он.  логинов
 НАУКА

РОССИЙСКАЯ
 АКАДЕМИЯ
 НАУК
 ИНСТИТУТ  БИОЛОГИИ
УФИМСКОГО
НАУЧНОГО  ЦЕНТРА
 АКАДЕМИЯ  НАУК
 РЕСПУБЛИКИ
 БАШКОРТОСТАН
 ГУП  «ОПЫТНЫЙ  ЗАВОД
АКАДЕМИИ  НАУК
РЕСПУБЛИКИ  БАШКОРТОСТАН»
 о.н.  логинов
 БАКТЕРИИ
 Pseudomonas
и  Azotobacter
 как  объекты
сельскохозяйственной
биотехнологии
 в
 МОСКВА  НАУКА  2005

УДК  663.1
ББК  30.16
JI69
 Ответственный  редактор
доктор  биологических  наук  Ф.М.  ШАКИРОВА
 Рецензенты:
 доктор  биологических  наук  В.А.  ВАХИТОВ,
доктор  биологических  наук  И.М.  ГАББАСОВА
 ISBN  5-02-034403-6 	© 	Институт 	биологии 	Уфимского 	научного
 центра  РАН,  ГУП  “Опыт,  завод  АН  РБ”
АН  Респ.  Башкортостан,  2005
©Логинов  О.Н.,  2005
©  Редакционно-издательское  оформление.
Издательство  “Наука”,  2005

...бактерии  одни  могли  бы  под¬
держивать  круговорот  веществ  на
нашей  планете,  тогда  как  эукариоты
на  это  не  способны.
 Х.Г.  Шлегель
 ВВЕДЕНИЕ
 Интенсификация  сельскохозяйственного  производства  пред¬
полагает  широкое  применение  пестицидов,  что  увеличивает
опасность  загрязнения  продуктов  растениеводства.  Развитие  био¬
технологических  способов  защиты  сельскохозяйственных  расте¬
ний  от  болезней  связано  с  разработкой  новых  биопрепаратов,  не
только  функционально  эффективных,  но  и  экологически  без¬
опасных  как  для  человека,  так  и  для  почвенной  микробиоты.
 Изучение  возможности  использования  явления  микробного
антагонизма,  а  также  способности  микроорганизмов  стимулиро¬
вать  рост  и  развитие  растений  относится  к  числу  наиболее  важ¬
ных  направлений  прикладной  микробиологии.  Актуальность
этих  исследований,  в  первую  очередь,  связана  с  интересом,  кото¬
рый  во  всем  мире  проявляют  к  биологическому  земледелию.
Очевидно,  что,  с  точки  зрения  природоохранного  земледелия,
биологические  средства  защиты  растений  являются  единствен¬
ной  альтернативой  химическим  фунгицидам.
 В  связи  с  изложенным  выше  не  вызывает  сомнений  актуаль¬
ность  проблемы  поиска,  изучения  и  сохранения  микроорганизмов  -
антагонистов  фитопатогенов  и  стимуляторов  роста  растений.
 В  систему  поиска  агентов  биологического  метода  борьбы  с
патогенными  организмами  входят  выбор  места  поиска,  изоляция,
предварительный  отбор,  вторичный  отбор,  подробное  исследо¬
вание  выделенных  иггаммов-антагонистов,  сокращенные  поле¬
вые  испытания,  полевые  испытания  по  полной  программе
[Campbell,  1986].
 Бактерии  p.  Pseudomonas  относят  к  числу  наиболее  перспек¬
тивных  объектов  для  использования  в  сельскохозяйственной
практике.  Это  связано  с  тем,  что  среди  представителей  этого  ро¬
да  встречаются  не  только  антагонисты  фитопатогенных  грибов  и
бактерий  [Osbum  et  al.,  1989;  Zaspel,  1989;  Elsherif,  Grossmann,
1991];  псевдомонады  обладают  также  рядом  других  замечатель¬
ных  свойств:  почва  является  для  них  естественной  средой  обита-
 з

ния,  они  способны  усваивать  разнообразные  органические  суб¬
страты,  легко  приживаются  в  ризосфере  и  ризоплане  различных
растений  и  обладают  более  быстрым  ростом  по  сравнению  с  дру¬
гими  ее  обитателями.  Некоторые  штаммы  бактерий  рода
Pseudomonas  стимулируют  рост  и  развитие  растений  [Пат.
2051586;  Pietr,  Kempa,  1989;  Renato  de  Freitas,  Germida,  1991].
 Бактерии  p.  Azotobacter  обладают  значительным  потенциалом
для  создания  биоудобрения  на  их  основе,  поскольку  бактерии  это¬
го  рода  отвечают  практически  всем  требованиям,  предъявляемым
к  PGPR  -  Plant  Growth-Promoting  Rhizobacteria  (ризобактерии,  спо¬
собствующие  росту  растений).  Главным  условием  для  создания  эф¬
фективного  биоудобрения  на  основе  азотобактера  является  поиск
и  применение  штамма,  обладающего  комплексом  положительных
свойств:  высокий  уровень  фиксации  молекулярного  азота,  широ¬
кий  спектр  антагонистической  активности  по  отношению  к  фито¬
патогенам,  продуцирование  витаминов  и  гормонов  роста.
 Основой  для  написания  этой  книги  явились  исследования,
проведенные  с  1998  по  2004  гг.  автором  и  его  учениками  канди¬
датами  биол.  наук  Е.В.  Свешниковой,  С.П.  Четвериковым,
Е.Г.  Пугачевой  и  аспирантом  Н.С.  Васильевой  в  лаборатории
биологически  активных  веществ  Института  биологии  Уфимско¬
го  научного  центра  Российской  академии  наук.
 В  монографии  впервые  обобщены  результаты,  полученные
под  руководством  автора  на  ГУП  “Опытный  завод  Академии  на¬
ук  Республики  Башкортостан”.
 В  подготовке  рукописи  вместе  с  автором  принимал  участие
канд.  техн.  наук  Н.Н.  Силшцев,  чей  кропотливый  и  добросовест¬
ный  труд  заслуживает  особой  признательности  и  искренней  бла¬
годарности.
 Автор  выражает  огромную  благодарность  сотрудникам  ла¬
боратории  прикладной  микробиологии  Института  биологии
УНЦ  РАН  кандидатам  биол.  наук  Т.Ф.  Бойко  и  Н.Ф.  Галимзяно-
вой  и  д-ру  биол.  наук,  проф.  А.И.  Мелентьеву.  Без  постоянного
общения  с  ними,  научного  и  просто  человеческого,  эта  моногра¬
фия  никогда  бы  не  была  написана.
 Автор  признателен  д-ру  биол.  наук,  проф.  Г.Р.  Кудояровой  и
научному  редактору  д-ру  биол.  наук,  проф.  Ф.М.  Шакировой  за
те  вопросы  и  замечания,  которые  позволили  нам  уточнить  и
скорректировать  тему,  обсуждаемую  в  монографии.
 Автор  приносит  благодарность  рецензентам  академику  АН  РБ
В.А.  Вахитову  и  д-ру  биол.  наук,  проф.  И.М.  Габбасовой  за  то,  что
они  будучи  первыми  читателями  высказали  свои  соображения  и  за-
мечения,  которые  только  улучшили  качество  этой  монографии.

БАКТЕРИИ  РОДОВ  PSEUDOMONAS  И  AZOTOBACTER  -
АНТАГОНИСТЫ  ФИТОПАТОГЕННЫХ  ГРИБОВ
И  БАКТЕРИЙ
 Известно,  что  бактерии  p.  Pseudomonas  обладают  целым  ря¬
дом  механизмов,  определяющих  их  способность  ингибировать
развитие  почвенных  фитопатогенов:  это,  в  первую  очередь,  син¬
тез  антифунгальных  метаболитов,  конкуренция  за  питательные
субстраты  и  поверхность  корней,  а  также  индукция  защитных  си¬
стем  растений.  К  настоящему  времени  в  литературе  описано  мно¬
жество  штаммов  псевдомонад,  обладающих  антагонистическими
свойствами  в  отношении  широкого  круга  фитопатогенных  гри¬
бов  и  бактерий.
 В  публикациях,  посвященных  использованию  бактерий  р.
Pseudomonas  для  защиты  злаковых  культур  от  болезней,  фигури¬
руют  различные  виды  псевдомонд.  Из  посевов  пшеницы  выделе¬
ны  бактерии  p.  Pseudomonas,  обладающие  антагонистическим
действием  в  отношении  гриба  Gaeumannomyces  graminis  [Weller  et
al.,  1989;  Zaspel,  1989].  Показано,  что  в  результате  обработки  се¬
менного  материала  пшеницы  культурами  псевдомонад  растения
на  ранних  фазах  развития  были  заражены  незначительно,  что
способствовало  повышению  урожая  (по  сухому  веществу)  в  сред¬
нем  на  61%  [Zaspel,  1989].  В  мелкоделяночных  опытах  штаммы
Р.  cepacia  обеспечивали  защиту  пшеницы  от  фузариоза  и  повы¬
шали  урожайность  на  80%  по  сравнению  с  контролем  [Додатко  и
др.,  1989].  Канадскими  исследователями  ризобактерии  P.  cepacia
и  P.  putida  были  использованы  в  качестве  агентов  биологической
защиты  растений  озимой  пшеницы  против  поражения  грибом
Rhizoctonia  solani.  В  вариантах  с  использованием  штаммов  ризо-
бактерий  биомасса  растений  заметно  возрастала  по  сравнению  с
контролем,  а  масса  сухих  корней  увеличивалась  на  92-128%
[Renato  de  Freitas,  Germida,  1991].
 Подавляющее  большинство  штаммов,  антагонистически  ак¬
тивных  по  отношению  к  возбудителям  корневых  гнилей  злако¬
вых  культур,  относится  к  флуоресцирующим  видам  бактерий  р.
Pseudomonas,  а  также  к  не  флуоресцирующим  сапрофитным  ви¬
дам  P.  cepacia  и  Pseudomonas  sp.  [Гарагуля  и  др.,  1989].
 В  литературе  имеются  данные  о  высокой  биологической  эф¬
фективности  почвенных  флуоресцирующих  бактерий  p.  Pseudo¬
 5

monas  также  против  других  возбудителей  заболеваний  злаковых
и  травянистых  растений:  септориоза  и  листовой  ржавчины  пше¬
ницы  [Levy  et  al.,  1989],  ржавчины  [Tosi,  Zazzerini,  1994]  и  увяда¬
ния  сафлора  [Liang  et  al.,  1996].  Изолят  P.fluorescens,  выделенный
из  ризосферы  рапса  озимого,  обладал  антагонистическими  свой¬
ствами  против  патогенных  и  сапрофитных  для  рапса  и  льна  гри¬
бов.  Он  способен  защитить  прорастающие  растения  от  инфекции
Phoma  lingam,  Fusarium  avenaceum  [Novotna,  1990].
 Исследованы  антагонистическая  активность  штаммов  псев¬
домонад,  выделенных  из  ризосферы  огурца,  по  отношению  к
Pythium  ultimum,  вызывающего  выпревание  всходов,  а  также  вли¬
яние  бактерий  на  рост  рассады.  Некоторые  изоляты  имели  поло¬
жительное  влияние  на  рост  растений  огурца,  и  8%  выделенных
изолятов  подавляли  развитие  патогенеза  [Pietr,  Kempa,  1989;
Sugimoto  et  al.,  1990].
 В  вегетационных  и  полевых  мелкоделяночных  опытах  изуча¬
ли  возможность  использования  обработки  посевного  материала
ризосферными  бактериями  из  группы  флуоресцирующих
Pseudomonas  для  предпосевной  защиты  свеклы  от  болезней.  По¬
казано,  что  штамм  ML5  P.fluorescens-putida  и  штамм  R20  P.  puti-
da  подавляют  заселение  перикарпа  семян  сахарной  свеклы  пато¬
геном  Pythium  ultimum.  Штамм  R20  тормозил  мицелиальный  рост
гриба  в  тканях  семян,  а  штамм  ML5  препятствовал  как  мицели-
альному  росту,  так  и  прорастанию  спор.  Активность  штаммов
ML5  и  R20  была  сопоставима  с  активностью  фунгицидов,  подав¬
ляющих  выпревание  всходов  сахарной  свеклы  в  условиях  тепли¬
цы  [Osbum  et  al.  1989;  Sikora  et  al.,  1990].  В  другой  работе,  также
посвященной  способам  биологической  борьбы  против  болезней
сахарной  свеклы,  выявлено,  что  псевдомонады,  используемые
для  дражирования  семян,  сохраняли  антагонистические  свойства
в  течение  нескольких  месяцев  [Gordon-Lennox  et  al.,  1987].
 В  вегетационных  опытах  изучено  действие  изолятов  P.  fluo-
rescens  и  P.  putida  на  Plasmodiophora  brassicae,  Rhizoctonia  solani  и
Tilletia  caries.  Бактериальным  препаратом  обрабатывали  посев¬
ной  материал,  корни  растений  или  лунки  для  их  посадки.  Из  141
изолята,  испытанного  против  Plasmodiophora  brassicae  на  капусте
китайской,  19  существенно  подавляли  развитие  патогена.  На  кор¬
мовых  бобах  только  1  из  44  изолятов  снижал  пораженность
Rhizoctonia  solani  и  приводил  к  увеличению  сырой  биомассы  рас¬
тений.  Из  5  изолятов,  испытанных  на  озимой  пшенице,  только
один  мог  снижать  пораженность  растений  Tilletia  caries  [Elsherif,
Grossmann,  1991].
 Сначала  в  опытах  in  vitro,  а  затем  в  условиях  теплицы  иссле¬
дована  активность  штаммов  P.  fluorescens  в  отношении
 6

Rhizoctonia  solani,  а  также  возбудителя  корневой  и  стеблевой  гни¬
ли  арахиса  (Sclerotium  rolfsii)  [Canesan,  Gnanamanickam,  1987;
Savithiry,  Gnanamanickam,  1987].  Растения  арахиса,  инокулирован-
ные  P.  fluorescens  перед  заражением  Rhizoctonia  solani,  поража¬
лись  заболеванием  в  два  раза  слабее,  чем  контрольные;  99%  рас¬
тений  арахиса  были  защищены  от  инфекции  Sclerotium  rolfsii,  если
их  подвергали  бактеризации  (106  КОЕ/мл).  Под  влиянием  бакте¬
ризации  урожай  арахиса  возрастал  на  59%,  а  высота  растения
увеличивалась  на  25,7%.
 Известно,  что  среди  бактерий  p.  Pseudomonas  достаточно  ча¬
сто  встречаются  антагонисты,  эффективные  против  бактериаль¬
ных  поражений  растений.  Так,  например,  предпосевная  обработ¬
ка  клубней  картофеля,  инфицированных  Erwinia  carotovora  subsp.
Atroseptica,  смесью  двух  флуоресцирующих  псевдомонад  снижала
зараженность  клубней  потомства,  а  также  задерживала  развитие
болезни  на  материнских  клубнях  [Rhodes,  Logan,  1986].  Эпифит-
ные  псевдомонады,  выделенные  с  перца  и  томата,  проявляли  ан¬
тагонизм  по  отношению  к  возбудителю  бактериозов  Erwinia
carotovora  subsp.  carotovora.  Изолят  P.  putida  PP22  подавлял  рост
широкого  спектра  фитопатогенных  бактерий  на  питательной
среде,  включая  24  вида  возбудителей  мокрой  гнили  (родов
Erwinia,  Pseudomonas,  Xanthomonas,  Cytophaga)  [Liao,  1989].
 Во  многих  публикациях  отражено  [Hasegawa  et  al.,  1987;  Con¬
way  et  al.,  1989;  Liao,  1989],  что  антагонисты  p.  Pseudomonas  отли¬
чаются  широким  спектром  антагонистической  активности  и  по
праву  рассматриваются  авторами  как  потенциальные  агенты
биологической  защиты.
 Исследователями  предложены  биологические  методы  борьбы
с  фузариозами  растений  с  использованием  бактерий  p.  Pseudo¬
monas.  Исследована  антифунгальная  активность  концентриро¬
ванной  КЖ  (культуральной  жидкости)  бактерий  P.  solanacearum
[Tsuyumu  et  al.,  1989]  и  отмечена  возможность  ее  использования
для  биологической  борьбы  с  фузариозным  вилтом  томатов
[Toyoda  et  al.,  1988].
 В  работе  ряда  исследователей  [Janisiewicz,  Yourman,  1989;
Мао,  Cappellini,  1989;  Wilson,  Chalutz,  1989;  Sobiczewski,  Bruk,
1999]  дана  высокая  оценка  эффективности  применения  микроор-
ганизмов-антагонистов  p.  Pseudomonas  для  борьбы  с  грибами
p.  Penicillium  и  Botrytis,  поражающих  плоды  фруктовых  деревьев
в  послеуборочный  период.
 В  некоторых  публикациях  авторы  отмечают  наличие  поло¬
жительного  комплексного  действия  на  растение  со  стороны  бак-
терий-антагонистов.  Речь  идет  не  только  о  биологическом  конт¬
роле  почвенных  инфекций,  использование  культур  пггаммов-ан-
 7

тагонистов  способствует  также  индукции  системной  устойчиво¬
сти  растений,  благоприятствует  раннему  росту  и  увеличению
урожая  сельскохозяйственных  культур  [Becker  et  al.,  1990].
 Еще  одним  подтверждением  перспективности  микроорганиз¬
мов  p.  Pseudomonas  для  использования  в  качестве  агентов  биоло¬
гической  защиты  растений  стало  выявление  у  некоторых  псевдо¬
монад  нематоцидной  активности  [Смирнов  и  др.,  1999;
McLaughlin,  Sequeira,  1988;  McLaughlin  et  al.,  1989;  Ali  Siddiqui  et
al.,  2001].
 Таким  образом,  среди  бактерий  p.  Pseudomonas  встречаются
антагонисты  различных  грибных  и  бактериальных  фитопатоге¬
нов,  причем  в  основном  это  представители  флуоресцирующих
видов  псевдомонад.  В  многочисленных  опытах  получено  под¬
тверждение,  что  бактерии-антагонисты  p.  Pseudomonas  могут
использоваться  для  снижения  и  предотвращения  заболеваний
растений.  Очевидно,  что  наиболее  перспективными  для  практи¬
ческого  использования  следует  считать  иггаммы-антагонисты  с
широким  спектром  антимикробной  активности.
 Бактерии  p.  Azotobacter  также  способны  угнетать  и  нарушать
развитие  фитопатогенных  грибов  p.  Helminthosporium,  Fusarium,
Alternaria  и  Penicillium,  вызывающих  корневые  гнили  растений
[Мишустин,  1975;  Дегтярева  и  др.,  2001;  Фатыхова  и  др.,  2001;
Kumari  Lakshmi  et  al.,  1972].
 В  ранних  работах  некоторые  исследователи  полагали,  что
влияние  азотобактера  на  снижение  заболеваемости  растений  мо¬
жет  быть  связано  с  его  стимулирующим  действием  на  бактерий-
антагонистов  фитопатогенов  преимущественно  из  p.  Pseudo¬
monas  либо  с  усилением  иммунитета  растений.  Опыты,  основанные
на  обработке  семян  сельскохозяйственных  культур  азотобакте¬
ром,  показали  повышение  их  устойчивости  к  ряду  болезней,  вы¬
зываемых  почвенными  грибами.  Так,  применение  азотобактера
на  песчаной  почве  снизило  заболевание  картофеля  паршой  с  75%
(контроль  без  бактеризации)  до  3%,  а  на  дерново-подзолистой  -  с
24  до  4%,  причем  штамм,  полученный  в  результате  направленной
изменчивости  в  ризосфере  картофеля,  действовал  несколько  эф¬
фективнее  исходного  штамма  [Линчевская  с  др.,  1958].  В  серии
опытов,  поставленных  на  картофеле,  применение  биопрепарата
азотобактерина  в  14  опытах  из  19  предохраняло  картофель  от
вирусных  заболеваний  и  в  11  -  от  бактериальных  [Винтик,  1964].
Бактеризация  картофеля  азотобактером  позволила  снизить  по¬
ражение  растений  фитофторой  на  подзолистой  среднесуглини¬
стой  почве  [Рубенчик,  1960].
 Внесение  азотобактера  совместно  с  фосфобактерином  в  тор¬
фоперегнойные  кубики  с  растениями  капусты  позволило  после
 8

высадки  растений  в  подзолистую  почву  предохранить  корни  от
килы,  тогда  как  небактеризованные  корни  оказались  поврежден¬
ными  полностью.  При  этом  внесение  одного  азотобактера  дало
снижение  поражаемое™  на  43%,  а  совместно  с  фосфобактери-
ном  -  на  69%  [Наумова,  1958].
 Было  установлено,  что  при  обработке  семян  пшеницы  азото¬
бактером  поражаемость  растений  пыльной  головней  уменьши¬
лась  с  4  до  0,4%.  Использование  азотобактера  снизило  почти
вдвое  поражаемость  фасоли  каемчатой  пятнистостью  [Бельтю¬
кова,  1953].
 В  последнее  время  отмечается  некоторое  возрастание  инте¬
реса  исследователей  к  бактериям  p.  Azotobacter.  Так,  был  разра¬
ботан  биофунгицид  на  основе  комплекса  штаммов  ризосферных
бактерий  Pseudomonas  sp.  В-6798  и  Az.  chroococcum,  обладающих
антагонистической  активностью  по  отношению  к  фитопатоген¬
ному  грибу  Fusarium  sp.,  выделенному  из  семян  пшеницы  [Фаты-
хова  и  др.,  2002].  На  основе  штамма  Az.  chroococcum  А41  индий¬
скими  учеными  предложено  бактериальное  удобрение  для  оздо¬
ровления  корневой  системы  растений,  поскольку  данный  штамм
проявляет  антагонистическую  активность  против  широкого
спектра  фитопатогенных  грибов,  относящихся  к  10  родам
[Pandey  et  al.,  1990].
 С  целью  получения  биопрепарата  для  повышения  почвенно¬
го  плодородия  и  восстановления  нарушенных  земель  был  пред¬
ложен  штамм  Az.  chroococcum  2Е-16,  обладающий  антибиотиче¬
ской  активностью  в  отношении  грибных  и  бактериальных  фито¬
патогенов;  кроме  того,  штамм  хорошо  приживался  в  почве  и
грунтах  [Пат.  2177466].  В  качестве  способа  выращивания  овощ¬
ных  культур  предложена  обработка  семян  комплексом  культур
микроорганизмов,  обладающих  фунгистатическим  действием,  в
том  числе  Az.  indicum  spp.,  P.  putida  spp.,  Fusarium  moniliforme
BKM-136  [Пат.  2110170].
 Применение  биопрепаратов
на  основе  псевдомонад  и  азотобактера
для  защиты  растений  от  болезней
 В  последние  годы  в  нашей  стране,  как  и  за  рубежом,  растет
интерес  к  экологически  чистым  и  сравнительно  безопасным  в
применении  микробиологическим  препаратам.  Преимущество
биологического  метода  по  сравнению  с  химическим  -  в  отсутст¬
вии  отрицательного  влияния  на  окружающую  среду,  получении
продукции  без  остаточных  количеств  пестицидов,  в  природе  со¬
 9

храняются  полезные  насекомые  и  микроорганизмы,  сдерживаю¬
щие  развитие  вредных  видов.
 Применение  микроорганизмов  для  защиты  растений  от  бо¬
лезней  ни  за  рубежом,  ни  у  нас  в  стране  не  получило  пока  широ¬
кого  распространения.  Использование  биопрепаратов  вместо  хи¬
мических  средств  защиты  или  наряду  с  ними  до  сих  пор  носит  еди¬
ничный  характер,  и  большинство  примеров  имеют  отношение  к
научным  изысканиям  ученых.
 Успешно  применяли  флуоресцирующие  псевдомонады  для
бактеризации  семян  пшеницы,  риса,  хлопчатника  с  целью  борь¬
бы  с  офиоболезом,  ризоктониозом,  гоммозом  в  Нидерландах,
Индии,  на  Филиппинах  [Mew,  Rosales,  1986;  Lamers  et  al.,  1988;
Vasantha  et  al.,  1989].
 Чешскими  микробиологами  [Bakker  et  al.,  1989;  Vrany  et  al.,
 1990] 	проведено  исследование  влияния  инокуляции  картофеля  и
сахарной  свеклы  изолятами  P.  putida  и  Trichoderma  sp.  в  суспензии
и  в  препаратах  с  носителями  из  каолина  и  торфа  на  рост,  урожай¬
ность  и  физиологические  свойства  клубней  и  корнеплодов.
В  57,5%  экспериментов  отмечено  увеличение  урожайности.
 Один  из  наиболее  удачных  отечественных  бакпрепаратов  на
основе  псевдомонад  -  планриз  (ризоплан).  Хотя  механизм  дейст¬
вия  ризоплана  авторами  до  конца  не  изучен,  по  литературным
данным  его  влияние  на  растения,  проявляющееся  в  улучшении
прорастания  семян,  усилении  роста  и  развития  растений  и,  в
конечном  счете,  повышении  урожайности,  объясняется  продуци¬
рованием  сидерофоров,  антибиотиков  (типа  феназина),  регуля¬
торов  роста  растений  и  способностью  переводить  фосфор  в  дос¬
тупное  состояние.
 Спектр  применения  ризоплана  достаточно  широк.  По  дан¬
ным  ВИЗР,  БелНИИземледелия,  Калининградской,  Ульянов¬
ской,  Тюменской,  Томской,  Карельской  и  многих  других  област¬
ных  и  республиканских  станций  защиты  растений,  ризоплан
подавляет  развитие  возбудителей  твердой  головни,  бурой  и  стеб¬
левой  ржавчины,  гельминтоспориозной,  фузариозной,  офиобо-
лезной  корневых  гнилей  зерновых,  фитофтороза,  парши,  ризок-
тониоза,  бактериозов,  мокрой  и  сухих  гнилей  картофеля,  бакте¬
риозов  капусты,  церкоспороза  [Кузнецова,  Филиппов,  1995;
Назарова  и  др.,  1995;  Титаренко  и  др.,  1995].  В  Краснодарском
НИИ  овощного  и  картофельного  хозяйства  хорошие  результаты
получены  при  использовании  ризоплана  для  предпосевной  обра¬
ботки  семян  репчатого  лука,  столовой  свеклы,  томатов  [Сторо-
жук  с  соавт.,  1995].
 В  ИБФМ  РАН  (Пущино)  были  выделены  перспективные
штаммы  микроорганизмов  P.  aureofaciens  BS1393  (биопрепарат
 Ю

на  его  основе  псевдобактерин-2  (ПС-2))  и  P.  putida  BS  1398  (био¬
препарат  на  его  основе  псевдобактерин-3  (ПС-3)).  Использова¬
ние  смеси  бактериальных  препаратов  ПС-2  и  ПС-3  в  северо-вос-
точной  части  Украины  в  1996  г.  было  эффективным  против  сеп-
ториоза,  бурой  ржавчины,  твердой  головни  пшеницы.  Против
мучнистой  росы  лучшие  результаты  получены  при  применениии
ПС-2,  чем  ПС-3  или  их  смеси  [Долгова  и  др.,  1997].
 В  1993-1995  гг.  биопрепарат  псевдобактерин-2  успешно  ис¬
пользовали  в  тепличных  хозяйствах  для  защиты  огурцов  и  томатов
от  корневых  и  стеблевых  гнилей;  в  Краснодарском  крае  получен
положительный  эффект  от  применения  препарата  для  защиты
яблонь  от  парши,  а  также  при  предпосевной  обработке  семян
озимой  пшеницы  [Кочетков  и  др.,  1997].
 В  тепличном  хозяйстве  КСХП  “Россия”  в  1996  г.  проведены
испытания  комбинированного  препарата  на  основе  псевдобакте-
рина-2  с  целью  замены  дорогостоящей  термической  стерилиза¬
ции  почвы.  Комбинированный  препарат  содержал  живые  клетки
трех  штаммов  бактерий  p.  Pseudomonas  и  двух  -  бактерий  р.
Azotobacter.  Показано,  что  обработка  почвы  не  уступает  по  эф¬
фективности  пропариванию,  но  по  стоимости  в  5  раз  дешевле
[Кочетков  и  др.,  1997].
 Л.Н.  Назарова  [2002]  сообщает,  что  в  Саратовской  области
на  яровой  пшенице  Л-503  биологическая  эффективность  протра¬
вливания  семян  агатом-25К  в  1996  г.  равнялась  66%,  1997  г.  -
70%,  в  2000  г.  -  71%  при  уровне  развития  пыльной  головни  соот¬
ветственно  2,3;  0,7;  3,2%,  прибавка  урожая  составила  3,3-4,6  ц/га.
 В  Новосибирском  аграрном  университете  разработана  сухая
форма  препарата  РИЦ  на  основе  P.fluorescens  (штамм  В661).  Со¬
гласно  данным  испытаний,  предпосевная  обработка  семян  овса  и
томатов  снижала  степень  поражения  корневой  системы  Fusarium
oxysporum  и  на  40-76%  количество  пораженных  растений.  Эффек¬
тивность  против  черной  ножки  составляла  до  95%.  Биологиче¬
ская  эффективность  против  сухой  гнили  составляла  67-93%,
фитофторы  -  64—72%.  РИЦ  полностью  защищал  картофель  от
мокрой  гнили  при  исходной  зараженности  клубней  фитофторой
до  20%  [Ермакова,  Штершнис,  1994].
 В  1993-1995  гг.  проведены  исследования  по  эффективности
применения  на  картофеле  биопрепарата  на  основе  флуоресциру¬
ющих  псевдомонад  (P.fluorescens,  P.  putida  Т-89)  (препарат  ПП)  и
различных  видов  азотобактера  в  смеси  с  бациллами  и  псевдомона¬
дами  (препарат  СП).  Биопрепараты  способствовали  повышению
урожая  картофеля.  Эффективность  действия  биопрепаратов  во
многом  определялась  сортовыми  особенностями  картофеля  и  ме¬
теорологическими  условиями  года  [Сидоренко  и  др.,  1996].
 11

Штамм  Pseudomonas  sp.  В-6798  показал  свою  эффективность
в  качестве  основы  биопрепарата  для  увеличения  урожая  льна  и
повышения  его  устойчивости  к  фузариозу  [Гущина,  Евдокимов,
2001].
 С  целью  ограничения  развития  фузариозной  корневой  гнили
семена  пшеницы  сортов  Мироновская  808  и  Артемовка  обраба¬
тывали  штаммами  бактерий  P.  aurantia  387,  P.  aureofaciens  2117,
P.  aeruginosa  1901,  Pseudomonas  sp.  19,  Bacillus  mesentericus  1701,
Вас.  polumyxa  636  и  полученными  из  них  препаратами.  Показано,
что  обработка  семян  пшеницы  суспензиями  бактерий  и  получен¬
ными  из  них  препаратами  повышала  энергию  прорастания  и
всхожесть  семян,  ограничивала  развитие  болезни  в  условиях  ве¬
гетационных  и  полевых  опытов,  способствовала  повышению
продуктивности  растений.  Эти  препараты  были  эффективнее,
чем  ТМТД,  или  не  уступали  ему  [Пидопличко,  Гарагуля,  1986].
 Говоря  об  эффективном  использовании  биологических
средств  защиты,  нельзя  не  остановиться  на  проблеме,  связанной
с  разработкой  для  них  таких  препаративных  форм,  которые  бы
обеспечивали  стабильность  защитного  эффекта  и  при  этом  были
бы  высокотехнологичными.  Авторы  биопрепаратов  предлагают
разные  пути  решения  этой  проблемы.
 В  бактериальный  препарат  Агат-25К  со  сравнительно  невы¬
соким  сроком  хранения  (18  мес)  дополнительно  вносят  гидроли¬
зат  бактерий  Вас.  megaterium,  содержащий  биополимер  -  поли-Р-
гидроксимасляную  кислоту,  а  вместо  живых  бактерий  P.  aureofa¬
ciens  ВКМ  В-1973  Д  -  их  гидролизат.  Полученный  препарат  в
отличие  от  прототипа  имеет  более  длительный  срок  хранения
(3  года  против  1,5  лет)  и  на  протяжении  всего  срока  хранения  не
снижает  свою  биологическую  активность  [Пат.  РФ  2147181].
 Существенный  недостаток  стандартной  суспензии  планриза
заключается  в  очень  непродолжительном  периоде  жизнеспособ¬
ности  бактерий  на  поверхности  семян.  При  18-20°  он  не  превы¬
шает  3  сут,  при  хранении  в  холодильнике  (4°)  достигает  20  сут,
для  его  продления  к  суспензии  препарата  добавляли  5%  ПВП.
Это  обеспечивало  удовлетворительную  прилипаемость  бактери¬
альных  клеток  к  семенам.  Жизнеспособность  псевдомонад  сохра¬
нялась  на  близком  к  исходному  уровню  в  течение  1  мес,  тогда  как
в  контроле  титр  бактерий  резко  снижался  через  2  нед  после  изго¬
товления  суспензии  препарата  [Боровая,  2001].
 Препарат  фитоспорин  содержит  в  качестве  основы  живые
клетки  Вас.  subtilis  ВНИИСХМ  128  и  наполнитель  в  количестве
8-2  об.%.  Необходимость  наполнителя  обусловлена  его  защит¬
ным  действием  для  бактериальных  клеток  при  дальнейшем  лио-
фильном  высушивании  препарата.  В  качестве  наполнителя  в  со¬
 12

став  препарата  могут  входить  сыворотка  крови  крупного  рогато¬
го  скота  (КРС),  молоко,  обрат  и  т.д.,  предпочтительно  сахарозо¬
желатиновая  смесь  (4%  сахарозы,  1%  желатины)  [Пат.  РФ
2099947].  Для  получения  препарата  фитоспорин  в  жидком  виде
КЖ  сливают  и  добавляют  стабилизатор  биомассы  (гуми  -  0,5-2%
или  сульфит  натрия  -  2-6%).  Стабилизатор  обеспечивает  сохра¬
нение  количества  живых  клеток  в  препарате.  Препарат  может
храниться  без  лиофильной  сушки  в  течение  6-8  мес  [Пат.  РФ
2128914].
 Бактерии  p.  Azotobacter  могут  служить  основой  для  производ¬
ства  бактериальных  удобрений  под  различные  сельскохозяйст¬
венные  культуры  -  огурцы  [Пат.  РФ  2074157],  томаты  [А.с.
СССР  1359272],  зеленные  культуры  [Пат.  РФ  2074159],  амарант
[Пат.  РФ  2074158],  ячмень  [А.с.  СССР  1316189].  Кроме  того,  ба¬
ктерии  этого  рода  входят  в  состав  биопрепаратов  для  повышения
почвенного  плодородия  и  урожайности  сельскохозяйственных
культур  [Пат.  РФ  2177466],  получения  регуляторов  роста  расте¬
ний  [Пат.  РФ  2161884].
 Курдиш  и  др.  [1999]  изучено  влияние  различных  условий  хра¬
нения  культуры  P.  aureofaciens  УКМ  В-111  в  высокодисперсных
материалах  на  жизнеспособность  и  антагонистическую  актив¬
ность  штамма  к  фитопатогенным  грибам.  Наибольшая  числен¬
ность  жизнеспособных  клеток  бактерий  с  сохранением  физиоло¬
гической  активности  популяции  наблюдалась  при  температуре
хранения  4°  с  использованием  носителей  в  ряду:  монтмориллонит
>  палыгорскит  >  аэросил  А-300.
 Таким  образом,  перечень  отечественных  бактериальных  пре¬
паратов,  предназначенных  для  борьбы  с  инфекциями  растений,
на  сегодняшний  день  весьма  невелик.  Поэтому  разработки  новых
эффективных  биологических  средств  защиты  растений  остаются
приоритетными  задачами  прикладной  микробиологии  и  сельско¬
хозяйственной  биотехнологии.  Необходимо  также  упомянуть,
что  в  связи  с  отходом  в  другие  суверенные  государства  био¬
химических  заводов  “Прогресс”  (Казахстан),  Запорожского  и
Новгород-Волынского  (Украина),  Унгенского  (Молдова),  научно-
исследовательских  учреждений  ВНИИБМЗР  (Молдова),
ВНИИГИНТОКС  и  ВНИИЦ  “Биотехника”  (Украина)  актуаль¬
ной  становится  организация  регионального  производства  микро¬
биологических  средств.
 Анализ  литературных  источников,  представленных  в  данном
обзоре,  наглядно  демонстрирует,  что  представители
p.  Pseudomonas  выступают  в  качестве  антагонистов  широкого
спектра  фитопатогенных  грибов  и  бактерий.  Положительное
влияние  псевдомонад  на  растения  обусловлено  рядом  механиз¬
 13

мов,  важнейшие  из  которых  -  выработка  антибиотических  ве¬
ществ  различной  природы,  сидерофоров  и  стимуляторов  роста
растений.  Способность  активно  заселять  ризосферу  и  филлосфе-
ру,  присущая  псевдомонадам,  позволяет  считать  их  перспектив¬
ными  агентами  биоконтроля  болезней  растений.  Ряд  препаратов
на  основе  псевдомонад,  созданных  и  успешно  используемых  в
России  и  за  рубежом,  подтверждает  это  положение.
 Однако  многие  исследования  заканчиваются  только  односто¬
ронним  изучением  иггаммов-антагонистов  в  условиях  in  vitro  или,
в  лучшем  случае,  доводятся  до  испытания  их  в  качестве  агентов
биоконтроля  в  вегетационных  опытах.  На  наш  взгляд,  чтобы  су¬
дить  о  перспективности  микробов-антагонистов  для  применения
их  в  сельском  хозяйстве,  необходимо  иметь  полную  характери¬
стику  изучаемых  штаммов.  Сюда  необходимо  включить  спектр
антагонистической  активности  бактерий,  описание  механизмов
их  положительного  влияния  на  растение,  изучение  колонизирую¬
щей  способности  культур,  испытание  биопрепаратов  на  их  осно¬
ве  в  условиях  вегетационных  и  полевых  опытов  на  различных
растениях.

ВЫДЕЛЕНИЕ  И  ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА
НОВЫХ  ШТАММОВ  БАКТЕРИЙ
РОДОВ  PSEUDOMONAS  И  AZOTOBACTER  -
АНТАГОНИСТОВ  ФИТОПАТОГЕННЫХ  ГРИБОВ
 Источниками  выделения  бактерий,  проявляющих  антагонизм
в  отношении  фитопатогенных  грибов,  послужили  образцы  раз¬
личных  типов  почв,  в  том  числе  находящихся  в  сельскохозяйст¬
венном  использовании,  образцы  ризосферы  культурных  и  дико¬
растущих  растений,  а  также  сточные  воды  биологических  очист¬
ных  сооружений.  Образцы  почв  отбирали  в  апреле-октябре
1999-2002  гг.
 Всего  проанализировано  около  320  образцов:  почвы  Башкор¬
тостана  (Мелеузовский,  Кугарчинский,  Уфимский,  Салаватский,
Нуримановский,  Мечетлинский,  Туймазинский  районы),  почвы
Оренбургской,  Московской  областей,  Ставропольского  края
(Прикумская  опытная  селекционная  станция),  Краснодарского
края  (Адлер,  Анапа),  образцы  с  опытно-заливных  станций  с  раз¬
ной  степенью  увлажнения,  почвенные  образцы  из  Турции,  США,
Израиля,  Китая,  Ирана;  ризосфера  растений  семейств  злаковых,
лютиковых,  зверобойных,  кирказоновых,  первоцветных,  мако¬
вых,  пасленовых,  маревых,  зонтичных,  луковых,  бобовых,  тык¬
венных;  а  также  сточные  воды  биологических  очистных  соору¬
жений  Уфы,  Стерлитамака,  Орска.
 Для  выделения  бактерий  p.  Pseudomonas  применяли  метод  на¬
копительных  культур  с  использованием  синтетической  питатель¬
ной  среды  Козера  [Смирнов,  Киприанова,  1990]  с  добавлением
 0,1%  пирувата.  Пируват  был  выбран  в  качестве  источника  углеро¬
да  в  связи  с  тем,  что,  по  данным  В.В.  Смирнова  и  Е.А.  Киприано-
вой  [1990],  пировиноградную  кислоту  утилизирует  98%  штаммов
различных  видов  псевдомонад.  pH  среды  устанавливали  перед  сте¬
рилизацией  с  помощью  20%-ного  раствора  NaOH,  pH  6,8-7,2.
 В  качалочные  колбы  объемом  250  мл  со  100  мл  стерильной
среды  Козера  вносили  исследуемые  пробы  в  количестве  1  г  (мл)
и  инкубировали  на  качалке  (п  =  170  об/мин)  при  28-30°  в  течение
5  сут,  после  чего  содержимое  колб  высевали  на  чашки  Петри  с
МПА  для  получения  изолированных  колоний.
 Для  выделения  штаммов  азотобактера  из  почвы  была  ис¬
пользована  одна  из  классических  методик  -  метод  посева  почвен¬
ных  комочков  по  Виноградскому  [Рубенчик,  1960].
 15

Метод  почвенных  комочков  заключается  в  высеве  мелких
комочков  почвы  на  агаризованную  среду,  не  содержащую  азот.
Для  этого  на  среду  Эшби  с  добавлением  следовых  количеств  мо¬
либдена  раскладывали  мелкие  комочки  просеянного  почвенного
образца  (15  комочков  на  1  чашку  Петри),  чашки  с  комочками  ин¬
кубировали  в  термостате  при  температуре  28°  в  течение  4—6  сут.
При  наличии  в  почвенном  образце  азотобактера  на  комочках  по¬
являлся  характерный  слизистый  налет,  преимущественно  состоя¬
щий  из  культур  азотобактера.  С  целью  получения  чистых  изоля¬
тов  проводили  высев  на  чашки  Петри  с  агаризованной  средой
Эшби  для  получения  изолированных  колоний.
 Полученные  изоляты  микроорганизмов  исследовали  на  нали¬
чие  антагонизма  в  отношении  фитопатогенных  грибов.  На  на¬
чальном  этапе  исследований  в  качестве  тест-объекта  был  вы¬
бран  несовершенный  гриб  Bipolaris  sorokiniana  Shoem
(=  Drechslera  sorokiniana  Subram.,  Helminthosporium  sativum  P.,  K.  et
В.)  -  один  из  возбудителей  обыкновенной  корневой  гнили  злако¬
вых  культур  [Пересыпкин,  1989].  Изучение  антагонистических
свойств  изолятов  проводили  в  чашках  Петри  на  среде  ГПА,  со¬
держащей  0,5%  глюкозы;  0,5%  пептона;  0,4%  К2НР04;  0,2%
КН2Р04  и  1,5%  агар-агара  в  дистиллированной  воде,  а  также  на
среде  КГА.  Данные  среды  были  выбраны  с  целью  создания  опти¬
мальных  условий  для  одновременного  роста  культур  гриба  и  ба¬
ктерий.  Суспензию  спор  тест-гриба  высевали  на  агаризованную
среду,  а  исследуемую  культуру  вносили,  делая  посев  уколом  по¬
верх  газона  гриба.  Чашки  инкубировали  в  термостате  в  течение
3  сут  при  температуре  28°.  Антагонистов  выявляли  по  наличию
вокруг  колонии  бактерии  зоны  подавления  роста  тест-гриба.
В  дальнейшем  данную  методику  использовали  во  всех  случаях,
когда  необходимо  было  определить  антагонистическую  актив¬
ность  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера.
 В  качестве  тест-объектов  для  определения  спектра  антагони¬
стического  действия  штаммов  пседомонад  и  азотобактера  служи¬
ли  также  следующие  мицелиальные  грибы:
 1. 	F.  culmorum  ВКМ  844,
 2. 	F.  gibbosum  ВКМ  848,
 3. 	F.  graminearum  ВКМ  1668,
 4. 	F.  nivale  ВКМ  3106,
 5. 	F.  oxysporum  ВКМ  137,
 6. 	F.  semitectum  ВКМ  1938,
 7. 	F.  solani  ВКМ  142,
 8. 	F.  avenaceum  ВКМ  132,
 9. 	Alternaria  alternata.
 10.  Penicillium  funiculosum.
 16

Микромицеты  под  номерами  9,10  и  Bipolaris  sorokiniana  -  ме¬
стные  изоляты  и  хранятся  в  Коллекции  микроорганизмов  Инсти¬
тута  биологии  УНЦ  РАН.
 Для  каждого  штамма  делали  по  5  повторностей  (уколов).  Ко¬
личественная  оценка  антагонистической  активности  культур
представлена  величинами  диаметров  зон  ингибирования  роста
тест-грибов,  мм.
 Определение  культуральных  и  физиолого-биохимических  ха¬
рактеристик  культур  псевдомонад  проводили  по  стандартным
методикам  идентификации  бактерий  p.  Pseudomonas  [Практи¬
кум...,  1976;  Скворцова,  1981;  Методы...,  1984;  Смирнов,  Киприа-
нова,  1990;  Определитель...,  1997].
 Определение  культуральных  и  физиолого-биохимических  хара¬
ктеристик  штаммов  азотобактера  проводили  по  стандартным  мето¬
дикам,  описанным  в  “Определителе  бактерий  Берджи”  [Определи¬
тель...,  1997),  по  идентификационным  признакам,  указанным
Л.И.  Рубенчиком,  Е.Н.  Мишустиным  [Рубенчик,  1960;  Мишустин,
Шильникова,  1968],  а  также  Ф.  Герхардтом  и  др.  [Методы...,  1984].
 Изучение  особенностей  углеродного  питания  псевдомонад
проводили  на  агаризованной  среде  Козера  [Смирнов,  Киприано-
ва,  1990]  либо  для  культуры  азотобактера  -  на  агаризо¬
ванной  среде  Федорова  с  внесением  0,1-1%  исследуемого  источ¬
ника  углерода.  Культуры  бактерий  высевали  на  чашки  штрихом.
Рост  микроорганизма  или  его  отсутствие  отмечали  визуально.
Контролем  служила  среда  без  источника  углерода.
 В  результате  обширного  скрининга  из  различных  источников
было  изолировано  около  2300  штаммов  микроорганизмов  родов
Pseudomonas  и  Azotobacter,  из  которых  антагонистическую  актив¬
ность  проявили  17  изолятов,  наиболее  активные  из  которых
представлены  в  табл.  1.  Как  видно  из  таблицы,  источниками
 Таблица  1.  Источники  выделения  штаммов-антагонистов
 Штамм
 Источник  выделения
 51
 Пашня,  культура  -  сахарная  свекла  Льговская  042,
предшественник  -  пшеница  Харьковская  46,  Мелеузовский
район  РБ
 6
 БОС  ОАО  "Орскнефтеоргсинтез",  аэротенк
 56
 БОС  г.  Стерлитамака,  отстойник  №  2
 17
 БОС  ОАО  "Орскнефтеоргсинтез”,  вход  хозбытовых  стоков
 182
 Супесчаная  почва,  Иглинский  район  РБ
 1
 Пашня,  Уфимский  район  РБ
 3
 Прикорневая  зона  моркови,  Уфимский  район  РБ
 4
 Пашня,  Мечетлинский  район  РБ
 17

Таблица  2.  Спектр  антагонистической  активности  новых  штаммов  бактерий
 родов  Pseudomonas  и  Azotobacter  (3  сут  инкубации  при  28  °С)
 Вид  фитопатоген¬
ных  грибов
 Диаметр  зоны  ингибирования  роста  гриба,  мм
 Р  aureofaciens
ИБ  51
 Р  aureofaciens
ИБ  6
 Р  putida
ИБ  56
 Р  putida
ИБ  17
 F  culmorum
 9,2±2,3
 21,0±3,2
 18,7±1,1
 14,3±2,4
 F  gibbosum
 35,1  ±2,7
 10,3±3,4
 12,2±2,3
 12,5±3,3
 F  graminearum
 7,4±1,1
 -
 -
 -
 F  mvale
 31,4±2,3
 18,8±3,1
 10,0±2,1
 12,8±2,7
 F  oxysporum
 29,1  ±2,5
 10,2±2,8
 7,4±1,3
 11,0±3,9
 F  semi  tectum
 9,3±1,7
 14,5±3,4
 22,3±3,8
 26,7±4,9
 F  solani
 9,1  ±2,3
 10,1  ±2,7
 12,1  ±2,7
 12,3±2,5
 F  avenaceum
 16,1  ±2,5
 8,2±3,2
 8,2±1,4
 9,3±2,5
 Bipolaris
 sorokiniana
 33,7±3,3
 35,0±1,5
 30,3±4,7
 25,0±2,3
 Alternaria
 alternata
 19,2±3,5
 15,5±1,2
 14,0±3,3
 18,0±2,2
 Penicillium
 fumculosum
 31,7±3,2
 10,0±2,6
 14,5±2,4
 Вид  фитопатоген¬
ных  грибов
 Диаметр  зоны  ингибирования  роста  гриба,  мм
 Pseudomonas
sp  ИБ182
 Az  vinelandu
ИБ  1
 Az  vinelandu
ИБ  3
 Az  vinelandu
ИБ  4
 F  culmorum
 18,3±3,2
 21,0±2,1
 22,0±3,0
 20,0±2,5
 F  gibbosum
 8,4±2,1
 20,5±1,9
 6,0±2,2
 18,0±2,2
 F  graminearum
 -
 11,3±1,5
 8,5±2,4
 14,4±1,4
 F  mvale
 10,0±3,3
 9,0±1,7
 5,5±2,3
 9,5±0,5
 F  oxysporum
 10,5±2,2
 12,7±2,2
 -
 10,4±2,1
 F  semitectum
 15,3±1,1
 15,0±2,0
 19,5±1,6
 14,2±1,1
 F  solani
 13,7±2,2
 12,5±2,1
 12,0±1,3
 9,0±0,5
 F  avenaceum
 9,4±1,1
 18,0±1,3
 12,0±1,7
 19,0±2,3
 Bipolaris
 sorokiniana
 25,0±3,3
 28,0±2,0
 19,7±2,5
 21,0±2,1
 Alternaria
 alternata
 14,0±2,5
 30,0±4,3
 12,0±2,1
 14,0±2,0
 Penicillium
 fumculosum
 -
 11,0±3,3
 21,0±1,5
 14,0±1,6
 Примечание
 (-)  означает  отсутствие  подавления  роста  тест-гриба.
 18

Таблица  3.  Морфология  колоний  штаммов-антагонистов  p.  Pseudomonas
при  росте  на  плотных  питательных  средах
 Диагности¬
ческая  среда
 Штаммы  51,6
 Штаммы  56,17,  182
 МПА
 МПА  с  2%
глицерина
 Кинг  А
Кинг  В
 Колонии  круглые  с  ровными  краями,
гладкие,  слабовыпуклые,  непрозрач¬
ные,  ярко-оранжевые  в  центре  с  более
светлой  окантовкой,  слизистой  кон¬
систенции,  диаметром  5-6  мм,  пигмент
ярко-оранжевый,  диффундирующий  в
среду;  также  наблюдается  образование
желто-зеленого,  флуоресцирующего,
диффундирующего  в  среду  пигмента.
Молодые  колонии  беловатые,  красно¬
оранжевый  пигмент  появляется  с  уве¬
личением  возраста  культуры
 Колонии  крупнее,  интенсивнее  окра¬
шены,  чем  на  МПА,  более  интенсивная
диффузия  в  среду  оранжевого  пигмента
 Синий  пигмент  отсутствует
 Образуется  желто-зеленый,  флуоресцир
 Колонии  круглые  с
ровными  краями,
гладкие,  слабовы¬
пуклые,  непрозрач¬
ные,  серовато-белые,
диаметром
5-7  мм,  пигмент
желто-зеленый,
флуоресцирующий,
диффундирующий
вереду
 ующий  пигмент
 Таблица  4.  Особенности  роста  штаммов-антагонистов  p.  Pseudomonas
в  жидкой  культуре  и  на  скошенном  агаре
 Штамм
 Рост  в  жидкой  культуре  (МПБ)
 Рост  на  скошенном  ага¬
ре  (МПА)
 51
 Тонкая,  сплошная,  складчатая  пленка
 Штрих  обильный,
 6
 Тонкая,  сплошная,  складчатая  пленка
 сплошной  с  ровным
 56
 Обильный,  хлопьевидный  осадок  и
тонкая,  сплошная,  рыхлая  пленка
 краем
 17
 Обильный,  плотный,  дискообразный
осадок
 182
 Обильный,  плотный,  дискообразный
осадок
 выделения  новых  штаммов  служили  как  традиционные  природ¬
ные  биотопы,  обеспечивающие  высокое  биоразнообразие  мик¬
робного  населения  -  почва  ризосферы,  так  и  антропогенные  эко¬
системы.  Очевидно,  микробиота  биологических  очистных
сооружений,  осуществляющая  жизнедеятельность  за  счет  разно¬
образных  субстратов,  -  перспективный  источник  штаммов,  обла¬
дающих  необходимыми  свойствами.
 19

Таблица  5.  Морфологические  признаки  штаммов-антагонистов  p.  Azotobacter
 Штамм
 Морфология  на  среде  Эшби
 Морфология  на  КГ  А
 На  24-48  ч  роста  колонии
слизистые,  прозрачные,  круглые
диаметром  3  мм,  тянутся  за
петлей.  Клетки  -  длинные  тонкие
палочки,-  1,5  х  0,5  мкм,  под¬
вижные
 На  72  ч  колонии  морщинистые  с
неровными  краями,  слегка
вросшие  в  агар
 В  культуре  встречаются  палочки,
1,5  х  1  мкм  клостридиальной
формы,  неподвижные,  цисты
 На  24-48  ч  роста  колонии
слизистые  прозрачные,  круглые,
диаметром  3  мм,  тянутся  за  пет¬
лей.  Клетки  представляют  собой
толстые  палочки  1,5  х  0,7  мкм  с
закругленными  концами,  подвиж¬
ные
 На  72  ч  колонии  круглые,
диаметром  5  мм,  выпуклые,  с
ровными  краями,  слизистые  с
блестящей  поверхностью,  про¬
зрачные.  В  культуре  встречаются
палочки,  1,5  х  1  мкм,  клостриди¬
альной  формы,  неподвижные,
цисты
 На  24—48  ч  колонии  слизистые,
прозрачные,  слегка  тянущиеся
за  петлей,  выпуклые  с  ровными
краями,  диаметром  1-2  мм.  Клет¬
ки  -  мелкие  палочки,  0,6  мкм,  с
закругленными  концами,  подвиж¬
ные
 На  72  ч  колонии  круглые,  диа¬
метром  5  мм,  выпуклые  с  ров¬
ными  краями,  слизистые  с  блес¬
тящей  поверхностью,  прозрач¬
ные.  Палочки  0,7  мкм,  неподвиж¬
ные
 На  24-48  ч  колонии
круглые,  диаметром  6  мм,
выпуклые,  белого  полу¬
прозрачного  цвета,  кон¬
систенция  тягучая,  мягкая
 Клетки  представляют  со¬
бой  мелкие,  подвижные
палочки,  1,5  х  1  мкм
 На  24-48  ч  колонии
круглые,  диаметром  6  мм,
выпуклые,  белого  полу¬
прозрачного  цвета,  консис¬
тенция  тягучая,  мягкая.
Клетки  представляют  со¬
бой  мелкие  подвижные  па¬
лочки,  1,5  х  2  мкм
 На  24—48  ч  колонии  круг¬
лые,  диаметром  5  мм,  плос¬
кие  с  неровными  краями,
непрозрачные,  цвета  слоно¬
вой  кости,  консистенция
маслянистая,  мягкая.  Мел¬
кие,  0,7  мкм,  малоподвиж¬
ные  палочки  с  тупыми
концами
 На  48-72  ч  образуют  цисты
 20

Для  дальнейших  исследований  были  отобраны  пять  штаммов
p.  Pseudomonas:  51,  6,  56,  17,  182  и  три  штамма  p.  Azotobacter:  1,  3,
 4, 	которые  продемонстрировали  высокую  антагонистическую
активность  в  отношении  широкого  спектра  фитопатогенных  гри¬
бов  (табл.  2,  рис.  1,  2;  см.  цв.  вкл.).
 Определение  культуральных  и  физиолого-биохимических  ха¬
рактеристик  культур-антагонистов  проводили  стандартными  ме¬
тодами.  Морфологию  колоний  штаммов-антагонистов
p.  Pseudomonas  на  питательных  средах  определяли  после  4—5  сут
роста  при  28°  (табл.  3).  Особенности  роста  штаммов  в  жидкой
культуре  (в  МПБ)  и  на  скошенном  агаре  МПА  представлены  в
табл.  4.  Морфологию  колоний  штаммов-антагонистов
p.  Azotobacter  определяли  после  2-3  сут  роста  при  28°  на  пита¬
тельных  средах  КГА  и  Эшби  (табл.  5).
 Данные,  характеризующие  физиолого-биохимические  свой¬
ства  штаммов-антагонистов,  представлены  в  табл.  6-10.
 Анализ  физиолого-биохимических  признаков  показал,  что
выделенные  штаммы  51,  6,  56,  17,  182  представляют  собой  под¬
вижные  прямые  мелкие  клетки  палочковидной  формы;  спор  не
образуют;  грам-отрицательные;  аэробы;  оксидазная  реакция  -
положительная;  в  органических  факторах  роста  не  нуждаются;
каталазоположительные  (см.  табл.  6)  и  могут  быть  отнесены  к
бактериям  p.  Pseudomonas.
 По  ряду  признаков,  используемых  для  дифференциации  псев¬
домонад,  таких  как  образование  оранжевого  пигмента,  рост  при
4°,  наличие  аргининдигидролазной  активности,  синтез  левана  из
сахарозы,  гидролиз  желатины  и  лецитина,  липолиз  Твина-80,  не¬
способность  к  денитрификации  и  гидролизу  крахмала;  утилиза¬
ция  сахарозы,  галактозы,  DL-триптофана,  L-аргинина,  фенил¬
аланина,  а  также  неспособность  использовать  в  качестве  источни¬
ка  углерода  сорбит,  адипиновую  кислоту,  DL-метионин,  этанол,
штаммы  51  и  6  были  отнесены  к  представителям  вида  P.  aureofa-
ciens.  Перечисленные  выше  признаки  характерны  для  более  чем
80%  штаммов  данного  вида  [Скворцова,  1981;  Смирнов,  Киприа-
нова,  1990;  Определитель...,  1997].
 Ряд  свойств,  таких  как  образование  желто-зеленого,  флуо¬
ресцирующего,  диффундирующего  в  среду  пигмента,  рост  при  4°,
наличие  аргининдигидролазы,  а  также  отсутствие  желатиназной,
амилолитической,  лецитиназной,  левансахаразной  активностей,
неспособность  к  денитрификации;  утилизация  глюкозы,  бутанола,
пропионовой  кислоты,  L-аргинина,  DL-лейцина,  DL-a-аланина,
DL-валина,  а  также  неспособность  использовать  в  качестве  ис¬
точника  углерода  адипиновую,  антраниловую,  малеиновую  кис-
 21

Таблица  6.  Физиолого-биохимические  свойства  штаммов  -  антагонистов
 p.  Pseudomonas
 Признак
 Штамм  51
 Штамм  6
 Штамм  56
 Штамм  17
 Штамм  182
 Морфологичес¬
 Подвиж¬
 Подвиж¬
 Подвиж¬
 Подвиж¬
 Подвиж¬
 кие  свойства
 ные
 ные
 ные
 ные
 ные
 клеток
 прямые
 прямые
 прямые
 прямые
 прямые
 мелкие
 мелкие
 мелкие
 мелкие
 мелкие
 палочки
 палочки
 палочки
 палочки
 палочки
 Окраска  по
Граму
 Грам  (-)
 Грам  (-)
 Г  рам  (-)
 Грам  (-)
 Г  рам  (-)
 Пастеризация
(80  °,  10  мин)
 Рост  (-)
 Рост  (-)
 Рост  (-)
 Рост  (-)
 Рост  (-)
 Флуоресцирую¬
щие  диффунди¬
рующие  пигмен¬
ты
 +
 +
 +
 +
 +
 Нефлуоресци¬
рующие  диф¬
фундирующие
пигменты
 +(оранж.)
 +(оранж.)
 Рост  при  4  °
 +
 +
 +
 +
 +
 Потребность  в
органических
факторах  роста
 Отношение  к
 Аэроб¬
 Аэроб¬
 Аэроб¬
 Аэроб¬
 Аэроб¬
 кислороду
 ный  рост
 ный  рост
 ный  рост
 ный  рост
 ный  рост
 Каталаза
 +
 +
 +
 +
 +
 Оксидаза
 +
 +
 +
 +
 +
 Денитрификация
 -
 -
 -
 -
 -
 Аргининдигид-
 ролаза
 +
 +
 +
 +
 +
 Образование
Левана  из
сахарозы
 +
 +
 Гидролиз
 желатины
 +
 +
 —
 —
 —
 Г  идролиз
крахмала
 -
 -
 -
 —
 —
 Гидролиз
 лецитина
 +
 +
 —
 —
 +
 Липолиз
 Твина-80
 +
 +
 -
 —
 —
 Рост  в  присут¬
ствии  3%  NaCl
 +
 +
 +
 +
 +
 Примечание.  (+)  -  наличие  признака;  (-)  -  <
 отсутствие  признака.
 22

Таблица  7.  Характеристика  использования  питательных  субстратов
штаммами-антагонистами  p.  Pseudomonas
 Источник  углерода
 Штамм  51
 Штамм  6
 Штамм  56
 Штамм  17
 Штамм  182
 Глюкоза
 +*
 +*
 +*
 +*
 +*
 Ксилоза
 +*
 +*
 +*
 +*
 +*
 Арабиноза
 +*
 -
 +*
 +*
 -
 Сахароза
 +*
 +*
 +
 +
 +
 Мальтоза
 +
 +
 +
 +
 -
 Раффиноза
 +*
 +*
 +
 +*
 +
 Фруктоза
 +*
 +*
 +*
 +
 +
 Лактоза
 -
 +
 +*
 +*
 +
 Рамноза
 +
 -
 +
 +*
 +
 Г  алактоза
 +*
 +*
 +*
 +*
 +*
 Глицерин
 +
 +
 +
 +
 +
 Этанол
 -
 -
 +
 +
 +
 Пропанол
 -
 +
 -
 +
 +
 Бутанол
 +
 +
 +
 +
 +
 Гексанол
 +
 +
 +
 +
 +
 Маннит
 +
 +
 -
 -
 -
 Сорбит
 -
 -
 -
 -
 -
 L-инозит
 -
 -
 -
 -
 -
 Пропионовая
 +
 +
 +
 +
 -
 кислота
 Малеиновая
 -
 -
 -
 -
 +
 кислота
 Адипиновая
 -
 -
 -
 -
 -
 кислота
 Антраниловая
 +
 -
 -
 -
 -
 кислота
 Янтарная
 +
 +
 +
 +
 +
 кислота
 а-кетоглутаро-
 +
 +
 +
 +
 +
 вая  кислота
 Изомасляная
 -
 +
 -
 +
 -
 кислота
 Ацетат
 +
 +
 +
 +
 -
 Пируват
 +
 +
 +
 +
 -
 Лактат
 +
 +
 +
 +
 -
 23

Таблица  7  (окончание)
 Источник  углерода
 Штамм  51
 Штамм  6
 Штамм  56
 Штамм  17
 Штамм  182
 Цитрат
 +
 +
 +
 +
 +
 Оксалат
 -
 -
 -
 -
 -
 DL-треонин
 -
 -
 +
 -
 -
 DL-серин
 +
 +
 +
 -
 +
 DL-метионин
 -
 -
 -
 -
 -
 DL-цистеин
 -
 -
 -
 -
 -
 DL-лейцин
 +
 +
 +
 +
 +
 L-аргинин
 +
 +
 +
 +
 +
 DL-a-аланин
 +
 +
 +
 +
 +
 DL-валин
 +
 +
 +
 +
 +
 DL-триптофан
 +
 +
 -
 -
 -
 L-пролин
 +
 +
 +
 +
 +
 DL-лизин
 +
 +
 +
 +
 +
 L-тирозин
 +
 +
 +
 +
 +
 D-аспарагин
 -
 -
 -
 -
 -
 L-аспарагин
 +
 +
 +
 +
 +
 Фенилаланин
 +
 -
 +
 +
 +
 Тетрадекан
 -
 -
 -
 -
 -
 Октадекан
 -
 -
 -
 -
 -
 Ацетамид
 -
 -
 -
 -
 -
 Формальдегид
 -
 -
 -
 -
 +
 Фенол
 -
 -
 -
 -
 -
 *  Утилизация  сахаров  с  образованием  кислоты;  (+)  -  субстрат  используется  в  качестве
 источника  углерода,  (-)  -  субстрат  не  используется  в  качестве  источника  углерода.
 лоты,  сорбит,  ацетамид,  позволили  отнести  изоляты  56  и  17  к
представителям  вида  P.  putida.  Упомянутые  выше  признаки  ха¬
рактерны  для  более  чем  80%  штаммов  данного  вида  [Скворцова,
1981;  Смирнов,  Киприанова,  1990;  Определитель...,  1997].
 Гетерогенность  штаммов  Р.  putida  в  отношении  источников
углеродного  питания  нашла  отражение  в  том,  что  в  пределах  ви¬
да  выделены  биовары  А  и  В.  Изучение  использования  выделен¬
ными  штаммами  56  и  17  ряда  источников  углерода  и  сопоставле¬
ние  полученных  результатов  с  данными  литературы  [Смирнов,
Киприанова,  1990]  позволило  сделать  предварительные  выводы
 24

Таблица  8.  Потребление  некоторых  источников  углерода  штаммами  56  и  17
в  сравнении  с  биоварами  А  и  В  P.  putida
 Источник
 углерода
 Биовар  А
 Биовар  В
 Штамм  56
 Штамм  17
 Сорбит
 -
 +
 -
 -
 Маннит
 в
 в
 -
 -
 Галактоза
 в
 в
 +
 +
 Фенол
 -
 в
 -
 -
 Антранило-
вая  кислота
 -
 -
 -
 -
 Триптофан
 +
 -
 -
 -
 Метионин
 -
 +
 -
 -
 Цистеин
 -
 +
 -
 -
 Примечание,  в  -  признак  варьирует;  (+)  -  i
 субстрат  используется  в  качестве
 источника  углерода;  (-)  -  субстрат  не  используется  в  качестве  источника  углерода.
 о 	том,  что  фенотипически  штаммы  56  и  17  ближе  к  биовару  А
(табл.  8).
 Таким  образом,  по  совокупности  признаков  новые  штаммы
51  и  6  были  идентифицированы  как  P.  aureofaciens  и  депонирова¬
ны  в  Коллекцию  микроорганизмов  Института  биологии  УНЦ
РАН  под  №  ИБ  51  и  №  ИБ  6;  штаммы  56  и  17  были  идентифици¬
рованы  как  P.  putida  и  депонированы  в  Коллекцию  микроорга¬
низмов  Института  биологии  УНЦ  РАН  под  №  ИБ  56  и  №  ИБ  17.
 У  культуры  182  по  совокупности  морфологических,  культу¬
ральных  и  биохимических  признаков  не  удалось  однозначно  уста¬
новить  видовую  принадлежность.  Этот  изолят  по  своим  свойст¬
вам  схож  с  P.  putida,  но  в  отличие  от  представителей  этого  вида
гидролизует  лецитин.  Вследствие  сказанного  выше  штамм  был
депонирован  в  Коллекцию  микроорганизмов  Института  биоло¬
гии  УНЦ  РАН  как  Pseudomonas  sp.  ИБ  182.
 В  соответствии  с  культуральными  свойствами  штаммы  1,  3,4
были  отнесены  к  p.  Azotobacter.  Среди  важнейших  диагностиче¬
ских  характеристик,  использованных  в  процессе  идентификации
данных  изолятов,  следует  перечислить  следующие  свойства:
грам-отрицательные,  на  твердых  питательных  средах,  не  содер¬
жащих  азотных  соединений,  штаммы  1,  3,  4  образуют  крупные
слизистые,  иногда  морщинистые  колонии  [Рубенчик,  I960];  отли¬
чаются  крайне  широким  спектром  потребления  источников
углерода  [Мишустин,  Шильникова,  1968],  растут  на  среде  с  0,15%
бензойнокислого  натрия.  Не  растут  (штаммы  1,3)  или  проявляют
слабый  рост  (штамм  4)  на  белковых  средах,  спор  не  образуют,  но
имеет  место  цистообразование,  аэробы,  фиксируют  молекулярный
 25

Таблица  9.  Физиолого-биохимические  свойства  штаммов-антагонистов
 p.  Azotobacter
 Физиолого-биохимическая
 характеристика
 Штамм  1
 Штамм  3
 Штамм  4
 Окраска  по  Г  раму
 -
 -
 -
 Спорообразование  (80°,  15мин)
 -
 -
 -
 Образование  цист  (50°,  15  мин)
 +
 +
 +
 Рост  в  анаэробных  условиях
 -
 -
 -
 Способность  к  нитрификации
 -
 -
 -
 Способность  к  денитрификации
 -
 -
 +
 Окислительно-восстановительные  ферменты
 Оксидаза
 -
 -
 -
 Каталаза
 +
 +
 +
 Дегидрогеназа
 -
 -
 -
 Протеолитические  ферменты
 Гидролиз  желатины
 -
 -
 -
 Гидролиз  казеина
 +
 +
 +
 Рост  на  МПА
 -
 -
 +
 Липолитические  ферменты
 Липолиз  Твина-80
 +
 +
 +
 Гидролиз  лецитина
 +
 +
 -
 Примечание.  (+)-  наличие  признака;  (-)  -  отсутствие  признака.
 азот,  в  молодой  культуре  все  штаммы  подвижны,  имеют  форму
палочек  с  закругленными  концами  [Рубенчик,  1960]
(табл.  9,  10).
 Согласно  “Определителю  бактерий  Берджи”  из  всех  видов
азотобактера  только  бактерии,  относящиеся  к  Az.  vinelandii,  ис¬
пользуют  рамнозу  в  качестве  источника  углерода;  кроме  того,
представители  этого  вида  на  среде,  дефицитной  по  железу,  обра¬
зуют  флуоресцирующий  пигмент.  Оба  эти  свойства  были  отме¬
чены  у  всех  трех  выделенных  изолятов,  предварительно  отнесен¬
ных  к  p.  Azotobacter  (см.  табл.  9,  10).
 Еще  одной  из  отличительных  черт,  характерных  для  бакте¬
рий  вида  Az.  vinelandii,  является  выделение  экзополисахаридов  на
богатых  питательных  средах  [Пат.  РФ  2073712;  Horan  et  al.,  1981;
Anderson  et  al.,  1987;  Brivonese,  Sutherland,  1989;  Beale,  Foster,
1996;  Parente  et  al.,  1998;  Vargas-Garcia  et  al.,  2003;  и  др.].  Штаммы
 1 	и  3  проявили  эту  способность  при  росте  в  жидкой  культуре  на
 26

Таблица  10.  Способность  штаммов  азотобактера  к  росту
на  различных  источниках  углеродного  питания
 Используемый  источник  углерода
 Штамм  1
 Штамм  3
 Штамм  4
 Глюкоза
 +
 +
 +
 Сахароза
 +
 +
 +
 Маннит
 +
 +
 +
 Фруктоза
 +
 +
 +
 Сорбит
 +
 +
 -
 Глицерин
 +
 +
 +
 Мальтоза
 +
 +
 +
 Декстрин
 +
 +
 +
 Арабиноза
 +
 +
 -
 Ксилоза
 +
 +
 +
 Маноза
 +
 +
 +
 Г  алактоза
 +
 +
 +
 Лактоза
 +
 +
 +
 Рамноза
 +
 +
 +
 Мезо-инозитол
 +
 +
 +
 Капронат
 +
 +
 +
 Капилат
 +
 +
 +
 Манитол
 +
 +
 +
 Малонат
 +
 +
 +
 Натрий  бензойнокислый
 +
 +
 +
 Натрий  уксуснокислый
 +
 +
 +
 Калий  виннокислый
 +
 +
 +
 L-инозит
 +
 +
 +
 Цистеин
 +
 -
 +
 Этанол
 +
 +
 +
 Леван
 +
 +
 +
 Твин
 +
 +
 +
 Крахмал
 +
 +
 +
 Пировиноградная  кислота
 -
 -
 -
 Янтарная  кислота
 -
 -
 -
 а-кетоглуторат
 +
 +
 +
 Изомасляная  кислота
 -
 +
 +
 Малеиновая  кислота
 -
 -
 +
 Сульфаниловая  кислота
 +
 +
 +
 Пропионовая  кислота
 -
 -
 +
 Щавелевая  кислота
 -
 -
 -
 Цитрат
 -
 -
 +
 а-аминобензойная  кислота
 -
 -
 +
 Муравьиная  кислота
 -
 -
 -
 Примечание.  (+)  -  субстрат  используется  в  качестве  источника  углерода;
(-)  -  субстрат  не  используется  в  качестве  источника  углерода.
 27

картофельно-глюкозной  среде  и  на  среде  Федорова  с  мелассой  в
качестве  источника  углерода,  штамм  4  на  этих  средах  также  про¬
дуцировал  экзополисахарид,  но  в  меньшей  степени.
 Таким  образом,  по  совокупности  признаков  новые  штаммы  1,
 3, 	4  были  идентифицированы  как  Az.  vinelandii  и  депонированы  в
Коллекцию  микроорганизмов  Института  биологии  УНЦ  РАН
под  №  ИБ  1,  №  ИБ  3,  №  ИБ  4.
 Таким  образом,  были  выделены  и  идентифицированы  до  ви¬
да  пять  новых  штаммов  бактерий-антагонистов  p.  Pseudomonas:
P.  aureofaciens  ИБ  51,  P.  aureofaciens  ИБ  6,  P.  putida  ИБ  56,  P.  puti¬
da  ИБ  17,  Pseudomonas  sp.  ИБ  182  и  три  новых  штамма
p.  Azotobacter:  Az.  vinelandii  ИБ  1,  Az.  vinelandii  ИБ  3,  Az.  vinelandii
ИБ  4.

БАКТЕРИИ  РОДОВ  PSEUDOMONAS  И  AZOTOBACTER
КАК  ПРЕДСТАВИТЕЛИ  ГРУППЫ  PGPR
 Псевдомонады,  в  первую  очередь  флуоресцирующие,  синте¬
зируют  целый  ряд  соединений,  стимулирующих  рост  растений
либо  угнетающих  развитие  фитопатогенов.  Стимуляторы  роста
растений,  образуемые  псевдомонадами,  представлены,  во-пер-
вых,  фитогормонами,  такими  как  ИУК  и  цитокинины,  и,  во-вторых,
сидерофорами  -  низкомолекулярными  веществами,  которые
облегчают  транспорт  железа  как  в  микробные  клетки,  так  и  в
клетки  корня.  Кроме  того,  некоторые  штаммы  псевдомонад  спо¬
собны  улучшать  азотное  и  фосфорное  питание  растений.  К  мета¬
болитам,  ингибирующим  развитие  почвенных  фитопатогенов,
относятся  антибиотики,  такие  как  феназины,  флороглюцинол,
пиолютеорин,  пирролнитрин,  оомицин  А.  Некоторые  виды  псев¬
домонад  выделяют  такие  токсичные  летучие  соединения,  как  ам¬
миак  и  циановодород.
 У  ризосферных  псевдомонад  наиболее  хорошо  изучена  спо¬
собность  к  синтезу  ИУК,  стимулирующей  развитие  корневой  си¬
стемы  растений.
 N.S.  Iacobellis  и  др.  [1990]  осуществили  выделение  биологиче¬
ски  активных  соединений  из  Pseudomonas  syringae  pv.  papulans,
P.  amygdali  и  P.  syringae.  Из  подкисленной  КЖ  бактерий  P.  amyg-
dali  выделены  ИУК,  ее  метиловый  эфир,  m/мшс-зеатин,  изопен-
тениладенин  и  дигидрозеатин.  При  исследовании  щелочного  экс¬
тракта  выделен  и  охарактеризован  новый  цитокинин  -  2-дезокси-
зеатинрибозид.
 Е.А.  Мордухова  и  др.  [1991],  изучив  коллекцию  из  216  штам¬
мов  ризосферных  бактерий  p.  Pseudomonas  на  способность  проду¬
цировать  ИУК,  выявили  гетерогенность  популяции  псевдомонад
по  этому  признаку.
 Псевдомонад,  выделенных  из  ризосферы  разных  растений  на
обедненной  азотом  среде,  испытывали  на  их  способность  к  обра¬
зованию  сидерофоров,  факторов  роста,  ферментов.  Большинст¬
во  штаммов  синтезировали  ИУК,  9  из  40  псевдомонад  оказали
значительное  влияние  на  рост  растений  [Forlani  et  al.,  1995].
 М.О.  Холмецкая  и  др.  [1996]  исследовали  способность  к  син¬
тезу  ИУК  у  фитопатогенных  видов  псевдомонад.  Изучение  взаи¬
 29

мосвязи  между  патогенностью  и  ИУК-продуцирующей  способно¬
стью  штаммов  p.  Pseudomonas  не  выявило  явной  корреляции  этих
признаков.
 Изучение  динамики  синтеза  ИУК  и  условий,  оптимальных
для  накопления  в  среде  максимума  гормона,  показало,  что  син¬
тез  фитогормона  псевдомонадами  стимулируется  добавлением
в  среду  триптофана  или  триптамина  и  подавляется  ионами  ам¬
мония  [Мордухова  и  др.,  1991].  Выращивание  в  периодическом
режиме  продуцентов  ИУК  ризосферных  бактерий  Р.  fluorescens
20  и  P.  putida  23  выявило  два  максимума  в  накоплении  ИУК,  со¬
ответствующих  9  и  40  ч  культивирования  [Олюнина,  Шабаев,
1996].
 При  изучении  влияния  ИУК  ризосферных  псевдомонад  на
растения  в  условиях  водной  культуры  была  обнаружена  индук¬
ция  выделения  фенолов  корнями  кукурузы  при  введении  ИУК  в
среду  выращивания.  Предполагается,  что  выделение  в  среду  фе¬
нолов  является  ответной  реакцией  растения  на  воздействие  со
стороны  ростстимулирующих  бактерий  p.  Pseudomonas  [Шабаев
и  др.,  1999].
 Исследования  синтеза  ИУК  у  псевдомонад  показали  возмож¬
ность  получения  генетически  модифицированных  штаммов
PGPR  Pseudomonas,  способных  к  повышенному  синтезу  ИУК.
Это  может  быть  осуществлено  за  счет  переноса  в  PGPR
Pseudomonas  некоторых  плазмид  биодеградации  нафталина,  что
обусловлено  наличием  в  составе  этих  плазмид  гена,  ответствен¬
ного  за  синтез  нафталиндиоксигеназы  (первого  фермента  в  пути
окисления  нафталина),  вовлекаемого  в  процесс  биосинтеза  ИУК
[Мордухова  и  др.,  1998].
 Существует  огромное  число  публикаций,  посвященных  де¬
монстрации  роли  сидерофоров,  продуцируемых  флуоресцирую¬
щими  псевдомонадами,  в  подавлении  грибов  p.  Pythium,  комплек¬
са  микромицетов,  вызывающих  корневые  гнили,  Colletotrichum
spp.  и  др.  [Swinburne,  1985;  Campbell  et  al.,  1986;  Weller,  Cook,  1986;
Becker,  Cook,  1988;  Loper,  1988;  Comelis  et  al.,  1990].  В  своей  рабо¬
те  Cook  и  др.,  [1986]  подчеркивают,  что  мутанты  псевдомонад,
утратившие  способность  к  синтезу  сидерофоров,  лишаются  фун¬
гицидной  активности,  хотя  сохраняют  способность  к  колониза¬
ции  почвы  и  корней  пшеницы.
 По  мнению  следующих  авторов  [АЫ  et  al.,  1986;  Colin,  Maraite,
1987;  Jacque  et  al.,  1990],  исследование  биохимии  сидерофоров
псевдомонад  еще  не  завершено,  а  их  роль  в  борьбе  с  патогенами
растений  далеко  не  так  одназначна.  Четкой  корреляции  между
способностью  микроорганизмов  к  синтезу  сидерофоров,  их  кон¬
центрацией  и  антагонистической  активностью  до  сих  пор  не  вы-
 зо

явлено.  Так,  свободные  от  железа  хелатообразующие  соедине¬
ния  штамма  P.  fluorescens  не  влияли  на  прорастание  эндокони¬
дий,  хламидоспор  и  мицелиальный  рост  патогена,  но  в  компле¬
ксе  с  Fe3+  сильно  подавляли  мицелиальный  рост  и  прорастание
спор.  Свободное  железо  было  менее  токсично  по  отношению  к
патогенам,  чем  связанные  с  железом  хелатообразующие  соеди¬
нения.  Но  последние,  по  мнению  авторов  [Ahl  et  al.,  1986],  ток¬
сичны  не  потому,  что  они  истощают  запасы  железа,  а  из-за  то¬
го,  что  увеличивают  его  концентрацию  до  наиболее  токсичного
уровня.
 Отмечается  роль  сидерофоров  и  в  подавлении  различных
бактериальных  поражений  [Смирнов  и  др.,  1990;  Henry  et  al.,
 1991].  М.В.  Henry  и  др.  [1991]  считают,  что  железохелатирующие
сидерофоры,  образуемые  антагонистами,  нельзя  принимать  за
единственный  фактор,  ответственный  за  угнетение  роста  патоге¬
на,  если  бактериальные  штаммы  выделяют  антибиотические
вещества.
 В  настоящее  время  существует  большое  число  публика¬
ций,  посвященных  изучению  способности  представителей
p.  Pseudomonas  к  фиксации  атмосферного  азота.  Особенно  ин¬
тенсивно  изучаются  вопросы  эффективности  применения  азот-
фиксаторов-псевдомонад  в  современном  сельском  хозяйстве.
 При  инокуляции  азотфиксирующими  псевдомонадами  уста¬
новлено  усиление  нитрогеназной  активности  в  ризосфере  раз¬
личных  сельскохозяйственных  культур  (как  бобовых,  так  и  не
бобовых)  и  увеличение  их  урожая  [Бурлуцкая  и  др.,  1991;  Лукин
и  др.,  1995;  Смолин,  Сафрина,  1995;  Шабаев  и  др.,  1998,  1999;
Kloepper,  Schroth,  1981;  Suslov,  Schroth,  1982;  Kloepper  et  al.,
1988].
 В  лабораторном  опыте  без  растений  было  показано,  что  вне¬
сение  в  почву  азотфиксирующих  бактерий  P.  putida  23  повышает
потенциальную  активность  азотфиксации.  Изучение  выживания
интродуцированных  в  ризосферу  столовой  свеклы  бактерий
P.  putida  23  показало,  что  численность  меченых  бактерий  в  ризо-
плане  снижалась  к  концу  вегетационного  периода.  Вероятно,  рас¬
тения  используют  фиксированный  бактериями  азот  атмосферы
как  в  виде  их  прижизненных  выделений,  так  и  после  отмирания
клеток,  о  чем  свидетельствуют  данные  по  снижению  численно¬
сти  псевдомонад  в  ризосфере  на  поздних  стадиях  роста  столовой
свеклы  [Смолин,  Сафрина,  1995].
 Повышение  урожая  рапса,  столовой  свеклы,  а  также  сои
при  применении  псевдомонад  исследователи  объясняют  тем,
что  наряду  с  улучшением  азотного  питания  растений  происхо¬
дит  также  увеличение  выноса  ими  других  макро-  и  микроэле¬
 31

ментов  [Минеев  и  др.,  1991;  Смолин,  Шабаев,  1992;  Шабаев,
Смолин,  1999].
 Изучение  влияния  бактерий  p.  Pseudomonas  на  физиолого¬
биохимические  процессы  в  растениях  показало,  что  усиление
азотфиксации  в  ризосфере  столовой  свеклы  и  редиса  при  иноку¬
ляции  псевдомонадами  сопровождалось  повышением  интенсив¬
ности  фотосинтеза  в  результате  увеличения  площади  листьев
[Минеев  и  др.,  1992;  Шабаев  и  др.,  1998].
 При  изучении  влияния  инокуляции  бобовых  бактериями
p.  Pseudomonas  установлено  усиление  клубенькообразования  у
сои  [Nishijima  et  al.,  1988]  и  фасоли  [Grimes,  Mount,  1984].
 Эффект  от  применения  микроорганизмов-диазотрофов  в  зна¬
чительной  степени  зависел  от  формы  и  доз  минеральных  удобре¬
ний.  Установлено,  что  при  внесении  нитратного  азота  в  отличие
от  его  аммонийной  формы  интродукция  стимулирующих  рост
растений  ризосферных  псевдомонад  сопровождается  большим
увеличением  размера  популяции  данных  бактерий  [Samiguet
et  al.,  1992].
 По  данным  ряда  исследователей,  микроорганизмы-стимуля-
торы  роста  не  являются  альтернативой  минеральным,  в  том  чис¬
ле  азотным,  удобрениям.  Как  правило,  урожаи  сельскохозяйст¬
венных  культур,  инокулированных  данными  микроорганизмами,
ниже,  чем  при  внесении  в  почву  минеральных  удобрений.  Но  в  то
же  время  применение  повышенных  доз  минеральных  удобрений
с  целью  получения  высоких  урожаев  сельскохозяйственных
культур  приводит  к  изменению  химического  состава  раститель¬
ной  продукции  [Алексеев,  1978].  Инокуляция  овощных  культур
ризосферными  псевдомонадами  не  заменяла  полностью  азотное
удобрение,  но  позволяла  снижать  в  1,5-2  раза  дозы  минеральных
удобрений  без  существенного  снижения  урожая  [Минеев  и  др.,
1991;  Шабаев  и  др.,  1998;  Шабаев,  Смолин,  1999].  При  увеличении
уровня  минерального  питания  инокуляция  сельскохозяйственных
культур  микроорганизмами  не  приводила  к  дальнейшему  увели¬
чению  урожая.  Таким  образом,  по  мнению  авторов,  целесообраз¬
ность  применения  культур  бактерий  связана,  в  первую  очередь,  с
внесением  в  почву  низких  доз  азотных  удобрений.
 Бактерии  p.  Azotobacter  являются  одним  из  эффективных  сти¬
муляторов  для  разных  видов  растений  [Антипчук  и  др.,  1985;  Са-
дыков  и  др.,  1985;  Хабиров,  1993],  что  объясняется  их  способно¬
стью  фиксировать  молекулярный  азот,  синтезировать  витамины
и  гормоны  роста  [Антипчук  и  др..,  1985],  проявлять  антагонисти¬
ческую  активность  против  фитопатогенов  [Мишустин  и  др.,  1969;
Придачина  и  др.,  1982;  Антипчук  и  др.,  1985].  Показано,  что  бак¬
терии  Az.  chroococcum  способны  подавлять  развитие  широкого
 32

спектра  фитопатогенных  грибов  [Pandey,  Kumar,  1990].  Кроме
того,  при  использовании  биоудобрений  на  основе  азотобактера
было  отмечено  увеличение  количества  и  качества  урожая  [Че-
мерисов,  1988],  а  также  накопление  азота  в  почве  [Шабаев  и  др.,
1990].
 Положительное  влияние  азотобактера  на  высшие  растения
связывают  с  его  способностью  улучшать  азотное  питание  рас¬
тений  и  продуцировать  биологически  активные  вещества,  пода¬
вляющие  патогены  и  стимулирующие  рост  растений.  Степень
положительного  влияния  интродуцированных  штаммов  азото¬
бактера  на  сельскохозяйственные  растения  часто  тесно  зависит
от  вида  и  даже  сорта  растения  и  способности  штамма  колонизи¬
ровать  корни  в  течение  вегетационного  периода.  Бактерии
p.  Arotobacter  -  свободноживущие  микроорганизмамы,  т.е.  они
не  способны  проникать  в  ткани  растений,  обитая  в  ризосфере
растений,  а  вплотную  зависят  от  вида  и  величины  корневого
опада,  конкурируя  с  остальными  обитателями  ризосферы  за  пи¬
тательные  вещества.
 Большое  количество  работ  посвящено  положительному
влиянию  инокуляции  посадочного  материала  сельскохозяйст¬
венных  культур  штаммами  азотфиксирующих  бактерий,  в  том
числе  бактерий  p.  Azotobacter.  Так,  положительное  влияние  на
прорастание  и  устойчивость  к  заболеваниям  семян  огурца  было
отмечено  на  уровне  высокого  инфекционного  фона  [Антипчук
и  др.,  1985],  в  условиях  закрытого  грунта  инокуляция  смешан¬
ной  культурой,  состоящей  из  штаммов  псевдомонад  и  азотобак¬
тера,  повысила  урожай  огурца  на  44%  [Егоров  и  др.,  1994].
Обработка  семян  огурца  азотфиксирующей  бактерией
Clostridium  sp.  стимулировала  развитие,  причем  при  двухкрат¬
ной  обработке  стимуляция  была  более  очевидной,  обработан¬
ные  растения  зацвели  на  10  дней  раньше  контрольных  [Полян¬
ская  и  др.,  2002].
 Существуют  данные,  что  экссудаты  корней  томатов  угнета¬
ют  развитие  азотобактера  [Мишустин,  Шильникова,  1968],  но  в
то  же  время  ряд  авторов  указывает  на  стимуляцию  развития
растений  томатов  и  повышение  урожая  при  обработке  чистыми
культурами  азотобактера  [Dibut  et  al.,  1997;  Aguilar,  Sanchez,
1998],  причем  бактеризация  азотобактером  совместно  с  извест¬
кованием  и  добавлением  перегноя  существенно  повышала
урожай  .  Также  отмечали  улучшение  качества  урожая  томатов,
которое  характеризовалось  увеличением  сухого  вещества,  об¬
щего  сахара,  витамина  С,  каротина,  и  устойчивость  к  фитофто-
розу  при  обработке  рассады  азотобактером  [Плетнева  и  др.,
 1998].
 2.  О.Н.  Логинов
 33

В  результате  обработки  клубней  картофеля  штаммами  азо¬
тобактера  повысился  урожай  [Сидоренко  и  др.,  1996;  Sood,
Sharma,  2001]  и  изменилось  его  качество  (повысилось  содержа¬
ние  незаменимых  аминокислот  и  крахмала)  [Zahir  et  al.,  1997].
 Многие  исследователи  отмечали  прибавку  урожая  пшеницы
при  ее  инокуляции  азотобактером,  связанную  как  с  азотфиксаци-
ей,  так  и  с  действием  ростстимулирующих  веществ,  продуцируе¬
мых  микроорганизмами  [Терехов,  Ежова,  1997;  Нурмухаметов,
Нагимова,  1998;  Лихолат,  Шишова,  2000;  Konde,  Desai,  1976;
Sindhu  et  al.,  1994;  Rabie  et  al.,  1995;  Shanshoury,  1995;  Tomar  et  al.,
 1998].  Также  было  отмечено  увеличение  урожая  (130%)  при  оп¬
рыскивании  растений  пшеницы  в  модельном  эксперименте  азот-
фиксирующими  бактериями,  однако  в  полевых  условиях  при
трехкратном  опрыскивании  этими  микроорганизмами  прибавка
урожая  пшеницы  составила  33%,  что  эквивалентно  эффекту  от
внесения  60  кг/га  азотных  удобрений.  Другие  исследователи  пос¬
ле  опрыскивания  в  полевых  условиях  получили  прибавку  урожая
зерна  пшеницы  в  70%  (4  ц/га).  Сообщалось,  что  после  опрыски¬
вания  листьев  высокоурожайного.  сорта  пшеницы  Kalyansona
смесью  азотфиксирующих  микроорганизмов  прибавка  урожая
зерна  составила  10-20%  при  повышенном  почти  вдвое  содержа¬
нии  белка  в  зерне  [Чемерисов,  1988].
 Комплексная  предпосадочная  обработка  семян  микроорга¬
низмами  p.  Azotobacter  в  сочетании  с  другими  группами  PGPR-ми-
кроорганизмов  также  положительно  влияла  на  показатели  уро¬
жая  пшеницы  [Shanshoury,  1995;  Нурмухаметов,  Нагимова,  1998];
так,  в  сочетании  с  фосфорными  бактериями  азотобактер  в  веге¬
тационных  опытах  вдвое  увеличил  урожай  зерна  пшеницы  [Че¬
мерисов,  1988].  Обработка  семян  томатов  бинарной  культурой,
состоящей  из  штаммов  азотобактера  и  фосфатмобилизующей
культуры  В.  subtilis  5,  значительно  повысила  количество  нор¬
мально  сформировавшихся  проростков,  а  также  энергию  прора¬
стания  [Курдиш  и  др.,  2001].
 Сообщается,  что  внесение  азотобактера  с  семенами  сахарной
свеклы  способствовало  повышению  урожая  и  значительному  на¬
коплению  общего  и  гидролизуемого  азота;  прибавка  общего  азота
в  ризосферной  почве  достигала  200  мг/кг  почвы  [Доросинский,
1965].  В  Югославии  было  изучено  влияние  бактеризации  семян
штаммами  Az.  chroococcum  и  Az.  lipoferum  на  урожай  и  качество
сахарной  свеклы.  Показано,  что  эффективность  бактеризации
семян  зависит  от  вида  и  штамма  азотфиксирующих  бактерий  и
сортовых  особенностей  сахарной  свеклы  [Govedrica  et  al.,  1999;
Mrkovacki  et  al.,  2002].  Применение  азотобактера  позволило  по¬
высить  урожайность  сахарной  свеклы  до  590  ц/га,  а  выход  саха-
 34

pa  -  до  100  ц/га.  Применение  бактериальных  удобрений  снижало
содержание  натрия  и  аминного  азота,  что  способствовало  повы¬
шению  качества  сахарной  свеклы  [Govedrica  et  al.,  1999;
Mrkovacki  et  al.,  2001].  Бактеризация  семян  сахарной  свеклы  Az.
chroococcum  шт.  20,  77  и  Az.  vinelandii  шт.  56  способствовала  по¬
вышению  азотфиксации  в  ризосфере,  увеличению  содержания
витаминов  группы  В  в  сахарной  свекле,  значительному  увеличе¬
нию  урожая  и  снижению  развития  грибных  инфекций,  причем
обработка  штаммом  Az.  vinelandii  имела  лучшие  результаты  по
всем  показателям  [Антипчук  и  др.,  1997].
 Ряд  исследователей  сообщает  о  влиянии  свободноживущих
азотфиксаторов  на  формирование  и  функционирование  бобово-
ризобиальных  симбиозов;  так,  отмечено,  что  диазотрофы  могут
как  значительно  стимулировать  развитие  клубеньковых  бакте¬
рий,  так  и  отрицательно  влиять  на  симбиотическую  систему  ри-
зобий,  конкурируя  за  питание  [Надкерничная,  Ковалевская,
2001].  Диазотрофы  родов  Enterobacter  и  Pseudomonas  усиливали
рост  корневой  системы  растений  клевера  с  увеличением  азотфи¬
ксации  на  40%  по  сравнению  с  применением  только  ризобий,  но
не  увеличивали  массу  надземной  части;  бактерии  p.  Azotobacter  не
оказывали  влияния  на  симбиоз  клевера  с  ризобиями,  а
Azospirillum  угнетали  данный  симбиоз.  При  комплексной  иноку¬
ляции  сои  азотобактером  и  клубеньковыми  бактериями  наблю¬
далось  увеличение  массы  сухой  надземной  части,  в  варианте  с
использованием  Az.  brasilense  и  Pseudomonas  sp.  увеличивалось
количество  клубеньков  на  корнях  растений,  при  использовании
бактерий  рода  Enterobacter  возрастали  оба  показателя.  Поэтому
эффективность  комплексной  бактеризации  диазотрофами  и  клу¬
беньковыми  бактериями  зависит  от  индивидуального  подбора
макро-  и  микросимбионтов  [Надкерничная,  Ковалевская,  2001].
Показана  возможность  создания  комплексных  препаратов  на  ос¬
нове  ассоциаций  ризобий  с  диазотрофами  родов  Klebsiella,
Enterobacter  и  фосфатмобилизующими  гетеротрофами  родов
Streptococcus  и  Bacillus,  эффективность  которых  на  14%  на  клевере
и  на  28%  на  горохе  выше,  чем  моноризобиальных  инокулянтов
[Суховицкая  и  др.,  2002].  Биопрепараты  на  основе  диазотрофных
бактерий  повышали  продуктивность  сои  и  симбиотическую  азот-
фиксацию,  лучшие  результаты  получены  при  использовании
флавобактерина  (Flavobacterium  sp.  шт.  JI30),  ризоагрина
(Agrobacterium  radiobacter  шт.  204)  и  агрофила  (Agrobacterium
radiobacter  шт.  10)  [Толкачев,  1997].  Сообщается,  что  инокуляция
посевного  материала  бобов  азотобактером  повысила  урожай  и
симбиотическую  азотфиксацию  [Kucharski  et  al.,  1997].  Значи¬
тельный  стимулирующий  эффект  для  сои,  который  выражался  в
 2*
 35

увеличении  количества  и  массы  клубеньков  и  массы  надземной
части  (22-105%),  был  получен  при  использовани  бактериальных
бинарных  композиций  штаммов  Bradyrhizobium  japonicum  со
штаммами  Bacillus  subtilis,  В.  megaterium,  Az.  chroococcum  и  Az.
vinelandii.  В  случае  композиции  штаммов  В.  japonicum  10к  и  Az.
vinelandii  56  наблюдалось  увеличение  числа  клубеньков  и  их  мас¬
сы,  а  при  использовании  штамма  В.  japonicum  6346  была  отмече¬
на  высокая  нитрогеназная  активность  в  расчете  на  1  растение  сои
[Мельникова  и  др.,  2002].
 Существуют  попытки  формирования  искусственных  азотфи¬
ксирующих  симбиозов;  так,  были  получены  псевдоклубеньки  на
корнях  рапса,  выращенного  в  нестерильной  почве  при  одновре¬
менном  воздействии  на  растительные  клетки  нодулирующих
агентов:  ауксиноподобного  вещества  и  азотфиксирующей  ассо¬
циации,  состоящей  из  Azotobacter  nigricans  и  Baccilus  sp.  Азотфи-
ксирующая  активность  нодулированных  растений  в  2  раза  выше,
чем  у  инокулированных  растений  без  псевдоклубеньков,  и  в  5  раз
выше,  чем  в  неинокулированном  контроле.  Формирование  псев¬
доклубеньков  повышало  продуктивность  растений  на  40%  отно¬
сительно  контроля  и  обеспечивало  достоверный  прирост  содер¬
жания  общего  и  белкового  азота  в  растениях  [Ковальская,  2000;
Ковальская  и  др.,  2001].
 В  последнее  время  все  большее  внимание  уделяется  ассоциа¬
тивной  азотфиксации.  Азотфиксирующие  микробные  ассоциа¬
ции,  природные  [Злотников  и  др.,  1990]  и  искусственно  создан¬
ные  [Умаров  и  др.,  1993;  Шабаев  и  др.,  1995;  Казанцева,  Ашмари¬
на,  1999;  Меуег,  1986;  Liste,  1993],  характеризуются  повышенной
эффективностью  действия  на  растение  по  сравнению  с  чистыми
культурами  диазотрофов.
 А.К.  Злотников  и  др.  [1990]  проводили  эксперименты  с  би¬
нарными  культурами  диазотрофных  бактерий,  обладающих  ярко
выраженным  “ассоциативным  эффектом”:  нитрогеназная  актив¬
ность  ассоциаций  превышала  сумму  слагающих  их  компонентов
в  2-10  раз.  Было  установлено,  что  активность  азотфиксации  сме¬
шанных  культур  имеет  четко  выраженный  максимум  при  строго
определенном  соотношении  компонентов,  индивидуальном  для
каждой  ассоциации.
 Отмечено  положительное  влияние  совместной  инокуляции
сои  клубеньковыми  бактериями  Bradyrhizobium  japonicum  110  и
бактериями  P.  fluorescens  20  по  сравнению  с  применением  одних
клубеньковых  бактерий  [Шабаев  и  др.,  1995].  Под  влиянием  двой¬
ной  инокуляции  сои  увеличивались  масса  корневых  клубеньков  и
количество  “биологического”  азота  в  растениях,  вынос  азота
растениями  и  масса  зерна  сои.
 36

В  модельном  вегетационном  опыте  внесение  в  почву  P.  puti¬
da  с  эндомикоризными  грибами  стимулировало  образование
клубеньков  и  повысило  массу  клевера  [Meyer,  Linderman,  1986].
Применение  смешанных  культур  клубеньковых  бактерий  с  бак¬
териями  p.  Pseudomonas,  наряду  с  усилением  клубенькробразо-
вания,  улучшило  азотное  питание  и  повысило  урожай  люцерны
[Liste,  1993].  В  результате  предпосевой  обработки  семян  сои  ба¬
ктериями  родов  Pseudomonas  и  Rhizobium  отмечено  усиление  ак¬
тивности  азотфиксации  и  повышение  продуктивности  растений
на  29-33%  по  сравнению  с  контролем  [Казанцева,  Ашмарина,
 1999].
 Е.В.  Надкерничная  и  Т.М.  Ковалевская  [2001]  в  своей  работе
отмечают,  что  комплексная  бактеризация  бобовых  растений  сво-
бодноживущими  азотфиксаторами  и  клубеньковыми  бактериями
не  всегда  дает  положительный  эффект.  Так,  например,  совмест¬
ная  инокуляция  люпина  желтого  ризобиями  и  Pseudomonas  sp.
1140  незначительно  повлияла  на  увеличение  массы  сухой  надзем¬
ной  части  растений,  на  количество  клубеньков,  но  нитрогеназная
активность  оказалась  в  1,8  раза  слабее,  чем  при  использовании
только  клубеньковых  бактерий.
 Еще  один  механизм  положительного  влияния  ризобактерий
p.  Pseudomonas  на  растения  -  это  мобилизация  труднодоступных
питательных  веществ  почвы  [Алексеева,  1982;  Пат.  1805849].  Ла¬
бораторными  экспериментами  подтверждено,  что  некоторые
штаммы  псевдомонад  участвуют  в  превращении  органических  и
минеральных  фосфатов  почвы  в  соединения  фосфора,  доступ¬
ные  для  растений  [Сидоренко,  2001].  К  сожалению,  исследова¬
нию  возможности  использования  штаммов  p.  Pseudomonas  для
улучшения  фосфорного  питания  растений  не  уделяется  достаточ¬
ного  внимания.
 Таким  образом,  доказано,  что  способы  положительного  воз¬
действия  псевдомонад  на  растения  весьма  разнообразны:  защита
от  патогенов  за  счет  синтеза  антибиотиков,  сидерофоров,  экзо¬
ферментов;  синтез  фитогормонов,  фиксация  молекулярного  азо¬
та,  мобилизация  труднодоступных  питательных  веществ  почвы.
К  сожалению,  в  большинстве  работ  авторы  акцентируют  внима¬
ние  на  каком-либо  одном  из  механизмов  биологического  контро¬
ля,  тогда  как  в  естественных  условиях  супрессирующее  влияние
псевдомонад  на  фитопатогены  всегда  определяется  комплекс¬
ным  действием  ряда  факторов.  Поэтому,  на  наш  взгляд,  если
речь  идет  о  PGPR-микроорганизмах,  необходимо  давать  суммар¬
ную  характеристику  их  полезных  свойств  с  антимикробным
и  ростстимулирующим  эффектом.
 37

Характеристика  выделенных  культур  по  наличию  свойств,
положительно  влияющих  на  растение
 Фитогормоны,  синтезируемые  штаммами  псевдомонад
и  азотобактера
 Известно,  что  микроорганизмы  синтезируют  ряд  веществ,  яв¬
ляющихся  регуляторами  роста  растений.  Установлено,  что  рост-
стимулирующая  активность  некоторых  штаммов  p.  Pseudomonas
связана  с  продуцированием  ИУК  [Forlani  et  al.,  1995].  Способ¬
ность  продуцировать  цитокининоподобные  вещества  и  гетероау¬
ксины  выявлена  также  у  бактерий  p.  Azotobacter  [Rosario,  Вагеа,
1975;  Nair,  Chandra,  1997;  Ожиганова  и  др.,  1993].
 Фитогормональную  активность  образцов  КЖ  штаммов  псевдо¬
монад  и  азотобактера  определяли  методом  иммуноферментного
анализа  (ИФА)  [Кудоярова  и  др.,  1986,  1990].  ИФА  построен  на
оценке  способности  КЖ  реагировать  с  антителами  к  ИУК  и  цитоки-
нину  зеатину.  В  ходе  исследований  использовали  двухсуточную  КЖ
штаммов  p.  Pseudomonas,  полученную  на  среде  Кинг  В,  и  трехсуточ¬
ную  КЖ  штаммов  p.  Azotobacter,  полученную  на  среде  40.  Результа¬
ты  подтверждены  тестом  на  разведение  (т.е.  когда  степень  разведе¬
ния  не  влияет  на  результаты  анализа)  и  представлены  в  виде  коли¬
чества  нанограммов  соответствующего  гормона  в  миллилитре  КЖ.
 С  помощью  метода  ИФА  у  выделенных  штаммов  псевдомо¬
над  и  азотобактера  была  изучена  способность  к  синтезированию
ИУК  и  цитокининоподобных  веществ.  Определение  концентра¬
ции  гормонов  в  КЖ  штаммов-антагонистов  проводили  в  фазе
стационарного  роста  культур.  Результаты  оценки  иммунореак¬
тивности  образцов  КЖ  штаммов  приведены  в  табл.  11
 Таблица  11.  Концентрация  гормонов  в  неочищенной  культуральной  жидкости
штаммов  псевдомонад  и  азотобактера
 Штамм
 Концентрация  гормона,  нг/мл  КЖ
 ИУК
 Цитокининоподоб¬
ные  вещества
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 878
 205
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 511
 680
 P.  putida  ИБ  56
 38
 40
 P.  putida  ИБ  17
 255
 -
 Pseudomonas  sp.  ИБ  182
 -
 18
 Az.  vinelandii  ИБ  1
 490
 290
 Az.  vinelandii  ИБ  3
 -
 78,5
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 -
 119
 38

Как  видно  из  табл.  11,  все  штаммы-антагонисты  обладают
способностью  к  синтезу  фитогормонов.  Способностью  к  проду¬
цированию  ИУК  обладают  4  из  5  штаммов  псевдомонад  и  только
один  из  исследуемых  штаммов  азотобактера.  В  данном  случае
фитогормональная  активность  возрастает  в  ряду  P.  putida
ИБ  56  -  P.  putida  ИБ  17  -  Az.  vinelandii  ИБ  1  -  P.  aureofaciens
ИБ  6  -  P.  aureofaciens  ИБ  51.  Другая  закономерность  выявлена
при  изучении  синтеза  цитокининоподобных  веществ:  значитель¬
ная  иммунореактивность  отмечена  у  штамма  P.  aureofaciens
ИБ  6,  а  также  у  штаммов  P.  aureofaciens  ИБ  51  и  Az.  vinelandii
ИБ  1.
 Таким  образом,  среди  исследуемых  изолятов  наибольшая  фи¬
тогормональная  активность  выявлена  у  штаммов  P.  aureofaciens
ИБ  51,  P.  aureofaciens  ИБ  6  и  Az.  vinelandii  ИБ  1.  Данные  штаммы
обладают  способностью  к  синтезу  как  ИУК,  так  и  цитокинино¬
подобных  веществ.  Для  штаммов  P.  putida  ИБ  17  отмечено  до¬
вольно  высокое  значение  концентрации  ауксинов  в  КЖ,  а  для  Az.
vinelandii  ИБ  4  -  цитокининов.  В  КЖ  штаммов  P.  putida  ИБ  56,
Pseudomonas  sp.182  и  Az.  vinelandii  ИБ  3  также  присутствуют  ли¬
бо  цитокинины,  либо  ауксины,  но  по  их  концентрации  данные
штаммы  уступают  остальным  изолятам  почти  на  порядок.
 Нитрогеназная  активность  штаммов  псевдомонад
и  азотобактера
 Изучение  особенностей  биологической  азотфиксации  имеет
большое  значение  для  функционирования  наземных  экосистем.
Растения  потребляют,  в  основном,  почвенный  азот,  причем  даже
в  том  случае,  когда  в  почву  вносятся  высокие  дозы  минерально¬
го  азота.  Основная  масса  азота  содержится  в  органическом  веще¬
стве  почвы,  которое  состоит  из  гумусовых  и  негумифицирован-
ных  веществ  растительного  и  животного  происхождения.  Лишь
незначительная  часть  азота  входит  в  состав  неорганических
соединений  в  нитратной  и  аммонийной  формах,  способной  усваи¬
ваться  растениями.  За  счет  ассоциативной  азотфиксации  в  фито¬
плану  луговых  и  зерновых  злаков  в  зоне  умеренного  климата  по¬
ступает  30-40  кг  азота/га  за  вегетационный  период,  тогда  как  в
почве  без  растений  только  10-13  кг  азота/га/год.  Растения  стиму¬
лируют  деятельность  диазотрофных  бактерий  и  определяют  су¬
точную  и  сезонную  динамику  ассоциативной  азотфиксации.  Наи¬
более  важную  роль  в  стимуляции  играют  продукты  экзоосмоса  и
корневой  опад,  являющиеся  энергетическим  субстратом  для  диа-
зотрофов.  Высокая  поглотительная  деятельность  корней  способ¬
ствует  быстрому  оттоку  азотсодержащих  продуктов  метаболизма
 39

бактерий  и  поддерживает  высокую  активность  нитрогеназы.  Ме¬
таболитами  азотфиксирующих  бактерий  являются  аминокисло¬
ты,  аминосахара  и  продукты  их  частичной  амонификации,  кото¬
рые  потребляются  растениями.  Оптимальный  уровень  парамет¬
ров  среды  для  роста  растения  соответствует  и  ее  оптимуму  для
ассоциативной  азотфиксации  [Умаров,  1986].
 Целью  наших  исследований  было  изучение  нитрогеназной
активности  выделенных  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера.
 Определение  нитрогеназной  активности  штаммов  проводили
методом,  основанным  на  восстановлении  ацетилена  [Методы...,
1984,  Умаров,  1986].
 Исследуемые  микроорганизмы  родов  Pseudomonas  и
Azotobacter  культивировали  на  среде  Эшби  с  добавлением  следов
Na2Mo04  •  2Н20  в  условиях  аэрации.  Ацетилен  вводили  в  сосуды
с  культурами  до  концентрации  10%  (по  объему).  После  инкуба¬
ции  культур  в  атмосфере  ацетилена  в  течение  1,5  ч  отбирали
шприцем  пробы  газа  по  1  мл  из  сосуда  и  определяли  наличие  эти¬
лена  методом  газовой  хроматографии  на  газовом  хроматографе
“Кристалл  Люкс  4000”  с  пламенно-ионизационным  детектором.
 Нитрогеназную  активность  бактерий  p.  Pseudomonas  опре¬
деляли  через  72  ч  культивирования.  Активность  фермента  нит¬
рогеназы  бактерий  p.  Azotobacter  определяли  на  48-м  и  72-м  ча¬
сах  роста  культур.  Также  для  азотобактера  нитрогеназная  ак¬
тивность  была  определена  на  среде  Берка  [Рубенчик,  1960],  на
среде  40  с  использованием  в  качестве  источников  углеродного
питания  глюкозы,  сахарозы,  калия  виннокислого,  натрия  уксус¬
нокислого.
 По  результатам  проведенных  экспериментов  установлено,
что  на  агаризованной  среде  Эшби  хорошо  растут  штаммы
Р.  aureofaciens  ИБ  51  и  P.  aureofaciens  ИБ  6.  Следует  отметить,
что  при  росте  на  безазотистой  среде  данные  микроорганизмы  не
образуют  характерного  ярко-оранжевого  пигмента.  В  то  же  вре¬
мя  было  показано,  что  наибольшей  ацетиленредуктазной  способ¬
ностью  в  жидкой  культуре  обладает  штамм  Pseudomonas  sp.
ИБ  182,  который  характеризовался  слабым  ростом  при  выращи¬
вании  на  плотной  среде  Эшби  (табл.  12).
 Таким  образом,  для  штамма  Pseudomonas  sp.  ИБ  182  выявле¬
но  наличие  азотфиксирующей  активности.  Причем  нитрогеназ¬
ная  активность  штамма  (0,43  мкг  И^мл/ч)  сопоставима  с  анало¬
гичной  характеристикой  для  бактерий  p.  Azotobacter  -  типичных
представителей  азотфиксирующих  микроорганизмов  [Пат.  РФ
2074159].  Штамм  Pseudomonas  species  ИБ  182  запатентован  в  ка¬
честве  продуцента  хитинолитических  ферментов  [Пат.  РФ
2187553].
 40

Таблица  12.  Нитрогеназная  активность  штаммов  псевдомонад
 Штамм
 Рост  на  агаризован-
ной  среде  Эшби
 Нитрогеназная
 активность,
 мкгЫ2/мл/ч
 P.  aureofaciens  ИБ  51
P.  aureofaciens  ИБ  6
P.  putida  ИБ  56
P.  putida  ИБ  17
Pseudomonas  sp.  ИБ  182
Примечание.  (++)  -  хорошим
 ++
 ++
 +
 +
 +
 i  рост;  (+)  -  слабый  рост
 0,0801±0,012
0,4312±0,023
 Для  изучения  азотфиксирующей  способности  выделенных
нами  штаммов  бактерий  p.  Azotobacter  были  поставлены  экспери¬
менты  по  определению  нитрогеназной  активности  в  условиях  in
vitro  в  жидкой  культуре  [Пугачева  и  др.,  2004].  В  эксперименте
использовали  также  два  штамма,  полученные  из  ВКМ  (Az.
vinelandii  В-1617,  Az.  chroococcum  В-1616).
 При  определении  нитрогеназной  активности  в  жидкой
культуре  было  установлено,  что  ее  величина  не  зависела  от
температуры  культивирования  штаммов  азотобактера  и  была
одинаковой  при  25°  и  35°  (табл.  13).  При  культивировании  сме¬
шанной  культуры  нитрогеназная  активность  была  значительно
выше,  чем  у  отдельных  штаммов  в  аналогичных  условиях,
что  согласуется  с  данными  некоторых  авторов  [Умаров,  1986;
Белимов,  Кожемяков,  1992].  Кроме  того,  эта  зависимость
прослеживалась  при  росте  на  всех  испытуемых  источниках
углерода.
 Мы  выявили  лишь  незначительную  разницу  в  величине
нитрогеназной  активности  при  выращивании  культур  на  та¬
ких  источниках  углеродного  питания,  как  маннит,  сахароза  и
глюкоза  (табл.  14).  Величина  фиксации  азота  при  росте  на
глюкозе  была  несколько  ниже,  чем  при  росте  на  сахарозе  и
манните.  Поэтому  при  дальнейшем  культивировании  штам¬
мов  азотобактера,  прежде  всего,  необходимо  ориентировать¬
ся  на  источник  углерода,  на  котором  достигается  высокий  вы¬
ход  биомассы  и  который  не  относится  к  дорогим  субстратам.
Мы  выбрали  в  качестве  такого  источника  сахарозу,  посколь¬
ку  при  выращивании  на  среде  с  использованием  10  г/л  сахаро¬
зы  в  качестве  источника  углеродного  питания  большинст¬
во  штаммов  при  температуре  23°  достигали  за  48  ч  куль¬
тивирования  численности  108  КОЕ/мл  КЖ,  причем  нитроге¬
назная  активность  в  данном  случае  была  высокой  для  всех
штаммов.
 41

Таблица  13.  Значение  нитрогеназной  активности  штаммов  p.  Azotobacter
при  выращивании  на  среде  Эшби  с  маннитом  при  различных  температурах
 Культура  бактерий
 Нитрогеназная  активность  на  48-м  часу
культивирования,  мкгЫ2/мл/ч
 25°
 35°
 Az.  vinelandii  ИБ  1
Az.  vinelandii  ИБ  3
Az.  vinelandii  ИБ  4
Az.  vinelandii  В-1617
Az.  chroococcum  B-1616
Смешанная  культура:
 Az.  vinelandii  ИБ  \,Az.  vinelandii
ИБ  3,  Az.  vinelandii  ИБ  4
 0,650010,021
0,6133±0,018
0,6423±0,019
0,6475±0,101
0,6555±0,031
 0,7407±0,023
 0,6497±0,018
 0,6369±0,015
 0,6435±0,032
 0,647010,023
 0,653810,012
 нд
 Культура  бактерий
 Нитрогеназная  активность  на  72-м  часу
культивирования  мкгЫ2/мл/ч
 25°
 25°
 Az.  vinelandii  ИБ  1
Az.  vinelandii  ИБ  3
Az.  vinelandii  ИБ  4
Az.  vinelandii  В-1617
Az.  chroococcum  B-1616
Смешанная  культура:
 Az.  vinelandii  ИБ  \yAz.  vinelandii
ИБ  3,  Az.  vinelandii  ИБ  4
 Примечание,  нд  -  нет  данных.
 0,6474Ю,210
0,641610,012
0,647510,130
0,642610,112
0,656010,270
 0,741110,089
 0,650810,025
 0,642110,147
 0,648010,123
 0,646710,014
 0,654110,023
 нд
 Таблица  14.  Величина  нитрогеназной  активности  штаммов  p.  Azotobacter
при  выращивании  на  среде  40  с  сахарами
 Культура  бактерий
 Нитрогеназная  активность,  мкгЫ2/мл/ч
 Сахароза
 Глюкоза
 Az.vinelandii  ИБ  1
Az.vinelandii  ИБ  3
Az.vinelandii  ИБ  4
Az.vinelandii  В-1617
Az.chroococcum  В-1616
Смешанная  культура:
 Az.  vinelandii  ИБ  1,  Az.  vinelandii
ИБ  3,  Az.  vinelandii  ИБ  4
 0,655310,012
 0,634410,021
 0,647610,003
 0,655310,022
 0,642310,014
 0,712310,016
 0,468310,024
 0,423010,007
 0,432710,014
 0,412310,031
 0,398910,017
 0,515610,023
 42

Таблица  15.  Нитрогеназная  активность  штаммов  p.  Azotobacter
при  выращивании  на  среде  40  с  солями  органических  кислот  в  качестве
источника  углерода
 Культура  бактерий
 Нитрогеназная  активность,  мкгЫ2/мл/ч
 Калий  виннокислый
 Натрий  уксуснокис¬
лый
 Az.  vinelandii  ИБ  1
Az.  vinelandii  ИБ  3
Az.  vinelandii  ИБ  4
Смешанная  культура:
 Az.  vinelandii  ИБ  1,  Az.  vinelandii
ИБ  3,  Az.  vinelandii  ИБ  4
 0,0714±0,002
0,0722±0,001
0,0679±0,004
 0,0835±0,002
 0,0627±0,003
0,0649±0,001
0,0615±0,007
 0,0692±0,002
 Крайне  незначительное  повышение  нитрогеназной  актив¬
ности  (или  ее  отсутствие)  при  увеличении  титра  объясняется
природой  процесса  азотфиксации.  Микроорганизмы
p.  Azotobacter,  фиксируя  молекулярный  азот,  выделяют  в  сре¬
ду  азотсодержащие  соединения  (аминокислоты,  аминосахара,
аммонийный  азот),  а,  как  известно,  наличие  в  среде  любых
форм  азота  ингибирующе  действует  на  процесс  азотфиксации
[Умаров,  1986].  Поэтому  в  дальнейшем  в  качестве  азотного
питания  клетки  потребляют  накопленный  в  среде  азот,  не  за¬
трачивая  энергию  на  фиксацию  азота.  Интересные  результа¬
ты  получены  при  культивировании  микроорганизмов  на  солях
органических  кислот.  При  относительно  высоком  титре  кле¬
ток  105-106  КОЕ/мл  величина  нитрогеназной  активности  ока¬
залась  на  порядок  ниже,  чем  при  выращивании  на  сахарах
(табл.  15).
 Таким  образом,  для  всех  трех  выделенных  штаммов  Az.
vinelandii  была  изучена  интенсивность  азотфиксации  в  зависимо¬
сти  от  источника  углеродного  питания,  времени  и  температуры
культивирования.  Было  отмечено,  что  максимальная  величина
нитрогеназной  активности  приходится  на  период  экспоненциаль¬
ной  фазы  развития  культур  и  не  зависит  от  количества  жизнеспо¬
собных  клеток  в  среде.  Величина  нитрогеназной  активности  при
росте  на  сахарозе  и  манните  была  в  1,3  раза  выше,  чем  при  куль¬
тивировании  на  глюкозе  и  в  8,8  раз  выше  при  росте  на  солях  ор¬
ганических  кислот.
 Определение  величины  усваиваемого  азота  в  смешанной
культуре,  состоящей  из  трех  штаммов  азотобактера,  показало,
что  при  росте  на  всех  используемых  источниках  углерода  азот-
фиксация  смешанной  культурой  в  1,2  раза  превышает  способ¬
ность  к  фиксации  азота  у  чистых  культур.
 43

Исследование  способности  к  разложению  фосфатов
у  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера
 Среди  механизмов  положительного  влияния  бактерий  родов
Pseudomonas  и  Azotobacter  на  растения  исследователи  отмечают
их  способность  к  мобилизации  труднодоступных  соединений  фо¬
сфора  [Пат.  1805849;  Бажанов,  Чернышев,  1999;  Сидоренко,
2001;  Kumar,  Narula,  1999;  Narula  et  al.,  2000].  Нами  была  постав¬
лена  задача  изучить  у  выделенных  штаммов-антагонистов  спо¬
собность  к  разложению  минеральных  и  органических  соедине¬
ний  фосфора  in  vitro.
 Для  выявления  у  псевдомонад  и  азотобактера  способности  к
растворению  неорганических  фосфатов  использовали  среду,
предложенную  Н.В.  Пиковской  [Большой  практикум..,  1962],  а
также  среду  Муромцева.  Фосфат  кальция  вносили  в  питательную
среду  Муромцева  методом  осаждения,  предложенным  Герретсе-
ном,  в  модификации  Муромцева  [Методы...,  1991].  Приготовлен¬
ные  питательные  среды  разливали  по  чашкам  Петри,  подсушива¬
ли  в  термостате  и  сажали  уколом  исследуемые  культуры  микро¬
организмов.  Чашки  инкубировали  в  термостате  при  28  °  в  тече¬
ние  7  сут.  О  растворении  фосфатов  судили  по  образованию  вок¬
руг  колоний  бактерий  зон  просветления  питательной  среды.
 Для  того  чтобы  выявить  у  изучаемых  штаммов  микроорга¬
низмов  способность  к  расщеплению  органических  соединений
фосфора,  микроорганизмы  высаживали  уколом  на  среду  МПА
либо  среду  40  с  добавлением  2,0%  мела  и  органического  фосфо¬
ра  в  виде  натрия  аденозинтрифосфата  в  количестве  0,005%.
В  случае  гидролиза  фосфатов  вокруг  колоний  бактерий  образу¬
ются  прозрачные  зоны,  т.е.  происходит  растворение  мела  под
влиянием  отщепившейся  фосфорной  кислоты.
 В  результате  проведенных  исследований  было  установлено,
что  штаммы,  отнесенные  нами  к  виду  P.  putida,  а  также  близкий
им  по  физиолого-биохимическим  признакам  штамм  Pseudomonas
sp.  ИБ  182,  способны  к  активному  растворению  трифосфата
кальция.  Штаммы  P.  aureofaciens  ИБ  51,  P.  aureofaciens  ИБ  6,  Az.
vinelandii  ИБ  1,  Az.  vinelandii  ИБ  3,  Az.  vinelandii  ИБ  4  также  хоро¬
шо  росли  на  средах  Пиковской  и  Муромцева,  но  зоны  просветле¬
ния  среды  образовывались  только  непосредственно  под  колони¬
ями  данных  бактерий  либо  в  радиусе  0,5-1  мм  от  них  и  лишь  по
истечении  длительного  времени  инкубации.
 Изучение  роста  исследуемых  микроорганизмов  на  среде  с  на¬
трий  аденозинтрифосфатом  позволяет  сделать  вывод  о  неспособ¬
ности  данных  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера  к  минерали¬
зации  органических  соединений  фосфора  (табл.  16).
 44

Таблица  16.  Характеристика  роста  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера
на  плотных  питательных  средах,  содержащих  соединения  фосфора
 Штамм
 Растворение  минеральных
фосфатов
 Гидролиз
 органиче¬
 Среда  Пиков-
ской
 Среда  Муром¬
цева
 ских  фосфа¬
тов
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 +
 +
 -
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 +
 +
 -
 P.  putida  ИБ  56
 ++
 ++
 -
 P.  putida  ИБ  17
 ++
 ++
 -
 Pseudomonas  sp.  ИБ  182
 ++
 ++
 -
 Az.  vinelandii  ИБ  1
 ±
 ±
 -
 Az.  vinelandii  ИБ  3
 ±
 ±
 -
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 +
 +
 -
 Примечание.  (++)  -  диаметр  зоны  просветления  среды  значительно  превышает
диаметр  колонии  бактерии;  (+)  -  диаметр  зоны  просветления  среды  незначительно
превышает  диаметр  колонии  бактерии;  (±)  -  диаметр  зоны  просветления  среды  равен
диаметру  колонии  бактерии;  (-)  -  зон  просветления  среды  не  обнаружено.
 Выявлено,  что  среди  восьми  изучаемых  штаммов  родов
Pseudomonas  и  Azotobacter  только  три  активно  растворяют  мине¬
ральные  фосфаты  и  ни  один  из  штаммов  не  способен  к  гидролизу
органического  фосфора.  Показано  также,  что  по  способности  к
растворению  минеральных  фосфатов  наблюдается  некоторая  ви¬
довая  дифференциация,  т.е.  данное  свойство  отмечено  для  штам¬
мов  вида  P.  putida  и  слабо  выражено  у  штаммов  вида  P.  aureofaciens.
 Таким  образом,  у  выделенных  штаммов  псевдомонад  и  азото¬
бактера  был  обнаружен  ряд  свойств,  оказывающих  положитель¬
ное  влияние  на  растение,  улучшающих  его  рост  и  развитие.
По  совокупности  обнаруженных  полезных  свойств  выделенные
иггаммы-антагонисты  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter  были  при¬
знаны  перспективными  для  дальнейшего  изучения,  с  точки  зре¬
ния  применения  в  агробиотехнологии.
 Особенности  антагонистического  действия
штаммов  псевдомонад  и  азотобактера
на  фитопатогенные  грибы
 Задачей  исследования  было  изучить  влияние,  которое  оказы¬
вают  выделенные  штаммы  псевдомонад  и  азотобактера  на  рост  и
развитие  различных  фитопатогенных  грибов.
 Анализ  данных,  полученных  при  снятии  спектра  антагони¬
стической  активности  штаммов-антагонистов,  показал,  что
 45

Bipolaris  sorokiniana  среди  исследованных  фитопатогенных  мик-
ромицетов  для  всех  культур-антагонистов  является  наиболее  чув¬
ствительным  тест-объектом  (см.  табл.  2).  Кроме  того,  выявлено,
что  изучаемые  изоляты  бактерий  достаточно  специфичны  в  от¬
ношении  исследуемых  тест-грибов,  т.е.  диаметры  зон  ингибиро¬
вания  ими  роста  фитопатогенов  сильно  варьируют.  Показано,
что  отобранные  штаммы  псевдомонад  и  азотобактера  обладают
широким  спектром  антагонистической  активности  в  отношении
фитопатогенных  грибов  p.  Fusarium.
 Морфологические  изменения,  происходящие  с  фитопатоген¬
ными  грибами  под  воздействием  метаболитов  пггаммов-антаго-
нистов  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter,  изучали  в  условиях  сов¬
местного  роста  микромицетов  и  бактерий  на  плотных  средах
ГПА  либо  КГ  А.  Наблюдения  за  развитием  микроорганизмов
проводили  под  микроскопом  марки  AMPLIVAL  30-G048-1  (“Carl
Zeiss”,  Германия)  после  инкубации  в  течение  48  ч.
 В  условиях  непосредственного  взаимодействия  со  штаммами
псевдомонад  и  азотобактера  формирование  мицелия  всех  тест-
грибов  значительно  замедлялось  по  сравнению  с  контролем
(задержка  прорастания  спор  на  24-96  ч),  а  формирующийся  ми¬
целий  патогенов  отличался  ярко  выраженными  морфологиче¬
скими  изменениями.  Так,  под  воздействием  метаболитов  пггам-
мов-антагонистов  происходило  ограничение  развития  ростковых
трубок  с  формированием  на  кончиках  растущих  гиф  сферопла-
стов.  Нарушения  в  развитии  гиф  приводили  в  свою  очередь  к
формированию  излишне  разветвленного,  часто  септированного
мицелия,  напоминающего  нитку  бусин  (см.  рис.  3-7;  см.  цв.  вкл.).
Сходный  эффект  наблюдали  и  другие  исследователи  при  изуче¬
нии  воздействия  бацилл-антагонистов  на  фузарии  [Мелентьев,
Галимзянова,  1999;  Широков  и  др.,  2002].  Известно,  что  показа¬
тель  частоты  ветвления  может  характеризовать  физиологиче¬
ское  состояние  развивающегося  микромицета  [Марфенина,
 1999].  По  имеющимся  на  сегодняшний  день  данным,  ветвление
растущей  гифы  начинается  после  достижения  ею  определенного
объема  [Мирчинк,  1988].  В  нашем  эксперименте  образование
сферопластов,  связанное,  очевидно,  с  нарушением  формирова¬
ния  стенки  гифы  под  воздействием  метаболитов  пггаммов-анта-
гонистов,  стимулировало  преждевременное  ветвление.
 При  совместном  культивировании  штаммов-антагонистов  и
фитопатогенных  грибов  на  чашках  Петри  были  отмечены  осо¬
бенности  формирования  колоний  микромицетов.  При  этом  не¬
обходимо  подчеркнуть,  что  степень  воздействия  на  фитопато¬
ген  определялась  радиальным  градиентом  концентрации  мета¬
болитов  бактерий-антагонистов:  вне  зоны  действия  веществ
 46

формировался  обычный  мицелий  гриба,  а  чем  ближе  к  коло¬
нии  бактерии,  тем  ярче  были  выражены  аномалии  в  строении
мицелия.
 Для  грибов  Fusarium  gibbosum,  F.  oxysporum,  F.  semitectum,
 F. 	solani  при  культивировании  с  бактериями  родов  Pseudomonas  и
Azotobacter  было  отмечено  развитие  колоний  только  в  виде  суб¬
стратного  мицелия;  ускорение  процесса  спорообразования  было
выявлено  для  Fusarium  graminearum  (табл.  17,  18).
 Таблица  17.  Воздействие  биологически  активных  веществ,
выделяемых  штаммами  псевдомонад  на  развитие  тест-грибов
 Тест-гриб
 Штамм
 Fusarium
 gibbosum
 Fusarium
 oxysporum
 Fusarium
 culmorum
 Fusarium
 graminearum
 Fusarium
 nivale
 Fusarium
 semitectum
 P.  aureofaciens
ИБ  51
 зп,  ч,
 Б
 зп,  в,
 Б,  С,  SM
 зп,  в,ч,
 3,  Б
 зп,с
 зп,в
 зп,  в,
 4,B,SM
 P.  aureofaciens
ИБ  6
 ЗП,  Ч,
Б
 ЗП,В,
 Б,  С,  SM
 ЗП,  В,Ч,
3,  Б
 зп,в
 зп,в,
 Ч,  Б,
SM
 P.  putida  ИБ  56
 ЗП,  SM
 ЗП,  В,
 Б,  С,  SM
 ЗП,В,
4,3,  Б
 -
 -
 зп,в
 P.  putida  ИБ  17
 ЗП,  SM
 ЗП,  В,
 Б,  С,  SM
 ЗП,  В,Ч,
3,  Б
 -
 зп,в
 зп,в
 Pseudomonas  sp.
ИБ  182
 ЗП,  SM
 ЗП,В,
 Б,  С,  SM
 ЗП,  В,Ч,
3,  Б
 —
 зп,в
 зп,в
 Тест-гриб
 Штамм
 Fusarium
 solani
 Fusarium
 avenaceum
 Bipolar  is
sorokiniana
 Alternaria
 alternate
 Penicillium
 funiculosum
 P.  aureofaciens
ИБ  51
 ЗП,В
 ЗП,В
 ЗП,В,Ч
 ЗП,В,Ч
 ЗП,  Б
 P.  aureofaciens
ИБ  6
 ЗП,В
 ЗП,В
 ЗП,  В,  Ч
 ЗП,  В,  Ч
 —
 P.  putida  ИБ  56
 ЗП,  В,  SM
 ЗП,  В,
 ЗП,В,Ч
 ЗП,  В,  Ч
 ЗП,  Б
 P.  putida  ИБ  17
 ЗП,  В,  SM
 ЗП,В
 ЗП,В,
 ч
 ЗП,  В,  Ч
 ЗП,  Б
 Pseudomonas  sp.
ЙБ  182
 ЗП,  В,  SM
 ЗП,В
 зп,  В,  Ч,
3
 ЗП,  В,  Ч
 -
 Примечание.  ЗП  -  задержка  прорастания  спор  в  зоне  действия  антагонистов;
Ч  -  формирование  гиф  в  виде  нитки  бус;  В  -  нарушение  в  строении  апексов
(сферопласты)  и  усиление  ветвления  мицелия;  3  -  зернистость  мицелия;  SM  -  не
образуется  воздушный  мицелий;  Б  -  образование  вокруг  колонии  бактерии  "валика"
из  гиф  гриба;  С  -  усиленное  спорообразование;  (-)-  изменений  по  сравнению  с
контролем  не  отмечено.
 47

Таблица  18.  Влияние  штаммов-антагонистов  p.  Azotobacter
на  развитие  тест-грибов
 Тест-гриб
 Штамм
 Az.vinelandii  И  Б  1
 Az.vinelandii  ИБ  3
 Az.vinelandii  ИБ  4
 Fusarium  culmorum
 ЗП,В
 ЗП,В
 зп,в
 F.  gibbosum
 зп,в
 зп,в
 зп,в
 F.  graminearum
 3II,SM
 зп
 зп,  ч,  в
 F.  nivale
 зп
 -
 зп
 F.  oxysporum
 SM
 зп
 -
 F.  semitectum
 зп,ч,в
 зп
 зп,в
 F.  solani
 ЗП
 -
 зп
 F.  avenaceum
 ЗП,  ч,  в
 зп,в
 зп
 F.  moniliforme
 зп,ч,в
 зп
 зп,  ч,  в
 Bipolaris  sorokiniana
 зп,ч
 зп,  ч,  в
 зп,  ч,  в
 Alternaria  alternata
 зп,ч,в
 -
 зп
 Penicillium  funiculosum
 зп
 зп
 зп
 Примечание.  Уел.  обозн.  см.  табл.  17.
 Изучение  воздействия  метаболитов  штаммов-антагонистов
Az.  vinelandii  на  развитие  фитопатогенных  грибов  показало,  что
характер  изменений  в  морфологии  мицелия  фитопатогенов  схо¬
ден  с  реакцией  микромицетов  на  метаболиты  псевдомонад
(см.  рис.  3-7;  см.  цв.  вкл.).
 Как  видно  из  рис.  5  (см.  цв.  вкл.),  мицелий  Bipolaris  sorokini¬
ana,  формирующийся  под  воздействием  метаболитов  Az.
vinelandii  ИБ  1,  Az.  vinelandii  ИБ  3,  характеризуется  заметными
морфологическими  особенностями  -  увеличение  объема,  умень¬
шение  длины,  учащение  образования  септ,  зернистость  клеточ¬
ного  содержимого.  При  воздействии  на  грибы  p.  Fusarium  к
указанным  эффектам  прибавляется  и  отделение  клеточного  со¬
держимого  от  стенок  (рис.  6,  7;  см.  цв.  вкл.).  Различия  в  реакции
грибов  на  воздействия  метаболитов  связаны,  очевидно,  с  особен¬
ностями  строения  клеточных  стенок.  Bipolaris  sorokiniana  отно¬
сится  к  темноокрашенным  грибам  (Dematiaceae),  в  состав  клеточ¬
ных  стенок  которых  входит  меланин,  способный  выполнять  про¬
текторные  функции  [Carlile  et  al.,  2001].
 Проведенные  исследования  позволяют  предположить,  что
антигрибные  метаболиты  изученных  штаммов-антагонистов
родов  Pseudomonas  и  Azotobacter,  хотя  и  являются  различными  со¬
единениями,  тем  не  менее  обладают  сходным  механизмом  воз¬
действия  на  развитие  мицелия  фитопатогенных  грибов.  Основ¬
 48

ной  мишенью  служит,  очевидно,  процесс  синтеза  клеточной
стенки.
 Хорошо  известно,  что  один  из  основных  механизмов  биоло¬
гического  контроля,  используемых  псевдомонадами,  заключает¬
ся  в  их  способности  к  образованию  сидерофоров-пигментов,  об¬
ладающих  сродством  к  трехвалентному  железу  [Campbell  et  al.,
1986;  Loper,  1988;  Comelis  et  al.,  1990].  В  литературе  встречаются
также  сообщения  о  способности  бактерий  p.  Azotobacter  продуци¬
ровать  биологически  активные  вещества  группы  сидерофоров
[Suneja,  Lakshminarayana,  1993;  Suneja  et  al.,  1996].
 Для  того  чтобы  выяснить,  обусловлен  ли  антагонизм  выде¬
ленных  нами  штаммов  псевдомонад  и  азотобактеров  по  отноше¬
нию  к  фитопатогенным  грибам  конкуренцией  за  железо,  необхо¬
димо  было  проверить  антифунгальные  свойства  культур  в  усло¬
виях  избытка  данного  макроэлемента.
 Для  исследования  влияния  железа  на  антифунгальные  свойства
выделенных  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера  сравнивали  их
антагонистическую  активность  на  среде  Кинг  В  в  отсутствие  желе¬
за  и  с  добавлением  100  мкг/мл  FeCl3  [Смирнов  и  др.,  1990].
 На  чашках  со  средой  Кинг  В  в  присутствии  железа  было  от¬
мечено  изменение  внешнего  вида  колоний  бактерий:  колонии
штаммов  P.  putida  ИБ  56,  Р.  putida  ИБ  17,  Pseudomonas  sp.  ИБ  182
приобрели  коричневую  окраску;  у  колоний  штаммов  P.  aureofa¬
ciens  ИБ  51  и  P.  aureofaciens  ИБ  6  увеличилась  интенсивность
оранжевой  пигментации.  Внесение  в  среду  железа  подавляло  син¬
тез  желто-зеленых  флуоресцирующих  пигментов  псевдомонад.
 В  целом  проведенные  нами  исследования  показали  (табл.  19),
что  антагонистическая  активность  выделенных  штаммов  не
 Таблица  19.  Влияние  железа  на  антифунгальную  активность  штаммов
псевдомонад  и  азотобактера
 Штамм
 Активность  штаммов  (диаметр  зоны  подав¬
ления  роста  Bipolaris  sorokiniana,  мм)
 Среда  без  добавле¬
ния  FeCl3
 Среда  +100  мкг/мл
FeCl3
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 33,1  ±2,1
 33,3±1,7
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 33,3±2,7
 33,6±1,4
 P.  putida  ИБ  56
 27,2±3,4
 28,6±2,1
 P.  putida  ИБ  17
 33,2±0,5
 35,5±0,5
 Pseudomonas  sp.  ИБ  182
 33,7±2,2
 35,5±0,4
 Az.  vinelandii  ИБ  1
 28,0±2,0
 27,7±1,8
 Az.  vinelandii  ИБ  3
 18,7±2,5
 19,0±2,1
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 21,0±2,1
 20,7±0,7
 49

лимитируется  присутствием  железа  в  среде,  т.е.,  по-видимому,
антифунгальные  свойства  культур  определяются  синтезом  не  си-
дерофоров,  а  веществ  другой  природы.
 Известно,  что  у  некоторых  штаммов  бактерий-антагонистов
способность  подавлять  рост  и  развитие  грибов-фитопатогенов  свя¬
зана  с  синтезом  хитиназ  [Пат.  РФ  2031119;  Кравченко  и  др.,  2002].
 Для  определения  хитинолитической  активности  выделенных
штаммов  p.  Pseudomonas  их  выращивали  на  среде  с  1,5%  агара
следующего  состава  (в  г/л):  дрожжевой  экстракт  -  0,5;
(NH4)2S04  -  1,0;  MgS04  •  7Н20  -  0,3;  КН2Р04  -  1,36;  дистиллиро¬
ванная  вода  -  1  л.  В  качестве  источника  углерода  в  среду  вводи¬
ли  коллоидный  креветочный  хитин  в  количестве  0,5%.  Культиви¬
ровали  штаммы  на  чашках  Петри  при  28°.
 Способность  псевдомонад  к  синтезу  хитинолитических  фер¬
ментов  определяли  по  наличию  вокруг  колонии  бактерии  зоны
просветления  мутной  среды.  Эффективность  гидролиза  хитина
определяли  по  величине  отношения  диаметра  зоны  просветления
мутной  среды  вокруг  колонии  к  диаметру  колонии  (в  мм/мм).
 Для  бактерий  p.  Pseudomonas  наличие  хитинолитической  ак¬
тивности  -  достаточно  редкое  свойство  [Andreeva  et  al.,  1996].  Сре¬
ди  исследуемых  штаммов  псевдомонад  способность  к  продуциро¬
ванию  хитинолитических  ферментов  была  обнаружена  только  у
штамма  бактерий  Pseudomonas  sp.  ИБ  182  ]Пат.  РФ  2187553].  Хи-
тинолитическая  активность  данной  культуры  составила
5,75  мм/мм.  Однако  на  данном  этапе  исследований  роль  хитиназы,
продуцируемой  Pseudomonas  sp.  ИБ  182,  в  проявлении  антагони¬
стической  активности  данной  бактерии  до  конца  не  выяснена.
 Таким  образом,  анализ  данных,  полученных  при  снятии  спект¬
ра  антагонистической  активности  штаммов  псевдомонад  и  азото¬
бактера,  показал,  что  выделенные  изоляты  активно  подавляют
развитие  фитопатогенных  грибов  широкого  круга,  в  числе  кото¬
рых  основные  возбудители  корневых  гнилей  злаковых  культур  -
Fusarium  oxysporum,  F.  solani,  F.  avenaceum,  Bipolaris  sorokiniana,  a
механизм  антагонистического  действия  изучаемых  культур  связан,
по-видимому,  с  синтезом  веществ  антибиотической  природы.
 Изучение  ростстимулируюкцей  активности
штаммов  псевдомонад  и  азотобактера
 Ростстимулирующему  воздействию  псевдомонад  и  азотобак¬
тера  на  растения  посвящено  большое  число  публикаций  [Сидо¬
ренко  и  др.,  1996;  Калько  и  др.,  2001;  Пат.2051586;  Becker  et  al.,
1990;  Sood,  Sharma,  2001;  Forlani  et  al.,  1995;  Rabie  et  al.,  1995].
Но  при  этом  в  ряде  работ  авторы  отмечают,  что  эффективность
 50

воздействия  бактерий  на  растение  во  многом  определяется  сор¬
том  семян  и  их  морфологическим  строением  [Sikora  et  al.,  1990],  а
также  зависит  от  вида  и  штамма  микроорганизмов  [Mrkovacki
et  al.,  2002].
 Для  того  чтобы  оценить,  как  влияет  на  всхожесть  семян  бак¬
теризация  теми  или  иными  штаммами  псевдомонад  и  азотобактера,
в  данной  серии  экспериментов  мы  использовали  семена  расте¬
ний,  относящихся  к  четырем  различным  семействам  -  паслено¬
вых  (томат),  тыквенных  (огурец),  маревых  (свекла),  крестоцвет¬
ных  (капуста,  редис).  Для  замачивания  семян  применяли  различные
количества  КЖ  штаммов-антагонистов.
 Для  определения  характера  воздействия  выделенных  изоля-
тов  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter  на  растения  проводили  бак¬
теризацию  семян  сельскохозяйственных  культур  суспензией  клеток
штаммов-антагонистов.  Наличие  ростстимулирующего,  ингиби¬
рующего  либо  нейтрального  эффекта  определяли,  сравнивая
всхожесть  и  энергию  прорастания  семян  растений  в  контрольном
(замачивание  семян  в  дистиллированной  воде  либо  в  стерильной
питательной  среде  Кинг  В)  и  опытных  вариантах.
 Испытания  проводили  во  влажной  камере.  Для  обработки  се¬
мян  использовали  двухсуточную  либо  трехсуточную  КЖ  штам¬
мов,  полученную  при  выращивании  псевдомонад  на  среде  Кинг  В
(титр  1,0—9,1  •  109  КОЕ/мл),  штаммов  азотобактера  -  на  среде  40
(титр  1,0-4,0  •  109  КОЕ/мл).  Инокуляцию  зерен  проводили  путем
встряхивания  их  в  колбах  с  бактериальной  суспензией.
 Для  проращивания  семян  во  влажной  камере  использовали
культуры  томата,  огурца,  свеклы,  капусты,  редиса.  Обработан¬
ные  семена  раскладывали  на  увлажненную  до  полной  влагоемко-
сти  фильтровальную  бумагу  в  чашки  Петри  и  помещали  в  термо¬
стат  при  28°.  Повторность  опыта  трехкратная,  на  каждую
повторность  использовали  по  50  семян.
 По  методике,  предложенной  для  выявления  наличия  в  среде
веществ  типа  ауксинов  [Рубенчик,  1960],  определяли  способность
КЖ  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера  стимулировать  обра¬
зование  корней  у  черенков  фасоли.  Для  этого  черенки  14-днев-
ных  растений  фасоли  ставили  в  воду  с  добавлением  КЖ  (титр  сус¬
пензии  107  КОЕ/мл).  Черенки  контрольных  растений  помещали
в  стерильную  воду.  В  каждом  варианте  -  10  черенков,  продолжи¬
тельность  опыта  -  12  дней.  После  окончания  опыта  подсчитыва¬
ли  образовавшиеся  корни.
 Растение  особенно  чувствительно  к  факторам  внешней  среды  в
ранней  фазе  роста,  когда  прорастает  семя  и  формируется  пророс¬
ток,  поэтому  влияние  бактеризации  легче  всего  определить  именно
в  этот  период  жизни  растения,  чем  в  последующие  фазы.
 51

Таблица  20.  Влияние  бактеризации  выделенными  штаммами  псевдомонад  на  всхожесть  семян
 сельскохозяйственных  культур
 Всхожесть  семян,  %
 Вариант
 I.  10  мл  КЖ/г  семян
 Томат  Подарок
 Огурец  Пионер
 Свекла  Египетская
 Капуста  Слава  1305
 2-е  сутки
 4-е  сутки
 2-е  сутки
 4-е  сутки
 2-е  сутки
 4-е  сутки
 2-е  сутки
 4-е  сутки
 Контроль
 33,1  ±4,7
 93,3±5,2
 38,3±3,5
 89,2±7,3
 15,4±3,1
 36,3±2,8
 91,2±1,3
 92,4±6,9
 P.  aureofaciens
ИБ  51
 1,0±0,4*
 88,1±1,3
 2,5±2,3*
 2,3±0,3*
 4,3±3,1*
 20,6±5,8*
 8,4±3,7*
 91,3±7,8
 P.  putida  ИБ  56
 13,3±2,5*
 88,4±2,4
 1,4±1,0*
 1,4±1,0*
 4,5±2,7*
 23,2±6,38
 93,9±3,6
 99,4±0,3
 Pseudomonas  sp.
ИБ  182
 12,7±6,Г
 87,2±1,8
 0,7±1,0*
 1,2±0,5*
 3,6±1,9*
 12,4±10,0*
 89,2±4,1
 99,5±0,3
 И.  I08  КОЕ/г  семян
 Вариант
 Томат  Подарок
 Свекла  Египетская
 Капуста  Слава  1305
 2-е  сутки
 4-е  сутки
 2-е  сутки
 4-е  сутки
 2-е  сутки
 4-е  сутки
 Контроль
 33,3±4,8
 93,4±3,4
 15,3±3,4
 36,3±1,9
 91,6±3,0
 92,2±6,1
 P.  aureofaciens
ИБ  51
 6,7±5,1*
 87,3±6,9
 0,0±0,0*
 26,7±8,2
 62,9±10,5*
 80,4±6,7
 Р.  putida  ИБ  56
 33,2±8,1
 96,5±2,7
 0,0±0,0*
 39,1±0,5*
 80,4±8,0*
 98,2±0,4
 Pseudomonas  sp.
ИБ  182
 26,7±6,2
 94,8±4,8
 0,0±0,0*
 25,2±4,9*
 76,7±9,1*
 98,2±1,1

Таблица  20  (окончание)
 >П  (Л  h
со  ~  с$
 4  $  ё
 <N  40  VO
ON  ON  ON
 —'  »n
+»
»n
 S'
 2
 <N
 ГП  CO  ^
 -H  -H  +|
<N  o
^  VO
On  00  Г-
 Tt  <N
 ?  +i
 m  <n
 V
 00  VO  h
ri  Tf  Tt
 -H  -H  -H
<4  Г-  ON
 <N  00
 5  ti
 ГО  00
со  VO
(N  ^
 Ш
 Ш
 о
 и
 о
 s
 a
 v
 00  ON  CO
r~-  со  ~
-H  ±1  -H
 CO  О  ^
ON  VO  oo"
00  ON  ON
 Г-;  On
 +\  5
 rf  <N
00  oo*
On  On
 a
 £
 О
 r-  со
oo  »n
-H  -H  -H
 <N  CO
OO*  VO
со  oo
 af
 ^  oo
-H  -H
<N  On
00*“  00
ON  00
 о
 e
 H
 cd
 2
 О
 H
 о
 in
 00
 я
 vO
 СП
 -Н
 со
 со
 -н
 (N
 +i
 vO
 +!
 00
 со
 ON
 00
 ri
 On
 СО
 On
 in
 On
 ^  oo  cn
<N  vO
-H  -H  -H
vo  со  f4
со  СЧ
m  м  (N
 oo  oo
<N  1П
-H  -H
r-  —
 ©  ON
^  (N
 S’
 CD
 PQ
 S  *
s  *
 vo  cx
 m  “>
 W
 s
 0
 1 	=
 S*  w
 £s
 Известно,  что  сами  пита¬
тельные  среды,  не  инокулиро-
ванные  бактериями,  могут
оказывать  ингибирующее  вли¬
яние  на  прорастание  семян
[Михновская  и  др.,  1988].  При
сравнении  всхожести  семян  по¬
сле  замачивания  в  воде  и  сте¬
рильной  питательной  среде
Кинг  В  в  последнем  случае  от¬
мечено  незначительное  инги¬
бирование  прорастания  семян,
особенно  на  начальном  этапе.
Наибольшему  отрицательному
воздействию  со  стороны  ком¬
понентов  питательной  среды
оказались  подвержены  семена
свеклы:  в  вариантах  с  исполь¬
зованием  питательной  среды
семена  прорастали  медленнее
и  общее  количество  пророс¬
ших  семян  было  в  1,5  раза
меньше,  чем  в  контроле  с  во¬
дой  (табл.  20,  Ш).
 При  использовании  боль¬
шого  количества  неразбавлен¬
ной  КЖ  псевдомонад  и  азото¬
бактера  (10  мл  КЖ/г  семян)
всхожесть  семян  всех  расте¬
ний,  участвующих  в  опыте,
снижалась  по  сравнению  с  кон¬
тролем  (вода)  (табл.  20,  I).
Оказалось,  что  наиболее  чув¬
ствительны  к  высокой  концен¬
трации  протравителя  незави¬
симо  от  рода  и  вида  испытуе¬
мых  микроорганизмов  огурцы.
Тем  не  менее,  уменьшив  рас¬
ход  КЖ  бактерий  родов
Pseudomonas  и  Azotobacter  до
107-108  КОЕ/г  семян,  мы  на¬
блюдали,  что  всхожесть  семян
огурцов  в  вариантах  с  обработ¬
кой  штаммами  псевдомонад  и
 53

Таблица  21.  Влияние  бактеризации  выделенными  штаммами  азотобактера
на  всхожесть  семян  сельскохозяйственных  культур
(107—108  КОЕ/г  семян)
 Вариант
 Всхожесть  семян,  %
 Редис  Красный  с  белым
кончиком
 Капуста  Золотая  ранняя
 1-е  сутки
 3-и  сутки
 3-и  сутки
 7-е  сутки
 Контроль
Az.  vinelandii  ИБ  1
Az.  vinelandii  ИБ  3
Az.  vinelandii  ИБ  4
 *  Различия  по  сравнению
 32  Л  ±4,8
48,1  ±7,7*
39,2±3,3
53,6±5,4*
 с  контролем  су
 96,6±3,2
 97,3±4,1
 96,0±2,9
 99,3±0,4
 щественны  при
 30,7±5,1
 41,6±5,2*
 30,0±2,4
 50,0±3,5*
 р  =  0,95;  но  -  н
 50,3±7,7
 54,6±3,8
 75,0±8,8*
 65,3±6,2*
 е  определяли.
 штаммом  Az.  vinelandii  ИБ  4  выше,  чем  в  контроле  (см.  табл.  20,
Ш;  21).  Наименее  чувствительны  к  концентрированной  бактери¬
альной  суспензии  псевдомонад  и  азотобактера  семена  капусты  и
томата;  процент  всхожести  данных  семян  на  4-е  сутки  во  всех  ва¬
риантах  опыта  (с  бактеризацией  и  без  обработки)  -  статистиче¬
ски  не  различим  (см.  табл.  20,1).
 Отмечено,  что  положительное  влияние  бактеризации  на
всхожесть  семян  заметнее  выражено  на  начальном  этапе  контак¬
тирования  между  растением  и  микроорганизмами,  а  затем  оно
нивелируется  по  отношению  к  контролю.
 Это  особенно  характерно  для  семян  с  высокой  энергией  про¬
растания  (редис)  (см.  табл.  21).
 В  целом  среди  испытанных  бактерий  p.  Pseudomonas  лучше
всего  на  разных  культурах  растений  показал  себя  штамм  P.  puti¬
da  ИБ  56.  Для  семян  томата  и  огурца  оптимальным  оказался  ва¬
риант  бактеризации  с  расходом  КЖ  107  КОЕ/г  семян,  для  семян
свеклы  лучшие  результаты  получены  при  обработке  КЖ  из  рас¬
чета  108  КОЕ/г  (см.  табл.  20).
 Бактеризация  семян  растений  штаммами  азотобактера  спо¬
собствовала  увеличению  всхожести  огурца,  редиса,  капусты;
наибольший  ростстимулирующий  эффект  был  отмечен  на
культурах  свеклы  и  томата  (в  1,5-2,2  раза).  Обобщая  получен¬
ные  результаты,  следует  сказать,  что  среди  описанных  изолятов
псевдомонад  и  азотобактера  только  один  штамм  Az.  vinelandii
ИБ  4  активизировал  всхожесть  всех  пяти  культур  растений
(см.  табл.  21).
 Таким  образом,  как  показывают  результаты  исследований,
бактеризация  семян  растений  изучаемыми  штаммами  псевдомо-
 54

Всхожесть  семян,  %
 Свекла  Египетская
 Томат  Марманд
 Огурец  Патерна
 3-и  сутки
 7-е  сутки
 5-е  сутки
 7-е  сутки
 3-и  сутки
 7-е  сутки
 14,4±4,2
 33,3110,1
 3,4±3,2
 23,3±11,3
 88,8±3,4
 88,8±3,4
 31,1  ±9,5*
 44,4±5,6
 6,2±0,8
 43,3±7,2*
 83,3±5,7
 83,3±5,7
 25,5±5,9*
 50,9±4,5*
 5,5±2,1
 50,4±4,8*
 но
 но
 30,7±2,7*
 50,4±6,0*
 8,7±2,7
 43,3±5,9*
 94,4±2,0*
 94,4±2,0*
 над  и  азотобактера  стимулирует  всхожесть  ряда  сельскохозяйст¬
венных  культур.  Но  необходимо  подчеркнуть,  что  не  существует
универсального  варианта  обработки  семян,  т.е.  оптимальная  до¬
за  биопрепаратов  должна  определяться,  исходя  из  индивидуаль¬
ных  особенностей  культуры  растения  и  иггамма-антагониста.
 Одним  из  примеров,  наглядно  иллюстрирующим  положи¬
тельный  эффект  воздействия  на  растение  со  стороны  изучаемых
нами  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера,  может  служить  веге¬
тационный  опыт  на  фасоли  сорта  Харьковская  белосемянная
Д-45  (табл.  22).  Бактеризация  семян  фасоли  штаммами  псевдомо¬
над  и  азотобактера  стимулировала  развитие  на  корнях  молодых
растений  клубеньков.  В  литературе  отмечается  положительное
влияние  свободноживущих  азотфиксаторов  на  формирование  и
функционирование  бобово-ризобиальных  симбиозов  [Надкер¬
ничная,  Ковалевская,  2001].  Известно  также  о  попытках  созда¬
ния  искусственных  азотфиксирующих  симбиозов  на  основе  Az.
nigricans  и  Bacillus  sp.,  влекущих  за  собой  образование  псевдоклу¬
беньков  на  корнях  рапса  [Ковальская,  2001].  Тот  факт,  что  псевдо¬
монады  могут  стимулировать  клубенькообразование  у  растений
семейства  бобовых,  также  подтверждается  некоторыми  автора¬
ми  [Grimes,  Mount,  1984;  Nishijima  et  al.,  1988].
 Эффект  стимуляции  клубенькообразования  (в  5,3-12,5  раза)
может  быть,  по-видимому,  объяснен  тем,  что  инокуляция  семян
фасоли  штаммами  культур  азотобактера  и  псевдомонад  создает  в
ризосфере  фасоли  условия,  благоприятные  для  формирования  и
дальнейшего  развития  азотфиксирующего  симбиоза  на  корнях
растений,  даже  без  искусственного  внесения  в  почву  и  на  семена
культур  p.  Rhizobium.
 55

Таблица  22.  Влияние  штаммов  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter
на  развитие  растений  фасоли  в  вегетационном  опыте
 Вариант
 Длина
растения,  см
 Средняя  масса
зеленой  части
одного  рас¬
тения,  г**
 Средняя
масса  корней
одного  рас¬
тения,  г**
 Контроль
 Р.  aureofaciens  ИБ  51
P.  putida  ИБ  17
Az.  vinelandii  ИБ  1
Az.  vinelandii  ИБ  3
Az.  vinelandii  ИБ  4
 *  Различия  по  сравнению  с  контролек
по  сырой  массе.
 21,8±4,3
24,5±2,1
18,8±1,5
21,9±3,6
23,3±2,4
23,9±3,5
1  существенны  п|
 2,5±1,5
2,8±0,7
2,2±0,9
3,6±1,1
3,3±0,6
3,2±0,8
)и  р  =  0,95;  **  ци<|
 0,8±0,2
1,3±0,2
1,3±0,3
1,7±0,2*
1,3±0,Г
1,6±0,4*
зры  приведены
 Вариант
 Среднее  число
клубеньков  на
корнях  одного
растения,  шт.
 Развитие
корневых
гнилей,  %
 Биологи¬
ческая
эффектив¬
ность,  %
 Контроль
 0,6±0,3
 43,8±12,1
 -
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 4,8±1,2*
 16,7±2,3*
 61,9*
 P.  putida  ИБ  17
 3,0±0,9*
 8,3±1,2*
 81,Г
 Az.  vinelandii  ИБ  1
 4,8±1,5*
 10,0±3,1*
 77,  Г
 Az.  vinelandii  ИБ  3
 5,2±1,7*
 11,1  ±2,5*
 74,6*
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 6,9±0,9*
 25,0±3,5*
 42,9*
 В  ходе  проведенных  опытов  удалось  также  показать,  что
предпосевная  обработка  семян  культурами  штаммов-антагони-
стов  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter  способствует  защите  расте¬
ний  от  болезней  и  влияет  на  интенсивность  роста  и  развития
проростков  фасоли,  а  также  корневой  системы  растений  (см.
табл.  22).
 Полученные  результаты  можно  объяснить  способностью
изучаемых  штаммов  Az.  vinelandii  и  Pseudomonas  к  продуцирова¬
нию  цитокининов  и  ауксиноподобных  веществ,  а  также  наличи¬
ем  у  них  выраженной  антагонистической  активности  в  отноше¬
нии  грибных  фитопатогенов  растений.  Кроме  того,  в  опытах  in
vitro  было  показано  ранее,  что  упомянутые  штаммы  потенциаль¬
но  способны  улучшать  фосфорное  и  азотное  питание  растений.
 Для  подтверждения  ростстимулирующей  активности  КЖ  изу¬
чаемых  штаммов  азотобактера  был  использован  описанный  вы¬
ше  метод  [Рубенчик,  1960].  О  наличии  положительного  влияния
 56

Таблица  23.  Влияние  бактерий-антагонистов  p.  Azotobacter
на  стимуляцию  корнеобразования  на  черенках  фасоли
 Вариант
 Число  черенков,
образовавших
корни,  шт.
 Суммарное  число
корней  на  10
черенках  фасоли,
шт.
 Контроль
 2
 17
 Az.  vinelandii  ИБ  1
 6
 61
 Az.  vinelandii  ИБ  3
 6
 74
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 7
 93
 со  стороны  микроорганизмов  в  данном  опыте  судили  по  образо¬
ванию  корней  на  стеблях  фасоли,  инкубируемых  в  течение
12  дней  в  разбавленной  КЖ  штаммов-антагонистов  (табл.  23).
В  вариантах  со  штаммами  Az.  vinelandii  количество  вновь  образо¬
ванных  корней  на  черенках  фасоли  превысило  контрольное  зна¬
чение  в  3,6-5,5  раза.
 Таким  образом,  комплексные  исследования,  проведенные  в
отношении  новых  штаммов  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter,  по¬
зволили  нам  отнести  их  к  ростстимулирующим  ризобактериям
(PGPR).  В  данном  случае  речь  идет  о  комплексе  механизмов  по¬
ложительного  воздействия  со  стороны  микроорганизмов  на
растения:  защита  от  патогенов  за  счет  синтеза  антибиотиков,  эк¬
зоферментов;  продуцирование  фитогормонов,  фиксация  моле¬
кулярного  азота,  мобилизация  труднодоступных  соединений
фосфора.

ВЫДЕЛЕНИЕ,  ОЧИСТКА
И  ХАРАКТЕРИСТИКА  МЕТАБОЛИТОВ,
ОБЛАДАЮЩИХ  ФУНГИЦИДНОЙ  АКТИВНОСТЬЮ,
ПРОДУЦИРУЕМЫХ  БАКТЕРИЯМИ  РОДОВ  PSEUDOMONAS
И  AZOTOBACTER
 Антибиотические  вещества  псевдомонад,  подавляющих  раз¬
витие  различных  групп  фитопатогенных  бактерий  и  грибов,  дав¬
но  уже  являются  предметом  интенсивных  исследований  ученых.
Несомненно,  что  способность  штамма  к  синтезу  антибиотиче¬
ских  веществ  во  многом  определяет  активность  бактерии-антаго-
ниста.
 К  настоящему  времени  у  бактерий  p.  Pseudomonas  обнаруже¬
но  около  100  антибиотических  веществ  самого  разнообразного
строения  и  только  не  более  20%  из  них  играют  роль  в  подавлении
фитопатогенных  грибов.
 Способность  к  синтезу  ациклических  антибиотиков  широко
распространена  у  псевдомонад.  Но  с  точки  зрения  подавления
фитопатогенных  грибов,  можно  отметить  антифунгин,  выделен¬
ный  Худяковым  и  др.  [1965]  из  культуральной  жидкости
Р.  mycophaga.  Он  действует  на  возбудителя  вилта  хлопчатника
Verticillium  dahliae,  в  связи  с  чем  высказывалось  мнение  о  перспе¬
ктивности  его  применения  в  борьбе  с  грибными  заболеваниями
растений.  В  дальнейшем  выяснилось  [Попова  и  др.,  1971],  что  ан¬
тифунгин  представляет  собой  комплексный  препарат,  содержа¬
щий  смесь  уксусной,  пропионовой,  масляной,  валериановой,
капроновой  и  салициловой  кислот.  Наиболее  активным  компо¬
нентом  среды  являлась  н-капроновая  кислота.
 Наибольшее  количество  публикаций  посвящено  антибиоти¬
кам  феназиновой  группы,  их  химической  структуре,  биологиче¬
ской  активности,  путям  синтеза.
 Способность  к  синтезу  гетероциклического  феназинового  яд¬
ра  является  одной  из  отличительных  особенностей  метаболизма
бактерий  p.  Pseudomonas.  Многие  антибиотики-феназины  выде¬
лены  из  псевдомонад  сравнительно  давно.
 Один  из  наиболее  ранних  антибиотиков  -  пиоцианин  (синий  пиг¬
мент  P.  aeruginosa)  выделен  в  1860  г.  По  химическому  строению  он
представляет  собой  9-Ы-метил-1-оксифеназин  [Knight  et  al.,  1979].
 Наряду  с  пиоцианином  в  КЖ  штаммов  P.  aeruginosa  были  об¬
наружены  и  другие  пигменты  -  гемипиоцианин  и  оксихлорора-
фин.  Оксихлорорафин  является  амидом  феназин-1-карбоновой
 58

кислоты,  может  быть  получен  синтетически  [Takeda,  1958]  из
хлорорафина  -  изумрудно-зеленого  пигмента,  характерного  для
P.  chlororaphis,  однако  выделенного  и  из  КЖ  P.  aeruginosa  [Kanner
et  al.,  1978].
 Было  показано,  что  штаммы  P.  aeruginosa,  образующие  геми-
пиоцианин  и  оксихлорорафин,  обладали  более  высокой  антифун-
гальной  активностью  в  опытах  по  антагонизму  [Takeda,  1959].
 Способность  к  синтезу  феназиновых  пигментов  свойственна
и  другим  видам  p.  Pseudomonas.  Феназин-1-карбоновую  кислоту
способны  синтезировать  штаммы  Р.  putida,  P.  fluorescens  и
P.  aeruginosa  [Slininger,  Shea-Wilbur,  1995;  Slininger  et  al.,  1996].
 Исследованиям  антибиотических  свойств  штамма  P.  fluo¬
rescens  2-79,  подавляющего  развитие  Gaeumannomyces  graminis
var.  tritici  (Ggt),  поражающего  пшеницу,  посвящены  работы
 D.M.  Weller  и  L.S.  Thomashow  [1989,  1990].  Показано,  что  клетки
Р.  fluorescens  2-79  продуцируют  антибиотик  феназин-1  «карбоно¬
вую  кислоту,  которая  обнаруживалась  у  растений,  выросших  из
семян,  обработанных  культурой  псевдомонады  [Thomashow  et  al.,
1990],  она  также  входит  наряду  с  наиболее  сильным  антибиоти¬
ком  2-оксифеназин-1-карбоновой  кислотой  и  2-оксифеназином  в
состав  пигментного  комплекса  Р.  aureofaciens  [Петренко,  Боров¬
ков,  1970;  Toohey  et  al.,  1965].
 Широкое  распространение  феназиновых  пигментов  у  бакте¬
рий  p.  Pseudomonas,  высокая  активность  их  биосинтеза  свиде¬
тельствуют  о  важной  и  пока  окончательно  не  выясненной  роли
их  в  жизнедеятельности  бактерий-продуцентов  [Pierson  L.S.P.,  Ш,
Pierson  Е.А.,  1996;  Chin-A-Woeng  et  al.,  2003].
 Комплекс  антибиотиков  ароматической  природы  был  выде¬
лен  из  штаммов  P.  aurantiaca  [Киприанова  и  др.,  1969,  1971]  и  па¬
раллельно  из  Р.  fluorescens  [Редди,  Боровков,  1969],  компоненты
комплекса  имели  близкий  химический  состав,  сходные  УФ-  и
ИК-спектры  [Есипов  и  др.,  1975].  После  разделения  компонентов
комплекса  антибиотически  высокоактивным  веществом  оказал¬
ся  2,4-диацетилфлороглюцин.  Этот  антибиотик  наряду  с  фенази-
нами  является  одним  из  всесторонне  изучаемых  [Shanahan  et  al.,
1992;  Nowak-Thompson  et  al.,  1994;  Bonsall  et  al.,  1997].  Это,  по-ви-
димому,  обусловливается  способностью  Pseudomonas  к  образова¬
нию  сложных  многоядерных  производных  из  более  простых  пу¬
тем  конденсации  с  помощью  формальдегида  подобно  тому,  как
это  происходит  в  химическом  синтезе.
 Можно  отметить,  что  антибиотики  ароматической  природы
встречаются  у  псевдомонад  сравнительно  редко  [Смирнов  и  др.,
1991;  Nowak-Thompson  et  al.,  1994],  чего  нельзя  сказать  о  способ¬
ности  к  синтезу  азотсодержащих  гетероциклических  соединений.
 59

К  числу  соединений,  содержащих  пиррольное  ядро,  относит¬
ся  антибиотик  пиолютеорин,  впервые  выделенный  из  P.  aerugi¬
nosa  [Takeda,  1959],  но  чаще  всего  встречающийся  у  Р.  fluorescens
[Mauerhofer  et  al.,  1994].
 Еще  одно  производное  пиррола  -  пирролнитрин  -  является
одним  из  самых  мощных  антифунгальных  агентов,  выделенных
из  бактерий  p.  Pseudomonas.  Пирролнитрин  впервые  был  выде¬
лен  из  КЖ  P.  pyrrocynia  [Arima  et  al.,  1964].  Позже  D.  Livelly  и  др.
[1966]  пирролнитрин  был  обнаружен  в  КЖ  Р.  aureofaciens.  В
дальнейшем  пирролнитрин  был  обнаружен  и  у  других  видов  псев¬
домонад:  P.  fluorescens,  P.  cepacia  [Burkhead  et  al.,  1994].
 В  работе  C.R.  Howell,  R.D.  Stipanovic  [1980]  показано,  что
штамм  P.  fluorescens  Pf-5  синтезировал  два  антибиотика  -  пир¬
ролнитрин  и  пиолютеорин.
 Изолят  P.  cepacia  RB425  продуцировал  ряд  антибиотиков,  ко¬
торые  оказались  близкими  пирролнитрину,  2-(2-гептенил)-3-ме-
тил-4-хинолинолу  и  2-(2-ноненил)-3-метил-4-хинолинолу.  Обна¬
ружена  высокая  активность  очищенных  соединений  в  отношении
Pyricularia  oryzae,  Rhizoctonia  solani,  Verticillium  dahliae.  В  то  же
время  бактерицидная  активность  выделенного  штамма  была  низ¬
кой  [Homma  et  al.,  1989].
 Новые  хлорированные  фенилпиррольные  антибиотики,  вы¬
деляемые  бактерией  P.  cepacia,  получены  W.J.  Janisiewicz,
J.  Roitman  [1988].  Они  представляли  собой  2,3-дихлор-4-(2-амино-
 3-хлорфенил)-пиррол 	и  2-(2-гептенил)-3-метил-4(1Н)-хинолинон
[Roitman  et  al.,  1990].  Из  другого  штамма  P.  cepacia  RB425  были
выделены  антибиотики,  близкие  по  строению  к  пирролнитри-
ну,  2-(2-гептенил)-3-метил-4-хинолину  и  2-(2-ноненил)-3-метил-
 4-хинолину 	[Roitman  et  al.,  1990];  из  штамма  P.  cepacia  PC  II
были  выделены  2-пентил-3-метил-4-хинолинон,  2-гептил-З-ме-
тил-4-хинолинон,  2-нонил-3-метил-4-хинолинон  [Moon  et  al.,
1996].
 В  1981  г.  К.  Kintaka  и  др.  сообщили  о  выделении  из  бактерий
p.  Pseudomonas  антибиотика  р-лактамной  природы.  Продуцент
нового  антибиотика  сульфазецеина  получил  название  P.  aci-
dophila.  Отличительной  особенностью  этого  вида  является  спо¬
собность  к  росту  при  низких  значениях  pH,  что  крайне  редко
встречается  у  псевдомонад.  Сульфазецеин  -  водорастворимый
антибиотик,  содержащий  серу,  аланин,  глутаминовую  кислоту  и
представляющий  собой  Зда-Зу-ё-глютамин-амино-З-метокси-
азетидин-2он-сульфоновую  кислоту,  позже  было  показано,  что
этот  антибиотик  обладает  антифунгальной  активностью.
 Т.  Paulitz  и  др.  [2000]  выделили  из  КЖ  штамма  P.  aureofaciens
(  =  P.  chlororaphis)  63-28  антибиотик  бутиролактонной  (фура-
 60

новой)  природы  -  3-(1-гексенил)-5-метил-2-(5Н)-фуранон  или
(г)-4-метил-2-(1-гексенил)-2-бутенолид  ,  ранее  у  этого  штамма  бы¬
ли  выделены  еще  два  бутиролактона  с  антифунгальными  свойства¬
ми  -  (7)-4-гидрокси-4-метил-2-(1-гексенил)-2-бутенолид  и  (Z)-4-
гидроксиметил-2-(1-гексенил)-2-бутенолид  [Gamard  et  al.,  1997].
 Новый  антибиотик,  обладающий  фунгицидными  свойствами,
выделен  у  штамма  Pseudomonas  sp.  Q38009  и  представляет  собой
15-членное  макролактоновое  кольцо  с  ответвлением  метоксии-
минной  структуры  [Suzumura  et  al.,  1997].
 Считалось,  что  способность  к  синтезу  антибиотиков  -  поли¬
пептидов  -  у  бактерий  p.  Pseudomonas  распространена  сравни¬
тельно  слабо  [Parker  et  al.,  1984],  но  в  последнее  время  это  утвер¬
ждение  было  опровергнуто.
 У  P.  cepacia  АТСС  39277  обнаружена  целая  группа  цикличе¬
ских  пептидов,  проявляющих  антигрибные  свойства,  -  ксилокан-
дины  Al,  А2,  Bl,  В2,  Cl,  С2,  D1  и  D2  [Bisacchi  et  al.,  1987;  Meyers
et  al.,  1987].  При  помощи  масс-спектрометрии  определены  их  мо¬
лекулярные  массы  (кДа):  А1  -  1,215;  А2  -  1,199;  В1  -  1,229;  В2  -
1,213;  С1  -  1,097;  С2  -  1,081;  D1  -  1,083;  D2  -  1,067.  Каждый  кси-
локандин  содержит  глицин,  серин,  аспарагин  (1-3  остатка),  р-гид-
рокситирозин  и  необычную  аминокислоту  с  формулой
C|8H37N05.  Дополнительно  компоненты  Al,  А2,  D1  и  D2  содер¬
жат  2,4-диаминобутановую  кислоту,  компоненты  Al,  Bl,  С1  и
D1  -  эритро-р-гидроксиаспарагин,  а  ксилокандины  Al,  А2,  В1  и
В2  содержат  еще  и  ксилозу.  Для  каждой  пары  ксилокандинов
эритро-р-гидроксиаспарагин  в  первом  компоненте  пары  таким
образом  заменен  аспарагином  во  втором  компоненте,  что  массо¬
вое  различие  для  каждой  пары  составляет  16  Да.
 Из  другого  штамма  P.  cepacia  AF  2001  корейскими  учеными
[Lee,  1994]  выделен  другой  антибиотик  пептидной  природы  -  се-
пацидин  А,  обладающий  высокой  антигрибной  активностью  и
представляющий  собой  смесь  двух  очень  близких  по  химической
природе  компонентов  сепацидина  А1  и  сепацидина  А2.
 Штамм  P.  cepacia  ВС  И  продуцирует  антибиотик  AFC-BC11,
отличающийся  высокой  антагонистической  активностью  [Kang
et  al.,  1998].
 Ранее  отмечалось,  что  Pseudomonas  sp.  продуцирует  также
комплекс  полипептидных  антибиотиков  -  эльтерецидинов,  пода¬
вляющих  рост  Alternaria  [Kirinuki  et  al.,  1977].
 В  последнее  время  появились  сообщения  о  циклических  ли-
попептидах,  обладающих  фунгицидной  активностью,  -  вискози-
намиде,  тенсине,  амфизине,  обнаруженных  у  P.  fluorescens
[Nielsen  N.  et  al.,  1998;  Nielsen  T.  et  al.,  2000],  Pseudomonas  sp.
DSS73  [Sorensen  et  al.,  2001].
 61

W.  Fakhouri  и  др.  [2001]  выделили  из  штамма  P.  fluorescens
G308  новое  антибиотическое  вещество,  идентифицированное  как
М-меркапто-4-формилкарбостирил.
 Из  КЖ  другого  штамма  P.  fluorescens  ММ-В16  С.  Lee  и  др.
[2003]  выделили  антибиотик  аеругин,  проявляющий  антигриб-
ную  активность.  Эмпирическая  формула  выделенного  соедине¬
ния  C10HuNO2S,  молекулярная  масса  209,0513,  по  химической
структуре  4-оксиметил-2-(2-оксифенил)-2-тиазолин.
 Корейскими  учеными  во  главе  с  К.К.  Kim  [2000]  выделен  дру¬
гой  антифунгальный  антибиотик  -  N-бутилбензенсульфонамид.
 Штаммы  WH157  и  WH161  P.  fluorescens,  развивающиеся  на
семенах,  корнях,  гипокотилях  и  семядолях  хлопчатника,  синтези¬
руют  антибиотик  оомицин  А.  Обработка  семян  хлопчатника
штаммом  WH157  стимулировала  прорастание  семян  на  15-20%  и
снижала  заражение  всходов  Pythium  ultimum  [Howie  et  al.,  1989].
 Другой  класс  антифунгальных  метаболитов  псевдомонад  -
это  экзоферменты  (хитиназы  и  глюконазы).  Так,  наличие  у  неко¬
торых  псевдомонад  комплекса  гидролитических  ферментов
определяет  их  способность  использовать  в  качестве  источника
питания  грибной  мицелий.
 Изучена  хитинолитическая  активность  у  235  изолятов  раз¬
личных  видов  Pseudomonas,  отнесенных  к  комплексу  P.  fluo¬
rescens  и  Xanthomonas  maltophilia,  близких  к  Pseudomonas.  Способ¬
ность  к  образованию  хитинолитических  ферментов  выявлена
лишь  у  отдельных  штаммов  Pseudomonas,  в  то  время  как  у  боль¬
шей  части  штаммов  (33  из  41)  X.  maltophilia  хитинолитическая
активность  обнаружена  [Andreeva  et  al.,  1996].
 В  коллекцию  микроорганизмов  ВКМ  депонирован  штамм
Р.  maltophilia  ТС-259,  обладающий  хитинолитической  активно¬
стью.  Данный  штамм  обладает  способностью  подавлять  рост  фи¬
топатогенных  грибов-возбудителей  сосудистых  увяданий  и  кор¬
невых  гнилей  растений  [Пат.  РФ  2031119].
 Анализ  ферментативной  активности  группы  штаммов
p.  Pseudomonas  выявил  у  штамма  SPB2142  способность  к  проду¬
цированию  хитиназы.  При  изучении  антифунгальной  активности
бактерий  подтвердилось,  что  данный  штамм  обладает  способно¬
стью  использовать  грибной  мицелий  как  источник  питания
[Кравченко  и  др.,  2002].
 На  основе  Тп  7  была  сконструирована  система,  несущая  chiA
ген  Serratia  marcescens  под  контролем  Рис-промотора  в  составе
плазмиды  pUXH21.  В  трехродительском  скрещивании  pUXH21
была  передана  в  P.  fluorescens,  в  результате  чего  получили
штамм,  стабильно  экспрессирующий  и  секретирующий  актив¬
ную  хитиназу.  Сконструированный  штамм  обладал  биологиче¬
 62

ской  активностью  против  почвенного  растительного  патогена
Rhizoctonia  solani  [Simi  Body  et  al.,  1994].
 Большинство  авторов  сообщает  о  способности  штаммов
Az.  chroococcum  продуцировать  антифунгальные  антибиотики,  но
в  литературе  практически  нет  сведений  о  химической  природе
этих  веществ.  В  единственном  источнике  сообщается  о  штамме
Az.  chroococcum  92,  синтезирующем  на  среде  с  мелассой  антифун-
гальный  антибиотик,  представляющий  собой  метиловый  эфир
алифатической  тетраеновой  кислоты.  Антибиотик  угнетал  рост
фитопатогенных  грибов  Helminthosporium  sativum,  Botrytis  cinerea,
Verticillum  dahliae,  Fusarium  sp.  [Пат.  922105].  Из  культуральной
жидкости  штамма  Azotobacter  chroococcum  53  Е.Н.  Мишустиным
и  др.  [1969]  был  выделен  антибиотик,  сходный  по  структуре  с
анисомицином,  но  отличающийся  от  последнего  по  УФ-спектру,
поэтому  был  сделан  вывод  о  выделении  нового  антибиотика,  ра¬
нее  не  описанного  в  литературе.  Антибиотик  угнетал  рост  фито¬
патогенных  и  фитотоксичных  грибов  родов  Aspergilus,
Penicillium,  Alternaria,  Fusarium.
 Реже  в  литературе  сообщается  о  способности  бактерий
p.  Azotobacter  продуцировать  биологически  активные  вещества
группы  сидерофоров,  которые  подавляют  рост  фитопатогенов
путем  конкуренции  с  ними  за  железо  [Suneja  et  al.,  1993,  1996].
 Таким  образом,  у  бактерий  p.  Pseudomonas  в  отличие  от  пред¬
ставителей  Azotobacter  наиболее  широко  изучены  свойства,  хара¬
ктеризующие  способность  подавлять  или  замедлять  рост  почвен¬
ных  фитопатогенов.  Механизмы  антагонистических  взаимодей¬
ствий  псевдомонад  и  фитопатогенов  различны.  Это  продукция
сидерофоров,  отвечающих  за  связывание  и  транспорт  железа  и
синтез  антибиотических  веществ.  Нам  представлялось  наиболее
интересным  изучить  вторичные  метаболиты  как  псевдомонад,
так  и  азотобактера,  с  точки  зрения  их  антагонистической  актив¬
ности  к  фитопатогенам.  Для  этого  были  апробированы  разрабо¬
танные  нами  схемы  выделения  и  очистки  метаболитов,  обладаю¬
щих  фунгицидной  активностью.
 Широкая  распространенность  Pseudomonas  обеспечивается
их  способностью  развиваться  в  самых  различных  условиях  в  при¬
роде,  в  широком  интервале  температур  и  использовать  самые
разные  соединения  углерода  и  азота  в  энергетическом  и  констру¬
ктивном  обмене  [Рубан,  1986;  Corbell,  Loper,  1995].  Но  для  куль¬
тивирования  Pseudomonas  с  целью  получения  антибиотических
веществ,  как  правило,  требуются  богатые  органическими  фор¬
мами  азота  и  углерода  среды.
 Е.О.  King  и  др.  [1954]  предложили  среду  для  определения  об¬
разования  флюоресцирующих  пигментов;  в  дальнейшем  и  до  на¬
 63

ших  дней  эта  среда  Кинг  В,  в  состав  которой  входят  глицерин,
пептон,  K2HP04,  MgS04,  является  одной  из  основных  для  культи¬
вирования  Pseudomonas  -  продуцентов  веществ  с  фунгицидной
активностью.  Реже  используются  также  богатые  среды  -  такие
как  среда  LB  и  питательные  бульоны  с  добавлением  0,5-1,0%  ис¬
точника  углевода  (обычно  глюкозы)  [Katoh,  Iton,  1983;  Gould  et
al.,  1985;  James,  Gutterson,  1986].  Однако,  как  показано  в  работе
 Е.И.  Квасникова  и  др.  [1975],  штаммы  P.  aurantiaca  способны  к
синтезу  веществ  с  фунгицидной  активностью  не  только  на  бога¬
той  среде  Кинга,  но  и  на  синтетической  среде  Мюнца  в  присутст¬
вии  низкомолекулярных  н-алканов  (С8-С10).
 Достаточно  хорошо  изучен  синтез  антибиотиков  феназино-
вой  природы  на  средах,  где  в  качестве  единственного  источника
углерода  фигурировал  н-алкан,  что  было  показано  для  пиоциани-
на  [Поморцева,  1965],  феназин-1-карбоновой  кислоты  (с  октаде¬
каном,  гексадеканом,  тетрадеканом)  [Higashihara,  Sato,  1969].
Т.  Higashihara  и  A.  Sato  [1985]  получили  феназин-1-карбоновую
кислоту  из  штамма  P.  aeruginosa,  источником  углерода  для  кото¬
рой  служил  этанол.  Из  работы  Т.  Ohmori  и  др.  [1978]  следует,  что
в  значительных  количествах  синтезируется  бактериями  на  средах
с  н-парафинами  и  пиолютеорин.
 В.К.  Duffy,  G.  Defago  в  своих  работах  [1997,  1999]  показали
влияние  источника  углерода  и  минерального  состава  питатель¬
ной  среды  на  биосинтез  диацетилфлороглюцина,  пиолютеорина,
пирролнитрина  и  сидерофора  пиохелина,  продуцируемых  штам¬
мом  P.  fluorescens  CHAO.  Секреция  флороглюцина  стимулирова¬
лась  наличием  в  питательной  среде  ионов  Zn+2,  NH4Mo+2  и  глюко¬
зы,  биосинтез  пиолютеорина  стимулировался  ионами  Zn+2,  Со*2  и
глицерином,  но  в  то  же  время  подавлялся  глюкозой,  а  выход  ан¬
тибиотика  пирролнитрина  увеличивался  на  средах  с  фруктозой,
маннитолом  в  присутствии  смеси  ионов  Zn+2  и  NH4Mo+2,  синтез  же
сидерофора  пиохелина  стимулировался  ионами  Со*2  и  источника¬
ми  углерода,  такими  как  фруктоза,  маннитол  и  глюкоза.  Эти  за¬
кономерности  сохранялись  и  для  других  41  штамма  этого  вида,
менее  продуктивных  по  количеству  синтезируемых  антибиоти¬
ков.  В  этой  работе  также  показано,  что  неорганические  фосфа¬
ты  ингибируют  синтез  флороглицина,  а  секреция  других  анти¬
биотиков  уменьшается  незначительно.  Внесение  в  питательную
среду  таких  ионов,  как  Cu+,  Mn+2,  Li+,  Fe+2,  Mg+2,  Са+2,  В+3,  не  игра¬
ет  значительной  роли  в  биосинтезе.
 Синтез  феназиновых  антибиотиков  начинается  в  стационар¬
ную  фазу  роста.  На  среде  с  глицерином  в  качестве  источника
углерода,  лейцином  и  аланином  в  качестве  источников  азота  и  оп¬
ределенным  уровнем  содержания  магния  и  фосфора  выход  фена-
 64

Рис.  1.  Зоны  подавления  роста  микромицета  Bipolaris  sorokiniana  штаммами-
антагонистами
 а  -  Az.vinelandii  ИБ  4;  б  -  Pseudomonas  sp.  ИБ  182;  в  -  P.  putida  ИБ  17;  г  -  P.  aureofaciens
ИБ  51

шШШт

Рис.  3.  Прорастание  конидий  и  форми¬
рование  мицелия  Bipolaris  sorokiniana:
 48  ч  инкубации.  Световая  микроско¬
пия.  Увел.  400  (а,  в,  г,  д);  1600  (б)
а  -  контроль;
 под  воздействием  метаболитов:
б,  д  -  Pseudomonas  aureofaciens  ИБ  6;
в  -  Pseudomonas  sp.  ИБ  182;
г  -  Pseudomonas  aureofaciens  ИБ  51

Рис.  4.  Прорастание  конидий  и  форми¬
рование  мицелия  Fusarium  culmorum
 48  ч  инкубации.  Световая  микроско¬
пия.  Увел.  400  (д,  в,  г,  д)\  1600  (б)
 а  -  контроль;
 под  воздействием  метаболитов:
б,  д  -  Pseudomonas  putida  ИБ  56;
в  -  Pseudomonas  sp.  ИБ  182;
г  -  Pseudomonas  aureofaciens  ИБ  51

•W-'i
 А.  Щ  \
 a
 Рис.  5.  Влияние  штаммов  азотобак¬
тера  на  развитие  микромицета
Bipolaris  sorokiniana
 а  -  Az.  vinelandii  ИБ  1;
б  -  Az.  vinelandii  ИБ  3;
в  -  контроль

Рис.  13.  Пространственная  конфигурация  молекулы  триглицеридпептида
псевдомонад

зинов  достигает  максимальной  концентрации  [MacDonald,  1967;
Leisinger,  Margraff,  1979].  Лимитирование  фосфатами  вызывает
синтез  феназинов.  Низкий  уровень  фосфатов  в  конце  экспонен¬
циальной  фазы  является  триггером  синтеза  феназинов.  Повыше¬
ние  концентрации  фосфатов  останавливает  синтез  [Martin,  1977;
Martin  et  al.,  1992].
 Большое  влияние  на  синтез  антибиотиков  оказывает  аэрация
в  процессе  культивирования.  Как  правило,  культивирование
псевдомонад  с  целью  получения  антибиотиков  фунгицидной  при¬
роды  проводят  в  течение  48-72  ч  (исключение  составляет  синтез
антибиотика  аеругина  -  6  сут)  [Lee  et  al.,  2003]  при  температуре
24-28  °  в  условиях  аэрации.  И  также,  как  правило,  максималь¬
ный  рост  фунгицидной  активности  наблюдается  в  стационарную
фазу.
 Влияние  условий  культивирования
на  биосинтез  низкомолекулярных  метаболитов
штаммами  бактерий  Pseudomonas
 Как  уже  указывалось  выше,  на  образование  антибиотических
веществ  культурами  Pseudomonas  оказывает  влияние  природа  ис¬
точника  углерода  в  среде.  В  наших  экспериментах  по  оптимиза¬
ции  питательной  среды  [Логинов,  Четвериков,  2003]  за  основу
принимали  среду  Кинг  В  [King,  1956],  в  качестве  источников  уг¬
лерода  использовали  глицерин  (классический  вариант  этой
среды),  сахарозу,  глюкозу,  ацетамид,  пируват  (как  наиболее  уни¬
версальные  субстраты  для  псевдомонад  [Смирнов,  Киприанова,
1990].
 При  исследовании  физико-химических  факторов,  влияющих
на  титр  клеток  и  секрецию  метаболитов  с  фунгицидной  активно¬
стью,  переменными  величинами  являлись  концентрации  углеро¬
да,  органического  азота  и  температура  культивирования.
 Время  культивирования  -  72  ч.  Отбор  проб  для  анализа  анти-
грибной  активности  и  титра  клеток  осуществляли  через  каждые
 8-12  ч.
 Установлено,  что  максимальное  количество  антибиотиче¬
ских  веществ  образуется  культурами  на  среде  с  глицерином.
 Исследуя  влияние  природы  источников  органического  азота
как  второго  существенного  фактора  для  накопления  в  среде  наи¬
большего  количества  метаболитов  с  антигрибной  активностью  в
качестве  таковых  использовали  пептон  и  дрожжевой  экстракт.
Перечисленные  компоненты  добавляли  в  питательную  среду  как
одиночно  в  количестве  0,5-1,0  мас.%,  так  и  вместе,  но  так,  чтобы
суммарное  их  количество  не  превышало  1  мас.%.  Оптимальным
 3.  О.Н.  Логинов
 65

Таблица  24.  Зависимость  фунгицидной  активности  штаммов  культур
P.  aureofaciens  ИБ  51,  /\  aureofaciens  ИБ  6  и  P.  putida  ИБ  17  от  состава  среды
 Состав  среды,  г/л
 Фунгицидная
активность,
ед./мл  КЖ
 дэ
 пептон
 источник  углерода
 к2нро4
 MgS04
 5
 -
 Глицерин,  10
 1,5
 1,5
 3
 10
 -
 Глицерин,  10
 1,5
 1,5
 6
 5
 5
 Глицерин,  10
 1,5
 1,5
 12
 -
 5
 Глицерин,  10
 1,5
 1,5
 4,5
 -
 10
 Глицерин,  10
 1,5
 1,5
 6
 5
 5
 Сахароза,10
 1,5
 1,5
 6
 5
 5
 Глюкоза,  10
 1,5
 1,5
 6
 5
 5
 Ацетамид,  10
 1,5
 1,5
 3
 5
 5
 Пиру  ват,  10
 1,5
 1,5
 3
 оказалось  одинаковое  соотношение  дрожжевого  экстракта  и
пептона  по  0,5  мас.%,  что  может  быть  связано  со  сбалансирован¬
ностью  факторов  роста,  витаминов  и  микроэлементов,  входящих
в  их  состав.
 Данные  по  оптимизации  источников  углеродного  и  азотного
питания  приведены  в  табл.  24.
 Существенное  влияние  на  выход  антибиотических  веществ  у
псевдомонад  оказывает  температура  выращивания.  В  связи  с
этим  была  изучена  способность  штаммов  Pseudomonas  продуци¬
ровать  антибиотические  вещества  в  оптимизированной  жидкой
питательной  среде  при  различных  температурах  культивирова¬
ния.  Оптимальными  для  секреции  низкомолекулярных  (НМ)  ме¬
таболитов  с  антигрибной  активностью  являются  температуры  в
диапазоне  от  22  до  26  °С,  что  коррелирует  с  данными  литерату¬
ры  по  биосинтезу  антибиотических  веществ  псевдомонадами
[Gamard,  1997;  Paulitz,  2000;  Lee,  2003].
 Существенным  достоинством  культур  P.  aureofaciens  ИБ  51,
P.  aureofaciens  ИБ  6  и  P.  putida  ИБ  17  является  способность  к  ак¬
тивному  росту  при  пониженных  температурах.
 Проведенными  исследованиями  (рис.  8)  установлено,  что  на
оптимизированной  среде  при  температуре  22  °  штаммы  интен¬
сивно  накапливают  метаболиты  с  антигрибной  активностью  на
завершающей  стадии  экспоненциального  роста  к  28-30-ти  часам
культивирования,  в  дальнейшем  активность  практически  не  из¬
меняется  до  окончания  выращивания.  Причем  следовые  количе¬
ства  антибиотических  веществ  обнаруживались  в  среде  уже  че¬
рез  8  ч  после  начала  культивирования.
 66

Время  культивирования,  ч
 Рис.  8.  Динамика  периодического  роста  и  накопления  антибиотических  веществ
культурами  Pseudomonas
 1-3  -  титр  клеток,  млрд  КОЕ/мл  КЖ,  при  22°  (/),  30°  (2)  и  15°  (3);  4-6  -  антигрибная
активность,  ед./мл  КЖ,  при  22  °  (4\  30  °  (5)  и  15  °  (6)
 Повышение  температуры  среды  до  30°  отрицательно  сказыва¬
лось  на  накоплении  метаболитов  с  фунгицидной  активностью.  Их
секреция  в  среду  начиналась  после  30  ч,  антигрибная  активность
была  невысокой  и  не  увеличивалась  до  окончания  процесса.
 Снижение  температуры  до  15°  также  приводило  к  уменьше¬
нию  образования  метаболитов  с  фунгицидной  активностью  и  за¬
держке  их  секреции  в  среду  (через  40  ч  после  начала  культивиро¬
вания),  что  может  быть  связано  с  замедлением  роста  культур.
 При  этом  максимальный  титр  клеток  оставался  высоким  вне
зависимости  от  температуры  культивирования  и  составлял
(6,5-7,0)  •  1010  КОЕ/мл  КЖ  при  22°  и  (2,5-3,0)  •  10*°  КОЕ/мл  КЖ
при  15°  и  30°.
 Структура  и  свойства
новых  метаболитов  Pseudomonas  и  Azotobacter,
обладающих  фунгицидной  активностью
 Предварительные  эксперименты  по  изучению  термостабиль¬
ности  неочищенных  метаболитов  Pseudomonas  aureofaciens
ИБ  51,  P.  aureofaciens  ИБ  6  и  P.  putida  ИБ  17  показали,  что
100%-ная  активность  по  отношению  к  грибу  Bipolaris  sorokiniana
сохранялась  при  нагреве  фракции  метаболитов  до  70°.  Фракция
 з*
 67

неочищенных  метаболитов,  подвергшаяся  термообработке  от  70
до  100°,  имела  менее  30%  активности  по  отношению  к  ненагрева-
емой  части  фракции,  поэтому  мы  предположили,  что  изучаемые
культуры  рода  Pseudomonas  продуцируют  комплекс  метаболи¬
тов,  обладающих  фунгицидной  активностью.
 Выделение  метаболитов  с  антигрибной  активностью
Pseudomonas  проводили  следующим  образом.  После  удаления
биомассы  на  центрифуге  “К23  D”  (3000  мин-1,  20  мин)  суперна¬
тант  подвергали  ультрафильтрации  на  модулях  волоконного  ти¬
па  “Amicon  ЗР-10  “  (США),  отбирая  фильтрат,  содержащий  НМ
фракцию  (^  3  кДа)  внеклеточных  метаболитов  исследуемых
штаммов.  Фильтрат  упаривали  на  вакуумном  роторном  испари¬
теле  при  35°,  примеси  осаждали  метанолом  и  отделяли  центрифу¬
гированием  в  тех  же  условиях.  После  отгонки  метанола  из  супер¬
натанта  изучаемые  вещества  осаждали  ацетоном.
 Чистоту  и  гомогенность  выделенных  метаболитов  проверяли
при  помощи  ВЭЖХ  (высокоэффективная  жидкостная  хромато¬
графия)  в  системе,  состоящей  из  насоса  высокого  давления  моде¬
ли  572Р  (“Gasukuro  Kogyo”,  Япония),  ультрафиолетового  детек¬
тора  (“Du  Pont”,  США).  Для  разделения  использовали  колонку  из
нержавеющей  стали  с  сорбентом  (размер  зерна  5  мкм)  Zorbax-
ODS  (250  х  4,6  мм,  “Shimadzu”,  Япония).  Образцы  вводили  с  по¬
мощью  дозатора  модели  7125  (“Rheodyne”,  США)  с  петлей  объе¬
мом  20  мкл.  В  качестве  элюента  использовали  воду,  подвержен¬
ную  дополнительной  очистке  [Сакодынский,  1993;  Стыскин,
1986].  Расход  подвижной  фазы  1,0  мл/мин.  Пики  регистрировали
при  254  нм.
 Молекулярную  массу  выделенных  метаболитов  оценивали
при  помощи  эксклюзионной  хроматографии  в  системе,  описан¬
ной  выше,  на  колонке  TSK  G2000SW  (300  х  7,8  мм,  “Toyo  Soda”,
Япония)  при  элюировании  смесью  0,1  М  NaH2P04  и  0,3  М  хло¬
рида  натрия  (pH  7,0)  с  расходом  1  мл/мин  с  УФ-детектировани-
ем  при  254  нм.  В  качестве  маркеров  молекулярной  массы
использовали  инсулин  (молек.  масса  5,8  кДа,  “Lilly”,  Франция)
и  витамин  В12  (молек.  масса  1355  Да,  ЗАО  “Верофарм”,
Россия).
 Аминокислотный  анализ  кислотного  гидролизата  (6н  НС1,
24  ч,  при  105°)  метаболитов  выполнен  на  анализаторе  Т339М
(Чехословакия).
 Элементный  состав  метаболитов  определяли  на  С,  Н,  N-ана-
лизаторе  HP  Model  185  В  (США)  и  по  общепринятым  методикам
[Климова,  1967].
 УФ-спектры  записывали  на  спектрофотометре  Specord  М40
(“Carl  Zeise”,  Германия)  в  области  200-330  нм  (в  воде).
 68

ИК-спектры  записывали  на  спектрофотометре  Specord  М80
(“Carl  Zeise”,  Германия)  в  области  40СМ000  см-1  (в  вазелиновом
масле  или  в  тонком  слое).
 Спектры  ЯМР  13С  регистрировали  на  спектрометре  Bruker
AMX-III-300  (Германия)  при  рабочей  частоте  300,13  МГц  с  внут¬
ренним  стандартом  -  тетраметилсиланом  (ТМС)  и  растворите¬
лем  CD3OD.  Расшифровку  спектров  проводили  при  помощи  про¬
граммы  ChemNMR  Pro.
 Схема  выделения  метаболитов  Pseudomonas  с  антигрибной
активностью  включала  в  себя  стадии  центрифугирования,  ульт¬
рафильтрации,  концентрирования,  осаждения  примесей  и  осаж¬
дения  метаболитов.
 Центрифугирование  КЖ.  Стадия  удаления  биомассы  из  КЖ  -
общая  стадия  для  всех  методик  по  выделению  экзоцеллюлярных
антибиотических  веществ.
 Ультрафильтрация  на  модулях  волоконного  типа.  Стадия  из¬
бавления  от  высокомолекулярных  соединений.  Ультрафильтра¬
ции  подвергают  супернатанты  со  стадии  центрифугирования  КЖ
с  отбором  фильтратов,  заведомо  содержащих  низкомолекуляр¬
ные  фракции  (<  3  кДа)  внеклеточных  метаболитов.
 Концентрирование  ультрафильтрата.  Эту  стадию  проводили
путем  упаривания  фильтрата  на  вакуумном  роторном  испарителе
при  35°.  Степень  концентрирования  20  раз.
 Выделение  отдельных  компонентов  полученных  таким  обра¬
зом  НМ  фракций  проводили  при  помощи  препаративной  ВЭЖХ.
Хроматографические  профили  НМ  фракций  метаболитов
Pseudomonas  представлены  на  рис.  9.  Были  получены  6  компо¬
нентов  для  штамма  Р.  aureofaciens  ИБ  51,  10  компонентов  для
штамма  P.  aureofaciens  ИБ  6  и  11  компонетов  для  штамма  P.  puti-
da  И  Б  17,  для  каждого  из  них  был  снят  спектр  поглощения  в
УФ-области  и  проведен  анализ  на  наличие  фунгицидной  активно¬
сти  и  иммуноферментный  анализ  (табл.  25).
 Осаждение  примесей.  На  этой  стадии  проводили  осаждение
солей  и  других  остатков  питательной  среды  в  концентрате  мета¬
нолом  до  60%  насыщения  с  дальнейшим  их  отделением  центри¬
фугированием  и  отгонкой  метанола  из  супернатанта  под  вакуу¬
мом.  Эту  стадию  проводили  двукратно.
 Покомпонентный  анализ  показал,  что  фунгицидной  активно¬
стью  обладает  лишь  один  компонент  из  НМ  фракции  метаболи¬
тов  каждого  изучаемого  штамма  Pseudomonas.  При  хроматогра¬
фическом  разделении  эти  компоненты  первыми  выходят  с
колонки,  они  также  не  имеют  ярко  выраженного  максимума  по¬
глощения  в  УФ-области.  Остальные  компоненты  фракций,  за
некоторым  исключением,  имеют  максимумы  УФ-поглощения  в
 69

Время  элюции,  мин
 Рис.  9.  Хроматографические  профили  НМ  фракций  метаболитов  КЖ  штаммов
P.  aureofaciens  ИБ  51  (л),  P.  aureofaciens  ИБ  6  (б)  (ВЭЖХ,  254  нм,  колонка
Zorbax-ODS  (250  х  4,6  мм,  “Shimadzu”,  Япония),  элюент  -  вода)
 Цифрами  обозначены  номера  компонентов  фракции
 70

Таблица  25.  Характеристики  компонентов  НМ  фракций  метаболитов
штаммов  Pseudomonas
 Штамм
 Номер
 компо¬
 нента
 в  УФ,  нм
 Фунгицид¬
ная  актив¬
ность
 Фитогормо¬
 нальная
 активность
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 1
 —
 +
 -
 2
 275
 -
 +
 3
 267
 -
 +
 4
 267
 -
 +
 5
 252;  257,5;  263,5
 -
 -
 6
 267;  280
 -
 +
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 1
 -
 +
 -
 2
 274
 -
 +
 3
 4
 267
 —
 +
 5
 6
 267
 —
 +
 7
 267
 -
 +
 8
 252;  257,5;  263,5
 -
 -
 9
 267
 -
 +
 10
 272
 -
 +
 P.putida  ИБ  17
 1
 -
 +
 -
 2
 -I
 263
 -
 +
 j
 4
 267
 _
 +
 5
 272,5
 -
 +
 6
 270
 -
 +
 7
 268
 -
 +
 8
 о
 279,5
 -
 +
 у
 10
 276
 -
 +
 11
 —
 —
 —
 интервале  от  265  до  280  нм,  характерные  для  регуляторов  роста
растений  цитокининовой  природы,  что  и  было  подтверждено
данными  иммуноферментного  анализа.
 В  результате  применения  разработанной  оригинальной  мето¬
дики  выделения  в  хроматографических  профилях  элюции  выде¬
ленных  метаболитов  присутствовал  лишь  один  пик  (см.  рис.  9),  по
времени  выхода  соответствующий  пикам  компонентов,  обладаю¬
щих  антигрибной  активностью  (рис.  10),  причем  время  выхода
активного  компонента  для  каждого  из  штаммов  Pseudomonas  до¬
стоверно  не  различалось.
 Температурный  оптимум  и  термостабильность.  Максимум
активности  для  изучаемых  метаболитов  штаммов  Pseudomonas
наблюдался  в  диапазоне  температур  25-60°,  при  температуре  70°
 71

Рис.  10.  Характерный  хроматографический  профиль  выделенных  метаболитов
штаммов  Pseudomonas,  обладающих  фунгицидной  активностью
 Условия  хроматографического  разделения  см.  рис.  9
 происходит  значительная  термоинактивация,  но  при  этом  у
штаммов  вида  P.  aureofaciens  20-25%  от  начальной  активности
остается  даже  после  инкубирования  при  температуре  100°.  Такая
картина  может  быть  обусловлена  наличием  во  фракциях  двух
компонентов,  обладающих  фунгицидной  активностью,  один  из
которых  имеет  пептидную  природу  и  денатурирует  при  темпера¬
туре  выше  60°,  а  второй  -  антибиотик  феназиновой  природы  в
следовых  количествах,  характерный  для  данного  вида  бактерий,
наличие  которого  мы  установили  в  наших  исследованиях.
 рн  -стабильность.  В  интервале  pH  6-9  уровень  фунгицидной
активности  НМ  фракций  метаболитов  штаммов  P.  aureofaciens
ИБ  51  и  P.  aureofaciens  ИБ  6  остается  максимальным  и  стабиль¬
ным,  критическими  точками  стабильности  являлись  значения
pH  <  4  и  pH  >11,  после  которых  активность  падала  больше,  чем
в  два  раза.
 Схема  выделения  метаболитов  Azotobacter  с  антигрибной  ак¬
тивностью  включала  в  себя  стадии  центрифугирования,  ультра¬
фильтрации,  концентрирования,  осаждения  метаболитов  метано¬
лом  и,  в  общем,  вписывалась  в  схему  выделения  псевдомонадных
 72

Рис.  11.  Характерный  хроматографический  профиль  фракции  после  стадии
упаривания  (а)  и  выделенных  метаболитов  штаммов  Azotobacter  (б),  обла¬
дающих  фунгицидной  активностью  (ВЭЖХ,  рефрактометр,  колонка  HP-NH2
(250  х  4,6  мм,),  элюент  -  ацетонитрил  :  вода  =  75  :  25,  расход  1  мл/мин)
 1  -  вода,  2  -  метаболит,  3  -  остаточная  сахароза
 73

Таблица  26.  Схема  очистки  метаболитов,  обладающих  фунгицидной  активностью,
продуцируемых  бактериями  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter
 Этап
 Штамм
 Объем,  мл;
масса,  г
 АСВ,  %
 АСВ
общ.,  г
 Активность
 Выход  по
активности,  %
 Выход
по  АСВ,  %
 всего  ед.
 ед./г  АСВ
 Супернатант  КЖ
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 2000
 2,18
 43,600
 4000
 91,743
 100
 100
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 2000
 2,15
 43,000
 4000
 93,023
 100
 100
 P.putida  ИБ  17
 2000
 2,20
 44,000
 4000
 90,909
 100
 100
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 2000
 1,25
 25,000
 800
 32,000
 100
 100
 Ультра¬
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 1600
 0,85
 13,600
 3200
 235,294
 80
 31
 фильтрация
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 1600
 0,78
 12,480
 3200
 256,410
 80
 29
 P.putida  ИБ  17
 1600
 0,80
 12,800
 3200
 250,000
 80
 29
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 1600
 0,65
 10,400
 640
 61,538
 80
 42
 Концентрирова¬
 P.  aureofaciens  И  Б  51
 100
 12,8
 12,880
 3125
 242,624
 78
 29
 ние  упариванием
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 100
 12,2
 12,250
 3125
 255,102
 78
 28
 под  вакуумом
 P.putida  ИБ  17
 100
 12,3
 12,300
 3125
 254,065
 78
 28
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 105
 9,74
 10,227
 628
 61,406
 79
 41
 Осаждение
 Р.  aureofaciens  ИБ  51
 80
 10,1
 8,144
 3077
 377,824
 77
 19
 метанолом
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 85
 9,20
 7,820
 3091
 395,269
 77
 18
 P.putida  ИБ  17
 80
 9,90
 7,920
 3077
 388,510
 77
 18
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 1,5
 99,0
 1,485
 6
 Осаждение
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 8,1
 72,5
 5,873
 3000
 510,812
 75
 13
 ацетоном
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 9,2
 57,8
 5,319
 3067
 576,612
 76
 12
 P.putida  ИБ  17
 8,8
 58,8
 5,181
 2933
 566,107
 73
 12

метаболитов,  представляя  ее  упрощенный  вариант.  Упрощение
схемы  выделения  метаболитов  азотобактера  объясняется  тем,
что  на  используемой  среде  синтезируется  в  отличие  от  псевдомо¬
над  только  единственный  метаболит,  что  также  упрощает  хрома¬
тографическую  оценку  чистоты  выделенных  метаболитов,  и  где
в  качестве  примесей  присутствует  только  остаточная  сахароза
(рис.  11).
 Схема  выделения  и  этапы  очистки  метаболитов,  обладающих
фунгицидной  активностью,  продуцируемых  бактериями  родов
Pseudomonas  и  Azotobacter,  представлены  в  табл.  26.
 Определение  молекулярной  массы  метаболитов  проводили
при  помощи  эксклюзионной  жидкостной  хроматографии  с  ис¬
пользованием  маркеров  молекулярной  массы.  В  результате  че¬
го  было  установлено,  что  метаболиты  штаммов  Pseudomonas
близки  по  молекулярной  массе,  различие  составляет  ~±  200  Да,
и  их  молекулярная  масса  варьирует  в  пределах  2,8-3,0  кДа
(рис.  12).
 Рис.  12.  Типовая  хроматограмма  метаболитов  с  антигрибной  активностью,  вы¬
деленных  из  штаммов  Pseudomonas  (2,  время  выхода  15,2  ±  0,1  мин),  и  маркеров
молекулярной  массы  (7  -  инсулин  (5,8  кДа),  время  выхода  11,5  мин,  3  -  витамин
В12  (1355  Да),  время  выхода  17,2  мин)  (280  нм,  колонка  TSK  G2000SW  (300  х
х  7,8  мм)),  элюент  -  0,1  М  фосфат  натрия,  0,3  М  хлорид  натрия  (pH  7,0),  расход
1  мл/мин)
 75

Полученные  величины  молекулярных  масс  нашли  подтвер¬
ждение  и  при  использовании  метода  определения  бактериальных
пептидов  и  белков  с  молекулярной  массой  <  20  кДа,  дающего  до¬
статочно  достоверную  информацию  об  их  количестве  в  частично
очищенных  смесях  и  молекулярной  массе,  основанного  на  прове¬
дении  адсорбционной  ВЭЖХ  с  использованием  сорбента
Ultrasphere  Si  и  предложенном  в  одной  из  наших  работ  [Логинов,
2004].
 Аминокислотный  и  элементный  составы  метаболитов
Pseudomonas,  обладающих  фунгицидной  активностью.  Изучение
свойств  пептидных  факторов,  продуцируемых  штаммом  Bacillus
sp.  739  [Широков,  2003],  показало,  что  активность  пептидного
метаболита  с  массой  до  3  кДа  не  зависит  в  значительной  мере  от
температуры.  А  максимум  активности  для  изучаемых  метаболи¬
тов  штаммов  P.  aureofaciens  ИБ  51,  P.  aureofaciens  ИБ  6и  P.  puti¬
da  ИБ  17  наблюдался  в  диапазоне  температур  22-26°,  при  темпе¬
ратуре  70°  происходила  их  значительная  термоинактивация;  в
связи  с  этим  можно  было  предположить,  что  метаболиты  изуча¬
емых  псевдомонад  имеют  сложнокоординированную  пептидную
природу.  Это  предположение  было  подтверждено  данными  ами¬
нокислотного  анализа  гидролизатов  метаболитов.  Данные  ами¬
нокислотного  и  элементного  анализов  (табл.  27,  28)  также  показа¬
ли,  что  метаболиты  изучаемых  штаммов  неидентичны  по  своему
 Таблица  27.  Эквимолярное  содержание  аминокислот  в  структуре
триглицеридпептидов,  продуцируемых  псевдомонадами
 Аминокислота
 Штамм-продуцент
 P.  putida  ИБ  17
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 Аспарагиновая
 килота
 1
 2
 1
 Треонин
 1
 2
 1
 Серин
 1
 1
 1
 Глутаминовая
 кислота
 2
 2
 2
 Пролин
 2
 2
 2
 Глицин
 4
 4
 4
 Аланин
 2
 2
 2
 Валин
 1
 1
 1
 Метионин
 1
 1
 1
 Лейцин
 1
 -
 1
 Лизин
 1
 1
 1
 Г  истидин
 1
 1
 1
 76

Таблица  28.  Элементный  состав  метаболитов  бактерий  родов  Pseudomonas
и  Azotobacter,  обладающих  фунгицидной  активностью
 Культура
 Содержание  элемента,  %
 углерод
 водород
 азот
 сера
 фосфор
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 48,6
 6,4
 16,0
 1,7
 -
 P.putida  ИБ  17
 50,2
 6,5
 16,1
 1,8
 -
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 50,0
 6,6
 16,1
 1,8
 -
 Az.  vinelandii  ИБ  1
 5,2
 1,6
 0,1
 12,2
 34,1
 Az.  vinelandii  ИБ  3
 14,3
 3,0
 0,1
 6,8
 22,5
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 3,5
 1,7
 1,5
 5,1
 34,2
 составу,  различие  в  одной  аминокислоте,  чем  и  определяется  раз¬
ница  в  их  молекулярных  массах.
 В  состав  метаболита  штамма  Р.  aureofaciens  ИБ  51  входит
19  аминокислот,  штаммов  ИБ  6  и  ИБ  17  -  18  аминокислот,  в  ос¬
новном  составы  схожие,  за  некоторым  исключением.  У  метабо¬
лита  штамма  P.  aureofaciens  ИБ  51  в  составе  нет  лейцина,  кото¬
рый  присутствует  в  составе  метаболитов  штаммов  ИБ  6  и
ИБ  17,  а  аспарагиновая  кислота  и  треонин  присутствуют  в  удво¬
енном  количестве.
 ИК-  и  ЯМР  13С-спектроскопия  метаболитов  Pseudomonas,
обладающих  фунгицидной  активностью.  Сравнение  спектров
выделенных  метаболитов,  полученных  экспериментально,  с
расчетными  данными  в  ChemNMR  Pro  позволило  составить  их
предполагаемую  конфигурацию,  изображенную  на  рис.  13  (см.
цв.  вкл.).
 Анализ  данных  ИК-  и  ЯМР  13С-спектроскопии  показал,  что
молекулы  изучаемых  метаболитов  содержат  глицериновый  ос¬
тов,  что  характеризуется  наличием  химических  сдвигов  (ХС)  65  и
74  м.д.  и  характерными  полосами  поглощения  в  ИК-спектрах  на
2968  и  1408  см-1.  К  молекуле  глицерина  через  эфирные  атомы
кислорода  посредством  карбонильных  групп  (1044  см-1,  170  м.д.)
присоединены  три  полипептидные  цепочки,  на  наличие  которых
указывает  увеличение  площади  пиков  аминогрупп
(3100-3200  см-1)  и  изменение  пропускания  в  области  1500  см-1,  ха¬
рактерной  для  аминных  и  ацетамидных  групп.
 Элементный  состав,  ИК-  и  ЯМР  13С-спектроскопия  метабо¬
литов  Az.  vinelandii,  обладающих  фунгицидной  активностью.  Ре¬
зультаты  спектрального  анализа  метаболитов,  продуцируемых
штаммами  Az.  vinelandii,  представлены  в  табл.  29.  Наличие  в
спектре  ЯМР  13С  химических  сдвигов  62,2;  63,0;  66,8;  71,7;  71,8;
 77

Таблица  29.  Результаты  спектрального  анализа  метаболитов,
продуцируемых  штаммами  Az.  vinelandii
 Данные  ЯМР  13С-спектроскопии
 Данные  ИК-спектроскопии
 Хим.  сдвиг,
эксперимент,  м.д.
 Хим.  сдвиг
расчет,  м.д.
 Волновое  число
ИК-спектра,  см-1
 Функциональная
 группа
 62,2
 63,0
 66,8
 71.7 	и  71,8
 74.8 	и  76,5
 78.9
 83,4  и  83,8
 94,6
106,1
 62,2
 62,3
 67.7
 71.8 	и  71,9
 74,7
 92,3
 103,2
 2800-3000
 724
 1296
 3200-3300
 Амино
 С-Н
 СН3-Х[Х  =  Р,  S)
О-Н
 78,9;  106,1  м.д.  показывает,  что  основу  метаболитов  составляет
молекула  сахарозы,  аминированная  с  учетом  данных  элементно¬
го  анализа  (табл.  28)  в  четырех  положениях  (на  наличие  амино¬
групп  указывают  характерные  полосы  поглощения  в  ИК-спектре
на  2800-3200  см-1).  Так  как  фосфат-  и  сульфатионов  в  исследуе¬
мых  веществах  обнаружено  не  было,  учитывая  результаты  эле¬
ментного  анализа  и  полос  в  ИК-спектре,  характерных  для  Р-  и
 S-связей  (1296  см-1),  можно  говорить  о  наличии  в  структуре  мета¬
болитов  политиофосфатного  “хвоста”  различного  состава  для
каждого  штамма,  а  структуру  самих  метаболитов  можно  предста¬
вить  в  виде  политиофосфатов  тетрааминосахарозы  [Логинов,
Четвериков,  Гусаков,  2003;  Четвериков,  Логинов,  2005]  (рис.  14).
 Присутствие  в  структуре  метаболитов  полифосфатного  “хво¬
ста”  косвенным  образом  согласуется  с  данными  о  том,  что  бакте¬
рии  p.  Azotobacter  при  росте  на  молекулярном  азоте  в  латентной
фазе  образуют  значительное  количество  высокомолекуляр¬
ных  кислотонерастворимых  полифосфатов,  служащих  резервом
 ОН
 1
 ОН
 |
 р.)
 “(“  О-  Р”)
 II  п
 II  Е
 о
 S
 :35
 т=6
 Рис.  14.  Вероятная  структура  метаболитов,  продуцируемых  штаммами
Azotobacter  vinelandii
 78

Таблица  30.  Спектр  фунгицидной  активности  метаболитов,  продуцируемых
 бактериями  родов  Pseudomonas,  Azotobacter  и  Bacillus
 Штамм-продуцент
 Минимальная  ингибирующая  концентрация  подавления
следующих  видов  патогенных  грибов,  мг/мл
 F.  culmo-
гит
 F.  gibbo-
sum
 F.  оху-
sporum
 F.  solani
 F.  semit¬
ectum
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 0,1-0,2
 0,5-0,6
 >  1
 0,5-0,6
 0,5-0,6
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 0,1-0,2
 0,5-0,6
 0,5-0,6
 0,1-0,2
 0,5-0,6
 P.putida  ИБ  17
 0,1-0,2
 0,3-0,4
 >  1
 0,5-0,6
 0,2-0,3
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 >  1
 >  1
 >  1
 >  1
 >  1
 Bacillus  sp.  739
(фракция  0-20  кДа)
 0,2-0,3
 0,3-0,4
 0,5-0,7
 0,5-0,7
 0,8-1,0
 Bacillus  sp.  739
(фракция  0-3  кДа)
 0,1-0,2
 0,2-0,3
 0,2-0,3
 0,2-0,3
 0,1-0,2
 Минимальная  ингибирующая  концентрация  подавления
следующих  видов  патогенных  грибов,  мг/мл
 Штамм-продуцент
 F.  avena-
сеит
 F.  monili-
forme
 Bipolaris
 soroki-
 niana
 Alternaria
 alternata
 Penicil-
 liumfuni-
 culosum
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 0,5-0,6
 0,8-1,0
 0,1-0,2
 0,3-0,4
 0,3-0,4
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 0,2-0,3
 0,8-1,0
 0,1-0,2
 0,3-0,4
 0,3-0,4
 P.putida  ИБ  17
 0,3-0,4
 0,3-0,4
 0,1-0,2
 >  1
 0,2-0,3
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 >  1
 >  1
 0,5-0,6
 >  1
 >  1
 Bacillus  sp.  739
(фракция  0-20  кДа)
 0,2-0,3
 0,5-0,7
 0,5-0,7
 0,8-1,0
 -
 Bacillus  sp.  739
(фракция  0-3  кДа)
 0,1-0,2
 0,5-0,7
 0,2-0,3
 0,3-0,4
 —
 фосфора  и  энергии,  а  также  использующихся  для  регенерации
АТР.  При  активации  синтетических  процессов  или  при  фосфор¬
ном  голодании  клетки  накопленные  полифосфаты  могут  потреб¬
ляться  на  синтез  различных  органических  веществ,  возможно,  и
веществ  с  антибиотическими  свойствами.
 Антигрибная  активность  триглицеридпептидов  Pseudomonas
и  политиофосфата  тетрааминосахарозы  Azotobacter.  В  связи  с
тем,  что  выделенные  триглицеридпептиды  и  политиофосфаты
 79

тетрааминосахарозы  являются  новыми  группами  метаболитов
бактерий  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter,  было  интересно  опре¬
делить  величину  их  фунгицидной  активности  и  соотнести  ее  с
таковыми  известных  метаболитов  бактерий  p.  Bacillus,  обладаю¬
щих  антигрибной  активностью.
 Методом  разведений  выявлена  минимальная  ингибирующая
концентрация  для  ряда  фитопатогенных  грибов  (табл.  30),  кото¬
рая  является  сопоставимой  с  величинами  ингибирования  фитопа¬
тогенов  известными  бациллярными  пептидными  факторами.
 Таким  образом,  установлены  оптимальные  условия  культи¬
вирования  бактерий  p.  Pseudomonas,  позволяющие  получить
культуры  с  высоким  титром  клеток  и  максимальной  продукцией
метаболитов,  обладающих  фунгицидной  активностью,  для  выде¬
ления  которых  предложена  оригинальная  схема,  в  которую  впи¬
сывается  и  схема  выделения  антигрибных  метаболитов
Azotobacter.  Методами  жидкостной  хроматографии,  аминокис¬
лотного  анализа,  ИК-  и  ЯМР  13С-спектроскопии  показано,  что
выделенные  метаболиты  штаммов  Pseudomonas  и  Azotobac¬
ter  представляют  собой  соответственно  триглицеридпептиды  и
политиофосфаты  аминосахарозы,  а  это  означает,  что  они  не  от¬
носятся  к  сидерофорам  в  классическом  понимании.
 Комплексообразующая  способность  триглицеридпептидов
Pseudomonas
 Триглицеридпептиды  Pseudomonas  не  обладают  сидерофор-
ной  активностью  по  отношению  к  ионам  Fe+3,  но  в  то  же  время
они  способны  образовывать  комплексы  с  ионами  Zn+2  и  молеку¬
лами  мальтозы,  причем  комплексообразование  метаболитов  с
углеводами  у  бактерий  p.  Pseudomonas  -  новое  свойство,  не  отме¬
ченное  другими  исследователями.
 Образование  межмолекулярных  комплексов  с  углеводами
и  их  стехиометрический  состав  определяли  следующими  спо¬
собами:
 - 	методом  Бента-Френча  [Бек,  Надьпал,  1989]  по  спектрам
вычитания  растворов  метаболитов  с  углеводами  при  помощи
спектроскопии  в  УФ-области  при  длинах  волн  260-265  нм,  соот¬
ветствующих  я  —>  я*  электронным  переходам  карбонильных
групп  метаболитов,  на  спектрофотометре  Specord  М  40.  Спект¬
ры  вычитаний  снимались  для  водных  растворов,  содержащих  по¬
стоянное  количество  метаболита  (0,001  моль/дм3)  и  возрастаю¬
щее  количество  углевода,  соответствующее  мольным  отноше¬
ниям  метаболит  :  углевод  =  1:1,  1  :  10,  1  :  30,  1  :  50.  В  канале
сравнения  находился  раствор  метаболита  без  углевода.  Тангенсы
 80

углов  наклона  графиков,  построенных  в  логарифмических
координатах:
 lg(AD)  =  f  (1ёСуглевод),
 где  AD  -  разность  оптической  плотности  раствора  метаболит  :
углевод;
 Суглевод  ~  концентрация  углевода  в  растворе  метаболит  :  углевод;
соответствуют  мольным  отношениям  в  комплексе  метаболит:
углевод;
 - 	методом  поляриметрии  по  изменению  угла  вращения  в  за¬
висимости  от  мольного  соотношения  метаболит  :  углевод  на  по¬
ляриметре  СМ-2  (Россия).  Углы  вращения  снимали  для  водных
растворов  метаболитов  (0,01  моль/дм3)  и  углевода  (0,01  моль/дм3)
в  различных  соотношениях.  Отклонение  угла  вращения  смеси
этих  растворов  от  монотонного  изменения  угла  вращения  в  зави¬
симости  от  мольного  соотношения  компонентов  в  смеси  и  указы¬
вает  на  образование  комплекса  метаболит  :  углевод  и  его  сте¬
хиометрию.
 Вольтамперограммы  растворов,  содержащих  0,01  моль/дм3
ионов  Zn+2  и  переменное  в  интервале  0-0,01  моль/дм3  количество
метаболитов  изучаемых  штаммов  псевдомонад,  регистрировали
с  использованием  современной  разновидности  полярографии  -
постояннотоковой  вольтамперометрии.
 Установлено,  что  в  присутствии  молекул  метаболитов  потен¬
циал  пика  восстановления  ионов  цинка  смещается  в  сторону  бо¬
лее  отрицательных  потенциалов,  а  высота  пика  восстановления
при  этом  уменьшается.  Смещение  пика  восстановления  и  умень¬
шение  его  величины  постоянно  в  интервале  концентраций
метаболитов  от  0,001  до  0,01  моль/дм3.  Эффект  смещения  пика
 с  мальтоза/с  метаболит
 Рис.  15.  Стехиометрия  молекулярных  комплексов  метаболитов  Pseudomonas
с  мальтозой  методом  поляриметрии
 81

восстановления  в  сторону  более  отрицательных  потенциалов  и
уменьшение  его  величины  указывают  на  то,  что  ионы  цинка  в
водных  растворах  образуют  комплексные  соединения  с  метабо¬
литами  псевдомонад  сложного  стехиометрического  состава,  со¬
держащие  несколько  ионов  цинка  на  одну  молекулу  метаболита.
 В  УФ-спектрах  всех  трех  метаболитов  имеется  максимум  по¬
глощения,  лежащий  на  длинах  волн  260-265  нм  и  соответствующий
я  —»  я*  электронным  переходам  карбонильной  группы  метаболи¬
та.  Методом  Бента-Френча  по  спектрам  вычитания  растворов
метаболитов  с  мальтозой  установлено,  что  стехиометрия  моле¬
кулярных  комплексов  соответствует  составу  метаболит  :  маль¬
тоза  =  1:1.  Стехиометрия  молекулярных  комплексов  метаболи¬
тов  с  мальтозой  была  также  подтверждена  методом  поляримет-
рии.  Установлено,  что  смесь  растворов  метаболита  и  углевода
имеет  монотонно  изменяющийся  угол  вращения  [а]  в  зависимо¬
сти  от  их  мольного  соотношения.  Но  при  их  соотношении  1  :  1
обнаруживается  отклонение  от  монотонности  с  ярко  выражен¬
ным  минимумом  угла  вращения  (рис.  15).
 В  природных  условиях  корневая  система  растений  выделяет  в
ризосферу  различные  вещества,  в  том  числе  и  углеводы.  Борьба
за  источник  питания  между  бактериями  p.  Pseudomonas  и  фитопа¬
тогенами  может  характеризоваться  продукцией  во  внешнюю
среду  метаболитов,  которые,  связывая  субстрат,  ограничивают
его  доступность  для  других  микроорганизмов.  Поэтому  хелато-
образующая  способность  по  отношению  к  углеводам,  по  всей
вероятности,  обусловливает  дополнительное  ингибирующее  дей¬
ствие  на  прорастание  спор  фитопатогенных  грибов  в  средах,  со¬
держащих  в  качестве  источника  углерода  различные  сахара.

КОЛОНИЗАЦИЯ  РИЗОСФЕРЫ  РАСТЕНИЙ
БАКТЕРИЯМИ-АНТАГОНИСТАМИ  РОДОВ
PSEUDOMONAS  И  AZOTOBACTER
 Современные  представления  о  функционировании  микроб¬
ных  сообществ  весьма  ограничены  и  о  реальных  взаимодействи¬
ях  микроорганизмов  в  природных  местообитаниях  известно
крайне  мало.  Мнение  о  том,  что  привнесенная  популяция  погибает
в  нестерильной  почве,  что  связано  с  антагонизмом  по  отноше¬
нию  к  посторонней  микробиоте  со  стороны  почвенных  микроор¬
ганизмов  и  выеданием  ее  простейшими,  не  оправдалось.  В  насто¬
ящее  время  распространено  представление  о  ненасыщенности
комплекса  почвенных  микроорганизмов,  т.е.  о  способности  при¬
нять  в  себя  внесенные  извне  популяции  [Кожевин,  1985].
 Показано,  что  в  регуляции  численности  микробных  популя¬
ций  в  почве  основную  роль  играют  не  внутри-,  а  межпопуляцион-
ные  процессы.  Тип  взаимодействия  одной  и  той  же  пары  популя¬
ций  может  меняться  в  ходе  сукцессии.  На  выживание  конкретно¬
го  микроорганизма  в  почве  оказывают  влияние  свойства  почвы,
количественный  уровень  внесения  и  стадия  микробной  сукцес¬
сии,  на  которой  вносится  популяция  [Полянская,  Звягинцев,
1984;  Тригер  и  др.,  1990].
 При  исследовании  способности  к  размножению  на  семенах  и
корнях  пшеницы  антифунгально  активных  рифампицинустойчи-
вых  мутантов  p.  Pseudomonas  установлено,  что  способность
бактерий  к  размножению  на  корнях  пшеницы  штаммоспецифична.
Как  правило,  лучше  всего  размножались  на  корнях  пшеницы  штам¬
мы,  выделенные  из  ризосферы  пшеницы  [Гарагуля  и  др.,  1988].
 Изучению  пространственно-временного  характера  колониза¬
ции  подземных  органов  картофеля  антагонистической  бактерией
P.fluorescens  посвящена  работа  J.B.  Bahme  и  M.N.  Schroth  [1987].
Культуру  бактерии  P.fluorescens  (штамм  Al-В)  вносили  в  почву  с
блоками  из  зерна,  которые  содержали  по  108  КОЕ/блок.  Штамм
заселял  корни,  подземные  части  побегов,  столоны  и  клубни,  при¬
чем  наибольшую  плотность  отмечали  на  частях  растений  вблизи
блоков.  Штамм  не  был  приурочен  к  определенному  участку  кор¬
ней:  41%  клеток  находились  в  ризосфере,  54%  -  неплотно  приле¬
гали  к  поверхности  корней  и  5%  -  находились  в  тесном  контакте
и  даже  проникали  в  корни.
 83

Бактериальные  сообщества  трех  мест  обитания  (ризосфера,
внутренние  ткани  корней  и  почва)  изучали  для  выявления  коли¬
чественных  и  качественных  изменений,  связанных  с  внедрением
штамма  Р.  fluorescens  PGPR  89-В-27  и  его  люминесцентного  про¬
изводного.  Исследование  популяций  трех  сред  обитания  показало,
что  они  достоверно  различались  по  видовому  составу  и  количест¬
ву.  Структура  популяций  в  вариантах  с  двумя  бактериальными
обработками  достоверно  отличалась  от  неинокулированного
контроля,  но  не  отличалась  одна  от  другой  [Mahaffee  et  al.,  1995].
 Проведено  сравнительное  изучение  поведения  интродуциро-
ванных  бактерий  в  моноксеничных  условиях  (агар,  песок)  и  в  не¬
стерильной  почве.  Количество  клеток  P.  fluorescens  в  зоне  апек¬
са  в  моноксеничных  вариантах  в  29,7  раз  больше,  чем  в  варианте
с  почвой.  В  моноксеничных  вариантах  и  вариантах  с  почвой  наи¬
большая  плотность  внесенной  популяции  наблюдалась  в  зоне  ос¬
нования  и  уменьшалась  по  направлению  к  апикальной  части  кор¬
ня  [Кравченко,  Макарова,  1993].
 Изучая  процесс  заселения  флуоресцирующими  псевдомона-
дами-антагонистами  фитопатогенных  микроорганизмов  корней
растений,  авторы  не  могли  не  отметить,  что  инокулирование  се¬
мян  бактериями  способствовало  защите  растений  от  болезней
[Caponlgro,  Contillo,  1986],  а  также  приводило  к  увеличению  мас¬
сы  стеблей  и  корней  [Munoz-Garcia,  Valdes,  1995].
 Колонизация  корней  сои  бактериями  Pseudomonas  и  Serratia
spp.  в  связи  с  подвижностью,  хемотаксисом  и  временем  генерации
исследована  в  работе  [Scher  et  al.,  1988].  Установлено,  что  при
одинаковом  среднем  периоде  генерации  бактерий  в  жидкой  пита¬
тельной  среде  уровень  колонизации  корней  и  семян  для  разных
штаммов  был  отличен.  Показано  также,  что  подвижность  бакте¬
рий  не  являлась  необходимой  для  успешной  колонизации.
 В  работах  других  авторов  [Wessendorf,  Lingens,  1989;
Zablotowicz  et  al.,  1991]  акцент  сделан  на  изучение  влияния  поч¬
венных  условий,  условий  культивирования,  исходной  плотности
бактериальной  суспензии  на  выживание  интродуцированных  в
почву  штаммов.  Показано,  что  максимальная  колонизация  кор¬
ней  сои  и  сурепицы  штаммами  Pseudomonas  достигается  при  вне¬
сении  в  почву  водной  суспензии  с  титром  108  клеток/мл.  При  та¬
кой  инокуляционной  нагрузке  колонизация  корней  сои,  сурепи¬
цы  и  пшеницы  превышала  КИ-Ю5  клеток/г  сырых  корней,  тогда
как  колонизация  корней  кукурузы  составляла  менее  KP-IO4  кле¬
ток/г  [Zablotowicz  et  al.,  1991].  Внесенный  на  уровне  107  и
109  КОЕ/г  штамм  P.  fluorescens  R1  сохранял  плотность  на  30-е  су¬
тки  на  уровне  1,3  •  104  КОЕ/г,  а  при  внесении  на  уровне
105  КОЕ/г  -  полностью  исчезал  из  посевов.  Динамика  снижения
 84

плотности  R1  была  сходной  во  всем  диапазоне  влажности  почвы
от  14  до  24%.  Из  песчаной  почвы  на  30-е  сутки  R1  не  высевался,
тогда  как  из  глинистой  выделялось  106  КОЕ/г  [Wessendorf,
Lingens,  1989].
 Существует  несколько  методик  наблюдения  за  развитием  по¬
пуляций  бактерий  в  гетерогенной  среде.  Очевидно,  что  наиболее
популярны  методы,  основанные  на  получении  антибиотикоус¬
тойчивых  штаммов.  На  примере  следующей  работы  [Tang
Weizhen  et  al.,  1995]  показано,  что  получаемые  с  помощью  мето¬
дов  генетического  маркирования  мутанты  нередко  частично  или
полностью  утрачивают  полезные  свойства  материнского  штам¬
ма.  При  введении  в  штамм  Р.  putida  GR12-2  многокопийной  плаз¬
миды  pGSS15  (кодирует  устойчивость  к  ампициллину  и  тетраци¬
клину)  наблюдали  замедление  роста  (время  клеточной  генерации
возрастало  от  1,6  до  1,8  ч),  снижение  приживаемости  в  почве  и
способности  стимулировать  удлинение  корней  полевой  капусты
(Brassica  campestris).
 Показано,  что  внесение  в  почву  экзотических  источников  уг¬
лерода  способствует  увеличению  в  ризосфере  растений  числен¬
ности  популяции  плазмидосодержащих  вариантов  PGPR
p.  Pseudomonas,  способных  к  утилизации  этих  соединений.  Так,
численность  популяции  штамма  P.  aureofaciens  BS1393  (pBS216),
содержащего  плазмиду  биодеградации  нафталина,  в  присутствии
салицилата  натрия  увеличивалась  в  4  раза  в  почве  и  в  20  раз  в  ри¬
зосфере  пшеницы  по  сравнению  с  исходным  безплазмидным
штаммом.  Используя  данный  подход  в  случае  бактерий,  стимули¬
рующих  рост  растений  и  защищающих  их  от  фитопатогенов,
можно  существенно  повысить  эффективность  использования
биопрепаратов  на  их  основе  [Мордухова  и  др.,  2000].
 В  микрополевом  эксперименте  проведена  оценка  динамики
плотности  колонизации  корней  ячменя  генетически  измененны¬
ми  по  признаку  фиксации  азота  ризобактериями  Pseudomonas.
Показано,  что  способность  фиксировать  азот  определяет  возрас¬
тание  численности  ризобактерий  на  поверхности  корней  в  фазы
колошения  -  молочной  спелости  [Бажанов  и  др.,  1995].
 Анализ  данных  литературы  наглядно  демонстрирует,  что  ба¬
ктерии  p.  Pseudomonas,  нанесенные  на  семена,  способны  успешно
колонизировать  ризосферу  различных  растений  (пшеница,  кар¬
тофель,  томаты,  огурец,  салат,  соя,  табак,  гвоздика),  поддерживая
высокую  численность  (в  среднем  103-105  КОЕ/г  корней),  выжи¬
вать  в  почве  и  филлосфере.  Несомненно,  что  это  свойство
псевдомонад  имеет  особое  значение  для  осуществления  штамма-
ми-антагонистами  биологического  контроля  в  ризосфере  расте-
ния-хозяина.  К  сожалению,  в  литературе  недостаточно  четко  ос¬
 85

вещен  вопрос  о  том,  какое  влияние  оказывают  интродуцирован-
ные  штаммы-антагонисты  p.  Pseudomonas  на  аборигенную  мик¬
рофлору  растений,  а  также  как  влияют  условия  нового  местооби¬
тания  на  сохранение  антагонистических  характеристик  штаммов
псевдомонад.
 Прикорневая  зона  и  корни  вегетирующих  растений  -  благо¬
приятное  место  обитания  многочисленных  представителей  поч¬
венной  биоты,  поэтому  для  изучения  выживания  интродуциро-
ванных  штаммов-антагонистов  на  корнях  растений  необходимо
пользоваться  методами  маркирования  используемых  штаммов.
Одним  из  методов,  позволяющих  обнаруживать  на  корнях  расте¬
ний  среди  аборигенной  микробиоты  интродуцированные  штаммы,
служит  метод  генетического  маркирования.  Методы  генетиче¬
ского  маркирования  основаны  на  использовании  антибиотикоус¬
тойчивых  штаммов.  Их  получение  связано  с  отбором  резистент¬
ных  клонов  на  средах,  содержащих  повышенные  концентрации
антибиотиков.  При  получении  антибиотикоустойчивой  модифи¬
кации  исходного  штамма  необходимо  удостовериться,  что  полу¬
ченный  мутант  генетически  стабилен  в  своей  нечувствительно¬
сти  к  высоким  концентрациям  антибиотика,  а  также  не  утратил
важных  свойств  исходной  бактериальной  культуры.
 Для  получения  антибиотикорезистентных  клонов  штаммов
P.  aureofaciens  ИБ  51  и  Az.vinelandii  ИБ  4  культуры  выращивали
в  жидкой  среде  Кинг  В  либо  среде  40  на  качалке  (п  =  170  об/мин)
при  26°  в  течение  24  ч.  Накопительную  культуру  из  колб  высева¬
ли  на  чашки  Петри  с  агаризованной  средой,  содержащей  анти¬
биотик  стрептомицин  для  штамма  P.  aureofaciens  ИБ  51  либо  ам¬
пициллин  для  штамма  Az.  vinelandii  ИБ  4  в  концентрации  100,200,
300,  400  и  500  мкг/мл.  Засеянные  чашки  Петри  выдерживали  в
термостате  при  температуре  28°  в  течение  3  сут.
 Клоны  спонтанных  мутантов,  полученные  на  среде,  содержа¬
щей  антибиотик  в  концентрации  500  мкг/мл,  пересевали  затем
последовательно  на  среду  МПА  со  стрептомицином  в  концентра¬
ции  600,  700,  800,  900,  1000  и  1500  мкг/мл.  В  итоге  получили  кло¬
ны  псевдомонад,  устойчивые  к  концентрации  стрептомицина  в
среде  1000  мкг/мл,  и  клоны  азотобактера,  устойчивые  к  концен¬
трации  ампициллина  в  среде  1500  мкг/мл.
 Полученные  клоны  прошли  проверку  их  антагонистической
активности  к  фитопатогенным  грибам.  Исходя  из  диаметра  зон
подавления  роста  тест-грибов  на  плотной  среде,  среди  получен¬
ных  клонов  были  отобраны  наиболее  активные  антагонисты.
Стабильность  признака  устойчивости  к  антибиотику  была  прове¬
рена  путем  проведения  клонов  через  пять  пассажей  на  среды  без
антибиотика  с  последующим  высевом  на  среду  со  стрептомици¬
 86

ном  либо  ампициллином.  Для  ампициллинрезистентного  штамма
Az.  vinelandii  ИБ  4ап|р  также  была  проверена  способность  расти  на
среде,  не  содержащей  азот,  для  чего  была  использована  среда  40
без  дрожжевого  автолизата.
 Среди  клонов,  обладающих  устойчивостью  к  антибиотикам,
для  дальнейших  исследований  в  вегетационных  и  полевых  опы¬
тах  отобрали  стрептомицинустойчивый  мутант  P.  aureofaciens
ИБ  51str,  и  ампициллинустойчивый  мутант  Az.  vinelandii  ИБ  4“"р.
 Изучение  способности  к  колонизации  корней  растений
у  стрептомицинрезистентного  штамма
Pseudomonas  aureofaciens  ИБ  51  «г
и  ампициллинрезистентного  штамма
Azotobacter  vinelandii  ИБ  4®mP
 Эксперименты  по  изучению  колонизирующей  способности
клонов  P.  aureofaciens  ИБ  51str  и  Azotobacter  vinelandii  ИБ  4*п,р
предваряли  исследования,  связанные  с  определением  периода
времени,  в  течение  которого  на  зерне  пшеницы  сохраняются
жизнеспособные  клетки  исследуемых  штаммов.  Необходимость
данных  исследований  связана  с  тем,  что  только  достаточно  высо¬
кий  титр  клеток  на  зерне  перед  посевом  может  гарантировать
будущую  хорошую  приживаемость  в  ризосфере  интродуцирован-
ного  микроорганизма.
 Для  изучения  динамики  численности  клеток  пггаммов-анта-
гонистов  на  зерне  пшеницы  на  среде  Кинг  В  была  наработана
двухсуточная  КЖ  штамма  P.  aureofaciens  ИБ  51str  (титр
5,6-108  КОЕ/мл)  и  соответственно  на  среде  Федорова  -  двухсуточ¬
ная  КЖ  штамма  Az.  vinelandii  ИБ  4М1,р  (титр  8,0*  109  КОЕ/мл).
 Нестерильные  зерна  яровой  пшеницы  обрабатывали  из  рас¬
чета  1105  КОЕ/зерно.  В  качестве  стабилизатора  клеточной  био¬
массы  P.  aureofaciens  ИБ  51str  на  поверхности  зерен  использовали
2%-,  10%-  и  20%-ные  стерильные  растворы  сахарозы,  которые
смешивали  с  КЖ  в  соотношении  1:1.  Обработанные  зерна  хра¬
нили  в  стеклянных  колбах,  закрытых  ватно-марлевыми  пробка¬
ми,  в  холодильнике  (6°).
 Численность  интродуцированных  микроорганизмов  на  семе¬
нах  определяли  высевом  с  5  зерен.  Инокулированные  семена  по¬
мещали  в  ступку  с  10  мл  стерильной  воды  и  легко  растирали  для
удаления  верхнего  слоя  с  семян.  Из  полученной  суспензии  гото¬
вили  ряд  последовательных  разведений,  которые  высевали  на
МПА  со  стрептомицином  (1000  мкг/мл)  либо  на  среду  40  с  ампи¬
циллином  (1500  мкг/мл).  Через  3  сут  инкубации  в  термостате  при
 87

28°  подсчитывали  число  выросших  колоний  и  определяли  коли¬
чество  КОЕ  в  расчете  на  1  семя.
 Колонизирующую  способность  штаммов  P.  aureofaciens  ИБ
51str  и  Az.  vinelandii  ИБ  Ф^р  изучали  в  условиях  вегетационных
опытов  на  яровой  пшенице  и  огурцах.
 Была  проведена  предпосевная  обработка  семян  пшеницы  и
огурца  двухсуточной  КЖ  штамма  P.  aureofaciens  ИБ  51str,  полу¬
ченной  на  среде  Кинг  В  (титр  2,0*  108  КОЕ/мл)  из  расчета
1-105  и  МО6  КОЕ/семя  соответственно.  Инокуляцию  семян
проводили  путем  встряхивания  их  в  колбах  с  бактериальной
суспензией.
 Для  вегетационного  опыта  на  пшенице  использовали  пласти¬
ковые  стаканы  объемом  0,5  л,  заполненные  нестерильной  серой
лесной  почвой.  Высаживали  по  10  зерен  на  стакан,  глубина  за¬
делки  -  1,5-2  см.  Влажность  почвы  на  протяжении  опыта  поддер¬
живали  на  уровне  оптимальной,  соответствующей  60%  от  полной
влагоемкости.  Опыт  продолжительностью  60  сут  проводили  при
комнатной  температуре  и  естественном  освещении.
 Вегетационный  опыт  на  огурцах  сорта  Пионер  проводили  с
использованием  пластиковых  стаканов  объемом  0,2  л.  В  качест¬
ве  субстрата  для  выращивания  растений  применяли  промытый,
просеянный,  прокаленный  песок.  В  каждый  стакан  помещали  по
одному  инокулированному  семени  огурца,  глубина  заделки  се¬
мян  -  4—5  см.  Поддержание  оптимальной  для  развития  растений
влажности  песка,  а  также  питание  растений  осуществляли  за
счет  полива  последних  раствором  Кнопа  для  выращивания  сте¬
рильных  растительных  культур  [Сеги,  1983].  Для  обеспечения
оптимума  температурного  и  светового  режима  для  культуры
огурца  опыт  проводили  с  использованием  искусственного  осве¬
щения  (светоплощадка).  Температуру  поддерживали  на  уровне
23-25°.  Продолжительность  опыта  -  105  сут.
 Изучение  колонизации  корней  огурцов  штаммом  Az.  vinelandii
ИБ  4amP  проводили  на  огурцах  сорта  Пионер  в  модельном  лабора¬
торном  эксперименте,  как  это  было  описано  выше.  Семена  зама¬
чивали  в  КЖ  штамма  Az.  vinelandii  ИБ  4amP  с  титром  4107  КОЕ/мл
в  течение  4  ч,  затем  сажали  в  пластиковые  стаканы.
 Процесс  колонизации  ризосферы  пшеницы  интродуцирован-
ными  клетками  штамма  P.  aureofaciens  ИБ  51str  изучали  также  в
условиях  полевого  эксперимента  на  опытном  участке  совхоза  им.
Цюрупы,  а  штамма  Az.  vinelandii  ИБ  4amP  -  на  опытном  поле  учеб¬
ного  хозяйства  БГАУ  (пос.  Миловка).  Обработку  семян  проводи¬
ли  из  расчета  104  КОЕ/семя.  Семена  высаживали  в  рядки  -  по
100  семян/рядок,  расстояние  между  рядками  -  15  см.  Посев,  уход
(прополки)  проводили  вручную.
 88

Анализ  плотности  популяции  интродуцированных  микроор¬
ганизмов  со  всей  корневой  системы  сельскохозяйственных  куль¬
тур  (пшеница,  огурец)  проводили  на  разных  фазах  развития  рас¬
тений.  Для  анализа  корни  каждого  образца  с  приставшими  к  ним
частицами  почвы  или  песка  увлажняли  до  состояния  пасты,  рас¬
тирали  в  стерильной  ступке  и  помещали  в  колбы  со  100  мл  сте¬
рильной  воды.  Колбы  встряхивали  на  качалке  в  течение
20-30  мин.  Из  полученной  суспензии  готовили  ряд  последова¬
тельных  разведений,  которые  высевали  на  агаризованную  среду
с  антибиотиком.  Чашки  Петри  инкубировали  в  термостате  при
28°  в  течение  3  сут.  Численность  бактерий,  выросших  на  чашках
Петри,  пересчитывали  на  1  г  массы  сухих  корней  и  ризосферной
почвы  (песка)  (КОЕ/г)  или  КОЕ/растение.  Для  микробиологиче¬
ского  исследования  ризосферы  пшеницы  брали  по  10  растений,
огурца  -  по  3  растения.
 Для  оценки  влияния,  которое  может  оказывать  интродукция
штамма-антагониста  в  почву  на  аборигенную  микрофлору  ризо¬
сферы  пшеницы,  изучали  динамику  численности  микроорганиз¬
мов  в  ризосфере  пшеницы  в  варианте  без  обработки  (контроль)
и  с  обработкой  семян  клетками  штаммов-антагонистов.  Для  вы¬
явления  численности  гетеротрофных  микроорганизмов  высев
осуществляли  на  среду  МПА,  олигонитрофилов  -  на  среду  Эшби,
микромицетов  -  на  среду  Чапека,  спорообразующих  микроорга¬
низмов  -  на  среду  МПА  с  предварительным  прогреванием  сус¬
пензии  микроорганизмов  соответствующего  разведения  в  тече¬
ние  10  мин  при  80°,  актиномицетов  -  на  КА  А  [Разумовская  и  др.,
1960].  Численность  бактерий  выражали  количеством  КОЕ  на  1  г
массы  сухих  корней  или  ризосферной  почвы.
 Наличие  у  бактерий,  относящихся  к  группе  PGPR,  способно¬
сти  к  активной  колонизации  корней  растения-хозяина  дает  им
заметное  преимущество  среди  микроорганизмов,  обладающих
антагонистическими  свойствами,  но  не  конкурентных  в  новых  ус¬
ловиях  обитания  [Caponlgro,  Contillo,  1986;  Кравченко,  Макарова,
1993].  Приживаемость  в  ризосфере  интродуцированного  микро¬
организма  зависит  от  многих  факторов,  но  в  первую  очередь
определяется  самим  бактериальным  штаммом,  видом  и  сортом
растения.
 Целью  исследования  было  изучить  колонизирующую  способ¬
ность  штаммов-антагонистов  Р.  aureofaciens  ИБ  51  и  Az.  vinelandii
ИБ  4.  В  экспериментах  использовали  штамм  P.  aureofaciens  ИБ
51str,  устойчивый  к  стрептомицину,  и  ампициллинрезистентный
штамм  Az.vinelandii  ИБ  4атР.
 В  начальной  серии  экспериментов  была  поставлена  задача
изучить  выживаемость  клеток  штаммов-мутантов  P.  aureofaciens
 89

Таблица  31.  Выживаемость  штамма  P.  aureofaciens  ИБ  51ьи
 на  зернах  пшеницы
 Вре¬
 мя,
 сут
 Численность  клеток,  КОЕ/семя
 Диаметр  зо¬
ны  подавле¬
ния  роста
Bipolaris
sorokiniana,
мм
 КЖ
 КЖ+сахароза
 2%
 КЖ+сахароза
 10%
 КЖ+сахароза
 20%
 0,5
 6
 11
 20
 При»
 (1,0  ±0,5)-103
(6,0±2,0)10'
(2,0±0,9)10‘
 л  е  ч  а  н  и  е.  нд
 (4,2±1,7)103
 (1,8±1,7)102
 (2,6±0,7)102
 -  нет  данных;  (-
 (6,8±0,7)103
(1,3±2,2)103
(0,9±0,5)  103
(6,0±2,1)  101
)  -жизнеспособь
 (1,2±1,9)104
 (1,9±0,9)103
 (0,8±2,3)103
 (4,0±2,0)ю'
 1ые  клетки  не  об
 17,1±1,3
 нд
 НД
 19,3±1,7
 наружен  ы.
 ИБ  51str  и  Az.  vinelandii  ИБ  4amP  на  поверхности  зерен  пшеницы.
Установлено,  что  срок  жизнеспособности  клеток  на  зерне  край¬
не  ограничен.  В  течение  1,5  нед  после  инокуляции  зерен  числен¬
ность  популяции  штамма-антагониста  P.  aureofaciens  ИБ  51str  на
их  поверхности  снижается  в  50  раз,  а  через  20  дней  после  бакте¬
ризации  вообще  не  удалось  обнаружить  на  семенах  жизнеспособ¬
ных  клеток  штамма  (табл.  31).
 Для  продления  срока  выживания  штамма  псевдомонады  на
посевном  материале  пшеницы  была  использована  обработка  се¬
мян  суспензией  клеток  штамма-антагониста  совместно  с  раство¬
рами  сахарозы  в  различных  концентрациях  (табл.  32).
 Данная  обработка  способствовала  поддержанию  на  семенах
титра  бактерий,  на  2  порядка  превышающего  контрольные  зна¬
чения.  Даже  по  истечении  3  нед,  когда  в  контрольном  варианте
уже  не  обнаруживали  клеток  штамма-антагониста,  использова¬
ние  10%-  и  20%-ного  сахарного  раствора  способствовало  сохра¬
нению  на  зернах  жизнеспособных  клеток.  Подобный  положи¬
тельный  эффект  может  быть  обусловлен  защитным  действием,
которое  оказывает  раствор  сахарозы,  препятствуя  высушиванию
и  гибели  бактериальных  клеток  [Методы..,  1984].
 В  отношении  штамма  азотобактера  показано,  что  он  спо¬
собен  выживать  на  зернах  пшеницы  в  течение  3  мес,  что,  по-
видимому,  объясняется  его  способностью  сохраняться  на  поверх¬
ности  зерен  длительное  время  в  виде  цист.  Однако  общее  коли¬
чество  клеток  на  поверхности  зерен  постепенно  снижалось
(см.  табл.  32).
 Таким  образом,  показана  способность  азотобактера  длитель¬
ное  время  выживать  на  поверхности  зерен  пшеницы,  что  дает
 90

Таблица  32.  Выживаемость  штамма  Az.  vinelandii  ИБ
 на  зернах  пшеницы
 Время,  сут
 Численность  клеток,
КОЕ/семя
 Диаметр  зоны  подавления
роста  Bipolaris  sorokiniana,
мм
 1
 (3,4±0,7)106
 18,5±0,7
 12
 (6,0±1,2)105
 19,4±0,3
 60
 (3,7±0,9)105
 18,4±0,5
 90
 (2,4±1,1)103
 19,3±0,9
 возможность  предварительной  обработки  посевного  материала,
а,  следовательно,  речь  идет  об  экономии  времени  и  трудозатрат
в  день  посева.
 Изучение  процесса  колонизации  корней  сельскохозяйствен¬
ных  растений  штаммами-антагонистами  проводили  также  в  усло¬
виях  вегетационных  и  полевых  экспериментов.
 В  вегетационном  опыте  с  пшеницей  в  течение  всего  периода
наблюдений  вплоть  до  гибели  растений  (60  сут),  титр  жизнеспо¬
собных  клеток  штамма-антагониста  P.  aureofaciens  ИБ  51str  в  ри¬
зосфере  не  только  не  снизился  по  сравнению  с  исходным  значе¬
нием,  а  увеличился  на  порядок.  В  опыте  показано,  что  культура
штамма-антагониста  P.  aureofaciens  ИБ  51str  не  только  обладает
хорошей  колонизирующей  способностью,  но  и  характеризуется
стабильной  антагонистической  активностью.  Последний  факт
был  подтвержден  при  проверке  антигрибной  активности  повтор¬
но  выделенного  из  ризосферы  растений  штамма-антагониста
(табл.  33).
 Изучение  колонизации  ризосферы  огурца  штаммами-антаго-
нистами  проводили  в  вегетационном  опыте,  в  котором  субстра¬
том  для  развития  растений  служил  стерильный  песок.  Начальная
численность  интродуцентов  составила  106  КОЕ/семя.  Как  видно
 str
 Таблица  33.  Динамика  численности  штамма  P.  aureofaciens  ИБ  51
в  ризосфере  пшеницы  (вегетационный  опыт)
 Время,  сут
 Численность  клеток  в
ризосферной  зоне  одного
растения  пшеницы
 Диаметр  зоны  по¬
давления  роста  Bipolaris
sorokiniana,  мм
 7
 (2,5±1,7)  •  105
 17,1±3,2
 15
 (1,1±0,5)  •  Ю5
 20,5±2,1
 60
 (1,9±0,6)  •  106
 18,9±3,4
 91

Таблица  34.  Динамика  численности  штаммов  Pseudomonas  aureofaciens  ИБ  51su
и  Az.  vinelandii  ИБ  4amp  в  ризосфере  огурца  (вегетационный  опыт)
 Время,  сут
 Численность  клеток  в  ризосферной
зоне  одного  растения  огурца
 Диаметр  зоны  подавления
роста  Bipolaris  sorokiniana,  мм
 P.  aureofaciens
ИБ  51slr
 Az.  vinelandii
ИБ  4ал,р
 P.  aureofaciens
ИБ51*Г
 Az.  vinelandii
ИБ  4amp
 20
 (1,7±0,7)  •  105
 (5,5±0,9)  •  106
 19,7±3,4
 17,7±  1,8
 45
 (1,1±0,5)  •  Ю6
 (9,1±1,3)  •  Ю7
 23,2±3,1
 18,3±2,1
 105
 (5,0±0,8)  •  104
 (1,8±0,7)  •  108
 18,7±2,2
 18,4±2,0
 из  табл.  34,  динамика  развития  штаммов-антагонистов  в  ризо¬
сфере  огурца  различна.  Численность  штамма  P.  aureofaciens
ИБ  51str  достигала  максимума  на  45-е  сутки  эксперимента  и
снижалась  к  концу  опыта,  тогда  как  увеличение  популя¬
ции  Az.  vinelandii  ИБ  4amP  продолжалось  в  течение  всего  экспе¬
римента.
 Антагонистическая  активность  штаммов  сохранялась  на  вы¬
соком  уровне  на  протяжении  всего  срока  наблюдений  (см.
табл.  34).
 Изучение  колонизирующей  способности  новых  штаммов-ан-
тагонистов  было  продолжено  в  условиях  полевых  опытов.
 В  полевом  эксперименте  количество  жизнеспособных  клеток
штамма  Az.  vinelandii  ИБ  4^  в  период  активного  роста  пшеницы
(в  фазу  третьего  листа)  составляла  14,2  •  109  КОЕ/г  корней,  но
постепенно  численность  интродуцента  снижалась  и  на  период
восковой  спелости  составила  1,4  •  106  КОЕ/г  (табл.  35).  Снижение
титра  может  быть  обусловлено  дефицитом  углеродного  питания
 Таблица  35.  Динамика  численности  штаммов  P.  aureofaciens  ИБ  51str
и  Az.  vinelandii  ИБ  4amp  в  ризосфере  пшеницы  (полевой  опыт)
 Фаза  развития
 Численность  клеток  в  ризосфере
пшеницы,  КОЕ/г
 Диаметр  зоны  подавления
роста  Bipolaris  sorokiniana,  мм
 P.  aureofaciens
ИБ  51$В
 Az.  vinelandii
ИБ4”пр
 P.  aureofaciens
ИБ  51str
 Az.  vinelandii
ИБ  4amp
 Третий  лист
Кущение
 Восковая
 спелость
 Примечан
 (1,0±0,6)-  ю7
 (3,4±0,5)  •  106
(1,7±0,8)  •  106
 и  е.  нд  -  нет  даннь
 (14,2±1,1)Ю9
 (3,2±0,8)107
 (1,4±1,2)106
 .IX.
 13,2±2,3
 22,7±3,4
 14,3±2,8
 16,5±1,7
 17,5±1,2
 нд
 92

в  ризосфере  отмирающих  корней  пшеницы,  объем  корневых
эксудатов  которых  значительно  ниже  по  сравнению  с  таковыми
интенсивно  развивающихся  растений.
 В  полевом  опыте  антагонистическая  активность  штамма  Az.
vinelandii  ИБ  4amP,  выделенного  из  ризосферы  пшеницы  на  на¬
чальном  этапе  развития  растений  и  в  фазе  кущения,  оставалась
на  исходном  высоком  уровне,  но  к  моменту  восковой  спелости
пшеницы  фунгицидная  активность  не  обнаружена  (см.  табл.  35).
В  момент  активного  роста  зеленой  массы  растения  наиболее  уяз¬
вимы  из-за  активного  заселения  корней  различными  видами  ми¬
кроорганизмов,  в  том  числе  и  фитопатогенными,  поэтому
штамм,  активно  развивающийся  в  ризосфере  в  первую  половину
вегетации,  может  обеспечить  защиту  растения  от  корневых
инфекций.
 Анализ  численности  штамма  P.  aureofaciens  ИБ  51s*  в  ризо¬
сфере  пшеницы  показал,  что  популяция  антагониста  сохранила
стабильность  на  протяжении  всего  вегетационного  сезона.  Спо¬
собность  подавлять  развитие  фитопатогенных  грибов  также  не
снижалась  (см.  табл.  35)
 Анализ  доли  интродуцированного  штамма  P.  aureofaciens
ИБ  51slr  в  составе  микробиоты  ризосферы  пшеницы  показал,
что  численность  штамма-антагониста  по  отношению  к  общей
численности  гетеротрофных  микроорганизмов  в  ризосфере
пшеницы  колебалась  в  течение  полевого  сезона  в  пределах
0,4-2,7%.  Максимум  численности  штамма  P.  aureofaciens  ИБ
51str  (2,7%  от  общей  численности  гетеротрофных  микроорга¬
низмов)  отмечен  в  фазе  третьего  листа  -  через  месяц  после  по¬
сева.  В  фазе  кущения,  когда  численность  гетеротрофных  мик¬
роорганизмов  достигла  своего  максимального  значения  и
возросла  по  сравнению  с  фазой  третьего  листа  в  2,4  раза,  ко¬
личество  интродуцированных  микроорганизмов  постепенно
снижалось,  и  именно  в  этот  период  на  долю  штамма-мутанта
приходится  минимальный  процент  присутствия  в  ризосфере  по
сравнению  с  общей  численностью  микроорганизмов.  Далее
наблюдалось  быстрое  снижение  общей  численности  микроор¬
ганизмов  (в  период,  предшествующий  уборке  урожая,  по  срав¬
нению  с  фазой  кущения  титр  гетеротрофных  микроорганиз¬
мов  снизился  в  4,9  раза).  Титр  клеток  штамма  P.  aureofaciens
ИБ  5  lslr  за  аналогичный  период  уменьшился  всего  в  2  раза,  и  за
счет  этого  доля  штамма-мутанта  в  ризосфере  опять  возросла
почти  до  1%  и  составила  в  период  восковой  спелости  зерна
1,7  •  10*  КОЕ/г  корней.
 93

Изучение  влияния  интродукции
штаммов-антагонистов  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter
на  микробиоту  ризосферы  пшеницы
 Ризосфера  растений  представляет  собой  специфическую  эко¬
нишу,  характерной  особенностью  которой  является  поступление
питательных  веществ  за  счет  экзоосмоса  корней.  Корневые  вы¬
деления  содержат  небольшие  количества  разнообразных  соеди¬
нений,  включая  сахара,  аминокислоты,  пептиды,  ферменты,  ви¬
тамины,  органические  кислоты  и  др.  Постоянное  поступление
питательных  веществ  стимулирует  развитие  микроорганизмов  в
зоне  ризосферы.
 Известно,  что  PGPR-бактерии  влияют  не  только  на  рост  и
развитие  растений,  но  и  могут  принимать  участие  в  формировании
микробных  ассоциаций  [Калько,  Воробьева,  2001].  Для  успешной
борьбы  бактерий-антагонистов  с  почвенными  возбудителями
грибных  болезней  растений  необходимо,  чтобы  интродуцируе-
мые  в  ризосферу  полезные  микроорганизмы  обладали  способно¬
стью  к  формированию  стабильной  популяции.
 Нами  была  поставлена  задача  определить  влияние  интроду-
цированных  штаммов-антагонистов  родов  Pseudomonas  и
Azotobacter  на  численность  аборигенной  микрофлоры  ризосферы
пшеницы  сорта  Жница.  В  эксперименте  изучали  также  воздейст¬
вие  на  микробиоценоз  биопрепаратов  агата-25  К  и  фитоспорина,
а  также  фунгицида  широкого  спектра  действия  феразима.
 Изучение  динамики  численности  микроорганизмов  ризо¬
сферной  зоны  пшеницы  показало,  что  предпосевная  обработка
семян  пшеницы  всеми  видами  препаратов,  за  исключением  фи¬
тоспорина,  привела  к  снижению  численности  грибов  в  ризосфере
в  начальной  фазе  развития  растений  (табл.  36),  причем  препара¬
ты  на  основе  изучаемых  псевдомонад  и  азотобактера  сопостави¬
мы  по  эффективности  подавления  развития  микромицетов  с  из¬
вестным  биопрепаратом  агат-25  К  и  химическим  фунгицидом  фе-
разимом.  Отмечено  также  влияние  псевдомонад  и  азотобактера
на  увеличение  численности  в  ризосфере  микроорганизмов
p.  Bacillus  (см.  табл.  36).  Для  штамма  Az.  vinelandii  ИБ  4  в  фазе
третьего  листа  и  фазе  восковой  спелости  выявлено  превышение
количества  спорообразующих  микроорганизмов  в  ризосфере
пшеницы  в  5  раз  по  сравнению  с  контрольным  вариантом.  По¬
добную  стимуляцию  популяции  p.  Bacillus  можно  объяснить  на¬
личием  механизма  положительного  взаимодействия  по  типу  ком¬
менсализма,  т.е.  взаимно  благоприятного  влияния  сопутствую¬
щих  бактерий.  В  частности,  для  бактерий  Az.  vinelandii  был  отме¬
чен  такой  специфический  механизм  отношений  с  В.  circulans,  при
 94

Таблица  36.  Влияние  бактеризации  семян  пшеницы  сорта  Жница  на  динамику  численности  аборигенных  микроорганизмов
 в  ризосферной  зоне,  КОЕ/  г  ризосферы
 Вариант
 Гетеротрофные
 микроорганизмы,
 х108
 Олигонитрофи-
 лы,х108
 Спорообразую¬
щие  бактерии,
хЮ6
 Микромицеты,
 хЮ4
 Актиномицеты,
 хЮ6
 Контроль
 I
 1,47±1,47
 3,31±2,70
 4,29±4,02
 24,4±8,17
 4,44±1,91
 II
 4,72±3,47
 16,0±10,16
 2,03±0,95
 3,65±1,81
 нд
 III
 4,81  ±2,04
 3,38±0,96
 0,31  ±0,28
 2,39±2,14
 4,17±3,48
 Фитоспорин
 I
 1,15±0,58
 1,13±0,41
 2,52±1,60
 83,96±30,51*
 3,54±0,89
 II
 9,59±4,45
 7,04±5,97
 5,76±2,27*
 1,37±1,29
 нд
 III
 3,09±2,07
 3,44±1,25
 0,06±0,02
 13,75±12,94
 7,40±6,55
 Агат-25К
 I
 2,46±2,04
 0,76±0,66
 1,53±1,11
 6,32±3,46*
 1,93±0,76
 II
 25,52±  18,28
 13,76±  10,99
 5,05±0,61*
 2,31±0,00
 нд
 III
 2,33±1,16
 1,83±0,25*
 0,03±0,01
 3,99±2,07
 2,77±2,39
 Феразим
 I
 1,84±1,36
 2,08±1,16
 2,25±1,41
 5,83±0,89*
 3,13±1,55
 II
 2,98±1,16
 3,89±3,52
 2,92±0,36
 0,63±0,41*
 нд
 III
 4,23±0,57
 3,04±1,99
 0,25±0,18
 8,47±6,07
 7,20±5,76
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 I
 1,31±0,51
 1,58±1,23
 2,14±1,32
 8,43±3,37*
 2,35±1,38
 II
 4,04±2,09
 4,02±2,05
 5,21±4,23
 7,26±4,09
 нд
 III
 2,46±2,00
 3,75±1,73
 0,09±0,06
 7,08±0,45*
 8,33±4,48

Таблица  36  (окончание)
 Вариант
 Гетеротрофные
микроорганизмы,
 хЮ8
 Олигонитрофи-
 g
 лы,  хЮ
 Спорообразую¬
щие  бактерии,
 хЮ6
 Микромицеты,
 хЮ4
 Актиномицеты,
 хЮ6
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 I
 1,34±0,67
 1,32Ю,59
 1,6910,39
 5,8014,64*
 2,4711,24
 II
 3,45±2,89
 3,5412,49
 5,9512,88*
 1,7210,34
 НД
 III
 5,16±3,37
 3,8412,41
 0,1610,12
 7,4111,39*
 5,9213,18
 P.putida  ИБ  17
 I
 2,31  ±2,22
 1,2610,17
 0,7910,56
 11,7913,07*
 2,6914,38
 II
 4,42±3,71
 4,8712,47
 3,5312,44
 1,8911,34
 нд
 III
 5,56±1,85
 58,78127,98*
 0,1610,08
 7,2311,39*
 6,3815,05
 Pseudomonas  sp.  ИБ  182
 I
 1,41  ±  1,05
 1,8111,15
 1,8011,22
 6,5015,38*
 2,5012,48
 II
 5,32±3,16
 15,64110,57
 7,0413,18*
 5,0010,00
 нд
 III
 5,97±1,44
 3,2811,28
 0,0410,01
 21,7014,69*
 12,7619,06
 Az.vinelandii  ИБ  1
 I
 6,94±6,55
 16,4419,45*
 2,2210,55
 1,2011,12*
 нд
 II
 11,7614,26
 15,3116,37
 8,713,50*
 5,1511,84
 нд
 III
 4,05±2,05
 2,9611,90
 4,0811,80*
 8,5314,18
 6,315,10
 Az.vinelandii  ИБ  3
 I
 1,75±0,90
 1,7311,58
 2,3911,35
 7,4914,17*
 2,6311,01
 II
 2,44±0,56
 17,0813,91
 2,5310,79
 3,7211,77
 нд
 III
 3,14±  1,50
 2,6711,60
 5,2712,10*
 5,1113,30
 3,3711,77
 Az.vinelandii  ИБ  4
 I
 2,7512,63
 2,5311,37
 22,62111,10*
 12,6312,92*
 2,8912,30
 II
 4,7412,60
 3,5312,81
 7,312,40*
 6,2813,58
 нд
 III
 4,2611,70
 4,1710,78
 22,113,74*
 6,7811,87*
 7,3611,87
 *  Различия  по  сравнению  с  контролем  существенны  при  р  =  0,95.
 1  -  фаза  третьего  листа;  И  -  фаза  кущения;  111  -  фаза  восковой  спелости;  нд  -  нет  данных

котором  наблюдалось  увеличение  численности  бацилл  и  увели¬
чение  азотфиксации  в  2-3  раза  [Белимов,  1992].  Биопрепараты
фитоспорин  и  агат-25  К  также  способствовали  увеличению  в  ри¬
зосфере  пшеницы  численности  бацилл  в  середине  вегетации.
 Анализ  динамики  численности  групп  гетеротрофных  микро¬
организмов,  актиномицетов,  олигонитрофилов  не  выявил  досто¬
верных  различий  между  контролем  и  опытными  вариантами
(табл.  36).  Только  для  штамма  Az.  vinelandii  ИБ  1  было  отмечено
достоверное  увеличение  популяции  олигонитрофильных  микро¬
организмов  на  начальной  стадии  роста  растений.
 Таким  образом,  можно  сделать  вывод,  что  интродукция
штаммов  антагонистов  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter  в  при¬
корневую  зону  пшеницы  сорта  Жница  не  угнетает  жизнедеятель¬
ность  аборигенной  бактериальной  микрофлоры  и  оказывает  не¬
гативное  влияние  только  на  представителей  группы  микромице-
тов-фитопатогенов  растений,  что,  по-видимому,  объясняется
спецификой  действия  метаболитов,  вырабатываемых  штаммами-
антагонистами.
 Таким  образом,  проведенные  эксперименты  показали,  что
предпосевная  бактеризация  семян  растений  пггаммами-антагони-
стами  позволяет  интродуцентам  успешно  заселять  ризосферу
развивающихся  растений.  В  вегетационных  и  полевых  опытах  ус¬
тановлено,  что  динамика  численности  интродуцируемых  штам¬
мов  различается.  Псевдомонады  как  типичные  представители
ризосферной  микробиоты  [Мишустин,  1972,  Holich,  Steinbrenner,
1986]  успешнее  выдерживают  конкурентное  давление  со  сторо¬
ны  аборигенной  микробиоты,  их  численность  в  ризосфере  оста¬
ется  стабильной  на  протяжении  большей  части  вегетационного
периода.  Вместе  с  тем  немаловажно  и  то,  что  интродукция  иггам-
мов-антагонистов  p.  Pseudomonas  не  приводит  к  изменениям  стру¬
ктуры  микробного  ценоза  ризосферы.
 Свободноживущие  азотфиксирующие  бактерии  p.  Azotobacter
не  являются  типичными  представителями  ризосферы  растений.
Однако  наши  эксперименты  показали,  что  изучаемые  штаммы
Az.  vinelandii  способны  не  только  приживаться  в  ризосфере  раз¬
личных  растений,  но  и  сохранять  высокую  антагонистическую
активность  по  отношению  к  фитопатогенным  грибам.

ОЦЕНКА  ЭФФЕКТИВНОСТИ
ПРИМЕНЕНИЯ  НОВЫХ  ШТАММОВ  БАКТЕРИЙ
РОДОВ  PSEUDOMONAS  И  AZOTOBACTER
ДЛЯ  ЗАЩИТЫ  РАСТЕНИЙ  ОТ  БОЛЕЗНЕЙ
И  ПОВЫШЕНИЯ  УРОЖАЙНОСТИ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ  КУЛЬТУР
 Использование  псевдомонад  для  защиты  зерновых  культур  от
болезней  вызывает  у  исследователей  значительный  интерес.  Выя¬
влено,  что  штаммы-антагонисты  p.  Pseudomonas  могут  быть  ис¬
пользованы  против  возбудителей  корневых  гнилей  пшеницы
[Zaspel,  1989]  и  ячменя  [Гарагуля  и  др.,  1989],  фузариоза  пшеницы
[Додатко  и  др.,  1989],  септориоза  и  листовой  ржавчины  пшеницы
[Levy  et  al.,  1989],  против  поражения  растений  озимой  пшеницы
грибом  Rhizoctonia  solani  [Renato  de  Freitas,  Germida,  1991]  и  т.д.  По
литературным  данным,  положительное  влияние  бактерий  p.  Azoto¬
bacter  на  развитие  злаковых  культур,  главным  образом,  связывают
со  снабжением  растений  доступным  азотом  и  выделением  биологи¬
чески  активных  веществ  [Tomar  et  al.,  1998;  Rabie  et  al.,  1995;  Narula
et  al.,  1998];  крайне  мало  сообщений  об  использовании  инокуляции
азотобактером  для  защиты  пшеницы  от  болезней.
 Эффективность  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера  про¬
тив  комплекса  возбудителей  корневых  гнилей  пшеницы  изучали
в  лабораторных  условиях  на  яровой  пшенице  с  естественным
уровнем  заражения  посевного  материала,  полученного  в  услови¬
ях  опытных  полей  Учебного  хозяйства  БГАУ.  Всхожесть  пшени¬
цы  после  проращивания  в  течение  2  сут  во  влажной  камере
составила  90,7%.
 Семена  пшеницы  обрабатывали  двухсуточной  КЖ  бактерий,
полученной  на  среде  LB  либо  среде  40  (титр  109  КОЕ/мл)  из  рас¬
чета  106  КОЕ/семя.  Инокуляцию  зерен  проводили  путем  встряхи¬
вания  их  в  колбах  с  бактериальной  суспензией.  Семена  переносили
на  увлажненную  полоску  фильтровальной  бумаги,  прикрывали
такой  же  полоской,  поверх  которой  накладывали  полоску  поли¬
этилена,  сворачивали  в  рулон,  помещали  вертикально  в  лабора¬
торный  стакан  и  оставляли  при  комнатной  температуре.  В  конт¬
рольных  опытах  обработку  семян  осуществляли  водопроводной
водой.  В  качестве  эталонов  использовали  химический  фунгицид
дивиденд  (2  л/т),  а  также  биопрепараты  -  фитоспорин  в  жидком
виде  (4  л/т)  и  планриз  (0,5  л/т).  Эксперимент  выполняли  в  четы¬
 98

рехкратной  повторности  (по  50  растений  в  повторности).  Обра¬
ботку  результатов  проводили  через  7  дней.  Эффективность
штаммов  определяли  при  сопоставлении  распространения  и  раз¬
вития  корневых  гнилей  проростков  пшеницы  в  опыте  и  контро¬
ле  (ГОСТ  Р  50459-92).  Кроме  того,  в  опыте  учитывали  процент
распространения  на  семенах  альтернариоза,  а  также  измеряли
длину  проростков.
 По  аналогичной  методике  был  поставлен  эксперимент  с  до¬
полнительным  инфицированием  посевного  материала  спорами
фитопатогенных  грибов  Fusarium  oxysporum  и  Bipolaris  sorokini¬
ana  (титр  споровой  суспензии  обоих  патогенов  составил
~1  •  102  КОЕ/зерно).
 Для  приготовления  суспензии  конидий  фитопатогенного  гри¬
ба  брали  3—4  чашки  Петри  с  газоном  микромицета  (2  нед  после
появления  колоний),  вносили  в  них  по  10-12  мл  стерильной  воды
и  с  помощью  микробиологической  петли  делали  смыв  с  агаризо-
ванной  среды  в  стерильную  колбу.  Определение  титра  споровой
суспензии  осуществляли  в  камере  Горяева.
 Для  изучения  воздействия  комплекса  штаммов-антагонистов
родов  Pseudomonas  и  Azotobacter  на  развитие  корневых  гнилей  пше¬
ницы  использовали  приготовленную  непосредственно  перед  зама¬
чиванием  семян  смесь  КЖ  штаммов,  взятых  в  соотношении  1:1.
 Полевой  опыт  проводили  в  2002  г.  на  опытном  участке  совхо¬
за  им.  Цюрупы  Уфимского  района  Республики  Башкортостан.
Почва  -  выщелоченный  чернозем.  Площадь  опытных  делянок  -
4  м2,  повторность  опыта  четырехкратная.  Расстояние  между  ряд¬
ками  -  15  см.  Норма  высева  пшеницы  -  20-30  г/м2.  Глубина  заделки
семян  -  3  см.  Посев,  уход  (прополки)  и  уборку  урожая  проводили
вручную.  Для  определения  всхожести  пшеницы  проращивали
50  зерен  во  влажной  камере  в  трехкратной  повторности.  Всхо¬
жесть  пшеницы  составила  96,0%.
 Для  инокуляции  семян  использовали  двухсуточную  КЖ
штаммов  псевдомонад  и  трехсуточную  КЖ  штаммов  азотобакте¬
ра,  полученные  на  среде  КингВ  и  среде  40  соответственно  (титр
109  КОЕ/мл)  из  расчета  104  КОЕ/семя.  В  контрольном  варианте
семена  обрабатывали  водопроводной  водой.  В  качестве  эталонов
в  экспериментах  использовали  биопрепараты  фитоспорин  и  агат-
25К,  а  также  системный  фунгицид  феразим  в  дозах,  рекомендо¬
ванных  “Списком  пестицидов...”.
 Учет  поражения  растений  корневыми  гнилями  проводили
2  раза  за  полевой  сезон:  в  фазе  кущения  и  фазе  восковой  спело¬
сти.  Для  анализа  выкапывали  по  25  растений  с  каждой  повторно¬
сти  полевого  опыта  и  оценивали  процент  развития  корневых  гни¬
лей  и  процент  поражения  болезнью  (распространение  болезни)  в
 4*
 99

соответствии  с  методическими  указаниями  [Методические  указа¬
ния..,  1985].  Оценку  эффективности  предпосевной  бактеризации
семян  проводили,  сравнивая  показатели  элементов  структуры
урожая  в  контрольном  и  опытных  вариантах.
 В  течение  полевого  сезона  трижды  производили  отбор  расте¬
ний  для  анализа  популяционной  численности  микроорганизмов  в
ризосферной  зоне  пшеницы:  в  фазе  третьего  листа,  фазе  куще¬
ния  и  фазе  восковой  спелости.  Анализ  плотности  популяции
ризосферных  микроорганизмов  проводили  со  всей  корневой  сис¬
темы  растений  пшеницы  по  методике,  описанной  ранее.  Для  ана¬
лиза  отбирали  по  5  растений  с  каждой  повторности  варианта.
 Изучение  эффективности
применения  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера
для  защиты  пшеницы  от  корневых  гнилей  и  альтернариоза
в  условиях  вегетационных,
полевых  и  производственных  испытаний
 В  опытах  in  vitro  мы  показали,  что  новые  штаммы  псевдомо¬
над  и  азотобактера  являются  антагонистами  возбудителей  аль¬
тернариоза  и  корневых  гнилей  пшеницы.  Целью  дальнейших  ис¬
следований  было  определить,  сохраняется  ли  у  выделенных
штаммов-антагонистов  активность  против  данных  фитопатоге¬
нов  в  условиях  in  vivo.
 По  результатам  лабораторных  экспериментов  на  яровой
пшенице  было  установлено,  что  в  случае  естественной  инфекци¬
онной  нагрузки  на  семенах  исследуемые  штаммы  псевдомонад
способствуют  снижению  распространения  гельминтоспориозной
корневой  гнили  в  среднем  на  60,3-87,3%.  Наряду  с  этим  отмече¬
но  также,  что  бактеризация  семян  пшеницы  штаммами  P.  aureo¬
faciens  ИБ  51,  P.  aureofaciens  ИБ  6,  Pseudomonas  sp.  182  способст¬
вует  снижению  распространения  грибов  p.  Alternaria  на  54,7%;
53,5%;  51,4%  соответственно  (табл.  37).  Используемые  в  данном
модельном  эксперименте  в  качестве  аналогов  биологические
препараты  планриз  и  фитоспорин  продемонстрировали  высокую
биологическую  эффективность  по  отношению  к  возбудителю
корневых  гнилей  пшеницы  Bipolaris  sorokiniana  (71,4%  и  55,6%
соответственно),  но  оказались  малоэффективными  против  аль¬
тернариоза  проростков.  Таким  образом,  показано,  что  новые
штаммы  псевдомонад  в  условиях  естественного  инфекционного
фона  заражения  не  только  не  уступают  известным  биологиче¬
ским  препаратам  в  эффективности  воздействия  на  фитопатоге¬
ны,  а  даже  превосходят  их.
 100

Таблица  37.  Эффективность  применения  штаммов  бактерий  p.  Pseudomonas  против  заболеваний  пшеницы
 (естественный  инфекционный  фон)
 Вариант
 Непророс¬
шие  се¬
мена,  %
 Ненор¬
мально
проросшие
семена,  %
 Поражение  проростков  пшеницы  болезнями
 Длина
 проростка
 пшеницы,
 см
 %  пре¬
вышения
длины
пророст¬
ка  пше¬
ницы  над
контро¬
лем
 альтернариоз
 Bipolaris  sorokiniana
 распро¬
странение
болезни,  %
 биологи¬
ческая
эффектив¬
ность,  %
 распро¬
стране¬
ние  бо¬
лезни,  %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 развитие
болезни,%
 биоло¬
гическая
эффек¬
тив¬
ность,  %
 Контроль
 11,0±7,6
 18,0±16,9
 48,6±15,2
 -
 12,6±2,8
 -
 4,0±3,2
 —
 13,3±0,4
 _
 Планриз
 8,0±6,9
 8,6±7,2
 44,6±14,6
 -
 3,6±3,0*
 71,4*
 1,4±  1,1
 -
 14,5±0,3*
 9,0
 Фитоспорин
 10,0±2,6
 11,6±7,1
 44,0±11,6
 -
 5,6±1,6*
 55,6*
 1,8±0,6
 -
 14,0±0,4
 -
 Дивиденд
 8,0±4,5
 6,6±5,4
 12,6±4,0*
 74,1*
 0,0±0,0*
 100,0*
 0,0±0,0*
 100,0*
 13,1±0,3
 -
 P.  aureofaciens
 12,6±4,8
 4,0±3,9
 22,0±9,4*
 54,7*
 3,0±2,2*
 76,2*
 1,0±0,4
 —
 15,8±0,3*
 18,8
 ИБ  51
 P.  aureofaciens
 9,0±1,8
 7,0±5,5
 22,6±9,6*
 53,5*
 3,0±2,2*
 76,2*
 1,0±0,4
 —
 15,8±0,3*
 18,8
 ИБ  6
 P.  putida
 10,6±3,0
 8,0±6,9
 24,0±11,4
 -
 1,6±0,6*
 00
 ы
 *
 0,5±0,4
 —
 13,9±0,3
 _
 ИБ  56
 P.  putida
 10,0±2,6
 6,6±5,4
 30,0±5,2
 -
 2,0±0,0*
 84,1*
 0,9±0,5
 —
 13,3±0,3
 _
 ИБ  17
 Pseudomonas
 15,0±3,2
 7,0±4,1
 23,6±7,8*
 51,4*
 5,0±3,2*
 60,3*
 1,9±  1,5
 _
 14,8±0,4*
 11,3
 sp.  ИБ  182
 *  Различия  по  сравнению  с  контролем  существенны  при  р
 =  0,95.

Статистическая  обработка  данных,  характеризующих  про¬
цент  непроросших  семян,  а  также  процент  ненормально  развива¬
ющихся  проростков,  не  выявила  достоверных  отличий  ни  в  од¬
ном  из  вариантов  по  отношению  к  контролю.
 Для  химического  фунгицида  дивиденд  отмечена  100%-ная  эф¬
фективность  подавления  развития  корневых  гнилей,  а  также  наи¬
большая  биологическая  эффективность  подавления  распростра¬
нения  альтернариоза  семян  -  74,1%.
 Несмотря  на  высокую  эффективность  химического  фунгици¬
да  по  сравнению  с  биологическими  средствами  защиты  против
болезней  пшеницы,  было  отмечено,  что  штаммы  псевдомонад
P.  aureofaciens  ИБ  51,  P.  aureofaciens  ИБ  6,  Pseudomonas  sp.  182,  а
также  биопрепарат  планриз  способствовали  увеличению  длины
проростков  пшеницы  по  сравнению  с  контролем  в  среднем  на
 9—18,8%,  тогда  как  Дивиденд  не  оказывал  ростстимулирующего
воздействия  на  молодое  растение.
 Следующий  опыт  с  дополнительным  заражением  посевного
материала  фитопатогенами  показал,  что  только  один  из  исследу¬
емых  штаммов  -  P.  aureofaciens  ИБ  6  -  успешно  справился  с  при¬
сутствием  на  зернах  повышенной  инфекционной  нагрузки,  в  том
числе  полностью  подавил  распространение  фузариозной  корне¬
вой  гнили  (табл.  38).  Вообще  при  дополнительной  инфекционной
нагрузке  эффективность  от  применения  фунгицидов  как  биоло¬
гической,  так  и  химической  природы  либо  снизилась,  либо  пол¬
ностью  отсутствовала.  Так,  хотя  штаммы  P.  aureofaciens  ИБ  51  и
Pseudomonas  sp.  182  характеризовались  100%-ной  эффективно¬
стью  в  отношении  фитопатогенного  гриба  F.  oxysporum,  их  био¬
логическая  эффективность  в  отношении  других  фитопатогенов,
присутствующих  на  зернах,  не  подтверждена  статистически.
 Отмечено  также,  что  в  опыте  с  дополнительным  инфициро¬
ванием  посевного  материала  исследуемые  псевдомонады  не
смогли  проявить  свои  ростстимулирующие  свойства,  отмечен¬
ные  в  предыдущем  эксперименте.  Только  для  штамма  P.  aureofa¬
ciens  ИБ  51  выявлено  статистически  подтвержденное  превыше¬
ние  длины  проростков  над  контролем  на  13,8%.
 Для  бактерий  p.  Pseudomonas  также  изучался  вопрос  об  эф¬
фективности  применения  бинарных  смесей  для  защиты  пшеницы
от  болезней.  В  предыдущих  экспериментах  наибольшей  биологи¬
ческой  эффективностью  в  борьбе  против  корневых  гнилей  и  аль¬
тернариоза  пшеницы  при  разных  уровнях  инфекционной  нагруз¬
ки  характеризовался  штамм  Р.  aureofaciens  ИБ  6,  поэтому  он  и
был  выбран  в  качестве  постоянного  компонента  бактериальных
смесей,  а  варианты  обработок  были  составлены  за  счет  добавле¬
ния  к  нему  других  штаммов-антагонистов.
 102

Таблица  38.  Эффективность  применения  штаммов  бактерий  p.  Pseudomonas  против  заболеваний  пшеницы
 (искусственный  инфекционный  фон)
 Вариант
 Непророс¬
шие  се¬
мена,  %
 Ненор¬
мально
пророс¬
шие  се¬
мена,  %
 Поражение  проростков  пшеницы  болезнями
 Длина
проро¬
стка
пше¬
ницы,  см
 альтернариоз
 Fusarium  oxysporum
 Bipolaris  sorokiniana
 распростра¬
нение  бо¬
лезни,  %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 распрост¬
 ранение
 болезни,
 %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 распрост¬
 ранение
 болезни,
 %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 развитие
 болезни,
 %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 Контроль
 14,6±6,6
 11,0±9,5
 42,0±10,1
 -
 2,5±2,0
 —
 13,5±3,0
 —
 4,8±1,7
 _
 18,8±1,1
 Планриз
 8,6±7,9
 2,0±1,6
 38,0±6,9
 -
 2,0±1,6
 —
 12,0±4,5
 —
 3,5±1,7
 _
 19,9±1,4
 Фитоспо-
 7,0±6,6
 2,6±2,0
 30,0±8,2
 -
 1,0±0,8
 -
 6,5±3,7*
 51,9*
 1,9±1,4
 —
 17,8±0,9
 рин
 Дивиденд
 12,0±9,4
 5,0±4,1
 11,0±4,1  *
 73,8*
 2,5±2,0
 -
 1,5±0,6*
 88,9*
 0,4±0,2*
 91,7*
 17,8±1,4
 Р.  аиге-
 10,0±4,5
 2,6±1,0
 24,5±9,5
 -
 0,0±0,0*
 100,0*
 8,0±6,9
 -
 3,3±3,1
 —
 21,4±1,4*
 ofaciens
 ИБ  51
 Р.  аиге-
 13,0±7,6
 4,0±3,5
 22,0±4,5*
 47,6*
 0,0±0,0*
 100,0*
 4,5±4,0*
 66,7*
 1,6±0,8*
 66,7*
 19,2±1,1
 ofaciens
 ИБ  6
 P.  putida
 12,0±5,2
 4,0±2,6
 34,5±9,5
 -
 0,5±0,3
 -
 12,5±7,9
 -
 4,9±4,1
 _
 18,9±0,3
 ИБ  56
 *
 P.  putida
 8,0±7,8
 3,0±2,2
 24,5±  11,1
 -
 1,0±0,8
 -
 10,5±3,0
 -
 3,6±0,8
 _
 19,7±0,8
 ИБ  17
 Pseudo¬
 12,6±5,4
 5,0±3,2
 31,3±12,5
 -
 0,0±0,0*
 100,0*
 10,0±5,8
 -
 4,9±3,9
 -
 20,2±0,9
 monas  sp.
 ИБ  182
 *  Различия  по  сравнению  с  контролем  существенны  при  р  =  0,95.

Таблица  39.  Эффективность  применения  смесей
 из  штаммов  псевдомонад  против  заболеваний  пшеницы
 (естественный  инфекционный  фон)
 Поражение  проростков  пшеницы  болезнями
 Вариант
 альтернариоз
 Bipolaris  sorokiniana
 распростране¬
ние  болезни,  %
 биологическая
 эффективность,
 %
 распростране¬
ние  болезни,  %
 развитие
болезни,%
 Контроль
 47,0±5,5
 —
 5,5±4,8
 2,1±1,8
 6
 21,0±5,6*
 55,3*
 1,0±0,8
 0,4±0,2
 51
 24,0±8,7*
 48,9*
 1,3±1,0
 0,4±0,3
 17
 27,4±7,6*
 41,7*
 1,5±0,6
 0,9±0,6
 182
 31,4±5,8*
 33,2*
 2,5±1,0
 0,9±0,4
 6+51
 30,5±  11,8
 -
 2,0±1,4
 0,7±0,1
 6+17
 39,0±4,2**
 -
 3,5±2,8
 1,4±0,8
 6+182
 31,6±4,7**
 32,8*
 3,5±3,0
 1,0±0,7
 *  Различия  по  сравнению  с  контролем  существенны  при  р  =  0,95;  **  различия
по  сравнению  с  P.  aureofaciens  ИБ  6  существенны  при  р  =  0,95.
 Показано,  что  использование  бактериальных  смесей,  состоя¬
щих  из  штаммов-антагонистов  p.  Pseudomonas,  для  защиты  пше¬
ницы  от  фитопатогенов  оказалось  менее  эффективно,  чем  обра¬
ботка  чистыми  культурами  бактерий  (табл.  39).  Так,  по-прежнему,
среди  испытуемых  культур  p.  Pseudomonas  наибольшей  биологи¬
ческой  эффективностью  в  отношении  альтернариоза  пшеницы
обладал  штамм  P.  aureofaciens  ИБ  6  (55,3%).
 Статистическая  обработка  полученных  результатов  показа¬
ла,  что  в  вариантах  “6+17”  и  “6+182”  распространение  альтерна¬
риоза  выше,  чем  в  варианте  “6”  в  1,9  и  1,5  раза  соответственно,
но  нет  достоверных  отличий  между  вариантами  “6+17”  и  “17”,
“6+182”  и  “182”.  Таким  образом,  при  добавлении  к  активному
штамму  6  менее  активных  антагонистов  17  и  182  не  обнаружено
роста  биологической  эффективности  по  сравнению  с  вариантом,
где  использовался  только  штамм  P.  aureofaciens  ИБ  6;  не  удалось
также  превысить  значения  биологической  эффективности,  полу¬
ченные  для  чистых  культур  17  и  182.  Данные  литературы  [Над-
керничная,  Ковалевская,  2001;  Sikora  et  al.,  1990]  также  подтвер¬
ждают,  что  использование  комплекса  бактерий  не  всегда  по
эффективности  превосходит  отдельные  штаммы  консорциума.
 Для  изучения  влияния,  которое  оказывает  на  пшеницу  бакте¬
ризация  семян  иггаммами-антагонистами  p.  Azotobacter,  был  по¬
ставлен  вегетационный  опыт  с  дополнительным  инфицировани¬
 104

ем  посевного  материала  спорами  фитопатогенных  грибов
 F. 	oxysporum  и  Bipolaris  sorokiniana  (количество  спор,  приходя¬
щихся  на  одно  зерно,  обоих  патогенов  составило  5  •  104  КОЕ/зер-
но).  Отмечено,  что  предпосевная  инокуляция  семян  пшеницы
штаммами  азотобактера  позволила  значительно  снизить  количе¬
ство  непроросших  и  деформированных  семян  (табл.  40).  Количе¬
ство  непроросших  семян  для  варианта,  инокулированного  штам¬
мом  Az.  vinelandii  ИБ  1,  было  достоверно  ниже,  чем  в  контроле,  в
3,75  раза,  а  для  штамма  Az.  vinelandii  ИБ  4  -  в  2,5  раза.  Так  же,  в
среднем  в  3  раза,  снизилось  количество  ненормально  проросших
семян  при  инокуляции  КЖ  штаммов  азотобактера.
 В  условиях  повышенной  инфекционной  нагрузки  применение
штаммов  азотобактера  обеспечивало  высокую  эффективность
защиты  растений  пшеницы  от  болезней.  Показано,  что  все  штам¬
мы  Az.  vinelandii  эффективно  подавляли  альтернариоз,  биологи¬
ческая  эфффективность  по  использованию  азотобактера  против
данного  фитопатогена  составила  48,1-57,6%.  В  вариантах  с  обра¬
боткой  семян  штаммами  Az.  vinelandii  ИБ  1  и  Az.  vinelandii
ИБ  4  отмечена  эффективность  данных  культур  как  против  фуза-
риозной,  так  и  против  гельминтоспориозной  корневых  гнилей.
Из  всех  изучаемых  культур  p.  Azotobacter  штамм  Az.  vinelandii
ИБ  3  оказался  наиболее  эффективным  против  фитопатогенного
гриба  Bipolaris  sorokiniana,  эффективность  от  его  применения  со¬
ставила  62,6%.
 При  инокуляции  посевного  материала  бинарными  компози¬
циями  штаммов  азотобактера  наибольшую  эффективность  в  за¬
щите  пшеницы  от  альтернариоза  (92,3%)  проявил  консорциум  из
штаммов  Az.  vinelandii  ИБ  1  и  Az.  vinelandii  ИБ  3.  Таким  образом,
показано,  что  против  альтернариоза  оказалось  эффективнее
применение  смеси  штаммов-антагонистов.
 Но  также  было  отмечено,  что  эффективность  защиты  от
корневых  гнилей  при  обработке  семян  пшеницы  бинарными  ком¬
позициями  штаммов  азотобактера  не  отличается  от  вариантов  с
обработкой  чистыми  культурами  Az.  vinelandii.
 Достоверные  результаты  по  превышению  средней  длины
проростков  над  контрольным  вариантом  получены  в  вариантах  с
обработкой  штаммом  Az.  vinelandii  ИБ  4  и  бинарной  композици¬
ей  штаммов  Az.  vinelandii  ИБ  1  и  Az.  vinelandii  ИБ  4.  Подобную
стимуляцию,  выражающуюся  в  увеличении  длины  проростков  и
увеличении  количества  нормально  проросших  семян,  можно
объяснить  способностью  данных  штаммов  синтезировать  рост-
стимулирующие  вещества  типа  ауксинов  и  цитокининов.
 Положительные  результаты,  полученные  при  испытании
штамма  Az.  vinelandii  ИБ  1  в  лабораторных  опытах  на  пшенице,
 105

Таблица  40.  Эффективность  применения  штаммов  бактерий  p.  Azotobacter  против  заболеваний  пшеницы
 (искусственный  инфекционный  фон)
 Поражение  проростков  пшеницы  болезнями
 Непророс¬
 Ненор¬
 альтернариоз
 Fusarium  oxysporum
 Bipolaris  sorokiniana
 Длина
 Вариант
 шие  се¬
мена,  %
 мально
пророс¬
шие  се¬
мена,  %
 распростра¬
нение  бо¬
лезни,  %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 распрост¬
 ранение
 болезни,
 %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 распрост¬
 ранение
 болезни,
 %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 развитие
 болезни,
 %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 проро¬
стка
пше¬
ницы,  см
 Контроль
 15±2,5
 13,0±4,5
 26,0±5,9
 -
 15,5±1,9
 -
 26,9±7,1
 -
 13,4±3,6
 -
 19,5±0,7
 Фитоспо-
 рин
 8,0±6,9
 8,6±5,2
 22,1±7,2
 15,0
 11,9±2,3
 23,2
 12,6±
 ±5,8*
 53,2*
 11,8±2,6
 12,3
 19,4±1,1
 Az.  vine¬
landii
ИБ  1
 4,0±3,5*
 3,5±2,5*
 11,0±3,4*
 57,6*
 7,6±4,3*
 50,9*
 10,3±
±6,8*
 61,6*
 6,4±2,1*
 52,0*
 19,9±1,4
 Az.  vine-
 landii
 ИБЗ
 5,0±1,1*
 3,5±2,4*
 12,0±2,8*
 53,8*
 11,0±3,4
 29,0
 9,2±2,8*
 65,6*
 4,6±1,4*
 62,6*
 20,3±1,3
 Az.vinelan¬
dii  ИБ  4
 6,0±3,6*
 4,0±2,8*
 13,5±5,5*
 48,1*
 9,0±3,8*
 41,9*
 11,9±
±3,2*
 55,5*
 5,9±1,6*
 55,6*
 21,5±1,1
 ♦

Таблица  40  (окончание)
 Вариант
 Непророс¬
шие  се¬
мена,  %
 Ненор¬
мально
пророс¬
шие  се¬
мена,  %
 Поражение  проростков  пшеницы  болезнями
 Длина
проро¬
стка
пше¬
ницы,  см
 альтернариоз
 Fusarium  oxysporum
 Bipolaris  sorokiniana
 распростра¬
нение  бо¬
лезни,  %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 распрост¬
 ранение
 болезни,
 %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 распрост¬
 ранение
 болезни,
 %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 развитие
 болезни,
 %
 биологи¬
ческая  эф¬
фектив¬
ность,  %
 Az.  vine¬
 5,0±1,1*
 5,5±2,8*
 2,0±1,1*
 92,3*
 11,5±4,7
 25,8
 9,9±5,5*
 63,0*
 4,9±2,7*
 63,0*
 21,2±1,7
 landii  ИБ
 1+Az.  vi¬
 nelandii
 ИБ  3
 Az.  vine¬
 4,0±3,3*
 4,0±2,8*
 12,5±3,7*
 51,9*
 12,0±
 22,6*
 6,8±2,7*
 74,7*
 3,4±2,3*
 74,7*
 21,8±
 landii  ИБ
 ±1,4*
 ±0,9*
 1+Az.  vi-
 nelandii
 ИБ  4
 Az.  vine¬
 3,5±2,5*
 3,5±3,0*
 12,0±2,8*
 53,8*
 11,5±4,4
 25,8
 7,6±5,4*
 71,7*
 3,8±2,7*
 71,7*
 21,3±1,2
 landii  ИБ
 4+Az.  vi¬
 nelandii
 ИБЗ
 *  Различия  по  сравнению  с  контролем  существенны  при  р  =  0,95.

отражены  в  патенте  РФ  №  2224791  “Штамм  бактерий  Azotobacter
vinelandii  для  получения  биопрепарата  для  борьбы  с  болезнями
пшеницы,  вызываемыми  грибными  фитопатогенами,  и  повыше¬
ния  урожая”.
 Таким  образом,  в  модельных  экспериментах  показано,  что
исследуемые  штаммы  псевдомонад  и  азотобактера  способствуют
снижению  распространения  гельминтоспориозных,  альтернари-
озных,  а  также  фузариозных  корневых  гнилей.  Это  обусловило
дальнейшее  исследование  антагонистических  свойств  штаммов-
антагонистов  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter  в  условиях  полево¬
го  мелкоделяночного  опыта.
 В  полевом  опыте  2002  г.  (опытный  участок  в  совхозе  им.  Цю¬
рупы)  была  оценена  эффективность  использования  предпосев¬
ной  бактеризации  семян  штаммами  псевдомонад  и  азотобактера
для  защиты  пшеницы  от  корневых  гнилей  и  стимуляции  развития
пшеницы,  а  также  изучено  влияние  интродукции  бактерий-анта-
гонистов  на  аборигенную  микробиоту  ризосферы.
 Учет  поражения  растений  пшеницы  корневыми  гнилями  про¬
водили  в  фазе  кущения  и  фазе  полной  спелости.  В  фазе  кущения
развитие  корневых  гнилей  на  пшенице  колебалось  в  пределах
3,0-6,8  %.  На  ранних  стадиях  развития  растений,  к  сожалению,  не
удалось  обнаружить  достоверных  отличий  между  вариантами  с
предпосевной  обработкой  и  контрольным.
 По  результатам  опыта  в  целом  наиболее  эффективными
культурами,  с  точки  зрения  подавления  развития  корневых  гни¬
лей,  среди  бактерий  p.  Pseudomonas  показали  себя  штаммы
P.  aureofaciens  ИБ  51,  P.  putida  ИБ  17  (табл.  41):  биологическая
эффективность  данных  псевдомонад  составила  на  период  уборки
урожая  15,7  и  14,7%  соответственно  по  сравнению  с  контролем.
Было  отмечено,  что  штамм  P.  aureofaciens  ИБ  6,  который  в  мо¬
дельных  лабораторных  опытах  демонстрировал  высокую  антаго¬
нистическую  активность  против  возбудителей  корневых  гнилей
пшеницы,  оказался  неэффективным  в  условиях  полевого  экспе¬
римента.
 Эффективность  штаммов  азотобактера  против  корневых
гнилей  пшеницы  составила  12,3-16,6%.
 Предотвращение  распространения  корневых  гнилей  в  фазу
полной  спелости  было  достоверным  только  для  вариантов  с  об¬
работкой  фунгицидом  широкого  спектра  действия  Феразим
(21,3%)  и  штаммом  Az.  vinelandii  ИБ  4  (15,9%),  что  является  весь¬
ма  неплохим  результатом  для  биологического  препарата.
 Необходимо  подчеркнуть,  что  предпосевная  обработка  семян
пшеницы  культурой  штамма  P.  aureofaciens  ИБ  51  не  только  спо¬
собствовало  снижению  заболевания  растений  корневыми  гнилями,
 108

Таблица  41.  Результаты  полевых  испытаний  по  использованию  штаммов-антагонистов  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter
 для  подавления  корневых  гнилей  пшеницы  сорта  Жница
 Вариант
 Высота
растения,  см
 Длина
 главного
 колоса,
 см
 Число
колосков
в  главном
колосе,
шт.
 Число
зерен  в
главном
колосе,
шт.
 Масса
1000  зе¬
рен,  г
 Урожай,
 ц/га
 Распростра¬
нение  кор¬
невых  гнилей
(полная
спелость),  %
 Биоло¬
гическая
эффек¬
тив¬
ность,  %
 Развитие
 корневых
 гнилей
 (полная
 спелость),
 %
 Биологи¬
ческая
эффек¬
тив¬
ность,  %
 Контроль
 90,1  ±2,6*
 5,4±0,7
 9,6±0,7*
 15,3±3,1
 33,5±2,1
 33,4±2,2
 57,7±7,9

 20,4±1,2

 Фитоспорин
 85,9±1,9
 5,1±0,2
 9,2±0,1
 11,9±1,9
 36,5±5,5
 27,3±7,6
 61,9±4,1
 -
 23,1±1,8
 _
 Агат-25К
 91,2±12,5
 5,0±1,6
 10,2±2,2
 11,5±4,8
 36,3±6,3
 28,2±8,9
 53,9±8,9
 —
 22,2±4,3
 _
 Феразим
 94,2±22,1
 6,1  ±0,5
 11,2±1,9
 18,0±3,4
 43,2±6,3*
 35,3±4,9
 45,4±4,2*
 21,3*
 13,7±4,5*
 32,8*
 P.  aureofaciens
 106,4±10,6*
 6,2±0,5
 11,4±0,5*
 18,2±2,4
 41,3±4,8*
 38,6±2,7*
 58,6±3,4
 -
 17,2±1,6*
 15,7*
 ИБ  51
 P.  aureofaciens
 93,3±24,0
 5,9±0,9
 10,7±3,1
 17,4±5,9
 37,5±14,9
 28,0±4,6
 56,6±6,9
 _
 21,1±1,5
 _
 ИБ  6
 P.  putida
 99,4±13,3
 5,4±  1,0
 11,6±5,1
 15,8±3,7
 34,9±4,9
 32,4±8,7
 53,9±5,4
 _
 17,4±1,7*
 14,7*
 ИБ  17
 Pseudomonas
 107,4±3,9*
 6,0±0,2
 11,7±1,0*
 18,9±4,8
 38,6±3,3
 32,0±5,6
 55,4±7,6
 —
 20,6±5,9
 _
 sp.  ИБ  182
 Az.  vinelandii
 97,9±9,3
 5,7±1,6
 10,5±1,6
 16,5±4,1
 39,2±2,7*
 40,3±2,5*
 54,7±5,4
 5,1
 17,8±4,5*
 12,7*
 ИБ  1
 Az.  vinelandii
 98,4±6,8*
 5,1±1,3
 11,3±1,1*
 18,0±4,5
 40,4±4,0*
 41,6±2,0*
 55,9±6,5
 3,1
 17,0±1,8*
 16,6*
 ИБ  3
 *
 Az.  vinelandii
 103,9±2,2*
 5,9±0,2
 11,0±0,6*
 16,9±0,5
 41,1  ±2,2*
 44,6±7,7*
 48,5±4,7*
 15,9*
 17,9±0,1*
 12,3*
 ИБ  4
 *  Различия  по  сравнению  с  контролем  существенны  при  р  =  0,95.

Таблица  42.  Содержание  белка  в  зерне  пшеницы,  полученном  в  ходе
мелкоделяночного  полевого  опыта  (2002  г.)
 Образец
 Количество
белка  в  зерне,
 %
 Образец
 Количество
белка  в  зерне,
 %
 Контроль
 Фитоспорин
 Агат-25  К
Феразим
 P.  aureofaciens  ИБ  51
P.  aureofaciens  ИБ  6
 *  Различия  по  сравнению
 13,5±1,4
 13,4±2,8
 14,5±2,9
 13,9±2,4
 15,3±0,3*
 13,3±3,5
 с  контролем  сущес
 P.putida  ИБП
 Pseudomonas  sp.  ИБ
182
 Az.  vinelandii  ИБ  1
Az.  vinelandii  ИБ  3
Az.  vinelandii  ИБ  4
 твенны  при  р  =  0,95.
 13,9±3,2
 13,0±3,2
 13,6±0,7
 13,8±1,3
 14,3±0,5*
 но  и  положительно  повлияла  на  элементы  структуры  урожая  и
урожай  в  целом.  Так,  применение  биопрепарата  на  основе  штам¬
ма  P.  aureofaciens  ИБ  51  увеличивало  длину  растений  и  число  ко¬
лосков  в  колосе  на  18,1  и  18,8%  соответственно;  масса  1000  зерен
увеличилась  на  23,3%,  а  урожай  -  на  15,6%  (см.  табл.  41).  Кроме
того,  было  установлено,  что  в  варианте  с  обработкой  семян
штаммом  P.  aureofaciens  ИБ  51  содержание  белка  в  зерне  по  срав¬
нению  с  контролем  увеличилось  на  13,3%  (табл.  42).
 Обработка  культурами  азотобактера  также  благоприятно
повлияла  на  структуру  урожая,  в  частности  высота  растений  в
варианте  с  обработкой  штаммом  Az.  vinelandii  ИБ  4  превысила
высоту  контрольных  растений  на  16%,  отмечено  увеличение  чис¬
ла  зерен  главного  колоса  на  18%,  массы  1000  зерен  -  на  22,7%,  а
массы  урожая  -  на  33%  (см.  табл.  41).  Благоприятное  влияние  ба¬
ктеризации  на  элементы  структуры  урожая  отмечено  также  и
для  штаммов  Az.  vinelandii  ИБ  1  и  Az.  vinelandii  ИБ  3.  Так,  для  ва¬
рианта,  обработанного  культурой  Az.  vinelandii  ИБ  3,  мы  наблю¬
дали  превышение  числа  колосков  главного  колоса  над  контро¬
лем  на  17%  и  массы  1000  зерен  на  20%,  несколько  меньшее  пре¬
вышение  данных  показателей  структуры  урожая  было  отмечено
для  варианта  с  обработкой  культурой  Az.  vinelandii  ИБ  1.  Выяв¬
лено  также,  что  обработка  семян  биопрепаратом  на  основе
штамма  Az.  vinelandii  ИБ  4  повлияла  на  увеличение  содержания
белка  в  зерне  на  6,0%  (см.  табл.  42)  [Логинов  и  др.,  2004].
 Положительные  результаты,  полученные  при  использовании
в  лабораторных  и  полевых  опытах  штаммов  P.  aureofaciens
ИБ  51  и  Az.  vinelandii  ИБ  4  для  защиты  пшеницы  от  болезней,  по¬
служили  основанием  для  патентования  указанных  штаммов  мик¬
роорганизмов  [Пат.  РФ  №  2203945;  Пат.  РФ  №  2245918].
 110

То,  что  при  использовании  биопрепаратов  фитоспорин  и
агат-25К  не  удалось  получить  статистически  достоверных  дан¬
ных  о  снижении  развития  корневых  гнилей  пшеницы,  а  также  не
выявлено  отличий  по  сравнению  с  контролем  по  элементам  струк¬
туры  урожая,  к  сожалению,  подтверждает  мнение  о  нестабильно¬
сти  защитного  действия  биопрепаратов.  Применение  химического
препарата  феразим,  напротив,  имело  достоверно  подтвержден¬
ный  положительный  эффект,  который  выразился  в  снижении
развития  корневых  гнилей  пшеницы  в  1,5  раза  и  увеличении  мас¬
сы  1000  зерен  на  28,9%  по  сравнению  с  контролем.
 Следующим  этапом  исследований  стало  изучение  эффектив¬
ности  применения  биопрепаратов  на  основе  штаммов  бактерий
p.  Pseudomonas  для  подавления  твердой  головни  пшеницы.
 Оценка  эффективности
применения  штаммов  бактерий  p.  Pseudomonas
против  твердой  головни  в  условиях  защищенного
и  открытого  грунтов
 Головневые  инфекции  относят  к  числу  наиболее  вредонос¬
ных  заболеваний  зерновых  культур,  передающихся  с  семенами.
Ежегодно  потери  урожая  зерновых  культур  от  головневых  забо¬
леваний  составляют  в  среднем  8-15%.  При  отсутствии  высокоус¬
тойчивых  к  головне  сортов  озимой  и  яровой  пшеницы  неизбеж¬
но  использование  протравителей  семян.  Известно  множество
химических  протравителей,  обладающих  высокой  эффективно¬
стью  против  твердой  головни  пшеницы  (“Список  пестицидов...”),
и  очень  мало  сведений  об  использовании  биопрепаратов  для  за¬
щиты  от  головневых  заболеваний  [Долгова  и  др.,  1997;  Elsherif,
Grossmann,  1991].
 Для  инокуляции  зерен  яровой  пшеницы  использовали  двухсу¬
точную  КЖ  штаммов  псевдомонад,  полученную  на  среде  LB
(титр  109  КОЕ/мл)  из  расчета  I  -  104  КОЕ/зерно,  П  -  106  КОЕ/зер-
но.  В  качестве  эталонов  протравителей  семян  в  опыте  были  вы¬
браны  биопрепараты  фитоспорин  (0,5  кг/т)  и  планриз  (0,5  л/т),  и
фунгицид  дивиденд  (2  л/т).
 Для  создания  инфекционного  фона  использовали  местный
изолят  твердой  головни  Tilletia  caries,  предоставленный  Р.Ф.  Иса¬
евым.  Семена  пшеницы  первоначально  инокулировали  телиос-
порами  Tilletia  caries  из  расчета  1-2  г  спор  на  1  кг  зерна,  а  затем
уже  обрабатывали  протравителями.  В  качестве  контрольных  ва¬
риантов  были  семена  без  обработок  -  контроль  и  семена,  иноку-
лированные  только  патогеном,  -  контроль  Т.  caries.
 ill

Таблица  43.  Результаты  испытаний  эффективности  использования  штаммов-антагонистов  p.  Pseudomonas
 для  подавления  твердой  головни  пшеницы  в  закрытом  грунте
 Структура  урожая
 Распрост¬
ранение
головни,%
 Биологичес¬
кая  эффек¬
тивность,  %
 Вариант
 Высота  рас¬
тения,  см
 Длина  глав¬
ного  коло¬
са,  см
 Число  колос¬
ков  в  главном
колосе,  шт.
 Число  зерен
в  главном
колосе,  шт.
 Масса  1000
зерен,г
 Урожай,  г
 Контроль
 53,5±1,7
 2,5±0,2
 3,7±0,3
 4,0±0,9
 23,6±1,6
 2,4±0,2
 -
 -
 Контроль  Т.  caries
 48,2±2,0*
 3,8±0,2*
 5,2±0,3*
 3,4±1,3
 23,8±2,0
 1,8±0,3*
 59,0±6,0*
 -
 Планриз
 42,1  ±2,5*
 3,3±0,2*
 5,0±0,3*
 2,8±1,5
 25,7±15,9
 1,4±0,7*
 32,0±13,5*
 45,8**
 Фитоспорин
 50,6±1,9*
 3,1±0,Г
 4,5±0,3*
 1,8±1,2*
 25,0±2,9
 2,5±0,3**
 17,5±4,3**
 70,3**
 Дивиденд
 43,3±2,1*
 2,6±0,2**
 3,9±0,3**
 1,8±0,5*
 25,7±5,8
 1,7±  1,3
 0,0±0,0**
 100,0**
 P.  aureofaciens  ИБ  51
(104  КОЕ/семя)
 51,6±1,3
 3,3±0,1*
 5,1±0,2*
 4,7±0,5
 24,9±4,9
 1,9±0,6
 50,3±3,8**
 14,7**
 P.  aureofaciens  ИБ  51
(106  КОЕ/семя)
 49,8±1,4*
 3,5±0,2*
 5,2±0,3*
 3,5±0,9
 29,0±3,7*
 3,1  ±0,9**
 25,7±4,9**
 56,4**
 P.  aureofaciens  ИБ  6
(104  КОЕ/семя)
 51,1±2,1
 3,3±0,2*
 5,1±0,3*
 3,9±0,7
 25,7±9,9
 2,1  ±0,6
 41,0±4,3**
 30,5**

Таблица  43  (окончание)
 Структура  урожая
 Распрост¬
ранение
головни,  %
 Биологичес¬
кая  эффек¬
тивность,  %
 Вариант
 Высота  рас¬
тения,  см
 Длина  глав¬
ного  коло¬
са,  см
 Число  колос¬
ков  в  главном
колосе,  шт.
 Число  зерен
в  главном
колосе,  шт.
 Масса  1000
зерен,  г
 Урожай,  г
 P.  aureofaciens  ИБ  6
(106  КОЕ/семя)
 42,3±2,3**
 2,8±0,2**
 4,4±0,3**
 2,2±0,6*
 25,6±8,9
 1,6±2,3
 10,7±12,5**
 81,9**
 P.  putida  ИБ  56
(104  КОЕ/семя)
 51,2±1,8
 з,1±о,г*
 4,8±0,3*
 4,0±0,8
 25,2±4,7
 1,8±0,8
 50,0±13,1  *
 -
 P.  putida  ИБ  56
(106  КОЕ/семя)
 40,7±1,8**
 з,1±ол**
 4,7±0,3*
 2,9±0,6
 24,8±2,4
 1,6±1,4
 43,7±12,3*
 25,9*
 P.  putida  ИБ  17
(104  КОЕ/семя)
 47,4±1,9*
 2,8±0,2**
 4,4±0,3**
 ЗЛ±0,5
 25,8±5,0
 2Л±1,3
 37,0±21,2*
 —
 P.  putida  ИБ  17
(106  КОЕ/семя)
 52,7±1,9
 3,1±0,2**
 4,8±0,3*
 4,2±0,6
 22,9±5,0
 2,4±1,2
 32,3±15,6**
 45,3**
 Pseudomonas  sp.  ИБ  182
(104  КОЕ/семя)
 47,3±1,7*
 2,8±0,1**
 4,5±0,3**
 3,3±0,8
 22,3±0,7
 1,4±0,1*
 55,3±17,6*
 -
 Pseudomonas  sp.  ИБ  182
(106  КОЕ/семя)
 37,3±2,7**
 2,6±0,2**
 4,5±0,3**
 1,5±0,6*
 27,4±14,9
 1,2±2,5
 19,3±6,3**
 67,3**
 *  Различия  по  сравнению  с  контролем  существенны  при  р  =  0,95;  "различия  по  сравнению  с  контролем  Т.  caries  существенны  при  р  =  0,95.

При  проведении  испытаний  в  закрытом  грунте  обработанные
семена  высаживали  в  сосуды  высотой  20  см  и  диаметром  21  см  с
трубкой  для  полива,  заполненные  почвой.  Почва  -  чернозем  вы¬
щелоченный  тяжелосуглинистый.  Повторность  опыта  трехкрат¬
ная.  Влажность  почвы  на  протяжении  опыта  поддерживалась  на
уровне  оптимальной,  соответствующей  60%  от  полной  влагоем-
кости.  На  сосуд  высаживали  по  60  семян,  глубина  заделки
1,5-2  см.  Средняя  температура  в  теплице  29-32°  с  искусственным
освещением.  Продолжительность  опыта  до  наступления  стадии
полной  спелости  -  85  сут.
 Полевые  испытания  для  оценки  эффективности  применения
штаммов  бактерий  p.  Pseudomonas  против  твердой  головни  пше¬
ницы  проводили  в  2001  г.  на  опытном  поле  Учебного  хозяйства
БГАУ  (пос.  Миловка).  Почва  -  выщелоченный  чернозем.  Семе¬
на  каждого  варианта,  подготовленные  к  посеву  способом,  опи¬
санным  выше,  высевали  в  2  рядка  длиной  1  м,  расположенные  на
расстоянии  15  см  друг  от  друга.  Норма  высева  пшеницы  -
20-30  г/м2.
 Эффективность  предпосевной  обработки  семян  оценивали,
учитывая  процент  пораженных  твердой  головней  колосьев  в  пе¬
риод  восковой  спелости  зерна.  Кроме  того,  учитывали  влияние,
которое  протравливание  семян  оказало  на  показатели  структуры
урожая  в  соответствии  с  методическими  указаниями  [Методиче¬
ские  указания...,  1985].
 В  вегетационных  и  полевых  опытах  нами  получены  результа¬
ты,  которые  свидетельствуют  о  том,  что  использование  биопре¬
паратов  на  основе  псевдомонад  способствует  снижению  распро¬
странения  твердой  головни  на  пшенице  [Логинов  и  др.,  2002;
Кузьмина  и  др.,  2003].  В  табл.  43  представлены  данные  вегетаци¬
онного  опыта  по  влиянию  предпосевной  обработки  семян  пшени¬
цы  препаратами  на  основе  штаммов-антагонистов  на  развитие
твердой  головни.  При  сравнении  данных  по  структуре  урожая  в
искусственно  инфицированном  контроле  и  в  контроле  без  иноку-
лирования  патогеном  было  выявлено,  что  у  пораженных  голов¬
ней  растений  патоген  вызывал  удлинение  главного  колоса  на
52,0%  и  увеличение  числа  колосков  в  главном  колосе  на  40,5%.
При  патологическом  процессе  отмечалось  уменьшение  длины
стебля  на  9,9%.
 Предпосевная  обработка  семян  биопрепаратами  и  фунгици¬
дом  вызывала  значительное  снижение  поражения  растений  твер¬
дой  головней.  Фунгицид  дивиденд  полностью  предотвращал  зара¬
жение  пшеницы  головней,  но  оказывал  значительное  фитоток¬
сическое  воздействие  на  растение,  которое  выразилось  в  умень¬
шении  длины  растений,  скручивании  колосьев  и  пустоколосице;
 114

число  зерен  в  главном  колосе  снижалось  на  55,0%.  Среди  биопре¬
паратов  наибольшей  эффективностью  по  воздействию  на  твердую
головню  отличался  биопрепарат  на  основе  штамма  P.  aureofa¬
ciens  ИБ  6  (106  КОЕ/семя).  Остальные  биопрепараты  -  препара¬
ты  на  основе  псевдомонад  (планриз,  фитоспорин)  -  также  успеш¬
но  подавляли  головню  с  биологической  эффективностью
14,7  -  70,3%.
 Отмечено,  что  при  использовании  биопрепаратов  на  основе
псевдомонад  из  расчета  104  КОЕ/семя  для  штаммов  P.  aureofa¬
ciens  ИБ  51  и  P.  aureofaciens  ИБ  6  биологическая  эффективность
защиты  была  значительно  ниже,  чем  в  варианте  10*  КОЕ/семя  (в
3,8  и  2,7  раза  соответственно).  А  штаммы  P.  putida  ИБ  56,  P.  puti¬
da  ИБ  17,  Pseudomonas  sp.  ИБ  182  при  расходе  биопрепаратов  из
расчета  104  КОЕ/семя  оказались  вообще  неэффективными  про¬
тив  твердой  головни.  Но  в  то  же  время  отмечено,  что  если  штам¬
мы  P.  aureofaciens  ИБ  6  и  Pseudomonas  sp.  ИБ  182  использовать,
исходя  из  106  КОЕ/семя,  то  наряду  с  высоким  защитным  эффек¬
том  (биологическая  эффективность  -  81,9%  и  67,3%  соответст¬
венно),  данные  культуры  оказывают  токсическое  действие  на
растения  пшеницы.  Внешне  это  проявляется  аналогично  фитото¬
ксическому  действию  дивиденда,  описанному  выше,  и  подтвер¬
ждается  данными  табл.  43,  показывающими,  что  в  этих  вариан¬
тах  наблюдается  снижение  числа  зерен  в  колосе.
 Анализ  данных  по  урожаю  зерна  показал,  что  варианты  пше¬
ницы  с  протравливанием  посевного  материала  не  имеют  сущест¬
венных  различий  по  сравнению  с  контролем  Г.  caries.  Исключе¬
ниями  стали  штамм  P.  aureofaciens  ИБ  51  (106  КОЕ/семя)  и
фитоспорин;  использование  данных  биопрепаратов  позволило
увеличить  собранный  урожай  на  72,2  и  38,9%  соответственно.
 Проведенный  анализ  структуры  урожая  пшеницы,  получен¬
ной  с  применением  биопрепаратов,  свидетельствует,  что  некото¬
рые  показатели  (длина  растения,  длина  главного  колоса,  число
колосков  в  главном  колосе)  были  достоверно  ниже,  чем  в  конт¬
рольном  варианте  с  головней.  Одновременно  у  растений,  обрабо¬
танных  биопрепаратами,  было  отмечено  по  сравнению  с  чистым
контролем  увеличение  длины  (на  24,0-  40,0%)  и  числа  колосков
(на  18,9-40,5%)  главного  колоса,  а  высота  растений  снизилась  на
5,4—30,3%.  На  наш  взгляд,  данные  по  структуре  урожая  не  явля¬
ются  показательными,  так  как  у  пораженной  головней  пшеницы
патоген  вызывает  значительные  нарушения  в  физиологии
развития.
 В  табл.  44  представлены  результаты  полевых  испытаний  по
влиянию  биопрепаратов  на  основе  псевдомонад  на  распростране¬
ние  твердой  головни  пшеницы.  Как  показывают  результаты
 115

Таблица  44.  Результаты  полевых  испытаний  по  использованию  штаммов-антагонистов  p.  Pseudomonas
 для  подавления  твердой  головни  пшеницы
 Вариант
 Структура  урожая
 Расп¬
ростра¬
нение
голов¬
ни,  %
 Биоло¬
гичес¬
кая  эф¬
фектив¬
ность,
 %
 Высота  рас¬
тения,  см
 Длина  глав¬
ного  колоса,
см
 Число  ко¬
лосков  в
главном
колосе,  шт.
 Число  зерен
в  главном
колосе,  шт.
 Масса
1000
зерен,  г
 Урожай,
 ц/га
 Прибав¬
ка  уро¬
жая,  %
 Контроль  Т.  caries
 61,7±2,8
 6,0±0,3
 10,0±0,6
 16,0±2,5
 27,8
 14,5
 -
 50,9
 -
 Фитоспорин
 67,8±2,9*
 6,6±0,3
 11,8±0,7*
 17,5±2,5
 27,5
 19,3
 32,8
 40,0
 21,4
 Дивиденд
 71,5±3,8*
 6,4±0,4
 11,6±0,8*
 20,3±2,4
 30,6
 41,3
 185,2
 0,00
 100,0
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 62,9±2,9
 5,9±0,3
 10,5±0,6
 17,8±2,3
 26,3
 19,9
 37,4
 36,0
 29,3
 (106  КОЕ/семя)
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 74,6±2,5*
 7,1±0,3*
 12,5±0,6*
 23,0±2,7*
 28,7
 26,9
 85,3
 38,5
 24,4
 (106  КОЕ/семя)
 P.  putida  ИБ  56
 54,7±3,2*
 5,2±0,3*
 9,4±0,7
 12,3±2,6
 24,6
 11,9
 -
 40,6
 20,2
 (106  КОЕ/семя)
 P.  putida  ИБ  17
 71,1±3,3*
 6,5±0,3
 11,6±0,7*
 19,1±2,5
 27,4
 24,1
 66,0
 30,2
 40,7
 (106  КОЕ/семя)
 Pseudomonas  sp.  ИБ  182
 70,2±3,3*
 6,3±0,3
 10,9±0,6
 16,1±2,5
 29,5
 19,7
 35,4
 38,3
 24,7
 (106  КОЕ/семя)
 ‘Различия  по  сравнению  с  контролем  Т.  caries
 существенны  при  р  =  0,95.

полевого  эксперимента,  по  сравнению  с  испытаниями  в  закры¬
том  грунте  эффективность  биологических  средств  защиты  сни¬
зилась  в  некоторых  случаях  в  3,4  раза,  тогда  как  дивиденд
по-прежнему  продемонстрировал  100%-ную  эффективность  в
подавлении  твердой  головни  пшеницы.  По  результатам  полевых
испытаний,  максимум  биологической  эффективности  в  борьбе  с
болезнью  отмечен  для  биопрепарата  на  основе  штамма  P.  putida
ИБ  17  (40,7%).  На  данный  штамм  был  получен  патент  РФ
№  2213774  “Штамм  бактерий  Pseudomonas  putida  для  получения
препарата  против  заболеваний  пшеницы,  вызываемых  грибными
фитопатогенами”.
 Таким  образом,  показано,  что  бактерии-антагонисты  ро¬
дов  Pseudomonas  и  Azotobacter  могут  быть  использованы  для
защиты  яровой  пшеницы  от  корневых  гнилей,  альтернариоза,
а  штаммы  псевдомонад  -  также  для  защиты  пшеницы  от  твер¬
дой  головни.  Отмечено,  что  предпосевная  обработка  семян
пшеницы  биопрепаратами  на  основе  штамма  Р.  aureofaciens
ИБ  51  и  штаммов  азотобактера  способствует  увеличению
урожайности  данной  сельскохозяйственной  культуры.  Пос¬
кольку  штаммы  P.  aureofaciens  ИБ  51  и  Az.  vinelandii  ИБ  4  в
различных  испытаниях  на  сельскохозяйственных  и  овощных
культурах  показали  более  высокие  результаты  по  сравнению  с
другими  штаммами  антагонистов,  на  их  основе  были  созданы
микробиологические  препараты  -  соответственно  Елена  и
азолен.
 Для  предприятия-производителя  на  биопрепарат  Елена  и  ми¬
кробиологическое  удобрение  азолен  были  подготовлены  лабора¬
торный  регламент  и  техническое  задание.  На  основе  этих  доку¬
ментов  ГУП  “Опытный  завод  АН  РБ”  разработал,  согласовал  с
контролирующими  организациями  и  утвердил  технические  усло¬
вия  на  биопрепарат  Елена  (ТУ  №  9291-017-22657427-2002)  и  на
микробиологическое  удобрение  азолен  (ТУ  №  9291-018-
22657427-2003).
 На  посевных  площадях  производственных  объединений  Ме-
леузовского  района  Республики  Башкортостан  в  2002-2003  гг.
были  проведены  производственные  испытания  биопрепаратов
Елена  и  азолен.
 Биопрепарат  Елена  был  испытан  на  яровой  пшенице  двух
сортов:  Симбирка  (СПК-колхоз  им.  Салавата)  и  сорт  Казахстан¬
ская-10  (АО  “Нугуш”  Мелеузовского  района  Республики  Баш¬
кортостан).  С  целью  защиты  пшеницы  от  корневых  гнилей  была
проведена  предпосевная  обработка  семян  биопрепаратом  из  рас¬
чета  -  1  л/т.  Биологическая  эффективность  защиты  от  корневых
гнилей  в  фазу  восковой  спелости  зерна  на  разных  сортах  состави¬
 117

ла  27,1  и  37,5%.  Применение  биопрепарата  Елена  способствова¬
ло  увеличению  урожайности  пшеницы  -  прибавка  урожая  на
обоих  сортах  составила  1,2  ц/га.
 В  2003  г.  в  СПК-колхозе  им.  Салавата  прошли  испытания
биопрепаратов  Елена  и  азолен  на  посевах  озимой  пшеницы  Бе-
зенчукская  380.  Использование  биопрепарата  Елена  привело  к
снижению  развития  корневых  гнилей  на  29,1%,  а  также  способст¬
вовало  повышению  урожайности  озимой  пшеницы  на  4,2%.  Эф¬
фективность  применения  азолена  выразилась  в  снижении  разви¬
тия  корневых  гнилей  в  фазу  цветения  на  5,3%,  а  урожайность  по¬
высилась  на  5,2%  по  сравнению  с  урожаем,  полученным  с  конт¬
рольных  участков.
 Использование  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера
в  качестве  агентов  биологического  контроля
заболеваний  овощных  культур
 Обзор  литературных  источников  свидетельствует,  что  бак¬
терии  p.  Pseudomonas  способны  защищать  от  болезней  самые
различные  овощные  культуры  [Gordon-Lennox  et  al.,  1987;
Osbum  et  al.,  1989;  Pietr,  Kempa,  1989;  Sikora  et  al.,  1990;  Sugimoto
et  al.,  1990;  Elsherif,  Grossmann,  1991].  Отмечено,  что  штаммы-
антагонисты  p.  Pseudomonas  не  только  подавляют  развитие  фи¬
топатогенов,  но  и  оказывают  стимулирующее  воздействие  на
рост  и  развитие  растений  [Минеев  и  др.,  1992;  Шабаев  и  др.,
1998;  Becker  et  al.,  1990,  Forlani  et  al.,  1995].  Данные  литературы
свидетельствуют,  что  инокуляция  овощных  культур  бактерия¬
ми  p.  Azotobacter  повышает  устойчивость  растений  к  болезням
(Антипчук  и  др.,  1985;  Антипчук  и  др.,  1997;  Плетнева  и  др.,
1998]  стимулирует  урожайность  [Aguilar,  Sanchez,  1998]  и  часто
положительно  влияет  на  качество  овощей  за  счет  увеличения  в
них  витаминов,  белка  и  незаменимых  аминокислот  [Плетнева  и
др.,  1998;  Govedrica  et  al.,  1999;  Mrkovacki  et  al.,  2001].  Нами  был
проведен  ряд  экспериментов  по  изучению  эффективности  ис¬
пользования  выделенных  штаммов  псевдомонад  и  азотобакте¬
ра  для  защиты  от  болезней  картофеля,  огурцов,  капусты  и
фасоли.
 В  экспериментах  использовали  двухсуточную  КЖ  штаммов
псевдомонад,  наработанную  на  среде  Кинг  В,  и  трехсуточную
КЖ  штаммов  азотобактера,  полученную  при  культивировании
на  среде  40,  с  титром  жизнеспособных  клеток  109  КОЕ/мл.
 Для  оценки  эффективности  использования  штаммов  родов
Pseudomonas  и  Azotobacter  в  борьбе  с  возбудителем  ризоктониоза
 118

картофеля  в  условиях  теплицы  был  поставлен  следующий  экспе¬
римент.  Для  опыта  были  отобраны  клубни,  на  поверхности  кото¬
рых  было  отмечены  псевдосклероции  ризоктонии.  Бактериза¬
цию  посадочного  материала  провели  из  расчета  300  мл  КЖ  на
100  кг  картофеля.  Картофель  высаживали  в  деревянные  ящики  с
почвой  размером  40x60  см.  Почва  -  чернозем  выщелоченный  тя¬
желосуглинистый.  Температуру  воздуха  в  теплице  поддерживали
на  уровне  15-20  °С,  что  соответствовало  оптимуму  для
развития  инфекции  [Пересыпкин,  1989].  Влажность  почвы  на
протяжении  опыта  поддерживали  на  уровне  оптимальной,  соот¬
ветствующей  60%  от  полной  влагоемкости.  Продолжительность
опыта  -  55  сут.  Повторность  опыта  трехкратная,  каждую  повтор¬
ность  -  10  растений.  Результаты  эксперимента  оценивали,  срав¬
нивая  распространение  ризоктониоза  на  проростках,  а  также
длину  и  массу  надземной  части  растений  картофеля  в  опытных  и
контрольном  вариантах.
 В  2002  г.  на  опытном  поле  Учебного  хозяйства  БГАУ  (совхоз
Дмитриевский)  был  проведен  полевой  эксперимент  с  целью  вы¬
явления  у  исследуемых  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера
способности  к  подавлению  развития  фитофтороза  на  картофеле.
Почва  -  чернозем  выщелоченный.  Ширина  опытной  делянки  -
три  рядка  картофеля.  Расстояние  между  рядами  -  70  см,  между
кустами  -  30  см  (механическая  посадка).  В  каждой  повторности
по  30  растений,  повторность  опыта  трехкратная.  В  фазе  заверше¬
ния  бутонизации  проведено  однократное  опрыскивание  растений
КЖ  штаммов-антагонистов.  Обработку  проводили  из  расчета  3  л
КЖ/га.  Степень  поражения  фитофторозом  оценивали  в  период,
предшествующий  уборке  урожая,  по  восьмибалльной  шкале
[Методические  указания...,  1985].  Уборку  картофеля  проводили
вручную.
 В  качестве  эталонов  в  проведенных  экспериментах  использо¬
вали  биопрепараты  фитоспорин,  агат-25К  и  химический  фунги¬
цид  ТМТД.  Предпосадочную  обработку  клубней  эталонами,
а  также  опрыскивание  растений  по  вегетации  осуществляли
в  соответствии  с  нормами,  рекомендуемыми  “Списком
пестицидов...”.
 В  модельном  вегетационном  опыте  на  фасоли  инокуляцию
семян  КЖ  штаммов-антагонистов  проводили  из  расчета
107  КОЕ/семя.  Контрольный  вариант  замачивали  в  стерильной
воде.  Замачивали  семена  в  течение  5  ч  в  чашках  Петри,  далее
инокулированные  таким  образом  семена  помещали  в  пластико¬
вые  сосуды  высотой  10  см  и  диаметром  10  см,  наполненные  серой
лесной  почвой.  В  сосуд  высаживали  по  3  семени,  глубина  заделки
3-4  см.  В  каждом  варианте  -  по  12  семян  фасоли.  Влажность  поч¬
 119

вы  на  протяжении  опыта  поддерживали  на  уровне  оптимальной,
соответствующей  60%  от  полной  влагоемкости.  Температура
комнатная  с  естественным  освещением.  Продолжительность
опыта  -  14  сут.
 Оценку  эффективности  предпосевной  бактеризации  семян
фасоли  проводили,  сравнивая  длину  растений,  сырую  массу  над¬
земной  части  и  корней,  а  также  количество  образовавшихся  на
корнях  клубеньков  размером  более  2  мм  в  контрольном  и  опыт¬
ных  вариантах.  Интенсивность  поражения  растений  фасоли  кор¬
невыми  гнилями  оценивали  в  соответствии  со  шкалой,  предло¬
женной  для  зернобобовых  в  методических  указаниях  [Методиче¬
ские  указания...,  1985].
 Для  изучения  влияния  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера
на  культуру  огурца  был  заложен  вегетационный  опыт.  Учет
всхожести  семян  огурца,  а  также  определение  бактериальной  и
грибной  обсемененности  проводили  путем  высева  семян  на  КГА
и  проращивания  их  в  течение  5  сут  в  термостате.  Всхожесть
семян  огурца  составила  86,7%.  Бактериальная  и  грибная  обсеме-
ненность  оказались  равными  соответственно  100  и  6,7%.  С  уче¬
том  того,  что  опыт  проводили  на  стерильном  субстрате,  а  естест¬
венное  присутствие  на  семенах  микромицетов  оказалось  незна¬
чительным,  дополнительно  инфицировали  посевной  материал  из
расчета  2  •  105  спор  Fusarium  oxysporum  на  семя  по  методике,  опи¬
санной  ранее.
 В  каждый  вариант  брали  по  20  семян  огурца.
 Учет  зараженности  бактериозом  определяли  по  семядолям
огурцов  в  соответствии  с  методическими  указаниями  [Методиче¬
ские  указания...,  1985].
 Интенсивность  поражения  растений  бактериозом  оценивали
в  баллах:
 0 	-  здоровые  растения,
 1 	-  слабое  поражение  (поражено  не  более  25%  площади  семя¬
долей),
 2 	-  среднее  поражение  (поражено  до  50%),
 3 	-  сильное  поражение  (поражено  до  75%),
 4 	-  очень  сильное  поражение  (поражено  свыше  75%  площади
семядолей),  сюда  относят  и  погибшие  растения.
 Развитие  бактериоза  (Р,  %)  вычисляли  по  формуле:
 Е(аб)100
А-К  ’
 где  а  -  число  растений  с  одинаковыми  признаками  поражения;
б  -соответствующий  этому  признаку  балл  поражения;  А  -  число
растений  в  учете;  К  -  наихудший  балл  учетной  шкалы.
 120

С  целью  изучения  защиты  картофеля  сорта  Невский  от  ризо-
ктониоза  штаммами-антагонистами  родов  Pseudomonas  и
Azotobacter  был  поставлен  модельный  опыт  в  теплице.
 Ризоктониоз  (черная  парша)  -  широко  распространенное  за¬
болевание,  возбудитель  -  Rhizoctonia  solani.  Серьезную  опас¬
ность  ризоктониоз  представляет  для  семенного  картофеля,  по¬
скольку  наиболее  значимый  вред  фитопатоген  причиняет  в  пе¬
риод  развития  всходов.  Массовое  заражение  нового  урожая
происходит  за  счет  склероций  гриба,  находящихся  в  почве,  а
также  за  счет  базидиоспор,  попадающих  в  почву  со  стеблей
больных  растений.
 Результаты  вегетационных  экспериментов  [Логинов,  Пугаче¬
ва  и  др.,  2003,  Свешникова  и  др.,  2003]  показали,  что  бактериза¬
ция  картофеля  в  ряде  случаев  позволила  значительно  снизить  по¬
ражение  проростков  ризоктониозом  (табл.  45).  При  обработке
штаммами  псевдомонад  P.  aureofaciens  ИБ  51,  P.  aureofaciens
ИБ  6  развитие  болезни  оказалось  соответственно  в  2,8;  3,9  раза
меньше,  чем  в  контроле  (без  проведения  бактеризации).  Высо¬
кая  биологическая  эффективность  защиты  проростков  картофе¬
ля  от  ризоктониоза  (66,9%)  была  получена  при  бактеризации
штаммом  Az.  vinelandii  ИБ  1.  Для  штамма  Az.  vinelandii  ИБ  4  мы
отметили  достоверную  стимуляцию  роста  (увеличение  длины
проростков  по  сравнению  с  контрольным  вариантом  в  1,72  раза),
эффективность  биологической  защиты  для  варианта  с  обработ¬
кой  Az.  vinelandii  ИБ  4  составила  51,7%.  В  литературе  также
встречаются  сообщения  о  способности  бактерий  p.  Azotobacter
препятствовать  распространению  парши  картофеля  [Доросин-
ский,  1965].
 В  полевом  мелкоделяночном  опыте  по  изучению  влияния
изучаемых  штаммо-антагонистов  на  степень  развития  и  распро¬
странения  фитофтороза  картофеля  сорта  Невский  было  устано¬
влено,  что  использование  данных  штаммов  в  качестве  агентов
биологической  защиты  в  условиях  сильного  развития  фитофто¬
роза  малоэффективно.
 Только  в  варианте  со  штаммом  P.  aureofaciens  ИБ  51  удалось
снизить  развитие  фитофтороза  в  1,3  раза.  Следует  отметить,  что
2002  г.  (год  проведения  исследований),  дождливый  и  недостаточ¬
но  теплый,  по  метеорологическим  условиям  периода  вегетации
картофеля  оказался  благоприятным  для  развития  фитофтороза
[Макарова,  1977].  Возможно,  поэтому  в  условиях,  когда  развитие
фитофтороза  в  контроле  составило  53,8%,  даже  рекомендован¬
ные  для  борьбы  с  этим  заболеванием  биологические  средства
защиты  растений  (фитоспорин,  агат-25К)  оказались  неэффек¬
тивными.
 121

Таблица  45.  Эффективность  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера  против  ризоктониоза  и  фитофтороза
 на  картофеле  сорта  Невский
 Вариант
 Ризоктониоз
 Фитофгороз
 Распространение
ризоктониоза,  %
 Биологическая
эффективность,  %
 Высота  расте¬
ния,  см
 Масса  надземной
части,  г
 Развитие  фито¬
фтороза,  %
 Урожай,  ц/га
 Контроль
 61,6±22,9
 -
 10,1  ±4,7
 20,9±20,2
 53,8±6,7
 153,4±58,2
 Фитоспорин
 41,8±34,9
 -
 8,3±6,0
 17,6±5,7
 44,6±10,5
 121,7±74,1
 Агат-25  К
 нд
 нд
 НД
 нд
 43,5±24,9
 121,7±18,5
 ТМТД
 9,5±1,1*
 84,6*
 8,7±5,8
 18,1±15,8
 нд
 нд
 P.  aureofaciens
 22,0±  16,2*
 64,3*
 11,1±6,6
 16,2±12,9
 41,9±4,9*
 156,1  ±134,9
 ИБ  51
 P.  aureofaciens  ИБ  6
 15,8±3,9*
 74,4*
 11,5±10,7
 21,6±20,3
 48,6±8,9
 113,8±86,4
 P.  putida  ИБ  17
 27,9±20,7
 -
 13,1  ±8,3
 24,1±  16,0
 44,5±15,2
 119,0±13,2
 Pseudomonas  sp.
 нд
 -
 нд
 нд
 49,8±15,8
 113,8±18,5
 ИБ  182
 Az.  vinelandii  ИБ  1
 20,4±9,8*
 66,9*
 9,4±5,6
 15,2±9,1
 51,5±7,4
 141,5±25,3
 Az.  vinelandii  ИБ  3
 33,3±12,2
 48,9
 12,7±8,3
 24,2±13,0
 52,6±10,3
 124,1  ±30,6
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 29,8±8,7*
 51,7*
 17,4±2,5*
 25,2±12,3
 48,9±11,8
 154,2±45,6
 ‘Различия  по  сравнению  с  контролем  существенны  при  р  =  0,95;  нд  -  нет  данных.

Вегетационные  опыты  на  огурцах  и  капусте  продемонстри¬
ровали  эффективность  использования  исследуемых  штаммов
псевдомонад  и  азотобактера  для  защиты  данных  овощных  куль¬
тур  от  бактериоза  (табл.  46,  47).
 В  опытах  на  огурцах  при  сравнении  развития  бактериоза  в
вариантах  дополнительно  инфицированного  контроля  и  конт¬
роля  с  естественным  уровнем  заражения  отмечено,  что  повы¬
шенная  инфекционная  нагрузка  в  виде  грибного  фитопатогена
Fusarium  oxysporum  сама  по  себе  уже  способствовала  снижению
интенсивности  поражения  семядолей  огурца  бактериозом  в
 1,6 	раза  (см.  табл.  46).  Данный  факт  может  быть  объяснен  анта¬
гонизмом,  который  мог  возникнуть  между  присутствующей  на
зернах  бактериальной  микробиотой  и  интродуцированным
грибным  патогеном,  что  усложняет  интерпретацию  получен¬
ных  результатов.
 Максимальный  уровень  защиты  от  развития  и  распростра¬
нения  бактериоза  отмечен  при  инокуляции  семян  штаммами
P.  aureofaciens  ИБ  51  и  Az.  vinelandii  ИБ  4  и  составил  32,5  и
33,9%  соответственно.  Для  этих  же  штаммов  отмечено  досто¬
верное  увеличение  длины  растений  по  сравнению  с  контролем
(см.  табл.  46).
 В  эксперименте  на  капусте  сорта  Золотая  Ранняя  (табл.  47)
все  изучаемые  штаммы  замедляли  развитие  бактериоза  проро¬
стков.  Наибольшую  эффективность  защиты  наблюдали  при
инокуляции  штаммом  Az.  vinelandii  ИБ  1  -  90,4%,  для  этого  же
штамма  отмечена  стимуляция  роста,  которая  выразилась  в
улучшении  показателей  структуры  растений  капусты.  Для  ос¬
тальных  штаммов  уровень  защиты  также  был  на  довольно  вы¬
соком  уровне.
 По  результатам  вегетационных  опытов  был  сделан  вывод  о
необходимости  изучения  эффективности  использования  биопре¬
паратов  Елена  и  азолен  на  овощных  культурах  в  условиях  произ¬
водственных  испытаний.
 В  2003  г.  в  тепличном  хозяйстве  ГУ  СП  “Рощинский”  Респуб¬
лики  Башкортостан  были  обработаны  растения  томата  сорта  Га-
маюн.  Вегетирующие  растения  опрыскивали  1%-ным  водным
раствором  биопрепарата  Елена  и  3%-ным  водным  раствором
азолена.  За  период  вегетации  проведено  3  обработки.  В  резуль¬
тате  у  растений  томатов  на  опытных  участках  отмечены  стиму¬
ляция  роста  растений,  более  раннее  созревание  плодов  и  некото¬
рое  подавление  развития  на  листьях  сажистого  гриба.  Отмечено,
что  в  результате  обработок  биопрепаратом  Елена  урожайность
томатов  возросла  в  2  раза  по  сравнению  с  контролем,  при  обра¬
ботке  азоленом  -  на  16%.
 123

Таблица  46.  Эффективность  использования  штаммов  родов  Pseudomonas
 и  Azotobacter  на  огурцах  сорта  Пионер
 Вариант
 Длина  рас¬
тения,  см
 Процент
 заражен¬
 ности
 бакте¬
 Биологичес¬
кая  эффек¬
тивность^
 Разви¬
 тие
 бакте¬
 Биологичес¬
кая  эффек¬
тивность^
 риозом,
 %
 риоза^
 Контроль  (инфи¬
цированный)
 12,7±1,6
 68,4
 -
 50,0
 -
 Контроль
 13,6±1,3
 92,9
 -
 75,0
 -
 P.  aureofaciens  ИБ  51
 13,4±2,3*
 46,2
 32,5/50,3**
 32,7
 34,6/56,4**
 P.putida  ИБ  17
 9,0±3,6
 80,0
 -/13,9
 62,5
 -/16,7
 Az.  vinelandii  ИБ  1
 12,4±  1,5
 53,5
 21,7/42,4
 45,2
 9,6/90,4
 Az.  vinelandii  ИБ  3
 13,1±2,4
 60,2
 11,9/35,2
 51,4
 -/68,5
 Az.  vinelandii  ИБ  4
 13,4±1,4*
 45,2
 33,9/51,34
 31,2
 37,6/41,6
 'Различия  по  сравнению  с  контролем  существенны  при  р  =  0,95;  **в  числителе  -
биологическая  эффективность  по  отношению  к  контролю  (инфицированному);  в
знаменателе  -  биологическая  эффективность  по  отношению  к  контролю.
 Таблица  47.  Влияния  штаммов-антагонистов  на  развитие  капусты  сорта
 Золотая  Ранняя
 Вариант
 Средняя
длина  рас¬
тения,  см
 Ширина
самого
крупного
листа,  см
 Число
 настоящих
 листьев,
 шт.
 Развитие
 болезни,
 %
 Эффек¬
 тивность
 биологи¬
 ческой
 защиты,
 %
 Контроль
Фитоспорин
P.  aureofaciens  ИБ  51
Az.  vinelandii  ИБ  1
Az.  vinelandii  ИБ  3
Az.  vinelandii  ИБ  4
^Различия  по  сравнению  с
 5,3±1,3
4,2±1,5
5,8±2,3
6,9±0,2*
4,3±2,1
5,4±0,8
:  контролем  с;
 3,7±1,1
 3,8±3,1
 3,9±1,7
 3,8±0,8
 3,7±2,1
 3,9±2,2
 ущественны
 3,1±2,1
3,6±2,1
3,8±2,0
4,4±0,2
3,7±1,8
4,6±1,7
при  р  =  0,95.
 37,0±8,9
 17,2±4,5*
 4,9±3,1*
 3,5±3,2*
 7,6±3,4*
 5,2±2,6*
 53,5*
 86,7*
 90,4*
 79,5*
 85,9*
 В  2003  г.  биопрепараты  Елена  и  азолен  прошли  производст¬
венные  испытания  на  томатах  закрытого  грунта  в  тепличном  хо¬
зяйстве  ГУ  СП  СВХ  “Алексеевский”.  Технология  применения
биопрепаратов  заключалась  как  в  предпосадочной  обработке  се¬
мян  и  рассады  растений,  так  и  обработке  вегетирующих  растений
(полив  под  корень  и  опрыскивание).  Опытные  и  контрольные
растения  томатов  сорта  Энерго  выращивали  в  условиях  одной  те¬
плицы,  посадочная  площадь  под  опытными  образцами  растений,
 124

lOOOOr
 Период  сбора  урожая,  сут
 Рис.  16.  Влияние  биопрепаратов  на  урожай  томатов  сорта  Энерго  в  защищен¬
ном  грунте
 обработанными  биопрепаратами,  составляла  по  920  м2,  посадоч¬
ная  площадь  под  контрольными  растениями,  выращиваемыми  по
обычной  технологии,  принятой  в  ГУП  СВХ  “Алексеевский”,  -
3680  м2.
 Наиболее  высокий  урожай  получен  на  участке,  где  осуществлен
комплекс  обработок  биопрепаратом  Елена.  Причем  величина  теку¬
щего  сбора  урожая  томатов  значительно  возросла  после  опрыски¬
вания  растений.  В  целом  прибавка  урожая  по  сравнению  с  конт¬
рольным  участком  за  период  около  5  нед  после  начала  сбора  тома¬
тов  составила  899,5  кг  (или  15%)  [Логинов,  Свешникова  и  др.,  2004].
 Прибавка  урожая  томатов  отмечена  и  для  опытного  участка,
где  использован  биопрепарат  азолен,  -  322,5  кг  (или  5,4%)
(рис.  16).
 Таким  образом,  производственные  испытания  биопрепаратов
Елена  и  азолен  в  условиях  защищенного  грунта  на  томатах  сор¬
тов  Гамаюн  и  Энерго  показали  эффективность  их  использова¬
ния,  выразившуюся  в  повышении  урожайности  этой  сельскохо¬
зяйственной  культуры.
 Биопрепарат  Елена,  кроме  того,  прошел  производственные
испытания  на  горохе  и  картофеле.  В  СПК-колхозе  им.  Салавата
 125

была  проведена  предпосевная  обработка  биопрепаратом  Елена
семян  гороха,  а  также  последовательная  обработка  семян  гороха
химическим  препаратом  ТМТД  и  биопрепаратом  Елена.  Норма
расхода  биопрепарата  составила  1  л/т.  В  случае  использования
только  биопрепарата  прибавка  урожая  по  сравнению  с  контро¬
лем  составила  4,9  ц/га,  а  последовательная  обработка  ТМТД  и
биопрепаратом  Елена  позволила  увеличить  урожай  по  сравне¬
нию  с  контролем  на  5,7  ц/га.
 Там  же  была  проведена  предпосадочная  обработка  картофе¬
ля  из  расчета  1  л/т.  В  результате  бактеризации  биопрепаратом
урожайность  картофеля  возросла  в  1,4  раза,  что  позволило  полу¬
чить  прибавку  урожая  -  87  ц/га.
 Таким  образом,  при  использовании  биопрепаратов  Елена  и
азолен  в  производственных  условиях  получены  положительные
результаты  по  увеличению  урожайности  на  томатах  защищенно¬
го  грунта,  а  для  биопрепарата  Елена  прибавка  урожая  отмечена
также  при  использовании  его  на  горохе  и  картофеле.

РАЗРАБОТКА  ТЕХНОЛОГИИ
ОПЫТНО-ПРОМЫШЛЕННОГО  ПРОИЗВОДСТВА
БИОПРЕПАРАТОВ
НА  ОСНОВЕ  БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ
 Разработка  бактериальных  препаратов  для  защиты  сельско¬
хозяйственных  растений  от  болезней  связана  с  созданием  товар¬
ных  форм  таких  биопрепаратов.  Иммобилизация  бактериальных
клеток  на  различных  твердых  адсорбентах  позволяет  получать
товарные  формы  биопрепаратов,  длительное  время  сохраняю¬
щих  стабильность  и  активность  [Вудворд,  1988;  Егоров  и  др.,
1987].  В  технологическом  процессе  производства  бактериальных
препаратов  стадии  иммобилизации  микроорганизмов  предшест¬
вует  стадия  концентрирования  биомассы  микроорганизмов  из
культуральной  жидкости  после  завершения  культивирования  в
ферментере.
 Исследование  процесса
выделения  биомассы  микроорганизмов
из  культуральной  жидкости
 Известны  способы  выделения  биомассы  микроорганизмов  из
культуральной  жидкости,  предусматривающие  добавление  высо¬
комолекулярных  реагентов  -  флокулянтов  -  с  последующим  от¬
делением  осадка.  В  качестве  высокомолекулярных  реагентов  ис¬
пользуют  поли-1  -этил-2-метил-5-винилпиридиний 	бромид
 [А.с.  СССР  1133290],  фталоилжелатину  или  сополимер  акрило¬
вой  кислоты  и  2-метил-5-винилпиридина  [А.с.  СССР  1105501],  со¬
полимер  акрилонитрила  с  N-триметиламмонийэтилметакрилат-
метилсульфатом  [А.с.  СССР  1557160],  поли-N,  N-диметил-М,  N-
диаллиламмоний  хлорид  -  ВПК-402  [А.с.  СССР  1458382].
 В  качестве  флокулянтов  для  концентрирования  биомассы
микроорганизмов  использованы  катионогенные  водораствори¬
мые  полиэлектролиты  ВПК-402  (поли-N,  N-flHMeTiui-N,  N-диал-
лиламмоний  хлорид)  по  ТУ  6-05-2009-86,  каустомин-15  (поли-
N,  Г^-диметил-1Я-(2-гидрокси)-пропиламмоний  хлорид)  по  ТУ
2227-222-00203312-2002  и  водорастворимый  полимер  гивпан
(продукт  гидролиза  полиакрилонитрильного  сополимера  акрило¬
нитрила  с  метакрилатом)  по  ТУ  2216-001-04698227-99.  Концент¬
 127

рация  реагентов  варьировала  в  экспериментах  в  пределах
0,01-0,8  об.%  по  отношению  к  культуральной  жидкости.
 Время  перемешивания  культуральной  жидкости  с  флокулян-
том  составляло  2  мин.  Оптическую  плотность  культуральной
жидкости  и  супернатанта  измеряли  на  фотоэлектроколориметре
марки  КФК-2  (длина  волны  -  540  нм,  толщина  кюветы  -  1,7  мм).
В  кювету  сравнения  вносили  супернатант,  полученный  при  цент¬
рифугировании  культуральной  жидкости  на  лабораторной  уста¬
новке  марки  ОПн-8УХЛ  4.2  (число  оборотов  -  8000  об./мин,  вре¬
мя  центрифугирования  -  20  мин).
 Для  осаждения  биомассы  микроорганизмов-антагонистов
фитопатогенов  Р.  aureofaciens  ИБ  51  (биопрепарат  Елена),
Az.  vinelandii  ИБ  4  (биопрепарат  азолен),  а  также  P.  putida  ИБ  17
и  P.  aureofaciens  ИБ  6  использован  процесс  флокуляции  высоко¬
молекулярными  реагентами,  в  качестве  которых  исследованы
ВПК-402,  каустомин-15  и  гивпан.  При  этом  было  обнаружено,
что  применение  катионогенных  полиэлектролитов  ВПК-402  и
каустомин-15  в  качестве  флокулянтов,  хотя  и  приводит  к  осажде¬
нию  биомассы  микроорганизмов  из  культуральной  жидкости,  но
при  этом  теряется  активность  микроорганизмов  по  отношению  к
грибным  фитопатогенам,  что  является  определяющей  функцией
биопрепаратов  на  основе  этих  микроорганизмов  [Логинов,  Ва¬
сильева  и  др.,  2004].
 Графическая  интерпретация  результатов  экспериментов  по
осаждению  биомассы  микроорганизмов  с  использованием  гивпа-
на  в  качестве  флокулянта  приведена  на  рис.  17.
 Процесс  седиментации  под  действием  флокулянта  для  раз¬
личных  бактериальных  суспензий  имеет  свои  особенности.  Так,
бактериальные  суспензии,  содержащие  биомассу  псевдомонад,
сравнительно  быстро  и  довольно  четко  (процент  осветления  на
уровне  90%)  разделимы  на  супернатант  и  осажденную  биомассу.
Время,  необходимое  для  концентрирования  биомассы  микроор¬
ганизмов  из  той  или  иной  культуральной  жидкости  с  указанным
уровнем  процента  осветления,  зависит  от  особенностей  культу¬
ры  и  составляет  в  условиях  эксперимента  от  100  мин  для  P.  aure¬
ofaciens  ИБ  51  до  150  мин  для  Р.  putida  ИБ  17  и  220  мин  для
P.  aureofaciens  ИБ  6.  При  этом  концентрация  флокулянта  для  до¬
стижения  необходимого  результата  должна  составлять
0,5-0,8  мас.%  от  культуральной  жидкости.  В  эксперименте  по
концентрированию  биомассы  микроорганизмов,  полученной  при
культивировании  штамма  Az.  vinelandii  ИБ  1,  степень  осветления
культуральной  жидкости  в  процессе  флокуляции  не  превысила
70%  (рис.  17,  г),  что,  очевидно,  связано  с  наличием  в  культураль¬
ной  жидкости  экзополисахаридов,  секретируемых  этим  штаммом
 128

§
 8
 §
 §
 Рис.  17.  Характеристика  процесса  выделения  биомассы  из  культуральной  жид¬
кости  P.  aureofaciens  ИБ  17  (а),  P.  putida  ИБ  51  (б),  P.  aureofaciens  ИБ  6  (в)  и  Az.
vinelandii  (г)  под  действием  флокулянта  гивпан  при  его  содержании:  1  -  натив¬
ная  культуральная  жидкость;  2  -  0,1%;  3  -  0,3%  ;  4  -  0,5  %;  5  -  0,8%
 в  процессе  ферментации  и  значительно  повышающих  вязкость
культуральной  жидкости.
 Оценка  антагонистической  активности  микроорганизмов,
выделенных  при  флокуляции  гивпаном  из  соответствующих
культуральных  жидкостей,  на  тест-грибах  Bipolaris  sorokiniana,
Fusarium  oxysporum  и  Alternaria  alternata  показала,  что  это  свойст¬
во  микроорганизмов-антагонистов  не  претерпевает  при  исполь¬
зовании  в  качестве  флокулянта  гивпана  каких-то  изменений.
Таким  образом,  проведенное  исследование  процесса  концентри¬
рования  биомассы  различных  микроорганизмов-антагонистов
грибных  фитопатогенов  позволяет  рекомендовать  флокулянт
гивпан  в  качестве  реагента,  обеспечивающего  указанный  про¬
цесс  при  достаточно  приемлемых  технологических  показателях.
Новый  способ  выделения  биомассы  микроорганизмов  с  исполь¬
зованием  в  качестве  флокулянта  гивпана  в  настоящее  время  за¬
патентован  в  Российской  Федерации  (Пат.  РФ  2245916).
 5.  О.Н.  Логинов
 129

Таким  образом,  разработаны  технологические  аспекты,  свя¬
занные  с  выделением  биомассы  микроорганизмов  из  культураль¬
ных  жидкостей  для  биопрепаратов  на  основе  бактерий-антагони-
стов  фитопатогенов,  в  том  числе  и  биопрепарата  Елена.
 Разработка  твердых
препаративных  форм  биопрепаратов
 Жизнеспособность  клеток  микроорганизмов  и  стабильность
их  свойств  при  хранении  в  жидкой  культуре  (как  один  из  возмож¬
ных  вариантов  препаративной  формы  биопрепаратов)  определя¬
ются  не  только  условиями  хранения,  но  и  особенностями  микро¬
организма,  составляющего  основу  того  или  иного  препарата.
Известно,  что  в  некоторых  случаях  чистые  культуры  микроорга¬
низмов,  в  частности  бактерий-антагонистов,  при  пересевах  на  ис¬
кусственные  питательные  среды  способны  диссоциировать  на
формы  разной  активности  [Никонорова,  1996].  Это  приводит  к
постепенному  снижению  или  даже  к  полной  утрате  некоторых
свойств  антагониста.
 Необходимость  проведения  исследований  для  выяснения
однородности  и  стабильности  свойств  выделенных  штаммов  ми¬
кроорганизмов  (антагонистических  для  препаратов  сельскохо¬
зяйственного  назначения)  вызвана  чувствительностью  бактерий
к  различным  способам  хранения  и  поддержания  их  при  лабора¬
торном  и  промышленном  культивировании.
 Изучение  выживаемости  штаммов  p.  Pseudomonas  в  условиях
жидкой  культуры  проводили  на  среде  Кинг  ВТ.  В  каждом  из  вари¬
антов  опыта  использовали  двухсуточную  КЖ  в  объеме  100  мл.
Конические  стеклянные  колбы  объемом  250  мл  с  КЖ  штаммов
хранили  при  разных  температурных  режимах:  в  холодильнике
(6°),  термостате  (26°),  а  также  при  комнатной  температуре  (20°).
Численность  жизнеспособных  клеток  определяли  путем  высева
тщательно  перемешанного  содержимого  колб  на  среду  МПА  из
серийных  разведений  и  подсчета  выросших  колоний.
 Для  исследования  влияния  адсорбирующих  материалов  на
жизнеспособность  и  антифунгальную  активность  штаммов  псев¬
домонад  в  качестве  носителей  использовали  оксид  алюминия
(глинозем)  А1203,  оксид  магния  (жженая  магнезия)  MgO,  а  также
каолин-глину  белого  цвета,  состоящую  из  природного  глинисто¬
го  минерала  каолинита.  Материалы-носители  стерилизовали
сухим  жаром  при  180°  в  течение  3  ч.  В  качестве  объекта  исследо¬
вания  был  выбран  штамм  P.  aureofaciens  ИБ  51,  который  выра¬
щивали  в  жидкой  культуре  в  течение  2  сут.  Титр  бактериальной
 130

суспензии  -  1,2  •  1010  КОЕ/мл.  В  стерильные  материалы  вносили
КЖ  штамма  из  расчета  30  и  50%  по  массе  и  тщательно  переме¬
шивали  до  получения  однородной  массы  стерильным  шпателем.
Полученные  препараты  хранили  в  холодильнике  при  6°.  Для  кон¬
троля  стерильности  носителей  перед  началом  эксперимента,  а
также  для  учета  численности  жизнеспособных  клеток  на  адсор¬
бентах  в  течение  опыта  вносили  по  1  г  навески  препарата  в  кол¬
бы  со  100  мл  стерильной  воды,  затем  содержимое  колб  переме¬
шивали  в  течение  40  мин  на  качалке  (п  =  100  об/мин)  и  проводи¬
ли  высев  из  серийных  разведений  на  МПА.
 Для  изучения  возможности  хранения  культур  на  силикагеле
за  основу  был  взят  метод  Д.  Перкинса  [Методы...,  1982].  Объек¬
том  исследования  послужил  штамм  P.  putida  ИБ  17.  Для  пригото¬
вления  бактериальной  суспензии  культуру  выращивали  на  кося¬
ке  МПА  в  течение  5  дней.  Флакон  (10  мл),  наполовину  заполнен¬
ный  силикагелем  КСМГ  (ГОСТ  3956-76),  стерилизовали  сухим
жаром  при  180°  в  течение  1,5  ч  и  затем  вносили  0,5  мл  бактери¬
альной  суспензии,  полученной  смывом  стерильным  обезжирен¬
ным  молоком  с  косяка  (титр  1,9  •  109  КОЕ/мл).  Содержимое  фла¬
кона  тщательно  перемешивали  и  хранили  его  в  закрытом  состо¬
янии  в  холодильнике  при  5°.  Проверку  жизнеспособности  клеток
штамма  на  силикагеле  осуществляли  путем  высева  нескольких
бусин  на  свежий  косяк  МПА.  Косяк  помещали  в  термостат  при
28°  на  неделю.  О  жизнеспособности  культуры  судили  по  колони¬
ям  бактерий,  образующимся  на  МПА  вокруг  бусин  силикагеля.
 Метод  хранения  микроорганизмов  в  лиофильно-высушенном
состоянии  -  один  из  наиболее  оптимальных  способов  длительной
консервации  культур  в  лабораторных  условиях.  Целью  наших
исследований  было  выяснение  вопроса  о  влиянии  лиофилиза-
ции  на  антагонистические  свойства  культур  псевдомонад  и  азото¬
бактера.
 Для  подготовки  культур  к  лиофилизации  их  выращивали  на
агаризованных  средах  Кинг  В  (для  штаммов  псевдомонад),  Федо¬
рова  (для  штаммов  азотобактера)  сплошным  газоном  в  течение
 2 	сут.  Среда  Федорова  была  выбрана  в  связи  с  тем,  что  на  ней  (ис¬
точник  углерода  -  меласса)  штаммы  выделяют  экзополисахарид,
который  выполняет  защитную  функцию  при  высушивании  кле¬
ток  микроорганизмов.
 Далее  клетки  суспендировали  в  среде,  содержащей  24%-ный
раствор  сахарозы,  разведенный  равным  объемом  соответствую¬
щей  стерильной  питательной  среды.  В  каждую  ампулу  наливали
по  400  мкл  суспензии  бактерий.  Лиофилизацию  проводили  в  те¬
чение  20  ч  на  лиофильной  сушилке  “Иней  3-2”.  Восстановление
культур  из  лиофилизированного  состояния  и  проверку  жизнеспо-
 5*
 131

Таблица  48.  Жизнеспособность  и  антагонистическая  активность  штамма
 Pseudomonas  putida  ИБ  17  при  хранении  на  силикагеле
 Время  хранения,
мес
 Жизнеспособность
 клеток
 Диаметр  зоны  подавления  роста
Bipolaris  sorokiniana,  мм
 0
 +
 31,5±0,5
 0,5
 +
 27,0±3,0
 1,5
 +
 31,0±1,0
 2,5
 +
 31,5±0,5
 4,5
 +
 32,5±0,5
 12
 +
 32,5±0,5
 собности  бактерий  проводили  в  соответствии  с  рекомендациями,
описанными  в  “Методах  общей  бактериологии”  [1984).
 Установлено,  что  штаммы  микроорганизмов  Р.  aureofaciens
ИБ  51,  P.  aureofaciens  ИБ  6,  P.  putida  ИБ  17,  P.  putida  ИБ  56,
Pseudomonas  sp.  ИБ  182;  Az.  vinelandii  ИБ  1,  Az.  vinelandii  ИБ  3,
Az.  vinelandii  ИБ  4  в  лиофильно-высушенном  состоянии  сохраня¬
ют  длительное  время  (до  полутора  лет)  свои  свойства  без  потери
активности.
 Перкинс  [Методы...,  1982]  ранее  сообщал  о  том,  что  предло¬
женный  им  метод  хранения  на  силикагеле  пригоден  для  штам¬
мов,  образующих  конидии.  Проведенные  нами  исследования  по¬
казали,  что  подобный  метод  консервации  культур  микроорга¬
низмов  может  быть  использован  также  и  для  неспорообразую¬
щих  видов  бактерий.  В  табл.  48  представлены  данные,  подтвер¬
ждающие  возможность  длительного  хранения  штамма  Р.  putida
ИБ  17  на  силикагеле  при  пониженной  температуре.  Следует  от¬
метить,  что  подобный  способ  консервации  культуры  позволил
не  только  сохранить  жизнеспособность  клеток  штамма,  но  и  в
течение  12  мес  поддерживать  на  исходном  уровне  его  анта¬
гонистическую  активность  в  отношении  фитопатогенных
грибов.
 Разработана  твердая  препаративная  форма  биопрепарата
азолен.  Экспериментально  установлено,  что  биомасса  микроор¬
ганизмов  Az.  vinelandii  ИБ  4,  адсорбированная  на  твердом  носи¬
теле  (каолин)  при  массовом  соотношении  носителя  и  культураль¬
ной  жидкости,  составляющем  1  :  0,1-0,03,  и  подвергнутая  вакуум¬
ной  сушке  (остаточное  содержание  воды  -  1-10  мас.%),  способна
сохранять  в  течение  4  мес  высокий  титр  микроорганизмов  на
уровне  1  •  1010  КОЕ/г.  При  этом  антагонистическая  активность
микроорганизмов  по  отношению  к  грибным  фитопатогенам  ос¬
тается  стабильной  величиной.
 132

Таблица  49.  Жизнеспособность  и  антагонистическая  активность  штамма
 P.  putida  ИБ  17  в  зависимости  от  условий  хранения  в  жидкой  культуре
 Время
 хранения,  мес
 Количество  клеток,  КОЕ/мл
 20°
 26°
 6°
 0
 (1,1±0,0)  •  10ю
 (1,1±0,4)-  Ю10
 (1,0±0,1)-  10ю
 0,5
 (6,3±1,0)  •  109
 (5,9±3,8)  •  109
 (1,3±0,6)-  Ю10
 1
 (3,1  ±0.5)  •  10*
 (3,6±0,5)  •  10*
 (6,8±4,4)  •  109
 1,5
 (3,1±0,7)  •  10*
 (3,5±1,3)'  10®
 (8,3±2,1)'  109
 2,5
 (4,3±0,5)  •  10*
 (1,8±0,5)  •  10®
 (2,1±0,5)  •  109
 4,5
 (3,6±0,5)  •  10*
 (2,9±0,5)  •  10*
 (2,2±0,5)  •  109
 12
 нд
 нд
 (1,7±0,6)  •  10®
 Время
 хранения,  мес
 Радиус  зоны  подавления  роста  Bipolaris  sorokiniana,  мм
 20°
 26°
 6°
 0
 14,0±3,0
 12,5±2,5
 13,5±1,5
 0,5
 нд
 нд
 нд
 1
 11,5±0,5
 11,0±1,0
 13,5±1,5
 1,5
 14,5±2,5
 11,0±1,0
 13,5±1,5
 2,5
 10,0±2,0
 13,0±2,0
 11,5±3,5
 4,5
 13,5±1,5
 15,0±2,0
 16,0±2,0
 12
 нд
 нд
 13,0±2,0
 Примечание,  нд-  нет  данных.
 С  целью  оценки  выживаемости  псевдомонад  в  жидкой  куль¬
туре  при  различных  условиях  хранения  проведены  эксперимен¬
ты  для  двух  штаммов  бактерий-антагонистов  p.  Pseudomonas:
P.  putida  ИБ  17  и  P.  aureofaciens  ИБ  51.  У  штамма  P.  putida
ИБ  17  (табл.  49)  в  условиях  хранения  при  20  и  26°  в  течение  ме¬
сяца  численность  жизнеспособных  клеток  снизилась  на  два  по¬
рядка,  далее  в  течение  4,5  мес  титр  клеток  поддерживался  на
уровне  1,8-4,3-108  КОЕ/мл.  Хранение  культуральной  жидкости
штамма  при  6°  позволило  сохранять  численность  клеток  в  преде¬
лах  2,1-8,3*  109  КОЕ/мл  в  течение  4,5  мес.  Таким  образом,  пони¬
женная  температура  (6°)  способствовала  выживанию  клеток  и
дала  возможность  даже  по  истечении  года  сохранить  титр  КЖ  на
уровне  1,7*108  КОЕ/мл.,  сохраняя  при  этом  антагонистическую
активность  штамма  P.  putida  ИБ  17.
 Для  представителя  другого  вида  бактерий  p.  Pseudomonas  -
P.  aureofaciens  ИБ  51  -  наблюдался  совершенно  иной  вариант  по¬
ведения  в  жидкой  культуре  (табл.  50).  Показано,  что  уже  через
30-45  сут  при  комнатной  температуре,  а  также  при  постоянной
температуре  26°  штамм  полностью  утрачивает  антагонистические
 133

Таблица  50.  Жизнеспособность  и  антагонистическая  активность  штамма
 P.  aureofaciens  ИБ  51  в  зависимости  от  условий  хранения  в  жидкой  культуре
 Время
 хранения,  мес
 Количество  клеток,  КОЕ/мл
 20е
 26°
 6°
 0
 (1,9±0,2)  •  Ю10
 (2,2±0,6)  •  Ю10
 (8,6±3,2)  •  10ю
 0,5
 (2,5±1,1)  -  109
 (1,4±0,6)  •  10*
 (4,2±2,0)  •  109
 1
 (2,8±0,5)  •  10*
 (1,0±0,1)-  10*
 (6,0±2,4)  •  10*
 1,5
 (7,9±0,5)  •  107
 (9,4±0,5)  •  107
 (9,1  ±0,5)  •  10*
 3
 (2,3±0,5)  •  107
 (2,1±0,5)  •  10*
 (11,6±0,5)  *  10*
 11
 (4,9±0,5)  •  107
 нд
 (1,6±0,7)  •  10*
 Время
 хранения,  мес
 Радиус  зоны  подавления  роста  Bipolaris  sorokiniana,  мм
 20°
 26°
 6°
 0
 0,5
 1
 1.5
 3
 11
 Примечан]
 10,0±2,0
 11,0±1,0
 1  е.  нд  —  нет  данных;  (-)
 10,0±2,0
 10,0±2,0
 10,0±2,0
 2,5±0,5
 нд
 -  активных  форм  не  061
 10,0±2,0
 11,0±1,0
 12,5±2,5
 8,0±1,0
 8,0±2,0
 6,0±1,0
 наружено.
 свойства.  Хранение  при  6°  позволяет  до  некоторой  степени  под¬
держать  антифунгальную  активность  клеток,  но  тем  не  менее  за
11  мес  ее  значение  снижается  по  сравнению  с  исходным  прибли¬
зительно  в  2  раза.  Следует  отметить,  что,  несмотря  на  подобное
непостоянство  активности  данного  штамма  в  жидкой  культуре,
титр  жизнеспособных  клеток  поддерживался  на  достаточно  вы¬
соком  уровне  (1,9  -8,6  •  1010  КОЕ/мл  -  исходный  титр,  через
 11 	мес  хранения  4,9  •  107  КОЕ/мл  -  при  комнатной  температуре  и
 1,6 	•  108  КОЕ/мл  -  в  холодильнике).
 Следующий  этап  работы  -  изучение  различных  вариантов
хранения  штаммов  псевдомонад  на  твердых  дисперсных  матери¬
алах.  В  качестве  адсорбентов  использовали  оксид  алюминия,  ок¬
сид  магния,  а  также  каолин  в  количестве  50  и  70%  от  общей  мас¬
сы  смеси.  В  качестве  объекта  исследования  был  выбран  штамм
P.  aureofaciens  ИБ  51  -  основа  биопрепарата  Елена.
 Установлено,  что  оксид  магния  не  эффективен  для  хранения
исследуемого  штамма.  Уже  через  0,5  мес  эксперимента  в  данной
смеси  не  удалось  обнаружить  жизнеспособных  клеток  культуры
(табл.  51).
 Ряд  экспериментов  показал,  что  жизнеспособность  культуры
обеспечивали  каолин  и  оксид  алюминия  (глинозем),  который
 134

Таблица  51.  Жизнеспособность  и  антагонистическая  активность  штамма
 P.  aureofaciens  ИБ  51  при  хранении  на  твердых  носителях
 Вариант
 Время  хра¬
нения,  мес
 Количество  клеток,
КОЕ/г  смеси
 Радиус  зоны  подав¬
ления  роста  Bipolaris
sorokiniana,  мм
 А1203-70%
 0
 (7,3±0,6)
 109
 9,5±2,5
 Mg0-70  %
 0
 (2,3±0,6)
 109
 9,5±1,5
 Каолин-70  %
 0
 00
 109
 9,5±2,5
 Каолин-50  %
 0
 (4,2±0,3)
 109
 11,0±1,0
 А1203-70%
 1
 (5,6±0,5)
 10*
 5,5±0,5
 Mg0-70  %
 1
 *
 -
 Каолин-70  %
 1
 (1,4±0,0)
 ю9
 9,0±1,0
 Каолин-50  %
 1
 (1,5±0,5)
 ю9
 6,0±1,0
 А1203-70%
 3
 (1,4±04)
 10*
 -
 Каолин-70  %
 3
 (3,4±0,5)
 10*
 8,0±2,0
 Каолин-50  %
 3
 (5,3±0.5)
 10*
 -
 А1203-70%
 10
 *
 -
 Каолин-70  %
 10
 (9,7±0,5)  •
 106
 6,5±0,5
 Каолин-50  %
 10
 (4,2±0,5)  •
 107
 -
 *  Жизнеспособные  клетки  не  обнаружены;  (-)  -  антагонистическая  активность  в
отношении  гриба  Bipolaris  sorokiniana  не  обнаружена.
 также  получают  из  каолина.  При  хранении  в  течение  3  мес  в  сме¬
си  с  оксидом  алюминия  титр  клеток  штамма  P.  aureofaciens
ИБ  51  составлял  (1,4  ±  0,5)  •  108  КОЕ/г,  но  антагонистическая  ак¬
тивность  клеток  к  этому  времени  уже  была  утрачена.  После
10  месяцев  хранения  на  глиноземе  не  удалось  обнаружить  живых
клеток  штамма  (см.  табл.  51).
 Наиболее  эффективным  твердым  носителем,  с  точки  зрения
длительного  поддержания  жизнеспособности  и  активности  кле¬
ток  штамма  P.  aureofaciens  ИБ  51,  оказался  каолин  при  весовом
соотношении  с  КЖ,  равном  7:3.  Численность  клеток  бактерий
оставалась  в  течение  10  мес  на  уровне  9,7  ±  0,5  •  106  КОЕ/г,  при
этом  сохранялась  фунгистатическая  активность  клеток  в  отно¬
шении  Bipolaris  sorokiniana  (табл.  51).
 Высокий  титр  культуры  (3,4  ±  0,5)  •  108  КОЕ/г  без  утраты  анта¬
гонистической  активности  (размер  зон  подавления  роста  гриба
6-10  мм)  оставался  стабильным  в  течение  3  мес,  что  позволило  ре¬
комендовать  каолин  в  качестве  компонента  биопрепарата  Елена.
 Таким  образом,  разработаны  твердые  препаративные  формы
биопрепаратов  Елена  и  азолен  для  защиты  сельскохозяйствен¬
ных  растений  от  болезней.
 135

Технологическая  схема
опытно-промышленного  производства  биопрепаратов
 При  разработке  технологической  схемы  опытно-промыш¬
ленного  производства  биопрепаратов  рассмотрено  три  вариан¬
та  реализации  стадии  выделения  биомассы  микроорганизмов:
вакуумная  выпарка  КЖ,  микрофильтрация  КЖ  и  седиментаци-
онное  осаждение  биомассы  из  КЖ  с  использованием  флокулян-
тов.  Продолжительность  этой  стадии  технологического  процес¬
са  различна  для  различных  вариантов  ее  осуществления  и  соста¬
вляет  по  экспериментальным  данным  60,  26  и  12  ч  соответст¬
венно.
 Стадия  адсорбирования  клеток  микроорганизмов  на  твердом
носителе,  в  качестве  которого  используется  каолин,  заключает¬
ся  в  смешении  выделенной  на  предыдущей  стадии  технологиче¬
ского  процесса  биомассы  микроорганизмов  и  каолина.  Продол¬
жительность  этой  стадии,  как  показали  лабораторные  экспери¬
менты,  составляет  не  менее  40  мин.
 Заключительной  стадией  технологического  процесса  являет¬
ся  сушка  каолина  с  адсорбированными  микроорганизмами  в  ро¬
торной  барабанной  вакуумной  сушилке  РВ  0,8-1,6  ВК-02  с  полу¬
чением  целевого  продукта.  Содержание  клеток  микроорганизмов
составляет  в  нем  4,1—4,4  •  109  КОЕ/г  твердого  носителя.  Необхо¬
димо  отметить,  что  продолжительность  стадии  сушки  зависит  от
 Таблица  52.  Результаты  расчетов  капитальных
и  эксплуатационных  расходов  технологического  процесса
промышленного  производства  биопрепарата  Елена
 Показатель
 Варианты  осуществления  стадии  выделения
биомассы  микроорганизмов  из  культуральной
жидкости
 вакуумная
 выпарка
 микрофильт¬
 рация
 седиментация  с
использовани¬
ем  флокулянта
 Стоимость  оборудования  и
СМР,  руб.
 6722500
 6478500
 5510000
 Сырье,  руб./т
 12345
 12339
 12586
 Энергоресурсы  (электроэнер¬
гия,  пар,  вода  техническая),
руб./т
 1319
 994
 632
 Заработная  плата  с  начисле¬
ниями,  руб./т
 5672
 3807
 2779
 Заводская  себестоимость,  руб./т
 48935
 37055
 30499
 136

Рис.  18.  Принципиальная  технологическая  схема  производства  биопрепаратов  с  использованием  седиментационного  осаждения
 1  -  установка  компрессорная  К-6*;  2  -  ресивер;  3  -  фильтр  головной;  4,  5,  6,  16,  17,  18  -  аппарат  теплообменный  кожухотруб¬
чатый;  7,8,9  -  фильтры  индивидуальные;  10,11,12  -  ферментаторы;  13,14,  15  -  расширители;  19,  20,  21  -  фильтры  для  очи¬
стки  выбрасываемого  воздуха;  22  -  термостат;  23  -  насос  герметичный  центробежный  ЦГ  6,3/20К-1,1-2;  24  -  насос  консольный
одноступенчатый  моноблочный  КМ-50-32-125a-AL;  25,  26  -  реакторы  для  приготовления  питательных  солей  ;  27  -  сборник;
28  -  аппарат  с  перемешивающим  устройством;  29  -  сушилка  барабанная  роторная  вакуумная  РВ-0,8-1,6ВК-01

принятого  способа  выделения  биомассы,  определяется  количест¬
вом  остаточной  воды  в  суспензии  микроорганизмов  и  составляет
40  ч  при  вакуумной  выпарке,  25  ч  при  микрофильтрации  и  12  ч
при  седиментационном  методе.
 Расчеты  стоимости  оборудования  и  строительно-монтаж-
ных  работ  установки  по  производству  биопрепаратов  (в  частно¬
сти,  биопрепарата  Елена)  также  выполнены  в  трех  перечислен¬
ных  выше  вариантах.  В  качестве  оборудования  во  всех  вариан¬
тах  предусмотрены  ферментер,  инокулятор,  насосы,  вспомога¬
тельное  оборудование,  вакуумная  сушилка.  Для  обеспечения
стадии  выделения  биомассы  при  седиментационном  методе  пре¬
дусматривался  фильтр-нутч,  при  вакуумной  выпарке  соответст¬
вующая  установка  и  при  микрофильтрационном  методе  также
соответствующая  установка,  реализующая  этот  способ  разделе¬
ния  суспензий.
 Итоговые  результаты  расчетов  капитальных  и  эксплуатаци¬
онных  расходов  технологического  процесса  опытно-промыш¬
ленного  производства  биопрепарата  Елена  с  производительно¬
стью  3,1  т  целевого  продукта  за  один  цикл  приведены  в  табл.  52.
Полученные  данные  свидетельствуют,  что  наименьшая  величина
как  капитальных,  так  и  эксплуатационных  расходов  связана  с
вариантом  седиментационного  метода  выделения  биомассы  [Ло¬
гинов,  Силшцев,  Погосова,  2003].
 Принципиальная  технологическая  схема  производства  био¬
препаратов  на  основе  бактерий  p.  Pseudomonas  с  использованием
седиментационного  метода  выделения  биомассы  из  культураль¬
ной  жидкости  приведена  на  рис.  18.
 Таким  образом,  разработан  способ  выделения  биомассы  ми¬
кроорганизмов  из  культуральных  жидкостей  с  использованием
флокулянта,  определены  оптимальные  условия  осуществления
этой  стадии  технологического  процесса  получения  биопрепара¬
та  Елена,  предложена  технологическая  схема  производства
биопрепарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
 Развитие  биотехнологических  методов  в  растениеводстве
связано  с  разработкой  новых  микробиологических  препаратов,
целенаправленно  воздействующих  на  окружающую  среду.  Глав¬
ная  причина  повышенного  внимания  к  развитию  биотехнологии
состоит  в  тенденции  к  общей  экологизации  природопользования,
что  обусловлено  заботой  человечества  об  охране  окружающей
среды  и  рациональном,  более  эффективном  использовании  при¬
родных  ресурсов.
 Еще  11  лет  назад  коллегией  Минсельхоза  России  было  при¬
нято  “Постановление  о  мерах  по  расширению  производства  и
применения  биологических  средств  защиты  растений”.  Таким  об¬
разом,  биологическую  защиту  следует  считать  приоритетным
направлением  в  интегрированной  борьбе  с  вредителями  и  болез¬
нями  сельскохозяйственных  растений.
 Болезни  культурных  растений,  вызываемые  фитопатогенны¬
ми  грибами,  уничтожают  до  30%  потенциального  урожая.  Кроме
того,  заражая  культурные  растения,  грибы  загрязняют  их  продук¬
тами  своей  жизнедеятельности  -  микотоксинами,  которые  ухуд¬
шают  потребительские  качества  сельскохозяйственного  пищево¬
го  сырья,  что  снижает  его  биологическую  полноценность  и  безо¬
пасность.  Применяемые  химические  фунгициды  небезопасны,
загрязняют  окружающую  среду,  патогенные  грибы  вырабатыва¬
ют  к  ним  устойчивость.  Поэтому  в  последние  годы  большое  вни¬
мание  уделяется  развитию  экологически  чистых  биологических
методов  борьбы  с  болезнями  растений,  которые  рассматривают¬
ся  как  альтернатива  традиционным  методам  защиты  растений,
связанным  с  применением  химических  фунгицидов.  Аналогичная
тенденция  по  использованию  биопрепаратов  в  сельском  хозяйст¬
ве  наблюдается  во  всех  развитых  странах,  где  объемы  при¬
менения  химических  препаратов  в  растениеводстве  неуклонно
снижаются.
 Разработка  новых  типов  биопрепаратов  для  сельского  хозяй¬
ства,  обладающих  комплексным  действием,  сочетающим  антаго¬
нистическую  активность  по  отношению  к  фитопатогенам  с  про¬
дукцией  биологически  активных  веществ,  является  актуальной
 139

задачей.  Новые  штаммы  бактерий  родов  Pseudomonas  и
Azotobacter,  выделенные  нами  в  ходе  скрининга  из  различных
природных  и  техногенных  экониш,  проявляют  антагонистиче¬
скую  активность  к  широкому  спектру  фитопатогенных  грибов,
вызывающих  болезни  зерновых  и  овощных  культур.
 Антагонистическая  активность  изученных  бактерий  связана
с  продукцией  антибиотиков.  Показано,  что  метаболиты  псевдо¬
монад,  обладающие  фунгицидной  активностью,  представляют
собой  трипептиды  глицерина.  Способность  к  продукции  псевдо¬
монадами  антибиотиков  подобного  типа  показана  впервые.  Уста¬
новлено,  что  антагонистическая  активность  штамма  Az.  vinelandii
ИБ  4  обусловлена  политиафосфатом  тетрааминосахарозы.
 Новые  штаммы  бактерий-антагонистов  способны  синтезиро¬
вать  ряд  фитогормонов,  стимулирующих  развитие  растений,  кро¬
ме  того  изученные  бактерии  положительно  влияют  на  азотное  и
фосфорное  питание  растений.  Совокупность  положительных
свойств  изученных  штаммов  позволяет  считать  их  перспектив¬
ной  основой  для  создания  биопрепаратов  нового  поколения.  Сле¬
дует  отметить,  что  использование  биопрепаратов  на  основе  та¬
ких  типичных  представителей  почвенной  микробиоты,  какими
являются  бактерии  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter,  не  нарушает
экологического  равновесия  в  аборигенном  сообществе  почвен¬
ных  микроорганизмов.
 Испытание  разработанных  биопрепаратов  Елена  и  азолен  в
лабораторных  и  полевых  условиях  показало  их  эффективность
для  защиты  пшеницы  от  корневых  гнилей,  альтернариоза.  Био¬
препарат  Елена  в  вегетационных  опытах  показал  возможность
его  применения  для  защиты  пшеницы  от  поражения  твердой  го¬
ловней.  Разработанные  биопрепараты  также  могут  быть  исполь¬
зованы  для  подавления  развития  бактериоза  огурцов,  корневых
гнилей  фасоли,  некоторых  болезней  картофеля.  Эффективность
применения  новых  биопрепаратов  подтверждена  в  производст¬
венных  испытаниях  на  яровой  и  озимой  пшенице,  горохе,  карто¬
феле,  томатах  защищенного  грунта.  Таким  образом,  применение
в  сельском  хозяйстве  биопрепаратов  Елена  и  азолен,  на  наш
взгляд,  будет  весьма  перспективно.
 Одним  из  ключевых  этапов  внедрения  новых  биопрепаратов
является  разработка  технологий  их  производства.  При  этом  сле¬
дует  отметить,  что  получение  концентрированных  сухих  препа¬
ратов  биопрепаратов  на  основе  псевдомонад  и  азотобактера
сдерживается  отсутствием  стандартных  подходов  концентриро¬
вания  биомассы  этих  микроорганизмов.  В  проведенных  нами  рас¬
четах  установлено,  что  использование  микрофильтрации  или
вакуум-сушки  экономически  менее  целесообразно,  чем  предло¬
 140

женный  нами  способ  осаждения  биомассы  с  сохранением  началь¬
ных  свойств  седиментируемых  культур.  В  проведенных  исследова¬
ниях  были  найдены  не  токсичные  для  псевдомонад,  азотобактера
осадители  на  основе  водорастворимых  высокомолекулярных  по¬
лимеров.  В  ходе  исследования  установлены  рабочие  концентра¬
ции  этих  реагентов,  способные  быстро  и  с  высокими  выходами
седиментировать  культуры  микроорганизмов.  Использование
разработанного  нами  метода  концентрирования  биомассы  бакте¬
рий,  не  способных  выдерживать  повышенные  температуры  при
концентрировании,  позволяет  существенно  экономить  эксплуа¬
тационные  энергозатраты  при  производстве  сухих  форм  биопре¬
паратов.

ЛИТЕРАТУРА
 Алексеев  Ю.В.  Качество  растительной  продукции.  JL:  Колос,  1978.
256  с.
 Алексеева  Р.П.  Влияние  фосфатмобилизующих  микроорганизмов  на
рост  растений  //  Использование  микроорганизмов  в  сельском  хозяйстве  и
промышленности.  Новосибирск:  Наука,  1982.  С.  4.
 Антипчук  А.Ф.,  Канцелярук  P.M.,  Скочинская  Н.Н.  и  др.  Влияние
Азотобактера  на  прорастание  семян  огурцов  //  Микробиол.  журн.  1985.
Т.  47,  №  2.  С.  19.
 Антипчук  А.Ф.,  Рангелова  В.М.  и  др.  Вплив  азотобактерана
врожай  та  яшсть  цукрових  буряюв  //  Мжробюл.  журн.  1997.  Т.  59,  JM®  4.
С.  90-94.
 А.с.  1105501  СССР,  С  12  N  1/02.  Способ  выделения  дрожжей  /  В.П.  Ба¬
рабанов,  Ш.Г.  Еникеев,  А.И.  Курмаева  и  др.  Заявл.  29.03.83;  Опубл.
 30.07.84, 	Бюл.  №  28.
 А.с.  1133290  СССР,  С  12  N  1/02.  Способ  выделения  дрожжей  /  В.П.Ба-
рабанов,  Ш.Г.Еникеев,  А.И.  Курмаева  и  др.  Заявл.  30.03.83;  Опубл.
 07.01.85. 	Бюл.  №  1.
 А.с.  1316189  СССР.  С  05  F  11/08,  С  12  N  1/20  //  С  12  R  1  :  065  :  С  12
N  1/20.  Штамм  бактерий  Azotobacter  chroococcum  -  несимбиотический  азот-
фиксатор  для  ячменя  /  Н.А.  Троицкий,  М.А.  Новицкая,  Т.М.  Троицкая.  За¬
явл.  07.06.85;  Опубл.  15.03.88,  Бюл.  №  10.
 А.с.  1359272  СССР,  С  05  F  11/08.  Штамм  Azotobacter  chroococcum  для  по¬
лучения  бактериального  удобрения  под  томаты  /  Н.А.  Троицкий,  М.А.  Но¬
вицкая,  Т.М.  Троицкая,  В.М.  Васильев.  Заявлено  26.07.85;  Опубл.  15.12.87,
Бюл.  №  46.
 А.с.  1458382  СССР,  С  12  N  1/02.  Способ  очистки  культуральной  жидко¬
сти  микроорганизмов-продуцентов  протеолитических  ферментов  /  С.С.  Фо¬
кина,  Э.А.  Шишкова,  Л.И.  Орещенко,  Н.В.  Барсукова.  Заявл.  01.10.85;
Опубл.  15.02.  89,  Бюл.  №  6.
 А.с.  1557160  СССР,  С  12  N  1/02.  Способ  выделения  биомассы  микроор¬
ганизмов  /  П.П.  Гнатюк,  Т.Ю.  Клопова,  О.В.  Головчанская  и  др.  Заявл.
29.06.87;  Опубл.  15.04.90,  Бюл.  №  14.
 Бажанов  Д.П.,  Рудова  Е.В.,  Троицкий  Н.А.  Колонизация  корней  ячме¬
ня  диазотрофными  Pseudomonas  sp.,  генетически  измененными  по  признаку
фиксации  азота  //Докл.  АН  Беларуси.  1995.  Т.  39,  №  1.  С.  84—87.
 142

Бажанов  Д.П.,  Чернышев  С.П.  Растворение  фосфата  кальция  азотфи-
ксирующими  ризосферными  бактериями  //  Генетика  и  селекция  на  рубеже
XXI  в.  Минск,  1999.  С.  166-168.
 Бек  М.,  Надъпал  И.  Исследование  комплексообразования  новейшими
методами.  М.:  Мир,  1989.  413  с.
 Белимов  АЛ.,  Кожемяков  А.П.  Смешанные  культуры  азотфиксирую-
щих  бактерий  и  перспективы  их  использования  в  земледелии  //  С.-х.  биоло¬
гия.  1992.  №  2.  С.  77-86.
 Бельтюкова  К.И.  Влияние  азотобактерина  на  поражаемость  сельскохо¬
зяйственных  растений  бактериальными  болезнями  //  Вопросы  применения  ба¬
ктериальных  удобрений:  Сб.  статей.  -  Киев:  АН  УССР,  1953.  С.  67-71.
 Блажевич  О.В.,  Максимова  Н.П.  Биосинтез  флуоресцирующего  пиг¬
мента  пиовердина  Рм  у  ризосферных  бактерий  Pseudomonas  putida  М  //  Изв.
РАН.  Сер.  биол.  1994.  №  2.  С.  205-209.
 Большой  практикум  по  микробиологии  /  Под  общ.  ред.  Г.Л.  Селибера.
М.:  Высш.  шк.,  1962.  492  с.
 Боровая  В.П.  НПА  “Биота”:  Опыт  производства  и  применения  микро¬
биологических  препаратов  //  Защита  и  карантин  растений.  2001.  №  8.
С.  15-16.
 Воронин  А.М.  Ризосферные  бактерии  рода  Pseudomonas,  способст¬
вующие  росту  и  развитию  растений  //  Сорос,  образов,  журн.  1998.  №  10.
С.  25-31.
 Бурлуцкая  Г.Р.,  Кубицова  3.,  Умаров  М.М.  Влияние  азотфиксирующе-
го  штамма  Pseudomonas  fluorescens  на  развитие  небобовых  растений  //
Вестн.  МГУ.  Сер.  17,  Почвоведение.  1991.  №  1.  С.  54-58.
 Винтик  Я.  Некоторые  вопросы  использования  азотобактерина  в
ЧССР//Бактериальные  удобрения:  Сб.  ст.  JL:  Колос,  1964.  С.  136-150.
 Гарагуля  А.Д.,  Бабин  Л.В.,  Киприанова  ЕЛ.  и  др.  Способность  различ¬
ных  видов  бактерий  рода  Pseudomonas  к  колонизации  корней  пшеницы  //
Микробиол.  журн.  1988.  Т.  50,  №  6.  С.  77-81.
 Гарагуля  А.Д.,  Шамрай  С.Н.,  Колесова  ЭЛ.  и  др.  Использование  бакте¬
рий  рода  Pseudomonas  против  корневой  гнили  ярового  ячменя  //  Всесоюз.
конф.  “Микроорганизмы  -  стимуляторы  и  ингибиторы  роста  растений  и
животных”,  3-5  окт.  1989  г.:  Тез.  докл.  Ташкент,  1989.  Ч.  1.  С.  47.
 ГОСТ  Р  50459-92.  Семена  сельскохозяйственных  культур.  Методы  оп¬
ределения  зараженности  болезнями.  Издание  официальное.  М.:  Изд-во
стандартов,  1993.  С.  13-18.
 Гущина  ЮЛ.,  Евдокимов  Е.В.  Формальдегидрезистентные  бактерии
рода  Pseudomonas  как  агенты  биоконтроля  и  биостимуляции  льна  //  Эколо¬
гия  сегодня.  2001.  №  1.  С.  65-67.
 Дегтярева  ИЛ.,  Врачев  А.Ф.  Влияние  бактеризации  семян  на  азотфи-
ксирующую  активность  ризосферной  зоны  сахарной  свеклы  //1  Рос.  науч.-
практ.  конф.  “Актуальные  проблемы  инноваций  с  нетрадиционными  расти¬
тельными  ресурсами  и  создания  функциональных  продуктов”,  4-6  июня
2001  г.  М.,  2001.С.  180-183.
 143

Дегтярева  ИЛ.,  Чернов  ИЛ.  Роль  ассоциативной  азотфиксации  в  по¬
вышении  продуктивности  небобовых  культур,  биологической  активности
почв  и  их  плодородия  //  Там  же.  2001.  С.  183-186.
 Додатко  ТЛ.,  Гарагуля  АД.,  Киприанова  Е.А.  и  др.  Антимикробная
активность  Pseudomonas  cepacia  и  ее  использование  для  борьбы  с  заболева¬
ниями  сельскохозяйственных  растений  //  Всесоюз.  конф.  “Микроорганиз¬
мы  -  стимуляторы  и  ингибиторы  роста  растений  и  животных”,  3-5  окт.
1989  г.:  Тез.  докл.  Ташкент,  1989.  Ч.  1.  С.  61.
 Долгова  Е.М.,  Манько  О.П.,  Зубко  И.Я.  и  др.  Препараты  псевдобакте-
рин-2  и  псевдобактерин-3  против  болезней  пшеницы  //  Химия  в  сель,  хоз-ве.
1997.  №  1.  С.  13-14.
 Доросинский  Л.М.  Бактериальные  удобрения  -  дополнительное  сред¬
ство  повышения  урожая.  М.:  Россельхозиздат,  1965.  174  с.
 Егоров  Н.С.,  Олескин  А.В.,  Самуилов  В  Д.  Биотехнология:  Проблемы
и  перспективы.  М.,  1987.  459  с.
 Егоров  С.Ю.,  Захарова  Н.Г.,  Акимова  ФЛ.  и  др.  Азотфиксирующие  ба¬
ктерии  защищенного  грунта  //  Вестник  Российской  Академии  с.-х.  наук.
 1994. 	№  6.  С.  18-20.
 Ермакова  Н.И.,  Штершнис  М.В.  Новый  биопрепарат  РИЦ  против  бо¬
лезней  растений  //  Защита  растений.  1994.  №  12.  С.  18.
 Есипов  С.Е.,  Аданин  В.М.,  Баскунов  Б.П.  Новый  антибиотически  ак¬
тивный  флороглюцид  из  Pseudomonas  aurantiaca  II  Антибиотики.  1975.
Т.  20,  №  12.  С.  1077-1081.
 Злотников  А.К.,  Глаголева  О.Б.,  Умаров  М.М.  Взаимосвязь  нитроге¬
назной  активности,  устойчивости  и  относительного  содержания  компонен¬
тов  смешанных  культур  диазотрофных  бактерий  //  Микробиология.  1990.
Т.  66,  №  6.  С.  807-812.
 Иммобилизованные  клетки  и  ферменты:  Методы  /  Под  ред.  Дж.  Вуд¬
ворда.  М.:  Мир,  1988.  215  с.
 Казанцева  Е.В.,  Ашмарина  Л.Ф.  Эффективность  предпосевной  обра¬
ботки  семян  сои  бактериями  рода  Pseudomonas  и  Rhizobium  //  Проблемы  ста¬
билизации  и  развития  сельскохозяйственного  производства  Сибири,  Монго¬
лии  и  Казахстана  в  XXI  в.:  Тез.  докл.  Междунар.  науч.-практ.  конф.,
20-23  июля,  1999  г.  Новосибирск,  1999.  Ч.  1.  С.  61-62.
 Калько  Г.В.,  Воробьева  Н.И.,  Лагутина  Т.М.  и  др.  Ингибирование  ми-
кробами-антагонистами  фитопатогенного  гриба  Fusarium  oxysporum  в  тор-
фогрунте  //  Микология  и  фитопатология.  2001.  Т.  35,  №  3.  С.  66-73.
 Каталог  культур  микроорганизмов.  Пущино;  М.,  1992.  363  с.
 Квасников  Е.И.,  Айзенман  Б.Е.,  Соломко  Э.Ф.  и  др.  Рост  и  образование
антибиотиков  бактериями  рода  Pseudomonas  на  средах  с  низкомолекуляр¬
ными  н-алканами  //  Микробиология.  1975.  Т.  44,  №  1.  С.  55-60.
 Киприанова  Е.А.,  Рабинович  А.С.,  Бойко  О.И.,  Каминская  Л.Ю.  Высо¬
коактивное  антибиотическое  вещество,  выделенное  из  бактерий  рода
Pseudomonas  //  Антибиотики.  1969.  Т.  14,  №  3.  С.  228-231.
 Киприанова  ЕЛ.,  Рабинович  А.С.,  Каминская  Л.Ю.  Химическая  и  био¬
логическая  характеристика  антибиотических  веществ,  образуемых
 144

Pseudomonas  aurantiaca  //  Физиологически  активные  вещества.  1971.  №  3.
С.  283-290.
 Климова  В  Л.  Основные  микрометоды  анализа  органических  соедине¬
ний.  М.:  Химия,  1967.  208  с.
 Ковальская  Н.Ю.  Новый  тип  азотфиксирующего  растительно-бакте-
риального  симбиоза  //  Тез.  докл.  III  съезда  Докучаев,  о-ва  почвоведов,  Суз¬
даль,  11-15  июля  2000  г.  М.,  2000.  Кн.  2.  С.  27-28.
 Ковальская  Н.Ю.,Лобакова  Е.С.,  Умаров  М.М.  Формирование  искусст¬
венного  азотфиксирующего  симбиоза  у  растений  рапса  (Brassica  пар  us  var.
Napus)  в  нестерильной  почве  //  Микробиология.  2001.  Т.  70,  №  5.  С.  701-708.
 Кожевин  ПЛ.  Экология  микроорганизмов:  Эксперименты  в  природе  //
Природа.  1985.  №  7.  С.  78.
 Кочетков  В.В.,  Чигалейчик  А.Г.,  Петрикевич  С.Б.  Биопрепарат  псев-
добактерин-2  для  защиты  растений  от  широкого  спектра  фитопатогенов  //
Химия  в  сел.  хоз-ве.  1997.  №  1.  С.  15-16.
 Кочетков  В.В.,  Чигалейчик  А.Г.,  Петрикевич  С.Б.  Защита  растений
биопрепаратами  в  защищенном  грунте  //  Там  же.  1997.  С.  16-17.
 Кравченко  Л.В.,  Макарова  Н.М.  Кинетика  колонизации  корневой  по¬
верхности  злаков  при  интродукции  ассоциативных  бактерий  //  Микробио¬
логия.  1993.  Т.  62,  №  3.  С.  524-529.
 Кравченко  Л.В.,  Макарова  Н.М.,  Азарова  Т.С.  и  др.  Выделение  и  фено¬
типическая  характеристика  ростстимулирующих  ризобактерий  (PGPR),  со¬
четающих  высокую  активность  колонизации  корней  и  ингибирования  фи¬
топатогенных  грибов  //  Там  же.  2002.  Т.  71,  №  4.  С.  521-525.
 Кудоярова  Г.Р.,  Веселов  С.Ю.,  Еркеев  М.И.  и  др.  Иммуноферментное
определение  содержания  индолилуксусной  кислоты  в  семенах  кукурузы  с
использованием  меченых  антител  //  Физиология  растений.  1986.  Т.  33,  №  6.
С.  1221-1227.
 Кудоярова  Г.Р.,  Веселов  С.Ю.,  Каравайко  Н.И.  Иммуноферментная  си¬
стема  для  определения  цитокининов  //  Там  же.  1990.  Т.  37,  №  1.  С.  193-199.
 Кузнецова  МЛ.,  Филиппов  А.В.  Ризоплан  и  фитофтороз  картофеля  //
Защита  растений.  1995.  №  8.  С.  19-20.
 Кузьмина  Л.Ю„  Логинов  О.Н.,  Бойко  Т.Ф.  и  др.  Эффективность  бакте¬
риальных  препаратов  при  защите  растений  яровой  пшеницы  от  твердой  го¬
ловни  //  С.-х.  биология.  2003.  №  5.  С.  69-73.
 Курдиш  И.К.,  Рой  АЛ.,  Гарагуля  АД.и  др.  Выживаемость  и  антагони¬
стическая  активность  Pseudomonas  aureofaciens  УКМ  В-111  при  хранении  в
высокодисперсных  материалах  //  Микробиология.  1999.  Т.  68,  №  3.
С.  387-391.
 Курдиш  И.К.,  Рой  АЛ.,  Мельникова  Н.Н.  и  др.  Формирование  проро¬
стков  сельскохозяйственных  растений  при  бактеризации  семян  отдельными
видами  микроорганизмов  и  их  композициями  //  Физиология  и  биохимия
культ,  растений.  2001.  Т.  33,  №  4.  С.  341-346.
 Линчевская  М.П.,  Калиберда  P.M.  Влияние  бактериальных  удобрений
на  урожай  картофеля  //  Получение  и  применение  бактериальных  удобре¬
ний:  Сб.  ст.  Киев:  АН  УССР,  1958.  С.  203-209.
 145

Лихо  лат  Т.В.,  Шииюва  Т.К.  Роль  инокуляции  пшеницы  почвенными
культурами  Azotobacter,  Bacillus  и  Enterobacter  в  ослаблении  воздействия  не¬
благоприятных  факторов  среды  //  Тез.  докл.  III  съезда  Докучаев,  о-ва  поч¬
воведов.  М.,  2000.  Кн.  2.  С.  35-36.
 Логинов  О.Н.,  Васильева  Н.С.,  Силище  в  Н.Н.,  Гусаков  В.Н.  Исследова¬
ние  процесса  выделения  биомассы  микроорганизмов  с  использованием
флокулянта  //  Биотехнология.  2004.  №  2.  С.  55-57.
 Логинов  О.Н.,  Мелентьев  А.И.,  Силище  в  Н.Н.  и  др.  Роль  бактерий  -
антагонистов  фитопатогенов  в  защите  сельскохозяйственных  растений  от
болезней.  Уфа:  Гилем,  2001.  66  с.
 Логинов  О.Н.,  Пугачева  Е.Г.,  Исаев  Р.Ф.  и  др.  Биологические  средства
защиты  картофеля  от  болезней  //  Аграр.  наука.  2003.  №  7.  С.  24.
 Логинов  О.Н.,  Пугачева  Е.Г.,  Силищев  Н.Н.  и  др.  Оценка  влияния
штаммов  бактерий-антагонистов  рода  Azotobacter  на  поражение  корневыми
гнилями  и  урожайность  посевов  яровой  мягкой  пшеницы  //  С.-х.  биология.
2004.  №5.  С.  104-108.
 Логинов  О.Н.,  Свешникова  Е.В.,  Исаев  Р.Ф.  и  др.  Биопрепараты  про¬
тив  твердой  головни  пшеницы  //  Защита  и  карантин  растений.  2002.  №  9.
С.  39.
 Логинов  О.Н.,  Свешникова  Е.В.,  Пугачева  Е.Г.  и  др.  Биопрепараты  для
томатов  в  защищенном  грунте  //  Аграр.  наука.  2004.  J4®  5.  С.  7-8.
 Логинов  О.Н.,  Силищев  Н.Н.,  Погосова  С.В.  Технологические  аспекты
опытно-промышленного  производства  биопрепарата  на  основе  бактерий
рода  Pseudomonas  //  Башкир,  хим.  журн.  2003.  Т.  10,  №  4.  С.  22-25.
 Логинов  О.Н.,  Четвериков  С.П.  Биосинтез  низкомолекулярных  мета¬
болитов  бактериями  Pseudomonas  aureofaciens  ИБ  51  //  Биотехнология.
2003.  №  5.  С.  22-25.
 Логинов  О.Н.,  Четвериков  С.П.,  Гусаков  В.Н.  Триглицеридпептиды  -
новая  группа  антигрибных  метаболитов  псевдомонад  (Pseudomonas)  //  Докл.
РАН  2003.  Т.  393,  №  3.  С.  715-717.
 Логинов  О.Н.,  Четвериков  С.П.,  Мелентьев  А.И.,  Актуганов  Г.Э.  Вы¬
сокоэффективная  жидкостная  хроматография  низкомолекулярных  бакте¬
риальных  метаболитов  белковой  природы,  обладающих  фунгицидной  ак¬
тивностью  //  Журн.  аналит.  химии.  2004.  Т.  59,  №  3.  С.  275-279.
 Лукин  С.М.,  Симаков  Г.В.,  Морозов  А.М.  Эффективность  использова¬
ния  препаратов  азотфиксирующих  микроорганизмов  под  картофель  //  Хи¬
мия  в  сельском  хозяйстве.  1995.  №  2/3.  С.  36-38.
 Марфенина  О.Е.  Антропогенные  изменения  комплексов  микро¬
скопических  грибов  в  почвах:  Автореф.  дис...  д-ра  биол.  наук.  М.,  1999.
49  с.
 Мелентьев  А.И.,  Галимзянова  Н.Ф.  Влияние  метаболитов  бацилл-ан-
тагонистов  на  прорастание  спор  и  развитие  грибов-возбудителей  обыкно¬
венной  корневой  гнили  //  Прикл.  биохимия  и  микробиология.  1999.  Т.  35,
No  3.  С.  353-357.
 Мельникова  Н.Н.,  Булавенко  Л.В.,  Кудриш  И.К.  и  др.  Формирование  и
функционирование  бобово-ризобиального  симбиоза  у  растений  сои  при  ин¬
 146

тродукции  штаммов  родов  Azotobacter  и  Bacillus  //  Там  же.  2002.  Т.  38,  №  4.
С.  427-432.
 Методические  указания  по  государственным  испытаниям  фунгицидов,
антибиотиков  и  протравителей  семян  сельскохозяйственных  культур  /  Под
ред.  К.В.  Новожилова.  М.,  1985.  130  с.
 Методы  общей  бактериологии:  В  3  т.  /  Под  ред.  Ф.  Герхардта  и  др.  М.:
Мир,  1984.  Т.  1-3.
 Методы  почвенной  микробиологии  и  биохимии  /  Под  ред.  Д.Г.  Звягин¬
цева.  М.:  Изд-во  МГУ,  1991.  304  с.
 Методы  экспериментальной  микологии  /  И.А.  Дудка,  С.П.  Вассер,
И.А.  Эланская  и  др.  Киев:  Наук,  думка,  1982.  552  с.
 Минеев  В.Г.,  Сафрина  О.С.,  Шабаев  В.П.  Химический  состав  растений
столовой  свеклы,  инокулированных  бактерией  рода  Pseudomonas  //  Докл.
ВАСХНИЛ.  1991.  №  10.  С.  21-26.
 Минеев  ВТ.,  Сафрина  О.С.,  Шабаев  В.П.  Влияние  бактерий  рода
Pseudomonas  на  некоторые  физиолого-биохимические  процессы  в  растени¬
ях  столовой  свеклы  //  Там  же.  1992.  №  1.  С.  16-21.
 Минеев  В.Г.,  Шабаев  В.П.,  Сафрина  О.С.  и  др.  Влияние  бактерий  рода
Pseudomonas  на  урожай  столовой  свеклы  и  вынос  азота  растениями  //  Там
же.  1991.  №9.  С.  26-31.
 Мирчинк  Т.Г.  Почвенная  микология.  М.:  Изд-во  МГУ,  1988.  224  с.
 Михновская  НД.,  Шевцова  И.И.,  Рубан  Е.М.  и  др.  К  вопросу  о  неспеци¬
фической  токсигенности  некоторых  представителей  рода  Pseudomonas  //
Микробиол.  журн.  1988.  Т.  50,  №  5.  С.  83-86.
 Мишустин  Е.Н.  Ассоциации  почвенных  микроорганизмов.  М.:  Наука,
1975.  108  с.
 Мишустин  Е.Н.,  Наумова  А.Н.,  Хохлова  Ю.М.  Антифунгальный  анти¬
биотик  из  культуры  Auotobacter  chroococcum  II  Микробиология.  1969.  Т.  38,
№  1.  С.  87-90.
 Мишустин  Е.Н.,  Шильникова  В.К.  Биологическая  фиксация  атмо¬
сферного  азота.  М.:  Наука,  1968.  531  с.
 Мордухова  Е.А.,  Кочетков  В.В.,  Поликарпова  Ф.Я.  и  др.  Синтез  индо-
лил-3-уксусной  кислоты  ризосферными  псевдомонадами:  Влияние  плазмид
биодеградации  нафталина  //  Прикл.  биохимия  и  микробиология.  1998.  Т.  34,
№  3.  С.  287-292.
 Мордухова  Е.А.,  Кочетков  В.В.,  Лобанова  Е.В.  и  др.  Влияние  салици-
лата  натрия  на  популяционную  динамику  ризосферного  штамма
Pseudomonas  aureofaciens  в  почве  и  на  корнях  пшеницы  //  Микробиология.
 2000. 	Т.  69,  №  6.  С.  844-849.
 Мордухова  ЕЛ.,  Скворцова  Н.П.,  Кочетков  В.В.  и  др.  Синтез  фито¬
гормона  индол-3-уксусной  кислоты  ризосферными  бактериями  рода
Pseudomonas  //  Там  же.  1991.  Т.  60,  №  3.  С.  494-500.
 Надкерничная  Е.В.,  Ковалевская  Т.М.  Влияние  свободноживущих
азотфиксирующих  бактерий  на  формирование  и  функционирование  бобо-
во-ризобиального  симбиоза  у  некоторых  сельскохозяйственных  культур  //
Физиология  и  биохимия  культ,  растений.  2001.  Т.  33,  №  4.  С.  355-361.
 147

Назарова  Л.Н.  Агат-25  на  зерновых  культурах  //  Защита  и  карантин
растений.  2002.  №  1.  С.  21-22.
 Назарова  Л.Н.,  Наговицин  В  Л.,  Черемисина  В.Г.  Против  комплекса
болезней  озимой  ржи  //  Защита  растений.  1995.  №  8.  С.  18-19.
 Наумова  А.Н.  Приживаемость  азотобактера  в  подзолистых  почвах  //
Получение  и  применение  бактериальных  удобрений.  Киев:  АН  УССР,  1958.
С.  189-203.
 Никонорова  А.К.  Особенности  взаимодействия  Bacillus  subtilis  с
Helminthosporium  sativum  Раш.,  King  et  Bakke  //  Микология  и  фитопатология.
 1996. 	Т.  30,  №  5/6.  С.  69-73.
 Нурмухаметов  Н.М.,  Нагимова  Л.М.  Влияние  продуктов  обмена  мик¬
роорганизмов  на  урожай  яровой  пшеницы  //  Повышение  эффективности
производства  в  сельском  хозяйстве  Республики  Башкортостан.  Уфа,  1998.
С.  184-188.
 Ожиганова  Г.У.,  Андреева  М.Г.,  Заляева  С.Ф.  Изучение  азотфиксиру-
ющей  активности  и  способности  к  продуцированию  физиологически  актив¬
ных  веществ  микроорганизмов  рода  Azotobacter  //  Амарант:  Агроэкология,
переработка,  использование.  Казань,  1993-1994  гг.  С.  48-49.
 О  люпина  Л.Н.,  Шабаев  В.П.  Продуцирование  индол  ил-3-уксусной  кис¬
лоты  ризосферными  бактериями  рода  Pseudomonas  в  процессе  роста  //  Ми¬
кробиология.  1996.  Т.  6,  №  6.  С.  813-817.
 Определитель  бактерий  Берджи:  В  2  т.  /  Под  ред.  Дж.  Хоулта  и  др.  М.:
Мир,  1997.  Т.  1.
 Пат.  1805849  СССР,  А  01  N  63/00,  С  12  N  1/20.  Штамм  бактерий
Pseudomonas  putida  для  получения  препарата,  используемого  для  стимуля¬
ции  роста  растений  и  защиты  растений  от  грибов  рода  Fusarium  и  бактерий
Erwinia  /  В.В.Кочетков,  Н.П.  Скворцова,  А.Н.  Дубейковский  и  др.  Заявл.
26.06.90;  Опубл.  30.03.93.  Бюл.  №  12.
 Пат.  2031119  Российская  Федерация,  С  12  N  9/42,  1/20.  Штамм  бактерий
Pseudomonas  maltophilia  -  продуцент  хитинолитических  ферментов  /
Н.Б.  Андреева,  Т.А.  Сорокина,  И.А.  Хмель  и  др.  Заявл.  21.12.90;  Опубл.
20.03.95,  Бюл.  №  8.
 Пат.  2051586  Российская  Федерация,  6  А  01  N  63/00,  С  12  N  1/20  (С  12
N  1/20,  С  12  R  1  :  40).  Штамм  бактерий  Pseudomonas  putida  -  биостимулятор
роста  растений  /  Н.П.  Максимова,  В.В.  Лысак,  O.K.  Игнатович  и  др.  Заявл.
12.07.91;  Опубл.  10.01.96,  Бюл.  №  1.
 Пат.  2073712  Российская  федерация,  6  С  12  N  1/20,  С  12  Р  19/04  (  С  12  N
1/20,  С  12  R  1  :  065).  Штамм  бактерий  Azotobacter  vinelandii  (Lipman)  -  про¬
дуцент  экзополисахарида  /  Н.В.  Краснопевцева,  А.В.  Чернягин,  С.В.  Яроц-
кий.  Заяв.  05.01.93;  Опубл.  20.02.97.  Бюл.  №  5.
 Пат.  2074157  Российская  Федерация,  6  С  05  F  11/08  (С  12  R  1:065).
Штамм  бактерий  Azotobacter  chroococcum,  используемый  для  получения  ба¬
ктериального  удобрения  под  огурцы  /  Г.У.  Ожиганова,  М.Г.  Андреева,
И.А.  Дегтярева.  Заявл.  02.09.92;  Опубл.  27.02.97,  Бюл.  №  13.
 Пат.  2074158  Российская  Федерация,  6  С  05  F  11/08.  Штамм  бактерий
Azotobacter  chroococcum,  используемый  для  получения  бактериального  удо¬
 148

брения  под  амарант  /  Г.У.  Ожиганова,  И.А.  Чернов,  И.А.  Дегтярева.  Заявл.
02.09.94;  Опубл.  27.02.97.  Бюл.  13.
 Пат.  2074159  Российская  Федерация,  6  С  05  F  11/08  //  (С  05  F  11/08,  С  12
R  1  :  065).  Штамм  бактерий  Azotobacter  chroococcum,  используемый  для  по¬
лучения  бактериального  удобрения  под  зеленные  культуры  /  Г.У.  Ожигано¬
ва,  Г.П.  Ланских,  И.А.  Чернов.  Заявл.  02.09.92;  Опубл.  27.02.97.  Бюл.  №  13.
 Пат.  2099947  Российская  Федерация,  А  01  N  63/00,  С  12  N  1/20  (С  12  N
1/20,  С  12  R  1  :  125).  Биопрепарат  Фитоспорин  для  защиты  растений  от  бо¬
лезней  /  В.В.  Смирнов,  И.Б  .Сорокулова,  Т.Г.Бережницкая  и  др.  Заявлено
15.11.96;  Опубл.  27.12.97,  Бюл.  36.
 Пат.  2110170  Российская  Федерация,  6  А  01  G  1/00,  А  01  С  1/06.  Способ
выращивания  овощных  культур  /  О.Д.  Сидоренко.  Заявл.  30.09.96;  Опубл.
 10.05.98.
 Пат.  2128914  Российская  Федерация,  6  А  01  N  63/00,  С  12  N  1/20  (С  12
N  1/20,  С  12  R  1  :  125).  Способ  получения  препарата  Фитоспорин  /  Ф.А.  Бай-
гузина,  Г.А.  Штроман,  Т.Н.  Кузнецова  и  др.  Заявл.  30.03.98;  Опубл.
 20.04.99, 	Бюл.  11.
 Пат.  2130261  Российская  Федерация,  А  01  N  63/00,  С  12  N  1/20  (С  12  N
1/20,  С  12  R  1  :  38).  Штамм  бактерий  Pseudomonas  species  для  получения  пре¬
парата,  используемого  для  стимуляции  роста  и  защиты  растений  от  фито¬
патогенных  микроорганизмов  /  B.C.  Дашкевич,  Н.Ю.  Дашкевич,  Л.Ф.  Аш¬
марина  и  др.  Заявл.  30.09.97;  Опубл.  20.05.99.  Бюл.  14.
 Пат.  2147181  Российская  Федерация,  А  01  N  63/00,  С  05  F  11/08.  Препа¬
рат  для  повышения  урожая  растений  и  защиты  их  от  болезней  /  А.К.  Злот¬
ников,  И.К.  Злотникова,  Н.И.  Санцевич  и  др.  Заявлено  07.09.99;  Опубл.
10.04.2000.
 Пат.  2161884  Российская  Федерация,  А  01  N  63/00,  63/04,  С  12  Р  39/00,
С  01  С  1/00.  Сообщество  микроорганизмов  для  получения  регулятора  рос¬
та  растений,  способ  получения  регулятора  и  регулятор  роста  растений  /
Я.М.  Гусейнов,  Ю.П.  Бондарев,  Н.В.  Попик,  B.C.  Щербакова.  Заявл.
18.04.2000;  Опубл.  20.01.2001.
 Пат.  2177466  Российская  Федерация,  С  05  F  11/08,  С  12  N  1/20  //(С  12  N
1/20,  С  12  R  1  :  065).  Штамм  бактерий  Azotobacter  chroococcum  ЗАО  “Био¬
флора”  N°  13-05  для  получения  биопрепарата  для  повышения  почвенного
плодородия,  повышения  урожая  сельскохозяйственных  культур  и  качества
его,  оздоровления  почвы,  восстановления  нарушенных  земель  и  биопрепа¬
рат  на  его  основе  для  повышения  почвенного  плодородия  и  восстановления
нарушенных  земель  /  Е.В.  Чекасина,  И.В.  Егоров,  Р.А.  Корицкая.  Заявл.
04.06.99;  Опубл.  27.12.2001.
 Пат  2187553  Российская  Федерация,  7  С  12  N  1/20,  9/42.  Штамм  бакте¬
рий  Pseudomonas  species  -  продуцент  хитинолитических  ферментов  /
О.Н.  Логинов,  Е.В.  Свешникова,  Н.Н.  Силищев,  А.И.  Мелентьев,  Н.Ф.  Га-
лимзянова,  Т.Ф.  Бойко.  Заявл.  11.04.2001;  Опубл.  20.08.2002.  Бюл.  N°  23.
 Пат.  2203945  Российская  Федерация,  7  С  12  N  1/20,  А  01  N  63/00  //(С  12
N  1/20,  С  12  R  1:38).  Штамм  бактерий  Pseudomonas  aureofaciens  для  получе¬
ния  препарата  против  заболеваний  пшеницы,  вызываемых  грибными  фито¬
 149

патогенами  /  О.Н.  Логинов,  Е.В.  Свешникова,  Н.Н.  Силищев,  А.И.  Мелен¬
тьев,  Н.Ф.  Галимзянова,  Т.Ф.  Бойко;  Заявл.  17.08.2001;  Опубл.  10.05.2003,
Бюл.  №  13.
 Пат.  2213774  Российская  Федерация,  7  С  12  N  1/20  (С  12  N  1/20,  С  12  R
1:40).  Штамм  бактерий  Pseudomonas  putida  для  получения  препарата  против
заболеваний  пшеницы,  вызываемых  грибными  фитопатогенами  /  О.Н.  Ло¬
гинов,  Е.В.  Свешникова,  Н.Н.  Силищев,  А.И.  Мелентьев,  Н.Ф.  Галимзяно¬
ва,  Т.Ф.  Бойко,  Р.Ф.  Исаев.  Заявл.  25.03.2002;  Опубл.  10.10.2003,  Бюл.  №  28.
 Пат.  222479  Г  Российская  Федерация,  7  С  12  N  1/20,  А  01  N  63/00.  Штамм
бактерий  Azotobacter  vinelandii  для  борьбы  с  болезнями  пшеницы,  вызывае¬
мыми  грибными  фитопатогенами,  и  повышения  урожая  /  О.Н.  Логинов,
Е.Г.  Пугачева,  Н.Н.  Силищев,  А.И.  Мелентьев,  Н.Ф.  Галимзянова,
Т.Ф.  Бойко.  Заявл.  25.06.2002;  Опубл.  27.02.2004,  Бюл.  №  6.
 Пат.  2245916  Российская  Федерация,  7  С  12  N  1/02.  Способ  выделения
биомассы  микроорганизмов  /  О.Н.  Логинов,  Н.С.  Васильева,  Н.Н.  Сили¬
щев,  В.Н.  Гусаков;  Заявлено  24.06.2003;  Опубл.  10.02.2005,  Бюл.  №  4.
 Пат.  2245918  Российская  Федерация,  7  С  12  N  1/20,  А  01  N  63/00.  Штамм
бактерий  Azotobacter  vinelandii  для  получения  биопрепарата  для  борьбы  с
корневыми  гнилями  пшеницы  и  повышения  количества  и  качества  урожая
/  О.Н.  Логинов,  Е.Г.  Пугачева,  Н.Н.  Силищев,  Т.Ф.  Бойко,  Н.Ф.  Галимзяно¬
ва.  Заявл.  07.07.2003;  Опубл.  10.02.2005,  Бюл.  №  4.
 Пересыпкин  В.Ф.  Сельскохозяйственная  фитопатология.  М.:  Агро-
промиздат,  1989.  480  с.
 Петренко  М.Б.,  Боровков  А.В.  Производные  феназина  из  Pseudomonas
sp.  штамм  2/3  //  Химия  природ,  соединений.  1970.  №  6.  С.  779.
 Пидопличко  В.Н.,  Гарагуля  АД.  Антагонистическое  действие  бакте¬
рий  родов  Pseudomonas,  Bacillus  и  некоторых  актиномицетов  на  возбудите¬
лей  корневой  гнили  пшеницы  //  Всесоюз.  конф.  “Пути  совершенной  микро¬
биологической  борьбы  с  вредными  насекомыми  и  болезнями  растений”,
13-15  мая,  1986  г.:  Тез.  докл.  и  стенд,  сообщ.  Оболенск,  1986.  С.  165-166.
 Плетнева  Т.Н.,  Ладыгина  Г.Н.,  Дыдыкин  А.М.  Влияние  азотобактера
на  урожайность,  качество  и  некоторые  болезни  томатов  сорта  “Горьков¬
ский  44”  //  Тез.  докл.  конф.  “80  лет  селекционеру-генетику,  академику
И.П.  Елисееву”.  Нижний  Новгород.  1998.  С.  187-190.
 Полянская  Л.М.,  Ведина  О.Т.,Лысак  Л.В.,  Звягинцев  Д.Г.  Стимуляция
роста  растений  культурами  Bejerinckia  и  Clostridium  //  Микробиология.  2002.
Т.71,№  1.С.  123-129.
 Полянская  Л.М.,  Звягинцев  Д.Г.  Популяционная  экология  актиномице¬
тов  в  почвах  и  ее  роль  в  управлении  комплексом  почвенных  микроорганиз¬
мов  //  Изв.  АН  СССР.  Сер.  биол.  1984.  №  5.  С.  746-753.
 Поморцева  Н.В.  Образование  пиоцианина  на  средах  с  углеводородами
//  Микробиология.  1965.  Т.  34,  №  3.  С.  473-476.
 Попова  Ж.П.,  Эськин  С.Б.,  Матисова  А.Н.  О  составе  антифунгина-
сырца  //  Бюл.  ВНИИ  с.-х.  микробиологии.  1971.  Т.  15,  №  1.  С.  79-80.
 Практикум  по  микробиологии  /Под  ред.  Н.С.  Егорова.  М.:  Изд-во
МГУ,  1976.  308  с.
 150

Придачина  Н.Н.,  Новогрудская  Е.Д.,  Кругляк  Е.Б.  Azotobacter
chroococcum  -  продуцент  нового  противогрибкового  антибиотика  //  Анти¬
биотики.  1982.  Т.  27,  №  1.  С.  3-5.
 Пугачева  Е.Г.,  Логинов  О.Н.,  Четвериков  С.П.,  Силищев  Н.Н.  Изучение
влияния  условий  культивирования  на  нитрогеназную  активность  штаммов  ба¬
ктерий  рода  Azotobacter  //  Башкир,  хим.  журн.  2004.  Т.  11,  №  2.  С.  51-54.
 Разумовская  З.Г.,  Чижик  Г.Я.,  Громов  Б.В.  Лабораторные  занятия  по
почвенной  микробиологии.  Л.:  Изд-во  ЛГУ,  1960.  184  с.
 Редди  Т.К.,  Боровков  А.В.  Моно-,  ди-  и  триацетилфлороглюцины  из
Pseudomonas  fluorescens  //  Химия  природ,  соединений.  1969.  N°  2.  С.  133.
 Рубан  ЕЛ.  Физиология  и  биохимия  представителей  рода  Pseudomonas.
М.:  Наука,  1986.  200  с.
 Рубенчик  Л.И.  Азотобактер  и  его  применение  в  сельском  хозяйстве.
Киев:  АН  УССР,  1960.  328  с.
 Сакодынский  К.И.,  Бражников  В.В.,  Волков  С.А.  и  др.  Аналитическая
хроматография.  М.:  Химия,  1993.  464  с.
 Свешникова  Е.В.,  Логинов  О.Н.,  Исаев  Р.Ф.  и  др.  Для  борьбы  с  болез¬
нями  картофеля  //  Защита  и  карантин  растений.  2003.  №  10.  С.  35.
 Сидоренко  О.Д.  Действие  ризосферных  псевдомонад  на  урожайность
сельскохозяйственных  культур  //  Агрохимия.  2001.  N°  8.  С.  56-62.
 Сидоренко  ОД.,  Стороженко  В  Л.,  Кухаренкова  О.Р.  Применение  ба¬
ктериальных  препаратов  при  выращивании  картофеля  //  Междунар.  с.-х.
журн.  1996.  N°  6.  С.  36-38.
 Скворцова  И.Н.  Методы  идентификации  и  выделения  почвенных  бак¬
терий  рода  Pseudomonas.  М.:  Изд-во  МГУ,  1981.78  с.
 Смирнов  В.В.,  Киприанова  Е.А.  Бактерии  рода  Pseudomonas.  Киев:  На¬
ук.  думка,  1990.  264  с.
 Смирнов  В.В.,  Киприанова  Е.А.,  Гарагуля  АД.  и  др.  Антибиотическая
активность  и  сидерофоры  Pseudomonas  cepacia  //  Прикл.  биохимия  и  микро¬
биология.  1990.  Т.  26,  №  1.  С.  75-80.
 Смирнов  В.В.,  Киприанова  Е.А.,  Гарагуля  АД.  и  др.  Антибиотики  аро¬
матической  природы  из  Pseudomonas  cepacia  I/  Микробиол.  журн.  1991.
Т.  53,  №5.  С.  41-45.
 Смирнов  В.В.,  Киприанова  Е.А.,  Гарагуля  АД.  и  др.  Антимикробные  и
энтомопатогенные  свойства  штаммов  Pseudomonas  aureofaciens  //  Прикл.
биохимия  и  микробиология.  1999.  Т.  35,  N°  4.  С.  413-416.
 Смолин  В.Ю.,  Сафрина  О.С.  Азотфиксация  в  ризосфере,  урожай  сто¬
ловой  свеклы  и  баланс  азота  в  пойменной  почве  при  применении  азотфик-
сирующих  бактерий  рода  Pseudomonas  //Агрохимия.  1995.  N°  11.  С.  3-15.
 Смолин  В.Ю.,  Шабаев  В.П.  Химический  состав  растений  сои  при  при¬
менении  клубеньковых  бактерий  с  ризосферными  псевдомонадами  или  эн-
домикоризными  грибами  и  локальном  внесении  азотного  удобрения  //  Там
же.  1992.  N°  11.  С.  73-79.
 Список  пестицидов  и  агрохимикатов,  разрешенных  к  применению  на
территории  Российской  Федерации.  2001  г.  М.,  2001.  (Защита  и  карантин
растений;  N°  3,  приложение).
 151

Сторожу  к  С.В.,  Сидоров  И  Л.,  Соколов  М.С.  Высокое  качество  био¬
препарата  -  залог  успеха  //  Защита  растений.  1995.  №  8.  С.  17.
 Стыскин  EJ1.,  ИциксонЛ.Б.,  Брауде  Е.В.  Практическая  высокоэффе¬
ктивная  жидкостная  хроматография.  М.:  Химия,  1986.  288  с.
 Суховицкая  Л  .А.,  Сафронова  Г.В.,  Клышко  Г.М.  Выживаемость
Rizobium  в  монокультуре  и  бинарных  популяциях  с  ризосферными  бактери¬
ями  //  Прикл.  биохимия  и  микробиология.  2002.  Т.  38,  №  1.  С.  73-78.
 Сэги  Й.  Методы  почвенной  микробиологии.  М.:  Колос,  1983.  296  с.
 Терехов  М.Б.,  Ежова  Л  .А.  Об  использовании  биологической  фикса¬
ции  молекулярного  азота  штаммами  ассоциативных  азотфиксаторов  при
возделывании  яровой  пшеницы  //Тез.  докл.  Междунар.  науч.  конф.  “Раз¬
витие  научного  наследия  академика  Н.И.  Вавилова”.  Саратов,  1997.  Ч.  1.
С.  134-136.
 Титаренко  Л.Н.,  Вяткина  Г.Г.,  Алещенко  М.Н.  Применение  ризопла-
на  на  Северном  Кавказе  //  Защита  растений.  1995.  №  8.  С.  17.
 Толкачев  Н.З.  Повышение  эффективности  симбиотической  азотфик-
сации  и  продуктивности  сои  путем  применения  стимуляторов  и  биопрепара¬
тов  //  Физиология  и  биохимия  культурных  растений.  1997.  Т.  29,  №  4.
С.  304-309.
 Тригер  Е.Г.,  Полянская  Л.М.,  Кожевин  ПЛ.  Межмикробные  взаимо¬
действия  в  почве  (на  примере  некоторых  популяций  стрептомицетов  и  бак¬
терий)  //  Микробиология.  1990.  Т.  59,  №  4.  С.  688-694.
 Умаров  М.М.  Ассоциативная  азотфиксация.  М.:  Изд-во  МГУ,  1986.
136  с.
 Умаров  М.М.,  Шабаев  В.П.,  Смолин  В.Ю.  и  др.  Нитрогеназная  актив¬
ность  в  ризосфере  и  урожай  тритикале  при  применении  азотфиксирующих
смешанных  культур  микроорганизмов  //  Почвоведение.  1993.  №  9.  С.  70-75.
 Фатыхова  Ю.Н.,  Минаева  О.М.,  Бондаренко  АЛ.  Разработка  биофун¬
гицида  на  основе  бактерий  рода  Azotobacter  и  Pseudomonas  //  Региональные
проблемы  экологии  и  природопользования.  Томск,  2000.  С.  90-91.
 Холмецкая  М.О.,  Лобанок  Е.В.,  Чернин  Л.С.  Синтез  индолилуксусной
кислоты  некоторыми  фитопатогенными  и  непатогенными  бактериями  //
Докл.  АН  Беларуси.  1996.  Т.  40,  №  2.  С.  80-83.
 Худяков  Я.П.,  Шкляр  М.С.,  Савадеров  Е.П.  Антибиотик  антифунгин,
образуемый  бактериями  рода  Pseudomonas  //  Прикл.  биохимия  и  микробио¬
логия.  1965.  Т.  1,  №  2.  С.  186-190.
 Чемерисов  Б.М.  Усиление  азотфиксации  -  новое  направление  в  селек¬
ции  пшеницы  и  других  небобовых  полевых  культур  //  С.-х.  биология.  1988.
№  6.  С.  43.
 Четвериков  С.П.,  Логинов  О.Н.  Триглицеридпептиды  псевдомонад  -
новые  агенты  биологического  контроля  фитопатогенных  грибов  //  Прик¬
ладная  биохимия  и  микробиология.  2005.  Т.  41,  №  1.  С.  90-93.
 Шабаев  В.П.,  ОлюнинаЛ.Н.,  Смолин  В.Ю.  Функциональная  активность
корней  кукурузы  при  инокуляции  стимулирующими  рост  растений  ризо¬
сферными  бактериями  рода  Pseudomonas  //  Изв.  РАН.  Сер.  биол.  1999.  №  1.
С.  39-46.
 152

Шабаев  В.П.,  Сафрина  О.С.,  Мудрик  В  Л.  Влияние  ризосферной  бакте¬
рии  Pseudomonas  fluorescens  20  и  эндомикоризного  гриба  Glomus  mosseae  на
урожай  и  рост  редиса  в  зависимости  от  условий  минерального  питания  //
Агрохимия.  1998.  №  6.  С.  34—41.
 Шабаев  В.П.,  Смолин  В.Ю.  Урожай  рапса  и  вынос  элементов  минераль¬
ного  питания  растениями  при  инокуляции  семян  культурой  ризосферной
бактерии  Pseudomonas  fluorescens  20  на  фоне  различных  доз  азотного  удоб¬
рения  //  Там  же.  1999.  №  5.  С.  67-73.
 Шабаев  В.П.,  Смолин  В.Ю.,  Мудрик  В  А.  С02  -  газообмен  растений  сои
и  симбиотическая  азотфиксация  при  двойной  инокуляции  клубеньковыми
бактериями  с  ризосферными  псевдомонадами  или  эндомикоризными  гри¬
бами  //  Изв.  РАН.  Сер.  биол.  1995.  №  6.  С.  693-701.
 Шабаев  В.П.,  Смолин  В.Ю.,  Стрекозова  В.И.  Влияние  азотфиксирую-
щих  родов  Azospirillum  и  Azotobacter  на  баланс  азота  в  почве  при  выращива¬
нии  растений  //  Агрохимия.  1990.  №  5.  С.  82.
 Широкое  А.В.,  Логинов  О.Н.,  Мелентьев  А.И.,  Актуганов  Г.Э.  Белко¬
вые  и  пептидные  факторы  Bacillus  sp.  739  -  ингибиторы  роста  фитопато¬
генных  грибов  //  Прикл.  биохимия  и  микробиология.  2002.  Т.  38,  №  2.
С.  161-165.
 Aguilar  J.E.,  Sanchez  М.  Efecto  de  una  rizobacteria  nitrofijadora  у  niveles  de
fertilizante  en  el  comortamiento  agronomico  del  tomate  Lycopersicon  esculentum
var.  //  Acta  agron.  1998.  Vol.  48,  №  1/2.  P.  60-70.
 Ahl  P.,  Voisard  C.,  Difago  G.  Iron  bound-siderophores,  cyanic  acid  and  antibi¬
otics  involved  in  suppression  of  Thielaviopsis  basicola  by  a  Pseudomonas  fluo¬
rescens  strain  //  Phytopathol.  J.  1986.  N  2.  P.  121-134.
 Ali  Siddiqui  I.,  Ehetshamul-Haque  S.,  Shahid  Shaukat  S.  Use  of  rhizobacteria
in  the  control  of  root  rot-root  knot  disease  complex  of  mungbean  II  J.  Phytopathol.
 2001. 	N  6.  P.  337-346.
 Anderson  AJ.,  Hacking  AJ.,  Dawas  E.A.  Alternative  pathways  for  the  biosyn¬
thesis  of  alginate  from  fructose  and  glucose  in  Pseudomonas  mendocina  and
Azotobacter  vinelandii  //J.  Gen.  Microbiol.  1987.  Vol.  133.  P.  1045-1052.
 Andreeva  N.B.,  Sorokina  T.A.,  Khmel  I  A.  Chitinolytic  activity  of  pigmen¬
ted  Pseudomonas  and  Xanthomonas  bacteria  I  I  Microbios.  1996.  N°  350.
P.  53-57.
 Anthony  U.,  Christophersen  C.,  Nielse  P.H.  et  al.  Pseudomonine,  an  isoxazoli-
done  with  siderophooric  activity  from  Pseudomonas  fluorescens  AH2  isolated  from
lake  Victoria  Nile  perch  //J.  Nat.  Prod.  1995.  Vol.  58.  P.  1786-1789.
 Arima  K.,  Imanaka  H.t  Konsara  M.  et  al.  Pyrrolnitrin,  a  new  antibiotic  sub-
stans,  produced  by  Pseudomonas  //  Agr.  and  Biol.  Chem.  1964.  Vol.  28,  N  8.
P.  575-582.
 Azcon  R.f  Barea  J.M.  Synthesis  of  auxins,  gibberellins  and  cytocinins  by
Azotobacter  vinelandii  and  Azotobacter  biejirincii  related  to  effects  produced  on
tomato  plants  //  Plant  and  soil.  1975.  N  43.  P.  609-619.
 Bahme  J.B.,  Schroth  M.N.  Spatial-temporal  colonization  patterns  of  a  rhi-
zobacterium  on  undergraund  organs  of  potato  I  I  Phytopathology.  1987.  Vol.  77,
№7.  P.  1093-1100.
 153

Bakker  PA.f  Bakker  A.W.,  Geets  F.P.  et  al.  Increase  of  potato  tuber  yields  in
short  rotations  of  potato  by  seed  tuber  treatment  with  fluorescent  Pseudomonas  sp.
//  Develop.  Plant  Soil  Sci.  1989.  N  40.  P.  163-170.
 Baysse  C.,  De  Vos  D.,  Naudet  Y.  et  al.  Vanadium  interferes  with  siderophore-
mediated  iron  uptake  in  Pseudomonas  aeruginosa  I  I  Microbiology.  2000.  Vol.  146.
P.  2425-2434.
 Beale  J.M.,  Foster  JL.  Carbohydrate  fluxes  into  alginate  biosynthesis  in
Azotobacter  vinelandii  NCIB  8789:  NMR  investigations  of  the  triose  pools  //
Biochemistry.  1996.  Vol.  35.  P.  4492-4501.
 Becker  J.O.,  Cook  RJ.  Role  of  siderophores  in  suppression  of  Pythium  species
and  production  of  increased-growth  response  of  wheat  by  fluorescent  pseudomon¬
ads  //  Phytopathology.  1988.  Vol.  78,  №  6.  P.  778-782.
 Becker  J.O.,  Hepfer  С  .A.,  Yuen  G.V.  et  al.  Effect  of  rhizobacteria  and  metham-
sodium  on  growth  root  microflora  of  celery  cultivars  //  Ibid.  1990.  Vol.  80,  N  2.
P.  206-211.
 Bisacchi  G.S.,  Hockstein  DJ?.,  Koster  W.H.  et  al.  Xylocandin:  A  new  complex
of  antifungal  peptides.  II.  Structural  studies  and  chemical  modifications  //  J.
Antibiot.  1987.  Vol.  40.  P.  1520-1529.
 Bloemberg  G.V.,  Lugtenberg  BJ.  Molecular  basis  of  plant  growth  promotion
and  biocontrol  by  rhizobacteria//Curr.  Opin.  Plant.  Biol.  2001.  Vol.  4.  P.  343-350.
 Bonsall  R.F.,  Weller  D.M.,  Thomashow  L.S.  Quantification  of  2,4-
diacetylphloroglucinol  produced  by  fluorescent  Pseudomonas  spp.  in  vitro  and  in
the  rhizosphere  of  wheat  //  Appl.  and  Environ.  Microbiol.  1997.  Vol.  63.
P.  951-955.
 Brivonese  A.C.,  Sutherland  I.W.  Polymer  production  by  a  mucoid  strain  of
Azotobacter  vinelandii  in  batch  culture  //  Appl.  Microbiol,  and  Biotechnol.  1989.
Vol.  30,  N  1.  P.  97-102.
 Burkhead  K.D.,  Schisler  D.A.,  Slininger  PJ.  Pyrrolnitrin  production  by  biolog¬
ical  control  agent  Pseudomonas  cepacia  B37w  in  culture  and  in  colonized  wounds
of  potatoes  //  Appl.  and  Environ.  Microbiol.  1994.  Vol.  60.  P.  2031-2039.
 Campbell  R.,  Renwick  A.,  Coe  S.K.  Antagonism  and  siderophore  production  by
biocontrol  agents,  plant  growth  promoting  organisms  and  the  general  zhitosphere
population  //  Iron,  siderophores  and  plant  diseases:  Proc.  NATO  Adv.  Res.
Workshop,  Wye,  July  1-5,  1985.  New  York;  London,  1986.  P.  179-188.
 Campbell  R.  The  search  for  biological  control  agents  against  plant  pathogens:
A  pragmatic  approach  I  I  Biol.  Agr.  and  Hort.  1986.  Vol.  3,  №  2/3.  P.  317-327.
 Canesan  P.,  Gnanamanickam  S.S.  Biological  control  of  Sclerotium  rolfsii  Sacc.
in  peanut  by  inoculation  with  Pseudomonas  fluorescens  //  Soil  Biol,  and  Biochem.
 1987. 	Vol.  19,  №  1.  P.  35-38.
 Caponlgro  V.,  Contillo  R.  Coloizzazione  radicale  di  tabacco  con  Pseudomonas
fluorescenti  I  I  Ann.  1st.  sperim.  tabacco.  Scafoti.  1986.  Vol.  12.  P.  49-64.
 Carlile  М.,  Watkinson  S.,  Gooday  G.  The  Fungi.  San  Diego:  Acad,  press,  2001.
588  p.
 Chin-A-Woeng  T.F.C.,  Bloemberg  G.V.,  Lugtenberg  BJJ.  Phenazines  and
their  role  in  biocontrol  by  Pseudomonas  bacteria  //  New  Phytol.  2003.  Vol.  157.
P.  503-523.
 154

Colin  J.E.,  Maraite  H.  Caract6risation  spectrophotom6trique  et  activite
biologique  de  siderophores  de  Pseudomonas  fluorescents,  antagonistes  de  bacteries
phytopathogenes  //  Parasitica.  1987.  Vol.  43,  №  4.  P.  168-175.
 Conway  K.E.,  Foor  С  J.,  Malvick  D.  et  al.  Inhibition  by  Pseudomonas  cepacia
a  potential  biocontrol  agent  of  selected  soilbome  pathogens:  Abstr.  Present.  1989
Annu.  meet.  Amer.  Phytopathol.  Soc.,  Richmond,  Va.,  Aug.  20-24,  1989  //
Phytopathology.  1989.  Vol.  79,  N  10.  P.  1159.
 Cook  RJ.,  Thomashow  L.S.,  Weller  DM.  Fungal-bacterial  interactions  in  the
root  region,  with  special  reference  to  antagonism  of  wheat  root-infecting  fungi  by
rhizobacteria  //  Perspect.  microbiol.  ecol.:  Proc.  of  4th  Intern.  Symp.,  24—29  Aug.
1986.  Ljubljana,  1986.  P.  401-405.
 Corbell  N.t  Loper  J.E.  A  global  regulator  of  secondary  metabolite  produc¬
tion  in  Pseudomonas  fluorescens  Pf-5  //  J.  Bacteriol.  1995.  Vol.  177.  P.  6230-
6236.
 Cornelis  P.,  Hettiarachi  S.,  Muunga  X.  et  al.  Disease-suppression  by
Pseudomonas  in  the  Cicer-Fusarium  system  //  Physiol  plant.  1990.  Vol.  79,  N  2,
pt.  2.  P.  102.
 Dibut  Alvarez  B.,  Martinez  Viera  R.f  Casanova  Castillo  I.  Accion  estimulado-
ra  de  Azotobacter  chroococcum  sobre  cultivo  del  tomate  en  suelo  Ferralitico  Rojo  //
Agrotecn.  Cuba.  1997.  Vol.  27,  №  2/3.  P.  20-25.
 Duffy  B.K.,  Defago  G.  Zinc  improves  biocontrol  of  Fusarium  crown  and  root
rot  of  tomato  by  Pseudomonas  fluorescens  and  represses  the  production  of  pathogen
metabolites  inhibitory  to  bacterial  antibiotic  biosynthesis  //  Phytopathology.  1997.
Vol.  87.  P.  1250-1257.
 Duffy  B.K.,  Defago  G.  Environmental  factors  modulating  antibiotic  and
siderophore  biosynthesis  by  Pseudomonas  fluorescens  biocontrol  strains  //  Appl.
and  Environ.  Microbiol.  1999.  Vol.  65.  P.  2429-2438.
 Elsherif  М.,  Grossmann  F.  Versuche  zur  biologischen  Bekampfung  einiger
phytopathogener  Pilze  durch  fluoreszierende  Pseudomonaden  unter  Anwendung
verschiedener  Applikationsverfahren  //  Ztschr.  Pflanzenkrankh.  und
Pflanzenschutz.  1991.  Bd.  98,  №  3.  S.  236-249.
 Fakhouri  W.f  Walker  F.,  Vogler  B.  et  al.  Isolation  and  identification  of  N-mer-
capto-4-formylcarbostyril,  an  antibiotic  produced  by  Pseudomonas  fluorescens  //
Phytochemistry.  2001.  Vol.  58.  P.  1297-1303.
 Forlani  G.,  Pastorelli  R.,  Branzoni  M.  et  al.  Root  colonization  efficiency,  plant-
growth-promoting  activity  and  potentially  related  properties  in  plant-associated  bac¬
teria  //J.Genet.  and  Breed.  1995.  N  4.  P.  343-352.
 Gamard  P.,  Sauriol  F.f  Benhamou  N.  et  al.  Novel  butyrolactones  with  antifun-
gal  activity  produced  by  Pseudomonas  aureofaciens  strain  63-28  //  J.  Antibiot.
 1997. 	Vol.  50.  P.  742-749.
 Gordon-Lennox  G.,  Walther  D.,  Gindral  D.  Utilisation  d’antagonistes  pour
l’enrobage  des  semences:  efficacite  et  mode  d’action  contre  les  agents  de  la  fonte
des  semis  //  Bull.  OEPP.  1987.  Vol.  17,  N  4.  P.  631-637.
 Gould  W.D.,  Hagedorn  C.,  Bardinelli  T.R.,  Zablotowicz  R.M.  New  selective
media  for  enumeration  and  recovery  of  fluorescent  pseudomonads  from  various
habitas  //Appl.  and  Environ.  Microbiol.  1985.  Vol.  49.  P.  28-32.
 155

Govedrica  M.t  Milosevic  N.,  Jarak  M.  et  al.  Uticai  diazatrofa  na  prinos  i
kvalitet  seceme  гере  I  I  Zb.  Rad.  /  Nauc.  Inst.  Ratarstvo  Povrtarstvo.  1999.  Sv.  32.
S.  285-292.
 Grimes  H.D.,  Mount  MS.  Influence  of  Pseudomonas  putida  on  Nodulation
Phaseolus  vulgaris  //  Soil  Biol,  and  Biochem.  1984.  Vol.  16,  N  1.  P.  27.
 Hasegawa  S.,  Kodama  F.,  Kaneshima  H.  et  al.  Biological  control  of  Fusarium
diseases,  isolation  of  antagonistic  microorganisms  and  seed  bacterization  on  the
control  for  Fusarium  wilt  of  adzuki-bean  //J.  Pharmacobic-Dyn.  1987.  Vol.  10,  N  3.
P.  57.
 Henry  M.B.,  Lynch  J.M.,  Fermor  ТЯ.  Role  of  siderophores  in  the  biocontrol  of
Pseudomonas  tolaasii  by  fluorescent  pseudomonad  antagonists  //  J.  Appl.  Bacteriol.
1991.  Vol.  70,  N2.  P.  104-108.
 Higashihara  Т.,  Sato  A.  Microbial  formation  of  1  -phenazine-carboxylie  acid
from  hydrocarbons  //Agr.  and  Biol.  Chem.  1969.  Vol.  33.  P.  1802-1804.
 Higashihara  T.t  Sato  A.  Production  of  1-phenazine-carboxylie  acid  from
ethanol  by  a  hydrocarbon-assimilating  bacterium  Pseudomonas  aeruginosa  //  Rep.
Ferment.  Res.  Inst.  1985.  N  63.  P.  80-92.
 Homma  Y.t  Sato  Z.,  Hirayama  F.  et  al.  Production  of  antibiotics  by
Pseudomonas  cepacia  as  an  agent  for  biological  control  of  soilbome  plant
pathogens  I  I  Soil  Biol,  and  Biochem.  1989.  Vol.  21,.N  5.  P.  723-728.
 Horan  NJ.f  Jarman  T.R.,  Dawas  E.A.  Studies  on  some  enzymes  of  alginic  acid
biosynthesis  in  Azotobacter  vinelandii  grown  in  continuous  culture  //  J.  Gen.
Microbiol.  1981.Vol.  129.  P.  2985-2990.
 Howel  СЯ.,  Stipanovic  R.D.  Suppression  of  pythium  ultimum-induced  damp¬
ing-off  of  cotton  seedlings  by  Pseudomonas  fluorescens  and  its  antibiotic,  pyolute-
orin  //  Phytopathology.  1980.  Vol.  70,  N  8.  P.  712-715.
 Howie  W.f  Matsubara  D.,  Gutterson  N.  et  al.  Directed  cuhancement  of  biocon¬
trol  in  Pseudomonas  by  constitutive  antibiotic  biosynthesis:  Abstr.  Present.  1989
Annu.  meet.  Amer.  Phytopathol.  Soc.,  Richmond,  Va.,  Aug.  20-24,  1989  //  Ibid.
 1989. 	Vol.  79,  N10.  P.  1160.
 lacobellis  N.S.,  Evidente  A.,  Surico  G.  Isolation  of  biologically  active  com¬
pounds  from  Pseudomonas  syringae  pv.  papulans  and  Pseudomonas  amygdali  //
Plant  Pathogen.  Bacteriol.:  Proc.  of  7th  Intern,  conf.,  11-16  June,  1989.  Budapest,
 1990. 	P.  139-143.
 lacobellis  N.S.,  Lavermicocca  P.,  Surico  G.  et  al.  Properties  of  a  syringomycin-
macromolecular  complex  produced  by  Pseudomonas  syringae  pv.  Syringae  I  I  Ibid.
1990.  P.  93-97.
 Jacque  P.,  Ongena  М.,  Delfosse  P.  et  al.  Production  of  siderophores  in  antago¬
nistic  and  non-antagonistic  strains  of  Pseudomonas  //  5th  Europ.  congr.  on  biotech¬
nology,  July  8-13,  1990.  Copenhagen,  1990.  Vol.  1.  P.  150-152.
 James  D.W.,  Gutterson  N.I.  Multiple  antibiotics  produced  by  Pseudomonas
fluorescens  HV37a  and  their  differential  regulation  by  glucose  I  I  Appl.  and  Environ.
Microbiol.  1986.  Vol.  52.  P.  1183-1189.
 Janisiewicz  WJ.,  Roitman  J.  Biological  control  of  blue  mold  and  gray  mold  on
apple  and  peer  with  Pseudomonas  cepacia  //  Phytopathology.  1988.  Vol.  78,  N  12,
pt.  2.  P.  1697-1700.
 156

Janisiewicz  W.,  Yourman  L.  Biological  control  of  postharvest  diseases  of  pears
with  Pseudomonas  syringae  pv.  lachrymans:  Abstr.  Present.  1989  Annu.  meet.
Amer.  Phytopathol.  Soc.,  Richmond,  Va.,  Aug.  20-24,  1989  I  I  Phytopathology.
 1989. 	Vol.  79,  N  10.  P.  1216.
 Jayaswal  R.K.,  Fernander  MA.,  Schroeder  R.G.  Isolation  and  characterization
of  a  Pseudomonas  strain  that  restricts  growth  of  various  phytopathogenic  fungi  //
Appl.  and  Environ.  Microbiol.  1990.  Vol.  56,  N  4.  P.  1053-1058.
 Kang  Y.,  Carlson  R.,  Tharpe  W.,  Schell  MA.  Characterization  of  genes
involved  in  biosynthesis  of  a  novel  antibiotic  from  Burkholderia  cepacia  BC11  and
their  role  in  biological  control  of  Rhizoctonia  solani  I  I  Ibid.  1998.  Vol.  64,  N  10.
P.  3939-3947.
 Kanner  D.,  Gerber  N.t  В  art  ha  R.  Pattern  of  phenazine  pigment  production  by
strain  of  Pseudomonas  aeruginosa  //J.  Bacteriol.  1978.  Vol.  134,  N  2.  P.  690.
 Katoh  К.,  I  ton  K.  New  selective  media  for  Pseudomonas  strains  producing  flu¬
orescent  pigment  //  Soil  Sci.  and  Plant  Nutrit.  1983.  Vol.  29.  P.  525-532.
 Kim  K.K.,  Kang  J.G.,  Moon  S.S.,  Kang  K.Y.  Isolation  and  identification  of  anti-
fungal  N-butylbenzenesulphonamide  produced  by  Pseudomonas  sp.  AB2  //  J.
Antibiot.  -  2000.  Vol.  53.  P.  131-136.
 King  E.O.,  Ward  M.K.,  Raney  D.E.  Two  simple  media  for  the  demonstration  of
pyocyanin  and  fluorescin  //J.  Lab.  Clin.  Med.  1954.  Vol.  44.  P.  301-307.
 Kintaka  K.,  Kitano  K.,  Nosari  Y.  et  al.  Sulfazecin,  a  novel  P-lactam  antibiotic
of  bacterial  origin:  Discovery,  fermentation  and  biological  characterization  //  J.
Ferment.  Technol.  -  1981.  Vol.  59,  N  4.  P.  263-268.
 Kirinuki  Т.,  Iwanuma  K.f  Suzuki  N.  et  al.,  Altericidins,  a  complex  of  polypep¬
tide  antibiotics  produced  by  Pseudomonas  sp.  and  their  effect  for  the  control  of
black  spot  of  pear  caused  by  Alter  naria  kikuchiana  Tanaka  I  I  Sci.  Rep.  Fac.  Agr.
Kobe  Univ.  1977.  Vol.  12.  P.  223-230.
 KloepperJ.W.,  Hume  DJ.t  Scher  F.M.  et  al.  Plant  growth-promoting  rhizobac-
teria  on  canola  (rapeseed)  //  Plant  Disease.  1988.  Vol.  72,  N  1.  P.  42-46.
 Kloepper  J.W.,  Schroth  M.N.  Plant  growth-promoting  rhizobacteria  and  plant
growth  under  gnotobiotic  conditions  //  Phytopathology.  1981.  Vol.  71,  N  6.
P.  642-644.
 Knight  М.,  Hartman  Ph.,  Hartman  Z.,  Young  V.  A  new  method  of  preparation
of  piocyanin  and  demonstration  of  an  unusual  bacterial  sensivity  //  Ann.  Biochem.
1979.  Vol.  95,  N  1.  P.  19-23.
 Koby  S.,  Schickler  H.,  Chet  /.,  Oppenheim  A.B.  The  chitinae  encoding  Tn-7-
based  chiA  gene  endows  Pseudomonas  fluorescens  with  the  capacity  to  control
plant  pathogenes  in  soil  //  Gene.  1994.  N  1.  C.  81-83.
 Konde  B.R.,  Desai  J.N.  Influence  of  inoculum  of  Azotobacter  on  growth  and
yield  of  wheat  I  I  Food  Farmg.  Agr.  1976.  Vol.  8,  N  3.  P.  13-14.
 Kucharski  J.,  Wyszkowska  J.,  Nowak  G.  Wplyw  prekursorow  ety-
lenu  i  Azotobacter  sp.  na  plonowanie  bobiku  i  aktywnose  drobnoustrojow  gle-
bowych  //  Rosliny  straczkowe  w  hodowli  i  uprawie.  Warszawa,  1997.  S.  213-220.
 Kumar  V.,  Narula  N.  Solubilization  of  inorganic  phosphates  and  growth  emer¬
gence  of  wheat  as  affected  by  Azotobacter  chroococcum  mutants  //  Biol,  and  Fertil.
Soils.  1999.  Vol.  28,  N  3.  P.  301-305.
 157

Kumari  Lakshmi  М.,  Vijayalashmi  V.,  Subba  Rao  N.S.  Interaction  between
Azotobacter  species  and  fungi  //  Phytopathology.  1972.  Vol.  75.  P.  27-30.
 Kunitaka  S.,  Matsuyama  N.  Purification  of  antifungal  substance  produced  by
Pseudomonas  avenae  Manns  //  Ann.  Phytopathol.  Soc.  Jap.  1989.  Vol.  55,  N  3.
P.  366-368.
 Lamers  J.G.,  Schippers  B.t  Geels  F.P.  Soil-borne  diseases  of  wheat  in  the
Netherlands  and  results  of  seed  bacterization  with  pseudomonads  against
Gaeumannomyces  graminis  var.  tritici  //  Cereal-breeding  related  to  integrated  cere¬
al  production.  Pudoc:  Wageningen,  1988.  P.  134-139.
 Lee  СKim  S.,  Hyun  B.  et  al.  Cepacidine  A,  a  novel  antifungal  antibiotic  pro¬
duced  by  Pseudomonas  cepacia  //J.  Antibiot.  1994.  Vol.  47.  P.  1402-1418.
 Lee  J.,  Moon  S.,  Hwang  B.  Isolation  and  antifungal  and  antioomycete  activities
of  aerugine  produced  by  Pseudomonas  fluorescens  strain  MM-B16  II  Appl.  and
Environ.  Microbiol.  2003.  Vol.  69,  N  4.  P.  2023-2031.
 Leisinger  Т.,  Margraff  R.  Secondary  metabolism  of  the  fluorescent
Pseudomonas  //  Microbiol.  Rev.  1979.  Vol.  43.  P.  422—442.
 Levy  E.,  Eyal  Z.,  Carmely  S.  et  al.  Suppression  of  Septoria  tritici  and  Puccinia
recondite  of  wheat  by  an  antibiotic-producing  fluorescent  pseudomonad  //  Plant
Pathol.  1989.  Vol.  38,  N  4.  P.  564-570.
 Liang  X.Y.,  Huang  H.C.,  Yanke  LJ.  Control  of  damping-off  of  safflower  by
bacterial  seed  treatment  //  Canad.  J.  Pathol.  1996.  N  1.  P.  45-49.
 Liao  C.H.  Antagonism  of  Pseudomonas  putida  strain  PP22  to  phytopathogenic
bacteria  and  its  potential  use  as  a  biocontrol  agent  //  Plant  Disease.  1989.  Vol.  73,
N  3.  P.  223-226.
 Liste  H.H.  Stimulation  of  symbiosis  and  growth  of  lucerne  by  combined  inoc¬
ulation  with  Rhizobium  meliloti  and  Pseudomonas  fluorescens  I  I  Zbl.  Mikrobiol.
1993.  Bd.  148,  N  3.  S.  163-176.
 Lively  D.,  Gorman  М.,  Mabe  M.  Metabolism  of  tryptophans  by  Pseudomonas
aureofaciens.  I.  Biosynthesis  of  pyrrolnitrin  //  Antimicrobial  agents  and  chemother¬
apy.  Philadelphia,  1966.  P.  462-469.
 Loper  J.E.  Role  of  fluorescent  siderophore  production  in  biological  control  of
Pythium  ultimum  by  a  Pseudomonas  fluorescens  strain  I  I  Phytopathology.  1988.
Vol.  78,  N2.  P.  166-172.
 MacDonald  J.C.  Pyocyanine  //  Antibiotics.  L.;  N.Y.:  Springer,  1967.  Vol.  2:
Biosynthesis.  P.  52-65.
 Mahaffee  W.F.,  Bauske  E.M.,  Kloepper  J.W.  Structural  changes  in  bacterial
communities  associated  with  introduction  of  plant  growth-promoting  rhizobacte¬
ria//Phytopathology.  1995.  N  10.  P.  1191.
 Mao  GH.,  Cappellini  RA.  Postharvest  biocontrol  of  gray  mold  of  pear  by
Pseudomonas  gladioli:  Abstr.  Present.  1989  Annu.  meet.  Amer.  Phytopathol.  Soc.,
Richmond,  Va,  Aug.  20-24,  1989  //  Ibid.  1989.  Vol.  79,  N  10.  P.  1153.
 Martin  J.  Control  of  antibiotic  synthesis  by  phosphate  I  I  Adv.  Biochem.  Eng.
 1977. 	Vol.  6,  N  l.P.  105-127.
 Martin  J.F.,  Marcos  A.T.,  Martin  A.  et  al.  Phosphate  control  of  antibiotic
biosynthesis  at  the  transcriptional  level  //  Phosphates  in  microorganisms:  Cellular
 158

and  molecular  biology  /  Wash.  (D.C.):  Ed.  A.  Torriani-Gorini  et  al.  1992.
P.  140-147.
 Mauerhofer  М.,  Keel  C.,  Haas  D.,  Defago  G.  Pyoluteorin  production  by
Pseudomonas  fluorescens  strain  CHAO  is  involved  in  the  suppression  of  Pythium
damping-off  of  cress  but  not  of  cucumber  //  Europ.  J.  Plant  Pathol.  1994.  Vol.  100.
P.  221-232.
 McLaughlin  RJ.,  Sequeira  L.  Evaluation  of  an  avirulent  strain  of  Pseudomonas
solanacearum  for  biological  control  of  bacterial  wilt  of  potato  //  Amer.  Potato  J.
 1988. 	Vol.  65,  N  5.  P.  255-268.
 McLaughlin  RJ.,  Sequeira  L.,  Weingartner  D.P.  Biocontrol  of  bacterial  wilt  of
potato  with  an  avirulent  strain  of  Pseudomonas  solanacearum:  Interactions  with
root-knot  nematodes  I  I  Ibid.  1989.  Vol.  67,  N  2.  P.  93-107.
 Mew  T.W.,  Rosales  A.M.  Bacterization  of  rice  plants  for  control  of  sheath  blight
caused  by  Rhizoctonia  solani  I  I  Phytopathology.  1986.  Vol.  76,  N  11.  P.  1260-1264.
 Meyer  J.R.,  Linderman  R.G.  Responce  of  subterranean  clover  to  dual  inocula¬
tion  with  vesicular-arbuscular  mycorrhizal  fungi  and  a  plant  growth-promoting  bac¬
terium  Pseudomonas  putida  //  Soil  Biol,  and  Biochem.  1986.  Vol.  18,  N  2.  P.  185.
 Meyers  E.,  Bisacchi  G.S.,  Dean  L.et  al.  Xylocandin:  A  new  complex  of  anti-
fungal  peptides.  I.  Taxonomy,  isolation,  and  biological  activity  //J.  Antibiot.  1987.
Vol.  40.  P.  1515-1529.
 Moon  S.-S.,  Kang  P.М.,  Park  К  S.,  Kim  C.H.  Plant  growth  promoting  and  fun¬
gicidal  4-quinolines  from  Pseudomonas  cepacia  //  Phytochemistry.  1996.  Vol.  42.
P.  365-368.
 Mrkovacki  N.,  Cacic  N.,  Kovacev  L.  et  al.  Response  of  sugar  beet  to  inocula¬
tion  with  Azotobacter  in  field  trials  //  Agrochimica.  2002.  Vol.  46,  N  1/2.  P.  18-26.
 Mrkovacki  N.,  Kovacev  L.,  Cacic  N.  et  al.  Primena  mikrobioloskog  preparata  u
proi-zvodnji  seceme  repe  //  Zb.  Rad.  /  Nauc.  Inst.  Ratarstvo  Povrtarstvo.  2001.
Sv.  35.  S.  67-73.
 Munoz-Garcia  Andres  A.,  Valdes  M.  The  population  dynamics  of  maize  rhizo-
plane  inoculated  with  Pseudomonas  and  Azospirillum  //  Rev.  latinoamer.  microbiol.
1995.  N4.  P.  305-313.
 Nair  S.K.,  Chandra  N.  Phytohormone  production  by  diazotrophs  associated
with  plantation  and  orchard  crops  //  J.  Trop.  Agr.  1997.  Vol.  35,  N  1/2.  P.  47-48.
 Narula  N.t  Kumar  V.,  Behl  R.K.,  et  al.  Effect  of  P-solubilizing  Azotobacter
chroococcum  on  N,  P,  К  uptake  in  P-responsive  wheat  genotypes  grown  under
greenhouse  conditions  I  I  J.  Plant.  Nutrit.  and  Soil  Sci.  2000.  Vol.  163,  N  4.
P.  393-398.
 Nielsen  N.M.,  S0rensen  J.,  Fels  J.,  Pedersen  H.C.  Secondary  metabolite  and
endochitinase-dependent  antagonism  toward  plant-pathogenic  microfungi  of
Pseudomonas  fluorescens  isolates  from  sugar  beet  rhizosphere  //  Appl.  Environ.
Microbiol.  1998.  Vol.  64.  P.  3563-3569.
 Nielsen  Т.Н.,  Thrane  C.,  Christophersen  C.  et  al.  Structure,  production  charac¬
teristics  and  fungal  antagonism  of  tensin  -  a  new  cyclic  lipopeptide  from
Pseudomonas  fluorescens  strain  96.578  //  J.  Appl.  Microbiol.  2000.  Vol.  89.
P.  992-1001.
 159

Nishijima  F.,  Evans  W.R.,  Vesper  SJ.  Enhances  nodulation  of  soybean  by
Bradyrhizobium  in  presense  of  Pseudomonas  fluorescens  //Plant  ant  Soil.  1988.
Vol.  Ill,  N  1.  P.  149.
 Novotnd  J.  Antagonisticky  vliv  Ьакгёпс  Pseudomonas  fluorescens  na  nektere
patogenni  i  saprofytick£  druhy  hub  fepky  a  Inu  //  Ochr.  rostl.  1990.  Sv.  26,  N  2.
S.  113-122.
 Nowak-Thompson  B.t  Gould  SJ.,  Kraus  J.,  Loper  J.E.  Production  of  2,4-
diacetylphloroglucinol  by  the  biocontrol  agent  Pseudomonas  fluorescens  Pf-5  //
Canad.  J.  Microbiol.  1994.  Vol.  40.  P.  1064-1066.
 Ohmori  Т.,  Hagiwara  S.,  Ueda  A.  et  al.  Production  of  pyoluteorin  and  its  deriv¬
atives  from  n-paraffin  by  Pseudomonas  aeruginosa  S  10B2  //Agr.  and  Biol.  Chem.
 1978. 	Vol.  42.  P.  767-771.
 Osburn  R.M.,  Schroth  MJV.,  Hancook  J.G.  et  al.  Dynamics  of  sugar  beet  colo¬
nization  by  Pythium  ultimum  and  Pseudomonas  species:  Effects  on  seed  rot  and
damping-off  //Phytopathology.  1989.  Vol.  79,  N  6.  P.  709-716.
 Ownley  B.H.,  Weller  D.M.,  Thomashow  L.S.  Effects  of  soil  pH  on  suppression
of  take-all  by  Pseudomonas  fluorescens  2-79:  Abstr.  Present.  1989  Annu.  meet.
Amer.  Phytopathol.  Soc.,  Richmond,  Va,  Aug.  20-24,  1989  //  Ibid.  1989.  Vol.  79,
N  10.  P.  1159.
 Pandey  A.,  Kumar  S.  Inhibitory  effects  of  Azotobacter  chroococcum  and
Azospirillum  brasilense  on  a  range  of  rhizospere  fungi  I  I  Indian.  J.  Exp.  Biol.  1990.
Vol.  28,  N  1.  P.  52-54.
 Parente  E.,  Crudele  M.A.,  Aquino  M.  et  al.  Alginate  production  by  Azotobacter
vinelandii  DSM  567  in  batch  fermentation  //  J.  Industr.  Microbiol,  and  Biotechnol.
 1998.N  20.  P.  171-176.
 Parker  WL.,  Rathnum  ML.,  Seiner  V.  et  al.  Cepacin  A  and  cepacin  B,  two  new
antibiotics  produced  by  Pseudomonas  cepacia  //  J.  Antibiot.  1984.  Vol.  37.
P.  431-440.
 Paulitz  Т.,  Nowak-Thompson  B.,  Gamard  P.  et  al.  A  novel  antifungal  furanone
from  Pseudomonas  aureofaciens,  a  biocontrol  agent  of  fungal  plant  patogens  //  J.
Chem.  Ecol.  2000.  Vol.  26.  P.  1515-1524.
 Pierson  L.S.P.,  III,  Pierson  E.A.  Phenazine  antibiotic  production  in
Pseudomonas  aureofaciens:  Role  in  rhizosphere  ecology  and  pathogen  suppression
//FEMS  Microbiol.  Lett.  1996.  Vol.  136.  P.  101-108.
 Pietr  SJ.,  Kempa  R.  Cucumber  rhizosphere  pseudomonads  as  antagonists  of
Fusarium  I  I  Interrelationships  between  microorganisms  and  plants  soil:  Proc.  Intern,
symp.,  June  22-27,  1987.  Praha,  1989.  P.  411^17.
 Powell  J.F.,  Vargas  J.M.,  Nairet  M.G.  et  al.  Management  of  dollar  spot  on
creeping  bentgrass  with  metabolites  of  Pseudomonas  aureofaciens  (TX-1)  I  I  Plant
Disease.  2000.  N  1.  P.  19-24.
 Rabie  KA.E.,  Nasr  SA.,  Mervat  A  A.  The  effect  of  a  symbiotic  nitrogen  fixers
on  the  growth  and  endogenous  growth  substances  of  wheat  plants  //  Ann.  agr.  sci.
 1995. 	Vol.  40,  N  1.  P.  11-32.
 Renato  de  Freitas  J.,  Germida  JJ.  Pseudomonas  cepacia  and  Pseudomonas
putida  as  winter  wheat  inoculants  for  biocontrol  of  Rhizoctonia  solani  //  Canad.  J.
Microbiol.  1991.  Vol.  37,  N  10.  P.  780-784.
 160

Rhodes  DJ.,  Logan  C.  Effects  of  fluorescent  pseudomonads  on  the  potato
blacked  syndrome  //  Ann.  Appl.  Biol.  1986.  Vol.  108,  N  3.  P.  511-518.
 Roitman  /JV.,  Mahoney  N.E.,  Janisiewicz  WJ.,  Benson  M.  A  new  chlorinated
phenylpyrrole  antibiotic  produced  by  the  antifungal  bacterium  Pseudomonas  сера-
cia  //J.  Agr.  and  Food  Chem.  1990.  Vol.  38,  N  2.  P.  538-541.
 Sarniguet  A.,  Lucas  P.,  Lucas  M.  Relationships  between  take-all,  soil  con¬
duciveness  to  the  disease,  populations  of  fluorescent  pseudomonads  and  nitrogen
fertilizers//Ibid.  1992.  Vol.  145,  N  1.  P.  17-27.
 Savithiry  S.,  Gnanamanickam  S.S.  Bacterization  of  peanut  with  Pseudomonas
fluorescent  for  biological  control  of  Rhizoctonia  solani  and  for  enhanced  yield  //
Ibid.  1987.  Vol.  102,  N  1.  P.  11-15.
 Scher  F.M.,  Kloepper  J.W.,  Singleton  C.  Colonization  of  soubean  roots
by  Pseudomonas  and  Serratia  species:  Relationship  to  bacterial  motility,
chemotaxis  and  generation  time  //  Phytopathology.  1988.  Vol.  78,  N  8.
P.  1055-1059.
 Shanahan  P.,  Borro  A.,  Ogara  F.f  Glennon  J.D.  Isolation,  trace  enrichment  and
liquid-chromatographic  analysis  of  diacetylphloroglucinol  in  culture  and  soil  sam¬
ples  using  UV  and  amperometric  detection  //  J.  Chromatogr.  1992.  Vol.  606.
P.  171-177.
 Shanshoury  A.R.  Interactions  of  Azotobacter  chroococcum,  Azospirillum
brasilense  and  Streptomyces  mutabilis  in  relation  to  their  effect  on  wheat  develop¬
ment  //J.  Agron.  Crop.  Sci.  1995.  Vol.  175.  N  2.  P.  119-127.
 Sikora  R.A.,  Bodenstein  F.,  Nicolay  R.  Einflup  der  Behandlung  von
Rubensaatgut  mit  Rhizospharebakterien  auf  den  Befall  durch  Pilze  der  Gatting
Puthium.  Antagonistische  Wirkung  verschiedener  Bakterienisolate  gegenuber
Pythium  spp.  //  J.  Phytopathol.  1990.  Bd.  129,  N  2.  S.  111-120.
 Sindhu  S.S.,  Lakshminarayana  K.,  Singh  D.  Expression  of  hydrogenase  activi¬
ty  in  Azotobacter  chroococcum  and  its  possible  role  in  crop  productivity  I  I  Ind.  J.
Exp.  Biol.  1994.  Vol.  32,  N  4.  P.  423^26.
 SliningerP.,  Shea-Wilbur  M.A.  Liquid-culture  pH,  temperature  and  carbon  (not
nitrogen)  sourse  regulate  phenazine  productivity  of  the  take-all  biocontrol  agent
Pseudomonas  fluorescens  2-79  I  I  Appl.  Microbiol.  Biotechnol.  1995.  Vol.  43.
P.  794-800.
 Slininger  PJ.,  Van  Cauwenberger  J.E.,  Bothast  R.G.  et  al.  Effect  of  growth
culture  physiological  state,  metabolites,  and  formulation  on  the  viability,  phytotox¬
icity,  and  efficacy  of  the  take-all  biocontrol  agent  Pseudomonas  fluorescens  2-79
stored  encapsulated  on  wheat  seeds  //Ibid.  Vol.  45.  P.  391-398.
 Sobiczewski  P.,  Bruk  H.  Mozliwosci  i  ograniczenia  biologicznej  ochronny
jablek  bakteriami  Pantoea  agglomerans  i  Pseudomonas  sp.  przed  szara  plesnia  i
mokra  zgnilizna//  Post.  ochr.  rosl.  1999.  N  1.  C.  139-147.
 Sood  M.C.,  Sharma  R.C.  Value  of  growth  promoting  bacteria,  vermicompost
and  Azotobacter  on  potato  production  in  Shimla  hills  //  J.  Ind.  Potato  Assoc.  2001.
Vol.  28,  N  1.  P.  52-53.
 Sorensen  D.,  Nielsen  T.H.,  Christophersen  C.  et  al.  Cyclic  lipoundecapeptide
amphisin  from  Pseudomonas  sp.  strain  DSS73  //  Acta  crystallogr.  C.  2001.  Vol.  57.
P.  1123-1124.
 161

Sugimoto  E.E.,  Hoitink  HAJ.,  Tuovinen  0Л.  Oligotrophic  pseudomonads  in
the  rhizosphere:  Suppressiveness  to  Pythium  damping-off  of  cucumber  seedlings
(Cucumis  sativus  L.)  //  Biol,  and  Fertil.  Soils.  1990.  Vol.  9,  N  3.  P.  231-234.
 Suneja  S.,  Lakshminarayana  K.  Production  of  hydroxamate  and  catechol
siderophores  by  Azotobacter  chroococcum  I  I  Ind.  J.  Exp.  Biol.  1993.  Vol.  31,  N  11.
P.  878-881.
 Suneja  S.,  Narula  N.,  Anand  R.C.  et  al.  Relationship  of  Azotobacter  chroococ¬
cum  siderophores  with  nitrogen  fixation  //  Folia  microbiol.  1996.  Vol.  41,  N  2.
P.  154-158.
 Suslov  T.V.,  Schroth  MM.  Rhizobacteria  of  sugar  beets:  effects  of  seed  appli¬
cation  and  root  colonization  on  yield  //  Phytopathology.  1982.  Vol.  72,  N  2.
P.  199-206.
 Suzumura  K.,  Taka  has  hi  /.  et  al.  Structural  elucidation  of  YM-75518,  a  novel
antifungal  antibiotic  isolated  from  Pseudomonas  sp.  Q38009  I  I  Tetrahedron  Lett.
 1997. 	Vol.  38,  N  43.  P.  7573-7576.
 Swinburne  ТЯ.  Stimulation  of  disease  development  by  siderophores  and  inhi¬
bition  by  chelated  iron  //  Iron,  siderophores  and  plant  diseases:  Proc.  NATO  Adv.
Res.  Workshop,  Wye,  July  1-5,  1985.  N.Y.;  L.,  1986.  P.  217-226.
 Takeda  R.  Pseudomonads  pigments.  II.  Two  pigments,  penazinee-carboxylic
acid  and  oxy  chlororaphine,  produced  by  P.  aeruginosa  T  359  //  J.  Ferment.
Technol.  1958.  Vol.  36,  N  2.  P.  286-290.
 Takeda  R.  Pseudomonads  pigments.  IV.  The  structure  of  pyoluteorin  //  Bull.
Agr.  and  Chem.  Soc.  Jap.  1959.  Vol.  23,  N  3.  P.  165-171.
 Tang  Weizhen.,  Pasternak  JJ.,  Bernard  Glick  R.  Persistence  in  soil
of  the  plant  growth  promoting  rhizobacterium  Pseudomonas  putida  GR12-2  and
genetically  manipulated  derived  strains  I  I  Canad.  J.  Microbiol.  1995.  N  6.
P.  445-451.
 Thomashow  L.S.,  Weller  D.M.  Role  of  antibiotics  and  siderophores  in  biocon¬
trol  of  take-all  disease  of  wheat  //  Plant  and  Soil.  1990.  Vol.  129,  N  1.  P.  93-99.
 Thomashow  L.S.,  Weller  DM.,  Bonsall  R.F.  et  al.  Production  of  the  antibiotic
phenazine-l-carboxylic  acid  by  fluorescent  Pseudomonas  species  in  the  rhizosphere
of  wheat  I  I  Appl.  and  Environ.  Microbiol.  1990.  Vol.  56,  N  4.  P.  908-912.
 Tomar  U.S.,  Tomar  I.S.,  Badaya  A.K.  Response  of  chemical  and  biofertilizers
on  some  matric  traits  in  wheat  //  Crop  Res.  1998.  Vol.  16,  N  3.  P.  408-410.
 Tooney  JJ.,  Nelson  CD.,  Krotrov  G.  Isolation  and  identification  of  two
phenazines  from  a  strain  of  Pseudomonas  aureofasiens  //  Can.  J.  Bot  1965.  Vol.  43,
N  9.  P.  1055-1062.
 Tosi  L.,  Zazzerini  A.  Evaluation  of  some  and  bacteria  for  potential  control  of
safflower  rust  //  J.  Phytopathol.  1994.  N  2.  P.  131-140.
 Toyoda  H.,  Hashimoto  H.,  Utsumi  R.  et  al.  Detoxification  of  fusaric  acid  by  a
fusaric  acid-resistant  mutant  of  Pseudomonas  solanacearum  and  its  application  to
biological  control  of  Fusarium  wilt  of  tomato  //  Phytopathology.  1988.  Vol.  78,
N  10.  P.  1307-1311.
 Tsuyumu  S.,  Tsuchida  S.,  N  aka  no  T.  et  al.  Antifungal  activiti  in  cell-free  culture
fluid  of  Pseudomonas  solanacearum  I  I  Ann.  Phytopathol.  Soc.  Jap.  1989.  Vol.  55,
N  l.P.  9-15.
 162

Vargas-Garcia  М.С.,  Lopez  MJ.,  Elorrieta  МЛ.  et  al.  Properties  of  polysac¬
charide  produced  by  Azotobacter  vinelandii  cultured  on  4-hydroxybenzoic  acid  I  I  J.
Appl.  Microbiol.  2003.  Vol.  94.  P.  388-395.
 Vasantha  D.T.,  Malar  1Л/?.,  Sakthivel  N.  et  al.  Biological  control  of  sheath-
blight  of  rice  in  India  with  antagonistic  bacteria  I  I  Plant  and  Soil.  1989.  Vol.  119,
N  2.  P.  325-330.
 Venkateswaran  K.,  Harayama  S.  Sequential  enrichment  of  microbial  popula¬
tions  exhibiting  enhanced  biodegradation  of  crude  oil  //  Canad.  J.  Microbiol.  1995.
Vol.  41.  P.  767-775.
 Vrany  J.,  Rasochova  М.,  Fiker  A.  et  al.  Inoculation  of  potatoes  with  microor¬
ganisms  under  field  conditions.  Effect  on  plant  growth  yields  and  physiological
properties  of  tubers  in  potato  and  sugar-beet  regions  //  Folia  microbiol.  (tSSR).
 1990. 	Vol.  35,  N  4.  P.  326.
 Weller  DM.,  Cook  RJ.  Suppression  of  root  diseases  of  wheat  by  fluorescent
pseudomonas  and  mexanisms  of  action  //  Iron,  siderophores  and  plant  diseases:
Proc.  NATO  Adv.  Res.  Workshop,  Wye,  July  1-5,  1985.  N.Y.;  L.,  1986.  P.  99-107.
 Weller  DM.,  Howie  WJ.t  CookRJ.  Relationship  between  in  vitro  inhibition  of
Gaeumannomyces  graminis  var.  tritici  and  suppression  of  take-all  of  wheat  by  flu¬
orescent  pseudomonads  //  Phytopathology.  1988.  Vol.  78,  N  8.  P.  1094-1100.
 Weller  DM.,  Thomashow  L.S.  Antibiotics:  Evidence  for  their  operation  and
sites  where  they  might  by  produced  //J.  Cell.  Biochem.  1989.  Suppl.  13A.  P.  154.
 Wessendorf  J.,  Lingens  F.  Effect  of  culture  and  soil  conditions  on  survival  of
Pseudomonas  fluorescens  R1  in  soil  I  I  Appl.  Microbiol,  and  Biotechnol.  1989.
Vol.  31,  N  l.P.  97-102.
 Wilson  CL.,  Chalutz  E.  Postharvest  biological  control  of  Penicillium  rots  of  cit¬
rus  with  antagonistic  yeasts  and  bacteria  //  Sci.  hort.  1989.  Vol.  40,  N  2.  P.  105-112.
 Zablotowicz  R.M.,  Tipping  EM.,  Scher  F.M.  et  al.  In-furrow  spray  as  a  deliv¬
ery  system  for  plant  growth-promoting  rhizobacteria  and  other  rhizosphere-compe-
tent  bacteria  //  Canad.  J.  Microbiol.  1991.  Vol.  37,  N  8.  P.  632.
 Zahir  Z.A.,  Arshad  М.,  Azam  М.,  Hussain  A.  Effect  of  an  auxin  precursor  tryp¬
tophan  and  Azotobacter  inoculation  on  yield  and  chemical  composition  of  potato
under  fertili-zed  conditions  //  J.  Plant  Nutrit.  1997.  Vol.  20,  N  6.  P.  745-752.
 Zaspel  J.  Isolierung  und  Selektion  fluoreszierender  Pseudomonas-Arten  als
Antagonisten  gegen  Gaeumannomyces  graminis  (Sacc.)  Arx  et  Olivier  //  Arch.
Phytopathol.  und  Pflanzenschutz.  1989.  Bd.  25,  H.  2.  S.  123-130.

СОДЕРЖАНИЕ
 Введение  		3
 Бактерии  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter  -  антагонисты  фитопа¬
тогенных  грибов  и  бактерии  		5
 Применение  биопрепаратов  на  основе  псевдомонад  и  азотобактера  для
защиты  растений  от  болезней 		9
 Выделение  и  фенотипическая  характеристика  новых  штаммов
бактерии  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter  -  антагонистов  фитопа¬
тогенных  грибов 		15
 Бактерии  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter  как  представители
группы  PGPR  		29
 Характеристика  выделенных  культур  по  наличию  свойств,  положительно
 влияющих  на  растение  		38
 Фитогормоны,  синтезируемые  штаммами  псевдомонад  и  азотобактера  ... 	38
 Нитрогеназная  активность  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера  		39
 Исследование  способности  к  разложению  фосфатов  у  штаммов  псевдо¬
монад  и  азотобактера  		44
 Особенности  антагонистического  действия  штаммов  псевдомонад
 и  азотобактера  на  фитопатогенные  грибы  		45
 Изучение  ростстимулирующей  активности  штаммов  псевдомонад
и  азотобактера 		50
 Выделение,  очистка  и  характеристика  метаболитов,  обладающих
фунгицидной  активностью,  продуцируемых  бактериями  родов
Pseudomonas  и  Azotobacter  		58
 Влияние  условий  культивирования  на  биосинтез  низкомолекулярных
 метаболитов  штаммами  бактерий  Pseudomonas  		65
 Структура  и  свойства  новых  метаболитов  Pseudomonas  и  Azotobacter,
 обладающих  фунгицидной  активностью 		67
 Комплексообразующая  способность  триглицеридов  Pseudomonas  		80
 Колонизация  ризосферы  растении  бактериями-антагонистами
родов  Pseudomonas  и  Azotobacter 		83
 Изучение  способности  к  колонизации  корней  растений  у  стрептомицин-
резистентного  штамма  Pseudomonas  aureofaciens  ИБ  51str  и  ампициллинре-
зистентного  штамма  Azotobacter  vinelandii  ИБ  4amP  		87
 164

Изучение  влияния  интродукции  штаммов-антагонистов  родов
 Pseudomonas  и  Azotobacter  на  микробиоту  ризосферы  пшеницы 		94
 Оценка  эффективности  применения  новых  штаммов  бактерий
родов  Pseudomonas  и  Azotobacter  для  защиты  растений  от  болезней
и  повышения  урожайности  сельскохозяйственных  культур  		98
 Изучение  эффективности  применения  штаммов  псевдомонад  и  азотобак¬
тера  для  защиты  пшеницы  от  корневых  гнилей  и  альтернариоза  в  услови¬
ях  вегетационных,  полевых  и  производственных  испытаний  		100
 Оценка  эффективности  применения  штаммов  бактерий  p.  Pseudomonas
против  твердой  головни  в  условиях  защищенного  и  открытого  грунтов  .. 	111
 Использование  штаммов  псевдомонад  и  азотобактера  в  качестве  агентов
биологического  контроля  заболеваний  овощных  культур 		118
 Разработка  технологии  опытно-промышленного  производства
биопрепаратов  на  основе  бактерий-антагонистов 		127
 Исследование  процесса  выделения  биомассы  микроорганизмов  из  культу¬
ральной  жидкости  		127
 Разработка  твердых  препаративных  форм  биопрепаратов 		130
 Технологическая  схема  опытно-промышленного  производства  биопре¬
паратов  		136
 Заключение 		139
 Литература  		142

Логинов  О.Н.
 Бактерии  Pseudomonas  и  Azotobacter  как  объекты  сельскохозяйст¬
венной  биотехнологии  /  О.Н.  Логинов  ;  [отв.  ред.  Ф.М.  Шакирова]  ;
Ин-т  биологии  Уфим.  науч.  центра  РАН;  ГУП  “Опыт,  завод  АН  РБ”
АН  Респ.  Башкортостан.  -  М.:  Наука,  2005.  -  166  с.  -  ISBN  5-02-034403-6
(в  пер.).
 Монография  посвящена  разработке  биопрепаратов  комплексного  действия  на  осно¬
ве  почвенных  бактерий  родов  Pseudomonas  и  Azotobacter.  Приведено  микробиологическое
описание  группы  новых  эффективных  штаммов  антагонистов  грибных  фитопатогенов.
Определена  химическая  структура  метаболитов  с  антибиотическими  свойствами,  проду¬
цируемых  бактериями,  разработаны  биотехнологические  аспекты  производства  новых
микробиологических  препаратов  Елена  и  азолен.  В  полевых  экспериментах  показано  сти¬
мулирующее  воздействие  изученных  бактерий  на  рост  и  развитие  сельскохозяйственных
растений.
 Для  микробиологов,  биохимиков,  биотехнологов,  специалистов  в  области  защиты
растений.

Научное  издание
 Логинов  Олег  Николаевич
 БАКТЕРИИ
PSEUDOMONAS  И  AZOTOBACTER
как  объекты
сельскохозяйственной
биотехнологии
 Утверждено  к  печати  совместным  решением
Ученого  совета  Института  биологии
Уфимского  научного  центра  Российской  академии  наук
и  Научно-технического  совета  ГУП  иОпытный  завод  АН  РБ”
Академии  наук  Республики  Башкортостан
 Зав.  редакцией  Н.А.  Степанова
Редактор  Г.П.  Панова
Художник  Ю.И.  Духовская
Художественный  редактор  В.Ю.  Яковлев
Технический  редактор  З.Б.  Павлюк
Корректор  Е.А.  Желнова

Подписано  к  печати  10.10.2005
Формат  60  х  90  V16.  Гарнитура  Таймс
Печать  офсетная
Усл.печл.  11,0.  Усл.кр.-отт.  13,0.  Уч.-изд.л.  12,0
Тираж  500.  Заказ  438.
 Издательство  “Наука”
 117997,  Москва,  Профсоюзная  ул.,  90
 E-mail:  secret@naukaran.ru
www.naukaran.ru
 Отпечатано  в  ООО  «ДизайнПолиграфСервис»
450005,  г.  Уфа,  ул.  Кирова,  65,  тел.:  (3472)  52-70-88
www.dizain.ufanet.ru

ЛОГИНОВ  Олег  Николаевич-
доктор  биологических  наук.
 |  Область  научных  интересов:
микробиологические,  био-
.!  Ы  химические  и  биотехнологи-
'  ческие  аспекты  Использо¬
вания  биопрепаратов  в  сель-
 ! 	L 	ском  хозяйстве  И  ЭКОЛОГИИ.
 Автор  79  опубликованных  научных  работ,
XI  также  29  авторских  свидетельств  СССР  и
Патентов  Российской  Федерации.
 НАУКА