Текст
                    Воловенко ЮМ, Карцев В,Г„
Комаров ИВ„ Туров АВ„ Хиля ВЛ,
но
'J-JAJ-Ji;-'
ОН
(CSPF
Москва — 2011
Shield ।
ТНОГО РЕЗО
ДЛЯ ХИМИКОВ

Воловенко Ю.М., Карцев В.Г., Комаров И.В., Туров А.В., Хиля В.П. СПЕКТРОСКОПИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА ДЛЯ ХИМИКОВ
УДК 547.77.8:615.011 ББК 24.23 Авторский знак Х=46 Воловенко Ю.М., Карцев В.Г., Комаров И.В., Туров А.В., Хиля В.П. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса для химиков. Учебник для химических специальностей вузов. - М.: Издано Международным бла- готворительным фондом "Научное Партнерство", МБФНП (International charitable foundation "Scientific Partnership Foundation", ICSPF), 2011. - 704 c. Все права защищены. Никакая часть настоящей книги не может быть вос- произведена или передана в какой бы то ни было форме и какими бы то ни было средствами, будь то электронные или механические, включая фотоко- пирование и запись на магнитный носитель, если на то нет письменного разрешения © МБФНП (ICSPF). spfond @ spfond.ru conf @ ibscreen.chg.ru ISBN 978-5-903078-34-9 ©МБФНП (ICSPF), 2011
Учебник предназначен для студентов и аспирантов университетов, в программу обучения которых входят курсы по физическим методам иссле- дования химических соединений. В учебнике на современном уровне пред- ставлены основные разделы ЯМР-спектроскопии жидких образцов на яд- рах 1Н, 13С, 31Р, 19F. Большое внимание уделено методикам гомоядерной и гетероядерной корреляционной спектроскопии. Построение учебника отли- чается от классического. В главе 1 описана практика использования спектро- скопии ЯМР для решения химических проблем. Здесь приведен минимум теоретического материала, необходимый для анализа спектров ЯМР, и осве- щены методики обработки одномерных и двумерных спектров ЯМР. Для лучшего освоения материала студентами приведено решение методом ЯМР типичных задач органической химии. Имеются задачи для самостоятельно- го решения, которые позволят студенту овладеть методом ЯМР даже в том случае, если он не имеет возможности пользоваться спектрометром. Во второй и последующих главах описаны физические основы метода ЯМР и дано подробное описание современных методик ЯМР, которые ис- пользуются наиболее часто. Авторы старались при этом избегать громозд- ких математических выкладок и заменять их подходящими механическими моделями. Учебник будет полезен для специалистов-химиков, использующих ме- тод ЯМР в научной работе. Таблиц - 49, библиография - 16 ссылок.
This manual is recommended for University and PhD students whose study programs include major courses on the use of spectroscopic methods in che- mistry. The book covers the essential state-of-the-art aspects of the liquid-state NMR on ’H, i3C, 31P, 19F nuclei. Special attention has been given to homo- and heteronuclear correlation NMR spectroscopy. The structure of the book differs from that of most of the conventional NMR textbooks. The first chapter descri- bes the practical use of NMR methods in the solution of chemical problems. Gi- ving the minimal theoretical background, the chapter introduces the reader to the basics of analysis of one- and two-dimensional NMR spectra. Solutions of typi- cal problems in organic chemistry with the help of the NMR method are given as examples. This chapter also includes a set of problems for readers to solve on their own, which will make it possible for those having no or only a limited ac- cess to spectrometers to master the NMR method. The second and subsequent chapters present the theoretical aspects of the NMR method as well as a detailed description of its modem techniques currently most frequently used. The authors tried to avoid cumbersome mathematical cal- culations of the subject where possible, concentrating instead on the appropriate simplified models. The book will also be useful to scientists who use NMR in their research work. Tables - 49, bibliography - 16 references.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Оглавление Предисловие................................................. 14 Глава 1. Интерпретация спектров............................. 19 1.1. Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в химии...... 19 1.1.1. История возникновения метода..................... 19 1.1.2. Первые спектрометры и первые спектры............. 21 1.1.3. Для чего спектрометру магнит?.................... 23 1.2. Простейшие спектры ЯМР................................. 24 1.2.1. Почему возникает спектр ЯМР?..................... 27 1.2.2. Спектры на ядрах *Н.............................. 29 1.2.3. Спектры на ядрах 13С............................. 32 1.2.4. Спектроскопия ЯМР на различных магнитных ядрах... 35 1.3. Параметры спектров ЯМР................................. 36 1.3.1. Химические сдвиги................................ 37 1.3.1.1. Воздействие на химические сдвиги функциональных групп................................ 39 1.3.1.2. Воздействие на химические сдвиги ароматических фрагментов.......................................... 41 1.3.2. Спин-спиновое взаимодействие (ССВ)............... 43 1.3.2.1. Правила спин-спинового взаимодействия 1-го порядка........................................ 46 1.3.2.2. Прямое и непрямое спин-спиновое взаимодействие...................................... 50 1.3.2.3. Механизм непрямого спин-спинового взаимодействия...................................... 52 1.3.2.4. Отклонения от правил ССВ первого порядка.. 54 1.3.2.5. Номенклатура спиновых систем.............. 57 1.3.3. Интенсивность сигналов........................... 58 1.4. Импульсное возбуждение ядерных спинов.................. 60 1.5. Подготовка образца..................................... 64 1.5.1. Выбор растворителя............................... 64 1.5.2. Стандарты в ЯМР.................................. 69 1.5.3. Трубки для измерения и объем образца............. 71 1.5.4. Фильтрование образца............................. 73 1.5.5. Регенерация дейтерированных растворителей........ 73 1.6. Химические сдвиги и структура молекулы................. 75 1.7. Вид сигналов ЯМР и структура молекулы.................. 81 5
Оглавление 1.8. Интерпретация спектров на ядрах ’Н....................... 81 1.8.1. Определение параметров сигналов.................... 97 1.8.2. Представление результатов анализа спектра ЯМР..... 100 1.8.3. Анализ спектра чистого соединения................. 101 1.8.4. Анализ спектра соединения, содержащего примеси.... 104 1.8.5. Анализ сложных спектров ПМР....................... 107 1.9. Задачи. Интерпретация спектров ЯМР на ядрах *Н........... 110 1.10. Константа спин-спинового взаимодействия (КССВ) (Н,Н) и строение молекул.............................................. 122 1.10.1. Геминальные КССВ 2J(H,H)......................... 123 1.10.2. Вицинальные КССВ 3J(H,H)......................... 127 1.10.2.1. Воздействие электроотрицательности заместителей на3/(Н,Н).......................................... 129 1.10.2.2. Воздействие углов между связями на величины 3J(H,H)........................................... 131 1.10.2.3. Воздействие на 3J(H,H) неподеленных электронных пар.................................... 132 1.10.3. Константы дальнего ССВ........................... 132 1.11. Влияние внешних условий на спектры ЯМР на ядрах *Н..... 134 1.11.1. Влияние растворителя на спектры 1Н-ЯМР........... 135 1.11.2. Влияние температуры на спектры 'Н-ЯМР............ 138 1.11.3. Влияние добавок D2O на спектры 'Н-ЯМР............ 139 1.12. Влияние на спектр 'Н спинов различных магнитных ядер.... 140 1.13. Методы развязки (декаплинга) ядерных спинов............ 142 1.13.1. Физические основы декаплинга..................... 143 1.13.2. Гомоядерный декаплинг............................ 144 1.13.3. Сдвиги Бл оха-Сигерта............................ 145 1.14. Ядерный эффект Оверхаузера............................. 147 1.14.1. Гетероядерные ЯЭО................................ 147 1.14.2. Измерение ЯЭО: разностные спектры................ 148 1.14.3. Количественное измерение ЯЭО..................... 153 1.14.4. Применение спектров ЯЭО.......................... 153 1.14.4.1. Нахождение структуры Е- и Z-изомеров..... 154 1.14.4.2. Определение строения скелета ароматических соединений........................................ 155 1.14.4.3. Замещение в ароматических соединениях.... 155 1.14.4.4. Определение конфигурации заместителей.... 156 1.14.4.5. Отнесение сигналов...................... 157 1.14.4.6. Выбор между эндо- и экзо-аддуктами...... 158 6
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 1.14.4.7. Определение преимущественной конформации молекулы........................................... 159 1.15. Спектроскопия на ядрах 13С.................................. 160 1.15.1. Спектры 13С в условиях декаплинга на протонах С {1Н}. 160 1.15.2. Анализ углеродного спектра соединения................ 162 1.15.3. Корреляции химических сдвигов ядер 13С со строением молекул................................................... 165 1.15.4. Редактирование спектров на ядрах 13С................. 172 1.15.4.1. Редактирование спектров методом APT........ 173 1.15.4.2. Редактирование спектров методом DEPT 175 1.15.4.3. Пример отнесения сигналов в спектре на ядрах 13С........................................... 177 1.15.4.4. Задачи. Отнесение сигналов в углеродных спектрах............................................... 181 1.15.5. Спин-спиновое взаимодействие 'Н-|3С.................. 186 1.15.5.1. ССВ 13С-'Н через одну химическую связь, константы 1 J(H,C)..................................... 187 1.15.5.2. ССВ 13С-’Н через две связи, константы 2J(H,C) 190 1.15.5.3. ССВ |3С-*Н через три связи, константы 3J(H,C) 193 1.15.5.4. ССВ |3С-’Н через четыре связи, константы 4J(H,С)...................................... 194 1.16. Основные закономерности спектров 19F........................ 195 1.16.1. ССВ между ядрами 19F и 13С........................... 200 1.17. Спектры на ядрах 31Р........................................ 201 1.17.1. Химические сдвиги ядер 31Р 201 1.17.2. Величины КССВ для ядра 3|Р........................... 203 1.18. Программы обработки спектров................................ 205 1.18.1. Программа MESTREC.................................... 206 1.18.2. Программа ADV ASP analyzer........................... 209 1.18.3. Программа NUTS32..................................... 211 1.19. Двумерная спектроскопия ЯМР................................. 212 1.20. Спектры COSY 216 1.20.1. Что дает метод COSY................................ 217 1.20.2. Требования к образцу................................. 217 1.20.3. Вид спектра.......................................... 218 1.20.4. Анализ спектра COSY.................................. 220 1.20.5. Представление результатов............................ 220 1.21. Спектроскопия NOESY-2D...................................... 220 1.22. Гетероядерная корреляционная спектроскопия ЯМР 225 7
Оглавление 1.22.1. Корреляции 'Н-|3С через одну связь. Метод HMQC..... 226 1.22.2. Корреляции ’Н-13С через 2-3 связи. Метод НМВС...... 229 1.22.3. Отнесение сигналов на ядрах 13С с помощью гетероядерной корреляционной спектроскопии.............. 236 1.23. Использование двумерной корреляционной спектроскопии ЯМР для выяснения строения химических соединений....... 248 1.24. Задачи для самостоятельного решения................... 259 1.24.1. Блок задач 1. Найдите строение соединения...... 259 1.24.2. Блок задач 2. Найдите строение соединения...... 271 1.24.3. Блок задач 3. Найдите строение соединения...... 280 Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР 289 2.1. Атомное ядро........................................... 289 2.1.1. Магнитное ядро в магнитном поле.................. 291 2.1.2. Воздействие на ядерный спин электромагнитного поля... 298 2.1.3. Явление ЯМР и вращающаяся система координат (ВСК).... 299 2.2. Способы возбуждения ядерных спинов..................... 303 2.2.1. Стационарное возбуждение ядерных спинов.......... 303 2.2.2. Импульсное возбуждение ядерных спинов............ 308 2.3. Внерезонансные эффекты................................. 318 2.4. "Жизнь" спина после импульса........................... 322 2.5. Продольная релаксация: установление равновесия......... 322 2.6. Поперечная релаксация......*........................... 324 2.7. Компоненты ядерной намагниченности и их поведение в ВСК.... 327 2.8. Воздействие второго импульса на возбужденную спиновую систему 330 2.9. Импульсные последовательности.......................... 331 2.10. Спиновое эхо.......................................... 335 2.11. Воздействие импульсных градиентов поля на поперечную намагниченность............................................. 338 2.12. Регистрация сигнала ЯМР 343 2.12.1. Отбор точек сигнала спада свободной индукции (ССИ). 345 2.12.2. Критерий Найквиста............................. 345 2.12.3. Время сбора данных и цифровое разрешение....... 347 2.12.4. Квадратурное детектирование.................... 350 2.12.5. Отраженные сигналы............................. 354 2.13. Фазовые циклы, селекция сигналов...................... 355 2.14. Генерация когерентностей разных порядков.............. 359 2.15. Диаграммы уровней когерентности....................... 364 8
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 2.16. Применение импульсных градиентов поля для селективной рефокусировки когерентностей разного порядка................ 365 2.17. Подготовка спектрометра к измерению спектра........... 368 2.17.1. Частотно-полевой лок........................... 370 2.17.2. Оптимизация лока............................... 371 2.17.3. Сбор данных в отсутствие лока.................. 372 2.17.4. Оптимизация однородности поля: шиммирование..... 372 2.17.5. Система шимм................................... 373 2.17.6. Процесс шиммирования........................... 375 2.17.7. Основные дефекты формы линии................... 376 2.17.8. Градиентное шиммирование....................... 378 2.17.9. Калибровка спектрометра........................ 383 2.18. Радиочастотные импульсы............................... 383 2.18.1. Сила радиочастотного поля...................... 384 2.18.2. Методика определения угла импульсов............ 385 2.19. Температура образца................................... 387 2.20. Форма линии и разрешение.............................. 389 2.21. Чувствительность....................................... 391 2.22. Обработка сигнала ССИ (функции сглаживания)........... 393 2.22.1. Повышение чувствительности..................... 395 2.22.2. Повышение разрешения........................... 397 2.23. Фазовая коррекция сигналов............................ 400 2.24. Импульсы в спектроскопии ЯМР 402 2.24.1. Композитные импульсы........................... 402 2.24.2. Семейство композитных импульсов................ 406 2.24.3. Широкополосный декаплинг....................... 408 2.24.4. Спиновые замки.................................. 411 2.24.5. Адиабатические импульсы........................ 412 2.24.6. Селективное возбуждение и импульсы заданной формы (сформованные импульсы)................................. 413 2.24.7. Форма мягких импульсов......................... 414 2.24.8. Гауссовы импульсы.............................. 415 2.24.9. Импульсы идеальной фазы........................ 418 2.24.10. Воздействие оператора на форму импульса....... 422 2.24.11. Последовательность DANTE...................... 422 2.24.12. Скульптурное возбуждение...................... 424 2.25. Более подробно о релаксации........................... 427 2.25.1. Связь релаксации с молекулярным движением...... 427 9
Оглавление 2.25.2. Механизмы релаксации........................... 431 2.25.3. Диполь-дипольная релаксация.................... 432 2.25.4. Релаксация, связанная с анизотропией химического сдвига................................................. 433 2.25.5. Квадрупольная релаксация....................... 434 2.26. Природа ядерного эффекта Оверхаузера.................. 435 2.26.1. ЯЭО в двухспиновой системе..................... 436 2.26.2. ЯЭО и молекулярное движение.................... 441 2.26.3. ЯЭО и расстояния между спинами................. 443 2.26.4. ЯЭО в многоспиновых системах................... 444 2.26.5. Дополнительные пути релаксации................. 444 2.26.6. Определение межспиновых расстояний............. 446 2.26.7. Непрямые эффекты и диффузия спинов............. 449 2.26.8. Кинетика ЯЭО................................... 452 2.26.9. Измерение межъядерных расстояний............... 454 2.27. Перенос поляризации................................... 455 2.28. Динамические эффекты в ЯМР............................ 459 2.28.1. Типы динамических систем....................... 461 2.28.2. Количественное описание динамических молекул..... 466 2.28.3. Приближенные методики динамического ЯМР 469 2.28.4. Вычисление термодинамических параметров обменных процессов.............................................. 469 Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР............... 471 3.1. Измерение Ti с помощью последовательности инверсия-восстановление..................................... 471 3.2. Измерение Т2 с помощью последовательности спинового эха.. 474 3.3. Использование различий в величинах Т2 для редактирования спектров.................................................... 480 3.4. 1D градиентный NOESY 482 3.5. ЯЭО в ВСК.............................................. 485 3.6. TOCSY в одном измерении................................ 489 3.7. Лантаноидные сдвигающие реагенты (ЛСР)................. 491 3.7.1. Типы соединений, которые можно изучать методом ЛСР. 494 3.7.2. Использование ЛСР для упрощения спектров ЯМР 495 3.7.3. Определение химического строения молекулы с помощью ЛСР............................................ 497 3.7.4. Использование ЛСР для выявления хиральности...... 498 3.8. Подавление сигнала растворителя........................ 500 10
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 3.8.1. Преднасыщение..................................... 501 3.8.2. Нулевое возбуждение............................... 503 3.8.3. Прыжок с поворотом................................ 504 3.8.4. Биномиальные последовательности................... 505 3.9. Методы редактирования углеродных спектров............... 507 3.9.1. /-модулированное спиновое эхо..................... 507 3.9.2. Методика редактирования спектров APT.............. 514 3.9.3. Методика редактирования спектров INEPT............ 516 3.9.3.1. INEPT с рефокусировкой..................... 519 3.9.3.2. Чувствительность метода INEPT по сравнению со спектрами Х{Н}................................... 522 3.9.3.3. Редактирование спектров с помощью INEPT 525 3.9.4. Последовательность DEPT........................... 528 3.9.4.1. Редактирование спектров с помощью DEPT..... 531 3.10. Изучение квадрупольных ядер............................ 533 Глава 4. Корреляционная 2П-спектроскопия ЯМР (COSY) 537 4.1. Принципы получения двумерных спектров................... 537 4.1.1. Перенос когерентности как механизм образования кросспиков............................................... 543 4.1.2. Тонкая структура пиков в спектрах COSY............ 547 4.1.3. Особенности детектирования сигнала в двумерных экспериментах............................................ 549 4.1.4. Представление 2О-спектра в абсолютных значениях.... 553 4.1.5. Фазочувствительные эксперименты COSY 556 4.1.6. Фаза сигналов в фазочувствительном COSY........... 559 4.1.7. Аксиальные пики................................... 560 4.1.8. Инструментальные артефакты........................ 562 4.1.8.1. Г2-квадратурные артефакты.................. 562 4.1.8.2. ti-шум..................................... 563 4.1.8.3. Артефакты симметризации.................... 564 4.1.9. Особенности сбора 2О-данных....................... 565 4.1.10. Обработка данных в эксперименте 2D............... 568 4.1.11. Фазовая коррекция................................ 571 4.1.12. Оптимизация контурных линий....................... 571 4.2. COSY с градиентным отбором.............................. 572 4.2.1. Фазочувствительные эксперименты................... 574 4.3. Интерпретация структуры мультиплетов в спектрах COSY..... 575 4.4. Разновидности COSY...................................... 580 И
Оглавление 4.5. COSY-P................................................. 582 4.6. COSY с двухквантовой фильтрацией (DQF-COSY) 585 4.6.1. Последовательность DQF-COSY 585 4.6.2. Использование DQF-COSY 589 4.7. COSY с задержкой: выявление малых КССВ................. 591 4.8. Спектроскопия тотальных корреляций (TOCSY) 594 4.8.1. Последовательность TOCSY......................... 596 4.8.2. Спиновый замок и перенос когерентности........... 597 4.8.3. Использование TOCSY 599 4.8.4. Разновидности спиновых замков для TOCSY 602 4.8.5. TOCSY с градиентным отбором...................... 604 4.9. Осложнения, возникающие при интерпретации спектров COSY... 605 Глава 5. Методики ZD-спектроскопии ЯМР 609 5.1. Введение............................................... 609 5.2. Методы, основанные на ядерном эффекте Оверхаузера...... 610 5.2.1. Спектроскопия NOESY-2D........................... 611 5.2.1.1. Последовательность NOESY-2D............... 612 5.2.1.2. Осложнения, возникающие в спектрах NOESY 616 5.2.1.3. Оптимизация времени смешивания............ 617 5.2.2. Измерение ЯЭО в ВСК: ROESY 619 5.2.2.1. Последовательность ROESY-2D............... 619 5.2.2.2. Осложнения, возникающие в спектрах ROESY 621 5.3. Изучение химического обмена: EXSY 625 5.4. Двумерные методики для нахождения КССВ................. 627 5.5. Гетероядерная /-разрешенная спектроскопия.............. 628 5.5.1. Измерение дальних КССВ между протонами и углеродом.. 633 5.5.2. Полуселективное измерение КССВ................... 633 5.5.3. Селективное измерение гетероядерных КССВ......... 634 5.5.4. Селективное измерение КССВ с детектированием на протонах.............................................. 636 5.6. Гомоядерная /-разрешенная спектроскопия................ 638 5.6.1. Косметическая обработка/-разрешенных спектров.... 640 5.6.2. ’’Непрямая” гомоядерная /-разрешенная спектроскопия. 641 5.7. INADEQUATE............................................. 644 5.8. Гетероядерная корреляционная спектроскопия............. 649 5.9. Гетероядерная корреляционная спектроскопия с корреляцией через одну связь............................................. 652 5.10. Гетероядерная корреляционная спектроскопия HMQC....... 653 12
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 5.10.1. Импульсная последовательность HMQC............. 654 5.10.2. Влияние на сигналы в спектрах HMQC гомоядерных протонных расщеплений.................................. 657 5.11. Методы удаления из спектров сигналов ’Н-12С или ’H-^N. 658 5.12. Гетероядерная корреляционная спектроскопия HSQC....... 659 5.13. Методы селекции сигналов в гетероядерной корреляционной спектроскопии............................................... 662 5.13.1. Градиентная селекция целевых сигналов в методах HMQC/HSQC.............................................. 663 5.13.2. Селекция сигналов в методе HMQC с помощью импульса BIRD................................................... 665 5.13.3. Практические замечания......................... 668 5.14. Х-У-корреляции........................................ 669 5.15. Корреляция гетероядер с протонами через 2-3 связи..... 670 5.16. Последовательность НМВС............................... 671 5.17. Традиционная корреляционная спектроскопия с детектированием на ядрах X................................ 674 5.17.1. Корреляции через одну связь. Метод HETCOR...... 674 5.17.2. Корреляции через 2-3 связи. Метод COLOC........ 677 Использованная литература................................... 680 Предметный указатель........................................ 681 13
Предисловие Предисловие Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) - это одно из наиболее общих прояв- лений широко распространенного в природе ядерного магнетизма. Ядра практически всех химических элементов имеют изотопы, проявляющие ядерный магнетизм. Суть этого явления заключается в том, что если помес- тить образец вещества в магнитное поле, то ядра атомов этого образца способны поглощать электромагнитные волны определенной частоты. На регистрации такого поглощения и основано изучение химических соедине- ний или образцов материалов методом магнитного резонанса. Если образец однороден, то есть мы имеем дело с жидкостью, раство- ром или порошком, то измеряют так называемые спектры ЯМР, которые представляют собой зависимость интенсивности поглощения электромаг- нитных волн от их частоты. Уже более полувека измерение таких спектров занимает ведущие позиции в методах исследования химических соедине- ний. С их помощью можно не только определять строение молекул и выяс- нять их стереохимические особенности, но и находить термодинамические параметры движения как молекулы в целом, так и отдельных ее фрагмен- тов, анализировать сложные смеси. Типичный пример спектра ЯМР на яд- рах !Н приведен на рис. А. Рис. А. Пример спектра ЯМР на ядрах !Н. Совершенно уникальной особенностью магнитных ядер является то, что они ’’чувствуют” присутствие возле себя других магнитных ядер. Это их свойство открывает путь к изучению взаимного расположения атомов в молекуле. Именно это и позволяет решать множество проблем структурной химии. По мере усложнения изучаемого химического соединения в его спектре ЯМР возникает все больше сигналов. Проанализировать такой 14
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса спектр становится все сложнее. Однако и для таких задач спектроскопия ЯМР предлагает удобные методы решения. Для этого от одномерных спектров переходят к двумерным или даже трехмерным спектрам ЯМР. На рис. Б дан пример двумерного спектра на ядрах 6Li одной из равновесных систем. (BuLi)4 Li(3) 4 Li(2) Li(4) I ft Li(1) jUUOLx. 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 5 (6Li), м.д. Li1 Li'/(BuLi)3 Рис. Б. Общий вид одной из разновидностей двумерного спектра ЯМР (EXSY). Анализ двумерных спектров ЯМР является в настоящее время рутин- ной процедурой для химиков разного профиля и специалистов по молеку- лярной биологии. Такой анализ часто можно провести, изучая имеющиеся в двумерном спектре сигналы ЯМР. В результате анализа удается опреде- лить строение и конформацию молекул, масса которых вплотную прибли- жается к 1000 Дальтон. Однако для изучения таких биополимеров, как бел- ки и нуклеиновые кислоты и такой подход оказывается неэффективным. Для решения проблем такой сложности разработаны методики трехмерной 15
Предисловие спектроскопии ЯМР. Вид трехмерного спектра белкового объекта показан на рис. В. Как видим, здесь в спектре могут содержаться тысячи отдельных сигналов ЯМР, которые отвечают магнитным ядрам отдельных аминокис- лот. Выводы по такому спектру уже можно сделать только на основании его компьютерной обработки. Для этого существуют специальные про- граммы, которые широко используются в биологических и биохимических исследованиях. Результатом таких исследований чаще всего является мо- дель молекулы биополимера; которая лучше всего согласуется с измерен- ным спектром ЯМР. На рис. Г приведен пример модели одного из белков, данные о строении которого были получены методом ЯМР. 9 созСН) 6 Рис. В. Общий вид трехмерного спектра ЯМР. Существует совершенно особая разновидность объектов, которые мож- но изучать методом ЯМР, - это фрагменты живых организмов или же це- лые организмы, включая человека. Все такие объекты объединяет то, что они содержат воду, а в воде, как известно, имеются атомы водорода, кото- рые обладают сильным ядерным магнетизмом. Таким образом, имеется воз- можность изучать ЯМР-параметры воды в живых организмах. При этом, как правило, эксперимент ставят так, чтобы получить изображение изуча- емого объекта. Это дает возможность заглянуть внутрь организма анало- 16
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса гично тому, как это делалось уже давно с помощью рентгеновских уста- новок. Бесспорным преимуществом метода ЯМР является то, что облуче- ние организма радиоволнами не оказывает вредного влияния на организм, то есть такие исследования являются вполне безопасными медицинскими процедурами. Приборы для медицинских исследований методом ЯМР на- зываются томографами, а метод исследования - магнитной резонансной томографией (МРТ). Сейчас это отдельная область медицинской диагнос- тики со своими специфическими подходами к изучению различных орга- нов. Для примера на рис. Д приведена томограмма тазобедренного участка тела человека, полученная с помощью МРТ. Рис. Д. Томограмма тазобедренного участка тела человека. Как следует из приведенного выше краткого описания основных направ- лений использования метода ЯМР, он может быть применен в самых раз- ных целях. Физхимики с его помощью могут определять термодинамичес- кие параметры процессов молекулярного движения, химики-неорганики - строение и динамику комплексных соединений, химики-органики - строе- ние молекул органических соединений, биохимики - взаимодействие моле- кул с органеллами клеток, медики могут диагностировать многие заболева- ния. Описаны применения метода также и в геологии. Каждое из примене- ний метода имеет свои особенности, которые используются для решения задач определенного типа. Поэтому учебная литература по ЯМР должна быть ориентирована на специалистов определенного профиля. При написании данного учебного пособия мы поставили перед собой задачу донести основы метода ЯМР до исследователей, которые использу- 17
Предисловие ют или планируют использовать метод ЯМР для решения химических за- дач. Поскольку 90% исследований, в которых применяется данный метод, касаются органической химии, то мы, в первую очередь, ориентировались на химиков-органиков. Мы постарались написать книгу, которая помогла бы читателю освоить современные методики ЯМР "с нуля", то есть не имея практически никаких предварительных сведений о методе. Для этих целей, к сожалению, совершенно не подходят учебники, написанные до середины 90-х годов XX века, поскольку именно в последние годы промышленность стала выпускать спектрометры, на которых можно реализовать практичес- ки все известные методики ЯМР. Учебное пособие условно можно разбить на две части. В первой части (глава 1) мы рассмотрели вопросы интерпретации спектров ЯМР. Здесь мы полностью игнорировали физические основы метода, а рассматривали толь- ко способы извлечения из спектров ЯМР информации о строении молекул. Эта часть доступна для освоения даже студентам младших курсов, по- скольку материал носит описательный характер. Во второй части пособия (главы 2-5) рассмотрены физические основы экспериментов ЯМР. Однако и здесь мы постарались не включать в рассмотрение их математические основы, а описывали эксперименты с помощью подходящих механических моделей и аналогий. Тем не менее, мы надеемся, что читатель учебного по- собия получит о методе достаточно адекватное представление и сможет ис- пользовать метод ЯМР в своей повседневной работе. 18
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Глава 1. Интерпретация спектров 1.1. Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в химии К середине XX века химия стала одним из наиболее важных направлений науки. Она в значительной степени обеспечивала прогресс медицины, фар- мацевтики, легкой промышленности, авто- и авиастроения. Широко исполь- зовались химические разработки также и в области военных технологий. Основные достижения химии базировались на разработанных к тому вре- мени методах синтеза сотен тысяч и даже миллионов химических продук- тов с помощью многочисленных реакций между органическими и неор- ганическими соединениями. Однако в это время ощущался явный недоста- ток надежных методов установления строения синтезированных веществ. В середине XX века, как и в XIX веке, для исследования структуры хими- ческих соединений широко использовались методы классического элемент- ного и функционального анализа. Использование этих методов в повсе- дневной работе химиков существенно замедляло работу из-за необходи- мости проведения многочисленных и часто длительных экспериментов. Во многих случаях установление структуры синтезированных молекул требо- вало гораздо больше времени, чем собственно их синтез. Наиболее передо- вые лаборатории были оснащены ИК-спектрометрами, которые, хотя и по- зволяли в ряде случаев делать выводы о структуре молекул, однако часто не давали возможности различить молекулы близкой химической природы. Поэтому все время шли поиски методов, которые бы позволили облегчить решение этой задачи. Прорывом в данном направлении было открытие яв- ления ядерного магнитного резонанса (ЯМР). 1.1.1. История возникновения метода В 40-х годах XX века широко изучались радиотехнические устройства, способные генерировать и принимать радиоволны различного частотного диапазона. Результатом таких исследований явилось создание мощных пе- редатчиков и чувствительных приемников с регулируемым диапазоном из- лучения и приема радиоволн. Особый интерес представляли коротковол- новые приемники и передатчики, способные обеспечивать качественную радиосвязь. Естественно, изучалось и поглощение радиоволн различного диапазона разнообразными химическими объектами. Поскольку к тому вре- мени строение атома и его квантово-механическая модель были уже из- вестны, то физики предполагали, что поглощение радиоволн образцом, вне- сенным в магнитное поле, может существенно отличаться от поглощения в отсутствие магнитного поля. Это связано с тем, что в магнитном поле уве- личивается количество неэквивалентных энергетических уровней атома и 19
Глава 1. Интерпретация спектров соответственно изменяется спектр частот поглощения. В ходе таких экспе- риментов практически одновременно две группы американских ученых под руководством профессоров Эдварда Парсела и Феликса Блоха обнаружили такое поглощение радиоволн. Для опытов использовались самодельные ра- диотехнические устройства, которые позволяли облучать образец монохро- матическими радиоволнами в широком диапазоне частот при постепенном изменении частоты генератора и следить за поглощением радиоволн. Уже в ходе первых экспериментов стало понятно, что обнаруженное явление имеет весьма большие перспективы для практического использования. Так, на рис. 1.1 изображена фотография первого опубликованного спектра ЯМР этанола. В эксперименте сигнал (поглощение энергии) фиксировался с по- мощью осциллографа, луч которого двигался синхронно с изменением час- тоты генератора. Таким образом высота луча на экране оказывалась про- порциональной уровню поглощенной энергии. Рис. 1.1. Первый опубликованный спектр ЯМР-*Н высокого разрешения этанола. Видно, что протоны, которые различаются по химическому окру- жению, поглощают радиоволны различной частоты. Уже из приведенного на рисунке спектра можно сделать ряд важных выводов о строении молекулы. Так, спектр содержит три пика. Именно столько неэквивалентных групп протонов имеется в молекуле этанола. Ин- тенсивность сигналов различна. Так и должно быть исходя из формулы мо- лекулы, поскольку этанол содержит один гидроксильный протон, два про- тона метиленовой группы и три протона метильной группы. Все сигналы соответствуют поглощению радиоволн различной частоты. Из этого следу- ет, что на частоту поглощения магнитного ядра влияет его химическое ок- ружение. Таким образом, полученный рисунок (спектр ЯМР) позволяет де- лать однозначные выводы о расположении в молекуле этанола атомов во- дорода. Эксперименты ЯМР проводились как для жидких образцов, так и для кристаллических соединений. При этом было найдено, что жидкости 20
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса дают спектры со значительно более узкими сигналами, чем твердые образ- цы, поэтому в дальнейшем именно жидкости и растворы соединений в ор- ганических растворителях стали чаще всего использоваться для установле- ния строения химических соединений. 1.1.2. Первые спектрометры и первые спектры Метод ЯМР, пожалуй, - единственный физический метод исследования, который стал общедоступным уже через 10 лет после открытия явления ЯМР. Так, первые эксперименты по наблюдению эффекта ЯМР были опуб- ликованы в 1947 г., а первый промышленный спектрометр ЯМР был выпу- щен уже в 1953 г. В начале 60-х годов XX века уже все серьезные химичес- кие лаборатории мира были оснащены спектрометрами ЯМР, и это несмот- ря на то, что цена спектрометра никогда не была намного ниже 100 тыс. дол- ларов. Триумфальное внедрение метода ЯМР в практику научной работы было обусловлено многократным повышением производительности труда химиков при использовании метода ЯМР. Отпала необходимость проведе- ния длительного анализа каждого полученного соединения. Достаточно бы- ло зарегистрировать и проанализировать его спектр ЯМР, и многое в струк- туре молекулы становилось понятным. Весьма полезными спектры ЯМР оказались и для обнаружения примесей, поскольку они давали в спектре свои сигналы, интенсивность которых пропорциональна мольной доле при- меси. При измерении спектра ЯМР образец помещают в тонкостенную стек- лянную трубку диаметром 5 мм и растворяют его в подходящем раствори- теле, который, по возможности, не дает своих сигналов ЯМР. Трубку с об- разцом вводят в межполюсной зазор мощного магнита, где она попадает в радиотехническое устройство, которое называется датчиком. Датчик позво- ляет зафиксировать образец в строго определенной области магнитного по- ля. Поскольку датчик состоит исключительно из немагнитных материалов, то он не вносит возмущений в магнитное поле, созданное магнитом спект- рометра. Таким образом трубка с образцом оказывается внутри специаль- ной катушки, которая является частью излучателя передатчика и колеба- тельного контура чувствительного цриемника, работающего в УКВ-диапа- зоне. Схема такого эксперимента ЯМР приведена на рис. 1.2. Если имеется возможность плавно изменять частоту передатчика, то в какой-то момент эта частота будет совпадать с частотой поглощения каж- дого из имеющихся в образце магнитных ядер. В этот момент энергия пе- редатчика начнет поглощаться образцом и превращаться в энергию тепло- вого движения молекул. При этом разность потенциалов на выводах ка- тушки, в которую помещен образец, изменится. Это изменение после соот- ветствующего усиления можно зарегистрировать вольтметром. Если вместо 21
Глава 1. Интерпретация спектров вольтметра в схему включить самопишущий потенциометр и синхронизиро- вать его работу с изменением частоты передатчика, то получим графическое представление зависимости разности потенциалов на выводах катушки дат- чика от частоты генератора. Поскольку изменение разности потенциалов пропорционально интенсивности поглощения радиоволн, то полученный график, если его соответствующим образом откалибровать, представляет собой зависимость интенсивности поглощения радиочастотного облучения от его частоты. Эта зависимость и называется спектром ЯМР. С помощью простейшего спектрометра ЯМР можно было измерять спектры лишь на наиболее чувствительных магнитных ядрах, таких как 19F, 31Р. Для при- мера на рис. 1.3 приведен спектр амида пропионовой кислоты 1.1, изме- ренный на приборе первого поколения. При этом для измерения требова- лось 20-50 мг вещества в зависимости от его молекулярной массы. передатчик усшштвль Л________1_ радиочастот- ный мост самописец ’7 ампула с образцом Рис. 1.2. Общая схема эксперимента ЯМР. Перечислены основные устрой- ства, необходимые для регистрации спектра ЯМР. Как видим, качество данного спектра намного превышает качество спектра этанола, который показан на рис. 1.1. Здесь видны не только сигна- лы неэквивалентных протонов, но и хорошо заметно, что каждый из сигна- лов может состоять из нескольких компонентов. Так, сигнал метиленовых протонов расщеплен на 4 компонента, а сигнал метильных протонов - на три. Вначале такое расщепление называли сверхтонким взаимодействием. Сейчас для него используют другой термин - спин-спиновое взаимодейст- вие (ССВ), который лучше отражает его природу. Расщепление возникает за счет взаимодействия магнитных ядер (их часто называют спинами) с со- седними магнитными ядрами. Поскольку ССВ подчиняется строгим прави- лам, то по количеству компонентов сигналов (расщепленные сигналы на- 22
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса зывают еще мультиплетами) можно судить об окружении магнитных ядер, что тоже весьма полезно для определения строения молекул. Рис. 1.3. Спектр амида пропионовой кислоты 1.1, измеренный на приборе первого поколения с рабочей частотой 60 МГц. 1.1.3. Для чего спектрометру магнит? Из школьного курса химии известно, что атомы химических элементов со- стоят из ядер, несущих положительный заряд, и отрицательно заряженных электронов. Электроны атомов представляют собой квантовые частицы. Это означает, что их энергия не может изменяться плавно - она изменяется скачками. При таком скачке атом переходит из одного энергетического состояния в другое. Поскольку такие состояния определяются внутренни- ми свойствами атома, то их называют энергетическими уровнями. Энергию перехода с одного энергетического уровня на другой (ДЕ) в соответствии с постулатом Планка можно выразить уравнением: AE = hv, (1.1) где h - постоянная Планка, а V - частота электромагнитного излучения, ко- торая поглощается или выделяется при переходе. Количество энергетичес- ких уровней в атоме фиксировано. Оно определяется квантовыми числами. Есть четыре квантовых числа: п - главное квантовое число, 1 - орбитальное квантовое число, m - магнитное квантовое число и s - спиновое квантовое число. В атоме имеются энергетические уровни электронов, которые отве- чают всем возможным наборам квантовых чисел. Все энергетические уров- ни в атоме не одинаковы по энергии. Исключением являются уровни, кото- 23
Глава 1. Интерпретация спектров рые различаются только значением спинового квантового числа. Такие пе- реходы называются вырожденными, то есть энергия для них одинакова. Таким образом, для электронов атома при его возбуждении электромагнит- ным излучением можно наблюдать все возможные переходы за исключе- нием тех, которые отвечают изменению спинового квантового числа. Снять вырождение переходов, обусловленное изменением спинового квантового числа, можно, если поместить атом в магнитное поле. В этом случае энер- гия таких переходов становится неодинаковой и наблюдается появление новых полос поглощения. Это свойство электронов используется в элект- ронном парамагнитном резонансе (ЭПР), который по своей физической природе весьма близок к ЯМР. Метод ЭПР был открыт в 1944 г. советским исследователем Е.К. Завойским. Ядро атома также имеет свои энергетические уровни. Однако, в отли- чие от электронов атома, энергетические уровни ядра описываются исклю- чительно спиновым квантовым числом, которое определяется числом нук- лонов, входящих в состав ядра. Поэтому в случае, если на ядро атома не действует внешнее магнитное поле, то все его энергетические уровни име- ют совершенно одинаковую энергию и переходы между ними невозможно зафиксировать. Если же поместить ядро атома в магнитное поле, то проис- ходит снятие вырожденности уровней. Во внешнем магнитном поле между энергетическими уровнями ядра возникает разница в энергии, что позво- ляет наблюдать переходы между ними. Чем сильнее магнитное поле, тем больше разница энергий уровней и тем легче зафиксировать поглощение энергии при облучении ядра электромагнитными волнами подходящей дли- ны волны. Именно поэтому стараются, чтобы спектрометр ЯМР содержал магнит, который создает как можно более сильное магнитное поле. Это способствует повышению чувствительности метода. Поскольку спиновое квантовое число у различных магнитных ядер мо- жет быть неодинаковым, то различается и количество неэквивалентных энергетических уровней, которые образуются в магнитном поле. Вследст- вие этого вводится понятие спина магнитного ядра. Минимальное значе- ние спинового квантового числа, s, равно Vi. Для таких ядер в магнитном поле возникают только два неэквивалентных уровня. Если спиновое кван- товое число равно 1, то таких уровней возникает 3, если s = 3/2, то воз- никают 4 уровня и т.д. Наиболее удобны для исследования ядра со спином s = 1/2. К таким ядрам относятся ядра 1Н, 13С, 31Р, 19F. 1.2. Простейшие спектры ЯМР Существует количественное соотношение между силой магнитного поля, в котором находится образец, и частотой электромагнитного излучения, по- 24
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса глощающегося атомным ядром. Это уравнение иногда называют основным уравнением ЯМР. Оно имеет вид: у = уНо/2л, (1.2) где v - частота поглощения, Но - сила внешнего магнитного поля, у - коэф- фициент пропорциональности, который зависит от количества нуклонов в магнитном ядре. Данный коэффициент называют гиромагнитным соотно- шением, поскольку он определяет связь магнитного и механического мо- ментов ядра. Важным следствием уравнения (1.2) является то, что частота поглощения пропорциональна напряженности магнитного поля. Это зна- чит, что добиться поглощения электромагнитной энергии образцом можно либо путем изменения напряженности магнитного поля, либо изменением частоты облучения при неизменном магнитном поле. Оба способа возбуж- дения ядра оказываются эквивалентными с точки зрения конечного спект- ра ЯМР. По спектру невозможно определить, какой именно параметр изме- нялся при получении спектра. В соответствии с уравнением (1.2) между частотой поглощаемой энер- гии и напряженностью внешнего магнитного поля имеется коэффициент пропорциональности у. Гиромагнитное отношение для различных ядер мо- жет существенно различаться. Наибольшую величину оно имеет для лег- ких магнитных ядер, таких как *Н, 19F, 13С, 31Р. Соответственно сигнал ЯМР для таких ядер имеет большую величину. Это связано с тем, что в соответст- вии с уравнением (1.1) ДЕ пропорциональна частоте поглощения, а следо- вательно, и гиромагнитному отношению. Тяжелые магнитные ядра, как пра- вило, имеют небольшую величину гиромагнитных отношений, что приво- дит к слабым сигналам ЯМР и низкой частоте поглощения. Ситуация, однако, осложняется тем, что химические элементы в боль- шинстве случаев представляют собой смесь различных изотопов. Изотопы имеют различные величины гиромагнитных соотношений, поэтому они по- глощают совершенно разные частоты электромагнитных колебаний. Кроме того, ряд изотопов может и вовсе не иметь магнитных свойств. Это происхо- дит тогда, когда ядро имеет четное количество как нейтронов, так и прото- нов. В этом случае магнитные моменты нуклонов взаимно компенсируют друг друга и ядро оказывается немагнитным. Такая ситуация реализуется для изотопов 12С и 16О, которые являются основными компонентами при- родной смеси изотопов углерода и кислорода, соответственно. Изотоп 13С составляет всего 0.8% в природной смеси изотопов, поэтому его сигнал до- статочно слаб, несмотря на значительную величину гиромагнитного соот- ношения. Казалось бы, в одном эксперименте ЯМР можно получить сигналы всех магнитных ядер, которые входят в состав образца. Так, для органичес- 25
Глава I. Интерпретация спектров ких соединений можно получить сигналы таких атомов, как водород, кис- лород, углерод, фтор и азот. Если учесть гиромагнитные отношения для ядер *Н, l9F, |7О и 15N и предположить, что названные изотопы имеют в об- разце 100%-ное содержание, то для поля напряженностью 10 Тесла мы бы получили примерно такой спектр, как тот, что изображен на рис. 1.4. Рис. 1.4. Гипотетический спектр ЯМР органического соединения одновре- менно на нескольких Магнитных ядрах на спектрометре с полем напряжен- ностью 10 Тесла. Однако на самом деле данный спектр получить практически невозмож- но, поскольку, даже если побороть технические трудности, возбуждение такого широкого диапазона частот требует использования исключительно мощных импульсных генераторов или неприемлемо большого времени развертки спектра. Кроме того, препятствием для работы спектрометра од- новременно на нескольких магнитных ядрах является то, что в реальных образцах невозможно получить 100%-ное содержание многих изотопов, таких, например, как |7О и 15N. Поэтому настройка спектрометра на усиле- ние, соответствующее распространенным магнитным ядрам, таким как *Н или i9F, не будет соответствовать оптимальным условиям измерения на ред- ких ядрах. Поэтому спектры ЯМР измеряются исключительно на од- ном магнитном ядре. Если необходимо измерять спектры на нескольких 26
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ядрах, то проводят соответствующее количество независимых эксперимен- тов с последовательным возбуждением каждого из магнитных ядер. В ре- зультате для образца получают несколько различных спектров ЯМР. Ниже мы приведем примеры простых спектров ЯМР на распространенных маг- нитных ядрах и на редких ядрах. В качестве примера для этого будут ис- пользованы соответственно ядра !Н и 13С. 1.2.1. Почему возникает спектр ЯМР? Если бы все магнитные ядра одного типа, которые содержатся в образце, да- вали один сигнал ЯМР, то измерять спектры ЯМР для установления строения химических соединений не имело бы никакого смысла. Однако, к счастью, это не так. Все неэквивалентные с химической точки зрения магнитные ядра дают сигналы при несколько различных частотах (при развертке спектра за счет изменения частоты) либо в разных магнитных полях (при развертке спектра за счет изменения напряженности магнитного поля). Это связано с тем, что при измерении спектров ЯМР образцов химических соединений маг- нитные ядра, которые входят в их состав, окружены электронными оболоч- ками, причем свойства электронной оболочки в точках локализации различ- ных ядер неодинаковы. Электронную оболочку можно себе представить в виде облака, которое окружает ядро атома. В простейшем случае, если мы имеем дело с атомом водорода, электронное облако имеет вид сферы. В каж- дой точке электронного облака существует вполне определенная вероятность существования электрона. Электрон, как и протон, имеет магнитный момент. Поэтому в магнитном поле электрон взаимодействует с этим полем. Такое взаимодействие проще всего представить себе, если считать, что поведение электрона аналогично поведению в магнитном поле стрелки компаса, которая, как известно, всегда указывает на север, как бы мы не вращали корпус компаса. Аналогично и электрон, в какой бы точке электронного облака он не находился, имеет маг- нитный момент, ориентированный вдоль линий магнитного поля. Коль скоро электрон и сам является магнитом, то он способен создавать собственное магнитное поле. В случае, если электрон имеет фиксированную ориентацию, то его поле накладывается на внешнее магнитное поле. Таким образом, вбли- зи электрона магнитное поле оказывается неодинаковым - оно зависит от плотности электронного облака и расстояния до него. Можно математически рассчитать для электронных оболочек различной формы, каким будет поле электрона в точке локализации атомного ядра. Оказывается, что оно чаще всего противоположно направлению внешнего магнитного поля. Поэтому суммарное локальное магнитное поле, в котором находится ядро (Нлок), не- сколько меньше, чем поле Но. 27
Глава 1. Интерпретация спектров Итак, локальное магнитное поле, в котором находится ядро, определяется соотношением: Нлок = Н0-оНо = Но(1 -о). (1.3) Безразмерный параметр о называется постоянной экранирования. Он учитывает электронное (химическое) окружение, в котором находится ядро. В одноатомных молекулах постоянная экранирования всегда положительна, то есть реальное магнитное поле в месте нахождения ядра всегда оказывается меньшим, чем Но. Величина а изменяется от 10~5 для протонов до 10"2 для дру- гих ядер. Описанное экранирование называют диамагнитным. Результат его дейст- вия - смещение сигналов ЯМР в область сильных полей относительно сиг- нала ’’голого” ядра ХН+ Термин ’’сильное поле” предполагает, что разверт- ка спектра осуществляется путем изменения силы магнитного поля. Хотя спектр ЯМР может быть получен различными методами, условились счи- тать, что увеличение п соответствует смещению сигнала в сильное поле, даже если поле при измерении спектра оставалось неизменным, а менялась частота облучения. На спектре, записанном на бумаге, область сильного поля располо- жена справа. Поэтому чем сильнее экранировано магнитное ядро, тем правее в спектре будет располагаться его сигнал. В многоатомных молекулах сферическое распределение электронов вокруг атомных ядер в значительной мере нарушается. Вследствие этого величины диамагнитных смещений сигналов ЯМР могут быть существен- но меньшими, чем в одноатомных молекулах. Удобнее всего считать, что в многоатомных молекулах постоянная экранирования имеет две составля- ющие - диамагнитную и парамагнитную: & = Одна + ^пара> (1.4) где Пиара отображает уменьшение экранирования ядра, которое обусловлено асимметрией электронной оболочки. В некоторых молекулах пПара может быть большей, чем n^a. В этом случае сигналы ЯМР будут смещаться не в сильное, а в слабое магнитное поле. В отличие от экранирования такой эффект называют дезэкранированием. Таким образом, независимо от того, какой из факторов смещения сигналов доминирует, формула для резонансной частоты реальных ядер V,, кото- рые входят в состав химического соединения, имеет такой вид: vi = YH0(l-Qi)/2n. (1.5) 28
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Отсюда можно сделать важный для химиков вывод. Если получен сиг- нал ЯМР ядер одного и того же самого изотопа для молекулы химического сое- динения, которое содержит магнитные ядра в разном химическом окружении, то вместо одного резонансного сигнала с частотой уНо/2л появляется целый ряд сигналов с частотами, которые определяются соотношением (1.5). Это и есть спектр ЯМР, вид которого определяется постоянными экранирования су, магнитных ядер, которые входят в состав исследуемого соединения. 1.2.2. Спектры на ядрах !Н _ В соответствии с уравнением (1.2) для достижения условий резонанса мож- но либо постепенно изменять частоту генератора, либо изменять напряжен- ность внешнего магнитного поля. Результатом в любом случае будет полу- чение спектра ЯМР, причем вид его не зависит от того, какой именно па- раметр изменялся - частота или напряженность поля. Измерение спектров ЯМР на первых спектрометрах производилось путем постепенного изме- нения силы внешнего магнитного поля. Это достигалось с помощью специ- альной катушки, расположенной в межполюсном зазоре. Постепенное из- менение силы тока в этой катушке приводит к изменению поля в точке ло- кализации образца. При этом последовательно достигаются условия резо- нанса для всех магнитных ядер выбранного изотопа. Если изменение силы поля синхронизировано с самописцем, регистрирующим напряжение на выводах катушки датчика, то самописец будет регистрировать спектр ЯМР. Однако чтобы воспользоваться таким спектром, необходимо иметь возможность каждый из полученных пиков охарактеризовать количествен- но. Казалось бы, наиболее просто было бы определять частоты поглощения пиков, поскольку каждому значению магнитного поля соответствует стро- го определенная величина частоты поглощения. Однако на самом деле па- раметры сигналов спектра, полученные таким образом, оказываются не слишком удобными для восприятия. Пример такого спектра для 2-фенил- этилового спирта, измеренный в поле 9.4 Тесла, показан на рис. 1.5а. Здесь шкала частот соответствует истинным частотам поглощения магнитных ядер в имеющемся магнитном поле, если считать, что частота 400 МГц от- вечает сигналу, расположенному в самом сильном поле. Видно, что часто- ты отдельных сигналов представляют собой многозначные числа, которые весьма трудно сравнивать между собой. Они различаются только в шестом знаке после запятой. Аналогичный результат получается и в случае, если спектр отградуировать в единицах силы магнитного поля. При такой градуи- ровке для каждого из пиков получаются значения поля, которые различа- ются только в шестом знаке после запятой, а предыдущие значащие цифры оказываются совершенно одинаковыми. /' 29
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.5. Фрагмент спектра на ядрах *Н 2-фенилэтанола 1.2, измеренный на спектрометре, имеющем магнит с напряженностью поля 9.4 Тесла. Шкала соответствует истинным частотам поглощения магнитных ядер (а) и Гер- цам (б). Проще всего избавиться от лишних значащих цифр при определении частот поглощения неэквивалентных магнитных ядер, если считать, что час- тота одного из сигналов равна нулю. Это эквивалентно вычитанию из ис- тинной частоты пика частоты спектрометра в Гц. В этом случае мы изме- ряем не частоты поглощения, а разности частот поглощения пиков в спект- ре. Для этого фактически используется формула (1.6): V = (Vi-V0), (1.6) где Vo - частота спектрометра в Гц. Результат такой обработки спектра представлен на рис. 1.56. Хотя спектром, представленным в таком виде, уже можно пользоваться, однако возникают трудности в сравнении частот поглощения пиков в спектрах 30
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса различных соединений, поскольку в них за нуль шкалы будут приняты раз- личные точки спектра. Для того, чтобы избавиться от этого недостатка, к каждому измеряемому образцу добавляют небольшую порцию одного и то- го же соединения, которое имеет в спектре интенсивный единичный сиг- нал. Именно этому сигналу и присваивают значение 0 Гц. Положение этого сигнала практически не изменяется от одного образца к другому, поэтому можно сравнивать величины v для различных образцов. Добавляемое хи- мическое соединение в спектроскопии ЯМР называют стандартом. Для спектров на ядрах !Н и 13С стандартным соединением (эталоном) является тетраметилсилан (CH3)4Si. При определении частот пиков по формуле (1.6) оказывается, что ре- зультат, полученный для одного и того же соединения на спектрометрах, имеющих магниты с различным магнитным полем, будет различным. Чем более мощным является магнит спектрометра, тем большей будет разность частот в Гц между сигналом эталона и сигналами образца. Поэтому, если частоты пиков определены в Гц, всегда следует указывать частоту спектро- метра, на котором произведены измерения. Для того, чтобы положения пиков в спектре не зависели от частоты спектрометра, параметры сигналов измеряют в специфических единицах, которые называют миллионными долями (от частоты спектрометра). В этом случае положение в спектре произвольного сигнала vt можно найти по формуле: А = (Vj — Vo)/VcneKTpoMCTpa» (1*7) где Vi и Vo - частоты пиков образца и стандарта в Гц, VcneKrpoMerpa - частота спектрометра в МГц. Если частота спектрометра для данного ядра составляет, например, 400 МГц, то vCneicrpoMCTpa = 400 МГц. Величины А обычно не превышают 1000 даже для магнитных ядер с большим диапазоном частот поглощения. Расстояние между центром любого пика в спектре и сигналом эталона, выраженное в миллионных долях, называется химическим сдвигом сигна- ла. На рис. 1.6 приведен спектр 2-фенилэтанола 1.2 на ядрах *Н, где поло- жения сигналов и шкала частот показаны в миллионных долях (м.д.). Вид- но, что в данном случае сравнение положений сигналов не вызывает ника- ких проблем. Поэтому именно в таком виде химикам и приходится сталки- ваться со спектрами ЯМР. Чаще всего спектрометр ЯМР или программа обработки спектра заранее настраивается таким образом, что пики в спект- ре определяются в м.д. Поэтому пользователю обычно не приходится само- стоятельно производить оцифровку сигналов в спектре. 31
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.6. Спектр на ядрах !Н 2-фенилэтанола 1.2, измеренный на спектро- метре, имеющем магнит с напряженностью поля 9.4 Тесла. Шкала соответ- ствует миллионным долям от величины поля. Стандарт - ТМС - имеет сиг- нал при 0 м.д. Информативность спектра не меняется от того, где, слева или справа, в нем находятся сигналы, которые поглощают в более сильном магнитном поле (если развертка спектра осуществляется за счет изменения напряжен- ности магнитного поля). Однако принято, что более сильные поля в спектре находятся справа. Следует отметить, что, каким бы образом не производилась развертка спектра - изменением напряженности поля, изме- нением частоты или путем импульсного возбуждения, спектр получается одинаковым. Поэтому его всегда представляют в таком виде, что ’’область сильных полей” расположена в нем справа. Это правило справедливо для спектров на любых магнитных ядрах. Такая стандартизация вида спектра позволяет более наглядно представлять воздействие различных факторов на положение сигналов в спектрах ЯМР. 1.2.3. Спектры на ядрах 13С В предыдущем разделе был рассмотрен спектр на протонах. Протоны име- ют 100%-ное естественное содержание в природной смеси изотопов и боль- шой магнитный момент. Поэтому спектры на ядрах !Н имеют максимально 32
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса возможную интенсивность. Однако такая ситуация является скорее исклю- чением, чем правилом. Поэтому спектры на подавляющем большинстве магнитных ядер имеют интенсивность сигналов в тысячи, а иногда и в мил- лионы раз меньше интенсивности сигналов протонов. Поэтому первые спектрометры ЯМР, в которых спектр получался за счет развертки магнит- ного поля (или частоты), были приспособлены исключительно для измере- ния протонных спектров. Иногда на них можно было измерять спектры на ядрах 19F и 31Р, однако для этого требовалось, чтобы образец растворялся в концентрации 20-30%. Измерение спектров для других магнитных ядер было возможно только для жидких образцов. Поэтому первой задачей раз- работчиков спектрометров ЯМР стало повышение чувствительности при- боров. Прорыв произошел в 70-е годы XX века, когда доступной стала компьютерная техника. Появилась возможность запоминать спектр в памя- ти компьютера. Это дало возможность многократно повторять эксперимент ЯМР, накапливая в памяти полезный сигнал. На таких приборах удавалось уже измерять спектры на самых разнообразных магнитных ядрах. Наибо- лее важной оказалась спектроскопия на ядрах 13С, поскольку углерод вхо- дит в состав большинства химических соединений. Конечно, в отличие от измерения спектров на протонах, такие эксперименты требовали намного больше времени - если протонный спектр измерялся за 5-20 минут, то спектр на ядрах 13С требовал 1-12 часов. Однако информативность угле- родных спектров компенсировала дополнительные затраты времени, по- скольку давала возможность делать выводы об углеродном скелете моле- кул органических соединений. Для примера приведем углеродный спектр того же 2-фенилэтанола 1.2, протонный спектр которого мы видели в пре- дыдущем разделе. Он изображен на рис. 1.7. Сравнение данного спектра со спектром на ядрах !Н показывает, что углеродный спектр намного сложнее протонного. Это связано с тем, что в молекулах органических соединений, как правило, количество неэквива- лентных углеродных атомов превышает количество неэквивалентных про- тонов. Кроме того, углеродные сигналы часто расщеплены на большое ко- личество компонентов, что затрудняет интерпретацию спектров. Поэтому, если из спектра требуется найти только количество неодинаковых атомов углерода и их химические сдвиги, то спектр измеряют в таких условиях, чтобы сигналы ЯМР в нем не расщеплялись. Для этого были разработаны приемы, которые будут освещены ниже (декаплинг). Если измерять спектр в таких условиях, то он будет иметь вид, показанный на рис. 1.8. Как видим, спектр оказался значительно проще того, который показан на рис. 1.7. В нем легко можно найти сигналы четырех неэквивалентных ароматических атомов углерода в слабом поле и сигналы двух метилено- вых групп в сильном поле. 33
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.7. Спектр 2-фенилэтанола 1.2 на ядрах 13С. Ноль шкалы соответству- ет расположению сигнала ТМС. Сигналы фенила ОСН2 PhCH2 4135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 55 50 75 70 65 60 55 50 45 40 35 Рис. 1.8. Спектр 2-фенилэтанола 1.2 на ядрах 13С в условиях ликвидации расщепления сигналов (при декаплинге). 34
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Если сравнить данный спектр со спектром на протонах (рис. 1.5), то помимо различий в них имеется много общего. Так, в обоих спектрах в сла- бом поле расположены сигналы магнитных ядер, которые входят в состав бензольного кольца. В более сильном поле располагаются сигналы метиле- новых групп, причем в обоих спектрах сигнал группы СН2, связанной с атомом кислорода, располагается в более слабом поле, чем сигнал второй метиленовой группы. Существенным отличием спектров на ядрах ’Н и 13С является диапазон сигналов. Если в протонном спектре максимальное расстояние между сиг- налами не превышало 10 м.д., то в углеродном спектре оно достигает сотен м.д. Каждое магнитное ядро имеет свой диапазон сигналов, поэтому усло- вия измерения спектров должны быть согласованы с этим диапазоном. В эксперименте мы должны видеть все имеющиеся сигналы. Для этого диа- пазон развертки спектра (ширина спектра, SW) должен быть несколько больше диапазона имеющихся сигналов. 1.2.4. Спектроскопия ЯМР на различных магнитных ядрах В принципе возможно измерение спектров ЯМР на всех магнитных ядрах. Однако не всегда это сделать одинаково легко. Это связано с различной ин- тенсивностью сигналов ЯМР различных ядер и большим влиянием свойств ядра на ширину сигналов. Представление о том, насколько различается ин- тенсивность сигналов различных магнитных ядер при одинаковом их облу- чении электромагнитным полем соответствующей частоты, можно полу- чить, если сравнивать между собой сигналы различных ядер. Принято счи- тать, что интенсивность сигнала ядер !Н равна единице. Тогда интенсив- ность сигнала других ядер может быть найдена как отношение интенсивнос- ти сигнала ядра X к интенсивности сигнала протонов. Эти величины для важнейших магнитных ядер приведены в таблице 1.1. Таблица 1.1. Свойства важнейших ядер со спином Уг Изотоп Естественное содержание (%) ЯМР частота* (МГц) Интенсивность относительно сигнала ЯМР на ядрах 1 2 3 4 ’н 99.98 400.0 1.0 Зн 0 426.7 1.2** 13с 1.11 100.6 1.76 х 10-4 15n 0.37 40.5 3.85 х 10-6 ,9f 100.00 376.3 0.83 35
Глава 1. Интерпретация спектров 1 2 3 4 29Si 4.7 79.5 3.69 x 10"1 31р 100.00 161.9 6.63 x 10’2 77Se 7.58 76.3 5.25 x 10^* l03Rh 100.00 12.6 3.11 x 10’5 ll3Cd 12.16 88.7 1.33 x 10’3 ,l9Sn 8.58 149.1 4.44 x 10’3 183W 14.40 16.6 1.03 x 10’5 l95Pt 33.80 86.0 3.36 x 10’3 2°7pb 22.60 83.7 2.07 x 10'3 * Частоты приведены для спектрометра на 400 МГц (магнит 9.4 Тесла). Чувстви- тельности даны относительно протонов. Они включают сомножители чувствитель- ности ядра и его естественного содержания. ** При условии 100%-ного обогащения 3Н. Из данных таблицы 1.1 видно, что интенсивность сигналов ядер X, как правило, значительно меньше интенсивности сигналов протонов, причем различия интенсивности могут составлять несколько порядков. Этому есть две основные причины. Во-первых, ядра различаются по величине магнит- ного момента, поэтому в магнитном поле образец имеет разную намагни- ченность; во-вторых, многие элементы представляют собой смесь изотопов, в которой изучаемое магнитное ядро представлено лишь очень небольшим вкладом. Так, например, магнитный изотоп углерода 13С содержится в ес- тественной смеси изотопов в концентрации около 0.8%. Поэтому, естест- венно, его сигнал будет достаточно слабым. В зависимости от интенсив- ности сигнала ЯМР методика измерения спектров различных магнитных ядер может существенно различаться. В таблице 1.1 сведены магнитные ядра, для которых в спектре наблюдаются узкие сигналы. Именно эти ядра изучать наиболее просто. Все другие ядра дают сигналы, ширина которых составляет 0.1-10 кГц. Поэтому их изучать достаточно сложно даже при большой величине магнитного момента ядра и высоком его содержании в природной смеси изотопов. 1.3. Параметры спектров ЯМР Если бы не существовало строгих зависимостей вида спектра ЯМР от хи- мического строения молекулы, то спектроскопия ЯМР никогда бы не за- воевала доминирующего положения в исследованиях структуры химичес- ких соединений. Существование таких зависимостей предполагает, что каждый из сигналов может быть описан совокупностью нескольких пара- 36
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса метров, которые отражают количественную связь со структурой молекулы. Таких параметров имеется три. Первый, уже знакомый нам параметр, который отражает положение сигнала в спектре ЯМР, называется химическим сдвигом. Он характери- зует частоту электромагнитного излучения, которая поглощается образцом при формировании данного сигнала. Второй параметр сигналов ЯМР - это их интенсивность. Здесь имеется в виду относительная интенсивность сигналов - одного по сравнению с дру- гим. Если измеряется спектр образца, в котором присутствует несколько неэквивалентных ядер одного типа, то для этих ядер сигналы могут иметь различную интенсивность в зависимости от того, сколько одинаковых маг- нитных ядер образует тот или иной сигнал. Поэтому в спектре ЯМР интен- сивности сигналов относятся друг к другу как целые числа, пропорцио- нальные количеству ядер, образующих сигнал. Ядра атомов, имеющих одинаковый химический сдвиг, называют магнитно-эквивалентными. Третьим параметром сигнала является его форма. Она также определя- ется несколькими факторами. Наибольшее воздействие на форму сигнала оказывают свойства магнитного ядра, на котором происходит измерение. Одни ядра, такие как !Н, 13С, 31Р и другие ядра, приведенные в таблице 1.1, дают узкие сигналы, ширина линий в которых составляет 1-3 Гц. Другие ядра, напротив, дают сигналы с шириной 10-10000 Гц. К сожалению, таких ядер большинство. Они называются квадрупольными ядрами, поскольку имеют несимметричное распределение электрического заряда по поверх- ности ядра. Если ядро не является квадрупольным, то есть если оно дает узкие сиг- налы, то оно способно ощущать присутствие поблизости от себя других магнитных ядер. Это проявляется в расщеплении сигнала на несколько компонентов. Такое расщепление называется спин-спиновым взаимодейст- вием. Ниже каждый из параметров спектра будет обсужден более подробно. 1.3.1. Химические сдвиги Как мы уже знаем, химические сдвиги магнитных ядер в химических соеди- нениях определяются магнитным полем электронного облака в точке ло- кализации ядра и магнитными свойствами этого ядра. Воздействие хими- ческого окружения на химические сдвиги удобнее всего обсуждать как со- вокупность нескольких факторов, воздействующих на частоту поглощения ядра независимо (аддитивно). Различают три основных фактора, совмест- ное воздействие которых определяет химические сдвиги: электронное влияние заместителей, влияние полей магнитно-анизотропных групп, взаимодействие магнитных ядер и электронов через пространство (не- связанное взаимодействие). 37
Глава 1. Интерпретация спектров Электронное влияние заместителей состоит в изменении электронной плотности возле магнитных ядер, которые расположены вблизи от функ- циональной группы, причем влияние передается через несколько связей, а иногда может распространяться и на всю молекулу. Тем не менее, вследст- вие быстрого затухания электронного влияния при передаче по цепи орди- нарных связей оно чаще всего перестает ощущаться уже через две-три связи. Заместители, которые имеют -I- или -М-эффект, оттягивают электронную плотность на себя, а заместители с +1- и +М-эффектом смещают электроны на близлежащие атомы. Наличие в молекуле заместителей с -1-эффектом предопределяет смещение сигналов протонов в сторону слабого поля, по- скольку уменьшение плотности электронного облака приводит к уменьше- нию экранирования магнитных ядер. Так, в нитрометане протоны метиль- ной группы поглощают в значительно более слабом поле (5 = 4.3 м.д.), чем метильная группа бромметана (5 = 2.15 м.д.), поскольку -1-эффект нитро- группы сильнее, чем у атома брома. Заместители с +1-эффектом влияют на химические сдвиги соседних протонов противоположным образом. Замес- тители, имеющие -М- и +М-эффект, характеризуются влиянием в целом аналогичным тому, которое имеют заместители соответственно с -I- и -1-1-эф- фектом. Итак, во всех случаях, когда электронная плотность оттягива- ется от магнитного ядра, его сигнал в спектре ЯМР смещается в сла- бое поле, а если электронная плотность возле ядер возрастает, то его сигнал смещается в сильное поле. Некоторые функциональные группы в молекуле органического соеди- нения могут влиять на химические сдвиги близлежащих магнитных ядер и по другому механизму. К таким группам относятся те, которые имеют в своем составе атомы, связанные двойной или тройной связью. При обра- зовании кратных химических связей в молекуле имеются протяженные мо- лекулярные л-орбитали, которые охватывают сразу несколько атомов. При внесении молекулы в постоянное магнитное поле в этих орбиталях воз- никают локальные электронные токи специфической формы. Магнитное поле, которое создается этими токами, сильно неоднородно (анизотропно). Поэтому, в зависимости от расположения магнитных ядер относительно л-орбиталей, их сигналы могут смещаться как в слабое, так и в сильное по- ле. Функциональные группы, которые служат причиной такого влияния, называются магнитно-анизотропными. К ним относятся, прежде всего, группы с кратными связями, а также бензольное кольцо. Третий механизм влияния одних атомов молекулы на другие реализу- ется, если протоны или другие магнитные ядра размещены в пространстве настолько близко, что их электронные оболочки начинают заметно взаимо- действовать (ван-дер-Ваальсовое взаимодействие). В этом случае происхо- дит смещение сигналов в слабое поле. При сближении протонов такой эф- 38
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса фект наблюдается тогда, когда расстояние между ними Д становится меньше 0.2 нм. Примером соединения, для ft \—) \ которого наблюдается такое взаимодействие, является у__/ \) фенантрен 13. Данный эффект называется несвязанным \ / взаимодействием. н н Сигнал двух указанных протонов смещен в слабое 13 поле больше, чем на 0.64 м.д., относительно сигналов других протонов мо- лекулы. Определенный вклад в это смещение вносит также эффект кольце- вых токов противоположного бензольного ядра. 1.3.1.1. Воздействие на химические сдвиги функциональных групп Для того, чтобы понять, как именно функциональные группы влияют на хи- мические сдвиги близлежащих магнитных ядер, прежде всего рассмотрим, какое магнитное поле создает вокруг себя точечный магнитный диполь. Его проще всего представить себе в виде микроскопического магнита. Раз- меры магнита таковы, что его можно считать одной точкой, которая имеет ощутимый магнитный момент. Если то- чечный магнитный диполь поместить в магнитное поле, то он ориентируется в этом поле таким образом, чтобы иметь минимально возможную энергию. При этом Северный полюс точечного дипо- ля будет направлен к Южному полюсу внешнего магнитного поля. Таким об- разом, поведение точечного диполя в магнитном поле совершенно аналогич- но поведению стрелки компаса. Вид магнитного поля, которое создает вок- руг себя точечный диполь, изображен на рис. 1.9. Рис. 1.9. Форма магнитных сило- вых линий поля, которое создает вокруг себя точечный диполь М, ориентированный во внешем по- ле Во против поля. Как следует из направления магнитных силовых линий поля магнит- ного диполя, для различных точек пространства может наблюдаться как совпадение направления магнитных силовых линий с направлением внеш- него поля, так и их противоположная ориентация. Соответственно магнит- ный диполь может смещать сигналы близлежащих магнитных ядер как в сильное, так и в слабое поле в зависимости от их расположения относи- тельно вектора магнитного поля точечного диполя. В точках пространства, где магнитные силовые линии диполя совпадают с направлением внешнего магнитного поля, реальное магнитное поле увеличивается, поэтому сигна- лы ЯМР для магнитных ядер, которые находятся в этих точках, будут по- 39
Глава 1. Интерпретация спектров глощать в более слабом магнитном поле, то есть для них будет наблюдаться дезэкранирование. Количественно воздействие точечного диполя на маг- нитные моменты близлежащих магнитных ядер изучил Мак-Коннел. Он вывел формулу, которая позволяет произвести вычисление этого воздейст- вия, Д8: Д5 = К( 1 - 3cos20)/R3, (1.8) где 0 - угол между направлением диполя и направлением на соседнее маг- нитное ядро, R - расстояние от ядра до диполя, Д8 - изменение химическо- го сдвига ядра, К - константа для ядер данного типа. Из формулы следует, что воздействие магнитного диполя быстро убы- Рис. 1.10. Конусы анизотро- пии для точечного диполя. Знак "+" соответствует сло- жению поля диполя с внеш- ним магнитным полем. нальные группы являются вает с увеличением расстояния до него, а знак воздействия определяется углом между направлением диполя и направлением на данный протон. Нулевое воздействие диполя будет наблюдаться для ядер, которые распо- ложены под углом 0 = 54.5° В этом случае произведение 3cos20 в формуле (1.8) равно нулю. Этот угол называется магическим уг- лом. Для качественной оценки воздействия магнитного диполя на соседние магнитные ядра можно использовать конусы анизотро- пии, которые делят пространство на облас- ти, где воздействие диполя различается по знаку. Вид такого конуса для точечного маг- нитного диполя показан на рис. 1.10. Как уже указывалось, многие функцио- магнитно-анизотропными. К ним относятся группы с кратными химическими связями: С=С, С=О, C=N и т.п. Некоторая анизотропия имеется даже у связи С-С. Поэтому с некоторым приближени- ем их воздействие на близлежащие магнитные ядра также можно описы- вать с помощью конусов анизотропии. В отличие от точечного диполя нап- равление магнитного момента в таких группах может быть неодинаковым. Соответственно и магнитное воздействие функциональных групп может быть различным. Ниже на рис. 1.11 приведены конусы магнитной анизотро- пии для распространенных функциональных групп. Поскольку в данном случае магнитный диполь не является точечным, то магнитное поле также имеет несколько измененную форму. Рисунок дает возможность предвидеть знак величины воздействия та- ких групп Д8 на магнитные ядра, которые находятся рядом, если известны стереохимические особенности молекулы. Так, например, в молекулах, ко- 40
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса торые содержат тройную связь, сигналы ацетиленовых протонов смещают- ся под влиянием магнитной анизотропии связи в сильное поле, а в олефи- нах - в слабое, поскольку конусы анизотропии в этих молекулах имеют не- одинаковую направленность. Рис. 1.11. Магнитная анизотропия распространенных функциональных групп. 1.3.1.2. Воздействие на химические сдвиги ароматических фрагментов Специфической магнитно-анизотропной группой является бензольное коль- цо. л-Электроны бензольного кольца можно рассматривать в первом при- ближении как кольцевой сверхпроводник, по которому под воздействием внешнего магнитного поля двигаются шесть л-электронов. Ток течет в плос- кости, параллельной плоскости бензольного ядра. При этом создается маг- нитное поле, конфигурация которого показана на рис. 1.12. В том месте, где размещены ароматические протоны, индуцированное магнитное поле скла- дывается с внешним, то есть происходит дезэкранирование протонов, и их сигнал смещается в слабое поле. В центре бензольного кольца индуциро- ванное магнитное поле вычитается из внешнего поля. Здесь должны наблю- 41
Глава 1. Интерпретация спектров даться сдвиги в сильное поле. Хотя в самом бензольном кольце наблюдать такой эффект невозможно, но он проявляется в более сложных молекулах, когда протоны других фрагментов молекулы оказываются над плоскостью бензольного кольца. Рис. 1.12. Конфигурация магнитного поля, которое возникает вокруг бен- зольного ядра благодаря наличию кольцевых токов. Слабопольные смещения сигналов ароматических протонов (по срав- нению с олефиновыми протонами) достигают 2-3 м.д. Так, химический сдвиг сигнала протонов в этилене равняется 5.2 м.д., а у сигнала протонов в бензоле - 7.2 м.д. Известны такие производные бензола, как 1,4-полиме- тиленбензолы, в которых одна часть метиленовых групп попадает в об- ласть экранирования, а другая часть метиленовых групп - в область дезэк- ранирования кольцевыми токами бензольного ядра. У таких соединений разность химических сдвигов сигналов ЯМР-1]-! метиленовых протонов мо- жет достигать 3-5 м.д. Кольцевой электронный ток является особенностью не только бензоль- ного ядра, но и других ароматических систем, например многочисленных гетероциклов, аннуленов, порфирина и даже циклопропана. Для случая бензольного ядра существует способ количественного вы- числения величин смещений сигналов ЯМР-1!! протонов под воздействи- ем кольцевых л-электронных токов. Способ был предложен Дж.С. Уо и Р.У. Фессенденом и уточнен К.Э. Джонсоном и Ф.А. Бови. На основе мате- матической модели взаимодействия кольцевого тока бензольного кольца с близлежащим магнитным ядром с определенными шагами расстояний от центра кольца (в его плоскости) и от плоскости кольца в перпендикуляр- ном направлении были вычислены вклады кольцевого тока в химические сдвиги сигналов протонов и составлены соответствующие таблицы. Зная геометрическую структуру молекулы, которая содержит бензольное ядро, 42
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса по указанным таблицам можно точно предсказать химические сдвиги сиг- налов протонов, которые расположены возле бензольного ядра. В ряде слу- чаев удается решить и обратную задачу - по известным величинам хими- ческих сдвигов найти особенности строения молекулы соединения, кото- рое изучается. Например, можно определить преобладающую ориентацию фенильной группы относительно другой части молекулы. Однако при ис- пользовании таких вычислений следует помнить, что магнитное поле в за- мещенном бензоле имеет асимметричную конфигурацию, и расчеты могут иметь большие погрешности. Таким образом, на основании рассмотренных факторов влияния на хи- мические сдвиги можно примерно представить себе, в каком поле погло- щают магнитные ядра той или иной молекулы. 1.3.2. Спин-спиновое взаимодействие (ССВ) До сих пор мы рассматривали влияние на частоту поглощения магнитного ядра его химического окружения, которое определяется плотностью элект- ронного облака, сосредоточенного вокруг ядра. Как было показано, частота поглощения ядра в условиях различного электронного окружения может существенно различаться, но никакого влияния на форму сигнала электро- ны не оказывают - изменяется исключительно частота поглощения. Теперь рассмотрим ситуацию, когда вблизи одного магнитного ядра в молекуле находится другое ядро. Хотя термин "вблизи" и является несколь- ко неопределенным, но будем считать, что это означает, что расстояние между ядрами таково, что они способны ощущать магнитный момент сосе- да. Пусть оба взаимодействующих ядра имеют спин Уг и несколько различ- ные частоты поглощения, то есть ядра А и В имеют разные химические сдвиги. В этом случае в магнитном поле для каждого ядра возможно су- ществование двух энергетических уровней. Поэтому часть ядер будет на- ходиться на уровне с несколько более низкой энергией. Этот уровень обыч- но называют уровнем а. Другая часть магнитных ядер находится на более высоком энергетическом уровне. Этот уровень называют 0. Данная ситуа- ция изображена на рис. 1.13. Рассмотрим ситуацию на примере ядра А. Возможны три варианта. Если на молекулу, которая содержит ядра А и В, не воздействует внешнее магнитное поле, то оба возможных состояния спина А являются вырожден- ными, то есть они имеют одинаковую энергию. На рис. 1.13 такая ситуация изображена в области 1. Если поместить молекулу во внешнее магнитное поле, происходит расщепление уровней энергии. Состояние а имеет более низкую энергию, а состояние 0 - более высокую. При таких условиях воз- можен переход между спиновыми состояниями с поглощением энергии. 43
Глава 1. Интерпретация спектров Если ядро А находится далеко от ядра В и не ощущает его магнитного мо- мента, реализуется ситуация 2 на рис. 1.13. Здесь возможен единственный переход между спиновыми состояниями, соответствующий спектр ЯМР каждого из ядер будет иметь 1 линию. Если же ядро А ощущает ориента- цию магнитного момента ядра В, происходит дальнейшее расщепление энергетических уровней ядра А. Состояние а будет иметь уже два воз- можных уровня энергии в зависимости от того, какую ориентацию имеет спин ядра В. Если магнитный момент ядра В ориентируется в направлении внешнего поля, то в точке локализации ядра А поле будет иметь немного большую величину, а если спин В ориентируется против внешнего поля, то немного меньшую. На рис. 1.13 данной ситуации отвечает область 3. Здесь при поглощении ядром А энергии возможны уже два варианта (показаны стрелками). Таким образом, в общем случае наличие соседнего спина при- водит к расщеплению сигнала ядра А. Совершенно аналогичные соображе- ния можно применить и для спина В. Его сигнал также может расщеплять- ся благодаря спину А. Таким образом, наличие взаимодействия (связи) между спинами ведет к расщеплению сигналов в спектре. Для системы ядер А и В возможны 4 перехода между энергетическими уровнями, кото- рые могут происходить при поглощении радиочастотного облучения со- ответствующей частоты. Поэтому в этих условиях система дает в спектре 4 линии - по две линии для каждого магнитного ядра. Рис. 1.13. Энергетическая диаграмма ядра А при разных обстоятельствах. Область 1 - ситуация при отсутствии внешнего поля, когда энергии состояний а и Р совпадают; область 2 - ситуация, которая возникает во внешнем магнитном поле при отсутствии ядра В (здесь наблюдается расщепление энергетических уровней); область 3 - ситуация в присутствии ядра В. Выше мы рассмотрели схему расщепления уровней одного из взаимо- действующих ядер. Аналогичную схему можно нарисовать и для второго ядра. Однако чаще всего для иллюстрации переходов между энергетичес- кими уровнями рисуют обобщенную схему, на которой показывают уровни 44
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.14. Энергетическая диаграмма двухспиновой системы ядер А и В. всех взаимодействующих ядер. Такая схема для системы АВ приведена на рис. 1.14. Здесь энергия на шкале, в отличие от шкалы энергий, которая была изображена на рис. 1.13, име- ет другой масштаб. Переход с одно- го уровня на другой требует энер- гии, которая эквивалентна сотням МГц, тогда как расщепление сигна- лов и их изменения благодаря хи- мическому окружению не превыша- ют нескольких килогерц, то есть их энергия в тысячу раз меньше. Рас- хождения в энергии поглощения всех спинов данного типа являются незначительными, и их не видно в масштабе энергии ядерных перехо- дов. Поэтому при анализе такой энергетической диаграммы следует учитывать ряд обстоятельств. Если не принимать во внимание химическое окружение, то спиновые состояния системы можно изобразить четырьмя комбинациями спинов: аа, аР, Ра, РР. Мы раньше условились, что состояние а имеет более низкую энергию, чем состояние р. Поэтому данные состояния вдоль шкалы их энергии можно расположить так, как показано на рис. 1.14. Здесь имеем четыре энергетических уровня. Два из них (аР, Ра) имеют одинаковую энергию, один уровень (аа) имеет наиболее низкую энергию, а один (РР) - более высокую. Если условиться, что первым на всех энер- гетических уровнях изображен спин ядра А, а вторым - спин ядра В, то переходы ядер А и В будут такими, как показано на рис. 1.14. Для этого ядра имеются два перехода - А1 и А2. Оба уровня соответствуют измене- нию спина ядра А, поскольку для перехода А1 происходит превращение аР в РР, а для перехода А2 - превращение аа в Ра. Так как мы условились, что на схеме энергетических уровней спин ядра А обозначается первым, то именно он изменяется для обоих переходов. Различие переходов состоит в том, что изменение спина А происходит для различных спиновых состояний спина В. Хотя различия в энергии этих переходов на диаграмме и не вид- ны, однако это не мешает анализу диаграммы, если всегда помнить, что состояния, например РР и Ра, имеют некоторое различие в энергиях. Энер- гетические диаграммы довольно часто используются для иллюстрации процессов, которые происходят в многоспиновых системах. Явление рас- щепления сигналов ЯМР на несколько компонентов называется спин-спи- новым взаимодействием. Его закономерности будут рассмотрены в следу- ющих разделах. 45
Глава 1. Интерпретация спектров 13.2.1. Правила спин-спинового взаимодействия 1-го порядка Магнитные ядра, которые входят в состав молекул химических соедине- ний, могут располагаться на разных расстояниях одно от другого. Поэтому некоторые из них могут не ощущать присутствия других магнитных ядер. Соответственно в спектре такие магнитные ядра дадут нерасщепленный сигнал, который называется синглетом. Если же магнитное ядро ощущает ориентацию соседнего ядра, то сигнал будет расщепляться. Соответствен- но в спектре можем получить сигналы, которые расщеплены на несколько компонентов. Если таких компонентов два, то сигнал называется дублетом, если компонентов три - то триплетом, четыре - квартетом и т.д., то есть название мультиплета происходит от греческих названий цифр. Расщеп- ленные сигналы с различным количеством пиков часто называют мульти- плетами. Так, протонный спектр диэтилового эфира, который измерен на частоте 100 МГц, содержит два мультиплета - триплет (СНз) и квартет Рис. 1.15. Спектр диэтилового эфира на ядрах !Н. Вид мультиплетов по- казан в увеличенном размере. Расстояние между компонентами мультипле- тов в Гц равняется константе спин-спинового взаимодействия J. Расстояние между двумя соседними компонентами в каждом из мультиплетов, выраженное в Герцах, называется константой спин- спинового взаимодействия (КССВ, coupling constant, J). В отличие от хи- мического сдвига КССВ не зависит от рабочей частоты прибора, поэтому 46
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса расстояние между компонентами мультиплетов является одинаковым неза- висимо от прибора, на котором был измерен спектр. В приведенном приме- ре имеющееся расщепление можно изобразить схемой, которая приведена на рис. 1.16. Для обозначения принадлежности КССВ используют такое правило: количество связей, через которое передается ССВ, обозначается как верхний индекс перед буквой "J", а магнитные ядра, между которыми имеется ССВ, обозначаются в скобках после буквы "J" Так, если между ядрами А и В имеется ССВ через 2 химические связи, то его обозначают как 2J(A,B). Рис. 1.16. Вид рассчитанных мультиплетов для спиновой системы диэтило- вого эфира. Причину возникновения спин-спинового взаимодействия рассмотрим на примере простейшей молекулы с неэквивалентными магнитными ядра- ми H-D. Если каким-то образом поле магнитного момента протона передается на дейтрон, то напряженность магнитного поля, в которое попадает дейт- рон, зависит от спинового квантового числа протона. Пусть это число рав- няется + 1/2, то есть вектор магнитного момента протона ориентируется по полю. Тогда суммарное магнитное поле, которое действует на дейтрон, будет состоять из приложенного внешнего магнитного поля Но и поля АН, наведенного протоном. Итак, для достижения резонансной частоты дейт- рона в молекуле H-D нужна более низкая напряженность магнитного поля Но, чем в случае свободного атома дейтерия. В молекуле, в которой протон имеет спиновое квантовое число -1/2, наведенное им магнитное поле про- 47
Глава 1. Интерпретация спектров тивоположно внешнему магнитному полю Но, и потому необходимое для резонанса дейтрона магнитное поле будет более сильным, чем для свобод- ного атома дейтерия. Поэтому спектр на частоте дейтерия будет содержать две компоненты (рис. 1.17, слева). Интенсивности обеих компонент одина- ковы, поскольку вероятности того, что протоны будут иметь магнитное квантовое число + 1/2 и -1/2, практически равны. Рис. 1.17. Схематическое изображение спектра ЯМР молекулы H-D: слева - на частоте дейтерия, справа - на частоте протонов. На рис. 1.17 (справа) показан другой спектр H-D, теперь уже на час- тоте протона. Здесь сигнал расщепляется на три компоненты одинаковой интенсивности, поскольку спин дейтрона, который обусловливает это рас- щепление, равняется 1, и соответственно его магнитное квантовое число может иметь три значения: -1, 0 и +1. Укажем, что КССВ J(H,D) и J(D,H) имеют одинаковые значения (43 Гц), то есть расщепление как протон- ного, так и дейтериевого сигналов происходит с одинаковой константой. В общем случае количество компонентов в спиновых мультиплетах ядер можно определить по формуле: n = 2ZSB + 1, (1.9) где п - мультиплетность сигнала магнитных ядер A, ZSB - сумма спинов соседних эквивалентных ядер В. Для случая спектров на ядрах *Н, 13С и других, которые имеют спин 1/2, мультиплетность сигнала можно найти по формуле: 48
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса n = SNB+ 1, (1.10) где NB - количество эквивалентных ядер в соседних группах. Иными сло- вами, количество компонентов, на которые распадается сигнал, на еди- ницу больше количества протонов в соседней группе, с которой проис- ходит спин-спиновое взаимодействие. Н-------сн3 Hl III III III Vs +3/2 +1/2 -1/2 -3/2 Рис. 1.18. Спиновые состояния протонов метила, которые опре- деляют количество компонентов протона СН, имеющего спино- вую связь с метилом. Относительные интенсивности ком- понентов мультиплета ядра А опре- деляются количеством эквивалентных спиновых состояний в соседней груп- пе В. Так, если рядом с протоном Н на- ходится метильная группа, то для про- тонов метила возможные ориентации спинов приведены на рис. 1.18. Каждая из восьми комбинаций спи- нов практически равновероятна, однако в целом суммарный спин +1 /2 или —1/2 получаем в результате трех разных ком- бинаций спиновых ориентаций, а сум- марный спин +3/2 и -3/2 - лишь в од- ной комбинации. Поэтому соотноше- ние интенсивностей компонентов квар- тета протона А составляет 13 3 1. Если возле данного магнитного яд- ра находятся две разные группы экви- валентных протонов В1 и В2, взаимодействие с каждой из них идет не- зависимо. Поэтому количество компонентов в мультиплете сигнала ядра А будет равняться: n = (2ZSBi + 1)(2ZSb2 + 1), (l.H) где SSBi и ZSB2 - соответственно суммы спинов соседних групп эквива- лентных ядер В1 и В2. Для случая ядер со спином 1/2 n = (NBi + l)(NB2+l), (1.12) где NBi и NB2 - количества протонов в соседних группах. Следует заметить, что когда константы спин-спинового взаимодействия протона с разными группами являются одинаковыми, для расчета количества компонентов мультиплета следует применять формулу (1.10). 49
Глава 1. Интерпретация спектров 1 1 1 1 2 1 133 1 1 464 1 1 5 10 105 1 1 6 15 20 15 6 1 1 7 21 35 35 21 7 1 Приведенные выше рассуждения можно при- менять для определения интенсивности компонен- тов произвольных мультиплетов. Однако в слож- ных случаях это не всегда удобно. Поэтому для этих целей разработаны математические правила определения соотношения интенсивностей. Наи- более известным способом расчета интенсивностей компонентов мультиплетов является треугольник Паскаля (приведен слева), пригодный для анализа спектров ядер со спином 1А. В этом треугольнике сумма двух произвольных элементов ряда равня- ется элементу, который расположен между ними в соседнем нижнем ряду. Числа в каждом ряду треугольника Паскаля отвечают интенсивностям ком- понентов мультиплета, который имеет столько компонентов, сколько чисел содержится в данном ряду треугольника. Так, в дублете интенсивнос- ти компонентов относятся как 1 1, в триплете - 1:2:1, в квартете - 1 3:3 1 и т.д. 1 1 1 1 1 232 1 1367631 1 4 10 16 19 16 104 1 Для тех случаев, когда спины ядер больше 1/2, можно построить числовые треугольники, подобные треугольнику Паскаля. Слева приве- ден треугольник для случая 1=1. Здесь, чтобы получить числа любого нижнего ряда, прибавля- ют уже не два, а три числа, которые содержатся в предыдущем верхнем ряду (включая нули справа и слева от единиц). Каждый ряд треугольника дает возможность определить интенсивнос- ти компонентов мультиплета, образованного вследствие спин-спинового взаимодействия ядра (или группы ядер) А с группой ядер В, которые име- ют спин 1. Например, сигнал ядер 13С молекулы CD4 состоит из 7 компо- нентов, которые имеют относительные интенсивности 1:3:6:7:6:3:1. Для ядер, имеющих другие значения спина, со спин-спиновым взаимо- действием иметь дело не приходится из-за большой ширины сигналов. Описанные правила ССВ называются правилами расщепления пер- вого порядка. Их можно применять в случаях, когда разность химических сдвигов взаимодействующих ядер превышает их КССВ, по крайней мере, в шесть раз. В противном случае соотношения интенсивностей компонентов мультиплетов нарушаются. 1.3.2.2. Прямое и непрямое спин-спиновое взаимодействие Как мы уже знаем, магнитные ядра можно представить себе как точечные магнитные диполи, которые имеют определенный магнитный момент. Ес- ли в состав молекулы входят два магнитных ядра А и В, моменты которых 50
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса равны соответственно цА и цв, то ядро с моментом цА обусловит появление в точке локализации ядра с моментом Цв дополнительного магнитного по- ля, напряженность которого, как это было показано Мак-Коннелом, можно вычислить по формуле: ДН = |4.A(3cos20 - 1)/г3, (1.13) где г - расстояние между ядрами, 0 - угол между векторами цА и Но. Если ядра имеют спин Vi, то в зависимости от спинового квантового чис- ла ядра А на ядро В будет действовать суммарное магнитное поле (Но - АН) или (Но + АН). Поэтому, спектр ядра В будет дублетом с КССВ, которая равняется J = 2ДН. Аналогичный спектр будет наблюдаться и для ядра А. В приведенном случае спин-спиновое взаимодействие передается через про- странство, которое разделяет ядра А и В. Такое взаимодействие называется диполь-дипольным или прямым спин-спиновым взаимодействием. Ча- ще всего с прямым ССВ приходится иметь дело при изучении ЯМР спект- ров твердых образцов. В твердом состоянии атомы или молекулы практи- чески неспособны к поступательному или вращательному движению, они лишь колеблются вблизи положения равновесия. Вследствие этого локаль- ные магнитные поля на разных магнитных ядрах кристалла могут приобре- тать значения в диапазоне от -5ц/г3 до +ц/г3 (0° < 0 < 90°). В случае прото- нов напряженность локальных магнитных полей составляет приблизитель- но 10"3Т, поэтому константы прямого ССВ и ширина сигналов в спект- рах твердых тел составляют от 100 до 1000 КГц. В невязких жидкостях магнитные моменты ядер быстро переориенти- руются один относительно другого, поэтому за время жизни ядра А в опре- деленном спиновом состоянии для ядра В, которое с ним взаимодействует, наблюдаются все возможные ориентации угла 0. При этом в точке располо- жения ядра А напряженность локального магнитного поля, индуцирован- ного ядром В, усредняется до нуля (среднее значение cos20 равняется 1/3, отсюда 3cos20 -1=0). Поэтому в обычных жидкостях и растворах пря- мое ССВ не может наблюдаться. Однако существует класс растворителей, в которых видеть прямые ССВ все-таки удается. Это так называемые жидкокристаллические раство- рители. Для растворов в этих растворителях cos20 = 1/3 и полного усредне- ния прямых ССВ не происходит. Расщепление сигналов ЯМР в жидких образцах определяется другим механизмом - непрямым спин-спиновым взаимодействием ядерных спи- нов. В этом случае передача взаимодействия не зависит от ориентации мо- лекул относительно внешнего магнитного поля и осуществляется через электроны химических связей. Константы спин-спинового взаимодействия, 51
Глава 1. Интерпретация спектров которые при этом наблюдаются, на несколько порядков меньше соответст- вующих констант прямых ССВ. Эффективность непрямого спин-спинового взаимодействия в случае жидкостей определяется электронным строением молекул и быстро падает с увеличением числа химических связей между ядрами, которые взаимодействуют. Величины КССВ растворов несут важную информацию об электронном и пространственном строении молекул химических соединений. 1.3.2.3. Механизм непрямого спин-спинового взаимодействия В молекулах, которые содержатся в растворах невязких жидкостей, ядер- ные спины взаимодействуют через электроны химических связей, которые играют роль проводника спиновой информации. Рассмотрим механизм та- кой передачи в упрощенном виде. Пусть молекула содержит лишь два магнитных ядра с магнитными мо- ментами Ц1 и Ц2> а также два связывающих электрона Si и S2. Предполо- жим, что один из электронов (например Si) находится преимущественно возле ядра с моментом щ, а электрон S2 - возле ядра с моментом ц2- Рассмотрим ситуацию возле первого ядра с магнитным моментом щ. Ядро будет создавать на электроне Si магнитное поле HgiSi, напряженность которого пропорциональна щ. При этом одна из возможных ориентаций электронного спина, которая антипараллельна ориентации ядерного спина, будет энергетически более выгодной. Поэтому электроны с такой ориентацией возле ядра щ будут иметь избыточную плотность. Эта избы- точная плотность будет пропорциональной величине поля HgiSi. Теперь рассмотрим ситуацию возле второго ядра с магнитным момен- том Ц2- Согласно принципу Паули для стабильной связи между атомами спин второго электрона должен быть антипараллельным спину Si первого электрона, то есть возле ядра с магнитным моментом ц2 будет находиться электрон, ориентация которого будет параллельная вектору щ. Электрон S2 создает на втором магнитном ядре поле Hg2S2> причем его напряженность также пропорциональна Цг- Энергия взаимодействия ядра с моментом ц2 и поля Hg2s2 определяется по формуле: £ = -114^2 (1.14) или, учитывая, что поле Hg2s2 пропорционально |щ: Е = АЦ1Ц2. (1.15) Константа А учитывает специфику электронов химической связи и про- порциональна КССВ. 52
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Из формулы (1.15) вытекают важные выводы. Во-первых, процесс спин-спинового взаимодействия и его энергия не зависят от того, находит- ся молекула во внешнем магнитном поле или нет, поскольку сила поля не входит в формулу (1.15). Поэтому напряженность внешнего магнитного поля не влияет на КССВ. Во-вторых, энергия ССВ является одинаковой для обоих взаимодействующих ядер, а потому и величины КССВ для них также одинаковы. Приведенный механизм непрямого ССВ дает возмож- ность описать перенос спиновой информации также и через несколько хи- мических связей. При этом наблюдается ориентация векторов ядерных (ко- роткие стрелки) и электронных (длинные стрелки) спинов, изображенная на рис. 1.19. Рис. 1.19. Взаимная ориентация ядерных (короткие стрелки) и электрон- ных спинов (длинные стрелки) многоатомной молекулы. Одинаковая ориентация магнитных моментов многоэлектронного ато- ма углерода обусловлена правилом Гунда, согласно которому на орбиталях атома с одинаковым побочным квантовым числом параллельная ориента- ция электронов является энергетически более выгодной. Из рис. 1.19 вид- но, что в зависимости от количества химических связей между атомами, яд- ра которых взаимодействуют, энергетически выгодная взаимная ориента- ция их магнитных моментов может быть разной. Так, если взаимодействие происходит через две связи, то ядерным моментам выгоднее быть парал- лельными, а если между ядрами существует три связи - антипараллельны- ми. Поскольку взаимная ориентация ядерных магнитных моментов влияет на некоторые спектральные особенности, то вводят понятие о знаке КССВ. Константа спин-спинового взаимодействия положительна, когда резуль- татом ССВ является уменьшение суммарной энергии взаимодействующих 53
Глава 1. Интерпретация спектров ядер, то есть реализуется антипараллельная ориентация их магнитных мо- ментов. Таким образом, положительный знак КССВ означает, что па- раллельное внешнему полю направление магнитного момента первого из ядер приводит к возникновению отрицательного дополнительного поля в точке локализации второго ядра. Знак КССВ протонов альтерни- рует: через две связи он, как правило, положительный, через три - отрица- тельный, через четыре - снова положительный и т.д. Абсолютные знаки КССВ можно определить измерением спектров в жидкокристаллических растворителях или методами двумерной спектроскопии. Бывают случаи, когда знак КССВ имеет неожиданное значение. Это возникает в случае ано- мальной формы молекулярных орбиталей, связанной со стерическими при- чинами. В этом случае электроны химических связей ориентируются не так, как это следует из правила Гунда, и соответственно изменяется ориен- тация магнитных моментов взаимодействующих ядер. 1.3.2.4. Отклонения от правил ССВ первого порядка Правила ССВ первого порядка дают возможность с удовлетворительной точностью предусматривать количество пиков в мультиплетах и относи- тельные интенсивности компонентов мультиплетов. Но для этого разность химических сдвигов ядер, которые взаимодействуют, Av должна превышать константу J их ССВ не меньше, чем в 6 раз. На практике такая ситуация случается далеко не всегда, и поэтому в реальных спектрах довольно часто приходится иметь дело с искаженными спиновыми мультиплетами. Простейшей системой взаимодействующих магнитных ядер является двухспиновая система, в которой взаимодействуют два магнитных ядра. Обозначим их А и В. Если константа спин-спинового взаимодействия J ма- ла относительно разности химических сдвигов Av данных ядер, в спектре ЯМР, согласно правилам ССВ первого порядка, будут наблюдаться два дублета с компонентами одинаковой интенсивности. В случае уменьшения Av вид спектра изменяется так, как это показано на рис. 1.20. Из рисунка 1.20 видно, что при уменьшении разности химических сдви- гов ядер А и В внутренние компоненты дублетов усиливаются, а внешние компоненты в той же самой степени уменьшаются. При Av = 0 и постоян- ной J два внутренних компонента дублетов сливаются в синглет, а внеш- ние компоненты исчезают. В случае близкого расположения сигналов более сложных спиновых систем кроме изменений относительной интенсивности компонентов муль- типлетов возможно также увеличение числа пиков. Так, для случая взаимо- действия протонов двух соседних метиленовых групп можно получить спектры, которые приведены на рис. 1.21. 54
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.20. Рассчитанный вид спектра системы АВ с разным соотношением разности химических сдвигов ядер А и В и КССВ между ними. Сверху вниз отношение Д v/J убывает. Искажения, которые наблюдаются в спектрах ЯМР при взаимо- действии магнитных ядер с малой разностью химических сдвигов, на- зывают эффектами второго порядка или эффектами высшего порядка. Мультиплеты высших порядков имеют такую особенность, что в общем случае значение химического сдвига пика не совпадает с центром мульти- плета, а определить величину КССВ непосредственно из спектра (путем измерения расстояний между компонентами мультиплета) можно далеко не всегда. 55
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.21. Рассчитанный вид спектра системы А2В2 при разных соотноше- ниях величин химических сдвигов и КССВ. Сверху вниз отношение Av/J убывает. Эффекты высших порядков приводят к значительному усложнению спектров ЯМР, однако в тех случаях, когда искажение мультиплетов не слишком значительно, эти эффекты даже помогают уточнить отнесение взаимодействующих сигналов. Это возможно вследствие того, что искаже- ния мультиплетов обоих взаимодействующих ядер происходят навстречу друг другу и в равной степени. Например, внутренние компоненты этих мультиплетов одинаково возрастают, а внешние одинаково уменьшаются. 56
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Поэтому, если в спектре ПМР неизвестного соединения существуют два мультиплета с искажениями компонентов навстречу друг другу, то они от- вечают взаимодействующим протонам. Искажение мультиплетов иногда называют ’’эффектом крыши”, так как огибающие, проведенные по вер- шинам компонентов обоих мультиплетов, образуют фигуру, которая напо- минает крышу дома. При квантово-механических описаниях спиновые системы, для кото- рых возникают эффекты высшего порядка, называют сильно связанными спинами. В таких системах спины не являются независимыми. В процессе взаимодействия с электромагнитным облучением такие спины действуют как единое целое, причем поглощенная ими энергия перераспределяется по всем энергетическим уровням спиновой системы. Близкой аналогией воз- никновения сильно связанных спиновых систем является образование мо- лекулярных орбиталей из атомных орбиталей. 1.3.2.5. Номенклатура спиновых систем Мы уже видели, что вид спектра ЯМР определяется тем, сколько и каких магнитных ядер входит в молекулу образца и как эти ядра воздействуют одно на другое. Поскольку ССВ передается не слишком далеко, чаще всего максимум через три химических связи, то в молекулах во многих случаях содержатся группы атомов, между которыми ССВ существует, но оно не передается за границы данной группы атомов. Такие группы атомов часто называют спиновыми системами. Спектр спиновой системы мало зависит от внешнего окружения, поэтому вид сигналов одинаковых спиновых сис- тем в разных молекулах будет близким, хотя сигналы могут размещаться в разных участках спектра. Поскольку вариантов спиновых систем может быть не так уже и много, для них разработаны специальные правила но- менклатуры. Опытный химик, основываясь на названии спиновой системы, сразу представит, какие мультиплеты она должна дать в спектре ЯМР. Ядра в спиновой системе обозначают заглавными буквами латинского алфавита. Ядра одной группы, которые имеют одинаковые химические сдвиги и КССВ, называют магнитно-эквивалентными и обозначают буква- ми с нижним цифровым индексом, который указывает количество одина- ковых ядер. Если разность химических сдвигов двух групп эквивалентных ядер мала и для сигналов имеют место эффекты второго порядка, то для обозначения типа спиновой системы используют соседние буквы алфавита, например АВ, А2В, АВС и т.п. Если же разность химических сдвигов доста- точно велика по сравнению с КССВ, то используют буквы, которые в алфа- вите расположены далеко одна от одной - АХ, АМХ и т.п. Если ядра одной группы имеют одинаковые химические сдвиги, но разные КССВ с ядрами 57
Глава 1. Интерпретация спектров АА’ВВ* д| другой группы, то их обозначают штрихами сверху. Например, в 1,4-дизамещенном бензоле ароматические протоны образуют систему АА'ВВ', поскольку КССВ каждого из двух эквивалентных протонов А и А' с про- Н тонами В и В' не одинаковы. В' В отличие от этой системы, в спиновой системе А2В2, которая реализуется в молекуле 1-бром-2-хлор- этана, взаимодействие ядер А с обоими ядрами В осу- ществляется с одинаковыми КССВ. В тех случаях, когда в спектре наблюдаются сигналы трех групп маг- нитных ядер на большом расстоянии один от другого, третью группу про- тонов обозначают буквой М. Так, в 1-нитропропане спиновую систему можно обозначить А3М2Х2. В2 Х2 н2 н2 С1\ /С^ Н3С^ /С^ С Вг 3 С NO. Н2 А3 Н2 а2 м2 а3м2х2 Если в спиновую систему входят четыре разных ядра, их можно обо- значить AMRW. Следует отметить, что разные авторы могут обозначать сложные спиновые системы несколько по-разному. Но, если Вы усвоите ос- новное правило, что расстояние между буквами в названии пропорцио- нально разности химических сдвигов атомов в спиновой системе, то неод- нозначности в интерпретации названия не возникнет. В случае, когда спектр одного и того же химического соединения из- меряется на спектрометрах с различной рабочей частотой, для сигналов об- разца обозначение спиновых систем может измениться. Это связано с тем, что при возрастании частоты спектрометра величины КССВ не изменяют- ся, а величины химических сдвигов сигналов растут. При этом отношение Av и J растет и спиновая система, которая на спектрометре с низкой рабо- чей частотой обозначалась, например, АВХ, на спектрометре с большой ра- бочей частотой может превратиться в АМХ, то есть искажения сигналов, связанные с эффектом второго порядка, могут исчезнуть. 1.3.3. Интенсивность сигналов Мы уже видели, что площадь под кривой, которая отвечает сигналу ЯМР, пропорциональна количеству магнитных ядер, образующих сиг- нал. Поэтому, если в молекуле содержится несколько групп эквивалент- 58
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ных магнитных ядер (в частности протонов), то отношение площадей под отдельными сигналами будет отвечать отношению количества ядер, кото- рые дают эти сигналы. Здесь имеется в виду суммарная площадь всех компо- нентов каждого из мультиплетов. Например, молекула этанола С2Н5ОН 1.4 содержит три группы эквивалентных протонов - ОН, СН2 и СН3. Поэтому в протонном спектре (рис. 1.22) сигналы наблюдаются в трех областях, кото- рые отвечают поглощению протонов гидроксильной, метиленовой и ме- тильной групп. Количество протонов в этих группах и соответственно пло- щади под сигналами относятся как 1:2 3. 5 4 3 2 1 О Рис. 1.22. Спектр на ядрах *Н этанола 1.4 и его интегральная кривая. Для нахождения относительных интенсивностей сигналов в каждом спектрометре имеется возможность производить их интегрирование. Этот процесс осуществляется с помощью программного обеспечения спектро- метра. Результат интегрирования, интегральная кривая, может быть выве- ден или на экран монитора, или на спектр на бумажном носителе. Она име- ет вид ступенчатой линии, которая на участках, где поглощение отсутствует, является горизонтальной, а над сигналами она поднимается на величину, пропорциональную интенсивности сигнала. Пример интегральной кривой приведен на рис. 1.22. В настоящее время интегральную кривую чаще все- го разбивают на фрагменты, которые отвечают отдельным мультиплетам, а 59
Глава 1. Интерпретация спектров интегральные интенсивности сигналов подают в цифровом виде. На участ- ках спектра, которые не содержат сигналов, интегральную кривую не изо- бражают. Анализ интегральной кривой во многих случаях помогает при интер- претации сложных спектров ЯМР. Так, если есть спектр соединения с из- вестной брутто-формулой, но с неизвестным строением, измерение интег- ральных интенсивностей сигналов помогает в их отнесении. Для этого оп- ределяют общую интегральную интенсивность всех сигналов. Она равняет- ся сумме высот всех ступенек интегральной кривой. Поделив полученную величину на число протонов в соединении, можно определить высоту сту- пеньки интегральной кривой, которая приходится на один протон. После этого уже нетрудно рассчитать, какое количество протонов отвечает тому или иному сигналу ЯМР. В тех случаях, когда брутто-формула соединения неизвестна, в спект- ре, прежде всего, стараются найти сигнал, который отвечает группе с из- вестным числом протонов. Чаще всего таким сигналом является пик ме- тильной или метиленовой группы, который имеет достаточно характерное расположение в спектре. Число протонов, которое отвечает остальным сиг- налам в спектре, находят с помощью сравнения их интенсивности с ин- тенсивностью известного сигнала, которому присвоено соответствующее значение интегральной интенсивности. При обработке спектров соединений, которые содержат большое число протонов (или других магнитных ядер одного сорта) с близкими значения- ми химических сдвигов, следует учитывать, что величины интегральных интенсивностей сигналов тяжело определить с точностью более высокой, чем 10%. Поэтому часто невозможно с уверенностью сказать, например, сколько протонов - 10 или 11 - отвечает интенсивному мультиплету в спект- ре ЯМР. Определение интенсивностей сигналов особенно важно при изучении спектров смесей. В этом случае, если в спектре наблюдается отдельно хотя бы по одному пику от каждого компонента, то по их интенсивности уда- ется определить состав смеси. 1.4. Импульсное возбуждение ядерных спинов Явление ЯМР, как мы это уже знаем, состоит в поглощении магнитными ядрами образца, который помещен в сильное внешнее магнитное поле, энер- гии электромагнитного поля, которым облучается образец. До этого мо- мента мы принимали, что возбуждение осуществляется путем линейного изменения частоты генератора либо напряженности внешнего магнитного поля. Именно так работали первые спектрометры ЯМР. Однако, несмотря на простоту восприятия данного способа получения спектра, он имеет су- 60
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса щественный недостаток, который заключается в большом времени экспе- римента. Для развертки спектра требуется от 5 до 30 минут. Это сущест- венно ограничивает возможность накопления сигнала разбавленных образ- цов. Выход из этого положения был известен уже давно. Математически было показано уже в середине XX века, что короткие импульсы радиочас- тотного облучения, даже если они содержат только одну исходную радио- частоту (несущую частоту), являются эффективно полихроматическими, то есть они ведут себя так, как будто они содержат компоненты частот в оп- ределенном диапазоне, который зависит от длительности импульса. Чем им- пульс короче, тем диапазон частот, которые в нем присутствуют, будет боль- шим. Это проиллюстрировано на рис. 1.23. На этом рисунке слева импульс изображен в виде прямоугольника на шкале времени. Длительность им- пульса обозначена как At. Данное изображение достаточно хорошо отобра- жает реальную ситуацию, поскольку импульс возникает практически мгно- венно и через заданное время At также быстро исчезает. Справа на шкале частот представлен профиль возбуждения импульса на шкале частот. Если бы импульс возбуждал только одну частоту, которая соответствует частоте электромагнитного излучения, формирующей импульс, то профиль возбуж- дения имел бы вид вертикальной линии, соответствующей частоте воз- буждения. Мы же имеем достаточно эффективное возбуждение в определен- ном частотном диапазоне. Можно показать, что этот диапазон равен 1 /At. 1/At Рис. 1.23. Единичный монохроматический радиочастотный импульс имеет эффективную полосу возбуждения обратно пропорциональную его дли- тельности. Показаны варианты короткого и длинного импульсов. Короткий сильный импульс вызывает возбуждение в широкой полосе частот (а), тогда как длинный импульс обеспечивает более избирательное возбуждение (б). 61
Глава 1. Интерпретация спектров Видно, что чем меньше длительность импульса, тем больший диапазон частот он возбуждает. Таким образом, можно облучить образец настолько коротким импульсом, что он одновременно возбудит все магнитные ядра данного типа. Для этого требуется, чтобы отношение l/At соответствовало спектральному диапазону. Длительность импульса для этого выбирают в диапазоне 10-20 микросекунд (мкс). Именно так происходит возбуждение магнитных ядер в современных импульсных спектрометрах ЯМР. Короткий импульс содержит компоненты частот в достаточно широ- ком диапазоне (2-20 кГц), поэтому он способен возбудить все ядра опреде- ленного изотопа. Однако поглощение энергии импульса происходит исклю- чительно избирательно - поглощаются только те компоненты частоты им- пульса, которые отвечают частотам поглощения каждого из неэквивалент- ных типов магнитных ядер. После окончания возбуждающего импульса яд- ра, которые поглотили его энергию, находятся в возбужденном состоянии, которое можно представить как синхронную прецессию их магнитных моментов вокруг направления внешнего магнитного поля. Если вокруг воз- буждаемого образца расположена катушка, настроенная на частоту погло- щения магнитных ядер, то после импульса в ней возникает ток, который содержит те компоненты частоты, которые были поглощены ядрами образ- ца. Со временем этот ток постепенно слабеет и, наконец, падает до нуля. Этот процесс называется ядерной релаксацией. Если на протяжении процесса ядерной релаксации измерять величину тока в катушке, то полу- чим кривую, которая носит название интерферограммы или спада свобод- ной индукции (ССИ). Она представляет собой зависимость интенсивности сигнала ЯМР от времени. Целью эксперимента ЯМР является получение спектра частот поглощения, то есть зависимости интенсивности поглоще- ния от частоты. От интерферограммы к спектру можно перейти с помощью математической процедуры, которая носит название Фурье-преобразова- ния (ФП). Таким образом, весь эксперимент ЯМР можно изобразить схе- мой, которая приведена на рис. 1.24. Импульс Интерферограмма Фурье-преобразование Процесс релаксации Рис. 1.24. Этапы простейшего импульсного эксперимента ЯМР, который включает один возбуждающий импульс. 62
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Это запись так называемой импульсной последовательности. Здесь чер- ным прямоугольником обозначен возбуждающий импульс, а синусоидой - спад свободной индукции (интерферограмма). Аналогичным образом мож- но представить и все другие эксперименты ЯМР. Если эксперимент вклю- чает два импульса, их изображают один за другим, а промежуток времени между ними обозначают как А или т. Результат процесса Фурье-преобразования наглядно представлен на рис. 1.25 для случаев поглощения одной, двух или четырех частот. Временное представление ФП Частотное представление время частота Интерферограмма Спектр Рис. 1.25. Процесс перехода от интерферограммы к спектру с помощью Фурье-преобразования. Показан реальный вид интерферограмм и спектров, которые можно из них получить. Как видно из рис. 1.25, спектр ЯМР представляет собой совокупность сигналов, которая представлена на шкале частот. Каждый из сигналов, как и в рассмотренных ранее спектрах, характеризуется частотой, интенсив- ностью и количеством компонентов (мультиплетной структурой). 63
Глава 1. Интерпретация спектров 1.5. Подготовка образца В данном разделе описаны наиболее важные аспекты подготовки образца для анализа методом ЯМР. Их знание совершенно необходимо каждому химику, который использует метод ЯМР, поскольку от правильности под- готовки образца во многих случаях зависит и результат всего исследова- ния. При измерениях спектров на различных магнитных ядрах может по- требоваться некоторая модификация условий измерения, поскольку интен- сивность сигналов ЯМР определяется тем ядром, на котором измеряется спектр. Кроме того, следует учитывать, что органические растворители да- ют свои сигналы в спектрах на ядрах *Н и 13С, которые всегда налагаются на спектр растворенного соединения. 1.5.1. Выбор растворителя В спектроскопии ЯМР, как правило, используются растворители, в которых протоны замещены на дейтерий. Это, с одной стороны, позво- ляет избежать появления в спектрах на ядрах !Н мощных пиков, а с другой стороны, помогает осуществлять дополнительную стабилизацию магнит- ного поля прибора, используя для этого сигнал имеющегося в растворе дейтерия (по отдельному радиочастотному каналу). Широкий спектр таких растворителей выпускается промышленностью. В загруженных лаборато- риях, занимающихся органическим синтезом, объемы используемых раст- ворителей могут быть достаточно большими. Поэтому в выборе раствори- теля не последнюю роль играет его цена. Обычно широко используются такие растворители, как дейтероацетон, дейтерохлороформ и тяжелая вода. Однако в последние годы, особенно в промышленном секторе, предпочти- тельным растворителем стал диметилсульфоксид (ДМСО-й?б)- Это связано с его высокой растворяющей способностью. Выбор растворителя основыва- ется, прежде всего, на его способности растворять исследуемое вещество. Поскольку для измерения на ядрах !Н и 19F используют, как правило, 5-10 мг образца, а объем раствора для измерения составляет 0.7 мл, то концентра- ция измеряемого раствора близка к 1%-ной. При измерении на всех дру- гих магнитных ядрах стараются, если это только возможно, приготовить 5-10%-ный раствор. Необходимо сразу запомнить, что присутствие осадка в растворе недопустимо, так как он может привести к резкому снижению качества спектра. Поэтому, если Вам придется подготавливать образец для измерения спектра самостоятельно, не стремитесь взять вещества как мож- но больше. Надежнее всего пользоваться весами и брать для измерения одинаковое количество вещества в диапазоне 5-10 мг. Если же все-таки об- разец полностью не растворился, не спешите выливать раствор, а попро- 64
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса буйте его подогреть до температуры несколько более низкой, чем темпера- тура кипения растворителя. При нагревании часто удается получить доста- точно устойчивый для быстрого измерения спектра пересыщенный раствор. Бывают случаи, когда осадок не снижает качество спектра настолько, что оно становится неприемлемым. Если уж Вы истратили на приготовление образца дорогой дейтерированный растворитель, то измеряйте спектр и лишь в случае неудачи эксперимента готовьте новый образец в другом растворителе. Следует также стремиться к тому, чтобы сигналы раствори- теля не совпадали с сигналами измеряемого вещества, поскольку, несмотря на дейтерирование, растворитель все же содержит некоторое количество не полностью дейтерированных молекул, которые дают в спектре характер- ный сигнал. Кроме того, практически все растворители содержат некоторое количество воды, которая также дает свой сигнал в спектре. О его наличии также всегда следует помнить. В таблице 1.2 приведены свойства раство- рителей, которые в спектроскопии ЯМР используются наиболее часто. Таблица 1.2. Свойства важнейших дейтерированных растворителей Растворитель Остаточ- ный сигнал ’н, 5н* (м.д.) Сигнал воды, 8(ноо)** (м.д.) Остаточный сигнал 13С, 5С* (м.д.) Темпера- тура плавле- ния (°C) Темпе- ратура кипения (°C) 1 2 3 4 5 6 Уксусная кислота-^4 11.65,2.04 11.5 179.0, 20.0 16 116 Ацетон-б/6 2.05 2.0 206.7, 29.9 -94 57 Ацетонитрил-^з 1.94 2.1 118.7, 1.4 -45 82 Бензол -d^ 7.16 0.4 128.4 5 80 Хлороформ-^ 7.27 1.5 77.2 -64 62 Оксид дейтерия-^2 4.80 4.8 - 4 101 Дихлорметан-^2 5.32 1.5 54.0 -95 40 М,Ь1-Диметил- формамид-^7 8.03, 2.92, 2.75 3.5 163.2, 34.9, 29.8 -61 153 Диметилсульфо- ксид-Л6 2.50 3.3 39.5 18 189 Метанол-^д 4.87,3.31 4.9 49.2 -98 65 Пиридин-^5 8.74,7.58, 7.22 5.0 150.4, 135.9, 123.9 -42 114 Т етрагидрофуран - 3.58, 1.73 2.4 67.6, 25.4 -109 66 65
Глава 1. Интерпретация спектров — 1 2 3 4 5 6 Толуол -d% 7.09, 7.00, 6.98, 2.09 0.4 137.9, 129.2, 128.3, 125.5, 20.4 -95 111 Трифторуксусная кислота-^ 11.30 11.30 164.2, 116.6 -15 75 Трифторэтанол-^з 5.02, 3.88 5.0 126.3,61.5 -44 75 * Протонные сдвиги 8Н и сдвиги сигналов углерода 8С даны относительно ТМС. ** Протонные сдвиги сигналов HDO/H2O сильно зависят от условий измерения спектра. В случае проведения измерения при низких температурах необходимо также быть уверенным, что снижение температуры не приведет к выпаде- нию изучаемого вещества в осадок, что значительно ухудшит качество спектра. Для экспериментов при температуре, отличающейся от комнат- ной, следует учитывать температуры плавления и кипения используемых растворителей. Для работы при повышенных температурах чаще всего применяются ДМСО и толуол, а при низких температурах - дихлорметан, метанол и тетрагидрофуран. Даже при проведении экспериментов при ком- натной температуре температуру плавления растворителей следует прини- мать во внимание. Так, в холодный день растворы в ДМСО могут в лабора- тории замерзнуть при +18°С. Вязкость растворителя оказывает влияние на ширину сигналов в спектре. С этой точки зрения лучше применять такой невязкий растворитель, как ацетон (именно этот растворитель используется при тестировании спектрометра). Сигнал протонов растворителя на ядрах !Н и 13С, за исключением хло- роформа и воды, представляет собой мультиплет из-за наличия ССВ с ато- мами дейтерия, имеющего спин 1. Так, например, в дихлорметане он имеет вид триплета, поскольку основной компонент недейтерированной примеси содержит молекулы CDHC12. Ацетон, ДМСО и метанол содержат сигнал в виде квинтета группы CD2H (рис. 1.26). В углеродной спектроскопии сиг- нал растворителя чаще всего является доминирующим. Из-за расщепления на дейтерии он также представляет собой мультиплет. При измерении спектров на других ядрах растворитель не оказывает влияния на спектр, за исключением изучения самого дейтерия. В этом случае, несмотря на то, что масса образца может составлять десятки мг, сигнал дейтерированного растворителя может воспрепятство- вать обнаружению полезных сигналов. Поэтому такие измерения, как пра- вило, проводят в недейтерированных растворителях. 66
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса в) лаАлл I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 10 5 0 -5 Гц Рис. 1.26. Сигналы остаточных протонов дейтерированных растворителей: (а) СНС13 в CDC13, (б) CHDC12 в CD2C12 и (в) CHD2COCD3 в (CD3)2CO. Мультиплетность сигналов в спектрах (б) и (в) связана с расщеплением спина на дейтерии через две связи. Поскольку спин дейтерия равен 1, в спектре присутствуют 1 1 1 триплет и 1 : 2 : 3 : 2 : 1 квинтет, соответст- венно. Синглет слева в (б) - это остаток СН2С12 в растворителе, разница в сдвиге возникает из-за Н-D изотопного сдвига, равного 6 Гц. Помимо сигналов самого растворителя в спектре может содержаться также сигнал воды, которая, с одной стороны, в некоторых количествах при- сутствует в растворителе, а, с другой стороны, может содержаться также и в образце. Резонансный сигнал воды обычно несколько уширен, и на его положение в спектре оказывают влияние условия измерения. Все раствори- тели в некоторой степени гигроскопичны (включая тяжелую воду). Поэто- му их контакт с атмосферой должен быть сведен к минимуму. Сильно гиг- роскопичные растворители, такие как ДМСО, метанол, тяжелая вода, луч- ше хранить в атмосфере сухого инертного газа. Если измерения спектров ЯМР проводятся регулярно и Вы имеете значительное количество раство- рителя, упакованное, например, в литровую бутылку, то не следует наби- рать каждый раз растворитель из такой большой упаковки, поскольку каж- дое открывание крышки приводит к попаданию в бутылку порции воздуха, содержащего воду. При этом концентрация воды в растворителе будет все время возрастать. Рациональнее отобрать в отдельный флакон столько раст- 67
Глава 1. Интерпретация спектров ворителя, сколько его необходимо для недели измерений, и при необхо- димости доливать новые порции растворителя из основного запаса. В этом случае возрастание интенсивности сигнала воды будет менее заметным. Можно использовать также растворители, расфасованные в небольшие ампулы. В этом случае их используют сразу после вскрытия ампулы. Для осушения растворителей можно использовать молекулярные сита. Однако в этом случае перед использованием растворители следует профильтро- вать, чтобы исключить попадание в образец частичек молекулярного сита. Альтернативой этому является пропускание растворителя через слой акти- вированного оксида алюминия. Наличие в растворителе протонов, способных к химическому обмену, может также привести к потере сигналов обменивающихся протонов вслед- ствие их замещения на дейтерий. В особенности часто это происходит в таких растворителях, как вода и метанол. Для предотвращения этого мож- но использовать растворы, содержащие 10-20% D2O или метанола-б/д. При таких измерениях следует использовать подходящую схему подавления сигнала растворителя. Однако даже в этом случае сигналы обменивающих- ся протонов могут быть утеряны из-за явления, известного как перенос на- сыщения. Измерения в смеси, содержащей 90% Н2О и 10% D2O, доминиру- ют при изучении биологических макромолекул, поскольку такие обмени- вающиеся протоны, как NH в пептидах и протеинах, а также амидные про- тоны в ДНК и РНК играют ключевую роль в определении их структуры. Природа растворителя может оказывать влияние также и на вид спект- ра. В разных растворителях положение сигналов отдельных протонов мо- жет существенно меняться. Предвидеть такие изменения заранее бывает достаточно сложно, что может приводить к определенным ошибкам. Одна- ко сильная зависимость химических сдвигов от растворителя может быть и полезной. Так, часто используется сравнение спектра в неароматическом растворителе, таком как хлороформ, со спектром в ароматическом бензоле (рис. 1.27), что показано на примере спектров производного глюкозы 1.5. Замена растворителя может привести к спектру, в котором совпадения сигналов менее значительны либо вовсе отсутствуют, что облегчает интер- претацию спектра. В данном случае изменения в спектре связаны с маг- нитной анизотропией ароматического растворителя. Если в обоих приме- няемых растворителях спектр получается неудовлетворительным из-за сов- падения сигналов, но изменения химических сдвигов сигналов достаточно велики, можно прибегнуть к титрованию образца, растворенного в одном растворителе, другим растворителем. Варьирование растворителя может быть особенно полезным в одномерных экспериментах с селективным на- сыщением сигналов, когда из-за совпадения сигналов в одном растворите- ле эксперимент провести не удается. Селективное воздействие на опреде- ленные резонансные сигналы с помощью добавки другого растворителя 68
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса можно также использовать при интерпретации спектров. Так, добавление капли D2O приводит через некоторое время к исчезновению из спектра или уменьшению интенсивности тех сигналов, для которых характерен протон- ный обмен. Для кислых протонов, связанных прочными водородными свя- зями, такой обмен может не произойти сразу, а потребовать много минут или даже часов. Это может служить удобным тестом на наличие водород- ных связей. I I I I I ' Г » I I I I I I I I I I | I I I Г"["Г'1 I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I I I 'Г' 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 м.д. Рис. 1.27. Влияние растворителя на положения сигналов в спектре. Пока- зан фрагмент протонного спектра производного глюкозы 1.5 в CDCI3 (а) и СбВ6 (б). В спектре (б) наблюдается появление сигнала при 3.2 м.д., кото- рый в спектре (а) был скрыт под другими сигналами. 1.5.2. Стандарты вЯМР При приготовлении образца обычно к нему добавляют небольшое коли- чество соединения, которое служит внутренним стандартом химического сдвига. В протонной и углеродной спектроскопии ЯМР при работе в орга- нических растворителях в качестве такого стандарта используется тетраме- тилсилан (ТМС), его химическому сдвигу присваивается значение 0.0 м.д. ТМС как стандарт имеет ряд неоспоримых преимуществ. Он дает узкий 12-протонный синглет, расположенный на краю спектрального диапазона, он летучий, поэтому может быть легко удален из образца, и химически инертный. В некоторых случаях данный стандарт может оказаться непри- 69
Глава 1. Интерпретация спектров емлемым, например при изучении силанов и циклопропанов. При рутин- ной работе нет настоятельной необходимости добавлять к образцу стандарт, поскольку его роль могут выполнять остаточные протоны растворителя. В этом случае сигналу растворителя присваивается химический сдвиг отно- сительно ТМС, взятый из таблицы 1.2. В водных растворах применяется водорастворимый эквивалент ТМС - частично дейтерированный 3-(триме- тилсилил)пропионат-б?4 натрия (ТСП-б/4). Этот стандарт также поглощает при 0 м.д. Летучим стандартом для водных растворов является 1,4-диоксан (химический сдвиг !Н равен 3.75 м.д., а 13С - 67.5 м.д.), который из раство- ра можно удалить путем лиофилизации. Распространенные стандарты для других ядер приведены в таблице 1.3. Бывают случаи, когда стандарт не добавляется к раствору образца, а помещается в отдельный капилляр. В этом случае стандарт может быть растворен не в том растворителе, кото- рый используется для изучаемого образца. Таблица 1.3. Стандартные соединения для важнейших изотопов (0 м.д.) и стандартные частоты 5 для них Изотоп Принятый стандарт 3-значение (МГц) Альтернативный стандарт 'н Me4Si 100.000000 TSP-J4 (вода) 2Н Me4Si 15.350609 частично дейтерированный растворитель 6Li LiCl (вода) 14.716086 9.7 М раствор LiCl в D2O 7Li LiCl (вода) 38.863797 9.7 М раствор LiCl в D2O i°B BF3OEt2 (CDC13) 10.743658 "в BF3OEt2 32.083974 ,3С Me4Si 25.145004 1,4-диоксан (67.5 м.д.), TSP-J4 (вода) 14n ch3no2 7.226317 NH4NO2 (вода), NH3 (жидкий)* 15n ch3no2 10.136767 NH4NO2 (вода), NH3 (жидкий)* 17о H2O 13.556457 ,9f CFC13 94.094003 29Si Me4Si 19.867184 31p H3PO4 (85%) 40.480747 1,9Sn Me4Sn 37.290665 195Pt K2[Pt(CN)6] 21.414376 207Pb Me4Pb 20.920597 * 15N сдвиги биомолекул чаще всего измеряются относительно жидкого аммиака, взятого как внешний стандарт. 70
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Альтернативой добавлению в образец стандартного образца является использование так называемого внешнего стандарта. В этом случае спектр стандартного соединения измеряется перед измерением спектра изучаемо- го образца и устанавливается величина химического сдвига стандарта. Ес- ли в обоих случаях были одинаковые установки параметров поля и исполь- зован одинаковый растворитель, то положение сигналов в спектрах не из- менится и их можно находить на основании химического сдвига стандарта в отдельном спектре. Если установки различны, то экспериментально можно найти поправки, которые следует ввести в найденные химические сдвиги. Стандартизация спектров более экзотических ядер часто бывает менее общей, чем для распространенных ядер. Часто бывает невозможным доба- вить к образцу стандарт, а иногда даже непонятно, что может служить стан- дартом. В таких случаях применяют Е-шкалу, которая не требует исполь- зования специального стандарта. Частоты магнитных ядер при этом опре- деляют относительно протонов, считая, что сдвиг протонов сигнала ТМС равен 100.000000 МГц. При этом частоту каждого ядра можно пересчитать относительно про- тонов и представить также в МГц с точностью до нескольких знаков после запятой. Такая шкала для некоторых ядер также представлена в таблице 1.3. 1.5,3. Трубки для измерения и объем образца Спектры ЯМР измеряются в специальных стеклянных трубках, которые после заполнения их раствором закрывают пластмассовыми колпачками. Трубки можно приобрести по цене 2-10 долларов за штуку. Тем, кто впер- вые сталкивается с ЯМР, кажется, что цена трубок для измерения чрезмер- но велика. Цена в данном случае отражает то, что трубки должны соответ- ствовать жестким требованиям по изгибу и концентричности, поскольку в противном случае в спектре могут появиться нежелательные паразитные сигналы. Чаще всего, более высокое качество трубок (и более высокая це- на) требуется для приборов с большой напряженностью поля при работе на протонах. Оптимальное соотношение цены трубок и требуемого качества спектра можно найти экспериментально. Диаметр трубки определяет объем образца, который используется для измерения спектра. В лабораториях наиболее широко применяются трубки диаметром 5 мм, а также 2.5-3 мм (это так называемые микротрубки) и 10 мм (обычно используются для ядер с низкой чувствительностью, когда имеются ограничения в растворимости образца). При изучении спектров биологических образцов популярны также трубки диаметром 8 мм. Объем растворителя в трубке должен быть достаточным для того, чтобы раствор находился несколько ниже и выше радиочастотной катушки датчика. Это связано с наличием скачка магнитной восприимчивости на границах раст- 71
Глава 1. Интерпретация спектров вор-воздух и раствор-стекло, ведущего к появлению локальных неодно- родностей магнитного поля. Для стандартной трубки в 5 мм требуемый объем растворителя составляет 500-700 мкл. Для микротрубок он умень- шается до 100-150 мкл. Для больших трубок может возникнуть необходи- мость подавления вихрей, возникающих в растворе. Для этого применяется специальная вставка для трубки, которая погружается в нее до поверхности образца и делает раствор неподвижным. При работе с переменной темпера- турой такие вставки следует использовать осторожно, поскольку при высо- кой температуре вставка может размягчиться, а при низкой - погрузиться в раствор. Для работы с малыми количествами образца применяются микроячей- ки. Они представляют собой стандартные 5 мм трубки, внутренний объем которых составляет всего несколько микролитров. Это позволяет весь об- разец расположить внутри катушки детектора. В последнее время начали применяться специальные вставки в трубки, которые наилучшим образом используют чувствительную зону детектора. Для их изготовления исполь- зуется стекло, магнитная восприимчивость которого согласована с раство- рителем и поэтому допускает меньшую высоту столба жидкости без воз- никновения дефектов формы линии. Существуют трубки из стекла, "согла- сованного” с водой и с некоторыми органическими растворителями. Трубки ЯМР должны быть чистыми, сухими и свободными от пыли. Они также не должны иметь дефектов стекла, поскольку при этом может быть нарушена их цилиндричность. Новые трубки также могут оказаться недостаточно чистыми. На них могут остаться следы смазки, которые, если трубка используется впервые, могут дать в спектре соответствующие сиг- налы. Обычно для мытья трубок применяют подходящий органический раст- воритель, такой как ацетон, либо дистиллированную воду. Достаточно про- мыть трубку растворителем несколько раз. Если присутствуют более ус- тойчивые загрязнения, для их удаления следует отдать предпочтение хими- ческим, а не механическим методам. Можно применять детергенты или концентрированные минеральные кислоты. Не следует использовать для мытья хромовую смесь, поскольку на стекле могут остаться парамагнит- ные примеси, которые ухудшат разрешение в спектре. Для высушивания трубок не следует их слишком сильно нагревать, поскольку это может при- вести к их деформации. Лучше всего сушить трубки в вакууме при темпе- ратуре несколько выше комнатной или путем вдувания в них профильт- рованного азота. Если высушивание производится в термостате, трубки сле- дует положить на перфорированный лоток. Не следует помещать их в мен- зурку или мерный цилиндр, поскольку это может привести к их изгибанию. Нагревание следует производить не более 30 мин. Если важно удалить с поверхности трубок малейшие следы воды, то перед сушкой их следует 72
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса промыть D2O, что приведет к дейтерированию воды, находящейся на по- верхности стекла, и исчезновению ее сигнала. Неиспользующиеся трубки следует закрывать колпачками, чтобы в них не попала пыль. Наконец, сле- дует следить за чистотой внешней поверхности трубок. На трубках может остаться жир от пальцев, который в дальнейшем, при вводе их в датчик, может дать в спектре соответствующий сигнал, который будет воспринят как примесь. Соблюдение описанных правил позволит избежать ошибок в работе. 1.5.4. Фильтрование образца В любом эксперименте ЯМР для получения высокого качества спектра тре- буется, чтобы магнитное поле было постоянным во всем объеме образца. Поэтому необходимо знать факторы, которые могут нарушить эти условия. Один из важнейших факторов - присутствие в образце твердых частиц, ко- торые могут вызвать возникновение локальных магнитных полей. Перед проведением эксперимента такие частицы необходимо из образца удалить. Даже очень малые изменения поля могут существенно повлиять на ширину сигналов и возможность видеть отдельно сигналы, близкие по своим хими- ческим сдвигам (этот параметр спектрометра ЯМР называется разрешени- ем). Для удаления твердых частиц можно воспользоваться стандартными ла- бораторными фильтрами, однако их после фильтрования необходимо мыть. Удобной альтернативой является фильтрование раствора непосредственно в трубке ЯМР через кусочек ваты, намотанный на жесткую проволочку и введенный в трубку до дна. Если залить раствор образца в трубку со вкла- дышем ваты, а затем начать вытягивать ватный вкладыш за проволочку, произойдет фильтрование раствора. Остатки растворенного вещества мож- но смыть с такого фильтра в трубку добавлением после фильтрования не- большой порции растворителя. После полного вытягивания из трубки ват- ного вкладыша в ней останется профильтрованный раствор. Следует учи- тывать, что такой способ фильтрования не слишком хорош для раствори- телей, которые смешиваются с водой (ДМСО, ДМФА, ацетон). Это связано с тем, что такие растворители вымывают имеющуюся воду из ваты, что мо- жет значительно увеличить сигнал воды в спектре. Если в растворе присут- ствуют ионы парамагнитных металлов, удалить их можно путем пропуска- ния раствора через маленькую ионообменную колонку. 1.5.5. Регенерация дейтерированных растворителей Дейтерированные растворители имеют физические и химические свойства, идентичные обычным растворителям. Поэтому их очистка может быть про- изведена по тем же методикам, что и очистка их недейтерированных ана- 73
Глава 1. Интерпретация спектров логов. Однако следует учесть, что растворители, молекулы которых содер- жат активные протоны, такие как метанол-б/з, трифторуксусная кислота-d. тяжелая вода, регенерации не поддаются, поскольку в процессе измерения спектра они поглощают воду, которая содержится в образце и в воздухе, что существенно нарушает их изотопный состав. Такие растворители, как дейтерохлороформ и ацетон-^, можно очистить перегонкой, однако лишь в том случае, если в них не измерялись спектры легколетучих жидкостей. Наиболее часто регенерируют ДМСО-б/6. Лучше всего себя зарекомен- довал такой процесс регенерации данного растворителя. Растворитель, со- держащийся в трубках для измерения спектров, сливают в стеклянную бутылку с герметичной пробкой. Регенерацию лучше всего начинать, когда соберется не меньше 200 мл растворителя. Грязный растворитель помеща- ют в аппарат для вакуумной перегонки и в вакууме водоструйного насоса без нагревания отгоняют летучие примеси. Затем температуру в перегон- ной колбе доводят до точки кипения ДМСО в имеющемся вакууме и вы- держивают при данной температуре 30-60 мин. Перегонка при этом не должна происходить в заметной степени. Это необходимо для удаления ос- новного количества воды, привнесенной в растворитель. После этого про- изводят отгонку ДМСО. Вначале отбирают фракцию, содержащую воду Ее объем обычно не превышает 10% от объема перегоняемого ДМСО. Да- лее перегонку проводят до тех пор, пока не начнется повышение темпера- туры паров перегоняющегося растворителя. После окончания первичной перегонки к перегнанному растворителю добавляют прокаленный поташ или оксид бария и выдерживают отгон не менее суток. Данная процедура необходима для удаления из ДМСО кислых примесей. После фильтро- вания осадка ДМСО подвергают повторной вакуумной перегонке, отбирая фракцию с неизменной температурой кипения. Перед началом отгонки ос- новной фракции полезно выдержать растворитель 30-60 мин при темпера- туре на 1-5 градусов ниже температуры его кипения для дальнейшего уда- ления воды. Чистоту перегнанного растворителя следует контролировать путем измерения его спектра ЯМР. Если полученный после перегонки растворитель содержит посторонние примеси, которые проявляются в спектре ЯМР в виде соответствующих пиков, то уменьшить их количество часто удается путем вымораживания ДМСО. Для этого колбу с перегнанным растворителем помещают в ем- кость из пенопласта и ставят в холодильник на несколько часов, периоди- чески контролируя выпадение осадка. Добиваются того, чтобы закристал- лизовалось около 90% растворителя. Незамерзший остаток сливают в от- дельную колбу. Данная порция растворителя содержит основную массу примесей. Закристаллизовавшийся ДМСО расплавляют и повторно измеря- ют его спектр ЯМР. Обычно описанная процедура приводит к получению 74
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса растворителя, вполне пригодного для дальнейшего измерения в нем спект- ров ЯМР. Для того, чтобы растворитель загрязнялся в меньшей степени, следует не сливать в него остатки после измерения спектров жидкостей. Такие ос- татки лучше собирать отдельно или просто выливать, поскольку попадание в слив растворителя жидкостей, которые имеют температуру кипения, близкую к температуре кипения ДМСО, может полностью испортить раст- воритель. При контроле качества регенерированного ДМСО особое вни- мание следует уделять сигналу остаточной воды. Он должен располагаться при 3.3 м.д. и не быть уширенным. Если же это не так, то растворитель содержит кислые примеси и его следует дополнительно очистить от них путем выдерживания над прокаленным поташом или оксидом бария. Бывают случаи, когда желательно полностью удалить воду из таких растворителей, как ДМСО-<4 или ДМФА-</7. Сделать это с помощью обыч- ных процедур осушения обычно не удается. Было найдено, что лучше всего остатки воды из названных растворителей удаляются с помощью пиромел- литового диангидрида, который можно купить в фирмах, торгующих хими- ческими реактивами. Данный реагент взаимодействует с водой, растворен- ной в ДМСО-б/б или ДМФА-^7, превращаясь в соответствующую кислоту. Поэтому достаточно добавить к порции растворителя количество реагента, необходимое для взаимодействия с водой, которая имеется в растворителе, и перегнать раствор в вакууме. После перегонки удается получить раство- ритель, практически свободный от воды. Следует, однако, отметить, что полученный таким методом растворитель необходимо хранить в запаянных ампулах, а работать с ним лучше в сухом боксе. Поэтому без крайней не- обходимости производить эксперименты с сухими ДМСО-^6 или ДМФА-J7 не целесообразно. 1.6. Химические сдвиги и структура молекулы Начиная с первых опытов применения спектроскопии ЯМР для выяснения строения химических соединений проводились и работы по систематиза- ции химических сдвигов, найденных для магнитных ядер отдельных струк- турных фрагментов. Как результат таких работ были опубликованы много- численные корреляционные диаграммы, которые давали возможность пред- сказать приблизительные величины химических сдвигов магнитных ядер соединений на основании их структурных формул. Пример таких диаграмм для протонов приведен на рис. 1.28. Однако, как видно из рисунка, делать отнесение сигналов с помощью диаграмм довольно неудобно, поскольку сигналы протонов разных типов могут поглощать в одном и том же самом участке спектра. 75
Глава 1. Интерпретация спектров 98765432 1 I_I_I_I_I_I-1_I_L снз— ““ НС= -- --------- н2с= -- —с= н гь а) диапазоны химических сдвигов ядер *Н в зависимости от гибридизациии связанного с ними атома углерода, 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 R-COOH R-SO3H Ph-OH Ph-OH с Н-связью Спирты Енолы r-nh2 Ar-NH2 R-SH e Ar-SH б) диапазоны химических сдвигов "активных протонов" в ДМСО. Рис. 1.28. Диаграмма химических сдвигов сигналов ЯМР на ядрах 'Н для подвижных (активных) протонов. 76
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Если же детализировать диаграмму так, чтобы показать на ней воздей- ствие на величины химических сдвигов отдельных функциональных групп, то диаграмма становится слишком сложной для визуального восприятия. Более наглядными могут быть диаграммы химических сдвигов, составлен- ные для однотипных функциональных групп. Так, на рис. 1.286 приведена диаграмма химических сдвигов "активных протонов", которые входят в состав групп ОН, NHX, SH. По нашему мнению, надежнее пользоваться таблицами, в которых при- ведены типичные соединения разных классов с соответствующими значе- ниями химических сдвигов сигналов магнитных ядер. Ряд таких таблиц, которые охватывают важнейшие структурные фрагменты органических соединений, приведен ниже (таблицы 1.4-1.8). В них размещены формулы фрагментов органических молекул и присущие им величины химических сдвигов. Поскольку химические сдвиги определяются по большей части ближайшим химическим окружением, то найденные с помощью данных таблиц величины химических сдвигов дают возможность довольно хорошо отнести сигналы в протонных спектрах большинства не слишком сложных химических соединений. Если проводить интерпретацию спектров прихо- дится часто, то со временем необходимость использования корреляцион- ных таблиц отпадает, поскольку основные закономерности, которые харак- теризуют зависимость изменения химических сдвигов от строения хими- ческих соединений, запоминаются наизусть. Таблица 1.4. Зависимость химических сдвигов сигналов метильных групп от строения молекул CH3F4.26 СН3С13.05 СН3Вг 2.69 СН312.19 СН3ОСН3 3.24 CH3NR2 2.30 CH3NO2 4.31 CH3SR 2.09 CH3SOR 2.50 CH3SO2R 2.80 CH3CNI.9O СН3СООН2.Ю CH3C6H5 2.32 (CH3)3N 1.61 (CH3)4C 0.94 77
Глава 1. Интерпретация спектров Таблица 1.5. Зависимость химических сдвигов сигналов метиленовых групп от строения молекул Q 40 3.71 Aik 1 сн2 4.4 с г" Aik 1 сн2 3.44 Вг^ Aik 1 сн2 3.36 Aik Aik 1 Aik 1 Aik 1 1 /СН2 ХН, 3.17 хн, 2.60 хн, 2.35 1 2.00 2 Ph" 2 NC' 1 XR Aik 1 Aik 1 Aik 1 О Aik 1 'СН2 3.4 ХН- 3.95 ^сн, 3.75 X /СН7 4.1 RO 2 PhO' 2 ONO ' 2 R О 2 А1к Ph I /СН2 3.92 Ph 2 Н с н2 2 40 о JL /А1к Ph £ 2.90 н2 R2N-CH2 2.6 Кроме фрагментов, присутствующих в приведенных таблицах 1.4-1.8, в спектре около 10 м.д. могут присутствовать сигналы альдегидных прото- нов, а в диапазоне от 8 до 17 м.д., в зависимости от силы водородных свя- зей, располагаются сигналы групп ОН и NH, связанных с ароматическими или ненасыщенными фрагментами. Сигналы гидроксильных групп алифа- тических спиртов, как правило, находятся в диапазоне 4.5-6 м.д., а про- тоны аминогрупп, связанных с алифатическими радикалами, - при 1-3 м.д. 78
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Таблица 1.6. Зависимость химических сдвигов сигналов метиновых групп от строения молекул Aik 4.80 | Alk^HF Aik 4.10 | Alk^H^Cl Aik 4.20 1 c Alk^H'Br Aik 4.25 | r Alk^H I Aik с 2,80 Alk^H^CN Aik 3.60 | Alk^HOR Aik 4.60 | .c. Alk^HOPh Aik о 5 0 11 Alk^H^O^R Aik с 2’87 Alk^H^Ph Aik 2.40 | Alk^HYH 0 Aik 3.40 | ... -CP ^Ph Alk^Hy 0 Aik 2.40 | а и Alk^HY 0 Р- О г 1.4 1 C 1 H 3.63 Cl н 4.31 Таблица 1.7. Положение в спектре сигналов олефиновых протонов Приведенные закономерности дают возможность предусмотреть лока- лизацию сигналов в спектре исследуемой молекулы с точностью ±0.5 м.д., а иногда и значительно точнее. Этого вполне достаточно, чтобы с учетом мультиплетности сигналов провести их корректное отнесение. Но не сле- дует считать, что совпадение химических сдвигов исследуемого соедине- ния с табличными данными является достаточным аргументом для уста- новления его строения. На самом деле, это лишь первое свидетельство в его пользу. 79
Глава 1. Интерпретация спектров Таблица 1.8. Положение в спектре сигналов ароматических протонов Ситуация значительно усложняется, если в молекуле присутствуют несколько похожих, но неодинаковых фрагментов, которые являются идентичными спиновыми системами. В таких случаях для надежного от- несения приходится дополнительно изучать двумерные спектры COSY или NOESY. В более сложных случаях помочь могут эксперименты по гетеро- ядерной корреляции. Но такие ситуации возникают сравнительно нечасто. Для того, чтобы исключить ошибки в интерпретации спектров при прове- дении исследовательской работы, следует хотя бы по одному соединению из каждой серии синтезированных продуктов подвергнуть углубленному изучению. Это предполагает измерение помимо спектра на ядрах ’Н, также и спектров на ядрах 13С, а также проведение всех возможных эксперимен- тов по гомоядерной и гетероядерной корреляции. Если вся совокупность полученных данных согласуется с предполагаемой структурой молекулы, то ее строение, а также строение всех ее аналогов можно считать установ- ленным надежно. 80
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 1.7. Вид сигналов ЯМР и структура молекулы Как мы видели, сигналы в спектрах ЯМР на ядрах *Н в зависимости от химического окружения могут иметь разные химические сдвиги, которые можно более или менее точно найти из приведенных выше корреляцион- ных таблиц. Форма сигналов также может существенно различаться. Это связано, прежде всего, с различным спин-спиновым взаимодействием каж- дого из магнитных ядер. При интерпретации спектров следует учитывать оба фактора - химический сдвиг и форму сигналов, причем оба эти факто- ра одинаково важны. Хотя все молекулы чем-то отличаются одна от дру- гой, однако их можно мысленно разбить на более простые фрагменты, каж- дый из которых содержит изолированную спиновую систему. Поскольку, как правило, ССВ не распространяется больше, чем на 3 химических связи, таких полностью отличных от других изолированных спиновых систем оказывается не так уже и много. Если заранее представить себе, какой вид должны иметь сигналы того или иного структурного фрагмента молекулы, то в спектре их можно выявить достаточно просто, иногда с одного взгля- да. В таблице 1.9 приведены структурные фрагменты молекул, которые встречаются чаще всего, и соответствующие им фрагменты протонных спектров. Спектры большинства химических соединений являются резуль- татом наложения спектров нескольких отдельных изолированных спино- вых систем. Для удобства в таблице 1.9 структурные фрагменты располо- жены в порядке увеличения количества углеродных атомов, причем внача- ле приведены сигналы алифатических протонов, а потом - ароматических. 1.8. Интерпретация спектров на ядрах Рассмотрим, как использовать приведенную выше таблицу 1.9 на примере одного не слишком слож- ного соединения 1.6, формула которого приведена справа. Ее можно разбить на 4 изолированных фраг- мента: В спектре должно наблюдаться наложение сигналов этих структурных фрагментов. В приведенной ниже таблице 1.9 содержатся три из них (соот- ветственно строки 18, 20 и 2). Если в спектре соединения найти сигналы, которые по форме мультиплетов близки к тем, которые показаны в табли- це 1.9, то можно идентифицировать основное количество сигналов. При 81
Таблица 1.9. Вид спиновых мультиплетов в спектрах важнейших спиновых систем № Спиновая п/п система Спиновые мультиплеты в спектре спиновой системы Примечание 3 /СН9 X 2 Спиновая система АВ Расщепление сигнала метиле- новых протонов возникает в пространственно затрудненных и несимметричных соединениях. Диапазон химических сдвигов 3-6м.д., 2J= 15-20 Гц. 2 Х-С2Н5 Спиновая система А3Х2 Квартет в зависимости от X может располагаться в диапазоне от 2.5 до 4 м.д., 3J = 7.5-8.5 Гц. Глава 1. Интерпретация спектров
1 2 3 4 оо 3 сн2 /СН, xz 2 4 СН3 Y~j—Н X Спиновая система А3Х Спиновая система А2Х2 1.93 Фрагмент может входить в состав как нежестких циклических соединений, так и алифатических заместителей. В зависимости от электроотрицательности X и Y химические сдвиги находятся в диапазоне от 2.5 до 4 м.д., 3J = 7.5-8.5 Гц. В зависимости от X и Y химический сдвиг квартета может изменяться в диапазоне 3-5 м.д., 3J=7.5-8.5 Гц. 5.0 4.5 4.0 3.5 !.5 2.0 гост 1.5 Спектроскопия ядерного магнитного резонанса
12 3 4 5 X Z И—|—|—Y H H Спиновая система ABX Фрагмент чаще всего встречается в циклических системах. Сигнал метикового протона СН, как пра- вило, поглощает в более слабом поле, чем сигнал метиленового протона СН2. Слабопольный триплет может иметь химический сдвиг до 4 м.д., 3J = 7.5-8.5 Гц. Глава 1. Интерпретация спектров
1 2 3 00 ил н3с н сн3 Спиновая система А6Х
Сигнал метанового протона в зависимости от X может поглощать в диапазоне 3-5 м.д., 37=7.5-8.5 Гц. Г I г I I I I' I I I I I I I ! I I 1.5 1.0 Фрагмент содержится в гете- роциклических соединениях и алифатических заместителях. Слабопольные сигналы погло- щают в диапазоне 2.5-4.5 м.д., 3J = 7.5-8.5 Гц. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 2.0
12 3 4 00 О\ / 2 н2с сн2 н3с Спиновая система A3M2R2X2 Z5 Z0 Электроотрицательность X влияет на химический сдвиг слабопольного мультиплета. Он поглощает в диапазоне от 2.8 до 4 м.д., 3J = 7.5-8.5 Гц. Слабопольный сигнал отвечает фрагменту СНХ. Его химический сдвиг может составлять 4-5.5 м.д. Глава 1. Интерпретация спектров
1 2 3 4 11 Электроотрицательность X влияет только на взаимное расположение слабопольных сигналов. To 660 Для разных X положение слабо- польного сигнала изменяется в диапазоне от 3 до 4 м.д. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса
2 оо оо 13 4 При варьировании X сигналы практически не изменяются. Спиновая система AA’MRX В спектре легко выявляются сигналы олефиновых протонов, которые имеют цис- и транс-партнера по ССВ (3J = 7 и 15 Гц, соответственно). Глава 1. Интерпретация спектров
12 3 4 Спиновая система АА’ММ’Х Если X = NHR, OR, то дублет расположен в сильном поле; если X = COR, COOR, то - в слабом поле, 3J= 7.5-8.5 Гц. 16 Спиновая система АА’ВВ’ В зависимости от X и У положения дублетов могут находиться в диапазоне 6-8.5 м.д., 3J=7.5-8.5 Гц. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса
чо о
7.0 6.: Относительное расположение мультиплетов зависит от замес- тителей X и Y. Диапазон сдвигов 6.5-8.5 м.д., 3J = 7.5-8.5 Гц. Часто дублеты находятся в более слабом поле, чем триплеты. Диапазон локализации сигналов 6-8.5 м.д., 3J = 7.5-8.5 Гц. Глава 1. Интерпретация спектров
40
4 3J(H,F) близка к 8 Гц, a 4J(H,F) - к 5 Гц. ' 7.40....... В зависимости от заместителей относительное расположение сигналов может изменяться в диапазоне 6-8.5 м.д., 3/ = 7.5-8.5 Гц,4/=2 Гц. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса
8.5 8.0 7.5 7.0 а-Протон поглощает около 8.6 мд.3/(Р-Р) = 3-4 Гц. 3J (а-Р) = 1-2 Гц. При алифати- ческом X оба сигнала Р-протонов поглощают при 6-6.7 м.д. Глава 1. Интерпретация спектров
24 Спиновая система АМХ В отличие от производных бензола 3J составляют 3-5 Гц для а-Н и 6 Гц - для других сигналов. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса
4 0.94 Для пиридиновых производных 3J (а-р) = 4 Гц, 3J (P-Y) = 8 Гц, поэтому сигнал Р-Н является дублетом дублетов. 1.07 7.8 7.6 Глава 1. Интерпретация спектров
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса этом отнесение синглета метиленовой группы, которая содержится в спект- ре в дополнение к ним, не будет представлять проблемы. При сравнении спектра с табличными данными всегда следует помнить, что возможны отклонения в положениях сигналов от табличных величин, которые обуслов- лены наличием электронодонорных или электроноакцепторных заместите- лей. Поэтому на первом этапе анализа спектра следует обратить внимание лишь на форму мультиплетов, а уже потом проанализировать, согласуются ли имеющиеся в молекуле структурные особенности с отклонениями хими- ческих сдвигов от табличных данных. Следует заметить, что такая интер- претация спектра является простой лишь в том случае, когда сигналы од- них структурных фрагментов не совпадают полностью с сигналами других фрагментов. Если происходит перекрывание сигналов, то вид спектра мо- жет коренным образом измениться - вместо четких пиков с видимой муль- типлетностью в спектре могут появиться сложные сигналы неопределенной формы, которые имеют интегральную интенсивность в несколько прото- нов. Особенности интерпретации таких сложных спектров будут объясне- ны в приведенных ниже примерах. Здесь мы остановимся на основных правилах обработки измеренного спектра ЯМР. Правильно записанный спектр ЯМР должен содержать об- зорный спектр, который включает все имеющиеся в спектре сигналы. Над пиками должны быть обозначены химические сдвиги всех компонентов сигналов (чаще всего в м.д.). Кроме того, должны содержаться сведения об интегральной интенсивности сигналов, которая пропорциональна количест- ву протонов, образующих каждый сигнал. Если интенсивности сигнала, ко- торый отвечает одному протону, присвоено значение 1 (обозначается 1Н), то интенсивности всех других сигналов будут отвечать количеству прото- нов, которые их образуют (1Н, 2Н и т.д.). Участки спектра, которые содер- жат сложные сигналы, расписывают в виде дополнительных фрагментов. Масштаб фрагментов должен быть таким, чтобы мультиплетная структура сигналов была ясно видимой. Обычно как обзорный спектр, так и допол- нительные фрагменты содержат шкалу химических сдвигов в м.д. Кроме того, в спектре может содержаться (но не обязательно) таблица некоторых параметров спектрометра, которые были заданы при измерении спектра. Ниже, на и рис. 1.29, приведен пример правильно за- Л писанного спектра ЯМР несложного орга- ( ) \ JI Н нического соединения 1.7. О Первый вопрос, который возникает 17 после измерения спектра ЯМР, - это его соответствие прогнозируемому строению молекулы. Для того, чтобы с уверенностью ответить на этот воп- рос, следует отнести сигналы в спектре к конкретным магнитным ядрам, которые содержатся в исследуемой молекуле. Наиболее целесообразно для 95
Глава 1. Интерпретация спектров проведения этой работы прямо на спектре изобразить структурную форму- лу соединения. Прежде всего следует убедиться, что количество протонов в молекуле отвечает относительным интегральным интенсивностям сигна- лов в спектре. Так, молекула, формула которой изображена выше, содержит 6 ароматических протонов, группу NH, изолированную метильную группу (3 протона) и бутильную группу, которая состоит из трех неэквивалентных метиленовых групп и метильной группы. Таким образом, общее количест- во протонов в молекуле составляет 19Н. Суммируя интегральные интен- сивности сигналов, которые содержатся в спектре (с округлением величин до целого числа протонов), приходим к выводу, что суммарная интеграль- ная интенсивность сигналов согласуется с формулой соединения, если счи- тать, что сигнал с минимальной интенсивностью соответствует 1Н. Рис. 1.29. Спектр на ядрах !Н соединения 1.7. Следующий этап рассмотрения спектра заключается в идентификации спиновых систем. Для этого на формуле соединения следует выделить изо- лированные спиновые системы и мысленно представить, какой вид долж- ны иметь соответствующие фрагменты спектра исходя из правил расщеп- ления сигналов 1 порядка. Если вы нечасто пользуетесь методом ЯМР, то можно найти вид спектров отдельных спиновых систем в таблице 1.9. Ход рассуждений объясним на примере сигналов, которые содержатся в спект- 96
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ре. Так, молекула соединения содержит фенильный радикал, который име- ет в своем составе 3 группы неэквивалентных протонов - 2 эквивалентных ор/ио-протона, которые расщеплены на соседнем с ними л/е/ла-протоне в дублет (данные протоны разделяют 3 химические связи); 2 эквивалентных л/етла-протона, которые расщепляются в триплет на орто- и «ара-прото- нах, и один лара-протон, который расщепляется в триплет на двух эквива- лентных л/е/иа-протонах. Таким образом, фенильный заместитель имеет три сигнала - дублет (2Н) рр/ло-протонов, триплет (2Н) л/е/иа-протонов и триплет (1Н) лара-протона. Протон, имеющийся в фурановом цикле, явля- ется изолированным, поскольку ближайший от него протон удален более чем на 3 связи, то есть он не связан ССВ с другими протонами, поэтому его сигнал будет синглетом. Все названные сигналы мы и видим в области 7-7.6 м.д., которая характерна для поглощения ароматических протонов. Сигналы бутильного заместителя должны быть расщеплены в соответствии с правилами ССВ 1 порядка, поскольку на расстоянии 3 химических связей от каждого из них имеются другие протоны. Сигнал метильной группы бу- тила должен иметь вид триплета. Сигнал метиленовых протонов, связан- ных с группой NH, должен в спектре проявиться в виде квартета (если все КССВ 37 одинаковы), сигнал метиленовой группы, ближайшей к мети- лу, должен иметь 6 компонентов, а сигнал соседней метиленовой группы - 5 компонентов. Их сигналы должны располагаться в области сильных по- лей. Таким образом, мультиплеты при 3.2, 1.5, 1.3 и 0.9 м.д. отвечают сиг- налам бутильной группы. По мере удаления от электроотрицательного атома азота химические сдвиги сигналов метиленовых протонов уменьшаются. На этом может быть основано отнесение мультиплетов. Сигнал протона NH чаще всего поглощает в слабом поле. Действительно, в спектре содер- жится триплет (1Н) при 7.8 м.д., который отвечает этому сигналу. Синглет изолированной метильной группы (ЗН) мы видим при 2.6 м.д. Таким обра- зом, спектр полностью согласуется с формулой соединения. Как свидетельствует проведенный выше анализ спектра, точные вели- чины химических сдвигов и КССВ не всегда используются для выяснения природы соединения. Для этого вполне достаточно знать приблизительные области поглощения сигналов и количество компонентов в мультиплетах. В более сложных случаях величины 8 и КССВ также следует приобщать к анализу спектра. 1.8.1. Определение параметров сигналов Получение из спектра параметров сигналов является вторым шагом его об- работки. Рассмотрим методику полного анализа протонного спектра. Для этого воспользуемся спектром гетероциклического соединения, которое соответствует формуле 1.8. 97
Глава 1. Интерпретация спектров Спектр изображен на рис. 1.30 и за- писан в таком виде, чтобы спектроско- пические параметры сигналов можно бы- ло найти максимально надежно. Пред- варительно следует заметить, что для оп- ределения величин КССВ в Гц из спект- ра, где положения пиков приведены в м.д., необходимо, чтобы точность оп- ределения химических сдвигов компонентов мультиплетов была не хуже 0.001 м.д. В таком случае, если разность между положениями компо- нентов мультиплета, выраженную в м.д., умножить на рабочую часто- ту прибора, выраженную в МГц (в нашем случае 400 МГц), получим величину КССВ в Гц с точностью до ±0.1 Гц. Положение синглетов и триплетов определяют как химический сдвиг средней линии сигнала, по- ложение дублетов и квартетов - как среднее значение между центральны- ми компонентами. Рис. 1.30. Спектр на ядрах !Н гетероциклического соединения 1.8. Как и раньше, проведем сначала отнесение сигналов. Для этого исполь- зуем таблицы химических сдвигов в распространенных фрагментах органи- ческих молекул и имеющиеся в спектре расщепления сигналов под влияни- ем ССВ (см. таблицы 1.4-1.8). Так, сигнал в наиболее слабом поле относится к протону NH. Этот сигнал имеет вид синглета, поскольку другие протоны 98
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса в молекуле расположены от него на расстоянии, которое превышает 3 хи- мические связи. Учитывая строение молекулы, отнесение этого сигнала бесспорно, поскольку никакой другой протон не может иметь сигнала в та- ком слабом поле. Сигналы при 8.80 и 8.74 м.д. отвечают поглощению про- тонов Н2’ и НЗ’. Мотивы для данного отнесения такие: во-первых, эти сиг- налы должны иметь близкие химические сдвиги, поскольку данные протоны имеют похожее химическое окружение; во-вторых, для данных протонов должны наблюдаться аномально маленькие КССВ через 3 связи, поскольку оба они находятся в a-положении пиридинового кольца (см. таблицу 1.9, строка 25). Синглет при 8.43 м.д. отвечает поглощению протона Н5’. Хотя для этого протона может наблюдаться ССВ через 4 химических связи, но оно проявляется в спектрах далеко не всегда. Другие сигналы в арома- тической части спектра надо анализировать одновременно. Так, согласно формуле, соединение содержит ароматическое кольцо со спиновой систе- мой AMRX, которая отвечает протонам Н4-Н7. Два из этих сигналов долж- ны быть дублетами, а два - триплетами. В спектре мы видим дублет при 7.38 м.д. и триплеты при 7.42 и 7.58 м.д. Наиболее логично отнести их со- ответственно к сигналам протонов Н4, Н6 и Н5. О том, что рядом с дуб- летом протона Н7 находится триплет протона Н6, свидетельствует то, что эти сигналы почти не искажены эффектами второго порядка - компоненты мультиплетов не имеют значительных аномалий интенсивности. Таким об- разом, еще не отнесенные сигналы образуют трехпротонный синглет при 7.96 м.д. Хотя на самом деле этот сигнал является мультиплетом, но его тонкая структура не проявляется из-за перекрывания сигналов. В более сильном поле мы наблюдаем три дублета дублетов, которые отвечают спиновой системе АВХ, образующейся протонами Н2 (X) и НЗа,Ь (АВ). Очевидно, что в более слабом поле при 5.34 м.д. содержится сигнал протона Н2, который имеет химическую связь с атомом кислорода. Для анализа мультиплетной структуры данных сигналов полезно, как это при- ведено на рис. 1.31, строить ’’деревья мультиплетов”, которые показывают, как именно происходит расщепление сигналов. При построении таких ’’деревьев” считают, что расщепление сигнала происходит сначала на одном партнере по ССВ, а потом - на другом. Таким образом, довольно просто показать принадлежность тех или иных КССВ и сравнивать их значения в связанных мультиплетах. Правила обозначения КССВ понятны из рис. 1.31. Количество связей, через которые передает- ся спиновое взаимодействие, обозначается как верхний индекс перед символом "J", а магнитные ядра, между которыми происходит взаи- модействие, обозначаются в скобках после символа ”J” Для нахожде- ния численного значения КССВ из частоты поглощения более слабополь- ного компонента мультиплета на ’’дереве” вычитают частоту компонен- та, который находится в более сильном поле. Разность умножают на рабо- 99
Глава 1. Интерпретация спектров чую частоту прибора (в нашем случае 400 МГц). Так, например, КССВ 2/(Н3а,Нзь) из компонентов мультиплетов, которые обозначены цифрами на рис. 1.31, можно найти как 51 - 53 = 52 - 54 = 55 - 57 = 56 - 58. Значения КССВ могут несколько отличаться для связанных мультиплетов. Отличия могут достигать 0.1-0.2 Гц. Это определяется дискретностью оцифровки сигналов. Если спектр измерен со стандартной цифровой разрешающей спо- собностью, то точность определения КССВ не превышает 0.2 Гц. Поэтому, если нужно более точное определение величин КССВ, спектр измеряется с увеличением количества точек оцифровки сигнала. Для этого при записи спектра достаточно увеличить время сбора данных (AQ) при неизменной ширине спектра (SW). Рис. 1.31. Принцип построения "дерева мультиплетов" 1.8.2. Представление результатов анализа спектра ЯМР После проведения отнесений сигналов и нахождения значений химических сдвигов и КССВ спектроскопические параметры описывают общеприня- тым образом. В описании спектра для каждого из сигналов указывается его химический сдвиг, количество протонов, которые образуют сигнал, най- денные величины КССВ и отнесение сигнала к конкретному протону. Опи- 100
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса сание является своеобразным паспортом синтезированного вещества, кото- рый размещается в экспериментальной части научной работы рядом с ана- литическими данными и физико-химическими характеристиками вещества. Объясним это на примере спектра, рассмотренного на рис. 1.30, описание которого дано ниже. Спектр ^-ЯМР, растворитель - ДМСОч/6, химические сдвиги в м.д. относительно ТМС, КССВ - в Гц: 10.68, с, 1Н, NH; 8.80, с, 1Н, НЗ’; 8.74, с, 1Н, Н2'; 8.43, с, 1Н, Н5'; 7.96, с, ЗН, Н7, Н7', Н8'; 7.56, т, 1Н, 3J = 7.5, Н5; 7.42, т, 1Н, 3J = 7.6, Н6; 7.38, д, 1Н, 3J = 7.5, Н4; 5.34, 1Н, дд, 3J = 5.2, 7.2, Н2; 3.49, дд, 1Н, 2J = 17.0,3J = 5.0, НЗЬ; 3.37, дд, 1Н, 2J = 17.0, 3J = 7.5, НЗа. В таких описаниях мультиплетность представляется в сокращенном ви- де: с - синглет, д - дублет, т - триплет, дд - дублет дублетов, кв - квартет, м - мультиплет. Количество протонов, которые образуют сигнал, обознача- ется для одного протона - 1Н, для двух протонов - 2Н и т.д. Именно так чаще всего подают результаты обработки спектра в диссертациях, научных журналах и т.п. Однако, хотя такое представление результатов и является общепризнанным, оно недостаточно наглядно и сопряжено с возмож- ностью возникновения ошибок. Если Вы производите отнесение сигналов не для публикации, а "для себя", луч- 7 % ше всего, на наш взгляд, подписы- вать величины химических сдвигов на структурной формуле молекулы возле соответствующих атомов, как показано на примере соединения 1.8. Здесь при необходимости можно ° также указать и величины КССВ. Аналогично результаты анализа представляются и при измерении спектров на других магнитных ядрах. Как вытекает из предыдущего обсуждения, запись спектра в том виде, как это нужно для нахождения спектроскопических параметров, требует намного больше времени, чем стандартный обзорный спектр, который пре- доставляет химику оператор спектрометра ЯМР. Поэтому каждый химик, который использует спектроскопию ЯМР для структурных исследований, должен сам уметь обрабатывать спектры с помощью программ для ПК. 1.8.3. Анализ спектра чистого соединения Измерение и анализ спектров на ядрах ’Н на предмет его соответствия структуре изучаемого соединения является ЯМР исследованием, которое проводится наиболее часто. Синтез новых соединений, их выделение из ре- 101
Глава 1. Интерпретация спектров акционной смеси и очистка разными методами нуждаются в контроле с помощью ЯМР. Этот контроль заключается в анализе вида спектра с целью идентификации сигналов примесей и установления соответствия спектра предполагаемой структуре соединения. Для проведения анализа часто бы- вает достаточно измерить обзорный спектр ЯМР. Главное требование к та- кому спектру - запись его в масштабе, который является достаточным для анализа мультиплетности сигналов. Кроме того, спектр должен содержать интегральную кривую и цифровые данные о химических сдвигах соедине- ния. Типичным спектром, который пригоден для идентификации соединения, является ОМе спектр соединения 1.9, который приведен N. на рис. 1.32. Спектр содержит фрагменты || 5 I сигналов ароматических протонов в увели- О ченном масштабе для более точного анали- Рис. 1.32. Спектр ЯМР соединения 1.9 на ядрах !Н, пригодный для иденти- фикации сигналов. Анализ спектра следует начинать с рассмотрения предполагаемой фор- мулы соединения. В ней надо выделить отдельные фрагменты, которые об- разуют изолированные спиновые системы, и по возможности точнее пред- ставить (используя справочные данные), как будут выглядеть их сигналы в спектре. В нашем примере имеем 5 изолированных спиновых систем. 102
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса а) Протоны метильной группы (интенсивность сигнала отвечает трем протонам ЗН) должны соответствовать спиновой системе Аз. Поскольку эта группа содержит три эквивалентных протона, которые не имеют спино- вой связи с другими ядрами, то ее сигнал должен быть синглетом. б) Протон группы NH (интенсивность сигнала 1Н) расположен в моле- куле таким образом, что от ближайшего протона его отделяют 4 химичес- кие связи. Поэтому он представляет собой спиновую систему Ai и его сиг- нал также должен быть синглетом. в) Протоны пиран-2-онового цикла (три сигнала по 1Н каждый), соглас- но формуле, образуют систему АВХ. При этом один из сигналов, который отвечает протону, расположенному возле гетероциклического атома кисло- рода, должен поглощать в значительно более слабом поле, чем сигналы двух других протонов, отвечающие метиленовой группе. Типичный вид спектра этого фрагмента содержится в приведенной выше таблице 1.9 (строка 5). г) Протоны ароматического цикла бензопирона (три сигнала по 1Н) отвечают спиновой системе АМХ. Они должны располагаться в диапазоне 6-8 м.д. Предсказать мультиплетность этих сигналов можно исходя из ана- лиза того, сколько протонов расположено на расстоянии 3 химических свя- зей от каждого из них. В соответствии с формулой два из числа протонов данной спиновой системы являются вицинальными (они отдалены один от другого на 3 химических связи), а третий протон - более изолированный. От него до ближайшего протона 4 связи. Таким образом, для данной спи- новой системы можно ожидать появления в спектре синглета и двух дубле- тов. Однако следует помнить, что в ароматических системах спин-спино- вая связь может передаваться и через 4 химических связи. КССВ при этом может составлять 2-3 Гц. Поэтому синглет и один из дублетов спиновой системы, которая рассматривается, могут быть расщепленными с неболь- шой КССВ. Типичный вид спектра этого фрагмента содержится в табли- це 1.9, строка 20. д) Протоны ароматического цикла анилинового фрагмента отвечают спиновой системе AMQX, они дают сигналы с суммарной интенсивностью 4Н. Учитывая количество протонов, которые отдалены один от другого на 3 химических связи, для сигналов данной системы следует ожидать появ- ления в спектре двух дублетов и двух триплетов (возможно также дальней- шее расщепление компонентов этих сигналов благодаря ССВ через 4 свя- зи). Сигналы должны располагаться в диапазоне 6-8 м.д. Типичный вид спектра этого фрагмента содержится в таблице 1.9, строка 18. Теперь, когда мы исходя из формулы соединения уже имеем представ- ление, какие именно сигналы должен содержать спектр, надо найти их в приведенном спектре. Прежде всего, обратим внимание на интегральные интенсивности сигналов. Они обозначены под соответствующими сигнала- ми (некоторые программы обработки спектров обозначают их также над сиг- 103
Глава 1. Интерпретация спектров налом или возле интегральной кривой). Видим, что лишь один из сигналов имеет интенсивность ЗН (сигнал]). Он расположен при 3.85 м.д. и отвечает метоксильной группе ОСН3. Синглет при 9.38 м.д. находится в области, ко- торая нехарактерна для поглощения ароматических протонов. Поэтому его следует отнести к протону NH. Следует запомнить, что протоны NH и ОН могут располагаться в очень широком спектральном диапазоне (1-16 м.д.). Поэтому, если в спектре содержатся сигналы с аномальными химическими сдвигами, то часто они принадлежат именно таким протонам (их называют подвижными). Доказать принадлежность сигнала к группам NH и ОН мож- но с помощью дейтерообмена, который происходит при добавлении к раст- вору капли дейтерированной воды. Если после этого повторно измерить спектр, сигналы подвижных протонов исчезнут или уменьшат свою интен- сивность. Количество протонов в ароматической области (6.7-8.0 м.д.) отвечает приведенной формуле. Следует лишь отнести сигналы к спиновым систе- мам, которые содержатся в молекуле. В нашем случае сигналы с, d, е отвеча- ют ароматическим протонам конденсированного к гетероциклу бензольного кольца А, а сигналы b, f, g, h отвечают протонам анилинового цикла В. При отнесении сигналов следует внимательно анализировать их мультиплет- ность и искажение интенсивности компонентов мультиплетов (эффект кры- ши). Так, принадлежность сигналов d и е именно протонам кольца А выте- кает, с одной стороны, из наличия дальней ССВ с протоном с, а с другой стороны, из одинакового увеличения интенсивности внутренних компонен- тов мультиплетов, которое свидетельствует о наличии спиновой связи меж- ду ними. Сигналы протонов пиран-2-онового фрагмента дают в спектре три дуб- лета дублетов (сигналы i, k, 1). Вид сигналов является характерным для сис- темы АМХ, где все КССВ являются неодинаковыми. Кроме сигналов сое- динения, в спектре содержится сигнал растворителя ДМСО-б?5 при 2.5 м.д., а также сигнал воды при 3.2 м.д. Таким образом, спектр соединения пол- ностью соответствует его формуле. 1.8.4. Анализ спектра соединения, содержащего примеси Рассмотрим пример спектра органического соединения 1.10, который кро- ме сигналов целевого соединения содержит также и сигналы примесей. Та- кие спектры можно получить в случае, если соединение после синтеза не было дополнительно очищено. Хотя строение примесей может быть раз- ным, но чаще всего примесями являются или исходные вещества, или раст- ворители, или продукты альтернативных реакций. Анализ спектра может дать химику ценные сведения о присутствии в образце веществ, которые 104
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса являются продуктами конкурирующих процессов. Они могут быть даже более интересными, чем основная реакция. Поэтому, когда Вы получили спектр грязного вещества, проанализируйте вид сигналов примесей. Если же спектр содержит сигналы растворителей, то не следует дополнительно очищать соединение, достаточно его хорошо высушить. Ниже на рисунке 1.33 приведен спектр соединения 1.10, которое явля- ется близким аналогом соединения 1.9. О Как и раньше, прежде всего установим соответствие соединения приведенной || J | 9 Н формуле, для чего проанализируем, сигналы каких спиновых систем долж- II 11^1 ны содержаться в спектре исходя из ® ^^^NEt строения соединения. 110 Рис. 1.33. Спектр !Н соединения 1.10, которое содержит примеси. Соединение содержит две эквивалентные этильные группы (строка 2 в таблице 1.9). Поэтому в спектре следует ожидать появления триплета и квартета с относительными интенсивностями сигналов 4Н и 6Н, соответст- венно. В слабом поле должен присутствовать синглет NH. Протоны бензо- пиран-2-онового кольца должны дать в ароматической области сигналы спиновой системы АМХ, а именно два дублета и синглет с возможным даль- нейшим расщеплением, обусловленным дальним ССВ (строка 20 в табли- 105
Глава 1. Интерпретация спектров це 1.9). Ароматические протоны анилинового фрагмента образуют спино- вую систему АА’ВВ’, которая в большинстве случаев имеет вид двух дуб- летов с относительной интенсивностью 2Н каждый (строка 16 в таблице 1.9). Протоны пиран-2-онового цикла образуют систему АМХ с неодинаковыми КССВ между каждым из протонов (строка 5 в таблице 1.9). Таким образом, их сигналы должны иметь вид трех дублетов дублетов. Анализ спектра позволяет выявить в нем все спиновые системы, кото- рые отвечают формуле соединения. Так, сигнал а отвечает протону NH. Сигналы Ь, с, d, имеющие вид двух дублетов и синглета с относительной интенсивностью 1Н каждый, являются сигналами ароматических протонов цикла А. Два дублета е и f интенсивностью по 2Н связаны с ароматичес- кими протонами анилинового фрагмента. В наиболее сильном поле, при 1.38 м.д., виден триплет, а при 3.28 м.д. - квартет этильной группы. Име- ются в спектре и сигналы спиновой системы АВХ пиран-2-онового цикла. Однако в данном случае один из сигналов совпадает с сигналом метилено- вых протонов этила. Это видно из его завышенной интегральной интенсив- ности. Сигнал при 3.28 м.д. имеет относительную интенсивность не 4Н, а 5Н. Другие два сигнала спиновой системы АВХ наблюдаются отдельно (сигналы g и h). Таким образом, спектр соединения отвечает приведенной формуле. Однако кроме сигналов, интенсивность которых отвечает одному или нескольким протонам, в спектре содержится ряд сигналов сравнитель- но низкой интенсивности. Их хорошо видно при увеличении масштаба аро- матической области спектра. Имеется посторонний сигнал также и в али- фатической области (сигнал при 1.24 м.д.). Таким образом, спектр содер- жит сигналы примесей. Для того, чтобы оценить их количество, считают, что молекулярная масса примеси несильно отличается от молекулярной массы основного соединения. В этом случае, в первом приближении, соот- ношения интенсивностей сигналов основного соединения и примесей при- близительно отвечают мольной доли примеси. Так, если считать, что сиг- нал примеси при 6.65 м.д. интенсивностью 0.17Н отвечает двум протонам (аналогичным двум протонам основного вещества, которые поглощают при 6.54 м.д.), то содержание примеси равняется 0.17/(2 + 0.17) = 8 моль- ным %. Следует еще раз отметить, что рассчитанное таким образом содержание примесей является очень приблизительным, поскольку на самом деле неизвестно не только химическое строение и молекулярная масса примеси, а даже количество примесных компонентов. Тем не ме- нее, среди химиков устоявшимся является подход: если сигналы каждого из протонов примесей не превышают по интенсивности 0.1Н, то соедине- ние считается достаточно чистым для дальнейшей работы и биологических исследований. В таком случае при наихудших условиях содержание при- меси не превысит 10%, а на самом деле, когда примесью является один из исходных компонентов, оно составляет около 5%. 106
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 1.8.5. Анализ сложных спектров ПМР В предыдущих параграфах были рассмотрены довольно простые спектры, которые не содержали перекрывающихся сигналов, не поддающихся иден- тификации. При анализе спектров часто приходится сталкиваться с ситуа- цией, когда в спектре видны не отдельные сигналы, а плохо структуриро- ванные мультиплеты, являющиеся результатом наложения нескольких сиг- налов. Форма сигналов при этом во многих случаях является такой, что невозможно заранее предусмотреть, какие именно сигналы образовали этот сложный мультиплет. Анализ таких спектров касательно их соответствия предполагаемой структуре имеет некоторые особенности. Прежде всего, следует проанализировать значения интегральных интенсивностей отдель- ных сигналов и убедиться, что общее количество протонов отвечает струк- турной формуле молекулы. При этом надо особое внимание уделить интен- сивности многопротонных сигналов. Поскольку как стандарт интенсивнос- ти берется тот сигнал, количество протонов в котором известно, то вели- чины интегралов других сигналов, которые содержатся в спектре, являются производными от этой величины. Следует иметь в виду, что значения ин- тегральных интенсивностей не являются точными, они измеряются с неко- торой, иногда значительной (5-10%), погрешностью. Если, как это было раньше, все сигналы наблюдались отдельно, то отклонение величин их ин- тегралов не превышало нескольких процентов. Если же есть сигнал, кото- рый отвечает одновременно 4-5 протонам, то для него интегральная ин- тенсивность может составлять, например, 4.5Н. В таком случае может по- казаться, что в целом спектр содержит на 1 протон больше, чем это отвеча- ет формуле, или меньше, чем это предполагается. Тогда на первой стадии анализа спектра целесообразно считать, что спектр согласуется со структу- рой молекулы, и искать веские аргументы, которые могут пошатнуть такое предположение. Поэтому, если значение интегральной интенсивности слож- ного сигнала не является целым числом, то можно попробовать присвоить ему нужное значение, соответствующее структуре молекулы, и посмот- реть, как изменятся при этом интенсивности других сигналов. Если их величины отличаются от целых чисел не больше, чем на 0.1Н, то считают, что интеграл согласуется со структурной формулой. Если это не совсем так, то можно попробовать как репер интенсивности выбрать произволь- ный сигнал, присутствующий в спектре. Если хотя бы при одном варианте выбора репера все интегралы окажутся близкими к целым величинам, мож- но считать, что соединение имеет ожидаемое количество протонов. Ниже, на рис. 1.34, приведен фрагмент спектра соединения 1.11, для которого наблюдается именно такая ситуация. Видим, что сигнал с, который является результатом наложения не- скольких сигналов, имеет нецелое значение интегральной интенсивности, 107
Глава 1. Интерпретация спектров которое не дает возможности надежно проанализировать спектр. При этом интенсивности всех других сигналов довольно близки к целым числам. Из формулы видно, что соединение должно содержать 8 ароматических про- тонов, поэтому сигнал с должен состоять из пяти протонов. Ниже (рис. 1.35) приведен тот же самый спектр соединения, но как репер интегральной ин- тенсивности выбран сигнал метиленовых протонов g, причем ему присвое- но значение 2Н. Рис. 1.34. Спектр !Н соединения 1.11 с совпадающими сигналами и неудач- но установленными интегральными интенсивностями сигналов. Видим, что в данном случае все интенсивности достаточно близки к целым числам. То, что относительные интегральные интенсивности зави- сят от выбора репера, обусловлено, с одной стороны, неточностями интег- рирования, а с другой стороны - эффектами насыщения, которые всегда могут иметь место в спектре. Если в качестве репера интенсивности вы- брать сигнал ядер, которые полностью не отрелаксировали и имеют зани- 108
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса женную интенсивность, то все другие сигналы будут иметь завышенную интенсивность. Рис. 1.35. Спектр !Н соединения 1.11 с совпадающими сигналами при пра- вильной установке интегралов. Если все сигналы в спектре, которые наблюдаются отдельно, можно отнести к конкретным протонам, которые содержатся в молекуле, то мож- но считать, что еще не отнесенные сигналы накладываются один на другой и дают сложный мультиплет. В таких случаях считается, что соединение отвечает ожидаемой структурной формуле при условии, если изучается не одно соединение, а ряд структурных аналогов, которые имеют некоторые отличия в структуре. В таких рядах практически всегда хотя бы для одного из соединений спектр оказывается достаточно простым для полного отне- сения сигналов. Если же исследуемое соединение является единственным, то для большей уверенности в отнесении сигналов следует измерить его спектр на ядрах 13С либо провести другие ЯМР эксперименты. В нашем при- мере в состав сигнала с интенсивностью 5Н попадают два дублета и синг- лет фрагмента, который является льзамещенным фенилом, и один из двух протонных дублетов фрагмента и-фенила. Все остальные сигналы, которые имеются в спектре, согласуются с формулой. Так, сигнал а при 10.5 м.д. отвечает протону NH, триплет b отвечает протону Н5 льфенила, дублет d интенсивностью 2Н связан с протонами и-фенильного заместителя, синглет е отвечает изолированной метиленовой группе, а сигналы f-h отвечают 109
Глава 1. Интерпретация спектров протонам бутильного заместителя. Приведенный пример иллюстрирует то, что спектр ЯМР на ядрах 1Н, удовлетворяющий структурной формуле соединения, не является 100%-ной гарантией того, что целевое соединение имеет предполагаемое строение. Для большей уверенности следует изме- рять спектр вещества также и на других ядрах, чаще всего на ядрах 13С. Если и этот спектр согласуется со структурой молекулы, то достоверность выводов о структуре существенно увеличивается. 1.9. Задачи. Интерпретация спектров ЯМР на ядрах !Н Поскольку первая часть учебника посвящена интерпретации спектров ЯМР. то читатель должен иметь возможность получить в этом практические на- выки. Для этого ниже приведена серия задач. Мы весьма рекомендуем чи- тателю решить несколько из предложенных задач, прежде чем переходить к освоению последующего материала книги. (Внимание! Все спектры сняты на спектрометре с рабочей частотой 400 МГц для протонов и при использовании ДМСОч7б как растворителя.) 1. Основываясь на положении сигналов в спектре который приве- q ден на рис. 1.36, и на их мультиплетное™, най- II Дите, согласуется ли спектр со структурной фор- мулой соединения 1.12. Если в спектре содер- Л Н О Л жатся сигналы примесей, найдите их приблизи- ! 12 тельное количество. При анализе пользуйтесь таблицами 1.4-1.8. 110
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 2. Пользуясь спектром на ядрах 'Н, показанным на рис. 1.36, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите формулу соединения 1.12 и обозначьте найденные парамет- ры возле соответствующих магнитных ядер. 3. Основываясь на положении сигналов в спектре *Н, который приве- ден на рис. 1.37, и на их мультиплетности, найдите, согласуется ли спектр со структурной формулой соедине- ния 1.13. Если в спектре содержатся сигналы примесей, найдите их при- близительное количество. При ана- лизе пользуйтесь таблицами 1.4-1.8. 1.13 Рис. 1.37. Спектр на ядрах ’Н соединения 1.13. 4. Пользуясь спектром на ядрах 'Н, показанным на рис. 1.37, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите структурную формулу соединения 1.13 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 5. Основываясь на положении сигналов в спектре 'Н, который при- веден на рис. 1.38, и на их мультиплетности, найдите, согласуется ли спектр со структурной формулой соединения 1.14. Если в спектре содержатся сигналы примесей, найдите их приблизительное количество. При анализе пользуйтесь таблицами 1.4-1.8. 111
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.38. Спектр на ядрах !Н соединения 1.14. 6. Пользуясь спектром на ядрах ‘Н, показанным на рис. 1.38, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите структурную формулу соединения 1.14 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 7. Основываясь на положении сигналов в спектре !Н, который приведен на рис. 1.39, и на их мультиплетное™, найдите, согласуется ли спектр со 8. Пользуясь спектром на ядрах структурной формулой соединения 1.15. Если в спектре содержатся сигналы примесей, найдите их при- близительное количество. При ана- лизе пользуйтесь таблицами 1.4-1.8. !Н, показанным на рис. 1.39, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите структурную формулу соединения 1.15 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 112
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.39. Спектр на ядрах !Н органического соединения 1.15. 9. Основываясь на положении сигналов в спектре ‘Н, который приве- 1.16 ден на рис. 1.40, и на их мультиплетности, най- дите, согласуется ли спектр со структурной фор- мулой соединения 1.16. Если в спектре содер- жатся сигналы примесей, найдите их приблизи- тельное количество. При анализе пользуйтесь таблицами 1.4-1.8. Рис. 1.40. Спектр на ядрах !Н органического соединения 1.16. ИЗ
Глава 1. Интерпретация спектров 10. Пользуясь спектром на ядрах ‘Н, показанным на рис. 1.40, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите структурную формулу соединения 1.16 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 11. Основываясь на положении сигналов в спектре ’Н, который приве- ден на рис. 1.41, и на их мультиплетности, найдите, согласуется ли спектр со структурной формулой соединения 1.17. Если в спектре содержатся сиг- налы примесей, найдите их приблизи- тельное количество. При анализе поль- зуйтесь таблицами 1.4-1.8. Рис. 1.41. Спектр на ядрах !Н органического соединения 1.17. 12. Пользуясь спектром на ядрах *H, показанном на рис. 1.41, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите структурную формулу соединения 1.17 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 13. Основываясь на положении сигналов в спектре !Н, который приве- ден на рис. 1.42, и на их мультиплетности, найдите, согласуется ли спектр 1.18 со структурной формулой соединения 1.18. Если в спектре содержатся сигналы примесей, найдите их приблизительное количество. При анализе пользуйтесь таблицами 1.4-1.8. 114
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.42. Спектр на ядрах !Н органического соединения 1.18. 14. Пользуясь спектром на ядрах !Н, показанным на рис. 1.42, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите структурную формулу соединения 1.18 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 15. Основываясь на положении сигналов в спектре !Н, который при- веден на рис. 1.43, и на их мультиплет- N ности, найдите, согласуется ли спектр со / Н / структурной формулой соединения 1.19. —\\ /)—S Если в спектре содержатся сигналы при- || I Z ' месей, найдите их приблизительное коли- О чество. При анализе пользуйтесь табли- 1.19 цами 1.4-1.8. 16. Пользуясь спектром на ядрах !Н, показанным на рис. 1.43, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите структурную формулу соединения 1.19 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 17. Основываясь на положении сигналов в спектре !Н, который приве- ден на рис. 1.44, и на их мультиплетности, найди- те, согласуется ли спектр со структурной форму- / н лой соединения 1.20. Если в спектре содержатся \^J сигналы примесей, найдите их приблизительное |1 / v количество. При анализе пользуйтесь таблица- ® О ми 1.4-1.8. 1,20 18. Пользуясь спектром на ядрах !Н, показанным на рис. 1.44, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- 115
Глава 1. Интерпретация спектров ре. Начертите структурную формулу соединения 1.20 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. Рис. 1.43. Спектр на ядрах !Н органического соединения 1.19. Рис. 1.44. Спектр на ядрах !Н органического соединения 1.20. 19. Основываясь на положении сигналов в спектре !Н, который приве- ден на рис. 1.45, и на их мультиплетности, найдите, согласуется ли спектр со структурной формулой соединения 1.21. Если в спектре содержатся сиг- 116
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса налы примесей, найдите их приблизитель- ное количество. При анализе пользуйтесь таблицами 1.4-1.8. 20. Пользуясь спектром на ядрах !Н, по- казанным на рис. 1.45, найдите спектроско- пические параметры всех сигналов, которые содержатся в спектре. Начертите структурную формулу соединения 1.21 и обозначьте найденные параметры возле соответствующих магнитных ядер. Рис. 1.45. Спектр на ядрах !Н органического соединения 1.21. 21. Основываясь на положении сигналов в спектре !Н, который при- веден на рис. 1.46, и на их мультиплетное- ти, найдите, согласуется ли спектр со струк- Г Н турной формулой соединения (соединение 1.22). Если в спектре содержатся сигналы II I I примесей, найдите их приблизительное ко- С1//^"Х^С1 Н О личество. При анализе пользуйтесь таблица- 1.22 ми 1.4-1.8. 22. Пользуясь спектром на ядрах !Н, показанным на рис. 1.46, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите структурную формулу соединения 1.22 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 23. Основываясь на положении сигналов в спектре !Н, который при- веден на рис. 1.47, и на их мультиплетности, найдите, согласуется ли 117
Глава 1. Интерпретация спектров ОМе 1.23 спектр со структурной формулой сое- динения 1.23. Если в спектре содер- жатся сигналы примесей, найдите их приблизительное количество. При анализе пользуйтесь таблица- ми 1.4-1.8. Рис. 1.46. Спектр на ядрах ’Н органического соединения 1.22. Рис. 1.47. Спектр на ядрах *Н органического соединения 1.23. 118
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 24. Пользуясь спектром на ядрах !Н, показанным на рис. 1.47, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите структурную формулу соединения 1.23 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 25. Основываясь на положении сигналов в спектре !Н, который приве- ден на рис. 1.48, и на их мультиплетное™, найдите, согласуется ли спектр Рис. 1.48. Спектр на ядрах !Н органического соединения 1.24. 26. Пользуясь спектром на ядрах !Н, показанным на рис. 1.48, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите структурную формулу соединения 1.24 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 27. Основываясь на положении сигналов в спектре !Н, который при- веден на рис. 1.49, и на их мультиплет- ное™, найдите, согласуется ли спектр со структурной формулой соединения 1.25. Если в спектре содержатся сиг- налы примесей, найдите их приблизи- тельное количество. При анализе поль- зуйтесь таблицами 1.4-1.8. 119
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.49. Спектр на ядрах !Н органического соединения 1.25. 28. Пользуясь спектром на ядрах !Н, показанным на рис. 1.49, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спект- ре. Начертите структурную формулу соединения 1.25 и обозначьте найден- ные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 29. Основываясь на положении сигналов в спектре !Н, который приве- ден на рис. 1.50, и на их мультиплетности. найдите, согласуется ли спектр со струк- турной формулой соединения 1.26. Если в спектре содержатся сигналы примесей, най- дите их приблизительное количество. При анализе пользуйтесь таблицами 1.4-1.8. 30. Пользуясь спектром на ядрах !Н, по- казанным на рис. 1.50, найдите спектроскопические параметры всех сигна- лов, которые содержатся в спектре. Начертите структурную формулу соеди- нения 1.26 и обозначьте найденные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 31. Основываясь на положении сигналов в спектре 1Н, который приве- ден на рис. 1.51, и на их мультиплетнос- ти, найдите, согласуется ли спектр со структурной формулой соединения 1.27. Если в спектре содержатся сигналы при- месей, найдите их приблизительное коли- чество. При анализе пользуйтесь табли- цами 1.4-1.8. 120
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.50. Спектр на ядрах 'Н органического соединения 1.26. Рис. 1.51. Спектр на ядрах ‘Н органического соединения 1.27. 32. Пользуясь спектром на ядрах 'Н, показанным на рис. 1.51, найдите спектроскопические параметры всех сигналов, которые содержатся в спектре. Начертите структурную формулу соединения 1.27 и обозначьте найденные параметры возле соответствующих магнитных ядер. 121
Глава 1. Интерпретация спектров 1.10. Константа спин-спинового взаимодействия {КССВ) (Н,Н) и строение молекул Из предыдущих разделов учебника мы узнали, что анализ положения сиг- налов в спектре ЯМР, их интенсивности и мультиплетности во многих слу- чаях дает возможность идентифицировать химическое соединение, то есть ответить на вопрос о том, соответствует ли оно предполагаемой структур- ной формуле. Однако у химиков часто возникает потребность выяснить более тонкие детали строения синтезированного соединения. Так, бывает необходимо определить, какую форму, плоскую или неплоскую, имеют циклические соединения, как ориентируются в пространстве имеющиеся в молекуле заместители и т.п. Все эти вопросы относятся к конформацион- ному анализу химических соединений. Произвести такой анализ на основа- нии величин химических сдвигов магнитных ядер, которые входят в состав соединения, как правило, не удается. Решению таких вопросов во многих случаях помогает анализ величин КССВ. Эффективность такого подхода обусловлена тем, что информация об ориентации каждого из спинов пере- дается в молекуле на другие спины посредством связывающих электронов. Поэтому на эффективность такой передачи, а следовательно, и на вели- чину КССВ влияют все электронные и геометрические параметры мо- лекулы - углы между связями, ориентация связей в пространстве, гиб- ридизация, наличие неподеленных электронных пар. Теоретически, зная строение молекулы, можно с помощью квантово-механических подходов рассчитать величины всех имеющихся в молекуле КССВ, а путем их опти- мизации для различных конформаций предсказать стереохимическое строе- ние молекулы. Однако, как и при других квантово-химических расчетах, для того, чтобы они были точными, о молекуле необходимо слишком мно- го знать. Поэтому такие расчеты редко бывают надежными для произволь- ной молекулы, когда для нее известна только предполагаемая структура. Вследствие этого химик чаще решает противоположную задачу - по имею- щимся параметрам спектров ЯМР он делает выводы о строении молекулы. В таком подходе с самого начала заложена некоторая неопределенность, поскольку выводы, которые делаются на основании спектральных парамет- ров, зависят от первоначальной гипотезы о строении молекулы. Это может обусловливать получение ошибочных результатов. Для того, чтобы резуль- таты были более надежными, приходится анализировать намного больше спектральных параметров, чем это, казалось бы, необходимо. Так, сейчас является общепринятым параллельно анализировать величины химических сдвигов и КССВ для ядер !Н и 13С. Эти разновидности спектроскопии ЯМР вполне независимы, и каждая из них позволяет делать выводы о строении молекулы. Если данные, которые получены для разных ядер, позволяют 122
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса сделать одинаковые выводы о строении молекулы, то полученный резуль- тат считается вполне достоверным. Наилучшим образом для целей повседневного анализа структуры син- тезированных соединений зарекомендовал себя подход, когда выводы о строении неизвестной молекулы делаются на основании аналогий с изучен- ными ранее соединениями. Поэтому мы коснемся того, как те или иные структурные особенности молекулы влияют на величины различных КССВ. Это позволит читателю при необходимости перенести описанные рассуж- дения на изучаемые им объекты. При таком подходе всегда следует учиты- вать, что в Вашем конкретном случае величины КССВ могут несколько отличаться от тех, которые найдены для других соединений. Поэтому не следует из них делать слишком строгих выводов, например говорить о том, что торсионный угол в молекуле составляет 55° на основании того, что 3J(H,H) = 3 Гц. Более правильно говорить в данном случае о скошенной или гош-конформации, когда величина угла не указывается. 1.10.1. Геминальные КССВ 2J(H,И) Геминальные КССВ - это константы спин-спинового взаимодействия через две химические связи. Они чаще всего встречаются во фрагменте СН2 и имеют величины в интервале от -23 Гц в молекуле циклопентадиена до +41 Гц в молекуле формальдегида. Как видим, диапазон данных КССВ яв- ляется довольно большим, причем может изменяться не только видимая аб- солютная величина 2J(H,H), но и ее знак. При сравнении соединений может возникнуть ситуация, когда увеличение геминальной КССВ приводит к уменьшению ее видимого значения. Так, например, увеличение 2J(H,H) в ряде соединений от -10 Гц до +2 Гц визуально будет восприниматься как уменьшение величины данной КССВ на 8 Гц. В целом большие отрица- тельные значения геминальных КССВ являются более характерными, поэто- му, если в спектре соединения наблюдается большая геминальная КССВ, то с высокой вероятностью она имеет отрицательный знак. Когда же геми- нальная КССВ является небольшой, то она может быть как положитель- ной, так и отрицательной. Прежде чем делать выводы о структуре молекулы на основании вели- чин КССВ, следует всегда помнить, что на них оказывают влияние несколь- ко факторов одновременно, причем знак такого воздействия может быть разным - одни факторы увеличивают КССВ, а другие - ее уменьшают. Мы же в эксперименте наблюдаем усредненный результат тако- ф = q го воздействия. Например, в случае геминальных КССВ меж- Н L-_q ду протонами следует учитывать такие факторы: а) электро- ® отрицательность атома X, связанного с метиленовым фраг- Н х ф = 0 123
Глава 1. Интерпретация спектров ментом; б) угол 0 между связями Н-С-Н метиленовой группы; в) торсион- ный угол ф с соседним заместителем; г) наличие и ориентацию близлежа- щих неподеленных электронных пар. Все названные факторы одинаково сильно влияют на величину геми- нальной КССВ, поэтому ни один из них нельзя игнорировать. Ниже мы рассмотрим каждый из названных факторов по отдельности. Это даст чита- телю представление об их воздействии на КССВ. При анализе строения реальной молекулы следует, прежде всего, построить ее пространственную модель (механическую или компьютерную) и одним из методов молеку- лярной механики произвести оптимизацию ее строения. Это даст возмож- ность выявить факторы, которые оказывают наибольшее влияние на КССВ в данном конкретном случае. Весьма полезно также производить анализ величин КССВ в серии однотипных соединений, различающихся объемом и электроотрицательностью заместителей. Такой подход во много раз по- вышает надежность выводов о строении молекулы, которые Вы сделаете на основании величин КССВ. Угол между протонами в метиленовой группе существенно влияет на величину геминальной КССВ. Представление об этом можно получить при сравнении величин 2J для соединений различного строения, которые при- ведены на рис. 1.54. Однако следует отметить, что отклонение угла от тет- раэдрического, как правило, связано с тем, что метиленовая группа являет- ся частью жесткого цикла, а в этом случае имеется несколько альтернатив- ных путей передачи ССВ. Поэтому трудно утверждать однозначно, что на величину КССВ влияет изменение угла. Возможно, решающее влияние здесь оказывают пути передачи ССВ. На величину геминальной КССВ сильно влияет атом, с которым свя- заны взаимодействующие протоны, а также возможность делокализации электронов этих протонов. При этом смещение электронов от протонов на связанный с ними атом приводит к возрастанию КССВ, а смещение элект- ронов на взаимодействующие протоны - к ее убыванию. Эту тенденцию можно использовать для объяснения изменений величин геминальных КССВ в соединениях близкого строения. Наиболее практически важным для химиков является воздействие на величину КССВ неподеленных электронных пар атомов, соседних с мети- леновой группой, для которой наблюдается ССВ. Так, если рядом с метиле- новой группой расположен карбонил, то величину геминальной КССВ для протонов метиленовой группы можно найти из графика, изображенного на рис. 1.52. Здесь угол <р = О отвечает конформации, когда ориентация бис- сектрисы угла Н-С-Н и связи С=О (показана стрелкой) является антипери- планарной. 124
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.52. Зависимость рассчитанной величины геминальной КССВ от ее ориентации относительно соседней неподеленной электронной пары, ср - торсионный угол между биссектрисой угла Н-С-Н и связью С=О. Данный график можно использовать для выяснения на основании ве- личины геминальной КССВ конформации подвижных циклов или же для определения усредненной конформации метиленовой группы относитель- но соседнего карбонила. Величину КССВ можно также найти математичес- ки, для чего пригодна эмпирическая формула: 2J(H,H) = -12.6- 6.0 cos2(p. (1.16) Похожее уравнение получено и для геминальной КССВ протонов ме- тиленовой группы, расположенной рядом с олефиновой двойной связью. Оно имеет вид: 2J(H,H) =-10.6-9.1 cos2(p. (1.17) Совершенно аналогичный подход можно использовать и для конфор- мационного анализа соединений, которые содержат по соседству с метиле- новой группой гидроксильную либо аминогруппу. Здесь основной вклад в КССВ также вносит ориентация неподеленных электронных пар атома кис- лорода либо азота относительно метиленовых протонов. Однако диапазон возможных КССВ для таких соединений несколько меньше, чем в случае карбонилсодержащих производных. Зависимость КССВ между метилено- выми протонами, рядом с которыми находится группа ОН либо NH2, пока- зана на рис. 1.53. Здесь различия в графиках обусловлены тем, что атом азота имеет одну неподеленную пару электронов, а атом кислорода - две такие пары. 125
Глава 1. Интерпретация спектров Угол ф, градусы Рис. 1.53. Зависимость КССВ между протонами метиленовой группы, рас- положенной рядом с аминогруппой (черный кружок) и гидроксильной груп- пой (черный квадрат). При конформационном анализе органических соединений, основанном на КССВ, всегда следует помнить, что на величину геминальной КССВ ока- зывает влияние не только ориентация близлежащих неподеленных элект- ронных пар, но и такой фактор, как наличие альтернативных путей пере- дачи ССВ. Поэтому при анализе циклических структур реальные величины КССВ могут существенно отличаться от расчетных. Желательно в серии изучаемых соединений иметь хотя бы одно соединение, геометрия которо- го установлена ранее. Это позволит внести в расчеты соответствующие коррективы. Ниже, на рис. 1.54, приведены типичные значения геминальных КССВ для органических соединений разнообразного строения. Здесь в большинстве случаев приведены величины 2J(H,H) для незаме- щенных соединений. Наличие электроноакцепторных заместителей рядом с метиленовой группой уменьшает КССВ на 3-5 Гц (если КССВ отрица- тельная, абсолютная ее величина увеличивается). Чаще всего с геминаль- ными КССВ приходится иметь дело, когда измеряются спектры цикличес- ких соединений или когда в соединении содержится метиленовая группа во фрагменте, который не способен к свободному вращению. Геминальная КССВ может также проявляться между протонами метиленовых групп в хиральных соединениях, даже когда возможно свободное вращение соответствующих фрагментов. В таких случаях протоны метиленовых групп являются диастереотопными, что обусловливает неодинаковые хи- мические сдвиги их сигналов. В случае, когда возможен эффективный пе- 126
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса реход между конформерами в ахиральных соединениях, химические сдви- ги протонов метиленовой группы усредняются и соответственно они дают в спектре синглет. Рис. 1.54. Зависимость величины геминальной КССВ от строения молекулы. 1.10.2. Вицинальные КССВ 3J(H,H) Константы, которые отвечают спин-спиновому взаимодействию ядер через три химические связи, называют вицинальными. С ними приходится иметь дело наиболее часто. Величины констант 3J(H,H) наблюдаются в диапазоне от 0 до 20 Гц. Знак вицинальных КССВ, как правило, положительный. Они встречаются в соединениях практически всех типов - в ароматических, ге- тероциклических, алициклических и алифатических. На величины вици- нальных КССВ влияют как электронные, так и стереохимические особен- ности молекулы, поэтому их часто используют для нахождения простран- ственного строения органических соединений. Для конформационного анализа молекул наиболее часто используют изученную Карплусом зависимость величины 3J(H,H) от двугранного угла 127
Глава 1. Интерпретация спектров между взаимодействующими спинами. Эта зависимость в простейшем слу- чае имеет вид: 3 J = А + Bcos(p + Ccos2(p. (1.18) Для ССВ между протонами А = 4.22, В = -0.5 и С = 4.5. График этой зависимости показан на рис. 1.55. 0° 20° 40° 60° 80° 100° 120° 140° 160° 180° Ф Рис. 1.55. Зависимость 3J(H,H) от двугранного угла ф между взаимодейст- вующими протонами в соответствии с формулой Карплуса (сплошная ли- ния). Заштрихована область экспериментальных значений. Поскольку, как это уже указывалось ранее, на величину КССВ влияет не только двугранный угол, то для реальных молекул одному и тому же торсионному углу могут соответствовать вицинальные КССВ в некотором диапазоне. Представление о величине этого диапазона дает заштрихован- ная на рис. 1.55 область. Вертикальный срез этой области для различных торсионных углов ф соответствует возможному отклонению 3J(H,H) от ве- личины, вычисленной по формуле Карплуса. В литературе описано множество модификаций формулы Карплуса, которые позволяют более точно вычислять торсионные углы в молекуле на основании КССВ, однако они пригодны лишь для ограниченного круга объектов. На качественном уровне формулу Карплуса и график, показан- ный на рис. 1.55, можно использовать и для предсказания КССВ между другими магнитными ядрами. Зависимость вицинальной КССВ от двугранного угла между взаимо- действующими протонами наблюдается для соединений самого различного строения. Это отражает тесную связь величин КССВ со строением молеку- лярных орбиталей. На рис. 1.56 приведено несколько реальных молекул с из- вестным строением, для которых имеются данные по вицинальным КССВ. Они могут служить основой для анализа соединений близкого строения. 128
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 3*7(акс,экв) 3.7 Гц, 0 = 55° 3Лэкв, экв) 3.0 Гц, 0 = 64° Чаксакс)= 13-17 ГЦ, 0= 173° 3 J (транс) 0= 123° = 3.9 Гц, Н Н Н Стране) 3.8 Гц, 3*4иис) 8.4 Гц, 0=147° 0 = 4° 3J(TpaHC) = 1.8 Гц, 3/(цис) = 4.7Гц, 0=130° 0 = 0° Рис. 1.56. Вицинальные КССВ, 3J(H,H), и строение молекул. 1.10.2.1. Воздействие электроотрицательности заместителей на 3J(H,H) Помимо зависимости вицинальной КССВ от двугранного угла между взаи- модействующими спинами на них оказывает влияние также и электро- отрицательность заместителей, то есть их способность оттягивать на себя электроны. При этом кривая Карплуса, приведенная на рис. 1.55, может сжиматься либо растягиваться вдоль вертикальной оси. Уменьшение элект- ронной плотности на атомах, через которые передается ССВ, приводит к уменьшению вицинальной КССВ. Уже данный факт позволяет предвидеть изменение 3J(H,H) на качественном уровне. Более точные результаты можно получить с помощью простейших расчетов. Так, для алифатических углево- дородов воздействие изменения электроотрицательности, ДЕ = Е(Х) - Е(Н), вызванное заменой водородного атома Н на группу X, на величину 3J(H,H) можно вычислить по формуле: 3J(H,H) = 9.41 - 0.80ДЕ. (1.19) В качестве величин электроотрицательностей атомов и функциональ- ных групп можно использовать любые табличные значения, например те, которые приведены в таблице 1.10. 129
Глава 1. Интерпретация спектров Таблица 1.10. Величины электроотрицательностей распространенных за- местителей Заместитель Электро- отрицательность Заместитель Электро- отрицательность Н 2.592 I 2.778 F 4.000 СН3 2.472 о 3.654 СН2С1 2.538 С1 3.475 СС13 2.666 N 3.194 Ph 2.717 Вг 3.219 CF3 2.985 S 2.957 CN 3.208 р 2.515 no2 3.421 Насколько силен этот эффект для алифатических углеводородов по- нятно из таблицы 1.11. Таблица 1.11. Величины 3J(H,H) между протонами этильной группы Формула 3J(H,H), Гц Формула 3J(H,H), Гц CH3CH2Li 8.9 СН3СН2С1 7.2 CH3CH2Si(Me3) 8.0 CH3CH2OEt 7.0 CH3CH2CN 7.6 CH3CH2O+Me2 4.7 В непредельных соединениях воздействие электроотрицательности за- местителей может быть еще более существенным. Для вычисления предпо- лагаемых КССВ в замещенных этиленах можно использовать формулы: 3Лранс = 19.0-3.3 ДЕ, (1.20) Чис = 11.7-4.7 ДЕ. (1.21) Величины наблюдающихся при этом КССВ можно оценить на основа- нии данных, которые приведены в таблице 1.12. В ароматических соединениях воздействие заместителей на вициналь- ные КССВ оказывается намного менее явным. Практически во всех таких веществах 3J близки к 8 Гц. Хотя и возможны отклонения от этой величи- ны в ту или иную сторону на 0.5-1 Гц, однако использование этих отклоне- ний для суждения о структуре молекулы не слишком надежно. Единствен- ными соединениями, для которых данные КССВ существенно отличаются, являются металлорганические соединения. Для этих продуктов вициналь- ные КССВ могут быть на 2-3 Гц меньшими, чем у бензола (8.5 Гц). 130
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Таблица 1.12. Величины вицинальных КССВ, 37(Н,Н), в олефинах Соединение J цис 37 «/транс Соединение 3/ J цис 37 «/транс к □ х 19.3 23.9 W Н Вг 6.0 14.9 Н SiMe3 14.6 20.4 Е Е х о^е 5.4 14.5 W Н I 6.2 15.9 н Н F 4.0 12.8 1.10.2.2. Воздействие углов между связями на величины 3J(H,H) В органических соединениях углы между связями в молекуле существенно изменяются при возникновении пространственных затруднений. Особенно силен этот эффект в циклах малого размера. Поскольку при деформации валентных углов в молекуле происходит менее эффективное перекрывание атомных орбиталей, то образующиеся при этом молекулярные орбитали оказываются менее энергетически выгодными. Они хуже передают инфор- мацию о спиновом состоянии ядерных спинов. Соответственно величины вицинальных КССВ в напряженных циклах уменьшаются. Увеличение размера цикла приводит к увеличению величин вициналь- ных КССВ. Так, для пятичленных циклов характерны величины 37(Н,Н) 4-6 Гц, для шестичленных - 7.5-8.5 Гц, а семичленных - 10-12 Гц. Это го- ворит о том, что на величину вицинальной КССВ влияет не только дву- гранный угол между взаимодействующими протонами, но и углы между связями на пути передачи ССВ. При этом оба эффекта действуют одновре- менно. Ниже, на рис. 1.57, приведены величины вицинальных КССВ для некоторых органических соединений, различающихся валентными углами. 5-7 9-11 Рис. 1.57. Типичные величины вицинальных КССВ. 131
Глава 1. Интерпретация спектров 1,10.2.3. Воздействие на 3J(H,H) неподеленных электронных пар Еще одним фактором, который может привести к уменьшению вициналь- ных КССВ по сравнению с ожидаемыми величинами, является воздействие неподеленных электронных пар. Сильнее всего такое влияние проявляется в случае, если взаимодействующие протоны и Н н неподеленная электронная пара находятся в одной плоскости, как это показано на примере. Если реализуется такая ориентация неподеленной электронной пары, то вицинальная КССВ уменьшается на 3-4 Гц. Проявление этого эффекта видно из приведенных на рис. 1.57 данных по КССВ для бензола и пириди- на. В пиридине для протонов Н2 и НЗ наблюдается указанная выше ориен- тация неподеленной электронной пары. Соответственно вицинальная КССВ составляет 4 Гц, а не 8 Гц, как в бензоле. В случае, когда на взаимодействующие протоны влияют одновременно две неподеленные электронные пары, имеющие аналогичную ориентацию, воздействие на КССВ оказывается еще более сильным. Так, в производных хиноксолина величина вицинальной КССВ не превышает 1.5 Гц. 3J= 1.5 Гц В большинстве соединений, включающих данный структурный фраг- мент, протоны имеют вид слегка уширенных синглетов. Интересно, что неподеленные пары электронов атома кислорода ока- зывают на вицинальные КССВ меньший эффект, поскольку они, как прави- ло, не могут располагаться в одной плоскости с взаимодействующими про- тонами. 1.10.3. Константы дальнего ССВ Дальними называются ССВ, которые передаются через 4 или более хими- ческие связи. В большинстве химических соединений такие ССВ не наблю- даются. Однако при благоприятных условиях взаимного расположения про- тонов можно наблюдать их взаимодействие даже через 5 химических свя- зей. Такие случаи бывают как в ряду алифатических, так и ароматических соединений. Если константа 4J(H,H) наблюдается в насыщенной углерод- ной цепи, то для ее вычисления можно воспользоваться формулой Быст- рова-Степанянца: 4J(H,H) = Acos2(p'cos2(p" + С, (1.22) 132
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса где А = 0.31 (для ср’, ф" < 90°), А = 3.61 (для ср’, ф" > 90°), А = 1.06 при дру- гих соотношениях углов; С = 0.35. Вид этой зависимости для трех вариантов угла ф", а также геометри- ческая интерпретация углов ф' и ф" показаны на рис. 1.58. В насыщенных системах 4J(H,H) имеют заметные величины только в молекулах с жесткой структурой в случаях, когда химические связи, разделяющие взаимодействующие протоны, лежат в одной плоскости и их конфигу- рация напоминает букву W (W-взаимодействие). Именно при такой кон- формации ф' = ф" = 180° Рис. 1.58. Угловая зависимость для константы дальнего взаимодействия 4дн,н). Наиболее эффективно ССВ передается через 4 связи в случаях, когда благодаря структурным особенностям молекулы существует несколько пу- тей передачи спиновой информации. Такая ситуация реализуется в бицик- лических соединениях, которые содержат малые циклы. Для них 4J(H,H) могут достигать и 18 Гц. Ниже, на рис. 1.59, приведен ряд таких примеров. В конформационно-подвижных молекулах константы дальнего ССВ чаще всего близки к нулю. Заметные величины 4J(H,H) наблюдаются в ненасыщенных соедине- ниях (аллильные КССВ). Проявляются дальние КССВ и в ароматических соединениях. Наиболее часто они видны в случае, если в бензольном коль- це имеются три неодинаковых заместителя, а протоны образуют спиновую систему АВХ или АМХ. Обычное значение этих констант составляет 1-3 Гц. 133
Глава 1. Интерпретация спектров Если в бензольном кольце имеется больше трех протонов, то 4J(H,H) обыч- но не проявляется. Рис. 1.59. Величины констант дальних ССВ !H-!H для некоторых соеди- нений. 1.11. Влияние внешних условий на спектры ЯМР на ядрах !Н Мы уже кратко указывали на то, что, в отличие от КССВ, химические сдвиги отдельных протонов не являются неизменными константами соеди- нения. Это связано с тем, что спектры ЯМР измеряются, как правило, для растворов веществ в органических растворителях. В таких растворах каж- дая молекула растворенного вещества окружена молекулами растворителя. Поскольку большинство молекул химических соединений содержат атомы, которые сильно различаются по электроотрицательности, то в целом на по- верхности молекулы имеются области повышенной и пониженной элект- ронной плотности. Молекулы растворителей, за исключением разве что ССЦ, также не являются электрически изотропными. Поэтому в растворе всегда происходит ассоциация растворителя и растворенного вещества та- ким образом, что более электроотрицательные атомы молекул растворен- ного вещества, на которых имеется частичный отрицательный заряд, окру- жены менее электроотрицательными атомами растворителя. Такая ассоциа- ция приводит к изменению электронной плотности на магнитных ядрах, что приводит к изменению их констант экранирования. На положение от- 134
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса дельных сигналов в спектрах может существенно влиять также и темпера- тура. Вследствие этого сравнивать спектры разных соединений можно лишь в том случае, когда они измерены при одинаковых условиях. Часто изменение условий измерения спектров можно использовать для то- го, чтобы выявить в спектре те мультиплеты, которые при стандартных ус- ловиях эксперимента совпадают. Изменение условий эксперимента являет- ся простейшим методом целенаправленного воздействия на спектры ЯМР. Этот прием следует использовать в первую очередь, когда измеренный спектр оказывается недостаточно информативным. Следует отметить, что, как правило, смену растворителя используют при анализе протонных спект- ров, поскольку именно в них чаще всего наблюдается совпадение сигналов мультиплетов. Хотя использование мощных магнитов и приводит к увели- чению разности химических сдвигов магнитных ядер, однако полностью исключить совпадение мультиплетов, как правило, не удается. Поэтому правильный подбор растворителя и температуры является актуальным для любых ЯМР-измерений. 1.11.1. Влияние растворителя на спектры !Н-ЯМР В настоящее время стандартным считается измерение спектров ЯМР в дей- терохлороформе CDCI3 и ДМСО-б/б- Каждый из этих растворителей имеет свои преимущества и недостатки. Так, CDCI3 содержит весьма малое ко- личество воды и дает слабый сигнал остаточных протонов. Однако многие классы химических соединений в хлороформе практически не растворимы. С другой стороны, ДМСО-б?б обладает уникальной растворяющей способ- ностью, однако весьма гигроскопичен и химически недостаточно инертен - многие восстановители могут с ним реагировать за время, необходимое для измерения спектра. Поэтому чаще всего растворитель выбирают исходя из растворимости и химической активности изучаемого соединения. После измерения спектра производят отнесение сигналов. Если это удается сде- лать, то никакая замена растворителя и не требуется. Если же полученный спектр не удается проинтерпретировать, то встает вопрос о замене раство- рителя. Когда замену растворителя используют для изменения положений отдельных сигналов в спектре, то следует исходить из того, что новый растворитель должен как можно больше отличаться от того, который был использован ранее. Например, если первый спектр был измерен в CDC13, то можно второй спектр измерить в ДМСО-б?б и наоборот. Замена раствори- теля на тот, который мало отличается по своей полярности, как правило, не приводит к значительным изменениям в спектре. Так, нецелесообразно за- менять ДМСО-б?б на ацетон-б76 или CDC13 на CD2C12. Существует также бо- лее универсальный подход, который базируется на измерении второго 135
Глава 1. Интерпретация спектров £ 810 спектра в дейтеробензоле или на добавлении дейтеро- бензола к образцу, который был ранее измерен в дру- гом растворителе. Уникальность дейтеробензола заклю- чается в том, что он ассоциируется со многими функ- циональными группами и вызывает сдвиги сигналов протонов, которые могут достигать 1 м.д. Ниже, на рис. 1.60, приведен фрагмент спектра ЯМР на ядрах !Н производного бензофурана 1.28, измеренного в разных растворителях. Чистый бензол 7 70 7 60 7 50 7 40 7.30 7.20 7.10 7.00 6 90 6 8 Бензол + ДМСО Рис. 1.60. Изменение растворителя можно использовать для увеличения разности химических сдвигов отдельных сигналов. Показан протонный спектр производного бензофурана 1.28 в СбО6, ДМСО-б/6 и их смеси. Видно, что анализ спектра в смеси ДМСО и дейтеробензола можно про- вести значительно надежнее. Как правило, в дейтеробензоле сигналы сдви- гаются в сильное поле. Это хорошо видно из приведенного рисунка 1.60. В случаях, когда химическое соединение является основанием, для мо- дификации его спектра можно использовать добавление 1-2 капель три- фторуксусной кислоты. В таких условиях мы измеряем спектр не основа- ния, а соли, вследствие чего сигналы протонов, возле которых сосредо- точен частичный положительный заряд, сдвигаются в слабое поле. Метод пригоден для измерения спектров аминов и азотсодержащих гетероцикли- ческих соединений. Иногда при добавлении кислоты удается растворить в 136
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ДМСО-б/б соединения, которые сами по себе практически нерастворимы в этом растворителе. Особенно сильно растворитель может влиять на спектры веществ, ко- торые представляют собой смесь изомеров. Наиболее часто в виде изомер- ных смесей существуют амиды и гидразиды органических кислот. Здесь изомерия возникает за счет затрудненного вращения вокруг связи CO-NH. В спектре наличие двух изомеров легко устанавливается по удвоению сиг- налов протонов, расположенных вблизи амидного фрагмента. Растворитель влияет не только на величины химических сдвигов сигналов отдельных изомеров, но и на соотношение между ними. Интересно то, что добавление уже очень небольшого количества более полярного растворителя может привести к кардинальному изменению соотношения между изомерами. Ни- же, на рис. 1.61, это проиллюстрировано на примере одного из простейших гидразидов 1.29. Рис. 1.61. Влияние концентрации ДМСО на изомерный состав гидрази- да 1.29, растворенного в дейтерохлороформе. 137
Глава 1. Интерпретация спектров Если измерять спектр этого соединения в дейтерохлороформе, то ока- зывается, что в растворе присутствуют изомеры а и b в количестве 32% и 68%, соответстенно. Если же к раствору добавить 3-5% ДМСО, то в раство- ре содержание изомера а повышается до 60% и практически не изменяется при дальнейшем возрастании концентрации ДМСО. Наблюдаемое воздействие растворителя на изомерный состав соедине- ния объясняется тем, что для образования сольвата достаточно 1-2 моль ДМСО на 1 моль растворенного вещества, что соответствует его невысо- кой процентной концентрации. 1.11.2. Влияние температуры на спектры ^-ЯМР При изменении температуры спектры большинства соединений изменяют- ся мало. Обычно температурные сдвиги достигают 0.1-0.3 м.д. Это связано с тем, что большинство типов молекулярных движений, которые происхо- дят в растворе, являются быстрыми движениями. С точки зрения метода ЯМР это означает, что за время жизни спина в возбужденном состоянии яд- ро успевает побывать во всех возможных для него конформационных или таутомерных состояниях. Поэтому мы видим для него усредненный сиг- нал. Однако в случаях, когда молекулярные движения являются более мед- ленными и их скорость близка к скорости релаксации, полного усреднения не происходит. В таких случаях некоторые из сигналов или даже все сигна- лы в спектре имеют аномальную ширину. Это уширение сигналов называ- ется динамическим уширением, а молекулы, для которых оно наблюдает- ся, называются динамическими молекулами. Теоретически при соответствующем снижении температуры можно за- медлить любое движение, однако на практике возможность снижения тем- пературы при измерении спектров ЯМР ограничена температурой плавле- ния растворителей и растворимостью образца. Поэтому далеко не для всех молекул удается наблюдать динамические уширения сигналов. Скорость молекулярных движений, которая приводит к динамическим уширениям, называется промежуточной в шкале времени ЯМР. При дальнейшем сни- жении температуры для молекул могут наблюдаться несколько устойчивых состояний. Поэтому сигналы при таких условиях расщепляются на соот- ветствующее количество компонентов. Когда это происходит, то говорят, что молекулярное движение является медленным в шкале времени ЯМР. Целью измерения спектров при разных температурах в большинстве случаев и является выявление затрудненного вращения в молекулах или наличия заторможенных конформационных состояний. Часто с по- мощью динамических спектров ЯМР рассчитывают также термодинамичес- 138
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса кие константы молекулярных движений, од- нако для этого необходимо использова- ние соответствующих компьютерных про- грамм. Одной из простейших динамических систем является молекула диметилацет- амида 1.30. В его молекуле, благодаря сопряжению карбонильного атома кислорода с атомом азота и делокализации неподеленной пары электронов атома азота на п орбиталь свя- зи С=О, связь C-N оказывается частично двойной, что затрудняет вращение вокруг нее. Вследствие этого вид сигналов метиль- ных групп при разных температурах силь- но изменяется. Это показано на рис. 1.62. Здесь при комнатной температуре наб- людаются два узких сигнала. При повыше- нии температуры сначала происходит дина- мическое уширение сигналов, а потом об- разуется узкий сигнал, который отвечает усредненному значению химических сдви- гов каждого из ротамеров. 1.11.3. Влияние добавок D2O на спектры 1Н-ЯМР Рис. 1.62. Вид сигналов ди- метиламиногруппы диметил- ацетамида 1.30 при темпера- турах от 30 до 100°С с ша- гом 10 град. Сверху вниз происходит увеличение тем- пературы. Тяжелая вода часто используется для выяв- ления в спектре ЯМР сигналов "подвиж- ных” протонов, то есть тех, которые могут замещаться на дейтерий. К этой категории относятся сигналы групп NH, NH2, ОН, SO3H, СООН. При добавлении капли D2O такие сигналы из спектра исчезают вслед- ствие процесса дейтерообмена (протоны, которые соответствуют исчезнув- шим после дейтерообмена сигналам, входят в состав воды, которая в ДМСО дает широкий сигнал в районе 3-4 м.д.). Полное исчезновение сигнала мо- жет происходить почти мгновенно или требовать нескольких минут или даже часов в зависимости от скорости дейтерообмена. Нагревание образца увеличивает скорость дейтерообмена. Сигналы других протонов при до- бавлении D2O своего положения в спектре и интенсивности не изменяют. 139
Глава 1. Интерпретация спектров Ниже, на рис. 1.63, для иллюстрации приведен спектр соединения 1.31 в ДМСО-б?б и тот же спектр через 5 минут после добавления капли D2O. Хоро- шо видно исчезновение двух сигналов - сигналов гидроксильной группы и протона NH. Рис. 1.63. Влияние тяжелой воды на спектр !Н соединения 1.31. 1.12. Влияние на спектр !Н спинов различных магнитных ядер До сих пор мы рассматривали спектры исключительно тех соединений, ко- торые не содержат других магнитных ядер кроме протонов. Однако в не- которых случаях в состав молекулы могут входить такие магнитные ядра как 19F, 31Р, 14N, 35С1,37С1. Первые два из названных ядер имеют спин Уг. Их присутствие приводит к дополнительному расщеплению сигналов прото- нов. Величины наблюдающихся при этом КССВ могут изменяться в ши- роких пределах. Так, для ССВ с ядрами 19F расщепления могут достигать 50 Гц. Однако сам вид мультиплетов будет таким же самым, как и при рас- щеплении на протонах. Другие ядра имеют спин, отличный от Уг. Поэтому они, помимо магнитного момента, имеют также и электрический момент. Такие ядра называются квадрупольными. Как правило, наличие квадру- польного момента у ядра приводит к существенному возрастанию скорости переориентации их ядерных спинов. Это приводит к исчезновению всякого спин-спинового взаимодействия с квадрупольным ядром. Поэтому спектр на протонах оказывается таким, как будто бы ядра 14N, 35С1, 37С1 являются немагнитными. Однако, если в молекуле присутствует квадрупольное ядро с небольшим квадрупольным моментом, оно может принимать участие в спин-спиновом взаимодействии с другими магнитными ядрами. Наиболее 140
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса часто для протонов такое взаимодействие наблюдается с ядрами дейтерия в дейтерированных растворителях. Расщепление на квадрупольном ядре со спином I теоретически дает 21 + 1 линию. Поэтому, например, для сигнала углерода в CDC13 наблюдается триплет с соотношением интенсивностей компонентов 1 1 1 (2Н имеет спин = 1) и расстоянием между пиками 32 Гц, что отвечает расщеплению 13С-2Н (рис. 1.64). Таким образом, вид спектра на ядрах со спином Уг зависит от величины квадрупольного момента связанных с ним квадрупольных ядер. Еще одним фактором, который влияет на ССВ с квадрупольным ядром, является хими- ческое окружение этого ядра. В высоко симметричном окружении удается наблюдать расщепление даже на квадрупольном ядре с заметным квадру- польным моментом. Так, протонный спектр иона 14NH4+ представляет со- бой неожиданно узкий триплет 1 1 1 (рис. 1.65, 14N имеет 1=1). ^(’H/N) 7.4 7.3 7.2 м.д. Рис. 1.64. В спектре I3C CDC13 прояв- Рис. 1.65. ’Н спектр нитрата ам- ляется расщепление на дейтерии, но мония в ДМСО-б/6 (а) перед и не на хлоре-35 или хлоре-37. (б) после подкисления. В (б) ион NH4+ доминирует и вследствие симметрии молекулы скорость квадрупольной релаксации на 14N уменьшается, что дает возмож- ность наблюдать константу взаи- модействия ’H-^N через одну связь, которая равняется 51 Гц. 141
Глава 1. Интерпретация спектров Повышение температуры образца приводит к замедлению релаксации квадрупольного ядра, при этом появляется больше шансов выявить спин- спиновое взаимодействие. Наоборот, снижение температуры увеличивает скорость релаксации и сглаживает тонкую структуру спектра. Эта ситуация противоположна той, которая обычно наблюдается в динамических систе- мах, где нагревание, чаще всего, приводит к упрощению спектра вследст- вие совпадения сигналов. Вероятность потери тонкой структуры возрастает также при уменьшении констант спин-спинового взаимодействия. Возмож- ность наблюдения расщепления на квадрупольных ядрах является скорее исключением, чем правилом. 1.13. Методы развязки (декаплинга) ядерных спинов Мы уже сталкивались с простейшими спектрами и видели, что большинство сигналов в них оказываются расщепленными из-за наличия спин-спинового взаимодействия. Хотя явление ССВ, с точки зрения химиков, является очень полезным, поскольку дает возможность получить дополнительную инфор- мацию о структуре молекулы. Однако в ряде случаев из-за наличия ССВ спектр оказывается настолько сложным, что не поддается интерпретации. Это связано с тем, что в спектре, как правило, содержится всего несколько типов мультиплетов. Если, например, мы видим в нем 5 одинаковых на вид дублетов, не так просто выяснить, какой именно сигнал отвечает тому или иному протону. Для анализа спектра нужно выяснить, между какими имен- но сигналами существует спиновая связь. Поэтому уже в первые годы раз- вития ЯМР были разработаны методы селективного уничтожения спин- спинового взаимодействия. Все они основаны на облучении выбранного магнитного ядра дополнительным радиочастотным полем небольшой ин- тенсивности, которое отвечает его частоте поглощения. Действие такого по- ля на ядро состоит в ускорении переходов между его спиновыми состояни- ями. В этом случае соседние ядра уже не ощущают, какое именно спиновое состояние в каждый момент времени имеет ядро, которое облучается. Их сигналы при этом изменяют мультиплетность, поскольку ССВ с облучаемым ядром снимается. Факт изменения мультиплетности определенных сигна- лов свидетельствует об их спиновой связи с облучаемым ядром. Недостат- ком метода является то, что сигнал ядра, который селективно облучается, из спектра исчезает. Сам процесс дополнительного облучения магнит- ных ядер с целью уничтожения ССВ называется спиновой развязкой или декаплингом. Использование спинового декаплинга явилось одной из первых методик, которые применялись для выяснения структуры органи- ческих соединений. Декаплинг является частью многих импульсных экспе- риментов. Сейчас декаплинг используется в двух вариантах. Селективный декаплинг единичного резонансного сигнала применяется для определения 142
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса партнеров по спин-спиновому взаимодействию. Неселективный (широко- полосный) декаплинг на одном ядре применяется для упрощения спектра и повышения интенсивности сигналов другого ядра. Эта разновидность де- каплинга ведет к исчезновению всех спиновых мультиплетов, в результате чего спектр содержит лишь синглеты. Декаплинг подразделяют на гомоядер- ный, при котором насыщение и наблюдения происходят на ядрах одного типа, и гетероядерный, при котором эти ядра различаются. Для описания экспериментов по декаплингу ядро, которое подвергается насыщению, бе- рется в фигурные скобки. Так, например, обозначение ^С^Н} показывает, что ядром наблюдения является углерод, а насыщение происходит на про- тонах. Обозначение ^{^С,31?} означает, что измеряется спектр на прото- нах при одновременном декаплинге на ядрах 13С и 31Р. В литературе можно иногда встретить термин ’’двойной резонанс”. Он пришел из стационарных методик ЯМР и означает, что на систему ядерных спинов одновременно воздействуют двумя частотами - одной для наблюдения ядра, а другой - для развязки. С этой точки зрения последний из описанных экспериментов можно назвать тройным резонансом. 1.13.1. Физические основы декаплинга Наиболее просто понять действие декаплинга на примере системы двух ядер А и X со спином Уг, между которыми имеется скалярное (непрямое) спин-спиновое взаимодействие с константой / Гц. Резонансная частота яд- ра X зависит от того, какую ориентацию относительно внешнего магнитно- го поля имеет его партнер по спин-спиновому взаимодействию. Ориента- ция по полю, как мы это уже знаем, называется a-ориентацией, а ориентация против поля - P-ориентацией. Для ансамбля спинов, вследствие очень ма- лого различия энергий, можно считать, что населенности состояний а и Р являются одинаковыми. Поэтому сигнал X расщепляется в дублет с одина- ковой интенсивностью компонентов. Воздействие дополнительного посто- янного радиочастотного поля В2 (в дополнение к возбуждающему импуль- су, который создает поле В\) на частоте ядра А вызывает быструю переори- ентацию ядер между состояниями а и р. Если частота такой переориента- ции является быстрой относительно величины КССВ, то дублет ядра X превращается в синглет, поскольку время жизни состояний аа и РР ока- зывается недостаточным для наблюдения взаимодействия. Таким образом, если спины А облучать во время сбора данных полем такой силы, чтобы уВ2 > J Гц, то ядро X не будет ощущать ССВ с ядром А. В этом случае го- ворят, что спины развязаны. Хотя снятие спин-спинового взаимодействия является целью экспериментов по декаплингу, при этом может возникать ряд дополнительных эффектов. Эти эффекты, в зависимости от ситуации, 143
Глава 1. Интерпретация спектров могут быть или полезными, или вредными. Неполный декаплинг может вызвать уширения или искажения частично развязанных спиновых мульти- плетов. Неодинаковое насыщение компонентов сигнала может привести к эффектам переноса заселенностей, что приводит к изменению относитель- ных интенсивностей компонентов мультиплетов. Изменение заселенностей, связанное с радиочастотным облучением, может также привести к возник- новению ядерного эффекта Оверхаузера, который является независимым от спин-спинового взаимодействия. И, наконец, могут происходить изме- нения положений сигналов, которые расположены вблизи участка спект- ра, который подвергается облучению. Это так называемые сдвиги Блоха- Сигерта. 1.13.2. Гомоядерный декаплинг Гомоядерный декаплинг представляет собой селективное воздействие дополнительного радиочастотного поля на один из сигналов с целью выявления партнеров по ССВ. Чаще всего он используется в протонной спектроскопии. Так, для примера на рис. 1.66 показано, какие изменения происходят в протонном спектре при дополнительном насыщении одного из сигналов. Видно, что при насыщении одного из триплетов в спектре уп- ростились сигналы двух других протонов, которые имеют спиновую связь с сигналом, который подвергнулся насыщению. Из примера понятно, что ССВ со всеми другими сигналами при декаплинге не изменились. Хотя использование данного метода для идентификации ’Н-1!! взаимо- действия в значительной мере вытеснено двумерными корреляционными методами, он продолжает оставаться удобным и полезным инструментом в ЯМР-исследованиях. Метод легко реализовать на любых спектрометрах, он дает быстрый результат при решении относительно простых задач. Осо- бенно он полезен для идентификации спинов с очень малыми КССВ, кото- рые трудно обнаруживать в экспериментах по двумерной (2D) корреляции. В сильно перегруженных спектрах, когда могут быть выявлены только от- дельные взаимодействия, результат экспериментов по декаплингу лучше виден в разностном спектре. В этом случае спектр, который измерен без декаплинга, вычитают из спектра со включенным декаплером. Это дает возможность нагляднее выявить изменения в спектре. Одно из ограничений в использовании селективной развязки обуслов- лено необходимостью селективного облучения одного из сигналов. Если при этом происходит частичное насыщение других сигналов, то могут воз- никнуть ошибки в интерпретации результатов. Когда мультиплет, который подавляется, расположен довольно далеко от других сигналов, то можно использовать мощность декапл ера, достаточную для полной развязки ССВ. 144
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Если же вблизи от сигнала, который подавляется, расположены другие пи- ки, бывает необходимо уменьшить мощность декаплера. Это предотвраща- ет искажение интенсивности близлежащих сигналов. В такой ситуации не- возможно осуществить полную развязку и о партнерах по ССВ приходится судить лишь по изменениям тонкой структуры сигналов. Рис. 1.66. Гомоядерный декаплинг дает возможность быстро идентифици- ровать партнеров по ССВ с помощью удаления расщеплений между ними. Внизу - спектр сравнения, вверху - спектр при развязке. Звездочками обо- значены сигналы, которые изменили свою мультиплетность. 1.13.3. Сдвиги Блоха-Сигерта Использование дополнительного радиочастотного облучения во время сбо- ра данных может привести к сдвигам сигналов, которые расположены вбли- зи частоты, которая подавляется. Этот эффект известен как сдвиги Блоха- Сигерта. Эффект возникает из-за того, что поле декаплера влияет на близ- лежащие спины таким образом, что для них эффективное магнитное поле оказывается обратно пропорциональным разности между частотой резонан- са ядра и частотой декаплера и пропорциональным мощности облучения. На рис. 1.67 показан фрагмент спектра органического соединения без дополнительного облучения и при работающем декаплере. Видно, что по- 145
Глава 1. Интерпретация спектров ложения пиков в спектре несколько меняются. Величины сдвигов Блоха- Сигерта в нашем случае достигают 0.02 м.д. При повышении мощности де- каплера они могут быть еще немного больше. Эффект проявляется исклю- чительно в гомоядерных спектрах, в которых сигналы могут располагаться вблизи частоты декаплера. В большинстве импульсных экспериментов та- кие сдвиги исключены, поскольку во время сбора данных декаплер выклю- чается. В экспериментах по гомоядерному декаплингу сдвиги Блоха-Си- герта лишь изредка являются проблемой, поскольку поле Вг довольно се- лективно и сдвиги оказываются небольшими. Тем не менее, даже небольшие сдвиги могут привести к значительным артефактам в разностных спектрах, поскольку спектр сравнения не содержит сдвигов Блоха-Сигерта. Поэтому при интерпретации таких спектров следует быть особенно осторожным. Надо также внимательно относиться к величинам химических сдвигов, найденным из спектра в условиях декаплинга, поскольку их величины мо- гут оказаться несколько неверными. б) Рис. 1.67. Сдвиги Блоха-Сигерта наблюдаются для сигналов, располо- женных вблизи частоты декаплера. (а) Обычный спектр и (б) спектр, кото- рый получен при действии радиочастотного поля в точке, которая обозна- чена стрелкой. 146
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 1.14. Ядерный эффект Оверхаузера Широкое применение методов декаплинга привело к обнаружению еще од- ного интересного и полезного явления. Оно заключается в изменении ин- тенсивностей сигналов ЯМР при дополнительном облучении одного из магнитных ядер. Это явление называется ядерным эффектом Оверхау- зера (ЯЭО). ЯЭО представляет собой изменение интенсивности одного сиг- нала при таком воздействии на другой сигнал, которое выводит ядерный спин из состояния теплового равновесия. Другими словами, если избира- тельно облучить один из сигналов в спектре, то интенсивности других сигналов могут измениться. Найдено, что такие изменения происходят лишь для сигналов тех ядер, которые в пространстве расположены вблизи облученного ядра. Чем ближе в пространстве расположены маг- нитные ядра, тем более сильный ЯЭО может наблюдаться между ними. Та- ким образом, появляется возможность выявлять пространственную бли- зость магнитных ядер, а значит, и делать выводы о строении изучаемой мо- лекулы. Величина ЯЭО определяется как изменение интенсивности сигна- ла, I, относительно его равновесной интенсивности, 10: T|i{S} = (I -10)/10 • ЮО (%), (1.23) где r|i{S} - величина наблюдаемого ЯЭО для спина I, когда облучается спин S. Говорят еще, что это ЯЭО спина I под влиянием спина S. Исполь- зование символов I и S взято из оригинальной литературы, где был впер- вые описан эффект Оверхаузера. Хотя это открытие было сделано доволь- но давно и сначала касалось ядер металлов и электронов, однако обозначе- ния сохранились до сих пор. В дальнейшем при обсуждении данного эф- фекта под ядром I мы будем понимать исследуемое ядро (Interesting), а под ядром S (Source) - возбуждаемое ядро. Изменения интенсивности могут быть как положительными, так и отрицательными. Это зависит от знаков гиромагнитных отношений пары ядер и от динамических свойств молекулы. 1.14.1. Гетероядерные ЯЭО Гетероядерные ЯЭО возникают в случае, когда дополнительному облуче- нию подвергается ядро, отличное от ядра наблюдения, например экспери- мент 13С{1Н}. В этом варианте декаплинга чаще всего облучаются одновре- менно все протоны (или ядра другого типа). Это достигается с помощью так называемого широкополосного подавления, когда дополнительное об- лучение ведется не на одной фиксированной частоте, а содержит частоты во всем диапазоне поглощения облучаемых магнитных ядер. 147
Глава 1. Интерпретация спектров Для случая, когда наблюдение ведется на ядрах 13С, рост интенсивнос- ти сигналов углерода за счет ЯЭО достигает 200%, то есть сигнал возрас- тет в три раза. Максимальное изменение интенсивности сигнала за счет ЯЭО для других магнитных ядер приведено в таблице 1.13, где оно обозна- чено как Т|х{ Таблица 1.13. Теоретические величины гетероядерного ЯЭО при насыще- нии протонов X TlxfH}, % X TlxfH}, % X Пх{*Н}, % 6Li 339 31Р 124 l83w 1202 |3С 199 57Fe 1548 I95pt 233 l5N -494 l03Rh -1589 207Rb 239 19f 53 l09Ag -1075 29Si -252 "9Sn -141 В гетероядерных системах наблюдаемый ЯЭО зависит от знака гиро- магнитного отношения ядра. Поэтому для ядер с отрицательными у при насыщении протонов ЯЭО всегда отрицательны, то есть ЯЭО приво- дит к уменьшению интенсивности сигнала ЯМР. Наиболее яркими при- мерами этому являются ядра 15N и 29Si, для которых наблюдается такое уменьшение интенсивности сигналов при насыщении протонов, что сами сигналы становятся отрицательными. В случаях, когда максимальная вели- чина ЯЭО не достигается, сигналы вообще могут исчезнуть. Поэтому изме- рение спектров ядер с отрицательными у проводится при отсутствии ЯЭО или с помощью импульсного декаплинга, или методом переноса поляриза- ции (см. ниже). 1.14.2. Измерение ЯЭО: разностные спектры Импульсная последовательность для проведения эксперимента по выявле- нию ЯЭО отличается от обычного одноимпульсного эксперимента лишь тем, что перед подачей импульса образец некоторое время облучается декаплером на выбранной частоте. Период такого облучения называется периодом преднасыщения. Продолжительность этого периода определяет- ся динамикой нарастания эффекта ЯЭО. Поэтому основным требованием для успеха эксперимента по наблюдению ЯЭО является наличие достаточ- ного периода преднасыщения выбранного сигнала перед началом сбора данных. Типичное время преднасыщения составляет от 1 до 10 с. В таком эксперименте стараются получить максимально возможные величины ЯЭО. Их еще называют стационарными ЯЭО, поскольку при дальнейшем увели- чении времени преднасыщения их величины остаются неизменными. В 148
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса связи с необходимостью использования длительного периода преднасыще- ния измерение стационарных ЯЭО можно проводить только в одномерных спектрах. Результатом эксперимента ЯЭО является получение спектров, интен- сивность сигналов в которых изменяется по сравнению с обычным одно- мерным спектром. Наиболее важным вопросом является то, как лучше представить найденные изменения интенсивностей сигналов. Хотя теоре- тически можно просто выполнить интегрирование сигналов и сравнить их с интенсивностями соответствующих сигналов в спектре без ЯЭО, однако на практике такой подход оказывается недостаточно надежным, поскольку изменения интенсивности сигналов могут составлять всего несколько про- центов, что может оказаться меньше точности интегрирования. Вместо это- го применяют так называемую разностную спектроскопию. В этом случае из спектра, где должны наблюдаться ЯЭО, в памяти компьютера вычитают спектр сравнения, измеренный в тех же условиях, но без преднасыщения. В полученном таким образом разностном спектре в идеале должны присутст- вовать только те сигналы, интенсивность которых в ходе эксперимента из- менилась, то есть сигналы ЯЭО и отрицательный пик сигнала, который на- сыщается (рис. 1.68). На рисунке показаны исходный спектр вещества 1.32 и разностный спектр, в котором проводилось облучение сигналов протонов НЗ. Такой разностный ЯЭО-эксперимент играет ведущую роль в структур- ной органической химии на протяжении многих лет. Полученные с его по- мощью спектры достаточно наглядны. Данным методом могут быть найде- ны ЯЭО, величины которых меньше 1%. Схематически разностный ЯЭО-эксперимент показан на рис. 1.69. В хо- де такого эксперимента последовательно измеряются два спектра - спектр с сигналами, интенсивности которых изменены благодаря ЯЭО, и спектр сравнения. ЯЭО-спектр получается за счет предварительного облучения выбранного сигнала на протяжении периода т (период преднасыщения). Спектр сравнения измеряется при идентичных условиях за исключением того, что в этом случае преднасыщение отсутствует. Для того, чтобы усло- вия сбора данных были совершенно идентичными, что очень важно в раз- ностной спектроскопии, при измерении спектра сравнения дополнительное облучение не выключается полностью, а его частота смещается в сторону от имеющихся в спектре сигналов (внерезонансное облучение). Вычитание полученных спектров один из другого (или вычитание интерферограмм) дает разностный спектр. Успех эксперимента сильно зависит от идентич- ности условий измерения двух спектров. При несоответствии условий их измерения в разностном спектре появляются более или менее интенсивные артефакты вычитания (сигналы с перекошенной фазой) (рис. 1.70). Для их минимизации разработаны специальные методы обработки спектров. 149
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.68. Одномерный спектр и разностный спектр ЯЭО соединения 1.32 в ДМСО-Je- В разностном спектре содержатся только сигналы ЯЭО и сре- занный сигнал протона, который подвергнут насыщению. Спектр ЯЭО Спектр сравнения Разностный спектр Рис. 1.69. Процедура генерации разностного ЯЭО спектра. 150
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ЯЭО в) ЯЭО яэо Рис. 1.70. Разностные артефакты (в разностном спектре показаны звездоч- кой). Возникают наряду с ЯЭО, когда два похожих, но не полностью иден- тичных сигнала вычитаются один из другого. В спектре (в) артефакты вы- читания минимизированы с помощью сглаживания разностной интерфе- рограммы. Поскольку изменения интенсивностей сигналов могут быть довольно малыми, ЯЭО-эксперименты требуют достаточно большого приборного вре- мени. Обычное время получения спектра ЯЭО с насыщением одного про- тона составляет не меньше 20 мин. Если надо провести насыщение несколь- ких сигналов, общее время эксперимента соответственно возрастает. Главным требованием успеха эксперимента является обеспечение посто- янства его условий, включая температуру образца. Это в особенности каса- ется водных растворов и растворов веществ, сигналы которых зависят от температуры. Играют роль также перемещения людей и предметов вблизи магнита. Степень этого влияния зависит от особенностей установки магни- та и напряженности его поля. Может влиять даже перемещение по сосед- 151
Глава 1. Интерпретация спектров ним коридорам и лабораториям, которые расположены над магнитом и под ним. Для того, чтобы такие влияния свести к минимуму, накопление дан- ных иногда приходится проводить ночью или по выходным дням. Кратковременную нестабильность прибора можно компенсировать пу- тем накопления большого числа сканов. При этом одновременно происхо- дит уменьшение амплитуды шума, что также способствует более надежно- му определению величин ЯЭО. Нестабильности, которые изменяются за более продолжительное время, связанные с медленным дрейфом поля или температуры, устраняются с помощью поочередного накопления спектра сравнения и спектра ЯЭО. В этом случае оба спектра измеряются при оди- наковых условиях. Типичный подход при измерении ЯЭО для нескольких сигналов заключается в том, чтобы накапливать для каждой частоты, ко- торая подавляется, 8 или 16 сканов, после чего переключать передатчик на другую частоту. Процесс циклически повторяется до накопления необхо- димого числа сканов в каждом эксперименте. При этом в одном из экспе- риментов, где накапливается спектр сравнения, частоту декаплера смеща- ют в сторону от области поглощения протонов. Перед началом каждого на- копления при переходе на очередную частоту вводят 2^4 мнимых скана (при этом импульсы подаются, но данные не накапливаются) для устране- ния эффектов насыщения от предыдущего эксперимента. Поскольку перед каждым импульсом имеется период преднасыщения, то дополнительный релаксационный промежуток не вводится. Релаксация осуществляется в период преднасыщения. Артефакты вычитания можно уменьшить с помощью подходящей про- цедуры обработки данных. Наиболее часто с этой целью применяется сгла- живающая функция. В этом случае путем вычитания из интерферограммы, соответствующей спектру ЯЭО, интерферограммы спектра сравнения по- лучают разностную интерферограмму. Далее каждую точку полученной интерферограммы умножают на коэффициенты, величина которых экспо- ненциально убывает от начала интерферограммы до ее конца (экспонен- циальная мультипликация). При этом вклад начальных точек интерферо- граммы остается неизменным, а вклад ее конечных точек убывает. Это эк- вивалентно искусственному уменьшению разрешения спектра. Поскольку артефакты вычитания представляют собой узкие сигналы с перекошенной фазой, то они в значительной степени удаляются из спектра, так как поло- жительные и отрицательные фрагменты сигналов при низком разрешении взаимно уничтожаются. В отличие от этого, сигналы ЯЭО представляют собой сигналы поглощения, и их интенсивность при такой обработке ин- терферограммы практически не изменяется. Использование экспоненци- альной мультипликации, настроенной на ширину линии 4-5 Гц, является стандартным методом представления разностных ЯЭО-спектров. 152
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 1.14.3. Количественное измерение ЯЭО Как мы уже упоминали, ЯЭО возникает между магнитными ядрами, рас- положенными поблизости одного от другого. Существует связь величины ЯЭО с расстояниями между атомами, для которых наблюдается эффект. Поэтому бывает полезным количественно сопоставлять величины ЯЭО для различных протонов изучаемой молекулы. Для количественного определе- ния величин ЯЭО пик, который насыщается, используется как внутренний стандарт интенсивности. Если он отвечает единичному протону, то счита- ется, что его интенсивность равняется -100%. Если же это метильная группа, то интенсивность принимается за -300%, и т.д. Знак минус означает, что сигнал репперного протона является отрицательным, поэтому для положи- тельных ЯЭО величины сигналов будут положительными. Интенсивности сигналов в разностном спектре при таких допущениях будут отвечать вели- чинам ЯЭО в процентах. Такой метод определения интенсивности позволя- ет исключить влияние на величины ЯЭО неполноты насыщения сигналов - если сигнал насыщен не полностью, то его интенсивность изменяется про- порционально степени насыщения, поэтому величины ЯЭО, которые изме- рены относительно величины насыщаемого сигнала, остаются неизменными при изменении степени насыщения. Точность определения величин ЯЭО обычно не превышает 0.5 или 1%. Для структурных отнесений этого вполне достаточно, тем более что часто интерес представляет отношение величин ЯЭО для сигналов разных протонов, а не сами их абсолютные величины. 1.14.4. Применение спектров ЯЭО ЯЭО чаще всего используется на последних этапах структурных исследо- ваний, когда общая структура молекулы уже выяснена. Целью таких иссле- дований, как правило, является установление корреляций между наблюда- емыми величинами ЯЭО и пространственной близостью протонов в мо- лекуле, которая следует из ее предполагаемого строения. Таким образом, во многих случаях появляется возможность подтвердить или опровергнуть гипотезу о строении молекулы или же из нескольких возможных вариантов выбрать тот, который соответствует реальности. Необходимым предвари- тельным условием для успеха таких работ является отнесение сигналов в спектре, поскольку в противном случае выводы о структуре могут оказать- ся совершенно ошибочными. Все приведенные здесь примеры базируются на стационарном ЯЭО, причем результаты получены методом разностной спектроскопии. Все изу- ченные молекулы относятся к "малым молекулам", а разрешение в спект- рах достаточно для селективного насыщения целевых сигналов. Такие ус- ловия выполняются для многих молекул, которые синтезируются в хими- ческих лабораториях, поэтому метод имеет многочисленные применения. 153
Глава 1. Интерпретация спектров Для оптимального разделения сигналов в спектре бывает необходимым по- добрать соответствующий растворитель. Приведенные в примерах найден- ные величины ЯЭО являются типичными при рутинных исследованиях. Применение других методик ЯЭО будет описано в следующих разделах. 1.14.4.1. Нахождение структуры Е- и Z-изомеров В то время, когда методики ЯЭО только приобретали популярность, в на- учных статьях часто публиковались оригинальные разностные спектры, в которых можно было увидеть сигналы ЯЭО. Но поскольку для каждого ис- следуемого соединения приходится измерять по несколько разностных спектров, разместить их всех в ограниченном формате научной статьи не представляется возможным. Поэтому для более компактного размещения материала наличие ЯЭО между протонами обозначают искривленными стрелками на структурной формуле соединения. Иногда над стрелкой ука- зывается найденная величина эффекта в процентах. Если результаты полу- чены с помощью методик нестационарного ЯЭО, то величины эффектов часто не определяют, а указывают лишь стрелку между сигналами, для ко- торых найден эффект. Именно так мы будем иллюстрировать ЯЭО-экспе- рименты при дальнейшем обсуждении. Идентификацию Е- и Z-изомеров алкенов чаще всего можно осущест- вить с помощью прямого измерения вицинальной протон-протонной КССВ. Для цис- и /иранс-изомеров величины КССВ отличаются довольно сущест- венно (/цис = 7-Н Гц, /транс = 12-18 Гц). Однако когда в молекуле возле двойной связи присутствует только один протон, измерение КССВ стано- вится невозможным. В этом случае возможно измерение величин ЯЭО между группами протонов, которые расположены вблизи от двойной связи. Примером этому может служить стереохимическое отнесение изомеров 1.33а и 1.33b. Z-изомер легко идентифицируется по наличию ЯЭО между олефиновым протоном и метиленовой группой CH2Si, которая дает сигнал в виде характерного синглета. Дальнейшее подтверждение этому можно получить при изучении ЯЭО для протонов изомерного продукта. В данном случае имеет место ЯЭО между сигналами двух сближенных в пространст- ве метиленовых протонов. Одновременно ЯЭО для олефинового протона изомера Е отсутствует. В данном эксперименте хорошо видна асимметрия в величинах ЯЭО. Причины этого эффекта станут понятны при изучении физических основ ЯЭО, приведенных во второй главе книги. 1.33а (Z) 6 1.33b (Е) 4% j I 0Н 154
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 1.14.4.2. Определение строения скелета ароматических соединений При проведении реакций внутримолекулярной конденсации и гетероцик- лизации полифункциональных соединений часто возникают случаи, когда удается выделить чистый индивидуальный продукт, строение которого мо- жет иметь два или более вариантов. Часто в альтернативных структурах име- ем одинаковые спиновые системы, которые не дают возможности осущест- вить выбор структуры, основываясь на ССВ. В таких случаях использова- ние ЯЭО может оказаться незаменимым. Так, например, в ходе реакции был получен конденсированный гетероцикл 1.34, катион которого может иметь линейную (Ь) либо ангулярную (а) структуру: Оба варианта структуры имеют по две спиновые системы AMQX и синглеты двух ароматических протонов и метильной группы. Из формулы видно, что в ангулярном варианте а имеется фенантреноподобный фраг- мент, в котором два ароматических протона находятся очень близко один от другого. Соответственно, для них должен наблюдаться ЯЭО, который по величине приближается к максимально возможному. В линейной струк- туре b такой ситуации не возникает. Таким образом, выявление аномально большого ЯЭО будет свидетельствовать в пользу ангулярной структуры а. Как видно из приведенных величин ЯЭО, получена именно ангулярная структура а. Дополнительные эксперименты по выявлению ЯЭО между другими протонами подтверждают сделанные выводы. 1.14.4.3. Замещение в ароматических соединениях Определение положения заместителя при отсутствии ССВ также может быть предметом изучения с помощью ЯЭО. Особенно часто проблема воз- никает при N-алкилировании гетероциклов, содержащих несколько атомов азота. Эксперименты ЯЭО позволяют решить эту задачу достаточно надеж- но. Гетероароматические системы особенно удобны для таких исследова- ний, поскольку они планарны, и для решения задачи достаточно выяснить, 155
Глава 1. Интерпретация спектров какой заместитель располагается вблизи алкилированного атома азота. Ил- люстрацией этому служит выяснение строения замещенных гистидинов 1.35а и 1.35b. Для изомера 1.35а при облучении протона Н5 возрастает интенсивность только сигнала метиленовой группы, которая связана с ими- дазольным кольцом. В то же самое время, для изомера 1.35b возрастает ин- тенсивность сигналов обеих метиленовых групп. Найденные ЯЭО на фор- мулах обозначены стрелками. Следует обратить внимание на то, что в дан- ном случае не указаны величины ЯЭО в процентах, однако это не мешает решению поставленной задачи. Именно так наличие ЯЭО представляется в большинстве публикаций. Это связано с тем, что для того, чтобы количест- венные данные по ЯЭО имели какую-либо ценность, надо выполнить це- лый ряд условий и подробно описать методику проведения эксперимента. Между тем, для решения конкретной структурной проблемы такой подход является излишним - достаточно обнаружить само наличие ЯЭО между со- ответствующими протонами. BnO^NPK /-N П Н До открытия ЯЭО определить строение таких изомеров можно было только с помощью их химической модификации или эмпирических корре- ляций со структурой величин КССВ для разных изомеров. Однако, поскольку значение 4J(H2,H5) не превышает 1.5 Гц, решение задачи не всегда является окончательным, кроме того, такой подход требу- ет наличия нескольких соединений близкого строения. Альтернативный подход, который сейчас можно применить для решения данной структур- ной задачи, базируется на выявлении дальних протон-углеродных корреля- ций по методике НМВС. 1.14.4.4. Определение конфигурации заместителей Еще одним типом задач, который часто возникает в синтетической органи- ческой химии, является установление конфигурации заместителей в цикли- ческих системах. Наиболее часто эта проблема возникает в 5- и 6-членных циклах. Это связано не только с большой распространенностью данных систем, но также и с тем, что в циклах большего размера, которые име- ют повышенную подвижность, решение такой задачи может оказаться не- 156
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса выполнимым. В частности, для 6-членных циклов выяснение ориента- ции протонов можно провести уже на основании вицинальных КССВ, по- скольку величины аксиально-аксиальной, аксиально-экваториальной и эк- ваториально-экваториальной КССВ существенным образом различаются (3/(акс,акс) = 10-12 Гц, 3/(акс,экв) и 3/(экв,экв) = 2-5 Гц). Однако ориента- цию метильной группы в соединении 1.36 таким методом определить не- возможно из-за эквивалентности констант 3/(акс,экв) и 3/(экв,экв). Прове- дение нескольких экспериментов ЯЭО позволяет решить эту задачу совер- шенно однозначно и доказать, что метильная группа имеет экваториальную ориентацию. Для решения таких задач нужно довольно четко представлять себе стереохимию исследуемого соединения. Только в этом случае можно сопоставить межатомные расстояния и спрогнозировать относительные ве- личины ЯЭО. В более простых случаях с этой целью можно использовать соответствующие стереохимические формулы соединений. В более слож- ных случаях следует построить механическую модель соединения (напри- мер модель Дрейдинга) или выполнить компьютерное моделирование геометрии соединения с помощью программы HYPERCHEM. Ниже (справа) приведены стереохимические модели соединения 1.36 и показаны найденные величины ЯЭО. Вывод об ориентации метильной группы вытекает из найденного ЯЭО между сигналами протонов Н2 и Н6. Данный эффект возможен лишь в том случае, когда оба названных протона являются аксиальными. Это, в свою очередь, свидетельствует об экватори- альном расположении метильной группы при атоме С2. OR R = SiMe2CMe3 1.36 1.14.4.5. Отнесение сигналов Предварительным условием успеха применения ЯЭО для установления конфигурации или конформации молекулы является правильное отнесение сигналов в ее протонном спектре. Это означает, что каждый сигнал должен 157
Глава 1. Интерпретация спектров быть связан с совершенно определенным атомом. Чаще всего такие отнесе- ния проводятся на основании одномерного спектра и разных корреляци- онных методов, основанных на развязке спинов. Однако, в ряде случаев, именно величины ЯЭО можно использовать для отнесения сигналов. Наибо- лее надежно можно делать отнесение для изолированных групп протонов, которые не связаны спин-спиновым взаимодействием, хотя наличие ССВ далеко не всегда препятствует отнесению. В качестве примера приведем отнесение сигналов ортио-прото- нов для двух идентичных замес- тителей, которые находятся в мо- лекуле вещества 1.37. Поскольку разность химичес- ких сдвигов в спектре этого сое- динения не превышает 0.03 м.д., метод ЯЭО в данном случае использовать наиболее целесообразно. Най- денные ЯЭО показаны стрелками. Видно, что ортио-протоны одного из и-ме- токсифенильных заместителей, которые дают сигнал при 7.36 м.д., прояв- ляют ЯЭО при насыщении узлового СН, сигнал которого является слож- ным мультиплетом, обусловленным взаимодействием с тремя соседними неэквивалентными протонами. Аналогичные о/нио-протоны другого замес- тителя ощущают ЯЭО при насыщении сигнала протона, соседнего с экзо- циклической двойной связью. Таким образом, несмотря на близость сигна- лов в спектре с помощью ЯЭО отнести их можно вполне надежно. 1.14.4.6. Выбор между эндо- и экзо-аддуктами Насыщенные бициклические соединения в своем большинстве являются неплоскими. Это обусловлено тем, что химические связи в таких соедине- ниях ориентируются под углом, близким к 109° Поэтому аннелирование циклов также происходит под этим же углом. Таким образом, бицикличес- кое соединение по своей форме напоминает открытую двухстворчатую ра- ковину с тупым углом между створками. Если по периметру молекулы со- держатся заместители, они могут быть направленными вглубь такой "рако- вины". Такие соединения называют эндо-аддукта- ми. Если же заместитель направлен наружу, то изомер называют экзо-аддуктом. Выбор между экзо- и эндо-аддуктами в конденсированных цик- лических системах удобно проводить с помощью ЯЭО. Одним из примеров этому может быть уста- новление конфигурации заместителей при атоме С5 лактама 1.38. 1.38 158
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса В таких случаях определяются величины ЯЭО между протоном, кото- рый связан с узловым атомом углерода, и протонами связанных циклов или заместителей в них. В нашем случае наличие ЯЭО между узловым ато- мом водорода и метиленовой группой сложноэфирного заместителя свиде- тельствует о том, что данные протоны сближены в пространстве, то есть о том, что соединение имеет экзо-ориентацию сложноэфирного фрагмента. Вывод подтверждают и ЯЭО для других протонов, которые были найдены для данного соединения. Следует еще раз подчеркнуть, что для надежности выводов, которые получены на основании ЯЭО, не следует ограничиваться одним экспериментом, а выявить по возможности все ЯЭО, присущие ис- следуемой молекуле, поскольку только совокупность ЯЭО-корреляций дает достаточно полное представление о пространственной близости протонов в молекуле. 1.14.4.7. Определение преимущественной конформации молекулы Выяснение с помощью ЯЭО преобладающей конформации малых подвиж- ных молекул часто является довольно сложной проблемой, поскольку в та- ких молекулах происходит быстрый переход между несколькими затормо- женными конформациями. В результате величины ЯЭО являются средне- взвешенными для нескольких стабильных конформаций. Поскольку чаще всего неизвестно, какие именно ЯЭО должны наблюдаться для каждой из конформаций, то и вклад их определить не удается. Поэтому такие иссле- дования проводятся довольно редко. Однако в случаях, когда из-за затруд- ненного вращения одна из конформаций оказывается наиболее населенной, ее вполне можно установить с помощью ЯЭО. Примером этому может слу- жить выбор между конформациями "кресла" и "ванны" для производных циклогексана или других ротамеров с медленным взаимопревращением. Конформации могут фиксироваться также за счет стерических затруднений или прочных водородных связей. Для примера приведем установление преобладающей конформации соединения 1.39. В экспериментах стационарного ЯЭО было найдено значительное воз- растание интенсивности сигнала метильной группы 5'-СНз при облучении 159
Глава 1. Интерпретация спектров сигналов протонов Н2 и НЗ, а также был найден ЯЭО для сигнала протона НЗ’ при облучении сигнала олефинового протона Н4. Из этого следует, что свободное вращение между гетероциклическими фрагментами молекулы отсутствует. Это происходит из-за наличия в молекуле 5’-метильной груп- пы, которая приводит к фиксации единственной конформации. Данный вы- вод подтверждается также наличием довольно малой КССВ между прото- нами Н4’ и НЗ, что свидетельствует о близости диэдрального угла между этими протонами к 90°. Таким образом, гетероциклические фрагменты мо- лекулы располагаются ортогонально один относительно другого. Данный пример показывает, что совместное использование данных ЯЭО и вели- чин КССВ оказывается наиболее надежным для установления кон- формации молекул. 1.15. Спектроскопия на ядрах 13С Спектры на ядрах 13С, после протонных спектров, являются важнейшими для установления строения химических соединений. Это определяется ши- рокой распространенностью соединений углерода. В принципе, измерение углеродных спектров можно проводить совершенно аналогично протон- ным спектрам, и в результате получать спектры, где сигналы имеют рас- щепление благодаря ССВ. Однако ситуация осложняется тем, что мы изме- ряем не сигналы основного изотопа (12С), а сигналы на ядрах 13С, причем таких ядер в естественной смеси изотопов углерода находится менее 1%. Поэтому сигнал ЯМР оказывается малоинтенсивным. Для измерения таких спектров приходится использовать приемы, которые позволяют увеличить интенсивность сигналов. Для этого в большинстве случаев используются методики гетероядерного декаплинга, то есть дополнительного облучения связанных с атомами углерода магнитных ядер - чаще всего протонов, что обозначается как С {!Н}. Целью гетероядерного декаплинга является упрощение спектра и по- вышение интенсивности сигналов благодаря гетероядерному ЯЭО. 1.15.1. Спектры 13С в условиях декаплинга на протонах С{!Н} Использование широкополосного протонного декаплинга во время накоп- ления углеродных спектров применяется для большинства измерений. Уда- ление всех расщеплений !Н-13С приводит к сосредоточению всей интенсив- ности углеродных сигналов в одной линии, что ведет к значительному росту интенсивности спектра и к его упрощению. (Заметим, что в случае, когда в молекулу входят, кроме протонов и 13С, еще и другие магнитные ядра, например 19F, 31Р, расщепление сигналов за счет ССВ с этими ядрами в ус- ловиях декаплинга 13С{!Н} не исчезает.) 160
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Еще одним положительным моментом является дальнейший рост ин- тенсивности углеродных сигналов за счет ядерного эффекта Оверхаузера. В случае 13С этот эффект может достигать 200%. Вследствие этого, ис- пользование широкополосного протонного декаплинга является стан- дартным приемом для измерения "рутинных" углеродных спектров. Используют три разновидности широкополосного декаплинга и соот- ветственно существуют три типа углеродных спектров, которые можно при этом получить. Для того, чтобы понять их различия, проще всего воспользо- ваться графическим изображением соответствующих импульсных последо- вательностей, которые для этого используются. Они показаны на рис. 1.71. Развязка б) 'н I Развязка в) !]_[ Развязка Развязка Рис. 1.71. Возможные схемы протонного декаплинга при наблюдении гете- роядер: (а) прерывистый декаплинг (дает расщепленный спектр с ЯЭО), (б) обратный прерывистый декаплинг (дает нерасщепленный спектр без ЯЭО), (в) декаплинг с переменной мощностью (дает нерасщепленный спектр с ЯЭО). В первой из них (а) декаплер включается на время релаксационного промежутка, который предшествует подаче импульса на ядра 13С и выклю- 161
Глава 1. Интерпретация спектров чается непосредственно перед подачей импульса. При действии такой раз- новидности декаплинга возникает усиление сигналов благодаря эффекту Оверхаузера, однако, поскольку при сборе данных декаплер выключается, то ССВ 13С-!Н в спектрах проявляется. В результате мы получаем расщеплен- ный спектр с мультиплетами, которые отвечают ССВ с протонами, но по- вышенной из-за ЯЭО интенсивности. Такую разновидность спектров ис- пользуют для измерения гетероядерных КССВ. Эксперимент называется из- мерением спектра с прерывистым декаплингом. Во втором варианте (б) де- каплер включается лишь на период сбора данных. При этом не проявля- ются гетероядерные КССВ между углеродом и протонами и не возникают ЯЭО. Эту разновидность спектров используют для измерения относитель- ной интенсивности углеродных сигналов. Его называют обратным преры- вистым декаплингом. Третья разновидность декаплинга (в) - это такой ва- риант, когда декаплер работает беспрерывно. Иногда на разных этапах импульсной последовательности варьируют его мощность для предотвра- щения нагревания образца. Полученные таким образом углеродные спект- ры используют наиболее часто. В них сигналы усилены благодаря ЯЭО и отсутствует расщепление сигналов. Применение описанных схем декаплинга проиллюстрировано на рис. 1.72 на примере спектра а-пинена 1.40. 1.15.2. Анализ углеродного спектра соединения В отличие от обзорных протонных спектров, углеродные спектры, если они измерены в стандартных условиях, при действии широкополосного декап- линга на протонах являются менее информативными. Они не содержат све- дений не только о КССВ, а даже о мультиплетности сигналов и их относи- тельной интенсивности, а следовательно, и о количестве протонов, кото- рые связаны с определенными атомами углерода. Основная информация, которая заключена в таких спектрах, сводится к количеству углеродных атомов в молекуле, которые находятся в разном химическом окружении. Поскольку диапазон химических сдвигов атомов углерода является значи- тельно большим, чем у протонов, то совпадение сигналов здесь гораздо ме- нее вероятно. Поэтому количество пиков в углеродном спектре во многих случаях отвечает количеству химически неэквивалентных углеродных ато- мов в молекуле. Сейчас значительное количество научных журналов требу- ет, чтобы в материалах статей содержались данные углеродных спектров новых соединений. В экспериментальную часть статьи надо вносить пере- чень химических сдвигов атомов углерода, который получен из обзорного углеродного спектра. Рассмотрим ход анализа углеродного спектра на примере довольно простого соединения - гетероциклического бромида 1.41. 162
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса а) м, и 1 .ill .I1JIIL I-1-1-1-1-1-[-1-1-1-[-1-11(1--1-1-[—I-1-1-[-1-Г—I-1-1-1 140 120 100 80 60 40 20 м.д. Рис. 1.72. Спектр I * * * * * * * * * * * 13С а-пинена 1.40, полученный (а) без декаплинга (рас- щепленный спектр без ЯЭО), (б) с обратным прерывистым декаплингом (расщепленный спектр с ЯЭО), (в) с прерывистым декаплингом (нерас- щепленный спектр без ЯЭО), (г) с постоянным декаплингом (нерасщеплен- ный спектр с ЯЭО). Все остальные условия экспериментов, включая шкалу интенсивности сигналов, при измерении были идентичными. Из спектра (рис. 1.73) видно, что количество синглетов в нем отвечает количеству углеродных атомов в молекуле (мультиплет при -40 м.д. отве- чает сигналу растворителя). Три из них, которые имеют химические сдвиги меньше 90 м.д., отвечают алифатическим атомам углерода. Другие пять сиг- налов дают ароматические атомы углерода. На формуле соединения при- ведены величины химических сдвигов углеродных сигналов. Однако для 163
Глава 1. Интерпретация спектров их однозначного отнесения в спектре, строго говоря, недостаточно данных. Так, если алифатические сигналы можно отнести достоверно, поскольку соответствующие им атомы углерода отличаются довольно сильно, то сиг- налы атомов пиридинового цикла надежно отнести не удается. Единствен- ное, что можно утверждать наверняка, это то, что сигнал при 154.2 м.д. от- носится к узловому атому углерода. Для всех остальных сигналов можно предложить два варианта отнесения. Так, а- и у-атомы углерода пиридино- вого кольца, если исходить из соответствующих табличных данных, можно отнести не так, как это приведено на формуле соединения. Поэтому при анализе даже простых углеродных спектров не следует без дополни- тельных экспериментов проводить окончательные отнесения сигна- лов. Достаточно, если положения имеющихся сигналов попадают в прису- щие им диапазоны химических сдвигов. Если же отнесение сигналов явля- ется необходимым для выводов о структуре молекулы, следует, кроме об- зорного углеродного спектра, измерить спектры DEPT, HMQC и НМВС (см. дальше). Анализ совокупности полученных таким образом данных в большинстве случаев дает возможность провести надежное отнесение сиг- налов. Именно так и было осуществлено отнесение углеродных сигналов данного соединения. Как проводятся такие исследования, будет показано в соответствующем разделе книги. 138.0 61.5 gr 1.41 88.7 145/7 138.0 154.2 114.7 1096 615 38.1 “•150 140 130 120 ПО 100 90 80 70 60 50 40 Рис. 1.73. Спектр |3С гетероциклического бромида 1.41, снятый в условиях широкополосного декаплинга. Если результаты измерения углеродного спектра нужны для экспери- ментальной части научной работы, то для рассмотренного спектра описа- ние будет иметь такой вид: спектр 13С, в растворе ДМСОч/б, сигналы в м.д. относительно ТМС: 154.2, 146.7, 138.0, 114.7, 109.6, 88.8, 61.5, 38.2. Здесь в скобках можно указать отнесение сигналов, если оно произведено 164
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса надежно. Однако, в отличие от описаний протонных спектров, для сигналов атомов углерода не указываются относительные интенсивности сигналов и величины КССВ, а приводится лишь перечень химических сдвигов. 1.15.3. Корреляции химических сдвигов ядер 13С со строением молекул Ядра атомов углерода 13С поглощают, как правило, в диапазоне 0-250 м.д. относительно сигнала ТМС. Общие закономерности изменения величин химических сдвигов в углеродных спектрах в зависимости от строения мо- лекул приблизительно те же самые, что и в протонных спектрах. Отлича- ется лишь масштаб изменения химических сдвигов ядер 13С и КССВ при определенных изменениях строения молекулы. В наиболее сильном поле (0-60 м.д.) поглощают ядра углеродных атомов насыщенных углеводород- ных радикалов. Переход от четвертичного углеродного атома к третичному, вторичному и, наконец, к первичному сопровождается уменьшением его химического сдвига. Однако диапазоны сдвигов, характерные для какого- то одного типа углеродных атомов (например группы СН3), перекрываются с диапазонами для атомов другого типа (например СН2 и СН). Поэтому на основании только величин химических сдвигов далеко не всегда удается идентифицировать такие атомы углерода. Ситуация осложняется также тем, что, в отличие от протонных спектров, углеродные спектры, измерен- ные в условиях широкополосного декаплинга на протонах (именно такие спектры измеряются наиболее часто), не содержат информации о спин-спи- новом взаимодействии. Это приводит к тому, что мультиплетную структу- ру углеродных сигналов нельзя приобщить к интерпретации спектра. Если углеводородный радикал соединен с функциональной группой, то химические сдвиги его углеродных сигналов могут значительно изме- няться. Действие функциональной группы быстро уменьшается по мере от- даления от нее, но может быть выявлено даже на расстоянии в 5 химичес- ких связей. Чаще всего под влиянием гетероатомов сигналы ядер углерода смещаются в слабое поле. Исключением являются атомы тяжелых галоге- нов (Вг, I). В соединениях, имеющих в своем составе такие галогены, сиг- налы атомов углерода, непосредственно связанных с ними, смещаются в сильное поле относительно незамещенных продуктов. Причем, когда атомов тяжелых галогенов имеется несколько, смещения могут достигать сотен миллионных долей. В сильном поле находятся также сигналы атомов угле- рода, которые связаны с металлами в металлорганических соединениях, а также с кремнием, бором или другими атомами, электроотрицательность которых меньше, чем у углерода. Наконец, следует отметить так называ- емый "у-эффект" - сдвиг сигналов ядер углерода в сильное поле под влияни- ем электроноакцепторных заместителей, которые находятся в у-положении, 165
Глава 1. Интерпретация спектров то есть на расстоянии трех химических связей от ядра, которое рассматри- вается. Атомы углерода, которые связаны кратными связями, поглощают в су- щественно более слабом поле, чем в соответствующих насыщенных соеди- нениях. Так, в олефиновых, ароматических и гетероциклических соедине- ниях диапазон химических сдвигов 13С составляет 100-140 м.д. Сигналы алкинов расположены в более сильном поле (70-90 м.д.). В наиболее слабом поле поглощают атомы углерода, которые связа- ны двойной связью с атомами кислорода и, особенно, серы. Так, сигналы ядер карбонильного атома углерода в кетонах расположены в области 200-250 м.д., а в альдегидах - 180-210 м.д. В производных карбоновых кис- лот карбонильный атом углерода поглощает в несколько более сильном по- ле - при 160-180 м.д. Углерод группы C=S поглощает в области 220-240 м.д. Представление о том, где именно поглощают атомы углерода в распро- страненных молекулах, дают таблицы 1.14-1.22, которые приведены ниже. Таблица 1.14. Положение в спектре 13С сигналов метильных групп (м.д.) сн4 -2.1 СН3-СН3 5.9 Et-СНз 15.6 НС(СН3)з 24.3 CH3CI 22.0 СН3Вг 14.0 СН31 -21 СН3ОН 49.3 СН3ОСН3 59.4 CH3OPh 54.0 СНзОСОРЬ 51.3 СНзСОРЬ 24.9 СН3СОСН3 29 CH3Ph 21.0 CH3CN 0.5 N(CH3)3 47.5 CH3NO2 57.3 CH3SCH3 19.5 CH3SOCH3 43.5 (СН3)4С 31.5 Г-Bu^. 'ОМе 80.1 ОМе 75.2 /-Ви Таблица 1.15. Положение в спектре 13С сигналов метиленовых групп 166
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Таблица 1.16. Положение в спектре 13С сигналов метиновых атомов Таблица 1.17. Положение в спектре 13С сигналов карбонильной группы Таблица 1.18. Положение в спектре 13С сигналов олефиновых атомов угле- рода 136.2 115.9 124.6 131.5 137.2 116.6 167
Глава 1. Интерпретация спектров Таблица 1.19. Положение в спектре сигналов sp-гибридизированного ато- ма углерода Et^== 67.3 85.0 73.9 CH3CN 117.8 HCN 109.1 CN' 168.8 38.4 Bu—=—Br 79.8 H2C=C=CHCH3 209 80.0 85.8 PhCN 118.7 Таблица 1.20. Положение в спектре сигналов ароматических атомов угле- рода 1 .ОН JLi4lo JL137,7 1 138.0 fin |2’° fll1273 АЧ 129.9 ЧЧ 128.9 129.0 127.3 129.9 128.9 125.9 127.7 134.7 132.9 Ph F Cl Br JL138,7 1 163.8 1’35.1 1 123.3 АЧ 129.1 114Л if4] 128'9 <4 132-° 129.1 129.6 129.7 130.9 129.1 124.3 126.7 127.7 I OH OMe o I96’4 Г155.6 Г158.9 1 168.3 A1386 A116-4 А и4,0 ЧЧ 120.5 131.3 *Х^ 130.4 129.6 A 130.6 128.3 121.4 120.6 115.1 NH, 1 2 NMe, 1 2 no2 133.9 14791 151.3 1 148.3 1 A116,3 A]113,0 A1234 126,1 130.0 < Л 129.5 < Л 129.5 119.2 116.9 134.7 128.3 126.2 s' nN/' II 1130.0 123.0 AT AL 4 125.3 132.зТ| J "^4 126.7 |l 126.7 131.8 128.1 127.3 128.9 168
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Таблица 1.21. Положение в спектре атомов углерода гетероциклических фрагментов 109.8 108.4 > 142.8 О >118.7 'N Н 125.6 127.4 135.5 123.6 166.8 I 145.2 128.4 147.9 154.9 128.7 126.8 129.7 121.5 149.0 150.9 136.0 160.5 127.5 129.0 К К Таблица 1.22. Положение в спектре сигналов атомов углерода в замещен- ных гетерополициклических соединениях . 1505 64;2 о / 141.7 " 120.1 127.0 27.2 156.5 152.0 ч 1104.5, 162.7 о. <С.О 32.9 22.5 | 1Z4.U у 481 147.5 25.5 22.1 113.6 1120.4 24.2 21.7 1Д5 s 142.3 ру155.5 1119 >7^'N^^x'120.9 141 4 50.9 127.5 110.9 ОМе 55.7 123.2Q 169
Глава 1. Интерпретация спектров 132.0 150.6 141.8 145.7 114.4 то д и Нг 14.3 136.0 163.3 ™ш 134.2 S 123.5 122.0 / / . 126.3 О О 94.6 "^4 11.4 .О тт1 loi.oH /Д\ 145.2 Г| Ч гч 1 .148.6 н N 141.2 170
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 124.5 18.2 Вещества в таблицах 1.14-1.22 подобраны таким образом, чтобы они содержали большинство распространенных структурных фрагментов орга- нических молекул. Поэтому с их помощью можно проводить интерпрета- цию несложных спектров ЯМР на ядрах 13С. Для этого надо иметь перед глазами углеродный спектр соединения и его предполагаемую структур- ную формулу. Исследуемую молекулу мысленно нужно разбить на струк- турные фрагменты, которые максимально близки к тем, которые помещены в таблицах 1.14-1.22, и сравнить табличные величины химических сдвигов со сдвигами сигналов в спектре. Отнесение следует начинать с тех струк- турных фрагментов, для которых погрешность в отнесении сигналов наи- менее вероятна. Отнесение сигналов ядер углерода, которые не содержатся в таблицах 1.14-1.22, следует проводить в последнюю очередь, когда выяс- 171
Глава 1. Интерпретация спектров нено происхождение всех других сигналов. Оно должно быть основано на том, с какими гетероатомами соединен атом углерода, сигнал которого же- лательно отнести, и на закономерностях влияния на химические сдвиги со- седних заместителей. С помощью приведенных таблиц 1.14-1.22 можно предсказать, где поглощают атомы углерода определенного типа. Но следует помнить, что погрешности найденных таким образом химических сдвигов могут дости- гать ±5 м.д. Поэтому в сложных случаях надежно отнести углеродные сиг- налы удается далеко не всегда. Это особенно четко видно из приведенных в таблице 1.22 примеров отнесения сигналов в сложных гетероциклических системах. Здесь мы видим, что целый ряд ядер 13С может поглощать в довольно узком спектральном диапазоне или даже совпадать. Отнесение таких сигналов, которые базируются на табличных аналогиях, практически невозможно. Поэтому, если в Вашем спектре содержится несколько сигна- лов, которые имеют химические сдвиги, отличающиеся лишь на 2-5 м.д.. даже не пытайтесь их отнести без дополнительных исследований. Ваши от- несения не будут достоверными. Еще одной проблемой при отнесении уг- леродных сигналов является большое влияние на них распределения элект- ронной плотности в исследуемой молекуле. Поскольку предусмотреть сме- щение электронов заранее не всегда возможно, определенные сигналы в спектре могут наблюдаться в неожиданных, на первый взгляд, участках спектра. Так, в конце таблицы 1.22 приведены отнесения сигналов для кра- сителя, который имеет длинную полиметиновую цепь. Химические сдвиги углеродных атомов в этой цепи находятся в интервале от 120 до 150 м.д.. причем отличие химических сдвигов для соседних атомов, которые, учиты- вая формулу, почти не отличаются один от другого, могут достигать 30 м.д. Конечно, предусмотреть заранее такие отличия практически невозможно. Наиболее надежный подход к отнесению углеродных сигналов состоит в измерении спектров гетероядерной корреляции ^С^Н через одну связь (HMQC, HSQC) и через 2-3 химических связи (метод НМВС). С помощью этих методов отнесения сигналов в углеродном спектре можно осущест- вить совершенно надежно. Единственным условием отнесения является на- личие протонов в молекуле на расстоянии не больше трех химических свя- зей от атомов углерода. Однако, поскольку это условие для большинства органических молекул выполняется, то сегодня отнесение сигналов прово- дят именно такими методами. 1.15.4. Редактирование спектров на ядрах 13С Как мы уже видели, измерение спектров 13С в условиях широкополосного декаплинга приводит к полному исчезновению ССВ с протонами, что зна- 172
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса чительно сужает возможности метода. Поэтому уже на ранних этапах при- менения спектроскопии на ядрах углерода производились попытки разра- ботки методик, которые, с одной стороны, обеспечивали бы достаточную интенсивность сигналов, а с другой стороны, давали бы возможность уста- новить, сколько протонов связано с тем или иным атомом углерода. Это привело к разработке так называемых методов редактирования углеродных спектров. Эти методы основаны на использовании многоимпульсных по- следовательностей. Подробнее действие этих последовательностей будет рассмотрено в последующих разделах учебника. Здесь мы лишь укажем на то, что в случае, если на спиновую систему подать последовательно два импульса, разделенные некоторым интервалом времени, то действие второго импульса зависит от мультиплетности сигнала углерода. Можно выбрать такой интервал между импульсами, что сигналы групп СН и СНз будут по- ложительными, а сигналы групп СН2 - отрицательными. Таким образом, появляется возможность закодировать мультиплетность углеродного сиг- нала в его знаке. На этом принципе основаны все методы редактирования углеродных спектров. 1.15.4.1. Редактирование спектров методом APT Первым достаточно эффективным методом редактирования углеродных спектров был разработан метод APT (Attached Proton Test). Метод получил весьма широкое распространение в связи со своей простотой и возмож- ностью реализации практически на всех типах спектрометров. Он требует ровно столько же времени, сколько и измерение углеродного спектра с ши- рокополосной развязкой, и дает возможность различить первичные, вто- ричные и третичные атомы углерода. Обычно, в спектре APT сигналы ме- тильных групп и атомов углерода групп СН имеют положительный знак, а сигналы метиленовых групп - отрицательный. Сигналы четвертичных ато- мов углерода в таком спектре не видны. Результат действия импульсной последовательности APT зависит от интервала А между двумя импульсами, которые последовательно воздействуют на образец. Импульсную последо- вательность можно настроить и так, что в ней будут видны четвертичные атомы углерода, однако в этом случае из спектра исчезнут сигналы всех протонированных атомов углерода. Поэтому, как правило, спектры APT из- меряют в дополнение к спектрам с широкополосной развязкой либо же измеряют два варианта спектра APT, в одном из которых присутствуют сигналы протонированных атомов углерода, имеющие различный знак в зависимости от мультиплетности сигнала, а во втором спектре - только сигналы четвертичных атомов углерода. Примером отредактированного та- ким образом углеродного спектра может служить спектр камфоры 1.42, изображенный на рис. 1.746. 173
Глава 1. Интерпретация спектров —।—!—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—| 50 40 30 20 10 м.д. Рис. 1.74. Углеродные спектры камфоры 1.42. (а) Обычный углеродный спектр снят в условиях широкополосного декаплинга (сигнал карбониль- ной группы не показан); (б) отредактированные спектры (параметры им- пульсной последовательности подобраны так, чтобы сигналы метильных и метиленовых групп имели противоположный знак); (в) последователь- ность настроена так, что проявляются лишь четвертичные атомы углерода. Отредактированные спектры представлены таким образом, что сигна- лы групп СН и СНз проявляются как положительные пики, а сигналы мети- леновых групп - как отрицательные. Таким образом, мультиплетность уг- леродных сигналов оказывается закодированной в знаке сигнала. Для этого интервал между импульсами, А, выбирают равным 1/J с, где J - величина ге- тероядерной КССВ ^-^С через одну химическую связь. При этом возвра- щается часть информации, которая теряется при использовании широко- полосного декаплинга. В спектрах, которые записаны с помощью данной последовательности, сохраняется повышение интенсивности сигналов вслед- ствие ЯЭО. Если выбрать промежуток между импульсами в импульсной последовательности APT, А = 1/2J с, то интенсивность сигналов всех ато- мов углерода, которые связаны с атомами водорода, будет нулевой и в 174
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса спектре останутся только сигналы четвертичных (не связанных с Н) атомов углерода (рис. 1.74в). Точность редактирования существенным образом за- висит от правильности выбора интервала А, который определяется величи- ной J. Интервал А можно назвать ’’управляющим интервалом”, поскольку от него зависят результаты редактирования. Управляющий интервал при- меняется и в других многоимпульсных последовательностях. Поскольку в реальных молекулах КССВ находятся в определенном, довольно большом диапазоне, приходится выбирать некоторое компромис- сное значение А. КССВ через одну связь лежат в диапазоне от 125 до 250 Гц, причем чаще всего встречаются их величины от 130 до 170 Гц. Поэтому для молекул, которые содержат ароматические фрагменты и электроотри- цательные группы в алифатической цепи, типичная величина А = 7 милли- секундам (^сн = 140 Гц). Если реальные КССВ находятся далеко от этого диапазона, то соответствующие сигналы могут иметь неожиданный знак и интенсивность. Так бывает при изучении производных ацетилена, для ко- торых характерны значительно большие КССВ. Поэтому для получения оптимальных результатов этим методом иногда приходится несколько из- менять интервал А. 1.15.4.2. Редактирование спектров методом DEPT Методика редактирования углеродных спектров, которая была описана вы- ше, не всегда дает удовлетворительные результаты. В ряде случаев отре- дактированные спектры содержат сигналы со значительным искажением фазы. В простых спектрах это не имеет особого значения, но при анализе сложных спектров, где сигналы разных углеродных атомов наблюдаются очень близко один от другого, такие искажения фазы могут привести к ошибочной интерпретации результатов. Поэтому необходимо было даль- нейшее усовершенствование методов редактирования углеродных спект- ров. Работы в этом направлении привели к разработке импульсной после- довательности DEPT (сокращение от Distortionless Enhancement by Polari- sation Transfer). Хотя разработана она еще в 1982 году, но и до сих пор яв- ляется наиболее совершенной и используется чаще всего. Для определения мультиплетности сигналов с помощью DEPT в наибо- лее общем случае необходимо измерение трех спектров, в которых изменя- ется один из параметров импульсной последовательности - угол послед- него *Н импульса 0. Необходимо записать спектры с 0 = 45, 90 и 135° При этом эксперимент с 0 = 90° требует вдвое больше сканов для получения спектра с тем же соотношением сигнал/шум. На рис. 1.75 приведен пример отредактированного спектра бициклического терпеноида андрографоли- да 1.43 для трех вариантов "управляющего угла" 175
Глава 1. Интерпретация спектров 1.43 В варианте спектра DEPT-45 содержатся сигна- лы всех связанных с Н атомов углерода. В варианте DEPT-90 содержатся лишь сигналы атомов углеро- да групп СН, а в варианте DEPT-135 сигналы мети- леновых групп имеют знак, противоположный зна- ку сигналов групп СНз и СН. Изучение всех трех спектров дает возможность провести исчерпыва- ющую идентификацию сигналов. DEPT-135 DEPT-90 DEPT-45 Рис. 1.75. Обычный углеродный спектр (широкополосный декаплинг) и DEPT-отредактированные спектры терпеноида андрографолида 1.43. Улучшенный подход заключается в комбинировании (прибавле- нии и вычитании) данных спектров и получении подспектров, в кото- рых отдельно присутствуют сигналы СН-, СН2- и СНз-групп. Однако 176
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса следует учитывать, что при таком подходе возникает возможность появле- ния артефактов (’’ненастоящих’’ сигналов). Кроме того, тяжелее определить причину неудачи эксперимента в случае, если в спектре имеются аномаль- ные КССВ 13C-JH или прибор плохо откалиброван. На практике измерение одного спектра DEPT с 0 = 135° дает возможность получить необходимую структурную информацию, несмотря на то, что в спектре отсутствуют сиг- налы четвертичных протонов. Чаще всего их удается идентифицировать путем сравнения с обычным углеродным спектром соединения. Имеется несколько причин, по которым в методе DEPT могут появить- ся ошибки. Наиболее часто это происходит при неправильной установке параметров импульсов, особенно протонного импульса 0, который исполь- зуется для редактирования спектров. Это может явиться следствием пло- хой настройки радиочастотного канала протонов спектрометра ЯМР. Даже небольшие ошибки в длительности импульса 0 могут привести к появле- нию неожиданных пиков в DEPT-90. Если угол 0 слишком мал, подспектр DEPT-45 оказывается более интенсивным, чем DEPT-135, и при вычитании одного спектра из другого появляются ’’паразитные’’ сигналы. Паразитные сигналы можно идентифицировать исходя из их аномально низкой интен- сивности. При измерении спектров DEPT может встретиться любой из вариантов их представления, поэтому следует быть готовым воспользоваться каждым из них. Запись того или иного варианта DEPT зависит от личных вкусов спектроскописта, производившего измерение спектра. 1.15.4.3. Пример отнесения сигналов в спектре на ядрах 13С Измерен спектр 13С органического соединения, кото- рое, предположительно, имеет структурную форму- лу 1.44. Данный спектр приведен на рис. 1.76. Кроме 4 того, для того же самого образца измерен спектр 5 DEPT-135. Он изображен на рис. 1.77. Давайте по- пробуем отнести сигналы в спектре. Прежде чем анализировать величины химических сдвигов, следует сравнить спектр, полученный в условиях широкополосного подавления взаимодействия с протонами (рис. 1.76), и спектр DEPT-135 (рис. 1.77). Это даст возможность еще до анализа выяснить, сколько протонов связано с тем или иным атомом углерода. Спектр DEPT-135 чаще всего записывают таким образом, что сигналы групп СН и СНз в нем положительны, а сигналы групп СН2 отрицатель- ны. Сигналы четвертичных атомов углерода в таком спектре отсутствуют. Поэтому в области поглощения ароматических атомов углерода мы имеем 4 сигнала групп СН бензольного ядра, а в области поглощения алифатичес- 177
Глава 1. Интерпретация спектров ких атомов мы имеем два положительных сигнала и один отрицательный. Это согласуется с формулой соединения, в которой имеются две метиль- ные группы и одна метиленовая. Уже на данном этапе анализа можно от- нести некоторые сигналы. Так, в молекуле одна из метильных групп связа- на с атомом кислорода, а вторая - с атомом углерода. Поскольку мы знаем, что атом кислорода более электроотрицательный, чем углерод, то связан- ная с ним метильная группа должна поглощать в более слабом поле. На этом основании сигнал метильной группы при 53.6 м.д. следует отнести к группе ОСН3. Соответственно сигнал при 25.02 м.д. отвечает второй ме- тильной группе. Как только мы отнесли сигналы метильных групп, стано- вится понятным отнесение сигнала метиленовой группы (36.71 м.д.) и сиг- нала четвертичного атома углерода, связанного с кислородом гетероцикла (82.33 м.д.). Последний сигнал в спектре DEPT не проявляется, что и сви- детельствует о том, что данный сигнал принадлежит четвертичному атому углерода. Удобно по мере отнесения сигналов наносить величины их хими- ческих сдвигов на структурную формулу соединения ющих атомов. возле соответству- Рис. 1.76. Спектр на ядрах 13С соединения 1.44. Теперь можно отнести сигналы карбонильных атомов углерода. Им отвечают пики спектра при 172.6 и 164.3 м.д. Ищем похожие структурные фрагменты в таблицах 1.14-1.22. В таблице 1.17, посвященной сигналам карбонильных соединений, находим, что в группе СООСНз сигнал карбо- 178
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса нильного атома углерода поглощает при 172 м.д. На этом основании сиг- нал при 172.6 м.д. относится к карбометоксильной группе. Соответственно сигнал при 164.3 м.д. относится к экзоциклическому карбонилу С2. 480 170 160 160 140 130 120 110 100 90 80 70 60 60 40 30 2( Рис. 1.77. Спектр DEPT-135 соединения 1.44. Изучение таблиц 1.14-1.22 показывает, что в них нет фрагмента, доста- точно близкого по строению к ароматическому ядру продукта 1.44. Поэто- му отнесение сигналов данного фрагмента проведем на основании законо- мерностей влияния на химические сдвиги электронных эффектов в моле- куле. Имеем 6 неэквивалентных атомов углерода бензольного кольца, два из которых являются четвертичными. Сигнал четвертичного атома углеро- да при 137.41 м.д. вероятнее всего относится к атому, который связан с ме- тиленовой группой. Его химический сдвиг не должен сильно отличаться от химического сдвига атома С1 в толуоле (137.8 м.д., таблица 1.20). Тогда четвертичному атому углерода, имеющему связи с карбонильной группой, следует приписать химический сдвиг 124.82 м.д. Среди протонированных атомов углерода бензольного кольца только один располагается сущест- венно в более слабом поле, чем другие атомы углерода. Логично предполо- жить, что это атом СЗ, находящийся в пери-положении относительно кар- бонильной группы соседнего цикла. В этом случае слабопольный сдвиг можно объяснить несвязанным взаимодействием с неподеленными парами 179
Глава 1. Интерпретация спектров О 1349 Нп54.2 128,7 (|^2О 9 /Р 129.7 72.6 128.5 125 О I 0Ме 53,6 137,4 36.7’ 82.3 1.44 кислорода карбонильной группы. Эта группа по мезомерному механизму может воздейст- вовать также и на атом углерода, располо- женный относительно нее в пара-положении. Это дает основание считать, что сигнал при 129.74 м.д. отвечает атому С5. Произведенные таким образом отнесения углеродных сигналов в спектре соединения 1.44 указаны слева. Следует, однако, учитывать, что сигналы бензольного кольца отнесены не вполне надежно, поскольку объективных подтверждений сделанных от- несений мы не имеем. Повысить надежность отнесений сигналов можно с использованием методов гетероядерной корреляции, которые будут описаны ниже. Существует еще один, ’’более продвинутый” способ предварительного отнесения сигналов в углеродных спектрах. Он основан на использовании компьютерных баз данных о сдвигах 13С для больших массивов измерен- ных ранее спектров органических соединений. Программа составлена та- ким образом, что изучаемую молекулу она воспринимает в виде структур- ной формулы в привычном химику виде. Если данное соединение присут- ствует в базе данных, то программа присвоит каждому углеродному атому соответствующее значение химического сдвига и выдаст на экран монито- ра формулу, где возле каждого атома имеются величины найденных хими- ческих сдвигов. Если же в базе данных изучаемое соединение отсутствует, то программа выдаст для атомов значения химических сдвигов, получен- ные для максимально близких структур. В этом случае величины химичес- ких сдвигов могут на 1-5 м.д. отличаться от реальных величин. Наиболее доступной из программ, предназначенных для анализа угле- родных спектров, является комплекс программ фирмы ICD-Labs. Лицензи- 127.9 130.5 1.44 онное математическое обеспечение достаточ- но дорого (около $3000), однако в интернете имеются более старые версии программ дан- ной фирмы, которые вполне могут быть ис- пользованы для проведения таких работ. Для примера мы приводим величины рассчитан- ных химических сдвигов для соединения 1.44, описанного выше. Видно, что хотя и не наблюдается полного совпадения рассчитанных и экспериментальных химических сдвигов, однако отнесение сигналов дан- ным методом можно выполнить достаточно надежно. При возрастании сложности химического соединения надежность отнесений уменьшается. На наш взгляд, не следует данный метод использовать в тех случаях, когда исследуемая молекула содержит более 15 углеродных атомов. 180
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 1.15.4,4. Задачи. Отнесение сигналов в углеродных спектрах Измерены спектры на ядрах 13С и соответствующие им спектры DEPT-135 для соединений, которые имеют структурные формулы 1.45-1.48. Ответьте на вопросы, поставленные в задачах, используя рис. 1.78-1.85. 1.47 1. Основываясь на спектре 13С соединения 1.45 и спектре DEPT-135, показанных на рис. 1.78 и 1.79, отнесите сигналы в спектре. Используйте данные таблиц 1.14-1.22 химических сдвигов ядер 13С. 2. Основываясь на спектре 13С соединения 1.46 и спектре DEPT-135, показанных на рис. 1.80 и 1.81, отнесите сигналы в спектре. Используйте данные таблиц 1.14-1.22 химических сдвигов ядер 13С. 3. Основываясь на спектре 13С соединения 1.47 и спектре DEPT-135, показанных на рис. 1.82 и 1.83, отнесите сигналы в спектре. Используйте данные таблиц 1.14-1.22 химических сдвигов ядер 13С. 4. Основываясь на спектре 13С соединения 1.48 и спектре DEPT-135, показанных на рис. 1.84 и 1.85, отнесите сигналы в спектре. Используйте данные таблиц 1.14-1.22 химических сдвигов ядер 13С. 181
Глава 1. Интерпретация спектров Рис.1.78. Спектр на ядрах 13С соединения 1.45 в ДМСО-*4- Рис. 1.79. Спектр DEPT-135 соединения 1.45 в ДМСО-Je- 182
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.80. Спектр на ядрах 13С соединения 1.46 в ДМСО-de- 170 1(0 1(0 140 130 120 110 100 90 (0 70 (0 50 40 3< Рис. 1.81. Спектр DEPT-135 соединения 1.46 в ДМСО-de- 183
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.82. Спектр на ядрах 13С соединения 1.47 в ДМСО-de. 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 Рис. 1.83. Спектр DEPT-135 соединения 1.47 в ДМСО-de. 184
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса PPM Рис. 1.84. Спектр на ядрах 13С соединения 1.48 в ДМСО-de- ь 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 Рис. 1.85. Спектр DEPT-135 соединения 1.48 в ДМСО-de- 185
Глава 1. Интерпретация спектров 1.15.5. Спин-спиновое взаимодействие !Н-13С Хотя стандартные спектры 13С, которые измеряются для большинства хи- мических соединений, и не содержат КССВ, однако это не означает, что получение из спектров величин J(H,C) затруднено, просто для этого требу- ется больше времени. Поэтому во всех случаях, когда выводы о структуре химических соединений можно подтвердить величинами гетероядерных КССВ, производят измерение спектров 13С без широкополосной развязки от протонов. В таких спектрах видны многочисленные КССВ через одну, две и три химические связи. Часто таких КССВ настолько много, что без специальных приемов 128.5 1.49 невозможно разобраться в структуре углеродных сигналов. Если же рядом с углеродными атомами протонов не слишком много, то в спектрах получа- ются мультиплеты первого порядка, которые визу- ально практически не отличаются от мультиплетов в протонных спектрах. Примером этому может слу- жить спектр 8-карбоксиметилхинолина 1.49, изме- ренный с помощью прерывистого декаплинга и по- казанный на рис. 1.86. Рис. 1.86. Спектр 13С 8-карбоксиметилхинолина 1.49, измеренный без раз- вязки от протонов методом прерывистого декаплинга. На отдельных раз- вертках показаны некоторые из спиновых мультиплетов. Сигнал при 96 м.д. отвечает растворителю ССЦ. 186
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Здесь отнесения сигналов атомов 13С приведены на структурной фор- муле. Они получены с использованием методов гетероядерной корреляции ^-^С. Анализ мультиплетное™ сигналов в таких спектрах производится совершенно аналогично анализу протонных спектров. Так, например, сиг- нал а-пиридинового протона, который поглощает при 151.4 м.д., имеет вид двух дублетов дублетов с центром при 151.4 м.д. Величина lJ для этого сигнала равна расстоянию между любыми эквивалентными компонентами данных дублетов дублетов. Если использовать для вычисления левые компоненты мультиплетов, получим }J= 152.34 - 150.56 = 1.78 м.д. Для того, чтобы КССВ найти в Герцах, достаточно эту величину умножить на частоту спектрометра. В нашем примере использован спектрометр, на котором яд- ра углерода поглощают при 100 МГц, поэтому lJ= 178 Гц. Величины даль- них КССВ определяются как расстояния между компонентами любого из дублетов дублетов. Так, если воспользоваться слабопольной частью сигна- ла, то 2J = (152.34 - 152.26) х 100 = 8 Гц, a 3J = (152.34 - 152.30) х 100 = 4 Гц. Совершенно аналогично можно провести определение КССВ и для других сигналов соединения. В нашем примере величины КССВ оказались целы- ми. Это связано с тем, что для их более точного определения оказалось недостаточно значащих цифр в величинах химических сдвигов компонен- тов мультиплетов. К сожалению, в большинстве случаев более точно найти величины гетероядерных КССВ не удается из-за недостаточного цифрово- го разрешения спектра - при измерении спектров, дающих сигналы в боль- шом диапазоне химических сдвигов, расстояние между соседними точками спектра редко бывает меньше 1 Гц. При анализе расщепленного спектра 13С бывает трудно различить КССВ через 2 и через 3 химические связи, поскольку они имеют близкие величины. Для того, чтобы найденные КССВ были надежными, следует на- ходить одинаковые расщепления в мультиплетах обоих взаимодействующих сигналов. Только в этом случае удается идентифицировать КССВ вполне надежно. Естественно, что для этого предварительно следует сделать отне- сение всех сигналов. 7.75.5.7. ССВ 13С-]Н через одну химическую связь, константы ^(Н,С) Исторически сложилось так, что спин-спиновое взаимодействие углерода с протонами через одну химическую связь было изучено намного раньше, чем более дальние ССВ. Это связано с тем, что для их определения часто нет необходимости измерять углеродный спектр, а можно воспользоваться протонным спектром исследуемого соединения. Поэтому изучение гетеро- ядерных КССВ J^H,1^) началось сразу после создания приборов, чувстви- тельность которых позволяла обнаружить сателлиты 13С в протонных спект- 187
Глава 1. Интерпретация спектров рах химических соединений. Хотя интенсивность таких сателлитов состав- ляет всего 0.8% от интенсивности основного сигнала образца, однако для концентрированных образцов или чистых жидкостей увидеть такие сигна- лы можно было уже на первых серийных спектрометрах. Поэтому основные закономерности изменения VCfyC) стали понятны уже в начале 60-х годов XX века. Так, для примера, на рис. 1.87 показан сигнал хлороформа при усилении, достаточном для анализа сателлитов 13С. Видно, что по обе сто- роны основного сигнала на расстоянии 104.5 Гц от него расположены угле- родные сателлиты. Расстояние между ними, 209 Гц, соответствует величи- не 1 J(H,C) в хлороформе. . — —'* > 11 -—> ' ’ I ' ’ ' • I ’ ' ' ’ I ' ' ’ ’ I ' ' ’ ’ I ’ ' ' ' 100 50 0 50 100 Гц Рис. 1.87. Сателлиты 13С, которые наблюдаются в спектре хлороформа. Расстояние между сателлитами равно величине lJ(H,C). Таким образом, первоначально КССВ ^(КС) изучали по протонным спектрам, которые имеют значительно большую чувствительность, чем спектры 13С. Только когда Фурье-спектрометры стали доступными, такие изучения начали проводить непосредственно по углеродным спектрам хи- мических соединений. Уже первые экспериментальные данные показали, что величины lJ(H,C) сильно зависят от строения молекулы. Так, если сравнить три соединения, которые различаются гибридизацией углеродного атома, то для величин lJ(H,C) получим двукратное изменение при переходе от sp- к зр3-гибриди- зованному атому углерода (таблица 1.23). Таблица 1.23. Изменение \/(Н,С) при изменении гибридизации атома уг- лерода Н Н Н3С-Н 125 Гц 157 Гц Н~ = И 250 Гц Н Н 188
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Из этого следует, что увеличение кратности связи углеродного атома существенно увеличивает константы взаимодействия \/(Н,С). Однако гиб- ридизация - не единственный фактор воздействия на 1 J(H,C). На него нала- гаются другие, хотя и менее значимые факторы. Важнейшими из них явля- ются искажения валентных углов в молекуле. При этом, чем более напря- женной является молекула, тем большие величины ^(Н.С) наблюдаются для ее атомов углерода. Весьма наглядно это видно при сравнении КССВ в циклических соединениях (таблица 1.24). Таблица 1.24. Изменение \/(Н,С) при изменении размеров циклов 220 Гц <^Н 170 Гц 0^162 Гц 1 /-Х.Н |] 158 Гц О-Н 161Гц 0-Н 134Гц O'l'srn [ Т 123 Гц Еще одним важным фактором воздействия на величины lJ(H,C) явля- ется наличие электроотрицательных заместителей. Проследить наблюда- ющиеся при этом изменения КССВ можно путем сравнения в рядах произ- водных метана, где водородные атомы последовательно замещаются, напри- мер, на атомы галогенов (таблица 1.25). Таблица 1.25. Изменение величин \/(Н,С) при изменении количества элект- роотрицательных заместителей ch2f-h 149 Гц CHF2-H 185 Гц CF3-H 239 Гц СН3С1 151 Гц СН2С12 178 Гц СНС13 209 Гц Для анализа стереохимических особенностей органических молекул весьма важным является воздействие на величину ’/(Н.С) неподеленной пары электронов соседнего гетероатома. Этот эффект был обнаружен А.С. Перлином и Б. Кейси и называется эффектом Перлина. Данный эф- фект имеет общий характер и проявляется для самых разнообразных гете- роядерных ССВ. Его можно обнаружить из сравнения lJ(H,C) для соединений, которые различаются только ориентацией за- /СМе3 местителей вблизи атома углерода. Так, для енаминов сущест- п вуют син- и анти-изомеры, в которых величина 1 J(H,C) разли- Н^и^Нанти чается более чем на 10 Гц. Для данной молекулы сигнал енаминового атома углерода представля- ет собой дублет дублетов с 1/(Нсин,С) = 178 Гц, а lJ(HaH™,C) = 157 Гц. 189
Глава 1. Интерпретация спектров Воздействие неподеленной пары электронов а-гетероатома на величи- ну *J(H,C) можно вычислить теоретически методами квантовой механики. Так, для насыщенных аминов и спиртов можно получить практически сов- падающие графики, изображенные на рис. 1.88. (§) ,-н N-H н-|—н, н Рис. 1.88. Зависимость воздействия неподеленной пары электронов а-гете- роатома на величину 'j(H,C) для насыщенных аминов (обозначены кру- жочком) и спиртов (обозначены квадратиком) от торсионного угла между нею и связью С-Н, по которой передается ССВ. Здесь наименьшее воздействие неподеленной электронной пары на 1 J(H,C) наблюдается для антиперипланарной ее ориен- тации относительно связи С-Нр Для такой конформации (слева) принято, что двугранный угол между неподеленной электрон- ной парой атома азота и связью C-Hi равен 0. Рис. 1.88 можно использовать для оценки влияния эффекта Перлина на ’j(H,C) для самых различных соединений, поскольку степень его воздейст- вия на КССВ остается практически неизменной независимо от абсолютной величины 1 J(H,C). Наиболее эффективным оказалось использование эффекта Перлина для определения ориентации связей С-Н в углеводах. Эффект Пер- лина проявляется также в соединениях серы и фосфора, однако здесь он приводит к изменению КССВ всего на 3-4 Гц. 1.15.5.2. ССВ ,3С-'Н через две связи, константы 2J(H,C) Величины КССВ через две химические связи, 2J(H,C), чаще всего ле- жат в диапазоне от -8 до +8 Гц. Таким образом, они могут быть как поло- жительными, так и отрицательными. На значения данных КССВ решающее 190
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса воздействие оказывает наличие в a-положении к ним электро- отрицательных атомов либо кратных связей. Так, например, для карбонильных соединений, в которых имеется фрагмент, ука- ® = занный справа, величина 2J(H,C) между a-протоном и карбо- нильным атомом углерода в зависимости от торсионного угла Я между связями С=О и Ca-Ha может принимать значения в диапазоне от -7 Гц до -2 Гц. График этой зависимости приведен на рис. 1.89. угол 0 Рис. 1.89. Зависимость величины 2J(H,C) между a-протоном и атомом уг- лерода карбонильной группы от торсионного угла между связями С=О и Ca-Ha. Угол 0 = 0 соответствует син-перипланарной ориентации этих свя- зей (заслоненная конформация). Приведенная на рис. 1.89 зависимость является мощным средством ус- тановления конформации протонов, расположенных в a-положении отно- сительно карбонильной группы. Это имеет большое значение для стерео- химического анализа природных соединений и их производных. Похожий график можно получить для производных спиртов и аминов (рис. 1.90). Для этих соединений величина 2J(Ca,Hi) во фрагменте Hi-Cp-Ca-X зависит от торсионного угла между связями Са-Х и Cp-Hj. Угол 0 = 0 соот- ветствует такой ориентации связей Hj-Cp и Са-Х, когда заместитель X и протон Hi расположены син-перипланарно. Из данных графиков видно, что при определенной ориентации заместителя X величина 2J(Ca,Hi) может оказаться равной нулю. Такая ситуация реализуется довольно часто. Наи- более распространена она среди ароматических соединений, в которых 2J в фенильных заместителях обычно не проявляется. Например, сигнал атома Сз 191
Глава 1. Интерпретация спектров 8-карбоксиметилхинолина 1.49 имеет вид дублета дублетов (рис. 1.91). несмотря на то, что исходя из химического строения он должен бы взаи- модействовать с протонами Н2, Н3 и Н4 и соответственно иметь 8 компо- нентов. Рис. 1.90. Зависимость величины 2J(Ca,Hi) во фрагменте Hi-Cp-Ca-X от торсионного угла между связями Са-Х и Ср-Нь Угол 0 = 0 соответствует син-перипланарной ориентации связей Hj-Cp и Са-Х (заслоненная конфор- мация). Кружочком показаны КССВ для аминов, квадратиком - для спиртов. Рис. 1.91. Фрагмент спектра 13С 8-карбоксиметилхинолина 1.49, отвеча- ющий сигналу атома Сз. 192
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Если для данного соединения из спектра 13С найти все величины 2J, то окажется, что большин- ство из них имеют нулевые значения, как это пока- зано на формуле соединения 1.49. Отличаются от нуля величины 2J(H,C) только для атомов, расположенных вблизи пиридинового атома азота. Такие величины 2J(H,C) характерны 1.49 для всех ароматических соединений. Они отличны от нуля только в том случае, если из-за наличия заместителей существенно изменяется распре- деление электронной плотности либо валентные углы. Нулевые значения 2J(H,C) в ароматических соединениях, с одной сто- роны, значительно упрощают углеродные спектры, а с другой стороны, не дают возможности использовать данные КССВ для анализа структуры этих соединений. 1.15.5.3. ССВ 13С-*Н через три связи, константы 3J(H,C) Величины КССВ 3J(H,C) находятся в том же диапазоне (0-10 Гц), что и константы взаимодействия через 2 химические связи, однако, в отличие от последних, для них характерны только положительные значения. Это прак- тически исключает возможность реализации нулевых значений данных КССВ. Закономерности изменения величин 3J(H,C) повторяют описанные ранее закономерности изменения вицинальных КССВ между протонами, 3J(H,H). Различие состоит в том, что гетероядерные КССВ в полтора-два раза меньше по величине. Если взаимодействие осуществляется в цепочке химических связей H-Ci-C2-C3, то величину 3J(H,C3) можно найти из со- отношения, аналогичного формуле Карплуса и описанного Р. Айдином и X. Гюнтером: 3J(H,C) (Гц) = 4.50 - O.87cos0 + 4.O3cos20, (1.24) где угол ф отвечает двугранному углу между связями H-Ci и С2-С3. Угол ф = 0 отвечает син-перипланарной (цисоидной) ориентации этих химичес- ких связей. Данное уравнение можно представить и в графической форме. Она приведена на рис. 1.92. Хотя в конкретных химических соединениях величины 3J(H,C) могут несколько отличаться от тех, которые следуют из данного графика, одна- ко с его помощью практически всегда удается различить конформации, в которых двугранный угол в цепи передачи ССВ различается достаточно сильно. 193
Глава 1. Интерпретация спектров Торсионный угол, град. Рис. 1.92. Угловая зависимость величины 3/(Н,Сз) в цепочке химических связей Н-С1-С2-С3 в зависимости от величины двугранного угла между свя- зями H-Ci и С2-С3. Угол ф = 0 отвечает син-перипланарной (цисоидной) ориентации этих химических связей. Величины 3J(H,C) могут иметь также и аномальные значения. Их умень- шению способствует присутствие в цепи передачи ССВ карбонильной груп- пы, а увеличению - возрастание числа возможных путей передачи ССВ. Данная ситуация часто реализуется в каркасных соединениях с малыми циклами. В них 3J(H,C) может превышать 10 Гц. Для того, чтобы проиллюстрировать, какими являются ве- личины 3J(H,C) в практически важных ароматических соединениях, воспользуемся уже обсуждавшимся на- ми спектром 8-карбоксиметилхинолина. Найденные для него величины 3J(H,C) в Гц представлены слева. Видно, что чаще всего 3J(H,C) между протоном и атомом углерода, который находится по отношению к нему в л/едид-положении, составляет 8 Гц. Присутствие в цепи передачи ССВ гетероциклического атома азота снижает данную КССВ до 5 Гц. Ана- логично изменяются КССВ в случаях, когда атом углерода не принадлежит бензольному кольцу, в котором находится протон. 1.15.5.4. ССВ 13С-1 Н через четыре связи, константы 4J(H,C) Чаще всего КССВ через 4 химические связи не проявляются из-за их бли- зости к нулю. Однако существуют взаимные ориентации химических связей, 194
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса через которые передается ССВ и которые приводят к 2 4 возрастанию 4J(H,C). Наиболее известно W-взаимодейст- Нх |/с\ вие. Оно реализуется в случае, если связи между взаи- модействующими атомами расположены зигзагом. Для таких молекул 4J(H,C4) может достигать 2 Гц. Данное расположе- ние цепочки передачи ССВ часто реализуется для отдельных магнитных ядер в конденсированных ароматических соединениях и гетероциклах. Оно возникает также в каркасных соединениях типа камфоры. Еще один вариант цепи передачи ССВ, который способствует увеличе- нию 4J(H,C), - бензольное кольцо. В нем КССВ между прото- г— ном и атомом углерода, расположенным относительно него в Н—С С4 ияря-положении, может достигать 1.5 Гц. \=/ На практике расщепления через четыре связи чаще всего не наблюда- ются из-за недостаточного разрешения углеродных спектров, однако их на- личие легко обнаруживается по появлению соответствующих корреляций в спектрах гетероядерной корреляции НМВС (см. ниже). 1.16. Основные закономерности спектров 19F Фтор является самым активным из химических элементов, поэтому его соединения широко распространены. Известны фториды практически всех элементов периодической системы, а также многочисленные классы орга- нических соединений, содержащих фтор. Интерес к таким соединениям оп- ределяется уникальностью их свойств. Так, полимер тефлон обладает наи- меньшим коэффициентом трения, а фторсодержащие кислоты являются са- мыми сильными из известных. Поэтому в химических лабораториях часто приходится иметь дело с веществами, в состав молекул которых входит один или несколько атомов фтора. Изучение спектров ЯМР на ядрах 19F по- зволяет получить ценные сведения об их структуре и стереохимических особенностях. Ядро 19F, как и ’Н, имеет спин 16. Во фторе естественное содержание магнитного изотопа 19F составляет 100%, причем магнитный момент ядер довольно большой. Поэтому чувствительность метода ЯМР на ядрах ато- мов фтора лишь немного (приблизительно в 1.2 раза) уступает чувстви- тельности ЯМР на протонах. С точки зрения аппаратурного оформления методика измерений спектров на ядрах фтора не отличается от методики измерения спектров на протонах. Практически на всех спектрометрах мож- но измерять спектры ЯМР !Н и 19F от одного и того же образца без измене- ния датчика, а лишь слегка меняя параметры его настройки. Это связано с тем, что частота поглощения ядер 19F лишь на 4% меньше частоты погло- щения протонов. 195
Глава 1. Интерпретация спектров Диапазон химических сдвигов 19F намного превышает диапазон хими- ческих сдвигов протонов и составляет около 500 м.д. Если же учесть, что в некоторых неорганических фторидах сигнал фтора не попадает в этот диа- пазон, то сигналы 19F могут различаться и на 1000 м.д. Уже на ранних этапах изучения спектров на ядрах 19F как внутренний эталон для фторных спектров был предложен трихлорфторметан (CFCI3). Его сигнал был принят за 0 м.д. Данное соединение удобно тем, что дает сигнал в области, где практически не содержатся другие сигналы 19F, одна- ко, в отличие от стандартов для ядер ’Н и 13С, здесь сигнал эталона наблю- дается в самом слабом поле, а не в самом сильном. Поэтому большинство химических сдвигов, которые измерены относительно CFCI3, имеют отри- цательные величины. Хотя к этому и можно привыкнуть, однако при сов- местном обсуждении спектров на разных ядрах могут возникнуть смысло- вые ошибки, поскольку сдвиг сигнала в слабое поле на ядрах 19F соответст- вует уменьшению абсолютной величины его химического сдвига, а на ядрах !Н и 13С эта величина возрастает. Еще одним неудобством трихлорфтор- метана является его слишком низкая температура кипения - при комнатной температуре это газ. Поэтому для спектров на ядрах 19F были предложены и другие эталоны, в частности трифторметилбензол (его химический сдвиг относительно CFCI3 равняется -63 м.д.), тетрафторметан (-64 м.д.), три- фторуксусная кислота (-77 м.д.), гексафторбензол (-163 м.д.). В настоящее время используются все эти эталоны. На наш взгляд, наиболее удобным из них является гексафторбензол. Он дает интенсивный сигнал, является жид- костью и химически достаточно инертен. Недостатком данного эталона яв- ляется то, что сигналы некоторых атомов фтора могут поглощать в том же магнитном поле и давать с ним совпадающие сигналы. Другими стандар- тами, которые часто используются при измерении спектров F, являются трифторуксусная кислота и бензотрифторид. Если спектр измерен относи- тельно гексафторбензола или другого стандарта, то его обычно пересчиты- вают относительно CFCI3. Для этого можно воспользоваться формулами: 8(CFC13) = 5(C6F6) - 163 м.д., 8(CFC13) = 8(CF3COOH) - 77 м.д., 8(CFC13) = 8(C6H5CF3) - 63 м.д. Следует также отметить, что для ядер 19F нежелательным является ис- пользование внешнего стандарта, поскольку в этом случае возможно от- клонение положения сигнала более чем на 5 м.д. Весьма велики для сигна- ЛОВ F также концентрационные изменения величин химических сдвигов. Общие закономерности изменения величин химических сдвигов ядер 19F те же самые, что и для рассмотренных ранее протонов и ядер 13С, од- 196
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса нако имеются и некоторые особенности. Так, при обсуждении протонных спектров мы говорили, что химический сдвиг определяется константой эк- ранирования, о, которая пропорциональна электронной плотности вокруг ядра. Для ядер 19F ситуация осложняется тем, что поле, создаваемое элект- ронной оболочкой атома, является несимметричным. Поэтому не сущест- вует простой связи между химическим сдвигом ядра и его электронным окружением. Это приводит к тому, что изменения химических сдвигов в рядах близких соединений носят менее закономерный характер. Еще од- ним важным фактором влияния на химические сдвиги ядер 19F являются ван-дер-Ваальсовые взаимодействия. При этом для атомов фтора, которые входят в соприкосновение с электронными оболочками других атомов, наблюдаются сдвиги в слабое поле, величина которых может достигать не- скольких десятков м.д. Примером этому могут служить ордио-замещенные фторбензолы, для которых наблюдаются величины химических сдвигов, приведенные в таблице 1.26. Таблица 1.26. Химические сдвиги 19F в замещенных фторбензолах относи- тельно CFCI3 Представление о величинах химических сдвигов ядер фтора для основ- ных классов фторсодержащих соединений дает таблица 1.27. Таблица 1.27. Химические сдвиги 19F в органических соединениях относи- тельно CFCI3 CH3F -271.9 CH2F2 -143.4 CHF3 -78.6 CF4 -63.3 CH3CF3 -65 CH3CH2F -215 н н Н F F F -165 }=\ ~186 -132.8 F F F Н F F F F -94.6 F = Н -157 F—=N -84 F3C~j—I—CF3 F F -129 197
Глава 1. Интерпретация спектров Хотя изменения химических сдвигов фтора в рядах химических соеди- нений и не столь закономерны, как в их протонсодержащих аналогах, су- ществуют области, где спектры на ядрах 19F имеют бесспорные преиму- щества. Особенно в этой связи следует отметить изучение заторможенного вращения в конформационно-подвижных соединениях. Поскольку для ядер 19F характерны большие разницы химических сдвигов, то для соединений фтора часто удается при охлаждении сигналы ротамеров наблюдать раз- дельно. Примером этому могут служить низкотемпературный спектр 1,2-ди- фтортетрахлорэтана 1.50, приведенный на рис. 1.93. Рис. 1.93. Спектр 19F 1,2-дифтортетрахлорэтана 1.50, измеренный при -120°С. Слева в спектре виден сигнал ротамера а, справа - сигнал ротаме- ров b и Ь’. В спектре четко видны сигналы всех заторможенных конформеров. Произвести такое изучение на протонах для молекул аналогичного строе- ния не представляется возможным из-за практически одинаковых химичес- ких сдвигов ’Н в ротамерах. 198
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Еще одна область применения спектров на ядрах 19F - изучение оптичес- ки активных веществ в хиральных растворителях. В этом случае исполь- зование хиральных растворителей, которые содержат атом фтора, позволя- ет легко обнаружить сигналы диастереотопных ассоциатов. Поэтому метод имеет широкое распространение. Величины КССВ J(H,F) и J(F,F) также имеют определенные особен- ности, они могут намного превышать соответствующие константы J(H,H) (см. таблицу 1.28). Наибольшие величины имеют геминальные КССВ (до 300 Гц). Другие КССВ, как правило, значительно меньше. Следует отме- тить тот факт, что величины 3J(F,F)TpaHc в олефинах в значительной мере, иногда в 10 раз, превышают соответствующую константу 3J(F,F)UHC. В спект- роскопии фтора следует также учитывать, что спин-спиновое взаимодейст- вие ядер фтора в отличие от взаимодействия протонов может передаваться не только по связям, а и через пространство, в случае сближения электрон- ных оболочек атомов фтора. Поэтому, если в молекуле органического сое- динения атомы фтора хотя бы в одной из конформаций расположены на расстояниях меньших, чем сумма их ван-дер-Ваальсовых радиусов, то между такими атомами могут наблюдаться очень боль- шие КССВ даже в том случае, когда взаимодействующие атомы разделены 5-6 химическими связями. Это приво- дит к тому, что для многих молекул дальние КССВ мо- гут быть больше ближних. Наиболее яркой иллюстраци- ей этого является 5J(F,F) в дифторфенантрене 1.51, рав- ная 109 Гц. Типичные значения констант 2-3J(F,F) и 2-3J(H,F) приведены в табли- це 1.28 вместе с формулами соответствующих соединений. Таблица 1.28. Величины 2 3J(F,F) и 2 3J(H,F) для ядер 19F 199
Глава 1. Интерпретация спектров 1 2 3 4 / \^F < )< 244 \ / F F F н-J—I—H pVj 550 F г г—F ] г 297 H H 85.0 H F F . JL 30-80 F H H Ж 73.0 F F Н F хХ хА 2-4 O^^ F F Cl Br—|—|—Br 156 F Cl Формула соединения 3J(F,F), Гц Формула соединения 3J(H,F), Гц CF3-CF2-CF2-NF2 1 CF3-CH3 12.8 CFj-CFH2 4 н jOQf гош 1 -2 Biq^Br транс 22.0 Br Вг^Д^/F TJPy гош 16.1 F уВг транс 18.4 Br Н F 4.4 F Н [f Т 20 х4 Т 6-ю 1.16.1. ССВ между ядрами 19F и 13С Все органические соединения фтора в спектрах на ядрах 13С дают расщеп- ленные сигналы из-за наличия ССВ между ядрами 19F и 13С. Поэтому с константами J(C,F) приходится сталкиваться достаточно часто. Прямые константы, ‘/(C^F), лежат в диапазоне от -150 до -300 Гц. На них во мно- гих случаях оказывает воздействие используемый растворитель. Это пре- пятствует широкому использованию данных КССВ для стереохимических отнесений. 200
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Геминальные КССВ, 2J(C,F), всегда положительны. Обычные их значе- ния находятся в диапазоне от 10 до 30 Гц. Если в молекуле имеется цепоч- ка химических связей F-C-C=O или F-Ca-Cb=C, то наибольшие величи- ны 2J(F,Cb) наблюдаются в том случае, когда связи F-С и С=О (или С=С) син-перипланарны. Таким образом, на основании величин 2J(C,F) можно проводить конформационный анализ фторсодержащих соединений. 1.17. Спектры на ядрах 31Р Фосфор - один из элементов, которые обусловливают функционирование живых организмов. В них, с одной стороны, он входит в состав скелета в виде неорганических фосфатов, а с другой стороны, кислоты пятивалентного фосфора дают соли с нуклеозидами, образуя такие продукты, как АТФ и АДФ, которые обеспечивают энергетический обмен в клетках. Поэтому в любом живом организме присутствуют одновременно сотни различных сое- динений фосфора. Этим обусловлен широкий интерес и важность спектро- скопии на ядрах 31Р. Фосфор имеет единственный изотоп 31Р со спином Vi. Магнитный мо- мент данного ядра также достаточно велик, что обусловливает высокую интенсивность сигналов в спектрах ЯМР. Хотя она и значительно меньше, чем на протонах (7% от ее величины), однако этого на современных прибо- рах вполне достаточно для того, чтобы накопить сигнал образца всего за несколько минут. Поэтому изучение спектров 31Р является достаточно ру- тинной процедурой. Измерение таких спектров не требует никаких специ- альных ухищрений. 1.17.1. Химические сдвиги ядер 31Р При измерении спектров на ядрах 31Р используют несколько стандартов. Исторически первым была предложена 85%-ная фосфорная кислота. Это соединение из-за его реакционной способности всегда используют как внеш- ний стандарт, помещая его в капилляр диаметром до 1 мм. До сих пор во многих справочниках и научных статьях химические сдвиги 31Р приводят относительно 85%-ной фосфорной кислоты. Считают, что данный стандарт имеет химический сдвиг 0 м.д. Несколько позже в качестве стандарта был предложен оксид фосфора Р4О6. Это соединение несколько менее реакцион- но-способно, чем фосфорная кислота. Оно имеет химический сдвиг 112.5 м.д. относительно Н3РО4. Еще одним стандартом, который имеет несомненные преимущества, является гексаметилфосфортриамид (ГМФТ) или, как его еще называют, гексаметапол ((СНз)2М)3Р=О. Это достаточно распростра- ненный органический растворитель, который смешивается как с водой, так 201
Глава 1. Интерпретация спектров и с органическими растворителями. Химический сдвиг 31Р в гексаметаполе составляет -23.4 м.д. относительно Н3РО4. Недостатком гексаметапола как стандарта является то, что его сигнал расщеплен в септет из-за спин-спино- вого взаимодействия 31Р с протонами. Однако, поскольку диапазон хими- ческих сдвигов на ядрах 31Р достаточно велик, это не приводит к серьезным затруднениям. При анализе биологических жидкостей в присутствии гекса- метапола расщепление сигнала стандарта даже помогает его идентифици- ровать, поскольку здесь часто присутствуют десятки синглетов, принадле- жащих разным химическим соединениям в достаточно широком диапазоне химических сдвигов. В таблице 1.29 приведены величины химических сдвигов 31Р для прос- тейших молекул, содержащих трех- и пятивалентные атомы фосфора. Таблица 1.29. Величины химических сдвигов 31Р для простейших молекул относительно Н3РО4 (внешний стандарт) Соединение 5, м.д. Соединение 5, м.д. Соединение 5, м.д. р4 450 РС13 -215 Н3РО4 0 рн3 241 РВг3 -222 НРО(ОН)2 -4.5 P4S3 114 HPF6 118 РОС13 -5.4 PF.3 -97 F2PO(OH) 20.1 Н2РО(ОН) -13.8 Р2Ц -170 pocif2 14.8 PSCI3 -30.8 Р1з -178 poci2f 0 Как видно из сравнения данных таблицы 1.29, где приведены величи- ны химических сдвигов соединений трех- и пятивалентного фосфора соот- ветственно, диапазон изменения химических сдвигов для соединений трех- валентного фосфора намного больше. Это объясняется тем, что в таких сое- динениях вид заместителей сильно влияет на гибридизацию атома фосфора. Имеются также многочисленные данные по химическим сдвигам фос- форорганических соединений. В таблице 1.30 приведены величины хими- ческих сдвигов для соединений, которые встречаются наиболее часто. При изменении радикала R в таблице 1.30 изменение величины хими- ческого сдвига фосфора происходит обычно не более чем на 5 м.д., поэтому данные таблицы можно использовать для анализа многочисленных соеди- нений. Поскольку для соединений фосфора весьма характерны окислитель- но-восстановительные реакции, то сильное изменение величины химичес- кого сдвига обычно свидетельствует о переходе фосфора в другое валент- ное состояние. 202
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Таблица 1.30. Химические сдвиги 31Р для некоторых классов фосфорорга- нических соединений относительно Н3РО4 (внешний стандарт) МеО ХР— -175 МеО MeS^ Р— -70 MeS MeO ZP-OMe -139 MeO MeS^ ^P-SMe MeS -117 —Р=О —46 R R—P=O -55 1 OR or' 1 R-P=O -33 OR1 OMe 1 MeO-P=O 1 OMe 1.1 OPh 1 МеО-Р=О 12 1 OPh SR 1 RS-P=O -61 1 SR NMe2 Me2N-P=O -23.4 NMe2 NMe2 Me2N-P=S NMe2 -76 1.17.2. Величины КССВ для ядра 31Р Прямые КССВ *J(H,P) могут для разных соединений принимать значения от 100 до 600 Гц. Как показывают квантово-механические расчеты, основ- ной фактор, который влияет на величину данной КССВ, - это гибридиза- ция атома фосфора. О ней можно судить по ’’степени пирамидальное™” молекулы. Для плоской молекулы РХ3 величина ’/(Н,Р) близка к 100 Гц. Для пирамидальной молекулы, в которой связи Р-Х направлены к трем вершинам тригональной пирамиды, а к четвертой верши- не направлена неподеленная электронная пара атома фосфора, величина ’/(Н,?) составляет 400-600 Гц. Можно построить гра- Х^'^Х А фик, который позволяет оценить ожидаемую величину !J(H,P). Он связы- вает степень пирамидальное™ атома фосфора со значением данной КССВ. Этот график приведен на рис. 1.94. Соответствие данного графика реальным КССВ следует из сравнения величин ’/(Н,?) для различных фосфинов. Так, в молекуле РН3, которая является плоской (пирамидальное™ равна нулю), ‘/(Н,?) = 147 Гц. В чисто пирамидальном соединении [(СН3)3-Р-Н]+ ‘/(Н,?) = 500 Гц. Аналогично, в плоском дифенилфосфине Ph2P-H ’j(H,P) = 176 Гц, а в его пирамидальном оксиде Ph2HP=O ‘j(H,P) = 418 Гц. Геминальные КССВ, 2J(H,P), во фрагменте Р-С-Н лежат в диапазоне от 0 до 60 Гц. На них оказывают влияние два фактора - ориентация непо- деленной электронной пары атома фосфора относительно связи С-Н и угол между связями во фрагменте Р-С-Н. Поэтому для соединения с неизвест- ной геометрией заранее предсказать величину 2J(H,P) достаточно трудно. Однако, в случае если 2J(H,P) > 15 Гц, взаимная ориентация неподеленной 203
Глава 1. Интерпретация спектров электронной пары атома фосфора и связи С-Н приближается к син-пери- планарной (цисоидной). Пирамидальность (градусы) Рис. 1.94. Зависимость величины 1 J(H,P) от углов между связями в молеку- ле РХ3. 0° отвечает плоскому строению молекулы, углы между связями в ней равны 120°, пирамидальность равна нулю. В чисто пирамидальной мо- лекуле углы между связями составляют 90°. Их отклонение от плоской ориентации составляет 30° Вицинальные КССВ, 3J(H,P), обычно не превышают 10 Гц. Они часто используются для выяснения стереохимических особенностей органичес- ких молекул, которые содержат в своем составе атом фосфора. Для их ве- личин характерна зависимость от двугранного угла между взаимодейству- ющими ядрами, похожая на зависимость Карплуса, описанную ранее для вицинальной КССВ между протонами. Однако коэффициенты в уравнении, которое соответствует этой зависимости, существенно меняются в зависи- мости от вида атомов, через которые передается спин-спиновое взаимо- действие. Так, например, для цепочки связей Р-О-С-Н, которая реализу- ется в молекулах ДНК, было использовано уравнение: 3J(H,P) = 16.3cos20 - 4.6COS0, (1.25) где 0 - двугранный угол между связями Р-0 и С-Н. Весьма важной для установления строения фосфорорганических сое- динений является константа 2J(C,P) между атомами фосфора и углерода во фрагменте молекулы Р-Х-С. Ее величина лежит в диапазоне от -10 до +50 Гц, причем сильно зависит от ориентации связи Х-С. На ее величину 204
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса решающее воздействие оказывает ориентация неподеленной электронной пары атома фосфора (эффект Перлина). Теоретически было найдено, что эта зависимость j(C,P) имеет вид, изображенный на рис. 1.95. Св 0 = 0 X I Рис. 1.95. Зависимость величины 2J(C,P) от двугранного угла между непо- деленной электронной парой атома фосфора и связью Х-С во фрагменте Р-Х-С. Угол 0 = 0 соответствует их син-перипланарной (цисоидной) ори- ентации. Для демонстрации того, насколько H3Cfl данный график соответствует реальным QН 2 соединениям, приведем величины КССВ / 3 Цр.од = 9-2 Гц для одного из гетероциклов, содержа- Цр,с/>)= 44-6 Гц щих в цикле атом фосфора. Здесь одна из метильных групп QH3 имеет цисоидную, а другая - тран- соидную ориентацию относительно неподеленной электронной пары атома фосфора. 7.78. Программы обработки спектров Если Вы не имеете возможности самостоятельно измерять спектры ЯМР, то приходится пользоваться услугами оператора. В этом случае Вы, как правило, получаете лишь обзорный спектр, который измерен при стандарт- ных условиях. На нем может содержаться также увеличенный фрагмент области ароматических протонов. Для идентификации соединения такой 205
Глава 1. Интерпретация спектров спектр подходит всегда, но точные значения спектральных параметров из него иногда найти тяжело. Это связано с тем, что положение пиков на нем могут быть представлены в м.д. с округлением до второго знака после за- пятой. Именно такая точность нужна для нахождения химических сдвигов. Однако величины КССВ из найденных положений пиков можно найти лишь очень приблизительно. Точность здесь может оказаться меньшей, чем ±2 Гц, что является совершенно неприемлемым для публикации спектро- скопических параметров. Поэтому, если Вы не хотите каждый раз просить оператора расписать спектр так, как это нужно Вам, необходимо научиться обрабатывать спектры самостоятельно с помощью ПК. В качестве исход- ного для такой обработки берется файл спектра, который получен со спект- рометра ЯМР. Как правило, такой файл можно получить у оператора вместе с бумажной распечаткой спектра. Самостоятельная обработка спектра нуж- на также при подготовке постеров и статей, которые содержат определен- ные, нужные Вам, спектральные фрагменты. Для реализации самостоятель- ной работы со спектрами существует целый ряд компьютерных программ. Мы коротко рассмотрим, как пользоваться важнейшими из них. Хотя при- веденное описание и не является исчерпывающей инструкцией по работе с программами, но оно поможет ими овладеть. Для облегчения процесса обу- чения все программы обработки спектров имеют опцию HELP, где разъяс- няется работа отдельных их процедур. 1.18.1 . Программа MESTREC Работа с программой MESTREC начинается с загрузки файла, который со- держит спектр, подлежащий обработке. Чаще всего такой файл имеет рас- ширение .fid. Поскольку спектр мог быть записан на спектрометрах разных типов, его формат может различаться. Программа способна работать с фай- лами спектров, записанных на спектрометрах разных фирм. В зависимости от конкретной версии программы формат спектра может распознаваться автоматически или задаваться вручную в специальном меню, которое появ- ляется на экране при открытии соответствующего файла. Если спектр запи- сан на спектрометре фирмы VARIAN, то он находится в папке вместе со вспомогательными файлами, содержащими информацию об условиях запи- си спектра. Их следует игнорировать, а открывать файл .fid, предваритель- но выбрав в меню тип спектрометра, на котором был записан спектр. Для того, чтобы воспользоваться меню выбора файлов, надо избрать режим, при котором в меню выводятся файлы всех типов. Если спектр загрузился пра- вильно, на экране появится сигнал спада свободной индукции (ССИ) в ви- де экспоненциально спадающей интерферограммы. Над спектром располо- жены строки клавиш, предназначенных для обработки спектра. Вид окна будет похожим на то, которое изображено на рис. 1.96. 206
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Л Mr.ine-C - [fid] file £сК yew Process loots flptions Advanced ^imulahonPlug ns Window Help - |iS| x| g> fid | £. * SE103 «4 s в s • a ►. Fa Help, press Fl Пуск| Программа MESTREC •... ||^>MestRe-C [fid] £ ® E3 Zl ШЖЛя 17:50 Рис. 1.96. Вид окна интерфейса программы MESTREC после загрузки фай- ла спектра. При наведении курсора на клавишу появляется окно с расшифровкой функции клавиши, поэтому при первом использовании программы целесо- образно последовательно навести курсор на каждую из клавиш и узнать о ее функции. Если функция осталась непонятной, обращайтесь к обучающей базе данных "HELP". В нижней строке клавиш последовательно располо- жены клавиши Фурье-преобразования (FT), фазовой коррекции (ручной и автоматической), коррекции нулевой линии (BL), установки нуля спектра (TMS), оцифровки пиков (Peak peaking) и интегрирования. Обработку спект- ра следует делать путем последовательного нажатия названных клавиш. Прежде всего, делаем Фурье-преобразование кривой ССИ, для чего на- жимаем клавишу "FT". В меню, которое появляется при этом, нажимаем кла- вишу "ОК" (или в поздних версиях "Apply to tl"). Сигнал ССИ превращает- ся в спектр. Дальше устанавливаем границы спектра так, чтобы имеющиеся сигналы занимали весь спектральный диапазон. Для этого нажимаем кла- вишу "View" в верхней строке клавиш и в меню, которое появится, после- довательно выбираем опции "Zoom" (растяжка) и "Manual zoom" (ручная растяжка). Дальше определяем численно левую и правую границы спектра. 207
Глава 1. Интерпретация спектров Вслед за этим осуществляем коррекцию фазы сигналов путем нажатия клавиш ’’Phase correction” (ручная фазовая коррекция) или ’’Automatic Phase correction” (автоматическая фазовая коррекция). В ручном режиме появ- ляется окно с желтым квадратом внутри. Нажатие левой кнопки "мыши" внутри этого квадрата дает возможность откорректировать фазу сигналов, расположенных в левой части спектра, а нажатие правой кнопки "мыши” - сигналов, расположенных в правой части спектра. В большинстве случаев необходимо проведение нескольких циклов фазовой коррекции. После окончания регулирования фазы нажимаем клавишу "ОК". Автоматический способ коррекции фазы более быстрый, но менее точный. После фазирова- ния сигналов для коррекции нулевой линии нажимаем клавишу "BL" ("Ba- seline correction") и производим коррекцию нажатием клавиши "ОК". Уста- новка нуля спектра осуществляется с помощью клавиши "TMS". При ее на- жатии появляется перекрестие, которое необходимо установить на пик стан- дарта (ТМС или сигнал растворителя) и присвоить ему соответствующее значение химического сдвига. Для определения величин химических сдви- гов нажимаем клавишу "Peak peaking", устанавливаем курсор левее и выше самого левого пика в спектре и при нажатой левой кнопке "мыши" путем ее передвижения выбираем диапазон пиков, которые подлежат оцифровы- ванию. При этом нижняя граница пунктирного квадрата, который выделяет диапазон пиков, является предельным значением, ниже которого пики не оцифровываются. Интегрирование спектра производим нажатием клавиши "Integration”. После этого появляется возможность вручную выбрать интер- валы интегрирования соответственно имеющимся сигналам. Автоматичес- ки первому проинтегрированному пику присваивается величина интеграла, который равняется единице. Если необходимо изменить масштаб интегри- рования, нажатием правой клавиши "мыши" можно войти в меню "Integra- tion manager" и выбрать для реперного пика необходимую величину интег- рала. Величины интегралов приводятся под пиками. Таким образом можно получить на экране обзорный спектр. Часто бывает необходимо кроме обзорного спектра записать одновре- менно какой-либо его фрагмент в большем масштабе. Для этого в програм- ме MESTREC есть клавиша "Create Expansion" Она на экране расположена под спектром. Если нажать на эту клавишу, то спектр, представленный на экране, в сжатом виде будет отображен в отдельном окне. Необходимую растяжку спектра можно выделить с помощью клавиши "Full view" При нажатии на эту клавишу появляется окно, в котором можно ограничить до- полнительный спектр избранным диапазоном. Окно с дополнительной рас- тяжкой спектра можно перемещать по экрану, сжимать и растягивать, если навести курсор на выделенные на рамке окна метки. Если "кликнуть" левой кнопкой "мыши" вне окна, можно перейти к редакции основного спектра. 208
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Отредактированный спектр можно отправить на печать или запомнить в виде файла. Для этого в программе есть клавиши, аналогичные, напри- мер, клавишам в программе WORD. 1.18.2 . Программа ADVASP analyzer Отличительной особенностью данной программы является возможность размещения на спектре формулы измеренного вещества, которую можно подгрузить с помощью SDF-файла, сформированного программой обработ- ки химических баз данных ISIS-Base. В программе имеется автоматичес- кий распознаватель форматов спектров, записанных на разных приборах, поэтому проблем с загрузкой спектра обычно не возникает. После загрузки спектра и его Фурье-преобразования с помощью клавиши "FT" на экране появляется примерно такая картинка, которая показана на рис. 1.97. Ete £di View Spectrum Edit Spectrum View Erocess Window Help ADVASP Ar• (1 i >OTON ui] Рис. 1.97. Вид окна интерфейса программы ADVASP после загрузки файла спектра. Для ускорения обработки все основные команды программы, кроме клавиш меню, дублированы на кнопки "мыши". Поэтому необходимость использования команд сведена к минимуму. После подачи первой команды (кнопка FT) следующим этапом является фазирование спектра. Для этого 209
Глава 1. Интерпретация спектров нажимают на клавиатуре клавишу ’’Ctrl” и одновременно левую кнопку ’’мыши”. На экране появляется вертикальная красная линия, которая прохо- дит через наиболее интенсивный пик. Перемещение "мыши” при нажатой левой кнопке дает возможность произвести фазовую коррекцию пика, обо- значенного красной линией. Аналогично, если нажать одновременно кла- вишу ’’Ctrl” на клавиатуре и правую кнопку ’’мыши”, можно откорректиро- вать фазу пиков, отдаленных от красной линии. Для того, чтобы оптимизи- ровать диапазон записи спектра, курсор размещают левее левого пика в спектре и нажимают левую кнопку ’’мыши”. С помощью пунктирного квад- рата, который возникает при этом на экране, при нажатой левой кнопке ’’мыши” охватывают весь спектр, предназначенный для записи, после че- го курсор размещают внутри пунктирного квадрата и "кликают” правой кнопкой "мыши”. В меню, которое появляется при этом, выбирают опцию "Zoom in" На экране возникнет спектр в избранном диапазоне. Для оциф- ровки пиков вместо опции "Zoom in” избирают опцию "Peak peaking”. Для интегрирования пика курсор размещают по левую сторону от него, нажи- мают на клавиатуре кнопку "Shift” и одновременно левую кнопку "мыши” Возникают две красные линии, причем правая двигается синхронно с дви- жением "мыши". После прохождения пика кнопку "мыши" отпускают. Под пиком появляется численная величина интеграла. Операцию повторяют для каждого пика. Для того, чтобы величины интегралов отвечали коли- честву протонов, которые образовывают пик, наводят курсор на величину интеграла сигнала, который можно легко отнести, и "кликают” правой кнопкой "мыши”. В меню, которое появится, выбирают опцию "Set value” и присваивают интегралу необходимое значение. Таким образом на экране формируется обзорный спектр со всей необходимой вспомогательной ин- формацией. Для того, чтобы на спектре разместить одновременно также и фрагмент, который требует растяжки, курсор располагают по левую сторо- ну от необходимого фрагмента и, нажимая левую кнопку "мыши”, переме- щают ее до тех пор, пока пунктирный квадрат не охватит весь необходи- мый фрагмент. Курсор размещают внутри квадрата и кликают правой кнопкой "мыши”. В меню, которое при этом появляется, выбирают опцию "Clone”. После этого выделенный фрагмент появится на экране в виде от- дельного спектра. С помощью меток, которые содержатся на рамке, огра- ничивающей фрагмент, можно изменять его размеры и расположение отно- сительно основного спектра. Фрагмент спектра можно интегрировать, оцифровывать пики и выполнять другие операции точно так же, как и на основном спектре. Для того, чтобы на спектре содержалась также и форму- ла исследуемого вещества, перед открыванием файла спектра в меню "File" выбирают опцию "Attach data base” и вводят файл химических структур, полученный с помощью программы ISIS-Base. При этом необходимо сле- 210
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса дить, чтобы имя спектра, вызываемое программой ADVASP, совпадало с именем в .sdf-файле. Его можно изменить путем последовательного нажа- тия клавиш "file", "setting", "structure base" 1,18.3 . Программа NUTS32 Эта программа является одной из первых программ, которые вошли в прак- тику обработки спектров на ПК. С современной точки зрения она немного архаична, но дает возможность производить обработку спектров достаточ- но качественно и быстро. Поэтому среди химиков-органиков она довольно распространена. Есть современные версии программы, однако они распро- странены, в основном, среди спектроскопистов. Программа кроме загрузочного файла имеет файл инициализации с расширением .ini. В этом файле указываются основные параметры связи программы с внешними устройствами и с файловой системой компьюте- ра. Работу с программой лучше всего начинать с редактирования файла NUTS.ini. В нем следует указать, из какого каталога считывать файлы спектров и куда писать файлы обработанных спектров. Если необходимо - изменить параметры шрифтов, которые используются программой. Кроме того, файл NUTS.ini содержит так называемые "линки" - последователь- ности команд, которые обеспечивают выполнение ряда команд путем по- дачи одно-, двухбуквенной команды. Можно сформировать "линк" так, что программа автоматически выполнит значительную часть обработки спект- ра. Если, например, в линк 1 ввести команды ВС FT QP, то подачей коман- ды "LT после загрузки спектра будут выполнены процедуры коррекции нулевой линии, Фурье-преобразования и коррекции фазы. На экране сразу появится частично обработанный спектр соединения. На правой стороне экрана расположена кнопка, с помощью которой можно отрегулировать об- щую интенсивность спектра. Программа NUTS имеет два командных уров- ня. На первом уровне, когда выполняется редактирование полного спектра, работает система двухбуквенных команд. В этом случае, например, для интегрирования спектра следует подать команду "ID" - Integration Display. При подаче этой команды происходит автоматическое интегрирование спект- ра и по левую сторону на экране появляется регулятор интенсивности ин- теграла. Передвигая его с помощью "мыши", можно увеличить или умень- шить величину ступенек на интегральной кривой. Для разбивки общего ин- теграла на отдельные ступеньки, которые отвечают каждому из пиков, надо курсор расположить немного левее пика и левой кнопкой "мыши" сделать "двойной клик", потом перенести курсор правее пика и сделать еще один клик. Процедуру повторить для каждого пика. Для оцифровывания интег- ралов следует навести курсор на репперный пик, сделать клик левой кноп- кой "мыши" и подать команду "V" Появится окно, в котором можно при- 211
Глава 1. Интерпретация спектров своить пику необходимую величину интеграла. Нажатием на клавиатуре кнопки ’’Enter” можно выйти из режима интегрирования спектра. Если при этом на экране величины интегралов исчезнут, следует одновременно на- жать на клавиатуре кнопки ’’Ctrl” и ”1” Для оцифровки пиков подается ко- манда ”DP” - Display Peaks. При этом курсор превращается в перекрестие. Если навести курсор на необходимый пик и сделать клик левой кнопкой ’’мыши”, то над пиком появится величина его химического сдвига. Если цифровое значение не появилось, следует одновременно нажать на клавиату- ре клавиши ’’Ctrl” и ”р” Для выхода из режима оцифровки пиков надо на- жать на клавиатуре кнопку ’’Enter”. Если фазирование спектра оказалось недостаточно точным, можно войти в режим ручной коррекции фазы. Для этого служит команда ”РН”. После подачи этой команды нажатие левой кнопки ’’мыши” и ее перемещение влево или вправо позволяет выполнить коррекцию фазы нулевого порядка (для максимального пика), а такие же действия, но произведенные с помощью правой кнопки ’’мыши”, - коррек- цию фазы первого порядка (для пиков, удаленных от максимального). Режим работы с обзорным спектром, когда на экране высвечен весь измеренный спектральный диапазон, не всегда удобен, поскольку некото- рые пики в нем могут быть расположены слишком близко один от другого. Поэтому чаще работают со спектром в режиме растяжки. Для перехода в этот режим размещают курсор немного левее левого сигнала в спектре и делают двойной клик левой кнопкой ’’мыши”. После этого снова нажимают ту же кнопку и перемещают ’’мышь” вправо. На экране часть спектра при этом выделяется красным. После того, как в красную область попадет весь необходимый участок спектра, отпускают левую кнопку ’’мыши” и делают клик правой кнопкой. На экране остается только выделенный участок спект- ра. Этот участок можно интегрировать, оцифровывать так же, как и пол- ный спектр. После окончания обработки спектра его можно запомнить с по- мощью команды "SB” или отправить на печать с помощью команды ”PL" В режиме растяжки одновременно с двухбуквенными командами работают также и однобуквенные команды. По сравнению с описанными ранее про- граммами NATS32 имеет тот недостаток, что не дает возможность записать растяжку спектра одновременно с обзорным спектром. Каждый фрагмент записывается на отдельном листе бумаги. 1.19. Двумерная спектроскопия ЯМР В настоящее время наряду со спектрами на различных ядрах, обсуждавши- мися ранее, используют так называемые двумерные спектры. Эти спектры часто позволяют решить проблемы, связанные с перекрыванием сигналов и селективностью дополнительных радиочастотных воздействий на образец. Для понимания физической природы двумерной спектроскопии ЯМР необ- 212
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ходимо знание процессов, которые происходят при воздействии на образец радиочастотных импульсов. Адекватное описание таких экспериментов будет дано в соответствующих разделах учебника. Здесь же мы для описа- ния двумерной спектроскопии воспользуемся аналогиями с одномерными спектрами, которые нам уже известны. Это позволит читателю пользовать- ся данными методами для решения химических проблем, не вдаваясь в их физическую суть. При рассмотрении вопросов, посвященных использованию гомоядерно- го декаплинга и ЯЭО, мы сталкивались с проблемой селективного насыще- ния отдельных сигналов. Так, для выявления спиновой связи между муль- типлетами нам необходимо производить насыщение каждого из имеющих- ся в спектре мультиплетов с помощью его дополнительного облучения. В результате приходится иметь дело с анализом не одного, а целой серии спектров. Естественно, что решение проблемы отнесения спиновых муль- типлетов с помощью селективного насыщения требует много времени. Поэтому уже очень давно предпринимались попытки создания методик, которые позволяли бы выявить спиновую связь между магнитными ядрами в одном эксперименте. Результатом явилось создание двумерной спектро- скопии ЯМР. Наиболее просто представить себе получение двумерного спектра сле- дующим образом: мы уже знаем, что разностные спектры ЯМР представля- ют собой результат вычитания из спектра, записанного при каком-то допол- нительном воздействии, спектра, записанного без такого воздействия. В раз- ностном спектре содержатся только сигналы, изменившиеся в результате до- полнительного воздействия. Например, можно из спектра при работающем декаплере вычесть спектр при выключенном декаплере. В результате по- лучим спектр, в котором имеется только насыщаемый сигнал, поскольку его амплитуда уменьшается из-за насыщения, и сигналы связанных с ним мультиплетов, поскольку для этих сигналов изменяется мультиплетность. Теперь рассмотрим более сложный эксперимент - давайте представим себе вид разностного спектра, который будет получаться при постепенном изменении частоты декаплера во всем спектральном диапазоне с неболь- шими шагами изменения его частоты. Для простоты будем считать, что в спектре имеется единственный сигнал, который не имеет спиновой связи с другими сигналами. Пусть это будет спектр хлороформа, содержащий единственный пик. В случаях, когда частота декаплера не совпадает с имеющимся в спект- ре пиком, никаких изменений интенсивности сигналов не происходит. Поэтому разностный спектр будет представлять собой просто горизонталь- ную линию с некоторыми шумами, которые обусловлены наличием шумов в исходных спектрах. Если же частота декаплера приближается к сигналу хлороформа, он начинает насыщаться и интенсивность его падает. Наиболь- 213
Глава 1. Интерпретация спектров шее падение интенсивности будет происходить при совпадении частоты декаплера и частоты сигнала. После прохождения частоты декаплера через пик в разностном спектре снова не будет никаких сигналов. Данный экспе- римент можно представить в виде набора спектров, которые записаны один над другим. Этот набор разностных спектров для сигнала хлороформа по- казан на рис. 1.98. v Развертка спектра Рис. 1.98. Вид разностных спектров, которые можно получить при после- довательном изменении частоты декаплера во всем спектральном диапа- зоне. В спектре имеется единственный сигнал, который не имеет спиновой связи с другими сигналами. Фактически изображенная на рис. 1.98 совокупность разностных спект- ров представляет собой простейший двумерный спектр. В нем одно изме- рение соответствует обычной развертке спектра, а второе измерение - раз- вертке частоты декаплера. Сигнал в спектре имеет координаты (v,v), по- скольку в обоих измерениях он имеет одну и ту же частоту. Данное пред- ставление двумерного спектра, хотя и наглядно, однако не слишком удобно, поскольку при наличии в нем нескольких сигналов, они могут заслонять друг друга. Поэтому для таких спектров чаще всего используют другое представление сигналов. Сигналы изображают так же, как возвышенности на географических картах в виде контурных линий, имеющих равное уда- ление от плоскости спектра. Совокупность таких линий дает представление об имеющихся в спектре пиках. Такое представление - вид на спектр свер- 214
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ху. На рис. 1.99 показан вид двумерного спектра хлороформа в виде кон- турной карты. развертка частоты декаплера Рис. 1.99. Двумерный спектр хлороформа, представленный в виде контур- ных линий. В таком представлении двумерный спектр имеет вид квадрата, по осям которого происходят развертка спектра и развертка частоты декаплера. Сигнал в спектре расположен на диагонали квадрата, поскольку его коор- динаты на обеих осях одинаковы. Как видно из рисунка 1.99, оба измере- ния двумерного спектра совершенно идентичны, несмотря на то, что спо- соб формирования измерений совершенно различен. Теперь давайте представим себе двумерный спектр соединения, в ко- тором имеется спин-спиновое взаимодействие. Для примера рассмотрим простейшую спиново-связанную систему АХ. В ней, как мы это уже знаем, имеются два дублета. Если измерять для нее разностные спектры так, как и в предыдущем примере, то в них при совпадении частоты декаплера с ком- понентами дублетов, помимо изменения интенсивности насыщаемых сиг- налов, будет изменяться и мультиплетная структура сигналов, имеющих спиновую связь с сигналом, который насыщается. Координаты данных до- полнительно возникающих сигналов равны (vA,vx). Поэтому в спектре, по- 215
Глава 1. Интерпретация спектров мимо сигналов на диагонали, будут содержаться и недиагональные пики, связанные с наличием спин-спинового взаимодействия. Двумерный спектр спиновой системы АХ показан на рис. 1.100. О о О « о е> & & Рис. 1.100. Двумерный спектр спиновой системы АХ, записанный в виде контурной карты. Сигналы, которые находятся вне диагонали двумерного спектра, назы- ваются недиагональными пиками. Их также называют кросспиками или корреляциями. Данные сигналы с координатами (vA,Vx) свидетельствуют о наличии спиновой связи (корреляции) между диагональными пиками с ко- ординатами (vA,vA) и (Vx,VX). 1.20. Спектры COSY Спектры COSY (аббревиатура от Correlation spectroscopy) являются прос- тейшей разновидностью двумерной (2D-) спектроскопии ЯМР. Эти дву- мерные спектры представляют собой квадрат или прямоугольник, ограни- 216
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ченный шкалами химических сдвигов. Таким образом, двумерные спектры имеют две частотные координаты и соответственно две перпендикулярные шкалы протонных химических сдвигов. Сигналы в таком двумерном спект- ре могут располагаться во всей плоскости квадрата. Поэтому здесь имеется намного больше места для локализации пиков, чем в одномерном спектре, благодаря чему часто удается решить проблему совпадения пиков. Спектры COSY позволяют выявить спин-спиновую связь между протонами, что дает возможность произвести отнесение мультиплетов к определенным спиновым системам молекулы. Спектры COSY явля- ются симметричными относительно диагонали. В них различают два типа пиков. Одни из них, расположенные вдоль диагонали спектра, являются полными аналогами сигналов в соответствующем одномерном спектре. Эти сигналы называются диагональными. Если спроектировать диаго- нальные пики на вертикальную или горизонтальную ось двумерного спект- ра COSY, получим соответствующие проекции, которые ничем не отлича- ются от обычных одномерных спектров. Второй тип сигналов - недиаго- нальные пики или кросспики. Проекции кросспиков на оси двумерно- го спектра отвечают сигналам ядер, между которыми имеется спин- спиновая связь. Такие кросспики еще называют корреляциями, посколь- ку они дают возможность относить (коррелировать) сигналы, основываясь на наличии ССВ между соответствующими ядрами. 1.20.1. Что дает метод COSY Метод COSY дает возможность решить две важные проблемы, которые возникают при отнесении сигналов в протонных спектрах. Во-первых, он позволяет выявить сигналы тех протонов, между кото- рыми существует спин-спиновая связь, а следовательно, установить, какие именно спиновые системы присутствуют в исследуемом соединении. Со- поставление найденных спиновых систем с формулой соединения часто позволяет провести полное отнесение сигналов в спектре. Следует отме- тить, что кросспики в спектрах COSY могут наблюдаться даже тогда, когда расщепление сигналов не проявляется в одномерном спектре из-за недоста- точного разрешения. Во-вторых, в спектре COSY в виде кросспиков отдельно наблюдаются сигналы, которые совпадают в одномерном спектре. Это происходит пото- му, что совпадение диагональных пиков не обязательно ведет к совпаде- нию кросспиков. В большинстве случаев кросспики наблюдаются раздельно. 1.20.2. Требования к образцу Метод COSY имеет почти такую же чувствительность, что и обычный спектр на ядрах !Н. Поэтому для измерения спектров COSY необходимо 217
Глава 1. Интерпретация спектров использовать такое же самое количество образца, что и для обычного спект- ра. Если в наличии имеются 5-10 мг образца, то для него можно получить вполне качественный спектр COSY. Единственное, на что следует обращать внимание, это на наличие динамических уширений сигналов. Для уширен- ных сигналов интенсивность кросспиков уменьшается, и некоторые из них могут оказаться утерянными. Мешают получению качественного спектра также механические примеси, поэтому надо следить, чтобы исследуемое вещество полностью растворялось в используемом растворителе и не выпа- дало из раствора на протяжении всего эксперимента (до одного часа). 1.20.3. Вид спектра При измерении спектра COSY стараются сузить спектральный диапазон таким образом, чтобы на краях спектра не было пустого места, но чтобы все сигналы попадали в спектр. Полученный таким образом спектр явля- ется аналогичным обзорному одномерному протонному спектру. Ниже, на рис. 1.101, показан пример такого спектра, который был измерен для про- изводного бензофурана 1.52. Рис. 1.101. Обзорный спектр COSY соединения 1.52. 218
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Как видим, в таком спектре, хотя и содержится вся необходимая ин- формация, но извлечь ее довольно тяжело, поскольку ряд кросспиков рас- положен очень близко к диагонали, и их сложно отнести к конкретным сиг- налам в одномерном спектре. Поэтому для анализа часто используют не обзорные спектры, а их фрагменты. Так, из приведенного выше спектра видно, что все интересные сигналы находятся в диапазоне от 6 до 8 м.д. Поэтому целесообразно записать именно этот фрагмент спектра. Он пока- зан на рис. 1.102. нз Н4 Н7 На Н6 нр Рис. 1.102. Информативный фрагмент спектра COSY соединения 1.52. Полученный таким образом спектр более удобен для анализа ССВ. Из спектра также видно, что интенсивность кросспиков пропорциональна ве- личине КССВ, что позволяет делать выводы о наличии дальних КССВ (ме- тодику измерения COSY спектра можно модифицировать так, что будут проявляться лишь кросспики между протонами с дальними КССВ). Следу- 219
Глава 1. Интерпретация спектров ет также заметить, что в спектре COSY могут наблюдаться пики примесей даже в случае, когда их плохо видно в одномерном спектре. Такой сигнал мы наблюдаем вблизи 7 м.д. 1.20.4. Анализ спектра COSY Анализ спектра COSY состоит в определении координат кросспиков. Для проведения этой процедуры от каждого кросспика проводят горизонталь- ную и вертикальную линии до пересечения с диагональю. Например, для кросспика А, который показан на рис. 1.102, горизонтальная линия прохо- дит через дублет протона На при 7.57 м.д., а вертикальная - через дублет протона Нр при 6.40 м.д. Итак, кросспик А свидетельствует о наличии спин-спинового взаимодействия между этими протонами. Кросспики явля- ются симметричными относительно диагонали, то есть одной КССВ отве- чают два эквивалентных кросспика в спектре COSY. Для исследования ССВ можно использовать любой из пары кросспиков. Следствием вици- нального взаимодействия между протонами Н6 и Н7 является появление в спектре кросспика Б. Более слабый кросспик В отвечает взаимодействию через 4 химических связи между протонами Н4 и Н6. 1.20.5. Представление результатов Результаты анализа спектров COSY удобно подавать в графическом виде, 1.21. Спектроскопия NOESY-2D пользуясь структурной формулой соедине- ния. На ней возле соответствующих про- тонов обозначаются величины химичес- ких сдвигов, а наличие кросспика обозна- чается изогнутыми стрелками между ни- ми. Пример такого представления данных для описанного спектра показан слева. Недостатком экспериментов по получению разностных спектров ЯЭО яв- ляется то, что их приходится повторять для каждого из протонов соедине- ния. Только тогда можно получить полную картину ЯЭО-взаимодействий. Для упрощения эксперимента разработана двумерная методика, которая да- ет возможность в одном эксперименте получить все имеющиеся эффекты ЯЭО. Она называется NOESY (от Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy). Принцип получения двумерного набора данных в эксперименте NOESY полностью аналогичен описанному ранее эксперименту COSY. Отличие за- 220
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ключается в том, что благодаря несколько измененной схеме облучения образца в этом случае кросспики соответствуют не ССВ, а ЯЭО-корреляци- ям между соответствующими протонами. Для того, чтобы показать читате- лю практическую ценность метода NOESY, приведем пример применения метода для изучения двух органических соедине- g i ний, одно из которых имеет простое строение, а второе - достаточно сложное. ’ || 12 Первое соединение является замещенным ку- марином и имеет строение 133. L^OMe В спектре, который приведен на рис. 1.103, |f имеется кросспик между ароматическими вици- 1-53 О нальными протонами Н5 и Н6, расположенными рядом. Аналогичный кросспик мы бы видели в спектре COSY, только здесь он связан не с нали- чием ССВ, а с пространственной близостью данных протонов. 7-ОСН3 4-ОСНз Н5 Н8 Н6 Н3 1 11 _____L Рис. 1.103. Спектр NOESY соединения 1.53. Корреляции между сигналами протонов обозначены горизонтальными и вертикальными линиями. 221
Глава 1. Интерпретация спектров Для идентификации кросспика, как и в методе COSY, полезно провес- ти от него горизонтальную и вертикальную линии до пересечения с диаго- налью. В точках пересечения будут находиться диагональные пики прото- нов, между которыми возник соответствующий ЯЭО. Для названной кор- реляции такие линии проведены ниже диагонали. Кроме того, в отличие от соответствующего спектра COSY, в спектре содержатся кросспики между сигналом 4-СН2-группы и сигналами протонов НЗ и Н5, между которыми находится данный заместитель. В данном случае между протонами нет ССВ, но они расположены в пространстве достаточно близко один от другого для возникновения заметного ЯЭО. Аналогичные кросспики воз- никают и между сигналами группы 7-ОСНз и сигналами протонов Н6 и Н8. На рисунке связь этих кросспиков с диагональными пиками показана для корреляций, расположенных выше диагонали. Таким образом, спектр позво- ляет легко провести отнесение сигналов ме- токсильных групп и подтвердить положение заместителей в молекуле. Данный пример наглядно показывает, как метод NOESY мож- но использовать для подтверждения строения молекул. Результаты эксперимента NOESY представляют аналогично эксперименту COSY с помощью изогнутых стрелок на формуле соединения 1.53. На рис. 1.104 представлен спектр NOESY значительно более сложного соединения - алкалоида налоксона 1.54. Анализ таких сложных спектров имеет свои особенности. Однако преж- де чем его проводить, обратим внимание на некоторые детали спектра. Прежде всего отметим, что на диагонали мы уже не видим индивидуаль- ных пиков - вся она видна в виде сплошных областей поглощения. Это связано с тем, что разрешение в спектре NOESY намного меньше, чем в обычном одномерном спектре. Поэтому отдельные сигналы не разделяют- ся. Следует также учесть, что в данном случае сигналы, расположенные на диагонали, являются отрицательными, поскольку им соответствуют сигна- лы в режиме подавления. Кросспики, напротив, чаще всего положительны, поскольку они соответствуют повышению интенсивности сигналов. Часто знак кросспика выделяется цветом. Именно так представляются двумерные спектры на экранах цветных мониторов. На бумаге приходится довольство- ваться одноцветными спектрами. Однако все равно некоторые различия в контурном изображении сигналов разного знака имеют место. Различия можно заметить путем сравнения вида диагональных пиков и кросспиков. В приведенном спектре присутствуют также и отрицательные сигналы. Они связаны с протонным обменом между гидроксильными группами и 222
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса сигналом воды, который поглощает при 3.3 м.д. Это общее правило спект- ров ЯЭО - в них всегда обменивающиеся с водой протоны дают интенсив- ные отрицательные сигналы. Вдоль осей спектра NOESY изображен одномерный протонный спектр соединения. Как видим, разрешение сигналов в этом спектре достаточно высоко. Это связано с тем, что данный спектр, на самом деле, не имеет ни- чего общего со спектром NOESY. Его записывают цд отдельно, а программа обработки спектров сама || j размещает его вдоль осей двумерного спектра так, как это удобно пользователю. Если на оси вынести О JU- । проекцию двумерного спектра (это тоже вполне 'ri\XN возможно), то разрешение в нем окажется намного I он \ ниже и производить интерпретацию спектра будет О v сложнее. F2 (PPm) 15 ; 2.0-: 2.5J 3.0- 3.54 4.0- 4.54 5.0- 5.54 6.0- 6.5- 7.0 ~ГТ~Г' ' I ' 1 1 I ' 1 ' I 1 1 1 ' I ' -Т-1-| . , I | I | I I I т Г ТТ-Г-]' 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 F1 (ppm) Рис. 1.104. Спектр NOESY алкалоида налоксона 1.54. 223
Глава 1. Интерпретация спектров Чтобы не потеряться в многочисленных корреляциях, проще всего на первой стадии анализа составить таблицу кросспиков. Для этого в таблицу заносят все пики, находящиеся на одной горизонтали (либо вертикали) и соответствующие наличию ЯЭО с одним и тем же сигналом. Поскольку в двумерном спектре отсутствует оцифровка сигналов, удобнее всего про- изводить заполнение таблицы, глядя на одномерный спектр, где над каж- дым сигналом проставлена величина его химического сдвига. Можно также найденные из одномерного спектра величины химических сдвигов надпи- сать над соответствующими пиками одномерных спектров, присутствующих над шкалами химических сдвигов двумерного спектра. Для налоксона та- кая таблица 1.31 приведена ниже. Таблица 1.31. Корреляции NOESY в спектре налоксона Положение сигнала, 5, м.д. Корреляции NOESY 6.55 6.51,3.33 6.51 6.55, 2.99,2.48 5.82 3.10,2.92,5.21,5.12 5.21 3.10, 5.82 5.12 5.82, 5.21 5.00 9.20 (-) 4.75 2.92,2.32, 1.27 3.10 2.99, 2.92, 2.48, 1.95 2.99 2.45, 1.95 2.92 3.10,2.48, 2.06, 1.71,4.75 2.88 3.33, 2.06 2.48 2.32, 1.95 2.45 2.99, 1.43 2.32 1.27, 1.95,4.75 2.06 2.92, 1.71, 1.43 1.95 1.27, 2.48, 2.32 1.71 1.43, 2.92 1.43 1.71,2.06, 2.45 1.27 2.32, 1.95,4.75 Преимуществом такой таблицы 1.31 является то, что ее можно состав- лять даже в том случае, если сигналы ЯМР до конца не отнесены. Такая си- 224
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса туация случается достаточно часто, поскольку именно спектры NOESY служат основанием для отнесений ряда сигналов в сложных спектрах. После анализа полученных дан- ных и окончательного отнесения сиг- налов, как и в предыдущем приме- ре, составляется схема корреляций NOESY. Эта схема для налоксона приведена справа. Из схемы становится понятно, какие именно протоны сближены в пространстве. 7.22. Гетероядерная корреляционная спектроскопия ЯМР При обсуждении спектров на ядрах 13С мы видели, что отнесение углерод- ных сигналов часто является достаточно сложной задачей, поскольку в обычных углеродных спектрах, которые измерены в условиях широкопо- лосного подавления ССВ с протонами, все сигналы имеют вид синглетов. Если же измерять углеродные спектры в отсутствие такого подавления, то они часто усложняются настолько, что многие гетероядерные ССВ оказы- ваются невидимыми из-за наложения компонентов мультиплетов. Для ре- шения проблемы выявления гетероядерных ССВ были разработаны методы, которые являются гетероядерными аналогами метода COSY. В результате их использования удается выявить факт наличия спин-спинового взаимо- действия между ядрами !Н и 13С без получения расщепленного углеродно- го спектра. Использование таких методов позволяет производить надежное отнесение сигналов 13С в углеродных спектрах. Однако для этого предва- рительно должны быть отнесены сигналы в протонном ij yj спектре образца. Такой подход к отнесению сигналов в OZh углеродном спектре является наиболее надежным. Прин- цип такого отнесения можно рассмотреть на примере простейшей молекулы. Пусть нам необходимо отнести xU углеродные сигналы в молекуле метилэтилкетона. V В протонном спектре этой молекулы присутствуют синглет метильной группы, а также квартет и триплет этильной группы, отвечающие поглоще- нию метиленовой и метильной групп, соответственно. Поскольку все про- тонные сигналы имеют различную мультиплетность, то их отнесение сомне- ний не вызывает. В углеродном спектре метилэтилкетона с широкополос- 225
Глава 1. Интерпретация спектров ной развязкой от протонов мы имеем четыре синглета. Если представить себе эксперимент, в котором бы, как в методе COSY, мы бы могли выявить гетероядерные ССВ через одну химическую связь, то мы сразу могли бы отнести все протонированные сигналы углерода. С другой стороны, если бы мы могли выявить гетероядерные ССВ через 2-3 химические связи, то можно было бы отнести и сигнал четвертичного атома углерода. Именно так и работают методики гетероядерной корреляционной спектроскопии. Поскольку величины 1 J(H,C) и 2-3J(H,C) различаются более чем на порядок, то их выявление производится в отдельных экспериментах. Поэтому для выявления наличия всех гетероядерных ССВ производится измерение двух двумерных корреляционных спектров. Наиболее часто эти методики используются для пар ядер *Н-13С и *H-15N. Нельзя сказать, что они непригодны для установления корреляций с другими ядрами, например !H-15N или даже 31Р-13С. Однако эти возможнос- ти используются значительно реже. Корреляции *H-15N чаще всего находят в протеинах и пептидах. В отличие от методов редактирования углеродных спектров по мультиплетности сигналов методы гетероядерной корреляци- онной спектроскопии дают возможность не только определить количество протонов, которые связаны с каждым атомом углерода, но и выяснить, ка- кой именно протон в молекуле связан с определенным гетероатомом. Най- денная таким методом гипотетическая структура молекулы может быть подтверждена или опровергнута при дальнейших исследованиях. 1.22.1. Корреляции через одну связь. Метод HMQC Существуют два эксперимента, которые позволяют найти корреляцию меж- ду сигналами протонов и сигналами непосредственно связанных с ними атомов углерода. Эти эксперименты имеют аббревиатуры HSQC и HMQC. Их детали будут обсуждены в последующих разделах учебника. Визуально спектры, полученные с их помощью, почти не различаются, поэтому мож- но использовать любой из названных методов. Мы рассмотрим лишь один эксперимент - HMQC, поскольку он менее ’’капризен” и дает сигналы не- сколько большей интенсивности. Как видно из его английской аббревиату- ры (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation), он является экспериментом по гетероядерной многоквантовой корреляции. Хотя мы еще и не можем до конца понять, что именно это означает, однако можно себе представить, что кросспики в таком спектре появляются за счет одновременного воз- буждения атомов *Н и 13С, между которыми имеется химическая связь. Как и двумерные спектры, которые были рассмотрены ранее, спектр HMQC представляет собой квадрат или прямоугольник. Одна из осей спектра HMQC отвечает шкале химических сдвигов протонов, а вторая - шкале хи- мических сдвигов 13С. Часто спектр представляют в таком виде, когда вдоль 226
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса осей изображены соответствующие одномерные спектры. Корреляции про- являются в виде кросспиков, расположенных на перпендикулярах, ко- торые проведены через соответствующие сигналы в одномерных спект- рах. Таким образом, наличие кросспика свидетельствует о том, что сущест- вует непосредственная химическая связь между протоном и атомом угле- рода, которые имеют сигналы напротив кросспика в соответствующих од- номерных спектрах. Метод дает возможность легко отнести сигналы всех связанных с протонами атомов углерода. Для того, чтобы сразу дать читателю возможность понять, насколько важную информацию можно получить из спектра HMQC, приведем дву- мерный HMQC спектр для простого соединения ментола 1.55 (рис. 1.105). Рис. 1.105. Корреляции через одну связь в спектре HMQC ментола 1.55. Вдоль соответствующих осей показаны также одномерные протонный и углеродный спектры. 227
Глава 1. Интерпретация спектров Двумерный гетероядерный корреляционный спектр HMQC является исключительно простым для интерпретации. В одном измерении он содер- жит сигналы атомов углерода в условиях их полной развязки от протонов, а во втором измерении - обычный протонный спектр. Координаты кросспи- ка отвечают химическим сдвигам в протонном и углеродном спектрах тех ядер, между которыми существует прямое ССВ и которые, таким образом, связаны одной химической связью. Например, в самом низу приведенного выше спектра имеется кросспик, который отвечает корреляции протона с химическим сдвигом 3.32 м.д. и атома углерода с химическим сдвигом 72 м.д. Сигнал протона при 3.32 м.д. отвечает атому Н1 соединения 1.55. поскольку именно этот сигнал должен располагаться в наиболее слабом поле благодаря влиянию электроотрицательного атома кислорода. Наличие кросспика позволяет утверждать, что между атомами !Н и 13С с названны- ми химическими сдвигами существует химическая связь, то есть в углерод- ном спектре сигнал при 72 м.д. отвечает протону при атоме С1. Аналогич- но можно отнести и сигналы всех других, связанных с протонами, атомов углерода. Единственным условием для этого является предварительное от- несение сигналов в протонном спектре. Его, в свою очередь, можно про- вести с помощью спектров COSY. Не существует какого-то общепринятого расположения осей в спект- рах HMQC. Ось протонов может быть как вертикальной, так и горизон- тальной в зависимости от "вкусов" спектроскописта, измерявшего спектр. Однако это никоим образом не влияет на результаты анализа спектра. Если сигналов в протонном и углеродном спектрах не слишком много, корреля- ции можно найти визуально. Если же спектр хотя бы вдоль одной оси со- держит сигналы, которые близки по химическим сдвигам, следует провес- ти вертикальную и горизонтальную линии от кросспика до соответству- ющих шкал или сигналов в одномерных спектрах, которые имеются вдоль осей. Альтернативой этому является запись загруженных участков спектра в увеличенном масштабе. Для составления таблицы найденных корреляций полезно над сигналами в одномерных спектрах, расположенных вдоль шкал химических сдвигов, проставить величины химических сдвигов, получен- ные при измерении протонного и углеродного спектров соединения. Имеется, по крайней мере, три причины, которые могут побудить хи- мика к измерению спектра HMQC - отнесение сигналов протонированных атомов углерода, разнесение совпадающих протонных сигналов в углерод- ном измерении двумерного спектра и выявление диастереотопных прото- нов метиленовых групп. Спектр ментола иллюстрирует все эти возможности метода HMQC. Поскольку на отнесении сигналов мы уже останавливались, обсудим два последних аспекта спектров HMQC. Если рассмотреть область протонного спектра ментола, которая распо- ложена между 0.7 и 1.2 м.д., то можно видеть, что здесь из-за совпадения 228
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса сигналов не только невозможно проанализировать их мультиплетность, но даже сказать, сколько именно протонов там поглощает. Однако в двумер- ном спектре HMQC все протонные сигналы дают несовпадающие кросспи- ки. Их центры соответствуют химическим сдвигам соответствующих сиг- налов на осях *Н и 13С. Таким образом, спектр помогает уточнить химичес- кие сдвиги *Н для изучаемого соединения. Ценность такого подхода воз- растает при повышении сложности молекулы и росте числа перекрыва- ющихся сигналов. Обычно каждому углеродному сигналу отвечает один сигнал в протон- ном спектре. Однако в спектре ментола мы видим, что на одной горизон- тали с некоторыми из углеродных сигналов имеется по два кросспика, ко- торые отвечают неэквивалентным протонам. Это означает, что с атомом углерода связаны два неэквивалентных протона. Такая ситуация возникает в случаях, когда протоны метиленовых групп являются диастереотопными и имеют неодинаковые химические сдвиги. Их не всегда легко идентифи- цировать с помощью спектра COSY, так как геминальные и вицинальные КССВ могут иметь одинаковые величины. Однако только для геминаль- ных пар протонов имеют место две корреляции с одним углеродным атомом. На рис. 1.105 это наблюдается для сигналов С6, С4 и СЗ. Следует заметить, что бывают случаи, когда протонному сигналу не соответствует ни один из кросспиков. Это является надежным свидетельст- вом того, что протон, которому соответствует данный сигнал, связан не с атомом углерода, а с каким-то другим атомом, например с азотом или кис- лородом. Это свойство спектров HMQC также можно использовать для от- несения сигналов в спектрах ЯМР. Таким образом, метод HMQC позволяет извлечь из спектра много полезной информации и сделать это весьма прос- то и надежно. 1.22.2. Корреляции 1Н-13С через 2-3 связи. Метод НМ ВС Рассмотренный ранее метод HMQC основан на наличии связи атома 13С с протоном, которая характеризуется КССВ. Величины КССВ находятся в диапазоне 100-200 Гц. Поэтому метод нельзя применить для отнесения сиг- налов атомов углерода, не связанных непосредственно с протонами. Меж- ду тем, таких атомов в молекулах органических соединений бывает доволь- но много. Отнести их на основании величин химических сдвигов можно далеко не всегда. Поэтому для этой цели используется другой, близкий к HMQC метод, в котором выявляются ССВ через 2-3 химические связи. Это так называемые дальние или многосвязевые корреляции. Различие ме- тодов состоит в величинах КССВ, для которых в спектре наблюдаются кор- реляции - программу измерения спектра настраивают на малые величины констант взаимодействия, поэтому в результирующем спектре находятся 229
Глава 1. Интерпретация спектров кросспики, обусловленные гетероядерными КССВ, равными 2-10 Гц. Чаще всего для этой цели используют эксперимент НМВС (Heteronuclear Mul- tiple Bond Correlation). Анализ полученных таким образом корреляций дает возможность устанавливать весь скелет органических молекул. Метод яв- ляется одним из самых информативных для выяснения строения химичес- ких соединений. Однако данный метод не лишен недостатков - он не позво- ляет различать 2J(H,C) и 3J(H,C). Более того, в спектрах НМВС часто про- являются КССВ через 4 связи, когда они имеют ненулевые значения. С другой стороны, довольно часты случаи, когда 2J(H,C) оказывается близ- кой к нулю. В этом случае ожидаемый кросспик может в спектре и не по- явиться. Поэтому анализ спектров НМВС следует производить исключи- тельно внимательно и не делать слишком поспешных выводов о структуре молекулы. Вид спектра НМВС подобен виду спектра HMQC. Здесь координатные оси также отвечают одномерным спектрам на ядрах 13С и !Н. В отличие от метода HMQC каждому протонному (или углеродному) сигналу может от- вечать несколько корреляций, поскольку ССВ одного и того же протона может наблюдаться одновременно с несколькими атомами углерода. Если в двумерном спектре шкала химических сдвигов протонов расположена вертикально, то все корреляции, отвечающие одному протонному сигналу, расположены на одной горизонтали. Корреляции, отвечающие каждому из углеродных сигналов, в этом случае располагаются на одной вертикальной линии, проходящей через соответствующий углеродный сигнал. Ориента- ция осей не является стандартизированной и может быть произвольной. Интенсивности кросспиков зависят от величин дальних КССВ и от того, на какие величины констант настроена методика. Чаще всего параметры им- пульсной последовательности эксперимента НМВС устанавливают такими, чтобы максимальную интенсивность имели КССВ, близкие к 8 Гц. Именно такие КССВ наиболее распространены. Следует сразу запомнить, что величины дальних КССВ могут иметь нулевые значения. Особенно часто с этим приходится сталкиваться для 2J(H,C). Вследствие этого, как правило, не удается получить полный набор корреляций, которые можно ожидать исходя из структурной формулы мо- лекулы. Однако практически маловероятны случаи, когда все КССВ для данного углеродного атома имели бы нулевые значения. Поэтому получен- ных корреляций чаще всего бывает достаточно для установления структу- ры молекулы. Анализ НМВС спектра проиллюстрируем на примере уже известного нам 8-карбоксиметилхинолина 1.49 (рис. 1.106). Как правило, когда приступают к анализу имеющихся в спектре НМВС корреляций, еще непонятно, что с чем коррелирует - это выясняется толь- ко в ходе анализа. Поэтому сначала устанавливают сам факт наличия кор- реляции между пиками протонов и атомов углерода безотносительно к от- 230
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса несению сигналов. Удобнее всего иметь перед глазами одновременно про- тонный и углеродный спектры, на которых обозначены величины химичес- ких сдвигов сигналов, а также двумерный спектр НМВС. Можно также вручную нанести величины химических сдвигов на одномерные спектры !Н и 13С, которые расположены вдоль осей двумерного спектра. Мы при анализе будем использовать именно такой вариант спектра. Отметим сразу, что сигнал с химическим сдвигом 96.3 м.д. отвечает ССЦ, присутствующе- 3.75 8.30 8.92 7.58 7.78 8.02 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.51 8.07 8.57 9.07 F2 (РРт) 170 160 150 140 130 120 110 100 90 F1 (ppm) Рис. 1.106. Спектр НМВС 8-карбоксиметилхинолина 1.49. Начнем обработку с сигнала метильной группы, который в протонном спектре дает пик при 3.75 м.д. Для этого пика имеется единственная корре- ляция с углеродным сигналом, расположенным при 168.6 м.д. В спектре имеются еще два малоинтенсивных пика напротив данного сигнала, кото- 231
Глава 1. Интерпретация спектров рые не отвечают никаким сигналам в углеродном спектре. Такие пики из рассмотрения исключаются. Чаще всего они вызваны либо примесями, ли- бо шумами, которые особенно сильны для сигналов высокой интенсивнос- ти, каковым является протонный сигнал метильной группы. Углеродному сигналу метильной группы, который поглощает при 52.7 м.д., в спектре отвечает дублет с центром при 3.75 м.д. Если присмотреться к протонному спектру, который мы видим вдоль вертикальной оси, то видно, что ком- поненты этого дублета соответствуют 13С сателлитам протонного сигнала метила. Таким образом, появление данного дублета связано с ^(FLC). Хотя программа настроена таким образом, что максимальную интенсивность имеют корреляции, обусловленные малыми КССВ, однако в спектре НМВС с небольшой интенсивностью проявляются и ^(Н^). Поэтому в спектре могут быть видны соответствующие дублеты. Хотя это несколько и ослож- няет спектр, однако, на наш взгляд, наличие таких дублетов может дать до- полнительную информацию. Так, можно измерять величину ^(КС) и ис- пользовать ее для выводов о строении молекулы. Кроме того, если в спект- ре имеются все дублеты, связанные с прямой гетероядерной КССВ, то можно и не измерять спектра HMQC, поскольку информацию о положении протонированных атомов углерода можно извлечь и из спектра НМВС. Прежде чем перейти к дальнейшему анализу спектра, отметим, что все остальные корреляции в спектре содержатся в более узком диапазоне - они отвечают поглощению только ядер, связанных с ароматическим ядром молекулы. Поэтому целесообразно производить анализ не для обзорного спектра, а для его фрагмента. Этот фрагмент показан на рис. 1.107. Как видим, для каждого из протонных сигналов присутствуют, как правило, корреляции с несколькими сигналами 13С. Для того, чтобы их все представить в виде, удобном для последующего анализа, лучше всего их занести в таблицу, в которой каждая строка соответствует протонному сиг- налу. Для рассматриваемого соединения результат такой обработки спект- ра представлен в таблице 1.32. Таблица 1.32. Координаты кросспиков в спектре НМВС 8-карбоксиметил- хинолина 1.49 3, *Н, м.д. 3,13С, м.д. 3.75 168.6 7.50 151.4, 145.3, 128.5 7.58 145.3, 133.1, 129.5, 128.5 7.88 168.6, 145.3, 131.3, 128.5 8.02 145.3, 136.7, 133.1, 129.5 8.30 151.4, 145.3, 131.3, 128.5 8.92 145.3, 136.7, 128.5, 122.4 232
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.107. Фрагмент спектра НМВС 8-карбоксиметилхинолина 1.49. Таблица 1.32 содержит всю необходимую информацию для отнесения сигналов в спектре 13С, однако она недостаточно наглядна. Значительно удобнее анализ производить, глядя на структурную формулу молекулы, где возле протонов приведены величины соответствующих им химических сдвигов. Тогда сразу видно, какие именно атомы углерода отстоят от того или иного протона на 2 или 3 химические связи и способны давать корре- ляции в спектре НМВС. Сами корреляции, как и в других случаях, удобно показывать изогнутыми стрелками. Ниже приведена построенная таким образом схема корреляций для 8-карбоксиметилхинолина 1.49. 233
Глава 1. Интерпретация спектров На схеме отнесения сигналов, как в протонном, так и в углеродном спектрах уже сделаны. На самом де- ле, если Вам придется делать выводы из спектра НМВС, то эти отнесения необходимо будет сделать именно Вам. Это невозможно, если у Вас име- ется только спектр НМВС. Поэтому предварительно необходимо изме- рить и обработать спектр на ядрах !Н и спектр HMQC. В результате Вы сможете отнести сигналы в протонном спектре и сигналы протониро- ванных атомов 13С и нанести их на схему до проведения анализа спектра НМВС. Спектр НМВС даст Вам возможность отнести сигналы четвертич- ных атомов углерода и проверить сделанные ранее отнесения других сиг- налов в протонном и углеродном спектрах. Анализ корреляций в спектре НМВС целесообразно начинать с тех про- тонных сигналов, отнесение которых наиболее достоверно. Так, в нашем случае целесообразно начать анализ с корреляций, которые наблюдаются для сигнала протонов метильной группы при 3.75 м.д. Для нее в спектре имеется единственная корреляция с углеродным сигналом при 168.6 м.д. Из структурной формулы соединения следует, что единственным атомом углерода, который отдален от протонов метила не более чем на 3 хими- ческие связи, является карбонильный атом углерода. Поэтому сигнал при 168.6 м.д. соответствует именно этому атому. Данное отнесение подтверж- дается также наличием корреляции карбонильного атома углерода с прото- ном Н7 с химическим сдвигом 7.88 м.д. Эти ядра также разделены тремя химическими связями. Следующей нашей задачей является отнесение сигналов четвертичных атомов углерода хинолинового ядра. Отнесение сигнала 128.5 м.д. к узло- вому атому С4а следует из наличия для него корреляций с атомами НЗ при 7.50 м.д. и Н5 при 7.58 м.д. От обоих названных протонов атом С4а отстоит на 3 химические связи. Второй узловой атом С8а имеет химический сдвиг 145.3 м.д. Это следует из наличия для него корреляций с протонами с хи- мическими сдвигами 8.92, 8.02 и 7.88 м.д., которые отвечают протонам Н2, Н4 и Н6, соответственно. Последний из неотнесенных сигналов четвертич- ных атомов углерода соответствует атому С8, связанному с карбометоксиль- ной группой. Это следует из наличия для него корреляции с протоном Н6 с химическим сдвигом 7.58 м.д. После того, как все сигналы окажутся отне- сенными, можно предыдущую таблицу 1.32 преобразовать таким образом, чтобы химические сдвиги атомов заменить положениями атомов в молеку- 234
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ле в соответствии с правилами номенклатуры органических соединений. Ниже приведен такой вариант таблицы корреляций (таблица 1.33). Таблица 1.33. Корреляции НМВС в спектре 8-карбоксиметилхинолина 1.49 Протоны Атомы 13С СН3 со НЗ С2, С8а, С4а Н6 С8а, С8, С7, С4а Н7 СО, С8а, С5, С4а Н5 С8а, С4, С8, С7 Н4 С2, С8а, С5, С4а Н2 С8а, С4, С4а, СЗ Таблица 1.33 вполне пригодна для публикации результатов примене- ния гетероядерной корреляционной спектроскопии ЯМР. Ее внимательное рассмотрение позволяет вывести ряд правил, общих для анализа аромати- ческих соединений. 1. Корреляции между орто-протонами в бензольных кольцах, как правило, не наблюдаются либо малоинтенсивны. Так, сигнал протонов Н6 с химическим сдвигом 7.58 м.д. не имеет в спектре НМВС корреляции с соседним атомом углерода С5. Аналогично не наблюдаются корреляции Н4 с СЗ и Н7 с С6. Это связано с тем, что соответствующие КССВ, 2J(H,C), весьма близки к нулю. Наличие гетероатома в молекуле приводит к возрастанию 2J(H,C) и появлению в спектре НМВС соответствующих корреляций, например между атомом Н2 и СЗ. 2. В ароматических соединениях часто проявляются корреляции между сигналом протона и атомом углерода, расположенным по отно- шению к нему в лара-положении. Это связано с тем, что величина 4J(H,C) для таких атомов близка к 2 Гц. В нашем случае мы видим присутствие корреляций между атомами Н2 и С4а, а также между Н7 и С4а, Н6 и С8а. 3. В ароматических соединениях часто проявляются корреляции между сигналом протона и атомом углерода, отдаленным от него на 4 химические связи, если ориентация химических связей между ними напоминает букву "W". Применение данных простых правил весьма помогает при отнесении корреляций в спектрах НМВС. 235
Глава 1. Интерпретация спектров 1.22.3. Отнесение сигналов на ядрах 13С с помощью гетероядерной корреляционной спектроскопии Наиболее часто методы гетероядерной корреляционной спектроскопии при- меняются для установления положения сигналов в спектрах на ядрах 13С. Для этой цели обычно измеряют последовательно два двумерных спектра - HMQC и НМВС. Первый спектр дает возможность отнести сигналы про- тонированных атомов углерода, а второй спектр - сигналы четвертичных атомов. При этом часто имеется возможность произвес- ти или уточнить отнесение тех протонных сигналов, для которых надежное отнесение сигналов сделано не было. Продемонстри- руем это на примере спектров несложного гетероциклического соединения 1.56, фор- мула которого приведена слева. Спектр данного соединения на ядрах !Н показан на рис. 1.108. Он со- держит в слабом поле сильно уширенные сигналы гидроксильных прото- нов. Сигналы настолько широки, что определить величины их химических сдвигов можно лишь весьма приблизительно. Один из сигналов имеет мак- симум вблизи 12.3 м.д., а другой - вблизи 11.2 м.д. Сильное уширение сиг- налов активных протонов часто наблюдается для соединений, которые име- ют в своем составе карбоксильную группу. Являясь сильной кислотой, эта группа ускоряет протонный обмен и соответственно увеличивает ширину сигналов. В области поглощения ароматических протонов имеем два синглета протонов Н5 и Н8. Поскольку мы знаем, что гидроксильная группа смеща- ет сигналы оргао-протонов в сильное поле, то сигнал протона Н8, очевид- но, имеет химический сдвиг 6.95 м.д. Соответственно сигнал протона Н5 поглощает при 7.78 м.д. Сигналы ароматических протонов бензимидазоль- ного фрагмента Н4’-Н8’ дают в спектре два дублета и два триплета, харак- терные для данной спиновой системы. Однако отнести данные сигналы только на основании протонного спектра не представляется возможным. В области поглощения алифатических протонов имеем синглет груп- пы N-CH3 интенсивностью ЗН при 3.61 м.д., триплет метильной группы 6-этильного заместителя при 1.17 м.д. интенсивностью ЗН и два плохо раз- решенных мультиплета с центрами 2.81 м.д. интенсивностью 2Н и 2.64 м.д. интенсивностью 4Н. Очевидно, что последний мультиплет образовался за счет наложения сигналов двух метиленовых групп, одна из которых при- надлежит 2-этильному заместителю, а вторая - 2-карбэтоксильному замес- тителю. 236
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.108. Спектр !Н продукта 1.56. Таким образом, хотя спектр !Н в целом подтверждает строение соеди- нения, однако он требует уточнения отнесения ряда сигналов. На рис. 1.109 приведен спектр того же соединения на ядрах 13С. Количество пиков в спектре соответствует количеству неэквивалентных атомов углерода в ис- следуемой молекуле. Однако надежно отнести можно лишь некоторые из сигналов, в частности, сигнал при 14.47 м.д. отвечает метильной группе 6-этильного заместителя, сигналы при 174.9 и 173.7 м.д. отвечают атомам углерода карбонильных групп. Остальные сигналы удается отнести только с определенной вероятностью - для каждого из сигналов можно предполо- жить 2 или даже 3 варианта отнесения. Внести ясность могут только спект- ры гетероядерной !Н-13С корреляции. Рассмотрим спектр HMQC. При этом наиболее целесообразно записать отдельно фрагменты спектра, соответствующие его алифатическим и аро- матическим сигналам. Это позволит видеть кросспики в более крупном масштабе. Данные фрагменты представлены на рис. 1.110а, б. Координаты кросспиков, которые присутствуют в спектре HMQC, мож- но свести в таблицу корреляций. Эту работу удобнее всего производить, имея перед глазами соответствующие протонный и углеродный спектры, где имеются величины химических сдвигов каждого из пиков (см. рис. 1.109). В результате получим таблицу 1.34. 237
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.109. Спектр 13С продукта 1.56. Рис. 1.110а. Фрагмент спектра HMQC соединения 1.56, содержащий аро- матические сигналы. 238
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса F1 (ppm) Рис. 1.1106. Фрагмент спектра HMQC соединения 1.56, содержащий али- фатические сигналы. Таблица 1.34. Результаты обработки спектра HMQC для соединения 1.56 *Н сигнал, 8, м.д. Положения кросспиков в измерении 13С 7.78 125.4 7.66 119.7 7.59 111.0 7.30 123.0 7.23 122.2 6.95 102.3 3.61 31.0 2.82 28.5 2.64 31.2,23.1 1.17 14.5 239
Глава 1. Интерпретация спектров Казалось бы, на данном этапе анализа спектра мы уже могли бы отнести сигналы 13С всех протонированных атомов углерода. Однако, как мы уже отмечали, сигналы протонов бензимидазольного фрагмента, а также сигна- лы метиленовых протонов карбэтоксильной группы еще не отнесены, что не дает возможности отнести и сигналы атомов 13С, которые связаны с дан- ными протонами. Поэтому оставим вопрос отнесения сигналов до тех пор, пока не будет проанализирован спектр НМВС данного соединения. На рис. 1.111а-г приведены фрагменты спектра НМВС исследуемого соединения, которые содержат все имеющиеся в нем кросспики. F1 (ppm) Рис. 1.111а. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.56. Стрелкой обозна- чены компоненты дублетов, отвечающие ’j(H,C); крестиком обозначены кросспики примесей и шумы. Прежде чем составлять таблицу НМВС-корреляций, следует вниматель- но рассмотреть все кросспики. Это связано с тем, что в спектре могут при- сутствовать пики, которые не отвечают НМВС-корреляциям. Внесение та- ких пиков в таблицу корреляций приведет к путанице или даже к неверным 240
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса выводам о структуре молекулы. Прежде всего, следует идентифицировать пики, отвечающие константам ^(HjC). Их отличительной особенностью является то, что они представляют собой дублет в протонном измерении спектра. Точно по центру между компонентами этого дублета расположен сигнал, для которого наблюдается данная КССВ. В спектре HMQC для данного сигнала имеется соответствующая корреляция через 1 химическую связь. Полезно измерять расстояние между компонентами дублета в Гер- цах. Это расстояние равно величине соответствующей ^(HjC). Знание этой константы может помочь в отнесении сигналов, поскольку она существен- но зависит от строения молекулы (см. раздел 1.15.5). Наиболее интенсив- ные дублеты мы видим во фрагменте спектра (рис. 1.111 в), отвечающем поглощению метильных и метиленовых протонов. Для того, чтобы поме- тить дублеты, связанные с 1 J(H,C), можно на спектре соединить их стрел- ками, как это и сделано на рисунке. Рис. 1.1116. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.56. Крестиком обозна- чены кросспики примесей и шумы. 241
Глава 1. Интерпретация спектров F1 (ppm) Рис. 1.111b. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.56, Стрелкой обозна- чены компоненты дублетов, отвечающие *J(H,C); крестиком обозначены кросспики примесей и шумы. Второй тип пиков, которые следует исключить из дальнейшего рас- смотрения, - это кросспики, отвечающие примесям. В спектре НМВС уг- леродные сигналы более интенсивны, чем в обычном спектре на ядрах 13С с широкополосным подавлением протонов. Поэтому кросспик может по- явиться в том месте, где углеродный сигнал не виден. Поэтому все кросспи- ки, для которых в углеродном или протонном измерениях сигналы отсутст- вуют либо имеют аномально малую интенсивность, следует игнорировать. На рис. 1.11 la-г такие кросспики обозначены крестиком. После того, как мы "отбраковали" паразитные кросспики, следует об- ратить внимание на интенсивность оставшихся пиков. Хотя контурное пред- ставление двумерного спектра и не позволяет визуально определять высоту пика, однако о ней можно судить по его площади или количеству контур- ных линий, которые образуют кросспик. Наиболее четко разница в интен- сивности кросспиков видна на рис. 1.111д, где синглеты ароматических 242
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса протонов Н5 и Н8 дают кросспики с углеродным сигналом, который распо- ложен при 23.1 м.д. Слабая интенсивность кросспика свидетельствует о малой величине соответствующей КССВ. Другой случай, когда кросспики могут иметь весьма низкую интенсивность, возникает тогда, когда сигнал в протонном спектре расщеплен на большое количество компонентов. Для таких сигналов кросспики могут и не наблюдаться даже при значительных величинах гетероядерных КССВ. Такая ситуация часто возникает для сиг- налов алифатических протонов в жестких насыщенных циклах. Рис. 1.111г. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.56. Как мы видели в разделах 1.15.5.2-1.15.5.4, посвященных величинам гетероядерных КССВ, 2J(H,C) обычно близки к нулю для протонов, кото- рые расположены в ортио-положении один относительно другого, a 3J(H,C) близки к нулю в случаях, когда торсионный угол между связями в цепи передачи ССВ близок к 90°. Наконец, в определенных случаях дальние КССВ, V(H,C), могут иметь аномально большую величину и проявляться в 243
Глава 1. Интерпретация спектров спектрах НМВС в виде слабоинтенсивных кросспиков. Это происходит при зигзагообразной ориентации атомов, через которые передается ССВ (W-взаимодействие), а также в случае, когда взаимодействующие ядра ле- жат на одной линии (взаимодействие протона с углеродом, расположенным в ияра-положении относительно него). Поэтому в таблицу корреляций по- лезно вносить координаты соответствующих кросспиков. Мы в дальнейшем такие кросспики будем отмечать буквой "с" - слабый. Данные кросспики несут важную информацию о строении молекулы. il I I I I I I I Hl III I Рис. 1.111д. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.56, отвечающий про- тонным сигналам вблизи 2.64 м.д. Горизонтальная линия проведена через центры кросспиков, которые отвечают одному из сигналов. Теперь можно составлять таблицу координат кросспиков. Для этого из протонного спектра молекулы определяют величину химического сдвига сигнала в протонном измерении двумерного спектра. Кросспики НМВС, ко- торые соответствуют данному сигналу, лежат на одной горизонтали. Поэто- му их координаты в углеродном измерении спектра последовательно зано- 244
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса сят в таблицу. Удобнее всего определять эти координаты, глядя на соответ- ствующий углеродный спектр, где уже определены химические сдвиги всех сигналов (рис. 1.109). В этом случае достаточно перечислить химичес- кие сдвиги тех углеродных сигналов, для которых имеется кросспик на од- ной горизонтали на рис. 1.111а-г. Результаты такого анализа спектра при- ведены в таблице 1.35. Таблица 1.35. Координаты кросспиков в спектре НМВС для соедине- ния 1.56 сигнал, 5, м.д. Положения кросспиков в измерении 13С 7.78 174.9, 161.8, 156.3, 102.3(c), 23.1 7.66 136.4, 123.0 7.59 143.2, 122.2 7.30 136.4, 119.7 7.23 143.2, 111.0 6.95 174.9, 161.8, 156.3, 131.3, 115.4, 23.1(c) 3.61 148.3, 136.4 2.82 173.7, 169.2, 113.9,31.2 2.64 161.8, 131.3, 125.4, 14.5 2.65 173.7, 169.2(c), 28.5 1.17 131.3, 23.1 Бывают случаи, когда в протонном спектре налагаются несколько сиг- налов, образуя неразрешенный мультиплет. Такая ситуация в нашем при- мере наблюдается для сигнала с химическим сдвигом 2.64 м.д. Этот сигнал образован за счет квартета метиленовых протонов этильной группы и три- плета одной из метиленовых групп карбэтоксильного заместителя. Раз- личие химических сдвигов этих групп не превышает 0.01 м.д. Как видно из рис. 1.1116, кросспики, которые отвечают каждому из протонных сигна- лов, различить не удается. Однако это можно сделать, если записать фраг- мент спектра, в котором протонная координата близка к ширине сигнала (рис. 1.111д). В этом случае становится заметным небольшое смещение центров кросспиков один относительно другого. Наиболее четко это за- метно, если через центры одного из рядов кросспиков провести горизон- таль. Тогда кросспики, которые отвечают другому сигналу, оказываются смещенными относительно проведенной линии и их можно отнести к скры- тому сигналу. 245
Глава 1. Интерпретация спектров После составления таблиц гетероядерных корреляций начинается са- мая творческая часть анализа спектра - на основании корреляций НМВС произвести отнесение всех сигналов в спектре. При этом попутно следует объяснить наличие каждой из корреляций. Присутствие в спектре "необъяс- нимых” кросспиков может свидетельствовать либо об ошибке в составле- нии таблицы корреляций, либо об ошибочности гипотезы о строении мо- лекулы. Работу удобнее всего производить с использованием структурной формулы молекулы, которая изображена в таком масштабе, чтобы возле каждого магнитного ядра можно было бы подписать соответствующую ему величину химического сдвига. Прежде всего, с помощью корреляций HMQC следует отнести сигналы протонированных атомов углерода. Это легко сделать, основываясь на отнесении протонных сигналов. Если отнесение протонных сигналов неочевидно, то следует принять наиболее вероятный вариант отнесения. В дальнейшем, на основании кросспиков в спектре НМВС, эти отнесения можно подтвердить либо опровергнуть. В последнем случае необходимо будет откорректировать химические сдвиги протонных сигналов. Отнесение сигналов четвертичных атомов углерода следует на- чинать с атомов или групп, для которых положения сигналов в протонных спектрах являются очевидными. В нашем случае целесообразно начать с отнесения сигналов атомов углерода в фенольном фрагменте молекулы. Синглет протона Н5 при 7.78 м.д. имеет в спектре НМВС 5 корреляций, 4 из которых - интенсивные, а 1 - слабая (первая строка таблицы 1.35). Как правило, в ароматических фрагментах наиболее сильны корреляции через 3 химические связи. Поэтому рассмотрим все углеродные атомы, отстоящие от протона Н5 на три химические связи. Таких атомов оказывается четыре, что совпадает с количеством интенсивных кросспиков в спектре НМВС. Из них в наиболее слабом поле должен наблюдаться сигнал карбонильного атома углерода С4. Поэтому кросспик с координатой 174.9 м.д. в углерод- ном измерении следует отнести именно к данному атому углерода. В наи- более сильном поле при 23.1 м.д. имеется кросспик, соответствующий ато- му углерода метиленовой группы 6-этильного заместителя. Его отнесение ранее уже было сделано на основании спектра HMQC. Еще две корреляции с координатами в углеродном измерении 161.8 м.д. и 156.3 м.д. отвечают атомам С7 и С8а. Для их более точного отнесения следует посмотреть, с какими еще протонными сигналами для них имеются корреляции. Оказы- вается, что для углеродного сигнала при 161.8 м.д. имеется корреляция с сигналом протонов метиленовой группы при 2.64 м.д. Поэтому данный сигнал следует отнести к атому С7, который отстоит на 3 химические связи от протонов метиленовой группы при атоме С6. Соответственно сигналу С5а следует приписать химический сдвиг 156.3 м.д. Слабый кросспик про- тонного сигнала при 7.78 м.д. с углеродным сигналом при 102.3 м.д. отве- 246
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса чает ССВ через 4 химические связи. Итак, в фенольном кольце неотнесен- ными остались только сигналы атомов С6 и С4а. Их отнесение можно сде- лать на основании кросспиков, которые наблюдаются для протонного сигна- ла Н8, имеющего химический сдвиг 6.95 м.д. Для данного сигнала в спект- ре НМВС присутствуют 4 сильные корреляции и 2 более слабые. Сильные корреляции отвечают КССВ 2J(H,C) с атомами С7 и С8а и 3J(H,C) с атома- ми С6 и С4а. Последние две корреляции дают возможность отнести угле- родные сигналы при 131.3 и 115.4 м.д. соответственно атомам С6 и С4а. Это очевидно, если учесть, что для атома с химическим сдвигом 131.3 м.д. наблюдается также корреляция с протонным сигналом метиленовой груп- пы при 2.64 м.д. Слабые кросспики, наблюдающиеся для протонного сиг- нала при 6.95 м.д., соответствуют его W-взаимодействию с атомами С4 (174.9 м.д.) и углеродом метиленовой группы при С6 (23.1 м.д.). То, что для сигнала Н8 наблюдаются равноинтенсивные корреляции как через 2, так и через 3 химические связи, объясняется соседством гетероциклическо- го атома кислорода 4-пиронового цикла. Обычно гетероатомы увеличива- ют величины 2J(H,C) для близлежащих протонов и соответственно приво- дят к возрастанию интенсивности соответствующих кросспиков в спектре НМВС. Отнесение сигналов в бензимидазольном фрагменте целесообразно на- чать с кросспиков, которые наблюдаются для сигнала N-метильной груп- пы. В протонном спектре ей соответствует сигнал при 3.61 м.д. В спектре НМВС для него имеются две корреляции с углеродными сигналами при 148.3 и 136.4 м.д. Как следует из структурной формулы соединения, эти корреляции должны отвечать атомам С2’ и С7'а, соответственно. Более сла- бопольное расположение сигнала С2’ следует из того, что он расположен между двумя атомами азота. Отнесение сигнала С7'а является ключом к уточнению отнесения протонных сигналов данного фрагмента. Поскольку в ароматических фрагментах С-Н корреляции через 3 связи являются наибо- лее сильными, то следует ожидать, что с углеродным сигналом при 136.4 м.д. будут иметь корреляцию сигналы протонов Н4’ и Н6’. Мы имеем корре- ляции сигнала С7’а с дублетом при 7.66 м.д. и с триплетом при 7.30 м.д. Поэтому именно данные сигналы следует отнести к протонам Н4’ и Н6’, со- ответственно. Анализ остальных кросспиков трудностей не вызывает и может быть произведен читателем самостоятельно. Результаты анализа приведены ни- же на схеме, где важнейшие корреляции НМВС, которые послужили осно- ванием для отнесений сигналов, показаны в виде изогнутых стрелок. Такая схема корреляций является наиболее компактным изображением резуль- татов анализа спектра НМВС. Ее использование избавляет от длительных словесных описаний, которыми нам, по необходимости, приходилось поль- зоваться. 247
Глава 1. Интерпретация спектров 1.23. Использование двумерной корреляционной спектроскопии ЯМР для выяснения строения химических соединений Рассмотрим одну не слишком сложную задачу, которая требует использо- вания методов двумерной корреляционной спектроскопии ЯМР. Такие за- дачи часто возникают перед химиком-синтетиком, и от того, насколько пра- вильно они будут решены, часто зависят сами результаты научной работы. В реакции гетероциклизации был получен продукт неизвестного строе- ния. Исходя из имеющихся данных продукт реакции 1.57 может иметь од- ну из двух структур - линейную b либо ангулярную а - в зависимости от того, по какому из атомов пиримидинового кольца происходит циклизация. 1.57а 10 При исследовании продукта реакции следует сделать вывод о том, со- ответствует ли его строение одной из приведенных выше формул. Кроме того, представляют интерес отнесение сигналов в протонном и углерод- ном спектрах соединения и анализ наблюдающихся величин химических сдвигов. Прежде чем приступать к измерению спектров, следует внимательно проанализировать все возможные для изучаемого соединения структурные 248
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса формулы и уяснить себе, чем именно они различаются. От результатов та- кого анализа зависит то, какие спектры следует измерить для того, чтобы ответ на поставленные вопросы был достаточно определенным. В нашем случае обе возможные структуры содержат одинаковые спиновые системы, поэтому для их идентификации следует помимо протонного спектра, изме- рять двумерный спектр COSY. Для структур а и b сильнее всего различа- ется окружение протона NH. Если в формуле а этот протон расположен по соседству с атомом углерода карбонильной группы на расстоянии 2 хими- ческих связей от нее, то в формуле b их разделяют 4 химические связи. Таким образом, выявление наличия спин-спинового взаимодействия между сигналом протона NH и карбонильным атомом углерода будет однозначно свидетельствовать в пользу структуры а. Для того, чтобы выявить эту спи- новую связь, следует измерять спектр НМВС. Полное отнесение сигналов в углеродном спектре потребует также измерения спектра HMQC. Однако часто бывает, что величины 2J(H,C) имеют нулевые значения. Поэтому в случае отсутствия корреляции вопрос о строении молекулы останется откры- тым. Поэтому, на всякий случай, необходимо найти и другие различия в формулах а и Ь, которые позволили бы сделать выбор между ними. Таким различием является относительное расположение протона NH и аромати- ческих протонов. В формуле а вблизи NH расположен только протон Н13, а в формуле b - также и протон Н2. Поэтому можно попытаться выявить наличие эффекта Оверхаузера при насыщении сигнала NH и сигналов аро- матических протонов. Этот эффект может также помочь при отнесении сиг- налов. Удобнее всего выявлять ЯЭО в эксперименте NOESY. Таким обра- зом, план исследования будет следующим: 1) измерить спектр на ядрах ’Н, 2) измерить спектр на ядрах 13С, 3) измерить спектр COSY, 4) измерить спектр NOESY, 5) измерить спектр HMQC, 6) измерить спектр НМВС. Совокупность полученной таким образом информации, вероятнее все- го, приведет к решению поставленной задачи. Прежде всего рассмотрим протонный спектр соединения 1.57. Он при- веден на рис. 1.112. В спектре имеются сигналы 9 ароматических протонов и сигнал груп- пы NH. Сигналами, которые можно отнести наверняка, являются сигнал про- тона NH, поскольку он поглощает в настолько слабом поле (11.860 м.д.), что сигналы других протонов там поглощать не могут, и синглет в сильном поле (6.178 м.д.), который отвечает протону Н13. Его отнесение следует из мультиплетности - ни в одном из вариантов структурных формул исследу- 249
Глава 1. Интерпретация спектров емой молекулы нет других протонов, которые могли бы давать в спектре ПМР синглет. Сигналы остальных протонов могут соответствовать любой из возможных структурных формул соединения. Следует обратить вни- мание на необычный химический сдвиг наиболее слабопольного дублета (9.22 м.д.). В таком слабом поле ароматические протоны могут поглощать только в том случае, если они, в силу пространственных особенностей мо- лекулы, сближены в пространстве с неподеленными электронными парами других атомов. Такая ситуация возникает в структуре а для протона Н6. Таким образом, аномальный химический сдвиг протона уже дает возмож- ность сделать некоторые выводы о строении молекулы. Однако оконча- тельно утверждать, что молекула имеет именно строение а еще преждевре- менно, поскольку мы не можем быть полностью уверенными в том, что углеродный скелет молекулы мы предсказали правильно. Рис. 1.112. Спектр на ядрах ’Н соединения 1.57. Для дальнейшего отнесения сигналов в протонном спектре рассмотрим двумерный спектр COSY изучаемого соединения. Он приведен на рис. 1.113, где стрелками показана связность кросспиков с диагональными сигналами. Результаты анализа спектра COSY удобнее всего показать на струк- турной формуле соединения (см. ниже). 250
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 9.4 9.2 9.0 9.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 F1 (ppm) Рис. 1.113. Спектр COSY соединения 137. Стрелками показаны корреля- ции, относящиеся к двум одинаковым спиновым системам AMQX. 7.30 Хотя мы и привели результаты обра- ботки спектра COSY для варианта струк- туры а, однако аналогичную картинку можно построить и для формулы Ь. Сам по себе метод COSY не позволяет полу- чить дополнительные сведения о строении молекулы - он только дает возможность выяснить связность мультиплетов, а следо- вательно, отнести сигналы в протонном спектре. Дальнейшую информацию уда- ется получить из спектра NOESY. Этот спектр приведен на рис. 1.114. 251
Глава 1. Интерпретация спектров F1 (ppm) Рис. 1.114. Спектр NOESY соединения 1.57, Цифрами обозначены корре- ляции, важные для установления строения молекулы. Здесь наиболее важными для установления строения молекулы явля- ются корреляции сигнала NH с сигналом протона Н13 (эта корреляция на рисунке 1.114 обозначена цифрой 1) и сигнала Н13 с соседним протоном Н12 (на рисунке 1.114 она обозначена цифрой 2). Поскольку сигнал NH име- ет корреляцию только с одним ароматическим протоном, то дальнейшее подтверждение получает предположение о том, что молекула имеет струк- туру а. Корреляция 2 в спектре NOESY позволяет точно различить имею- щиеся в молекуле спиновые системы. Поскольку сигнал Н13 близок в прост- ранстве к протону Н12, то наличие между ними ЯЭО дает возможность на- 252
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса дежно отнести сигнал протона Н12. Имеющиеся корреляции COSY позво- ляют отнести и все остальные сигналы данной спиновой системы. Именно таким образом были сделаны отнесения сигналов, показанные на предыду- щей схеме. Таким образом, основную задачу мы уже решили - молекуле соответст- вует структура а. Однако, строго говоря, мы еще не знаем, соответствует ли углеродный скелет молекулы формуле а, поскольку все наши выводы были основаны только на протонных спектрах молекулы. Поэтому иссле- дование молекулы следует продолжить и дополнить его данными по изу- чению спектров на ядрах 13С. Углеродный спектр молекулы приведен на рис. 1.115. * 160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 Рис. 1.115. Спектр соединения 1.57 на ядрах 13С. В спектре на ядрах 13С присутствуют 16 сигналов. Это согласуется со структурной формулой соединения - в ней присутствуют 16 неэквивалент- ных атомов углерода. Слабопольные сигналы, расположенные при 162.7 и 158.4 м.д., отвечают карбонильным группам молекулы. Сигнал в сильном поле при 87.6 м.д., вероятнее всего, отвечает протону Н13, который нахо- дится в неароматическом 6-членном цикле. Отнесение остальных сигналов лучше всего производить, используя двумерные спектры гетероядерных ]Н-13С корреляций через одну химическую связь (HMQC) и через 2-3 хими- ческие связи (НМВС). На рис. 1.116 показан спектр HMQC исследуемого соединения 1.57. 253
Глава 1. Интерпретация спектров F1 (ppm) Рис. 1.116. Спектр HMQC исследуемого соединения 1.57. В спектре, изображенном на рис. 1.116, имеются 9 корреляций, кото- рые соответствуют 9-ти имеющимся в молекуле протонированным атомам углерода. Как видим, каждому протонному сигналу отвечает один кросспик, координата которого на шкале химических сдвигов углерода дает положе- ние в спектре атома В * * * * 13С, который имеет связь с протонным сигналом, име- ющимся в протонном измерении спектра. Если сигналы расположены не слишком близко, то координаты кросспиков можно определить визуаль- но. Например, совершенно очевидно, что протон с химическим сдвигом 6.18 м.д. связан с атомом углерода, имеющим химический сдвиг 87.6 м.д. Хотя в данном случае на двумерных спектрах и не проставлены величины химических сдвигов отдельных сигналов, они имеются на соответствующих одномерных спектрах. В случаях, когда сигналы в протонном или углерод- ном спектре расположены слишком близко, для уточнения положения кор- реляций следует рассмотреть соответствующие участки двумерного спект- ра в увеличенном масштабе. Так, для изучаемого соединения целесообраз- 254
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса но записать на отдельном спектре область поглощения ароматических ато- мов 'Н и |3С. Такой фрагмент спектра приведен на рис. 1.117. F1 (ppm) Рис. 1.117. Фрагмент спектра HMQC соединения 1.57, содержащий только сигналы ароматических атомов 13С и *Н. Увеличенный фрагмент спектра позволяет определить координаты кросс- пиков значительно надежнее. Даже в случаях, когда сигналы в спектре практически не различимы, например протонные сигналы вблизи 7.46 м.д. или сигналы 13С с химическими сдвигами 134.1 и 134.2, различающимися всего на 0.1 м.д., дают кросспики, которые можно отнести визуально. Ре- зультаты обработки двумерного спектра на первом этапе удобно свести в таблицу. Данная таблица приведена ниже (таблица 1.36), где одновременно имеются также и корреляции НМВС. Дальнейшую информацию о связности атомов в молекуле дают кор- реляции через 2-3 химические связи, которые можно получить в спектре НМВС. Этот спектр приведен на рис. 1.118. 255
Глава 1. Интерпретация спектров Таблица 1.36. Гетероядерные корреляции *Н-13С HMQC и НМВС, найден- ные для сигналов протонов продукта 1.57 ’Н сигнал, 5, м.д. Положения кросспиков в измерении 13С HMQC НМВС 11.86 - 119.9, 137.8, 158.4 9.22 121.6 158.4, 138.7, 126.8, 119.9 8.17 128.7 162.7, 136.9, 134.1 8.09 127.5 158.4, 138.7, 134.2 7.75 134.2 138.7, 127.5, 121.6 7.61 134.1 136.9, 128.7 7.46 126.8 121.6, 119.9 7.45 125.1 136.9, 125.0, 122.2, 87.7 7.30 125.0 125.1, 122.2,136.9, 134.1, 128.7 6.18 87.7 137.8, 125.1, 122.2 Рис. 1.118. Спектр НМВС продукта 1.57. 256
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Определение координат кросспиков в спектре НМВС ничем не отли- чается от спектра HMQC. Главное здесь - иметь спектр в таком масштабе, чтобы сигналы в соответствующих одномерных спектрах были визуально различимы. Как и в случае спектра HMQC, область ароматических сигна- лов слишком загружена. Поэтому координаты близких кросспиков следует устанавливать на отдельных фрагментах спектра. Один из таких фрагмен- тов показан на рис. 1.119. В нем можно найти большинство корреляций, сведенных в таблице 1.36. Например, четко видно, что протонный сигнал с химическим сдвигом 6.18 м.д. имеет в спектре три кросспика с сигналами 13С, которые расположены при 137.8, 125.1 и 122.2 м.д. Аналогично, сигнал протона NH имеет корреляции с сигналами |3С, которые расположены при 119.9,137.8 и 158.4 м.д. Рис. 1.119. Фрагмент спектра НМВС продукта 1.57, содержащий сигналы ароматических атомов. Данные таблицы 1.36 являются основой для отнесения сигналов в спектре 13С. Этот процесс удобно производить, глядя на предполагаемую формулу соединения и по мере отнесения сигналов нанося их возле соот- ветствующих атомов. В первую очередь производят отнесение протониро- 257
Глава 1. Интерпретация спектров ванных атомов 13С, используя для этого столбец таблицы 1.36, где сведены результаты эксперимента HMQC. Корреляции НМВС на схеме обознача- ются изогнутыми стрелками. В результате мы получим схему корреляций, подтверждающих строение молекулы. Следует всегда помнить, что нали- чие хотя бы одной корреляции, которая не согласуется с предполага- емой формулой молекулы, может свидетельствовать об ошибочности гипотезы о ее структуре. Все корреляции должны иметь рациональное объяснение. После построения схемы корреляций следует проанализи- 8.09 1.57 7.30 ровать наблюдающиеся химические сдвиги атомов 13С. Они должны со- гласовываться с общими закономер- ностями изменения в зависимости от химического окружения атомов. Схема корреляций соединения 1.57, полученная на основании данных таблицы 1.36, приведена слева. От- несения сигналов следует начинать с обособленных сигналов. Так, по- ложение в спектре карбонильного атома углерода С8 следует из его корреляции с сигналом протона Н9, удаленного от карбонила на 3 хими- ческие связи. Аналогично, сигнал карбонильного атома С2 можно отнести на основании наличия его корре- ляции с сигналом протона НЗ. Положения узловых атомов углерода в боль- шинстве случаев удается отнести на основании наличия корреляции через 3 химические связи с протонами, расположенными относительно них в л/едиа-положении. ордио-Протоны для этих целей мало пригодны, посколь- ку величины 2J(H,C) чаще всего близки к нулю и соответствующие корре- ляции в спектре НМВС не проявляются либо малоинтенсивны. Важнейшей корреляцией, которая подтверждает то, что соединение име- ет ангулярное строение, является корреляция сигнала протона группы NH, поглощающего при 11.86 м.д., с атомом углерода одной из карбонильных групп, расположенным при 158.4 м.д. В случае, если бы молекула имела альтернативное строение, такая корреляция была бы невозможной, посколь- ку карбонильные атомы углерода в ней удалены от NH более чем на 3 хи- мические связи. Таким образом, метод ЯМР позволяет надежно устанавливать строе- ние химических соединений, причем применение гетероядерной корреля- ционной спектроскопии позволяет устанавливать связность атомов не ме- нее надежно, чем метод рентгеноструктурного анализа. 258
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 1.24. Задачи для самостоятельного решения Ниже приведен ряд типичных задач, которые приходится решать химикам при синтезе новых соединений, структуру которых заранее предсказать не- возможно. Весьма рекомендуем читателю решить самостоятельно эти зада- чи. Это поможет не только выяснить, насколько освоен материал учебника, но и убедиться в своей готовности активно использовать метод ЯМР в пов- седневных исследованиях. 1.24.1. Блок задач 1. Найдите строение соединения Синтезированное соединение может иметь одну из четырех структурных формул 1.58a-d: 1. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и исполь- зуя таблицы 1.4-1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.58а. Отвечает ли спектр пред- ложенной структуре молекулы? 2. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и исполь- зуя таблицы 1.4—1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.58b. Отвечает ли спектр пред- ложенной структуре молекулы? 259
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.120. Спектр !Н соединения 1.58 в ДМСО-de- 3. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и исполь- зуя таблицы 1.4-1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.58с. Отвечает ли спектр пред- ложенной структуре молекулы? 4. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и исполь- зуя таблицы 1.4-1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.58d. Отвечает ли спектр пред- ложенной структуре молекулы? 5. Основываясь на спектре 13С, показанном на рис. 1.121, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.58а. 6. Основываясь на спектре 13С, показанном на рис. 1.121, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.58b. 7. Основываясь на спектре 13С, показанном на рис. 1.121, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.58с. 8. Основываясь на спектре 13С, показанном на рис. 1.121, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.58d. 9. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и исполь- зуя таблицы 1.4-1.9, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблюдаются ли в спектре дальние КССВ? Используя соотношение Карплуса (раздел 1.10.2), найдите углы между алифатически- 260
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ми протонами, основываясь на имеющихся КССВ. Считайте, что соедине- Рис. 1.121. Спектр 13С соединения 1.58 в ДМСО-б?б- 10. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и исполь- зуя таблицы 1.4-1.9, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблюдаются ли в спектре дальние КССВ? Используя соотношение Карплуса (раздел 1.10.2), найдите углы между алифатически- ми протонами, основываясь на имеющихся КССВ. Считайте, что соедине- нию отвечает формула 1.58b. 11. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и исполь- зуя таблицы 1.4-1.9, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблюдаются ли в спектре дальние КССВ? Используя соотношение Карплуса (раздел 1.10.2), найдите углы между алифатически- ми протонами, основываясь на имеющихся КССВ. Считайте, что соедине- нию отвечает формула 1.58с. 12. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и исполь- зуя таблицы 1.4-1.9, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблюдаются ли в спектре дальние КССВ? Используя соотношение Карплуса (раздел 1.10.2), найдите углы между алифатически- ми протонами, основываясь на имеющихся КССВ. Считайте, что соедине- нию отвечает формула 1.58d. 13. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и спект- рах COSY, показанных на рис. 1.122-1.125, сделайте отнесение сигналов в спектре. Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.58а. 261
Глава 1. Интерпретация спектров 14. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и спект- рах COSY, показанных на рис. 1.122-1.125, сделайте отнесение сигналов в спектре. Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.58b. 15. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и спект- рах COSY, показанных на рис. 1.122-1.125, сделайте отнесение сигналов в спектре. Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.58с. 16. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.120, и спект- рах COSY, показанных на рис. 1.122-1.125, сделайте отнесение сигналов в спектре. Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.58d. 17. Объясните существование кросспика между сигналами 7.34 м.д. и 2.35 м.д. в спектре COSY, показанном на рис. 1.124. В каких из возможных вариантов структуры молекулы может наблюдаться этот кросспик? 18. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.135-1.137, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.120, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигналов используйте также спектры COSY, показанные на рис. 1.122-1.125. Счи- тайте, что соединению отвечает структура 1.58а. Рис. 1.122. Обзорный спектр COSY соединения 1.58. 262
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.123. Спектр COSY соединения 1.58. Фрагмент сигналов алифатичес- ких протонов. Рис. 1.124. Спектр COSY соединения 138. Фрагмент сигналов алифатичес- ких протонов. Связь с сигналами, которые находятся в слабом поле. 263
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.125. Спектр COSY соединения 138. Фрагмент сигналов ароматичес- ких протонов. 19. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.135-1.137, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.120, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигналов используйте также спектры COSY, показанные на рис. 1.122-1.125. Счи- тайте, что соединению отвечает структура 1.58b. 20. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.135-1.137, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.120, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигналов используйте также спектры COSY, показанные на рис. 1.122-1.125. Счи- тайте, что соединению отвечает структура 138с. 21. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.135-1.137, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.120, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигналов используйте также спектры COSY, показанные на рис. 1.122-1.125. Счи- тайте, что соединению отвечает структура 1.58d. 22. Основываясь на спектрах на ядрах ’Н и |3С, показанных на рис. 1.120- 1.121, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.126-1.134, отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Составьте таблицу ге- тероядерных корреляций. Постройте схему отнесений сигналов на ядрах |3С 264
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса и *Н и приведите на ней важнейшие корреляции НМВС, которые были ис- пользованы для отнесения сигналов. Отвечают ли спектры структуре 1.58а? 23. Основываясь на спектрах на ядрах !Н и 13С, показанных на рис. 1.120- 1.121, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.126-1.134, отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Составьте таблицу ге- тероядерных корреляций. Постройте схему отнесений сигналов на ядрах 13С и Н и приведите на ней важнейшие корреляции НМВС, которые были ис- пользованы для отнесения сигналов. Отвечают ли спектры структуре 1.58b? 24. Основываясь на спектрах на ядрах !Н и 13С, показанных на рис. 1.120- 1.121, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.126-1.134, отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Составьте таблицу ге- тероядерных корреляций. На структурной формуле приведите отнесения сигналов на ядрах 13С и *Н и стрелками покажите важнейшие корреляции НМВС, которые были использованы для отнесения сигналов. Отвечают ли спектры структуре 1.58с? 25. Основываясь на спектрах на ядрах !Н и 13С, показанных на рис. 1.120- 1.121, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.126-1.134, отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Составьте таблицу гетероядерных корреляций. На структурной формуле приведите отнесения сигналов на ядрах 13С и ’Н и стрелками покажите важнейшие корреляции НМВС, которые были использованы для отнесения сигналов. Отвечают ли спектры структуре 1.58d? (ppm)) з- 6о 0-8 • F1 (ppm) 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 Рис. 1.126. Обзорный спектр НМВС соединения 1.58. 265
Глава 1. Интерпретация спектров a_jvJJ V I _julJU НМВС соединения 1.58. 180 155 150 145 140 135 130 125 120Р1(РР<п) Рис. 1.128. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.58. 266
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.129. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.58. Рис. 1.130. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.58. 267
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.131. Фрагмент спектра НМВС соединения 138. Рис. 1.132. Обзорный спектр HMQC соединения 1.58. 268
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 269
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.136. Фрагмент спектра NOESY соединения 138. 270
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.137. Фрагмент спектра NOESY соединения 1.58. 1.24.2. Блок задач 2. Найдите строение соединения Синтезированное соединение может иметь одну из четырех структурных формул 1.59a-d: 1.59с 271
Глава 1. Интерпретация спектров 26. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, и исполь- зуя таблицы 1.4-1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.59а. Есть ли в образце при- меси? Рис. 1.138. Спектр на ядрах *Н соединения 1.59 в ДМСО-4/б- 27. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, и исполь- зуя таблицы 1.4-1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.59b. Есть ли в образце при- меси? 28. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, и исполь- зуя таблицы 1.4-1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.59с. Есть ли в образце при- меси? 29. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, и исполь- зуя таблицы 1.4-1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.59d. Есть ли в образце при- меси? 30. Основываясь на спектре 13С, показанном на рис. 1.139, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.59а. 31. Основываясь на спектре 13С, показанном на рис. 1.139, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.59b. 272
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.139. Спектр на ядрах 13С соединения 1.59 в ДМСО-de- 32. Основываясь на спектре |3С, показанном на рис. 1.139, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.59с. 33. Основываясь на спектре 13С, показанном на рис. 1.139, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.59d. 34. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблюда- ются ли в спектре дальние КССВ? Используя соотношение Карплуса и таб- лицы 1.4-1.9, найдите, какие из заместителей имеют трансоидную ориен- тацию, а какие - цисоидную. Считайте, что соединению отвечает форму- ла 1.59а. 35. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблюда- ются ли в спектре дальние КССВ? Используя соотношение Карплуса и таб- лицы 1.4-1.9, найдите, какие из заместителей имеют трансоидную ориен- тацию, а какие - цисоидную. Считайте, что соединению отвечает форму- ла 1.59b. 36. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблюда- ются ли в спектре дальние КССВ? Используя соотношение Карплуса и таб- лицы 1.4-1.9, найдите, какие из заместителей имеют трансоидную ориен- тацию, а какие - цисоидную. Считайте, что соединению отвечает форму- ла 1.59с. 273
Глава 1. Интерпретация спектров 37. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблюда- ются ли в спектре дальние КССВ? Используя соотношение Карплуса и таб- лицы 1.4-1.9, найдите, какие из заместителей имеют трансоидную ориен- тацию, а какие - цисоидную. Считайте, что соединению отвечает форму- ла 1.59d. 38. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, и спект- ре COSY, показанном на рис. 1.140, сделайте отнесение сигналов в спектре. Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.59а. । lh 1 । i> Рис. 1.140. Спектр COSY соединения 1.59. 39. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, и спект- ре COSY, показанном на рис. 1.140, сделайте отнесение сигналов в спектре. Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.59b. 40. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, и спект- ре CO$Y, показанном на рис. 1.140, сделайте отнесение сигналов в спектре. Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.59с. 274
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 41. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.138, и спект- ре COSY, показанном на рис. 1.140, сделайте отнесение сигналов в спектре. Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.59d. 42. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.141-1.143, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.138, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигналов используйте также спектр COSY, который приведен на рис. 1.140. Считай- те, что соединению отвечает структура 1.59а. 43. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.141-1.143, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.138, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигналов используйте также спектр COSY, который приведен на рис. 1.140. Считай- те, что соединению отвечает структура 1.59b. 44. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.141-1.143, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.138, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигналов используйте также спектр COSY, который приведен на рис. 1.140. Считай- те, что соединению отвечает структура 1.59с. Рис. 1.141. Обзорный спектр NOESY соединения 1.59. 275
Глава 1. Интерпретация спектров Мл 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 F1 (ppm) Рис. 1.142. Фрагмент спектра NOESY соединения 139. Рис. 1.143. Фрагмент спектра NOESY соединения 1.59. 276
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 45. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.141-1.143, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.138, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигналов используйте также спектр COSY, который приведен на рис. 1.140. Считай- те, что соединению отвечает структура 1.59d. 46. Основываясь на спектрах на ядрах !Н и 13С, показанных на рис. 1.138 и 1.139, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.144- 1.148, отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Приведите таб- лицу гетероядерных корреляций. Постройте схему молекулы, где приве- дены отнесения сигналов и важнейшие НМВС корреляции. Отвечают ли спектры структуре 1.59а? 47. Основываясь на спектрах на ядрах !Н и 13С, показанных на рис. 1.138 и 1.139, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.144- 1.148, отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Приведите таб- лицу гетероядерных корреляций. Постройте схему молекулы, где приве- дены отнесения сигналов и важнейшие НМВС корреляции. Отвечают ли спектры структуре 1.59b? .........1......................... 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ' Рис. 1.144. Обзорный спектр HMQC соединения 1.59. 277
Глава 1. Интерпретация спектров 121 F1 (ppm) Рис. 1.145. Фрагмент спектра HMQC соединения 1.59. Рис. 1.146. Обзорный спектр НМВС соединения 1.59. 278
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.147. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.59. 129.5 129.0 129.5 120.0 127.5 127.0 126.5 126.0 125 5 125.0 Рис. 1.148. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.59. 279
Глава 1. Интерпретация спектров 48. Основываясь на спектрах на ядрах 'Н и |3С, показанных на рис. 1.138 и 1.139, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.144- 1.148, отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Приведите таб- лицу гетероядерных корреляций. Постройте схему молекулы, где приве- дены отнесения сигналов и важнейшие НМВС корреляции. Отвечают ли спектры структуре 1.59с? 49. Основываясь на спектрах на ядрах *Н и 13С, показанных на рис. 1.138 и 1.139, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.144- 1.148, отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Приведите таб- лицу гетероядерных корреляций. Постройте схему молекулы, где приве- дены отнесения сигналов и важнейшие НМВС корреляции. Отвечают ли спектры структуре 1.59d? 1.24.3. Блок задач 3. Найдите строение соединения Синтезированное органическое соединение может иметь одну из четырех структурных формул 1.60a-d, которые приведены ниже. 1.60b 50. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, и ис- пользуя таблицы 1.4-1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если счи- тать, что структура молекулы отвечает формуле 1.60а. Отвечает ли спектр структуре молекулы? 51. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, и ис- пользуя таблицы 1.4-1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если счи- тать, что структура молекулы отвечает формуле 1.60b. Отвечает ли спектр структуре молекулы? 280
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.149. Спектр на ядрах 'Н соединения 1.60. 52. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, и ис- пользуя таблицы 1.4-1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если счи- тать, что структура молекулы отвечает формуле 1.60с. Отвечает ли спектр структуре молекулы? 53. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, и ис- пользуя таблицы 1.4-1.9, сделайте отнесение сигналов в спектре, если счи- тать, что структура молекулы отвечает формуле 1.60d. Отвечает ли спектр структуре молекулы? 54. Основываясь на спектре 13С, показанном на рис. 1.150, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.60а. 55. Основываясь на спектре |3С, показанном на рис. 1.150, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.60b. 56. Основываясь на спектре |3С, показанном на рис. 1.150, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.60с. 57. Основываясь на спектре |3С, показанном на рис. 1.150, и используя таблицы 1.14-1.22, сделайте отнесение сигналов в спектре, если считать, что структура молекулы отвечает формуле 1.60d. 58. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблю- даются ли в спектре дальние КССВ? Считайте, что соединению отвечает формула 1.60а. 281
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.150. Спектр на ядрах 13С соединения 1.60. 59. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблю- даются ли в спектре дальние КССВ? Считайте, что соединению отвечает формула 1.60b. 60. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблю- даются ли в спектре дальние КССВ? Считайте, что соединению отвечает формула 1.60с. 61. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, найдите величины химических сдвигов и КССВ для всех мультиплетов. Наблю- даются ли в спектре дальние КССВ? Считайте, что соединению отвечает формула 1.60d. 62. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, и спект- ре COSY, показанном на рис. 1.151, сделайте отнесение сигналов в спектре. Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.60а. Отвечает ли спектр структуре молекулы? 63. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, и спект- ре COSY, показанном на рис. 1.151, сделайте отнесение сигналов в спектре. Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.60b. Отвечает ли спектр структуре молекулы? 64. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, и спект- ре COSY, показанном на рис. 1.151, сделайте отнесение сигналов в спектре. 282
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.60с. Отвечает ли спектр структуре молекулы? 65. Основываясь на спектре, который изображен на рис. 1.149, и спект- ре COSY, показанном на рис. 1.151, сделайте отнесение сигналов в спектре. Какие спиновые системы содержатся в спектре? Считайте, что соединению отвечает формула 1.60d. Отвечает ли спектр структуре молекулы? Рис. 1.151. Спектр COSY соединения 1.60. 66. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.152 и 1.153, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.149, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигна- лов используйте также спектр COSY, который приведен на рис. 1.151. Счи- тайте, что соединению отвечает структура 1.60а. Согласуются ли спектры с формулой соединения? 67. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.152 и 1.153, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.149, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигна- лов используйте также спектр COSY, который приведен на рис. 1.151. Счи- тайте, что соединению отвечает структура 1.60b. Согласуются ли спектры с формулой соединения? 283
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.152. Обзорный спектр NOESY соединения 1.60. Рис. 1.153. Фрагмент спектра NOESY соединения 1.60. 284
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 68. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.152 и 1.153, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.149, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигна- лов используйте также спектр COSY, который приведен на рис. 1.151. Счи- тайте, что соединению отвечает структура 1.60с. Согласуются ли спектры с формулой соединения? 69. Основываясь на спектрах NOESY, показанных на рис. 1.152 и 1.153, и на протонном спектре, который изображен на рис. 1.149, определите, ка- кие протоны в молекуле сближены в пространстве. Для отнесений сигна- лов используйте также спектр COSY, который приведен на рис. 1.151. Счи- тайте, что соединению отвечает структура 1.60d, Согласуются ли спектры с формулой соединения? 70. Основываясь на спектрах на ядрах 'Н и 13С, показанных на рис. 1.149 и 1.150, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.154- 1.159, постройте таблицу гетероядерных корреляций и отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Отнесение сигналов покажите на схеме. Для отнесения протонного спектра используйте спектр COSY, который при- веден на рис. 1.151. Отвечают ли спектры структуре 1.60а? Рис. 1.154. Обзорный спектр HMQC соединения 1.60. 285
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.155. Фрагмент спектра HMQC соединения 1.60. Рис. 1.156. Обзорный спектр НМВС соединения 1.60. 286
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 1.157. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.60. Рис. 1.158. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.60. 287
Глава 1. Интерпретация спектров Рис. 1.159. Фрагмент спектра НМВС соединения 1.60. 71. Основываясь на спектрах на ядрах *Н и 13С, показанных на рис. 1.149 и 1.150, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.154- 1.159, постройте таблицу гетероядерных корреляций и отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Отнесение сигналов покажите на схеме. Для отнесения протонного спектра используйте спектр COSY, который при- веден на рис. 1.151. Отвечают ли спектры структуре 1.60b? 72. Основываясь на спектрах на ядрах *Н и 13С, показанных на рис. 1.149 и 1.150, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.154- 1.159, постройте таблицу гетероядерных корреляций и отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Отнесение сигналов покажите на схеме. Для отнесения протонного спектра используйте спектр COSY, который при- веден на рис. 1.151. Отвечают ли спектры структуре 1.60с? 73. Основываясь на спектрах на ядрах *Н и 13С, показанных на рис. 1.149 и 1.150, а также на спектрах HMQC и НМВС, показанных на рис. 1.154— 1.159, постройте таблицу гетероядерных корреляций и отнесите сигналы в углеродном спектре соединения. Отнесение сигналов покажите на схеме. Для отнесения протонного спектра используйте спектр COSY, который при- веден на рис. 1.151. Отвечают ли спектры структуре 1.60d? 288
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР 2.1. Атомное ядро Для того, чтобы понять явление ЯМР, необходимо, прежде всего, уяснить, что собой представляет атомное ядро. В соответствии с современными пред- ставлениями атомные ядра состоят из элементарных частиц - протонов, р, и нейтронов, п. Протон - элементарная частица с массой покоя 1.673х10"24 г, заря- дом +1, спином Уг и магнитным моментом, который равняется 2.79 ядерно- го магнетона. Нейтрон - элементарная частица с массой покоя 1.675Х10-24 г, заря- дом 0, спином Уг и магнитным моментом, который равняется 1.91 ядерного магнетона. Интересно, что несмотря на близость массы протон и нейтрон (нуклоны) обладают неодинаковым магнитным моментом. Элементарные частицы характеризуются массой, зарядом, спином и магнитным моментом. В ядре эти параметры нуклонов складываются. Та- кие параметры, как масса и заряд нам хорошо известны. Их сложение про- исходит аддитивно, как и в макрообъектах. Масса ядра равна сумме масс нуклонов, а его заряд - сумме зарядов протонов. Со спином и магнитным моментом не все так просто. Спин характеризует квантовые свойства ядра. Эти свойства проявля- ются при поглощении ядром дополнительной энергии. Ядро не может погло- щать произвольное количество энергии, а лишь определенную ее порцию - квант энергии. После поглощения кванта энергии ядро переходит на воз- бужденный энергетический уровень. В зависимости от спина ядра таких возбужденных энергетических уровней может быть несколько. Если спин ядра обозначить как I, то возможное количество энергетических уровней ядра, N, будет равно 21+1. Минимальное значение спина равно Уг. Если подставить это значение в приведенную формулу, то окажется, что N = 2. Таким образом, минимальное количество уровней равно 2. Соответственно спин нуклона, находящегося на этих уровнях, будет равен +Уг и -Уг. Энер- гия спиновых состояний нуклонов различается не слишком сильно - она не сравнима по величине с энергией их теплового движения. Это приводит к тому, что существование обоих спиновых состояний оказывается равнове- роятным. Если в ядре имеется несколько однотипных нуклонов, то часть из них имеет положительное значение спина, а часть - отрицательное. Спин ядра формируется за счет спинов нуклонов, которые входят в его состав. В соответствии с современной теорией ядро имеет упорядоченное строение - нуклоны в нем расположены не хаотически, а занимают вполне определенные "орбиты”. При этом, как и в электронных оболочках атомов, 289
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР одинаковые нуклоны стремятся образовать устойчивые пары, различа- ющиеся знаком спина. Суммарный спин такой пары равен нулю. Таким об- разом, большая часть спинов нуклонов взаимно компенсируют друг друга. Поэтому спин ядра не бывает слишком большим, несмотря на то, что в его состав могут входить десятки нуклонов. Спин ядра редко превышает 5/2 - это соответствует 5 нескомпенсированным спинам нуклонов. Бывают случаи, когда все нуклоны в ядре образуют устойчивые пары с однотипными элементарными частицами (протоны - с протонами, а нейтро- ны - с нейтронами). Это происходит в тех случаях, когда и количество про- тонов, и количество нейтронов - четное. Такая ситуация наблюдается для ядер 12С и 16О. Такие ядра не имеют магнитных свойств и соответственно не дают сигналов ЯМР. Вследствие этого ядра делятся на два типа - маг- нитные и немагнитные. Магнитный момент ядра является суммой магнитных моментов нукло- нов, которые входят в его состав и не скомпенсированы нуклоном, име- ющим спин противоположного знака. Он возникает за счет того, что поло- жительно заряженное магнитное ядро не является статичным образовани- ем, а присутствующие в нем нуклоны находятся в состоянии непрерывного движения. Движение заряженных частиц эквивалентно току в кольцевом сверхпроводнике. Как известно, кольцевой ток создает вокруг себя магнит- ное поле, величина которого пропорциональна силе тока. Поэтому ядро имеет определенный механический момент и связанный с ним магнитный момент. Величина магнитного момента, ц, пропорциональна механическо- му моменту ядра, Р: Ц = УР. (2.1) Коэффициент пропорциональности, у, называется гиромагнитным отношением. Он характеризует величину магнитного момента ядра. Протоны и нейтроны удерживаются в ядре специфическими силами, которые во много раз эффективнее кулоновского отталкивания одноимен- ных частиц. Поэтому ядра атомов представляют собой вполне устойчивые образования, которые не изменяются при любых химических превращени- ях веществ, в состав которых они входят. Свойства ядра обусловлены ко- личеством протонов и нейтронов, которые входят в его состав. Поскольку число протонов в ядре равняется величине его положительного заряда или порядковому номеру элемента в периодической системе, то число нейтро- нов равно разности между массовым числом и порядковым номером эле- мента. Магнитные ядра можно, в первом приближении, представить как вра- щающуюся заряженную сферу либо как микроскопический магнит (точеч- ный диполь), вокруг которого имеется магнитное поле (рис. 2.1). 290
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 2.1. Магнитное поле, которое создает вокруг себя атомное ядро. Рядом показан вид магнитного поля магнита, который имеет те же размеры, что и ядро. Показанное на рис. 2.1 ядро имеет вид сферы. К такой форме близки ядра, которые имеют спин Уг. Если же спин ядра имеет большую величину, то форма ядра отличается от сферической. В этом случае его можно изобра- зить в виде эллипсоида вращения. Магнитное поле, создаваемое таким яд- ром, может иметь весьма сложную форму. 2.1.1. Магнитное ядро в магнитном поле При отсутствии внешнего магнитного поля энергетические состояния ядра являются одинаковыми (вырожденными), поэтому ориентация оси враща- тельного движения каждого ядра является совершенно произвольной и не зависимой от ориентации других магнитных ядер образца. Если внести образец, который содержит магнитные ядра, во внешнее магнитное поле (обозначим плотность его магнитного потока Во), то ядра благодаря своим магнитным свойствам будут ориентироваться в нем лишь совершенно оп- ределенным образом. Их поведение аналогично поведению микроскопи- ческой стрелки компаса, которая внесена в магнитное поле. Такая стрелка расположится вдоль силовых линий магнитного поля, причем Северный полюс стрелки будет направлен к Южному полюсу внешнего магнитного поля. Однако, в отличие от стрелки компаса, для которой существует лишь одна энергетически выгодная ориентация, для микроскопичес- ких магнитных моментов атомных ядер относительно этого поля мо- гут реализоваться несколько дискретных ориентаций. Это связано с тем, что спиновое квантовое число ядра допускает несколько возможных энергетических состояний ядра. В простейшем случае для ядер со спином Уг. таких как протоны, возможно существование только двух состояний, ко- торые обозначаются +Уг и -Уг. Для ядер с I = 1, например для дейтерия, воз- можными являются спиновые состояния +1, 0 и -1 (рис. 2.2). Если же спин ядра равен 3/2, то возможны 5 спиновых состояний. 291
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР 1= 1/2 1=1 1 = 3/2 Рис. 2.2. Ядро с магнитным квантовым числом I может принимать 21+1 ориентаций относительно приложенного статического магнитного поля Во. Для ядер со спином Уъ> где существуют всего два спиновых сос- тояния, их часто обозначают а и 0, причем принимают, что первое из них имеет несколько меньшую энергию. Легче всего спиновые состояния ядра со спином Уг представить себе, если считать, что ядро не является иде- альной сферой, а похоже по форме на sp-орбиталь (асимметрическая ган- тель). Во внешнем магнитном поле такое ядро своей осью всегда ориенти- руется вдоль силовых линий поля, поскольку именно такая ориентация от- вечает минимуму энергии системы, но для него возможны две неравноцен- ные ориентации, которые несколько различаются по энергии. В одной из них к Северному полюсу магнита направлен более объемистый конец ган- тели, а в другой - менее объемистый. Самопроизвольный переход ядра из одного состояния (против поля) во второе (по полю) не происходит из-за достаточно высокого энергетического барьера. Следует также учесть, что точная ориентация ядра вдоль поля запрещена принципом неопределеннос- ти Гейзенберга, поскольку в этом случае и локализация ядра, и его энергия были бы совершенно определенными. Поэтому магнитные моменты ядер ориентируются не точно вдоль поля, а под определенным углом к нему. В этом случае сохраняется неопределенность локализации ядра. Воздействие статического поля на магнитный момент ядра, располо- женный под углом к внешнему магнитному полю, можно смоделировать с помощью классической механики. Математически можно показать, что воздействие внешнего магнитного поля на магнитный момент ядра должно привести к прецессии магнитного момента ядра вокруг нап- равления поля Во. Таким образом, поле заставляет магнитный момент прецессировать вокруг него. Вследствие этого вектор магнитного момента ядра совершает круговые движения вокруг направления поля Во (рис. 2.3). Если считать ядро похожим на асимметрическую гантель, то в одном спи- новом состоянии более объемный конец гантели будет прецессировать вдоль поля, а в другом - против поля. Такое движение будем в дальнейшем называть Ларморовой прецессией. Она аналогична движению гироскопа в гравитационном поле Земли, когда гироскоп вращается вокруг своей оси и 292
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса одновременно прецессирует вокруг направления гравитационного поля. Пре- цессия описывается угловой скоростью со (радиан/с) или частотой v (Гц): со = уВ0 (рад/с), (2.2) ¥ = -уВо/2л^уВо(Гц). (2.3) Во Во В z z прецессия магнитного момента состояние а Рис. 2.3. Статическое магнитное поле, приложенное к ядру, является при- чиной его прецессии. Поле приложено вдоль оси z декартовой системы ко- ординат, а движение ядра представлено как движение векторов по поверх- ности конуса. Состояния а и Р можно представить себе как результат сло- жения векторов ц1 и ц2, возникающих при прецессии ядра, если считать его похожим на асимметричную гантель. Направление движения определяется знаком у. Оно может происхо- дить по часовой стрелке или против нее, однако всегда в одну сторону для всех ядер данного типа. Разница энергий состояний а и Р весьма невелика по сравнению с энергетическим барьером перехода между спиновыми сос- тояниями, поэтому самопроизвольный переход между ними маловероятен. Можно показать, что время жизни изолированного спина в определенном 293
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР спиновом состоянии может составлять миллиарды лет. Поэтому в реальных образцах химических соединений часть спинов находится в состоянии а, а другая часть - в состоянии р. Для того, чтобы между спиновыми состояни- ями могли осуществляться переходы, необходимо внешнее воздействие. Таким внешним воздействием является электромагнитное облучение, час- тота которого совпадает с частотой прецессии ядерных спинов. Переход между спиновыми состояниями сопровождается поглощением или излуче- нием кванта энергии. Эту энергию можно найти из соотношения: АЕ = hv = ЬуВо/2т1, (2.4) где h - постоянная Планка. Спектрометр ЯМР - это прибор, способный создать условия для пере- ходов между спиновыми состояниями и зафиксировать происходящее при этом поглощение энергии. Таким образом, резонансная частота ядра равня- ется его Ларморовой частоте. Новейшие спектрометры ЯМР высокого раз- решения имеют напряженность магнитного поля до 20 Т (Тесла), что для протонов отвечает резонансной частоте 900 МГц. Для других ядер в том же самом поле частота поглощения будет отличной от протонов вследствие ее зависимости от гиромагнитного отношения конкретного ядра. Общеприня- той является практика характеризовать приборы по той частоте, которая отвечает резонансу протонов. Так, например, если используется спектро- метр на 400 МГц, то протоны на нем поглощают при 400 МГц, а ядра угле- рода-13 - при 100 МГц, поскольку ун/ус = 4. В таблице 2.1 приведены час- тоты поглощения на таком спектрометре наиболее важных магнитных ядер. Таблица 2.1. Свойства важнейших ядер со спином Уг Изотоп Естественное содержание, % Частота ЯМР*, МГц Относительная чувствительность** 1 2 3 4 'н 99.98 400.0 1.0 Зн 0 426.7 12*** 13С 1.11 100.6 1.76x10“* ,5n 0.37 40.5 3.85x1 О’6 ,9f 100.00 376.3 0.83 29Si 4.7 79.5 3.69x10“* Яр 100.00 161.9 6.63Х10’2 77Se 7.58 76.3 5.25x10“* ,03Rh 100.00 12.6 З.НхЮ’5 294
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 1 2 3 4 ll3Cd 12.16 88.7 1.33x10*3 ll9Sn 8.58 149.1 4.44x10"3 ,83W 14.40 16.6 1.03x10’5 ,95Pt 33.80 86.0 З.ЗбхЮ*3 207pb 22.60 83.7 2.07x10’3 Рис. 2.4. Компоненты про- дольной и поперечной на- магниченностей , которые возникают в магнитном поле для ядра, находяще- гося в состоянии Лармо- ровой прецессии. * Частоты приведены для спектрометра на 400 МГц (магнит 9.4 Т). ** Чувствительности даны относительно протонов; они включают сомножители чувствительности ядра и его естественного содержания. *** При условии 100% 3Н обогащения. Формула (2.4) показывает, что величина кванта энергии, ДЕ, которая поглощается ядром, пропорциональна силе внешнего магнитного поля Во. Понятно, что чем больше энергии поглощается в эксперименте ядерного магнитного резонанса, тем легче ее зарегистрировать. Поэтому чувстви- тельность эксперимента возрастает при использовании спектрометров с бо- лее мощными магнитами. Именно в этом и состоит смысл использования возможно более мощных магнитов, несмотря на существенный рост цены приборов. При рассмотрении явления ЯМР наиболее часто считают, что стати- ческое магнитное поле располагается вдоль оси z декартовой системы ко- ординат. Поэтому магнитные моменты ядер, которые прецессируют в магнитном поле под некоторым углом к нему, всегда имеют ком- поненту намагниченности вдоль этой оси (ц|| на рис. 2.4). Эта компонента называется про- дольной намагниченностью. Другая компо- нента намагниченности, pJ_, расположена в перпендикулярном направлении в плоскости х-у (поперечная намагниченность) (рис. 2.4). Теперь рассмотрим, как статическое маг- нитное поле воздействует на реальный обра- зец химического вещества, содержащего боль- шое количество одинаковых ядер со спином 1/2. Про такой образец говорят, что он содер- жит ансамбль ядер. Такая ситуация реализу- зить каждое из магнитных ядер образца в ви- де капли, расположенной под углом к внешнему полю, то для ориентации магнитных моментов отдельных ядер в ансамбле, помещенном во внешнее ется, например, для хлороформа. Если изобра 295
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР '0 шт AS Рис. 2.5. Ориентация во внеш- нем магнитном поле магнит- ных моментов отдельных ядер образца, содержащего ядра од- ного типа со спином 1/2. магнитное поле Во, получим картину, показанную на рис. 2.5. Вероятность пребывания ядра на каж- дом из энергетических уровней можно охарактеризовать физическим параметром, который носит название заселенности уровня. Заселенность - это доля или про- цент ядер, которые находятся на каж- дом из энергетических уровней. Чем более энергетически выгодным является уровень, тем больше ядер будет на нем находиться. Как указывалось раньше, ори- ентация спинов в направлении приложен- ного поля, а, имеет немного более низкую энергию, чем ориентация 0. Разность энер- гий спиновых состояний можно обозна- чить как ДЕ. Образец находится в сос- тоянии теплового равновесия. Это означает, что существует определенное равновесие между всеми возможными энергетическими состояниями ядер. Количественно заселенности уровней можно вычислить с помощью статистического распределения Больцмана. В соответствии с ним излишек заселенности энергетически более выгодного уровня будет составлять: Na/Np = еЛЕ/ит, (2.5) где Na, Np отвечают количеству ядер с определенной спиновой ориентацией, R - универсальная газовая постоянная, Т - абсолютная температура, К. Из формулы вытекает, что отношение заселенностей энергетических уровней (спиновых состояний) определяется разностью их энергии, а она, в свою очередь, как это мы видели раньше, пропорциональна напряженности внешнего магнитного поля. Поэтому смысл использования мощных магни- тов заключается также и в увеличении разности заселенностей энергети- ческих уровней, что ведет к повышению чувствительности эксперимента. Однако даже в самых сильных полях разность энергии между уровнями яв- ляется довольно малой, поэтому и разность в заселенностях уровней также не очень велика и составляет около 10001 : 10000. Именно вследствие ма- лой разности заселенностей энергетических уровней метод ЯМР малочув- ствителен по сравнению с такими спектроскопическими методами, как ИК или УФ, где разность энергии между основным и возбужденным состояни- ями является значительно большей. 296
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Если магнитный момент каждого из ядер образца представить в виде вектора, то намагниченность всего образца, который содержит множество одинаковых магнитных ядер, находящихся в состояниях а и 0, будет фор- мироваться за счет суммирования векторов ядер. Каждый из таких векто- ров занимает определенное положение на конусе прецессии. Поскольку движение векторов происходит независимо один от другого (несинхронно), то намагниченность образца можно представить себе как конусы прецес- сии, которые полностью заполнены векторами отдельных магнитных ядер. Конусы прецессии, отвечающие состояниям а и Р, имеют общую вершину (рис. 2.6). Рис. 2.6. В векторной модели ЯМР множество одинаковых спинов пред- ставлены стрелками, которые равномерно распределены по поверхностям двух конусов прецессии. Если найти векторную сумму всех этих векторов, получим суммарный вектор Мо, который направлен к оси +z. Он отвечает избытку спинов в состоянии а. Если рассмотреть такую систему векторов, отвечающих спинам от- дельных ядер, то можно увидеть, что большинство векторов в ней имеют векторы-антиподы, направленные в противоположную сторону. Векторная сумма таких пар векторов будет равняться нулю. Суммарная намагничен- ность образца формируется лишь за счет тех векторов, которые не имеют антиподов. Их векторная сумма образует вектор намагниченности Мо вдоль внешнего поля (рис. 2.6). Таким образом, суммарная намагничен- ность образца появляется из-за разности заселенностей энергетичес- ких уровней ядра. Поскольку векторы отдельных ядер равномерно рас- пределены по конусу прецессии, то в образце, который помещен во внеш- нее магнитное поле, не возникает поперечной намагниченности в плоскос- ти х-у (усредненная намагниченность в этой плоскости равняется нулю). 297
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Поэтому мы можем упростить нашу картину намагниченности образца во внешнем магнитном поле, заменив множество векторов намагниченнос- ти отдельных ядер одним вектором намагниченности Мо, направленным вдоль направления приложенного магнитного поля. Вектор Мо называет- ся вектором макроскопической ядерной намагниченности. Такая упро- щенная векторная модель называется векторной моделью Блоха в честь од- ного из основоположников ЯМР Феликса Блоха или просто векторной мо- делью ЯМР. Таким образом, при внесении образца, который содержит маг- нитные ядра, в магнитное поле возникает определенная намагниченность, которая описывается вектором Мо. При рассмотрении эффекта внешних воздействий на спиновую систему во многих случаях можно считать, что воздействие осуществляется именно на вектор макроскопической ядерной намагниченности. 2.1.2. Воздействие на ядерный спин электромагнитного поля Теперь давайте представим себе, что будет происходить, если на единич- ный ядерный спин воздействует, помимо внешнего постоянного магнитно- Рис. 2.7. Одновременное воздействие на единич- ный ядерный спин стати- ческого магнитного поля Во и перпендикулярного к нему электромагнитного поля Вь Результатом их совместного воздействия является эффективное по- ле Вэфф, направленное под углом 0 к Во. го поля Во, также и переменное электромаг- нитное облучение определенной частоты. По- скольку в эксперименте ЯМР нашей задачей является выведение спина из равновесного состояния, то электромагнитное поле должно быть определенным образом ориентировано относительно внешнего поля. Наиболее силь- но оно воздействует на ядерный спин, если магнитный вектор этого поля расположен в плоскости х-у, перпендикулярной направле- нию Во. Если на ядерный спин одновременно воздействуют два магнитных поля, статичес- кое и переменное, то ядерный магнитный мо- мент ощущает некоторое эффективное поле Вэфф, которое является результатом суммиро- вания обоих полей. На рис. 2.7 показана ситу- ация, которая возникает при ортогональном расположении вектора статического поля Во и электромагнитного поля Вь Математически можно показать, что ре- зультат суммирования векторов таких полей зависит от ориентации и частоты электромагнитного поля. Он подчиняется формуле: 298
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса tg0 = B1/[Bo(l-(D/(Do)], (2.6) где 0)о - Ларморова частота ядра, со - частота вращения магнитного вектора электромагнитного поля в плоскости х-у. Из формулы следует, что воздейст- вие электромагнитного поля на магнитный момент ядра, которое характе- ризуется углом отклонения, 0, ядерного спина от равновесного состоя- ния, невелико во всех случаях за исключением того, когда 0) = (Оо- В этом случае сомножитель (1 - cd/(jl)o) в уравнении (2.6) равен нулю и соот- ветственно tg0 приближается к бесконечности, а угол 0 - к 90° Таким об- разом, в случае, если нам удается создать ситуацию, которая изображена на рис. 2.7, воздействие электромагнитного поля на ядерный спин многократ- но превышает воздействие статического магнитного поля. Спин перестает ощущать статическое поле и начинает прецессировать вокруг направ- ления поля Bj. Эта прецессия происходит в плоскости, перпендикулярной направлению поля Вь Она приводит к смещению вектора ядерного спина от равновесного значения и появлению его проекции в плоскости х-у. Как только появляется составляющая магнитного момента в плоскости х-у, про- исходит поглощение энергии, которое можно регистрировать в виде сигна- ла ЯМР. На рис. 2.7 изображены векторы сил, которые воздействуют на магнит- ное ядро. Однако если бы мы попытались изобразить на таком рисунке и магнитный момент ядра, то пришлось бы отражать на нем тот факт, что спин ядра находится в движении. Сделать это не так просто. Поэтому для визуализации взаимодействия прецессирующего магнитного момента ядра с вращающимся магнитным вектором электромагнитного поля придумали специальный подход, который называется вращающейся системой коорди- нат (ВСК). 2.1.3. Явление ЯМР и вращающаяся система координат (ВСК) Как мы уже отмечали, явление ЯМР происходит при облучении образца, помещенного в сильное магнитное поле, радиоволнами определенной час- тоты. Для более наглядного представления процессов, которые происходят во время эксперимента ЯМР, применяется ряд упрощений. Во-первых, счи- тают, что при облучении образца электромагнитным полем существует компонента поля, которая вращается в плоскости х-у. Наличие такой ком- поненты достаточно вероятно, поскольку катушка датчика, которая облу- чает образец, имеет ориентацию, обеспечивающую наиболее полное погло- щение образцом электромагнитной энергии. В катушке генерируется плос- ко поляризованное электромагнитное излучение. Его можно описать векто- ром, который направлен вдоль какой-то оси в плоскости х-у. Пусть это бу- дет ось х. Поскольку электромагнитное поле можно считать синусоидаль- 299
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР ным колебанием определенной частоты, то вектор, который его описывает, постоянно изменяет свою величину - он колеблется вдоль оси х (рис. 2.86). Из физики известно, что такое колебание эквивалентно действию двух цир- кулярно-поляризованных электромагнитных волн, которые описываются магнитными векторами, вращающимися в плоскости х-у в противополож- ных направлениях (рис. 2.8а). а) б) Рис. 2.8. Плоско-поляризованное электромагнитное облучение создает пе- ременное магнитное поле вдоль одной оси (здесь ось х). Его можно описать двумя векторами, которые вращаются в противоположных направлениях в поперечной плоскости (а). Амплитуда результирующего вектора вдоль оси х меняется по синусоидальному закону (б). Взаимодействие электромагнитного поля с векторами магнитных ядер наиболее просто представить себе, если использовать не обычную стати- ческую систему координат, а систему координат, которая вращается с часто- той Ларморовой прецессии вокруг оси z (рис. 2.9). В этой системе со сторо- ны постороннего наблюдателя, который находится вне ее, набор координат х, у и z будет также вращаться с частотой ядерной прецессии. Если же наб- людатель находится во вращающейся системе координат (ВСК), ситуация будет другой. Такой наблюдатель не замечает вращения системы координат. Концепцию вращающейся системы координат лучше всего проиллюст- рировать с помощью следующей аналогии. Вообразите себе, что Вы стоите на земле и смотрите на детскую карусель. Вы видите детей на карусели, которые относительно Вас вращаются по кругу. Это отвечает наблюдению из лабораторной системы координат (рис. 2.10а). Теперь вообразите, что Вы будете видеть, если сами станете на карусель во время ее вращения. Те- перь Вы вращаетесь с той же угловой частотой, что и предметы, располо- женные на карусели. Поэтому Вы видите их неподвижными. Их движение, с Вашей точки зрения, оказалось замороженным. Теперь Вы смотрите на них во вращающейся системе координат (рис. 2.106). 300
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса лабораторная система координат вращающаяся система координат Рис. 2.9. Лабораторная и вращающаяся системы координат. В лаборатор- ной системе координат невозможно показать, как на вектор спина ядра Мо воздействуют компоненты электромагнитного поля, которые вращаются в противоположные стороны. В ВСК положение одной компоненты электро- магнитного поля остается постоянным, в то время как движение другой, которая вращается в противоположную сторону, происходит с частотой, далекой от резонансных условий. Ее можно игнорировать. Для лабораторной системы координат и ВСК применяют разные обо- значения - х, у, z и х, у, z\ соответственно, как это показано на рис. 2.9. Од- нако, в дальнейшем, если не будет возникать неопределенности в представ- лении материала, мы и для ВСК будем использовать для осей обозначения х, у, z. Таким образом, если в ВСК рассмотреть вращение двух векторов цир- кулярно поляризованного электромагнитного поля, то один из них будет неподвижным, поскольку частота осцилляции радиочастотного поля точно отвечает частоте ядерной прецессии, которая удовлетворяет условиям маг- нитного резонанса, а частота вращения второго вектора, который вращает- ся в противоположном направлении, возрастает вдвое. Таким образом, дви- жение этого вектора является далеким от условий резонанса и его взаимо- действием с ядрами можно пренебречь. Аналогично, прецессионное дви- жение спинов в этой системе координат также замораживается, поскольку оно происходит с той же самой угловой скоростью и в том же направле- нии, что и у вектора радиочастотного поля. Поэтому в ВСК интересующие нас векторы магнитных моментов ядер и магнитная компонента электро- магнитного поля, воздействующая на ядра, являются неподвижными. Это позволяет рассматривать их на обычном статичном рисунке. Главным пре- имуществом такого рассмотрения является то, что достаточно сложные 301
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР процессы можно рассмотреть весьма наглядно, а сделанные при этом вы- воды согласуются с реальностью. Так, отсутствие прецессии ядер в ВСК свидетельствует о том, что в данном приближении намагниченность ведет себя так, как будто на нее не воздействует внешнее магнитное поле Во- Если это так, то исчезает и разность энергий спиновых состояний и появляется возможность с помощью очень слабых воздействий изменять ориентацию ядерных спинов, а следовательно, и суммарного вектора на- магниченности образца. Этот же самый вывод мы ранее сделали при рас- смотрении формулы (2.6), которая описывает результат одновременного воздействия на ядерный спин статического магнитного поля и электромаг- нитного поля. Рис. 2.10. Детскую карусель можно наблюдать из лабораторной (а) или вращающейся (б) системы координат. Таким образом, в ВСК на вектор намагниченности Мо действует исклю- чительно одна из компонент радиочастотного поля, которая имеет частоту Ларморовой прецессии. Сила переменного поля Bt в тысячи раз меньше силы поля Во, однако именно это слабое поле обусловливает переходы между спиновыми состояниями. Явление резонанса и состоит в погло- 302
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса щении энергии слабого поля, если его частота совпадает с собственной частотой ядерной прецессии. Следует, однако, помнить, что внешнее ста- тическое магнитное поле перестает влиять на ядерный спин лишь при ус- ловии резонанса. Если частота радиочастотного поля хоть немного отлича- ется от Ларморовой, на ядро начинает действовать суммарное эффективное поле Вэфф и влияние радиочастотного облучения будет существенно иным. Концепция ВСК позволяет рассматривать поведение магнитных мо- ментов ядер исключительно в условиях резонанса, то есть тогда, когда на ядра одновременно воздействуют постоянное магнитное поле Во и возбуж- дающее электромагнитное поле соответствующей частоты. Мы постоянно будем пользоваться этой системой для описания физических процессов, которые происходят с ядрами образца в датчике спектрометра ЯМР. 2.2. Способы возбуждения ядерных спинов Уже с самого момента открытия метода ЯМР были предложены два спосо- ба выведения спинов из состояния равновесия. Один из них основывался на медленном возрастании (сканировании) частоты генератора либо напря- женности внешнего магнитного поля. В ходе такого процесса условия ре- зонанса соблюдаются последовательно для всех магнитных ядер данного типа, находящихся в различном химическом окружении. Такой метод на- зывается стационарным возбуждением. Альтернативным подходом является подача на образец мощного радио- частотного импульса, способного одновременно возбудить весь спектраль- ный диапазон ядра. Хотя данный метод является потенциально более перс- пективным, однако вначале он не использовался. Все спектрометры ЯМР, выпускавшиеся до середины 70-х годов XX века, использовали метод ста- ционарного возбуждения. Свое развитие импульсный ЯМР получил лишь после разработки достаточно совершенных компьютеров, которые можно было устанавливать на спектрометр ЯМР. Это связано с тем, что импульс- ное возбуждение требует математической обработки сигнала ЯМР, кото- рую можно произвести только с использованием вычислительной техники. 2.2.1. Стационарное возбуждение ядерных спинов Для начала рассмотрим, как осуществляется поглощение энергии в экспе- рименте, когда образец, помещенный в магнит, облучается постоянным плоско-поляризованным электромагнитным полем, частота, со, которого меняется. Вначале эксперимента она несколько меньше резонансной, затем она доходит до частоты резонанса, too, и, наконец, становится больше нее. Рассмотрим, как при этом будет перемещаться вектор макроскопической ядерной намагниченности образца. В начале эксперимента этот вектор, 303
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР естественно, совпадает с направлением внешнего магнитного поля, распо- ложенного вдоль оси z. Рассмотрим данную ситуацию в ВСК, причем бу- дем считать, что магнитный вектор поля Bi направлен вдоль оси х\ В мо- мент резонанса, как уже указывалось, магнитные моменты отдельных ядер начинают вращаться (прецессировать) вокруг направления радиочастотно- го поля Вь Это приводит к тому, что и вектор макроскопической намагни- ченности образца также будет вращаться вокруг Вь Необходимо запом- нить, что это вращение всегда происходит по часовой стрелке. Вектор Мо при этом в плоскости x'-j' будет на 90° отставать от направления по- ля Вь Это правило позволяет нам заранее предсказать, по направлению к какой оси сместится вектор Мо. Например, если поле Bi направлено вдоль оси +х’, то электромагнитное поле должно смещать вектор макроскопичес- кой намагниченности в направлении оси -у. Эта ситуация, а также вариан- ты ориентации поля Bi вдоль других осей в плоскости х’-у’ представлены на рис. 2.11. Рис. 2.11. Траектория движения вектора макроскопической ядерной намаг- ниченности в момент резонанса (со = со0) при различной ориентации радио- частотного поля в плоскости х-у. 304
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Ориентация синусоидального колебания относительно системы коор- динат называется его фазой. Таким образом, путем изменения фазы радио- частотного поля можно менять траекторию движения вектора макроскопи- ческой ядерной намагниченности. В спектрометре ЯМР всегда имеется устройство для целенаправленного изменения фазы (ориентации) радио- частотного облучения. Это дает возможность менять фазу сигнала ЯМР. В момент резонанса, когда со = Шо, вектор Мо должен переместиться в плоскость х’-у, как это показано стрелкой на рис. 2.11. После прохождения частоты генератора через резонанс, когда со > С0о, вектор намагниченности должен переместиться в обратном направлении и снова оказаться на оси z. Таким образом, при прохождении через резонанс вектор осуществляет ко- лебание от оси z к оси у’ (или к другой оси в плоскости х’-У) и обратно. Если при этом измерять разность потенциалов на катушке датчика, то в момент резонанса можно зафиксировать поглощение энергии, то есть обнаружить сигнал ЯМР при со = too. Этот сигнал должен быть весьма узким, поскольку малейшее отклонение от условий резонанса ведет к возврату вектора на- магниченности к оси z и соответственно к прекращению поглощения энер- гии электромагнитного облучения. В простом описании явления ЯМР, представленном выше, мы не учи- тывали ряд факторов, которые сильно влияют на траекторию движения век- тора намагниченности при приближении к резонансным условиям. Прежде всего, следует вспомнить, как образовался вектор макроскопической ядер- ной намагниченности. Он образовался за счет векторного сложения маг- нитных моментов ядер, которые расположе- ны на поверхности двух конусов прецессии. Поэтому траектории движения векторов каж- дого из магнитных ядер могут различаться. При подходе к условиям резонанса векторы магнитных моментов ядер стремятся распо- ложиться максимально близко к оси у. Для этого они перемещаются по поверхности конуса, концентрируясь в одном месте, как это показано на рис. 2.12. Вследствие этого вектор макроскопи- ческой ядерной намагниченности движется не по дуге, расположенной в плоскости z-y\ а по кругу, центр которого расположен в плоскости z-y', а ось наклонена под неко- Рис. 2.12. Поворот вектора макроскопической ядерной намагниченности под дейст- вием радиочастотного поля, направленного вдоль оси +х. торым углом к оси z. Следует также учитывать, что в реальном образце, который содержит магнитные ядра, помимо процессов поглощения энер- гии электромагнитного облучения, протекают процессы потери намагни- 305
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР ценности, когда возбужденное ядро теряет избыток энергии в виде тепло- выделения. Этот процесс, как мы это уже знаем, называется релаксацией. Релаксация влияет на конечный угол наклона вектора макроскопической намагниченности. Без релаксации этот вектор в момент резонанса распола- гался бы на оси у, а при наличии релаксационных процессов он не доходит до этой оси. Таким образом, траектория движения вектора макроскопичес- кой ядерной намагниченности будет такой, как показано на рис. 2.13. Рис. 2.13. Круговая траектория движения вектора макроскопической ядер- ной намагниченности: (а) без учета релаксации в момент резонанса вектор расположен на оси у\ (б) с учетом релаксации вектор намагниченности в момент резонанса расположен под углом к оси у'. Показана также проекция траектории вектора на плоскость х'-у'. Сигнал ЯМР измеряется в плоскости х-у чаще всего вдоль одной из осей. Сигнал, в конечном итоге, пропорционален разности потенциалов на катушке датчика спектрометра. В свою очередь, эта разность потенциалов пропорциональна намагниченности вдоль соответствующей оси. Форма сигнала ЯМР определяется проекцией траектории движения макро- скопической ядерной намагниченности на плоскость х-у. При прохож- дении частоты передатчика через резонанс в каждый момент времени век- тор проходит через какую-то точку траектории. Эта точка имеет совершен- но определенную проекцию на плоскость х-у. Если производить измерения разности потенциалов на катушке, которая ориентирована вдоль оси у, то вблизи резонанса она будет постепенно меняться. Если измерение произво- дится вдоль оси у, то сигнал будет постепенно нарастать до максимального значения, а после прохождения резонанса он будет спадать до нуля. Это следует из того, что проекция траектории вектора макроскопической на- магниченности не меняет знака - она расположена в области положитель- ных значений оси у. Полученный сигнал ЯМР будет иметь вид волны с 306
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса максимумом. Такой сигнал называется сигналом поглощения. Если же про- изводить измерение сигнала ЯМР вдоль оси х, то вначале сигнал будет на- растать, поскольку проекция траектории на ось х возрастает, далее она убывает до нуля. Именно в этот момент соблюдаются условия резонанса. После этого сигнал меняет знак, доходит до минимального отрицательного значения и возрастает до нулевого значения. Таким образом, вдоль оси х вид сигнала близок к синусоиде. Такой сигнал называется сигналом дис- персии. Поскольку измерение сигналов поглощения и дисперсии проис- ходит вдоль осей, угол между которыми равен 90°, говорят, что сигналы сдвинуты по фазе на 90°. Описанная ситуация представлена на рис. 2.14. Рис. 2.14. Образование сигнала поглощения и сигнала дисперсии при ре- гистрации поглощения вдоль взаимно-перпендикулярных осей. Показана проекция вектора макроскопической ядерной намагниченности на плос- кость х-у. Приведены точки на сигналах поглощения и дисперсии, которые соответствуют одному и тому же моменту развертки спектра. В методе ЯМР принято работать с сигналами поглощения, поэтому стараются поставить эксперимент так, чтобы получить чистые сигналы 307
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР поглощения. Максимум такого сигнала соответствует резонансной частоте ядра. Следует, однако, отметить, что, имея сигнал одного типа, например сигнал поглощения, можно для каждой его точки рассчитать координаты соответствующей точки сигнала дисперсии. Для этого достаточно неслож- ных тригонометрических преобразований. Дело сводится к умножению ко- ординат точек сигнала (их амплитуды и частоты) на вычисленные коэффи- циенты. Эти коэффициенты называются фазовыми поправками. Если сиг- нал ЯМР записан в память компьютера, то его легко можно преобразовать из формы сигнала дисперсии в форму сигнала поглощения и наоборот. Поэтому совершенно безразлично, вдоль какой оси проводится измерение интенсивности поглощения - мы в любом случае можем представить сиг- нал в том виде, как нам это удобно. Обычно на спектрометре имеется компьютерная программа для корректировки фазы сигнала. 2.2.2. Импульсное возбуждение ядерных спинов Хотя представленное выше описание эксперимента ЯМР, основанного на медленном прохождении через условия резонанса путем постепенного изме- нения частоты генератора, является весьма наглядным, однако в настоящее время такой способ возбуждения не применяется, поскольку полностью вытеснен импульсным возбуждением. Импульсное возбуждение имеет ряд неоспоримых преимуществ. Главное из них - возможность одновременно- го возбуждения всех ядер одного типа за время, измеряемое микросекунда- ми. Это во много раз уменьшает длительность эксперимента и позволяет накопить в памяти компьютера сигнал от десятков и сотен последователь- ных импульсов. Импульс представляет собой ограниченное во времени облучение ядер- ных спинов монохроматическим радиочастотным полем высокой мощнос- ти, то есть мощным излучением одной частоты. На шкале времени он име- ет вид, представленный на рис. 2.15. Основной характеристикой импульса является его длительность. Чаще всего ее в спектроскопии ЯМР обозначают PW (Pulse Wide). От этого пара- метра зависит диапазон частот, которые возбуждает импульс. Для того, что- бы возбудить диапазон в 10 КГц, достаточный для большинства магнитных ядер, обычная длительность импульса составляет около 10 микросекунд (10 мкс). Каждый импульс можно охарактеризовать полосой возбуждения на шкале частот (или, точнее, профилем возбуждения). Для импульса пря- моугольной формы, показанного на рис. 2.15, профиль возбуждения имеет вид, показанный на рис. 2.16. Здесь вертикальная ось соответствует интен- сивности возбуждения. 308
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса PW ш Рис. 2.15. Схематическое изображение на шкале времени импульса дли- тельностью PW. В спектроскопии ЯМР такой импульс на шкале времени чаще всего обозначают прямоугольником. Рис. 2.16. Профиль полосы возбуждения для прямоугольного импульса. Зная длительность импульса, можно вычислить диапазон возбуждаемых частот (SW). Видно, что диапазон возбуждаемых частот (SW, Spectral Wide) обратно пропорционален длительности импульса PW. Поэтому чем короче будет им- пульс, тем большую полосу частот он может возбудить. Однако при этом мощность облучения распределяется по всему диапазону частот, поэто- му мощность импульсного возбуждения должна быть во много раз больше мощности непрерывного облучения. Это требует использования в спектро- метре специальных мощных импульсных генераторов. Как видно из рис. 2.16, воздействие импульса на ядра, которые разли- чаются по частоте, несколько неодинаково. Больше всего оно для частот, 309
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Рис. 2.17. Результат воздействия импульса в ВСК на векторы мак- роскопической ядерной намагни- ченности трех неэквивалентных магнитных ядер Цг, Цз- близких к несущей частоте импульса. По мере удаления от этой частоты интенсивность облучения плавно спадает. Для того, чтобы наверняка возбу- дить все ядра данного типа, используют импульсы большой мощности с тем, чтобы частоты поглощения ядер не приближались к краям возбужда- емого диапазона частот. Рассмотрим, как влияет в ВСК на макроскопическую ядерную намаг- ниченность воздействие единичного радиочастотного импульса, направ- ленного вдоль оси у. Поскольку подаваемый импульс воздействует одно- временно на все магнитные ядра дан- ного типа, то при подаче импульса все магнитные моменты ядер практичес- ки мгновенно начинают концентриро- ваться вдоль оси х, перемещаясь по своим конусам прецессии. В резуль- тате все они окажутся направленными вдоль этой оси. Для каждого из неэкви- валентных магнитных ядер, если счи- тать, что в молекуле имеются три их разновидности, возникнет макроскопи- ческая ядерная намагниченность вдоль оси х, как это показано на рис. 2.17. В результате действия импульса мы получили удивительную ситуа- цию - магнитные моменты трех ядер с неодинаковыми частотами прецес- сии расположились в ВСК на одной оси. Это означает, что их вращение осуществляется синхронно, то есть с одинаковой частотой. Таким образом, импульс синхронизирует вращение всех магнитных ядер. Такая ситуация называется ядерной когерент- ностью. Ядерная когерентность существует только во время действия им- пульса. Как только импульсное облучение ядер прекращается, векторы на- магниченности начинают вращаться с присущими им частотами. Однако действие импульса не проходит бесследно - если за время его действия век- торы намагниченности ядер повернулись в плоскость х-у. то в дальнейшем эти векторы будут и далее вращаться в этой плоскости до тех пор, пока релаксационные процессы не уменьшат их до нуля. Если одновременно подать импульсы на частотах двух или боль- шего количества ядер, то во время действия импульсов и непосредст- венно после подачи импульсов все облученные ядра будут иметь фа- зовую когерентность несмотря на отличие их частот прецессии. Действие радиочастотного поля можно прервать в любой момент. Поэто- му величина проекции макроскопической намагниченности на ось у опре- 310
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса деляется продолжительностью действия радиочастотного поля. Импульсы можно характеризовать тем углом, на который под их влиянием по- вернется вектор намагниченности. Казалось бы, максимальный угол поворота вектора макроскопической намагниченности должен равняться 90°, ведь в этом случае вдоль оси у со- средоточится максимальное количество векторов ядерных спинов, однако на самом деле это не так. Как и в случае стационарного возбуждения, век- тор намагниченности во время действия импульса прецессирует вокруг направления поля В]. Если продолжать облучение образца, вектор суммар- ной намагниченности начинает вращаться в плоскости y-z, как это показа- но на рис. 2.18, и может быть ориентированным в этой плоскости под раз- ными углами в зависимости от продолжительности импульса. Так, на ри- сунке показана ориентация вектора М, которая отвечает углам импульса 90°и 180° Рис. 2.18. Радиочастотный импульс обладает вращающим моментом для всех векторов намагниченности и перемещает их из равновесного состояния в направлении к плоскости х-у. 0 - угол, на который векторы намагничен- ности переместились под действием импульса. Чаще всего нужно повер- нуть векторы на 90° или 180°. Скорость перемещения вектора пропорциональна силе радиочастотно- го поля (yBi). Поэтому угол 0, на который повернется вектор намагни- 311
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР ченности и который известен как угол поворота, зависит от амплиту- ды и продолжительности импульса. Эта зависимость имеет вид: 0 = 360yBrPW (град.), (2.7) где PW - продолжительность импульса. Если радиочастотный импульс прервать именно в тот момент, когда вектор намагниченности достигнет оси у, то получим 90°-импульс. Если вектор достигнет оси -г, импульс бу- дет 180° и т.д. До сих пор мы считали, что магнитный вектор радиочастотного поля направлен вдоль оси х, однако не объясняли, как это реализуется. Для того, чтобы это понять, вспомним, что эффект ЯМР происходит при взаимодейст- вии ориентированных во внешнем постоянном магнитном поле ядерных спинов с компонентой электромагнитного поля, которая вращается в плос- кости х-у. При подаче импульса, несущая частота которого представляет собой синусоиду, расположение компоненты циркулярно-поляризованного поля в плоскости х-у определяется начальной фазой этой синусоиды. Та- ким образом, если электромагнитное колебание начинается с нулевой фа- зы, как показано на рис. 2.19, то вектор циркулярно-поляризованного поля в плоскости х-у в ВСК будет направлен вдоль оси х. угол импульса, град. угол импульса, град. Рис. 2.19. Связь ориентации магнитного вектора циркулярно-поляризован- ного поля с начальной фазой высокочастотного импульса. Приведена си- туация, когда фаза сигнала 0 = 0°. Показано в ВСК. Если же колебание начнется с максимальной величины синусоиды, ко- торое наблюдается при ее смещении на 90°, то вектор циркулярно-поляри- зованного поля будет направлен вдоль оси у, как это показано на рис. 2.20. 312
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса угол импульса, град. Рис. 2.20. Связь ориентации магнитного вектора циркулярно-поляризован- ного поля с фазой высокочастотного импульса. Показан вариант, когда фа- за сигнала 0 = 90°. Показано в ВСК. Таким образом, меняя начальную фазу несущей частоты импульса, можно управлять вектором циркулярно-поляризованного поля, а следова- тельно, и вектором макроскопической намагниченности, заставляя его пе- ремещаться к выбранной оси ВСК. Если учесть, что изменение длитель- ности импульса ведет к остановке вектора намагниченности под любым выбранным углом к оси z, то мы можем направить вектор намагниченности так, как это необходимо для конкретного эксперимента. В любом спектро- метре ЯМР существуют простые команды, реализующие эту возможность. Для обозначения импульсов, которые используются наиболее часто, су- ществует специальная номенклатура. Так, если в результате действия им- пульса вектор макроскопической ядерной намагниченности оказался на оси +х, то импульс называют 90°г Если вектор намагниченности оказался на оси -х, то импульс называется 90%, Аналогично этому существуют им- пульсы 90°х и 90%. Они реализуются в случаях, когда вектор намагничен- ности перемещается к осям у и -у, соответственно. При этом всегда следу- ет помнить, что вектор макроскопической намагниченности движется в плоскости, перпендикулярной вектору электромагнитного поля в ВСК, то есть с фазовым сдвигом 90° (удобнее всего считать, что вектор намагниченности отстает на 90° от вектора поля). Если в используемом эксперименте применяются только 90°-импульсы, то их фазу можно обо- значать проще, указывая только оси, вдоль которых направлен вектор маг- нитного поля. Так, например, импульс 90°х обозначают как х, импульс 90% - как -х и т.д. 313
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Рис. 2.21. Траектория движе- ния вектора макроскопической намагниченности при дейст- вии импульса 90°х, представ- ленная в сферической системе координат. количество спинов в состоянии Траекторию движения вектора мак- роскопической ядерной намагниченнос- ти удобно изображать в сферической системе координат. Для примера, та- ким образом на рис. 2.21 показан им- пульс 90°х. Действие радиочастотных импуль- сов влияет и на заселенности энергети- ческих уровней. Так, при подаче 90°-им- пульса весь избыток заселенностей ока- жется переброшенным в плоскость х-у Таким образом, сразу после импульса заселенности ядерных энергетических уровней вдоль направления внешнего по- ля станут одинаковыми. 180°-импульс инвертирует заселенности спиновых сос- тояний, поскольку в этом случае коли- чество спинов в состоянии Р превышает а, а вектор суммарной намагниченности располагается в направлении, противоположном направлению приложен- ного магнитного поля. Только намагниченность в плоскости х-у способна индуцировать сигнал ЯМР в катушке приемника. Поэтому 90°- и 270°-им- пульсы дают максимальную интенсивность сигнала, в то время как для импульсов 180° и 360° интенсивность сигнала ЯМР равняется нулю. На этом основан удобный метод калибровки радиочастотных импульсов, кото- рый будет описан в последующих разделах. При изменении фазы импульса изменяется форма полученного в ре- зультате эксперимента сигнала ЯМР. Сигналы ЯМР, полученные в резуль- тате применения импульсов, направленных вдоль разных осей, различают- ся по фазе на 90° (рис. 2.22). В предыдущем описании процесса изменения фазы импульса мы пола- гали для простоты, что спектрометр ЯМР "знает", какую фазу имеет каж- дый импульс, подаваемый его генератором. На самом деле это не так. Если не настроить фазу импульса заранее, то импульс перебросит вектор намаг- ниченности в непредсказуемом направлении. Импульсный генератор спект- рометра обеспечивает только постоянство фазы импульса и ее изменение на заданную величину. Нулевое значение фазы должен настроить опера- тор, глядя на форму сигнала ЯМР. Для этого используются специальные подпрограммы фазовой коррекции импульса, которые имеются в любом спектрометре ЯМР. Для того, чтобы сделать процесс фазовой коррекции импульса максимально удобным, обычно подают пробный импульс, полу- 314
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса чают сигнал ЯМР, выводят его на экран монитора и корректируют его фазу с помощью программы фазовой коррекции. При этом автоматически запо- минаются фазовые поправки, которые следует внести в импульс для того, чтобы форма сигнала была такой, какая нужна оператору. Последующие импульсы уже будут иметь необходимую фазу. положительное положительная отрицательное поглощение дисперсия поглощение Рис. 2.22. Возбуждение спинов импульсами разной фазы при неизменной установке фазы приемника (здесь произвольно принято, что перенос векто- ра намагниченности к оси +у отвечает положительному поглощению). отрицательная дисперсия В спектрометре имеется еще один способ воздействия на фазу сигнала ЯМР. Это изменение фазы приемника. Систему детектирования спектро- метра также можно настроить на определенную фазу сигнала. Это нужно для того, чтобы не возникали искажения сигналов за счет расхождения фа- зы сигнала и фазы приемника. Обычно настройку приемника осуществляют так, чтобы сигнал ЯМР имел вид так называемого сигнала положительного поглощения. Если изменить фазу приемника на 90°, получим сигнал дис- персии. Если фазу приемника увеличить на 180°, то получим сигнал отри- цательного поглощения и т.д. При ненастроенной фазе приемника сигнал ЯМР будет представлять собой смесь сигналов поглощения и дисперсии. Для получения оптимального разрешения в спектре ЯМР все сигналы должны, если это только возможно, иметь вид сигналов поглощения. Этого можно достичь с помощью процесса фазовой коррекции. Следует помнить, что сигнал, который детектируется, в любом случае отвечает поглощению энергии магнитными ядрами. Изменение знака сигнала от положительного поглощения к отрицательному совсем не означает, что в одном случае энергия поглощается, а во втором - излучается. Изменение формы сигнала определяется только тем, насколько фаза радиочастотного импульса отли- 315
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Рис. 2.23. Типичная форма сигнала ЯМР единичного магнитного ядра. Стрелка- ми показана ширина сигна- ла на половине его высоты. чается от фазы приемника. По аналогии с фазой импульса фазу приемника обозначают буквами х, -х, у, -у. Если фаза приемника совпадает с фазой импульса, например у импульса х и у приемника х, то приемник не вносит в сигнал фазовых искажений. Если же фа- зу приемника сделать -х при неизмен- ной фазе импульса, то полученный сиг- нал ЯМР окажется инвертированным. При правильном фазировании сиг- нал представляет собой кривую с мак- симумом. Эта кривая имеет совершенно определенную форму, представленную на рис. 2.23. В математике такая кривая называ- ется кривой Лоренца. Она характеризу- ется тем, что ширина сигнала на поло- вине его высоты (показанная стрел- ками) является приблизительно в 10 раз меньшей, чем в области подошвы сиг- нала, поэтому сигнал ЯМР занимает до- вольно большой участок шкалы частот. Ширина сигналов определяется совер- шенством спектрометра. Чем более однородное поле имеет спектрометр, тем более узкими оказываются сигналы ЯМР. Хотя мы уже довольно живо оперировали такими понятиями, как "сиг- нал ЯМР" или "спектр ЯМР", однако, на самом деле, мы еще не знаем, что это такое в импульсном спектрометре ЯМР. Мы понимаем интуитивно, что поглощение энергии можно зарегистрировать в виде сигнала, но еще не знаем, как именно это происходит. Поэтому давайте посмотрим, что проис- ходит непосредственно после действия, например, 90°-импульса. В лабора- торной системе координат суммарный вектор намагниченности, который образовался при синхронизации под воздействием импульса вращения от- дельных ядерных спинов, будет прецессировать вокруг статического маг- нитного поля (ось z) в плоскости х-у с Ларморовой частотой. Вращение этого вектора намагниченности создаст в катушке, которая окружает обра- зец, слабое наведенное переменное высокочастотное напряжение совер- шенно аналогично тому, как движущийся магнит в двухконтурной динамо- машине создает напряжение в катушках, которые его окружают. Этот вы- сокочастотный электрический сигнал, который называется сигналом сво- бодной индукции, мы можем регистрировать. Для однотипных магнитных ядер этот первичный сигнал представляет собой радиочастотный ток со- вершенно определенной частоты, которая отвечает частоте Ларморовой 316
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса прецессии магнитного ядра, которое поглощает энергию. Если исследу- емый образец содержит несколько ядер, которые различаются частотами прецессии, то сигнал содержит все присущие им компоненты частот. Од- нако намагниченность в плоскости х-у, которая образовалась в результате воздействия 90°-импульса, отвечает неравновесной заселенности энергети- ческих уровней, поэтому, как и в других неравновесных химических систе- мах, данная система будет стремиться к равновесию. При этом вектор попе- речной намагниченности будет постепенно уменьшаться по интенсивнос- ти. Одновременно будет возрастать вектор намагниченности вдоль оси z. Такой процесс возвращения системы ядерных спинов к равновесию, как мы уже отмечали, называется релаксацией. Он обусловливает по- степенный спад сигнала свободной индукции ядер образца, подвергше- гося импульсному возбуждению. Итак, в результате воздействия импульса на первом этапе мы регистрируем сигнал спада свободной индукции (ССИ, FID). Он представляет собой экспоненциально спадающую синусоиду, ко- торая имеет компоненты частот, отвечающие поглощению всех имеющих- ся в образце магнитных ядер. Для единственного ядра сигнал ССИ показан на рис. 2.24. -----------► Время после импульса Рис. 2.24. ЯМР отклик, который детектируется после импульса, - спад сво- бодной индукции (ССИ или FID). Сигнал постепенно исчезает, так как вследствие релаксации ядерные спины стремятся к состоянию теплового равновесия. Процесс релаксации исключительно важен для метода ЯМР, поскольку он является путем преобразования энергии радиочастотного поля в тепло- вую энергию молекул образца, а именно это определяет саму возможность эффективного поглощения энергии и его регистрации. Релаксация обуслов- ливает также минимальные интервалы между повторными импульсами. Следующий импульс можно подавать лишь тогда, когда спиновая система отрелаксирует, то есть остаточный сигнал в датчике приблизится к нулю. Необходимость в повторной подаче импульсов возникает тогда, когда сиг- нал слишком слаб для регистрации. В этом случае подают несколько по- следовательных импульсов и результат их действия накапливают в памяти 317
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР компьютера. Этот прием позволяет многократно повысить чувствительность эксперимента. Последовательные импульсы в спектроскопии ЯМР час- то называют сканами по аналогии с методами стационарного возбуж- дения. Практически все эксперименты включают несколько, а иногда и ты- сячи сканов. Если подавать импульсы слишком часто, наблюдается на- сыщение сигналов, которое проявляется в изменениях их относитель- ных интенсивностей. Как видим, в результате эксперимента ЯМР мы получаем сигнал, кото- рый совсем не похож на кривую Лоренца, показанную выше. Однако, на самом деле, кривые, изображенные на рис. 2.23 и 2.24, несут идентичную информацию - так как из обоих рисунков можно получить частоты поглоще- ния магнитных ядер. Сигнал ССИ, получающийся непосредственно после действия импульса и изображенный на рис. 2.24, представляет собой зави- симость интенсивности поглощения от времени после импульса, а спектр, который изображен на рис. 2.23, является зависимостью интенсивности по- глощения от частоты. Как мы уже отмечали в первой главе книги, сущест- вует математическая процедура, которая дает возможность из сигнала ССИ получить спектр. Ее называют Фурье-преобразованием. Итак, в импульс- ной спектроскопии ЯМР сигналы образуются не методом непосредст- венного измерения, а в результате математической обработки первич- ного сигнала ССИ. 2.3. Внерезонансные эффекты Теперь давайте рассмотрим, что же будет происходить, когда сигнал ядра не попадает в зону возбуждения импульса. Как было показано в предыду- щей главе, вектор намагниченности, который описывает спины, во время импульса 90°х двигается под влиянием радиочастотного поля Bi к плоскос- ти х-у. Движение вектора происходит в плоскости y-z, перпендикулярной к оси х, вдоль которой направлено поле импульса Вь Когда импульс имеет компоненту частоты, которая совпадает с частотой Ларморовой прецессии ядра, на этот вектор действует исключительно радиочастотное поле Вр Если же в образце содержатся спины, для которых условие резонанса не соблю- дается, то есть соответствующей компоненты частоты импульс не содер- жит, то кроме поля Bi на них воздействует остаточный компонент ДВ ста- тического поля Во. Этот компонент в ВСК направлен вдоль оси z. Для него справедливо соотношение: уДВ/2л = уДВ = Ду (Гц), (2.8) где Ду отвечает расстоянию сигнала до полосы возбуждения импульса. 318
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Из формулы вытекает, что чем большей является разность между час- тотой поглощения ядра и краем полосы возбуждения импульса, тем боль- ше влияет на него постоянное поле. Векторная сумма Bi и ДВ отвечает эф- фективному полю Вэфф, вокруг которого поворачивается вектор спина, на- ходящегося вне резонансных условий (рис. 2.25). Как видно из рисунка, в данном случае вектор магнитного момента ядра поворачивается не вокруг оси х, а вокруг оси, которая направлена под углом 0 к оси х. Вследствие этого, если на ядро подать 90°-импульс, то магнитный момент ядра после воздействия импульса будет находиться не на оси у. Поскольку компонент постоянного поля прибавляется к полю Вь то суммарное поле оказывается большим, чем Bi, поэтому вектор под действием 90°-импульса пройдет несколько более длинный путь, он пересечет ось у и будет находиться под углом 0 к плоскости х-у, где tan0 = ДВ/Вь (2.9) в резонансе вне резонанса Рис. 2.25. Если сигнал попадает в полосу возбуждения радиочастотного импульса, то вектор его намагниченности поворачивается вокруг прило- женного радиочастотного поля Bi (а). Если же сигнал находится вне поло- сы возбуждения, его вектор намагниченности поворачивается вокруг эф- фективного радиочастотного поля, которое отклоняется от В! на угол 0. Величина этого угла тем больше, чем дальше находится сигнал от полосы возбуждения (б). В результате вектор намагниченности окажется вне плос- кости х-у. Для спинов, которые находятся дальше от условий резонанса, угол 0 возрастает и проекция вектора на плоскость х-у уменьшается. В предель- ных условиях, когда 0 = 90°, вектор суммарной намагниченности не сме- щается от оси z и возбуждения спина не происходит. Иначе говоря, ядра, которые резонируют далеко вне полосы возбуждения, в этом случае не воз- 319
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР буждаются вовсе. Поскольку векторы, которые описывают внерезонансные сигналы, расположенные недалеко от полосы возбуждения, после действия импульса ориентированы вне оси у, то соответствующие им сигналы име- ют фазовый сдвиг относительно сигналов, для которых условие резонанса соблюдается. Это показано на рис. 2.26, где смоделирована форма сигнала ЯМР при его постепенном удалении от условий резонанса. Для каждого из сигналов показана интенсивность поля Вь вычисляемая по соотноше- нию (2.10), которое следует из формулы (2.9). (2.10) Bj = AB/tan 0. 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Рис. 2.26. Экспериментальная форма сигнала ЯМР для 90°-импульса как функция разности частоты сигнала и частоты возбуждающего импульса, выраженной в степени падения силы радиочастотного поля Вь Чем дальше находится сигнал от полосы возбуждения, тем большими оказываются фа- зовые ошибки. Видно, что фазовый сдвиг линейно зависит от частоты сигнала. Поэто- му его можно откорректировать в конечном спектре с помощью фазовых коэффициентов. Таким образом, для возбуждающего 90°-импульса возможна нейтрали- зация внерезонансных эффектов с помощью фазовой коррекции конечного спектра. Интенсивность сигнала, который смещен относительно полосы возбуждения импульса, при этом практически не уменьшается в довольно большом диапазоне Av. Траекторию вектора намагниченности при откло- нении от резонансных условий наиболее наглядно видно в сферической системе координат, как это показано на рис. 2.27. В отличие от 90°-импульса 180°-импульс инвертирует намагничен- ность, поэтому он должен генерировать чистую -z намагниченность, не ос- 320
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса тавляя ничего в плоскости х-у. В случае внерезонансного сигнала измене- ние оси вращения намагниченности будет приводить к отдалению вектора от Южного полюса. Поэтому воздействие 180°-импульса не приводит к ин- версии такого сигнала (рис. 2.28) и сильно искажает условия эксперимента. Рис. 2.27. Траектории движения вектора намагниченности под действием 90°-импульса как функция сдвига частоты сигнала от полосы возбуждения. Сдвиг фазы сигнала виден как угол между проекцией конечной точ- ки траектории на плоскость х-у и осью у. Показаны рассчитан- ные траектории при уменьше- нии силы поля Bi вдвое с шага- ми по 0.1. Рис. 2.28. Траектории движения вектора намагниченности под действием 180°-импульса как функция сдвига частоты сигнала от полосы возбуждения. Видно, что при несоблюдении условий резонанса вектор намагничен- ности оказывается далеко от Юж- ного полюса. Показаны рассчи- танные траектории при умень- шении силы поля Bi вдвое с ша- гами по 0.1. При измерении спектров на протонах не составляет труда использо- вать настолько короткие импульсы, что их излучение перекроет весь спект- ральный диапазон. Поэтому с внерезонансными эффектами сталкиваться не приходится. Однако для ядер, которые резонируют в большем диапазо- не химических сдвигов, таких как 13С и 19F, в спектрах могут наблюдаться искажения фазы сигналов или исчезновение их из спектра из-за слишком узкого диапазона возбуждения. В многоимпульсных последовательностях узкий диапазон возбуждения может приводить к появлению ложных сиг- налов. Одним из путей устранения внерезонансных эффектов в этом случае является применение композитных импульсов, которые имеют увеличен- ный диапазон возбуждения. 321
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР 2.4. "Жизнь" спина после импульса В спектроскопии ЯМР принято ’’одушевлять” спины, находящиеся после импульса в возбужденном состоянии. И действительно, для них сущест- вует определенная аналогия с живыми организмами. До подачи импульса спин является "мертвым" - он сколь угодно долго может находиться в не- изменном спиновом состоянии. Однако, как только спин "оживлен" пода- чей импульса, он начинает "жить" по присущим ему законам до самой своей "смерти" - до перехода в стационарное состояние, когда вектор макроско- пической ядерной намагниченности совпадет с направлением внешнего магнитного поля. Поведение спина после импульса по аналогии с биологи- ей называют его эволюцией. Целенаправленное воздействие на возбуж- денную спиновую систему, результатом которого является приобретение системой спинов необходимых свойств, называется селекцией. Термины "эволюция" и "селекция" очень часто используются при описании экспери- ментов ЯМР. Прежде всего рассмотрим, что происходит с ядерной намаг- ниченностью в случае, если после импульса никаких дополнительных воз- действий не производится. Удобнее всего этот вопрос рассмотреть на при- мере подачи на систему 90°-импульса. 2.5. Продольная релаксация: установление равновесия В результате импульсного возбуждения ядерных спинов 90°-импульсом вектор общей намагниченности переходит от положения теплового равно- весия - оси +z - к выбранной оси в плоскость х-у, которая определяется фазой импульса. Это соответствует изменению заселенностей энергетичес- ких уровней. Образовавшееся неравновесное состояние может существо- вать лишь ограниченный период времени. Оно, как и любое неравновесное состояние, стремится к равновесию. Процесс возврата намагниченности к оси z называется продольной релаксацией. Он соответствует восстанов- лению равновесного распределения заселенностей и потере спинами избы- точной энергии (рис. 2.29). При этом вектор намагниченности, который был переброшен импуль- сом в плоскость х-у, постепенно уменьшается, а вектор намагниченности вдоль оси z растет. Энергия, теряемая спинами, распространяется в окру- жающей их среде в виде тепла. Однако изменение температуры при этом настолько мало, что не может быть зафиксировано. Принято называть дан- ный процесс спин-решеточной релаксацией. Этот термин пошел от пер- вых экспериментов по твердотельному ЯМР, где избыток энергии распре- делялся в жесткой кристаллической решетке образца. 322
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса z z z z полная релаксация время Рис. 2.29. Продольная релаксация. Возврат вектора намагниченности к рав- новесному состоянию (показано на сигналах во вращающейся системе ко- ординат) уменьшает компоненты намагниченности в плоскости х-у и уве- личивает продольную z-компоненту. В соответствии с теорией Блоха восстановление +z намагниченности, Мг, имеет экспоненциальный характер, который описывается уравнением: dM/dt = (M0-Mz)/TI, (2.11) где Мо - намагниченность в состоянии теплового равновесия, Ti - времен- ная константа этого процесса. Начиная с нулевой z-намагниченности, которая реализуется сразу пос- ле воздействия 90°-импульса, продольная намагниченность через время t составит: Мг =М0(1-е_,/Т|). (2.12) Это иллюстрируется графиком, представленным на рис. 2.30. Среди специалистов по ЯМР коэффициент Ti известен как время продольной релаксации. Именно так мы будем называть его в дальнейшем. Хотя при этом следует помнить, что это временная константа, а не реальное время, необходимое для полной продольной релаксации. Аналогично, если выясняется скорость, с которой восстанавливается продольная намагниченность, ее определяют как 1/Tj и говорят о констан- те скорости релаксации (в с-1). Для органических молекул среднего размера, масса которых составля- ет несколько сотен, времена Ti для протонов лежат в диапазоне 0.5-5 с. Для атомов углерода они лежат в диапазоне от нескольких секунд до мно- гих десятков секунд. Для полной релаксации спинов после воздействия 90°-импульса необходимо выдержать интервал 5Т1 (намагниченность при этом восстановится на 99.33%). Поэтому для полной релаксации бывает необходимо подождать несколько минут. Причиной столь длительного времени, необходимого для релаксации, является отсутствие эффективного 323
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР механизма преобразования энергии возбужденных ядерных спинов в теп- ловую энергию. Время, необходимое для спонтанного излучения кванта ра- диочастотной энергии возбужденным спином, столь велико (оно соизмери- мо с возрастом Вселенной), что не влияет на заселенности энергетических уровней. Поэтому единственным путем релаксации является стимулиро- ванная эмиссия. Вспомним, что обязательным условием для индуцирова- ния ядерных переходов и соответственно для восстановления равновесных заселенностей является наличие переменного электромагнитного поля, частота которого совпадает с Ларморовой частотой имеющихся магнитных ядер. Длительные времена релаксации свидетельствуют о том, что такие поля в образце не слишком распространены. Такие поля могут быть обус- ловлены молекулярными движениями, которые происходят с опреде- ленной скоростью. С практической точки зрения некоторые сведения о Tj дают возможность оптимизировать возбуждение спинов в большинстве экспериментов. 012345678 Время в единицах t/T 1 Рис. 2.30. Экспоненциальный рост продольной намагниченности определя- ется временной константой Ть В основном, он заканчивается после перио- да 5Tj. 2.6. Поперечная релаксация Еще раз рассмотрим ситуацию, которая происходит сразу после воздейст- вия на образец, содержащий одну разновидность магнитных ядер, например на хлороформ, 90°-импульса. Действие импульса приводит к появлению фазовой когерентности движения всех векторов магнитных моментов ядер 324
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса и их перебрасыванию в плоскость х-у. В этом случае возникает исключи- тельно поперечная намагниченность. Ее в ВСК можно описать неподвиж- ным вектором, расположение которого определяется фазой импульса. Од- нако существует еще один путь потери этой намагниченности. Поскольку суммарный вектор намагниченности представляет собой результат сложе- ния множества микроскопических векторов индивидуальных ядер, которые обладают фазовой когерентностью, вызванной импульсом, можно ожидать, что во вращающейся системе координат все эти векторы будут неподвиж- ными и направленными вдоль оси у. Это справедливо только в том случае, если магнитное поле вблизи каждого магнитного ядра является совершен- но одинаковым. Если это не так, то некоторые спины находятся в несколь- ко большем статическом магнитном поле и имеют соответственно более высокую скорость прецессии. Другие же, наоборот, находятся в несколько более слабом поле и имеют несколько меньшую скорость прецессии. Это приводит к постепенному расхождению индивидуальных магнитных век- торов в плоскости х-у и, как следствие, к уменьшению суммарного вектора намагниченности (рис. 2.31). Это релаксационный процесс, который назы- вают поперечной релаксацией. Она характеризуется экспоненциальным спадом намагниченности с константой Т2. время х полная релаксация Рис. 2.31. Поперечная релаксация. Различия в локальном поле для различ- ных точек образца приводят к прецессии ядер на несколько различающих- ся частотах. Вследствие этого суммарная намагниченность постепенно убы- вает до нуля. Различия магнитного поля в образце могут быть обусловлены двумя причинами. Первая из них связана с неоднородностью статического маг- нитного поля в объеме образца. Она, в свою очередь, связана с несовер- шенством прибора. Для каждого образца этот эффект минимизируется с 325
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР помощью повышения однородности статического магнитного поля. Вторая причина связана с наличием локальных магнитных полей, связанных с внутримолекулярными и межмолекулярными процессами в образце. Они обусловливают истинную или естественную поперечную релаксацию. Та- ким образом, временная константа для Т2 состоит из двух компонентов: 1/Т*2 = 1/Т2 + 1/Т2(ДВо), (2.13) где Т2 отвечает вкладу естественной релаксации, а Т2(ДВ0) - неоднород- ности магнитного поля. Спад поперечной намагниченности обусловливает видимый спад сигнала свободной индукции после воздействия импульса. Более того, ширина сигналов ЯМР обратно пропорциональна Т*2. Поэтому короткие Т*2 соответствуют быстрой потере поперечной намагниченности, что отвечает большей скорости расфазировки векторов и уширению линий в частотном представлении ССИ. Релаксация приводит к тому, что сигналы имеют вид Лоренцовой линии (рис. 2.32), полуширину которой можно най- ти из уравнения: Ду1/2= 1/лТ*2. (2.14) Малая величина Т2 Быстрая релаксация Большая величина Т2 Медленная релаксация Рис. 2.32. Быстро релаксирующие спины дают быстро спадающие ССИ и широкие сигналы, в то время как при медленной релаксации получаются продолжительные ССИ и узкие сигналы. Для большинства ядер со спином входящих в состав малых, быстро движущихся молекул в невязких растворах, основной вклад в поперечную релаксацию вносят неоднородности магнитного поля. Для них редко удает- 326
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ся определить естественные времена поперечной релаксации. Тем не ме- нее, ядра со спином >16 (квадрупольные ядра) могут очень эффективно ре- лаксировать вследствие имеющихся локальных градиентов электрического поля. Поэтому они имеют короткие времена релаксации Т2, которые можно определить непосредственно из ширины сигналов. Вообще говоря, все механизмы, которые приводят к потере продольной намагниченности, уменьшают и поперечную намагниченность, поскольку понятно, что в плоскости х-у намагниченность исчезает, если вектор намаг- ниченности уменьшается до нуля. Т2 никогда не бывает длиннее, чем Ть Однако существуют дополнительные механизмы, способные уменьшить величину Т2 и сделать ее еще короче. Для большинства ядер со спином 16, расположенных в быстро движу- щихся молекулах, Ti и Т2 имеют одинаковые величины. Для больших мо- лекул с медленным движением в растворах (или для твердых образцов) Т2 в большинстве случаев намного меньше, чем Ть В то время как продольная релаксация приводит к потере энергии спи- нов, при поперечной релаксации энергия перераспределяется между спина- ми, например спин с состоянием а переходит в состояние Р с одновремен- ным обратным переходом другой пары спинов. Это так называемый ”флип- флоп”-процесс. По-русски это можно перевести как зеркальный перескок спинов. Для истинной спин-спиновой релаксации этот процесс является наиболее значимым. Можно считать, что продольная релаксация является энтальпийным процессом, а поперечная - энтропийным. 2.7. Компоненты ядерной намагниченности и их поведение в ВСК До сих пор мы обсуждали поведение во вращающейся системе координат только тех спинов, для которых существует единственный вектор намагни- ченности, совпадающий с Ларморовой частотой ядра, то есть с его хими- ческим сдвигом. Во вращающейся системе координат он оказывался не- подвижным, если несущая частота импульса совпадает с частотой погло- щения ядра. Теперь рассмотрим образец, содержащий два неодинаковых, но невзаимодействующих спина А и X с химическими сдвигами vA и vx Гц, соответственно, различающимися на v Гц. После возбуждения единичным 90°х-импульсом оба вектора расположатся в плоскости х-у вдоль оси у. Ес- ли выбрать опорную частоту импульса, равной резонансной частоте ядра А (v0 = vA), то вектор намагниченности этого ядра, как и раньше, будет иметь стационарное положение во вращающейся системе координат (при игнори- ровании явления релаксации). Если ядро X имеет химический сдвиг боль- ший, чем A (vA < vx), то вектор ядра X будет вращаться быстрее, чем век- тор А и вращающаяся система координат, на v Гц, поэтому он будет обго- 327
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР нять вектор А (рис. 2.33). Если же, наоборот, vA > vx, вектор ядра X будет двигаться более медленно и отстанет от вектора А. vA А Рис. 2.33. Химические сдвиги во вращающейся системе координат. Векто- ры эволюционируют соответственно разности их собственной частоты пре- цессии и частоты импульса v0. Здесь условие резонанса соблюдается для спи- на A (Vo = vA), а спины X двигаются вперед со скоростью +v Гц (v = vx - v0). Набор из трех невзаимодействующих спинов можно представить в ви- де трех векторов и т.д. Таким образом, различия в химических сдвигах между спинами можно представить в виде векторов, которые прецессируют с различной скоростью. Во вращающейся системе координат их движение зависит от разности между химическим сдвигом ядра и опорной частотой импульса v0. При использовании ВСК для описания этих различий следует учитывать, что разница химических сдвигов интересующих магнитных ядер лежит в диапазоне нескольких килогерц, в то время как абсолютные частоты ядерной прецессии могут составлять многие мегагерцы. Аналогично в ВСК можно представить и сигналы, расщепленные ССВ. При обсуждении эффектов расщепления резонансных сигналов удобно выбрать частоту импульса такой, чтобы вектор намагниченности, который соответствует химическому сдвигу сигнала, был неподвижным в ВСК. Это происходит в случае выбора опорной частоты импульса точно в центре мультиплета. Картина эволюции векторов при этом существенно упроща- ется. В случае дублета обе его линии можно представить двумя векторами, прецессирующими на частотах +J/2 и -J/2 Гц, поскольку расстояние между компонентами дублета составляет J Гц. В случае триплета вектор, описы- вающий центральную линию, будет неподвижным, поскольку его частота совпадает с величиной химического сдвига сигнала. Векторы, описывающие боковые компоненты мультиплета, будут вращаться в противоположные стороны с частотами +J и -J Гц (рис. 2.34). 328
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 2.34. Расщепления сигналов во вращающейся системе координат. Компоненты мультиплетов эволюционируют соответственно их констан- там расщепления. После периодов эволюции 1/2J и 1/4J (в секундах) ком- поненты векторов соответственно для дублетов и триплетов имеют проти- вофазное расположение. Во многих экспериментах ЯМР требуется следить за взаимной ориен- тацией векторов мультиплетов. В особенности важным бывает установить, когда компоненты дублетов находятся в противофазе, то есть на векторной диаграмме располагаются антипараллельно. Это происходит через опреде- ленное время после импульса. Для дублета это время равно J/2, а для три- плета - J/4. Только что мы описали процесс эволюции после импульса компонен- тов ядерной намагниченности дублета и триплета. Совершенно аналогично 329
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР можно проанализировать и другие спиновые мультиплеты. Эволюция спи- нов рассматривается во всех случаях, когда необходимо описать принципы того или иного эксперимента ЯМР. 2.8. Воздействие второго импульса на возбужденную спиновую систему Если на спиновую систему, которая находится в возбужденном состоянии, подать еще один импульс, то его действие зависит от процессов эволюции, которые происходят со спиновой системой после подачи первого импуль- са. Рассмотрим несколько типичных вариантов. (а) Отсутствие эволюции. Если подать два последовательных импуль- са, например 90°х, без промежутка между ними, то движение векторов на- магниченности образца будет таким, как будто на систему подали один им- пульс вдвое большей длительности. Эта ситуация проиллюстрирована на рис. 2.35. z z Z Рис. 2.35. Эффект воздействия на спиновую систему двух одинаковых им- пульсов 90°х без промежутка между ними. Как видим, результат воздействия двух последовательных импульсов оказался таким же самым, как и в случае подачи одного 180°х-импульса. (б) Случай полной релаксации. Если подать на систему спинов два оди- наковых последовательных импульса через промежуток времени, доста- точный для полной релаксации спинов, то воздействие второго импульса будет точно таким же, как и первого. В результате вектор макроскопичес- кой ядерной намагниченности после действия второго импульса окажется на оси у (рис. 2.36). Рис. 2.36. Эффект воздействия на спиновую систему двух одинаковых им- пульсов 90°х с промежутком времени между ними, достаточным для пол- ной релаксации системы. 330
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (в) Импульс в период эволюции. Данный вариант воздействия второго импульса рассмотрим на примере односпиновой системы, Ларморова час- тота которой не совпадает с несущей частотой импульса. В этом случае вектор макроскопической намагниченности под действием импульса 90°х ориентируется вдоль оси у и в дальнейшем вращается в плоскости х-у в ВСК с частотой, соответствующей разности Ларморовой частоты спина и несущей частоты импульса. В произвольный момент времени после перво- го импульса вектор намагниченности образца находится под углом к оси у. Поэтому намагниченность можно представить в виде двух взаимно-пер- пендикулярных векторов, направленных вдоль осей х и у. Эта ситуация по- казана на рис. 2.37. Рис. 2.37. Эффект воздействия на спиновую систему двух одинаковых им- пульсов 90°х с небольшим промежутком времени между ними. Как видим из рисунка, одна из компонент вектора намагниченности совпадает с осью х. Если второй импульс подать также вдоль оси х, то для данной компоненты намагниченности его как бы не существует, поскольку при импульсном воздействии эта компонента вращается вокруг своей собственной оси и ее положение не меняется. Действие второго импуль- са распространяется только на ту компоненту намагниченности, которая направлена вдоль оси у. Эта компонента после импульса оказывается на- правленной вдоль оси -z. Таким образом, второй импульс выводит часть намагниченности из плоскости х-у. Если после второго импульса произ- вести измерение спектра, то сигнал ЯМР соответственно уменьшится. Доля удаляемой намагниченности зависит от ориентации вектора в момент пода- чи второго импульса. 2.9. Импульсные последовательности В предыдущем параграфе мы видели, что после первичного возбуждения системы ядерных спинов с помощью 90°-импульса компоненты намагни- ченности, которые отвечают химическим сдвигам и КССВ, определенное время эволюционируют в поперечной плоскости. Продолжительность та- кой эволюции определяется временами поперечной релаксации магнитных ядер. При отсутствии факторов, которые сокращают время релаксации, 331
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР эволюция может длиться до нескольких секунд. Это дает возможность осу- ществлять целенаправленные воздействия на поперечную намагниченность с помощью подачи дополнительных импульсов. Подачу дополнительных импульсов необходимо осуществить именно в то время, когда нужные ком- поненты намагниченности в СКО приобретут необходимую ориентацию. Таким образом и происходит организация практически всех экспериментов ЯМР. Поэтому каждый спектрометр имеет электронные устройства, кото- рые способны не только генерировать импульсы определенной мощности и продолжительности, но и подавать их через нужные интервалы времени. Такие системы нуждаются в исключительной точности, ведь векторы на- магниченности ждать не могут - воздействие нужно осуществить в нуж- ный момент времени с точностью до микросекунд. Для этого необходимо не только исключительно точное измерение интервалов времени, но и на- личие устройств, способных почти мгновенно включать и выключать гене- ратор и изменять его мощность. Управление всем этим электронным обо- рудованием осуществляется специальным процессором. Благодаря его су- ществованию оператор может заранее запрограммировать прибор так, что- бы спектрометр генерировал нужные импульсы в определенные моменты времени. Совокупность импульсов и интервалов между ними называется импульсной последовательностью. Импульсная последовательность мо- жет повторяться многократно с запоминанием полученного спада свобод- ной индукции в памяти компьютера. Обязательным условием при повторе- нии импульсной последовательности является то, чтобы к ее началу систе- ма спинов находилась в одном и том же состоянии. Для этого используется дополнительный интервал (релаксационный промежуток), который обеспе- чивает необходимую релаксацию спинов. Однократное действие импульс- ной последовательности называют сканом, хотя это, на самом деле, не со- ответствует действительности. Термин заимствован с тех времен, когда возбуждение ядерных спинов происходило не с помощью импульсов, а благодаря постепенному изменению (сканированию) частоты передатчика. Поскольку существует много разновидностей импульсных последова- тельностей, то целесообразно иметь возможность описывать их на "одном языке". Для этого разработана специальная система обозначений парамет- ров импульсов и интервалов времени, которая помогает понять действие последовательности на систему ядерных спинов. Таким образом можно описать все эксперименты ЯМР. Для наглядного представления импульс- ных последовательностей чаще всего (но не всегда) используются специ- альные графические схемы. Они похожи на ноты, с помощью которых мож- но запрограммировать работу оркестра. Поскольку такие схемы использу- ются во всей книге, надо, прежде всего, объяснить содержание принятых в них обозначений. Здесь мы дадим только описание компонентов схем им- 332
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса пульсных последовательностей. Их физическое содержание будет раскры- то в следующих разделах, которые посвящены разнообразным методикам ЯМР. На рис. 2.38 показан пример записи сравнительно сложной импульс- ной последовательности (эксперимент гетероядерной корреляции) и рас- шифрованы основные ее составляющие, причем на рис. 2.38а показана бо- лее детальная расшифровка, а на рис. 2.386 - ее сокращенный эквивалент, который применяется чаще всего. Радиочастотные импульсы Импульсы градиентов поля Рис. 2.38. Номенклатура импульсных последовательностей: (а) полная им- пульсная последовательность и (б) сокращенный вариант, который будет использован в данной книге. Ось времени одинакова для всех импульсных воздействий. Радиочастотные импульсы, которые подаются на различные ядра, рас- полагаются на отдельных строках. Их расположение слева направо отвеча- ет времени подачи соответствующего импульса. Считается, что ось време- ни одинакова для импульсов на разных ядрах. Поэтому, если импульсы на разные ядра подаются одновременно, то они расположены на схеме один под другим. Большинство экспериментов, которые используются сегодня, включает импульсы на протонах и еще на одном или двух дополнительных ядрах. В органической химии чаще всего такими ядрами являются ядра уг- 333
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР лерода, однако вместо него может быть использовано любое ядро, которое обозначается как Х-ядро. В импульсных последовательностях чаще всего используются 90°- и 180°-импульсы. Они обозначаются соответственно уз- ким и широким прямоугольниками. Импульсы с другими углами поворота вектора намагниченности обозначаются греческими буквами над соответ- ствующими прямоугольниками, смысл которых дается в пояснениях. Каж- дый импульс характеризуется фазой, которая указывается над импульсом в виде названия оси, вдоль которой действует импульс. Импульсы, которые действуют в узком диапазоне частот, называются селективными или сформованными. Для их обозначения вместо прямо- угольников используются полуэллипсы, которые приблизительно отвечают форме данных импульсов на шкале времени. Если в последовательность входит фрагмент, где ядро облучается продолжительное время непрерыв- ным радиочастотным полем или близко расположенными импульсами, на- пример при развязке спин-спинового взаимодействия (декаплинге), то его обозначают расположенным вдоль оси времени прямоугольником серо- го или черного цвета. Расположение данного прямоугольника отвечает пе- риоду времени, на который включается декаплер. Под строками, которые отвечают радиочастотным импульсам, при не- обходимости размещают строку так называемых градиентных импульсов. Эти импульсы также обозначают полуэллипсами. Градиентные импульсы используются для целенаправленного расфазирования или фазирования оп- ределенных компонентов ядерной намагниченности. Подробнее эти им- пульсы будут описаны ниже. Действие большинства импульсных последовательностей сильно зави- сит от настройки эксперимента на определенные величины КССВ. Такая настройка осуществляется с помощью выбора соответствующих промежут- ков между импульсами. Чаще всего эти промежутки обозначаются симво- лом А. Другие интервалы, которые не связаны с величиной КССВ и вводят- ся исходя из других соображений, например в соответствии со скоростью релаксации, обозначают символом т. Символами tj и t2 обозначают периоды времени, которые отвечают частотным осям fi и f2 в двумерном спектре, причем период t2 всегда отвечает периоду сбора данных, когда выполня- ется детектирование сигнала ЯМР. Период сбора данных на импульсной последовательности обозначается экспоненциально спадающей синусоидой, которая близка по своей форме к реальному ССИ, который при этом происходит. Здесь также может быть обозначена фаза приемника, которая используется при сборе данных. Может показаться, что воздействие всей импульсной последовательности на спиновую систему представить себе достаточно сложно. Однако, как правило, импульсная последовательность состоит из более простых фрагментов, действие которых можно изучить 334
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса отдельно. Поэтому, чтобы понять работу сложной импульсной последова- тельности, следует воспринимать ее как последовательное воздействие на систему спинов простых фрагментов, действие каждого из которых извест- но заранее. Наиболее часто в импульсные последовательности включается фрагмент так называемого ’’спинового эха”, который рассмотрен ниже. 2.10. Спиновое эхо Теперь мы рассмотрим простую двухимпульсную последовательность, ко- торая весьма полезна с практической точки зрения и широко используется в спектроскопии ЯМР. Она называется "спиновое эхо", поскольку резуль- татом ее воздействия является появление сигнала ЯМР не сразу после воз- буждающего импульса, а через некоторое время после него. Здесь имеется полная аналогия со звуковым эхо, которое возникает при отражении звуко- вых волн (рис. 2.39). На рисунке показано, что после подачи первого 90°-им- пульса происходит обычный спад сигнала ССИ. Однако если до окончания спада сигнала подать дополнительный 180°-импульс, то интенсивность сиг- нала ССИ начинает возрастать. Рис. 2.39. Последовательность спинового эха и его экспериментальное на- блюдение. Прежде всего, рассмотрим случай, когда имеются два неэквивалент- ных протона А и X с константой спин-спинового взаимодействия J(A,X) между ними. Пусть на систему воздействует двухимпульсная последова- тельность, которая изображена на рис. 2.39. 335
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Для простоты воздействие импульсов на компоненты намагниченнос- ти, которые отвечают химическим сдвигам и ССВ, мы будем рассматри- вать отдельно. Начнем с химического сдвига и предположим, что опорная частота импульса совпадает с химическим сдвигом ядра Л (рис. 2.40). Рис. 2.40. Рефокусировка эволюции химических сдвигов с помощью после- довательности спинового эха. Начальный 90°х-импульс индуцирует поперечную намагниченность ядер А и X, причем по окончании импульса оба вектора направлены вдоль оси у. После этого вектор X прецессирует на протяжении интервала време- ни А (вектор А в ВСК остается неподвижным). Второй импульс 180°^ (отметьте, что он направлен вдоль оси у) поворачивает намагниченность ядра X на 180° вокруг оси у и поэтому снова размещает ее в плоскости х-у, однако, теперь уже позади вектора А. Поскольку намагниченность А неподвижна и расположена вдоль оси у9 второй импульс на нее не действует. Во время второго периода времени А намагниченность X по- вернется на тот же самый угол, что и во время первого периода времени А, и в конце последовательности достигнет исходной точки - вектора А. Та- ким образом, через период 2А между векторами А и X не будет никакого фазового сдвига несмотря на различия в их химических сдвигах. Говорят, что спиновое эхо рефокусирует химические сдвиги. Первый и второй пе- риоды времени А называют соответственно периодами расфазировки и ре- фокусировки. Если через период времени, равный 2Д, начать сбор данных, то мы получим обычный спектр ЯМР, не отличающийся от того, который мы получили бы сразу после первого импульса. Естественно, что это спра- ведливо лишь в том случае, когда период 2Д значительно меньше времени релаксации магнитных ядер. Рассмотрим теперь эффект наличия между спинами А и X спин-спино- вого взаимодействия. Опорная частота импульса при этом, как и раньше, совпадает с химическим сдвигом ядра А. Неэквивалентность химических сдвигов будем игнорировать, поскольку мы уже знаем, что в конце импульс- ной последовательности они рефокусируются, то есть векторы, описыва- ющие химические сдвиги, сойдутся на одной оси. После первого импульса 336
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса векторы, которые описывают компоненты дублетов, двигаются в ВСК в противоположных направлениях. После второго 180°^-импульса движение векторов происходит в обратном направлении. По окончании последова- тельности эти компоненты приобретают начальную ориентацию. С этой точки зрения два компонента дублетов в результате воздействия последо- вательности рефокусируются точно так же, как и описанные выше хими- ческие сдвиги. Однако следует учитывать, что последовательность влияет также и на партнера по ССВ - ядро X. При этом надо вспомнить, за счет че- го образуются компоненты дублетов. Они возникают вследствие того, что спин А взаимодействует со спином X, который может иметь две ориента- ции а и р. Если спин X имеет одну ориентацию, то образуется сильнополь- ный компонент дублета спина А. Если же спин X имеет другую ориентацию, образуется слабопольный компонент дублета спина А. Поскольку заселен- ности состояний а и Р приблизительно одинаковы, то половинки дублетов имеют одинаковую интенсивность (незначительная разность в заселеннос- тях состояний практически не влияет на интенсивности компонентов). Эф- фект влияния 180°-импульса на спины X заключается в инвертировании спи- новых состояний. Поэтому спины М, которые раньше были связаны с Ха, теперь оказались связанными с Хр и наоборот. Это означает, что вектор, который двигался быстрее, теперь двигается медленнее и наоборот. Конеч- ный результат представлен на рис. 2.41а. Две половинки дублетов после второго импульса продолжают расфа- зироваться, поэтому в конце периода 2А, в отличие от химических сдвигов, компоненты намагниченности, связанные с ССВ, продолжат свою эволю- цию. Таким образом, гомоядерное ССВ не рефокусируется в результате действия последовательности спинового эха. Термин "гомоядерное" в предыдущем предложении подчеркивает то, что для случая, когда взаимо- действуют ядра разных типов, например *Н и 13С, ситуация может оказать- ся совершенно иной. В этом случае 180°-импульс влияет только на одно из магнитных ядер, тогда как другое ядро этого импульса не ощущает. При этом происходит рефокусировка гетероядерного ССВ (рис. 2.416). Если же одновременно приложить импульсы по двум каналам облуче- ния на частотах обоих ядер, которые связаны ССВ, получим ситуацию, аналогичную гомоядерному взаимодействию. Еще одной полезной особенностью последовательности спинового эха является уничтожение эффектов, связанных с неоднородностями статичес- кого магнитного поля, поскольку они могут быть представлены как вклад ядер образца с неодинаковыми химическими сдвигами. Важность последо- вательности спинового эха в современных методиках ЯМР трудно пере- оценить. Она позволяет проводить эксперименты, основанные на антипа- раллельной ориентации компонентов спиновых мультиплетов, не заботясь 337
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР об имеющихся расхождениях в химических сдвигах. Это позволяет мани- пулировать векторами компонентов всех мультиплетов одновременно, что дает возможность реализовать много методик современного ЯМР. а) гомоядерное ССВ +J/2 +J72 эволюция ССВ б) гетероядерное ССВ +J72 +J/2 рефокусировка ССВ Рис. 2.41. Влияние спинового эха на спиновые расщепления. Показано для двух связанных спинов А и X. (а) Гомоядерное спиновое эхо. В этом случае 180°-импульс воздействует на оба спина. При действии последователь- ности имеет место эволюция расщеплений, (б) Гетероядерное спиновое эхо. В этом случае 180°-импульс воздействует только на один спин. Вслед- ствие этого происходит рефокусировка гетероядерных расщеплений. Если одновременно подать 180°-импульсы на частотах обоих спинов, то эволю- ция расщеплений будет происходить так же, как и в (а). 2.11. Воздействие импульсных градиентов поля на поперечную намагниченность Из предыдущего материала мы узнали, что при действии импульсов радио- частотного поля на магнитные ядра их векторы намагниченности могут приобрести ту ориентацию, которая нужна для эксперимента ЯМР. Их, например, можно ориентировать в плоскости х-у. Простейшие двухимпульс- ные эксперименты, такие как эксперимент спинового эха, показали, что компонентами намагниченности, которые связаны с химическими сдвига- ми и КССВ, можно манипулировать раздельно. Так, компоненты намагни- ченности, которые отвечают ССВ, можно направить вдоль одной оси, а 338
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса компоненты, которые связаны с химическим сдвигом, - вдоль другой. Для некоторых экспериментов надо сохранить лишь определенные компоненты намагниченности. Поэтому для сложных экспериментов часто возникает потребность удаления определенных компонентов намагниченности из плоскости х-у. Для решения этой проблемы существуют два подхода - ме- тод фазовых циклов и метод импульсных градиентов поля. Исторически метод фазовых циклов возник раньше, поэтому его часто называют тради- ционным методом. Его действие состоит в измерении спектров в последо- вательных сканах с заданными фазовыми сдвигами и суммировании ре- зультата в памяти компьютера. Если фазовые сдвиги подобраны соответст- вующим образом, то нежелательные компоненты намагниченности для разных фаз импульса могут иметь противоположный знак, а целевые ком- поненты - одинаковый. При таких условиях нежелательные компоненты намагниченности при сложении спектров должны исчезнуть, а целевые компоненты сохраниться. Но такой метод не является идеальным, посколь- ку в результате сложения и вычитания спектров всегда имеют место неко- торые неточности, которые увеличивают величину шумов в результиру- ющем спектре. Поэтому возникла потребность в разработке более эффек- тивных методов удаления намагниченности из плоскости х-у. Таким мето- дом и оказался метод импульсных градиентов поля. Поскольку существование поперечной намагниченности базируется на когерентности сигналов, которая возникает под действием возбуждающего импульса, то наиболее эффективный путь ее уничтожения - это расфази- ровка этой намагниченности. При рассмотрении спин-спиновой релакса- ции мы видели, что такая расфазировка происходит и сама по себе со ско- ростью поперечной релаксации. Поэтому целесообразно многократно уве- личить скорость релаксации. Из уравнения (2.13) вытекает, что на величи- ну поперечной релаксации большое влияние оказывают неоднородности магнитного поля. Поэтому, если на некоторое время нарушить однород- ность поля, то намагниченность может мгновенно исчезнуть вследствие расфазировки ядерных спинов. Именно в этом и заключается основная идея импульсных градиентов поля (ИГП). Перед проведением эксперимента ЯМР проводится устранение неод- нородностей магнитного поля так, чтобы во всем объеме образца внешнее магнитное поле было совершенно одинаковым. О таком поле говорят, что оно является однородным. В результате все спины, которые находятся в одинаковом химическом окружении, поглощают энергию при одном значе- нии поля и соответственно прецессируют на одной Ларморовой частоте. Эта частота не зависит от расположения спина в той или иной точке объема образца. Если же к образцу приложить линейный градиент магнитного поля (это означает, что поле линейно нарастает вдоль градиента), скажем, напри- мер, вдоль оси z, химически эквивалентные спины будут находиться в раз- 339
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР ном поле в зависимости от их расположения в образце, в нашем случае - вдоль оси z. Такой градиент называют В0-градиентом. Принцип действия градиента поля можно лучше понять, если мысленно разделить образец на микроскопические диски в плоскости х-у. Если поле однородно, то оно одинаково во всех выделенных нами дисках (рис. 2.42а). При включении градиента поля в каждом диске будет свое магнитное поле, которое зави- сит от расположения диска, поэтому скорость вращения вектора намагни- ченности будет разной (рис. 2.426). Рассмотрим ситуацию, когда градиент поля действует небольшой пе- риод времени, то есть имеем дело с импульсным градиентом. При подаче такого импульса спины, возбужденные ранее радиочастотным импульсом и расположенные вдоль направления градиента, находятся в несколько раз- личном магнитном поле, а потому прецессируют на разных частотах. По окончании действия градиентного импульса в ВСК они в результате этого повернутся на разный угол (рис. 2.426). Этот угол определяется величиной локального магнитного поля. В свою очередь, локальное поле равно сумме напряженности внешнего магнитного поля и поля, создаваемого импульс- ным градиентом в данной точке образца. Весьма важно, что угол поворота вектора намагниченности (его фазовый сдвиг) в каждом из дисков является функцией силы градиентного импульса, Bg, и его длительности, Tg. Для проведения такого эксперимента необходимо, чтобы спектрометр имел специальное оборудование, приспособленное для генерации импульсного градиента. Оно включает дополнительный генератор и катушку определен- ной формы, которая окружает образец. Электронное управление генерато- ром должно давать возможность изменять величину тока в градиентной ка- тушке и продолжительность градиентного импульса с высокой точностью. Описанный эксперимент, который включает подачу единичного градиент- ного импульса после возбуждающего импульса, можно изобразить схемой, которая приведена на рис. 2.43а. Если приложить градиентный импульс достаточной мощности и про- должительности, общая намагниченность образца, которая является вектор- ной суммой намагниченности каждого из мысленно выделенных нами дис- ков, может стать равной нулю. Такая ситуация возникнет тогда, когда вклад каждого фазового сдвига станет одинаковым. Поэтому сигнал ЯМР для такой системы наблюдаться не будет. Говорят, что градиентный импульс вызвал расфазирование намагниченности. Таким образом, единичный импульсный градиент можно использовать для удаления из плоскости х-у видимых сигналов ЯМР. Эффект воздействия импульсной последователь- ности, которая состоит из возбуждающего 90°-импульса и следующего за ним градиентного импульса, представлен на рис. 2.44, где изображена амп- литуда сигнала ЯМР образца, который содержит ядра одного типа, после воздействия ИГП возрастающей мощности. 340
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса сигнал расфазирован сигнал рефокусирован Рис. 2.42. Действие импульсного градиента поля, (а) В гомогенном магнит- ном поле все химически эквивалентные спины имеют одинаковую Лармо- рову частоту в пределах каждого из микроскопических тонких дисков, на которые можно мысленно разделить образец. Резонанс таких спинов про- исходит одновременно, в результате чего получаем узкий сигнал, (б) После действия импульсного градиента поля силой Bg и продолжительностью xg спины эволюционируют с разными частотами в зависимости от локального магнитного поля. Суммарная намагниченность образца при этом равняется нулю, (в) Действие второго, идентичного градиента, но направленного в про- тивоположную сторону, рефокусирует индивидуальные векторы и восста- навливает резонансный сигнал. Говорят, что под действием двух градиен- тов намагниченность сначала расфазировалась, а потом рефокусировалась. 341
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР а) Канал ядра X Gz Рис. 2.43. Схемы импульсных последовательностей: (а) единичный гради- ентный импульс вдоль оси z и (б) два импульсных градиента вдоль оси z, имеющие противоположное направление (градиентное эхо). Импульсный градиент обычно имеет не прямоугольный профиль, а показанный здесь профиль синуса. Рис. 2.44. Исчезновение сигнала ЯМР под воздействием импульсного гра- диента поля. Использована последовательность, изображенная на рис. 2.43а, с последовательным увеличением силы градиента в каждом последующем эксперименте. 342
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса В отличие от процесса спин-спиновой релаксации, хотя видимый сиг- нал после действия единичного градиента и отсутствует, поперечная на- магниченность в образце не исчезает бесповоротно. Это связано с тем, что векторы намагниченности в выделенных нами дисках расположены не про- извольно (как это происходит при релаксации), а определяются параметра- ми градиентного импульса. Поперечную намагниченность после действия единичного градиентно- го импульса можно восстановить подачей второго градиентного импульса, который подается непосредственно после первого, одинаковой с ним ин- тенсивности и продолжительности, но ориентированного в противополож- ном направлении - вдоль оси -z. Его действие приводит к полной нейтра- лизации действия первого импульса и появлению сигнала ЯМР. Фазовые сдвиги в дисках, на которые мы мысленно разбили образец, рефокуси- руются и дают видимый сигнал (рис. 2.42в). Импульсная последователь- ность, которая для этого была использована, изображена на рис. 2.436. Она называется последовательностью градиентного эха. Для того, чтобы про- изошел процесс рефокусировки, не- обходимо, чтобы импульсы можно было воссоздавать с очень высокой точностью. Малейшие отклонения в продолжительности и мощности им- пульсов приведут к тому, что сигнал в спектре после действия такой пос- ледовательности не появится. Это проиллюстрировано на рис. 2.45, из которого видно, что несоответствие положительного и отрицательного градиентов всего на несколько про- центов может полностью изменить результат эксперимента. Концепция расфазировки всех нежелательных сигналов и выбороч- ной рефокусировки полезных сигна- лов лежит в основе всех ИГП-экспе- риментов. Рис. 2.45. Восстановление сигнала ЯМР при градиентном эхе. Исполь- зовалась последовательность, пока- занная на рис. 2.436. Сила первого градиента фиксировалась, а сила второго градиента изменялась в интервале от 90 до 110% от силы первого с интервалом 1%. 2.12. Регистрация сигнала ЯМР Теперь остановимся на том, как в спектрометре ЯМР осуществляется регист- рация сигнала. Под регистрацией в данном случае будем понимать процесс преобразования высокочастотного тока в катушке датчика, который возни- кает после импульса, в видимый сигнал ЯМР. Этот процесс включает ряд 343
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР этапов. Когерентное вращение ядерных спинов в плоскости х-у наводит в катушке датчика слабый аналоговый электрический сигнал, содержащий частотные компоненты, соответствующие всем имеющимся в спектре ЯМР пикам. Для того, чтобы этот сигнал воспринимался компьютером прибора, его следует оцифровать, то есть представить в виде последовательности двоичных цифр, которые и воспринимаются компьютером. Поскольку сиг- нал спада свободной индукции представляет собой зависимость амплитуды от времени после импульса, то для его оцифровки в идеале требуется опре- делить амплитуду сигнала в каждый момент времени после импульса. Од- нако это бы потребовало бесконечного объема памяти компьютера. Поэто- му амплитуду сигнала определяют дискретно. Для того, чтобы сигнал в цифровой форме был близок к первичному аналоговому сигналу, необходимо определять его амплитуду с очень ма- лыми промежутками времени. Как показывает математический анализ это- го процесса, необходимые промежутки времени тем меньше, чем больше частота сигнала. Поэтому сигнал с частотой в сотни мегагерц оцифровать весьма сложно. Выходом из этой ситуации является осуществление детек- тирования сигнала - вычитание из него несущей частоты импульса. В этом случае в сигнале останутся только те частоты, которые равны разнос- тям между несущей частотой импульса и частотами ядерной прецессии от- дельных ядер. Диапазон частот при этом уменьшится в тысячу раз. Де- тектирование осуществляется специальным электронным устройством, ко- торое называется детектором. Так, например, при детектировании протонного спектра, который запи- сан на спектрометре 400 МГц, диапазон химических сдвигов равен только 4 КГц. Даже для углерода (100 МГц на том же приборе) диапазон химичес- ких сдвигов составляет только 20 КГц. Поэтому, вместо того чтобы оциф- ровывать сигнал частотой сотни мегагерц и выделять из него компоненты в несколько килогерц, которые и представляют интерес, перед оцифровкой проводят вычитание из сигнала опорной частоты импульса. В результате все частоты сигнала размещаются в достаточно узком спектральном диапа- зоне (рис. 2.46). Результирующий сигнал находится в звуковом диапазоне частот, которые для человека составляют около 20 КГц. Поэтому, в прин- ципе, сигналы ЯМР после детектирования можно даже услышать. Процесс детектирования сигналов широко используется в радиоприемниках, посколь- ку там, как и в спектрометре ЯМР, передача сигналов происходит на высо- кой частоте, а целевой сигнал имеет звуковую частоту. Таким образом, с физической точки зрения спектрометр ЯМР ничем не отличается от радио- телефона, разве что тем, что он ’’немного” более дорогой. 344
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса сигнал сравнения 400000000 Гц детектор оцифрованный сигнал 4000 Гц сигнал ЯМР 400004000 Гц Рис. 2.46. Процесс ЯМР детектирования. Фиксированная частота импульса вычитается из частоты сигнала ЯМР. Поэтому оцифровываются и запоми- наются только разности частот сигналов, которые имеют частоту в тысячу раз меньшую, чем частота импульса. 2.12.1. Отбор точек сигнала спада свободной индукции (ССИ) Процесс преобразования аналогового сигнала, который присутствует на выходе детектора, в цифровой вид нужно проводить по определенным пра- вилам. В идеале лучше всего было бы получить настолько много точек, чтобы цифровой сигнал практически совпадал с исходным аналоговым сигналом. Но для этого определение амплитуды сигналов надо проводить чрезвычайно быстро, а этому препятствует скорость действия электронных устройств. Кроме того, цифровой сигнал, который содержит много точек, нуждается в большом объеме памяти. Поэтому на практике стараются получить наименьшее возможное количество точек, которое достаточ- но для более или менее правильного цифрового отображения сигнала. 2.12.2. Критерий Найквиста Сигналы ЯМР, которые мы видим в спектре, получаются в результате сложных математических преобразований. Это несет потенциальную угрозу адекватности полученного спектра исходному аналоговому сигналу ССИ. Для того, чтобы частота сигнала ЯМР (то есть положение пика в спектре) при Фурье-преобразовании была определена правильно, ее оцифровка долж- на быть выполнена с совершенно определенными интервалами времени между точками. Нижняя граница этих интервалов задается теоремой Найк- виста. Согласно этой теореме для корректного определения частоты сиг- нала при Фурье-преобразовании достаточно выбрать, по крайней мере, две точки на каждую его волну, если считать сигнал синусоидой. Иначе гово- ря, чтобы в спектре ЯМР получить сигнал с частотой F Гц, отбор точек ин- терферограммы (его называют также выборкой) следует осуществлять с частотой 2F Гц. Этот постулат известен как критерий Найквиста. Интерфе- 345
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР рограмма представляет собой результат интерференции всех частот, кото- рые поглощаются магнитными ядрами образца. Нам необходимо коррект- но определить все эти частоты. Наибольшая частота, которую может иметь сигнал, задается верхней границей спектрального диапазона, SW, содержа- щего все имеющиеся сигналы (рис. 2.47). Спектральная ширина, SW I-----------------------------------------------------------I ? 12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9^5 э'о 8^5 8^0 7.5 7.0 6.5 &0 Рис. 2.47. Ширина спектра SW отвечает размеру наблюдаемого частотного окна. Только в этом окне частоты линий отображаются корректно. Для заданной спектральной ширины максимальный временной интер- вал между точками выбираемых данных (время задержки, DW) можно най- ти по формуле: DW = 1/2SW. (2.15) Сигналы с частотами, находящимися внутри спектрального диапазона, будут воспроизведены в спектре правильно, поскольку для них будет ото- брано как минимум по две или больше точек на волну. Сигналы, которые не входят в спектральный диапазон, будут отображены в спектре непра- вильно. Найденная для них частота окажется более низкой, чем ее реальное значение. Таким образом, сигнал, который находится вне спектрального диапазона, все равно попадет в спектральный диапазон и окажется среди сигналов, частоты которых определены правильно, однако положение этого сигнала в спектре будет неправильным. Это ил- люстрирует рис. 2.48, где для трех разных частот применен одинаковый интервал выборки данных. Для двух из частот критерий Найквиста выпол- няется, поэтому частоты этих сигналов будут найдены правильно. Для наи- 346
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса большей из частот критерий Найквиста не выполняется, поэтому после оцифровки сигнал будет иметь неверную частоту. а) виден в виде отраженного сигнала б) отображается правильно в) отображается правильно DW Рис. 2.48. Критерий Найквиста. Для того, чтобы правильно определить час- тоту ЯМР сигнала, необходимо для каждого колебания выбрать, по мень- шей мере, две точки. Выборка сигналов (б) и (в) отвечает этому критерию. Если частоты сигналов слишком велики, чтобы отвечать этому условию (а), то при оцифровке они будут определены неправильно. В спектре такие частоты проявляются в виде отраженных сигналов. Сигналы с неправильными частотами, которые в действительнос- ти находятся вне спектрального диапазона, называют отраженными сигналами. Их положение в спектре зависит от схемы квадратурного де- тектирования, которое применяется в используемом приборе (см. ниже). Визуально они отличаются от других сигналов по своей фазе и таким обра- зом могут быть идентифицированы. 2.123. Время сбора данных и цифровое разрешение Суммарное время выборки точек сигнала ССИ известно как время сбора данных (AQ). Оно определяется тем, насколько близко в спектре располо- 347
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР жены отдельные сигналы. Чем точнее необходимо находить частоты по- глощения, тем больше точек должно быть в спектре после его оцифровки. Расстояние между соседними точками оцифрованного спектра в Гц на- зывается его цифровым разрешением DR (имеет размерность Гц/точка). В спектре не видны линии, расстояние между которыми меньше цифрового разрешения. При измерении спектра цифровое разрешение можно менять. Для этого увеличивают общее время сбора данных. Следует сразу отме- тить, что этот параметр не связан непосредственно с термином ’’разреше- ние", который часто употребляют спектроскописты для характеристики од- нородности магнитного поля. Цифровое разрешение определяется только со- отношением спектрального диапазона и количества точек выборки. Оно ве- лико для хорошо оцифрованных спектров и мало для плохо оцифрованных. Из принципа неопределенности Гейзенберга вытекает, что наблюдать отдельно две линии, частоты которых различаются на Av Гц, можно в слу- чае сбора данных за l/Av секунд. Если время сбора данных при формирова- нии ССИ оказывается недостаточным, разность в частотах определенных линий не проявится и тонкая структура будет утеряна. Минимальная ширина линий в Гц, которые удается различить, составляет приблизительно 0.6/AQ. С другой стороны, если спад сигнала вследствие релаксации проис- ходит слишком быстро, то бессмысленно осуществлять выборку за более продолжительный период. В этом случае тонкая структура также может те- ряться. Быстрый спад ССИ происходит чаще всего вследствие малого вре- мени поперечной релаксации или недостаточной однородности магнитного поля. В этом случае невозможно улучшить разделение пиков в спектре за счет увеличения времени сбора данных. Поэтому при выборе времени сбо- ра данных нужно учитывать два параметра - необходимое цифровое разре- шение и время поперечной релаксации образца. Лучше всего выбирать вре- мя сбора данных таким, чтобы интерферограмма спадала до нуля к концу периода AQ. Время сбора данных, AQ, определяется скоростью оцифровки, завися- щей от спектрального диапазона и времени задержки DW, и общим числом отобранных точек. Если сигнал ССИ содержит TD точек, то AQ = DW TD = TD/2SW. (2.16) Если рассмотреть математические основы Фурье-преобразования, то оказывается, что в результате этой процедуры получается не один набор данных, отвечающий спектру ЯМР, а два таких набора. Один от другого наборы данных различаются фазовыми сдвигами сигналов. Если в одном на- боре пики имеют вид сигналов поглощения, то во втором наборе - сигна- лов дисперсии. Полученные наборы данных называют "реальным" и "мни- мым" спектрами. В силу этих особенностей Фурье-преобразования реаль- 348
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ный спектр, с которым обычно имеют дело, содержит только половину то- чек, имеющихся в исходном сигнале ССИ (при отсутствии дополнитель- ных манипуляций). Поэтому объем данных, SI, равен TD/2. Цифровое раз- решение при этом составит: DR = SW/SI = 2SW/TD = 1/AQ. (2.17) Таким образом, цифровое разрешение является обратной величиной времени сбора данных. Поэтому для получения хорошо оцифрованного спектра необходимо увеличить период сбора данных. Эффект недостаточ- ного цифрового разрешения показан на рис. 2.49. Гц/точка AQ (с) Рис. 2.49. Влияние времени сбора данных на возможность наблюдения тонкой структуры сигнала. Более длительные времена сбора данных соот- ветствуют более высоким уровням оцифровки (меньше Гц/точка), которые делают возможным наблюдение структуры расщепления в дублете дубле- тов (J = 6 и 2 Гц). 349
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Ясно видно, что при малых AQ тонкая структура пиков теряется. Спектр без искажений удается получить только при использовании доста- точно длительного времени сбора данных. В протонной спектроскопии для определения малых КССВ обычно бывает необходимо получить разрешение линий, отстоящих одна от другой на 1 Гц или несколько меньше. Поэтому время сбора данных следует выбирать в диапазоне 2-4 с, что отвечает циф- ровому разрешению 0.5-0.25 Гц/точка. Эти величины являются той пре- дельной точностью, с которой можно определить значения химических сдвигов и КССВ (даже если прибор выдает эти величины с несколькими знаками после запятой). Несколько иной оказывается ситуация при изучении ядер, отличных от протонов. Для таких ядер спиновые расщепления (в особенности при воз- действии протонного декаплера) встречаются редко, кроме того при изме- рении таких спектров основное внимание сосредотачивается на оптими- зации чувствительности. Поэтому длительное время сбора данных в этом случае используется редко. В данном случае нет необходимости оцифро- вывать линии с большой точностью. При измерении таких спектров ис- пользуется цифровое разрешение 1-2 Гц/точка, что соответствует времени сбора данных 0.5-1 с. Для спектров на ядрах 13С чаще всего используются именно эти параметры. Исключением являются ядра с высоким естествен- ным содержанием, для которых могут проявляться гомоядерные КССВ, такие как 31Р. Использование низкого цифрового разрешения в рутинных углеродных спектрах является одной из причин, по которым точные интен- сивности сигналов найти не удается. Спектры квадрупольных ядер, имею- щих широкие сигналы, можно снимать при еще более низком цифровом раз- решении, поэтому для них можно использовать малое время сбора данных. 2.12.4 . Квадратурное детектирование Ранее мы отмечали, что в процессе детектирования сигнала ЯМР происхо- дит вычитание из сигнала опорной частоты импульса, который воздейство- вал на образец. В результате вместо высокочастотного отклика спиновой системы на импульс образуется сигнал звуковой частоты, который оцифро- вывается, а потом подвергается Фурье-преобразованию. Эту ситуацию лег- ко описать с помощью концепции ВСК. Мы уже сталкивались с тем, что в ВСК после импульса можно рассматривать не частоты ядерной прецессии, которые имеют порядок мегагерц, а разности между резонансными часто- тами и несущей частотой импульса. Именно такая ситуация складывается после детектирования сигнала ЯМР. В этом случае после детектирования получаем в плоскости х-у набор векторов, частота вращения которых равна разности частоты сигнала и несущей частоты импульса. Направление вра- 350
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса щения векторов может различаться. Если частота спина несколько меньше несущей частоты импульса, вращение соответствующего вектора будет происходить в одну сторону, а если частота спина превышает частоту им- пульса, то - в другую. На самом деле ситуация оказывается несколько сложнее. При дейст- вии возбуждающего импульса для каждого из спиновых состояний возникают как переходы с нижнего энергетического уровня на верх- ний (а-0), так и переходы в обратном направлении ((3—а). Каждому из таких переходов соответствует свой вектор намагниченности. Естественно, что частота таких переходов одинакова, но в ВСК они различаются знаком вращения. Поэтому мы имеем удвоенное количество векторов намагничен- ности. Один из наборов векторов соответствует изменению магнитного квантового числа системы на +1, а другой - на -1. В спектре такой спино- вой системы должно наблюдаться удвоенное число пиков, симметричных относительно несущей частоты импульса, если она соответствует центру спектрального диапазона. При детектировании сигнала нам необходимо ос- тавить в спектре лишь один из наборов пиков. Проблема заключается в том, что при обычной (одноканальной) схеме детектирования Фурье-преобразование не различает знака частот. Поэтому нет возможности различить частоты, которые расположены выше опорной частоты, от частот, которые расположены ниже от нее. Это приводит к то- му, что в спектре после Фурье-преобразования вместо одного сигнала с частотой v образуются два резонансных сигнала при частотах +v и -V Гц (рис. 2.50). Таким образом, после детектирования получаем сигнал и его копию. Как видно из рисунка, эти сигналы являются симметричными относительно несущей частоты. Рис. 2.50. Одноканальная схема детектирования не способна различить по- ложительные и отрицательные частоты в ВСК. В результате этого, если частота передатчика совпадает с центром спектра, в нем появляются зер- кально-отраженные сигналы. 351
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Неминуемую путаницу, возникающую из-за наложения этих сигналов в спектре, можно устранить, если опорную частоту импульса установить не в центре спектра, а в одном из его концов. В этом случае в ВСК все век- торы будут иметь одинаковый знак, а копии сигналов не попадут в спект- ральный диапазон. Хотя такой подход и избавляет от проблем перекрыва- ния сигналов разного типа, он привносит другие нежелательные проблемы. Во-первых, хотя из спектра исчезают отраженные сигналы, но шум, как и раньше, будет иметь отражение относительно опорной частоты и будет складываться с шумом, который имеется в спектральном диапазоне. Кроме того, при такой схеме детектирования разность между частотой импульса и наибольшей резонансной частотой сигналов оказывается максимальной, что увеличивает вероятность появления внерезонансных эффектов. Поэто- му более целесообразным является расположение опорной частоты им- пульса в центре спектрального диапазона и использование так называемой двухканальной (квадратурной) схемы детектирования сигнала. Этот метод детектирования позволяет различить знак частоты сигнала, а следователь- но, позволяет удалить из спектра ненужный набор сигналов. Двухканальная схема детектирования заключается в одновременной регистрации сигнала на двух детекторах, которые имеют между собой фазовый сдвиг на 90° Для того, чтобы яснее понять, почему одноканальная схема детектиро- вания не может различить положительные и отрицательные частоты и как это может осуществлять квадратурный метод, еще раз рассмотрим вектор намагниченности единичного спина в ВСК. Использование одноканального детектирования позволяет наблюдать амплитуду намагниченности только вдоль одной оси, скажем оси у, то есть детектируется на самом деле не ре- альная намагниченность, а ее проекция на ось у. Рис. 2.51 показывает, что результирующий сигнал вдоль этой оси для вектора, который переместил- ся на +v Гц, идентичен сигналу для вектора, который образуется при пере- мещении вектора намагниченности на -V Гц. В обоих случаях он подчиня- ется закону косинуса. Поэтому сигналы различить невозможно (рис. 2.51а). Если же использовать двухканальное (фазочувствительное) детектиро- вание с помощью двух детекторов, для которых опорный сигнал различа- ется по фазе на 90° (отсюда термин ’’квадратурное”, то есть со смещением на четверть периода), то появляется возможность одновременного наблю- дения намагниченности вдоль осей х и у. При этом в одном канале образу- ется синусоидальный сигнал, а во втором - косинусоидальный (рис 2.516). Использование дополнительных данных, которые получены во втором ка- нале, дает возможность найти направление движения векторов в СКО, а следовательно, и различить их перемещение на ±v Гц. Можно себе пред- ставить, что Фурье-преобразование осуществляется специальным элект- ронным устройством, которое имеет два входа - ’’реальный” и ’’мнимый”. 352
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса время Му d(Mv)/dt Рис. 2.51а. Сигнал, попадающий на датчик приемника при одноканальном детектировании. Индицируется намагниченность вдоль одной оси (ось у). Вверху показана форма сигнала для компонент намагниченности, враща- ющихся против часовой стрелки, внизу - по часовой стрелке. Видно, что при таком детектировании сигналы неразличимы. М* d(Mx)/dt время Рис. 2.516. Сигнал, попадающий на датчики приемников при двухканаль- ном (квадратурном) детектировании. Индицируется намагниченность вдоль двух ортогональных осей. Вверху показана форма сигнала для компонент намагниченности, вращающихся против часовой стрелки, внизу - по часо- вой стрелке. Видно, что при таком детектировании сигналы становятся раз- М( d(Mx)/dt время личимыми. 353
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Сигнал от образца разделяется на два канала. Один из них отвечает компонентам намагниченности х, а второй - компонентам у. Сигналы на ре- альном и мнимом входах Фурье-преобразователя обрабатываются раздель- но, причем один из них детектируется с фазовым сдвигом приемника на 90°. Это дает возможность в каждом из каналов раздельно получить спектр, который отвечает только одному набору сигналов. Полученные в каждом из каналов данные записываются в разные области памяти компьютера. В результате этого положительные и отрицательные частоты корректно раз- деляются, и используется только один набор данных. При работе по одно- канальной схеме оцифрованные данные подаются лишь на реальный вход Фурье-преобразователя. 2.12.5 . Отраженные сигналы Ранее мы показали, что сигналы, которые находятся вне спектрального диапазона, хотя и детектируются спектрометром, однако имеют неправиль- ную частоту, поскольку они не отвечают критерию Найквиста. Такие сиг- налы называют отраженными. Наличие в спектре отраженных сигналов может вызвать при интерпретации ошибки, поскольку заранее неизвестно, правильный химический сдвиг имеет сигнал или нет. Точное расположение отраженных сигналов в спектре зависит от используемой схемы квадратур- ного детектирования и от того, насколько далеко находится сигнал от спект- рального диапазона SW. Существуют две схемы квадратурного детектиро- вания, которые называются детектированием с параллельной и с после- довательной выборкой. Мы не будем анализировать их отличия, укажем лишь, что в схеме с параллельной выборкой (комплексное Фурье-преоб- разование) отраженный сигнал как будто бы наматывается на спектральное окно и проявляется в противоположной стороне спектра (рис. 2.526). В схе- ме с последовательной выборкой (реальное Фурье-преобразование) сигнал отражается от ближайшего к нему края спектрального диапазона (рис. 2.52в). Поэтому в зависимости от схемы, которая используется в приборе, отра- женные сигналы Вы можете наблюдать в разных концах спектра. В большинстве случаев в протонной спектроскопии удается легко иден- тифицировать отраженные сигналы, поскольку они, в отличие от всех дру- гих, имеют искаженную фазу. В гетероядерной спектроскопии, когда при- сутствует только один сигнал, о его фазе судить невозможно, поскольку в любом случае ее можно установить произвольно с помощью фазовой кор- рекции. В этом случае для выяснения природы сигнала следует изменить спектральный диапазон и проследить за перемещением пика. Если сигнал не является отраженным, его абсолютная частота останется неизменной. 354
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса а) 6 5 4 3 2 1 М.д. Рис. 2.52. Вид отраженных сигналов. В спектре (а) положения всех сигна- лов отвечают частотам их резонанса. В спектрах (б) и (в) спектральное окно было выбрано неправильно. Рисунок (б) показывает, как сигнал отра- жается назад в спектр от дальней границы окна, если применена параллель- ная выборка, тогда как в спектре (в), полученном с помощью последова- тельной выборки, сигнал отражается от ближнего края спектрального окна. Чаще всего фаза отраженных сигналов искажена. 2.13. Фазовые циклы, селекция сигналов Хотя использование квадратурного детектирования в спектроскопии ЯМР имеет неоспоримые преимущества, оно может приводить к появлению в 355
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР спектре ложных пиков. Такие пики чаще всего называют ’’артефактами” Для удаления их из спектров разработаны специальные методики обработ- ки данных. Чаще всего с этой целью применяют так называемые фазовые циклы. Этот метод является довольно эффективным и применяется в боль- шинстве современных экспериментов ЯМР. Фазовый цикл заключается в повторении импульсной последовательности с идентичными уста* новками углов импульсов и временных промежутков, но с заданными изменениями фаз действующих импульсов. Данные накапливаются в па- мяти компьютера. Одновременно может циклически изменяться и фаза приемника. Идея здесь заключается в том, что полезные сигналы накапли- ваются в памяти, а нежелательные сигналы, связанные с несовершенством прибора или с ненужным поглощением, взаимно уничтожаются в конце фазового цикла и не проявляются в результирующем спектре. Из последу- ющих разделов книги станет понятной важность фазовых циклов особенно для проведения многоимпульсных одномерных и двумерных эксперимен- тов, однако в данном параграфе мы рассмотрим их на примере артефактов квадратурного детектирования. В общей схеме квадратурного детектирования проводится оцифровка двух сигналов, которые различаются по фазе на 90°, а в остальном являют- ся идентичными. Оцифрованные данные для каждого из сигналов запоми- наются в разных областях памяти, которые мы обозначим 1 и 2. Экспери- ментально довольно сложно гарантировать фазовый сдвиг точно на 90° и идентичность амплитуды сигналов в обоих каналах, поскольку для регист- рации сигнала используются два разных детектора. Разбалансировка кана- лов по фазе и амплитуде ведет к появлению паразитных сигналов, которые являются отражениями относительно опорной частоты, как это мы наблю- дали в одноканальной схеме детектирования. Они известны как квадратур- ные копии (рис. 2.53). Их природу можно понять, если представить себе, что в какой-либо момент амплитуда сигнала в одном из каналов внезапно становится нулевой. При этом схема будет отвечать одноканальному детектированию, в котором положительные и отрицательные частоты различить невозможно, и происходит отражение сигналов относительно опорной частоты. Для пра- вильно отбалансированного приемника интенсивность квадратурных ко- пий для единичного скана составляет около 1%, однако даже такой сигнал может оказаться слишком большим, если нужно анализировать слабые сиг- налы в присутствии значительно более сильных. Поэтому их нужно уда- лять из спектра. Одно из решений проблемы заключается в обеспечении эквивалент- ности данных, которые получены в каналах А и Б и записаны в разделах памяти 1 и 2. Этого можно достичь, если провести два последовательных эксперимента. В первом из них используется импульс 90°г, а во втором - 356
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 90°v (рис. 2.54). Данные сохраняются в разделах памяти 1 и 2. Как следует из схемы, которая изображена на рисунке, при этом каналы фактически ме- няются местами, поэтому в сумме за 2 скана в каждом из них накаплива- ется одинаковый сигнал. Для того, чтобы приемник ”не заметил” измене- ния фазы сигналов, его фазу при переходе ко второму скану также меняют на 90° Так, после суммирования сигнала после действия фазового цикла, в области 1 сигнал будет равен {f(sincp)B + f(sincp)A}, а в области 2 равен {f(coscp)B - f(coscp)A}. Отсюда вытекает, что в каждом из каналов происхо- дит суммирование (с учетом изменения фазы приемника) сигнала, поступа- ющего из двух, несколько неэквивалентных каналов А и Б. импульса Рис. 2.53. Квадратурные копии являются нежелательными артефактами, которые возникают из-за несовершенства спектрометра. Интенсивность ко- пии сигнала СНС1з равняется приблизительно половине высоты углеродно- го сателлита. Путем использования двухшагового фазового цикла удается компенси- ровать несбалансированность двух каналов приемника. Необходимость ис- пользования фазового цикла при измерении спектров требует накопления спектра как минимум от двух сканов. Математическое обеспечение спект- рометров ЯМР составлено таким образом, что оператору не приходится за- ботиться об организации фазовых циклов. Имеются программы большин- ства стандартных экспериментов ЯМР, в которых необходимые фазовые циклы уже организованы. Поэтому при подаче команды на выполнение программы фазы импульсов и приемника при переходе от скана к скану меняются автоматически. 357
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Рис. 2.54. Фазовый цикл. Двухшаговый цикл устраняет нежелательные квад- ратурные артефакты, в то время как полезные ЯМР сигналы сохраняются. Чаще всего, фазовый цикл, который применяется в эксперименте ЯМР, записывают в виде таблицы, в которой указывают фазы импульса и прием- ника в каждом скане фазового цикла. Для примера описанный выше двух- шаговый фазовый цикл показан в виде таблицы 2.2. Таблица 2.2. Простейшие фазовые циклы Двухшаговый фазовый цикл Номер скана Фаза импульса Фаза приемника 1 X X 2 У У Цикл CYCLOPS 1 X X 2 У У 3 —X —X 4 -у -у Помимо того, что фазовый цикл может компенсировать несбалансиро- ванность квадратурных каналов, он может также уничтожать сигналы, фаза которых не соответствует изменению фазы импульса в цикле. К таким сиг- налам относятся многие артефакты, а также сигналы, возникающие за счет 358
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса различных типов когерентности. Таким образом, благодаря работе фазово- го цикла одни сигналы складываются в памяти компьютера и дают вклад в конечный спектр, а другие - удаляются из спектра. По аналогии с биологи- ческой селекцией такой процесс, как мы уже упоминали, называется селек- цией сигналов. Селекция сигналов широко применяется в многоимпульс- ных последовательностях. В одномерной спектроскопии ЯМР весьма часто применяется фазовый цикл CYCLOPS (Cyclically ordered phase cycle). Он используется для повышения качества большинства спектров (таблица 2.2). Существует и более современный метод селекции сигналов, основанный на использовании импульсных градиентов поля. Однако чтобы понять, как он действует, следует еще раз более подробно осветить понятие когерентности. 2.14. Генерация когерентностей разных порядков С понятием когерентности мы познакомились при описании механизма возникновения поперечной намагниченности. Оно лежит в основе всех экспериментов ЯМР, поскольку действие импульса приводит к синхрони- зации движения ядерных спинов. Аналогично тому, как вектор макроско- пической ядерной намагниченности мы разбивали на ряд векторов, кото- рые отвечают отдельным сигналам ЯМР, можно и когерентность рассмат- ривать раздельно для каждого из пиков. В некотором смысле понятие коге- рентности и намагниченности эквивалентны, поскольку намагниченность возникает именно благодаря когерентному вращению ядерных спинов. Поэтому среди спектроскопистов ЯМР весьма часто используют понятие ’’когерентность” вместо понятия "намагниченность” Понятие когерентнос- ти часто является даже более удобным, поскольку оно помогает пояснить, с какой именно намагниченностью мы имеем дело. Некоторые специфи- ческие особенности когерентности можно проиллюстрировать с помощью энергетической диаграммы двухспиновой системы АХ (рис. 2.55а). После подачи на систему, находящуюся в равновесии, 90°-импульса возникает поперечная намагниченность. В соответствии с векторной мо- делью в ВСК она может быть описана четырьмя векторами, которые во время подачи импульса ориентируются вдоль оси, соответствующей фазе импульса. На энергетической диаграмме каждому вектору отвечает свой переход (рис. 2.55а). Переходы различаются тем, какой из спинов изменяет свою ориентацию при возбуждении. В результирующем спектре это приводит к появлению четырех линий в двух дублетах. Эти переходы называются одноквантовыми переходами, поскольку они связаны с изменением ориентации только одного спина. При этом суммарное магнитное квантовое число спиновой системы, Л/, ме- няется на единицу (АЛ/ =1). Намагниченность, связанная с каждым таким 359
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР переходом, называется одноквантовой когерентностью. Говорят еще, что порядок когерентности для таких переходов равен 1. В общем однокванто- вую когерентность можно представить как фазовую когерентность между двумя состояниями, для которых АЛ/ = ±1. Рис. 2.55. Диаграмма энергетических уровней связанной двухспиновой сис- темы АХ (а); б) воздействие селективного импульса на переход Аь в) воз- действие двух селективных импульсов на переходы Ai и Хг, появление двухквантовой когерентности; г) когерентности, возникающие при дейст- вии неселективного импульса. SQC - одноквантовая когерентность, DQC - двухквантовая когерентность, ZQC - нульквантовая когерентность. 360
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Теперь промоделируем воздействие 90°-импульса на двухспиновую систему, находящуюся в равновесии, причем будем считать, что импульс воздействует только на один переход, скажем, на Аь Это вполне возможно при использовании специфических селективных импульсов. В результате мы получим одноквантовую когерентность для этого единственного пере- хода (рис. 2.556). В такой ситуации заселенности уровней 1 и 2 окажутся выравненными. Следующая картинка показывает, как воздействует селек- тивный 90°-импульс на переход Х2. При этом происходит выравнивание заселенностей вдоль этого перехода. Если второй селективный импульс мы подали через малое время после первого, то когерентности переходов Ai и Х2 существуют одновременно. Поэтому происходит выравнивание заселен- ностей в обоих возбужденных уровнях. Такой процесс переносит часть спинов, соответствующих состоянию Ра, в состояние рр. Часть фазовой когерентности, первоначально связанной с Аь теперь оказывается связан- ной с переходом 1-4 (аа-РР) (рис. 2.55в). Это новая форма когерентности, с которой ранее мы не имели дела. Она соответствует изменению главного квантового числа на 2 (АЛ/ = 2). Поэтому ее называют двухквантовой ко- герентностью (р = 2, где р - порядок когерентности). Ее невозможно пока- зать с помощью векторной модели. Выше мы рассмотрели, что произойдет, если с помощью двух селек- тивных импульсов последовательно возбудить два перехода спиновой сис- темы АХ. Обычный неселективный импульс одновременно возбуждает все возможные переходы спиновой системы. Поэтому после его воздействия одновременно появляются когерентности, соответствующие всем разре- шенным переходам, - Хь Х2, Аь Аг. Если после первого импульса через небольшой промежуток времени, когда возникшие когерентности еще су- ществуют, подать второй неселективный 90°-импульс, то когерентность, первоначально связанная с каждым из одноквантовых переходов, например Ai, распределяется между всеми другими переходами спиновой системы (Xi, Х2, А2, 1-4, 2-3). Часть намагниченности остается и на Ai (рис. 2.55г). При этом помимо одноквантовой когерентности возникают и другие, воз- можные в данной спиновой системе виды когерентности. Так, когерент- ность 1-4 является двухквантовой когерентностью, которая была описана выше. Когерентность 2-3 соответствует нулевому изменению магнитного квантового числа, поэтому ее называют нульквантовой когерентностью. Процесс перераспределения когерентностей под действием двух последо- вательных импульсов называется переносом когерентности. Эффектив- ность такого процесса зависит от взаимной ориентации в ВСК векторов, от- вечающих спиновым мультиплетам. Если, например, векторы, отвечающие компонентам дублета, расположены антипараллельно, эффективность пе- реноса когерентности будет максимальной. Если же эти компоненты вра- 361
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР щаются в момент подачи второго импульса синхронно, то есть они распо- ложены вдоль одной оси, то процесс переноса когерентности не происхо- дит. Этим объясняется отсутствие переноса когерентности при действии единичного импульса. Если целью эксперимента является именно перенос когерентности, то второй импульс следует подавать в момент антипарал- лельного расположения векторов намагниченности мультиплетов. Для дуб- лета оптимальная задержка между импульсами равна J/2. Продольная намагниченность, хотя и не является когерентной, также имеет р = О, однако ей не соответствует поперечная намагниченность. Все когерентности, для которых р Ф ±1, называют многоквантовыми когерент- ностями. Квантово-механические правила отбора свидетельствуют, что Рис. 2.56. Упрощенно кар- тину многоквантовой коге- рентности спиновой систе- мы АХ можно представить как группу противофазных векторов. Эта группа име- ет нулевую суммарную на- магниченность и в спектре не проявляется. - в соответствии с только одноквантовая когерентность непосредственно индуцирует сигнал ЯМР. Другие когерентности не связаны с появлением поперечной намагни- ченности. Таким образом, многоквантовая ко- герентность, которую невозможно наблюдать, имеет несколько иллюзорный характер. Прос- той физической картиной, позволяющей пред- ставить себе многоквантовую когерентность, является пара вращающихся векторов, кото- рые всегда располагаются в противофазе и поэтому никогда не дают суммарной намаг- ниченности (рис. 2.56). Скорость эволюции таких состояний оп- ределяется химическими сдвигами резониру- ющих ядер и порядком когерентности. Если во вращающейся системе координат эволюция одноквантовой когерентности происходит в соответствии с химическим сдвигом ядра, то двухквантовая когерентность эволюциониру- ет соответственно сумме химических сдвигов двух спинов (va + vx), а нульквантовая коге- их разностью (vA - vx). В системах, содержа- щих более двух спинов, могут присутствовать также когерентности более высоких порядков. Так, в трехспиновой системе может появиться трех- квантовая когерентность и т.д. Хотя когерентности высоких порядков и нельзя наблюдать непосредственно, их можно обнаружить непрямым мето- дом, если перед наблюдением перевести их в одноквантовую когерент- ность. Например, добавление еще одного, третьего, импульса может реге- нерировать одноквантовую когерентность из имеющейся многоквантовой когерентности. Спин-спиновая релаксация приводит к исчезновению наблю- даемого сигнала из-за нарушения фазовой когерентности поперечной на- 362
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса магниченное™. Многоквантовая когерентность также дефазируется вслед- ствие релаксационных процессов. Она, как и одноквантовая когерентность, имеет ограниченное время жизни, когда с ней можно манипулировать. Следует также отметить, что когерентность имеет определенный знак. Поэтому одноквантовая когерентность может иметь порядок р = +1 или р = -1. Аналогично двухквантовая когерентность может иметь значения р = ±2 и т.д. Положительный и отрицательный знаки соответствуют гипо- тетическим векторам, которые во вращающейся системе координат прецес- сируют одновременно, но в разных направлениях. Для одноквантовой ко- герентности они отвечают двум наборам зеркальных сигналов, распо- ложенных по обе стороны от опорной частоты в отсутствие квадратур- ного детектирования. Если при сборе данных применяется квадратурное детектирование, мы используем только один набор сигналов, а другой уда- ляем. Таким образом, создание состояния когерентности порождает оп- ределенные физические феномены^ р-квантовые когерентности, кото- рые существуют уже сами по себе и эволюционируют по присущим им законам. Существуют как гомоядерные р-квантовые когерентности, так и гетероядерные р-квантовые когерентности, которые образуются за счет возникновения когерентности ядер разных типов. Такую ситуацию можно реализовать путем одновременной подачи импульсов на частотах двух ядер. Частота их прецессии определяется по приведенным выше формулам. Так, частота двухквантовой гетероядерной когерентности протонов и ядер 13С равняется Vh + Vc. Невозможно привести наглядную картину образова- ния таких когерентностей, поскольку частоты их прецессии кардинально отличаются от частот прецессии каждого из спинов, однако их существова- ние является бесспорным, поскольку такие когерентности можно не только увидеть в определенных экспериментах, но и с успехом использовать для получения спектров гетероядерной корреляции. Наиболее близкой механи- ческой аналогией р-квантовым когерентностям, как физическому явлению, является образование стоячих волн из колебаний разной частоты. Из меха- ники известно, что частота стоячих волн существенно отличается от час- тоты колебаний, которые их образовали. Поэтому можно считать, что как только мы тем или другим путем создали состояние когерентности, то при этом образовались все возможные при данных условиях стоячие волны (р-квантовые когерентности). Поскольку они по-разному реагируют на фа- зу дальнейших импульсов или действие импульсных градиентов поля, то можно в ходе эксперимента целенаправленно работать лишь с необходимой р-квантовой когерентностью, а все другие типы когерентностей, которые также присутствуют, игнорировать или уничтожать путем расфазировки. 363
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР 2.15. Диаграммы уровней когерентности Наличие когерентностей разных порядков при действии любой импульс- ной последовательности можно проиллюстрировать с помощью диаграммы уровней когерентности. Эти диаграммы первоначально использовались для визуализации работы новых импульсных последовательностей. Они осо- бенно полезны для понимания того, как изменяется намагниченность на разных стадиях последовательности от ее начала и до детектирования сиг- нала. С их помощью удается показать наличие многоквантовой когерент- ности, которую невозможно описать с помощью векторной модели. Диаг- рамма уровней когерентности одноимпульсного 1D эксперимента пред- ставлена на рис. 2.57. Она представляет собой несколько горизонтальных линий, которые отвечают возможным уровням когерентности. Путь пере- хода когерентности с одного уровня на другой показывается жирной линией. Диаграмма располагается под диаграммой импульсной последовательнос- ти. Таким образом, она показывает, при действии каких элементов им- пульсной последовательности происходит изменение порядка когерентнос- ти, который используется в эксперименте. Поскольку один импульс гене- рирует только когерентность с р = ±1, то в данном случае диаграмма содер- жит лишь две горизонтальные линии, которые расположены выше и ниже состояния, где порядок когерентности равняется нулю. Они представлены на рисунке как пунктирные линии. Принято порядок когерентности указы- вать на каждой из горизонтальных линий. Рис. 2.57. Диаграмма уровней когерентности для одноимпульсного 1D экспе- римента. Сплошная линия показывает путь переноса когерентности для наблюдаемой намагниченности. Пунктирная линия показывает зеркальный путь переноса намагниченности, который удаляется схемой квадратурного детектирования. Как мы уже отмечали, квадратурное детектирование выделяет один из путей переноса когерентности, а другой удаляет. Будем считать, что выде- 364
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ляется путь, для которого р = -1. Этот путь показан жирной линией. При анализе таких диаграмм всегда следует помнить, что на ней приведен лишь один путь изменения когерентности, который использует данная импульсная последовательность. Все другие пути, хотя они и сущест- вуют, на диаграмме не приводятся. При работе с диаграммами уровней когерентности следует учитывать то, что они не отражают количественных отношений между когерентнос- тями различного порядка, а показывают лишь сам факт наличия этих коге- рентностей. Более того, если внимательно рассмотреть рис. 2.57, то из него можно сделать вывод о том, что когерентность не подвержена релаксации, поскольку она существует даже тогда, когда интерферограмма спадает до нуля. Однако на самом деле это не так. На рисунке интерферограмма обозна- чает лишь фазу эксперимента (сбор данных), но никоим образом не соот- ветствует реальной длительности этого периода. Несмотря на эти недостат- ки, диаграммы уровней когерентности являются мощным средством визуа- лизации процессов, происходящих во время экспериментов ЯМР, и широко применяются в оригинальной литературе. 2.16. Применение импульсных градиентов поля для селективной рефокусировки когерентностей разного порядка Импульсные градиенты поля являются мощным инструментом для селек- ции когерентностей разных порядков. С их помощью практически в любой импульсной последовательности можно избирательно расфазировать или сфазировать нужный тип когерентности. Такая возможность существует вследствие того, что когерентности разных порядков по-разному реаги- руют на градиентные импульсы. Проще всего такие различия понять, если выразить их математически. При отсутствии градиента поля Ларморова частота спина, со, опреде- ляется приложенным магнитным полем Во. При этом со = уВо. Если допол- нительно приложить импульсный градиент вдоль оси z, появляется дополни- тельное поле Bg(Z), связанное с градиентом. В таких условиях Ларморова частота спинов в зависимости от их расположения вдоль оси г будет опре- деляться суммой обоих этих полей: M(z) = Y(Bo + Bg(z)) (рад-с-1). (2.18) Если продолжительность импульса градиента составляет Tg (с), вектор намагниченности под его действием поворачивается на фазовый угол Ф: Ф(г)= Y(Bo + Bg(z))Tg = yBoTg + yBg(Z)Tg. (2.19) 365
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Первый член последнего соотношения описывает Ларморову прецессию без градиента. Она постоянна во всем объеме образца. Поэтому мы исклю- чаем его из дальнейшего обсуждения. Второй член описывает специфичес- кую зависимость фазы, вызванную действием градиента. Нас будет интере- совать именно эта зависимость. Приведенное выше уравнение можно использовать лишь для одно- квантовой когерентности. Распространить его на другие виды когерентнос- ти можно, если включить в него член, который описывает порядок ко- герентности р (то есть суммарное изменение спина перехода). Оказывает- ся, что изменение фазового угла пропорционально порядку когерентности. В результате получим: Ф(г)= PYBg(Z)Tg. (2.20) Из данной модификации уравнения следует вывод, что р-квантовая когерентность расфазируется со скоростью, которая пропорциональ- на р. Так, двухквантовая когерентность расфазируется вдвое быстрее одно- квантовой когерентности. Аналогично, нульквантовая когерентность не- чувствительна к действию импульсных градиентов. Если когерентность включает ядра разных типов, следует учитывать также и гиромагнитное со- отношение для каждого ядра: Ф(г) = Bg(Z) TgZ р, Yi- (2.21) Таким образом, мы приходим к выводу о том, что степень рефокуси- ровки когерентности зависит от ее порядка и гиромагнитного соотно- шения ядра. Это дает ключ к селекции сигналов методом импульсных гра- диентов. Целью применения градиентов в большинстве экспериментов яв- ляется избирательная рефокусировка намагниченности, которая связана с необходимым путем переноса когерентности. Другие пути удаляются с по- мощью их расфазировки и потому не проявляются в конечном спектре. Хо- тя сами ИГП не могут изменить порядок когерентности, это можно сделать с помощью радиочастотных импульсов. Комбинация радиочастотных им- пульсов, которые продуцируют когерентность нужного порядка, и импульс- ных градиентов для выделения нужных ее компонентов дает возможность в конечном спектре получить необходимый результат. Пример такой се- лекции для гомоядерной спиновой системы показан на рис. 2.58. Пусть в начале эксперимента присутствует только двухквантовая коге- рентность. Таким образом, перед подачей радиочастотного импульса име- ется когерентность с р = +2. Нашей целью является переведение ее в коге- рентность порядка р = -1. Рассчитаем, с помощью каких градиентных им- пульсов можно достигнуть этой цели. Очевидно, что прежде всего следует расфазировать имеющуюся когерентность. Для этого можно подать на спи- 366
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса новую систему произвольный градиент- ный импульс с полем Bgi продолжитель- ностью Тр Этот градиент вызовет опре- деленный фазовый сдвиг сигналов. Его можно вычислить по формуле: Ф1 = 2yBgiTi. (2.22) Хотя после подачи градиентного им- пульса намагниченность и расфазирует- ся, однако она все равно продолжает на- ходиться в поперечной плоскости. Сле- дующий радиочастотный импульс пере- распределит когерентность между всеми возможными состояниями и часть ее пре- вратит в целевую одноквантовую намаг- ниченность порядка р = -1. Если теперь на систему подать еще один градиент- ный импульс, то его воздействие на на- магниченность разных порядков будет различным. Если импульс имеет мощ- ность Bg2 и продолжительность Тг, то фа- зовый сдвиг для имеющихся когерент- ностей можно найти по формуле: Рис. 2.58. Иллюстрация селек- ции сигнала с помощью им- пульсного градиента поля. Ис- пользование двух градиентов с отношением Gi G2 = 1 : 2 выделяет только показанный путь переноса когерентности, оставляя все другие когерент- ности расфазированными и невидимыми. Ф2 = YpBg2?2. (2.23) Для когерентности с избранным путем перехода рефокусировка происходит в том случае, когда суммарная зависимость фазы от гради- ентных импульсов равняется нулю: ЕФ, = XyBgiTi = 0. (2.24) Иными словами, рефокусировка под воздействием последнего гради- ентного импульса должна нейтрализовать расфазирование под влиянием всех предыдущих градиентных импульсов. Так, в приведенном выше при- мере Ф2 должно быть эквивалентным Фь Этого можно достичь или изме- нением продолжительности второго градиентного импульса относительно первого при постоянстве его амплитуды, или изменением амплитуды при неизменной продолжительности. Сейчас принято использовать градиент- ные импульсы одинаковой продолжительности и переменной амплитуды. Поэтому в нашем примере, где мы хотим рефокусировать намагничен- ность, для которой р = -1, амплитуда второго градиентного импульса Bg2 367
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР должна быть равной 2Bgi. Таким образом, амплитуда второго градиентного импульса должна быть вдвое большей, чем у первого. В этом случае вы- деляется необходимый путь когерентности (рис. 2.58). В отличие от одноквантовой намагниченности трехквантовая когерент- ность, которая тоже может возникнуть в нашем эксперименте и для кото- рой р = 3, требует для рефокусировки суммарной фазы: Ф = (3yBglTgl) + (-Зу2Вё1Т!) = yBgiTb (2.25) Поэтому она остается расфазированной и не дает вклада в наблюдаемый сигнал. Таким образом, градиентные импульсы выделяют только необхо- димый путь изменения когерентности. Для гомоядерных систем при ис- пользовании градиентов одинаковой продолжительности необходимо знать только порядки когерентности и в соответствии с ними задавать отношение амплитуд градиентов. Для гетероядерных систем при расчете интенсив- ностей градиентных импульсов следует учитывать также и гиромагнитные отношения ядер. Поскольку во всех последующих обсуждениях градиенты имеют одинаковую форму и продолжительность, мы будем обозначать их Gj, имея в виду, что они имеют интенсивность Bgj и продолжительность т,. 2.17. Подготовка спектрометра к измерению спектра Теперь на время отвлечемся от теории и остановимся на основных момен- тах настройки спектрометра ЯМР. Это даст читателю возможность позна- комиться с основными техническими параметрами спектрометра, которые влияют на качество спектра. Такие знания оказываются совершенно необ- ходимыми в случаях, когда полученный Вами спектр ЯМР оказался недо- статочно качественным. Поскольку причины этого могут крыться либо в методике эксперимента, либо в настройке прибора, либо, наконец, в образ- це, Вам как пользователю необходимо знать, что следует предпринять для улучшения спектра. Прежде чем образец будет погружен в датчик спектрометра, прибор должен быть соответствующим образом подготовлен. Подготовка состоит в точной настройке прибора. Время, которое необходимо для этого, опре- деляется образцом, типом спектрометра и типом эксперимента, однако в любом случае должны быть обеспечены максимальные чувствительность, разрешение и воспроизводимость результатов. Детали настройки определя- ются конструкцией конкретного спектрометра, поэтому здесь мы их об- суждать не будем. Ниже мы опишем лишь основную последовательность действий оператора, которые он выполняет при измерении спектра на лю- бом спектрометре ЯМР. 368
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 1. Ввод образца. 2. Ввод параметров сбора данных. 3. Установка температуры образца. 4. Настройка датчика. 5. Настройка лока. 6. Шиммирование. 7. Накопление данных. Ввод образца заключается в надевании на трубку для измерения специ- ального спинера и погружении образца с помощью пневматического лифта в датчик спектрометра. Роль спинера состоит в точном позиционировании образца относительно приемопередающей катушки спектрометра и обеспе- чении возможности вращения образца в датчике. Установка параметров сбора данных включает задание всех парамет- ров, которые необходимы для измерения спектра. Это и тип магнитного яд- ра, и величина спектрального диапазона, и необходимое усиление сигнала в приемнике и передатчике, и параметры декаплера. Всего нужно задать несколько десятков параметров. Если это делать вручную, процесс задания параметров забирает довольно много времени. Упрощает ситуацию то, что параметры записи спектра сохраняются во всех файлах, которые содержат измеренные раньше спектры. Поэтому достаточно вызвать с диска спектр с нужными параметрами и можно сразу начинать измерение. Все параметры будут заданы автоматически. Выравнивание температуры образца чаще всего необходимо лишь при измерении спектра при температуре, отличающейся от комнатной. В этом случае для установления температурного равновесия надо приблизительно 5-10 минут. Настройку датчика выполняют при переходе на другое магнитное яд- ро. При измерении серии спектров на одном ядре дополнительную под- стройку датчика не производят. Настройка лока необходима при измерении всех спектров в дейтериро- ванных растворителях. Она состоит в поиске сигнала дейтерия, который осуществляется путем постепенного изменения частоты передатчика лока. Найденный таким образом сигнал отвечает поглощению дейтерия в ис- пользуемом растворителе. В современных спектрометрах существует воз- можность автоматического поиска сигнала дейтерия путем подачи соот- ветствующей команды. Оптимизация однородности поля осуществляется с помощью шимми- рования. Она также может выполняться вручную или в автоматическом ре- жиме. Как правило, на хорошо настроенном приборе шиммирование не за- нимает больше 5 минут. Сбор данных выполняется автоматически по окончании каждого скана. Сигнал при этом накапливается в памяти компьютера и одновременно вы- 369
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР водится на экран для его анализа оператором. При необходимости экспери- мент может быть остановлен в любой момент, а затем продолжен. Ниже отдельные стадии настройки будут разобраны более детально. 2.17.1. Частотно-полевой лок Несмотря на высокую стабильность поля сверхпроводящих магнитов, они имеют склонность к дрейфу за период времени, который исчисляется несколькими часами. Это приводит к соответствующему дрейфу сигналов ЯМР, что снижает разрешение в спектре. Для устранения этого эффекта на всех современных приборах производится непрерывная коррекция магнит- ного поля. Это осуществляется путем наблюдения за частотой сигнала дей- терия растворителя. Сигнал дейтерия наблюдается в специальном радио- частотном канале, присутствующем в спектрометре наряду с основными каналами. Этот канал называется каналом лока. Сам термин ”лок” происхо- дит от английского слова ’’lock”, что означает ’’замок”. Однако, поскольку применение последнего термина в тексте может вызвать неоднозначное толкование, мы в дальнейшем будем использовать его английскую транс- крипцию. Канал лока управляет полем путем отслеживания сигнала дейтериево- го резонанса в форме сигнала дисперсии и поддерживает центр этого сиг- нала на неизменной частоте (рис. 2.59). Рис. 2.59. Система лока спектрометра следит за сигналом дейтерия раство- рителя, который имеет форму сигнала дисперсии. Сдвиг резонансной час- тоты отвечает дрейфу сигнала. В результате генерируется корректиру- ющий потенциал, зависящий от величины и направления дрейфа. Система обратной связи компенсирует дрейф поля. 370
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса В отсутствие дрейфа сигнал дисперсии при резонансной частоте имеет нулевую амплитуду, поскольку в этой точке он проходит через ноль. Дрейф магнитного поля вызывает изменение резонансной частоты и сдвиг сигнала дейтерия в сторону от условий резонанса. Возникающий при этом коррек- тирующий потенциал имеет амплитуду и знак (в отличие от сигнала погло- щения, где изменяется только амплитуда сигнала). Этот сигнал подается на систему обратной связи, которая восстанавливает величину поля путем из- менения величины тока в соответствующей катушке, охватывающей дат- чик с образцом. Сигнал дисперсии обладает еще и тем преимуществом, что он имеет более крутой профиль, поэтому он более чувствителен к измене- ниям частоты. Индикация амплитуды сигнала дейтерия дает возможность измерять также и однородность магнитного поля, поскольку при повыше- нии однородности поля сигнал дейтерия становится более узким и соот- ветственно его амплитуда возрастает. Поэтому сигнал лока можно исполь- зовать также и для повышения однородности магнитного поля. Для этого сигнал дейтерия на экран компьютера выводится в виде сигнала погло- щения. 2.17.2. Оптимизация лока Правильная настройка канала лока совершенно необходима для получения спектра высокого качества, поскольку при плохой настройке лок может не улучшать, а сильно ухудшать разрешение сигналов в спектре. Первым эта- пом для осуществления лока является нахождение резонансных условий для сигнала дейтерия. Это осуществляется или путем изменения напряжен- ности поля, или настройкой частоты передатчика лока. Первый из этих двух вариантов имеет преимущества, поскольку он исключает необходи- мость изменения частоты передатчика. В современных спектрометрах имен- но эта система подстройки является стандартной. Существуют три основ- ных параметра, которые определяют оптимальную величину лока. Первый из них - мощность передатчика лока (power), который используется для возбуждения резонанса на дейтерии. Уровень мощности должен быть мак- симальным, однако не настолько большим, чтобы вызвать насыщение сиг- нала. Условия насыщения возникают тогда, когда радиочастотная энергия, которая передается на катушку лока, уже не может рассеяться с помощью релаксационных процессов. При этом возникают колебания интенсивности сигнала. Уровень насыщения находят экспериментально путем небольших изменений мощности передатчика и наблюдения за интенсивностью сигна- ла лока. Если повышение мощности не приводит к эквивалентному росту интенсивности сигнала, то уровень насыщения достигнут. Для правильной настройки надо определить точку насыщения сигнала и немного снизить 371
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР мощность передатчика. Второй параметр - это усиление сигнала лока (gain). Оно отвечает возрастанию интенсивности сигнала в усилителе. Этот пара- метр является менее критичным. Усиление следует выбирать таким, чтобы шум был не слишком сильным. Третий параметр - это фаза лока. Раньше мы видели, что коррекция поля с помощью лока осуществляется при инди- кации сигнала в форме дисперсии. Это возможно только в том случае, если сигнал правильно сфазирован. При этом сигнал лока имеет максимальную интенсивность, которая и используется для подстройки поля. 2.17.3. Сбор данных в отсутствие лока В случаях, когда в образце нет дейтерия или когда измерения ведутся на самих ядрах дейтерия, возникает потребность измерения спектра без лока (последние версии приборов позволяют работать с локом и на ядрах дейте- рия с помощью электронной защиты канала лока во время сбора данных). Измерение спектров без лока из-за имеющего место дрейфа поля лучше проводить за небольшие периоды времени. Для экспериментов, которые, из соображений чувствительности, требуют многих часов, лучше накапли- вать сигнал ССИ за более короткий период, например 1 час. Дрейф поля за этот период будет настолько малым, что им можно пренебречь по сравне- нию с общим дрейфом за время всего эксперимента. После этого спектры можно сложить, применяя ручную компенсацию дрейфа поля путем неко- торого сдвига спектров один относительно другого. Это даст необходимую чувствительность без заметного уширения сигналов. Потребность измерения спектра без лока иногда возникает также при работе в смесях растворителей, когда сигнал дейтерия оказывается недоста- точно интенсивным. В этом случае настройку однородности поля прибора ведут по форме полученного сигнала ССИ. При такой работе можно полу- чить качество спектра ничуть не уступающее качеству спектра, полученно- го с использованием для настройки сигнала лока. 2.17.4. Оптимизация однородности поля: шиммирование Эксперименты ЯМР требуют, чтобы во всем объеме образца, который нахо- дится внутри катушки датчика, магнитное поле было одинаковым. Откло- нение от идеальной однородности вызывает разнообразные изменения фор- мы линии сигналов ЯМР, что ухудшает качество спектра. Поэтому каждый раз, когда новый образец погружается в магнит, необходима точная коррек- ция однородности магнитного поля. Если позволяет время, то на этот про- цесс нужно израсходовать несколько минут. Любому человеку, который самостоятельно использует спектрометр ЯМР, необходимо знать основные правила повышения однородности поля. Даже если Вы занимаетесь только 372
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса интерпретацией спектров, а измерение проводит кто-то другой, или же они автоматизированы, необходимо ориентироваться в основных дефектах спект- ра, которые могут быть вызваны недостаточной однородностью магнитно- го поля. Это тем более актуально, что во многих случаях визуально необ- ходимо отличить дефекты формы линии, которые возникают за счет неод- нородностей магнитного поля магнита, от дефектов, связанных с наличием осадка, парамагнитных примесей и т.п. Поэтому нужно заранее знать, ка- кие именно дефекты могут быть обусловлены несовершенством однород- ности магнитного поля. 2.17.5. Система шимм Получение стабильного магнитного поля с однородностью 1/10 9 Т/м в ак- тивном объеме образца является совершенно необходимым условием по- лучения качественного спектра ЯМР. Такой однородности можно достичь путем последовательного использования трех уровней оптимизации поля. Первый уровень включает тщательную настройку сверхпроводящего маг- нита. Для этого в магните имеются так называемые ’’холодные шиммы" Это катушки специфической формы, которые расположены внутри главно- го соленоида. Они, как и соленоид, погружены в жидкий гелий. Сущест- вует специальное приспособление, которое при запуске прибора позволяет изменять величину тока в этих катушках, а следовательно, и однородность магнитного поля. В дальнейшем ток в этих катушках существует сколь угодно долго благодаря наличию в них сверхпроводимости. Хотя однород- ность, которая достигается при этом, и не отвечает критериям ЯМР, однако такая настройка обеспечивает возможность получения однородного поля за счет других методов его оптимизации. Холодное шиммирование выполня- ют специалисты, которые производят запуск магнита. При дальнейшей ра- боте спектрометра настройка основной катушки не проводится. Считается, что прибор настроен удовлетворительно, если путем холодного шиммиро- вания достигнута ширина сигналов 1-2 КГц. Помимо процедуры шимми- рования производят процедуру циклирования магнита. Она заключается в доведении тока магнита до значения несколько большего, чем номиналь- ный ток, и последующего его уменьшения до нормы. Такой прием дает возможность удалить неоднородности поля, которые связаны с динамикой нарастания тока. Циклирование магнита является очень ответственной про- цедурой. От опыта инженера, который проводит запуск, часто зависит вся дальнейшая работа спектрометра. Эта работа также не вполне безопасна - в любой момент могут произойти спонтанная потеря сверхпроводящих свойств катушки и внезапный выброс жидкого гелия из криостата магнита. Такой выброс называют "квенч" 373
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР После запуска магнита магнитное поле основной катушки модифици- руется ’’теплыми шиммами” - шиммирующими катушками, расположен- ными в межполюсном зазоре вокруг датчика. Через эти катушки проходит постоянный электрический ток разной величины и знака, который генери- рует собственные слабые магнитные поля, компенсирующие имеющиеся градиенты основного магнитного поля. Сначала, когда применялись посто- янные магниты, шиммами назывались небольшие клинообразные кусочки железа, которые использовались в конструкции железных магнитов для из- менения положения полюсных наконечников и соответствующего под- страивания однородности поля. Хотя сейчас используются, в основном, сверхпроводящие магниты, термин остался. Как и раньше, шиммировани- ем называют процесс оптимизации однородности поля. Блок теплых шимм представляет собой пластмассовый цилиндр, на котором размещены плоские катушки разнообразной формы. Блок закреп- ляется в цилиндрической шахте магнита. Внутрь блока шимм вводится датчик и жестко фиксируется в шахте магнита. В идеале высокочастотные катушки датчика, которые облучают образец, должны находиться в центре статического поля. Теплые шиммы (в современных приборах их количест- во может доходить до 30) удаляют все неоднородности поля, которые оста- ются после холодного шиммирования. Хотя при первичной настройке при- бора используются все теплые шиммы, однако для подстраивания прибора при изменении образцов применяются лишь некоторые из них (см. ниже). Статическое поле в вертикальном отверстии сверхпроводящего магни- та (шахте) также располагается вертикально. Считают, что оно совпадает с осью г. Шиммы, которые действуют вдоль поля, называются аксиальными или Z-шиммами. Таких шимм может быть несколько. Одна из них, Z0, ли- нейно изменяет поле вдоль оси z. Другие Z-шиммы (Z1, Z2, Z3, Z4, Z5) изме- няют поле нелинейно. Те шиммы, которые действуют в перпендикулярной плоскости, называются радиальными или X/Y-шиммами. Для получения вы- сокого разрешения образец вращают в магнитном поле с частотой 10-20 Гц вдоль вертикальной оси. При этом происходит усреднение поля в плоскос- ти х-у и разрешение сигналов в спектре повышается. Такое усреднение означает, что подстройка радиальных шимм должна проводиться без вра- щения образца. Поэтому такие шиммы называют иногда ’’неподвижными”, хотя это и не совсем верно. Современные наборы шимм дают возможность для неподвижного образца получить разрешение, практически такое же, как и для вращающегося образца. Поэтому измерение спектров без враще- ния становится все более популярным. При проведении многомерных экспе- риментов вращение образца также не используется, поскольку оно может вызвать нежелательную модуляцию сигналов, которая проявляется чаще всего в виде так называемого ti-шума. 374
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 2.17.6. Процесс шиммирования Для настройки шимм используется специальный набор образцов, который содержит вещества, сигналы которых наиболее удобны для оценки одно- родности магнитного поля. Для того, чтобы стандартный образец не изме- нялся во времени, трубку с образцом запаивают. В комплект поставки каж- дого спектрометра ЯМР входит набор стандартных образцов для полной его настройки. Для правильной настройки особое внимание следует обра- тить на глубину погружения образца в спикер. Каждой глубине погруже- ния отвечают свои величины токов в шиммирующих катушках. Поэтому все образцы погружают в спикер и соответственно в магнит на одинаковую глубину. Только в таком случае процесс шиммирования не будет требовать много времени. Большинство современных спектрометров имеют программное обеспе- чение, которое дает возможность автоматизировать процесс шиммирова- ния. Это совершенно необходимо, если используется автомат смены образ- цов. Важным фактором при шиммировании является также достижение образцом равновесной температуры. В этом случае обеспечивается отсут- ствие в образце конвекционных потоков. Для водных растворов в трубках большого диаметра для этого может понадобиться 10-20 минут. Для осуществления контроля протекания процесса шиммирования не- обходимо иметь удобный индикатор однородности магнитного поля. Су- ществуют три основных критерия шиммирования, каждый из которых об- ладает своими преимуществами и недостатками: 1) уровень лока, 2) форма сигнала ССИ и 3) форма сигнала ЯМР. Сигнал ЯМР является наиболее дос- товерным критерием однородности магнитного поля. Дефекты формы ли- нии прямо связаны с токами в определенных шиммах. Однако, поскольку для получения сигнала ЯМР требуется некоторое время, которое связано с Фурье-преобразованием, чаще за однородностью магнитного поля следят по интенсивности сигнала лока. При этом стараются подобрать такие токи в шиммах, чтобы интенсивность сигнала лока была максимальной. Хотя теоретически этот процесс довольно прост, однако на практике он услож- няется тем, что шиммы взаимодействуют одна с другой. Поэтому при из- менении тока в одной шимме надо менять токи и в других шиммах, кото- рые с ней взаимодействуют. При настройке шиммы разбивают на группы, внутри которых взаимодействие между ними происходит наиболее сильно. Внутри такой группы осуществляется циклическая настройка токов. Здесь мы остановимся только на способах устранения дефектов формы линии, которые встречаются наиболее часто. При шиммировании далеко не всегда оптимальным является простей- ший подход, когда уровень лока оптимизируется путем поочередной наст- 375
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР ройки каждой из шимм, поскольку при этом можно найти ’’ошибочный максимум” В этом случае сигнал лока будет максимальным, но сигна- лы образца будут иметь определенные дефекты. Поэтому чаще всего ис- пользуют интерактивное шиммирование. Для того, чтобы понять, в чем оно заключается, рассмотрим распространенный метод шиммирования кату- шек Z и Z2 1) Подстройка шиммы Z. Находят ток в шимме Z, отвечающий макси- мальной интенсивности сигнала лока и отмечают его величину. 2) Изменяют Z2 в любом направлении и отмечают направление измене- ния интенсивности сигнала лока. Если интенсивность уменьшилась, дают току в шимме прирост противоположного знака. 3) Подстраивают Z до достижения максимального уровня лока. 4) Повторяют подстройку Z2, если уровень лока увеличился по сравне- нию с первоначальным значением. Процедура повторяется до тех пор, пока происходит повышение уров- ня сигнала лока. Если однородность магнитного поля для образца, который погружен в магнит, находится вблизи оптимального значения, то для следующих об- разцов выполняется только однократная максимизация уровня лока с по- мощью шимм Z и Z2 Необходимым условием при этом является одинако- вая глубина погружения образца. 2.17.7. Основные дефекты формы линии Существует связь дефектов формы линии с совершенно определенными градиентами статического магнитного поля. Поэтому форму линии можно использовать для установления шимм, положения которых требуют кор- рекции (рис. 2.60). Так, все Z-шиммы влияют на ширину резонансных сиг- налов, однако немного по-разному. Несоответствие токов в четных шим- мах Z2, Z4, Z6 приводит к несимметричным искажениям линий. Неправиль- ная установка значений нечетных шимм Z (Z1, Z3, Z5) приводит к симмет- ричному уширению сигналов. Существует общее эмпирическое правило: чем больше порядок шимм, тем в более низкой части сигнала из-за них возникают искажения. Ошибка в установке Z3 чаще всего приводит к рас- ширению подошвы сигнала. Это расширение влияет на форму ССИ и в ря- де случаев может проявляться как быстрый спад начального участка ССИ. Другое распространенное искажение - ступенька на одной из сторон пи- ков. Оно связано с плохой настройкой шимм Z1, Z2 (часто именно в этом случае имеется ошибочный максимум интенсивности сигнала лока). Для устранения такого дефекта применяется описанная выше процедура интер- активной подстройки. 376
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Образец неподвижен Образец вращается Оптимум настройки I 1 I-1—г 1 ।—।—।—। 40 20 0 -20-40 40 20 6 -20-40 40 20 6 -20 -40 Гн Рис. 2.60. Дефекты формы линии, которые возникают из-за плохой настрой- ки различных шимм, указанных возле спектра. Плохая настройка "неподвижных" шимм проявляется в виде появления вращательных сателлитов. Их расстояние до основного пика соответствует 377
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР частоте вращения образца (сателлиты вращения первого порядка). Если же плохо настроены шиммы XY и X2-Y2, появляются вращательные сателлиты второго порядка, которые отстоят от центрального пика на вдвое большее расстояние. Однако, за исключением случаев очень плохой настройки при- бора, с сателлитами второго порядка встречаться не приходится. Интенсив- ность сателлитов первого порядка на настроенном приборе должна состав- лять 1-2% от интенсивности основного сигнала. Для выявления наличия вращательных сателлитов можно уменьшить скорость вращения образца до 5 Гц. Если подозрительные сигналы - вращательные сателлиты, то они при уменьшении скорости вращения образца изменят свое положение и увеличат интенсивность. Для неподвижных образцов ошибки в настройке радиальных шимм приводят к общему уширению сигналов. С точки зрения пользователя нужно не столько уметь компенсировать неоднородности магнитного поля, сколько своевременно выявить их нали- чие в полученном спектре ЯМР. Основное правило здесь такое: из-за неод- нородности магнитного поля во всех без исключения сигналах возни- кают одинаковые дефекты. Лишь в этом случае неудовлетворительное качество спектра связано с дефектами настройки. Если же уширенными или деформированными в спектре являются лишь некоторые сигналы - это обусловлено самим образцом, чаще всего происходящими в нем обменны- ми процессами. При получении некачественного спектра не всегда виноват оператор. Во многих случаях необходимость подстройки нестандартных шимм, из-за которых возникли дефекты формы линии, бывает связана с на- личием в образце механических или парамагнитных примесей или с нестан- дартным количеством растворителя. Уширения возникают также из-за чрез- мерной концентрации вещества и его плохого размешивания. 2.17.8. Градиентное шиммирование В последнее время для оптимизации магнитного поля используют подход, который раньше использовался в ЯМР-интроскопии физических объектов (томографии). Он состоит в том, что строится карта имеющихся в образце градиентов магнитного поля. В дальнейшем неоднородности поля, которые имеют место в образце, нейтрализуются путем введения рассчитанных компьютером изменений установок шимм. Результат такого шиммирова- ния может показаться удивительным особенно для тех, кому приходилось производить его вручную. Поэтому данный метод завоевал большую попу- лярность. Рассмотрим, как осуществляется градиентное шиммирование. В однородном магнитном поле все идентичные ядерные спины, нахо- дящиеся в одинаковом химическом окружении, прецессируют на одной Ларморовой частоте и дают узкий сигнал ЯМР (именно этого мы и добива- емся при шиммировании). Любое отклонение в однородности поля приво- дит к тому, что спины, которые локализованы в разных участках образца, 378
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса будут прецессировать с несколько различной частотой, которая обусловле- на изменением локального магнитного поля. Это проявляется в уширении сигнала ЯМР. Теперь рассмотрим ситуацию, которая возникает, когда в образце ис- кусственно создан определенный градиент (закономерное изменение вели- чины) поля вдоль оси z. В этом случае, если мысленно разбить образец на диски, перпендикулярные к оси z, в каждом из них будет несколько неоди- наковое магнитное поле, которое определяется как сумма внешнего поля, Но, и поля градиента в данной точке. Таким образом, ядра в каждом из дис- ков прецессируют на различных частотах. В результате в каждом из дисков в каждый момент времени происходит закономерное изменение фазы сиг- нала. Если действие градиента ограничено временем t, то в конце его дейст- вия получим ситуацию, которая изображена на рис. 2.61. Таким образом, при детектировании сигнала образца, в котором су- ществует градиент поля, пространственное расположение спинов кодиру- ется их резонансными частотами, зависящими от негомогенности поля. В случае z-градиента существует распределение химического сдвига сигнала вдоль оси образца (в случае х- и ^-градиентов - перпендикулярно трубке с образцом). Если измерить спектр образца, который в спектре содержит еди- ничный сигнал, например сигнал дейтерия, с помощью импульсной после- довательности, изображенной на рис. 2.62, когда градиент создается на все время регистрации спектра, то получим спектр, изображенный на рис. 2.63. Рис. 2.62. Последователь- ность для построения про- филя градиентов поля вдоль оси z. Последова- тельность накапливает сигнал ССИ в присутст- вии приложенного гради- ента. сирует в аксиально-неоднородном маг- нитном поле в течение периода t, то из- менения локального магнитного поля по длине образца кодируются в виде изме- нения частоты сигнала. Вследствие этого в каждый момент времени происходят за- кономерные изменения фазы сигнала по длине образца. 379
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Рис. 2.63. (а) Одномерный образ дейтерированного растворителя ДМСО. (б) Ось частот этого образа кодирует пространственное распределение раст- ворителя по длине образца. Из рис. 2.63 видно, что с помощью градиента можно получить '’изобра- жение” образца в том измерении, где создан линейный градиент поля. Если целенаправленно создать градиенты в трех взаимно перпендикулярных направлениях, можно получить трехмерное изображение образца. Именно в этом заключается один из методов построения ЯМР-томограмм физи- ческих объектов. Теперь мы можем представить, что будет происходить, если на искус- ственный линейный градиент поля накладываются посторонние градиенты, 380
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса которые обусловлены неоднородностью магнитного поля магнита. В этом случае на спектре, который изображен на рис. 2.63, будут проявляться оп- ределенные искажения. Их мож- но наблюдать отдельно. Для это- го используют так называемую последовательность градиентно- го спинового эха, которая изоб- ражена на рис. 2.64. При реализации градиентно- го шиммирования спины сначала расфазируются с помощью ИГП, далее они прецессируют на протяжении периода времени ть потом снова фазируются повтор- ным ИГП противоположного зна- ка и увеличенной вдвое продол- жительности и детектируются обычным образом. Сбор данных начинается точно по середине действия второго градиентного Рис. 2.64. Для z-градиентного шимми- рования по каналам !Н или 2Н приме- няется последовательность градиентно- го эха. Импульсные градиенты поля с промежутком т между ними обеспечи- вают пространственное кодирование не- однородности статического поля в ви- де различий химического сдвига сиг- нала. импульса. В условиях, когда поле совершенно однородно, к моменту начала сбора данных происходит полная рефокусировка спектра и появление уз- кого сигнала. Если же в объеме образца существует неоднородность поля, то результирующий спектр представляет собой пространственный профиль (образ) неоднородности поля в образце, который аналогичен, приведенно- му на рис. 2.63. Запись второго эха с промежутком т2 и получение раз- ностного спектра позволяют отделить действие градиентного импульса от градиентов, которые обусловлены неоднородностью магнитного поля, и по- лучить фазовую карту, в которой отображено распределение частот ядер- ной прецессии в образце за период Тг-Ть Распределение фаз в этом профиле отвечает распределению существующей неоднородности поля вдоль образ- ца. Если повторить опыт с фиксированными установками каждой с акси- альных шимм, то корректирование токов в шиммах, которое необходимо для исправления конфигурации поля, можно рассчитать. Единожды полу- ченные для данного датчика фазовые карты можно использовать для гра- диентного шиммирования всех последующих образцов. Данный процесс можно проводить в автоматическом режиме. Для первичного градиентного шиммирования необходимо иметь обра- зец, который содержит единственный мощный синглет. Идеальным образ- цом является смесь 90% Н2О+Ю% D2O. Однако она применяется только при изучении биологических объектов, а в химии чаще используются орга- 381
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР нические растворители. Поэтому в этом случае применяется тот раствори- тель, сигнал дейтерия которого используется в эксперименте для стабили- зации магнитного поля. При этом для облучения образца и регистрации спектра часто используется канал лока, то есть шиммирование проводится по сигналу дейтерия. Потенциальной проблемой для реализации градиент- ного шиммирования является чувствительность прибора и возможность ре- гистрации сигнала дейтерия без ручного переключения каналов датчика. Сегодня все приборы оснащены электронным переключателем каналов. Эффективность метода градиентного шиммирования продемонстриро- вана на рис. 2.65. Здесь нижний протонный спектр записан для случая, ког- да шиммам Z!-Z5 присвоены нулевые значения (токи в них отсутствуют). Верхний спектр получен за три итерации градиентного шиммирования, ба- зирующегося на сигнале ДМСО, в котором был растворен образец. Весь процесс занимает 3 минуты и не требует вмешательства оператора. Несмот- ря на сложность спектра, преимущества метода градиентного шиммирова- ния совершенно очевидны. Поэтому данный метод широко используется при автоматизированном измерении спектров, когда нестандартная глуби- на погружения образца в магнит приводит к неудовлетворительным ре- зультатам других схем автоматического шиммирования. Рис. 2.65. Автоматическое градиентное шиммирование на ядрах дейтерия. Спектр (а) получен для нулевых значений всех Z-шимм. После градиент- ного шиммирования шимм Z!-Z5 (3 итерации) был получен спектр (б). Вре- мя шиммирования составляло менее 2 мин. Спектр измерен в ДМСО. Для каждого градиента был использован один скан. 382
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 2.17.9. Калибровка спектрометра Этот параграф адресован тем, кому посчастливится измерять спектры ЯМР самостоятельно. В этом случае периодически возникает потребность в про- верке того, насколько корректно настроен спектрометр ЯМР, ведь только в этом случае цифровые значения параметров записи спектров совпадают с их реальными значениями. На современных спектрометрах существуют методы автоматической настройки прибора. Для реализации таких методов в датчик вводят специальный образец, запускают программу настройки, и прибор сам проводит все необходимые измерения. Однако работа такой программы длится несколько часов. Кроме того, часто на спектрометрах автоматическая настройка разрешается исключительно администратору прибора. Поэтому пользователю бывает необходимо быстро выяснить, от- вечают ли параметры спектрометра потребностям эксперимента, а при вы- явлении недостатков обратиться к администратору. Основное внимание при проверке параметров настройки спектрометра следует уделить продолжительности импульсов. Это необходимо потому, что данный параметр зависит от многих факторов - растворителя, темпера- туры образца, согласования катушек датчика. Все названные факторы яв- ляются переменными величинами и могут меняться от образца к образцу. Поэтому длительность импульса следует регулярно проверять. Даже при измерении простейших протонных спектров неправильная длительность импульса может вызвать довольно значительные изменения относительной интенсивности сигналов. В более сложных случаях, когда используются многоимпульсные последовательности, неправильная длительность им- пульсов может полностью испортить эксперимент. Поэтому следует ориен- тироваться в методике нахождения длительности импульса. 2.18. Радиочастотные импульсы Результат работы современных многоимпульсных последовательностей в большой степени зависит от амплитуды и продолжительности радиочас- тотных импульсов (ширины импульсов). Эти параметры определяют вели- чину угла, на который будет перенесен вектор намагниченности ядерных спинов под воздействием импульса. Чаще всего необходимый угол равня- ется 90° или 180° Принято калибровать продолжительность 90°-импульса (PW90). Если она настроена, то можно получить и любые другие импульсы. 90°-импульс в микросекундном диапазоне (8-20 мкс) возбуждает довольно широкую об- ласть спектра, поэтому он называется неселективным или жестким импуль- сом. В отличие от этого, если 90°-импульс находится в миллисекундном 383
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР (1-10 мс) диапазоне, то мощность его значительно меньше, и он возбужда- ет намного меньшую область спектра. Такие импульсы называются селек- тивными или мягкими импульсами. Поскольку на спектрометрах сущест- вуют электронные устройства для регулирования амплитуды импульсов, которые управляются компьютером (аттенюаторы), то достаточно откалиб- ровать лишь импульсы одной мощности. Все другие импульсы будут согла- сованы с откалиброванным импульсом автоматически. Единственное, что надо при этом помнить, это то, что каждый радиочастотный канал спектро- метра следует калибровать отдельно. Так, если импульсы на протонах от- калиброваны, это совсем не означает, что откалиброванными будут и им- пульсы на ядрах углерода, так как для этих ядер используется другой ра- диочастотный канал и соответственно другая катушка в датчике. 2.18.1. Сила радиочастотного поля Ширина полосы возбуждения, внерезонансные эффекты и ширина полосы декаплинга непосредственно связаны с мощностью радиочастотного поля, воздействующего на образец. Поскольку в современных спектрометрах все воздействия осуществляются с помощью импульсов, то именно параметры импульсов определяют результат такого воздействия. В отличие от силы постоянного магнитного поля, силу радиочастотного поля чаще всего вы- ражают в единицах частоты - Герцах. Это вполне оправданно, поскольку сразу становится определенным диапазон частот, на который воздействует импульс (см. основное уравнение ЯМР (1.2), дающее связь силы поля и частоты поглощения в ЯМР). Изменять силу радиочастотного поля можно по-разному - либо менять длительность импульса, либо изменять его амп- литуду. Однако какой бы способ ни использовался, необходимо иметь воз- можность менять силу поля именно так, как это необходимо для экспери- мента. Поскольку в спектрометре ЯМР импульсные воздействия осуществ- ляются с использованием одного импульсного генератора, то для стандар- тизации его работы принято все изменения параметров импульсов произво- дить для поля, которое соответствует 90°-импульсу. Связь между продол- жительностью импульса и мощностью создаваемого им радиочастотного поля, уВ 1, дается уравнением: YB! = l/PW36o = l/4PW90 (Гц). (2.26) При этом PW9o с длительностью 10 мкс отвечает силе поля 25 КГц. Это типичная величина для современных спектрометров. Калибровка продолжительности импульса эквивалентна определению силы радиочастотного поля Вь необходимого для фиксированного угла по- 384
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ворота вектора намагниченности. Существует много случаев, когда мощ- ность передатчика следует уменьшить, например при декаплинге или се- лективном возбуждении и насыщении. Такие уменьшенные мощности по- лучают путем ослабления сигнала генератора. Для количественной харак- теристики ослабления сигнала используются специальные единицы, которые называются децибелами (дБ). Они дают соотношение двух уровней мощ- ности, Pi и Р2, до и после ослабления сигнала: дБ = 10-lg(Pi/P2). (2.27) Если говорят об ослаблении исходной мощности передатчика на неко- торое количество децибел, то имеется в виду ослабление сигнала относи- тельно его максимальной мощности. Поэтому формулу (2.27) можно пре- образовать: дБ = 20-lg(PW1/PW2), (2.28) где PWi и PW2 - продолжительности двух импульсов с одинаковым углом для двух значений ослабления. Отсюда следует, что, если необходимо из- менить продолжительность импульса вдвое, то изменить амплитуду сигнала следует на 6 дБ. То же самое уравнение можно представить в другом виде: п (дБ) = PW х Ю"720, (2.29) иначе говоря, ослабление сигнала на п (дБ) уменьшает продолжительность импульса в IO1"20 раз. Ряд примеров ослабления сигнала приведен в табли- це 2.3. Этими данными можно пользоваться при необходимости ослабить импульс в заданное число раз. Таблица 2.3. Зависимость продолжительности импульсов от степени их ослабления Ослабление, дБ 1 3 6 10 12 18 20 24 Фактор продолжительности 1.1 1.4 2.0 3.2 4.0 7.9 10 15.8 2.18.2. Методика определения угла импульсов Если спектр анализируемого вещества можно получить от одного или не- скольких сканов, то угол импульса можно откалибровать, если постепенно увеличивать его продолжительность и следить за интенсивностью сигналов в спектре. При этом мы должны получить нулевую интенсивность сигнала 385
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР для импульсов 180° и 360°. Конечно, чтобы обеспечить воспроизводимость результатов, перед проведением калибровки следует провести настройку датчика. Частоту передатчика необходимо установить вблизи наблюдаемо- го сигнала. Это даст возможность исключить возникновение нежелатель- ных внерезонансных эффектов. Перед калибровкой делают предварительный эксперимент - задают продолжительность импульса намного меньшую про- должительности 90°-импульса, например 2-3 мкс, измеряют спектр и вы- полняют фазовую коррекцию сигнала так, чтобы получить сигнал положи- тельного поглощения. Данные фазовые установки используют в экспери- менте определения продолжительности 90°-импульса без дальнейшей кор- рекции. Эксперимент состоит в измерении спектров с последовательно воз- растающими величинами продолжительности импульса (рис. 2.66). Интен- сивность сигнала сначала возрастает, потом после 90° начинает уменьшать- ся, при 180° проходит через нуль и становится отрицательной. Считают, что углу 180° отвечает спектр с наименьшей интенсивностью сигнала. Рис. 2.66. Калибровка продолжительности импульса в канале наблюдения. В эксперименте применялась импульсная последовательность с возбужда- ющим импульсом, которому задавались постоянные приращения. Макси- мальный сигнал наблюдается в случае, когда импульс оказывается 90°. Пер- вое нулевое значение сигнала отвечает 180°-импульсу. Для калибровки мож- но воспользоваться как 180°-, так и 360°-импульсом. 386
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса После определения по полученным результатам продолжительности 180°-импульса устанавливают такое ослабление импульса в децибелах, ко- торое нужно для проведения эксперимента. Как правило, в программном обеспечении спектрометра содержится специальный файл, в который мож- но занести параметры импульсного генератора, которые обеспечивают по- лучение 90°-импульса. После настройки и запоминания в дальнейших экспе- риментах можно задавать импульсы непосредственно в градусах их влия- ния на вектор намагниченности. 2.19. Температура образца Большинство спектрометров оборудовано блоком контроля и регулирова- ния температуры образца. Чаще всего сенсор представляет собой термопа- ру, спай которой находится под образцом в потоке газа, осуществляющего регулировку температуры. Результаты измерения температуры выводятся на компьютер. Однако температура, которая определяется системой конт- роля, может отличаться от действительной температуры, если не была вы- полнена калибровка этой системы. Один из способов калибровки состоит в измерении спектрального параметра образца, температурная зависимость которого известна заранее. Для калибровки температурных блоков было предложено много разных образцов. Сейчас широко применяются два из них - это метанол (для диапазона температур 175-310 К) и этиленгликоль (для диапазона 300—400 К). Для сигналов ПМР метанола справедливо соотношение: Т (К) = 403 - 29.53Д8 - 23.87-(Д8)2, (2.30) где Д8 - разность химических сдвигов сигналов ОН и СНз в м.д. Это соот- ношение можно превратить в три линейные зависимости: 175-220 К: Т (К) = 537.4 - 143.1-Д5 (2.31) 220-270 К: Т (К) = 498.4 - 125.3 Д5 (2.32) 270-310К: Т (К) = 468.1 - 108.9 Д5 (2.33) Они приведены на калибровочном графике на рис. 2.67. Для калибровки высокотемпературной области по спектрам этиленгли- коля существует похожее уравнение: Т (К) = 566.0 - 101.6-Д8. (2.34) Здесь Д5 означает разность химических сдвигов гидроксильного и ме- тиленового протонов этиленгликоля (рис. 2.68). Для обоих образцов при 387
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР увеличении температуры наблюдается уменьшение разности сдвигов сиг- налов образца, которое связано с ослаблением внутримолекулярной водо- родной связи, сдвигающей сигнал гидроксила в слабое поле. 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 Т(К) Рис. 2.67. Диаграмма калибровки температуры для чистого метанола. Раз- ность сдвигов Д5 (м.д.) соответствует разности между сигналами СН3 и ОН в м.д. Т(К) Рис. 2.68. Диаграмма калибровки температуры для чистого этиленгликоля. Разность сдвигов Д5 (м.д.) соответствует расстоянию в спектре в м.д. меж- ду сигналами СНг и ОН. 388
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Перед выполнением температурных измерений в образце должно уста- новиться температурное равновесие, для чего нужно 5-10 мин. Это же вре- мя следует выжидать перед измерением спектра при каждой новой темпе- ратуре. Для оценки воспроизводимости полученных результатов перед их обработкой следует повторять эксперимент 2-3 раза. С помощью приведенных диаграмм всегда можно проверить, действи- тельно ли температура в датчике отвечает той, которая выдается компьюте- ром спектрометра, и при необходимости внести соответствующие поправ- ки. При проведении температурных измерений на незнакомом приборе сле- дует, прежде всего, измерить спектр соответствующего стандарта (метано- ла или этиленгликоля) внутри температурного диапазона, который будет использован для измерений, и убедиться, что отклонения температуры от рассчитанных величин не превышают 1-2°С. 2.20. Форма линии и разрешение Наиболее важным тестом спектрометра является тест формы линии сигна- ла ЯМР, поскольку этот тест характеризует максимальную однородность поля, которую можно достичь на данном спектрометре ЯМР. Под формой линии понимают ее ширину на заданных параметрах ее высоты. Только в случае оптимизации формы линии другие тесты также окажутся удовлет- ворительными. Тест проводится для образца, дающего интенсивный узкий синглет. Известно, что в этом случае при отсутствии неоднородностей поля сигнал будет представлять собой чистую Лоренцову линию. Во временном представлении ССИ будет иметь вид экспоненты. Единственным путем достижения этих условий является тщательное шиммирование неоднород- ностей магнитного поля. Иногда для получения параметров формы линии, совпадающих с фабричными, необходимо несколько часов. Продолжитель- ность шиммирования в большой степени зависит от исходной однороднос- ти поля. Сейчас как форму линии, так и разрешение находят по результа- там одного теста. Форма линии определяется по ширине сигнала протонов хлороформа на 0.55% и 0.11% его высоты (эти цифры отвечают высоте са- теллитов 13С и 1/5 этой высоты). Разрешение определяется как ширина сигнала на половине его высоты (полуширина линии, AVi/2). На самом деле это не совсем разрешение (как можно говорить о разрешении единич- ного сигнала?), а способность прибора различать линии, ширина которых равняется ширине данного синглета. Для чистой Лоренцовой линии ши- рина при 0.55% и 0.11% его высоты должна быть соответственно в 13.5 и 30 раз больше полуширины, хотя на практике этих величин никогда дос- тичь не удается. Тест можно провести как с вращением образца, так и без него. В первом случае он характеризует максимальное разрешение, кото- рое достигается на приборе. Второй вариант отвечает условиям измерения 389
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР тех одно- и двумерных экспериментов, которые проводятся без вращения образца. Тест формы линии на протонах проводят для раствора хлороформа в дейтероацетоне. На приборах до 400 МГц применяют 3%-ный раствор, а для спектрометров с рабочей частотой 500 МГц и выше - 1%-ный раствор. Для старых приборов и датчиков пониженной чувствительности могут быть необходимы более высокие концентрации хлороформа - 10%-ная для 200 МГц и 3%-ная для 500 МГц. Измерения проводятся с одного скана, а данные собираются в условиях высокого цифрового разрешения (время вы- борки 16 с или больше). Обработка данных выполняется без использования функций, которые сглаживают сигнал ССИ. Результат тестирования прибо- ра с частотой 400 МГц показан на рис. 2.69. Более старые стандарты для определения разделения, такие как ордио-дихлорбензол, сейчас не исполь- зуются и стали уже историей. Рис. 2.69. Тесты разрешения и формы линии для протонных спектров. Из- мерения проводились для 3%-ного раствора СНС1з в дейтероацетоне на спектрометре 400 МГц при неподвижном образце. Тесты формы линии и разрешения для других ядер выполняются соот- ветственно описанной выше методике. Для многоядерных датчиков обыч- но тестируют по одному ядру в каждом радиочастотном канале. Поэтому второй тест, как правило, проводят для ядер 13С. Для этого могут быть ис- пользованы два образца ASTM (American Society for Tasting and Materials) - 390
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 40%-ный диоксан в дейтеробензоле, который используется также в тесте чувствительности, и 80%-ный бензол в дейтероацетоне. В любом случае применяется постоянный узкополосный декаплинг, отвечающий положе- нию резонансного сигнала. При этом можно получить лучший результат, чем при использовании широкополосного декаплинга. Время сбора данных должно составлять 30-40 с. 2.21. Чувствительность Большим недостатком спектроскопии ЯМР по сравнению с другими анали- тическими методами является ее сравнительно небольшая чувствитель- ность. Несмотря на то, что этот недостаток компенсируется рядом неоспо- римых преимуществ, он может оказаться причиной неудачи многих экспе- риментов. Поэтому отнестись к нему надо с особым вниманием. Термин "чувствительность” в классическом его понимании определяет минимальное количество образца, которое можно обнаружить при стандартных услови- ях. Однако в ЯМР такое понимание чувствительности используется редко. Чаще всего под чувствительностью понимают соотношение сигнал/шум для стандартного образца. Тест чувствительности прибора состоит в из- мерении высоты пиков стандарта и величины максимальной амплитуды шума с последующим вычислением соотношения между ними. Для того, чтобы пики сигналов при этом имели оптимальную форму линии, перед этим тестом проводят оптимизацию формы линии (см. выше). Далее, после соответствующего повторного шиммирования для данного стандартного об- разца проводят собственно тест чувствительности. Как правило, этот тест осуществляют для образца с вращением. Естественно, для тестирования не- обходима предварительная настройка датчика и продолжительности 90°-им- пульса. Определение высоты шума является ключевым вопросом для полу- чения воспроизводимых результатов. Сейчас ’’ручной” метод определения уровня шума все чаще заменяют автоматическими подпрограммами. В традиционном методе высота пика Р сравнивается с удвоенной величиной уровня среднеквадратичного шума, Nrms. Хотя этот параметр невозможно найти непосредственно из спектра, его можно вычислить из пикового шу- ма, Npp: Nrms = Npp/5. Поэтому отношение сигнал/шум находится из соотно- шения: S/N = 2.5P/Npp. (2.35) Измерение пикового шума (разности амплитуд выбросов нулевой ли- нии) должно быть выполнено для всего спектрального диапазона, однако на практике диапазон выбирается оператором. При этом часто диапазон выбирается таким, чтобы в него не попадали спонтанные интенсивные выбросы и провалы, которые могут встретиться при рассмотрении шума 391
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР при большом усилении. Автоматизированные методы определения чувст- вительности исключают такое влияние оператора, однако каждая фирма разрабатывает свой алгоритм вычислений, что затрудняет сравнение ре- зультатов, полученных на разных приборах. Однако при рутинной работе главное - это неизменность методики определения чувствительности, по- скольку здесь важно сравнивать полученные результаты с теми, которые раньше были найдены на этом же приборе. Тест чувствительности на протонах проводится для 0.1%-ного раствора этилбензола в дейтерохлороформе. Как и во всех тестах чувствительности, применяется единичный 90°-импульс. Спиновая система при этом должна находиться в состоянии теплового равновесия (релаксационный промежу- ток больше 60 с). По традиции уровень шума измеряют в диапазоне между 3 и 5 м.д. Пример теста чувствительности для спектрометра на 400 МГц приведен на рис. 2.70. отношение С/ш = 170 высота шума /10 Рис. 2.70. Тест чувствительности для протонных спектров 0.1%-ного раст- вора этилбензола, записанный на спектрометре 400 МГц. Тест чувствительности на ядрах углерода может быть проведен в двух вариантах - с декаплингом на протонах и без него. В результате получают- ся совершенно разные данные о чувствительности. Если второй вариант дает возможность найти максимальную чувствительность прибора, то пер- вый из них дает картину, наиболее близкую к реальным измерениям. В этом случае оценивается также эффективность работы декаплера. В обоих слу- чаях спектр измеряется при нестандартных условиях высокого цифрового разрешения, которые необходимы для правильной передачи формы сигна- 392
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ла. Время сбора данных при этом составляет около 4 с. В версии тестов без развязки от протонов используется образец ASTM (40%-ный диоксан в дейтеробензоле), однако в этом случае измеряется высота триплета угле- родного сигнала дейтеробензола. Спектр сглаживается соответственно ши- рине сигнала, которая равняется 3.5 Гц, а высота шума измеряется в диапа- зоне от 80 до 120 м.д. В версии с развязкой от протонов используется обра- зец, который содержит 10% этилбензола в дейтерохлороформе. Тестовые образцы для других наиболее распространенных магнитных ядер приведе- ны в таблице 2.4. Таблица 2.4. Образцы и условия записи тестов чувствительности для раз- личных магнитных ядер Ядро Образец для теста чувствительности Условия записи *Н 0.1% этилбензол в CDC13 |3С 10% этилбензол в CDC13 широкополосный протонный декаплинг 13с 40% диоксан в C6D6 (ASTM) без декаплинга З'р 0.0485 М трифенилфосфат в ацетоне-^б без декаплинга 19f 0.05% трифтортолуол в CDC13 без декаплинга i5N 90% формамид в ДМСО-^6 обратный импульсный декаплинг 29Si 85% гексаметилдисил оксан в бензоле-^б без декаплинга 2.22. Обработка сигнала ССИ (функции сглаживания) Существует несколько способов обработки данных перед Фурье-пре- образованием для повышения качества конечного спектра. Наиболее часто при этом преследуется цель увеличения соотношения сигнал/шум. Это бы- вает необходимо для выявления слабых сигналов или для полного анализа их мультиплетной структуры. С этой целью было предложено много мате- матических функций, которые взвешивают точки интерферограммы (window functions, функции сглаживания). Некоторые из них показаны на рис. 2.71. Принцип применения всех этих функций одинаков. В любом ССИ ин- тенсивность сигнала во времени уменьшается, а интенсивность шума оста- ется неизменной. Это означает, что вес шума относительно сигнала в конце ССИ возрастает. В результате хвостовая часть интерферограммы содержит почти исключительно шумы. Поэтому уменьшение веса ’’хвоста” ССИ при- водит к росту соотношения сигнал/шум, то есть к повышению чувствитель- ности. С другой стороны, повышение веса центральной и конечной облас- 393
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР тей ССИ эквивалентно удлинению времени спада сигнала, то есть повыше- нию его разрешения. Процесс взвешивания ССИ заключается в умножении его точек на коэффициенты, величина которых отвечает избранной функ- ции сглаживания. На графиках функций, которые изображены на рис. 2.71, считается, что максимум отвечает коэффициенту 1. Таким образом, для точ- ки ССИ, которая во времени совпадает с максимумом функции сглажива- ния, амплитуда не изменяется. Для других точек, которые не совпадают с максимумом функции, амплитуда уменьшается в соответствии с формой функции. б) Гауссова мультипликация, lb = -l,gb = 0.2 Синусоидальный колокол со сдвигом на 45° Синусоидальный колокол в) Гауссова мультипликация, ж) со сдвигом на 90° Квадратичный синусоидальный колокол Доля полного времени выборки Рис. 2.71. Некоторые распространенные функции, предназначенные для обработки сигнала ССИ. Они используются для модификации получаемого ССИ с целью повышения чувствительности и/или разрешения (1b = ширина сигнала в Гц, gb = доля времени накопления, когда функция имеет макси- мальное значение; см. текст). Трапецеидальная функция 0 0.5 1 Доля полного времени выборки 394
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Форму всех функций можно несколько корректировать. Если макси- мум функции совпадает с началом ССИ, то, как правило, можно откоррек- тировать лишь скорость спада функции. Для этого используют параметр ширины линии, 1b. Он подбирается в зависимости от ширины сигналов в спектре. Если максимум функции сглаживания не совпадает с началом ССИ, то для определения положения максимума функции вводится еще один дополнительный параметр, gb. Он определяет долю полного времени сбора данных, при которой функция является максимальной. При применении функций сглаживания следует учитывать, что они яв- ляются разновидностью цифровой обработки данных или цифрового фильт- рования. В литературе эти функции в зависимости от цели их использова- ния обычно рассматриваются отдельно. Когда говорят о функции, которая повышает соотношение сигнал/шум, ее называют функцией сглаживания, а когда говорят о функции, которая увеличивает разрешение сигналов, то ее называют взвешивающей функцией. В математике данные процессы назы- ваются аподизацией, поэтому все функции можно называть также функ- циями аподизации. 2.22.1. Повышение чувствительности Как указывалось выше, амплитуда шума в спектре может быть уменьшена путем уменьшения веса конечной части ССИ. Общепринятой процедурой для этого является умножение точек данных на коэффициенты, величина которых зависит от расположения точки относительно начала ССИ. Вели- чины таких коэффициентов представляют собой функцию, которая экспо- ненциально спадает до нуля (рис. 2.71а). Эта процедура называется еще экспоненциальной мультипликацией. Результат экспоненциальной муль- типликации зависит от того, насколько быстро спадает экспоненциальная функция по сравнению со спадом ССИ. Если спад экспоненты происходит медленнее спада ССИ, то процедура почти не влияет на результирующий спектр. Экспоненциальная мультипликация имеет смысл тогда, когда экспо- нента спадает несколько быстрее, чем ССИ, поскольку при этом величины хвостовой части ССИ приближаются к нулю. При этом шумы в результи- рующем спектре уменьшаются, что эквивалентно повышению чувствитель- ности спектрометра. Однако ничего не дается даром - данная процедура увеличивает скорость спада сигнала ЯМР и потому приводит к уширению сигналов. Таким образом, здесь следует выбирать между разрешением и чувствительностью и пользоваться компромиссным значением параметра функции сглаживания. Результат эффективного применения экспоненци- альной мультипликации показан на рис. 2.72. 395
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Рис. 2.72. Экспоненциальная мультипликация ССИ может быть использо- вана для уменьшения шума в спектре: (а) исходные ССИ и спектр после его Фурье-преобразования, (б) результат экспоненциальной мультиплика- ции с lb = 1 Гц. Использование чрезмерно жесткой функции приводит к слишком быст- рому спаду сигнала, что может привести к снижению соотношения сиг- нал/шум из-за уменьшения высоты пиков, связанного с их уширением. Обычно программное обеспечение спектрометра позволяет задавать пара- метр сглаживания непосредственно в Герцах (параметр 1b). Это делает экспо- ненциальную мультипликацию довольно гибкой и позволяет химику подо- брать параметр 1b оптимальным с точки зрения качества конечного спектра. Наилучший баланс между уменьшением шума и дополнительным ушире- нием сигналов достигается тогда, когда спад функции сглаживания согла- суется с естественным временем спада ССИ. В этом случае его называют согласованным фильтрованием. Для того, чтобы экспоненциальная функ- ция хорошо согласовывалась с ССИ, спад сигнала должен быть экспонен- циальным (это означает, что сигналы ЯМР имеют Лоренцову форму). Это требует высокой однородности поля магнита, которая достигается тща- тельным шиммированием. Условия, которые необходимы для максималь- ного повышения чувствительности, не всегда удается соблюсти. Это связа- но с тем, что в этом случае близкие сигналы в спектре могут совпасть. Поэтому иногда предпочитают работать со спектрами, имеющими худшую чувствительность, но более высокое разрешение. Кроме того, бывает, что естественная ширина разных сигналов в исходном спектре неодинакова. В 396
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса этом случае невозможно подобрать параметр сглаживания, пригодный для разных сигналов. При измерении рутинных протонных спектров удобно вы- бирать параметр сглаживания равным цифровому разрешению. При этом происходит заметный рост чувствительности с незначительным изменени- ем ширины сигналов. В гетероядерной спектроскопии разрешение спектра чаще всего играет меньшую роль. Для таких спектров параметр 1b выби- рают равным нескольким Гц, что немного больше цифрового разрешения. Для спектров, в которых резонансные сигналы имеют ширину в сотни или даже тысячи Гц (чаще всего это квадрупольные ядра), можно использовать сглаживание, которое отвечает их ширине. 2.22.2. Повышение разрешения Для повышения разрешения сигналов в спектре следует использовать функ- цию, которая увеличивает вес отдаленных участков ССИ, что эквивалентно увеличению времени спада сигнала. Проблемой такого подхода является то, что одновременно возрастает и амплитуда шума в хвосте ССИ. Лучшим подходом является использование функции, которая противодействует ран- нему спаду ССИ, а точкам его хвоста присваиваются значения, близкие к нулю. Наиболее популярной функцией, которая используется с этой целью, является преобразование Лоренца-Гаусса (рис. 2.716, в). Иногда его еще называют Гауссовой мультипликацией (хотя на самом деле в математике этот термин относится к другому преобразованию). Ту же функцию ряд ав- торов называет биэкспоненциальной мультипликацией. Это преобразова- ние превращает сигналы Лоренцовой формы в Гауссову, профиль которой намного уже, особенно в крыльях сигналов (рис. 2.73). Это дает возмож- ность лучше разрешить пики, которые расположены близко один от другого. Рис. 2.73. Сравнение формы линии для функций Лоренца и Гаусса. 397
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Форма сигнала при применении такой функции регулируется двумя переменными параметрами, которые определяют степень сужения сигналов и точку ССИ, на координате времени, для которой функция имеет наиболь- шее значение. Для этого оператор задает отрицательный параметр 1b в Гц, определяющий ширину гауссовой линии, и параметр gb, величина кото- рого равна доле общего времени сбора данных, для которой функция будет максимальной. Параметры чаще всего подбирают методом проб и ошибок, анализируя спектр, который получается в результате сглаживания. Если сигналы в спектре различаются по ширине, для каждого из них необходи- мы свои параметры взвешивания. Современные спектрометры ЯМР дают возможность осуществлять подбор параметров в интерактивном режиме, когда на экран компьютера одновременно выводятся профиль функции, ко- торая сглаживает, и результирующий спектр. Это дает возможность опти- мизировать спектр достаточно быстро. Более отрицательные 1b дают более узкие линии, а расположение мак- симума функции дальше от времени начала сбора данных при росте gb еще увеличивает этот эффект. Одновременно возрастают и искажения нулевой линии вблизи сигналов, а также шумы (рис. 2.74). В любом случае повы- шение разрешения сопровождается ухудшением соотношения сигнал/шум, поэтому следует применять компромиссные величины параметров функ- ции Гауссовой мультипликации. В последние годы начали использоваться новые функции обработки ССИ, аналогичные Гауссовой мультипликации, которые дают возможность повысить разрешение без потери чувствительности. Это так называемые TRAF-функции (рис. 2.71д). Они увеличивают интенсивность центральной части ССИ и одновременно осуществляют согласованное фильтрование ко- нечной части ССИ для снижения шума. Сейчас такие функции уже вклю- чают в программное обеспечение спектрометров. Еще одна функция, которую широко применяют при обработке дву- мерных наборов данных, это функция синусоидального колокола. Она не имеет параметров, нуждающихся в настройке. Функция отвечает половине синусоидальной волны, начало которой совпадает с началом выборки дан- ных. Она имеет максимум в середине времени выборки, а потом снова спа- дает до нуля (рис. 2.71е). Функция всегда равняется нулю в конце выборки, поэтому она устраняет эффекты усечения (ситуация, которая возникает, когда выборка завершается прежде полного спада сигнала), которые часто встречаются в двумерных массивах данных. Данная функция имеет тенден- цию увеличивать разрешение спектра, что может вызвать нежелательные искажения сигналов и уменьшение чувствительности. Это связано с тем, что интенсивность начальных участков ССИ действием синусоидального колокола уменьшается. Поэтому в одномерных спектрах такая функция 398
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса используется редко. Разновидностью данной функции является смещенный синусоидальный колокол, для которого положение максимума является пе- ременной величиной (рис. 2.71 е, ж). Эту функцию можно отодвигать от на- чала выборки. Данная функция, как и предыдущая, применяется в дву- мерной спектроскопии и служит для балансирования между разрешением и чувствительностью в результирующем спектре. Последний вариант - это квадратично-синусоидальный колокол (рис. 2.71з). Данная функция анало- гична синусоидальному колоколу, однако она более резко спадает на кра- ях. Как и трапецеидальная функция (рис. 2.71 и), она иногда используется при обработке двумерных спектров. в) Рис. 2.74. Преобразование Лоренца-Гаусса (Гауссова мультипликация) мо- жет быть использовано для улучшения разрешения, (а) Необработанный ССИ и спектр после его Фурье-преобразования. Результаты после преобра- зования Лоренца-Гаусса: (б) lb = -1 Гц, gb = 0.2; (в) 1b = -3 Гц, gb = 0.2. 399
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР 2.23. Фазовая коррекция сигналов При записи спектра ЯМР мы всегда хотим, чтобы сигналы в нем имели вид сигналов положительного поглощения. Однако это возможно только в том случае, если вне зависимости от места локализации в спектре сигналы име- ют одинаковую фазу. Если же это не так, то некоторые сигналы могут про- явиться в виде смеси сигнала поглощения и сигнала дисперсии. Существу- ет несколько причин, обусловливающих изменение фазы сигналов. Прежде всего, фаза импульса может точно не соответствовать фазе приемника. В этом случае все сигналы спектра будут иметь определенный фазовый сдвиг. Такой сдвиг будет одинаковым для всех сигналов. Компенсировать фазо- вые погрешности данного типа можно, вводя для сигналов определенные фазовые коэффициенты, которые нейтрализуют искажения. Компенсация таких фазовых ошибок называется коррекцией фазы нулевого по- рядка. Кроме этого, существуют фазовые погрешности, которые зависят от частоты сигналов. Для компенсации фазового сдвига сигналов, кото- рый зависит от их частоты, проводят фазовую коррекцию первого по- рядка. Фазовые ошибки, зависящие от частоты сигнала, обусловлены тем, что перед сбором данных приходится вводить короткий промежуток вре- мени, назовем его DE, необходимый для того, чтобы электроника прибора восстановила свою чувствительность после подачи импульса. Этот проме- жуток обычно составляет десятки микросекунд. Во время этого промежут- ка векторы намагниченности продолжают свою эволюцию в соответствии со своими химическими сдвигами, поэтому, когда начинается сбор данных, их фаза оказывается неодинаковой (рис. 2.75). момент момент начала возбуждения оцифровки Рис. 2.75. Фазовые ошибки первого порядка (частотно зависимые) возника- ют из-за расфазировки векторов намагниченности во время задержки перед сбором данных, которая вводится после возбуждающего импульса. В мо- мент начала сбора данных векторы намагниченности с разными частотами имеют значительные фазовые расхождения, которые изменяются в зависи- мости от положения сигнала в спектре. 400
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Понятно, что чем больший сдвиг имеет сигнал, тем сильнее нужно от- корректировать его фазу. Если промежуток DE мал в сравнении со време- нем сбора данных, то для фазовых ошибок наблюдается линейная зависи- мость от частоты и их можно компенсировать с помощью фазовых коэф- фициентов. В противном случае фазовую коррекцию невозможно провести без коррекции нулевой линии. Действие коррекции нулевого и первого по- рядков проиллюстрировано на рис. 2.76. Здесь на спектре "а" приведен при- мер откорректированного спектра, в котором фазовые погрешности пол- ностью компенсированы. На спектре "б" имеют место лишь фазовые по- грешности нулевого порядка. Они являются одинаковыми для всех сигна- лов. На спектре "в" присутствуют лишь фазовые погрешности первого по- рядка. Их вклад увеличивается с увеличением частоты сигнала. На самом деле, когда в спектре присутствуют оба типа фазовых погрешностей, ви- зуально их различить довольно тяжело. Однако в современных приборах и программах обработки спектров имеющиеся фазовые погрешности часто удаляются автоматически. Оператору остается удалить вручную лишь не- большие остаточные фазовые искажения. Рис. 2.76. Фазовые ошибки нулевого и первого порядков в протонном спект- ре: (а) корректно сфазированный спектр, (б) спектр с фазовыми ошибками, не зависящими от частоты сигнала (нулевого порядка), (в) спектр в присут- ствии фазовых ошибок первого порядка. 401
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Чаще всего фазовая коррекция сигналов, как и вообще задание фазы приемника, выполняется не благодаря работе электронных устройств, а программно. Для этого математическое обеспечение спектрометра содер- жит определенные программы фазовой коррекции, которые модифицируют массив данных, представляющий собой сигнал ССИ, таким образом, что фаза имеющихся сигналов изменяется в соответствии с необходимыми фа- зовыми поправками. 2.24. Импульсы в спектроскопии ЯМР Как мы уже знаем, любой эксперимент ЯМР начинается с подачи возбуж- дающего импульса. Именно импульс переводит спиновую систему в нерав- новесное состояние, необходимое для возникновения сигнала ЯМР. При воздействии импульса его энергия поглощается ядрами и переходит в энер- гию ядерной прецессии. В зависимости от решаемых задач импульс дол- жен возбуждать различную полосу частот. Этот параметр меняется в боль- шом диапазоне - от 1 МГц до 1 Гц. Естественно, что простым изменением длительности импульса или его амплитуды невозможно добиться столь су- щественного изменения диапазона возбуждаемых частот. Поэтому для гене- рации очень сильных и очень слабых импульсов приходится применять раз- личные ухищрения. Именно этому вопросу и посвящен настоящий раздел. 2.24.1. Композитные импульсы Большое число многоимпульсных последовательностей для успешной ра- боты требует, чтобы угол поворота ядерных спинов был в точности таким, как это предусмотрено физикой эксперимента. Однако даже тщательная ка- либровка длительности импульса может не привести к возбуждению всех магнитных ядер в одинаковой мере. Это связано с тем, что форма импульса неидеальна и воздействие его на магнитные ядра зависит от удаленности их резонансных частот от несущей частоты импульса. На длительность им- пульса оказывают влияние также неточности в системе измерения времени спектрометра, а также в измерении мощности импульса и его фазы. Воз- действовать на эти факторы оператор не может. Еще один вклад в несовер- шенство импульсов вносит негомогенность радиочастотного поля. Неоднородность радиочастотного поля импульса означает, что не для всех ядер в объеме образца угол поворота является одинаковым (рис. 2.776), особенно для периферийных участков раствора. Эффект при этом получа- ется таким же, как и в случае плохой калибровки длительности импуль- са. Поэтому актуальными для экспериментаторов являются импульсные последовательности, менее чувствительные к таким погрешностям экспе- римента. 402
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 2.77. Несовершенство импульсного возбуждения: (а) идеальный 90°х-импульс, приложенный к равновесной намагниченности, (б) эффект В1 -неоднородности, (в) эффект внерезонансного возбуждения. Внерезонансные эффекты состоят в том, что при недостаточной мощнос- ти импульса вдали от его несущей частоты в ВСК эффективное магнитное поле выведено из плоскости х-у. При этом векторы намагниченности вра- щаются вокруг эффективного магнитного поля и их траектория (рис. 2.77в) не соответствует той, которая должна была бы наблюдаться в идеальном случае (рис. 2.77а). Воздействие негомогенности Bi в очень большой степени зависит от конструкции радиочастотной катушки датчика, поэтому для современных приборов оно может быть небольшим. Самый простой способ преодоления внерезонансных эффектов состоит в повышении мощности передатчика. При этом ширина полосы возбуждения увеличивается, однако параллельно возникают две принципиальные проблемы. Первая состоит в том, что ка- тушка датчика может не выдержать повышения мощности радиочастотно- го излучения, а вторая - в нежелательном нагреве, который может привести к разложению нестойких молекул образца. Хотя улучшение конструкции датчика и может уменьшить эффекты нагрева, однако применение более высоких статических магнитных полей требует дальнейшего увеличения мощности радиочастотного поля, поэтому данная проблема все равно оста- ется. Наиболее острой проблема является для спектрометров с сильными магнитными полями в случаях, когда измерения ведутся на ядрах с боль- шим диапазоном химических сдвигов (такими как 13С и 19F). Используемый жесткий 90°-импульс должен обеспечивать поворот век- тора намагниченности в плоскость х-у, а 180°-импульс должен обеспечить инверсию этого вектора. В сферической системе координат если до 180°-им- пульса намагниченность была направлена к Северному полюсу, то после импульса она должна совпадать с Южным полюсом системы. Важнейшей характеристикой любого импульса является ширина его полосы возбуждения. Она отвечает диапазону частот, в котором магнитные 403
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР моменты ядер повернутся на угол, соответствующий углу действия им- пульса. Чисто интуитивно можно предположить, что чем более интенсив- ным является облучение, тем большим будет и диапазон возбуждения. Ин- тенсивность облучения пропорциональна амплитуде радиочастотного поля Bi и гиромагнитному соотношению. При подаче простого 90°-им- пульса ширина полосы возбуждения составляет ±yBj Гц или 2yBi Гц, где yBi соответствует силе радиочастотного поля. Обычно для 90°-импульса, длительность которого близка к 10 мкс, ширина полосы возбуждения сос- тавит 25 КГц. Для возбуждения ядер !Н на спектрометре 400 МГц общая полоса возбуждения при этом составит 125 м.д. Этого вполне достаточно для эффективного возбуждения всего спектрального диапазона. В тех же са- мых условиях для ядер 13С полоса возбуждения составит 500 м.д., посколь- ку частота поглощения углерода вчетверо меньше. Этого также достаточно для отсутствия внерезонансных эффектов. В отличие от этого инвертиру- ющий 180°-импульс имеет общую полосу возбуждения (при 90%-ной эф- фективности) только 0.4 уВь Для протонов это эквивалентно 25 м.д., а для 13С - только 100 м.д. Для ядер углерода, Рис. 2.78. Траектории воз- буждения ядер 13С под дей- ствием 180°-импульса для находящихся вне данного диапазона, эф- фективность инверсии будет недостаточ- ной, и векторы намагниченности удаленных сигналов могут оказаться вдали от Южного полюса. Внерезонансные ошибки для ин- вертирующего 180°-импульса иллюстриру- ет рис. 2.78. Из рис. 2.78 понятно, что траектории векторов намагниченности далеки от идеала и заканчиваются тем дальше от Южного по- люса, чем дальше отстоит сигнал от опор- ной частоты импульса. Поэтому для таких векторов намагниченности, различающихся по своему химическому сдвигу. Рас- считаны траектории возбуж- дения при отклонении на 50-150 м.д. от частоты им- пульса (0.2-0.6yBi). сигналов генерируется нежелательная попе- речная намагниченность. В многоимпульс- ных последовательностях при использова- нии таких несовершенных импульсов сни- жается чувствительность эксперимента и мо- гут возникать паразитные сигналы (артефак- ты), которые после этого следует устранять. Любой импульс можно охарактеризо- вать полосой частот, на которые он действует. Если мы имеем дело с прос- тым 180°-импульсом, то полосу частот, которые он возбуждает, можно представить в виде графика, показанного на рис. 2.79. 404
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 11 ' " ।.।...... ।' ' 2 10 12 уВ1 Рис. 2.79. Полоса возбуждения для 180°-импульса. Шкала соответствует от- клонению сигнала от несущей частоты импульса в единицах уВь Видно, что инверсия сигна- лов наблюдается только в том случае, если их резонансные час- тоты лежат в интервале ±уВ]. При этом интервал эффектив- ной инверсии еще меньше. Если отклонение сигнала от несущей частоты импульса больше ±уВь то инверсии сигнала не проис- ходит, зато возникает значитель- ная намагниченность в плоскос- ти х-у. Элегантный подход к ком- пенсации погрешностей, связан- ных с негомогенностью радио- частотного поля Bi и внерезо- нансными эффектами, состоит в использовании так называемых композит- ных импульсов. Это пакет (кластер) импульсов различной длительности и фазы, который используется вместо единичного импульса. Он имеет тот же конечный угол поворота ядерных спинов, что и единичный импульс, однако значительно менее чувствителен к несовершенству эксперимента. Первым был применен композитный импульс 90Л180>,90х, который эк- вивалентен 180°-импульсу. Этот импульс и в настоящее время применяется наиболее широко. Действие данного кластера на вектор намагниченности показано на рис. 2.80. Рис. 2.80. Траектории движения векторов намагниченности при действии композитного импульса 90х180^90/ (а) при отклонении длительности сос- тавляющих импульсов, (б) отклонение сигнала от условий резонанса. Вид- но, что в обоих случаях происходит компенсация несовершенства экспе- римента. 405
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Первый 90х-импульс кластера ориентирует намагниченность вдоль оси у. Если угол импульса равен точно 90° и внерезонансные эффекты от- сутствуют, то второй импульс 180у не влияет на вектор намагниченности. В этом случае третий импульс 90х поворачивает вектор намагниченности точно к Южному полюсу. Если же имеются отклонения в длительности импульсов, то ситуация меняется. На рис. 2.80а показаны траектории дви- жения векторов намагниченности при изменении длительности импульса и при наличии внерезонансных эффектов. В этом случае после первого им- пульса вектор намагниченности не совпадает с осью у. Поэтому второй, 180у-импульс, вращает его вокруг оси у. Траектория движения при этом зависит от имеющихся отклонений - чем больше отклонения от оси у, тем большую траекторию описывает вектор намагниченности. Наиболее инте- ресно здесь то, что при воздействии третьего импульса в значительной сте- пени компенсируются отклонения вектора от оси. Действие кластера им- пульсов приводит к компенсации как негомогенности радиочастотного по- ля (рис. 2.80а), так и внерезонансных эффектов (рис. 2.806). В результате ......Г......Г '...I..... 2.....10...12 уВ1 Рис. 2.81. Полоса возбуждения для композитного импульса 90х180у90х. Шкала соответствует отклонению сиг- нала от несущей частоты импульса в единицах уВь вектор намагниченности для сиг- налов, сильно различающихся по своим химическим сдвигам, попадает в область "Южного полюса". Эффективная ширина полосы возбуждения кластера импульсов составляет 2уВь что в 5 раз больше, чем при действии простого 180°-им- пульса. Полоса возбуждения композитного импульса пред- ставлена на рис. 2.81. Видно, что эффективная ин- версия под воздействием такого импульса происходит для значи- тельно большей полосы частот, чем у простого 180°-импульса. Здесь полная инверсия сигналов происходит в диапазоне ±уВь 2.24.2. Семейство композитных импульсов Разработка композитных импульсов уже много лет является обширной об- ластью усовершенствования экспериментов ЯМР. Опубликовано большое число удобных импульсных последовательностей, имеется ряд обзоров. Однако на практике в популярных экспериментах ЯМР используется толь- ко малая часть описанных импульсов. Главным ограничением применения 406
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса новых импульсов является то, что чем лучше импульс компенсирует экспе- риментальные ошибки, тем он более длителен и сложен. Длительность сос- тавного импульса может во много раз превышать длительность единичного импульса, что, в свою очередь, может воспрепятствовать его применению в отдельных импульсных последовательностях. Более того, большинство составных импульсов эффективно устраняет ошибки, связанные либо с не- гомогенностью радиочастотного поля, либо с внерезонансным эффектом, но не с обоими данными факторами одновременно. Поэтому следует ис- пользовать какой-то компромисс. Чаще всего в спектроскопии ЯМР высо- кого разрешения стараются, в первую очередь, компенсировать внерезо- нансные ошибки. В последнее время для разработки новых композитных импульсов стали применяться расчетные методы. Это позволило сделать общую дли- тельность импульса достаточно малой. Применение композитных импульсов осложняется тем, что все они разрабатывались для определенного исходного состояния вектора намагни- ченности. Если оно отличается от запланированного, то действие компо- зитного импульса может и не дать ожидаемого результата. Инвертирующие 180°-импульсы могут применяться либо для инверсии спиновых состоя- ний, например в методе инверсии-восстановления, либо для рефокусиров- ки сигналов в методе спинового эха. В первом случае импульс воздейст- вует на продольную намагниченность, а во втором - на поперечную. Так, например, составной импульс QO^lSO^Ox, если он применяется в качестве рефокусирующего, лишь в малой степени компенсирует внерезонансные эффекты. Такой импульс хоро- шо компенсирует негомоген- ность Bi и делает интенсив- ность эха менее чувствительной к соответствующим ошибкам в связи с тем, что векторы намаг- ниченности располагаются бли- же к плоскости х-у. Однако он увеличивает фазовые ошибки эха, что для эксперимента может оказаться значительно более вредным. Для компенсации при рефокусировке внерезонансных эффектов был предложен сос- тавной импульс 90х240^90л. Его профиль возбуждения показан на рис. 2.82. ......г ....I.....'I...... 2 10 12 уВ1 Рис. 2.82. Полоса возбуждения для ком- позитного импульса 90х240у90х. Шкала соответствует отклонению сигнала от несущей частоты импульса в едини- цах уВь 407
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Применение такого импульса приводит к значительно меньшим фазо- вым искажениям. В последнее время методом компьютерного моделирования разработа- ** I ...।......г —— 2 10 12 yBi Рис. 2.83. Полоса возбуждения для композитного импульса 38х111_х159х250_х. Шкала соот- ветствует отклонению сигнала от несущей частоты импульса в единицах уВ]. ны композитные импульсы, не требующие заранее оговоренно- го исходного состояния вектора намагниченности. Поэтому они одинаково эффективны как для инверсии спиновых состояний, так и для рефокусировки. Од- ним из лучших импульсов ока- зался композитный импульс 38х111_х159х250_х. Он имеет дос- таточный диапазон частот, для которых наблюдается инверсия сигналов. Его профиль возбуж- дения показан на рис. 2.83. Разработаны импульсы с еще большим диапазоном ин- вертируемых частот, однако они применимы не на всех спектро- метрах. 2.24.3. Широкополосный декаплинг При гетероядерном декаплинге требуется одновременно возбудить боль- шую полосу частот. При декаплинге на протонах эта полоса составляет около 5 КГц, а в случаях, когда декаплинг производится на ядрах углерода, то необходимо возбудить полосу частот более 25 КГц. Если с этой целью применять постоянное высокочастотное облучение с шумовой модуляцией, как это делалось первоначально, то требуется настолько мощное облуче- ние, что образец подвергается сильному нагреву. Поэтому в настоящее вре- мя декаплинг, как правило, производится с помощью импульсного облу- чения. Композитные импульсы широко используются в спектроскопии ЯМР для реализации широкополосного гетероядерного декаплинга. Их примене- ние основано на том, что гетероядерный декаплинг может быть осуществ- лен путем непрерывной подачи на развязываемое ядро последовательности инвертирующих 180°-импульсов. Их действие для пары Х-Н с декаплингом на протонах иллюстрирует рис. 2.84. После возбуждения векторы намагни- ченности дублета X расходятся в соответствии с в течение периода t. Приложенный в это время 180°-импульс на частоте протонов инвертирует 408
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса состояния протонов а и р и поэтому изменяет направление прецессии век- торов спина X на противоположное. Поэтому они через время t рефокуси- руются. Если эту процедуру повторять во время наблюдения ядра X со ско- ростью, намного превышающей величину то вектор намагничен- ности ядра X не расщепляется на протонах, то есть ССВ оказывается по- давленным. В результате мы будем наблюдать спектр X с развязкой от про- тонов. Рис. 2.84. Гетероядерный широкополосный протонный декаплинг, основан- ный на последовательности протонных 180°-импульсов. Как мы уже показали выше, простые 180°-импульсы не являются наибо- лее эффективным способом возбуждения широкой полосы частот. Один из путей увеличения полосы декаплинга состоит в использовании композит- ных инвертирующих импульсов. В настоящее время широко применяются композитные импульсы 90х180л,90х и 90х240у90х. Эти импульсы позволяют избавиться от внерезонансных эффектов. Их называют CPD-импульсами. Однако простая замена 180°-импульса на композитный оказывается не вполне подходящей. Если кластер QOJSO^Ox обозначить как R, то он пово- рачивает вектор намагниченности в направлении оси -г. Можно показать, что действие последовательности RR (два последовательных композитных импульса) должно привести к повороту вектора в направлении оси +г. Од- нако сами кластеры импульсов не вполне совершенны, поэтому при их воз- действии на векторы намагниченности возникают определенные ошибки, которые при многократном повторении таких импульсов накапливаются. Для устранения ошибок можно повторить процесс в обратном направлении, то есть инвертировать фазы импульсов таким образом, чтобы компенсиро- вать возникающие ошибки. Для этого вводится элемент R' (9O„x18O_v9O_x) и выполняется так называемый "магический цикл" RRR'R'. Полученная в ре- зультате последовательность называется MLEV-4. Показано, что неболь- шие ошибки, которые все-таки остаются после действия данной последова- тельности, могут быть компенсированы с помощью "суперциклов", таких 409
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР как RRR'R'R'RRR'R'R'RRRR'R'R. Такой подход приводит к последователь- ности MLEV-16. Данный цикл способен возбуждать более широкую поло- су частот без необходимости повышать мощность передатчика. Разработано много похожих композитных импульсов, обеспечивающих гетероядерный декаплинг (таблица 2.5). Наиболее часто применяется по- следовательность WALTZ-16, содержащая элемент 90х180_л270х (или более кратко 12’3). С ее помощью достигается эффективный декаплинг в диапа- зоне 2уВ2 с остаточными расщеплениями, не превышающими 1 Гц. Данный метод широко используется в спектроскопии высокого разрешения с гете- роядерной развязкой. Однако для развязки ядер, имеющих большой диапа- зон химических сдвигов, таких как 13С или 31Р, с детектированием на про- тонах полоса декаплинга даже для этого импульса может оказаться недо- статочной. В таких случаях применяются другие последовательности ком- позитных импульсов, полученные с помощью компьютерной оптимизации. Остаточные расщепления при их использовании не превышают 1.5 Гц. Наиболее популярной последовательностью является GARP (таблица 2.5), которая эффективна в диапазоне 4.8уВ2 (рис. 2.85). Именно такая последо- вательность применяется в методах гетероядерной корреляционной спект- роскопии HMQC и HSQC. Таблица 2.5. Важнейшие последовательности композитных импульсов для широкополосного декаплинга и спиновых замков Последовательность Ширина полосы (уВ2) Применение Декаплинг Непрерывная волна <0.1 только селективный декаплинг MLEV-16 1.5 *Н декаплинг WALTZ-16 2.0 *Н декаплинг высокого разрешения DIPSI-2 1.2 *Н декаплинг очень высокого разрешения GARP 4.8 Х-ядерный декаплинг SUSAN 6.2 Х-ядерный декаплинг Спиновый замок MLEV-17 0.6 схема смешивания TOCSY DIPSI-2 1.2 схема смешивания TOCSY FLOPSY-8 1.9 схема смешивания TOCSY При увеличении напряженности статического магнитного поля даже таких диапазонов декаплинга может оказаться недостаточно. В этом случае используются еще более эффективные методы декаплинга, например адиа- батическое насыщение, описанное ниже. 410
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса отклонение от несущей частоты в уВ2 Рис. 2.85. Экспериментальное сравнение профилей полос декаплинга (a) WALTZ-16 и (б) GARP. Образцом служила меченная 13С муравьиная кислота в D2O. 2.24.4. Спиновые замки Как следует из рис. 2.84, где показано воздействие повторяющихся 180°-им- пульсов на гетероядерную спиновую систему, данная импульсная последо- вательность приводит к фиксации направления вектора намагниченности. Пока мы подаем повторяющиеся 180°-импульсы, вектор намагниченности будет иметь постоянную ориентацию. На этом основаны так называемые "спиновые замки". Они широко распространены в спектроскопии TOCSY и в спектроскопии ЯЭО во вращающейся системе координат ROESY. Прос- тейший спиновый замок представляет собой серию повторяющихся 180°-им- пульсов с весьма малым промежутком между ними. Как следует из приве- денного выше обсуждения композитных импульсов, они более эффектив- ны для возбуждения широкой полосы частот. Поэтому их используют и в экспериментах, которые основаны на спиновых замках. Наиболее широко с этой целью применяется последовательность MLEV-16, в конце каждого цикла которой добавлен 60°-импульс. Дополнительный импульс служит для компенсации ошибок, возникающих при использовании длительного периода смешивания. Полученную последовательность называют MLEV-17 (таблица 2.5). Последовательность MLEV-17 является базовым элементом спинового замка в канале декаплера при подавлении ядер с широким диапа- зоном химических сдвигов. Намагниченность имеет фиксированную ори- 411
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР ентацию до тех пор, пока подача импульсов не прекратится. Разработаны также специальные, более сложные последовательности, обеспечивающие высокое качество спинового замка. Лучшие результаты дает последователь- ность DIPSI-2. Именно она широко применяется в экспериментах TOCSY. 2.24.5. Адиабатические импульсы Альтернативный подход к инверсии спинов, который приобретает все большую популярность для эффективного широкополосного гетероядерно- го декаплинга, состоит в использовании адиабатических импульсов. Вмес- то того, чтобы прилагать импульсы фиксированной частоты, во время дей- ствия импульса производится развертка его частоты от величин, намного Рис. 2.86. Импульс адиаба- тической инверсии. Радио- частота во время импуль- са меняется. Это приводит к тому, что эффективное радиочастотное поле пе- ремещается от оси +z к оси -z, уводя за собой суммарный вектор намаг- ниченности. превышающих резонансную частоту, до вели- чин, намного меньших резонансной частоты. Во время такой развертки эффективное ра- диочастотное поле, Вэфф, вначале располага- ется вдоль оси +z, затем проходит через плос- кость х-у и в конце импульса совпадает с направлением -z (рис. 2.86). Если развертка частоты происходит дос- таточно медленно, то во время действия им- пульса векторы намагниченности вращаются вокруг ВЭфф. При этом они движутся вслед за вектором ВЭфф и в конце импульса оказывают- ся на ’’Южном полюсе”, претерпевая, таким образом, необходимую инверсию. Математи- чески можно показать, что скорость разверт- ки частоты должна быть настолько медлен- ной, чтобы удовлетворять адиабатическим ус- ловиям: dO/dt« уВэфф (2.36) (здесь 0 соответствует углу между ВЭфф и осью х). При этом скорость раз- вертки частоты должна намного превышать скорость релаксации. Адиаба- тические импульсы практически независимы от негомогенности Bi и пере- крывают широкую полосу частот, поэтому они весьма подходят для широ- кополосного декаплинга. Для того, чтобы вектор Вэфф гарантированно начинался и заканчивался на оси ±г для предельного разброса химических сдвигов, амплитуду прило- женного импульса плавно обрезают с обеих сторон импульса. При этом профиль амплитуды импульса имеет вид сосиски. Такие импульсы называ- 412
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ют WURST (Wideband, uniform rate and smooth truncation). Использование суперцикла адиабатических импульсов приводит к декаплингу, эффектив- ному в намного более широкой полосе (>20уВ2), чем последовательности обычных композитных импульсов. Такой декаплинг можно применять для развязки гетероядер при самых высоких статических магнитных полях. Ве- роятно, распространение данного метода декаплинга будет постоянно воз- растать. 2.24.6. Селективное возбуждение и импульсы заданной формы (сформованные импульсы) Ранее мы рассмотрели так называемые жесткие импульсы, которые в иде- але одинаково эффективны для всего диапазона химических сдвигов. Мы также показали, что приблизиться к такому идеалу можно путем использо- вания композитных импульсов. Бывают, однако, случаи, когда требуется возбудить только ограниченный участок спектра. Для этого применяются специальные ’’мягкие” импульсы. В основном, мягкие импульсы применя- ются для следующих целей: - уменьшение размерности спектра, например получение 1D аналогов 20-экспериментов; - селективное удаление из спектра нежелательного сигнала, например подавление сигнала растворителя; - получение специфической информации, например измерение вы- бранной дальней гетероядерной КССВ, возбуждение единичного сигнала. Замена жесткого импульса его селективным аналогом в многомерной последовательности приводит к спектру более низкой размерности, кото- рый имеет определенные преимущества перед двумерным. В таких спект- рах достигается более высокое цифровое разрешение, что дает возмож- ность лучше анализировать тонкую структуру сигналов. Такие спектры эк- вивалентны срезам двумерного спектра, проведенным через выбранный химический сдвиг. Их измерение требует значительно меньше времени и объема памяти для записи эксперимента. Одномерные модификации дву- мерных экспериментов часто позволяют быстро и точно ответить на целый ряд вопросов, касающихся структуры изучаемых соединений. Основной подход для получения селективного импульса состоит в уменьшении его мощности и увеличении длительности. При уменьшении Bi разброс частот, на которые воздействует импульс, уменьшается. В то же самое время скорость движения векторов намагниченности также умень- шается, поэтому для достижения необходимого угла поворота вектора на- магниченности импульс должен быть более длительным. Таким образом, простейшим селективным импульсом является длинный слабый прямо- угольный импульс. Такой импульс, как и жесткий импульс, может иметь не 413
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР слишком подходящий профиль возбуждения - по его краям могут распо- лагаться выбросы, отстоящие далеко от заданной полосы возбуждения (рис. 2.87а). Время Частота Рис. 2.87. Профили возбуждения в координатах времени и частоты для (а) маломощного прямоугольного импульса и (б) плавно усеченного сфор- мованного импульса. Эти выбросы производят возбуждение соответствующих частот, что снижает селективность импульсного воздействия и вносит в сигналы фазо- вые искажения. Причиной нежелательных краевых выбросов является рез- кий спад интенсивности импульса. При этом возникают периодические биения, аналогичные тем, которые наблюдаются при обрезании сигнала ССИ. Подавить такие биения можно путем сглаживания краев импульса (рис. 2.876). Таким образом, можно получить мягкие импульсы заданной формы, которые в настоящее время широко используются в ЯМР. Ниже приведены основные разновидности селективных импульсов. Их форма обеспечивает оптимальное проведение различных экспериментов в спект- роскопии высокого разрешения. 2.24.7. Форма мягких импульсов Все современные спектрометры ЯМР имеют электронные устройства для создания импульсов заданной формы. Эти устройства управляются компьютером спектрометра и дают возможность оператору программиро- вать форму импульса. Выбор формы селективного импульса для проведе- ния конкретного эксперимента определяется рядом экспериментальных параметров, которые требуется соблюсти при его применении. Важнейшие из них следующие: - длительность, - профиль возбуждаемых частот, - воздействие на фазу сигналов. 414
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Мягкие импульсы обычно имеют длительность 1-100 мс, то есть они в тысячу раз длиннее жестких импульсов. Поэтому при их использовании могут возникать осложнения, связанные с эволюцией химических сдвигов и КССВ, а также с релаксационными процессами. Поэтому селективные импульсы должны быть как можно короче, но при этом обеспечивать тре- буемую селективность. Селективность импульса определяется полосой час- тот, в которой импульс эффективен. В идеале профиль возбуждения им- пульса должен быть прямоугольным, причем вне выбранного окна воздей- ствие импульса должно быть нулевым. Такой профиль иногда называют цилиндром. Фаза возбуждаемых сигналов также должна быть постоянной во всей полосе возбуждения, однако на практике данное требование реали- зовать трудно, поскольку при использовании слабых радиочастотных им- пульсов заметную роль играют внерезонансные эффекты. Поэтому в мно- гоимпульсных последовательностях, когда требуется точный контроль ори- ентации векторов намагниченности, следует проводить соответствующую корректировку фазы возбуждаемых сигналов. 2.24.8. Гауссовы импульсы Простейшим импульсом заданной формы (сформованным импульсом) яв- ляется Гауссов импульс (рис. 2.88). Рис. 2.88. Профиль Гауссова импульса в шкале частот. Профиль полосы возбуждения такого импульса соответствует функции Гауссиана, в которой по мере удаления от центра импульса быстро проис- ходит спад интенсивности возбуждения. Хотя профиль возбуждения дан- ного импульса и не является идеальным цилиндром, однако он намного бо- лее близок к нему, чем у прямоугольного импульса (рис. 2.89). Рис. 2.89 иллюстрирует различие в полосе возбуждения прямоуголь- ного и Гауссова импульсов. Однако этот рисунок не позволяет видеть воз- действие импульса на фазу сигналов, поскольку на нем представлены абсо- лютные величины возбуждения. Если же произвести расчет воздействия 415
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Гауссова импульса (Гауссиана) на сигнал, отстоящий от центра импульса на фиксированное значение частоты с учетом знака такого воздействия, то мы получим совершенно другую картину (рис. 2.90). Рис. 2.90. Воздействие Гаус- сова импульса на сигналы, от- стоящие от частоты импульса на заданные значения частоты с интервалом 20 Гц. Рис. 2.89. Абсолютные значения про- филей возбуждения в частотной шкале (а) прямоугольного импульса и (б) сфор- мованного Гауссова импульса. Видно, что при небольших отличиях частоты сигналы не меняют своего знака, а в случае, если разность частот сигнала и импульса составляет бо- лее 50 Гц, наблюдается инверсия знака сигнала. Это свидетельствует о зна- Рис. 2.91. Траектории дви- жения сигналов после дейст- вия Гауссова импульса. Рас- чет произведен для частот сигналов, отстоящих от час- тоты импульса на пх20 Гц. чительных искажениях фазы, которые вно- сит Гауссов импульс. Поэтому Гауссовы импульсы хотя и значительно лучше подхо- дят для селективного возбуждения сигна- лов, чем прямоугольные, однако далеки от идеала. Траектория векторов намагничен- ности для сигналов, частота которых точно не соответствует частоте импульса, может существенно меняться. Рассчитанные тра- ектории для Гауссова импульса показаны на рис. 2.91. Из данного рисунка следует, что при не- больших отличиях частот сигнала импульса изменяется фаза сигнала, а в случаях, когда такие различия больше, траектория движе- ния их векторов намагниченности близка к 416
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса круговой, поэтому суммарная намагниченность в поперечной плоскости для них отсутствует. Многие импульсные последовательности, основанные на селективном возбуждении сигналов, требуют применения более совершенных импуль- сов, чем Гауссов импульс. Это стало причиной для проведения многочис- ленных работ по разработке селективных импульсов. Форма наиболее по- лезных импульсов во временной шкале показана на рис. 2.92. Гауссиан Полугауссиан Q5 Каскад Гауссианов IBURP2 Q3 Каскад Гауссианов REBURP Рис. 2.92. Профили во временной шкале некоторых сформованных селек- тивных возбуждающих импульсов. Лучшей альтернативой для возбуждения продольной намагниченности являются импульсы Полугауссиан, а также Гауссиан-270. Как следует из названия, Полугауссиан имеет профиль Гауссиана, разделенный пополам. Полугауссиан не дает отрицательных биений, поскольку векторы намагни- ченности при действии этого импульса никогда не инвертируются. Гаусси- 417
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Рис. 2.93. Вычисленные тра- ектории движения векторов намагниченности как функ- ция отклонения от резонанс- ных условий сигнала для Гауссиана-270. ан-270 вызывает вращение вектора намаг- ниченности на -90°, поэтому он идентичен 90°-импульсу. Интересной особенностью этого импульса является то, что для сигна- лов, близких к частоте импульса, наблюда- ется эффект самофокусировки как для хими- ческих сдвигов, так и для КССВ (рис. 2.93). Поэтому у данного импульса фазовые свойства лучше, чем у 90°-Гауссиана. Дан- ный импульс не требует фазовой коррек- ции, его легко включать в импульсные по- следовательности. Поэтому он наиболее удобен в случаях, когда не требуется слиш- ком высокой селективности возбуждения. 2.24.9. Импульсы идеальной фазы В последние годы разработан ряд импульсов, которые дают профиль воз- буждения весьма близкий к цилиндру. При воздействии таких импульсов фаза всех сигналов, попадающих в полосу возбуждения, остается практичес- ки неизменной. Поэтому отпадает необходимость последующей фазовой очистки или обработки сигналов, что позволяет вводить такие импульсы в импульсные последовательности вместо жестких импульсов. Такие импуль- сы получаются с помощью специальных компьютерных процедур. Они вы- зывают движение векторов намагниченности по весьма сложным траекто- риям. Профили возбуждения некоторых из таких импульсов показаны на рис. 2.94. Здесь представлен результат воздействия на спины представителей се- мейства импульсов BURP (Band-selective, Uniform Response, Pure phase pul- ses), называемых EBURP2 и IBURP2, которые служат соответственно для возбуждения и инверсии сигналов. Несмотря на сложные траектории дви- жения векторов намагниченности, все они, в конце концов, оказываются именно в той точке, куда мы их и стремились переместить с очень малыми дефектами интенсивности и фазы. Это иллюстрирует рис. 2.95. Профили возбуждения, отвечающие данным импульсам, представлены на рис. 2.94. Они показывают, что дефекты фазы при их применении прак- тически полностью отсутствуют. Следует, однако, отметить, что для этого настройка импульсов также должна быть идеальной. На рис. 2.96 показан результат применения импульсов EBURP2 для селективного возбуждения сигналов образца для двух различных полос возбуждения (для двух дли- тельностей импульса). 418
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Гауссов I Полугауссиан Гауссиан-270 импульс Рис. 2.94. Рассчитанные профили возбуждения отдельных сформованных импульсов (длительностью 10 мс). Профили инверсии (нижний ряд) были вычислены для последовательности 180°- и 90°-импульсов (мягкого и жест- кого, соответственно). Рис. 2.95. Вычисленные траектории движения векторов намагниченнос- ти как функция отклонения сигнала от резонансных условий для (а) воз- буждающего импульса EBURP (90°) и (б) инвертирующего импульса IBURP2 (180°). 419
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР в) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 м.д. Рис. 2.96. Возбуждение селективным импульсом EBURP2. Использован импульс длительностью (б) 14 мс и (в) 100 мс. Внизу (а) показан спектр, полученный при действии жесткого импульса. Импульсы семейства BURP являются не единственной разновидностью селективных импульсов без фазовых искажений. При другом подходе к ди- зайну импульсов получено семейство импульсов с весьма похожими свой- ствами, так называемые каскады Гауссианов (таблица 2.6, рис. 2.92). Как следует из названия, они состоят из кластеров Гауссовых импульсов, сум- марный эффект которых значительно ближе к идеалу, чем воздействие лю- бого из простых селективных импульсов. Одной из особенностей сложных композитных импульсов является то, что они работают только в том слу- чае, когда исходная ориентация намагниченности соответствует той, для которой разработан импульс. Например, импульсы EBURP являются воз- буждающими 90°-импульсами для продольной намагниченности. Они не применимы для поперечной намагниченности. Аналогично, селективный 180°-импульс IBURP не может быть использован для рефокусировки в экспериментах спинового эха. Если импульс можно использовать для про- извольной исходной ориентации вектора намагниченности, его называют универсальным импульсом. Большинство сложных импульсов не являются универсальными. В таблице 2.6 приведены основные свойства сформованных импуль- сов. Для них наиболее важны два параметра - ширина полосы возбуждения относительно прямоугольного импульса и относительная мощность им- пульса. Последний параметр показывает, на сколько децибел следует по- высить мощность передатчика, чтобы угол поворота импульса был таким же, как и у соответствующего селективного прямоугольного импульса. 420
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Видно, что все селективные композитные импульсы требуют увеличения мощности передатчика. Таблица 2.6. Свойства некоторых сформованных мягких импульсов Сформованный импульс Применение Фактор ширины полосы* ** Фактор ослабления, dB 1 2 3 4 Прямоугольный универсальный * * 1.0 0 90°-импульсы Гауссиан универсальный 2.1 7.7 Очищенный Г ауссиан только возбуждение 0.8 7.7 Гауссиан-270 только возбуждение 1.3 16.7 EBURP2 только возбуждение, с исправлением фазы 4.9 24.3 SNEEZE только возбуждение, с исправлением фазы 5.8 26.6 UBURP универсальный, с исправлением фазы 4.7 32.2 G4 Каскад Гауссианов только возбуждение, с исправлением фазы 7.8 25.4 Q5 Каскад Г ауссианов универсальный, с исправлением фазы 6.2 25.3 180°-импульсы Гауссиан-180 универсальный 0.7 13.7 IBURP2 только инверсия, с исправлением фазы 4.5 25.9 REBURP универсальный, с исправлением фазы 4.6 28.0 G3 Каскад Гауссианов только инверсия, с исправлением фазы 3.6 23.1 Q3 Каскад Гауссианов универсальный, с исправлением фазы 3.4 22.4 * Фактор ширины полосы - ширина полосы воздействия импульса относительно прямоугольного импульса, имеющего тот же угол воздействия. ** Универсальные импульсы действуют одинаково на любое исходное состояние намагниченности, тогда как импульсы возбуждения и инверсии предназначены для воздействия только на продольную намагниченность. 421
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Следует также учитывать, что чем более сложный импульс мы при- меняем, тем больше его суммарная длительность. Поэтому всегда следует помнить о воздействии релаксационных процессов во время действия им- пульса. Особенно важно это при изучении больших молекул и при исполь- зовании очень длительных импульсов повышенной селективности. Для быстро релаксирующих молекул разработаны специальные селективные импульсы, такие как SLURP. 2.24.10. Воздействие оператора на форму импульса На современных приборах высокого разрешения возможность влияния на амплитуду импульса во время его действия является стандартной процеду- рой. Она осуществляется с помощью так называемого генератора формы волны, который контролирует амплитуду импульса перед тем, как он пода- ется на импульсный усилитель. Чаще всего весь подаваемый импульс раз- бивается на малые фрагменты, для каждого из которых задаются необходи- мая амплитуда и фаза. В целом импульс после этого напоминает гисто- грамму. Для того, чтобы суммарный импульс имел необходимую форму, его разбивают на достаточно большое число элементов, чаще всего 256. В современных приборах импульсы можно представить в графическом виде и откорректировать на экране компьютера. Однако эта процедура не явля- ется стандартной. Чаще всего при проведении эксперимента пользуются уже готовыми импульсами, форма которых известна заранее. Самостоятель- ное конструирование импульсов хотя и возможно, однако требует прове- дения многочисленных экспериментов по определению их воздействия на ядерную намагниченность. Поэтому химики, которые используют спект- роскопию ЯМР для решения практических задач, возможность воздействия на форму импульса используют весьма редко. 2.24.11. Последовательность DANTE В первые годы использования селективного возбуждения спектрометры не могли генерировать сформованные радиочастотные импульсы. Поэтому тогда для этой цели использовалась последовательность DANTE (Delays Alternating with Nutration for Teilored Excitation), в которой применялись короткие жесткие импульсы. Хотя данный метод в настоящее время вытес- нен применением селективных импульсов, однако он продолжает исполь- зоваться на более старых приборах и в случаях, когда на приборе отсутст- вует генератор формы волны. Базовая последовательность DANTE, показанная на рис. 2.97, пред- ставляет собой серию N коротких жестких импульсов с углом поворота а, где а «90°, разделенных фиксированным промежутком т. 422
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ататататататата Рис. 2.97. Схематическое изображение последовательности DANTE на шка- ле времени. Общая длительность импульса составляет N(t+oc), где а - длительность каждого жесткого импульса. Общий угол поворота импульса равен сумме углов индивидуальных импульсов 0 = Еа. Действие данной последователь- ности иллюстрирует рис. 2.98. Рис. 2.98. Воздействие 90°-импульса DANTE на сигнал, совпадающий с частотой импульса, и вычисленные зигзагообразные траектории возбужде- ния векторов ядерного спина при отклонениях частоты сигнала от частоты возбуждения на 20 и 40 Гц. В последовательности использовано 30 импуль- сов по 3 град, каждый. Импульсы были разделены промежутками по 0.33 мс с образованием эффективного 10-микросекундного селективного импульса. После каждого импульса спины прецессируют в течение короткого промежутка т. За это время происходит их эволюция в соответствии с раз- ностью химических сдвигов и частоты импульса. Для сигнала, частота ко- торого точно соответствует частоте импульса, прецессия отсутствует и под действием последовательных импульсов его вектор намагниченности пере- мещается по направлению к оси +у. Для сигналов, расположенных вблизи частоты облучения, путь движения вектора будет зигзагообразным, как по- казано на рис. 2.98. Если N достаточно велико (обычно больше 20), траек- тории движения намагниченностей весьма похожи на траектории их дви- жения под воздействием мягкого прямоугольного импульса одинаковой суммарной длительности. Модификация формы импульсов в методе DANTE осуществляется пу- тем изменения длительности импульсов при их неизменной амплитуде. 423
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Так, например, Гауссова форма импульса может быть воссоздана путем из- менения длительности импульсов в соответствии с профилем Гауссиана. Ограничением при этом является нижний предел длительности импульсов, равный примерно 1 мкс, который определяется точностью работы импульс- ного передатчика. В таких случаях может понадобиться ослабление мощ- ности импульсов, чтобы требуемый угол импульса был достигнут для не- сколько более длительного импульса. Главное различие между мягкими импульсами и методом DANTE со- стоит в наличии в последнем методе сильных боковых областей возбужде- ния с обеих сторон от полосы импульса. Максимумы таких боковых участ- ков возбуждения расположены на расстояниях, кратных 1/т. Они отвечают векторам намагниченности, отстоящим далеко от частоты импульса и дела- ющим полный круг за время т. Таким образом, данные векторы через время т оказываются в таком по- ложении, как будто они вообще не вращаются. Возбуждение отвечающих им сигналов происходит так же, как и сигналов, частота которых совпадает с частотой импульса. Существуют также более далекие области поглоще- ния, отстоящие на ±2/т, 3/т и т.д. и отвечающие поворотам векторов намаг- ниченности на 2, 3 и более полных циклов за время т. Нежелательные бо- ковые области поглощения можно сместить в сторону от имеющихся в спектре сигналов путем подбора соответствующей величины интервала т. Таким образом можно добиться возбуждения только одного сигнала. 2.24.12. Скульптурное возбуждение Весьма эффективный метод селективного возбуждения состоит в комбина- ции сформованных импульсов с импульсными градиентами поля. В резуль- тате можно получить возбуждающую импульсную последовательность с рядом полезных свойств. Такие последовательности включают в себя одно или два градиентных спиновых эха (рис. 2.99). Разберем работу данной по- следовательности на примере одного спинового эха (рис. 2.99а). Последо- вательность начинается с подачи жесткого 90°-импульса, который возбуж- дает все ядра данного типа. После действия этого импульса все векторы на- магниченности оказываются в плоскости х-у. Далее следует цепочка им- пульсов Gi-S-Gi. Здесь S соответствует селективному 180°-импульсу, а расположенные по бокам от него градиентные импульсы Gi одинаковы. Для тех спинов, которые подверглись селективной инверсии, градиенты действуют в противоположных направлениях, вследствие чего соответст- вующие намагниченности рефокусируются. Таким образом, для инверти- рованных сигналов наблюдается градиентное эхо. Спины, находящиеся вне полосы селективного возбуждения, подвергаются суммарному воздейст- 424
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса вию двух градиентных импульсов, поэто- му они полностью расфазируются в по- перечной плоскости и их сигналы не на- блюдаются. Вследствие этого единичное градиентное эхо производит точную се- лекцию сигнала, инвертированного селек- тивным импульсом S. Фазовый профиль сигнала после се- лекции определяется фазовыми свойст- вами селективного импульса S, которые могут быть неидеальными. Повторение спинового эха с другой силой градиента (рис. 2.996) полностью устраняет оста- точные фазовые ошибки и позволяет по- лучить инвертированный сигнал без за- метных фазовых искажений. Изменение амплитуды градиентов второго эха тре- буется для исключения возможности ре- фокусировки расфазированной ранее не- желательной намагниченности. Данный метод является техническим прорывом в а) * S 'н/х | 1 Gz i ii А Gi Gi G2 G2 Рис. 2.99. Последовательности скульптурного возбуждения, основанные на спиновом эхе с (а) единичным и (б) двойным градиентным эхом. Элемент S представляет любой селектив- ный инвертирующий 180°-им- пульс или импульсную после- довательность. селективном возбуждении сигналов, поскольку он позволяет не только произвести возбуждение исключительно выбранного сигнала, но и пол- ностью удалить из спектра все остальные сигналы. С помощью данного ме- тода намного проще получить профиль возбуждения, близкий к идеально- му цилиндру, и измерять спектры без фазовых искажений. Результирующий профиль возбуждения в последовательности с двойным градиентным спи- новым эхом (DPFGSE) определяется кумулятивным эффектом повторя- ющихся инвертирующих импульсов. Одновременно в результате действия серии градиентных эхо полностью удаляется намагниченность сигналов, не попадающих в полосу селективного возбуждения. Этот прием называ- ют еще "скульптурным возбуждением". Пример чистого неискаженного возбуждения при использовании данной последовательности показан на рис. 2.100. Этот прием можно использовать в таких одномерных модифи- кациях двумерных экспериментов, как TOCSY-1D и NOESY-1D. Вариант эксперимента с единственным градиентным эхом используется для изуче- ния больших молекул, для которых имеют место большие релаксационные потери. При рутинной работе в качестве импульса S удобно применять Гауссов импульс. На рис. 2.101 показаны рассчитанные профили возбуждения для такого импульса различной длительности. Их можно использовать при вы- боре величины полосы возбуждения. 425
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР 8.50 8.40 8.30 8.20 8.10 8.00 7.90 7.80 7.70 7.60 7.50 7.40 7.30 7.20 7.10 8.50 8.40 8.30 8.20 8.10 8.00 7.90 7.80 7.70 7.60 7.50 7.40 7.30 7.20 7.10 8.50 8.40 8.30 8.20_____8Л0______8.00 7.90 7,80 7,70 7.60 7,50 7.40 7.30 7.20 7.10 Рис. 2.100. Чистое селективное возбуждение выбранных сигналов методом скульптурного возбуждения с двойным градиентным отбором. Показаны варианты возбуждения двух из имеющихся сигналов. Внизу приведен пол- ный спектр соединения, полученный при действии жесткого импульса. В скульптурном возбуждении использован 40 мс Гауссов 180°-импульс. 80 мс 100 50 0 50 100 Гц Рис. 2.101. Профили скульптурного возбуждения сигналов с двойным им- пульсным градиентным отбором. Элемент S представляет собой Гауссов 180°-импульс указанной длительности. 426
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Для большинства практических задач лучше всего подходит импульс с длительностью 40 мс. 2.25. Более подробно о релаксации В предыдущей главе мы рассмотрели вопросы, связанные с возбуждением спинов. Здесь мы рассмотрим процессы, которые происходят после воз- буждения. Эти процессы могут оказывать существенное влияние на форму сигналов, а иногда даже обусловливать саму возможность проведения того или иного эксперимента ЯМР. Как мы уже знаем, количественными харак- теристиками релаксационных процессов являются времена продольной (ТО и поперечной (Т2) релаксаций. Они характеризуют скорость спада намагни- ченности соответственно вдоль оси z и в плоскости х-у. Общая релаксация спиновой системы характеризуется наименьшим из этих времен. Кроме то- го, время продольной и поперечной релаксаций является еще одним пара- метром спектров ЯМР, который можно использовать для выяснения осо- бенностей строения молекул химических соединений. 2.25.1. Связь релаксации с молекулярным движением Основным механизмом продольной релаксации ядер со спином Vi является взаимодействие магнитного момента ядра с имеющимися в молекуле пере- менными магнитными полями, частота которых совпадает с частотой Лар- моровой прецессии. Эти поля возникают за счет движения с подходящей скоростью электронных оболочек атомов, функциональных групп и моле- кул в целом. Исключительно благодаря наличию таких полей могут осуще- ствляться изменения спиновых состояний магнитных ядер, что и обуслов- ливает их релаксацию. Реально только хаотичные перемещения молекулы имеют скорости, которые могут обеспечить возникновение переменных магнитных полей в сотни МГц и оказывать содействие ядерной релакса- ции. Другие типы движений или слишком быстры, или, наоборот, медленны. Усредненная скорость движения молекул в жидкой или газообразной среде определяется частотой их столкновений и молекулярной ассоциацией. Ко- личественно она характеризуется временем вращательной корреля- ции, тс, которое равняется среднему времени поворота молекулы на 1 радиан. Короткие времена корреляции отвечают быстрому вращению. В зависимости от массы молекулы и физического состояния окружающей среды (температура, вязкость) скорость движения молекулы меняется. Со- ответственно меняются и частоты электромагнитных полей, возникающие за счет движения молекулы. В любом случае при движении молекулы инду- цируется не одна фиксированная частота, а их набор в определенном частот- ном диапазоне. Распределение флуктуирующих магнитных полей по час- 427
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР тотам называется спектром частот движения. Вероятность существования компонента движения с данной частотой, 0) (рад/с), называется его спект- ральной плотностью, J(co). На основании спектра частот для каждой часто- ты можно найти величину спектральной плотности. Только если существу- ет компонент, который отвечает Ларморовой частоте конкретного ядра, может происходить его продольная релаксация. Математическая функция, которая описывает спектральную плотность частот, возникающих при дви- жении молекул, имеет вид: J(w) = 2тс/(1 + со2т2с). (2.37) Из формулы следует, что для каждого времени корреляции, то есть для каждой скорости молекулярного движения существует свой спектр частот. Формулу (2.37) можно представить в графическом виде. Если для шкалы частот использовать логарифмическую шкалу, то график будет представлять собой кривую, похожую на ступеньку. Для широкого диапа- зона малых частот спектральная плотность будет почти одинаково высо- кой. Аналогично, для широкого диапазона высоких частот спектральная плотность будет тоже одинаковой, но намного меньшей. Область перехода между этими участками довольно узка, а ее положение определяется вре- менем корреляции молекул. Схематично график зависимости спектральной плотности от частоты для молекулярных движений, которые сильно раз- личаются по скорости, представлен на рис. 2.102. Масштаб шкалы частот выбран так, чтобы частота спектрометра, а следовательно, и резонансная частота магнитных ядер располагались в центре диапазона. Условно ско- рость движения молекул можно разбить на три диапазона - медленную, среднюю и высокую. Этот рисунок позволяет оценить вероятность существования частоты ядерной прецессии, too, в случаях медленного, быстрого движения и движе- ния с промежуточной скоростью. Поскольку каждая кривая отображает ве- роятность существования определенных частот, то в сумме эта вероятность равна единице, соответственно площадь под кривыми является константой. Для Ларморовой частоты, too, представленной на рис. 2.102, с помощью имеющихся на рисунке графиков можно оценить спектральную плотность. Она показана на отдельных кривых точками a-в. Видно, что наибольшую спектральную плотность частота too имеет для промежуточных скоростей движения молекулы (точка б). Теперь мы можем оценить, как скорость молекулярного движения влияет на время продольной релаксации. Эффективность релаксации Ti определяется вероятностью присутствия компоненты молекулярного движения, частота которой совпадает с Ларморовой частотой. Мы только что показали, что наиболее вероятными такие частоты являются для 428
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса движений промежуточной скорости. Поэтому график зависимости Tj от скорости молекулярного движения представляет собой кривую с миниму- мом при промежуточных скоростях молекулярного движения. Он пред- ставлен на рис. 2.103. Здесь, в отличие от рис. 2.102, шкала частот заменена на шкалу времени корреляции в единицах log(Tc)-1. Можно показать, что этот параметр пропорционален логарифму частоты молекулярного вращения. спектральная плотность Рис. 2.102. Схематическое представление спектральной плотности как функции частоты вращения молекул. Показано для молекул, которые дви- гаются быстро, со средней скоростью и медленно. Для данных молекул на- блюдается различная величина спектральной плотности (a-в), отвечающая частоте поглощения too. С помощью данного графика можно проследить, как изменяется время релаксации при переходе от молекул, которые двигаются быстро (разбав- ленные растворы в невязких растворителях), к молекулам большой массы (полимеры и биомолекулы), для которых характерно медленное движение. Быстрые молекулярные движения содержат сравнительно малый вклад частот, которые совпадают с частотой Ларморовой прецессии, поэтому в этом случае релаксация происходит медленно (Tj большие). Такая ситуа- ция характерна для малых молекул в невязких растворителях. Она известна как область максимального сужения линий. В этой области спектры ЯМР 429
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР содержат узкие сигналы. В этом случае скорости продольной и поперечной релаксаций одинаковы (Тг = Tj). При уменьшении скорости молекулярного движения спектральная плотность частот, соответствующих (Do, сначала воз- растает, а потом для медленных движений снова падает. Поэтому умень- шение скорости молекулярного движения, которое, например, может про- исходить при повышении вязкости раствора или уменьшении температуры образца, уменьшает время релаксации и уширяет сигналы ЯМР. Точка, для которой наблюдается минимум времени релаксации, зависит от напряжен- ности магнитного поля, поскольку от него зависит сама (Do (рис. 2.103). В более сильных магнитных полях она находится при более высоких часто- тах. Поэтому область максимального сужения сигналов на мощных магнитах является более узкой. Рис. 2.103. Для спинов с Ларморовой частотой (Do в логарифмических шка- лах показана зависимость Ti от скорости молекулярного движения (вели- чина, обратная времени корреляции тс). Вследствие того, что (Do зависит от напряженности поля, кривая Ti также зависит от напряженности поля. Поэтому в более сильном магнитном поле минимум на кривой наблюда- ется для более быстрых движений (верхняя кривая). Поведение спиновой системы в области медленных движений несколь- ко сложнее. Здесь спин-спиновая и спин-решеточная релаксации по-раз- ному зависят от частоты молекулярных движений. Это связано с тем, что флип-флоп процесс, который определяет скорость спин-спиновой релакса- ции, стимулируется очень медленными молекулярными движениями, а это ускоряет поперечную релаксацию образца. Поэтому кривая для Тг корен- ным образом отличается от кривой для Т] (рис. 2.104). 430
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса log(T) Рис. 2.104. Схематическая иллюстрация зависимости Ti и Т2 от скорости молекулярного движения. Релаксация Ti нечувствительна к очень медлен- ным движениям, в то время как релаксация Т2 чувствительна к любой ско- рости молекулярного движения. Это приводит к тому, что общая ширина сигналов при дальнейшем охлаждении образца не уменьшается, как это можно было ожидать ис- ходя из рис. 2.103, а продолжает увеличиваться, но теперь уже за счет поперечной релаксации. 2.25.2. Механизмы релаксации Если бы релаксация всех магнитных ядер молекулы имела одинаковую скорость, то механизм релаксации не играл бы никакой практической роли, поскольку время релаксации не зависело бы от структуры молекулы. На самом деле это не так. Обычно в молекуле все ядра имеют несколько раз- личные времена релаксации, а в ряде случаев время релаксации одного из ядер может кардинально отличаться от других. Это позволяет использовать время релаксации для выяснения структурных особенностей молекулы. Хотя здесь и нет таких четких связей со структурой молекулы, как мы наблю- дали для химических сдвигов и КССВ, однако аномалии времени релакса- ции для некоторых атомов позволяют делать выводы об особенностях мо- лекулярного движения. Часто такие аномалии обусловлены сильным вкла- дом специфических механизмов в релаксацию отдельных магнитных ядер. Для идентификации таких случаев требуется иметь представление об ос- новных механизмах релаксации. 431
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР 2.25.3. Диполь-дипольная релаксация Наиболее важным механизмом релаксации для ядер со спином Уг является диполярное взаимодействие спинов. Оно является также причиной возник- новения очень важного для практики эффекта Оверхаузера. Диполярные взаимодействия можно описать, если воспользоваться моделью точечного магнитного диполя. При этом ядра со спином Уг можно представить в виде микроскопических магнитов, имеющих Южный и Северный полюса. Во внешнем магнитном поле такие диполи, как стрелки компаса, все время ориентируются так, что их Северный полюс направлен в сторону Южного полюса внешнего магнита. Теперь предположим, что такие диполи соот- ветствуют двум соседним ядрам в молекуле, находящейся в состоянии хао- тического движения в растворе. При этом каждый из диполей создает маг- нитное поле, достаточное для того, чтобы его ощущало соседнее магнитное ядро. Несмотря на движение молекулы, диполи все время ориентируются вдоль внешнего магнитного поля. Однако при этом взаимная ориентация полей магнитных диполей в молекуле при ее вращении будет меняться. В результате каждый из диполей создает для другого диполя флуктуирующее магнитное поле (рис. 2.105). Таким образом, вращение молекулы с подхо- дящей частотой приводит к релаксации спинов. Рис. 2.105. Диполь-дипольная релаксация. Интенсивность взаимодействия двух спинов через пространство модулируется молекулярным движением. Модуляция эквивалентна переменному магнитному полю, которое индуци- рует переходы между спиновыми состояниями, что и обеспечивает релак- сацию спинов. Для протонов данный механизм релаксации является доминирующим. Вследствие этого протоны, не содержащие поблизости других протонов, релаксируют медленнее. Наиболее важным последствием этого может быть уменьшение величин интегральных интенсивностей сигналов протонов с медленной релаксацией из-за эффекта частичного насыщения таких сигна- лов. Насыщение происходит вследствие того, что времени между сканами 432
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса недостаточно для полной релаксации таких ядер. Наибольшие времена ре- лаксации будут наблюдаться для тех протонов, которые удалены от других протонов молекулы. Ядра 13С также релаксируют преимущественно по ди- полярному механизму на находящихся поблизости протонах. Если вблизи углеродного ядра протоны отсутствуют, релаксация, хотя и менее эффек- тивная, происходит на удаленных протонах. В очень больших молекулах и в сильных магнитных полях может играть заметную роль также механизм релаксации, связанный с анизотропией химического сдвига. Особенно эф- фективным он оказывается для атомов углерода sp2, для которых диапазон химических сдвигов ядер со спином 1/2 достаточно велик. Диполярная ре- лаксация может происходить также из-за взаимодействия ядерного спина с неспаренным электроном. Магнитный момент электрона в 600 раз превы- шает магнитный момент протона, что обусловливает высокую эффектив- ность такого пути релаксации. Эту релаксацию иногда называют парамаг- нитной релаксацией. Даже присутствие растворенного кислорода, который является парамагнитным соединением, может существенно повлиять на времена релаксации магнитных ядер. Если необходимо целенаправленно сократить время релаксации, используют специальные парамагнитные реа- генты, такие как ацетилацетонат хрома(Ш) Сг(асас)3 для органических раст- ворителей или MnCh для водных растворов. 2.25.4. Релаксация, связанная с анизотропией химического сдвига Распределение электронов в химических связях, как правило, несиммет- рично или, другими словами, анизотропно. В результате локальное поле, воздействующее на ядро, и соответственно его химический сдвиг зависят от ориентации связи относительно статического магнитного поля. В раст- воре быстрое движение молекул усредняет такую анизотропию химичес- кого сдвига (АХС), поэтому мы наблюдаем только одну частоту поглоще- ния для каждого химически неэквивалентного ядра. Это позволяет считать химический сдвиг изотропным. Несмотря на это, такие флуктуирующие магнитные поля могут стимулировать релаксацию и делать ее сравнитель- но быстрой. Это чаще всего наблюдается для ядер, имеющих большой диа- пазон химических сдвигов и соответственно большую анизотропию сдви- гов. К таким ядрам относятся 19F, 31Р, а также ядра многих металлов. Характерной особенностью АХС-релаксации является ее зависи- мость от квадрата приложенного поля. Это означает, что она намного эффективнее в сильных магнитных полях. Ядра, релаксация которых про- исходит по механизму АХС, в более сильных полях, где анизотропия сдви- га возрастает, должны давать существенно более широкие сигналы. Это может в значительной степени снизить чувствительность в полученном 433
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР спектре. По этой причине изучение ядер ряда металлов лучше проводить при невысоких полях. Механизм АХС может вызвать также неожиданные эффекты для ядер, имеющих спиновую связь с ядром, для которого наблю- дается АХС. Если АХС вызывает очень быструю релаксацию, компоненты мультиплетов, связанные со спин-спиновым взаимодействием с таким яд- ром, уширяются и вообще могут исчезнуть из спектра. Поэтому спин-спино- вое взаимодействие в слабых полях может наблюдаться, а в сильных - нет. 2.25.5. Квадруполъная релаксация Квадрупольный момент ядра + - - + Рис. 2.106. Схема механизма возникновения у ядра элект- рического квадрупольного мо- мента. Для ядер со спином I > Vi характерен специфический механизм релаксации, который реализуется благодаря тому, что эти ядра, кроме магнитного мо- мента, обладают также несимметричным распределением заряда в ядре. Такое не- симметричное распределение заряда мож- но представить, если считать, что ядро име- ет форму эллипса, в котором заряд скон- центрирован на концах эллипса, как это показано на рис. 2.106. Степень сосредоточения зарядов в определенных областях ядра не являет- ся постоянной величиной - она зависит от электрического поля вокруг ядра. Ес- ли это поле изотропно, то заряды в ядре рас- полагаются более или менее симметрично и анизотропия зарядов в ядре уменьшается. Скорость релаксации квадрупольных ядер определяется двумя факторами. Первый - это величина квадрупольного момента. Большие его значения обусловливают более эффективную релак- сацию и более широкие сигналы ЯМР. Величину квадрупольного момента можно представить как степень асимметрии распределения заряда в ядре. Малые значения квадрупольного момента приводят к более узким сигна- лам в спектре ЯМР. Поэтому лучшими для наблюдения являются ядра с небольшим квадрупольным моментом. Вторым фактором является величина градиента электрического поля, в котором находится квадрупольное ядро. В высокосимметричном окруже- нии, таком как тетраэдрическое или октаэдрическое, градиент поля равняется нулю и квадрупольный механизм релаксации оказывается неэффективным. На практике продолжают оставаться некоторые искаже- ния структуры электронного окружения, которые сохраняют его несиммет- ричность и обусловливают ускорение релаксации и уширение сигналов. Вы- 434
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса сокая степень электрической симметрии приводит к сужению сигналов. Так, например, ширина линий 14N для N(Me4)+ оказывается меньшей, чем 1 Гц, а для NMe3 она равняется 80 Гц. Квадрупольная релаксация происходит за счет движения молекулы, со- держащей квадрупольное ядро. При таком движении вокруг квадрупольно- го ядра возникает переменное электрическое поле. Если частота этого поля отвечает частоте Ларморовой прецессии, происходят перескоки ядерных спинов и соответственно возрастает скорость ядерной релаксации. Ситуа- ция аналогична той, которая возникает при релаксации за счет переменных магнитных полей, образованных ядерными диполями, с тем отличием, что квадрупольный механизм определяется исключительно электрическими, а не магнитными взаимодействиями. Помимо того, что квадрупольный механизм ускоряет релаксацию са- мого квадрупольного ядра, он оказывает воздействие и на релаксацию дру- гих магнитных ядер, которые находятся поблизости. Это воздействие, как правило, проявляется в уширении сигналов. Механизм квадрупольной ре- лаксации эффективен только для тех ядер, которые непосредственно связа- ны с квадрупольными ядрами, имеющими спиновое квантовое число I > Уг. В этом случае данный механизм релаксации становится доминирующим. Этот механизм исключительно эффективен, поэтому ширина сигналов близ- лежащих ядер может достигать сотен Гц. Однако если квадрупольный мо- мент ядра невелик, то соседние ядра могут практически не уширяться. Так, для соединений, содержащих такие квадрупольные ядра, как 2Н, 35С1, 37С1, 6Li, 7Li, можно измерять протонные и углеродные спектры без заметных уширений сигналов. Как и для других механизмов релаксации, для того, чтобы квадруполь- ный механизм был эффективным, нужна определенная частота молекуляр- ных движений. Поэтому наличие слишком быстрых движений приводит к уменьшению эффективности релаксации и сужению сигналов ЯМР. По этой причине для получения узких сигналов в присутствии квадрупольных ядер эффективным бывает использование растворителей с пониженной вяз- костью или повышение температуры. 2.26. Природа ядерного эффекта Оверхаузера Ядерный эффект Оверхаузера является одним из полезнейших в ЯМР. Как мы это видели в первой главе, с его помощью можно повышать чувст- вительность спектров магнитных ядер, связанных с протонами, и решать множество структурных проблем. Последнее применение ЯЭО основано на его зависимости от межъядерных расстояний. В этом разделе мы раскроем физическую природу эффекта и ограничения, которые накладывает на него физика данного явления. 435
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР 2.26.1. ЯЭО в двухспиновой системе Простейшей системой спинов, в которой может проявляться ЯЭО, является двухспиновая система. Пусть система содержит два одинаковых ядра со спином */2, I и S, которые находятся в жесткой молекуле, растворенной в невязком растворе. Рассмотрим ситуацию, когда между ядрами отсутствует спин-спиновое взаимодействие (Jis = 0), однако они располагаются доста- точно близко одно к другому для наличия диполярного взаимодействия. Это прямое магнитное взаимодействие их спинов через пространство. При этом каждый из спинов чувствует ориентацию партнера по взаимодейст- вию. Здесь ситуация совершенно аналогична той, которая наблюдается для двух точечных магнитов, расположенных один возле другого. Предположим, что в образце имеется 4N молекул. Диаграмма энерге- тических уровней для такого ансамбля ядер показана на рис. 2.107. Посколь- ку мы рассматриваем гомоядерную систему, то энергии переходов спинов I и S будут практически идентичными (разница химических сдвигов пренеб- режимо мала по сравнению с Ларморовой частотой) и можно считать, что состояния ос0 и Ра в равновесии одинаковы. В соответствии с распреде- лением Больцмана имеется избыток ядер на более низком энергетическом уровне (аа) и некоторый дефицит на более высоком уровне (РР). Посколь- ку нас интересует только изменение заселенностей энергетических уров- ней, то обозначим избыток ядер на самом низком уровне как А. Тогда де- фицит ядер на верхнем уровне будет -А (относительно заселенности уров- ней аР и Ра). Поскольку спин-спиновое взаимодействие между ядрами, как мы условились, отсутствует, то оба перехода, связанные с одним спи- ном, идентичны по энергии. Поэтому в отсутствие дополнительного облу- чения спектр содержит два синглета равной интенсивности (рис. 2.107а). Теперь предположим, что мы насыщаем сигнал S. При этом, вследст- вие быстрой реориентации спинов, разность заселенностей для переходов ядра S станет равной нулю. Полученное при этом распределение заселен- ностей показано на рис. 2.1076. Сравнение с диаграммой на рис. 2.107а показывает, что система вышла из состояния равновесия и разница засе- ленностей между уровнями изменилась. Поэтому система будет стремиться восстановить равновесную заселенность. Это возможно под воздействием процессов продольной релаксации. В связи с этим следует решить, какие релаксационные процессы будут способствовать установлению равновесия. Если игнорировать механизмы релаксации, можно предположить 6 воз- можных путей релаксации двухспиновой системы (рис. 2.108). Четыре из них отвечают одноквантовым переходам, в которых проис- ходит перескок только одного спина, например аа-0а. Вероятность каж- дого перехода или скорость, с которой осуществляется перескок спина по данному пути, обозначим W. Два оставшихся пути соответствуют переско- 436
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ку двух спинов одновременно - ар-ра и аа-рр. Хотя эти переходы и су- ществуют, их, в отличие от одноквантовых переходов, невозможно увидеть в эксперименте ЯМР, поскольку в данном случае общее изменение магнит- ного квантового числа (ДМ) не равно единице. Говорят, что эти переходы запрещены квантовомеханическими правилами отбора. Процесс аР~Ра с вероятностью Wo соответствует нульквантовому переходу (ДМ = 0), а про- цесс аа-РР - двухквантовому переходу W2 (ДМ = 2). Хотя эти переходы и запрещены при поглощении энергии, однако при релаксации они могут быть реализованы. Для ЯЭО они оказываются наиболее важными. Их на- зывают путями кросс-релаксации. Термин подчеркивает участие в релак- сации обоих спинов. Положительный ЯЭО Рис. 2.107. Диаграммы энергетических уровней и разности заселенностей для двух спинов, S и I, между которыми имеется диполярное взаимодейст- вие; (а) в равновесии, (б) после насыщения спина S, (в) после релаксации посредством процесса W2 и (г) после релаксации через путь Wo. Внизу по- казаны спектры, соответствующие каждому варианту. S I _________L_ Отрицательный ЯЭО 437
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Рис. 2.108. Шесть возможных переходов для двухспиновой системы. Остановимся на вопросе о том, как различные релаксационные процессы мо- гут способствовать восстановлению рав- новесия, если учесть, что переход WiS продолжает насыщаться постоянным ра- диочастотным облучением. Разность за- селенностей между переходами спина I, как и раньше, равна А, поскольку для это- го спина равновесные условия сохраня- ются. Поэтому путь W/ не играет роли в восстановлении равновесия и соответст- венно в возникновении ЯЭО. Процесс W2 переводит спины из состояния 00 в состояние аа и тем самым восстанавли- вает разность заселенностей между переходами спина S. При этом разность заселенностей между уровнями спина I возрастает (рис. 2.107в). Таким образом, результатом осуществления релаксации через путь W2 является общее возрастание интенсивности в спектре сигнала I. В результате при этом появляется положительный ЯЭО. Аналогично, процесс Wo приводит к переходу спинов из состояния Ра в состояние ар. При этом происходит восстановление заселенностей спина S. Результатом является уменьшение разности заселенностей спина I (рис. 2.107г). Поэтому релаксация по пути Wo приводит к общему уменьшению интенсивности сигнала спина I. Это отрицательный ЯЭО. Исходя из приведенных выше качественных описаний становится по- нятным, почему возникает явление ЯЭО и почему эффект может иметь раз- личный знак. Процессы кросс-релаксации W2 и Wo осуществляются одно- временно, и наблюдаемый знак ЯЭО определяется тем, какой путь для дан- ной системы является более эффективным. Помимо кросс-релаксации на восстановление равновесия может влиять также и путь W/. После возникновения ЯЭО он начинает оказывать содейст- вие восстановлению равновесной заселенности переходов спина I, поэтому он уменьшает величину ЯЭО. Вследствие этого, если механизм W/ оказы- вается более эффективным, чем механизмы кросс-релаксации, то ЯЭО мо- жет стать настолько малым, что может и не наблюдаться. Таким образом, видимый ЯЭО является результатом баланса нескольких конкуриру- ющих путей релаксации. Насыщение спина S в течение периода времени, большего времени его релаксации, приводит к новым стационарным засе- ленностям уровней, которые определяют интенсивность сигналов в полу- ченном спектре. Полный анализ всех путей релаксации и изменений засе- 438
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса n,{s}=^ Yi ленностей, возникающих при этом, позволяет количественно рассчитать величину ЯЭО. Для этого служит так называемое уравнение Соломона: ---W2-Wn------1_ Ys.F^is.'I (238) Wo + 2W,'+W2J YiLPisJ Множитель (Jis представляет собой скорость кросс-релаксации двух спинов, a Pis отвечает общей скорости диполярной продольной релаксации спина I. Для учета влияния на заселенности гиромагнитных отношений взаимодействующих ядер в уравнение включены их величины (ys и Yi)- Для гомоядерной системы, которая обсуждалась выше, эти величины одинако- вы и могут быть исключены из уравнения. Данное общее уравнение вклю- чает и качественные критерии, которые описаны выше, например W2 - Wo определяет знак ЯЭО, a W/ отвечает конкурирующему процессу релакса- ции, который уменьшает величину ЯЭО. Для того, чтобы найти величину и знак ЯЭО, необходимо знать, как влияют на скорость разных релаксацион- ных процессов молекулярная подвижность и расстояния между спинами. Именно этому вопросу будет посвящено следующее обсуждение. Для нульквантового процесса Wo разность энергий спиновых состо- яний довольно мала. Она отвечает разности частот поглощения спинов I и S. Поэтому частоты молекулярных движений, которые могут стимулиро- вать данные процессы, tot, можно найти по формуле tot = toi - tos. Такие частоты возникают исключительно в случае медленного движения молекул. Двухквантовые переходы W2 отвечают сумме частот поглощения спинов I и S. Поэтому tot = (Di + tos. Такие частоты стимулируются быст- рыми движениями молекул. Для примера рассмотрим гомоядерную спи- новую систему при частоте наблюдения в 400 МГц. Частоты однокванто- вых переходов Wj1 и WjS будут равняться приблизительно 400 МГц. Часто- та перехода Wo отвечает разности частот поглощения спинов I и S, то есть разности их химических сдвигов. Она лежит в диапазоне от Гц до КГц. Частоты переходов W2 отвечают сумме частот переходов спинов и близки к 800 МГц. Понятно, что скорость молекулярного движения, которая может стимулировать такие переходы, должна быть довольно большой. Таким образом, для молекул с высокой скоростью движения следует ожидать положительных ЯЭО, что обусловлено кросс-релаксацией по пути W2, а для молекул, которые движутся медленно, должны реализовываться отрицательные ЯЭО за счет повышения эффективности пути Wo. Это и происходит на практике. Количественные соотношения для скоростей диполярной релаксации в двухспиновой системе имеют вид: 439
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР W2 °C y?Ys W,1 ос Y‘YS2 wo Y?Ys 12тс Г6(1 + (Ц-Ц;)Ч2). (2.39) (2.40) (2.41) Константы пропорциональности во всех случаях одинаковы. Отметим, что в дополнение к зависимости от времени корреляции эти уравнения содержат величину межъядерного расстояния, г, между спинами I и S. Поскольку в формулу этот параметр входит в шестой степени, то количественные расчеты на основании ЯЭО следует делать с большой ос- торожностью. Множитель межъядерных расстояний описывает величину диполярного взаимодействия между спинами. Здесь важно то, что все пути релаксации одинаково зависят от межъядерных расстояний. Это, как будет показано ниже, позволяет проводить корреляцию величин ЯЭО со структу- рой молекул. То, что величина ЯЭО обратно пропорциональна шестой сте- пени межъядерного расстояния, свидетельствует о быстром спаде эффекта. Заметные ЯЭО наблюдаются между протонами, которые отстоят один от другого не больше чем на 0.5 нм (конечно, это зависит от чувствительнос- ти спектрометра и от того, насколько точно можно измерять интенсивнос- ти сигналов). Следует также помнить о наличии в уравнениях (2.39-2.41) величин гиромагнитных отношений взаимодействующих спинов. Поэтому в гетероядерной системе величины скоростей релаксации и соответственно ЯЭО могут существенно различаться. Если молекула в растворе вращается настолько быстро, что 0)Тс« 1, то всеми множителями, которые содержат со, можно пренебречь. Выраже- ния для скоростей релаксации при этом упрощаются: W‘-Y?Ys^> W0-Y?Ys|t’ W2-Y?Ys^- г (2.42) (2.43) (2.44) 440
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Эта ситуация отвечает условию предельного сужения линий, посколь- ку при этом все уширения сигналов, которые связаны с диполярным взаи- модействием, усредняются до нуля. Такая ситуация имеет место только при измерении спектров малых молекул в невязких растворителях. Соблю- дение условий предельного сужения зависит от времени корреляции моле- кулы и от напряженности магнитного поля спектрометра. 2.26.2. ЯЭО и молекулярное движение Если взять константы скорости уравнений (2.39-2.41) и рассчитать величи- ну ЯЭО по уравнениям (2.42-2.44) для различных скоростей молекулярно- го движения, то можно построить кривую, которая наглядно демонстриру- ет зависимость величины ЯЭО от скорости молекулярного движения, (ОоТс (где (Do - частота спектрометра, которая приблизительно равняется (Dj и (Ds). Эта кривая приведена на рис. 2.109. Следует напомнить, что это справедли- во только для двухспиновой системы с исключительно диполь-дипольным механизмом релаксации, когда величина ЯЭО является максимальной. Кривая содержит три участка, которые можно назвать областями быстрой, промежуточной и медленной скорости движения. Для молекул с большой скоростью движения (короткие тс и условие предельного сужения) ЯЭО име- ет максимально возможное значение +0.5 или 50%. Такими молекулами яв- ляются малые органические молекулы в невязких растворителях, поэтому именно они чаще всего изучаются с помощью стационарного ЯЭО. Другой предельный случай - молекулы с довольно медленным движением. Для них, как это было показано выше, характерен отрицательный ЯЭО. Максимальное изменение интенсивности сигнала для них происходит в случае, когда W2 и W/ равняются нулю. Если подставить эти значения в уравнение (2.38), то для ЯЭО получим величину -1 или -100%. Для изме- рения ЯЭО таких молекул следует использовать нестационарные условия, поскольку при стационарных условиях спектры оказываются неинформа- тивными (см. ниже). В данную область попадают биологические макромо- лекулы. Их традиционно изучают в нестационарных условиях с примене- нием таких экспериментов, как NOESY. Между этими предельными слу- чаями существует область промежуточных скоростей молекулярного дви- жения. Здесь ЯЭО изменяет знак или даже может равняться нулю, когда Wo = W2. В этой области величина и знак ЯЭО оказываются довольно чув- ствительными к скорости молекулярного движения, однако их величины могут быть слишком слабыми для надежных структурных корреляций. Расположение области промежуточных скоростей движения зависит от многих факторов - размера и формы молекул, свойств раствора (вязкость, температура, иногда pH) и силы поля спектрометра. Чаще всего в данный 441
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР диапазон попадают молекулы с молекулярной массой 1000-2000 Дальтон. С повышением интереса химиков к большим молекулам, в частности к суп- рамолекулярной химии, все большее количество молекул попадает в диа- пазон промежуточных скоростей движения, для которого возникают ос- ложнения при использовании ЯЭО. График на рис. 2.109 проходит через ноль в случае, когда скорость молекулярного движения приблизительно равняется частоте спектрометра. Рис. 2.109. Изменения максимального теоретического гомоядерного ста- ционарного ЯЭО в двухспиновой системе как функция скорости молеку- лярного движения (задается безразмерным параметром (ОоТс). Область быст- рого движения отвечает предельному сужению линий. Область медленного движения отвечает границе спиновой диффузии. Таким образом, величины ЯЭО в значительной мере зависят от часто- ты спектрометра. Это иллюстрирует рис. 2.110, где зависимость величины ЯЭО от времени корреляции приведена для трех разных магнитных полей. Использование сильных магнитных полей повышает вероятность попада- ния малых молекул в область промежуточных скоростей движения, а моле- кул среднего размера - в область медленных движений. Поэтому использо- вание магнитов с сильными полями всегда оказывает содействие исследо- ванию больших молекул, поскольку для них возрастает вероятность пере- хода в область отрицательных ЯЭО. Изучение малых молекул в сильных магнитных полях методом ЯЭО может оказаться неэффективным из-за пе- рехода этих молекул в область нулевых ЯЭО. Скорость движения молекул можно до некоторой степени регули- ровать с помощью изменения условий эксперимента. Наиболее просто с 442
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса этой целью измерять спектры при разных температурах. Еще один возмож- ный подход - измерять спектры во вращающейся системе координат. Дан- ный подход будет описан ниже, отметим только, что в этом случае все ЯЭО оказываются положительными для любых скоростей молекулярного движения, поэтому снимается проблема нулевой кросс-релаксации. Рис. 2.110. Изменение максимального теоретического гомоядерного ста- ционарного ЯЭО в двухспиновой системе как функция скорости молеку- лярного движения. Показано для трех частот спектрометра (МГц). 2.26.3. ЯЭО и расстояния между спинами Теперь можно остановиться подробнее на вопросе о том, как влияет на ве- личины стационарных ЯЭО расстояние между спинами. Если соблюдается условие предельного сужения линий, то подстановка упрощенных выра- жений для скорости релаксации (2.42-2.44) в уравнение (2.38) даст соотно- шение: 2* (2.45) 443
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР Как следует из этого уравнения, максимальная величина ЯЭО в двухспиновой системе может достигать 50%. При этом зависимость от межъядерных расстояний в этой системе отсутствует. Поэтому, по крайней мере, для гипотетической изолированной двухспиновой системы величина стационарного ЯЭО не несет информации о расстоянии между спинами. Таким образом, утверждение о том, что величины ЯЭО обратно пропорциональны шестой степени межъядерных расстояний, имеет свои ограничения. В реальных химических системах перед выяснением зависи- мости ЯЭО от расстояний между атомами следует учесть ряд дополнитель- ных факторов. Хотя величина стационарного ЯЭО в двухспиновой системе и не зави- сит от расстояния между спинами, скорость нарастания ЯЭО такую зависи- мость проявляет, поскольку от межъядерных расстояний зависит скорость релаксации. Это приводит к тому, что чем ближе одно к другому находятся магнитные ядра, тем быстрее устанавливается стационарная величина ЯЭО. Это является основой измерений динамики ЯЭО. Кроме того, отсюда вы- текает, что для выявления ЯЭО между ядрами, удаленными одно от друго- го, следует использовать продолжительный период предварительного на- сыщения. 2.26.4. ЯЭО в многоспиновых системах В предыдущих параграфах ЯЭО обсуждался для гипотетической двухспи- новой системы, в которой релаксация происходит исключительно по ди- поль-дипольному механизму. При переходе к реальным многоспиновым системам надо ответить на два ключевых вопроса: как присутствие посто- ронних спинов влияет на величину стационарного ЯЭО и какой в этом слу- чае окажется зависимость ЯЭО от межспиновых расстояний. Теоретический анализ этих вопросов показывает, что ЯЭО можно применять для опре- деления отношений расстояний между спинами, но не их абсолютных ве- личин. 2.26.5. Дополнительные пути релаксации Величина ЯЭО определяется эффективностью путей кросс-релаксации меж- ду двумя ядрами, поэтому только диполь-дипольный механизм релаксации может привести к возникновению ЯЭО. Все другие механизмы уменьшают долю релаксации по путям Wo и W2, поскольку они стимулируют релакса- цию по пути Wi. При этом величина ЯЭО уменьшается. Все альтернатив- ные пути релаксации можно объединить и обозначить как р*ь Этот пара- метр называют скоростью внешней релаксации спина I. Прибавив ее в соотношение (2.38), получим: 444
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ni{s}=— Yi ais Pis + Pi (2.46) Отсюда можно определить степень ослабления ЯЭО за счет внешней релаксации. Величину p*i называют еще ’’утечкой” релаксации. Этот эффект оказывается несколько большим для молекул в условиях предель- ного сужения линий и меньшим - в случае отрицательных ЯЭО. Для малых молекул с высокой скоростью движения абсолютная величина Qis мала по сравнению с молекулами, которые имеют малую скорость движения, поэто- му относительный вклад p*i в уравнение (2.46) оказывается для них боль- шим. Данный эффект схематично показан на рис. 2.111. Здесь видно, что "утечка” становится более значимой при росте скорости молекулярного движения (при уменьшении 0Vc)- Поэтому для малых молекул могут на- блюдаться довольно малые величины ЯЭО. В отличие от этого, для моле- кул с отрицательным ЯЭО "утечка” релаксации существенным образом не влияет на ЯЭО. Рис. 2.111. Зависимость максимального гомоядерного стационарного ЯЭО от скорости движения молекул в присутствии (сплошная линия) и в от- сутствие (пунктирная линия) внешнего источника релаксации, который конкурирует с кросс-релаксацией. Для увеличения значений ЯЭО молекул в условиях предельного суже- ния линий необходимо минимизировать р*ь Наиболее просто этого можно достичь, если удалить из раствора растворенный кислород. Неспаренный электрон кислорода имеет спин !/2. Его магнитный момент в 600 раз превы- шает магнитный момент протона, поэтому он создает сильные флуктуиру- ющие магнитные поля, которые ускоряют релаксацию. Поэтому при изуче- 445
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР нии дальних взаимодействий в малых молекулах приходится перед измере- ниями проводить дегазацию раствора. При рутинной работе такой необходи- мости чаще всего не возникает, поскольку ЯЭО имеют величину, достаточ- ную для их регистрации. Аналогично присутствие парамагнитных приме- сей, например солей некоторых металлов, может приводить к исчезнове- нию ЯЭО. Поэтому образцы, к которым для ускорения релаксации добав- лены релаксационные реагенты, непригодны для изучения ЯЭО. Это же относится и к спектрам веществ, в которых наблюдаются уширения сигна- лов. Вне зависимости от природы уширений для таких молекул время ре- лаксации будет аномально малым, что не позволит наблюдать заметные ЯЭО. Межмолекулярные диполярные взаимодействия между растворите- лем и растворенным веществом также могут влиять на скорость релакса- ции. Если применяется дейтерированный растворитель, то ядра дейтерия обычно слабо влияют на релаксацию протонов растворенного вещества, поскольку продольная диполярная релаксация пропорциональна у2, а для дейтерия гиромагнитное отношение намного меньше, чем у протонов. Если же применять протонсодержащие растворители, то при больших концент- рациях они могут существенным образом увеличить скорость протонной релаксации. Поэтому для изучения ЯЭО такие растворители лучше не при- менять. Другие, недиполярные механизмы релаксации, которые были описа- ны выше, также уменьшают величины ЯЭО. Наиболее важной при этом ока- зывается квадрупольная релаксация под влиянием ядер со спином >!/г. Для таких ядер данный механизм доминирует, поэтому ЯЭО для молекул с квад- рупольными ядрами наблюдается редко (исключением является ядро 6Li). 2.26.6. Определение межспиновых расстояний Очевидно, наиболее важным "посторонним" воздействием на релаксацию спина I в многоспиновой системе является влияние ядер, отличных от S. Диполярное взаимодействие с этими спинами приводит к ускорению про- дольной релаксации спинов I независимо от процессов кросс-релаксации между I и S. Поэтому ЯЭО между I и S ослабевает. Для иллюстрации воз- действия соседнего спина рассмотрим гипотетическую трехъядерную спи- новую систему, содержащую ядра I, S и N (соседнее ядро). Пусть релакса- ция происходит исключительно по диполь-дипольному механизму, а все другие механизмы релаксации отсутствуют. Если предположить для прос- тоты, что ЯЭО существует только между ядрами I и S, то для стационарно- го ЯЭО можно записать уравнение: ni{s}=nmax ris -6 . -6 riS + rlN (2.47) где T|max отвечает максимально возможному ЯЭО в двухспиновой системе. 446
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Отметим, что при отсутствии спина N ЯЭО просто равен Т|тах и не име- ет зависимости от межъядерных расстояний. Эффект введения дополни- тельного спина состоит в возникновении зависимости ЯЭО от межспи- новых расстояний. Однако величина ЯЭО не зависит просто от Она определяется соотношением расстояний rIS и rIN. Это справедливо для всех экспериментов стационарного ЯЭО. Наблюдаемые величины ЯЭО всег- да определяются соотношением расстояний ns и всех других рассто- яний riN. В реальной молекуле соседей может быть достаточно много, и все они оказывают воздействие на ЯЭО ядра I. Таким образом, величина стационарного ЯЭО ядра I определяется отношением скорости кросс- релаксации между ядрами I и S и суммарной скоростью релаксации спина I на всех других ядрах. Уравнение (2.47) показывает также, что уменьшение межъядерного расстояния между I и S приводит к увеличению ЯЭО между спинами I и S, поскольку вклад кросс-релаксации в общую ре- лаксацию при этом возрастает. Таким образом, в многоспиновой системе малые межспиновые расстояния соответствуют большим величинам ЯЭО. Однако данное правило следует применять с определенной осторож- ностью. На рис. 2.112 представлены величины ЯЭО т|в{ А} для трехспиновой системы А-В-С, рассчитанные по формуле (2.47), в которой расстояние между спинами В и С меняется. При этом непосредственным взаимодейст- вием между спинами А и С будем пренебрегать. Когда спин С находится далеко от спина В, его воздействие на релаксацию спина А оказывается малым. Поэтому кросс-релаксация между ядрами А и В доминирует и ЯЭО оказывается близким к максимально возможному. Если А и С находятся от В на равных расстояниях, то они играют одинаковую роль в релаксации В, поэтому для ЯЭО получим половину максимальной величины. Если же спин С находится к В вдвое ближе, чем А, то доминирующей является ре- лаксация В на ядрах С, а кросс-релаксация относительно нее оказывается слабее. Поэтому в данном случае ЯЭО будет маленьким. Таким образом, если два спина находятся вблизи один от другого и между ними есть сильное диполярное взаимодействие, то ЯЭО между ними может быть и маленьким, если неподалеку располагается третий спин. Еще одну интересную особенность можно выявить, если в описанной выше трехспиновой системе насыщать ядро В и определять ЯЭО для ядра А, то есть находить Г|А{В} (рис. 2.113). Видно, что в этом случае ЯЭО для А лишь в небольшой степени зависит от расстояния между В и С. Это свя- зано с тем, что ядро С оказывает слабое влияние на релаксацию ядра А, вследствие чего процесс кросс-релаксации между ядрами А и В во всех случаях доминирует. Таким образом, ЯЭО оказываются несимметричны- ми, то есть т|в{А} не равняется Г|А{В}, поскольку химическое окружение ядер А и В существенным образом различается. 447
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР 0.8% ЯЭО ЯЭО 25% облучение облучение 49% ЯЭО 2 облучение Рис. 2.112. Рассчитанные стационарные ЯЭО Г|В{А} для изолированной трехспиновой системы с близкими межъядерными расстояниями. Стрелка показывает спин, который насыщается. Цифры показывают относительные расстояния между ядрами. ЯЭО 46% А --------В ----- 1 О 0.5 ЯЭО 49% А--------В --------- С 1 О 1 облучение облучение ЯЭО 49.9% А---------В ------------------ С 1 2 облучение Рис. 2.113. Рассчитанные стационарные ЯЭО Т|А{В} для изолированной трехспиновой системы с близкими межъядерными расстояниями. Стрелка показывает спин, который насыщается. Прямым взаимодействием А-С пре- небрегаем. 448
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 2.26.7. Непрямые эффекты и диффузия спинов В предыдущих примерах расчета ЯЭО в трехспиновых системах мы созна- тельно игнорировали эффект, который наблюдается для ядра С при насы- щении ядра А. Между тем, этот эффект может оказаться совершенно не- ожиданным. На рис. 2.114 показано, какие величины ЯЭО будут наблю- даться на ядрах В и С при насыщении ядра А. Видно, что в этом случае для ядра С наблюдается не возрастание, а снижение интенсивности сигнала, то есть происходит изменение зна- ка ЯЭО. Это эстафетная пере- дача ЯЭО. Она происходит в случае, когда при насыщении ядра А изменяющаяся заселен- ность ядра В, в свою очередь, вызывает изменение заселен- ности ядра С. Данный эффект обусловлен наличием кросс- релаксации между ядрами В и С. Отрицательный ЯЭО ядра С является результатом роста разности заселенностей уров- ней ядра В, вызванного ЯЭО за счет облучения ядра А. Вспом- ним, что в условиях предельно- го сужения линий насыщение одного из сигналов (то есть ЯЭО 25% -12% А-------- В -------- С /\ 1 1 облучение Рис. 2.114. Стационарный трехспиновый эффект. Отрицательный ЯЭО для ядра С возникает из-за непрямого эффекта, ко- торый передается через спин В при на- сыщении спина А. В величину ЯЭО для В вносит свой вклад изменение заселен- ности уровней спина С. Считается, что расстояния между спинами А и В, а так- же В и С одинаковы. уменьшение разности заселенностей соответствующих спиновых перехо- дов) приводит к положительному ЯЭО, поэтому увеличение разности засе- ленностей для В должно приводить к отрицательному ЯЭО соседа, с кото- рым у него есть диполь-дипольное взаимодействие. Такой непрямой эф- фект часто называют трехспиновым эффектом. Его следует отличать от прямого отрицательного ЯЭО, наблюдающегося для молекул с медленным движением. Величина отрицательного трехспинового эффекта чаще всего намного меньше, чем положительные ЯЭО, поскольку она определяется не слишком большим ЯЭО непосредственного соседа. Ее характерной особенностью является более медленное нарастание во времени - для ее появления нужен определенный промежуток времени, поскольку вначале должен возникнуть ЯЭО на ядре В, а уже затем эффект будет перенесен на ядро С (рис. 2.115). Поэтому для наблюдения эстафетного ЯЭО следует применять большой период преднасыщения сигнала. В примерах, которые приведены выше, показаны необычно большие величины ЯЭО, поскольку при расчетах счи- 449
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР талось, что между спинами существует исключительно диполярное взаи- модействие. Экспериментальные ЯЭО чаще всего не превышают 20%, вследствие чего трехспиновые эффекты могут достигать не больше несколь- ких процентов. Наиболее часто они возникают в случаях, когда В и С пред- ставляют собой геминальную диастереотопную пару протонов, рядом с ко- торой имеется еще один протон, который и подвергается насыщению. В этом случае расстояние между ядрами достаточно мало для возникновения эстафетного эффекта. Он возникает также в случаях, когда три спина рас- полагаются приблизительно на одной линии. В этом случае эстафетный эффект можно использовать для констатации именно такого расположения спинов. Рис. 2.115. Динамика роста прямого и непрямого ЯЭО в трехспиновой сис- теме в условиях быстрого движения молекулы. Хотя для эстафетного переноса через 4 спина можно прогнозировать положительную величину, однако с ним приходится иметь дело чрезвы- чайно редко вследствие крайне малой величины такого эффекта. Влияние разных факторов, которые описаны выше, на четырехспино- вую систему иллюстрирует рис. 2.116. Из него вытекает, что для правиль- ной интерпретации наблюдаемых величин ЯЭО нужен анализ всех возмож- ных ЯЭО для исследуемой молекулы. Иначе выводы могут оказаться со- вершенно неверными. Так, если рассматривать ЯЭО на ядрах А и С при насыщении ядра 5, видно, что интенсивность сигналов А и С возрастает практически одинаково, несмотря на разность межъядерных расстояний. Если же насыщать ядро С, то для более удаленного от него ядра D наблю- дается намного больший ЯЭО, чем для более близкого ядра В. Для пра- вильного понимания величин стационарного ЯЭО следует выполнить все 450
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса возможные эксперименты и строить заключения о структуре молекулы толь- ко на основании всего массива полученных данных. Конечно, приведенные на рис. 2.114 аномальные значения ЯЭО во многом определяются тем, что в расчетах мы игнорировали все пути релаксации, кроме диполь-диполь- ного. Однако следует понять, что к полученным величинам ЯЭО всегда следует относиться довольно осторожно. В общем, только в немногочис- ленных случаях измерение ЯЭО для одного протона может дать возмож- ность сделать надежные структурные выводы. Более оправданным подхо- дом является анализ всех возможных величин ЯЭО. ЯЭО ЯЭО -0.4% 1% А-------- В 1 Л 49.9% I ' п облучение - С --------- 49.9% 44.5% — D -16.2% облучение Рис. 2.116. Рассчитанные стационарные ЯЭО в изолированной четырех- спиновой системе с близкими межъядерными расстояниями. Еще сложнее делать стереохимические выводы на основании величин стационарных ЯЭО для молекул с малой скоростью движения. ЯЭО для та- ких молекул отрицательны. В этом случае воздействие непрямых эффектов может оказаться настолько сильным, что полностью скроет зависимость ЯЭО от межъядерных расстояний. Поэтому для изучения таких молекул стационарные методы ЯЭО применяются редко. Этому есть две причины: во-первых, непрямые эффекты в этом случае имеют тот же самый знак, что и первичный ЯЭО, поэтому их невозможно различить; во-вторых, они воз- никают довольно быстро и имеют значительную величину. В предельном случае при достаточном времени насыщения ЯЭО, который вначале возник между двумя ядрами, может распространиться на всю молекулу. Таким об- разом, для всех ядер изменение интенсивности сигналов будет одинаковым (рис. 2.117). Такой перенос ЯЭО с одного спина на всю молекулу называется спиновой диффузией, поскольку она напоминает тепловую диффузию в твердом теле. Наибольшая скорость молекулярного движения, при которой возникает спиновая диффузия, называется границей спиновой диффузии. Наличие спиновой диффузии при отрицательных ЯЭО делает невозможны- ми корреляции величин стационарных ЯЭО с межспиновыми расстояни- ями. Поэтому вместо стационарных ЯЭО для таких молекул изучают ско- 451
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР рость, с которой ЯЭО передается от спина к спину. Это дает возможность делать выводы о том, насколько один спин удален от другого. Для решения таких задач используются методы нестационарного ЯЭО, чаще всего NOESY. Рис. 2.117. Схема процесса спиновой диффузии, в котором генерируется ЯЭО между спинами S и I. Этот эффект в дальнейшем передается на сосед- ние ядра и распространяется на всю молекулу. 2.26.8. Кинетика ЯЭО Начальная скорость нарастания ЯЭО для спина I (dlz/dt) после мгновенной инверсии сигнала спина S линейно зависит от скорости кросс-релаксации, Ois, между этими двумя спинами. Это справедливо даже в том случае, если молекула содержит и другие спины. Таким образом, dlz/dt = 2oISS°z, (2.48) где S°z означает степень инверсии спина S. Коэффициент 2 в этом урав- нении присутствует вследствие того, что происходит инверсия, а не насы- щение спина. Использование уравнений (2.39-2.41), если считать, что для гомоядерной системы <jl>i = 0)s, позволяет для скорости кросс-релаксации (oIS = w2-Wo) получить выражение: nis=Y 6 1 + 4<0qT^ (2.49) 452
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Если подставить это уравнение в предыдущее, то увидим, что в отли- чие от стационарного ЯЭО начальная скорость нарастания нестацио- нарного ЯЭО зависит только от межъядерного расстояния между спи- нами I и S. Спины при этом ведут себя так, как будто бы они являются изолированными. Величина ЯЭО между ними линейно зависит от пери- ода преднасыщения. При дальнейшем росте этого периода для спина I ста- новятся значимыми другие механизмы релаксации, которые конкурируют с кросс-релаксацией между спинами I и S, поэтому кривая отклоняется от линейности и постепенно спадает до нуля (рис. 2.118). Таким образом, для определения начальной скорости нарастания ЯЭО следует использовать времена преднасыщения намного меньшие, чем время продольной релак- сации Ti спина I. Только при этих условиях возможно измерение межъядер- ных расстояний. Рис. 2.118. Схема динамики нарастания ЯЭО между спинами I и S как функция периода преднасыщения. Если же, как это бывает в большинстве случаев, целью исследования является получение максимально возможных нестационарных ЯЭО, то пе- риод преднасыщения или время смешивания в NOESY надо выбирать близким ко времени релаксации Tj. Поскольку нестационарные ЯЭО измеряются в отсутствие постоян- ного дополнительного радиочастотного облучения, они обычно немного меньше стационарных значений. Для положительных ЯЭО максимальная величина ЯЭО уменьшается с 50% до 38%. Поэтому для успеха таких экспе- риментов более важным становится выбор соответствующего периода пред- 453
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР насыщения. Зависимость нестационарных ЯЭО от времени корреляции молекул такая же, как и у стационарных ЯЭО. Максимальные отрицатель- ные нестационарные ЯЭО в случае преобладающего протекания кросс-ре- лаксации равняются -100%. Для молекул, скорость вращения которых от- вечает отрицательным ЯЭО, следует также учитывать влияние на резуль- таты эксперимента эффекта спиновой диффузии. За исключением случаев, когда именно спиновая диффузия является предметом исследования, сле- дует использовать по возможности меньшие периоды преднасыщения. 2.26.9. Измерение межъядерных расстояний В начальный период нарастания ЯЭО, когда рост интенсивности ЯЭО ли- нейно зависит от времени, величина эффекта между спинами А и В через период т пропорциональна скорости кросс-релаксации, оАВ, которая, в свою очередь, обратно пропорциональна шестой степени расстояния между спи- нами: т|а{В} = коАВт = к'глв^т. (2.50) Здесь константы пропорциональности к и к’, кроме известных физичес- ких констант, включают время корреляции молекул, тс, а {В} указывает, ка- кой спин инвертируется. Из формулы следует, что, если известна величи- на тс, то все сомножители, входящие в константы к и к’, можно рассчитать, а следовательно, можно вычислить и величину межъядерного расстояния гАВ. Хотя на основании релаксационных измерений время корреляции и можно определить, однако на практике такой подход к определению межъ- ядерных расстояний используется редко. Чаще известное межатомное рас- стояние используют как стандарт для измерения неизвестного расстояния. Если измерять ЯЭО между ядрами X и Y, расстояние между которыми из- вестно, то можно записать: Па{В}/Пх{¥} = гав-6/гХу'6 (2.51) Таким образом, сравнение двух величин ЯЭО прямо дает неизвест- ное межъядерное расстояние. Данное простое соотношение интенсивно используется для определения межъядерных расстояний, особенно в био- логических системах. Из единичного эксперимента величины межъядер- ных расстояний можно определить только в том случае, если для всех спи- нов выполняется условие начальной скорости нарастания ЯЭО. При этом времена корреляции для всех спинов должны быть одинаковыми. В случа- ях, когда, кроме общего вращения молекулы, имеют место и движения ее 454
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса фрагментов, это может оказаться и не так. Поэтому следует учитывать воз- можность возникновения ошибок в расчетах. Следует также внимательно относиться к понятию межъядерного рас- стояния. В реальных молекулах расстояние между спинами может постоян- но изменяться вследствие конформационных движений. Поэтому в резуль- тате расчетов мы можем получить лишь усредненную величину. Более то- го, при наличии конформационной подвижности вклад конформации с максимально сближенными ядрами может казаться завышенным, по- скольку ЯЭО для такой конформации является намного большим вследст- вие его зависимости от г-6. В общем, величины межъядерных расстояний, которые получены на основании ЯЭО, имеют тенденцию к занижению, что создает пробле- мы для выводов о структуре. Чаще всего такие проблемы возникают для малых молекул, где происходит усреднение конформационных состояний. Поэтому для таких молекул количественное определение межъядерных расстояний выполняется довольно редко. Тем не менее, данный подход оказывается исключительно плодотворным для установления структуры биологических макромолекул, где отсутствуют проблемы усреднения кон- формаций и ошибок в определении интенсивности ЯЭО. 2.27. Перенос поляризации До сих пор при обсуждении эффектов, которые сопровождают использова- ние декаплера, мы затрагивали полное насыщение выбранного сигнала. Для этого мы использовали дополнительное радиочастотное облучение образца полем Bi такой мощности, которая обеспечивала одновременное воздействие на все компоненты мультиплета сигнала, который выбран для насыщения. Однако если уменьшить интенсивность облучения, то оно мо- жет воздействовать не на весь мультиплет, а лишь на один его компонент. Такая ситуация отвечает селективному насыщению определенного энерге- тического перехода. В этом случае наблюдается интересное явление, ко- торое заключается в изменении интенсивностей всех других перехо- дов, которые имеют ССВ с тем, что облучается. Это явление называет- ся переносом поляризации. На начальных этапах развития ЯМР это яв- ление использовалось для изучения связности спинов. Для этого даже была разработана специальная методика, которая называется INDOR. Сейчас, однако, она имеет лишь исторический интерес. Тем не менее, само явление переноса поляризации широко применяется в большинстве новейших экспе- риментов ЯМР. Методы переноса поляризации дают возможность увели- чить интенсивность сигнала за счет обмена заселенностей между ядрами с большим и малым гиромагнитными отношениями. Если перенос поляриза- ции происходит от протонов на ядра X (а такой эксперимент проводят 455
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР наиболее часто), то таким образом происходит увеличение интенсивности сигнала в ун/ух раз. Для понимания физических основ явления переноса поляризации предположим, что имеется система ядер 13С и !Н, между ко- Рис. 2.119. Диаграмма энергети- ческих уровней для двухспино- вой системы *Н-13С. Два перехо- да для каждого ядра отвечают двум линиям в каждом дублете. торыми существует ССВ, причем при- мем, что содержание ядер обоих изо- топов составляет 100%. Энергетическая диаграмма такой системы приведена на рис. 2.119. В тепловом равновесии заселеннос- ти каждого из четырех переходов оп- ределяются распределением Больцма- на. Схематически это показано на рис. 2.120а. Пусть разности заселенностей для протонных и углеродных переходов составляют соответственно 2ДН и 2ДС. Поскольку заселенности линейно зави- сят от у, то 2ДН/2ДС = Ун/Ух = 4. Поэто- му интенсивность сигнала протонов должна быть в 4 раза большей, чем для сигнала углерода (рис. 2.1206). Теперь посмотрим, что произойдет, если селек- тивно инвертировать один из компонентов дублета !Н, например Н1 Сде- лать это можно с помощью слабого селективного 180°-импульса. При этом для соответствующего перехода будет наблюдаться инверсия заселеннос- тей уровней (рис. 2.120в). Поскольку переход Н2 остался невозбужденным, то и разность заселенностей в этом переходе будет такой же, что и без инверсии. Ключевым моментом является то, что в результате инверсии из- менились заселенности обоих углеродных переходов, хотя селективный им- пульс воздействовал на ядра !Н. Так, для С1 разность заселенностей будет составлять -2ДН + 2ДС, а для перехода С2 составлять 2ДН + 2ДС. Таким образом, разность заселенностей, которая сначала наблюдалась для протонов, теперь оказалась перенесенной на ядра углерода. Поскольку величина 2ДН является в 4 раза большей, чем 2ДС, то для С-переходов от- носительные интенсивности будут составлять -3 5. Поэтому, если после такой начальной инверсии компоненты протонного сигнала подать неселек- тивный импульс на частоте атомов углерода, то получим спектр, в котором содержится дублет, одна из компонент которого оказывается инвертирован- ной, причем абсолютная интенсивность каждой из компонент будет боль- шей, чем в одноимпульсном эксперименте на ядрах углерода (рис. 2.120г). Для пары *H-I5N интенсивности компонент сигнала I5N при переносе поля- ризации от протонов составляют +11 и -9 (Yh/Yn = 10), и рост интенсивнос- 456
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ти сигнала будет еще большим. Хотя половина заселенности спина Н ин- вертирована, однако интенсивности компонент протонного сигнала ос- тались неизменными. Поэтому суммарного переноса намагниченности от протонов к углероду не происходит. Интегральная интенсивность всего дублета углерода также не отличается от той, которая имела место до ин- версии. Поэтому можно говорить о дифференциальном переносе поляриза- ции, когда изменяются лишь интенсивности компонент мультиплетов, а не общая интенсивность мультиплета. Рис. 2.120. Перенос поляризации в двухспиновой системе, (а) Заселенности и разности заселенностей для каждого перехода в состоянии равновесия, (б) Спектры, которые получены после возбуждения на ядрах *Н и 13С (см. текст), (в) Ситуация после селективной инверсии половинки протонного дублета, (г) Спектр, который иллюстрирует рост интенсивности сигнала углерода. Описанный выше эксперимент называется селективным переносом поляризации SPT (Selective Population Transfere) или, что более точно для случая инверсии протонного спина, селективной инверсией заселенности SPI. Надо, однако, отметить, что инверсия обоих компонент сигнала протонов не приводит к эффекту SPT. Его вызывает лишь неравновес- 457
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР ное возмущение отдельной линии мультиплета протонов. В экспе- риментах по гетероядерному переносу поляризации в протонном спектре объектом воздействия служат сателлиты основного сигнала, которые свя- заны с расщеплением на углероде. Эффект легко может быть реализован и в гомоядерных системах. При этом его можно обнаружить по изменению интенсивностей компонент спиново-связанного сигнала при насыщении одной из компонент мультиплета его партнера по ССВ. На рис. 2.121 пока- зан результат такого эксперимента. Лучше всего такие изменения видны в разностном спектре. Рис. 2.121. Селективный перенос поляризации (SPT) искажает интенсив- ность протонного мультиплета, если сигнал спиново-связанного партнера насыщается неравномерно (б). Изменения интенсивности лучше видны в разностном спектре (в), полученном путем вычитания из (б) невозмущен- ного спектра (а). Несмотря на возникновение искажений, интегральная интенсивность спиновых мультиплетов в условиях SPT остается неизменной из-за нали- чия эквивалентных отрицательных и положительных вкладов в изменения интенсивностей компонентов сигналов (рис. 2.121в). Наблюдаемые в раз- 458
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ностном спектре изменения интенсивностей похожи на те, которые возни- кают вследствие ЯЭО. Наибольшим ограничением экспериментов SPI является их недоста- точная общность. Одновременно мы можем облучать лишь одну линию в спектре и наблюдать за изменением интенсивности других сигналов. Для исследования данным методом более или менее сложного спектра прихо- дится пошагово насыщать компоненты отдельных мультиплетов, что тре- бует значительных затрат времени. Понятно, что более эффективно было бы насыщать одновременно по одному из переходов в каждом протонном сигнале в одном эксперименте. Эту задачу решает импульсная последова- тельность INEPT, описанная в соответствующем разделе книги. Изменения, которые возникают в спектрах при инверсии определен- ного энергетического перехода, являются следствием важного физического явления, носящего название переноса когерентности. Изменение интенсив- ностей компонентов связанных мультиплетов свидетельствует о том, что изменение заселенности одного из переходов (то есть его возбуждение) распространяется на всю систему спинов, которые имеют с ним общие энергетические уровни. Таким образом, в спиново-связанной системе про- исходит процесс перераспределения энергии. Поскольку сигналы ЯМР свя- заны с возникновением когерентности ядерных моментов в плоскости х-у, то можно говорить, что происходит перенос когерентности с одного пере- хода на другой. Явление переноса когерентности широко используется во многих методиках ЯМР, поскольку противофазная ориентация компонен- тов мультиплетов при определенных обстоятельствах может возникнуть сама собой. Для этого достаточно после подачи возбуждающего импульса выдержать определенное время, которое определяется величиной КССВ (J/2 для дублета). Если в этот момент подать на систему еще один импульс, то он перераспределит намагниченность между всеми возможными перехо- дами, а, кроме того, при этом возникнет также намагниченность, в которой квантовое число в сравнении с равновесным состоянием изменяется мень- ше или больше, чем на 1. Все полученные компоненты намагниченности можно выделить отдельно и получить разнообразные спектры. Как прово- дятся такие эксперименты, станет ясно из дальнейшего обсуждения. 2.28. Динамические эффекты в ЯМР Др сих пор мы говорили о методе ЯМР как о средстве установления строе- ния химических соединений. Однако это не единственная область приме- нения данного метода. Метод ЯМР широко используется для изучения осо- бенностей молекулярных движений. В таких исследованиях часто удается получить совершенно уникальную информацию, которую другими метода- ми получить невозможно. Все молекулы являются частицами, которые на- 459
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР ходится в беспрерывном движении: одни молекулы двигаются относитель- но других, колеблются химические связи в молекулах, вращаются вокруг простых связей функциональные группы, происходят переходы между кон- формациями циклов и т.п. Чаще всего скорость таких движений оказывается очень высокой. Все эти типы движений оказывают влияние на поведение молекул в растворе. Если молекула является биологически активной, то часто ее активность определяется подвижностью определенных фрагмен- тов молекулы. Поэтому изучение внутримолекулярных движений имеет большой практический интерес. Для того, чтобы отдельные состояния мо- лекул можно было изучать с помощью метода ЯМР, скорость их взаимо- превращений должна находиться в определенном интервале. Рассмотрим, с чем это связано. Пусть определенный протон в молекуле может существовать в двух разных химических окружениях А и Б. Поскольку окружение протона определяет его химический сдвиг, то в общем случае можно записать, что протон в состоянии А имеет химический сдвиг 3А, а в состоянии Б - 3Б. медленный обмен промежуточная скорость обмена быстрый обмен Рис. 2.122. Вид сигналов ЯМР при двухпозиционном обмене с равнозаселенными состояни- ями. Если между состояниями А и Б возможен переход, то в зависимости от его ско- рости реализуются три варианта для вида спектра указанного протона. Если переходы между состояниями А и Б в образце происходят значительно медленнее, чем переориентация спинов протонов, то в равновесии одна часть этих протонов (WA) находится в состоянии А и имеет химический сдвиг 3А, а вторая часть (1 - WA) - в состоянии Б с химичес- ким сдвигом 3Б. В спектре при этом бу- дут наблюдаться два узких пика с от- ношением интенсивностей WA/(1-WA). Процессы, которые происходят с такой скоростью, когда для двух возможных состояний протона наблюдаются два от- дельных пика, называются медленными в шкале времени ЯМР (рис. 2.122а). Если процесс перехода между состоя- ниями происходит значительно чаще, чем переориентация ядерных спинов, то за время существования определенного спинового состояния протон Н успевает несколько раз перейти из состояния А в 460
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса состояние Б. Тогда химический сдвиг протона будет промежуточным меж- ду 8д и 8б. В спектре будет наблюдаться один узкий сигнал между пиками с 3А и 8б (спектр ”в” на рис. 2.122). Химический сдвиг этого сигнала рав- няется WA3A + (1 - WA)3B. О процессах, которые происходят со скоростью, при которой наблюдается один усредненный сигнал, отвечающий обоим возможным состояниям протона, говорят, что они являются быстрыми в шкале времени ЯМР. Если скорости переориентации ядерных спинов и перехода между состояниями А и Б близки между собой, то в спектре будет наблюдаться широкий сигнал в промежутке между 3А и 3Б (см. рис. 2.1226). Такую скорость перехода между состояниями А и Б называют промежуточной в шкале времени ЯМР. Итак, вид спектра ЯМР зависит от отношения скорости перехода меж- ду состояниями А и Б и скорости переориентации ядерных спинов. Посколь- ку скорость переориентации ядерных спинов определяется временем их поперечной релаксации, то шкала времени ЯМР - это, в сущности, шкала сравнения скорости хода процесса со временем поперечной ядерной релак- сации. Методом ЯМР можно изучать те процессы, скорости которых с по- мощью нагревания или охлаждения можно сделать промежуточными в шкале времени ЯМР. На практике удается изучать процессы, константы скорости которых лежат в интервале 10"1- 1СГ5 с-1 2.28.1. Типы динамических систем Динамический ЯМР (ДЯМР) объединяет совокупность методик, которые дают возможность изучать динамику процессов внутримолекулярного и межмолекулярного движений. Обычная методика ДЯМР - измерение спект- ров при разных температурах. Температурный интервал выбирают так, что- бы скорость процесса, которую измеряют, в центре интервала или хотя бы вблизи его границ стала промежуточной в шкале времени ЯМР. В методи- ках ДЯМР, в отличие от обычных спектральных измерений, основную ин- формацию дают ширина пиков и величина их температурных смещений. Системы, спектры которых изменяются со временем, или те, для кото- рых при изменении температуры удается обеспечить промежуточную (в шкале времени ЯМР) скорость обмена, называются динамическими. Рас- смотрим основные разновидности динамических систем. Внутримолекулярные перегруппировки и конденсации. В отличие от дру- гих динамических систем системы данного типа изменяются во времени, причем скорость такого изменения зависит от температуры. Процесс изме- нения вещества во времени, как правило, необратим, поскольку он обу- словлен протеканием определенных химических реакций. Для таких дина- 461
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР мических систем уширение сигналов нехарактерно. В них изменяется лишь относительная интенсивность отдельных сигналов - исходные вещества постепенно исчезают, а вместо них образуются продукты химической реак- ции. Скорость таких процессов чаще всего определяют интегрированием - находят интенсивности пиков, которые исчезают или возникают через оп- ределенные промежутки времени. Скорость процесса в этом случае опре- деляется "периодом полуреакции", Ti/2, то есть временем, за которое поло- вина исходного соединения превратится в продукт реакции. Константу ско- рости процесса определяют по формуле: к = т1/2/[с], (2.52) где Ti/2 - период полуреакции, [с] - мольная концентрация вещества. Сле- дует напомнить, что определенная таким методом константа скорости силь- но зависит от температуры. Поэтому, если ее определяют, то необходимо указывать, при какой температуре она определена. Сравнение констант скорости, которые измерены для разных веществ, возможно лишь при ус- ловиях измерений при одинаковой температуре. Методики динамического ЯМР большей частью предназначены для изучения динамических систем второго типа - тех, что обратимо меняются с температурой. Такие системы являются равновесными. Это означает, что можно много раз изменять температуру образца в ту или другую сторону и при каждом таком изменении мы будем получать спектр, который отвечает именно выбранной температуре. Во времени такие спектры не изменяются. Ниже мы приведем несколько разновидностей динамических систем, кото- рые наиболее часто встречаются на практике. Заторможенное внутреннее вращение. На рис. 2.123 приведены экспе- риментальные фрагменты спектра ПМР диметилацетамида, которые содер- жат сигналы протонов диметиламиногруппы. Спектры измерены при раз- ных температурах. При комнатной температуре метильные группы дают два синглета, тогда как при нагревании происходит их слияние. В данном случае изменение спектра обусловлено тем, что вращение вокруг связи N-CO заторможено. В шкале времени ЯМР при комнатной температуре вращение проис- ходит медленно, а при нагревании до 100°С становится быстрым. Затормо- женное вращение часто является следствием сопряжения связей или воз- никновения пространственных препятствий для вращения вокруг простой связи. Такая ситуация возникает в спектрах многих амидов и гидразидов. Поэтому в них можно увидеть признаки динамики. Такие спектры имеют или удвоенный набор некоторых сигналов, или аномальные уширения сиг- налов, которые изменяются с изменением температуры измерения спектра. 462
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Ниже, для примера, на рис. 2.124 приведен спектр одного из гидрази- дов, который измерен при разных температурах. Спектры записаны так, чтобы из них можно было най- ти зависимость ширины сигналов от температуры. На дополнительных развертках спектра показана область поглощения метиленовых протонов при разных температурах. Из спект- ров видно, что совпадение сигналов происходит при 110°С. Ширина сигналов в использованном темпе- ратурном интервале изменяется от 5 до 100 Гц, что вполне достаточно для расчета термодинамических па- раметров обменного процесса. Как вытекает из обзорного спектра, на- блюдается удвоение сигналов всех протонов, которые расположены вблизи гидразидного фрагмента. Расстояние между сигналами мети- леновых протонов двух конформе- ров достигает 0.4 м.д. Рассмотрение интенсивностей сигналов показыва- ет, что в данном случае заселеннос- ти конформеров сильно различаются между собой. Это связано с наличи- ем разных пространственных пре- пятствий в каждом из конформеров. Следует, однако, отметить, что со- отношение конформеров в динами- ческих системах не является посто- янной величиной. Оно часто изме- Рис. 2.123. Вид сигналов диметил- аминогруппы диметилацетамида при температурах от 30°С до 100°С с ша- гом 10 градусов. няется при смене растворителя. Это свойство имеют и гидразиды. Так, рас- сматриваемый спектр в дейтерохлороформе имел бы совсем другое соот- ношение конформеров. Конформационные переходы молекул. Динамическими свойствами обла- дают также циклические соединения, которые могут существовать в виде двух устойчивых конформаций, переход между которыми разделяет более или менее значительный энергетический барьер. Примером таких соедине- 463
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР ний могут служить некоторые семичленные гетероциклы. Один из таких спектров приведен на рис. 2.125. При температуре 35°С в спектре видны два дублета протонов метиленовой группы, что дает право считать переход между конформациями медленным в шкале времени ЯМР. При повышен- ной температуре сигналы уширяются, а потом сливаются в один широкий сигнал. При 150°С он превращается в узкий пик, который отвечает усред- ненному сигналу метиленовых групп двух конформеров (рис. 2.125). Рис. 2.124. Температурная зависимость спектра органического гидразида. Таутомерия. Зависимость от температуры является характерной для спектров соединений, которые существуют в виде смеси таутомеров. Если при комнатной температуре в них наблюдаются сигналы двух таутомерных форм, то при нагревании они сливаются в один общий пик. Положение усредненного пика в спектре определяется величинами химических сдви- гов подвижного протона в отдельных таутомерах и содержанием таутоме- ров в равновесной смеси. Химические сдвиги сигнала в области быстрого обмена можно рассчитать по формуле: 8 = (3АпА + 8БпБ), (2.53) где 8а и 8б - химические сдвиги протонов соответственно таутомеров А и Б‘, пА и пБ - мольные доли таутомеров А и Б. 464
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 2.125. Температурные спектры бензодиазепина. Протонный обмен. Если в состав соединения входят ’’активные" про- тоны, то есть протоны таких групп, как -ОН, -NH2, -СООН и т.п., то сиг- налы этих групп часто уширяются вследствие межмолекулярного протон- ного обмена. Зависимость ширины пиков от температуры носит такой же характер, что и в спектрах, которые описаны выше (см. рис. 2.123), с тем лишь отличием, что в области медленного обмена два отдельных сигнала не возникают, так как в обмене принимают участие одинаковые молекулы. Протонный обмен возможен как между одинаковыми, так и между раз- ными молекулами. Иллюстрацией этому может быть спектр этанола, кото- рый содержит небольшое количество воды (рис. 2.126). При низкой тем- пературе в спектре присутствуют сигналы как воды, так и гидроксильных протонов спирта. Последний сигнал расщеплен в триплет вследствие спин- спинового взаимодействия с протонами соседней метиленовой группы. При повышении температуры оба указанные сигналы дают усредненный пик, лишенный расщеплений. 465
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР а) ОН+Н2О СН2 ...................» » > | 5 4 3 Н2О Рис. 2.126. Спектр этанола при различных температурах. Шкала в обоих спектрах одинакова. 2.28.2. Количественное описание динамических молекул Выше мы дали описание динамических процессов на качественном уровне. Однако эти спектры можно использовать и для того, чтобы определять тер- модинамические параметры процессов молекулярного движения. Такой под- ход позволяет количественно сравнивать воздействие изменений в структуре молекулы на скорость молекулярного движения. Это является основной за- дачей метода ДЯМР. При этом все расчеты основаны на первоначальном определении констант скорости химических процессов по спектрам ЯМР. Для решения этой задачи в общем случае используют связь формы сигнала со временем жизни ядра в разных химических окружениях. Эта связь да- ется уравнениями Блоха, которые описывают форму резонансного сигнала как функцию частоты и времени поперечной спин-спиновой релаксации Т2. Для удобства использования в ДЯМР уравнение Блоха модифицируют та- ким образом, чтобы учесть влияние обменных процессов на время релакса- ции Т2. В результате для формы линии резонансного сигнала g(v) получено такое выражение: g(v) = [(1 + тлД)Р + QRJ/cWp2 + Q2), (2.54) где Р = (0.25Д2 - v2 + 0.255v2)t + Д/4л; Q = [-V - 0.5(рА - Pb)5v]t; R = 0.5(рд - Pb)5v - у(1+2тлД); т = таТб/(та + тБ); тА, тБ - средние продолжи- тельности жизни ядер в окружениях А и Б, соответственно; рА, рБ - моль- 466
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ные доли форм А и Б\ 5v = (бА - vB) - разность резонансных частот ядер в окружениях А и Б, Гц; Д - полуширина сигнала при отсутствии обмена; v - текущая частота, Гц. Как видим, в уравнение (2.54) входят величины, которые можно изме- рять экспериментально, поэтому для каждой заданной продолжительности жизни ядра в окружениях А и Б можно получить теоретический вид спект- ра. В принципе такое построение можно сделать и вручную, однако для это- го необходимо выполнить большой объем расчетов, поэтому задачу чаще всего решают с помощью ПК. Программу составляют так, чтобы компьютер выдавал в графическом виде форму линии ЯМР для заданного пробного набора времен жизни магнитных ядер в окружениях А и Б. В качестве ис- ходных данных при этом задают величины 5v, рА, Рб и Д. Пример результата подобных вычислений приведен на рис. 2.127, где изображен сигнал ПМР группы ]Ч(СНз)2 диметилацетамида. Форма сигнала вычислена по уравне- нию (2.54) для разных температур в случае, когда 5v = 30 Гц, рА = рв = 0.5, Д= 1 Гц. Сравнение полученных таким образом спектров с экспериментальными позволяет определить время жизни магнитных ядер в разных состояниях при всех заданных температурах. Если известны времена жизни ядер в состояниях А и Б, то для процесса КА А Б КБ можно вычислить константу скорости. Для этого существуют такие форму- лы: ТА = т/рБ = 1/КА и ТБ = т/рА = 1 /КБ. (2.55) В случае, если заселенности энергетических уровней в состояниях А и Б одинаковы, пользуются уравнением: ТА = ТБ = 1/К. (2.56) Итак, анализ формы резонансного сигнала дает возможность с по- мощью уравнения (2.54) определить скорость процесса. Важным здесь яв- ляется то, что задачу можно решить как в области быстрого обмена, так и в области промежуточного или медленного обмена. Теперь такой подход к ре- шению проблем динамики молекул наиболее распространен. Имеются мно- гочисленные компьютерные программы для анализа динамических спект- ров ЯМР. Обычно их названия близки к аббревиатуре "DNMR". Для динами- 467
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР ческих исследований можно использовать не только спектры на ядрах 1Н. Если исследуемая молекула содержит атомы фтора, то эксперименты мож- но производить на ядрах 19F. Это может оказаться особенно полезным, по- скольку диапазон химических сдвигов ядер 19F намного больше, чем у про- тонов. Это может дать возможность обнаружить динамику молекул даже тог- да, когда в протонных спектрах видны лишь узкие сигналы, соответству- ющие быстрому обмену. Можно использовать также и спектры на ядрах 13С, однако такие эксперименты требуют намного больше времени. Sv Рис. 2.127. Расчетная форма линии сигнала метильных групп в диметил- ацетамиде для различных времен жизни протона в одинаковом окружении. 468
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 2.28.3. Приближенные методики динамического ЯМР Хотя вычисления с помощью уравнения (2.54) являются наиболее надеж- ными, тем не менее для них необходимо проведение достаточно трудоем- ких экспериментов и использование определенных программ для ПК. В простейших случаях можно обойтись и без этого. Тогда для определения констант скорости обменных процессов используют приближенные форму- лы. Проще всего найти константу скорости при температуре, когда два пика ядер, которые обмениваются, сливаются в один. Процесс слияния пиков называют коалесценцией, а температуру, при которой происходит слия- ние, - температурой коалесценции. При температуре коалесценции спра- ведливо такое уравнение: Ккоал = 7i5vA/2 = 2.225v, (2.57) где Sv - разность химических сдвигов протона в состояниях А и Б при отсутствии обмена, Гц; Ккоал - константа скорости обменного процесса при температуре коалесценции. Использование соотношения (2.57) предполагает одинаковую заселен- ность конформеров или таутомеров в состояниях А и Б. Для оценки констант скорости обмена при температурах, которые от- личаются от температуры коалесценции, используют дополнительное уши- рение сигналов, которое происходит вследствие обменного процесса. Счи- тают, что это обменное уширение, ДОбм, можно определить по формуле: Добм “ Днабл — До» (2.58) где Днабл - ширина сигнала, который наблюдается; До - ширина сигнала при отсутствии обмена. В этом случае в области медленного обмена для константы скорости можно применить уравнение: к = лДобм. (2.59) В области быстрого обмена используют соотношение: к = 4лр2Ар2Б5у2/Добм, (2.60) обозначения в котором те же, что и в уравнении (2.54). 2.28.4. Вычисление термодинамических параметров обменных процессов Если с помощью одного из приведенных выше уравнений определена кон- станта скорости реакции обмена при разных температурах, то с помощью 469
Глава 2. Физические основы экспериментов ЯМР полученных данных можно определить все термодинамические параметры этих процессов. Для этого чаще всего пользуются формулой Аррениуса: Ink = -Ea/RT + InA, (2.61) где k - константа скорости обменного процесса при температуре Т; Еа - энергия активации обменного процесса; А - константа. Для вычисления энергии активации определяют величину к для не- скольких температур и строят график зависимости Ink от 1/RT. В этом слу- чае Еа равняется тангенсу угла наклона полученной прямой, а константа А равняется отрезку, который отсекается этой прямой на оси абсцисс. Вели- чины энтальпии активации, АН*, и энтропии активации, AS*, можно найти соответственно по формулам: АН* = Еа - RT, AS* = R[ln(hA/kBT) - 1], (2.62) (2.63) где Т - абсолютная температура; R - универсальная газовая постоянная (8.31 Дж/(К моль)); кв - постоянная Больцмана (1.381-1(Г23Дж/К); h - по- стоянная Планка (6.626-10-34 Дж-с). По известным величинам АН* и AS* можно определить свободную энергию активации обменного процесса: AG* = АН* - TAS*. (2.64) 470
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР В данной главе учебника будут описаны основные эксперименты ЯМР, ко- торые используются для установления строения химических соединений. С практическим использованием некоторых из них мы уже знакомы из пер- вой главы учебника. Однако здесь мы обратим внимание не столько на при- менение, сколько на их физические основы. Будут описаны также модифика- ции различных методик, расширяющие границы их применения. Освоение данного материала позволит читателю более грамотно планировать экспе- римент ЯМР и использовать именно те методики, которые приведут к ре- шению поставленной задачи наиболее быстро. 3.1. Измерение 7} с помощью последовательности инверсия-восстановление Релаксация магнитных ядер является важным физическим явлением, кото- рое связано с особенностями молекулярного движения. Поэтому для многих физико-химических исследований весьма полезно знать численные вели- чины времени релаксации каждого из магнитных ядер молекулы. Отличия времени релаксации отдельных ядер могут свидетельствовать об анизотро- пии вращения молекулы, особенно, если измерения проводятся на ядрах 13С. Как мы уже знаем, общее время релаксации магнитного ядра состоит из двух слагаемых - времени продольной и времени поперечной релакса- ций. Для быстро движущихся молекул эти времена часто одинаковы. Одна- ко бывают случаи, когда в силу особенностей молекулярного движения время поперечной релаксации может существенно сокращаться. Поэтому бывает полезно измерять оба этих параметра. Для этого уже давно разрабо- таны специальные импульсные последовательности. Здесь мы опишем важ- нейшие из них. Существует много различных экспериментов, которые позволяют опре- делить время продольной релаксации ядерных спинов. Мы обсудим лишь метод инверсии-восстановления, который используется наиболее широко. Сначала будут описаны основы метода, а потом детали его практического применения. Эксперимент инверсия-восстанов- ление является простой двухимпульс- ной последовательностью, показанной на рис. 3.1. В соответствии со своим названием первичное возбуждение заселенностей осуществляется путем инверсии, то есть Рис. 3.1. Последовательность ин- версия-восстановление. 471
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР действием 180°-импульса. Вектор намагниченности, который сначала был расположен вдоль оси +z, под воздействием такого импульса проходит че- рез плоскость х-у и, двигаясь дальше, ориентируется вдоль оси -z. Посколь- ку намагниченность вдоль оси z наблюдать невозможно, степень ее измене- ния определяется путем перевода вектора в плоскость х-у подачей 90°-им- пульса через заданные периоды времени, т (рис. 3.2). Рис. 3.2. Процесс инверсии-восстановления. При коротких периодах вос- становления вектор намагниченности направлен вдоль оси -z и спектр ос- тается инвертированным, а при длинных периодах восстановления спектр становится положительным и интенсивность сигналов последовательно возрастает. Если т = 0, то есть второй импульс подается сразу же после первого, то вектор намагниченности в плоскости х-у после выполнения импульсной последовательности будет иметь максимально возможную амплитуду. По- скольку действием 90°-импульса вектор намагниченности перебрасывается к оси -у, а не к оси +у, как это было бы при подаче единственного импуль- са 90°х, то фаза сигнала оказывается смещенной на 180° относительно сиг- нала поглощения. Это приводит к тому, что при малых величинах интер- вала т сигналы оказываются отрицательными. Повторение эксперимента с возрастающими величинами т позволяет наблюдать процесс восстановле- ния намагниченности после ее первичной инверсии (рис. 3.3). В случае, когда т оказывается достаточно продолжительным (т > 5Tj), происходит полная релаксация. При этом регистрируется максимальный положительный сигнал. Интенсивность наблюдаемой намагниченности, Mt, подчиняется соотношению: Mt = M0(l-2e-vr'), (3.1) где Мо отвечает равновесной намагниченности, которая наблюдается при бесконечном т. Множитель 2 в данном уравнении присутствует для того, чтобы учесть начальную инверсию намагниченности и соответствующее удвоение времени процесса релаксации. Время релаксации находят мето- дом наименьших квадратов путем подгонки экспериментальных интенсив- 472
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ностей сигналов, найденных для разных т, под значения, которые рассчита- ны с помощью данного уравнения. Алгоритмы таких расчетов имеются в математическом обеспечении большинства спектрометров ЯМР. Более ста- рый метод определения Ti заключается в построении графика зависимости ln(Mo - Mt) от т. Наклон этого графика отвечает 1/Tj. Рис. 3.3. Эксперимент инверсия-восстановление показан на примере спектра а-пинена 3.1. Была использована задержка между импульсами в диапазоне от 5 мс до 20 с. Для каждого сигнала показаны найденные величины Ть Они рассчитаны на основании пиковых интенсивностей, как описано в тексте. Применяют также более быстрый метод определения Ть который тоже основывается на инверсии-восстановлении. Основой метода является оп- ределение момента, когда сигнал, который релаксирует, проходит через плоскость х-у и равняется нулю, так называемый т0. Эта ситуация отвечает моменту, когда разность заселенностей энергетических уровней ядра рав- няется нулю (Mt = 0). Исходя из предыдущего уравнения можно записать: То = Тг1п2 или Т1=т0/1п2= 1.443т0. (3.2) (3.3) Таким образом, процедура сводится к проведению эксперимента при т = 0 и настройке фазы спектра на сигнал чистого отрицательного поглоще- ния. После этого через интервалы времени, большие, чем 5ТЬ эксперимент 473
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР повторяется с заданными инкрементами для т и неизменными фазовыми коэффициентами до тех пор, пока сигнал не уменьшится до нуля. Посколь- ку нет потребности повторять эксперимент до полного восстановления равновесных заселенностей, то его общее время значительно уменьшается. Большой проблемой методов, которые описаны выше, является то, что перед экспериментом необходимо располагать некоторыми сведениями о величинах Ть поскольку в ином случае инкременты т будут выбраны не- правильно и точность эксперимента будет недостаточной. Следует также отметить, что перед каждым новым значением т необходимо вводить ре- лаксационный промежуток, достаточный для полного установления равно- весия. Если же используется накопление нескольких сканов, то и перед каждым из них также следует вводить тот же релаксационный промежуток. Поэтому для разбавленных образцов эксперимент может потребовать мно- го времени. При проведении релаксационных измерений лучше учитывать известные закономерности для величин Ti разных ядер и типов молекул. Это позволит провести эксперименты более быстро. 3.2. Измерение Т2 с помощью последовательности спинового эха Время поперечной релаксации Т2 включает два слагаемых - одно из них представляет собой истинное время релаксации образца. Оно зависит от релаксационных свойств самого образца. Второе слагаемое отвечает неод- нородностям магнитного поля, в которое помещен образец. Часто ширина сигналов в спектре определяется именно данным вкладом в релаксацию. Настройка однородности поля (шиммирование) приводит к уменьшению вклада неоднородности поля и к сужению сигналов. Практический смысл имеет только измерение истинного времени релаксации. Его измерение можно осуществить, если исключить вклад в релаксацию неоднородности магнитного поля. Этого можно достичь с помощью последовательности спинового эха (рис. 3.4). От описанного выше метода инверсии-восстанов- ления данная импульсная последовательность отличается порядком подачи импульсов. Здесь вначале подается возбуждающий 90°х-импульс, а затем - 180°х-импульс. Рис. 3.4. Последовательность спинового эха. Сбор данных начинается че- рез время т после инвертирующего импульса. 474
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Для того, чтобы представить себе, как последовательность спинового эха уничтожает неоднородности магнитного поля, вообразим, что исследу- емый образец разделен на микроскопические области, в пределах каждой из которых неоднородность поля отсутствует. Векторы намагниченности ядер в таких областях будут иметь одинаковые частоты прецессии. При действии последовательности спинового эха векторы намагниченности в одних областях за время периода т двигаются с опережением, а в других за это время немного отстают в зависимости от величины локального магнит- ного поля. Эта ситуация показана на рис. 3.5. Рис. 3.5. Рефокусировка с помощью спинового эха векторов намагничен- ности, расфазированных неоднородностью магнитного поля. Для простоты на рисунке показаны всего два вектора, которые отве- чают двум областям с постоянным магнитным полем. Отстающий вектор обозначен знаком а опережающий - знаком ”4-”. 180°х-импульс повора- чивает векторы вокруг направления оси х. После этого в конце следующего периода т более быстрый вектор сойдется с более медленным в момент прохождения через ось -у. Если в этот момент начать сбор данных, то получим такой сигнал ССИ, как будто неоднородностей поля в пределах образца не существует. Таким образом, спиновое эхо рефокусирует в плос- кости х-у расфазировку векторов, связанную с неоднородностью магнитно- го поля. Рефокусировку сигнала под воздействием спинового эха можно наблюдать экспериментально. Для этого достаточно несколько изменить схему эксперимента, показанного на рис. 3.6. Если начать сбор данных сразу же после подачи возбуждающего импульса и следить за формой интерфе- рограммы, то видно, что через период т наблюдается спад сигнала свобод- ной индукции практически до нуля (рис. 3.6а). Однако если в этот момент, не прекращая сбора данных, подать 180°-импульс, то амплитуда интерфе- рограммы снова начнет возрастать. Максимум будет наблюдаться через пе- риод т. Однако за период 2т происходит также и некоторая потеря фазовой когерентности, которая связана с естественной поперечной релаксацией. Она не рефокусируется с помощью спинового эха. Поэтому наблюдается спад намагниченности в соответствии со временем естественной попереч- ной релаксации Т2, не зависящей от неоднородности поля. Это хорошо вид- 475
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР но, если во время сбора данных приложить несколько 180°-импульсов, ко- торые отстоят один от другого на периоды 2т (рис. 3.66). Рис. 3.6. Экспериментальное наблюдение спинового эха. (а) Сбор данных был начат немедленно после возбуждающего 90°-импульса. При действии 180°-импульса происходит рефокусировка намагниченности и соответст- венно восстанавливается интенсивность ССИ, связанная с потерей коге- рентности из-за неоднородности поля, (б) Серия спиновых эхо отражает истинную релаксацию Т2 (пунктирная линия). Для определения Т2 можно провести эксперимент, в котором измеря- ются спектры после действия на образец последовательности спинового эха. Для каждого из спектров период т последовательно возрастает. В ре- зультате получим серию спектров, в которых амплитуда сигналов спадает в соответствии с релаксацией ядер образца за период т. Если построить зави- симость амплитуды сигналов от длительности периода т аналогично тому, как это было описано выше для метода инверсия-восстановление, то мож- но вычислить время поперечной релаксации. Однако такой подход следует применять с определенной осторожностью, поскольку для его успеха необ- ходимо, чтобы во время действия всей последовательности не происходило 476
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса перехода спинов из одной области с постоянным магнитным полем в дру- гую. Если во время действия последовательности происходит диффузия спинов между соседними областями, то они попадают в немного отличное магнитное поле, вследствие чего полная рефокусировка для них наблю- даться не будет. При росте т такие диффузионные потери возрастают и по- лученные релаксационные данные становятся менее достоверными (этот метод лежит в основе измерения молекулярной диффузии в растворе). Более целесообразно использовать метод определения величин Т2, ко- торый минимизирует эффекты диффузии. Он заключается в повторении последовательности эха в рамках одного эксперимента. В этом случае мож- но получить множественные эхо при малых т. Спад этих эхо дает временную константу Т2. Эта последовательность называется последовательностью Карра-Парсела (рис. 3.7а). Рис. 3.7. Последовательности спинового эха для измерения времени ре- лаксации Т2 (а) Карра-Парсела и (б) Карра-Парсела-Мейбаума-Жилла (CPMG). При действии этой последовательности эхо при каждом рефокуси- рующем импульсе создается поочередно вдоль осей +у и -у. Потери, свя- занные со спиновой диффузией, возникают за период 2т. Если этот период мал по сравнению со скоростью диффузии (обычная величина т составляет 100 мс), эти потери становятся настолько малыми, что ими можно прене- бречь. Для больших задержек сигнал эха ослабляется в связи с многократ- ным повторением фрагмента т-180-т. Проблемой данного метода является то, что в нем недопустимы отклонения импульса от 180°, поскольку при этом неточности рефокусировки накапливаются от импульса к импульсу. Поэтому применяется улучшенная схема эксперимента, известная как ме- тод Карра-Парсела-Мейбаума-Жилла (CPMG) (рис. 3.76). По этой схеме после возбуждающего импульса 90°х происходит подача инвертирующих 477
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР импульсов 180°^. Рефокусировка при этом для каждого эха происходит по оси +у. При этом ошибки не накапливаются, а имеют постоянную величи- ну для каждого нечетного эха и уничтожаются для каждого четного эха (рис. 3.8). Рис. 3.8. Действие последовательности CPMG при несовершенстве им- пульсов. Если 180°-импульс оказывается на а° меньше, чем нужно, то век- торы намагниченности при его действии расположатся выше (обозначено знаком "+") и ниже (обозначено знаком плоскости х-у. Если эхо пов- торяется, ошибка устраняется, поскольку следующий 180°-импульс имеет такую же погрешность. Таким образом, для точного определения времени релаксации Т2 следует использовать четные эхо. После первичного возбуждения 90°-импульсом через период т проис- ходит расфазировка намагниченности вследствие наличия неоднородности магнитного поля. Как и раньше, ее можно проиллюстрировать двумя век- торами, один из которых движется быстрее, а второй - медленнее (рис. 3.8а). После воздействия инвертирующего импульса, угол которого на а° отлича- ется от 180°, один из векторов окажется ниже плоскости х-у (рис. 3.86). Во время последующего периода т направление движения векторов изменится на противоположное, и в конце этого периода векторы окажутся макси- мально сближенными с осью у. Однако один из векторов будет расположен выше этой оси, а второй - ниже нее (рис. 3.8в). Такая ситуация возникает после первого спинового эха и всех последующих нечетных эхо. Видно, что в этом случае неточность рефокусировки оказывается одинаковой. При 478
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса действии второго инвертирующего импульса, который имеет такое же отклонение от 180°, что и первый, векторы намагниченности снова оказы- ваются в плоскости х-у (рис. 3.8д) и через период т совпадут на оси +у. Та- ким образом, после второго и всех четных эхо происходит полная компен- сация дефектов инвертирующего импульса. Та можно получить, если провести серию экспериментов с возраста- ющей величиной 2тп (п возрастает от эксперимента к эксперименту) и в каждом случае производить сбор данных от последнего четного эха. При- менение последовательности CPMG показано на рис. 3.9 для образца, со- держащего линии разной ширины. Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu Рис. 3.9. CPMG спектры пентапептида 3.2 в ДМСО. Очень быстрый спад слабопольного сигнала амидного протона происходит из-за его участия в быстром химическом обмене с водой, вследствие чего сигнал сильно уши- рен. Числа отвечают длительности периода 2тп. Здесь можно видеть более быстрый спад интенсивности сигналов ши- роких линий, которые имеют меньшие величины Тг. С точки зрения совре- менной спектроскопии ЯМР величины Тг не слишком информативны. Они в большей степени зависят от межмолекулярных взаимодействий, чем от структуры молекулы. Поэтому чаще их используют в физико-химических исследованиях. В этом случае обычно получают температурную зависи- мость Тг. Вид этой зависимости позволяет делать выводы о механизмах ре- лаксации и процессах межмолекулярного обмена. Для практических целей Тг используется для определения параметров импульсных последователь- ностей, зависящих от релаксации. Однако для этого достаточно находить величины Тг*, которые, как показано выше, можно определить непосредст- 479
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР венно из ширины пиков. Поскольку эти величины отвечают скорости спада поперечной намагниченности, то они и определяют возможную продолжи- тельность многоимпульсного эксперимента до того момента, как сигнал полностью исчезнет. 3.3. Использование различий в величинах Т2 для редактирования спектров При изучении полимерных материалов бывают случаи, когда образец одно- временно содержит макромолекулы и молекулы малого размера. При этом у таких молекул могут существенно различаться величины Т2. В спектре это проявляется как присутствие узких сигналов малых молекул на фоне широких сигналов полимера. Одна из интересных методик применения спинового эха основана на использовании большой разницы времен попе- речной релаксации разных частиц. Если разность Т2 оказывается достаточно большой, то с помощью по- следовательности CPMG можно уменьшить интенсивность сигналов ком- понентов, которые релаксируют быстро, и получить спектр только того компонента, который релаксирует медленно (рис. 3.10). а) ______аА Д Ди j г,г........Г'1'.1.....Г.г^,гп,-,^г.,|..!........................................! 2.5 2.3 2.1 1.9 1.7 1.5 1.3 м.д. Рис. 3.10. Т2 фильтр, (а) Широкий сигнал полистирола 3.3 (М.м. = 50000) в смеси с камфорой, (б) Результат, полученный в результате действия после- довательности CPMG. При этом в спектре остаются только сигналы малых по размерам молекул камфоры. Время задержки т составляло 1.5 мс, эхо было повторено 150 раз для того, чтобы суммарный период релаксации составлял 450 мс. 480
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Таким образом, появляется возможность редактирования спектра смеси в зависимости от молекулярной массы составляющих компонентов. Такой подход широко используется при анализе биологических жидкостей для исключения из спектра неинформативных интенсивных сигналов таких ве- ществ, как липиды и протеины. Аналогичным методом можно селективно ослабить в спектре интен- сивный сигнал воды, если уменьшить время релаксации ее протонов (то есть уширить ее сигнал) до величин, значительно меньших, чем у раство- ренных веществ. Этого можно достичь с помощью добавления к раствору подходящего парамагнитного релаксационного реагента, который включа- ет воду в свою гидратную оболочку, или реагента, который ускоряет про- тонный обмен. С этой целью используются хлорид аммония и гидроксил- амин. Результат показан на рис. 3.11 для спектра пептида аргининвазопрес- сина в 90%-ной воде. ”1—'—'—'—’—I—’—’——'—I—'——'—'—I—— 5 4 3 2 м.д. Рис. 3.11. Ослабление сигнала растворителя методом WATR. (а) Одномер- ный протонный спектр раствора восстановленного аргининвазопрессина в смеси 90% HjO + 10% D2O, pH = 2.75 поддерживается с помощью 0.2 М раствора NH2OH. (б) Тот же образец, записанный с последовательностью CPMG с суммарной задержкой 235 мс. Данный метод ослабления сигнала растворителя называется WATR (water attenuation by transverse relaxation). Несмотря на впечатляющие ре- зультаты, метод имеет ограниченное применение. 481
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР 3.4. 1D градиентный NOESY Мы уже упоминали раньше о том, что одной из популярных методик не- стационарного ЯЭО является методика NOESY-1D. Несмотря на то, что ее название близко к соответствующей двумерной методике, это совершенно самостоятельный эксперимент, который использует специфическую им- пульсную последовательность. При применении он дает результаты, кото- рые очень похожи на те, которые можно получить с помощью разностной спектроскопии, однако он требует меньше времени. Кроме того, спектры NOESY-1D лишены артефактов вычитания, которые характерны для раз- ностных спектров. Сегодня наиболее распространен эксперимент, основанный на двухим- пульсном градиентном спиновом эхе, DPFGSE (рис. 3.12). Рис. 3.12. Схема импульсной последовательности эксперимента NOESY-1D, основанная на селективном возбуждении с градиентным отбором. Этот эксперимент позволяет селективно рефокусировать намагничен- ность выбранного спина, в то время как другие сигналы остаются расфа- зированными и в спектре не наблюдаются. Последовательность начинается с неселективного 90°-импульса, который переводит в поперечную плос- кость векторы намагниченности всех протонов. Дальше в последователь- ности содержатся два элемента градиентного спинового эха, которые пред- ставляют собой комбинацию селективного 180°-импульса на протонах и двух градиентных импульсов, которые подаются до и после селективного импульса. Действие первого из градиентов фрагмента градиентного эха приводит к полной расфазировке всей намагниченности, которая существу- ет в поперечной плоскости. Селективный импульс избирательно инверти- рует компоненты намагниченности, которые отвечают сигналу, служащему источником ЯЭО. Следующий градиентный импульс, который точно соот- ветствует предыдущему, рефокусирует эту намагниченность. Таким об- разом, имеем эффект селективной рефокусировки избранного сигнала 482
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса при полной расфазировке всех других. Второй элемент градиентного спинового эха используется для более полной расфазировки всех сигналов и более точного выделения из спектра избранного сигнала. В нем исполь- зуются два одинаковых градиента, которые отличаются по амплитуде от предыдущих. Это делается, чтобы сделать невозможным рефокусировку намагниченности, которая была расфазирована предыдущим спиновым эхом. Следующий 90°-импульс располагает выбранный вектор намагничен- ности вдоль оси -z, что приводит к нарастанию ЯЭО на протяжении после- дующего периода смешивания, тт. Существенным отличием от экспе- риментов ЯЭО, обсуждавшихся ранее, является то, что в данном случае за время периода смешивания тт возникают лишь сигналы ЯЭО, а все исход- ные сигналы оказываются расфазированными и в спектре не проявляются. Дополнительный чистящий импульс Gm используется для удаления из по- перечной плоскости остаточных компонентов намагниченности. На насы- щаемый сигнал этот импульс не влияет, поскольку он в момент подачи им- пульса расположен вдоль оси -z. После обычной выборки получаем спектр, где присутствуют только инвертированный сигнал, который облучается се- лективным импульсом, и сигналы ЯЭО, появившиеся в результате его на- сыщения. Получение разностного спектра при этом излишне. Таким обра- зом могут быть получены спектры высокого качества, которые не содержат дефектов разностной спектроскопии. Это является весомым преимущест- вом перед описанными ранее методами. Данная методика оказывается также довольно быстрой, поскольку отпадает необходимость продолжительного накопления сигнала для усреднения артефактов вычитания. Оптимальным в этом случае оказывается также и динамический диапазон приемника. Релаксационные процессы, которые имеют место во время периода тт, вызывают постепенное уменьшение намагниченности. Это приводит к то- му, что градиентные импульсы воздействуют на несколько неодинаковые состояния спиновой системы. Результатом релаксации может явиться не- желательная фазировка компонентов намагниченности, вследствие чего в конечном спектре с небольшой интенсивностью могут проявиться все име- ющиеся сигналы. Для того, чтобы интенсивность таких сигналов была как можно меньшей, в импульсную последовательность вводится один или два 180°-импульса (одновременно с градиентными чистящими импульсами). Поскольку данные импульсы инвертируют имеющиеся в плоскости х-у компоненты намагниченности, то после их действия интенсивность сигна- лов под влиянием релаксации какое-то время стремится к нулю. Показано, что для малых молекул и молекул среднего размера, когда продолжитель- ность периода смешивания составляет около 500 мс, для удаления фоновых сигналов достаточно во время тт подавать один 180°-импульс, который ин- вертирует намагниченность. Если же продолжительность периода смеши- вания составляет 1.5 с, то следует подавать два таких импульса. 483
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР Для расщепленных под действием ССВ сигналов, как и в случае экспе- риментов по стационарному разностному ЯЭО, могут возникать артефак- ты, связанные с эффектом SPT. Большим преимуществом градиентного подхода является возможность наблюдать с его помощью дальние ЯЭО. В разностных экспериментах такие эффекты или не проявляются, или их не- возможно наблюдать в присутствии артефактов вычитания. Типичный ре- зультат такого эксперимента для малого бициклического лактама 3.4 при- веден на рис. 3.13. Селекция каждого сигнала осуществлялась с помощью селективного Гауссового 180°-импульса продолжительностью 40 мс. Во время периода смешивания продолжительностью 800 мс подавались два не- селективных 180°-импульса. Каждый спектр является результатом накоп- ления на протяжении 12 мин сигнала образца массой 10 мг. Спектры с ус- пехом можно использовать для качественных стереохимических выводов. Наблюдаемые в спектрах сигналы вызваны ЯЭО и SPT-артефактами. Рис. 3.13. Селективный 1D градиентный NOESY спектр бициклического лактама 3.4, записанный с периодом смешивания 800 мс. Спектр (а) пред- ставляет собой обычный одномерный спектр. Спектры (б) и (в) - два вари- анта насыщения сигналов. Сильный геминальный ЯЭО для сигнала Н4'-Н4 в спектре (в) для сохранения масштаба рисунка был усечен. 484
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 3.5. ЯЭО в ВСК Наибольшей проблемой экспериментов ЯЭО является существование об- ласти нулевой кросс-релаксации, когда (ОоТс = 1. При этом как стационарные, так и нестационарные ЯЭО оказываются близкими к нулю. Чаще всего такая ситуация наблюдается для молекул среднего размера с массами в диапа- зоне 1000-2000 Дальтон. Нулевые ЯЭО могут также явиться результатом ассоциации меньших молекул. Величина диапазона нулевой кросс-релакса- ции зависит от вязкости растворителя и частоты спектрометра, поэтому область нулевой кросс-релаксации может реализоваться и для молекул меньшего размера. Поскольку в лабораториях синтезируется все больше многоатомных молекул, то они все чаще составляют предмет исследования химиков, и возникает потребность в изучении их ЯЭО. С тем, чтобы для таких молекул не выполнялись условия нулевой кросс-релаксации, следует измерять их спектры на приборах с большей напряженностью магнитного поля, однако измерение спектров на таких приборах оказывается очень до- рогим. Поэтому спектрометры с очень большой напряженностью поля все еще мало распространены. Единственный доступный способ анализа таких систем - это искусственное устранение условий нулевой кросс-релак- сации. Этого можно достичь, проводя измерение ЯЭО во вращающей- ся системе координат. Измерение ВСК-ЯЭО требует немного специфического эксперимен- тального подхода. Данный эффект возникает, когда вектор намагниченнос- ти фиксируется в плоскости, перпендикулярной направлению магнитного поля, а не вдоль поля. Поэтому его иногда называют поперечным ЯЭО. Для генерирования необходимого возмущения заселенностей избранного спина на его сигнал воздействуют селективным 180°-импульсом. После этого подается неселективный 90°-импульс. Поэтому общий угол поворота избранного спина составляет 270°. Вследствие этого он оказывается инвер- тированным в плоскости х-у относительно всех других спинов. После пода- чи этих двух импульсов поперечная намагниченность ’’замораживает- ся” в ВСК с помощью продолжительного импульса низкой мощности. Такой импульс, как мы уже знаем, называется ’’спиновым замком" Спино- вый замок используется для предотвращения эволюции химических сдви- гов. Простейшая схема последовательности для одномерного эксперимента ВСК-ЯЭО приведена на рис. 3.14. Чаще этот эксперимент проводят в дву- мерном варианте. Тогда его называют ROESY (rotating frame NOE spectro- scopy). Таким образом, при действии спинового замка на протяжении всего периода тт эволюции химических сдвигов не происходит. О спинах, находящихся под воздействием спинового замка, говорят, что 485
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР их магнитные моменты в этот период заперты в ВСК, в данном случае вдоль оси +у (рис. 3.15). Рис. 3.14. Основная схема для наблюдения ЯЭО в ВСК. ВСК-ЯЭО развива- ется на протяжении длинного импульса спинового замка, который пред- ставляет собой период смешивания, тт. спиновый замок Рис. 3.15. Векторы удержива- ются вдоль оси у длинным ра- диочастотным импульсом. О таких векторах говорят, что они заперты в ВСК. Ситуацию, которая возникает во вре- мя действия спинового замка, можно представить в виде поперечного эквива- лента процессов, которые происходят во время периода смешивания в нестацио- нарном ЯЭО (рис. 3.16). Действие спинового замка заключа- ется в сохранении на длительное время противоположной ориентации вектора на- магниченности ядра, сигнал которого ин- вертируется, и векторов намагниченности других спинов. При отсутствии спиново- го замка такая ориентация быстро теряет- ся из-за процесса эволюции химических сдвигов. Таким образом, возникает воз- можность возникновения ВСК-ЯЭО за счет процессов кросс-релакса- ции в поперечной плоскости. В этом случае релаксация спинов определя- ется временной константой Т1р (= Т2). Отличием от обычного ЯЭО является то, что в поперечной плоскости статическое магнитное поле Во не воз- действует на векторы намагниченности, которые находятся в поперечной плоскости. Таким образом, при использовании спинового замка силь- ное статическое магнитное поле Во заменяется намного более слабым радиочастотным полем Вь При этом динамика нарастания ЯЭО соответ- ственно изменяется. В то время, как уВ0 составляет сотни мегагерц, yBj равно всего нескольким килогерцам. Поэтому уВ0 » уВь а значит CDj (час- тота ВСК) « (Do. Вследствие этого <jl>iTc « 1 для всех реальных величин тс и молекулы ведут себя так, как будто они находятся в условиях пре- дельного сужения линий. Поэтому все ВСК-ЯЭО являются положитель- ными, знак непрямых эффектов совпадает со знаком прямого эффекта. 486
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса нестационарный ЯЭО Рис. 3.16. Эксперимент ЯЭО в ВСК можно представить как эквивалент эксперимента нестационарного ЯЭО для поперечной намагниченности. В обоих случаях создается ситуация, когда выбранный спин (Ms) и все ос- тальные спины (Mi) ориентируются антипараллельно. Для ЯЭО в ВСК (ROE, ВСК-ЯЭО) скорость кросс-релаксации для го- моядерных спинов задается уравнением: <*is ж Y4 ^ + 2 1 + соХ (3.4) В отличие от соответствующего уравнения для нестационарного ЯЭО это выражение остается положительным для всех значений тс. Поэтому ВСК-ЯЭО имеют бесспорные преимущества для анализа молекул с произ- вольными скоростями молекулярного движения. Для малых молекул вели- чина ВСК-ЯЭО отвечает величине нестационарного ЯЭО, а для больших молекул она может достигать 68%, но никогда не приближается к нулю (рис. 3.17). Аналогично, скорость роста ЯЭО и ВСК-ЯЭО для малых моле- кул одинакова, а для больших молекул эти скорости существенным обра- зом различаются. Для малых молекул, когда (DqTc « 1, как уравнение (3.4), так и (2.49) упрощаются до формулы (3.5): О ос 6 (3.5) Поэтому величины ЯЭО и ВСК-ЯЭО для таких молекул одинаковы. В отличие от этого для больших молекул, для которых CDoTc » 1, множитель в скобках уравнений (3.4) и (2.49) становится настолько малым, что им можно пренебречь, что дает: 487
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР _ЯЭО “Y4tc „ -ВСК-ЯЭО _ 2у4Т( nis ж—— И QIS ris или (3.6) r,6s —ВСК-ЯЭО _ о_ЯЭО nis -“2ais Поэтому для больших молекул ВСК-ЯЭО нарастает вдвое быстрее, чем ЯЭО и имеет противоположный знак. Рис. 3.17. Зависимость ВСК-ЯЭО (ROE) и нестационарного ЯЭО для изо- лированной гомоядерной двухспиновой системы от скорости молекуляр- ного движения lOg(CDoTc). Несмотря на наличие явных преимуществ, для спектров ВСК-ЯЭО воз- никает и ряд экспериментальных осложнений. Главное из них то, что во вре- мя действия спинового замка происходит перенос когерентности TOCSY (смотри ниже). Кроме того, сигналы могут ослабляться внерезонансными эффектами. Таким образом, анализ спектров ВСК-ЯЭО может сопровож- даться еще большими трудностями, чем интерпретация обычных спектров ЯЭО, поэтому такие измерения следует проводить только подготовленным специалистам. 488
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 3.6. TOCSY в одном измерении Спиновый замок используется еще в одном интересном эксперименте, который называется TOCSY-1D. Этот эксперимент предназначен для ана- лиза сложных спектров ЯМР. Он основан на том свойстве спинового зам- ка, что во время его действия происходит эффективное перераспреде- ление намагниченности возбужденного спина со всеми спинами, кото- рые имеют с ним ССВ. При этом перераспределение происходит даже тогда, когда величины КССВ имеют практически нулевые значения. Глав- ным условием является то, чтобы спины имели общий энергетический уро- вень. Таким образом, эксперимент можно осуществить так, чтобы возбу- дить исключительно одну спиновую систему соединения. Для этого доста- точно селективно возбудить лишь один из сигналов, который принадлежит выбранной спиновой системе. Поскольку даже в наиболее сложных спект- рах практически каждая спиновая система имеет хотя бы один сигнал, который расположен в спектре отдельно от других, то его насыщение при- ведет к избирательному появлению в TOCSY-спектре сигналов, которые имеют с ним спиновую связь. Другие сигналы, которые содержатся в спект- ре, не возбуждаются и в спектре отсутствуют. Общая схема эксперимента, которая основана на использовании спи- нового замка MLEV-17, показана на рис. 3.18. Эксперимент начинается с селективного возбуждающего 90°-импульса, частота которого соответству- ет выбранному сигналу. Сразу после возбуждения выбранного спина вклю- чается спиновый замок, который осуществляет перенос его намагничен- ности на другие протоны спиновой системы. Рис. 3.18. Основная последовательность для селективного TOCSY-1D. Для возбуждения заданного сигнала, с которого осуществляется перенос намаг- ниченности, может быть использован любой селективный 90°-импульс. Единственными сигналами, которые появляются в полученном таким образом спектре, оказываются те, на которые перенесена намагниченность возбужденного спина. Эксперимент дает 1D подспектр для спиновой сис- темы молекулы, к которой относится возбуждаемый сигнал. При этом дос- тигается упрощение спектра, поскольку исчезает перекрывание сигналов, которые принадлежат к различным спиновым системам. Получение таких 489
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР спиновая система А спиновая спектров является также удобным методом для быстрого установления зависимости вида спектра от продол- жительности периода смешивания, а значит и определения пути переноса намагниченности вдоль цепи спинов. На рис. 3.19 приведен TOCSY-1D спектр соединения 3.5. Рис. 3.19. Одномерные TOCSY спектры различных спиновых систем сое- динения 3.5 в СбО6. Возбуждение одного из сигналов в каждой спиновой системе дает возможность отнести в спектре ее сигналы. Селективное воз- буждение было достигнуто методом скульптурного возбуждения со вре- менем смешивания 150 мс и спиновым замком MLEV-17. Видно, что при селективном насыщении одного из протонов в каждой спиновой системе молекулы удается получить подспектр, который содер- жит только сигналы данной спиновой системы. Интенсивность сигналов в подспектрах может быть уменьшена для сигналов, удаленных от облуча- емого сигнала. Такой подход довольно эффективен при изучении спектров олигосахаридов, которые имеют аномерный протон в слабом поле. Насы- щение этого протона позволяет записать раздельно все протонные сигналы каждого из сахаридных остатков. 490
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 3.7. Лантаноидные сдвигающие реагенты (ЛСР) В 1969 г. Хинкли К., а вскоре Сандерс Дж. и Уильямс Д. установили, что хелаты (Р-дикетонаты) лантаноидов вызывают в спектрах ЯМР многих ор- ганических соединений сильные смещения сигналов и это ведет к значи- тельному упрощению спектров ПМР. Например, добавление дикетонатов европия(Ш) и празеодима(Ш) (Еи(ФОД)з и Рг(ФОД)з) к растворам гепти- лового спирта 3.6 в ССЦ приводит к изменениям в спектре, показанным на рис. 3.20. В отсутствие лантаноидного хелата отдельно в спектре наблюда- ются лишь сигналы гидроксильной и ближайшей к ней метиленовой групп. Другие сигналы имеют структуру, которая не поддается интерпретации. Рис. 3.20. Спектры ПМР гептилового спирта 3.6: а) при обычных условиях, б) при добавлении Еи(ФОД)з, в) при добавлении Рг(ФОД)з. При добавлении Еи(ФОД)з или Рг(ФОД)з к раствору гептилового спир- та сигналы всех неэквивалентных протонов спирта наблюдаются отдельно, причем европиевый реагент смещает сигналы в слабое поле, а празеодимо- вый - в сильное. Сильнее всего смещается сигнал гидроксильного протона. Величины индуцированных реагентами сдвигов достигают 30 и более м.д. С отдалением протонов от гидроксильной группы индуцированные сдвиги уменьшаются, то есть сдвиги имеют ярко выраженный избирательный ха- рактер. Сдвиги сигналов сопровождаются лишь небольшим уширением, что дает возможность наблюдать мультиплетную структуру в ’’растянутых” 491
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР спектрах и выгодно отличает лантаноидные реагенты от других парамаг- нитных комплексов (например комплексов Со и Ni, которые тоже вызыва- ют смещение сигналов ЯМР, но одновременно и их сильное уширение). Все сказанное стало причиной широкого использования лантаноидных реа- гентов для упрощения спектров ЯМР и изучения строения органических соединений особенно в тот период, когда многоимпульсные ЯМР-экспери- менты еще не имели большого распространения. Сейчас все лантаноидные хелаты, используемые для модификации спектров ЯМР, называют лантано- идными сдвигающими реагентами (ЛСР). В процессе изучения большого количества хелатов лантаноидов было найдено несколько комплексов, которые вызывают максимальные смеще- ния сигналов при наименьшем их уширении. Они нашли широкое практи- ческое применение в спектроскопии ЯМР. Эти хелаты содержат остатки енольных форм следующих 0-дикетонов: дипивалоилметан (ДПМ) трифторметилоксиметилен- камфора (ТФК) 1,1,1,2,2,3,3-гептафтор-7,7-ди метил октан- дион-4,6 (ФОД) гептафторбугирилоксиметилен- камфора (ГФБК) Последние два р-дикетона содержат асимметрические атомы углерода, что дает возможность изучать с их помощью хиральные соединения. Вмес- то европия и празеодима в состав ЛСР могут входить атомы иттербия. ЛСР, которые содержат атомы других лантаноидов, используются намного реже из-за сильного уширения сигналов. Воздействие ЛСР на спектры ЯМР определяется наличием у атомов лантаноидов неспаренных электронов, которые имеют значительный маг- нитный момент. Образование связи ЛСР с донором пары электронов - суб- стратом - обусловлено координационной ненасыщенностью этих атомов в хелатах. Типичное координационное число атомов лантаноидов равняет- ся 8, а в молекулах ЛСР задействованы лишь 6 валентностей. Поэтому, ес- ли к раствору субстрата (электронодонорное органическое соединение А) добавить порцию ЛСР, то устанавливается равновесие: ЛСР + А ЛСР : А. 492
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса В результате образуются вторичные комплексы (аддукты), которые можно рассматривать как соли кислоты Льюиса (ЛСР) и основания Льюиса (молекулы субстрата А). Неспаренные f-электроны атома лантаноида име- ют значительный магнитный момент, его ощущают магнитные ядра ад- дукта. Вследствие этого происходит изменение положений сигналов ЯМР магнитных ядер соединения А на определенные величины, которые назы- вают лантаноидными индуцированными сдвигами (ЛИС). Влияние атома лантаноида на магнитные ядра молекулы А может происходить по двум ме- ханизмам, которые напоминают механизмы прямого и непрямого спин- спинового взаимодействия. Контактное (Ферми) взаимодействие состоит в переносе спиновой плотности с атома лантаноида по цепи химических связей. Эффективность такого переноса определяется характером химических связей в цепи, кото- рая разделяет атом лантаноида и магнитное ядро. Повышение прочности связи и рост ее порядка часто увеличивают контактные сдвиги. Поэтому контактный механизм дает большой вклад в ЛИС сигналов ядер 13С в аро- матических соединениях. Для спектров !Н контактные сдвиги имеют зна- чение только для протонов, расположенных на расстоянии 1-2 химических связей от атома лантаноида в аддукте. Псевдоконтактное взаимодействие состоит в воздействии через про- странство магнитного момента неспаренного электрона иона лантаноида на магнитные ядра субстрата. Величину псевдоконтактного (диполь-ди- польного) взаимодействия можно вычислить по уравнению Мак-Коннела- Робертсона: Д'пск = [Ci(3cos20i - 1) + C2sin20iXcos2(Pi]ri3, (3.7) где г, 0, ф - сферические координаты i-ro ядра относительно иона ланта- ноида, который находится в начале координат, а полярная ось совпадает с главной магнитной осью аддукта ЛСР-субстрат, то есть связью Ln-X; Ci и С2 - константы, одинаковые для всех магнитных ядер аддукта. Как видно из уравнения (3.7), величины псевдоконтактных сдвигов Д’пск определяются, прежде всего, удаленностью i-ro ядра от иона ланта- ноида в аддукте. При локализации i-ro ядра вблизи главной магнитной оси аддукта величинами углов 0 и (р можно пренебречь. Тогда уравнение су- щественно упрощается: Д‘пск = К/гЛ (3.8) где К - константа, одинаковая для всех магнитных ядер аддукта. Уравнение (3.8) используется для полуколичественной оценки величин ЛИС. 493
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР 3.7.1. Типы соединений, которые можно изучать методом ЛСР Для того, чтобы в спектрах ЯМР исследуемого вещества (субстрата) при добавлении ЛСР индуцировались достаточно большие смещения сигналов, соединение должно удовлетворять определенным требованиям. Во-первых, оно должно раствориться хотя бы в одном из таких растворителей, как тет- рахлорид углерода, хлороформ, хлористый метилен, бензол или ацетонит- рил. Другие органические растворители, которые используются в спектро- скопии ЯМР, сами по себе эффективно взаимодействуют с ЛСР и потому непригодны для таких исследований. Во-вторых, соединение должно иметь функциональные группы, способные к координации с электроноакцеп- торной молекулой ЛСР, которая обладает свойствами жесткой кислоты Льюиса. Чаще всего такие группы содержат атомы с одной или несколь- кими неподеленными парами электронов. Эффективная координация ЛСР происходит с соединениями, которые являются жесткими основаниями Льюиса, то есть такими, которые содержат функциональные группы: -ОН, -NH-, -NHR, -COR, COOR (R = Н, Aik), -SO- -РО-, а также атом азота пиридинового типа и эпоксидный атом кислорода. Мягкие основания Льюиса (меркаптаны, сульфиды, фосфины) и сильные акцепторы (-NO2, -SO2) с ЛСР не реагируют. Эффективность координации с ЛСР может сильно уменьшаться при наличии пространственных препятствий возле электронодонорной функ- циональной группы. Например, 2-метилтиазол 3.7 эффективно взаимодей- ствует с Еи(ДПМ)з, тогда как 2,4-диметилтиазол 3.8 с ним практически не реагирует. 3.7 2-метилтиазол 2.0 Н3С 0.3 Н СН3 1.8 Еи(ФОД) 3.8 2,4-диметилтиазол з Индуцированные лантаноидом сдвиги сигналов ЯМР имеют место исключительно в аддукте. С увеличением количества ЛСР мольная доля аддукта в растворе возрастает, следовательно, возрастают и величины ЛИС. Поэтому наблюдается линейная зависимость ЛИС от соотношения ЛСР/субстрат. Чтобы сравнивать величины ЛИС магнитных ядер разных соединений, находят удельные ЛИС - индуцированные сдвиги сигналов ЯМР в миллионных долях при соотношении ЛСР/субстрат =1 1. Обычно их рассчитывают с использованием ЛИС, найденных для нескольких соот- ношений ЛСР/субстрат. Для рассмотренных выше тиазолов на формулах возле соответствующих атомов водорода или групп, которые его содержат, 494
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса приведены именно удельные величины ЛИС. Видно, что если сигналы про- тонов 2-метилтиазола 3.7 смещаются при добавлении ЛСР на несколько миллионных долей, то для 2,4-диметилтиазола 3.8 индуцированные сдвиги сигналов оказываются на порядок меньшими. Разработан также метод изучения с помощью ЛСР олефинов и арома- тических углеводородов. Хотя они сами и не реагируют со сдвигающим реагентом, однако образуют аддукты с солями и комплексами серебра, на- пример Ag(OOfl). Наиболее эффективным сдвигающим реагентом для этих классов углеводородов оказался AgEu(OOfl)4. ЛСР можно также использовать для изучения органических солей, по- скольку анионы также могут быть эффективными центрами координации с ЛСР. Лучше всего координация Еи(ФОД)3 происходит с таким органичес- ким анионом, как иора-толуолсульфонат (тозилат), с метилсульфатом и хлоридом. В данном случае координационный центр (анион) расположен на некотором расстоянии от катиона, поэтому пространственные препятствия в катионе почти не влияют на эффективность координации с ЛСР. Это дает возможность изучать соединения, которые в виде оснований с ЛСР не взаи- модействуют или взаимодействуют плохо. Иллюстрацией этому являются величины ЛИС при добавлении Еи(ФОД)3, найденные для 2,4,6-триметил- пиридина (коллидина) 3.9 и тозилата 3.10. 0.6 3.9 2,4,6-триметилпиридин (коллидин) 2.4 1.4 3.10 1,2,4,6-тетраметилпиридиния тозилат 3.7.2. Использование ЛСР для упрощения спектров ЯМР При измерении спектров ЯМР сложных органических соединений часто бывает так, что сигналы многих типов протонов поглощают в узкой облас- ти, образуя сложный неразрешенный мультиплет. Определить химические сдвиги и КССВ для сигналов отдельных протонов в этом случае непосред- ственно из спектра не удается. Если соединение растворяется в неполярных растворителях и содержит электронодонорные функциональные группы, применение ЛСР является методом упрощения сложного спектра. Рассмот- рим методику использования ЛСР на конкретном примере. На рис. 3.21 изображен фрагмент спектра ароматических протонов производного хро- мона 3.11. 495
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР Рис. 3.21. Фрагмент спектра ароматических протонов производного хромо- на 3.11 без ЛСР и при добавлении Еи(ФОД)з. Как видно из рисунка, сигналы ароматических протонов фенильного заместителя образуют сложный мультиплет в области 6.9-7.1 м.д. Сделать отнесение пиков, то есть найти химические сдвиги и КССВ части сигна- лов, в таком спектре невозможно. Добавление к раствору порции ЛСР - Еи(ФОД)з - дает возможность получить спектр, в котором все сигналы на- блюдаются раздельно. Теперь по их мультиплетности можно провести от- несения сигналов. Из формулы соединения видно, что наиболее близко к координационному центру (карбонильный атом кислорода) находится про- тон 5-Н. Соответственно, его сигнал должен смещаться под действием ЛСР сильнее всего. Поэтому слабопольный дублет в спектре (сильно уширен- ный) принадлежит именно этому протону. Сигналы других ароматических протонов смещаются значительно меньше вследствие своей большей уда- ленности от координационного центра. Окончательные выводы о принад- лежности сигналов тем или иным протонам делают на основании анализа изменений, которые происходят в спектрах в процессе добавления ЛСР с учетом уравнения (3.8). 496
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 3.7.3. Определение химического строения молекулы с помощью ЛСР Поскольку сдвиги, индуцированные ЛСР в протонных спектрах органи- ческих молекул, имеют преимущественно псевдоконтактную природу, то между ними и строением аддукта ЛСР-субстрат существует достаточно строгая математическая зависимость, которая описывается уравнением Мак-Коннела-Робертсона (3.7). Если в этом уравнении пренебречь вторым членом, вклад которого чаще всего является небольшим, то выражение для сдвига сигнала i-ro протона будет иметь вид: А‘пск = K(3cos20i - 1)/гД (3.9) где обозначения величин те же, что и в полном уравнении (3.7). Это же самое уравнение можно сокращенно записать в виде: AincK = Kri, (3.10) где i - номер протона в соединении, Г; - геометрический фактор - обозна- чает (3cos20i - 1)/г3;. Если принять, что для одного из протонов, например первого, A'i1Ck = 1, то система уравнений для всех протонов будет иметь вид: AincK/A1ncK = ri/r1, (3.11) где i - номер протона в соединении. Эта система уравнений наиболее удобна для расчетов, так как в ней от- сутствует один неизвестный параметр - константа К, в вычислении кото- рой нет особой потребности. Решение системы дает возможность найти рас- положение иона лантаноида в аддукте. Следует отметить, что аналитичес- кого решения этой системы нелинейных трансцендентных уравнений не су- ществует, поэтому приходится эту задачу решать численно с помощью ПК. Смысл таких расчетов сводится не столько к тому, чтобы определить, где и с какой вероятностью находится ион лантаноида в аддукте, сколько к тому, чтобы подтвердить или опровергнуть ту или другую гипотезу о гео- метрическом строении молекулы субстрата. Если эта гипотеза правильная и положение магнитных ядер в ней отвечает экспериментальным ЛИС, то компьютер найдет удовлетворительное, с химической точки зрения, распо- ложение иона лантаноида в аддукте относительно центра основности и магнитных ядер субстрата. Наоборот, если гипотеза о геометрии молеку- лы субстрата ошибочна, то удовлетворительное решение системы уравне- ний (3.11) не будет найдено. В этом случае вычисленные ЛИС будут плохо 497
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР коррелировать с экспериментальными или найденная длина связи X-Ln бу- дет иметь аномальное значение. В некоторых случаях расчет оказывается излишним. Это касается си- туаций, когда необходимо методом ЛСР сделать выбор между двумя изу- ченными изомерными молекулами. Вывод о структуре изомера особенно облегчается, если ЛСР эффективно реагирует лишь с одним из изомеров. Как пример можно привести структуры производных гетероциклического соединения изоиндоло[1,2-а]бензимидазола 3.12а, Ь, которые легко разли- чить методом ЛСР: 3.12а 3.12b Исходя из спектров ПМР этих соединений без ЛСР надежный выбор той или иной структуры сделать невозможно, поскольку спиновые системы изомеров не отличаются одна от другой. Добавление Еи(ФОД)з приводит к изменению спектра лишь одного изомера - 3.12а. Причина такого избира- тельного взаимодействия с ЛСР заключается в разном пространственном окружении центра основности в этих соединениях (атома азота при двой- ной связи). В изомере 3.12b вблизи этого центра содержится объемистая метильная группа, которая препятствует координации с ЛСР. Во втором изомере пространственные затруднения значительно меньше, что дает воз- можность молекуле образовывать координационную связь с ЛСР. 3.7.4. Использование ЛСР для выявления хиральности Хиральные ЛСР (формулы см. выше) с успехом применяются для изучения оптически активных соединений. При этом чаще всего решаются задачи нахождения соотношения энантиомеров в смеси или выявления хиральнос- ти соединения. Оптически активные ЛСР, как и обычные, образуют аддукты с основаниями Льюиса. Однако если основание Льюиса тоже является хи- ральным, то в аддукте будут содержаться уже, как минимум, два центра хиральности. Поэтому такие аддукты являются смесью уже не энантио- меров, а диастереомеров, в которых в отличие от энантиомеров величины ЛИС различаются. Если хиральный субстрат представляет собой рацемат, то при наличии ЛСР происходит расщепление сигналов: синглеты приоб- ретают вид дублетов, дублеты дают дублеты дублетов и т.п. Обычно рас- щепление тем больше, чем ближе протон или группа протонов располо- 498
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса жены к хиральному центру молекулы. Интегрирование расщепленных сиг- налов дает возможность определить соотношение энантиомеров в исход- ной смеси. Если в хиральном субстрате один из антиподов преобладает, то расщепленные сигналы имеют интенсивности, которые отвечают составу смеси энантиомеров. Это дает возможность определить оптическую чисто- ту продуктов после разделения рацемических смесей. Для примера на рис. 3.22 приведен спектр ПМР одного из гетероцик- лических аналогов изофлавона 3.13. Рис. 3.22. Спектр ПМР аналога изофлавона 3.13 (0.8 моль), а) При наличии 0.5 моль оптически активного ЛСР - Еи(ГФБК)3; б) при обычных условиях. Звездочкой обозначен сигнал ЛСР. Это соединение хирально вследствие ограниченного вращения вокруг связи, которая соединяет гетероциклические фрагменты, и является смесью атропоизомеров. Каждый из них, реагируя с хиральным ЛСР, образует диастереомерный аддукт, что хорошо видно по спектрам ЯМР. При добавлении Еи(ГФБК)3 расщепляются сигналы всех метильных групп и даже некоторых ароматических протонов (рис. 3.22). Особенно сильное расщепление пиков диастереомеров происходит при охлаждении раствора до -10°С —20°С. Расстояние между ними в этом случае может достичь 1.5 м.д. Этот эксперимент подтверждает отсутствие свободного вращения вокруг связи между гетероциклическими фрагментами данной молекулы. 499
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР 3.8. Подавление сигнала растворителя Большинство растворителей, которые применяются для измерения спект- ров ЯМР, достаточно доступны в дейтерированном виде. Их применение позволяет получать спектры, не искаженные мощным сигналом раствори- теля, находящегося в большом избытке относительно растворенного ве- щества. В отличие от этого, большинство молекул, интересных для биохи- мии и медицины, а также биологических макромолекул приходится изучать в воде. Поскольку в большинстве случаев необходимо, чтобы в спектре присутствовали также и сигналы активных протонов, приходится приме- нять для измерений недейтерированную воду, содержащую 10% D2O для дейтериевого лока. Разница мольных концентраций воды и растворенного вещества сос- тавляет 104-105, вследствие чего возникают значительные эксперименталь- ные трудности, которые связаны с необходимостью уменьшения интенсив- ности сигнала растворителя. Подавление сигнала растворителя необходимо и в современных методиках ЯМР-хроматографии, где для удешевления эксперимента применяются недейтерированные растворители. Сильный сиг- нал растворителя может присутствовать также при обычных измерениях гиг- роскопичных веществ или кристаллогидратов в растворах D2O или MeOD. В этом случае остаточный сигнал воды может во много раз превышать ин- тенсивность сигналов растворенного вещества и представлять собой проб- лему для выбора оптимальной величины усиления приемника. Принципиальной причиной необходимости подавления сильных сиг- налов растворителя при наличии намного более слабых сигналов раство- ренного вещества является ограниченный диапазон интенсивностей сигна- лов, который может быть корректно воспринят приемником и аналого- цифровым преобразователем. Кроме того, интенсивные сигналы искажают нулевую линию, приводят к ti-шуму в двумерных спектрах и появлению паразитных сигналов. В общем случае, перед тем как проводить подав- ление сигнала воды, нужно, чтобы этот сигнал имел правильную форму. Поэтому необходимо прецизионное шиммирование прибора, если возмож- но, то с помощью процедуры градиентного шиммирования. Качество спект- ра повышается, если удалить из образца микроскопические пузырьки воз- духа, которые часто присутствуют в водных растворах. Сделать это можно с помощью ультразвукового перемешивания. Целью подавления сигнала растворителя является уменьшение ампли- туды его сигнала, перед тем как сигнал поступит на приемник. Огромное количество работ, посвященных данному вопросу, свидетельствует о том, что задача является совсем нетривиальной. Подходы к ее решению, кото- рые используются наиболее широко, можно разбить на две группы: 500
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса - методы насыщения сигнала воды; - методы, препятствующие возбуждению сигнала воды. В следующих разделах приведены примеры использования данных под- ходов, которые стали особенно популярными. Однако они не охватывают все известные методы. Все схемы подавления приводят к уменьшению интенсивности сигна- лов, которые расположены вблизи сигнала растворителя. Для того, чтобы такие сигналы все же наблюдались, необходим тщательный подбор усло- вий эксперимента, в простейшем случае - изменение температуры образца. Этот подход наиболее эффективен при изменении спектров в водных раст- ворах вследствие сильной температурной зависимости сигнала воды. Та- ким образом, вследствие сдвига сигнала воды относительно сигналов раст- воренного вещества удается избежать потери сигналов (рис. 3.23). I—•—।—1—।——।—1—।—•—I——।—•—।—'—।—•—।—•—Г" 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 Рис. 3.23. Температурная зависимость HDO (сигнал частично насыщен). Сдвиги отвечают приблизительно 5 Гц/К при 500 МГц. Спектры измере- ны относительно внутреннего стандарта TSP. 3.8.1. Преднасыщение Простейшим, наиболее надежным и широко применяемым методом подав- ления сигнала растворителя является преднасыщение. Фрагмент преднасы- щения легко вводить в различные эксперименты ЯМР, в результате его действия сигнал растворителя удаляется из спектра, а сигналы, частоты ко- торых отличаются от частоты преднасыщения, остаются практически неиз- 501
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР менными. Метод основан на применении постоянного слабого радиочас- тотного облучения на частоте растворителя до того, как будет произведено возбуждение остальных сигналов и сбор данных (рис. 3.24а). В результате сигнал растворителя оказывается эффективно насыщенным и в спектре не наблюдается (рис. 3.25). Для сигналов, расположенных вблизи сигнала растворителя, также наблюдается некоторая потеря интенсивности. Ее можно уменьшить путем снижения мощности преднасыщения, однако при этом сигнал воды может оказаться подавленным не полностью. Увеличе- ние периода преднасыщения улучшает подавление, но увеличивает время эксперимента. Поэтому для периода преднасыщения выбирают компро- миссное значение, равное чаще всего 1-3 с. Оптимизация эксперимента производится методом проб и ошибок. Если имеется такая возможность, то и для преднасыщения и для последующих импульсов на протонах следует использовать один радиочастотный канал. 0 Рис. 3.24. Схемы подавления растворителя, которые базируются на пред- насыщении: (а) только преднасыщение, (б) NOESY-1D, (в) FLIPSY. Особенностью простого преднасыщения протонированных растворов (в особенности с использованием более старых датчиков, где катушки в недостаточной степени экранированы) является наличие в спектре интен- сивных бугров вблизи подавляемого сигнала, связанных с периферийными областями образца, где имеются неоднородности Во и Bj. Эффективный способ их подавления заключается в использовании так называемой после- 502
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса довательности преднасыщения NOESY, которая представляет собой по- следовательность NOESY-1D с нулевым временем смешивания или первый инкремент NOESY-2D с тт = 0 (рис. 3.246). Обычный для NOESY фазовый цикл подавляет искажения, однако применение такой последовательности затрудняется тем, что в ней используются 90°-импульсы, которые не явля- ются оптимальными для интегрирования спектра. Недавно опубликована усовершенствованная разновидность данной методики, называемая FLIPSY (flip-angle adjustable one-dimensional NOESY) (рис. 3.24в), в которой можно применять произвольный угол импульсов. Эта последовательность лучше всего подходит для рутинной работы. Рис. 3.25. Преднасыщение растворителя (в течение 2 с) дает возможность в спектре (б) увидеть сигнал при 4.75 м.д., который маскируется сигналом HDO в спектре (а). Принципиальным недостатком всех схем преднасыщения является то, что они, вследствие процесса переноса насыщения, приводят к подавлению сигналов активных протонов. В некоторых подходящих случаях путем мо- дификации физического состояния растворов (температура, pH) удается за- медлить обмен настолько, что сигналы будут подавляться в меньшей сте- пени, однако такой подход не является универсальным. Методы, описан- ные ниже, в значительной степени устраняют данный недостаток. 3.8.2. Нулевое возбуждение Второй общий метод состоит в том, чтобы возбуждение сигнала раствори- теля было нулевым. В этом случае используемая импульсная последова- тельность возвращает намагниченность, связанную с растворителем, к на- правлению +z, в то время как все другие компоненты намагниченности переводятся в поперечную плоскость. 503
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР 3.8.3. Прыжок с поворотом Для понимания принципа нулевого возбуждения рассмотрим простейший пример, называемый ’’прыжок с поворотом”, использующий последова- тельность 90х-т-90_х. От нее ведут свое начало и другие последовательнос- ти, которые служат для этой цели. Частота передатчика устанавливается соответствующей сигналу растворителя. Первый жесткий 90°-импульс пе- ремещает всю намагниченность в поперечную плоскость. Во время после- дующего промежутка т (его длительность составляет несколько сотен мик- росекунд) все векторы вращаются в поперечной плоскости в соответствии Рис. 3.26. Вычисленные профили воз- буждения для последовательности ’’прыжка с поворотом” (а) и биноми- альных последовательностей (б) 1-1 и (в) 1-3-3-1 (объяснение этих обо- значений будет дано ниже в тексте). Последовательность "прыжка с пово- ротом” использует т = 250 ps, а бино- миальная последовательность исполь- зует т = 500 ps. с величинами своих химических сдви- гов, за исключением сигнала раство- рителя, вектор которого во вращаю- щейся системе координат положения не меняет. Поэтому намагниченность сигна- ла растворителя под действием вто- рого 90°-импульса возвращается к направлению +z. Перед вторым им- пульсом в плоскости х-у существуют ±х компоненты всех векторов намаг- ниченности. Их интенсивность зави- сит от разности химических сдвигов сигналов и сигнала растворителя. Эта зависимость имеет вид синусоидаль- ной функции (рис. 3.26а). Максималь- ная амплитуда возбуждения наблю- дается для сигналов, отстоящих от сигнала растворителя на ±1/4т Гц, причем для сигналов, расположенных по разные стороны от сигнала раство- рителя, знак сигналов будет различ- ным (из-за ±х ориентации векторов), однако без дополнительных фазовых искажений. На практике такая прос- тая схема эксперимента дает слиш- ком малую область нулевого возбуж- дения, поэтому в спектре могут при- сутствовать остаточные сигналы раст- ворителя. Вследствие этого чаще при- меняются более сложные последова- тельности. 504
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 3.8.4. Биномиальные последовательности В предыдущем параграфе была рассмотрена простейшая схема экспери- мента, который позволяет удалить из спектра сигнал, который совпадает с несущей частотой импульса. Как мы видели, для этого достаточно подать два противофазных импульса, разделенных некоторым промежутком вре- мени. Данные импульсы можно обозначить 90х-т-90_х. Оказывается, что в случае, если на систему ядерных спинов подавать не два, а большее число импульсов, разделенных промежутком т, то можно достичь такого же ре- зультата, но увеличить область нулевого возбуждения. Преимуществом та- кого подхода является то, что можно влиять на область возбуждения путем изменения угла импульсов в такой последовательности. Можно подобрать такую комбинацию импульсов, чтобы суммарный результат их воздейст- вия на сигнал, совпадающий с несущей частотой импульсов, не приводил к его возбуждению, а все другие сигналы возбуждались достаточно эффек- тивно. Наибольшее распространение приобрели так называемые биноми- альные импульсы, в которых угол действия для центральных импульсов является наибольшим, а в направлении периферии импульсной последова- тельности он спадает. Название импульсов происходит от коэффициентов бинома Ньютона, с которыми коррелируют углы воздействия импульсов. Для них разработана сокращенная запись, в которой угол импульса обозна- чается цифрой, а изменение знака фазы импульса обозначается путем под- черкивания (или надчеркивания) соответствующей цифры. Предполагается, что суммарный угол воздействия всей последовательности распределяется по индивидуальным импульсам пропорционально цифрам в обозначении последовательности. Так, для биномиального импульса 1-1 с суммарным действием 90° длительность каждого из составляющих импульсов будет по 45° Если же суммарное воздействие биномиального импульса равно 180°, то каждый из двух составляющих импульсов будет иметь угол воз- действия в 90°. Биномиальные последовательности позволяют увеличить область ну- левого возбуждения и сделать эксперимент менее чувствительным к не- совершенству прибора. Последовательность может иметь вид 1-1, 1-2-1, 1 -3-3-1, •••> где числа означают относительные продолжительности им- пульсов, каждый из которых отделен промежутком т. Величина данного промежутка выбирается такой, чтобы за время его действия вектор намаг- ниченности мог переместиться на 180°. Подчеркивание означает, что фаза импульса инвертирована. Для спинов, которые не совпадают с частотой им- пульса, действие отдельных импульсов в максимуме возбуждения склады- вается. Поэтому, например, 90°-возбуждение при действии последователь- ности 1-1 достигается в результате действия импульсов 45х-т-45_Л. В груп- 505
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР пе биномиальных последовательностей наилучшей является последова- тельность 1—3—3—1. В этой последовательности сумма коэффициентов для вложенных импульсов равна 8(1 + 3 + 3+ 1). Поэтому угол, приходящийся Рис. 3.27. Траектория вектора намагниченности при работе би- номиальной последовательное - ти 1-3-3-1. Показана для спина с отклонением от частоты пере- датчика на +1/2т Гц относитель- но максимума возбуждения. на биномиальный коэффициент "1", составляет 90°/8 = 11.25°. Вследствие своей симметрии эта последователь- ность наименее чувствительна к несо- вершенству импульса. Траекторию дви- жения спинов, частоты которых не сов- падают с частотой импульса, при дейст- вии такой последовательности, настро- енной для суммарного импульса в 90°, можно показать в сферических коорди- натах (рис. 3.27). Здесь во время подачи импульса вектор намагниченности дви- жется вдоль меридиана сверху вниз, а во время промежутка т - в горизон- тальной плоскости. Во время каждого периода т спины в ВСК вращаются на половину оборота, вследствие чего эффект действия про- тивоположных по фазе импульсов явля- ется аддитивным и вектор намагниченности с каждым шагом приближа- ется к поперечной плоскости. Как и раньше, вектор растворителя, который совпадает с частотой передатчика, остается неподвижным, поэтому он просто делает ряд колебаний и, в конце концов, оказывается на "Северном полюсе". Поскольку максимальное возбуждение происходит на расстоянии ±1/2т Гц от частоты передатчика, следующие нули функция имеет при ±п/т (n = 1, 2, 3,... соответственно циклам эволюции за время т). Поэтому т сле- дует выбирать таким, чтобы исключить возбуждение вне выбранного диа- пазона частот. Профили возбуждения последовательностей 1-1 и 1-3-1 показаны на рис. 3.266, в. Видно, что возбуждение неодинаково для разных сигналов. Это накладывает определенные ограничения на количественные измерения, кроме того, как и раньше, сигналы, которые расположены по разные стороны от сигнала растворителя, оказываются инвертированными. При использовании данной последовательности степень ослабления сигна- ла растворителя может достигать 1000. Для того, чтобы в конечном спектре все сигналы имели вид сигналов поглощения, можно спектр подвергнуть определенной математической обработке - представить его в виде абсо- лютных значений. При этом все сигналы будут иметь положительный знак. 506
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса При использовании биномиальной последовательности для увеличения продолжительности каждого из импульсов может понадобиться дополни- тельное ослабление мощности передатчика. Это необходимо для того, что- бы наиболее короткие импульсы были не меньше 1 мкс. Для того, чтобы суммарный угол поворота спина биномиальной последовательностью имел нужную величину, следует тщательно настраивать угол минимального им- пульса. Результат применения современной методики удаления из спектра сигнала воды показан на рис. 3.28. Рис. 3.28. Подавление растворителя по схеме нулевого возбуждения. Обра- зец - сахароза, 2 мМоль в смеси Н2О D2O = 9 1. 3.9. Методы редактирования углеродных спектров При измерении спектров на ядрах 13С в условиях декаплинга на протонах весьма полезным бывает получение отредактированного спектра, в кото- ром сигналы углеродных атомов, связанных с различным числом протонов, имели бы различный знак. Возможно также получение отдельных под- спектров для каждого типа углеродных атомов. Имеется значительное ко- личество вариантов редактирования спектров. Мы остановимся лишь на важнейших из них. 3.9.1. J-модулированное спиновое эхо В первой главе книги для анализа углеродных спектров мы использовали их редактирование методом APT. Здесь мы объясним физические основы таких экспериментов. Проще всего это сделать для эксперимента с прос- 507
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР тейшей импульсной последовательностью /-модулированного спинового эха (рис. 3.29). Иногда ее называют SEFT (Spin-Echo Fourier Transform). Прин- ципы редактирования сохраняются и в других, более сложных, импульс- ных последовательностях, которые широко применяются для анализа угле- родных спектров. Рис. 3.29. Последовательность /-модулированного спинового эха, вариант с прерывистым декаплингом. Последовательность включает элемент спинового эха по каналу атомов углерода и постоянный декаплинг по каналу протонов, который выклю- чается лишь на время первого из двух одинаковых интервалов Д спинового эха. Ее действие легко понять с помощью векторной модели. Ключом к по- ниманию действия последовательности является осознание того, что эво- люция векторов намагниченности ядер углерода под влиянием гетероядер- ного расщепления ’/(С,Н) происходит только при отключенном декаплере. Когда декаплер включен, спин-спиновое взаимодействие мгновенно исче- зает и все векторы намагниченности, обусловленные гетероядерным ССВ, объединяются в один сигнал по правилам векторного сложения. При этом ориентация и величина полученного суммарного вектора зависят от ориен- тации векторов спиновых мультиплетов в момент включения декаплера. Эта ситуация показана на рис. 3.30 для дублета при произвольной величи- не интервала Д. Из рисунка 3.30 видно, что в момент включения декаплера абсолютная величина вектора намагниченности уменьшилась по сравнению с его перво- начальной длиной. Скорость разбегания векторов, соответствующих спи- новым расщеплениям, определяется величиной КССВ, /. Для дублета каж- дая из компонент намагниченности, движущихся в ВСК в противоположных направлениях, делает полный оборот за 2// с. Поэтому путем включения декаплера в тот или иной момент времени можно получить любую необхо- димую ориентацию векторной суммы компонентов намагниченности. Это же касается и сигналов другой мультиплетности. 508
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 3.30. Векторные диаграммы для дублета на разных этапах работы им- пульсной последовательности /-модулированного спинового эха при про- извольном выборе интервала Д: а) после подачи 90°-импульса; б) по окон- чании интервала Д; в) при включении декаплера. Поскольку интенсивность сигнала ЯМР в конце действия последова- тельности определяется абсолютной величиной и направлением вектора намагниченности каждого из ядер в момент начала сбора данных, то вели- чина интервала Д является определяющей для результата эксперимента. При изменении Д меняется интенсивность и знак сигнала 13С, имеющего спино- вую связь с протонами. Если рис. 3.30 применить к двум магнитным ядрам с близкими КССВ, но различающимся по своим химическим сдвигам, то для них скорость вращения компонентов намагниченности в ВСК в общем случае будет различной. Однако следует помнить о том, что спиновое эхо полностью рефокусирует химические сдвиги сигналов, поскольку их эволюция во вре- мя первого интервала Д полностью рефокусируется во время второго ин- тервала Д, который расположен за 180°-импульсом. Поэтому воздействие последовательности на все углеродные сигналы будет одинаковым, незави- симо от того, в какой части спектра они находятся. В связи с этим при рас- смотрении процессов, которые происходят при действии последователь- ности, следует учитывать только наличие гетероядерного расщепления во время первого периода Д. Для разных мультиплетов в случае, когда Д изме- няется от 0 до \U секунд, эволюция вектора намагниченности показана на рис. 3.31. Таким образом, в конце периода Д векторы намагниченности, которые отвечают разным гетероядерным мультиплетам, будут иметь разную ори- ентацию. При включении в этот момент декаплера гетероядерное расщеп- ление исчезнет, но интенсивность и знак углеродного сигнала, который появится в конечном спектре, будут определяться взаимной ориен- тацией векторов намагниченности в момент включения декаплера. 509
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР Интенсивность сигнала будет определяться векторной суммой компонент намагниченности гетероядерных мультиплетов, то есть мультиплетность сигналов окажется закодированной в их интенсивности. Поскольку хи- мические сдвиги не играют роли в экспериментах спинового эха, то все уг- леродные атомы, которые связаны с определенным числом протонов, будут вести себя совершенно одинаково. Векторы намагниченности четвертич- ных атомов углерода не изменяются при действии импульсной последова- тельности, поскольку они не имеют гетероядерного расщепления сигналов и расположены во время периода А вдоль оси +у. Дальние С-Н константы хо- тя и вызывают дальнейшее расщепление компонентов намагниченности, но они имеют величину значительно меньшую, чем у прямых КССВ, и их эволюцией за период А можно пренебречь. Рис. 3.31. Эволюция векторов намагниченности углерода под влиянием протон-углеродной спиновой связи. Для пары спинов метановой группы СН имеются два вектора, которые эволюционируют (вращаются в ВСК) со скоростью ±7/2 Гц. Поэтому каж- 510
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса дый из них поворачивается на половину оборота за 1/J с. При этом они встречаются на оси -у. В этот момент они на 180° различаются по фазе от векторов намагниченности четвертичных атомов углерода. В конечном спектре сигнал такой группы будет инвертированным. Аналогичные сооб- ражения для сигналов с другой мультиплетностью показывают, что векто- ры намагниченности для метиленовой группы, которые вращаются со ско- ростью ±J Гц, в этот момент будут ориентированы вдоль оси +у, а векторы метильных групп, которые вращаются с частотами ±J/2 Гц и ±3J/2 Гц, - вдоль оси -у. В общем случае интенсивности сигналов углеродных муль- типлетов, I, изменяются соответственно уравнениям: С 1 = 1, СН: Icos(180JA), СН2: Icos2( 180JA), СН3: Icos3(180JA). Величина (180JA) соответствует углу 0, на который поворачиваются векторы намагниченности, отвечающие компонентам гетероядерного дуб- лета за период А. Этот угол связан с периодом Д уравнением 0 = 180/Д (гра- дусов). Как видим, через угол 0 можно вычислить и интенсивности сигна- лов гетероядер, связанных с другим количеством протонов. Эти уравнения можно представить в графическом виде. Им отвечают графики, которые приведены на рис. 3.32. Таким образом, имеем ситуацию, когда интенсивность углеродных сигналов и их знак зависят от периода Д в импульсной последовательности. Для каждого выбранного периода Д име- ется свое соотношение интенсивностей углеродных сигналов, имеющих различную мультиплетность. Для редактирования спектра целесообразно выбрать такое Д, чтобы разница в соотношениях интенсивностей была мак- симальной. Наиболее часто используют Д = 1/J с (0 = 180°). В этом случае сигналы четвертичных и метиленовых атомов углерода положительны, а сигналы метиновых и метильных групп - отрицательны, если их отфази- ровать так, как это делается в обычном углеродном спектре. Примером от- редактированного таким образом углеродного спектра является спектр камфоры 3.14, изображенный на рис. 3.336. Часто отредактированные спектры представляют в таком виде, когда сигналы СН положительны, а сигналы метиленовых групп отрицательны. Для того, чтобы получить такие спектры, достаточно фазу сигналов изме- нить на 180° с помощью соответствующей фазовой коррекции. Таким об- разом, мультиплетность углеродных сигналов оказывается закодированной в знаке сигнала. В спектрах, которые записаны с помощью данной после- 511
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР довательности, сохраняется повышение интенсивности сигналов вследст- вие ЯЭО. Если выбрать А = 1/2J с, то интенсивность сигналов всех прото- нированных углеродов, как это следует из рис. 3.32, будет равняться ну- лю и в спектре останутся только сигналы четвертичных атомов углерода (рис. З.ЗЗв). Точность редактирования существенным образом зависит от правильности выбора интервала А, который определяется величиной J. Рис. 3.32. Изменение интенсивности сигналов углерода в эксперименте по /-модулированному спиновому эху как функция периода эволюции (9 = 180JA). Поскольку в реальных молекулах КССВ находятся в определенном диапазоне, приходится использовать некоторое компромиссное значение А. Протон-углеродные КССВ через одну связь лежат в диапазоне от 125 до 250 Гц, хотя чаще всего встречаются их величины от 130 до 170 Гц. Поэто- му для молекул, которые содержат ароматические фрагменты и электроот- рицательные группы в алифатической цепи, типичная величина А = 7 мил- лисекунд (1/(Н,С) = 140 Гц). Если реальные КССВ находятся далеко от это- го диапазона, то соответствующие сигналы могут иметь неожиданную фазу и интенсивность. Так бывает при изучении производных ацетилена, для которых характерны значительно большие КССВ. Поэтому для получения оптимальных результатов этим методом иногда приходится несколько из- менить продолжительность интервала А. 512
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса a2j___________I ________________ II___________________________ —I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I 50 40 30 20 10 м.д. Рис. 3.33. Углеродный спектр камфоры 3.14, отредактированный с по- мощью последовательности /-модулированного спинового эха. (а) Обыч- ный углеродный спектр (карбонил не показан) и отредактированные спектры в случаях, когда (б) А = 1// (0 = 180°) и (в) А = 1/2/ (0 = 90°). Считается, что / = 130 Гц. Искажение сигналов протонированных атомов углерода в (в) связано с расхождениями в величинах КССВ для разных атомов углерода. Эксперименты спинового эха легко реализовать, поскольку они не тре- буют настройки протонных импульсов. Хотя исторически они были разра- ботаны первыми, сейчас они применяются редко, поскольку вытеснены бо- лее совершенными методиками. Эксперимент может быть выполнен и с включением декаплера только на период сбора данных. В этом случае по каналу протонов подается дополнительный 180°-импульс. В данном вари- анте импульсной последовательности интервал А разбивается на два интер- вала по 1/2/ (рис. 3.34), разделенных 180°-импульсом, который подается одновременно на протоны и на атомы углерода. 513
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР Рис. 3.34. Импульсный вариант /-модулированного спинового эха. В этой последовательности после действия первого импульса на ядра 13С во время периода Д/2 происходит эволюция компонентов векторов на- магниченности, связанных с гетероядерным расщеплением и химическими сдвигами. Одновременная подача 180°-импульсов на ядра !Н и 13С приво- дит к переброске соответствующих компонентов в плоскости х-у на 180° В результате этого в последующий период времени Д/2 химические сдвиги рефокусируются, а векторы, связанные с ССВ, продолжают свою эволю- цию. В результате по окончании второго периода Д/2 получаем ориентацию векторов намагниченности такую же, как и в первом варианте эксперимен- та /-модулированного спинового эха. Соответственно и спектры получаются практически идентичными. Оба варианта редактирования практически одинаковы, однако импульсный вариант несколько менее чувствителен к несовершенству эксперимента. Это наиболее короткая последовательность, которая реализует гетероядерное спиновое эхо. Она используется как фраг- мент более сложных импульсных последовательностей. 3.9.2. Методика редактирования спектров APT Принципиальный недостаток описанного выше /-модулированного спино- вого эха состоит в использовании возбуждающих 90°-импульсов на 13С. Применение таких импульсов требует полной релаксации спиновой систе- мы перед подачей следующего импульса. Поэтому с точки зрения резуль- тирующей чувствительности спектра такие импульсы не являются опти- мальными. В результате использования данной методики возможно насы- щение медленно релаксирующих сигналов, в особенности четвертичных атомов углерода. Предпочтительным является подход, при котором для уг- лерода используются импульсы, меньшие 90° Этот эксперимент является некоторой модификацией эксперимента по /-модуляции. Он называется APT (Attached Proton Test) (рис. 3.35). 514
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 3.35. Последовательность APT (Attached Proton Test). Если в последовательности, которая изображена на рис. 3.35, исполь- зовать импульс с углом воздействия меньшим, чем 90°, то в результате его действия вектор намагниченности не достигнет плоскости х-у. В результате кроме поперечной намагниченности возникнет также и компонента намаг- ниченности вдоль оси +z. Эта компонента потом инвертируется следующим 180°(С)-импульсом. В системе со спинами, которые релаксируют медлен- но, при последующих сканах эта инвертированная компонента будет накла- дываться на компоненту намагниченности, которая успела отрелаксиро- вать и расположена вдоль оси +z. Это может подавить или уменьшить на- магниченность. Для того, чтобы этого не происходило, непосредственно пе- ред сбором данных вводится дополнительный 180°(С)-импульс, который возвращает проблемную -z компоненту к направлению +z. При этом исклю- чается исчезновение сигнала. Следует заметить, что поперечные компонен- ты намагниченности также поворачиваются на 180°, однако это не влияет на относительную интенсивность сигналов, поскольку все они перемеща- ются на этот угол одновременно. Чаще всего в эксперименте APT исполь- зуется угол импульса возбуждения, который равняется 45° или меньше, поэтому метод позволяет значительно быстрее накапливать сигнал. Ре- зультаты редактирования оказываются такими же, как и в эксперименте спинового эха. Ошибки редактирования, которые возникают при большом диапазоне КССВ в исследуемой молекуле, и значительные фазовые искажения сигна- лов в АРТ-спектрах являются основными ограничениями применения дан- ных методик. Однако преимуществом методики APT является то, что ее можно реализовать на любых спектрометрах. Поэтому методика все еще довольно популярна. Более сложные варианты экспериментов импульсного /-модулированного спинового эха дают возможность осуществить более полное редактирование спектра и получить отдельно подспектры, отвеча- ющие сигналам С, СН, СН2 и СН3. Удается также снизить нежелательное влияние на результаты редактирования большого диапазона величин гете- роядерных КССВ. 515
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР 3.9.3. Методика редактирования спектров INEPT Эксперимент INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarisation Transfer) был одним из первых импульсных экспериментов ЯМР, однако даже сей- час он широко применяется как составная часть многомерных эксперимен- тов в современном ЯМР. Основное достоинство эксперимента - возмож- ность неселективного переноса поляризации между спинами и соот- ветствующее повышение интенсивности сигналов в результирующих спектрах. При этом для многих ядер возрастание интенсивности сигналов оказывается значительно более сильным, чем в результате гетероядерного ЯЭО. Это позволяет существенно повысить чувствительность эксперимен- та. Действие эксперимента INEPT лучше всего можно понять из векторной модели. Наиболее часто эксперимент проводится с переносом поляризации от протонов. Поэтому обсуждение будет проведено для частного случая спиновых систем ХН. Следует, однако, отметить, что эксперимент можно реализовать для любой пары спинов, один из которых имеет большую ве- личину у и спин 1/2. Вследствие того, что в эксперименте используются только неселектив- ные импульсы, последовательность INEPT (рис. 3.36) является методом ин- вертирования половины каждого из дублетов ХН, независимо от их хими- ческих сдвигов. Рис. 3.36. Последовательность INEPT. Работу последовательности для простоты разберем на примере спино- вой системы, которая содержит только не взаимодействующие между со- бой группы СН. В этом случае спектр будет содержать исключительно ге- тероядерные дублеты, которые различаются своими химическими сдвигами. Последовательность начинается с возбуждения протонов путем подачи 90°-импульса. В результате в плоскость х-у попадают векторы намагничен- ности, отвечающие протонным сигналам. После этого на протяжении пе- риода времени Д/2 происходит эволюция спиновой системы протонов в со- 516
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ответствии с величинами химических сдвигов и констант гетероядерного спин-спинового взаимодействия. Далее на систему одновременно подают 180°-импульсы по каналам протонов и углерода. Воздействие 180°(А)-им- пульса на ядра X заставляет векторы намагниченности протонных гетеро- ядерных мультиплетов продолжить эволюцию, поскольку этот импульс ин- вертирует направление прецессии векторов обоих спиново-связанных ядер. Одновременно происходит рефокусировка химических сдвигов и неодно- родностей магнитного поля. Для пары СН после периода Д, если он равняет- ся 1/2J (Д/2 = <7/4), два протонных вектора, которые отвечают гетероядерным КССВ, располагаются в противофазе вдоль оси ±х. Поэтому следующий 90°-импульс располагает их вдоль оси +г также в противофазе (рис. 3.37). Рис. 3.37. Эволюция векторов намагниченности протонов во время рабо- ты последовательности INEPT. Такая ситуация отвечает инверсии одного из компонентов дублета, что и нужно для эффективного переноса поляризации, причем для всех спино- вых пар одновременно. Сразу после того, как возникла такая ситуация, осу- ществляется изменение заселенностей уровней ядра X за счет переноса по- ляризации от протонов. Таким образом, импульс 90°(С) воздействует на систему углеродных спинов с увеличенной за счет переноса поляри- зации разностью заселенностей. При этом для результирующего углерод- ного спектра несущественным является то, что его намагниченность перед этим была инвертирована действием 180°-импульса. Главное то, что в ре- зультате действия последовательности перед сбором данных она оказалась в поперечной плоскости. Фактически, на углеродные ядра воздействовал суммарный импульс в 270°, что эквивалентно подаче 90°-импульса. Это 517
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР позволяет получить спектр повышенной интенсивности. На практике два последних импульса на протонах и ядрах С подаются одновременно. Одна- ко с точки зрения иллюстрирования физического процесса можно считать, что импульс на протонах подается первым. Как было показано в разделе, посвященном селективному переносу по- ляризации, интенсивности пиков в полученном спектре неодинаковы. Так, например, для пары СН они равны -3 и +5. Данный эффект связан с нали- чием естественной ядерной намагниченности спина С. Эту намагничен- ность можно удалить с помощью подходящего фазового цикла. Так, повто- рение эксперимента с фазой последнего протонного импульса -у приводит к противофазному распределению интенсивностей компонентов мульти- плетов в сравнении с экспериментом, в котором используется импульс +у, поскольку намагниченность теперь ориентируется не вдоль оси -z, а вдоль оси +z (рис. 3.38). Рис. 3.38. Инверсия фазы последнего протонного импульса в INEPT ин- вертирует другой компонент протонных дублетов. Результирующие дублеты спинов ядер углерода оказываются инверти- рованными, хотя естественная намагниченность этих ядер остается неиз- менной. Вычитание одного эксперимента из другого путем инвертирова- ния фазы приемника приводит в суммарном спектре к восстановлению на- чальных соотношений интенсивностей компонентов дублетов. На рис. 3.39 это показано на примере спектра муравьиной кислоты. Такой двухшаговый фазовый цикл является основой эксперимента INEPT. Поскольку последо- вательность эффективна только для системы НХ с достаточной величиной КССВ, при отсутствии ССВ она оказывается бесполезной. 518
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 3.39. Экспериментальный 13С спектр INEPT муравьиной кислоты, записанный с фазой последнего протонного импульса, который равняется у (а) и -у (б). Вычитание этих двух наборов данных один из другого (в) устраняет естественную намагниченность, на которую перенос поляриза- ции влияния не оказывает. При этом происходит выравнивание интенсив- ностей компонентов дублетов. 3.9.3.1. INEPT с рефокусировкой Одной из проблем описанной выше последовательности INEPT является то, что она не дает возможности использовать во время сбора данных про- тонный декаплер. Это связано с тем, что при включении декаплера сразу исчезает гетероядерное J-расщепление, противофазные намагниченности в результате векторного сложения взаимно уничтожаются и переноса поля- ризации не происходит. Данный эффект обусловлен тем, что явление пере- носа поляризации, как и все процессы, которые основаны на релаксации, нуждается в определенном времени. Поэтому, если желательно использо- вать декаплер, надо начинать сбор данных через определенное время после окончания последовательности INEPT. Из этой ситуации можно выйти, ес- ли в импульсную последовательность ввести элемент еще одного спинового эха на обоих ядрах. Преимуществом такого эксперимента является также и то, что в случае, если дополнительный период Д2 выбрать соответству- ющим существующим гетероядерным КССВ, то компоненты дублетов, которые продолжают свою эволюцию, окажутся в фазе и будут иметь тот 519
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР же самый вид, что и в обычном углеродном спектре, но с увеличенной ин- тенсивностью, то есть за время действия дополнительного периода Д2 про- исходит рефокусировка компонентов намагниченности спина X, связанной с расщеплением на ядрах Н. Данная постановка эксперимента уже позво- ляет во время сбора данных использовать широкополосный декаплинг на протонах. При этом получаем последовательность INEPT с рефокусиров- кой (рис. 3.40). Результат действия этой последовательности иллюстрирует рис. 3.41. Рис. 3.40. INEPT с рефокусировкой. спектр без развязки ССВ INEPT с INEPT с рефокусировкой рефокусировкой и развязкой спектр INEPT с развязкой Рис. 3.41. Экспериментальный 13С спектр муравьиной кислоты, получен- ный без INEPT и с INEPT, иллюстрирует увеличение интенсивности, кото- рое является результатом переноса поляризации. 520
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Как и раньше, период рефокусировки делится пополам л-импульсом спинового эха, которое удаляет зависимость от химического сдвига. Для полной рефокусировки период Д2 выбирают эквивалентным 1/2J. Однако такой период годится только для ядер X, связанных с одним протоном. Для групп ХН2 и А7/3 он непригоден. Компоненты таких сигналов продолжают находиться в противофазе и не дают результирующего сигнала при дейст- вии декаплера. Однако этот эффект можно с успехом использовать для редактирования спектра. Для каждого типа мультиплетов можно подо- брать свою продолжительность интервала Д2, в течение которой происхо- дит максимальный перенос поляризации. Теоретически показано, что для получения оптимальной чувствительности разных мультиплетов период рефокусировки должен составлять д2=------Ц=-, (3.12) 7L/sin(l/Vn) где п - количество протонов, которые связаны с атомами углерода. Ангу- лярный параметр следует выбирать в радианах. В углеродных спектрах для групп СН, СН2 и СН3 величина Д2 должна составлять соответственно 1/2J, 1/4J и 1/5J. Если необходимо наблюдать одновременно все расщепленные мультиплеты, выбирают компромиссное значение Д2 = 1/3.3J. Для величи- ны КССВ 140 Гц при этом оптимальный Д2 = 2.2 мс. Спектр, который запи- сан при этих условиях, но без протонного декаплинга, содержит опреде- ленные фазовые искажения, поскольку период рефокусировки не является оптимальным. Однако эти искажения могут быть удалены с помощью де- каплинга. В случаях, когда тонкая структура расщепления ХН представляет инте- рес и протонный декаплинг не применяется, относительные интенсивности компонентов мультиплетов могут отличаться от обычных величин. Это один из недостатков последовательности INEPT. Даже после подавления вклада естественной намагниченности ядра X для групп ХНп остаются ано- малии интенсивностей (рис. 3.42). а б В СН 1 1 -2+5 -1 +1 сн2 1 2 1 -7 2 +9 -1 0 +1 СНз 133 1 -11 -9 +15 +13 -1 -1 +1 +1 Рис. 3.42. Относительная интенсивность линий мультиплетов в спиново- связанных спектрах INEPT, (а) Обычные интенсивности компонентов муль- типлетов INEPT, (б) без и (в) с подавлением естественной намагниченности. 521
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР Особенно следует отметить заниженную интенсивность центральных линий мультиплетов. Одной из последовательностей, которые предложены для устранения этого недостатка, является INEPT+. Эта последователь- ность включает дополнительный "очищающий" импульс на протонах, ко- торый удаляет составляющие намагниченности, связанные с аномалиями интенсивностей. На практике описанная ниже последовательность DEPT оказывается лучшей, поскольку она менее чувствительна к несовершенству условий эксперимента. Метод INEPT можно использовать также и для переноса поляризации через несколько химических связей. В этом случае удается наблюдать в спектре четвертичные атомы углерода или непротонированные атомы азо- та, интенсивность которых увеличена за счет переноса поляризации. Для реализации такого эксперимента нужно выбрать интервалы Д1 в соответст- вии с имеющимися величинами КССВ. В некоторых случаях ситуацию можно существенным образом упростить, если во время периода Д1 удалить гомоядерное взаимодействие с помощью селективного протонного декап- линга. На рис. 3.43 приведен результат накопления спектра 15N для адено- зин-5’-сульфата 3.15 с переносом поляризации от протонов через одну и через две связи. В спектре при этом удается наблюдать сигнал атома азота аминогруппы (рис. 3.43а) и сигналы атомов азота, входящих в пуриновое ядро (рис. 3.436). В первом случае используется перенос поляризации от протонов аминогруппы, а во втором - от протонов, входящих в пиримиди- новый и имидазольный циклы. 3.9.3.2. Чувствительность метода INEPT по сравнению со спектрами Х{Н} Для определения степени повышения чувствительности в методе INEPT следует сравнить интенсивность сигналов в этом эксперименте с их интен- сивностью при простом измерении спектров на ядрах с малым у при ис- пользовании широкополосного декаплинга на протонах. Такой декаплинг повышает чувствительность за счет гетероядерного ЯЭО. Теоретически можно показать, что в этих экспериментах интенсивность сигналов можно найти из соотношений: Iinept = Io|Yh/Yx|, Inoe = 1о(1 + Ун/2ух), (3.13) где Iinept - интенсивность сигнала при переносе поляризации, Inoe - интен- сивность сигнала с учетом ЯЭО, 10 - интенсивность сигнала в отсутствие дополнительных воздействий. 522
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса м.д. б) I I Г 'Г 1'1'Г Г ГГ1~1~Т"ГГГ Г~Т I 1 Г1 I~l I I Г I I I 1 I I I I I I I I I I I I 1 I -130 -150 -170 -190 -210 м.д. Рис. 3.43. Спектр 15N-INEPT аденозин-5'-сульфата 3.15 с переносом поляри- зации через одну связь (а) и через 2 связи (б) при естественном содержании 15N. Нижние спектры измерены с помощью последовательности INEPT, а верхние - с помощью INEPT с рефокусировкой. Химические сдвиги в спект- рах измерены относительно нитрометана. Прежде всего, следует отметить, что ЯЭО дает вклад, который добав- ляется к природной намагниченности. Поэтому результирующий сигнал 523
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР зависит от относительных знаков гиромагнитных отношений протона и яд- ра X. Перенос поляризации от этого не зависит. Таким образом, ЯЭО вызы- вает уменьшение сигналов для ядер с отрицательными гиромагнитными отношениями. Вследствие этого в некоторых случаях из-за ЯЭО сигнал мо- жет быть отрицательным или близким к нулю. В таблице 3.1 дано сравне- ние максимального выигрыша в интенсивности, который можно получить за счет ЯЭО и за счет INEPT для различных ядер, связанных с протонами. Степень возрастания интенсивности сигнала не зависит линейно от числа связанных протонов, которые используются для переноса поляризации. Иными словами, интенсивность сигнала не возрастает вдвое для ХН2 по сравнению с ХН. Таблица 3.1. Интенсивности сигналов для А-спина в парах ^-Х, получен- ные в результате переноса поляризации (Iinept) и при прямом наблюдении с теоретически возможным ЯЭО (1яэо) X 13с 15n 29Si З'р 57Fe l03Rh ,09Ag "9Sn 183W ,95Pt 207Pb Iinept 3.98 9.87 5.03 2.47 30.95 31.77 21.50 2.81 24.04 4.65 4.78 1яэо 2.99 -3.94 -1.52 2.24 16.48 -14.89 -9.75 -0.41 13.02 3.33 3.39 Примечание. Интенсивности даются относительно интенсивностей сигналов, кото- рые получены прямым наблюдением при отсутствии ЯЭО (10). На практике вследствие несовершенства эксперимента и релаксацион- ных процессов, уменьшающих величину ЯЭО (в частности анизотропии химического сдвига для металлов), данные таблицы 3.1 нельзя считать точ- ными, однако их можно использовать для оценки перспективности прове- дения эксперимента. Наиболее сильный выигрыш в чувствительности при- менение переноса поляризации дает для ядер с отрицательным у. Резуль- таты воздействия альтернативных методов повышения чувствительности для ядер с положительным у, таких как 31Р и 13С, различаются меньше. Дополнительным преимуществом переноса поляризации, которое не нашло своего отражения в таблице 3.1, является то, что время сканирова- ния в экспериментах с переносом поляризации определяется продольной релаксацией протонов, а не ядра X поскольку результирующие заселеннос- ти определяются только данными спинами. В отличие от этого, время ска- нирования в прямых экспериментах на ядрах X определяется временами релаксации этих ядер, которые, как правило, значительно больше, чем для протонов. Поэтому выигрыш в чувствительности за фиксированное время сбора данных, который связан с повышением частоты сканирования, мо- жет в ряде случаев превышать выигрыш в интенсивности собственно за 524
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса счет самого процесса переноса поля- ризации. Таким образом, наибольший выигрыш чувствительности за счет переноса поляризации возникает для ядер с большими временами релакса- ции и малыми гиромагнитными отно- шениями. Наиболее часто перенос по- ляризации используют для ядер 15N и 29Si, а также для изучения переходных металлов, таких как 57Fe, 103Rh, 109Ag, 193W. Наглядное представление о сте- пени роста интенсивности сигнала в эксперименте INEPT дает рис. 3.44. Вследствие низкой интенсивнос- ти сигналов спинов X при прямом на- блюдении большинство современных подходов к получению их спектров сводится к непрямому наблюдению ядер X через связанные с ними прото- ны. Эти подходы реализуются в раз- ных гетероядерных корреляционных экспериментах. Г I ' |Ч~ I I I—Г—I—I I I I I—f I ! -|- |—Г—1 400 200 0 -200 -400 Гц Рис. 3.44. Повышение интенсив- ности сигнала 15N в спектре INEPT нитрата аммония, (а) Прямое на- блюдение с использованием угла Эрнста, оптимизированного для Ti азота и (б) INEPT, оптимизирован- ный для Ti протона. Оба спектра бы- ли измерены за одинаковое время. 3.9.3.3. Редактирование спектров с помощью INEPT С помощью импульсной последовательности INEPT можно осуществить редактирование спектра, то есть получать отдельно подспектры, отвеча- ющие атомам углерода, связанным с различным количеством протонов. Рассмотрим, как это делается. Для этого возвратимся к импульсной по- следовательности INEPT с рефокусировкой и обратим внимание на то, что происходит с компонентами гетероядерных мультиплетов на протяжении периода Д2. Наиболее наглядно это видно из векторной модели ситуации. Прежде всего, вспомним, что расстояние между компонентами дублета составляет J. Это означает, что скорость разбегания векторов намагничен- ности, отвечающих этим компонентам, будет соответствовать этой величи- не. Половину оборота векторы сделают за период Д2 = 1/2J. Аналогично, расстояние между крайними компонентами триплета составляет 2J. Таким образом, в СКО эти компоненты будут расходиться вдвое быстрее, чем компоненты дублетов. Поэтому через период Д2 = 1/4J компоненты дубле- тов повернутся на ±45°, аналогично, компоненты триплетов за этот проме- жуток времени повернутся на 90° Для того, чтобы сигнал был видимым в 525
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР декаплера Векторы Векторы вычитаются складываются Сигнала нет Полный сигнал Рис. 3.45. Редактирование методом INEPT можно осуществить с по- мощью подбора периода рефокуси- ровки Аг- При выборе этого периода, равным 1/2J(H,C), сохраняются СН сигналы, но удаляются из спектра сигналы СН2 и СН3. конце выбранного периода Д2, нужно, чтобы компоненты муль- типлетов располагались в одном направлении. Если возвратиться к выбору величины периода Д2 в последовательности INEPT с ре- фокусировкой, то видно, что при выборе Д2 = 1/2J дублеты пол- ностью рефокусируются, посколь- ку векторы намагниченности, ко- торые им отвечают, совпадают в конце этого периода с осью х. Компоненты триплетов и кварте- тов при этом остаются в противо- фазе и удаляются из спектров при декаплинге на протонах вследст- вие того, что результат их век- торного сложения равен нулю (рис. 3.45). Таким образом, выбор пери- ода Д2 = 1/2J приводит к под- спектру, содержащему сигналы только метиновых атомов угле- рода. Идея редактирования спект- ров соответственно мультиплет- ности сигналов близка к редакти- рованию с помощью метода спи- нового эха, который описан в со- ответствующем разделе учебника. Расширение этой идеи на вы- деление других углеродных муль- типлетов удобно провести для уг- ла 0 = 180/Д2. В этом случае ин- тенсивности сигналов атомов уг- лерода различной связности в эксперименте с декаплингом бу- дут равны: С: I sin 0, СН2: I-2sin0 cos0, СН3: I-3sin0 cos20. 526
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Графически эти интенсивности сигналов представлены на рис. 3.46. Рис. 3.46. Изменение интенсивности сигналов углерода в эксперименте INEPT с рефокусировкой как функция угла 0. Данный угол связан со вре- менем эволюции Д2 формулой 0 = 180/Д2. Идентичные результаты полу- чены для эксперимента DEPT, для которого угол 0 представляет собой угол последнего протонного импульса. Для разделения сигналов всех протонированных атомов углерода удобнее всего измерять три спектра, в которых Д2 подобран так, чтобы 0 составлял 45, 90 и 135 градусов. Эксперимент 90° отвечает Д2 = 1/2J и дает в спектре только метановые протоны. При 0 = 45° и 0 = 135° в спектре про- являются все пики, однако в последнем случае сигналы метиленовых групп инвертированы. Данный процесс объединяет усиление сигналов с по- мощью переноса поляризации и редактирование спектров. При этом редак- тирование выходит более совершенным, чем в случае использования метода спинового эха, поскольку сравнение трех спектров INEPT дает возможность полностью разделить по мультиплетности все наблюдаемые сигналы. Сей- час, однако, данную информацию чаще всего получают с использованием последовательности DEPT, которая менее чувствительна к несовершенству условий эксперимента и дает отредактированные спектры, полностью ли- шенные фазовых искажений. 527
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР 3.9.4. Последовательность DEPT Методики редактирования углеродных спектров, которые были описаны выше, не всегда дают удовлетворительные результаты. В ряде случаев от- редактированные спектры содержат сигналы со значительным искажением фазы. В простых случаях это не имеет особого значения, но при анализе сложных спектров, где сигналы разных углеродных атомов наблюдаются очень близко один от другого, такие искажения фазы могут привести к не- правильной интерпретации результатов. Поэтому необходимо было даль- нейшее усовершенствование методов редактирования углеродных спект- ров в соответствии с мультиплетностью сигналов. Работы в этом направле- нии привели к разработке импульсной последовательности DEPT (Distorti- onless enhancement by polarisation transfer). Хотя разработана эта последова- тельность была еще в 1982 году, однако и до сих пор она остается наиболее совершенной и используется весьма часто. Импульсная последовательность методики DEPT показана на рис. 3.47. Рис. 3.47. Последовательность DEPT. Для частного случая, когда 0 = 90°, механизм действия последователь- ности DEPT можно понять с помощью векторной модели. Рассмотрим си- туацию, которая возникает при действии последовательности на гетеро- ядерный дублет СН, причем будем учитывать, что одновременная подача 180°-импульсов на оба ядра не влияет на движение намагниченности в по- перечной плоскости, которая связана с КССВ, из-за того, что компоненты намагниченности каждого из ядер меняются местами. После первого 90°-им- пульса на протонах вектор намагниченности группы СН располагается в ВСК вдоль оси >> (рис. 3.48а). Он расщепляется на два вектора, На и Нь, ко- торые связаны с гетероядерным расщеплением на атоме углерода. 528
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 3.48. Векторная модель действия последовательности DEPT для част- ного случая сигнала СН. Пусть вектор На связан с компонентом углеродной намагниченности Са, расположенным по полю, а вектор Нь соответственно связан с компонен- том Сь, который расположен против поля. В дальнейшем, в период эволю- ции один из этих векторов вращается по часовой стрелке, а второй - против нее. По окончании первого периода 1/2J оба эти вектора повернутся на 90° и расположатся в противоположных направлениях вдоль оси х (рис. 3.486). В этот момент подается 90°-импульс на ядрах С. Под действием этого им- пульса компоненты углеродной намагниченности будут переброшены в по- перечную плоскость и образуют векторы Са и Сь, расположенные в проти- воположных направлениях вдоль оси >> (рис. 3.48в). При этом реализуется необычная ситуация, когда векторы намагниченности и протонов, и угле- рода одновременно находятся в поперечной плоскости и вроде бы способ- ны к эволюции соответственно частотам своей Ларморовой прецессии. Од- нако оказывается, что в данном случае эволюция не происходит вовсе, поскольку компоненты намагниченности протона по природе своей связаны с компонентами намагниченности атома углерода. Изменение ориентации спина протона ведет к соответствующему изменению ориента- ции спина углерода и наоборот. Поэтому, несмотря на различие в частотах прецессии спинов атомов водорода и углерода, их вращение происходит синхронно, то есть на одной частоте. Когда частоты прецессии двух атомов 529
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР одинаковы, то говорят, что они когерентны. Таким образом, состояние, ког- да в поперечной плоскости вращаются компоненты векторов намаг- ниченности двух различных ядер, связанных ССВ, называют гетеро- ядерной многоквантовой когерентностью (ГМКК). Все время, когда су- ществует ГМКК, взаимная ориентация спинов является неизменной, поэто- му в конце второго периода 1/2J будем иметь ту же ситуацию, которая бы- ла в момент появления ГМКК (рис. 3.48г). 90°/Н)-импульс в конце второго периода 1/2J поворачивает компоненты протонной намагниченности На и Нь к оси +г (рис. 3.48д). На этом этапе происходит перенос поляризации от протонов к атому углерода. Этот процесс происходит во время третьего пе- риода 1/2J. Одновременно с подачей последнего импульса на протонах вследствие разрушения ГМКК начинается эволюция векторов намагничен- ности ядер углерода. В конце данного периода эволюция векторов Са и Сь приведет к тому, что они оба сойдутся на оси х (рис. 3.48е). Если в этот момент начать сбор данных, то получим для атомов углерода дублеты с одинаково сфазированными компонентами. Интенсивность сигналов будет увеличена благодаря переносу поляризации. При применении декаплера на протонах во время сбора данных получим синглеты соответствующей интен- сивности. При рассмотрении последовательности мы видели, что во время второго периода 1/2J, когда образуется ГМКК, векторы намагниченности не изменяют ориентацию, поэтому, казалось бы, этот период можно исклю- чить из последовательности. Но, на самом деле, это справедливо лишь для групп СН. Если же в молекуле присутствуют группы СНП, то для их ком- понентов намагниченности существуют более сложные соответствия меж- ду ориентациями векторов Нп и Сп в период существования ГМКК. В резуль- тате по окончании последовательности сигналы атомов углерода групп СНП будут иметь разную интенсивность и знак. Это в комбинации с продолжи- тельностью заключительного импульса дает возможность проводить редак- тирование спектра в соответствии с мультиплетностью сигналов углерода. Для удаления эффектов протонных химических сдвигов эволюционный период выбирают соответствующим 1/2J и в центре его подают 180°-им- пульс. Подача этого импульса происходит одновременно с импульсом 90°(С). Действие импульса 0, как уже отмечалось, заключается в удалении протонной намагниченности из поперечной плоскости, что приводит к по- явлению в поперечной плоскости вместо ГМКК поперечной углеродной на- магниченности, то есть в восстановлении намагниченности, которую мож- но наблюдать. Детали такого процесса зависят от мультиплетности угле- родного сигнала. Другими словами, метановые, метиленовые и метильные сигналы реагируют на этот импульс по-разному. Это и дает возможность проводить редактирование спектров. Во время последнего интервала, кото- 530
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса рый отвечает 1/2J, углеродная намагниченность, связанная с расщеплением на протонах, рефокусируется, но продолжается ее эволюция, связанная с углеродными химическими сдвигами. Поэтому одновременная подача им- пульса 180°(С) и протонного импульса 0 приводит к полной рефокусиров- ке углеродной намагниченности за время последнего периода 1/2J. Таким образом, намагниченность углерода наблюдается без зависимых от хими- ческого сдвига фазовых искажений. Соответственно задачам эксперимента сбор данных можно проводить с протонным декаплингом или без него. Альтернирование фазы импульса 0 со сложением или вычитанием данных на входе приемника приводит к уничтожению естественной намагничен- ности углерода, как это делалось в методе INEPT. Конечным результатом является перенос поляризации от протонов к углероду с возможностью редактирования спектров. 3.9.4.1. Редактирование спектров с помощью DEPT Как было сказано выше, ключом к редактированию спектров с помощью методики DEPT является зависимость фазы и интенсивности углеродных сигналов от угла 0. На практике результат редактирования совершенно ана- логичен тому, который можно получить с помощью INEPT при Д2 = 0/180J. Если для разных гетероядерных мультиплетов построить зависимость их интенсивности от продолжительности импульса 0, то можно получить ве- личины, которые изображены на рис. 3.49. Тем не менее, в методе INEPT редактирующий интервал, Д2, следует выбирать соответствующим величине КССВ, а в методе DEPT редактиро- вание осуществляется с помощью переменного угла импульса 0, кото- рый не имеет зависимости от J. Это означает, что эффективность ре- дактирования с помощью DEPT намного превышает INEPT при зна- чительном диапазоне КССВ. Это обусловливает преимущества DEPT при рутинных исследованиях. Хотя период эволюции в DEPT и зависит от ве- личин J, однако последовательность не слишком чувствительна к ошибкам в его установке. Для определения мультиплетности сигналов с помощью DEPT необхо- димо измерение трех спектров с 0 = 45, 90 и 135° При этом эксперимент с 0 = 90° требует вдвое больше сканов для получения спектра с тем же соот- ношением сигнал/шум. Получаемые при этом результаты сведены в таб- лице 3.2. Путем сравнения данных спектров можно легко найти мульти- плетность сигналов углерода в неразвязанном спектре. Четвертичные атомы углерода при этом устанавливаются путем сравнения с обычным углерод- ным спектром с широкополосной развязкой от протонов. 531
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР Рис. 3.49. Интенсивности сигналов мультиплетов СНП, которые можно по- лучить при изменении продолжительности импульса 0. Результаты получе- ны в условиях декаплинга на протонах во время сбора данных. Таблица 3.2. Знаки углеродных сигналов в спектрах DEPT DEPT-45 DEPT-90 DEPT-135 хн + + + ХН2 + 0 - ХН3 + 0 + 532
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Улучшенный подход заключается в комбинировании данных спектров и получении подспектров, в которых сигналы СН-, СН2- и СН3-групп при- сутствуют отдельно. Однако следует учитывать, что при таком подходе возникает возможность появления артефактов. Кроме того, тяжелее опре- делить причину неудачи эксперимента в случае, если в спектре имеются аномальные КССВ или прибор плохо откалиброван. На практике измере- ние одного спектра DEPT с 0 = 135° дает возможность получить необходи- мую структурную информацию, несмотря на то, что в спектре сигналы групп ХН и ХНз имеют одинаковый знак. Чаще всего их удается идентифи- цировать в спектре по величинам химического сдвига. Недавно появилась модификация метода DEPT, называемая DEPTQ. Эта последовательность позволяет получить информацию о четвертичных атомах углерода и выполнить редактирование спектра. Таким образом, она может оказаться довольно удобной для рутинных исследований. Имеется несколько причин возникновения искажений в методе DEPT. Наиболее распространенной причиной является неправильная установка угла протонных импульсов, особенно импульса 0, который используется для редактирования спектров. Это может быть следствием плохой настройки канала протонов. Даже небольшие ошибки в величине 0 могут привести к появлению неожиданных пиков в DEPT-90. Если 0 слишком мал, под- спектр DEPT-45 оказывается большим, чем DEPT-135. Даже при правильной калибровке импульсов в спектре могут появить- ся артефакты, связанные с отличием периода Д2 от оптимального для име- ющихся КССВ *У(Н,С). В этом случае в подспектре СН могут появиться слабые сигналы групп СН3. Типичным компромиссным значением !J(H,C) является 140 Гц. Для нее Д2 = 3.6 мс. Для алкиновых углеродов характерны очень большие величины ^(HjC) (больше 200 Гц). Они могут вызвать по- явление в спектре DEPT сигналов низкой интенсивности с неожиданным знаком. Еще более неожиданными могут оказаться сигналы четвертичных атомов углерода, которые связаны с алкиновым фрагментом. В них вслед- ствие аномально большой величины 2J может проявиться перенос поляри- зации через две связи. 3.10. Изучение квадруполъных ядер Характерной особенностью многих квадрупольных ядер является большая ширина их сигналов, которая связана с быстрой квадрупольной релаксаци- ей. Быстрое восстановление исходной намагниченности спинов после воз- буждения означает, что сбор данных можно осуществлять при очень быст- ром сканировании. Возбуждающий импульс может равняться 90°, что яв- ляется оптимальным с точки зрения чувствительности. Однако такое быст- 533
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР рое сканирование может вызвать определенные проблемы при непосредст- венном наблюдении ядер с шириной сигнала в сотни и тысячи Герц. Сразу после импульса, хотим мы этого или нет, существует вспомогательный интервал, который необходим для того, чтобы электроника могла осущест- вить оцифровывание сигнала. Во время этого интервала в датчике может возникать так называемый акустический звон. Он наиболее силен для ядер с низкой резонансной частотой и малым естественным содержанием. Его интенсивность возрастает в слабых магнитных полях. Период спада акус- тического звона составляет много десятков микросекунд. При изучении ядер со спином 16 без вреда для спектра перед сбором данных можно ввес- ти такой промежуток, поэтому для таких ядер никаких проблем акустичес- кий звон не создает. Однако в случае ядер, которые релаксируют быстро, таких как 17О и 33S, введение дополнительного промежутка между импуль- сом и началом сбора данных может привести к потере значительной части сигнала ССИ (ширина линии 1 и 5 КГц отвечает временам релаксации 320 и 60 мкс, соответственно). Кроме этого, наличие промежутка перед сбором данных вызывает сильные фазовые искажения сигналов. Таким образом, сокращение промежутка повышает интенсивность сигнала, но вызывает зна- чительные искажения нулевой линии спектра, которые проявляются в виде широких волн. Разработан ряд последовательностей, при использовании которых можно подавить акустические шумы. Две из них изображены на рис. 3.506, в. В обоих случаях подавление акустических шумов от 90°-им- пульса достигается измерением двух последовательных сканов, в одном из которых с помощью дополнительного 180°-импульса инвертирована фаза сигнала ЯМР. Одновременно инвертируется также фаза приемника. Следует отме- тить, что включение в импульсную последовательность 180°-импульса так- же ведет к появлению акустического звона. Поэтому этот дополнительный звон также необходимо удалять. Это в двух рассмотренных последова- тельностях осуществляется немного по-разному. В последовательности ACOUSTIC (Alternate Compound One-eights Used to Suppress Transients In the Coil) (рис. 3.506) весь эксперимент повторяется с инверсией 180°-им- пульса. При этом инвертируется акустический звон, связанный с этим импульсом. Сложение данных, которые получены в двух экспериментах, приводит к удалению из спектра этого вклада. Альтернативная последова- тельность RIDE (Ring-down Delay) (рис. 3.50в) сводится к повторению экспе- римента с инверсией фазы обоих 90°-импульсов и вычитанием второго эксперимента из первого. Обе последовательности вследствие применения 180°-импульсов могут привести к внерезонансным эффектам, однако при их помощи можно достичь кардинального уменьшения искажений нулевой линии. Рис. 3.51 иллюстрирует применение RIDE при накоплении сигна- 534
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ла 17О спектра этилацетата. Видно, что в результате получаем практически горизонтальную нулевую линию. Рис. 3.50. Последовательности для наблюдения квадрупольных ядер с очень широкими линиями, для которых акустический звон является проб- лемой. Последовательность (а) устраняет звон, связанный с 90°-импуль- сом, а последовательность ACOUSTIC (б) и RIDE (в), кроме того, устра- няют звон, который связан с 180°-импульсом. Современное математическое обеспечение спектрометров ЯМР дает возможность использовать также и альтернативный подход к измерению спектров квадрупольных ядер. При этом для накопления неискаженного сигнала ССИ используется простая одноимпульсная последовательность. Первые точки сигнала ССИ, которые искажены, корректируются на осно- вании более удаленных от начала сбора данных точек методом обратной линейной экстраполяции. Эффективность такого подхода иллюстрирует спектр, который приведен на рис. 3.51 в. В этом спектре первые 10 точек получены методом линейной экстраполяции. Искажение нулевой линии и ухудшение соотношения сигнал/шум, которое связано с несовершенством эксперимента, в спектре полностью отсутствуют. 535
Глава 3. Основные методы ID-спектроскопии ЯМР Рис. 3.51. 17О спектр этилацетата записан (а) с последовательностью RIDE и (б) без нее. Сильные искажения нулевой линии в спектре (б) являются результатом акустического звона в датчике. Спектр (в) получен из того же самого ССИ (б), но первые 10 точек данных в нем заменены точками, ко- торые получены методом обратной линейной экстраполяции, они вычисле- ны на основании 256 неискаженных точек. Спектры измерены относи- тельно D2O и обработаны функцией экспоненциальной мультипликации с 1Ь= 100 Гц. 536
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Глава 4. Корреляционная 2П-спектроскопия ЯМР (COSY) 4.1. Принципы получения двумерных спектров В первой главе книги мы уже познакомились с двумерными спектрами и научились извлекать из них информацию о строении молекулы. Однако физические основы таких экспериментов мы до сих пор не рассматривали. Поэтому в данной главе мы попытаемся осветить эти вопросы. Процесс генерации двумерного спектра мы рассмотрим на примере простейшей из таких методик - методики COSY. Хотя все другие двумерные методики ЯМР и отличаются от COSY видом импульсной последовательности, од- нако сам принцип получения двумерного спектра остается всегда одним и тем же. Поэтому материал данного раздела будет полезен и для понимания других, более сложных методик двумерного ЯМР. Для того, чтобы лучше понять физическую картину генерации двумер- ного спектра, прежде всего вспомним, что происходит во время детекти- рования сигнала спада свободной индукции и каким образом получается одномерный спектр. Процесс детектирования включает оцифровывание сигнала спада свободной индукции через выбранные интервалы времени, которые для заданного времени сбора данных должны отвечать критерию Найквиста. Накопленный таким образом массив данных отражает зависи- мость интенсивности сигнала ССИ от времени. Путем Фурье-преобразова- ния эти данные трансформируются в спектр, который представляет собой зависимость интенсивности сигнала от частоты. Таким образом, общая процедура формирования частотного измерения состоит в фиксации интенсивности сигнала через заданные интервалы времени. Совокуп- ность таких данных дает интерферограмму или сигнал ССИ. Каким бы методом мы ни получили ССИ, его можно превратить в соответст- вующий спектр ЯМР путем Фурье-преобразования. Эту идею можно распространить на два частотных измерения. В этом случае спектр должен представлять собой зависимость интенсивности сигнала от двух частот f] и f2. Для его получения необходимо зафиксировать зависимость интенсив- ности сигнала от двух независимых времен ti и t2, то есть получить двумер- ный массив данных. Каждая строка такого массива является функцией tb а каждая колонка - функцией t2. Понятно, что один временной интервал и со- ответственно одно частотное измерение отвечают обычному периоду де- тектирования (t2 на рис. 4.1). Однако откуда берется второе измерение? От- вет на этот вопрос и является ключом к пониманию принципов двумерной спектроскопии ЯМР. Независимо от природы параметра, который изучается методом дву- мерной спектроскопии, все импульсные последовательности двумерных 537
Глава 4. Корреляционная 2П-спектроскопии ЯМР (COSY) tl ^|^\Л/У'лллл~— Рис. 4.1. Общая схема любого дву- мерного эксперимента. П - подготов- ка, Э - эволюция, С - смешивание и Д - детектирование. п э С методик включают 4 этапа. Они на- зываются: подготовительный пери- од, период эволюции, период сме- шивания и период детектирования (рис. 4.1). Подготовительный период, как правило, включает релаксационный промежуток, необходимый для пе- рехода спиновой системы в стацио- нарное состояние. Этот период заканчивается возбуждающим импульсом. Период эволюции - ключевой для формирования второго измерения. Он представляет собой промежуток времени, на протяжении которого возбужденная спиновая система приобретает необходимые для экспе- римента свойства. Особенностью периода эволюции в двумерной спект- роскопии является то, что его продолжительность является перемен- ной величиной. Состояние, которое приобретает система в период эво- люции, влияет на вид сигнала ССИ, который формируется в период детектирования. Период смешивания чаще всего включает импульс или группу импульсов и/или фиксированные временные интервалы. Он служит для перераспределения намагниченности между спиновыми состояниями. В деталях, в зависимости от типа эксперимента, эти периоды могут сущест- венно различаться. Период детектирования совершенно аналогичен соот- ветствующему периоду в одномерных одноимпульсных спектрах. Во время этого периода происходит оцифровывание сигнала и запись ССИ возбуж- денных спинов. Рассмотрим простую импульсную последовательность, в которой как подготовительный период, так и период смешивания содержат лишь по од- Рис. 4.2. Простейшая двумерная по- следовательность, в которой периоды П и С отвечают 90°-импульсам. Это базовая последовательность COSY. ному 90°х-импульсу (рис. 4.2). Эти импульсы разделяет период эволю- ции, время которого обозначим tb Пусть последовательность воз- действует на образец, молекулы которого содержат единственный протон, например это может быть хлороформ. Будем считать, что хи- мический сдвиг образца равен v Гц. В соответствии с векторной мо- делью (рис. 4.3) начальный 90°х-им- пульс переворачивает равновесную намагниченность в плоскость х-у и располагает ее вдоль оси +у. После это- го вектор намагниченности прецессирует (эволюционирует) в соответствии 538
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса с величиной его химического сдвига. Через время ti вектор повернется на угол 36Ovtj градусов. В этот момент на него воздействует второй импульс. Для понимания результата воздействия второго импульса предположим, что вектор намагниченности состоит из двух ортогональных компонент. Одна из них направлена вдоль оси у, ее величина составляет M0cos360vti. Другая компонента располагается вдоль оси х и равна Mosin36Ovti (рис. 4.3). Второй 90°х-импульс вращает компоненту у в плоскости y-z и располагает ее вдоль оси -г. При этом на х-компоненту импульс не действует, вследст- вие чего она продолжает прецессировать в плоскости х-у. Эта компонента продуцирует сигнал ССИ. Фурье-преобразование данного ССИ дает спектр с единственной линией, интенсивность которой определяется величиной оставшейся в плоскости х-у компоненты х, амплитуда которой равна 36Ovti. Таким образом, ситуация при измерении двумерного спектра отли- чается от обычного одномерного эксперимента тем, что второй импульс выводит часть намагниченности из поперечной плоскости, поэтому интен- сивность сигнала, который можно получить после Фурье-преобразо- вания, зависит от периода tb Рис. 4.3. Действие последовательности COSY (рис. 4.2) на единичный сиг- нал, который не имеет спиновой связи. Выполнение данного эксперимента с ti = 0 приведет к добавлению двух 90°х-импульсов, что эквивалентно действию 180°х-импульса. Такой им- пульс просто инвертирует исходную намагниченность. Поскольку в этом случае не возникает поперечной намагниченности, сигнал после Фурье-пре- образования будет содержать только шумы. Теперь представим себе, что будет происходить, если повторять экспе- римент, давая фиксированные приращения интервалу tb Результат будем записывать отдельно для каждого варианта. Поскольку ч возрастает от нуля, интенсивность сигнала в результирующем спектре также будет возрастать от нуля. При увеличении ti сигнал достигнет максимума при 36Ovt] = 90° После этого начинается спад интенсивности сигнала. Она доходит до нуля, становится отрицательной и начинает снова возрастать. Таким образом, ве- личина сигнала изменяется по синусоидальному закону. Можно сказать, что амплитуда сигнала модулирована синусоидальной функцией. Если 539
Глава 4. Корреляционная 2П-спектроскопии ЯМР (COSY) каждый полученный таким образом сигнал ССИ (он является функцией t2) подвергнуть Фурье-преобразованию, получим серию спектров с единствен- ным сигналом, интенсивность которого будет функцией от 360vt] (рис. 4.4). Рис. 4.4. Модуляция амплитуды резонанса синглета как функция периода эволюции ti. При росте ti интенсивность сигнала уменьшается из-за на- личия спиновой релаксации. На рис. 4.4 такие спектры нарисованы один за другим под некоторым углом к наблюдателю. При больших t2 релаксационные эффекты уменьша- ют величину намагниченности соответственно времени поперечной релак- сации Т2*, поэтому в дополнение к амплитудной модуляции для сигнала характерен постоянный экспоненциальный спад. Если из каждого спектра взять лишь одну точку, которая отвечает максимуму сигнала, то получим массив данных, который ничем не отличается от ССИ за исключением спо- соба его получения. Таким образом, интенсивность сигнала относитель- но ti изменяется идентично сигналу спада свободной индукции. Такой ССИ был получен непрямым методом (рис. 4.5). Рис. 4.5. Изменение пиковой интенсивности амплитудно-модулированно- го сигнала, показанного на рис. 4.4, дает ССИ (интерферограмму) для из- мерения tp Частота амплитудной модуляции отвечает химическому сдвигу сигна- ла. Говорят, что намагниченность является помеченной частотой от- 540
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса носительно tb Если подвергнуть эту временную зависимость Фурье-пре- образованию, получим резонансный сигнал с химическим сдвигом v Гц в измерении fb совершенно аналогичный тому, который можно получить в измерении f2. В приведенном выше примере мы заранее знали, что нужно следить за интенсивностью сигнала в точке, которая отвечает частоте его поглощения. В реальных спектрах частоты поглощения сигналов являются совершенно произвольными. Поэтому для формирования непрямого измерения прихо- дится следить за интенсивностью сигналов во всех точках спектра с опре- деленными промежутками между ними и для каждого варианта выполнять Фурье-преобразование. Таким образом, для построения двумерного спект- ра проводится мониторинг интенсивности каждой точки данных в измере- нии f2 как функции ti. В этом случае получим полный двумерный набор данных. Последующие Фурье-преобразования относительно ti формируют новое частотное измерение, которое в совокупности с частотным измере- нием fi дает двумерный спектр. В таком спектре в обоих измерениях при- сутствует единственный сигнал с частотой v Гц (рис. 4.6). Рис. 4.6. Двумерный спектр, полученный с помощью последовательности, которая приведена на рис. 4.2, для образца, содержащего единственный спин. Пик имеет сдвиг v Гц в обоих измерениях. Обозначение частотных осей как fi и f2 вытекает из порядка соответ- ствующих временных интервалов в импульсной последовательности. Оно 541
Глава 4. Корреляционная 2В-спектроскопии ЯМР (COSY) Рис. 4.7. Обобщенная схема сбора дву- мерных наборов данных. Эксперимент повторяется много раз с пошаговым уве- личением периода Ц. Полученные ССИ запоминаются отдельно. Последующее двойное Фурье-преобразование относи- тельно t2, а затем относительно Ц при- определяется тем, что интервал t2 находится после интервала Ц. Но- вое непрямое (ц) временное изме- рение образуется точка за точкой путем измерения сигнала ССИ для каждого значения tj (рис. 4.7) и раздельной записи этих ССИ в памяти компьютера. Таким образом, получаем се- рию сигналов ССИ, каждый из которых записан для опреде- ленного ti (в одномерном спект- ре записываются точки одного ССИ как функция t2). Этот под- ход является общим для любого двумерного эксперимента. Дан- ную идею можно распространить на три и большее количество из- мерений. Так, импульсная по- следовательность для получения трехмерного спектра содержит три временных интервала. В та- ком эксперименте одно измере- ние детектируется прямо, а два - опосредованно (рис. 4.8). водит к получению двумерного спектра. Рис. 4.8. Схема (а) двумерных и (б) трехмерных экспериментов. Накопле- ние данных в 3D эксперименте происходит при варьировании независи- мых переменных интервалов tj и t2. В результате, по аналогии с двумер- ным экспериментом, возникают независимые измерения fi и f2. 542
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 4.1.1. Перенос когерентности как механизм образования кросспиков Теперь рассмотрим более общий случай воздействия импульсной последо- вательности, которая изображена на рис. 4.2, на спиновую систему двух одинаковых ядер, между которыми существует спин-спиновое взаимодей- ствие. Одномерный спектр такой системы содержит четыре линии, сосре- доточенные в двух дублетах. Действие первого импульса последовательнос- ти приводит к переносу всех компонентов намагниченности в поперечную плоскость и сосредоточению их вдоль одной оси, которая определяется фа- зой первого импульса. Таким образом, первый импульс приводит к возник- новению когерентности векторов намагниченности, которые описывают химические сдвиги и КССВ имеющихся сигналов. Дальше, в период эво- люции, в СКО начинается расхождение векторов соответственно частотам их прецессии. Наиболее интересен результат воздействия второго импуль- са, который соответствует периоду смешивания. Этот импульс, в отличие от первого, воздействует на намагниченность, находящуюся в поперечной плоскости. Вспомним, что при рассмотрении одномерных спектров мы уже стал- кивались с тем фактом, что в спиновых системах, где присутствует ССВ, возможен перенос заселенности с одного спина на другой (перенос поля- ризации). Для этого необходимо подать дополнительный импульс в тот мо- мент, когда векторы намагниченности взаимодействующих ядер прецесси- руют в поперечной плоскости, а компоненты спинового дублета одного из них, с которого происходит процесс переноса заселенности, взаимно пер- пендикулярны. Этот процесс, хотя и менее эффективно, протекает и при других взаимных ориентациях данных векторов, поскольку произвольный вектор в плоскости х-у можно представить как два взаимно перпендику- лярных вектора, направленных вдоль осей х и у. Поэтому какая-то часть векторов спиновых мультиплетов всегда оказывается антипараллельной. Это проиллюстрировано на рис. 4.9, где показано, что компоненты дублета в ВСК через произвольный период Д всегда имеют составляющую взаимно перпендикулярной ориентации векторов. Перенос поляризации является частным случаем более общего явления переноса когерентности. Для понимания механизма переноса когерентнос- ти можно предложить такую механическую модель: во время действия им- пульса на спиново-связанную систему, намагниченность которой находит- ся в поперечной плоскости, спины как будто бы объединяются в один клас- тер и становятся неразличимыми. Все они при этом ориентированы вдоль оси, которая определяется фазой импульса. Их движение полностью конт- ролируется подаваемым импульсом, про наличие собственных частот пре- цессии спины ’’забывают”. При этом данное образование содержит все час- тоты, которые были присущи каждому отдельному спину. По окончании 543
Глава 4. Корреляционная 2П-спектроскопии ЯМР (COSY) действия импульса такой кластер спинов распадается, но частоты спинов теперь "не могут найти своих первичных хозяев" и распределяются равно- мерно между всеми спинами. Поэтому в результате действия второго импульса первичная намагниченность одного спина перераспределя- ется на все другие спины, которые имеют с ним спиновую связь. Про- цесс переноса когерентности реализуется только при наличии ССВ. Рис. 4.9. Возникновение взаимно перпендикулярной составляющей векто- ров, описывающих спиново-связанную систему, а) Картина после возбуж- дающего 90°-импульса; б) ориентация векторов через произвольный про- межуток времени Д; в) результат разложения векторов на составляющие, ориентированные вдоль координатных осей. В случае гетероядерного взаимодействия процесс переноса когерент- ности можно легко проиллюстрировать с помощью диаграмм заселенности и векторной модели (последовательность INEPT), поскольку влияние им- пульсов на протоны и на ядра углерода можно рассматривать отдельно. В случае гомоядерных взаимодействий сделать это намного сложнее, посколь- ку все спины подвергаются влиянию импульсов одновременно. При этом простой иллюстрации физических процессов получить не удается. Тем не менее, во всех разновидностях двумерной спектроскопии в период смеши- вания происходит именно процесс переноса когерентности. Дальней- шее подтверждение такой аналогии вытекает из сравнения базовой после- довательности COSY на рис. 4.2 и последовательности INEPT на рис. 3.36. Если не обращать внимания на рефокусирующий 180°-импульс в INEPT, то две последовательности оказываются практически идентичными. В них обеих после первичного возбуждения имеется период эволюции, после че- го оба связанных спина подвергаются воздействию импульса, который вы- зывает перенос когерентности. 544
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Концепция когерентности и переноса когерентности является общей для большинства экспериментов ЯМР. К чему приводит такой перенос в спектре COSY, рассмотрим на примере простейшего случая двух спиново- связанных протонов. Пусть система состоит из двух спинов А и X, между которыми имеется КССВ ДА^Х). Протоны имеют химические сдвиги vA и vx. Намагниченность, которая связана со спином А, после первичного 90°-импульса во время периода ti прецессирует в соответствии с его хи- мическим сдвигом vA. Аналогично ведет себя и намагниченность спина X. Действием первого импульса она также переносится в поперечную плос- кость и прецессирует соответственно химическому сдвигу ядра X на часто- те vx. Как мы уже знаем, для векторов, описывающих компоненты дубле- тов А и X во время их эволюции в поперечной плоскости, в каждый произ- вольный момент времени существует определенный вклад антипараллель- ных компонент намагниченности. Величина такой составляющей изменя- ется во времени соответственно синусоидальной функции. Второй 90°-им- пульс равномерно перераспределяет намагниченность между связанными спинами в случае антипараллельной ориентации компонентов одного из мультиплетов. Таким образом, он переносит некоторую часть этой намаг- ниченности от спина А на связанный с ним спин X, а часть намагничен- ности остается связанной со спином А. Та намагниченность, которая остается связанной со спином А, в пери- од детектирования продолжает прецессировать с частотой vA так же, как это было и в период ti. Поэтому в конечном спектре она даст пик с коорди- натами vA в обоих измерениях. Его можно обозначить (vA, vA). Поскольку пик имеет одинаковую частоту в обоих измерениях, он располагается на диагонали 2О-спектра и называется диагональным пиком. В отличие от этого, перенесенная когерентность во время периода t2 будет прецесси- ровать на частоте "нового хозяина" - спина X. Поэтому она даст пик, который имеет в двух измерениях разные химические сдвиги (vA, vx). Этот пик расположен вне диагонали и потому называется недиагональным или, более часто, кросспиком (рис. 4.10). Этот пик представляет особый интерес, поскольку он является свидетельством наличия спиновой связи между ядрами А и X. Совершенно аналогичный процесс переноса когерент- ности осуществляется и в обратном направлении. Часть намагниченности от спина Xпереносится на спин А. При этом образуются диагональный пик (vx, vx) и кросспик (vx, vA). Таким образом, спектр COSY содержит два типа сигналов - диагональ- ные, являющиеся полными аналогами сигналов в соответствующем одно- мерном спектре, и кросспики, возникающие за счет переноса когерентности. Спектр COSY представляет собой квадрат, симметричный относительно диагонали с кросспиками по обеим сторонам от нее. 545
Глава 4. Корреляционная 2В-спектроскопии ЯМР (COSY) о е> О €> ф €> Va Vx О О О с о о о « VA Рис. 4.10. COSY спектр спиново-связанной системы АХ. Диагональные пики эквивалентны тем, которые наблюдаются в одномерных спектрах, а кросспики свидетельствуют о наличии ССВ между пиками. ССВ в данном случае является параметром корреляции. \ 7 \ f\ 1 6Р- 2 5 Р--/Р' | 4 Р— 4.1 3 Эксперимент COSY не ограничивается протонной спектроскопией. Он пригоден для установления гомоядерных корреляций между любыми спи- нами с высоким естественным содержанием. Наиболее часто он применяется в спектроскопии на ядрах 19F, 31Р, 11В. На рис. 4.11 показан спектр COSY 31Р-31Р, получен- ный для соединения Р7(СН3)5 4.1. Процедура отнесения сигналов здесь полностью аналогична той, которая была описана для протонов в первой главе книги. В данном случае существование бицикла между атомами фосфора удается доказать на основании наличия КССВ через две связи между ато- мами Р2 и Р7. 546
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 4.11.31Р-31Р COSY спектр Р7(СНз)5; внизу показан одномерный 31Р спектр соединения. На спектре указаны номера атомов фосфора в соответ- ствии со структурной формулой соединения 4.1. 4.1.2. Тонкая структура пиков в спектрах COSY Спектр, который приведен на рис. 4.11, иллюстрирует то, что как диаго- нальные пики, так и кросспики имеют тонкую структуру, аналогично тому, как это наблюдается в одномерных спектрах. То, как эта тонкая структура проявляется в спектрах, зависит от условий осуществления сбора данных. В примере, который показан на рис. 4.11, данные были собраны таким об- 547
Глава 4. Корреляционная 2В-спектроскопии ЯМР (COSY) РР Рис. 4.12. Энергетическая диаграмма для двухспино- вой системы АХ. разом, чтобы сохранились детали тонкой структуры. Часто, чтобы сокра- тить время эксперимента, спектры COSY записывают с недостаточным ко- личеством точек в двумерном массиве данных. В таких спектрах кросспики оказываются неструктурированными, однако время получения спектра со- кращается во много раз. Именно с такими спектрами чаще всего приходит- ся иметь дело при рутинных измерениях. При анализе одномерных спектров мы привыкли к тому, что спектр спиновой системы АХ имеет вид двух дублетов. В соответствующем дву- мерном спектре такой спиновой системы ко- личество компонентов мультиплетов намно- го больше. Так, на рис. 4.10 можно насчи- тать 16 отдельных пиков. Для понимания природы тонкой структуры в двумерном эксперименте необходимо учитывать, что перенос когерентности происходит не прос- то между связанными спинами, а, что бо- лее точно, между переходами, связанными с этими спинами. Это иллюстрирует диаг- рамма энергетических уровней для связан- ной двухспиновой системы, показанная на рис. 4.12. Намагниченность, которая связана, ска- жем, с переходом Аь отвечающим одному из компонентов дублета спина А, при дейст- вии второго импульса последовательности COSY переносится на другие три перехода - А2, Xi и Х2. Это означает, что в спектре появляется соот- ветствующее количество кросспиков. Аналогичный перенос когерентности происходит и для всех других переходов. Таким образом, как диагональные пики, так и кросспики являются совокупностью нескольких сигналов, ко- торые обусловлены переносом когерентности от соответствующих перехо- дов. Количество компонентов в сигналах определяется количеством спино- во-связанных переходов. Для двухспиновой системы количество компо- нентов в каждом кросспике равняется 4, для трехспиновой системы - 16. Если в спиновую систему входит больше трех ядер, то, как правило, пол- ностью проанализировать структуру спиновых мультиплетов не удается. Теперь для нас очевидно то, что природа образования кросспиков в дву- мерных спектрах отличается от природы возникновения пиков в одномер- ных спектрах. Помимо изменения количества компонентов в мультиплетах в двумерном спектре кардинальным образом меняется и фаза компонентов мультиплетов. Поскольку все кросспики в двумерном спектре образу- ются за счет переноса когерентности от противофазных компонентов 548
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса мультиплетов, то компоненты кросспиков также имеют противофаз- ную ориентацию. Это является существенным отличием спектров COSY от соответствующих одномерных спектров. 4,1.3. Особенности детектирования сигнала в двумерных экспериментах Мы уже знаем, что двумерный массив данных, который образуется в ре- зультате измерения спектра COSY, представляет собой прямоугольную матрицу, в которой каждая строка представляет собой ССИ, измеренный при фиксированном периоде смешивания. Каждый столбец такой матрицы представляет собой интерферограмму в непрямом измерении. Если пред- ставить матрицу данных в графическом виде, где амплитуда сигнала пер- пендикулярна осям ti и t2, то она будет иметь вид, показанный на рис. 4.13. Рис. 4.13. Графическое представление двумерного массива данных, кото- рый получается при измерении спектра COSY. Для каждого из измерений Фурье-преобразование осуществляется не- зависимо. Поэтому процесс детектирования двумерного спектра в принци- пе аналогичен детектированию одномерного спектра. Для того, чтобы понять, чем различаются отдельные разновидности ме- тодики COSY, рассмотрим данный эксперимент с точки зрения воздейст- вия импульсов на порядок когерентности, возникающей на отдельных эта- пах действия импульсной последовательности. Первый импульс вызывает появление двух разновидностей одноквантовой когерентности, которые различаются знаком. Их можно обозначить +1 и -1 (рис. 4.14). 549
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) Рис. 4.14. Диаграмма уровней ко- герентности до и после воздейст- вия первого импульса последова- тельности COSY. Пунктирная ли- ния показывает зеркальный путь переноса намагниченности, кото- рый удаляется при квадратурном детектировании. Если осуществить сбор данных не- посредственно после первого импуль- са на одноканальном детекторе, то в спектре получим два комплекта сигна- лов, соответствующих каждому из ти- пов когерентностей. Если частота им- пульса соответствует центру спектра, то сигналы, отвечающие когерентнос- ти разного знака, имеют вид отражений относительно центра спектра. Естест- венно, что такая ситуация является весьма нежелательной. Поэтому систе- мы детектирования сигналов в спект- рометрах ЯМР сконструированы так, чтобы удалять из спектра один из на- боров сигналов. Это осуществляется с помощью сочетания квадратурного де- тектирования, о котором мы уже упо- минали, и работы фазового цикла. В результате такого детектирования в спектре остается лишь один комплект сигналов. Фазовый цикл можно на- строить так, чтобы необходимая когерентность при реализации цикла накап- ливалась, а ненужная - уничтожалась. Для этого достаточно двухшагового цикла. На рис. 4.14 удаленный тип когерентности показан прерывистой линией, а тот путь, который использован при детектировании сигнала, - жирной линией. В двумерном эксперименте ситуация оказывается совершенно анало- гичной. В период эволюции, который следует за возбуждающим импуль- сом, мы имеем дело с существованием двух когерентностей. Можно считать, что в ВСК эти когерентности различаются направлением вращения векто- ров химических сдвигов. Присутствие обоих типов когерентности позво- ляет детектировать сигналы ЯМР, а также их зеркальное отражение по fb Для того, чтобы в период детектирования индицировалась когерент- ность только одного знака, эксперимент COSY можно реализовать по-раз- ному. На рис. 4.15 показаны возможные пути изменения когерентности в различных вариантах эксперимента. Проще всего следить за каким-то одним типом когерентности, напри- мер за тем, для которого р = -1. В этом случае можно получить две разно- видности эксперимента COSY. В одном из них выделяется когерентность, которая и на протяжении периода tj, и на протяжении периода t2 является отрицательной. Такую когерентность называют N-когерентностью. Во вто- ром варианте эксперимента когерентность во время периода Ц положитель- на, а во время периода t2 - отрицательна. Такую когерентность называют 550
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Р-когерентностью. Выделить тот или иной тип когерентности можно, если в фазовом цикле измененить фазу приемника на 180°. в) Фазочувствительный Рис. 4.15. Диаграммы уровней когерентности и пути переноса когерент- ности для (а) P-типа, (б) N-типа и (в) фазочувствительного COSY. Применение подходящей схемы детектирования удаляет один из сиг- налов на стадии накопления сигнала. Однако, в отличие от одномерного эксперимента, такое удаление одного из наборов сигналов вносит в дву- мерный спектр определенные искажения. Они связаны с изменением фазы сигналов в различных инкрементах. На рис. 4.166 показано расположение вектора намагниченности одного из сигналов для произвольного времени после воздействия возбуждающего импульса. Это время соответствует не- которому инкременту в двумерном эксперименте. Видно, что вектор намаг- ниченности располагается под некоторым углом к оси у. Этот угол будет определять фазу сигнала при сборе данных после второго импульса. Если измеряется единственный спектр, то сигнал можно сфазировать путем вво- да определенных фазовых коэффициентов. При изменении величины ин- тервала tb то есть при переходе к другому инкременту, угол 0 изменится. Поэтому для второго инкремента фазовые свойства сигналов будут дру- гими. Эти же рассуждения касаются и всех последующих инкрементов. 551
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) Поэтому в двумерном массиве данных фаза сигналов после квадратурного детектирования в измерении f2 оказывается неодинаковой для различных инкрементов. Это не дает возможности без определенной обработки полу- чать в двумерном спектре сфазированные сигналы. В двумерном спектре каждый из сигналов представляет собой непредсказуемую смесь сигналов поглощения и дисперсии. Рис. 4.16. (а) Для вычисления фазовых коэффициентов отдельных инкре- ментов требуется, чтобы оба вектора намагниченности, вращающиеся в противоположные стороны (когерентности порядка р = ±1), в течение ti были сохранены. В результате определяется амплитуда сигнала вдоль оси^ (серая стрелка), (б) Если сохраняется только один вектор (р = 1 или р = -1), то, поскольку фазовый угол 0 при прецессии изменяется, происходит фазо- вый разбаланс инкрементов. Математически можно показать, что, для того, чтобы рассчитать фа- зовые коэффициенты для независимых инкрементов двумерного спектра, а следовательно, получить сфазированные сигналы (фазочувствительный эксперимент COSY), в период ti должны быть сохранены оба пути перено- са когерентности, для которых р = ±1. В этом случае для каждого инкре- мента удается определить начальную амплитуду сигнала вдоль осей х и у (рис. 4.16а), а значит, и появляется возможность откорректировать его фазу. Соответственно тому, какой тип когерентности мы индицируем в экспе- рименте, существуют два варианта представления данных в спектроскопии COSY. Один из них, когда в период ti накапливаются данные об обоих ти- пах когерентности, для которых р = ±1, называется фазочувствительным представлением данных, а второй - экспериментом с данными в виде их абсолютных значений. В последнем случае вся фазовая информация ока- зывается утерянной, но получить спектр в абсолютных значениях можно за значительно более короткое время. Поэтому для выявления самого факта наличия спин-спинового взаимодействия чаще используют именно спект- ры в абсолютных значениях. Только в случаях, когда предполагается ана- лиз структуры мультиплетов в кросспиках, применяют фазочувствительное представление данных. Рассмотрим названные подходы более детально. 552
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 4.1.4. Представление 2D-спектра в абсолютных значениях Выделение только одного из двух возможных зеркальных наборов данных по Л достигается с помощью квадратурного детектирования. Оно реализу- ется при подходящем комбинировании наборов данных в фазовом цикле. Сложение двух наборов данных, полученных в последовательных опытах с циклированием фазы (таблица 4.1), выделяет те сигналы, которые имеют одинаковый знак прецессии во время ti и во время t2 (скажем, оба положи- тельные). Они дают сигналы типа Р. Вычитание во время фазового цикла выделяет сигналы, имеющие противоположное направление прецессии в периоды ti и t2 (например положительное во время ti и отрицательное во время t2). Таким образом, получаются сигналы N-типа. Информация, со- держащаяся в спектрах P-типа и в спектрах N-типа, полностью идентична. Они различаются как отражения относительно fj = 0. Таблица 4.1. Фазовые циклы COSY для отбора в измерении fi сигналов N-типа (эхо) или P-типа (антиэхо) N-тип Р-тип Импульс 1 Импульс 2 Сбор данных Импульс 1 Импульс 2 Сбор данных Шаг 1 X X X X X X Шаг 2 У X -х У X X Одним существенным различием Р- и N-спектров является то, что в N-спектрах прецессия в периоды ti и t2 различается по знаку. Ситуация здесь похожа на эксперимент спино- вого эха, в котором векторы движут- ся в противоположных направлениях до и после рефокусирующего импуль- са. Аналогичный эффект наблюдает- ся и для сигналов N-типа во время пе- риода t2. Такой эксперимент называ- ется ’’эхо переноса когерентности” (рис. 4.17). Поэтому выделение сиг- налов N-типа называют еще эхо-се- лекцией, а выделение сигналов Р-ти- па - антиэхо-селекцией. Для таких сигналов отсутствует эффект рефо- кусировки. Рефокусировка неодно- родностей поля при эхо-селекции, а также тот факт, что P-сигналы имеют Второй импульс COSY Рис. 4.17. Эхо переноса когерент- ности, полученное для ССИ набора данных COSY N-типа. больше искажений, приводят к тому, 553
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) что селекция сигналов N-типа является предпочтительной. На таких спект- рах диагональ направлена от нижнего левого угла в верхний правый, как это и наблюдалось для приведенных ранее спектров. Наибольшим недостатком данных, которые собраны при условиях се- лекции лишь одного типа когерентности, является то, что они представ- ляют собой смесь сигналов поглощения и дисперсии. Говорят, что сигналы имеют скошенную фазу. Форма такого сигнала приведена на рис. 4.18а. Для сравнения здесь приведен также сигнал, полученный с применением фазочувствительного представления (рис. 4.186). Рис. 4.18. Участок спектра с сигналом, полученным в условиях селекции сигнала N-типа (а), и с тем же сигналом в фазочувствительном экспери- менте (б). Как видно, сигнал N-типа имеет длинные крылья, неудобные для спект- роскопии высокого разрешения. Для исключения неудобств, которые связаны со смешиванием положительных и отрицательных компонен- тов интенсивности, сигналы обычно представляют в виде абсолютных значений, чаще всего после вычисления их магнитуды, М (рис. 4.19). Для вычисления магнитуды используют формулу: М = (реальный2 + мнимый2)172, где М отвечает результирующему спектру. При этом на основании имеющихся после сбора данных двух спектров - ’’реального" и "мнимого", которые эквивалентны во всем за исключением фазы сигналов (она сдвинута на 90°), вычисляют обобщенный спектр. В полученном спектре отсутствуют фазовые искажения сигналов, поскольку отрицательные их участки заменяются положительными. Хотя при такой обработке форма сигналов и искажается, однако в значительно меньшей степени, чем при перекосе фазы, возникающем в каждом из исходных спектров. 554
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 4.19. Контурное изображение (а) сигнала с искаженной фазой, (б) того же сигнала в виде магнитуды, (в) того же сигнала после повышения раз- решения с помощью функции несмещенного синусоидального колокола и вычисления магнитуды. Без дополнительной обработки качество полученных таким образом спектров оказывается неприемлемым. Поэтому для повышения разрешения применяется одна из нескольких сглаживающих функций (окон). Их ис- пользование позволяет удалить из спектра нежелательные крылья сигна- лов. Наиболее часто используется функция синусоидального колокола или квадратичного синусоидального колокола. Эти функции удобны для при- менения, поскольку имеют только один переменный параметр - положение максимума. Если используется функция без смещения, когда полуволна си- нуса имеет максимум в центре времени выборки, то результирующие пики не содержат дисперсионного компонента и отвечают адсорбционной фор- ме линии (рис. 4.19в). Функция синусоидального колокола использу- ется также для повышения интенсивности кросспиков относительно диагональных пиков. Это возможно, поскольку кросспики в начале вре- мени выборки имеют нулевую интенсивность. Диагональные пики, наобо- рот, в начале выборки имеют максимум интенсивности, и потому колоко- лообразное окно их ослабляет. Тем не менее, уменьшение интенсивности сигнала является проблемой для пиков с небольшим временем релаксации. Если сигналы довольно широки, они могут исчезнуть из спектра совсем, поскольку попадают под начальную часть колоколообразной функции. Поэтому при интерпретации спектров, полученных с использованием тако- го окна, следует осторожно относиться к интенсивностям кросспиков. Их малая интенсивность может не быть связанной с малой величиной КССВ. Проблемы могут возникнуть также при использовании окон, которые по- вышают разрешение сигналов. Их применение может способствовать уве- личению шумов и соответственно снижению чувствительности в спектре. Конечно, можно сместить окно в сторону начала ССИ, однако это приведет к росту интенсивности дисперсионного компонента в диагональных пиках. 555
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) Лучшими подходами являются использования фазочувствительных данных, которые не требуют применения функций, ограничивающих спектральное окно. Тем не менее, когда чувствительность не является лимитирующим фактором, магнитудные эксперименты имеют то преимущество, что они не требуют фазовой коррекции, поэтому они больше подходят для рутинной работы и для автоматизированных экспериментов. Особенно это касается эксперимента 0-COSY, который описан ниже. 4.1.5. Фазочувствителъные эксперименты COSY При описании детектирования одномерных спектров мы видели, что для получения спектра, в котором отсутствуют отраженные сигналы, следует использовать квадратурное детектирование. Напомним, что для его осу- ществления необходимо сигнал подавать на два детектора, настроенных так, чтобы фазовый сдвиг между ними составлял 90° В результате получа- ем два набора данных, один из которых называется ’’реальным”, а второй - ’’мнимым” Эти данные различаются фазовыми свойствами сигналов и мо- гут быть преобразованы один в другой путем введения соответствующих фазовых коэффициентов. Как и при квадратурном детектировании одномер- ного спектра, квадратурное детектирование по непрямому измерению fi также требует наличия двух наборов данных, которые различаются по фазе на 90° Поскольку измерение fi генерируется непрямым методом, то не су- ществует радиочастотного репера для определения фазы сигналов. Поэто- му фаза сигнала, который детектируется, определяется фазой самого им- пульса. Чтобы обеспечить образование двух наборов данных, для каж- дого значения (инкремента) ti последовательно проводятся два экспе- римента. В одном из них применяется подготовительный импульс 90°х. Во втором эксперименте используют импульс 90°г Данные, получен- ные в обоих экспериментах, собираются раздельно (рис. 4.20). Эти два набора данных эквивалентны сбору данных по двум каналам с их одновременным накоплением. В результате мы получаем возможность различить положительные и отрицательные частоты при комплексном Фурье-преобразовании в двух измерениях. Степень оцифровки по ti опре- деляется спектральной шириной fi и подчиняется тем же самым правилам, что и оцифровка одномерных данных. Данный метод был разработан Ста- том Д., Хабекорном Р. и Рабеном Д., поэтому в литературе он известен как метод Стата квадратурного детектирования по fi. Альтернативный подход состоит в устранении фазового сдвига сигна- лов между спектрами, измеренными для различных величин (для разных инкрементов), путем сдвига фазы сигналов в каждом инкременте на вели- чину, пропорциональную tj. Помимо этого спектральный диапазон изменя- ется от ±l/2sw до 0 +sw Гц, то есть при данном подходе все частоты стано- 556
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса вятся положительными и отпадает необходимость в устранении отражен- ных сигналов. При этом видимая эволюция частот в период ti будет более быстрой, чем на самом деле. Как и в описанном выше методе Стата, здесь нет стандарта радиочастоты для определения фазы сигнала в непрямом из- мерении. Поэтому применяется сдвиг фазы препарирующего импульса для каждого инкремента ti и проводится вдвое большая частота оцифровки сигнала, чем это делалось в методе Стата (с помощью деления пополам ин- кремента по ti). Для каждого периода tb таким образом, получают только один набор данных, однако количество самих инкрементов удваивается. Поэтому общее время сбора данных и соответственно цифровое разреше- ние в обоих методах оказываются одинаковыми. Такой подход к квадра- турному детектированию по fi называется фазовым инкрементом, пропор- циональным времени (в англоязычной литературе он известен как TPPI; именно такую аббревиатуру мы и будем для него использовать). набор данных 1 набор данных 2 Рис. 4.20. Метод Стата квадратурного детектирования по fi требует, что- бы для каждого инкремента были получены два набора данных. Это до- стигается путем воздействия на образец двух последовательных импуль- сов, фаза которых различается на 90° Методы Стата и TPPI дают эквивалентные наборы данных, хотя они отличаются интенсивностью артефактов и аксиальных пиков (см. ниже). В разных спектрометрах может быть реализована разная схема квадратурно- го детектирования. На новейших приборах чаще всего можно реализовать любую из схем. Независимо от схемы детектирования в памяти компьюте- ра формируются независимые области, в которых содержатся мнимая и реальная части данных, которые получаются при Фурье-преобразовании относительно h и t2. При образовании одномерного спектра существовало лишь две таких области, а для двумерного спектра их формируется четыре. 557
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) При построении двумерного спектра происходит комбинирование не- зависимых данных, которые получены для каждого из измерений. Очевидно, что путем комбинации имеющихся реальных и мнимых частей данных можно получить четыре варианта. Из четырех возможных наборов данных (рис. 4.21) только данные (’’реальный, реальный”) являются важны- ми для использования и записываются как конечный фазочувствительный 2О-спектр. Другие наборы данных не поддаются фазовой коррекции, поскольку каждый сигнал в них является комбинацией сигнала поглощения в одном измерении и сигнала дисперсии в другом измерении. Для постро- ения 2В-спектров используют только данные, отвечающие поглощению в обоих измерениях. Это связано с тем, что в этом случае достигается наибо- лее высокое разрешение сигналов (рис. 4.21, квадрант RR). Рис. 4.21. Четыре типа фазочувствительных наборов данных. Только тип RR можно использовать для получения 2В-спектра, поскольку в этом случае в обоих измерениях пики имеют вид сигналов поглощения, что обеспечивает наиболее высокое разрешение (R = реальный, I = мнимый). Знаком ”+” обозначены области положительного поглощения. 558
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 4.1.6. Фаза сигналов в фазочувствителъном COSY Прежде чем приступить к анализу двумерных спектров в фазочувствитель- ном представлении, важно иметь сведения о фазовых свойствах диагональ- ных пиков и кросспиков, содержащихся в 2О-спектре. Для спектра COSY, как было показано выше, диагональные пики образуются из компонентов намагниченности спиновой системы, которые не принимают участия в пе- реносе когерентности. Поэтому компоненты диагональных пиков всегда в обоих измерениях имеют одинаковую фазу. В отличие от этого, кросспики образуются путем переноса намагни- ченности от противофазных компонентов мультиплетов. Поэтому в обоих измерениях компоненты кросспиков имеют противофазную ориента- цию. Кроме того, начальная фаза наборов диагональных и недиагональных сигналов также различается на 90°, поскольку диагональные пики образо- ваны за счет намагниченности, которая модулирована в соответствии с функцией косинуса, а кросспики имеют фазу, соответствующую синусои- дальной модуляции. Вследствие этого в конечном спектре фазы диаго- нальных сигналов и кросспиков также различаются на 90° Как и в случае одномерных спектров, исходные фазовые свойства сиг- налов можно изменить с помощью процесса фазировки. Это дает возмож- ность присвоить полезным сигналам ту фазу, которая обеспечивает наибо- лее удобную их обработку. Поэтому после получения двумерного спектра осуществляют его фазировку в двух измерениях. При этом следует учесть, что фазировка не дает возможности изменить фазу одних сигналов относи- тельно других, она, как и в одномерных спектрах, лишь устраняет зависи- мость фазы от частоты сигнала. При анализе одномерных спектров мы привыкли, что сигналы должны иметь вид сигналов поглощения. Поэтому кросспики, которые представ- ляют наибольший интерес, фазируют после получения спектра так, чтобы они имели форму линии, которая отвечает чистому поглоще- нию в обоих измерениях. При этом фазовое состояние диагональных пиков будет отвечать двойной дисперсии (рис. 4.22). Таким образом, мы видим, что фазочувствительный двумерный спектр, в отличие от одномерного, содержит сигналы различной фазы. Даже когда мы говорим о том, что сигналы имеют вид сигналов поглощения, то и тогда следует помнить, что компоненты мультиплетов имеют проти- вофазную ориентацию. Присутствие в спектре дисперсионных диагональ- ных сигналов может привести к тому, что их широкие крылья могут маски- ровать полезные сигналы, которые расположены вблизи от диагонали дву- мерного спектра. Одним из популярных вариантов эксперимента, который устраняет этот недостаток, является эксперимент DQF-COSY. Противофаз- ная природа кросспиков в спектре COSY также может вызвать определен- 559
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) ные затруднения в случаях, когда величины спиновых расщеплений малы по сравнению с использованным цифровым разрешением спектра. В этом случае происходит взаимное уничтожение линий мультиплета и искажение формы кросспика. Эти эффекты могут затруднить анализ формы кросспи- ков при наличии малых КССВ. Рис. 4.22. Фазочувствительный спектр COSY для связанной двухспиновой системы АХ. Диагональные пики имеют вид широких сигналов дисперсии в двух измерениях (D), тогда как кросспики имеют вид узких сигналов поглощения в обоих измерениях (А). Это наглядно видно в приведенном сверху одномерном срезе спектра, который проходит через центр сигнала. 4.1.7. Аксиальные пики Аксиальные пики - это артефакты эксперимента, которые связаны с тем, что во время периода эволюции ti для каждого из сигналов спектра су- ществует компонента продольной намагниченности (она направлена вдоль 560
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса оси z). Эта компонента возникает за счет отличия возбуждающего импуль- са от 90° и в связи с наличием релаксационных процессов в период tj. Под действием смешивающего импульса эта намагниченность переносится в плоскость х-у, перпендикулярную к направлению внешнего поля. Поэтому в период t2 ее можно детектировать. Поскольку данная намагниченность не эволюционирует в период tb она не является частотно-помеченной и пото- му ее частота fi = 0. Пики, которые возникают в спектре из-за этой намаг- ниченности, могут быть связанными со всеми спинами спектра. Поэтому они представляют собой полосу сигналов при Л = 0, которая содержит все сигналы, имеющиеся в спектре. Для метода Стата и метода абсолютных значений полоса аксиальных пиков отвечает центру измерения fj (рис. 4.23). Рис. 4.23. Аксиальные пики в COSY спектре дают полосу сигналов вдоль f2 (а) в середине fi (метод Стата или представление данных в абсолютных значениях) или (б) в высокочастотном конце спектра (набор данных TPPI). Такие пики могут совпадать с реальными кросспиками. Если для квад- ратурного детектирования по fi используется метод TPPI, аксиальные пики оказываются смещенными к тому концу спектра, который, как описано вы- ше, отвечает fi = 0. Хотя такие пики и являются нежелательными, в данном случае они не могут совпадать с кросспиками. Удаление аксиальных пиков осуществляется путем повторения экспе- римента с инвертированием фазы приемника. Поскольку фаза аксиальных 561
Глава 4. Корреляционная 2О-спектроскопии ЯМР (COSY) пиков остается неизменной, то они удаляются, если в фазовом цикле вы- честь один из наборов данных из другого. Эта процедура дает также воз- можность нейтрализовать ошибки, связанные с дефектами установки фазы приемника. Для предотвращения одновременного исчезновения полезных сигналов фазу первого (препарирующего) импульса также инвертируют со- ответственно фазе приемника. В результате получаем двухшаговый фазо- вый цикл, который приведен в таблице 4.2. Таблица 4.2. Основной двухшаговый фазовый цикл для устранения акси- альных пиков Импульс 1 Импульс 2 Приемник Скан 1 X X X Скан 2 -X X -X Таким образом, если учесть, что для получения самого спектра COSY мы уже использовали двухшаговый цикл, то минимальное общее количест- во шагов в данном эксперименте равно 4. 4.1.8. Инструментальные артефакты В 2О-спектрах, в зависимости от особенностей эксперимента, могут появ- ляться и другие артефакты. Здесь мы обсудим две наиболее важные их раз- новидности. Они связаны с несовершенством приборов, и их влияние на спектр определяется конкретным имеющимся оборудованием. Однако в любом случае следует быть готовым распознать эти артефакты и знать их природу. 4.1.8.1. /2-квадратурные артефакты Артефакты, которые расположены вдоль f2, во многих отношениях близки к тем, которые наблюдаются в 1 D-спектрах. Поэтому для их удаления из спектров применяются аналогичные приемы. Артефакты зеркального отра- жения возникают вследствие разбалансировки квадратурного приемника. Они могут быть подавлены с помощью дополнения обычного четырехша- гового фазового цикла COSY фазовым циклом CYCLOP, который исполь- зуется также и для обработки одномерных спектров. В этом случае фазу каждого импульса на каждом шаге фазового цикла изменяют на 90° Одно- временно изменяется и фаза приемника. Такая процедура приводит к четы- рехкратному росту продолжительности фазового цикла. В современных приборах интенсивность квадратурных артефактов довольно низка и ис- пользование CYCLOP может оказаться ненужным. При этом время экспе- римента удается сократить. 562
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 4.1.8.2. tj-шум При оцифровке данных во время 2О-эксперимента, как и в случае одномер- ных экспериментов, происходит оцифровка также и теплового шума, кото- рый возникает в датчике и предусилителе. Поэтому в 2В-спектре имеется определенная плоскость, ниже которой сигналы тонут в шумах. Кроме это- го шума, который более или менее равномерно распределен по всей площа- ди спектра, в 2О-спектрах содержатся артефакты, которые называются ti-шумами. Они проявляются как полосы дополнительного шума, па- раллельные оси проходящие через точки диагонали в местах, где присутствуют резонансные сигналы. В ряде случаев наличие tj-шума сильнее мешает наблюдению пиков в 2В-спектре, чем наличие теплового шума. Возникновение ti-шума связано с нестабильностью прибора, которая приводит к флуктуациям интенсивности и фазы сигналов от скана к скану. Эти флуктуации при проведении Фурье-преобразования по t] воспринима- ются приемником как своеобразная модуляция частот имеющихся сигна- лов поглощения. Поэтому вместо одной частоты в измерении f] получаем полосу сигналов. Их интенсивность пропорциональна интенсивности соот- ветствующего сигнала в одномерном спектре (рис. 4.24). 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 м.д. Рис. 4.24. Вид двумерного спектра при наличии полос tj-шума. 563
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) Наиболее интенсивные полосы шума сопровождают высокие узкие пи- ки, особенно синглеты. Нестабильность прибора, которая служит причиной появления tj-шума, включает ряд факторов. Здесь - и нестабильность фазы и амплитуды радиочастотных импульсов, и нестабильность частотного ло- ка, и неоднородность поля. Со всеми этими факторами приходится бороть- ся разработчикам спектрометров. С каждым годом здесь достигается все больший прогресс, хотя полностью проблема не решена и до сих пор. При проведении сбора 2О-данных существует ряд приемов, минимизирующих артефакты. Приемы здесь приблизительно те же самые, что и в разностной спектроскопии. Они позволяют сохранить полезные сигналы и удалить не- нужные (см., например, эксперимент разностного ЯЭО). Использование мощного узкого сигнала лока дает возможность повысить стабильность по- ля и частоты, а применение процедур автошиммирования для шимм низко- го порядка повышает воспроизводимость сигналов при их продолжитель- ном накоплении. Важна также правильность приготовления образца. Ста- бильность магнитного поля, естественно, также весьма важна. Поэтому во время эксперимента не следует вблизи спектрометра перемещать предметы из магнитных материалов. Если образец недостаточно концентрирован, на качество спектра может повлиять даже движение людей за дверью лабора- тории. Следует также обеспечить стабильность температуры в датчике. Для этого чаще всего используется специальная температурная приставка. Необходимо также, чтобы измеренный образец находился в химически равновесном состоянии. Особенно это важно в случаях, когда в растворе протекают обменные процессы. Рекомендуется при проведении двумерных экспериментов не вращать образец в межполюсном зазоре, поскольку вра- щение приводит к дополнительной модуляции детектируемых сигналов. Все названные факторы вносят свой вклад в интенсивность Ц-шума. Сей- час, когда приборы и методы обработки достаточно совершенны, Ц-шум имеет сравнительно небольшое влияние на конечный двумерный спектр. Для удаления tj-шума проводится специальная математическая обработка спектра, которая называется симметризацией. 4.1.8.3. Артефакты симметризации Нежелательный tj-шум можно уменьшить с помощью специальной обработ- ки собранных данных. Одной из наиболее общих методик для COSY-экспе- риментов с представлением пиков в виде абсолютных значений является симметризация. Она включает замену точек данных, которые располо- жены симметрично относительно диагонали, на меньшее из двух име- ющихся значений. При этом кросспики оказываются неизменными, в то время как несимметричные артефакты существенным образом подавля- ются. Поскольку Ц-шум несимметричен относительно диагонали спектра, 564
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса то он эффективно подавляется с помощью симметризации. Тем не менее, данный прием следует применять с осторожностью, поскольку он может со- хранить артефакты, которые являются симметричными относительно диаго- нали. Так могут быть сохранены некоторые участки ti-шума, которые свя- заны с интенсивными синглетами. В этом случае их можно принять за кор- реляционные пики. Ошибок чаще всего удается избежать, если сравнить симметризованный и несимметризованный спектры. Данный метод не сле- дует применять в случае обработки фазочувствительных данных, поскольку он может вызвать искажения структуры кросспиков и потерю чувствитель- ности. Поэтому метод симметризации имеет определенные ограничения. Практически полного исключения из спектра ti-шума можно дос- тичь в экспериментах COSY при выделении полезных сигналов с по- мощью импульсных градиентов. 4.1.9. Особенности сбора 2О-данных Современные спектрометры ЯМР позволяют измерять спектры COSY в автоматическом или полуавтоматическом режиме. В первом случае все параметры, необходимые для измерения, задаются автоматически исходя из предварительно измеренного одномерного спектра. В таком варианте за- писи спектра Вам как заказчику нет необходимости составлять для опера- тора подробную инструкцию проведения эксперимента. Поскольку мате- матическое обеспечение спектрометров сейчас достаточно совершенно, то в нем запрограммированы наиболее целесообразные значения всех пара- метров записи спектра. Результатом является получение спектра COSY до- статочно высокого качества. В полуавтоматическом режиме записи спект- рометр запрашивает у оператора, какие параметры задать при измерении спектра. Как правило, можно менять количество инкрементов (чаще всего задаются 128, 256 или 512 инкрементов) и ширину спектра (SW). Однако для того, чтобы полученный спектр COSY позволил Вам извлечь из него необходимую информацию, следует измерять его только после анализа со- ответствующего одномерного спектра. 1 D-спектр должен удовлетворять следующим условиям: во-первых, концентрация образца должна быть та- кой, чтобы спектр не имел значительных шумов при измерении спектра с одного скана; во-вторых, образец не должен содержать осадка нераство- рившегося вещества, поскольку это значительно уменьшит интенсивность кросспиков; в-третьих, сигналы в спектре не должны быть уширенными, поскольку уширения связаны с уменьшением времени релаксации Т2, ко- торое также оказывает сильное воздействие на интенсивность кросспиков. Поэтому, если измеренный Вами одномерный спектр имеет невысокое ка- чество, следует, прежде всего, либо подобрать другой растворитель, либо провести работы по дополнительной очистке образца. Измерять спектры 565
Глава 4. Корреляционная 20-спектроскопии ЯМР (COSY) COSY для образцов с некачественным одномерным спектром - задача практически бесперспективная. Если же в силу каких-либо причин приходится самостоятельно уста- навливать или менять параметры измерения двумерного спектра, то необ- ходимо четко представлять себе, как изменяемый параметр скажется на ви- де спектра и времени его записи. Ниже мы приведем несколько важнейших правил, которые помогут читателю не сделать ошибки при изменении па- раметров записи спектра. Имеются два наиболее важных параметра, которые определяют резуль- тативность эксперимента COSY. Это время эксперимента и величина раз- решения сигналов в спектре. Эти параметры взаимосвязаны - чем выше не- обходимое разрешение, тем больше времени требует эксперимент. Задача исследователя - получить как можно более качественный спектр за наимень- шее возможное время. Ключ к решению проблемы оптимизации данных двух параметров лежит в выборе количества точек в спектре (количество точек в измерении tj) и количества инкрементов (количество точек в изме- рении t2). Прежде всего, следует отметить, что добавление дополнительных точек в измерении t2 приводит к сравнительно малому возрастанию дли- тельности эксперимента, хотя размер матрицы данных при этом и возрас- тает. С другой стороны, добавление точек данных по ti требует записи дополнительных ССИ, причем по нескольку на каждый инкремент. Это приводит к значительному росту времени сбора данных. Поэтому необходимо свести количество инкрементов по ti к минимуму, который не- обходим для достаточного разрешения полезных корреляций. При этом для получения более высокого разрешения можно увеличить количество точек по t2. По этой причине цифровое разрешение по f2 обычно намного больше, чем по fi. В частности, это справедливо и для фазочувствительных экспе- риментов. Использование малого времени сбора данных (AQd) также по- лезно с точки зрения повышения чувствительности, поскольку в этом случае используется лишь начальный, наиболее интенсивный участок интерферо- граммы. Однако отрицательным следствием использования недостаточно- го времени сбора данных является обрезание части данных в измерении tj. Поэтому для уменьшения интенсивности артефактов, связанных с обреза- нием спектра, необходимо применение соответствующей сглаживающей функции. Для спектра COSY одним из факторов, который определяет минималь- ный уровень оцифровки имеющихся в спектре противофазных кросспиков, является то, что при слишком грубой оцифровке противофазные сиг- налы, которые расположены близко один от другого, могут взаимно уничтожаться, понижая общую интенсивность кросспика. Для COSY в абсолютных значениях наибольший интерес представляет само наличие корреляций. Тонкая структура пиков при этом значительно менее важна. В 566
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса этом случае можно использовать уровень оцифровки, минимально необхо- димый для фиксации корреляций. Существует правило, согласно которому минимальное разрешение в таком спектре COSY должно составлять от J до 2J на точку (в Гц) и соответственно время сбора данных должно равняться от 1/J до 1/2/ с. Эти параметры являются достаточными для выявления кор- реляций, которые имеют величину / Гц или больше. Таким образом, для нижней границы КССВ, скажем 3 Гц, цифровое разрешение должно сос- тавлять 3-6 Гц/точка (AQ ~ 300-150 мс). Время сбора данных для ti обыч- но равняется половине времени сбора данных для t2. Поскольку конечная матрица данных должна содержать одинаковое количество точек в обоих измерениях, для увеличения количества точек в измерении ti используется один уровень нулевого заполнения по tb то есть к массиву данных при- бавляют равный ему массив нулевых значений. При этом, как это и нужно для последующей симметризации спектра, цифровое разрешение в обоих измерениях оказывается одинаковым. При накоплении данных в фазочувствительном эксперименте надо учи- тывать, что в этом случае основная информация может содержаться в мультиплетной структуре кросспиков. Для ее адекватного представления необходимо более высокое цифровое разрешение. Для большинства слу- чаев необходимо иметь разрешение не хуже, чем //2 Гц/точка. Для этого необходимо, чтобы время сбора данных AQ равнялось 2// с или больше. Степень оцифровывания по t2 в фазочувствительных экспериментах обыч- но в 2 или даже в 4 или 8 раз выше, чем по tb Для того, чтобы в обоих изме- рениях массива полученных данных содержалось одинаковое количество точек, в измерении tj следует использовать соответствующую кратность нулевого заполнения. При этом всегда необходимо учитывать, что продол- жительность периода сбора данных является естественным пределом раз- решения пиков. Общим правилом является то, что для более высокого разрешения необходим более продолжительный период сбора данных. Определив приемлемый уровень оцифровки и объема данных, остается выбрать количество сканов для каждого ССИ и интервал между сканами. Для этого вводится специальный релаксационный промежуток. Минималь- ное количество сканов определяется количеством шагов в фазовом цикле, который используется для выделения полезных сигналов. Для подавления артефактов, связанных с несовершенством импульсов, можно вводить так- же дополнительные сканы. Поскольку большинство экспериментов прово- дится при стационарных условиях, следует включать в эксперимент также мнимые сканы. Они подаются перед началом накопления сигнала и служат для того, чтобы спиновая система во время всего эксперимента находилась в стационарном состоянии. В современных спектрометрах, которые имеют двойной буфер памяти, мнимые сканы необходимы только в самом начале каждого эксперимента. Поэтому их использование вносит очень малый 567
Глава 4. Корреляционная 20-спектроскопии ЯМР (COSY) вклад в общее время эксперимента. На более старых спектрометрах следу- ет вводить мнимые сканы для каждого инкремента tj. При этом общее время эксперимента может существенно возрасти. Время между сканами зависит от времени протонной релаксации Tj, и, поскольку в программах исполь- зуются 90°-импульсы, для получения оптимальной чувствительности им- пульсы надо подавать через 1.3Т1 с. 4.1.10. Обработка данных в эксперименте 2D Принципы проведения процедуры обработки любого 2В-массива данных практически одинаковы. Последовательность основных операций обработ- ки представлена на рис. 4.25. Смысл отдельных математических операций над полученным массивом данных становится понятным, если вспомнить, что данные представляют собой квадратную матрицу, в которой измерения отвечают интервалам Ц и t2 двумерного эксперимента. С математической точки зрения оба измерения являются эквивалентными, поэтому каждая строка (измерение t2) и каждый столбец (измерение Ц) массива представля- ют собой интерферограмму. Если сначала выполнить Фурье-преобразова- ние всех строк, то получим матрицу, в которой в одном измерении будет содержаться спектр, а в другом - интерферограмма. Последующее Фурье- преобразование всех колонок даст матрицу, графическое представление которой и является двумерным спектром. Все другие процедуры являются вспомогательными, хотя и необходимыми для получения качественного 2В-спектра. Детали выбора параметров на каждой стадии зависят от совершенства прибора, условий сбора данных и природы исследуемого образца. Поэтому здесь представлены только основные принципы обработки данных. Техни- ка обработки данных для двумерных спектров особенно важна, поскольку от оператора зависят выбор параметров обработки, а следовательно, и вид конечного спектра. Для качества спектра наиболее важен тип сглажива- ющей функции. Она сильно различается для наборов данных в абсолютных значениях и в фазочувствительных модификациях. Сначала мы обсудим случай фазочувствительных спектров. Применение функции сглаживания преследует три основные цели: • уменьшить артефакты, связанные с обрезанием массива данных по Ц; • повысить разрешение спектра; • оптимизировать соотношение сигнал/шум. В связи с тем, что при записи 2Э-спектров приходится использовать недостаточное время сбора данных, то, как правило, в одном или даже в обоих измерениях имеет место обрезание данных. Это происходит, когда выборка заканчивается раньше, чем интерферограмма спадет до нуля. 568
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 4.25. Типичная схема обработки двумерного массива данных. Справа приведены дополнительные или альтернативные процедуры. 569
Глава 4. Корреляционная 20-спектроскопии ЯМР (COSY) При таком обрезании происходит практически мгновенный спад интер- ферограммы до нуля. Для сохранения необходимого разрешения спектра в каждом из измерений такие усеченные массивы данных дополняются нулями (нулевое заполнение необходимой кратности) с тем, чтобы в каж- дом из измерений присутствовало заданное количество точек. Обработка таких усеченных интерферограмм имеет свои особенности. Для того, что- бы нейтрализовать искажение спектра, которое связано с обрезанием дан- ных, сглаживающая функция должна свести ССИ к нулю до того, как закончится сбор данных. При использовании больших величин времени сбора данных по t2 отпадает потребность в использовании нулевого запол- нения, поскольку периферийный участок спектра имеет нулевую интенсив- ность благодаря действию сглаживающей функции. Обработка таких спект- ров не отличается от обработки 1 D-спектров. В общем, некоторого повыше- ния разрешения без ухудшения соотношения сигнал/шум можно достичь с помощью любой из функций повышения разрешения, описанных в разде- ле 2.22. Наиболее популярными являются преобразования Лоренца-Гаусса, смещенный синусоидальный колокол или, наконец, квадратичный синусо- идальный колокол. Две последние функции гарантируют спад сигнала до нуля, поэтому они пригодны также для обработки ti данных перед нулевым заполнением. В каждом из измерений слишком сильное усиление сигнала ведет к появлению вокруг сигнала областей с отрицательной интенсив- ностью (канав). Для оптимизации результатов следует точно выбирать па- раметры функции сглаживания. Часто первый ССИ в матрице 2О-данных можно использовать как удобный эталон 1 D-спектра для визуализации эффекта влияния разных функций сглаживания. Современное программное обеспечение спектрометров позволяет производить интерактивное измене- ние параметров сглаживания с контролем результатов непосредственно на мониторе. Альтернативой нулевому заполнению ti данных для наборов данных с высоким соотношением сигнал/шум является расширение ti-ин- терферограмм путем линейной экстраполяции, когда следующие точки интерферограммы рассчитывают исходя из известных предыдущих точек. Таким методом набор данных можно увеличить в 2-4 раза. При этом не только замедляется спад ССИ, но и уменьшается потребность в сглажи- вании сильно обрезанных данных. Оба метода позволяют увеличить разре- шение спектра по fb Для улучшения оцифровки конечного спектра после сглаживания ССИ можно применять нулевое заполнение необходимой кратности. Наборы данных в виде абсолютных значений (чаще всего они получа- ются с помощью вычисления магнитуды) требуют применения функций, которые сильнее повышают разрешение спектра. Это необходимо для по- давления нежелательных вкладов сигналов дисперсии в пики, которые со- 570
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса держат фазовый перекос. Чаще всего для этого используется функция си- нусоидального колокола или квадратичного синусоидального колокола. 4.1.11. Фазовая коррекция Фазовая коррекция 2В-спектра проводится независимо в двух частотных измерениях. Если первый ССИ в 2В-матрице содержит сигналы, их можно обработать и сфазировать так же, как и в случае одномерных спектров. По- лученные константы фазовой коррекции нулевого и первого порядков можно распространить на данные в измерении f2. Частотно-независимая фазовая коррекция для fi зависит от особенностей фазового цикла, который используется импульсной последовательностью. Она должна быть близкой к 0° или 90°. Теоретически частотно-зависимая (1-й порядок) фазовая кор- рекция по fj не является обязательной, поскольку временные промежутки перед оцифровкой данных, из-за которых возникают эти искажения, не влияют на измерение, которое генерируется непрямым методом. На прак- тике все же необходима небольшая коррекция в обоих измерениях. Только в этом случае можно получить оптимальные результаты. Как и в случае 1 D-спектров, фазовая коррекция осуществляется с помощью интерактив- ных программ. Для этого выбирается сигнал, который расположен в любом конце спектра, и проводится коррекция его фазы в двух измерениях. После этого аналогичную процедуру выполняют для сигнала, который располо- жен в противоположном конце спектра. Полученные фазовые константы распространяются на всю матрицу. 4.1.12. Оптимизация контурных линий Ранее было показано, что наиболее информативный и удобный путь пред- ставления 2В-данных - это контурные карты, в которых частотные измере- ния расположены в плоскости х-у. Интенсивность пиков определяется кон- турными линиями, которые представляют собой сечения сигналов плоскос- тями, параллельными плоскости х-у, но расположенными выше нее вдоль оси z декартовой системы координат. Вдоль этой оси изменяется интенсив- ность сигналов. Нижняя контурная линия выбирается таким образом, что- бы удалить участок спектра, который содержит тепловой шум. Эту линию выбирают немного выше максимального уровня теплового шума. Если ее выбрать слишком высоко, могут быть утеряны и некоторые полезные кор- реляции, которые связаны, например, с малыми КССВ. В ряде случаев уро- вень обрезки шума, который подходит для слабых корреляций, оказывается слишком низким для интенсивных сигналов, что может привести к появле- нию таких артефактов, как tj-шум. В таких случаях полезно записать не- 571
Глава 4. Корреляционная 20-спектроскопии ЯМР (COSY) сколько вариантов двумерного спектра с разными установками плоскости отсекания. Весьма помогает также запись отдельных фрагментов спектра. Это дает возможность проанализировать тонкую структуру мультиплетов, которая может быть невидимой в обзорном спектре из-за загруженности пиками отдельных спектральных областей. Лучше всего такой анализ про- водить интерактивно на дисплее спектрометра или компьютера, поскольку использование курсора и шкал является более точным, чем применение ка- рандаша и линейки. В случаях, когда необходимо проанализировать одно- временно положительные и отрицательные линии, используют выделение знака контурных линий разными цветами. На монохромных мониторах воз- можно применение разных типов линий. Таким образом, для исчерпывающего анализа 2О-спектра недоста- точно иметь обзорный спектр, который чаще всего записывается в автоматическом режиме. Следует иметь полный набор фрагментов спектра, которые записаны в таком масштабе, чтобы их анализ можно было провести совершенно надежно. Иногда для сложных спектров при- ходится анализировать по 10-15 отдельных фрагментов, а потом сводить полученные данные в соответствующие таблицы корреляций. 4.2. COSY с градиентным отбором Сейчас практически все новые спектрометры ЯМР приспособлены для ис- пользования импульсных градиентов поля. Поэтому в них во многих случа- ях вместо традиционных методик селекции сигналов с помощью фазовых циклов используется метод градиентной селекции. Это не только сокраща- ет время эксперимента, но и ведет к значительному повышению качества спектров. Поэтому основные методики измерения спектров, как правило, существуют в двух вариантах - с селекцией сигналов с помощью фазовых циклов и с градиентной селекцией. Принцип работы таких разновидностей базовых экспериментов мы рассмотрим на примере эксперимента COSY. Как раньше было показано для эксперимента COSY в абсолютных зна- чениях, в двумерном спектре COSY должны быть сохранены те сигналы, когерентность которых отвечает одному из путей переноса, показанных на рис. 4.26. При этом желательно выделять сигналы N-типа. Для селекции необхо- димого пути переноса когерентности применяют фазовое кодирование ко- герентности перед вторым 90°-импульсом и декодирование после него, не- посредственно перед детектированием. Такое кодирование осуществляется подачей соответствующего градиентного импульса. Как мы уже знаем, фа- зовый угол, Ф, на который поворачивается намагниченность действием градиента определенной силы и продолжительности, G, составляет: 572
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Ф = pG, (4.1) где р - порядок когерентности, то есть он различается для когерентностей разного порядка. Вследствие этого, после подачи единичного градиента на систему ядерных спинов, которая имеет поперечную намагниченность, ко- герентности разных порядков будут иметь разное фазовое кодирование. Поэтому для рефокусировки когерентностей разных порядков следует подавать разные градиентные импульсы. Выделение когерентности N-типа Выделение когерентности Р-типа Рис. 4.26. Необходимые комбинации градиента для выбора данных COSY N- и P-типов. Показаны также соответствующие им пути переноса коге- рентности. Так, для сигналов P-типа порядки когерентности до и после второго 90°-импульса должны составлять +1 и -1, соответственно. Фазовое кодиро- вание сигнала с таким порядком когерентности в сокращенном виде можно записать так: Ф1=+1С1Ф2 = -Ю2. (4.2) Единственной переменной в этих уравнениях является интенсивность градиента. Совершенно очевидно, что для того, чтобы воздействие второго градиентного импульса нейтрализовало действие первого для избранного пути переноса когерентности, надо, чтобы G2 = Gi, то есть оба градиента должны быть одинаковыми. В отличие от этого для выделения сигналов N-типа (порядок когерентности -1 с обеих сторон от импульса) G2 = -Gj. Иными словами, в этом случае градиенты должны различаться знаком. В любом случае необходимый путь переноса когерентности выбирается с од- 573
Глава 4. Корреляционная 2П-спектроскопии ЯМР (COSY) ного скана без применения фазового цикла. Это связано с тем, что градиент, который рефокусирует сигналы N-типа, не рефокусирует одновременно и сигналы P-типа. Поэтому отпадает потребность и в квадратурном детек- тировании. Описанная градиентная селекция подавляет также аксиальные пики, поскольку они связаны с намагниченностью, которая расположена в период ti вдоль оси z. Поэтому первый градиент на них не влияет. Когда эта намагниченность переходит в поперечную плоскость под действием второго импульса, последний градиент расфазирует ее, в результате чего в спектре она не наблюдается. Таким образом, четырехшаговая последовательность фазочувст- вительного COSY (два шага для квадратурного детектирования по fi и два шага для подавления аксиальных пиков) может быть с помощью ИГП заменена на одношаговую. При этом 2О-данные собираются с по- мощью только 1 скана на инкремент. Выигрыш во времени экспериментов составляет 4 раза. Чувствительность метода такова, что измерения одного скана на инкремент обычно вполне достаточно. 4.2.1. Фазочувствителъные эксперименты Хотя, как это было показано в предыдущем параграфе, использование ИГП дает возможность сократить время эксперимента COSY, однако для полу- чения фазочувствительных данных эксперимент нуждается в определенной модификации, поскольку получение такого спектра требует сохранения в период ti обоих путей переноса когерентности, для которых р = ±1. Мето- дика преодоления данного затруднения заключается в том, что за два по- следовательных скана собирают наборы данных N- и P-типов. Они запоми- наются раздельно для каждого инкремента tb Селекция пути переноса ко- герентности осуществляется благодаря инверсии знака конечного гради- ентного импульса, как это описывалось выше для сигналов N-типа. Полу- ченные наборы данных содержат спектры, которые являются зеркально от- раженными в измерении fb Если провести обработку данных таким образом, чтобы один из набо- ров данных зеркально отразить относительно fi = 0 и прибавить его ко вто- рому набору данных, получим только один набор данных. В результате та- кой процедуры дисперсионная составляющая, которая обусловливала фазо- вый перекос сигналов в каждом из наборов данных, полностью удаляется из спектра. Поэтому в результате мы получаем спектр, который содержит сигналы исключительно в форме сигналов поглощения. Математические приемы, необходимые для описанной процедуры, сейчас входят в матобес- печение большинства приборов, а сам подход к получению сфазированно- го спектра называется методикой эха-антиэха. 574
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 180 8 ran с* I 5 Рис. 4.27. Фрагмент импульсной по- следовательности, в которой спино- вое эхо используется для рефокуси- ровки фазовых искажений, происхо- дящих во время действия градиент- ного импульса. Необходимо отметить, что для получения полностью сфазированных спектров импульсную последовательность следует еще несколько услож- нить. Это связано с изменением фазы сигнала за время действия градиент- ных импульсов, которые длятся несколько миллисекунд. Такое изменение фазы может быть весьма значительным, при этом оно зависит от частоты сигнала (от его химического сдвига). Данные искажения фазы не- важны для сигналов COSY в аб- солютных значениях, поэтому раньше мы на них не останав- ливались. В случае фазочувстви- тельных спектров для нейтрали- зации этих искажений фазы сиг- налов используют эффект спи- нового эха (рис. 4.27). После по- дачи каждого из градиентных импульсов подают неселектив- ный 180°-импульс, а после него вводят промежуток времени, 5, который равняется продолжи- тельности градиентного импульса. В результате расфазирование химических сдвигов полностью устраняется. Таким образом, в импульсную последова- тельность градиентного COSY вместо каждого из градиентных импульсов вводят фрагмент, показанный на рис. 4.27. 4.3. Интерпретация структуры мультиплетов в спектрах COSY Важная часть анализа одномерных спектров состоит в измерении КССВ отдельных мультиплетов. Это дает возможность получить из спектра мак- симальную структурную информацию. Хотя эта задача довольно проста для хорошо разрешенных мультиплетов, она многократно усложняется для перекрывающихся сигналов. В таких случаях можно воспользоваться пре- имуществами двумерных спектров, в которых кросспики сигналов, кото- рые перекрываются, могут наблюдаться отдельно. В этом параграфе будет показано, как определить величины КССВ исходя из мультиплетной струк- туры кросспиков. Прежде всего, надо всегда иметь в виду, что кросспики в двумерном спектре возникают за счет переноса когерентности от противофазных ком- понентов мультиплетов на спиново-связанные с ними сигналы. Как было показано ранее, спиновое взаимодействие в кросспике проявляется как про- тивофазное расщепление в двух измерениях, поэтому для двухспиновой системы в результате получаем противофазный квадрат (рис. 4.28). 575
Глава 4. Корреляционная 2В-спектроскопии ЯМР (COSY) Ах Рис. 4.28. Квадрат противофазных расщеплений для Ах между двумя спи- нами А и X. Такой вид имеют кросспики всех дублетов в эксперименте фазочувствительного COSY. Направленность сигналов показана знаками и КССВ J(A,X), показанная на рис. 4.28, называется активной, поскольку именно благодаря ей происходит образование кросспика. В двухспиновой системе существует лишь активная КССВ. Если же имеем более сложную спиновую систему, то кроме нее сигнал может содержать и другие рас- щепления. Эти расщепления обусловлены пассивными КССВ. Они, хотя и влияют на мультиплетность кросспика, не предопределяют его появление благодаря явлению переноса когерентности. Поэтому такие КССВ не име- ют противофазной ориентации компонентов мультиплета. Каждая КССВ является активной относительно того кросспика, появление которого она предопределяет, и пассивной относительно других кросспиков, где она так- же проявляется. Пассивные КССВ имеют софазное расщепление и прояв- ляются в противофазном массиве активных расщеплений как компоненты с 576
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса неизменным знаком фазы. Эти особенности и основные принципы анализа мультиплетной структуры можно проиллюстрировать на примере кросс- пика трехспиновой системы АМХ, в которой J(A,M) > J(A,X) > J(M,X) (рис. 4.29). Будем считать, что в кросспике MX, который содержит проти- вофазный квадрат, отвечающий активной КССВ J(M,X), располагается в верхнем левом углу. Этот фрагмент репродуцируется с неизменной фазой большой пассивной J(A,X) в направлении f2 и константой J(A,M) в направ- лении fj. Рис. 4.29. Структура кросспиков в фазочувствительном COSY спектре трехспиновой системы АМХ. Стрелки указывают расщепление для обо- значенных КССВ. Спектр был рассчитан для J(A,M) =18, J(A,X) = 12 и J(M,X) = 6 Гц. Знаки сигналов приведены слева от мультиплетов. В результате получаем структуру мультиплета, который содержит 4x4 компонентов. Такой пошаговый анализ расщепления полностью аналоги- чен тому, который используется в одномерной спектроскопии при построе- нии "деревьев” мультиплетов. Структура мультиплета АХ в направлении f2 определяется большим противофазным расщеплением соответственно J(A,X) и дальнейшим расщеплением, обусловленным меньшей пассивной J(M,X). В результате структура пика в данном измерении будет + + —. В измерении fi активная КССВ является наименьшей, поэтому знаки компо- нентов повторяются и получаем + - + -. И, наконец, мультиплет AM содер- жит очень большую активную константу J(A,M) в обоих измерениях. При этом образуется противофазный квадрат, который охватывает весь мульти- плет. Дальнейшее расщепление с меньшими пассивными КССВ ядра X приводит к удвоению каждого из компонентов. Таким образом, правила интерпретации структуры двумерных мультиплетов аналогичны тем, которые применяются в одномерной спектроскопии с учетом сущест- вования активных и пассивных констант. Если взаимодействие проис- ходит между одним спином и п эквивалентными протонами, то мульти- 577
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) плетную структуру можно описать, если считать, что только с одним про- тоном имеется активная КССВ, а с остальными - пассивные. Поэтому для взаимодействия с одинаковыми спинами можно построить противофазный аналог обычного треугольника Паскаля. Так, для системы А$Х кросспик содержит дублет для А и +1+1-1-1 квартет для X(рис. 4.30). п а) б) 0 1 1 1 1 1 1 -1 2 1 2 1 1 0 -1 3 13 3 1 1 1-1-1 4 1 4 6 4 1 120-2-1 5 1 5 10 10 5 1 132-2-3-1 6 1 6 15 20 15 6 1 1450-5-4-1 Рис. 4.30. (а) Треугольник Паскаля для 1D мультиплетов и (б) противо- фазный эквивалент для предсказания структуры мультиплетов COSY для расщепления сигналов п эквивалентных спинов. В реальных системах структура мультиплета может определяться мно- гими КССВ, причем все они могут и не разрешаться. Это приводит к пере- крыванию компонентов мультиплетов и взаимному уничтожению некото- рых из них. По большей части при этом наблюдается видимое упрощение структуры мультиплетов. Часто в таких случаях малые КССВ не проявля- ются, как это показано для одного из кросспиков на рис. 4.31. Для деталь- ного анализа тонкой структуры иногда полезно бывает рассмотреть оба эк- вивалентных кросспика, расположенных зеркально относительно диагона- ли. Они могут немного различаться в связи с отличием степени оцифровки в двух измерениях. Таким образом, измерение КССВ ограничено шириной линии в компо- нентах мультиплетов, которая в двумерных спектрах для малых молекул и молекул среднего размера определяется в основном цифровым разреше- нием, а не естественной шириной линии. В таких условиях линии, которые находятся в фазе, имеют тенденцию к объединению с образованием одного пика, который маскирует соответствующую КССВ. Противофазные компо- ненты хотя и остаются разделенными, однако расстояние между ними мо- жет быть несколько меньше величины КССВ. Показано, что уменьшение видимого расщепления противофазных компонентов мультиплета равняет- 578
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ся 0.6 ширины линии. Дальнейшее уменьшение расщепления приводит к уменьшению интенсивности пиков или к полному их исчезновению. Отсю- да можно сделать вывод о невозможности измерения КССВ, величины ко- торых существенно меньше ширины линии. Практически величина рас- щепления должна быть в 1.5 раза больше цифрового разрешения. X Рис. 431. COSY кросспик для группы А3Х иллюстрирует структуру, пред- сказанную с помощью треугольника Паскаля. Направленность компонен- тов мультиплетов показана знаками ”+" и Отсюда также вытекает, что кросспики могут исчезать из спектра COSY, если ширина линии оказывается большей или цифровое разрешение является меньшим величины активной константы. Поэтому кросспики, вызванные малыми КССВ или широкими линиями, могут быть утеряны. Это является большой проблемой для очень больших молекул, которые имеют большую естественную ширину сигналов. В этом случае намного лучшие результаты можно получить с применением TOCSY, поскольку компоненты мультиплетов кросспиков в этом случае всегда находятся в фазе и не могут взаимно уничтожаться. Существуют также более прогрес- сивные методы, которые позволяют измерять константы взаимодействия в сложных мультиплетах. Например, метод DISCO позволяет после получе- ния спектра COSY производить сложение и вычитание отдельных инкре- ментов и таким образом получать упрощенные спектры, которые содержат только некоторые расщепления. Поэтому измерения КССВ становятся бо- лее надежными. 579
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) 4.4. Разновидности COSY Существует большое количество экспериментов, в основе которых лежит модифицированная импульсная последовательность COSY. В этом разделе мы рассмотрим преимущества модифицированных методик с точки зрения практики использования COSY для интерпретации спектров. В литературе предложено много вариантов COSY, которые являются значительно более сложными, чем простая последовательность COSY. Однако их преиму- щества можно реализовать только для узкого класса молекул. Приведенные ниже эксперименты представляют собой лишь небольшую часть описан- ных методик, но они имеют наиболее широкое применение среди химиков. Прежде чем описывать детали экспериментов, коротко охарактеризу- ем, что может дать каждый из них. В таблице 4.3 сведены наиболее важные характеристики популярных экспериментов. Некоторые из них уже были описаны, другие будут описаны в последующих параграфах. Хотя экспери- мент TOCSY, строго говоря, не относится к семейству COSY, однако при его помощи можно получить информацию, аналогичную той, которую дает COSY, поэтому он также включен в таблицу. Таблица 4.3. Обзор характерных особенностей основных модификаций экспериментов COSY и эксперимента TOCSY Последова- тельность Преимущества Потенциальные недостатки 1 2 3 COSY-90 Простой и грубый метод. Об- работка спектра с сигналами в виде абсолютных значений хо- рошо подходит для автомати- зированных экспериментов. Форма линии с перекошенной фазой имеет недостаточное разрешение. Для повышения разрешения необходимо при- менение сглаживающих функ- ций. Тонкая структура кросс- пиков часто не проявляется. COSY-P Простой и грубый метод. Об- работка спектра с сигналами в виде абсолютных значений хорошо подходит для автома- тизированных экспериментов. Упрощение структуры кросс- пиков уменьшает перекрыва- ние сигналов. Вицинальные и геминальные расщепления в некоторых случаях можно раз- личить по наклону кросспиков. Обычно требует представле- ния в виде магнитуды, по- скольку фазочувствительный вариант имеет форму линии со скошенной фазой. 580
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 1 2 3 Фазочувстви- тельный COSY-90 Дает спектры с высоким раз- решением, поскольку сигналы имеют форму сигналов погло- щения. Кросспик имеет ясно выраженную тонкую струк- туру. Возможно измерение КССВ. Диагональные пики имеют дисперсионную форму линии. Соседние сигналы могут пере- крываться. Для выявления мультиплетной структуры пи- ков необходимо высокое циф- ровое разрешение. Фазочувстви- тельный DQF-COSY Дает спектры с высоким раз- решением, поскольку сигналы имеют форму сигналов погло- щения. Кросспик имеет ясно заметную тонкую структуру. Возможно измерение КССВ. Диагональные пики имеют форму сигналов поглощения. Синглеты подавлены. Метод вдвое менее чувствите- лен, чем COSY-90. Для выяв- ления мультиплетной структу- ры пиков необходимо высокое цифровое разрешение. COSY с задержкой Позволяет выявить маленькие расщепления (<2 Гц), напри- мер между протонами в алиль- ном фрагменте, или W-взаи- модействие. Обычно требует представле- ния в виде магнитуды. Кросс- пики, связанные с большими КССВ, могут иметь аномаль- но малую интенсивность. Эстафетный COSY Обеспечивает двухшаговый (или больше) перенос коге- рентности и может помочь при интерпретации перекры- вающихся кросспиков. Обычно имеет низкую чувст- вительность. Форма сигнала может быть искаженной, что требует представления сигна- лов в виде магнитуды. Лучше применять метод TOCSY. TOCSY Обеспечивает многошаговые переносы когерентности. Ис- пользуется для интерпрета- ции перекрывающихся кросс- пиков. Высокая чувстви- тельность. Фаза сигналов не искажается, что дает возмож- ность наблюдать корреляции даже в присутствии широких сигналов. Количество шагов переноса когерентности, связанных с каждым кросспиком, заранее неизвестно. Поскольку все компоненты мультиплетов имеют одинаковую фазу, тон- кая структура может быть пло- хо разрешенной, что может воспрепятствовать определе- нию КССВ. При выборе типа эксперимента для решения конкретной структурной проблемы следует помнить о том, что чем больше информации Вы желаете получить из спектра COSY, тем большее время следует на него израсходо- вать. Это обусловлено тем, что время измерения двумерного спектра оп- 581
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) ределяется заданным цифровым разрешением. Поэтому надо пользовать- ся принципом разумной достаточности - использовать наиболее быстрый эксперимент, который является достаточным для решения поставленной задачи. Так, если надо лишь найти спиновую связь между сигналами, то для этого достаточно применять разновидности COSY в абсолютных зна- чениях, такие как COSY-90 или COSY-0. Такие эксперименты требуют меньше всего времени, и измерение этих спектров можно полностью авто- матизировать. Вариант COSY-0 для получения спектров в абсолютных зна- чениях использует смешивающий импульс 0 = 45 или 60° Это дает спект- ры с более четкой структурой как диагональных пиков, так и кросспиков. Такая методика лучше всего подходит для рутинной работы. Если же предполагается выполнять анализ структуры мультиплетности кросспиков, то следует применять фазочувствительные эксперименты, наилучшим из которых является DQF-COSY. Эта методика позволяет получить хорошо разрешенный спектр, в котором проявляется тонкая структура сложных мультиплетов. Как будет показано ниже, реальная потеря чувствительнос- ти в этом эксперименте может быть меньшей, чем это может казаться на первый взгляд. Поэтому данный метод широко применяется в структурных исследованиях. Для успеха извлечения информации, которая содержится в мультиплетной структуре кросспиков, необходимо высокое цифровое раз- решение. Поэтому приходится идти на увеличение продолжительности эксперимента. Фазирование полученного при этом двумерного спектра требует определенного искусства. Поэтому использование такого подхода нуждается в довольно значительном времени и не применяется тогда, когда результаты надо получить очень быстро. При анализе сложных спектров, в которых происходит значительное перекрывание отдельных сигналов, довольно информативными могут ока- заться эксперименты с полной корреляцией или TOCSY-эксперименты. Они дают дополнительную корреляционную информацию путем распределения намагниченности на всю сеть связанных спинов. Такой подход оказывается лучшим при анализе спектров олигосахаридов и пептидов, в которых моле- кулы состоят из дискретных мономерных блоков, представляющих собой изолированные спиновые системы. Этот метод с успехом заменяет более старый метод эстафетного COSY, в котором используется пошаговый ана- лиз спиновой связи. COSY с задержкой используется для анализа малых КССВ. Однако данный метод применяется все реже. 4.5. COSY-fi Данная разновидность COSY объединяет методики, в которых второй им- пульс в последовательности COSY уменьшен по продолжительности до 45° 582
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса или 60° (рис. 4.32). Чаще всего та- кие эксперименты проводят в пред- ставлении абсолютных значений, поскольку при использовании им- пульсов, меньших 90°, невозможно получить сигналы, имеющие вид сигналов поглощения. Использование уменьшенного смешивающего импульса значи- тельно меняет относительную интенсивность переноса когерентности меж- ду переходами, которые имеют общий энергетический уровень, например Ai и Х2 на рис. 4.33, и между удаленными переходами, такими как Ai и А2. Рис. 4.32. Эксперимент COSY-0. Смешивающий импульс Р часто выбирается 45° или 60° Связанные уровни АрХьАгХг, А2-Х2, А2-Х2 Удаленные уровни ХГХ2, АгА2 Рис. 4.33. Связанные и удаленные энергетические уровни в двухспиновой системе АХ. Ослабление эффективности переноса когерентности между удаленны- ми переходами приводит к уменьшению интенсивности соответствующих компонентов мультиплетов как в диагональных пиках, так и в кросспиках. Часто такое изменение не предсказуемо, если присутствуют несколько КССВ. Диагональные пики становятся немного менее интенсивными, что улучшает идентификацию расположенных вблизи них кросспиков. Некото- рые компоненты мультиплетов в кросспиках так- Н(Э „ ОН же уменьшаются по интенсивности, вследствие V___л чего кросспики имеют скошенный вид, как пока- j 2/ зано в спектре COSY-45 на рис. 4.34 для соедине- у 3 ния 4.2. В ряде случаев такой эффект наклона ' О д2 можно использовать для того, чтобы различить активные константы противоположного знака, такие как геминальные и вицинальные. 583
Глава 4. Корреляционная 2В-спектроскопии ЯМР (COSY) I I id l 2-Н 3-Н 4,5-Н 6-Н б'-Н COSY-90 S3 @ & © Й @ © © $9 О 0 о о а 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 м.д. 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 м.д. Рис. 4.34. Сравнение спектра COSY-45 соединения 4.2 в форме абсолютных значений со стандартным спектром COSY-90. Направление наклона кросс- пиков в спектре COSY-45 связано со знаком КССВ. Исходя из наклона можно строить заключения о том, является ли активная константа положи- тельной или отрицательной, и различать геминальные и вицинальные КССВ. Рассмотрим трехспиновую систему АМХ, в которой все спины связа- ны между собой. Кросспик AM имеет положительный наклон. Он почти параллелен диагонали спектра, если обе пассивные константы J(A,X), J(M,X) имеют одинаковый знак. В отличие от этого, кросспик будет иметь отрицательный наклон и располагаться перпендикулярно диагонали, если знаки пассивных констант различаются. В протонной спектроскопии ви- цинальные КССВ обычно положительны, а геминальные - отрицательны. Поэтому кросспик между протоном и его геминальным партнером чаще всего имеет положительный наклон, а с вицинальным партнером - отрица- тельный. Этот эффект проявляется в спектре COSY-45 соединения 4.2, при- веденном на рис. 4.34 для протонов метиленовой группы 6-Н и б’-Н. Взаи- модействие с дополнительным спином приводит к дальнейшему искаже- нию структуры кросспика, и наклон в этом случае может не проявляться. Тем не менее, если эффект проявляется, он может оказаться довольно по- лезным для идентификации геминального партнера. 584
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Выбор между Р = 45° и 60° осуществляется в зависимости от личного вкуса. Если использовать 0 = 45°, то получим большее соотношение интен- сивностей между связанными и отдаленными переходами (для 45° соотно- шение интенсивностей достигает 6, а для 60° - 3) и соответственно проис- ходит большее упрощение структуры мультиплетов. При использовании Р = 60° можно достичь немного более высокой чувствительности спектра. Поскольку главной целью применения данной разновидности COSY явля- ется уменьшение интенсивности диагональных пиков и подошв кросспи- ков, то применение COSY-45 для рутинных исследований представляется более оправданным. Вследствие упрощения структуры пиков, простоты ис- пользования и возможности автоматизации измерений данная разновид- ность COSY получила широкое распространение среди химиков-органиков. 4.6. COSY с двухквантовой фильтрацией (DQF-COSY) В предыдущих разделах были описаны методы сбора данных COSY в фа- зочувствительном виде. Получение чистых линий поглощения требует мак- симально возможного разрешения и соответственно увеличения времени эксперимента. Однако с его помощью можно получить информацию о тон- кой структуре мультиплетов в кросспиках. Обычная последовательность фазочувствительного COSY-90 имеет тот важный недостаток, что в случае, если кросспики имеют вид чистых сигналов поглощения, то диагональные пики отвечают сигналам дисперсии. Длинные крылья диагональных пиков могут маскировать близко расположенные кросспики, поэтому потенци- ально полезная информация может оказаться утерянной. Присутствие дис- персионной составляющей в диагональных пиках можно в значительной мере уменьшить путем использования варианта COSY с двухквантовой фильтрацией. Поэтому эксперимент DQF-COSY лучше всего подходит для получения фазочувствительных данных. 4.6.1. Последовательность DQF-COSY Последовательность DQF-COSY (рис. 4.35) отличается от базовой последо- вательности COSY наличием дополнительного третьего импульса и ис- пользованием модифицированного фазового цикла или градиентной после- довательности для необходимой селекции когерентности. После периода th во время которого происходит пометка частот, по- дается второй 90°-импульс. Он генерирует многоквантовую когерентность, которая в методике COSY-90 хотя и существует, но не наблюдается, по- скольку она остается невидимой для детектора. Тем не менее, она может быть переведена в одноквантовую когерентность путем подачи третьего 585
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) импульса, который повторно перераспределяет намагниченности между всеми спиново-связанными уровнями, и после этого ее уже можно наблю- дать. Необходимый для этого фазовый цикл или комбинация градиентов выделяет только те сигналы, которые связаны с наличием двухквантовой когерентности между последними двумя импульсами. Все другие сигналы удаляются из спектра. Такие спектры называют спектрами с двухквантовой фильтрацией (таблица 4.4). Правила для отфильтровывания многокванто- вой когерентности порядка р просты, но они отличны от тех, что применя- ются для селекции одноквантовой когерентности. Все импульсы, которые действуют на р-квантовую когерентность, надо циклировать с шагом 180/р с соответствующим альтернированием фазы приемника на каждом шаге фазового цикла. Рис. 4.35. Эксперимент DQF-COSY и его путь переноса когерентности. Для импульсов применяются фазовые циклы, как описано в тексте. Пока- зан путь переноса когерентности, который в конечном итоге выделяет на- магниченность р = -1. Период 8 служит для того, чтобы спектрометр успел изменить фазу последующего импульса, и обычно равняется нескольким микросекундам. Таким образом, для селекции многоквантовой когерентности можно использовать ее большую чувствительность к фазе импульса, чем у одно- квантовой когерентности. Изменение фазы импульса на 90° для двухкван- товой когерентности будет отвечать изменению ориентации ее вектора на- магниченности на 180°, поэтому лишь для нее сигнал будет накапливаться, а вся одноквантовая когерентность будет удалена из спектра в ходе выпол- нения фазового цикла. 586
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Таблица 4.4. Фазовый цикл для двухквантовой фильтрации Ф Фпр X X У -X X -у —х Примечание. Фаза Ф используется для всех импульсов, действующих на двухкван- товую когерентность, а Фпр - фаза приемника. Фаза заключительного импульса ос- тается неизменной. Наиболее эффективную фильтрацию можно получить с помощью гради- ентной селекции. Здесь также используется большая чувствительность мно- гоквантовой когерентности к дейст- вию градиентов. Когерентность по- рядка +2 может быть выделена при использовании до и после последнего импульса градиентных импульсов, амплитуды которых относятся как 1 : 2 (рис. 4.36). Здесь изображен фрагмент им- пульсной последовательности, которая включает лишь последний импульс последовательности DQF-COSY, по- этому перед подачей этого импульса в поперечной плоскости содержится кроме одноквантовой, также и двух- квантовая когерентность. Первый гра- диентный импульс мощностью Gi рас- фазирует всю существующую намаг- ниченность. Но эта намагниченность, хотя расфазирована, продолжает на- ходиться в поперечной плоскости. Следующий радиочастотный импульс превратит часть двухквантовой коге- рентности в видимую одноквантовую намагниченность порядка р = -1. Даль- ше подается градиентный импульс мощностью G2 = 2Gi, который фази- рует лишь ту одноквантовую когерент- Рис. 4.36. Иллюстрация селекции сигнала с помощью импульсного градиента поля. Использование двух градиентов с отношением Gj G2 = 1 : 2 выделяет только по- казанный путь переноса когерент- ности, оставляя все другие расфо- кусированными и невидимыми. 587
Глава 4. Корреляционная 20-спектроскопии ЯМР (COSY) ность, которая образовалась из двухквантовой когерентности. Поскольку чувствительность когерентности к действию градиентного импульса про- порциональна порядку когерентности, то для когерентности с избранным путем перехода рефокусировка происходит в том случае, когда суммарная зависимость фазы от градиентных импульсов равняется нулю: SOi = 0, (4.3) а это реализуется тогда, когда второй градиентный импульс будет иметь вдвое большую амплитуду, чем первый. При этом одноквантовая когерент- ность, которая образовалась из двухквантовой когерентности, будет рефо- кусирована, а все другие намагниченности будут претерпевать дальней- шую расфазировку. Выделение когерентности порядка -2 требует применения градиентов с соотношением интенсивности +1 -2. Таким образом, имеется возмож- ность выделения путей перехода когерентности, для которых р = +2 и р = -2, но не обоих путей одновременно. Этим градиентный эксперимент отлича- ется от эксперимента с фазовым циклом, в котором сохраняются одновре- менно оба пути перехода когерентности. Таким образом, градиентный экспе- римент детектирует только половину того сигнала, который получаем в случае фазового цикла, поэтому он имеет вдвое меньшую чувствитель- ность. Это принципиальное отличие является одним из недостатков гради- ентных экспериментов по селекции путей когерентности, однако потеря чувствительности с лихвой компенсируется более полным удалением не- желательных сигналов. Поскольку в этом случае градиенты не использу- ются в период эволюции tb то для детектирования сигналов можно исполь- зовать квадратурное детектирование (Стата или TPPI). Как и в случае градиентного эксперимента COSY, простое включение в импульсную последовательность градиентов соответствующей амплитуды до и после последнего импульса приводит к сильным фазовым искажениям сигналов, которые связаны с эволюцией химических сдвигов во время действия градиентных импульсов. Для нейтрализации нежелательных фа- зовых искажений оба градиентных импульса сопровождаются дополнитель- ными радиочастотными 180°-импульсами, которые генерируют спиновое эхо, и соответствующими по продолжительности градиентным импульсам дополнительными задержками, которые компенсируют фазовые сдвиги. Таким образом, для последовательности фазочувствительного DQF-COSY с градиентной селекцией получим последовательность, изображенную на рис. 4.37. 588
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 4.37. Импульсная последовательность эксперимента DQF-COSY с гра- диентным отбором и соответствующий ей путь переноса когерентности. Для того, чтобы получить результат в фазочувствительном виде, оба гра- диента включены во фрагменты спинового эха. Обратите внимание на то, что после двухквантового фильтра сохраняется только один путь когерент- ности. 4.6.2. Использование DQF-COSY Результатом процесса двухквантовой фильтрации является то, что после нее диагональные пики имеют противофазную сигналам поглощения фор- му, а кросспики после фильтрации остаются неизменными. Если говорить более точно, для систем, которые содержат больше двух спинов, для акси- альных пиков остается некоторая дисперсионная составляющая, однако ее величина значительно меньше, чем в эксперименте COSY и обычно она не препятствует интерпретации сигналов. Поскольку после двухквантовой фильтрации у диагональных пиков отсутствуют широкие дисперсионные крылья, качество спектра значительно улучшается (рис. 4.38). Дополнительным преимуществом фильтрации является то, что в спект- ре не проявляются синглеты, поскольку они не способны к формированию двухквантовой когерентности. Поэтому отпадают проблемы, которые свя- заны с ti-шумом наиболее интенсивных сигналов. Двухквантовая фильтра- 589
Глава 4. Корреляционная 2В-спектроскопии ЯМР (COSY) ция исключает из спектра также пики растворителя, которые обычно име- ют исключительно большую интенсивность. При использовании фазового цикла степень ослабления пиков растворителя может достигать нескольких сотен. Если же использовать импульсные градиенты, сигналы растворителя можно уменьшить в 10000 раз. Редактирование спектра с помощью двух- квантовой фильтрации можно проиллюстрировать с помощью 1 D-спектра пептида лейцин-энкефалина 4.3 в дейтерометаноле (рис. 4.39). Для его по- лучения использован одномерный вариант импульсной последовательнос- ти, приведенной на рис. 4.37. Сигнал растворителя из спектра исчез, а спи- ново-связанные мультиплеты имеют характерную противофазную ориен- тацию. Противофазную ориентацию мультиплетов можно скрыть путем представления спектра в виде абсолютных значений. Рис. 4.38. Спектр COSY с двухквантовой фильтрацией (справа) обеспечи- вает более высокое разделение пиков, близких к диагонали, чем спектр фа- зочувствительного COSY (слева), поскольку он не содержит широких дис- персионных диагональных пиков. Потенциальным препятствием для применения двухквантовой фильт- рации является уменьшение, соответственно теории, соотношения сиг- нал/шум в два раза. Однако преимущества, которые связаны с удалением из спектра дисперсионной составляющей диагональных пиков, обычно зна- чительно сильнее повышают общую чувствительность эксперимента. Поэто- му спектры DQF-COSY широко используются на практике. 590
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 4.39. Одномерный спектр пептида лейцин-энкефалина 4.3 в CD3OD с двухквантовой фильтрацией. Синглет растворителя, который имеет наи- большую интенсивность в обычном 1 D-спектре (а), отфильтрован в спектре (б). Пики в спектре (б) имеют характерную противофазную струк- туру мультиплетов. 4.7. COSY с задержкой: выявление малых КССВ Последовательность COSY оказывается исключительно эффективной для выявления малых КССВ между протонами. Однако такие кросспики при обычных измерениях слишком слабы, и их идентификация может быть за- труднена, поскольку дальние корреляции теряются среди имеющихся в спектре шумов и артефактов. Эксперимент COSY с задержкой (рис. 4.40) позволяет увеличить ин- тенсивность корреляций и увидеть кросспики, связанные с константами, меньшими, чем естественная ширина линии. Это дает возможность обнару- жить взаимодействие через несколько химических связей, поэтому такой эксперимент называют еще COSY дальних взаимодействий (COSY с за- держкой). Корреляции через 4 или 5 связей в жестких или ненасыщенных системах, такие как W-, аллильные или гомоаллильные КССВ в таком спект- ре могут наблюдаться даже в том случае, если в соответствующем одно- мерном спектре они не проявляются (рис. 4.41). В предыдущих разделах 591
Глава 4. Корреляционная 20-спектроскопии ЯМР (COSY) указывалось, что для наиболее эффективного осуществления переноса ко- герентности необходима противофазная ориентация векторов намагничен- ности в мультиплетах. Рис. 4.40. COSY с задержкой. Дополнительная фиксированная задержка А вводится в базовую последовательность COSY, чтобы усиливать корреля- ции малых КССВ. ""I......I......।......।...’"'г11...।............ '"I......I......(--’I......।......।......। 8.4 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 м.д. 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 м.д. Рис. 4.41. (а) Стандартный COSY-90 спектр и (б) спектр COSY с задержкой для соединения 4.4. При снятии спектра (б) была использована дополни- тельная задержка А в 200 мс, в то время как другие параметры были такими же, как и в спектре (а). Маленькие (1 Гц) расщепления, которые невидимы в стандартном эксперименте COSY, хорошо проявились в спектре (б). 592
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Для очень малых КССВ противофазная ориентация при обычных усло- виях сбора данных COSY может реализоваться через слишком большое время. Поэтому кросспики для таких констант оказываются слабыми или вообще отсутствуют. Существует возможность повысить интенсивность этих пиков путем изменения величин периодов t| и t2 таким образом, чтобы оптимизировать перенос когерентности для малых КССВ и соответственно повысить интенсивность кросспиков между удаленными ядрами. Этого в принципе можно достичь путем увеличения обоих временных интервалов в последовательности COSY и соответствующим увеличением цифрового разрешения в обоих измерениях. Однако при этом генерируются исключи- тельно большие массивы данных, и время эксперимента значительно воз- растает. В альтернативном подходе, который применяется в эксперименте COSY с задержкой, после каждого импульса вводится фиксированный про- межуток А. При этом время эволюции спинов возрастает, а цифровое раз- решение остается тем же самым, что и в стандартной последовательности COSY. Введение в последовательность двух дополнительных промежут- ков А обеспечивает фазировку намагниченности к моменту начала сбора данных, как это происходит и в других последовательностях, включающих элемент спинового эха. Использование дополнительных задержек препят- ствует реализации фазочувствительного представления спектров в связи с возникновением значительных фазовых искажений. Поэтому в этом случае применяется только представление спектров в абсолютных значениях. Для оптимизации детектирования малых КССВ максимальный перенос когерентности сигнала должен происходить в середине каждого из времен- ных интервалов. Можно показать, что максимум достигается за время t, где t = (4.4) Если J мало так, что JT2«1, то можно принять, что t = Т2, и считать, что середина каждого интервала отвечает максимуму переноса когерент- ности, тогда продолжительность дополнительного интервала, А, можно найти из соотношения: А = Т2 - 1/2AQ, (4.5) где AQ - общее время сбора данных по tj и t2. Для типичных параметров COSY и типичных величин Т2 для протонов величины А лежат в диапазоне 50-500 мс. Поскольку действительное время релаксации протонов Т2 чаще всего неизвестно и оно различается для разных протонов, для интервала за- держки выбирают компромиссное значение 200 мс. Такая величина подхо- дит в большинстве случаев. Кросспики, связанные с большими величинами КССВ, в данном эксперименте значительно ослабляются. Поэтому перед 593
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) применением данной методики следует измерять также и спектр COSY в стандартных условиях. 4.8. Спектроскопия тотальных корреляций (TOCSY) Целью всех описанных выше разновидностей эксперимента COSY явля- лось выявление наличия спин-спинового взаимодействия между протонами. В этих спектрах наличие ССВ проявляется как возникновение соответст- вующих кросспиков. Физическая природа кросспиков определяется пере- носом когерентности, который осуществляется при действии на возбуж- денную спиновую систему второго импульса. Однако интенсивность кросс- пиков резко уменьшается при уменьшении величин КССВ между взаимо- действующими магнитными ядрами. Это связано с тем, что перенос коге- рентности осуществляется за весьма малое время (десятки микросекунд), в течение которого на систему воздействует второй импульс импульсной последовательности. В протонной спектроскопии методы COSY дают воз- можность химику наблюдать геминальные и вицинальные взаимодействия между протонами в молекуле. Для обнаружения более далеких корреляций следует увеличить период смешивания. Эта идея реализуется в методике, которая называется ’’спектроскопия тотальных корреляций (TOCSY)” Ме- тод основан на использовании в качестве второго импульса последователь- ности COSY спинового замка. Метод обнаруживает корреляции между протонами, которые принадлежат к одной спиновой системе, даже в том случае, если непосредственная спиновая связь между ними отсутствует (КССВ = 0). Иначе говоря, если есть цепочка атомов A-B-C-D и так далее, содержащих протоны, между которыми имеются общие энергетические уровни, то последовательность TOCSY осуществляет перенос намагничен- ности от спина А к В, С, D и т.д. путем эстафетной передачи когерентности вдоль цепи спиново-связанных ядер. В принципе возможна полная (тоталь- ная) корреляция всех имеющихся в молекуле протонов, что и дало основа- ние назвать данную методику спектроскопией тотальных корреляций. Воз- можность переноса намагниченности такого типа дает исключительно мощ- ный метод составления карт корреляций. Особенно полезным метод бывает в случаях, когда несколько сигналов перекрывается, и метод COSY не дает однозначного результата. На рис. 4.42 приведен спектр TOCSY соедине- ния 4.2, которое ранее уже упоминалось. Он записан так, чтобы проиллюст- рировать пошаговые переносы намагниченности вдоль углеводного цикла. При этом полезно сравнить данный спектр со спектром COSY для этого же образца, который приведен на рис. 4.34. Эстафетные кросспики в TOCSY отвечают корреляциям между всеми спинами циклической систе- мы. Таким образом, появляется возможность составить полную карту спин- спиновых взаимодействий несмотря на перекрывание части сигналов. Как 594
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса видно из рисунка, в данном случае имеем горизонтальные ряды кросспи- ков для каждого из сигналов. Таким образом, в отличие от COSY, кросс- пики многократно повторяются, и вероятность их совпадения уменьшает- ся. Поэтому, если в спектре хотя бы один из горизонтальных рядов кросс- пиков виден полностью, то из него можно найти все возможные корреля- ции, а следовательно, и химические сдвиги всех протонов, которые входят в спиновую систему. Как правило, кросспики, отвечающие геминальным и вицинальным КССВ, имеют большую интенсивность, чем все другие. Это видно из большей площади кросспика. Данная особенность позволяет от- личить их от более далеких корреляций. Рис. 4.42. TOCSY спектр соединения 4.2. Эстафетные кросспики возника- ют между спинами, не связанными ССВ, но находящимися в одной спино- вой системе. Они образуются вследствие распространения намагниченнос- ти на всю цепочку связанных спинов. 595
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) Принимая во внимание структуру спектра TOCSY, его следует анали- зировать несколько иначе, чем спектр COSY. Здесь анализу подвергают по- следовательно каждый из горизонтальных (или вертикальных) рядов кор- реляций, которые отвечают каждому из сигналов протонов, принадлежа- щих данной спиновой системе. В ряду отмечают наиболее интенсивные корреляции, которые отвечают геминальным и вицинальным КССВ. Если какие-то корреляции являются невидимыми в данном ряду из-за перекры- вания сигналов, их находят, опираясь на другие ряды корреляций, где сов- падения сигналов не происходят. Таким образом, можно построить табли- цу корреляций для каждой из спиновых систем, содержащихся в спектре. Сопоставление данных такой таблицы со структурной формулой молекулы дает возможность осуществить отнесение сигналов всех протонов. Хотя анализ спектра TOCSY несколько более сложен, чем анализ спектра COSY, но он дает возможность проанализировать ССВ в значительно более слож- ных протонных спектрах. Еще одно важное преимущество TOCSY в сравнении с COSY - это то, что здесь происходит перенос компонентов намагниченности, которые на- ходятся в фазе. Поэтому отпадает проблема взаимного уничтожения ком- понентов мультиплетов при недостаточном цифровом разрешении или боль- шой ширине линий. В этих случаях метод TOCSY по чувствительности превосходит COSY. 4.8.1. Последовательность TOCSY Последовательность TOCSY в наиболее простом варианте представлена на рис. 4.43. Она близка к последовательности COSY, описанной выше. Един- ственным отличием является использование вместо смешивающего им- пульса спинового замка. Мы уже сталкивались с такими импульсами рань- ше при обсуждении соответствующего одномерного эксперимента. Дейст- вие спинового замка приводит к эстафетному переносу намагниченности вдоль цепи групп, содержащих протоны, между которыми существует спи- новая связь. Такие детали эксперимента, как квадратурное детектирование и подавление аксиальных пиков, не отличаются от тех, которые применя- лись в COSY. Вследствие этого, для понимания работы последователь- ности TOCSY необходимо разобраться только в действии спинового замка. Рис. 4.43. Последовательность TOCSY. Смешивающий импульс базового эксперимента COSY заменен периодом смешивания спинового замка тт. 596
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 4.8.2. Спиновый замок и перенос когерентности Спиновый замок в простейшем случае представляет собой очень длинный (сотни миллисекунд) импульс сравнительно небольшой мощности. Такой импульс можно представить себе как последовательность 180°-импульсов с одинаковыми очень малыми промежутками между ними (рис. 4.44). Это есть не что иное, как многократное повторение импульсной последователь- ности спинового эха. Про до л ж ител ь ны й импульс Рис. 4.44. Схематическая иллюстрация событий, которые происходят во время действия спинового замка. Все расхождения химических сдвигов между спинами устранены. Все КССВ сохраняются. Таким образом, для всех ядер реализуются условия сильной спиновой связи. Поэтому в период действия спинового замка химические сдвиги не эволюционируют. Их векторы намагниченности расположены вдоль опре- деленной оси в поперечной плоскости, которая определяется фазой спино- вого замка. Поскольку векторы намагниченности, которые описывают хи- мические сдвиги, во время работы спинового замка совпадают, то разность в химических сдвигах исчезает. Система ведет себя так, как будто все ядра имеют одинаковый химический сдвиг. В отличие от химических сдвигов, константы гомоядерного спин-спинового взаимодействия во вре- мя подачи 180°-импульсов спинового эха продолжают эволюционировать. Поэтому в период действия спинового замка они ведут себя так же, как и во время свободной прецессии. Таким образом, во время работы спинового замка разность химических сдвигов из спектра удаляется, а КССВ продол- жают прецессировать. Мы знаем, что магнитные ядра, которые имеют малую разность в хи- мических сдвигах по сравнению с величинами КССВ, называются сильно связанными. При этом они теряют независимость, и различить их невоз- можно. Так, в двухспиновой системе АВ невозможно найти химические сдвиги А и В непосредственно из спектра, поскольку они оказываются за- висимыми от существующей между А и В величины КССВ. Такие условия сильного взаимодействия при использовании спинового замка распростра- няются на всю спиновую систему, поскольку протоны продолжают взаимо- 597
Глава 4. Корреляционная 2Э-спектроскопии ЯМР (COSY) действовать один с другим, а разность их эффективных химических сдви- гов равняется нулю. Поэтому протоны в период смешивания теряют свою индивидуальность. Можно показать математически, что в сильно связан- ных спиновых системах возбуждение любого энергетического уровня (лю- бой линии спектра) способно передаваться на другие энергетические уров- ни. При этом реализуется так называемый осцилляторный механизм пере- носа когерентности. Если применить механическую аналогию, то можно себе представить, что в сильно связанных системах спины как бы связаны пружинками - толкнешь один спин, и вся система начинает колебаться, по- ка воспринятая энергия полностью не рассеется. Для системы АХ полный перенос намагниченности с А на X происходит за время 1/2J(A,X) секунд, а возвращение намагниченности на А - за время J(A,X) секунд. На рис. 4.45 этот процесс показан с помощью специального эксперимента. Здесь изо- бражен спектр системы АХ в условиях селективного возбуждения дублета, который находится в слабом поле. Непосредственно после такого возбуж- дения включается спиновый замок, но продолжительность его действия от спектра к спектру последовательно увеличивается. Видно, что в случае, когда продолжительность включения спинового замка равняется 1/2J(A,X), вместо дублета в слабом поле наблюдается дублет в сильном поле, по- скольку вся намагниченность перенесена на него. При удвоении времени действия спинового замка наблюдается исключительно сигнал возбужден- ного дублета в слабом поле. Рис. 4.45. Колебательный перенос намагниченности между связанными про- тонными парами под влиянием спинового замка. Перенос был смоделиро- ван с использованием спинового замка MLEV-17. В каждом эксперименте продолжительность действия спинового замка последовательно возрастала. 598
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Хотя для многоспиновых систем ситуация оказывается более сложной, основная идея осцилляторного механизма переноса когерентности остается той же самой. Она объясняет распространение намагниченности по цепи связанных атомов (рис. 4.46). При коротких временах смешивания (для экспериментов на протонах около 20 мс) важным оказывается только пер- вый шаг переноса намагниченности. Видимые корреляции при этом экви- валентны тем, которые наблюдаются в соответствующих спектрах COSY. Более продолжительные периоды смешивания позволяют намагниченности продвинуться дальше по цепи спинов. В этом случае в спектре проявляются сигналы, которые отвечают многошаговому переносу когерентности. Для малых КССВ перенос когерентности менее эффективен, что может привес- ти к обрыву переноса когерентности и потере эстафетных пиков. Посколь- ку намагниченность может переноситься в любом направлении цепочки спинов, спектры TOCSY так же, как и COSY, являются симметричными от- носительно диагонали. А < В ---------- С ------ D Е А <----> В < 7вс > С ---------- D Е А <----> В <-----> С < JcD-> D --------- Е А <------> В <--------> С <-------> D < > Е Рис. 4.46. Схематическая иллюстрация распространения намагниченности вдоль цепи связанных спинов как функция времени смешивания спинового замка. Стрелочки означают циклический обмен когерентности между яд- рами. Существуют также гетероядерные разновидности TOCSY. С их по- мощью можно осуществить перенос когерентности, например, от протонов на ядра углерода. Для этого используют спиновый замок на двух ядрах одновременно. В результате получим гетероядерный TOCSY или, как его называют чаще, НЕНАНА - гетероядерную спектроскопию Хартмана-Ха- на, которая служит для установления гетероядерных корреляций. 4.8.3. Использование TOCSY Способность TOCSY переносить намагниченность вдоль спиновой систе- мы делает его эффективным методом исследования молекул, которые сос- тоят из дискретных спиновых систем. Примерами таких систем являются протеины, пептиды и полисахариды. Для таких молекул часто удается про- извести отнесение сигналов в пределах каждого спинового блока, если в его спектре отдельно расположен хотя бы один сигнал. Мы проиллюстри- 599
Глава 4. Корреляционная 2О-спектроскопии ЯМР (COSY) Pro-Val-Om-Leu-D-Phe I I D-Phe-Leu-Om-Val-Pro 4.5 руем это на примере циклического декапептида гра- мицидина S 4.5 (рис. 4.47). Сокращения названий аминокислот имеют общепринятое значение. е о Pro а 8 § & Leui & От ’Т^ --—Г”—I— 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 р Рл 9 О Э сз во 2.0 1.5 Рис. 4.47. Спектр TOCSY алифатической области циклического декапепти- да грамицидина S 4.5. Был использован спиновый замок MLEV-17 продол- жительностью 80 мс. При этом происходит полный перенос когерентности между протонами боковых алифатических заместителей каждого из амино- кислотных остатков. В спектре обозначены корреляции а-протонов проли- на и орнитина с а-5-протонами, которые отвечают 1-3-шаговым переносам. Показана только алифатическая область спектра. Сигналы протонов от- дельных аминокислотных остатков образуют горизонтальные ряды кросс- пиков. Видно, что протоны каждого аминокислотного остатка можно от- нести на основании их связности с соответствующим а-протоном амино- кислоты, который наблюдается отдельно в слабом поле. Это показано на примере остатков двух аминокислот - пролина и орнитина. Для этого в 600
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса спектре достаточно проанализировать горизонтальные ряды кросспиков, связанных с ос-протонами отдельных аминокислотных остатков. Положе- ние кросспиков отвечает химическим сдвигам протонов в спиново-связан- ной системе. Таким методом удается произвести отнесение в спектрах, которые в одномерном варианте совершенно бесперспективны для анализа. Следует, однако, заметить, что точное отнесение сигналов к конкретным протонам невозможно осуществить, основываясь исключительно на приве- денном спектре, поскольку в нем ССВ, передающиеся через 2-3 химичес- ких связи, невозможно визуально отличить от более далеких взаимодейст- вий. Однако этот вопрос можно решить при измерении нескольких спект- ров с разным временем действия спинового замка. Для молекул, которые не состоят из отделенных мономерных блоков, метод TOCSY может служить дополнением к COSY. Он дает возможность установить отдаленных спиновых соседей. Для выполнения такой работы достаточно сравнить спектры COSY и TOCSY для исследуемого образца. В первом из них будем иметь кросспики, отвечающие взаимодействию через 2-3 химических связи, а во втором - также и кросспики для более дальнего взаимодействия. Следует также указать, что TOCSY обеспечивает перенос софазной на- магниченности, что предотвращает исчезновение противофазных корреля- ций в пределах мультиплетов. Такое исчезновение сигналов особенно ха- рактерно для молекул, которые имеют большую естественную ширину ли- ний, например биополимеров. Эффект может проявиться также в спектрах малых молекул, которые содержат мультиплеты со сложной структурой, в условиях низкого цифрового разрешения. В этом случае эксперимент TOCSY имеет неоспоримые преимущества в сравнении с COSY, поскольку в результате его применения образуются более интенсивные кросспики. Отсутствие противофазной структуры пиков означает также, что спектры можно измерять значительно быстрее, поскольку отпадает необходимость в высоком цифровом разрешении. И, наконец, поскольку как диагональные пики, так и кросспики имеют одинаковую фазу, то форма их линии отве- чает чистому поглощению в обоих измерениях. Поэтому можно получить фазочувствительные спектры высокого разрешения. Один из побочных эффектов спинового замка - это возникновение не- когерентного переноса намагниченности в ВСК. Иначе говоря, спиновый замок, как мы уже это видели, способствует возникновению эффекта Овер- хаузера в ВСК (ROE, ВСК-ЯЭО). Чаще всего для малых молекул при не- больших периодах смешивания этот эффект не создает проблем. Проблемы могут возникнуть только для молекул большого размера. Для устранения данного эффекта разработана специальная последова- тельность TOCSY с очисткой. Эта последовательность удаляет ROE-пики путем вычитания из спектра TOCSY соответствующего спектра ROESY, 601
Глава 4. Корреляционная 2П-спектроскопии ЯМР (COSY) содержащего пики ЯЭО, которые являются отрицательными. Методику можно применять только в случае больших молекул, для которых эффекты ЯЭО и ВСК-ЯЭО имеют противоположный знак. 4.8.4. Разновидности спиновых замков для TOCSY Хотя спектры TOCSY в принципе можно получить с помощью простой схемы, которая представлена на рис. 4.44, для практических целей она огра- ничена шириной полосы возбуждения спинового замка, который создается постоянным радиочастотным полем. Для спинов, которые оказались вне спинового замка, созданного импульсом малой мощности, переноса намаг- ниченности не происходит. Здесь ситуация совершенно аналогична подаче 180°-импульса со сдвигом относительно имеющегося диапазона химичес- ких сдвигов. Для решения этой проблемы вместо спинового замка, который создается постоянным радиочастотным полем, применяется последователь- ность композитных (составных) 180°-импульсов (см. раздел 2.24.3). При этом достигается многократное увеличение спектрального диапазона спи- нового замка без увеличения мощности передатчика, поскольку эффектив- ность действия композитных импульсов намного превышает действие ши- рокополосных 180°-импульсов. Для практической реализации эксперимента TOCSY существуют два подхода, которые базируются на применении композитных импульсов (рис. 4.48). Первый из них (рис. 4.48а) включает так называемый спиновый замок MLEV-17 (от MLEV-16, описанной ранее, последовательность отли- чается наличием чистящих импульсов). В нем для получения необходимо- го общего периода смешивания используется четное число композитных импульсов. Кластер импульсов, которые образуют единичный элемент спи- нового замка, можно обозначить как RRR'R'R'RRRR'R'R'RRR'R'R, где эле- мент R означает последовательность импульсов QO^ISO^PO0^, а элемент R' - последовательность 90°_л180°_у90°_л. Поскольку спиновый замок для каж- дого инкремента включается в момент времени, который определяется пе- риодом tj, то на момент его включения каждый из векторов намагничен- ности, отвечающих резонансным сигналам образца, имеет две взаимно пер- пендикулярные составляющие, направленные вдоль осей х и у. Для обеспе- чения сбора данных в виде сигналов поглощения необходимо устранить всю намагниченность, которая не совпадает с осью действия спинового замка, то есть ту, которая направлена вдоль оси х. Это достигается путем ис- пользования чистящих импульсов (trim-pulses) продолжительностью 2-3 мс, ориентированных вдоль оси спинового замка (SLy на рис. 4.48а). Они не воздействуют на ту намагниченность, которая расположена на оси спино- вого замка, а намагниченность, которая расположена в других направле- 602
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ниях, расфазируется, поскольку попадает в неоднородное радиочастотное поле (аналогично тому, как происходит расфазировка поперечной намагни- ченности в неоднородном статическом магнитном поле). I Рис. 4.48. Две практически важные схемы для осуществления TOCSY бази- руются на (a) MLEV-17 и (б) DIPSI-2. Последовательность MLEV для по- лучения сфазированных сигналов по краям спинового замка включает чис- тящие импульсы (SL). В схеме (б) исправление фазы сигналов достигается с помощью фазового цикла 90°-импульсов z-фильтра, которые расположе- ны с обеих сторон DIPSI-2. Альтернативный подход основан на том, что расфазировка спинов не происходит, если их векторы направлены вдоль внешнего магнитного поля. Поэтому, если на время периода эволюции повернуть векторы вдоль оси z и использовать подходящую схему смешивания намагниченности, то мож- но полностью устранить расфазировку сигналов в этот период. Этого можно достичь подачей дополнительного 90°-импульса перед включением спино- вого замка. В результате вся намагниченность из поперечной плоскости перебрасывается на ось z. Действие самого замка также можно ориентиро- вать вдоль оси z. По окончании периода смешивания подачей еще одного импульса z-намагниченность снова превращается в сфазированную попе- речную намагниченность, которую можно детектировать в виде сигналов поглощения. Идея преобразования поперечной намагниченности в z-намаг- ниченность с целью последующего получения спектров без фазовых иска- жений называется z-фильтрацией. Реализовать спиновый замок вдоль за- данной оси можно с помощью различных типов композитных импульсов - MLEV-16, WALTZ-16 и DIPSI-2. Для 'Н-'Н TOCSY последняя последова- тельность оказывается оптимальной. Использование данной последователь- ности требует независимой инверсии каждого 90°-импульса с соответст- 603
Глава 4. Корреляционная 2П-спектроскопии ЯМР (COSY) вующей инверсией фазы приемника, так, (р = х, -х, х, -х, Ф = х, х, -х, -х и Фг = х, -х, -х, х. Периоды 5 необходимы для переключения мощности гене- ратора. В каждой из описанных двух общих схем достигается широкая полоса спинового замка при радиочастотной мощности, которая является значи- тельно меньшей, чем это необходимо для 90°-импульса. Для MLEV мощ- ность радиочастотного поля должна вдвое превышать необходимый спект- ральный диапазон спинового замка. В более совершенной последователь- ности DIPSI-2 она может отвечать этому спектральному диапазону. Так, для спектрального окна в 10 м.д. при 400 МГц для этих последовательнос- тей уВ! = 8 КГц (90° = 30 мкс) или 4 КГц (90° = 60 мкс), соответственно. 4.8.5. TOCSY с градиентным отбором Для образцов, концентрация которых достаточна для того, чтобы измерять их спектры с одного скана, градиентная разновидность TOCSY может ока- заться особенно полезной для сокращения времени эксперимента. По ана- логии с приведенными выше обсуждениями спектров COSY, последова- тельность TOCSY в абсолютных значениях требует размещения одинако- вых градиентных импульсов с обеих сторон последовательности спинового замка (рис. 4.49а). Рис. 4.49. TOCSY с градиентным отбором. Последовательность (а) подхо- дит для спектров в форме абсолютных значений. Соотношение градиентов 1 1 обеспечивает отбор спектра N-типа. Последовательность (б) обеспечи- вает получение фазочувствительного набора данных с помощью метода эха-антиэха. При этом с помощью инверсии первого градиента данные Р- и N-типа собираются раздельно. 604
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса При этом селективно рефокусируются когерентности N-сигналов. Чис- тящие импульсы не используются, поскольку в этом методе нет необхо- димости в точной фазировке сигналов. Как и для COSY абсолютных зна- чений, данный эксперимент легко автоматизировать, поскольку обработка спектров довольно проста. Однако фазочувствительный вариант програм- мы является лучшим с точки зрения получаемого разрешения. Его можно реализовать с помощью последовательности, в которой градиентные им- пульсы сопровождаются фрагментами спинового эха для рефокусировки химических сдвигов. В этом случае данные для переноса когерентности Р- и N-типов для каждого инкремента ti собираются раздельно. Для этого, как обычно, проводят инверсию знака одного из градиентных импульсов. На- личие двух наборов данных дает возможность использования квадратур- ного детектирования. Обработка данных с помощью методики эха-антиэха приводит к получению спектров в фазочувствительном представлении. 4.9. Осложнения, возникающие при интерпретации спектров COSY Материал, который помещен в предыдущих разделах, свидетельствует о том, что методика COSY является мощным методом для интерпретации протонных спектров. С ее помощью можно решать множество сложных вопросов структурной органической химии. Большинство спектров COSY измеряется для установления спиновой связи между вицинальным и геми- нальным протонами. Решение этого вопроса позволяет надежно отнести сигналы, которые в спектре имеют одинаковый вид, к разным спиновым системам. Чаще всего спектры COSY измеряются в автоматическом режи- ме, когда параметры измерения спектра устанавливаются спектрометром самостоятельно исходя из избранной величины спектрального диапазона и заданного числа инкрементов. Хотя такой подход существенно упрощает работу оператора, однако анализ спектров COSY, полученных таким обра- зом, может сталкиваться с определенными осложнениями. Они связаны с тем, что кросспики, видимые в спектре, возникают не только за счет геми- нальных и вицинальных КССВ, а и за счет взаимодействия через 4 хими- ческие связи. Особенно часто такое взаимодействие имеет место в арома- тических соединениях. Дальнее ССВ проявляется в спектрах как дальнейшее расщепление спиновых мультиплетов, образованных за счет вицинальных КССВ. Именно для таких соединений спектры COSY измеряются наиболее часто с целью идентификации мультиплетов, ко- торые для разных спиновых систем могут иметь практически идентичный вид. Типичную ситуа- цию, которая возникает при анализе рутинных спектров COSY ароматических соединений, мы покажем на примере довольно простого вещест- ва, которое имеет строение 4.6. 605
Глава 4. Корреляционная 2П-спектроскопии ЯМР (COSY) Как видно из приведенной формулы, соединение содержит две иден- тичные спиновые системы. Хотя сигналы в спиновых системах и различа- ются, но из протонного спектра определить принадлежность мультиплетов к конкретной спиновой системе не удается. Ниже, на рис. 4.50, приведен фрагмент спектра COSY, содержащий сигналы ароматических протонов. Вдоль оси приведен соответствующий одномерный протонный спектр сое- динения. При измерении спектра мы, согласно представленным выше реко- мендациям, заузили спектральный диапазон, SW, таким образом, чтобы в спектре наблюдались лишь сигналы ароматических протонов. В этом случае разрешение оказывается достаточно большим в обоих измерениях спектра. Рис. 4.50. Спектр COSY соединения 4.6, измеренный в условиях сужения SW до границ поглощения ароматических протонов. В слабопольной части спектра содержатся два дублета, между которы- ми кросспик отсутствует. Из этого следует, что они принадлежат разным спиновым системам. Исходя из формулы эти дублеты можно отнести к протонам Н5 и НЗ', однако на данном этапе анализа еще невозможно опре- 606
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса делить, где именно поглощает каждый из протонов. Анализ начнем со сла- бопольного дублета, которому отвечает диагональный пик, обозначенный на схеме цифрой 1. Этот пик связан с двумя кросспиками, 15 и 2, имеющи- ми почти одинаковую интенсивность. Один из кросспиков обусловлен ви- цинальным взаимодействием, а другой - взаимодействием через 4 хими- ческие связи. Нашей первоочередной задачей является отслеживание вици- нальных взаимодействий. Для выяснения того, какой сигнал имеет вициналь- ную КССВ с сигналом 1, надо проанализировать оба возможных варианта. Если считать, что вицинальная КССВ обусловливает появление кросспи- ка 15, то окажется, что ему должен отвечать диагональный пик 5, а следую- щим его партнером по ССВ будет сигнал 7, имеющий вид дублета (посколь- ку между этими диагональными пиками существует кросспик 6). Между тем, из формулы соединения вытекает, что следующим сигналом в спино- вой системе должен быть триплет, а уже он должен быть связан с дубле- том. Таким образом, гипотеза о том, что сигнал 15 является вицинальным партнером сигнала 1, не подтверждается. Итак, сигнал 1 имеет вицинальную связь с сигналом 3 через кросспик 2. Сигнал 3 имеет спиновую связь с диа- гональным пиком 5, имеющим вид триплета. Поэтому именно сигнал 5 яв- ляется следующим партнером по вицинальному ССВ. Сигнал 5 связан с сиг- налом 7 через кросспик 6. Таким образом, в проанализированную спи- новую систему входят сигналы с диагональными пиками 1-3-5-7. В соеди- нении этим пикам могут отвечать протоны Н5-Н6-Н7-Н8. Совершенно аналогично можно проанализировать и вторую спиновую систему соеди- нения, которой отвечают пики 8-10-3-14. Этим пикам отвечают протоны Н3’-Н4’-Н5’-Н6’. Связь между диагональными пиками через соответст- вующие им кросспики на схеме показана прямыми линиями. Поскольку кросспики являются симметричными относительно диагонали, то для ана- лиза можно использовать любой из них. Целесообразно схемы взаимодей- ствий в разных спиновых системах вычерчивать так, чтобы линии на схе- мах по возможности меньше пересекались. В зависимости от взаимного расположения сигналов, линии, которые отвечают корреляциям, могут об- разовывать собой спираль, как это показано на приведенной выше схеме. Таким образом, мы видим, что проанализировать даже простой спектр COSY бывает не так уже и просто, когда в нем содержатся корреляции че- рез 4 химические связи. Простейшим подходом, который дает возможность удалить из спектра дальние корреляции, является применение более жест- кой функции сглаживания. При этом близкие противофазные компоненты мультиплетов взаимно уничтожаются, что уменьшает интенсивность соот- ветствующего кросспика. Ниже, на рис. 4.51, приведены COSY спектры, идентичные предыдущему, за исключением параметра функции сглажива- ния - синусоидального колокола. На рис. 4.51а эта функция спадает вдвое 607
Глава 4. Корреляционная 2В-спектроскопии ЯМР (COSY) медленнее, чем на рис. 4.50, а на рис. 4.516 - вдвое быстрее. Видно, что в первом случае в двумерном спектре остались лишь кросспики, обусловлен- ные дальними КССВ, а во втором - те кросспики, которые отвечают вици- нальным КССВ. Таким образом, мы видим, что в отличие от одномерных спектров, где функции сглаживания влияют лишь на разрешение сигналов в спектре, в двумерной спектроскопии они могут кардинально изменить весь спектр. Поэтому при анализе спектров COSY надо всегда учитывать эту особенность и строить заключения очень осторожно. 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 Fl (ppm) Fl (ppm) Рис. 4.51. Влияние параметров сглаживающей функции - синусоидального колокола - на вид спектра COSY соединения 4.6. Условия измерения спект- ра те же самые, что и на рис. 4.50. При увеличении ширины спектрального диапазона при неизменном ко- личестве инкрементов цифровое разрешение спектра снижается и кросспи- ки, обусловленные малыми КССВ, из спектра исчезают. Однако при этом увеличивается относительная интенсивность диагональных пиков, которая может также воспрепятствовать однозначной интерпретации спектра. 608
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Глава 5. Методики 2В-спектроскопии ЯМР 5.1. Введение В настоящее время, если проанализировать литературу, которая посвящена использованию двумерных методик ЯМР для структурных исследований, можно найти описания многих десятков экспериментов, которые дают воз- можность найти структуру соединения, основываясь на определенных па- раметрах спектров ЯМР. Мы уже знаем, что таких параметров не так уже и много. Это время релаксации, величины КССВ и значения химических сдвигов магнитных ядер. Итак, какой бы метод мы ни использовали, его действие сведется к генерации кросспиков, связанных с одним из трех наз- ванных спектроскопических параметров между разными атомами молеку- лы. Таким образом, все методы двумерного ЯМР можно поделить на три большие группы. Среди методов, которые эксплуатируют явление релакса- ции, наиболее важны те, которые позволяют выявить гомоядерные и гете- роядерные эффекты Оверхаузера. Хотя сам ЯЭО и неэквивалентен явле- нию релаксации, но механизм его возникновения основан на вкладах в суммарное время релаксации ядра диполярного взаимодействия с соседни- ми ядрами. Поэтому данный метод совершенно оправданно можно отнести к релаксационным. В двумерном варианте наиболее известной и распрост- раненной методикой является NOESY. Метод имеет многочисленные раз- новидности, но с физической точки зрения они существенно не отличаются одна от другой. Поэтому мы рассмотрим лишь базовый эксперимент NOESY-2D и его разновидность EXSY, которая используется для изучения химического обмена. Будут также даны основы эксперимента ROESY-2D, который является двумерным аналогом соответствующего одномерного эксперимента, описанного ранее. Методы двумерной спектроскопии ЯМР, которые используют явление спин-спинового взаимодействия между отдельными спинами, мы уже изу- чали в разделе, посвященном методикам COSY. Поскольку, как это мы ви- дели, нахождение величин КССВ данным методом можно выполнить лишь для простейших систем, был разработан ряд методик, который специально приспособлен для этой цели. Это так называемые методики /-разрешенной спектроскопии. Существуют методы нахождения гомоядерных и гетеро- ядерных КССВ, а также дальних КССВ. Целесообразность таких экспери- ментов определяется тем, что существуют многочисленные корреляции между КССВ и геометрическими параметрами молекулы, вследствие чего структуру молекулы часто можно установить, основываясь именно на зна- чениях КССВ. Хотя в предыдущих разделах мы видели, что в ряде случаев КССВ между протонами (взаимодействие 1Н-1Н) можно найти непосредст- вен
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР венно из одномерного спектра, но на самом деле это возможно лишь в относительно простых случаях. Когда же в спектре имеем наложение спи- новых мультиплетов, то проанализировать такой сигнал оказывается прак- тически невозможным. Наиболее сложно найти в одномерных спектрах КССВ для пар ядер, в которых хотя бы одно из них имеет малое естест- венное содержание. Чаще всего это касается пар !Н-13С и 13С-13С. Для на- хождения КССВ !Н-!Н и !Н-13С используются соответствующие методики /-разрешенной спектроскопии, а для нахождения КССВ 13С-13С применя- ется метод INADEQUATE. Именно эти методы и будут обсуждены в соот- ветствующих разделах. Последними будут обсуждены методы, которые основаны на корреля- циях химических сдвигов ядер разного типа. Такие эксперименты назы- вают экспериментами по гетероядерной корреляции. С их помощью можно найти величины химических сдвигов ядер одного типа, если ранее сделано отнесение сигналов ядер второго типа. Чаще всего, основываясь на сделан- ном ранее отнесении сигналов в протонном спектре соединения, проводят отнесение сигналов углеродного или азотного спектра. Однако несмотря на то, что целью таких экспериментов является определение химических сдвигов, все они основаны на наличии между ядрами спин-спинового взаи- модействия. Наличие ССВ предопределяет возникновение кросспиков в соответствующих спектрах. С этой точки зрения, данные методики являют- ся гетероядерными разновидностями COSY. Хотя эксперименты по гетеро- ядерной корреляции и будут обсуждены последними, однако это не означа- ет, что они имеют небольшое применение. На наш взгляд, эти эксперименты являются наиболее мощным методом структурных исследований. Часто они помогают полностью доказать строение углеродного скелета молеку- лы, то есть получить те же самые результаты, которые иначе можно полу- чить с помощью рентгеноструктурного анализа. Существуют две разновид- ности гетероядерной корреляционной спектроскопии. Одна из них реализу- ется в методах HMQC и HSQC, в которых кросспики образуются за счет КССВ через одну химическую связь. Этот метод позволяет отнести атомы углерода, которые непосредственно связаны с протонами. Вторая разно- видность гетероядерных корреляций - это метод НМВС и его аналоги, даю- щие возможность отнести четвертичные атомы углерода. При комбиниро- ванном использовании обоих методов можно выполнить полное отнесение сигналов в углеродном спектре. 5.2. Методы, основанные на ядерном эффекте Оверхаузера В данном разделе будет рассмотрено несколько однотипных методик дву- мерного ЯМР, в которых кросспики образуются между ядрами, принимаю- щими участие в релаксации друг друга. Поскольку такая релаксация обу- 610
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса словлена, в первую очередь, диполь-дипольным взаимодействием, то нали- чие кросспика свидетельствует о пространственной близости магнитных ядер. Хотя в предыдущих разделах можно было ознакомиться с многочис- ленными одномерными методиками, пригодными для выявления простран- ственной близости ядер, однако для многоатомных молекул эти методы требовали проведения соответствующего количества независимых экспе- риментов. Преимуществом двумерных методик является то, что в одном эксперименте удается найти все имеющиеся факты близкого расположения магнитных ядер. Анализ полученных результатов позволяет построить гео- метрическую модель молекулы, которая наиболее полно отвечает получен- ным эффектам. 5.2.1. Спектроскопия NOESY-2D Хотя метод одномерного ЯЭО является одним из старейших в спектро- скопии ЯМР, его двумерный вариант был вначале использован для иссле- дования лишь биологических макромолекул. С этой целью была разрабо- тана импульсная последовательность NOESY-2D. Она является средством изучения нестационарных ЯЭО. Поэтому наиболее легко ее применить для объектов, в которых ЯЭО возникает достаточно быстро. Этим условиям вполне отвечают биологические макромолекулы, ЯЭО для которых явля- ются отрицательными, сильными и возникают за несколько десятков мил- лисекунд. Традиционно эта методика для малых молекул использовалась реже, поскольку в условиях предельного сужения линий величины ЯЭО нарастают намного медленнее, что увеличивает время эксперимента. Су- ществование довольно эффективного альтернативного подхода, который базируется на разностной спектроскопии, во многих случаях делало ис- пользование NOESY менее желательным. Однако в последние годы, после того как приборы стали значительно более совершенными и чувствитель- ными, данный метод все шире используют и для изучения малых молекул. Для решения ряда задач он оказывается даже лучшим по сравнению со стационарным ЯЭО. Наиболее важным преимуществом такого подхода яв- ляется то, что эксперимент NOESY не селективен. Поэтому в одном экспе- рименте можно получить все возможные ЯЭО (это аналогично сравнению спектров COSY с экспериментами селективной развязки ССВ). Кроме того, для NOESY не нужна ручная установка параметров и частот подавления, что позволяет проводить эксперимент в автоматическом режиме. К недостаткам NOESY и других методов нестационарного ЯЭО сле- дует отнести их меньшую чувствительность. Разница в чувствительности обусловлена тем, что в экспериментах стационарного ЯЭО осуществляется непрерывный приток в систему энергии внешнего радиочастотного облу- 611
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР чения, которое оказывает содействие увеличению ЯЭО. В отличие от это- го, в экспериментах по нестационарному ЯЭО изменения интенсивностей сигналов обусловлены лишь первичной инверсией сигналов. В результате этого ЯЭО возникает только на короткое время. Поэтому сбор данных дол- жен быть осуществлен довольно быстро, однако даже в этом случае макси- мально возможной величины для ЯЭО зарегистрировать не удается. Для очень малых молекул (М <200), которые в растворе вращаются с высокой скоростью, величины ЯЭО оказываются слишком малыми. Это связано с не- эффективностью процессов кросс-релаксации для таких молекул. Поэтому изучать малые молекулы методами нестационарного ЯЭО практически не удается. Такие исследования становятся возможными, если масса молекул превышает 200 Дальтон. 5.2.1.1. Последовательность NOESY-2D Принцип получения двумерного набора данных в эксперименте NOESY совершенно аналогичен тому, который был описан для эксперимента COSY. Отличие заключается в том, что в этом случае кросспики отвечают ЯЭО-корреляциям между соответствующими сигналами. Поэтому спектр является графическим представлением пространственных взаимодействий ядерных спинов. Последовательность NOESY (рис. 5.1) отличается от COSY тем, что в ней период смешивания включает два 90°-импульса, разделенных пери- одом смешивания, тт, во время которого и возникают ЯЭО. Для объяснения его роли в эксперименте мы воспользуемся векторной моделью (рис. 5.2). Рис. 5.1. Последовательность NOESY-2D и соответствующий ей путь пере- носа когерентности. Преимущества использования импульсного градиента поля (импульс Gz) во время периода смешивания описаны в тексте. 612
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 5.2. Эволюция векторов намагниченности при работе последователь- ности NOESY. Инвертированная намагниченность на протяжении периода смешивания генерирует ЯЭО. Поперечная намагниченность, которая оста- лась, удаляется с помощью фазового цикла или импульсного градиента поля. Действием первого 90°-импульса вся продольная намагниченность пе- реносится в поперечную плоскость. После первичного возбуждения имеет место период эволюции tb В это время вектор намагниченности находится в перпендикулярной плоскости, а его компоненты, которые отвечают хи- мическим сдвигам и КССВ, эволюционируют согласно своим частотам прецессии. Период эволюции изменяется от одного инкремента к другому и служит, как и в методе COSY, для генерации второго измерения непря- мым методом. На момент подачи второго импульса каждый из векто- ров намагниченности, отвечающих отдельным магнитным ядрам, мож- но представить в виде двух векторов, расположенных в направлении осей х и у. Второй импульс один из этих векторов переносит к оси -г. Если мы используем импульсы 90°х, то в направлении к оси -г перемещается тот компонент, который был направлен вдоль оси у. В методе COSY мы ис- пользовали тот компонент намагниченности, который оставался в попереч- ной плоскости, именно для него второй импульс осуществлял перераспре- деление намагниченностей в спиново-связанных системах и генерировал образование кросспиков. Компонент намагниченности, который второй им- пульс перемещал к оси -г, мы раньше игнорировали и не использовали. Однако этот компонент оказывается очень полезным для генерирования ЯЭО, так как, как это мы видели раньше из селективных экспериментов, ЯЭО возникает в том случае, когда вектор намагниченности определенного ядра оказывается инвертированным. В случае спектроскопии NOESY ин- вертированными оказываются одновременно компоненты намагни- ченности всех магнитных ядер, поэтому все они, если это только воз- можно с точки зрения взаимного расположения ядер, являются источ- ником возникновения ЯЭО. Ориентация векторов намагниченности, ко- торые соответствуют различным магнитным ядрам, зависит от их химичес- кого сдвига. Поэтому после подачи второго импульса для одних ядер к оси -г будет направлена практически вся намагниченность и для них ЯЭО будет максимальным, для других же ядер, векторы которых в этот момент 613
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР близки к оси у, переноса практически не произойдет. При переходе от инкре- мента к инкременту ЯЭО будет наблюдаться для различных ядер, а весь эксперимент даст возможность наблюдать все имеющиеся ЯЭО. Эффект ЯЭО для своего возникновения требует определенного време- ни. Это время и обеспечивается последующим периодом смешивания тт. Компоненты намагниченности, которые остаются в поперечной плос- кости и которые можно детектировать в эксперименте COSY, в экспе- рименте NOESY удаляют с помощью дальнейшей обработки сигнала. На рис. 5.1 для этого использован единичный градиентный импульс. Одна- ко с не меньшим успехом, как мы покажем дальше, выделять сигнал ЯЭО можно также и с помощью соответствующего фазового цикла. По оконча- нии периода смешивания, тт, новое распределение заселенностей регист- рируется с помощью еще одного 90°-импульса. Действие этого импульса заключается в перенесении намагниченности от оси -z в поперечную плос- кость. При этом переносится исключительно та намагниченность, которую к оси -z перенес второй импульс. Ее компоненты образуют в конечном спектре диагональные пики. Эти пики должны быть инвертированны- ми. Кроме того, в поперечную плоскость переносится намагничен- ность, которая отвечает изменению интенсивностей сигналов за счет ЯЭО. Они могут быть как положительными, так и отрицательными в зави- симости от особенностей молекулярного движения. Эти компоненты на- магниченности в периоды времени ti и tm имели разные частоты прецессии, поэтому в конечном спектре они образуют кросспики между диагональ- ными пиками, для которых имеет место ЯЭО. Эти ЯЭО и регистрируются при сборе данных, который происходит непосредственно после подачи третьего импульса. Таким образом, в результате действия последователь- ности NOESY вместо кросспиков, связанных с переносом когерентности (их мы из спектра удаляем), появляются кросспики, связанные исключи- тельно с изменениями заселенностей. Для достижения необходимого соотношения сигнал/шум последова- тельность повторяется многократно. Поскольку для полного восстановления исходной намагниченности перед следующим сканом необходим период времени 5ТЬ то эксперимент занимает довольно много времени, особенно для малых молекул. На практике в этом случае применяют более короткий период релаксации, который равняется 1-3 с (1—2Ti - для спина, который релаксирует наиболее медленно). Последовательность NOESY во многом аналогична последовательнос- ти DQF-COSY, поскольку обе они включают 3 последовательных 90°-им- пульса, которые разделены определенными промежутками времени. Поэто- му она требует аналогичного выделения целевых сигналов ЯЭО и подав- ления нежелательных сигналов с помощью подходящего фазового цикла 614
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (таблица 5.1). Поскольку ЯЭО связан исключительно с заселенностями ядерных уровней, то порядок когерентности соответствующей ему z-намаг- ниченности равняется нулю. Вследствие этого сигналы ЯЭО нечувстви- тельны к изменениям фазы радиочастотных импульсов. Поэтому при четы- рехшаговом фазовом цикле можно удалить из спектра сигналы, которые связаны с 1- и 2-квантовой когерентностями и возникают за период тт. Для удаления из результирующего спектра аксиальных пиков цикл повторяется с дополнительной инверсией фазы возбуждающего импульса и приемника. Таким образом, получаем восьмишаговый фазовый цикл. Поскольку хи- мический обмен также связан с обменом продольной намагниченности определенных сигналов, то в результате эксперимента NOESY в ко- нечном спектре обменные процессы также проявляются. Если описы- ваемая последовательность используется для изучения обменных процес- сов, то ее еще называют EXSY (Exchange Spectroscopy). Таблица 5.1. Базовый фазовый цикл NOESY для трех импульсов (Рп) и приемника (PR) с устранением аксиальных пиков Скан Pi р2 Рз Pr 1 X X X X 2 X X У У 3 X X -X —X 4 X X -у -у 5 -X X X —X 6 -X X У -у 7 -X X —X X 8 -X X -у У Для NOESY желательно использование фазочувствительного пред- ставления спектров, поскольку в этом случае, с одной стороны, удается различить ЯЭО и обменные процессы по знаку эффектов, а с другой сторо- ны - избавиться от ряда артефактов, которые описаны ниже. Фазочувстви- тельное представление спектров позволяет также повысить разрешение в спектрах и проводить количественные определения величин ЯЭО. В экспе- рименте NOESY кросспики имеют одинаковую фазу, форма линии отвеча- ет сигналу поглощения и пики расположены симметрично относительно диагонали (поскольку изменение интенсивностей параллельных переходов происходит в одинаковой мере). Знак кросспиков относительно диагональ- ных пиков определяется особенностями молекулярного движения и совпа- дает со знаком эффекта Оверхаузера. 615
Глава 5. Методики 2П-спектроскопии ЯМР Селекцию необходимой когерентности можно осуществить также и с помощью импульсных градиентов поля. В этом случае отпадает потреб- ность использования фазового цикла. Ее можно осуществить путем введе- ния единичного z-градиентного импульса во время периода смешивания. При этом все векторы когерентности, за исключением ^-намагниченности, расфазируются (рис. 5.1). Однако выигрыш во времени проведения экспе- римента при градиентной селекции достигается только в случае, если кон- центрация образца настолько высока, что количество сканов на каждый инкремент будет меньше 8. Несмотря на то, что выделение целевых сигна- лов ЯЭО методами фазового цикла или градиентов не имеет преимуществ с точки зрения времени эксперимента, однако метод градиентов все же более предпочтителен, поскольку удаление ненужных сигналов типа COSY с его помощью происходит более полно. При работе с водными растворами в базовую импульсную последовательность могут быть также включены схемы подавления сигнала растворителя. 5.2.1.2. Осложнения, возникающие в спектрах NOESY Основными нежелательными сигналами, которые следует удалить из спект- ра NOESY, являются сигналы, которые связаны с нульквантовой когерент- ностью (ZQC). Эта когерентность присутствует во время периода смешива- ния и переводится в видимые сигналы подачей последующего 90°-импуль- са. Поскольку, как и в сигналах ЯЭО, у этих сигналов порядок когерент- ности равняется нулю, они не удаляются из спектра с помощью фазового цикла или градиентной селекции. Поэтому они могут присутствовать в ко- нечном спектре. Такая когерентность возникает в спиновых системах, связанных ССВ, и дает пики, похожие на COSY, которые являются нульквантовым аналогом сигналов, детектируемых в спектрах COSY с двухквантовой фильтрацией. Эти сигналы имеют противофазную ориента- цию компонентов мультиплетов. Если в спектре присутствуют /-связан- ные сигналы, для которых наблюдается ЯЭО, то пик ЯЭО будет иметь искажения, связанные с ZQC. Поэтому такие искажения следует по воз- можности подавлять. Для больших молекул, которые имеют широкие ли- нии, ZQC-пики имеют тенденцию к исчезновению, а для малых молекул и молекул среднего размера их величина может оказаться сравнительно большой. Для подавления ZQC-пиков разработано довольно много подходов. Однако наиболее широко применяется метод введения в период смешива- ния малых интервалов, которые усредняют ZQC-пики. На практике такие дополнительные интервалы вводятся между каждым ti-инкрементом. В то время как в период смешивания ZQC осциллирует со звуковой частотой, 616
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса которая равняется разности хими- ческих сдвигов /-связанных спи- нов, (vA - vx), величина ЯЭО плав- но нарастает (рис. 5.3). Поэтому усредняющие вариации тт приво- дят к усреднению ZQC, в то вре- мя как ЯЭО изменятся несущест- венно (фактически усреднение сигналов ZQC скорее уменьшает ti-шумы, а не конкретные кросс- пики). Степень вариаций тт долж- на быть близкой к обратной вели- чине разности химических сдви- гов взаимодействующих ядер, (Va-Vx)"1 Поэтому для разнос- ти химических сдвигов, например 50 Гц, усредняющие флюктуации должны составлять 50 мс. Даже в случае использования такого под- хода вблизи диагонали наблю- даются остаточные сигналы типа COSY. Дополнительные артефак- ты возникают между /-связанны- ми спинами, если продолжитель- ZQC Рис. 5.3. Изменение интенсивностей ЯЭО и ZQC на протяжении периода смешивания NOESY. ZQC можно уменьшить с помощью малых усред- няющих вариаций тт, которые сущест- венным образом не влияют на вели- чины ЯЭО. ность импульсов отличается от 90° Поэтому перед проведением экспери- мента импульсы следует тщательно калибровать. 5.2.1.3. Оптимизация времени смешивания В экспериментах нестационарного ЯЭО крайне важно выбрать оптималь- ный период смешивания, тт. Неправильный выбор этого интервала может привести к полному исчезновению из спектра сигналов, связанных с ЯЭО. Это обусловлено тем, что в случае, если тт слишком мал, ЯЭО не успеет вы- расти до видимого уровня. Если же тт слишком велик, ЯЭО может умень- шиться до нуля из-за протекания релаксационных процессов. На выбор тт более всего влияет скорость молекулярного движения и связанная с ней скорость продольной релаксации протонов молекулы (рис. 5.4). На вели- чину тт влияет также вид информации, которую желательно получить из спектра. Если, как это часто бывает при изучении малых молекул, из спект- ра необходимо получить лишь качественную карту ЯЭО-взаимодействий между протонами, то оптимальная величина тт отвечает времени, за кото- 617
Глава 5. Методики 2В-спектроскопии ЯМР рое ЯЭО возрастает до максимума. Если же полученные данные исполь- зуются для количественных или полуколичественных определений расстояний между атомами, то следует работать в области, где рост ЯЭО имеет линейный характер. В этом случае период тт должен быть соответствующим образом уменьшен. Интенсивность кросспика ЯЭО Медленное движение Быстрое движение Рис. 5.4. Схема роста кросспика ЯЭО для больших молекул, которые дви- гаются медленно, и маленьких молекул, которые двигаются быстро. Счита- ется, что диагональный пик положителен. Оптимальную величину тт для качественных исследований можно пред- сказать заранее на основании величины времени релаксации Ть Поскольку чаще всего времена релаксации неизвестны, то можно осуществить их быстрое определение с помощью соответствующих методов. Не следует стремиться найти точные времена релаксации, поскольку в любом случае величина тт будет компромиссной для времен релаксации разных протонов в молекуле. Для малых молекул оптимальное значение тт близко к Ть Именно таким надо его задавать для молекул с молекулярной массой меньшей 500 Дальтон в невязких растворителях. Ti при этом находится в диапазоне от 0.5 до 2 с. При уменьшении скорости молекулярного движения (при по- вышении молекулярной массы образца или вязкости растворителя) соот- ветственно уменьшается Ti и для эксперимента необходимы более корот- кие тт. Следует проявлять особую осторожность при работе вблизи района нулевых ЯЭО. В области отрицательных ЯЭО оптимальная величина тт составляет 0.5Ть поскольку увеличение периода смешивания приводит к нарастанию спиновой диффузии. 618
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 5.2.2. Измерение ЯЭО в ВСК: ROESY Преимущества использования ВСК были обсуждены в предыдущих раз- делах, посвященных соответствующим одномерным спектрам. Наиболее важным является то, что ЯЭО в этом случае положительны при любых скоростях молекулярного вращения и соответственно для молекул любых размеров. Поэтому для молекул среднего размера, когда ЯЭО близки к нулю, измерение в ВСК оказывается единственно возможным. Вполне естественно, что разработана двумерная методика, которая позво- ляет фиксировать ВСК-ЯЭО одновременно для всех сигналов молекулы. Эту методику называют ROESY (Rotating-frame Overhauser effect spectroscopy). Поскольку ВСК-ЯЭО являются разновидностью нестационарных ЯЭО, их применение и интерпретация спектров не отличаются от спектров NOESY, поэтому мы не будем повторяться. Отличительной особенностью сигналов ROESY является то, что на них, кроме кросс-релаксации, влияет целый ряд других факторов. Вследствие этого в полученном спектре, кроме ЯЭО, могут присутствовать и другие сигналы, которые могут вызвать ошибки при интерпретации результатов. Поэтому, если Вы решили про- вести ROESY-эксперимент, то следует заранее быть готовым столкнуться с необходимостью выявления артефактов на фоне полезных сигналов и к борьбе с ними. 5.2.2.1. Последовательность ROESY-2D Как и в случае одномерных экспериментов во вращающейся системе коор- динат, основным средством создания условий возникновения ЯЭО в попе- речной плоскости является использование ’’спинового замка” В простей- шей последовательности ROESY (рис. 5.5) роль спинового замка играет слабый длительный радиочастотный импульс. Во время действия спиново- го замка происходит нарастание ВСК-ЯЭО. х Рис. 5.5. Последовательность (ROESY-2D). Период смешивания, тт? зада- ется продолжительностью маломощного импульса спинового замка. Возникновение ВСК-ЯЭО в условиях действия данной последователь- ности можно представить себе следующим образом. В период tb который меняется от одного инкремента к другому и предшествует моменту вклю- 619
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР чения спинового замка, происходит эволюция всех векторов намагничен- ности, которые отвечают магнитным ядрам образца, в соответствии с вели- чинами химических сдвигов и КССВ. Таким образом, в момент включения спинового замка каждый из векторов имеет компоненты намагниченности вдоль осей х и у. Если за время ti тот или иной вектор повернется больше чем на пол-оборота, то его компонента может ориентироваться также и вдоль оси -у. Поэтому при включении спинового замка для разных магнитных ядер, которые различаются по химическим сдвигам, мо- жем иметь противоположную ориентацию компоненты их магнитных векторов вдоль направления у. Противоположные компоненты намагни- ченности фиксируются спиновым замком, который и обеспечивает возник- новение ВСК-ЯЭО. При варьировании периода ti противофазную ориента- цию будут принимать векторы намагниченности протонов с различными химическими сдвигами. Поэтому в разных инкрементах будут накоплены ЯЭО для различных ядер. Весь эксперимент дает возможность получить в спектре все возможные ВСК-ЯЭО. Намагниченность, которая не является параллельной оси спинового замка, во время его действия расфазируется из-за того, что компоненты на- магниченности, которые перпендикулярны фазе спинового замка, враща- ются при его действии в плоскости х-z и расфазируются из-за существу- ющей неоднородности высокочастотного поля (рис. 5.6). Вследствие этого, по окончании действия спинового замка имеем только сигналы ЯЭО. Един- ственными сигналами, которые дополнительно следует подавить, являются аксиальные пики. Это осуществляется с помощью фазового цикла. В изме- рении fi используется квадратурное детектирование. Предложены также варианты эксперимента с градиентной селекцией. Для малых молекул и молекул среднего размера, как и в случае NOESY, период смешивания тт выбирается меньшим 600 мс. компонента, вращающаяся в плоскости x-z запертая компонента Рис. 5.6. Спиновый замок ROESY. Во время его действия намагничен- ность, параллельная полю Вь остается запертой, тогда как ортогональные компоненты намагниченности вращаются вокруг Bi (в нашем случае в плос- кости xz) и, в конце концов, расфазируются из-за неоднородности поля Вр 620
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Для больших молекул, когда имеет место диффузия спинов, величи- ну тт уменьшают, поскольку скорость роста ВСК-ЯКО вдвое превышает скорость роста ЯЭО. Двумерный спектр представляет собой карту транс- анулярных взаимодействий между протонами. Знак кросспиков противопо- ложен знаку диагональных пиков. 5.2.2.2. Осложнения, возникающие в спектрах ROESY Как отмечалось ранее, в спектрах ROESY, кроме пиков, которые связаны с кросс-релаксацией, могут появляться пики, связанные с другими физичес- кими явлениями, протекающими во время действия спинового замка. Они могут иметь такую природу: • кросспики типа COSY, которые проявляются между /-связанными спи- нами; сигналы TOCSY между /-связанными спинами; ослабление кросспиков вследствие внерезонансных эффектов. Первая разновидность сигналов связана с тем, что продолжительный импульс спинового замка действует аналогично последнему импульсу в последовательности COSY, поэтому он индуцирует когерентность /-свя- занных спинов. Полученные пики имеют вид обычных противофазных сиг- налов COSY небольшой интенсивности, поэтому их наличие не слишком мешает интерпретации спектра. Общая интенсивность таких кросспиков, учитывая противофазную ориентацию компонентов мультиплетов, близка к нулю. Значительно большую проблему представляют собой сигналы TOCSY. Они возникают, поскольку продолжительность спинового замка в эксперименте ROESY практически такая же, как и в эксперименте TOCSY Поэтому между /-связанными спинами может происходить эффективный перенос когерентности. В наибольшей мере это происходит для связанных спинов, которые имеют одинаковую по абсолютной величине разность хи- мического сдвига и частоты передатчика, то есть для сигналов, которые расположены симметрично относительно центра спектра. Такие условия часто выполняются в спектрах природных соединений, содержащих боль- шое количество сигналов. В дополнение к нежелательным прямым эффек- там TOCSY может происходить многошаговый процесс передачи намагни- ченности, который включает шаги TOCSY и ВСК-ЯЭО. В результате в спектре могут появиться сигналы ложных ВСК-ЯЭО, которые не связаны с реальными ВСК-ЯЭО-корреляциями. Так, например, перенос TOCSY от спина А к спину В и последующий перенос ВСК-ЯЭО от В к С (рис. 5.7) в итоге приведут к возникновению кросспика, вроде бы подтверждающего наличие ВСК-ЯЭО между А и С. Обратные шаги ВСК-ЯЭО-TOCSY дадут аналогичный сигнал для А, однако в обоих случаях выводы окажутся оши- 621
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР бочными. Поскольку при переносе TOCSY фаза сигнала сохраняется, его вклад в кросспик остается незаметным и может привести к совер- шенно ошибочным выводам. Кросспик В-С Истинный ВСК-ЯЭО Кросспик А-С Ложный ВСК-ЯЭО Кросспик С-А Ложный ВСК-ЯЭО Рис. 5.7. Ошибочные ROE пики в ROESY спектре могут возникать из-за одновременного возникновения эффектов ROE и TOCSY. При проведении экспериментов ROESY особое внимание следует уде- лить исключению из спектров пиков TOCSY. Простейшим методом явля- ется выбор для частоты передатчика такого значения частоты, чтобы пики в спектре не могли быть расположены симметрично относительно него. Можно также измерять два спектра с разной частотой передатчика. Сдвиг частоты довольно мало сказывается на сигналах ROE, но существенным образом меняет интенсивности сигналов TOCSY. Сравнение таких спект- ров позволяет надежно идентифицировать сигналы в спектре. Для умень- шения интенсивности сигналов TOCSY можно также модифицировать им- пульс, который создает спиновый замок (рис. 5.8). 622
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса При этом можно использовать им- пульсный спиновый замок (рис. 5.86). Недавно было показано, что для эффек- тивного подавления переносов TOCSY можно использовать спиновый замок с альтернированием фазы (рис. 5.8в). Та- кой эксперимент называют знакопере- менным ROESY или Tr-ROESY (trans- verse). В этом случае сигналы TOCSY оказываются эффективно подавленны- ми. В эксперименте Tr-ROESY измеря- ются средние величины между ROE и ЯЭО, поскольку вектор намагниченнос- ти проводит некоторое время как в по- перечной плоскости, так и вдоль про- дольной оси z. Это связано с тем, что траектория движения вектора намагни- ченности напоминает движение маят- ника (рис. 5.9). Таким образом, интенсивность кросспиков в такой разновидности эксперимента оказывается уменьшенной по сравнению с истинными ROESY. Для малых молекул, когда (ОоТс «1, теоре- тически потери интенсивности отсутст- вуют. Для средних молекул ((ОоТс = 1) интенсивность сигналов может быть сни- Рис. 5.8. Схемы импульсов сме- шивания для ROESY-эксперимен- та: (а) единичный, маломощный импульс, (б) импульсный спино- вый замок включает последова- тельность импульса с малым уг- лом и коротким промежутком, ко- торый многократно повторяется, (в) Tr-ROESY спиновый замок с альтернированием фазы импульса. жена вдвое, а для очень больших моле- кул ((ОоТс »1) - в 4 раза. Видно, что для молекул среднего размера, для которых измерение спектров ROESY является наиболее целесообразным, имеем комп- ромиссную величину ослабления сигна- лов. Метод требует, чтобы сила радио- частотного поля, yBi, была вдвое боль- шей, чем диапазон сигналов в спектре (уВ j обычно составляет 4-6 КГц). Успех эксперимента в большой степени зави- сит от точности калибровки 180°-им- пульса. Эффективность подавления не- Рис. 5.9. Маятниковое движение векторов, запертых спиновым замком с альтернированием фа- зы в импульсной последователь- ности Tr-ROESY. желательных пиков TOCSY данным методом показана на рис. 5.10 для тет- 623
Глава 5. Методики 2В-спектроскопии ЯМР рамерного карбопептоида 5.1. Видно, что в спектре (б) сигналы TOCSY оказались эффективно подавленными. 5.0 5.0 4.5 4.0 м.д. Рис. 5.10. Спектр ROESY тетрамерного карбопептоида 5.1 записан (а) с единичным непрерывным импульсом спинового замка и (б) со спиновым замком Tr-ROESY с альтернированием фазы с частотой 3.7 КГц и центром при 4.5 м.д. В спектре (а) доминируют пики TOCSY, которые имеют такую же фазу, что и диагональные сигналы. В спектре (б) они в значительной мере подавлены, что дает возможность выявить истинные пики ROE. Третий фактор, который усложняет применение ROESY, заключается в ослаблении интенсивности кросспиков в зависимости от их расстояния от частоты передатчика (центра спектрального диапазона). Особенно это ка- сается количественных экспериментов ROESY. Для устранения такой зави- симости разработаны последовательности ROESY с компенсацией. Именно их следует использовать для определения численных значений ROE. 624
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 5.3. Изучение химического обмена: EXSY Для изучения процессов химического обмена используется импульсная по- следовательность EXSY. Хотя механизмы химического обмена и ЯЭО со- вершенно различны, в обоих случаях происходит перенос продольной на- магниченности. Поэтому оба процесса можно регистрировать с помощью одинаковых одномерных и двумерных методик. Вследствие этого последо- вательность EXSY, которая используется для изучения процессов обмена, на самом деле та же самая, что и NOESY, а последовательность одномер- ного нестационарного ЯЭО можно использовать для определения констант скорости. EXSY отличается от NOESY только тем, что в ней период смешивания выбирается в соответствии со скоростью обмена, а не со скоростью релаксации. Различия в данных программах имеются также в их ’’сервисе” Часто программа EXSY на спектрометрах реализуется таким образом, чтобы кинетические параметры обмена можно было получить мак- симально просто. Как и в случае ЯЭО-экспериментов, эксперименты по изучению хими- ческого обмена можно проводить на качественном либо количественном уровнях. В первом случае выясняются исключительно пути обменного процесса. Эта задача решается с помощью выявления кросспиков, отвеча- ющих сигналам отдельных соединений, между которыми происходит про- цесс обмена. Наличие такого кросспика является доказательством сущест- вования обмена. Во втором случае, кроме того, находятся константы ско- рости обмена. Для этого используются интенсивность кросспиков и ее из- менение с течением времени смешивания. В системах с многопозицион- ным обменом с помощью эксперимента EXSY-2D можно найти константы для всех путей обмена. Однако для этого необходимо, чтобы исследуемые обменные процессы были медленными в шкале времени ЯМР, поскольку для того, чтобы наблюдать обмен между сигналами, их необходимо видеть раздельно. С другой стороны, процессы обмена не должны быть слишком медленными, иначе релаксационные процессы, которые протекают во вре- мя периода смешивания, удалят всю информацию об обменном процессе. Поэтому эксперименты по переносу намагниченности можно проводить только в ограниченном диапазоне скоростей обмена. Существует прави- ло, согласно которому скорость обмена должна быть больше скорости ре- лаксации (keX > 1/Ti). На практике это означает, что эксперименты являют- ся чувствительными к процессам обмена, если их скорость составляет 102 < кеХ < 10“2 с-1 Для разных ядер диапазон допустимых скоростей обме- на также будет разным, что определяется их скоростями релаксации. Чем медленнее релаксируют ядра, тем более медленные процессы обмена можно изучать. Процессы быстрого обмена, когда сигналы коалесцируют, мето- дом EXSY изучать невозможно. В этом случае следует применять методы 625
Глава 5. Методики 2В-спектроскопии ЯМР анализа формы линии, которые основаны на компьютерном моделирова- нии формы сигнала. Для иллюстрации двумерного метода EXSY на рис. 5.11 приведен спектр на ядрах ПВ смеси ВС1з и ВВг3. Присутствующие в спект- ре обменные кросспики свидетельствуют о наличии межлигандного обме- на и показывают, что в обмене принимает участие только один атом гало- гена. На это указывает тот факт, что между всеми диагональными пиками имеется только по одному кросспику, отвечающему переходу иона от од- ной молекулы к другой. Рис. 5.11.128 МГц “В EXSY-2D спектр смеси ВС13 и ВВг3 (1: 1) при 400 К. Спектр был записан с периодом смешивания 50 мс. Для успешного применения EXSY необходим правильный выбор пе- риода смешивания тт. Это связано с зависимостью периода смешивания от константы скорости обменного процесса. При работе на качественном уровне целью работы является получение кросспиков максимальной ин- тенсивности. Поэтому для периода смешивания рекомендуется использо- вать величину тт = 1/кех- Для ее определения проще всего измерять спект- ры EXSY для нескольких значений тт и найти скорость нарастания обмен- ных кросспиков на начальном линейном участке зависимости их интенсив- 626
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ности от тт. Большим недостатком такого подхода является необходимость измерения нескольких двумерных спектров, что требует больших затрат приборного времени. Второй подход состоит в определении констант скорости из единичного EXSY спектра. В этом случае выбор подходяще- го тт становится критически необходимым. Если длительность тт выбрана слишком малой, то величины кросспиков также будут небольшими. Если же, наоборот, интервал тт будет слишком большим, то интенсивность кросспиков не будет коррелировать с кинетическими параметрами. Одно- и двумерные методики изучения обмена находят широкое при- менение для неорганических и органометаллических систем, для которых обычно наблюдается высокая подвижность лигандов. 5.4. Двумерные методики для нахождения КССВ Поскольку довольно часто определение величин КССВ в спектрах ЯМР яв- ляется основной целью их измерения, то для достижения этой цели разра- ботан целый ряд методик, которые называются /-разрешенной спектроско- пией. В отличие от методик, которые были описаны в предыдущих разде- лах, в /-разрешенных экспериментах химические сдвиги и спин-спиновые взаимодействия разделяются вдоль координатных осей. Это дает химику возможность анализировать ССВ без тех осложнений, которые возникают при небольших расстояниях между химическими сдвигами. Например, ана- лиз сложных протонных спектров часто оказывается затрудненным из-за перекрывания соседних мультиплетов, а это может сделать невозможным определение величин химических сдвигов и КССВ. Перекрывание является результатом близких значений химических сдвигов соответствующих маг- нитных ядер. Поэтому, если добиться того, чтобы мультиплеты можно бы- ло рассматривать независимо от химических сдвигов, то эти ограничения были бы в значительной мере сняты и спектр можно было бы легко про- анализировать. На практике получение /-разрешенных спектров сопряжено с рядом технических трудностей, которые снижают эффективность метода. Поэтому эти методики намного менее распространены в структурных ис- следованиях, чем корреляционные. Одним из основных источников ослож- нений при использовании /-разрешенной спектроскопии является сильное взаимодействие между спинами (эффекты второго порядка), которые воз- никают, когда величины КССВ близки к разности химических сдвигов. Уменьшить влияние сильного взаимодействия можно при использовании магнитов с сильными магнитными полями. Поскольку такие приборы ста- новятся все более доступными для химиков, то можно прогнозировать, что методы /-разрешенной спектроскопии будут получать все большее распро- странение. Все методы /-разрешенной спектроскопии основаны на двумер- ной спектроскопии, в которой КССВ и химические сдвиги разделяются по 627
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР координатным осям двумерного спектра. При этом химический сдвиг нахо- дится на оси f2, а спин-спиновое расщепление - на оси fj, причем, в зави- симости от типа эксперимента, оно может быть как гомоядерным, так и ге- тероядерным. 5.5. Гетероядерная J-разрешенная спектроскопия Рассмотрение основ /-разрешенной спектроскопии мы начнем с ее гетеро- ядерного варианта, работу которого понять несколько проще. Поскольку, с практической точки зрения, наиболее важными гетероядерными КССВ являются /(’Н,13С), их мы и будем исследовать. Идея метода заключается в том, чтобы в двумерном спектре вдоль одной оси получить углеродный спектр с полной развязкой от протонов, а во втором измерении - мульти- плетную структуру каждого из пиков. Вообще, цель эксперимента та же са- мая, что и в одномерных экспериментах редактирования спектров, с тем лишь отличием, что в таком эксперименте можно определить не только мультиплетность сигналов, но и найти точные величины гетероядерных КССВ. Для наблюдения в разных измерениях двумерного спектра химических сдвигов ядра X и их расщеплений на ядрах другого типа (чаще всего на протонах) следует соблюсти ряд условий. Необходимо, чтобы в период эволюции соответствующей импульсной последовательности мы имели де- ло лишь с эволюцией векторов, связанных с гетероядерным спин-спино- вым взаимодействием. В период смешивания должны эволюционировать лишь химические сдвиги ядер X. В этом случае при построении непрямого измерения будем иметь модуляции сигнала ядра X, отвечающие лишь вели- чинам гетероядерных КССВ. Оказывается, что такую ситуацию можно реа- лизовать с помощью последовательности /-модулированного спинового эха (рис. 5.12), которую раньше мы использовали для редактирования угле- родных спектров по мультиплетности сигналов углерода. Отличием при этом является то, что длительность интервала А спинового эха меняется от одного инкремента к другому, что дает возможность сформировать измере- ние спектра fi, содержащее информацию о гетероядерных КССВ. Последовательность включает элемент спинового эха по каналу атомов углерода и постоянный декаплинг по каналу протонов, который выклю- чается лишь на время первого из двух одинаковых интервалов А спинового эха. Ключом к пониманию действия последовательности является то, что эволюция векторов намагниченности ядер углерода под влиянием гетеро- ядерного расщепления ’/(Н,С) происходит только при отключенном декап- лере. Когда декаплер включается, спин-спиновое взаимодействие мгновен- но исчезает и все векторы намагниченности, обусловленные гетероядер- 628
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ным ССВ, объединяются в один сигнал по правилам векторного сложения и продолжают эволюцию только векторы химических сдвигов. Рис. 5.12. Метод прерывистого декаплинга для записи гетероядерного /-разрешенного спектра. Эволюция расщеплений происходит только во время первого интервала Д. Таким образом, расщепления, которые наблю- даются в измерении fb проявляются с половиной их истинных значе- ний 'j(H,X). Модель еще упрощается, если вспомнить о том, что можно полностью игнорировать разницу химических сдвигов углерода, поскольку их эволю- ция во время первого интервала Д полностью рефокусируется во время второго интервала Д, который следует за 180°-импульсом. Мы уже знаем, что в СКО эволюция векторов намагниченности определяется мультиплет- ностью сигналов и величинами гетероядерных КССВ. Если следить за про- екцией векторов намагниченности, I, на ось х, то она для разных мульти- плетов при изменении продолжительности интервала Д задается уравне- ниями: СН: I = Imaxcos(180JA), СН2: I = Imaxcos2(180JA), СН3: I = Imaxcos3(180JA), (5.1) где Imax - максимальное значение проекции. Таким образом, если мы изменяем величину интервала Д в достаточно большом диапазоне, то для сигнала непротонированного атома углерода для величины проекции будем наблюдать единственный максимум, соот- ветствующий химическому сдвигу данного ядра. Соответственно в непря- мом измерении fj будет наблюдаться единственный пик. В этих же услови- ях для сигнала углерода, связанного с одним протоном (группа СН), в про- 629
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР екции будут наблюдаться два максимума. Они в измерении fi проявятся как два пика, расстояние между которыми определяется величиной гетеро- ядерной КССВ. Аналогично, для групп СН2 и СН3 будем наблюдать три и четыре пика, соответственно. Таким образом, в период времени, когда де- каплер не работает, имеем сигнал, который состоит исключительно из час- тот, которые отвечают гетероядерным ССВ. При этом количество частот- ных компонентов для сигнала каждого из атомов углерода определяется мультиплетностью сигнала. С другой стороны, во время сбора данных КССВ исчезают благодаря действию декаплера, и сигнал спада свободной индукции содержит лишь частоты, которые отвечают химическим сдвигам атомов углерода. Таким образом, после проведения эксперимента с измене- нием интервала А от одного инкремента к другому на определенную вели- чину получим двумерный массив данных, в котором в одном измерении будут содержаться лишь частоты углеродных сигналов с развязкой от про- тонов, а во втором измерении - гетероядерные мультиплеты. Следует, од- нако, указать, что видимые расщепления в спектрах уменьшены вдвое по сравнению с КССВ, поскольку эволюция векторов, отвечающих гетероядер- ным расщеплениям, происходит лишь на протяжении первого периода А фрагмента спинового эха по каналу ядер углерода. Хотя метод прерывистого декаплинга для получения /-разрешенных спектров был разработан раньше, сейчас более популярна другая разновид- ность эксперимента гетероядерной /-разрешенной спектроскопии, которая включает элементы спинового эха на обоих ядрах (рис. 5.13). Рис. 5.13. Метод спинового щелчка для получения /-разрешенных гетеро- ядерных спектров. При действии этой последовательности после первичного возбуждения спинов А" в середине ti подаются 180°-импульсы, которые приложены одно- временно на ядрах Н и X, В результате векторы химических сдвигов спи- нов X в конце периода ti рефокусируются, а эволюция ССВ сохраняется. Поскольку в период детектирования всегда используется протонный декап- 630
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса линг, то по оси f2 гетероядерное расщепление в парах Х-Н не наблюдается. Таким образом, в сигнале, который детектируется, как это и нужно, при- сутствует амплитудная модуляция, связанная исключительно с эволюцией гетероядерных расщеплений в период ti (рис. 5.13). Кроме того, спиновое эхо рефокусирует эффекты неоднородности поля, которые являются дру- гим источником расхождений химических сдвигов ядер X образца. Поэто- му спектр в измерении fj содержит сигналы с естественной шириной ли- ний, которая определяется временем поперечной релаксации Т2 гетероядер. Эксперимент, представленный на рис. 5.13, называется методом ’’спи- нового щелчка” или "протонного щелчка”, поскольку он включает 180°-им- пульс на протонах. Его преимуществом является то, что в результате по- лучаем спектр, в котором расщепления сигналов, наблюдающиеся в непрямом измерении, отвечают значениям КССВ. В отличие от этого, как это уже отмечалось, при использовании метода прерывистого декап- линга эволюция КССВ происходит только во время первой половины пери- ода Д и потому видимые расщепления сигналов в измерении fi уменьша- ются вдвое. Поэтому, если метод используется для определения величин КССВ, следует точно знать, какая версия импульсной последовательности используется. На рис. 5.14 показан /-разрешенный !Н-13С спектр ментола 5.2. Проек- ция на ось f2 представляет собой обычный углеродный спектр с декаплин- гом на протонах, сигналы в котором имеют вид синглетов. В измерении f2 при этом содержатся мультиплеты, связанные с ’/(Н^). Данный метод по- зволяет легко определять мультиплетность сигналов, однако с этой целью сейчас он используется редко, поскольку вытеснен более удобными мето- дами одномерного редактирования спектров. Информацию о мультиплет- ности гетероядерных мультиплетов можно получить также в двумерных спектрах гетероядерной корреляции. /-Разрешенный спектр полезен также в случаях, когда в нем имеются аномальные значения гетероядерных КССВ, которые приводят к существенным ошибкам при одномерном редактирова- нии спектра. Более привлекательным сегодня является использование /-разрешенной спектроскопии для измерения величин дальних гетеро- ядерных КССВ. Знание этих величин может существенно помочь при вы- яснении структуры и конформации органических соединений. Описанный метод можно применить для нахождения как прямых КССВ, так и дальних констант взаимодействия. Хотя в принципе возможно в из- мерении fi достичь цифрового разрешения, достаточного для разделения малых дальних КССВ в присутствии намного больших прямых констант (они как минимум на порядок больше). Однако более эффективный подход состоит в удалении из спектра взаимодействий через одну связь. В этом случае в спектре остаются только дальние КССВ, которые обусловлены 631
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР взаимодействием через 2-3 химические связи. При этом можно сократить спектральный диапазон по fi и улучшить цифровое разрешение спектра. Другие подходы для решения данной проблемы будут описаны ниже. 10 2 6 4573,8 9 Рис. 5.14. 125 МГц гетероядерный /-разрешенный !Н-13С спектр ментола 5.2. Сверху показан обычный углеродный спектр в условиях широкополосного декаплинга на частоте протонов. Был использован метод прерывистого де- каплинга, показанный на рис. 5.12. Расщепления по оси fi отвечают поло- вине истинных значений 1/(СН). Для усовершенствования основной последовательности, которая при- ведена на рис. 5.13, в нее для создания поперечной намагниченности спи- нов X можно перед спиновым эхом включить фрагмент переноса поляриза- ции. С этой целью можно применять последовательности INEPT, DEPT или более позднюю последовательность PENDANT. В дополнение к повы- шению чувствительности перенос поляризации дает возможность устанав- ливать промежуток между сканами в соответствии со временем релаксации протонов, а не ядер X. Большие преимущества в чувствительности можно также получить для ядер, которые имеют отрицательный эффект Оверхаузе- ра и соответствующее снижение интенсивности сигнала при протонном де- каплинге. К таким ядрам относятся ядра с отрицательным гиромагнитным отношением, такие как 15N, 29Si. Хотя исключение протонного декаплинга во время релаксационного промежутка и приводит к потере интенсивности сигналов, однако увеличение интенсивности за счет переноса поляризации все же обусловливает заметный рост чувствительности спектра. 632
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 5.5.7. Измерение дальних КССВ между протонами и углеродом В последние годы величины дальних КССВ между *Н и 13С широко ис- пользуются для установления конфигурации и конформации молекул. В принципе методы /-разрешенной спектроскопии хорошо подходят для этой цели, однако требуют удаления из спектра взаимодействия через одну связь. Общий подход, который применяется в описанных ниже импульсных по- следовательностях, состоит в удалении из спектра малоинформативных констант !/(Н,С) и соответствующем уменьшении спектрального диапа- зона в измерении fb Поскольку !/(Н,С) обычно больше 125 Гц, а дальние КССВ чаще всего не превышают 10 Гц, то соответствующее уменьшение диапазона частот по fi позволяет намного увеличить цифровое разрешение и повысить точность определения малых КССВ без обработки больших массивов данных. 5.5.2. Полуселективное измерение КССВ Основным компонентом импульсных последовательностей, которые приме- няются для гетероядерной /-разрешенной спектроскопии, является после- довательность спинового эха. Ее эффективность определяется тем, что ге- тероядерные КССВ определенной величины (например !/(Н,С)) можно изби- рательно удалить из измерения fb если в момент подачи инвертирующего импульса на ядрах углерода подать также соответствующий инвертиру- ющий импульс и на протонах. Осуществить эту идею можно несколькими способами. Разработан метод неселективной инверсии компонент намагни- ченности, связанных с дальними гетероядерными КССВ. В этом случае уда- ление гетероядерных КССВ через одну химическую связь можно осущест- вить с помощью очень интересного составного импульса, который называ- ется BIRD (рис. 5.15). Он представляет собой три последовательных импульса, средний из которых имеет угол 180°, а боковые - по 90°, разделенные промежутком времени Д с фазами протонных импульсов х, х, -х. Действие этого импульса на сигналы определяется тем, насколько величина промежутка Д отвечает имеющимся КССВ. Если интервал между импульсами составляет 1/2п/(Н,С), как это показано на рисунке 5.15, то кластер BIRD инвертирует компонен- ты намагниченности, связанные с дальними гетероядерными КССВ, а ком- поненты, которые связаны с прямыми КССВ, оставляет неинвертирован- ными. Это приводит к селективной рефокусировке констант ’/(HjC) под влиянием импульса 13С(180°) и их удалению из измерения fb В результате измерение fj можно уменьшить приблизительно в 10 раз, что приводит к увеличению цифрового разрешения. В измерении fi остаются все констан- 633
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР ты П/(Н,С), связанные с каждым углеродным атомом. Сигналы атомов уг- лерода могут иметь довольно сложную тонкую структуру, поскольку каж- дый атом углерода имеет спиновую связь с несколькими протонами. Такая сложность сигналов может не дать возможности измерить величины КССВ, вследствие чего корреляция ССВ с расположением отдельных ядер может при этом оказаться невозможной. Рис. 5.15. Импульсная последовательность /-разрешенной спектроскопии для измерения дальних протон-углеродных констант расщепления с ис- пользованием импульса BIRD. Полуселективное измерение. 5.5.3. Селективное измерение гетероядерных КССВ Для упрощения тонкой структуры сигналов в измерении fi можно селек- тивно инвертировать намагниченности, которые связаны только с одним протоном, избегнув при этом инвертирования сателлитов 13С. Для этого в стандартном методе "протонного щелчка" необходимо вместо жесткого им- пульса применить селективный импульс !Н(180°), частота которого точно отвечает поглощению сигнала выбранного протона (рис. 5.16). В этом случае рефокусируются и потому удаляются из измерения fi гетероядерные КССВ всех протонов, за исключением протона, для которо- го была проведена инверсия компонентов намагниченности. Поэтому в из- мерении fi остаются только дублеты (или другие мультиплеты), связанные с избранным протонным сигналом. Таким образом, спиновую связь между 634
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса выбранным протоном и конкретными атомами углерода можно легко иден- тифицировать. Недостатком метода является продолжительность экспери- мента, поскольку в одном спектре мы видим гетероядерные КССВ, связан- ные лишь с одним протоном. Поэтому часто для изучения стереохимии соединения необходимо проводить несколько таких экспериментов. 180сел X X С Ltl/2 ti*'”' Рис. 5.16. Гетероядерная последовательность /-разрешенной спектроскопии для измерения дальних протон-углеродных констант расщепления. Селек- тивное измерение КССВ. Эффективность данного метода можно продемонстрировать на при- мере его использования для определения величин дальних гетероядерных КССВ мостикового углерода в производных соединения 5.3. Найденные величины гетероядерных КССВ для атомов углерода бицикла, связанные с протоном На, обозначенным звездочкой, приведены ниже: 5.3а эндо 5.3b экзо nJ(H,C) № атома 1 2 3 4 nJ(H,C) экзо 3.4 1.9 0.5 3.9 nJ(H,C) эндо 5.9 2.7 2.8 1.0 Эксперимент позволил осуществить выбор между экзо- и эндо-про- дуктами. Поскольку ЯЭО не дает возможности решить эту задачу, то выво- ды были сделаны на основании сравнения КССВ для неизвестных соеди- нений с соответствующими параметрами продуктов с известной конфигу- рацией. На рис. 5.17 приведен один из таких спектров. 635
Глава 5. Методики 2В-спектроскопии ЯМР 1 2 3 4 ------------Гц 1.0 1-2 ; г» г-2 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 м.д. Рис. 5.17. Фрагмент селективного гетероядерного /-разрешенного спект- ра соединения 5.3. Дальние гетероядерные расщепления для избранного протона проявляются как расщепления по fb значения которых показаны сверху. Вертикальный срез проведен через сигнал с химическим сдвигом 199 м.д. 5.5.4. Селективное измерение КССВ с детектированием на протонах Дальнее гетероядерное взаимодействие можно также изучать путем наблю- дения расщеплений протонных сигналов. Это дает значительное повыше- ние чувствительности. Изящная разновидность эксперимента с детектиро- ванием на протонах основана на простой модификации метода HSQC, ко- торый описан ниже. Он может быть реализован как фазочувствительный эксперимент с селекцией с помощью ИГП или без нее (рис. 5.18). Рис. 5.18. Гетероядерная последовательность /-разрешенной спектроско- пии для измерения дальних протон-углеродных констант расщепления. Се- лективное измерение КССВ с наблюдением на протонах. Неселективный 1Н(180°)-импульс во время периода ti здесь заменя- ется селективным импульсом. Одновременно подается неселективный 636
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 13С(180°)-импульс, который в конце ti индуцирует спиновое эхо аналогич- но тому, как это было описано выше для эксперимента по селективному измерению КССВ. Шаг переноса поляризации, который имеет место после ti, переносит намагниченность через одну связь назад на прото- ны для ее дальнейшего детектирования. В резуль- тате получаем нормальный протонный спектр по f2 и п/(Н,С)-дублеты по fh Расщепления, которые наблюдаются в спектре (рис. 5.19), отвечают даль- нему ССВ атома углерода, связанного с селективно инвертированным сигналом протона. Эффектив- ность метода проиллюстрирована на примере спект- ра аденозина 5.4. Рис. 5.19. Селективный гетероядерный /-разрешенный спектр аденози- на 5.4 с детектированием на протонах. Протон НГ был селективно инвер- тирован. Дублетные расщепления по fi отвечают дальним ССВ для С8 и С2’. С помощью данного метода дальние КССВ можно измерять только для протонированных атомов углерода. Кроме того, протон, который инверти- руется, должен иметь сигнал, отстоящий от других сигналов на расстояние, достаточное для его селективной инверсии. 637
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР 5.6. Гомоядерная J-разрешенная спектроскопия Гомоядерная версия /-разрешенного эксперимента наиболее часто приме- няется в протонной спектроскопии, хотя, в принципе, ее можно применить для любых ядер с высоким естественным содержанием. Разделение по из- мерениям величин 5 и J дает возможность расположить спиновые мульти- плеты в измерении fi и избежать перекрывания сигналов, что облегчает их анализ, а в измерении f2 оставить только химические сдвиги. Таким обра- зом, в этом измерении спектр будет иметь тот же самый вид, что и при ис- пользовании широкополосного декаплинга. Получение такого спектра дает возможность точно измерять величины химических сдвигов в случае, когда обычные одномерные спектры слишком сложны. На первый взгляд это мо- жет показаться странным, ведь импульсная последовательность не включа- ет использования декаплера, однако его функцию выполняет спиновое эхо. Измерение величин КССВ данным методом также сопряжено с некоторы- ми трудностями, которые коротко будут описаны ниже. Гомоядерная последовательность /-разрешенной спектроскопии пред- ставляет собой классическую по- Рис. 5.20. Гомоядерный /-разрешен- ный эксперимент. 180°-импульс в се- редине ti рефокусирует протонные сдвиги, но не гомоядерное расщепле- ние, поэтому только они и появляют- ся в измерении fb следовательность спинового эха с переменным интервалом между импульсами (рис. 5.20). Принци- пиальное отличие гомоядерного эксперимента от гетероядерного заключается в том, что здесь не- возможно использовать гомоядер- ный декаплер, поскольку сбор данных при одновременном об- лучении образца частотой декап- лера невозможен. Давайте попробуем представить, какие данные мы получим в резуль- тате работы этой импульсной последовательности. Мы знаем, что спиновое эхо рефокусирует химические сдвиги и не рефокусирует гомоядерные рас- щепления. Это позволяет считать, что в период эволюции ti эволюциониру- ют исключительно векторы намагниченности, которые отвечают гомоядер- ным КССВ. Поэтому, если из полученных результатов эксперимента сфор- мировать двумерный массив данных, то в нем вдоль оси fi будут содер- жаться лишь частоты, которые отвечают величинам гомоядерных КССВ. При сборе данных, который происходит по окончании спинового эха бла- годаря рефокусированию химических сдвигов, возникают частоты, кото- рые отвечают химическим сдвигам магнитных ядер. Кроме этого, сущест- 638
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса вуют также частоты, которые связаны с КССВ, поскольку спиновой раз- вязки не происходит. Таким образом, в данном эксперименте, в отличие от всех рассмотренных ранее, не происходит полного разделения спектральных параметров вдоль измерений в двумерном массиве дан- ных. Вследствие этого в результирующем двумерном спектре спиновые мультиплеты располагаются не вдоль оси fb а вдоль диагонали спектра, то есть под углом 45° к оси f2, если в обоих измерениях применяют одинако- вую шкалу (рис. 5.21). В связи с этим в проекции f2 присутствуют как хи- мические сдвиги, так и КССВ. Для устранения этого недостатка применя- ют дополнительную обработку данных. Еще одно осложнение возникает из-за того, что, в отличие от гетероядерного варианта, детектируемый сиг- нал имеет зависимую от ti фазовую модуляцию, которая приводит к пере- косу фазы сигнала. Поэтому спектры представляют исключительно в виде абсолютных значений. Перед этим проводятся их сглаживание и вычис- ление магнитуды. При наличии сильного взаимодействия между протона- ми спектры сильно усложняются из-за появления дополнительных пиков. Поэтому /-разрешенная спектроскопия более пригодна для анализа спект- ров первого порядка. Рис. 5.21. Мультиплет в гомоядерном /-разрешенном эксперименте имеет характерный наклон, вызванный наличием протонных расщеплений в обо- их измерениях fi и f2. 639
Глава 5. Методики 2П-спектроскопий ЯМР 5.6.1. Косметическая обработка J-разрешенных спектров Использование необработанного /-разрешенного спектра оказывается не очень удобным, поскольку присутствие спиновых мультиплетов в измере- нии f2 может привести к перекрыванию сигналов. Поэтому для того, чтобы в измерении £2 остались только химические сдвиги, а КССВ были изъяты, можно провести математическую обработку двумерного массива данных так, чтобы наклонить мультиплеты на 45° относительно их центров, как это схематически показано на рис. 5.22. Рис. 5.22. Схема процедуры наклона для устранения гомоядерных расщеп- лений из измерения f2: (а) первоначальная структура мультиплета и (б) вид мультиплета, полученный в результате процедуры наклона. В настоящее время математические программы, которые необходимы для этого, входят в стандартный комплект программного обеспечения спектрометров ЯМР. Полученный таким образом спектр похож на свой гетероядерный аналог. В нем в вертикальном направлении представлена мультиплетная структура, а проекция на f2 содержит протонный спектр в условиях широкополосной развязки взаимодействия с протонами (рис. 5.23). 5.5 640
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 5.23. (а) 500 МГц протонный гомоядерный /-разрешенный спектр сое- динения 5.5 (после наклона и симметризации). Проекция (б) по f2 похожа на протонный спектр при широкополосном протонном декаплинге. (в) Про- тонный спектр без декаплинга. 5.6.2. "Непрямая " гомоядерная J-разрешенная спектроскопия Мультиплеты в протонных спектрах возникают по большей части для функциональных групп, которые содержат в своем составе кроме протонов также и атомы углерода. Так, например, группа СН2 имеет два протона и один атом углерода. Мы знаем, что когда в состав молекулы входят маг- нитные ядра разных типов, то они образуют общую спиновую систему, в которой магнитные ядра влияют одно на другое. Поэтому ядро углерода ощущает все спиновые состояния протонов. В принципе можно осущест- вить перенос компонент намагниченности, которые связаны с гомоядерны- ми КССВ, на атомы углерода, которые имеют спиновую связь с соответст- вующими протонами. На этом основан подход к двумерному разделению протонных мультиплетов, который заключается в распределении их соот- 641
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР ветственно химическим сдвигам связанных с ними углеродных атомов. Преимущества такого подхода определяются большим диапазоном хими- ческих сдвигов ядер углерода, а недостатком является снижение чувстви- тельности. Последовательность, которая реализует эту идею (рис. 5.24), начинается с возбуждающего 90°-импульса на ядрах !Н. После этого на протяжении пе- ременного периода времени ti происходит эволюция гомоядерных КССВ. Период ti служит для формирования непрямого измерения в конечном спектре. В середине периода ti подается 180°-импульс, который рефокуси- рует химические сдвиги и гетероядерные КССВ. Таким образом, можно считать, что во время периода ti происходит эволюция лишь гомоядерных КССВ. По окончании периода ti в импульсную последовательность включен элемент неселективного переноса поляризации от протонов к атомам угле- рода. Этот элемент также представляет собой спиновое эхо, задержка, Дь в котором определяется временем, необходимым для антипараллельной ори- ентации векторов намагниченности, связанных с гетероядерными КССВ. Перенос поляризации от протонов к атомам углерода обеспечивается одно- временной подачей 180°-импульсов на протонах и на ядрах углерода в тот момент, когда векторы, связанные с гетероядерными КССВ, ориентиру- ются оптимальным образом. Период Д1 завершается подачей 90°-импульсов одновременно на ядрах ’Н и 13С. Такая комбинация импульсов осуществля- ет модуляцию сигналов углерода частотами гомоядерных взаимодействий связанных с ними протонов. Период Д2 перед сбором данных необходим для рефокусировки векторов намагниченности углерода, которые связаны с ге- тероядерным ССВ. В полученном с помощью описанной импульсной после- довательности двумерном массиве данных в измерении fi содержатся лишь гомоядерные ССВ, а в измерении f2 - лишь частоты, которые отвечают по- глощению атомов углерода в условиях развязки от протонов. Пример /-раз- решенного спектра, который получен таким образом, приведен на рис. 5.25. Рис. 5.24. Последовательность непрямой гомоядерной /-разрешенной спект- роскопии. Протонные расщепления имеют место на протяжении ti, после че- го осуществляется перенос поляризации и наблюдение на частоте спина X. 642
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 м.д. Рис. 5.25. Прямой гомоядерный /-разрешенный спектр (а) и непрямой го- моядерный /-разрешенный спектр (б) соединения 5.2. Оба эксперимента содержат гомоядерные расщепления в измерении fb которые распределены соответственно протонным или углеродным химическим сдвигам. 643
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР Как и в предыдущих экспериментах, наличие сильного взаимодействия между протонами приводит к усложнению спектров. Более того, поскольку необходимо влиять на 13С сателлиты каждого протона, а не на его основ- ной сигнал (поскольку для переноса поляризации используются именно са- теллиты), вид мультиплетов для систем высшего порядка может отличаться от вида мультиплетов в одномерном спектре. Еще одно осложнение наблю- дается для неэквивалентных геминальных протонов, поскольку каждый из них имеет свои протонные сигналы, но они связаны с одним атомом угле- рода. Поэтому в результирующем спектре такие мультиплеты накладыва- ются один на другой (на рис. 5.25 такая ситуация наблюдается для сигнала протонов Н6). Наиболее целесообразно данный вариант эксперимента ис- пользовать в случаях, когда в протонном спектре происходит совпадение мультиплетов, что не позволяет видеть их раздельно в гомоядерной версии методики. 5.7. INADEQUATE Во всех методиках, которые были ранее описаны в этом разделе, мы имели дело с исследованием ССВ для ядер, хотя бы одно из которых дает интен- сивные сигналы и которые принадлежат распространенному изотопу. Прин- ципиальным препятствием попыток получения корреляций между спинами с низким естественным содержанием является то, что такие ядра в моле- куле большей частью связаны с ядрами доминирующего изотопа. Ве- роятность соседнего расположения малораспространенных ядер рав- няется квадрату их содержания в естественной смеси изотопов. Так, если содержание ядер 13С в естественной смеси составляет 0.8%, то лишь 0.064% молекул будут содержать 2 таких атома одновременно. Поэтому го- моядерное расщепление наблюдать довольно тяжело. Большинство попу- лярных корреляционных методик, таких как COSY, которые в принципе можно применять с этой целью, оказываются малоэффективными. Наибо- лее удачной и удобной последовательностью, которая дает возможность решить эту проблему, является последовательность INADEQUATE. В ее основе лежит двухквантовая фильтрация, которая позволяет удалить из спектра неинформативные сигналы основного компонента. Эта фильтра- ция аналогична той, которая ранее была описана для методики DQF-COSY. Для ядер 13С при их естественном содержании этот метод особенно хорошо подходит, поскольку они могут входить исключительно в состав спиновых систем АВ или АХ. Это является следствием того, что существование моле- кул, в состав которых одновременно входит больше двух ядер 13С, исклю- чительно маловероятно. Успеху двухквантовой фильтрации содействует 644
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса также и то, что величины V(C,C) находятся в ограниченном диапазоне зна- чений, поэтому параметры последовательности можно хорошо оптимизи- ровать для получения двухквантовой когерентности. Полная последова- тельность INADEQUATE приведена на рис. 5.26. Рис. 5.26. Последовательность INADEQUATE и соответствующий ей путь переноса когерентности. Эксперимент во время периода эволюции с по- мощью подходящего фазового цикла выделяет двухквантовую когерент- ность. В результате все сигналы, которые связаны с одноквантовой коге- рентностью, из спектра удаляются. Двухквантовая когерентность возникает при действии смешивающего импульса на спиновую систему, которая подверглась первоначальному возбуждению. Момент подачи второго импульса выбирается так, чтобы компоненты всех векторов намагниченности, которые отвечают компонен- там дублетов, были расположены антипараллельно. Таким образом, преж- де чем подать импульс, который генерирует двухквантовую когерентность, следует обеспечить оптимальное расположение данных векторов для всех магнитных ядер. Этого можно достичь с помощью фрагмента спиново- го эха, в котором период рефокусировки, А, подобран соответствующим Таким образом, последовательность начинается с возбуждающего импульса, за которым расположен период времени Д, посредине которого подается 180°-импульс. В конце периода происходит рефокусировка хими- ческих сдвигов, то есть все векторы, которые им отвечают, расположатся вдоль одной оси, а векторы, которые отвечают гомоядерному С-С взаимо- действию, будут находиться в противоположных направлениях. Если в этот момент подать еще один 90°-импульс, то вследствие явления переноса 645
Глава 5. Методики 2П-спектроскопии ЯМР когерентности произойдет образование двухквантовой когерентности. Да- лее она эволюционирует на протяжении переменного периода tb После этого для детектирования ее переводят в одноквантовую поперечную намагни- ченность подачей еще одного импульса. Селекция двухквантовой коге- рентности может проводиться или с помощью соответствующего фазового цикла, или с помощью импульсных градиентов. Период ti представляет собой период эволюции двухквантовой коге- рентности, когда когерентности эволюционируют в ВСК как суммы частот двух связанных спинов. Таким образом, для двух связанных спинов А и X, поглощающих при частотах vA и vx, частота кросспика в измерении fi будет составлять (vA + vx). Как видим, для обоих спинов частота прецессии в пе- риод ti одинакова. Поэтому координаты кросспиков связанных спинов в измерении fi будут иметь одну и ту же координату (vA + vx). При последу- ющем преобразовании двухквантовой когерентности в одноквантовую кросспики в измерении f2 будут располагаться соответственно химическим сдвигам А и X. В этом измерении частоты пиков будут равны vA и vx. Как видим, в полученных двумерных спектрах частотные оси оказываются неодинаковыми - в измерении fi ось растянута вдвое, поэтому 2fi = f2. Для предотвращения появления гетероядерных КССВ во время работы после- довательности можно применять широкополосную развязку на протонах. Ее использование приводит также к повышению чувствительности, обуслов- ленному возникновением гетероядерного ЯЭО. Действие последовательности показано на примере спектра бутано- ла 5.6 (рис. 5.27). Спектр существенным образом отличается от других кор- реляционных спектров, которые описаны в данном разделе. В измерении f2 в нем расположены химические сдвиги ядер углерода. Поскольку два свя- занных спина в измерении f] имеют одинаковую частоту двухквантовой ко- герентности, DQ, корреляции располагаются на горизонтальных линиях, параллельных f2. Поэтому связность углеродных атомов определяется по- следовательностью вертикальных и горизонтальных шагов. Если импульс- ная последовательность для двухквантового возбуждения оптимизирована для расщепления через одну С-С связь, то каждый горизонтальный шаг от- вечает переходу на соседний углеродный атом. В спектре отсутствуют диа- гональные пики, однако центры между спиновыми парами, которые корре- лируют, располагаются вдоль псевдодиагонали (двухквантовой диагонали) с наклоном 2, поскольку = 2f2. Такие свойства симметрии полученного спектра являются полезными для выявления артефактов. Каждый кросспик представляет собой дублет с расщеплением J(C,C), которое отвечает тон- кой структуре мультиплетов АХ или АВ. Пример эффективности этого ме- тода для структурных исследований показан для сесквитерпенового лакто- на ацетилизомонтанолида 5.7 (рис. 5.28). 646
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 5.27. Углеродный спектр INADEQUATE бутанола 5.6 (в виде магни- туды). Из спектра можно получить полный углеродный скелет молекулы. Раз- рывы в нем появляются только в случае присутствия в цепи гетероатомов. Тем не менее, редко в руках исследователя имеется количество образца, достаточное для таких исследований, поэтому метод, в его первоначальном виде, имеет довольно ограниченное применение. Больший потенциал для применения имеют разработанные в последнее время методы установления углерод-углеродной связности, которые основаны на предварительном воз- буждении протонов и последующем переносе поляризации на ядра углеро- да с градиентным выделением углерод-углеродных корреляций. Величины прямых КССВ 13С-13С можно использовать для выяснения структуры химических соединений. Хотя часто аналогичные данные мож- но получить и из протонных спектров, однако углерод-углеродные КССВ имеют довольно значительный диапазон, что дает возможность делать на их основе более надежные выводы. 647
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР Рис. 5.28. Спектр 2D 13С INADEQUATE и соответствующий одномерный углеродный спектр сесквитерпенового лактона ацетилизомонтанолида 5.7 в CDC13. 648
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 5.8. Гетероядерная корреляционная спектроскопия Еще одной важной разновидностью двумерной спектроскопии является так называемая гетероядерная корреляционная спектроскопия. Она представ- ляет собой совокупность методик, которые дают возможность выявить факт наличия спин-спинового взаимодействия между ядрами разных типов. Наиболее часто эти методики используются для пар ядер !Н-13С и !H-15N. Обнаружение такого ССВ дает химикам-органикам возможность опреде- лить связность протонов с гетероатомами и, в частности, с атомами угле- рода. Поэтому будут описаны методики, которые позволяют решать такие задачи. Те же самые методы в принципе пригодны и для установления корреляций с другими ядрами, например !H-14N или даже !Н-31Р и !Н-13С. Однако эти возможности используются значительно реже. Корреляции !H-15N чаще всего находятся в протеинах и пептидах. В отличие от методов редактирования углеродных спектров по мультиплетности сигналов, мето- ды гетероядерной корреляционной спектроскопии позволяют не только оп- ределить количество протонов, связанных с каждым атомом углерода, но и выяснить, какой именно протон в молекуле связан с определенным гетеро- атомом (чаще всего атомом углерода). Кроме того, эксперименты данного типа можно применять для разделения резонансных сигналов в сложных протонных спектрах с помощью анализа мультиплетности ядра X, для ко- торого разности химических сдвигов чаще всего значительно больше. Вы- сокая чувствительность современных корреляционных методик позволяет определять величины химических сдвигов ядра X непрямым методом, что дает возможность избежать продолжительных экспериментов на ядре X. Таким образом, совокупность гомоядерных COSY) и гетероядерных (таких как HMQC или HSQC) !Н-13С корреляций является основой для установления строения органических соединений. Во всех методах, которые предназначены для изучения ядер с неболь- шим естественным содержанием, вопрос чувствительности является перво- степенным, поскольку именно она определяет продолжительность экспери- мента и возможность изучения небольших масс образцов. Поэтому уже первые методики, которые были разработаны для изучения гетероядерных корреляций, были основаны на явлении переноса поляризации, которая значительно повышает чувствительность эксперимента. Фактически эти методики являются развитием метода INEPT, целью которого является по- вышение чувствительности ядер с малым гиромагнитным отношением. Ге- тероядерные корреляционные спектры продолжительное время исполь- зуются в спектроскопии ЯМР. Однако особенный успех в их применении был достигнут после разработки в 90-х годах прошлого века метода не- прямого детектирования спектров. Это привело к коренному изменению подхода к сбору данных в гетероядерных экспериментах. Новации состоят 649
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР в том, что наблюдаются ядра с большим у, чаще всего протоны, а спектр гетероядра образуется непрямым методом. Такие эксперименты принято называть обращенными корреляциями химических сдвигов. Их основное преимущество - значительное повышение чувствительности. Рассмотрим коротко, что дает применение методов непрямого детекти- рования. Можно показать, что для соотношения сигнал/шум в эксперименте, который включает ядра со спином /2, справедливо уравнение: S/N = NAT-1B03/2YexcYobs3/2T2*(NS)1/2, (5.2) где N - количество молекул в измеренном объеме образца; А - переменная, которая учитывает содержание в изотопной смеси активных в ЯМР спинов, Т - температура; Во - величина статического магнитного поля; уехс и уоЬ5 - ги- ромагнитные соотношения для ядер, которые облучаются и наблюдаются, соответственно; Т2* - эффективное время поперечной релаксации; NS - об- щее количество сканов при накоплении. Возможны четыре схемы эксперимента по гетероядерной корреляции, которые представлены на рис. 5.29. Они отличаются тем, какой именно спин служит источником первичной намагниченности и какой спин ис- пользуется для детектирования сигнала. На каждой из схем представлены ожидаемые интенсивности сигнала для пары Н-Х, которые следуют из ве- личин гиромагнитных соотношений. На первой схеме 5.29а показан обыч- ный эксперимент по измерению спектра на ядрах гетероатома с использова- нием декаплера на протонах. Будем считать, что интенсивность сигналов, которые можно получить таким образом, равняется единице для каждого из анализируемых ядер (31Р, 13С и 15N). На схеме 5.296 представлен тради- ционный эксперимент гетероядерной корреляции химического сдвига. В нем первичная намагниченность протона оказывается частотно-меченной во время периода tb а потом передается на спин А" для детектирования. Рас- считанные интенсивности сигналов показывают значительное повышение чувствительности эксперимента. Дальнейшего повышения чувствитель- ности можно достичь в эксперименте, когда возбуждение происходит на ядрах X а детектирование - на протонах. Однако относительно предыду- щего варианта эксперимента увеличение интенсивности сигнала оказывает- ся не таким уж и сильным. Наиболее эффективным является эксперимент, когда и возбуждение сигнала, и его детектирование происходят на про- тонах, а ядра X используются лишь для соответствующей частотной модуляции в период эволюции. Именно такую схему реализуют новейшие обращенные методики получения гетероядерных корреляционных спект- ров. Схему таких экспериментов отображает рис. 5.29г. Видно, что расчет- ная чувствительность в этом случае существенно выше, чем в традицион- 650
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ном эксперименте. Отрицательное воздействие низкого гиромагнитного соотношения для ядер X полностью исчезает, хотя и остается влияние низ- кого содержания ядер X в естественной смеси изотопов. Чем меньшей явля- ется величина у для ядра X, тем сильнее возрастает относительная чувстви- тельность при детектировании на протонах. Это можно видеть из сравнения чувствительности на ядрах 31Р и 15N. Дополнительное повышение чувстви- тельности при детектировании на протонах в 2 или 3 раза происходит соот- ветственно для групп ХН2 и ХН3. Рис. 5.29. Четыре основные схемы для получения гетероядерного 2В-кор- реляционного спектра. Сравнение относительных чувствительностей этих методов приведено для экспериментов по корреляции протонов с 31Р, 13С и i5N. Относительная чувствительность для пар ядер 'Н-3|Р 'Н-'3С 'H-'5N 1 1 1 Традиционный метод 2.5 4 10 4 8 30 Обращенный эксперимент 10 32 300 Величины изменения чувствительности, которые представлены на рис. 5.29 для обращенной методики в сравнении с традиционной, в реальном эксперименте могут и не реализовываться. Важным фактором при этом является различное релаксационное поведение взаимодействующих спинов или наличие расщепленных мультиплетов, ведущее к уменьшению общей интенсивности сигналов и соответственно соотношения сигнал/шум. Тем 651
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР не менее, если задаться вполне реалистичным фактором увеличения интен- сивности сигналов в протон-углеродной корреляции, равным 4, то выиг- рыш во времени эксперимента достигнет 16. Иными словами, эксперимент, требующий для накопления целой ночи, может быть проведен за 1 час. Ес- ли же необходимо было потратить час, то теперь достаточно нескольких минут. Использование обращенных методик привело также к усовершенство- ванию спектрометров ЯМР. Сконструированы удобные датчики, в которых оптимизирована чувствительность при изучении ядер с малым гиромагнит- ным соотношением в режиме обращенной спектроскопии. В этих датчиках катушка Х-ядра располагается по возможности ближе к образцу, в то время как катушка для протонов отдалена от него. 5.9. Гетероядерная корреляционная спектроскопия с корреляцией через одну связь Поскольку сегодня серьезные исследования основаны почти исключитель- но на методах обращенного детектирования, именно эти методы мы и бу- дем обсуждать в первую очередь. Традиционный метод с детектированием на ядрах 13С сейчас используется лишь на устаревших приборах и скоро, очевидно, будет иметь лишь исторический интерес. Мы обсудим этот ме- тод в конце раздела, поскольку его приходится использовать при отсутст- вии нового спектрометра. Существуют две общепринятые методики для реализации гетероядер- ной корреляции химических сдвигов через одну связь, известные под абб- ревиатурами HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) и HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation). Корреляционные данные, кото- рые можно получить с помощью этих двух методов, практически эквива- лентны. Методы различаются лишь на последнем этапе, который для ру- тинных экспериментов имеет лишь небольшое значение. Исторически ме- тод HMQC чаще используют химики, а метод HSQC больше распространен среди биологов. Это обусловлено в частности тем, что HMQC чаще ис- пользуют для корреляций ‘Н-^С в малых молекулах, a HSQC - для ‘H-^N корреляций в белках. С практической точки зрения метод HMQC менее чувствителен к несовершенству эксперимента, а метод HSQC имеет пре- имущества в случаях, когда необходимо повысить разрешение сигналов в корреляционном спектре. Этот метод также легче поддается модификации импульсной последовательности. Обе методики отвечают рис. 5.29г и являются оптимальным подходом к установлению связности между гетероатомами при детектировании на протонах. Как и все гетероядерные эксперименты, данный подход имеет определенные технические трудности, связанные с подавлением материнс- 652
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса кого сигнала, который отвечает протонам, имеющим химическую связь с основным изотопом (!Н-12С, !H-14N). Их сигнал является доминирующим в протонном спектре, но он подлежит удалению при гетероядерных корреля- циях, поскольку лишь малоинтенсивные сателлиты сигнала несут необхо- димую корреляционную информацию. Традиционным методом удаления материнских сигналов является применение специальных фазовых циклов. Однако таким методом не удается получить спектры, которые полностью лишены артефактов. Прорыв в использовании метода был сделан благо- даря применению импульсных градиентов поля, которые, как это мы уже неоднократно видели, имеют огромное значение для многих методик совре- менной спектроскопии ЯМР. 5.10. Гетероядерная корреляционная спектроскопия HMQC Эксперимент, основанный на обнаружении гетероядерных многокванто- вых корреляций, является одним из двух экспериментов с детектированием на протонах, которые широко используются для обнаружения связности протонов с гетероядрами. Хотя эксперимент был предложен еще в 70-е го- ды XX века, однако он не имел распространения, пока не были преодолены технические трудности по удалению из спектра сигналов протонов для пар *H-12C, интенсивность которых во много раз превосходит интенсивность сигналов в парах !H-13C. Лишь после внедрения в спектроскопию метода ИГП он стал доминировать в спектроскопии ЯМР органических соединений. Двумерный корреляционный спектр, как мы это уже видели в первой главе учебника, исключительно прост для интерпретации. В одном измере- нии он содержит сигналы атомов углерода в условиях полной развязки от протонов, а во втором измерении - обычный протонный спектр. Коорди- наты кросспика отвечают химическим сдвигам в протонном и углеродном спектрах, между которыми он возник. Легче всего корреляции можно от- нести, если эти спектры изображены вдоль осей двумерного спектра в со- ответствующем масштабе. Нет какого-то стандартизированного располо- жения осей в спектрах HMQC. Ось протонов может быть как вертикаль- ной, так и горизонтальной в зависимости от вкусов спектроскописта. Одна- ко это ни коим образом не влияет на результаты анализа спектра. Если сигналов в протонном и углеродном спектрах не слишком много, корре- ляции можно отнести визуально. Если же спектр хотя бы вдоль одной оси содержит сигналы, близкие по химическим сдвигам, следует провести вер- тикальную и горизонтальную линии от кросспика до соответствующих шкал, которые приведены возле координатных осей двумерного спектра. Использование спектров HMQC позволяет решить ряд важных задач по от- несению сигналов. Во-первых, появляется возможность использования 653
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР найденных прежде отнесений протонных сигналов для отнесения сиг- налов в спектрах гетероядер. Такой подход ведет к значительно большей убедительности структурных выводов. Не существует другого метода, с помощью которого было бы настолько просто отнести сигналы в угле- родном спектре. Во-вторых, появляется возможность разнесения неразде- ленных протонных сигналов во втором измерении соответственно хими- ческим сдвигам гетероядер. Это дает возможность уточнить отнесение сиг- налов в протонном спектре. Ценность такого подхода возрастает при усложнении структуры мо- лекулы и росте числа перекрывающихся сигналов. Еще одним преиму- ществом эксперимента является то, что он дает возможность идентифици- ровать диастереотопные геминальные пары. Их не всегда легко идентифи- цировать по COSY спектрам, так как геминальные и вицинальные КССВ мо- гут иметь одинаковые величины. Только для геминальных пар в спектре HMQC имеют место две корреляции с одним углеродным атомом. В отличие от гомоядерных двумерных спектров, которые приведены в этой книге, гетероядерные корреляционные спектры не содержат диагональных пиков и несимметричны относительно диагонали. Это является следствием того, что в двух измерениях представлены разные ядра и не существует компонент намагниченности, которые бы в периоды смешивания и детек- тирования имели бы одинаковые частоты. 5.10.1. Импульсная последовательность HMQC Базовая последовательность HMQC удивительно проста и содержит лишь четыре радиочастотных импульса (рис. 5.30). Действие последовательнос- ти проследим для пары спинов ‘Н-^С. Последовательность начинается с возбуждения протонов с последующей эволюцией протонной намагничен- ности под влиянием протон-углеродного расщепления через одну связь. Во время периода Д протонная намагниченность эволюционирует соответст- венно ‘/(Н^), и в конце этого периода компоненты, которые отвечают гетероядерным дублетам, становятся противофазными. Типичная величи- на Д составляет 3.3 мс. Как и в случае INEPT или COSY, данная противо- фазная намагниченность может быть передана связанному ССВ партнеру действием соответствующего радиочастотного импульса. При действии первого импульса на ядрах углерода в методе HMQC в поперечную плоскость переносится, помимо намагниченности протонов, также и намагниченность ядер углерода. Таким образом, в момент подачи этого импульса намагниченности как протонов, так и ядер углерода распо- лагаются в одной плоскости. Поскольку момент подачи импульса на угле- роде выбран таким образом, чтобы компоненты намагниченности протонов 654
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса оказались в противофазе, то образуется протон-углеродная многокван- товая когерентность, при существовании которой эволюция намагни- ченностей ядер происходит согласованно. В данном случае становятся когерентными намагниченности протона и непосредственно связанного с ним атома углерода, однако их невозможно наблюдать непосредственно. Рис. 5.30. Последовательность HMQC и соответствующий ей путь перено- са когерентности. Периоды Д заданы равными 1/2J(H,C). Как мы уже видели, особенностью многоквантовой когерентности яв- ляется то, что при ее существовании для обоих ядер возникают компонен- ты частот, которые отвечают поглощению ядер-партнеров по взаимодейст- вию, то есть протоны будут иметь компоненты частот, которые отвечают поглощению ядер углерода, и наоборот. Говорят, что происходит модуля- ция (пометка) частот одних ядер частотами других. На самом деле образо- ванная многоквантовая когерентность является комбинацией гетероядер- ной двухквантовой и нульквантовой когерентностей, как это показано на схеме переноса когерентности на рис. 5.28. Так, например, для случая, ког- да порядок когерентности для протонов !Нр = +1 и порядок когерентности для ядер углерода 13Ср = +1, имеем двухквантовую когерентность (Ер = 2), а когда ‘Нр = +1 и 13Ср = -1 -- нульквантовую когерентность (Ер = 0). Клю- чевым моментом при этом является вопрос о том, как такая когерентность эволюционирует во время периода tb Поскольку она содержит частотные компоненты поперечной намагниченности как для протонов, так и для уг- лерода, то ее эволюция происходит под влиянием как протонных, так и угле- родных химических сдвигов. Частотную пометку намагниченности про- тонов соответственно химическим сдвигам углерода можно выявить 655
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР при непрямом детектировании в измерении fb Для того, чтобы экспери- мент происходил неселективно для всех протонов, независимо от влияния их химических сдвигов, в последовательность вводят элемент спинового эха путем подачи 180°-импульса посредине периода tb Таким образом, в конце периода эволюции эти сдвиги рефокусируются и потому не влияют на измерение Л. На эволюцию углеродных сдвигов протонный импульс не влияет, поэтому для них сохраняется необходимая частотная пометка (мо- дуляция). Финальный импульс на углероде превращает часть многокванто- вой когерентности назад в одноквантовую протонную намагниченность, которую теперь можно детектировать. Эта намагниченность находится в противофазе относительно lJ(H,C). Во время накопления протонного ССИ в большинстве случаев используют широкополосный декаплинг углерод- ных спинов для удаления из спектра дублетов J(H,C), что повышает соот- ношение сигнал/шум в результирующем спектре. Для предупреждения ис- чезновения противофазных протонных сателлитов вводится второй пери- од А. Во время этого периода рефокусируется протон-углеродное расщеп- ление. В тот момент, когда компоненты гетероядерных расщеплений сов- падут, проводится детектирование протонной намагниченности. Эксперимент HMQC является яркой иллюстрацией квантового поведе- ния магнитных ядер. Ведь частотную пометку протонов мы осуществляем с помощью импульсов на ядрах углерода. На первый взгляд, это может по- казаться странным, поскольку протоны не ощущают импульсов на часто- тах, которые отличаются от их частоты Ларморовой прецессии. Однако квантовые частицы не являются изолированными. Они за счет спин-спино- вого взаимодействия образуют общие энергетические уровни. Поэтому воздействие на энергетические уровни одного атома сразу переносится к ядру-партнеру по ССВ. При проведении эксперимента в измерении fi проводится квадратур- ное детектирование. Для этого в углеродные импульсы, которые подаются до начала периода tj, вводятся фазовые инкременты, равные 90°. Это дает возможность использовать как метод Стата, так и метод TPPI для получения фазочувствительного сигнала. В результате получаем двумерный спектр, в котором сдвиги !Н представлены измерением f2, а углеродные сдвиги - измерением fj, поскольку именно в этот период благодаря существованию многоквантовой когерентности протоны были помечены частотами связан- ных с ними ядер углерода. Кросспики отвечают связности через одну связь (рис. 5.31а, б). Следует отметить, что хотя данная последовательность (и HSQC, опи- санная ниже) детектирует взаимодействия через одну связь, в некоторых исключительных случаях может проявляться и более далекое взаимодейст- вие. Это происходит тогда, когда КССВ находятся далеко за пределами 656
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса диапазона, для которого подобран интервал А. Такая си- туация наблюдается для алкинов, в которых как ^(Н^), так и 2J(H,C) довольно велики. Поэтому константа 2J(H,C) (50 Гц) может дать в спектре кросспик. Вследствие этого анализ спектров таких систем следует проводить с опреде- ленной осторожностью. Рис. 5.31. Спектр HMQC на 400 МГц соединения 5.8, записанный (а) с и (б) без декаплинга на углероде в период сбора данных. В отсутствие декап- линга каждый кросспик проявляется в виде дублета вдоль f2 из-за наличия ’j(CH). Эти дублеты представляют собой обычные 13С сателлиты, которые наблюдаются в соответствующем протонном спектре. 5.10.2. Влияние на сигналы в спектрах HMQC гомоядерных протонных расщеплений Выше отмечалось, что компоненты протонной намагниченности, которые связаны с химическими сдвигами, после первичного возбуждения также эволюционируют на протяжении периода Д. Однако они полностью рефоку- сируются во время второго периода Д благодаря использованию протонно- го спинового эха. Поэтому они не вносят фазовых искажений в протонном измерении f2. Более существенно влияние гомоядерных КССВ на эволю- цию протонной намагниченности, которая существует во время двух пери- одов Д, и на многоквантовую когерентность, которая присутствует во вре- мя периода tb Поскольку эти гомоядерные расщепления не рефокусируют- ся спиновым эхом, они присутствуют во время обоих периодов Д и могут 657
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР вносить нежелательные фазовые искажения в протонное измерение дву- мерного спектра. Тем не менее, их воздействие на конечный спектр оказы- вается небольшим, поскольку А выбирается соответственно константам 1 J(H,C), которые, по крайней мере, на порядок превышают величины J(H,H). Иначе говоря, интервал А слишком короток для того, чтобы могла осу- ществиться заметная эволюция J(H,H). Небольшие, вызванные ею фазовые искажения редко представляют проблему. В отличие от этого, многокван- товая когерентность, которая существует в период tb эволюционирует под влиянием J(H,H) и не рефокусируется. Поэтому в полученном углеродном спектре в измерении fi сигналы расщеплены из-за протон-протонных взаи- модействий. Такое расщепление углеродных сигналов может показаться немного странным, однако оно свидетельствует о том, что в период ti про- исходит совместная эволюция протонной и углеродной намагниченностей. Просто с помощью спинового эха мы исключаем влияние на нее протон- ных химических сдвигов. На самом деле довольно низкое цифровое разде- ление, которое используется в углеродном измерении fb препятствует про- явлению в спектре этих протонных расщеплений. Они вызывают лишь не- желательные уширения резонансных сигналов вдоль fb Такие гомоядерные расщепления не проявляются при использовании метода HSQC. 5.11. Методы удаления из спектров сигналов 1Н-12С или lH-l4N Последовательность HMQC позволяет детектировать сигналы только тех гетероядер, которые имеют спиновую связь с протонами. При этом исполь- зуются гетероядерные сателлиты в протонном спектре. В случае 13С это означает, что только один из 100 протонов вносит вклад в двумерный спектр (другие 99% связаны с немагнитными ядрами 12С). Для 15N, где ес- тественное содержание изотопа составляет лишь 0.37%, только одно яд- ро из 300 вносит вклад в двумерный спектр. Когда записывается спектр HMQC, все протоны дают сигнал на приемнике прибора, поэтому нежела- тельный сигнал с превосходящей интенсивностью должен быть удален из спектра с помощью подходящего фазового цикла или импульсных градиен- тов поля. Только в этом случае появляется возможность увидеть в спектре корреляционные пики. Фазовый цикл HMQC основан на инвертировании фазы первого импульса на ядрах 13С в каждой паре сканов. При этом фа- за 13С сателлитов инвертируется, в то время как для сигнала протонов, ко- торые связаны с 12С, она остается неизменной. Одновременное инвертиро- вание фазы приемника приводит к исчезновению нежелательных сигналов и сложению интенсивности полезных сателлитов (рис. 5.32). Двухшаговая процедура является основой фазового цикла в эксперименте HMQC, пред- ставленном выше на рис. 5.30. 658
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 5.32. Селекция сателлитных сигналов в эксперименте HMQC с по- мощью фазового цикла. Фаза 13С сателлитов может быть инвертирована с помощью инвертирования фазы первого углеродного 90°-импульса (срав- ните (а) и (б)). Вычитание этих двух наборов данных с одновременным ин- вертированием фазы приемника удаляет исходный сигнал !Н-12С, но усили- вает сигналы сателлитов (в). Поскольку немагнитных ядер 12С намного больше, чем магнитных, проблемой в данном эксперименте оказывается достаточно полное подав- ление нежелательных сигналов. Это оказывается невозможным с помощью одного только фазового цикла. Поэтому в спектре могут возникнуть зна- чительные шумы, маскирующие слабые корреляции. Преодолеть данную проблему можно увеличением времени эксперимента или использованием более эффективного метода селекции. 5.12. Гетероядерная корреляционная спектроскопия HSQC Эксперимент, основанный на обнаружении гетероядерных одноквантовых корреляций, проводится по общей схеме, которая представлена на рис. 5.29г. Он отличается от эксперимента HMQC тем, что во время периода ti ин- дуцируется не многоквантовая когерентность ^-Х, а только поперечная одноквантовая намагниченность гетероядра X (Др = ±1), как показано на рис. 5.33. Последовательность начинается с возбуждения протонов с по- мощью первого 90°-импульса. После этого последовательность включает элемент спинового эха, в котором период Д = 1/2J(H,C). В середине этого периода размещен 180°-импульс на частоте углерода, который рефокуси- рует гетероядерные КССВ. Таким образом, в конце периода Д векторы на- магниченности протонов, которые отвечают гетероядерному взаимодейст- вию, располагаются вдоль оси х антипараллельно. Одновременная подача 90°-импульсов на частотах протонов и ядер углерода, с одной стороны, на- правляет векторы протонной намагниченности вдоль оси ±z, что обеспе- 659
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР чивает перенос поляризации от протонов к углероду, а, со второй стороны, переносит в поперечную плоскость намагниченность ядер углерода. В сле- дующий период времени ti протонная намагниченность не эволюциони- рует, поскольку она выведена из поперечной плоскости. В этот период эво- люционирует лишь углеродная намагниченность соответственно химичес- ким сдвигам и КССВ ядер углерода. 180°-импульс на частоте протонов в середине этого периода рефокусирует взаимодействие !Н-Х. Таким обра- зом, при развязке взаимодействия ’Н-Х в измерении fi остаются только химические сдвиги гетероядер. После окончания периода ti гетероядерная намагниченность превращается в протонную с помощью шага обратного INEPT. Он состоит из двух 90°-импульсов на протонах и на ядрах углерода и последующего элемента спинового эха. Импульс на протонах переносит противофазные компоненты намагниченности от оси ±z к оси у, а импульс на ядрах углерода осуществляет перенос поляризации от атомов углерода на связанные с ними протоны, что обеспечивает модуляцию (пометку) про- тонной намагниченности частотами химических сдвигов ядер атомов угле- рода. Спиновое эхо обеспечивает рефокусировку гетероядерных КССВ в начале сбора данных. Протонная намагниченность с неинвертированной фазой детектируется при одновременном декаплинге на частоте X. Базо- вый двухшаговый фазовый цикл, аналогичный тому, что использовался в HMQC, включает инверсию первого импульса с одновременной инверсией фазы приемника. Рис. 5.33. Эксперимент HSQC и используемый им путь переноса когерент- ности. Для генерации поперечной намагниченности ядра X эксперимент включает последовательность INEPT. Созданная ею намагниченность пос- ле периода эволюции переносится назад на протоны с помощью шага об- ратного INEPT. Обратите внимание на то, что, в отличие от HMQC, на про- тяжении tj эволюционирует только одноквантовая когерентность ядра X. 660
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Хотя последовательность HSQC дает те же корреляции, что и HMQC, однако она не содержит гомоядерных взаимодействий ’Н-’Н в измере- нии fb Это обусловлено тем, что в период ti происходит эволюция только намагниченности ядра X, вследствие чего на нее не влияют гомоядерные расщепления. При этом повышается разрешение в данном измерении, что весьма важно для небольших молекул (рис. 5.34). I HSQC !' 4.15 4.10 -------- м д -48.8 0000 49.0 j-49.2 । 49.4 4.05 4.00 3.95 3.90 м.д. Рис. 5.34. Сравнение кросспиков, полученных в спектрах HMQC и HSQC в идентичных условиях. Верхние 1D срезы отвечают 1D протонному спект- ру, а вертикальные срезы - проекции fi 2О-спектра. Дополнительное уши- рение в спектре HMQC возникает из-за наличия гомоядерных протонных расщеплений в измерении fb Потенциально более высокое разрешение вдоль fi для HSQC делает этот метод лучшим для сложных спектров, хотя во многих случаях для ма- лых молекул разрешение сигналов не является критически важным, что позволяет использовать оба метода. Наиболее существенным отличием ме- тода HSQC по сравнению с HMQC является большее количество импуль- сов, особенно 180°-импульсов на гетероядрах. Это ведет к потере интенсив- 661
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР ности сигнала под воздействием негомогенности радиочастотных импуль- сов, их несовершенству и внерезонансному возбуждению. Эффект имеет большее значение для 13С, чем для 15N, в связи с большим диапазоном хи- мических сдвигов. Потерю интенсивности можно минимизировать путем тщательной подстройки. Как и в случае HMQC, в данном методе осуществ- ляется подавление нежелательных сигналов основного изотопного компо- нента. 5.13. Методы селекции сигналов в гетероядерной корреляционной спектроскопии Для того, чтобы методики HMQC и HSQC стали общеупотребительными, нужно было научиться эффективно подавлять резонансные сигналы тех спинов, которые не дают гетероядерных корреляций. Сделать это с по- мощью одного только фазового цикла невозможно. Существуют два мето- да решения этой проблемы. Более современный и эффективный подход состоит в использовании в последовательности импульсных градиентов по- ля. Более старая, но не менее эффективная схема основана на селективном насыщении нежелательного сигнала. В обоих случаях нежелательный сиг- нал становится настолько малым, что им можно пренебречь. Эффектив- ность методов подавления исходного сигнала можно сравнить с помощью одномерных ’Н-13С HMQC спектров, которые показаны на рис. 5.35. Рис. 5.35. Сравнение методов подавления сигналов, которые используются в экспериментах гетероядерной корреляции с детектированием на прото- нах. Спектр (а) отвечает 1D протонному спектру без устранения исходного сигнала. В нем видны сателлиты 13С. Другие спектры записаны с фазовым циклом (б), с оптимизированным насыщением BIRD (в) и с удалением цент- ральной линии с помощью импульсных градиентов поля (г). Все спектры были записаны при идентичных условиях. При градиентной селекции уда- ется достичь наиболее полного устранения центрального пика, однако при этом происходит некоторая потеря чувствительности. 662
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 5.13.1. Градиентная селекция целевых сигналов в методах HMQC/HSQC Импульсные градиенты поля, бесспорно, являются наилучшим методом подавления сигналов (рис. 5.35г). Степень ослабления остаточного сигнала составляет 1000 : 1 даже в случае единичного скана. Это означает практи- чески полное подавление исходных сигналов !Н-12С или !H-14N. Фазовое циклирование становится ненужным, поскольку выделение сигналов с по- мощью градиентной рефокусировки оказывается вполне достаточным. В случае наличия большого количества образца эксперимент может быть проведен всего за несколько десятков минут. Последовательность для градиентной селекции включает комбинацию градиентных импульсов, которые рефокусируют только сигналы, отвеча- ющие когерентности одного порядка. Схема на рис. 5.36 пригодна для сбо- ра данных только в абсолютных значениях, поскольку она выделяет лишь один путь переноса намагниченности 13С за период tb Для того, чтобы по- нять процесс селекции сигнала с помощью ИГП, следует учитывать, что действие каждого градиента зависит от порядка когерентности р (как это представлено на пути переноса когерентности) и гиромагнитного отноше- ния имеющихся спинов. Надо учесть, что представленный путь переноса касается только когерентности, которую мы хотим выделить. Другие типы когерентности не показаны, поскольку они не выделяются. Все градиенты, которые использованы в эксперименте, имеют одинаковый профиль и про- должительность, а отличаются только мощностью, Gn. Первый градиент на рис. 5.36 действует в тот момент, когда как протоны, так и атомы уг- лерода имеют порядок когерентности р= +1 (гетероядерная двухкванто- вая когерентность). Поэтому влияние первого градиента на фазу сигнала можно записать как Ф1 = Gi(Yh + Yc)- Аналогично, для второго градиента Ф2 = G2(~Yh + Yc), Для третьего - ФЗ = G3(~Yh)« Для того, чтобы выделить данный путь переноса когерентности, общая фаза, индуцированная гради- ентами, должна быть нулевой: Ф1 + Ф2 + ФЗ = Gi(Yh + Yc) + G2(-Yh + Yc) + G3(~Yh) = 0. (5.3) Отметим, что в гетероядерных экспериментах важны только отноше- ния величин у, а поскольку gH/gc = 4, то данное уравнение можно упростить: Gj(5) + G2(-3) + G3(-4-) = 0. (5.4) Существует ряд соотношений градиентов, которые удовлетворяют дан- ному уравнению и приводят к необходимой селекции сигналов, например 2:2: 1,5 3 4 или 3 5:0. 663
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР Оптимальным вариантом в присутствии разных экспериментальных несовершенств является соотношение 3 5 0 (то есть используются только два градиентных импульса). Рис. 5.36. Последовательность эксперимента HMQC с градиентным от- бором. Последовательность пригодна для сбора данных в абсолютных зна- чениях. Аналогичные подходы справедливы и для градиентной селекции в эксперименте HSQC. Здесь также описан ряд вариантов градиентной се- 5.9 лекции. Способность полностью подавлять ис- ходные сигналы *Н-12С и !H-14N с помощью импульсных градиентов позволяет практичес- ки полностью исключить из спектра шум. Это иллюстрируется на рис. 5.37, где изображен фрагмент спектра HSQC !H-15N для соедине- ния 5.9 с градиентной селекцией сигнала и де- каплингом на 15N. 664
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Рис. 5.37. Спектр HSQC соединения 5.9 при естественном содержании 15N с градиентным отбором (химические сдвиги 15N измерены относительно жидкого аммиака, который взят как внешний стандарт). 5.13.2. Селекция сигналов в методе HMQC с помощью импульса BIRD Некаждый спектрометр ЯМР или датчик укомплектован оборудованием для использования импульсных градиентов и потому приспособлен для прове- дения описанных выше экспериментов гетероядерной корреляции. Когда невозможно использовать градиентную селекцию, вполне пригодной ока- зывается альтернативная схема удаления нежелательных сигналов и полу- чения спектров без значительных артефактов. В варианте BIRD (Bilinear rotation decoupling) (рис. 5.38) нежелательные сигналы !Н-12С подавляются перед использованием последовательности HMQC с помощью остроумной схемы насыщения. Она заключается в инверсии сигнала протонов, которые связаны с ядрами 12С, с помощью импульса BIRD (ранее уже рассматрива- лось применение такого импульса в методе гетероядерной /-разрешенной спектроскопии, раздел 5.5.2). Сигналы протонов, которые связаны с ядра- ми 13С, при этом остаются неизменными. Следующий за инверсией период восстановления, т, позволяет вектору намагниченности релаксировать по направлению к равновесному положению вдоль оси +z до тех пор, пока он 665
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР не пересечет плоскость х-у (рис. 5.39). В этой точке начинается последова- тельность HMQC. Поскольку в этот момент отсутствует продольная намаг- ниченность, которая связана со взаимодействием ’Н-12С, для этих спинов не генерируется и поперечная намагниченность, то есть происходит необ- ходимое подавление сигнала. Во время детектирования и последующего периода инверсии-восстановления намагниченность ’Н-^С, поскольку она не инвертируется импульсом BIRD, просто релаксирует до равновесного значения и подготавливается к следующему циклу последовательности. Рис. 5.38. Вариант эксперимента HMQC с BIRD. Последовательности HMQC предшествуют элемент BIRD для инверсии сигналов и задержка т для их восстановления. Эта процедура, в конечном итоге, ведет к удалению из спектра нежелательных исходных сигналов. ’Н(12С) Рис. 5.39. Устранение исходных протонных сигналов, связанных с ядра- ми 12С [!Н(12С)], с помощью последовательности инверсии-восстановления BIRD. 666
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Импульс BIRD является составным импульсом (рис. 5.38). Он исполь- зуется в ЯМР для дифференциации спинов, которые имеют гетероядерное расщепление, от тех, которые такого расщепления не имеют. Результат воздействия импульса сильно зависит от фазы импульсов, которые входят в кластер, поэтому здесь мы остановимся на селективной инверсии, кото- рая описана выше. Для упрощения картины рассмотрим протонные им- пульсы, которые имеют фазы х, у, х (аналогичные результаты выходят и для фаз х, х, -х). Прежде всего посмотрим, как импульс BIRD воздействует на вектор намагниченности протона, связанного с изотопом 12С. На схеме, показанной на рис. 5.40, последовательность начинается с протонного возбуждающего импульса с последующим спиновым эхом. По- скольку протоны, связанные с 12С, не имеют гетероядерного расщепления через одну связь, на протяжении периода А эволюционируют только их хи- мические сдвиги. Они полностью рефокусируются 180°-импульсом на час- тоте протонов. Поэтому второй 90°-импульс, который подается в конце второго периода А элемента BIRD, располагает вектор вдоль оси -z и вызы- вает необходимую инверсию сигналов ’Н-^С. Для тех спинов, которые имеют гетероядерное расщепление, химические сдвиги также рефокусиру- ются, поэтому для них можно учитывать только эффект расщепления. Если выбрать А соответствующим 1/2J(C,H), непосредственно перед 180°-импуль- сом для протонов получим два вектора, которые расположены в направле- ниях ±х (рис. 5.41). Рис. 5.40. Воздействие импульса BIRD на вектор намагниченности прото- на, связанного с атомом 12С. Рис. 5.41. Воздействие импульса BIRD на вектор намагниченности прото- на, связанного с атомом 13С. 667
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР После 180°-импульсов на обоих ядрах компоненты намагниченности, связанные с расщеплением, продолжают эволюционировать. Поэтому в конце периода 2Д дублет векторов располагается вдоль направления -у. Он затем возвращается к +z под воздействием финального протонного им- пульса. Эти спины ведут себя так, как будто импульс BIRD на них не влиял. Схема BIRD достаточно эффективна для подавления ненужных сигна- лов !Н-12С, вызывающих ti-шум. Она широко используется при изучении малых молекул. Однако данный метод непригоден для изучения макромо- лекул, поскольку во время периода т генерируются отрицательные сигналы ЯЭО, что приводит к уменьшению интенсивности протонных сигналов и соответствующему падению чувствительности. Традиционный подход к изу- чению больших молекул при отсутствии градиентного датчика - исполь- зование сильного спинового замка во время действия первой последова- тельности INEPT в эксперименте HSQC. При этом исчезает любая намаг- ниченность, которая не отвечает параметрам спинового замка, а это ведет к подавлению нежелательных сигналов. 5.13.3. Практические замечания Большой диапазон химических сдвигов кросспиков, наблюдающихся в экспериментах гетероядерной корреляции, вместе с отсутствием потреб- ности анализа их тонкой структуры позволяет проводить эксперименты HMQC и HSQC с низким цифровым разрешением. Это значительно сокра- щает время эксперимента. Необходимое в таких экспериментах цифровое разрешение для протонного измерения f2 составляет 5 Гц, а для гетероядер - только 50 Гц. При этом можно получить достаточно разрешенные кросспи- ки. Увеличения разрешения в измерении fi можно достичь линейной экстра- поляцией сигнала ССИ или повышением цифрового разрешения методом нулевого заполнения. Когда недоступно достаточное количество образца, использование линейной экстраполяции может привести к существенной экономии времени. Это обусловлено возможностью уменьшения количест- ва инкрементов по tj. Надо, однако, помнить, что слишком высокое разре- шение по fi в экспериментах HMQC нецелесообразно, поскольку экспери- мент не должен приводить к появлению расщеплений, связанных с протон- протонным взаимодействием. Таким образом, на практике необходима лишь небольшая аподизация. Эксперименты по протон-углеродной корреляции, которые основаны на описанных выше методиках, оказываются неожиданно быстрыми при измерении спектров рутинных органических образцов, особенно, когда ис- пользуются импульсные градиенты и датчики, которые оптимизированы для непрямого детектирования. Время между сканами определяется минималь- 668
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ным временем релаксации атомов 13С, которые связаны с протонами, и мо- жет быть меньшим, чем в гомоядерных спектрах COSY, когда изучаются протоны, связанные с 12С. Спектры обычно измеряются быстрее и часто более информативны, чем одномерные углеродные спектры. Среди хи- миков-органиков такие эксперименты стали рутинными. 5.14. Х-У-корреляции Следует отметить, что представленные здесь 2В-методики пригодны для корреляций между различными ядрами и не требуют обязательного детек- тирования на протонах, если имеются другие ядра с высоким естественным содержанием. Для иллюстрации этого на рис. 5.42 приведен корреляцион- ный спектр 31р.13с молекулы 5.10 с детектированием на фосфоре. Использо- вана базовая последовательность HMQC с дополнительной широкополос- ной развязкой на протонах и без развязки на ядрах 13С во время периода де- тектирования. Корреляция видна в виде дублета 1 J(C,P). L ,3с о и МеО^/РхОМе МеО 5.10 -9.5 -10.0 -10.5 -11.0 35.0 34.5 34.0 м.д. З'р Рис. 5.42. Спектр 31Р-13С HMQC соединения 5.10 с детектированием на фосфоре. Во время всего эксперимента использовался декаплинг на прото- нах, однако декаплинг на углероде не использовался. Такие эксперименты чаще всего проводятся для выявления корреляций между ядрами, которые отличны от протонов. Сами протоны при этом обычно подавляются с помощью декаплера. Для этого необходимо, чтобы спектрометр имел три радиочастотных канала с возможностью подстройки на необходимые частоты. Серийные спектрометры с двумя радиочастот- ными каналами для таких экспериментов непригодны. Тем не менее, по 669
Глава 5. Методики 20-спектроскопии ЯМР мере того, как трехканальные спектрометры становятся доступными для химиков, данные методы приобретают все большую популярность для ре- шения химических проблем. Непрямые корреляционные методы использу- ются также для получения данных о химических сдвигах ядер, чувствитель- ность которых слишком низка, чтобы эти сдвиги наблюдать непосредст- венно. Особенно это важно при изучении комплексов металлов. Многие металлы имеют довольно малую собственную чувствитель- ность, однако их можно детектировать непрямым методом через спиново- связанные с ними соседние ядра в лигандах, наиболее часто с помощью протонов или атомов фосфора. Изучение координационного соединения железа на ядрах 57Fe, очень неудобных для спектроскопии ЯМР, методом непрямого детектирования может служить тому примером (рис. 5.43). Рис. 5.43. Спектр 31P-57Fe HMQC соединения 5.11 с детектированием на фосфоре и декаплингом на протонах. Срезы на осях - проекции, взятые из двумерного спектра. 5.75. Корреляция гетероядер с протонами через 2-3 связи Рассмотренные ранее методы гетероядерной Н-Х корреляции позволяют идентифицировать лишь протонированные атомы X. Их невозможно при- менить для отнесения сигналов непротонированных атомов X, в частности 670
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса углерода. Для полного отнесения сигналов ядер X следует данный подход дополнить установлением корреляций между атомами углерода и близле- жащими протонами, которые отстоят более чем на одну химическую связь. Это так называемые дальние или многосвязевые корреляции. Чаще всего их обнаруживают в экспериментах гетероядерной многосвязевой корреля- ции (НМВС) с детектированием на протонах. В большинстве случаев при этом находится связность углерода с протонами, которые отстоят на 2-3 хи- мические связи, поскольку более далекие КССВ, как правило, слишком слабы. Возможность идентифицировать Н-С корреляции через связи углерод-углерод и углерод-гетероатом способствует получению инфор- мации о скелете молекулы и является одним из наиболее мощных подходов к установлению строения органических молекул. Вид спектра НМВС похож на спектр HMQC. Здесь также координатные оси отвечают одномерным спектрам на ядрах углерода и на протонах. Дальние корреля- ции каждого протона содержатся на линии, которая отвечает его химичес- кому сдвигу. Взаимная ориентация осей не является стандартизированной и может быть произвольной. 5.16. Последовательность НМВС Эксперимент НМВС позволяет найти корреляции между протонами и ядра- ми X через несколько химических связей. Он имеет высокую чувствитель- ность, обусловленную детектированием на протонах. Для его реализации фактически используется последовательность HMQC, которая ’’настраива- ется” на получение корреляций через малые КССВ (рис. 5.44а). Вследствие большого сходства мы обсудим только моменты, которые отличают НМВС от HMQC. Настройка эксперимента на малые КССВ состоит в выборе продолжи- тельности периода Д, достаточной для того, чтобы слабые протон-углерод- ные взаимодействия получили противофазную ориентацию векторов на- магниченности, необходимую для появления гетероядерной многокванто- вой когерентности. Дальние !Н-13С КССВ имеют величину, по крайней ме- ре, на порядок меньшую, чем прямые КССВ через одну химическую связь (обычно они меньше 5Гц). Промежуток Д для них должен составлять около 100 мс (nJ(C,H)/2). Хотя такой интервал и является оптимальным, однако для предотвращения потери интенсивности сигнала вследствие релаксации на практике часто используют меньшие интервалы. Во время продолжи- тельного периода Д гомоядерные расщепления 1Н-1Н, которые имеют вели- чины, близкие к гетероядерным КССВ через несколько химических связей, также эволюционируют и вносят некоторые фазовые искажения в наблю- даемые кросспики, однако они не слишком существенны. Для маскировки фазовых ошибок в методе НМВС получают абсолютные значения сигна- 671
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР лов. Отличием от последовательности HMQC является также то, что период рефокусировки (второй период Д) здесь пропускается, поэтому гетероядер- ные расщепления через несколько химических связей находятся в противо- фазе в начале t2, что препятствует использованию декаплинга на 13С. а) Рис. 5.44. Последовательность НМВС (а) без и (б) с импульсными градиен- тами поля. Последовательность близка к эксперименту HMQC и исполь- зует тот же самый путь переноса когерентности. Хотя период Д выбирается соответствующим величинам дальних КССВ, он может оказаться кратным величинам КССВ через одну связь. Поэтому часто в спектре в дополнение к дальним корреляциям проявляются расщепления через одну связь с относительно малой интенсивностью. Поскольку сбор данных осуществляется без развязки на протонах, то в спектрах появляются соответствующие дублеты. В зависимости от точки зрения их появление в спектре можно считать ’’пороком” или преимущест- вом, поскольку их можно использовать для идентификации сигналов про- тонированных атомов углерода. На практике можно отказаться от любых схем фильтрации и примириться с наличием в спектре корреляций через одну химическую связь. 672
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Несомненно, наибольшей проблемой в методике НМВС является по- давление исходных сигналов !Н-12С. Остатки таких сигналов вызывают шумы, маскирующие сателлиты сигналов, связанных с дальним ССВ. В отличие от HMQC, в этом случае последовательность BIRD не позволяет полностью удалить нежелательные сигналы, поскольку одновременно про- исходит ослабление и информативных сигналов. Сначала для уничтожения интенсивных исходных сигналов в данной импульсной последовательности использовались только фазовые циклы. Однако при этом необходима исклю- чительно высокая стабильность работы спектрометра, и даже в этом случае в спектре присутствуют полосы остаточного ti-шума, который ограничи- вает применение метода для рутинных исследований. Введение в практику исследований метода импульсных градиентов оказалось революционным для методики НМВС, поскольку в этом случае удается полностью изба- виться от исходных сигналов, что во много раз уменьшает величину tj-шума. Преимущества градиентного метода селекции сигналов демонстрируются на спектрах, которые приведены на рис. 5.45. Рис. 5.45. Спектр НМВС, записанный при идентичных условиях, но с се- лекцией сигнала: с помощью (а) импульсных градиентов поля и (б) фазово- го цикла. Здесь спектр 5.45а записан в условиях градиентной селекции сигналов, а спектр 5.456 - с помощью соответствующего фазового цикла при прочих одинаковых условиях измерения. Наблюдается увеличение отношения сиг- нал/шум больше чем в 256 раз. При записи спектра было использовано 4 скана, что отвечает минимуму, необходимому для работы фазового цикла (два скана для селекции сигнала и два - для подавления аксиальных пиков). В спектре (а) хорошо видны дальние корреляции, а в спектре (б) они прак- тически полностью скрыты в шумах. Улучшить результаты в версии фазо- вого цикла удается путем значительного увеличения количества сканов и соответственно времени эксперимента. 673
Глава 5. Методики 2В-спектроскопии ЯМР 5.17. Традиционная корреляционная спектроскопия с детектированием на ядрах X Традиционные методы гетероядерной корреляции описываются схемой, которая приведена на рис. 5.296. Они основаны на прямом наблюдении спина X и непрямом детектировании протонов. Как обсуждалось в начале данного раздела, этот общий подход менее чувствителен, чем тот, который включает прямое детектирование на протонах. Поэтому популярность ме- тода все уменьшается. Тем не менее, вполне вероятно, что метод не исчез- нет полностью, поскольку он имеет то преимущество перед методом не- прямого детектирования, что позволяет записать спектр спина X с большим цифровым разрешением. В методах с детектированием на протонах боль- шой диапазон химических сдвигов ядра X измеряется непрямым методом, и сбор данных с высоким разрешением требует использования большого числа инкрементов, что неприемлемо увеличивает время эксперимента. В случае детектирования на ядрах X высокого разрешения можно до- стичь путем простого увеличения количества точек ССИ, что приводит к незначительному увеличению общего времени эксперимента. Когда гете- роядерные корреляции связаны с перегруженным протонным спектром, например со сложной ароматической системой, подход с детектированием на ядрах 13С может иметь преимущество. Более прозаической причиной использования данного метода может быть невозможность применения об- ращенной спектроскопии на конкретном спектрометре ЯМР по техничес- ким причинам. Возможность реализации современных методик имеется только у новейших спектрометров. Дальнейшие эксперименты описаны для примера взаимодействия !Н-13С, но они могут быть распространены и на другие пары ядер. 5.17.1. Корреляции через одну связь. Метод HETCOR Методы для установления связности гетероатомов основаны на фундамен- тальной идее переноса поляризации от протона к атому углерода. Это фи- зическое явление мы уже использовали раньше в разделах, которые были посвящены редактированию одномерных углеродных спектров, в частнос- ти в методе INEPT. Вспомним, что импульсная последовательность INEPT с рефокусировкой осуществляет перенос заселенности протонов (поляриза- цию) на связанные с ними ядра углерода путем одновременной подачи на оба ядра 90°-импульсов. Этот шаг реализуется после того, как гетероядер- ное расщепление на протонах эволюционирует на протяжении периода Ai и его компоненты приобретут антипараллельную ориентацию. Вследствие такого переноса компоненты углеродной намагниченности находятся в про- тивофазе. Поэтому их эволюцию удлиняют на период Д2 до момента совпа- 674
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса дения векторов. В это время включается декаплер на протонах и записыва- ется углеродный ССИ (рис. 5.46а; здесь 180°-импульсы в середине Д1 и Д2, устраняющие эволюцию химических сдвигов, для простоты опущены). а) 'Н X X б) Рис. 5.46. (а) Эксперимент INEPT-1D с рефокусировкой. Показан в упро- щенной форме. Рефокусирующие импульсы в центре Д1 и Д2 для ясности не показаны, (б) Двумерный эксперимент по корреляции сдвигов (HETCOR), полученный из INEPT добавлением периода эволюции tb В эксперименте перед шагом переноса поляризации осуществляется кодирование протон- ных химических сдвигов. 180°-импульс на углероде в центре h рефокуси- рует эволюцию гетероядерных расщеплений, которые потом удаляются из спектра с помощью декаплинга на углероде в измерении fb При проведении двумерного корреляционного эксперимента непосред- ственно после первичного возбуждения протонов и перед шагом переноса поляризации в последовательность включен переменный период эволю- ции tb Таким образом, эффективность переноса поляризации оказывается за- висимой от частот химических сдвигов протонов. Поэтому детектируемый сигнал 13С модулируется частотами протонных химических сдвигов как функция tj (рис. 5.466). Одновременно эволюционируют расщепления и ^-^С. Это приводит в измерении fi как к гомоядерным, так и к гетероядерным расщеплениям, которые значительно снижают интенсив- ности сигналов. Удаление из измерения fi корреляций, которые связаны с ^-^С, можно осуществить рефокусировкой ^(HjC) под влиянием углерод- ного 180°-импульса в середине ti (чаще всего с этой целью используется составной импульс, рис. 5.466). 675
Глава 5. Методики 2Э-спектроскопии ЯМР Вследствие того, что в период ti происходит эволюция не только рас- щеплений СН, то противофазная ориентация векторов, которая необходима для переноса поляризации, может быть достигнута только соответству- ющим подбором периода Др Поэтому период Д1 тщательно оптимизируют для того, чтобы соблюдалось условие Д1 = 1/2!./(Н,С), как это раньше дела- лось в методике INEPT. Типичное значение Д1 составляет 3.5 мс. В результи- рующем спектре возникают кросспики, отвечающие корреляциям углерод- ных химических сдвигов в измерении f2 и протонным сдвигам в измерении fi, расщепленным вследствие гомоядерных взаимодействий. На рис. 5.47 приведена часть протон-углеродного корреляционного спектра палладие- вого комплекса 5.12. Несмотря на сильное переполнение спектра в области ароматики, углеродные сдвиги полностью разделяются, проявляя все кор- реляции (следует отметить, что некоторые сигналы уширены вследствие затруднения динамических процессов, а некоторые расщепляются на ядрах фосфора). Рис. 5.47. Ароматическая область спектра 13С-!Н HETCOR (500 МГц) пал- ладиевого комплекса 5.12 в абсолютных значениях. 676
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Схема, приведенная на рис. 5.466, широко используется для получения корреляционных спектров. Ее называют HETCOR или hetero-COSY. По- скольку в эксперименте используется перенос поляризации, интервал меж- ду сканами определяется временем восстановления намагниченности про- тона, который релаксирует наиболее быстро. Промежуток между сканами должен быть большим 1.3Ть Разрешение в протонном измерении для ру- тинных спектров может быть довольно низким, поскольку обычно не воз- никает потребности в полном разделении протонных мультиплетов, а также потому, что гомоядерные расщепления находятся в фазе и не влияют на уменьшение амплитуды сигнала. Поэтому цифровое разрешение в из- мерении fi может быть близким к 10 Гц/точка. 5.17.2. Корреляции через 2-3 связи. Метод COLOC Для выявления дальних корреляций !H-13C с детектированием на ядрах X было разработано большое количество импульсных последовательностей. Здесь представлена наиболее популярная последовательность COLOC (Correlation through LOng Coupling). Наиболее простой путь для получения дальних корреляций - это наст- ройка периода эволюции гетероядерных расщеплений в последовательнос- ти HETCOR на малые величины КССВ. Потенциальным недостатком тако- го подхода является общее время действия полученной последовательности. Поскольку рефокусирующие интервалы Ai и Д2 при этом значительно уве- личиваются, это приводит к потере малоинтенсивных кросспиков вследст- вие протекания за эти периоды процессов релаксации. В методе COLOC для предотвращения излишней релаксации интервал ti вводится в середину интервала Дь что уменьшает общую продолжительность импульсной после- довательности (рис. 5.48). *Н Ai X Рис. 5.48. Последовательность COLOC для установления дальних корреля- ций с наблюдением на ядрах X.
Глава 5. Методики 2В-спектроскопии ЯМР Как видно из схемы последовательности, интервал ti определяется па- рой импульсов 180°(Н,С), которые перемещаются вдоль Aj для каждого ин- кремента tj. Такие эксперименты носят название ’’эксперименты постоян- ного времени”, поскольку, в отличие от HETCOR, общее время действия последовательности не изменяется при переходе от одного инкремента к другому. Сигнал, который детектируется, оказывается модулированным протонными сдвигами, поскольку, хотя они и рефокусируются во время пе- риода ti, однако продолжают эволюционировать в остаток периода Дь ко- торый зависит от tj. В отличие от гомоядерных протонных расщеплений, эволюционирующих на протяжении всего постоянного периода Ai незави- симо от положения 180°-импульса, модуляция этими КССВ не является функцией ti. Поэтому в измерении fi присутствуют только протонные хи- мические сдвиги. Перенос намагниченности, связанный с расщеплением через одну связь, также может проявляться в спектре COLOC, если перио- ды Д1 и Д2 оказываются кратными соответствующим значениям ^(HjC). В результате в спектре возникают дублеты, которые отвечают этим расщепле- ниям совершенно аналогично тому, как это мы наблюдали в методе НМВС. Однако при работе последовательности COLOC расщепление через од- ну связь имеет еще одно отрицательное последствие. Во время шага пере- носа поляризации векторы намагниченности углеродного ядра, которые связаны с расщеплением через одну связь, находятся в фазе. Во время сле- дующего периода Д2 под влиянием ^(HjC) они много раз оказываются в фазе и не в фазе. Если случится так, что во время начала сбора данных они окажутся в противофазе, векторы взаимно уничтожатся и кросспик исчез- нет. В любом случае интенсивность наблюдаемых дальних корреляций ока- зывается модулированной расщеплением Н-С через одну связь. Для удале- ния этих эффектов следует обеспечить переход данных векторов в исход- ное состояние (в фазе) в конце периода Д2. Такую же ориентацию следует обеспечить также и векторам, которые связаны с дальними КССВ. Этого можно достичь размещением последовательности BIRD в середине Д2. Под ее воздействием инвертируются намагниченности, которые связаны с даль- ними протон-углеродными взаимодействиями, но остаются неизменными компоненты намагниченности, которые связаны с расщеплением Н-С через одну связь. Использование кластера BIRD рекомендовано для всех корре- ляционных методов выявления дальних взаимодействий с детектировани- ем на ядрах X. В общем оптимизация периодов Aj и Д2 для эксперимента COLOC мо- жет оказаться проблемой. В дополнение к описанным выше эффектам моду- ляции КССВ через одну С-Н связь на эффективность переноса намагничен- ности влияют также и гомоядерные протонные расщепления, которые эво- люционируют в период Др Фиксированный интервал Aj также ограничен 678
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса временем ti(max) (ti(max)/2 < Ai). Это может привести к необходимости сокра- щения количества инкрементов tj, что, в свою очередь, приведет к сниже- нию цифрового разрешения в измерении fb Показано, что для рутинного использования последовательности COLOC оптимальный промежуток для nJ(H,C) = 10 Гц составляет для Aj и А2 соответственно 50 мс (l/2nJ(H,C)) и 33 мс (l/3nJ(H,C)). 679
Использованная литература Использованная литература 1. Воловенко Ю.М., Туров А.В. Ядерный магнитный резонанс. - Киев: Перун, 2007 (на укр. языке). 2. Комаров И.В., Туров А.В. Практикум по спектроскопии ЯМР. - Киев: изд-во Киевского университета им. Т. Шевченко, 2009 (на укр. языке). 3. Корнилов М.Ю., Туров А.В., Борсдорф Р., Клейнпетер Э. Ядерный магнитный резонанс в вопросах и ответах. - Киев: Вища школа, 1995 (на укр. языке). 4. Корнилов М.Ю., Туров А.А., Хиля В.П. Применение метода ядерного магнитного резонанса для исследования химических соединений. - Киев: УМК МО, 1990. 5. Гюнтер X. Введение в курс спектроскопии ЯМР. - М.: Мир, 1984. 6. Эмсли Дж., Финней Дж., Сатклиф Л. Спектроскопия ЯМР высокого разрешения. - М.: Мир, т. 1, 1968; т. 2, 1969. 7. Сильверстейн Р., Басслер Г., Морил Т. Спектрометрическая идентификация органических соединений. - М.: Мир, 1977. 8. Вашман А.А., Пронин И.С. Ядерная магнитная релаксационная спектроскопия. - М.: Энергоатомиздат, 1986. 9. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. - М.: Мир, 1976. 10. Леви Г., Нельсон Г. Руководство по ядерному магнитному резонансу углерода-13 для химиков-органиков. -М.: Мир, 1975. 11. Сергеев Н.И. Спектроскопия ЯМР. - М.: МГУ, 1981. 12. Эрнст Р., Боденхаузен Дж., Вокаун А. ЯМР в одном и двух измерениях. -М.: Мир, 1990. 13. Claridge T.D.W. High-resolution NMR techniques in organic chemistry. - Pergamon, 1999. 14. Contreras R.H., Peralta J.E. Angular dependence of spin-spin coupling constants. - Progress in NMR spectroscopy, 2000, v. 37, p. 321-425. 15. Grant D.M., Harris R.K. Encyclopedia of nuclear magnetic resonance. - Pergamon, 2000, v. 1-8. 16. Преч Э., Бюльманн Ф., Аффольтер К. Определение строения органических соединений. Таблицы спектральных данных. - М.: Мир, 2006. 680
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Предметный указатель* А ACOUSTIC 534,535 APT 173,514 ASTM 390,393 В BIRD 633,634,662,665 принцип метода 665 селекция сигналов в HMQC 665 BURP 418,420 С COLOC 677 импульсная последовательность 677 COSY 216,537 ti-шум 563 аксиальные пики 557, 560 анализ спектра 220,250,251 аподизация 395, 555, 668 артефакты 562 симметризации 564 вид спектра 218 влияние сглаживания 608 выделение заданной когерентности 572, 573, 588 выделение сигналов N-типа 573 Р-типа 573 действие на сигналы аподизации 555 измерение КССВ 578 квадратурное детектирование 556 квадратурные артефакты 562 методика эха-антиэха 574, 605 обработка данных 568 оптимизация контурных линий 571 осложнения 605 представление результатов 220 применение 217 разновидности 580 пиков 217 с градиентным отбором 572 с задержкой 581, 582, 591 сбор данных 565 сигналы N-типа 551,553 Р-типа 551,553 структура кросспиков 548 мультиплетов 575 пиков 547, 566 требования к образцу 217 треугольник Паскаля 578, 579 удаление аксиальных пиков 561 фаза сигналов 559 фазовая коррекция сигналов 571 фазочувствительное представление 556 фазочувствительный эксперимент 574 функции аподизации 570 цифровое разрешение 347, 566 эстафетный 581 COSY-45 583,584,585 * Полужирным шрифтом указана страница начала раздела, посвященного данному термину. 681
Предметный указатель COSY-90 580, 582, 584, 585, 592 COSY-0 580,582 CPMG 477,478,479,480,481 CYCLOP 562 D DANTE 422 DEPT 164,175,528,632 получение подспектров 531, 532 управляющий импульс 531 физика эксперимента 528 DIPSL2 410,412,603,604 DISCO 579 DPFGSE 425,482 DQF-COSY 559, 581, 582, 585, 589, 614, 644 Е EBURP2 418,419,420,421 Еи(ГФБК)3 499 Еи(ДПМ)3 494 Еи(ФОД)3 491,494,495,496,498 EXSY 609,615,625 F FLIPSY 502,503 FLOPSY-8 410 G GARP 410,411 Н НЕНАНА 599 HETCOR 674 импульсная последовательность 674 пример спектра 676 НМВС 156,164,172, 195, 229, 610, 671 W-взаимодействие 133, 195, 235, 244, 247 анализ спектра 230, 231, 255, 256 вид спектра 231 для установления структуры 236 импульсная последовательность 671 8-карбоксиметилхинолина 230, 231 построение таблицы корреляций 232,233 представление результатов 234 проявление ’/(Н,С) 240 удаление шумов 673 HMQC 164,172, 226,410, 652, 653 анализ спектра 253,254 вид спектра 227 для установления структуры 236 импульсная последовательность 654 сИГП 653,663,664 ментола 227, 228 отнесение сигналов 228 HSQC 172, 226,410, 652, 653, 659 импульсная последовательность 654, 660 I IBURP2 418,419,420,421 INADEQUATE пример спектра 647, 648 INEPT 459,453,516,544 величины для различных ядер 524 682
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса для повышения чувствительности 522 с рефокусировкой 519 физика эксперимента 517,518 М MLEV-4 409 MLEV-16 410,603 MLEV-17 410,489 N NOESY 80,220,453 анализ спектра 222,252 артефакты 616 вид спектра 221 для подавления сигнала растворителя 502 замещенного кумарина 221 представление результатов 222 составление таблицы корреляций 224 спектр налоксона 222, 223 фазовый цикл 615 NOESY-1D 482 NOESY-2D 611 импульсная последовательность 612 удаление нуль-квантовой когерентности 616 R______________________ RIDE 534,535 ROESY 485,619 импульсная последовательность 619 ложные сигналы 621 S SEFT 508 SPI 457 SPT 457 SUSAN 410 Т TOCSY 489,581,594 импульсная последовательность 596 применение ИГП 604 спектр грамицидина 600 TOCSY-1D 489 ТРИ 557,561,656 TRAF-функции 398 Tr-ROESY 623 W WALTZ-16 410,603 WATR 481 WURST 413 W-взаимодействие 133, 195 в спектрах НМВС 235 Z ZQC 616 А Айдина-Гюнтера формула 193 Анизотропия химического сдвига 433 Аррениуса формула 470 Артефакты 356 в методе DEPT 176,177 вычитания 149 Атом строение 23 ядро 289 Атропоизомерия выявление с помощью ЛСР 499 Аттенюатор 384 683
Предметный указатель Б 9^^^S=S=S^S^S Бензольное кольцо влияние на химические сдвиги 41 конфигурация магнитного поля 41,42 Биномиальные последовательности 505 Блоха-Сигерта сдвиги 145 Быстрова-Степанянца формула 132 В Вектор макроскопической намагниченности 304,313 Векторная модель в ЯМР 298 Внерезонансные эффекты 318 Возбуждение импульсное 60 Вращающаяся система координат 299 Время задержки 346 релаксации 471 сбора данных 347 ВСК 299 ВСК-ЯЭО 486,619 ложные 621, 622 Выборка сигнала параллельная 354, 355 последовательная 354, 355 Выборка точек 345 Г Гауссиан 417,419 Гауссиан-270 417,419 Гауссов импульс 415 Гауссова линия 397 мультипликация 397 Гиромагнитное соотношение 25, 290 Гироскоп 292 ГМКК 530 Градиент поля 340 электрического поля 434 Градиентное шиммирование 378 принцип 379 Градиентное эхо 381 J________________________ Датчик спектрометра настройка 369 Двойной резонанс 143 Двумерная спектроскопия 212 Двумерный эксперимент детектирование сигнала 549 Дезэкранирование 28 Декаплинг гетероядерный 143 прерывистый 161 гомоядерный 143,144 вид спектра 144,156 сдвиги Блоха-Сигерта 145 использование композитных импульсов 409 основы метода 143 цель применения 142 широкополосный 160, 161, 408 Деревья мультиплетов 99, 100 Детектирование сигнала ЯМР 344 квадратурное 350 двухканальная схема 352 одноканальная схема 352 непрямым методом 540 Децибелы 385 Диагональные пики фаза 559 Диаграмма когерентности 550 684
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 0-Дикетоны для ЛСР 492 Динамические системы 139,461 эффекты в ЯМР 459 Диффузия спинов 451 ДЯМР 461 гидразидов 463 диметилацетамида 462, 463, 467, 468 конформационный анализ 463 основы метода 466 приближенные методики 469 таутомерия 464 3 Замок спиновый 411 Заселенность уровня 296 Заторможенное вращение выявление 138 И ИГП 339 в методах HMQC и HSQC 663 для COSY 572,573 для NOESY-ID 482 для селекции когерентности заданного порядка 366, 367 для селекции сигналов 366 для шиммирования 378 карты градиентов 380 необходимое оборудование 340 принцип действия 339, 340 расфазировка сигналов 340 рефокусировка сигналов 343 Импульс 308 SLURP 422 WURST 413 адиабатический 412 внерезонансные эффекты 318, 404 диапазон возбуждаемых частот 309 длительность 308 для широкополосного декаплинга 409 идеальной фазы 418 калибровка 383 композитный 402 коррекция фазы 314 мягкий 414 опорная частота 336 определение угла 385 полоса возбуждения 62 профиль возбуждения 415 разновидности 417 семейства BURP 418 сформованный 413 угол 311 фаза 314,315 чистящий 602 Импульсная последовательность для единичного импульса 63 управляющий интервал 175 угол 175 Импульсное возбуждение 308 Импульсные последовательности, компоненты 331 Импульсный градиент 338 рефокусировка сигналов 343 Импульсный ЯМР 303 Инверсия-восстановление 471 Индукционный эффект влияние на химический сдвиг 38 Интегрирование сигналов 60 Интерферограмма 62, 345, 346 К Карплуса формула 127, 128 для ЙР 204 685
Предметный указатель Карра-Парсела последовательность 477 Квадрупольная релаксация 434 Квадрупольный момент ядра 434 Квантовые числа 23 Квенч 373 Кластер импульсов 405, 406 Когерентность 359 N- 550 Р- 551 графическое представление 550 двухквантовая 360, 361 диаграмма 364 многоквантовая, модель 362 нульквантовая 360, 361 одноквантовая 360 порядок 359 пути переноса 364 Компоненты намагниченности 295 поведение в ВСК 327 Константа скорости определение 462 Контактное взаимодействие 493 Конусы анизотропии 40 прецессии 297 Копии сигналов квадратурные 351 Корреляционная спектроскопия для структурного анализа 236 Корреляция Х-У 669 Кросспики 545 фаза 559 в COSY 549 Кросс-релаксация 487 КССВ 46 ‘/(С,С) 645 ‘/(Н,С) 187 в спектрах НМВС 244,245 в циклических соединениях 189 влияние электронных пар 190 зависимость от гибридизации 188 ‘/(Н,Р) 203,204 влияние пирамидальности 203, 204 2J(C,F) 201 2J(C,P) 204,205 2J(F,F) 199,200 2J(H,C) 190 в ароматике 191, 192 зависимость от углов в молекуле 191 2J(H,F) 199,200 2J(H,H) 123 расчет 125 типичные значения 126,127 37(Н,С) 193 в ароматике 194 угловая зависимость 193, 194 37(Н,Н) 127 Балканах 130 в олефинах 130,131 влияние неподеленных электронных пар 132 воздействие углов между связями 131 электроотрицательности заместителей 129 расчет 128 типичные значения 128, 129 4J(H,C) 194 4J(H,H) 132 расчет 132, 133 типичные значения 133, 134 гетероядерные 186, 187 дальние, определение 633 малые, определение с помощью COSY 591 686
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса нахождение 2D методами 627 номенклатура 99, 100 определение по спектрам COSY 578 Л Лантаноидные сдвигающие реагенты 491 Ларморова прецессия 292 ЛИС 493,494 Лок 370 настройка 371 предотвращение насыщения 371 Лоренца кривая 316 Лоренца-Гаусса преобразование 397 Лоренцова линия 397 ЛСР 492 определение строения молекул 497 применимость 494 хиральные 498 М Магический угол 40 Магнит функция 24 шиммирование 369, 374 Магнитная ось 493 Магнитное поле локальное 28 стабилизация 370 Магнитные ядра свойства 35, 36, 294 Магнитный диполь 39 момент ядра 290 Магнитуда 554 Мак-Коннела формула 51 Мак-Коннела-Робертсона уравнение 493 Макроскопическая намагниченность угол поворота 311 Мезомерный эффект влияние на химический сдвиг 38 Метанол как температурный стандарт 387 Метод линейной экстраполяции 535 Микроячейки для измерения спектров ЯМР 72 Миллионные доли 31 Момент ядра квадрупольный 434 Мультиплетность сигналов, связанных с квадрупольным ядром 141 Н Найквиста критерий 345 Наклоны в J-разрешенной спектроскопии 640 Нейтрон 289 Несвязанное взаимодействие влияние на химические сдвиги 38, 39 Нуклоны 289 Нулевое возбуждение 503 О Область максимального сужения линий 429 сильного поля 28 Облучение внерезонансное 149 Образец для ЯМР подготовка 64 температурные измерения 387 фильтрование 73 Отраженные сигналы 347 687
Предметный указатель П Паскаля треугольник 50 Перенос когерентности 543 поляризации 455 Период детектирования 538 смешивания 538 эволюции 538 Перлина эффект 189, 190, 205 Пики диагональные 545 недиагональные 216, 545 Подавление сигнала растворителя 500 Подвижные протоны обнаружение 139 Подготовительный период 538 Полугауссиан 417,419 Поперечная релаксация для редактирования спектров 480 Постоянная экранирования 28 составляющие 28 Преднасыщение для подавления сигнала растворителя 501 Прецессия спинов частота 293 Программа ADV ASP 209 MESTREC 206 NUTS32 211 Протон 289 Прыжок с поворотом 504 Псевдоконтактное взаимодействие 493 Р Разностный спектр 149 Растворители для ЯМР влияние на спектр 68 выбор 64 для образцов с протонным обменом 68 мультиплетность остаточных сигналов 66 регенерация 73 свойства 65, 66 Редактирование 13С спектров методом APT 514 DEPT 528 INEPT 516 SEFT 508 Релаксационный промежуток в эксперименте ЯЭО 152 Релаксация истинное время 474 связь с молекулярным движением 427 Релаксация поперечная 324 влияние на ширину пиков 327 время релаксации 326 механизм флип-флоп 327 определение времени 474 флип-флоп процесс 432 Релаксация продольная 322 время 323,427 определение 471 механизм 427 АХС 433 диполь-дипольный 432 Релаксация ядерная 62 С Сверхтонкое взаимодействие 22 Селективная рефокусировка 482 Селективное возбуждение с помощью DANTE 422 скульптурное 424 688
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Селекция сигналов 359 методом ИГП 365 Сигнал дисперсии 307,315 поглощения 307,315 растворителя подавление 500 спада свободной индукции 317 Сигнал ЯМР детектирование 344 дефекты формы 376 дрейф 370, 371 отраженный 354 повышение разрешения 397 разрешение 389 регистрация 343 тест формы линии 389 фазовая коррекция 400 функции обработки 393 Симметризация артефакты 564 в /-разрешенной спектроскопии 640 Синусоидальный колокол 398 Система координат вращающаяся 300, 301 лабораторная 300, 301 Скан 332 Скульптурное возбуждение 424 Соломона уравнение 439 Спад свободной индукции 62, 317 Спектр 13С INADEQUATE, бутанола 646, 647 аденозина, селективный /-разрешенный 637 анализ 162 андрографолида, DEPT 175, 176 гетероциклического бромида 162, 164 зависимость от строения молекулы 165 камфоры с APT 173,174 8-карбоксиметилхинолина 186 краткое описание 164 ментола, /-разрешенный 631, 632 определение КССВ 186, 187 отнесение сигналов 177 пинена 162, 163 разновидности 162,163 редактирование 172, 507 методом APT 173 DEPT 175 с декаплингом 160 селективный, /-разрешенный 636 сигналы алкинов 168 ароматики 168 в гетероциклах 169 групп СН 167 карбонильных групп 167 метиленовых групп 166, 167 метильных групп 166 олефиновых протонов 167 таблицы химических сдвигов 166-171 2-фенилэтанола-1 33,34 Спектр 15N аденозин-5-сульфата 522, 523 Спектр |7О этилацетата 535, 536 Спектр 19F 195 в конформационном анализе 198 стандарты 196 трансаннулярные эффекты 199 химические сдвиги 197 Спектр ‘Н 20 /-разрешенный, пример 641 689
Предметный указатель амида пропионовой кислоты 22, 23 анализ сложных сигналов 107 аргининвазопрессина 481 в присутствии ЛСР 491 влияние добавок D2O 139 растворителя 135 температуры 134, 135,138 выявление примесей 104 диметилацетамида, температурный 139 динамическое уширение 13 8 диэтилового эфира 46 замещенной глюкозы 69 2-метил-З-карбамидобутил- 5-фенилфурана 95, 96 представление результатов 101 производного бензофурана 136 кумарина 103 тетразола 107, 108 тиазола 140 хиноксалина 97, 98 разностный для выявления ЯЭО 149, 150 2-фенилэтилового спирта 29, 30 этанола 59 Спектр 31Р 201 стандарты 201 химические сдвиги 201 Спектр HETCOR пример 677 Спектр ROESY пример 624 Спектр двумерный COSY 216 НМВС 229,671 HMQC 226,653 NOESY 80,220,453 гетероядерной корреляции 225 690 недиагональные сигналы 216 Спектр ЯМР 44, 316 СНС1з двумерный 215 COSY3IP-3IP 546,547 EXSY, пример 626 HMQC, пример 656 HSQC, пептида 664, 665 NOESY-ID бициклического лактама 484 TOCSY углевода 594, 595 TOCSY-ID, пример 490 временное и частотное представления 62 гептилового спирта с ЛСР 491 двумерный 213,214 генерация 537 измерение 368 интегральная кривая 60 интегрирование сигналов 59 интенсивность сигналов 58 квадрупольных ядер 533 на ядрах 13С 32 параметры 36 сигналов 29 первый 20 повышение чувствительности 395 причины возникновения 27 программы обработки для ПК 205 разностный 149 сахарозы с подавлением сигнала растворителя 507 энкефалина с двухквантовой фильтрацией 590, 591 Спектральная плотность 428 Спектрометр ЯМР калибровка 383 общая схема 22 Спектроскопия /-разрешенная 628 импульсная последовательность 642, 643
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Спектроскопия |3С 33,160 Спектроскопия ЯМР гетероядерная корреляционная 649 Спектры COSY в абсолютных значениях 553 Спектры двумерные в виде контурных линий 215, 216 Спектры ЯМР на ядрах 'Н интерпретация 81 Спин ядра 24 Спиновая развязка 142 Спиновая система АА'ВВ', вид спектра 89 АА'ХХ', вид спектра 91 АА'ММ'Х, вид спектра 89 AA'MRX, вид спектра 88 АВ 54,55 вид спектра 82 энергетическая диаграмма 44,45 АВХ, вид спектра 84 АМРХ, вид спектра 90 АМХ, вид спектра 91, 92, 93, 94 АХ, вид спектра 93 AXX'YY'ZZ'WW, вид спектра 86 А2В2 54,56 А2М2Х2, вид спектра 85 А2Х2, вид спектра 83 A3M2R2X2, вид спектра 86 А3М2Х2, вид спектра 84 А3Х, вид спектра 83 А3Х2, вид спектра 82 А6Х, вид спектра 85 Спиновое квантовое число 24 эхо 335 /-модулированное 508 для определения Т2 478 эффект рефокусировки 336 Спиновые состояния 45,291 Спиновый замок 411, 597 MLEV-17 598 TOCSY 489,602 ROESY 485,486 Спиновый щелчок 631 Спин-спиновое взаимодействие 22 в NH4C1 141 в 1-бром-2-хлорэтане 58 в 1-нитропропане 58 в 1,4-дизамещенном бензоле 58 интенсивности компонентов мультиплета 49 количество компонентов в спиновых мультиплетах 48 константа 46 знак 53 номенклатура 99, 100 спиновых систем 57 механизм 47 возникновения 43 непрямого ССВ 52 непрямое 51 отклонения от правил 1 порядка 54 первого порядка 46 построение деревьев мультиплетов 99, 100 правила первого порядка 50 прямое 51 развязка 142 с квадрупольным ядром 140 сильно связанные спины 57 спиновые системы 57 треугольник Паскаля 50 эффект крыши 57 Стандарт ЯМР на ядрах *Н 31 691
Предметный указатель Стандарты в ЯМР 69 Стата метод 556, 557 Т______________________ Тест чувствительности 391, 392 Тестовые образцы 393 Тетраметил сил ан 31 Точечный диполь 290 магнитное поле 39 Трубки для измерения спектров 71 подготовка 72 У Угол импульса 311 Условия резонанса 307 Утечка релаксации 445 Ф Фаза приемника 316 Фазовая коррекция 314 Фазовые ошибки 400 нулевого порядка 400, 401 первого порядка 400, 401 Фазовые циклы 355 Фазовый цикл для DQF-COSY 586,587 для устранения аксиальных пиков 562 Флип-флоп процесс 430 Функции аподизации 395 сглаживания 393 Функциональные группы магнитно-анизотропные 40 Фурье-преобразование 62, 63 в спектроскопии COSY 568 X Химические сдвиги альдегидные протоны 78 ароматические протоны 80 корреляционные диаграммы 75 метиленовые группы 78 метильные группы 77 обменивающиеся протоны 76 олефиновые протоны 79 СН протоны в алифатике 79 таблицы значений 77 Химический обмен изучение методом EXSY 625 Химический сдвиг 31,37 влияние заместителей 38 кольцевых токов 42 расчет 42 магнитно-анизотропных групп 38 несвязанного взаимодействия 38, 39 функциональных групп 39 химического окружения 37 Хрома ацетилацетонат для ускорения релаксации 433 ц______________________ Цифровое разрешение 347 влияние на вид спектра 349, 350 Ч Частотная пометка 540 Ш Шиммирование 372 Шиммы 374 аксиальные 374 радиальные 374 разновидности 373 692
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Широкополосное подавление в гетероядерном ЯЭО 147 Широкополосный декаплинг 408 Э Эволюция спина 322 Экранирование диамагнитное 28 Экспоненциальная мультипликация 395 Энергетическая диаграмма двухспиновой системы 45 Энергетические уровни 23 а и Р 43 расщепление на соседних ядрах 43 ядра 24 Энергия спиновых состояний 294 Энкефалин, спектр CPMG 479 ЭПР 24 Этиленгликоль как температурный стандарт 387 Эффект крыши 57 Эхо переноса когерентности 553 Я Ядерная когерентность 310 Ядерные спины способы возбуждения 303 стационарное возбуждение 303 Ядра квадрупольные, влияние на ССВ 140 магнитно-эквивалентные 37 немагнитные 25 ЯМР история возникновения 19 метод 19 основное уравнение 25 физика явления 298 чувствительность 391 шкала времени 460 эксперимент 21,22 сбор данных 369 Ядерный эффект Оверхаузера 147, 435 артефакты ZQC 616 в ВСК 485 в двухспиновой системе 436, 444 в конформационном анализе 159 в многоспиновых системах 444 в разностных спектрах 149 в 6-членных циклах 156, 157 влияние посторонних спинов 447 вычисление 147 гетероядерный 147 для различных ядер 148 гомоядерный 148 диффузия спинов 449 для выяснения стереохимии 156 для межспиновых расстояний 446 для отнесения сигналов 157 для экзо- и эндо-аддуктов 158 знак 438, 439 измерение межспиновых расстояний 454 изучение Е-, Z-изомеров 154 импульсная последовательность 148 кинетика 452 количественное определение 153 непрямые эффекты 449 определение положения заместителей 155 693
Предметный указатель скелета молекулы 155 связь с молекулярным движением 441 с расстоянием между спинами 443 скорость нарастания 453 трехспиновый эффект 449 утечка релаксации 445 эстафетный 449 694
ЮЛИАН МИХАЙЛОВИЧ ВОЛОВЕНКО ВИКТОР ГЕОРГИЕВИЧ КАРЦЕВ ИГОРЬ ВЛАДИМИРОВИЧ КОМАРОВ АЛЕКСАНДР ВСЕВОЛОДОВИЧ ТУРОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ХИЛЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА ДЛЯ ХИМИКОВ Учебник для химических специальностей вузов Заказ 2809к. Подписано в печать 16.05.2011 г. Формат 70X100/16. Гарнитура Таймс. Печать офсетная. Бумага офсет №1. Усл. печ. л. 44. Тираж 250 экз. Издано по заказу Международного благотворительного фонда "Научное Партнерство" 107345, Москва, Открытое шоссе, д. 18 E-mail: press@solidbiz.ru Отпечатано ООО "СОЛИД пресс" ISBN 978-5-903078-34-9
Компания InterBioScreen и Международный Фонд ’’Научное Партнерство” издает с 2003 г. периодическую серию монографий "Избранные методы синтеза и модификации гетероциклов” под редакцией В.Г. Карцева Международный редакционный комитет: проф. Э.Дж. Кори (США, Нобелевский лауреат по химии 1990 г.) проф. Ж.-М. Лен (Франция, Нобелевский лауреат по химии 1987 г.) проф. Р. Нойори (Япония, Нобелевский лауреат по химии 2001 г.) проф. Я. Бергман (Швеция) проф. А.Р. Катрицкий (США) проф. X. ван дер Плас (Нидерланды) проф. Р. Хьюзген (Германия) Серия монографий посвящена химии, синтезу, биологической активнос- ти различных классов гетероциклических соединений и включает новей- шие данные и последние достижения, полученные в университетах и науч- ных институтах России, Украины, Беларуси, других республик бывше- го СНГ и стран Балтии, а также зарубежными учеными. В 2003-2011 гг. вышли следующие тома: 1. Том 1. Избранные методы синтеза и модификации гетероциклов, 2003 г., 624 с. Том содержит тематические обзоры, посвященные основным аспектам синтеза, изучению свойств и биологической активности азотсодержащих гетероциклов, и специальный раздел "Избранные методы синтеза", в ко- торый вошли 80 наиболее интересных методов синтеза и модификации азотистых гетероциклов. 2. Том 2. Избранные методы синтеза и модификации гетероциклов, 2003 г., 568 с. Том посвящен химии кислород- и серусодержащих гетероциклов и охва- тывает большое многообразие гетероциклов от оксиранов и тииранов до сложных конденсированных систем синтетического и природного про- исхождения.
3. Том 3. Избранные методы синтеза и модификации гетероциклов. Химия синтетических индольных систем, 2004 г., 600 с. Материалы тома охватывают большое многообразие индолов от простых представителей этого класса до сложных конденсированных систем син- тетического происхождения и включают более 60 методов синтеза ин- дольных систем, разработанных учеными России и зарубежными иссле- дователями. 4. Том 4. Избранные методы синтеза и модификации гетероциклов. Химия и биологическая активность природных индольных систем, часть 1, 2005 г., 352 с. Том содержит материалы по химии индольных алкалоидов, самой боль- шой по численности группы алкалоидов, насчитывающей более 1200 сое- динений из более чем 40 семейств растений, множества микроорганиз- мов и морских организмов. 5. Том 5. Избранные методы синтеза и модификации гетероциклов. Карбо- лины: химия и биологическая активность, 2006 г., 616 с. Материалы тома посвящены химии и биологической активности карбо- линов - соединений, представляющих собой одну из самых обширных групп алкалоидов. В обзорах этого тома детально обсуждаются различ- ные аспекты химии и биологической активности всех четырех карболи- новых систем (как природных, так и синтетических). Заключительный раздел тома содержит подробное описание избранных методов синтеза и модификации карболинов, разработанных учеными различных стран. 6. Том 6. Избранные методы синтеза и модификации гетероциклов. Хино- лины: химия и биологическая активность, 2007 г., 744 с. В томе приведены данные по химии и биологической активности синте- тических и природных хинолинов, в том числе ароматических, дигидро-, тетрагидро- и пергидрохинолиновых систем. В заключительном разделе опубликованы более 100 избранных методов синтеза и модификации хи- нолинов, разработанных российскими и зарубежными учеными. 7. Том 7. Избранные методы синтеза и модификации гетероциклов. Изохи- нолины: химия и биологическая активность, 2008 г., 608 с. Материалы тома посвящены методам синтеза, превращениям и биологи- ческой активности синтетических изохинолинов, в том числе аромати-
ческих и гидрированных изохинолиновых систем, а также некоторых природных аналогов. Том содержит раздел "Избранные методы синтеза", в который вошли более 100 интересных методов синтеза и модификации изохинолинов, разработанных учеными различных стран. 8. Том 8. Избранные методы синтеза и модификации гетероциклов. При- родные изохинолины: химия и биологическая активность, 2011 г., 704 с. Том посвящен природным изохинолинам, т.е. алкалоидам, имеющим скелет ароматических и гидрированных изохинолиновых систем. Этот класс природных соединений является, вероятно, наиболее распростра- ненным среди известных алкалоидов. В книге показан биогенез таких систем, примеры их полного синтеза, а также различные аспекты биоло- гической активности. Отдельными книгами изданы 1. Дрюк В.Г., Карцев В.Г., Войцеховская М.А., Оксираны - синтез и био- логическая активность, 1999 г., 528 с. В книге проведен сравнительный анализ данных о механизме, стереохи- мических и стереоэлектронных закономерностях эпоксидирования оле- финов пероксидными реагентами. Предложена новая теоретическая кон- цепция поликислородного нерадикального механизма окисления алкенов и других электронообогащенных субстратов триплетным кислородом. Отдельная глава посвящена биологической активности оксиранов синте- тического и природного происхождения. 2. Исак А.Д., Карцев В.Г., Химия нафтостирилов, 2005 г., 752 с. Книга посвящена химии нафтостирилов (нафтолактамов) и их производ- ных, являющихся промежуточными продуктами в синтезе различных классов органических красителей и биологически активных соединений. В книге подробно рассмотрены свойства, строение и методы получения многочисленных производных нафтостирила и их реакционная способ- ность. Широко охвачена научная и патентная литература по этим вопро- сам. В отдельной главе "Биологическая активность синтетических и при- родных нафтостирилов и их аналогов" впервые представлен материал, посвященный биологически активным соединениям на основе нафтости- рила и его природных аналогов. В приложении приведена база данных по известным синтезам нафтостирила и его производных.
3. Семенов А.А., Карцев В.Г., Основы химии природных соединений, 2009 г., том 1 (624 с.), том 2 (424 с.). В книге впервые в отечественной литературе дается систематическое описание структурной химии вторичных метаболитов - низкомолекуляр- ных веществ, вырабатываемых различными представителями фауны и флоры для нужд своей жизнедеятельности. Первый том знакомит с хи- мическим строением, своеобразием физиологического действия и функ- циями природных алифатических и алициклических веществ, изопре- ноидов и соединений ароматического характера. Второй том посвящен алкалоидам, азотсодержащим антибиотикам, редким типам метаболитов и содержит краткий обзор подходов к полному синтезу природных соеди- нений. Много внимания уделено путям и принципам биосинтеза вто- ричных метаболитов, что не только выявляет взаимосвязи между часто внешне непохожими химическими структурами, но и иллюстрирует единство происхождения и принципов функционирования живых су- ществ. КНИГИ МОЖНО ЗАКАЗАТЬ в Международном Фонде "Научное Партнерство": 142432, г. Черноголовка, Московская область, Институтский просп., д. 7а тел.: (49652) 40-091, факс: (49652) 40-092 Директор Фонда Карцева Наталья Викторовна e-mail: spfond@spfond.ru Секретарь редколлегии Семенова Любовь Федоровна e-mail: conf@ibscreen.chg.ru
Компания InterBioScreen и Международный Фонд "Научное партнерство" при участии и поддержке Российской Академии наук и Российской Академии Естественных наук проводят цикл Международных конференций "Химия и биологическая активность синтетических и природных соединений" По материалам пленарных, устных и стендовых докладов каждой Международной конференции издаются двухтомные Сборники тру- дов конференции параллельно на русском и английском языках. Международный редакционный комитет: проф. Э.Дж. Кори (США, Нобелевский лауреат по химии 1990 г.) проф. Ж.-М. Лен (Франция, Нобелевский лауреат по химии 1987 г.) проф. Р. Нойори (Япония, Нобелевский лауреат по химии 2001 г.) проф. Я. Бергман (Швеция) проф. X. ван дер Плас (Нидерланды) проф. А.Р. Катрицкий (США) проф. Р. Хыозген (Германия) 1. 1-ая Международная конференция "Химия и биологическая активность азотистых гетероциклов и алкалоидов" (СВС2001). Труды 1-ой Меж- дународной конференции "Азотистые гетероциклы и алкалоиды", под ред. В.Г. Карцева, Г.А. Толстикова, Москва: Иридиум-пресс, 2001, том 1 (608 с.), том 2 (480 с.). Это двухтомное издание посвящено наиболее объемной и интересной области химии - синтетическим азотистым гетероциклам и их природ- ным представителям - алкалоидам. В первый том вошли пленарные и устные доклады, подготовленные ведущими специалистами в данной об- ласти, во второй том - стендовые доклады и 100 наиболее интересных методов синтеза и модификации азотсодержащих гетероциклов. 2. 2-ая Международная конференция "Химия и биологическая актив- ность кислород- и серусодержащих гетероциклов" (СВС2003). Труды 2-ой Международной конференции "Кислород- и серусодержащие гетероциклы", под ред. В.Г. Карцева, Москва: IBS Press, 2003, том 1 (504 с.), том 2 (360 с.). В двухтомный Сборник трудов конференции вошли оригинальные рабо- ты, в которых особое внимание было уделено биологической активности
и различным аспектам использования кислород- и серусодержащих гете- роциклов. В последний раздел издания включены описания избранных методов синтеза и модификации О- и S-гетероциклов, разработанных учеными СНГ, стран Балтии и зарубежными исследователями за послед- нее время. 3. 3-я Международная конференция ’’Химия и биологическая активность азотсодержащих гетероциклов” (СВС2006), посвященная 90-летию со дня рождения проф. А.Н. Коста. Труды 3-ей Международной конферен- ции ’’Азотсодержащие гетероциклы”, под ред. В.Г Карцева, Москва: ICSPF, 2006, том 1 (512 с.), том 2 (456 с.). Первый том Сборника составлен из обзоров и статей по материалам пле- нарных и устных докладов, посвященных последним достижениям в хи- мии азотистых гетероциклов отечественных и зарубежных ученых. Во второй том вошли 223 стендовых доклада и описания 94 новых, наибо- лее интересных авторских/именных методов синтеза и модификации сложных гетероциклических соединений, разработанных за последнее время учеными России, Украины, Беларуси и других стран. 4. 4-я Международная конференция ’’Современные аспекты химии гете- роциклов” (СВС2010), посвященная 95-летию со дня рождения проф. А.Н. Коста. Труды 4-ой Международной конференции ’’Современные аспекты химии гетероциклов”, под ред. В.Г Карцева, Москва: ICSPF, 2010, 504 с. Настоящее издание содержит материалы пленарных, устных и стендо- вых докладов, представляющих оригинальные работы отечественных и зарубежных ученых по методам синтеза и химическим превращениям, а также биологической активности гетероциклических соединений, выпол- ненные за последние годы и охватывающие большое многообразие гете- роциклов от простых до сложных конденсированных систем, синтети- ческих и природных. КНИГИ МОЖНО ЗАКАЗАТЬ в Международном Фонде ’’Научное Партнерство”: 142432, г. Черноголовка, Московская область, Институтский просп., д. 7а тел.: (49652) 40-091, факс: (49652) 40-092 Директор Фонда Карцева Наталья Викторовна e-mail: spfond@spfond.ru Секретарь редколлегии Семенова Любовь Федоровна e-mail: conf@ibscreen.chg.ru
Для записей
Для записей
Для записей