличие на
поверхности белков положительных зарядов, которые взаимодей-
ствуют с противоионами из раствора или с отрицательно заря-
женными карбоксильными группами белка, образуя в последнем
случае солевые мостики. Если для нормального функционирования
фермента важно сохранение положительного заряда, то этого
можно достичь при химической модификации аминогрупп, пере-
водя их (алкилированием) из первичных во вторичные. В-четвер-
тыХ, если некоторые аминогруппы, а не только их заряд, окажутся
существенными для структуры и функции фермента, то их при
необходимости нетрудно защитить, например, ацилированием
ангидридом трифторуксусной кислоты или малеиновым ангид-
ридом (первая из указанных защитных групп снимается в щелоч-
ной среде, а вторая — в кислой). В-пятых, для ковалентной иммо-
билизации ферментов посредством их аминогрупп разработано
большое количество подходящих носителей и сшивающих реаген-
тов.
Таким образом, наиболее удобной группой — мишенью, сле-
дует считать аминогруппу. Однако, чтобы не сложилось впечат-
ление об уникальности использования аминогрупп белков для
целей ковалентной иммобилизации, необходимо отметить, что
(как правило) обычные химические реагенты являются неспецифи-
85

ческими и, помимо аминогрупп, в реакциях модификации могут
принимать участие и другие функциональные группы белка,
такие, как тиольные (цистеина), имидазольные (гистидина),
гуанидиновые (аргинина), гидроксильные (тирозина, серина и
треонина), а также небелковые компоненты фермента или же реак-
ционной системы, в частности вода. Реакционная способность тех
или иных групп белка существенным образом зависит от условий:
макро и микро. Группу макроусловий составляют такие, как
природа растворителя, pH среды, температура — эти условия
могут и должны быть строго контролируемыми. Микроусловия,
микросреда функциональной группы определяются структурой
фермента, ее трудно изменять в нативном белке, но важно учиты-
вать при выборе метода и внешних условий модификации.
В заключение этого раздела необходимо подчеркнуть, что в
целом белковые структуры весьма лабильны и существует огром-
ное количество факторов, в том числе химических, вызывающих
денатурацию и инактивацию ферментов. Поэтому исключительную
значимость при операциях с белками приобретает выбор реакции
и условий ее проведения: желательно, чтобы эти условия были
мягкими и неденатурирующими. Что же касается получения,
трансформации и химической активации носителей и сшивающих
агентов, то здесь практически нет ограничений в выборе условий
реакции. Без особого преувеличения можно сказать, что любой
твердый материал (природный или синтетический) может быть
использован при необходимости в качестве носителя ковалентно
иммобилизованных ферментов (см. гл. 1).
| 3. Приемы химической (ковалентной)
иммобилизации белков
Реакции образования амидной связи |—С(О)—NH—|. При-
соединить белок (Ф) к носителю (И) или сшивающему агенту (С)
посредством амидной связи можно многими путями и при участии
различных функциональных групп. Наиболее часто применяется
реакция ацилирования аминогрупп фермента. В качестве ацили-
рующих агентов широко используются ангидриды:
В случае ангидридного метода в непосредственной близости от
возникшей амидной связи в препарате иммобилизованного фер-
мента оказывается карбоксильная группа, образующаяся в ходе
86

реакции (1). Это обстоятельство следует учитывать как с точки
зрения ее возможного влияния на баланс электростатических
взаимодействий в белке и направления локального смещения pH,
так и с точки зрения химической стабильности иммобилизован-
ного препарата: в кислой среде карбоксильная группа может
катализировать гидролиз амидной связи в конъюгате.
В качестве ацилирующих агентов также могут выступать ак-
тивированные эфиры (или другие производные карбоновых кис-
лот с хорошими уходящими группами), например п-нитрофенило-
вые эфиры:
(?)
Реакция (3) замечательна тем, что в процессе модификации
белка высвобождается нитрофенолят-ион (рКа = 7), удобная хро-
мофорная метка для строгого контроля за ходом реакции спек-
трофотометрическим методом.
Реакционная способность активированных производных кар-
боновых кислот падает по мере уменьшения кислотности уходя
щей группы (от хлорангидридов до эфиров).
Перечисление ацилирующих агентов можно было бы продол-
жить и рассмотреть, например, реакции с ацилазидами, образую-
щимися из гидразидов карбоновых кислот при их обработке азо-
тистой кислотой. Однако новыми здесь будут лишь методы (более
сложные) подготовки носителей и сшивающих агентов, тогда как
суть проведения самого процесса иммобилизации и тип образуемой
связи в конъюгате будут аналогичны тем, которые характерны
реакциям (1)—(3).
Принципиально иные реагенты и реакции могут быть заимство-
ваны, например, из такой хорошо разработанной области органи-
ческой химии, как пептидный синтез, центральной задачей кото-
рого является образование амидных связей. В качестве удобных
ацилирующих агентов в пептидном синтезе используют производ-
ные О-ацилизомочевины:
Реакция (4) отражает взаимодействие аминогрупп фермента с
носителем или сшивающим агентом, содержащими карбоксиль-
ные группы активированные карбодиимидом, R— N=C=N—R.
Иными словами, карбодиимид служит конденсирующим агентом
и равным образом осуществляет реакцию образования амидной
связи за счет активированных карбоксильных групп белка и
аминогрупп носителя или сшивающего реагента. Низкомолекуляр-
ные карбодиимиды сами по себе могут рассматриваться как
своеобразные сшивающие агенты. Дело в том, что обработка
87

белков такими карбодиимидами может приводить к образованию
межмолекулярных и внутримолекулярных амидных связей между
карбоксильными и аминогруппами белковых молекул: при этом
исходный карбодиимид превращается в соответствующее произ-
водное мочевины и не входит в состав возникшего белкового
конъюгата. В пептидном синтезе главным образом находит при-
менение дициклогексилкарбодиимид, при трансформации кото-
рого образуется дициклогексилмочевина — труднорастворимое
в воде вещество и поэтому легко отделяемое от водорастворимых
целевых продуктов. Это обстоятельство создает определенные
неудобства при необходимости иммобилизации ферментов на твер-
дых носителях. Указанный недостаток устраняется при исполь-
зовании растворимых карбодиимидов, имеющих гидрофильные
и (или) заряженные группы в боковых радикалах R и R', напри-
мер, 1-циклогексил-3- [2-морфолино- (4) -этил] -карбодиимид - ме-
то-п-толуолсульфонат	CH3C-H4SOJ
С6Н,N=C=.N-СН2—СН2—N<Z	^>0
СНз
,ц;>ий пример конденсирующего агента, достаточно широко
употребляемого для ковалентной иммобилизации ферментов
путем образования амидной связи, также заимствован из пептид-
ного синтеза — это изоксазолиевая соль, реактив Вудворда:
pH 3,8 -4,5; 20°С
1 -2ч
Условия проведения реакции (5) с реактивом Вудворда в
общем близки к условиям проведения реакции (4) с карбодиими-
дами, разница лишь в том, что в случае реакции (5) применимы и
слабощелочные среды. Добавим также, что реакция (5) протекает
весьма энергично и в ряде случаев при использовании реактива
Вудворда, особенно при его избытке, обнаруживается инактивация
ферментов (например, креатинкиназы и гексокиназы).
Реакции образования карбамидных связей (производных
мочевины: —-(NH, О)—С(0, S)—NH—). Химия мочевины, ее
предшественником и производных чрезвычайно богата и разно-
88

образна по реакциям. Именно синтезом мочевины из цианово-
кислого аммония, осуществленным Ф. Велером в 1828 г., было
положено начало современной препаративной органической химии.
Приведенный пример вполне здесь уместен, поскольку аналогич-
ная реакция может быть с успехом использована для ковалентной
иммобилизации ферментов.
Изоцианаты, RNCO, способны эффективно взаимодействовать
с различными функциональными группами белков с образованием
производных мочевины, таких, как диалкилмочевины, уретаны и
уреиды. Наиболее реакционноспособными группами белков по
отношению к изоцианатам являются аминогруппы:
(gy__N==C=O + H2N—(ф)	NH—j— NH—<Ф)	(6)
Аналогичным образом могут быть применены изотиоцианаты.
При этом, соответственно, образуются производные тиомочевины.
Одним из самых распространенных методов активации при-
родных полисахаридных носителей (или синтетических полиолов)
является бромциановый метод. При обработке бромцианом на
таких носителях формируются исключительно реакционноспо-
собные, цианатные, —-О—C-^N, и имидокарбонатные,
/°\
< >C=NH, группы. При взаимодействии белка с таким сбра-
зом активированным носителем образуются азомочевины (7) и
уретаны (8):
(7)
(8)
Полиольные носители (в том числе полисахариды) активи-
руют также алкилхлорформиатами, при этом получают цикличе-
ские карбонаты, эффективно взаимодействующие с аминогруппами
белков:
Z-4 pH7,8; О- 4°С	II	—.
нГ ^С=о + H2N—(ф)----—-----— ®—о—С—NH—(Ф)
ХОН
(9)
При обработке нитрилов, например полиакрилнитрила, хлорводо-
родом и спиртами в безводной среде получают хлоргидраты ими-
Доэфиров:
89

сг
Имидоэфиры могут быть также синтезированы при алкилировании
(диметилсульфатом) амидной группы, например, в полиамидах,
В свою очередь они легко реагируют с аминогруппами белков с
образованием амидинов:
tNH2Cl~	.NH
н)—+ H2N—(ф) -РН7та~Сы.4С* (н>—с—NH—(ф)
4 OR	десятки
часов
(10)
В случае реакции с имидоэфирами (10) образующаяся в конъю-
гате связь химически более прочная, чем в (7) — (9). Дело в том,
что характерная особенность конъюгатов, получаемых по реак-
циям (7) — (9), заключается в возникновении соединительной
группировки уретанового типа, т. е. содержащей сложноэфирную
связь. Эта связь может расщепляться под действием нуклеофиль-
ных реагентов, в том числе под действием аминогрупп белков:
р
НУ~О——NH-—($) + HjN—
'"ОН
О
+ (Ф)—NH— С—NH—(Ф) (11)
^ОН
Эта реакция может быть положена в основу получения сшитых
димеров белков или их субъединиц (одинаковых или разных) либо
ею можно воспользоваться для удаления иммобилизованного фер-
мента с носителя. В том же случае, когда отщепление иммобили-
зованного белка от носителя крайне нежелательно, следует
исходить из других типов носителей, например носителей, содер-
жащих вместо гидроксильных групп аминогруппы.
Реакции образования вторичных аминов (связи —NH—).
Первичные а- и в-аминогруппы белков могут быть трансформиро-
ваны во вторичные в реакциях алкилирования и арилирования,
а также путем восстановления азометиновых связей (оснований
Шиффа). Если в качестве алкилирующих или арилирующих аген-
тов использовать соответствующие носители и сшивающие агенты,
то образуются конъюгаты, в которых белковая часть фермента
закреплена прочной, негидролизуемой азот-углеродной связью,
причем вторичный амин легко протонируется и, таким образом,
может нести на себе положительный заряд так же, как исходная
аминогруппа.
Хорошо известными алкилирующими и арилирующими аген-
тами служат галогенпроизводные алифатических и ароматических
углеводородов, а также метилкетонов. Взаимодействие носите-
лей и сшивающих агентов, содержащих активный атом галогена
при атоме углерода, с ферментами протекает по схеме (12)
£н)—СН2—Cl + H2N—<Ф)  (Ен)—СН2—NH—<Ф) + НС1 (12)
90

в щелочной среде, требующейся для депротонирования амино-
группы и связывания образующегося хлорида водорода. В этих
условиях алкилируются также тиольные группы цистеина, имида-
зольные — гистидина, гидроксильные — тирозина и, в меньшей
степени, алифатические гидроксильные группы белка. В качестве
арилирующих агентов, помимо галогенпроизводных, могут быть
применены и сульфопроизводные. Однако в последнем случае
наряду с реакцией алкилирования может протекать и реакция
сульфирования аминогрупп белка с образованием сульфамидной
связи.
В общем число алкилирующих и ацилирующих агентов очень
большое. Но особого упоминания заслуживает метод, исполь-
зующий хлорпроизводные 1,3,5-триазина, в частности цианурхло-
рид, из-за его простоты и надежности. В цианурхлориде три
атома хлора связаны с атомами углерода. В присутствии соедине-
ний с HS-, H2N- и НО-группами происходит быстрое расщепление
одной из трех С — Cl-связей, затем (более медленно) подвергается
расщеплению и вторая группа, а третья обычно в реакции арили-
рования участия не принимает (время иммобилизации около
суток при 4°С). Цианурхлорид может быть с успехом применен
для активации носителей, например полисахаридов, а также как
бифункциональный сшивающий или вшиваемый агент.
Исключительно эффективными алкилирующими агентами яв-
ляются такие производные олефинов, как имины, оксиды и тио-
оксиды (оксираны и тиираны):
(н)—СН—СН2 + H2N—(ф) ---(н)—СН—СН2—NH—(Ф)	(13)
(НО- HS-)	I (-O-.-S-)
где X = >NH,>0,>S
Реакцию (13) можно проводить в средах с различными зна-
чениями pH, причем от выбора pH существенно зависит направ-
ление реакции: по амино- или оксигруппам белка.
Реакции как алкилирования, так и арилирования можно про-
вести путем присоединения фермента (посредством его тиольных,
амино- и гидроксильных групп) по активированным двойным
связям. Для этой цели используют гидроксилсодержащие носи-
тели, предварительно активированные дивинилсульфоном или
бензохиноном. Процесс иммобилизации можно представить, со-
ответственно, схемами (14) и (15):
(н>—о—сн2—сн2—SO2—СН=СН2 + H2N—(ф) рН>8 >
(HS-, но-)
---*- (н)—О(СН2)2—SO2 (СН2)2—NH—(ф)	(14)
(-O-.-S-)
91

h2n—(ф)
(15)
Реакции активации носителей бензохиноном и последующего
присоединения к таким носителям фермента правильнее было бы
называть окислительным арилированием, поскольку в качестве
промежуточных группировок в них образуются гидрохиноновые,
которые, в свою очередь, окисляются хиноном или растворенным
кислородом воздуха (среда щелочная, что благоприятствует про-
цессу окисления).
Если теперь вернуться к рассмотренным реакциям (1)—(15),
то можно констатировать, что все эти реакции в общем-то неспе-
цифические и помимо аминогрупп в них могут принимать участие,
как это уже отмечалось, другие функциональные группы: тиоль-
ные, имидазольные, гидроксильные. Одним из наиболее распро-
страненных методов специфической модификации аминогрупп бел-
ков является образование азометиновых связей, —CH=N—,
в реакциях белков с альдегидами (16):
+ H2n—(Ф)
pH >8	х—X
(С,Н)—CH=N—(ф
pH <6	'
(16)
Продукты конденсации амино- и альдегидсодержащих соеди-
нений — основания Шиффа — образуются легко и быстро в ще-
лочных средах и в этих условиях весьма стабильны. Особенно
широкое распространение в методах иммобилизации получили
диальдегиды, такие, как глутаровый альдегид, используемый
в качестве сшивающего агента. При применении низкомолеку-
лярных альдегидов, в том числе глутарового, необходимо учи-
тывать возможность образования разнообразных побочных про-
дуктов полимеризации и поликонденсации уже в исходных реа-
гентах. В результате при действии глутарового альдегида на
фермент помимо оснований Шиффа могут возникать и другие
конъюгаты, в том числе связанные через вторичные амины.
Характерной особенностью азометиновой связи является то,
что она легко разрушается в кислых средах с регенерацией исход-
ных веществ реакции (16). Это ее свойство может использоваться
для удаления с носителя ковалентно иммобилизованного фермента
путем простого изменения pH среды. Очевидно также, что азоме-
тиновая связь непригодна для ковалентной иммобилизации фер-
ментов, предназначенных для работы в кислых средах. Однако
устойчивости конъюгатов с азометиновой связью к кислотам мож-
но добиться путем восстановления этой группировки:
NaBH*
^9~ch=n-(£)
(17)
92

Реакция (17) приводит к образованию вторичного амина, проч-
ной ковалентной связующей группировки между белком и носите-
лем или сшивающим агентом.
Взаимодействие альдегидных и аминогрупп можно осуществить
и таким образом, чтобы сразу (в один прием) получить прочный
конъюгат. Примером такого процесса служит метод Уги, который
схематически может быть представлен реакцией (18):
,0	хО
Ri—СГ	+ R2—NH2 + Из—С< +R4—NC->
хон	хн
->R,—С(О)—N(R2)—CH(R3)—С(О)—NH—R4	(18)
Как видно из схемы, помимо альдегидных и аминных групп в
реакцию (18) вступают соединения с карбоксильной группой и
изонитрилы с образованием амидной связи между белком и носи-
телем. Иными словами, по методу Уги ферменты можно кова-
лентно иммобилизовать на носителях, содержащих альдегидные
группы, в присутствии изоцианатов как по амино-, так и карбо-
ксильным группам. Равным образом иммобилизация может быть
осуществлена на носителях, содержащих изонитрильные группи-
ровки в присутствии низкомолекулярных альдегидов.
Реакции азосочетания (образование азосоединений со связью
— N=N—). Соли диазония [Аг—N = N] + Ci ~ способны всту-
пать в различные реакции сочетания, скорость которых и направ-
ление существенно зависят от pH среды и природы ароматиче-
ского субстрата. В реакциях азосочетания могут, в принципе,
участвовать аминные, гуанидиновые, тиольные, имидазольные и
фенольные группы белков, причем в ряде случаев с одной функ-
циональной группой могут реагировать две диазогруппы.
В слабощелочной среде основной группой-мишенью в белке
является фенольный радикал тирозина (атаке ионом диазония в
этих условиях может также подвергаться незащищенный незаря-
женный имидазол гистидина):
В результате реакции (19) быстро образуется прочный конъюгат
белка с носителем, связанный через диазогруппу. Важно отметить
простоту процедуры иммобилизации этим методом, несложным
также является получение соли диазония при работе с носителем
(или сшивающим агентом), содержащим n-аминофенильные функ-
циональные группы. Добавим, что комбинацией различных хими-
ческих приемов можно вводить аминофенильные группы в раз-
нообразные носители, например в полистирол и даже в полиакри-
ламид.
Реакции тиол-дисульфидного обмена (образование дисуль-
фидной связи, —S —S—). В предыдущем разделе было отмече-
но, что свободные сульфгидрильные группы в белках встречаются
93

доволно-таки редко из-за ярко выраженной способности к окисле-
нию и образованию в нативных условиях дисульфидных мости-
ков — сшивок, которые, однако, в белках нетрудно восстановить
до исходных сульфгидрильных групп. Способность к созданию
дисульфидных мостиков может быть использована для ковалент-
ной иммобилизации ферментов путем формирования межмолеку-
лярных дисульфидных связей по реакции (20):
(С\н)~—SH + HS—(ф)	1 *• (£Н)—S—S—(Ф)	(20)
Окисление сульфгидрильных групп до дисульфидных проте-
кает спонтанно под действием растворенного кислорода воздуха.
С целью увеличения содержания тиольных групп в исходном белке
проводят восстановление дисульфидных связей подходящим вос-
становителем, например боргидридом натрия, меркаптоэтанолом,
дитиотреитолом, цистеином или его производными. Однако реокис-
ление тиольных групп при проведении реакции (20) может приво-
дить к образованию «неправильных» внутримолекулярных ди-
сульфидных мостиков в белке и, таким образом, сопровождаться
существенной потерей каталитической активности иммобилизо-
ванного фермента. Содержание сульфгидрильных групп в белке
можно увеличить за счет введения эндогенных групп, т. е. тиоли-
рованием. Для этого, избрав в качестве групп-мишеней амино-
группы белка, обрабатывают их подходящими ацилирующими
или алкилирующими реагентами, содержащими защищенную
сульфгидрильную группу, например тиолактоном гомоцистеина.
Пример указанного реагента интересен тем, что при его исполь-
зовании в белке увеличивается содержание сульфгидрильных
групп, тогда как число аминогрупп не изменяется (а- и е-амино-
групны белка образуют с реагентом амидную связь, однако реа-
гент несет на себе собственную а-аМиногруппу, а также сульфгид-
рильную, формируемую при раскрытии лактонного кольца).
В общем случае удобным приемом ковалентной иммобилиза-
ции ферментов путем образования дисульфидных мостиков явля-
ется использование реакций тиол-дисульфидного обмена (при
этом резко уменьшается вероятность закрепления «неправиль-
ных» дисульфидных внутримолекулярных мостиков в белке).
Суть этого процесса можно выразить реакцией (21):
Ri — S — S—R2 + HS — R3^Ri— S-S-R3 + HS-R2	(21)
где Ri, R2 и R3 могут представлять собой белок, носитель, сши-
вающий агент и (или) радикал низкомолекулярного тиола. Реак-
ции тиол-дисульфидного обмена обычно происходят в сильно-
кислой среде, но могут катализироваться тиольными анионами в
нейтральных и щелочных растворах. Примером иммобилизации
ферментов по реакции (21) может служить взаимодействие белка
с носителем, содержащим дитионитробензойную группу:
94

:оо~
(н)—S—S-^'V-COO- + HS—(ф)  P"8 * (H>-S—S—@ +s—P y— NO, + H+ (22)
NO,	\=/
В этом методе присоединение фермента к носителю удобно кон-
тролировать спектрофотометрически (X —412 нм, 13 600) по
количеству освобождающегося тионитробензоата.
Важным достоинством методов иммобилизации, основанных
на реакции тиол-дисульфидногр обмена, является простота про-
цедуры как присоединения фермента к носителю, так и отщепле-
ния (под действием низкомолекулярного тиола).
Радикальные реакции (графт-сополимеризация). Одним из
распространенных приемов получения синтетических полимерных
материалов служит графт-сополимеризация, осуществляемая,
например, путем химической прививки одного полимера к дру-
гому. Эта цель достигается при рекомбинации макрорадикалов,
образующихся в исходной смеси полимеров при воздействии
мощного источника у-излучения. Нетрудно представить себе ана-
логичную ситуацию, когда в роли одного из компонентов смеси
выступает биополимер, фермент. Однако жесткое облучение
ферментов сопровождается, как правило, их необратимой инакти-
вацией. Потери ферментативной активности могут быть суще-
ственно снижены при переходе к фотоинициируемым реакциям.
Примером фотореактивных агентов являются алкил - и арила-
зиды, которые, в свою очередь, могут входить в состав носите-
лей или сшивающих агентов. При фотохимическом распаде
таких соединений образуются молекулы азота и короткоживу-
щие (0,1 —10 мс) высокореакционноспособные радикалы — нит-
рены:
r—N3	R--N + Н2
взаимодействующие практически с любыми группами белка с
образованием прочных ковалентных связей.
§ 4. Недостатки и преимущества получения
и использования ковалентно иммобилизованных ферментов
При описании методов ковалентной иммобилизации после
рассмотрения основных химических приемов для их иллюстрации
обычно приводят конкретные практические методики. Дело в том,
что объективный общий сравнительный анализ различных мето-
дов крайне затруднителен, если вообще возможен, поскольку ни
одному из указанных в предыдущем разделе приемов не может
быть отдано абсолютное предпочтение. Накопленный экспери-
ментальный материал свидетельствует, например, о том, что
использование одного и того же метода в качестве стандартной
процедуры приводит в случае различных ферментов к резко
отличающимся конечным результатам [уровню остаточной актив-
95

ности и (или) стабильности]. Более того, характеристики полу-
чаемых методами ковалентной иммобилизации ферментных пре-
паратов существенным образом зависят от исходного образца
фермента (в частности, от процедуры его выделения и очистки),
природы носителя, чистоты используемых реагентов и т. д. Не
последнее место в этом перечне занимают личный опыт и квали-
фикация экспериментатора. В этой связи отметим, что те условия
реакций, которые были указаны в предыдущем разделе, ориен-
тировочны. Короче говоря, химическая иммобилизация фермен-
тов в целом является искусством, уровень которого определя-
ется, в первую очередь, умением экспериментатора (уровнем его
научного мышления, способностью к целенаправленному поиску
оптимальных условий для реализуемого процесса). Тем не ме-
нее одну общую рекомендацию к разработке процедуры хими-
ческой иммобилизации можно дать.
Напомним, что основная задача экспериментатора заключается
в формировании новых ковалентных связей в молекуле фермента
при использовании функциональных групп, не существенных для
проявления его каталитической активности. Следовательно, при
химической модификации фермента его активный центр жела-
тельно защищать — ковалентно или нековалентно. Для этого
можно употреблять обратимые ингибиторы, субстраты, различ-
ные защитные реагенты. В ряде случаев для иммобилизации
могут быть применены каталитически неактивные предшествен-
ники ферментов, зимогены, превращаемые в соответствующие
ферменты после завершения стадии ковалентной фиксации.
При сопоставлении различных приемов иммобилизации хи-
мические методы для крупномасштабных процессов кажутся
малопривлекательными из-за сложности и дороговизны. Действи-
тельно. сегодня нельзя с достоверностью назвать ни одного
промышленного процесса с ковалентно иммобилизованными фер-
ментами — обычно в них используются те или иные методы
физической иммобилизации.
Иная ситуация сложилась в лабораторной практике, где
химические методы иммобилизации занимают доминирующее
положение. Без них немыслимы аффинная хроматография, имму-
ноферментный анализ, тонкий органический синтез особо чистых
препаратов и многие другие процедуры. Кроме того, в химиче-
ской сложности и гибкости методов ковалентной иммобилиза-
ции заложены широкие возможности создания препаратов
иммобилизованных ферментов со строго определенными и
контролируемыми свойствами, что особенно важно для целей
медицины и высокочувствительных методов анализа (детекции)

Глава КИНЕТИКО-
Л ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ
Я I ЗАКОНОМЕРНОСТИ КАТАЛИЗА
* р ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ
I ФЕРМЕНТАМИ
Кинетика действия ферментов в растворе является одним из
наиболее хорошо изученных разделов химической энзимологии.
Кинетические закономерности катализа простыми ферментами
подчиняются уравнению Михаэлиса—Ментен, предложенному
еще в начале века. Кооперативные и аллостерические эффекты
в катализе более сложными ферментами (в частности, олиго-
мерными) описываются на основе модели Моно—Уаймена -
Шанже, сформулированной в 60-х годах. Хорошо разработана
теория влияния на кинетику ферментативных процессов таких
факторов, как pH, присутствие ингибиторов и активаторов и т. п.
Несколько более сложными закономерностями характеризуется
кинетика действия ферментов на высокомолекулярные, в том
числе, нерастворимые субстраты (белки, ДНК и РНК, целлю-
лозу). Однако и в этой области достигнут-очевидный прогресс.
Закрепление катализатора на носителе создает целый ряд
принципиальных трудностей для описания кинетических законо-
мерностей. Не случайно общая теория гетерогенного катализа
до сих пор не создана. В дальнейшем изложении будет сделана
попытка выявить те основные факторы, которые определяют
кинетические закономерности катализа иммобилизованными фер-
ментами, и выяснить, как изменяются каталитические характе-
ристики иммобилизованных ферментов по сравнению с натив-
ными ферментами в растворе.
§ 1.	Кинетические параметры ферментативных реакций
В простейшем случае скорость (и) катализируемой фермен-
том реакции анализируется в рамках уравнения Михаэлиса—
Ментен:
_ ^кат[£]0 [S]
КМ.каж + [5]о ’	' 1 '
4—133
97

где [£]0 и [S]o — концентрация фермента и субстрата в системе
соответственно; kKaT — каталитическая константа ферментатив-
ной реакции; Лм.ка» — определяемое эффективное (кажущееся)
значение константы Михаэлиса.
Параметр Лм.каж служит характеристикой сродства фермента
к субстрату и, следовательно, является мерой той концентрации
субстрата, которая необходима для насыщения фермента. При
катализе иммобилизованными ферментами концентрация суб-
страта вблизи фермента (локальная) может отличаться от кон-
центрации субстрата во всем объеме системы. В этом случае на-
блюдаемая на опыте Км.каж должна зависеть от распределения
субстрата между свободным раствором и носителем, где сосре-
доточен фермент. Что касается параметра kKaT, то он характе-
ризует реакционную способность уже образовавшегося фер-
мент—субстратного комплекса, поэтому не зависит от распреде-
ления субстрата в системе, а определяется состоянием, в первую
очередь, конформацией самого фермента.
Каталитические параметры ферментативной реакции (/гкат и
Км.каж) могут зависеть от наличия в реакционной системе раз-
личных эффекторов, таких, как ингибиторы и активаторы, ионы
водорода и т. п. В таких случаях необходимо учитывать рас-
пределение также этих эффекторов между раствором и фермент-
содержащей матрицей.
Таким образом, все кинетические эффекты, наблюдаемые при
катализе иммобилизованными ферментами, можно разделить на
две группы. К первой из них относятся эффекты, связанные с
влиянием иммобилизации на состояние (конформацию) фермен-
та, а ко второй — эффекты, обусловленные распределением реа-
гентов в системе.
§ 2.	влияние иммобилизации на состояние фермента
Конформационные свойства иммобилизованных ферментов.
При иммобилизации существует опасность, что белок присоеди-
нится к носителю в конформации, отличной от нативной. В этом
случае каталитическая активность фермента может существенно
измениться или вообще исчезнуть.
Вопрос о том, произошли ли в белке конформационные из-
менения при иммобилизации, решается исследованием структуры
иммобилизованных ферментов физическими методами. Для этой
цели с успехом использовали оптические методы (спектрофото-
метрический, флуоресцентный), метод спиновых меток и др.
Анализируя данные этих исследований, можно сделать следую-
щие выводы.
1.	В результате иммобилизации пространственная структура
фермента может либо существенно измениться, либо изме-
ниться незначительно, либо остаться неизменной (что наблюда-
ется чаще всего).
2.	В тех случаях, когда конформация нативного и иммобилизо-
98

ванного ферментов различается, это обусловлено одной из трех
причин. Во-первых, конформационные различия могут быть
обусловлены химической модификацией каких-либо важных д-.я
структуры функциональных групп белка и не связаны с самим
процессом иммобилизации фермента (т. е. его присоединением
к носителю). Чтобы устранить действие этого фактора, необхо-
димо выбрать соответствующий метод иммобилизации не затра-
гивающий этих функциональных групп в белке. Кроме того,
часто фермент удается защитить от инактивации на стадии
иммобилизации простым добавлением субстрата или другого
специфического лиганда в насыщающей концентрации, что поз-
воляет получать препараты с более высокой удельной каталити-
ческой активностью (т. е. активностью, отнесенной к 1 г носи-
теля) .
Во-вторых, причиной искажения структуры фермента могут
быть неспецифические взаимодействия (электростатические,
гидрофобные, водородные связи) между ферментом и носителем,
приводящие к денатурации. Чтобы избежать этих взаимодей-
ствий, иногда достаточно заменить носитель на инертный по
отношению к белку. Такой инертностью обычно обладают поли-
сахаридные носители, полиакриламид и некоторые другие. Если
замена носителя по какой-либо причине нежелательна, то исполь-
зуют следующий методический прием: отдаляют белковые моле-
кулы от поверхности носителя за счет увеличения длины «ножки»
(сшивающего агента). При этом, как правило, удается ослабить
неблагоприятное для фермента воздействие носителя.
И наконец, третьей возможной причиной различия структур
нативного и иммобилизованного ферментов может быть большое
число связей между ферментом и носителем.
3.	В принципе может реализоваться такая ситуация, когда в
результате иммобилизации конформация фермента практически
не изменяется, но нарушается динамика конформационных
изменений в белке. Так, у белков, связанных с носителями,
могут замедляться необходимые для катализа конформационные
переходы, уменьшаться число конформационных стадий и
глубина их протекания. Причиной этого являются неспецифиче-
ские взаимодействия функциональных групп белка с носителем.
Чтобы избежать их, необходимо, как показывает практика, про-
водить иммобилизацию на инертных носителях.
Фиксация «напряженных» состояний фермента. Иногда
исследователи целенаправленно стремятся «закрепить» с по-
мощью иммобилизации конформацию фермента, отличающуюся
от нативной. Это, в частности, оказывается важным для детек-
ции конформационных изменений в ферментах, индуцированных
субстратами, кофакторами и другими специфическими лиган-
дами.
Рассмотрим, как это делается (рис. 14). Комплекс фермента
с субстратом или другим специфическим лигандом, образующий-
ся в присутствии насыщающих концентраций этого лиганда,
4*
99

Рис. 14. Схематическое изображение фиксации с помощью иммо-
билизации «напряженной» конформации белка
сшивают бифунциональными агентами (стадия а на рис. 14) или
присоединяют к предварительно активированному носителю
(стадия б на рис. 14). После удаления лиганда фермент оста-
ется зафиксированным в «напряженной» конформации.
Как показали многочисленные исследования, «замороженные»
конформации фермента могут отличаться от обычных, ненапря-
женных состояний, реализуемых в тех случаях, когда иммоби-
лизацию проводят в отсутствие специфических лигандов, по це-
лому ряду свойств: стабильности, доступности к действию моди-
фицирующих агентов, сродству к субстрату и специфическим
лигандам, а также каталитическим свойствам. Этот фактор
необходимо учитывать, поскольку иммобилизацию фермента
иногда рекомендуют проводить в присутствии специфических
лигандов с целью большей сохранности ферментативной ак-
тивности.
§ 3.	Эффекты распределения реагентов в катализе
иммобилизованными ферментами
Распределение субстрата. В условиях равновесного распре-
деления субстрата между раствором и ферментсодержащей
матрицей Км.каж, входящая в уравнение (1), определяется сле-
дующим выражением:
Км.каж = КглР,	(2)
где Км — значение константы Михаэлиса реакции, катализи-
руемой свободным (неиммобилизованным) ферментом; Р — коэф-
фициент распределения субстрата, который задается формулой
№
(3)
100

где [S]p и [S]w — концентрации субстрата в растворе и в матрице
носителя соответственно.
Из уравнения (1) следует, что при высоких концентрациях
субстрата (|S|»Км.каж) эффекты распределения не играют
существенной роли, поскольку в этом случае скорость фермента-
тивной реакции V = /гкат [Е], т. е. не зависит от концентрации
субстрата. Если же концентрация субстрата невелика
([5]^Лм.каж), то анализ уравнений (1) — (3) показывает, что
концентрирование субстрата в матрице (Р<1) приводит к
уменьшению значения Км.каж, т. е. к возрастанию скорости
ферментативной реакции. В тех же случаях, когда Р>\, скорость
ферментативной реакции падает вследствие возрастания Км.каж-
Неравномерность распределения субстрата в системе обус-
ловлена его взаимодействием с матрицей за счет, например,
электростатических сил, водородных связей, гидрофобных взаи-
модействий и т. п. В случае электростатических взаимодействий
установлена количественная взаимосвязь между коэффициентом
распределения Р и характеристиками субстрата и матрицы:
р = ехр (—	(4)
где е — единичный заряд электрона; Z — заряд субстрата,
кратный заряду электрона; ф — электростатический потенциал
носителя; k — константа Больцмана; Т — абсолютная темпе-
ратура. .
В заключение отметим, что в случае тех ферментов, которые
характеризуются низким сродством к субстрату (высокое зна-
чение Ли) или действуют на плохо растворимые субстраты
(предел растворимости субстрата ниже значения Км), выбор
носителя для иммобилизации приобретает первостепенное зна-
чение. В этих случаях, подобрав носитель, для которого коэф-
фициент Р»1, можно добиться существенного увеличения скоро-
сти ферментативной реакции [см. уравнения (1) — (3)].
Диффузионные ограничения в катализе иммобилизованными
ферментами. Если молекула фермента находится на поверхности
(или внутри) частицы носителя, то для протекания ферментатив-
ной реакции необходимо, во-первых, чтобы молекула субстрата
подошла к поверхности частицы, и, во-вторых, продиффундиро-
вала внутрь нее. В зависимости от того, как соотносятся скорости
диффузионных стадий и непосредственно ферментативной
реакции, может реализоваться одна из трех нижеперечисленных
ситуаций.
Если ферментативная реакция в поверхностных слоях час-
тицы протекает быстрее, чем субстрат из раствора подходит
к поверхности, то через непродолжительное время вокруг части-
цы образуется зона, обедненная субстратом. В результате
наблюдаемая скорость ферментативной реакции будет опреде-
ляться скоростью массопереноса субстрата к частице. В этом
случае говорят, что процесс контролируется внешней диффу-
зией.
101

Если массоперенос субстрата проходит быстрее, чем идет
ферментативная реакция на поверхности частицы, то может
возникнуть другой тип диффузионных затруднений. А именно,
если размер частицы носителя велик, а фермент очень активен
(или велика его плотность внутри частицы), то практически
весь субстрат израсходуется уже в приповерхностных слоях
носителя, а глубинные области будут обеднены субстратом.
В таком случае говорят, что процесс контролируется внутренней
диффузией.
И наконец, когда диффузия субстрата как к поверхностному
слою, так н во внутренние области частицы проходит достаточно
быстро, общая скорость превращения субстрата определяется
непосредственно ферментативной реакцией. В этом случае гово-
рят о кинетически контролируемом процессе.
Учет диффузионных факторов является одним из наиболее
сложных вопросов в катализе иммобилизованными ферментами.
В рамках уравнения Михаэлиса—Ментен [уравнение (1)] будет
проанализировано влияние диффузионных факторов на эффек-
тивные кинетические параметры ферментативной реакции.
Внешнедиффузионное торможение. К поверхности частицы
носителя примыкает неперемешиваемый слой жидкости, в преде-
лах которого перенос молекул происходит исключительно за
счет молекулярной диффузии. Поскольку молекулярная диффу-
зия в жидкостях проходит очень медленно (с коэффициентом
диффузии 10-5—10~6см2/с), массоперенос может стать лимити-
рующей стадией процесса, катализируемого иммобилизованным
ферментом.
Согласно первому закону Фика диффузионная скорость по-
дачи субстрата j, отнесенная к единице площади поверхности
частицы носителя, пропорциональна градиенту концентрации
субстрата. При наиболее часто распространенном случае линей-
ного градиента концентрации
/ = Р[Зо-3], (5)
где р — коэффициент массопереноса; So и S — концентрации
субстрата в растворе и в частице с иммобилизованным фермен-
том соответственно.
При достижении стационарного состояния в системе, т. е.
когда скорость диффузионного потока субстрата равна скорости
его расходования в ферментативной реакции, справедливо сле-
дующее уравнение:
(6)
где буквенные символы обозначают те же параметры системы,
что и в уравнениях (1) — (5).
Проанализируем частные случаи уравнения (6). В условиях
насыщения фермента субстратом (Ам.Каж<^[5[) кинетика фер-
ментативной реакции описывается нулевым порядком по кон-
102

(7)
центрации субстрата и ферментативный процесс не может лими-
тироваться диффузией, т. е. всегда протекает в кинетическом
режиме.
В случае, когда Км, каж^>[5], т. е. когда кинетика фермен-
тативной реакции подчиняется уравнению первого порядка,
имеем следующее выражение для стационарной скорости фер-
ментативной реакции:
___ ккат 1 £] г е| _ 	[ So|	
U~ К.М.каж 11 ~ 1 ,__________1
Р	&кат[£-]/Км, каж
Анализ выражения (7) показывает, что возможны два край-
них случая. Если р	/гкат[£]/Дм,каж, т. е. массоперенос осу-
ществляется намного быстрее, чем идет ферментативная реак-
ция, то v — ^ат[£] в Этом СЛучае реакция проходит в ки- '
нетическом режиме. Если же ферментативная реакция идет на-
много быстрее массопереноса, т. е. р С ^кат[£’]/Км, каж, то v—
= P[S] и ферментативный процесс протекает в диффузионном
режиме.
В общем случае, когда Км,каж ~[S], т. е. кинетика фермен-
тативной реакции характеризуется дробным порядком по суб-
страту, несмотря на существенно более громоздкие выражения,
по-прежнему справедлив вывод о двух режимах протекания
ферментативного процесса — кинетическом и диффузионном.
Можно ли решить заранее, в каком режиме, кинетическом
или диффузионном, будет протекать ферментативная реакция?
Для этого прежде всего необходимо оценить параметр р. Срав-
нив его со значением &кат[Е]/Км,каж, можно, в принципе, сде-
лать вывод о режиме (кинетическом или диффузионном) про-
текания ферментативной реакции [см. уравнение (6)[.
Этот путь, однако, дает слишком приближенные оценки.,
поэтому им относительно редко пользуются на практике. Чаще
используют экспериментальные критерии. Рассмотрим основные
из них.
Зависимость скорости ферментативной ре-
акции от концентрации субстрата. Как уже отме-
чалось, в условиях насыщения иммобилизованного фермента
субстратом, т. е. при достаточно высоких его концентрациях,
ферментативный процесс, в принципе, не может контролиро-
ваться диффузией субстрата, и, следовательно, реакция проте-
кает в кинетической области. Однако по мере уменьшения
концентрации субстрата повышается вероятность перехода реак-
ционной системы в диффузионную область. Поэтому по экспе-
риментальной зависимости v от S в координатах Лайнуивера —
Берка (рис. 15) наблюдается четко выраженный излом: при
концентрациях субстрата выше значения в точке излома (т. е.
при низких значениях 1/[ S]) реакция проходит в кинетическом
режиме — прямая /, а при низких концентрациях субстрата (вы-
соких значениях 1 /[ S]) в диффузионном режиме — прямая 2. Таким
юз

Рис. 15. Гипотетическая зависимость скорости
реакции, катализируемой иммобилизованным
ферментом, от концентрации субстрата в ко-
ординатах Лайнуивера—Берка, осложненная
внешнедиффузионными ограничениями
образом, если для иммоби-
лизованного фермента в
координатах Лайнуиве-
ра — Берка получена за-
висимость, аналогичная
представленной на рис. 15,
это является существен-
ным указанием на то, что
диффузия играет в процес-
се важную роль.
Температурные
зависимости. Фер-
ментативные реакции ха-
рактеризуются обычно
энергиями активации по-
рядка 40—120 кДж/моль.
В то же время скорость
процессов, протекающих в
диффузионной области,
должна слабо зависеть от
температуры, поскольку
единственный чувствительный к температуре параметр D ха-
рактеризуется энергией активации порядка 15—20 кДж/моль.
Следовательно, слабая зависимость скорости реакции, катали-
зируемой иммобилизованным ферментом, от температуры может
служить указанием на то, что процесс протекает в диффузион-
ном режиме. Однако с повышением температуры реакция мо-
жет переходить из кинетической области в диффузионную,
поскольку р и У/Км в уравнении (7) по-разному зависят от
температуры.
Зависимость скорости реакции от удель-
ной концентрации иммобилизованного фер-
мента (количества активного фермента на 1 г носителя). Как
видно из анализа уравнения (7), скорость реакции в диффузион-
ной области не должна изменяться при возрастании удельной
концентрации иммобилизованного фермента. Кроме того, ско-
рость диффузионно-контролируемых реакций не должна также
зависеть от таких факторов, как изменение pH, ионной силы,
добавление ингибиторов и активаторов, которые оказывают спе-
цифическое влияние исключительно на ферментативные стадии
(что легко проследить в случае нативного фермента). Следует,
однако, учитывать, что для одного и того же препарата иммоби-
лизованного фермента реакция со специфическим (высокореак-
ционноспособным) субстратом может быть диффузионно контро-
лируемой, а с неспецифическим субстратом (менее реакционно-
способным) протекать в кинетической области.
Зависимость скорости реакции от степени
измельчения частиц с иммобилизованным
ферментом. Скорость реакции в кинетической области не
104

должна зависеть от степени измельчения частиц, содержащих
катализатор (если, конечно, нет внутридиффузионных затрудне-
ний для субстрата, см. ниже). С другой стороны, скорость диф-
фузионно-контролируемых реакций будет возрастать по мере
уменьшения размера частиц с иммобилизованным ферментом, по-
скольку такое уменьшение приводит к увеличению диффузионно-
го параметра 0 в уравнении (7).
Зависимость от скорости перемешивания.
Влияние диффузионных факторов ослабляется по мере ускорения
массопереноса путем более интенсивного перемешивания. Этот
вывод становится особенно очевидным, если встать на позиции
представлений о неперемешиваемом слое (слое Нернста) как о
физической реальности, для которой применим первый закон
Фика. Из гидродинамики следует, что толщина неперемеши-
ваемого слоя уменьшается при увеличении скорости потока жид-
кости вокруг частицы. Таким образом, зависимость наблюдаемой
скорости ферментативной реакции от скорости перемешивания
или скорости протока субстрата указывает на существенную роль
диффузии в процессе. Увеличение скорости протока субстрата
через колоночный реактор и повышение числа оборотов мешалки
в реакторе перемешивания должно ослабить диффузионные огра-
ничения. Существенное ускорение перемешивания может, в прин-
ципе, перевести реакцию из диффузионной области в кинетическую.
Внутридиффузионное торможение. Реакция, катализируемая
ферментом, иммобилизованным внутри частицы (например,
включенным в полимерный гель), может оказаться чувствитель-
ной к торможению за счет внутренней диффузии. Иными слова-
ми, скорость ферментативной реакции может лимитироваться
скоростью проникновения субстрата внутрь частицы. Внутридиф-
фузионное торможение ферментативных реакций зависит от фор-
мы частицы с иммобилизованным ферментом.
Рассмотрим следующую модель. Имеется плоская мембрана
толщиной I, содержащая иммобилизованный фермент с концен-
трацией в мембране [£]. Мембрана погружена в раствор субстра-
та, концентрация которого равна [S]. Коэффициент распределе-
ния субстрата между раствором и мембраной равен Р. Требуется
найти зависимость между скоростью появления продукта в
растворе и кинетическими параметрами (&кат и Км, каж) фермен-
тативной реакции.
В соответствии со вторым законом Фика скорость диффузии
субстрата в мембрану (в направлении х, перпендикулярном ее
поверхности — см. рис. 16) равна D , где D — коэффици-
ент диффузии субстрата. В стационарном состоянии системы
скорости ферментативной реакции, задаваемой уравнением Ми-
хаэлиса— Ментен [уравнение (1)], и диффузии субстрата равны.
Этому условию соответствует следующее равенство:
П ^[S]   &кат[£] Е51о
дх2	Км.каж + [5]о
(8)
105

х—о
Рис. 16. Схематическое изображе-
ние диффузии субстрата в плоскую
мембрану толщиной I
Прямая 1 описывает распределение
субстрата в начальный момент време-
ни (/ = 0); прямая 2—равновесное
распределение субстрата в отсутствие
ферментативной реакции в мембране;
кривая 3 — распределение субстрата
при наличии ферментативного процесса
в мембране после установления ста-
При анализе уравнения (8) воз-
можны три частных случая.
1. [S]o /\М, каж- Тогда выра-
жение скорости ферментативной
реакции, отнесенной к единице
объема матрицы (ц), примет сле-
дующий вид:
V = £кат[£],	(9)
Очевидно, что в этом случае диф-
фузия не влияет на скорость фер-
ментативной реакции.
2. [S]o < Км , каж • Тогда спра-
ведливо выражение
&кат[£] Ио 2	COSha/— 1
V =	-----------J-----г-—:----- , ( 10)
Км, каж al sin/ia/
„-  n , I — толщина
Am, к.гР
мембраны.
Видно, что вклад диффузии учи-
тывается фактором F
2 cosha/ — 1
al sinh а/
циопарного состояния	а выражение (10) отличается от
обычного уравнения Михаэлиса —
Ментен, справедливого в отсутствие внутридиффузионных
ограничений, лишь множителем F, который называют фактором
эффективности и который отражает влияние внутридиффузион-
ных ограничений на ферментативный процесс. На рис. 17 приве-
дена зависимость F от al. При al^. 1 F отличается от единицы
не более чем на 10%, т. е. влиянием диффузии на кинетику
ферментативной реакции можно пренебречь. При al> 1 F заметно
меньше единицы. Иными словами, отличие al от единицы может
служить критерием влияния диффузии на скорость реакции, ката-
лизируемой иммобилизованным ферментом.
3. [S]0~Km.каж- В этих условиях получаем следующее выра-
жение:	W£][S]o
Ц = ----гг------,
Км	^Л?каж ‘5°
ГГГР А'эфф __ ^м, каж	м.ьаж
АС ЛМ, каж	р
(11)
Таким образом, роль внутридиффузионных ограничений в кине-
тике реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами,
сводится к увеличению кажущейся константы Михаэлиса.
При выводе уравнений для рассмотренных систем делалось
допущение, что частицы носителя с иммобилизованным ферментом
представляют собой плоские мембраны. Однако в общем случае
форма частиц может быть иной — сферической, цилиндрической,
неправильной. Решение задачи в случае частиц носителя произ-
вольной формы приводит к следующему выражению для наблюда-
106

емой скорости фермента-
тивной реакции, контро-
лируемой диффузией:
Цнабл. = где v - ско-
рость реакции в отсутст-
вие диффузионных огра-
ничений; ц — фактор эф-
фективности, который за-
висит от параметра Ф,
называемого модулем Ти-
ле. Хотя конкретный вид
функции ц (Ф) зависит
от формы частицы и по-
рядка реакции по суб-
страту, но очень часто
описывается кривой, ана-
логичной виду зависи-
мости F от al (рис. 17).
Таким образом параметр
Рис. 17. Вид зависимости фактора эффектив-
ности (Г) ферментативной реакции от al:
(i — параметр, определяемый кинетическими и
диффузионными характеристиками системы с им-
мобилизованным ферментом; 1 — толщина мем-
браны
al, характеризующий внутреннюю диффузию в плоской мембра-
не, является частным случаем модуля Тиле. Для оценки роли
внутренней диффузии в конкретной системе с иммобилизованным
ферментом в принципе необходимо вычислить модуль Тиле Ф и, ос-
новываясь на рис. 17, сравнить соответствующее значение г; с еди-
ницей.
Способы различия внутридиффузионных и внешнедиффузион-
ных ограничений. Существует два основных экспериментальных
критерия, по которым можно определить, протекает ли реакция, ка-
тализируемая иммобилизованным ферментом, во внутридиффу-
зионном или внешнедиффузионном режиме. Они основаны на раз-
личной чувствительности кинетических параметров ферментатив-
ных процессов, контролируемых внешней и внутренней диффузией
субстрата, к действию специфических лигандов и температуры.
Для внутридиффузионно-контролируемых реакций при очень
больших значениях al, когда F 1, т. е. ферментативная реакция
существенно замедлена диффузией, имеем Км, каж [S]o. В этом
случае для общей скорости ферментативной реакции, отнесенной к
объему носителя, справедливо выражение
Ц = 2РСо	.	(12)
Лм.каж
Видно, что скорость реакции пропорциональна квадратному корню
из концентрации фермента и его активности (£кат). Эта ситуация
существенно отличается от случая внешнедиффузионных ограни-
чений, когда скорость реакции в диффузионной области не зависит
от каталитических свойств фермента. В частности, ферментатив-
ные реакции, контролируемые внутренней диффузией, «чувствуют»
эффекты ингибирования, pH-зависимость активности и т. п.
Как было отмечено выше, температурные зависимости реакций,
107

контролируемых внешнедиффузионными ограничениями, целиком
определяются чувствительностью к температуре коэффициента
диффузии D (энергии активации порядка 15—20 кДж/моль).
Иная ситуация реализуется для процессов, контролируемых внут-
ридиффузионными ограничениями. Здесь кажущееся значение
энергии активации зависит от температурного хода как кинетиче-
ского (/^кат/Км.каж) и диффузио иного па ра метров, та к и коэффи-
циента распределения Р субстрата между раствором и фазой носи-
теля [уравнение (12)] и, как правило, характеризуется более вы-
сокими численными значениями (больше 40 кДж/моль).
Стерические ограничения в катализе иммобилизованными фер-
ментами. Пространственная сетка матрицы, в которой иммоби-
лизован фермент, может препятствовать продвижению молекул
субстрата, например, в силу чисто механических причин. В резуль-
тате активные центры части ферментных молекул оказываются
недоступными для субстрата. Фактически это означает снижение
концентрации активного фермента и приводит к уменьшению
наблюдаемой скорости ферментативной реакции. Следовательно,
хотя истинные каталитические параметры и не изменились, фер-
мент не может полностью проявить свою потенциальную актив-
ность.
Уменьшение каталитической активности фермента за счет сте-
рических факторов проявляется особенно часто в случае высоко-
молекулярных субстратов. Поэтому при создании биокатализато-
ров, действующих на белки, нуклеиновые кислоты и другие природ-
ные биополимеры, предпочтительнее иммобилизовать ферменты на
водорастворимых носителях с небольшой молекулярной массой.
Стерические ограничения иногда удается уменьшить или даже
полностью устранить путем деградации носителей под действием
химических реагентов (мягкой обработкой окислителями, кисло-
тами и т. п.) или специальными ферментами (декстраназой, цел-
люлазой и др.). При этом важно, чтобы такая обработка не затро-
нула первичную структуру и не нарушила пространственную орга-
низацию ферментов, пришитых к носителю.
pH-Эффекты в катализе иммобилизованными ферментами.
Из ферментативной кинетики хорошо известно, что скорости реак-
ций с участием ферментов в гомогенном растворе сильно зависят от
значения pH. Это обусловлено тем, что в катализе участвуют функ-
циональные группы белка, способные протонироваться или депро-
тонироваться в зависимости от pH в растворе, а реакционноспо-
собной является, как правило, только одна из форм.
В принципе pH-эффекты в катализе иммобилизованными фер-
ментами описываются теми же закономерностями, которые были
рассмотрены при анализе распределения субстрата. Однако
ионы Н+ и ОН"* относятся к числу наиболее общих эффекторов
ферментативной активности, поэтому вопрос о влиянии их рас-
пределения и диффузии на кинетику действия гетерогенных
биокатализаторов необходимо рассмотреть отдельно.
1. Распределение протонов. В качестве примера рассмотрим
108

Рис. 18. Гипотетические рН-завйсимости каталити-
ческой активности свободного (неиммобилизован-
ного) фермента (кривая 2), иммобилизованного на
поликатионном (кривая /), полианионном (кри-
вая 3) носителях
фермент, иммобилизованный на полиэлектролитном носителе.
Пусть для определенности оптимум действия фермента в гомо-
генном растворе наблюдается при pH 8, а кривая зависимости ак-
тивности от pH имеет колоколообразный вид (кривая 2 на рис. 18).
Если для работы с иммобилизованным ферментом значение pH
во внешнем растворе выбрать равным 8, то из-за эффекта распре-
деления протонов внутри полиэлектролитной матрицы оно будет
другим. Так, если фермент иммобилизован на полианионном носи-
теле, то внутри него концентрация протонов выше, чем во внешнем
растворе (сдвиг в сторону более кислых значений pH); обратная
картина имеет место в случае поликатионного носителя. Это при-
ведет к тому, что фермент, иммобилизованный как на поликатион-
ном (кривая 1 на рис. 18), так и на полианионном (кривая ,3 на
рис. 18) носителе, будет работать не с полной эффективностью,
хотя значение pH во внешнем растворе соответствуюет оптимуму
его каталитической активности.
Подобные изменения pH-зависимости ферментативной актив-
ности часто наблюдаются в реальных системах. Они целиком обу-
словлены присутствием на полиэлектролитном носителе заряжен-
ных групп. Добавление в систему с.иммобилизованным ферментом
высококонцентрированных растворов солей или буферных систем
вызывает экранирование зарядов групп носителя и, следователь-
но, уменьшение сдвигов рН-оптимумов активности. Иными слова-
ми, сдвиг pH-зависимостей активности иммобилизованных фер-
ментов, обусловленный распределением протонов, наблюдается
только в разбавленных буферных растворах с низкой ионной си-
лой. С другой стороны, зависимость сдвига pH-оптимума актив-
ности от ионной силы служит серьезным указанием на то, что
распределение протонов между раствором и носителем играет
109

важную роль в катализе иммобилизованным препаратом фер-
мента.
2. Ограничение диффузии протонов. Полимерный носитель, на
котором иммобилизован фермент, может препятствовать свобод-
ной диффузии протонов внутри частицы носителя. Это связано с
тем, что внутри частицы носителя существенно заторможена
диффузия протонов по механизму, характерному для гомоген-
ного раствора. Поскольку концентрация протонов в системе
обычно мала (10~z моль/л или ниже), то даже небольшой избы-
ток (или, наоборот, дефицит), обусловленный торможением диф-
фузии, может вызвать заметное изменение pH внутри частицы.
Это, в свою очередь, приведет к существенному изменению рН-
зависимости каталитической активности, особенно для тех фер-
ментативных реакций, в которых протоны являются субстратом
или продуктом (как, например, при действии гидролаз, дегидро-
геназ, киназ и некоторых других ферментов).
Пусть, например, фермент, иммобилизованный на носителе,
катализирует реакцию, сопровождающуюся образованием про-
тонов, в отсутствие буферного раствора. После начала реакции
в матрице начинают накапливаться протоны, что приводит к по-
явлению градиента концентрации протонов и последующей их
диффузии из частицы во внешний раствор. Однако если диффу-
зия заторможена, то протоны накапливаются внутри частицы и
вызывают уменьшение pH в микроокружении фермента. Это, в
свою очередь, влияет на скорость ферментативной реакции, а
значит, и на скорость выделения протонов — продукта фермента-
тивной реакции. Если pH внутри частицы до начала реакции вы-
ше pH-оптимума фермента, то образующиеся в ходе реакции
протоны снижают pH, повышая тем самым скорость фермента-
тивной реакции, т. е. скорость выделения протонов. В результате
значение pH частицы уменьшается еще сильнее, а скорость фер-
ментативной реакции еще больше возрастает. Иными словами,
в такой системе будет наблюдаться явление автокатализа. Окон-
чательно стационарное состояние будет достигнуто только тогда,
когда значительное повышение концентрации протонов будет
оказывать лишь незначительное влияние на скорость фермента-
тивной реакции*.
Если значение pH начала реакции ниже pH-оптимума актив-
ности, то по мере выделения протонов в ходе ферментативной
реакции pH уменьшается еще сильнее и реакция замедляется.
На графике pH-зависимости относительной ферментативной ак-
тивности (рис. 19) это отразится следующим образом: ветви кри-
вой, соответствующие низким значениям pH для иммобилизован-
ного и нативного ферментов, практически совпадут, а «щелоч-
ная» ветвь кривой (выше pH-оптимума активности) в случае
иммобилизованного фермента существенно расширится (сравни
Возможны ситуации.........>. .... ,(tn ।>п к.» w.’i
>.м случае наблюдаются колебательные процессы; о них речь пойдет ic
ПО

кривые 1 и 2), причем до та-
кой степени, что может пре-
вратиться в плато (кри-
вая 3). В предельном слу-
чае, когда иммобилизован-
ный фермент работает при
pH ниже значения pH опти-
мальной активности, рН-за-
висимость активности может
трансформироваться к виду
(кривая 4), т. е. с достиже-
нием плато. Чем существен-
нее диффузионные ограниче-
ния протонов в носителе и
чем выше активность иммо-
билизованного фермента, тем
ниже будет высота плато на
кривой 4. Если в ходе реак-
Рис. 19. Изменение pH-профилей активно-
сти иммобилизованного фермента в ре-
зультате ограничения диффузии протонов
в частицах носителя.
Кривая 1 — свободный (неиммобилизован-
ный) фермент в растворе; кривая 2 —иммоби-
лизованный фермент при слабых ограничениях
в диффузии протонов; кривые 3 и 4 — иммо-
билизованный фермент по мере усиления огра-
ничений в диффузии протонов
ции происходит поглощение
протонов, то будут наблю-
даться обратные явления.
Таким образом, если в
эксперименте наблюдаются
pH-зависимости активности,
аналогичные тем, что приве-
дены на рис. 19, то это ука-
зывает на ограничения диф-
фузии протонов в системе с иммобилизованным ферментом.
Ускорение диффузии протонов в присутствии буферных
растворов. Если система с иммобилизованным ферментом (по-
добная той, что была описана в конце предыдущего раздела)
Рис. 20. Схематическое изображение процесса пере-
носа протонов компонентами буферного раствора в
системе с иммобилизованным ферментом
111

Рис. 21. Влияние буферной системы,
ускоряющей перенос протонов в си-
стеме с иммобилизованным ферментом,
на вид pH-зависимости его каталитиче-
ской активности
Кривая ! — свободный (неиммобилизован-
ный) фермент в растворе; кривая 2 —
иммобилизованный фермент при значи-
тельных ограничениях в диффузии прото-
нов: кривые 3 и 4 — иммобилизованный
фермент по мере снятия ограничений в
диффузии протонов увеличивающимися
ч<•!••ентраниямп буферного раствора
работает в присутствии компо-
нентов буферного раствора, то
они, связывая образующиеся в
ходе реакции протоны, могут
переносить их, удалять из мик-
роокружения фермента. Обу-
словлено это тем, что на гра-
нице раздела частица носителя/
/раствор создается градиент
концентрации протонированной
формы основной компоненты
буферного раствора (ВН+).
Это приведет к диффузии фор-
мы ВН+ в свободный раствор,
где за счет более высокого
значения pH она продиссоци-
ирует с высвобождением сво-
бодной формы В, которая, в
свою очередь, будет диффунди-
ровать по градиенту концент-
рации в частицу носителя
(см. рис. 20). В системе, где
свободная диффузия протонов
сильно ограничена (кривая 2
на рис. 21), добавление буфер-
ного раствора может привести
к смещению плато в сторону
более высоких значений актив-
ности и к появлению S-образ-
ного характера у «кислой»
ветви pH-зависимости (см. кривые 3, 4 на рис. 21).
Таким образом, добавление буферных растворов в систему
с иммобилизованным ферментом может «снимать» ограничения
в диффузии протонов и приводить к увеличению ферментативной
активности в области некоторых значений pH.
Сочетание эффектов распределения и диффузии протонов.
Если в системе с иммобилизованным ферментом одновременно
имеют место эффекты распределения протонов и ограничения
их диффузии, то заранее трудно предсказать вид рН-зависи-
мости активности. Оба этих фактора могут действовать взаимо-
согласованно: либо как синергисты (т. е. усиливать друг друга),
либо как антагонисты (ослаблять действие друг друга). Возмож-
но несколько различных вариантов: фермент иммобилизован
на полианионном, поликатионном или нейтральном носителе,
и катализируемая им реакция протекает с выделением или поглоще-
нием протонов, либо вообще не сопровождается изменением их кон-
центрации. Здесь не будут рассмотрены все эти возможные ва-
рианты. Отметим, что только для фермента, иммобилизованного
на электронейтральном носителе и катализирующего процесс.
112

не сопровождающийся изменением концентрации протонов, не
должно наблюдаться изменений pH-зависимости активности.
Но даже в такой системе вид кривой зависимости активности
фермента от pH может измениться, если лимитирующей стадией
реакции является диффузия субстрата.
Эффекты ингибирования и активации в катализе иммобили-
зованными ферментами. Полимерный носитель может вносить
свою специфику и в действие таких регуляторов ферментативной
активности, как ингибиторы и активаторы.
Низкомолекулярные ингибиторы и активаторы. Влияние низко-
молекулярного ингибитора на фермент определяется, в основном,
распределением молекул ингибитора между фазой носителя и
раствором. Диффузионные ограничения, как правило, не изме-
няют характер ингибирования фермента после достижения ста-
ционарного состояния.
Наиболее прост для анализа тот случай, когда носитель не
накладывает ограничения на диффузию субстрата и характер
ингибирования целиком определяется распределением субстрата
и ингибитора между матрицей и раствором. Если ингибитор
и полимерный носитель одноименно заряжены, то степень
ингибирования снижается (по сравнению с ситуацией в гомо-
генном растворе), а если они несут на себе заряды противо-
положного знака, то степень ингибирования возрастает. Если
в последнем случае субстрат имеет одинаковый заряд с носи-
телем, то степень ингибирования еще более увеличивается.
В данном изложении не будут рассмотрены конкретные примеры:
случаи конкурентного и неконкурентного ингибирования, ингиби-
рования продуктом реакции и т. п. Читатель может это проделать
сам в качестве упражнения и вывести соответствующие матема-
тические выражения. Анализ этих систем показывает, что во
всех случаях кинетика действия иммобилизованных ферментов,
осложненная ингибированием, описывается уравнением Миха-
элиса — Ментен.
Несколько более сложную задачу представляет описание
ингибирования при наличии диффузионных ограничений для
субстрата. Можно показать, что при очень сильном ограничении
диффузии субстрата иммобилизованный фермент может вообще
не реагировать на добавление ингибитора, и скорость реакции
определяется скоростью диффузии субстрата. При достаточно
высоких концентрацих субстрата процесс может перейти в кине-
тическую область и присутствие ингибитора становится заметным.
Если же диффузия субстрата ограничена незначительно, то
ингибитор будет подавлять активность иммобилизованного фер-
мента. В промежуточных случаях степень ингибирования фермен-
та постепенно снижается по мере того, как повышается уровень
ограничений в диффузии субстрата.
Высокомолекулярные ингибиторы. Активность некоторых
ферментов in vivo, в первую очередь протеаз, регулируется
ингибиторами белковой природы с молекулярными массами
из

около 10 000 и выше. Естественно, их действие на иммобилизо-
ванные ферменты может осложняться как диффузионными огра-
ничениями, так и стерическими затруднениями. Оба этих эф-
фекта будут препятствовать контакту молекулы ингибитора с
ферментом и тем самым уменьшать эффективность ингибиро-
вания.
Ингибирование продуктом реакции. Все рассмотренные со-
ображения справедливы и для этого частного случая ингибиро-
вания. Однако при ограничении диффузии продукта не может
быть справедливым допущение о равномерном распределении
ингибитора в фазах свободного раствора и носителя. Проанали-
зируем, к каким кинетическим последствиям может привести
этот фактор.
Во-первых, концентрация продукта-ингибитора в микроокру-
жении фермента должна быть существенно выше, чем в свобод-
ном растворе. Следовательно, иммобилизованный фермент может
заметно ингибироваться даже тогда, когда концентрация про-
дукта во внешнем растворе мала. Во-вторых, в случае внутри-
диффузионных ограничений продукта концентрация субстрата
будет убывать по направлению к центру частицы, а концентрация
продукта будет увеличиваться в том же направлении. Иными
словами, степень ингибирования иммобилизованного фермента,
находящегося в глубине частицы носителя, будет существенно
выше, чем на границе раздела с внешним раствором.
В зависимости от того, по какому механизму происходит
ингибирование продуктом, изменяется потенциально достижимое
значение максимальной скорости ферментативной реакции V.
Если продукт — конкурентный ингибитор, то при высоких
концентрациях субстрата удается преодолеть и ограничение
диффузии, и ингибирование продуктом (т. е. достичь значе-
ния V в отсутствие ингибирования). В случае неконкурентного
ингибирования продуктом оптимальное значение скорости реак-
ции (в условиях насыщения фермента субстратом) никогда не
достигнет значения V. Чем эффективнее носитель препятствует
свободной диффузии, тем более существенные различия в этих
значениях будут наблюдаться.
Резюмируя, можно сказать, что диффузионные ограничения
играют роль своеобразного кинетического буфера по отношению
к экзогенному эффектору (ингибитору или активатору).
Гистерезисные и колебательные явления в катализе иммоби-
лизованными ферментами. Диффузные ограничения в катализе
иммобилизованными ферментами могут приводить к принципи-
ально новым явлениям, не наблюдаемым ранее для ферментов
в гомогенных растворах. Это гистерезисные и колебательные
процессы, обнаруженные Д. Тома с сотрудниками в начале 70-х
годов. Причины возникновения этих необычных явлений удобно
проследить на одном частном примере — ингибировании фермен-
та субстратом.
Зависимость ферментативной активности от концентрации
114

субстрата определяется дву-
мя взаимосвязанными фак-
торами: степенью диффузи-
онных ограничений субстрата
и его концентрацией в сво-
бодном растворе. При этом-
чем выше концентрация суб-
страта и чем ниже исходная
активность фермента, тем
больше вероятность, что
ферментативная реакция
будет протекать в кинетиче-
ском режиме. Поэтому по-
нятно, что увеличение кон-
центрации субстрата, сопро-
вождаемое снижением фер-
ментативной активности (за
счет ингибирования фермен-
та), может вызвать резкий
переход реакции из диффу-
зионного режима в кинети-
ческий.
Рассмотрим этот вывод
подробнее. Согласно перво-
му закону Фика скорость
переноса субстрата к фер-
менту прямо пропорциональ-
на концентрации субстрата
у поверхности носителя. Ка-
тализируемая иммобилизо-
ванным ферментом реакция
достигает стационарного со-
Активность, %
Скорость
диффузии
Рис. 22. Влияние ограничения диффузии
субстрата на кинетику действия иммоби-
лизованного фермента, подверженного ин-
гибированию субстратом: прямые 1, 2 к
йвиспмости скорости диффузии суб-
а к ферменту от [S]o; кривая 4 -
зависимость скорости ферментативной ре-
акции от концентрации субстрата в от-
сутствие диффузионных ограничений, точ-
ки (А. В. С, D, Е) — стационарные со-
стояния., когда скорость диффузии суб-
страта к ферменту равна скорости реакции
для иммобилизованного фермента
стояния, когда скорость переноса субстрата к ферменту стано-
вится равной скорости его ферментативной трансформации. На
рис. 22 стационарные состояния задаются точками пересечения
кривой зависимости ферментативной активности от концентра-
ции субстрата с прямой скорости диффузии субстрата к фер-
менту. При высоких скоростях диффузии, т. е. незначительных
диффузионных ограничениях (прямая /), так и при низких ско-
ростях диффузии, т. е. весьма больших диффузионных ограни-
чениях (прямая 3), на рис. 22 наблюдается лишь одна точка
пересечения — одно стационарное состояние. При промежуточ-
ных скоростях диффузии (прямая 2) имеется три точки пересе-
чения, т. е. допустимы три различных стационарных состояния.
Если построить график зависимости реальной скорости фермен-
тативной реакции от концентрации субстрата, то при высоких
и низких значениях концентрации субстрата возможно только
одно стационарное состбяние, а при промежуточных значениях —
три состояния: А, В и С. Таким образом, получаем гистерезисную
115

Рис. 23. Гистерезисная зависимость реаль-
ной скорости реакции для иммобилизован-
ного фермента, подверженного ингибирова-
нию субстратом, при диффузионных ограни-
чениях субстрата от его концентрации; стрел-
ки —обозначено направление изменения кон-
центрации субстрата [S]o в системе
кривую (рис. 23). Она
означает, что скорость
ферментативной реакции
определяется не только
концентрацией субстрата
во внешнем растворе, но
и зависит от направ-
ления изменения концент-
рации субстрата. Так, при
повышении концентрации
субстрата во внешнем
растворе скорость фер-
ментативной реакции уве-
личивается. Однако при
достижении некоторой
критической концентрации
субстрата система перехо-
дит из диффузионной об-
ласти в кинетическую и
скорость реакции суще-
ственно падает (рис. 23).
При понижении концен-
трации субстрата скорость реакции остается низкой до тех пор
пока не произойдет обратный переход из кинетической области
в диффузионную. При дальнейшем уменьшении концентра-
ции субстрата скорость ферментативной реакции снова нач-
нет падать.
Причины того же характера приводят к появлению внутри-
мембранных колебательных процессов. В качестве одного из
примеров приведем катализируемый папаином, иммобилизован-
ным в искусственной мембране, гидролиз этилового эфира
N-бензоил-Е-аргинина. Один из продуктов ферментативной реак-
ции — аминокислота, накапливается в мембране (за счет ограни-
чения диффузии) и тем самым сдвигает pH внутри мембраны в сто-
рону более кислых значений. Это неизбежно уменьшает гидролити-
ческую активность папаина, так как фермент «выходит» из своего
pH-оптимума активности. В дальнейшем за счет более быстрой диф-
фузии Н+ по сравнению с ОН~возрастает значение pH внутри мем-
браны и активность папаина снова увеличивается. Таким образом,
был получен микрореактор с периодом колебания 20 с. Изменением
концентрации фермента в мембране, толщины мембраны и дру-
гих параметров системы удается варьировать продолжитель-
ность одного колебания.
Анализ условий, при которых могут наблюдаться гистерезис-
ные и колебательные явления, показал, что для их возникновения
необходимо, чтобы, во-первых, на зависимости скорости фермен-
тативной реакции от концентрации субстрата имелся максимум
или точка перегиба, т. е. фермент активируется или ингибируется
116

субстратом или продуктом, и, во-вторых, процесс должен быть
диффузионно-контролируемым.
Аллостерические и кооперативные свойства иммобилизован-
ных олигомерных ферментов. Выше были рассмотрены в основ-
ном те ферменты, кинетика действия которых подчиняется урав-
нению Михаэлиса — Ментен. Однако в природе наиболее распро-
страненными являются аллостерические ферменты. Основная
особенность этих ферментов состоит в том, что регуляция их
активности под действием субстратов, продуктов и других мета-
болитов клетки осуществляется по кооперативному механизму
(подробно об этом явлении и его кинетическом описании см. в
монографии Б. И. Курганова «Аллостерические ферменты»,
1978).
В настоящее время не вызывает сомнения, что решающая
роль в механизме кооперативной регуляции активности при-
надлежит конформационной подвижности белков. Поскольку
иммобилизация иногда существенно ограничивает ее, то коопе-
ративные и аллостерические свойства олигомерных ферментов
в иммобилизованном состояния часто отличаются от свойств
этих ферментов в гомогенном растворе. При этом иногда умень-
шается или даже совсем исчезает S-образный характер зависи-
мости скорости реакции от концентрации субстрата или аллостери-
ческого лиганда. Эти зависимости могут трансформироваться в
сигмоидальные, которые характерны для ферментов, действую-
щих в соответствии с кинетическим уравнением Михаэлиса —
Ментен.
Иммобилизованные полиферментные системы. В последние
годы получено немало доказательств того, что многие ферменты
в клетках работают в виде структурно и кинетически единых
комплексов. В них проходит цепь последовательных процессов,
когда продукт первого фермента является субстратом для второ-
го фермента и т. д. В полиферментных комплексах активность
каждой компоненты, как правило, превышает активность изо-
лированного фермента в гомогенном растворе. Основная причина
этого заключается в том, что в комплексе за счет простран-
ственного сближения и диффузионных ограничений могут ло-
кально концентрироваться промежуточные соединения: суб-
страты, активаторы, ингибиторы. Эффекта локального концентри-
рования удается добиться при иммобилизации нескольких фер-
ментов вместе на одном носителе.
Первая искусственная биферментная система, основанная на
иммобилизованных ферментах, была создана К. Мосбахом
(1970). Гексокиназу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу ко-
валентно присоединяли к носителю; они последовательно пере-
рабатывали глюкозу в глюкозо-б-лактон-б-фосфат. По сравнению
с системой двух ферментов в растворе эффективность возросла
на 40—140%; при этом исчезал индукционный период в актив-
ности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (второго фермента в по-
следовательности) .
1 17

К настоящему времени описано несколько десятков иммоби-
лизационных систем, в которых согласованно действуют два, три,
четыре и большее число ферментов. Все они выигрывают в
эффективности по сравнению с ферментами в растворе за счет
того, что вблизи активного центра второго (третьего и т. д.)
фермента очень быстро достигается стационарная концентрация
его субстрата.
Иммобилизованные органеллы и клетки. Иногда ферменты
используют, не выделяя их из нативного микроокружения in
vivo, а в виде целых клеток или субклеточных структур —
митохондрий, хлоропластов и т. п. Такая форма биокатализато-
ров имеет целый ряд преимуществ. Перечислим наиболее важ-
ные из них: сохранность природного микроокружения (которое,
как правило, обеспечивает ферментам повышенную стабиль-
ность) и способность воспроизводить ферменты природным путем
при использовании варианта растущих клеток.
Для придания органеллам или клеткам большей технологич-
ности их иммобилизуют. Кинетическое описание катализа под
действием иммобилизованных клеток представляет очень сложную
проблему. Здесь необходимо учитывать последовательную цепь
диффузионных и кинетических процессов, осложненных эффек-
тами распределения метаболитов и их активного транспорта
(например, через биологическую мембрану). Для растущих
клеток требуется также учет процессов биосинтеза и биоде-
градации макромолекул. В настоящее время еще не созданы
математические модели, которые бы исчерпывающе описывали
кинетику действия иммобилизованных клеток, — это задача бли-
жайшего будущего.

Глава
СТАБИЛЬНОСТЬ
ИММОБИЛИЗОВАННЫХ
ФЕРМЕНТОВ
Во Введении отмечалось, что главное преимущество иммоби-
лизованных ферментов перед свободными (несвязанными)
заключается в их большей технологичности. Одним из проявле-
ний этого является более высокая стабильность иммобилизован-
ных ферментов по сравнению с нативными. Дело в том, что фер-
менты, как класс биологических молекул, обладают очень низкой
стабильностью: стандартная свободная энергия нативной кон-
формации при обычных условиях (комнатная температура, физи-
ологические значения pH, нормальное давление, определенный
состав среды), как правило, лишь на 20—60 кДж/моль меньше
свободной энергии денатурированной формы. Это соответствует
энергии всего лишь нескольких водородных связей или одного-
двух солевых мостиков и намного меньше энергии обычных кова-
лентных связей, составляющих сотни кДж/моль. Поэтому даже
небольших отклонений внешних условий от тех, которые харак-
терны для микроокружения ферментов в клетке, может оказаться
достаточно, чтобы нарушить структуру и функцию фермен-
тов, т. е. инактивировать их.
Для практических целей, однако, часто требуется, чтобы
ферменты работали при повышенных температурах, экстремаль-
ных значениях pH, в присутствии высоких концентраций органи-
ческих растворителей или поверхностно-активных веществ и т. п.
В связи с этим возникает проблема существенного увеличения
стабильности ферментов.
§ 1. Воздействия и вещества,
вызывающие инактивацию ферментов
Все воздействия, приводящие к инактивации ферментов,
иногда условно подразделяют на физические и химические.
К физическим относят нагревание или переохлаждение, облуче-
ние (у- и рентгеновское излучение), ультразвук, сорбцию на
119

границах раздела фаз (типа вода — воздух или жидкость —
жидкость). Химическая инактивация может быть вызвана, на-
пример, щелочами и кислотами, поверхностно-активными веще-
ствами, органическими растворителями, мочевиной и гуанидин-
хлоридом, некоторыми окислителями (например, кислородом или
пероксидом водорода) и восстановителями (например, тиолами,
ионами металлов), а также некоторыми ферментами (например,
протеазами или протеинкиназами). Однако попытка классифи-
цировать инактивационные процессы, основываясь на условном
разделении инактивирующих воздействий на физические и хими-
ческие, практически ничего не дает для понимания сути этих
процессов. Так, например, под действием физического фактора
(нагревания) в молекуле белка часто происходят химические
изменения: окисление функциональных групп, гидролиз пептид-
ных связей. С другой стороны, действие таких химических дена-
турантов, как мочевина или гуанидин хлорид, как правило, вы-
зывает изменения только физического состояния белка (конфор-
мационные перестройки), но не меняет его химическую струк-
туру.
Более информативной, с точки зрения решения стабилиза-
ционной задачи, является классификация инактивационных про-
цессов по молекулярным механизмам.
§ 2. Молекулярные механизмы инактивации ферментов
Еще в 40-х — начале 50-х годов сложились основные пред-
ставления о механизмах инактивации. В наиболее общем случае
инактивационный процесс можно представить в виде двухстадий-
ной схемы:
N^D^I,	(О
где N, D и I — соответственно нативная, обратимо денатури-
рованная и необратимо инактивированная формы белка*. Первая
стадия на схеме (1) чаще всего представляет собой обратимое
конформационное изменение; в случае олигомерных ферментов
эта стадия состоит в обратимой диссоциации на субъ-
единицы. Вслед за обратимыми процессами протекают необрати-
мые стадии (D -I). Механизмы инактивации ферментов, как
правило, классифицируют, исходя из природы процессов, про-
исходящих именно на второй, необратимой стадии. Кратко рас-
смотрим основные инактивационные механизмы.
Агрегация. Очень часто при длительной инкубации в растворе
при повышенной температуре, при экстремальных значениях pH,
* Термин «необратимость» по отношению к инактивации имеет тот смысл,
что после снятия инактивационного воздействия (например, при понижении
температуры после продолжительного нагревания) фермент не возвращается к
нативной каталитически активной конформации N. Он остается в неактивной фор-
ме I и в течение разумных времен наблюдения (часы, сутки) не способен само-
произвольно реактивироваться, т. е. перейти в форму N.
120

в присутствии химических денатурантов белки агрегируют.
На возможность такой инактивации оказывает влияние целый
ряд факторов: температура, pH и т. п.; однако решающим
среди них является концентрация белка. Поскольку кинетиче-
ский порядок уравнения, описывающего стадию агрегации, равен
или даже больше двух, то, естественно, увеличение концентрации
белка приводит к увеличению скорости агрегации и размеров
образующихся агрегатов, а также ускорению инактивации в
целом. По этому характерному признаку (сильная зависимость
скорости инактивации от концентрации фермента в растворе)
можно кинетически отличить агрегацию от мономолекулярных
инактивационных механизмов.
Как правило, белковые агрегаты образуются за счет слабых
нековалентных взаимодействий, таких, как гидрофобные взаимо-
действия, водородные связи. Однако если в молекулах белков
имеются SH-группы или дополнительно к ним еще S—S-связи,
то отдельные молекулы внутри агрегатов могут сшиваться ко-
валентными дисульфидными мостиками. Размер и форма некова-
лентных или ковалентно-сшитых агрегатов могут изменяться в
широких пределах вплоть до образования отдельной фазы —
белковых осадков.
Изменение первичной структуры. Все химические процессы,
приводящие к инактивации белков, можно подразделить на две
группы. К первой относятся реакции разрыва полипептидной це-
почки, ко второй — химическая модификация отдельных функ-
циональных групп белка.
Гидролиз пептидных связей, протеолиз и автолиз. Некатали-
тическое расщепление пептидных связей проходит в очень-жест-
ких условиях. Так, полного расщепления полипептидной цепи
на отдельные составляющие аминокислоты добиваются лишь пу-
тем длительного (многочасового) кипячения раствора белка в
концентрированной соляной кислоте. В несколько более «мягких»
условиях, при нагревании белковых растворов при нейтральных
или слабощелочных pH и температуре 80-100°С, гидролиз пеп-
тидных связей либо проходит лишь незначительно, либо его вооб-
ще не наблюдается. Из всех пептидных связей наиболее лабиль-
ными к высокотемпературному гидролизу, как правило, оказыва-
ются те, которые образованы остатками аспарагиновой кислоты.
Однако гидролиз пептидных связей в белках может происхо-
дить и при нормальных условиях — комнатной температуре,
нейтральных значениях pH. Это является результатом работы
протеаз — ферментов, созданных природой для деградации дру-
гих белков в мягких условиях. Поскольку в любых (даже высоко-
очищенных) препаратах белков могут находиться протеазы в ка-
честве сопутствующих примесей, при изучении механизмов инак-
тивации необходимо учитывать и возможность протеолиза.
Другим примером протеолитической инактивации может слу-
жить бактериальное заражение реакторов, содержащих фер-
менты. Случайно попавшие в реактор клетки микроорганизмов
121

секретируют протеазы, которые расщепляют молекулы фермента-
биокатализатора, находящегося в растворе. Используя «осколки»
протеолитической деградации в качестве питательной среды для
роста, микроорганизмы размножаются; тем самым они, с одной
стороны, «засоряют» реактор, с другой — уменьшают активность
биокатализатора в растворе, т. е. инактивируют его.
Сами протеолитические ферменты способны расщеплять не
только молекулы других белков, но и себе подобные. Этот про-
цесс «саморасщепления» протеаз получил название автолиза.
От большинства других инактивационных механизмов (за исклю-
чением агрегации) автолиз можно отличить кинетически. Дело
в том, что существенной стадией при автолизе является обра-
зование комплекса между двумя молекулами протеазы; эта би-
молекулярная стадия часто определяет общую скорость инакти-
вации. Поэтому, если при изменении начальной концентрации
протеазы наблюдается изменение скорости инактивации, то
изучаемый инактивационный процесс с большой вероятностью
представляет собой автолиз.
Окисление функциональных групп фермента. При повышен-
ных температурах некоторые функциональные группы в белках,
и в первую очередь SH-группы цистеина и индольные фрагменты
триптофана, окисляются. В результате окисления образуются
модифицированные производные аминокислот: сульфоксисоеди-
нения цистеина (SOH, SO2H и т. д.), продукты раскрытия ин-
дольного кольца триптофана и др. В некоторых ферментах сульф-
гидрильные группы, входящие в состав активного центра, обла-
дают повышенной реакционной способностью и окисляются даже
при комнатной температуре.
Расщепление S—S связей в белках. Расщепление может про-
исходить либо в восстановительной среде (в присутствии тиолов,
других восстановленных соединений серы, например NazSCb,
NaaSiCh), либо в щелочной среде при повышенной температуре.
В первом случае продуктом восстановления S—S-связи является
ее тиольная форма (белок —SH) либо смешанный дисульфид
тиольной формы белка с восстанавливающим реагентом (белок
—S—S—R; белок —S—SOr и т. п.). При щелочном расщепле-
нии S—S-связей происходит более сложная цепь химических
реакций. Сначала цистин гидролизуется с образованием дегидро-
аланина:
>СН—СН2— S—S—СН2—Сн/ + ОН"
->/>СН—СН2—S—S“ + СН2 = С /
который, как нуклеофил, взаимодействует с аминогруппами
остатков лизина, сульфгидрильными группами остатков цистеина,
гуанидиниевыми группами остатков аргинина, образуя новые
аминокислоты, соответственно, лизиноаланин, лантионин и орни-
тиноаланин:
122

COOK	/СООН
Vhch2nh(ch2)4ch<'
nh2 z	znh2
лизиноаланин
COOK	/СООН
>chch2sch2ch/
NH 2	' лантионин	nh2
COOK	/СООН
J>CHCH2NH(CH2)3CH<
NH2z	zNH2
орнитиноаланин
Для того чтобы в белке произошло расщепление всех S—S-
связей, требуются достаточно жесткие условия. Так, их восста-
новление происходит при очень высоких концентрациях тиолов;
в случае многих белков действие тиолов необходимо сочетать с
одновременным разворачиванием белковой глобулы денатуран-
тами, например концентрированными растворами мочевины или
гуанидин хлорида. Полная щелочная деструкция S—S-связей
в белке происходит только в 0,1 — 1 М растворе щелочи при тем-
пературах, близких к 100°С. Однако в белках, как правило, одна-
две S—S-связи более реакционноспособны, чем остальные, и их
деструкция (как восстановительная, так и щелочная) проходит
с заметными скоростями в существенно менее жестких условиях:
например, при температурах 60—80°С и слабощелочных значе-
ниях pH. Поэтому, работая с ферментами в этих условиях, необ-
ходимо учитывать возможность такого инактивационного меха-
низма, как щелочное расщепление S—S-связей.
Следует также отметить, что иногда в литературе обсужда-
ется механизм внутримолекулярного перераспределения S—S-
связей. Его можно представить следующим образом: под дейст-
вием гидроксид-ионов в белке расщепляются некоторые «натив-
ные» S—S-связи и образуются SH-группы. Они, в свою очередь,
могут атаковать другиеЛЗ—S-связи в молекуле белка, что долж-
но приводить к образованию новых «ненативных» дисульфидных
мостиков. Однако этот гипотетический инактивационный меха-
низм представляется маловероятным и до сих пор не нашел
экспериментальных подтверждений.
Химическая модификация участвующих в катализе SH-групп.
в ферментах (например, входящих в состав активных центров).
Подобная модификация часто приводит к инактивации фермен-
тов. Один из примеров такой модификации — высокотемпера-
турное окисление SH-групп был рассмотрен выше. В качестве
другого примера можно привести «отравление» белков катиона-
ми тяжелых металлов: Hg, Pb, Си и другими, следовые качества
которых всегда присутствуют в воде. Механизм такой инактива-
ции состоит в модификации SH-групп белков, проходящей до
образования соответствующих меркаптидов.
123

Фосфорилирование белков in vivo. Этот процесс играет важ-
ную регуляторную роль и иногда вызывает инактивацию фер-
ментов. Происходящие при этом молекулярные процессы до кон-
ца не ясны. По-видимому, в большинстве случаев потеря фер-
ментом активности вызвана не непосредственно ковалентным вве
дением в белок фосфатных групп (через остатки серина, треонина,
тирозина), а происходящими вслед за этим конформационными
изменениями. С этим механизмом инактивации также приходится
считаться in vitro, поскольку фосфорилазы и фосфатазы (фер-
менты, осуществляющие фосфорилирование) иногда содержатся
в препаратах белков в качестве примесей.
«Самоубийственная» (суицидная) инактивация. Так принято
называть группу механизмов, при которых в ходе каталитиче-
ского акта ферментативной реакции образуется реакционноспо-
собная частица (чаще всего свободнорадикальной природы),
способная химически модифицировать функциональную группу
активного центра и тем самым нарушать активность фермента.
В качестве примера приведем инактивацию простагландинсин-
тетазы свободным радикалом пероксидной природы, образую-
щимся из арахидоновой кислоты под действием самого же фер-
мента. Механизм «самоубийственной» инактивации обнаружен
для ферментов различных классов (гидролаз, оксидоредуктаз).
In vivo, по-видимому, он играет важную регуляторную роль, кон-
тролируя в клетке содержание некоторых «ключевых» ферментов,
обладающих особенно высокой каталитической активностью.
Однако при практическом использовании ферментов для синтеза
или. модификации физиологически важных соединений с такой
инактивацией необходимо бороться.
Радиационная инактивация ферментов (под действием рент-
геновского и у излучения, УФ света и г. п.) является сложным
многостадийным процессом. В нем выделяют фотофизические,
фотохимические стадии (химические реакции под действием
облучения в хромофорах— триптофане, цистеине и др.), а также
темновые химические реакции. Возможность радиационной инак-
тивации необходимо учитывать в тех случаях, когда иммобили-
зация ферментов (например, при образовании гелей) иницииру-
ется у излучением, УФ светом и др.
Рацемизация аминокислот в белках. Этот процесс проходит
в «сверхжестких» условиях — при экстремальных значениях pH
(ниже 2,0 и выше 12,0) и температуре выше 100°С. Поскольку
в настоящее время в таких условиях ферменты не применяют, то
далее этот инактивационный механизм рассматриваться не будет.
Дезаминирование остатков аспарагина. Этот процесс проис-
ходит в белках с заметными скоростями при высоких температу-
рах (порядка 100°С) и слабокислых значениях pH (порядка
4,0—5,0). Такое изменение первичной структуры ферментов так-
же приводит к их инактивации.
Десорбция кофактора из активного центра фермента. Из-
вестен большой класс ферментов, в состав активных центров
124

которых входят атомы металлов, металлосерные кластеры и дру-
гие нековалентно связанные простетические группы (кофакто-
ры). При нагревании, действии некоторых химических реагентов
(например, хелатирующих), равновесном диализе и других про-
цедурах равновесие между связанной с белком и свободной, не-
связанной формами кофакторов может сдвигаться в сторону по-
следней и кофакторы диссоциируют из активных центров фер-
ментов в раствор. Если удаление кофактора из активного центра
не сопровождалось последующими значительными изменениями
конформации белка, то при добавлении избытка кофактора к де-
натурированному ферменту он самопроизвольно реактивируется.
Однако если диссоциация кофактора привела к большим конфор-
мационным изменениям или вслед за ней произошла химиче-
ская модификация существенных для структуры функцио-
нальных групп, то инактивация фермента становится необра-
тимой.
Диссоциация олигомерных белков на субъединицы. При дей-
ствии многих денатурантов (мочевины, детергентов, кислот, на-
гревании и т. п.) на олигомерные белки происходит их диссоциа-
ция на отдельные субъединицы. Процесс этот, в принципе, обра-
тимый. Однако, как правило, вслед за стадией диссоциации
происходят другие процессы: конформационные изменения в от-
дельных субъединицах, диссоциация кофакторов из активных
центров, модификация (например, окисление) тех функциональ-
ных групп, которые в олигомерном белке были экранированы от
контакта с растворителем, агрегация субъединиц. Эти процессы
часто являются необратимыми; в результате и сама диссоциа-
ция приобретает кажущийся необратимый характер. В связи
с этим необходимо отметить, что установление механизмов
инактивации (кинетических и особенно молекулярных) олиго-
мерных белков является одной из наиболее сложных задач в
современной энзимологии.
Сорбция белка на стенках реакционного сосуда. В общем
случае поверхность реакционного сосуда не является абсолютно
инертной по отношению к белку. Так, например, на поверхности
стекла имеются нескомпенсированные заряженные группы и
потенциальные доноры и акцепторы водородных связей. Поэтому
некоторые материалы, из которых изготовляют реакторы (в част-
ности, стекло), способны сорбировать на своей поверхности фер-
менты за счет образования слабых нековалентных взаимодейст-
вий. Это приводит к уменьшению концентрации фермента в
растворе, т. е. к кажущейся инактивации.
Сорбционная способность поверхности ограничена и опреде-
ляется число имеющихся на ней сорбционных центров. Поэтому
при работе с концентрированными растворами белков практи-
чески не чувствуется уменьшение ферментативной активности из
раствора за счет сорбции. Однако «сорбционная инактивация»
становится весьма заметной в разбавленных белковых растворах
(концентрация 10~8—1О-10 моль/л).
125

Если в растворе произошло частичное или полное развора-
чивание белковой молекулы, например, в результате нагревания,
то на ее поверхности появляются новые дополнительные центры
взаимодействия с поверхностью реакционного сосуда. За счет этого
усиливается сорбционная способность белков и, как следствие,
«сорбционная инактивация» начинает чувствоваться в несколько
более концентрированных растворах белка.
Инактивация в потоке. Этот тип инактивации особенно важен
при проведении ферментативных процессов в проточных реакто-
рах. По-видимому, это связано с тем, что в потоке происходит
механическая деформация белковых молекул.
Необратимые конформационные изменения (необратимая де-
натурация). Причиной необратимой инактивации могут быть так-
же необратимо прошедшие в белковой макромолекуле конформа-
ционные изменения, т. е. необратимая денатурация. Механизм
необратимой денатурации состоит в следующем. При денатура-
ционном воздействии, например при повышенной температуре,
в белке разрушаются «правильные» нековалентные взаимодей-
ствия. которые поддерживают нативную структуру, и образуются
«ненативные» нековалентные взаимодействия, термодинамически
выгодные при повышенной температуре. При охлаждении эти
«неправильные» нековалентные взаимодействия сохраняются по
чисто кинетическим причинам, поскольку молекулярная подвиж-
ность существенно уменьшается при понижении температуры.
Иными словами, в результате охлаждения белок оказывается
«замороженным» в метастабильном «необратимо денатурирован-
ном» состоянии и не может самопроизвольно ренатурироваться,
т. е. перейти в нативную конформацию.
§ 3.	Влияние иммобилизации
на инактивацию ферментов
Для иммобилизованных ферментов число возможных инакти-
вационных механизмов существенно меньше, чем в случае раст-
воримых ферментов.
Иммобилизация подавляет такие полимолекулярные инакти-
вационные процессы, как агрегация и автолиз. Дело в том, что
в иммобилизованном состоянии подвижность белков, как прави-
ло, резко ограничена, в то время как существенной стадией
обоих механизмов является перемещение двух (или нескольких)
молекул ферментов друг к другу с их последующим взаимодей-
ствием. По этой же причине для многих форм иммобилизован-
ных белков исключен механизм инактивации путем сорбции на
стенках реакционного сосуда и часто удается существенно за-
тормозить необратимую диссоциацию олигомерных белков на
субъединицы.
Иммобилизация на (или в) носителе, как правило, создает
126

вокруг молекул фермента стерические ограничения, т. е. как бы
экранирует их от внешнего раствора. Это приводит к сущест-
венному ограничению диффузии молекул других, не связанных
с носителем ферментов, в частности протеаз, фосфорилаз, фос-
фатаз. Поэтому для иммобилизованных ферментов практически
сведены на нет такие инактивационные процессы, как протеолиз,
микробное заражение и фосфорилирование.
Иммобилизованные белки стабильнее нативных по отношению
к инактивации в потоке. Причина заключается в том, что носи-
тель механически защищает молекулы ферментов от деформа-
ций в потоке, выполняя роль своеобразного демпфера.
В последние годы активно развиваются методы иммобили-
зации, позволяющие ковалентно пришивать молекулу кофактора
в районе активного центра фермента или совместно иммобилизо-
вать молекулы кофактора и фермента на одном носителе в не-
посредственной близости друг от друга. С помощью таких ме-
тодических приемов становится возможным подавить такой инак-
тивационный механизм, как десорбция кофактора из активного
центра фермента.
Наиболее сложная задача — затормозить химические изме-
нения в белке, приводящие к инактивации. Однако и в этой
области имеются положительные примеры использования иммо-
билизации.
В тех случаях, когда инактивация происходит под действием
пероксида водорода или супероксидных радикалов, хорошо за-
рекомендовал себя следующий прием. Подвергающийся инактива-
ции белок иммобилизуют совместно с каталазой или супероксид-
дисмутазой — ферментами, катализирующими разложение,
соответственно, Н2О2 и О2.
Как уже говорилось, некоторые ферменты инактивируются
вследствие окисления кислородом воздуха высокореакционно-
способных функциональных групп их активного центра и в пер-
вую очередь SH-групп. Такую инактивацию также удается
подавить методами иммобилизации. Для этого фермент иммоби-
лизуют в полиэлектролитной матрице, обладающей способностью
«высаливать» кислород. В результате фермент экранирован
от контакта с инактиватором и стабильность его по отношению
к окислению становится существенно выше, чем у неиммоби-
лизованного,
Кроме того, можно создать условия для конкуренции за
вещество-инактиватор. Например, многие ферменты, имеющие
SH-группы, необходимые для катализа, инактивируются в ре-
зультате их «отравления» катионами тяжелых металлов по ме-
ханизму образования меркаптидов. Иммобилизуя такой фермент
с другим белком с высоким содержанием реакционноспособных
SH-групп или пришивая к матрице носителя низкомолекулярные
тиолы, добиваются того, что основная часть катионов металлов
расходуется не на «отравление» фермента, а на модификацию
SH-групп «несущественного» белка или тиола.
127

§ 4.	Подавление с помощью иммобилизации
первичных обратимых стадий денатурации
и диссоциации нативных белков
Как уже отмечалось, практически любой инактивационный
процесс начинается с обратимой стадии [N^±D на схеме (1)].
Ее молекулярный механизм сводится либо к обратимому конфор-
мационному изменению (обратимая денатурация), либо, в случае
олигомерных белков, к обратимой диссоциации на субъединицы.
В этом случае стабилизация ферментов состоит в том, чтобы
подавить первую стадию.
На основе подобных представлений разработан ряд общих
принципов, следуя которым можно в сотни и тысячи раз замед-
лить необратимую инактивацию большого числа различающихся
по структуре и функции ферментов. В результате стало возмож-
ным проводить целенаправленный поиск конкретных путей стаби-
лизации как мономерных белков, так и ферментов с четвертич-
ной структурой, используемых в биотехнологии.
Наибольшие успехи в стабилизации ферментов связаны с
применением метода иммобилизации. В общем случае можно
указать по крайней мере три причины изменения стабильности
в результате иммобилизации: 1) изменение конформации им-
мобилизованного фермента по сравнению с нативной структурой;
2) изменение микроокружения ферментной молекулы; 3) ужест-
чение нативной конформации белковой глобулы. Первые два
фактора, по-видимому, нельзя положить в основу разработки
общих методов стабилизации ферментов. Дело в том, что вопрос
о связи стабильности белков с изменением их конформации и
микроокружения является малоизученным. Более того, такая
связь (даже если ее удастся установить) индивидуальна для
каждого фермента. Поэтому для целенаправленной стабилиза-
ции ферментов гораздо более перспективным представляется
третий путь — ужестчение (закрепление) нативной конформации
фермента с целью воспрепятствовать ее разворачиванию. Сле-
дует отметить, что этот подход (увеличение жесткости белков)
широко используется природой при создании стабильных белков
термофильных микроорганизмов, живущих при повышенных
температурах (50°С и выше).
Многоточечное нековалентное взаимодействие фермента с
носителем. В принципе белковые молекулы могут связываться
с теми носителями, на поверхности которых имеются заряжен-
ные, гидрофобные, полярные группы, за счет относительно сла-
бых электростатических и гидрофобных взаимодействий, водо-
родных связей. Однако, поскольку эти связи слабые, они прак-
тически не обрузуются в разбавленных растворах полимерных
носителей. Дело в том, что большие потери энтропии, происходя-
щие при образовании комплекса белок — носитель вследствие «за-
мораживания» поступательного и вращательного движения моле-
128

кул белка, не могут быть скомпенсированы за счет энергии
образования слабых нековалентных взаимодействий.
Ситуация существенно изменяется при включении ферментов
в концентрированные полимерные гели. Здесь в силу стерических
препятствий, вносимых частой пространственной сеткой полимера,
поступательное и, возможно, вращательное движение белковых
молекул существенно заторможено. В результате в таких систе-
мах образование комплекса белок — матрица становится термо-
динамически гораздо более выгодным, поскольку здесь уже не
требуется затрат свободной энергии для погашения потерь посту-
пательной и вращательной энтропии ферментной глобулы при ее
сорбции на полимерной матрице. Благодаря этому в концентриро-
ванных полимерных гелях становится возможным многоточечное
взаимодействие (за счет слабых нековалентных сил) фермента
с носителем, поскольку в таких гелях^полимерные цепи со всех
сторон окружают ферментную глобулу. Такое многоточечное
взаимодействие в гелевых системах действительно имеет место;
оно приводит к существенной стабилизации ферментов. Так,
а-химотрипсин, нековалентно включенный в заряженный гель по-
лиметакриловой кислоты, в 105 раз более термостабилен, чем
нативный фермент, если концентрация полимерных цепей в геле
составляет 50%.
Говоря о практическом применении гелевых систем, необхо-
димо отметить один их существенный недостаток. Частички геля
склонны к набуханию в воде, что приводит к снижению концент-
рации полимерных цепей в геле. В результате эффект стабили-
зации включенного в гель фермента может уменьшаться и даже
вовсе исчезать, поскольку, как обсуждалось, для реалиазации
многоточечного нековалентного взаимодействия фермента с носи-
телем необходимо, чтобы гель был достаточно концентрирован-
ным. Поэтому практическую ценность с точки зрения повышен-
ной стабильности препарата биокатализатора в суспензии имеют
только те системы, в которых молекулы фермента включены в
«сильносшитые», ненабухающие в воде гелевые частицы.
Многоточечное ковалентное присоединение фермента к по-
верхности носителя (рис. 24,а). Другой путь ужестчения струк-
туры фермента заключается в его иммобилизации на носителе
с образованием большого числа ковалентных связей. Для реали-
зации многоточечного взаимодействия необходимо, чтобы разме-
ры ферментной глобулы и поры носителя соответствовали друг
другу. Если проводить иммобилизацию белка на произвольно
взятом носителе, то такое соответствие можно получить лишь
случайно, поскольку поверхность носителя и поверхность белка
имеют свои индивидуальные рельефы, в общем случае не комп-
лементарные друг другу.
Этого недостатка лишен сополимеризационный метод иммоби-
лизации, позволяющий создать полимерной носитель, комплемен-
тарный молекуле фермента. Фермент химически модифици-
руют (например, по аминогруппам) аналогом мономера, т. е.
5—133
129

фермент
дисфункциональный реагент
Рис. 24. Схематическое изображение иммоби-
лизационных подходов к стабилизации ферментов
соединением, содержащим ненасыщенные связи (например, хло-
рангидридом акриловой кислоты или акролеином). При после-
дующей сополимеризации с мономером (например, с акрила-
мидом или метакрилатом натрия) белковая глобула формирует
вокруг себя поверхность носителя, комплементарную собствен-
ной, ковалентно к ней присоединяясь. Сополимеризационный ме-
тод дает уникальную возможность получать препараты фермен-
тов, пришитых различным числом ковалентных связей к поверх-
ности носителя, за счет варьирования степени модификации на
стадии обработки фермента аналогом мономера.
Ферменты, иммобилизованные по сополимеризационной мето-
дике, обладают гораздо более высокой устойчивостью против
инактивации при повышенных температурах, чем соответствую-
щие нативные ферменты. Эффект стабилизации, определяемый
как отношение констант скоростей необратимой инактивации
нативного и иммобилизованного препаратов, возрастает с увели-
чением числа связей между ферментом и носителем и достигает
больших величин. Например, для а-химотрипсина, пришитого
к носителю 15 связями, стабилизационный эффект составляет
более 1000 раз. Такие ферментные препараты сохраняют ката-
литическую активность при существенно более высоких темпе-
ратурах. Так, например, оптимум эстеразной активности трип-
сина, ковалентно вшитого в полиакриламидный гель 15 связями,
наблюдается при температуре 75°С, что на 25° выше оптимума
активности нативного фермента. Это указывает на резкое по-
давление быстрых обратимых денатурационных процессов в
иммобилизованном препарате.
Следует отметить, что эффект стабилизации для иммобили-
зованного по сополимеризационной методике фермента зависит
только от числа ковалентных связей с носителем, но не зависит
ни от плотности гелевого носителя (т. е. от концентрации поли-
мера в геле), ни от степени его набухания. Более того, проводя
сополимеризационную иммобилизацию в отсутствие бифункцио-
нального сшивающего агента, удается получить водорастворимые
130

ферментные препараты, также обладающие повышенной термо-
стабильностью.
Внутримолекулярное сшивание фермента бифункциональными
реагентами (рис. 24,6). Модификация фермента бифункциональ-
ными агентами в принципе может привести к наложению на
белковую глобулу внутримолекулярных ковалентных сшивок.
Следует ожидать, что сшивание увеличит конформационную
жесткость белка и, следовательно, его стабильность. Этот подход
(внутримолекулярное сшивание белка) активно используется в
природе для увеличения стабильности белковых структур. К чис-
лу «природных сшивок» относятся как ковалентные S—S-связи,
так и нековалентные «солевые мостики», ионы Са2+ и других
металлов, связанные с молекулой белка, и т. п.
Успех или неудача при попытке повысить стабильность фер-
мента обработкой бифункциональными реагентами в основном
определяется соответствием длины реагента расстоянию между
возможными центрами пришивки на белковой глобуле. Очевидно,
что для каждого конкретного белка существует оптимальный
размер сшивающих агентов. Единственно надежный путь опре-
деления размера подходящего реагента — эмпирический поиск.
Для этого изучаемый фермент модифицируют соединениями
гомологического ряда бифункциональных реагентов, например
алифатических диаминов или имидоэфиров алифатических ди-
карбоновых кислот, в условиях, когда не происходит межмоле-
кулярного сшивания белковых молекул. Далее изучают зависи-
мость стабилизационного эффекта от длины бифункционального
реагента. Обычно такие зависимости имеют вид кривой с мак-
симумом. Дело в том, что при модификации бифункциональным
реагентом наряду с образованием «сшивок» происходит одното-
чечная модификация функциональных групп белка. Соотношение
этих двух процессов тем сильнее сдвинуто в сторону реакции
сшивания, чем больше на поверхности белковой глобулы пар
функциональных групп, расстояние между которыми примерно
равно длине сшивающего агента. Именно в этом случае наблю-
даются максимальные стабилизационные эффекты.
Следует отметить, что эмпирический характер поиска опти-
мального сшивающего агента несколько снижает ценность мето-
да внутримолекулярного сшивания белков для практических
целей. Действительно, для каждого вновь взятого белка или при
использовании нового гомологического ряда бифункциональных
реагентов работу по подбору наилучшего сшивающего агента
надо проводить заново.
Тем не менее метод сшивок весьма полезен, поскольку позво-
ляет получать водорастворимые стабилизированные производные
ферментов с относительно низкой молекулярной массой (срав-
нимой с молекулярной массой самого фермента). Такие препа-
раты предпочтительны в некоторых прикладных областях, в
частности в медицине.
Механическое включение ферментов в «тесные» поры носите-
5*
131

ля (рис. 24,в). Разворачиванию белковой глобулы можно также
воспрепятствовать, если поместить молекулу фермента в ячейку
носителя, не взаимодействующую с ней ни химически, ни сорб-
ционно, но столь «тесную», чтобы развернутая конформация не
могла образоваться по стерическим причинам. В этом случае
нативная конформация белка могла бы поддерживаться чисто
механическим путем.
Стабилизацию фермента в «тесных» ячейках методически
проще всего осуществить включением белков в полимерные
гели, например при проведении процесса полимеризации моно-
меров в присутствии фермента. Известно (см. гл. 1), что попе-
речно сшитые полимерные гели (полиакриламидный, полисаха-
ридные и др.) имеют пористую структуру. В геле, как правило,
наблюдается относительно узкое распределение пор по размерам;
размер пор задается концентрацией полимерных цепей. Он тем
меньше, чем выше концентрация полимера в геле. Поэтому,
включая фермент в гели различной концентрации, можно реа-
лизовать ситуацию, когда белковая глобула окажется «зажа-
той» полимерными цепями носителя и благодаря этому «кле-
точному эффекту» не сможет развернуться. В таких случаях
достигаются существенные стабилизационные эффекты: вклю-
ченные в гель ферменты в тысячи раз стабильнее своих на-
тивных (неиммобилизованных) предшественников, причем ста-
билизация проявляется тем сильнее, чем выше концентрация
полимера.
Практическое применение гелевых препаратов тормозится,
однако, тем, что в водных растворах гидрофильные гели сильно
набухают. При этом значительно уменьшается концентрация по-
лимера в гелевой фазе и, следовательно, нарушается соответ-
ствие размеров пор геля и белковой глобулы. Один из способов
устранения этого нежелательного эффекта заключается в том,
что при получении гелей увеличивают концентрацию сшиваю-
щего агента; за счет этого макроструктура образовавшихся
гелей получается более жесткой и они набухают в гораздо
меньшей степени.	' •
§ 5.	Пути стабилизации ферментов,
не основанные на методе иммобилизации
Стабильные препараты иммобилизованных ферментов можно
получать не только методами иммобилизации, но и другими
путями. Иммобилизации подвергают ферменты, которые сами по
себе обладают высокой стабильностью. Это прежде всего вы-
сокостабильные биокатализаторы, встречающиеся в природе.
Для этого проводят поиск ферментов, обладающих высокой
термостабильностью, как в мезофильных организмах, живущих
при обычных температурах, так и в термофильных микроорга-
низмах, которые самой природой приспособлены для существо-
вания в высокотемпературном режиме. Кроме того, стабильные
132

ферментные препараты можно создавать искусственным путем,
например методами химической модификации и белковой инже-
нерии.
Химическая модификация белков. Со времени появления пер-
вых сообщений об изменении стабильности ферментов в резуль-
тате модификации их функциональных групп химическими реа-
гентами (середина 50-х годов) предпринимались неоднократные
попытки стабилизировать ферменты методом химической моди-
фикации. Анализируя эти попытки, удается выделить следующие
основные молекулярные причины повышения стабильности бел-
ков при их ковалентной модификации:
1)	в результате химической модификации белок может перей-
ти в отличную от нативной, например, более стабильную кон-
формацию;
2)	при химической модификации в белок зачастую вводятся
новые функциональные группы, способные завязать дополни-
тельные стабилизирующие белок водородные связи или солевые
мостики;
3)	химическая модификация неполярными соединениями
иногда усиливает в белках гидрофобные взаимодействия;
4)	в результате модификации гидрофильными соединениями
поверхностных гидрофобных областей в белке уменьшается пло-
щадь неблагоприятного контакта внешних неполярных остат-
ков с водой, что должно стабилизовать белок.
Белковая инженерия. В начале 80-х годов в генетической
инженерии был разработан метод, позволяющий получать из-
мененные белки, отличающиеся от белков-прототипов заменой
всего лишь одного аминокислотного остатка в строго заданном
положении. Для биотехнологии этот метод, названный сайт-
специфическим мутагенезом, или белковой инженерией, интере-
сен тем, что позволяет целенаправленно изменять структуру
ферментов, а значит, их каталитические свойства и стабиль-
ность.
Рассмотрим вкратце суть метода. Для белка с установлен-
ной первичной и третичной структурой (известно более сотни
таких белков) выбирают так называемый сайт (или центр)
мутации, т. е. тот аминокислотный остаток, который подлежит
замене. Поскольку in vivo мутация всегда осуществляется при
биосинтезе путем замены отдельных нуклеотидов в гене, то не-
обходимо перейти с языка структуры белка (аминокислотной
последовательности) на язык генетического кода. Для этого, во-
первых, ищут (или создают искусственным путем) кольцевую
генетическую структуру — плазмиду, в состав которой входит
ген, кодирующий нужный белок. Во-вторых, химическим путем
синтезируют олигодезоксирибонуклеотид длиной 12—18 основа-
ний. Его химический состав должен быть таков, чтобы соот-
ветствовать небольшому участку первичной структуры выбран-
ного белка (длиной 4—6 аминокислотных остатков), включаю-
щего сайт мутации. Однако в процессе химического синтеза
133

вместо нуклеотидного триплета, кодйрующего «нативную ами-
нокислоту», в состав нуклеотидной последовательности вводят
другой триплет, который кодирует новый аминокислотный ос-
таток. На основе однонитевой плазмиды и синтезированного
олигонуклеотида ферментативным путем создают гетеродуп-
лексную двунитевую плазмиду, в состав которой входит «му-
тантный ген», несущий информацию о структуре белка с за-
меной аминокислотного остатка в определенном положении.
Далее путем генетико-инженерных манипуляций и клонирования
гена получают клетки-трансформаторы, которые осуществляют
биосинтез мутантного запрограммированного исследователем
белка.
Использование метода белковой инженерии уже дало пер-
вые успехи в стабилизации ферментов. Оценивая перспективы
метода, следует помнить, что он является и в течение некоторого
времени будет оставаться довольно дорогостоящим. Поэтому
наиболее эффективным будет его использование в случае тех
ферментов, которые, во-первых, сами достаточно дорого стоят,
и, во-вторых, инактивация которых связана с химической мо-
дификацией какой-то «ключевой» группы, существенной для
инактивации белка (например, окислением SH-группы вблизи
активного центра или дезамидированием остатков аспара-
гина) .

Глава
Б РЕГЕНЕРАЦИЯ
КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМ
С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ
ФЕРМЕНТАМИ

Системы с иммобилизованными ферментами имеют относи-
тельно высокую стоимость, поэтому крайне желательно добиться
многократного их использования. Иными словами, возникает
проблема регенерации систем с иммобилизованными фермен-
тами или, по крайней мере, их отдельных, наиболее дорого-
стоящих компонентов. К основным компонентам таких систем
относятся носители, ферменты и кофакторы. Как правило, не
возникает необходимости регенерировать носитель, так как ис-
пользуемые в промышленности носители либо дешевы, либо ста-
бильны. В то же время достаточно остро стоит вопрос реге-
нерации ферментов и кофакторов.
§ 1. Реактивация инактивированных ферментов
С точки зрения эффективности применения биокатализаторов
было бы крайне заманчиво не только повысить стабильность
ферментов, но и научиться возвращать активность отработан-
ным в ходе технологического процесса ферментативным препа-
ратам.
Практически одновременно с обнаружением феномена инак-
тивации ферментов (начало XX в.) исследователи стали пред-
принимать попытки их реактивации. К настоящему времени
накоплено довольно много положительных примеров в этом
направлении. Их удобно классифицировать согласно причинам,
вызывающим инактивацию.
Реактивация агрегированных белков. Ее часто удается осу-
ществить, разрушив межмолекулярные нековалентные контакты
(гидрофобные, электростатические, водородные связи). Для
этого используют те же денатуранты, которые разрушают не-
ковалентные взаимодействия в нативных белках, вызывая их
обратимую денатурацию: концентрированные растворы моче-
вины и гуанидинхлорида, экстремальные значения pH и т. п.
135

Если образование агрегатов сопровождалось ковалентным
сшиванием отдельных глобул между собой S—S-связями, то
эти связи необходимо разрушить. Это достигается при действии
относительно невысоких концентраций (порядка мкмоль/л) тиол-
содержащих реагентов: цистеина или дитиотреитола; в этих усло-
виях, как правило, не затрагиваются внутримолекулярные
S—S-связи в белке. Если при образовании ковалентных агрега-
тов большую роль сыграли и нековалентные взаимодействия, то
действие тиолов дополняется высокими концентрациями денату-
рантов типа мочевины.
Реактивация белков с измененной первичной структурой.
Если белок потерял активность в результате химической мо-
дификации функциональных групп, то можно попытаться реак-
тивировать его с помощью обратной химической реакции. Фер-
менты, инактивированные путем модификации SH-групп (на-
пример, их окислением), иногда удается реактивировать, добав-
ляя избыток низкомолекулярного тиола или другого восстано-
вителя.
Если под действием тиола в белке были разрушены S—S-
связи, что привело к его инактивации, а образовавшиеся
SH-группы провзаимодействовали с получением смешанных с
тиолом дисульфидов, то такие ферменты иногда можно реак-
тивировать, добавляя другие тиолы или ионы металлов. Меха-
низм реактивации заключается в расщеплении смешанного
дисульфида и последующем образовании «правильной» S—S-
связи.
В литературе пока практически отсутствуют примеры удач-
ной реактивации белков, инактивация которых явилась след-
ствием таких химических процессов, как гидролиз пептидных
связей, фосфорилирование, дезамидирование остатков аспара-
гина.
Десорбция инактивированного белка со стенок реакционного
сосуда. Как уже отмечалось, «сорбционная инактивация» бел-
ков обусловлена слабыми нековалентными взаимодействиями
(электрическими, гидрофобными, водородными связями) между
белком и поверхностью реакционной ячейки. Реактивация в
этом случае достигается за счет разрушения неспецифических
взаимодействий при экстремальных значениях pH, под дей-
ствием концентрированных растворов мочевины или гуанидин-
хлорида и других реагентов, являющихся «обратимыми денату-
рантами» для большинства белков.
Реактивация «необратимо денатурированных» ферментов.
Реактивацию удается провести, руководствуясь следующей двух-
стадийной схемой (рис. 25): сначала в инактивированном бел-
ке следует разрушить все, в том числе ненативные нековалент-
ные взаимодействия, т. е. перевести белок в развернутое состоя-
ние и уже из этого состояния попытаться свернуть его в на-
тивную конформацию. Таким образом, в общем случае задача о
реактивации какого-либо «необратимо денатурированного» фер-
136

НЕОБРАТИМО ТЕРМО-
ДЕНАТУРИРОВАННЫЙ
ФЕРМЕНТ
Рис. 25. Схематическое изображение цикла: термоинактивация —
реактивация фермента; а — разворачивание термоинактивирован-
ного фермента с одновременным расщеплением S—S-связей; б —
последующее сворачивание фермента в каталитически активную кон-
формацию, сопровождающееся реокислением S—S-связей
мента, по существу, сводится к решению двух задач. Во-пер-
вых, поиску условий, при которых инактивированный белок
удается развернуть. Для разворачивания инактивированных
белков обычно используют те же реагенты, с помощью которых
нативные (неинактивированные) белки можно перевести в со-
стояние статистического клубка. Это концентрированные раство-
ры обратимых денатурантов (мочевины или гуанидинхлорида);
если в белке имеются S—S-связи, то действие денатурантов
усиливают добавлением тиолов — реагентов, расщепляющих
S—S-связи. Во-вторых, экспериментальному подбору условий, в
которых развернутый белок успешно сворачивается в нативную
(каталитически активную) конформацию. Для этой цели часто
полезными оказываются эффекторы ферментативной активно-
сти (субстраты, ингибиторы, кофакторы и т. п.), которые од-
новременно являются и эффекторами сворачивания, т. е. повы-
шают выход реактивации фермента.
К настоящему времени, основываясь на описанной двух-
стадийной процедуре, удалось реактивировать около десятка
различных ферментов. По-видимому, число примеров удачной
реактивации «необратимо денатурированных» ферментов будет
увеличиваться по мере накопления знаний об особенностях
процессов денатурации и ренатурации (разворачивания и сво-
рачивания) белков.
Возможность реактивации ферментов, инактивированных по
другим, более сложным механизмам. В гл. 5 было отмечено,
что такие процессы в белках, как диссоциация кофактора из
137

активного центра фермента, диссоциация олигомерного белка
на субъединицы, в принципе ..являются обратимыми. Иными
словами, эти процессы сами по себе не приводят к необра-
тимому характеру инактивации, а лишь «запускают» другие,
истинно необратимые процессы: агрегацию, ковалентные изме-
нения в структуре белка, «необратимые» конформационные из-
менения. Таким образом, вопрос о реактивации в таких более
сложных случаях, по существу, сводится к одной из трех выше-
перечисленных ситуаций: реактивации агрегированных белков,
реактивации белков с измененной первичной структурой и ре-
активации «необратимо денатурированных» ферментов или к
различным комбинациям этих трех случаев.
§ 2. Регенерация кофакторов [коферментов)
К категории кофакторов относятся коферменты, простети-
ческие группы и ионы металлов. С технологической точки зре-
ния наибольший интерес представляет регенерация кофермен-
тов. Коферменты — это низкомолекулярные органические соеди-
нения, которые играют роль дополнительного субстрата в функ-
ционировании многих ферментов. Примеры наиболее распро-
страненных коферментов приведены ниже.
Формула
Название
О к и с л и т о л ь н о-в осстановительные системы
Неокислительн о-в осстановительные системы

Кофермент Е
(витамин В и)
Аскорбиновая
кислота
Ферредоксин
(фрагмент молекулы)
Тиаминпирофосфат
(витамин Bi)
Пиридоксальфосфат
(витамин В6)
139

140

Глутатион
О=С—ОН	О
I	II
H2N—СН—СН2—СН2—С—NH—СН—С—Nil—СН2—С—ОН
II I	II
О	СН2—SH	о
Витамины А, Д, Е, К,
например витамин А
При использовании систем иммобилизованных ферментов с
коферментами приходится решать две задачи: собственно ре-
генерацию кофермента и его удержание в реакционной систе-
ме. Последнее обычно осуществляется путем ковалентной иммо-
билизации коферментов на полимерных носителях. Для регене-
рации разработано несколько подходов, суть которых отражает-
ся следующей схемой:
субстрат
кофактор -
продукт
фермент
система регенерации
(кофактор)
Согласно этой схеме кофермент, изменяющийся в реакции с
участием одного из ферментов, благодаря системе сопряжен-
ных реакций регенерирует, т. е. принимает свое первоначальное
состояние. В зависимости от типа сопряженной реакции все
способы регенерации коферментов можно разделить на две
группы: ферментативные и неферментативные. К ферментатив-
ным относятся способы регенерации с использованием сопря-
женных субстратов или сопряженных ферментов. Нефермента-
тивные пути можно подразделить на химические и электро-
химические. В качестве примера подробно остановимся на
пиридиндинуклеотидных коферментах НАД(Н) и НАДФ(Н),
способы регенерации которых разработаны наиболее полно.
Ферментативные способы регенерации НАД(Н) и НАДФ(Н).
Использование сопряженных субстратов.
Регенерация коферментов может быть проведена, если в
систему ввести избыточное количество сопряженного субстрата
того же фермента, катализирующего реакцию в обратном на-
правлении. Схематически принцип метода выглядит следующим
образом:
основной субстрат
кофактор
(окисленный или
восстановленный)
побочный продукт
основной продукт
кофактор
(восстановленный
или окисленный)
сопряженный субстрат
141

Системы регенерации НАД на основе алкогольдегидроге-
назы из печени лошади впервые были предложены Дж. Ван Ей-
сом. Один из применяемых процессов — это процесс восстанов-
ления лактальдегида в пропан-1,2-диол:
Н+ + СН3СН(ОН)СНО + НАДН СН3СН(ОН)СНгОН + НАД+
В присутствии сопряженного субстрата, этанола, число циклов
НАД может достигать 800.
Разработаны также методы регенерации, основанные на дру-
гих парах сопряженных субстратов, в частности циклогекса-
нол и п-нитрозо-М.М'-диметиланилин. Преимущество использо-
вания этой пары заключается в возможности непрерывного
слежения за реакцией восстановления /г-нитрозо-М,М'-диметил-
анилина.
Недостатки использования сопряженных субстратов в процес-
сах регенерации НАД связаны с тем, что, во-первых, равновесие
реакции альдегид «=> спирт сильно сдвинуто в сторону спирта
(что требует высоких концентраций сопряженного субстрата)
и, во-вторых, выделение основного продукта из смеси затрудне-
но. Применение известных методов иммобилизации ферментов
и коферментов будет способствовать преодолению возникшей
проблемы.
Использование сопряженных ферментативных реакций. Суть
этого способа регенерации заключается в том, что в реакцию,
катализируемую ферментом А, дополнительно вводится фер-
мент Б, в функционировании которого участвует сопряженная
форма кофермента:
основной субстрат
кофактор
(восстановленный
или окисленный)
побочный продукт
основной продукт
кофактор
(окисленный или
восстановленный)
вспомогательный субстрат
Существенным для данного способа регенерации кофермента
является различие в специфичности используемых ферментов
для исключения возможной конкуренции основных и побочных
субстратов и продуктов.
В числе удачных систем регенерации НАД могут быть назва-
ны системы лактатдегидрогеназа — глутаматдегидрогеназа и
лактатдегидрогеназа — алкогольдегидрогеназа. Так, включение
последней системы позволяет провести десятки тысяч циклов
регенерации НАД.
В последние годы системы сопряженных ферментативных
реакций находят все большее применение в тонком органи-
ческом синтезе. В качестве примера назовем реакцию окисле-
ния стероидов в присутствии 17-р-оксистероиддегидрогеназы.
142

Для регенерации окисленной формы НАД используется ката-
лизируемое лактатдегидрогеназой восстановление пирувата.
Для придания большей технологичности промышленным про-
цессам разрабатываются процессы регенерации, основанные на
применении иммобилизованных ферментов и (или) коферментов.
Так, процесс регенерации НАД был осуществлен при использо-
вании иммобилизованных в полупроницаемых микрокапсулах
алкогольдегидрогеназы и малатдегидрогеназы. Наряду с им-
мобилизованными ферментами употребляется и иммобилизован-
ный НАД, например, связанный с растворимыми производными
декстрана.
Для того чтобы система регенерации коферментов была эко-
номически выгодной, необходимо понизить стоимость вспомога-
тельного субстрата. Это было сделано с применением процес-
са на основе формиатдегидрогеназы и НАДН-дегидрогеназы
(А. М. Егоров, А. П. Осипов, 1978).
формиатдегндрогеяаза
НСОСГ --------------------------•- со2
НАД НАДЯ
НА ДН-дегидроген аза
дихлорфенолиндофенол	:------— дихлорфенолиндофенол
(восстановленный)	(окисленный)
Неферментативные способы регенераци НАД(Н) и
НАДФ(Н). К неферментативным методам регенерации кофак-
торов относятся химические и электрохимические способы.
Ввиду своей низкой специфичности они меньше распространены,
чем ферментативные.
Химические методы. В качестве химических реагентов для
регенерации НАДН находят применение дитионит натрия и
некоторые соли пиридиния. Преимущество проведения регенера-
ции в присутствии этих веществ заключается в их относи-
тельно невысокой стоимости. Однако следует отметить, что и
дитионит натрия, и пиридиниевые соли могут являться ингиби-
торами ряда ферментов.
В последнее время в качестве реагента для химической
регенерации НАД применяется сравнительно дешевый флавин-
мононуклеотид (ФМН). Использование этого вещества обуслов-
лено тем, что флавиновые коферменты участвуют в процессах
регенерации НАД in vivo. Иммобилизация ФМН на полиэти-
ленимине приводит к существенному увеличению скорости окис-
ления НАДН.
Удобным оказалось применять для регенерации пиридинди-
нуклеотидных коферментов различные красители, которые дают
возможность определять малые количества коферментов. Среди
красителей наиболее употребимы метиленовый голубой, тиазолил
143

голубой, акрифлавин, феназинметосульфат. Так, при использова-
нии последнего достигается до 10 000 циклов восстановления
кофермента.
Электрохимические методы регенерации коферментов только
начинают развиваться. При проведении прямого электрохими-
ческого восстановления или окисления кофермента могут возни-
кать трудности, связанные с появлением ферментативно неак-
тивных форм в результате,. например, его димеризации, Для
преодоления этих трудностей проводят электрохимическое вос-
становление иммобилизованного НАД. В качестве носителя ис-
пользуют водорастворимую альгиновую кислоту.
Регенерация АТФ. АТФ— один из важных коферментов,
участвующих в ферментативных процессах образования новых
химических связей. Для регенерации АТФ применяют следую-
щие методы: 1 — прямой химический синтез из АМФ или АДФ и
фосфорной кислоты; 2 — получение АТФ in vivo с использова-
нием дрожжей, бактерий, клеточных органелл; 3 — фермента-
тивный синтез in vitro.
Химический синтез АТФ. Осуществляется путем фосфорили-
рования аденозина или АМФ. В качестве фосфорилирующих
агентов употребляются фосфорилхлорид, фосфорная кислота
и др. Реакция протекает в органическом растворителе. Хими-
ческий метод регенерации АТФ не очень удобен из-за обра-
зования побочных продуктов, необходимости применения боль-
шого избытка фосфорилирующего агента, а также из-за необ-
ходимости дальнейшей очистки АТФ.
Регенерация АТФ с использованием, целых клеток и орга-
нелл. Многие клетки и клеточные органеллы содержат фер-
менты, катализирующие синтез АТФ из аденозина, АМФ и
неорганического фосфата. Так, для регенерации АТФ использу-
ются дрожжи, а также субклеточные органеллы, такие, как
митохондрии, хлоропласты и хроматофоры. В последние годы
для регенерации АТФ начали применять иммобилизованные
клетки.
Процесс регенерацит АТФ, происходящий с участием мито-
хондрий, может быть в сумме представлен следующим образом:
2НАДН + 2Н+ + 6АДФ + 6Р, + О2 -> 2НАД+ + 8Н2О + 6АТФ
2 пируват + ЗОАДФ + ЗОР, + 5О2 -> 6СО2 + 34Н2О + ЗОАТФ
К недостаткам этого процесса относятся: 1 — низкая стабиль-
ность систем; 2 — необходимость создания дополнительной си-
стемы регенерации НАД, участвующего в первой реакции.
Значительно более перспективным в регенерации АТФ яв-
ляется использование хроматофоров, способных осуществлять
реакцию циклического фосфорилирования. Преимуществом хро-
матофоров по сравнению с митохондриями и хлоропластами
144

является их высокая механическая и химическая стойкость,
которая может быть еще увеличена путем иммобилизации хро-
матофоров в полиакриламидном геле.
Методы ферментативной регенерации АТФ in vitro. Они полу-
чили наибольшее развитие. Среди более чем 100 ферментов,
катализирующих перенос фосфатсодержащих групп, наиболее
часто применяют полифосфаткиназы (реакция 1) и фосфотранс-
феразы (киназы) (реакция 2):
АДФ + (PO3-)„ АТФ + (РОГ)п- 	(1)
АДФ + ВР^АТФ + В	(2)
где ВР — ацилфосфат, фосфоенолпируват, Т-фосфоаргинин
и т. д.
В качестве доноров фосфатной группы ВР в реакции (2)
могут принимать участие такие соединения, как ацетилфосфат,
L-фосфоаргинин, 4 фосфо-Т-аспартат, карбамилфосфат, креатин-
фосфат, 1,3-дифосфо-£)-глицерат, фосфоенолпируват, фосфор-
амидат.
При использовании систем регенерации АТФ с участием
фосфотрансфераз удается осуществить практически полную
регенерацию этого кофермента (с выходом более 95%).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Идеи иммобилизации биокатализаторов инициировали и
стимулировали бурное развитие одного из важнейших направ-
лений современной биотехнологии — инженерной энзимологии.
Текущая (тактическая) задача инженерной энзимологии — это
разработка (конструирование) биоорганических катализаторов с
заданными свойствами на основе ферментов (в том числе с
использованием полиферментных комплексов и даже целых кле-
ток). Говоря о «заданных» свойствах, следует понимать, что
они продиктованы потребностями практики; это, например, не-
обходимое время службы катализатора при определенных усло-
виях реакции (что зависит от его термостабильности, чувстви-
тельности к тем или иным факторам среды), избирательность
(специфичность) действия, производительность (каталитическая
активность), иммуногенность, токсичность, геометрическая фор-
ма препарата катализатора, его механические свойства и т. д.
Однако рамки инженерной энзимологии гораздо шире, чем
создание катализаторов нового типа. Цель этой дисциплины,
ее стратегическая задача состоит в том, чтобы разработать
научные основы применения ферментативных катализаторов для
создания новых биотехнологических процессов в промышлен-
ности, новых методов в терапии и медицинской диагностике,
анализе, органическом синтезе и в других областях практиче-
ской деятельности.
В качестве примера, наглядно иллюстрирующего разработку
новых подходов к решению практических задач инженерной
энзимологии с привлечением методов иммобилизации, может
служить проблема применения биокатализаторов для проведения
реакций органического синтеза в среде органических растворите-
лей с низким содержанием воды. Дело в том, что широкое приме-
нение ферментов в органическом синтезе существенно ограничи-
вается тем, что ферменты, как принято считать, способны
эффективно функционировать лишь в среде с высоким содержа-
нием воды. В то же время в классическом органическом синтезе
в качестве реакционной среды нашли применение самые разнооб-
разные органические растворители. Имеется несколько карди-
нальных причин, которые делают необходимым использование
органических растворителей как среды также и для фермента-
146

тивных реакций. Во-первых, при использовании органических
растворителей решается проблема растворения гидрофобных
реагентов, которая часто представляет трудно преодолимый
барьер при проведении реакции в воде. Во-вторых, благодаря
использованию органических растворителей термодинамическое
равновесие многих ферментативных реакций сдвигается в сторо-
ну требуемых продуктов. Прежде всего это относится к тем реак-
циям, одним из продуктов которых является вода, в частности,
к реакциям синтеза сложноэфирных, пептидных и амидных свя-
зей. В-третьих, применение органических растворителей снимает
проблему бактериального заражения технологических установок,
которая весьма остро стоит при использовании водных раство-
ров.
Благодаря этим очевидным преимуществам в последние годы
обозначился резко возросший интерес к проблемам биокатализа
в неводных средах. Были предложены многочисленные и разно-
образные подходы, направленные на конструирование биоката-
литических систем, способных функционировать с исключительно
малым содержанием воды. С точки зрения круга проблем, обсуж-
дающихся в данном пособии, важным является то, что эти
подходы в подавляющем большинстве, случаев основаны в той
или иной степени на различных способах иммобилизации (физи-
ческой или химической) биологических катализаторов.
Методические аспекты инженерной энзимологии во многом
определены иммобилизационными подходами. В этой книге были
рассмотрены лишь основные принципы получения иммобилизо?
ванных ферментов и влияние иммобилизации на свойства полу-
чаемых препаратов. Поэтому главная цель пособия будет до-
стигнута, если у читателя пробудится интерес к этому разделу
биотехнологии и появится желание дальнейшего изучения затро-
нутых вопросов.
В заключение отметим, что в целом иммобилизация (как
инструмент биотехнологии) сама по себе является достаточно
развитой в методическом отношении, в будущем здесь следует
ожидать лишь детализации отдельных приемов, а наибольший
интерес и перспективы связаны с ее практическим использо-
ванием. И в этой связи хотелось обратить внимание, что идеи
иммобилизации и ее методология приложимы не только к фер-
ментам, но и многим другим соединениям, как высоко-, так и
низкомолекулярным (гормонам, витаминам, лекарственным ве-
ществам и т. п.).

ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИМЕРЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДИК
1.	Иммобилизация трипсина на целлюлозе. 10 мл 6%-ного
раствора перйодата натрия смешивают с 0,5 г целлюлозы. Пере-
мешивают смесь в течение 3 ч, затем осадок отделяют и промы-
вают водой. Промытый осадок помещают в 10 мл 0,1 М трисового
буфера, pH 8,0, содержащего 10 мМ СаСЕ для уменьшения авто-
лиза, и добавляют фермент. Количество добавляемого трипсина
зависит от его удельной активности и, как правило, это 100 мг.
Смесь инкубируют при перемешивании в течение 1—3 ч. Точное
время инкубации устанавливают экспериментально, определяя
удельную активность нативного трипсина и активность в супер-
натанте для расчета количества фермента, связавшегося с но-
сителем. Пробы для измерения активности супернатанта следует
отбирать в процессе иммобилизации через каждые 20—30 мин.
Полученный препарат иммобилизованного фермента отделяют
фильтрованием, промывают буферным раствором и насыщенным
раствором мочевины для удаления не связавшегося с носителем
фермента. Высушенный на фильтре препарат иммобилизованного
трипсина может храниться в течение нескольких месяцев при
4°С практически без потери активности.
2.	Определение ферментативной активности иммобилизован-
ного трипсина. Определение проводят, измеряя скорость фермен-
тативного гидролиза этилового эфира N-бензоил-Ь-аргинина,
потенциометрически на pH-стате. Для этого из инкубационной
смеси отбирают пробы по 0,5—1,0 мл и помещают в ячейку
pH-стата, содержащую 10~3М субстрата (pH около 7), 0,1 М
КС1 и 10 мМ СаСЕ. Измеряют активность отобранных проб,
учитывая фоновую реакцию гидролиза субстрата в отсутствие
фермента.
3.	Ковалентная иммобилизация а-химотрипсина в полиакрил-
амидном геле. Процедура иммобилизации включает две стадии:
модификацию хлорангидридом акриловой кислоты и включение
в гель.
а)	К раствору 5—20 мг химотрипсина в 10 мл 0,2 М фосфат-
ного буфера, pH 8,0, при 0°С добавляют 10—100 мкл хлорангид-
рида акриловой кислоты порциями по 10 мкл при интенсивном
148

перемешивании. После добавления каждой новой порции хлор-
ангидрида акриловой кислоты инкубируют раствор в течение
5 мин, доводят pH до 8,0, добавляя концентрированный раствор
К.ОН; затем вносят новую порцию модификатора. После завер-
шения модификации раствор инкубируют при 0°С без перемеши-
вания в течение 30 мин.
б)	К раствору модифицированного фермента (10 мл) после-
довательно добавляют 3,33 г акриламида, 0,2 г М,М'-метилен-
бис-акриламида и 0,1 мл 10%-ного водного раствора N,N,N',N'-
тетраметилэтилендиамина, доводят pH до -8,0 концентрированной
НС1 и далее добавляют 20 мг персульфата аммония в виде
20%-ного раствора. Раствор быстро (в течение нескольких се-
кунд) перемешивают, разливают в тонкостенные стеклянные
пробирки диаметром 5 мм и инкубируют в течение суток при 4°С.
Полученный гель извлекают из пробирок, измельчают, растирая
в ступке, и инкубируют в течение суток в 0,1 М трисовом буфере,
pH 8,0, при 20°С. Суспензию переносят на стеклянный фильтр
G-2 (пор-100), промывают несколькими объемами дистиллиро-
ванной воды, высушивают гель на фильтре в течение нескольких
минут. Удельная активность иммобилизованного а-химотрипсина
составляет 0,1—0,3 мг фермента на ’ г геля.
4.	Определение активности иммобилизованного «-химотрипси-
на. Определение проводят потенциометрически, измеряя скорость
ферментативного гидролиза специфического субстрата этилового
эфира N-ацетил-Е-тирозина на pH-стате. Для этого навеску
иммобилизованного фермента (0,05—1,0 г) помешают в ячейку
pH-стата с 5—10 мл 5 мМ раствора субстрата в 0,1 М КС!
(pH 8,0) и измеряют активность препарата фермента, учитывая
фоновую реакцию гидролиза субстрата в отсутствие фермента.
5.	Реактивация термоинактивированного иммобилизованного
трипсина. Препарат иммобилизованного трипсина (0,2—1 г)
после термоинактивации (остаточная активность 5—15% от
уровня активности препарата фермента до термоинактивации)
вносят в 4 мл раствора 10 М мочевины (pH 3) и инкубируют в
течение 30 мин. Затем доводят pH до 8,5 концентрированным
раствором КОН и в суспензию добавляют 1 мл 0,1 М раствора
трисового буфера (pH 8,5), содержащего 10 мг дитиотреитола —
реагента, расщепляющего S—S-связи в белках. Суспензию ин-
кубируют в течение 3 ч при 20°С в атмосфере инертного газа
(азота или аргона). После инкубации препарат иммобилизован-
ного трипсина переносят на стеклянный фильтр G-3 (пор-40) и
промывают 1 мМ раствором НС1 и 5%-ным раствором уксусной
кислоты несколько раз порциями по 10—20 мл до исчезновения
запаха дитиотреитола. Промывание препарата проводят в токе
инертного газа, ее продолжительность не превышает 10—15 мин.
Затем препарат помещают в 10 мл 0,1 М раствора трисового
буфера (pH 8,0), содержащего 10 мг ЭДТА и смесь глутатионов:
12 мг восстановленной формы и 2,4 мг окисленной формы. Инку-
бацию иммобилизованного препарата в этих условиях проводят
149

в течение 1—2 сут при 20°С. При этом происходит реактивация
иммобилизованного трипсина на 70—100% от уровня исходной
(до иммобилизации) активности фермента.
6.	Микрокапсулирование ферментов в полупроницаемые най-
лоновые оболочки методом межфазной полимеризации. К 0,75 мл
10%-ного раствора полиэтиленимина, pH которого доведен до
9,8, добавляют 0,75 мл 0,38 М раствора 1,6-гексаметилендиамина
в 0,8 М карбонатном буфере, pH 9,8. Раствор перемешивают,
охлаждают до 0°С, растворяют в нем 15 мг а-химотрипсина.
К полученному 1%-ному водному раствору фермента в тефлоно-
вом стаканчике объемом 100 мл, помещенном в ледяную баню,
добавляют 7,5 мл охлажденной смеси хлороформа и циклогекса-
на (1 :5 по объему), содержащей 1% по объему эмульгирующего
агента Спан-85. Эмульгируют водный раствор фермента в орга-
ническом растворителе на магнитной мешалке при 0°С в течение
1 мин. Размер капсул определяется скоростью перемешивания и
концентрацией Спан-85 — стабилизатора эмульсии.
К полученной эмульсии типа «вода в масле», не прекращая
перемешивания, добавляют 7,5 мл охлажденного 18 мМ раствора
себацилхлорида в вышеназванной смеси органических раство-
рителей. Раствор себацилхлорида готовят непосредственно перед
употреблением путем растворения 0,03 мл дихлорида в 7,5 мл
смеси растворителей. В результате диффузии 1,6-гексаметилен-
диамина из водной в органическую фазу на поверхности раздела
фаз образуется полимерная мембрана. Реакцию образования по-
лимерной мембраны на поверхности эгиульсионных капелек про-
водят в течение 3—5 мин при перемешивании. Для прекращения
реакции полимеризации к суспензии микрокапсул добавляют
15 мл вышеназванной смеси органических растворителей.
Полученную суспензию микрокапсул разливают в две центри-
фужные пробирки и добавляют в каждую по 10 мл 15%-ного рас-
твора Спан-85 в смеси хлороформа и циклогексана в объемном
соотношении 1 : 3. Суспензию перемешивают палочкой и центри-
фугируют при 8000 об/мин в течение 1.—2 мин, супернатант уда-
ляют.
Микрокапсулы диспергируют в 15 мл 50%-ного водного рас-
твора Твин-20 на магнитной мешалке в течение 1 мин при макси-
мальной скорости перемешивания. К полученной суспензии пор-
циями добавляют 130 мл воды при перемешивании на магнитной
мешалке в 0,5 л стеклянном стакане (по мере добавления воды
постепенно снижают скорость перемешивания).
Суспензию центрифугируют при 8000 об/мин в течение 2—
3 мин. Супернатант удаляют, микрокапсулы промывают раство-
ром НС1, pH 3,0, до исчезновения ферментативной активности в
фильтратах. Полученные микрокапсулы хранят в виде суспензии
в 1 мМ НС1 при 4°С. Размеры полученных микрокапсул 10—
15 мкм.
7.	Микрокапсулирование ферментов в поликарбонатные обо-
лочки методом двойного эмульгирования. К 10 мл 10%-ного
150

раствора поликарбоната в метилен хлориде при интенсивном
перемешивании быстро по каплям добавляют 2 мл 1%-ного вод-
ного раствора фермента (pH 3,0), содержащего 5% полиэтилен-
амина. Эмульгирование проводят в течение 1 мин. К полученной
первичной эмульсии, не прекращая перемешивания, постепенно
приливают 50 мл 2%-ного раствора поливинилового спирта —
стабилизатора эмульсии в 0,5 М ацетатном буфере, pH 4,7. Про-
должают перемешивание в течение 2,5—3 ч при комнатной тем-
пературе. За это время метилен хлорид полностью испаряется,
и на поверхности водных капелек фермента образуется твердая
полупроницаемая полимерная оболочка. Микрокапсулы отделяют
и промывают 1 мМ раствором НС1 на воронке со стеклянным
пористым фильтром.
8.	Солюбилизация ферментов в обращенные мицеллы поверх-
ностно-активных веществ в органических растворителях. К 2 мл
0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в октане добавляют 5—150 мкл
10—50 мМ водного буферного раствора, pH 3—11 (концентрация
не должна превышать 50 мМ, при наличии высокой ионной силы
следует использовать буферный раствор с более низкой концен-
трацией). Смесь интенсивно встряхивают до образования опти-
чески, прозрачного раствора. Для ускорения процесса образова-
ния прозрачного раствора, содержащего большие количества
буферного раствора, добавляют буферный раствор порциями по
2—3% (40—60 мкл). Далее добавляют 5—20 мкл водного
раствора фермента и опять интенсивно встряхивают до образо-
вания оптически прозрачного раствора. Фермент можно вносить
и в виде навески сухого обессоленного порошка, однако время
растворения фермента в этом случае в системе обращенных
мицелл с низким содержанием воды (меньше 2%) существенно
увеличивается (от нескольких десятков секунд при внесении
водного раствора белка до десятков минут и даже часов
при внесении сухого белка). Для солюбилизации белка и опре-
деления активности включенного фермента наиболее широко
используются растворы Аэрозоля ОТ в октане в концентрациях
от 30 до 300 мМ.
9.	Получение наногранулированного а-химотрипсина. К 5 мл
0,235 М раствора Аэрозоля ОТ в толуоле добавляют 100 мг
акриламида и 25 мг М,М'-метилен-бис-акриламида в 200 мкл
воды и инициатор радикальной полимеризации, азо-бис-изобу-
тиронитрил, из расчета 0,1 мг/мл. Смесь встряхивают в течение
15—30 мин до полной солюбилизации. Затем к полученному
раствору добавляют 100 мкл концентрированного (0,5 мМ) вод-
ного раствора акрилоилированного а-химотрипсина (см. его
получение в примере 3) и после встряхивания получают одно-
родный прозрачный раствор обращенных мицелл Аэрозоля ОТ
в толуоле, содержащий солюбилизованные мономеры.
Полимеризацию инициируют облучением деаэрированного
мицеллярного раствора УФ-светом (ксеноновая лампа ХВО-200,
расстояние от источника 33 см, толщина слоя раствора 1см).
151

Для завершения полимеризации облучение продолжают в тече-
ние 10 мин.
После проведения полимеризации мицеллярную систему раз-
рушают добавлением 10-кратного избытка ацетона. При этом по-
лимерные наногранулы (размер менее 100 нм в диаметре) выпа-
дают в осадок, а растворимые в ацетоне непрореагирбвавшие
мономеры и Аэрозоль ОТ удаляют с супернатантом. Полученный
сухой порошок наногранулированного а-химотрипсина обладает
до 40—60% ферментативной активности (от исходной), может
храниться практически без потери активности в течение полугода
при 4°С, растворим как в воде, так и в мицеллярных растворах
в органических растворителях.
10.	Гидрофобизация белков (на примере а-химотрипсина) для
целей нековалентной иммобилизации на гидрофобных носителях
(биомембранах). К 10 мл 0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в октане
добавляют 450 мкл 33 мМ боратного буфера, pH 9,0. Раствор
интенсивно встряхивают в течение 1—2 мин, солюбилизуют в нем
20—50 мг препарата лиофилизованного фермента, затем добав-
ляют ~100мкл раствора стеароилхлорида в 0,1 М Аэрозоле ОТ
в октане (соотношение стеароилхлорид — белок составляет
2: 1). Раствор перемешивают в течение 20—30 мин.
Из реакционной системы белок осаждают на холоду добавле-
нием двойного объема ацетона, выпавший осадок белка отделяют
и встряхивают с .20 мл холодного ацетона для отмывки от приме-
сей октана и Аэрозоля ОТ. Эту операцию повторяют 2—3 раза.
Остаток ацетона удаляют на роторном испарителе (18°С) или
током воздуха. Выход по белку контролируют по массе и спектро-
фотометрически (280 нм).
Фракционирование стеароилированного химотрипсина прово-
дят на колонке (объем 210 мл) с сефадексом G-50, уравновешен-
ным 1 мМ НС1. На колонку наносят 10—20 мл 20 мкМ раствора
белка, pH 3,0. Гидрофильную фракцию элюируют 1 мМ HCI,
гидрофобную — 0,5%-ным раствором Бридж 35, pH 3,0. Выход
модифицированного белка составляет ~85%.

ЛИТЕРАТУРА
Основная:
Введение в прикладную энзимологию/Под ред. И. В. Березина и К. Марти-
нека. — М.: Изд-во /МГУ, 1982. 384 с.
Иммобилизованные ферменты//Современное состояние и перспективы/Под
ред. И. В. Березина, В. К. Антонова и К. Мартинека. — М.: Изд-во МГУ,
1976. Т. 1, 2. 296 с.; 358 с.
Тривен М. Иммобилизованные ферменты. — М.; Мир, 1983. 213 с.
Лурье А. А. Хроматографические материалы. — М.: Химия, 1978.
Кормак В. В., Штильман М. И. Полимеры в процессах иммобилизации
модификации природных соединений, — М.: Наука, 1984. 261 с.
Handbook of Enzyme Biotechnology Ed by A. Wiseman 2-nd edition —
Chichester: John Wiley and Sons, 1985. 437 p.
Methods in Ensymology//Irnmobilized Enzymes/Ed by K. Mosbch, —
New York: Academic Press, 1976. Vol. 44 . 999 p.
Rosevear A. Immobilized biocatalysts—a critical rev:ew//J. Chem. Technol.
Biotechnol. 1984. 34 В. P. 127--150.
Glazer A. N. The chemical modification of proteins by groupspecific and
site-specific reagents//In: The Protein. (H. Neurath, R. L. Hill, Eds). — New-York.
Academic Press, 1976. Vol. 2. P. I —103.
Дополнительная:
Березин И. В., Мартинек К. Основы физической химии ферментатив-
ного катализа. — М.: Высшая школа, 1977. 280 с.
Курганов Б. И. Аллостерические ферменты. — М.: Наука, 1978. 248 с.
Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. — М.:
Наука, 1985. 536 с.
Поверхностные явления и поверхностно-активные вещества/Под ред.
А. А. Абрамзона и Е. Д. Щукина. — М.: Химия, 1984. 392 с.
Мартинек К., Березин И. В. Стабилизация ферментов — ключевой фактор
при внедрении биокатализа в практику//Успехи химии. 1980. Т. 49. С. 737—770.
Можаев В. В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению
фундаментальных проблем энзимологии//Успехи биологической химии. 1983.
Т. 24. С. 99—134.
Хмельницкий Ю. Л., Левамов А. В., Клячко Н. Л., Мартинек К- Микро-
гетерогенная среда для химических (ферментативных) реакций на основе
коллоидного раствора воды в органическом растворителе//Успехи химии. 1984.
Т. 53. С. 545—565.
Мартинек К-, Левамов А. В., Клячко Н. Л., Хмельницкий Ю. Л., Бере-
зин И. В. Мицеллярная энзимология. Биол. мембраны. Т. 2. 1985. С. 669—696.
Исторический очерк
Биокатализ//История моделирования опыта живой природы/Березин И. В.,
Кузнецов В. И., Варфоломеев С. Д. и др. М.: Наука, 1981. 344 с.
153

предметный
УКАЗАТЕЛЬ
Автолиз 121, 122
Агар 14, 16
Агароза 14
Адсорбция ферментов на но-
сителях 46—56; 60, 61; 78.
80
— влияние ионной силы 50
— — концентрация фермен-
та 50, 51
— — модификация носителя
51—54
—	— — фермента 54
—	— пористости носителя 49
—	— pH 50
—	— температура 51
— — удельной поверхности
носителя 49
— способ нанесения в колон-
ке 47, 48
— — с перемешиванием 47
— — статический 47
— электроосаждение 48, 60,
61
— электроудерживание 56
Акриламид 20, 22
Акролеин 130
Акрилекс 21
Активация носителей, гидрок-
сильных и аминогрупп 27—
31, 42, 43
— амидных групп 33
— карбоксильных групп 32, 33
— путем введения функцио-
нальных групп, альдегидных
17, 30, 33, 34
— — — — — диазо- 31, 33
— — — — — имидоэфирных
30
154
Активация ферментов 113, 114
Альгинаты 16, 61
Амберлит 19
Амины вторичные, образование
с использованием галоген-
производных алифатических
и ароматических углеводоро-
дов 90
—	оксиранов 91
—	оснований Шиффа 92
—	соединений с активирован-
ными двойными связями 91
—	тииранов 91
Ангидриды карбоновых кислот
86
Бактериальное заражение ре-
акторов
Белковая инженерия 133
Биогель А 14. 15
—	Р 21
Бромциан 27, 28, 89
N-винилпирролидон 25, 26, 30,
32, 35
Влажное прядение 70
Вудворда реактив 32, 88 .
Гели для иммобилизации, ор-
ганические 13, 14, 16, 21, 26,
58—62, 80, 132

из готовых полимеров
13, 14, 16 26, 60-62, 132
— — из мономеров 21, 58—59.
80, 132
— неорганические 59-60
Гепарин 16
Гидрофобные взаимодействия
20, 49 53, 83, 136
Гистерезис 114—-116
Дауэкс 19
Двойная иммобилизация 66
Дегидроаланин 122
Декстран 12—13, 32, 34
Денатурация 99
— необратимая 126, 136
— обратимая 128
Диазония соли 93
Диссоциация фермента на
субъединицы 125, 128
Диффузионные ограничения
18, 50, 63, 67, 72, 78, 101,
107, 112—115, 117
Диффузия, внешняя 101 —103
— внутренняя 102, 105—107
Имидокарбонаты 27, 28, 89
Имидоэфиры 89, 90
Имины 91
Иммобилизация сополимериза-
ционная 129, 130
Инактивация, «самоубийствен-
ная» (суицидная) 124
— ферментов 113, 114
—	— при иммобилизации 51,
59, 60
Ингибирование ферментов 113,
114
Карбодиимиды 32, 87
Карбонаты циклические 89
Карбохром 44
Кердтин 18
Кинетически контролируемый
процесс 102
Колебания кинетические 114,
116
Коллаген 17, 60
Комплексы полиэлектролитные
61, 62
Конформация иммобилизован-
ного фермента 98, 99
Концентрация удельная иммо-
билизованного фермента 104
Коферменты 138—141
Лайнуивера-Берка координаты
103, 104
Лаитионин 122, 123
Лизиноаланин 122, 123
Мембраны жидкие 70
Микрокапсулы 68, 69
—	белковые 69
—	нитроцеллюлозные 69
—	полиамидные 69
Микроорганизмы термофиль-
ные 132
Микросреда иммобилизованно-
го фермента 51, 52, 66, 67, 78
Микроэмульсии 73—75, 80
—	бездетергентные 75
Мицеллы обращенные 39, 40,
65, 73, 80
Михаэлиса — Ментен уравне-
ние 97; 102, 105, 106, ИЗ,
117
Модификация носителя 42, 44,
51—54
—	— альбумином 52
—	— гидрофобными группами
53
— — ионами металлов 42, 52
—	— лигандами фермента 54
—	— липидами 44, 54
—	— полимерами 52
—	— танином 53, 54
155

Модификация фермента 54
129
— — аналогом мономера 80,
129
— — гидрофобными группами
54
— — полиэлектролитами 54
Молселект 13
Мочевина, производные	88—
90
Найлон-6, 25, 52
Наночастицы 65
Нернста слой 105
Нитрены 95
Нитрилы 89
Носители алюмосиликатные 43
— белковые 16—18, 30
— кремнеземные 42—43
— полиакриламидные 20, 30,
32, 33, 99
— полиамидные 25, 27, 30, 31
— полисахаридные 10-16, 28,
30, 32, 99, 132
— полистирольные 19. 30, 33.
99
— на основе: липосом 37—38.
40—41, 71
— — металлов и их оксидов
. 44
— — монослоев липидов 35—
37
— — поверхностно - активных
веществ 38—40
—	— пористой керамики 43
—	— поливинилового спипта
26, 30, 31, 62
— — угля и графитированной
сажи 44
Оксираны 28—29, 91
Определение иммобилизации 7,
45
Орнитиноаланин 122, 123
Плазмида 133
Плиакриламидный гель 20—
21, 30, 33, 59, 130, 152
Полимеризация эмульсионная
19, 65, 80
Полиуретаны 26
Полиферментные системы 117
Полые волокна 70
Пористость носителей 10, 13
19, 21, 24
Превращение высокомолеку-
ляпных субстратов 50, 67,
72'
Пришивка 78
Протеолиз 121, 127
Размер частиц носителя 63—
66, 80, 105
Расппеделение субстрата 100,
101, 105, 108, 112, 118
Рацемизация аминокислот 124
Реакция азосочетания 93
ирования 90, 91
— арилирования 90, 91
—	ацилирования 85, 86
—	конденсации 92
—	тиол-дисульфидного обме-
на 93
Ретикуляция 79—82
Регенерация НАД(Н) и
НАДФ(Н) 141 — 143
—	АТФ 143—144
Сайт-специфический мутагенез
133
Связь азометиновая, образова-
ние 92
— — восстановление
— амидная, образование с ис-
пользованием активирован-
ных эфиров 87
— — — ангидридов 86
— — — карбодиимидов 87
— — — реактива Вудворда
88
156

хлорангидридов 86
— дисульфидная, образование
93, 137
Сефадекс 13, 54
Сефароза 14, 31
Силикагель 42, 51, 59, 60
Сорбция аффинная 54
Стерические ограничения 108
114
Сополимеризация 20, 21, 24,
26, 80, 130
Сферон 24—25
Сшивка 10, 13, 29, 78, 131
— — второй 105
Фильтровальная бумага 52
Форма носителей 21, 24, 25,
37, 41, 42, 44, 47, 79, 80
Фосфорилирование 124,	127
Хитин 11 —12
Хитозан 12
Хлорангидриды карбоновых
кислот 86, 130
Хлортриазины 29, 54, 91
Хлорметилирование 33
Тиираны 91
Тилемодуль 107
Тиолактон гомоцистеина 85, 94
Тиолы 94, 95, 120, 136, 137
Ультрогель 21, 23
Шиффа основания 82, 90, 92
Ферментативные пленки, полу-
чение 81
Фика закон, первый 102, 105,
115
Энзакрил 21, 32
Эфиры активированные 87
Эффекты в катализе, коопера-
тивные и аллостепические
97, 117
- pH 108, 109, 111

ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие........................................................... 5
Введение ............................................................. 6
Глава I. Носители для иммобилизации ферментов......................... 9
Органические полимерные носители...................................... 9
§ 1.	Природные носители.............................................. 10
§ 2.	Синтетические полимерные носители............................... 18
§ 3.	Активация полимерных носителей.................................. 27
§ 4.	Биодеградация полимерных носителей.............................. 34
Органические низкомолекулярные носители.............................. 35
§ 5.	Природные носители (липиды).....................................  35
§ 6.	Синтетические аналоги липидов (поверхностно-активные вещества) 38
Неорганические материалы — носители для иммобилизации ферментов . .	41
§ 7.	Макропористые кремнеземы..................'..................... 42
§ 8.	Другие неорганические носители ................................. 43
Глава II. Методы физической иммобилизации ферментов.................. 45
Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях 46
§ 1.	Носители для адсорбционной иммобилизации........................ 46
§ 2.	Методика адсорбционной иммобилизации...........................  47
§ 3.	Природа адсорбционных взаимодействий фермента с носителем . . .	49
§ 4.	Влияние различных факторов на адсорбцию ферментов иа носителе	49
§ 5.	Способы увеличения эффективности связывания фермента с носителем	51
§ 6.	Преимущества и недостатки адсорбционной иммобилизации ....	56
Иммобилизация ферментов путем включения в гели..................  .	57
§ 7.	Иммобилизация ферментов в гелях, полученных полимеризацией мо-
номеров ............................................................ 58
§ 8.	Иммобилизация ферментов в гелях, полученных из готовых полимеров 60
§ 9.	Влияние различных факторов иа каталитическую активность фермен-
тов, иммобилизованных путем включения в гель........................ 62
§ 10.	Преимущества и недостатки иммобилизации ферментов путем вклю-
чения в гель........................................................ 67
Иммобилизация ферментов с использованием полупроницаемых оболочек
(мембран)...........................................................  67
§ 11.	Микрокапсулирование...........................................  68
§ 12.	Двойное эмульгирование ........................................ 70
§ 13.	Включение в волокна............................................ 70
§ 14.	Включение в липосомы........................................... 71
§ 15.	Преимущества и недостатки иммобилизации с использованием полу-
проницаемых оболочек................................................ 72
Иммобилизация ферментов с использованием систем двуфазного типа . .	72
§ 16.	Двухфазные системы типа «вода — несмецшвающийся с водой ор-
ганический растворитель» ........................................... 73
§ 17.	Микроэмульсии . . . •.......................................... 73
§ 18.	Двухфазные водные системы.....................................  75
158

Глава 111. Химические методы иммобилизации ферментов................ 77
§ 1.	Основные принципы конструирования препаратов ковалентно иммо-
билизованных ферментов.............................................. 77
§ 2.	Химическая структура ферментов и их функциональные группы ...	82
§ 3.	Приемы химической (ковалентной) иммобилизации белков ....	86
§ 4.	Недостатки и преимущества получения и использования ковалентно
иммобилизованных ферментов.......................................... 95
Глава IV. Кинетико-термодинамические закономерности катализа им-
мобилизованными ферментами.......................................... 97
§ 1.	Кинетические параметры	ферментативных	реакций................ 97
§ 2.	Влияние иммобилизации	на состояние фермента.................... 98
§ 3.	Эффекты распределения реагентов в катализе иммобилизованными
ферментами......................................................... 100
Глава V. Стабильность иммобилизованных ферментов.................
§ 1.	Воздействия и вещества, вызывающие инактивацию ферментов . . .
§ 2.	Молекулярные механизмы инактивации ферментов................
§ 3.	Влияние иммобилизации на инактивацию ферментов..............
§ 4.	Подавление с помощью иммобилизации первичных обратимых стадий
денатурации и диссоциации нативных белков .......................
§ 5.	Пути стабилизации ферментов, не основанные на методе иммобили-
зации ...........................................................
Глава VI. Регенерация компонентов систем с иммобилизованными фер-
ментами	................................... 135
§ 1. Реактивация инактивированных	ферментов ....................... 135
§ 2. Регенерация кофакторов	(коферментов).......................... 138
Заключение......................................................... 146
Приложение........................................................  148
Литература........................................................ 153
Предметный указатель..............................................  154

Учебное издание
БИОТЕХНОЛОГИЯ. 8 S ми.
Илья Взсмльаьм-.; Березин,
Наталья Л^.чоеяа Клячи.©.
Андрей Вадимович Левашов.
Нарел Мартинек,
Зад им Всеволодович Можасе,
Юрий Леноровмч Хмельницкий
Книга 7
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ
Заведующий редакцией А. Г. Гаврилов. Редактор М. М. Пенкина. Младшие
редакторы И. М. Павлова, Е. И. Попова. Художественный редактор Т. А. Колен-
кова. Художник С. Ю. Вериченко. Технический редактор Н. А. Битюкова.
Корректор С: К. Завьялова
ИБ № 6703
Изд. № Е-536. Сдано в набор 17.02.87. Подп. в печать 06.10.87. Т—19013.
Формат 60X90'/ie. Бум. кн.-журн. Гарнитура литературная. Печать офсетная.
Объем 10 усл. печ. л. 20,5 усл. кр.-отт. 9,76 уч.-изд. л. Тираж 30 000 экз.
Заказ № 133. Цена 35 коп.
Издательство «Высшая школа», 101430, Москва, ГСП-4, Неглинная ул., д. 29/14.
Ярославский полиграфкомбинат Союзполиграфпрома при Государственном ко-
митете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. 150014,
Ярославль, ул. Свободы, 97.
Фотографировал Семенюченко Владимир
chem_vova@mail.univ.kiev.ua; vova2002@mail.ru

ТЕННОЛОШН
И.В.Березин
НЛКлячко
А.В.Левашов
КМартинек
ВВ.Можаев
ЮЛ.Хмельницкий
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ
ФЕРМЕНТЫ


35 коп.
ПРОБЛЕМЫ
И ПЕРСПЕКТИВЫ
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ
СОЗДАНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ
ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
АВТОМАТИЗАЦИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
ПРОИЗВОДСТВО
БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ПРОИЗВОДСТВО БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ПРЕПАРАТОВ
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ
ФЕРМЕНТЫ
ИНЖЕНЕРНАЯ
ЭНЗИМОЛОГИЯ