/
Автор: Кушнір Г.П. Сарнацька В.В.
Теги: біологія рослинництво культурні рослини біотехнології
ISBN: 966-00-0551-2
Год: 2005
Текст
Г.П. КУШНІР
В.В. САРНАЦЬКА
мікроклональнє
розмноження
рослин
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ
Г.П. КУШНІР
В.В. САРНАЦЬКА
мікроклональнє
розмноження
рослин
ТЕОРІЯ І ПРАКТИКА
ПРОЕКТ
«НАУКОВА КНИГА»
КИЇВ • НАУКОВА ДУМКА • 2005
УДК 581.143.6
Монографія присвячена теоретичним основам і прикладним аспектам мік-
роклонального розмноження рослин, яке дедалі ширше застосовують у прак-
тиці сільськогосподарського виробництва для збільшення коефіцієнта роз-
множення і оздоровлення рослин. Викладено техніку роботи з культурами
клітин, тканин і органів рослин та індукції морфогенезу в культурі іп уііго,
подано склад живильних середовищ, які найширше використовують. Наве-
дено етапи сучасної техніки мікроклонального розмноження окремих видів
рослин: овочевих, злакових, технічних та плодово-ягідних культур, декора-
тивних рослин та основних деревних порід.
Для науковців, викладачів і студентів вищих закладів освіти біологічно-
го і біотехнологічного напрямів, працівників біотехнологічних лабораторій.
Відповідальний редактор
академік НАН України Д.М. Гродзинський
Рецензент
чл.-кор. НАН України, д-р біол. наук,
професор Я. Б. Блюм
Рекомендовано до друку вченою радою
Інституту фізіології рослин і генетики
Видання здійснене за державним контрактом
на випуск наукової друкованої продукції
Редакція медико-біологічної, хімічної
та геологічної літератури
Редактор Ж. В. Загоруйко
3704010000 - 067
к----------------
2005
18ВN 966-00-0551-2
© Г.П. Кушнір,
В.В. Сарнацька, 2005
ПЕРЕДМОВА
Фундаментальні дослідження молекулярної біології, фізіології
рослин і генетики минулого століття сприяли розвитку біотехно-
логії рослин, яка в багатьох країнах визнана одним із пріоритет-
них напрямів національної економіки.
Використання мікроклонального розмноження (МКР) рослин
дає змогу вирішувати важливі проблеми рослинництва, а саме: в
десятки і сотні тисяч разів збільшити коефіцієнт розмноження
рослин, отримати здоровий, позбавлений вірусної й бактеріаль-
ної інфекції посадковий матеріал. Цей метод можна застосовува-
ти у селекційній роботі для репродукції нових гібридних сортів і
отримання трансформованих рослин, а також за його допомогою
зберегти генофонд рідкісних і зникаючих видів природної флори.
Метод культури ізольованих тканин незамінний у досліджен-
ні послідовності метаболічних процесів при індукції проліфера-
ції, вивченні біохімії клітинного циклу, механізму морфогенезу,
дії фітогормонів, а також створенні нових форм рослин за допо-
могою генної інженерії. Технологія МКР рослин постійно роз-
вивається й удосконалюється: в культуру вже введено понад 1000
видів декоративних, овочевих, технічних і деревних рослин.
В Україні дослідження в галузі біотехнології розпочато понад
20 років тому в інститутах Національної академії наук — Інсти-
туті фізіології рослин і генетики, Інституті клітинної біології та
генетичної інженерії, Інституті ботаніки ім. М.Г. Холодного, На-
ціональному ботанічному саду ім. М.М. Гришка, а також в На-
ціональному аграрному університеті та інститутах Української
академії аграрних наук (УААН) — Інституті цукрового буряку,
Інституті картоплярства, Інституті винограду і вина “Магарач”,
Інституті садівництва, Селекційно-генетичному інституті, Нікіт-
ському ботанічному саду — Національному науковому центрі
(НБС-ННЦ) та ін.
Багато наукових розробок уже вийшли за межі лабораторій і
впроваджені у промислове виробництво. Лабораторії і виробничі
об’єднання проводять оздоровлення і контроль за санітарним
З
Передмова
станом посадкового матеріалу і передають його у господарства,
що спеціалізуються на вирощуванні певних видів рослин.
Слід зазначити, що ефективність і рентабельність цього мето-
ду розмноження можливі лише у разі залучення кваліфікованих
спеціалістів і чіткої організації усіх етапів процесу. Потрібно та-
кож автоматизувати і механізувати трудомісткі операції, оптимі-
зувати і здешевити склад живильних середовищ.
Поглиблене, всебічне вивчення морфогенетичних потенцій
тканин у культурі іп уіїго сприятиме розробці оптимальних, ра-
ціональних схем МКР, добору фітогормонів, що стимулюють ре-
генерацію рослин.
З часу виходу нашої монографії [44] дослідження цього мето-
ду розмноження рослин набули широкого розмаху і практичного
застосування. Це спонукало нас до повнішого висвітлення до-
сягнень світового, вітчизняного і власного досвіду МКР різних
видів рослин.
У монографії викладено теоретичні основи та найраціональ-
ніші методи розмноження деяких декоративних, сільськогоспо-
дарських, плодово-ягідних і деревних рослин. Наведені дані да-
леко не вичерпні, бо постійно з’являються повідомлення щодо
нових видів рослин, які розмножують у культурі іп уіїго, а також
ефективних технологій МКР і впровадження їх у практику рос-
линництва. Можна сподіватися, що найближчим часом відкри-
ються нові можливості біотехнології.
Висловлюємо щиру подяку З.П. Антонюку і | Б.Ю. Середюку|
за допомогу у підготовці цієї монографії, І.В. Кушніру — за ху-
дожнє оформлення.
_________________РозОіл 1 _________________
МОРФОГЕНЕЗ В УМОВАХ ІМ УІТРО:
ТИПИ МОРФОГЕНЕЗУ І ЙОГО РЕГУЛЯЦІЯ
Морфогенез — це розвиток структур із недиференційованого
стану в диференційований. У культурі рослин цей процес
може приводити до диференціації органів сіє поуо (органогенез).
Специфіка морфогенезу у вищих рослин полягає в тому, що тео-
ретично кожна соматична клітина зберігає здатність до диферен-
ціації і може дати початок цілій рослині внаслідок переходу в
умовах іп уііго до дедиференціації. Рослинній клітині властива
тотипотентність, тобто спроможність клітини зберігати потен-
ціал до формування усіх типів клітин зрілого організму. Іншими
словами, тотипотентність — це здатність окремих клітин до від-
творення ембріо- і морфогенезу без проходження репродуктив-
ної фази — цвітіння. Отже, органогенез і соматичний ембріоге-
нез є репродуктивною стратегією, альтернативною до цвітіння.
Висловлюється припущення, що такий нестатевий тип розмно-
ження — це релікт розвитку, який зберігся у рослин і завдяки
якому можливе їх клональне розмноження. Фізіологічні, біохі-
мічні та молекулярні процеси, які лежать в основі морфогенезу,
вивчені недостатньо, що не дає можливості створити теорію
морфогенезу. Труднощі у вивченні цього процесу полягають в
тому, що диференціація клітин і органогенез відбуваються асин-
хронно: клітини, які диференціюють, розділені у просторі. У
зв’язку з цим під час дослідження морфогенезу ведеться пошук
найпростіших модельних систем, у яких зміна факторів навко-
лишнього середовища супроводжується чіткою морфогенетич-
ною реакцією.
Відтворення різних реакцій клітин і тканин у відповідь на
зміни умов живлення, дії гормонів чи фізичних факторів дає
змогу пізнати природу і механізм дії індукторів диференціації.
Класичним прикладом демонстрації ролі співвідношення гор-
монів (ауксинів і цитокінінів) в утворенні коренів або стеблових
бруньок є досліди з серцевиною тютюну [444].
5
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Ізоляція рослинних клітин, що знаходяться у стані спокою,
відділення від клітин, які їх оточують, і культивування в жи-
вильному середовищі з гормонами відновлюють проліферацію.
Вважають, що у цілому організмі неконтрольована проліферація
клітин усередині тканини пригнічується внаслідок контактного
інгібування. При ізоляції зі зрілої тканини, що знаходиться в
стані спокою, і культивуванні у живильному середовищі рослин-
на клітина втрачає свою ідентичність, тобто ознаки диферен-
ціації, а також здатність відповідати пригніченням проліферації у
відповідь на контактне інгібування.
Як відомо, органогенез у культурі тканин відбувається у дві
фази [14, 419]. Перша — дедиференціація, під час якої спеціалі-
зована клітина перетворюється в калусну. Необхідною умовою
для цього є перенесення ізольованої рослинної тканини в агари-
зоване, або рідке живильне середовище, яке містить елементи
живлення і гормональні фактори. Успіх в отриманні калусу пе-
реважно залежить від вдалого підбору концентрації і співвідно-
шення фітогормонів та вибору експланта. Під час другої фази —
індукції морфогенезу — в неорганізованих калусних тканинах ут-
ворюються морфологічні структури, в яких, у свою чергу, фор-
муються адвентивні (утворені де поуо) бруньки, корені, пагони,
квітки або квіткові ініціалі, зародки, структурно подібні до тих,
які формуються в насінні, листки (що засвідчує наявність мери-
стеми пагонів) і окремі рослинки-регенеранти. Тканини або ор-
гани, які зберігають здатність до морфо- чи органогенезу, нази-
вають морфогенними або органогенними.
Морфогенні меристеми можуть утворюватись як на експлан-
тах диференційованої тканини, перенесеної в умови іп уіїго, без
утворення калусу, внаслідок прямого органогенезу, так і в ка-
лусній тканині, яка складається із дедиференційованих клітин,
або в культурі суспензії клітин, внаслідок непрямого органоге-
незу. Іноді на практиці важко чітко розрізнити ці два способи
органогенезу, оскільки у морфогенних меристемах, що форму-
ються на експлантах диференційованої тканини, перед утво-
ренням соматичних зародків або пагонів спостерігається фор-
мування ділянок тканини, схожої на калус. Диференційовані
клітини інтактної рослини дуже відрізняються за здатністю до
дедиференціації і морфогенезу; деякі форми високоспеціалізо-
ваних клітин втратили її назавжди. Клітини, які зберегли або
набули здібності до певного типу диференціації чи морфогенезу
6
Розділ 1. Морфогенез в умовах іп міго: типи морфогєнезу і його регуляція
у відповідь на конкретний стимул, називають компетентними
[226]. Як за прямого, так і за непрямого органогенезу на певній
стадії утворення нової меристеми компетентні клітини вибира-
ють різні програми, шо визначають подальший розвиток (стадія
детермінації). Існує припущення, шо морфогенно компетентна
клітина набуває здатності до диференціації певного типу, на-
приклад до диференціації лише пагонів. Окремі клітини або їх
групи стають детермінованими, коли вступають на генетично
детермінований шлях розвитку до певного типу морфогєнезу, і
цей розвиток триває без подальшого впливу регуляторів росту
[168]. Стадії компетентності і детермінації часто важко розме-
жувати, оскільки у разі неорганізованої калусної тканини це
програмування (детермінація) індукується регуляторами росту
разом із відповідною комбінацією елементів живлення. Мор-
фогенні центри утворюються лише з невеликої кількості клітин
порівняно з їх загальною кількістю в культурі. Можливо, вони
виникають із тих клітин, які були у відповідній фазі клітинного
циклу в момент застосування індукторів диференціації (орга-
ногенезу). Крім того, є дані (цит. за: [226]), що меристеми, які
утворилися першими, пригнічують подальше формування цих
структур за допомогою регуляторів росту, які синтезуються в
первинних меристемах.
Як зазначено вище, молекулярні процеси, зокрема сигнальні
системи, відповідальні за індукцію диференціації і органогенезу
та їх зв’язок з регуляцією клітинного циклу, ще потребують по-
дальших детальних досліджень. Серед фізіологічних характери-
стик, властивих клітинам калусу або суспензійної культури, що
здатні переходити до морфогєнезу, відмічають накопичення кро-
хмалю [476, 478—480], найчастіше в клітинах, розміщених там,
де утворюються примордії пагонів. Крохмаль синтезується з цук-
рози, яка надходить з культурального середовища [477]. Оскіль-
ки крохмаль швидко зникає з клітин після утворення меристе-
моїдів або примордіїв пагонів, зроблено висновок, що він є пря-
мим джерелом енергії для клітини, яка переходить до морфоге-
незу [480]. Встановлено також, що крохмаль накопичується в
калусах перед утворенням пагонів або коренів. Для калусів, не
здатних до морфогєнезу, це не характерно [301].
У літературі, присвяченій органогенезу, широко дискутуєть-
ся питання, чи походять органогенні пагоневі меристеми з од-
нієї епідермальної клітини, чи для їх ініціації потрібна асоціа-
7
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ція епідермальних і субепідермальних клітин. Одноклітинне по-
ходження адвентивних пагоневих бруньок засвідчує висока час-
тота утворення мутантних рослин, яка має місце при обробці
рослин мутагенами. Якби органогенні меристеми виникали з
декількох клітин, спостерігалося б утворення великої кількості
химер. У зв’язку з цим С. Вгоеі]і8 і А. Кееп [153] вважають, що
адвентивні меристеми пагонів, які формуються в результаті пря-
мого органогенезу, завжди утворюються з однієї або декількох
дочірніх клітин, що, у свою чергу, беруть початок з окремої
клітини. Водночас В. Моггіз і В.. 8тііЬ [372], вивчаючи регене-
рацію пагонів із листків сенполії, дійшли висновку, що в утво-
ренні стеблових меристем беруть участь також клітини субепі-
дермального шару.
Органи рослин часто формуються із сфероподібних утворів,
меристемоїдів, що складаються з дрібних меристематичних клі-
тин, заповнених цитоплазмою, і мають велике ядро.
При МКР використовують меристеми, верхівки пагонів, па-
зушні бруньки для індукції адвентивних пагонів і/або адвентив-
них соматичних зародків безпосередньо з експлантів, виділених
із материнської рослини (прямий органогенез), або неорганізо-
ваних калусів чи суспензійних культур, отриманих проліфера-
цією клітин експланта (непрямий органогенез).
Підсумовуючи багаторічний досвід МКР, автори [44, 226,
227] рекомендують (рис. 1) використовувати:
• культури меристем (0,2—0,5 мм), латеральні бруньки чи вер-
хівки пагонів (1—2 мм), які укорінюють або розділяють на між-
вузля і після підростання укорінюють;
• міжвузля, які отримують розрізанням пагонів, що ростуть в
культурі іп уіїго; при культивуванні іп уіїго на кожному міжвузлі
формується пазушна брунька, з якої утворюється пагін, придат-
ний для розмноження;
• квіткові меристеми для отримання вегетативних пагонів,
які використовують для розмноження, як описано вище;
• експланти листків, сегменти стебла чи запасаючих органів
для регенерації стебла перед утворенням калусу (прямий орга-
ногенез);
• експланти ембріогенної тканини для отримання соматич-
них зародків до утворення калусу (прямий ембріогенез);
• морфогенний калус для регенерації пагонів, які після до-
сягнення висоти 10 мм укорінюють (непрямий органогенез);
8
Розділ 1. Морфогенез в умовах іп м(го: типи морфогенезу і його регуляція
• калус або суспензійну культуру клітин, здатну утворювати
соматичні зародки (непрямий ембріогенез).
Культуру пагонів отримують із верхівок латеральних або го-
ловних пагонів завдовжки до 20 мм, вичленених із пагонів, що
активно ростуть, або сплячих бруньок. Великі експланти краще
реагують на внесення в умови іп уіїго, швидше ростуть і мають
більше пазушних бруньок, проте їх важче стерилізувати. З метою
отримання великої кількості матеріалу для МКР в культурах
пагонів індукують ріст пазушних бруньок введенням до складу
живильного середовища цитокінінів. При цьому усувається апі-
кальне домінування й утворюється багато бічних пагонів, що
використовують як мікроживці. Щоб позбутися апікального до-
мінування, для деяких рослин (троянда [151], груша [433]) реко-
мендують відщипнути верхівку основного пагона під час першої
пересадки. Потрібно зазначити, що цитокініни, які вносять у се-
редовище для індукції росту пазушних пагонів, як правило, при-
гнічують утворення коренів. Тому перед перенесенням їх із умов
іп УІІГО у ґрунт пагони спочатку укорінюють у живильному сере-
довищі або стерильному грунті.
Іншим способом усунення апікального домінування є гори-
зонтальне розташування експлантів на середовищі. Цей спосіб
досить ефективний при культивуванні відрізків пагонів (2—3 між-
вузля) деревних порід [343].
Для того щоб легше було розділити пагін на міжвузля, у се-
редовище вводять гіберелову кислоту, яка спричинює його ви-
довження.
Одним з ефективних методів отримання пагонів для МКР є
пророщування насіння на середовищі з цитокініном. У цьому
разі утворюються цілі пучки пазушних або адвентивних паго-
нів, які розділяють і пересаджують на таке ж середовище. Біль-
шість повідомлень щодо пророщування насіння на середовищі
з цитокінінами стосується утворення адвентивних пагонів під
час пророщування насіння дводольних, як трав’янистих, так і
деревних (сої [267], цукрового буряку [404], мигдалю [268],
огірка і гарбуза [267, 268]), а також однодольних — кукурудзи і
рису [268].
Крім того, при культивуванні сегментів молодих суцвіть, з
яких ще не утворились індивідуальні квіткові меристеми, отри-
мують пагони для МКР (цибулі [197, 198|, цвітної капусти
[241]).
9
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Розділ 1. Морфогенез в умовах іп уііго: типи морфогєнезу і його регуляція
Меристеми
Верхівка
пагона
Пазушні
бруньки
Сегменти
бутона
Сегменти
квітки
Сегменти
пагона
Рис. 1. Схема мікроклонального розмноження рослин
Сегменти
листка
Відрізки
меристеми
кореня
Прямий ембріогенез, тобто формування на експлантах сома-
тичних зародків без утворення калусної тканини, спостерігається
при культивуванні пиляків із пилкових мікроспор, усіх частин
зав’язі, яйцеклітини, особливо з тканин нуцелуса, зиготичного
зародка або молодих проростків.
Прямий ембріогенез іп уііто відбувається лише у тих клітинах
експланта, які вже попередньо підготовлені до диференціації в
зародки, і перенесення їх в умови іп уііго тільки прискорює цей
процес [431]. Експланти, здатні до прямого ембріогенезу, можуть
утворювати калус, який регенерує зародки. Суспензійна культура
10
11
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
клітин, отримана з такого калусу, має такі ж властивості [448].
Отже, тканини, здатні до прямого ембріогенезу, зберігають цю
властивість і в більш дедиференційованому стані, при культиву-
ванні їх у вигляді калусу або суспензії клітин.
Соматичні зародки завжди утворюються на поверхні калусу,
легко відділяються від довколишніх клітин, оскільки не зв’язані
з тканиною, на якій формуються. Ці структури утворюються та-
кож із клітин, що мають щільну цитоплазму та великі ядра і міс-
тять багато крохмалю, водночас звичайні клітини калусу є па-
ренхіматичними з великими вакуолями. Соматичні зародки за
структурою дуже подібні до зиготичних. Також майже немає
різниці у стадіях їх розвитку, і тому вважають, що процеси зиго-
тичного і соматичного ембріогенезів однакові. Для зародків дво-
дольних розрізняють такі стадії розвитку: 1) проембріо — малі
угруповання меристематичних клітин, з яких утворюються сома-
тичні зародки; 2) глобулярна — більші групи меристематичних
клітин, що за формою нагадують зародок; 3) серцеподібна — за-
родок має характерну 3-лопатеву форму; 4) торпедо — зародок
видовжений, ініціалі сім’ядолей виразніші; 5) рослинка — можна
розгледіти малий “проросток” з первинним корінцем і стебель-
цем. У однодольних стадії розвитку зародка дещо інші: на глобу-
лярній утворюються пагони, які в процесі розвитку дають поча-
ток структурам, що нагадують щиток і колеоптиль. Від адвен-
тивних пагонів вони відрізняються своєю біполярністю, тобто
мають пагоневий і корінцевий полюси і не зв’язані судинами із
тканиною, з якої утворились. Розвиток техніки культивування
рослинних клітин і тканин іп уіїго дає змогу стимулювати сома-
тичний ембріогенез у більшості видів.
Прямий органогенез
Для його ініціювання, як правило, використовують відносно
великі експланти. У живильних середовищах на них можуть
формуватися корені, пагони або соматичні зародки без поперед-
нього утворення калусу. Для реалізації морфогенного потенціалу
має велике значення, з якого органу рослини відбирають екс-
планти. Адвентивні бруньки можуть утворитися на експлантах,
взятих із різноманітних органів (черешків листя, стебла, коренів,
листків чи сім’ядоль). Частіше вони формуються на тканинах
нунелуса, проростках, отриманих із соматичних зародків, і дуже
рідко — на тканинах листків. Утворення коренів унаслідок пря-
12
Розділ 1. Морфогенез в умовах іп иііго: типи морфогенезу і його регуляція
мого морфогенезу на експлантах некореневого походження спо-
стерігається не так часто: це відмічено тільки у видів Вгаккіса,
Реіипіа, Саркісшп і АЬеїтоксЬия ексиїепіик (цит. за: {226]).
Непрямий органогенез
Для індукції непрямого морфогенезу з калусних культур, тобто
для утворення морфогенних меристем, які дають початок росту ко-
ренів або пагонів, потрібна пересадка калусних культур на середо-
вище для регенерації іншого складу, зі зміненим співвідношенням
регуляторів росту. У деяких випадках, у разі тривалого вирощуван-
ня без пересадок, спостерігається спонтанний органогенез. Зазна-
чено, що культури з найбільшою здатністю до органогенезу отри-
мані від молодих органів рослин з інтенсивним поділом клітин.
Утворення органів із калусу відбувається також внаслідок поперед-
нього формування меристематичних центрів, які дають початок ад-
вентивним пагонам, кореням та ембріоїдам. Непрямий соматичний
ембріогенез здійснюється у клітинах, в яких у процесі інтенсивного
поділу в культурі відбулися дедиференціація та індукція детермі-
нації ембріогенезу.
Морфогенез іп уііто має три етапи [362], які характеризують-
ся не лише зміною процедур у процесі культивування, а й різни-
ми вимогами до здовколишнього середовища. Перед введенням
у культуру часто проводиться обробка і підготовка маточних рос-
лин. Деякі автори у зв’язку з цим виділяють цей період в окре-
мий етап, наприклад етап 0 (цит. за: [226]). У сучасних дослі-
дженнях виокремлюють також етап IV, на якому рослини пере-
носяться з умов іп уйго в умови вирощування в ґрунті.
Етап 0. Відбір і підготовка маточних рослин
Перед початком МКР велику увагу слід приділити відбору
маточних рослин, які мають бути типовими для цього виду чи
сорту і без ознак захворювання. У цей період вживають заходи
щодо зниження рівня інфікованості експлантів, визначення на-
явності системного вірусного чи бактеріального захворювання та
його лікування.
Етап І. Отримання стерильної культури
На цьому етапі основне завдання — виділити стерильний ек-
сплант, перенести його у стерильних умовах на відповідне жи-
13
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
вильне середовище і отримати на експланті ріст тканин певного
типу — калусу чи ізольованих меристем.
Етап II. Утворення морфогенних структур
До них належать соматичні зародки, протокорми, пазушні
або верхівкові бруньки і т. і., які у разі відділення від калусу на
живильному середовищі можуть дати початок рослинам-регене-
рантам. Деякі з новоутворень, що формуються протягом етапу
II, наприклад пагони, можна використати як матеріал для по-
дальших циклів розмноження, якщо під час пересадок їх кіль-
кість збільшується.
Етап III. Підготовка до росту
в природному середовищі — укорінення
Рослинки, або пагони, що утворилися протягом етапу II, ду-
же малі і нездатні для росту в грунті або компості. Упродовж
етапу III на пагонах мають утворитись корені. Для цього вико-
ристовують спеціальні середовища для укорінення. У деяких ла-
бораторіях для зниження вартості пагони переносять з умов іп
уііго в умови ехіга уіігит і укорінюють їх поза культуральними
посудинами. У тому разі, коли при МКР використовують адвен-
тивні або пазушні бруньки, етап ПІ розділяють на два підетапи:
етап Ша, протягом якого ініціюють ріст бруньок або пагонів,
утворених на етапі II, і етап ІПб — укорінення пагонів, отрима-
них на етапі І Па в умовах як іп уіїго, так і ехіга уіігит.
Етап IV. Перенесення рослин-регенерантів
у природне середовище
Протягом цього етапу рослини-регенеранти готують до пе-
ресадки в грунт: виймають з посудин, в яких вони були на ета-
пі ПІ, ретельно відмивають корені від агару, переносять у сте-
рилізовану суміш для укорінення, наприклад суміш торфу й
компосту, і витримують декілька діб в умовах підвищеної во-
логості і зниженої інтенсивності освітлення або в туманоутво-
рювальній установці. Поки не буде ретельно відпрацьована тех-
нологія перенесення регенерантів у ґрунт, може відбуватись
значна їх втрата. У зв’язку з тим, що рослини-регенеранти в
умовах іп уйго ростуть за високої вологості і низької інтен-
сивності освітлення, кутикула їх листків містить менше воску,
14
Розділ 1. Морфогенез в умовах іп иїго: типи морфогєнезу і його регуляція
продихи втрачають здатність до повного закриття в умовах мен-
шої вологості, в результаті чого такі рослини швидше втрача-
ють воду при перенесенні у природне середовище. Встановлено
також, шо перехід до автотрофного живлення у цьому разі від-
бувається протягом декількох діб.
Фактори, що впливають на регенерацію рослин
Реалізація морфогенного потенціалу культивованих тканин
залежить від багатьох факторів, серед яких можна виділити три
групи: генотип материнської рослини, тип експланта та умови
його культивування.
Генотип рослин. Найбільший вплив на регенерацію експлан-
тів має генотип материнської рослини. Помічено, що види рос-
лин, які добре розмножуються вегетативно (бегонія, паперомія,
стрептокарпус, сенполія та ін.), мають високу регенераційну
здатність у культурі іп уіїго. Це представники родин 8о1апасеае,
ПтЬеІіГегае, СгисіГегае, Сотрокііае. Дуже важко регенерують рос-
лини з родин Сгатіпеае і Ье^нтіпокае. У межах одного виду
певні генотипи можуть розмножуватися краще. Так, експланти
сортів антуріуму Андре з рожевими та малиновими оцвітинами
майже у 100 % випадків утворювали калус і регенерували росли-
ни, а форми з червоними оцвітинами — лише у ЗО—40 %. Серед
генотипів антуріуму Андре лише 1/3 може його проліферувати, а
серед антуріуму Шерцера 3/4 здатні утворювати калус з наступ-
ним морфогенезом. Значні відмінності спостерігали у культива-
рів бегонії, гладіолуса, нарцисів, лілії, гіацинта. Дуже часто на
МКР впливають сортові відмінності рослин, що зумовлені різ-
ним вмістом ендогенних регуляторів росту в тканинах. Експлан-
ти по-різному реагують на склад живильного середовища і вияв-
ляють відмінності у проліферації калусу і морфогенезі рослин.
Морфогенний потенціал дводомних рослин також відрізняється:
жіночі екземпляри Асііпісііа сіїіпепкік утворюють більше пагонів
на експлантах апексу стебла, ніж чоловічі [226].
Фізіологічний стан материнської рослини. Успіх МКР часто
залежить від умов вирощування материнської рослини. Визначе-
но, що найкращі експланти можна отримати від здорової силь-
ної рослини, що росте на удобреному ґрунті за достатньої воло-
гості. У багатьох рослин морфогенна здатність у культурі тканин
обмежена періодом активного вегетаційного росту, збільшується
під час бутонізації й цвітіння і знижується в період спокою. Тка-
15
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
нини, вилучені весною, дають більшу кількість регенерованих
рослин. Так, весняні експланти гербери мають більші морфоген-
ні потенції, ніж осінні.
В основі динаміки морфогенного потенціалу, пов’язаного з
порами року, лежать зміни фізіологічного стану рослин під час
вегетації, накопичення ендогенних регуляторів росту в ткани-
нах. Експланти лусок цибулини Ьоііит 8р., видалені весною
або влітку, проліферують калус на живильному середовиші без
додавання ауксинів, а восени — лише за допомогою регуляторів
росту.
Тип експланта. Реалізація морфогенного потенціалу значною
мірою залежить від якості експланта. Тканини різного поход-
ження від рослин багатьох таксономічних груп успішно вводять
у культуру. Для МКР придатні усі меристематичні тканини,
яким властива метаболічна активність. Ці тканини краще за інші
приживлюються в культурі і зберігають ознаки клону. Вони міс-
тяться в апексах пагонів, термінальних і латеральних бруньках,
по всій тканині молодих листків або піхвах і кінчиках, на череш-
ках листків і квіток, лусках цибулин, сплячих бруньках пагонів і
квітконосах, на бутонах і пелюстках квітки.
Тотипотентність властива усім рослинним клітинам, але її
прояви обмежуються невеликою кількістю меристемоїдних, мор-
фогенно компетентних клітин, які започатковують розвиток ем-
бріоїдів, бруньок, пагонів, коренів [362].
Регенерація рослин у культурі відбувається за умови експе-
риментального керування трансформацією немеристематичних
клітин у меристемоїдні. Тому першорядним є виділення тканини
з найбільшим морфогенним потенціалом.
Органогенез культивованих тканин залежить від розміру екс-
планта: чим він менший, тим нижча його регенераційна здат-
ність. Великі експланти з ділянками паренхіми, провідною тка-
ниною і камбієм можуть спонтанно індукувати морфогенез неза-
лежно від концентрації фітогормонів у живильному середовищі.
Разом із тим помічено, що невеликі гомогенні ділянки епідер-
мальних і субепідермальних тканин, вільні від корелятивного
впливу інших тканин, можуть утворювати складні структури —
бруньки, пагони, корені.
З метою знищення вірусної інфекції ізолюють апікальні вер-
хівки завдовжки 0,1—0,2 мм без листкових примордіїв. Прижи-
влюваність таких експлантів дуже низька (1—10 %). Для масо-
вого МКР використовують апекси розміром 0,1—0,5 см з лист-
16
Розділ 1. Морфогенез в умовах іп уііго: типи морфогенезу і його регуляція
ковими примордіями і субапікальною тканиною, приживлю-
ваність яких значно більше, і вони здатні регенерувати цілі рос-
лини. Так, експланти верхівок пагонів яблуні з 4—6-листковими
примордіями розвиваються краще за апекси з 2 листками. Як
правило, розмір експлантів із листкових пластинок становить
1 см2, довжина листкових черешків — 3—5 мм. Прямий і непря-
мий морфогенез також залежать від розміру експланта. Так,
кількість регенерованих цибулинок на експлантах лусок гіацинта
зростає, якщо розміри збільшуються від 1 до 3 см. Формування
коренів на калусі Рориіик також зумовлене його розміром: на
більшому калусі, що утворився на великому експланті, проліфе-
рує більша кількість коренів. Проте у арабідопсиса невеликі екс-
планти калусу (75 мг) формують пагони і листки, а інокулюми
до 250 мг продовжують утворювати калус без морфогенезу [226].
Успіх регенерації часто залежить від розміщення експланта на
інтактній рослині. Апекси, видалені з термінальних бруньок,
мають більший морфоргенний потенціал, ніж апекси латераль-
них бруньок. Помітний вплив на проліферацію клітин і морфо-
генез має полярність органа чи тканини на інтактній рослині або
орієнтація експлантів на живильному середовищі.
Так, сегменти квітконоса гладіолуса утворюють калус і корені
на базальній частині, а бруньки і пагони — на дистальній [553].
Значні відмінності морфогенезу бруньок спостерігали у різних ек-
сплантів квітконоса лілії. Сегменти, взяті біля квітконоса (дис-
тальний кінець), утворюють у 5 разів більше бруньок, ніж сусідні,
особливо якщо їх розмістити дистальною частиною у середовище
(цит. за: [226]). Регенеративна здатність фрагментів листка, як пра-
вило, більша на проксимальній частині, ніж на дистальній. Це
пояснюється тим, що його проксимальна частина містить більше
меристематичних клітин. Експланти листків яблуні регенерують
пагони лише на проксимальній частині [512]. Численні протокор-
ми укорінюються на проксимальній частині адаксіальної поверхні
листка орхідей (Рйаіаепоркік і Уапсіа) [469].
Виявлено, що морфогенна здатність поверхні листка гене-
тично детермінована. Так, у рослин родини Ьіііасеае більшу ре-
генеративну активність має адаксіальна поверхня лусок, у Ата-
гуПісіасеае — абаксіальна (нижня). Експланти, вилучені з базаль-
ної частини лусок цибулин, утворюють більше адвентивних па-
гонів і цибулинок, ніж із дистальної.
Іноді ріст і морфогенез експланта залежать від його розмі-
щення на живильному середовищі. Сегменти молодих листків
2-6-83
17
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
суниці регенерують більше адвентивних пагонів, коли їх адаксі-
альна поверхня контактує з середовищем. Експланти лусок Ьі-
Іішп 1оп£ІПогигп проліферують набагато більше цибулинок, коли
їх розміщують абаксіальною частиною на середовищі.
Відрізки квітконоса гладіолуса утворюють калус і корені з
базального кінця, коли він занурений у середовище, але якщо
експлант перевернути, морфогенез відбувається значно швидше.
Інколи горизонтальне розміщення відрізків пагонів сприяє
кращій ініціації адвентивних пагонів, ніж вертикальне (у груші,
яблуні та деяких деревних рослин).
Морфогенетичний потенціал ізольованих тканин значною
мірою залежить від тривалості культивування. Помічено, що у
багатьох випадках під час перших декількох пересадок морфоге-
нез зростає. Подальше субкультивування знижує регенераційну
здатність експлантів. Експерименти з калусом Сопуоіуиінк вия-
вили, що після 3 пересадок деякі лінії втрачають здатність до
морфогєнезу, але її можна відновити додаванням кінетину до
живильного середовища.
Тканинні і клітинні культури багатьох рослин зберігають
регенераційну здатність тривалий час. Так, калус хризантеми, що
містить меристематичні зони, не втратив морфогенну властивість
протягом 3—5 років субкультивування, а калус томатів після
ЗО пасажів продовжував регенерувати рослини. Понад 3 роки ка-
лус Ьіііит був здатний до утворення коренів.
Первинний калус, що утворився безпосередньо з тканин екс-
планта, зберігає генотип материнської рослини. Під час субкуль-
тивування в ньому можуть виникати аномалії: зміна плоїдності,
хромосомні порушення, клітини-мутанти. Регенерація таких клі-
тин призводить до появи екземплярів, що генетично відрізня-
ються від материнської рослини. Кількість змінених рослин се-
ред загальної маси регенерантів тим більша, чим довше субкуль-
тивували калус. Тому краще використовувати лише первинний
калус, здатний до морфогєнезу ідентичних рослин.
Місткість культуральиого посуду. Помічено, що ріст і пролі-
ферація в культурі іп уіїго часто залежать від розміру культураль-
ного посуду. Це, очевидно, пояснюється різною концентрацією
кисню, оксиду вуглецю та етилену у посудинах різної місткості.
У малих посудинах, як правило, ріст ізольованої тканини при-
гнічується. Так, ріст пагонів сенполії відбувається краще в кол-
бах місткістю 120 мл, ніж 60 мл [179]. У багатьох деревних куль-
тур пагони також швидше проліферують у колбах на 200 мл.
18
Розділ 1. Морфогенез в умовах іп уііго: типи морфогенезу і його регуляція
Більшу кількість пагонів гербери отримано у посудинах місткіс-
тю 125 мл, ніж у пробірках 25 х 150 мм. Апекси актинідії краще
проліферують у колбах на 125 мл, ніж на 50, 250 чи 500 мл. Оче-
видно, не можна давати певної рекомендації щодо місткості по-
суду для певного виду, це слід добирати експериментально. Про-
те відомо, що експланти більшості видів рослин краще ростуть у
колбах на 250 мл [226].
Температура. На ріст і регенерацію ізольованих тканин іс-
тотно впливають умови культивування експлантів: температура,
освітлення, фотоперіод, відносна вологість повітря, склад жи-
вильного середовища.
Для більшості тканин температурний оптимум становить
24—25 °С, але існують відмінності між деякими видами рослин.
Очевидно, температурні умови, потрібні для вирощування мате-
ринської рослини, будуть оптимальними і при культивуванні ізо-
льованих тканин. Для тканин теплолюбивих тропічних рослин
температуру слід збільшити до 25—28 °С.
Іноді у рослин у межах одного генотипу виявляють різні оп-
тимуми температур. Так, під час дослідження морфогенної ак-
тивності експлантів 14 різних гібридів троянди більшість сортів
утворювала адвентивні пагони при 18 °С, інші — при 12, а де-
які — при 24 °С [100]. Формування цибулинок у Ьіііит аигаШт
найефективніше відбувається за температури 20 °С і поступово
знижується у разі її зростання до 30 °С.
Низькі значення температури (15—18 °С) протягом 2 тижнів
потрібні для індукції утворення пагонів у культурі черешків бе-
гонії [214]. Охолодження експлантів перед культивуванням тка-
нин гладіолуса поліпшує їх регенераційну здатність. Для деяких
видів рослин потрібне зниження температури для подолання
періоду спокою. Культура тканин сосни поступово припиняє
ріст, і його можна відновити зниженням температури культиву-
вання.
Для бруньок квітконосів фаленопсиса відмічено вплив тем-
ператури на тип морфогенезу: при 28 °С із бруньок регенерують
вегетативні пагони, а при 20 °С — генеративні.
Морфогенез експлантів часто залежить від температури ви-
рощування материнської рослини. Регенераційна здатність лист-
кових черешків у деяких видів бегонії зростає після витримуван-
ня інтактних рослин при 15—18 °С протягом 4 тижнів [214]. Ек-
спланти Рісеа аЬіех формують більше адвентивних бруньок після
утримання при 10—16 °С.
2‘
19
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Умови освітлення і фотоперіод. Як правило, ізольовані ткани-
ни впрошують за освітлення люмінісцентними лампами з ураху-
ванням вимог материнської рослини до інтенсивності освітлення
і тривалості фотоперіоду.
Т. МигазНі^е [362] радить на етапах розмноження І і II куль-
тивувати тканини при 1000—5000 лк і фотоперіоді 14—16 год.
Такі умови освітлення сприяють ініціації пагонів і коренів у
більшості рослин. Низька інтенсивність освітлення спричинює
зниження морфогенезу і вітрифікацію пагонів.
Так, культура пагонів Зіппіп^іа найкраще розвивається при
3000—10 000 лк; зниження освітлення сприяє утворенню калусу.
У експлантів І_о1іит тикіПогит формується більше пагонів за
освітлення 12 000 лк, ніж 9000 лк.
Збільшення освітлення експлантів Ве^опіа Ніегпаїік сприяло
посиленому утворенню пагонів. Проте є рослини, що негатив-
но реагують на інтенсивне освітлення. Так, пагони глоксинії
краще проліферують і утворюють листки за освітлення 3200 лк,
ніж 10 700 лк [226]. Максимальне утворення пагонів і коренів у
культурі тканин аспарагуса відбувається при 1000 лк (фотопе-
ріод 16 год); зниження інтенсивності освітлення пригнічує ор-
ганогенез. Регенерація коренів у протокормів цимбідіума зрос-
тає за збільшення освітлення. У темряві або при 1250 лк прото-
корми утворюють лише бруньки, а пагони і корені формуються
при 2200—2500 лк. Калусні тканини звичайно вирощують у
темряві, оскільки культура клітин на середовищі з цукрозою не
потребує фотосинтезу. Соматичний ембріогенез у культурі ка-
лусу здійснюється після перенесення на світло. Короткий пе-
ріод перебування у темряві іноді сприяє морфогенезу пагонів.
Адвентивні бруньки на експлантах Рісеа рип^епк проліферують
лише після того, як їх витримають у темряві протягом 8 діб, а
потім перенесуть на світло (1000 лк, фотоперіод 16 год). Така
закономірність спостерігається і у експлантів квітконосів фре-
зії. Утворення адвентивних бруньок значно зростає, якщо їх
експланти спочатку культивувати у темряві, а потім на світлі.
Для посилення регенерації пагонів експланти листків яблуні
протягом 3 тижнів витримують у темряві [512]. Морфогенний
потенціал експлантів рододендрона зростає після культиву-
вання у темряві протягом 2 тижнів перед перенесенням на світ-
ло [349].
Інтенсивність і характер росту ізольованих тканин залежить
також і від спектрального складу світла. Так, біле, червоне і синє
20
Розділ 1. Морфогенез в умовах іп иіго: типи морфогєнезу і його регуляція
світло інтенсивніше індукує утворення бруньок у тканині Неіопіо-
ргік огіепіаііх, ніж зелене. Червоне світло стимулює у тканині тю-
тюну утворення квіткових бруньок, а темнота — проліферацію
коренів. Адвентивні бруньки в калусі тютюну індукує ультрафіо-
летове, синє та фіолетове світло. У експлантів салату і псевдотсуги
червоне світло викликає утворення пагонів [362].
Тривалість освітлення впливає на морфогенез тканини і за-
лежить від виду інтактної рослини. Так, для тканини НеІіапіЬик
оптимальним є фотоперіод 12 год, що сприяє морфогєнезу паго-
нів. У калусі герані максимальна кількість бруньок утворюється
при фотоперіоді 16 год; зменшення або збільшення тривалості
освітлення пригнічує морфогенез. У деяких сортів винограду
проліферація пагонів і коренів відбувається інтенсивніше за ко-
роткого дня (фотоперіод 10 год); збільшення його тривалості
спричинює некроз тканин [226]. Є рослини, тканини яких не
реагують на зміни фотоперіоду. Апікальні меристеми РйагЬіїік пії
ростуть і утворюють пагони при фотоперіоді від 16 до 24 год, їх
морфогенез не пригнічує постійне освітлення. Для більшості
культур рекомендують фотоперіод у межах 14—16 год [178].
Умови культивування рослин-регенерантів. Головні вимоги до
навколишнього середовища. Перенесення рослин-регенерантів у
субстрат є відповідальним етапом, що завершує процес МКР.
Найсприятливіший час для пересадки пробірочних рослин —
весна або початок літа. Не слід затримувати рослини у стериль-
ній культурі, бо це негативно впливає на приживлюваність і по-
дальший ріст регенерантів. Рослини, що мають 2—3 листки і доб-
ре розвинену кореневу систему, обережно виймають з колб дов-
гим пінцетом або спеціальним гачком, корені відмивають від
агару. Для отримання однорідного посадкового матеріалу слід
сортувати рослини за розміром; великі, середні та невеликі рос-
лини посадити окремо в пікірувальні ящики або плошки. Суб-
страт повинен мати велику вологоємність і повітропроникність.
Як правило, для більшості рослин застосовують суміш торфу,
піску і перліту (1:1:1). Для орхідних слід брати суміш сфагнового
моху, листків бука або дуба, соснової кори (1:1:1).
Після звільнення від хвороб і вірусної інфекції для запобі-
гання вторинному зараженню субстрати прогрівають при 90—
100 °С. Використовують суміш торфу з піском (3:1) або дерно-
вим ґрунтом, перлітом (1:1:1).
Культивують рослини-регенеранти у спеціальній теплиці, де
можна регулювати температуру (22—25 °С) і вологість (65—80 %).
21
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Для кращих приживлюваності й росту доцільно розміщувати їх в
умовах підвищеної вологості, які забезпечують за допомогою ту-
маноутворювальних приладів.
Добре укорінені рослини через 20- 30 діб після пересадки
слід підживити розчинами Кнудсона, Чеснокова, Ольсена [33]
залежно від виду рослин.
Надалі рослини-регенеранти вирощують згідно з розробле-
ною для кожного виду технологією.
Комерційні структури з великим обсягом робіт по МКР рос-
лин застосовують комп’ютерні програми вирощування [182, 261].
Хоча закладення програми забирає багато часу, але згодом стає
необхідним і вигідним. Для цього потрібно, щоб усі посудини з
культурами мали свій штрих-код.
________________Розділ 2 ________________
МЕТОД І ТЕХНІКА МІКРОКЛОНАЛЬНОГО
РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Необхідною передумовою успішного застосування методу МКР
рослин є дотримання певних правил. Передусім тканини, які
використовують для культивування, треба асептично ізолювати
від материнської рослини і створити задовільні умови, аби відбу-
вався органогенез. Цьому сприяють хімічний склад середовища,
внесення певних концентрацій фітогормонів, оптимальні умови
освітлення, температури, вологості.
Обладнання лабораторії
Технологія МКР рослин потребує дотримання суворої сте-
рильності, чистоти і ретельності у роботі. Цим і визначаються го-
ловні вимоги до організації і устаткування лабораторії, в якій
доцільно мати спеціально обладнані приміщення для проведення
окремих етапів роботи. Як правило, лабораторія розташовується у
5—8 кімнатах. Це кімната для миття посуду і приготування жи-
вильних середовищ, приміщення для стерилізації (автоклавна),
асептична кімната для маніпуляцій з рослинним матеріалом, куль-
туральна кімната, лабораторія. Для дорощування рослин-регене-
рантів доцільно мати спеціальну теплицю.
Основні підготовчі роботи проводять у кімнаті для миття по-
суду, оснащеній глибокими раковинами з кислотостійкого ма-
теріалу, трубопроводами гарячого і холодного водопостачання,
стелажами для сушіння посуду і шафами для його зберігання.
Спеціальні машини прискорюють процес миття посуду. Тут же
розмішують апарати для дистиляції води та бідистилятори.
Живильні середовища готують у кімнаті, обладнаній лабора-
торними столами, шафами для реактивів і посуду, холодильни-
ками, газовими або електроплитами. Потрібно також мати аналі-
тичні, технічні й торзійні терези, рН-метри, магнітні змішувачі.
У приміщенні для стерилізації встановлюють автоклави (вер-
тикальні або горизонтальні), сушильні шафи.
23
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
За вимогами техніки безпеки автоклавну кімнату доцільно ізо-
лювати від інших приміщень і забезпечити надійну вентиляцію
повітря. Для проведення робіт в асептичних умовах використо-
вують ламінарні бокси або пилозахисні камери, де безперервно
циркулює стерильне повітря. За відсутності ламінарів обладну-
ють спеціальну кімнату — бокс (операційну), куди через очисні
фільтри надходить стерильне кондиціоноване повітря. Кімнату
стерилізують бактерицидними аргонно-ртутними, ртутно-квар-
цевими або ультрафіолетовими лампами-опромінювачами. По-
чинати роботу слід не раніше, ніж через 2—3 год після відклю-
чення ламп.
Халати, допоміжні матеріали попередньо автоклавують при
2 атм протягом 1 год, тоді заносять у бокс перед включенням бак-
терицидних ламп.
В операційній кімнаті розмішують медичні столи, шафи, біно-
кулярні мікроскопи, інструменти, спиртівки. По закінченні ро-
боти бокс миють.
Ізольовані тканини культивують у спеціальному приміщенні
в контрольованих умовах освітлення, температури і вологості.
Кімнату обладнують стелажами з підсвіткою люмінесцентними
лампами, які розміщують горизонтально уздовж полиць. Світ-
ловий режим регулюють за допомогою реле часу, потрібну тем-
пературу підтримують контактними термометрами. Для культи-
вування тканин можна використовувати спеціальні стелажі для
гідропонного вирощування рослин, на яких можна регулювати
режим освітлення. Проте найкраще оптимальні умови освітлен-
ня, вологості і температури забезпечують кліматичні або факто-
ростатні камери.
Подальше вирощування рослин-регенерантів відбувається у
спеціальній теплиці за умов, що запобігають вторинному зара-
женню Для цього створюють регульований мікроклімат, повітря
пропускають крізь спеціальні фільтри, використовують штучне
туманоутворення для підвищення вологості.
Матеріали та інструменти. Для проведення МКР лабораторію
оснащують певною кількістю посуду. Потрібно мати колби ко-
нічні на 50, 100, 200, 300 мл, пробірки біологічні розмірами 14 х
х 20, 16 х 150, 18 х 180 і 21 х 200 мм, чашки Петрі різного діа-
метра. Бажано, аби лабораторний посуд був якісний, зі скла
марки “ТУ” або “Пірекс”. Проте у разі великого обсягу робіт
можна використовувати будь-які скляні ємності, що добре ми-
ються і стерилізуються (банки з кришками, що закручуються).
24
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
За кордоном широко застосовують пластмасовий лаборатор-
ний посуд різних типів з поліетилену або полікарбонату, стійкий
до дії температури і хімічних речовин.
Для стерилізації рослинного матеріалу і його промивки вико-
ристовують хімічні склянки (300—500 мл), які накривають чаш-
ками Петрі.
Живильні середовища готують у великих посудинах (3—5 л),
в яких змішують складові компоненти з агаром. Потрібні також
мірні колби, циліндри різної місткості, піпетки. Для збереження
концентрованих маточних розчинів використовують склянки з
темного скла.
Маніпуляції з рослинними тканинами проводять за допомо-
гою скальпелів, дисцизійних і препарувальних пінцетів. Зручні в
роботі і невеликі уламки лез, які вставляють у спеціальні держаки.
Потрібні також допоміжні матеріали: вата, марля, целофан,
алюмінієва фольга, папір. їх стерилізують у автоклаві 1 год за
тиску 2 атм.
Миття посуду. Неодмінною умовою успішного культивування
тканин є чистий стерильний посуд. Найпоширенішим і надій-
ним методом підготовки скляного посуду, особливо нового, є
замочування на 2—3 год у хромпіку — розчині хромової кислоти
в концентрованій сірчаній кислоті (9,2 г К2Сг2О7 розтирають у
ступці і розчиняють під час нагрівання у фарфоровій чашці на
водяній бані в 100 мл концентрованої Н28О4). Потім посуд ре-
тельно миють у теплій воді з пральним порошком, споліскують
дистильованою водою, висушують і стерилізують сухим теплом у
сушильній шафі 1—2 год за температури 170—180 °С.
Найефективнішим є такий режим миття посуду [226]: по-
верхню очищають від забруднень проточною водою, потім ки-
п’ятять протягом 30 хв у розчині, що містить 0,80 г/л мета-
силікату натрію та 0,90 г/л калгону (гексаметафосфат натрію —
№,„(РО3)„), промивають у теплій воді і замочують у 0,01 н НС1
на 4 год, знов миють і висушують.
Інструменти попередньо прожарюють протягом 2 год за темпе-
ратури 140—160 °С. Під час роботи у боксі інструменти занурю-
ють у склянку з 96°-м етанолом, обпалюють у полум’ї спиртівки
і зберігають між аркушами стерильного паперу. Інструменти ви-
користовують лише для одноразової маніпуляції з тканиною,
після чого знову стерилізують спиртом і обпалюють. Дуже тонкі
інструменти (голки, леза) можуть втрачати свої властивості під
час обпалювання, тому їх лише занурюють у спирт.
25
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Підготовка вихідного рослинного матеріалу. Стерилізація
Отримання стерильного матеріалу для культивування є до-
сить складним завданням, бо поверхня рослин інфікована епі-
фітними бактеріями, грибами та їх спорами. Правильний добір
стерилізуючих речовин полягає у тому, щоб нейтралізувати епі-
фітну мікрофлору і не пошкодити тканини рослини. Крім того,
речовина не має проникати в тканини і легко змиватися.
Здебільшого режим стерилізації визначають експерименталь-
но для кожного об’єкта, але існують загальні правила, яких слід
дотримуватися.
Перед стерилізацією рослину звільняють від залишків землі,
сухих листків, покривних лусок. Ретельно миють щіткою з ми-
лом у теплій проточній воді протягом 40—60 хв, потім споліску-
ють дистильованою водою. Така попередня підготовка значно
знижує контамінацію поверхневих тканин.
Листки, пагони трав’яних і деревних рослин промивають те-
плою водою з милом, потім проточною (ЗО—40 хв) і дистильова-
ною водою. Загалом стерилізацію починають із занурення рос-
линного матеріалу у 96°-й етанол: листки, бруньки, насіння —
на декілька секунд (2—10), корені, бульби, цибулини — на 1 —
5 хв. Іноді радять поверхню пагонів, листків та великих плодів
протирати ватою, змоченою абсолютним спиртом. Обробка тка-
нин етанолом руйнує восковий шар на листках, посилює дію
стерилізуючих речовин. Ефективність стерилізації підвищується
додаванням до стерилізуючого розчину детергентів типу твій 80
(декілька крапель на 1 л) або звичайних миючих засобів —
прального порошку чи мила.
Для стерилізації інтактних рослин застосовують велику кіль-
кість різноманітних стерилізуючих речовин. Найпоширенішими
є розчини, що містять активний хлор (гіпохлорит кальцію і нат-
рію, хлорне вапно, хлорамін, хлорокс, доместос), ртуть (сулема,
діацид) та окисники — пероксид водню та перманганат калію.
Дуже часто використовують сполуки срібла — 0,8—1,0 % А£І\Ю3.
Гіпохлорит натрію (N3010) застосовують у вигляді 0,5—5%-
го розчину протягом 1—20 хв. У зарубіжній літературі часто ра-
дять використовувати готовий препарат хлорокс — 5—25%-й роз-
чин гіпохлориту натрію з додаванням перманганату калію. Гіпо-
хлорит натрію є клітинною отрутою, і після його застосування
потрібна багаторазова промивка у стерильній дистильованій воді.
Менш токсичним для тканин є гіпохлорит кальцію [Са(С1О)2],
26
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
його частіше застосовують для стерилізації різних органів рослин
у концентрації 90 г/л протягом 15—30 хв.
Хлорне вапно, за допомогою якого нерідко стерилізують рос-
линні об’єкти, складається з гіпохлориту кальцію (містить 70 %
активного хлору); його використовують у концентрації 50—90 г/л
протягом 5—ЗО хв. Комерційний препарат пітхлор містить до 70 %
гіпохлориту кальцію; також використовують 5%-й розчин.
Ефективну стерилізуючу здатність має суміш рівних об’ємів
розчинів хлорного вапна і кальцинованої соди (5%-й розчин).
Така суміш містить 2 % активного хлору і 1,5—3,0 % лугу, має
поверхневу активність і миючу здатність. Використовують свіжо-
виготовлений розчин.
Для менш забруднених об’єктів застосовують різні концен-
трації (0,2—6—10 %) хлораміну протягом 20—30 хв. Щоб приго-
тувати стерилізуючі розчини, які містять хлор, зважують потріб-
ну кількість препарату, розчиняють у дистильованій воді, збов-
тують 8—10 хв і фільтрують. Розчин використовують одноразово
одразу після приготування.
З метою стерилізації різного рослинного матеріалу часто ви-
користовують препарати, що містять ртуть — сулему, діацид, фа-
мосепт. Незважаючи на їхню токсичність для тканин, ці речови-
ни при доборі відповідної концентрації і режиму стерилізації
дають задовільні результати. Найчастіше використовують 0,1 %-й
розчин сулеми (Н§С12). Бульби і коренеплоди стерилізують про-
тягом 15—20 хв, насіння, пагони деревних рослин — 10—20, ли-
стки, стебла трав’яних рослин — 4—8 хв.
Крім того, застосовують діацид, що є розчином 666,5 мг
М-цитилпіридинхлориду і 333,5 мг етиленмеркурхлориду в 1 л во-
ди. Діацид діє слабше сулеми і використовується в концентрації
0,1 % триваліший час. Позитивні результати дає застосування
рідкого ртутного препарату фамосепту при розбавленні 1:9 і ек-
спозиції 10—20 хв у кожній порції.
Менш за все пошкоджує рослинні тканини пероксид водню
(Н2О2), який також можна використовувати для стерилізації у
концентрації 10—30 % протягом 10—20 хв. Він швидко розкла-
дається, тому відпадає потреба тривалого промивання тканин.
Для досягнення оптимальних наслідків стерилізації рослин-
них тканин, як правило, використовують комбінації декількох
стерилізуючих речовин: етиловий спирт (ЗО с — 1 хв), сулема (5—
10 хв), пергідроль (10—20 хв) або етиловий спирт (30—40 с); гіпо-
хлорит натрію (кальцію) (10—15 хв), пергідроль (10 хв) або спирт
27
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
(40—60 с); сулема (діацид, фамосепт) (5—10 хв), хлорне вапно
(10—15 хв), пергідроль (5—8 хв).
У деяких випадках можна використовувати різні концен-
трації однієї речовини. Так, при стерилізації тканин орхідеї ви-
користовують 10%-й хлорокс протягом 10 хв, після видалення
листків — 5%-й розчин упродовж 5 хв, надалі стерилізують ок-
ремі бруньки в 1%-му розчині І хв і висаджують тканину без
промивання на живильне середовище.
Досить ефективним стерилізатором є 0,8—1%-й розчин ніт-
рату срібла (А§№О3) за експозиції 10—12 хв.
Чимало рослинних тканин (бульби, цибулини, туберидії орхі-
дей) мають внутрішню інфекцію, яку важко знищити звичайними
методами стерилізації. Стерилізація антибіотиками звільнює ма-
теріал від бактеріального і грибкового зараження, але при цьому
можливе послаблення життєдіяльності експланта, пригнічення
проліферації калусу і регенерації рослин. Іноді антибіотики до-
дають до живильного середовища, що також може негативно
вплинути на морфогенну здатність експланта.
Останнім часом найчастіше рекомендують використовувати
антибіотики, які розчиняються у воді (карбеніцилін (1 — 100 мг/л),
цефатаксім (0,05—200 мг/л), гентаміцину сульфат (10—100 мг/л),
канаміцину моносульфат (10—100 мг/л)) та етанолі (подальше
розбавлення водою) — хлорамфенікол (10—100 мг/л) і рифампі-
цин (10—100 мг/л). У деяких випадках кращий результат отри-
мують за одночасного використання двох або більше антибіоти-
ків. Водночас слід зазначити, що цитотоксичний ефект суміші
антибіотиків часто може проявитись за нижчих концентрацій,
ніж за використання окремих антибіотиків.
Більшість антибіотиків руйнуються під час нагрівання, тому
стерилізувати їх потрібно з використанням мембранних фільт-
рів і зберігати в холодильнику за температури 0—5 °С; збері-
гати їх у флаконах (у вигляді порошку) при 20 °С не рекомен-
дують, оскільки є небезпека конденсації води на порошку ан-
тибіотика. На етикетці антибіотиків вказується вміст активної
речовини на одиницю маси порошку в 1 мг/мл або 1 од./мг
порошку.
Кількість (масу) антибіотика з урахуванням його активності
(мг або од.) і об’єму розчину, який слід приготувати (мл), щоб
отримати потрібну концентрацію антибіотика в розчині, розра-
ховують так:
Кількість (мг) антибіотика = об’єм концентрація / активність.
28
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
Більшість розчинів антибіотиків, крім рифампіцину, можна
зберігати протягом 3 міс при -20 °С. Рифампіцин потрібно роз-
чиняти перед його використанням.
У деяких випадках, особливо під час роботи з деревними
культурами, доцільна попередня перевірка експланта на зараже-
ність сапрофітною мікрофлорою. Після стерилізації експланти
розміщують на живильному середовищі, що містить лише міне-
ральні компоненти, цукрозу та агар. Через 8—10 діб оцінюють
стан тканини, відбирають неуражені експланти і переносять їх
на певне середовише з регуляторами росту.
Для виявлення латентної інфекції, яка може з’явитись навіть
після декількох пересадок експланта, тканину розтирають або
мацерують і занурюють у рідке бактеріальне живильне середо-
вище з пептоном, екстрактом дріжджів й глюкозою. Доцільно
використовувати декілька різних живильних середовищ. Наяв-
ність помутніння після 3 тижнів культивування при ЗО °С за-
свідчує, що тканина контамінована.
Цей захід дає змогу культивувати лише стерильні експланти,
економити дефіцитні компоненти середовища. Час культивуван-
ня тканин на безгормональному середовищі для різних культур
різний: для фруктових дерев — 7 діб, для агрусу — 3—4 тижні,
для кавового дерева — 7 тижнів.
Наводимо схему стерилізації тканин плодових і деревних
культур.
Стадія І. Тканину занурюють у 0,01—0,1 %-й розчин тритону
Х-100, твіну 20 або прального порошку, потім у 0,14%-й розчин
будь-якого препарату, що містить хлор (хлорокс, хлорамін, гіпо-
хлорит кальцію), далі промивають у 3 порціях стерильної води і
вносять у живильне середовище без фітогормонів на 24 год.
Стадія II. Тканини середовища переносять у 0,01—0,1 %-й роз-
чин тритону Х-100 або твіну 20, занурюють у 0,1 %-й розчин фун-
гіциду (беноміл) на 15 хв, далі у 0,42—0,50%-й розчин хлорного
препарату на 30—40 хв, тричі промивають у стерильній воді й
розміщують на свіжому живильному середовищі з фітогормонами.
Детальні режими стерилізації окремих видів рослин наведено
нижче.
Техніка стерилізації. Стерилізацію проводять у стерильних хі-
мічних склянках, накриваючи їх чашками Петрі. Очищений і про-
митий рослинний матеріал у боксі занурюють на кілька секунд у
склянку з етанолом, виймають і переносять у стерилізуючий роз-
чин (згідно з заданим режимом). Аби тканини не спливали під час
29
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
стерилізації, їх накривають стерильним ватним тампоном. Дрібне
насіння стерилізують у мішечках із цупкої тканини (насіння орхі-
дей) або марлі, послідовно проводячи усі етапи. Стерильний рос-
линний матеріал висушують між аркушами стерильного фільтру-
вального паперу і зберігають у чашках Петрі до початку роботи.
У деяких лабораторіях аркуші фільтрувального паперу змочу-
ють слабким розчином гіпохлориту (0,01 %). Частини рослин,
що безпосередньо контактували з папером, зрізають. Для змен-
шення контамінації, особливо при розмноженні деревних рослин,
експлант послідовно занурюють у розчини гіпохлориту натрію
різної концентрації (1; 0,1; 0,01 %) і відразу (без промивання у
воді) викладають на живильне середовише. Те ж саме можна ро-
бити і при пересадках експлантів.
Експланти стебла, листків, коренів вичленовують на фільтру-
вальному папері стерильним інструментом. Видалення меристем
проводять під бінокулярним мікроскопом за відповідного збіль-
шення (10—15): обережно знімають листки і листкові примордії,
розкривають меристематичний купол і швидко переносять екс-
плант на живильне середовище.
Живильні середовища: склад і приготування
Живильне середовище — головний фактор, що обумовлює
успіх МКР [328]. Основою усіх середовищ є мінеральні солі, які
містять необхідні для росту рослин макро- (М, Р, К, Са, М§, 8) і
мікроелементи (Ре, В, Мп, 7п, Си, N3, Со, Мо, СІ, N1). Крім
того, до їх складу входять вітаміни, амінокислоти, фізіологічно
активні речовини.
Основне завдання під час розробки середовища для культи-
вування рослинних тканин іп уііго — це вибір оптимальної кон-
центрації іонів і їх співвідношення. Макро- і більшість мікроеле-
ментів вводять до складу живильного середовища у вигляді со-
лей. У середовищах — водних розчинах — кожна розчинна сіль
дисоціює на два іони — катіон і аніон. Рослинні клітини погли-
нають кальцій, магній і калій у вигляді катіонів Са2+, М§2+ і К+.
Азот надходить у клітину у вигляді іонів ІМЕЦ або N0, , фосфор —
у вигляді іонів НРО2- і Н2РО; , сірка — у вигляді іонів 80\ .
Азот у рослині знаходиться майже повністю у відновленій
формі. Культури тканин використовують як джерело віднов-
леного азоту первинні аміни (А—1ЧН2) і аміди (К—СО—N14—ЛО-
ЗО
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
Первинні аміни — це аміак і амінокислоти. Аміди для сере-
довищ використовують рідше, головним чином сечовину, алан-
тоїн і алантоїнову кислоту. В більшості середовищ переважають
нітрат-іони. Ефективне надходження нітратів має місце у кисло-
му середовищі; воно супроводжується виділенням аніонів із рос-
лини, в результаті чого середовище стає менш кислим. І навпа-
ки, при поглинанні амонію з клітин у середовище виділяються
протони (Н+), внаслідок чого воно підкислюється. Свіже середо-
вище, як правило, має рН 5,4—5,8. Якщо у середовищі одночас-
но містяться іони нітратів і амонію, спочатку відбувається швид-
ке поглинання амонію, що знижує рН середовища до 4,2—4,6.
За цих умов поглинання амонію припиняється, але стимулюєть-
ся поглинання нітратів, унаслідок чого рН підвищується. Існує
тісна залежність між поглинанням азоту культурами тканин, рос-
том клітин і використанням азоту для синтезу органічних спо-
лук. За достатньої кількості легкодоступного азоту культивовані
клітини довше зостаються недиференційованими. У разі знижен-
ня вмісту азоту розпочинається синтез безазотистих сполук на
основі фенілпропанів, наприклад лігніну, який пов’язаний з ди-
ференціацією клітин — утворенням елементів провідної системи
[247]. І навпаки, за наявності у середовищі іонів амонію має міс-
це швидкий синтез амінокислот і білка внаслідок синтезу вугле-
водневих сполук; при цьому з’являються гіпергідратовані пагони.
Гіпергідратація — це утворення іп уііго деформованих крихких
органів, які мають вигляд просякнутих водою.
У більшості живильних середовищ для культур тканин ос-
новна кількість доступного азоту представлена нітратами.
У клітині іони амонію безпосередньо включаються в біосин-
тетичні процеси. Висока концентрація іонів амонію може бути
токсичною для тканин. Навпаки, іони нітратів нетоксичні. У
зв’язку з цим більша частина азоту в середовищах для культур
тканин представлена іонами нітрату. У клітині останні віднов-
люються до амонію і лише тоді використовуються у процесах
біосинтезу. Перетворення нітратів на амоній відбувається за до-
помогою ферментів нітратредуктаз, які відновлюють МО3 до ніт-
риту N€>2. Останній відновлюється до ГЧЩ за допомогою нітрит-
редуктази, яка локалізована у пластидах. Відновлення нітратів до
амонію — процес, що потребує енергетичних затрат. З цього
погляду поглинання клітиною відновленого азоту у вигляді ТЧН3
більш енергетично вигідно.
31
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Водночас відомо, що на середовищі з високою концен-
трацією іонів амонію затримується ріст пагонів або вони стають
гіпергідратованими. Таку дію іонів амонію можна усунути пере-
несенням культур на середовище з високим вмістом іонів ТЧО3
або на середовище, в якому N0, — єдине джерело азоту [360].
Сечовина може бути єдиним джерелом азоту для культур тка-
нин, але ріст їх при цьому буде менш інтенсивний, ніж у разі
використання іонів амонію і нітратів [305]. Через декілька па-
сажів на середовищі з сечовиною в тканинах підвищується ак-
тивність уреази. Хоча при метаболізації сечовини, як і інших
відновлених сполук азоту, утворюється надлишок іонів водню, у
середовище їх виділяється менше, ніж при засвоєнні ТЧЩ [416],
у зв’язку з чим сечовина менш, ніж амоній, здатна нормалізува-
ти рН середовища з N0^. Коли в середовищі є одночасно і ніт-
рати, і сечовина, іони нітратів використовуються в першу чергу
[304]. Також сечовина може бути джерелом відновленого азоту в
середовищі для ембріогенезу [200].
Більшість тканин і органів, так само, як і інтактні рослини,
ростуть краще на живильних середовищах, що одночасно містять
іони і нітрату, і амонію, ніж на середовищах з одним із цих дже-
рел азоту. Хоч у середовищах, як правило, відновленого азоту
міститься менше, ніж нітратів, відмічено, що для нормального
морфогєнезу потрібні іони N1^4, які виконують регуляторну
роль. За наявності цих іонів відновлення й асиміляція N0, про-
ходять краще: у клітинах накопичується вдвічі більше білка, ніж
на середовищі з одними нітратами [354]. Крім того, іони амонію
виконують роль буфера живильного середовища за наявності
нітратів, і у такий спосіб збільшують поглинання останніх.
При створенні нового живильного середовища для певного
типу культур чи іншого виду рослин потрібно визначити загаль-
ну концентрацію азоту в середовищі та співвідношення між іона-
ми нітратів і амонію, яке слід підбирати для кожного виду рос-
лин. Загальна концентрація азоту в середовищі — найважливі-
ший визначальний фактор для росту або морфогєнезу. Наприк-
лад, для утворення адвентивних пагонів із калусу ріпаку опти-
мальною концентрацією загального азоту є 35—45 ммоль і у разі
підвищення чи зниження його кількості відсоток експлантів, що
утворюють пагони, зменшується [331].
32
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
Морфогенез за високого рівня азоту не підсилиться, якщо в
середовищі не буде відповідної концентрації цукрози [219]. Ін-
тенсивність росту суспензії клітин троянди “Поле Скарлет” зале-
жить від співвідношення N0^ і цукрози. Високе співвідношення
сприяє накопиченню в клітинах відновленого азоту, але не швид-
кому росту клітин [211]. Встановлено, що для соматичного емб-
ріогенезу в культурі клітин і калусів потрібна деяка кількість
відновленого азоту [419], особливо для розвитку зародка [297].
Більшість авторів зазначають, що для посиленого ембріогенезу й
росту зародків потрібні іони і нітрату, і амонію. Середовища, роз-
роблені для різних об’єктів, відрізняються як за загальним вміс-
том азоту — від 20 до 125 ммоль, так і за співвідношенням іонів
N€>3 і МЬЦ — від 90 : 10 до 20 : 80.
Амінокислоти. У деяких випадках для підсилення ембріоге-
незу і росту зародків крім N0^ і МН^ у середовище вводять
амінокислоти. Позитивний ефект від амінокислот має місце при
використанні середовищ із невисокою концентрацією солей (се-
редовища Уайта [515], Хеллера [258], Ніча і Ніч [147, 371]) і
майже відсутній за наявності таких оптимальних концентрацій і
співвідношень N0^ і ТЧН4, які є в середовищі Мурашіге-Скуга
(М8). Поглинання амінокислот із середовища призводить до зни-
ження рН, як це буває при поглинанні іонів ТЧН4. Найчастіше у
середовищах використовують гліцин (2 мг/л) і суміш амінокис-
лот, які отримують при ферментативному або кислотному гідро-
лізі казеїну чи лактальбуміну.
Частка окремих амінокислот у різних гідролізатах залежить
від білка і методу гідролізу. Гідролізат казеїну може бути джере-
лом кальцію, фосфору, низки мікроелементів і суміші 18 аміно-
кислот. Найкращі для використання ферментативні гідролізати
казеїну, наприкпад “М—Х-атіпе”, які містять глутамін — джере-
ло відновленого азоту.
Відомо багато праць, в яких повідомляється, що введення до
складу середовищ гідролізату казеїну або глутаміну стимулює емб-
ріогенез. У багатьох випадках за відсутності джерела амінокислот
або однієї амінокислоти не утворюється ембріогенний калус і не
відбувається ембріогенез або формування зародка [115, 245].
Фосфор входить до складу нуклеїнових кислот, сполук, що бе-
руть участь у синтезі білків і нуклеїнових кислот, та сполук, які
сприяють перенесенню енергії. Рослина поглинає іони фосфору
З 6-83
33
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
у вигляді повністю окисненого ортофосфату (РО4 ). Поглинання
фосфатних іонів є активним процесом і вимагає витрат енергії у
процесі дихання.
У живильних середовишах фосфор представлений у вигляді
натрію і калію моно- і двозаміщених фосфатів. Іони моновалент-
ного Н2РО; найлегше засвоюються рослиною при рН нижче 7,
а оптимумом для надходження фосфатів (НРО2-) є рН 4. Біль-
шість середовищ містить в середньому 1,7 ммоль фосфатів, хоча в
деяких їх вміст досягає близько 20 ммоль. Середовище М8 міс-
тить 1,2 ммоль фосфату, що для деяких культур недостатньо. Ко-
ли воно виснажується за вмістом фосфатів, у клітинах збільшу-
ється вміст вільних амінокислот, оскільки припиняється синтез
білка і починається його розщеплення [488]. У зв’язку з цим у по-
дальших модифікаціях середовища М8 концентрацію фосфатів
збільшили до 1,86 [294], 2,48 [362] або навіть до 3,71 ммоль [480].
У разі збільшення рівня фосфатів для інтенсивнішого росту
культури доцільно одночасно збільшити у середовищі кількість
мезоінозитолу.
Калій. Основна фізіологічна роль іонів (катіонів) калію в клі-
тині — компенсування негативного заряду неорганічних і орга-
нічних аніонів. Він швидко проникає через мембрани, зв’язу-
ється з органічними аніонами і таким чином одночасно виконує
дві функції: регулює рН і осмотичний стан. В інтактній рослині
іони К+ беруть участь у транспорті аніонів по ксилемі. Для ба-
гатьох ферментів К+ є кофактором, який, змінюючи конфігура-
цію білка, робить його активним. Нестача в середовищі К4 веде
до гіпергідратації [385] і зниження поглинання фосфатів (цит. за:
[266]). Як правило, у середовищах концентрація іонів калію і
нітратів витримується на одному рівні. Потреба в іонах калію
різко зростає під час переходу до органогенезу. У середньому
концентрація калію в середовищі становить 13,6 ммоль.
Натрій здебільшого не потрібен для росту і розвитку рослин,
крім солевитривалих рослин з С4-метаболізмом. Багато середо-
вищ взагалі не містять Ьіа+, а в інших його середня концентрація
дорівнює 1,9 ммоль [229].
Магній. Основна фізіологічна роль магнію в рослинному ор-
ганізмі зумовлена тим, що він входить до складу молекули хло-
рофілу і є обов’язковим кофактором для багатьох ферментів, на-
приклад РНК- і ДНК-полімераз та АТФ-аз. Іони М§2+, як і К+,
34
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
мобільні і сприяють нейтралізації аніонів і органічних кислот.
Середовища для культур тканин містять відносно низькі концен-
трації магнію (у середньому 6,8 ммоль) [226]. У середовищах
магній наявний у вигляді М§8О4, який у цьому випадку є єдиним
джерелом І М^2*, І 80 4 .
Сірка поглинається рослинами переважно в окисненій формі
80 4“, але входить до складу хімічних сполук у вигляді відновле-
них груп —8Н, —8 або —8—8—. У рослинній клітині вона регу-
лює структуру білків через утворення містків 8—8. Деякі аміно-
кислоти (цистин, цистеїн і метіонін) містять сірку. 8Н-групи —
це реакційні центри деяких ферментів, а також ліганди, що при-
єднують іони заліза, міді і цинку до білків і ферментів. За не-
стачі сірки порушується синтез білка, рослини мають тонке і
крихке стебло. Більшість живильних середовищ для культур тка-
нин містять до 2—5 мг/л 80 4~ [226].
Кальцій. Вивчення фізіологічної ролі іонів Са2+ у клітинах
живих організмів взагалі і рослин зокрема є проблемою, на вирі-
шення якої спрямовані зусилля багатьох лабораторій світу. Відо-
мо, що Са2+, як і цАМФ, виконує роль вторинного месенджера —
внутрішньоклітинного посередника, що бере участь у посиленні
і передачі первинного стимулу зі здовколишнього середовища до
клітини. В основі регуляторної ролі Са2+ лежать зміни його
внутрішньоклітинної концентрації і дія через Са2+-модулювальні
білки та їх мішені.
Здебільшого Са2+ діє в клітині, зв’язуючись із кальмодулі-
ном, який, в свою чергу, взаємодіє з білками, що спричинюють
зміни метаболізму. Маючи здатність зв’язувати біологічні струк-
тури, Са2+ є елементом, від якого залежать структура і функції
клітинних стінок. Активність ферменту Р(1->3)-глюкансинтази
пов’язана з наявністю іонів Са2+, і синтез целюлози в культу-
рах не відбувається, якщо у середовищі відсутній Са2+.
У клітині вміст Са2+ підтримується в межах 0,1 мкмоль, над-
лишок Са2, виділяється з цитоплазми за допомогою активного
процесу, який потрібний для того, щоб не відбулись преципіта-
ція фосфатів і порушення тих ланок метаболізму, в яких беруть
участь фосфати. Тимчасове підвищення концентрації Са2* до
1 або 10 мкмоль запускає специфічні молекулярні процеси у від-
повідь на дію стресових факторів зовнішнього середовища (низь-
ких або високих температур, гравітації) чи гормонів.
З* 35
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Більша частина Са2+ може депонуватись за межами прото-
пласта, в клітинних вакуолях і клітинній стінці. Вважають, що
кальцифікація зміцнює клітинну стінку і завдяки цьому посилює
стійкість до патогенів. Іони Са2+ беруть участь у процесах мор-
фогенезу, зокрема в морфогенезі іп уііто, вони потрібні для пе-
редачі сигналів ауксинів і цитокінінів. Безпосередню участь Са2+
у процесах морфогєнезу засвідчують такі дані: у моху Еипагіа ци-
токініни спричинюють специфічне збільшення мембраннозв’яза-
ного Са2+ саме в тих місцях, в яких відбувається диференціація
бруньок (цит. за: [266]). Протокорми на калусах ВепсІгоЬіит ПЬ-
гіаіит утворюються дуже слабко, якщо середовище не містить
цього елемента [353]. Підвищення вмісту Са2+ у клітинах сегмен-
тів стебла Тогепіа збільшує кількість індукованих цитокініном
адвентивних бруньок [470].
Хлор. Вважається, що іони хлору (СІ) потрібні для росту
рослинних тканин і основна їх роль полягає в підтримці тургору
клітин і збалансуванні різких змін рівня вільних катіонів — К+,
М§2+ та №+. Як правило, у середньому середовища містять 6 ммоль
СІ . Багато видів рослин переносять досить високі концентрації
хлоридних іонів, але у деяких рослин надлишок С1“ спричинює
гіпергідратацію, і в таких випадках виключення хлоридних іонів
із складу середовища попереджує появу цих симптомів у регене-
рантів (наприклад, у Ргипиз [391]).
Мікроелементи входять до складу більшості культуральних
середовищ. Найчастіше використовують суміш мікроелементів
середовищ М8 і В5 [221]. Як і у разі макроелементів, для
успішного культивування і морфогєнезу окремих видів потрібно
підбирати відповідну суміш мікроелементів або встановлювати їх
оптимальну концентрацію експериментально [249]. Відомо бага-
то випадків, коли збільшення концентрації мікроелементів сере-
довища М8 поліпшувало ріст і морфогенез [326, 499]. Ембріоге-
нез у культурі калусів, отриманих із пиляків Неуеа Ьгазіїіепзіз,
був найінтенсивнішим за умов подвоєння концентрації мікро-
елементів у середовищі М8 і за зниження концентрації макросо-
лей на 60—80 % (цит. за: [266]). Навпаки, для зменшення ступе-
ня гіпергідратації в культурі пагонів гвоздики рекомендують зни-
зити концентрацію мікроелементів в середовищі М8 до 1/10. Є
дані, що засвідчують більшу потребу в мікроелементах тих тка-
нин, в яких індуковано морфогенез [322, 509].
Манган — мікроелемент, який є обов’язковим компонентом
більшості культуральних середовищ. Його основна фізіологічна
36
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
роль зумовлена тим, що він входить до складу металопротеїнів,
які беруть участь у процесах дихання і фотосинтезу [174]. Ман-
ган необхідний для функціонування деяких ферментів (дегідро-
геназ, кіназ, декарбоксилаз, оксидаз та супероксиддисмутаз) і
підтримання ультраструктури хлоропластів.
Виділення кисню в процесі фотосинтезу залежить від актив-
ності ферментів, у складі яких є манган. Його регуляторна роль
у процесах росту і диференціації зумовлена впливом на вміст
природного ауксину індолілоцтової кислоти (ІОК), оскільки за
наявності мангану зменшується її вміст. Це відбувається завдяки
тому, що певні ферменти, до складу яких він входить, інакти-
вують інгібітори ауксиноксидази [217]. Концентрація мангану у
живильних середовищах коливається в межах 25—150 мкмоль.
Цинк входить до складу багатьох ферментів. Серед них РНК-
і ДНК-полімерази, а також фермент, який бере участь у синтезі
триптофану — попередника ІОК, і через це існує тісний зв’язок
між доступністю цинку для рослин і вмістом у них ауксину. Кон-
центрація іонів 2п2+ у культуральних середовищах коливається в
межах 0,1—70 мкмоль, що засвідчує його низьку токсичність.
Бор — елемент, який підтримує меристематичну активність
тканин, тому що бере участь у синтезі азотистих основ, а отже, й
РНК [348]. Він сприяє метаболізму фенольних кислот і біосин-
тезу лігніну, оскільки є кофактором ферменту, який здійснює
синтез кофеату і 5-оксиферулату із д-кумарової кислоти. Вважа-
ють, що бор стабілізує природні металохелати, які, в свою чергу,
підтримують структуру і функції клітинної стінки і мембран
[102, 174].
За відсутності бору не відбувається біосинтез лігніну, оскіль-
ки цей елемент активує фенолази, що беруть участь у синте-
зі фенілпропанових сполук, які, полімеризуючись, утворюють
лігнін.
Відсутність бору пригнічує синтез ДНК, внаслідок чого при-
пиняються мітози [356] і синтез РНК [104]. Бор бере участь у
метаболізмі природних регуляторів росту. За його відсутності
уповільнюються транспорт ІОК, яка накопичується в місцях
синтезу [232], і синтез цитокінінів [104]. Вважають, що бор
сприяє деструкції ауксинів, зокрема в тих умовах, коли їх високі
концентрації пригнічують ріст коренів [290, 312].
У культуральних середовищах бор представлений борною ки-
слотою або її солями концентрацією 50—100 мкмоль. Виші кон-
центрації можуть бути токсичними [148], але в окремих випад-
37
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ках, наприклад для стимуляції проростання пилку, використо-
вують високі концентрації бору (1,6—6,5 ммоль) [473].
Мідь входить до складу ферментів, пов’язаних із участю кис-
ню в метаболізмі, — цитохромоксидази, аскорбіноксидази, супер-
оксиддисмутази — і ферментів, під дією яких відбувається окис-
нення фенольних сполук. Також мідь є складовою частиною
пластоціаніну — пігменту, що бере участь у перенесенні елект-
ронів. Більшість середовищ містить 0,1—1,0 мкмоль Си2+ у ви-
гляді сульфату міді, зрідка — СиС12 або Си(МО3)2.
Молібден також є компонентом низки ферментних систем —
нітратредуктази і нітрогенази, які необхідні для засвоєння азоту.
На середовищах з N0 3, але без молібдену, нітрати стають ток-
сичними, оскільки не відбувається їх відновлення до аміаку.
Іони молібдену Мо2“ концентрацією 1 мкмоль у вигляді моліб-
дату натрію вносять до складу живильних середовищ.
Кобальт — складова частина вітаміну В,2, а також половини
опублікованих середовищ для культур тканин. Е. Оеоцге [226]
відмітив, що Т. Мига8НІ£е і Е. 8коо§ [366] включили його до
складу середовища з огляду на те, що він потрібен для нижчих
рослин і може відігравати регуляторну роль у морфогенезі вищих
рослин. Є відомості, що кобальт іноді стимулює ріст калусів де-
яких однодольних. Крім того, вважають, що він може виявляти
захисну дію щодо токсичності металохелатів, а також пригнічу-
вати окиснювальні реакції, каталізовані іонами міді і заліза [102].
Нікель є компонентом ферменту уреази, необхідного для ме-
таболізації сечовини до аміаку. Показано, що це важливий мік-
роелемент для культур деяких бобових. Внесення в середовище
0,1 мкмоль 1Чі2+ різко стимулює ріст клітин сої при використанні
сечовини як єдиного джерела азоту [400]. Таку концентрацію
іонів нікелю вважають достатньою.
Йод входить до складу багатьох середовищ. Ще Р. \¥ЬіІе [516]
зазначив, що за наявності йоду ізольовані корінці томатів рос-
туть інтенсивніше. Згодом це підтвердили інші дослідники. Існує
припущення, що позитивний вплив іонів йоду пов’язаний із їх
відновл «овальною дією [226, 229].
Залізо в рослині бере участь в окисно-відновних реакціях, які
відбуваються у хлоропластах, мітохондріях і пероксисомах. Цей
елемент входить до складу амінолевулінової кислоти і протопор-
фіриногену — попередників хлорофілу. Залізо є також компонен-
том фередоксину — переносника електронів у процесі фотосин-
38
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
тезу. У живильних середовищах залізо — один із важливих ком-
понентів. Більшість сучасних середовищ містить залізо у вигляді
хелату з етилендіамінтетраацетатом (ЕДТА). Розчин ЕеЕДТА для
культур тканин можна приготувати двома способами: до водного
розчину ЕДТА додати сіль заліза або розчинити у воді готову
сіль ЕеЕДТА при нагріванні. У деяких середовищах використо-
вують готові сполуки, наприклад №2ЕеЕДТА • 2Н2О (теоретична
молекулярна маса 428,2).
Вуглеводи. Для росту в культурі іп уііго ізольованих органів,
тканин або клітин потрібно до складу середовища включати дже-
рело вуглецю. Для більшості культур тканин з цією метою вико-
ристовують цукрозу. Встановлено, що при промисловому МКР
рослин до складу середовища можна додавати звичайний рафі-
нований білий цукор [226]. Тільки для деяких культур кращий
ріст іп уііго спостерігали за використання глюкози, при цьому ін-
тенсивніше відбувався органогенез [393]. Для культури ізольова-
них коренів однодольних використовують переважно глюкозу [136].
В окремих випадках кращі результати отримують за внесення
фруктози. Наприклад, деякі види орхідей інтенсивніше ростуть
на фруктозі, ніж на глюкозі [113]. Також на середовищі з фрук-
тозою утворюється більше адвентивних пагонів із сім’ядольних
вузлів сої [520]. Оскільки цукроза в середовищі гідролізується на
моноцукриди глюкозу і фруктозу, К. Кгогпег і К. КикиїсЬапка
[308] порівнювали ефективність цукрози (ЗО г/л) і комбінації
двох моноцукридів (25 г/л глюкози і 5 г/л фруктози) і встанови-
ли, що кінчики меристем Саппа іпєііса краще виживають у дру-
гому випадку.
Регулятори росту рослин. Ендогенні ростові речовини, або
фітогормони, регулюють процеси росту і розвитку рослин. Куль-
тури тканин і органів іп уііто потребують введення у середовище
екзогенних регуляторів росту і морфогенезу рослин. Як правило,
це синтетичні аналоги ауксинів і цитокінінів, гібереліни і абсци-
зова кислота природного походження.
Ауксини. Введення в культуру потребує наявності в середо-
вищі ауксинів для індукції поділу клітин і дедиференціації тка-
нин первинного експланта. Під впливом ауксинів тканини ре-
програмуються на меристематичний ріст, який можна спрямува-
ти далі під дією інших комбінацій регуляторів росту до різного
типу органогенезу — утворення пагонів чи ембріоїдів. Існує
багато синтетичних аналогів ауксинів, а саме: ІОК, 2,4-дихлор-
феноксиоцтова кислота (2,4-Д), індолілмасляна кислота. Крім
39
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
того, досить часто використовують такі сполуки з ауксиновою
активністю: 2-нафтилоцтова кислота (НОК), фенілоцтова кисло-
та, 4-хлорфеноксиоцтова кислота, 2-метил-4-хлорфеноксиоцтова
кислота, 2,4,5-трихлорфеноксиоцтова кислота (2,4,5-Т), дікамба
(3,6-дихлоранісова кислота) або її диметиламінова сіль (Банвел
Д), піклорам (4-аміно-3,5,6-трихлорпіколінова кислота).
Залежно від мети використовують один із препаратів, що має
властивості ауксину. Фітогормони ауксинового типу неоднаково
впливають на різні фізіологічні процеси (індукція меристематич-
ної активності диференційованих тканин, індукція органо- й емб-
ріогенезу, стимуляція утворення коренів або пагонів) та на рос-
лини, що належать до різних видів.
Найчастіше і для індукції калусоутворення та морфогєнезу, і
для культури меристем у живильні середовища додають ІОК,
2,4-Д, НОК та індолілмасляну кислоту (ІМК). Синтетичну ІОК
використовують для калусоутворення, індукції морфогєнезу, куль-
тури меристем і пагонів, НОК і ІМК — у живильних середови-
щах для укорінення культури пагонів, 2,4-Д — для індукції калу-
су і росту суспензійних культур. 2,4,5-Т використовують рідше і
виключно для індукції калусу і непрямого ембріогенезу однодоль-
них. Деякі сорти Тгіїісит аеміуит утворюють ембріогенний ка-
лус на живильних середовищах з 2,4-Д, а інші — лише за наяв-
ності 2,4,5-Т (цит. за: [226]).
Для індукції ембріогенного калусу однодольних — Г)асіу1І8
£Іотегаіа [235], рису [532], пшениці [158] — часто використову-
ють дікамбу та фенілоцтову кислоту [528].
При культивуванні суспензії клітин широколистих рослин і
для утворення ембріогенного калусу використовують піклорам
[134], який додають у середовище в значно нижчих концентраці-
ях, ніж 2,4-Д. У середовищах для МКР ефективну концентрацію
кожного ауксину підбирають за типом органа чи тканини або
генотипом рослини.
У деяких випадках додають суміш двох або більше ауксинів,
особливо ІОК у комбінації із синтетичним ауксином. Так,
суміш ІОК і 2,4-Д (або 2,4,5-Т) була ефективна при індукції
утворення ембріогенного калусу пшениці, деяких сортів рису і
проса [367].
Для індукції калусу на первинних експлантах найчастіше ви-
користовують 2,4-Д. У широколистих рослин його концентрація
становить 1,0—3,0 мг/л або 4,5—13,6 мкмоль (у комбінації з
цитокінінами), у однодольних вона значно вища (2,0—10 мг/л
40
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
або 9,0—45 мкмоль), причому внесення цитокініну в середовище
не обов’язкове.
Тривале культивування тканин на середовищі з 2,4-Д спри-
чинює генетичні зміни клітин, у зв’язку з чим для культивуван-
ня отриманого калусу використовують НОК і ІОК.
Вважають, що ризогенез потребує наявності лише ауксину
або ауксину в концентрації набагато вищій, ніж цитокініну [370].
Процес соматичного ембріогенезу також часто відбувається у ра-
зі використання середовищ, рівень ауксинів (2,4-Д) в яких висо-
кий. Для подальшого розвитку зародків потрібно знизити кон-
центрацію ауксинів у середовищі. Є припущення [432], що аук-
сини в певних клітинах калусу або суспензійної культури спри-
чинюють ембріогенну детермінацію, причому у проембріогенних
детермінованих клітин припиняється поділ, який відновлюється
за нижчих концентрацій ауксину або взагалі без нього.
Зазначено тісний зв’язок між концентраціями ауксину і цук-
рози у середовищі. Кількість зародків під час соматичного емб-
ріогенезу з незрілих сім’ядолей сої різко зменшувалась у разі по-
єднання цукрози або ауксину високої концентрації з іншим ком-
понентом низької концентрації (цит. за: [226]). Найбільша кіль-
кість зародків була при використанні або низьких (1—2 % і
6,25—25 мг/л відповідно), або високих (4 % і 50 мг/л відповідно)
концентрацій цукрози і НОК.
Природні й синтетичні ауксини інтенсивно використовують
в культурі іп уііго клітин, тканин і органів для отримання спе-
цифічної морфогенетичної відповіді, найчастіше — для індукції
утворення адвентивних коренів [253]. Наявність ауксину в пев-
ній комбінації з цитокінінами у культуральному середовищі по-
трібна також для формування адвентивних пагонів [288].
Цитокініни — це регулятори росту, ефект від яких найбіль-
ший при застосуванні на культурах ізольованих тканин, в яких
вони разом з ауксинами стимулюють поділ клітин і морфогенез.
Обробка цими речовинами інтактних рослин підвищує синтез
білків.
Серед цитокінінів першим був описаний кінетин, виділений
в лабораторії Ф. Скуга із старих зразків ДНК оселедця, а також
інших зразків ДНК, автоклавованих у кислому середовищі.
Кінетин не є природним цитокініном, хоча він структурно
споріднений з цілою низкою природних цитокінінів, що існу-
ють у рослинах і як окремі сполуки, і як глікозиди або рибози-
ди. Встановлено, що цитокініни ініціюють поділ клітин, а саме
41
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
синтез і функціонування білків апарату мітотичного веретена
[296].
У рослині цитокініни синтезуються переважно в кінчиках
коренів, особливо в клітинах центру спокою, а також у клітинах
камбію і апексах пагонів. Синтезовані в коренях цитокініни
транспортуються по ксилемі в інші частини рослини.
Як правило, для росту ізольованих тканин потрібно додавати
цитокініни у середовище. Трансформовані за допомогою А§го-
Ьасіегішп Штеґасіепк клітини та деякі клони, що виникають
спонтанно, мають здатність до біосинтезу цитокінінів. Найшир-
ше використовують такі цитокініни природного походження:
зеатин (4-окси-3-метил-/дрднс-2-бутеніламінопурин), 2-іР (ТЧ6-
(2-ізопентил)аденін) або ІРА (1\І6-(Д2-ізопентеніл)аденозин)), ди-
гідрозеатин (6-(4-окси-3-метил-/иранс-2-бутеніл)амінопурин).
Зеатин у рослинних тканинах існує у вигляді як окремих мо-
лекул, так і глікозидних (цукор) і глікотидних (цукрофосфати)
кон’югатів. Дигідрозеатин — це природний метаболіт зеатину,
що проявляє цитокінінову активність. Часто як високоефектив-
ний цитокінін використовують зеатинрибозид. Рибозид 2-іР або
його 2-метилтіо-аналог входять до складу т-РНК цитоплазми і
хлоропластів. Серед цитокінінів природні сполуки 2-іР і зеатин є
найдорожчими, і тому їх використовують лише у фундаменталь-
них дослідженнях. Для підтримання росту ізольованих клітин,
тканин й органів і МКР крім кінетину використовують синте-
тичні аналоги цитокінінів, переважно похідні аденіну із заміщен-
ням в 6 положенні, наприклад 6-бензиламінопурин (БАП), і тіді-
азурон (ТДЗ).
Феписечовипи. Вперше роль похідних сечовини як речовин,
що індукують поділ цитокінінзалежних калусних культур, засвід-
чили такі дані: 1,3-дифенілсечовина, що входить до складу коко-
сового молока, відповідає за цитокінінову активність [430]. Піз-
ніше були ще повідомлення щодо цитокінінової активності й
похідних сечовини [156], але широкого застосування вона не
набула.
Нині дедалі частіше використовують дефоліант бавовнику —
ТДЗ (1\І-феніл-1\І-1,2,3-тіадіазол-5-сечовина) — для регенерації ад-
вентивних пагонів [422] як окремо, так і в комплексі з БАП, на-
приклад для МКР Ругик соштипів (5 мкмоль БАП + 0,4 мкмоль
ТДЗ) [441], а також деревних порід родини Оіеасеае |205].
Наскільки ауксини є найефективнішими фітогормонами в ін-
дукції коренеутворення, настільки цитокініни — в індукції паго-
42
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
нів. Найкращій результат отримують за певного співвідношення
ауксинів і цитокінінів.
Цитокініни низької концентрації (0,5—2,5 мкмоль) викори-
стовують для індукції ембріогенезу у широколистих рослин, у
однодольних усе навпаки: навіть дуже низькі концентрації ци-
токініну пригнічують ембріогенез [514].
У середовище для росту багатьох культур тканин додають
аденін (аденінсульфат), що також має назву вітамін В4.
Аденін найчастіше використовують у середовищах для куль-
тур, з яких мають отримати регенеранти. Часто найкращий резу-
льтат має місце тоді, коли його вносять у середовище разом із
цитокінінами (кінетином або БАП). Для індукції ембріогенезу в
калусних культурах у середовище додають 40—80 мг/л аденіну
(цит. за: [226]). Ця сполука підвищує ефективність цитокінінів
при індукції адвентивних пагонів із калусів [522] чи експлантів
[457].
Гібереліни. Окремий клас регуляторів росту — гібереліни —
налічує понад 80 різних сполук, але у практиці культур ізольова-
них тканин і рослинництві найчастіше використовують гіберело-
ву кислоту й суміш гіберелінів ГК4 і ГК7.
Основні фізіологічні ефекти гібереліну — стимуляція росту
стебла, індукція цвітіння і стимуляція зав’язування плодів. Гібе-
релова кислота різко змінює активність цілої низки ферментів й
індукує синтез сіє поуо а-амілази і мальтози, особливо під час
проростання зерна злакових культур. Як правило, ріст, диферен-
ціація і органогенез культур тканин не потребують наявності у
середовищі гіберелінів, але є окремі повідомлення, що введення
до складу середовища гіберелової кислоти дає змогу стимулюва-
ти коренеутворення [108].
У деяких випадках гіберелову кислоту вносять у середовище
разом з ауксинами і цитокінінами для культури пагонів, особли-
во на ранніх стадіях, для ініціації росту експлантів, взятих зі зрі-
лих частин деревних порід, а також для поліпшення росту і
збільшення кількості пагонів троянди [490] і камелії [133].
Абсцизова кислота (АБК) — природний регулятор росту, який
визначає період спокою бруньок і насіння, а також пригнічує
підкислення і розм’якшення клітинної стінки, що є передумовою
росту розтягненням. Найкраще вивчена роль АБК у регуляції за-
кривання продихів, старінні та опаданні листя.
АБК має дві ізомерні форми — сіз- і ігапз-. У природі існує
сй-форма, синтетична сполука є сумішшю обох форм.
43
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Як правило, АБК пригнічує ріст калусів. Пригнічення росту
клітин на 50 % спостерігається у разі використання АБК у кон-
центрації 5—50 мг/л [220], але є відомості і щодо стимуляції рос-
ту досить малих її концентрацій (0,05—1,0 мг/л) [486].
Також відомо, що застосування низьких концентрацій
(0,01 — 1 мг/л) АБК стимулює морфогенез у багатьох рослин.
Найчастіше це стимуляція утворення адвентивних бруньок на
експлантах вегетативних органів [471] і стимуляція ембріогенезу.
Для отримання великої кількості соматичних ембріоїдів і зрілих
зародків для масового розмноження вважається за потрібне вико-
ристовувати АБК [106, 107] у низьких концентраціях (0,03 мг/л).
Використання АБК також попереджує утворення додаткових за-
родків у тканин, де соматичні зародки вже сформувалися.
Етилен. Під час культивування ізольованих органів, тканин і
клітин рослин утворюється етилен (Н2С = СН2). Інтенсивність
його синтезу збільшується в умовах стресу [209, 222], при старін-
ні культур [316]. Крім того, деякі компоненти середовища, на-
приклад маннітол, чи певні комбінації ауксину і цитокініну та-
кож підвищують синтез етилену [350]. Можливо, завдяки нако-
пиченню цієї речовини в посудинах відбувається індукція калу-
соутворення і морфогенезу.
Велику кількість етилену (до 1220 нмоль/г сухої маси клітин)
виділяють суспензійні культури рослин [316], особливо у стаціо-
нарній фазі росту.
Встановлено, що етилен може стимулювати ріст іп уіїго ка-
лусів деяких видів рослин. Зародки Сіпк§о ЬіІоЬа на середовищі
без ауксину в колбах із ватними пробками проростають, а в кол-
бах, покритих плівкою парафільм, в якій накопичується етилен,
утворюють калус [508]. Деякі автори відмічають чітку кореляцію
інтенсивності синтезу етилену і швидкості росту калусних куль-
тур рослин (тютюну [152], георгин [224], томатів [361]). Е. Сеог§е
[226] вважає, що існує критична концентрація етилену, за якої
стимулюється морфогенез; нижчі або вищі концентрації будуть
відповідно або неефективними, або пригнічувальними. Є чис-
ленні повідомлення щодо пригнічення етиленом (етефоном) ут-
ворення пагонів і коренів, і навпаки, внесення у середовище 5—
50 мг/л нітрату срібла (інгібітор синтезу етилену) стимулювало
утворення пагонів [169, 407]. Однак також відомо, що етилен у
певних концентраціях стимулює утворення адвентивних бруньок
на сім’ядолях Ріпик гасііаіа [310, 311], папороті РіегіФит адиііі-
пит [206] і експлантах лусок цибулини лілій [491].
44
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
Є відомості щодо стимуляції утворення коренів за наявності
етилену; в інших випадках стимуляція має місце при обробці
тканин Л£ІМО3 [176].
Підвищення концентрації етилену в атмосфері, як правило,
пригнічує ріст клітин у меристемах пагонів і коренів. Надзви-
чайно чутливі до наявності етилену проростки гороху, у яких
цей процес спостерігався за дуже низьких концентрацій, менш
чутливі — однодольні (злаки і трави).
Культури тканин, що ростуть у закритих посудинах, мали б
надзвичайно чутливо реагувати на накопичення етилену, але на-
справді рідко коли ріст пригнічується через накопичення етиле-
ну. Навпаки, додавання до середовища 50—100 мг/л метіоніну,
попередника етилену, разом з 1 мг/л БАП збільшувало ефек-
тивність розмноження декількох деревних видів [192]. Однак є
відомості і про те, що під час вирощування пагонів у щільно за-
критих пробірках накопичується така кількість етилену, яка при-
гнічує їх ріст. Крім того, зменшується довжина міжвузль і по-
жовтіння листя (наприклад, у КаїапсЬое £ІО88Іе1с1іапа [269] і гвоз-
дики [347].
Поліаміші. Останнім часом досить інтенсивно вивчається
роль поліамінів, аліфатичних сполук амінів, у процесах росту,
диференціації та морфогенезу. Найпоширенішими речовинами
цього класу є путресцин (діамін), спермідин (тріамін) і спермін
(тетраамін). Поліаміни утворюються з аргініну і орнітину за до-
помогою ферментів орнітиндекарбоксилази, що значною мірою
активується під час поділу клітин [121, 122], і аргініндекарбокси-
лази, яка активується у процесі росту клітин розтягненням [216].
Фізіологічна роль поліамінів зумовлена їх властивостями. Як
катіони вони легко зв’язуються із негативно зарядженими гру-
пами нуклеїнових кислот і білків. При зв’язуванні з поліамінами
РНК і ДНК стають стійкішими до дії нуклеаз і термальної дена-
турації [218], активують реплікацію і транскрипцію ДНК. їх дія в
деяких аспектах нагадує дію катіонів К+, Са2+ і М§2+ в умовах
стресу [453]. Поліаміни, крім того, можуть зв’язуватись з аніон-
ними групами, зокрема з фосфоліпідними групами мембран і
поліцукридами клітинних стінок; вони також змінюють актив-
ність ферментів. Відзначено, що найвищий рівень поліамінів у
тканинах, що активно ростуть (кінчики коренів, бруньки), і під
час морфогенезу [336].
Екзогенні поліаміни беруть участь у процесах поділу клітин
та їх росту розтягненням [121]. Деякі експериментальні дані вка-
45
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
зують на те, що для функціонування поліамінів потрібні іони
Са2+; крім того, поліаміни спричинюють швидке відділення Са2+
від плазматичних мембран [303].
У біосинтезі поліамінів, як і етилену, бере участь аденозил-
метіонін, і це, очевидно, є причиною взаємного антагонізму між
цими сполуками: поліаміни пригнічують біосинтез етилену блоку-
ванням участі аміноциклопропанкарбонової кислоти у його син-
тезі, а етилен зменшує активність аргініндекарбоксилази, у зв’яз-
ку з чим також знижується його рівень [382].
Здатність поліамінів індукувати і стимулювати поділ клітин
використовують для отримання клітинних колоній з протоплас-
тів [218].
Також існують літературні дані щодо стимуляції поліамінами
регенерації пагонів із листкових експлантів [288] та утворення
адвентивних коренів [212].
Органічні кислоти. Позитивний ефект від наявності органіч-
них кислот у середовищах має місце переважно при викори-
станні кислот циклу Кребса [189]. Щодо ролі органічних кислот
у живильних середовищах, то вони можуть діяти як хелатуючі
агенти, бути буфером і підтримувати сталий рН або слугувати
елементами живлення [226]. Встановлено [374], що яблучна ки-
слота в концентрації 100 мг/л діє як буфер у середовищі для
культури зародків ячменю і за наявності глутаміну і аланіну сти-
мулює їх ріст. Є відомості, що невисокі концентрації лимонної і
бурштинової кислот не пригнічують ріст культур багатьох видів
рослин, а у деяких видів стимулюють його. Кислоти також є
ефективними буферами в межах рН 5—6 [427].
Встановлено [517], що бівалентні органічні кислоти — ли-
монна, малеїнова, яблучна і малонова — містяться у ксилемному
соці рослин. Разом з амінокислотами вони утворюють комплек-
си з іонами металів і беруть участь у транспорті останніх. В умо-
вах іп уіїґо культивовані клітини і тканини виділяють органічні
кислоти в середовище. Є дані [377], що яблучна і лимонна ки-
слоти, які виділяються клітинами рису в середовище, роблять
доступнішими іони заліза, в результаті чого не спостерігаються
ознаки його дефіциту. Встановлено також, що внесення у сере-
довище органічних кислот циклу Кребса може сприяти кращому
засвоєнню 1\1Н4. К. Као і М. Місіїауіик [298] додавали у середо-
вище низькі концентрації натрію пірувату, лимонної, яблучної і
фумарової кислот, що сприяло росту культури клітин Уісіа йаіак-
іапа за низької їх густини. Цю суміш органічних кислот багато
46
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
дослідників використовували у середовищах для культури прото-
пластів. Для деяких культур тканин стимулювальну дію виявляє
одна органічна кислота, наприклад ріст калусу лимона поліпшу-
ється у разі внесення у середовище лимонної кислоти. Також
відомо, що яблучна кислота значно поліпшує ріст і виживання в
умовах іп уіїго сукулентів і кактусів (цит. за: [226]).
Вітаміни є необхідними компонентами живильних середо-
вищ для культур тканин, оскільки ізольовані клітини і тканини
втрачають здатність до їх синтезу. Найчастіше використовують
тіамін (В]), нікотинову кислоту (ніацин) і піридоксин (В6), а та-
кож мезоінозитол. Саме ці вітаміни входять до складу найвжи-
ванішого середовища М8.
Роль тіаміну визначається його участю в метаболізмі вугле-
водів і біосинтезі амінокислот. Тіамін є складовою частиною пі-
руватдекарбоксилази у вигляді фосфорнокислого ефіру тіамінпі-
рофосфату і в зв’язку з цим відіграє важливу роль у метаболізмі
вуглеводів. Тіамінпірофосфат також входить до складу комплексу
ферментів, що каталізують окисне декарбоксилювання кетокис-
лот. Тіамін необхідний для всіх культур тканин. До складу сере-
довищ тіамін вносять у концентрації 0,1—10,0 мг/л. Високий
вміст тіаміну в середовищах Гамборга (10 мг/л) і Шенка (5 мг/л).
Середовище М8 містить 0,3 мкмоль тіаміну. Внесення у середо-
вище тіаміну у вищих концентраціях (до 5 мкмоль [130]) за од-
ночасного підвищення концентрації нікотинової кислоти до
30 мкмоль збільшує частоту утворення соматичних ембріоїдів до
70 %. Давно відзначено, що існує деяка взаємодія тіаміну і ци-
токінінів [186]: якщо нормальна тканина тютюну росте на сере-
довищі з високим вмістом кінетину (1 мг/л), в ній синтезується
тіамін у кількості, достатній для росту, але у разі перенесення на
середовище з меншою концентрацією кінетину тканина може
рости лише за наявності у ньому тіаміну.
До складу багатьох середовищ входить піридоксин, фосфор-
нокислий ефір якого є складовою частиною ферментів декарбо-
ксилювання і переамінування амінокислот. У середовище вно-
сять 0,1—1,0 мг/л піридоксину одночасно з тіаміном і нікотино-
вою кислотою (суміш вітамінів по Уайту, Мурашіге та ін.) або
окремо по 0,5—1,0 мг/л.
Нікотинова кислота у вигляді аміду входить до складу дегід-
рогеназ, які каталізують віднімання водню від речовин, що при
цьому окиснюються. До живильних середовищ додають 0,5—
1,0 мг/л нікотинової кислоти.
47
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Пантотенова кислота необхідна для росту культур тканин
деяких видів, наприклад верби і дурману [223], але багато ізо-
льованих тканин здатні її синтезувати.
Рибофлавін є компонентом суміші вітамінів за Р. ХУНііе [515].
Відомо, що за наявності рибофлавіну поліпшується ріст і якість
пагонів [190], але пригнічується утворення калусу.
До складу багатьох середовищ входить мезоінозитол, який
вважають вітаміном; здебільшого він міститься в дріжджовому
екстракті, лише невелика кількість — в агарі. Мезоінозитол у рос-
линах знаходиться у складі фосфатидилінозитолу, який є ком-
понентом клітинних мембран.
Існує думка, що фосфатидилінозитол — це вторинний ме-
сенджер, який бере участь у відповіді клітин на дію різних фак-
торів навколишнього середовища. Вважають, що інозитолфосфа-
ти також діють як вторинні месенджери під впливом ауксинів.
Фітинова кислота (інозитолгексафосфат) може стимулювати ріст
тканин (цит. за: [226]) і бути джерелом інозитолу. Крім того,
встановлено, що стимулювальна дія мезоінозитолу частково є
результатом участі цієї сполуки у синтезі пектину і геміцелюлоз
клітинної стінки [327]. Культури тканин відрізняються за здат-
ністю синтезувати мезоінозитол. Хоч багато калусних культур
можуть рости на середовищах без мезоінозитолу, оскільки збері-
гають здатність до його біосинтезу, додавання до середовища не-
великої кількості цього вітаміну стимулює клітинний поділ. Вне-
сення мезоінозитолу до живильного середовища потрібне для
культур тканин усіх однодольних [300].
Компоненти невизначеного складу. Внаслідок розвитку методу
культури тканин, створення збалансованих живильних середо-
вищ, які містять амінокислоти і нові регулятори росту, добавки
до середовищ компонентів невизначеного або нестійкого складу
застосовують значно рідше.
Серед тих компонентів, які й зараз використовують для сти-
муляції росту, органогенезу і накопичення речовин вторинного
синтезу, є дріжджовий екстракт, дія якого залежить від вмісту в
ньому амінокислот, вітамінів (інозитолу і тіаміну). Як правило,
дріжджовий екстракт додається до середовищ у концентрації
0,1 —1,0 г/л, іноді 5, 10 і 20 г/л.
Екстракт бульб картоплі широко використовують при куль-
тивуванні іп уііго пиляків пшениці або інших злакових. Середо-
вище складається з екстракту відвареної картоплі, 0,1 мкмоль
РеЕДТА, 9 % цукрози і регуляторів росту [170, 172]. Відвар кар-
48
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
топлі використовують при МКР: є відомості про додавання екст-
ракту картоплі (із 100 г картоплі, вареної 5 хв у 1 л середовища
Ф. Ваціна і Ф. Вента [425]) до середовища для орхідей. С. Наг-
уаік [254] вводив 5%-й екстракт, виготовлений із 200 г картоплі,
звареної в 1 л води, до того ж середовища.
Для приготування 20%-го екстракту 200 г свіжих бульб кар-
топлі миють водою, якщо є пагони — їх відламують. Бульби
розрізають на маленькі шматочки і кип’ятять в 400—600 мл дис-
тильованої води 25—30 хв. Рідину, в якій варили картоплю, ра-
зом із розвареними шматочками фільтрують крізь 2 шари марлі.
Можна екстрагувати залишки картоплі ще раз і об’єднувати два
екстракти [226]. Екстракт одразу використовують для приготу-
вання середовища. Відзначено, що кращі результати отримують
при використанні картоплі, що зберігалася недовго.
Кокосове молоко. Рідкий ендосперм Сосок писіГега як компо-
нент живильного середовища вперше використав 1. Уап Оуєг-
Ьеекі (цит. за: [226]) під час вирощування дуже молодих зародків
дурману. Пізніше було встановлено [223, 458], що введення у
склад середовища з ауксином кокосового молока сприяє поділу і
росту клітин. Крім того, його можна використовувати як для
індукції росту калусних і суспензійних культур, так і для стиму-
ляції морфогєнезу. Ефект спостерігається при використанні до-
сить високих концентрацій (10—15 % за об’ємом). Є відомості,
що додавання кокосового молока до середовища М8 сприяє ін-
дукції соматичного ембріогенезу в калусних і суспензійних куль-
турах злаків [496]. Треба зазначити, що в комерційних лаборато-
ріях з МКР кокосове молоко використовують рідко з огляду на
його високу вартість. Тепер цей компонент застосовують пере-
важно в теоретичних дослідженнях соматичного ембріогенезу.
Деякі фірми розповсюджують готове до використання коко-
сове молоко, але більшість дослідників отримують його самі зі
свіжих кокосових горіхів із рідким ендоспермом. В очищених від
зовнішньої оболонки кокосових горіхах просвердлюють дірки в
двох мікропіле. З одного горіха отримують 100 мл кокосового
молока. Його проціджують і нагрівають при 80—100 °С протягом
10 хв при перемішуванні для осадження білка. Дають відстоятися
і фільтрують крізь папір для звільнення від осаду білка. Рідина
зберігається за температури -20 °С. Деякі дослідники автоклаву-
ють середовище з кокосовим молоком [359], інші стерилізують
кокосове молоко фільтруванням крізь бактеріологічний фільтр і
додають його до автоклавованого середовища [462]. Свій метод
4-6-83
49
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
підготовки кокосового молока пропонують С. Вогкігсі і К. 8іпк
(цит. за: [226]): молоко фільтрують крізь декілька шарів марлі,
доводять рН до 10,0 за допомогою 2,0 н N3014 і витримують
протягом ночі при 4 °С. Наступного дня знижують рН до 7,0 до-
даванням НС1, знову фільтрують і зберігають у замороженому
стані при -20 °С.
Фенольні сполуки. Серед речовин, які стимулюють ріст калу-
сів і утворення адвентивних пагонів, поліпшують їх укорінення,
відомі поліфеноли, органічні сполуки, основним структурним
компонентом яких є ароматичне кільце з однією або декількома
гідроксильними групами. У зв’язку з цим інтенсивно вивчається
біологічна дія флороглюцинолу та його аналогів (глікозидів —
флоридзину, флоретової кислоти), катехолу, кумарину та хлоро-
генової кислоти.
Стосовно фізіологічної дії фенольних сполук існує декілька
гіпотез, в основі яких лежить їх відновна властивість: вони можуть
бути субстратами для окиснювальних ферментів і таким чином
захищати від руйнування природну ІОК [462]. Феноли можуть
також реагувати з пероксидом водню, який утворюється в резуль-
таті розкладу ІОК, і у такий спосіб запобігати його токсичній дії.
Для успішного МКР рослин має значення інтенсивність ут-
ворення фенольних сполук у тканинах, яка залежить від інтен-
сивності росту культур тканин. Вміст фенольних сполук у куль-
тивованих тканинах зумовлений співвідношенням ауксин:цито-
кініни [445]. Стосовно кореляції вмісту фенольних сполук і здат-
ності до морфогенезу відомо, що утворення пагонів у калусній
тканині тютюну спостерігається при зниженні вмісту природних
фенольних сполук (цит. за: [226]). Ініціація коренеутворення
відбувається за низького рівня фенольних сполук у тканинах, а
ріст коренів потребує вищої концентрації. Так, у пагонах яблуні
у фазу індукції коренеутворення був визначений низький вміст
фенолів, але пізніше він зростав [192]. На основі спостереження,
що флороглюцинол стимулює коренеутворення лише у клонів
яблуні з високою активністю фенолоксидаз, було висловлено
припущення, що морфогенетична активність індукується про-
дуктами окиснення таких фенольних сполук, як флороглюцинол
і флоридзин (цит. за: [226]).
Речовини, які застосовують для отримання твердого середови-
ща. Для цього найчастіше використовують агар — поліцукрид із
морських водоростей. Зараз існує чимало видів порошкоподібно-
го очищеного агару: “ВіГсо”, “Васіо”, “МоЬІе”, “РигіГіесГ та ін.
50
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
Останнім часом дослідники шукають замінники агару. Так,
для культивування пиляків ячменю у середовище додають 5 %
крохмалю. На середовищі з крохмалем адвентивні пагони кар-
топлі формуються з дисків за 3 тижні, на агаризованому — за 5—
14 тижнів [226]. При культивуванні протопластів використовують
агарозу, Фітогель (комерційний замінник агару) і Гелріт. Гелріт —
це гетерополіцукрид, який продукує бактерія Рзеиботопаз еіо-
Оеа. Комерційний препарат містить значну кількість калію, нат-
рію, кальцію і магнію, вільний від органічних забруднювачів, які
можуть бути в агарі. Гелріт у концентраціях, менших за агар, ут-
ворює прозорий гель. Цей препарат можна використовувати од-
ночасно з агаром [226].
Іноді для підтримки тканини використовують пластинки з
поліуретану та перліт. Під час вирощування тканин у стаціонар-
ному рідкому середовищі застосовують невеликі аркуші з фільт-
рувального паперу [259].
Концентрація водневих іонів у живильному середовищі впли-
ває на стійкість і засвоюваність його компонентів. Найчутливіші
до рН фізіологічно активні речовини — гіберелова кислота, НОК,
вітаміни. Від рівня рН також залежить доступність для тканин
фосфатів, сполук заліза та солей важких металів. За низького рН
агар не желатинизується, не твердне. Оптимальними для більшос-
ті ізольованих тканин є середовища з рН 5,0—5,8. Аби підтри-
мати постійне значення рН, у середовище вносять буферні су-
міші (фосфат і карбонат кальцію) та хелат заліза.
Тканини деяких рослин під час культивування виділяють у
середовище фенольні сполуки, внаслідок чого середовище швид-
ко темніє, і тканина відмирає. Аби уникнути цього, потрібно до-
давати у середовище активоване вугілля (1—2 г/л), адсорбційні
властивості якого сприяють рівномірному розподілу поживних
елементів у середовищі та видаленню продуктів метаболізму.
Крім того, додавання вугілля забезпечує затемнення середовища,
сприяє кращому розвитку коренів. На середовищі з активованим
вугіллям концентрація водневих іонів за тривалого культивуван-
ня тканин або рослин-регенерантів не змінюється.
Приготування живильного середовища. Для зручності у робо-
ті та прискорення цього процесу доцільно заздалегідь приготу-
вати концентровані розчини макроелементів об’ємом 0,5—1 л, в
яких концентрація солей в 20 разів вище, ніж у робочому роз-
чині. Солі кальцію готують окремо для запобігання випаданню
осаду.
4*
51
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Маточні розчини мікроелементів готують у концентраціях,
що в 100 разів перевищують необхідні, з таким розрахунком, аби
1 мл маточного розчину містив масу речовини, потрібну для при-
готування 1 л робочого розчину.
Ці концентровані розчини зберігають у холодильнику при
2—4 °С у пляшках із темного скла не довше 4—6 тижнів. Розчи-
ни регуляторів росту та вітамінів готують з розрахунку 1 мг речо-
вини у 1 мл розчину. Цитокініни спочатку розчиняють у неве-
ликій кількості 1,0 н лугу, ауксини — у краплі етанолу, а потім
доводять до потрібного об’єму дистильованою водою.
Концентровані розчини органічних речовин зберігають у хо-
лодильнику при -20 °С. Слід враховувати, що вітаміни і фітогор-
мони не можна довго зберігати у розчинах навіть у холодильни-
ку. Вуглеводи, амінокислоти, гідролізат казеїну, дріжджовий ек-
стракт зважують і додають безпосередньо у середовище під час
приготування.
Хелатну форму заліза готують так: розчиняють при нагріван-
ні 557 мг Ре8О4- 7Н2О і 745 мг трилону Б (ЕДТА) у 100 мл бі-
дистиляту. Для приготування 1 л живильного середовища беруть
5 мл розчину. Хелатна форма покращує доступність заліза у ши-
роких межах рН. Зберігають розчин у холодильнику в склянці з
темного скла.
Приготування живильних середовищ потребує особливої ува-
ги; аби уникнути помилок, слід дотримуватись певної послідов-
ності у роботі (див. схему).
Схема приготування 1 л живильного середовища
Рідке середовище
Налити 250—300 мл бідистильованої
води у мірну колбу або циліндр
Додати потрібну кількість маточних
розчинів макро- і мікроелементів
Додати розчини вітамінів і регулято-
рів росту
Додати органічні компоненти і вуг-
леводи, довести об’єм до 350—400 мл
Визначити рН додаванням по крап-
лях 0,1 н КОН або 0,1 н НС1
Довести об’єм до 1 л
Тверде середовище
Налити 500 мл бідистильованої во-
ди у термостійку склянку
Додати потрібну кількість агару (6—
8 г), витримати 15—20 хв, аби він
набух
Нагріти (постійно перемішуючи) до
повного розчинення агару
Злити обидва розчини, профільтру-
вати крізь марлю
Визначити рН додаванням по крап-
лях 0,1 н КОН або 0,1 н НС1
Довести об’єм до 1 л
52
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
Розлита у стерильний посуд і закрити Розлити у стерильний посуд і закрити
Стерилізувати при 0,8—1 атм 20— Стерилізувати при 0,8—1 атм 20—
25 хв (залежно від об’єму середо- 25 хв (залежно від об’єму середо-
вища) вища)
Готові середовища бажано швидко використати (протягом
7—10 діб). Рідке середовище розливають у пробірки з підставка-
ми з фільтрувального паперу для стаціонарного вирощування
тканини або у спеціальні посудини для культивування на ролері
чи шейкері.
Розчини термолабільних компонентів (рослинних екстрактів,
амінокислот, деяких стимуляторів росту, вітамінів) слід стерилі-
зувати крізь бактеріальні фільтри. Стерильні розчини додають у
боксі до готового стерильного середовища.
Склад найпоширеніших живильних середовищ. Дотепер роз-
роблено велику кількість різних за складом живильних сере-
довищ, найчастіше це модифікації середовищ Кнопа, Уайта,
Готре, Хеллера, М8. Мінеральний склад середовищ зумовлений
головними фізіологічними потребами рослин. Він стабільний,
змінюється переважно вміст амінокислот, регуляторів росту, ві-
тамінів.
Найчастіше вживаним є середовище М8, що містить збалан-
совану кількість поживних речовин, яка сприяє росту ізольова-
них тканин багатьох рослин. Деякі середовища — це його моди-
фікації (середовища Піріка, Лінсмайєр—Скуга (Ь8), Джонса,
Міллера та ін.).
Не менш популярним є середовище Гамборга (В5) та його
модифікації. Загальна концентрація солей тут нижча, але більше
нітратного азоту і менше аміачного, ніж у середовищі М8.
Середовище Уайта найчастіше використовують у модифіка-
ціях, бо в оригінальному пропису рівень солей К+ і №+ досить
низькій для росту тканин і проліферації калусу.
Нижче наведено склад основних живильних середовищ для
росту культур рослин. Концентрація компонентів подана в мг на
1 л середовища.
Середовище Андерсона [109]
Макроелементи 2п8О4 7Н,О 8,60
КТМО, 480,0 КІ 0,30
МН4ЙО3 400,0 №2МоО4 2Н2О 0,25
СаС12 б/в 332,2 Си8О4 • 5Н2О 0,025
М^8О4 б/в 180,7 СоС12 6Н2О 0,025
53
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ИаН,РО4 б/в 330,6
Мікроелементи
Н,ВО, 6,20
Мп8О4 4Н2О 16,90
Ее8О4 • 7Н2О 55,70
Иа2ЕДТА • 2Н,О 74,50
(рН 4,5)
Призначене для МКР вересових, малини.
Середовище Андерсона [110], модифіковане
АІ А II А III
II стадія III стадія
Компоненти І стадія (збільшення (підготовка
(розмноження) кількості до перенесення
мікроструктур) в ґрунт)
Макроелементи
МН4ЬІО, 200,00 400,00 100,00
кгю, 240,00 480,00 120,00
№Н2РО4 б/в 165,00 330,60 82,50
СаС12 б/в 166,00 332,20 83,00
Мв8О4 б/в 90,35 180,70 45,18
Мікроелементи
Мп8О4 • 4Н-.О 8,45 16,90 4,225
Н3ВО3 3,10 6,20 1,55
СоСІ, • 6Н2О 0,0125 0,025 0,00625
Си8О4 5Н,О 0,0125 0,025 0,00625
ЬІа2ЕДТА 37,25 74,50 18,625
Ее8О4 • 7Н2О 27,85 55,70 13,925
Иа,МоО4 2Н,О 0,125 0,25 0,0625
кі 0,15 0,30 0,075
2п8О4 • 7Н2О 4,30 8,60 2,15
Органічні добавки
Активоване вугілля Аденінсульфат 6-диметилаліламіно- 80,0 80,0 600,0
пурин (2-іР) 2,00 15,0
ІОК 0,50 4,00
Мезоінозитол 100,0 100,0 100,0
Тіамін — НС1 0,40 0,40 0,40
Цукроза 30 000,0 30 000,0 22 500,0
Агар 10 000,0 10 000,0 10 000,0
Середовища Андерсона розроблені для МКР рододендрона (Кіюсіосіеп-
бгоп), а також вересових, малини, голубики та деревних порід. Оптимальну
концентрацію органічних добавок (цукрози, ауксинів і цитокінінів) підби-
рають експериментально для кожного виду окремо.
54
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
Середовище Блейдса [140]
Макроелементи Мп8О„ 4,40
КН,РО4 300,0 РеК'аЕДТА 32,0
КІЧО, 1000,0 Органічні добавки
МН4ЙО, 1000,0 Гліцин 2,00
Са(МО,)2 347,0 Тіамін — ПСІ 0,10
Мв8О4 35,0 Нікотинова кислота 0,50
КС1 65,0 Піридоксин — НС1 0,10
Мікроелементи ІОК 5,0
КІ 0,80 Кінетин 0,5
2п8О4 1,50 Цукроза 30 000,0
Н3ВО3 1,60
Призначене для МКР геснерієвих, сенполії.
Середовище Борнмана (МСМ) [144]
Макроелементи №2МоО4 • 2Н,О 0,25
СН^а,О 150,0 КІ 0,25
КК'О3 2000,0 Си8О4 5Н,О 0,025
Са(МО3)2 • 4Н2О 500,0 СоС12 6Н,О 0,025
(ІЧН4)28О4 400,0 Органічні добавки
КН2РО4 270,0 Мезоінозит 90,0
КС1 150,0 Гліцин 2,00
Мв8О4 • 7Н,О 250,0 Тіамін — НС1 1,70
Мікроелементи Нікотинова кислота 0,60
К'аРеЕДТА 2Н2О 37,50 Пантотенат 0,50
Н,ВО, 1,50 Піридоксин — НС1 1,20
2п8О4 • 7Н2О 3,00 Фолієва кислота 1,10
Мп8О4 • 4Н2О 0,17 Біотин 0,125
Призначене для МКР ялини та інших хвойних порід.
Середовище Боксуса [149]
Макроелементи Органічні добавки
Са(МО,), 4Н2О 500,00 Гліцин 2,00
КТМО3 125,00 Едамін 1000,0
Мв8О4 7Н,О 125,00 Мезоінозит 100,0
КН,РО4 125,00 Нікотинова кислота 0,50
Мікроелементи Піридоксин — НС1 0,50
№2ЕДТА 37,30 Тіамін — НС1 0,10
Ре8О„ • 7Н,О 27,80 БАЛ 0,10
Н,ВО3 6,20 ІМК 1,00
Мп8О4 4Н,О 22,30 Гіберелін 0,10
Хп8О4 7Н2О 8,60 Глюкоза 40 000
КІ 0,73 Агар 8000
№2МоО4 2Н2О 0,25
Си8О4 5Н2О 0,025 (рН 5,6-5,8)
Призначене для МКР суниці.
55
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Середовище Ваціна і Вента [489]
Макроелементи
(МН4)28О4 500,0
Са(РО4)2 200,0
М§8О4 б/в 122,1
К1ЧО3 525,0
КН2РО4 250,0
Мікроелементи
Ее-тартрат 2Н,О 28,00
Мп8О4 б/в ’ 5,078
Органічні добавки
Тіамін — НС1 0,40
Цукроза 20 000,0
Призначене для МКР орхідних і бромелієвих (иимбідіу-
ма, катлеї, дендробіума і ванди).
Середовище Гамборга В5 [221]
Макроелементи Ее8О4 7Н2О 27,85
(МН4)28О4 134,0 Мп8О4 б/в 10,0
СаСІ, б/в 113,24 №,МоО4 2Н2О 0,25
М^8О4 б/в 122,09 кі 0,75
КЕІО3 2500,0 2п8О4 7Н2О 2,0
№Н2РО„ б/в 130,5 Органічні добавки
Мікроелементи Нікотинова кислота 1,00
НчВО3 3,00 Піридоксин — НС1 1,00
СоСІ, 6Н2О 0,025 Тіамін — НС1 10,0
Си8О4 5Н,О 0,025 Мезоінозитол 100,0
№2ЕДТА • 2Н2О 37,25 2,4-Д Кінетин 0,1-1,0 0,1
Призначене для МКР бобових (сої, конюшини), а також
троянд, цукрового буряку та інших сільськогосподарських
культур, для виділення і культивування протопластів.
Середовище Грешофа і Доя [239]
Макроелементи Ее8О4 7Н,О 27,85
МН4МО3 1000,0 Мп8О4 1,0
Са(МО,)2 4Н2О 241,20 І\'а2МоО4 2Н2О 0,025
М&8О4 б/в 17,099 КІ 0,8
КС1 65,0 2п8О4 7Н2О 0,3
КГЮз 1000,0 Органічні добавки
КН2РО4 300,0 ^/-Біотин 0,2
Мікроелементи Тіамін — НС1 1,0
н,во3 0,30 Нікотинова кислота 0,1
СоСІ, • 6Н,О 0,025 Піридоксин — НС1 0,1
Си8О4 • 5Н2О 0,025 Мезоінозитол 10,0
№2ЕДТА 2Н2О 37,30 Гліцин 4,0
Призначене для культивування тканин АгаЬісІорях іііаііа-
па, томатів, гаплоїдних клітин винограду, МКР сосни.
56
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
Середовища Дженовезі (¥Р) [225], ¥Р<1 та ¥Рг
¥Р Макроелементи ¥Рс1 ¥Рг
кмо, 2500,00 2500,00 2500,00
мн4ьіо, 165,00 165,00 165,00
СаСІ, 2Н2О 176,00 176,00 176,00
КН2РО4 510,00 510,00 510,00
М§8О4 7Н,О 370,00 370,00 370,00
Мікроелементи
Мп8О4 4Н2О 4,40 4,40 4,40
2п8О4 7Н,О 1,50 1,50 1,50
Н,ВО, 1,60 1,60 1,60
КІ 0,80 0,80 0,80
№2ЕДТА 2Н2О 37,30 37,30 37,30
Еє8О4 7Н2О 27,80 27,80 27,80
Органічні добавки
Тіамін — НСІ 0,25 0,25 —
Піридоксин — НСІ 0,25 0,25 —
Нікотинова кислота 1,30 1,30 —
Пантотенат кальцію 0,25 0,25 —
Гідролізат казеїну 500,00 500,00 500,00
Гліцин 7,70 7,00 —
Глутамін — 146,00 —
ІОК — 1,0 —
Кінетин — 1,0 —
Активоване вугілля 5000,00 — —
2,4,5-трийодобензойна кислота 0,10 — —
Цукроза 120 000,0 30 000,0 30 000,0
Агар 8000,00 8000,00 8000,00
(рН 5,8)
Призначене для ініціації і підтримання калусогенезу та органогенезу
пилкових ембріоїдів кукурудзи.
Середовище Данстена і Шорта (ВВ8) [198]
Макроелементи СоСІ2 6Н2О 0,025
Са(КЮ,)2 4Н2О 150,0 Н,ВО, 3,00
ККЮ, 2530,0 №2МоО4 2Н,О 0,25
]ЧН4Ї\'О, 320,0 Еє8О4 7Н2О 27,80
МН4Н2РО4 230,0 №,ЕДТА • 2Н,О 37,30
(ЬІН4)28О4 134,0 Органічні добавки
МЕ8О4 7Н,О 247,0 Нікотинова кислота 1,00
№Н2РО4 2Н2О 172,0 Тіамін — НСІ 10,0
Мікроелемеї нти Піридоксин — НСІ 1,00
Мп8О4 4Н2О 13,20 Мезоінозит 100,0
Хп8О4 7Н2О 2,00 2,4-Д 0,25
Си8О4 5Н,О 0,039 Цукроза 30 000,0
КІ 0,75 (рН 5,5)
Модифіковане середовище В5. Призначене для індукції калусу і
МКР цибулі.
57
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Середовище Де Гріфа і Якобса [184]
Макроелементи СоС12 6Н2О 0,0025
(N114)2804 400,0 Си8О4 5Н2О 0,0025
СаС12 б/в 226,5 N а, ЕДТА 2Н2О 37,3
Мв8О4 244,73 Еє8О4 • 7Н2О 27,8
КН2РО4 б/в 250,0 Мп8О4 4Н2О 1,68
КС1 600,0 №2МоО4 • 2Н2О 0,0025
ККО, 2000,0 КІ 1,583
Мікроелементи Н,ВО4 10,62 Хп8О4 7Н2О 1,06
Призначене для індукції органогенезу буряків.
Середовище Драйвера (ВКМ'/Зи§1аіі8) [191]
Макроелементи Мп8О4 33,5
N^N0, 1416,0 №,МоО4 2Н2О 0,39
СаС12 б/в 112,5 №8О4 • 6Н,О 0,0053
Са(НО,)2 б/в 948,68 Хп^ОД, 17,0
М&8О4 б/в 361,49 Органічні добавки
КН,РО4 265,0 Тіамін — НС1 2,0
К28О4 1559,0 Нікотинова кислота 1,0
Мікроелементи Мезоінозитол 100,0
Н,ВО3 4,80 Гліцин 2,0
Си8О4 5Н2О 0,25 1МК 0,01
№2ЕДТА 2Н2О 45,4 БАП 1,0
Ее8О4 7Н,О 33,8
Призначене для МКР каштана, горіха, бузку, дикої яблуні.
Середовище Еріксона [207]
Макроелементи СоС12 6Н2О 0,0025
N^N0, 1200,0 Си8О4 5Н2О 0,0025
СаСІ, б/в 332,2 На, ЕДТА • 2Н2О 37,3
Мв8О4 б/в 180,78 Хп1Ма2ЕДТА 15,0
1900,0 Ее8О4 7Н2О 27,8
КН,РО4 340,0 Мп8О46/в 1,69
Мікроелементи Н3ВО3 0,53 Н'а2МоО4 • 2Н,О 0,025
Призначене для культивування тканин Наріораррік £га-
СІ1І8, суспензії клітин моркви.
Середовище Као і і Михайлюка [298]
Макроелементи СоС12 6Н2О 0,025
НН4НО3 600,0 Си8О4 • 5Н,О 0,025
СаСІ, б/в 453,0 Н'а,ЕДТА 2Н,О 37,3
Ме8О4 б/в 146,55 Ее8О4 • 7Н2О 27,8
58
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
КС1 300,0
КМО, 1900,0
КН2РО4 170,0
Мікроелемеї нти
Н3ВО3 3,0
Мп8О4 б/в 10,0
№,МоО4 2Н,О 0,25
КІ 0,75
2п8О4 7Н2О 2,0
Призначене для культури протопластів трав’яних рослин і
деревних порід.
Середовище Кемпбела і Дарзана [157]
Макроелементи 2п8О4 • 7Н,О 8,60
МН4МО3 800,0 КІ 0,83
КН2РО4 170,0 К'а2МоО4 • 2Н2О 0,25
М§8О4 7Н,О 370,0 Сп8О4 5Н2О 0,025
Са(К'О,)2 4Н2О 980,0 СоСІ, 6Н,О 0,025
КМО, 340,0 Органічні добавки
КС1 65,0 Тіамін 5,00
Мікроелементи Мезоінозитол 500,0
Ма,ЕДТА 2Н2О 37,30 Цукроза 30 000,0
Рє8О4 • 7Н,О 27,80 Агар 8000,0
Н3ВО, 6,20
Мп8О„ • 4Н,О 16,90 (рН 5,6-5,8)
Призначене для МКР винограду.
Середовище Кнудсона [306], модифіковане
Макроелементи
(МН4),8О4 500,0
Са(МО,), 4Н2О 694,4
КН2РО4 250,0
Мв8О4 б/в 122,125
Мікроелементи
Н3ВО3 0,056
Си8О4 5Н,О 0,0624
Рє8О4 7Н,О 25,00
Мп8О4 б/в 5,078
МоО3 0,016
2п8О„ • 7Н2О 0,331
Органічні добавки
Цукроза 20 000,0
Середовище Кнудсона в модифікації Мореля [357]
Макроелементи Мікроелементи
МН4МО, 500,0 Ре8О4 7Н2О 25,0
(МН4)28О4 500,0 Мп8О4 б/в 5,078
Са(І\О3), • 4Н2О 347,2 Ре-цитрат 4,40
М^8О4 б/в 122,1 Органічні добавки
КСІ 250,0 Цукроза 20 000,0
КН,РО4 250,0
Призначене для пророщування насіння і МКР орхідей.
59
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Середовище Куаріна і Лепуавра (мінеральна основа) [409]
М акроелеме нти Мікроелементи
ІЧН4ТЧО3 400,0 Мп8О4 0,75
Са(ІЧО,)2 • 4Н2О 833,8 Еє8О4 • 7Н2О 27,8
Мв8О4 175,8 Н,ВО4 6,2
КН2РО4 270,0 Си8О4 6Н2О 0,025
кіч о. 1800,0 2п8О4 8,6
ІЧа2ЕДТА 37,3 КІ 0,08
СоС12 6Н2О 0,025
Призначене для МКР сливи.
Середовища Кунца [314]
Компоненти Промивання мікроспор Індукція мікроспор
Макроелементи
КІЧО, 500,0 1000,0
КН,РО4 100,0 200,0
(ТЧН-,)8О4 50,0 100,0
Са(ІЧО4) 4Н2О 50,0 100,0
Мв8О4 • 4Н2О 62,5 125,0
КС1 17,5 35,0
Мікроелементи
ЕеСІ, 27,0 27,0
ТЧа,ЕДТА 37,3 37,3
Хп8О4 • 7Н2О 1,5 1,5
НВО, 1,6 1,6
КІ 0,8 0,8
Органічні добавки
Тіамін — НС1 1,0 1,0
2,4-Д 1,5 1,5
Кінетин 0,5 0,5
Цукроза 60 000,0 —
Мальтоза (моногідрат) —- 90 000,0
Глутамін 1000,0 1000,0
Д-серин 100,0 100,0
Призначене для культивування мікроспор пшениці.
Середовище Лі і де Фоссарда [321]
Макроелементи Мікроелементи
ІЧН4ТЧОі 800,0 ІЧа2ЕДТА 16,80
КІЧОз 1010,0 Си8О4 5Н,О 0,025
СаС12 • 2Н2О 294,0 СоС12 • 6Н2О 0,118
Мв8О4 • 7Н,О 370,0 Органічні добавки
ТЧаН2РО4 • Н2О 138,0 Фолієва кислота 0,44
ТЧа28О4 63,9 Рибофлавін 0,38
60
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
Біотин 0,49 КІ 0,40
Холінхлорид 0,14 Ма,МоО4 2Н2О 0,024
Пантотенат кальцію 0,48 Нікотинамід 1,46
Тіамін — НСІ 0,67 Піридоксин — НСІ 0,61
Ре8О4 - 7Н,О 13,90 Мезоінозит 54,0
Мп8О4 • 4Н,О 11,10 Гліцин 0,38
Хп8О4 • 7Н2О 5,80 Аскорбінова кислота 1,80
Н,ВО, 3,10 Цукроза 60 000,0
Призначене для МКР смородини, суниці.
Середовище Ліндемана [323]
Макроелементи Си8О4 • 5Н2О 0,019
(МН4)28О4 1000,0 Мп8О4 б/в 0,0515
Са(МОз), • 4Н2О 347,2 Ре-цитрат 4,4
М§8О4 б/в 58,62 МІСІ, • 6Н,О 0,0312
КС1 1050,0 КІ 0,099
КН2РО4 135,0 Хп8О4 • 7Н,О 0,565
Мікроелементи АІСІз 6Н,О 0,0561
Н3ВО3 1,014
Призначене для МКР орхідних.
Середовище Лінсмайєр—Скуга [324]
Макроелементи КІ 0,83
МН4МО3 1650,0 Ма,МоО4 • 2Н2О 0,25
КМО3 1900,0 Си8О4 • 5Н2О 0,025
СаС12 • 2Н,О 440,0 СоС12 6Н2О 0,025
М§8О4 • 7Н,О 370,0 Органічні добавки
КН,РО4 170,0 Мезоінозит 100,0
Мікроелементи ІОК 15,00
Ма2ЕДТА 37,30 2,4-Д 2,00
Ре8О4 • 7Н2О 27,80 Тіамін — НСІ 0,40
Н,ВОз 6,20 Цукроза 30 000,0
Мп8О4 • 4Н2О 22,30 Агар 10 000,0
2п8О4 7Н,О 8,60
Середовище М8, в якому вміст тіаміну збільшено в 4 рази;
призначене для ініціації і росту калусу тютюну, а також для
МКР багатьох рослин із родин бегонієвих, геснерієвих, іри-
сових, лілейних, ароїдних, троянд, пеларгонії, фікуса, аль-
стромідії, актинідії, моркви, спаржі, часнику, конюшини.
Середовище Літвея [326]
КМО,
МН4МО,
КН,РО4
Макроелементи
1900,0
1650,0
340,0
Мп8О4 4Н2О 21,0
Ма2МоО4 • 2Н2О 1,25
КІ 4,15
61
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
СаС12 • 2Н2О 22,0 СоС12 • 6Н2О 0,125
М§8О4 • 7Н2О 1850,0 Органічні добавки
Мікроелементи Мезоінозит 100,0
Ее8О4 7Н2О 27,80 Тіамін — НСІ 0,10
]Ча2ЕДТА • 2Н,О 37,30 Нікотинова кислота 0,50
Н,ВО, 31,0 Піридоксин — НСІ 0,10
Хп8О4 - 7Н2О Си8О4 • 5Н2О 43,0 0,50 Цукроза 30 000,0
Призначене для МКР хвойних, моркви.
Середовище МакКоуна [344]
Макроелементи Си8О4 • 5Н,О 0,25
МН4ЕЮ3 400,0 №,ЕДТА • 2Н2О 37,3
Са(МО3)2 • 4Н,О 386,0 Еє8О4 • 7Н2О 27,8
СаС12 б/в 72,50 Органічні добавки
М§8О4 б/в 180,7 Мезоінозит 100,0
КН,РО4 170,0 Тіамін — НСІ 1,0
К28О4 990,0 Нікотинова кислота 0,5
Мікроелементи Піридоксин — НСІ 0,5
Н,ВО, 6,20 Гліцин 2,0
Мп8О4 • Н2О 22,3 Глутамін 2,0
№2МоО4 2Н2О 0,25 Цукроза 30 000,0
Хп8О4 • 7Н2О 8,6
Призначене для МКР дуба, троянди, чорниць, кальмії, родо-
дендронів.
Середовище Міллера [352]
Макроелементи Хп8О4 • 7Н2О 3,80
МН4МО3 1000,0 Н3ВО3 1,60
КМО, 1000,0 Си(МО,), • ЗН2О 0,35
Са(МО3)2 4Н2О 500,0 (ТШ4)6Мо7О2 • 4Н2О 0,10
М§8О4 7Н2О 71,50 Органічні добавки
КН,РО4 300,0 Тіамін — НСІ 0,10
ІЧаЕеЕДТА 13,20 Нікотинова кислота 0,50
КС1 65,00 Піридоксин 0,10
Мікроелементи Мезоінозит 100,0
Мп8О4 • 4Н2О 14,0 Цукроза 30 000,0
Призначене для МКР персика.
Середовище Мореля [358]
Макроелементи Н3ВО3 1,00
(МН4)28О4 1000,0 Мп8О4 • 4Н2О 0,10
Са(МО,), 4Н,О 500,0 Си8О4 • 5Н2О 0,03
КС1 1000,0 А1С1, 0,03
62
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
КН2РО4 125,0 МіС12 • 6Н2О 0,03
МЄ8О4 • 7Н2О 125,0 КІ 0,10
Мікроелементи Органічні добавки
ЕеС13 • 6Н2О 1,0 Гомогенат банана 40 000,0
2п8О4 - 7Н2О 1,0 Цукроза 20 000,0
Призначене для розмноження протокорма цимбідіума, катлеї,
дендробіума, ванди, мільтонії та інших орхідей.
Середовище Мурашіге—Скуга [366]
Макроелементи КІ 0,83
мн4ею3 1650,0 Ее8О4 • 7Н2О 27,80
КМО3 1900,0 №,ЕДТА 2Н2О 37,3
СаСІ, 2Н,О 440,0 Органічні добавки
М§8О4 7Н,О 370,0 Тіамін — НСІ 0,1
КН2РО4 170,0 Піридоксин — НСІ 0,5
Мікроелементи Нікотинова кислота 0,5
Н,ВО3 6,2 Мезоінозит 100,0
Мп8О4 • 4Н2О 22,3 Гліцин 2,0
СоС12 6Н2О 0,025 іок 2,0
Си8О4 5Н,О 0,025 Кінетин 0,2
2п8О4 • 7Н,О 8,6 Цукроза 30 000,0
№2МоО4 • 2Н2О 0,25
Універсальне живильне середовище, що використовується для
МКР великої кількості видів рослин. Модифікація цього сере-
довища [429] для укорінення верхівок пагонів розроблена для
МКР ОіапІЇїиа сагуоруїіия; використовують як середовище для
стадії II багатьох сільськогосподарських рослин.
Середовище Ніча і Ніч [371]
Макроелементи Мікроелементи
МН4МО3 720,0 Н3ВО3 10,0
СаС12 б/в 166,0 2п8О4 • 7Н,О 10,0
М§8О4 б/в 90,4 Си8О4 5Н,О 0,025
КМО, 950,0 Ма,ЕДТА 2Н2О 37,30
КН2РО4 68,0 Еє8О4 • 7Н2О 27,80
Мп8О4 б/в 16,93
№2МоО4 • 2Н,О 0,25
Призначене для МКР бегонії, кордиліни, актинідії, винограду,
спаржі, хризантеми і культивування гаплоїдних рослин тютю-
ну, пиляків злакових.
Середовище Оуянга \¥14 [378]
Макроелементи Мікроелементи
КІЧО3 2000,0 Н,ВО3 3,0
МН4Н2РО4 380,0 Мп8О„ • 4Н2О 8,0
63
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
М8$О4 7Н,О 200,0 2лі8О4 7Н2О 3,0
СаСІ2 2Н2О 140,0 №2МоО4 2Н2О 0,005
К28О4 700,0 Си8О4 5Н2О 0,025
СоС12 6Н2О 0,025
Призначене для культури пиляків жита, пшениці.
Середовище Полсоні Iі Макроелементи 90-2 (мінеральна основа) [402] Мікроелементи
КМО, (МН4)28О4 Мв8О4 • 7Н2О КН2РО4 КС1 1000,0 380,0 200,0 300,0 40,0 Н,ВО3 Мп8О4 • 4Н,0 2п8О4 7Н,О 3,0 8,0 3,0
Середовище Сміта і МакКоуна [449]
Макроелементи МН4МО3 400,0 СаСІ2 2Н2О 96,0 Са(ТЧО,)2 4Н,О 556,0 К28О4 990,0 М88О4 • 7Н2О 370,0 КН,РО4 170,0 Мікроелементи Иа2ЕДТА 37,30 Ее8О4 7Н2О 27,80 Н3ВО, 6,20 Мп8О4 4Н2О 22,30 2п8О4 • 7Н2О 8,60 №2МоО4 • 2Н2О 0,25 Си8О4 5Н,О 0,25 Органічні добавки Мезоінозит 100,0 Тіамін — НС1 1,00 Нікотинова кислота 0,50 Піридоксин — НСІ 0,50 Гліцин 2,00 Глутамін 2,00 Цукроза 30 000,0
Призначене для МКР деревних порід.
Середовища Піріка [395]
Компоненти Індукція калусу Культиву- вання калусу Регенерація пагонів Укорінення пагонів
Макроелементи
КІН4МО, 825,0 825,0 206,0 412,0
КМО, 950,0 950,0 950,0 475,0
СаСІ, • 2Н2О 440,0 220,0 220,0 220,0
Мє8О4 • 7Н2О 370,0 185,0 185,0 92,0
КН,РО4 85,0 85,0 85,0 42,0
Мікроелементи
Н3ВО3 6,20 6,20 6,20 6,20
Мп8О4 4Н,О 22,30 22,30 22,30 22,30
Хп8О4 8,60 8,60 8,60 8,60
КІ 0,83 0,83 0,83 0,83
Ма2МоО4 0,25 0,25 0,25 0,25
Си8О4 5Н,О 0,025 0,025 0,025 0,025
64
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
СоС12 6Н,О 0,025 0,025 0,025 0,025
№2ЕДТА 37,30 37,30 37,30 37,30
Еє8О4 27,80 27,80 27,80 27,80
Органічні добавки
Нікотинова кислота 0,50 0,50 0,50 0,50
Піридоксин — НСІ 0,50 0,50 0,50 0,50
Тіамін — НСІ 0,40 0,40 0,40 0,40
Мезоінозит 100,0 100,0 100,0 100,0
Глюкоза 30 000,0 20 000,0 — 30 000,0
Цукроза — — 20 000,0 —
БАП 1,0 1,о 1,0 —
2,4-Д 0,08 — — —
Агар 8000,0 8000,0 8000,0 8000,0
(рН 6,0)
Призначене для МКР ароїдних і бромелієвих.
Середовище Табачника—Кестера [446]
Макроелементи КІ 0,83
ККІО3 200,0 №2МоО4 2Н2О 0,25
Са(ІЧО3), • 4Н,О 140,0 Сн8О4 • 5Н2О 0,025
МЄ8О4 - 7Н2О 410,0 СоС12 - 6Н2О 0,025
КН,РО4 200,0 Органічні добавки
Мікроелементи Тіамін 0,10
№,ЕДТА 37,30 Нікотинова кислота 0,50
Ее8О4 • 7Н2О 27,80 Піридоксин — НСІ 0,50
Мп8О4 4Н2О 16,90 Мезоінозит 100,0
2п8О4 • 7Н2О 8,60 Гліцин 2,0
Н3ВО, 6,20 Цукроза 20 000,0
Призначене для МКР вишні, черешні і груші.
Середовище Халупи [160]
Макроелементи 2п8О4 7Н2О 8,6
КЕЮ, 190,0 КІ 0,15
МН4КЮ3 165,0 №2МоО4 • 2Н2О 0,25
СаС12 2Н2О 44,0 Си8О4 5Н,О 0,25
Са(КЮ3)2 • 4Н,О 640,0 СоС12 6Н2О 0,02
(МН4)28О4 240,0 Органічні добавки
К,8О4 860,0 Мезоінозит 100,0
М§8О4 • 7Н2О 370,0 Тіамін — НСІ 1,0
КН2РО4 170,0 Нікотинова кислота 0,5
Мікроелементи Піридоксин — НСІ 0,5
№,ЕДТА 37,3 Гліцин 2,0
Ее8О4 • 7Н,О 27,8 Глутамін 2,0
Н3ВО3 6,2 Цукроза 30 000,0
Мп8О4 • 4Н2О 22,3
Призначене для МКР деревних порід.
5 - - 6-83
65
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Середовище Хеллера [257]
Макроелементи Си8О4 5Н,О 0,03
СаС12 56,7 ЕеСІ, 6Н2О 1,00
М§8О4 122,1 Мп8О4 0,0677
КС1 750,0 №СІ2 6Н2О 0,03
№КЮ3 600,0 КІ 0,01
ІЧаН2РО4 108,8 2п8О4 • 7Н2О 1,0
Мікроелементи Н3ВО3 1,0 А1СІ3 6Н2О 0,0543
Призначене для МКР орхідних, персика, каштана, пророщування насіння магнолії. абрикоса.
Середовище Хогланда (цит. за: [226])
Макроелементи Н3ВО3 2,86
КН2РО4 136,09 МпС12 • 4Н2О 1,81
кмо3 505,0 К'а2МоО4 • 2Н2О 0,02
Са(КЮ3)2 • 4Н2О 1181,0 2п8О4 • 7Н2О 0,22
М§8О4 • 7Н2О 493,0 Си8О4 • 5Н2О 0,08
Мікроелементи
№2ЕОТА 74,50 Органічні добавки
Еє8О4 • 7Н2О 27,80 Агар 13 000,0
Призначене для МКР ароїдних, персика, абрикоса.
Середовище Чу (мінеральна основа) [170]
Макроелементи
(КІН4)28О4 463,0
СаС12 б/в 125,33
М§8О4 б/в 90,37
ККЮ, 2830,0
КН2РО4 400,0
Мікроелементи
Н3ВО3 1,60
К'а2ЕДТА 2Н,О 37,30
Ее8О4 7Н2О 27,85
Мп8О4 б/в 3,33
КІ 0,80
2п8О4 • 7Н,О 1,50
Призначене для культивування пиляків пшениці, ри-
су та інших зернових культур.
Середовище Чу, модифіковане [171]
Макроелементи Органічні добавки
КГЮ3 1415,0 Глутамін 1000,0
(N40,80, 232,0 Мезоінозит 300,0
КН2РО4 200,0 Тіамін — НСІ 2,50
М§8О4 • 7Н2О 93,0 Гліцин 1,00
СаСІ, • 2Н2О 83,0 Нікотинова кислота 0,50
Мікроелементи Піридоксин — НСІ 0,50
Ее8О4 • 7Н2О 27,8 Аскорбінова кислота 0,55
Мп8О4 • 4Н2О 5,0 Біотин 0,25
66
Розділ 2. Метод і техніка мікроклонального розмноження рослин
2п8О4 • 7Н2О 5,0 Пантотенат кальцію 0,25
Н,ВО, 5,0 2,4-Д 0,50
КІ 0,40 Кінетин 0,50
№2Мо04 • 2Н2О 0,0125 Глюкоза 0,21
Со8О4 5Н26 0,0125
СоС12 6Н2О 0,0125 (рН 5,4)
Призначене для органогенезу злакових.
Середовище Чу, модифіковане N6 [378]
Макроелементи Глутамін 146,0
КМО, 2830,0 Казамінокислоти 550,0
(МН4),8О4 463,0 Мезоінозит 80,0
кн,рд4 400,0 Тіамін — НСІ 3,0
Ме§О4 • 7Н2О 185,0 Гліцин 3,0
СаС12 2Н,О 166,0 Нікотинова кислота 2,0
Мікроелементи Піридоксин — НСІ 2,0
Ее8О4 7Н,О 27,8 Біотин 2,0
Мп8О4 • 4Н-.О 4,4 2,4-Д 2,0
2п8О4 7Н2О 1,5 НОК 0,5
Н,ВО3 1,6 Кінетин 0,5
КІ 0,8 Мальтоза 9000,0
№2МоО4 2Н2О 0,025
Си8О„ • 5Н2О 0,025
СоС12 • 6Н,О 0,025 (РН 5,8)
Призначене для органогенезу злакових, культури пи-
ляків пшениці, жита.
Середовище Шенка і Гільдебрандта [427]
Макроелементи Си8О4 • 5Н2О 0,20
МН4Н2РО4 300,0 №2ЕДТА 2Н2О 20,0
СаСІ, 2Н,О 200,0 Еє8О4 7Н,О 15,0
МЄ8б4б/в 195,4 Мп8О4 10,0
КТ4О3 2500,0 №2МоО4 • 2Н2О 0,10
Мікроелементи КІ 1,00
Н3ВО, 5,00 2п8О4 • 7Н,О 1,00
СоС12 6Н2О 0,10 Призначене для МКР сої, сосни, ялини, бавовнику,
злакових (ячменю, пшениці, рису).
Середовище Уайта (515, 516]
Макроелементи
Са(МО,)2 • 4Н,О 300,0
М88О4 б/в 360,0
Мікроелементи
Н3ВО, 1,5
Ее2(8б4)3 2,5
Органічні добавки
Нікотинова кислота 0,5
Піридоксин — НСІ 0,1
5*
67
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
КС1 65,0 Мп8О4 б/в 3,4 Тіамін — НСІ 0,1
КІЧ О, 80,0 КІ 0,8 Гліцин 3,0
ІМаН2РО4 16,5 2п8О4 • 7Н2О 3,0 Цукроза 20 000,0
№28О4 200,0
Призначене для культури ізольованих коренів томатів, лимона і МКР бе-
гонії, ірису, троянди, моркви, соняшнику, персика, абрикоса, смородини,
суниці.
Розчин Чеснокова [33]
КМО3 0,400 Н3ВО3 0,0007
Са(Г4О3)2 0,500 2п8О4 0,00006
МН4МО, 0,160 Мп8О4 0,0005
М§8О4 0,280 Си8О4 0,00002
РеСІ, 0,006
Призначений для підживлення рос-
л ин-регенеранті в.
Розчин Ольсена [33]
КМО, 0,149 Н3ВО, 0,0004
Са(К1О,)2 0,168 2п8О4 - 7Н2О 0,0002
КН2РО4 0,023 Си8О4 • 5Н2О 0,0001
М§8О4 • 7Н2О 0,101 (МН4)2МоО4 0,00005
Мп8О4 4Н2О 0,0004 Ре-цитрат 1 % 5,0 (см3)
Призначений для підживлення рослин-регенеран-
тів.
___________________Р о з 0 і л 3 ________________
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ
ДЕКОРАТИВНИХ РОСЛИН
Метод МКР вперше запропонував С. Могеї [357] для звіль-
нення цимбідіума від вірусної інфекції й отримання оздо-
ровлених рослин-регенерантів. І ось уже протягом чотирьох де-
сятиліть цей метод розвивається, вдосконалюється, збагачується
новими фундаментальними результатами [136].
У багатьох країнах виникла могутня галузь промислового
квітникарства, що ґрунтується на широкому застосуванні МКР
для отримання високоякісного оздоровленого посадкового ма-
теріалу. У культуру введено понад 50 видів декоративних рослин
із багатьох родин, і їх кількість з року в рік збільшується.
Застосування методу апікальних меристем дає змогу звільни-
ти рослини від вірусних хвороб і вирішити проблему їх масового
розмноження. Він не пов’язаний із сезонністю, тому рослини-ре-
генеранти можна отримувати протягом року. МКР використову-
ють у селекційній роботі для масової репродукції гібридних
сортів. За його допомогою можна зберегти генофонд рідкісних і
зникаючих видів природної флори.
Вперше в Україні МКР деяких тропічних і субтропічних рос-
лин (ароїдних, бегонієвих, орхідних) було розроблено і вдоско-
налено у відділі рослин закритого ґрунту Національного ботаніч-
ного саду ім. акад. М.М. Гришка НАН України [44, 56, 57].
З’ясовано специфічні потреби окремих видів і форм до умов
культивування на його головних етапах. Застосування методу да-
ло можливість отримати велику кількість рослин для поповнення
колекцій та впровадження у промислове квітникарство й озе-
ленення.
Тривалий час у Нікітському ботанічному саду — Національ-
ному науковому центрі УААН проводять дослідження у галузі
біотехнології декоративних рослин. Розроблено систему отри-
мання безвірусного посадкового матеріалу і МКР гвоздики, хри-
зантеми, лілії, гіацинта, гіппеаструма, троянди [83].
69
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Деякі промислові комплекси — агрофірма “Квіти України”,
“Теремки”, “Троянда” — успішно застосовують методики МКР
та оздоровлення декоративних рослин. Проте для нашої держави
і надалі існує нагальна потреба в подальшому розвитку проми-
слового квітникарства на безвірусній основі, створенні нових
комплексів і лабораторій, які б спеціалізувались на розмноженні
декоративних рослин, здійснювали санітарний контроль і сорто-
ву селекцію маточних рослин, адже доведено, що потенціал цьо-
го методу значно перебільшує можливості традиційних методів
отримання посадкового матеріалу.
АМАРИЛІСОВІ (АтагуІІігіасеае Завше зі. Нііаіге)
Рослини цієї родини відомі своєю декоративністю і досить
поширені у промисловому квітникарстві багатьох країн, але вони
повільно розмножуються вегетативно (діленням цибулин). Для
прискорення процесу використовують метод культури ізольова-
них тканин.
Амариліс, гіпеаструм (Нірреазігвш)
Метод культури ізольованих тканин дає змогу значно збіль-
шити коефіцієнт розмноження амариліса внаслідок інтенсивної
регенерації цибулин на експлантах. Морфогенез іп уіїго можна
індукувати на різних органах, але найбільшу регенераційну здат-
ність мають тканини основ листків і лусок, що містяться над
денцем цибулини. Пагони, що утворились, можна ділити і вико-
ристовувати для повторного культивування.
Розроблено ефективний метод розмноження цибулинних
рослин додатковими пагонами [277]. Щоб усунути апікальне до-
мінування і отримати велику кількість пагонів, потрібно розріза-
ти верхівку головного пагона. Для цього роблять два вертикаль-
них неглибоких надрізи під прямим кутом до горизонтальної
площини, аби не пошкодити денце. Між лусками згодом утво-
рюються численні додаткові пагони, які можуть слугувати експ-
лантами. Для МКР гіпеаструма використовують меристематичну
тканину бруньки і сегменти листків, квітконосів, лусок, денця.
Експланти культивують на середовищі М8 з різними концен-
траціями фізіологічно активних речовин. Додавання 5 мг/л НОК
і 1 мг/л кінетину сприяє утворенню коренів, а 5—10 мг/л кіне-
тину — формуванню бруньок на експлантах лусок. Деякі автори
[26] для індукції проліферації пагонів використовують БАП (1 —
70
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
10 мг/л) і НОК (1—3 мг/л). Експланти культивують при 17 °С і
освітленні 300 лк. Через місяць інтенсивність освітлення збіль-
шують до 600—700 лк, а температуру — до 23 °С. За цей час ут-
ворюються проростки, які переносять для укорінення на 1/2
концентрації середовища М8 без регуляторів росту.
При розмноженні гіпеаструма можна використати середови-
ще Кнудсона. Стерилізовані цибулини розрізають на частини,
що містять луски і денце, й культивують при 22—25 °С і освітлен-
ні 4000 лк. За 20—25 діб утворюються пагони. Цибулина діамет-
ром 6 см може регенерувати до 150—200 рослин.
Регенераційна здатність експлантів гіпеаструма залежить від
фізіологічного стану (максимальна в період активного росту) і ге-
нотипу материнської рослини. Із 20 досліджених гібридних форм
найпродуктивнішими виявились лише 4, у 3 форм здатність до
органогенезу становила 56—65 %, у 10—100 %. Генотип материн-
ської рослини впливав також і на швидкість регенерації рослин,
яка коливалась від 2 до 7 міс [26]. У технологічному процесі МКР
гіпеаструма складним є період адаптації рослин-регенерантів, що
утворили пагін і корені, але не сформували цибулину. Для успіш-
ної приживлюваності таких рослин слід витримувати їх в умовах
високої вологості (до 100 %) і постійної температури 24—27 °С.
Залежно від генотипу рослини-регенеранти розвиваються значно
швидше, ніж отримані вегетативно, і зацвітають через 2—2,5 роки
після введення в культуру. Цибулини таких рослин мають висо-
кий коефіцієнт розмноження: дворічна цибулина здатна формува-
ти залежно від генотипу 15—40 дочірніх цибулин.
Для МКР гіпеаструма використовують здорові цибулини діа-
метром 8—10 см.
Стерилізація вихідного матеріалу, видаляють листки, корені,
старі луски; миють теплою проточною водою 30—40 хв, потім
водою з пральним порошком 20 хв, споліскують у дистильованій
воді; занурюють у 1%-й розчин гіпохлориту кальцію на 8—10 хв
або у 0,2%-й розчин діациду на 12 хв; промивають у 3—4 порціях
стерильної дистильованої води. Можна також занурити цибули-
ну у 96°-й етанол на 5 с.
Після цього видаляють зовнішні луски, з середніх лусок вич-
леновують експланти розміром 1 х 1 см і розміщують на живиль-
ному середовищі М8. Культивують при 23—25 °С, постійному
освітленні 4 клк і вологості 80 %.
За кілька діб експланти стають зеленими, збільшуються у
розмірах. Подальша регенерація рослин залежить від концен-
71
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
трації регуляторів росту в живильному середовищі. Наявність
0,05 мг/л НОК і 0,1 мг/л кінетину сприяє утворенню коренів.
Збільшення концентрації кінетину до 1 мг/л індукує проліфера-
цію бруньок. Для регенерації цибулин оптимальним є додавання
5 мг/л НОК і 1 мг/л кінетину.
Укорінені цибулини пересаджують у стерильний субстрат із
торфу і перліту (2:1) і дорощують за високої вологості в теплиці.
Доцільно висаджувати регенеранти гіпеаструма у вегетаційні по-
судини на 3 л, де вони за відповідного догляду, підживлення і
поливу швидко розвиваються.
Нарцис (№ГСІ85115)
У промисловому квітникарстві нарциси є однією з провідних
культур відкритого і захищеного ґрунту. Світова колекція нара-
ховує близько 10 тис. сортів і садових форм, площі під цією
культурою постійно зростають, і відчувається нестача здорового
посадкового матеріалу. Нарциси вражають численні віруси,
звільнитись від яких досить складно. Оздоровлення селекційного
і колекційного матеріалу має включати термотерапію, культиву-
вання меристематичних тканин, діагностику вірусної інфекції і
захист від повторного зараження. Лише використання цих за-
ходів допомагає звільнити цибулини нарциса від вірусів.
І досі продовжується удосконалення методів МКР нарцисів.
Експланти, як правило, видаляють із бульб, які попередньо вит-
римують на холоді, а потім 2—3 тижні — за кімнатної темпера-
тури. Для культивування використовують апікальні меристеми,
тканини основ листків, лусок, сегменти стебла, квітконосів і
зав’язі [27, 92, 277].
На середовищі М8 з додаванням 10 мг/л БАП і 1 мг/л НОК
на основах листків утворюються рослинки, які потім пересаджу-
ють для масового розмноження на середовище, що містить по
2 мг/л БАП і НОК. Для індукції коренів використовують 1/2
концентрації солей середовища М8 без регуляторів росту.
Численні адвентивні пагони формуються на експлантах лист-
ків, лусках цибулини і сегментах базальної частини денця при
культивуванні на середовищі М8 з додаванням 2—16 мг/л БАП і
0,25—4,0 мг/л НОК. їх можна розділяти і субкультивувати для
отримання нових пагонів. Проте слід зазначити, що згодом при
повторному культивуванні швидкість регенерації знижується, і
пагони формують цибулинки. Використання цього методу дає
72
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
змогу отримати з однієї материнської цибулини до 500—2000 ре-
генерантів [92]. Цитологічні спостереження показали, що адвен-
тивні пагони формуються з поверхневих шарів меристематичних
клітин парних лусок, що прилягають до денця цибулини. На дум-
ку автора, це зумовлює генетичну ідентичність регенерантів, так
само як і при вегетативному розмноженні.
Запропоновано методику прискореного МКР нарциса гібрид-
ного (на прикладі сорта Форчун) із калусної тканини, що утво-
рюється на експлантах денця і лусок цибулини. Анатомічні до-
слідження показали, що верхні частини денця, луски і дорсальні
частини листків складаються з дрібних меристематичних клітин,
які мають підвищену проліфераційну активність. Морфогенетич-
ну здатність експлантів можна регулювати введенням у середо-
вище фітогормонів — БАП, кінетину, НОК. Утворенню калусу
на експлантах сприяє НОК (3—10 мг/л). Внесення 3 мг/л БАП
викликає проліферацію точок росту, а за сумісного внесення
ауксинів і цитокінінів формуються калус і меристематичні зони
(точки росту) (цит. за: |44]).
Перспективним методом МКР нарциса є використання тка-
нини квітконоса. Експлант слід розміщувати на поверхні живиль-
ного середовища базальним кінцем догори [26]. Для індукції про-
ліферації пагонів використовують високі концентрації цитокінінів
(10 мг/л кінетину) і низькі — ауксинів (1 мг/л НОК), культивують
за постійної температури 24 °С і освітлення 700 800 клк.
Для звільнення від вірусної інфекції цибулини нарцисів під-
дають термообробці, витримуючи їх у камері за температури
37 °С протягом місяця.
Стерилізація вихідного матеріалу, цибулини звільнюють від
сухих лусок, коренів, зрізають декілька зовнішніх запасаючих лу-
сок; промивають у проточній воді 15—20 хв, занурюють у 1%-й
розчин детергента на 30 хв, а потім у інтенсивно-рожевий роз-
чин КМпО4 на 30 хв і у 1%-й розчин Са(СЮ)2 на 15 хв або у 5%-й
розчин хлораміну на 8—10 хв; промивають у 2—3 порціях сте-
рильної дистильованої води. Такий метод стерилізації знижує
інфікування експлантів до 3—5 %.
Вичленування експланта: основи листків обережно відділяють
від денця, розкривають і вирізають бруньку; під бінокулярним
мікроскопом за допомогою препарувальної голки відокремлюють
покривні луски і розкривають меристему; вичленовують екс-
плант розміром 0,2—0,5 мм і переносять на поверхню живиль-
ного середовища.
73
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Для отримання експлантів парних лусок зрізають верхню
частину цибулини, видаляють зовнішні луски, вичленовують ос-
нови лусок із прилеглими тканинами денця, частини денця, ос-
нови квітконосів і листків.
Умови культивування: первинні експланти культивують на
середовищі М8 з 1,5 мг/л НОК, 0,5 — кінетину, 1000,0 — гід-
ролізату казеїну і 20 мг/л аденіну, рН 6,0. Подальше культиву-
вання відбувається на середовиші з 1/2 концентрації солей М8,
0,25 мг/л тіаміну, 0,5 — піридоксину, 2,5 — нікотинової кислоти,
50,0 — мезоінозиту, 1,0 — гліцину, 1,25 — НОК, 0,25 — кінетину
(або 0,25 мг/л БАП), 500 мг/л гідролізату казеїну, 15 г/л цукрози,
рН 5,8. На цьому середовищі формуються рослини з добре роз-
виненими коренями (іноді з цибулинками). Додавання БАП
стимулює утворення численних пагонів, які використовують для
подальшого клонування.
На експлантах основ лусок, денця і безхлорофільних основах
листків на середовищі М8 з 1,0 мг/л аскорбінової кислоти, 1,0 —
БАП (або 2,0 — кінетину), 1 мг/л НОК через 4—6 тижнів куль-
тивування утворюється калус з численними точками росту. При
подальшому культивуванні формуються цибулинки діаметром
2—5 мм з 1—2 листочками. Утворення коренів відбувається за
зниження температури до 5 °С. Уже через 6—8 тижнів у цих
умовах формуються рослини з добре розвинутими цибулинками,
листками та коренями. Після пересадки на свіже живильне сере-
довище рослини переносять у камеру з температурою 20 °С, в
якій відбувається подальший ріст регенерантів.
Коефіцієнт МКР нарцисів можна значно збільшити, якщо
культивувати калусну тканину на рідкому середовищі в ролері.
За 6 тижнів кількість рослин збільшується в 10—15 разів. Умови
освітлення не впливають на інтенсивність утворення точок рос-
ту; світло потрібне лише для формування рослин-регенерантів,
стимуляції росту листків.
З однієї середньої цибулини нарциса можна отримати до 50
адвентивних пагонів безпосередньо з експланта і до 500 — в ка-
лусній культурі.
Отримані рослини можна використовувати для подальшого
клонування [27]. Регенеранти нарцисів висаджують у вологу
торфоперлітну суміш, накривають склянками, аби не пересиха-
ли. Рослини зацвітають на 4—5-й рік.
74
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Неріне (Мегіпе)
Для розмноження Кегіпе Ьохусієпіі, N. 5агпіеп5І5 і гібридів ви-
користовують експланти лусок і відрізки квітконосів [396, 397].
У цибулин діаметром 3,8—4,5 см видаляють корені, сухі зовнішні
луски і верхню 1/3 бульби. Цибулину розрізають на 4 частини.
Кожну з них занурюють у 70%-й етанол на кілька секунд, а
потім у 2%-й N3001 на 25 хв, промивають у стерильній дистильо-
ваній воді. Луски розрізають на чотирикутники (1,5—2,5 см зав-
довжки і 1,0—1,5 см завширшки). Квітконоси розрізають на час-
тини завдовжки 2,5—5,0 см. Експланти розміщують на живиль-
ному середовищі дистальним кінцем вниз.
К. Ріегік і В. Ірреї [397] культивують експланти на середо-
вищі Б8 (3/4 концентрації мікроелементів). І. Засобе [282] вико-
ристовує середовище М8 з ЗО г/л цукрози і 1 мг/л БАП.
Цибулини утворюються на експлантах парних лусок із ад-
вентивних бруньок. При використанні експлантів квітконосів на
середовищі М8 з І мг/л БАП, 0,5 мг/л НОК і 4 % цукрози про-
ліферація калусу відбувається у темряві за температури 18 °С.
Цибулинки і рослини формуються на середовищі без цитокініну,
на світлі при 25 °С.
Перед висадкою в субстрат регенеранти витримують у тем-
ряві протягом 6 тижнів на середовищі без регуляторів росту, де
продовжується ріст цибулинок, коренів і листків.
Використовуючи запропоновану вище методику, можна роз-
множувати інші рослини родини амарилісових: Сгіпипі тасохуа-
піі, Уаііоіа ригригеа, Херйугапіїїех гоЬихІа [121, 227].
АЛЬСТРОМЕРІЄВІ
(АІБІгоетегіасеае Оитогііег)
Альстромерія — популярна декоративна культура. Постійно
створюються нові її гібриди, для масового розмноження яких
запропоновано метод культури іп уїїго.
Використовують експланти сплячих пазушних бруньок, сег-
менти і верхівки кореневищ, відрізки квітконосів [227].
Стерилізація експлантів кореневищ має певні труднощі. Най-
кращі результати дає занурення експлантів у 1%-й розчин гіпо-
хлориту натрію на 10 хв, потім на 5 хв і утретє — на 1 хв. Перед
кожним зануренням видаляють луски листків.
Експланти культивують на середовищі М8 або Б8 з 30—40 г/л
цукрози і вітамінами або лише з 0,4 мг/л тіаміну. Додавання до
75
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
середовища 100 мг/л гідролізату казеїну дає змогу виявити кон-
тамінацію культиварів. Для індукції і розмноження пагонів варто
збільшити концентрацію РО4 до 2,5 ммоль. Окремі експланти ко-
реневищ, що мають латеральні бруньки, утворюють пагони. Під
час кожної пересадки експланти розрізають на сегменти з одним
або двома міжвузлями. На середовищі без цитокінінів з 0,5—
1,0 мг/л НОК (або ІМК) пагони укорінюються. Проте найчастіше
проліферація пагонів і коренів відбувається на одному середо-
вищі. Експланти культивують при 15—21 °С. Для прискорення
МКР кореневищ до середовища додають 105 мг/л БАП.
Верхівки кореневищ і апекси пагонів мають апікальне домі-
нування, яке стримує розвиток сплячих бруньок. Розгалуження
кореневищ також зростає, якщо апекси і пагони видаляти з сег-
ментів експлантів при кожному субкультивуванні [227].
АРОЇДНІ (Агасеае Зизз)
Чимало рослин із родини ароїдних вирощують у промисло-
вому квітникарстві як декоративно-листяні й квіткові культури.
Існує потреба в здоровому високоякісному посадковому матеріа-
лі, яку звичайні методи вегетативного і насінного розмноження
не можуть задовольнити.
Застосування МКР дає змогу отримати потрібну кількість
рослин для впровадження у квітникарські господарства. Крім то-
го, можна швидко ввести в культуру нові селекційні клони, ви-
сокопродуктивні рослини.
Перші відомості щодо успішного культивування Соїосакіа
е8си1епїа з’явились у 1972—1973 рр. (цит. за: [44]). Культивари
апексів на модифікованому середовищі Кнудсона утворювали
пагони. Надалі з’являється численна інформація стосовно МКР
інших видів ароїдних [44, 227, 395, 396].
Метод культури апексів пагонів антуріуму запропоновано для
звільнення від вірусної інфекції. Проте досить важко отримати
стерильну культуру від дорослої рослини. Крім того, материнська
рослина гине. Тому запропоновано метод МКР ароїдних із вико-
ристанням тканини листків [44, 395]. Доведено, що інтенсивність
утворення калусу і органогенез рослин у експлантів листків різ-
них видів залежить від генотипу, фізіологічного стану рослини, її
віку і віку тканини листка. У межах виду деякі генотипи розмно-
жуються легше, ніж інші. Лише 1/3 генотипів Апіигіит апсігеа-
пит здатні утворювати калус. За нашими спостереженнями, мак-
76
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
симальний морфогенний потенціал в усі фази вегетації мають
листки А. апсігеапит з рожевими і малиновими оцвітинами —
100 % експлантів утворювали калус. У рослин з червоними оцві-
тинами лише 10—30 % експлантів здатні до утворення калусу і
морфогєнезу залежно від фізіологічного стану і віку листків.
Високий морфогенетичний потенціал у А. Ьакегі, А. сотіит,
А. оііегмапит (до 50 % і вище). Серед А. хсЬеггегіапит лише 1 %
експлантів утворювали калус. Нездатні до калусогенезу сегменти
листків А. та^піїїсит, А. 1оп§іГо1іит [44].
Розмноження апікальними меристемами
(Соїосазіа евсиїепїа, Апішіит апсігеапит)
Стерилізація вихідного матеріалу: відділяють верхівку бульби
(у колоказії) разом із черешками листків розміром 3—6 см або
центральний пагін завдовжки 1,0—1,5 см (у антуріуму); проми-
вають теплою проточною, потім мильною водою; занурюють у
70%-й етанол на 1 хв; споліскують стерильною дистильованою
водою; кладуть у 10%-й розчин гіпохлориту натрію (або 10%-й
хлорокс) на 20 хв; промивають в 3 порціях стерильної дистильо-
ваної води; підрізають експланти і знову стерилізують у 5%-му
хлороксі 5 хв; споліскують стерильною дистильованою водою з
0,1%-ю аскорбіновою кислотою.
Вичленування експланта: під мікроскопом відділяють залишки
листкових зачатків, вирізають апікальну меристему з 1—2 лист-
ковими примордіями і невеликою ділянкою тканини під нею.
Для звільнення від вірусної інфекції використовують експлант
не більше 0,5 мм, для масового розмноження — 0,8—1,0 см.
Умови культивування: використовують рідке середовище М8 з
15 мг/л ІОК, 1 мг/л кінетину на ротаторі при 2 об/хв, темпера-
турі 25—28 °С і освітленні 1 клк. Після 6 тижнів експланти зе-
леніють, збільшуються в розмірах. Для індукції пагонів викори-
стовують агаризоване середовище М8 з 0,2 мг/л БАП.
Для апексів колоказії застосовують рідке середовище М8 з
0,4 мг/л тіаміну і 15 % ендосперму кокосового горіха, культиву-
ють у темряві для утворення калусу при температурі 27 °С. Ад-
вентивні пагони диференціюються на світлі (фотоперіод 16 год).
Розмноження тканинами листка
Технологія МКР ароїдних (Апіигіит апсігеапит, А. ксЬегге-
гіапит, А. Ьакегі, А. раіиіит, Саіадіит Ьісоїог, С. Ьогіиіапит) із
тканини листкової пластинки складається з кількох етапів: індук-
77
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Рис. 2. Проліферація калусу на експланті
листка антуріуму Андре
Рис 3. Ріст калусу і регенерація пагонів
антуріуму Андре
ція калусу на сегментах
листка, збільшення біома-
си калусу, органогенез па-
гонів і коренів [44].
Використовують моло-
ді (1,5—2-місячні) листки
2—5-річних рослин. Старі
листки (4—6-місячні) не
здатні до проліферації ка-
лусу, експланти з них від-
мирають.
Стерилізація вихідного
матеріалу, листки проми-
вають теплою проточною,
потім мильною водою; за-
нурюють у 70%-й етанол
на 1 хв; споліскують сте-
рильною дистильованою во-
дою; кладуть у 10%-й роз-
чин гіпохлориту кальцію
або хлорного вапна на 20—
25 хв; промивають стериль-
ною дистильованою во-
дою; занурюють у 20%-й
пергідроль на 10—15 хв;
промивають стерильною ди-
стильованою водою.
Вичленування експлан-
та: гострим скальпелем
або лезом вирізають сег-
менти листка 1 см2 з боко-
вими жилками і розміщу-
ють на поверхні агаризо-
ваного середовища.
Умови культивування:
використовують живильні
середовища Піріка-1, М8, Ь8. Експланти культивують у темряві
за температури 25—26 °С. Проліферація калусу в антуріуму Анд-
ре відбувається протягом 2—2,5 міс по всьому периметру екс-
плантів або по жилкам (рис. 2). Калус щільний, світло-жовтий,
іноді рожевуватий.
78
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Для збільшення біомаси калус відділяють і переносять на се-
редовище Піріка-2. Період наростання калусної маси триває
близько 2 міс. Після пересадки шматочків калусу на третє сере-
довище починається інтенсивне утворення пагонів (рис. 3).
Калусна тканина об’ємом 2—3 см3 протягом 6 тижнів куль-
тивування утворює в середньому до ЗО пагонів. Після їх вида-
лення калус відновлює здатність до органогенезу і проліферує
ще 5—6 пагонів. Етіольовані паростки при перенесенні на світло
на середовищі Піріка-3 швидко зеленіють і утворюють листки.
Пагони укорінюють на середовищі Піріка-4 без фітогормонів.
Слід зазначити, що у більшості експлантів антуріуму утворення
пагонів і коренів відбувається на одному середовищі, що значно
скорочує цикл регенерації рослин.
Кількість рослин-регенерантів антуріуму можна значно збіль-
шити черенкуванням пагонів та їх укоріненням: стебла ділять на
частини з одним листком; з його пазухи утворюється новий па-
гін; укорінення відбувається спонтанно на середовищі Піріка-3.
За 9 міс такого черенкування коефіцієнт розмноження однієї рос-
лини можна збільшити у 100 разів.
Як правило, цикл розвитку рослин-регенерантів антуріуму
від початку культивування до пересадки у субстрат відбувається
протягом 11 — 12 міс. Морфогенна здатність калусу може зберіга-
тися до 2 років.
Пересадка в субстрат і культивування регенерантів', рослини з
4—5 листками і добре розвинутим корінням пересаджують у суб-
страт весною або на початку літа. їх виймають із колб, відми-
вають від залишків агару і висаджують у суміш сфагнового моху,
битої цегли і річкового піску (2:1:1). Полив помірний. Через
місяць рослини підживлюють розчином мінеральних солей. По-
дальше вирощування рослин-регенерантів відповідає вживаній
технології. Для кращого укорінення і росту рослин обладнують
стелажі з підігрівом.
Розмноження інших ароїдних
Методики МКР антуріуму можна застосувати і для інших
рослин з родини ароїдних.
Експланти пагонів Саіабіит НогШІапит культивують на се-
редовищі Е8 з 1 мг/л БАП або М8 з 1 мг/л кінетину і 15 мг/л
ІОК. Пагони укорінюються на середовищі з 0,1 мг/л БАП
[227].
79
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Для МКР каладіуму можна використати експланти листків.
На середовищі М8 з 1 мг/л НОК і 0,5 мг/л кінетину при 22—
24 °С утворюється калус, з якого через 4 тижні регенерують
адвентивні пагони, листки і корені. Через 8—10 тижнів укорінені
пагони відділяють і переносять у субстрат.
Для звільнення від інфекції рослин спатіфілюму (8раДііріїу1-
Іит) використовують латеральні бруньки. На середовищі Ь8 з
0,2—2,0 мг/л БАП або кінетину на експлантах апексу утворю-
ються адвентивні пагони [227].
МКР сингоніуму (8іп£опішп роборИуІІит) здійснюють куль-
тивуванням латеральних бруньок на рідкому середовищі Міллера
і Мурашіге з 1 мг/л ІОК і 3 мг/л 2-іР на ротаторі при 27 °С, фо-
топеріоді 16 год і освітленні 1000 лк. При перенесенні на стаціо-
нарне рідке середовище того ж складу з 20 мг/л 2-іР і 3 мг/л
ІОК утворюються пагони, які можна субкультивувати. Укорінен-
ня пагонів відбувається на середовищі Е8 з 3 мг/л ІОК при
освітленні 300 лк. Для утворення і росту рослин-регенерантів
інтенсивність освітлення збільшують до 10 000 лк [227].
Гібриди калли (2ап(ес1е5сйіа) розмножують бруньками коре-
невища. Культивують у напівтвердому середовищі Е8 з 3 мг/л
БАП. За 3 тижні утворюються конгломерати бруньок. Ріст паго-
нів відбувається за зниження концентрації БАП до 0,3 мг/л, а
укорінення — до 0,1 мг/л.
Для МКР монстери (Мопкіега беїісоха) використовують вер-
хівки пагонів сіянців, оскільки латеральні бруньки розвивають-
ся гірше. Експланти розділяють вертикально і розміщують на
середовищі Е8 з 2 мг/л ІОК і 10 мг/л БАП. Протягом 6 тижнів
інкубації при ЗО °С кожен експлант утворює в середньому по
8 пагонів, які ростуть і укорінюються на середовищі з 2 мг/л
ІОК.
Метод розмноження ксантозоми (Хапіохота Ьгакіїіепхік) із
базальної частини черешків запропонував Б. 8іагіІкку (цит. за:
[227]). Культивують експланти на середовищі М8 з 2,0 мг/л
НОК, 1,0 — кінетину (або 5 мг/л ІМК) і 1,0 мг/л БАП. За кілька
діб на експлантах утворюється калус. Протягом подальших 6 тиж-
нів проліферують адвентивні пагони. Для утворення укорінених
рослин потрібно 6—7 тижнів.
Також для МКР ксантозоми можна використовувати апі-
кальні меристеми пагонів. На середовищі М8 з 1 мг/л НОК і
0,03 мг/л кінетину утворюються пагони, корені й розвиваються
невеликі бульбоцибулини.
80
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Метод швидкого МКР запропоновано для X. сагасп. На рід-
кому середовищі М8 (на ролері) з 100 мг/л аскорбінової кислоти
(без регуляторів) з експлантів апексів утворюються пагони. На
агаризованому середовищі з 0,5 мг/л ІОК і 2 мг/л БАП регене-
ранти формують пазушні пагони, які можна відділяти і укоріню-
вати [117].
Експланти пагонів ксантозоми на середовищі Ь8 з 0,1 мг/л
ІОК і 1,0 мг/л кінетину або з 5,0 мг/л НОК, 2,0 — кінетину і
10 % кокосового молока утворюють калус. Проліферація калусу
спостерігається також і на середовищі АЬо-Е1-Мі1 (А7), що міс-
тить 2 мг/л НОК. Регенерація рослин відбувається при перене-
сенні калусу на середовище М8 з 0,2—2,0 мг/л НОК і 2 мг/л
кінетину. Рослини, що формуються з калусу, вільні від вірусу,
але у них спостерігаються морфологічні зміни.
Для МКР аморфофалусу (АтогрЬорЬаІІик сотрапиіаіик, А. гі-
уегі, А. Ііїапит) використовують латеральні бруньки, бульбоци-
булини [117, 227]. Експланти розміщують на середовищі М8 (1/2
концентрації) з 200 мг/л КІН4МО3, 0,1—0,3 — НОК і 4—8 мг/л
БАП або з 0,5 мг/л НОК і 0,05 мг/л кінетину. Культивують у
темряві 5 тижнів, а потім на світлі (16 год). На експлантах пролі-
ферує калус, з якого через 3 міс регенерують пагони. Для стиму-
ляції утворення адвентивних пагонів експланти переносять у рід-
ке середовище М8 з 3 мг/л зеатину, 0,01 — гібереліну і 0,3 мг/л
НОК. Укорінюють пагони на середовищі з 0,5—1,0 мг/л НОК.
Рослини-регенеранти висаджують у субстрат.
БЕГОНІЄВІ (Ведопіасеае)
Вегетативне розмноження рослин із родини бегонієвих є не-
складним, воно широко застосовується у декоративному квітни-
карстві. Проте за недостатньої кількості вихідного матеріалу при
розмноженні гібридних сортів і для оздоровлення рослин засто-
сування МКР дає змогу отримати багато посадкового матеріалу.
Огляд літератури засвідчує великі можливості методу культури
ізольованих тканин у разі масового розмноження окремих сортів
і маточників бегонії [111, 437, 467]. Для культивування викори-
стовують сегменти листків, відрізки черешків і квітконіжок, епі-
дерміс листкових жилок [44, 166, 214, 346]. З метою звільнення
від бактеріальних хвороб культивують експланти верхівки пагона.
Регенераційна здатність експлантів залежить від умов виро-
щування інтактної рослини, її фізіологічного стану. Збільшення
6 - 6-83
81
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
морфогенетичного потенціалу листкових черешків, сегментів квіт-
коносів і листків бегонії спостерігали після витримування мате-
ринських рослин при 15—18 °С і освітленні 2—8 клк протягом
4 тижнів. Тривале освітлення (більше 9 тижнів) і підвищення тем-
ператури до 24—27 °С знижує регенераційну здатність експлантів.
Виявлено, що листки бегонії мають високу цитокінінову ак-
тивність, рівень якої зростає у разі вирощування за короткого
дня і температури 16 °С. Сезонні зміни регенераційної здатності
експлантів бегонії корелюють зі змінами рівня ендогенних фізіо-
логічно активних речовин у рослині. У період цвітіння морфоге-
нез експлантів значно знижується.
Для культивування ізольованих тканин бегонії запропонова-
но декілька живильних середовищ і різні регулятори росту.
Середовище Уайта використовували для листків Вецопіа кет-
регПогепк, В. сйеітапійа. Додавання 0,1—1,0 мг/л 2,4-Д сприяло
проліфації калусу на експлантах. Внесення 0,1—1,0 мг/л ІОК або
НОК стимулювало ріст коренів, а на середовищі з кінетином або
зеатином (0,1—0,5—1,0 мг/л) формувались адвентивні бруньки
по всій поверхні експланта листка В. кетрегОогепк. Оптимальна
концентрація БАП і НОК, що стимулює морфогенез бруньок і
пагонів у В. сйеітапійа, становить 0,5—1,0 і 0,1—1,0 мг/л відпо-
відно. При використанні середовища Ніча-4 для культивування
експлантів листків і черешків В. рісіа додавали 0,1 мг/л БАП або
кінетину, 0,1 мг/л ІОК, ІМК або НОК, що сприяло органогене-
зу. Сегменти черешків бегонії хемаліс вирощували 3—6 тижнів
на агаризованому середовищі М8 з 0,1 мг/л НОК і 0,05 мг/л
БАП. Потім експланти переносили на рідке середовище того ж
складу, в якому значно збільшувалась кількість пагонів. Пагони
завдовжки 1 см зрізали, обробляли 0,4%-ю ІМК і висаджували в
субстрат для укорінення [437]. Під час клонального розмноження
В. іиЬегЬуЬгіда материнські рослини вирощують при 18—24 °С і
фотоперіоді 16 год, на ніч температуру знижують до 16 °С.
Листки промивають проточною водою 2—3 год, стерилізують
у 0,6%-му розчині гіпохлориту натрію з 2 краплями твій 20 про-
тягом 20 хв, споліскують стерильною дистильованою водою і
кладуть у 0,1%-й розчин діациду на 10 с, потім тричі промива-
ють стерильною дистильованою водою.
Пластинку листка ділять на частини розміром 2 х 2 см із
центральною жилкою. Експланти на 1/3 занурюють у напіврідке
середовище М8 з 1,0 мг/л нікотинової кислоти, 1,0 — тіаміну,
2,0 — піридоксину, 200,0 — мезоінозиту, 125,0 — аденіну, 100,0 —
82
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
тирозину, 1,0 — НОК, 5,0 мг/л БАП, 6,5 г/л агару. Експланти
культивують при 20 °С і фотоперіоді 16 год.
Через 3—4 тижні експланти набухають і утворюється калус;
через 8—10 тижнів з’являються адвентивні бруньки. На цій стадії
експланти виймають, розрізають на 4—5 частин і субкультивують
у рідкому середовищі М8 з 1 мг/л БАП. За 4 тижні проліферу-
ють пагони і корені.
Наведені дані засвідчують, що існує чимало досить трудо-
містких методик МКР різних сортів бегонії. Для промислового
розмноження бажано уніфікувати технологію, виключити часті
пересадки і складні живильні середовища. Після численних до-
слідів ми запропонували просту методику розмноження бегонії
рекс експлантами молодих листків [44, 55].
Стерилізація вихідного матеріалу, свіжозрізані листки проми-
вають проточною, потім теплою водою з детергентом; занурюють
у 70%-й етанол на 5—10 с, потім у 0,1 %-й розчин сулеми на 1—
2 с (або 10%-й розчин гіпохлориту кальцію на 15—20 хв); промива-
ють стерильною дистильованою водою 3—4 рази; кладуть у 15%-й
пергідроль на 15 хв, споліскують дистильованою водою; листки
осушують стерильним фільтрувальним папером. Такий режим сте-
рилізації дає змогу отримати 85—90 % стерильних експлантів.
Вичленування експланта'. пластинки листків розрізають на
квадрати розміром 1 х 1 см з жилками і швидко переносять на
поверхню агаризованого середовища М8 з 0,2 мг/л 2,4-Д, 0,05 —
ІОК і 0,05 мг/л кінетину.
Умови культивування', експланти витримують у темряві за
температури 21—24 °С. Через 25—ЗО діб по периметру експланта
утворюється калус, що швидко розростається по всій поверхні;
через 50—60 діб регенерують корені, а через 90—100 діб з’явля-
ються пагони. Колби виставляють на світло (1000—2000 лк), де
формуються листки. Така повна регенерація рослин на одному
середовищі виключає потребу у додаткових пересадках, що знач-
но спрощує процес розмноження.
У середньому від початку культивування тканини листка до
утворення укоріненого пагона проходить 120—130 діб. Рослини-
регенеранти виймають із колб, відмивають від залишків агару і
висаджують у субстрат.
Для МКР різних видів бегонії можна також використовувати
сегменти черешків листка [55, 476].
Стерилізація вихідного матеріалу', черешки молодих листків
промивають проточною водою; занурюють у 70%-й етанол на 5—
б*
83
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
10 с, потім у 1,5%-й розчин гіпохлориту з 1—2 краплями твій 20
на 10 хв; промивають у 3 порціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта'. черешки розрізають на сегменти
завдовжки 5—10 мм і кладуть на поверхню агаризованого сере-
довища Уайта з 1 г/л гідролізату казеїну, 20 г/л цукрози, 0,1 мг/л
НОК, 0,5 мг/л БАП або середовище М8, яке містить 0,3 мг/л
БАП, по 1 мг/л кінетину і НОК.
Умови культивування: культивують за температури 18—21 °С.
Для збільшення регенераційної здатності експлантів використо-
вують перемінні температури: 3—4 тижні черешки витримують
при 18 °С, а потім за постійної температури 24 °С. Такий темпе-
ратурний режим і безперервне освітлення сприяють морфогенезу
пагонів і коренів (до 200 бруньок на експланті, 70 пагонів і 50
коренів з однієї бруньки). Крім того, можна використовувати
сегменти квітконосів [111].
Стерилізація вихідного матеріалу: квітконоси розрізають на
частини розміром 4—5 см; промивають проточною водою; зану-
рюють у 70%-й етанол на 5—10 с, потім у 1%-й розчин гіпо-
хлориту натрію на 20 хв; промивають у 3 порціях стерильної
дистильованої води.
Умови культивування: вирізають сегменти квітконоса 2—3 мм
і переносять на поверхню агаризованого середовища М8 зі зни-
женим до 44 мг/л вмістом СаС12 і 25 мг/л мезоінозиту, додають
2 мг/л ІОК і 0,2 мг/л БАП. Культивують при 21 °С, освітленні
2 клк і фотоперіоді 10 год.
Протягом 4 тижнів на експлантах утворюються численні па-
гони і корені. Укорінені рослини відділяють і переносять у суб-
страт.
Для звільнення маточних рослин бегонії елатіор від вірусних
і бактеріальних хвороб використовують апекси пагонів. їх куль-
тивують на 1/2 концентрації середовища Б8 з 1 мг/л ІМК,
0,5 мг/л БАП при 21—22 °С, освітленні 2,2 клк і фотоперіоді
16 год. За 6—8 тижнів на експлантах регенерують рослини з доб-
ре розвинутими листками. Ці листки (не менше 4 см2) також
можна використовувати для культивування, розрізав їх на сег-
менти розміром 5x5 мм. На середовищі Е5> з 0,5—1,0 мг/л ІМК
і 1 мг/л кінетину (або 0,5 мг/л БАП) утворюються численні па-
гони. Від кожного експланта листка можна отримати до 10 рос-
лин, вільних від хвороб й ідентичних материнському сорту.
Пересадка в субстрат: пробіркові рослини завдовжки не
менше 1 см з 2—3 коренями виймають із колб, відмивають від
84
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
агару і висаджують у посудини з сумішшю торф’яного перегною
і піску (1:1). Культивують у кліматичній камері при фотоперіоді
16 год і освітленні 5 клк. Добре укорінені рослини пересаджують
і переносять у теплицю в умови короткого дня.
БРОМЕЛІЄВІ (Вготеїіасеае)
Оригінальні декоративні рослини родини бромелієвих перс-
пективні для озеленення інтер’єрів і в кімнатному квітникарстві.
Більшість видів вирощують з насіння або розмножують паростка-
ми, але коефіцієнт вегетативного розмноження цих рослин досить
низький і вихід посадкового матеріалу не задовольняє потреб квіт-
никарства. Тому вже давно (1973—1974) розробляють методи МКР
бромелієвих, зокрема промислової культури ананаса [340, 362, 529].
Відзначено певні труднощі отримання стерильної культури
апікальних і пазушних бруньок від дорослих рослин. Тому для
МКР використовують молоді латеральні пагони (паростки) із не-
розкритими листками, шо дає змогу одержати до 50 % стериль-
них експлантів [44].
Успішне вирощування великої кількості життєздатних рослин
із меристематичної тканини залежить від багатьох факторів, од-
ним із яких є склад живильного середовища. Т. МигаДііве [362]
використовував рідке середовище з ІМК і НОК (по 1,75 мг/л),
лимонною кислотою (150 мг/л) для першої стадії культивування
на ролері. Для другої стадії до середовища додається по 2 мг/л
ІОК і кінетину, 80,0 — аденінсульфату і 170 мг/л №Н2РО4.
У рідкому стаціонарному середовищі при 27 °С, освітленні
1000 лк і фотоперіоді 16 год утворюються адвентивні бруньки у
експлантів ехмеї, ананаса, криптаптуса, криптбергії. Укорінюють
пагони на середовищі без кінетину і аденінсульфату за освітлення
3000 лк.
На рідких середовищах Кнудсона, Вацина і Вента, М8 з 10—
20 % (за об’ємом) ендосперму кокосового горіха і 20 мг/л адені-
ну (під час струшування на ротаторі) на бруньках ананаса, гуз-
манії, більбергії через 4—8 тижнів утворюється калус [330]. Для
індукції формування пагонів калус переносять на тверде середо-
вище Вацина і Вента, М8.
Пазушні бруньки ехмеї і кріптаптуса на рідкому середовищі
Кнудсона з 0,1 мг/л НОК, 1 мг/л БАП і 10 % березового соку
утворюють численні пагони. Для збільшення коефіцієнта розм-
ноження можна відділяти листки у рослин-регенерантів і куль-
85
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
тивувати їх на середовищі з 1 мг/л БАП. Через місяць на кож-
ному листку утворюється до 20 пагонів. Середовище слід міняти
кожні 4 тижні, при цьому від однієї рослини за рік можна отри-
мати до 10 тис. рослин [294].
Для розмноження врієзії, гузманії, ехмеї культивували лате-
ральні бруньки молодих пагонів на рідкому середовищі М8 з
1 мг/л БАП і 1 мг/л НОК [270]. Пагони, що утворились, вико-
ристовували для повторного культивування: відділяли 2 зовніш-
ніх листка, і на тому ж середовищі за ЗО діб на піхвах формува-
лись численні бруньки, з яких регенерували рослини.
За 2—3 міс від одного експланта апікальної меристеми ніду-
ляріуму можна отримати по 7—8 пагонів на середовищі М8, яке
містить по 5 мг/л тіаміну і нікотинової кислоти, 4,0 — гліцину,
по 1 мг/л БАП і НОК. Спершу експланти культивують на твер-
дому середовищі; через місяць для збільшення біомаси адвен-
тивних бруньок їх переносять на рідке середовище того ж складу
і вирощують у колбах Ерленмейера на ротаторі. Укорінення ад-
вентивних пагонів відбувається на агаризованому середовищі.
Подібну методику використовують і для МКР ананаса [227].
На першій стадії апікальні чи пазушні бруньки культивують
на середовищі Б8 або М8 з додаванням 0,1 мг/л ІОК, 0,1 —
БАП і 40 мг/л аденіну чи по 2 мг/л НОК і БАП, або по 2 мг/л
НОК, ІМК і кінетину. Культивують на світлі за температури
24—28 °С. Ріст експлантів відбувається повільно, і їх треба пере-
носити на свіже живильне середовище кожні 6 тижнів, поки не
з’являться пагони. Пагони переносять у напіврідке або рідке се-
редовище, яке містить по 2 мг/л НОК, ІМК і кінетину.
На другій стадії культивування в середовищі збільшують
вміст фосфатів і додають 1,8 мг/л НОК, 2,0 — ІМК, 2,1 мг/л кі-
нетину. Проліферація пагонів зростає, якщо у експлантів вида-
ляють листкові примордії. Укорінення пагонів відбувається на
середовищі без регуляторів росту [227].
Ми дослідили регенераційну здатність деяких видів рослин із
родини бромелієвих: Апапак сотокик, Аесіїтеа саисіаіа, А. Гаксіа-
Іа, А. писіісаиіік, ВіІІЬег^іа пиіапк, В. ругатісіаіік, В. уіиаіа, В. ка-
ипбегзіі, СгурїоЬег^іа гиЬга, Кеогецеїіа сагоііпеа, N. уаг Ігісоїог,
Кісіиіагіит ЬигсЬеІІіі, N. іппосепііі. Було розроблено метод МКР
з використанням молодих, ще не розкритих пагонів.
Стерилізація вихідного матеріалу, пагони промивають проточ-
ною, а потім теплою водою з детергентом; занурюють у 70%-й
етанол на 1 хв; споліскують стерильною дистильованою водою;
86
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
кладуть у 10%-й розчин гіпохлориту кальцію або 1%-й фамосепт
на 10—12 хв; промивають стерильною дистильованою водою;
переносять у 20%-й пероксид водню на 7—10 хв; споліскують
дистильованою водою.
Слід зазначити, що у деяких видів (А. сапсіаіа, А. Гаксіаґа,
А. ппсіісаиіік) використання такого режиму стерилізації спричи-
нює потемніння тканин. Для більшості досліджених видів сте-
рильність вихідного матеріалу забезпечував гіпохлорит кальцію
за експозиції 15 хв. До 80 % стерильних експлантів дає викори-
стання 1%-го фамосепту і 20%-го пероксиду водню.
Вичленування експланта'. покривні листки видаляють, під
бінокулярним мікроскопом вичленовують латеральні бруньки
розміром 3—5 мм і верхівку пагона 2—3 мм. Із дотриманням
фізіологічної полярності експланти розміщують на поверхні ага-
ризованого середовища Кнудсона, М8 або Піріка з додаванням
0,2 мг/л 2,4-Д і 10%-го березового соку.
Умови культивування-, регенераційна здатність ізольованих бру-
ньок у різних рослин родини бромелієвих залежить від умов ос-
вітлення. Так, бруньки більбергії регенерують рослини на світлі
(через місяць кожен експлант утворював по 10—20 адвентивних па-
гонів), а у темряві гинуть. У криптбергії проліферація калусної тка-
нини відбувалась у темряві, а після перенесення на світло утво-
рювались численні пагони. Надалі усі експланти після вичленуван-
ня витримували в темряві за температури 24—25 °С до початку на-
бухання бруньок (20—30 діб), потім виставляли на світло, де відбу-
валась індукція адвентивних бруньок і пагонів протягом 60—70 діб.
За 3—4 міс кожна брунька утворювала по 15—20 пагонів, які
можна відділяти, відсаджувати і безперервно культивувати, поки
кількість рослин не буде достатньою. Добре розвинуті проростки
з 3—4 листками укорінювали на середовищі Кнудсона [44].
За 9 міс культивування з кожної бруньки криптбергії отрима-
но в середньому по 500 рослин, з бруньок більбергії — по 200—
300 рослин.
Регенераційна здатність бромелієвих залежить від генотипу.
Найбільшим морфогенним потенціалом відзначаються види роду
ВіІЬецра. їм властиво утворення численних адвентивних пагонів
безпосередньо з тканини експланта; лише зрідка бруньки пролі-
ферували калус, з якого регенерували рослини. Експланти ехмеї
і нідуляриуму в наших умовах утворювали одиничні рослини,
але листки цих рослин можна використовувати для подальшого
клонування.
87
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
За нашими спостереженнями, використання середовища Кну-
дсона з березовим соком сприяє утворенню генетично однорідних
рослин, у той час як тривале вирощування бромелієвих на середо-
вищах з БАП призводить до утворення хімерних рослин [44].
Пересадка в субстрат', рослини-регенеранти з добре розвину-
тими коренями і листками виймають з колб, відмивають від за-
лишків агару і висаджують у субстрат зі сфагнового моху і лис-
тяної землі (1:1). Перші 2—3 тижні після пересадки в теплиці
підтримують високу вологість (до 90 %). Через кілька місяців
рослини досягають 7—8 см. Подальше вирощування проводять
згідно з технологією, прийнятною для кожного виду.
ВЕРЕСОВІ (Егісасеае)
Рослини з родини вересових досить поширені у промислово-
му квітникарстві відкритого і захищеного ґрунту. Особливо по-
пулярні рододендрони — оригінальні чагарники з гарними яск-
равими квітками, які використовують у декоративному садівниц-
тві різних регіонів, та азалії — промислові горшкові культури з
тривалим періодом цвітіння в зимовий і весняний періоди.
Вегетативне розмноження рододендронів та азалій досить
складне, бо живці погано укорінюються. До того ж рослини уш-
коджуються вірусними хворобами, що легко передаються вегета-
тивним шляхом.
Застосування технології МКР дає змогу отримати велику
кількість здорових рослин протягом короткого часу. Інтродукція
нових гібридних сортів рододендронів та азалій скорочується з
10 до 3 років [251].
Досліди В. Апсіегхоп [109, ПО] сприяли уніфікації методу,
який можна застосовувати для МКР багатьох сортів рододенд-
ронів, азалій та інших рослин з родини вересових. Він запропо-
нував оптимальне живильне середовище, мінеральний склад
якого збалансований відповідно до вимог рослин цієї родини.
Додавання до середовища 1 мг/л ІОК та 5 мг/л 2-іР сприяє ре-
генерації численних пагонів. Для культивування використовува-
ли апікальні меристеми молодих пагонів. Маточні рослини ро-
додендронів вирощували 1—2 міс у теплиці для зниження кон-
тамінації. Проте отримати стерильну культуру апексів з опуше-
них пагонів досить важко, тому деякі дослідники пропонують
використовувати квітки та зав’язь, яких на одній рослині може
бути до 1000 шт. [180, 349]. Інші автори отримали добрі резуль-
88
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
тати, застосувавши вегетативні бруньки у період спокою та ак-
силярні бруньки пагона, що росте [379]. МКР листопадних ро-
додендронів доцільно проводити у два етапи: культивація мік-
роживців на живильному середовищі з підвищеним вмістом
цитокінінів для стимуляції росту бруньок; субкультивація їх на
середовищі з ауксином і гібереловою кислотою. Укорінюють па-
гони при зниженні концентрації мінеральних речовин без фіто-
гормонів із попередньою обробкою їх ауксином [29, 46].
Більшість авторів використовують середовища зі зменшеною
концентрацією мінеральних речовин (1/3 або навіть 1/10 середо-
вища М8, 1/2 — Кнопа, 1/2 — Хеллера), але рН в усіх середо-
вищах має становити 4,5—5,2. Часто для всіх стадій культиву-
вання застосовують те ж саме середовище. Найефективніші регу-
лятори росту: для регенерації пагонів — 2-іР, зеатин, ТДЗ, для
укорінення — ІОК, ІМК [334, 335].
Успіх МКР азалій залежить від генотипу материнської рос-
лини. При культивуванні апікальних меристем і сегментів паго-
нів регенераційна здатність експлантів коливалась від 80 до 15 %
для окремих сортів. Цикл культивування експлантів складається
з проліферації пагонів (4—8 тижнів), їх росту (6—8 тижнів) і уко-
рінення (8 тижнів) [345].
Пропонуємо опис найпоширеніших методик МКР вересових.
Використання верхівок пагонів і бруньок міжвузлів
(для рододендронів і азалій)
Стерилізація вихідного матеріалу, напівздерев’янілі пагони
(3—5 см) промивають проточною і теплою водою з детергентом;
занурюють у 70%-й етанол на 30—40 с, потім у 0,5%-й розчин гі-
похлориту з 5 краплями твін 20 на 12—15 хв; промивають у 3 пор-
ціях стерильної дистильованої води. Можна використовувати
0,1%-й розчин діациду і 0,1%-й розчин сулеми (5—10 хв).
Вичленування експланта'. під мікроскопом відділяють покрив-
ні листки, відрізають верхівку пагона (0,5—1,0 см) і кладуть її го-
ризонтально на поверхню агаризованого середовища.
Умови культивування', культивують на середовищі Андерсона
за температури 23 °С. Верхівки пагонів швидше розвиваються в
культурі, ніж експланти міжвузлів. Уже через 3—4 тижні утво-
рюється калус, потім проліферують пагони. Для індукції калусо-
утворення до середовища додають 0,043 ммоль аденіну і
0,018 ммоль 2,4-Д. Після 2 пересадок калусу і збільшення його
89
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
біомаси на середовищі з 0,034—0,068 ммоль зеатину регенерують
пагони. За кілька тижнів на шматочках калусу масою 70—75 мг
утворюється до 20 пагонів. Для стимуляції формування пагонів
використовують також 5—10 мг 2-іР. Укорінення пагонів відбу-
вається на тому ж середовищі. За 10 міс рослини готові до пере-
садки у субстрат [110].
Для розмноження зимостійких листопадних азалій викори-
стовують модифіковане середовище М8 (1/2 концентрації) з 2-іР
(5—10—20 мг/л). У культурі апікальних меристем проліферація і
ріст пагонів починаються через 5—6 тижнів (по 2—7 пагонів на
експлант). Для збільшення коефіцієнта розмноження радять зрі-
зати пагони, що утворились, а материнський експлант перенести
на свіже живильне середовище з 10 мг/л 2-іР і 1 мг/л ІОК. Із па-
зушних бруньок експланта формуються нові пагони; додавання
до середовища ІОК збільшує їх кількість. Пагони субкультиву-
ють на свіжому живильному середовищі або укорінюють.
Прямий органогенез пагонів можна отримати на сегментах
листків рослин, що виросли іп уііго. Листки культивують на се-
редовищі з 10,1 мг/л 2-іР і 2 мг/л ІМК протягом 2 тижнів; далі
на середовищі з 0,2—2,0 мг/л ТДЗ вони проліферують численні
пагони [227].
Використання квіткових бруньок
Автори, що запропонували цей метод для листопадної азалії
Кїюсіосіепсігоп ргіпоріїуііит, радять перенести маточні рослини у
великі горщики і витримувати їх протягом 2 міс при 4 °С і сла-
бому освітленні [180]. Потім рослини переносять у теплицю і
місяць вирощують при 20 °С і природному освітленні. Це сприяє
утворенню квіткових бруньок, які вводять у культуру.
Стерилізація вихідного матеріалу, бруньки занурюють у 70%-й
етанол на 3 хв; залишки спирту видаляють стерильним фільтру-
вальним папером; кладуть у 10%-й хлорокс із краплею твін 80 і
струшують на шейкері 20 хв; промивають у 4 порціях стерильної
дистильованої води.
Вичленування експланта'. видаляють зовнішні смолисті луски,
залишають оцвітину, вичленовують квітку із зав’яззю. Експлант
розміщують горизонтально на поверхні агаризованого середовища.
Умови культивування', використовують середовище Андерсона
з 4 мг/л ІОК, 15 мг/л 2-іР для індукції утворення пагонів. Роз-
множення пагонів відбувається на середовищі ЕК [203] з 1,0 мг/л
90
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
ІОК і 5 мг/л 2-іР. Укорінюють пагони додаванням до середови-
ща 4,0 мг/л ІОК і 1 г/л активованого вугілля.
Первинні експланти культивують у темряві при 25 °С. Через
2 тижні пелюстки квітки відпадають, і стінка зав’язі безпосеред-
ньо контактує з середовищем. Через місяць експланти перено-
сять у культуральну кімнату з освітленням флуоресцентними
лампами, фотоперіодом 16 год і температурою 25 °С на 1—2 міс.
Після регенерації пагонів (по 20—50 на кожному експланті) їх
відділяють і переносять на середовище для розмноження. Паго-
ни утворюють багато листків, збільшуються в розмірах: водночас
продовжується регенерація нових пагонів зі стінки зав’язі і
квітконіжок. Кожні 1,5—2 міс групу пагонів видаляють і перено-
сять на свіже середовище. У такий спосіб можна отримати по-
трібну кількість пагонів. Для індукції коренів пагони відрізають і
переносять на середовище для укорінення, в якому через 1 —
2 міс утворюються корені. Часто корені регенерують спонтанно
на середовищі для розмноження пагонів через 3 міс культиву-
вання. Рослини-регенеранти (8—10см заввишки, з 10—^лист-
ками) переносять у субстрат із торфу і перліту (1:1); в умовах
теплиці вони добре приживлюються. Подальше вирощування
відбувається відповідно до вимог рослини.
ГВОЗДИЧНІ (СагуорЬуІІасеае)
Ремонтантна гвоздика — ОіапіЬик сагуорЬуІІик — одна з про-
відних культур промислового квітникарства. Застосування веге-
тативного розмноження призвело до поширення вірусних і бак-
теріальних хвороб, що суттєво зменшує кількість і якість квітів.
Надійним ефективним заходом оздоровлення посадкового
матеріалу гвоздики є культура апікальних меристем у поєднанні
з термотерапією материнських рослин.
Ці методи почали застосовувати з початку 1960-х років, і
нині їх широко використовують у промисловому квітникарстві
багатьох країн і в Україні також [83].
Основні методичні принципи подібні у різних авторів і від-
мінні лише за складом живильних середовищ, температурним
режимом та умовами освітлення. Для вирощування ізольованих
апексів гвоздики використовують рідкі та агаризовані живильні
середовища М8, Буюса, Ван-Хофа, Мореля в оригінальних про-
писах та модифікаціях із різними концентраціями та сполучен-
нями регуляторів росту. Найчастіше застосовують середовище
91
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
М8 з додаванням 1,0 мг/л кінетину та 0,1 мг/л НОК. На цьому
середовищі спостерігали кращий ріст меристем (до 75 %) і нор-
мальний морфогенез рослин (до 60 %). На середовищі Буюса
скорочується тривалість росту експлантів гвоздики, збільшується
вихід нормально розвинутих рослин і підвищується приживлю-
ваність регенерантів у субстраті [83].
Важливим фактором, що впливає на морфогенез рослин, є
розмір експлантів. Для звільнення від вірусної інфекції викори-
стовують апікальні меристеми малих розмірів (90—100 мкм), що
складаються з купола та ледь помітних листкових примордіїв.
Такі апекси важко вичленовувати; вони повільно ростуть, їх
здатність до морфогенезу знижена. У разі збільшення розмірів
експланта до 200 мкм за рахунок субапікальної тканини та лист-
кових примордіїв підвищується морфогенетична здатність, але
при цьому зростає можливість переносу вірусної інфекції від ма-
теринської рослини.
Виявлено, що наявність верхньої пари листків у експланта
апекса сприяє нормальному морфогенезу більше, ніж субапікаль-
на тканина. Найбільшу кількість добре розвинутих проростків
отримали у разі застосування апексів з листками без субапікаль-
ної тканини розміром 350 мкм [429]. Експланти такого розміру
вичленовують із здорових рослин або після термотерапії.
Залежно від розміру експланта, складу живильного середо-
вища і умов культивування можна отримати регенеранти з добре
розвинутими листками і коренями, пагони з калусом або пагони
без коренів. На рідкому середовищі ріст апексів активніший, ніж
на агаризованому; додавання 1 мг/л кінетину сприяє індукції чис-
ленних пагонів. Для збільшення коефіцієнта розмноження оз-
доровлені регенеранти гвоздики можна живцювати. Пагони з
4—5 парами листків розрізають на частини з однією парою
листків і укорінюють на середовищі Уайта з мікроелементами за
Хеллером, зниженим вмістом цукрози і 1 мг/л НОК або ІОК.
Цей захід дає змогу збільшити вихід рослин-регенерантів у
425 разів (рис. 4).
Іншим ефективним методом масового розмноження гвозди-
ки є культура калусної тканини. На середовищі М8 із додаван-
ням 2 мг/л 2,4-Д або 0,5 мг/л кінетину і 0,1 мг/л НОК з апі-
кальної тканини розростається калус, відбувається проліферація
численних пагонів і коренів. У наших дослідах калусна тканина
утворювалась у разі додавання до середовища 0,5 мг/л гумату
натрію. Окремі частини калусу або пагони з калусом переносять
92
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Рис. 4. Рослини-регенеранти гвоз-
дики
у колби з рідким живильним
середовищем, 2 мг/л кінетину і
0,002 мг/л НОК. За тиждень
маса тканини збільшується в
З—4 рази, а за 6 тижнів утво-
рюються пагони. Корені пролі-
ферують спонтанно в рідкому
середовищі або після пересадки
пагонів на агаризоване середо-
вище без фітогормонів.
Найпринятнішим методом,
що дає змогу отримувати цито-
логічно і генетично стабільні ре-
генеранти, є індукція соматич-
них ембріоїдів безпосередньо
на тканинах рослини. На рід-
кому середовищі М8, яке міс-
тить 1 мг/л 2,4-Д і 0,2 мг/л БАП,
відбувається утворення ембріої-
дів (без калусу) на експлантах
листків гвоздики. Перші глобу-
лярні структури з’являлись через 20 діб культивування; подаль-
ший розвиток до стадії торпедо стимулювало додавання поліети-
ленгліколю (2,5 %) (РЕС 6000). Морфогенез рослин відбувався
при внесенні 1000 мг/л гідролізату казеїну і залежав від гепотипу
рослини.
Регенеранти були ідентичні материнській рослині і нормаль-
но розвивались у теплиці. У регенерантів гвоздики поширене
явище вітрифікації, особливо при вирощуванні на рідкому сере-
довищі. Аби запобігти цьому, багато авторів знижують кон-
центрацію мінеральних компонентів у живильному середовищі
(1/2 М8) і використовують кінетин (замість БАП) з НОК у таких
концентраціях, мг/л: 0,1—0,5; 0,2—2,2; 0,02—2,0; 0,09—2,9; 0,5—
0,5 [226, 227].
Наводимо головні етапи методу МКР гвоздики.
Стерилізація вихідного матеріалу. пагони беруть від рослин,
що пройшли термічну обробку, або від безвірусних маточних
рослин; видаляють листки, промивають проточною і теплою во-
дою з детергентом; занурюють у 10%-й розчин гіпохлориту нат-
рію на 5 хв (або в 5%-й розчин на 20 хв); промивають стериль-
ною дистильованою водою.
93
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
У багатьох лабораторіях пагони гвоздики не стерилізують, бо
його апікальна меристема надійно захищена від зовнішньої ін-
фекції молодими листками.
Вичленування експланта'. препарувальною або дисцизійною
голкою видаляють основи листків (щоразу змінюють стерильний
інструмент), під бінокулярним мікроскопом вичленовують апекс
із 2 листковими примордіями. Розмір експланта для оздоровлен-
ня рослин — 0,1—0,2 мм, для масового розмноження — 0,30—
0,5 мм. Експланти переносять у пробірки на місточки з фільтру-
вального паперу.
Умови культивування: культивують на рідких живильних се-
редовищах М8, Ван-Хофа при 20—25 °С, вологості 70—80 %,
освітленні 1—4 клк, фотоперіоді 14—16 год. Деякі автори вико-
ристовують постійне освітлення флуоресцентними лампами за
температури 18—22 °С. Періодично здійснюють контроль за рос-
том експлантів, вибраковують недорозвинуті й ті, що відстають у
рості. Активність росту меристем залежить від пори року: екс-
планти краще ростуть весною і влітку, гірше — восени. Відповід-
но змінюється і вихід добре розвинутих рослин-регенерантів.
Пересадка в субстрат: рослини заввишки 3—5 см зі сформо-
ваними листками і коренями виймають з пробірок, відмивають
від залишків агару і висаджують у субстрат — вермикуліт з пер-
літом (1:1) або перліт з торфом (1:1). Горщики з рослинами на-
кривають склянками для забезпечення вологості і кращої при-
живлюваності. Через 10—15 діб рослини переносять у теплицю і
проводять перший вірусологічний контроль. Здорові добре роз-
винуті рослини пересаджують у більші горщики в нестерильну
ґрунтову суміш. Під час росту рослини ще 2 рази контролюють
наявність вірусів. Відібраний здоровий елітний матеріал перено-
сять в окремі теплиці і вирощують згідно з технологією. Протя-
гом усього періоду вирощування маточників застосовують не-
обхідні заходи для запобігання повторного зараження рослин.
ГЕСНЕРІЄВІ (СеБпегіасеае)
Рослини з родини геснерієвих легко розмножуються вегета-
тивно — листками, черешками, діленням куща, особливо такі,
як сенполія, стрептокарпус, ахіменес, синінгія. Проте у практиці
декоративного садівництва часто виникає потреба розмноження
селекційних рослин, і застосування методу МКР дає змогу швид-
ко отримати потрібну кількість регенерантів.
94
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Чимало фірм спеціалізуються на виробництві посадкового
матеріалу сенполії для промислового квітникарства. Із застосуван-
ням мікроклонування можна отримати з експланта до 20 000 рос-
лин за рік [92]. Як вихідний матеріал використовують листкові
пластинки, черешки, квітконіжки, апекси пагонів. Експланти
рослин із родини геснерієвих при культивуванні іп уіїґо мають
високу регенераційну здатність, яку можна регулювати умовами
утримання рослин-донорів (температура, тривалість фотоперіо-
ду), рівнем макро- і мікроелементів у живильному середовищі та
концентрацією регуляторів росту. Морфогенетичну здатність ли-
стків стрептокарпуса можна збільшити, якщо вирощувати мате-
ринські рослини при 12—18 °С. Експланти перші 3 тижні слід
також культивувати за такої самої температури. Підвищення тем-
ператури пригнічує утворення бруньок і коренів [112].
Істотно впливає на морфогенез і тривалість освітлення ін-
тактних рослин. Експланти листків стрептокарпуса від рослин,
що вирощували при фотоперіоді 8 год, утворювали квіткові
бруньки; при фотоперіоді 16 год проліферували лише вегетативні
бруньки.
Індукція вегетативних або репродуктивних структур на екс-
плантах залежала також і від концентрації компонентів живиль-
ного середовища. За високої концентрації К1ЧО3 (20 ммоль) і цук-
рози (100 ммоль) переважно розвиваються вегетативні бруньки, а
квіткові — лише у 28 % експлантів. Зниження КМО3 до 2 ммоль
і цукрози до 15 ммоль сприяє утворенню квіткових бруньок на
усіх експлантах [435]. Сильним інгібітором проліферації квітко-
вих бруньок є ІОК у концентрації 5-Ю’6 моль; водночас індукція
вегетативних бруньок збільшується в 3 рази.
Для МКР глоксінії використовують листки, черешки, квітко-
носи, частини квітки. Найбільша морфогенна активність у сег-
ментів листка і квітконіжок. На середовищі М8 з 1—2 мг/л БАП
і 0,2—1,0 мг/л НОК утворюються численні бруньки, пагони.
Укорінення пагонів відбувається при додаванні по 0,5 мг/л БАП
і ІОК (або лише 1 мг/л ІОК).
Високу морфогенну здатність має квітколоже глоксінії, роз-
різане на декілька частин. На середовищі М8 (з вищезгаданими
регуляторами) утворюються пагони.
Можливість швидкого МКР показана для сенполії, смітанти,
епісції, ешінантуса. Використовували сегменти листка (1 см2) з
жилками, відрізки черешка (3 мм). Культивували на 1/2 концент-
рації середовища М8 з 10“6 г/л НОК при 22 °С вдень і 18 °С вно-
95
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
чі, освітленні 6 клк, фотоперіоді 16 год, вологості 60 %. Через
4—5 тижнів утворювались пагони, які укорінювали на тому ж
середовищі з 10 г/л цукрози і 10'7 г/л НОК. Укорінені рослини
через 10—12 тижнів переносили у субстрат [372].
Від одного експланта сенполії багаторазовим субкультиву-
ванням можна отримати до 1500 рослин регенерантів, а у стреп-
токарпуса — до 2500 рослин.
Для розмноження ахіменеса, сенполії, сінінгії, стрептокарпу-
са можна також використовувати середовище Е8 з 0,2—1,0 мг/л
ІОК і БАП, 1 мг/л тіаміну, 100 мг/л інозиту [291].
Експланти черешків листка сенполії на середовищі Б8 з
0,2 мг/л ІОК, 0,1 — 2,4-Д і 0,4 мг/л БАП проліферували калус, з
якого утворювались пагони. Укорінення відбувалось на тому ж
середовищі з 2 мг/л ІОК. Для МКР сенполії використовували
субепідермальні тканини листка і черешка. На середовищах М8,
Гамборга з 0,1 мг/л НОК і 0,5 мг/л БАП культивували експланти
при 22 °С, освітленні 2 клк і фотоперіоді 18 год. Рослини, отри-
мані з субепідермальної тканини, розвиваються краше за тих, що
проліферують із сегментів листків і черешків. Вони утворювали
більше листків і були більшими, але цвітіння починалося пізні-
ше на 2 тижні [138, 139].
МКР гібридів сенполії, які погано розмножуються і повільно
ростуть, дає змогу в короткий термін (4—6 міс) отримати сотні
рослин, ідентичних материнським. Для цього сегменти листкової
пластинки (1—2 см2) розміщували абаксіальною поверхнею на
середовище М8 (або на 1/4 занурювали у середовище). Додаван-
ня 0,1 мг/л НОК, 5,0 — БАП і 125 мг/л аденінсульфату сприяє
проліферації пагонів, кількість яких через 6 міс сягала 80 на екс-
плант. У такий спосіб від одного експланта за рік можна отри-
мати до 1 млн рослин-регенерантів [435, 450].
Наведені результати засвідчують величезні можливості МКР
рослин з родини геснерієвих. Для індукції морфогєнезу можна
використовувати різні частини рослин, листки, черешки, квітки,
квітконіжки, пиляки, апекси. Регенерація успішно відбувається
на різних живильних середовищах: М8, Б8, Гамборга з добавка-
ми ауксинів і цитокінінів. Для звільнення від інфекцій і клону-
вання епісції, ешинантуса, колумнеї, сінінгії можна використо-
вувати верхівки пагонів (0,5—1,0 мм). На середовищі М8 з
0,2 мг/л ІОК і 0,2 мг/л кінетину на експлантах утворюються
численні пагони; їх укорінюють на середовищі без регуляторів
росту або з 1 мг/л ІОК [457].
96
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Для отримання гаплоїдних рослин сенполії і ешинантуса за-
пропоновано використовувати культуру пиляків [275]. Квіткові
бруньки відділяли від рослини, стерилізували у хлороксі 1—2 хв.
У стерильних умовах вичленовували пиляки і розміщували на
середовищі Блейдса, культивували при 27 °С, фотоперіоді 16 год
і освітленні флуоресцентними лампами. Через 6—8 тижнів прямо
з пиляків або світло-коричневого калусу виростають пагони (5—
18 шт. на кожному експланті). Найкращі результати отримано з
пиляків діаметром 3—5 мм: 18 % утворюють проростки, 2 % про-
ліферують темний калус. Пиляки менші або більші за розміром
не продукують ні калусу, ні пагонів. Укорінюють пагони дода-
ванням до середовища по 0,2 мг/л ІОК і кінетину.
У наших дослідах найбільший морфогенний потенціал у
листків сенполії і глоксінії відзначено на середовищі М8 з
0,2 мг/л 2,4-Д і 0,5 мг/л ІОК.
Використання листків для МКР сенполії,
стрептокарпуса, ешинантуса, глоксінії
Стерилізація вихідного матеріалу, свіжозрізані молоді листки
промивають проточною, а потім теплою водою з детергентом; зану-
рюють у 70%-й етанол на 5—10 с, далі — у 0,1%-й розчин сулеми
(або іншого ртутного препарату) на 1—2 хв; промивають у 3—4 пор-
ціях стерильної дистильованої води; переносять у 15%-й пергідроль
на 15 хв; споліскують стерильною дистильованою водою; листки
висушують стерильним фільтрувальним папером. Такий режим
стерилізації дає змогу отримати до 85 % стерильних експлантів.
Інколи замість сулеми використовують 10%-й розчин гіпо-
хлориту натрію (10—15 хв).
Вичленування експланта'. листки розрізають на квадрати роз-
міром 1 х 1 см з жилкою і розміщують на поверхні агаризованого
середовища. Експланти проксимальної частини листкової плас-
тинки мають більший морфогенний потенціал. Використовують
живильне середовище М8 з 0,2 мг/л 2,4-Д і 0,5 мг/л ІОК або Е8
з 2,0 мг/л ІОК, 2,0 — кінетину і 80 мг/л аденозинсульфату.
Умови культивування', експланти культивують у темряві або за
денного освітлення при 18—23 °С, фотоперіоді 16 год. Для ін-
дукції коренів пагони субкультивують на середовищі М8 з
0,4 мг/л тіаміну, 100,0 — інозиту, 2,0 мг/л ІМК. Після укорінен-
ня рослини виймають з колб, відмивають від агару і пересаджу-
ють у субстрат, накривають склянками [44, 291].
7 -6-83
97
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ІРИСОВІ (ІгШасеае)
Гладіолус (СІасііоІиг Ііогі.)
Селекційна робота з гладіолусами ведеться вже більше 100 ро-
ків, та інтерес до цих рослин постійно зростає. З’явилися нові
високодекоративні сорти з повними ароматними квітками. Про-
те значні втрати під час вирощування гладіолусів спричиняють
грибкові бактеріальні та вірусні хвороби.
Методи МКР дають змогу набагато скоротити селекційний
процес і розмножити потрібну кількість оздоровлених рослин.
Дослідження С. Нц88еу [92, 276] показали, що від кожної па-
зушної бруньки гладіолуса можна отримати за рік до 500 рослин.
В середньому на бульбоцибулині гладіолуса формується по 3 па-
зушні бруньки, тому відповідно зростають можливості отриман-
ня рослин-регенерантів (до 15—90 тис.).
Високу морфогенетичну здатність мають інші частини рос-
лин: сегменти квітконосів, суцвіття, оцвітини, пиляки, дочірні
цибулини, апекси столонів [439, 533, 534].
Максимальну здатність до регенерації мають сегменти квіт-
коносів. їх розміщують на середовищі М8 з 10 мг/л НОК і
0,5 мг/л кінетину морфологічно верхнім кінцем донизу. За тиж-
день утворюється калус, формуються ембріоїди. У сегментів, що
розміщені морфологічно нижнім кінцем, швидкість проліферації
калусу значно менша. Надалі з ембріоїдів формуються бруньки,
бульбоцибулини, столони. їх відділяють і субкультивують на се-
редовищі з 0,5 мг/л НОК для утворення коренів. Рослини доро-
щують на середовищі з 0,5 мг/л НОК і кінетину, перед висадкою
у субстрат пересаджують на середовище без регуляторів росту і
зниженим вмістом цукрози (до 1,5 %). Регенеранти з добре роз-
винутими листками і коренями переносять у субстрат, де вони
успішно приживлюються [276].
Детально досліджено процес росту і диференціації рослин у
культурі калусної тканини з верхівок столонів. На живильних се-
редовищах Уайта з 1 мг/л ІОК або 0,1 мг/л НОК і М8 з 0,6 мг/л
2,4-Д або 0,04 мг/л кінетину і 15 % кокосового молока експланти
бруньок протягом 6 тижнів утворювали калус, з якого формува-
лись пагони, листки, корені. За 6 міс регенерували цілі рослини.
Для проліферації пагонів використовували середовище М8 з БАП
(0,07—0,7 мг/л) і НОК (0,002—0,02 мг/л) або кінетином (2 мг/л).
Укорінювали на тому ж середовищі з 60 г/л цукрози, 0,02—
1,9 мг/л НОК і 0,5—5,0 г/л активованого вугілля. За 3—4 міс ут-
98
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
ворювались бульбоцибулини, які переносили у компост [423].
Адвентивні пагони формуються на фрагментах бульбоцибулини
при культивуванні на середовищі М8 з 0,5 мг/л БАП (для іншого
сорту 1—2 мг/л БАП), 60—90 г/л цукрози і за температури 15 °С.
Пагони укорінюються на середовищі з ауксином і активованим
вугіллям при 17 °С, надалі утворюються бульбоцибулини [227].
Дослідження гормональної регуляції утворення пагонів на екс-
плантах столона гладіолуса показало, що додавання 0,5—5,0 мг/л
НОК сприяє проліферації калусу і формуванню зачатків коренів і
пагонів, але їх подальший ріст не відбувається. Лише додавання
кінетину (0,5—1,0 мг/л) зумовлює диференціацію пагонів на екс-
плантах верхівок столона. Поєднання 3 мг/л НОК і 0,5 мг/л
кінетину ефективніше індукувало утворення пагонів. Внесення
АБК і гіберелової кислоти затримує їх ріст, а також розвиток
вторинних пагонів. Анатомічні дослідження показали, що нема
різниці у структурі пагонів, утворених іп уіїго і іп УІУО.
Методика МКР гладіолусів наведена нижче.
Стерилізація вихідного матеріалу, бульбоцибулини звільняють
від покривних лусок, промивають проточною водою; занурюють
на 1—2 хв у 70%-й етанол, потім у 0,5%-й гіпохлорит натрію на
15 хв; промивають у 4—5 порціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта. бруньки бульбоцибулини вичлено-
вують під бінокулярним мікроскопом; квітконос розрізають на
сегменти 3—4 мм.
Умови культивування', використовують агаризоване або рідке
середовище М8 з 5 мг/л НОК і 0,5 мг/л кінетину чи середовище
Уайта з 1 мг/л ІОК або 0,1 мг/л НОК. Культивують у темряві,
потім на світлі при фотоперіоді 16 год і 26 °С. Залежно від сорту
проліферація калусу починається через 3—4—6 тижнів, наступні
2—4 тижні формуються пагони, листки.
Пересадка в субстрат', рослини з коренями переносять на
стерилізований субстрат із сфагнового моху і піску, накривають
склянками. Раз на тиждень рослини-регенеранти підживлюють
розчином Уайта або Хогланда. За 4—6 міс формуються бульбо-
цибулини. Приживлюваність становить 60—80 %.
Фреезія (Егеезіа КІай)
У промисловому квітникарстві захищеного ґрунту фреезія знач-
но поширена завдяки своїй декоративності й можливості отрима-
ти зрізані квіти в осінньо-зимовий період. Селекціонери досягли
7*
99
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
значних успіхів у створенні нових сортів фреезії. Завдяки МКР
період накопичення вихідного рослинного матеріалу може бути
скорочений до 2—3 років (замість 6—8).
Під час розробки оптимальної схеми МКР фреезії було до-
сліджено морфогенетичні потенції різних органів і тканин рос-
лини: сегменти бульбоцибулин, апікальні і пазушні бруньки,
бутони, квітки, пиляки, корені [15]. Відзначено високу морфо-
генну здатність усіх тканин фреезії. Репродуктивні органи —
квіткові бруньки, пиляки — найактивніші. Нерозкриті бруньки
розміром 2—10 мм на середо виші М8 з 5—10 мг/л БАП і 0,1 —
1,0 мг/л ІОК формують численні меристематичні зони, бруньки,
пагони. На середовищі з 1 мг/л БАП і 0,1 мг/л ІОК квіткові
бруньки утворюють калус.
Ізольовані пиляки після дії високої температури (35 °С про-
тягом 24 год) культивували на середовищі з 4 мг/л БАП і 4 мг/л
НОК. За 3 тижні утворювався калус, з якого на середовищі з
2 мг/л БАП і 0,5 мг/л НОК диференціювались пагони, корені,
листкоподібні структури, рослини. Регенеранти не мали морфо-
логічних відхилень. При культивуванні апікальних і пазушних
бруньок бульбоцибулин на середовищі М8 з 0,5 мг/л БАП за 3—
4 тижні утворюються пагони. Сегменти бульбоцибулин (без бру-
ньок) на середовищі з цитокінінами (0,01—20,0 мг/л) також ре-
генерують пагони.
Отже, існують три способи МКР фреезії: утворення адвен-
тивних пагонів із тканини бруньки з подальшою проліферацією
пазушних меристем; формування адвентивних пагонів із ткани-
ни бульбоцибулин; утворення і проліферація калусу з дифе-
ренціацією стеблових апексів [120, 460].
Для звільнення від вірусної інфекції використовують мери-
стематичні тканини бульбоцибулин від рослин, що пройшли се-
рологічну перевірку. У здорових рослин видаляють верхню час-
тину бульбоцибулини з першою парою листків, стерилізують у
0,8%-му розчині А§МО3 або 10%-му №ОСІ і промивають у 6 пор-
ціях стерильної дистильованої води. Ізолюють апікальну мери-
стему і культивують на рідкому середовищі М8 з 2 мг/л БАП без
1ЧН41ЧОз або з меншою концентрацією, бо він сприяє форму-
ванню щільного калусу і слабкій регенерації пагонів [83]. Паго-
ни, що утворилися, культивують на твердому середовищі без
БАП, в якому вони укорінюються.
Наводимо схеми МКР фреезії.
100
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Використання квіткових бутонів
Стерилізація вихідного матеріалу, зрізані закриті квіткові буто-
ни розміром 2—20 мм занурюють у 70%-й етанол на 1—5 с, потім
у 10%-й хлорамін на 10 хв, далі у 0,1%-й діацид або 10%-й N300;
промивають у 3—4 порціях стерильної дистильованої води.
Основу квіткової бруньки занурюють на 1/3 у агаризоване
живильне середовище.
Умови культивування: використовують модифіковане середо-
вище М8 з додаванням 100 мг/л інозиту, 500,0 — гідролізату казе-
їну, 1,0 — ІОК, 5,0 мг/л БАП, 3 % цукрози, 0,7 % агару або 2 мг/л
БАП і 5 мг/л ІОК, рН 5,6—6,0. Культивують у темряві при 18—
22 °С і відносній вологості 70 %. Через 7—8 тижнів експланти
переносять на світло інтенсивністю 2 клк при фотоперіоді 16 год.
Протягом 6—16 тижнів культивування біля основи бруньки дифе-
ренціюються численні стеблові бруньки і пагони. Для збільшення
коефіцієнта розмноження ці структури ділять на фрагменти і суб-
культивують на 1/2 концентрації середовища М8 з 50 мг/л інози-
ту, 5,0 — БАП, 2 мг/л ІОК, 3,5 % цукрози і 0,8 % агару.
Через 2—3 міс розвиваються численні пагони і стеблові брунь-
ки. Подальше субкультивування дає змогу отримати потрібну кіль-
кість рослин-регенерантів. Пагони, що досягли 4 см, укорінюють
на 1/2 концентрації середовища М8 з 0,5 мг/л ІОК і 3 % цукрози.
Інтенсивність освітлення на цьому етапі збільшують до 10 клк.
Процес МКР фреезії з квіткових бутонів можна проводити
протягом року і отримати від однієї бруньки до 200—300 рослин.
Використання бульбоцибулин
Стерилізація вихідного матеріалу: бульбоцибулини або їх сег-
менти занурюють у 70%-й етанол на 1—5 хв, потім у 10%-й хло-
рамін на 20 хв або у 0,8%-й А^О3 на 3 хв; промивають у 4—6 пор-
ціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта: апікальні і пазушні бруньки виріза-
ють і переносять на поверхню агаризованого середовища.
Умови культивування: використовують середовище М8 з
50 мг/л інозиту, 0,5 — тіаміну, 0,5 — БАП, 0,1 мг/л ІОК, 2 %
цукрози і 0,8 % агару. Культивують при 22—25 °С, освітленні
2 клк і фотоперіоді 16 год. Через 3—4 тижні експланти набуха-
ють, зеленіють, формують пагони; інколи утворюється світло-ко-
ричневий калус і диференціюються стеблові бруньки. Для сти-
101
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
мулянії росту і розмноження бруньок слід видалити головний
пагін і субкультивувати структури на свіжому живильному сере-
довищі. Це сприяє утворенню численних стеблових зачатків і
адвентивних пагонів. Укорінюють пагони на 1/2 концентрації
середовища М8 з 0,5 мг/л ІОК і 3 % цукрози.
Пересадка в субстрат-, укорінені рослини відмивають від за-
лишків агару і для запобігання розвитку грибкової і бактеріаль-
ної інфекції занурюють у 0,2%-ву суспензію еупарену. Висаджу-
ють у перліт, а потім у субстрат з ЗО % торфу, 20 — перліту і
50 % компосту або у подрібнений збагачений мінеральними доб-
ривами торф і річковий пісок (1:1). Приживлюваність рослин на
цих субстратах становить 80—90 %.
Крокус (Сгосиз)
З метою збереження генофонду рослин природної флори, що
зникають, розроблено метод МКР шафрану алатавського (Стосик
аіаіауісик) і шафрану Королькова (Стосик КогоІкоМі). У природних
умовах коефіцієнт вегетативного розмноження дуже низький (1:1).
Здатність до проліферації калусу і морфогенезу шафрану зале-
жить від різних факторів: походження експланта, фази розвитку
інтактної рослини, складу і концентрації фітогормонів у живиль-
ному середовищі. Найбільший морфогенний потенціал мають
тканини бульбоцибулини, дещо нижчий — сегменти квітконосів,
зав’язі та пелюсток квітки. Для індукції росту калусної тканини
сегменти квітконоса слід розміщувати на живильному середо-
вищі базальним кінцем догори.
Найсприятливіший час для ізолювання бруньок шафрану —
кінець серпня. У таких експлантів за 6 тижнів культивування
об’єм калусу збільшується у 20 разів; у бруньок, що ізольовані у
травні—червні, цей процес триває 10—11 тижнів. Тканини лист-
ків, коренів і квітконосів краще вичленовувати восени, у період
виходу бульбоцибулини з періоду спокою [98].
Нижче наводимо методику МКР крокусів [72].
Стерилізація вихідного матеріалу, бульбоцибулини звільняють
від сухих лусок, промивають проточною водою; занурюють у 12%-й
пероксид водню на 10 хв; переносять у 1%-й гіпохлорит кальцію
на 20 хв; промивають у 3 порціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта: апікальні і латеральні бруньки, тка-
нину бульбоцибулини розміром 10 х 10 мм, сегменти квітконоса,
частини квітки вирізають і культивують.
102
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Умови культивування', використовують середовище М8 з
1 мг/л кінетину і 0,1 мг/л НОК, що сприяє формуванню рослин-
регенератів з добре розвинутими коренями. На середовищі з
2 мг/л 2,4-Д, 1,0 — аденіну і 0,4 мг/л кінетину експланти різних
органів шафрану (бруньки, корені, листки, сегменти бульбоцибу-
лин, квітконос, зав’язь, тичинки, приймочка) проліферують ка-
лус. Подальше субкультивування калусу на середовищі з 0,1 мг/л
НОК і 1 мг/л кінетину сприяє проліферації ембріоїдів. Форму-
вання пагонів і коренів відбувається на середовищі М8 з 5 мг/л
НОК і 2 мг/л БАП, а їх подальший ріст — у разі зниження кон-
центрації регуляторів росту в 2 рази.
Культивують при 22 °С у темряві, а надалі при фотоперіоді
16 год. Субкультивування тканин слід проводити кожні 6—8 тиж-
нів. Попередня обробка цибулин низькою температурою (5 °С)
протягом 3 тижнів стимулює морфогенетичний потенціал тка-
нин. Весь цикл формування рослин-регенерантів триває 6—8 міс
залежно від використаного експланта.
Пересадка в субстрат', рослини висаджують у субстрат з вер-
микуліту й торфу і утримують у кліматичній камері при 25 °С,
освітленні 8 клк і фотоперіоді 16 год. Потім рослини переносять
на 3 тижні в умови зниженої температури (5 °С), після чого ви-
рощують у теплиці, де формуються дрібні бульбоцибулини, які
можна висаджувати у відкритий ґрунт.
Ірис (Ігіз ІюІІапсІіса)
Група гібридних ірисів, що мають цибулини, дуже повільно
розмножується в природі. Тому для впровадження нових гібрид-
них форм розроблено декілька методів їх клонального розмно-
ження [141, 227, 234, 492, 493].
Як й інші цибулинні рослини, їх можна розмножувати сег-
ментами лусок. Після видалення сухих лусок і залишків коренів
цибулину розрізають навпіл і стерилізують у 15%-му N3001 ЗО хв,
промивають стерильною водою. Роблять подовжні розрізи лусок і
використовують їх як експланти. Доведено, що великі подовжні
секції лусок утворюють більше адвентивних пагонів, ніж маленькі.
Експланти культивують на напіврідкому середовищі М8 (1/2
концентрації) з вітамінами по Лінсмайер—Скугу і ЗО г/л цукрози
при 20 °С у темряві. Біля основи пагонів формуються цибулин-
ки. Використовуючи цю технологію, можна отримати до 50 ци-
булин з однієї материнської рослини за 6 міс культивування.
103
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Для МКР ірисів можна використовувати сегменти квітконо-
сів. На середовищі Неіп/ апсі Ми [226] з 0,02—2,0 мг/л НОК ек-
спланти розміром 1 мм проліферують адвентивні пагони, які
спонтанно укорінюються. Надалі за 6—10 тижнів утворюються
невеликі цибулинки.
Можна використовувати також апекси пагонів (0,5—0,8 мм)
з материнських цибулин, що почали проростати. Експланти куль-
тивують у напіврідкому середовищі Б8 з 3 % аденину, 1,5 мг/л
ІОК і 1,5 мг/л БАП. За кілька тижнів формуються численні па-
гони. Для індукції утворення цибулин пагони переносять на се-
редовище Б8 з 6 % цукрози, 0,5 мг/л НОК і 0,05 мг/л кінетину
на 3 тижні, а потім на це ж середовище без регуляторів. Пагони
утримують у темряві при 5 °С протягом 4 тижнів, а потім при
30 °С — 5—8 тижнів. Перед висадкою у ґрунт цибулини також
утримують при 5 °С. Коли вони дозрівають, їхні зовнішні луски
стають коричневими так само, як і у разі вирощування в грунті.
ЛІЛІЙНІ (ІЛіасеае)
Гіацинт (НуасіпІІіиз огіепіаііз)
Ця культура здавна приваблює квітникарів своєю декоратив-
ністю, різноманітним забарвленням і раннім цвітінням. Розмно-
жуються гіацинти дуже повільно; крім того, їх вражають бактері-
альні та вірусні хвороби. Метод культури ізольованих тканин дає
великі можливості отримання здорового посадкового матеріалу та
значно збільшує коефіцієнт розмноження цибулин гіацинта.
Показано, шо гіацинти досить легко розмножуються в куль-
турі іп уіїго [92, 227, 396]. Адвентивні цибулинки утворюються
безпосередньо на лусках цибулин, сегментах квітконоса, відріз-
ках листків або пазушних бруньках цибулини.
Визначено головні фактори, що впливають на регенераційну
здатність тканин гіацинта. Оптимальним терміном для вичлену-
вання експлантів є початок жовтня; тривале зберігання інтакт-
них рослин не впливає на регенераційну здатність.
Виявлено різницю у морфогенетичній реакції лусок гіацинта
різного фізіологічного віку. У внутрішніх молодших лусок швид-
кість регенерації цибулинок нижча, їх маса менша, ніж у зовніш-
ніх, фізіологічно старих лусок. Існує також різниця у регенера-
ційній здатності базальної і дистальної частин луски. Швидкість
регенерації, кількість і маса цибулинок на дистальних сегментах
луски нижча, ніж на проксимальних. Тому треба використовува-
на
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
ти нижню частину лусок і вирізати сегменти завширшки 0,5 см і
завдовжки 1—3 см. На таких експлантах формується максималь-
на кількість регенерантів. За 12 міс із сегментів лусок гіацинта
розміром 0,5 х 3 см отримали до 300 регенерантів [396]. Велике
значення має орієнтація експлантів на живильному середовищі:
кількість і маса цибулинок зростає на сегментах лусок, що зану-
рені дистальним кінцем.
Для культивування експлантів лусок гіацинта використовують
різні середовища: 1/2 концентрації середовища Кнопа та мікро-
елементами за Хеллером, з додаванням 2 % глюкози і 2 мг/л НОК;
середовище М8 з 1 мг/л НОК і 10 мг/л БАП; середовище Б8 з
1 мг/л ІОК або ІМК. Оптимальною температурою для регенерації
цибулин є 21,6 °С. Не помічено різниці у рості цибулин під час
культивування у темряві і за постійного освітлення [28, 396].
Експланти лусок гіацинта залежно від складу і концентрації
фізіологічно активних речовин у живильному середовищі здатні
до органогенезу або утворення калусу. На середовищі М8 з гід-
ролізатом казеїну (500 мг/л), мезоінозитом (500 мг/л), вітаміна-
ми за Уайтом, 1 мг/л 2,4-Д і 0,2 мг/л кінетину вони проліферу-
ють калус. Внесення БАП (8 мг/л) і НОК (0,08 мг/л) індукує
органогенез; субкультивувати тканини потрібно кожні 35—40 діб.
Адвентивні пагони, що утворилися, слід відділити і пересадити
на середовище М8 без регуляторів росту для укорінення. Через
25—30 діб формуються корені. Рослини переносять у контейнери
з піском і утримують 60—70 діб за низьких температур (5—6 °С).
Отже, протягом року від однієї цибулини можна отримати до
20 тис. рослин-регенерантів.
Високий морфогенний потенціал мають тканини генератив-
них органів гіацинта [381]. Квіткові бруньки завдовжки 4—5 мм
розрізають навпіл і культивують на середовищі М8 з 10,0 мг/л
інозитолу, 2,0 — гліцину, по 0,3 мг/л НОК і БАП. За 6 тижнів
на поверхні зрізу з’являються цибулинки, їх відділяють і перено-
сять на середовище з 0,1 мг/л НОК для стимуляції утворення
коренів. До 90—100 % рослин-регенерантів придатні для пере-
садки у субстрат. Від одного суцвіття гіацинта можна отримати
до 1000 рослин.
Для формування безвірусних клонів гіацинта цибулини ма-
теринських рослин діаметром 4—5 см витримують у термокамері
при 37 °С протягом місяця.
Стерилізація вихідного матеріалу, цибулину промивають про-
точною водою 15—20 хв, потім мильною теплою водою; зану-
105
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
рюють у 70%-й етанол на 1—2 хв, переносять у 3%-й гіпохлорит
натрію з 3—5 краплями твій 80 на 15 хв; промивають у 4—5 пор-
ціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта'. вирізають сегменти лусок цибулини
з базальною частиною розміром 0,5 х 3 см, частини денця, сег-
менти листків, зачатки квіток.
Умови культивування: культивують на середовищах М8, Б8
або Кнопа (1/2 концентрації) при 20—25 °С і за постійного ос-
вітлення. За 8—9 тижнів формуються цибулинки, які можна поді-
лити на сегменти, розрізати навпіл і субкультивувати для отри-
мання потрібної кількості регенерантів. Перед висадкою у суб-
страт цибулинки слід витримати за низької температури (5 °С).
Лілія (ІЛіит)
Численні види і сорти цього роду розмножуються вегетатив-
но дуже повільно: 3—5 цибулин за рік, що значно утруднює се-
лекційний процес. Метод культури ізольованих тканин дає змогу
за короткий термін отримати потрібну кількість рослин-реге-
нерантів і звільнити їх від вірусної інфекції.
Уже перші праці [424] довели можливість МКР лілій. Екс-
планти з базальної частини лусок цибулин Еіііит кресіокит утво-
рювали цибулинки, з дистальної — не були здатні до органогене-
зу. На апексах пагона Б. ІощіїПогит утворювався калус, з якого
проліферували численні пагони. Сегменти лусок розміром 1 см2
розміщували на живильному середовищі Ь8 з 2 мг/л ІОК епі-
дермальною поверхнею вниз. Кожен сегмент регенерував у се-
редньому до 12,5 цибулинок. Культивування експлантів у темря-
ві сприяє збільшенню регенерантів у 8—10 разів.
Подальші дослідження [227, 461] довели, що регенераційна
здатність експлантів лусок лілії залежить від умов культивування,
складу живильного середовища, температури та освітлення. Біль-
шість авторів використовують середовища М8 або Ь8. Утримання
експлантів у темряві протягом 6 тижнів при 25 °С збільшує кіль-
кість цибулинок-регенерантів та їх розмір, у той час як освітлен-
ня 1,6 клк при фотоперіоді 16 год пригнічує утворення цибулин,
але збільшує кількість листків, масу коренів і калусу. Експланти з
базальної частини лусок утворюють у 2 рази більше цибулин, ніж
експланти з дистальної. Для індукції органогенезу дистальних ек-
сплантів у живильне середовище Б8 слід додати 0,3 мг/л НОК і
З мг/л 2-іР, а для базальних — лише 0,03 мг/л НОК.
106
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
У середньому від 100 експлантів лусок лілії за 6 тижнів куль-
тивування можна отримати до 8000 цибулин. Автори [461] радять
зберігати материнські цибулини при 4 °С протягом 2 міс. Така
попередня низькотемпературна обробка прискорює органогенез
на експлантах внутрішніх лусок цибулини. Культивування екс-
плантів при ЗО °С прискорює морфогенез цибулин і скорочує
процес МКР до 90 діб.
Досліджено можливість регенерації лілії не лише з сегмен-
тів лусок, а й із зав’язі [376]. Цибулини материнських рослин
викопують у жовтні і зберігають при 5—10 °С до березня. Сег-
менти лусок розміром 1—2 см2 використовують для культиву-
вання. Зав’язь розміром 2—3 мм вичленовують у червні (за
15 діб до цвітіння).
Експланти культивують на середовищі Ь8 з 10 мг/л НОК.
Утворення бруньок відбувається через 10—14 діб. Корені фор-
муються на середовищі без фітогормонів або з 1—5 мг/л НОК.
Морфогенез рослин і утворення цибулин на експлантах лу-
сок лілії активізується низькими (0,05—0,1 мг/л) дозами НОК і
пригнічується високими (5,0—10,0 мг/л) дозами ауксинів. Ци-
токініни не впливають на процеси регенерації і призводять до
порушення росту. Інші автори [468] відзначають стимулювальну
дію цитокінінів на утворення численних зачатків лусок, але
формування цибулинок відбувається на рідкому середовищі без
цитокінінів. Регенераційна здатнісь лусок цибулини лілії обме-
жена періодом вегетативного росту: вона активніша навесні і
восени. Помічено відмінність у регенерації зовнішніх і внут-
рішніх лусок; останні утворюють більшу кількість регенерантів
[491].
Для звільнення від вірусної інфекції використовують мери-
стематичну тканину розміром 0,2—0,5 мм і культивують у напів-
рідкому середовищі 1.8 з 20—40 г/л цукрози і 0,1 мг/л НОК. До-
давання віразолу у культуральне середовище збільшує кількість
здорових рослин [227].
Отже, при МКР лілії здорові материнські цибулини потрібно
витримувати за температури 2 °С 6 тижнів або при 4 °С — 8 тиж-
нів.
Стерилізація вихідного матеріалу, видаляють верхні луски,
промивають проточною, потім теплою мильною водою; занурю-
ють у 95%-й етанол на 1,5 хв, потім у 0,5%-й гіпохлорит натрію
на 20 хв; промивають у 3 порціях стерильної дистильованої води
протягом 20 хв.
107
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Рис. 5. Схема мікроклонального розмноження лілій
Вичленування експланта: базальну частину зовнішніх і внут-
рішніх лусок розрізають на сегменти розміром 1x1 см.
Умови культивування: культивують на живильному середо-
вищі М8 з 1 мг/л БАП і 3 мг/л НОК або Ь8 з 0,03 мг/л НОК,
перші 6 тижнів — у темряві при 25 °С, потім за освітлення
1,6 клк і фотоперіоду 16 год.
108
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Вже за 4 тижні культивування на
експлантах утворюються листки, ци-
булинки, які можна субкультивувати.
Підвищення температури до ЗО °С
сприяє утворенню більшої кількості
цибулинок. Тривалість культивування
тканин при 25 °С — 112—120 діб, при
ЗО °С - 90-95 діб [461]. Запро-
понована ще й така схема МКР лілій
[468]. Материнські цибулини перед
введенням у культуру витримують при
5 °С. Луски розрізають на сегменти і
культивують на середовищі М8 з
0,1 мг/л НОК і 10 мг/л кінетину за
постійного освітлення і температури
25 °С. Адвентивні луски формуються
протягом 60 діб; їх субкультивують на
рідкому середовищі М8 з 0,1 мг/л
НОК, 90 г/л цукрози і 5 г/л активо-
ваного вугілля, що сприяє утворенню
цибулинок. Кожні 15—20 діб маса ци-
булин-регенерантів подвоюється. їх
слід відділяти і культивувати на сві-
жому живильному середовищі з
10 мг/л кінетину. Конгломерати ци-
булинок, що утворюються, придатні для пересадки у субстрат.
Теоретично від однієї цибулини лілії можна отримати до 2000
рослин-регенерантів [436] (рис. 5).
Пересадка в субстрат: цибулини різних сортів лілії (Еіііиш
аигаіит, Ь. кресіокит, Ь. іогтоіопці, Ь. Іоп^іЙогит), отриманих
при МКР, мають триваліший період спокою, ніж ті, що виросли
в полі. Для переривання стану спокою цибулинки-регенеранти
слід зберігати при 5 °С протягом 70—120 діб. Можна також утри-
мувати цибулинки у вологому сфагновому моху упродовж 5 тиж-
нів при 4 °С, а потім пересадити у вермикуліт [461] або освітлю-
вати цибулинки червоними флуоресцентними лампами по 16 год
протягом 2 тижнів. Це сприяє подальшому росту і формуванню
листків.
Після пересадки у ґрунт регенеранти Ь. ІопфГІошт добре
росли і зацвітали через рік; цвітіння Ь. аигаГит, Ь. кресіошт по-
чиналось через 2—3 роки.
109
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Тюльпан (Тиііра)
Унаслідок тривалої селекційної роботи отримано велику кіль-
кість високодекоративних сортів тюльпанів різного забарвлення і
форми. Проте вірусні хвороби, що часто вражають рослини,
призводять до втрати сортових ознак і знижують декоративність
квітів.
Тюльпани, як і інші однодольні рослини, досить важко вве-
сти в культуру іп уііго, та досліди багатьох авторів довели мож-
ливість МКР тюльпанів як внаслідок прямого органогенезу, так і
через калус [92, 103, 227].
Для культивування використовували різні тканини цибулини
тюльпана: луски з частиною денця, пазушні бруньки, квітконоси.
Із цибулини, що почала проростати, вичленовували пазушні
бруньки (3—5 мм) і культивували їх на середовищі М8 з 0,12 мг/л
НОК і 4 мг/л БАП, внаслідок чого утворювались численні ад-
вентивні і пазушні пагони [519].
Взимку (з січня по березень) можна використовувати луски
дочірніх цибулин. У стерильних умовах відділяли від денця З зов-
нішні луски, кожну розрізали на дві частини і розміщували на
середовищі М8 з вітамінами за Морелем, 40 г/л глюкози,
0,1 мг/л НОК і БАП. Експланти культивували при 23 °С і ос-
вітленні 1500 лк (фотоперіод 16 год). За кілька тижнів на екс-
плантах формувалися бруньки, які після утворення 2—3 лусок
переносили на те ж середовище без фітогормонів і культивували
при 5 °С протягом 2 міс для індукції утворення цибулин. По-
дальше формування цибулин відбувалося при 23 °С, після чого
цибулини висаджували у субстрат. Морфогенетична активність
експлантів тюльпана залежить від фізіологічного стану материн-
ської рослини. Мінімальний органогенез спостерігається у екс-
плантів, що ізольовані в період спокою (червень—липень), а мак-
симальний — у період виходу зі стану спокою і активізації росту
й розвитку (жовтень—березень) (цит. за: [44]).
Подібна здатність до регенерації помічена і для тюльпанів
Альберта і Грейга (ендеміків природної флори Казахстану): дуже
низька в період літнього спокою і найбільш активна взимку і під
час весняного росту [85]. Калусна тканина, що утворюється на
експлантах лусок, сегментах денця і квітконосі тюльпана на се-
редовищі М8 з 5 мг/л НОК і 1 мг/л БАП при 20—25 °С, не ви-
являла здатності до морфогєнезу. Для індукції органогенезу ка-
лус слід перенести в умови зниженої температури (4 °С) на
110
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
2 міс, а потім знову культивувати при 20—25 °С на світлі. Така
переміна температур сприяє утворенню адвентивних пагонів, ци-
булинок і коренів.
Висока морфогенна активність властива тканині квіткового
пагона. Маточні цибулини тюльпана зберігають при 17 °С, про-
тягом 6 тижнів витримують при 5 °С, висаджують у суміш торфу
і гравію і тримають 3 тижні при 5 °С, потім при 9 °С — 1 тиж-
день, при 13 °С — 1 тиждень, а опісля — при 17 °С до початку
цвітіння.
Як експланти використовують зачаткові квіткові пагони і час-
тини квітконоса. Квітконос завдовжки 25 мм розділяють на сег-
менти завтовшки до 1—2 мм, культивують на середовищі М8 з
500 мг/л гідролізату казеїну, 1 мг/л БАП і НОК 7—16 тижнів при
20 °С. Для стимулювання процесу формування цибулин пагони,
що утворилися, витримують протягом 8—10 тижнів при 4 °С, а
потім 12 тижнів при 20 °С.
Здатність експлантів квіткових пагонів до регенерації зале-
жить від стадії розвитку цибулини, складу живильного середови-
ща і місця розміщення. Пагони утворювалися лише з тканин не-
дозрілих квітконосів, з початком активного росту цибулин мор-
фогенна здатність експлантів втрачається. Експланти, видалені з
проксимального кінця квітконоса, що містять тканини вузла,
формують більше пагонів, ніж вичленовані безпосередньо під
квіткою.
Гістологічні дослідження показали, що адвентивні пагони
формуються із шару епідермальних клітин, які починають актив-
но ділитися через 5—6 тижнів культивування; пагони з’являють-
ся ще за 2 тижні, а через 14—16 тижнів біля основи пагонів ут-
ворюються цибулинки [519, 521].
Для активізації формування цибулин пагони слід перенести
на середовище з 1,0 мг/л гіберелової кислоти або 1,0 мг/л гібе-
релової кислоти-3 (ГК3) і витримувати при 4 °С протягом 8—
10 тижнів. Процес посилюється, якщо після холодної обробки
температуру підвищували до 25 °С і збільшували концентрацію
цукрози у живильному середовищі до 40—50 %. Можна також
замочувати пагони у розчині 1,0 мг/л ГК3 і фосфатному буфері
(рН 6,1) протягом 15—20 год [215].
Нижче наводимо схему МКР тюльпана, що складена на ос-
нові літературних даних.
Стерилізація вихідного матеріалу, з цибулини видаляють сухі
та пошкоджені луски і зрізають зовнішню частину денця; про-
111
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
мивають проточною водою 1,5—2 год, потім мильною теплою
водою; занурюють у розчин перманганату калію (інтенсивно-
рожевий) на ЗО хв, потім у 1%-й розчин гіпохлориту кальцію на
15 хв; споліскують стерильною дистильованою водою 10 хв; за-
нурюють у 0,2%-й діацид на 2 хв і промивають у 4 порціях сте-
рильної дистильованої води.
Вичленування експланта: цибулину звільняють від лусок, від-
кривають бруньки, шо містяться в їх основі, вирізають бруньку і
під мікроскопом знімають покривні луски. Вичленовують мери-
стему розміром 0,2—0,5 мм і переносять на поверхню живиль-
ного середовища. У цибулин першого розбору вичленовують по
4—5 бруньок. Квітконоси розрізають на сегменти 1—2 мм.
Умови культивування: використовують середовище М8 з
1000 мг/л гідролізату казеїну, 1,5 — ІОК, 0,5 мг/л кінетину,
0,7 % агару, рН 5,8. Для розмноження отриманих структур тка-
нини субкультивують на тому ж середовищі з 2,5 мг/л БАП і
1 мг/л НОК. За 4 тижні починається утворення пагонів. Індукція
цибулин відбувається після пересадки пагонів на 1/2 концентра-
ції середовища М8 без регуляторів росту при 4 °С, освітленні
1 клк протягом 100—120 діб.
Пересадка в субстрат: цибулинку виймають з пробірки, звіль-
няють від залишків агару і висаджують у субстрат із торфу і
перліту (1:1); посудину накривають склянкою для збереження
вологи. Протягом 2 міс цибулина тюльпана збільшується у роз-
мірах, але пагін не розвивається; її слід зберігати у зволоженому
субстраті до висадки у грунт.
ОРХІДНІ (ОгсШасеае Зивв)
Перспективним методом масового розмноження орхідей є
культура іп уііго, шо широко використовується для насінного і
клонального розмноження. Застосування цих методів сприяло то-
му, шо у багатьох країнах орхідеї вважають більш економічними,
ніж інші декоративні рослини.
Метод насінного розмноження орхідей, розроблений Б. Кписі-
8оп [306], стимулював дослідження по гібридизації і розмножен-
ню орхідей.
У нашій країні метод був удосконалений і вперше вико-
ристаний для розмноження орхідей природної флори і тропіч-
них декоративних видів у Національному ботанічному саду
ім. М.М. Гришка НАН України [56, 68]. Багаторічні дослідження
112
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Рис. 6. Плід цимбідіума з насінням
дали нам змогу вивчити особливості проростання насіння і росту
сіянців більш ніж 140 видів, форм і сортів епіфітних і наземних
орхідей.
Наявність великої кількості насіння (до 3—6 мян у плоді)
(рис. 6) засвідчує величезні потенційні можливості рослин, але,
як показали дослідження ]415], відновлення орхідних насінням
утруднене; навіть у природних умовах під впливом симбіотичних
грибів їх проростає близько 5 %. Насіння орхідей дуже дрібне
(завдовжки 0,25—1,5 мм). Гіфи гриба потрапляють у насінину
через отвір на халазальному кінці і заповнюють клітини зародка.
Після інфікування у клітинах зародка крохмаль перетворюється
на цукор, збільшується осмотичний тиск, що і зумовлює пророс-
тання насіння. Розроблено методику пророщування насіння
орхідей на живильних середовищах за наявності симбіотичних
грибів. Проте широкого застосування на практиці цей метод не
набув у зв’язку із труднощами виділення і культивування гриба
та складностями інфікування насіння.
Виявлено [175], що лише 25 % грибів, ізольованих з євро-
пейських наземних орхідей, є ефективними симбіонтами. Дія
гриба на насіння орхідей полягає у зміні концентрації клітинно-
го соку, що зумовлює його проростання. Це дало змогу Ь. Кпші-
хоп [306] розробити методику асимбіотичного пророщування
8 — 6-83
113
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
насіння орхідей. Він застосовував мінеральні живильні середо-
вища з додаванням цукрози і довів, що чимало видів орхідей
можуть рости в асептичних умовах. Це відкриття сприяло масо-
вому розмноженню орхідей, стимулювало досліди з гібридизації і
спричинило впровадження орхідей у промислове квітникарство
багатьох країн.
Незважаючи на великий набутий досвід, продовжуються ро-
боти з вдосконалення методу і вивчення особливостей пророс-
тання насіння, росту сіянців різних видів орхідних [56, 68, 353,
403, 474, 478]. Спираючись на метод Кнудсона, численні дослід-
ники і практики поліпшують живильне середовище, аби присто-
сувати його до вимог окремих видів орхідей: епіфітних, назем-
них, сапрофітних. Додавання до середовища різних рослинних
соків — апельсинового, бананового, ендосперму кокосового го-
ріха та інших — збільшує відсоток проростання насіння. Проте
ці компоненти дорогі й не придатні для промислового квітни-
карства.
Ми розробили модифікацію живильного середовища Кнуд-
сона з додаванням гумату натрію і активованого вугілля [68].
Для більшості наземних і епіфітних видів це середовище є
оптимальним: скорочується термін проростання насіння, зростає
схожість і прискорюється цикл розвитку сіянців. За наявності
фізіологічно активних речовин гумусової природи сіянці повні-
ше використовують елементи мінерального живлення, внаслідок
чого інтенсивніше розвивається асиміляційна поверхня листків,
активізується утворення коренів. Додавання вугілля забезпечує
затемнення середовища і рівномірний розподіл поживних еле-
ментів, сприяє видаленню продуктів метаболізму.
Під час пророщування насіння багатьох видів орхідей за-
стосовують також інші середовища: Мореля, Вацина і Вента,
Ардітті.
Для стерилізації насіння орхідей використовують 10%-й роз-
чин хлорного вапна і пергідроль. Насіння стерилізують у боксі у
спеціальних мішечках із цупкої тканини або батисту. їх занурю-
ють у склянки із стерилізаційним розчином на 15—20 хв, 3—4 ра-
зи промивають стерильною дистильованою водою і просушують
між аркушами стерильного фільтрувального паперу. У разі силь-
ного забруднення насіння режим стерилізації посилюють: зану-
рюють мішечки з насінням у слабкий розчин перманганату
калію (5 хв), 70%-й етанол (2 хв), 10%-й розчин хлорного вапна
(20 хв) і 20%-й пероксид водню (5—7 хв).
114
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
За наявності насіння власної репродукції використовують
цілі достиглі коробочки. Після поверхневої обробки у спирті
(1 хв) і хлорному вапні (15 хв) коробочки розкривають і насіння
розсіюють на поверхню живильного середовища.
Культивують насіння при 20—25 °С, але деякі види можуть
проростати і при 6—40 °С [113, 114]. Інші види потребують
періоду низьких температур (4—5 °С) протягом 10—12 тижнів.
Це стимулює ріст пагонів і туберидіїв [459].
Для пророщування насіння використовують різні режими ос-
вітлення — від повної темряви до 2000 лк. Виявлено, шо швид-
кість розвитку рослин значно збільшується в кліматичній камері
за освітлення 10—12 тис. лк, температури 25—26 °С і відносної
вологості повітря 70—75 %. Вирощування у факторостатних ка-
мерах дає змогу у 1,5—2 рази скоротити термін культивування і
збільшити кількість сильно розвинутих рослин.
Ми вирощували сіянці за природного освітлення або на сте-
лажах із підсвічуванням флуоресцентними лампами інтенсивніс-
тю 2000 лк і фотоперіодом 12—14 год при 24—26 °С.
Проростання насіння різних видів орхідей відбувається з
різною швидкістю і супроводжується утворенням структур, одна-
кових для багатьох видів. Спочатку насіння бубнявіє: змінюється
його колір і збільшується розмір; у більшості видів ці зміни по-
мітні через місяць після посіву. Потім формуються протокорми,
базальна частина яких вкрита всмоктувальними волосками (ри-
зоїдами). На апікальній частині відбувається диференціація лист-
ків, з’являється перший корінь (рис. 7).
Характерною особливістю орхідних є брунькування прото-
корма, що сприяє утворенню з однієї насінини численних струк-
тур, протокормів, бруньок. Важливою причиною цього явища
може бути поліембріонія. Додаткові зародки виникають унаслі-
док регенераційних процесів у зіготах або можуть диференціюва-
тись з епідермальних клітин первинного протокорма під дією
хімічних речовин живильного середовища (або грибів у природ-
них умовах).
Структури, що утворюються, можна регулярно відділяти і пе-
реносити на свіже середовище, тим самим збільшуючи кількість
рослин-регенерантів.
Цикл розвитку сіянців різних видів орхідей досить тривалий.
Формування рослин у більшості досліджених нами видів триває
170—200 діб, через 300—500 діб сіянці багатьох орхідей готові до
пересадки у субстрат.
8»
115
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
г
Рис. 7. Протокорми різних видів орхідей:
а — РарЬіорссЧІит Іопядт; б — СаНІеуа Ьоигіп^іапа; в — БепсігоЬіит Кіпвіапит; г —
ОепсігоЬіит рйаіаепоркіь
Так, насіння СутЬідіит НуЬгісіїїгп починає проростати на 16—
30-ту добу, свіже насіння власної репродукції — на 7—10-ту. По-
тім з’являються ризоїди, листки, корені; рослина формується в
середньому за 150—170 діб. Через 10 міс сіянці цимбідіума готові
116
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
д
Рис. 8. Етапи проростання насіння і ріст сіянців цимбіліума:
а — насінина; б — утворення протокорма; в — розростання протокорма, поява всмок-
тувальних волосків; г — формування листка; д — утворення рослини; е — сіянець,
придатний до пересадки у субстрат
117
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Рис. 9. Сіянці різних видів орхідей перед висадкою в субстрат
до пересадки у субстрат (рис. 8). Дуже короткий період утворен-
ня рослин у Ерібепсігит габісапя: насіння власної репродукції
проростає на 5—7-му добу, а через 190 діб сіянці епідендрума
можна висаджувати у субстрат.
Значні труднощі виникають під час пророщування насіння
орхідей природної флори. Як показали наші дослідження, дуже
часто насіння цих видів не має зародка. Період проростання
насіння (Огсіїік іїкса, О. тогіо, ПасїуІогсЬіга іпсагпаіа, Сургіребі-
ит саісеоіик) триває 80—100 діб, його схожість низька (1—2 %).
Розвиток сіянців триває 1,5—2 роки [56, 254].
У субстрат висаджують рослини з добре розвинутою корене-
вою системою і 3—4 листками (рис. 9). Сіянці обережно вийма-
ють із колб, відмивають теплою водою від залишків агару і пе-
реносять у субстрат із сфагнового моху, соснової кори, листків
дуба і берези. Найсприятливіший час для пересадки — весна і
початок літа.
Клональне розмноження орхідних
При насінному розмноженні гібридів орхідних внаслідок їх
складної гетерозиготної природи часто відбувається розщеплен-
ня сортових ознак. Тому метод МКР, розроблений С. Могеї
[357—359], широко застосовується на практиці. Він дослідив мож-
ливість отримання вільних від вірусів рослин орхідей і виявив,
що експлант апекса цимбідіума на живильному середовищі про-
ходив стадії, на яких відбувалась диференціація протокорма, по-
118
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
дібного до того, що утворюється під час проростання насіння.
Протокорм можна розділяти на частини, які за повторного куль-
тивування утворюють масу протокормоподібних структур. Поділ
і субкультивування протокормів можна повторювати кілька ра-
зів; їх морфогенетичні потенції реалізуються індукцією адвен-
тивних бруньок і пагонів. Кожна з цих структур може бути ви-
хідним матеріалом для клонування, що створює необмежені мож-
ливості розмноження і отримання потрібної кількості рослин
[56, 425].
Технологія МКР продовжує удосконалюватися. На цей час
розроблено методи розмноження більше 20 видів, сортів і форм
орхідних [56, 227, 256]. Це головним чином симподіальні орхідеї,
у яких основа апекса перестає ділитися і бокова меристема утво-
рює нову бруньку, що займає положення верхівкової. Моно-
подіальні орхідеї важче ввести в культуру, бо їх меристеми мають
іншу структуру і їх ріст у довжину не припиняється.
Для МКР використовують різні органи орхідей: апікальні і
латеральні бруньки молодих пагонів, туберидіїв (що ростуть або
уже відмирають), бруньки квітконосів, тканини основ і кінчиків
молодих листків. Ріст тканин орхідних в умовах іп уііго має деякі
особливості.
Прямий органогенез, тобто регенерація рослин безпосеред-
ньо з тканини експланта (без утворення протокормів), найчасті-
ше відбувається при культивуванні бруньок у стадії спокою з
відмираючого туберидію або квітконоса. Це явище помічено і
при культивуванні апікальних і латеральних бруньок катлеї, що
гарантує генетичну ідентичність материнським формам.
Морфогенетичні потенції експлантів реалізуються переважно
утворенням протокормів, адвентивних бруньок і пагонів [56, 114,
359, 459].
Технологія МКР орхідей складається з декількох етапів. На
1 етапі введення експланта в культуру потрібно забезпечити його
стерильність і приживлюваність на середовищі. Від отримання
первинної культури залежить подальший успіх клонування. Важ-
ливим фактором успішного культивування ізольованих тканин
орхідних є живильне середовище, яке містить збалансовану кіль-
кість макро- і мікроелементів, вуглеводи, вітаміни, регулятори
росту, амінокислоти. На цей час запропоновано більше ЗО про-
писів живильних середовищ (див. вище). Для проліферації про-
токормів рекомендують використовувати рідке середовище, для
індукції органогенезу — агаризоване. Проте, як показали наші
119
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
дослідження, дуже часто утворення протокормів і регенерація
рослин відбуваються на одному середовищі. Для багатьох видів
орхідних універсальним може бути середовище М8 з додаванням
регуляторів росту.
На процес МКР орхідей впливають генотип материнської рос-
лини і пора року, коли вичленовується експлант. Найкращий
ріст протокормів і морфогенез рослин спостерігаються навесні. Ве-
лике значення має вік інтактної рослини: експланти, вичленовані
з молодих рослин або сіянців, інтенсивніше проліферують про-
токорми і пагони. На виживаність експланта впливає і його роз-
мір. Для масового розмноження використовують експланти апек-
сів 0,1—0,5 см, а для звільнення від вірусної інфекції — 0,1 —
0,5 мм. Регенерація рослин з таких експлантів відбувається по-
вільно і вони часто гинуть.
Метою II етапу є швидке збільшення отриманих протокор-
мів, що можна досягти їх діленням і субкультивуванням, індук-
цією численних адвентивних бруньок і пагонів. Для досягнення
успіху на цьому етапі вирішальне значення має склад живиль-
ного середовища з додаванням речовин, що посилюють утворен-
ня протокормів і органогенез. Зазвичай використовують середо-
вища Кнудсона, Мореля, М8, Вацина і Вента з додаванням віта-
мінів і регуляторів росту. Морфогенетичні реакції експланта за-
лежать від співвідношення ауксинів і цитокінінів у живильному
середовищі. Високі концентрації ауксинів сприяють утворенню
коренів, але пригнічують морфогенез пагонів. Збільшення цито-
кінінів активізує появу пагонів і пригнічує утворення коренів.
Лише збалансоване співвідношення цих речовин сприяє нормаль-
ному розвитку рослин [213].
Умови III етапу мають відповідати спеціальним фізіологічним
потребам видів, що розмножуються. На цьому етапі рослини-ре-
генеранти готують до пересадки у субстрат: їх укорінюють, пере-
носять на середовище без вуглеводів для успішного переходу на
автотрофне живлення. Для цього збільшують інтенсивність освіт-
лення до 5—8 тис. клк, фотоперіод — до 14—16 год. Температур-
ний режим має відповідати умовам природного середовища виду.
Наводимо схеми (протоколи) МКР орхідних, які ми викори-
стовували у своїй практиці залежно від вихідного рослинного
матеріалу.
Молодий вегетативний пагін із нерозкритими листками (З—
5 см завдовжки) використовують для видів Апасатрііх, Агапсіа,
Агшкііпа, ВгакхосаШеуа, Сайіеуа, СутЬісІшт, ВасІуІогсЬік, Оеп-
120
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
дгоЬіит, Ерібепсігит, РарЬіоресІіІит, РЬаІаепоркік, Ріеіопе, КЬуп-
сЬокіуІік, Уапсіа, а також апекси термінальної і латеральних бру-
ньок [323, 341, 530].
Стерилізація вихідного матеріалу, з пагона видаляють 2—
З покривних листки, промивають проточною водою; занурюють
у 10%-й розчин гіпохлориту кальцію або натрію на 10 хв; споліс-
кують стерильною дистильованою водою; видаляють решту лист-
ків і переносять у 5%-й розчин гіпохлориту кальцію або 10%-й
пероксид водню на 10 хв; промивають у 2—3 порціях стерильної
дистильованої води.
Вичленування експланта'. обережно відділяють покривні лус-
ки, вичленовують куб 2—5 мм3, шо містить апекс із 2—3 листко-
вими примордіями і тканиною під ними. При вичленуванні
апекса катлеї слід залишати декілька листкових лусок, що по-
кривають апікальну меристему, аби не пошкодити її. Розмір екс-
планта має бути 5—6 мм3, бо менші експланти гинуть.
Умови культивування', первинні експланти культивують у рід-
кому середовиші на ролері або на поверхні агаризованого сере-
довища. Також використовують рідке середовище Вацина і Вен-
та з 15 % (за об’ємом) ендосперму кокосового горіха або 20 %
картопляного екстракту, агаризовані середовища Кнудсона С,
Ліндемана, М8.
Під час введення в культуру апексів фаленопсиса до живиль-
ного середовища слід додавати 1—2 г активованого вугілля для
адсорбції фенольних сполук. Для запобігання відмиранню екс-
планта можна також використовувати рідке середовище Вацина і
Вента, яке потрібно замінювати кожні 10 діб. Через місяць екс-
планти переносять на тверде середовище.
Культивують при 25—28 °С, освітленні 1—3 клк, фотоперіоді
12—16 год. Проліферація протокормів деяких видів (катлея, ден-
дробіум, цимбідіум) (рис. 10) починається за 4—6 тижнів, у
інших (аранда, фаленопсис, плейоне) — за 6—8 тижнів. Прото-
корми збільшуються у розмірах, розростаються, вкриваються ри-
зоїдами. У цей час їх слід ділити і переносити на свіже живильне
середовище, де протягом 6—7 тижнів з’являються пагони і коре-
ні. Рослини, що утворились, відділяють, а протокорми продов-
жують кл снувати.
Пагін, що вегетує, та зелений туберидій використовують для
видів СаШеуа, СутЬідіит, ОепсІгоЬіит, РЬаІаепоркік, ТЬипіа.
Стерилізація вихідного матеріалу, видаляють листки, довгі па-
гони розрізають на частини з 2—3 вузлами; промивають проточ-
121
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Рис. 10. Проліферація протокормів на
експланті цимбідіума
Рис. 11. Органогенез пагонів і ко-
ренів на протокормах цимбідіума
ною, потім мильною водою; занурюють у 70%-й етанол на 1 —
1,5 хв; споліскують стерильною дистильованою водою; кладуть у
5%-й розчин гіпохлориту кальцію або 10%-й пероксид водню на
10 хв; промивають у 3 порціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта'. у симподіальних орхідей терміналь-
на брунька редукована, тому використовують латеральні брунь-
ки в пазухах листків і біля основи туберидію. Відділяють по-
кривні луски і вичленовують куб (3—5 мм3), що містить апекс з
2—3 примордіями і тканиною під ними. У апексів катлеї зали-
шають 3—4 листкових примордія і вичленовують експлант
розміром 5—6 мм3.
Умови культивування', культивують експланти у рідкому сере-
довищі на ролері або на поверхні агаризованого середовища при
25—28 °С, освітленні 1—3 клк і фотоперіоді 12—16 год.
Залежно від експланта і складу живильного середовища фор-
мування протокормів починається через 4—8 тижнів (рис. 11).
Кожні 4 тижні агрегати протокормів можна розділяти і субкуль-
тивувати. Часто на протокормах утворюються адвентивні пагони,
які відділяють і пересаджують на середовище для укорінення з
пониженим вмістом цукрози (до 5 г/л).
122
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Пагони і туберидії, що закінчили вегетацію і відмирають, вико-
ристовують для розмноження ВепбгоЬіит, Ріїаіаепоркік, СутЬкіі-
ит, Тіїипіа.
Застосування резервних бруньок туберидіїв і пагонів, що за-
кінчили вегетацію, дає змогу використати потенційні можливості
відтворення орхідних без шкоди для материнської рослини. За-
звичай на добре розвинутому туберидії цимбідіума 4—6 бруньок
перебуває у стані спокою, у дендробіума фаленопсисовидного —
7—8, у тунії Маршалла — 15—20. Ці бруньки лишаються резерв-
ними і відмирають разом із материнською рослиною; їх морфо-
генетичний потенціал залежить від розміщення на туберидії.
Бруньки нижнього ярусу дендробіума фаленопсисовидного добре
диференційовані і мають великий морфогенний потенціал, брунь-
ки середнього — редуковані, а у бруньок верхньої частини паго-
на морфогенетична здатність слабка. У тунії Маршалла, як пра-
вило, бруньки нижньої і центральної частин пагона крупніші,
більш диференційовані і морфогенез у них відбувається швидше,
ніж у бруньок верхнього ярусу.
Введення в культуру сплячих бруньок туберидію пов’язано з
труднощами отримання стерильного матеріалу, тому застосову-
ють посилений режим стерилізації.
Стерилізація вихідного матеріалу, видаляють сухі листки,
довгі пагони розрізають на частини з 2—3 вузлами; промивають
проточною водою ЗО—40 хв; миють щіткою в теплій воді з ми-
лом; споліскують стерильною дистильованою водою; занурю-
ють у 70%-й етанол на 2—3 хв, промивають стерильною дисти-
льованою водою і опускають у розчин ртутного препарату:
0,1%-ну сулему, 0,1 %-й діацид або фамосепт на 20—25 хв; по-
тім промивають у 3 порціях стерильної дистильованої води і
кладуть у 10%-й розчин гіпохлориту натрію або кальцію на 20 хв;
промивають стерильною дистильованою водою і занурюють у
10%-й пероксид водню; ретельно споліскують стерильною дис-
тильованою водою.
Вичленування експланта'. вирізають пазушну бруньку із части-
ною тканини під нею, відділяють покривні луски і кладуть екс-
плант на живильне середовище.
Умови культивування', використовують одне з живильних се-
редовищ — модифіковане середовище Кнопа з транскоричною
кислотою (1,5—14,8 мг/л), Вацина і Вента з 15 % ендосперму ко-
косового горіха, М8, Гамборга, Шенка. Культивують за освіт-
лення 1—3 клк, фотоперіоду 16 год і температури 22—25 °С.
123
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Бруньки квітконосів використовують для видів АзсоГіпеІіа,
ОепсІгоЬіит ріїаіаепорзіз, СутЬісІіит, №ео8ії!І8, Опсісііит, РЬаІае-
порзіз. Моноподіальний характер росту багатьох видів орхідей
утруднює їх клонування. Реальною можливістю збільшити коефі-
цієнт розмноження цих орхідей є використання сегментів квіт-
коноса з пазушними бруньками (302, 469].
Більшість орхідей має китице- або колосоподібне суцвіття; як
правило, бруньки базальної частини квітконоса здатні до регене-
рації. Використовують здорові сильні квітконоси після розпус-
кання першої квітки.
Стерилізація вихідного матеріалу, відрізають квітконос, вида-
ляють квітки і бутони, розрізають на частини з 2—3 бруньками;
промивають проточною і теплою мильною водою; занурюють у
70%-й етанол на 45—60 хв; споліскують стерильною дистильова-
ною водою; переносять у 10%-й розчин гіпохлориту натрію або
кальцію на 10—15 хв; промивають стерильною дистильованою
водою.
Вичленування експланта-. квітконос розрізають на частини з
однією брунькою, видаляють покривні луски. Для стимуляції
проліферації численних протокормів бруньку пошкоджують гол-
кою. Розміщують відрізок квітконоса вертикально в агаризоване
середовище; можна відділити бруньку з частиною тканини і по-
класти на поверхню агаризованого або в рідке середовище.
Умови культивування-, для первинної культури аскофінетії ви-
користовують рідке середовище Вацина і Вента з 15 % кокосо-
вого молока [114]. Протягом 3—7 тижнів відбувається проліфе-
рація протокормів, які надалі субкультивують на агаризовано-
му середовищі Вацина і Вента з 20 % картопляного відвару без
цукрози.
Бруньки квітконосів цимбідіума культивують на середовищі
М8 з 10,0 ммоль БАП і 0,5 ммоль НОК, для субкультивування
протокормів і регенерації рослин оптимальним є середовище з
1,0 ммоль кінетину, 10,0 — НОК або 1,0 ммоль БАП і 5,0 — НОК.
Для культивування бруньок квітконосів фаленопсиса, дендро-
біума фаленопсисовидного, ванди, онцидіума можна використо-
вувати середовища М8, Кнопа (з 1—2 мг/л БАП і 0,5—3,0 мг/л
НОК), Вацина і Вента.
Проліферація протокормів починається через 6—8 тижнів.
Пошкодження бруньки і додавання до живильного середовища
гідролізату казеїну (500 мг/л), кінетину (50 мг/л), НОК (3 мг/л)
сприяє утворенню численних протокормів, адвентивних бруньок
124
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
і пагонів. Багаторазовий поділ і субкультивування цих структур
забезпечує потрібну кількість рослин.
Часто квіткові бруньки регенерують одиничну рослину, яку
відокремлюють і укорінюють на середовищі М8 з 0,3 мг/л ІОК.
Листки рослин-регенерантів можна використати для МКР.
Культивують експланти при 20—25 °С, освітленні 1—2 клк,
фотоперіоді 16 год.
Листки використовують для видів ОепсІгоЬіит рйаіаепоркік,
РЬаІаепорзік, Сайіеуа, Баеііа, Рарйіоресіііит, Уапсіа.
Як показала практика вегетативного розмноження, у багатьох
рослин лист є самодостатнім органом з численними клітинами,
що мають меристематичну активність. Особливо активні мери-
стеми піхви і кінчика листка. Експланти листків багатьох видів
орхідних в умовах іп уііго здатні до утворення калусу, диференці-
ації адвентивних бруньок, пагонів і коренів. Використання лист-
ків орхідних для МКР не завдає шкоди материнській рослині.
Утворення протокормів у культурі листків деяких видів ор-
хідей уперше виявив Уімбер [114]. Пізніше були опубліковані
праці з МКР багатьох видів орхідей тканиною листка [56, 231,
357, 359].
При розмноженні катлеї ізольованими бруньками С. Могеї
[357] виявив, що апекс здебільшого відмирає, а органогенез від-
бувається на примордіях листків: клітини пазушної меристеми і
середньої частини листка здатні до індукції протокормів. Під час
видалення основ листка на пошкодженій поверхні утворюється
калус, що регенерує адвентивні бруньки і пагони. Морфологічні
зміни експланта помітні через 7—10 діб, проліферація калусу по-
чинається через 15 діб, надалі утворюються протокорми і чис-
ленні пагони.
Подальші дослідження довели можливість МКР різних видів
орхідних ізольованою тканиною листка [274, 501]. Так, на
кінчику листка (2 мм) сіянця епідендрума на рідкому середовищі
М8 з 1 мг/л 2,4-Д і 0,5 мг/л БАП утворюється калус. Адвентивні
пагони формуються у разі перенесення калусу на агаризоване
середовище М8, а корені — на середовищі Кнудсона С.
Експланти молодих листків Кепапіапсіа утворюють калус на
середовищі Вацина і Вента з кокосовим молоком; диференціація
протокормів відбувається на тому ж середовищі без кокосового
молока [231]. У експлантів листка леліокатлеї калус утворюється
на рідкому середовищі Кнудсона С з 2,4-Д, а протокорми — на
агаризованому. Інколи на експлантах листка протокорми і паго-
125
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ни утворюються внаслідок прямого органогенезу. Так, на лист-
ках КепапіКега ііпзсИоІіапа на агаризованому середовищі Прасада
і Мітри з 1 мг/л НОК і 10 мг/л БАП проліферували численні
пагони.
Наводимо методику культивування листків орхідних.
Стерилізація вихідного матеріалу, відділяють молоді, ледь роз-
криті листки (їх краще відривати, аби зберегти піхву); промива-
ють проточною і теплою мильною водою; занурюють у 70%-й
етанол на 20—ЗО с; споліскують стерильною дистильованою во-
дою і кладуть у 10%-й розчин гіпохлориту кальцію або хлораміну
на 10 хв; промивають стерильною дистильованою водою і пере-
носять у 10%-й пероксид водню на 5 хв; споліскують стериль-
ною водою.
Часто використовують молоді листки рослин-регенерантів із
стерильної культури; у цьому разі стерилізація не потрібна.
Вичленування експланта'. листкову пластинку розрізають на
сегменти розміром 1 х 1 см, невеликі листки відривають і розкла-
дають цілими на живильному середовищі.
Умови культивування', використовують середовища Вацина і
Вента, Хеллера, М8. Культивують у темряві або за освітлення
500—800 лк і температури 25—28 °С.
У наших дослідах ізольовані листки дендробіума фаленопси-
совидного на середовищі М8 з 10 мг/л аденіну і різними ком-
бінаціями та концентраціями НОК (0,02—2,0 мг/л) і БАП (0,02—
2,0 мг/л) за 3—4 міс утворюють протокорми, бруньки і пагони
(рис. 12). Оптимальним виявився варіант з 0,5 мг/л НОК і
0,1 мг/л БАП.
Численні протокорми формуються на основах листків сіян-
ців пафіопеділюма при культивуванні на середовищах М8, Ваци-
на і Вента. За 2—3 міс проліферують адвентивні пагони з коре-
нями.
Велику морфогенну активність мають листки сіянців ванди.
На середовищі Вацина і Вента (рідкому) і М8 (агаризованому) в
основі листка через 1,5—2 міс утворюються протокорми, з яких
регенерують численні адвентивні пагони. За рік культивування
кожен листок регенерував до 50—60 пагонів з 2—3 листками і
коренями.
Успішно відбувалась проліферація протокормів на листках
Уапсіа іекїасеае при культивуванні на середовищі Прасада і Міт-
ри з 2 г/л пептону, 1 мг/л НОК і 1 мг/л БАП. Меристематична
активність залежала від віку листка: у молодих листків протокор-
126
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
ми утворювались по всій
поверхні, у старих — лише
на базальних і апікальних
частинах експланта.
Індукція протокормів
у ювенільних листків кат-
леї Боурінга і гібридної від-
бувається досить повільно,
лише через 6—8 тижнів на
основі листка з’являються
округлі зелені протокорми.
Проте надалі численні ад-
вентивні бруньки і пагони
швидко проліферують. На
світлі регенерація прохо-
дить краще, ніж у темряві.
Оптимальним є середови-
ще М8 з 0,3 мг/л НОК і
2 мг/л БАП. На експлан-
Рис. 12. Органогенез пагонів і коренів на
експлантах листка дендробіума
тах утворюються агрегати
з 12—15 протокормів, їх
розділяють і переносять
на свіже живильне середовище. Подальший ріст і проліферація
протокормів відбувається досить швидко, кожні 2—3 тижні про-
токорми можна розділяти. На середовищі з 0,3 мг/л НОК і
1 мг/л БАП з’являються численні адвентивні бруньки і пагони,
їх укорінюють на середовищі без фітогормонів або з 0,3 мг/л
ІОК. Аналогічно утворюються протокорми і відбувається орга-
ногенез у лелії пурпурної (Ьаеііа ригригаіа) на середовищі Кнуд-
сона з 0,3 мг/л НОК і 2 мг/л БАП.
Запропоновано використовувати кінчики молодих листків
дорослої рослини катлеї. Для проліферації протокормів викори-
стовують рідке середовище Хеллера, для органогенезу — агари-
зовані середовища М8, або Кнудсона [114].
Для успішного культивування ізольованих листків фаленоп-
сиса до середовища обов’язково слід додавати 1—2 г активова-
ного вугілля для адсорбції фенольних сполук. Листки краще не
різати, а обережно відривати і цілими розкладати на поверхні
живильного середовища. Оптимальним для проліферації прото-
кормів є середовище М8 з 0,1 мг/л кінетину і НОК, для індукції
адвентивних бруньок і пагонів додають 1 мг/л НОК і 0,1 мг/л
127
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
кінетину. Ювенільні ЛИСТКИ 6-МІСЯЧНИХ рослин КНуПСО8ІІ1І8 геіика
утворювали протокорми за 4—7 тижнів, експланти старих лист-
ків не здатні до проліферації.
Корені використовують для видів ВепбгоЬіит, Ерідепсігит,
Опсісііит, РЬаІаепоркік, Уапіііа. У багатьох видів орхідей повітря-
ні зелені корені здатні до фотосинтезу і часто виконують функ-
цію листків і стебел, тому було зроблено спроби використати їх
як експланти для регенерації рослин [56, 392, 415]. Досягнуто
певних успіхів при культивуванні ізольованих коренів сіянців
фаленопсиса на середовищі Рейнерта і Мора з 1,75 мг/л НОК і
ІМК, 5 мг/л БАП і 1 г/л пептона. С. Агсііііі [114] повідомив про
успішну проліферацію протокормів з подальшою регенерацією
пагонів на ізольованих коренях епідендрума та фаленопсиса.
Корені сіянців гібридів фаленопсиса проліферували калус, а
потім протокорми і рослини на середовищі М8 [469]. Експланти
кінчиків коренів Опсісііит уагісокит на середовищі Вацина і
Вента з додаванням гомогенату банана, активованого вугілля,
0,9 % агару і 20 г/л цукрози росли в довжину; зниження концен-
трації агару і цукрози стимулювало утворення протокормів і па-
гонів. Найкраще використовувати кінчики коренів сіянців у сте-
рильній культурі.
Стерилізація вихідного матеріалу (для дорослих рослин): від-
діляють кінчики повітряних коренів (2—3 см); промивають про-
точною і теплою мильною водою; занурюють у 70%-й етанол на
30—40 с; споліскують стерильною дистильованою водою; опус-
кають у 10%-й гіпохлорит кальцію на 10 хв; промивають стериль-
ною водою; кладуть у 10%-й пероксид водню на 5—8 хв; знову
споліскують стерильною водою.
Вичленування експланта: відрізають кінці коренів 5—10 мм і
розміщують у рідкому або агаризованому живильному середовищі.
Умови культивування-, використовують середовища М8,
Кнудсона С, Рейнерта і Мора, Вацина і Вента. Експланти утри-
мують у темряві або за природного освітлення і температури 22—
25 °С [421].
У наших дослідах проліферація протокормів відбувалась дуже
повільно. Корені довго лишалися зеленими, збільшувались у роз-
мірах; лише через 8—10 тижнів на коренях фаленопсиса і епі-
дендрума почали з’являтися протокорми. Морфогенетичний по-
тенціал коренів дуже низький. Лише 10 % експлантів фаленоп-
сиса утворювали протокорми і адвентивні пагони (рис. 13). Ме-
тод МКР орхідей потребує подальших досліджень.
128
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Рис. 13. Морфогенез на експланті кореня фаленопсиса
Пересадка в субстрат сіянців і регенерантів орхідей вимагає
особливої уваги, бо коренева система рослин має пристосуватись
до умов автотрофного живлення.
Для посадки відбирають рослини з 2—3 коренями і добре роз-
винутими листками. Корені відмивають від залишків агару і ви-
саджують у субстрат із верхового торфу, лісової підстилки, сфаг-
нового моху, деревного вугілля, піску і кори сосни (2:2:2:1:1:1)
або у суміш, що складається з соснової кори, листя дуба чи бе-
рези. Рослини підживлюють раз на ти «день розчином Мура-
шіге—Скуга.
ПАЛЬМОВІ (Агессеае, Раїтае)
Численні види родини пальмових — вічнозелені тропічні
рослини; у наших умовах популярні як декоративні горшкові
культури.
Вегетативне розмноження пальмових живцюванням, поділом,
кореневими паростками доволі обмежене, тому промислове квітни-
карство зацікавлене у розробці надійного методу МКР пальм.
9 -6-83
129
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Перші повідомлення щодо культивування ізольованих тка-
нин різних видів пальм з’явились ще у 1970-х роках [204]. По-
дальші дослідження морфогенетичних потенцій латеральних
бруньок, верхівок пагонів, тканин, листків, ізольованих ембріонів
показали, що експланти потребують ретельної стерилізації, бо
внутрішня контамінація може проявитися після тривалого культи-
вування. Найефективнішим є застосування антибіотиків (0,15 %
стрептоміцину та 0,01 % мертіолату) разом з N3001 [227]. Крім
того, тканини пальм швидко темніють і виділяють у живильне
середовище феноли, тому експланти після вичленування зану-
рюють у розчин лимонної або аскорбінової кислоти, а до живиль-
ного середовища додають 1—3 г/л активованого вугілля і суб-
культивують тканини кожного тижня [227].
МКР пальм відбувається внаслідок різних морфогенних реакцій
експлантів: соматичний ембріогенез, утворення численних адвентив-
них бруньок і пагонів, ембріоїдогенез [369, 383, 498]. У такий спо-
сіб з ембріонального калусу фінікової та олійної пальм отримали
рослини-регенеранти [482, 483]. На сегментах молодих листків (зав-
товшки 0,25 мм) 2-річних сіянців кокосової пальми індукували со-
матичний ембріогенез на середовищі М8 з 5 • 10"6 моль БАП і 2-іР,
10" моль 2,4 Д і 2,5 г/л активованого вугілля при культивуванні в
темряві при ЗО °С. Утворення меристемоїдної тканини відбувалося
на середовищі зі зниженою концентрацією 2,4-Д (10“7 моль) [383].
Експланти основи молодих листків 6-місячних рослин олійної
пальми на середовищі М8 з 50—70 мг/л 2,4-Д утворювали калус.
Для індукції ембріогенезу застосовували 1/2 концентрації середо-
вища М8 з 170 мг/л КаН2РО4, 10,0 — 2,4-Д, 0,01 мг/л 2-іР, 1 г/л
гідролізату казеїну і 0,5 г активованого вугілля. Вже за тиждень
культивування відбувалась проліферація ембріоїдів, з яких утворю-
вались пагони. їх укорінювали на середовищі з НОК і гіберело-
вою кислотою і переносили у посудини зі стерильним ґрунтом.
Детально розроблено методику МКР фінікової пальми з різ-
них органів дорослої рослини, пагонів і сіянців [482, 483].
Вичленування експланта'. гострим ножем відділяють пагін або
сіянець, видаляють листки, розкривають пазушні бруньки біля
основи кожного листка, а з термінального пагону відрізають вер-
хівку. Бруньки і верхівки пагона переносять у розчин антиокси-
данта (150 мг/л лимонної кислоти). Потім відділяють зовнішні
листки на бруньках і вичленовують експланти розміром 0,5 см2.
Стерилізація матеріалу, експланти занурюють у 2,6%-й роз-
чин гіпохлориту натрію з І краплею твій 20 (на 100 мл розчину)
130
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
на 15 хв, тричі промивають у стерильній дистильованій воді.
Стерилізацію слід проводити у холодильнику при 0 °С. Надалі
експланти переносять у стерильні чашки Петрі, видаляють при-
мордіальні листки і вичленовують апекси розміром 1—3 мм2.
Для запобігання контамінації їх занурюють на Юсу стерилізу-
ючий розчин і переносять на живильне середовище для індукції
калусу.
Субкультивують експланти кожні 8 тижнів. Уже через 2—
З пасажі помітно проліферацію калусу: білий пухкий вузлуватий
калус розділяють на частини (1 см2) і переносять на середовище
для утворення пагонів.
Умови культивування: температура 28 °С, освітлення 50 лк і фо-
топеріод 16 год. За 2—4 тижні проліферують вегетативні зародки
та з’являються зелені пагони. Аби посилити утворення адвентив-
них коренів, пагони переносять на відповідне середовище і суб-
культивують кожні 8 тижнів, поки паростки підростуть до 10 см.
Пересадка в субстрат: регенеранти з 2—3 листками і добре
розвинутою кореневою системою виймають з колб, відмивають
від залишків агару і занурюють у 0,5%-й розчин бенолату (або
іншого фунгіциду). Висаджують рослини в субстрат із стериль-
ного моху і вермикуліту (1:1). Перші тижні вирощування росли-
ни притіняють, обробляють бенолатом, підживлюють розчином
Хогланда. Культивують при 28 °С, освітленні 80 лк і фотоперіоді
16 год. Поступово рослини акліматизують до умов теплиці і че-
рез 2 міс переносять у звичайні для цього виду пальм умови.
Використання кореневих пагонів
Термінальні і латеральні бруньки кореневих пагонів мають
великий морфогенний потенціал, більший, ніж у дорослих рос-
лин. Кореневий пагін відділяють, зрізають листки, верхівку па-
гона і латеральні бруньки в пазухах листків і занурюють у розчин
антиоксиданта.
Стерилізація вихідного матеріалу: її проводять у холодильни-
ку, як зазначено вище (для попередження потемніння тканини).
Вичленування експланта: апекс 1—3 мм з 2—3 примордіями
занурюють на Юсу стерилізуючий розчин і розміщують на по-
верхні агаризованого середовища для утворення пагонів.
Умови культивування: температура 28 °С, освітлення 500 лк і
фотоперіод 16 год, у кліматичній камері. Протягом 4—6 тижнів
значно збільшується розмір експлантів, утворюються листки.
9*
131
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Кожні 8 тижнів слід переносити експланти на свіже живильне
середовище для запобігання побурінню.
Пересадка тканин на середовище для проліферації пагонів
сприяє утворенню численних додаткових бруньок і пагонів. Отри-
мані структури розділяють і субкультивують багато разів протягом
наступних 8—10 тижнів. Укорінюють пагони на середовищі з
0,1 мг/л НОК. Рослини-регенеранти переносять у субстрат, як
наведено вище, і культивують у кліматичній камері. За 2 міс рос-
лини переносять у теплицю і вирощують згідно з вимогами виду.
Наведену методику використовували для отримання регене-
рантів РНоепіх басіуІіГега, Р. гесііпаїа, Р. сапагіепкік, Р. рикіїїа,
Р. 8уІ¥Є8ігІ8, Егуїек агтаіа |482, 483].
Молоді тканини, що продукують ембріогенний калус, здатні
до морфогенезу латеральних бруньок і пагонів. Старі тканини і
органи не проліферують калус і мають обмежений морфогенез.
Так, дорослі листки і квіткові бруньки утворюють калус, що про-
дукує лише корені. Кожен невеликий відрізок ембріогенного ка-
лусу фінікової пальми містить тисячі проембріо. Пересадка тако
го калусу на середовище без гормонів сприяє росту вегетативних
ембріоїдів і проростків протягом кількох тижнів культивування.
Регенеранти, отримані внаслідок прямого органогенезу з ла-
теральних і термінальних бруньок, мають менше генетичних абе-
рацій, ніж із калусу.
СКЛАДНОЦВІТІ (Согпрозіїае, Азіегасеае)
Рослини родини складноцвітих — гербери, хризантеми, айст-
ри, жоржини — досить поширені у промисловому квітникарстві і
методи їх МКР здавна привертають увагу дослідників і практиків.
Гербера (СегЬега іатегопіі)
Гербсру широко використовують у квітникарстві багатьох країн
завдяки високодекоративним сортам з яскравим забарвленням і
різноманітною формою. Площі, що займає ця культура, безперерв-
но зростають, тому існує велика потреба в якісному посадковому
матеріалі. Застосування методу МКР гербери дає змогу значно
прискорити селекційний процес (2—3 роки замість 8—10) і отри
мати потрібну кількість рослин регенерантів (до 1 млн за рік) [364].
Для клонування використовують апікальні меристеми [15] та
квіткові бутони [317]. Метод культури апікальних меристем ма-
132
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
лорентабельний, бо призводить до загибелі великої кількості ма-
теринських рослин у зв’язку з труднощами введення у первинну
культуру. Використання квіткових бутонів та квітколожа дає змо-
гу зберегти материнські рослини і отримати багато регенерантів.
За 12 тижнів один квітковий бутон може регенерувати до 240—
300 проростків. Крім того, рослини звільняються від збудників
хвороб [396]. Морфогенетична здатність експлантів гербери за-
лежить від сорту материнської рослини. Дослідження регене-
раційної здатності тканин квіткових бруньок і суцвіть 17 гено-
типів гербери показало, що 92 % експлантів бруньок і 45 % екс-
плантів суцвіть регенерували пагони.
За активністю утворення пагонів тканиною квітколожа
К. Ріегік [396] поділив усі досліджені сорти гербери на три групи:
з низькою здатністю до морфогєнезу пагонів, які слабко реагу-
ють на концентрацію екзогенного бензиладенину; сорти, що
мають велику морфогенну активність за будь-яких концентрацій
БАП у живильному середовищі; сорти з середньою здатністю до
утворення пагонів. МКР гербери часто поєднують зі знищенням
вірусної інфекції. Для цього відбирають безвірусні клони мате-
ринських рослин тестуванням за зовнішніми ознаками та інди-
каторами. Надалі проводять теплову обробку материнських рос-
лин, які використовують для вичленування експлантів.
Наявна інформація дає можливість застосовувати кілька ме-
тодичних прийомів клонування гербери [15 227].
Використання верхівки пагона
Опушені пагони гербери важко стерилізувати. Для зменшен-
ня контамінації материнську рослину вирощують так, аби розет-
ка листків перебувала над поверхнею ґрунту, доцільно також на-
кривати рослини плівкою. У здорових добре розвинутих рослин
зрізають пагін, видаляють листки, крім самого верхнього.
Стерилізація вихідного матеріалу, пагони промивають про-
точною, а потім теплою мильною водою; відрізають верхню час-
тину з вегетативною брунькою (1—5 см), занурюють у 70%-й
етанол на 5—10 с, потім у 1%-й №ОС1 на 10 хв або у 0,5%-й
розчин фундазолу на 30 хв і у 10%-й хлорамін Б на 20 хв; тричі
промивають у стерильній дистильованій воді.
Вичленування експланта. гострою дисцизійною голкою відділя-
ють листкові примордії, що закривають апекс, відрізають експлант
(1—3 мм) і розміщують його на поверхні живильного середовища.
133
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Умови культивування: використовують середовище М8 з
10,0 мг/л нікотинової кислоти, 1,0 — піридоксину, 30,0 — тіамі-
ну, 10,0 — аденіну, 100,0 — інозиту, 0,1 — ІОК, 1,0 мг/л кінети-
ну, 45 г/л цукрози або 1/2 концентрації середовища М8 з мікро-
елементами за Хеллером, 5 мг/л БАП, 0,1 мг/л ІОК, 40 г цукрози.
Культивують за температури 25 ± 1 °С, освітлення 2—5 клк,
фотоперіоду 16 год і вологості 70 %. Через 7—10 діб апекси збіль-
шуються, зеленіють, з’являються листки. За 7—8 тижнів форму-
ється розетка листка. Такі експланти переносять на середовище
для розмноження, яке містить МН41\ІО3 — 2100 мг/л, КГ^О3 —
1940, (МН4)28О4 - 1000, СаС12 - 2Н2О - 440, М§8О4 • 7Н2О -
370, КН2РО4 — 170, тіамін — 7, аденін — 10, кінетин — 0,6 мг/л,
цукрозу — 30 г/л, агар — 1 %; рН 5,6—5,9. Вміст мікроелементів
і хелату заліза — за Мурашіге—Скугом [15]. На цьому середови-
щі розвиваються бічні бруньки, що утворюють пагони. Субкуль-
тивування пагонів сприяє розвитку нових бруньок і пагонів.
Цикл розмноження повторюють 10—12 разів протягом 1,5—2 ро-
ків; надалі регенераційна здатність експлантів знижується. Паго-
ни укорінюють на середовищі М8 (1/2 концентрації) з 0,3 мг/л
ІОК, 20 г/л цукрози. За 2—3 тижні формується нормальна коре-
нева система. Можна також укорінювати пагони гербери на се-
редовищі М8 з 10 мг/л ІОК або ІМК [317].
Використання бутонів і суцвіть
Беруть молоді, ще закриті бутони діаметром 0,5—0,7 см або
суцвіття.
Стерилізація вихідного матеріалу: промивають проточною,
потім теплою мильною водою; занурюють у 70%-й етанол на
2 хв; переносять у 1,5%-й N3001 з краплею твін 20 на 10—12 хв;
промивають у кількох порціях стерильної дистильованої води
протягом 45 хв.
Вичленування експланта: у квіткових бруньок видаляють покрив-
ні обгортки і розрізають на 20—25 частин із язичковими квітками,
у суцвіть вичленовують язичкові квітки і розрізають квітколоже на
4 частини.
Умови культивування: використовують середовище М8 (1/2 кон-
центрації) з мікроелементами за Хеллером, 25 мг/л КаБеЕДТА,
10 г/л цукрози, 2 мг/л БАП і 0,1 мг/л ІОК, рН 5,6.
Культивують при 21 °С, фотоперіоді 16 год, освітленні флуо-
ресцентними лампами або в темряві протягом перших 4 тижнів,
134
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
а надалі при освітленні 8 клк.
За кілька тижнів на експлантах
проліферує зелений калус і ут-
ворюється велика кількість веге-
тативних бруньок. Кожні 4 тиж-
ні експланти можна ділити і
переносити на середовище для
розмноження (з додаванням
80 мг/л аденінсульфату). На кож-
ному експланті протягом 3—
4 тижнів формується по 2—4 па-
гони, їх відділяють і укорі-
нюють на середовищі з 0,1 мг/л
ІОК (без БАП і аденінсуль-
фату). На цьому середовищі
100 % пагонів утворюють коре-
неву систему (рис. 14).
Протягом 8—12 тижнів ко-
жен експлант утворює до 20—
25 пагонів, які можна субкульти- Рис' Морфогенез рослин гербери
Бувати 3—4 цикли. За тривалішого культивування морфогене-
тична здатність експлантів знижується, змінюється форма лист-
ків рослин-регенерантів.
Пересадка в субстрат: укорінені рослини пересаджують у суміш
перліту і сфагнового моху (1:1) і деякий час витримують у теплиці в
контрольованих умовах для акліматизації. Зручно висаджувати рос-
лини-регенеранти у торфові горщики і витримувати в теплиці з ту-
маноутворенням при 24—28 °С і вологості 90 %. Через місяць рос-
лини пересаджують у контейнери і вирощують відповідно до техно-
логії. Масове цвітіння регенерантів гербери настає через 3—4 міс.
Дослідження термінів цвітіння і якості квіток у різних сортів
гербери, які вирощували живцюванням, культурою апексів і
квітколожа, довело, що спосіб розмноження не впливає на швид-
кість цвітіння: рослини починають цвісти через 8—9 тижнів піс-
ля висадки в субстрат. Кількість квіток на одну рослину, діаметр
квітки і довжина квітконіжки також не залежали від способу
розмноження.
Для організації безперервної технології МКР гербери розроб-
лено умови тривалого зберігання рослин-регенерантів: укорінені
рослини можна зберігати в темряві при 4 °С протягом 12 тижнів
без шкоди для приживлюваності і подальшого росту.
135
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Хризантема (ОепгігапШета дгапгііііогит,
СЬгувапіІіетит тогИоІіит)
Культура хризантем дуже популярна у промисловому квітни-
карстві. У процесі відбору і селекції виведено багато сортів висо-
кодекоративних хризантем для осіннього і зимового зрізування.
У багатьох країнах хризантеми вирощують цілий рік і вважають
їх культивування рентабельним.
Значної шкоди хризантемам завдають вірусні хвороби, що зни-
жують якість і кількість квіткової продукції. Найефективнішим
методом звільнення хризантем від вірусної інфекції є метод куль-
тури апікальних меристем, який дає змогу також отримувати ба-
гато посадкового матеріалу. Рослини-регенеранти, як правило,
ідентичні материнським і не втрачають ознак сорту.
Розробці і удосконаленню методу МКР хризантем присвяче-
но велику кількість дослідів, на основі яких складено методичні
рекомендації [132].
Маточні рослини хризантем після термообробки вирощують
4 тижні в теплиці з тривалим освітленням. Використовують мо-
лоді пагони, з яких видаляють листки.
Стерилізація вихідного матеріалу: пагони промивають про-
точною, потім теплою мильною водою; занурюють у 70%-й ета-
нол на 20—30 с; споліскують стерильною дистильованою водою;
занурюють у 5%-й розчин гіпохлориту кальцію на ЗО хв; тричі
промивають у стерильній дистильованій воді.
Вичленування експланта: під бінокулярним мікроскопом за
допомогою препарувальної голки і уламка леза відділяють по-
кривні листки, залишають лише 1—2 листкових примордія.
Вирізають експлант розміром 0,1—0,5 мм (за іншими рекоменда-
ціями — 0,2—1,0 мм, частіше 1 мм біля основи і 0,5 — у верхній
частині). Експлант складається з апікального купола, листкових
примордіїв і частини субапікальної тканини. Його переносять на
поверхню агаризованого середовища зі збереженням фізіологіч-
ної полярності.
Умови культивування: оптимальними є середовище М8 з 2 мг/л
і 0,02 мг/л НОК, температура 24 °С, освітлення 1—4 клк. Пер-
винні експланти культивують у чашках Петрі, в яких протягом
тижня вони збільшуються. Навколо основи експланта утворюєть-
ся темно-зелений калус, формуються пагони, листки. Ці структу-
ри розділяють і культивують на рідкому середовищі в колбах на ро-
торі при 1 об/хв. Тканини можна субкультивувати кожні 10 діб.
136
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Інокуляти тканини краще рос-
туть у більшому об’ємі середо-
вища (ЗО мл), ніж у 15 мл. П'с-
ля перенесення на агаризоване
середовище з 0,5—2,0 мг/л кіне-
тину утворюються пагони, які
укорінюють на середовищі з
0,02 мг/л НОК (рис. 15).
Калусну тканину можна три-
валий час (до 6 міс) зберігати
на агаризованому середовищі з
2,0 мг/л кінетину і 0,02 мг/л
НОК при 4,5 °С і малому ос-
вітленні або в темряві; тканина
повільно росте, лишається зе-
леною.
Після перенесення на світ-
ло (1—4 клк) при 24 °С качус
швидко проліферує пагони. Та-
ке загартування калусу збіль-
шує холодостійкість рослин-ре-
Рчс. 15. Морфогенез рослин хри-
зантеми
генерантів [201]. Слід зазначити, що у дослідах цих авторів калус
зберігав регенераційну здатність протягом 3—4 років.
Пересадка в субстрат', через 3—4 міс укорінені рослини пе-
ресаджують у суміш перліту і торфу (1:1), збагачену макро- і мік-
роелементами. Вирощують в умовах підвищеної вологості і ко-
роткого дня, регулярно підживлюють. Через 2—3 міс регенеран-
ти зацвітають, сортові ознаки виду в більшості з них зберігають-
ся. Після перевірки на вірусну інфекцію здорові рослини можна
використовувати як маточники для живцювання.
Для МКР хризантем також застосовують тканини молодих
бутонів, язичкові й трубчасті квітки і листки [227].
Чашечку квітки з частиною квітконіжки ділять на сегменти,
вичленовують квітколоже з оцвітиною, кладуть на живильне се-
редовище Кнопа з мікроелементами за Хеллером, 20 г/л цукро-
зи, 1 мг/л БАП. Культивують при 18 °С і освітленні 2—3 клк
протягом 14 год і при 14 °С без освітлення. Через 2 тижні в
культурі утворюються численні пагони (у середньому до 25 шт.).
Зменшення концентрації цукрози в живильному середовищі до
0,5 % і зміна умов культивування (зниження денної температури
до 16,9 °С) збільшують регенерацію пагонів Пагони з 2—3 між-
137
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
вузлями відділяють, обробляють тальком з 1 % НОК і висаджу-
ють у субстрат для укорінення. Рослини-регенеранти зберігають
ознаки сорту.
ПАПОРОТЕПОДІБНІ (Роїуросііорітуіа)
Ці декоративні рослини, гцо останнім часом набувають по-
пулярності при озелененні приміщень, розмножують спорами у
стерильному ґрунті або поділом. Розроблено також метод про-
рощування спор іп уіїго на живильних середовищах з низькою
концентрацією макроелементів.
Спори папороті дуже дрібні, їх стерилізують у мішечках з цуп-
кої тканини, так само як і насіння орхідей. Найчастіше застосо-
вують 20%-й гіпохлорид кальцію (20 хв). Промивають у стериль-
ній дистильованій воді і висушують між аркушами стерильного
дистильованого паперу.
Розсівають на поверхню агаризованого середовища Кнудсона
(1/2 концентрації), Мора (1/2 концентрації), Міллера або Уайта.
Концентрацію глюкози або цукрози знижують до 2,5—10,0 г/л.
Зазвичай ми застосовували середовище Кнудсона з гуматом нат-
рію (50 мг/л) і активованим вугіллям (1 г/л).
Культури витримують за слабкого освітлення і температури,
оптимальної для певного виду. Під час проростання спори спо-
чатку утворюють заростки, пізніше — гаметофіти, але для цього
у посудину слід додати невелику кількість стерильної дистильо-
ваної води (рис. 16).
Для розмноження деяких видів папоротей можна використо-
вувати верхівки пагонів або латеральні бруньки столонів. Виро-
щування маточних рослин у закритих ящиках дасть змогу уник-
нути значної контамінації.
Органогенез у кожного виду папоротей має свої особливості.
Так, у Ркйусегіит на експлантах вай і коренів утворюються ад-
вентивні бруньки, у Біеріїгоіерік на експлантах верхівок столонів
регенерують пагони.
Інтенсивність органогенезу залежить від складу живильного
середовища. Для Абіапшт, Оауаіііа, №ерйго1ерІ8 і Ріаіусегіит за-
звичай використовують 1/2 або 1/4 концентрації макроелементів
середовища М8 з додаванням 200 мг/л БіаН2РО4 • Н2О. Експланти
Біерйгоіерік можна культивувати на середовищі В5 або 1/2 кон-
центрації Кнудсона з 2 мг/л ІМК, 0,04— кінетину і 1,12 мг/л
БАП. Для Ріегік уіВаїа оптимальним є середовище Уайта з 2 %
138
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
б
в
Рис. 16. Проростання спор папороті:
а — початок проростання; б — заросток; в — ваї
139
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
цукрози, 300 мг/л гідролізату казеїну і 2 мг/л 2,4-Д. Експланти
спорофіту і гаметофіту багатьох видів папоротей проліферують
калус на середовищі М8 з 0,5 г/л цукрози, 2 мг/л ІМК і 0,5 мг/л
БАП, надалі апогамно утворюються гаплоїдні спорофіти. Екс-
планти апексів на середовищі М8 з фосфатами і цитокінінами
регенерують пагони, які укорінюють на 1/2 концентрації М8
(без фосфатів і регуляторів) у темряві або безпосередньо у ґрунті
[206, 227].
РОЗОЦВІТІ (Аозасеае)
Троянда (Нова ііуЬгісіа)
У промисловому квітникарстві багатьох країн троянди зай-
мають одне з провідних місць. Крім того, останнім часом набула
поширення горшкова культура міні-троянд. Традиційні методи
вегетативного розмноження не в змозі забезпечити достатню
кількість посадкового матеріалу, тому широке застосування має
метод МКР, який вважають надійним, ефективним, швидким і
відносно дешевим.
Проведено детальні дослідження методів культивування ізо-
льованих тканин різних форм і сортів троянд [24, 151, 211, 255,
307, 490].
Так, у розсадниках Н. Дельбарда (Франція) застосовується
така технологія мікророзмноження троянд (цит. за: |44]). Мате-
ринські рослини вирощують в особливих умовах фітосанітарії. У
молодих пагонів видаляють листки і шипи і розрізають їх на час-
тини. Стерилізують відрізки у 70%-му етанолі 1 хв, потім у 7%-
му розчині гіпохлориту кальцію 20 хв, потім промивають у 3 пор-
ціях стерильної дистильованої води.
З апікальних і латеральних бруньок вичленовують меристеми
і розміщують на середовищі М8 (повної або 1/2 концентрації) з
додаванням 0,5—2,0 мг/л БАП. Тканини субкультивують кожні
20—30 діб, що сприяє утворенню конгломератів пагонів, які роз-
діляють і переносять на середовище для укорінення (без БАП).
Корені формуються за 15—18 діб у 96 % пагонів. Рослини заввиш-
ки 2,5—3,0 см з 2—5 корінцями виймають з колб, відмивають від
залишків агару і висаджують у контейнери розміром 7x9 см. Оп-
тимальним субстратом для пересадки є суміш рівних частин со-
снової кори і торфу з додаванням осмокоту (рН 5,8—6,0). Рос-
лини-регенеранти розміщують на стелажах в умовах штучного
туману, притінюють від перегріву; для попередження грибкових
140
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
хвороб їх обробляють беномілом. Через 3 тижні прищипують
рослини для стимуляції галуження, за 2—3 міс рослини готові до
реалізації. Виявлено, що найпридатнішими для введення в куль-
туру є апікальні меристеми верхівок пагонів, латеральні бруньки
і бруньки з невеликим сегментом стебла.
Найчастіше використовують агаризоване середовище М8 (пов-
ної або 1/2 концентрації), але помічено, що на рідкому стаціонар-
ному середовищі утворення пагонів відбувається швидше. Для
проліферації пагонів додають різні концентрації ауксинів (0,004—
0,1 мг/л НОК або 0,1—0,5 мг/л ІМК, 0,1—2,0 мг/л БАП). Для
утворення коренів найчастіше використовують 1/2 або 1/4 кон-
центрації солей М8 і ауксини (0,1 мг/л НОК, 0,1 — ІОК, 0,2—
0,5 мг/л ІМК) і 0,2—1,0 г/л активованого вугілля.
Експланти троянд слід переносити на свіже живильне сере-
довище кожні 3—5 діб, бо вони виділяють феноли і темніють.
Щоб запобігти цьому, до середовища слід додавати 50 мг/л ас-
корбінової кислоти і 150 мг/л полівінілпіролідону. Можна також
замочувати експланти у розчині полівінілпіролідону перед ви-
садкою і витримувати культуральні посудини у темряві 2 доби.
Культивують експланти при фотоперіоді 16 год і температурі
21—25 або 23—26 °С вдень і 19—22 °С вночі.
Субкультивування утворених структур дає можливість отри-
мати багато рослин-регенерантів. Оптимальним середовищем
для субкультивування пагонів є М8 з 0,3 мг/л ІОК, 3,0 — БАП і
100 мг/л метиллаурату [227]. Для укорінення використовують
середовище М8 з пониженою концентрацією мінеральних солей
(1/2 або 1/4) і додаванням по 1 мг/л ІМК і БАП або лише 3 мг/л
ІМК. Можна також культивувати пагони на рідкому середовищі
М8 з 60 г/л цукрози і 0,5 мг/л НОК (5 діб) або з додаванням
0,1 мг/л ІОК (2 тижні).
При культивуванні сегментів стебла, недозрілих зародків,
молодих листків на 1/2 концентрації середовища М8 утворюєть-
ся калус, здатний регенерувати адвентивні пагони і соматичні
ембріони [227].
Численні дослідники пропонують свої раціональні методики
розмноження троянд, які постійно удосконалюються [47, 49, 220,
307, 442]. Розроблено методику промислового розмноження тет-
ра- і диплоїдних сортів троянд [151, 227]. Використовують па-
зушні бруньки з невеликим (1 мм) шматочком стебла. Культи-
вують на середовищі М8 при 25 °С і освітленні 0,7—0,8 клк
(рис. 17).
141
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Рис. 17. Морфогенез рослин міні-
троянди
Експланти кожні 3—4 доби
переносять на свіже живильне
середовище для запобігання ви-
діленню поліфенолів. Пагони,
що утворилися, розділяють і пе-
реносять на середовище М8 (1/3
концентрації) з 2 мг/л ІОК для
укорінення. Протягом 9—14 діб
пагони укорінюються і рослини-
регенеранти висаджують у субст-
рат. Дослідження факторів, які
стимулюють ризогенез, показа-
ло, що зниження концентрації
солей у середовищі М8 активі-
зує утворення коренів. Так, при
зменшенні загального азоту з
60 до 75 ммоль збільшується
довжина і кількість коренів на
пагоні, зростає швидкість їх ут-
ворення. Оптимальними є кон-
центрації азоту в межах 7,5—
30,0 ммоль. Тенденція до подовження коренів помічена і при ви-
користанні 1/4 і 1/8 концентрації солей середовища М8 [255].
Досліджено прийоми культивування різних форм і сортів мі-
ніатюрних, чайно-гібридних троянд і сортів групи флорібунда. Як
експланти використовували верхівки пагонів і латеральні бруньки
з частиною стебла 2—3 мм. Випробовували різні середовища (рід-
кі та агаризовані) — Готре, Уайта, Мореля, Гамборга, М8. Екс-
планти культивували при температурі 24—26 °С, освітленні 3,5 клк
і фотоперіоді 16 год [2]. Виявлено, що у більшості сортів досить
швидко починається розвиток експлантів: формуються пагони,
листки. Перший етап культивування для всіх сортів успішніше
проходить на рідких середовищах. Для подальшої проліферації,
розмноження і укорінення експланти переносять на агаризовані
живильні середовища з додаванням 1—2 мг/л БАП. Часта пере-
садка експлантів сприяє утворенню численних бруньок і пагонів.
Відзначено, що представники різних груп троянд мають різний
морфогенетичний потенціал. Найбільшу здатність до проліферації
пазушних меристем мають експланти мініатюрних, а найменшу —
сорти чайно-гібридних троянд. Сорти групи флорібунда займають
проміжне положення щодо здатності утворювати адвентивні брунь-
142
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
ки і пагони. Ризогенез мікропагонів також істотно залежить від
сортових особливостей троянд. Максимальний (100) відсоток уко-
рінення спостерігали у сортів із групи міні-троянд. Важко укорі-
нюються пагони чайно-гібридних троянд. Живці рослин-регене-
рантів можна також укорінювати у водному розчині 25 мг/л ІМК,
замочуючи їх протягом 12 год. Акліматизацію та укорінення реге-
нерантів проводять у контейнерах на субстраті з торфу і піску
(3:1), попередньо прогрітому при 85—90 °С протягом 4 год і зво-
ложеному 1/4 розчину Мурашіге—Скуга (без хелату заліза).
Кондиційний посадковий матеріал троянд отримують через
8—9 міс після вичленування тканини (рис. 18).
Наводимо методику МКР троянд.
Стерилізація вихідного матеріалу, однорічні пагони звільня-
ють від шипів і листків й розрізають на частини з однією брунь-
кою, промивають проточною водою 15 хв, потім теплою миль-
Рис. 18. Укорінені регенеранти міні-троянди
143
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ною водою 15 хв і знову проточною водою ЗО хв; протирають
спиртом і знімають кору; занурюють у 70%-й етанол на 10—
12 хв, потім у 9%-й розчин гіпохлориту кальцію на 15 хв або у
3%-й розчин гіпохлориту натрію на 20 хв; промивають у 3 порці-
ях стерильної дистильованої води.
Позитивні результати дає і такий режим стерилізації: після
видалення листків і шипів відрізки пагонів занурюють у 70%-й
етанол на 1 хв, потім у розчин гіпохлориту кальцію (70 г/л) на
20 хв і промивають у 3 порціях стерильної дистильованої води.
Високий стерилізуючий ефект (85—90 % стерильних експлантів)
можна отримати при використанні ртутних препаратів: відрізки
пагонів промивають 1—1,5 год проточною водою, потім зану-
рюють на 5 хв у 0,1—0,15%-й розчин сулеми і промивають у 4—
5 порціях стерильної води.
Вичленування експланта'. апікальні і латеральні бруньки вич-
леновують з частиною стебла (1 мм) і розміщують на живильно-
му середовищі.
Умови культивування', використовують рідке або агаризоване
середовище М5 з 3 мг/л кінетину, 0,3 — ІОК, 50 мг/л аскорбіно-
вої кислоти, 0,2 г/л гідролізату казеїну. Внесення 2 мг/л БАП інду-
кує проліферацію додаткових бруньок і утворення пагонів. Можна
також застосовувати середовище Б8 з додаванням 10-8 г/л ІОК і
5 • 10 17 г/л БАП на першій стадії культивування, 10"7 г/л ІОК і
5 • 1017 г/л БАП — у фазу проліферації [227].
Культивують при 25—28 °С, освітленні 2,5—3,0 клк і фото-
періоді 16 год. Інколи радять нічну температуру знижувати до
20 °С. Для збільшення укорінення живців можна також перене-
сти регенеранти на один тиждень у приміщення з температурою
5 °С, а потім збільшити температуру до 20—22 °С. Стимулює
укорінення й освітлення в 1 клк. Затінення нижньої частини по-
судини також сприяє утворенню коренів. Рослини-регенеранти
троянд мають кращі декоративні якості і раніше зацвітають.
ІНШІ ДЕКОРАТИВНІ РОСЛИНИ
Кордиліна (Согсіуііпе)
Декоративно-листяну рослину родини А^ауасеае використо-
вують для озеленення приміщень. Є види з зеленими, пістряви-
ми, червоними листками.
Для МКР використовують верхівки пагонів і сегменти стеб-
ла. Культивують на середовищах М8 або Ніча і Ніч з 0,3 мг/л
144
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
ІОК, 0,5 — БАП і ЗО мг/л аденінсульфату. Ріст пагонів відбува-
ється у напіврідкому середовищі з 1 мг/л ІОК і 0,5 мг/л БАП.
Можна також використовувати рідке середовище з додаванням
40 г/л цукрози, 1- мг/л ІОК і 0,25 мг/л кінетину. Невелике освіт-
лення сприяє утворенню і росту пагонів.
Укорінюють пагони кордиліни на середовищі М8 без регуля-
торів росту або з 1 мг/л ІМК за освітлення 10 000 лк. За тиждень
пагони відділяють і переносять у субстрат [227].
Драцена (Огасаепа)
МКР драцени — декоративно-листяної рослини (родина А§а-
уасеае) — подібне до розмноження кордиліни.
Верхівки пагона культивують на середовищі М8 з 30 г/л цук-
рози, 1 мг/л ІОК, 0,3—1,0 — кінетину і 120 мг/л аденінсульфату
за освітлення 3000 лк. Кожні 3 тижні утворюється по 8—9 па-
гонів на експланті. їх відділяють і укорінюють на середовищі з
10 мг/л ІОК.
При культивуванні сегментів стебла молодих пагонів драце-
ни на середовищі з 0,25—0,5 мг/л 2,4-Д і 15 % кокосового моло-
ка або 1 мг/л БАП утворюється калус. Для диференціації адвен-
тивних пагонів калус переносять на середовище з 1 мг/л кінети-
ну і 15 % кокосового молока або з 0,5 ІМК і 0,5—1,0 мг/л БАП.
За 5—6 тижнів пагони виростають, їх укорінюють на 1/10 кон-
центрації середовища М8 з 0,5 мг/л ІМК [227].
Камелія (СатеІІіа)
Рід СатеІІіа нараховує багато видів вічнозелених дерев або
кущів. Особливо приваблюють квітникарів види, що гарно цві-
туть, чимало з них введено в культуру іп УІІГО.
Використовують верхівки пагонів 4—5-місячних сіянців. Час-
тіше за все культивують експланти на середовищі М8 (повної або
1/2 концентрації) з додаванням по 1 мг/л кінетину і БАП [133].
Прямий органогенез індукували на сегментах котиледона і не-
дозрілого зиготичного зародка на середовищі М8 без регуляторів
росту або з 0,5—1,0 мг/л ІМК. Вторинний і третинний ембріоге-
нез відбувається, коли соматичні ембріони субкультивують на се-
редовищі з 1 мг/л ГК3 або з 0,5—1,0 мг/л ІМК. Ембріоїди розви-
ваються на середовищі з 1 мг/л ГК3 і ІОК, а ембріоїди Сагпеї-
Ііа]аропіса — з 0,1—1,0 мг/л ІМК і 0,01—1,0 мг/л БАП [227].
10-6-83
145
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Для укорінення пагони камелії витримують у розчині І г/л ІМК
15—20 хв, а потім культивують на середовищі з низькою концентра-
цією солей (без реіуляторів росту) і 60—30 г/л цукрози. Кількість уко-
рінених пагонів збільшується, якщо культури спочатку витримувати
9—18 діб у темряві, а потім на світлі.
Пеларгонія (Реіагдопіііт зрр.)
Багато сортів пеларгонії (родина Сегапіасеае) дуже популярні
зараз як садові і горшкові культури. Оскільки пеларгонія легко
розмножується вегетативно і насінням, то МКР використовують
переважно для звільнення маточних рослин від бактеріальної ін-
фекції (Хапііютопак реіаг^опіі) та для розмноження нових гіб-
ридних сортів.
Для клонування використовують апекси пагона після термо-
терапії маточної рослини, інколи сегменти стебла і живці.
На середовищі з низькою (0,01—0,25 мг/л ІОК, 0,1—0,5 мг/л
2-іР) концентрацією регуляторів росту утворюються одиничні
рослини, інколи калус. Для проліферації численних адвентивних
бруньок збільшують концентрацію ІОК до 2 мг/л, кінетину — до
4,0-10,0 мг/л [159].
Для попередження потемніння експлантів їх субкультивують
щотижня на свіже середовище. Так, для 27 сортів Р. сіотекіісит
найкращим виявилось середовище Хамдорфа, інші автори [227]
використовують середовище М8 з ЗО г/л цукрози.
Через 3 міс культивування регенеранти переносять на сере-
довище без регуляторів росту для укорінення і температуру зни-
жують до 12 °С. Р. їіогіопип культивують на модифікованому се-
редовищі Ь8. Для розмноження Р. реііаіит використовують 1/2
концентрації цього середовища з 0,1—0,5 мг/л ІОК і 0,05—
0,25 мг/л БАП, що сприяє утворенню численних адвентивних і
пазушних бруньок.
Для збільшення коефіцієнту розмноження пеларгонії вико-
ристовують сегменти стебла рослин-регенерантів з культури іп
уіїго. Сегмент з брунькою на 1/2 концентрації середовиша М8 з
0,5 мг/л 2-іР і 15—30 г/л цукрози формують багато адвентивних
бруньок.
Для укорінення використовують повну або 1/2 концентрації
середовища М8 чи Б8 з 0,01—0,5 мг/л НОК, або 0,1 мг/л ІОК і
15—30 г/л цукрози. Добре впливає на укорінення додавання
0,01 мг/л кінетину [227].
146
Розділ 3. Мікроклональне розмноження декоративних рослин
Пуансеттія (ЕирІїогЬіа риісііеггіта)
Дуже популярна декоративно-листяна горшкова культура. У
період цвітіння (зазвичай у зимові місяці) верхні листки пагона
забарвлюються в яскраво-червоний колір, що надає рослинам
особливої декоративності.
Культивують пуансеттію методом соматичного ембріогенезу.
Верхівку пагона розміщують на агаризованому середовищі М8 з
2 мг/л ІОК і 0,2 мг/л БАП.
За 2—3 тижні утворюється компактний калус, який перено-
сять на рідке середовище М8 з 0,2 мг/л 4-хлорфеноксиоптової
кислоти і БАП у колби Ерленмейера на ротатор. Рідину з агрега-
тами клітин фільтрують і разом з фільтром кладуть на агаризова-
не середовище. Розростається пухкий ембріогенний калус, який
субкультивують кожні 10—14 діб. Для індукції соматичного емб-
ріогенезу калус переносять у біореактор. Суспензію ембріоїдів у
глобулярній або серцеподібній стадії фільтрують і культивують у
чашках Петрі на середовищі М8 з 0,05 мг/л БАП. Тут розвива-
ються рослини-регенеранти, які потім переносять у ґрунт [227].
Фікус (Еісив)
Популярна горшкова культура з великим красивим вічнозе-
леним листям, є також форми з невеликими або плямистими
листками.
Для МКР використовують верхівки пагонів. Культивують на
середовищах М8 або Б8. Для збільшення утворення пагонів до
середовища додають 120—170 мг/л №Н2РО4- Н2О. Використову-
ють такі регулятори росту: 0,3 мг/л ІОК, 30,0 — 2-іР, 80,0 мг/л
Аск-дігідрату або 1 мг/л ІОК, 2,5—5,0 — БАП, 80,0 мг/л Асік-ди-
гідрату або лише 2 мг/л БАП. Для прискорення росту пагонів пе-
ред укоріненням у середовищі зменшують концентрацію цитокі-
нінів (0,05 мг/л БАП, 1,0 — ІОК або 0,05 мг/л БАП, 1,4 — ГК3).
Мікропагони фікуса укорінюють на середовищах М8 (1 /2 кон-
центрації) і Б8 без регуляторів росту, аденіну і №Н2РО4- Н2О, з
0,1—0,3 % активованого вугілля [227].
10’
___________________Р о з 9 і л 4 ________________
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ
СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКИХ РОСЛИН
Впровадження у сільське господарство України методів біотех-
нології рослин може забезпечити гарантоване виробництво
сільськогосподарської продукції і сприяти побудові сучасної еко-
номіки. Біотехнологія має унікальні можливості практичного ви-
користання: це і МКР рослин, і клітинна селекція, що уможлив-
лює цілеспрямований відбір мутантних форм із потрібними оз-
наками, і оздоровлення рослин.
У багатьох країнах світу біотехнології надається першорядне
значення. Її сучасному стрімкому розвитку сприяє розвиток мо-
лекулярної біології і генетики, що дає змогу використати вели-
чезні потенціальні можливості рослинних організмів. Крім того,
існує гостра потреба в нових технологіях, які б ліквідували не-
стачу харчових продуктів.
В Україні теоретичні і методичні дослідження у галузі біотех-
нології сільськогосподарських рослин проводять у кількох напря-
мах: МКР, оздоровлення рослин, клітинна селекція, прискорен-
ня селекційного процесу. Багато наукових розробок уже вийшли
за межі лабораторій і впроваджені у промислове виробництво.
Досягнуто певних успіхів у клонуванні цукрового буряку, кар-
топлі, стевії, ведуться пошукові роботи зі злаковими і бобовими
культурами.
Застосування біотехнології у сільськогосподарському рослин-
ництві дасть змогу отримати нові високоврожайні сорти, стійкі
до хвороб і несприятливих ґрунтових і кліматичних умов.
ОВОЧЕВІ КУЛЬТУРИ
Метод культури ізольованих тканин і клітин, розроблений
для багатьох видів декоративних рослин, успішно застосовують
при вирощуванні овочевих культур. Уже введено в культуру іп
уіїґо понад ЗО видів овочевих рослин. Для деяких видів техно-
148
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
логія МКР поставлена на промислову основу (картопля), з ін-
шими рослинами (томати, капуста, морква, цибуля) проводять
селекційно-генетичні дослідження.
Селекційна робота з різними генотипами перцю (Сархісит)
дала змогу провести відбір за важливими ознаками: стійкістю до
хвороб, пестицидів, несприятливих умов. Оптимізовано живиль-
ні середовища і умови культивування апікальних меристем, от-
римано регенеранти гібридних рослин [202, 393].
Визначено, що адвентивні пагони утворюються на експлан-
тах гіпокотіля, котиледона, верхівки пагона, сегментах молодих
листків при культивуванні на середовищі М8 з 5,0 мг/л БАП або
2,5 мг/л БАП і 1,0 — ІМК.
Регенеранти огірка отримували з ізольованих апікальних ме-
ристем і використовували для експериментальної зміни статі рос-
лин (цит. за: [44|). Досліджено вплив фізіологічно активних ре-
човин і умов культивування на морфогенез ізольованих апексів
огірка [278]. Розроблено умови, що сприяють регенерації рослин
із листкових експлантів 2 сортів огірка, досліджено можливість
використання культури клітин для селекції [368].
Культуру ізольованих нерозвинутих зародків використовують
при міжвидовому схрещуванні для отримання гібридів цибулі
ріпчастої і цибулі багаторічної. Для оздоровлення цибулі і швид-
кого розмноження генетично однорідних рослин використову-
ють меристематичні верхівки розміром 1—2 мм [197, 198].
Проте оздоровлений посадковий матеріал дуже швидко знову
інфікується під час вирощування у польових умовах. Тому надій-
нішим є поєднання методу МКР і селекції стійких до патогенів
форм рослин. Це дає змогу значно скоротити селекційний про-
цес і швидко розмножити цінний генетичний матеріал.
Для розмноження генотипів моркви з високим вмістом каро-
тину і низьким вмістом нітратів використовували бруньки і дис-
ки коренеплоду. Кожна брунька (0,3—1,0 см) на середовищі Ь8 з
1 мг/л БАП формувала до 150 пагонів, що укорінювались на се-
редовищі з ІМК або НОК. Диски коренеплоду розміром 5 х 2 см
на середовищі М8 з 2 мг/л 2,4-Д проліферували калус. Індукція
соматичного ембріогенезу відбувалась на середовищі з БАП
(0,5—1,0 мг/л); надалі на середовищі з 0,5 мг/л НОК регенерува-
ли паростки. Від одного генотипу за 4 міс отримали до 3000 ре-
генерантів моркви (цит. за: [44, 232]).
Калус моркви можна легко отримати і на інших середови-
щах: Шенка, Хільдебрандта, Дін і Стаба, Уайта при додаванні
149
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
0,1 —10,0 мг/л 2,4-Д, 0,1—0,2 — БАП або 0,2 мг/л кінетину,
2,0 — аденіну. Субкультивують калус на тих же середовищах з
0,1 —1,0 мг/л 2,4-Д і 0,1 мг/л БАП. Соматичний ембріогенез
відбувається на середовищі без ауксинів [189, 297, 448].
Часто використовують таку методику: експланти сегментів ко-
ренів індукують калус на агаризованому середовищі М8 з 2 %
цукрози, 1,0 мг/л 2,4-Д і 0,2 мг/л кінетину. Суспензія клітин
утворюється при субкультивуванні калусу на рідкому середовищі
з 0,1 мг/л 2,4-Д і 0,2 мг/л кінетину на шейкері (120—150 об/хв).
Ембріогенез відбувається, коли калус або суспензію клітин пере-
носять на середовище М8 без 2,4-Д. Калус культивують у темря-
ві, потім за освітлення 2000 лк. Ембріогенний потенціал сус-
пензійної культури моркви зберігається протягом 15 тижнів, по-
тім знижується [227].
У такий спосіб можна розмножувати селеру (Аріит §гауео-
Іепк). Сегменти живця на середовищі М8 з 0,5 мг/л 2,4-Д і
0,6 мг/л кінетину утворюють калус, потім формуються соматичні
ембріоїди. На середовищі без регуляторів росту утворюються чис-
ленні пагони і рослини-регенеранти.
Велику регенераційну здатність мають експланти листків
ендивію і цикорного салату в культурі іп уіїго. На середовищі
М8 з 0,5 мг/л НОК і 1,0 мг/л БАП формуються численні паго-
ни, що легко укорінюються на середовищі зі зниженою кон-
центрацією мінеральних солей (до 1/4) і без регуляторів росту
[322, 535].
Для прискореного розмноження селекційних зразків гарбуза,
стійкого до вірусу огіркової мозаїки, використовували експланти
верхівкових меристем, ізольованих із проростків. Експланти
(0,5—1,0 мм) культивували на середовищі М8 з 2,56 мг/л кінети-
ну і 8 мг/л ІОК при 22 °С. Морфогенез пагонів відбувався на
середовищі з 1 мг/л БАП, ризогенез — на середовищі з 8 мг/л
ІОК, без цитокінінів. Протягом 3—4 тижнів формувались росли-
ни, придатні до пересадки в субстрат [227]. Для селекційної ро-
боти розмножували дикорослий посухостійкий гарбуз: вичлено-
вували верхівки бічних пагонів і сегменти міжвузля стебла (3—
6 см); на живильному середовищі з 1—5 мг/л БАП і 0,1 мг/л
НОК формувались пагони, які укорінювались при додаванні до
середовища 1 мг/л ІМК.
Нижче детальніше наводимо методи МКР деяких овочевих
культур.
150
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
Капуста (Вгаззіса)
До роду Вгаззіса належать багато видів цінних харчових
культур. Його представники легко розмножуються в культурі
ІП УІІГО.
Після перших експериментів, що довели можливість МКР
капусти [124, 173, 331], цей метод почали використовувати у се-
лекційній роботі для швидкого розмноження генетично цінного
матеріалу, подолання несумісності при міжвидовій і міжродовій
гібридизації, отримання гетерозисних гібридів [64]. У культуру
введено тканини капусти броколі, брюссельської, качанної,
цвітної, листкової [137, 146, 169, 241, 504, 505]. Розроблено опти-
мальні середовища і умови культивування експлантів для отри-
мання рослин-регенерантів. Середовища з високою концентра-
цією іонів — М8, Б8 — придатні для більшості рослин з родини
Вгаззіса. У деяких експериментах до середовища М8 додають
гідролізат казеїну (100—500 мг/л).
Експланти з різних частин сіянців качанної капусти (В. оіе-
гасеае Б.) культивували на середовищі М8. Частини кореня при
додаванні 0,5 мг/л ІОК, 0,5 — кінетину і 500 мг/л гідролізату ка-
зеїну проліферували калус, на якому протягом 4—6 тижнів роз-
вивались пагони. Сегменти гіпокотіля формували бруньки на се-
редовищі з 1,0 мг/л ІОК, 2,0 — кінетину і 500 мг/л казеїну; ко-
тиледон і листки регенерували численні бруньки при додаванні
до середовища по 2 мг/л ІОК і кінетину. Добре сформовані рос-
лини пересаджували у субстрат [124].
Розроблено оптимальні умови для морфогенезу тканин не-
сумісних ліній качанної капусти [64]. Використовували сегменти
стебла проростка у фазі 5—8 листків. Експланти культивували на
середовищі М8 з додаванням по 1 мг/л тіаміну, аскорбінової,
ферулової кислот, ІМК і 45 г/л цукрози. Внесення різних стиму-
ляторів росту індукувало різні типи морфогенезу. На середовищі
з кінетином (3 мг/л) сегменти живців регенерували пагони з ко-
ренями, додавання у середовище 2 мг/л БАП або по 0,1 мг/л
БАП і НОК сприяло утворенню численних пагонів у пазухах
листків і культурі верхівкових меристем. Проліферацію калусу
викликало внесення у середовище БАП або зеатину (по 3 мг/л),
з якого надалі формувались адвентивні пагони. Цей тип морфо-
генезу виявився найефективнішим для отримання рослин-реге-
нерантів самонесумісних ліній капусти, генетично однорідних із
материнською рослиною. Розроблений автором метод яровізації
151
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
регенерантів у пробірках дав змогу в перший вегетаційний пе-
ріод отримати рослини, шо зацвіли.
Найбільшу морфогенну здатність мав первинний калус, що
проліферував на експлантах листків і черешках капусти [64]. Вне-
сення у середовище М8 3,0 мг/л кінетину сприяло формуванню
бруньок, 1,0 — росту коренів, 2,0 — утворенню калусу. Бруньки
переносили на середовище з 1 мг/л ферулової кислоти та ІОК, в
якому регенерували пагони і корені. Проте багаторазова пере-
садка калусної тканини спричинює аномальний морфогенез.
Брюссельська капуста погано розмножується насінням. Екс-
планти бруньок, черешків і листків на середовищі М8 з 0,2 мг/л
2,4-Д і 0,5 мг/л кінетину проліферують калус. Після пересадки
на середовище з 2 мг/л ІОК, 0,5 — кінетину, 1 мг/л ІМК і 10 %
кокосового молока формуються пагони, на середовищі без регу-
ляторів росту відбуваються ризогенез і подальший ріст пагонів.
Не помічено жодних генетичних відхилень рослин-регенерантів
[146].
Високу регенераційну здатність мають бутони розетки брюс-
сельської капусти. На середовищі М8 з НОК і кінетином утворю-
ються численні бруньки, потім пагони і укорінені рослини [227].
Для МКР цвітної капусти використовують експланти з тка-
нини окремих квіткових бутонів і квіток, що містять численні
апікальні меристеми. На рідкому середовищі Б8 з 8 мг/л ІОК і
2,6 мг/л кінетину формуються пагони, що укорінюються у разі
зниження концентрації кінетину. Із меристематичної тканини
регенерують численні рослини, ідентичні материнським. Цей
метод можна використовувати для звільнення рослин від вірус-
ної інфекції. Швидкість морфогєнезу залежить від генотипу ви-
хідної рослини. Деякі сорти цвітної капусти формують численні
регенеранти за 3 міс.
Наводимо схему МКР Вгакмса оіегасеа (качанної капусти).
Стерилізація вихідного матеріалу, насіння занурюють у 96 °-й
етанол на 1 хв; переносять у 10%-й ррзчин хлорного вапна на
10 хв; промивають у 3 порціях стерильної дистильованої води.
Листки, черешки, сегменти стебла, квітки стерилізують у 0,15%-му
розчині сулеми 10 хв або у 19%-му розчині хлорного вапна 15 хв;
промивають у 3—4 порціях стерильної води.
Умови культивування', насіння пророщують на середовиші М8
з 1 % цукрози, 1 мг/л тіаміну, 1 мг/л аскорбінової кислоти. Че-
рез 3—5 тижнів сіянці розрізають на частини і культивують на
середовищі М8. Із листків, черешків, квіток вичленовують експ-
152
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
ланти розміром 0,5 х 1,0 см і розміщують на живильному сере-
довищі з дотриманням фізіологічної полярності. Культивують
при 25 °С, освітленні 3—5 клк.
Сегменти сіянців культивують на середовищі М8 з 3 мг/л
БАП або зеатину. Численні пагони, що утворюються, укоріню-
ють на середовищі Уайта з 1 % цукрози.
Для експлантів листків, черешків, стебел, квіток використо-
вують середовище М8 з 3 мг/л кінетину. За кілька діб проліфе-
рує світлий пухкий калус, на якому згодом формуються численні
бруньки, які відділяють і переносять на середовище з 1 мг/л фе-
рулової кислоти та ІМК, де відбувається морфогенез пагонів і
коренів. Добре сформовані рослини висаджують у субстрат (вер-
микуліт) і утримують в умовах підвищеної вологості.
Незважаючи на те що більшість авторів відзначає ідентич-
ність рослин-регенерантів з материнською рослиною, є дослід-
ження, які засвідчують їх фенотипічну і генотипічну відмінність.
Так, із 71 рослини, отриманих з калусу, лише 6 було диплоїдни-
ми, решта — тетра- і октапло'їдними [227].
Картопля (Зоїапит іиЬегозит)
Метод культури тканин для звільнення картоплі від вірусної
інфекції застосовують вже близько 50 років. У 1952 р. французькі
вчені Ж. Морель і С. Мартін оздоровили один сорт картоплі, вико-
риставши апікальну меристему паростків бульб. До середини
1970-х років технологія звільнення картоплі від вірусів була розроб-
лена і удосконалена в багатьох країнах світу. Для підвищення ефек-
тивності методу застосовували термотерапію, хіміотерапію, обробку
холодом. Останнє десятиліття характеризується подальшим розвит-
ком досліджень у галузі біотехнології картоплярства та їх широким
впровадженням у генетико-селекційний процес для створення ви-
сокоякісних сортів, стійких до негативної дії зовнішнього середо-
вища (засолення, гербіцидів, хвороб, шкідників тощо) [31, 60, 98].
Інститут картоплярства УААН — один з перших колективів,
що розробив і застосував методи МКР і клітинної селекції у кар-
топлярстві і отримав практичні результати зі створення рослин-
регенерантів картоплі. Розроблено низку технологій для отри-
мання нових форм і поліпшення існуючих сортів картоплі. Ме-
тодом клітинної інженерії створено фітофторостійкий середньо-
пізній сорт картоплі Ольвія, який характеризується добрими
смаковими якостями [51, 52].
153
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Технологія оздоровлення сортів картоплі є складовою части-
ною системи первинного насінництва і складається з декількох
етапів:
• підготовка бульб для видалення меристем, перевірка їх ін-
фікованості методом імуноферментного аналізу, пророщування в
темряві 1—2 міс при 35—37 °С;
• вичленування меристем і культивування їх на живильному
середовищі в умовах регульованої температури, освітлення та во-
логості;
• пересадка проростків (3—5 мм) на середовище з ауксином
для прискорення росту та укорінення, живцювання пагонів; пе-
ревірка зараженості регенерантів;
• пересадка рослин у теплиці для утворення бульб і повторна
перевірка інфікованості.
Для вичленування меристем використовують паростки (2—
З см) бульб після термотерапії. їх відділяють і стерилізують у
0,1%-му діациді протягом 5 хв, потім промивають у 2 порціях сте-
рильної дистильованої води. Вирізають меристематичний купол
з 2 примордіальними листками (0,1—0,2 мм); можна також вич-
леновувати меристеми пазушних бруньок (0,1—0,3 мм).
Культивують на середовищі М8 з 0,5 мг/л кінетину, аденіну,
і 1 мг/л гіберелової кислоти або на середовищі, розробленому в
лабораторії Інституту картоплярства, з пониженим вмістом спо-
лук азоту, мг: МН4МО3 - 1250, КМО3 - 1100, Са(МО3)2 • 4Н2О -
440, КН2РО4 — 970, М§8О4 • 7Н2О — 770, мікроелементами за
Мурашіге—Скугом, з додаванням 25 мг/л кінетину, 1,0 — ІОК,
3,0 — аскорбінової кислоти, 0,25 мг/л аденіну. За 30—45 діб ут-
ворюються рослини з 5—6 листками. Кожні 10—15 діб рослини
пересаджують на свіже живильне середовище.
Для збільшення кількості регенерантів рослини живцюють
на частини з листком і пазушною брунькою. Цей спосіб дає змо-
гу отримати за 2—3 міс 3—5 тис. рослин. Укорінюють пагони на
середовищі з 1 мг/л ІОК, без гіберелової кислоти.
Пробірочні рослини можна використати для отримання ка-
лусної культури. Для цього листки і сегменти стебла культиву-
ють на середовищі М8 з 2 мг/л пантотенату кальцію і 0,25—
0,5 мг/л БАП [227] або 1—2 мг/л 2,4-Д і 0,2 — БАП. Виявлено,
що інтенсивність калусоутворення і його морфогенна здатність
залежать від генотипу рослини, пори року, експланта та гормо-
нального складу живильного середовища. Так, для багатьох сор-
тів картоплі калус швидше утворюється на експлантах стебла,
154
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
ніж на листках. Для індукції калусу на листках треба додати до
середовища 3 мг/л 2,4-Д і 1 мг/л БАП. Для кожного сорту склад
живильного середовища підбирають емпірично. На оптимально-
му середовищі первинний калус утворюється за 3—5 тижнів,
його субкультивують кожні 4 тижні. Із калусної тканини стебла
пагони проліферують уже через 2—4, з тканини листка — через
З—10 пасажів.
Вік пересадженого калусу суттєво впливає на морфогенні про-
цеси різних сортів картоплі. Найбільше рослин-регенерантів от-
римано від 5—10-ї субкультури калусу, після 13—24-ї пересадки
морфогенна активність знижується (залежно від сорту). Здатність
калусної тканини до морфогєнезу має сезонний характер: найін-
тенсивніше регенеранти проліферують у березні—квітні і листо-
паді—грудні. Рослини, отримані з перших 5 пасажів, як правило,
були за фенотипом ідентичні вихідному сорту.
Останнім часом широкого застосування набув метод отриман-
ня мікробульб у рослин-регенерантів. Дослідження Інституту
картоплярства УААН показали, що здатність до утворення мікро-
бульб залежить від сорту картоплі. Сорти, що інтенсивно утво-
рюють бульби в полі, швидше регенерують мікробульби в куль-
турі іп уііго. Для цього пробірки з мікроживцями витримують
протягом 12—15 діб при фотоперіоді 16 год з подальшим культи-
вуванням за короткого дня і помірного освітлення. Використо-
вують середовище з 4—6 % цукрози для сортів, що схильні до
утворення бульб, і 6—8 % — для сортів, у яких утруднено буль-
боутворення 174].
За даними інших авторів, індукція формування мікробульб
відбувається в темряві при 18—22 °С на середовищі М8 з 5 мг/л
БАП, 500 мг/л хлорхолінхлориду, 8 % цукрози. Маса мікробульб
50—140 мг, діаметр 3—7 мм. Вони зберігають життєздатність про-
тягом 6 міс за утримання в піску при 4 °С [227].
Мікробульби також можна отримати культивуванням пагонів
на середовищі з 10 мг/л БАП і 8 % цукрози при температурі
22 °С, освітленні 100 лк і фотоперіоді 16 год. Протягом 2 міс до
47 % рослин формували по 1—3 мікробульби розміром 2—11 мм.
Регенеранти переносять у субстрат (пісок, торф, мінеральні доб-
рива) і витримують у теплиці до пересадки в ґрунт.
Досліджено регенераційну здатність кореневих експлантів
8 сортів та 5 гаплоїдних ліній картоплі. У дослідах використову-
вали корені асептичних рослин і “бородаті” корені, трансформо-
вані культурою А^гоЬасІегіит гйіхо§іпе8. Відрізки коренів розмі-
155
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
щували на середовищі М8 з 10 г/л цукрози, 1,5 мг/л БАП, 10,0 —
гіберелової кислоти і 0,05 мг/л ІОК. Експланти культивували
при інтенсивному освітленні (4—5 клк).
За 2 тижні утворювався щільний зелений калус, з якого про-
ліферували пагони; їх укорінювали на середовищі М8 без фіто-
гормонів. Два сорти (Лорх і Темп) і дві моногаплоїдні лінії від-
значались високим морфогенним потенціалом [40].
Томат (Ьусорегзісоп езсиїепіит)
МКР томатів дає змогу ефективно вирішити проблему оздо-
ровлення посадкового матеріалу цінних високопродуктивних сор-
тів, значно прискорити селекційний процес, швидко розмножи-
ти нові гібридні рослини. Крім того, рослини томатів часто слу-
гують моделлю в експериментах з культурою тканин.
Як засвідчують численні публікації, МКР томатів не стано-
вить великих труднощів [21, 91, 131, 176, 177].
Розроблено умови регенерації рослин з апікальних і латераль-
них меристем [21], тканин стебла, листків, квіткових бруньок, ізо-
льованих зародків [91] і протопластів. Дослідження великої
кількості живильних середовищ показало, що при культивуванні
тканин томатів слід уникати середовищ з високими концентраці-
ями мінерального азоту (середовище Гамборга), бо експланти
відмирають. Мало придатні й середовища з низьким вмістом мі-
неральних сполук (Ульриха, Уайта). Тканини томату індиферент-
ні до наявності у середовищі гідролізату казеїну і комплексу ві-
тамінів. Оптимальним для регенерації томатів є середовище М8,
модифіковане деякими дослідниками за складом і концентра-
цією регуляторів росту відповідно до вимог окремих сортів.
Для первинного культивування апікальних і латеральних ме-
ристем і регенерації пагонів використовують середовище М8 з
1 мг/л гіберелової кислоти, 0,5 — кінетину і 30 г/л глюкози. У
перші 2—3 тижні регенераційні процеси у верхівкових меристе-
мах відбуваються швидше, ніж у пазушних, при подальшому
культивуванні різниця зникає: ізольовані меристеми за 2—3 доби
зеленіють, збільшуються у розмірах і за 2—3 тижні формують
пагони. Пагони завдовжки 20—25 мм укорінюють на середовищі
з цукрозою (20 г/л) без регуляторів росту (цит. за: [44]).
Розмножувати регенеранти можна мікроживцюванням або
індукцією численних додаткових пагонів на середовищі з
1,0 мг/л БАП (за 9—12 тижнів — до 40 пагонів). На середовищі з
156
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
0,5 мг/л ІОК і 20 г/л цукрози пагони укорінюються. Рослини
можна зберігати при 7—10 °С протягом 3 міс, що не впливає на
їх подальший ріст. Для отримання регенерантів томатів можна
використовувати сегменти молодих листків. На середовищі М8 з
5 10“7 моль НОК і 1 - 10“5 моль БАП проліферує калус і пагони,
органогенез коренів відбувається при зменшенні концентрації
регуляторів росту (2,5 10-6 і 1 10-6 відповідно). Аналогічні ре-
зультати отримано при культивуванні експлантів листків на се-
редовищі М8 з 0,1—1,0 ммоль зеатину і 10,0—0,1 — ІОК. Укорі-
нюються пагони на середовищі без фітогормонів (цит. за: [44]).
Високу морфогенетичну здатність мають тканини квіткових
бутонів томатів. На середовищі Б8 з 5 % цукрози і 2 мг/л БАП
на квітконіжці бутона проліферує калус, на якому за 5—7 тижнів
формуються численні пагони [91]. На процеси морфогенезу впли-
ває фізіологічний стан бутона; дрібні бутони (2—4 мм) утворю-
ють менше пагонів, ніж великі (5—7 мм). На середовищі з
10 мг/л кінетину протягом 13 тижнів культивування формується
до 10 регенерантів на одному бутоні. Пагони укорінюються на
середовищі без добавок. За 2 тижні рослини можна перено-
сити у субстрат.
Відзначено різницю у регенераційній здатності окремих ге-
нотипів томатів. Гібриди морфогенно активніші за материнські
рослини. Дослідження листкових сегментів (6x8 мм) 12 сортів
томатів показало залежність морфогенетичної реакції від геноти-
пу материнської рослини і концентрації регуляторів росту у се-
редовищі. Для більшості сортів оптимальними були середовища
з 0,2 мг/л ІОК і 1—5 мг/л БАП, що сприяли проліферації калусу.
Генотип рослини впливав і на здатність до регенерації пагонів і
їх кількість на експланті. У більшості сортів на середовищі з
0,2—1,0 мг/л НОК і 2,5—5,0 мг/л БАП формувалась найбільша
кількість пагонів. Ризогенез у всіх сортів відбувався на середо-
вищі з 0,2—2,0 мг/л ІОК [227]. Різний морфогенний потенціал
мають експланти апекса, епікотиля, гіпокотиля і сім’ядолі про-
ростків томата звичайного і мутанта смородиновидного [32].
З використанням методу математичного планування прово-
дили оптимізацію живильного середовища Гамборга (з мікроеле-
ментами за Мурашіге—Скугом і вітамінами, мг/л: РР — 1,0, В| —
1,2, В6 — 5,0) для 6 генотипів томатів. Визначено оптимальні се-
редовища для індукції калусу і регенерації пагонів на експлантах
стебла. Концентрації фізіологічно активних речовин та інших
компонентів середовища різні для кожного генотипу. Оптималь-
157
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ний вміст кінетину коливається в межах 1,0—4,0 мг/л, ІОК —
0,25—3,0, НОК — 0,1—0,5, ферулової кислоти — 0,14—0,2 мг/л,
цукрози — 10—40 г/л. Проте з’ясовано, що при культивуванні
експлантів на оптимальному для цього генотипу середовищі ін-
дукція калусу відбувається з однаковою швидкістю. Автори дій-
шли висновку, що процеси проліферації калусу у томатів гене-
тично визначені і виявляються в конкретних зовнішніх умовах
залежно від складу середовища (цит. за: [44]).
Краще ростуть і регенерують експланти, взяті з тканин здо-
рових материнських рослин, але дуже часто доводиться вводити
в культуру тканини ослаблених рослин, отриманих при між-
видовому схрещуванні. Наводимо схему МКР томатів.
Стерилізація вихідного матеріалу: тканини промивають у про-
точній, потім у теплій мильній воді; занурюють у 0,1%-й розчин
діациду, 0,1%-й — сулеми або 1—6%-й — гіпохлориту натрію чи
кальцію. Експозиція залежить від тканини, що використовуєть-
ся: листки, бутони витримують у стерилізаторі 6—7 хв, насіння,
плоди — 10—20 хв; промивають у 3—4 порціях стерильної води.
Для стерилізації насіння можна використовувати і таку мето-
дику: занурити насіння у 20%-й розчин перманганату калію на
2 хв; перенести у 5—9%-й розчин хлорного вапна на 10 хв; про-
мити у 3 порціях стерильної води.
Для культивування зародків використовують 19—25-добові
плоди, які занурюють у 96°-й етанол на 30 с і обпалюють.
Вичленування експланта'. пластинки листків розрізають на
сегменти розміром 1 х 1 см, роблять 2—3 надрізи і розкладають
(злегка притискаючи в агар) нижньою стороною на поверхню
живильного середовища.
Умови культивування: використовують середовище М8 з 0,4—
1,0 мг/л тіаміну, 0,1—0,5 — піридоксину, 0,5—1,0 — нікотинової
кислоти, 20—80 мг/л інозиту. Внесення регуляторів росту зале-
жить від сорту і обумовлено метою експеримента. Для регене-
рації рослин і проліферації калусу найчастіше використовують,
мг/л: ІОК — 2,0—4,0—16,0, кінетин — 5,0 або НОК — 1,7 та
БАП — 3,5. Залежно від материнської рослини та експланта (лист,
стебло, брунька, зав’язь) можливі інші концентрації і співвідно-
шення регуляторів росту [21, 91].
Первинні експланти культивують при 24—26 °С, освітленні
1,5—3 клк, фотоперіоді 16 год і відносній вологості 70 %. За 5—
7 діб на експлантах починає утворюватись калус; максимальна
інтенсивність його росту триває 3—4 тижні, потім він поступово
158
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
відмирає. Тому слід працювати з первинним калусом, бо тривале
субкультивування призводить до втрати морфогенної активності.
На середовищі з 6,0 мг/л ІОК, 5,0 — кінетину або 1,7 мг/л ІОК і
3,5 — БАП на калусі утворюються меристематичні зелені струк-
тури, з яких формуються бруньки, потім пагони. Інтенсивність
освітлення в цей час збільшують до 5—10 клк. Укорінення па-
гонів відбувається на середовищі М8 без регуляторів росту і з
пониженим вмістом цукрози (1 %).
Добре сформовані рослини-регенеранти з 2—3 парами лист-
ків і розвинутою кореневою системою пересаджують у субстрат з
вермикуліту, поливають розчином Кнопа або Чеснокова і Базири-
ної. Для створення підвищеної вологості і кращої приживлюва-
ності їх накривають склянками або плівкою. Рослини, що почали
рости, пересаджують у легкий вологомісткий субстрат і утриму-
ють у теплиці, де вони зацвітають і плодоносять. Більшість отри-
маних регенерантів не мали морфологічних відхилень і не було
різниці в урожаї між контрольними рослинами і регенерантами.
Спаржа (Аврагадиз огїісіпаїів)
Вегетативне розмноження спаржі призводить до накопичен-
ня вірусної інфекції, яка передається через насіння. Для звіль-
нення від латентного вірусу використовують меристематичний
купол (0,1—0,3 мм) з 1—3 листковими примордіями або мерис-
тематичну верхівку (0,1 мм) без листкових примордіїв. Культи-
вують експланти на модифікованому середовищі М8 з 0,1 мг/л
НОК і кінетину. Хоча меристематичні верхівки дуже важко куль-
тивувати, але 90 % рослин-регенерантів звільняються від вірусу,
а при розмноженні меристематичним куполом з примордіями —
лише 43 % [227].
Для масового МКР запропонована методика з використан-
ням експлантів апексів пагона і латеральних бруньок [271, 365].
Стерилізація вихідного матеріалу, пагони промивають про-
точною водою; занурюють у 10%-й розчин хлороксу або 7%-й
розчин гіпохлориту кальцію (натрію) на 15 хв; промивають у З—
4 порціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта'. під бінокулярним мікроскопом вич-
леновують меристематичний купол з апікальних і латеральних
бруньок.
Умови культивування', використовують середовище М8, яке
містить, мг/л: 0,05—0,1 — НОК і 0,05 — кінетину або 0,3 —
159
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
НОК, 0,1 — кінетину і 40,0— аденінсульфатдигідрату. Можна
також використовувати 0,01 мг/л НОК і 0,1 мг/л БАП. Темпера-
тура 27 °С, освітлення на І і П стадії — 1—1,3 клк при фото-
періоді 16 год [188].
Протягом 4—6 тижнів формуються адвентивні бруньки і па-
гони, їх відділяють і розрізають на сегменти з однією брунькою.
Культивують на середовищі з 0,1 мг/л НОК і кінетину для фор-
мування численних пагонів, продовжують субкультивування до
отримання потрібної кількості рослин-регенерантів. Ризогенез
відбувається на тому ж середовищі, але у разі збільшення освіт-
лення до 3—10 клк.
Через 8—10 тижнів добре сформовані рослини висаджують у
субстрат і надалі використовують як маточні рослини для вегета-
тивного розмноження. Від посадки експланта до розвитку до-
рослої рослини проходить 6—8 міс.
Слід зазначити, що регенераційна здатність експланта зале-
жить від положення бруньки на пагоні, сили розвитку пагона.
Морфогенетичний потенціал бруньок, що видалені з добре роз-
винутих пагонів, значно вищий. Бруньки нижньої частини паго-
на мають більшу регенераційну здатність, ніж бруньки середньої
і апікальної частини [227]. Значному утворенню пагонів сприяє
горизонтальне розміщення сегмента, брунькою догори; крім то-
го, експлант слід злегка занурити у живильне середовище.
Експланти верхівки пагона і сегменти пагона при культиву-
ванні на середовищі Б8 з 1 мг/л НОК і кінетину утворюють ка-
лус. При субкультивуванні калусу на тому ж середовищі з 1,0 мг/л
ІОК і 0,1 мг/л БАП калус проліферує пагони і соматичні ембріо-
ни. Пагони укорінюють на базальному середовищі з 0,5 мг/л
ІОК або НОК. У рослин, що розмножені індукуванням пагонів
на калусі, генетичних порушень не виявлено [365].
Рослини-регенеранти 1—2 тижні утримують в умовах підви-
щеної вологості при 25 °С, потім пересаджують у субстрат із су-
міші піску і торфу (2:1).
Цибуля, часник (АІІіит сера, А. гаііуит)
Різні види цибулі, а їх налічують близько 450 видів, і часнику
значною мірою ушкоджуються вірусними хворобами, що знижує
урожайність, погіршує якість і сприяє виродженню цінних сор-
тів. Ціла низка даних [65, 227] засвідчує успішне застосування
МКР для оздоровлення посадкового матеріалу, розмноження но-
160
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
вих гібридних сортів і отримання поліплоїдних рослин. Опти-
мізовано живильні середовища і умови культивування, що спри-
яють органогенезу, підібрано експланти з найбільшим морфоге-
нетичним потенціалом.
Усі види цибулі (ріпчаста, шалот, порей) утворюють цибули-
ни із спеціалізованими запасаючими лусками і вкороченим стеб-
лом-денцем; в основі лусок і на денці є пазушні меристеми, які
при культивуванні іп уііго регенерують рослини.
У багаторічних видів цибулі (шніт, слизун, батун, духмяний)
псевдоцибулини утворюються тільки на кореневищі. Для вве-
дення в культуру використовують тканини денця цибулин, ба-
жано більшого розміру. Кореневища в культурі не регенерують
пагонів. Використовувати тканини можна в будь-яку пору року,
при цьому з однієї цибулини можна отримати 30—50 рослин-
регенерантів.
(З. Ни88еу [278] запропонував методику отримання аксилярних
і адвентивних пагонів з експлантів подвійних лусок цибулини і
рослин-регенерантів (10—15 мм завдовжки). Кожен експлант
утворює близько 10—20 адвентивних пагонів на 1/2 концентрації
середовища М8 з 1—4 мг/л БАП і 0,5 мг/л НОК. Пагони, що
утворилися, відділяють і видаляють деякі корені. Формування
цибулинок починається за 3—4 тижні у пагонів заввишки 8 см.
Подальшу проліферацію пагонів можна індукувати підрізанням
рослинок до 1 см.
Руйнування апекса під час цієї операції призводить до утво-
рення численних аксилярних і адвентивних пагонів в основі
листків. Пагони швидко укорінюються на середовищі з низькою
концентрацією регуляторів росту. Близько 60 тис. рослин можна
отримати з однієї цибулини протягом року [278]. Більшість із
них ідентичні материнським.
Крім того, для МКР різних видів цибулі можна використову-
вати тканини суцвіття. На квітколожі в основі квіток є меристе-
матичні зони, які в культурі іп уііго формують пагони [227].
Оптимальним для введення в культуру є період мікроспоро-
генезу і утворення одноядерного пилку. Зазвичай у цей час об-
гортка суцвіття ще закрита, пиляки зелені, а пізніше, на стадії
двоядерного пилку, при розкритій обгортці і жовтих пиляках от-
римати регенеранти не вдається. Цей обмежений період цвітіння
цибулі можна використати для розмноження міжвидових гібри-
дів, цінних селекційних сортів і від одного суцвіття отримати до
50—70 рослин, бо вся тканина здатна регенерувати пагони.
11-6-83
161
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Проліферація бруньок відбувається на середовищі ВГ)8 [198]
з 1 мг/л БАП. Адвентивні пагони або цибулинки утворюються
при культивуванні експлантів суцвіття при 28 °С і фотоперіоді
18 год. Експланти на середовищі М8 з ЗО г/л цукрози і 1 мг/л
БАП формують пагони, потім цибулинки; їх переносять на те ж
середовище з 120 г/л цукрози і 5 г/л активованого вугілля. Пря-
ма регенерація пагонів із суцвіть властива багатьом рослинам з
родини АПіасеае.
Для звільнення від вірусної інфекції використовують верхів-
кову меристему після зберігання маточних цибулин за низьких
температур (2, 5 °С). Експлант 0,5 мм регенерує лише одну росли-
ну на середовищі ВО8 з 0,1 мг/л БАП. Застосування піклораму
сприяє утворенню декількох пагонів.
Різним формам цибулі властиві свої морфологічні особливості
[65]. У цибулі шалот у пазухах листків закладаються бічні пагони
галуження (6—8 шт.); їх можна використати для вичленування
меристеми, яка у шалота злегка увігнута.
Сформована цибулина багатоярусної цибулі має 3—5 пагонів
галуження і пласку верхівкову меристему. Процес вичленування
апексів потребує певних навичок, бо у багатьох видів цибулі від-
сутні яскраво визначені морфологічні ознаки, що допомагають
відшукати меристему. Зазвичай останній примордіальний лист,
що має форму чаші, прикриває конус наростання. Вичленовують
експлант (0,5—0,8 мм), що містить апікальну меристему, зачаток
останнього листка і субапікальну тканину [65].
Кожен зубок часнику є пагоном галуження, соковита зов-
нішня луска прикриває зачаткові листки. З кожного зубка можна
ізолювати лише одну верхівкову меристему.
Меристеми конуса наростання кількох сортів часнику і ци-
булі-шалот на середовищі М8 з 4,5 % цукрози, 1,0 мг/л тіаміну і
аскорбінової кислоти, 3,0— БАП, 1,0 мг/л ІМК за 3—4 тижні
формують листки і зачатки коренів. Інші автори [227] пропону-
ють для малих експлантів часнику середовище Е8 з 0,1 мг/л
НОК або 0,01 мг/л НОК і БАП або 1 мг/л ІОК і БАП.
Експланти пагонів часнику (5—8 мм) проліферують адвентив-
ні пагони на середовищі В5 з 2 % цукрози, 0,5 мг/л 2-іР і
0,1 мг/л НОК. Укорінюють пагони на тому ж середовищі з
0,01 мг/л 2-іР і 0,2 мг/л НОК; цибулинки утворюються при суб-
культивуванні на середовищі з 0,1 мг/л НОК і БАП. Для культи-
вування меристем часнику використовують також середовище Е8
без ЬІН41ЧО3, з додаванням 187,3 мг/л ТЧН4С1 і збільшенні кон-
162
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
центрації КМО3 (5712,2 мг/л). На цьому ж середовищі з додаван-
ням 5 мг/л НОК, 10 мг/л БАП добре проліферують численні па-
гони. На середовищі Е8 з 60 г/л цукрози, без регуляторів росту
пагони утворюють цибулинки протягом 2 міс. Після цього листки
відмирають. Сухі цибулини перебувають у стані спокою і до ак-
тивного росту їх стимулюють зміною температур: 2 тижні витри-
мують при 35 °С, потім ще 2 — при 20 і 4 тижні — при 5 °С [227].
Калус на експлантах листків і апекса часнику утворюється на
середовищі М8. З додаванням 1,8 мг/л ІОК і 0,2 мг/л кінетину
пагони регенерують. Деякі регенеранти часнику, отримані з куль-
тури калусу, мають генетичні відхилення і можуть використову-
ватись у селекційній роботі [227].
Наведені дослідження можна покласти в основу методу МКР
різних видів цибулі і часнику. Використовують лише здорові ма-
теринські рослини.
Стерилізація вихідного матеріалу, цибулини звільняють від
сухих лусок і залишків коренів, обережно відрізують корені, аби
не ушкодити меристематичні зони. У багатолітніх кореневищних
видів цибулі слід ретельно відділити залишки кореневищ від ци-
булини, бо вони заважають росту експланта. Суцвіття викори-
стовують до розкриття обгортки. Матеріал промивають проточ-
ною, потім теплою мильною водою; занурюють у 75%-й етанол
на 3—5 с для кращого змочування і проникнення стерилізуючих
розчинів; переносять у ртутні препарати: 0,1%-й розчин сулеми
або діациду на 10—12 хв чи у 5—9%-й розчин гіпохлориту натрію
або кальцію на 10—12 хв; промивають у 3 порціях стерильної
дистильованої води; осушують між аркушами стерильного фільт-
рувального паперу.
Вичленування експланта'. зрізають луски цибулини і ділянки,
що були у стерилізуючих розчинах. Денце з залишками запасаю-
чих лусок розрізають на сегменти розміром 0,5 х 0,5 см. Суцвіття
звільняють від обгортки, квітки зрізають, квітколоже з залишка-
ми квіток розрізають на частини 0,5 х 0,5 см; усі частини суцвіт-
тя здатні до регенерації пагонів.
Для вичленування апікальної меристеми відділяють верхні
луски, обережно під бінокулярним мікроскопом видаляють ниж-
ні листки, звільняють меристему (0,5 мм) від покривних листків.
Умови культивування', експланти розміщують основою вниз
на модифікованому середовищі М8 і культивують при 20—25 °С,
освітленні 10—15 клк і фотоперіоді 16 год. За декілька діб екс-
планти і залишки лусок на денці збільшуються в розмірах, зе-
п*
163
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
леніють. На суцвіттях розростаються квітконоси і бутони. Через
2—3 тижні з’являються зелені пагони, які розміщуються групами
за лусками денця і в пазухах квітконосів. Пагони обережно відді-
ляють, причому важливо не пошкодити конус наростання, що
міститься в основі пагона. Краще відділяти пагони групами ра-
зом із тканиною, на якій вони регенерували.
Висаджують пагони на середовище з ІМК, де вони дорощу-
ються: в основі листків формуються потовщення і цибулинки.
Рослини відділяють і субкультивують на свіжому середовищі для
укорінення. За місяць у великих пагонів з’являються корені,
дрібні пагони дорощують ще 2—3 міс.
Пересадка в субстрат', рослини з добре сформованими коре-
нями висаджують у легкий ґрунт (перегнішдернова земля:пісок —
1:1:1). Під час подальших пересадок намагаються не пошкодити
кореневу систему. Для запобігання пересиханню рослини накри-
вають плівкою, полив помірний. За 2—3 тижні рослини можна
переносити в польові умови.
Бобові (І_едшпіпо8ае)
Клональне розмноження бобових застосовують головним чи-
ном для полегшення гібридизації, генної трансформації або
збільшення генетичної мінливості. Культура меристематичних
апексів сприяє звільненню материнських рослин від вірусів.
Тривалі дослідження дали змогу досягти успіху у МКР деяких
видів бобових [227]. Регенерація рослин відбувається переважно
через калусну культуру. Особливо важко ініціювати органогенез
у зернобобових. Розроблено спеціальні живильні середовища, які
містять (порівняно з середовищем М8) менше азотистих сполук,
а більше фосфатів і сульфатів. Середовище В5 розроблено для
суспензійної культури сої: калус сої краще росте, коли концент-
рація іонів ІЧНд у середовищі М8 знижена на 1/3. Зараз у куль-
туру введено близько 20 видів зернових і трав’янистих бобових
рослин.
Арахіс (Агасіїіз Ьуродаеа)
Технологія культури тканин арахісу допомагає виростити де-
які цікаві гібриди, які важко отримати гібридизацією.
Морфогенний калус досить легко утворюється з різних екс-
плантів на середовищі М8, але найкращими експлантами є мо-
164
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
лоді листочки (2—5 мм). Оптимальна регенерація бруньок відбу-
вається при додаванні по 1 мг/л НОК і БАП. На сегментах лист-
ка 8—13 мм регенерація незначна і зовсім відсутня на повністю
розкритих листках. Пагони утворюються і ростуть на середовищі
з 0,01 мг/л НОК і 1 мг/л БАП, а укорінюються без регуляторів
росту. Експланти можна брати як з молодих сіянців, так і з до-
рослих рослин. Морфогенний калус формується на сегментах
коренів, котиледонів, взятих із сухого насіння. Рослини-регене-
ранти отримують з експлантів котиледонів несумісних міжвидо-
вих гібридів Насіння стерилізують і розкладають на живильне се-
редовище. Під час проростання утворюються групи адвентивних
і пазушних пагонів, які можна відділяти і субкультивувати на
тому ж середовищі. Численні паростки проліферують з калусу,
що утворюється при культивуванні верхівок пагонів арахісу [227].
Боби (Уісіа ТаЬа)
Отримали культуру калусу на експлантах недозрілих ембріо-
нів і верхівок асептично вирощуваних сіянців на середовищі з
4,5 ммоль 2,4-Д. Регенерація ембріоїдів і адвентивних бруньок
відбувалась на тому ж середовищі з ауксинами і цитокінінами.
Найкращим виявилось середовище М8В з 0,1 ммоль НОК і
5 ммоль зеатину. Укорінення пагонів відбувалось на цьому ж се-
редовищі без регуляторів росту [227].
Горох (Різит заііуит)
Клональне розмноження гороху можливе через морфогенний
калус і прямий органогенез. У культуру вводять головним чином
експланти із сіянців.
Меристематичні верхівки стебла на середовищі В5 з 0,1 мг/л
БАП і 0,2 мг/л НОК проліферують пагони, які укорінюють на
середовищі В5 з 0,2 мг/л НОК. Ця техніка дає змогу звільнити
рослини від деяких вірусів [299], що передаються з насінням.
Апекси пагона і латеральні бруньки сіянців утворювали численні
пагони на середовищі М8 з 4,5 мг/л БАП, 0,2 мг/л НОК і
вітамінами за Гамборгом. Рослини укорінюють на тому ж сере-
довищі з 0,93 мг/л НОК [240].
Експланти епікотиля і бруньки сіянця здатні утворювати
морфогенний калус на середовищі М8 з 2 мг/л НОК і 0,5 мг/л
НОК або на середовищі 2іу з 2,8 мг/л НОК (або 0,5—2,0 мг/л
165
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
2,4-Д) * 1 мг/л БАП [279]. Регенерація пагонів відбувається при
перенесенні калусу на середовище з 0,25 мг/л ІМК і 1 мг/л БАП.
Регенеративний калус утворюється при інкубації апексів пагона
сіянця на середовищах В5 (20 г/л цукрози) або М8 (ЗО г/л цук-
рози) з 2 мг/л НОК і 0,05—1,1 мг/л БАП. Помічено, що на сере-
довищі В5 проліферують міцніші і більші пагони.
Прямий органогенез пагонів на експлантах недозрілих ембріо-
нів, бруньок і сегментах епікотиля отримано на середовиші М8 з
1 мг/л НОК, 3 мг/л БАП і 7 % кокосового молока (цит. за: [227]).
Адвентивні пагони регенерували на експлантах 3-добових лист-
ків на середовищі М8 з вітамінами за Гамборгом і додаванням
0,2 мг/л НОК і 2,2 мг/л БАП або по 2 мг/л ІОК і кінетину [299].
Подібний результат отримали і з 15-добовими листками: ут-
ворюється мінімальний калус, який на тому ж середовищі з
2,2 мг/л БАП і 1,9 мг/л НОК, 2 мг/л ІМК або 1,8 мг/л ІОК
проліферує пагони. Експланти культивують на світлі, бо в тем-
ряві формуються лише корені [227].
Дослідження морфогенетичної здатності 26 генотипів гороху
виявило різницю у інтенсивності і швидкості утворення калусу.
Підтверджено вплив генотипу на органогенез і соматичний емб-
ріогенез. Виявлено зразки гороху з високим морфогенетичним
потенціалом іп уііго [36].
Соя (Сіусіпе тах)
У багатьох країнах соя займає великі площі і використову-
ється як джерело протеїну і олії. Рослини добре самозапилюють-
ся, але часто гібриди не дають життєздатного насіння.
Тривалий час досліди з МКР сої не давали успіху. Важко бу-
ло отримати рослини з калусу при соматичному ембріогенезі.
Виявилось, що калус і суспензійна культура бобових добре росте
лише за низької концентрації солей амонію (середовище В5). У
суспензійній культурі сої на цих середовищах з’являються емб-
ріоїдоподібні структури. У експлантів сіянців можна індукувати
калус, але важко отримати паростки [227].
Подальші дослідження показали, що соматичний ембріогенез
можна ініціювати у цілої низки генотипів, якщо вводити в куль-
туру експланти недозрілих соматичних ембріонів, особливо ко-
тиледони [130, 320].
Для культивування найчастіше використовують середовища
М8, В5 з 10—30 мг/л НОК або 2,5—10,0 мг/л 2,4-Д. Крім того,
166
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
концентрація 2,4-Д може бути різною: 4,9, 2,5, 40,0 або 1 —
2 мг/л [130, 227, 360].
Немає чіткої рекомендації щодо концентрації цукрози у жи-
вильному середовищі. Одні автори додають до середовища 1.2 з
0,6 мг/л 2,4-Д 20 г/л цукрози або 15 г/л глюкози, інші викори-
стовують середовище М8 з 5 г/л активованого вугілля і 96 г/л
цукрози, ще інші культивують ембріоїди на середовищі Шенка і
Хільдебрандта з 9,6 г/л цукрози [227]. Можна також вирощувати
експланти котиледона на рідкому середовищі М8 з 0,12 мг/л
ІМК і 0,16 мг/л АБК у ротаторі (60 об/хв). Пізніше ембріоїди
переносять на середовище без регуляторів росту, де вони розви-
ваються [264].
Пряму проліферацію пагона на експланті гіпокотиля О. Ю-
тепііііа і С. сапепксепк отримано на середовищі М8 з БАП і
НОК [227]. Пагони відділяють і укорінюють.
Для того щоб запобігти утворенню калусу, сегменти стебла
розміщували на базальному середовищі без регуляторів росту на
20 діб, а потім переносили на те ж середовище з 5 мг/л ІМК і
1,1 мг/л БАП для індукції пагонів. Експланти вузла сіянців культи-
вували на середовищі В5 з 5,6 мг/л БАП, а потім на цьому ж се-
редовищі з 5 мг/л ІМК і 1—11 мг/л БАП, унаслідок чого утворю-
вались бруньки і пагони. Надалі пагони переносили на середови-
ще з 0,2 мг/л БАП, в якому продовжувалась їх проліферація [360].
Конюшина (ТгИоІіиіп 5рр.)
Клональне розмноження конюшини використовують пере-
важно для звільнення маточних рослин від вірусної і грибкової
інфекції, а також з метою створення корисних генетичних
варіантів для селекції.
Прямий органогенез отримано при культивуванні меристе-
матичних верхівок пагонів Т. герепк і Т. ргаіепке [227]. Культи-
вують експланти на середовищі Міллера з 0,2 мг/л ІОК і 2-іР
або на середовищі М8 з 0,2 мг/л БАП і 3 % цукрози за низької
температури (2—6 °С) у темряві або за освітлення 300 лк. Про-
ліферують адвентивні бруньки і пагони, звільнені від вірусної
інфекції.
Морфогенез конюшини залежить від генотипу рослини, і
ініціювати його регенерацію дуже важко.
За даними N. Масіеап і К. Ьіоу/ак [329], з 642 генотипів
Т. ргаїепке лише 3 були здатні регенерувати рослини з калусу гі-
167
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
покотили. Дослідження морфогенної здатності експлантів 4 ге-
нотипів Т. ргаіепке показали, що сегменти гіпокотпля, сім’ядоль-
ного листка, живця рослин, які виросли в асептичних умовах,
здатні до морфогенезу. На середовищах В5, М8, Б8 усі експлан-
ти утворювали калус. На середовищі Б8 з піклорамом (0,06 мг/л)
і БАП (0,1 мг/л) відбувався морфогенез пагонів. Утворення ембрі-
оїдів проходило на середовищі Б8 з 0,01 мг/л 2,4-Д і 2 мг/л
аденіну. Розвитку ембріоїдів і утворенню регенерантів сприяло
додавання піклораму (0,02 мг/л) і БАП (0,2 мг/л). Укорінення
відбувалось на середовищі з 0,2 мг/л НОК. Приживлюваність
рослин-регенерантів становила 90 %. Деякі рослини утворили
життєздатне насіння [67].
Люцерна (Месіісадо заііуа)
Техніку МКР люцерни вивчають, вдосконалюють і викорис-
товують головним чином як альтернативний метод при селекцій-
ній роботі.
Калус, здатний до регенерації рослин, отримано з різних ор-
ганів: недозрілої зав’язі, бруньки, зародка або частин сіянця. Ор-
ганогенез відбувається проліферацією адвентивних пагонів або
соматичних ембріоїдів. Інколи на одному шматочку калусу від-
буваються обидва види морфогенезу. Проростки, то з’являються
на калусі люцерни, проходять через ембріогенез.
Соматичні ембріоїди формуються на калусі на середовищі
8Н з низькою (50 ммоль) концентрацією іонів амонію, проліну
або аланіну [227]. Проліферації рослин з ембріоїдів сприяє дода-
вання до середовища мальтози або глюкози (замість цукрози).
На середовищі В5 з 0,2 мг/л НОК і 2-іР верхівки люцерни
регенерували пагони. Культури витримували 15—18 міс при 2—
4 °С і 300 лк, фотоперіод 8 год [162]. Морфогенна активність екс-
плантів люцерни значною мірою залежить від генотипу мате-
ринської рослини.
ЗЛАКОВІ КУЛЬТУРИ
У зв’язку з тим що більшість злаків і кормових трав легко
розмножуються насінням, отримання культури тканин іп уііго
злаків, індукцію в них органогенезу і регенерацію зелених рос-
лин використовують лише як основу для генної інженерії і ство-
рення трансгенних рослин, прискорення утворення нових сортів
168
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
за рахунок гаплоїдів і гомозиготних ліній подвійних гаплоїдів
при культивуванні пиляків і мікроспор. Останнім часом досяг-
нуті великі успіхи в розробці методів отримання калусних або
суспензійних культур злаків, здатних до регенерації і ембріоге-
незу. Такий прогрес став можливим завдяки використанню екс-
плантів, що містять меристематичні зони (кінчики кореня, при-
мордії пагонів, основи молодих листків, зародки, суцвіття) та
нових середовищ, розроблених на основі середовищ М8 та Сйи
N6 [170, 172].
Лише молоді, новоутворені листки або базальні частини ли-
стків злакових, які активно ростуть, можуть формувати калус в
умовах іп уііго [525]. У процесі отримання калусних культур із
тканин злакових встановлено, що найкраще утворюється калус із
щитка, клітини якого здатні до проліферації іп уіїго [238], або з
тканин мезокотиля [411]. У різних видів злакових оптимальна
орієнтація щитка відносно поверхні живильного середовища мо-
же бути різною.
Для отримання ембріогенних калусів злакових використову-
ють середовища, в основу яких покладено середовища М8 [115,
170—172], Огееп [237], Сагтап [158] (досить часто з подвоєною
концентрацією солей), а також СЬи N6 [170].
Для стимуляції утворення ембріогенного калусу злакових се-
редовище М8 часто доповнюють гідролізатом казеїну (100—
200 мг/л), казамінокислотами (500 мг/л) і/або глютаміном
(500 мг/л) [495].
Найкращий ріст калусу із зародків ячменю, жита і вівса спо-
стерігали у разі контакту щитка із середовищем [199], а із за-
родків кукурудзи — коли щиток був орієнтований назовні [239].
Відповідно до сучасних уявлень основний спосіб регенерації
у Огатіпеае — це соматичний ембріогенез і утворення таких
морфогенетичних структур, як адвентивні пагони, що в багатьох
випадках беруть початок із соматичних проембріо. Появу зеле-
них листкоподібних структур, із яких іноді утворюються пагони,
зв’язують із розростанням щитка соматичних зародків, що перед-
часно проростають і дають початок багатьом точкам росту па-
гонів [497], які можна укорінювати.
Для ембріогенезу спочатку потрібно отримати ембріогенний
калус. Перед індукцією морфогенезу на калусах злакових можна
спостерігати зелені ділянки. Дисперсне їх розміщення серед не-
диференційованої тканини пояснюють швидшою проліферацією
дедиференційованих клітин, які знаходяться поруч із зеленими
169
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ділянками [265, 266]. Останні вважають центрами синтезу регу-
ляторів росту, завдяки чому створюються їх градієнт і індукція
соматичних зародків.
Як згадувалось раніше, найпоширенішим способом отриман-
ня ембріогенного калусу злаків є використання незрілих зародків
[75, 82, 94, 95, 447|. Найчастіше калус утворюється із щитка,
іноді з епібласта. З експлантів одного походження можуть утво-
ритися калуси з різним ембріогенним потенціалом. Ознаки емб-
ріогенного калусу у різних видів злакових різні. Для його індук-
ції (стадія І) використовують середовище з ауксином, найчастіше
з 0,2—1,0 мг/л 2,4-Д або одночасно 2,4-Д і ІОК (1,8 мг/л) чи
НОК (1 мг/л). Для деяких видів замість 2,4-Д додають піклорам
або дікамбу.
Експланти незрілих зародків іноді замість утворення калусу
передчасно проростають. Для попередження цього явища у сере-
довище вносять 0,1—0,5 мг/л АБК [158]. Соматичний ембріоге-
нез іноді вже спостерігають на середовищі стадії 1, але, як пра-
вило, для утворення соматичних зародків ембріогенний калус
переносять на середовище стадії П. В останньому зменшують
концентрацію ауксинів (часто замінюють 2,4-Д на “більш легко
діючу” ІОК) і додають цитокініни (0,5—1,0 мг/л БАП, 0,2—5,0 —
кінетину, 1 мг/л 2-іР чи зеатину). Є відомості, що внесення в
середовище для індукції калусу нітрату срібла (100—200 мкмоль)
збільшує вихід рослин-регенерантів із ембріогенного калусу ку-
курудзи [194, 195].
У деяких випадках, наприклад при індукції утворення сома-
тичних зародків з калусу, отриманого з незрілих зиготичних за-
родків кукурудзи [342], у середовище стадії II не вносять регуля-
тори росту.
Для цього процесу має значення створення оптимального
водного потенціалу середовища й осмотичного тиску. Останній
(для стадії II) створюється за рахунок підвищеного вмісту цукро-
зи (50—60 г/л), або цукрози (20 г/л), манітолу (30 г/л) і 50 г/л
поліетиленгліколю з молекулярною масою 8000 [154].
Регенерація рослин із калусних тканин кукурудзи
Здатність соматичних клітин кукурудзи до проліферації іп
уііго, калусоутворення, органогенезу і регенерації рослин є осно-
вою нових підходів до прискорення селекційного процесу і за-
стосування методів генної інженерії для поліпшення цієї культу-
170
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
ри. Як первинні експланти найчастіше використовують недозрілі
зародки [94, 238, 485]. В умовах культури іп уііго утворюється
калус, інтенсивність росту і регенераційна здатність якого зале-
жать від генотипу. Деякі автори описують утворення різних типів
калусів, що відрізняються як зовнішнім виглядом, так і здатніс-
тю до регенерації. Так, Т.Н. Чеченєва [94] спостерігала форму-
вання калусів трьох типів: І — компактний, щільний, білий ка-
лус з ділянками зеленуватого кольору, здатний до органогенезу;
II — пухкий, світло-жовтий з позеленілими ділянками, в якому
формуються ембріоїди; III — безкольоровий калус, позбавлений
регенераційного потенціалу. Регенерація рослин з калусів І та II
типів відбувається внаслідок морфогенезу пагонів та соматично-
го ембріогенезу [94, 238]. Встановлено, що існує генетичний
контроль регенераційної здатності у кукурудзи [95, 475].
Найчастіше використовують недозрілі зародки рослин куку-
рудзи розміром 1,0—1,5 мм і віком 12—14 діб після запилення.
Для культивування ізольованих зародків використовують середо-
вище М8 [94, 238] з додаванням 1,0—1,2 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л ас-
парагіну і ЗО г/л цукрози. Культивування проводять у пробірках
(по два зародки на пробірку) з 10 мл середовища при 23 ± 1 °С і
фотоперіоді 16 год.
Калусні культури культивували [94] до регенерації 60—90 діб,
а в окремих випадках — до 9 міс. Перенесення калусної тканини
на таке ж середовище без 2,4-Д і аспарагіну, але з додаванням
0,1 мг/л НОК і зменшеним вмістом цукрози (20 г/л) стимулюва-
ло в умовах освітлення утворення рослин-регенерантів і форму-
вання коренів. Рослини з досить розвиненою кореневою систе-
мою і листочками пересаджували в посудини з ґрунтовою суміш-
шю і декілька діб витримували у вологій камері при 22—24 °С,
освітленні 2000—2500 лк і фотоперіоді 16 год. Через 2—3 тижні
рослини висаджували у вегетаційні посудини і дорощували до
зрілого стану в теплиці.
Здебільшого для регенерації з калусу кукурудзи немає потре-
би в наявності у середовищі цитокінінів, але за певних умов їх
застосування ефективне [50]. В інших випадках пропонують піс-
ля культивування протягом 2—3 пасажів на середовищі з 2,4-Д
переносити калуси на регенераційне середовище без нього, але з
додаванням БАП (3,5 і 5,0 мг/л). Калуси на середовищі з БАП
витримують в умовах освітлення упродовж 7—8 діб, після чого
переносять на середовище без БАП і 2,4-Д і до кінця пасажу
спостерігають утворення рослин-регенерантів.
171
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Суспензійна культура пшениці
як джерело соматичних зародків
В останнє десятиліття інтенсивно розробляють методи отри-
мання ембріогенних суспензійних культур злакових і кормових
трав, вирощених з ембріогенних калусів.
Регенерацію нормальних рослин пшениці із суспензійних
культур спостерігали багато дослідників [99, 506]. Метод, розроб-
лений А. АЬиіа [99], полягає в тому, що спочатку отримували
калус із основи листків асептично вирощених проростків пше-
ниці на середовищі М8 з 2 мг/л 2,4-Д, який потім пересаджува-
ли на це ж середовище з нижчим вмістом ауксинів (0,05 мг/л
НОК) та цитокінінів (0,5 мг/л БАП). Калуси, що швидко росли
на цьому середовищі, переносили в рідке середовище М8. Сере-
довище змінювали кожні 3 тижні, поки не утворювалась од-
норідна суспензія клітин, яку підтримували субкультивуванням
кожні 2 тижні (суспензію ділили на 3 рівні частини і додавали
свіже середовище до початкового об’єму). Через 4 міс клітини
переносили на тверде середовище М8 з 0,05 мг/л НОК та
0,5 мг/л БАП. При культивуванні в умовах освітлення (700 лк)
спостерігали утворення зелених рослин-регенерантів. Автори за-
значають, що мала місце поява альбіносних і строкатих рослин.
Ембріогенну суспензійну культуру використовують у дослід-
женнях з метою застосування селекції клітин, стійких до стресо-
вих факторів навколишнього середовища і фітопатогенів. Однак
при культивуванні клітин у вигляді суспензії швидко накопичу-
ються цитологічні і каріологічні порушення, які спричинюють
втрату здатності до морфогенезу і регенерації, появу альбіносних
рослин тощо. Культури тканин злакових через декілька місяців
можуть втратити здатність до морфогенезу.
XV. ХУап§ і Н. М§иеп [506] запропонували свій метод отриман-
ня і культивування ембріогенної суспензії Тгіїісит аеМіуит, яка
зберігає здатність до регенерації протягом декількох років. Калу-
си формувались із незрілих зародків пшениці (сорт Мустанг) на
середовищі М8 з 1 мг/л 2,4-Д. Молоді калуси розрізали на дрібні
шматочки (0,2 мм) і переносили в рідке середовище такого ж
складу (2 г калусу на 10 мл середовища). Після культивування
протягом 3—4 тижнів кожні 2 тижні додавали 5—10 мл свіжого
середовища. Вільноплавні клітини відкидали. Агреговані фракції
переносили в середовище зі зменшеною концентрацією ауксину
(0,25 мг/л 2,4-Д) або культивували упродовж 3 міс без додавання
172
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
свіжого середовища. Суспензію проціджували, відбирали і відки-
дали клітинні агрегати з корінцями. Агрегати без корінців, що
могли бути компетентними до утворення пагонів протягом 2 міс,
субкультивували кожні 3—4 тижні додаванням свіжого середови-
ща М8 з 0,25 мг/л 2,4-Д, замінюючи 2/3 суспензії цим середови-
щем. Коли в суспензії починався активний поділ клітин, період
субкультивування зменшувався до 10—14 діб. Під час висіву цієї
суспензії клітин на середовище М8, що містить 0,1—0,25 2,4-Д,
отримували калуси, які переносили на таке ж середовище з
0,1 мг/л 2,4-Д для їх росту, а потім на середовище М8, розбавле-
не вдвічі і без гормонів, — для укорінення пагонів.
Органогенез у культурі
ІП УІІГО пиляків і мікроспор
Культура іп уіїго пиляків пшениці. Створення гаплоїдів і гомо-
зиготних подвоєних (сІоиЬІесі) гаплоїдних ліній через культуру іп уії-
го пиляків або мікроспор може значно прискорювати виведення
нових сортів [451]. Культуру пиляків використовують при селекції
таких основних культур, як пшениця, ячмінь, рис, ріпак і картопля.
Гаплоїдні й дигаплоїдні рослини використовуть також у фун-
даментальних генетичних дослідженнях, оскільки в них експре-
сія рецесивних генів має фенотипний прояв. Вони можуть бути
матеріалом для картування геному, генетичного аналізу кількіс-
них ознак, вивчення взаємодії генів. Використання гаплоїдів має
переваги при геномному аналізі, дослідженні еволюції геномів та
багатьох інших теоретичних питань сучасної генетики.
Однак рутинному використанню методу культури пиляків
перешкоджає чітка залежність індукції ембіроїдів і регенерації
зелених рослин від генотипу [339]. У багатьох генотипів вихід
гаплоїдних рослин занадто низький для використання в прак-
тичних цілях, тому для створення нових сортів вплив генотипу
на ембріогенез і регенерацію потрібно зменшити внаслідок удос-
коналення методу. Основним фактором, що визначає успіх засто-
сування культури пиляків для отримання гаплоїдів у пшениці, є
середовище для індукції ембріоідів. Існує декілька модифікацій
стандартних середовищ для підвищення частоти індукції ембірої-
дів і регенерації зелених рослин.
Не дивлячись на інтенсивне (екстенсивне) дослідження і на-
копичення даних щодо андрогенезу у пшениці, використання
подвійних гаплоїдів у селекції пшениці дуже обмежене і для їх
173
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
отримання застосовують інші методи, наприклад схрещування
пшениці з кукурудзою. Причиною недостатнього використання
андрогенезу є низький рівень регенерації, який не може забезпе-
чити потреби практичної селекції. Низький рівень регенерації, в
свою чергу, є, можливо, результатом недостатньо розробленого
методу культури тканин або особливостей генотипу. Створюєть-
ся враження, що для отримання достатньої кількості подвійних
гаплоїдів через андрогенез потрібно оптимізувати умови культи-
вування для кожного окремого генотипу.
Для індукції андрогенетичної відповіді в культурі пиляків
пшениці використовують цілу низку середовищ для індукції, та-
ких як СЬи N6 [172], XV14 [380], СЬи 90 [170], а також середови-
ща з компонентами невизначеного складу, наприклад середови-
ща з екстрактом картоплі Р2 і Р4 [380].
Встановлено, що середовище XV14 забезпечує утворення ве-
ликої кількості ембріоподібних структур у культурі пиляків яро-
вої та озимої пшениці. М. Риоіітаїка і Ь. Раик [387, 406] викори-
стовували середовище XV14 з додаванням 2,0 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л
кінетину та 100 г/л цукрози (рН 6,0). За даними цих авторів, се-
редовище XVI4 може утворювати багато подвійних гаплоїдів у
широкого спектра генотипів пшениці. Встановлено, що на вихід
ембріоподібних структур і кількість зелених регенерантів впливає
тривалість періоду індукції. Кількість ембріоподібних структур,
здатних до регенерації, та зелених регенерантів була найвищою
за тривалості періоду індукції 6—7 тижнів.
Середовище ХУ14 містить сульфат натрію і не містить нітрату
амонію, чим істотно відрізняється від середовищ СЬи N6 та СЬи 90.
В. ОгкИіпкку [378] вивчав вплив трьох різних середовищ на
індукцію ембріоїдів, регенерацію рослин і частоту спонтанних і
індукованих подвоєнь хромосом на прикладі 10 сортів ярової
пшениці. Вихідне середовище для культури пиляків N6 модифі-
кували зменшенням у 2 рази концентрації основних компонентів
і використанням глюкози замість цукрози як джерела вуглецю.
Друге середовище — МИ6 — це модифіковане середовище N6 з
мальтозою. Основний компонент третього середовища Р4, опи-
саного Н. ХЬои та співавт. [526, 527], — екстракт картоплі.
Пагони відбирали в період розвитку мікроспор середньої або
пізньої одноядерної стадії, стерилізували 70%-м етанолом і у
стерильних умовах вилучали колос. Пиляки фарбували ацето-
карміном і розглядали під мікроскопом для перевірки стадії роз-
витку мікроспори перед культивуванням, а потім переносили в
174
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
пластмасові чашки Петрі (10 х 35 мм), які містили 2 мл середо-
вища. Усього відбирали 45—60 пиляків на колос і по 15—20 пи-
ляків на чашку, культивували 7—8 тижнів. З 3—4-го тижня після
початку культивування чашки перевіряли через кожні декілька
діб, шоб встановити утворення ембріоїдів. Пружні, добре розви-
нуті ембріоїди діаметром 2—3 мм переносили в пластикові чаш-
ки Петрі розміром 20 х 100 мм з 25 мл агаризованого середови-
ща для регенерації [527]. Ембріоїди витримували в умовах тьмя-
ного флуоресцентного освітлення (16 год світла/8 год темряви на
добу) при постійній температурі 25 °С. Ембріоїди утворювались
через 3—4 тижні після посадки пиляків.
Аналіз отриманих оптимальних результатів засвідчує, що
культивування пиляків у середовищі N6 з мальтозою зумовлює
найвищу частоту індукції ембріоїдів у деяких сортів, а середови-
ще Сіїи 90 є найбільш ефективним для всіх сортів.
Автори відмічають, що ембріоїди, які утворюються найрані-
ше, є компактними і найкраще розвиненими. їх якість погіршу-
ється в більш пізні строки індукції: вони дрібні і погано розви-
нені. Трохи більше ніж 10 % ембріоїдів, що утворилися на сере-
довищах N6 і Р4, регенерують зелені пагони. Є відомості [417],
що вихід подвійних гаплоїдів пшениці в культурі пиляків можна
збільшити за допомогою колхіцину.
Культура мікроспор пшениці. Останнім часом культура ізольо-
ваних мікроспор набуває все більшого значення для індукції га-
плоїдних рослин пшениці [273]. Порівняно з культурою пиляків
і індукцією гаплоїдів іп уіуо, культура мікроспор має декілька
цінних переваг. Насамперед треба відмітити, що при викорис-
танні культури ізольованих мікроспор можна спостерігати під
мікроскопом процес їх андрогенного утворення, починаючи з
самих ранніх стадій розвитку, індукцію зародків і диференціа-
цію. Оскільки культура ізольованих мікроспор дає можливість
прямого доступу до зародків, що розвиваються, вони можуть бу-
ти об’єктами для переносу генів [524]. Мікроспори або молоді
зародки також можна використовувати в дослідах з клітинної
селекції [283, 284]. Аналіз і оптимізацію факторів, які є критич-
ними для індукції андрогенних зародків і раннього їх розвитку,
можна робити тільки при культивуванні мікроспор. У деяких
видів кількість зародків на пиляк при використанні культури
ізольованих мікроспор вище, ніж при культивуванні пиляків.
Для отримання ембріогенезу з мікроспор [314] відбирають
колоски з донорних рослин, вирощенних у теплиці (фотоперіод
175
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
16 год, температура вдень 19, вночі 14 °С) і піддають їх дії холоду
(3—14 діб, 4 °С, темрява). Після поверхневої стерилізації 70%-м
етанолом із центральної частини колоса відділяють лусочки. Пи-
ляки з мікроспорами в пізній одноядерній чи ранній двоядерній
стадії видаляють і витримують у 3 мл середовища для промиван-
ня. Мікроспори вивільняють у середовище після продавлювання
пиляків стерильним предметним склом. Суспензію мікроспор ще
більше розбавляють додаванням 10 мл середовища для проми-
вання, фільтрують крізь сито в 100 мк меш і центрифугують З хв
при 65§. Осад обережно ресуспензують у 2 мл індукційного сере-
довища і переносять у чашки Петрі (35 х 10 мм). У кожній чашці
міститься приблизно 8 х 104 мікроспор, виділених із 80 пиляків.
Культури інкубують у темряві при 27 °С без покачувань. Сфор-
мовані зародки переносять на тверде середовище М8 для регене-
рації [263] з 0,3 % Фітогелю, де при 27 °С і 16-годинному освіт-
ленні відбувається регенерація гаплоїдних або спонтанно подвій-
них гаплоїдних рослин.
Хоча при культурі ізольованих мікроспор частота утворення
ембріоїдів у 20 разів більша, ніж при культурі пиляків [418],
вихід зелених рослин-регенерантів на 100 зародків не підвищу-
ється однаковою мірою. Відмічено, що найбільший їх вихід має
місце, коли зародки переносять на регенераційне середовище
через 25 діб після виділення мікроспор. Якщо розмір зародків
перевищує 4 мм2, утворюється в 2 рази більше зелених рослин,
якщо менше 1 мм2 — можна отримати тільки декілька рослин-
регенерантів. Витримування культури зародків на середовищі
для індукції до 45 діб викликає різке зниження ефективності
регенерації. Від розміру зародків залежить також частота утво-
рення альбіносних рослин. У дослідах С. Кип/ [314] найбільша
ефективність регенерації спостерігалась тоді, коли зародки, що
утворились із мікроспор, переносили на регенераційне середо-
вище відразу після 25 діб культивування на середовищі для
індукції. Крім того, із зародків, розмір яких перевищує 4 мм2,
помітно більше утворюється здорових рослин-регенерантів і
менше — альбіносних, ніж із зародків, менших за розмірами.
Для отримання мікроспор використовують метод високоча-
стотного перемішування або розтирання (тіхіп§ ог ЬІепбіп§), а
також метод роздавлювання пиляків накривним склом. За допо-
могою останнього можна отримати гомогенну популяцію мікро-
спор без домішок, що дає змогу обійтися без центрифугування в
градієнті щільності.
176
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
Культура пиляків жита. У практиці застосування технології
отримання подвійних гаплоїдів жита (8еса1е сегеаіе І_.) існують
труднощі, пов’язані зі слабким утворенням калусу і ембріоїдів,
низькою часткою ембріоїдів, які дають початок рослинам, і ве-
ликою — альбіносних рослин серед рослин-регенерантів. Порів-
няно кращі результати отримують при використанні ліній жита,
які мають у своєму родоводі 8. уауііопіі [181], однак низка неба-
жаних ознак, таких як самозапилювання, робить ці лінії непри-
датними до використання у селекції жита.
Останнім часом вдалося відібрати деякі лінії жита, які дають
досить високий рівень регенерації зелених рослин при викори-
станні методу культури пиляків [262, 273, 280]. 8. Іттопеп і
Н. Апйііа [280] вивчили вплив складу середовища і густоти по-
садки пиляків на 1 см2 чашки Петрі на регенерацію зелених рос-
лин у культурі пиляків жита.
Насіння різних сортів жита висівали в горщики діаметром
14 см із сумішшю торфу з землею (3 насінини на горщик) і під-
живлювали 1%-м розчином 8ирегех (11 % ТЧ, 4% Р і 25 % К).
Озиме жито сіяли в жовтні, яровизація відбувалася в холодній те-
плиці протягом зими, після чого ріст здійснювався за температур-
ного режиму 20 °С вдень і 15 °С вночі, фотоперіоду 16 год при
денному світлі з досвічуванням флуоресцентними лампами, щоб
загальна інтенсивність світла досягала 350 мкм/(м2 с). Ярові сор-
ти висівали в березні і вирощували в подібних контрольованих
умовах теплиці. Колоски відбирали в період, коли мікроспори бу-
ли в середній або пізній одноядерній фазі. Пагони зрізали і від-
діляли усі листки, за винятком флатового. Пагони упаковували в
пластикові мішки і витримували 2 тижні при 4 °С, поставивши
стебла у воду. Перед виділенням пиляків визначали фазу розвитку
мікроспор, готуючи давлені препарати пиляків в ацетокарміні.
Колоски стерилізували збовтуванням протягом 20 хв у 12%-му
розчині гіпохлориду натрію з 0,5 % твін 80. рН середовища дово-
дили до 5,8 перед стерилізацією в автоклаві (15 хв при 121 °С).
Культивували в стерильних чашках Петрі діаметром 5,4 см.
Для індукції використовували середовище Ванг і Ху, 190—2
[506] з додаванням вітамінів і заліза за Мурашіге-Скугом [366],
9 мкмоль/л 2,4-Д, 2,3 мкмоль кінетину, 9 % мальтози і 3 % Фіто-
гелю (комерційний замінник агару). Культури витримували при
25 °С у темряві 8—10 тижнів. Ембріогенні калуси переносили на
середовище 190—2 з додаванням вітамінів за Мурашіге-Скугом,
0,27 мкмоль/л НОК і 2,2 мкмоль БАП для регенерації рослин.
12-6-83
177
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Культури після пересадки витримували при 21 °С і фотоперіоді
16 год/8 год (день/ніч) протягом 5 тижнів, після чого зелені рос-
лини висаджували в горщики із сумішшю торфу і землі.
Культура пиляків кукурудзи. В основі селекційної роботи з
кукурудзою лежить використання інбредних (чистих) ліній, ство-
рення яких триває 6—7 років. Для прискорення цього процесу
використовують гаплоїди, які у кукурудзи можуть з’являтися
спонтанно [163], та гаплоїдні рослини, вирощені з гаплоїдних
пилкових зерен через культуру пиляків.
Перші успіхи при використанні пиляків кукурудзи отримали
китайські вчені [309], однак тільки в останні роки ефективність
дослідження ембріоїдів андроген ного походження іп уііго значно
зросла [390]. Нижче наводимо метод культури пиляків і отримання
рослин-регенерантів, розроблений Т.Н. Сатаровою [80], в основу
якого покладено використання середовища Дженовезе ¥Р [225].
Донорні рослини кукурудзи для отримання пиляків вирощу-
вали в умовах ґрунтової теплиці в січні—березні за температури
повітря 22—27 °С і фотоперіоду 16 год. Рослини зрізали до вихо-
ду волоті з розтрубу листків. Холодову передобробку матеріалу
здійснювали при 8 °С протягом 14 діб у холодильнику. Впливу
холоду піддавали або волоті, загорнені в мокрі паперові рушники
і поліетиленові пакети, або висаджені на живильне середовище
пиляки — у цьому випадку ефективність холодової обробки була
вищою. Стадію розвитку пилку визначали в день посадки пи-
ляків на живильне середовище для кожної зрізаної волоті окре-
мо. Після передобробки холодом на центральному стрижні во-
лоті вибирали ділянки, що містили пиляки з пилковими зернами
на відповідній стадії розвитку, і тільки пиляки висаджували на
живильне середовище.
Для культивування відбирали пиляки на стадії вакуолізованої
мікроспори або молодого двоклітинного пилкового зерна (відра-
зу ж після закінчення диференціювального мітозу, до початку
переміщення ядра вегетативної клітини).
Стерилізацію вибраних ділянок волотей проводили насиченим
розчином хлорного вапна з додаванням декількох крапель детер-
генту твін 80 протягом 7 хв або 0,1 %-м розчином сулеми (10 хв),
після чого промивали в 5 порціях стерильної дистильованої води.
Основним середовищем для індукції ембріогенного калусу
було середовище Дженовезі ¥Р [225]. Пиляки по 50—70 штук
висаджували в культуральні посудини діаметром 40 мм і завдов-
жки 100 мм або у стерильні пластикові чашки Петрі діаметром
178
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
40 мм. Утворений через 6 тижнів ембріогенний калус пересаджу-
вали на середовище для диференціації ¥Р0 [390], що містило
7,7 мг/л гліцину, 500,0 — гідролізату казеїну, 1,0— ІОК, 1,0 —
кінетину, 146 мг/л глютаміну, 30 г/л цукрози, 2,5 — активова-
ного вугілля, 7 г/л агару “ПіГсо”. Після початку росту колеоп-
тилів і корінця проростки пересаджували на середовище ¥Рг
[390] для розвитку кореневої системи і пагону.
Культивування пиляків, ембріогенного калусу і рослин-реге-
нерантів проводили при 27 °С і фотоперіоді 16 год.
Рослини-регенеранти обробляли 0,05%-м розчином колхіцину
і висаджували в ґрунт або суміш ґрунту і піску (1:1).
Індукція калусоутворення і регенерація рослин рису
Хоча використання звичайних методів селекції істотно по-
ліпшило харчові властивості рису, вважають, що застосуванням
культури тканин і технологій, пов’язаних з генетичними маніпу-
ляціями, можна досягти подальшого прогресу в поліпшенні куль-
тури. Успіх таких технологій, спрямованих на отримання, напри-
клад, агрономічно-корисних трансгенних або соматичних гібри-
дів, залежить від вдалих систем регенерації, які можна легко від-
творити. Розроблена система індукції калусу рису і регенерації
рослин з нього [119]. Насіння рису Огуха каііуа Б. очищають від
лусок, стерилізують зануренням у 50 % (за об’ємом) відбілювача
“Доместос” на 30 хв і ретельно промивають стерильною водою,
потім розрізають упоперек і половину, що містить зародок, куль-
тивують у 20 мл напівтвердого середовища М8 у чашці Петрі
діаметром 9 см (10 експлантів на чашку). Чашки Петрі заклею-
ють за допомогою стрічки НексоГіїт. Середовище доповнюють
2,5 м/л 2,4-Д, 3 % мальтози і 0,4 % агарози, рН 5,8.
Культури витримували в темряві (28 ± 1 °С) для утворення
калусу. Через 14 діб корінці й пагони відкидали і калус, отрима-
ний із щитка, переносили на нове середовище ще на 21 добу за
тих же умов. Через 35 діб культивування ембріогенні калуси пе-
реносили в посудини з 20 мл напівтвердого середовища М8 (1 %
агарози), доповненого 20 мг/л БАП і 5 % цукрози, рН 5,8. Куль-
тури витримували при 28 ± 1 °С у темряві 10 діб перед перене-
сенням на таке ж середовище, але зі зменшеною концентрацією
(до 0,4 %) агарози; вирощували за постійного освітлення люмі-
несцентними лампами 30 діб при 26 ± 1 °С. Частота регенерації
пагонів була максимальною через 20 діб після перенесення тка-
12*
179
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
нини. Рослини укорінювали в посудинах на 175 мл. Кожна по-
судина містила 40 мл середовища М8 з 5 % цукрози, 1,5 мг/л
НОК і 0,2 % Фітогелю, рН 5,8. Рослини витримували 15 діб при
фотоперіоді 16 год.
Регенеровані рослини (кожна заввишки приблизно 9 см) ви-
ймали із середовища, корені ретельно промивали водою. Потім
пересаджували в пластмасові горщики діаметром 7,5 см, які
містили суміш двох компостів і перліту (компости Левінгтона,
Дж. Іннеса і перліт — 6:6:1), накривали прозорими накривками і
переносили в теплицю з температурними максимумами день/ніч
(28 ± 1 °С / 24 ± 1 °С відповідно). Вентиляційні отвори в накрив-
ках відкривали через 5 діб, а самі накривки знімали через 14 діб.
Рослини після цього забирали з приміщень, де їх вирощува-
ли, пересаджували в горщики діаметом 15 см із компостом того
ж складу і витримували в теплиці за природного освітлення при
фотоперіоді 16 год.
Регенерація райграсу з клітинної суспензії
Багаторічний райграс (Ьоііит регеппе Б.) інтенсивно вико-
ристовують як фуражну і дерноутворювальну траву. З метою до-
повнення традиційних методів селекції цієї культури методами
генної інженерії і створення трансгенних рослин інтенсивно роз-
робляються методи регенерації рослин із культур тканин. Є по-
відомлення щодо отримання трансгенних рослин райграсу з
використанням ембріогенної культури клітин. Кількість таких
рослин дуже мала (від 1 до 6), оскільки диплоїдні сорти, які най-
ширше використовують, мають низьку ембріогенну активність.
Р. АІЇреіег і БІ. РоккеИ [105] пропонують більш удосконалений
метод отримання ембріогенної культури клітин і регенерації рос-
лин, яка дає змогу виростити рослини-регенеранти багатьох ко-
мерційних сортів і ліній райграсу.
Насіння райграсу стерилізували 1 год у розчині N3001 (12,4—
13,0 % активного хлору) з додаванням 0,2 % твін 80 як поверхне-
во-активної речовини і промивали в 5 порціях автоклавованої
дистильованої води. Насіння намочували 48—72 год при 4 °С,
після чого ізолювали скальпелем зрілі зародки і подрібнювали їх.
Усі середовища (для отримання суспензії, її підтримки і
індукції органогенезу) містили макро-, мікроелементи і вітаміни
за Мурашіге-Скугом. У середовище для ініціації суспензії, щоб
уникнути некрозу первинних експлантів, не вводили БАП; його
180
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
додавали в середовище для пересадки в концентрації 0,25 мг/л.
рН середовища доводили до 5,8 перед автоклавуванням (1,2 бар
при 121 °С, 20 хв).
Середовище для регенерації містило солі й вітаміни за Мура-
шіге-Скугом, 0,1 мг/л ауксину (2,4-Д), 2 мг/л БАП і ЗО г/л вуг-
леводів (мальтоза). Для другої пересадки використовували се-
редовище без гормонів. У тверді середовища додавали Фітогель
(0,25 %). Суспензію клітин райграсу отримували із 10 подрібне-
них зародків у колбах Ерленмейера на 25 мл з 2,5 мл живильного
середовища. Через 12 діб додавали 2,5 мл свіжого середовища,
через 19 діб після ініціації культури — ще 5 мл і переносили
суспензію в колби Ерленмейера на 100 мл. Через 4 тижні після
ініціації культуральне середовище проціджували крізь сито
(500 мкм меш) і додавали свіже середовище (1:1). Послідовні пе-
ресадки робили щотижня, розбавляючи суспензію в пропорції
1:1 або 1:5 залежно від інтенсивності росту культури.
Для отримання регенерантів мікрокалуси культивували
З тижні на регенераційному середовищі 1, після чого пересаджу-
вали на регенераційне середовище 2, де вирощували ще 3 тижні.
Автори стверджують, що регенераційний потенціал суспензійної
культури клітин зберігається протягом 33 тижнів. Вони отриму-
вали до 488 зелених пагонів на 1 г сирої маси суспензії.
Отже, на початковій (ініціація культури) і завершальній (ін-
дукція органогенезу) фазах Р. Аііреіег і ІЗ. РоккеЙ [105] пропону-
ють використовувати середовище без цитокініну. Вони додавали
БАП через 4 тижні після ініціації суспензійної культури, що
значно підвищило частоту регенерації.
ТЕХНІЧНІ КУЛЬТУРИ
Метод культури ізольованих тканин, органів, клітин розроб-
лено для цілої низки технічних культур. Застосовують його го-
ловним чином для вирішення селекційно-генетичних проблем,
створення нових гібридів, прискорення селекційного процесу,
оздоровлення окремих генотипів та отримання трансгенних рос-
лин. Використовують загальновживану технологію МКР.
Найбільших успіхів досягнуто з культурою тканин тютюну,
що є унікальною і розповсюдженою моделлю для багатьох фізіо-
логічних, біохімічних і цитологічних досліджень. Перше пові-
домлення про клональне розмноження Місойапа (аЬасит з апі-
кальних меристем з’явилось ще у 1968 р. З метою звільнення від
181
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
вірусної інфекції культивували апікальні верхівки (0,4—0,6 мм),
що складались із меристематичного купола і примордіальних
листків. На рідкому середовищі Ь8 з 8 мг/л ІОК і 2,56 мг/л кіне-
тину протягом 3—4 тижнів проліферував калус і формувались
пагони. Калус утворювався й на сегментах пагонів і листків тю-
тюну з подальшою регенерацією рослин (цит. за: [44]). На видах
роду Місоїіапа проведено досліди віддаленої і соматичної гіб-
ридизації.
Певних успіхів досягли при культивуванні різних тканин со-
няшника (Неііапііїиз аппиз Ь.): сегментів листків, гіпокотиля,
апексів, пагонів. На середовищі М8 з 2,4-Д і БАП (по 0,2 мг/л)
усі типи експлантів із різною швидкістю проліферують калусну
тканину, здатну до морфогєнезу пагонів [236]. Експланти парен-
хіми стебла (завтовшки 2,5 мм) культивували на модифікованому
середовищі Уайта з 1 мг/л ІОК при температурі ЗО °С і освітлен-
ні 1 клк. За 8 тижнів проліферував калус, з якого формувались
численні пагони. Укорінення відбувалось на середовищі М8 або
Гамборга без регуляторів росту. Соматичний ембріогенез можна
індукувати на недозрілих зиготичних ембріонах на середовищі з
1 мг/л 2,4-Д або 3,3 мг/л дікамби і 90 г/л цукрози при культиву-
ванні експлантів у темряві. Подальше культивування на середо-
вищі М8 з ЗО г/л цукрози при освітленні 1500 лк (16 год) сприяє
утворенню пагонів [227].
Для створення цінних форм гречки, стійких до хвороб і стре-
сових чинників, розроблено метод отримання міжвидових гіб-
ридів гречки звичайної і диких видів гречки татарської за до-
помогою ембріокультури [79]. Визначено оптимальний термін
ізолювання недозрілих зародків, отриманих після запилення.
Розроблено схему поетапного подолання бар’єрів міжвидової не-
сумісності у гречки, що дає змогу вирощувати міжвидові гібриди
з цінними ознаками. Створено трансгенні рослини гречки, стійкі
до гербіциду фосфінотриацину. Запропонована методика отри-
мання трансгенних рослин уможливить вирощування цінних для
селекції сортів унаслідок інтродукції генів, які кодують важливі
ознаки.
Льон (Ііпит и5ІіаіІ55Ітит)
Перші досліди з культурою тканин льону було розпочато по-
над 25 років тому, але ще й досі нема чіткої методики його кло-
нального розмноження. Певні труднощі становить значна варіа-
182
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
бельність морфогенетичної реакції експлантів різних сортів льо-
ну, залежність від генотипу, складу живильного середовища, вуг-
леводів, фітогормонів, дії екзогенних факторів [9, 77, 78].
Вивчення регенераційної здатності 12 сортів льону-довгунцю,
районованних в Україні, виявило значні відмінності морфоге-
нетичного потенціалу. Експланти усіх сортів були здатні до про-
ліферації калусу, але надалі одні сорти утворювали корені, ін-
ші — індукували пагони. Отримати рослини-регенеранти деяких
сортів льону досить складно. Найбільш морфогенними були сор-
ти Белинка, Светоч, Могилевский 2, Л-1120; їх можна викори-
стовувати у подальшій селекційній роботі [9].
У культуру вводять сегменти гіпокотиля сіянців льону. На-
сіння стерилізують у 70%-му етанолі 1 хв, потім двічі — у 5%-му
розчині гіпохлориту натрію по 3 хв і 3 рази промивають стериль-
ною дистильованою водою. Пророщують на середовищі М8 (по-
вної або 1/2 концентрації) без гормонів, з 3 % цукрози і 0,8 %
агару. Використовують сегменти гіпокотиля (2—3 мм) 7-добових
проростків.
Культивують на середовищі М8 з 0,4 мг/л 2,4-Д і 1,6 мг/л
зеатину. За даними іінших авторів, для олійних сортів льону
найбільш морфогенними були середовища з додаванням 5 мг/л
2,4-Д (для сорту 8/есІебі ЗО) і 0,25 мг/л ТДЗ (для сорту Аіех)
[185]. Утворювались ембріоноподібні структури з подальшим
соматичним ембріогенезом. Експланти гіпокотиля, котиледона і
апекси пагонів льону на середовищі М8 з 10 ммоль БАП
проліферували калус .із численними бруньками і пагонами. Ри-
зогенез відбувався на середовищі В5 (1/2 концентрації) з
1 ммоль ІОК [178].
Останнім часом увагу дослідників привертає можливість от-
римання нових сорті в льону за допомогою методів генетичної
трансформації. Розробляються методи створення трансгенних
форм льону, стійких до дії важких металів, гербіцидів та хвороб
[77]. Проте методика отримання великої кількості трансгенних
рослин потребує под альших досліджень.
Стевія (ЗДеша геЬапФапа Вегіопі)
Стевія — ендеміч на культура Парагваю, листки якої містять
дитерпенові глікозщ їй, що у 300 разів солодші за цукор. Вве-
дення у виробництво нової для України рослини з метою отри-
мання низькокалорійного замінника цукру — стевіозиду — на-
183
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
самперед залежить від розробки раціональних способів її роз-
множення.
Співробітники Інституту цукрових буряків УААН тривалий
час досліджували методи МКР стевії. Для регенерації і розмно-
ження використовували різні органи і тканини (меристеми,
бруньки, сегменти стебла, листки), але для масового розмно-
ження в культурі іп уііго найбільш придати -"ми є апікальні і ла-
теральні меристеми, сегменти листка і стебла [41, 81].
Введення в первинну культуру експлант в стевії утруднюєть-
ся сильною контамінацією вихідного матеріалу, яка залежить від
фази розвитку рослини. Найкращим терміном для добору екс-
плантів є середина вегетації. Пазушні верхівкові бруньки добре
переносять стерилізацію. Стерилізують пагони 0,04%-м розчи-
ном сулеми ЗО хв, промивають у 3—4 порціях стерильної води.
Вичленовують апікальні і латеральні б'руньки (0,5 см) або
відрізки стебла 1,0—1,5 см з пазушними бруньками. Культиву-
ють на середовищі Гамборга з 0,05—0,5 мг/л НОК. 100,0 — ме-
зоінозиту, 0,3— тіаміну і піридоксину, 0,5 мг/л нікотинаміду,
45 г/л цукрози, рН 5,8. Для прискорення регенерації додають
0,05—0,2 мг/л БАП. і
Витримують експланти при температурі 26—28 °С, освіт-
ленні 3—5 клк, фотоперіоді 14 год, відносній вологості 70 %. За
5—7 діб з експлантів пазушних бруньок розвивались пагони,
утворювались корені. За 2 тижні формувались рослини-реге-
неранти, придатні до пересадки у субстрат. Отримані росли-
ни можна живцювати, що значно збільшує" коефіцієнт їх роз-
множення.
Експланти листків і стебла на середовшнах з НОК і БАП
утворюють калус, з якого регенерують бруньїки, пагони [41]. У
культуру іп уііго можна вводити насіння стгвїї, яке має дуже
низьку схожість. Його стерилізують у 0,04%-му розчині сулеми
(ЗО хв), відмивають стерильною водою і провощують на моди-
фікованому середовищі Гамборга. Через 7—8 діб з’являються
проростки, які можна використовувати для подальшого клону-
вання.
Верхню частину рослин субкультивують на свіжому живиль-
ному середовищі, а нижню частину з двома партами листків і ко-
ренями дорощують. Помічено, що тривале субкультивування не
впливає на морфогенетичну активність експлантів [41, 97].
184
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
Хміль (Нитиіиг Іириіиг)
Вірусні хвороби хмелю значно знижують врожай і погіршу-
ють якість сировини. Система заходів, спрямованих на оздоров-
лення посадкового матеріалу хмелю, складається з термотерапії і
методу МКР.
Культивування апікальних меристем дало змогу оздоровити
від вірусної мозаїки і латентного вірусу до 66 % рослин-регене-
рантів, а у сполученні з термотерапією — від вірусного хлорозу
[208]. Апікальні меристеми розміром 250—300 мкм ізолюють з
бруньок кореневища і культивують. На першому етапі викорис-
товують середовище М8, збагачене вітамінами (по 0,5 мг/л тіамі-
ну, піридоксину, нікотинової кислоти, 1,0— аскорбінової ки-
слоти, 2,0 — гліцину) з додаванням регуляторів росту (0,2 мг/л
БАП і 1,0 мг/л гіберелової кислоти); замість цукрози використо-
вують глюкозу (30 г/л). На етапі укорінення до середовища без
цитокінінів додають 1,0—2,0 мг/л ІОК і 25—30 г/л цукрози.
Досліди з добору оптимальних середовищ для інтенси-
фікації регенераційних процесів у апексів хмелю показали, що
з цілої низки агаризованих або рідких середовищ (Готре, Уайта,
Хеллера, М8) кращим було тверде середовище М8. На рідких
живильних середовищах утворюються одиничні мікропагони,
не формуються пазушні бруньки [73]. Істотний вплив на реа-
лізацію морфогенного потенціалу має генотип материнської
рослини. Дослідження показали, що ізольовані апекси різних
сортів хмелю по-різному реагують на наявність регуляторів рос-
ту у живильному середовищі: для сорту Смолистий оптималь-
ною була концентрація БАП 1,0 мг/л, для сорту Істринський —
0,5—1,5 мг/л БАП і 0,05 — ІОК. Апекси першого не реагували
на внесення у середовище ІОК і 2,4-Д, у другого ріст пагонів
збільшувався при додаванні 0,05 мг/л ІОК і 0,05 мг/л 2,4-Д.
Поєднання гібереліну (6—12 мг/л) і ауксину (0,01 мг/л) діє си-
нергетично і сприяє морфогєнезу пагонів сорту Смолистий
(цит. за: [44]).
Для культивування зелених живців хмелю сорту Булліон оп-
тимальним було середовище М8 (регенерувало до 80 % експлан-
тів), на середовищі Уайта утворювався калус, а середовище Хел-
лера зовсім не придатне для культивування експлантів хмелю
(цит. за: [44]).
Стерилізація вихідного матеріалу, бруньки кореневищ або бо-
кових пагонів промивають проточною водою протягом 1—1,5 год;
185
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
занурюють у 0,1%-й розчин сулеми на 9—12 хв; промивають у
4—5 порціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта'. під мікроскопом видаляють покрив-
ні луски і вичленовують меристематичний купол з 2—4 листко-
вими примордіями розміром 250—300 мкм.
Умови культивування', культивують на середовищі М8 при
температурі 25 ± 1 °С, освітленні 3,5 клк, фотоперіоді 16 год. На
першому етапі до середовища додають 0,2 мг/л БАП, 1,0 мг/л
гіберелової кислоти і 30—40 г/л глюкози, що сприяє утворенню
бруньок і пагонів. Уже за кілька діб експланти збільшуються у
розмірах, розгортаються зачаткові листки, пагони виростають до
8—10 мм. Кожні 3—5 тижнів слід пересаджувати тканини на сві-
же живильне середовище, що стимулює ріст пагонів.
Індукцію розвитку численних пазушних бруньок і пагонів
викликає збільшення концентрації БАП до 0,75—1,5 мг/л, гібе-
релової кислоти — до 2,0—3,0 мг/л. На цьому етапі можна от-
римати потрібну кількість рослин, відділяючи конгломерати
бруньок і пагонів і субкультивуючи їх на тих же середовищах. Для
кращої приживлюваності і посилення морфогенезу слід висаджу-
вати по декілька пагонів у пробірку. Для індукції ризогенезу па-
гони переносять на середовище М8 із цукрозою (20—40 г/л) і
1,0—2,0 мг/л ІОК. Слід зауважити, що у більшості пагонів ко-
рені утворюються спонтанно на середовищах зі зниженою кон-
центрацією БАП і гіберелової кислоти.
Пересадка в субстрат', окорінені рослини висаджують у су-
міш торфу з піском або торфу з перлітом у співвідношенні 3:1,
попередньо прогріту при 80—85 °С протягом 2 год. Регенеранти
витримують за умов підвищеної вологості і поливають 1/2 кон-
центрації розчину Кнопа. Подібну методику розмноження хмелю
сортів Вге\уег8 Ооісі, ІЧи^еі використовують в Іспанії [246].
Кореневища хмелю промивають 4%-м розчином гіпохлориту
натрію 30 хв, потім теплою водою ЗО хв. Культивують у перліті
за контрольованих умов (25 °С, фотоперіод 16 год) протягом
10 діб. Пагони, що утворились, розрізають на сегменти (1 см) і
стерилізують у 7,5%-му розчині Сотезїоз 20 хв, потім тричі про-
мивають стерильною дистильованою водою.
Культивують на середовищі М8 з вітамінами за \Уеітоге,
З % глюкози, 4,4 ммоль БАП, 0,5 — ІМК, 0,7 % агару (рН 5,2)
при температурі 25 ± 1 °С, фотоперіоді 16 год і освітленні 55—
60 мкм/(м2 • с). Кожні 4 тижні експланти переносять на свіже жи-
вильне середовище. Через 2 міс сегменти міжвузля (0,5 см) куль-
186
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
тивують на середовищі для стимуляції розмноження і органогенезу.
Використовують інші комбінації і концентрації фітогормонів: зеа-
тин, БАП і ТДЗ. Через ЗО діб більшість експлантів (до 96 %) утво-
рювали калус, значно менше (1—40 %) регенерували корені і лише
одиничні експланти на середовищі з БАП (4,4 ммоль) або зеатином
(4,56 ммоль) формували пагони. Через ЗО діб культивування ЗО %
експлантів калусу сорту Вгєууєгк Ооісі регенерували бруньки і паго-
ни. Калус сорту Т^ц^еі не був здатний до регенерації [227].
Отже доведено, що морфогенна здатність експлантів хмелю
залежить від генотипу рослини, тому склад середовища, гормо-
нальні додатки і вид експланта для кожного сорту хмелю треба
добирати експериментально.
Цукровий буряк (Веіа уиїдагів)
Селекційний процес цукрового буряку дуже тривалий (15—
16 років), тому розробка методу МКР має велике значення для
генетико-селекційної роботи з цією важливою культурою.
Численні дослідження довели високу морфогенну активність
ізольованих тканин і органів цукрового буряку [10, 39, 42, 184,
404, 426]. У культуру можна вводити експланти сіянців (гіпоко-
тиль, котиледон, листки), живці, квіткові бутони, апекси паго-
нів. На регенераційну здатність експлантів впливають походжен-
ня і вік вихідної тканини, генотип материнської рослини, склад
живильного середовища і концентрація регуляторів росту. Розмно-
ження рослин може відбуватися внаслідок активізації пазушних
меристем, утворення адвентивних пагонів з клітин експланта й
отримання регенерантів з калусної тканини, що індукується на
експлантах. Певні труднощі виникають при введенні різних тка-
нин в первинну культуру через глибоку контамінацію мікроор-
ганізмами. Різні автори пропонують свої режими стерилізації.
Для насіння і коренеплодів використовують 1%-ну бромну воду,
0,2—0,5%-й нітрат срібла, 0,1—0,2%-ну сулему при експозиції
2—20 хв. Можна також використовувати 9,5%-й №ОС1 протягом
15 хв для стерилізації насіння. При введенні в культуру дворіч-
них рослин застосовують тривалішу стерилізацію: 0,1 %-й розчин
діациду протягом 2 год забезпечує до 96 % здорових експлантів
[37]. Зелені генеративні пагони стерилізують 0,1%-м розчином
діациду протягом 8—10 хв.
Експланти культивують при температурі 20 ± 2 °С, відносній
вологості 65—70 %, освітленні від 1,2 до 8,0 клк і фотоперіоді
187
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
16 год. Найчастіше використовують живильні середовища Гам-
борга і М8.
Для отримання калусу температуру збільшують до ЗО °С і
культивують експланти в темряві. На молодих листкових пла-
стинках калус формується швидше, ніж на старих, активність ка-
лусогенезу живців нижча за листки. Апікальні меристеми пагонів
дорослих рослин (1—2 мм) і сіянців культивують на середовищі
М8 (повної або 1/2 концентрації) з додаванням 0,08—0,12—
0,25 мг/л БАП. Адвентивні бруньки і пагони, що утворюються,
можна субкультивувати на середовищі з 0,5 мг/л БАП і 0,01 мг/л
гіберелової кислоти до утворення потрібної кількості рослин.
Деякі генотипи цукрового буряку формують пагони без пересад-
ки на інше середовище. Генеративні бруньки квітконосів вичле-
новують перед цвітінням і культивують на середовищі Гамбор-
га—Евелега з БАП і НОК.
Розроблено метод прискореного МКР цукрового буряку, що
дає змогу отримувати за рік до 8-Ю4 рослин-регенерантів від од-
ного експланта. На модифікованому середовищі М8 з вітамінами
за Уайтом, аскорбіновою (5—25 мг/л) і глутаміновою (5 мг/л)
кислотами, бета-аланіном (3 мг/л) і БАП (0,2 мг/л) культивували
генеративні бруньки та експланти сіянців декількох одно- і багато-
насінних тетраплоїдних гібридів. Високу регенераційну здатність
мають експланти листків, черешків і пагонів. Протягом 2 тижнів
формуються численні бруньки і адвентивні пагони. Багаторазове
субкультивування експлантів дає змогу отримати велику кіль-
кість регенерантів. Частини гіпокотиля, котиледона, сегменти
черешків листка на модифікованому середовищі Гамборга з віта-
мінами за Уайтом виявляють високу морфогенетичну активність.
Додавання 0,1 мг/л НОК, 0,2 мг/л БАП сприяє проліферації ка-
лусу, утворенню бруньок і регенерації рослин. Органогенна здат-
ність експлантів збільшується при внесенні 0,25 мг/л аскорбіно-
вої кислоти.
Морфогенна активність експлантів значною мірою залежить
від генотипу і сорту материнської рослини. Найбільшу кількість
регенерантів отримано від тетраплоїдних форм, менше — від
триплоїдних і найменшу — від диплоїдних. Сорти буряків цук-
ристого спрямування мають більшу регенераційну здатність, ніж
урожайні. На середовищі М8 з і—2 мг/л ІМК, 10,0—25,0 — ас-
корбінової кислоти, 0,05 — БАП, 0,5—5,0 мг/л гіберелової ки-
слоти формується до 45—60 пагонів на експлант (сорти Янаш,
Алтушківська однонасінна, Рамонська) і до 20—30 — у сорту
188
Розділ 4. Мікроклональне розмноження сільськогосподарських рослин
Верхняцька [39, 42]. Змінюючи концентрацію регуляторів росту,
можна індукувати проліферацію калусу і органогенез пагонів, фор-
мування численних бруньок і коренів. Внесення 0,1—0,5 мг/л
2,4-Д і БАП сприяє утворенню калусу, який після пересадки на
середовища з 0,1 мг/л кінетину і 15 мг/л аскорбінової кислоти
регенерує бруньки і пагони.
Можна збільшити кількість пазушних бруньок додаванням
0,1 мг/л ІМК, 0,05 — БАП, 2,5 — гіберелової кислоти і 15 мг/л
аскорбінової кислоти. Індукторами ризогенезу є аденін (0,5 мг/л),
ІМК (2 мг/л) і аскорбінова кислота (10 мг/л). На середовищах з
цими компонентами активно формується коренева система.
Заключним етапом МКР є пересадка рослин-регенерантів у
ґрунт. Попереднє загартування й акліматизація сприяє кращій
приживлюваності регенерантів. Добре укорінені рослини висад-
жують у суміш вермикуліту і перліту або у ґрунт і утримують у
кліматичній камері при освітленні 5—6 клк і вологості 90 %. Че-
рез 3—4 тижні рослини можна переносити в поле. Слід уникати
травмування стрижневого кореня при пересадці, бо коренеплоди
змінюють форму [42]. У регенерантів цукрового буряку не вияв-
лено морфологічних відхилень, зберігається специфіка вуглевод-
ного обміну материнської рослини, не змінюється якісний склад
білків. Генетична стабільність мікроклонів спостерігається навіть
після численних пасажів, що дає змогу зберігати генофонд цук-
рового буряку. Рослини можна депонувати кілька років за пони-
жених температур без втрати життєдіяльності. Маточні корене-
плоди рослин-регенерантів можна використовувати для створен-
ня високоякісних насінників [39].
Досліджено регенераційну здатність деяких сортів кормового
буряку. В культуру вводили експланти живця з листком від рос-
лин, що культивували іп уііго. Регенерацію пагонів індукували на
середовищах М8 (без фітогормонів) і РВ двома шляхами — без-
посередньо з клітин експланта і формуванням ембріоїдних струк-
тур і мікророзеток.
В усіх досліджуваних генотипах було індуковано пряму реге-
нерацію. Утворення розеток з калусу істотно залежало від гено-
типу вихідної рослини. Найбільшу морфогенну активність мав
сорт Панфільська. При культивуванні одиничних пагонів утво-
рювались численні розетки, які потім вирощували на модифі-
кованих середовищах ДС.
Регенераційна здатність експлантів кормового буряку значно
нижча, ніж цукрового [96].
_________________Розділ 5 _________________
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ
РОЗМНОЖЕННЯ ПЛОДОВИХ,
ЯГІДНИХ КУЛЬТУР І ВИНОГРАДУ
Дослідження культивування ізольованих тканин плодових і
ягідних культур розпочато пізніше, ніж декоративних рослин,
але це дало змогу перейти до промислового впрошування рос-
лин-регенерантів багатьох видів [192, 193, 210, 248, 281].
Можна визначити декілька аспектів практичного застосуван-
ня культури іп уйго плодових і ягідних рослин. Культуру ізо-
льованих зародків, наприклад, часто використовують під час се-
лекційної роботи для вирощування рослин з гібридного насіння,
отриманого при міжвидовому і міжродовому схрещуванні. Засто-
сування методу дає змогу збільшити коефіцієнт розмноження
нового сорту, цінного клону, перспективної форми тієї або іншої
рослини, сприяє отриманню оздоровленого посадкового матеріа-
лу, прискорює розмноження високоврожайних сортів плодових і
ягідних культур. Останнім часом кількість видів і сортів, що ви-
рощують методом культури ізольованих тканин, значно збільши-
лась. Дослідників і практиків садівництва приваблюють широкі
можливості МКР порівняно з традиційними методами: значне
збільшення (в сотні й тисячі разів) виходу посадкового матеріалу
і поліпшення його якості; можливість подолати період спокою і
розмножувати рослини протягом року. Оздоровлені рослини-
регенеранти можна зберігати тривалий час за понижених темпе-
ратур і використовувати за потребою. Розширюються можливості
реалізації й обміну рослинами між регіонами країни.
Слід відзначити, що при МКР плодових і ягідних культур
виникають певні труднощі, що обмежують його застосування.
Важко підібрати надійні методи стерилізації вихідного матеріалу
багатьох рослин, що утруднює введення первинного експланта в
культуру. Для деяких видів не розроблено оптимальних живиль-
них середовищ і умов культивування, які сприяють реалізації
морфогенетичного потенціалу експлантів і регенерації рослин.
Значні труднощі виникають при укоріненні пагонів і акліматиза-
ції рослин-регенерантів, перенесених у субстрат. Тому продов-
190
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
жується розробка й удосконалення промислових технологій кло-
нування багатьох плодових і ягідних культур.
Клональне розмноження цих культур можна здійснювати різ-
ними способами залежно від виду і сорту рослини, її фізіологіч-
ного стану, умов вирощування материнської рослини, місця до-
бору експланта. Регенерація життєздатних рослин може відбува-
тися безпосередньо з тканини експланта внаслідок активізації
наявних меристем. Морфогенез рослин може також проходити в
два етапи: спочатку проліферують адвентивні бруньки, розетки
листків або мікропагони, які потім переносять для укорінення
на середовища зі зміненими концентраціями регуляторів росту.
Досить часто на експлантах проліферує калус, в якому індукують
формування ембріоїдів, морфогенез пагонів і коренів.
У багатьох країнах метод МКР плодових, ягідних культур і
винограду поставлено на промислову основу; разом з термотера-
пією його використовують для отримання безвірусного посадко-
вого матеріалу.
Яблуня (Маїиг ботегіїса Вогкії.)
Яблуня — важлива промислова культура. Численна літерату-
ра з МКР яблуні засвідчує великий інтерес і успіхи використан-
ня цього методу у садівництві [5, 6, 167, 187, 230, 443].
Культура ізольованих ембріонів яблуні дає змогу прискорити
селекційний процес і отримувати сіянці при віддаленій гібриди-
зації яблуні і груші, яблуні і айви. Калусні тканини яблуні часто
використовують під час фізіологічних і біохімічних досліджень
[227]. Найрозповсюдженішим є метод культури тканин для
розмноження клонових підщеп багатьох сортів яблуні [89, 318].
Уперше можливість промислового розмноження підщеп яб-
луні М-7, М-26, М-27, ММ-106 була досліджена на Іст-Мол-
лінгській дослідній станції (Велика Британія) [292, 295].
Подальшому розвитку методу сприяли дослідження з удоско-
налення процесів стерилізації вихідного матеріалу. Відомо, що
фруктові дерева містять внутрішню інфекцію, яка може вияви-
тись через кілька місяців після введення в культуру. Тому до-
цільно витримати тканини 3 доби на збагаченому бактеріальному
субстраті при 25 °С, а потім використати стерильні експланти.
Вихідні рослини варто готувати заздалегідь: однорічні пагони
зрізають у січні—лютому і витримують у холодильнику, а пагони
з рослин, що вегетують, заготовляють безпосередньо перед робо-
191
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
тою. Значно знижує контамінацію вирощування маточних рос-
лин у теплиці [287, 288].
Для введення в культуру використовують апекси пагонів, ад-
вентивні бруньки, сегменти листків. Стерилізують у 10—20%-му
хлороксі (5,25%-й гіпохлорит натрію) протягом 20—30 хв, про-
мивають стерильною водою [288, 443].
Інший режим стерилізації застосовує І.В. Бартиш зі співавт.
[5]. Живці однорічних пагонів молодих дерев (5—6 років) про-
мивають водою з пральним порошком, потім проточною водою
протягом 2 год. Відрізки пагонів занурюють у 0,1—0,3%-й роз-
чин А&МО3 з декількома краплями тритону Х-100 на 15—ЗО хв,
тричі промивають стерильною дистильованою водою, занурюють
у етанол і обпалюють у полум’ї спиртівки. Стерильні пагони роз-
різають на частини з однією брунькою.
На першому етапі культивування найчастіше використовують
середовище М8 (у повній або 1/2 концентрації). Для індукції бру-
ньок і пагонів додають 0,5—1,0 мг/л БАП; збільшення концентрації
(до 3—5 мг/л) діє токсично. Три органічні речовини — цукрозу
(20—30 г/л), мезоінозит (100 мг/л) і тіамін (0,4—1,0 мг/л)— слід
обов’язково вносити у живильне середовище при клонуванні тка-
нин яблуні [210]. Інші автори [6, 523] до середовища М8 (1/2 кон-
центрації) додають 500 мг/л гідролізату казеїну, 0,5 — БАП,
0,1 мг/л ІМК і 1,5 % цукрози.
На етапі розмноження пагонів до середовища М8 додають
100 мг/л гідролізату казеїну, 0,5—3,0 — БАП, 0,1 мг/л ІМК і гі-
берелової кислоти, 3 % цукрози, 0,7 % агару і вітаміни, мг/л: тіа-
мін — 0,1, нікотинову кислоту — 2,0, піридоксин — 0,5, біотин —
1,0, фолієву кислоту — 0,01, гліцин — 2,0, кальцію пантотенат —
0,5, рібофлавін — 0,1, л-амінобензойну кислоту— 1,0, «-тиро-
зин — 0,1. Розмноження підщепи яблуні М-9 краще відбувається
на середовищі Б8 з 2 мг/л БАП і 0,1 мг/л ІМК, а М-27 і ММ-106 —
на середовищі Лепувра.
Тканини експлантів яблуні часто виділяють у середовище
таніни і поліфеноли, внаслідок чого середовище темніє, морфо-
генна активність пригнічується. Для запобігання окисним про-
цесам слід додавати антиокисники (полівінілпіролідон, глута-
тіон, хлорогенцінол) або адсорбенти (активоване вугілля) [385].
Етап укорінення пагонів яблуні досить складний і трудоміст-
кий, він може відбуватись як у культурі іп уіїго, так і в несте-
рильних умовах. Найчастіше для індукції ризогенезу використо-
вують 1/2 концентрації середовищ М8 або Б8 з різним вмістом
192
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
ІМК, залежно від сорту. Так, для підщепи М-9 і Айдаред най-
ефективнішим було додавання 2,0 мг/л ІМК, для М-26 — 0,8,
для сорту Флоріна — 0,5—10,0 мг/л.
Добрі результати дає попередня обробка базальних частин
пагонів розчином ІМК (25—50 мг/л) для індукції утворення ко-
ренів з подальшим вирощуванням на середовищі без фітогормо-
нів [53]. Укоріненню пагонів сприяє внесення у середовище 2—
З мг/л ІМК і 162 мг/л флороглюцинолу, а також обробка пагонів
пудрою із суміші тальку й ІМК.
Кінцевим результатом клонування є успішне перенесення
регенерантів у польові умови. Запропоновано декілька способів
адаптації рослин-регенерантів яблуні до зовнішнього середо-
вища.
Пробірочні рослини (2—3 см завдовжки) з добре розвинутою
кореневою системою (3—4 см) висаджують у торф’яні горщики з
прогрітим протягом 2—4 год (при 85—90 °С) субстратом із
суміші торфу з піском або перлітом (3:1). Упродовж 10—15 діб
рослини витримують за освітлення 4—5 клк, потім переносять у
теплицю, де регулярно, раз на 10 діб, підживлюють комплекс-
ним добривом або нітрофоскою (2 г/л). Такий режим адаптації
дає змогу значно підвищити приживлюваність рослин. Добре
адаптуються до зовнішніх умов рослини, висаджені наприкінці
зими або на початку весни, бо вони встигають пройти період
спокою за понижених температур.
Інші дослідники [443] визначальним фактором успішної
адаптації рослин-регенерантів яблуні вважають наявність добре
розвинутої кореневої системи. На середовищі для укорінення
пагони слід витримувати, поки не утворяться корені завдовжки
2,0—2,5 см. Такі рослини пересаджують у субстрат із суміші
торфу, перліту і піску (3:4:1) і переносять у приміщення з штуч-
ним туманом на 7—10 діб. Потім рослини тримають у теплиці
при освітленні 1,3—1,5 клк, фотоперіоді 16 год і температурі
25 °С. Поливати рослини слід обережно, бо надмірний полив
пошкоджує корені. Перед висадкою у субстрат потрібно знизити
освітлення і температуру. Ці заходи дають змоги отримати до
85 % рослин, що приживилися.
Ефективним методом МКР яблуні є індукція адвентивного ор-
ганогенезу пагонів на експлантах листків рослин-регенерантів з
культури іп уііго [5, 285, 288, 512].
Залежно від генотипу материнської рослини, складу живиль-
ного середовища, концентрації регуляторів росту і умов культи-
13 - 6-83
193
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
вування відбувається або прямий морфогенез пагонів, або з про-
міжною стадією утворення калусу.
Розроблено оптимальний склад живильного середовища і
концентрації екзогенних регуляторів росту для деяких перспек-
тивних сортів і кленових підщеп яблуні (Флорина, Айдаред, Не-
залежність, ММ-106, КР-І) [5].
Найбільш ефективно пагони сортів Айдаред і Незалежність
регенерують на середовищі М8 (1/3 концентрації) з додаванням
5 мг/л БАП. Оптимальною для усіх сортів яблуні була концен-
трація НОК 1,0—1,5 мг/л, цукрози — 20—30 г/л. Оптимізація
складу живильних середовищ збільшила частоту регенерації па-
гонів сорту Незалежність до 67 %, Айдаред — до 72, Флорини —
до 80, клена КР-1 — до 100 %.
Наведені дослідження можуть бути основою для розробки
схеми МКР яблуні.
Однорічні пагони заготовляють у період спокою, набубнявін-
ня бруньок або в фазу активного росту; їх можна зберігати у хо-
лодильнику при 3—4 °С і використовувати за потреби. Пагони,
що вегетують, зрізують у день ізолювання експланта.
Стерилізація вихідного матеріалу, пагони розрізають на части-
ни з 2—3 бруньками, промивають проточною водою; занурюють у
70%-й етанол на 2—3 с, потім у 0,1%-й діацид (або 0,1%-ну суле-
му) на 8—15 хв; промивають у 3 порціях стерильної дистильованої
води. Можна застосувати такий режим стерилізації: пагони про-
мивають водою з пральним порошком, потім проточною водою
протягом 2 год; занурюють відрізки пагонів у 0,1—0,3%-й розчин
А^МО, на 15—30 хв; промивають стерильною дистильованою во-
дою, змочують етанолом і обпалюють у полум’ї спиртівки.
Вичленування експланта'. в апікальних і латеральних бруньок
видаляють покривні луски і вичленовують експлант розміром
0,5—2,0 мм, що складається з меристематичного купола, 2—3 при-
мордіїв і субапікальної тканини. Можна також культивувати від-
різки пагонів з однією брунькою; після її розпускання експлант
переносять на середовище для розмноження.
Умови культивування', використовують середовища М8 (пов-
ної або 1/2 концентрації), Лепувра [409] або Джонса. Залежно
від генотипу додають різні концентрації регуляторів росту, мг/л:
0,5—1,0 — БАП; 1,0 — БАП і 3,0 — кінетину; 1,0 — БАП і 0,1 —
ІМК. Кожні 4—6 тижнів експланти переносять на свіже живиль-
не середовище. За 2—3 міс формуються численні бруньки і па-
гони, їх розділяють і субкультивують. Підвищення концентрації
194
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
БАП до 3 мг/л сприяє утворенню пагонів. Невеликі пагони (5—
7 мм) слід дорощувати на середовищі з 1 мг/л БАП і 5 мг/л
гіберелової кислоти до висоти 20—25 мм. Укорінюють пагони на
середовищі з 0,5—3,0—5,0 мг/л ІМК або замочують у концен-
трованих розчинах ІМК (25—30 мг/л) протягом 12—24 год, а
потім культивують на середовищі без регуляторів росту.
Добрі результати дає укорінення в нестерильних умовах. Па-
гони обробляють пудрою (100 г тальку, 15 мг ІМК, 20 мг тіаміну,
20 мг аскорбінової кислоти), висаджують у перліт і витримують
при 25 °С і відносній вологості 100 %. Поливають розчином
Кнопа з мікроелементами за Мурашіге—Скугом.
Рослини-регенеранти з добре розвинутими листками і коре-
нями переносять у субстрат із суміші торфу й піску або торфу й
перліту (3:1), попередньо прогрітий протягом 2—4 год при 86—
90 °С, і витримують за підвищеної вологості.
Приживлюваність регенерантів 70—80 %. У польових умовах
ці рослини ростуть краще, ніж отримані за допомогою зеленого
живцювання. Протягом року з однієї верхівки пагона вирощують
до 2—5 тис. укорінених рослин.
Груша (Ругиз соттипіз)
Метод культури ізольованих тканин груші поки мало засто-
совується, але його величезні можливості відзначили багато до-
слідників [7, 66, 319, 433, 441].
Застосування цього методу дасть змогу отримувати здоровий
генетично однорідний посадковий матеріал з високим коефіці-
єнтом розмноження, гаплоїдні або поліплоїдні форми, життє-
здатні гібриди при віддалених схрещуваннях. Культуру насінного
зачатка і зав’язі широко використовують для вирішення селек-
ційно-генетичних проблем.
Калусну культуру використовують під час дослідження суміс-
ності тканин при щепленнях і диференціації органів. Метод
МКР застосовують для оздоровлення й отримання підщеп і при-
щеп груші. Перше повідомлення стосовно МКР сортів груші
Бартлет і Секел з’явилось у 1979 р. [319]. Оскільки дослідник не
намагався звільнити рослини від вірусної інфекції, розмір екс-
плантів був 0,5—2,0 см. Вичленовували верхівки пагонів і лате-
ральні бруньки, культивували на середовищі М8 з 1—22 мг/л
БАП, що сприяло проліферації численних пагонів. Збільшення
концентрації БАП пригнічувало їх ріст.
13*
195
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Подальші дослідження показали сортову специфічність екс-
плантів груші до складу живильного середовища, якісного і
кількісного складу регуляторів росту [440, 441]. Одні автори ви-
користовують повну або 1/2 концентрації солей Мурашіге—
Скуга, інші — середовище Б8, ще інші — середовище Лепувра.
Так, для індукції органогенезу в експлантів сорту Секел дода-
ють 1 мг/л БАП, а для розмноження пагонів — 2 мг/л БАП
(другий етап); для сортів Бартлет і Вільям додають лише
0,75 мг/л БАП, бо більші концентрації пригнічують морфогенез
[227]. До низької концентрації БАП (0,75) можна додавати аук-
сини (0 02 мг/л НОК, 0,1 — ІМК, 0,75—1,0 мг/л 2-іР) залежно
від сорту [135].
Досліди з добору оптимальних концентрацій регуляторів рос-
ту для експлантів груші сортів Бартлет і Секел показали [319],
що найбільша кількість пагонів формується на середовищі з
10 ммоль БАП, але ці пагони фасційовані і погано ростуть; мен-
ше пагонів проліферує при додаванні 5 ммоль БАП, але вони доб-
ре розвиваються і легко укорінюються. Поєднання БАП (5 ммоль),
НОК (0,05 ммоль) або гіберелової кислоти (1 ммоль) пригнічує
утворення пагонів у цих сортів.
Значно підвищити проліферацію адвентивних пагонів можна
подоланням апікального домінування. У пагона завдовжки 4,5—
5,0 см видаляють верхівку (0,25 см) і розміщують його го-
ризонтально на живильне середовище з 5 ммоль БАП. Пазушні
бруньки формують численні пагони (до 80 шт.).
Для індукції ризогенезу до середовища М8 додають 1,0 ммоль
ІМК або 10,0 — НОК [319]. Значну відмінність морфогенетич-
ного потенціалу експлантів термінальних і латеральних бруньок
виявлено у груші сорту Березка [22]. У термінальних частин па-
гона на середовищі М8 з І мг/л БАП проліферували бруньки, з
яких протягом місяця регенерували пагони. У експлантів пазуш-
них бруньок формувались розетки листків, а диференціація па-
гонів проходила лише після декількох пересадок на свіже жи-
вильне середовище. Підвищення концентрації БАП до 3 мг/л
пригнічує ріст пагонів, але сприяє проростанню бічних бруньок
Горизонтальне розміщення пагонів на живильному середо-
вищі стимулює проліферацію бруньок і ріст пагонів. Значно
збільшити коефіцієнт розмноження при субкультивуванні можна
за рахунок видалення листків і стимуляції росту пазушних бру-
ньок. Укорінюють пагони на середовищі з ІМК або на середо-
вищі без регуляторів після обробки пагонів концентрованим
196
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
розчином ІМК (50 мг/л). Додавання НОК сприяє утворенню ка-
лусу і появі гіпертрофованих коренів.
Культивари деяких сортів груші схильні до вітрифікації, особ-
ливо при вирощуванні на середовищі з високою концентрацію
БАП або на рідкому живильному середовищі. Зниження концен-
трації БАП до 0,1 мг/л сприяє поверненню рослин до нормаль-
ного фенотипу.
Ефективну методику МКР і адвентивного органогенезу з ли-
сткових експлантів для 6 сортів груш розробили співробітники
відділу селекції Інституту садівництва УААН [7, 66]. Для сте-
рилізації живців використовували 0,1—0,3%-й розчин А£КІО3.
Культивували відрізки пагонів на середовищі М8 з 35 г цукрози,
100 мг/л гідролізату казеїну, 0,7% агару, 1,0 мг/л БАП, 0,1 —
ІМК і гіберелової кислоти, яке також містило вітаміни, мг/л:
тіамін — 0,1, нікотинову кислоту — 2,0, піридоксин — 0,5, біо-
тин — 1,0, фолієву кислоту — 0,01, гліцин — 2,0, кальцію панто-
тенат — 0,5, рібофлавін — 0,1, р-амінобензойну кислоту — 1,0,
а-тирозин — 0,1. Кожні 4 тижні пагони живцювали і субкульти-
вували на свіжому живильному середовищі.
Укорінювали пагони завдовжки 2—3 см у дві стадії. Спочатку
індукували ризогенез на середовищі з 1/2 концентрації макросо-
лей Мурашіге—Скуга, 1,5 % цукрози і 2,0 мг/л ІМК (інші ком-
поненти як у середовищі для розмноження). Через 2—3 доби
пагони переносили на таке ж середовище без ІМК.
Укорінені пагони висаджували в стерилізований субстрат
(торф:перліт:пісок— 4:1:1) і витримували за вологості 60—80 %
протягом 4—6 тижнів. Адаптовані рослини переносили у тепли-
цю, а потім у польові умови.
Для індукції адвентивного органогенезу використовували лист-
ки одномісячних регенерантів, розрізали на частини перпенди-
кулярно середній жилці і розміщували абаксіальною стороною
на середовищі М8 (1/2 концентрації) з ЗО г/л цукрози, 100 мг/л
мезоінозитолу, 50,0 — гідролізату казеїну, 1 мг/л тіаміну, нікоти-
нової кислоти і піридоксину, 7 г/л агару. Ефективним індукто-
ром адвентивного органогенезу груші виявився ТДЗ (оптимальна
концентрація 1 мг/л). Експланти листків культивували 3 тижні в
темряві при 25 °С, де формувався невеликий калус. Регенерація
адвентивних пагонів відбувалась за розсіяного освітлення на се-
редовищі без ауксинів, а проліферація пагонів — на середовищі
з 2,0 мг/л БАП, 0,2 мг/л ІМК і освітленні 3000 лк. Для індукції
ризогенезу до середовища М8 (1/2 концентрації) додавали 2,0 мг/л
197
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ІМК; через 1—Здоби пагони переносили на середовище без ре-
гуляторів росту.
Автори [7, 66] відзначають сортову специфічність груші на
усіх етапах МКР і адвентивного органогенезу, тому бажано для
кожного сорту індивідуально добирати схеми клонування. На ос-
нові вищенаведених досліджень можна скласти методику МКР
груші.
Для введення в культуру відбирають однорічні пагони моло-
дих дерев (5—6 років) навесні, у фазу початку активного росту,
або в період спокою (січень—лютий).
Стерилізація вихідного матеріалу, відрізки пагонів промива-
ють проточною водою; занурюють у 70%-й етанол на 1—2 с; ви-
даляють зовнішні луски і переносять у 2,5%-й розчин гіпохлори-
ту кальцію на 15 хв; промивають в декількох порціях стерильної
дистильованої води.
Добрі результати дає стерилізація пагонів у 0,1%-му розчині
діациду протягом 10—20 хв або у 0,1%-му розчині сулеми (15 хв).
Можна також використати режим стерилізації, що запропону-
вав І.В. Бартиш зі співавт. [7]: живці миють водою з пральним
порошком, промивають проточною водою протягом 2 год; зану-
рюють у 0,1—0,3%-й розчин нітрату срібла з декількома крап-
лями тритону Х-100; промивають стерильною дистильованою
водою (тричі по 5 хв); замочують у етанолі й обпалюють над
спиртівкою.
Вичленування експланта'. пагони нарізають на частини (2—
З см) з брунькою і розміщують на середовищі для культивування
(1/2 концентрації солей Мурашіге—Скуга, 1,5 % цукрози, 100 мг/л
м-інозитолу, 500 мг/л гідролізату казеїну).
Можна також використовувати експланти меристематичного
куполу з декількома примордіями, які після вичленування швид-
ко розміщують на поверхні агаризованого середовища М8 зі —
2 мг/л БАП.
Умови культивування', температура 26—28 °С вдень і 22 °С вно-
чі, освітлення 1,5—2 клк, фотоперіод 16 год. Протягом 4—6 тиж-
нів формуються численні адвентивні пагони, які розділяють і
субкультивують кожні 2—3 тижні до отримання потрібної кіль-
кості рослин.
Укорінюють пагони на середовищі з 1/2 концентрації солей
Мурашіге—Скуга і додаванням 10 ммоль НОК або 1 ммоль ІМК.
Пересадка в субстрат', рослини з добре розвинутими лист-
ками і коренями переносять у посудини з субстратом із садо-
198
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
вого грунту, торфу і перліту (1:1:1) або стерилізованої суміші
(торф:перліт:пісок — 4:1:1) і витримують в умовах підвищеної
вологості. Раз на тиждень рослини підживлюють, пересаджують
у більші посудини, а потім переносять у ґрунт.
Вишня, черешня (Ргипиз сегазиз, Р. ауіит)
Вишню і черешню, як і інші плодові культури, сильно ура-
жують бактеріальні, вірусні та мікоплазмові хвороби. Крім того,
ці рослини погано розмножуються живцюванням. Техніка куль-
тури ізольованих тканин дає можливість оздоровлення і масо-
вого розмноження селекційних сортів і підщеп. У деяких країнах
МКР вишні і черешні успішно переведено на промислову основу
[227, 281, 391]. В Україні цей метод перебуває у стадії розробки і
входить у систему виробництва безвірусного посадкового мате-
ріалу [11, 12, 59].
Численні дослідження різних сортів і підщеп вишні і череш-
ні визначили головні фактори, що спричиняють регенерацію
рослин у культурі іп уіїго [22, 126, 281, 289, 293, 332, 452]. Мор-
фогенетичний потенціал значною мірою залежить від генотипу
материнської рослини, використаного експланта, живильного
середовища, складу і концентрації регуляторів росту.
Живці однорічних пагонів заготовляють у стадії спокою і на-
бубнявіння бруньок, зберігають при 4 °С, використовують за по-
требою; під час вегетації живці зрізають безпосередньо перед по-
чатком роботи. Апікальні меристеми вичленовують з терміналь-
них і латеральних бруньок (0,2—0,5 мм).
Культивують залежно від сорту на живильних середовищах
Джонса, М8, Б8, Табачника—Кестера. Для індукції морфогене-
зу найчастіше застосовують, мг/л: БАП — 0,1 —1,0, ІМК — 0,5,
2,4-Д — 0,02, гіберелову кислоту — 0,1. Протягом 20—30 діб на
експлантах формуються конгломерати бруньок, розетки лист-
ків, які розділяють і субкультивують на середовищі з 1 мг/л
БАП для подальшого розмноження пагонів. На цьому етапі
можна отримати потрібну кількість трансплантатів, які потім
дорощують на середовищі зі зниженою концентрацією БАП
(0,1 мг/л). Для елонгації пагонів додають 0,5—1,0 мг/л гібере-
лової кислоти, укорінюють пагони на середовищі М8 (1/2 кон-
центрації) з 3 мг/л ІМК.
На перебіг регенераційних процесів істотно впливає генотип
материнської рослини. Так, для розмноження підщепи вишні і
199
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
черешні Маззард Е12/1 культивували апекси (3—5 мм) на сере-
довищі М8 з 0,1 мг/л гіберелової кислоти, 1 мг/л БАП і ІМК.
Кожні 3 тижні формувалось по 4—5 пагонів, які укорінювали (на
90 %) на середовищі з 3 мг/л ІМК, без БАП [293].
В інших умовах для тієї ж підщепи (Р12/1) оптимальним бу-
ло середовище Джонса з 1 мг/л БАП і 0,5 мг/л ІМК, для індукції
ризогенезу додавали 5—10 мг/л ІМК або 162 мг/л флороглюци-
нолу (без БАП) [293]. Отримані регенеранти були ідентичні ма-
теринським рослинам.
Успішно відбувалась регенерація 6 сортів черешні з експлан-
тів 1 мм завдовжки, ізольованих із сплячих бруньок пагонів, які
зберігали протягом 3—7 міс при 4 °С [28]. Оптимальним було
середовище Табачника—Кестера. Розвиток пагонів у вишні сорту
Шаттен—Мореллі стимулювало витримування експлантів перші
7—10 діб у темряві, а потім при низькій температурі (4 °С) про-
тягом 2—2,5 міс.
Сортові особливості материнської рослини впливають і на
процеси ризогенезу [22]. Пагони вишні сорту Шубинка після об-
робки розчином ІМК (50 мг/л) укорінювались на 52 %, сорту
Владимирская — на 18, сорту Любская — лише на 13 %. Для ін-
дукції ризогенезу у черешні оптимальним виявилось середовище
М8 (1/2 концентрації) з 0,5 мг/л НОК (до 90 % укорінених рос-
лин). Збільшення концентрації НОК до 2 мг/л призводило до
загибелі пагонів [289].
Можна також замочувати базальну частину пагонів упродовж
18 год у концентрованому розчині ІМК (50 мг/л) або 3 с — у
200 мг/л ІМК [227]; при подальшому культивуванні на середо-
вищі без фітогормонів рослини добре укорінюються. Деякі сорти
черешні добре укорінюються за 1/2 концентрації М8 з 1 мг/л
ІМК або 0,5 мг/л НОК.
Дослідження морфогенетичного потенціалу різних сортів,
підщеп, гібридів і форм вишні і черешні показали, що найбільшу
регенераційну здатність мають міжвидові та міжродові гібриди і
підщепи, значно меншу — сорти черешні та дикі форми вишні і
черешні [11].
Для морфогєнезу експлантів міжродових гібридів і диких форм
вишні та черешні кращим було середовище Піріка з 0,25 мг/л
ІМК і БАП, 0,5 мг/л кінетину й ІОК. Для кленових підщеп кон-
центрацію фітогормонів слід збільшити вдвічі, а для сортів череш-
ні оптимальним було середовище М8 з 0,25 мг/л ІОК і кінетину
та 0,5 мг/л зеатину.
200
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
Від генотипу материнської рослини залежить і здатність па-
гонів до ризогенезу. Клонові підщепи мають найбільші потенції
до утворення коренів. Вік материнської рослини також впливає
на регенераційну здатність експлантів. Так, морфогенез у експла-
нтів верхівкових бруньок саджанців значно інтенсивніший, ніж у
експлантів плодоносних дерев. Кращим часом для введення в
культуру є періоди спокою (січень) та активного росту (квітень).
Найбільш надійним способом отримання безвірусного посад-
кового матеріалу сортів і підщеп вишні й черешні є поєднання
методів термотерапії і МКР. Проте деякі сорти не витримують
термообробки, для інших визначена пряма залежність між теп-
лотолерантністю і приживлюваністю експлантів у культурі іп уіі-
го [13]. Сорт Шпанка найкраще витримує термотерапію, причо-
му термінальні бруньки приживлюються краще, ніж латеральні.
Клональне розмноження вишні і черешні починається з за-
готівлі вихідного матеріалу. Живці можна зрізати у зимовий пе-
ріод, в стадії спокою, і зберігати при 4 °С декілька місяців. Зеле-
ні живці відбирають протягом усього періоду вегетації безпосе-
редньо перед вичленуванням.
Стерилізація вихідного матеріалу, пагони розрізають на час-
тини з 3—4 бруньками; промивають проточною водою, потім
теплою водою з детергентом; занурюють у 70%-й етанол на 2—
З с, далі у 0,1%-й розчин діациду (чи 0,1%-й розчин сулеми) на
5—8 хв або в 7%-й розчин гіпохлориту кальцію на 20 хв; проми-
вають у 3—4 порціях стерильної дистильованої води.
Можна використовувати інший режим стерилізації [59]. Веге-
тативні бруньки стерилізують послідовним зануренням у 70%-й
етанол (ЗО с), 1%-й ТІіітегоБої (10 хв) і 0,8%-й А£МО3 (3 хв). Про-
мивають у 4—5 порціях стерильної дистильованої води. Верхівки
пагонів, що ростуть, занурюють послідовно у 70%-й етанол
(ЗО с), 0,8%-й А§МО3 (2 хв) і промивають у стерильній дистильо-
ваній воді (5 разів).
Вичленування експланта: апікальні і латеральні бруньки звіль-
няють від покривних лусок і вичленовують меристематичний ку-
пол з примордіями і субапікальною тканиною (1—2 мм). Можна
використовувати бруньки, що набубнявіли (3—5 мм), або верхів-
ки зелених пагонів (до 2 см).
Умови культивування: використовують середовища М8, Та-
бачника—Кестера, Джонса (залежно від сорту) з 1 мг/л БАП,
0,5 мг/л ІМК. Температура 23—26 °С, освітлення 3—5 клк, фо-
топеріод 16 год.
201
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Органогенез у експлантів вишні і черешні відбувається в кіль-
ка етапів: спочатку формується розетка листків, після 2—3-го
пасажу починається формування додаткових пагонів, які можна
живцювати і субкультивувати. Укорінення пагонів відбувається
на середовищі Піріка з 1,5—10,0 мг/л ІМК.
Можна також опудрювати базальну частину пагонів суміш-
шю ІМК, тальку і активованого вугілля (3:2:1) або замочувати
пагони у 45%-му спиртовому розчині ІМК (2 мг/л) на 1—2 с.
Пересадка в субстрат: рослини з добре розвинутими кореня-
ми і листками виймають з колб, відмивають від залишків агару і
висаджують у субстрат (вермикуліт:садова земля — 1:2). Опти-
мальний час для пересадки — квітень—червень, восени рослини
переносять у відкритий ґрунт.
Адаптація рослин-регенерантів значною мірою залежить від
розвитку кореневої системи. Найкраще адаптуються рослини з
коренями першого і другого порядку (5—10 см). Крім того, ре-
генеранти повинні пройти період спокою за низьких температур
(-4, +2 °С) [12].
Персик, абрикос
(Ршпііз регзіса, Р. агтепіаса)
Проблема вирощування здорового посадкового матеріалу пер-
сика і абрикоса вирішується в багатьох країнах завдяки технології
МКР.
Розроблено головні етапи методу (режим стерилізації і вве-
дення в культуру первинного експланта), підібрано оптимальний
склад живильних середовиш, концентрацію і співвідношення фі-
тогормонів, умови укорінення мікропагонів, фактори, що сприя-
ють приживлюваності регенерантів у субстраті [58, 227, 248, 351].
Важким виявився етап введення в культуру через сильну ін-
фікованість епіфітною мікрофлорою і вірусними хворобами ма-
теринських рослин (не лише зовнішньою, а й внутрішньою). За-
пропоновано використовувати таку методику стерилізації пагонів
від рослин, що пройшли термотерапію: відрізки пагонів проми-
вають проточною водою, занурюють у 25%-й хлорокс з детерген-
том на 10 хв, споліскують стерильною дистильованою водою і
переносять у 70%-й етанол на 5 хв, двічі промивають стериль-
ною водою. Добрі результати дає стерилізація у 0,1%-му розчині
сулеми (20—25 хв). Для кращого проникнення стерилізуючої ре-
човини пагони розрізають на частини (1 см), знімають з бруньок
202
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
покривні листки і луски. Доцільно також розміщувати первинні
експланти на деякий час на середовищі без регуляторів росту для
виявлення прихованої інфекції.
Значно знижується контамінація після витримування пагонів
у посудинах з водою за пониженої температури [248].
Для введення в культуру краще використовувати тканини
молодих рослин або регенерантів, що пройшли індексацію на ві-
руси. У разі масового розмноження вичленовують апекси розмі-
ром 15—20 мм, а для звільнення від вірусних хвороб — 10—15 мм.
Для культивування тканин персика і абрикоса запропоновано ці-
лу низку живильних середовищ: Хогланда, Кнопа з мікроелемен-
тами за Хеллером, Міллера, Уайта, М8.
Середовища з низьким складом мінеральних речовин вико-
ристовують для вирощування ізольованих зародків персика і аб-
рикоса, а середовища з високим рівнем макросолей (М8, Мілле-
ра) — при культивуванні меристематичних тканин. Для індукції
морфогєнезу додають такі речовини, мг/л: кінетин — 0,2—1,0,
БАП — 0,1—2,0, ІМК— 1,0—3,0, ІОК — 1,0-2,0 або НОК—
0,5—1,0. Часто, аби запобігти окисним процесам, у середовище
додають аскорбінову кислоту (10—50 мг/л). Культивування ізо-
льованих апексів персика і абрикоса відбувається в декілька ета-
пів: на першому середовищі М8 з 0,5 мг/л БАП (або іншому се-
редовищі) експланти збільшуються, формуються бруньки і адвен-
тивні пагони; на другому етапі пагони ростуть, на третьому вони
укорінюються, розвиваються рослини-регенеранти. Кожен з цих
етапів потребує своїх оптимальних умов.
Так, для експлантів підщепи персика Немагард використову-
вали середовище М8 з вітамінами за Стаба, 2 % цукрози, 50 мг/л
аскорбінової кислоти, 2,0 — БАП і 0,1 мг/л НОК. За 3 тижні
культивування на експлантах формувалось по 6—10 пагонів, які
укорінювали на середовищі з 0,1 мг/л НОК, без цитокінінів. При-
живлюваність рослин-регенерантів у субстраті близько 60 % [351].
Проліферація пагонів у гібридів мигдалю і персика відбува-
ється на середовищі з 1,0 мг/л БАП, ріст і розмноження — на
рідкому середовищі М8, а укорінення — на середовищі Лепувра
з 1 мг/л ІМК і 0,003 мг/л кінетину.
Пагони персика сорту Хабрайт успішно укорінювались на
модифікованому середовищі М8 з 200,0 мг/л мезоінозиту, 1000,0 —
гідролізату казеїну, 0,05— біотину, 2,0— тіаміну, 1,0— холін-
хлориду, 0,25— піридоксину, 2,5— нікотинової кислоти, 1,0 —
параамінобензойної, 0,25 — фолієвої, 1,0 — пантотенової, 0,1 —
203
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
гіберелової кислота, 0,4 — кінетину і 0,01 мг/л БАП. Пагони
персика С-305 укорінювались (на 100 %) на середовищі з 3 мг/л
ІМК і 162 мг/л флорглюцинолу.
Кількість пагонів на експлантах абрикоса значно збільшуєть-
ся на середовищі з сорбітолом (21,3 г/л) замість цукрози [227].
Наводимо схему МКР персика і абрикоса.
Пагони заготовляють у фазу набубнявіння бруньок і початку
активного росту.
Стерилізація вихідного матеріалу, відрізки пагонів (2—4 см)
промивають проточною, потім теплою водою з детергентом; з
бруньок знімають верхні луски і занурюють їх у 70%-й етанол на
1—2 хв, потім у 0,1%-й розчин діациду або сулеми на 15—20 хв;
можна використовувати 7%-й розчин гіпохлориту кальцію або
натрію протягом 20 хв; промивають у 3—4 порціях стерильної
дистильованої води.
Вичленування експланта: термінальні і латеральні бруньки
звільняють від покривних лусок, вичленовують апекси (10—
15 мм) з 2—3 примордіями і субапікальною тканиною.
Умови культивування: використовують середовища, наведені
вище, або М8 з 1—2 мг/л БАП при 22—25 °С, освітленні 1 —
З клк і фотоперіоді 16 год. Протягом 3—5 тижнів формуються
адвентивні бруньки і пагони, які субкультивують кожні 3—4 тиж-
ні. Ризогенез індукують на середовищі з 2,0—3,0 мг/л ІМК,
потім вирощують на середовищі з 0,1 —1,0 мг/л ІОК або НОК.
Пересадка в субстрат: рослини-регенеранти з добре розвину-
тими листками і коренями переносять у субстрат з торфу і пер-
літу (4:1) і утримують 2—3 тижні в умовах підвищеної вологості
(під плівкою) або штучного туману. Це забезпечує високу при-
живлюваність регенерантів.
Слива (Ршпііз гіотезііса)
Перші роботи були присвячені культивуванню ізольованих
зародків гібридів сливи і лише потім з’явились методи культиву-
вання апікальних меристем для оздоровлення і масового роз-
множення. Проте й дотепер кількість введених у культуру сортів
сливи досить незначна [22, 59, 193, 399].
МКР сливи складається з декількох етапів. На стадії введен-
ня в культуру використовують експланти апікальних меристем,
пагонів, латеральних бруньок. Стерилізують вихідний матеріал у
етанолі (кілька секунд), аби зруйнувати восковий шар, потім за-
204
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
нурюють у гіпохлорит натрію або кальцію і промивають у сте-
рильній воді. Експланти розміщують на живильному середовищі
для диференціації меристематичної тканини. Найчастіше вико-
ристовують середовища М8, Скірвіна, Лепувра, Б8 з додаванням
0,1—1,0 мг/л БАП або 0,2 мг/л кінетину. Протягом 1—2 міс фор-
муються розетки листків, експланти субкультивують на свіжому
живильному середовищі кожні 4 тижні.
Для збільшення проліферації пазушних бруньок розетки лист-
ків переносять на середовище з 1 мг/л БАП. Помічено, що ін-
тенсивність утворення бруньок залежить від віку материнської
рослини. Експланти дорослих рослин сливи формують менше
бруньок, ніж тканини молодих рослин [399].
Для деяких сортів субкультивування тканин на рідкому сере-
довищі значно стимулює формування пагонів, індукує їх пролі-
ферацію і зберігання при 4 °С протягом 2—6 міс. Ріст пагонів
відбувається на середовищі з 1 мг/л гіберелової кислоти; рослини
заввишки 2,0—2,5 см переносять на середовище без цитокінінів
для укорінення. Збільшення вмісту ауксинів (до 2 ммоль ІОК або
5 ммоль ІМК) сприяє укоріненню до 90 % пагонів сливи Маріа-
на; на середовищі з 1—4 мг/л ІМК укорінюється 95 % пагонів
Р. каїісіпа, а для Р. сегакіїега оптимальними були 1—5 ммоль ІМК.
Пагони сливи Міраболан укорінюються в темряві на середо-
вищі з 2,5—5,0 мг/л ІОК, а для підщепи Піксі обов’язково слід
додавати флороглюцинол. Поєднання 162 мг/л флороглюцинолу,
3,0 — ІМК і 0,1 мг/л гіберелової кислоти індукує ризогенез у
90 % пагонів [370].
Кращому укоріненню пагонів сливи сприяє утримання їх у
темряві протягом 7—9 діб на середовищі з 2 мг/л ІМК і 0,1 мг/л
вітаміну Е. Збільшення темного періоду до 12—14 діб викликає
утворення калусу, що утруднює ризогенез. Пагони деяких сортів
сливи краще укорінюються у разі зниження концентрації макро-
елементів у живильному середовищі в 2—4 рази [193].
Виявлено значну відмінність швидкості морфогенезу різних
сортів сливи. На середовищі М8 з 0,75—1,0 мг/л БАП експланти
термінальних і латеральних бруньок сливи сорту Пам’ять Тіміря-
зєва розвивались досить повільно, протягом місяців формувалось
по 3—5 адвентивних бруньок. Експланти кленової підщепи Піксі
мають більший морфогенний потенціал: при кожному субкуль-
тивуванні проліферувало до 25 бруньок і пагонів. Ризогенез лег-
ко проходив на середовищі з 1,0 мг/л ІМК або на безгормональ-
ному середовищі після попередньої обробки пагонів розчином
205
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ІМК (25—50 мг/л). Укорінення пагонів сливи сорту Пам’ять Ті-
мірязєва відбувається набагато гірше [22].
Апікальні і латеральні бруньки з пагонів дорослих дерев Р. ке-
гоїіпа активно проліферували конгломерати адвентивних бруньок
на середовищі М8 з 20 г/л цукрози, 1,0 — БАП і 0,1 мг/л гібере-
лової кислоти. Розмноження пагонів відбувалось у разі додаван-
ня відповідно ЗО г/л, 0,75 і 0,2 мг/л цих речовин. Через кожні
З—4 тижні кількість пагонів зростала у 5 разів. Утворенню ко-
ренів сприяло додавання 1 мг/л ІМК (без БАП і гіберелової ки-
слоти); укорінення пагонів збільшувалось у темряві на середо-
вищі з 10~3 моль рутину і кверцетину [248].
Наводимо основні етапи МКР сливи.
Однорічні пагони заготовляють у січні, розрізають на части-
ни з 2—3 бруньками і зберігають при 2 °С до початку роботи.
Зелені пагони зрізають у липні—вересні в період активного росту.
Стерилізація вихідного матеріалу, відрізки пагонів промивають
проточною, потім теплою водою з детергентом; занурюють у 70%-й
етанол на 5—10 с, потім у 0,1%-й розчин діациду або сулеми на
15—20 хв; можна використати розчин гіпохлориту кальцію або нат-
рію протягом 20 хв; промивають у 3—4 порціях стерильної води.
Вичленування експланта-. вичленовують меристематичний ку-
пол з 2—3 примордіями і субапікальною тканиною (0,5—2,0 мм);
також можна культивувати термінальні бруньки без лусок або
пазушні бруньки розміром 20 і 10 мм відповідно.
Умови культивування-, використовують середовища М8 з
0,1 мг/л БАП або Б8 при 22—25 °С, освітленні 1—3 клк і фото-
періоді 16 год. Протягом 6—8 тижнів проліферують конгломера-
ти адвентивних бруньок, які субкультивують на середовищі з
1 мг/л БАП для утворення пагонів. Ріст пагонів відбувається при
додаванні 1 мг/л гіберелової кислоти; пагони заввишки 2—3 см
укорінюють на середовищі з 2,0—3,0 мг/л ІМК, без цитокінінів.
Пересадка в субстрат', рослини-регенеранти з розвинутими
листками і коренями висаджують у субстрат з вермикуліту і са-
дового ґрунту (1:2) і витримують в умовах підвищеної вологості.
Малина (НиЬиз зрр.)
У комплексі заходів, що сприяють забезпеченню садівництва
високоякісним оздоровленим посадковим матеріалом, одне з про-
відних місць посідає клональне розмноження, шо дає змогу от-
римати генетично однорідні рослини.
206
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
Відомо близько 20 вірусних хвороб малини, що поширюють-
ся під час вегетативного розмноження рослин. У багатьох краї-
нах переходять на вирощування оздоровленого посадкового ма-
теріалу, що поєднує термообробку при 37,5 °С протягом 40—
60 діб і метод культури ізольованих апексів. Звільнення промис-
лових посадок малини від комплексу вірусних захворювань
підвищує продуктивність рослин у 6—8 разів [90].
Технологію МКР малини розробляють і удосконалюють, але
досягти стабільних результатів досить складно. Успіх введення в
культуру тканин малини залежить від стану материнської росли-
ни, її сорту і часу добору тканини [510]. Одні автори використо-
вують пагони високопродуктивних рослин без ознак захворю-
вання в період активного росту, інші вводять у культуру бруньки
етіольованих підземних пагонів [23, 70, 71, 227].
Вичленовують експланти апексів розміром 0,2 мм (для оздо-
ровлення) і 2 мм (для масового розмноження). Морфогенний
потенціал експланта залежить від його розмірів: чим більший
ізолят, тим швидше він регенерує рослини. До 60 % апексів роз-
міром 2 мм утворили регенеранти на середовиші Мореля (нит.
за: [44]).
Експланти 0,2—0,75 мм формують рослини протягом 6—
8 тижнів на середовищі М8 з 0,1—3,0 мг/л БАП [23]. Для деяких
генотипів малини задовільні результати дає вирощування екс-
плантів на середовищі Андерсона з додаванням 2 мг/л БАП,
0,05 — ІМК і 0,1 мг/л гіберелової кислоти або на середовищі М8
з 5 г/л активованого вугілля, 1 мг/л БАП, 0,1 — ІМК і подвій-
ною концентрацією ЕеЕДТА (для запобігання хлорозу) [227].
Укорінюють пагони малини на середовищах М8 (повної або 1/2
концентрації) і Е8 без регуляторів росту або з додаванням 0,1—
1,6 мг/л ІМК. Інколи ризогенез відбувається спонтанно на дру-
гій стадії культивування.
Добрі результати дає обробка пагонів (5—6 см) 0,1 %-ю ІМК;
у стерильному піску за 2—4 тижні формується коренева система,
після чого рослини пересаджують у субстрат.
Узагальнюючи наведені літературні дані, метод МКР малини
можна представити таким чином: прикореневі пагони влітку бе-
руть в полі або від рослин, що пройшли термообробку. Можна
також заздалегідь заготувати вихідний матеріал і використовувати
його за потребою. Для цього викопують восени корені малини,
нарізають на частини з 1—2 бруньками, присипають землею і збе-
рігають за температури від -1 до +1 °С. За 2—3 тижні до вичлену-
207
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
вання живці висаджують у ящики, зволожують грунт, закривають
чорним папером і витримують при 18—20 °С. Етіольовані пагони
розрізають на частини з апікальними і латеральними бруньками.
Стерилізація вихідного матеріалу, промивають проточною теп-
лою водою, занурюють у 0,1%-й розчин сулеми чи діациду (5—
7 хв) або у 10%-й розчин гіпохлориту кальцію (15—20 хв); проми-
вають у 3—4 порціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта'. апікальні і сплячі бруньки звільня-
ють від лусок і під бінокулярним мікроскопом вичленовують ме-
ристематичний купол з 2—4 примордіями розміром 0,25—0,5—
0,75—2,0 мм.
Умови культивування: використовують середовища М8 з 0,1 —
3,0 мг/л БАП або Мореля (з мікроелементами за Хеллером) з
0,07 мг/л ІМК при 21—22 °С, освітленні 4—5 клк, фотоперіоді
16 год. Протягом місяця формуються розетки листків (на сере-
довищі з 0,5—1,0 мг/л БАП). Після пересадки на свіже середо-
вище проліферують пагони, які кожні 3—4 тижні слід субкульти-
вувати. У пазухах листків індукуються бруньки, які дають поча-
ток новим пагонам. Для інтенсифікації цього процесу слід у 3—
4-му пасажі збільшити концентрацію БАП до 3 мг/л, що сприяє
утворенню численних бруньок і пагонів [23].
Укорінюють пагони на 1/2 концентрації середовища М8
(крім хелату заліза) з додаванням 0,5 мг/л ІМК.
Пересадка в субстрат: рослини-регенеранти з добре розвину-
тими листками і коренями пересаджують у простерилізований
субстрат (торф:пісок — 3:1) і дорощують у теплиці. Період розм-
ноження малини, залежно від сорту, становить 3—5 міс. Рослини
перевіряють на наявність вірусної інфекції. Оздоровлений по-
садковий матеріал використовують для закладки розсадника,
розмножують і через 3—4 роки передають у виробництво.
Смородина (АіЬез підгит, А. гиЬгит)
Проблема вирощування здорового посадкового матеріалу,
прискореного розмноження нових урожайних сортів чорної і
червоної смородини (порічки) посідає провідне місце в сучасно-
му садівництві. Метод МКР дає змогу вирішити цю проблему,
отримати оздоровлені рослини, збільшити коефіцієнт розмно-
ження у 3 тис. разів за рік [227].
Регенераційна здатність ізольованих тканин чорної смороди-
ни залежить від сортової специфіки материнських рослин, скла-
208
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
ду живильного середовища і концентрації регуляторів росту. Ізо-
лювати експланти доцільно в період активного росту (в квітні—
липні). Апекси розміром 0,5—2,0 мм мають більший морфоген-
ний потенціал, ніж апекси 0,2—0,3 мм. Утворення рослин-реге-
нерантів відбувається в два етапи: на першому проліферують па-
гони, на другому — формуються корені.
Ізольовані апекси розміщують на агаризованому живильному
середовищі М8 з аскорбіновою кислотою (1 мг/л) і БАП (0,1 —
0,5 мг/л) або БАП (0,2 мг/л) і гібереловою кислотою (1 мг/л).
Протягом 1—2 міс розвиваються розетки листків або пагін. Для
індукції коренів пагони замочують у розчині ІМК (25—50 мг/л)
протягом 18—20 год і переносять на середовище Уайта з мікро-
елементами за Хеллером. Корені формуються за 10—14 діб, од-
ночасно росте пагін; за місяць сформовані рослини-регенеранти
можна переносити в ґрунт (цит. за: [44]).
Культивування апексів смородини на рідкому середовищі М8
з БАП (0,1 мг/л) у ролері (4 об/хв) значно прискорює ростові
процеси, формування пагонів з листками відбувається протягом
3—4 тижнів (цит. за: [44]).
На середовищі Лі—Фоссарда з 0,2 мг/л БАП на експлантах
смородини утворюються численні бруньки і пагони. Внесення
флороглюнинолу (1,62 мг/л) поліпшує ріст пагонів, але значно
ускладнює технологію, бо він термолабільний і потребує стерилі-
зації крізь бактеріальний фільтр. Укорінюють пагони на середо-
вищах Лі—Фоссарда або М8 (1/2 концентрації) з додаванням
0,5-1,0 мг/л ІМК і 3 мг/л ІОК [227].
Наводимо основні етапи МКР смородини.
Навесні і влітку використовують здорові пагони, що рос-
туть: можна також заздалегідь заготувати пагони, тримати їх у
воді при кімнатній температурі і використовувати взимку. Після
видалення листків пагони розрізають на частини з 1—2 брунь-
ками.
Стерилізація вихідного матеріалу, верхівкові і латеральні бру-
ньки звільняють від лусок; промивають проточною і теплою
мильною водою; занурюють у 0,1%-й розчин сулеми або діациду
(з детергентом) на 5—8 хв; промивають у 4—5 порціях стериль-
ної дистильованої води по 5—7 хв у кожній порції. Задовільні
результати дає також стерилізація бруньок у 33%-му пероксиді
водню протягом 8—10 хв.
Вичленування експланта. препарувальною голкою видаляють
залишки покривних листків, вичленовують меристематичний ку-
14 — 6-83
209
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
пол із кількома примордіями і субапікальною тканиною (0,2—
0,5—2,0 мм).
Умови культивування', використовують середовища М8 з 0,5—
1,0 мг/л БАП і 1 мг/л аскорбінової кислоти або Лі—Фоссарда з
0,2 мг/л БАП за температури 23—25 °С, освітлення 3,5—5 клк,
фотоперіоду 16 год. Протягом 3—4 тижнів розвиваються розетки
листків, формуються пагони. Пересадка на середовище з 1,5 мг/л
БАП стимулює проліферацію додаткових бруньок і пагонів.
Ризогенез пагонів відбувається на середовищі М8 (1/2 кон-
центрації, крім хелату заліза) з 20 г/л цукрози і 2,5 мг/л ІМК.
Найкраще пагони смородини укорінюються після обробки роз-
чином ІМК (25 мг/л) протягом 16—18 год і висадки на середови-
ще без регуляторів росту. Через місяць укорінюються до 90 %
пагонів. Сорти чорної смородини укорінюються швидше, ніж
червоної.
Пересадка в субстрат', добре сформовані рослини (не менше
2 см) з 3—4 листками і коренями висаджують у простерилізова-
ний субстрат з торфу і піску (3:1), торфу, грунту і піску (1:1:1)
або торфу, ґрунту і перліту (1:1:1). Для їх адаптації потрібна ви-
сока вологість повітря, оптимальна температура і освітлення.
Найкраще витримувати рослини в умовах штучного туманоутво-
рення, досвічування і за температури 22—24 °С. Протягом пер-
ших 3 тижнів регенеранти поливають розбавленим (1/4—1/8)
розчином Мурашіге—Скуга. На початку весни рослини перено-
сять у розсадник: у цей час приживлюваність рослин досить ви-
сока, швидко відбувається їх ріст і розвиток (цит. за: [44]).
Аґрус
(Сгоззиіагіа гесііпаіа)
Проблема вирощування безвірусного посадкового матеріалу
агрусу поки шо не вирішена, хоча перша праця з МКР цієї рос-
лини з’явилась іще у 1968 р. Дослідники відмічають значні труд-
нощі, які виникають на різних етапах культивування окремих
сортів аґрусу [48, 502, 503, 511].
На першому етапі введення в культуру вирішальне значення
має фізіологічний стан материнської рослини. Найкраще росли і
регенерували пагони експланти, які вичленовували навесні в пе-
ріод набубнявіння бруньок й інтенсивного росту. Верхівки паго-
нів, ізольовані влітку, тобто після завершення росту материнсь-
кої рослини, не розвивались і гинули. Лише експланти сорту Фі-
210
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
нік (з 4 досліджених сортів) зберігали здатність до регенерації
пагонів і влітку. На середовищі М8 з 0,5 мг/л БАП апекси про-
ліферували калус, з якого регенерували рослини.
На етапі розмноження формувалось по 2—6 пагонів на екс-
плант. Для морфогенезу коренів пагони завдовжки не менш 1 см
переносять на середовище Мореля з мікроелементами за Му-
рашіге—Скугом і 0,05 мг/л ІМК. За 1,5—2 міс формуються ко-
рені [48]. Регенерація рослин від початку культивування до пере-
садки в субстрат триває близько 18 міс і залежить від генотипу
материнської рослини.
На думку деяких авторів [502, 503], концентрація макроеле-
ментів у живильному середовищі М8 не є оптимальною для
культивування тканин агрусу. Зниження вмісту КТ4О3 і Т4Н41ЧО3
до 6,7 ммоль покращує морфогенез. Додавання 0,1 ммоль НОК
значно зменшує виділення фенольних сполук у живильне сере-
довище і побуріння експлантів. Збільшення концентрації НОК
до 0,5 ммоль сприяє проліферації калусу і утворенню пагонів.
Для індукції ризогенезу пагони занурювали у розчин 4 ммоль
НОК (на 5 діб), а потім субкультивували на середовищі М8
(1/2 концентрації) без фітогормонів, де відбувався ріст коренів.
Через 2 тижні пагони переносили в субстрат. Слід відзначити,
що рослини, які добре розвивались у культурі іп уііго, краще
приживлюються при пересадці [502, 503].
Дослідження регенераційної здатності термінальних і лате-
ральних бруньок пагонів показали, що найбільший морфогенний
потенціал мають верхівкові меристеми. На першому етапі розмно-
ження формувався конгломерат бруньок, який субкультивували
(не розділяючи) на свіжому середовищі для дорощування і утво-
рення пагонів. Укорінюють пагони заввишки понад 10 мм. Ріст
коренів прискорюється після перенесення пагонів у суміш пер-
літу і піску (1:1) з додаванням розчину Мурашіге—Скуга (1/2 кон-
центрації). Приживлюється до 93—98 % регенерантів [69].
Нижче наводимо схему МКР агрусу.
Стерилізація вихідного матеріалу, відрізки пагонів у період
активного росту промивають проточною водою; відділяють апі-
кальні і латеральні бруньки, звільняють їх від верхніх лусок і за-
нурюють у 70%-й етанол на 20—30 с; переносять у 0,1 %-й роз-
чин діациду на 5—8 хв або у 2%-й розчин гіпохлориту натрію на
З—5 хв; промивають у 3 порціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта: вичленовують меристематичні вер-
хівки з примордіальними листками (3—5 мм).
14*
211
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Умови культивування', культивують на живильному середо-
вищі М8 з 1 мг/л БАП при 22—26 °С, освітленні 3—5 клк і фо-
топеріоді 16 год. Протягом 4—6 тижнів на експлантах формують-
ся конгломерати адвентивних бруньок і пагонів. їх дорощують,
не розділяючи, на свіжому живильному середовищі. Пагони (не
менше 10 мм) укорінюють на 1/2 концентрації середовища М8 з
0,2 мг/л ІМК.
Можна розмістити пагони на середовищі з 4 ммоль НОК (на
5 діб) для індукції ризогенезу, потім перенести на середовище
без регуляторів росту.
Пагони агрусу заввишки 2—3 см добре укорінюються в не-
стерильних умовах на субстраті перлїгпісок (1:1) з додаванням
розчину Мурашіге—Скуга (1/2 концентрації).
Актинідія (Асііпісііа)
Серед ЗО видів родини Асйпібіасеае, яка останнім часом ста-
ла дуже популярною, найпоширенішими є А. аг^Ша, А. коїотікїа
і А. сіеіісіока. Це субтропічна рослина з великими плодами, що
мають чудовий смак і містять багато вітаміну С.
Перші праці з МКР актинідії з’явилися ше у 1975 р. [250].
Інтерес до цієї культури постійно зростає і методи клонування
продовжують розробляти і удосконалювати [25, 53, 54, 87, 333,
355, 394].
Кліматичні умови півдня України і Криму уможливлюють
вирощування великоплідної актинідії (ківі), тому в НБС—ННЦ
УААН тривалий час ведуться дослідження з інтродукції, селекції
і клонування А. беїісіока [19, 20].
Автори дослідили морфогенну активність експлантів 4 сортів
і 2 гібридів актинідії. У культуру вводили апікальні і пазушні
бруньки, сегменти листків і пагонів, насіння.
Виявлено, що морфогенетичний потенціал значною мірою
залежить від генотипу материнської рослини і корелює зі здат-
ністю до вегетативного розмноження іп уіуо. Так, сильнорослі
сорти Бруно і Монті активніше регенерували в культурі іп уіїго,
ніж середньорослий сорт Томурі і слаборослий — Хайвард.
Помічена залежність морфогенної здатності експлантів від
стану і віку материнської рослини. Бруньки, відібрані під час
цвітіння, утворюють більше життєздатних регенерантів. У моло-
дих (ювенільних) рослин регенераційна активність вища. Екс-
планти зелених (не здерев’янілих) пагонів найбільш придатні для
212
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
культивування. У культуру можна вводити апекси пагонів і лате-
ральні бруньки. Деякі дослідники віддають перевагу сплячим
брунькам, які можна зберігати при низькій температурі і вико-
ристовувати тривалий час. Ці бруньки легше стерилізувати; крім
того, вони мають більше листкових примордіїв і при культиву-
ванні регенерують більше пазушних пагонів [325]. На першій
стадії експланти культивують на середовищі М8 (3/4 концентра-
ції) з додаванням 128 мг/л №Н2РО4 Н2О, 2,0 — БАП, 0,02 —
ІМК і 60 мг/л аденінсульфату. Проліферація додаткових пагонів
відбувається на середовищі М8 або Ь8 з 170 мг/л №Н2РО4 х
х Н2О, 2,0 — БАП, 0,03—0,06 — ІМК і 80 мг/л аденінсульфату
[227, 325].
Укорінюють пагони на середовищі з 1 мг/л ІМК (10 діб) і
субкультивують на безгормональному середовищі. Добрі резуль-
тати дає короткочасне занурення пагонів у концентрований
(400—500 мг/л) або на 24 год — у слабкий (20 мг/л) розчин ІМК
[355, 389]. До 90 % пагонів А. сйіпепкік утворили корені після
того, як мікропагони (30 мм) занурили на 2 год у розчин ІМК
(98,00 мкмоль), а потім субкультивували на середовищі М8 [242,
243].
Для МКР актинідії можна використовувати сегменти стебла.
Так, експланти стебла з латеральними бруньками А. коїотікіа і
А. аг§Ща на середовищі з БАП (4,44 мкмоль) і 2-іР (49,0 мкмоль)
проліферували численні пагони, які можна живцювати і субкуль-
тивувати [251
У дослідах П. Віджешвара [19] на сегментах пагонів і листків
формувався калус двох типів — морфогенний і неморфогенний
(залежно від сорту досліджуваної рослини і регуляторів росту у
живильному середовищі). Найбільш морфогенним виявився ка-
лус сорту Монті. Крім того, вводячи певні концентрації фітогор-
монів у живильне середовище, можна індукувати прямий орга-
ногенез пагонів на експлантах листка. За 3 тижні культивування
максимальна кількість адвентивних бруньок утворилась на сере-
довищі з 8,90 мкмоль БАП і 8,56 — ІОК, а регенерація пагонів
найінтенсивніше відбувалась через 8 тижнів на середовищі з 8,90 і
5,71 та 8,90 і 11,42 мкмоль відповідно.
Листкові диски слід розміщувати адаксіальною стороною на
живильному середовищі, що також збільшує кількість пагонів.
Частота регенерації пагонів залежить від генотипу материнської
рослини. Так, у гібрида Бруно-х-Томурі через 8 тижнів культи-
вування 100 % експлантів проліферували пагони. Оптимальним
213
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
для індукції адвентивних бруньок і пагонів було освітлення 2 клк
[19, 20].
Для 4 видів актинідії — аргута, коломікта, полігама і джи-
ральді — найкращим було середовище М8 з 1 мг/л БАП і 5 мг/л
гіберелової кислоти. На первинних експлантах утворювалось до
2—5 пагонів заввишки 40—70 мм із 2—7 міжвузлями. Це дало
змогу живцювати пагони і істотно збільшити коефіцієнт розм-
ноження.
Укорінення пагонів актинідії також залежало від її виду. Так,
для актинідії аргута оптимальним було середовище М8 з 1 мг/л
ІМК і 0,1 — БАП, для джиральді, полігама — безгормональне се-
редовище Ніча і Ніч, а для коломікта — середовище М8 з 1 мг/л
ІОК і 0,1 мг/л БАП.
Культивування зародків актинідії на різних живильних сере-
довищах, що відрізнялися за складом і концентрацією мінераль-
них компонентів, вітамінів і фітогормонів, викликало різні мор-
фогенетичні процеси: утворення неморфогенного компактного
калусу, формування морфогенного калусу і утворення численних
адвентивних бруньок на експланті.
На середовищі М8 з 13,31 мкмоль БАП і 1,48 — ІМК фор-
мувався компактний калус. На середовищах з 2,32—4,60 мкмоль
кінетину або 2,22—4,44 — БАП проліферували адвентивні брунь-
ки, які відділяли і культивували на тому ж середовищі. Пагони,
що утворюються, можна живцювати і субкультивувати.
Усі органи проростка мають високу морфогенну здатність.
Живцювання, активація пазушних меристем і індукція адвентив-
них пагонів дає змогу отримати велику кількість регенерантів.
Активна регенерація пагонів ківі спостерігалась на експлантах
меристем, видалених із сплячих апікальних бруньок і тих, що
активно ростуть на середовищі Лепувра.
Пазушні бруньки актинідії китайської на середовищі В5 з
4,44—8,90 мкмоль БАП і 0,54—1,07 — НОК проліферували орга-
ногенний калус, з якого регенерували численні адвентивні паго-
ни (20—50 шт.) [87]. Індукція ризогенезу відбувалась протягом
3—4 тижнів на середовищі В5 з 4,90—9,80 мкмоль ІМК. Це сере-
довище з додаванням 4,44 мкмоль БАП було оптимальним для
5 сортів актинідії.
Наводимо методику МКР актинідії, розроблену співробіт-
никами НБС—ННЦ УААН [20]. Відбір експлантів можна робити
протягом року із зелених і напівздерев’янілих пагонів дорослих
(З—5-річних рослин) або пагонів рослин-регенерантів.
214
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
Стерилізація вихідного матеріалу, насіння, вегетативні брунь-
ки, сегменти пагона, листки послідовно занурюють у 70%-й ета-
нол (1 хв), 1%-й Тії і те токаї (10—20 хв), 0,8%-й А£ІЧО3 (2—3 хв)
з твій 80; промивають 3—4 рази стерильною дистильованою
водою.
Умови культивування', насіння культивують на живильних се-
редовищах М8, Мольє, вегетативні бруньки (5—8 мм) — на се-
редовищах М8, Піріка або М8 з 1/2 концентрації МН4МО3 і
КІЧО3, 66,48 мкмоль гліцину, 1,48—7,40 — тіаміну, 2,22—8,9 —
БАП (модифікація П. Виджешвара [19]), сегменти листків — на
середовищі з 8,9 мкмоль БАП і 8,56 — ІОК.
Для пригнічення бактеріальної інфекції у середовище доціль-
но додавати 0,207 мкмоль тетрацикліну гідрохлориду. Укоріню-
ють пагони (2—3 см завдовжки) на середовищі М8 (1/2 концент-
рації) з 9,8 мкмоль ІМК і 5,71 — ІОК.
Пересадка в субстрат', рослини-регенеранти переносять у
субстрат (торф:перліт — 1:3), вирощують при температурі 25 ±
± 1 °С, освітленні 4,5—5 клк і фотоперіоді 16 год (на стелажах
прискореного вирощування рослин). Кожні 4 тижнів підживлю-
ють розчином Кнопа. Адаптовані рослини (через 2 міс) пересад-
жують у суміш перліту, торфу і перегною (1:2:1) і переносять у
теплицю.
Наведена методика дає можливість отримати велику кіль-
кість генетично однорідного посадкового матеріалу актинідії.
Виноград (Уіііг шпііега)
Метод МКР винограду вже давно застосовують у промисло-
вому виноградарстві багатьох країн. Це сприяє збільшенню ви-
робництва здорового посадкового матеріалу нових високовро-
жайних сортів. Виноградники, які закладено такими рослинами,
довговічні і дають якісну продукцію.
Повідомлення про успішне клонування різних сортів вино-
граду почали з’являтися наприкінці 1970-х років, але й дотепер
окремі етапи технології розробляють і удосконалюють. Дослі-
джують головні аспекти методу: вік і фізіологічний стан мате-
ринської рослини, склад живильного середовища і умови куль-
тивування експлантів, адаптація рослин-регенерантів до умов
відкритого ґрунту [ЗО, 62, 164, 375].
Нині створено технології промислового МКР винограду [ЗО,
84, 127, 128, 252].
215
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Найбільш прийнятним і високопродуктивним є метод пролі-
ферації пазушних бруньок у експлантів верхівок пагонів вино-
граду. За короткий термін він дає змогу значно збільшити коефі-
цієнт розмноження рослин (1:30).
На першій стадії культивування найчастіше використовують
середовище М8 (повної або 3/4 концентрації) з 0,5—1,0 мг/л
БАП, 0,5 — гіберелової кислоти або 1 мг/л ІОК. Верхівки і сег-
менти пагонів можна також культивувати на середовищі Кнопа.
Для звільнення від вірусної інфекції материнські рослини підда-
ють термообробці, після чого культивують апікальні меристеми.
Досить перспективним виявився метод, запропонований для
промислового виробництва посадкового матеріалу винограду
[127—129]. Верхівкову меристему з 2—3 листковими примордія-
ми розчленовують на фрагменти (до 0,1 мм) і культивують на
рідкому середовищі М8 з додаванням 1,25 мг/л нікотинової ки-
слоти, 0,25 — тіаміну, 20,0 — інозиту, 50,0 — а-треоніну, 0,25 —
піридоксину, 10,0 — гліцину, 50,0 — а-глутаміну, 1,5 мг/л БАП.
За 20—30 діб утворюються конгломерати зелених бруньок, їх
переносять на агаризоване середовище того ж складу. Через ЗО—
40 діб проліферують адвентивні пагони, які відділяють і укоріню-
ють на середовищі такого складу, мг/л: КЬЮ3 — 474, МН4МО3 —
414, СаСІ - 246, Мо8О4 - 240, КН2РО4 - 168, Бе8О4 7Н2О -
13,9, №2ЕДТА — 18,6, тіамін — 0,5, піридоксин — 0,25, нікоти-
нова кислота — 0,1, ІОК — 0,5, мікроелементи за Мурашіге—
Скугом, цукроза — 15 г/л, агар — 7 г/л, рН 5,6.
Протягом 2—3 міс культивування формуються рослини з 8—
10 вузлами і розвинутою кореневою системою. Адаптація рослин
відбувається в умовах підвищеної вологості на нестерильному
субстраті. Використання цього методу дає змогу отримати за
4 міс до 8 тис. рослин, генетично ідентичних материнському
сорту [128].
При клональному розмноженні більшості сортів винограду
використовують живильні середовища М8 (рідке або агаризова-
не), Кемпбела і Дарзана. Проте для деяких сортів потрібно ек-
спериментально добирати оптимальний склад середовища з ура-
хуванням їх фізіологічних особливостей.
Для сортів групи Піно концентрацію БАП знижують до 1,0—
0,5 мг/л, для ризогенезу пагонів сортів Інтервітіс Магарача і По-
дарок Магарача не слід додавати ауксини. Перед укоріненням
пагони пересаджують на середовище зі зниженою концентрацією
БАП (1,0 мг/л) для стимуляції їх росту.
216
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
Укорінюють пагони на рідкому середовищі зі зменшеною кон-
центрацією макроелементів, мг/л: МН4МО3 — 212, КГ4О3 — 903,
Мо8О4 7Н2О - 72, КН2РО4 - 51, СаС12 - 366, 1/4 концентра-
ції мікроелементів середовища М8, 17 г/л цукрози, 50 мг/л ме-
зоінозиту, 0,2 — нікотинової кислоти, 0,1 — ІОК, 1,0 — феруло-
вої кислоти.
Інколи використовують агаризоване середовище такого скла-
ду, мг/л: МН41ЧО3 - 212, КІЧО3 - 717, Мо8О4 7Н2О - 233,
КН2РО4 — 68, СаС12 — 356, 1/4 концентрації мікроелементів
середовища М8 з тими ж компонентами, що і для рідкого сере-
довища; замість ІОК і ферулової кислоти додають 30 мг/л гумату
натрію [ЗО].
Показана можливість індукції пагонів на експлантах листків
та живців V. ІаЬгиксіапа сорту СаІаиБа. На середовищі Ніча і Ніч
до 15 % експлантів живців формували пагони при культивуванні
в темряві (без стадії калусоутворення). Після перенесення на
світло пагони зеленіли і нормально розвивалися [165].
Прямий органогенез та регенерацію рослин на експлантах
листків 5 сортів V. УІпіГега і V. гирекігіз та їх гібриду було індуко-
вано на живильних середовищах М8, Ніча і Ніч з різними кон-
центраціями БАП (1, 2, 4 мг/л) [456]. Додавання до середовища
активованого вугілля (3 г/л) сприяє росту пагонів і адсорбує ток-
сичні продукти метаболізму. На рідкому середовищі розвиток
експлантів відбувається швидше. Через 2 міс формується пагін з
8—10 міжвузлями, його можна розділити на мікроживці з одним
вічком і культивувати на свіжому живильному середовищі М8 із
феруловою кислотою (1,0 мг/л). За декілька діб формуються ко-
рені, потім розвивається пагін, який можна використовувати для
подальшого живцювання [164].
Виявлено сортову специфічність дії цитокінінів при розмно-
женні 4 генотипів і 15 гібридних форм винограду [422]. Най-
ефективнішим для усіх рослин виявився БАП, але для кожного
генотипу і гібридної форми визначено свою оптимальну концен-
трацію: внесення 5—10 ммоль БАП сприяло проліферації пагонів
і збільшенню загальної маси у більшості гібридів, 2,5 — викли-
кало ризогенез. Для сортів Конкорд і Альба оптимальною була
концентрація 5,0, для Рислінга — 10 ммоль БАП. Кінетин (0,1 —
15,0 ммоль) виявився неефективним для двох міжвидових гібри-
дів і слабо впливав на V. ІаЬгикса і V. ІаЬгиксіапа.
У селекційній роботі з виноградом для вирощування транс-
генних рослин, стійких до різних негативних факторів, часто ви-
217
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
користовують калусну тканину і суспензії клітин, отриманих у
процесі соматичного ембріогенезу. Експлантами можуть бути як
генеративні органи зав’язі, пиляки, так і вегетативні тканини —
листки, черешки, міжвузля [61—63, 337, 412, 438].
Здатність до ембріогенезу залежить від генотипу винограду і
є спадковою ознакою. За допомогою різних концентрацій і спо-
лучень регуляторів росту у живильному середовищі можна керу-
вати морфогенним потенціалом рослин.
Ембріогенний калус отримали з експлантів листків і череш-
ків V. гире8ігІ8 на середовищі М8 з 1 мг/л 2,4-Д, 0,1—1,0 мг/л
БАП [337]. Глобулярні соматичні ембріоїди формувались на екс-
плантах черешків у 8 генотипів винограду на середовищі Ніча і
Ніч з 2,4-Д і БАП [38].
Наводимо найпоширенішу схему МКР винограду.
Вихідний матеріал готують заздалегідь. Здерев’янілу лозу здоро-
вих рослин зрізають у листопаді—грудні, нарізають на черешки 8—
15 см з 2—3 вічками і витримують у воді або розчині ІОК (2 мг/л)
до появи пагонів. Пагони, що вегетують, зрізають у період актив-
ного росту (у травні—червні). Використовують верхівки пагонів
(2—3 см) або міжвузля з бруньками.
Стерилізація вихідного матеріалу, відрізки пагонів промива-
ють проточною водою; занурюють послідовно у 70%-й етанол на
30—40 с, у 0,1%-й розчин діациду з 2 краплями твій 20 на 8—
10 хв або 12%-й розчин гіпохлориту натрію на 10—12 хв; проми-
вають у 4—5 порціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта: вичленовують апікальну меристему з
листковими примордіями (0,5—0,8 мм).
Умови культивування: культивують на рідкому або агаризова-
ному середовищі М8 при температурі 23—28 °С, освітленні
1 клк, фотоперіоді 16 год; за тиждень освітлення можна збіль-
шити до 2—5 клк.
Для індукції органогенезу на першому етапі культивування
до середовища додають, мг/л: мезоінозит — 75, параамінобен-
зойну кислоту — 5, тіамін — 10, нікотинову кислоту — 4, глута-
мін — 50, гліцин — 10, аденін — 80, БАП — 1.
Через 20—ЗО діб експланти збільшуються у розмірах; їх суб-
культивують на тому ж середовищі з підвищеною концентрацією
БАП (2 мг/л), що сприяє формуванню пагонів. При подальших
пересадках пагони поділяють на окремі вузли і на тому ж се-
редовищі протягом 15—20 діб утворюються численні бруньки і
пагони.
218
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
На цьому етапі МКР можна отримати потрібну кількість па-
гонів, які укорінюють на середовищі зі зниженою кількістю мак-
ро- і мікроелементів, без цитокінінів, з додаванням 0,1 мг/л
НОК і 1 мг/л ферулової кислоти.
У пагонів завдовжки 1,5—2,0 см корені з’являються через 5—
10 діб, за 2 міс розвиваються рослини з 8—10 міжвузлями і добре
розвинутою кореневою системою.
Надалі регенеранти витримують на модифікованому жи-
вильному середовищі при температурі 25—ЗО °С і фотоперіоді
16 год протягом 50—60 діб, а потім при фотоперіоді 8 год 25—
30 діб. Такі рослини можна тривалий час зберігати за пониже-
ної температури (3,5 °С); вони краще приживлюються при пе-
ресадці в субстрат, їх можна використовувати для отримання
суперелітних саджанців і створення колекції генофонду вино-
граду [34].
Етап адаптації рослин до зовнішніх умов і пересадки в суб-
страт вимагає особливої уваги. Доцільно останні тижні перед пе-
ресадкою збільшити інтенсивність освітлення до 8—10 клк, що
підвищує відсоток приживлюваності експлантів [8].
Субстрат для пересадки регенерантів повинен бути легким,
водопроникним і багатим на поживні речовини; бажано, аби
він відповідав ґрунтовим умовам конкретної зони виногра-
дарства.
Найчастіше використовують суміш рівних частин торфу, пе-
рліту і лісового ґрунту, торфу і перегною або торфу і перліту. Раз
на тиждень рослини поливають розчином Чеснокова. Перші
2 тижні рослини витримують в умовах підвищеної вологості, в
теплицях із туманоутворювальними установками. На кінець ве-
гетації довжина лози сягає 0,4—0,5 м залежно від біологічних
особливостей сорту і часу пересадки. Восени саджанці перено-
сять на постійне місце в поле.
Суниця (Егадагіа апапазза)
Тривале вегетативне розмноження суниці призвело до масо-
вого зараження плантацій комплексом вірусних інфекцій, що
знижують якість і кількість урожаю.
Виявлено, що суницю вражають понад 50 вірусних та 8 міко-
плазмових хвороб [149]. З метою оздоровлення і збільшення ко-
ефіцієнта розмноження рослин використовують культуру апі-
кальних меристем [321].
219
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Технологія МКР суниці і звільнення її від вірусних інфекцій
розроблена досить детально, але окремі етапи методу постійно
удосконалюють [1, 76, 150, 434].
Для збільшення виходу здорових рослин застосовують різні
заходи, спрямовані на пригнічення репродукції вірусів: поєд-
нання термотерапії з культурою апікальних меристем, внесення
до живильного середовища різних інгібіторів вірусів. Так, дода-
вання до середовища 100 мг/л циангуанідину значно збільшува-
ло вихід здорових рослин-регенерантів.
Головним фактором, що сприяє звільненню суниці від вірус-
них інфекцій, є використання експлантів апексів малих розмірів
(0,25—0,5 мм). При цьому слід особливу вагу приділити складу
живильного середовища і добору регуляторів росту. Найчастіше
використовують середовища М8, Боксуса, Уайта (з мікроелемен-
тами за Хеллером), Ван-Хофа або Готре. Для індукції морфоге-
незу додають 0,1—1,0 мг/л БАП, для ризогенезу — 0,1 мг/л ІОК
або ІМК [286].
Протягом 2—3 міс формуються рослини, які можна висаджу-
вати у субстрат. Не помічено відмінностей у швидкості регене-
рації експлантів апексів з латеральних чи апікальних бруньок
материнської рослини, але тканини молодих пагонів мають біль-
шу регенераційну здатність, ніж тканини старих сформованих
рослин. Ізолювати експланти суниці можна протягом усього пе-
ріоду вегетації, але помічено, що на початку активного росту
столонів при дозріванні урожаю регенераційна здатність апексів і
швидкість росту рослин-регенерантів знижується. Крім того,
морфогенна активність значною мірою залежить від сортових
особливостей материнської рослини. До того ж у різних кліма-
тичних умовах один і той же сорт може мати різну регенераційну
здатність [86].
Дослідження 15 сортів суниці виявили, що сорти Мисовка,
Талісман мають високу регенераційну здатність, сорти Зенга Зен-
гана, Пурпуровая, Фестивальна — середню, а Внучка, Кавалер,
Рання Махерауха, Ідун — низьку. Сприятливий час для вичлену-
вання експлантів у сортів Фестивальна, Деснянка, Заря — бере-
зень—квітень, у сорту Талісман — серпень—вересень (цит. за: [44]).
Запропоновано промислову технологію масового клональ-
ного розмноження суниці [150], яку і досі широко використову-
ють. Меристематичні верхівки ізолюють у молодих здорових
рослин. Культивують на живильному середовищі Боксуса. За 3—
4 тижні утворюються адвентивні бруньки, які дуже швидко рос-
220
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
туть і дають початок новим брунькам. Протягом 6—8 тижнів ут-
ворюється конгломерат бруньок, з’єднаних сполучною ткани-
ною, їх розділяють і переносять на середовище з 1 мг/л БАП. За
деякий час формуються листки і пагони, які субкультивують. На
середовищі з цитокініном продовжується проліферація додатко-
вих пагонів, на середовищі без регуляторів росту формуються
рослини з листками і коренями. Морфогенетична активність екс-
плантів може зберігатися протягом 3—4 років.
Рослини-регенеранти з добре розвинутими листками і коре-
нями висаджують у кювети з попередньо простерилізованим суб-
стратом: листяна земля, суміш торфу і піску (3:1) або торфу,
піску і дернової землі (1:1:1). Витримують в умовах підвищеної
вологості. Як показав генетичний контроль, рослини-регенеран-
ти ідентичні материнським клонам. Крім того, вони протягом
2—3 років лишаються здоровими.
Материнські рослини можна зберігати у стерильних умовах
на живильному середовищі, де вони не втрачають здатність до
проліферації протягом кількох років. Застосовуючи метод МКР,
можна отримати від однієї материнської рослини до 1 млн реге-
нерантів [150].
Цей метод можна використовувати і для отримання безвірус-
них рослин лісової суниці (Рга^агіа уекса) [76]. Експланти апек-
сів різного розміру (0,25—0,50—1,0—2,0 мм) культивували на се-
редовищі Уайта з мікроелементами за Хеллером, 5 мг/л цитрату
заліза, 2 % глюкози, вітамінами за Бутенко і 0,5 мг/л ІОК.
При застосуванні експлантів розміром 0,5—2,0 мм вихід про-
бірочних рослин становив 77—100 %, при розмірі апекса 0,25 мм —
лише 28 %. За своїм розвитком ці рослини відстають від регене-
рантів, отриманих з більших експлантів, і гірше переносять пе-
ресадку у субстрат. Використання малих апексів (0,25 мм) збіль-
шує кількість здорових рослин до 45,4 % і значно зменшує
(29 %) — при застосуванні апексів до 0,5 мм.
Метод культури ізольованих апексів суниці успішно викори-
стовують для прискорення селекційного процесу [76]. Так, при
первинному вивченні гібридних сортів треба висадити 200—500
оздоровлених рослин, на вирощування яких витрачається З—
4 роки. Метод МКР у 3 рази скорочує період розмноження здоро-
вих елітних сіянців.
Фізіолого-біохімічні дослідження процесу морфогєнезу в
культурі тканин суниці показали його залежність від комплексу
факторів: природи первинного експланта, складу живильного
221
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
середовища і співвідношення фітогормонів, що впливають на
популяцію клітин. Унаслідок цього впливу можуть відбуватися
зміни у генетично обумовленій програмі розмноження, коли не
всі клітини первинних експлантів спроможні проявляти свою
регенераційну здатність. Виявлено, що морфогенні калуси суни-
ці характеризуються відносною цитогенетичною стабільністю і
відсутністю хромосомних порушень. їм притаманний менш ін-
тенсивний поділ клітин, ніж у неморфогенних калусів. Дослі-
дження компонентів клітинної стінки показало, що морфоген-
ний калус має підвищений вміст уронових кислот, ваніліну та
ферулової кислоти. На думку О.В. Колісніченко [45], морфо-
генні потенції калусних культур суниці залежать від кількісного і
якісного складу білків. У морфогенних калусів кількість легко-
розчинних білків значно вища, ніж у неморфогенних, до того ж
майже половину спектра складають білки з низькою молекуляр-
ною масою. Зміни кількісного і якісного складу білків виклика-
ють порушення механічних властивостей клітинних стінок, що
призводить до морфологічних змін клітини і втрати морфоген-
них потенцій.
Отже, визначені фізіолого-біохімічні показники, які відріз-
няють калусні культури за здатністю до морфогенезу, можуть бу-
ти основою для добору морфогенних калусів у процесі проми-
слового МКР суниці [45].
Наведені дослідження дають можливість визначити головні
етапи цієї технології.
Стерилізація вихідного матеріалу, з вусів і ріжків суниці
зрізають верхівки завдовжки 1,5—2,0 см; промивають проточною
і теплою водою з детергентом; видаляють покривні листки і лус-
ки; занурюють у 0,1%-й розчин сулеми або діациду на 5 хв; про-
мивають у 3 порціях стерильної дистильованої води.
Високий процент стерильних експлантів дає використання
розчину хлораміну (препарат “Білизна”) у концентрації 1:3 про-
тягом 2 хв і 0,1 %-ї сулеми (3 хв).
Вичленування експланта. препарувальною голкою обережно
відділяють покривні луски, звільняючи меристематичний купол,
ізолюють меристему з 1—2 листковими примордіями і субапі-
кальною тканиною; розмір експланта для звільнення від вірусної
інфекції становить 0,3—0,5 мм, для масового розмноження здо-
рових рослин — 1—2 мм.
Умови культивування', культивують на живильному середови-
щі М8 з 1 мг/л аскорбінової кислоти, 0,8 мг/л БАП (або 5,0 мг/л
222
Розділ 5. Мікроклональне розмноження плодових, ягідних культур і винограду
кінетину) при 23—26 °С, освітленні 2—3 клк, фотоперіоді 16 год,
відносній вологості 70—75 %. Добрі результати дає вирощування
експлантів на середовищах Боксуса, Кнопа, Уайта.
На кожному експланті формуються численні бруньки, з яких
у подальшому розвиваються пагони і листки. Конгломерат бру-
ньок розділяють і субкультивують на свіжому живильному сере-
довищі. Пагони, що утворились, укорінюють на середовищі з
0,5 мг/л ІОК.
Пересадка є субстрат', рослини до 2 см з 3—4 листками і ко-
ренем пересаджують у субстрат з торфу і піску (3:1) або торфу,
піску і дернового ґрунту (1:1:1), попередньо простерилізованого
протягом 1 год при 1,5—2,0 атм. Для забезпечення підвищеної
вологості рослини накривають плівкою або витримують в умовах
штучного туману. Після утворення 1—2 нових листків рослини
висаджують у ґрунт. За 40—50 діб формується стандартна розсада
суниці. Для запобігання розвитку грибних і бактеріальних хвороб
слід раз на тиждень обробляти рослини 0,3%-м фундазолом.
Застосування оздоровленого посадкового матеріалу суниці
для промислових плантацій дає змогу в 1,5—2 рази підвищити їх
продуктивність.
__________________Р о з 3 і л 6 ________________
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ
ДЕРЕВНИХ РОСЛИН
Процес вегетативного розмноження деревних порід тривалий і
трудомісткий, а для деяких дерев таке розмноження неможливе.
Зусилля багатьох дослідників спрямовані на розробку рентабель-
них і швидких технологій мікроклонування листяних і хвойних
порід [124]. Відзначається, що культура ізольованих тканин —
перспективний метод розмноження оздоровлених клонів і гіб-
ридних форм, стійких до хвороб, токсинів, гербіцидів, засоле-
ності грунту [87, 142, 143, 205, 227].
Уже введено в культуру понад 200 видів деревних порід, що
належать до ЗО родин. Значного прогресу досягло МКР хвой-
них [116]: закладено промислові плантації сосни [446], крипто-
мерії [227].
Методи МКР окремих порід відзначаються певною специ-
фічністю, але спільним для всіх деревних є такі етапи: введення
в культуру, індукція морфогєнезу рослин, пересадка регенерантів
у субстрат. Регенерація в культурі іп уііго може бути прямою (на
експлантах бруньок, верхівках пагона), внаслідок формування
пагонів і рослин, та через калусну культуру з проліферацією емб-
ріоїдів і пагонів. Експланти молодих (ювенільних) дерев мають
більший морфогенний потенціал, ніж експланти старих екземп-
лярів, але є повідомлення про успішне клонування 100-літньої
секвойї і ялини європейської. Зазвичай експланти від дорослих
дерев ростуть і регенерують повільно або зовсім не ростуть, тому
можна використовувати пагони (поріст) коренів старих дерев.
Більшість методик розроблено для тканин сіянців, тому що
їх легше стерилізувати і вводити в культуру. Калусні тканини
можна отримати з будь-якої частини дерева, значно важче інду-
кувати морфогенез і регенерацію рослин. Для кожної культури
слід добирати оптимальне середовище, концентрацію і співвід-
ношення ауксинів і цитокінінів. Часто індукторами морфогєнезу
слугують речовини негормональної природи. Мезоінозит, напри-
клад, сприяє формуванню бруньок у культурі в’яза, АБК стиму-
224
Розділ 6. Мікроклональне розмноження деревних рослин
лює утворення пагонів у криптомерії. Важливими факторами,
що впливають на морфогенну активність, є вид експланта, його
фізіологічний вік, генотип і вік материнської рослини.
Прямий органогенез гарантує ідентичність з материнської
рослиною, а регенерація рослин з калусної тканини може при-
вести до генетичних відхилень.
Досить перспективним є метод індукції соматичного ембріо-
генезу з калусної тканини або суспензії клітин. Ембріоїди, по-
криті оболонкою, можна використовувати при механізації техно-
логії висадки в ґрунт, особливо для рослин, які продукують мало
насіння [124].
ЛИСТЯНІ ПОРОДИ
МКР листяних порід застосовують головним чином для от-
римання елітних дерев, створення розсадників високої якості з
метою підвищення продуктивності лісорозведення й оздоров-
лення цінних видів дерев. Останнім часом досягнуто певних
успіхів у мікроклонуванні окремих порід дерев, що засвідчує на-
ведений нижче огляд літератури [352].
Береза (Веіиіа зрр.)
Береза карельська (В. репсіиіа КоіИ уаг сагеїіса Мегскі.) нале-
жить до цінних промислових культур, вегетативне розмноження
якої живцюванням малоефективне, тому розробка нових методів
має значний інтерес.
Технологія МКР цінних гібридів берези карельської скла-
дається з трьох етапів [3].
На першому етапі в культуру вводять пазушні бруньки одно-
річних пагонів гібридних материнських дерев. Пагони промива-
ють у воді з детергентом, потім у проточній воді. Стерилізують
послідовно у 70%-му етанолі (1 хв), 3%-му пероксиді водню
(5 хв) і 0,1%-му розчині діациду (3—6 хв), тричі промивають у
стерильній дистильованій воді.
Вичленовують пазушні бруньки з невеликою частиною стеб-
ла, видаляють усі покривні луски і залишають меристему з при-
мордіальними листками.
Культивують на живильному середовищі М8 з додаванням
100 мг/л лізину, 20,0 — аденінсульфату, 0,1 — кінетину, 0,5—
0,9 - БАП, 0,05 - ІОК, 0,07 мг/л НОК.
15-6-83
225
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
За 7—10 діб із експлантів бруньок, відібраних у травні (у пе-
ріод активного росту), виростають пагони, які видаляють і пе-
реносять на середовище для отримання максимальної кількості
культиварів. На цьому етапі використовують 1/2 концентрації
середовища М8 з додаванням 0,5 мг/л БАП і ІОК. Пагони (3 см
завдовжки) субкультивують кожні 4—5 тижнів для досягнення
максимальної кількості регенерантів. На експланті бруньки в ос-
нові пагонів утворюється калус, який також використовують для
проліферації рослин. За 3 тижні маса калусу збільшується, утво-
рюються зелені меристематичні структури, з яких регенерують
нові пагони.
Рослини заввишки 2,0—2,5 см укорінюють на 1/2 концентра-
ції середовища М8 з 0,5 мг/л ІМК, 0,2 мг/л НОК, 10 г/л цукро-
зи (без агару). За 10—14 діб утворювалось по 4—5 коренів [4].
Рослини з розвинутою надземною частиною і сформованою
кореневою системою переносять у субстрат із піску і торфу (2:1) з
поживною сумішшю Коссовича. Два тижні регенеранти витриму-
ють в умовах підвищеної вологості. Адаптація рослин триває 60—
90 діб, після чого регенеранти переносять у добре підготовлений,
забезпечений органічними і мінеральними добривами ґрунт.
Доведена можливість МКР берези протягом року без ознак
старіння і втрати регенераційної здатності [338]. Тривалість одного
циклу мікроживцювання пробірочних рослин — 2—3 міс. За цей
час від одного регенеранта можна отримати 4—5 живців. Пагони
відзначалися енергійним ростом і високою ризогенною активніс-
тю, а рослини-регенеранти добре адаптувались до зовнішніх умов
після пересадки в ґрунт. Перспективним є метод МКР берези з
використанням недозрілих зародків, сім’ядолей і сегментів листків.
Культивували експланти на середовищах М8, \УРМ [449] і
СНи N6 з додаванням БАП (0,5—2,0 мг/л), 2-іР (5 мг/л), НОК
(0,1—1,0 мг/л) при температурі 25 °С, фотоперіоді 16 год і освіт-
ленні 2—4 клк. За 3—4 тижні формувались бруньки і пагони, їх
субкультивували на свіжих живильних середовищах для подаль-
шого росту і стимуляції додаткових пагонів.
Для збереження ознак генотипу доцільно використовувати
сегменти або черешки листка дорослої рослини [227]. На цих
експлантах внаслідок прямої регенерації або через проміжний
калусогенез утворюються бруньки і пагони. Високу морфогенну
здатність мають також листки пробірочної культури пагонів. Ри-
зогенез відбувається на середовищах (1/2 концентрації) з дода-
ванням 0,1 мг/л ІМК або без гормонів.
226
Розділ 6. Мікроклональне розмноження деревних рослин
Горіх ('Юдіапз гедіа)
Для МКР горіха використовують апікальні меристеми па-
гонів ювенільних рослин або сіянців, сегменти пагонів із пазуш-
ними бруньками. Експланти стерилізують у 0,1—1,0%-му А£МО3
(15—30 хв), 0,1%-му діациді (5—8 хв) і 1%-му гіпохлориті каль-
цію (7—10 хв).
Культивують на середовищах М8, ВКХУ [191] або \¥РМ з дода-
ванням регуляторів росту, мг/л: 0,1 БАП +0,15 НОК; 1,0 БАП +
+ 0,01 ІМК; 1,0 БАП + 0,3 кінетину + 1,0 ІМК або 0,5 БАП.
Великою проблемою при вирощуванні експлантів горіха є
потемніння середовища; аби запобігти цьому, слід субкультиву-
вати експланти на свіжому живильному середовищі кожні 2—
З доби протягом 3 міс. Після припинення виділення ексудату екс-
планти субкультивують раз на тиждень.
Пагони завдовжки 4—5 см розрізають на сегменти з однією
брунькою і переносять на середовище з більшою концентрацією
макроелементів для проліферації численних пагонів, які укорі-
нюють на 1/4 концентрації середовища ВК\¥ з додаванням
1 мг/л рибофлавіну, 2 мг/л ІМК і 20 г/л цукрози. Пагони також
можна укорінювати, занурюючи їх у розчин 5 ммоль ІМК або
розмістивши на середовищі з 0,15 мг/л ІМК і витримуючи при
19 °С протягом 7 діб. Для запобігання інфікуванню регенеранти
обробляють розчином фунгіциду [227].
Дуб (Оиегсиз)
Різні види дуба належать до порід, які повільно, з великими
труднощами розмножуються вегетативно. Тому розробка методів
МКР має неабияке практичне значення. Літературні відомості сто-
совно досліджень представників роду фііегсик у культурі іп УІІГО
досить обмежені [16, 160, 401]. Виявлено, що морфогенна здат-
ність експлантів дуба залежить від багатьох факторів: генотипу ма-
теринської рослини, складу живильного середовища і умов куль-
тивування (температури і освітлення) [160, 161, 227, 414].
Для вичленування експлантів використовували 2—12-місячні
сіянці і однорічні пагони порослі дорослих дерев. Відрізки пагонів
(15—20 см) стерилізували у 0,1—0,3%-му розчині меркурійхлори-
ду 15—25 хв або у 0,1%-му розчині діациду протягом 10—15 хв,
промивали у 3 порціях стерильної дистильованої води, розрізали
на сегменти з однією брунькою (10—25 мм). Культивували експ-
ланти на середовищі М8 або на одному з чотирьох живильних се-
15*
227
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
редовищ, рекомендованих для деревних порід. Для індукції про-
ліферації пазушних, адвентивних бруньок і пагонів використову-
вали різні співвідношення та концентрації ауксинів і цитокінінів.
Культури вирощували в контрольованих умовах за темпера-
тури 25 °С (вдень) і 20 °С (вночі), фотоперіоду 16 год або ціло-
добового освітлення 3—8 клк.
На першому етапі культивування до середовищ додавали
0,2—1,0 мг/л БАП. За 2 тижні з’являлись адвентивні бруньки і
пагони. Для більшості експлантів різних фенотипів дуба опти-
мальними були середовища Халупи і \¥РМ. На середовищі М8
лише 10—25 % експлантів формували бруньки, а на середовищі
Грешофа—Доя [239] утворювались численні невеликі пагони, які
швидко відмерли [44, 160].
Для стимуляції росту і розмноження пагонів до середовищ
додавали кінетин і БАП (0,2—5,0 мг/л). Ефективнішим виявився
БАП: його низькі концентрації (0,2—0,8 мг/л) стимулювали
швидкий ріст пагонів, які через місяць сягали 3—5 см; високі
концентрації (2,0—5,0 мг/л) пригнічували їх ріст. Додавання аук-
синів (ІМК і НОК по 0,05—0,1 мг/л) не впливало на розвиток
експлантів. Для збільшення коефіцієнта розмноження пагонів їх
живцюють і субкультивують на середовищах Халупи і \¥РМ з
0,2—1,0 мг/л БАП, кожен сегмент утворює по 3—9 нових пагонів
протягом місяця. Цей прийом можна повторювати для отриман-
ня потрібної кількості рослин.
Укорінюють пагони завдовжки не менше 2 см на середовищах
з низьким вмістом мінеральних сполук і цукрози (1/2 концен-
трації) та додаванням ІМК і НОК (0,1—0,5 мг/л). На середовищах
з 0,3 мг/л ІМК і 0,1 мг/л НОК укорінювалось до 70—95 % пагонів.
Сформовані рослини-регенеранти висаджують у субстрат з
торфу і перліту (1:1) і утримують в умовах підвищеної вологості.
Приживлюється до 90—95 % регенерантів. Через 2—3 міс росли-
ни сягають 20—30 см і їх можна переносити в ґрунт [160, 161].
Реалізація морфогенних потенцій дуба черешчатого значною
мірою залежала від генотипу материнської рослини. Істотний
вплив мають умови культивування. Інтенсивне освітлення (10 клк)
при 16-годинному фотоперіоді активізувало морфогенетичний
потенціал усіх досліджуваних генотипів. Інтенсифікація росту та
розвитку бруньок і пагонів відбувалась і за постійного освітлен-
ня 8 клк. На розсіяному світлі експланти дуба ліванського утво-
рювали калус, при подальшому культивуванні за інтенсивного
освітлення формувались бруньки і корені.
228
Розділ 6. Мікроклональне розмноження деревних рослин
Експланти різного походження істотно відрізняються за вимо-
гами до складу живильних середовищ. Ювенільні експланти доб-
ре розвиваються на середовищах з низькою (1/2) концентрацією
солей за Мурашіге—Скугом, а експланти поросту потребують
більш вимогливих до концентрації елементів живлення [16].
На життєздатність регенерантів істотно впливають умови ви-
рощування пробірочних рослин після пересадки в субстрат. У
цей період потрібно витримувати рослини за підвищеної воло-
гості й цілодобового освітлення.
Каштан (Сазіапеа 5рр.)
Для розмноження селекційних сортів каштана, звільнених
від хвороб, культивують апікальні меристеми пагонів, ювеніль-
них або дорослих рослин С. заііуа і С. сіепіаїа. Оскільки отри-
мати стерильний вихідний матеріал від рослин, що ростуть у
природі, досить складно, використовують маточні рослини,
вирощені у теплиці. Пагони 3—4-місячних рослин стерилі-
зують у 70%-му етанолі ЗО с і 5%-му гіпохлориті кальцію 5 хв.
При великій контамінації режим стерилізації посилюють: витри-
мують відрізки пагонів у етанолі 3 хв і у 8%-му гіпохлориті
25 хв [410].
Вичленовують апікальні меристеми з кількома примордіями і
пазушні бруньки (1 см завдовжки). Культивують на живильних
середовищах Хеллера, М8 (з 1/2 концентрації ГЮ3) і Лепувра з
різними концентраціями БАП. Додавання 0,1—0,5 мг/л БАП до
всіх середовищ оптимальне, сприяє утворенню 4—5 пагонів на
експлант і стимулює їх ріст. Збільшення концентрації БАП до
1—2 мг/л пригнічує ріст пагонів і знижує ризогенез. Пагони зав-
вишки понад 2 см переносять на 1/2 концентрації середовища
М8 або 1/2 концентрації середовища Лепувра з 3 мг/л ІМК. Про-
тягом 12 діб до 58—74 % пагонів утворюють по 4—6 коренів.
Збільшення концентрації ауксину до 5 мг/л пригнічує укорінен-
ня і сприяє утворенню калусу. Ефективним методом укорінення
є обробка пагонів концентрованими розчинами ІМК: 1 г/л про-
тягом 2 хв або 0,5 г/л — 15 хв.
Метод, розроблений для МКР ювенільних рослин, можна за-
стосовувати і для клонування дорослих (10—18-річних) дерев каш-
тана. Використовують кореневий поріст, який зрізають у грудні і
зберігають при 4 °С до березня—квітня. Потім відрізки пагонів
(до 20 см) переносять у теплицю. Через деякий час розкривають-
229
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ся і починають рости сплячі бруньки. З пагонів, що утворились
(2—4 см завдовжки), вичленовують апекси і сегменти міжвузль
(0,5 см). Експланти культивують на середовищі з 0,1 —1,0 мг/л
БАП. За 3—4 тижні апекси збільшуються і регенерують по де-
кілька адвентивних пагонів. На середовищі з 0,1—0,2 мг/л БАП
відбувається розмноження потрібної кількості пагонів, їх субкуль-
тивують на середовищі з 0,01 мг/л БАП або 1 мг/л аденін-
сульфату, що сприяє росту.
Морфогенез коренів проходить на 1/2 концентрації середо-
вища М8 після обробки пагонів розчином ІМК (1 г/л) протя-
гом 2 хв. Залежно від генотипу материнської рослини укоріню-
ється 40—70 % пагонів. Рослини з добре розвинутими коренями
і листками переносять у субстрат (ґрунт : перліт), утримують у
теплиці в умовах підвищеної вологості, а потім висаджують у
ґрунт.
Декілька методів масового розмноження А. Нірросайапит
дослідив Б. Кас1о)еуіс [410]: культуру пиляків для індукції гап-
лоїдних рослин; культуру зиготичних ембріонів для отримання
соматичних зародків; культуру апікальних меристем для розмно-
ження і оздоровлення рослин.
Застосування цих методів дає можливість індукувати регене-
рацію рослин унаслідок соматичного ембріогенезу, андрогенезу і
клонування гібридів каштана. У культуру вводять апікальні ме-
ристеми (0,3 мм) або латеральні бруньки пагонів, взяті з моло-
дих або дорослих рослин і кореневого поросту. Найкращий час
для добору пагонів — березень.
Стерилізують відрізки пагонів у 70%-му етанолі (1 хв), 0,1%-му
беномілі (10 хв) і 3%-му гіпохлориті кальцію (10 хв).
Культивують на середовищі Лепувра або М8 (1/2 концентра-
ції) з 2 % цукрози, 0,7 % агару, 0,001 мг/л 2,4-Д, 1,0 — БАП,
0,1 мг/л ГК3. Експланти утримують за температури 28 ± 1 °С, ос-
вітлення 2 клк і фотоперіоду 12 год.
За деякий час утворюються адвентивні бруньки або розетки
листків. Індукція пагонів відбувається на середовищі, збагачено-
му вітамінами (по Готре), яке містить 1—10 мг/л гіберелової ки-
слоти. Укорінюють рослини на 1/2 концентрації середовища Ле-
пувра. Прискорює ризогенез утримання пагонів у темряві про-
тягом 10 діб.
Добре розвиваються корені на середовищі М8 з 3 мг/л кіне-
тину, 1 мг/л ІМК і ГК3. Рослини-регенеранти пересаджують у
субстрат і акліматизують у теплиці [227].
230
Розділ 6. Мікроклональне розмноження деревних рослин
Липа (Тіїіа зрр.)
Для швидкого розмноження селекційних фенотипів липи
(Т. согсіаіа) використовували експланти верхівок пагону та сег-
менти пагонів сіянців віком від 2 міс до 1 року. Пагони розрі-
зали і стерилізували у 0,1—0,3%-му розчині діациду протягом
15—25 хв, потім тричі промивали в стерильній дистильованій
воді. Сегменти з брунькою (розміром 10—25 мм) розміщували на
агаризованих середовищах БТМ і ХУРМ з 0,2—2,0 мг/л кінетину
або БАП. Культивували в кліматичних камерах за температури
25 °С і фотоперіоду 16 год або при 20 °С, освітленні 5—8 клк і
фотоперіоді 18 год [160, 161].
Інтенсивний ріст і розмноження адвентивних пагонів відбу-
валися на середовищі М8 з 20,0 мг/л аденінсульфату, 10,0 — глу-
таміну, 5,0 — гліцину, 0,2 — БАП і 0,1 мг/л НОК. Кожен куль-
тивар проліферує по 5—8 пагонів, які можна розрізати на части-
ни з брунькою і культивувати на тих же середовищах. Один сег-
мент формує протягом місяця по 3—8 нових пагонів, які також
можна живцювати і субкультивувати. Ризогенез пагонів від-
бувається на середовищах з 1/2 концентрації мінеральних солей,
10 г/л цукрози з додаванням 0,3 мг/л ІМК і 0,1 мг/л НОК. Про-
тягом 2—4 тижнів 80—100 % пагонів утворюють корені. Око-
рінені рослини переносять у посудини з сумішшю торфу і перлі-
ту (1:1) і вирощують в умовах підвищеної вологості протягом З—
4 тижнів. Приживлюється до 90—95 % регенерантів. Поступово
вологість знижують і готують рослини до пересадки в польові
умови. Запропоновану методику можна використовувати для МКР
не лише сіянців, а й кореневих паростків дорослих дерев [160, 161].
Свою модифікацію цього методу запропонували В. Киппе-
гпап і М. АІЬегз [312]. Для вичленування експлантів вони вико-
ристовували рослини, вирощені у теплиці. Це значно зменшу-
вало контамінацію вихідного матеріалу. Пагони рослин занурю-
вали в етанол (96 °) на 1 хв і у стерильну воду (1 хв), розрізали
на сегменти з брунькою і продовжували стерилізацію у розчині
СаОСІ (5 г/л) з декількома краплями твій 20 протягом 15 хв;
промивали у 3 порціях стерильної води. Таку стерилізацію добре
витримують вузлові сегменти, в той час як верхівкові бруньки
часто темніють, гинуть. Експланти вузлових бруньок культиву-
ють на модифікованому середовищі М8 зі збільшеним вмістом
кальцію (2880 мг/л Са(ТЮ3)2). Це сприяє посиленому росту па-
гонів і запобігає пожовтінню і некрозу експлантів, які спостері-
231
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
гають на інших середовищах. За кілька тижнів утворюються па-
гони з листками. Оптимальною температурою культивування є
25 °С. Найбільшу морфогенну здатність мають експланти базаль-
ної частини пагона. Адвентивні паростки можна живцювати на
сегменти з 2—3 листками і субкультивувати.
Укорінюють культивари на 1/2 концентрації живильного се-
редовища з 0,2—0,8 мг/л ІОК у темряві протягом 7 діб, а потім
на світлі при 25 °С. Процент укорінених пагонів збільшується із
кількістю субкультур. Так, через 3 цикли пересадок укорінюється
до 15 % пагонів Т. еисіїїога, через 5 — 50 %, а через 10 субкуль-
тивувань — до 90 %.
Рослини-регенеранти пересаджують у суміш торфу й перліту
і акліматизують у теплиці. Приживлюється до 90 % рослин, вони
добре ростуть і за 1—2 роки придатні до пересадки в грунт.
Тополя (Рориіиз зрр.)
Метод МКР тополі розроблено для відновлення цінних гібри-
дів, які важко розмножуються традиційними методами [17, 18, 227].
У культуру вводили апікальні верхівки і латеральні бруньки
пагонів дорослих дерев. Використовували цілу низку середовищ
для різних видів тополі, але оптимальним було середовище М8
повної або 1/2 концентрації з додаванням БАП (0,2—0,5 мг/л),
ІМК (0,01 мг/л), зеатину (0,25 мг/л). Пагони, що утворилися,
можна живцювати. Тривалість одного циклу живцювання 2—
З міс, за цей час від одного регенеранта можна отримати до 6—
10 мікроживців. Виявлено, що мікроживцювання можна повто-
рювати протягом 4 років без втрати регенераційної здатності.
Такі пагони відзначаються хорошим ростом і високою ризо ген-
ною активністю. Укорінення відбувається на середовищі з аукси-
нами (0,01 мг/л ІМК або 0,2 мг/л НОК).
Для МКР тополі бальзамічної можна використовувати сегмен-
ти листків. На середовищі М8 з 3 мг/л 2,4-Д і 0,5 мг/л кінетину
утворювався калус з подальшим органогенезом. Додавання 1—
2 мг/л ІОК і кінетину сприяло морфогенезу пагонів і коренів [18].
Шовковиця (Могаз аІЬа)
Методи МКР шовковиці мають велике значення в регіонах, де
займаються розведенням тутового шовкопряда, оскільки вегета-
тивне розмноження (живцювання і щеплення) досить утруднене.
232
Розділ 6. Мікроклональне розмноження деревних рослин
Детально ця методика наведена у роботі японських дослідни-
ків [377].
Для вичленування апікальних меристем і латеральних бруньок
використовують добре розвинуті пагони материнської рослини
протягом зими (січень—лютий). Після настання періоду спокою
пагони зрізають і зберігають у пластикових пакетах при 2 °С; ви-
користовують за потребою, оскільки бруньки не втрачають жит-
тєздатності упродовж 6 міс.
Стерилізація вихідного матеріалу, пагони розрізають на час-
тини з однією брунькою, промивають водою з детергентом, за-
нурюють у 4%-й розчин гіпохлориту кальцію на 20—ЗО хв; про-
мивають у 3 порціях стерильної дистильованої води.
Вичленування експланта'. з бруньок, що зимували, видаляють
покривні луски і вичленовують меристематичний купол розмі-
ром 2—4 мм з листковими примордіями; апікальні бруньки звіль-
няють від молодих листків і вичленовують апекс розміром 1 мм,
латеральні бруньки вичленовують з лусками або без них.
Умови культивування', температура 28 °С, освітлення 4 клк, фо-
топеріод 12 год. Оптимальним для всіх експлантів було середовище
М8 з 1 мг/л БАП. На першому етапі на середовищі з цукрозою
розвивається декілька листків, але пагони не ростуть. При пересад-
ці на середовище з 2—3 % фруктози, глюкози або мальтози відбува-
ється проліферація пагонів. Велике значення має вміст агару у жи-
вильному середовищі: високі концентрації (0,8—1 %) пригнічують
ріст пагонів і листків, зниження до 0,4 % сприяє росту пагонів.
Важливим компонентом живильного середовища є цитокіні-
ни: БАП (0,1—1,0 мг/л) ефективніший, ніж зеатин. Індукція па-
гонів корелює з концентрацією БАП у живильному середовищі:
одиничні пагони утворюються на експлантах при 0,1 мг/л БАП,
а при 1,0 мг/л проліферують численні додаткові пагони.
Ризогенез відбувається протягом 2 тижнів на середовищі без
гормонів або з 0,01—0,1 мг/л ІОК. Пагони заввишки 3—5 см мож-
на розділяти на частини з бруньками і субкультивувати на середо-
вищі М8 з 1 мг/л БАП. Протягом місяця утворюється 3—5 пагонів,
які можна використовувати для подальшого субкультивування.
Пересадка в субстрат', рослини-регенеранти з 7—10 листками
і 5—7 коренями пересаджують у субстрат з вермикулітом, закри-
вають плівкою для попередження висихання і утримують на роз-
сіяному світлі 2 тижні. Кожні 5 діб поливають 1/2 розчину Му-
рашіге—Скуга, потім переносять у фітотрон. Через місяць реге-
неранти висаджують у грунт [377].
233
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Досліджено морфогенну здатність експлантів 3 видів шовко-
виці: М. саіііауапа, М. іЬои і М. аеггаіа. У культуру вводили апі-
кальні і латеральні бруньки молодих здорових пагонів 5-річних
рослин. Відрізки пагонів (0,8—1,0 см) з пазушними бруньками
стерилізували у 7%-му розчині гіпохлориту (20 хв), потім у
0,1%-му Н§С12 — 10 хв і промивали 5—6 разів у стерильній дис-
тильованій воді.
Культивували апікальні меристеми і латеральні бруньки на
середовищі М8 з 0,5—5,0 мг/л БАП і кінетину, 0,2—0,4 мг/л
НОК і гіберелової кислоти, рН 5,8. Температура 25 ± 1 °С, фо-
топеріод 16 год, вологість 60 %.
Проліферація бруньок на експлантах значною мірою залежить
від типу і віку, часу добору зразків, складу і концентрації регуля-
торів росту. Так, лише 20—30 % експлантів, взятих з 2—3-місяч-
них пагонів, утворюють бруньки протягом 25—28 діб, а 80—88 %
експлантів з молодих (20—30 діб) пагонів регенерують бруньки
за 10—12 діб на середовищі з 1 мг/л БАП. Додавання 0,4 мг/л
гіберелової кислоти прискорює індукцію бруньок і пагонів.
Максимальну кількість пагонів утворюють експланти М. са-
(Иауапа і М. еііои у липні—жовтні, а експланти М. кеггаіа — у
листопаді—лютому. Пазушні сегменти активніші, ніж апікальні
меристеми.
Укорінюють пагони на 1/2 концентрації середовища М8 з
2 % цукрози і 0,5—2,0 мг/л ІОК. Регенеранти з добре розвину-
тими листками і коренями переносять у горщики з компостом і
утримують у теплиці при 25 °С. Приживлюваність становить 90—
95 %. Рослини-регенеранти не відрізняються за морфологічними
ознаками від материнських рослин [386].
Платан (РІаіапиз зрр.)
Для МКР платана використовували апікальні меристеми і па-
зушні бруньки молодих пагонів від здорових 1 —2-річних дерев.
Відрізки пагонів стерилізували у 70%-му етанолі 1 хв, потім у
10%-му розчині діациду 5—10 хв, після чого занурювали у 10%-й
гіпохлорид натрію на 40—60 хв і промивали у 3 порціях стериль-
ної води. Апікальні і латеральні меристеми культивували на се-
редовищі М8 з БАП (0,1—50,0 ммоль) при температурі 25 ± 1 °С,
інтенсивності освітлення 200 лк. Великий морфогенний потен-
ціал мають пазушні бруньки, навіть на безгормональному сере-
довищі з них формуються численні мікропагони.
234
Розділ 6. Мікроклональне розмноження деревних рослин
Укорінюють рослини на середовищі з НОК (0,01—0,1 ммоль).
Через 4—6 тижнів регенеранти можна переносити в субстрат з
торфу і вермикуліту; витримують в умовах підвищеної вологості;
приживлюється до 50 % рослин [101].
ХВОЙНІ ПОРОДИ
Багаторічні дослідження дали змогу визначити кілька методів
МКР хвойних порід: соматичний ембріогенез, прямий органоге-
нез, формування пазушних бруньок і калусогенез. Більшість пуб-
лікацій присвячена клонуванню експлантів сіянців, ювенільних
дерев; досить важко індукувати морфогенез у дорослих дерев
[100, 155, 313].
У культуру уже введено близько 70 видів і форм, що належать
до 7 родин хвойних [178, 183, 227].
Вихідним матеріалом для ізолювання експлантів можуть слу-
гувати сім’ядолі (3—6 мм) або їхні частини (1—3 мм), верхівки
проростків (4—8 мм), вегетативні бруньки (5—7 мм), глиця, вер-
хівки молодих пагонів дорослих дерев (рис. 19).
Пагони можна індукувати на зиготичних ембріонах, експлан-
тах сіянців, особливо на котиледоні, гіпокотилі і апексі. Регене-
раційна здатність котиледона залежить від його віку. Так, най-
більшу морфогенну здатність мають 1-добові котиледони Ріпик
гасііаіа і 2—4-тижневі Пон^Іах Гіг [100, 118]. Підвищенню морфо-
генної активності експлантів сіянців сприяє стратифікація на-
сіння або замочування його протягом 5—7 діб у Н2О2. Ембріоїди
Ріпик сопіойа утворюють більше адвентивних бруньок після по-
переднього витримування експлантів у темряві і наступного пе-
ренесення на світло [472].
Виявлено, що морфогенна здатність багатьох хвойних порід
залежить від віку материнської рослини, часу вичленування і ви-
користаного експланта. Індукція органогенезу у дорослих дерев
ялини європейської активніше відбувається на експлантах веге-
тативних бруньок і верхівках пагонів, ізольованих у лютому—бе-
резні, ніж у травні або вересні. Експланти ялини голубої, білої і
чорної мають більший морфогенний потенціал, ніж експланти
ялини європейської [227].
Верхівки проростків і експланти сім’ядолей на середовищі М8
з 0,05 мг/л 2,4-Д і 2 мг/л БАП формували пагони і пазушні
бруньки, які після пересадки на середовища з 0,5—1,0 мг/л БАП
регенерували численні додаткові пагони. Для індукції ризогенезу
235
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Рис. 19. Схема мікроклонального розмноження хвойних
236
Розділ 6. Мікроклональне розмноження деревних рослин
пагони переносять на середовище
з 5—10 мг/л ІМК, ІОК або НОК.
Відзначають труднощі при укорі-
ненні хвойних. Так, з 20 досліджу-
ваних порід лише 15 виявили здат-
ність до ризогенезу. Краще укорі-
нювалися пагони сосни звичайної,
піцундської, ельдарської (85 %),
модрини, смереки, ялини євро-
пейської (75—80 %). Максимальну
здатність до ризогенезу мають ек-
спланти біоти східної (до 90 %),
вони одночасно формують пагони
і корені. Протягом 1,5—2 міс реге-
нерували рослини, придатні до пе-
ресадки у субстрат (цит. за: [44]).
Велику здатність до органоге-
незу мають експланти сосни пі-
цундської, ізольовані від дерев
різного віку (10—50 років). На ве-
гетативних бруньках формувались
пазушні бруньки і регенерували
пагони на середовищі М8 з
0,05 мг/л 2,4-Д і 1,5 мг/л БАП.
Регенерація рослин від початку
культивування до пересадки у суб-
страт тривала близько 1,5 року.
Найбільшу морфогенну здатність
з 20 досліджених порід хвойних
мала секвойя вічнозелена. Екс-
планти верхівок молодих пагонів
від дорослих материнських дерев
(20—40 років) на середовищах з 0,01—0,3 мг/л 2,4-Д або 0,05—
2,0 мг/л БАП і 1 мг/л ІОК протягом 6—7 тижнів формували па-
зушні бруньки і пагони. їх можна поділяти на фрагменти і суб-
культивувати до отримання потрібної кількості рослин. Укорі-
нення пагонів відбувається на середовищі з 5—10 мг/л НОК або
ІМК. Морфогенну активність експлантів секвойї можна під-
тримувати тривалий час (до 3—4 років) (цит. за: [44]).
Розроблено методики МКР різних видів сосни (понад 10 ви-
дів) [413, 487]. Вони ґрунтуються на використанні соматичного
237
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ембріогенезу й індукції адвентивних бруньок з меристематич-
них тканин пагонів, гіпокотиля, сім’ядолі, епікотиля і глиці
проростків.
Експланти сіянців Ріпик гасііаіа на середовищі Шенка і Хіль-
дебрандта з 3 % цукрози і 5 мг/л БАП формують меристемоїдну
тканину, з якої регенерують пагони. Через 40—50 діб пагони від-
діляють, розрізають на частини (3 мм) і культивують на середо-
вищі з 2 % цукрози. Кожен експлант формує групу пагонів, які
розділяють і субкультивують. Протягом кожного циклу (10—
12 тижнів) можна в 4—6 разів збільшити кількість регенерантів.
Для поліпшення приживлюваності та індукції ризогенезу рослини
переносять на середовище Грешофа—Доя з 1 мг/л ІМК і 0,5 мг/л
НОК. Регенеранти висаджують у субстрат із подрібненого осоко-
вого торфу (40 %) і пемзи (60 %). Витримують за температури
22—24 °С вдень і 17—19 °С — вночі, потім переносять у торф’яні
горщики, що сприяє кращому розвитку коренів [310, 311, 446].
Для М КР Р. 8уІУЄ8ігІ8 використовують два типи регенерації —
індукцію адвентивних бруньок на експлантах сіянця й індукцію
органогенезу на глиці регенерантів [464].
Первинними експлантами слугували частини стерильно ви-
рощених сіянців — гіпокотиль, сім’ядолі і епікотиль. їх культи-
вували на 1/2 концентрації середовища М8 з органічними ком-
понентами середовища Ніча і Ніч [371] та додаванням 10 мг/л
БАП і 1 мг/л ІМК. Пазушні бруньки, що утворилися, переноси-
ли на те ж саме середовище з активованим вугіллям (2 г/л), де
витримували 2 міс. Розмноження адвентивних бруньок відбува-
лось на середовищі з 5 мг/л БАП і 0,5 % (за об’ємом) кокосо-
вого молока, ріст пагонів — на середовищі без гормонів, а укорі-
нення — на середовищі Грешофа і Доу (1/2 концентрації) з до-
даванням 0,2 мг/л НОК і 2 г/л цукрози.
Для подальшого росту регенеранти переносили у стерильний
перлітовий субстрат із додаванням розчину Мурашіге—Скуга
(1/2 концентрації) та інокулята ектомікоризних грибів (НеЬеІопіа
суііпгігокрогит). Рослини витримували у теплиці за підвищеної
вологості.
Для розмноження можна використовувати експланти рос-
лин-регенерантів, мікроживці й глицю. На середовищі Лойда і
МакКоуна (\УР\У) [344] з додаванням 3 мг/л БАП і 0,4 мг/л ІМК
утворюється органогенний калус в основі мікроживця.
На експлантах глиці (від основи до верхівки) проліферують
адвентивні бруньки у вигляді глобулярних китиць, що утворю-
238
Розділ 6. Мікроклональне розмноження деревних рослин
ються із меристематичних центрів, розмішених в епідермальних
або субепідермальних тканинах глиці. Ці структури мають здат-
ність до органогенезу протягом року у разі щомісячної пересадки
на середовище М8 (1/2 концентрації) без гормонів. Рослини-ре-
генеранти утворюються з адвентивних бруньок і калусу, пагони
укорінюються за 20—ЗО діб на середовищі з 0,2 мг/л НОК і 2 г/л
цукрози [499].
Після перенесення укорінених рослин у субстрат з перлітом
ріст коренів прискорюється, особливо після інокуляції мікориз-
ним грибом Н. суііпдгокрогит. Мікориза допомагає регенерантам
перенести стрес, пов’язаний з пересадкою, і підвищує прижив-
люваність рослин до 70 % [464].
Подібні методики можна використовувати і для клонування
інших видів хвойних: ялини, смереки, модрини, ЯЛІВЦЮ [116,
118, 315].
Особливо важливо застосовувати МКР дорослих дерев, але
внаслідок внутрішньої контамінації епіфітною мікрофлорою до-
сить важко отримувати стерильні експланти. Інфікування тканин
можна зменшити після обробки пагонів антибіотиками і систем-
ними фунгіцидами.
Під час введення в культуру бруньок дорослих дерев ялини
європейської треба видаляти декілька зовнішніх лусок перед сте-
рилізацією. Тривалий час бруньки промивають проточною во-
дою, занурюють у 70%-й етанол і стерилізують у 5—7%-му роз-
чині гіпохлориту кальцію протягом 15—40 хв, потім переносять у
розчин пероксиду водню і промивають стерильною водою.
Експланти бруньок культивують на середовищах М8, Б8,
Шенка і Хільдебрандта або Борнмана (МСМ). Для індукції адвен-
тивних бруньок у середовище вводять цитокініни (5 10б моль
БАП). Культивують при 10—16 °С протягом першого тижня, по-
тім підвищують температуру до 20 °С. Подібні умови потрібні і
для культивування глиці молодих пагонів, на якій протягом 4—
14 тижнів формуються адвентивні бруньки. Для подальшого роз-
витку транспланти переносять на середовище без цитокінінів,
затримка з пересадкою призводить до проліферації калусу. Екс-
планти з тканин проростків субкультивують кожен місяць, з бру-
ньок — кожні 2 міс.
Автори [118] відзначають, що отримати адвентивні бруньки
на експлантах ялини досить легко, складніше індукувати ріст
пагонів і коренів. На ці процеси впливає генотип материнської
рослини і вид експланта. Ріст адвентивних пагонів стимулює пе-
239
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
ресадка експлантів на середовище зі зниженою концентрацією
мінеральних солей і додаванням активованого вугілля.
На глиці ялини Рісеа аЬіек, що зібрана з 5-річних дерев, від-
бувається індукція примордіїв. На середовищі Борнмана з висо-
ким співвідношенням цитокінінів і ауксинів формувався калус, з
якого при подальшому культивуванні на середовищі без ре-
гуляторів росту проліферували бруньки. Утворення бруньок зро-
стало при культивуванні за пониженої температури (10—16 °С
перші 4—14 діб вирощування), потім температуру підвищували
до 20 °С. Бруньки завдовжки 3—5 мм відділяли і субкультивува-
ли до утворення пагонів. Індукція ризогенезу відбувалась після
витримування (12—24 год) за високої концентрації ауксинів
(10“4—10 3 моль) [116].
Регенерацію пагонів ялини Р. аЬіек індуковали на глиці ко-
тиледона сіянців [144, 145]. Після стерилізації насіння пророщу-
вали і культивували частини гіпокотиля і глицю котиледона на
середовищах М8, Шенка і Хільдебрандта, Літвея, Борнмана. Для
індукції проліферації бруньок додавали БАП (15—125 ммоль). На
експлантах глиці проліферували меристемоїди, з яких формува-
лись адвентивні бруньки і пагони.
Наводимо схему МКР хвойних порід.
Стерилізація вихідного матеріалу.
а) насіння промивають проточною водою 1—2 год, занурю-
ють у 10%-й хлорокс (0,5 % №ОС1) на 10—15 хв або у Н2О2
(1:10) на 20 хв; можна також помістити насіння у 95%-й етанол
на 1— 2 хв і у 2,1%-й гіпохлорит натрію на 7 хв, промити сте-
рильною дистильованою водою;
б) молоді пагони стерилізують у розчині гіпохлориту кальцію
(90 г/л) 15 хв або у 0,1%-му розчині меркурхлориду і 50%-му ета-
нолі по 1 хв і тричі промивають стерильною дистильованою водою.
Умови культивування'.
а) насіння пророщують на середовищі Кемпбела і Дарзана з
3,0 мг/л БАП; для подальшого розвитку сіянці культивують на се-
редовищі Соммера за температури 20—22 °С, освітлення 2000 лк,
фотоперіоду 16 год, а потім розділяють на окремі органи — ко-
тиледон, гіпокотиль, апекс;
б) експланти розміщують горизонтально, апекси — вертикаль-
но на середовищі Соммера з мікроелементами за Мурашіге-
Скугом з 2 мг/л БАП;
в) за 6 тижнів утворюються адвентивні бруньки і пагони, які
відділяють і укорінюють на середовищі М8 з 10-6 моль НОК,
240
Розділ 6. Мікроклональне розмноження деревних рослин
10 г/л цукрози; на середовищі без гормонів в дбувається ріст ко-
ренів;
г) укорінені рослини-регенеранти виймають з колб, корені
відмивають від агару, занурюють у розчин бенлату (2 г/л) і пере-
носять у субстрат із суміші кори (50 %), вермикуліту (ЗО %) і тор-
фу (20 %); витримують за підвищеної вологості.
Соматичний ембріогенез'.
а) експланти насіння після стерилізації культивують на сере-
довищі ДСК [244] (1/2 концентрації); через місяць субкультиву-
ють на тому ж середовищі повної концентрації в темряві при
26 °С; калус, що утворюється, переносять на свіже середовище
кожні 2 тижні і культивують на світлі для проліферації ембріоїдів
[118, 196];
б) експланти глиці видаляють з рослин-регенерантів або до-
рослих рослин і стерилізують, як було показано вище;
в) розрізають на сегменти 2—5 см завдовжки і культивують
на середовищі М8 з 1,25 г/л тіаміну, 50,0 мг/л — аспарагіну,
0,1—0,2 моль маннітолу, 1,5 мг/л 2,4-Д і 3,5 % цукрози. Перший
місяць культивують у темряві при 25 °С, потім переносять на
інтенсивне світло (фотоперіод 15 год). Із калусу, що утворився,
проліферують ембріоїди, бруньки і пагони.
Подальша розробка, удосконалення і впровадження методів
МКР хвойних порід дасть змогу значно прискорити селекційний
процес і швидко отримувати цінний високопродуктивний посад-
ковий матеріал.
16 — 6-83
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Абраменко Н.М., Бондаренко П.А., Ткаченко В.Д., Спиваченко А.Б. По-
лучение безвирусного посадочного материала земляники и ускоренное раз-
множение ее в производствс // Вирусньїе заболевания культурних растений
Молдавии. — Кишинев: Штиинца, 1984. — С. 3—12.
2. Алехно Г.Д., Вьісоцкий В.А. Влияние форми питательной средьі на мик-
роразмножение розьі // Сортоизучение и размножение декоративних куль-
тур. - М., 1985. - С. 57-61.
3. Байбурина Р.К. Микроклональное размножение взрослнх гибридньїх
деревьев Веіиіа репдиіе Коік уаг. сагеїіса Мегскі // Раст. ресурси. — 1998. —
34. - Внп. 12. - С. 9—22.
4. Байбурина Р.К., Жерновкова Т.В. Размножение зеленими черенками
Веіиіа репйиіе Коіїї уаг. сагеїіса Мегскі, вьірощенной в культуре іп гіїго // Там
же. — 1999. — 35. — Внп. 2. — С. 95—100.
5. Барпшш И.В., Корховой В.И. Состав культуральной средн и зффек-
тивность образования побегов іп уііго из листових зксплантов яблони //
Физиология растений. — 1997. — 44, № 3. — С. 440—444.
6. Бартиш И.В., Корховой В.И., Меркулов С.М., Копань В.П. Оптимиза-
ция методов культивирования іп уііго различньїх сортов и кленових подвоев
яблони (Маїих йотехііса Вогкії) // Физиология и биохимия культ, растений. —
1994. - 26, № 6. - С. 587-593.
7. Бартиш И.В., Меркулов С.М., Корховой В.И., Копань В.П. Микроклональ-
ное размножение груши іп \’ііго // Там же. — № 1. — С. 84—91.
8. Батукаев А.А., Маашева М. Применение регуляторов роста в период
адаптации растений винограде в сосуд-пакетах // Регулятори роста и разви-
тия растений в биотехнологиях. — М.: МСХА, 2001. — С. 140—141.
9. Баер О.А., Баер Г.Я., Ємец А.И., Блюм Я.Б. Введение в культуру іп уіі-
го и регснерационная способность сортов льна-долгунца с различной устой-
чивостью к полеганию// Физиология и биохимия культ, растений. — 2004. —
36, №1. - С. 48-54.
10. Белоус В.Е., Ильенко Н.И., Редько В.И. и др. Биотехнологические ме-
тоди в селекции сахарной свекльї. — М.: Агропромиздат, 1989. — С. 32—41.
11. Бленда А.В. Вплив генотипу на особливості мікроклонального роз-
множення представників підродини РгипоМае: Дис. ... канд. біол. наук. —
К., 2000. - 143 с.
12. Бленда В.П., Бленда А.В., Созінов 0.0. Особливості реадаптації під-
щеп кісточкових культур, отриманих мікроклональним розмноженням до
умов відкритого грунту// Физиология и биохимия культ, растений. — 1998. —
ЗО, № 3. - С. 225-229.
242
Список літератури
13. Богуш Л.Ю., Чернец А.М., Бондаренко С.С. Размножение іп уііго сор-
тов витни после термотерапии І І Садоводство, виноградарство и виноделие
Молдавии. — 1994. — 6. — С. 33—34.
14. Бутенко Р.Г. Зкспериментальньїй морфогенез и дифференциация в
культуре клеток растений. — М.: Наука, 1975. — 50 с.
15. Бутенко Р.Г., Катаева Н.В., Ксенофонтова Д.В. Методические реко-
мендации по клональному микроразмножению гербери и фрезии. — Сочи,
1982. - 35 с.
16. Бутова Г.П., Скробова Л.Л. Морфогенез и регенерация растений ду-
ба черешчатого в культуре іп уіїго // Физиология растений. — 1988. — 35,
вьіп. 5. — С. 1023—1030.
17. Бутова Г.П., Табацкая Т.М. Некоторьіе особенности морфогенеза в
каллусной культуре тополя // Там же. — 1982. — 28, вьіп. 1. — С. 274—
283.
18. Бьіченкова д.А., Давид А. Каллусообразование и органогенез в тканях
листа, культивируемого іп уііго // Там же. — 1978. — 25, вьіп. 2. — С. 274—
283.
19- Виджешвар П. Биотехнологические и физиологические основьі кло-
нального микроразмножения Асііпісііа деИсіона (Сіієу.) Ьіащ>, Реі'вихоп: Дис. ...
канд. биол. наук. — Ялта, 1996. — 158 с.
20. Виджешвар П., Митрофанова О.В., Лиіцук А.И. Клональное микро-
размножение актинидии превосходной // Сб. науч. трудов Никит. бот. сада. —
1997. - Т. 119. - С. 111—126.
21. Внучкова В.А. Методические указания по культуре тканей томатов. —
М., 1985. - 16 с.
22. Вьісоцкий В.А. Применение методов культури изолированньїх тканей
и органов для размножения плодових и ягодньїх растений // Ягодоводство в
Нечерноземье. — М., 1982. — С. 30—41.
23. Вьісоцкий В.А. Усовершенствование способов получения растений
малини из изолированньїх меристематических верхушек // Ягодоводство в
Нечерноземье. — М., 1984. — С. З—8.
24. Вьісоцкий В.А., Алехно Г.Д. Клональное микроразмножение роз //
Декоративнеє садоводство Нечерноземья. — М., 1985. — С. 59—67.
25. Вьісоцкий В.А., Бартенева Л.В. Особенности клонального микрораз-
множения актинидии І/ Биология культивирования клеток и биотехнология
растений. — М.: Наука, 1991. — С. 213—216.
26. Вьіхристова Г.И. Размножение гипеаструма гибридньїх форм в куль-
туре ткани І І Вьіращивание посадочного материала цветочньїх культур. —
Сочи, 1987. - Вьіп. 34. - С. 94-101.
27. Вьіхристова Г.И., Копьілов С.С. Культивирование меристем тюльпа-
нов и нарциссов для получения безвирусного посадочного материала І І Ви-
рашивание посадочного материала цветочньїх культур. — Сочи, 1987. —
Вьіп. 34. - С. 71-82.
28. Гераскина Е.О. Влияние фитогормонов на размножение гиацинтов
методом культури тканей // Регулятори роста и развития растений в био-
технологиях. — М.: МСХА, 2001. — С. 145—146.
29. Гертнере Д.Х., Кондрапювичс Р.Я. Зтапи клонального микроразмно-
жения листопадних рододендронов // Биология культивируемьіх клеток и
биотехнология. — Новосибирск, 1988. — 355 с.
16»
243
Список літератури
ЗО. Голодрига П.А., Зленко Б.А., Чекмарев Л.А. и др. Методические реко-
мендации по клональному микроразмножению винограда. — Ялта: ВНИИВ,
1986. - 56 с.
31. Гончаров Н.Д., Кожушко Н.С., Рудь В.Д. Применение методов био-
технологии для селекции, оздоровлення и размножения картофеля. — Харь-
ков, 1987 — 67 с.
32. Горбатенко И.Ю. Особенности регенерации у различньїх генотипов
томата іп хііго 11 Состояние и перспективи сельскохозяйственной биотехно-
логии. - Л., 1986. - С. 118-120.
33. Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физио-
логии растений. — Киев: Наук, думка, 1964. — 387 с.
34. Губарь С.Ж. Культивирование растений винограда и введение их в
состояние глубокого покоя іп тйго: Автореф. дис. ... канд. биол. наук — Ял-
та, 1995. — 23 с.
35. Джонс О.П. Размножение хозяйственно важних древесньїх растений
іп тііго // Биотехнология сельскохозяйственньїх растений. — М.: ВО Агро-
промиздат, 1987. — С. 134—152.
36. Жаркова Т.В., Дейнеко Е.В., Шумньїй В.К. Скрининг коллекции го-
роха (Ріят заііушп Б.) по морфогенетической способности в культуре іп уіі-
го // Биология клеток растений іп уііго, биотехнология и сохранение гено-
фонда: Тез. докл. — М., 1997. — С. 91.
37. Жужжалова Т.П., Знаменская В.В., Мазенин К.Г. Рост и развитие ме-
риклонов сахарной свекльї // Биотехнологические методи в селекции сахар-
ной свекльї. — М.: Агропромиздат, 1989. — С. 7—11.
38. Зленко В.А., Грошин Л.П. Соматический змбриогенез в суспензион-
ной культуре винограда іп уііго // Цитология и генетика. — 1993. — 27, № 3. —
С. 53-63.
39. Зубенко В.Ф., Ільєнко 1.1., Редько В.І. та ін. Використання методів
біотехнології в генетичних дослідженнях та селекційній практиці // Інсти-
тут цукрових буряків УАНН. 36. наук, праць. — К.: Аграр. наука, 1997. —
С. 33-42.
40. Зубко М.К., Зубко Е.И. Регенерационная способность у корневих
зксплантов различньїх генотипов картофеля // Физиология и биохимия
культ, растений. — 1994. — 26, № 6. — С. 581—583.
41. Ильенко И.РІ. Микроклональное размножение стевии в культуре іп
уііго 11 Введение в культуру стевии — источника низкокалорийного замени-
теля сахара. - Киев: ВНИИС, 1999. - С. 27-29.
42. Ильенко И.И., Редько В И., Павловская Л.Л. Микроклоновое размно-
жение и перевод стерильной культури сахарной свекльї в грунт. — Киев:
Урожай, 1985. — С. 27—29.
43. Калннин Ф.Л., Сарнацкая В. В., Полшцук В.Е. Методи культури тка-
ней в физиологии и биохимии растений. — Киев: Наук, думка, 1980. — 488 с.
44. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микрокло-
нального размножения растений. — Киев: Наук, думка, 1992. — 228 с.
45. Колісніченко О.В. Морфогенез у культурі клітин суниці в нормі і в
умовах сольового стресу: Автореф. дис. ... канд. біол. наук — К., 1998. —
17 с.
46. Кондратовичс Р.Я., Гертнере Д.Х., Мшике И.В., Тевелєва М.К. Мик-
робньїе цитокининьї в клональном микроразмножении рододендронов //
244
Список літератури
Биотехнология культивируемьіх клеток и биотехнология. — Новосибирск,
1988. - 37 с.
47. Кондратюк Е.Н., Кудина Г.А. Разработка метода клонального микро-
размножения садовой розьі // Интродукция и акклиматизация растений. —
1988. — Вьіп. 10. - С. 65-67.
48. Кочетова Н.И., Алеиікевич Л.В., Кочетое Ю.В. Особенности регене-
рации растений крьіжовника в условиях іп тіїго // Вестн. с.-х. науки. —
1981. — № 2 (293). - С. 80-82.
49. Красильникова Т.А. Клональное микроразмножение роз іп х’ііп: гор-
мональнеє регулирование роста микропобегов и ризогенеза // Регулятори
роста и развития растений в биотехнологиях. — М.: МСХА, 2001. — С. 170.
50. Кунах В.А., Чеченева Т.Н., Моргун В.В. Получение каллуеньїх тканей
от разньїх по генотипу растений кукурузьі І І Физиология растений. — 1980. —
27, № 2. - С. 399-403.
51. Кучко А.А. Клеточньїе технологии создания исходного материала для
селекции картофеля // Сб. науч. тр. Ин-та картофелеводства УААН. — Ки-
ев, 1992. - С. 11-19.
52. Кучко А.А., Олійник Т.М. Сомаклональна мінливість у картоплі. —
К.: Довіра, 1988. — 191 с.
53. Куиінер Л.И. Влияние 6-БАП и ГК на образование адвентивних по-
бегов актинидии в культуре іп тііго // Регулятори роста и развития растений
в биотехнологиях. — М.: МСХА, 2001. — С. 173.
54. Кушнер Л.И. Влияние ауксинов на укоренение побегов актинидии в
условиях іп уііго І І Регулятори роста и развития растений в биотехнологиях. —
М.: МСХА, 2001. - С. 174.
55. Кушнір Г.П. Регенерація бегонії в культурі іп уііго // Інтродукція та
акліматизація рослин в Україні. — 1982. — Вип. 20. — С. 28—30.
56. Кушнир Г.П. Орхидеи в культуре. — Киев: Наук, думка, 1986. —
С. 77-130.
57. Кушнір Г.П., Сарнацька В.В. Стан і перспективи клонального мікро-
розмноження рослин в Україні // Генетика і селекція в Україні на межі ти-
сячоліть. — К.: Логос, 2001. — Т. 1. — С. 484—500.
58. Лесникова Н.П., Смьїков А.В., Горина В.М. Культура зародьішей и
получение гибридньїх форм персика, абрикоса, аличи // Сб. науч. тр. Ни-
кит. бот. сада. — 1997. — Т. 119. — С. 46—63.
59. Лукичева Л.А. Особенности клонального микроразмножения безви-
русньїх сортов вишни и сливи 11 Сб. науч. тр. Никит. бот. сада. — 1997. —
Т. 119. - С. 34-45.
60. Макаров П.П. Применение биотехнологических методов в селекции
и семеноводстве картофеля // Биотехнология в картофелеводстве. — М.,
1991. — С. 116—136.
61. Марченко А.О. Гормональная регуляция морфологических процессов
в культуре соматических тканей винограда // Физиология и биохимия культ,
растений. — 1997. — 29, № 5. — С. 375—379.
62. Марченко А.О. Индукция змбриогенеза в первинних каллусах из стебля
и листьев винограда // Физиология растений. — 1991. — 38, № 3. — С. 580—590.
63. Марченко А.О., Голодрига П.Я., Клименко В.П. Соматический змб-
риогенез в культуре тканей винограда // Физиология и биохимия культ,
растений. — 1987. — 19, № 4. — С. 408—411.
245
Список літератури
64. Марьяхина И.Я. Характер морфогенеза и размножение кочанной ка-
пуста в культуре ткани при использовании различньїх стимуляторов роста І І
С.-х. биология. — 1981. — 16, № 2. — С. 246—251.
65. Марьяхина И.Я. и др. Получение безвирусного посадочного материа-
ла чеснока, лука-шалота и многоярусного лука с использованием биотехно-
логических приемов: Метод, рекомендации. — М., 1987. — 31с.
66. Меркулов С.М., Барпими И.В., Глеба Ю.Ю. Регенерация адвентивних
побегов из листових тканей груши // Физиология и биохимия культ, расте-
ний. - 1993. - 25, № 3. - С. 375-379.
67. Месянкина Л.В., Солодкая Л.А., Мазин В.В. Изучение морфогенеза и
змбриогенеза некоторнх сортов клевера лугового Тгі/оПит ргаїепзе Ь. //
Биология клеток растений в культуре іп уііго, биотехнология и сохранение
генофонда: Тез. докл. — М., 1997. — С. 133.
68. Методические рекомендации по массовому размножению орхидей. —
Киев, 1982. — 55 с.
69. Миронова О.А. Проблеми вегетативного размножения в садоводстве. —
М.: Наука. - С. 102-106.
70. Мохаммед А.И., Бутенко Р.Г. Сортовьіе особенности клонального
микроразмножения малини красной // Физиология растений. — 1998. — 45,
№ 5. - С. 738-740.
71. Наумова Г.А. Современнне приеми возделнвания малини. — М.:
ВНСШТЗИСХ, 1984. - 76 с.
72. Нурмуханбетова Г.А. Физиология роста и устойчивости интродуци-
руемьіх растений в Казахстане. — Алма-Ата: Наука, 1986. — С. 139—148.
73. Олешко Е.В., Попов В.И., Шаповалова И.Ф. Питомниководство хмеля. —
М., 1986. - С. 72-83.
74. Остапенко Д.П. Способ сохранения селекционннх оздоровленннх
от инфекции сортообразцов картофеля. Описання изобретения к авторскому
свидетельству (51) м.кл. а 01Н1/04/ Бюл. № 9 от 07.03.82. О-ко Пат. 733646. —
1982. - С. 1-4.
75. Пиралов Г.Р., Абраимова О.Е. Влияние физиологических особеннос-
тей исходного материала и состава питательньїх сред на каллусогенез и ре-
генерацию в культуре незрелих зародишей кукурузн // Физиология и био-
химия культ, растений. — 1997. — 29, № 1. — С. 44—50.
76. Попов Ю.Г., Мишина А.Г. Получение безвирусннх растений Рга^агіа
уехса методом культивирования іп уііго изолированньїх верхушек стебля //
Культура земляники в СССР. — М.: Наука, 1972. — С. 335—389.
77. Поляков А.В., Чикризова О.Ф., Каляева М.А. и др. Трансформация
растений льна-долгунца // Физиология растений. — 1998. — 45, № 6. —
С. 882-887.
78. Поляков А.В., Рутковска-Краусе И. Сомаклональная изменчивость у
льна І І Биология клеток растений іп уііго, биотехнология и сохранение ге-
нофонда: Тез. докл. — М., 1997. — С. 225.
79. Рубцова М.А., Левенко Б.А., Тараненко Л.К. и др. Получение межви-
дових гибридов между гречихой обьїкновенной и гречихой татарской с по-
мощью змбриокультурьі // Физиология и биохимия культ, растений. —
1994. - 26, № 6. - С. 563-566.
80. Сатарова Т.Н. Особенности культури пильников кукурузьі на примере
генотипа В14 Ч \УГ9 // Изв. РАН. Сер. Биология. — 1994. — 5. — С. 771—779.
246
Список літератури
81. Сікач В. О. Вплив поживних середовищ на фізіологічні особливості
культивованих рослин стевії за умов іп уііго // Физиология и биохимия
культ, растений. — 1998. — ЗО, № 4. — С. 294—299.
82. Сидорова Н.В., Моргун В.В., Логвиненко В.Ф. Особенности каллусо- и
морфогенеза в культуро незрельїх зародьішей разньїх генотипов мягкой ози-
мой пшеницьі І І Там же. — 1988. — 20, № 4. — С. 349—353.
83. Соболева Л.Е., Митрофанова О.В. Методические рекомендации по
размножение цветочньїх растений іп уііго. — Ялта, 1985 — 13 с.
84. Стецько С.А., Черевата Т.М. Размножение винограда іп уііго на
унифицированной питательной среде // Виноградарство и виноделие. —
Киев: Аграр. наука, 1997. — С. 24—27.
85. Сьіртанова Г.Ф. Физиология роста и устойчивости интродуцируемьіх
растений в Казахстане. — Алма-Ата: Наука, 1986. — С. 102—111.
86. Таварткиладзе О.К., Вечернина Н.А. Ускоренное размножение іп уііго
и адаптация іп уііго ремонтантних сортов земляники // Биотехнология на
рубеже двух тьісячелетий. — Саранск, 2001. — С. 143—144.
87. Таварткиладзе О.К., Вечернина Н.А., Кутубидзе В. В. Биотехнологиче-
ские методи в селекции и размножении актинидии китайской // Субтроп.
культури. — 1990. — № 2. — С. 136—140.
88. Технология производства исходного безвирусного материала карто-
феля методом культури меристеми для первичного семеноводства. — Не-
мешаево: Б.и., 1979. — 20 с.
89. Трушечкин В.Т., Вьісоцкий В.А., Леонтьев-Орлов О.А. Методические
указания по клональному микроразмножению подвоев и сортов яблони. —
М.: Наука, 1985. — 19 с.
90. Туровская Н.И., Стрьігина О.В. Микроклональное размножение ма-
лини І І Садоводство и виноградарство. — 1990. — № 8. — С. 26—29.
91. Уралец Л.И. Культура репродуктивних органов томатов и перспекти-
ви ее использования: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — М., 1982. — 28 с.
92. Хасси Г. Биотехнология сельскохозяйственньїх растений. — М.: Аг-
ропромиздат, 1987. — С. 105—133.
93. Черньшіова В.Г., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Бутенко Р.Г. Влияние
генетических характеристик исходньїх растений на морфогенний потенциал
каллусньїх клеток кукурузьі // Докл. АН СССР. Сер. Б. — 1988. — 300, № 1. —
С. 227-229.
94. Чеченева Т.Н., Моргун В.В., Рубан Т.А. Регенерация растений из раз-
них типов каллусньїх тканей инбредних линий и гибридов кукурузьі // Там
же. - № 11. - С. 80-83.
95. Чеченева Т.Н., Труханов В.А. Генетическая обусловленность каллусо-
образования и регенерационной способности у кукурузьі // Цитология и
генетика. — 1994. — 28, № 5. — С. 46—50.
96. Чугункова Т.В., Юркова Г.Н., Розумна Л.Ф., Шевцов И.А. Регенера-
ционная способность у сортов и селекционньїх образцов кормовой свек-
льї // Физиология и биохимия культ, растений. — 1994. — 26, № 6. —
С. 572-575.
97. Чудновский Б.Д., Запольский О.Ю. Способи виращивания рассадьі
стевии из материала, полученного іп уііго і і Введение в культуру стевии —
источника низкокалорийного заменителя сахара. — Киев, 1990. — С. 9—
13.
247
Список літератури
98. Акцій А., Кеші 5., Кат Л, Камі В. 8отаІіс етЬгуодспехіх апд гедспега-
ііоп оГ ріапііеік іп зайтоп, Сгосиз ^аіітиі Ь. // Іпі. Ехр. Віоіо^у. — 1994. —
32, N 2. - Р. 135-140.
99. Акціа Р.5>., Репіаі И., Соскіпр Е.С. Ріапі ге^епегаїіоп Ггот ІеаГЬахе саі-
Іік апд сеіі хихрепхіоп оГ Тгііїсит аехііуит Ь. // 2. РйапхепхйсЬів — 1982. —
89. - 8. 139-144.
100. Аіікеп А., Ногсіап К, Ткогре Т. ІпЙиепсе оГ ехріапі хеіесііоп оп іЬе
кііооі — Гогтіпв сарасіїу оГ]иуепі!е Ііхяиек оГ Ріпих гасііаіа // Сап. 3. Рогекі. К.ез. —
1981. - 2, N 1. - Р. 112-117.
101. Аке 5., Сгіїїеі Е., РатЬеП 5. Ріапе Ігеек (Ріаіани^ зрр) // Віоіесіїпоіо^у
іп А§гісиіІиге апсі Рогекігу. Тгеек / Есі. Ьу У.Р.8. Ва]а/ — Вегііп есе.: 8ргіп£ег-
Уегіав, 1991. - Уоі. 16. - Р. 191-210.
102. АІЬегІ А. МеІа1-Ьіпс1іп£ а^епік іп сйетоійегару: ІІіе асііуаііоп оГ теїак
Ьу сЬсІаІіоп // ТЬе 8ігаіе£у оГ СЬетоІегару / Ед. Ьу Я. Сохуап, 8. Яохуаіі. —
СатЬгісІбе: СатЬгісІее Спіу. Ргекз, 1958. — Р. 112—138.
103. АІсІегіаоп Р.С., ТаеЬ А.С. ІпЙиепсе оГ сиііигаї епуігоптепі оп кЬооІ
£іо\УіИ апсі ЬиІЬіп^ оГ Іиіір іп уііго // Асіа Ногі. — 1990. — 266. — Р. 91—94.
104. АН А.Е'., Рагуіх В.С. ЕЙесІк оГ аихіп апсі Ьогоп оп писіеіс асісік тега-
Ьоіікт апсі сеіі сііуізіоп апсі асіуепііііоик гооі ге^епегаїіоп // Кєху РЬуІоІ. —
1998. — 108. - Р. 383-391.
105. Аііреіег Г., Роззеїі ІІ.К: Ітргоуесі ріапі ге^епегаСіоп Ггот сеіі кикреп-
8ІОП8 оГ соттегсіаі сиіііуаге, Ьгеесііпд- апсі іпЬгес! Ііпск оГ регеппіаі гуе^гакз
(коііит регеппе Ь.) //1. Ріапі РЬукіоІ. — 2000. — 156, N 5/6. — Р. 790—796.
106. Аттігаіо Р.У. ТЬе еГГесІк оГ аЬксікіс асісі оп іЬе сіеуеіортепі оГ кота-
Ііс етЬгуоБ Ггот сеіія оГсагахуау (Сагих сапі Ь.) // Воі. Сах. — 1974. — 135. —
Р. 328-337.
107. Аттігаіо Р.У. Коїе оГ АВА іп гс^иІаСіоп оГ котаїіс етЬгуодепемк //
НоП. 8сі. - 1988. - 23. - Р. 520.
108. Апапеї У.К., СкіЬЬаг Я.А., Мапсіа К.К. ЕПесІз оГ ОА3 апсі ІВА оп гоо-
ііпв апсі оп кргоиііпв оГ Ьисік оп кіст си11іп£5 оГ Іротоеа /Ііїиіоха // Ріапі апсі
Сеіі РЬухіоІ. - 1972. - 13. - Р. 912-917.
109. АпсІег5оп ЖС. ТІ88ПЄ сиііиге ргора^аііоп оГ гЬосіосіепсІгопк І І Іп уііго. —
1978. - 14. - Р. 334-337.
110. Апсіепоп кУ.С. А геуікесі тесііит Гог кЬооІ ргоІіГегаІіоп оГ гЬосІосІепсІгоп //
1. Атег. 8ос. Ногі. 8сі. — 1984. — 109, N 3. — Р. 343—347.
111. Арреіргеп М. К.е£епегаІіоп оГ Вер,опіа кіетаііх іп уііго // Асіа Ногі. —
1976. - 64, N 1. - Р. 31-38.
112. Арреіргеп М., Неісіе О. Кедепегеїіоп іп Еіегріосагрих ІеаГ сіікск апсі
йгохуіЬ киЬзІапсез // РЬухіоІ. Ріапі. — 1972. — 27, N 3. — Р. 417—423.
113. Агсіііїі /. Азресік оГ СЬе рЬукіоІо^У оГ огсЬісіх І І Асіу. Воі. Кек. — 1979. —
7. - Р. 421-655.
114. Агііігіі Р. ОгсЬісІ Ьіоіову: Кєуієхук апсі регересііуез. — ІІІіаса еіс.: Сог-
пеіі. Ііпіу. Рге88, 1997. — 310 р.
115. Агтіїгопр С.К, Сгееп С.Е. ЕзіаЬІізЬтепі апсі таіпіепапсе оГ ГгіаЬІе ет-
Ьгуо£епіс таіхе саііик апсі іпуоіуєгпєпі оГ /-ргоііпе // РІапіа. — 1985. — 164. —
8. 207-214.
116. Агпоісі 5., Егікжоп Т. Моги/ау хгрисе (Рісеа аЬіех Ь.) // Віоіесіїпоіоду
іп А§гісиІСиге апсі Рогекігу / Есі. Ьу У.Р.8. Ва]а]. — Вегііп еіс.: 8ргіп£ег-УегІав,
1986. - Р. 291—309.
248
Список літератури
117. Анокап М.Р., О’Нагін 8.К., Ніг. В.Е. Карій тикіріісаііоп оГ ХапІЇїо-
нота сагаси Ьу іп тііго бИооі іір сиііиге // Ногі8сіепсе. — 1984. — 19, N 6. —
Р. 885-886.
118. Аііее 8.М., Рокке ІЇ.С. Місгоргорадаїіоп ікгоидії котаііс етЬгуодепеж
іп сопіГсге // НІ£Іі Тсскпоіоду апй Місгоргорадаііоп. І / Ей. Ьу У.Р.8. Ва]а]. —
1991. - УоІ. 15. - Р. 53-70.
119. Аіїїакапапсіат К., Ромег В., Ьоке К.С. е/ аі. «Зиаіііаііуе азкеактепі оГ
аготаііс іпйіса гісе (Огига каііеа Ь.): ргоіеіпк, Ііріск апй аіагсЬ іп дгаіп Ггот хо-
таїіс етЬгуо — апй кеей — йєгіуєй ріапік // 1. Ріапі РЬуаіоІ. — 2000. — 156,
N 5/6. - Р. 783-789.
120. Баскі А. ТЬе сараЬіІііу оГ іп тіїго гедепегаііоп оГ уагіоик сиіііуаге оГ Еге-
еніа куЬгісіа // Асіа Ногі. — 1987. — 212. — Р. 715—718.
121. Ваупі її., ВагЬіегу Р., Тот^іапі Р. Роїуатіпе іііег апй ЬіохупіЬеііс
епгутек Йигіпд іиЬег Гогтаііоп іп І/еІЇапікин іикегонин // 3. Ріапі ОгосуіЬ Кед. —
1983. - 2. - Р. 177-184.
122. Ваупі Р/., Біопсії 5. Роїуатіпех // Сеіі апй Тіхзие Сикиге іп Еогекігу /
Егі. Ьу З.М. Вопда, В.З. Биггап. — ВогйгесЬі сіс М. МцЬоГГ РиЬІ. — 1987. —
УоІ 1. - Р. 113-124.
123. Вара] У.Р.8. ВіоіссЬпоІоду оГ Осе ітргогетепі Гог гарій ргорадаОоп
апй Ьіотазз епегду ргойисііоп // ВіоіесЬпоІоду іп Адгісикиге апй Еогекігу / Есі.
Ьу У.Р.8. Ваіау — УоІ. 1. — Вегііп еіс.: 8ргіпдег-Усг1ад, 1996. — Р. 1—23.
124. Ваісу У.Р.8., Ііїеінк Р. Іп уііго ргогадаііоп оГ гей саЬЬаде (Вганніса оіе-
гасеа) І І 3. Ехр. Воі. - 1975. - 26, N 6. - Р. 883-890.
125. Вагаіїії В., Бонні Р., іїег^агі В. Іп уііго хЬооі Йеееіортепі оГ Ргипик
ОТ655: іпіегасііоп Ьєісусєп ІідЬі апсі Ьсп/уіасіспіпе // Ркукіоі. Ріапі — 1988. —
74. — Р. 440—443.
126. Вагаіїії В., Магіпо ¥., Вонаії Р., Соіїпеіїі А. 8оиг сііеггу (Ргипин сега-
нин) тісгоргорадаііоп // Асіа Ногіісикигае. — 1988. — 277. — Р. 405—407.
127. Вагіанн М., 8кепе К. Іп тііго ргорадаііоп оГ дгарсУІпс (Уііїн тіпі/ега Ь.)
Ггот Ггадтепіей біюоі аріеа // Уііік. — 1978. — 17. — Р. 335—340.
128. Вагіанн М., 8кепе К. Зіийіех оп іЬс Ггадтепіей хЬооі арех оГ дгарееіпе.
1. ТЬе гсдепсгаОее сараску оГ ІеаГ ргітогйіаі ГгадтспО, іп уііго // 3. Ехр. Воі. —
1980. — 31. — Р. 484—488.
129. Вагіанн М., 8кепе К. Зіидіек оп ікс Ггадтепіесі кітооі арех оГ дгареуіпс.
2. РасіогБ аГГссііпд дгоМЬ апсі сІіГГеїепііаііоп іп тііго // ІЬісІ. — Р. 489—495.
130. Вагу/аіе І).В., Кегпн Н.Р., ІРісіІюІт Р.М. Ріапі гедепегаііоп Ггот саііик
сикигез оГ хеуегаї хоуЬеап депоіурех уіа етЬгуодепсхіх апсі огдаподепекіх // Ріа-
піа. - 1986. - 167. - 8. 473-481.
131. Веіїкі В.М., Ьеніеу 8.М. 8Ьооі гедепегаОоп Ггот ІеаГ саііик оГ Ьусоре-
гнісоп енсиїепіит 11 7.. РГІапгепрЬухіоІ. — 1980. — 98, N 5.- 8. 83—87.
132. Веп-Раасоу ії, Іапуїшпн В. Ж Карій тикіріісаііоп оГ Сіїгунапііїетит
ріапік Ьу 8іет-іір ргоІіГегаііоп // Ноіі8сіепсе. — 1972. — 7, N 2. — Р. 289—
291.
133. ВегеПа О., Ессіїег Т. ВсіеїтіпаОоп оГ оріітит Іеуеі оГ ВАР, ОА3 апй
ІАА іп тісгоргорадаііоп оГ Сатеїіїа Ьу ап огіЬодопаї сотрокке йехідп // Асіа
Ногі. - 1987. - 212. - Р. 151-154.
134. Веуі С., 8іїагта ¥.С. Рісіогат іпйисей котаііс етЬгуодепекіз іп Оаз-
іегіа апй Нахуоіікіа // Ріапі Сеіі, Тіяккие апй Огдап Сикиге. — 1983. — 2. —
Р. 123-132.
249
Список літератури
135. Вкоутуапі 8.5., Миіііпх К, Сокеп О. Іп уііго ргоргщаііоп оГ Рупія ру-
гі/оііа /І 8сі. Ногі. — 1984. — 23, N 3' — Р. 347—254.
136. Вкоруапі 5.5, Ва&іап М.К. Ріапі Тіжие Сикиге: ТЬеогу апд Ргас-
іісе. — Атвіегдат: Еівєуієг 8сі. РиЬІ., 1983. — 236 р.
137. Вісісііп^іоп N.2., 5иікегІап(1 В.. А., КоЬіпяоп Н.Т. Зііуєг піігаіе іпсгеакек
етЬгуо ргодисііоп іп апікег сикиге оГ Вгиввеїв вргоиів //Апп. Воі. — 62. — Р. 181—
185.
138. Віїкеу Р.С., Соскіп% Е.С. Іпсгеааед ріапі уідоиг Ьу іп уііго ргора^аііоп
іп 5аіпіраиІіа іопапіка Ггот киЬ-ерідегтаї ііккие // Ногі8сіепсе. — 1981. — 16,
N 4. - Р. 643-644.
139. Віїкеу Р.С., МсСотуп В.Н., НікіеЬгапсІі А.С. Місгоргора^апііоп оГ АГ-
гісап уіоієі Ггот реііоіе сго88-8есііоп8 І І ІЬід. — 1978. — 13, N 1. — Р. 37—40.
140. Віасіея В.Е. Іпіегасііоп оГкіпеііп апд уагіоив іпкіЬііоге іп іііе дгоМГі оГ
8оуЬеап ііввие // РГіувіоІ. Ріапі. — 1966. — 9. — Р. 648—753.
141. Воііепкоу Е.У. Ріапі ге^епегаііоп Ггот са11и8 сикиге оГ Ігія ряешіосогия
(Ігісіасеае) // ВіоіескпоІо^У АрргоасЬев Гог Ехріокаііоп апд Ргевегуаііоп оГ
Ріапі Ке8оиг8Є8. — Уака, 2002. — Р. 27.
142. Вопуа Е.М. Арр1іісаііоп8 оГ ІІ88ие сикиге іп Гогезігу І І Ріапі Сеіі, ТІ8-
8ие апсі Ог^ап Сикиге / ЕсЕ Ьу 1. Кеіпегі, У.Р.8. Ваіар — Вегііп еіс.: Зргіпдсг-
Уегіае, 1977. - Р. 93-108.
143. Воп$а Е.М., Виг^ап В.І. ТІ88ие Сикиге іп Роге8ігу. — Гкщие: N1(11011,
1982. - 245 р.
144. Воттап С.Н. Ро88ІЬі1ііе8 апсі соп8ігаіпі8 іп (Не гедепегаііоп оГ ігее8
Ггот соіуіесіопагу пеедіевв оГ Рісеа акіея іп уііго // РГіуаіоІ. Ріапі. — 1983. — 57,
N 1. - Р. 5-16.
145. Воттап С.Н. Рісеа аЬіе8 // Сеіі апі ТІ88ие Сикиге іп Еоге8ігу / Ед. Ьу
ЇМ. Воп^а, О.У. Оигхап. — ОогдгеЬі еіс.: М. МукоІГриЬІ., 1987. — Р. 2—29.
146. Воіііпо Р.Е. СІопіп^ а^гісикигаї ріапі уіа іп уііго іесітідиев / Ед. Ьу
В.У. Сопдег. — Ваіог, Ріогіда: СВС Рге88, іпс. ВОСА, 1981. — Р. 141—164.
147. Воиг^іп ЕР., Иііяк Е.Р. ОЬіепііоп де Иісоііапа Ьаріоідев а рагііг д’еіа-
тіпее8 сиіііуее іп уііго // Апп. РЬу8Іо1. Уе§. — 1967. — 9. — Р. 377—382.
148. Воміеп Е.Е. Вогоп Є88епііа1ііу апд Ігап8роП іп 8и8реп8Іоп сикигед кидаг-
сапе сеіі // Ріапі РЬувіоІ. — 63 (5 8ирр1.). — Р. 163.
149. Вохия Рк., Вгиагі Р. УІШ8 — Ггее 1гее8 ііігоидк іІ88ие сикиге // Віо-
іескпоіо^у іп Авгісикиге апсі Рогевігу / Ед. Ьу У.Р.8. Ва]а). — Вегііп еіс.:
8ргіп8ег-Уег1а£, 1986. — Р. 24—30.
150 Вохия Рк., Оиоігіп М., Раіпе Е.М. Еаг^е зсаіе ргора^аГіоп оГ зігасуЬеггу
р1апі8 Ггот ІІ88ие сикиге І І Ріапі Сеіі, ТІ88ие апсі Огцап Сикиге / Ед. Ьу І. Веі-
пегі, У.Р.8. Ва]а(. — Вегііп еіс.: Зргіпйег-Уегкщ, 1977. — Р. 130—143.
151. Вгеяяап Р.М., Кіт ¥.Р., Нупсітап 5.Е. еі аі. Расіогв аГГесііп£ іп уііго
ргораваііоп оГ Кояе// 1. Атег. 8ос. Ногі. 8сі. — 1982. — 107. — Р. 979—990.
152. Вгісі^еі М.Р., ЕіпеЬег^ег В. В. ТЬе еГГесі оГ Гіогтопек оп ІІіе еікуіепе
ргодисііоп гаіе оГ Еїсоііапа іокасит “КУ 10” са11и8 іп уііго і і Ногі8сіепсе. —
1981. - 16. - Р. 441 (АЬ8і. 310).
153. ВгоегЦея С., Кееп А. Адуепікіоиз кГюоік: до іЬеу деуеіор Ггот опе сеіі І І
ЕирЬуііса. — 1980. — 29. — Р. 73—87.
154. Вготуп С., Вгоокз ЕЕ, Реагяоп В., Маікіах В.Е. Сопігої оґ етЬгуо£Єпе8І8
апд оі^апо£Єпе8І8 іп іттаіиге суііеаі етЬгуо саііік икіп^ іпсгеазед тедіит овто-
Іагііу апд аЬ8СІ8Іс асід //1. Ріапі РЬувіоІ. — 1989. — 133, N 6. — Р. 727—733.
250
Список літератури
155. Втуп С.Е., Воттег Н.Е. Вид апсі гооі сііГГегепііаііоп іп сопіГег сиі-
Іиге8 // ТІ88ие Сикиге іп Рогекігу / Есі. Ьу ЇМ. Вопва, 0.1 Оиг/.ап. — Навис:
М. МцЬоЕГ, 1982. - Р. 109-149.
156. Вгисе М.І., 2каг ТА., Ке//огіі ЬІ.Р. СЬетісаІ 8ігисіиге апсі ріапі кіпіп
асііуііу; іЬе асііуііу оГ игеа апсі іЬіоигеа дсгіуаііуск // ЬіГе 8сі. — 1965. — 4. —
Р. 461-466.
157. СатрЬеІІ В. А., Оигіап О.}. Іпдисііоп оГ тикіріе Ьиск апсі пеесіїез іп
ІІ88ие сикиге8 оГ Рісеа діаиса // Сап. 3. Воі. — 1975. — 53. — Р. 1652—1657.
158. Сагтап Е, Те//егхоп Й., СатрЬеІІ кИ Іпігосіисііоп оГ етЬгуовепеііс Тгі-
іісит аезііуит Ь. саііі. 1. ОиапііГісаііоп оГ депоіуре апд сикиге тесііит ейесів //
Ріапі Сеіі, ТІ88ие апсі Огвап Сикиге. — 1988. — 12. — Р. 83—95.
159. Саззеїз А.С. ТЬе еГГесія оГ 2,3,5 -ігі-іодоЬепгоік асід оп саи1овепе8І8 іп
саііик сикигех оГ іотаіо апсі РеІаі%опіит // РЬухіоІ. Ріапі. — 1979. — 46. —
Р. 159-164.
160. Сіюіира V. Уедеіаііуе ргорадаііоп оГ ЕпвІізЬ Оак (Оисгсик гоЬиг Ь.),
ктаїї — ісаусд Ьіпдеп (Тіїіа согсіаіа МІ11.) апсі Еигореап тоипіаіп А§Ь (8огЬи$
аисирагіа Е.) іп уііго і і Ьєкпісіуі. — 1984. — ЗО. — Р. 1019—1028.
161. СИаІира V. Іп уііго ргораваііоп оГ Оак (Сиегсиі гоЬиг Ь.) апсі Еіпсіеп
{Тіїіа соніаіа МіП.) іп уііго // Віоі. Ріапі. — 1984. — 26.—Р. 374—377.
162. СИеупе У.А., Оаіе Р.Е. 8Ьооі іір сикиге іп Готове Іевите8 // Ріапі 8сі.
Ьеіі. - 1980. - 19. - Р. 303-309.
163. Сказе 5. Мопоріоідк апсі топоріоід-дегіуед таіге (2са тауз Е.) //
Воі. Вєу. - 1969. - 35. - Р. 117-167.
164. Сііее В., Рооі В.М. 8исго8е апсі І^ІАА іпЛиепхе оп дгосуіЬ оГ киЬсикигед
кЬооік апсі іп уііго ргосіисііоп оГ гооі8 іп УііІ8 // НогіЗсіепсе. — 1988. — 23. —
Р. 776.
165. СНепу 7.М., Веізсії В.І. 8Ьооі гевепегаііоп Ггот реііоіек апсі 1еауе8 оГ Уііїз
ІаЬгизсапа “СаіасуЬа” // Ріапі Сеіі Верогіз. — 1989. — 8, N 7. — Р. 403—406.
166. Скіуак А., Тгап ТІлапІл Уап М. ОіГГегепііаІ геасііуііу іп ерідегтаї сеік
оГ Веуопіа гех ехсікесі апсі вгосуп іп уііго // РЬувіоІ. Ріапі. — 1975. — 35, N 1. —
Р. 16-20.
167. СІ10П8 С., Риа Е.С. СагЬоп пиігіііоп оГ Оііасуа 3 арріе гооізіоск дигіпв
8іа£е оГ іп уііго ргораваііоп // 1. Ногі. 8сі. — 1985. — 60, N 3. — Р. 285—290.
168. Скгізііапзоп М.І.. Саи8а1 ейесі8 іп тогр1іовепе8І8// Ріапі ТІ88ие апсі
Сеіі Сикиге / Есі. Ьу С.Е. Огееп еі аі. — 1\Іесу ¥огк: Аіап В. ЬІ88, Іпс. —
1987. - Р. 45-55.
169. Скі С.-Е., Вафеїіі Б.С., Віт С.-Е., Риа Е.С. ЕГГесі оГАвТІо3апс! аті-
поеікохууіпуівіусіпе оп іп уііго 8Ьооі апд гооі ог§апо£епе8І8 Ггот кеесіїіпв ех-
р1апі8 оГ гесаіскгапі Вгаззіса вепоіурез // Ріапі Сеіі Верогік. — 1990. — 9. —
Р. 195-198.
170. СІш С.С. ТЬе N6 тесііит апсі кк арріісаііопв іо апіЬег сикиге оГ
сегеаі сгорз // Ргосеес1іп£8 оГ 8утро8Іит оп Ріапі ТІ88ие Сикиге, Мау 25—30,
Везипв. — Ве]ипв, 1978. — Р. 43—50.
171. СІш С.С., Нііі В.Б., ВгиІе-ВаЬеІ А.Е. Ні^Ь Ггедиетсу оГ роїіеп етЬ-
гуоід Гогтаііоп апсі ріапі ге£епегаііоп іп Тгііісит аезііуит Ь. оп топскассЬагісІе
сопіаіпіпв тедіа // Ріапі 8сі. — 1990. — 66. — Р. 255—262.
172. СІш С. С., ІУап^ С.-С., Еип С.-Е. еі аі. Е8іаЬ1І8Ьтепі оГ ап сГГісіепі
тесііит Гог апіЬег сикиге оГ гісе, іЬгоидЬ сотрагаііуе ехрегітепі8 оп іЬе пкго-
Веп 8оигсе8 // 8сі. 8іпіс. — 1975. — 18. — Р. 59—668.
251
Список літератури
173. Сіаге М.У., Соїііп Н.А. ТЬе Ргосіисііоп оГ ріапііеік Ггот ііххие сикигек
оГ Вгиххеїх кргоиі (Вгаххіса оіегасеа Ь.) 11 Апп. Воі. — 1974. — 38, N 8. —
Р. 1067-1068.
174. Сіагкзоп В.Т., Напьоп -І.В. ТЬе тіпегаї пиігіїіоп оГ ЬідЬег ріалів //
Апп. Кєу. Ріапі РЬухіоІ. — 1980. — 31. — Р. 239—298.
175. Сіетепії М.А., Миігі Н., СгіЬЬ Р.Р. А ргеїітіпагу герогі оп іЬе хутЬіо-
Ііс вегтіпаїіоп оГ Еигореап Іеггезігіаі огсЬіск // Кєіу Виїіеііп. — 1986. — 41. —
Р. 437-445.
176. Соїетап (У.К., Нихіеп/ Т.¥., Реісі В.М., Ткогре Т.А. ЕіЬуІепе а8 ап еп-
сіодепоик іпЬіЬіІог оГ гооі ге^епегаїіоп іп Іотаїо ІеаГ сіікск сиііигесі іп тііго //
РЬІ8іоІ. Ріапі. - 1980. - 48. — Р. 519-525.
177. Соїетап ІУ.К., Сгеуят В..І. Апа1у8І8 оГ гооі Гогтаііоп іп ІеаГ сіікск сиі-
Іигесі іп тііго // Апп. Воі. — 1977. — 41. — Р. 307—320.
178. Сопуег В., Соїетап \У.К., ТІюгре Т.А. Іп тііго сикиге оГ чекіст гед се-
даг (Піца ріісаіа Вопп.). 5. СІопіпд адгісикигаї ріапІ8 уіа іп Т’ііго ІесЬпіциек //
СК.С Рге88 Іпс. Воса Каїоп, Еіогісіа, 1981. — Р. 141 —164.
179. Ситтіп%5 Р.Б., Сгееп С.Е., 8іиіктап В. В. Са11и8 іпсіисііоп апсі ріапі
ге^епегаїіоп іп оаїх// Сгор 8сі. — 1976. — 16. — Р. 465—470.
180. Ваі Р.С., ІлітЬегік У.ІЧ., Татеп В., Мегіа О. Місгоргора^аііоп оГ
Вкосіосіепіігоп ргипоркуііит Ьу оуагу сикиге // Ногі8сіепсе. — 1987. — 22. —
Р. 491-493.
181. Вапіеі ¥. АпіЬег сикиге іп гуе: ітргоуед ріапі гедепегаїіоп ихіпд тосіі-
Песі М8-тедіа // Ріапі Вгеес1іп£. — 1993. — ПО. — Р. 259—261.
182. Ваіе К. Сотриіег сопігоііесі вгеепЬоихех іп Зарап // ВіоіесЬпоІоду іп
Адгісикиге апсі Еогехігу / ЕО. Ьу У.Р.8. Ва]а]. — Вегііп еіс.: 8ргіп£ег-Уег1а8,
1991. - УоІ. 17. - Р. 540-553.
183. Ватії! А. Іп уііго ргора^аііоп оґ Сутпозрегтх // ТІ88ие Сикиге іп Ео-
ге8ігу І Есі. Ьу З.М. Воп^а, В.З. Оиггап. — Надие: М. N41101? РиЬІ., 1982. —
Р. 72-108.
184. Ве Сгее/ И4, РасоЬа М. Іп уііго сикиге оГ іЬе хиеагЬееІ: <1е8сгір1іоп оГ а сеіі
Ііпе міЬ Ьі^Ь гедепсгаїіоп сарасіїу// Ріапі 8сі. Ееіі. — 1979. — 17. — Р. 55—61.
185. Весіісоуа В., Нгісога А., 8атау /. еі аі. 8ЬооІ8 апсі етЬгуо-Ііке хігис-
Іиге8 ге£епегаіес1 Ггот сикигесі Пах (Ьіпит и8ІІаІІ88Іти8 Ь.) Ііуросоїуі хедтепіх //
3. Ріапі РЬухіоІ. - 2000. — 157. — Р. 327.
186. ОіуЬу Р, 8кооу Р. Суіокіпіп асііуаііоп оГ іЬіатіпе Ьіо8упіЬе8І8 іп ІоЬас-
со саііих /1 Ріапі РЬувіоІ. — 1966. — 42. — Р. 647—652.
187. Воі^ікк 8. ¥ РЬукіоІодісаІ гсдиіагіїісх оГ тісгосіопаї осуп — гооіесі
арріе // ВіоіесЬпоІоду АрргоасЬе8 Гог Ехріоііаііоп апсі Рге8егуаііоп оГ Ріапі Ке-
8еагсЬе8. — ¥ака, 2002. — Р. 29.
188. Воге С. Ахрага^их сіопіп^ гєуіхііссі // Асіа Ьогі. — 1990. — 271. —
Р. 101-108.
189. Вои^аіі В.К., У/еугаиск КАР., Аііоп ГК ТЬе сГГесіх оГ ог^апіс асісік оп
дгосуіЬ апсі апіЬосуапіп ргосіисііоп Ьу місі саггої £гомп£ оп аттопіа ах а хоіе
пііго^еп хоигсе // Іп уііго. — 1979. — 15. — Р. 189—190 (АЬхІ. 103).
190. Вгеш Н.А., 8тіік /У.У. СгосуіЬ оґ арісаі апсі Іаіегаї Ьисік оГ расурасу
(Сагіса рарауа Ь.) ах еПесІесі Ьу пиігіііопаї апсі Ьогтопаї Гасіогз І І 3. Ногі. 8сі. —
1986. - 61. - Р. 535-543.
191. Вгіуег Р.А., Кипіуикі А.Н. Іп уііго ргора^аііоп оГ Рагасіох суаіпиі гооі-
хіоск. // Ногі8сіепсе. — 1984. — 19. — Р. 507—509.
252
Список літератури
192. Іігиагі Рк. Кс^иіаііоп оГ ахіїїагу Ьгапсіїіпв іп тісгоргораеаііоп оГ хуоо-
сіу Ггик зресіез // Асіа Ногі. — 1988. — 227. — Р. 369—380.
193. Вгиагі РИ., Сігихеїіе Р. Ріит (Ргипиз гіотехГіса) 11 Віоіескпоіо^у іп А^-
гісикиге апсі Еогезігу / Есі. Ьу У.Р.8. Ваза]. — Вегііп еіс.: 8ргіп£ег-УсгІа£, 1986. —
Р. 130-153.
194. Випсап 1).Р., Мїсікоїт ВМ. Ітргоуссі ріапі гс£спсгаііоп Ггот таіге
саііііа сиііигез изіп£ А^МОз // Ріапі РЬуяоІ. — 1987. — 83, зиррі. 35 (АЬзі.
208).
195. Випсап В.Р., ІЕісІкоїт ВМ. Ітргоуесі ріапі гееепегаііоп Ггот таіге
саііиз сиііигек изіпц 6-ЬепгуІ-атіпоригіпе // Ріапі Сеіі Керогіз. — 1988. — 7. —
Р. 452-455.
196. Випхіап В.І., Веккаохуі Е, Рііоп М., АЬгат$ 8.В. ЕГГесіз оГ аЬзсізіс асісі
апсі апаїо^исз оп іііе таіигаііоп оГ хуГіііє хргисс (Рісеа &1аиса) зотаііс етЬгуоа //
Ріапі 8сі. — 1988. - 58. - Р. 77-84.
197. Випхіап В.І., 8коп К.8. Ітргоуссі §го\уіЬ оГ іізяис сиііигез оГ іЬе опіоп
АІПит сера 11 РЬузіоІ. Ріапі. — 1977. — 41, N 1. — Р. 70—72.
198. Випаіап В.І., 8когі К.8. 8Ьооі ргосіисііоп Ггот іЬе Поууєг Ьеасі оГ АІ-
Ііит сера Ь. // 8сі Ногі. - 1979. - 10, N 3. - Р. 345-346.
199. ВипкеИ В.М., СогпЕк М. Кс^епегаііоп оГ ріапіз Ггот іттаіиге етЬ-
гуок оГ 8есаІе сегеаіе // Апп. Вер. ІоЬп Іппез Іпзі. — 1980. — Р. 59—60.
200. Виг^ап В.В. Аттопіа: Ііх апаїо^иез, теіаЬоІіс ргосіисіз апсі зііе оГ ас-
ііоп іп хотаііс стЬгуо^спсзіз // Тізяие Сикиге іп Еогезігу / Есі. Ьу Л.М. Воп^а,
0.1. Оиггап. — ОогсІгесЬі еіс.: М. ІЧуЬоГРиЬІ, 1987. — Уоі. 3. — Р. 92—136.
201. Еагіе Е.В., Еап^капх кії'. Ргора^аііоп оГ Скгуьапікетит іп уііго //
1. Атег. 8ос. Ногі. 8сі. - 1974. - 99, N 4. - Р. 352-358.
202. ЕЬіііа А.І.А., Ни С. ¥. Іп уііго тогрЬо^спеііс гсзропзез апсі ріапі ге^спс-
гаііоп Ггот реррег (Саржит аппит Ь.) зсссііп^ ехріапіз // Ріапі Сеіі Керогіз. —
1993. - 13, N 2. — Р. 107-110.
203. Есопотои А.8., Ееасі Р.Е. Іп уііго хЬооі ргоІіГегаііоп оГ Міппсзоіа сіе-
сісіиоиз агаїеа зкооі іірз // Ногі8сіепсе. — 1984. — 19, N 1. — Р. 60—61.
204. Ееиуепх С.В. Міпегаї гедиігетепіз Гог єгосуіЬ апсі саііиз іпіііаііоп оГ
ііззие ехріапіз ехсізесі Ггот таіиге сосопиі раї та (Сосох писі/ега) апсі сикигесі
іп уііго // Ркузіоі. Ріапі. — 1976. — 36, N 1. — Р. 23—28.
205. Еіпхеї В. Ж, Аіехапсіег В.К Миіііріісаііоп оГ 8угіпра зресіез апсі сикі-
уагз іп ііззие сиііиге // СотЬ. Ргос. Іпі. Ріапі Ргор. 8ос. — 1984. — 34. —
Р. 628-638.
206. Еітоге Н. Ж, ІЕіііШег В.Р. ТЬе гоїе оГ еіЬуІепе іп іЬе іпсіисііоп оГ аро-
еатоиз Ьисіа іп Ріегісііит §атеіорЬуіез // Ріапіа. — 1973. — 111. — 8. 85—90.
207. Егік$$оп Т. 8іис1ісз оп іЬе §го\уіЬ гедиігетепі апсі §го\уіЬ теазигетепіз
оГ сеіі сикигез оГ Нарріорариь ргасіїіх // РЬуаіоІ. Ріапі. — 1965. — 18. — Р. 976—
993.
208. Еегапі N. Уіша еіітіпаііоп іп Ьорз (Нипшіих Іириіи^ Ь.) //
ВіоіссЬпо1о£у АрргоасЬез Гог Ехріоііаііоп апсі Ргезегуаііоп оГ Ріапі Везоигеез. —
Така, 2002. - Р. 44.
209. Еісіїег З.С. Маіигаїїу оссигтіпц уоіаіііе ог^апіс сотроипсіа // Епсусіоре-
сііа оГ Ріапі Ркіузіо1о§у. — Вегііп: 8ргіп8-Уег1а§, 1960. — Уоі. 12(1). — Р. 347—
359.
210. Еіогіпо Р., Іогеіі Г. Ргора^аііоп оГ Ггиіі ігеез Ьу ііззие сикиге іп Ііаіу //
Ногі8сіепсе. - 1987. - 22, N 3. - Р. 353-358.
253
Список літератури
211. РІеісИег .1.8. ІпЙиепсе оґ піїгаїе апсі зисгояс зирріу оп іііе §го\уіЬ апсі ке-
псксспсе оґ РаиГз 8сагіеІ гове сеіів // Ріапі РЬувіоІ. — 1980. — 65, зиррі. — Р. 37.
212. Ріеіскег К.А., Лхсаге-ВоатаИ И.К., Кгіеу Е.С. еі аі. Тгіасіітсґоп вііти-
Іаісв гооІіп§ іп Ьеап Иуросаіиі // РЬувіоІ Ріапі. — 1988. — 73. — Р. 401—405.
213. РоппезЬеск М. ОгосуіЬ Ьогтопев апсі ргораваііоп оґ СутМіит іп уііго //
ІЬід. - 1972. - 27, N 3. - Р. 310-316.
214. РоппехЬесИ М. ТЬе ІпЙиепсе оГМАА, ВА апсі Іетрегаїиге оп вйооі апсі
гооі деуеіортепі Ггот вертепів оґ Веуопіа х скеітапіИа цгоулИ іп уііго // ІЬід. —
1974. - 32, N 1. - Р. 49-54.
215. СаЬгузуеи/ка Е., 8апіек.\кі М. Аихіп сопігої оґ Іиіір зіаїк сіопцаїіоп іп
уііго // 8сі. Ногі. - 1983. - 29. - Р. 153-159.
216. СаЕіоп А. Ж Роїуатіпев аз тосіиіаіогя оґ ріапі деуеіортепі // Віо8сі. —
1983. - 33. - Р. 382-388.
217. СіаЕіоп А. IV., Нііітап IV. 8. ТЬе сіецгасіаііоп оґ аихіп 11 Епсусіорссііа оґ
Ріапі РЬувіоІо^у. — Вегііп есі.: 8ргіпц-Уег1а£, 1961. — УоІ. 14. — Р. 647—670.
218. СаЕіоп А.IV., Рахткіпеу Е.К., Аіітап А., ЕІогез Н. Роїуатіпев тасгото-
іесиїаг вупіИевсв апсі іЬе ргоЬІет оґ сегеаі ргоіоріаві гевепегаііоп // Адуапсев іп
Ргоіоріаві ВевеагсЬ / Ед. Ьу Ь. Еегепсгу, О.Ь. Еагкав. — Охґогсі еіс.: 8хе§ед,
Рег^атоп Ргевв, 1979. — Р. 485—497.
219. СатЬогу О.Р., СопмаЬІе Е, 8кіуІик Р.Р. Ог^апо^епевів іп саііив ґогт
вЬооІ арісев оґ РЕит хаііуит // РЬувіоІ. Ріапі. — 1974. — ЗО. — Р. 125—128.
220. СатЬогу О.Ь., Ьагие Т.АУ. ТЬе еґґесі оґ аихіп, аЬвсівіс асісі, кіпеїіп оп
еіЬуІспе ргосіисііоп іп виврепвіоп сиііигев оґ го.ве апсі Киіа сеіів 11 Ріапі РЬувіоІ. —
1971. - 48. - Р. 399-401.
221. СатЬогу О.Ь., Міііег Е.А., 0/іта К. Ь'иігіспі гедиігетепі оґ виврепвіоп
сикигев оґ воуЬеап гооі сеіів // Ехр. СеІІ Рев. — 1968. — 50. — Р. 598—600.
222. Сагсіа Е.6., Еіпхеі ).№. ЕіЬуІспе апсі сіЬапс ргосіисііоп іп 2,4-В-ігс-
аіесі апсі ваіі-ігсаіед іоЬассо Іі.ввис сикигев // Апп. Воі. — 1983. — 51. — Р. 287—
295.
223. Оаиікегеї ЕУ. Мапиеі ТссЬпідие сіє Сиііиге дсв Тіввие Уеееіаих. —
Рагів: Маввоп еі Сіє, 1942. — 535 р.
224. Сауіпіегіуаіапа Р., Ееас! Р.Е., №Икіпз Н.Е, Неіпз А. Еііуіепе ієуєів іп
Йавк аітоврйсгсв оґ ГкМіа рісаіа Сау. Іеаґ вертепів апсі саііив сиііигесі іп уііго //
І. Атег. 8ос. Ногі. 8сі. — 1982. — 107. — Р. З—6.
225. Сєпоуєзі А.І)., СоШпз С.Е. Іп уііго ргосіисііоп оґ Ііаріоісі ріапі оґ сот
уіа апіЬег сикиге // Сгор 8сі. — 1982. — 22, N 6. — Р. 1137—1144.
226. Сеогуе Е.Е. Ріапі Ргораваііоп Ьу Тіввие Сикиге 11 ТЬе ТесЬпоІо^у. —
2-пд есі. — Ехе£е1іс8 Еітіїесі, 1993. — Р. 1. — 574 р.
227. Сеогуе Е.Е. Ріапі Ргораваііоп Ьу Тіввие Сикиге // Іп Ргасіісе. — Ехе-
^сіісв Еітіїесі, 1993/1996. — Р. 2. — 640 р.
228. Сеогуе Е.Е, Риііаск [)У.М., Сеогуе НУ. Ріапі Сикиге Медіа. — \Уе8і-
Ьигу, Еп^ІапО: Ехєвєіісб 11й., 1987. — УоІ. 1. — 567 р.
229. Сеогуе Е.Р., Риііаск [)У.М., беогуе НУ. Ріапі Сикиге Медіа. — ХУекі-
Ьигу, Еп^іапд: Ехеееііск Іід., 1988. — УоІ. 2. — 420 р.
230. Сеогуіеу Е.Т. Іп уііго ргораваііоп оґІііе арріе віоск М9: Іпіііаііоп, рго-
Ііґегаїіоп, гооііпв // ВіоІссЬпоІо^у АрргоасЬев (ог Ехріоііаііоп апд Ргехсгуаііоп
оґ Ріапі Вевоигсев. — ¥ака, 2002. — Р. 30.
231. Сой СУ., Тап Н. Сіопаї ргораваііоп Ггот Іеаґ ехріапіх оґ Репапіапсіа
огсЬід ЬуЬгід // Огсіїід геу. — 1982. — 90. — Р. 295—296.
254
Список літератури
232. СоІМасИ Н., АтЬегдег А. ІпГІиепяе оґ Ьогоп сІсЛсіепсу оп 3Н іпсіоіс-
Зуі-асеііс асі сі иріаке апсі еґїіих іп сеіі сикигся оґ [)аиси.$ сагоіа Ь. // Ріапі
СґгоуЛЬ Ке8. - 1986. - 4. - Р. 81-86.
233. Согдіепко N. V. Сіопаї тісгоргора^аііоп \уіік ргсяепаііоп оґ сіесогаііуе
сЬагасіегя оґ 8аіпіраиІіа сиіііуагя // ВіоіесНпоІо^у АрргоасЬея Гог Ехріоііагіоп
апсі Веяспаїіоп оґ Ріапі Кеяоигяся. — ¥ака, 2002. — Р. ЗО.
234. Сот.н Е, Уокоуата М., Макапига М. еі аі. Іп уііго ргора^аііоп оґ /т
раІМа // Ріапі Сеіі Ксрогія. — 1993. — 13, N 1. — Р. 12—16.
235. Сгау Сопуег В. V. Іпґіиспсс оґ сІісатЬа апсі саясіп Ьусігоіуяаіе оп
.яотаііс етЬгуо питЬег апсі сикиге диаїку іп сеіі яиярепяіопя оґ РасІуІЕ ріо-
тегаїа (Огатіпеае) // Ріапі Сеіі Тіяя. Ог£ап Сиіі. — 1985. — 4. — Р. 123—
133.
236. Сгесо В., Тап^агеїіа О.А., Соггоцо К, Віапсо А. Саііия іпсіисііоп апсі
8ІЮОІ гецепсгаііоп іп яипґіоусг (НеНапіІша аппиии) // Ріапі 8сі. Ьсії. — 1984. —
36, N 1. - Р. 73-77.
237. Сгееп С.Е. 8отаііс стЬгуо£спсяія апсі ріапі гс£спегаііоп Ггот іЬе Ггі-
аЬІе саііия оґ 2еа тауа // Ріапі Тіязие Сикиге / Есі. Ьу А. Еіціісуага. — Токуо:
Зарап Аяяос. Ріапі Тіяяие Сиіі., 1982. — Р. 107—108.
238. Сгееп С.Е., Ркііірз КЕ. Ріапі ге^спегаііоп Ггот ііяяие сикигея оґ таіхе //
Сгор. 8сі. — 1975. - 15, N 5. - Р. 417-421.
239. Сге^кіо// Р.М., Иоу С.Н. Осгіуаііоп оґ Ьаріоісі сеіі Ііпе Ггот УііЕ гіпі-
/ега апсі іке ітрогіапсе оґ іке яіа^е оГ теіоііс сіеуеіортепі оГ апікегя Гог Ьаріоісі
сикиге оГ іЬіб апсі оікег вепега // X. РЛапхепркуяіоІ. — 1974. — 73. — 8. 132—
141.
240. Сгіуа М., Те/кіога Е., Иоуак Е., КиЬаІакоуа М. Іп уііго сіопаї ргора-
еаііоп оГ РЕит хаіїуцт // Ріапі Сеіі Тіяя. Огцап Сиіі. — 1986. — 6. — Р. 95—
104.
241. Сгоиі В. Ж Ж., Сгіхр Р. Ргасіісаі адресі оґ іке ргора^аііоп оґ саиІіПоу/ег
Ьу тегіяіет сикиге // Асіа Ногі. — 1977. — 78. — Р. 289—296.
242. Сиі С.К. Іпсіисііоп оГ саііия апсі ге^епегаііоп оГ ріапіїсія іп яіст яе§-
тепі сикиге оГ Скіпеяе §оояеЬеггу 11 Асіа Воі. 8іп. — 1979. — 21. — Р. 339—
244.
243. Сиі С.К. 8іет іір сикиге оГ Асііпісііа сМпепж // Виї. Воіі. Рея. —
1984. - 2, N 3. - Р. 10-13.
244. Сиріа Р.К., Виг^ап 1).Е 8отаііс роїуетЬгуоеепеяія Ггот саііия го та-
іиге яіщаг ріпе етЬгуоя // ВіоТескпоІо^у. — 1986. — 4. — Р. 643—645.
245. Сиріа 8., 8еп В., ВкіаИаскіагуа 8. ЕтЬгуовепеяія апсі сІіГґегспІіаііоп іп
іу/о ярссіся оґ Тгіропеїіа 11 РЬуіотогрЬ. — 1987. — 37. — Р. 95—101.
246. Сиггіагап М.Е, РетіНа М.А., Татех К8. Асіуепікіоия якооі гевепегаііоп
іп сикигея оГ НитиІіи> Іириіих І І Ріапі Сеіі Иеропя. — 1999. — 18. — Р. 1007—
1011.
247. НаМЬгоск К. Соггеїаііоп Ьсіи/есп піігаіе иріаке, ^гоуЛк апсі сЬап^ея іп
теіаЬоІіс асііуіііся оГ сиііигесі ріапі сеіія // Ріапі Тіяяис апсі СеІІ Сикиге. Воі.
Мопо^г / Есі. Ьу Н.Е. 8ігееі. — 1977. — УоІ. 2. — Р. 363.
248. НаттексМа^ Е Реасії (Ргипи8 регхіса Е.) // ВіоіссНпоІо^у іп Аегісиї-
іиге апсі Еогекігу І Есі. Ьу ¥.Р.8. Ва]а]. — Вегііп еіс.: 8ргіп£ег-Уег1а8, 1986. —
Р. 170-182.
249. Наппау / Ж. А яіисіу оГ іііе тісгопиігіепі гедиігетепія оГ ехсіяссі гооія //
РЬ. О. Т11Є8І8. — Мапскеяіег: і_1піу. МапсЬеяіег, 1965. — 47 р.
255
Список літератури
250. Нагатіа Н. Іп уііго оі£ап сикиге оГ Асііпісііа скіпепзіз Р1 аз а іескпі-
дие Гог уе§еіаііуе тиіііріісаііоп // Л. Ноп. 8сі. — 1975. — 50, N 1. — Р. 81—83.
251. НагЬа^е Р.Е., 8іітагі О.Р. Асіуспііііоиз зкооі ге^епегаГіоп Ггот іп уііго
зиЬ сикигеб саііиз оГ Кіюдодепдгоп ЕхЬигу куЬгід // Ноп. 8сі. — 1987. — 22,
N 6. - Р. 1324-1325.
252. НаггЕ К.Е., 8іеуеп$оп й.Р. Іп уііго ргорацаііоп оГ Уіііх// Уіііз. — 1982. —
21. - 8. 22-25.
253. Нагітапп Н.Т., Ке.\іег И.Е. Ріапі Ргора^аііоп: Ргіпсіріез апсі Ргасіісез.
4ік ссі. — Несу Легзеу: Ргепіісе-НаІІ Іпс., Еп^ієлуоосі СІіГГз, 1983. — 285 р.
254. Нагуат ¥. Ап ітргоуесі тссііит Гог ^гоуЛЬ оГ ікс огскісіз Сургіредіит
геуіпае ахепісаііу // СаІІ. Л. Воі. — 1983. — 60. — Р. 2547—2555.
255. Нааераууа Р.М. Еасіогз аГГесііп^ зкооі апсі гооі іпіііаііоп Ггот сиі-
іигесі го8е зкооі іірз 11 Л. Атег. 8ос. НоП. 8сі. — 1980. — 105, N 2. — Р. 216—
220.
256. Нааерахуа А. Оссиггепсе оГ уагіецаііоп іп ікс зкооі оГ уапс^аіссі Сут-
Ьідіит тиііірііед Ьу зіюоі іір сиііиге // Асіа НоП. — 1991. — 300, N 3. —
Р. 353-356.
257. Неііег В. Кссіїсгскез оп тіпегаї пиігіііоп оГ ріапі ііззисз // Апп. 8сі.
N31. Воі, Віоі. Уе8., 11"’ 8ег. - 1953. - 14. - Р. 1-23.
258. Неііег А. Ьез Ьезоіпз тіпегаих без ііззиз еп сикиге // Еа Ркузіоіо^іе
сіез Сикигез сіє Тіззиз Уе^еіаих. — 1955. — Р. 1—21.
259. Неііег В., СаиіИегеі К.Р. 8иг 1'етріоі сіє раріег Гікге запз сепсігсз
соттез зирроп роиг Ісз сикигсз сіє ііззиз уе^еіаих // Сотрі. Репсі. 8еапсе 8ос.
ВіоІ. - 1949. - 143. - Р. 335-337.
260. Нетрегі М., Реггох-ІУіікоюхка В., Туто^ик І. Тке іпГІиепсе оГ суіокі-
піпз оп тикіГісаііоп апсі зиЬзедиспі гооііп^ оГ ОегЬега іп уііго // ІЬісІ. — 1985. —
165. - Р. 301-305.
261. Нетреї М. Місгосотриіегз іп тісгорора§аііоп 11 Асіа Ноп. — 1988. —
226. - Р. 699-702.
262. Непгу ¥., де Виу.\ег Р. Еіоаі сикиге оГ у/ксаі апікегз 11 Ткеог., Аррі.
Оепеі. - 1981. - 60. — Р. 77-79.
263. Непгу С., де Виухег У. ХУкеаі апікег сикиге: А^гопотіс регГогтапсе оГ
сіоикіесі каріоісі Ііпез апсі іке геїеазе оГ а пе\у уагіеіу “Еіогіп” // Віоіескпоіо^у
іп А^гісикиге апсі Еогезігу І Есі. Ьу У.Р.8. Ва]а|. — ХУкеаі, Вегііп, Неіс1е1Ьег£:
8ргіп8ег-Уег1а8, 1990. - Уоі. 13. - Р. 285-352.
264. Неркег А., Воиііег М.Е., НаггЕ N.. Иекоп В.8. Веусіортспі оГ а зиреп
ГісіаІ тсгізіет сіигіп^ зотаііс стЬгуоцспсзіз Ггот іттаіиге соіуіесіопз оГ зоу-
Ьеап {Сіусіпе тах. Е.) // Апп. Воі. — 1988. — 62. — Р. 513—519.
265. Неухег УЖ, Оуке8 Т.А., Петоіі К.Р., НаЬога МЛУ. Ні^к Ггедиепсу,
Іоп^-іегт ге^епегаііоп оГ гісе Ггот саііиз сикиге 11 Ріапі 8сі. Ееіі. — 1983. —
29. - Р. 175-182.
266. Неухег У.Ж, ИаЬогч МЛУ. Ьоп^-ісгт ріапі ге^епегаііоп, зотаііс етЬ-
гуо§епе8Із апсі егееп зрої Гогтаііоп іп зесопсіагу оаі (Ауепа хоііуа) саііиз //
X. РГІапхепркузіоІ. — 1982. — 107. — 8. 153—160.
267. НЕарта 8. Миіііріе зкооі Гогтаііоп Ггот уагіоиз кіпеїз оГ ріапі зеесіз //
Ріапі РкузіоІ. — 1981. — 67. — Р. 147.
268. Нізаііта 8. Місгоріапі ргора^аііоп ікгоїщк тикіріе зкооі Гогтаііоп
Ггот зеесіз апсі етЬгуопз // Ріапі Тіззие Сикиге І Есі. Ьу А. Ец)і\уага. — Токуо,
1982. - Р. 141-142.
256
Список літератури
269. Ноги Ж. 8сМе£еІ Є., Наи/і В. Іп уііго хіоск ріапі сикиге оґ Каїапсіюе
куЬгісІв 11 Асіа Ноп. — 1988. — 226. — Р. 627—630.
270. Нохокі Т., А.чакіга Т. Іп уііго ргораваііоп оґ Ьгопіеііасіх іп Іідиісі сикиге 11
ІЬісІ. - 1980. - 15, N 5. - Р. 603-604.
271. Н&и І.-С. Тіввие сиііиге гссИпідие сісусіорсп Гог аврага^ив ргораваііоп //
Ноп8сіепсе. — 1977. — 12, N 2. — Р. 140—142.
272. Ни Н. Іп уііго іпсіисесі Ьаріоісів іп у/ііеаі // Іп уііго Наріоісі Ргосіисііоп
іп Нщкег Ріапів І Есі. Ьу 8.М. Іаіп, 8.К. 8орогу, К.Е. Уеіііеих. — Оогсігескі:
Кіисусг Асасі. риЬІ., 1996. — УоІ. 4. — Р. 73—97.
273. Ни Т., Кахка К.Е. Ітргоуетепі оґ івоіаіссі тісговроге сикиге оґ у/ЬсаІ
(Тгііісит аехііуит Е.) іЬгои^к оуагу со-сиїїиге 11 Ріапі СеІІ НероПз. — 1997. —
16, N 8. - Р. 520—525.
274. Ниап& Ь.-С. Акетаїіуе тесііа апсі тсіЬосІ Гог Саіііеуа ргораваііоп Ьу
Ііввис сикиге // Атег. Огскісі. 8ес. Виїї. — 1984. — 53. — Р. 167—170.
275. Ниуііех К.ІР. Отатепіаі врссісв 11 Сіопіпц а^гісикигаї ріапів уіа іп
уііго Іескпідиев І Есі. Ьу В.У. Соп^ег. — Еіогісіа: СВС Ргевв, Воса Каїіоп, 1981. —
Р. 5-50.
276. Нихаеу С. Іп уііго ргораваііоп оґ СІаВіоіих Ьу ргссосіоив ахіїїагу вкооі
Гогтаїіоп // 8сі. Ноп. — 1977. — 6, N 4. — Р. 287—296.
277. Нияеу С. Іп уііго ргораваііоп оґ Нагсізхих // Апп. Воі. — 1982. — 49,
N 5. - Р. 707-719.
278. Нимеу С., ЕаіаЬіупа А. Огі^іп апсі ргосіисііоп оГ іп уііго асіуепііііоив
вкосів іп Іке опіоп АПіит сера Ь. 11 3. Ехр. Воі. — 1980. — 31, N 125. —
Р. 1675-1686.
279. Ниххеу С., Сипп Н.У. Ріапі ргосіисііоп іп реа (Ріхит хаііуит Ь. сув.
Ри^еі апсі Ііріоп) Ггот 1оп§ Іегт саіісв хуіік вирегґісіаі тегівіетв 11 Ріапі 8сі.
Ееіі. - 1984. — 37. — Р. 143—148.
280. Іттопеп 8., Апііііа Н. Соїсі ргеїгеаїтепі Іо епкапсе §гееп ріапі ге^е-
пегаїіоп Ггот гуе апіЬег сикиге // Ріапі СеІІ Тівв. Ог§ап. Сик. — 1999. — 57. —
Р. 121-127.
281. Іуапіска Ргєіоуо А. Скеггу (Ргипих ауіит Ь.) // Віогескпоіо^у іп
А^гісикиге апсі Еогсвігу І Есі. Ьу У.Р.8. Ва]ау — Вегііп еіс.: 8ргіп8ег-Уег1а§,
1986. - Р. 316-320.
282. ІасоЬх С., Влскагсі М., АІІВегтап Ь., Пегоп К. Бігесі апсі іпсіігесі ог&а-
по^спсвів іп Ііввис сикигев оґ Негіпе Ьокіїегіі XV /1 Асіа НоП. — 1992. — 325. —
Р. 475-480.
283. Іесіте А., Вескег В., Вгеііхсіїпеісіег В.., Соегт. Н. Ке^епегаїіоп оґ Ігапв-
£спіс, тісгозроге-сіегіуесі, ГеПіІе Ьагіеу // ТЬеог. апсі Аррі. Оепеї. — 1994. — 59. —
Р. 525-533.
284. Іаесіїпе А., коегт. Н. Сегеаі тісговроге сикиге // Ріапі 8сі. — 1995. —
109, N 1. - Р. 1-12.
285. Іатек В.І. Асіуєпііііоіів гооі Гогтаїіоп іп уііго іп арріе гооівіоск (Маїих
ритіїа) // Ркувіок Ріапі. - 1983. - 57, N 2. - Р. 149-158.
286. Іатех В.Н ТЬе гоїе оґ аихіпв апсі ркіого^іисіпої іп асіуспікіоив гооі
Гогтаїіоп іп Диких апсі Ргарагіа его\уп іп уііго і і Л. Ноп. 8сі. — 1979. — 54,
N 3. - Р. 273-277.
287. Лтех В.І., Раххеу А.Е. ЕахіегЬгоок М.А. еі аі. Рго^гез іп іке іпігосіис-
Ііоп оГ 1гап8£епек Гог реві гехіхіапсе іп арріе апсі вігасуЬеггіев // Ркуіорагазіїіса. —
1992. - 20. - Р. 83-87.
17-6-83
257
Список літератури
288. Лтех І).3., Рамеу А.І., Риріпі Е. Еасіогв аГГесііп^ Ьіцк ігедиепсу ріапі
гецепсгаїіоп Ггот арріе ІеаГ ііввисв сикигесі іп уііго // Л. Ріапі РЬувіоІ. — 1988. —
132. - Р. 148-154.
289. .Іапр НЛ., Есіітісіі Н. ЕіпПивв уєгвсЬієсіспсг Аихіпе аиГ сііс іп уііго Всу/-
ууехеїипе уоп ЗиввкіівсЬспвогГсп (Ргипиь ауіит Е.) // ОаПепЬаисуіввепвскаГі. —
1994. - 59, N 1.- 8. 45-47.
290. Іагх’Е В.С. Епсіоцепоив сопігої оГ асіуспікіоив іп поп — у/оосіу сиі-
Ііп^.в // N0^' гооі Еогтаїіоп іп Ріапі апсі сигііп^в / Есі. Ьу М.В. Ласквоп. —
Навие: М. МііІюГГ РиЬІ., 1986. - Р. 191-222.
291. ЛИпіоп В. В. Іп уііго ргора^аііоп оГ Сіохіпіа Ггот ІеаГ ехріапів // Ногі.
8сі. - 1978. - 13, N 2. - Р. 149-150.
292. .Іопеа О.Р. Ргорацаїіоп іп уііго оГ арріе Ігеев апсі оіЬсг у/оосіу Ггиіі
ріапів: теїіюсів апсі арріісаііопв // 8сі. Ногі. — 1979. — ЗО, N 1. — Р. 44—48.
293. .Іопех О.Р., НоррооВ М.Е. ТЬе виссеввГиІ ргора§аІіоп іп уііго оГ іу/о
гооівіоскв оГ Ргшши'. ІІіс ріит гооівіоск Ріху (Р. іпвііііа) апсі іЬе сЬеггу гооівіоск
Е. 12/1 (Р. ауіит) // Л. НоП. 8сі. - 1979. - 54, N 1. - Р. 63-66.
294. І. В., МигсіхИіре Т. Тіввие сиііиге ргора^аііоп АесИтеа /ахсіаіа
Вакег апсі оіЬег ВготеїіаіЕ 11 СотЬ. Ргос. Іпі. Ріапі Ргор. 8ос. — 1974. — 24. —
Р. 117-126.
295. Уоле5 О.Р., їїттегтап В.Н., ЕогсІІіат І.М., Норроосі М.Е. Ргора§аІіоп іп
уііго оГ воте сіу/агк арріе Ігеев 11 Л. Ногі. 8сі. — 1985. — 60, N 2. — Р. 141—144.
296. Іоиаппеаи -І.Р. Ргоіеіп вупіЬсвів гедиігетепі Гог іЬе суіокіпіп еГГесІ
ироп ІоЬассо сеіі сііуізіоп // Ехр. Сеіі. Ксв. — 1975. — 91. — Р. 184—190.
297. Катасіа Н., Нагасіа Н. 8іис1ісв оп ІЬе ог£апо£епевів іп саггої Ііввие
сикигев. 2. ЕГГесІв оГ атіпо асісів апсі іпог^апіс пііго^епоив сотроипсів оп во-
таїіс етЬгуоцепевів // X. РГІапгепркувіоІ. — 1979. — 91. — 8. 453—463.
298. Као К.і\!., Міскауіик М.В. N11111110(1^1 гсс]иігетсп(в Гог цгоуЛЬ оГ Уісіа
ксуахіапа ссіїв апсі ргоіоріавів аі а уегу іоу/ рориіаііоп сіепвіїу іп 1іс]іііс1 тесііа 11
Ріапіа. — 1975. — 126. — 8. 105—110.
299. Кагіїїа К.К., СатЬогр О.І., СопхіаЬеІ Е. Кееепегаїіоп оГ реа (Рівит ва-
Ііуит) ріапів Ггот віюоі арісаі тсгівіств// 2. РПапгепрІїувіоІ. — 1974. — 77. —
8. 292-301.
300. Кеші К., ЕаЬкагкаї Р.8. Могріїо^епсііс віисііев оп НакогіМа. ЕГГесІв оГ
іповіїоі оп цгоу/ііі апсі сііГГегепІіаІіоп // Атег. Л. Воі. — 1975. — 62. — Р. 655—
659.
301. Кауі КЕИог Р.В., МесИіа А. В. 8оте аврссів оГ сагЬокусІгаІс тсіЬаЬо-
Іівт іп огоап-сІіГГсгспІіаІіпй ІоЬассо апсі поп-сІіГГегеІіаІіп^ соїіоп саііив сикигев //
Ріапі Тіввие Сикиге І Есі. Ьу А. Еіщіу/ага. — Токуо, 1982. — Р. 143—144.
302. КегЬапу С.В. Іп уііго Гіоіуєгіп^ оГ Опсісііит уагісохит тегісіопсв (Ог-
сИМасеае) // Ріапі 8сі. Ееіі. — 1984. — 85, N 1. — Р. 73—75.
303. Кєуєгз С., Єазраг П., Репеї С., Сгерріп Н. Аихіп-роіуатіпе іпіегасііоп
хуііИ ІЬе саісіит-сопігоііесі вссгсііоп оГ рсгохісіаве Ьу віщаг Ьееі ссіїв // Ріапі
Сеіі Керопв. - 1985. - 4. - Р. 120-122.
304. Кіпр С.І. 8іис1іе8 оп Іііе ^гохуіИ іп сикиге оГ ріапі сеіів, ^гоіуіИ Іітіїа-
Ііоп Ьу піїгаїе апсі рисове іп а сЬетовІаІ сиііиге оГ Асег р.\еисІорІаіапих // Л. Ехр.
Воі. - 1977. - 28. - Р. 142-155.
305. КігЬу Е.С., Ееихіек Т., Еее М.Е. Ь'ііюйсп пиігіїіоп // Тіввие Сикиге іп
Еогевігу І Есі. Ьу Л.М. Воп^а, В.І. Оигхап. — ОогсігесЬі еіс.: М. ТЧукоГ РиЬІ.,
1987. - Р. 67-88.
258
Список літератури
306. Кпшіхоп £. А псу.' пиігіспі зоїиііоп Гог (Не еегтіпаїіоп оГ огскісі зессі //
Атег. Огскісі 8ос. Виїї. — 1946. — 15. — Р. 214—217.
307. Копсігаіепко О. V., Міїго/апоуа І. V. Ееаіигез оГ тіпіаіиге гозсз сіопаї
тісгоргораеаііоп // Віоісскпоіоцу Арргоаскез Гог Ехріоііаііоп апсі Ргезсгуаііоп
оГ Ріапі Кезоигссз. — ¥ака, 2002. — Р. 34.
308. Кготег К., Какаїс^апка К. Іп уііго сикигез оГ тсгізіст іірз оГ Саппа
іпсііса 11 Асіа Ноп. - 1985. - 167. - Р. 279-285.
309. Ки М.К., СИепр УУ.О., Кио С.Е. еі аі. Іпсіисіюп Гасіогз апсі тогрко —
сієгіуєсі ріапіз оГ таіге (7еа таух Ь.) // Ргос. 8утр. Ріапі Тіззие Сикиге: 8іепсе
Ргезз. - Рекіпв, 1978. - Р. 18.'
310. Китаг Р.Р., Реісі В.М., Тіюгре ТА. ЕіИуІепе апсі сагЬоп сііохісіе ассити-
Іаііоп апсі тогріто^епезіз іп схсізсгі соїуіссіопз оГ Ріпах гасііаіа // АЬзІгасІз VI Іпі.
Соп^. Ріапі Тіззие апсі Сеіі Сикиге. — Міппеароііз, Міпп, 1986. — Р. 11.
311. Китаг Р.Р., Кеісі й.М., ТЬогре Т.А. ТІїе гоїе оГ еіИуІспс апсі сагЬоп
сііохісіе іп сІіГГегепІіаІіоп оГ зкооі Ьисіз іп ехсізсгі соїуіссіопз оГ Ріпах гаВіаІа іп
уііго 11 Ркузіоі. Ріапі. — 1987. — 69. — Р. 244—252.
312. Киппетап В., АІЬогх М. Еіпсіеп Ігеез (Тіїіа 8рр.) // ВіоІесИпоІо^у іп
А^гісикиге апсі Еоге8ігу / Есі. Ьу У.Р.8. Ва]а]. — Вегііп еіс.: 8ргіп£ег-Уег1а£,
1991. - Уоі. 3. - Р. 152-163.
313. Киппетап В., АІЬогх М. Сутпозрегт Тгее8 // ВіоІссЬпоІоцу іп Л^гі-
сикиге апсі Еогезігу / Есі. Ьу У.Р.8. Ва]а). — Вегііп еіс.: 8ргіпцсг-Усг1а£, 1991. —
Уоі. 3. - Р. 241-491.
314. Капт. С., Іхіат М.8., ВегЬегаі І. еі аі. Аззеззтепі апсі ітргоуетепі оГ
у/ЬсаІ тісгозроге сісгіуссі етгуо іпсіисііоп апсі ге^епегаїіоп // 3. Ріапі Ркузіоі. —
2000. - 156. - Р. 190-196.
315. Ьаіпе Е., І)ауіс! А. 8ота1іс етЬгуоцепсзіз іп іттаїиге етЬгуоз апсі
ргоіоріазіз оГ Ріпи8 сагіЬеа// Ріапі 8сі. — 1990. — 69. — Р. 215—224.
316. Ьа Виє Т.А.С., СатЬог& О.Е. Еікуіепе ргосіисііоп Ьу ріапі сеіі сикигез.
Уагіаііопз іп ргосіисііоп сішіп^ §го\уіп8 сусіе апсі іп сІіГГсгспі ріапі зресіез //
Ріапі Ркузіоі. — 1971. - 48. - Р. 394-398.
317. ЬаІіЬегіе 8., СНгеіїеп /., УіеіИ І. Іп уііго ріапііеі ргосіисііоп Ггот уоипц
саріїиіит ехріапіз оГ СегЬега /атехопіі // Ноп. 8сі. — 1985. — 20, N 1. —
Р. 137-139.
318. Еапе Ж 7). Кс^епегаїіоп оГ арріе ріапіз Ггот зкооі тегізіет Іірз //
Ріапі 8сі. Ьеіі. - 1978. - 13, N 3. - Р. 281-285.
319. Еапе ГРО. Кееепегаїіоп оГ реаг ріапіз Ггот зкооі тегізіет Іірз // ІЬісІ. —
16, N 2/3. - Р. 337-342.
320. Ьаиегі Р.А., НіїсІеЬгапсІ І).Е., 8апера І. еі аі. 8оуЬеап зотаїіс етЬгуо-
еепезіз: іпіегасііопз ЬсІУ/ееп зисгозе апсі аихіп // Ріапі Сеіі Керопз. — 1988. —
7. - Р. 517-520.
321. кее Е.С.М., Ве Гоххагсі В. А. Ке^епегаїіоп оГ зігадакепу ріапіз Ггот
Ііззие сикигез // К’су/ Ркуіоі. — 1974. — 73. — Р. 707—717.
322. Ьеугапсі В. Асііоп оГ ігоп апсі ЕВТА оп іке пеоГогтаїіоп оГ Ьисіз Ьу
Іке ІеаГ Гга^тепіз оГ спсііус сикіуаіед іп уііго // Сотрі. Репсі. Асасі. 8сі. Рагіз. —
1975. — 280. — Р. 2215—2218.
323. ИпВетап Е.С.Р., Сипкеї І.Е., Вауідхоп О.\У. Мегізіет сикиге оГ Саі-
Пеуа 11 Атег. Огскісі 8ос. Виїї. - 1970. - 39. - Р. 1002-1004.
324. Ипхтауег Е.М., 8коор Е. Ог^апіс вгоіУІк Гасіог гедиігетепіз оГ ІоЬассо
ііззис сикигез // Ркузіоі. Ріапі. — 1965. — 18. — Р. 100—127.
17*
259
Список літератури
325. Попакіх 8.М., 7ігагі А. ТИе сГГесі оГ кі псі оґ ехріапі апсі оґ сіїііііпц рге-
ігсаїтспі оґ ріапі таїегіаі оп акооі ргоііґегаїіоп оґ кіи/і Ггиіі іп уііго // Асіа
Ноп. - 1991. - 297. - Р. 205-210.
326. іліхау І.Б., Зокпаоп М.А., Уегта Б. еі аі. Сопіґег хиарспаіоп сикиге
тесііит сісуеіортепі иаіп^ апаїуіісаі сіаіа Ггот сісуеіоріп^ пеесПеаа 11 ІРС Теск-
пісаі рарег асгіса. — 1981. — N 115.
327. ковких Р.А., коеких М. Ж. Муо-іпоакої: Ьіскупікеаіа апсі теїаЬоІікт //
ТИе Віоскетіаігу оґ Ріапів / Есі. Ьу Р. 8іитрГ, V. Сопп. — Кесу ¥огк: Асасі.
Ргсав, 1980. - УоІ. 3. - Р. 43-76.
328. китхтіеп Р.У., Ргусе 8., кеі/егі С. ЕГГесІ оґ тіпегаї пиігіїіоп оп Іке
^госуік апсі тиіііріісаііоп оґ іп уііго сиііигесі ріапів // Рго^гсаа іп Ріапі Сеііиіаг
апсі Моїесиїаг Віоіо^у / Есі. Ьу Н. Гіукатр. — Атвіегсіат: Кіисуег Асасі. РиЬІ.,
1990. - Р. 108-113.
329. Масіеап N.1., Мокак КЛ. Ріапі ге^епегаїіоп Ггот куросоїуі апсі
реііоіе саііиа оґ Тгі/оііит ргаіепхе Е. // Ріапі СеІІ ВсроПк. — 1989. — 8. —
Р. 395-398.
330. Марех М.О. Тіааис сиііиге оґ Ьготеїіасіз // Ргос. І пі. Ріапі 8ос. —
1973. - 27. - Р. 47-55.
331. Магната ,к, кеусіескег М.Т. НіГГсгепів Іурс.ч сГогоапо^сп&с оЬасгУса
скег 1е Соїга, Вгаххіса парих Ь. уаг. оіеі/ега Меіге 11 Сотрі. Вепсі. Асасі. 8сі.
Рагів. - 1978. - 287. - Р. 17-20.
332. Магіп БА., Сеііа Я. 8оиг скеггу (Ргипих сегахих к.) І І Віоіескпоіо^у іп
А§гіси11иге апсі Еогсаігу / Есі. Ьу У.Р.8. Ва]а]. — Вегііп еіс.: 8ріїП£ЄГ-Уег1ац,
1991. - УоІ. 1. - Р. 23-43.
333. Магіпо 6., Ваіііхііпі 8. ЕеаГ — саііив згосуік, акооі §епегаІіоп апсі ао-
тасіопаі уагіаііоп іп Асїіпісііа Веіісіоха: ЕГГесІ оґ тесііа рН // Асіа Ноп. —
1990. - 280. - Р. 37-44.
334. Магкх Т.К. Вкосіосіспсігоп сиіГіпцз (І) Ітргоуссі гооііпв Гоііосуіпє ге-
діуепаїіоп іп уііго // 3. НоП. 8сі. — 1991. — 66. — Р. 103—111.
335. Магкх Т.К. Вкосіосіспсігоп сиіііп^к (II) Еасіогв аґґесІіп§ гооііпц Гої-
іосуіпц тісгоргорацаїіоп // ІЬісІ. — Р. 113—118.
336. Магііп-Тап^иу Б, МаПіп С., Раупоі М., Роххіп N. ЕГГесІ оґ когтопе
Ігеаїтепі оп егосуік апсі Ьисі Гогтаїіоп апсі Ггее атіпе апсі кусігохусіппатоуі
риігезсіпс ісуєів іп Іеаґ ехріапі оґ Р’ісоііапа іаЬасит сиіііуаіесі іп уііго // Ріапі
Ркувіоі. - 1998. - 88. - Р. 600-604.
337. Магііпеїіі І., Вгауа^па В., Роїеііі V., 8сіеп^а А. 8ота1іс етЬгуо£спеаіа
Ггот Іеаґ апсі рсііоіе-сіегіуссі саііиа оГ Уіііх гирехігіх // Ріапі СеІІ ВероПз. —
1993. — 12, N 4. - Р. 207-210.
338. Махіїкіпа О.8., ТаЬаіхкауа Т.М., ХетІіапиШпа О.А., Іхакоу ¥и.М. Нас
оґ іп уііго 1ескпо1о§у Гог сПаЬІіактепІ оґ Кагеїіап Ьігск ріапіаііопа // Віоіеск-
поіову Арргоаскеа Гог Ехріоііаііоп апсі Ргеаегуаііоп оґ Ріапі Всхоигсса. — Уаііа,
2002. — Р. 36—37.
339. Махо/с Р., Хикок О.М., МсКепгіе Р.Р.Н , Нотхех ІЇ.К. Всароп.чуспсаз Ю
апікег сикиге іп сикіуага апсі Е, сгоааса оГ аргіп^ сукеаі // Сап. 1. Ріапі. 8сі. —
1993. - 73. - Р. 777-783.
340. Маікеу.’Х У., Вапуап Т. Огосуік апсі гевепегаїіоп оГ ріапііеіа іп саііих
сикигеа оґ ріпеарріе // 8сі. Ноп. — 1981. — 14, N 3. — Р. 227—234.
341. Маікетух У., Као Р. Іп уііго тиіііріісаііоп оґ Уапсіа куЬгісІв Іктои^к
Ііааие сикиге іескпідие // Ріапі 8сі. Ьеіі. — 1980. — 17. — Р. 383—389.
260
Список літератури
342. МсСаіи Е. і¥., Като К.К., Но(І£Є$ Т.К. Скагасісгіхаїіоп оґ вотаїіс
етЬгуо сісуеіортепі апсі ріапі гееепегаїіоп Ггот ГгіаЬІс таіге саіііів сикигев 11
Воі. Оаг. - 1988. - 149. - Р. 16-20.
343. МсСІеЧапіі М.Т., 8тііІг М.А.Е Уеввеї Іуре, сіовиге апсі ехріапі огіепіа-
Ііоп іпПиспсс іп уііго регґогтапсе оґ Гіус у/оосіу врссіев // Ноп8сіепсе. — 1990. —
25. - Р. 797-800.
344. МсСоюп В.Н., ІЕоусІ С.В. ХУоосіу ріапі тебіит (\¥Р14) — а тіпегаї
пиігіепі Гогтиіаііоп Гог тісгосиїїиге оґ у/оосіу ріапі вресісв // ІЬісІ. — 1981. —
16. - Р. 453.
345. МсСои/п В.Н., ЬІоуВ С.В. А виг/еу оґ Іке гевропве оґ гкосіосіепсігоп Іо
іп уііго сикиге // Ріапі Сеіі Тівв. Ог^ап Сиіі. — 1983. — 2. — Р. 77—85.
346. Меі В.Е., Аі Н. ТИс гарісі ргора^аііоп оґ Веуопіа тахопіапа іп уііго //
Ріапі Ркувіоі. Сот. — 1987. — N 3. — Р. 27—30.
347. Меіе Е., Меххераег Е., СатргиЬі Р. ЕГГесІ оґ еікуіепе оп сагпаїіоп ехр-
Іапів £гоу/п іп зеаіесі уеввеїв // Ріапі Тіввие сикиге / Есі. Ьу А. Еіуіу/ага. —
Токуо, 1982. - Р. 69-70.
348. Мепуеі К., КігкЬу Е.А. Ргіпсіріез оґ ріапі пиігіїіоп. — Згсі есі. — Вегп,
8\УІІгег1апс1: Іпіегпаї Роїавк Іпвіііиіе, 1982. — 420 р.
349. Меуег М.М. Іп уііго ргора§аІіоп оґ Віїосіосіепсігоп саіаиЖіепсе Ггот
ґіодаег Ьисів // Ногі8сіепсе. — 1982. — 17, N 5. — Р. 891—892.
350. МіЧегА.В. Сгаху/огсі О. І., КоЬегіх Е.ІУ. Еі^піГісаІіоп апсі хуіо^спсвів іп
Ьасіиса рііЬ ехріапів сикигесі іп уііго іп Іке ргсвепсс оґ аихіп апсі суіокіпіп: а
гоїе Гог спсіо^споив еікуіепе 111. Ехр. Воі. — 1985. — 36. — Р. ПО—118.
351. МіЧег С.А., Сохіоп О.С., Беппу Е.С., Вотео М.Е. Іп уііго ргора^аііоп
оґ “Пста^иагсі” реаск гооівіоск І І НоП. 8сі. — 1982. — 17, N 2. — Р. 194—195.
352. Міііег Ь.К., МигахЧіре Т. Тіввие сикиге ргора^аііоп оґ Ігорісаі Гоїіа^е
ріапів // Іп уііго. — 1976. — 12. — Р. 797—813.
353. Мііга С.8., РгахаЧ В.К, ВоусіюмсЧїигу А. Іпог^апіс ваіів апсі біГГегеп-
Ііаііоп оґ ргоіосогтв іп веесі — саііив оГ ап огскісі апсі соггеїаіесі скап^ев іп іів
Ггее атіпо асісі сопіепі // Іпсі. 1. Ехр. Віоі. — 1976. — 14. — Р. 350—351.
354. МоИапіу В., Гіеіскег 1.8. Аттопіит іпГІиепсе оп піїго^еп аввіті1а1іп§
епгутев апсі ргоіеіп асситиіаііоп іп виврепвіоп сикигев оГ РаиГв 8саг1еі гове //
Ркувіоі. Ріапі. - 1980. - 48. - Р. 453- -459.
355. Мопеііе Р.Ь. Місгоргора^аііоп оґ кіхуі Ггиіі ивіпц поп-ахепіс вкосі Іірв //
Ріапі Сеіі, Тіввие апсі Оі£ап Сикиге. — 1986. — 6, N 1. — Р. 73—82.
356. Мооге Н.М., Нігхсії А.М. ПИА вупікевів апсі тковів іп Ьогоп-сІсГісіспІ
апсі сопігої випГ1о\Уег гооі Іірв // Ріапі Ркувіоі. — 1981. — 67, виррі. — Р. 12
(АЬвІ. 66).
357. Могеї С. Сіопаї ргора^аііоп оГ огскісів Ьу тегівіет сикиге 11 СутЬ.
8ос. ІЧесув. - 1965. - 20, N 7. - Р. 3-11.
358. Могеї С.М. Сіопаї тикіріісаііоп оґ огкісів // ТЬе Огскісів: 8сіепІіГіс
8іискев І Есі. Ьу С.Е. ХУіІкпег, Л. \¥і1еу. — Псу.' ¥огк; Еопсіоп, 1974. — Р. 169—
222.
359. Могеї С., ІУеітоге В.Н. Тіввие сикиге оГ топосоїуіесіопв // Атег. 1.
Всі. — 1951. — 38. — Р. 138—140.
360. Моіі В.І.., Согсііх ЕМ., Ьагхоп А.М. Піїгсщеп апсі §го\УІк ге^иіаіог еґ-
Гесі оп вкосі апсі гооі §го\у1к оґ воуЬеап іп уііго // Тіввие Сикиге іп Еогевігу апсі
А^гісикиге / ЕсЗ. Ьу У.Р.8. Ва)ар — Ие\у ¥огк, Еопсіоп: Ріепит Ргевв, 1985. —
Р. 336-337.
261
Список літератури
361. Микити! 8., КоЬаскег С., 8ке\у/еІІ К Саки? апд ?и?реп?іоп сикиге? оГ
іотаіо Ггиіі? Гог ро?ікагуе?і ?іидіе? // Ноп. 8сі. — 1988. — 23. — Р. 754.
362. Мигахкіуе Т. Ріапі ргора^аііоп ііігоїщк іі??ие сикиге? 11 Апп. Кеу.
Ріапі. Рку?іо1. - 1974. - 25. - Р. 135-166.
363. Мигахкіре Т., А'акапо Е.Т Тке ІіцРп гедиігетепі Гог ?кооі іпіііаііоп іп
іоЬассо саки? сикиге 11 Атег. Л. Воі. — 1968. — 55. — Р. 710.
364. МигаМ^е Т., 8егра М., !опеа Р Сіопаї тикіріісаііоп оГ СіегЬега
ікгои^к іі??ие сикиге // Ноп. 8сі. — 1974. — 9, N 3. — Р. 175—180.
365. Мигазкі^е Т., 8каЬс!е М.А., Назе^ата Р.М. еі аі. Ргора^агіоп оГ а?рага§и?
іГігои^Іі ?кооі арех сикиге // Л. Атег. 8ос. Ноп. 8сі. — 1972. — 97. — Р. 158—161.
366. Мигазкще Т., 8коор р. А геуі?ед тссііит Гог гарісі §го\уік апд Ьіо-аз-
?ау? іуііЬ іоЬассо ііззис сикиге? // РЬузіоІ. Ріапі. — 1962. — 15. — Р. 473—497.
367. АаЬотз М. Ж, Неузег Р Ж, ІУукез Т.А., Моіі К.Р. Ьоп^-сіигаііоп, кіцк —
Ггедиепсу ріапі гееепегаііоп Ггот сегеаі іі??ие сикиге? // Ріапіа. — 1983. — 157. —
8. 385-391.
368. Іїадоізка-Огсгук А., Маїерхту 8. СиситЬег ріапі ге^епегаііоп Ггот ІеаГ
ехріапі? оГ ?е!есіед скагасіегі?ііс? // Виїї. Рої. Асад. 8сі. Віоі. 8сі. — 1984. —
32, N 11/12. - Р. 425-428.
369. Касеті 8., Ккозккап 8., А/.\кагі М. еі аі. 8отаііс етЬгуо§епе?і? іп сіаіе
раїт 11 8еед апд Ріапі. — 1993. — 8, N 3/4. — Р. 16—20.
370. Аетеїк С. Іпдисііоп оГ гооііпе І І Віоісскпооіо^у іп А^гісикиге апд
Роге?ігу / Ед. Ьу У.Р.8. Ва)а). — Вегііп еіс.: 8ргіп£сг-Усг1а£, 1986. — Р. 49—67.
371. ІУіїзск Р.Р., Аіізск С. Наріоід ріапі? Ггот роїіеп егаіп? // 8сіепсе. —
1969. - 163. - Р. 85-87.
372. кіоггіз КЕ., 8тіІк КН. Ке^епегаііоп оГуапс^аісд АГгісап уіоієі (8аіпІраиІіа
іопапіка ХУепдІ.) ІеаГ скітега? іп сикиге І І Ріапі РЬугіоІ. — 1981. — 67. — Р. 117.
373. А’огхіоу К. Іпдисііоп оГ аромату іп тс^а^атеІоркуГе? оГ Ьатіа іпіе^гі-
/оііа 11 Атег. Л. Воі. — 1965. — 52. — Р. 993—999.
374. Аогхіоц К., 8тііИ Р. Сикиге оГ ?та!1 Ьагіеу етЬгуо? оп деГіпед тедіа //
8сіепсе. — 1963. — 142. — Р. 1655—1656.
375. Ріоуак Р.Р., ІиЬоуа Ь. Сіопаї ргора^аііоп оГ ^гареуіпе ікгоїщк іп уііго
аихіїіагу Ьид сикиге // 8сі. НоП. — 1983. — 18, N 2. — Р. 231—240.
376. Аоуак ЕР., Реіги Е. Ті??ие сикиге ргора^аСіоп оГ Еіііит ЬуЬгід? // ІЬід. —
1981. - 14, N 2. - Р. 191-199.
377. Ока 8., Окуата К. МиЬЬеггіе? (Моги? аІЬа Ь.) 11 ВіоіесЬпоІоуу іп А%-
гісиїїиге апд Роге?ігу / Ед. Ьу У.Р.8. Ва]а). — Вегііп еіс.: 8рпп£сг-Уеі1а£, 1986. —
Р. 384-392.
378. Огзкіпзку В.К., 8аі!азіуаіак К8. ЕГГесі оГ тедіа оп етЬгуоід іпдисііоп
апд ріапі ге^епегаііоп Ггот сиііигед апікег? оГ ?оГі у/Нііс ?ргіп§ дакеаі? (Тгііісит
аезііуит Е.) // Ріапі 8сі. — 1994. — 102. — Р. 99—107.
379. Оітазккіпа А.У. Ехрегіепсе оГ іпдисііоп іпіо іп уііго сикіуаііоп оГ
РіюРосІепсІгоп ІеРекоигк Вгуак // ВіоіесЬпоІо^у АрргоасЬс? Гог Ехріоііаііоп апд
Рге?егуаііоп оГ Ріапі Ве?оигсе?. — ¥ака, 2002. — Р. 23.
380. Оиуапр .7. Ж, Ріа 8.6., Хкапу С. еі аі. А псу/ ?упіЬеііс тедіит (\¥ 14)
Гог у/Ьсаі апіЬег сикиге // Аппиаі Керогі Гог 1988, Іп?ікиіе оГ Оепеііс?. Веціпв:
Асадетіа 8іпіса, 1988. — Р. 91—92.
381. Раек К.¥., Кее Р. 8іидіе? оп іке сіопаї ргора^аііоп Ьу іке сикиге оГ
ЬиІЬ ?са1е ?евтепі?, іпГ1оге?сепсе ?іет? апд Гіодаег Ьид? іп Нуасіпік 11 Ріапі
Ті??ие Сик. — 1982. - N 6. — Р. 713-714.
262
Список літератури
382. Раіауап N.. Согеп Р., Саїхіоп А.8. ЕГГесіх оГ хоте цгоуЛИ гециіаіогх оп
роїуатіпе ЬіохупіЬеііс епгутех іп еііоіаіесі реа хеесіїіпцх // Ріапі СеІІ РЬухіоІ. —
1984. - 25. - Р. 541-546.
383. Раппеїіег С., Ви//агсі-МогеІ 7. Сосопиі раїт (Сосох писі/ога 1_.) // Віо-
іесЬпоІоцу іп Авгісикиге апсі Рогехігу / Есі. Ьу У.Р.8. Ва|а]. — Вегііп еіс.: 8ргіп-
Вег-Уег1а§, 1986. — Р. 430—450.
384. Раггоі Ж.Л., Вауіеу М.А. СЬагасіегігаііоп оГ гесиггепі хотаііс етЬгуо-
цспехіх оГ аІГака оп аихіп-Ггее тесііит // Ріапі СеІІ Тіхх. Огцап Сиіі. — 1993. —
32. - Р. 69-76.
385. Рахдиаіеііо Р.Ь., Хіттегтаіп Р.Н., Рогсікат Р. ТЬе іпПиепсе оГ саііоп
апсі 8ЄІ1ІП8 а§епі сопсепігаііопх оп УІігіГісаііоп оГ арріе сикіуагх іп уііго // Ріапі
СеІІ, Тіххие апсі Ог^ап Сикиге. — 1988. — 14. — Р. 31—40.
386. Раііпаі К.8.К., Скапе! Р.К. Карій сіопаї ргораваііоп оГ іЬгее тиІЬег-
гіех, Могих саікауапа, М. ікои апсі М. хеггаіа іЬгоицЬ іп уііго сикиге оГ арісаі
хЬооі Ьисіх апсі посіаі ехріапіх Ггот таіиге ігеех // Ріапі СеІІ Керогіх. — 1997. —
16, N 7. - Р. 503-508.
387. Раик Р., Маппіпеп О., Маііііа Р. еі аі. Лпсігоцспсхіх іп Ьехаріоісі у/Ьеаі
Р2 рориіаііопх апсі іЬеіг рагепіх ихіпц а тиіііріе-хіер гецепегаіюп хухіет // Ріапі
Вгеесі. - 1991. - 107. - Р. 18-27.
388. Раиі Р., Теискі Ж. Махх ргораваііоп оГ Ргипих сегахих апсі Ргипих ауі-
ит іп уііго // ОаПспЬаиу/екх. — 1985. — 50. — 8. 268—273.
389. Ресігохо С., Оііуеіга М., Раіх 8.8. Місгоргорацаііоп апсі хітикапеоих
гооііпв оГ Асііпісііа сіеіісіоха // Ногі. 8сі. — 1992. — ТІ. — Р. 443—445.
390. Реіоііпо Р., Ропех А. АпіЬег сикиге оГ еіііе цепоіурех оГ таіхе // Сгор
8сі. - 1986. - 26. - Р. 1072-1074.
391. Реуаіек-Котріпа В., Реіахка 8. Місгосіопаї ргора§аііоп оГ Ргипих ауіит
Ь. //Асіа Ногі. - 1987. - 212. - Р. 599-602.
392. Ркіїір У.Р., ІРаіпаг 8.А.7. Іп уііго ігапхГогтаііоп оГ гооі тегіхіет іо
хЬооі апсі ріапііеіх іп Уапіііа ріапі/оііа // Апп. Воі. — 1988. — 61, N 1. —
Р. 193-199.
393. Ркіііірх С.8., НиЬхіепЬег^ег Р.Р. Ог^апоцепехіх іп реррег ііххие сикигех //
Ріапі СеІІ, Тіххие апсі Ог^ап Сикиге. — 1985. — Р. 261—269.
394. Ріаупапі С., Есскег Т., Сахіеііі 8. Місгоргораваііоп оГ Асііпісііа скіпеп-
хіх: еГГесіх оГ цгоу/іЬ гевиїаіогх оп ргоІіГегаііоп гаіе // Асіа НоП. — 1986. — 2,
N 179. - Р. 887-890.
395. Ріегік Р.к.М. Апікигіит апсігеапит ріапііеіх ргосіисесі Ггот іп уііго сиі-
ііуаіесі саііих ііххиех // РЬухіоІ. Ріапі. — 1976. — 37, N 1. — Р. 80—82.
396. Ріегік Р.к.М. Місгоргора§аііоп оГ огпатепіаі ріапіх // Асіа НоП. —
1991. - 289, N 1. - Р. 45-53.
397. Ріегік Н.Ь.М., Ірреї В.Р. Ріапііеі Гогтаїіоп Ггот ехсіхесі ЬиІЬх хсаіе
хецтепіх оГ 8'егіпе // ІЬісІ. — 1977. — 78, N 2. — Р. 197—202.
398. Ріегік Р.Ь.М., Уап Ьееиууеп Р. апсі Ріуіег С.С. Ке^епегаііоп оГ ІеаГ ех-
ріапіх оГ Апікигіит апсігеапит Еіпсі. іп уііго // Ь’еіЬ. 1. Ацг. 8сі. — 1979. — 27,
N 3. - Р. 221-226.
399. Ріеігораоіо Р.А., Кеіхск В.Р. Місгоргорацаііоп оГ 8іап1у ріит // НоП.
8сі. - 1984. - 19, N 2. - Р. 535-536.
400. Роїассо Р.С. Ніігоцеп теіаЬоІіхт іп хоуЬеап ііххие сикиге. II ЕІгеа иі-
ііігаііоп апсі игеахе хупіЬехіх гедиіге ТЧІ2+ 11 Ріапі РЬухіоІ. — 1977. — 59. —
Р. 827—830.
263
Список літератури
401. РоЦакоуа £. Ж. ВіосЬетісаІ тагкег оГіЬе оак Іеауек (Оиегсих гоЬиг Ь.)
оп гекікіапі іо Місгохркаега атркіїоісіе.ч СгіГ. еі киііаЬІе Гог тісгосіопаї ргораца-
ііоп оГ 1—3 уеаг оісі кееГ1іп£8 // ВіоіесЬпоІову АрргоасЬек Гог Ехріоііаііоп апсі
Ргекегуаііоп оГ Ріапі Векоигсек. — Така, 2002. — Р. 15.
402. Роїаопі Ь. ТЬе іпсіисііоп оГ тісгокроге етЬіуо^епекік іп апіЬег сикиге
оГ оаік (Ауєпз ьаііуа Ь.)// М.8с. ТЬєкік, ІЬе ипіуегкіїу оГ СиеІГ, Сапасіа. — 1990. —
130 р.
403. Роркоча Ь.Ь. ВіоіесИпоІоцісаІ акресік оГ сиіііуаііоп оГ огпатепіаі Сгі-
теап кресіек оГ огсЬідк // ВіоіесЬпоІову АрргоасЬек Гог Ехріоііаііоп апсі Ргекег-
уаііоп оГ Ріапі Векоигсек. — Уаііа, 2002. — Р. 38.
404. Рон>1іп% А., Ниххеу С. ЕкІаЬІікЬтепІ оГ акерііс сиііигек оГ кицаг Ьееі //
Апп. Вер. Зокп Іппек. — 1981. — Р. 60.
405. Риоіітаїка М., Ьаіпе 8., Раик ]. ЕГГесІк оГ оуагу со — сиіііуаііоп апсі
сиііиге тесііит оп етЬгуоцспекік оГ сіігесіїу ікоіаіесі тісгокрогек оГ у/ЬеаІ // Се-
геаі Век. Сотт. — 1996. — 24, N 4. — Р. 393—400.
406. Риоіітаїка М., Раик Р. ЕГГесІ іпсіисііоп сіигаііоп апсі тесііит сотро-
кіііоп оп ріапі гевепегаїіоп іп у/Ьеаі (Тгііїсит аехііуит Е.) апіЬег сикиге //
3. Ріапі РЬукіоІ. - 2000. - 156, N 2. - Р. 197-203.
407. Риткаихег Ь, Месі^уеху Р., Сгако М. еі аі. Зіітиіаііоп оГ кЬооі геце-
пегаііоп іп Тгііїсит аехіїуит Ь., Мсоіїапа рІитЬа^іпі/оіїа іп Ііккие сикигек икіпц
іііе еіЬуІепе іпЬіЬііог А^ЬЮ, // Ріапі СеІІ Верогік. — 1987. — 6. — Р. 1—4.
408. ()иак Р. Мегікіет сикиге апсі уігик-Ггее ріапік // Ріапі СеІІ, Тікше апсі
Ог§ап Сикиге / Есі. Ьу С. Веіпегі, ¥.Р.8. Ваіа]. — 1977. — Р. 598—615.
409. ()иоігіп М., Ьероіуге Р. Ітргоуесі тесііа Гог іп уііго сикиге оГ Ргипик
кр. І І Асіа Ногі. - 1977. - 78. - Р. 437-442.
410. Расіріеміс Ь. Ногке СЬекпиі (Аексиїик крр.) // ВіоіесЬпоІоцу іп АегісиІ-
іиге апсі Рогекігу / Есі. Ьу ¥.Р8. Ва]а|. — Вегііп еіс.: Зргіпцег-Уегіац, 1991. —
УоІ 3. — Р. 111-141.
411. Кап^ап Т.8. СгоіуіЬ апсі ріапііеі гецепегаїіоп іп ііккие сикигек оГ коте
Іпсііап тіїїеік: Рахраіит хсгоЬісиїаІит Ь., Еіеияіпе согасапа Саегі., РеппЕеІит
Іуркоііїеит Регк. // X. РПапгепрЬукіоІ. — 1976. — 76. — 8. 208—216.
412. КаіахеЕігап К., Миіііпх М.С. Ог^апо^епекік іп іпіегпосіе ехріапік оГ
цгареуіпек // ¥ііік. — 1981. — 20, N 4. — 8. 218—227.
413. Капсіїїас М., Рауе М., Г)сіх>ісІ Л. Іп уііго гооііпв оГ сіопссі кЬооі іп Ріпих
ріпахіег // РЬукіоІ. Ріапі. — 1982. — 56, N 1. — Р. 97—101, 535—536.
414. Рапсіїїас М., Кііп^ег А., Кііп^ег 5. Ріапі ЬіоіссЬпоІоціск аррііесі іо а
Гогекі ігее, іЬе Атегісап гссі оак // Асіа Ногі. — 1991. — 289, N 3. — Р. 341 —
342.
415. Всю А.М. Тіккие сикиге іп іЬе огсЬісІ іпдикігу // Ріапі СеІІ, Тіккие апсі
Ощап Сикиге / Есі. 3. Веіпегі, ¥.Р.8. Ва]а]. — Вегііп еіс.: 8ргіпцег-Уег1а§, 1977. —
Р. 44-69.
416. Рсіуєп ЕА. ВіосЬетісаІ сіікрокаї оґ ехсекк Н+ іп цгоу/іпц ріапік? // Мс\у
РЬуіоІ. - 1986. - 104. - Р. 175-206.
417. Кесіка А., Аіііа Т., Виеіег В. еі аі. Ітргоуесі ргосіисііоп оГ сІоиЬІссІ
Ьаріоісік Ьу соїсЬісіпек арріісаііоп Іо суЬеаІ (Тгііїсит аехііуит Ь.) апіЬег сикиге //
Ріапі СеІІ Верогік. — 1998. — 17. — Р. 974—979.
418. Весіка А., АШа Т., Виеіег В. еі аі. 8іпв1е апсі сотЬіпесі еГГесік оГ соїсЬі-
сіпек, 1-рго1іпе апсі рокі-іпосиїаііоп іоіу іетрегаіиге оп апіЬег сикиге оГ суЬеаі,
Тгііїсит аехііуит Ь. // Ріапі Вгеесі. — 1998. — 117. — Р. 335—340.
264
Список літератури
419. Веіпегі 3. Ахресіх оГ ог§апігаііоп-ог§апо£епехіх апд етЬгуоцепехіх //
Ріапі Сеіі, Тіхзие апд Ог^ап Сикиге: Воіапісаі топо^гарк / Ед Ьу Н.Е. Зігееі. —
Охґогд: Віаскадеіі Зсі. РиЬІ., 1973. — Уоі. 11. — Р. 338—355.
420. Кеіпегі 3., Та^тш М., 8етепо// 8. І^кго^еп сотроипдх ах Гасіогх оГ
етЬгуоцепехіх іп уііго і і ІМаіиге. — 1967. — 216. — Р. 1215—1216.
421. Веіпегі 3., Мокг Н.С. Ргора^аііоп оГ Саіііеуа Ьу ііххие сикиге оГ Іаіегаї
Ьид тегіхіетх // Атег. Зос. Ногі. Зсі. — 1967. — 91. — Р. 667—671.
422. Пенсії В.З., Магіеп8 М.Н.В. Зкооі гецепегаііоп Ггот &гаре ІеаГ, реііоіе
апд іепдгії ііххиех // НопЗсіепсе. — 1982. — 2—3. — Р. 807.
423. Еетоііі Р.С., Во//ег Н.З.М. СаІІих іпдисііоп апд ріапі гсцспегаііоп Ггот
ціадіоіих // Ріапі Сеіі, Тіжие апд Ог^ап Сикиге. — 1995. — 42, N 2. — Р. 171—
178.
424. ВоЬЬ 8.М. Тке сикиге оГ ехсіхед ііххие Ггот ЬиІЬ хсаіех оГ ІЗІіит 8ресі-
08ит // 1. Ехр. Воі. — 1957. — 8, N 3. — Р. 348—352.
425. 8ауака ¥., Кипі8акі 3. Т. Сіопаї ргора§аііоп оГ огскідх Ьу ііххие сикиге //
Ріапі Тіжие Сикиге / Ед. Ьу А. Еиііуага. — Токуо: Лар. Аххос. Ріапі Тіххие
Сикиге, 1982. — Р. 683—684.
426. 8аипс!ег8 3. Ж., ВаиЬ М.Е. Зкооі гевепегаііоп Ггот когтопе-аиіопо-
тоих саііих апд адуепііііоих Ьидх іп хицаг Ьееі (ВеТа уиІ$агІ8 £.) // Ріапі Зсі.
Ьеп. - 1984. - 34. - Р. 219-223.
427. 8скепк В. і!., НіісІеЬтпсІ А.С. Медіит апд іескпідиех Гог іпдисііоп апд
цгоМк оГ топосоіуіедопоих апд дісоіуіедопоих ріапі сеІІ сикигех // Сап. 1.
Воі. — 1972. — 50. — Р. 199—204.
428. 8сиІіу Е.М. Зіет ргорацаііоп оГ РкаІепор8І811 Атег. Огскід Зос. Виїї. —
1966. - 35. - Р. 40-42.
429. 8каЬс!е М., Мигснкіуе Т. Ногтопаї гедиігетепіх оГ ехсіхед Оіапікім
сагуоркуііік Ь. хкооі арісаі тегіхіет іп уііго // Атег 1. Воі. — 1977. — 64. —
Р. 443-448.
430. 8капіі Е.М., 8>еіуагсІ Е.С. Сосопиі тіїк Гасіог: Тке цгоуЛіі рготоііпц
хиЬхіапсех іп сосопиі тіїк // Л. Атег. Скет. Зос. — 1952. — 74, N 23. —
Р. 6133-6135.
431. 8кагр Ж/?., Еуан8 й.А. Арріісаііопх оГ хотаііс етЬгуоцспсж іо сгор
ітргоуетепі // Ріапі Тіххие Сикиге / Ед. Ьу А. Ецііуага. — Токуо, 1982. —
Р. 759-762.
432. 8кагр IV. В., 8опс1акІ М.В., СаІскі8 Е8., Мага//а 8.В. Тке ркухіоіоцу оГ
іп уііго ахехиаі етЬгуоцепехіх І І Ногі. Кеу. — 1980. — 2. — Р. 268—310.
433. 8кеп Х.-8., МиПіп8 М.С. Ргорацаііоп іп уііго оГ реаг, Руги8 соттипІ8
Ь., сикіуаге ‘ХУіІІіат’х Воп Скгеііеп’, ‘Расккатх Тгіитрк’ апд ‘Веигге Вохс’//
Зсі. Ногі. — 23. — Р. 51-57.
434. 8коетакег В'.Р.. Вхуагіт. Н.З. Сикіуаг дерепдепі уагіаііоп іп раікоцеп
гехіхіапсе дие іо ііххие сикиге ргораааііоп оГ хіга\уЬеггіех // НопЗсіепсе. —
1985. - 20, N 2. - Р. 253-254.
435. 8іттоипсІ8 З.А. Іп уііго Гіоу/єгіпц оп ІеаГ ехріапіх оГ 8ігеріосагри8 іюкіІІ8 //
Сап. Л. Воі. - 1982. — 60, N 8. - Р. 1461-1468.
436. 8іттоипсІ8 З.А., Ситтіп& В.У. Рорацаііоп оГ Ьіііит куЬгіск // Зсі.
Ноп. - 1976. - 5. - Р. 161-170.
437. 8іттоипсІ8 З.А., іУеггу Т. Ьідиід хкаке сикиге Гог ітргоуед тісгорго-
раваііоп оГ Ве^опіа кіетаІІ8 // НопЗсіепсе. — 1987. — 22, N 1. — Р. 122—
124.
265
Список літератури
438. 5/ияй А.К., ЗИагта В.В., Рапсіеу Я.М. Карій іп уііго тикіріісаііоп оГ
Уіїії уіпі/ега £. іИгоицИ хЬооі іірх апсі посіаі хецтепіх // Асіа Ногі. — 1992. —
321, N 6. - Р. 601-605.
439. Зіп^к В. Іп уііго віайіоіих ргораваііоп Гог уігих еіітіпаііоп іЬгоицИ
ііххие сиііиге І І Іпй. Ркуіораікоі. — 1985. — 38, N 2. — Р. 375—377.
440. Зіпака 3. Реаг (Ругих соттипіх Ь.) 11 ВіоіесИпоІоцу іп А§гісикиге апсі
Рогехігу І Ей. ¥.Р.8. Ва)а). — Вегііп еіс.: Зргіпцег-Уегіа^, 1986. — Р. 198—206.
441. Зіпака 3., Вкаііа З.К. 8Ьооі ргоІіГегаііоп оГ реаг сикигех оп тейіит соп-
іаіпіпц іЬійіахигоп апй Ьепгуїатіпоригіп // Ногі8сіепсе. — 1988. — 23. — Р. 803.
442. Зкігуіп Я.М., СІш М.С. Іп уііго ргора§аііоп оГ гохе (Яоха куЬгісіа) //
ІЬій. - 1979. — 14, N 6. - Р. 667-672.
443. ЗкіУгіп Я.М., Коиісіег М., Роип$ Н., КогЬап 3.3. Арріе (Маїих Йотсхіі-
са Вогкії.) // Віоіескіпоіоцу іп Авгісиііиге апй Рогехігу І Ей. ¥.Р.8. Ваіа|. —
Вегііп еіс.: Зргіпцсг-Уегіац, 1986. — Р. 183—197.
444. Зкоо& Р., Міііег С.О. СЬетісаІ ге^шіаііоп оГ цгоу/іЬ апй ог^ап Гогтаїіоп іп
ріапі ііххиех сиііигей іп уііго // 8утр. 8ос. Ехр. Віоі. — 1961. — 11. — Р. 118—131.
445. Зкооз Р., МопіакН Е. Аихіп-кіпеііп іпіегасііоп ге^иіаііпц іііе хсороіеііп
апй хсороііп ієуєіх іп іоЬассо ііххие сиііигех // Ргос. №і. Асай. 8сі. ЕІ8А. —
1961. - 47. - Р. 36-49.
446. Зтіік Б. Я. Кайіаіа ріпе (Ріпих гайіаіа Ооп.) // Віоіесіїпоіоцу іп Ацгі-
сикиге апй Рогехігу / Ей. Ьу ¥.Р.8. Ва]а). — Вегііп еіс.: Зргіпвег-Уегіав, 1986.
- Р. 274-290.
447. Зтіік С. И< А хіийу оГ іЬе цгоу/іИ оГ ехсіхей етЬгуо хЬооі арісех оГ
у.'Иеаі іп уііго // Апп. Воі. — 1967. — 31. — Р. 593—605.
448. Зтіік БР., Кгікогіап А.Б. Кеіеахе оГ хотаііс етЬгуо цспеііс роіепііаі
Ггот ехсіхей хуцоііс етЬгуох оГ саггоі апй таіпіепапсе оГ роІуетЬгуопіс сиііигех
іп Ьогтопе-Ггее тейіит // Атег. 1. Воі. — 1989. — 76. — Р. 1832—1843.
449. Зтіік М.К., МсСотЬ РА. 8е1есііоп Гог НаСІ юіегапсе іп сеіі сикигех
оГ Мейісацо хаііуа апй гесоуегу оГ ріапіх Ггот а №СІ-іо1егапі сеіі Ііпе // Ріапі
СеІІ Керогіх. — 1983. - 2. - Р. 126-128.
450. Зтіік Я.Н., АоггЕ Я. Іп уііго ргораваііоп оГ АГгісап уіоієі сЬітегах //
Ноіі8сіепсе. — 1983. — 18, N 4. — Р. 436—437.
451. Зпаке І. Ж ВоиЬІей Ьаріоій Ьгеейіпц: ТЬеогеіісаІ Ьахіх апй ргасіісаі ар-
ріісаііопх // Кєуієсу оГ Айуапсех іп Ріапі ВіоіесЬпо1с>8у,1985—88: 2ті Іпі. 8утр.
оп Сепеііс Мапіриіаііоп іп Сгорх, С1ММ¥Т / Ей. Ьу А. МціесЬ-Кахі, Ь.А.
8іісЬ. — Мехісо: Р., Мехісо апй ІКЮ; Мапііа, РЬіІірріпе, 1989. — Р. 19—30.
452. Зпіг І. Іп уііго ргораваііоп оГ скеггу сикіуагх // Ноіі8сіепсе. — 1982. —
17, N 2. - Р. 192-193.
453. Раї. 4802905 І)8А. МеіЬой Гог ргоіесііпв ріапіх апй ріапі тайег Ггот
хігехх / М. 8ресіог. — РиЬІ. 1989.
454. Зріе&еІ-Яоу Р., КоскЬа Р. Коїе оГ роїуетЬгуопу апй аротіхех іп Сіігих
ргораваііоп апй Ьгеейіпц // Айуапсех іп Віосіїетісаі Епвіпеегіпв / Ей. Ьу
А. РіесЬіег. — Вегііп еіс.: 8ргіп£сг-УсгІа§, 1980. — УоІ. 18. — Р. 28—48.
455. Зргіп^ег IV. Б., Сгееп С.Н.Е., Кокп К.А. А Ьіхіогісаі ехатіпаіюп оГ іі-
ххие сикиге іпкіаііоп Ггот іттаіиге етЬгуох оГ таіге 7.еа таух // Ргоіоріахта. —
1979. - 101. - Р. 269-282.
456. Зіатр Р.А., СоІЬу З.М., Мегесііік С.Р. Бігесі хііооі ог^апоцепехіх апй
ріапі гецепегаііоп Ггот Іеауех оГцгаре (Уіііх хрр.) // Ріапі СеІІ Тіхх. Ог§. Сик. —
1990. - 22, N 2. - Р. 127-133.
266
Список літератури
457. 8іагі Н.С., Саттіп^х В.С. Іп уііго ргора§аІіоп оГ 8аіпіраиІіа іопапіа
\Уепд1 11 НоП8сіепсе. - 1976. - 11. - Р. 204-206.
458. 8іемагсі Е.С., Сарііп 8.М., МШаг ЕК. Іпуекіі^аііопк оп цгоу/ІЬ апсі те-
ІаЬоІікт оГ ріапі сеіік. 1. №« іесЬпічие Гог ІЬе іпускііцаїіоп оГ тсІаЬоІікт,
пиігіїіоп, апсі ^гоу/іЬ іп іпдіГГегепІіаІед сеіік // Апп. Воі. — 1952. — 16. —
Р. 57-77.
459. 8іемагсі Е., Мііскеїі В. Тскі ІиЬе огсЬідк // ТГіе Оагсіеп. — 1991. —
116, N 1. - Р. 32—36.
460. 8іітагі О.Р., Ахкег Р.П. Ріапііеі гецепегаїіоп апсі кІаЬіІку Ггот саііик
сикигек оГ Ггеехіа ЬуЬгідк // 8сі. НоП. — 1982. — 17. — Р. 153—157.
461. 8іітагі О.Р., Ахкег Р.П., ИЇІкіпз Н.Е. Ахік еіопцаїіоп Ггот Ііккие
сикигесі ^епегаїіоп ЬиІЬІеІк оГ ЬИіит Іоп^і/Іогіїт // 1. Атег. 8ос. НоП. 8сі. —
1983. - 108. - Р. 99-101.
462. 8іопіег У. 1974 ТГіе гоїе оГ аихіп ргоіесіогк іп аиіопотоик цгоМЬ //
Ьек Сикигек де Тіккиек де Ріапіек. — Рагік: Соїі. Іпі. С.Г4.К8., 1974. — N 193. —
Р. 423-435.
463. 8ігееі Н.Е. ЬаЬогаІогу ощапігаїіоп // Ріапі Тіккие апд СеІІ Сикиге.
Воі. Мопо^гарЬ / Ед. Ьу Н.Е. 8ігееІ. — ОхІогд; Еопдоп: ВІаску/еІІ 8сі. РиЬІ,
1977. - УоІ. 11. - Р. 11—30.
464. 8иргіуапіо, Вокг В. Іп уііго ге^епегаїіоп оГ ріапііеік оГ 8соІк ріпе (Ріпах
хуІУехігіх) гуііЬ тісоїіЬігаї гооїк Ггот киЬсиІІигед саііик іпіііаіед Ггот пеедіе
адуепііііоик Ьидк // Сап. 3. Воі. — 1994. — 72. — Р. 1144—1150.
465. 8уопо К., Еигиуа Т. ЕГГесік оГ суіокіпіпк оп ІЬе аихіп сопіепк оГ гоЬас-
со саііикек // Ріапі СеІІ РЬукіоІ. — 1972. — 13. — Р. 843—856.
466. ТаЬаскпік Ь., Кехіег О.Е. 8ЬооІ сикиге Гог аітопд апд аІтопд-реасЬ
сіопек іп уііго // Ноп8сіепсе. — 1977. — 12. — Р. 545—547.
467. Такауата 8., МЕама М. Расіогк аГґссІіпц діГГегепІіаІіоп апд цгоуЛЬ іп
уііго, апд а такк ргора§а1іоп ксЬете Гог Ве^опіа кіетаІЕ // 8сі. НоП. — 1982. —
16, N 1. - Р. 65-74.
468. Такауата 8., Міхами М. ТЬе такк ргорацаїіоп оГ ЬИіит іп уііго Ьу кіі-
тиіаііоп оГ тиіііріе адуепііііоик ЬиІЬ-ксаІе Гогтаііоп апд Ьу кЬаке сикиге //
Сап. 3. Воі. - 1983. - 61. - Р. 224-228.
469. Тапака М., Китга М., Соі М. Оріітаї сопдіїіопк Гог кЬооі ргодисііоп
Ггот Ркаїаепорхіх По\уег-к1а1к сиіііпц сикигед іп уііго // 8сі. НоП. — 1988. —
35. - Р. 117-126.
470. Тапітоіо 8., Нагасіа Н. Іпуоіуетепі оГ саісіит іп адуепііііоик Ьид іпіііа-
Ііоп іп Тогепіа кіет ксцтепік // Ріапі СеІІ РЬукіоІ. — 1986. — 27. — Р. 1—10.
471. Тапітоіо 8., Міуаіакі А., Нагасіа Н. Кециіаііоп Ьу аЬксікіс асід іп уііго
По\уєг Гогтаііоп уіа кіет ке^тепік // ІЬід. — 1985. — 26. — Р. 675—682.
472. Татогих ТЕ., Еомке Ь.С., Оипхіап й.Е 8ота1іс етЬгуоцепекік іп сопі-
Гегк // Сап. 3. Воі. - 1991. - 69. - Р. 1873-1899.
473. Тауіог В.М. Сегтіпаїіоп оГ соїіоп (Соххуріит кігхишт Е.) роїіеп оп
ап аНіГісіа! тедіит // Сгор 8сі. — 1972. — 12. — Р. 243—244.
474. Теріііхкауа Ь.М. Сіопіпв теїЬодк деуеіортепі Гог гаге апд уапікЬіпв
ріапік оГ Сгітеап Пога // ВіоІесЬпоІ. АрргоасЬек Гог Ехріоііаііоп апд Ргєкєгує-
Ііоп оГ Ріапі Векоигкек. — ¥ака, 2002. — Р. 41.
475. Ткотах О Т., 8тіік О.8. ТЬе еГГесІ оГ раїегпаї &споІуре оп іпіііаііоп оГ
етЬгуоцепеїіс саііик Ггот еіііе таіге (2еа таух) цегтріакт // ТЬеог. апд Аррі.
Сепеї. - 1985. - 70, N 5. - Р. 505-509.
267
Список літератури
476. Т)югре Т.А. Ріапі Тіххие Сикиге. Меікодх апд Арріісаііопх іп АцгісиІ-
Іиге. — Ие\у ¥огк еіс.: Асад. Ргехх, 1981. — 285 р.
477. Потре Т.А., Роу /?. Ж, Ьеип% IV. М. 8іагск Іигпоуег іп хІтооіГогтіпц
ІоЬассо саііих // Ркухіоі. Ріапі. — 1986. — 66. — Р. 58—62.
478. Потре Т.А., Меіет 0.0. 8іагск теІаЬоІіхт іп хкооі Гогтіпц ІоЬассо
саііих // 2. Ехр. Воі. - 1974. - 25. - Р. 288-294.
479. Потре Т.А., Меіет 0.0. ЕГГесІ оГ віЬЬегеІІіс асід оп хІагсЬ теІаЬоІіхт
іп ІоЬассо саііих сиііигед ипдег хЬооіГогтіпц сопдіїіопх // РЬуІотогрЬ. —
1975. - 25. - Р. 238—245.
480. Потре Т.А., Мигаакі^е Т. 8оте ЬіхІосЬетісаІ сЬапцех ипдегіуіпц хкооі
іпіііаііоп іп ІоЬассо саііих сикиге // Атег. 3. Воі. — 1968. — 55. — Р. 710.
481. Потре Т.А., Мигаакі^е Т. 8іагск асситиіаііоп іп хкооі Гогтіпц ІоЬассо
саііих сикигех // 8сіепсе. — 1968. — 160. — Р. 421—422.
482. ТІ88етаі В. Ргорацаїіоп оГ даіе раїт (Ркоепіх сіасіуіі/ега Е.) іп уііго і і
Т Ехр. Воі. - 1979. - ЗО, N 119. - Р. 1275-1283.
483. Ті88етаі В. Ргора§а1іоп оГ даіе раїт Ьу хкооі Іір сикигех // НоП-
8сіепсе. - 1984. — 19, N 2. - Р. 230-231.
484. ТІ88етаі В., Митааігіуе Т. ЕГГесіх оГ еікеркоп, еікуіепе апд 2,4 — діск-
Іогркепохуасеїіс асід оп ахехиаі етЬгуо£епехіх іп уііго // Ріапі Ркухіоі. — 1977. —
60. - Р. 437-439.
485. Тогпе Р.М., 5апі08 М.А., Ропа А., Віапсо М. Кецепегаїіоп оГ ріапіх
Ггот техосоїуі Ііххие сикигех оГ іттаїиге етЬгуох оГ 2еа тау8 Ь. // Ріапі 8сі.
Ьеи. — 1980. - 17. - Р. 339-344.
486. Тоггії.0 Ь.В., Тараіа Р.Р. Апікег сикиге іп гісе. 4. Тке еГГесІ оГ аЬхсіх-
іс асід оп ріапі гееепегаїіоп // Ріапі СеІІ КероПх. — 1986. — 5. — Р. 136—
139.
487. Ттеі’уакоуа І., Моуоаеіоуа N. Сикиге іп уііго оГ тсцацатеїоркуіех апд
етЬгуох оГ 8іЬегіап ріпе апд Гогтаііоп оГ адуепііуе Ьидх // Віоіескпоіоцу Ар-
ргоаскех Гог Ехріоііаііоп апд Ргехегуаііоп оГ Ріапі Кехоигсех. — ¥ака, 2002. —
Р. 24.
488. (Ікарі Т., Аакіката Н. ЕГГесІ оГ іпог^апіс ркохркаїе оп Іке ієуєіх оГ аті-
по-асідх іп хихрепхіоп-сикигед сеііх оГ Саікатапікиа то8еи8 // Апп. Воі. — 1987. —
60. - Р. 109-114.
489. Уасіп Е.Р., ІУепі РАМ 8оте рН скап^ех іп пиігіепі хоіиііопх // Воі.
Саг. - 1949. - ПО. - Р. 605-613.
490. Уаііеа М., Вохп8 Рк. Місгоргорацаїіоп оГ хеуегаї Воаа куЬтісІа Е.
сикіуагх // Асіа Ноп. — 1987. — 212. — Р. 611—617.
491. Уап Аатітук Р., Біот Ватпкот С.Р., Втиіпата Р. Адуепііііоих Ьид Гог-
таїіоп Ггот ЬиІЬ — хсаіе ехріапіх оГ Ьіііит 8ресіо8ит ТкипЬ. іп уііго і і Г. Ріапі.
Ркухіоі. - 1985. - 117. - Р. 401-410.
492. Уап сіег Ьіпсіе Р.С.С. Тіххие сикиге оГ Гіоу/єґ — ЬиІЬ сгорх: Ікеогу апд
ргасіісе // Асіа НоП. - 1992. — 325, N 4. - Р. 419-428.
493. Уап сіег Біпсіе Р.С.С., Ноі С.М. еі аі. Іп уііго ргора§а1іоп оГ ІтІ8 коїіап-
Віса // ІЬід. - 1988. — 226. - Р. 121—128.
494. Уааіі І.К. Апдгоцепіс каріоідх // Регхресііуех іп Ріапі СеІІ апд Тіххие
Сикиге. Іпі. Кєу. оГ Суіоіоцу І Ед. Ьу І.К. Уахії. — 8ап Оіецо; №* ¥огк: Асад.
Ргехх, 1980. - 8ирр1. ПА. - Р. 195-223.
495. Уа8ІІ І.К. Регхресііуех іп Ріапі СеІІ апд Тіххие Сикиге // Іпі. Кєу.
Суіоіоцу. — 8ап Оіецо; ІЧе\у ¥огк: Асад. Ргехх, 1980. — 8ирр1. 11 В.
268
Список літератури
496. кім// У., Уазіі І.К. 8отаііс етЬгуоцепехіх апй ріапі ге^епегаііоп Ггот
хихрепхіоп сикигех оГ реагі тіїїеі (Реппііеіит атегісапит) // Апп. Воі. — 1981. —
47. - Р. 669-678.
497. Уахії V., Уазії І.К. ТГіе опіо^епу оГ хотаііс етЬгуох оГ Реппізеіит ате-
гісапит (Ь.) К. 8сЬит. І. Іп сикигед іттаіиге етЬгуох // Воі. Саг. — 1982. —
143. - Р. 454-465.
498. Уегсіаіі І.К., Ниеі С., Єгоісіетап^е Е, Ви//ап!-Моге! І. Ріапі ге^епсга-
ііоп Ггот сикигед іттаіиге іпПогехсепсех оГ сосопиі (Сосоз писі/ега Е.) // Ріапі
СеІІ Верогіх. - 1994. - 13, N 3/4. - Р. 218-221.
499. Уегта О.С., Ьііуау І.П., Іоктоп М.А., Еітркаг В. IV. Медіа деуеіор-
тепі Гог сеіі хихрепхіопх оГ сопіГегх // Ріапі Тіххие Сиііиге. — Ргос. 5ІЬ Іпі.
Сопе. Ріапі Тіхх. СеІІ Сиіі. — Токуо, 1982. — Р. 59—60.
500. Уі] 8.Р., 8оо<1 А., Ріака К.К. Ргораваііоп оГ Ркупско8ІуІіі> геіиха В1.
(ОгсЬідасеае) Ьу дігесі ог^апоцепехік Ггот ІеаГ хе^тепі сикигех // Воі. Саг. —
1984. — 145, N 2. - Р. 210-214.
501. Уі/ 8.Р., 8оос! А., Вкагта М. Іп уііго ІеаГ хецтепі сикиге оГ Уапсіа іеа-
іасеа (Ьіпді.) // Сигг. 8сі. - 1986. - 55, N 21. - Р. 1100-1101.
502. ІУаіпуугі^кі Н., Е1е%тапп А. IV. ТЬе тісгоргорацаііоп оГцоохЬеггу (Кікез
иуа-сгізра). І. ЕхіаЬІіхтепі іп уііго і і 3. Ногі. 8сі. — 1985. — 60, N 2. — Р. 215—
221.
503. ІУаіітгіукі Н., ЕІс^тапп А. Ж. ТЬе тісгоргорацаііоп оГ цоохЬеггу. II. Іп
уііго ргораваііоп апд іп уііго ехіаЬІіхЬтепі // ІЬід. — 1985. — 60, N 4. — Р. 485—
491.
504. ІУаІкеу О.С.А., Соорег У.С., Сгіхр Р. ТЬе ргодисііоп оГ уішх Ггее саи-
1іПо\уєгх Ьу ііххие сикиге // ІЬід. — 1974. — 49, N 3. — Р. 273—275.
505. ІУаІкеу В.С.А., Е'ееіеу Н.А., Сгіхр Р. Нарід ргораваііоп оГ у/Ьііе саЬ-
Ьа^е Ьу ііххие сикиге // 8сі. Ногі. — 1980. — 12, N 1. — Р. 99—107.
506. Жал# Ж.С., кіуиуеп Н.Т. А поуєі арргоасЬ Гог еГГісіепі ріапі гс^епега-
ііоп Ггот Іопв — іегт хихрепхіоп сикиге оГ адЬеаі // Ріапі СеІІ Керогіх. — 1990. —
8. - Р. 639-642.
507. Жалі' А-., Ни Н. ТЬе еГГесі оГ роїаю II тедіит Гог Тгііісаіе апіЬег сиі-
іиге І/ Ріапі 8сі. Ееіі. — 1984. — 36. — Р. 237—239.
508. ІУеЬЬ В.Т., Агіаз Ж, Ве Нояіоя Е. СаІІих Гогтаїіоп Ьу Сіпк§о Ьііока
етЬгуох оп Ьогтопе Ггее тедіа сопігоііед Ьу сіохигех апд тедіа сотропепіх //
РЬуіотогрЬоІову. — 1986. — 36. — Р. 121—127.
509. ІУеіапсІег М. Іп уііго ог§аповепехіх іп ехріапіх Ггот діГГегепі сикіуагх оГ
Ве^опіа х кіетаїіі // РЬухіоІ. Ріапі. — 1977. — 41. — Р. 142—145.
510. ІУеІа.псІег М. Іп уііго сикиге оГ гахрЬеггу (РиЬих ісіаеиз) Гог тахх рго-
ра§аііоп 11 3. Ногі. 8сі. - 1985. - 60, N 4. - Р. 493-499.
511. ІУеіапсіег М. Місгоргорацаііоп оГ цоохеЬеггу {Ріке8 угошиїагіа) // 8сі.
Ногі. - 1985. — 26. — Р. 267-272.
512. ІУеіапсІег М. Ріапі гсцепсгаііоп Ггот ІеаГ апд хіет хецтепіх оГ хЬооіх
гаіхед іп уііго Ггот таіиге арріе ігеех // 1. Ріапі. РЬухіоІ. — 1988. — 132. —
Р. 738-744.
513. ІУеІапсІег М., РамИскі N. А тодеї хухіет Гог хіидуіпц гооі гецспегаііоп
іп адооду хресіех // Асіа НоП. — 1993. — 336. — Р. 225—230.
514. ІЕепск А.Р., Соп&ег В.У., Тгіуіапо Р.А., Ваті Е.Е. ІпЬіЬіііоп оГхотаііс
етЬгуоцепехіх іп ОгсЬагдвгахх Ьу епдоцепоих суіокіпіпх І І Ріапі РЬухіоІ. —
1988. - 88. - Р. 990-992.
269
Список літератури
515. ІУкіїе Рк.Р. А НапсІЬоок оГ Ріапі Тіжие Сикиге. — Ьапсазісг: ТЬе
Ласдиез Саііеіі Ргехз, 1943. — 191 р.
516. кУкіїе Рк.Р. ТІїе сикіуаііоп оГ Апітаї апд Ріапі Ссіїх. 2п<1 ед. — Не\у
¥огк: Копаїд Ргеж, 1963. — 235 р.
517. кУкіїе М.С., Еескег А.М., Скапеу В./. Меіаі сотріехаііоп іп хуіет
Пиід. 1. Сіїетісаі сотрояіііоп оГ іотаіо апд хоуЬеап зіет ехидаіе // Ріапі РЬу-
8іо1. - 1981. — 67. - Р. 292-300.
518. ІУкіїе Р.Р. Ассехогу хакх іп діє пиігіїіоп оґ ехсіхед іотаіо гооіх //
ІЬід. - 1938. - 13. - Р. 391-398.
519. ІУіігніпк К.А., Уеп В.С.Е., Уап 1)е Сихіега -І.В.М. еі аі. Адуепііііоих
хЬоооі Гогтаііоп іп Шіір: Ьікіоіоцісаі апаїухіх апд гевропяе іо хсіесііус ацепіх //
Ріапі 8сі. - 1995. - ПО, N 1. - Р. 155-164.
520. ІРгі§кі 7.8, Коекіег 8.М., Ніпскее М.А., Сагпех М.С. Ріапі гецепегаііоп Ьу
оіцапоцепеж іп Сіусіпе тах // Ріапі СеІІ Керогіх. — 1986. — 5. — Р. 150—154.
521. ІУгідкІ М.А., Аісіегхоп Р.С. ТЬе цгоуЛЬ оГ іиіір ііжиех іп уііго // Асіа
Ногі. - 1980. - 109. - Р. 263-270.
522. Хіап£-Сап 7., Лпе8 О. А., Кегг А. Ке^епегаГіоп оГ хЬооіх оп гооі ех-
ріапіх оГ Пах // Апп. Воі. — 1989. — 63. — Р. 297—299.
523. Уае В. IV., 7іттегтап В.Н., ЕогВкат Е, Ко К.С. ІпЛиепсе оГ рЬоіоре-
гіод, арісаі тегіхіет, апд ехріапі огіепіаііоп оп ахіїїагу хЬооі ргоІіГегаііоп оГ
арріе сиіііуаге іп уііго // Л. Атег. 8ос. Ногі. 8сі. — 1987. — 112. N 3. —
Р. 588-592.
524. Уао £>.А., Кахка К.Е Роіепііаі оГ Ьіоііьііс ІгапхГогтаііоп оГ Ьагіеу тіс-
го8роге5 Ьажд оп уіаЬіІііу апд ігапхіепі Ьеіа-ціисигопідазе асііуііу // Сепоте. —
1997. - 40, N 5. - Р. 639-643.
525. Татога А.В., 8соІІ К.Р. СаІІих Гогтаііоп апд ріапі гецепегаііоп Ггот
\уЬеаі Іеауех // Ріапі 8сі. кеіі. — 1983. — 29. — Р. 183—189.
526. 7кои Н., ВаІІ 8.Т., Копт.сік С.Р. Рипсііопаї ргорегііек оГ Гісоїі апд ІЬеіг
іпґіиепсе оп апіЬег сикиге геяропхеб оГ у.'Ьеаі // Ріапі СеІІ, Тіккие апд Ог§ап
Сикиге. - 1992. - ЗО. - Р. 77-83.
527. 7кои Н., Коп^ак С.Р. Ітргоуетепі оГ апіЬег сикиге теіЬодк Гог Ьар-
Іоід ргодисііоп іп у/Ьеаі // Сгор 8сі. — 1989. — 29. — Р. 817—821.
528. 7іаи<к1іп А., Маг80ІаІ8 А., 8ітіоп Е., Каака К.Х Ітргоуед ріапі ге^е-
пегаііоп Ггот \уЬеаі апіЬег апд Ьагіеу тісгокроге сикиге ихіпц рЬепуІасеііс асід
(РАА) // Ріапі СеІІ Керопк. - 1992. — 11 (10). - Р. 489-493.
529. 7іттег К., Ріерег Ж. МеіЬодх апд ргоЬІетх оГ сіопаї ргорацаііоп оГ
Ьготеїіадк іп уііго // Асіа НоП. — 1976. — 64, N 1. — Р. 25—29.
530. 7іттег К., Ріерег Ж. Сіопаї ргора^аііоп оГ РкаІаепор8І8 Ьу ехсіхед
Ьидх // ОгсЬід Веу. - 1978. - 86. - Р. 223-227.
531. 7іттегтап В.Н., ГогВкат 1 8ітр1іГіед теііюд Гог гооііпу арріе сикі-
уагз іп уііго // 1. Атег. 8ос. НоП. 8сі. — 1985. — ПО, N 1. — Р. 34.
532. 7ітпу }., Ьогт. Н. Ріапі гецепегаііоп апд іпіііаііоп оГ сеіі хихрепхіопк
Ггот гооі-іір дегіуед саііих оГ Огу^а ааІІУа Ь. (гісе) // Ріапі СеІІ КероПх. —
1986. - 5. - Р. 89-92.
533. 7іу М. Епііапсед кЬооі апд согтіеі ргоІіГегаііоп іп Ііциід сикигед ціа-
діоіиз Ьидх Ьу вгслуіЬ геіагдапіх // Ріапі СеІІ, Тікзие апд Ог§ап Сикиге. — 1989. —
17. - Р. 387-394.
534. 7іу М., Наїеуу А.Н., 8МІо В. Ог^апк апд ріапііеіх гецепегаііоп оГ віа-
діоіих іЬгоивЬ ііккие сикиге // Апп. Воі. — 1970. — 34, N 2. — Р. 671—676.
зміст
ПЕРЕДМОВА........................................................... З
Розділ 1. МОРФОГЕНЕЗ В УМОВАХ ІМ У1ТЯО: ТИПИ МОРФОГЕНЕЗУ І ЙОГО
РЕГУЛЯЦІЯ .......................................................... 5
Розділ 2. МЕТОД І ТЕХНІКА МІКРОКЛОНАЛЬНОГО РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН... 23
Р о з д і л 3. МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ ДЕКОРАТИВНИХ РОСЛИН... 69
Амарилісові .................................................... 70
Альстромерієві ................................................. 75
Ароїдні ........................................................ 76
Бегонієві ...................................................... 81
Бромелієві...................................................... 85
Вересові ....................................................... 88
Гвоздичні....................................................... 91
Геснерієві...................................................... 94
Ірисові......................................................... 98
Лілійні ....................................................... 104
Орхідні ..................................................... 112
Пальмові ...................................................... 129
Складноцвіті .................................................. 132
Папоротеподібні ............................................... 138
Розоцвіті ..................................................... 140
Інші декоративні рослини ...................................... 144
Розділ 4. МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКИХ
РОСЛИН............................................................ 148
Овочеві культури .............................................. 148
Злакові культури .............................................. 168
Технічні культури.............................................. 181
Розділ 5. МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ ПЛОДОВИХ, ЯГІДНИХ КУЛЬТУР
І ВИНОГРАДУ....................................................... 190
Розділ 6. МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ ДЕРЕВНИХ ПОРІД............... 224
Листяні породи ................................................ 225
Хвойні породи ................................................. 235
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ................................................. 242
Наукове видання
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ
КУШНІР Галина Петрівна
САРНАЦЬКА Вереса Василівна
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ
РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН
Теорія і практика
Київ, видавництво “Наукова думка”, 2005
Художнє оформлення С.П. Муштенко
Художній редактор І.П. Савицька
Технічний редактор Т.М. Шендерович
Коректор О.В. Лакейчук
Оператори В.Г. Каменькович, М.А. Кравченко
Комп’ютерна верстка Л.М. Каткової
Підп. до друку 29.12.2005. Формат 60x90 1/6. Папір офс. № 1. Гарн. Тайме.
Друк. офс. Ум. друк. арк. 17,0. Ум. фарбо-відб. 17,0. Обл.-вид. арк. 20,98.
Тираж 300 прим. Зам. 6—83
Оригінал-макет підготовлено у видавництві “Наукова думка”.
Р.с. N2 05417561 від 16.03.95
01601 Київ 1, вул. Терещенківська, З
ЗАТ фірма “Віпол”
03151 Київ 151, вул. Волинська, 60