Выделение и анализ природных биологически активных веществ - Сироткина Е.Е.

Автор: Сироткина Е.Е.

Теги: физиология растений классификация органических соединений элементоорганические соединения органическая химия растения биология ботаника лекарственные растения издательство томского университета фармокология активные вещества

Год: 1987

Похожие

Человек и биологические активные вещества

Биологически активные вещества лекарственных растений

Физиология растений

Женьшень

Текст

он
ВЫДЕЛЕНИЕ
И
н
о
н
СН.ОН
АНАЛИЗ " ,
ПРИРОДНЫХ
БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ
ВЕЩЕСТВ ,

ТОМСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ
МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ
ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ ТОМСКОГО НАУЧНОГО
ЦЕНТРА АМН СССР
ВЫДЕЛЕНИЕ
И АНАЛИЗ
ПРИРОДНЫХ
БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Под редакцией доктора химических наук
Е. Е. Сироткиной
ИЗДАТЕЛЬСТВО ТОМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Томск—1987
УДК 581.192 (547.913+547.172+547.581)
Выделение и анализ природных биологически активных веществ/
Е. А. Краснов, 1*. П. Березовская, Н. В. Алексеюк,
Н. И. Белоусова, Л. А. Демиденко, В. В.'Дудко,
С. Е. Д м и т р у к, Г. И. К а л и н к и н а, Г. А. Романов а.— Томск:
Изд-во Том. ун-та, 1987. — 184 с. — 1 р. 60 к. 5000 экз. 4108000000.
В книге рассматривается ряд групп биологически актйвных сое-
динений растительного происхождения: эфирные масла, азулены, по-
лиины, сесквитерпеновые лактоны, тритерпеновые сапонины, экди-
стероиды, иридоиды, флавоноиды и кумарины. Приведены характе-
ристика, распространение, локализация в растениях, классификация
каждой группы природных соединений, а также методы выделения
и разделения, особенности идентификации, установления строения
и методы количественного определения. Для понимания биологиче-
ских процессов, происходящих в растении при образовании природ-
ных веществ, сообщаются сведения’об основных путях их биосин-
теза в связи с общим обменом веществ.
Для химиков^ биохимиков, ботаников и студентов фармацевти-
ческих институтов.
Рецензент— докт. биол. наук А. В. Положий
4108000000
177(012)—87
105-86
(6) Издательство Томского университета, 1987
ПРЕДИСЛОВИЕ
В Постановлении ЦК КПСС и Совета Министров
СССР «О дальнейшем развитии медицинской науки
в районах Сибири и Дальнего Востока» (13 августа
1979 г.) уделено большое внимание расширению ис-
следований дикорастущих лекарственных растений
с целью выявления в природе новых источников и созда-
нию на их основе лекарственных препаратов. В связи
'с этим Президиум СО АМН СССР составил региональ-
ную научную программу «Лекарственные растения
.Сибири и Дальнего Востока», а в октябре 1983 г.была
проведена Всесоюзная конференция «Проблемы освое-
ния лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Вос-
тока».
- Участие в программе различных учреждений, зани-
мающихся вопросами химического скрининга и изуче-
ния биологически активных веществ с использованием
различных методических подходов, затрудняет объек-
тивную оценку полученных результатов, поэтому целе-
сообразно создание унифицированных методик хотя бы
на этапе химического скрининга, чтр одновременно
явится инструментом координации исследований.
Предлагаемая читателю работа является итогом
анализа и обобщения литературных и собственных дан-
ных, полученных в результате Многолетних исследова-
ний сотрудниками фармацевтического факультета Том-
ского медицинского института.
В книге излагаются вопросы химической природы
эфирных масел, проазуленов, полиинов, сесквитерпено-
вых, лактонов, иридоидов, тритерпеновых сапонинов,
экдизонов, флавоноидов, и кумаринов, их распростра-
нения и локализации в растениях. Кроме того, в каж-
дую главу, посвященную * определенной группе биоло-
гически активных соединений, включены основные ма-
3
териалы исследования: обнаружение, выделение сум-
марных фракций и разделение на индивидуальные ком-
поненты, количественное Определение, идентификация
и установление строения с помощью химических и со-
временных инструментальных методов. Для целена-
правленной постановки всей схемы фитохимического
анализа приведены краткйе сведения об основных путях
биосинтеза рассматриваемых групп соединений, дающих
представление о биологических процессах,' происходя-
щих в растении при образовании природных веществ.
В написании книги участвовали: Н. И. Белоусова____
гл. 1; Г. И. Калинкина__гл. 2; С. Е. Ддаитрук__гл. 3;
В. В. Дудко — гл. 4; Г. А. Романова — гл. 5;
Ё. А. Краснов — гл. 6, -7; Л. А. Демиденко — гл. 8;
Н. В. Алексеюк — гл. 9; Т. П. Березовская — гл. 10.
Глава 1
ЭФИРНЫЕ МАСЛА "
1. Общая характеристика
Эфирные масла представляют собой сложные мно-
гокомпонентные смеси летучих душистых и разнообраз-
ных по структуре органических веществ, образующихся
в растениях в процессе жизнедеятельности. В их состав
входят вещества, относящиеся к различным классам ор-
ганических соединений: алифатические, алициклические,
ароматические и гетероциклические. Среди них встреча-
ются углеводороды, спирты, кислоты, альдегиды, кетоны,
фенолы, лактоны, оксиды, простые и сложные эфиры и
другие соединения.
Наиболее распространенными компонентами эфир-
ных масел являются терпены и их кислородсодержа-
щие производные. Наряду с монотерпенами общей
формулы СюН1б в эфирных маслах содержатся сескви-
терпены С15Н24 и их производные. Ароматические и
алифатические соединения встречаются реже.
Растения, содержащие эфирные масла и натураль-
ные эфирные масля», с давних пор употребляли в каче-
стве благовоний и пряностей. В основе характера ис-
пользования лежали органолептические (вкус, запах) и
антимикробные свойства сырья. Исторически сложи-
лось,. что наиболее широкое применение натуральные
эфирные масла. нашли в парфюмерной, косметической,
кондитерской и пищевой промыщленности.
Интерес к эфирным маслам как .к лечебным средст-
вам основан на их биологической активности.. Они с ус-
пехом используются для лечения заболеваний верхних
дыхательных путей ’(Растворы эфирного масла багуль-
ника—при ринитах, масло эвкалипта, сосны, пихты,
мяты и др.—для ингаляций), обладают- выраженным
спазмолитическим действием и. дают седативный эф-
фект (масла мяты, корней валерианы и др.). Эфирное
масло мяты издавна используется также для лечения
5
туберкулеза и в качестве ранозаживляющего сред-
ства [1, 2]. Авторы работы [26, 43] выявили противо-
воспалительное и ранозаживляющее свойство эфирных
масел 'багульника болотного, полыней и тысячелистни-
ка азиатского.
Эфирные Масла могут использоваться самостоятель-
но, а также усиливать лечебные свойства препарата
в комплексе о другими компонентами [29], их биоло-
гическая активность зависит от химического состава.
В медицинской практике общеизвестно применение с ле-
чебной целью и отдельных компонентов эфирных ма-
сел [37, 29]. Так, производные п-цимола используются
в качестве анестетиков [61], ментол и камфора входят
в состав валидола [41], ледол предложен в качестве
противокашлевого средства [4], хамазулен дает рано-
заживляющий и противовоспалительный эффект [43].
Интерес к эфирным маслам и к растениям, их со-
держащим, за последние годы сильно возрос, что можно
объяснить не только выраженными антибактериальны-
ми свойствами эфирных масел, но и тем, что они, как
и многие антибиотические вещества высших растений,
стимулируют защитные реакции клеток и тканей, акти-
визируют процессы регенерации.
2. Распространение в растительном мире
Эфирно-масличные растения встречаются почти
в 90 семействах, из них в тропической зоне произра-
стает 43,6%, в субтропиках — около 10%, а в умерен-
ной зоне — около 28 %.
В настоящее время известно около 3000 эфирно-
масличных растений; на мировом рынке представлено
более 120 ценных и широко используемых в различных
отраслях народного хозяйства эфирных масел (розовое,
лавандовое; гвоздичное, лимонное, имбирное, сантало-
вое, пачулевое, ветиверовое, леманграссовое, неролие-
вое и многие другие). Во флоре СССР насчитывают
около 1000 видов эфирно-мосличных растений (около
5% от видового состава отечественной флоры), из ука-
занного количества производится и используется лишь
40 видов эфирных масел. Флора Сибири (по данным
гербария им. проф. П. Н. Крылова при ТГУ) насчитыва-
ет 3380 видов цветковых растений, из которых перспек-
тивными душистыми являются 74 вида (2,1%). Наибо-
6
лее богаты эфирно-масличными сем. Asteraceae, Apiaceae,
Lamiaceae и Pinaceae. В настоящее время поисковые
исследования выявили более 70 видов ценных эфироно-
сов из сем. Asteraceae [7—10], около 60 видов душис-
тых и пряных растений из сем. Lamiaceae и Apiaceae
[39, 44, 18, 42, 21].
3. Локализация в растениях
Эфирн-ые масла в растении могут накапливаться в
различных органах: лепестках (роза, жасмин), плодах
(цитрусовый, тмин, фенхель, анис, кориандр), корневи-
щах (аир, девясил, валерьяна, колюрия), в древесине
.(сосна и др. хвойные), но наиболее часто в листьях
(йалфей,. мята, чабрец, эвкалипт, герань и т. д.).
Локализуются эфирные масла в специализирован-
ной выделительной ткани экзогенного (железистые во-
лоски различного типа и эфирно-масличные железки)
и эндогенного типов (секреторные клетки, вместилища,
секреторные канальцы). Определение типа локализации
чрезвычайно важно для исследователя при установле-
нии условий гидродистилляции, особенно при опреде-
лении количественного содержания эфирного масла
в исследуемом растении. Если оно локализуется в эфир-
но-масличных ^анальцах и вместилищах, в условиях
экспёримента должна быть предусмотрена более дли-
тельная обработка сырья водяным паром (иногда до
7 ч) с целью более полного;его извлечения.
Хранить сырье необходимо цельным, неизмельчен-
ным,- в плотно закрытой таре (например, в мешках из
плотной бумаги с двойными стенками) в сухом про-
хладном месте.
4. Классификация
Ввиду разнообразия состава эфирных масел клас-
сификация их довольно условна. Видимо, наиболее
пригодной является классификация, в основу которой
положены главные ценные составные части эфирных
масел. По этому принципу их можно разделить на
группы, содержащие:
1) монотерпены CioHfe (ациклические, моноцикли-
ческие и бициклические);
2) сесквитерпены С15Н24;
3) 'ароматические соединения.
7
Ациклические монртерпены сравнительно
малочисленны, по агрегатному состоянию—жидкости.
Благодаря им эфирные масла таких растений, как ро-
за, герань, лаванда, жасмин, цитрусовые, обладают
тонким. приятным запахом и применяются в парфюме-
рии.
К ациклическим монотерпенам относят ненасыщен-
ные соединения жирного ряда с 3 двойными связями
(например, мирцен).
Наиболее распространенными кислородными произ-
водными алифатических терпеной являются: из спир-
тов— гераниол, линалоол, цитронеллол, из альдеги-
дов— цитронеллаль и цитраль, из сложных эфиров —
эфиры гераниола ц, линалоола с органическими кисло-
тами жирного ряда (уксусной, изовалерийновой, мас-
ляной и т. д.).
Моноциклические моно терпены широко
распространены в растительном мире, используются
как ценные лекарственные средства. Так, в эфирном
масле мяты перечной содержатся ментол и ментон, в
масле листьев эвкалипта, шалфея, соцветий цитварной
полыни—цинеол, в эфирном масле лимона, сосны —
лимонен и т. д. Они представляют собой циклические
соединения с 2 двойными связями, преимущественно
производные метилизопропилциклогексана
Двойные связи могут быть в кольце или одна из них—•
в изопропильной группе.
Из углеводородов в эфирных маслах наиболее рас-
пространены лимонен, фелландрен, терпинен и их кисло-
родные производные: терпинеол, ментол, ментон, кар-
8
вон, цинеол. НаряДу с этим встречаются их эфиры с ор-
ганическими кислотами (например, борнилформиат, бор- ,
нилацетат, терпенилацетат и др.).
Бициклические монотерпены встречаются
в эфирных маслах камфорного лавра, некоторых ви-
дов полыни (камфора), пихты, валерьяны (сложные
эфиры борнеола с органическими кислотами), пижмы,
шалфея, хуи (туйон и туйол). Пинен — главный-компо-
нент скипидара, широко используемый в медицине, ор-
ганическом синтезе и технике. /
Бициклические терпены представляют собой соеди-
нения с двумя конденсированными неароматическими
кольцами и одной этиленовой связью. Характерной осо-
бенностью их является способность к глубоким из-
менениям структуры. Из этой группы терпенов можно
выделить -основные соединения типа карана, пинана,
’ сабинана' камфана. Эти углеводороды имеют общую
формулу СюН1б, но сличаются положением малого
цикла
Д3— карен а —пинен сабинен камфен
Их кислородные производные очень разнообразны. Из
спиртов можно отметить сабинол, туйол, борнеол, мир-
тенол, из кетонов — камфору, фенхон, туйон.
Сесквитерпены С15Н24 могут встречаться в
ациклической и циклической формах. Ациклические
сесквитерпены можно рассматривать как ненасыщен-
ные соединения жирного ряда с 4 двойными связями.
Так, фарнезол обнаружен в эфирном масле липы, цит-
.ронеллолоцом, розовом, апельсиновом и. многих дру-
гих маслах -
фарнезол
9
Моноциклические сесквитерпены представляют собой
соединения с одним замкнутым гидроароматическим.
кольцом и двумя двойными связями, одна из которых
находится в кольце, а другая— в алифатической цепи.
Наиболее часто встречаются моноциклические сескви-
терпены типа бисаболана, например, бисаболен, кото-
рый содержится в эфирном масле ромашки, липы и др.
растений
бисаболен
, Бициклические -сесквитерпены — соединения с двумя
конденсированными неароматическими кольцами и дву-
мя этиленовыми связями. В некоторых эфирных маслах
(аира и др.) моно- и бициклические сесквитерпены при-
сутствуют одновременно, что свидетельствует об их
биогенетической, близости.
Особой, группой среди бициклических сесквитерпенов
являются производные . азулена _ высоконепредельного
соединения с 5 двойными связями
скелет азулена СюНв
Ароматические соединения обладают,
как правило, сильными бактерицидными свойствами и
применяются в медицинской практике. Эфирные масла
ажгона и тимьяна, чабреца, душицы и др. растений
содержат тимол; плодов аниса, фенхеля—анетол; гвоз-
дики, эвгенольного базилика, эвгенольной камелии—
эвгенол.
Сами ароматические углеводороды в эфирных мас-
лах встречаются редко, но широко представлены их
10
кислорбдные соединения: спирты (анисовый, бензило-
вый и др.), фенолы ц их эфиры (тимол, карвакрол,
анетол, эвгенол), альдегиды (бензальдегид, анисовый'
альдегид и др.), кетоны (эвгенон, анискетон), бензойная,
фенилуксусная, коричная кислоты и их сложные эфиры
(эстрагол, анетол, хавикол):
карвакрол , анетол эвгенол
тимол
5. Физико-химические свойства
Эфирные масла в большинстве своем представляют
собой прозрачные бесцветные или желтоватые жидко-
сти (реже — окрашенные в другие цвета) с характер-
ным запахом, легко растворимые в органических раст-
ворителях (спирте, эфире, хлороформе, ацетоне и др.),
.практически нерастворимые в воде, но при взбалтыва-
’ нии образующие с ней эмульсии; они (в основном)
легче воды, однако плотность их возрастает с увеличе-
нием содержания кислородных соединений.
Температура кипения эфирных масел колеблется от
140 до 260°С, они оптически активны, имеют определен-
ную температуру застывания и коэффициент рефракции.
Реакция среды масел нейтральная или кислая. При ох-
лаждении ряда эфирных масел часть их застывает,
образуя кристаллическую массу—стеароптен.
Хранят эфирные масла в запаянных стеклянных ам-
пулах в прохладном, защищенном от света месте, так
как под влиянием кислорода воздуха и света они посте-
пенно окисляются, изменяя цвет и запах.
6. Количественное определение
Количественное определение эфирных масел прово-
дится методом гидродистилляции в приборе Клевендже-
ра (аппарат Деринга) [52, 59], принятым в отечествен-
11
ной и зарубежной фармакопеях. Преимущество ис-
пользуемого. прибора перед ^аппаратом Гинзберга
(ГФ IX, ГФ X) заключается в том, что эфирное масло
вместе с дистилляционными водами собирается вне зо-
ны нагрева, что исключает опасность его контакта с
парами воды, окисления и, таким образом, предотвра-
щает изменение физико-химических свойств и качества.
Содержание эфирных масел в эфирно-масличном сырье
колеблется в пределах от тысячных долей процента до
20% в расчете на объемно-массовые единицы.
7. Методы выделения, разделения и анализа эфирных
масел
7.1. Выделение эфирных масел.
До сих пор наиболее распространенным методом
извлечения эфирных масел из растительного сырья яв-
ляется его перегонка с водяным йаром (гидродистилля-
ция). Она основана на свойствах- эфирного масла (ле-
тучесть, нерастворимость в воде), на законе парциаль-
ного давления Рауля, гласящем, что две несмешиваю-
щиеся -жидкости, нагреваемые вместе, закипают при
температуре ниже точки- кипения каждой жидкости в
отдельности.
В лабораторных условиях извлечение эфирных масел -
осуществляют в установке, состоящей из парообразова-
теля, запарника, холодильника и приемника (флорен-
тийская склянка, прообраз которой можно соорудить
из бюретки). Эфирное масло механически отделяется от
воды и, конденсируясь в холодильнике, концентрируется
на поверхности воды в приемнике, помещается в кол-
бочку и высушивается безводным натрия сульфатом.
Через 24 ч оно фильтруется и запаивается в ампулы.
Этот вид эфирного масла Называется первичным, или
Основным. Часть его уходит в дистилляционные воды —
так называемое водорастворимое, или вторичные эфир-
ное масло. В настоящее время существуют различные
способы извлечения его из дистилляционных вод, из
них наиболее распространенный — экстракция диэти-
ловым эфиром, но лучше сначала дистилляционные
воды пропустить через колонку с активированным уг-
лем, а затем элюировать эфиром. Сушат и хранят вто-
ричное .эфирное масло так. же, как и первичное.
12
7.2. Предварительный анализ и разделение
эфирных масел
Предварительный анализ эфирных масел заключает-
ся в определении органолептических свойств, а также
физико-химических констант: плотности, показателя
преломления, оптической активности, кислотного и эфир-
ного числа, числа омыления по общепринятым методи-
кам f 16]. Иногда эфирные масла анализируют сразу по-
сле извлечения, но1чаще их разделяют на группы веществ,
сходных по химической природе: кислоты, фенолы, мо-
но-, сесквитерпены и их кислородсодержащие производ-
ные. Разделение эфирных масел на фракции можно
проводить с помощью вакуумной разгонки при раз-
личных .интервалах температур, но чаще для анализа
используется метод, предложенный итальянскими уче-
ными А. Либерти и Д. Картони [30]. Сущность его за-
ключается в сочетании химических методов разделения
масла на фракции по классам органических соединений
с последующим физико-химическим анализом этих
фракций. Преимущество метода заключается в том, что
он ценее трудоемок, и масло не подвергается излишнему
термическому воздействию. Ход анализа сводится
к следующему. Первоначально масло трижды обраба-
тывается насыщенным раствором натрия гидрокарбо-
ната в соотношении' 1 :1 для удаления кислот, а затем
3% раствором натрия гидроксида для освобождения
от фенолов.-После этой процедуры масло тщательно про-
мывается водой и карбонильные соединения извлека-
ются из него насыщенным раствором натрия бисульфи-
та. Тщательно отмытый. дистиллированной водой оста-
ток масла представляет собой смесь углеводородов и их
кислородсодержащих производных. Дальнейший анализ
каждой фракции ведется раздельно.
Водные растворы солей кислот и фенолов после ос-
вобождения от следов эфирных масел 'подкислением
10% серной кислотой выделяют в свободном виде кис-
лоты и фенолы обработкой диэтиловым эфиром; эфир-
ные растворы сушат и растворитель после фильтрова-
ния отгоняют. Фракции кислот, фенолов, терпенов ис-
следуют далее с помощью различных хроматографиче-
ских и спектрометрических методов.
Эфирное масло разделяют на фракций методом ад-
сорбционной колоночной хроматографии на алюми-
13
ния (III) оксиде при соотношении разделяемого вещест-
ва и сорбента 1:20 или на силикагеле, импрегнирован-
ном AgNO3 (для разделения сесквитерпеноидов исполь-
зуется 10—20% раствор AgNO3) [46, 12]. Элюентом для
углеводородов служит петролейный эфир, для кислород-
содержащих соединений — диэтиловый эфир или
этанол. Контроль за разделением обычно ведут
методом хроматографии в тонком закрепленном
слое сорбента. Часто этот метод используют и в препа-
ративных целях, проявляя хроматограммы в УФ-свете,
с помощью концентрированной серной кислоты или
бромфлуоресцеина [50]. Пределы обнаружения и опре-
деления некоторых компонентов эфирных масел мето-
дом ТСХ приведены в работе Kastelan-Macan, Cerjan-
A
Stef anovic [58]. Имеются сведения [65] о разделении
перед хроматографическим анализом насыщенных и не-
насыщенных компонентов эфирных масел с помощью
ацетата ртути (I).-
7.3. Применение газожидкостной
хроматографии для исследования
эфирныхмасел
В подавляющем большинстве исследований для ка-
чественного и количественного анализов эфирныхмасел
и в препаративных целях применяется газожидкостная
хроматография (ГЖХ). .
В настоящее время ГЖХ является одним из наибо-
лее мощных аналитических методов в микробиологии
и медицине. ' Благодаря своей высокой чувствительно-
сти, универсальности и специфичности, он позволяет
идентифицировать и количественно определять лекарст-
венные вещества в препаратах, биологических жидко-
стях, а также анализировать многокомпонентные лекар-
ственные смеси. Все шире метод ГЖХ применяется в
научной и практической работе биохимических, клини-
ческих и др. лабораторий. Он используется для изучения
качества лекарственных средств, определения продук-
тов разложения, образующихся в процессе синтеза или
хранения, а также для установления оптимальных ус-
ловий хранения и , сроков годности [6], поэтому он и
предложен для введения в XI издание Государственной
фармакопеи СССР.
Учитывая, что эфирные масла являются сложной
и трудноразделимой смесью, ГЖХ для их исследования
является незаменимым методом, тай как позволяет про-
вести быстро и экономично полный анализ исследуемого
образца [48, 11, 38, 34, 27, 31, 35].
Классические химические методы исследования тре-
буют значительных количеств эфирного масла для пол-
ного анализа, поэтому метод ГЖХ особенно приемлем
при сравнительном анализе эфирных масел, полученных
в небольших количествах из образцов различных эко-
типов, а также в онтогенезе растения, когда накопить
эфирные масла в ощутимых количествах на первых
этапах онтогенеза 'практически невозможно.
Как уже отмечалось, перед анализом эфирные масла
обычно разделяют на группы веществ, сходных по хи-
мической природе, однако ряд .исследований проведен
методом ГЖХ непосредственно после их извлечения. '
Рассмотрим выбор условий газохроматографических
определений на конкретных примерах.
Анализ эфирного масла лимонного сорго [22] про-
веден на отечественном хроматографе ЛХМ-8 МД
в следующих условиях: газ-носитель гелий со скоростью
6 мл/мин, неподвижная фаза Carbowax 20 М ПЭГ, ка-
пиллярная колонка длиной 50 м и внутренним диамет-
ром 0,25 мм, температура колонки 70—180° со скоростью
подъема 2 град/мин, ДИП. Указанная неподвижная фа-
за применяется для разделения кислот, спиртов, кисло-
род- и серосодержащих соединений [28, 32].
В данной методике применена капиллярная колон-
ка, носителем является ее внутренняя поверхность, на
которую непосредственно наносится неподвижная жид-
кая фаза, что приводит к устранению вредного влияния
вихревой диффузии, снижает сопротивление потоку га-
за-носителя и, таким образом, уменьшает размывание
хроматографических полос. Эти факторы позволяют
увеличить длину колонки, использовать для анализа
малые дозы пробы и сократить время анализа. {.
В последние годы капиллярная газовая хроматогра-
фия широко используется в биохимических .и медицин-
ских исследованиях: с ее помощью изучают состав био-
логических жидкостей человека, определяют барбиту-
раты, наркотические средства и различные фармпре-
параты в плазме крови. В этой работе применен один
из наиболее чувствительных • детекторов — детектор ио?
низации пламени (ДИП) и режим программирования
температуры, который используют для улучшения и ус-
15
корения разделения сложных смесей веществ, темпера-
тура кипения которых сильно различается.
В аналогичных условиях, только при- более высокой
температуре (170—220° С), был изучен химический со-
став эфирного масла тимьяна украинского, произра-
стающего в Белоруссии [36]. Aksoy Н. Ayse [49] раз-
делял эфирное масло лука на колонке с карбоваксом,
нанесенным на хромосорб W (AW—DMCS). Имеются
данные [56], что при анализе эфирных масел на стек-
лянных капиллярных колонках неподвижная фаза
Pluronic F68 значительно более эффективна, чем Carbo-
wax 2 ОМ.
В некоторых случаях лучших результатов достигают
при использовании смеси двух неподвижных фаз. Так,
изучая эфирное масло цитрусовых, Н. А. Кекелидзе
и М. И. Джаникашвили [23] на приборе Varian aero-
graph 1860 с ДИП применили колонки 550X0,2 см с
неподвижными- фазами SE-30 5% и FFAP 10% на
хромосорбе W.
Горяев и др. [17] при исследовании эфирного масла
полыни семиреченской применили на приборе «Выру-
хром» с пламенно-ионйзационным детектором 2 колон-
ки с размерами ЗООХОД см, заполненные розовым диа- .
томитовым носителем — целитом 545 (60—80 меш);
первая — с 10% ПЭГ 1540, вторая —с 10% ПЭГ-адипи-
натом. Применение двух колонок в режиме программи-
рования температуры вызвано необходимостью компен-
сации влияния улетучивания фазы. Две. колонки поме--
щаются параллельно, и сигнал из одной включается
навстречу сигналу из другой колонки. Разница в лету-
чести фазы с двух похожих колонок очень мала, что по-
зволяет поддерживать стабильную пулевую линию даже
при высоких температурах.
^Подробное описание процедуры нанесения неподвиж-
ной фазы (метилсиликоновой) на твердый носитель,
заполнения колонки, ее кондиционирования, приготов-
ления стандартных смесей для исследования эфирных
масел в режиме программирования температуры дано*
в работе [57]. При изучении багульника болотного
цельное масло было предварительно разделено на
17 фракций методом колоночной хроматографии на си-
ликагеле [67].
Наиболее эффективна ГЖХ при анализе отдельных
фракций эфирного масла. Наряду с этим при исследо-
16
вании состава фенолов и кислот находят применение
более простые методы бумажной и тонкослойной хрома-
тографии. При хроматографическом изучении этих ком-
понентов на бумаге чаще всего применяют систему н-бу-
танол, насыщенный 25% водным аммиаком [3,54], а про-
явление проводят в УФ-свете в парах йода 1% спирто-
вым раствором железа (III) хлорида или индикаторами
бромкрезоловым зеленым и бромтимоловым синим. Для
анализа фенолов используют хроматографию на неза-
крепленном слое оксида алюминия (II ст. акт) в си-
стеме- бензол-этанол-уксусная кислота 45:3,5:4 ' [5], а
также на пластинках Silufol в системе н-бутанол, насы-
щенный 25% раствором аммиака, или в системе бензол—
этанол (9: 1).
Метод ГЖХ, обладая высокой эффективностью и
большой разрешающей способностью, открывает новые
перспективы в изучении фракций эфирных масел. Если
при анализе фенольной фракции.эфирного масла багуль-
ника болотного методами бумажной и тонкослойной
хроматографии удалось разделить и идентифицировать
лишь 3—4 фенола, то с помощью ГЖХ было получено
уже 16 пиков и идентифицировано более десятка компо-
нентов [40]. Преимущества ГЖХ в анализе фенолов
и кислот широко отражены в литературе [15, 14, 51].
Поскольку терпеновая фракция эфирных масел пред-
ставляет собой также сложную многокомпонентную
смесь, то ее целесообразно предварительно разделять
с помощью колоночной хроматографии [62—64],
„ а затем использовать ГЖХ. ’
Условия газохроматографического разделения ве-
ществ терпеновой структуры разработаны в [55]. Реже
при изучении терпенов эфирных масел пользуются ме-
тодом ТСХ, применяя оптимальные условия хромато-
графирования [66].
7.4. Спектроскопические методы
исследования
Электронная спектроскопия
Для идентификации и определения структуры орга-
нических соединений широко используются электронные
спектры, поглощения в интервале 800—200 нм. Приме-
нение -электронных спектров даёт ценные данные
о строении терпеновых веществ, выделяемых из эфир-
17
ных масел (положение двойных связей, взаимное рас-
положение непредельных связей и карбонильных
групп и т. д.).
Интенсивные полосы поглощения с Атах > 200 нм и
Ige 4 характеризуют соединения с сопряженными свя-
зями. Так, максимумы полос поглощения мирцена в эта-
ноле находятся в области 225 нм, селинандиена — 240
и 247 нм. По УФ-спектрам легко отличаются соедине-
ния, содержащие сопряженные и несопряженные связи
(например, изоэвгенол и эвгенол), растворенные в гек-
сане [20].
Насыщенные сложные эфиры, лактоны и кислоты
обычно можно определить по максимумам поглощения
в области 220 нм и выше, для них характерным явля-
ется постепенное уменьшение интенсивности [33]. На-
пример, максимум.поглощения карвона проявляется при
Хтах=235 им, а цитраля — при 238 нм.
Азулены поглощают в областях 270—280 нм, менее
интенсивно — 320—360 нм. Особенностью азуленовых
систем является поглощение в видимой области, при-
дающее этим веществам глубокую’ синюю или фиолето-
вую окраску. Для хамазулена наиболее интенсивными
будут полосы с максимумами, поглощения 245, 287 и
305 нм [16].
Электронные спектры изучаются в сильноразбавлен-
ных растворах. В качестве растворителей используют-
ся вещества, не имеющие поглощения в исследуемой
области спектра и не реагирующие с растворенным
веществом.
• Инфракрасная спектроскопия
Метод ИК-спектроскопии существенно дополняет
УФ-спектроскопию. В инфракрасной области располо-
жено большинство колебательных и вращательных
спектров молекул. Набор полос в области 1400—
600 см-1 является индивидуальной характеристикой
каждого вещества («область отпечатков пальцев»).
В спектре имеются полосы, специфичные для каждой
функциональной группы.
Гидроксильная группа (спирты, фенолы) в случае
. терпеноидов характеризуется полосами поглощения ва-
' лентных колебаний группы ОН и ийтенсивными полоса-
ми в области 3650—3000 см-1.
Альдегиды, кетоны, насыщенные или сопряженные
эфиры, кислоты, лактоны и ангидриды, т. е. соединения,
18 Z
содержащие карбонильную группу >С = 0, имеют по-
глощение в более важном участке спектра (приблизи-
тельно 1820—1640 см-1). Характеристические частоты
валентных колебаний v(C=0) у а-, р-ненасыщенных
алкилкетонов проявляются при 1685 см-1, карбоновых
кислот — при . —1760 см-1, насыщенных эфиров — при
1740 см-1.
Кроме характеристической частоты колебаний С=0
в спектрах некоторых типов карбонильных соединений
появляются полосы, по которым можно различить эти
вещества. Например, полосы в. области около 1000—
1300 см-1 находятся в спектрах соединений с группой —
СО—О, т. е. в карбоновых кислотах, их эфирах, лакто-
нах, ангидридах и т. д. [16].
Важными, но менее общими являются данные по
поглощению в других участках спектра. Так, слабая по-
лоса поглощения в области 3050 см-1 свидетельствует
о наличии метиленовой группы в циклопропановом
кольце. Сильное поглощение в области 900 см-1 указы-
вает на присутствие экзометиленовой группы, что ока-
залось ценным для ее идентификации [33].
Спектры комбинационного рассеивания (КР) и ИК-
поглощения взаимно дополняют друг друга. Слабые
линии в спектре ИК-поглощения становятся сильными
в спектре КР и наоборот. Таблицы характеристических
групповых частот приведены в [13, 16, 19].
ЯМР-спектроскопия
ЯМР-спектроскопия исследует переходы между маг-
нитными энергетическими уровнями атомных ядер, вы-
зываемые радиочастотным излучением. В настоящее
время наиболее широко применяется ядерный магнит-
ный резонанс на протонах (ПМР).
Химический сдвиг является основной характеристи-
кой ПМР и зависит от структуры молекул. На величину
химического сдвига влияют, с одной стороны, электрон-
ная плотность у протона, с другой,— вторичные магнит-
ные поля, возникающие в результате циркуляции‘элек-
тронов в соседних атомах и связях. Кроме того, могут
оказывать влияние и внешние факторы: растворитель,
температура, агрегатное состояние. При получении
спектров ЯМР решающее значение имеют однородность
и стабильность магнитного поля.
Ценную информацию о строении органического сое-
динения можно получить из знания характера спин-
спинового расщепления, которое происходит в резуль-
тате взаимодействия спинов неэквивалентных протонов
через валентные электроны. По числу линий в сигнале
ПМР можно судить о ближайшем протонном окруже-
нии рассматриваемого фрагмента органической моле-
кулы.
Благодаря разработке высокочувствительных спект-
рометров, широко распространенным методом исследо-
вания стал магнитный резонанс на. ядрах 13С. -Этим
методом намного легче изучать соединения, обогащен-
ные изотопом. Поскольку естественное содержание маг-
нитного изотопа 13С в углероде составляет 1,108%» то
в промышленности готовят соединения с обогащением
13С до 90%; затем из этих исходных соединений могут
быть получены более сложные. Корреляционные табли-
цы химических сдвигов ЯМР 13С и константы спин-спи-
нового взаимодействия приведены в литературных ис-
точниках [13, 20].
Таким образом, по данным ЯМР-спектроскопии
можно судить о' структуре (конфигурации основной
цепи, изомерии и пространственной геометрии моле-
кул) чистых органических соединений. В сочетании с
ИК- и УФ-спектроскопией ЯМР-спектроскопия является
мощным средством исследования структуры, электрон-
ного распределения и реакционной способности органи-
ческих веществ. Основным недостатком метода является
необходимость применения растворов достаточно высо-
кой концентрации (5—20% ).
Примером использования спектроскопических мето-
дов исследования в анализе терпеноидов эфирных масел
может служить работа [25]. Во фракции кислородсо-
держащих моно- и сесквитерпеновых соединений эфир-
ного масла багульника болотного помимо известных
компонентов была обнаружена смесь изомерных вторич-
ных спиртов, которая была разделена на индивидуаль-
ные компоненты после ацетилирования. Для установле-
ния их структуры были сняты спектры ПК, ПМР и 13С
ЯМР*.
I И
20
I
Анализируя данные ИК-спектров, по линиям погло-
щения 3615 и 3630 см-1 можно установить наличие
ОН-групп, линии 3070 и 3090 см-1 соответствуют груп-
пе >С = СНг.
По данным ПМР-спектроскопии установлено нали-
чие в спиртах I и II изопропенильных групп —СНз
(сигнал 1,70 м. д. — синглет, ЗН) и фрагментов
>С==СНг (4,78 м. д. — синглет, 1Н).
При сравнивании спектров ЯМР 13С спиртов с экзо-
циклической двойной связью со спектрами большой
группы монотерпеновых соединений, а также расчетны-
ми спектрами с использованием инкрементов замести-
телей установлено, что они согласуются со структурами
. п-мента-1 (7)-8(9)-диен-2а-ола (I) и п-мента-1 (7)-8(9)-
-диен-2р-ола (II). Эти два соединения отличаются толь-
ко тем, что в спирте I гидроксильная группа экватори--
альна, а в спирте П-аксиальна.
Комбинированное использование различных видов
спектроскопии осуществляется во многих работах, по-
священных идентификации терпеноидов [24, 47, 67].
Таким образом, в настоящее время для идентификации
компонентов, эфирных масел широко используют различ-
ные виды хроматографии, УФ-, ИК-, ПМР-, 13С-ЯМР-
спектроскопию и ГЖХ-масс-спектрометрию [68]. На кон-
кретных примерах возможности этих методов проиллю-
стрированы в рбзоре [53]. В работе [60] рассмотрено
применение данных методов, а также сочетание методов
спектроскопии и хроматографии для анализа эфирных,
масел (40 наименований), включенных в Европейскую*
фармакопею и фармакопею США (1980).
ЛИТЕРАТУРА •
1. Алиев Р. К. Ранозаживляющий препарат из водяной мя-
ты/Meritha aquatica, — Фармация, 1945, № 5, с. 23.
2. Алиев Р. К. Ранозаживляющий эффект препаратов из ди-
кой мяты,—Изв./Азерб. фил. АН СССР, 1944, № 6, с. 91.
• 3. Алимова Е. К. К вопросу о хроматографии (бумажной)
жирных кислот. — Биохимия, 1960, т.-25, вып. 5, с. 773—780.
4. Андронова Л. М. Изучение противокашлевых свойств
2пД°тлпг>0Пх?Та1ХпЛа М°РСКИХ свинках.-В кн.: Сб. научных ра-
бот ВИЛР. М., 1975, вып. 8, с. 186—188. F
5. Ах ре м А А., Кузнецова А. И. Тонкослойная хрома-
тография.—М.: Наука, 1965. — 170 с. Р
упЛ™аб1ЛеВ В’ Тряпиц ,и на Т. П. Газожидкостная
хроматография в фармацевтическом анализе. — Кишинев: Штиин-
Ца, 1978. — 135 с.
21
7. Березовская Т. П. К химическому исследованию^ эфир-
ных масел сибирских видов полыней. — В кн.: Тез. докл. на симп.
Всес. иаучн. фарм. об-ва «Синтез и анализ лекарственных вещ.».
Львов, 1966, с. 238—239.
8. Березовская Т. П.. Биологически активные вещества
сибирских видов полыни. — В кн.: Тр. I Всесоюзного съезда фар-
мацевтов (г. Пятигорск, 1967). М., 1970, с. 273.
9. Б е рез о в с к а я Т. П., У р. а лов а Р. П., Серых Е. А.
Исследование представителей сем. сложноцветных из Сибирской
флоры на содержание в них азуленов (сообщ. I). — В кн.: Неко-
торые вопросы фармакогнозии дикорастущих и культив. растений
Сибири. Томск: Изд-во ТГУ, 1969, с. 77—81.
10. Березовская Т. П., Усыиина Р. В., Великано-
. в а В. И. и Др. Эфирные масла некоторых видов полыни сибир- -
ской флоры. — В кн.: IV Межд. конгр. по эфирным маслам «Хи-
мия и технология эфирн. масел ’и душистых вещ.». Тбилиси,-1968,
т. 1, с. 34.
11. Берчфилд Г., Сторрс Э. Газовая хроматография в
биохимии. — М.: Мир, 1964.— 620 с.
12. Б о л ьш а ков а В. И., Хан В. А,, Дубовенко Ж. В.
и др. Терпеноиды живицы лиственницы, произрастающей на Кам-
чатке.— Химия природ, соедин., 1980, № 3, с. 340—343.
13. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. — М.: Мир,
1976.— 547 с.
14. Горностаев а Л. И., Репях С. М., Левин Э. Д.
Состав фенолов эфирных масел хвойных пород Сибири. — Химия
древесины, 1978, № 1, с. 109—141.
15. Горяев М. И., Ев даков а Н. А. Справочник по газо-
жидкостной хроматографии органических кислот.—Алма-Ата: Нау-
ка, 1977. —551 с.
-16. Горяев М. И., Плива И. Методы исследования эфир-
ных масел. — Алма-Ата: Изд-во АН Каз. ССР, 1962. —739 с.
17. Горяев М. И., Шарипова Ф. С., Ельчибеко-
к о в а Е. С. Эфирное масло Artemisia Reptapotamica— Химия при-
. .род. соед., 1980, № 4, с. 572—573.
" 18. Гуськова И. Н. Губоцветные горного Алтая как источ-
ник получения эфирных масел: Автореф. дис. ... канд. биол. на- .
ук. —Томск, 1970.— 21 с.
19. Д а й е р Д. Р. Приложения абсорбционной спектроскопии
органических соединений. — М.: Химия, 1970.— 164 с.
20. Козицына Л. А., Куплетская Н. Б. Применение
УФ-, ИК-, ЯМР- и масс-спектроскопии в органической' химии.—
М.: МГУ, 1979. —240 с. ..
21. Калинкина Г. И., Супрунов Н. И. К исследованию
некоторых эфирно-масличных растений дальневосточной флоры —
В кн.: Раст. рес. Южной Сибири, их рац. использование и охрана.
Томск: Изд-во ТГУ, 1982, с. 68—71. н
22. К а сум о-в Ф. Ю., Бабаев Р. И. Компоненты эфирного
МЭ108 додМ0НН0Г0 с0РГ0-~ Химия природ, соед., 1983, № it
23. Кекелидзе Н. А„ Джа ник а ш вил и М. И Эфирное
масЛо листьев Citrus limonia.— Химия природ, соедин., 1982 № 4
с. 523—-524.
24. Клокова М. В., Березовская Т. П., Серых Е А
Харкевич С С. Эфирные масла рода Ledum.—Химия природ’,
соедин., 1981, № 6, с. 802-^803. р р
22
25. Клокова М. В., Хан В. А., Дубовенко Ж. В. и др.
Терпеноиды эфирного масла L. palustre. — Химия природ, соедин.,
1983, № 3, с. 293—296.
26. Клокова М. В., Чернова Н. А., Прищеп Т. П. Про-
тивовоспалительные свойства эфирных масел некоторых видов
Ledum L.— Раст, ресурсы, 1983, т. 19, вып. 1, с. 108—112.
27. Коллего'в В. Ф. Основы газовой хроматографии: Учеб.-
метод. пособие.—Новосибирск, 1970,— 168 с.
28 Коде в Н. Справочник по газЬвой хроматографии. — М.:
Мир, 1976. —200 с.
29. Лекарственные препараты., Изд. 5-е. — Минск: Изд-во
АН БССР, 1965.-516 с. v
30. Либерти А., Картони Дж. Анализ эфирных масел
методом газовой хроматографии.— В кн.: Газовая хроматография.
,М.: ИЛ, 1961, с. 299.
31. Литвинов Л. Д., Руденко Б. А. Газовая хроматогра-
фия в биологии и медицине. — М.: Медицина, 1971. —224 с.
32. Лурье А. А. Хроматографические материалы:—М.: Хи-
мия, 1978. — 439 с.
33.. Майо П. Терпеноиды. — М.: ИЛ, 1963, с. 17—18.
. 34. М а к - Н е й р Г., Бонелли Э. Введение в газовую хро-
матографию. — М,: Мир, 1970. — 277 с.
35. М и т р у к а Б. М. Применение . газовой хроматографии в
микробиологии и медицине. — М.: Медицина, 1978. — 608 с.
36. П о п о в В. И., О д ы н е ц А. И. Изучение химического
состава эфирного масла тимьяна украинского, произрастающего
в Белоруссии.— В кн.: Материалы 3-го съезда фармацевтов БССР.
Минск, 1977, с. 166—168.
37. Р о х л и н а М. Л., Ч к о н и я Э. А. Бфлогическое действие
цитраля и р-ионона. — Бюлл. эксп. биол. и мед., Г948, т. 25, № 3.
38. Руководство по газовой хроматографии. — М.: Мир,
1969. — 475 с.
39. Соболевская К. А., Тюрина Е. В., Гуськова И. Н.
Эфирно-масличные растения сем. зонтичных во флоре Сибири. —
Расъ ресурсы, 1973, т. 9, вып. 1, с. 68.
40. Серых Е. А., Клокова М. В., Белоусова Н. И. и
Др. Фенольные соединения багульника болотного и физико-хими-
ческие методы их исследования. — В кн.: Химия и химическая
технология: Тез. докл. конф., посвящ. Г50-летию Д. И. Менделе-
ева. Барнаул, 1984, с. 115.
41. Соколов С. Д. Смесь ментола и камфоры в качестве
заменителя валидола. — Уч. зап./Пяуигорский фарминститут. — Пя-
тигорск, 1961, т. 5, с. 303.
42. Супрунов Н. И., Горовой П. Г., Панков Ю. А,
Эфирио-масличные растения Дальнего Востока. — Новосибирск:
Наука, 1972. — 188 с.
43. Т а р а и Д. Д. Противовоспалительное и анальгетическое
действие эфирных масел некоторых видов полыней,'тысячелистника
и хамазулена,—В кн.: Тезисы докл. Всесоюзн. коиф. «Проблемы
освоения лек. ресурсов Сибири и Дальнего Востока». Новосибирск:
Изд-во СО АН СССР, 1983, с. 222—223.
44. Т ю р и н а Е. В. К изучению эфирно-масличных растений в
Западной Сибири. — В кн.: Состояв. И/перспективы-изучен, раст
рес. СССР. М.—Л.: Изд-во АН СССР, 1958, с. 453—457.
23
.45 . Т ю р и н а Е. В. Биоэкологические основы интродукции
зонтичных Южной Сибири: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. —
Новосибирск, 1980. — 50 с.
46. Хан В. А., Дубовенко Ж- В., Пентегова В. А.
Кислородсодержащие моно- и сесквитерпеноиды живицы Pice а
Koraiensis. — Химия прирбд. соед., 1983; № 1, с. 109—110.
47. Чубинидзе В. В., Берадзе Л. В., Бочоридзе Л.Д.
О химическом составе эфирного масла Artemisia artemisiifolia.—
Химия природ, соедин., 1984, № 4, с. 529—530.
48. Шингл яр М. Газовая хроматография' в практике. — М.:
Химия, 1964.— 195 с.
49. A k s о у Н. A. Untersuchung der atherischen- Ole der Zwiebeln
(Allrum сера Liliaceae) turkischer Herkunft.—Z. Lebensm. UntefSuch.
und Forsch., 1983, Bd. 177, № 1, S. 34—36.
50. Bhush an R. TLC separation and identification of essential
oil constituents on silicagel plates. — J. Liquid Chromatogr., 1982,
v. 5, № 6, p. 1097—1102.
51. Bur у an P., Mitera Y., Kubel к a V., Macak Y. Ana-
lyse fenoli. — Chem. listy, 1979, v. 73, № 2, p. 161—181.
52. EisenhuthF. Qualitatsforschung und Leistungsfragen bei
Valeriana officinalis. — Arzneipflanzen-Umschau, 1956, Bd. 14, № 4,
S. 269—286: •
53. Garner о Y. L’evolution des methodes et des techniques
d’analyse dans 1’etude de la compositionchimique des huiles essentiel-'
les;—Labo-pharma. Probl. et techn., 1978, v. 26, № 277, p. 486—497.
54. Gildemeister E., Hoffman Fr. Die atherischen, Ole. —
Berlin: Akademie-Verlag, 1960, Bd. 3. — 436 S. - ‘
55. H i 11 u n en R., L a a к s о Y„ Scheffer Y. Y. C. Application
of headspace gas chromatography in essential oil analysis. I Preci-
sion.— Acta Pharm. Finn., 1983, v. 92, № 3, p. 209—214.
56. Hl av ay- Y, В a r t c h a A., V i g h C. Use of Pluronic F 68.
glass capillary columns for the analysis of essential oil samples.—
J. Chr'omatogr., 1981, v. 204, p. 59—64.
57. H u ft p h г у A. M., Brett С. I., Cummings E. et al. Ap-
- plication of gas-liquid chromatography. to the analysis of essential
oils. Part VIII. Fingerprinting of essential oils by temperature
programmed gas-liquid chromatography using methyl silicone statio-
nary phases. — Analyst, 1981, v. 106, № 1261, p. 448—455.
08. Kastelan-Macan M., Ceryan-Stefanovic S. Gra
.nice dokazivanya i odredivanya nekih sastoyaka etericnih • ulya me-
todom tankosloyne kromatografiye. — Prehrambeno-tehnd. red., 1982,
v. 20, № 3—4, p. 157—161.
59. Kn utter S., Pohlouder-Fabini R. Versuche zur che-
mischen Identifizierung und Bestimmung des Matricarisesters aus
Wurzeln von Solidago Virgaurea. — Dip Pharmazie, 1962, Bd. 17,
№ 8, S. 456. v -
60. К u b e c z к a K. N. Qualitatsbeurteilung arzneilich verwende-
ter atherischer Ole. — Dtsch.-Apoth. Ztg, 1982, Bd. 122, № 45,
S. 2309—2316.
61. Samdahl B., Oddbyorn S., Staalesen Y. Anestttesi-
ques locaux derives du p-cymene et du mesitylene. — Ann. pharmac.
franc., 1965, v. 23, № 5, p. 355—362.
62. Scheffer J. Y. С., К о edam A. et al. Improced gas chro-
matographic analysis of naturally occurring oxygeft-centaining mo-
24
^jioterpenes following prefractionation by liquid-solid ehromatograp-
, hie. — Chromatographia, 1977, v. 10, № 11, p. 669—677.
63. S c h e f f e r Y. Y. С., Кoed am A., Svendsen A; Frak-
tionierte saulenchromatographische Vortrennung derMonoterpenkoh-
. ten wasser stoffe atherischer Ole tur^die Gaschromatographie.—Sci.
ilpharm., 1976, Bd. 44, № 2, S. 119—128.
' 64. Scheffer Y. Y. C., S w eji d s e n A. Saulen-chfomatographi-
sche Vertrennung von sauerstoffhaltigen Monoterpenen atherischer
Ole fur die Gaschromatographie.—Planta med., 1977, Bd. 32 A, № 1,
‘ S. £8. .
65. Stahl E. Pra-chromatographische Trennung atherischer Ole
in gesattigte und ungesattigte Komponenten durch Adduktbildung
mit Quecksilber (Il)-acetat. — Chromatographie, 1983, Bd. 27, № 3,
S. 69—70, 72.
66. S t a h 1 E., G l a t z A. Optimizierung der Aldehyd-Schwefel-
saurereagenzien ztir Detektion in der Diinnschicht-Chromatographie.—
J. Chromatogr., 1982, Bd. 243, № 1, S. 139—143.
67. T a 11 у e D. H. E., Bos R. Composition of Essential oil of
Ledum palustre.— Planta med., 1981, v. 41, № 3, p. 303—307.
.68 . Vorkommen und Analyse, atherischer Ole. — Stuttgart,
1979, S. 77—92, 114—145. . •
Г л а в a 2
АЗУЛЕНЫ
1. Общая характеристика
Еще в XV в. было известно, что существуют расте-
ния, эфирные масла, которых имеют интенсивно синюю
или фиолетовую окраску. Эта окраска обусловлена ве-
ществами, перегоняющимися с водяным паром-. Однако
только в 1863 г. был впервые выделен окрашенный ком-
понент из эфирного масла ромашки, который француз- '
ским ученым Д. Писсе [49] был назван азуленом (от
немецкого «azurblau»— лазоревый). Одновременно азу-
лен был изолирован из эфирных масел полыни горькой
и тысячелистника обыкновенного.
Позднее О. Валлах и Е. Туттель [68] получили.«си-
невх масло» из гвайанола с помощью дегидрирования
серой. Однако при экстракции смолы органическими
растворителями окрашенных в синий, цвет продуктов
получено не было, в связи с чем возникло предположе-
ние об образовании азуленов из своих предшественни-
ков в процессе обработки растения водяным паром.
Структура азуленов долго оставалась невыясненной, ‘
хотя их формула (С^Ни)' свидетельствовала о генети-
* ческой связи с сесквитерпенами (С15Н24). Действитель-
но, азулены, как и сесквитерпены, подобно монотерпе-
ноидным соединениям состоят из звеньев изопрена, рас-
положенных в молекуле по правилу Ружички [54]. Ка-
талитическое дегидрирование сесквитерпеновых фрак-
ций эфирных масел приводит к образованию азуленов.
Детальное химическое исследование азуленов началось
позднее, с момента обнаружения их ценных терапевти-
ческих свойств [43]. А. Пфау и А. Платтнер [48] уста-
новили, что в основе структуры азуленов лежит цикло-
пентаноциклогептан, дегидрированием которого обра-
зуется «ядро» азулена с суммарной формулой СщНв:
26
циклопентано-циклогептан скелет азулена
Указанная структура была подтверждена синтезом
-ряда азуленов [18, 34, 41, 46, 47, 50, 69]. Образование
различных групп замещенных азуленов происходит за
счет.. алкилирования конденсированной системы. Уста-
новление структуры азуленов дало возможность объяс-
нить главное свойство этих соединений — их интенсив-
ную окраску при низкой молекулярной массе. В резуль-
тате исследования спектров различных замещенных
азуленов в УФ- и видимой областях [50, 51, 52] была
выявлена закономерность, связывающая смещение их
максимумов поглощения с положением в ядре. При этом
установлено, что доминирующее влияние оказывает не
характер заместителя, а его местоположение в кольце
азулена; Именно этот фактор лежит в основе класси-
фикации известных в настоящее время- природных азу-
ленов и сесквитерпеновых соединений азуленового
: ряда. V
Азулены обладают гипотензивным, спазмолитиче-
у ским, противовоспалительным действием и в связи
с этим находят широкое применение для лечения ожо-
гов, лучевых язв, трахомы [23,36]. Способность хама-
* зулена снимать воспаление [22] и восстанавливать
тканевую поверхность нашла применение при лечении
'• лучевых и рентгеновских дерматитов [67]. Эти вещест-
. ва .оказались эффективными при местном лечении язвен-
ных циститов [21]. При этом в отличие от антибиотиков
азулены не вызывают раздражения мочёвого пузыря,
а благоприятно влияют на регенерацию и эпителиза-
цию тканей.
Ха,мазулен применяется при различных заболеваниях
аллергического характера [71]. По данным Блазо [37,
38], хамазуленотерапия вылечивает острую и хрониче-
скую астму в детском возрасте. Отечественными учены-
ми [12, 13] в качестве противоастматического средства
предложен препарат диметулен, представляющий собой
хамазулен из эфирного масла полыни Сиверса, отличдю-
-27
щийся низкой токсичностью и не вызывающий побочных
явлений. В практику здравоохранения внедрен ряд азу-
ленсодержащих препаратов, пользующихся широким
спросом: дермазулен — ЧССР, фасцинат и азулан —
в ПНР, ромазулан — в СРР. По данным Л. Фойстеля
[32], в ГДР а,зулены широко используются в парфю-
мерно-косметическом производстве для изготовления
лечебных кремов, лосьонов и паст.
Советскими учеными установлено противовоспали-
тельное и ранозаживляющее действие хам азуленсодер-
жащих эфирных масел полыней, тысячелистника азиат-
ского, а 3°/о масляный раствор эфирного масла послед-
него предложен в качестве [28] противоожогового сред-
ства.
2. Распространение в растительном мире
Случаи нахождения азуленов в природе крайне ред-
ки. Как правило, они образуются из своих предшест-.
венников проазуленов (природных сесквитерпеновых
соединений, находящихся в выделительных тканях рас-
тений) в результате процессов дегидрирования, кото-
рым часто предшествует дегидратация и декарбоксили-
рование 440}. Проазу'лены встречаются в различных
семействах независимо от их систематического положе-
ния, например в плодовых телах грибов (рыжики), ко-
торые, как известно, на изломе синеют вследствие пре;
вращения проазуленов под действием кислорода возду-
ха в азулены [58].
По данным Н. П. Кирьялова [19], существует около
270 проазуленсодержащих видов растений, относящихся
к сем. Piperaceae, Lauraceare, Asteraceae, Aristolochiace-
ae, Geraniaceae, Apiaceae, Afaliaceae,- Lygophyllaceae,
Lamiaceae и др. [15].
. Естественно, что в первую очередь были выделены
азулены из эфирных масел, у которых отмечалось появ-
ление синей .окраски после гидродистилляции, а также
обработки кислотами или окислителями. Однако боль-
шая. часть известных в настоящее время азуленовых сое-
динений получена путем более сложного и длительного
дегидрирования сесквитерпеновых фракций эфирных
масел растений, относящихся к вышеупомянутым се-
мействам.
Несмотря на сравнительно широкое распространение
в природе проазуленсодержащих растений, промыш-
28
ленными источниками азуленов до настоящего времени
служат лишь ромашка аптечная, тысячелистник обык-
новенный и полынь горькая [31]. Проведенные нами ис-
следования показали возможность расширения ассорти-
мента промышленно ценных источников хамазулена за
счет других видов полыни и тысячелистника, содержа-
щих значительное количество хамазулена в эфирном
масле: полынь Сиверса (7—15%), ч полынь понтий-
ская (7%), полынь крупноголовчатая (13%), полынь
якутская (до 30%), тысячелистник- азиатский (до 20%)
[3—6, 9—11, 17, 30].
3. Классификация
Большинство сесквитерпеновых соединений азулено-
вого ряда имеют углеродный скелет гвайазулена (I), но
известны и некоторые другие типы скелета, такие' как
ветивазулен (II) и циразулен (III):
Азуленовые сесквитерпеноиды можно разделить на две
основные группы в зависимости от наличия лактонного
кольца. . *
Азуленовые сесквитерпеноиды,
не содержащие лактонного кольца
Гвайол (IV) — спирт, впервые выделенный из гвай-
яколового древесного масла в 1892 г.:
Дегидрирование гвайола серой при температуре
около 200° приводит к образованию S-гвайазулена (V),
а селеном—(при температуре 250—330°)—изомера
29
гвайазулена (I)1 — Se-гвайазулена (VI) (характер ис-
пользуемого катализатора указан в названии образую-
щегося соединения)
Аромадендрен (VII) — основной сесквитерпеновый
углеводород эвкалиптового масла
Глобулол (VIII)—третичный спирт, выделен из
эфирного масла эвкалипта шарикового (Eucalyptus glo-
bulus). При дегидрировании его с серой образуется гвай-
азулен (I):
Ледол (IX) сесквитерпеновый спирт, выделен из
эфирного масла багульника болотного
30
Два азулена — лактаразулен (X) и лактарвиолин
(XI) —- выделены Вильштедтом [70] из пыльцы гриба
Lactarius deliciosus L. в виде синей жидкости, являют-
ся- непредельными изомерами S-гвайаЗулена (V):
Хамазулен (XII)—азулен синего цвета, впервые
выделен из эфирного масла полыни (A. absinthium L.),
а позднее — из эфирных масел ромашки аптечной, ты-
сячелистника обыкновенного и некоторых других видов
полыни [3].: '
XII
Азуленовые сесквитерпено иды,
содержащие лактонное кольцо
Азуленовые сесквитерпеноиды, содержащие лактон-
ное кольцо, включают в себя следующие соединения:
1 ) легко превращающиеся в хамазулен — «природ-
ные азулены»;
2 ) не способные легко превращаться в хамазулен.
Природные азулены — предшественники хамазулена.
Под данным термином подразумеваются азулены, кото-
рые, как правило, получаются из природных сесквитер-
пеновых соединений в результате дегидрирования, ко-
торому часто предшествует дегидратация и декарбо-
ксилирование [24].'
Хама.зуленоген (XIII) — сесквитерпеновый углеводо-
род хам азуленового ряда. Выделен из эфирного масла
полыни (A. absinthium L.). При его хроматографиче-
ском разделении дает первоначально зону оранжевого
31
цвета, предшествующую темно-синей зоне хаМазулена.
Выделенный хроматографически углеводород очень не-
устойчив и под влиянием кислорода воздуха почти не-
медленно окисляется и изменяет срой цвет до сине-зе-
леного
Другие вещества, образующие хамазулен, относятся
к группе гвайанолидов, сесквитерпеновых лактонов
S-гвайазуленовой структуры: матрицин (XIV), артаб-
син (XV).
Матрицин является источником образования хамазу-?
лена в эфирном масле ромашки аптечной (Matricaria
chamomilla L.) при перегонке его из растения с водяным
паром
Впервые выделен из экстракта ромашки в кристалли-
ческом виде и изучен чешскими учеными [39;].
Артабсин выделен из полыни горькой (A. absinthi-
um L.),no своему химическому строению очень близок
матрицину [42]:
32
Близкие по структуре матрицин и артабсин имеют •
общий путь превращения в хамазулен при обычной
перегонке сырья с водяным паром из нейтральной или
слабокислой среды
Образование хамазулена происходит путем разрыва
лактонного кольца, отщепления ацетильной группы
(у матрицина) и трех молекул воды. При этом перво»
начально образуется хамазуленкарбоновая кислота
(XVI), что экспериментально доказано Шталем [61—
63]. Это очень неустойчивое соединение, медленно де-
ка,рбоксилйрующееся уже при комнатной температуре
и переходящее в парах воды в хамазулен (XII) [66].
Кроме артабсина в полыни горькой дополнительными
источниками хамазулена являются гвайанолидные горь-
кие лактоны абсинтин и анабсинтин [66].
В настоящее время выделен, и ряд других гвайано-
лидов. Более десятка, из них получено из различных
видов полыни [2, 25—27]. -В тысячелистнике обыкновен-
йом обнаружено три проазуленовых лактона (XVII—
XIX) [65], близких по структуре матрикарину и пре-
вращающихся при гидродистилляции в хамазулен:
2. Заказ 2909.
33
о
о
Один из лактонов идентифицирован как дезацетил-
матрйкарин (XVII), два других — дезаЦетоксиматрика-
рин (леуколин) (XVIII) и ахиллин (XIX)— являются
стереризомерами [55].
4. Физико-химические свойства
Азулены являются жидкими маслянистыми вещест-
вами, сильно окрашенными в синий, фиолетовый, иногда
в зеленый цвет, редко могут существовать в виде сине-
фиолетовых ромбических пластинок (S-гвайазулен).
Азулены легко растворяются в этаноле й других
органических растворителях, в воде практически нераст-
воримы, но перегоняются с водяным паром, обладают
способностью связываться концентрированными кисло-
тами за счет образования комплексов: фосфорной — на
. 85—95% (продукт нерастворим в петролейцом эфире),
серной —на 63%. К щелочам азулены относятся ин-
дифферентно.
Природные азулены образуют кристаллические произ-
водные с пикриновой, стифниновой кислотами, тринитро-
бензолом, тринитротолуолом, которые идентифицируют
по температуре плавления. При доступе воздуху азулены
(хотя и очень медленно) разлагаются вследствие окис-
ления, при этом свет катализирует этот процесс. Дейст-
вие окислителей приводит к разрыву двойных связей,
что сопровождается изменением синего или фио-
. ледового цвета в зеленый, желтый и коричневый [16].
Температура кипения азуленов значительно выше, чем
других сесквитерпеновых соединений, поэтому при ва-
куумной разгонке они собираются вместе с сесквитер-
пеновыми фракциями, окрашивая их.-
34
5. Методы качественного обнаружения
азуленов в растении
Как уже отмечалось, азулены находятся в растениях
в виде своих бесцветных предшественников проазуленов.
* 1. Локализация проазуленов в растении определяет-
ся по методу Шталя [59],основанному на способности
этих соединений переходить в окрашенные азулены под
действием сильных кислот. Определение проводят на
плоскостном препарате цветка (эфирно-масличные же-
лезки легко обнаруживаются на малом увеличении мик-
роскопа, отсутствие хлорофилла позволяет четко наблю-
дать, результат реакции). В случае отсутствия последних
для определения можно использовать и плоскфтной
^препарат листа, стебля.
* Техника определения: плоскостной препарат труб-
чатого цветка, йомещают в концентрированную фосфор-
ную или серную кислоту и после слабого его нагрева-
ния над пламенем спиртовки через 1—2 мин наблюда-
ют под микроскопом окрашивание железок в синий цвет.
2. При выявлении наличия проазуленовых и без-
азуленовых хеморас у азулёнсодержащих растений
используют метод Шталя, видоизмененный М. В. Наза-
ренко [35]. Метод заключается в следующем: цветки
каждого из исследуемых экземпляров помещают в про-
бирки, заливают этанолом (до «зеркала»), закрывают
плотным ватным тампоном и, нагревая в течение 10—
15 мин на кипящей водяной бане, получают насыщен-
ное спиртовое извлечение, которое многократно' каплями
наносят на, кружочки фильтровальной бумаги. Затем
на полученное пятно наносят реактив Шталя*. Пятно
подсушивают на крышке кипящей водяной бани; при
наличии проазуленов пятно окрашивается в сине-зеле-
ный или сине-фиолетовый цвет.
3. Качественное определение азуленовых соединений
в эфирном масле проводит путем перегонки его с водя-
ным паром из нейтральной или слабокислой среды
в приборе для количественного определения эфирного
масла в растительном сырье. При наличии в растении
проазуленовых соединений, способных в данных усло-
виях легко переходить в азулены, эфирное масло окра-
* Реактив Шталя: раствор 1 г пара-диметиламинобензальдегида
в смеси 5 г фосфорной и 5 г уксусной кислот, разбавленный
водой до 100 мл.'
2*- ' 35
шивается в сине-зеленый, синий или фиолетовый цвет.
Более устойчивые азуленогенные 'сесквитерпены обна-
руживают в эфирном масле реакциями Шталя и Сабе-
тая [16].
Реакция Сабетая: растворяют 5. капель испытуемо-
го эфирного масла в 1—2 мл хлороформа и прибавля-
ют 0,5—1 мл 5 или 10% бромсодержащего хлороформа.'
После нескольких минут в присутствии азуленов или
азуленогенных сесквитерпенов появляется зеленое, го-
лубое или фиолетовое окрашивание. Реакция протека-
ет отчетливее и быстрее, когда эфирное масло сначала
растворяют в уксусной кислоте, а затем обрабатывают
бромсодержащим хлороформом.
Такие азуленобразующие сесквитерпеноиды, как
аромадендрен, гвайен, эйдесмен, обнаруживают в эфир-
ном масле с помощью следующих качественных реакций:
,1) при растворении 3 капель фракции эфирного
масла в ледяной уксусной кислоте и пропускании паров
брома в раствор при взбалтывании последний окраши-
вается в карминово-красцый цвет, который в скором
времени переходит в фиолетовый, а затем в индино-си-
ний;
2) несколько капель серной кислоты, прибавленной
к-раствору фракции эфирного масла в уксусном ангид-
риде, придают жидкости отчетливую зеленую окраску,
переходящую при стоянии в голубовато-синюю.
6. Количественное определение проазуленов
и азуленов в эфирном масле
Содержание проазуленовых соединений в раститель-
ном сырье определяют косвенным методом >— нахож-
дением перегоняющихся в составе эфирного масла азу-
ленов фотоэлектроколориметрическим методом.
Методика определения. В навеске сырья оп-
ределяется содержание эфирного масла по фармако-
пейному методу (ГФ, X, 1968). В связи с тем, что азу-
ленсодержащие эфирные масла загустевают на стенках
приемника, что мешает измерению объема « приводит
к значительной ошибке, перед дистилляцией в прием-
ник добавляют 0,2 мл декалина. После дистилляции
измеряют объем декалинового раствора масла и по
разности объемов находят объем эфирного масла.
36
Количество азуленов в полученном декалиновом рас-
творе эфирного масла определяют колориметрически.
Декалиновый раствор сушат безводным сульфатом нат-
рия и количественно переносят с помощью толуола
в мерную колбу (вместимостью 50—100 мл.). Раствор
доводят до метки толуолом и оптическую плотность
измеряют на фотоэлектроколориметре (нейтральный
светофильтр в кювете с толщиной слоя 10 мм). Содер-
жание азуленов находят по калибровочному графику,
построенному с помощью раствора 2,6-дихЛорфенолин-
дофенолята натрия.
Содержание проазуленов в сырье в мг% (Xf) рас-
считывают по формуле
v а . б • 100
Xi = ---------—
в
а содержание азуленов в эфирном масле в % (Х2) — по
формуле
v в, • б • 100
Ао —---------- ,
100 - t , .
где а — количество азуленов в 1 мл полученного раст-
вора, найденное по графику, мг; б —объем приготов-
ленного колориметрического раствора, мл; в — абсолют-
но сухая навеска сырья, г; с — навеска эфирного
масла, мл.
В зависимости от природы проазуленов и места их
локализации в растительной ткани при количественном
определении азуленов подбирают условия дополнитель-
ной обработки сырья, способствующие наиболее пол-
ному извлечению проазуленов и превращению их в азу-
лены. При этом исходят из того, что реакция среды при
извлечении должна быть нейтральной или слабокислой.
Обработка сырья щелочью необходима в случае нали-
чия лактонного кольца, так как при этом последнее раз-
рывается и образуется натриевая соль азуленкарбоно-
вой кислоты, переход которой непосредственно в кисло-
ту проводят путем подкисления омыленного образца.
Последующая дистилляция его способствует декарбок-
силированию азуленкарбоноврй кислоты и переходу ее
в азулен.
В настоящее время разработаны методики макси-
мального извлечения азуленов из сырья полыни горькой,
ромашки аптечной, тысячелистника [7, 20, 39, 44]. Так,
37
для тысячелистника использована обработка 10% рас-
твором щелочи (из расчета 40 мл раствора на 5,00
сырья) в течение 2 ч при нагревании на водяной бане
без доступа воздуха. Затем смесь охлаждают, нейтра-
лизуют и подкисляют разведенной серной кислотой до
рН=5Д Колбу с подкисленной смесью присоединяют
к. прибору Клевенджера, в котором ведут перегонку
. Эфирного масла в течение 2 ч.
7. Методы выделения и разделения азуленов
Один из методов выделения азуленов из эфирных
масел основан на их способности легко растворяться
в 50—60% водной и концентрированной кислоте, соля-
ной, железисто-синеродистой или 80—85% фосфорной
кислотах, образуя продукты присоединения. При раз-
бавлении кислотных комплексов азуленов • водой они
выделяются в свободном состоянии [16].
Хорошо охлажденный раствор фракции эфирного
масла в петролейном эфире взбалтывают с 85% фос-
форной кислотой. При разбавлении ледяной водой фос-
фо'рно-кислого экстракта выделяется азулен. Все азу-
лены адсорбируются на глиноземе, оксиде алюминия, что
позволяет выделить их из эфирного масла и разделять
на индивидуальные азулены [6, 16, 29]. Хроматографи-
рованию подвергается как цельное эфирное масло, так
и освобожденное от кислот и фенолов.
Выделение азуленовой фракции производят на. ко-
лонке оксида алюминия (II ст. акт.) в соотношении
1:100. В качестве элюента используются гексан или пет-
релейный эфир. Очистку азуленовой фракции произво-
дят повторным рехроматографированием. Для дополни-
тельной очистки используют свойство азуленов образо-
вывать кристаллические комплексы с пикриновой кис-
лотой и тринитробензолом, которые затем легко разру-
шаются на оксиде алюминия. При этом пикриновая кис-
лота и тринитробензол задерживаются в верхней части
колонки, а азулен элюируется гексаном. При соотно-
шении адсорбента 1:200 или 1:300 удается разделять
очень близкие' по свойствам азулены.
8. Идентификация и установление строения
Идентификацию выделенных азуленов проводят пу-
тем определения температуры плавления кристалличе-
38
скях производных (пикратов, тринитробензоатов, троти-
латов и стифнатов) методом бумажной хроматографии
и спектрофотометрически.
Получение производных азуленов
Пикраты. 1г пикриновой кислоты в 20 мл 95%
. спирта смешивают с 1 г азулена в 5 мл спирта (раство-
. ры должны быть горячие). При охлаждении смеси в те-
чение нескольких минут раствор .затвердевает в кри-
. сталлическую массу, которая при нагревании плавится.
Пикрат дважды перекристаллизовывают из этанола и
тщательно сушат в эксикаторе.
Тринитро бензоаты. Для приготовления три-
нитробензоатов смесь эквимолекулярных количеств йс-
следуемоТо вещества и тринитробензола растворяют в
горячем этиловом спирте или уксусной кислоте. При
охлаждении' происходит кристаллизация. Полученные
кристаллы отделяют, перекристаллизовывают и сушат
на воздухе.
Хроматографический анализ азуленов
Индивидуальность выделенного азулена, и идентич-
ность его с заведомо чистым веществом(.«свидетелем»)
можно подтвердить методом восходящей бумажной хро-
матографии с обращенной фазой [5, 45] и ТСХ. Бумагу
(ватман № 1) -пропитывают 10% раствором парафина
. в петролейном эфире. В качестве подвижной фазы ис-
пользуют 60% раствор фосфорной кислоты [64]. Бла-
годаря собственной интенсивной окраске пятно азулена
хорошо заметно без дополнительного проявления. Па-
раллельно хроматографируют заведомо известные об-
разцы. t
Тонкослойную хроматографию на незакрепленном
слое оксида алюминия (II ст. акт.) проводят в системе
бензол-этанол-уксусная кислота в соотношении *45:3,
5:4 [1], а также на пластинках Silufol в системах н-бу-
танол, насыщенный 25% аммиаком, бензол или бензол-
этанол 9:1. Хамазулен идентифицирует по ярко-синей
: окраске пятна с R/=0,78±0,01. Последний вариант
ТСХ применим для обнаружения азуленов в эфирных
маслах. При этом цельное эфирное масло или лучше
масло, освобожденное от кислот и фенолов, подвергают
39
хроматографии на пластинках Silufol. в вышеуказанных
системах. При наличии азуленов -проявляются пятна
, синего или фиолетового цвета.
Спектроскопические методы исследования
ИК-бпектр оскопи я. По ИК-спектру устанавли-
вают принадлежность выделенного' из эфирногог масла
вещества к азуленам. Так, ядро азулена имеет полосы
поглощения в области 1500—1600 см-1 [16]. ИК.-спектр
хамазулена содержит полосу поглощения при 775 см-1,
соответствующую этильной группе, а спектр S-гвайазу-
лена —характерное для изопропильной группы погло-
щение при 1375 см-1.
УФ-спектроскойия является надежным сред-
ством идентификации азулена. Наличие заместителей
в его ядре смещает УФ-спектр в сторону длинных волн.
•Наибольшее смещение наблюдается при замещений ме-
тильной группой положения 1, которое характеризуется
полосой поглощения при 364 нм. Максимумы при 235—
250 и 280—290 нм соответствуют поглощению 1, 4, 7-ал-
килированных азуленов (хамазулена) .[7, 24, 52].
ЛИТЕРАТУРА
1. А х р е м А. А., К У з н е ц о в а А. И. Тонкослойная хромато-
графия. М.: Наука, 1965. — 170-с.
2.' Бенешева В. И., Назаренко М. В., Слепцова Л. В.
Сесквитерпеновые у-лактоны из Artemisia jacutica. — Химия природ,
соед. — 1969, № 3, с. 186.
-3. Б ёф ез о в с к а я Т. П., Уралова Р. П., Серых Е. А.
Исследование некоторых представителей сем. сложноцветных из си-
бирской .флоры иа содержание в них азуленов (сообщ. I). —В кй.:
Некоторые вопросы фармакогнозии дикорастущих и культив. рас-
. тений Сибири. — Томск: Изд-во ТГУ, 1969, с. 77—81.
4. Березовская Т. П., Уралова Р. П., Серых Е. А.
Поиски азуленсодержащих растений.—В кн.: Тез. II Всероссийского
съезда фармацевтов. М., 1969, с.-54.
5. Березовская Т. П., Мальцева А. Т. .Применение тон-
кослойной хроматографии для исследования эфирных масел неко-
торых видов полыни Сибири. — В кн.: Тр. I конференции молодых
ученых-химиков ТГУ. — Томск, 1970, с. 332—335.
6. Березовская Т. П., Песегова Л. П/, Усы ни на Р. В.
и др. Полынь понтийская — новый источник азуленов. —- Раст, ре-
сурсы, 1973, т. 9, вып. 3, с. 225—235.
7. Б е р е з о в с к а я Т. П., К а ли н к и н а Г. И. Способ увели-
чения выхода азуленов из сырья тысячелистника азиатского. —
В“ кн.: Новые методы диагностики и лечения, разработанные в
Томском медицинском институте. Томск, 1978, вып. .3, с. 146—147.
8. Березовская Т. П„ Д-удк о В. Б. Калинки на Г. И.,
С е р й х Е. А., У с ы н и н а Р. В. Азуленсодержащие растения Си-
40
бирской .флоры.— В кн.: Тез. XII Международного ботан. конгресс
са. Л.: Наука, 1975, с. 514.
9. Березовская Т. П., Дудко В. В., Кал ин кин а Г. И.,
Серых Е. А. О возможности использования Сибирских источников
азулена в фармации—В кн.: Материалы III Всероссийского съезда
фармацевтов. Свердловск, 1975, с. 303т305.
10. Б е р ез о в с к а я Т. П., Дудко В. В., Серых Е. А.,
Усынина Р. В. Полынь крупноголовчатая — перспективный ис-
точник азуленов среди растений Сибирской флоры.—Раст, ресурсы,
1976, т. 12, вып. 4, с.-565-573.
11. Березовская Т. П., Цареградская А. П., Се-
рых Е. А., К а л и н к и н а Г. И. Фармакогностическое изучение
Artemisia jacutica Drob. — Раст, ресурсы, 1983, т. 19, вып. 1,
с. 54—60.
12. Болдина И. Г., Назаренко М. В. Фармакологическое
исследование азулена полыни Сиверса. — Раст, ресурсы, 1967, т. 3,
вып. 1, с. 67—71.
13, Болдин а И. Г. Противоастм этическое действие диметуле-
на. — Фармакология и токсикология, 1966, т. 29, № 6V с. 672—674.
14. Голуб М. Методика исследования лекарственных расте-
ний.— В кн.: Изучение и использование лекар. раст. ресурсов
СССР. Баку: Медицина, 1964, с. 224.
15. Гордон М. Азулены. — Успехи химии, 1953, т. 22, № 8,
с. 948—1001.
16. Горяев М. И., Пл ив а И. Методы исследования эфирных
масел. — Алма-Ата: Изд-во АН Каз. ССР, 1962. — 750 с.
17. Калинина Г. И., Березовская Т. П. Тысячелистйик
азиатский как возможный источник хамазулена. — Раст, ресурсы,
1975, т. 11, вып. 2, с. 220—225.
18. Келлер-Ширлейн У., Хельброннер Е. Пути син-
теза азуленов. — В кн.: Небензоидные ароматические соединения.
М., 1963, с. 302—340.
19. Кирьялов Н. П. Азулены. — Природа, 1946, № 8,
с. 20-31.
. 20. Киселева Е. Я., Рыбалко К. С., Лошкарев Ц. И.,
Г д а з о в а М. В. Изменение содержания эфирного масла и хама-
зулена в ромашке аптечной (Matricaria recutita L.) в течение веге-
тационного периода. — Фармация, 1969, Ns 4, с. 34—38.
21. Кю р т и В., Ул ь др их И. Местное лечение специфических
язвенных циститов гвайазуленом.—Урология, 1963, №'"•2, с. 51—52.
22. М а к с и м е н к о Г. Н. О противовоспалительном действии
азулена мятного масла.—Фармакология и токсикология, 1964, т. 27,
№ 5,. с. 571—573.
23. Машковский М. Д. Лекарственные средства. — М.: Ме-
дицина, ’ 1977, т. 1, с. 304. • z
24. Назаренко М. В. Природные азулены и сесквитерпеновые
соединения азуленового ряда (проазулены). — В кн.: Раст. сырье.
М>-Л.: Изд-во АН СССР, 1961, вып. 8, с. 83—210.
25. Назаренко М. В. Гвайанолиды полыни" Сиверса — Arte-
misia sieversiana Will. — Журнал прикл. химии, 19.65, т. 38, № 10,
с. 2372.
26. Назаренко М. В., Леонтьева Л. И. Новый сескви-
Овый Y-лактон-сиверсиннн. — Химия природ, соед., 1966, № 6,
с. 399—405. ' .
41
27. Рыбалко К. С., Баньковский А. И., Шейчен-
ко В. И. Природные сесквитерпеновые лактоны.—В кн.: Тр./ВИЛР.
Химия. М.: Колос, 1969, т. 15.
28. Т а р а н Д. Д. Противовоспалительное анальгетическое
действие эфирных масел некоторых видов полыней, тысячелистника
и хамазулена. — В кн.: Тез. докл. Всесоюзной конф. «Проблемы
освоения лек. ресурсов Сибири и Дальнего Востока». Новосибирск:
Изд-во СО АН СССР, 1983, с. 222—224.
29. Т и х а к Е., Б е к а с с и С., Ю х а ч К. Выделение и иссле-
дование состава компонентов эфирного масла ромашки. — В кн.:
Материалы IV Междун. конгресса по эфирным маслам. Тбилиси,
1968, с. 351. „ „ „ „ .
30. Уралова Р. П., Березовская Т. П., Серых Е. А.
Источники азулена во флоре Сибири. — В кн.: Совет, по вопросам
изуч. и освоения растит, ресурсов СССР: Тез. докл. Новосибирск,
1968, с. 172.
31. Федоров А. А. Растительные р!есурсы СССР для народ-
ного хозяйства и медицины. — Раст, ресурсы, 1965, т,. 1, № 1,
с. 5—18.
32. Фойстель Л. Методы определения, и устойчивость гвай-
азулена в косметических изделиях и особенно в лосьонах для лица,
бритья и волос.—-В кн.: Материалы IV Междун. конгресса по
эфирным маслам. Тбилиси, 1968, т. 1, с. 377.
33. Ш о р м Ф., В о н а ш е к Ф., Г е р о у т В. О новом цветном
дигидрохамазулене из эфирного полынного масла (A. absinthium).—
Химия, 1951, т. 1, с. 350—352.
34. Ш о р м Ф., Кучера И., Гут И. Полный синтез S-гвай-
азулена. — Химия, 1951, т. 1, с. 422—450.
35. Шухободский Б. А., Маркова Л. П., Кузьми-
на И. В. и др. Обследование растений флоры северо-запада
РСФСР на содержание флавоноидов, кумаринов проазуленов и
других физиологически активных веществ. — В кн.: Тр. БИН АН
СССР. Раст, сырье, сер. V. Л.: Наука, 1972, с. 117—135.
36. Bajusz Е. Beitrage zur Kenntnis der Azulene. Chemie der
Pharmakologisch wirksamen Azulene. — Pharmazie, 1956, Bd 11.
№ 13, S. 179—190.
37. Bl az so S. Behandlung asthmatischer Krankheiten in Saug-
lings und Kindesalter mit Chamazulen.— Schweis. Med. Wschr-
1949, Bd. 79, № 10, S. 222—225.
38. В1 a^’s 0 S. Weitere Erfahrugen mit der chamazulen Therapie
asthmatischer Krankheiten in Sauglings und Kindesalter. — Schweis.
Med. Wschr., 1951, Bd. 81, № 5, S. 110-415.
39. C e k a n L,, H e r 0 u t V., S о r m F. On terpenes LXII. Iso-
lation and properties of the prochamazulene from Matricaria chamo-
milla L. A further compound of the guajanolide group. — Coll. Cze-
chosl. Chem. Commun., 1954, v. 19, p. 796.
40. Her out V., Sorm F. On terpenes. LXl. Contribution to
the constitution of prochamazulenogen, the natural precursor of cha-
mazulene in Artemisia absinthium L. — Coll. Czechosl. Chem. Comm..
1954, v. 19, p. 792.
41. Heifbro nner E. Azulenes. Non-J>enzenoid aromatic com-
pounds.—Ed. D. Ginsburg. N. L., 1959.
42. H e г о u t V., Dolejs L., Sorm F. The structure of Artab-
sin, the Prochamazulenogen from Artemisia absinthium L. —Chem.
and Ind., 1956, v. 41, p. 1236.
42
43. H e u b п е г V., G г a b е F. Uber die entzungswidrige Wirkung
des Kamillenols.—Arch. exp. Pathol. Pharmakoi., 1933, Bd. 171,
S. 329—339.
44. Kaiser H., Hasenmaier G. Bedingungen ffir die Bil-
dung des atherischen Ols. und des Azulens bei der Wasserdamff-
destination von Kamillen. — Scientia pharmaceutica, 1956, Bd. 24,
№ 3, S. 155—160.
45. К ness el O., Vlastiborova A. Papier chromatography of
azulenes. On terpenes. LVI.— Coll. Czechosl. Chem. Comm., 1954,
v. 19, p. 782—785.
46. Novak J., Sorm F., Si ch er I. On terpenes. LXIII. To-
tale synthesis of 1, 4, 7-trisubstituted azulens.—Coll. Czechosl. Chem.
Comm., 1954, v. 19, p. 1264—1270.
47. Novotny L, Her out V., Sorm F. A contribution to*
the structure of absinthin and anabsinthin. — Chem. and Ind., 1958,
№ 6, p. 465—470.
48. P f a u A., PI a 11 n e r A. Kenntnis der fruchtigen Pflanzen-
stoffe. Uber die Konstitution der Azulene. — Helv. Chim. Acta, 1936,
Bd. 19, S. 858-865.
49. Piese D. Memoires Presents. — Comptes rend., 1864, v. 57,
p. 1016.
50. P1 a 11 n e r Pl. A. Zur Kenntnis der Sesguiterpene. Konsti-
tution und Farbe der Azulene. — Helv. Chim. Acta, 1941, Bd. 24,
S. 283—290.
51. Plattner Pl. A., Heilbronber E. Zur Kenntnis der
Sesquiterpene. Die Absorptionskurven *des Azulenens und der funf-
Monomethylazulene in sichtbaren Bereich. — Helv4 Chim. Acta, 1947,
Bd. 30, S. 910—913.
52. Plattner Pl. A., Hellbronner E. Zur Kenntnis des
Sesquiterpene und Azulene. Die Ultraviolet-Absorbtionsspectren der
funf-Monomethyl und einiger mehrfachsubstituierten Azulene. — Helv.
Chim. Acta, 1948, Bd. 31, S. 804—813.
53. R u z i с к a L., Rudolf E. Hohere Terpenverbindungen.
XXVII. Zur Kenntnis der Azulene. — Helv. Chim. Acta, 1926, Bd. 9,
S. 118. *
54. R u z i с к a L. The isoprene Rule «nd the biogenesis of terpe-
nic.—Experientia, 1953, v. 9, p. 357—365. ,
55. S m о 1 e n s к i J., Bell L., Bauer L. The Isolation of
achillin from Achillea millefolium L. — Loydia, 1967, v. 30, № 9,
p. 144—149.
56. Schenck G., Fromming K., Schmitt A. Einfluss den
Ph auf die Azulenbildung bei der Wasserdampfdestillation von Mat-
ricaria chamomilla L. —Arch. Pharm., 1956, Bd. 289, S. 312—316.
57. S c h e п с к G., Fromming.K. 01- und Azulengehalt von
Matricaria chamomilla L. in verschidenen Bluhtstadien.—Arch. Pharm.,
1956, Bd. 288, S. 200—204.
58. Sprecher E. Atherisches 01 in Pilzen. — Pharmazie, 1958,
Bd. 14, S. 455—458.
59. Stahl E. 1st der Proazulengehalt der Schafgarbe (Achillea
millefolium L.) genetisch oder umweltbedingt? — Pharmazie, 1952 a,
Bd. 7, S. 863—868.
60. Stahl E. Uber die Farbe des, Atherischen Oles von Arte-
misia absinthium L. und das Proazulen.— Naturwissenschaften, 1952 b,
Bd. 24, № 39, S 571—574.
43
61. Stahl E. Ober das Chamazulen und dessen Vorstufen.
Chamazulencarbonsaure.aus Schafgarbe. — Chem. Ber.; 1954a, Bd. 87,
№ 2, S. 202—205.
62. Stahl E. Ober das Chamazulen und dessen Vorstufen. Cha-
mazulencarbonsaure aus Kamille.— Chem. Ber., 1954 b, Bd. 87,
№ 4, S. 505—507.
63. Stahl E. Ober das Chamazulen und dessen Vorstufen. III.
Zur Konstitulion der Chamazulencarbonsaure.— Chem. Ber., 1954 c,
Bd. 87, Ns 11, S. 1626—1628.
Л .
64. Sy cor a V., Vocac K. A new modification of paper chro-
matography azulenes. On terpenes CXI. — Reprinted from Coll. Cze-
chosl.Chem. Comm., 1960, v. 25, p. 1702—1704.
, 65. Tetenyi P., Tyihak N., Ma the I., Svab J. Unter-1
suchungen fiber die Azulenverbindungen der Achillea Arten. I. Micro»
chemische Untersuchungensmetode.—Pharmazie, 1962, Bd. 8, S. 463—
466. .
,66. Thieme H. Die Azulenbildner der Kamille, der Schafgarbe
und des Wermuts. — Planta med., 1958, Ns 1, S. 70—77.
67. T h о m a s K. Ober Kamille, Azulen und seine pharmakologi-
schen Wirkungen. — Pharmaz. Ind., 1956, Bd. 18, S. 89—93.
68. W a 11 a c h O., Tuttle E. Zur Charakteristik der Sesquiter-
pene.—Ann., 1894, Bd. 279, S. 391—395.
69. Werner H. Azulen VII. A novel rear rangement in the
synthesis of azulenes.—J. Amer. Chem. Soc.,-1956, v. 78, Ns 7.
•70. Willstaedt H., Zetterberg B. Lactaroviolen, ein Tu-
berkelbacillerr in vitro wirksamen Antibioticum. — Svensk. kem. Tid.,
1946, Bd.-58, S. 306—307.
71. Vargha M. Migranebehandlung mit Chamazulen. — Phsychi-
atrie, Neurologic und medizinische Psychologic, 1950, Bd. 2, S. 116—
Глава 3
ПОЛИИНЫ
- 1. Общая характеристика
Полииновыми (полиацетиленовыми) соединениями на-
зывают органические вещества (как правило, углеводо-
роды), содержащие в углеводородной цепи несколько
сопряженных двойных и тройных связей. Отсюда следу-
ет, что полиины относятся к непредельным углеводоро-
дам группы ацетилена.
Начало изучения природных пблииновых соединений
относится к 1889 г., когда Ф. В. Землер [4] выделил
ненасыщенное вещество, получившее название окиси
карлика. Однако более интенсивное изучение природных
полиинов началось в 1935 г., когда было установлено
строение оксида карлина, а из эфирных масел растений
семейства Asteraceae было выделено и описано несколь-
ко соединений ацетиленового ряда. В качестве приме-
ров можно назвать лахнофиллум.-эфир, полученный
В. В. Вильямсом о сотр. из-эфирного мас^а дикорасту-
щего среднеазиатского шерстистолистника хлопковид-
ного Lachnophyllum gossypium L. [1], матрикария-эфир,
, выделенный в 1941 г. норвежским исследователем
Н. А. Серенсеном с сотр. из эфирного масла ромашки
непахучей Matricaria inodora L. [4},’дегидроматрика-
рия-эфир, обнаруженный К. Ставхольдом и Н. А. Се-
ренсеном в эфирном масле полыни обыкновенной
Artemisia vulgaris L. [4].
В настоящее время известно более 1600 природных
полиинов [2], к углеродной цепочке которых часто
присоединены. различные радикалы, сообщающие им
дополнительные химические свойства. Однако общие
свойства для этого класса соединений обусловлены на-
личием двойных и тройных связей.
Следует отметить, что сведения о биологическом
действии ацетиленовых соединений из растений довольно
ограничены. Тем не менее известны соединения (мико-
45
мицин и др.), обладающие высокой антимикробной ак-
тивностью £7]. Некоторые из полиинов (цикутоксин,
энантоксин) являются токсичными веществами [8]. В то
же время выделенный из веха другой пблиин—фалька-
риндиод — обладает высокой антимикробной актив-'
ностыо и малотоксичен.
' __ *
2. Распространение в растительном мире
Природные полиины довольно широко распространены
в растительном мире и ЁГ зависимости от происхождения
их условно можно разделить на три группы:
1) из высших растений; г
2) из низших растений; ‘
3) из жиров и жирных кислот.
Из высших растений наиболее богаты полиинами
такие семейства,-; как Asteraceae, Apiaceae, Simaruba-
ceae.^a также- бобовые, аралиевые и др. Большинство
ацетиленовых соединений было получено из эфирных
масел или растительных жиров, в которых они нередко
являются главными (по количеству) компонентами.
Еще в 40-е годы текущего столетия было показано,
что к синтезу полииновых соединений способны не толь-
ко высшие, но и низшие растения — грибы [6]. Под-
тверждением этого явилось получение таких ацетилено-
вых соединений, обладающих антибиотическими свой-
ствами, как агроцибин, диатретин и микоМицин. Харак-
терной особенностью указанных полииновг является то,
что при определенной температуре они разлагаются со
взрывом [1].
3. Локализация в растениях
Полиины локализуются в различных органах расте-
ний. Во всей надземной части их содержат василек ла-
зуревый Centaurea cyanus L., василек шероховатый
С. seabiosa L., шёрстистолистник хлопкбвидный Lachno-
phyllum gossipium L., ромашка непахучая Matricaria
inodora L., полынь эстрагон Artemisia dracunculus L.
и др. [1, 3, б, 7]. В подземных органах полиацетилено-
вые соединения локализуются в таких растениях, как
пырей ползучий Agropirum repens L., колючник бессте-
бельный Carlina acaulis L. и др. [1, 4].
К сожалению, сегодня трудно четко разделить все
описанные в литературе растения по локализации по-
46
лиинов в связи с тем, что большинство из них изучалось
в период отсутствия точных и необходимых методов
анализа. А учитывая крайнюю неустойчивость и незна-
чительное количество ацетиленовых соединений, можно
предположить, что в процессе исследования они могли
остаться незамеченными. По-видимому, этим же объяс-
няется тот факт, что вещества с тройными связями час-
то находят в корнях растений, надземные части которых
химически давно уже обследованы и не содержат аце-
<тиленовых соединений (например, роды Aster, Carlina,
Agropirum и др.) [1].
Следует отметить, что в последние годы, благодаря
применению новых методов анализа и идентификации
ролииновых структур, усовершенствованию техники их
изолирования, удалось интенсифицировать исследования
в этой области химии природных соединений, о чем сви-
детельствует количество выделенных полиацетиленовых
веществ. Однако пока изучена только незначительная
часть растений и не выяснено значение этих соединений
для самого растительного организма. В настоящее вре-
мя уже не вызывает сомнения факт, что полиины, как
правило, сопутствуют эфирным и жирным маслам
в местах их локализации.
4. Физико-химйческие свойства
-Полиины по физическим свойствам представляют со-
бой кристаллические вещества с температурой плавле-
ния от 32 до 190°С, окрашенные', как правило, в желтый
цвет, реже —маслообразные соединения (агропирен и
др.). Они легко растворяются в органических неполяр-
‘ ных растворителях, перегоняются с водяный паром
и, имеют специфический запах [4].
По своим химическим свойствам полиины во многом
повторяют самое простое вещество этой группы — аце-
тилен, весьма реакционноспособны и вступают во все
реакции, характерные для непредельных соединений.
. В результате поиска различных цветных и осадочных
реакций, характерных только для тройных .связей, пред-
ложено использовать карбонилы [9], с которыми полу-
чается окрашенный комплекс. Для этого ацетилениды
смешивают с солями ртути (II) в водной'или спиртовой
среде. При этом образуются металлоорганические сое-
динения, которые после гидролиза дают специфические
Сканировано Кипером Русланом
47
легко идентифицируемые продукты (кетоны, кетолы).
Химизм этих реакций можно представить следующим
образом:
+ _ (СН3СОО)2 Hg
R —С—С -CsC-R^R-C=C=:C=C-R------------>
z ОСОСН3
I Hg(CH3COO)2
^R-C = C = C = C^-R —__-___
ососн3
I . Hg (CH3COO)9
- R-C = C--C~O-R------------->
HgOCOCH,
ОСОСНз ОСОСНз
Г - . i .
^C = C - C = C-R
R HgOCOCH3 HgOGOCH3
ОСОСНз ОСОСНз
I • 1 -OHHgCH3COO
R —C=C—C«C —R ----->
Hg0C0CH3 HgOCOCH3
c
'ОСОСНз H
I I
->C = C-‘C = C-R-+
R H ОСОСНз
0-0
Ч’Н+Г-СНзСООН и- f!
---77 "7^ g T R — C — CH2 — C — CH2 - R +
— Hg++OH-Sp
0
II
4Ri C-H-ICOH]
Полиины весьма неустойчивые вещества. Па воздухе
они медленно окисляются, при облучении ультрафиоле-
товым светом превращаются в другие изомеры, а при
нагревании могут полимеризоваться. Изомерия у поли-
48
инов обусловлена разветлением углеродной цепи и по-
ложением тройной связи.
5. Классификация полиинов
В работе [4] все природные полиины разделены на
4 основные группы:
1) ациклические ацетиленовые соединения С^—Си;
2) ациклические ацетиленовые соединения С13—Се;
3) соединения алленовой структуры;
4) ароматические и гетероциклические ацетиленовые
соединения.
Внутри каждой из этих групп авторы выделяют еще
отдельные подгруппы в зависимости от количества уг-
леродных атомов или других признаков химической
структуры. Так, например, ацетиленовые соединения
с 18 углеродными атомами представлены в основном
ацетиленовыми карбоновыми кислотами:
СН2=СН (СН2)4С^ С—С=С (СН2)7СООН
изановая кислота
СНз (СН2) 3СН=СНС^е С—С г С— (СН2) 7СООН
изокарпоновая кислота
К подгруппе полиинов с 17 углеродными атомами от-
носят такие соединения, как цикутотоксин, фалькаринол
и другие:
НОСН2СН=СН(С==С)2СН = СН—СН =
= СНСН2СН2СНС3Н7
(!)Н
цикутотоксин
СН2=СНСН (С=С) 2СН2СН = СН (СН2 )6СНз
ОН
фалькаринол
Особенностью подгруппы природных полииновых сое-
динений с 16 углеродными атомами является то, что они
отличаются высокой ненасыщенностью (от 4 до 6 непре-
дельных групп) и содержат на конце углеродной цепи
кислородную функцию (спиртовую, сложноэфирную,
альдегидную). Примером может служить полиацетиле-
новое соединение, выделенное из соссюреи альпийской
Saussurea alpina L.:
СН3СН = CH—CH = CHC ss CCH = CH—CH=
2**.
49
, — СН(СН2)2СН2О—С—СН3
Ацетиленовые соединения подгруппы Сю и Си не от-
личаются существенно по своему строению от описан-
ных выше полиинов и имеют те же структурные-фраг-
менты. Из второй группы ‘полиинов наиболее предста-
вительной является подгруппа с числом углеродных
атомов 13. Синтезируются они главным образом выс-
шими растениями, отличаются, как правило, степенью
ненасыщенности, большинство из них имеет неразветв-
ленный скелет. Среди природных ациклических поли-
иновых метаболитов этого ряда обнаружены моно-, ди-,
три-, тетра- и пентаацетиленовые соединения с различ-
ными комбинациями двойных связей.
В отличие от предыдущей подгруппы ацетиленовые
соединения с 12 и 11 углеродными атомами представ-
лены очень небольшим количеством и содержатся в ос-
новном в низших растениях. К таким соединениям от-
носятся дегидроматрикариевый эфир
СН3С=Cfe СС^ ССН -ХЗНСООСНз
лахнофилловый эфир
СЫз—С Н2—СН2—С == С—С=ССН=СНСООСНз
и другие. В этой же группе ацетиленовые соединения
с Сю встречаются , как в высших растениях, так и в гри-
бах. Наибольшее число этих веществ представлено кар-
боновыми кислотами и их производными, имеющими
различную степень непредельности, например дегидро-
матрикарианол. CH3ChsСС=СС=ССН=СНСН2ОН.
Весьма невелика по объему подгруппа природных
ацетиленовых соединений С9 и Се. Характерно, что вы-
делены они главным образом из низших ра.стений
(различного типа грибов). " . -
Группа природных соединений алленовой структуры
соответственно включает подгруппы аллен-диацетилена
и другие полинепредельные аллены. Соединения первой
подгруппы достаточно широко представлены в расти-
тельном мире, но продуцируются главным образом раз-
личными грибами и обладают широким спектром анти-
микробного и фунгицидного действия. Первые предста-
вителем этих веществ был микомицин, выделенный
в 1947 г. Е. А. Джонсом и К. Л. Бордовом.
50
Заметное меоГо среди природных полиинов занимает
группа ароматических и гетероциклических ацетилено-
вых соединений, которые В. Ф. Кучеров и соавт. [4]
разделяют на следующие подгруппы: ароматические;
гетероциклические с О-гетероатомом; гетероцикличе-
ские с С-гетероатомом (например, фрутесцин, окись
карлина, ацетат хлоргидрина и др.):
свн5сн2с^с\^-ч /\/СН2С^СС^ССН3
окись карлина \0 / СООСНз
[ОСН3
фрутесцин
СНзС^СС^С^^ С=ССНСН2ОССНз
ацетат хлоргидрина \ s / О
6. Обнаружение полиинов в растительном сырье
Доказательство присутствия полиинов в раститель-
ном сырье затрудняется отсутствием образцов послед-
них. Для качественного их определения исследуемое
растительное сырье, измельченное до размера частиц
0,5—2 мм, многократно обрабатывается диэтиловым
эфиром. Эфирные извлечения упариваются, остаток
растворяется в этаноле и исследуется методом УФ-спект-
роскопии и тонкослойной хроматографии. В УФ-спект-
рах этанольные растворы имеют полосы поглощения
в области 230—310 нм, что характерно для полйи-
нов [3]. Для качественного определения полиинов ме-
'тодом ТСХ используются пластинки silufol, подвижная
фаза: диэтиловый эфир — петролейный эфир в соотно-
шениях 9:1, 7:3 или 1:1. В качестве детекторов приме-
няют 20% раствор серной кислоты или 10% этанольный
'раствор гидроксида калия. После проявления хромато-
граммы выдерживаются при температуре 105°С в течение
3 мин. Обнаружение пятен веществ проводят также па-
рами йода. Во всех случаях полииновые соединения
проявляются в виде пятен коричневого цвета различ-
ной интенсивности. Под действием УФ-лучей большинст-
во полиинов изменяет окраску от темно-бурой до жел-
той [3].
51
7. Методы выделения и разделения по'лиинов
Сравнительно позднее открытие природных поли-
ацетиленовых соединений Объясняется тем, что до не-
давнего времени отсутствовали достаточно надежные
методы их выделения и очистки. Введение в практику
хроматографических методов исследования (бумажной,
тонкослойной, колоночной хроматографии на оксиде
алюминия и силикагеле) позволило более надежно изу-
чать метаболический состав растений.
Общая методика выделения полиинов состоит в пред-
варительном разделении смеси на нейтральную и кис-
лую фракции. Последнюю затем метилируют и отдель-
но разделяют путем многократной хроматографии на
оксиде алюминия. Для примера, приводим выделение
полиинов из веха ядовитого Cicuta virosa L. [3].
Воздушно-сухое растительное сырье, измельченное
до 0,5—2 мм, подвергают последовательной экстракции
петролейным (т. кип. 40—70°С) и диэтиловым эфиром
путем настаивания в течение 5 дней. Порции раствори-
теля сливают через каждые 24 ч.
Диэтиловый экстракт сгущается до удаления раст-
ворителя с получением темно-коричневого остатка, име-
ющего резкий специфический запах.
Выделение из смеси полиинов цикуто.к-
с и н а. Густой эфирный экстракт смешивают с оксидом
алюминия в соотношении 1 :3. Однородный сыпучий по-
рошок желтого цвета переносят на хроматографическую
колонку, заполненную тем же сорбентом в петролейном
эфире. Элюирование проводят смесью петролейный
эфир (т. кип. 70—100°С)—хлороформ в соотношениях
1:3 или 1:9. Полученные фракции соединяют, упаривают,
а, густой маслянистый остаток смешивают с оксидом
алюминия в соотношении 1:3 и наносят на колонку, за-
полненную тем же сорбентом и предварительно промы-
тую смесью петролейный эфир — хлороформ (2:8).
Элюирование веществ начинается смесью петролей-
ный эфир — хлороформ (2:8) с постепенным увеличени-
ем содержания хлороформа. Фракции по 20 мл, содер-
жащие по данным ТСХ одно вещество, объединяют и
упаривают, в результате получают желтого цвета масло,
выход которого составляет около 0,7% на абсолютно
сухое сырье.- При высушивании его в вакууме над Р2О5
в течение 72 ч наблюдается появление кристаллов
52
в форме бесцветных игл. Однако отделить кристаллы от
масла и получить вещество в кристаллическом виде
трудно из-за крайней нестабильности соединения.
Выделение цикутола из смеси поли-
инов. Густой экстракт, полученный из петролейно-
эфирного извлечения, смешивают с трехкратным коли-
чеством оксида алюминия и наносят на колонку с тем
же сорбентом. Элюирование вещества проводят петро-
лейным эфиром, смесью петролейный эфир — хлоро-
форм с возрастанием градиента последнего .до 10%.
Собранные по 100 мл фракции элюата подвергают хро-’
матографическому контролю в системе растворителей
диэтиловый эфир — петролейный эфир (9:1).
Фракции с 10-й по 13-ю объединяют и получают гус-
той темно-коричневого цвета остаток. Последний сме-
шивают с оксидом алюминия в соотношении 1:3 и нано-
сят на колонку с тем же сорбентом (диаметр 15 мм, вы-
сота 95 мм), заполненную смесью петролейный эфир-
хлороформ (7:3). Колонку промывают указанной систем
мой постепенно увеличивая содержание хлороформа
до 80%. Собирают фракции по 50 мл. По данным ТСХ
в системе диэтиловый эфир—петролейный эфир (9:1)
цикутол содержится в основном в 5-й фракции. Ее упа-
ривают и получают густой желтый маслянистый осадок.
Выделение фалькариндиол а из смеси
полиинов. Собранные фракции (26-я—40-я) при вы-
делении цикутола упаривают до удаления растворителя.
Полученный маслянистый остаток смешивают с трех-
кратным количеством оксида алюмцния и наносят на
колонку. Элюирование проводят хлороформом и смесью
хлороформ—метанол (39:1). Собирают фракции элюата
по 20 мл, состав их контролируют методом ТСХ в си-
стеме диэтиловый эфир — петролейный эфир (9:1).
Фракции (4-я—15-я),содержащие фалькариндиол,объ-
единяют и упаривают, полученный желто-коричневый
маслянистый осадок растворяют в метаноле и помеща-
ют в холодильник. Выпавший осадок отфильтровывают,
фильтрат упаривают и получают фалькариндиол.
8. Идентификация и установление строения
Идентификацию выделенного полиина проводят мето-
дом тонкослойной хроматографии, сравнивая с извест-
ным образцом. Выделенные полииновые соединения хра-
53
нят в герметической упаковке в темном месте при тем-
пературе — 4° С.
Для определения физических и спектральных кон-
стант полииновых веществ растворитель отгоняют, а
вещества выдерживают над P2Os в вакууме в течение
72 ч при комнатной температуре. Все работы с полии-
нами проводят, максимально исключая доступ воздуха
и прямых солнечных лучей.
Классический подход к изучению структуры полии-
нов заключается в том, что ацетиленовые соединения
подвергаются расщеплению (окисление, озонирование,
гидролиз) с последующим исследованием и идентифи-
кацией продуктов деградации. Окисление тройных свя-
зей наиболее часто проводят КМПО4 или смесью перйо-
дата и перманганата калия. Расщепление сопряжен-
ной цепи тройных связей может протекать под дейст-
вием щелочи. При установлении строения полиинов ис-
пользуют методы УФ-, ИК-, ЯМР-спектроскопии.
В УФ-спектрах цикутотоксина имеется две полосы
поглощения (230—250 и 310—340 нм), что указывает на
принадлежность вещества к группе полиинов.
В ИК-спектрах полиины имеют полосы поглощения
в области 2140 и 2231 см~!, характерные для валент-
ных колебаний С^С группы. О наличии в молекуле
транс-С=С-групп свидетельствуют полосы поглощения
при 1601, 1633 и 995 см“1 [3].
9. Количественное определение
В основе метода количественного определения ле-
жит реакция образования полиинртутноацетатного
продукта с последующим определением его физико-хи-
мических констант (температуры плавления и оптиче-
ской активности) [8].
Пример. Около 0,1 г (точная масса)' выделенного
полиина или 1 мл эфирного масла переносят количест-
венно в мерную колбу на 25 мл, которую доводят до
метки 50% раствором этанола; 10 мл полученного раст-
вора переносят в другую колбу вместимостью 25 мл и
прибавляют 1 мл 50% раствора этанола, а в первую
колбу прибавляют 1 мл 5% раствора ацетата ртути (II)
в 50% растворе этилового спирта. В обе колбы добав-
ляют по 5 капель разбавленной уксусной кислоты. Кол-
бы закрывают пробками и нагревают на водяной бане
54
в течение 2—2,5 ч, затем добавляют по 0,1 мл 0,1 н.
раствора йода и оставляют при комнатной температуре
до полного охлаждения. Избыток йода оттитровывают
0,01 н. раствором тиосульфата натрия до обесцвечива-
ния раствора. Количественное содержание полиина рас-
читывают по формуле
' -.__________(ViNa2S2O3-~V2Na2S2O3 )К-Т.25-100,
* ~ Т.м. -10 -
где: Vi — объем тиосульфата натр'ия, затраченного на
контрольный опыт; У2 — объем тиосульфата натрия,
затраченного на эксперимент; К — поправочйый коэф-
фициент к титру, тиосульфата натрия; Т —титр опреде-
ляемого вещества; Т. м. — точная масса образца, взя-
того для анализа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гольмов В. П., Афанасьев Н. М. Природные соедине-
ния с тройными связями. — Успехи химии, 1958, т. 27, вып. 7,
с. 785-816.
2. Е р м а к о в а В. А. Фармакогностическое исследование веха
ядовитого и омежника болотного: Дис. ... канд. фарм. наук.—
М„ 1977.
3. Каррер П. П. Курс органической химии. — Л.: Госхимиздат,
I960.— 1216 с.
4. Кучеров В. Ф., Мавров М. В., Держинскиий А. Р.
Природные полиацетиленовые соединения.—М.: Наука, 1972.—
390 с.
5. Bohlmann F., Kleine К. N. Polyacetylen-Verbindungen.
4 XXXV. Die Polyine aus Chrysantemum prutescens L. und Artemisia
* dracunculusL. — Chem. Ber., 1962, Bd. 95, № 1, S. 34—36.
6. Вu’Lock J. D., Jones E. R., Turner W. B. —Chem. Ind..
1955, p. 686—693.
7. Gelmer W., Solomons J. The Structure of the antibiotic
mycomycin. — J. Amer. Chem. Soc., 1Q54, v. 74, p. 1870—1877.
8. Kohanawa M., Tsuyi H. The antagonism of hypnotics
against cicutoxin, and poisons principle isolated from Cicuta viro-
sa L.—J. Pharm. Soc. Japan, 1957, v. 53, p. 41—48.
9. Poloudec R. —Fab inf, К nut ter S., Block D. Die
Bestimmung von polyacetilen-Verbindungen mit Quecksilberacetat.—
Die Pharmazie, 1968, Bd. 3, S. 1200—1210.
Stavholt R., Sorensen N. A.—Acta Chem. Scand.,
1950, v. 4, p. 1567.
Глава 4
СЕСКВИТЕРПЕНОВЫЕ ЛАКТОНЫ
1. Общая характеристика
К сесквитерпеновым лактонам относятся кислород-
содержащие производные сесквитерпеноидов, имеющие
в своем составе 15 атомов углерода и 1 (реже 2) у-лак-
тонный цикл, а также, как правило, кетонную, гидрок-
сильную, эпоксидную или сложноэфирную группы. На-
ряду с этим известно незначительное количество лакто-
нов, содержащих хлор, серу, азот. В последнее время
выделены соединения, состоящие из 30 атомов углеро-
да и получившие название дисесквитерпеноидов.
Долгое время сантонин (сесквитерпеновый лактон),
выделенный из соцветий цитварной полыни Artemisia
cina Berg. [16], являлся единственным представителем
этой группы соединений
у-Сантонин {С15Н20О4)
С 1954 г., благодаря работам чешских ученых
Ф. Шорма и В. Героута [28], число выделенных и изу-
ченных сесквитерпеновых лактонов стало быстро рас-
ти. Крупные исследования представителей этой группы
соединений проведены в ВИЛРе [15]. С 1967 г. систе-
матические исследования сесквитерпеновых лактонов
флоры Средней Азии ведутся в Институте химии расти-
тельных веществ АН УзССР.-
В настоящее время из растительных источников вы-
делено свыше 1200 лактонов различных типов [14, 15,
28]. Указанный класс терпеноидов усиленно изучают во
56
,многих странах мира в связи с широким спектром их
биологического действия — антигельминтного, кардио-
тонического, противовоспалительного, анальгезирующе-
го, противомалярийного, противоопухолевого и др. В
последнее время из некоторых растений выделены сеск-
витерпеновые лактоны, являющиеся действующими ве-
ществами, например: арнифолин — из арники густо-
листной Arnica foliosa Nutt., матрикарин и матрицин—
из ромашки аптечной Matricaria recutita Л-., тауреми-
зин — из полыни таврической Artemisia taurica Willd.
и др.
- Первым сесквитерпеновым лактоном, применявшим-
ся как антигельминтное средство, был сантонин. Ана-
логичным действием обладает также Геленин — сумма
сесквитерпеновых лактонов из девясила высокого Inula
helenium L., который более эффективен, чем сантонин,
в особенности в детской практике. Сесквитерпеновый
лактон тауремизин оказывает возбуждающее действие
на кору головного мозга, урежает ритм сердечных сок-
ращений, мягко повышает артериальное давление, зна-
чительно усиливает сокращение мышцы сердца, не-
сколько увеличивает диурез и применяется в офици-
альной медицине [12]. Матрицин и матрикарин обла-
дают противовоспалительной активностью, что связано
со способностью матрицина легко превращаться в ха-
мазулен. Последний малотоксичен, активирует про-
цессы грануляции и эпйтелизации ран. Арнифолин в
опытах на животных обнаружил тонизирующее дейст-
вие на гладкую мускулатуру матки.
Известно, что многие лактоны, содержащие экзоцик-
лическую метиленовую группу, проявляют цитотоксиче-
скую активность, хотя это и не является обязательным
условием указанного эффекта. Количество лактонов,
для которых установлено противораковое действие,
уже перевалило за 70 [19]. Большинство из них отно-
сится к гермакранолидам (костунолид, алатолид, пар-
тенолид, элефантин, кницин, элеганин и др.), гвайано-
лидам (дезацетоксиматрикарин, артеглазины А и В,
гросгеймин, цинаропикрин, амброзии, геленалин, пау-
цин и др.). Внедрение этих соединений в медицинскую
практику тормозится их весьма высокой токсичностью.
С другой стороны, описаны у-лактоны (например, гейге-'
рин), стимулирующие процессы злокачественных ново-
57
образований. Установлена также антибактериальная и
днтипротозойная активность некоторых лактонов [5].
2. Распространение в растительном мире
Сесквитерпеновые лактоны широко распространены
в природе и изучены в основном в высших растениях.
'Наиболее богатым является семейство Asteraceae
(Compositae), в нем отличаются большим разнообра-
зием содержащихся лактонов роды: Achillea, Acroptilon,
Ambrosia, Artemisia, Helenium, Inula, Gaillatdia, Matri-
caria, Saussurea. Из других семейств следует отметить
Acanthaceae, Amarantaceae, Apiaceae (и его род Feru-
la), Aristolochiaceae, Canellaceae, Coriariaceae, Illicia-
ceae, Lauraceae, Lamiaceae (Labiatae), Magnoliaceae,
Menispermaceae, Polygoniaceae, Umbelliferae.
Из низших растений известны представители двух
семейств, содержащих сесквитерпеновые лактоны —
. Russulaceae и Frullaniaceae.
3. Локализация в растениях
. Сесквитерпеновые лактоны могут накапливаться во
всех органах растений, но большинство их выделено
из надземной части. Так, например, сантонин локали-
зуется в листьях и цветочных корзинках полыни цит-
варной. Интересно отметить, что после распускания бу-
тонов корзинки, а также семена, корни и одревеснев-
шие стебли сантонина не содержат. Количество послед-
него подвержено изменению в процессе вегетации рас-
тения: в начальной фазе развития цветочных корзинок
содержание его составляет около 7%, в дальнейшем
оно постепенно снижается (особенно резко — незадол-
го до цветения). Это объясняется локализацией санто-
нина главным образом в зеленой обертке корзинок,
внутренние же органы цветка его не содержат.
Интересные исследования проведены с ромашкой
аптечной. О наличии прохамазуленов (в частности,
матрицина) судили по выходу хамазулена, образующе-
гося, как известно,* из лактонов гвайанолидйой приро-
ды в процессе гидродистилляции. В листьях отечест-
венной. ромашки аптечной прохамазулены отсутствуют,
они содержатся только в цветочных корзинках, расп-
ределяются неравномерно (в оснрвном в трубчатых
Б8~
цветках), цветоложе и листочки обвертки содержат их
незначительное количество, а в язычковых цветках —
лишь следы. При сушке цветочных корзинок образуется
так называемая «осыпь», которая является наиболее
ценным сырьем.
Содержание прохамазуленов зависит также от фазы
,развития и места произрастания ромашки аптечной. По
мере роста и развития цветочных корзинок содержание
прохамазуленов возрастает, достигая максимума в пе- ?
риод массового цветения (82,29 мг% в сырье), а затем
.снижается.
4 Установлено, что цветы ромашки аптечной, произ-
растающей в Новосибирской области, лишены прохама-
зуленов, незначительное их количество отмечено в рас-
тениях из Куйбышевской области (27,50 мг°/о), не-
сколько больше — на Украине (47,33 мг%) и больше
всего — в ромашке с опытного поля .ВИЛРа
(73,27 мг.%) [10].'
При изучении эфирного масла болгарских образцов
ромашки аптечной установлено, что в растениях из се-
верных областей хамазулен присутствует, из южных —
.’отсутствует. По-видимому, это обусловлено генетиче-
• скими причинами, так как «бесхамазуленовая» ромаш-
ка, посеянная в северных районах Болгарии, лишена
хамазулена, а «хамазуленовая», высеянная на юге, со- .
держит его [24]. В зависимости от места произраста-
ния и фазы вегетации растений может меняться не
только содержание сесквитерпеновых лактонов, но и их
состав.
Более редки случаи выделения лактонов из подзем-
ных частей растений. В частности, из корней соссюреи
репейниковой (лопуховидной) Saussuijea lappa Clarke—
растения, широко используемого в народной и офици-
альной медицине стран Востока, получены костунолид,
дегидрокостуслактон,г дигидрокостуслактон, мокколак-
тбн, сауссуреалактон, 12-метоксидигидрбкостунолид [2].
Сумма сесквитерпеновых лактонов, называемых алан-
тоном, изолирована из корней и корневищ девясила
высокого. Кроме того, выделены сесквитерпеновые лак-
тоны из корней рода Ferula.
4. Классификация
По строению углеродного скелета все известные
сесквитерпеновые лактоны подразделяют на 24 основ-
< 59
ных типа [9]. Наибольшее их количество относится к
типам гермакрана (гермакранолиды), гвайана (гвай-
анолиды), амброзана (амброзанолиды) и эвдесмана
(эвдесманолиды):
Гвайанолиды ‘
Амброзан Амброзанолиды
Эвдесман Эвдесманолиды
По строению углеродного скелета лактоны можно
классифицировать как ациклические, моноциклические,
бициклические и трициклические. Некоторые из них
могут быть эстерифицированы по спиртовому гид-
роксилу, например паллиферидин из ферулы бледной
Ferula palida Eug. Ког., являющийся сложным эфиром
60
ферутинола с 3, 4, 5-триметоксибензойной кислотой [11].
Подобные соединения характерны для рода Ferula [4,
& 17]. *
Изредка встречаются гликозилированные лактоны,
^которые могут быть эстерифицированы по гидроксилам
ijgaxapHoro компонента [32].
5. Физико-химические свойства
Большинство лактонов — это твердые кристалличе-
ские вещества, реже — маслообразные жидкости, не-
растворимые в воде и растворимые в органических
растворителях: этаноле, хлороформе, диэтиловом эфи-
ре, гексане. На растворимость лактонов в воде значи-
тельное влияние оказывают сопутствующие экстрактив-
ные вещества, в присутствии которых она резко повы-
шается. На этом основан один из простых методов вы-
деления. В водных растворах щелочей сесквитерпено-
вые лактоны растворяются вследствие раскрытия лак-
тонного кольца и образования солей соответствующих
кислот.
Лактоны не имеют общих свойств, которые можно
было бы использовать при их выделении. Наиболее
достоверная информация может быть получена при
ИК-спектроскопии извлечения из растений. С этой
целью выделение лактонов производят по методу
К. С. Рыбалко [15], который основан на способности,
этих соединений растворяться в горячей воде в при-
сутствии других экстрактивных веществ с последую-
щим извлечением их хлороформом.
Для этого 50—100 г измельченного сырья настаи-
вают с горячей водой в соотношении 1 :5 на водяной
бане при 70—80° в течение 1 ч. Водное извлечение про-
цеживают и после охлаждения лактоны три раза экстра-
гируют хлороформом в соотношениях 10:1, 15:1, 20:1.
Растворитель отгоняют под вакуумом и остаток подвер-
гают ИК-спектроскопии в виде тонкой пленки хлоро-
формного раствора или в таблетке бромида калия в
области 1600—1800 см-1. Не исключается возможность
проверки наличия сесквитерпеновых лактонов методом
ИК-спектроскопии в других извлечениях, полученных
при обработке сырья петролейным эфиром, хлорофор-
мом, этилацетатом, ацетоном, этанолом.
61
Все описанные в настоящее время сесквитерпено-
вые лактоны содержат у-лактонный цикл и поэтому
имеют в ИК-спектре полосу поглощения лактонного
карбонила в области 1740—1800 см-1. Однако в облас-
ти 1740—1750 см-1 дает полосу поглощения также и
карбонил 6-лактона кумаринов, сложных эфиров и др.
Но кумарины и ароматические сложные эфиры отли-
чаются еще наличием двух полос в анализируемой
области: 1680—1750 (С = 0) и 1600—1620 см-1 (арома-
тическая С = С). При отсутствии второй полосы, в об-
ласти 1600—1620 см-1 полностью исключаются арома-
тические соединения, что указывает на возможность
присутствия у-лактонов; наличие же полос поглощения
в области 1760—1800 см-1 при возможной второй поло-
се в области 1610—1660 см"1 свидетельствует о при-
сутствии у-лактонов, в молекуле которых имеется двой-
ные связи в сопряжении; а-метилен-у-лактонный цикл
[15].
При исследовании лактонов методом тонкослойной
хроматографии в качестве адсорбентов используется
оксид алюминия IV степени активности или силика-
гель. Подвижной фазой могут служцть следующие сис-
темы растворителей: бензол—этанол (9:1), бензол-ме-
танол (9:1), бензол-бутанол (9:1), гексан-этилацетат
(85:5), хлороформ—метанол (7:3), хлороформ—эти-
лацетат (9:1), петролейный эфир—хлороформ—этила-
цетат (2:2:1), петролейный эфир — бензол — хлороформ
(5:4:1) и др.
Проявляют хроматограммы чаще всего 1 % раство-
ром перманганата калия в 1% растворе серной кисло-
ты. Однако данный проявитель не специфичен для
лактонов, так как с его помощью могут быть опреде-
лены и другие ненасыщенные вещества. Из других
проявителей можно отметить 1% раствор ванилина в
концентрйрованной серной кислоте и серную кислоту
при нагревании [3, 18, 27]. Что касается хроматогра-
фии на бумаге, то как аналитический метод исследова-
ния лактонов она используется чрезвычайно редко.
6. Количественное определение
Содержание суммы лактонов или отдельных пред-
ставителей определяют, как правило, гравиметриче-
ским методом после выделения из растений или хрома-
62 - -
^^графического разделения. Можно* использовать
Спектрофотометрические методы (например, ИК-спект-
врофотометрию в обла.сти 1600—1800 см-1, характерной
Яйля поглощения сесквитерпеновых лактонов), сочетая
шх с хроматографическим выделением.
Л| Количественное определение фармпрепаратов тауре-
Ямизина, а также ранее применяемого сантонина реали-
Жзуется алкалиметрическим методом, основанным на •
Шфаекрытии лактонного кольца под действием щелочи.
]^Для этого препарат подвергают действию титрованного,
I '^спиртового раствора гидроксида натрия в течение опре-
1 ‘деленного времени (в случае необходимости при нагре-
Ч вании), после чего избыток щелочи оттитровывают кис-
Я .лотой с индикатором фенолфталеином. Параллельно
^проводят контрольный опыт.
Можно воспользоваться фотоэлектроколориметри-
?Ж1еским методом, основанным на способности лактонов
' образовывать со щелочным раствором соляно-кислого
1 Гидроксиламина гидроксамовые кислоты, которые с со-
I ^лями железа (III) образуют комплексы, окрашенные
1||в фиолетовый цвет.
Я|г 7. Методы выделения и разделения
Я' сесквитерпеновых лактоцов
Унифицированного метода выделения сесквитерпе-
НЖновых лактонов не существует. В каждом отдельном
й «случае необходим конкретный подход. Значительное
^количество лактонов выделено хлороформом с после-
'^“дующим разделением полученного экстракта после
удаления растворителя колоночной . хроматографией.
В некоторых случаях малополярные лактоны извле-
кают петролейным эфиром (гексаном или гептаном).
Сильнополярные соединения можно извлекать поляр-
ным растворителем (ацетоном иди спиртом), в этих
случаях сырье рекомендуется обезжирить предвари-
тельной экстракцией петролейным эфиром. Ацетоновые
или спиртовые извлечения после удаления растворите-
ля и разбавления водой необходимо подвергнуть фрак-
ционированию растворителями с увеличивающейся по-
лярностью (петролейным эфиром, хлороформом, ди-
этйловым эфиром),.в полученных извлечениях следует
искать лактоны методом ЙК-спектроскопии. Для хро-
матографической очистки и разделения у-лактонов пу-
63
тем колоночной хроматографии чаще всего используют
нейтральный оксид алюминия (IV ст. акт., реже III)
или силикагель. Лактоны элюируют растворителями с
увеличивающейся полярностью или их смесями в раз-
личных соотношениях. В качестве примера приводим
несколько методик выделения и разделения сесквитер-
пеновых лактонов.
Выделение лактоной по методу Рыбалко
Надземную часть соссюреи иволистой Saussurea
salicifolia DC. экстрагировали горячей водой и водные
извлечения обрабатывали хлороформом. Хлороформный
остаток помещают на колонку с силикагелем и при элю-
ировании хлороформом выделяют индивидуальное ве-
щество в виде бесцветной и вязкой жидкости состава
С19Н22О6 • Н2О, идентифицированное с цинаропикри-
ном [7].
Выделение лактонов экстракцией
хлороформом
Хроматографированием хлороформного экстракта
надземной части танацетопсиса остроконечного Тапасе-
topsis mucronata S. Koval, на колонке с оксидом алю-
миния при элюировании смесью гексан-этилацетат
(19:1) выделены дезацетиллауренобиолид и дигидро-
дезацетиллауренобиолид. При увеличении койцетрации
этилацетата изолировали сиукрин, табулин, танахин
Выделение лактонов экстракцией
хлороформом с последующей очисткой
хлороформного извлечения
Цветочные корзинки псевдоханделии зонтичной
Pseudohandelia umbellifera L. экстрагировали хлоро-
формом. Сгущенный экстракт растворяли в этаноле и
разбавляли водой до получения 60% спиртового раст-
вора. Через сутки выпавший осадок отделяли. Из
фильтрата после обработки петролейным эфиром (для
удаления эфирного масла) сумму лактонов извлекали
бензолом. Выделенную смесь веществ разделяли хро-
матографированием на колонке с оксидом алюминия
(IV ст. акт.) в соотношении 1:10. При элюировании
64
Цмесью бензол—гексан (7 :3) получили ханфиллин и
Цртекалин [26]. 6,5 кг надземной части полыни Сивер-
на Artemisia sieversiana Willd. экстрагировали хлоро--
формом методоу настдивания. Сгущенный хлороформ-
ный экстракт растворили в спирте (1 л) и разбавили
равным количеством воды. При стоянии выпал осадок,
.который отфильтровали, а водно-спиртовый экстракт
Обработали хлороформом. Сгущенный хлороформный
экстракт разделили на оксиде алюминия (IV ст. акт.),
элюировали гексаном, смесью гексана с бензолом
.(•7:3, 1:1, 3:7), бензолом, смесью бензола с ацетоном
(19: 1, 9: 2-, 4:1). При этом были выделены артемолин
абсинтин [25].
t Выделение лактонов полярными
'• органическими растворителями
Из надземной части полыни Шовица Artemisia szo-
^aritziana (Bess.) Grosch. был получен ацетоновый экст-
ракт. Хроматографированием полученного экстракта
на оксиде алюминия выделены а-сантонин и артеми-
:^н [20].
8. Идентификация и установление строения
Доказательства строения сесквитерпенов, в том
числе и у-лактонов, проводят в несколько этапов:
1) установление структуры углеводородного скелета;
2) выяснение характера и положения функциональных
групп.
Д1. Определение углеводородного скелета
Метод дегидрирования
Для установления структуры- углеродного скелета
терпеноидов и отнесения к отдельным структурным ти-
пам служит чаще всего метод дегидрирования, пред-
ложенный Ружичкой [33]. Дегидрирование проводят
нагреванием вещества с серой или селеном в присутст-
вии Pd-катализатора при повышенной температуре.
При этом гидроароматические соединения переходят в
ароматические углеводороды, которые можно легко
очистить и идентифицировать получением производных
3. Заказ 2909. 65
(например, пикратов, тринитробензоатов) или спектре
фотометрическими методами. При этом в ряде случаев
достаточным бывает снятие спектра в УФ- и видимой
области, особенно для соединений азуленового ряда.
Результаты дегидрирования дали основание Ruzicka
классифицировать сесквитерпеноиды по типу углерод-
ного скелета па производные нафталина -и азулена,
имеющие различные углеводородные заместители:
Нафталин
Например, при дегидрировании матрицина Получа-
ется хамазулен. Азуленовые производные можно допол-
нительно идентифицировать бумажной хроматографией.
матриццн
хамазулен
Метод гидрирования
Для определения углеродного скелета можно ис-
пользовать метод исчерпывающего гидрирования [28].
Для этого исследуемое вещество переводится катали-
тическим гидрированием с предварительным устране-
нием всех функциональных групп до насыщенных угле-
водородов, идентифицируемых в дальнейшем ИК-
спектроскопией, так как образующиеся вещества —
жидкости, не дающие кристаллических производных.
В настоящее время при установлении строения угле-
родного скелета сесквитерпеновых лактонов пользуют-
|g обоими методами с учетом данных ЯМР-спектров
^ходных соединений и их производных.
.2. Определение функциональных групп
’ Лактонный цикл
Характерной особенностью у-лактонов является их
|сдособность подвергаться гидролитическому расщепле-
нию при воздействии щелочей с образованием солей
оксикислот, при подкислении которых вновь образуют-
ся исходные вещества. Однако если по соседству с лак-
тонным циклом расположен гидроксил, то при-замыка-
нии возможно образование цикла в ином направлении.
Для некоторых лактонов под действием щелочи воз-
можна дегидратация, образование окисей.
Сложноэфирная группа
Для выявления сложноэфирных групп применяются
реакции гидролиза. При этом возможны разнообразные
побочные реакции, во избежание которых подбирают
по возможности «мягкие» условия и проводят гидролиз
в присутствии минеральных кислот или щелочей (НС1,
H2SO4, КОН, NaOH, Ва(ОН)2) при комнатной темпе-
ратуре или при нагревании в водных, водно-спиртовых
или других растворах.
В качестве примера можно привести щелочной гид-
ролиз верпофлексина [32]: 0,1 г вернофлексина раст-
воряют в 15 мл 5% этанольного раствора гидроксида
калия и выдерживают при комнатной температуре. За-
-тем разбавляют водой, подкисленной разведенной сер-
ной кислотой до pH 1,0, и экстрагируют хлороформом.
Хлороформный экстракт промывают водой, 0,5% раст-
вором карбоната натрия (карбонатный раствор сохра-
няют), сушат безводным сульфатом натрия и концент-
рируют в вакууме; полученный после гидролиза сескви-
терпеновый лактон залузапин.С очищают колоночной
хроматографией на силикагеле, вымывая смесью беп-
зол-этилацетат (9:1).
Карбонатный раствор подкисляют серной кислотой
'До pH 1,0; извлекают диэтиловым эфиром, эфирное
извлечение промывают водой, сушат безводным суль-
фатом натрия и растворитель отгоняют под вакуумом.
67
66
После перекристаллизации получают р, р-диметилакри-
ловую кислоту.
Сесквитерпеновые гликозиды также гидролизую? в
разных условиях: кислотный гидролиз позволяет иден-
тифицировать сахарную часть молекулы, а щелочной—
сесквитерпеновую. Очень удобен ферментативный гид-
ролиз, позволяющий провести определение обеих час-
тей.
Для иллюстрации опишем энзиматический гидролиз
вернофлексуозида-[32]: 0,2 г этого соединения раство-
ряет в 10 мл ацетатно-буферного раствора (0,5 М раст-
вор ацетата натрия, доведенный уксусной кислотой до
pH 5,3), к раствору прибавляют 3 мг фермента р-гли-
козидазы и выдерживают при 37°С. Агликон извлекают
хлороформом, хлороформный раствор сушат безводным
сульфатом натрия, растворитель отгоняют под вакуу-
мом и после перекристаллизации из эфира получают
залузанин. Водный раствор подвергают хроматографи-
ческому анализу для доказательства сахарного остатка,
которым в. данном случае является D-глюкоза.
Гидроксамовая проба на лактонный цикл
и сложноэфирную группировку
Соединения, содержащие лактонный цикл или слож-
ноэфирную группировку, способны с гидроксиламином
в щелочной среде образовывать гидроксамовые кисло-
ты, которые с-солями железа (III) образуют окрашен-
ные комплексы.
Примером может служить методика гидроксамовой
пробы на тауремизин: 0,01 г препарата растворяют в
1 мл 95% спирта, добавляют 1 мл 1 % этанольного ра-
створа гидроксиламина соляно-кислого, перемешивают
и прибавляют 10% раствор гидроксида калия до pH 8
(по универсальной индикаторной бумажке), через 5-мин
подкисляют 3—4 каплями концентрированной хлорной
кислоты и прибавляют 2—3 капли 10% спиртового ра-
створа хлорида железа (III), при этом появляется фио-
летовое окрашивание.
Гидроксильная группа
Наличие и характер гидроксильной группы устанав-
ливают ацетилированием, окислением и дегидратацией.
Первичные или вторичные спиртовые гидроксилы лег-
ко подвергаются ацетилированию уксусным ангидри-
68
дом в пиридине при комнатной температуре или при
нагревании [6]. Это же правило относится и к гидрок-
силам сахарного компонента. Третичные гидроксилы в
этих условиях не ацетилируются, хотя имеются исклю-
чения, обусловленные некоторыми особенностями стро-
ения лактонов.
Для выяснения характера гидроксильных групп
проводят их окисление хромовым ангидридом и диок-
сидом марганца. При этом первичные гидроксилы окис-
ляются до альдегидных или карбоксильных групп, вто-
ричные — до кетогрупп, третичные не окисляются.
Сесквитерпеновые лактоны, содержащие третичные
гидроксилы, легко дегидратируются под действием сер-
ной, муравьиной кислот или их смеси и других реаген-
тов. В ряде случаев и вторичные гидроксилы могут де-,
гидратироваться.
Кетогруппа
Сесквитерпеновые лактоны, содержащие кетогруп-
пу, вступают в реакции конденсации с гидроксилами-
ном, 2,4-динитрофенилгидразином, семикарбазидом
и т. п. [6] с образованием соответствующих производ-
ных в случае отсутствия стерических затруднений.
Эпоксидная группа
При обработке эпоксидов гидроксидом натрия, хлор-
ной кислотой, смесью серной и уксусной кислот проис-
ходит раскрытие эпоксидного кольца с образованием
диолов [6]. - .
Двойные связи
Сесквитерпеновые лактоны могут содержать одну,
Две или три (реже более) ненасыщенные углерод-угле-
родные связи. Для их определения используют ката-
литическое гидрирование. При этом следует учитывать
возможность протекания различных побочных процес-
сов: восстановление Гидроксила., карбонила и т. д.
Наличие двойных связей устанавливают реакциями
бромирования и окисления. Последнее свойство приме-
няют для проявления ' лактонов на хроматограммах
обработкой серно-кислым раствором перманганата ка-
лия.
Особо следует отметить экЬоциклическую двойную
связь в сопряжении с лактонным карбонилом, обуслов-
69
ливающим повышенную реакционную способность не-
предельной связи, которая легко восстанавливается,
окисляется и, что интересно, присоединяет метанол,
первичные и вторичные амины, диазометан с образова-
нием пиразолиновых производных [15, 31].
8.3. Спектроскопические методы
исследования
ИК-спектроскопия
ИК-спектроскопия позволяет выяснить характер
функциональных групп и' в связи с этим играет значи-
тельную роль при идентификации лактонов. Поглоще-
ние, характерное для сесквитерпеновых у-лактонов,
обусловлено карбонильной группой пятичленного лак-
тонного кольца и проявляется в области 1780 —
1760 см-*1. В ряде случаев наблюдается расщепление
этой полосы поглощения, поэтому, чтобы исключить
возможность существования второй оксо-группы, сле-
дует образец снять в разных условиях.
С другой стороны, если в молекуле лактона наряду
с карбонилом у-лактонного цикла, имеется еще карбо-
нил в пятичленном цикле, то полосы поглощения их
могут сливаться, образуя широкую полосу поглощения.
Если в молекуле присутствуют полярные группы
О
П -
>С = О, —О—С—R, ОН (две последние могут нахо-
диться в сопряжении с лактонным карбонилом), то
полоса поглощения лактонного карбонила смещается
в сторону больших частот (1775—1800 см~г). В случае
же наличия сопряженной с лактонным карбонилом экзо-
циклической метиленовой группы полоса поглощения
- снижается в область 1765—1740 см~*. При этом мети-
леновая двойная связь характеризуется полосой 1405—
1410 см-1, обусловленной деформационными колебания-
О
ми С—Н связей. II
Многие лактоны имеют группировку —О—С—СНз,
которая характеризуется поглощением при 1735—1740 и
1250 см*1; СН2=С—С=О — 1660—1665 см*1 [15].
z Гидроксильная группа дает хорошо выраженную по-
лосу поглощения в области 3400—3600 см-1. Кристал-
логидратная вода в ИК- спектре обнаруживается по
широкой полосе в области 3200—3400 см”1.
70
УФ-спектроскопия
УФ-спектроскопия лактонов используется для опре-
деления наличия и характера сопряжения; у-лактон-
ный цикл с экзоциклической метиленовой группой имеет
максимум от 200 до 214 нм, мало изменяющийся при
наличии в молекуле других функциональных групп и
иного углеродного скелета [15].
Если в молекуле наряду с а, p-ненасыщенным кар-
бонилом у-лактонного цикла присутствует другой а,
р-ненасыщенный карбонил (сложноэфирный или кетон-
ный), то полосы их поглощения зачастую сливаются;
а-, p-ненасыщенные кетоны в УФ-спектре характери-
зуются полосами поглощения при 215—237 и 270—
340 нм. Первая (более интенсивная) характеризует
сопряженность двойной связи с.карбонилом, а вторая
(более слабая) типична для карбонила.
Спектроскопия ЯМР
Для изучения строения сесквитерпеновых лактонов
широко применяется спектроскопия ядерного магнитно-
го резонанса на протонах—ПМР-спектроскопия [13, 15,
21, 29, 30], которая дает информацию о-количестве во-
дородных атомов в молекуле данного соединения, так
как интегральная интенсивность сигналов протонов пря-
мо пропорциональна количеству атомов водорода в мо-
лекуле. Если известна площадь сигнала в спектре от
данного протона (Н), то количество атомов водорода
равно отношению площадей сигналов от всех протонов
к площади одного протона. Обычно найти единицу про-
тона в сесквитерпеновых лактонах нетрудно, посколь-
ку они, как правило, содержат метильные группы (ЗН),
дающие весьма характерные сигналы. Кроме того, лак-
тонный протон (1Н) и экзоциклические метиленовые
группы (обычно два сигнала от каждого протона), а
также некоторые другие функциональные группы и
протоны скелета дают отдельные сигналы, легко раз-
личимые в спектре. <
Наиболее интенсивными являются сигналы протонов
метильных групп. Сигналы протонов вторичных (дуб-
леты 7=5—7 Гц) и третичных (синглеты) метильных
групп находятся в области 0,6—1,4 м. д.
Наличие трехпротонпых сигналов метильных групп
В более слабом поле (1,3—1,6 м. д.) свидетельствует
71
О том, что в геминальном положении к метильной груп-
пе находится гетероатом (кислород).
Метильные группы при двойной связи дают сигна-
лы в еще более слабом поле,— 1,5—2,5 м. д., а. аце-
тильные — при 1,8—2,2 м. д. Сигналы протонов ме-
тильных групп при двойной связи (в отличие от тако-
вых при кислороде) нередко значительно уширены или
слабо расщеплены (/^2 Гц). В случае сопряжения с
карбонилом наблюдается смещение в более слабое по-
ле (2,2—2,5 м. д.).
Весьма характерным для сесквитерпеновых лакто-
нов является наличие в их спектрах в области 3,6—
5,1 м. д. сигнала протона, находящегося в геминальном
положении к лактонному кислороду. В этой же облас-
ти могут находиться и сигналы протонов при углероде
с гидроксильной группой. В соответствующих ацетатах
эти протоны дают сигналы приблизительно на 1 м. д.
в более слабом поле. Следовательно, из сравнения
спектров спиртов и их ацетатов, можно однозначно сде-
лать отнесение сигналов протонов при углероде с кис-
лородным атомом лактонного цикла.
В области от 4,5 до 8,1 м. д. располагаются сигналы
олефиновых протонов. Особый интерес представляет
рассмотрение сигналов протонов экзоциклической ва-
нильной группы. Каждая такая группа обычно дает два
одиночных сигнала в виде синглетов или слаборасщеп-
ленных дублетов интенсивностью по одной протонной
единице. Как правило, если экзоциклическая винильная
группа не сопряжена с карбонилом или двойной связью,
то сигналы ее протонов находятся в области от 4,5 до
5,4 м. д. Под влиянием лактонного карбонила сигналы
протонов сопряженной с карбонилом экзоциклической
винильной группы смещаются на 1 м. д. в более слабое
поле. При этом расстояние между сигналами в боль-
шинстве случаев равно 0,5—0,7 м. д. и мало изменяет-
ся при переходе от одного лактона к другому, если да-
же они относятся к разным типам. Однако если
в p-положении к двойной связи находится карбоксиль-
ная группа, расстояние иногда уменьшается до 0,1 м. д.
Эти особенности сигналов экзоциклических винильных
групп, сопряженных с карбонилом, позволяют однознач-
но идентифицировать их в ЯМР-спектрах сесквитерпе-
новых лактонов разных типов, а также отличать их от
подобных групп, не находящихся в сопряжении.
72
Данные ЯМР-спектра позволяют сделать вывод о ме-
4gre присоединения лактонного цикла, гидроксильной,
ацильной и других функциональных групп.
Рассмотрение величины спин-спинового взаимодей-
ствия протонов дает информацию о положении функ-
циональных групп, о конфигурации и конформации мо-
лекулы, а в некоторых случаях и об углеродном скеле-
те. Большинство сигналов в спектрах ЯМР расщепле-
ны. Эта константа сильно зависит от связей С—Н взаи-
модействующих протонов. Зависимость констант спин-
спинового взаимодействия (КССВ) от двухгранного
угла между взаимодействующими протонами, находя-
щимися в вицинальном или аллильном положениях, в
настоящее время хорошо изучена и успешно применя-
ется, особенно при решении вопросов, связанных со сте-
реохимией молекул. Некоторые примеры использова-
ния этих зависимостей для сесквитерпеновых лактонов
рассмотрены ниже.
Строение углеродного скелета
Для олефиновых протонов, находящихся в вициналь-
ном положении, имеется также зависимость между уг-
лом КССВ (связью С—Н) и. двойной связью. Этот угол
зависит, в частности, от того, в каком цикле находится
двойная связь. С увеличением цикла возрастает КССВ
вицинальных протонов; при этом угол между связями
С—Н и С=С уменьшается: если в пятичленных циклах
соответствующая КССВ равна приблизительно 5—6 Гц,
То в шестичленных — около 10 Гц. Такое различие по-
зволяет отличить пятичленные циклы от шестичленных
и, следовательно, говорить о строении углеродного ске-
лета.
. Константа взаимодействия между лактонным прото-
ном и вицинальным протоном лактонного цикла также
Несет информацию об углеродном скелете. Так, наиболь-
шее значение /6>7=11 Гц наблюдается в основном
5 э-вдесм анолидах.
4. Величина аллильной КССВ, также связана с разме-
ном цикла, к которому присоединено лактонное кольцо;
значение 0,6—1,5 Гц характерно для эвдесманолидов,
^сотя для них не исключается также константа в 3 Гц.
Положение лактонного цикла
Лактонный цикл может быть присоединен к угле-
Ирдному скелету так, что связи СЦПкл—Олакт и Слакт—
73
Слакт находятся либо по одну сторону от плоскости уг-
леродного цикла (цис^присоединение), либо по разные
(транс-присоединение):
В большинстве случаев КССВ между протонами, на-
ходящимися -в геминальном положении к лактонному
кислороду и вицинальному к нему протону лактонного
цикла, имеет-значение 6—11 Гц; КССВ 8 Гц и мень-
ше отвечает взаимодействию цис-протонов и говорит
о цис-присоединении лактонного цикла. Большая вели-
чина (9,5—11 Гц) отвечает взаимодействию протонов,
двухгранный угол между которыми приближается
к 180°. Таким образом, большая величина констант
взаимодействия указывает . на , транс-присоединение
лактонного цикла.
Для определения ориентации лактонного цикла в со-
единениях, имеющих экзоциклическую метиленовую
группу при лактонном цикле, можно применять следую-
щий прием. Учитывая, что лактонный цикл с экзоцик-
лической метиленовой группой более плоский, чем с ме-
тильной группой, следует ожидать различного измене-
ния величины между цис- и транс-протонами при пере-
ходе к гидрированным продуктам. В гидрированном
продукте двухгранный угол для транс-протонов ближе
к 180°, а для- цис-протонов—ближе к 60°, чем в исход-
ном. В связи с этим при переходе к гидрированным
продуктам для транс-протонов следует ожидать увели-
чения КССВ, а для цис-протонов — ее уменьшения.
Использование ЯМР 13С-спектроскопии для уста-
новления строения лактонов носит пока единичный хат
рактер [22, 23].
ЛИТЕРАТУРА
1. Абдуазимов Б. X., Юнусов А. И., Хамидходж.а-
ев С. А., Сидякин Г. П. Сесквитерпеновые лактоны Tanacetopsis
mucronata..—Химия, природ. соед., 1981, № 3, с. 398—399.
74
2. Агафонова Н. В,, Кушннр Л. Е„ Кузовков А. Д„
Ш р е т е р А. И., Пименов М. Г. Химическое изучение Saussurea
pulchella Fisch. — Аптечное дело, 1966, т. 15, № 2, с. 36—37.
3. Ахрем А. А., Кузнецова А, И. Тонкослойная хрома-
тография.— М.: Наука, 1965, с. 112—117.
4. Багиров В. Ю., Шейченко В. И., Гасанова Р. Ю.,
Пименов М. Г. Изучение лактонов Ferula malacophyla. — Химия
природ, соед., 1978, К» 4, с. 445—449.
5. Вичканова С. А., Рубинчик М. А., Шретер А. И.
Антимикробная активность видов рода Saussurea DC.—Раст, ре-
сурсы, 1969, т. 5, вып. 2, с. 224—229.
6. Горяев М., Пл ив а И. Методы исследования эфирных
масел. — Алма-Ата: Изд-во АН Каз.ССР, 1962. — 751 с.
7. Дудко В. В., Рыбалко К. С. О сесквитерпеновом лакто-
не из Saussurea salicifolia.— Химия природ, соед., 1982, № 4,
с. 524-525.
8. Кадыров А. Ш., Саидходжаев А. И. Строение аки-
феринина. — Химия природ, соед., 1978, № 1, с. 137—138.
9. К а с ы м о в Ш. 3. Успехи химии сесквитерпеновых лакто-
нов.— Химия природ, соед., 1982, № 5, с. 551—569.
10. Киселева Е. Я. Выделение и изучение сесквитерпеновых
лактонов — биологически активных веществ из некоторых растений
семейства сложноцветных: Автореф. дис. ... канд. хим. наук. — М.,
1972. —24 с.
11. Кушмурадов А. Ю., Саидходжаев А. И., Кады-
ров А. Ш. Строение паллиферидииа — сложного эфира. Ferula
pallida. — Химия природ, соед., 1981, № 3, с. 400.
12. Машковский М. Д. Лекарственные средства. Т. 1,—
М.: Медицина, 1977, с. 120—121.
13. Нурмухамедова М. Р., Касымов Ш. 3., Мельб а -
ев С. Грилактон из Ferula penninervis. — Химия природ, соед.,
1982, № 2, с. 261.
14. Майо де П. Терпеноиды. — М.: ИЛ, 1963. — 494 с.
15. Рыбалко К. С. Природные сесквитерпеновые лактоны.—
М.: Медицина, 1978. — 320 с.
16. Рыбал ко К. С., Б аньковский А. И. Изучение хими-
ческого состава эфирного масла цитварной полыни. — Тр./ВИЛАР.—
М.: Медицина, 1959, вып. 11, с. 106—151.
17. Саидходжаев А. И. Строение тенуферина, тенуферинина
и теиуферидина. — Химия природ, соед., 1978, № 4, с. 70—75.
18. С а ит б а ев а И. М., Малл а баев а А., Сидякин Г. П.
Лактоны Artemisia leucoides. — Химия природ, соед., 1981, № 2,
с. 247—248. . 7
19. Семенов А. А. Природные противОпухолевые соедине-
ния.—Новосибирск: Наука, 1979.— 220 с. -
20. Серкеров С. В., Алескерова А. Н. Сесквитерпеновые
лактоиы Artemisia szowitsiana.—Химия природ, соед., 1981 № 3
с. 397—398. ’
21. Серкеров С. В., Алеске’рова А. Н. О сесквитерпено-
вом лактоне из Acroptilon repens. — Химия природ, соед., 1982, № 3
с. 712—715. . .
22. Серкеров С. В. Исследование сесквитерпеновых лактонов
методом спектроскопии ЯМР 18С. II. Спектры ЯМР 18С алаханина,
ацетилартемизина и тауремизина.—Химия природ, соед., 1982, № 4,
с. 455—457,
75
23. Серверов С. В. Исследование сесквитерпеновых лакто*
нов методом спектроскопии ЯМР 18С. I. Спектры ЯМР 13С банхы-
зина и его производных. — Химия природ, соед., 1982, № 4,
с. 452—455.
24. С т о я н о в Н., П е н е в И., О г н я н о в И. Към въпроса
за йзуленовато съдържание на естеричните масла от кошничкн
от местна. — Фармация (София), 1960, № 6, с. 21—23.
25. У баев X., Касымов Ш. 3., Мухамеджанов М. Н.
Компоненты Artemisia sieversiana. — Химия природ, соед., 1982,
№ 5, с. 656.
26: ,У р м а н о в а Ф. Ф., Касымов Ш. 3., Сидякин Г. П.
Сесквитерпеновые лактоны Pseudohandelia umbellifera. — Химия
природ, соед., 1978, № 4, с. 530.
27. Шаршунова М., Шварц В., Мих а л ец Ч. Тонкослой-
ная хроматография в фармации и клинической биохимии. Ч. 2. —
М.: Мир, 1980, с. 448—457.
28. Ш о р м Ф., Г е р о у т В., П л и в а И. Успехи химии сескви-
терпенов—Успехи химии, 1953, вып. 5, с. 564—582.
29. Юсупов М. И., Абдулаев У. А., Касымов Ш. 3.,
Сидякин Г. П. Хлорфастинновый сесквитерпеновый лактон.
Ajania fastigiata.— Химия природ, соед., 1981, № 2, с. 246—247.
30. Юсупов М. И., Касымов Ш. 3., Абдулаев Н. Д.
Рупиколин 0-оксид и изохризартемин В — новые гвайанолиды из
Ajania fastigiata. — Хим. природ, соед., 1982, № 2, с. 260—261.
31. Kalsi Р. S., Chhabra В. R., Chhabra Alka, Wа-
dia М. S. Chemistry of costunolide. — Tetrahedron, 1979, v. 35,
№ 16, p. 1993—1996.
32. 'K i s i e 1 W. Phytochemical investigations of Vernonia fle-
xuosa Sims. Part. II. Vernoflexuoside and vernoflexin — new sesqui-
terpene lactones. — Pol. J. Pharmacol. Pharm., 1975, v. 27, p. 461—
.467.
33. R u z i c k a L. Uber Konstitutions and Zusammenhange in
der Sesquiterpenreiche. Bortreager—Berlin, 1928.
В
Г-л а в а 5
ИРИДОИДЫ
1. Общая характеристика
К иридоидам относятся органические соединения,
производные циклопентаноидных монотерпенов. Назва-
ние «иридоиды» предложено Бриггсом, так как основа
строения агликона соответствует полуацеталю иридо-
диала. Изучение иридоидных соединений началось в
середине прошлого столетия. Так, корнин (вербеналин)
был выделен в 1835 г. Geiger из Cornus flouida: Асперу-
лозид и аукубин были найдены соответственно в 1848
и 1868 гг..из марены красильной Rubia tinctorum (аспе-
рулозид) и погремка Rhinanthus alectorolophos (ауку-
бин). Однако интенсивные успешные исследования рас-
тительных иридоидов начались после 1946 г. с класси-
ческих работ П. Каррера и Н. Шмидта по аукубину.
Давно уже было замечено, что у растений, содержа-
щих иридоидные гликозиды, ’в высушенном или увлаж-
ненном состоянии наблюдается появление черной пиг-
ментации. Значительно позднее было высказано пред-
положение, что при этом происходит ферментативное
расщепление гликозидов до агликонов, которые легко
полимеризуются в темно-коричневые пигменты с обра-
зованием различных промежуточных продуктов [19].
2, Распространение в растительном мире
Иридоиды довольно широко распространены в рас-
тениях таких семейств, как Scrophulariaceae, Plantagina-
ceae, Rubiaceae, Hobulariaceae, Gentianaceae, а также
в отдельных видах семейства Lamiaceae.
Иридоиды являются важным хемосистематическим
признаком, помогающим решать вопросы таксономии
растений. При этом существенное значение имеет сте-
пень окисленности иридоидных соединений; предпола-
гают, что имеет место ее увеличение в процессе эволю-
77
ции видов [23]. Так, при анализе распространения
иридоидных соединений в родах и видах семейства
норичниковых установлено, что три из пяти исследо-
ванных видов рода Odontites содержат иридоиды 3 ти-
пов, которые не обнаруживаются в других родах (за
исключением филогенетически близкого рода Orthan-
tha): аукубин, изокаталпол и каталпол, причем харак-
терными являются аукубин-8-ацетат, одонтозид и аце-
тилодонтозид [5, 6]. .
Богатым источником иридоидных соединений счита-
ются виды семейства Lamiaceae. Распределение ири-
доидов в этом семействе также имеет хемотаксономиче-
ское значение. Например, ламиол и ламиозид обнару-
жены в яснотке Lamium и зеленчуке Galeobdolon, а гар-
пагид—только в дубровнике Melampyrum. Иридоидные
гликозиды не найдены только в подсемействе Satureoi-
deae, но оно в отличие от других богато эфирными
маслами, в состав которых входят цитраль (один из
предшественников иридоидов) и непетолактон (первый
представитель иридоидов в семействе, выделенный из
эфирного масла котовника обыкновенного).
Иридоиды обнаружены в видах 22 родов, относя-
щихся к подсемействам Ajugoidae, Scutellarioidae,
Stachyoidae. Эти соединения представлены в основном
гарпагидом, гарпагид-8-ацетатом и гарпагозидом в над-
земных частях 11 видов живучки и 18 видов дубров-
ника.
3. Локализация в растениях
В растениях иридоиды локализуются в'различных
органах: в соцветиях — коровяк мучнистый Verbascum
lychinitis, цветах—к. скипертовидный V. thapsiforme
Schrad., листьях—к. выемчатый V. sinuatum, во всей
надземной части—норичник бокоцветковый Scrophula-
ria lateriflora Traut., в корнях и основаниях стебля —
педикулярис болотный Pedicularis palustris L., во всем
растении — подорожник азиатский Plantago asiatica
и т. д. [6, 8, 25 и др.].
Пристальное внимание к этой группе соединений
в последнее время в различных странах Европы, Аме-
рики, Азии (особенно Японии) обусловлено их биологи-
ческой активностью. Аукубин и его производные оказа-
лись эффективными антибиотическими веществами, про-
являющими противовоспалительное, ранозаживляющее,
78
Желчегонное, диуретическое й другие виды действия,
рарпагид обладает ранозаживляющйм действием,
а ламиол и ламиозид — усиливают сокращения матки
[10].
В китайской медицине для лечения некоторых видов
опухолей применяется надземная часть гейдойтиса диф-
фузного— Hedeiotis diffusa Willd (сем. Rubiaceae),
Еодержащая помимо других биологически активных сое-
инений и асперулозид [3, 10].
4. Классификация иридоидов
По содержанию атомов С в агликоне иридоиды мож-
о разделить на 3 основные группы [18, 19, 29 а].
1. Группа вербеналина, содержащая _10 углеродных
атомов:
вербеналин
генипин
монотропин
Glc — остаток D-глюкозы.
моллугозид [21]
79
2. Группа аукубина, содержащая 9 углеродных ато-
мов:
CH^OH 0-p-QlC
R = H — аукубин
R=C — С6Н4ОН (п)— агнузид
II
О
R=O—р—Glc—6—О—р — гликозила-
укубин)
R=циннамоил-скрофуляриозид
r1 = R2=h — ката л пол
R! = CH3; R2=H — метилкаталпол
R2=H; Ri = C—C6H4—ОН(р)—катал
II
О
позид
н ОН
Rtf СН3
0-p-GLC
R=H —гарпагид
R-ОССНз —ацетилгарпагид
R=OC—СН=СН—СбН5 транс —
гарпагозид 3
3. Группа унедозида, не имеющая заместителей
в бициклической системе:
К группе иридоидов, по-видимому, следует отнести
гликозид плюмирид, содержащий фурановое кольцо*
сконденсированное с цнклопентановым фрагментом
ядра иридоидов:
8(1
В настоящее время выделено и установлено строе-
ние более сложных иридоидных гликозидов, например,
ацилированное производное асперулозида, содержащее
П-оксигидрркоричную кислоту по второму положению
остатка глюкозы [13], двух новых биологически актив-
ных иридоидов, обладающих алгицидальными свойства-
ми, имеющих строение 13-п-кумарил-и 13-10-глюкозил-п-
кумарил-плюмиерида [16].
Из коровяка грузинского Verbascum georgicum вы-
делен иридоид «вербаскозид А [1]:
«1
5. Физико-химические свойства
. Иридоиды —бесцветные кристаллические или аморф-
ные (вербаскозид А и др.) вещества с температурой
плавления от 50 до 300°С, в большинстве своем легко
растворимые в воде и низших спиртах. Однако встре-
чаются иридоиды, трудно растворимые в воде и лучше
в этйлацетате, например одонтозид (5-п-кумароила.уку-
бин) [5].
6. Обнаружение иридоидов в растительном сырье
Для доказательства присутствия в растениях иридо-
идных соединений наиболее часто используют реакцию
Трим—Хилла [28]. Спиртовое извлечение из раститель-
ного сырья, освобожденное от пигментов экстракцией
хлороформом, прибавляют к смеси, состоящей из 5 мл
концентрированной, соляной кислоты, 10 мл 0,2% рас-
твора сульфата меди и 100 мл ледяной уксусной кис-
лоты (реактив Трим—Хилла). Жидкость нагревают до
кипения и через 1—2 мин при наличии иридоидов на-
ступает более или менее интенсивное голубое окраши-
вание.
Хотя указанная реакция является общепринятой,
некоторые иридоиды (например, вербеналин, логанин,
плюмирид). ею не выявляются. Для более достоверно-
го суждения о содержании иридоидов в растениях мож-
но использовать бумажную хроматографию и более
удобный метод хроматографии в тонком слое силика-
геля. Определенной комбинацией различных систем
растворителей удается достигнуть разделения всех ири-
доидов [30].
В качестве растворителей в хроматографии на бу-
маге пригодна, смесь П'атриджа — н-бутанол—уксусная
кислота—вода (БУВ) 4:1:5 (I), а также системы, в
которых уксусная кислота заменена метиловым спир-
том для предотвращения гидролиза гликозидов типа
аукубина, — бутанол—метанол—вода 4:1:5 (II) и
н-пропанол—вода 4 :1 (III).
Обычно для ТСХ используют этанол в комбинации
с менее полярным растворителем (ацетон, этилацетат
или хлороформ). В качестве стандартного растворителя
наиболее пригодна система этанол—хлороформ в соот-
ношениях 1:1 (IV) и 3:7 (V) и этанол—ацетон 3:7
(VI), этанол—этилацетат 1 :1 (VII).
82
После- высушивания хроматограмму опрыскивают
одним из реактивов. Чаще всего используют кислые
реагенты (2 н. серная кислота или метанольный раствор
трихлоруксусной кислоты), реагенты на сахар (анисо-
вый альдегид—серная кислота и раствор анилин—фта-
лата), а также реактив Бэкон—Эдельмана (0,5 г бен-
зидина-и 10 г уксусной, кислоты в 100 мл этанола).
Обработанные хроматограммы нагревают 15 мин в
сушильном шкафу при 110°С.
После проявления последним реактивом иридоиды
в зависимости от строения чаще всего окрашиваются
от лимонно-желтого до коричневого цвета: каталпол
дает желтовато-розовую и коричневую окраску, а в
УФ-свете — яркую лимонно-желтую флуоресценцию;
аукубин — лимонно-желтую окраску. Однако известны
иридоиды, окрашивающиеся при этом в сине-фиолето-
вый цвет [9].
Для обнаружения иридоидов хроматограмму, полу-
ченную вышеописанным способом, опрыскивают реак-
тивом Трим—Хилла. При их наличии получают пятна
синего цвета с различными оттенками [6]. Кроме того,
в микроаналитической практике находит применение
реактив Шталя, для приготовления которого 1 г п-ди-
метиламинобензальдегида (п-ДМАБА) растворяют в
смеси 5 г фосфорной и 50 г уксусной кислот и разбав-
ляют водой до 100 мл [26]. В этом случае наблюдают-
ся пятна синего цвета с зеленоватым или серым оттен-
ками. Аукубин и каталпол обнаруживаются в виде со-
ответственно сиреневого и темно-синего пятен.
В табл. 1 приведены значения Rf для широко рас-
пространенных в растительном мире иридоидов [18].
Таблица 1
Хроматографическая подвижность некоторых иридоидов
на бумаге и в тонком слое
Соединение Rf В системе растворителей
I | II | III | IV | V | VI | VII
Каталпол 0,30 0,28 0,44 0,34 0,14 0,57 0,56
Аукубин 0,37 0,35 0,54 0,39 0,17 0,58 0,58
Каталпозид 0,68 0,65 0,78 0,58 0,37 0,72 0,70
Вербеналин 0,01 0,59 0,60 0,47 0,69 0,67
Агнузид 0,71 0,70 0,62 0,42 0,73 0,73
Примечание, I—III — на бумаге, IV- -VII - на кизильгеле.
83
Пример 1. 1 г измельченного воздушно-сухого
сырья, исчерпывающе обрабатывают хлороформом в
аппарате Сокслета, затем сырье высушивают, заливают
10 мл 70% этанола и оставляют на сутки при перио-
дическом перемешивании. Спиртоводный экстракт сгу-
щают в вакууме, хроматографируют на бумаге в сис-
теме БУВ 4:1:2 и высушенные хроматограммы про-
являют реактивом Шталя. В зависимости от структу-
ры иридоиды на хроматограммах проявляются в виде
коричневого, зеленого и синего пятен [И].
Пример 2. К навеске сырья приливают 50% эта-
нол (1:5) и оставляют на 24 ч (периодически встря-
хивают). К отфильтрованной жидкости добавляют
активированный уголь (0,4 г на 5 мл), смесь оставляют
на 30 мин при комнатной температуре и затем отфильт-
ровывают, промывая фильтр 50% этанолом. Фильтрат
хроматографируют на бумаге в системе БУВ (4:1:5).
Детекцию веществ осуществляют 1 % раствором
п-ДМАБА в смеси этанол—хлористо-водородная кис-
лота. (2:1), нагревая хроматограммы при 80°С в тече-
ние 5 мин. При этом аукубин обнаруживается в виде
серо-голубого пятна [14].
Пример 3. Сухие измельченные листья и соцветия
коровяка грузинского. Verbascum georgicum настаивают
с метанолом (1:5). Сгущенные под вакуумом мета-
нольные извлечения до 0,6 л разбавляют водой до 1 л
и промывают последовательно бензолом (4X0,5 л),
хлороформом (4X0,5 л), эфиром (8X0,5 л) и этил-
ацетатом (6X0,5 л). Очищенный водный раствор анали-
зируют методом БХ в системе БУВ (4:1:5), обнару-
живая ^иридоиды реактивом Бэкон-Эдельмана. В от-
дельной пробе сахар выявляют анилинфталатным
реактивом. В результате получают пятна оранжевого
и серого цвета.
7. Количественное определение
Для установления количественного содержания ири-
доидов используют фотоэлектроколориметрический ме-
тод, основанный на получении окрашенных соединений
с вышеназванными реактивами.
Пример 1. Около 1 г измельченного сырья (т. м.)
растирают в течение 15 мин с 50 мл 50% этанола,
смесь оставляют в закрытом сосуде на 24 ч при ком-
84
"натной температуре. Затем жидкость отфильтровывают
через бумажный фильтр и промывают па фильтре 50%
этанолом до $ исчезновения реакции 'на присутствие
аукубина в фильтрате. К фильтрату добавляют активи-
рованный уголь в количестве 0,4 г на 5 мл и смесь
оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Уголь
.отфильтровывают и промывают трижды по 5 мл 50%
этанолом, получая основной раствор для колориметри-
ческих определений.
Эталонный раствор. 0,0022 г аукубина раст-
воряют в 25 мл 50% этанола. Готовят 8 проб с возрас-
тающей концентрацией от 44 до 352 мг аукубина. Каж-
дую пробу доводят до 5 мл 50% этанолом и затем при-
бавляют по 1 мл 0,5% спиртового раствора п-ДМАБА
и 1 мл концентрированной НС1, нагревают при темпе-
ратуре 65-р1°С в течение 8 мин, затем охлаждают
15 мин на водяной бане при 20°. Параллельно готовят
-контрольный опыт, беря вместо раствора аукубина
:5 мл 50% этанола. Оптическую плотность окрашенных
•растворов (в голубой цвет) измеряют со светофильтром
(Хтах=570 нм) в кюветах с толщиной слоя 1 см про-
тив контрольного раствора. В аналогичных условиях
^колориметрируют опытные образцы.
ъ; Содержание аукубина в 13 видах растений сем.
iScrophulariaceae колебалось в пределах от 0,08 до
1.11%.
Пример 2. [6]. 0,2 г измельченного растительного
дсырья (т. м.} перемешивают с небольшим количеством
-кальция карбоната и трижды экстрагируют этанолом
-по 30 мин на кипящей водяной бане с обратным холо-
дильником. Объединенные фильтраты (30 мл) упари-
вают в вакууме досуха, остаток обрабатывают петро-
лейным эфиром. К очищенному остатку прибавляют
•5—10 мл дистиллированной воды и раствор фильт-
руют через небольшую колонку с нейтральным окси-
дом алюминия (1ХЮ см), после чего колонку промы-
вают водой до получения 20 мл фильтрата; 1 мл ис-
|следуемого раствора смешивают с 0,5 мл реактива
|Трим-Хилла, 2,5 мл 50% уксусной кислоты и нагревают
в течение 15 мин при 70°С . Полученный раствор синего
'Цвета охлаждают и перемешивают в течение 5 мин.
Для сравнения используют смесь из 50% уксусной кис-
длоты, реактива Трим—Хилла и воды (5:1:2). Фото-
|электроколориметрирование проводят в кюветах с тол-
85
щиной слоя 0,5 см с желтым светофильтром. Содержа*
ние иридоидов определяют по колориметрической кри-
вой, полученной для аукубина.
8. Методы выделения и разделения иридоидов
В настоящее время не существует общего метода
выделения иридоидов. Учитывая гидрофильный харак-
тер этих соединений, доминирующим подходом к их
изолированию является экстракция растительного ма-
териала низшими спиртами и водно-метанольными (или
этанольными) смесями, освобождение экстрактов от
красящих и липофильных веществ с последующим раз-
делением методом распределительной колоночной хро-
матографии.
При этом измельченное растительное сырье предва-
рительно обрабатывают тем или иным реагентом для
нейтрализации органических кислот, очищают от хло-
рофилла, жиров и удаляют фенольные соединения. В
некоторых случаях при неоднократной перекристалли-
зации из смеси иридоидов получают индивидуальные
вещества. Разделение проводят также методом коло-
ночной хроматографии на капроне, элюируя комбина-
цией различных систем растворителей, а также препа-
ративной хроматографией на бумаге.
Пример 1. Выделение иридоидов из зубчатки
поздней Odontites serotina [6]. Воздушно-сухое расти-
тельное сырье смешивают с карбонатом кальция (10:1)
и подвергают исчерпывающей экстракции 50% мета-
нолом на водяной бане при 60°С. Объединенные экст-
ракты после фильтрования концентрируют в вакууме до
водного остатка, который упа.ривают до половины объе-
ма и обрабатывают петролейным эфиром для очистки
от хлорофилла, жиров и других балластных веществ.
Затем водный раствор фильтруют через колонки
(5ХЮ см) с капроном и оксидом алюминия. Фильтрат
упаривают досуха, остаток растворяют в небольшом
количестве этанола и примеси сапонинов, резервных
углеводов и др., осаждают ацетоном. Выпавший оса-
док собирают на фильтре, а спиртоацетоновый фильт-
рат, содержащий сумму иридоидов, концентрируют. В
холодильнике смесь иридоидов осаждается в виде крис-
таллического порошка бледно-желтого цвета, горького
вкуса и растворимого в теплой воде и в спирте. Выход
86
1,5% в пересчете на абсолютно сухую массу расте-
ния.
? Выделение одонтозида из смеси ири-
доидов. 3,3 г порошкообразной смеси иридоидов ра-
створяют в теплой воде и одонтозид исчерпывающе
экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный экстракт
упаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в ми-
нимальном количестве горячей воды и оставляют на
ночь в холодильнике. При стоянии образуется желе-
образная масса, которая затем кристаллизуется в ви-
де белых крупных розеток. Кристаллы отфильтровы-
вают, перекристаллизовывают из безводного этилаце-
тата.
Выделение аукубина. Водный раствор после
обработки этилацетатом упаривают досуха, остаток
растворяют в небольшом количестве этилового спирта,
после стояния выпадает осадок, который отфильтровы-
вают, промывают этилацетатом и высушивают.
Пример 2 [25]. Цветки коровяка скипетровидного
Verbascum thapsiforme Schrad экстрагируют исчерпы-
вающе этанолом, экстракт помещают на колонку с
активированным углем и силикагелем и с помощью вы-
сокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ с
обращенной фазой выделяют иридоидные гликозиды.
Пример 3 [16]. Надземную часть глобулярии кар-
ликовой Globularia папа обрабатывают петролейным
эфиром. Обезжиренный остаток экстрагируют метано-
лом, полученный экстракт концентрируют досуха, оста-
ток обрабатывают водой, водный слой помещают на
колонку с нейтральным оксидом алюминия. Гликозид-
ную фракцию элюируют водой, рехроматографируют на
колонке с силикагелем, выделяя сумму иридоидов
смесью хлороформ—метанол—вода 80:20:2 и 60:40:4.
Затем с помощью ВЭЖХ получают индивидуальные
иридоиды.
9. Идентификация и установление строения
Идентификацию выделенного иридоида проводят
методом БХ и ТСХ, путем определения температур
плавления однородного вещества и в пробе смешения.
При установлении строения используют методы УФ-,
ИК-, ПМР-, 9 * * * 13С ЯМР-спектроскопии и масс-спектромет-
рии. Кроме того, важное значение в структурных ис-
87
следованиях имеют также классические химические
методы: ацетилирование, щелочное омыление, кислот-
ный, ферментативный гидролиз, гидроксаминолиз.
В УФ-спектрах, наблюдается максимум при
204—210 нм, указывающий на иридоидную природу сое-
динения и обусловленный енольной группой при С3—С4
незамещенных иридоидов.
ИК-с>п е к-т р о с к о п и я. Для иридоидов характер-
ны полосы поглощения в областях 3700—3050 (ОН)
1700 (С = О) 1660 (двойные связи) и 1450 см-1 (СН3)
[76,27].
Имеются данные по спектроскопии* ПМР ,3С
ЯМР и масс-спектрометрии, рентгеноструктурному ана-
лизу, позволяющие установить структуру и стерео-
конфигурацию молекулы [1, 2, 15, 16, 18, 20, 22, 29
и др.].
На основании ПМР-спектра было установлено
строение вербаскозида В [2] (в CD3OD, б): 5,25
(1 Нд, Ji == 6 Гц, С—1Н), 6,32 (1 Ндд, J43 — 6,5 Гц,
J5, з = 2 Гц, С—ЗН), 5,07 (1 Ндд, J4>3=.6,5 Гц, J4)5 =
= 3 Гц, С—4Н), 2,89—2,63 (1 Нм, J5,9 = 10 Гц, J5 6 =
= 2 Гц, С-5Н), 4,03 (1 Ндд, J5;6 = 2 Гц, J6>7 = 4 Гц,
О-6Н), 3,95 (1 Нд, J6(7 = 4 Гц, С—7Н), 2,32 (1 Ндд,
9,5= 10 Гц, Jli9=6 Гц, С—ЗН), 4,70 (1 Нд, Л=7,5Гц,
С— 1Н), 4,03 (1 Ндд, С—2Н), 3,20—4,10 (И Нм> С—
—10—2Н, С—З'Н, С—4'Н, С—5'Н, С—6'2Н, С—2'Н,
С—3"Н, С—4"Н, С—5"Н), 4,76 (1НД, J = 2 Гц,
С—Г'Н), 1,22 м. д. (3 Нд, J = 6,5 Гц, С—6"ЗН).
Масс-спектр нонаацетата вербаскозида В, т[е (%)
(молекулярный пик с т/е 904 отсутствует): 61,4 (1,6)
(М+—290), 598(2,7) (М+—17—331), 538(1), 331(100)
284(29) (М+—347—273), 273(70), 271(20), 267(17)
(М+—290—<347), 256(51), 242(22), 231(9), 229(9),
223(27) 213(25), 211(15), 205(20), 200(16), 185(24),
171(30), 168(97), 153(40), 149(50), 145(34), 137(29),
129(51), 127(30), 111(70), 109(66).
Рентгенострук.турное исследование три-
циклического гликозида иридоида [13] (ЛМО,
МНК в анизотропно-изотропном (Н) приближении по
2390 отражениям до R 0,053). Кристаллы V2 монокли-
нические, а 9,233; в 9,713; с 15,724, р 91,02°; р(выч)
1,363; L2. Повышенная реакционная способность
пятичленного лактонного кольца с нуклеофилами
связана с напряженностью трициклической системы,
88
"которая выражается в удлинении связи С6—Ci3
у(1,505А). Циклы A/В и В/С имеют- цис, цикЛы А/С
квазитранссочленения (атом O(i8) в р-аксиальном поло-
жении), циклы В и С—в 5е, а цикл А—в промежуточ-
ной конформации. Имеются Н-связи с участием
ОН-групп и молекулы воды.
Химические методы
Щелочной гидролиз
Пример 1 [6]. 50 мг одонтозида растворяли в 5 мл
t 25% водного раствора аммиака и нагревали с обрат-
ным холодильником на кипящей водяной бале в тече-
ние 3 ч. Конец гидролиза контролировали хроматогра-
фией на бумаге в системе ВМФ 4:1:5. Гидролизат
подкисляли до pH 6 и продукты омыления извлекали
эфиром. Полноту извлечения контролировали капель-
ной реакцией с диазотированной сульфаниловой кисло-
той и щелочью. Эфирные извлечения объединяли, кон-
центрировали и количественно переносили во взвешен-
ную колбу. После удаления эфира получили белое воз-
гоняющееся кристаллическое вещество с температурой
плавления 210°, которое по физико-химическим свой-
ствам, УФ- и ИК-спектрам и хроматографическим дан-
ным идентифицировали с п-оксикоричной кислотой.
Водный раствор после обработки эфиром нейтрализо-
вали, упарили досуха, а остаток растворили в неболь-
шом объеме метанола, разбавили равным количеством
ацетона и оставили для . кристаллизации. Получили
аукубин с т. пл. 180°С, [а]д°—117° ( с 0,1; этанол);
Атах (в этаноле) 270 нм (Ige 2,31). Реакция с реакти-
вами на иридоиды положительна.
Гидроксаминолиз иридоида [4]
К 0,3 г вещества, на часовом стекле прибавляли
3 капли тионилхлорида и нагревали на водяной бане в
течение 1 мин. В теплый раствор вносили по 2 капли
н-бутилового и салицилового спиртов и вновь нагрева-
ли в течение 1 мин, после чего прибавляли 2 капли
воды для гидролиза остатка тионй'лхлорида. К полу-
ченной смеси добавляли 5 капель 1 н. раствора соля-
нокислого гидроксиламина и спиртового раствора гид-
роксида калия до щелочной реакции на лакмус, нагре-
вали до кипения и охлаждали.
89
К 1 части смеси прибавляли 10% раствор хлористо*
водорсДной кислоты до pH 3 и 1 каплю 1°/о раствора
хлорида железа (III), при этом развивалась окраска
от красной до фиолетовой. Другую часть подвергали
хроматографированию на бумаге со свидетелями.
Кислотный гидролиз [1]
Раствор 15 мг иридоида вербаскозида. А и 5 мл 5%
раствора серной кислоты нагревали на водяной бане в
течение 1 ч. Выпавший голубовато-фиолетовый осадок
отфильтровывали и гидролизат нейтрализовали карбо-
натом бария. После удаления осадка фильтрат сгусти-
. ли в вакууме до 0,5 мл и с помощью хроматографии на
бумаге установили качественный состав сахаров со сви-
детелями D-глюкозой и L-рамнозой.
Ферментативное расщепление иридоидов [4]
0,01 г 8-0-ацетилгарпагида растворили в неболь-
шом количестве воды, прибавили 0,1 г эмульсина и
оставили в термостате на 1 ч при 30°С. Полноту гидро-
лиза контролировали хроматографированием на бума-
ге. По истечении указанного времени к раствору, кото-
рый приобрел синюю окра.ску, для инактивации фер-
мента прибавили 5 мл 96% этанола и упарили досуха.
Сухой остаток несколько раз обработали метиловым
спиртом на холоде и сконцентрированные метанольные
извлечения анализировали методом БХ.
Ацетилирование [1]
Смесь 120 мг вербаскозида А и по 16 мл безводно-
го пиридина, и свежеперегнанного уксусного ангидрида
выдерживали 24 ч при комнатной температуре. Затем
к реакционной смеси добавляли 100 мл ледяной воды,
взбалтывали 30 мин, отфильтровывали выпавший
аморфный осадок, промывали его водой и высушивали
в эксикаторе. Полученный остаток растворили в 5 мл
системы хлороформ—метанол 30:1 и хроматографи-
ровали на колонке с силикагелем (2X60 см), элюируя
данной системой. Получили хроматографически одно-
родный гептаацетат вербаскозида, который охаракте-
ризовали по температуре плавления.
ЛИТЕРАТУРА
1. Агабабян 3. Ю., Арутюнян Л. С., Мнацака-
нян В. А., Г а ч - Б а й т ц Э., Р а д и ч Л. Иридоиды Verbascum
georgicum. — Химия природ, соед., 1982, № 4, с. 446—451.
90
2. Арутюнян Л. С., Агабабян Э. Ю., Мнацака-
нян В. А. Вербаскозид В — минорный иридоид Verbascum geor-
gicum.— Химия прир. соед., 1983, № 5, с. 57.3—576.
6 3. Б о р и с о в М. И. Иридоиды отечественных растений семей-
ства мареновых. — В кн.: Современные проблемы фарм. науки и
практики: Тезисы докладов II съезда фармацевтов Украины. Киев,
1§72, с. 679-681. л „
4. Гелла Э. В., Вавилова Н. К., Литвиненко В. И.
Иридоидные гликозиды зопника клубненосного — Растит, ресурсы,
1972, т. 7, вып. 4, с. 554—556.
5. Деготь А. В., Литвиненко В. И., Ковалев И. П.
Одонтозид — новый иридоид Odontites serotina.— Химия прир.
соед., 1970, № 4, с. 474-475.
6. Деготь А.. В., Литвиненко В. И., Ковалев И. II.
Иридоиды из Odontites serotina (Lam) Dut. — Растит, ресурсы,
1971, т. 7, вып. 3, с. 390—396.
7. Комиссаренко Н. Ф., Деркач А. И., Шеремет Н.П.
Иридоиды Stachys inflata u Stachys iberica. — Химия прир. соед.,
1979, № 1, с. 99.
8. Лебедев-Косов В. И. Флавоноиды и иридоиды подо-
рожника большого и азиатского. — Растит, ресурсы, 1980, т. 16,
вып. 3, с. 403—406.
9. Л и т в и н е н к о В. И., Аронова Г. Н. Иридоиды Betonica
foliosa. — Химия прир. соед., 1968, № 5, с. 319.
10. Попова Т. П., Литвиненко В. И. Иридоиды в расте-
ниях семейства губоцветных.—В кн.: Современные проблемы фарм.
науки и практики: Тезисы докл. И съезда фармацевтов Украины.
Киев, 1972, с. 692—695.
11. П а к а л н Д. А., Захаров А. М. Поиск флавоноидных и
иридоидных соединений в семействе губоцветных флоры Кавказа.—
Фармация, 1976, № 5, с. 36—41.
12. Bi auсо A., Guiso М., Javorone С. Iridoids XXIX.
Sinuafol (6-0-L-rhamnopyranosyIaucubin) from Verbascum.—Planta
med. 1981, v. 41, № 1, p. 75—79.
13. В о j t h e - H or v a t h K., Kocsis A., Parka nyi L„
Simon K. A. New iridoid glicoside from Galium verum L. First
X-rayanabysis of a tricyclic iridoid glicoside. —Tetrahedron Lett.
1982, v. 23, № 9, p. 965—966.
14. В rod a B., Swentek L., Dr utsch inski Ja. — Arch.
Pharm., 1976, Bd. 309, S. 829—836.
15. Chandhuri R. K. et al. 13C NMR-spectroscopy of natu-
rally occuring iridoid glucosides and their acylated derivatives.—
Tetrahedron, 1980, v. 36, № 16, p. 2317—2326.
16. Chandhuri R. K., Salama O., Sticher O. Iridoid
and Arylglucosides from Globularia nudicaulis and Globularia па-
па.— He.lv. Chim. Acta, 1981, v. 64, № 7, p. 2401—2404.
17. Coggen S. S. W. Iridoids with algicidal properties from
Allamanda ca.thartica. — Phytochemistry, 1983, v. 22, № 1, p. 179—
182.
18. Dorn fort S. et al. l3C- and H-NMR spectroscopy as a
fool in the configurational analysis of iridoid glucosides. — Phyto-
chemistry, 1981, v. 20, № 12, p. 2717—2732.
19. Groger D., Simchen P. Zur Kenntnis iridoider Pflan-
zenstoffe. — Die Pharmazie, 1967, Bd. 22, H. 6, S. 281—344.
20. Hase Tsunao, Ivagawo Tetsuo. Bitter principles
of Viburnum suspensum. — Chem. Lett, 1982, № 1, p. 13—14.
91
21. Javarone C. et'al. Mollugoside, an iridoid glucoside from
Galium mollugo.— Phytochem., 1983, v. 22, № 1, p. 175——178.
22. Ishiguro Kyoko, lamaki, Masai, Takagi Shu-
z o.—. Pharm. Soc. Jap., 1982, v. 102, № 8, p. 755—759.
23. Kaplan N. A., Gottlieb O. R. Iridoids as Systematis
markers in Dicotyledons. — Biochem. Syst. and Ecol., 1982, v. 10,
№ 4, p. 329—347.
24. N a g g a r S. et al. Iridoid glycosides from Mantzelia deca-
petala. —Planta med., 1980, v. 39, № 3, p. 266.
25. Swiatek L.„ Salama O., Sticher O. 6-0-D-xylopyra-
nosylcatalpol, a new iridoid glycoside from Verbascum .thapsiforme.—
Planta med., 1982, v. 45, № 13, p. 153.
26. S t a h 1 E. Mikro-Asulennachweismethode fiir Schafgarten. —
Dtsch. Apoth.-Ztg., 1963, Bd. 93, № 12, S. 197.
27. Takeda C., Fujita T._ Iridoid Glucosides of Melampyrum
laxum. — Planta med., 1981, v. 41, № 2, p. 192—194.
28. T r i m A. R., Hill R. The preparation and properties of
aucubin, asperulosid and sowie related glycosides.—J. Biochem
1952, v. 50, p. 310—319.
29. Verma О. P., Kumar S., Joshi B. S. Iridoid glycosi-
des — a review. Part II. Isolation, characterisation and Synthesis.—
Herba pol„ 1980, v. 26, № 3, p. 195—200.
29a. VeYma О. P., Kumar S., Joshi B. S. Iridoid glyco-
sides- a review. Part I. Occurrence, nomenclature and classification.—
Herbe pol., 1980, v. 26, № 2, p. 133—146.
30. W i e f f e r i n g I. H. Aukubinartige Glukoside Pseudoindika-
ne und verwandte Heteroside als systematische Merkmale. — Phyto-
chemistry, 1966, v. 5, p. 1053.
Г л а в a. 6
ЭКДИСТЕРОИДЫ
1. Общая характеристика
Экдизоны (от греч. exdysis — линька) — группа
полигидроксилированных стероидных соединений, обла-
дающих активностью гормонов линьки и метаморфоза
насекомых. В соответствии с источником выделения эти
вещества разделяются на зоо- и фитоэкдйзоны. Впер-
вые экдизон был получен в кристаллическом виде в
1954 г. А. Бутенадтом и П. Карлсоном, однако ограни-
ченное количество выделенного вещества затрудняло
определение структуры: из 500 кг куколок тутового
шелкопряда удалось изолировать лишь 25 мг кристал-
лического вещества С27Н44О6. Структура и стереохимия
зооэкдизона, обладавшего сильной личиночной актив-
ностью, были окончательно установлены к 1965 г., и.это
соединение получило название а-экдизон [2, 7, 34].
В объектах растительного происхождения экдисте-
роиды
были открыты в 1966 г. японским химиком К- Наканнси
с сотруд. [35]. Ими же в ходе изучения популярного
в восточной медицине, растения Podocarpus nakai были
93
выделены из его листьев 4 родственных соединения —
понастероны А, В, С, D. При этом оказалось, что доми-
нирующий компонент понастерон А структурно близок
к а-экдизону, выделенному ранее из насекомых, а так-
же обладает свойствами гормона линьки.
Почти одновременно австралийские ученые М. Гелб-
райт и Д. Хорн выделили из близкого вида Podocarpus
elata подлинный гормон линьки — экдистерон, из
Р. vulgare — полиплоидии, а из корней Achyranthes
taurici — инокостерон. Вскоре экдизоны были получе-
ны из Polypodium vulgare и Pteridium aguilinum
[7, 29, 34]
экдистерон инокостерон
Во избежание путаницы экдизона с другими веще-
ствами группы рекомендовано для обозначения этого
соединения применять термин «экдистероиды» (соот-
ветственно зооэкдистероиды и фитоэкдистероиды) [1].
У экдистероидов выявлена разнообразная физиоло-
гическая активность в опытах in vitro и in vivo. Их рас-,
сматривают как источник получения принципиально.
94
новых инсектицидов гормонального действия» безопас-
ных для окружающей среды, не токсичных по отноше-
нию к теплокровным и обладающих > способностью про-
являть избирательность действия к одному или не-
скольким видам насекомых. Влияние экдистероидов на
циклы развития паразитических организмов открывает
возможность их применения в химиотерапии против па-
разитов человека и животных, особенно тех из них, ко-
торые имеют сложный цикл развития в макроорганиз-
ме (например, возбудитель малярии) [2].
Многие полирксистероиды обнаружили значитель-
ную анаболическую активность. Так, в опытах на рас-
тущих и взрослых крысах показано [16], что экдисте-
рои ускоряет прирост массы тела, увеличивая общее
количество белка в печени, сердце, почках. Это свиде-
тельствует о возможности создания новых препаратов
анаболического действия.
При изучении влияния выделенных из рапонтикума
Ьафлоровидного экдистерона и инокостерона на ЦНС
экспериментальных животных и их работоспособность
было установлено, что указанные соединения облада-
ют стимулирующим и адаптогенным действием, обус-
ловливая специфическую активность экстракта левзеи
[12, 17]. Получены данные о гипогликемических свой-
ствах циа стерона [18] ио влиянии некоторых экдисте-
ронов на митоз клеток.
< 2. Распространений в растительном мире
Первоначально обнаруженные в ничтожных количе-
ствах в организме насекомых и ракообразных экдисте-
роны- оказались сравнительно широко распространен-
ными соединениями в растительном мире. Так, из об-
следованных 1056 видов, относящихся к 186 семействам
флоры Японии, активностью гормонов линьки обладали
экстракты растений 77 семейств [32]. Для установле-
ния наличия фитоэкдизонов авторами использован
биологический метод (Chilo-тест), основанный на спо-
собности экдизоноподобных веществ вызывать склеро-
тизацию кутикулы личинки при превращении ее в ку-
колку. С этой целью в метанольный экстракт растения
погружали на 5—10 с 5 личинок вредителей риса стеб-
левой огневки- Chilo suppressalis й в течение 48 ч наб-
людали за процессом окукливания. Тест очень прост
95
по технике исполнения, но менее чувствителен, чем био
пробы на синей мясной мухе Calliphora erythrocephala
и комнатной Musca domestica. Последние два теста
используются наиболее ча.сто, при этом метанольный
или этанольный экстракты вводят микрошприцем в
изолированную путем перевязки нижнюю часть тела
личинки и наблкУдают за процессом окукливания. Таким
образом, при обследовании 16 видов сем. Asteraceae на-
личие экдизонов было выявлено в соцветиях и листьях
трех видов:) Serratula sogdiana Bunge, Rhaponticum
integrifolium C. Winkl u Rhaponticum nanum Lipsky
[6]. При исследовании вечнозеленых деревьев и кус-
тарников различных областей Украины подтверждено
присутствие экдистероидов в TaxUs baccata, Podocarpus
andinus, Podocarpus macrophyllus [21].
Ранее на основании результатов исследования фло-
ры Японии высказывалось мнение [32] о преимущест-
венном нахождении экдизонов только в папоротнико-
образных Polypodiophyta. Среди них экдистероиды об-
наружены в видах семейств Polypodiaceae, Aspidiaceae,
Lycopodiaceae, Pteridiaceae.
Более поздние исследования показали, что вероят-
ность нахождения фитоэкдизонов достаточно велика и
в других больших таксономических группировках. Так,
у голосеменных Pinophyta (Gymnospermaceae) гормоны
линьки выявлены в сем. Cupressaceae, Pinaceae, Podo-
cardaceae, Taxaceae, у покрытосеменных Magnoliophyta
(Angiospermae) — в видах не менее 12 семейств: Li-
liaceae, Amaranthaceae, Caryophyllaceae, Lamiaceae
(Labiatae), Asteraceae (Compositae) и др. Соединения
с линочной активностью пока не найдены у высших
грибов и водорослей [38], возможно, из-за слабой их
изученности.
Вероятность обнаружения фитоэкдизонсодержащих
видов в пределах одного семейства невелика. При этом
если растения одних родов накапливаю)' экдистероиды,
то другие роды этого семейства совершенно их лишены.
Например, в сем. Caryophylaceae гормоны линьки об-
наружены лишь в видах рода Lychnis, а из 21 изученно-
го рода сем. Lamiaceae экдистероиды выявлены только
в представителях Ajuga [32]. На уровне рода вероят-
ность нахождения фитоэкдизонов возрастает, что пока-
зано на примере родов Achyranthes, Ajuga, Serratula.
Однако имеются многочисленные случаи, когда даже
96
весьма близкие виды существенно различаются в этом
отношении. Так, в роде Helleborus фитоэкдизоны содер-
жит только Н. niger. Таким образом, пока можно кон-
статировать, что основное положение хемот аксоном и-
ческой теории, согласно которому растения одного рода
должны содержать родственные вещества, в большин-
стве случаев не подтверждается [2, 21].
Содержание экдистероидов в растениях колеблется
в широких пределах — от 4,5- 10~5 до 7 • 10-2% [30],
но обычно составляет 0,01—0,1% на сухую массу, дос-
тигая, даже 1—2%, что на несколько порядков превы-
шает концентрацию экдизонов в организмах насеко-
мых и ракообразных. Преимущество растительного
сырья перед животными организмами - заключается не
только в количественном отношении, но и в структур-
ном разнообразии экдизонов [1, 7].
Экдистероиды выделены (и надежно охарактеризо-
ваны физическими константами) из 90 видов растений,
принадлежащих к 41 роду и 20 семействам, В СССР
они описаны в видах живучки Ajuga — A. turkestanica,
A. genevensis; серпухи Serratula — S. sogdiana,
S. intermis, S. xeranthemoides; рапонтикума Rhaponti-
cum — Rh.. carthamoides, Rh. ijitegrifolium, Rh. nanum;
смолевки Silene —’ в. brachuica, S. pracmixte; чистоте-
ла Chelidonium majus; подорожника Plantago major;
трилистника Tripholium repens. Хорошим источником
фитоэкдистероидов оказались растения родов Serratula
u Rhaponticum [1, 13].
3. Локализация в растениях
Экдистероиды обнаружены в различных частях и
органах растений. Их концентрация значительно варьи-
рует в зависимости от ряда факторов: органа, в кото-
ром они обнаружены, времени и места сбора растения.
Примером этого может служить серпуха Serratula iner-
mis, в соцветиях которой содержится до 2% экдистеро-
на, тогда как в листьях в период цветения — 0,25%, в
стеблях — лишь 0,01%, а в корнях он практически от-
сутствует [26]. Другой экдизон — туркестерон — на-
капливается главным образом в корнях живучки тур-
кестанской. Весьма существенным колебаниям подвер-
жены экдизоны в зависимости от места и времени сбо-
ра. Так, ризомы папоротника Polypodium vulgare, по 4
4. Заказ 2909.
97
данным одних авторов, содержат до 1%' экдистерона, а
по другим данным — всего 0,07%.
4. Классификация
К настоящему времени установлена химическая
структура примерно 60 экдистероидов, продуцируемых
растительным организмом [1]. По числу атомов в мо-
лекуле они разделяются на 5 групп: 19С-, 21С-, 27С-,
28С- и 29С-ЭКДИЗОНЫ. При этом первые две группы
имеют лишь по одному представителю (рубростерон и
постстерон соответственно):
рубростерон постстерон
28С-экдизоны содержат два, соединения — макистеро-
ны А и В. Наиболее многочисленными являются груп-
пы фитоэкдистероидов, включающих 27 и 29 углерод-
ных атомов, причем последняя свойственна только рас-
тительному миру
макистерон А
К 27С-экдизонам относятся (помимо двух наиболее ши-
роко встречающихся экдизонов — экдистерон и инокос-
терон) понастероны А, В, С, D, вйтикостерон Е, туркес-
терон, интегристероны А, В, согдистерон и др.:
98
туркестерон
согдистерон
йг Значительная часть представителей группы 29С-
&ДИЗОНОВ составляет соединения, выделенные из рас-
чтений рода, Ajuga- и отличайэщиеся наличием 5- или
^-членного лактонного кольца в боковой цепи. К числу
их относятся циастерон, аюгалактон, аюгастерон В
;Н Др.
Для большинства фитоэкдизонов характерны пять
Основных элементов структуры, Отличающих эту груп-
пу природных соединений от других стероидов: 1) ви-
цинальная 2р-, Зр-диольная группировка в кольце А;
2) 5р-атом водорода (цис-А/В-сочленение); 3) Д7-6-ке-
.Тогруппировка .в кольце В;' 4)' 14 а-оксигруппа между
кольцами С и D; 5) боковая цепь в 17р-положении коль-
ца D. В боковой цепи почти всегда содержится окси-
группа при С22 и часто ОН-группа при С20 и С25 [2]:
99
о
циастерон
аюгалактон
„ Отклонения от указанной общей структуры немно-
гочисленны. Так, у пона.стерона В доказана 2а-, За-кон-
фигурация оксигрупп в кольце А. До недавнего време-
ни было обнаружено лишь два производных экдизонов
по оксигруппе — витикостерон Е (25-ацетат Ькдистс-
рона) и понастерозид А (Зр£>-глюкозид понастерона А).
Лишь в последние годы из корней Silene brahuica уда-
лось выделить три соединения гликозидной природы,
названные силенеозидами А, В и С, имеющих строение
соответственно 22-а-2)-галактозидд. экдистерона, интег-
ристеройа А и 3,22-0-а-£>-дигалактопиранозида экдис-
терона [1, 15]. Обращают на себя внимание две струк-
турные особенности указанных соединений: а-конфигу-
рация гликозидного центра £)-галактозы и непривычное
положение углеводного компонента при гидроксиле
С22 экдистероида.-
5. Физико-химические свойства
фитоэкдистероиды — бесцветные кристаллические
вещества без запаха, обладающие гидрофильными
свойствами: легко растворимы в низших спиртах, при
нагревании —г в воде, ацетоне, но не растворяются в
эфире, хлороформе, бензоле (за исключением сложных
эфиров, например, витикостерона Е).
Как уже отмечалось, для выяснения наличия в рас-
тении гормонов линьки существуют биотесты, которые
проводят на различных насекомых, в основном на му-
100
кислотой (90 —
i фильтрованном
ijr-ax. При этом активность-экдизонов у различных насе-
иомых неодинакова, поэтому биотесты не коррелируй
Яотся между собой. Следует также учитывать возмож-
Люсть наличия в растительных экстрактах соединений
ж аптиэкдизонным действием, к числу’которых относит-
ься, например, аюгалактон. Из-за неудобства биотестов
1и их ненадежности в скрининге растений наиболее ча.с-
fio экдистероиды выявляют с помощью хроматографн-
Нрования концентрированных метанольных или этаноль-
Цных экстрактов на тонком слое оксида алюминия в
^системах растворителей этилацетат—этанол 1 : Г, бута-
|даол—этанол—вода (БЭВ) 5; 1:2, силикагеля и на
Дшластинках Silufol UV-254 jb системах хлороформ—эта-
яИнпл 4:1, этилацетат—этанол 4:1 и БЭВ 5:1.: 2. После
Яюбработки’ ванилин-серцым реактивом (3% раствор
«ванилина в абсолютном, этаноле и 0,9% -конц. серной
Ясислоты) при 110°С фитоэкдизоны обнаруживаются по
^специфическому желто-зеленому окрашиванию или по
«флуоресценции в УФ-свете [13, 22, 29]. Пятна экди-
'ЯЬонов выявляют также 50% серной j
Ш10°) и пррсмотром хроматограмм в
Ш^Ф-свете [2, 7, 12].
ж- Выше указывалось, что экдизоны
Одинаковым набором заместителей в
Влете, которые выявляют рядом реакций. Наличие сте-
Вроидного цикла обнаруживают реакцией Либермана—
ЖБурхардта:- при смешивании раствора экдистероида в
«ледяной уксусной кислоте со смесью уксусного ангид-
Црида и концентрированной серной кислоты 50:1 дояв-
Еляющаяся розовая окраска переходит в зеленую или
|0инюю. Значительно более чувствительной является
(реакция Чугаева (хлорид цинка в уксусной кислоте-}-
Цацетилхлорид), дающая со -стероидами, способными к
Дегидратации, окрашенные комплексы [23].
К Экдистероиды содержат кетогруппу, сопряженную
Ее двойной связью; наличие Д7-6-кетогуппировки в мо-
клекуле.проявляется в том,-что соединение не подвер-
гается каталитическому гидрированию* даже в жестких
|условиях. Этот вывод подтверждается данными, полу-
Гченными при изучении превращений а-экдизона под
(действием минеральных кислот [33]. При нагревании
(экдизонов в метанольном или этанольном растворе в
(присутствии НС1 вначале из-за дегидратации с учас-
тием 14-оксигруппы образуется дважды ненасыщенный
характеризуются
стероидном ске-

*
101
кетон с Лтах === 292—298 нм, который вследствие стерй-
ческой .напряженности кольца В постепенно изомеризу-
ется в несопряженный диенон с Хшах —. 240—248 нм:
Указанная реакция, устанавливающая наличие в
молекуле Д7-6-кето-14-оксигруппировки, является об-
щей для всех экдистероидов, поэтому ее проведение
является важным моментом для надежного обнаруже-
ния экдизонов.
Кетогруппа подтверждается также стандартной
реакцией этанольного раствора вещества с 2,4-динитро-
фенилгидразином по выпадению красно-бурого осадка
[12].
Для выявления вицинальной диольной группировки
используют перйодатное окисление экдистероида. При
этом в нейтральном водном растворе на холоде расхо-
дуется приблизительно 1 М/экв.,' а при 80—90°С—
2М/экв. перйодата. Например, в случае экдистерона
для окисления расходуется два моля перйодата натрия,
при этом расщепляются две диольные группировки
(2р, Зр и 20р, 22а).
Вследствие присутствия спиртовых гидроксилов
экдизоны способны образовывать ацетаты: ацетилиро-
вание экдистерона в мягких условиях (0°С) дает 55%
2-моноацета.та, а в более жестких — 2, 3, 22, 25-тетра-
ацетат
102
2, 3, 22, 25-тетраацетат экдистерона
Наличие двух вицинальных диольных группировок
подтверждается образованием 2, 3, 20, 22-диацетонида
при нагревании экдистерона с ацетоном в присутствии
фосфорно-молибденовой кислоты [29].
6. Количественное определение
На. основе особенностей химической структуры раз-
работаны спектрофотометрические методы определе-
ния экдистероидов. В УФ-спектрах экдизонов имеется,
высокоинтенсивная полоса поглощения с максимумом
при 240—245 нм. С учетом этого был разработан метод
определения содержания экдистерона и инокостерона
без их разделения в корнях видов Achyranthis. Оба
экдистероида имеют одинаковые кривые поглощения
в УФ-области, при восстановлении их смеси NaBH4
указанный максимум поглощения исчезает. По разнос-
ти поглощения исходной и восстановленной смеси было
определено суммарное содержание этих веществ [38].
Однако подавляющее большинство спектрофотомет-
рических методов определения фитоэкдистероидов реа-
103
лизуется после предварительного их разделения на
тонком слое силикагеля или оксида алюминия [24, 25,
30, 34 и др.]. Поскольку экдистерон является наиболее
распространенным фитоэкдистероидом, не удивительно,
что большинство работ посвящено его количественно-
му определению. Наличие интенсивного экстремума
при 242* нм (Ige 4,07) в УФ-спектре экдистерона, позво-
ляет использовать его в качестве аналитической поло-
сы. При определении экдистерона в надземной части и
корнях левзеи. восточной растительное сырье исчерпы-
вающе экстрагировали метанолом, отделяли целевое
соединение на пластинках с закрепленным слоем алу-
сила в системе хлороформ—метанол—ацетон 6:2:1 и
экдистерон десорбировали метанолом. Полученные элю-
аты спектрофотометрировали при 242 нм [24].
На стадии очистки и разделения экдистероидов
используют также полиамид и’ хроматографирование на
пластинках с силикагелем LC 5/40 мкм в спёциально
подобранных системах растворителей (в частности, хло-
роформ—этанол 4:1).
Другой метод количественного определения основан
на реакции- Чугаева, специфичной для полиоксисте-
роидных соединений. После хроматографического раз-
деления в продуктах реакции с фитоэкдистероидами
обнаружена характерная полоса при 380 нм с высоким
молярным коэффициентом светопоглощения (е4000—
6500). Зависимость интенсивности поглощения от кон-
центрации экдизонов имеет линейный характер'и под-
чиняется закону Ламберта—Бера [20]. Для проведе-
ния реакции Чугаева к 0,5 мл хлороформного раство-
ра, содержащего 0,15—0,5 мг/мл экдистероида, при-
бавляют два объема 20% раствора хлорида цинка в
ледяной СНзСООН й 1 объем ацетихлорида. Смесь
нагревают при 65°С в течение 6 мин, жидкость доводят
хлороформом до 5мл и спектрофотометрируют при
380 нм. •
Помимо хроматоспектрофотометрии количественное
определение экдистероидов проводят также, методом
флуориметрии в серной кислоте. В спектрах флуорес-
ценции инокостерон, по данным М. Gilgan и М. Zink
(1972), имеет большую интенсивность, нежели экдисте-
рон, причем эта разница сильно возрастает при подще-
лачивании серно-кислого раствора аммиаком. Разраба-
тывались методы определения фитоэкдизонов с помощью
104
газожидкостной хроматографии, но наиболее перспек-
тивной является жидкостная хроматография высокого
разрешения с детектором при 254 нм [1, 34].
7. Методы выделения и разделения экдистероидов
В случае обнаружения фитоэкдизонов из сырых эк-
страктов различными методами выделяется суммарная
фракция, разделяемая далее на индивидуальные компо-
ненты. Следует подчеркнуть, что химический состав мно-
гих растений, содержащих экдистероиды, изучался и ра-
нее, однако полиоксистероиды из-за своей сравнительно
высокой растворимости в воде длительное время не
были обнаружены, поэтому необходима, разработка
специальных методов выделения, учитывающих особые
^‘свойства этих соединений (схема 1) [2, 34, 38]. В част-
Исходный I материал
_________Экстракция I метанолам________
Метанольный рост бор Остаток
1. Упарибание (угле/еды, трлаАоноиды и др.)
1. ЧЭаВабленив боди
Водно-нетамльный растбор *' > Остаток
| экстракция гексаном. (ррлабонаиды, хлорофилл и др.)
{-J-----------_--\‘1
Водно -лтетанольный слой Гексанобый слои.
• 1. Упарибание ' (хлоросрилл) .
2. ретракция этилацетатемн
Г------------Z~‘-----------------------:.
Водный слой _ э. Экс тракция дутанолож i 1. . Бутанольный слой Водный слои (ртЬрасы бается) Ц < Упаривание 2. Хролхатография на колоннах с AfzOs или Si Dg Экдистерон, инокостерон (рауделены кристаллархциеа цъ боды или слхеси этанол-генсан) Этил ацетатный слой 1. Упариба кие 2. Хроматография . на колонках с • ЛдгО} или SlOg Циастерон Пенас терон А (разделены кристалли- зацией боды или смеси этанол-гексан)
Рис. 1
105
них случаях наблюдаются расхождения с указанной
схемой в отношение используемых для экстракции и
кристаллизации растворителей,' а также адсорбентов
для хроматографического разделения. Для окончатель-
ной очистки экдистероидов иногда используется препа-
ративная хроматография в тонком слое силикагеля
[Singh S., Thakur R., 1982] при изолировании нового
фитоэкдизона — паристерона, отличающегося от экди-
стерона стереохимией гидроксильной группы при С2.
Ниже приведены некоторые примеры выделения экди
стероидов.
Получение циастерона (I) и экдистерона (II)
из живучки туркестанской Ajuga
turkestanica (R g 1.) Brig. [19]
Измельченные листья экстрагировали метанолом,
после концентрирования разбавляли водой и очищали
петролейным эфиром. Оставшуюся водно-метанольную
фракцию после отгбнки метанола проэкстрагировали
этилацетатом и полученный после удаления этилацетата
остаток хроматографировали на колонке с силикагелем.
При элюировании системой хлороформ — мётанол 9:1
выделили вещество 1 СгЛЛ с т. пл. 158—160°С (из
СНзОН), а при дальнейшем промывании колонки той
же системой в соотношении 4:1 получили соединение
11 С27Н44О7 с т. пл. 235—236° С (из водного СН3ОН).
Выделение э-кдистерона '(II)"
и инокостерона (Ш) из рапонтикума
сафлоровидного Rhaponticum
с а г t h a mo ides L. [11, 12]
0,5 кг измельченных корневищ с корнями экстраги-
ровали кипящим 96% этанолом (3X3 л), спиртовые
экстракты сгущали в вакууме и сумму экстрактивных
веществ (15,3 г) разделяли на колонке с полиамидом.
Элюировали Вначале хлороформом, затем этанольно-вод*
ными смесями (95—20%). Спиртовые и спиртоводные
фракции, содержащие экдистероиды, упаривали досуха
и остаток (10,8 г) рехроматографировали на оксиде алю-
миния (II ст. акт., нейтр.). При промывании колонки
смесью хлороформ—этанол 8:2 и 6:4 выделили бесцвет-
ные кристаллические вещества III и II состава С27Н44О7.
106
v Вещество III с т. пл. 247—248°С (из смеси ацетон—
|вода 10:1), [а] о +62,4° (с 0,38; метанол), Rt 0,66
f(TCX на А120з в системе бутанол—этанол—вода 5:1:2)
' идентифицировали с инокостероном.
Вещество II с т. пл. 236 — 238°С (из ацетона),
[а] Ъ1 +58,6° с 0,41; метанол), Rf 0,60 отождествление
с экдистероном.
Выделение фитоэкдистероидов
из смолевки
i Silene brahuica Boiss. [15]
I
10 кг измельченных корней исчерпывающе извлекали
уэтаполом. Экстракт сгустили (1 л), разбавили 2,5 л во-
(ды, выпавший осадок удалили и после упаривания эта-
• нола водный раствор проэкстрагировали сначала хло-
роформом, затем многократно бутанолом. Полученную
росле отгонки бутанола сумму экдистероидов (6,98 г)
|хроматографировали на колонке с силикагелем, элюи-
£руя системой хлороформ—метанол 9:1, затем 4:1. При
;этом выделили экдистерон с т. пл. 240—242°, затем его
'22-0-а-П—галактозид состава С33Н54О12 с т. пл. 254—
£256° (из водного метанола), [а]Ь3 ^-93,1° (с 1,03; ме-
:‘танол), названного силенеозидом А.
- При Дальнейшем элюировании получили интегристе-
,рон Act. пл. 246—248° (из смеси этилацетат — мета-
нол), [а]д3 4-36° (с 1,02; метанол), а при использова-
нии системы хлороформ—метанол—вода 80:3:0,3 и
’’60:32:6 выделили два новых экдистероида—силенео-
£зид В,' состава С39Н64О17 с т. пл. 236—238° (из смеси
|мета,нол—этилацетат), [а]д4+110,7° (с 0,51; метанол),
^имеющий строение экдистерон-3,22-бис-а-Р-галактопира-
рнозида, и силенеозид С ^интегристерон А-22-а-7)-галак-
^-тозид).
; 8. Идентификация и установление строения
f . экдистероидов
При изолировании известного соединения задача
^сводится к сравнению его физических констант с опи-
санным в литературе экдистероидом и параллельным
хроматографированием на тонком слое с заведомым об-
> разцом. В случае установления строения решающую
’ информацию получают с помощью физико-химических
107
методов исследования: протонного магнитного резонанса
(ПМР), масс-спектров (МС), кривых дисперсии опти-
ческого вращения (ДОВ) и кругового дихроизма (КД),
а также инфракрасных (ИК) и ультрафиолетовых (УФ)
спектров поглощения.
8.1. Протонный магнитный резонанс
При выяснении структуры экдистероидов огромную
помощь оказывают спектры ПМР, анализ которых по-
зволяет определить наличие и стереохимию структур-
ных элементов, присутствующих в стероидном скелете
и боковой цепи. При исследовании спектра ПМР неиз-
вестного экдистероида вывод о его структуре делается
прежде всего на основании сигналов ангулярных метиль-
ных груцп, а также метильных групп в боковой цепи.
Резонансные частоты протонов третичных метильных
групп зависят как от природы, так и от ориентации за-
местителей в скелете и боковой цепи. Две ангулярные
метильные группы имеют наименьшие химические сдви-
ги: у а-экдизона д протонов в Cte- и С^-метильных груп-
пах составляет соответственно 0,70 и 1,05 м. д. Имею-
щаяся в молекуле группа С21 -метил проявляется в виде
дублета равной интенсивности при 1,19 и 1,30 м. д.
Следующий одиночный сигнал при 1,38 м. д. (6Н) обус-
ловлен двумя одинаковыми третичными метильными
группами у Сгв и С27.
Необходимо заметить, что наряду со свободными
экдистероидами изучаются ПМР-спектры их производ-
ных— ацетатов и ацетонидов, дающие существенную
дополнительную информацию о стереохимии замести-
телей. Кроме того, указанные производные, благодаря
растворимости в дейтерохлороформе, более пригодны
для сравнения спектров ПМР [2].
Характерная для этих соединений Д7-6-кетогруппи-
ровка проявляется в виде дублета винильного протона
при С7, который для всех изученных экдистероидов на-
ходится в области 6,1—6,3 м. д. Свидетельством указан-
ного является тот факт, что в спектрах ПМР хейлан-
тонов А и В, представляющих собой 7,8-дигидроэкди-
зоны, сигналы винильных протонов в указанной области
отсутствуют.
Другим характерным структурным элементом стеро-
идного скелета экдистероидов является 2,3-диольная
108
группировка в кольце А, т. е. фрагмент — СН2—
—СН(ОН)—СН(ОН)—СНг—, наличие которого и его
конфигурация надежно выводятся из спектров ПМР.
Поскольку протоны, связанные с тем же углеродным
атомом, что и гидроксильная группа, обычно дезэкрани-
рованы и их резонансные сигналы находятся в нераз-
решенной части спектра (3,5—4,5 м. д.), определение
положения и стереохимии 2- и 3-гидроксильных групп
проводится анализом спектров ПМР их ацетатов, сиг-
налы соответствующих протонов в которых находятся
в области 4,6—5,6 м. д. и поэтому легко различимы
(6 — 4,98—5,05 и 5,25—5,30 м. д.).
Вывод относительно а- или ^-конфигурации 2,3-гли-
кольной группировки делается на основании химическо-
го сдвига протонов ангулярной С19-метильной группы.
Так, в спектре ПМР макистеронов и понастерона А хим-
'сдвиг с 6 1,00—1,02 м. д., аналогичный соответствую-
щему сигналу в спектре а-экдизона, конформация ко-
торого однозначно установлена, указывает на 2£, Зр-
конфигурацию гидроксильных групп. Что касается спект-
ра ПМР понастерона В, то химсдвиг протонов, с 6
0,93 м. д. свидетельствует в пользу 2а, За-конфигурации.
Характерным фрагментом стероидного скелета у эк-
Lдизонов является также 14а-оксигруппа. Наличие ее
в молекуле проявляется в спектрах ПМР смещением
резонансного сигнала протонов С^-ангулярной метиль-
ной группы в слабое поле примерно на 0,06 м. д. по
сравнению с синтетическими модельными 14-дсзоксиэк-
дистероидами. Помимо этого имеет место также сме-
щение сигнала олефинового протона при С7 на 0,02 м.д.
в слабое поле.
8.2. Масс-спектрометрия
ч
После спектров ПМР масс-спектрометрия является
вторым по значению источником информации о строе-
нии экдистероидов. С помощью МС получают следую-
щие основные структурные данные, касающиеся этих
соединений: молекулярная масса, число и распределе-
ние оксигрупп в стероидном скелете и боковой цепи,
а также некоторые особенности строения последней
[2, 27, 28, 34].
Как'' известно, МС основана на разделении ионов
вещества по массе и заряду при прохождении их через
109
магнитное или электрическое поле. Общий характер
распада молекул экдистероидов под электронным уда-
ром аналогичен другим типам стероидных соединений,
однако в деталях его имеются индивидуальные особен-
ности, позволяющие, с одной стороны, отличить эту
группу веществ, а с другой,— установить структуру ин-
дивидуального экдизона» Для масс-спектров многих
представителей экдистероидов характерными являются
, следующие общие черты фрагментации.
Прежде всего, будучи пдлиоксисоединениями, экди-
стероиды либо вовсе не дают в масс-спектре пика моле-
кулярного иона (М+), либо он обладает очень малой
интенсивностью. Во всех МС имеется ряд довольно ин-
тенсивных пиков, обусловленных последовательным от-
щеплением нескольких . молекул воды (М+—п НгО).
Кроме того, одна из метильных групп, связанных с чет-
вертичным атомом углерода, также способна к отщеп-
лению, давая в МС пики, отвечающие ионам (М+—
СНз), а также дегидратационные пики (М+—СНз—п
HsO). Указанные пики используются для установления
молекулярной массы экдистероида. и отвечающей ему
суммарной формулы. Так, например, масс-спектр экди-
стерона содержит очень слабый пик М+ с tnle 480.
Имеются также 4 дегидратационных пика (ги/е 462,
444, 426, 408). Появление пиков 411 и 393 можно объяс-
нить отщеплением от молекулы экдистерона СНз-груп-
пы и соответственно трех или четырех молекул воды.
Присутствующий пик 300 отвечает иону, образующему-
ся за счет полной потери боковой цепи и атома водо-
рода. Фрагменты боковой цепи экдистерона, образую-
щиеся при разрыве связи С!7—С20, представлены в МС
пиками 161, 143, 125 и 107.
Наиболее интенсивными пиками в низкомолекуляр-
ной части МС экдистерона являются 99 и 81, обуслов-
ленные фрагментацией боковой цепи с разрывом
С20—С22 связи [29].
Для установления некоторых деталей строения мо-
лекул экдистероидов (например, количество оксигрупп)’
по МС основное значение имеют три типа фрагмента-
ции: расщепление по типу а отвечает разрыву Ci7—С2о
связи, по типу б — разрыву С20—С22 связи и по типу в—
разрыв С23—С24 связи.
110
Наиболее типична для экдизонов фрагментация по
типу а и б, тогда как фрагментация по типу в встреча-
ется преимущественно у 28 С- и 29 С-экдистероидов,
•имеющих заместители при С24. Поскольку наиболее
' существенное различие между полиоксиостероидами за-
ключаются в основном в структуре их боковой цепи, вы-
яснение строения последней приобретает очень важное
значение, поэтому анализ осколочных ионов, образую-
щихся при указанных типах фрагментации, позволяет
установить строение экдистероида.
8.3. УФ-спектроскопия
Спектры поглощения экдистероидов в УФ-области
(как и в ПК) имеют второстепенное значение при уста-
новлении строения и используются для получения допол-
нительной информации о структурных элементах моле-
кулы.
В УФ-спектрах экдизонов наблюдаются две полосы,
связанные с наличием в их молекуле кетогруппы, со-
пряженной с двойной связью: интенсивная л—л* полоса
при 240—245 нм и слабая п—л* полоса (~ в 100 раз
меньше), при 305—327 им [31]. Положение главного
максимума, характерно для Д7-6-кетостероидов, у кото-
рых он наблюдается обычно при 244—246 нм. При вве-
дении в молекулу 5р-оксигруппы УФ-спектр заметно не
изменяется.
Как было указано ранее, УФ-спектры оказывают по-
мощь при установлении наличия в молекуле экдистеро-
йда оксигруппы при Си. Исследуя продукты превраще-
ния спиртового раствора анализируемого экдизона под
действием НС1 методом электронной Спектроскопии, на
Ш
основании обнаружения Лгаах 292—298 нм судят о при-
сутствии А7-6-оксигруппировки [31, 33, 34].
8.4. ИК-спёктроскопия
ИК-спектры экдистероидов в соответствии с
общностью стероидного цикла, содержащего полигид-
рокСи-Д7-6-кетогруппировки, имеют две основные ин-
тенсивные полосы поглощения: сопряженного кетона
в области 1670—1640 см-1 и гидроксильных групп при
3470—3400 см-1 [2, 11, 34]. Наличие в молекуле раз-
личных фрагментов структуры соответственно отража-
ется в ИК-спектре, что позволяет идентифицировать
вещества. Так, присутствие в некоторых экдизонах (по-
липодин В, понастерон С) 5(3-оксигруппы приводит к
смещению полосы поглощения 6-кетонепредельной груп-
пировки в область более длинных волн'на — 30 см-1.
Соединения, содержащие в боковой цепи у-лактоннып
фрагмент, например циа.стерон [27а, 28], обнаружи-
вают в ИК-спектре дополнительную полосу при 1752—
1748 см-1, а имеющие б-лактонное кольцо — при 1730—
1710 см-1.
8.5. Дисперсия оптического вращения
(ДОВ) и круговой дихроизм (КД)
Методы ДОВ и КД были в первую- очередь исполь-
зованы для определения сочленения колец А и В (цис-
или транс-А/В-изомеры), которое возможно благодаря
наличию карбонильного хромофора при Сб в кольце В.
Кривые ДОВ Д7-6-кетостероидов обнаруживают для
п—л*-перехода при — 350 нм — положительный эф-
фект Коттона с двумя максимумами, а для л—^-пе-
рехода — отрицательный эффект при — 240 нм. Ука-
занная картина характерна как для 5а-, так и для
5(3-изомеров, Однако они различаются величиной ампли-
туды. Помимо изменения амплитуды при переходе от
5а к 5р-ряду в кривых ДОВ для п—я*-переходов
имеет место также сдвиг экстремумов в длинноволно-
вую область — на 10 нм.
Кривая ДОВ экдистероидов с транс-сочленением
колец А и В имеет амплитуду порядка — 520 для
л—л*-перехода и порядка -|-140 — для п—^-перехо-
да. В то же время экдизоны, имеющие цис-сочленение
112
Ж A/В, дают эффекты Коттона с меньшими амплитудами:
И в среднем —200 для л—л* и +60—для п—*л-перехо-
q дов. Это позволило использовать данный метод для
Ь- аналитических целей [29].
ДОВ и КД были с успехом применены для подтвер-
> ждения конформации Д7-6-кетогруппировки в кольце В
' » и определения абсолютной конфигурации ди- и трибен-
зоатов экдистероидов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абубакиров Н. К. Экдистероиды цветковых растений.—
h Химия природ. соед., 1981, № 6, с. 685—702.
2. Ах рем А. А1? Левина И. С., Титов Ю. А. Экдизоны —
Истероидные гормоны насекомых.—Минск: Наука и техника, 1973.—
f 232 с.
3. Балтаев У. А., Горовиц М. Б., Абдуллаев Н. Д.
. и др. Фитоэкдизоны Rhaponticum integrifolium II. Интегристе-
рон А. — Химия природ, соед., 1977, № 6, с. 813—819.
= ‘ 4. Балтаев У. А., Горовиц М. В., Абдуллаев Н. Д.
s л др. Фитоэкдизоны Rhaponticum integrifolium III. Интегристе-
'' рон В. — Химия природ, соед., 1978, № 4, с. 457—467.
Ь' 5. Балтаев У. А., Горовиц М. Б., Хамидходжа-
£ в С. А, Абубакиров Н. К. Фитоэкдйзоны Rhaponticum in-
tegrifolium.— Хим. природ, соед., 1974, № 4, с. 406—407.
' 6. Ганиев Ш. Г. Содержание экдизонов в некоторых
Растениях трибы Cynareae Less. сем. Asteraceae (Compositae).—
астит. ресурсы^ 1975, т. 11, вып. 1, с. 94—96.
7. Горовиц М. Б., Зацны И. Л., Абубакиров Н. К.
Экдизоны в растительном мире. — Растит, рес., 1974, т. 10, вып. 2,
, с. 261—274.
г 8. Зацны И. Л., Горовиц М. Б-, А б у б а к и р о в Н. К.
. Экдистерон из Serratula sogdiana I. — Хим. природ, соед., 1971,
£ № 6, с. 840—841.
. ’ 9. 3 а ц н ы И. Л., Г о р о в и ц М. Б., А б у б а к и р о в Н. К.
Фитоэкдизоны Serratula II. Витикбстерон Е из Serratlila sogdiana
г и его частичный синтез. — Химия природ, соед., 1973, № 2,
с. 175—178.
/ 10. 3 а ц н ы И. Л., Горовиц М. Б., Р а ш к е с Я. В., А б у -
£б аки ров Н. К. Фитоэкдизоны Serratula III. Масс-спектрометри-
LnecKoe изучение ацетатов и ацетонидов экдистерона и витикосте-
£ рона Е. — Хим. природ, соед., 1975,.№ 2, с. 155—158. •
|- 11. Краснов Е. А., Саратиков А. С., Якунина Г. Д.
£ Инокостерон и экдистерон из Rhappnticum cartharnoides. — Хим.
и природ, соед., 1976, № 4, с. 550. -
F 12. Краснов Е. А., Саратиков А. С., Якунина Г. Д. •
^•Действующие вещества левзеи сафлоровидной. — Изв. СО АН
г СССР, сер. биол. наук, 1977, № 5, с. 93—95.
£ 13. Краснов Е. А. и др. Обследование растений флоры За-
1 падкой Сибири на содержание биологически активных веществ.
’Сообщ. 3.—Томск, 1983. — 18 с. — Рукопись представлена Томским
= Мед. ин-том. Деп. в ВИНИТИ 27 янв. 1983, № 475-.83.
4**
113
14. Н о во се л ь с к а я И. Л., Горовиц М. Б., Абубаки-
ров Н. К. Фитоэкдизоны Serratula IV. Согдистерон. — Хим. при-
род, соед.’, 1975, № 3, с. 429—430.
15. С а ат о в 3., Горовиц М. Б., Абуллаев Н. Д. и др.
Фитоэкдистероиды растений рода Silene V. Силенеозид В—дига-
лактозид экдистерона из Silene brahuica. — Хим. природ, соед.,
1982, № 5, с. 611—615.
16. С ы р о в В. Н., К у р к у м о в Л. Г. Об анаболической
активности фитоэкдизона — экдистерона, выделенного из Rhapon-
ticum carthamoides (Willd.) Jljin.— Фармакол. и токсикол., 1976,
т. 39, № 6, с. 690—693.
17. Сыров В. Н., Куркум ов А. Г. О тонизирующих свой-
ствах экдистерона, выделенного из левзеи сафлоровидной. — Докл.
АН УзССР, 1977, № 12, с. 27—30. .
18. Т а ш м у х а м е д о в а М. А., Абзалова М. X., Сы-
ров В. Я, Султанов М. Б. О гипогликемических, свойствах
циастерона. — Докл. АН УзССР, 1983, № 2, с. 33—34.
19. У с м а н о в Б. 3., Горовиц М. Б., Абубакиров Н. К.
Фитоэкдизоны Ajuga turkestanica. — Хим. природ, соед., 1971, № 4,
с. 535—536.
20. X о л о д о в а Ю. Д. Применение реакции Чугаева для ко-
личественного определения экдизонов. — Хим. природ, соед., 1977,
№ 2, с. 227—230.
21. Холодова Ю. Д. Фитоэкдизоны — биологически актив-
ные полигидроксилированные стерины.— Укр. биохим. журн., 1979,
т. 51, № 5, с. 560—575..
22. Холодова Ю. Д., Пастернак Л. П., Апосто-
лов А. Г. Внд1лення та щентифпсащя екдизон!в з рослин УкраТни.—
Укр. бюх1м1чний ж., 1976, т. 48, № 4, с, 533—535.
23. Холодова Ю. Д., Яхимович Р. И., Вендт В. П.
Реакция Чугаева на стбрины. — Вопр. мед. химии, 1976, т. 22,
вып. 1, с. 122—126.
24. Я к у б о в а М. Р., Г е н к и н а Г. Л., Ш а к и р о в Т. Т.,
А-бубакиров Н. К. Спектрофотометрический'метод определения
экдистерона в растительном сырье. — Хим. природ, соед., 1978,
№ 6, с. 737—740.
25. Я к у б о в а М. Р. и др. Контроль производства экдистеро-
на.— Хим. природ, соед., 1983, № 3, с. 322—324.
26. Я ц ю к Я. К., Сегаль Г. М. О выделении экдистерона. —
Химия природ, соед., 1970, № 2, с. 281.
27. Cherbas Р. et al. 14-Dexymuristerone, a compounds exhi-
biting exceptional moulting hormonal activity.—J. Chem. Soc Chem
Commun., 1982, № 22, p. 1307—1308.
27a. Ikan.R., Ravid U. The Isolation and Identification of
Cyasterone from Ajuga chia (Labiatae). —Phytochemistry. 1971.
v. 10, p. 1659—1661. *
28. J m a i S. et al. Isolation of Cyasterone and Ecdysterone
from Plant Materials.—Chem. Pharm. Bull.. 1969. v. 17 2
p. 340—342.
29. Galbraith M. N., Horn D. H. S. Insect moulting hor-
mones crustecdyson (20-hydroxyecdysone) from Podocarpiis elatus.—
Australian J. Chem., 1969,-v. 22, p. 1045-4057.
30. Hardman R., Benjamin T. V. Quantitative determina-
tion of phytoecdysones as illustrated by application to species of
Helloborus. — J. of Chromat., 1977, v. 131, p. 468—470.
114
b 31. Hof fmeister H., Grtitzroacher H. F. Zur Chemie des
^^Ecdysterons.— Tetrah. Lett., 1966, № 33, S. 4017—4023.
‘ L 32. Imai S. et al/Screening Resuls of Plants for Phytoecdyso-
^fipes. — Chem. Pharm. Bull., 1969, v. 17, № 2, p. 335—339.
О 33. К a r 1 s о и P. u. a. Zur Chemie des Ecdysons. IV. Reactionen
Elides ecdysonmolekules. — Chem. Ber., 1965, Bd. 98, S. 2394—2402.
Il 34. Nakanishi K. The ecdysones.— Pure and Applied- Chem.,
>71, v. 25, p. 167—195.
35. Nakanishi K. et al. Insect Hormones. The structure of
onasterone A, an Insect-moulting Hormone from the Leaves, of
odocarpus nakaii Hay. — J. Chem. Soc. Chem. Common., 1966,
> 24, p. 9*15—917. •
36. Rees H. H. Ecdysones.— In: Aspects of Terpenoid,. Che-
istry and Biochemistry. London: Acad. Press, 1971, № 4, p. 181—
>2. ’
37. Schooley D. A., Weiss G., Nakanishi K. A simple
id general ectraction for phytoecdysones based §n reversed phase.
Isoption chromatography. — Steroids, 1972, v. 19, p. 377—383.
38. T a к e m о t о T. et al. Studies on the constituents of Achy-
inthis Radix VII. The insect-moulting substances of Achyranthes
id Cyathula. — J. Pharm. Soc. Japan, 1968, v. 88, p. 1293—1297.
Г л а в a 7
ТРИТЕРПЕНОВЫЕ САПОНИНЫ
1. Общая характеристика
Термин «сапонин», или «еапонозид», был впервые
предложен в 1819 г, Мэлоном для вещества, выделенно-
го Шрайдером в 1811 г. из мыльнянки.
Сапонины представляют собой сложные органиче-
ские соединения гликозидного характера. Большинство
из них вызывают гемолиз Эритроцитов "крови. Водные
растворы сапонинов (или извлечения из растительного
сырья) образуют при встряхивании обильную стойкую
пену (подобно мыльной), в результате чего эти веще-
ства и получили-название сапонинов (от ларинского
sapo — мыло}. Сапонины весьма токсичны для холод-
нокровных животных (рыб, лягушек, червей), вызы-
вают их гибель (или паралич) даже в очень больших
разведениях (1:1000000).
Тритерпеновые глик*озиды как вещества экзогенного
происхождения проявляют физиологическую активность
в отношении теплокровных4 животных: влияют на. обмен
веществ, функциональное состояние органов и организ2
ма.в целом.
Тритерпеновые гликозиды состоят из агликона (ге-
нии) тритерпеновой природы и углеводной части. Дол-
гое время усилия ученых были сосредоточены на изуче-
нии структуры только генинов, получающихся в крис-
таллическом виде из исходных аморфных -веществ с
помощью кислотного гидролиза. Установить полную
структуру тритерпеновых гликозидов длительное вре-
мя не удавалось, так как не было хроматографических
методов их разделения. В 60-х годах под руководством
академика Н. К. Кочеткова были разработаны аналити-
ческие и препаративные условия разделения довольно
сложных смесей веществ, а также методы установления
строения углеводных составляющих гликозидов [7].
Благодаря атому удалось выделить и показать струк-
116
туру тритерпенрвых гликозидов с большой молекуляр-
.-ной массой, получивших название «олигозиды». Первым
к представителем этого класса оказался гйпсозид.
| Достижение школы химиков Н. К. Кочеткова позво--
|лило поставить на научную основу исследование глико-
азидов и занять лидирующее положение в мире в этой
I области химии природных соединений. Так, если $
t 1960 г. в литературе было описано строение четырех
^гликозидов тритерпеновой природы, то в настоящее
$ время число их приближается к 200, причем более 150
^.изучены советскими учеными.
2. Распространение в растительном мире
Тритерпеновые гликозиды широко распространены
в растениях и животных класса иглокожих. Они ис-
пользуются организмами для борьбы за существование
?и поддержания равновесия при антагонистических вза-
имоотношениях биологических систем и служат фак-
торами невосприимчивости растений к грибковым за-
болеваниям [1]. •
В результате, многочисленных исследований отече-
ственных и зарубежных ученых можно считать, что на-
личие тритерпеновых гликозидов в отдельных семей-
ствах растений может служить хемотаксономическим
•признаком. Наиболее богаты этими веществами сле-
дующие семейства: гвоздичные Caryophylaceae, люти-
|' ковые Ranunculaceae, бобовые Fabaceae, аралиевые
£ Araliaceae, сложноцветные AsteraCeae, сапиндовые Sa-
: pindaceae и др'. [5].
3. Локализация в растениях
- Показано, что тритерпеновые гликозиды локализу-
ются в жизненно важных органах и тканях. В больших
количествах они обнаружены в листьях, цветках, семе-
нах, плодах, корнях, корневищах и стеблях [5].
Тритерпеновые гликозиды и родственные им соеди-
нения в больших количествах обнаруживаются, в тех
органах и тканях, которые интенсивно функционируют
или содержат большое количество интенсивно, делящих-
ся клеток: хлоропласты> меристематические участки,
семена растений и яйцеклетки голотурий. В зависимос-
ти от состояния организма содержание и скорость био-
117
синтеза гликозидов изменяются в достаточно больших
пределах, что указывает на их активную роль в расте-
ниях и, следовательно, они не являются балластными
веществами. Можно предположить, что они включают-
ся в метаболизм в процессе ’ роста и развитий организ-
ма, выполняя еще не изученные до настоящего време-
ни регуляторные функции.
На . биосинтез тритерпеноидов в растениях большое
влияние оказывает интенсивность света, при этом обна-
руживается прямая зависимость между интенсивностью
фотосинтеза и скоростью синтеза тритерпеноидов.
4. Классификация
Тритерпеновые гликозиды' по характеру агликона
могут относиться к ct-(I) или p-амириновому (II), лу-
пановому (III), гопановому (IV), даммарановому (V),
ланостановому (VI) и голостановому (VII) ряду.
118
г
Ланостан
Голостан
Даммаран
В составе углеводной части найдены следующие мо-
носахариды: Д-глюкоза, (D-Gla), З-О-метил-О-глюкоза,
D-галактоза (D-Gla), D-ксилоза (D-Xyl), D-хиновоза,
L-арабиноза (L-Ara), L-рибоза, D-фукоза (D-Fuc),
L-рамноза (L-Rha), ликсоза (Lyx) и D-глюкуроновая
кислота (D-Gla), Они образуют одну или две углевод-
_ ные цепи линейной или разветвленной структуры. В
настоящее время предложено несколько вариантов
классификации тритерпеновых гликозидов, учитываю-
щих те или иные особенности углеводной части [7].
Так, например, вещества, содержащие углеводную цепь
по карбоксильной группе агликона Л. Г. Мжельская и
Н. К- Абубакиров [1968] предлагают называть аци-
лозидами. Р. Чеше и Г. Вульфф [39] разделяют гли-
козиды на бисмозиды и монозиды, т. е. на соединения
с двумя и одной углеводной цепями соответственно.
В состав некоторых гликозидов входят остатки орга-
нических кислот, например, ангеликовой, тиглиновой,
коричной, уксусной и других^ этерифицирующих преи-
мущественно агликоны.
5. Физико-химические свойства
Физико-химические свойства сапонинов изменяются
в широких пределах и зависят от строения сапогенинов
119
и углеводных компонентов. Сапонины представляют
собой, как правило, аморфные вещества. В кристалли-
ческом виде получены лишь те представители этого
класса соединений, которые имеют в своем составе до
4 моносахаридных остатков. Сапонины — вещества,
обладающие сильной поверхностной (что связано с на-
личием в одной молекуле гидрофильного и гидрофоб-
ного остатков) и оптической активностью.
Как правило, тритерпеновые гликозиды нераствори-
мы в хлороформе, ацетоне, петролейном эфире, раст-
воримы в этиловом и метиловом спиртах. Раствори-
мость сапонинов в воде определяется в первую очередь
количеством моносахаридов и увеличивается с возрас-
танием числа последних. Гликозиды с 1—4 моносаха-
ридными остатками обычно плохо растворимы в воде.
Прибавление этилового- эфира или ацетона к спирто-
вым растворам сапонинов вызывает их осаждение, что
используется в качестве метода очистки. Из водных
растроров различные группы тритерпеновых гликози-
дов могут осаждаться различными солями свинца и гид-
роксидом бария. На этом была основана первичная
классификация сапонинов, сохранявшая свое значение
до установления их химической природы [13].
Важным химическим свойством тритерпеновых са-
понинов является способность образовывать комплексы
с фенолами, высшими спиртами и стеринами. При этом
комплекс гликозидов со стеринами .распадается при
нагревании в ксилоле или пиридине. Указанйое свойст-
во иногда используют для выделения- суммы сапонинов
из экстрактов растений.
Тритерпеновые гликозиды бывают нейтральными и
кислыми, что обусловлено карбоксильной группой в
агликоне или присутствием уроновых кислот в углевод-
ной цепи.
Все сапонины неустойчивы по отношению к кислым
агентам, под действием которых расщепляются глико-
зидные связи, а те, для которых характерно наличие
О-ацилгликозидных связей, неустойчивы к действию
щелочей. Тритерпеновые гликозиды, этерифицициро-
ванные карбоновыми кислотами, легко омыляются ще-
лочами. Следует отметить, что для многих сапонинов
нет строгого доказательства индивидуальности. в связи
с их способностью образовывать устойчивые комплексы
между собой и с другими природными соединениями,
120 ,
поэтому их физико-химические свойства могут изме-
няться в широких пределах [13].
6. Количественное определение
Для количественного определения сапонинов в рас-
тительном сырье применяют методы, основанные на
использовании биологических и физических свойств
; сапонинов, т. е. определении гемолитического, рыбЫего
^.индексов и пенного числа, а также химические методы.
Количественное определение сапонинов гемолитиче-
ским методом основано на предположении, что гемо-
литическое действие прямо пропорционально количест-
ву вещества в растворе.
Из настоя растительного- сырья па изотоническом
растворе NaCl готовят ряд разведений различной кон-
центрации, затем к каждому разведению добавляют по
1 мл взвеси эритроцитов (2% свежей дефибринированной
бараньей крови в изотоническом растворе) и встряхи-
вают. Через . некоторое время наблюдают результаты
гемолиза.
Ввиду того, что различные сапонины при одинако-
вой концентрации имеют разный гемолитический ин-
декс (механизм гемолиза также различен), каждое
сырье должно иметь свой стандарт — раствор чистого
сапонина.
Предложен видоизмененный метод определения ге-
молитического индекса, который заключается в изме-
рении диаметра гемолитического пятна, образующегося
при соприкосновении кружка фильтровальной бумаги,
смоченного раствором - сапонина, с желатиновой сус-
пензией эритроцитов. Однако положительный резуль-
тат гемолитической пробы еще не является доказа-
тельством наличия сапонинов, так как другие расти-
тельные вещества (некоторые эфирные масла, кисло-
ты, спирты) также дают гемолиз. Надежность пробы
повышается, если гемолиз блокируется добавлением
холестерина и восстанавливается после разрушения
образовавшегося комплекса. Следует учитывать, что
некоторые сапонины (хедерин, примуловые кислоты
и др.) не образуют холестеридов. Сапонины могут так-
же находиться в растении в виде комплекса со стеро-
лами и не проявлять гемолитической активности до раз-
рушения этого комплекса [13]. .
121
Методы определения сапонинов, основанные на по-
вышенной токсичности этих соединений для холодно-
кровных животных (рыбы, головастики, жабы, черви),
не имеют преимущества по сравнению с гемолитиче-
ским индексом и сохраняют его главный недостаток—
невысокую надежность, невозможность строгого отне-
сения исследуемых веществ к классу сапонинов.
Методы количественного определения сапонинов,
основанные на биологических и физических свойствах
последних, как и определение поверхностной активнос-
ти, гемолитического действия и токсичности сапонинов,
дают результаты, которые нельзя взаимно сравнивать,
поскольку эти свойства друг от друга не зависят. Уста-
новив, одно из них, нельзя говорить о степени проявле-
ния второго или третьего. Ни один из перечисленных
методов не основан на определении абсолютного содер-
жания сапонинов в сырье.
Общих химических методов определения сапонинов
в растительном сырье не существует. Применяются
гравиметрические, титриметрические и фотометрические
методы. Наиболее часто для количественного определе-
ния сапонинов используются колориметрические и
спектрофотометрические методы анализа.
7. Методы обнаружения сапонинов
Для обнаружения сапонинов в растительном сырье
пользуются реакциями, основанными на физических,
химических и биологических свойствах этих веществ.
К первой группе относится реакция пенообразова-
ния. Это не только чувствительная, но и довольно ха-
рактерная проба, так как других веществ, обладающих
такой способностью к пенообразованию, в растениях
не встречается.
Ко второй группе относятся реакции осаждения са-
понинов и цветные реакции. Из водных растворов са-
понины осаждаются гидроксидом бария и магния, со-
лями меди, ацетатом свинца, причем тритерпеновые
сапонины осаждаются средним ацетатом свинца, а сте-
роидные — основным. Из спиртовых извлечений (или
растворов) стероидные и тритерпеновые сапонины вы-
падают в осадок при добавлении спиртового раствора
холестерина в виде холестероидов. Стероидные сапони-
ны, как и сердечные гликозиды, дают реакцию Либер-
122
мана—Бурхарда. Для качественных реакций готовят
водный настой 1:10, нагревая измельченное раститель-
ное сырье на водяной бане в течение 10 мин. Настой
после охлаждения фильтруют и проводят с ним необ-
ходимые реакции.
£ Учитывая, что многие из перечисленных химических
реакций могут давать и другие соединения, проводят
еще и биологические испытания. Большинство сапо-
нинов вызывают гемолиз эритроцитов крови. Для про-
ведения этой реакции из растительного сырья готовят
{настой на изотоническом растворе [13].
Наиболее достоверные результаты дают хроматогра-
'фические методы, которыми в основном пользуются в
последнее время для обнаружения и идентификации
Гтритерпеновых сапонинов. Для анализа широко ис-
|'пользуют как бумажную (БХ) [12, 14], так и тонко-
[ слойную хроматографию (ТСХ) [2, 14].
В качестве носителя в тонкослойной хроматографии
' обычно применяют силикагель, оксид алюминия, поро-
I шок целлюлозы, реже — фосфаты и карбонат кальция,
|г_крахмал, сахар. В качестве подвижной фазы исполь-
зуют различные смеси растворителей.
р Р. Чеше и Г. Вульфф [39] получили хорошие ре-
зультаты при БХ нейтральных гликозидов в системе
I ^растворителей хлороформ — пиридин—тетрагидрофу-
[ ран (10:10:2). Эту систему можно использовать так-
;же при ТСХ с применением кизельгеля; при наличии
*сильнополярных гликозидов хроматографирование сле-
йДует вести на протоке. Для БХ нейтральных гликози-
кдов подходящими оказались также системы: бутанол-1
К—этанол—вода (10:2:5) и бутанол-1—ледяная уксус-
ная кислота—вода (4:1:5) [12]. Напротив, кислые
. гликозиды можно хроматографировать в системах ра.ст-
Гворителей, имеющих значение pH>7; например, в сис-
^теме бутанол-1—этанол—15% раствор аммиака (18:3,5:
Г.18).
f Для обнаружения тритерпеновых гликозидов на
(^хроматограммах используют сильнокислые реагенты:
у насыщенный -хлороформный раствор пятихлористой и
*|,треххлористой сурьмы, 25% спиртовый раствор фос-
('’форно-вольфрамовой кислоты, серную кислоту и дру-
гие. Последняя реагирует главным образом с сапоге-
^ниновой частью. Однако чем больше сахарная цепь,
[тем меньше относительная доля генина и, следова-
123
тельно, чувствительность реакции. Среди перечислен-
ных реактивов предпочтение отдается раствору фос-
форно-вольфра.мовОй кислоты, так как при этом полу-
чается более отчетливое окрашивание пятен, сохраняю-
щееся продолжительное время.
Для ТСХ нейтральных гликозидов' рекомендуется
использовать систему хлороформ—метанол—вода
(65:35:10) на кизельгеле [43]. Кислые гликозиды
лучше разделяются на неактивированных силикагеле-
вых пластинках . [39]. Хорошие результаты были дос-
тигнуты при использовании смеси бутанол-1—-метанол
(1:1), насыщенной 2н. раствором аммиака. Пластинки
при этом предварительно опрыскивали неподвижной
фаЕзой. Р. Чеше и Г. Вульфф считают возможным ТСХ
кислых гликозидов в системе хлороформ—метанол—во-
да провести после этерификации, карбоксильных групп
[39].
Таким образом, при исследовании сырья на наличие
тритерпеновых гликозидов наиболее достоверные ре-
зультаты могут быть получены при комплексном приме-
нении вышеописанных методов или же после предва-
рительной очистки гликозидов от балластных веществ
с последующим анализом одного из описанных мето-
дов.
8. Методы выделения и разделения тритерпеновых
сапонинов
Выделение тритерпеновых гликозидов включает в
себя получение из растительного материала суммарно-
го экстракта и очистку его от балластных веществ
с последующим разделением смеси на индивидуальные
соединения.
Несмотря на то, что большинство тритерпеновых
гликозидов являются относительно стабильными при-
родными веществами, необходимо проявлять особую
осторожность при сборе и сушке растительного сырья
во избежание ферментативного гидролиза их углевод-
ной составляющей.
В настоящее время наиболее распространенным
методом выделения тритерпеновых гликозидов являет-
ся экстракция водным метиловым, этиловым или изо-
пропиловым спиртами с предварительным обезжирива-
нием петролейным [22] или диэтиловым эфиром [35,
124
45], гексаном [36], хлористым метиленом [21] и хло-
роформом [10, 11]. Необходимость этой операции свя-
зана с удалением из растений жироподобных .веществ
(прежде всего стеринов, с которыми большинство три-
терпеновых гликозидов -способно образовывать нераст-
воримые в водных спиртах комплексные соединения).
Известны различные способы экстракции: в экстрак-
торах непрерывного действия, неоднократное нагрева-
ние сырья с растворителем и настаивание на холоде,
Подбор растворителя для экстракции зависит от строе-
ния извлекаемых веществ. Для гликозидов урсоловой
кислоты, содержащих небольшое количество моносаха-
ридов, В. Бухаров [4] рекомендует использовать эти-
Лацетат, в котором соединения с большой молекуляр-
. ной массой практически не растворяются, а Г. Риппер-
гер для выделения моногликозида кукурбитацина Е
применяет смесь хлороформ — спирт (2:1). Японские
химики извлекают простейшие гликозиды чистым аце-
тоном. В случае сильнополярных гликозидов Р. Че-
ше с сотрудниками использует экстракцию водным бу-1
тиловым спиртом [40].
При экстракции тритерпеновых гликозидов водными
, спиртами применяется ряд предосторожностей, так как
наличие в растениях. органических кислот, может при-
вести к их частичной деструкции. Для устранения упо-
мянутого‘процесса Т. Кубота и Г. Хинох [29]'“добав-
ляют небольшое количество пиридина, связывающего
органические кислоты. В некоторых случаях предпочи-
тают применять многократную холодную экстракцию.
Это обстоятельство связано с возможностью алкилиро-
вания извлекаемых веществ спиртами при повышенной
температуре и высокой лабильностью исследуемых сое-
динений, каковыми, например, являются соединения
даммаранового и кукурбитанового ряда, а, также гли-
козиды, содержащие ацилированные генины' (аглико-
ны), кислотные остатки которых в этих условиях могут
омыляться или претерпевать миграцию.
Для извлечения тритерпеновых гликозидов кислого
характера используют разбавленный водный аммиак
[На] или водный раствор соды, так как эти соедине-
ния, содержащие небольшую углеводную составляю-
щую, хорошо растворимы в щелочах и выпадают в
осадок при их подкислении.
125
Извлечение водой применимо для гликозидов, устой-
чивых к действию относительно высоких температур.
Преимущество такого подхода заключается в получе-
нии экстракта, свободного от хлорофилла, нераствори-
мого в воде. Однако в этом случае необходимо исклю-
чить протекание возможных ферментативных процес-
сов, приводящих к расщеплению углеводной цепи три-
терпеновых гликозидов. В некоторых исследованиях
удаление хлорофилла проводят немедленным промыва-
нием свежих водных экстрактов циклогексаном или
четыреххлористым углеродом.
Способ очистки от сопутствующих или балластных
веществ зависит от строения и природы выделяемых
соединений. Гликозиды, содержащие небольшое коли-
чество моносахаридных остатков, могут быть очищены
переосаждением их из спиртовых растворов водой [46],
а полярные соединения, плохо растворимые в метаноле
и этаноле, выпадают в осадок при охлаждении или
длительном стоянии концентрированных спиртовых
экстрактов.
Некоторые гликозиды, содержащие глюкуроновую
кислоту, осаждаются гидроокисью бария или свинца,
ацетатом свинца, которые затем разлагают серной кис-
лотой, углекислотой или сероводородом [31]. Получен-
ные таким способом кислые гликозиды могут содер-
жать примесь веществ фенольного характера, также
осаждающихся в этих условиях. Последние могут быть
удалены перколяцией экстрактов водными спиртами на
оксиде алюминия. Эти соединения с успехом очищают
от балластных веществ с помощью ионно-обменной
хроматографии [4]. Одновременно достигается удаление
минеральных примесей. Как было показано Р. Чеше
и Д. Форстманном [37], этот метод оказывается ма-
лопригодным, если карбоксильная группа принадлежит
агликону.
В настоящее время очистка водно-спиртовых эк-
страктов достигается промыванием их малополярными
растворителями, такими, как петролейный эфир, гексан,
бензол, дихлорэтан, хлороформ, этилацетат. Следует
иметь в виду, что здесь возможны переходы веществ
из водного слоя в органический, поэтому рекомендует-
ся на всех стадиях очистки осуществлять контроль с
помощью хроматографии. Дополнительная очистка три-
терпеповых гликозидов достигается осаждением их эфи-
126
ром, ацетоном, этилацетатом из спиртовых растворов.
Получаемые таким способом фракции иногда, очищают
повторным переосаждением, не позволяющим, однако,
избавиться от полярных балластных веществ (моно- и
олигосахариды и гликозиды других классов). Кроме
того, необходимо учитывать, что малополярные глико-
зиды могут оставаться в растворе и, таким образом,
теряться в процессе очистки.
Обезжиривание сырья хлористым
этиленом
Змстрахци» 80-ным метанолом
Промывание экстракта цикло -
ъексанолн или гдтыреххлористым
, '____углеродом.
. Циклогексановый
экстракт
Хлорис тый
экстракт г .
Содержит лгалополярныс
гликозиды.
I
бутанольный
экстракт к
Содержит гликозиды
средней полярности 4
Упаривание до перво-
начального объёма
„ ♦
Экстракция хлоротрорлгом
Экстракция йодного раство-
ра н-Зутилобым спиртом
Водная <paja
Содержит сильнополярные
сапонины t олигосахариды,
лгинеральные соли
Схема 2
Предварительное ацетилирование с последующим
омылением ацетатов гликозидов с целью их очистки
имеет ограниченное применение. К указанному приему
прибегают Только в случае отсутствия в них О-ацило-
127
зйдного Компонента, подвергающегося расщеплению в
условиях омыления ацетатов щелочами.
В настоящее время большинство исследователей
предпочитают использовать для выделения чистой гли-
козидной фракции схему, разработанную Н. Кочетко-
вым и А. Хорлиным [7] и в настоящее время значи-
тельно модифицированную и дополненную. Такая
схема (схема 2) имеет ряд преимуществ, так как уже
на стадии извлечения водного экстракта бутанолом
происходит обогащение органического слоя гликозида-
ми, малой и средней полярности,, в то время как в вод-
ном растворе остаются соединения олигозидного типа
[15]. Применение сефадекса позволяет избавиться от
свободных сахаров, а предварительная хроматография
на дезактивированном оксиде алюминия — от флаво-
ноидов. Последние легко могут быть отделены с по-
мощью хроматографии на полиамиде.
Разделение и очистку сапонинов, содержащихся в
бутанольном экстракте и водной фазе, осуществляют
различными методами (осаждение ацетонрм, диэтило-
вым эфиром, гельфильтрацией, хроматографией на ко-
лонках с оксидом алюминия и силикагелем, ионо-
обменной хроматографией и др.).
Метод, разработанный А. Сегельманом с соавт.
[34] для скрининга гликозидов в растительном мире,
предусматривает дополнительную перколяцию экстрак-
тов через колонку с оксидами магния или кальция. В
результате происходит полная адсорбция танинов и
фенольных веществ, которые затрудняют определение
тритерпеновых гликозидов с помощью гемолиза. Под-
робные исследования вышеупомянутых авторов позво-
ляют понять причину отрицательной гемолитической
реакции гликозидов даже в случае таких классических
сапониноносов, как квилайя мыльнянковая, мыльнянка
лекарственная и др. .В работах последних лет для этой
же цели используют смесь полиамида и оксида алюми-
ния [44]. ' ’
Одним из наиболее- распространенных методов
очистки является холестериновый [38]. Он позволяет
освобождаться от значительного количества, примесей,
а сам комплекс достаточно легко может быть разрушен
пиридином или горячим толуолом. К недостаткам ме-
тода следует отнести трудности полного удаления хо-
лестерина из реакционной смеси, а преимуществом его
128
является возможность разделения исследуемых ве-
’ ществ на две фракции; На примере соединений, полу-
ченных из люцерны, было установлено, что гликозиды
медикагеновой кислоты и хедерагенина дают водораст-
воримые комплексы, в то время как производные сол-
сапогенолов А, В, С и Е их не образуют [20]. В целом
холестериновые комплексы образуют преимущественно
монодесмозиды,. несущие в агликоне свободную карбок-
сильную группу.
Среди прочих методов, описанных в литературе,
^известна очистка активированным углем, а также пер-
коляция на силикате магния и целите, смеси уголь —
целит. »
Концентрирование водных экстрактов достигается,
как правило, упариванием в вакууме с добавлением
небольших количеств высших спиртов, устраняющих
пенообразование. Что касается получения индивидуаль-
ных гликозидов, то в настоящее время не существует
универсального метода и отдельной системы раствори-
телей для. всех работ по их выделению. Причина этого
. заключается в том, что гликозиды содержат много
функциональных групп и различные агликоны. Кроме
того, тритерпеновые гликозиды абсорбируют на своей
поверхности хлорофилл, фенольные и другие соедине-
ния. Хроматографическое разделение сапонинов по
причине их многокомпонентности очень сложно и к
успеху приводит комбинация самых разнообразных
хроматографических методов.
При колоночной хроматографии в качестве элюи-
рующих рекомендуются для нейтральных сапонинов
Нейтральные и кислые системы, а для кислых — ам-
миачные. В последнее время в работах советских уче-
ных описывается применение градиентных систем, осо-
бенно смеси хлороформ и метанол. Необходимо соблю-
дать особую рсторожность при использовании систем с
уксусной кислотой, так как при этом возможно отщеп-
ление углеводных компонентов и даже деструкция аг-
ликонов [24]. В большинстве случаев провести удов-
летворительное разделение на отдельные компоненты
удается только в результате многократного хроматог-
рафирования. При этом индивидуальность сапонинов
предпочтительнее контролировать в нескольких систе-
мах растворителей, чтобы избежать выделения смеси
гликозидов. Кроме того, учитывая чрезвычайную важ-
5. Заказ 2909. " 129
ность однородности выделенных’веществ, их индивиду-
альность необходимо проверять и на более поздних
стадиях изучения тритерпеновых гликозидов. Для этой
цели чаще всего служит аналитическая хроматография
на тонком слое силикагеля, проводя детекцию веществ
серной или фосфорно-вольфрамовой кислотами разной
концентрации с последующим нагреванием при 110°С в
течение 10—15 мин. Ниже приведены примеры выделе-
ния тритерпеновых гликозидов.
Выделение тритерпе новых гликозидов из
проломника северного Androsace
septentrional is [10,11]
Красящие и липофильные вещества из сырья удаляли
хлороформом и затем экстрагировали кипящим мета-
нолом. Метанольные сгущенные экстракты обрабаты-
вали ацетоном. Полученный осадок тритерпеновых гли-
козидов пропускали через инактивную окись алюми-
ния. Выход суммы сапонинов составил 3,5—4% от
массы воздушно-сухого сырья.
. Методом ТСХ на пластинках силикагеля в системе
хлороформ—метанол—вада (61:32:7) обнаружили
одиннадцать гликозидов, четыре из которых домини-
руют в количественном отношении. Колоночной хрома-
тографией на силикагеле в системе хлороформ—мета-
нол—вода (61:32:7) выделили андросептозид F с
т. пл. 197—200°С, который составляет 15% от суммы
доминантных гликозидов.
После гидролиза гликозида 2,5% серной кислотой
в нейтрализованном гидролизате методом бумажной
хроматографии и ГЖХ ацетатов альдононитрильных
производных обнаружили глюкозу, арабинозу и рам-
нозу в соотношении 1:2:1. Температура плавления по-
лученного агликона, удельное вращение и ИК-спектр
совпали с таковыми для примулагенина А.
Выделение тритерпеновых гликозидов
из патринии средней Patrinia intermedia
[16]
В составе метанольного экстракта хроматографиро-
_ ванием на бумаге в различных системах растворителей
найдено 4 гликозида, названных патринозидами А, В,
130
C, D. При помощи распределительной хроматографии в
тонком закрепленном слое силикагеля в системе хло-
роформ—метанол—вода (61:32:7) в сапониновой
фракции обнаружено 7 гликозидов, главным из кото-
рых является патринозид D.
Выделение сапониновой фракции осуществлено гру-
бой распределительной хроматографией на оксиде алю-
миния с градиентным вымыванием системой раствори-
телей бутанол—этанол (1:1) — вода. Полученная са-
пониновая фракция переосаждалась ацетоном из мета-
нольного раствора и очищалась далее от сахаров при
помощи диализа или на сефадексе. В результате уста-
новлено, что чистая сапониновая фракция содержит
3 гликозида, патринозиды В, С и D, что составляет
30% от веса сухого метанольного экстракта. Основным
компонентом этой фракции (более 50%) оказался пат-
ринозид D, что было выяснено препаративной хрома-
тографией на незакрепленном слое силикагеля.
Для изучения генинов патринозидов был осуществ-
лен полный кислотный гидролиз сапониновой фракции.
Выделенный при этом гении по своим константам и
хроматографическому поведению оказался идентичным
олеаноловой кислоте, что и подтвердили полученные
производные.
9. Установление структуры и идентификация
тритерпеновых гликозидов
9.1. Определение моносахаридного состава
тритерпеновых гликозидов
Изучение строения тритерпеновых гликозидов начи-
нают с идентификации агликона и моносахаридов, сос-
тавляющих углеводные цепи. С этой целью гликозиды
подвергают кислотному гидролизу. В качестве рас-
щепляющих агентов используют серную, соляную,
хлорную кислоты, разбавленные водой, метанолом, эта-
нолом, диоксаном и другими растворителями, иногда
в токе азота [27]. Наличие уроновых кислот в углевод-
ных цепях повышает устойчивость гликозидных связей
при гидролизе, поэтому для их расщепления применяют
смесь Килиани [4], муравьиную кислоту либо восста-
навливают уроновые кислоты до соответствующих гек-
соз.
5*.
13!
При лабильном агликоне используют ферментные
препараты. Часто в таких случаях применяют распад
по Смиту [4, 5], при котором в мягких условиях пол-
ностью разрушаются и отщепляются углеводные цепи, а
агликон удается выделить в нативном виде. Новый ме-
тод фотолиза гликозидов УФ-светом позволяет изоли-
ровать нативный агликон [27].
Выделенные при кислотном гидролизе агликоны
идентифицируют или устанавливают их строение обыч-
ными приемами, органической химии с использованием
современных физических методов. Идентификация
агликонов сводится к определению их физических кон-
стант, сопоставлению их хроматографического поведе-
ния в тонком слое силикагеля с заведомо известными
образцами или к сравнению продуктов распада масс-
спектрометрическими методами [5, 10, 14, 25, 39].
4 Для идентификации моносахаридного состава гли-
козидов используют хроматографические методы путем
сравнения с подлинными образцами. Наиболее распро-
страненным является метод хроматографии на бумаге
[12], при котором используются следующие системы,
содержащие, как правило, воду: бутанол — уксусная
кислота—вода; бутанол—пиридин—вода; бутанол—
пиридин—бензол—вода; этилацетат—уксусная кисло-
та-вода [24]. Сахар на хроматограммах обнаружи-
вают обработкой такими реагентами, как щелочной
раствор нитрата серебра, анилинфталат, о-толуидин-са-
лицилат, дифениламин—анилин [12]. Последний реа-
гент позволяет обнаруживать наличие 1—4 связей
между моносахаридами [19].
. В последнее время в изучении углеводов широкое
распространение получил метод тонкослойной хрома-
тографии. При этом удобнее использовать силикагель
с различными добавками. Хорошее разделение углево-
дов наблюдается’ в тонком слое силикагеля с гипсом,
нмпрегнированного 0,3 М растворами фосфатов натрия.
Для метилированных сахаров используют систему бен-
зол—ацетон (2:1) и хлороформ—метанол (20:1) [17].
При исследовании углеводного состава простых
гликозидов применяют физические методы, такие, как
масс- и ЯМР-спектроскопия. С этой целью получают
летучие производные: метиловые эфиры, ацетаты, три-
м^тилсилиловые эфиры, трифторацетаты и др.
132
9.2. Количественно,е определение
углеводного состава
При изучении углеводного состава тритерпеновых
гликозидов важно установить не только качественный
состав моносахаридов, но и количество молекул от-
дельных углеводов, поскольку углеводные цепи могут
содержать несколько молекул одного и того же угле-
вода. Для этого методом хроматографии делят, а за-
тем измеряют плотность пятен непосредственно на
хроматограммах. Для обнаружения пятен углеводов
очень важен реагент, основные требования к которому
состоят в том, чтобы все углеводы давали на хромато-
грамме пятна одинаковой окраски, а фон при этом оста-
вался белым. В. Г. Бухаров с сотр. (1970) рекомендуют
использовать двойной реагент перйодата калия и ам-
миачный раствор азотно-кислого серебра/ Кроме того,.
ряд авторов [5, 6] предлагают отбирать отдельные зо-
ны сахаров на хроматограммах и определять оптиче-
скую плотность фотоколориметрически или спектрофо-
тометрически. В последнее, десятилетие наибольшее
распространение в исследовании углеводов получила,
газожидкостная хроматография (ГЖХ) [9].
Метод ГЖХ позволяет одновременно проводить ка-
чественную идентификацию моносахаридов и опреде-
лять их соотношение. Идентификацию моносахаридов
осуществляют по времени удерживания летучих произ-
водных углеводов (ацетатов альдононитрилов), а коли-
чественное определение компонентов проводят, вычис-
•ляя площадь пика [41]. Газожидкостная хроматогра-
фия широко используется при характеристике метили-
рованных сахаров [5, 8].
9.3. Определение последовательности
моносахаридов в углеводных цепях.
Конфигурация гликозидных центров
Метилирование дает возможность установить струк-
туру только простейших гликозидов, поэтому, начиная
с триозидов, исследователь вынужден прибегнуть к до-
полнительным методам, таким, как частичный и фер-
ментативный гидролиз, ацетолиз и т. д. Убедительной
иллюстрацией перечисленных методов может служить
установление строения гликозидов из плодов мыльного
дерева Sapindus mukorosii.
133
С помощью хроматографии на силикагеле было вы-
делено 5 сапонинов, а кислотным гидролизом и пос-
ледующей хроматографией установлено, что в состав
углеводной части сапиндозида А входят арабиноза и
рамноза. Тип связи удалось установить метилирова-
нием. Последовательность моносахаридов в углеводной
цепи гликозида была подтверждена частичным гйдроли-
зом 10% щавелевой кислотой. На основании этих'дан-
ных была установлена полная структура сапиндозида
А и В и др. гликозидов [5].
9.4. Метилирование и перйодатное
окислениегликозидов
Следующей стадией изучения сапонинов является
определение размера окисных циклов моносахаридов,
входящих в их состав, типа связей между отдельными
единицами, а также мест и характера разветвления уг-
леводных цепей. Для решения этих задач используются
метод исчерпывающего метилирования, перйодатное
окисление [30] и распад по Смиту. Наиболее часто для
гликозидов применяется метилирование по Хакомори
[24а], полноту его проверяют с помощью ИК-спектро-
скопии, тонкослойной хроматографии или путем опреде-
ления количества метоксильных групп в полученных со-
единениях. Окончательно вопрос о полноте метилирова-
ния решается при детальном исследовании гидролизата
продукта метилирования, проводимом с помощью бу-
мажной, тонкослойной и газожидкостной хроматогра-
фии, а также масс-спектрометрии.
Идентификация полностью и частично метилирован-
ных моносахаридов легко осуществима при наличии сви-
детелей. Если таковые отсутствуют, приходится прибе-
гать к получению продукта метилирования в препара-
тивных количествах и проводить дополнительные дока-
зательства с помощью различных химических реакций
или масс- и ЯМР-спектроскопии [18]. Результаты ме-
тилирования сапонинов в ряде случаев легко подтвер-
дить, проверить и дополнить данными распада по Сми-
ту. Сахара с различными типами связей дают неодина-
ковые продукты. Расход перйодата и выход муравьиной
кислоты позволяют уточнить полученные сведения.
134
ЛИТЕРАТУРА
1. Анисимов М. М., Чирва В. Я. О биологической роли
тритерпеновых гликозидов. — Успехи соврем, биологии, 1980, т. 90,
вып. 3 (6), с. 351—364.
2. Ахрем А. А., Кузнецова А. И. Тонкослойная-хромато-
графия.— М.: Наука, 1964.— 175 с.
3. рухаров В. Г., Щербак С. П. Гликозид гипсогеновой
Кислоты из Saponaria officinalis. — Изв. АН СССР, сер. хим., 1969,
с. 137.
4. Бухаров В. Г., Щербак С. П., Бещекова А. П. Три-
терпеновые гликозиды Dianthus deltoides. — Химия природ, соедин.,
197 И № 1, с. 33.
5. Д е к а н о с и д з е Г. Е., Чирва В. Я., Стригина Т. В.,
Уварова Н. И. Исследование тритерпеновых гликозидов. — Тби-
лиси: Мецниереба, 1982.-^-151 с.
6. Зайцева Г. Н., Афанасьева Т. П. Количественное
определение углеводов' методом нисходящей хроматографии на бу-
маге.— Биохимия, 1965, т. 22, вып. 6, с. 1035—1042.
7. К о ч б т к о в Н. К., X о р л и н А. Я. Олигосахариды — новый
тип растительных гликозидов.—ДАН СССР, 1963, т. 150, № 6,
с. 1289—1292.
8. КрохмалЮк В. В., К и нт я П. К., Чирва В. Я. Газо-
'жидкостная хроматография моносахаридов тритерпеновых гликози-
дов.— Изв. АН МССР, сер. биол.-хим. наук, 1975, № 1, с. 85—86.
9. Оводрв Ю. С. Газожидкостная хроматография углеводов.—
Владивосток, 1970.
10. Пирожкова Н. М., Краснов Е. А., К и нт я П. К.
.‘Тритерпеновые гликозиды Androsace septentrionalis.— Химия при-
>род. соед., 1980, № 6, с. 846—847.
$ 11. Пирожкова Н. М., Кинтя П. К. Тритерпеновые глико-
1'зиды из Androsace septentrionalis. — Химия природ, соед., 1982,
h № 5, с. 658—659.
: На. Семенченко В. Ф. Материалы к химической характе-
ристике корней солодки щетинистой. — Раст, ресурсы, 1969, т. 5,
с. 394.
12. Хайе И., Мацек К. Хроматография на бумаге. — М.: ИЛ,
1962. — 852 с.
13. Химический анализ лекарственных растений/Под ред.
Н. И. Гринкевич, Л. Н. Сафронич.—М.: Высшая школа, 1983.—
, 175 с.
-1 14. Хор л ин А. Я.,. Бак инов ский Л. В., Васьков-
с к и й В. Е., В е н ь я м и н о в а А. Г., О в о д о в Ю. С. Распреде-
- лительная хроматография тритерпеновых сапонинов. — Изв. АН
!'г СССР, сер. хим., 1963, с. 2008.
(15. Хор л ин А. Я., Чир-ва В. Я., Кочетков Н. К. Тритер-
пеновые сапонины. Сообщение 13. Клематозид С — тритерпеновый
олигозид из корней ломоноса манчжурского (Clematis manshurica
Rupn.).— Изв. АН СССР, сер. хим., 1965, с. 811.
’ 16. Хор л ин А. Я., Иванова В. М. Тритерпеновые сапонины.
Сообщение 16. — Сапонины патринии средней. — Изв. АП СССР,
сер. хим., 1965, № 2, с. 307—313.
17. Хор л ин А. Я., Вень ям инов а А. Г., Кочетков Н. К.
Тритерпеновые сапонины. Сообщение 18. Строение калапанакс-са-
поница В. — Изв. АН СССР, сер. хим., 1966, т. 9, с. 1588.
135
18. Abdel-Akher M., Hamilton J. К., Montgomery R.,
Smith F. A new procedure for the determination of the fine
structure of polysaccharides. — J. Amer. Chem. Soc., 1952, v. 74
p. 4970—4971.
19. Bailey R. W. Colour reactions betwen sugars and dife-
nylaminlurea and diphenylamine-p-anisidine on paper chromato-
grams.— J. of Chromatogr., 1962, v. 8, p. 57—62.
29. Bondi A., Birk J., Gestetner B. Forage Saponins.—
In: Chemistry and Biochemistry of Herbage, 1973, v. I, p. 511.
21. Comean L. C.r Druet D., Braun J. A. Etude des gly-
cosides. les aglycones.—Bull. Soc. chim. France, 1974, v. 26, p. 2643.
22. G 1 о m b i t z a K. W., G i e I s d о r f W., Eckhardt G.,
Koch M. L. Triterpen-Sapogenine aus Fruchten von Phytolacca
acinosa. — Planta med., 1975, Bd. 27, S. 367.
23. Gorski P. M., Jurzysta M. Calcium-Magnesium Salt of
Saponins from Bird’s Foot Trefoil Seeds (Lotus corniculatus Lf).—’
Acta Soc. Botan. Poloniae. 1975, v. 44, p. 51. '
24. Hiller K., Voigt G. Neue Ergebnisse in der Erforschung
der Triterpensaponine. Eine Obersicht.—Die Pharmazie, 1977, Bd 32,
№ 7, S. 365—393.
24a. Hokomori S. A. Rapid permethylation glycolipid and
polysaccharide catalyzed by methylsulfinyl carbanion in dimethyl
sulfoxide.— J. Biochem., 1964, v. 55, p. 205—208.
25. J а с о b s W. A., Isler 0. The Sapogenins of Polygala Se-
nega.— J. Biol. Chemistry, 1937 v. 119, p. 155.
26. Kitagawa I„ Yo.shikawa M., Y oshi ok a I. Saponin
and sapogenol. XIII. Structures of three soybean saponins: sogasa-
ponin I, sogasaponin II and sogasaponin III.— Chem. and Pharm.
Bull., 1976, v. 24, № 1, p. 1'21—129.
27. Kitagawa I., Sugawara T., Yosioka I., Kuri-
yama K. Structure of Stichopogenin A, the Genuine Aglycone of’
Holotoxin A.— Chem. Pharm. Bull., 1976, v. 24, p. 266.
28. Klyne W. The configuration of the anomeric carbori atoms
in some cardiac glycosides.— Biochem. J., 1950, v. 47, p. XLI—XLII.
29. Kubota T., Hinoh H. Isolation of Genuine Sapogenins:
Saikogenins E, F and G.— Tetrahedron, 1968, v. 24, p. 645.
30. Kuhn R., Trischman H. Permethylierung von Inosit
und andere Kohlenhydraten mit Dimethylsulfat.— Chem. Ber., 1963,
Bd 96, S. 254—297.
31. Kulshreshta J. AL, Rastogi R. P. Chemical Consti-
tuents Zizyphus Rugosa Lam.—Indian J. Chem., 1972, v. 10, p. 152.
32. N a r a n у a n a n V., S e s h a r i R., S e s h a d r i T. R. Acerg-
nin from the Heartwood of Acer Caesium.— Curr, Sci (India), 1973,
v. 42, p, 642.
33. Pas i ch P. Zwiazki trojterpenowe a materiale roslynum. —
Dissertat. Pharmac. 1959, v. 11, p. L
34. Segelman A. B., Farnsworth N. R. A New Rapid
Procedure for the Simultaneons Determination of Saponins and Tan-
nins.— Gloydia, 1969, v. 32, p. 59.
35. Shibata S„ Tanaka O.,. Nagai N., Ishii T. Stu-
dies on the Panaxadiol, a Sapogenin-of Ginseng Roots.— Chem.
Pharm. Bull., 1963, v. 11, p. 762.
36. T a d a s h i A., Y u mi к о T.,‘ T а к а у u к i S. Triterpenoid
Saponins from Fatsia japonica.— Phytochemistry, 1976, v. 15,
p. 781.
136 . '
' 37. Tschesche R., Forstmann D. Uber Triperpene. IV.
Musannirj, ein wurmwirksames Saponin aus der Rinde von Albizzia
anthelmintica.— Chem. Ber., 1957, Bd 90, S. 2383.
38. Tschesche R., Kammerer F.-J. Die Struktur von
Musennin und desglucomusennin.— Liebigs. Ann. Chem., 1969,
Bd 724, S. 183.
39. Tschesche R., Wulff G. Chemie und Biologie der Sa-
ponine. — In: Fortsch. Chem. Organ. Naturstoffe, 1973, Bd 30,
S. 461—606.
40. Tschesche R., Schuze H. Uber das Hauptsaponinder
Kornrade (Agrostemma githago L.).—Chem. Ber., 1974, Bd 107,
S. 2710.
41 Varma R;, Varma R. S., W a r d i A. H. Separation of
aldononitrile acetates of neutral sugars by gas-liguid chromato-
graphy and its application to polysaccharides.— J. Chromatogr., 1973,
v. 77, p. 222—227.
42. Varshney I. P., Pal R., Vyas P. Studies on lebbe-
kanin E, a new saponin from Albizzia lebbek Benth.— J. Indian
Chem. Soc., 1976, v. 53, № 8, p. 859—860.
43. Wo it ke H.-D., Kayser J.-P., Hiller K. Fortschritte
In der Erforschung der Triterpensaponine.— Pharmazie, 1970, Bd 25,
S. 133.
44. Yah ar a S., Tanaka O., Komori T. Saponins of the
Leaves of Panax Ginseng C. A. Meyer.— Chem. Pharm. Bull.,
1976, v. 24, p. 2204.
45. Yosioka I., Matsuda A., Kitagawa I. The Sa-
ponin Constituent of the Seeds of Camelia Sasungua Thunb.— Chem.
Pharm. Bull., 1967, v. 15, p.__547.
46. Jurzysta M., Gorski P. Sapohina krystaliezna Z nasion
komonicy Rozkowej (Lotus corniculatus L.).— XI Zjazd P. T. Bioch.
Bialistok., 1973, p. 81.
Глава 8
ФЛАВОНОИДЫ
1. Общая характеристика
Флавоноиды являются наиболее обширной группой
фенольных соединений и важной составной частью рас*
тительного организма. Они принимают активное участие
в окислительно-восстановительных процессах, выработ-
ке иммунитета, защите растений от неблагоприятных
воздействий ультрафиолетовых лучей и низких темпе-
ратур. Некоторые из них, взаимодействуя с аскорбато-
ксидазой, защищают аскорбиновую кислоту от окисле-
ния. Большинство флавоноидов оказывают на организм
человека и животных капилляроукрепляющее действие
и снижают проницаемость гематопаренхиматозных барь-
еров [2, 25]. Это действие лежит в основе фармаколо-
гического, профилактического и лечебных эффектов
этих соединений (противовоспалительное, противолуче-
вое, сенсибилизирующее, противоопухолевое действие
и т. д.).
2. Распространение в растительном мире
Флавоноиды присущи в основном высшим растениям,
однако встречаются также в водорослях, грибах и в
наиболее примитивной группе высших зародышевых
растений — мохообразных. Представители большинства
классов флавоноидов встречаются у папоротникообраз-
ных и голосеменных растений, а наиболее часто—у по-
крытосеменных. Дж. Харборн с сотруд. [33] исследова-
ли более 1000 видов и почти в 3/4 из них обнаружили
флавоноиды. При обследовании флоры ФРГ [36] вы-
яснилось, что большую часть видов можно отнести к
флавоноидоносным. К аналогичному выводу пришли оте-
чественные ученые при обследовании свыше 4000 видов.
Распространенность отдельных флавоноидов среди
высших растений неодинакова. Наиболее часто встреча-
138
ются гликозиды кверцетина, кемпферола и изорамнети*
на. Наличие флавоноидов в растении является таксоно-
мическим признаком, так как с помощью флавоноидных
соединений успешно определяют не только видовую са-
мостоятельность, но решают вопросы систематики внут-
ривидового характера. Использование полифенолов в хе-
’ мотаксономии -облегчает сравнительно высокая стабиль-
. ность некоторых классов, например, флавонов и флаво-
нолов. Кроме .того, эти вещества стабильны и при мно-
голетнем хранении гербария, что расширяет возможно-
сти использования растительного материала для хемо-
систематики.
3. Локализация в растениях
В ходе химического скрининга и изучения феноль-
^ных компонентов флавоноиды обнаружены в различных
> частях и органах растений. При этом их концентрация
часто варьирует в зависимости от ряда факторов: орга-
на растения, времени и места его сбора. Так, неодина-
ковую концентрацию флавонолов в органах растения
наблюдали у разных видов щавеля (обыкновенного и
пирамидального): максимальное содержание — в репро-
дуктивных органах (у щавеля обыкновенного 88,13, ща-
веля пирамидального 47,50 мг/г), меньшее — в листьях
(11,68 и 13,25 мг/г) и минимальное — в стеблях (4,85 и
2,31 мг/г) [19].
4. Классификация
В молекулах флавоноидов имеется два бензольных
ядра, соединенных трехуглеродным фрагментом, следо-
. вательно, флавоноиды являются производными дифе-
нилпропана. Посредством пропанового мостика в моле-
кулах большинства флавоноидов образуется гетероцикл,
являющийся производным пирана или у-пирона:
139
Перечислим основные подгруппы флавоноидных сое-
динений:
Флавоноиды существуют в природе преимуществен-
но в виде гликозидов путем соединения с молекулами
углеводов, чаще всего с глюкозой, арабинозой, ксило-
зой. Считают, что гликозилирование существенно важно
для жизнедеятельности растений. У флавонолов присое-
динение сахаров происходит обычно по месту располо-
жения гидроксилов в положении 3 или 7, значительно
реже—при С' или С3. Возникающая связь во всех слу-
чаях замыкается через атом кислорода. Этот класс сое-
динений носит название О-гликозидов.
катехины
лей ко а нтоци а ни дины
дигидрохалконы
халконы
Антоцианы, флаваноны, халконы, ауроны также об-
разуют О-гликозиды. Все О-гликозиды подвергаются
кислотному и ферментативному гидролизу, но есть груп-
па фенольных гликозидов, не поддающихся гидролизу
в обычных условиях. Моносахарид в этих соединениях
присоединен к молекуле фенола не через атом кислоро-
да, а непосредственно — это С-гликозиды, которые
встречаются гораздо реже, чем О-гликозиды [18, 26].
Иногда в молекуле природных флавоноидных глико-
зидов (кроме агликона и углеводного компонента) име-
140
ются остатки ароматических кислот: кофейной, феруло-
вой, коричной, хлорогеновой и др., которые, как прави-
ло, присоединены к углеводной части молекулы флаво-
ноидов [31].
антоцианидины
флаваноны
флаванонолы
ауроны
флавоны
флавонолы
5. Физико-химические свойства
Предварительную информацию об основных струк-
турных элементах флавоноидных соединений можно по-
лучить, используя химические методы исследования.
Флавоноиды обнаруживаются по качественным реакци-
141
ям, которые позволяют отнести исследуемые соединения
к определенному классу.
Характерной качественной реакцией на флавоноиды
является цианидиновая проба, проводимая с помощью
концентрированной соляной кислоты и металлического
магния [5]. Действие водорода в момент выделения
приводит к восстановлению карбонильной группы и об-
разованию насыщенного пиранового цикла, который под
действием концентрированной соляной кислоты превра-
щается в оксониевое соединение, имеющее окраску от
оранжевой до красно-фиолетовой.
Изменение условий восстановления путем замены
магния на цинк приводит к изменениям в окраске. При
использовании цинка положительную реакцию дают
флавонолы и флавонол-3-гликозиды, а флаваноны не
обнаруживают ее [47].
При модификации цианидиновой пробы по Брианту
предварительно можно определить гликозидную или
агликоновую природу исследуемого соединения. Это до-
стигается путем разбавления реакционной смеси водой
и извлечения октиловым спиртом. При этом пигменты,
образующиеся из агликонов, переходят в органическую
фазу, а окрашенный гидрофильный продукт реакции
гликозидов остается в воде [28]. В зависимости от ко-
личества и положения оксигрупп флаваноны, флавано-
нолы и флавонолы могут давать красную, розовую, фи-
олетовую и синюю окраску. Цианидиновую реакцию не
обнаруживают халконы, ауроны и изофлавоны.
Отношение флавоноидов к щелочам
Характерной реакцией на флавоноиды является их
взаимодействие со щелочами. Она проводится для оп-
ределения основного структурного типа флавоноидов,
которые очень чувствительны к действию щелочей, и
142
ориентации гидроксильных групп. Флавоны и флавоно-
лы растворяются в щелочах с образованием желтой
окраски, последние в разбавленных щелочах бесцветные
или слабо-желтые, но, легко изомеризуясь в халконы,
. приобретают ярко-желтую или красную1 окраску [5].
Изменение цвета в щелочных буферных растворах дает
указание на число и положение гидроксильных групп
флавонов.
Реакция с минеральными кислотами [30]
При действии на флавоны и флавонолы минераль-
ных кислот образуются интенсивно-желтые соли оксо-
ния, а флаваноны дают соли халконов, окрашенные от
ярко-оранжевого до малинового цветов.
Отношение флавоноидов к солям
тяжелых металлов
Флавоноиды со средним и основным ацетатом свин-
ца образуют окрашенные соли или комплексы. Этой
реакцией обнаруживаются соединения, содержащие
о-диоксигруппировку или сочетающие ортооксикарбонил
с о-диоксигруппировкой. Флавоны, халконы, ауроны, со-
; держащие свободную ортогидроксильную группу в коль-
; це В, при обработке их ацетатом свинца окрашиваются
в ярко-желтый цвет [5].
Флавоноидные соединения, содержащие эти группи-
ровки, образуют ярко окрашенные комплексы с ионами
таких металлов, как алюминий, цирконий, причем эти
комплексы часто имеют яркую флюоресценцию в УФ-
свете, что используется при исследовании флавоноид-
ных соединений методом хроматографии на бумаге и в
Тонком слое.
Дальнейшие сведения можно получить, опрыскивая
хроматограмму лимонной кислотой. Циркониевый цик-
лический комплекс с участием 3-го и 4-го атомов угле-
рода более прочен, чем комплекс с участием 4-го и 5-го
атомов. Если гидроксильная группа, в положении 3 гли-
козидирована, флюоресценция с хлористым цирконилом
после гидролиза обнаруживается непосредственно на
бумаге [35]:
143
V^QR
OH 0 J О J
XZr'
Проба с треххлористой сурьмой
Флавоноидные соединения с треххлрристой сурьмой
образуют специфические окраски. Халконы с раствором
треххлористой сурьмы в четыреххлористом углероде
окрашиваются в красный, или красно-фиолетовый цвет,
флавоны — в желтый или желто-оранжевый.
Реакция с реактивом Вильсона
(борная и лимонная кислоты,
растворенные в безводном ацетоне)
С реактивом Вильсона флавоны и флавонолы обра-
зуют желтую окраску с красноватой флюоресценцией
в УФ-свете [36, 50]. Таубеком [42] при замене лимон-
ной кислоты на щавелевую отмечена в УФ-свете зеле-
ная или желтая флюоресценция. Избирательность ре-
акции Вильсона—Таубека, характерная для о-оксикар-
бонильной группы, заключается в том, что хелатные
комплексы по 3-й и 5-й гидроксильным группам и кар-
бонильной группе в 4-м положении обладают различ-
ной устойчивостью по отношению к ряду органических
кислот (лимонной, щавелевой) и др. Лимонная кислота
вступает в конкурентную реакцию хелатообразования
с хлористым цирконилом и .образует более прочный не-
окрашенный хелат, чем 5-оксифлавоноиды. В 3,5-диок-
сифлавоноидах происходит разрушение 6-членного ком-
плекса при сохранении 5-членного по 3-оксихромоновой
группировке. Этой реакцией достаточно убедительно
определяется гидроксильная группа во флавонолах при
С3[36, 37].
Определение ОН- групп
Госсипетиновая проба [46]. При прибавле-
. нии к раствору флавоноидов в абсолютном спирте ра-
144
створа п-бензохинона в случае наличия гидроксильных
групп в положении С5 и Се наступает немедленное ок-
рашивание жидкости в малиново-красный цвет.
Реакция схлоридом железа (III) [5]. При
взаимодействии флавоноидов с хлоридом железа (III)
5-оксифлавоны образуют комплексы, окрашенные в зе-
леный цвет, халконы, флавонолы и флаванонолы обра-
зуют комплексы, окрашенные в коричневый цвет. Недо-
статком этой реакции является малая специфич-
ность [29].
ОН-групца, находящаяся в пара-положении по от-
ношению к карбонильной группе, из-за значительной
подвижности водорода, приводящего к его протонеза-
ции, обладает повышенной кислотностью. Вследствие
этого свободная 7-оксигруппа обнаруживается в водном
растворе карбоната и бикарбоната натрия.
Флавоны вступают в реакцию с солями диазония,
образуя оранжевые или красные продукты азосочета-
ния. Реакция сочетания происходит по о- и п-положе-
ниям у Сб- и Сз-молекуЛы флавонола. Если С5- и Ст-
атомы флавонового гликозида оказываются замещен-
ными, то реакцию с солями диазония следует проводить
после предварительного гидролиза гликозида [37].
С флавонолами реакция протекает быстро,' с флавано-
нами— со средней скоростью, с флавонами — медлен-
но [42].
Реакции на карбонильную группу являются общими
для карбонилосодержащих соединений (образование
фенилгидразонов, оксимов, семикарбазонов), однако
они не имеют аналитического значения. Качественные
реакции в настоящее время применяют в сочетании
с хроматографией на бумаге. Флавоноиды подходят для
хроматографического анализа благодаря характерным
окраскам самих веществ в видимом и фильтрованном
ультрафиолетовом свете до и после проявления различ-
ными хромогенными реагентами. По значению Rf, ок-
раске пятен в видимом и ультрафиолетовом свете до
и после обработки аммиаком или спиртовым раствором
алюминия хлористого можно установить наличие фла-
воноидов в исследуемом объекте и даже сделать пред-
варительные выводы о структуре этих веществ. На ос-
новании анализа литературных данных В. А. Бандюко-
ва [1] предложила ряд реактивов для проявления пя-
тен флавоноидов на бумажной хроматограмме. Это по-
5**. . 145
зволяет ориентировочно установить тип флавоноида и
положение заместителей в ядре флавона. Наиболее
часто применяемыми реактивами являются пары амми-
ака, 10% раствор щелочи, 5% раствор хлорида алюми-
ния и др.
6. Количественное определение
Для определения количественного содержания фла-
воноидов используют различные методы: химические,
физические, физико-химические. Наличие фенольных
гидроксилов, обусловливающих слабокислотные свойст-
ва флавоноидов, позволяет для анализа последних ис-
пользовать метод кислотно-основного титрования в не-
водных растворителях [6]. Однако указанным методом
невозможно с достаточной точностью определять со.-
держание полифенолов в растительном сырье.
Флавоноиды обладают значительной интенсивностью
поглощения в УФ-области спектра, обнаруживая макси-
мумы, относящиеся к первой и второй полосе. Эти свой-
ства были использованы для разработки спектрофото-
метрических методов определения флавоноидов [8, 14,
21].
Среди фотометрических методов анализа флавонои-
дов различают методы, основанные на реакциях ком-
плексообразования, восстановления в кислотной среде,
диазосочетания и др.
Флавоноиды могут образовывать с различными ка-
тионами металлов (алюминия, циркония, сурьмы, хро-
ма и др.), а также с борной кислотой, растворимые ок-
рашенные комплексы; при реакции с хлористым алюми-
нием они окрашиваются в желтый цвет или дают жел-
то-зеленую флюоресценцию, а это качество использует-
ся для их фотометрического определения [4]. Указан-
ный метод дает стабильные результаты, однако он не
обладает специфичностью и требует предварительного
разделения флавоноидов.
Методика определения флавоноидов по реакции вос-
становления в кислой среде или с боргидридом калия
не лишена недостатков: восстановление протекает не
количественно, а зависит от точности соблюдения вре-
менных интервалов при измерении. Методики, основан-
ные на образовании соединений с солями диазония, об-
ладают большой чувствительностью, однако мало спе-
146
цифичны и требуют также предварительного разделе-
ния.
Существуют и другие методы количественного опре-
деления флавоноидов, основанные на реакции нитрози-
рования [10], на реакциях взаимодействия со щелочью,
с 4-аминоантипирином [9], флюорометрический, поля-
рографический методы, метод комплексонометрического
определения кверцетина [3].
Наиболее точным, приемлемым методом количест-
венного определения флавоноидов, является хромато-
спектрофотометрический, основанный на разделении
этих веществ хроматографией на бумаге с последую-
щим установлением их содержания в элюатах [7, 12,
19].
Методика определения. Около 2 г (т. м.)
подземных органов заливали 20 мл 96% этанола и ис-
черпывающе экстрагировали при нагревании на кипя-
щей водяной бане по 15 мин. Сгущенные спиртовые эк-
стракты наносили на бумагу марки FN-4 в количестве
от 0,02 до 0,1 мл, хроматограммы развивали в системе
60% уксусной кислоты в течение 30—35 ч и затем про-
являли 10% спиртовым раствором хлористого алюми-
ния. Пятна флавоноидов отмечали, вырезали, измель-
чали и элюировали спиртом при двухчасовом настаи-
вании, а затем нагревали на кипящей водяной бане с
обратным холодильником в течение 30 мин. Получен-
ный элюат доводили спиртом до объема 5 мл и изме-
ряли оптическую ПЛОТНОСТЬ При Хщах = 433 нм.
Содержание флавоноидов (X) в исследуемом мате-
риале высчитывали по формуле
X --
Л — — м г / г,
п-В3. 1000
где С —количество флавонолов в 1 мл элюата, найден-
ное по калибровочному графику, мкг; Bi — объем, в ко-
тором растворены флавонолы всей навески, мл; В%—
объем элюата, мл; Вз— объем нанесенного экстракта,
. мл;п— навеска исследуемого растительного материа-
ла, г; 1000 — пересчетный коэффициент.
При составлении калибровочного графика 5 мг чис-
того вещества (отвечающего требованиям для стандарт-
ных образцов) растворили в 10 мл этилового спирта и
раствор нанесли на бумагу в количестве 2,5; 5; 7; 10;
12 мкг в расчете на 1 мл элюата. В указанных концент-
147
рациях анализируемых растворов соблюдается подчи-
нение закону Бугера-Ламберта-Бера.
7. Методй» выделения и разделения флавоноидов
Для предварительного суждения о содержании в ис-
следуемых видах флавоноидов широко используют ме-
тод хроматографии на бумаге с применением цветных
реакций. Для этого 2—30 г воздушно-сухих частей ра-
стения обрабатывается этанолом или метанолом с на-
стаиванием в течение суток или извлечением в аппара-
те Сокслета, или 30-минутиым кипячением с обратным
холодильником. Спиртовые извлечения непосредствен-
но подвергаются хроматографированию на бумаге или
очищаются от липофильных веществ. Для этого спирт
упаривается досуха, остаток растворяется в воде, филь-
труется, фильтрат обрабатывается хлороформом для
удаления липофильных веществ, после чего исследова-
ние проводят методом одномерной или двумерной хро-
матографии. Для этого на бумагу наносится несколько
проб анализируемой жидкости и растворов флавонои-
дов «свидетелей» (расстояние между-точками нанесе-
ния 1,5 см, время хроматографирования — до 20 ч).
Предварительно подбираются наиболее подходящие си-
стемы растворителей, например: н-бутанол-уксусная ки-
слота— вода (4:1:5), 15%; 60% растворы уксусной
кислоты. Затем хроматограммы высушиваются при ком-
натной температуре и просматриваются в фильтрован-
ном ультрафиолетовом свете до и после опрыскивания
реактивами, при этом отмечают контуры пятен, их флю-
оресценцию и определяют величину 7?/.
При двумерной хроматографии исследуемый раствор
наносят на бумагу на расстоянии 2 см от края и хро-
матографируют в одном направлении, после этого хро-
матограмму высушивают и процесс проводят в другом
направлении в этой же или чаще в другой системе ра-
створителей.
С помощью бумажной хроматографии по значениям
R/ можно предварительно установить, является ли фла-
воноид гликозидом или агликоном. В водных системах,
например СН3СООН, различной концентрации гликози-
ды передвигаются быстрее, чем агликоны. С увеличе-
нием числа гидроксильных групп у гликозидов умень-
шается подвижность в спиртовых системах и увеличи-
вается в водных.
148
Выделение фенольных соединений имеет много об-
щего и зависит от таких факторов, как вид сырья
(листья, корни, и т. д.), растворимость' основных биоло-
гически активных соединений, их лабильность и харак-
тер сопутствующих веществ. Наиболее употребитель-
ным способом выделения веществ является извлечение
их из растительного материала подходящим раствори-
телем. Большинство фенольных гликозидов растворимо
в воде, низших спиртах, ацетоне, этилацетате, аглико-
ны растворяются в диэтиловом эфире. Для удаления
основной массы сопутствующих веществ (хлорофилла,
липидов, терпеноидов) растительный материал обраба-
тывают петролейным эфиром, бензолом, гексаном или
хлороформом. Экстракцию растворителем проводят как
при нагревании, так и при комнатной температуре. В ре-
зультате такого фракционирования из растительного ма-
териала получают сумму фенольных соединений. Для
разделения суммы растительных фенольных соедине-
ний и контроля за изолированием применяют различные
хроматографические методы на колонках, на бумаге,
в тонком слое сорбентов, а в последние годы — высоко-
эффективную жидкостную хроматографию. В качестве
сорбентов для колоночной хроматографии фенольных
соединений используют магнезол, силикагель, кремне-
вую кислоту, порошок целлюлозы, сефадекс, но чаще
всего — полиамидный сорбент [17, 24]. Магнезол и си-
ликагель имеют малую сорбционную емкость и обра-
зуют комплексы. Что касается порошка целлюлозы, то
он может быть применен для разделения всех типов
фенольных соединений в тех же системах, что и при
хроматографировании на бумаге, но обладает также
малой сорбционной емкостью.
Полиамид — наиболее удобный сорбент для разде-
ления флавоноидов, обладающий значительными пре-
имуществами: большой сорбционной емкостью, высокой
разделительной способностью и химической инерт-
ностью. Установлен ряд закономерностей при хромато-
графии различных по строению природных флавонои-
дов на полиамидных сорбентах:
1) сорбция на полиамиде зависит от метода приго-
товления сорбента, его пористости, от концентрации и
природы разделяемых соединений и т. д.;
2) агликоны сорбируются на полиамиде более проч-
но, нежели их гликозиды [38];
149
3) сорбция агликонов обусловливается как числом,
так и расположением гидроксильных групп. При этом
выяснено, что основную роль в сорбции на полиамиде
играют пространственно-свободные 7- и 4'-гидроксилы.
Гидроксильная группа в 3-м положении является по
своему характеру енольной, поэтому обладает меньшей
сорбционной способностью, чем фенольная [24].
Для селективности разделения полиамид активиру-
ют обработкой растворами кислот и щелочей: для’луч-
шего разделения водорастворимых гликозидов, имею-
щих одинаковые агликоны, применяют 1% раствор хло-
ристоводородной кислоты, а сорбент, обработанный 1 %
раствором гидроксида натрия, оказался особенно по-
лезным для разделения агликонов [23].
Хроматографии на бумаге и в тонком слое широко
применяются как методы контроля и для препаративно-
го разделения фенолгликозидов и полифенолов. Извест-
но значительное количество систем растворителей, упот-
ребляемых для хроматографии фенольных и полифе-
нольных соединений на бумаге. Наиболее пригодными
для флавоноидов являются 2, 15 и 60% растворы ук-
сусной кислоты и БУВ 4:1:5, 4:1:2.
При хроматографировании на колонках полиамида
применяют обычно воду для удаления нефенольных сое-
динений, а для э'люации полифенолов—органические
растворители, чаще всего возрастающие концентрации
этанола [48], а также системы, состоящие из хлорофор-
ма и этанола с увеличивающимся градиентом последне-
го.
8. Идентификация и установление строения
8.1. Химические методы
Качественные реакции в сочетании с хроматографией
на бумаге и в тонком слое дают предварительные све-
дения о наличии фенолгликозидов и флавоноидов, а
кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз —
ценную информацию о структуре фенольных гликози-
дов [32].
Кислотный гидролиз проводят в различных
условиях, что позволяет, варьируя концентрацию кисло-
ты, температуру и среду, проводить ступенчатое отщеп-
ление сахаро? в зависимости от их положения в. моле-
150
"куле и других структурных особенностей. 3-гликозиды
.легко отличить по скорости отщёпления от 7,^-глико-
зидов, которые значительно менее гидролизуются в
^одинаковых условиях [18].
В зависимости от строения гликозида гидролиз про-
водят в мягких или жестких условиях. В основу метода
’положены различия в скорости гидролиза гликозидов в
• зависимости от положения сахара, связи сахарного ос-
татка с агликоном и между монозидами.
• При проведении гидролиза в мягких условиях веще-
\ ство нагревают в 1 % растворе серной кислоты или 10%
растворе уксусной кислоты. Большинство О-гликозидов
. подвергают гидролизу путем кипячения их в 3—5% ра-
створе серной плп соляной кислоты на водяной или воз-
душной бане. Время гидролиза зависит от места присое-
’ динения углеводного компонента и природы сахара. Как
правило, трудно гидролизуются 7-0-гликозиды, в том
числе 7-0-глюкурониды, легче всего 3-0-рамнозиды, 3-0-
галактозйды. С-гликозиды в этих условиях гидролизу не
' подвергаются, углеводный компонент у них отщепляют
путем кипячения в смеси Килиани (смесь концентриро-
ванных хлористо-водородной и уксусной кислот). Уста-
новлено, что способ определения пиранозной формы мо-
носахаридных остатков основан на трудности гидролиза
с помощью разбавленных минеральных кислот. Фурано-
зы отщепляются при нагревании с 0,05 н. раствором сер-
ной кислоты, а гликозиды, содержащие пиранозиды, не
обнаруживают существенного гидролиза [39]. Количе-
ственный кислотный гидролиз не устанавливает содер-
жание сахарных остатков.
Ферментативный гидролиз
Для определения природы гликозидной связи глико-
зиды подвергаются ферментативному гидролизу при по-
мощи ферментов гликозидаз. К ферментным препаратам
относятся гидролазы грибов Aspergillus oryzae u A. ni-
ger (р-глюкозидаза), сладкого миндаля Amygdalus com-
munis f. dulcis (эмульсин) и пищеварительного сока ви-
ноградной улитки Helik plectotropis. Эмульсин содер-
жит р-глюкозидазу,’ р-галактозидазу, а-галактозидазу,
а-маннозидазу и p-глюкуронидазу. Для того, чтобы гли-
козид гидролизовался под действием этого, фермента,
необходимы p-конфигурация гликозидных связей и соот-
ветствующая глюкозе стереохимия гидроксильных групп
151
У С2, С3 и С4 остатка моносахарида, т. е. гидролизу под-
вергаются лишь p-D-глюкопиранозиды и с меньшей
скоростью p-D-ксилопиранозиды.
Щелочное расщепление
В результате взаимодействия флавоноида со щело-
чью идет расщепление в ядре флавоноида [22]. Иден-
тифицируя оставшиеся осколки, можно сделать соответ-
ствующее заключение о структуре первоначально имев-
шегося агликона. Установлено, что в слабощелочной
среде устойчивы 3-гликозиды и биозиды, имеющие 1-й—
2-й порядок связи между сахарами.
Получение производных
Для идентификации и характеристики фенольных
соединений определенное значение' имеет получение раз-
личных производных по фенольным ОН-группам: мети-
ловых эфиров, ацетатов и бензоатов.
Ацетилирование флавоноидных соединений позволя-
ет идентифицировать полученные производные по тем-
пературе плавления и определить наличие замещения
по данным УФ- и ЯМР-спектров. Флавоноиды легко
ацетилируются уксусным ангидридом в присутствии све-
жеплавленного ацетата натрия, пиридина, концентриро-
ванной серной кислоты и ангидрона.
Метилирование используют для получения производ-
ных с четкими температурами плавления, защиты ок-
сигрупп от окисления при проведении синтезор и для оп-
ределения места присоединения углеводного компонента.
Метилирование флавоноидов чаще всего проводят при
помощи ди мети л сульфата в среде ацетона в присутст-
вии карбоната калия, реже—йодистым метилом.
8.2. Физико-химические методы
УФ-спектроскопия
Для изучения строения органических молекул наря-
ду с различными химическими и физическими методами
широко применяются электронные спектры поглощения.
Флавоноиды в УФ-облаети дают, две интенсивные поло-
сы поглощения при 320—380 нм (I полоса) и при 240—
270 нм (П полоса). Исследование УФ-спектров флаво-
ноидов показало, что различные типы фенольных сое-
152
динений отличаются друг от друга по спектрам погло-
щения (табл. 2). . * .
Таблица 2
УФ-спектральная характеристика основных типов
флавоноидов.
Тип Полоса по> глощения Основные максимумы, нм Дополни- тельные максимумы нм
Изофлавоны II 255—265 310-330
Флаваноны II 275—290 310—330
Флавоны ~ II 250—270
I 310—350
Флавонолы II 250—270 300
I 350—390
Халконы I 365—390 '• 240—280
Ауроны I 390-430 240—270
Антоцианидины I 475—560 270—280
Для выяснения -структуры флавоноидов используют
снятие У.Ф-спектров в присутствии различных реагентов,
оказывающих влияние на хромофорную систему. Такие
реагенты, как хлорид алюминия, этилат натрия, мети-
лат натрия, безводный ацетат натрия, борная кислота,
хлористый цирконил вызывают сдвиг максимума в со-
ответствии с расположением различных функциональных
групп в молекуле флавоноида.
О присутствии гидроксильной группы в положении 7
можно судить по батохромному сдвигу I полосы погло-
м щения при добавлении свежеплавленного ацетата нат-
рия к спиртовому раствору флавоноида. К'оротковолно-
вый максимум почти не смещается [15]. В основе от-
крытия свободного гидроксила в этом положении лежит
то обстоятельство, что все фенольные группы диссоции-
руют в растворе метилата натрия, в то время как в
спиртовом растворе ацетата натрия диссоциируют лишь
сильнокислые фенольные гидроксилы [15, 41].
Оксигруппа при С]4 флавонов и флавонолов обнару-
живается по батохромному сдвигу максимума поглоще-
ния I полосы на 50—60 нм под влиянием, этилата нат-
рия или щелочей. Если при этом в положении С3 нахо-
153
дится свободная оксигруппа, то вместо батохро'мии на-
блюдается гипсохромный сдвиг, что обусловлено окис-
лением и разрушением в щелочной среде 4'-оксифлаво-
нолов [32].
Для определения орто-диоксигруппировок в боковом
фенильном радикале прибавл*яют насыщенный раствор
борной кислоты в безводном этаноле или метаноле и
безводный ацетат натрия. Батохромный сдвиг максиму-
мов поглощения свидетельствует о наличии свободной
диоксигруппировки в боковом фенильном радикале. По
этим группам с борной кислотой образуется комплекс,
который при ионизации ацетатом натрия продуцирует
батохромный сдвиг I полосы на 25 нм [40].
Для обнаружения свободных оксигрупп у Сз и С5
флавонолов, С5 во флавонах и изофлавонах использу-
ются реакции комплексообразования с хлоридом алю-
миния или солями циркония, при этом образуются пяти-
и шестичленные комплексы. При наличии Cs-окси-
группы во флавонах, флаванонах и изофлавонах отме-
чается батохромный сдвиг максимума I полосы на 25—
45 нм. Если в присутствии лимонной кислоты батохром-
ный сдвиг уничтожается, то это явление обусловлено
5-оксигруппой во флавонах, флаванонах и изофлавонах.
Флавонолы с незамещенной оксигруппой в положении
С3 дают такой же батохромный сдвиг с хлористым цир-
конилом, но он устойчив к лимонной кислоте. Флавоны
с незамещенными Сз-Сб-оксигруппами дают с хлори-
стым цирконилом удвоенный батохромный сдвиг I поло-
сы, достигающий 100 нм и более [18].
При добавлении лимонной кислоты величина сдвига
уменьшается вдвое вследствие разрушения комплексо-
образования у оксигруппы в положении С5. Оксигруппа
при С3 во флавонолах дает.батохромию на 69 нм, а при
С5—40 нм.
И К-спектроскопия
Анализ инфракрасных спектров широко использует-
ся для установления и подтверждения предполагаемого
строения. С помощью ИК-спектров можно установить
наличие любой функциональной группы. Если спектры
двух образцов веществ одинаковые, можно предпола-
гать, что эти соединения являются идентичными. По
спектрам можно различать изомеры, ИК-спектроскопия
154
позволяет решить вопрос р конфигурации или конформа-
ции молекул.
*=- Соединения ароматического ряда дают большое чи-
сло характеристических полос, по которым удобно про-
водить анализ этих соединений с помощью ИК-спектров.
Заместители водорода бензольного кольца изменяют
спектр в определенных областях. Колебания групп обус-
ловливают, как правило, появление полос поглощения
выше 1500 см-1. В ИК-спектрах флавоноидов незаме-
щенная карбонильная группа флаванона поглощает при
1690 см-1. Наличие в положении С7 гидроксильной груп-
. пы понижает частоту валентных колебаний этой группы
на 15—10 см-1. Образованием водородной связи между
группами С=О и ОН в положении Cs объясняется сни-
жение значения частоты С = О до 1640 см-1. Валентные
колебания С=О группы флавонолов находятся в обла-
сти 1637—1650 см-1 [13]. В виде нескольких интенсив-
ных полос поглощения в области 1600—1470 см-1 прояв-
ляются валентные колебания двойных связей. Валент-
^.ные колебания СН-группы ароматических колец с двой-
. ной связью, сопряженной с С=О, проявляются в обла-
сти 3130—3110 см-1.
Свободные алифатические группы ОН поглощают в
^ интервале 3625—3600 см-1. Валентные колебания фе-
нольной ОН-группы проявляются вблизи нижней грани-
цы этого интервала вследствие образования впутримо-
лекулярной связи. В фенольных гликозидах гидроксиль-
ные группы проявляются в более низких частотах волн
—3600—3200 см-1 (вследствие образования межмоле-
?; кулярных водородных связей) и 3200—2500 см-1 (внут-
, римолекулярные водородные связи). ОН-группы угле-
водных заместителей проявляются в области 3600 —
. 3300 см-1, а фенольные гидроксилы агликона опреде-
ляются по поглощению в области 3300—2700 см-1
(оказывает влияние бензольное колйцо).
По данным ИК-спектров можно различать а- и р-
аномеры моносахаридов и их производных, так как для
a-конфигурации связи С—О характерна полоса 844 ±
8 см-1 [20], для р-конфигурации — полоса 891 ±7 см-1.
Область отпечатков пальцев (1400—650 см-1), бла-
годаря специфическому поглощению, служит, в основ-
ном, для целей идентификации соединений. Эта часть
спектра трудно поддается расшифровке и чаще всего
используется для установления подлинности путем эм-
155
лирического сравнения ИК-спектров исследуемого и из-
вестного соединений.
В области 1000—1100 см-1 отмечен ряд полос, ха-
рактеризующих сахарный компонент. Для пиранозидов
характерно наличие в ИК-спектре трех полос поглоще-
ния, принадлежащих колебаниям кольца и валентным
колебаниям С=О [18]. В фуранозидах в этой области
обнаруживаются только две полосы поглощения.
Поляриметрия
Во флавоноидных гликозидах определение а- и ^-ано-
меров фуранозных форм сахаров методом ИК-спектро-
скопии затруднено, так как фуранозный цикл имеет ме-
нее выраженное различие в конформациях. Вследствие
этого одним из методов, применяемых для изучения
строения гликозидов, является поляриметрический.
В основу этого метода положены сравнение молеку-
лярных вращений и метод их разностей [13]. Представ-
ление о характере гликозидной связи между сахаром и
агликоном и величине окисного цикла в сахарах скла-
дывается из данных по кислотному и ферментативному
гидролизу, а также по результатам ПК-спектроскопии и
поляриметрии. Конфигурацию связи как между сахаром
и агликоном, так и между сахарами, можно определить
пр,и помощи поляриметрического анализа. Этим мето-
дом также определяют величину окисных циклов саха-
ров.
ЯМ Р-спектроскопия
ЯМР-спектроскопия является одним из современных
методов исследования структур органических соедине-
ний, дающих в сочетании с УФ- и ИК-спектроскопией
очень ценную информацию при исследовании структур
флавоноидов. С помощью ЯМР-сПектроскопии изучают-
ся строение молекул, их конформация, распределение
электронной плотности, слабые межмолекулярные взаи-
модействия (комплексообразование, водородные связи)
[33, 44]. Наиболее важными параметрами этой спектро-
скопии является химический сдвиг и спнн-спиновая
связь между ядрами.
По числу сигналов в спектре ЯМР можно опреде-
лить, сколько типов протонов имеется в молекуле, а по
положению сигналов установить, тип протонов (арома-
тические, алифатические, первичные, вторичные и т. д.).
156
Вследствие низкой растворимости гликозидов в ма-
лополярных и неполярных растворителях, используемых
для получения спектров, они в большинстве случаев ис-
следуются в виде ацетильных или триметилсилиловых
(ТМС) производных. Последние имеют ^значительные
преимущества в спектроскопии ЯМР, так как легко об-
разуются, растворимы в липофильных растворителях,
термически устойчивы, а при нагревании в 50% водном'
метаноле в течение 2 ч они превращаются в исходные
соединения [43]. Кроме того, метилирование и ацетили-
рование флавоноидов можно осуществить с ТМС-эфи-
рами. Сигналы ТМС-протонов проявляются в более
сильном поле, чем 0,5 м.д., и далеко от адсорбционной
области протонов флавоноидов, следовательно, не меша-
ют интерпретации протонов фенольных и полифеноль-
ных соединений [27].
При помощи ПМР-спектроскопии можно не только
быстро и точно установить положение заместителей в
кольцах А и В флавоноида, но и расшифровать строе-
ние углеводного компонента, определить конфигурацию
гликозидной связи, природу и конформацию углевода
[33,34,45].
В результате систематического изучения спектров
ПМР ряда флавоноидных 0-арабинозидов, ксилозидов и
рамнозидов, Г. Г. Запесочной [11] выявлены корреля-
ции между параметрами спектров ПМР и структурой и
стереохимией гликозидов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Б ан дюков а В. А. Применение цветных реакций для об-
наружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге.— Растит,
ресурсы, 1965, т. 1, вып. 4, с. 591—596.
2. Барабой В. А. Биологическое действие растительных фе-
нольных соединений.— Киев: Наукова думка, 1976.— 260 с.
3. Б е л и к о в В. В. Комплексонометрическое определение квер-
цетина в лекарственных смесях.— Фармация, 1971, № 6, с. 42—45.
4. Волхонская Т. А. Изучение флавоноидов рода Вир-
leurum L. Западной Сибири: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. —
Томск, 1968,— 19 с.
5. Г е й с с м а н Т. А. Антоцианы, халконы, ауроны, флавоны
и родственные им водорастворимые пигменты.— В кн.: Биохим.
методы анализа растений. М.: ИЛ, 1960, с. 453.
6. Георгиевский В. П. Количественное определение флаво-
ноидных препаратов методом кислотно-основного титрования в не-
водных растворителях.— Всесоюз. симп. по методам анализа лекар-
ственных средств. Рига: Зинатне, 1969, с. 22.
157
7. Давидек Ю. Определение флавоноидных веществ после
разделения методом хроматографии на бумаге.— Биохимия, 1961,
т. 26, с. 93—97.
8. Дмитриев А. Б., Казакова А. Л. Спектрофотометриче-
ское определение флавонолов и изофлавонов при совместном при-
сутствии. Хим.-фарм. журн., 1981, т. 15, № 12, с. 90—93.
9. Е л ь-К ом м ос, М а к с ю т и н а Н. П. Спектрофотометричне
визначення флавоношв з розчином 4-аминоантипиршу.— Фарма-
цевт. журн., 1978, № 3, с. 60—65.
10. Ель-Ком мос, Максютина Н. П. Фотометрическое оп-
ределение флавоноидов с применением азотистой кислоты. — Фарма-
ция, 1979, № 2, с. 23—26.
Н.Запесочная Г. Г. Структурный анализ природных фла-
воноидных гликозидов и их ацилпроизводных.— В кн.: Состояние
и перспективы исследований биол. активных веществ из раст. и соз-
дание на их основе новых лекарственных препаратов. М., 1983,
с. 53—77.
12. Запрометов М. Н. Биосинтез фенольных соединений и
его регуляция. — Успехи совр, биол., 1971, т. 72, вып. 2 (5),
с. 219-252.
13. Ковалев И. П., Литвиненко В. И. Исследование
флавоноидных гликозидов. I. Моногликозиды. — Химия природ, со-
ед., 1965, № 4, с. 233—235.
14. Когет Т. А. Спектрофотометрический метод определения
гиперозида в пастернаке. — Фармацевт, журн., 1971, № 5, с. 52—54.
15. Литвиненко В. И., Максютина Н. П. Спектральное
исследование флавоноидов. Обнаружение свободных оксигрупп в
различных положениях. — Химия природ, соед., 1965, № 6, с. 470.
16. Литвиненко В. И. Фенольные соединения рода солодки,
их исследование и применение. — В кн.: Тезисы докладов симп. по
изучению и использованию солодки в народном хозяйстве СССР.—
Ашхабад, 1969, с. 55—56.
17. Лурье А. А. Сорбенты и хроматографические носители.—
М.: Химия, 1972. — 320 с.
18. Максютина Н. П., Литвиненко В. И. Методы вы-
деления и исследования флавоноидных соединений. — В 'кн.: Фе-
нольные соединения и их биологические функции. М.: Наука, 1968,
с. 7-26.
19. Минаева В. Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их
практическое использование. — Новосибирск: Наука, 1978. — 255 с.
20. Н а к а н и с и К. Инфракрасные спектры и строение органи-
ческих соединений.—М.: Мир, 1965.— 216 с.
21. Рен дюк Г. Д., Кривут Т. А., Глызин В. И. Спектро-
фотометрический метод определения акацетина в листьях бодяка
щетинистого Cyrsium cetosum (Wild.). — Фармация, 1978, № 2,
с. 68.
22. Сергиенко Т. А., Казарновская Л. С., Литви-
ненко В. И. Флаваноновые биозиды Acinosi thymoides. — Химия
природ, соед., 1966, № 3, с. 166—167.
23. С п и р и д о н о в В. Н. Хроматография флавонолов каштана
на полиамиде. — Химико-фарм. журн., 1968, № 5, с. 43—45.
24. Тюкавкина П. А., Литвиненко В. И., Шостаков-
ский М. Ф. Хроматография на полиамидных сорбентах в органи-
ческой химии. — Новосибирск: Наука, 1973. — 176 с. ч
158
25. X а д ж а й Я. И. Биологические свойства и фармакологиче-
ское действие кумаринов и фурокумаринов. — Тр./БИН АН СССР,
1965, сер. 5, вып. 12, с. 25—30.
26. X а р б о р н Дж. Б. Биохимия фенольных соединений. — М.:
Мир, 1968. — 451 с.
27. Эм ели Дж., Финей Дж., Сатклиор Л. Спектроскопия
ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. Т. 1. — М.:
Мир, 1968. —630 с.
28. В г у a n t Е. Т. A note of the Differentiation between Fla-
vonoid Glycosides and their Aglycones.—J. Amer, Chem. Soc., 1950,
V. 39, p. 480—491.’
29. Briggs L. H., Locker R. H. Chemistry of New Zeal
and Melicope Species. Part 6. A Revised Constitution for Meliterna-
tion and the Identification of Kanthoxyletin from the Bark of Meli-
cope ternata. — J. Chem. Soc., 1951, p. 3131—3136.
30. В u r w e 11 B. L., Gordon V. S. The Action of sulfuric
Acid on Opticaly Active Hydrocarbon. — J. Amer. Chem. Soc., 1948,
v. 70, № 9, p. 3128.
31. Chandler В. V., Harper K. A. Identification of Saccha-
rides in Anthocyanins and other Flavonoids.— Australian. J. of
Chem., 1961, v. 14, № 4, p. 586—595.
32. Geissman T. A. The chemistry of Flavonoids compounds.—
Oxford—London—N-Y—Paris, 1962, p. 70.
33. H a r b о r n e J. B., Mabry T. J., Mabry H. The Flavo-
noids. London : Chapman and Hall, 1975. — 1204 p.
34. H e n t i 1 i В., H о г о w i t z R. M. Flavonoids of Citrus. IX.
Some new C-glycosyiflavones and a nuclear magnetic resonance met-
hod for differentiating 6- and 8-c-glycosyl isomers. — J. Org. Chem.,
1968, v. 44, № 4, p. 1571.
35. H о r h a m m e r L., M fi 11 e r K. Zur Analytik der Flavone. IV.
Uber die Anwendung des Zirkon-Zitronensaure Tests als Spruhreak-
tion in der Papierchromatographie.— Arch. Pharm., 1954, Bd 287,
№ 6, S. 310—313.
36. H о r h a m m e r L., Hansel R. Zur Analytik der Flavone.
VIII. Weitere Eigenschafen halochromer Borkomplexe.—Arch. Pharm.,
1955, Bd 288, № 7, S. 315—321.
37. H о r h a m m e r L., Muller К. H. Zur Analytik der Flavo-
ne. II. Uber das Komplexbildung vermogen einiger Oxyflavone und
die Konstitution des in Polygonum hydropiper L. vorkommenden
Rhamnozinesters.—Arch. Pharm., 1953, Bd 286, № 8, S. 425—431.
38. Horhammer L., Wagner R., Leeb W. Uber die Po-
lyamidchromatographie von Flavonen, Flavonolen und deren Glyco-
sides.— Naturwissenschaften, 1957, Bd 44, № 19, S. 513.
39. Hunger A., Reichstein T. Frugosid, ein zweites kristal-
lisiertes Glucosid aus den Samen Gomphorcarpus fruticosus (L.)
R. Br. — Hel. Chim. Acta, 1952, Bd 35, S. 2.
40. J u r d L. A Spectrophometric method for the detection of
o-dihydroxyl grups in flavonoids Compounds.— Arch. Biochem. Bio-
phys., 1956, v. 63, p. 376—381.
41. Jurd L., Geissman T. A., Seinkel M. K. The flavo-
noid constituents of Spiroeles oligozhiza. IL—Arch. Biochem. B-io-
phys., 1957, v. 67, p. 284.
42. Lindstedt Y., Misiorny A. Constituents of Pine
Heartwood.—Acta chem. scand., 1951, v. 5, p. 121.
159
43. Mabry T. J., Rosler H. NMR Spectra of trimethylsilyl
ethers of flavonoid Glycosides. — Phytochemistry, 1965, v. 4> P- 177—
183.
44. Mabry T. J., Markham K. R., Thomas К. B. The
Systematic Identification of Flavonoids. Berlin—Heidelberg—N.-Y.:
Springer Verlag, 1970.—354 p.
45. N.ordby H. E., Fischer J. E., Kew T. J. Apigenin-7-fi-
rutinosid, a new flavonoid from the leaver of Citrus paridisi.— Phy-
tochemistry, 1968, v. 7, p. 1953.
46. Perkin A. Y. LXXLLI. Gossypetin.— J. of the Chem. Soc.,
1913, v. 103, p. 650—662.
47. S h i m i z u M. New method for Distingvishing Flavonol-3-
glycosides from Flavonols. — J. Pharm. Soc. (Japan), 1951, v. 71,
p. 1329.
48. T h i e m e H. Die Phenolglykoside des Salicaceen. 5 Mitt.
Untersuchungen uber die Glykosid-spektren und den Glykosidgehalt-
der Mitteldeutschen Salix arten. — Pharmazie, 1965, Bd 20, S. 570.
49. T a u b б с к К. Uber Reaktionsproducte von Flavonolen mit
Borsapre und Organischen Sauren und ihre Bedeutung fur die
Festlegung der Bore in Pflanzenorganen. — Nafurwissensch., 1942,
Bd 30, S. 433.
50. W i 1 s о п C. W. A Study of the Boric Acid color reaction
of flavone derivatives.— J. Amer. Chem. Soc., 1939, v. 61, p. 2303.
Глава 9
КУМАРИНЫ
1. Общая характеристика
Кумарины по своему строению являются ненасыщен-
ными ароматическими лактонами, в основе которых ле-
жит 5,6-бензо-а-пирон, лактон цис-орто-оксикоричной
кислоты.
.Кумарин — родоначальник соединений этой группы
—выделен впервые Фоголем в 1820 г. из плодов Dipte-
ryx odorata сем. Leguminosae. Позднее эти соединения
были найдены более чем в 50 родах различных се-
мейств [19]. Вышеуказанная структура кумарина была
принята не сразу; первоначально его рассматривали как
•производно^ бензойной кислоты. А. Г. Перкиным был
осуществлен синтез кумарина из салицилового альдеги-
да и указано на его связь с о-оксикоричной кислотой.
Для кумарина предлагались различные структурные
формулы, однако всеобщее признание получила струк-
тура 5,6 бензо-а-пирона.
Большой вклад в развитие химии кумаринов внесли
Своими работами Е. Шпет с соавт. [19] .Они установили
строение ряда кумаринов и открыли новые группы этих
соединений. Число открытых и изученных кумаринов с
40-х годов XX столетия и до настоящего времени увели-
чилось более чем в два раза. Успешному развитию ра-
бот в этой области способствовало широкое использова-
ние хроматографических и спектроскопических методов
исследования.
В природе чаще всего встречаются наиболее простые
г производные кумаринов. Основное количество предста-
6. Заказ 2909. 161
вителей соединений этой группы найдено в свободном
состоянии и лишь незначительное число—в виде глико-
зидов. Одни из них являются ингибиторами роста, дру-
гие стимулируют прорастание семян. Иногда кумарины
выступают как защитные вещества при некоторых за-
болеваниях растений [19].
Издавна известен ряд кумариноносных растений,
применяющихся в народной медицине при лечении раз-
личных заболеваний. Фармакологические исследования
и клинические испытания, проведенные преимуществен-
но за последние 15—20 лет, показали, что кумарины
обладают разносторонней биологической активностью и
имеют определенное медицинское значение (оказыва-
ют антиконцерогенное, спазмолитическое и антилейко-
дермическое действие). Спазмолитическое действие (в
том числе коронарорасширяющее) обнаружено у многих
кумаринов (биакангелицин, 5-метокси-8-окси-псорален,
изопимпинеллин, атамантин, ангесин, пеуцеданин, бер-
гаптен, императорин, остхол, дигидросамидин и др.). В
СССР и за рубежом разрешены для применения в каче-
стве спазмолитических средств препараты пастинацин,
представляющий смесь бергаптена, сфондина и ксанто-
токсина, вибелин, атамантин, димидин.
Антилейкодермическое действие связано с фотосен-
сибилизйрующей активностью кумаринов (особенно фу-
рокумаринов). Из природных фурокумаринов это свой-
ство обнаружено у псоралена, ксантотоксина, бергапте-
на, ангелицина, изобергаптена, оксипеуцеданина, ксан-
тотоксола, императорина, бергаптола, изопимпинеллина
и некоторых других. На основе'фурокумаринов создано
несколько препаратов для лечения лейкодермы, напри-
мер: меладинин, представляющий смесь ксантотоксина
и императорина из плодов Ammi majus и выпускаемый
в АРЕ: аммифугин, являющийся смесью изопимпинелли-
па и бергаптена и получаемый в СССР из плодов куль-
тивируемой Ammi majus, бероксан—смесь ксантотокси-
на и бергаптена из ллодов Pastinaca sativa; псорален —
смесь псоралена и ангелицина из плодов Psoralea drupa-
сеа. Интенсивные работы по изучению фотодинамиче-
ской активности кумаринов ведутся в СССР, США, Ита-
лии и АРЕ. Механизм действия кумаринов g этом на-
правлении еще недостаточно изучен. Противоопухоле-
вое действие пока изучено лишь для немногих веществ
из группы кумаринов [5, 22]. По результатам этих ра-
162
бот наличие у кумаринов противоопухолевой активности
связывают с их способностью тормозить рост тканей и
оказывать влияние на разные стадии митоза. Создан
препарат пеуцеданин, представляющий собой нативней
фурокумарин из корней Peucedanum morissonii.
Выявлены и другие стороны фармакодинамики кума-
ринов, изокумаринов, фурокумаринов:
— действие на ЦНС (наркотическое, седативное, бо-
леутоляющее, жаропонижающее, стимулирующее) [3];
— действие преимущественно на органы, иннервиру-
емые вегетативными нервами; адренолитическое;
— курареподобная, гипотензивная, мочегонная ак-
тивность;
— действие в области чувствительных нервных окон-
чаний (анестезирующее, желчегонное, слабительное);
— влияние на тканевой обмен (Р-витаминная актив-
ность, противосвертывающее, кровоостанавливающее
действие);
— гормональная активность (эстрогенное, гонадо-
тропное и гипогликемическое действие).
— противомикробное и противопаразитарное дейст-
вие [23]. _
2. Распространение в растительном мире
Кумарины довольно часто встречаются в высших
растениях, реже—в низших (грибы, актиномицеты, ли-
шайники), совсем не обнаружены в водорослях, незна-
чительно представлены в папоротникообразных и голо-
семенных. Практически все разнообразные кумарины
выделены из покрытосеменных. В этой группе особенно
выделяются несколько семейств как по обилию содер-
жащих кумаринов видов, так и по их разнообразию.
Umbelliferae, Rutaceae, Leguminosae, Saxifragacene и др.
[19,20,23].
3. Локализация в растениях
Кумарины локализуются в различных органах рас-
тений, чаще и больше всего в корнях, коре, плодах,
меньше—в стеблях и листьях. Содержание этих соеди-
нений в разных растениях колеблется от 0,2 до 10%,
причем часто можно встретить 5—10 различных кума-
ринов в одном растении [18, 19, 23].
6*. . 163
4. Классификация
1. Кумарин, дигидрокумарин и их гликозиды:
кумарин дигидрокумарин
2. Окси*, метокси-(алкокси-) и метилендиоксикума-
рины: с гидроксильными и алкоксильными группами в
бензольном кольце
умбеллиферон
эскулетин
с гидроксильными или алкоксильными группами в
пироновом кольце, например феруленол, который обна-
ружен в различных видах сем. зонтичных.
3. Фурокумарйны, содержащие заместители в бен-
зольном и фурановом кольце:
производные псоралена, т. е. фурокумарйны, фурано-
вое ядро которых сконденсировано с кумарином в 6, 7-
положении (псорален, ксантотоксин, бергаптён, изо-
пимпинеллин и др.)
псорален
осн3
ксантотоксин
Псорален выделен из плодов и корней псорален костян-
ковой и др. видов сем. бобовых, ксантотоксин, бергап-
тен, изопимпинеллин—из плодов аммии большой и па-
164
стернака посевного сем. зонтичных, пеуцеданин—из кор-
ней горичника Мориссона и др. видов сем. зонтичных;
производные ангелицина, т. е. фурокумарйны, фура-
новое кольцо которого сконденсировано с кумарином в
7, 8-положении
ангелицин атамантин
4. Пиранокумарины, содержащие ядро пирана, скон-
денсированное с кумарином в 5, 6; 6, 7; 7, 8-положениях
и имеющих заместитель в пирановом, бензольном или
пироновом кольце (дигидросамидин, виснадин, терик-
син и др.).
дигидросамидин виснадин
Дигидросамидин и виснадин выделены из корней и пло-
дов вздутоплодника сибирского сем. зонтичных.
5. 3, 4-бензокумарины:
эллаговая кислота
165
Эллаговая кислота обнаружена в растениях сем. сума-
ховых, розовоцветных и др.
6. Кумарины, содержащие систему бензофурана,
сконденсированную с кумарином в 3, 4-положении:
куместрол
5. Физико-химические свойства
Выделенные в индивидуальном состоянии кумарины
представляют бесцветные или слегка желтоватые кри-
сталлические вещества, хорошо растворимые в органи-
ческих растворителях (хлороформе, метиловом, этило-
вом спиртах, эфире, жирах)’ и жирных маслах. В воде
они малорастворимы, а их гликозиды растворяются в
воде, но не растворяются в органических растворите-
лях.
Особенностью кумаринов является легкая раствори-
мость в водных растворах щелочей (особенно при на-
гревании) за' счет образования солей оксикоричной ки-
слоты [7, 8]. В соответствии со структурой производные
этих веществ обладают химическими свойствами, обус-
♦ ловленными наличием лактонного кольца, двойной свя-
зи а-пирона и ароматического кольца [И, 13].
Характерным свойством всех групп кумаринов явля-
ется высокая устойчивость лактонного кольца. В отли-
чие от лактонов неароматических оксикислот кумарины
не раскрывают лактонного цикла ни при длительном ки-
пячении водных растворов, ни при воздействии карбона-
тов щелочных металлов. Раскрытие его происходит
лишь при воздействии едкой щелочью при нагревании,
но уже при воздействии углекислоты оно вновь замыка-
ется, образуя исходный кумарин.
Молекула кумарина состоит из конденсированных
между собой бензольного и а-пиронового колец. Устой-
чивость кумариновой системы определяется как арома-
166
тическими" свойствами бензольного кольца, так и нена-
сыщенностью а-пиронового цикла; 3, 4-дигидрокумарины
такой устойчивостью не обладают [10],
Устойчивость лактонного кольца зависит от наличия
алкильных и гидроксильных групп и их положения в
бензольном и пироновом циклах. Вследствие поляриза-
ции П-связи карбонильной группы в молекуле кумарина
происходят электронные смещения, в результате кото-
рых бензольное ядро и гетероциклический атом стре-
мятся восполнить недостаток электронов углеродного
атома карбонила.
Присутствие в 7-м и 5-м положении оксигрупп спо-
собствует этому смещению, что Придает их производным
повышенную устойчивость, тогда как 6- и 8-оксикума-
рины такой устойчивостью не обладают. При растворе-
нии в едких щелочах кумарины образуют соли кумари-
новых кислот ^аналоги цис-ортокрричной кислоты), ко-
торые окрашены в желтый цвет, на основании чего им
приписывают ортохиноидную структуру.
Кумариновые, кислоты в свободном состоянии неиз-
вестны, так как при попытках выделения тотчас образу-
ются лактоны
! Я / соон кумариновая кислота кумаровая кислота 167
Кумаровые кислоты лактонного кольца не образуют,
обладают выраженными кислотными.свойствами, хоро-
шо кристаллизуются. При гидрировании кумаринов (в
условиях нормального давления) в первую очередь вос-
станавливаются двойные связи в боковых цепях, затем
в присутствии катализаторов гидрируется вторая связь
в пироновом кольце, затем с большим трудом—арома-
тическое ядро [7, 15].
Одним из самых характерных свойств кумаринов
как лактонов, является их специфическое отношение к
щелочи (с кислотами и аммиаком кумарины не взаимо-
действуют). При действии горячей разбавленной щело-
чи они медленно гидролизуются, при этом происходит
разрыв лактонного кольца с образованием растворов
желтого цвета.
При подкислении щёлочных растворов или при на-
сыщении СО2 кумарины регенерируются в исходное со-
стояние
Изложенный выше материал помогает понять взаи-
модействие кумаринов, лишенных фенольных гидрокси-
лов, с солями диазония в слабощелочной среде [9, 19,
29, 26]:
Качественное определение кумаринов.
Для обнаружения кумаринов в растительном сырье ис-
пользуют их лактонные свойства, способность флуорес-
цировать при УФ-освещении и давать окрашенные раст-
воры с диазосоединениями, а также -хроматографиче-
ский анализ спиртовых или хлороформных экстрактов,
полученных из сырья [11, 18, 20, 26].
168
Методики качественного анализа. 2,0 г
измельченного сырья заливают 20 мл этанола и кипятят
в течение 15 мин с обратным холодильником. После ох-
лаждения фильтруют и проводят качественные реакции.
Взаимодействие со щелочами и образование азокра-
сителя. К 3—5 мл спиртового извлечения прибавляют 10
капель 10% метанольного раствора NaOH и нагревают
в течение 5 мин на водяной б-ане. При наличии кумари-
нов раствор желтеет, а после прибавления 5 капель све-
жеприготовленного диазореактива приобретает окраску
от коричневой до вишневой.
Лактонная проба.'К 3—5 мл спиртового извлечения
прибавляют 10 капель 10% раствора КОН (в метило-
вом спирте), растдор нагревают на водяной бане, затем
прибавляют 5—10 мл дистиллированной воды и хорошо
перемешивают, после чего нейтрализуют 10% НС1 до
кислой реакции. При этом помутнение или выпадение
осадка указывает на вероятное присутствие кумаринов в
сырье [10, 17}.
Хроматографическое определение
1. 0,01 мл спиртового извлечения наносят на пластин-
ку Silufol или на закрепленный слой силикагеля и хро-
матографируют в системе н-гексан-бензол-метиловый
спирт (5:4:1). Когда подвижная фаза достигнет рассто-
яния 10 см от линии старта, хроматограмму высушива-
ют на воздухе в течение 10 мин, опрыскивают 10% КОН
(в метаноле) и высушивают в сушильном шкафу при
НО—120°С (2—3 мин), отмечая окраску и положение
пятен при просмотре в УФ-свете, затем опрыскивают
свежеприготовленным диазореактивом. При наличии ку-
маринов в сырье на хроматограмме проявляются яркие
пятна от кирпично-красного до сине-фиолетового (в за-
висимости от структуры кумаринов).
2. Для определения кумаринов широко применяются
различные виды хроматографии, чаще всего на бумаге
и тонком слое. В качестве сорбентов используют сили-
кагель, Silufol, оксид алюминия (II—IV ст. акт.). Раст-
ворителями чаще всего служат следующие системы: пет-
ролейный эфйр-бензол-метиловый спирт (5:4:1); бензол-
этилацетат и бензол-хлороформ (в различных соотноше-
ниях), а на БХ—15 и 60% уксусная кислота [4, 6, 29].
169
Кумарины в зависимости от структуры имеют голу-
бую, синюю, фиолетовую, зеленую, желтую флуоресцен-
цию. Флуоресцирующие пятна отмечают и хроматограм-
мы обрабатывают щелочью, после чего высушивают в
сушильном шкафу при 120°С и вновь просматривают под
УФ-лампой; как правило, флуоресценция усиливается.
Затем хроматограмму обрабатывают диазотированным
сульфаниламидом, от действия которого кумарины в за-
висимости от структуры окрашиваются в оранжевый,
красно-оранжевый или фиолетовый цвет. В некоторых
случаях после просматривания хроматограммы в УФ-
свете ее обрабатывают реактивом Драгендорфа или
йодом. Кумарины проявляются в виде пятен, окрашен-
ных в коричневый цвет.
Выявление кумаринов
Для более достоверного, суждения о наличии произ-
водных кумаринов в растительном сырье применяют
взаимодействие с йодистоводородной (реже хлористово-
дородной) кислотой, при этом происходит восстановле-
ние или отщепление различных групп, находящихся в
кумариновых производных, с образованием свободного
кумарина, обнаруживаемого по интенсивному ярко-голу-
бому окрашиванию при УФ-освещении [12]. Для этого
берут 5 мг исследуемого вещества (или сухого экстрак-
та), кипятят с 1 мл реакционной смеси (0,5 мл жидкого
фенола, 3 мл 70% иодистоводородной кислоты и 0,5 мл
уксусного ангидрида) на парафиновой бане при 130° в
течение 1,5 ч. Горячую смесь вливают в 10 мл холодной
воды и экстрагируют хлороформом (3x20 тил), объеди-
ненные7 хлороформные извлечения обрабатывают 2—3
раза по 5—10 мл 1% карбонатом натрия, затем 2% ра-
створом хлористоводородной кислоты, промывают ди-
стиллированной водой и упаривают до сухого остатка,
который растворяют в спирте и пропускают через не-
• большой слой оксида алюминия. Последний промыва-
ют последовательно спиртом и хлороформом. Сконцент-
рированные элюаты хроматографируют в системе петро-
лейный эфпр-формамид и проявляют 10% спиртовым
раствором гидроксида натрия.
6. Методы количественного определения кумаринов
Применяют как объемные, так и физико-химические
методы анализа. Способность лактонного кольца кума-
170
рина к обратимому размыканию и замыканию в зави-
симости от pH среды используется в гравиметрическом
методе определения суммы кумаринов в растительном
сырье. Специфическое отношение кумаринов к щелочи
лежиту в основе метода нейтрализации (обратное тит-
рование), который применяется как для определения
суммы этих веществ, так и для индивидуальных компо-
нентов [27]. Избыток щелочи оттитровывают соляной
или серной кислотой. Недостатком метода является по-
лучение заниженных результатов, что объясняется
преждевременным замыканием лактонного кольца при
обратном титровании, поэтому было рекомендовано пе-
ред титрованием переводить соли кумариновой кислоты
(ненасыщенная цис-оксикислота) кипячением с раство-
ром гидроксида натрия в присутствии оксида ртути (II)
в кумаровую кислоту (трансформа) [1].
Полярографический метод получил широкое приме-
нение в анализе кумаринов. Установлено, что восстанов-
ление на ртутно-капельном электроде происходит в а-
пироновом кольце по месту двойной связи в положении
3, 4. Полярографический метод в качестве официально-
го используется для анализа препарата бероксана и его
таблеток по 0,01 и 0,25 г или 0,5% раствора. Описано
применение полярографии для анализа псоралена в пло-
дах Psoralea' drypacea и для контроля его производст-
ва [10].
Колориметрические методы определения кумаринов
основаны на способности последних вступать во взаимо-
действие с солями диазония, образуя устойчивые окра-
шенные соединения. Для проведения реакции азосоче-
тания к подщелоченному (1% раствор карбоната натрия
или 5% раствор гидроксида натрия) спиртовому раство-
ру производного кумарина прибавляют определенное
количество соли диазония [17]. В качестве реагентов
применяют диазотированный п-нитроанилин, сульфани-
ловую. кислоту, сульфаниламид.
Флюорометрические методы определения основаны
на способности кумаринов флюоресцировать при воз-
буждении УФ-светом. Флюоресценция этих соединений
усиливается в присутствии щелочи. Это свойство кума-
ринов используют для обнаружения их на хромато-
граммах. Они интенсивно флюоресцируют голубым, си-
не-фиолетовым или желто-зеленым цветом. Количест-
венный флюоресцентный анализ их не получил широко-
171
го применения, хотя и отмечается его высокая чувстви-
тельность. Это следует объяснить тем, что интенсив-
ность флюоресценции не всегда пропорциональна кон-
центрации [19].
Наличие нескольких полос высокой интенсивности в
интервале 220—320 нм электронного спектра позволяет.
использовать УФ-спектрофотометрию для количествен-
ного определения кумаринов.
УФ-спектрофотометрический метод рекомендован
для определения фурокумаринов в препарате аммифу-
рине. Метод основан на измерении поглощения раствора
смеси при двух длинах волн. Этот же принцип положен
в основу анализа фуралена, смеси пеуцеданина и оре-
озелона, псоберана и его лекарственных форм.
Из групповых методов УФ-спектрофотометрический
является наиболее перспективным, так как позволяет
проводить компонентный анализ фотосенсибилизиру-
ющих препаратов без предварительного разделения, на
основе различий в спектрах поглощения [25, 26].
7. Выделение и разделение кумаринов
Кумаринопроизводные являются нейтральными ма-
лополярными соединениями. Они хорошо растворяются
в хлороформе, эфире, бензоле, ацетоне, спиртах, жирах
и не растворяются в воде [7, 13, 15, 19].
Выделение первых кумаринов проводилось путем
экстракции сырья петролейным эфиром или спиртом.
При стоянии сгущенных экстрактов происходила кри-
сталлизация лактонов. Этим методом удавалось выде-
лить лишь хорошо кристаллизующиеся кумарины при
небольшом количестве балластных соединений. Для от-
деления сопутствующих веществ применяют специаль-
ную очистку, основанную на обратимом раскрытии лак-
тонного кольца у кумаринов. Сущность такой очистки
заключается в том, что эфирный экстракт вначале обра-
батывают при комнатной температуре спиртовым раст-
вором едкой щелочи. При этом кумарины, содержащие-
ся в экстракте, образуют соли кумариновых кислот, ра-
створимые в воде; сложные эфиры и хромоны омыля-
ются и разрушаются. После омыления жидкость разбав-
ляют водой и с помощью эфира удаляют так называе-
мые неомыляемые вещества (стерины, спирты, углево-
дороды, смолы и др.) [27].
172
Водно-щелочной раствор подкисляют и эфиром из-
влекают смесь кумаринов, фенолов и кислот. Для уда-
ления веществ кислотного характера эфирный раствор
промывают 0,5% раствором щелочи. При щелочной об-
работке некоторые кумарины претерпевают необрати-
мые изменения.
Сложность разделения кумаринопроизводных явля-
ется основной причиной того, что большинство выпуска-
емых в нашей стране и за рубежом препаратов пред-
ставляют собой смеси двух-трех веществ. Е. Шпет для
разделения кумаринов применял дробную перегонку или
сублимацию в вакууме, что позволило выделить значи-
тельное число этих соединений. Однако разделение ве-
ществ с близкой температурой кипения таким путем не
представляется возможным, а некоторые кумарины при
перегонке подвергаются разложению или изомеризации.
Широко применяется для разделения кумаринов хро-
матографический метод. Впервые он был использован
в 1952 г. Свендсеном, который использовал в качестве
адсорбента оксид алюминия, а в качестве элюента—
бензол, содержащий 1% метанола [31].
Эфирные масла, глицерины, стероиды и тритерпены
обычно появляются в первых фракциях элюента. Кума-
рины хорошо вымываются из колонки бензолом или сме-
сью бензола с этилацетатом (в различных соотношени-
ях). Кумарины на колонке и в элюатах обнаруживают-
ся по флуоресценции при УФ-освещении. Для ускорения
процесса разделения кумаринов колонку можно разре-
зать на зоны и каждую зону элюировать отдельно хло-
роформом, метиловым или этиловым спиртом. Кумари-
ны, содержащие фенольные или спиртовые гидроксиль-
ные группы, сильнее адсорбируются на оксиде алюми-
ния и элюируются полярными, растворителями, подоб-
ными спирту, иногда с добавлением 0,5% уксусной или
соляной кислоты. Адсорбционное средство кумаринов по
отношению к оксиду алюминия усиливается с увеличе-
нием числа гидроксильных групп.
Использование колоночной хроматографии позволя-
ет разделять смеси близких по структуре веществ; на-
пример, смесь императорина и прангенина (окиси им-
ператорина) была разделена на колонке с оксидом алю-
s. миния при их весовом соотношении 1:50. Для элюирова-
ния использована смесь петролейного эфира и бензола
я (1:5; 1:2). Проведение хроматографического разделения
173
кумаринов на колонке облегчается, благодаря примене-
нию методов бумажной и тонкослойной хроматографии
для качественного анализа элюатов [19].
8. Идентификация и установление строения
Уф-спектры кумаринов
Первые работы по изучению УФ-спектров поглоще-
ния кумаринов относятся к 30-м годам XX столетия. С
помощью УФ-спектроскопии решаются структурные
вопросы, изучаются явления глубокой изомерии, облег-
чается идентификация природных кумаринов. В элек-
ронных спектрах их поглощения наблюдаются характе-
ристические частоты в области 290—350 и 210—270 нм,
т« к. хромофор включает в себя сопряженные между
собой пирановое и бензольное кольца. Спектр самого
кумарина в спиртовом растворе имеет Атах=275, 310 нм;
УФ-спёктр поглощения производных кумарина в той
или иной степени видоизменяется в зависимости от ха^
рактера заместителя и положения его в бензольном
или пирановом кольце.
Спектрофотометрический метод применяется для от-
личия природных фурокумаринов от кумаринов. При
этом показано, что конденсация кумарина с фурановым
кольцом проявляется в УФ-спектре в виде трех макси-
мумов при 306, 265, 258 нм и одного минимума при
240 нм. По положению полосы спектра при 300 нм раз-
личают 5- и 8-замещенные фурокумарины с окси- и ал-
коксизаместителями [4].
ИК-спектры кумаринов
Изучение спектров поглощения молекул в инфракрас-
ной области имеет важное значение для установления
строения природных кумаринов. В кумаринах, как и в
а-пиронах, полосы валентных колебаний карбонильной
группы лежат в области 1750—1700 см'1, кроме того,
кумарины дают сильные полосы поглощения в области
1620—1470 см-1, обусловленные колебаниями аромати-
ческих двойных связей. Все фурокумарины, за немно-
гими исключениями, с неполностью замещенным фура-
новым кольцом, в спектре поглощения дают полосу
3170—3130 см-1, кумарины и фурокумарины полосу —
3130—3110 см-1.
174
Анализ ИК-спектров помогает установить строение
новых соединений, дает возможность идентифицировать
кумариновые производные и позволяет решать структур-
ные вопросы, связанные с характером и механизмом
влияния заместителей на карбонильную группу в а-пй-
ронах и др. [25, 26, 29, 30].
ЯМР-спектры кумаринов и
фурокумаринов
За последние годы большое значение приобрел метод
спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР)
высокого разрешения, который дает уникальные воз-
можности в установлении строения природных кумари-
нов и фурокумаринов и позволяет решать конформаци-
онные вопросы, которые не могли быть выяснены без
использования этого метода.
Большая заслуга в области развития ЯМР-спектро-
скопии в отечественной науке принадлежит Ю. Н. Шейн-
керу, Ю. Г. Пейу, М. Е. Перельсону. Они изучили боль-
шое число ЯМР-спектров одно- и двузамещенных при-
родных кумаринов и фурокумаринов, дали четкую схе-
му отнесения сигналов протонов в зависимости от по-
ложения в кумариновой системе [19, 26].
В ЯМР-спектре незамещенного кумарина имеется чет-
ко определяемый квадруплет аД обусловленный сиг-
налами от протонов в 3-м и 4-м положениях. Химиче-
ские сдвиги для протонов в 3-м и 4-м положениях ку-
марина близки к таковым у протонов этиленовой связи,
о-кумаровой кислоты, что указывает на наличие двой-
ной связи в пирановом кольце. ЯМР-спектр весьма удо-
бен для распознавания кумаринов, замещенных в 3-м
или 4-м положении. Замещение одного из двух протонов
приводит к исчезновению соответствующего химическо-
го сдвига.
За последние годы с помощью ЯМР-спектроскопни
установлена структура совершенно новых природных
соединений. Для подтверждения строения обтусипрени-
на и обтусипренона, выделенных из Haplophyllum obtu-
sifolium, использованы данные спектров 13С ЯМР-спект-
роскопии [2]. Имеются данные об использовании спек-
троскопии 13С ЯМР для установления строения простых,
гидроксилированных и алкилированных кумаринов, фу-
рокумаринов, пиранокумаринов, изокумаринов, кумари-
175
нолигноидов, гликозидо-кумаринов и для определения
положения заместителей [28.].
ЛИТЕРАТУРА
1. Абышев А. 3. Изучение продуктов превращения некоторых
природных кумаринов. — Химия природ, соед., 1978, № 5, с. 562—
566.
2. Б а т и р о в Э. X. и др. Изучение кумаринов Haplophyllum
obtusifolium методом спектроскопии ЯМР 13С. — Химия природ,
соед.,/1982, № 6, с. 780—781.
3. Богданов Н. Г., Лидер В. А. Влияние кумариновых
производных на активность некоторых экзоферментов поджелудоч-
ной железы и слизистой оболочки тонкого кишечника. — Фармакол.
и токсикол., 1967, № 6, с. 727—730.-
4. Б у р я к В. В., Старчевская Н. К. УФ-спектрофотомет-
рия лекарственных средств, производных 4-оксикумаринов. — Фар-
мация, 1981, № 5, с. 26—30.
5. Вермиль Е. М., Цетлин А. П. О противоопухолевой
активности некоторых фурокумаринов. — Вопросы онкологии, 1964,
№ 6, с. 85—89.
6. В у л ь ф с о н В. С. и др. Тонкослойная хроматография ку-
маринов и фурокумаринов. — Известия АН СССР. Химия, 1963,
№ 8, с. 1503—1505.
7. Второй симпозиум по изучению природных кумаринов.—
Л., 1р70, с. 67—80; 91—93.
8: Гашимов Н. Ф., Оразынухамедова Н. О. Кумарины
Haplophyllum bungei.—Химия природ, соед., 1975, № 5, с. 653—654.
9. Генкина Г. А. Методы анализа фурокумаринов. — Хим.
фарм. журн., 1981, т. 15, № 11, с. 108—115.
10. Генкина Г. А., Шакиров Т. Т. Усовершенствование
метода анализа фурокумарина в плодах Psoralia drupacea. — Хим.
фарм. журн., 1982, т. 16, № 7, с. 32. -
11. Георгиевский В. П., Казаринов Н. А., Карры-
е в М. О. Физико-химические методы анализа биологически актив-
ных веществ растительного происхождения. — Ашхабад: Ылым,
1976.— 240 с.
12. Гиоргобиани Э. Д., Комиссарен.ко Н. Ф. Действие
йодистоводородных и хлористоводородных кислот на' производные
кумарины. — Сообщ. АН ГССР, 1963, т. 53, № 2, с. 363—368.
13. Запрометов М. Н. Основы биохимии природных соеди-
нений.— М.: Высшая школа, 1974.— 214 с.
14. Кадыров А. Ш. и др. Строение ферозида и реозелина
A-новых гликозидов из корней Ferula Rurshinshyi.— Хим. природ,
соед., 1975, №. 5, с. 574—578.
15. Кирьянов Н. П., Букреева Т. В. Новый кумарин из
корней Ferula pseudooreselium. — Хим. природ, соед., 1972, № 5,
с. 643-645.
16. Колесников Д. Г., Комиссаренко Н. Ф., Черно-
бай В. Т. Методика выделения и разделения кумаринов. — Мед.
промышл. СССР, 1961, № 6, с. 32.
17. Коренман И. М. Фотометрический анализ. — М.: Химия,
1975, —359 с.
176
18. Кошелева Л. И., Никонов Г. К. О сезонной динамике
содержания оксикумаринов в волчнике обыкновенном.— Фармация,
1970, № 5, с. 36.
19. Кузнецова Г. А. Природные кумарины и фурокумари-
ны. — Л.: Наука, 1967. — 248 с.
20. К р а с н о в Е. А. и др. Обследование растений флоры За-
падной Сибири на содержание биологически активных веществ.
Сообщ. 3.Томск, 1983.— 18 с.—Рукопись представлена Том. мед.
ин-том. Деп. в ВИНИТИ 27 янв. 1983, К2 475-83.
21. Лазурьевский Г. В. и др. Практические работы по
химии природных соединений. — М.: Высшая школа, 1966. — 355 с.
22. Никонов Г. К. Фурокумарины как группа веществ расти-
тельного происхождения с противораковой активностью. — Тр./Всес.
ин-т лекарст. и аромат, раст., 1959, т. 11, с. 180—201.
23- П и м е н о в М. Г. Перечень растений-источников кумарино-
вых соединений. — Л.: Наука, 1971. — 200 с.
24. Прокопенко О. П., Тарасенко О. О. Колориметри-
ческий метод к1льк1ского визначення кумаришв.— Фармацевт, жур-
нал (Киев), 1962, № 6, с. 18—22.
25. П е р е л ь с о н М. Е., Ш е й н к е р Ю. Н., С а в и н а А. А.
Спектры и строение кумаринов, хромонов и ксантонов. — М.: Выс-
шая школа, 1975. — 232 с.
26. П е р е л ь с о н М. Е. Спектроскопическое изучение кумаринов
и родственных соединений: Авторефер. дис. ... канд. биол. наук.—
М., 1964.
27. Химический анализ лекарственных растений. — М.: Выс-
шая школа, 1983. — 176 с. >»-
28. В h a n d а г i Р„ Р a s t о g i R. P. Recent advances in natu-
rally occurring coumarins. Part II. Application of ,3C-NMR-spectro-
scopy.—J. Sci. and Jnd. Res., 1983, v. 42, № 8, p. 437—447.
29. Desai R. D., M a v a n i С. K. Coumarins from Hydroguinone
Derivatives—Proceedings of the Ind. Acad. Sci. Sect. A. 1942,
p. 11—15.
30. Mendez G., Logo M. G. Spectral Analysis of Coumarins.—
Microchem. J. 1968, № 13, v. 3, p. 506—511.
31. Mendez G., Logo M. G. Spectral Characterization of
Coumarins and Cinnamic Acids. — Microchem. J. 1969, v. 14, № 3,
p. 567—572.
32. S v e n d s e n A. B. Papierchromatographischer Nachweis na-
tiirlicher Cumarine in Pflanzen. Die Сшпагфе der Pimpinella mag-
na L. and Pimpinella saxifraga L. —Pharm. Acta Helv., 1952, Bd 27,
№ 2-3, S. 44—48.
6**.
Глава 10
БИОСИНТЕЗ НЕКОТОРЫХ ГРУПП БИОЛОГИЧЕС-
КИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ЕГО СВЯЗЬ
С ОСНОВНЫМ ОБМЕНОМ ВЕЩЕСТВ В
РАСТЕНИИ
Зеленые растения—удивительное создание природы.
Отличительной и чрезвычайно важной особенностью их
является способность создавать в процессе фотосинтеза
пластические вещества, обеспечивающие жизнь и бла-
гополучие человека на Земле. Кроме того, растение в
процессе своей жизнедеятельности в результате метабо-
лических реакций способно создавать вещества вторич-
ного синтеза, которые обладают ярко выраженной био-
логической активностью и (будучи изолированными из
растений) с успехом используются в качестве лекарст-
венных средств при лечении различных заболеваний че-
ловека.
Растения в процессе фотосинтеза используют сол-
нечную энергию. Энергия и углерод остаются в расти-
тельном организме в форме фосфорилированных саха-
ров, из которых в дальнейшем синтезируются углерод-
ные скелеты пластических веществ, служащих источни-
ком энергии расходуемой на синтезы веществ вторич-
ного происхождения.
Синтез биологически активных веществ тесно связан
с основными обменными процессами в растении. При
дыхании растению удается энергию, заключенную
в химических связях, использовать полностью, так как
процесс окисления субстрата состоит из ряда этапов и
энергия высвобождается небольшими порциями и тут
же постепенно используется для синтеза веществ струк-
турного характера, Запасных питательных веществ и
биологически активных веществ [3, 10].
Занимаясь исследованием соединений вторичного
синтеза (условно под этим термином мы подразумеваем
биологически активные вещества — эфирные масла, сте-
роидные и фенольные соединения, алкалоиды и др.), ис-
следователю важно представить место и характер их
178
биосинтеза, связь с метаболическими реакциями расти-
тельного организма. Познание путей биосинтеза позво-
лит углубить теоретические знания в области биохи-
мии растений и прогнозировать накопление их, учиты-
вая единый биогенетический путь синтеза.
Вещества, исследованием которых занимается кол-
лектив авторов настоящей работы, можно разделить на
две группы: фенольные и изопреноидные.
Изопреноиды — вещества, по составу кратные изопре-
ну С5Н8. Они составляют основу компонентов эфирных
масел, сесквитерпеновых у-лактонов, смол, витаминов
А и К, сердечных гликозидов, сапонинов, экдистероидов
и др. изопреноидных соединений и подразделяются на:
монотерпеноиды Ci0Hi6; сесквитерпеноиды С15Н24; дитер-
пены С20Н32; тритерпены Сз0Н48; тетратерпены С4оН64;
политерпены (Ci0Hi6)n. Их биосинтез начинается с окис-
ления глюкозы — продукта фотосинтеза (схема 3).
Более детально биосинтез изопреноидных соедине-
ний представлен на схеме 4, составленной по К. Боннеру
[1] и П. де Майо [8, 11].
Составные части эфирных масел, проазулены (гвай-
анолиды), сесквитерпеновые лактоны образуются из ге-
ранилпирофосфата (монотерпеноиды) и фарнезилпи-
рофосфата (сесквитерпеноиды). Фарнезилпирофосфат
является предшественником сквалена, циклизация ко-
торого приводит к образованию холестерина, фитосте-
ринов, стероидов и тритерпенов (схема 5).
У растений все типы стероидных соединений, как вид-
но на схеме, образуются из сквалена, но промежуточ-
ным продуктом на пути образования фитостеринов явл-
яется циклоартенол, найденный в культуре ткани таба-
ка и в проростках гороха, а не ланостерол — характер-
циклоартенол
179
180
ный промежуточный продукт при биосинтезе холесте-
рина в_ животном организме. Экспериментальные данные
свидетельствуют о наличии в растительном организме
холестерина, прегненолона и прогестерола — типичных
стероидов животного происхождения [8]:
Полимеризация двух молекул геранилпирофосфата
приводит к образованию геранилгеранилпирофосфата
[13], являющегося предшественником каротиноидов,
трициклических дитерпенов . и гиббереловой кислоты
(схема 6).
Полиацетиленовые соединения (полинны),. как вид-
но на схеме 3, в процессе своего образования в растении
тесно связаны с липидным обменом. Олеиновая кислота
является, как показали экспериментальные исследования
с помощью меченых атомов, предшественником в био-
синтезе различных типов полиацетиленовых соединений

рарнезилпирасроссрат
витано/шды
Схема 5
с Си [9]. Предлагают, что образование в природе боль-
шинства соединений этого ряда протекает за счет от-
181
щепления углерода карбоксильной группы олеиновой
кислоты путем известной в биохимии реакции фермента-
тивного р-окисления
R-CHrCH2-COOH-*R-CH2-CH2-C^H-^R-CH=CH2+CO2+H2O
Биосинтез фенольных соединений (флавоноиды, ку-
марины) тоже тесно связан с углеводным обменом [2,
4, 5, 6]. С помощью меченых атомов установлено обра-
зование их через шикимовую кислоту, биосинтез кото-
рой тесно связан с обменом углеводов и ароматических
кислот. Исходными продуктами при ее образовании слу-
жаТ~ фосфоенолпировиноградная кислота и^В-эритро-
зо-4-фосфат, возникающие в процессах гликозида из
пентозофосфатного цикла [5, 7, 12] (схема 7).
герзнил-гераниол
трициклический ди терпен
клротиноиды
Схема 6
Шикимовая кислота служит исходным продуктом для
образования многих ароматических соединений, в том
числе и флавоноидов. Длинный ферментативный путь
последовательных ее превращений в коричную кислоту
приводит к образованию В-кольца флавоноидов. Аце-
182
татно-малонатный путь, связанный с метаболизмом
жирных кислот, приводит к образованию кольца А фла-
воноидов (см. схему 7). Здесь указан путь образования
ГЛЮКОЗА-----------------------:----И крклеотиды
гликолиз „ -пентозный цикл
I +
ГЛЮКОЗО-б-фОСфЯТ эритрозо-4-растрат
4
фосфоеноллировиноградная дегидрохинная
кислота кислота
I y
пировиноградная кислота X. шикимовая кислота
ацетил-Ко А
I
жирные кислоты
кольцо А
. ^пререновая кислота
।
V
ароматические аминокислоты
г (ренилаланиц тирозин)
кислоты
I
флавоноиды
I
кольцо В
(коричная-кумаровая -коренная)
I
кумарины
кумаровая кислота
Схема 7
кумарин
кумаринов из ароматических аминокислот через ряд
последовательно образующихся фенолокислот (корич-
ная, кумаровая, кофейная, феруловая)/
Представление о близости биосинтетических путей
природных соединений, знание промежуточных этапов
183
их синтеза и промежуточных веществ, образующихся при
синтезе основных биологически активных веществ, мо-
жет способствовать более правильному и глубокому
решению проблем фитохимического анализа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Боннер К. Биохимия растений. — М.: Мир, 1968, с. 394—
433.
2. Биохимия фенольных соединений. — М.: Мир, 1968.—
451 с.
3. Гелетой А., Девис П., Сэттер Р. Жизнь зеленого
растения. — М.: Мир, 1983. — 549 с.
4. Запрометов М. Н. Образование к функции фенольных
соединений в выбших растениях. — Общ. биол., 1970, т. 31, № 2,
с. 201—220.
5. Запрометов М. Н. Биосинтез фенольных соединений и
его регуляция. — Усп. совр. биол., 1971, т. 72, вып. 2 (5), с. 219—
252.
6. Запрометов М. Н. Основы биохимии фенольных соеди-
нений.— М.: Высшая школа, 1974. — 214 с.
7. Запрометов М. Н. Метаболизм фенольных соединений
в растениях. — Биохимия, 1977, т. 42, вып. 1, с. 3—20.
8. Крет о вич В. Л. Основы биохимии растений.— М.: Высшая
школа, 1971.— 462 с.
Э. Кучеров В. Ф., Мавров М. В., Держинский А. Р.
Природные полиацетиленовые соединения.— М.: Наука, 1972. —
390 с.
10. Либберт Э. Физилогия растений. — М.: Мир, 1976.
с. 299-334.
11. Майо П. де. Терпеноиды. — М.: ИЛ, 1963. — 494 с.
12. М и н а е в а В. Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их
практическое использование. — Новосибирск: Наука, 1978.— 252 с.
13. Основы биохимии (Уайт А., Хендлер Ф., Смитт Э.,
Хилл Р., Леман И.). Т. 2. —М.: Мир, 1981, с. 542—869.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие........................... . . . 3
Глава 1. Эфирные масла..........................5
Глава 2. Азулены , ........ 26
Глава 3. Полиины ;..............45
Глава 4. Сесквитерпеновые лактоны..............56
Глава 5. Иридоиды..............................77
Глава 6. Экдистеронды ........ 93
Глава 7. Тритерпеновые сапонины...............116
Глава 8. Флавоноиды...........................138
Глава 9. Кумарины.............................161
Глава 10. Биосинтез некоторых групп биологически актив-
ных веществ и его, связь с основным обменом веществ в
растении......................................178
Ефим Авраамович КРАСНОВ
Тамара Павловна БЕРЕЗОВСКАЯ
Надежда Васильевна АЛЕКСЕЮК
Надежда Ивановна БЕЛОУСОВА
Людмила Андреевна ДЕМИДЕНКО
Владимир Владимирович ДУДКО
Степан Евгеньевич ДМИТРУК
Галина Ильинична КАЛИНКИНА
Галина Алексеевна РОМАНОВА
ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПРИРОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Редактор К. Г. Шилько
Художественный редактор Р. М. Вазиев
Технический редактор Р. А. Прошенкина
Корректор Г. П. Орлова
ИБ 1733
Сдано в набор 24.06.1985 г. Подписано в печать 19.03.1987 г.
К306128 Формат 84X108*/зг; Бумага типографская № 3. Гарнитура
Литературная. Печать высокая. Печ. л. 5,75+1 вкл.
Усл. печ. л. 9,87. Уч.-изд. л. 10,375.
Тираж 5000 экз. Заказ 2909. Цена 1 р. 60 к.
Типография изд-ва «Красное Знамя», 634050, ГСП,
Томск, пр. Фрунзе, 103.
Издательство Томского университета, 634029, Томск, ул. Никитина, 4.