Тема занятия: «Матричные биосинтезы»
Репликация. Репарация. Транскрипция
1.

Репликация – синтез ДНК: матрица, затравка, субстраты,

кофактор,ферменты и белки репликации
2. Основные повреждения в ДНК и их репарация
3.

Транскрипция – синтез РНК: субстраты, кофактор. РНК-

полимераза.Обратная транскрипция
4. Процессинг РНК: посттранскрипционные превращения различных типов
РНК
5. Генетический код и его свойства. Значение тРНК в декодировании
генетической информации

Тема занятия: «Матричные биосинтезы»
Трансляция. Теория оперона
1. Биосинтез белка (трансляция): основные этапы
функционированиябелоксинтезирующей системы (инициация, элонгация,
терминация)
2. Посттрансляционные изменения полипептидных цепей и
образованиефункционально-активных белков
3. Регуляция экспрессии генов у прокариот и эукариот. Теория оперона
4. Ингибиторы матричных биосинтезов, применение в медицине
5.

Механизмы

генетической

изменчивости.

Полиморфизм

белков.Наследственные болезни
Тема занятия: «СРО в норме и при патологии. Апоптоз»
1. Свободнорадикальное окисление: характеристика, значение в норме и патологии,
пути образования активных форм кислорода.
2. Перекисное окисление липидов (ПОЛ): субстраты, продукты ПОЛ, стадии,
механизмы повреждающего действия (перекисная гипотеза гибели клеток).

3. Ферментативная и неферментативная антиоксидантная система (АОС)
организма.
4. «Программированная клеточная гибель»: биологическое значение, классификация
и сравнительная характеристика различных видов гибели клеток.
5. Апоптоз: трансмембранные и внутриклеточные стимулы, стадии, роль каспаз,
Ca2+ и Mg2+ -зависимых эндонуклеаз, белка Р53 в развитии апоптоза клетки.
6. Молекулярные

механизмы

клеточной

гибели:

внешний,

внутренний

и

перфорингранзимный пути реализации клеточной гибели.
7. Нарушения апоптоза и их роль в механизмах развития опухолевого роста,
аутоиммунных заболеваний и дегенеративных процессов.

Тема занятия: «Биохимические основы канцерогенеза»

1. Опухоли:

определение,

классификация,

признаки

доброкачественных

и

злокачественных опухолей. Теории онкогенеза.
2. Основные положения современной полиэтиологической теории канцерогенеза.
3. Канцерогены: определение, свойства, классификация, гены-мишени. Онкогены и
онкобелки: характеристика и роль в канцерогенезе.
4. Последствия повреждения ДНК клетки канцерогенами.
5. Химический канцерогенез.
6. Радиационный канцерогенез.
7. Вирусный канцерогенез.
8. Особые свойства опухолевых клеток и механизм их приобретения.
9. Биохимические изменения метаболизма в опухолевых клетках.
10.Принципы

диагностики,

лечения

и

профилактики

злокачественных

новообразований.
"ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК-ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНЕ: МЕТОДЫ ПЦР И
СЕКВЕНИРОВАНИЯ. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ"

План:
1.

Полимеразная цепная реакция (классическая ПЦР, ПЦР в реальном времени,

мостиковая ПЦР, эмульсионная ПЦР, цифровая капельная ПЦР)
2.

Оборудование и материалы для ПЦР (Типы ПЦР-амплификаторов, Формат

пробирок для проведения ПЦР, "Горячий старт")
3.

Методы секвенирования нуклеиновых кислот (Максама-Гилберта, Сэнгера)

4.

Методы высокопроизводительного секвенирования нового поколения (NGS)

(Метод гибридизации на твердой фазе, MALDI-TOF-секвенирование, секвенирование
лигированием, пиросеквенирование, метод обратимых терминирующих нуклеотидов,
полупроводниковое секвенирование, нанопоровое секвенирование)
5.

Секвенирование генома человека (метод "дробовика", метод "клон-заклоном")

6.

Генная терапия

7.

Типы генотерапевтических вмешательств и выбор клеток-мишеней

8.

Методы генетической трансфекции в генной терапии

9.

Коструирование векторных систем для трансфекции клеток человека (Физико-

химические методы переноса чужеродной ДНК в клетки эукариот, липосомный метод
трансфекции, рекомбинантные вирусы)

Открытия в молекулярной биологии
1944г.

Доказательство генетической роли ДНК.

Освальд Эйвери, Колин Мак-

Леод, Маклин Мак-Карти
1953г.

Установление структуры ДНК.

Джеймс Уотсон, Френсис Крик

1961г. Открытие генетической регуляции синтеза ферментов. Андре Львов,
Франсуа Жакоб, Жак Моно
1962г. Расшифровка

генетического кода.

Маршалл Нирнберг, Генрих Маттеи,

Северо Очоа
1967г. Синтез in vitro биологически активной ДНК. Артур Корнберг
(неформальный лидер молекулярной биологии)
1970г. Химический синтез гена. Гобинд Корана
1970г. Открытие фермента обратной транскриптазы и явления обратной
транскрипции. Говард Темин, Дэвид Балтимор, Ренато Дульбеко
1974г. Открытие рестриктаз. Гамильтон Смит, Даниэль Натанс, Вернер Арбер
1978г.

Открытие сплайсинга. Филипп

Шарп

1982г.

Открытие автосплайсинга. Томас Чек

Основной фигурой матричных биосинтезов являются нуклеиновые кислоты.
Они представляют собой полимерные молекулы, в состав которых входят азотистые
основания пяти типов, пентозы двух типов и остатки фосфорной кислоты. Азотистые
основания в нуклеиновых кислотах могут быть пуриновыми (аденин, гуанин) и
пиримидиновыми (цитозин, урацил, тимин). В зависимости от строения углевода
выделяют

рибонуклеиновые

кислоты

–

содержат

рибозу

дезоксирибонуклеиновые кислоты – содержат дезоксирибозу (ДНК).

(РНК),

и

Центральная догма молекулярной биологии
В подавляющем большинстве случаев передача наследственной информации от
материнской клетки к дочерней осуществляется при помощи ДНК. Для
использования генетической информации самой клеткой необходимы РНК,
образуемые на матрице ДНК. Далее РНК непосредственно участвуют на всех этапах
синтеза белковых молекул, обеспечивающих структуру и деятельность клетки. На
вышесказанном основана центральная догма молекулярной биологии, согласно
которой перенос генетической информации осуществляется только от нуклеиновой
кислоты (ДНК и РНК). Получателем информации может быть другая нуклеиновая
кислота (ДНК или РНК) и белок.
перенос генетической информации в направлении ДНК → РНК → белок
Правила Чаргаффа
в ДНК всегда А/Т=1; Г/Ц=1; (Г+Ц) / (А+Т) = К,
коэффициент специфичности, постоянен для каждого вида
ДНК – наиболее важная часть хромосом:
две двухцепочечные молекулы ДНК образуют
одну хромосому. Наиболее хорошо хромосомы
видны перед митозом и во время его. В
покоящихся клетках хромосомный материал
выглядит нечетко и распределен по всему ядру.
В таком

состоянии

он получил название

"хроматин". В составе хроматина выделяют 60%
белка (гистоны и кислые белки), 35% ДНК и
около 5% РНК.

Хроматин уложен в виде сферических частиц – нуклеосом, соединенных друг с
другом нитью ДНК. Нуклеосома представляет собой комплекс участка молекулы
ДНК и восьми молекул гистонов. В составе нуклеосомы находятся по 2 молекулы
гистонов Н2α, Н2β, Н3, Н4. Нить ДНК последовательно контактируя с гистонами
Н2α, Н2β, Н4, Н3, Н3, Н4, Н2β, Н2α, наматывается на гистоновое ядро, которое
"маскирует" 146 пар оснований ДНК. Гистон Н1 связывается с нуклеосомой на
участке входа и выхода ДНК, "склеивая" 2 оборота и "маскируя" еще 20 пар
оснований. Всего замаскировано 166 пар оснований. Кроме нуклеосом, в ядре
присутствуют еще 2 структуры: фибриллы диаметром 10 нм, состоящие из цепочки
нуклеосом, и волокна, диаметром 30 нм, образующиеся при закручивании фибрилл в
спираль. На виток спирали приходится 6-7 нуклеосом. Участок ДНК между
нуклеосомами называется спейсерным (англ: space – пространство), его длина
варьирует в зависимости от вида организма и типа клеток. У человека она составляет
около 50 пар нуклеотидов. Благодаря наличию
нуклеосом

достигается

уменьшение

размеров

хромосомы в 7 раз, далее происходит укладка в
суперспираль и „суперсуперспираль".
Таким образом, благодаря гистонам размеры ДНК
уменьшаются в тысячи раз: если длина ДНК достигает 69 см (10-1), то размеры хромосом – всего несколько
микрометров (10-6).
Хроматин может быть активным (эухроматин) и неактивным (гетерохроматин).
Активный хроматин содержит активные
гены, т.е. те гены, с которых считывается
информация.

В

активном

нуклеосомная

структура

хроматине

изменена

или

вообще отсутствует, благодаря чему ДНК
становится доступной для соответствующих
ферментов.

Принципы строения ДНК
1. Нерегулярность. Существует регулярный
сахаро-фосфатный
присоединены

остов,

азотистые

к

которому

основания.

Их

чередование нерегулярно.
2. Антипараллельность. ДНК состоит из
двух

полинуклеотидных

цепей,

ориентированных антипараллельно. 3`-конец
одной расположен напротив 5`-конца другой.
3. Комплементарность
(дополнительность). Каждому азотистому основанию одной цепи соответствует
строго определенное азотистое основание другой цепи. Соответствие задается
химией. Пурин и пиримидин в паре образуют водородные связи. В паре A-Т 2
водородные связи, в паре Г-Ц - 3.
4.

Наличие

регулярной

вторичной

структуры.

Две

комплементарные,

антипараллельно расположенные полинуклеотидные цепи образуют правую спираль
с общей осью.
Функции ДНК
1. ДНК является носителем генетической информации. Функция обеспечивается
фактом существования генетического кода.
2. Воспроизведение и передача генетической информации в поколениях клеток и
организмов. Функция обеспечивается процессом репликации.
3. Реализация генетической информации в виде белков, а также любых других
соединений, образующихся с помощью белков-ферментов. Функция обеспечивается
процессами транскрипции и трансляции.
Строение РНК
Рибонуклеиновая кислота (РНК) представляет собой последовательность
рибонуклеозидмонофосфатов, связанных друг с другом 5’-3’-фосфодиэфирными

связями. РНК отличается от ДНК однонитевой структурой, наличием урацила вместо
тимина и рибозы вместо дезоксирибозы. В клетке присутствует четыре типа РНК.
Рибосомальные РНК (рРНК) у прокариот и эукариот различны и отличаются
величиной седиментации (S, величиной скорости оседания молекулы). У прокариот
три разновидности рРНК: 5S, 16S и 23S. У эукариот четыре разновидности: 5S, 5,8S,
18S и 28S. Рибосомальные РНК участвуют в построении рибосом, внутриклеточных
белоксинтезирующих органелл. Рибосомы состоят из двух неравных субчастиц,
малой и большой.
У прокариот малую (30S) субчастицу образуют белки, 23SрРНК и 5S-рРНК; большую (50S) – белки и 16S-рРНК. У
эукариот малую (40S) субчастицу образуют белки и 18S-рРНК,
большую (60S) – белки и 5S-, 5,8S-, 28S-рРНК.
Матричные РНК (мРНК) представляют собой линейную
последовательность

нуклеотидов.

К

5’-концу

молекулы

присоединен метилгунозиндифосфат, на 3’-конце имеется
полиадениловая

последовательность.

Их

функция

–

информационная, т.е. перенос информации о структуре белков
от ДНК к месту их синтеза.
Транспортные РНК (тРНК) бактерий и эукариот
включают 73-93 нуклеотида. Они
переносят аминокислоты из цитозоля к
рибосомам. Вторичная структура тРНК
напоминает клеверный лист, а третичная
– латинскую букву L. В «клеверном
листе» выделяют четыре участка (или
ветви, петли), каждый из которых имеет
собственную функцию: антикодоновый,
псевдоуридиловый,

дигидроуридиловый, акцепторный. На 5’-конце тРНК находится гуаниловый
нуклеотид, на 3’-конце – триплет Ц-Ц-А.
Малые РНК – используются для созревания мРНК и некоторых других
клеточных процессов.
Виды РНК
Виды РНК

Размер в нуклеотидах

gРНК - геномные РНК

10000-100000

mРНК - матричные РНК

100-100000

tPHK - транспортные РНК

70-90

rРНК - рибосомные РНК

несколько классов от 100 до 500000

sРНК - малые РНК

100-300

Отличия между ДНК и РНК
Параметры

ДНК

РНК

Дезоксирибоза

Рибоза

Азотистые основания

А, Т, Г, Ц

А, У, Г, Ц

Количество цепей в

99,99% двойная спираль

99,99% одноцепочечная

0,01% одноцепочечная

0,01% двухцепочечная

Сахар

молекуле
Форма
молекулы

Все одноцепочечные- кольцевые.
Большинство двухцепочечных -

Линейные молекулы

линейные, часть- кольцевые.

1. Репликация – синтез ДНК: матрица, затравка, субстраты, кофактор,
ферменты и белки репликации
Репликация ДНК - процесс, осуществляемый комплексом ферментов и
белков, образующих идентичные копии ДНК для передачи генетической информации
в поколениях клеток и организмов.

Синтез ДНК в клетке происходит не беспорядочно, а в строго определенный
период жизни клетки. Всего выделяют 4 фазы: митоз (М), синтетическую (S),
пресинтетическую (G1, от англ. gap - интервал), постсинтетическую (G2). Важное
участие в регуляции смены фаз клеточного цикла занимают циклины – белки массой
35-90 кДа, уровень которых меняется в ходе клеточного цикла. По функции циклины
– это активаторные субъединицы ферментов циклин-зависимых киназ (ЦЗК).
Активные комплексы циклин-ЦЗК фосфорилируют внутриклеточные белки, изменяя
их активность. Этим обеспечивается продвижение по клеточному циклу.
Принципы репликации:
1. Комплементарность.
2. Антипараллельность.
3. Униполярность.
4. Полуконсервативность
5. Потребность в затравке.
6. Прерывистость.
Синтез каждой дочерней цепи
ДНК идет комплементарно и
антипараллельно матричной
цепи и всегда в направлении 5'
3'.
Полуконсервативность означает, что каждая дочерняя ДНК состоит из одной
матричной цепи и одной вновь синтезированной.
Доказательство полуконсервативного характера репликации
Для выяснения вопроса о характере расхождения цепей по дочерним молекулам
Мэтт Мезельсон и Фрэнк Сталь в 1958 г. разработали метод равновесного
центрифугирования в градиенте плотности CsCl для разделения ДНК по удельной
плотности. E. сoli выращивали на протяжении нескольких поколений на среде,
содержащей тяжелый изотоп азота (N15) для того, чтобы вся ДНК была "тяжелой".

Перед очередным раундом деления клетки в среде заменяли N15 на легкий изотоп N14
с тем, чтобы вновь синтезированные цепи были "легкими". После репликации ДНК
выделяли и центрифугировали в градиенте плотности CsCl. Равное распределение
"тяжелых" и "легких" цепей между всеми молекулами исключало возможность
консервативного способа, согласно которому одна дочерняя клетка получает
материнскую ДНК, а другая - вновь синтезированную, обе цепи которой являются

новыми.
Матрицей для синтеза новых цепей служит
одноцепочечная ДНК.
Затравкой является 3'-гидроксильный конец
двуцепочечной ДНК, причем он должен быть спарен
с матрицей. Доказательством того, что затравка - 3'гидроксильный конец, является эксперимент с
дидезоксинуклеозидтрифосфатом.

Если

такой

активированный нуклеотид сделать меченым по αфосфату, то он включается в растущую полимерную
цепь и всегда обнаруживается на ее 3'-конце. Это
говорит о том, что он сам включается, но дальнейший рост цепи невозможен, т.к. нет
3'-гидроксильного конца. Это доказывает и униполярность репликации в
направлении 5'

3'.

Прерывистость репликации происходит в виде фрагментов Оказаки.

Синтез (репликация, удвоение) ДНК происходит в S-фазу клеточного цикла.
Механизм репликации, как установили эксперименты Мэтью Мезельсон и Франклин
Сталь в 1958 г, полуконсервативный, т.е. на каждой нити материнской ДНК
синтезируется дочерняя копия. Весь процесс репликации идет в S-фазу клеточного
цикла, в то время, когда клетка готовится к делению. Как матричный биосинтез,
репликация требует наличия нескольких условий:
• матрица – в ее роли выступает материнская ДНК;
• растущая цепь – дочерняя ДНК;
• субстраты для синтеза – dАТФ, dГТФ, dЦТФ, ТТФ;
• источник энергии – dАТФ, dГТФ, dЦТФ, ТТФ;
• ферменты.
Синтез ДНК начинается в определенных участках, получивших название точка
ori (англ. origin - начало). На каждой ДНК млекопитающих точек ori насчитывается
около 100. Репликация распространяется от этих участков в обе стороны по нитям
ДНК с образованием "репликативных пузырей". В каждом таком "пузыре" имеются
две "репликативные вилки", в которых происходит расплетание, раскручивание и
непосредственный синтез ДНК. Репликативные вилки удаляются друг от друга. В
целом вся репликация ДНК у эукариот заканчивается за 9 часов.
В каждой репликативной вилке идет синтез ДНК в направлении от 5'-конца к
3'-концу, т.е. 5'-конец новой ДНК остается свободным, следующие нуклеотиды
присоединяются к 3'-гидроксильной группе предыдущего нуклеотида. Поскольку
нити ДНК антипараллельны, то непрерывно синтезируется только одна нить, а
именно та, на которой направление движения репликативной вилки совпадает с
направлением 3' → 5'.

Оrigin (ori) - район начала репликации ДНК, содержит
4 шпильки, которые опознаются РНК-полимеразой и
используются в качестве матрицы. По мере образования РНК
шпилька плавится. Образуется РНК-затравка длиной 24
нуклеотида,

3'-конец

которой

используется

ДНК

полимеразой III.

Реплисома – комплекс ферментов для синтеза ДНК
(ДНК-полимераза III, ДНК-полимераза I, лигаза).
Репликон - участок ДНК между двумя участками ori. Каждая эукариотическая
хромосома – полирепликон.

По мере расплетания и движения репликативной вилки на нити открываются
участки, где возможен синтез новой нити в направлении 5' → 3'.
Направление 5' → 3' другой материнской нити ДНК совпадает с направлением
движения репликативной вилки. Поэтому синтез дочерней нити (в направлении 5' →
3') возможен только после расплетания части ДНК и освобождения участка для
синтеза. Таким образом, синтез дочерней ДНК на одной из нитей материнской ДНК
идет фрагментарно. По имени японского исследователя синтезируемые на отстающей
цепи отрезки ДНК назвали фрагменты Оказаки.
В целом для синтеза ДНК необходим ряд ферментов.

Топоизомеразы - ферменты, изменяющие топологию ДНК. Топоизомеразы
меняют число зацеплений одной цепи за другую. Делятся на два класса: тип I
(релаксазы) - уменьшают число зацеплений, тип II
(гиразы) - увеличивают число зацеплений.
Гиразы вносят двуцепочечный разрыв ДНК по
принципу работы рестриктаз.
Хеликазы - ферменты, денатурирующие (расплетающие) ДНК.
SSB белки (single strand bind) - связываются с
одноцепочечной ДНК электростатически, когда в ДНК
образуется расплавленный участок, не дают цепям
схлопнуться. Они не денатурируют ДНК, а лишь
фиксируют, удерживают матричные цепи ДНК в
репликативной вилке.
Праймаза – фермент, создающий РНК-затравку для начала синтеза ДНК. У
эукариот РНК-затравки размером 6-10
нуклеотидов удаляются РНК-азой. Бреши
заделываются

репарирующими

ферментами.
Рестриктазы - эндонуклеазы, узнающие определенные последовательности,
делают разрезы в обеих цепях ДНК, затем поворачивают концы ДНК на 360 и
проявляет лигазную активность, т.е. сшивают цепи ДНК. При этом используется
энергия АТФ. Результат деятельности гираз - супервитки. Суперспирализованная
ДНК напряжена. В некоторых местах цепи расходятся, т.к. расплавляются А-Т
участки.
Ферменты репликации эукариот и их функция

Проблема репликации концов линейных молекул ДНК эукариот
Удаление РНК-праймеров после завершения
синтеза линейных ДНК в виде фрагментов Оказаки и
заделывание

образующихся

между

фрагментами

брешей нуклеотидами ДНК приводит к тому, что
дочерние цепи ДНК оказываются короче материнских
на размер первого РНК-праймера (10-20 нукл.).
Образуются 3'-оверхенги, т.е. выступающие 3'-концы
материнских цепей. Они узнаются теломеразой ферментом, содержащим помимо белковой части еще и
РНК, выполняющую роль матрицы для наращивания

ДНК повторами. Теломераза последовательно наращивает материнские цепи ДНК
повторами, используя 3'-оверхенги в качестве затравок. Образующиеся длинные
одноцепочечные концы в свою очередь служат матрицами для синтеза дочерних
цепей традиционным репликативным механизмом.
Хромосомы соматических клеток человека фланкированы многократно
повторенными гексамерами TTAГГГ, общая длина районов с повторами может
достигать 10 тыс. пар нуклеотидов. В
комплексе со специфическими белками
такие

тандемные

повторы

образуют

теломеры, защищающие концы ДНК от
действия экзонуклеаз, предотвращающие
неправильную
позволяющие

рекомбинацию
концам

и

хромосом

прикрепляться к ядерной оболочке.
При каждом раунде репликации
происходит укорочение теломер в среднем
на 50 пар нуклеотидов. Поскольку
теломерные последовательности не являются кодирующими, они выступают в роли
буферной зоны - как защита от "проблемы концевой репликации". Укорочение ДНК
в ходе каждого раунда репликации лишь сокращает нетранскрибируемый текст
теломеры, но не приводит к утрате смысловых последовательностей - генов и
регуляторов их экспрессии.
2. Основные повреждения в ДНК и их репарация
На геном любой неделящейся клетки постоянно оказывает влияние
окружающая среда, при этом вполне вероятны повреждения в составе генома:
изменение нуклеотида (например, дезаминирование), сшивки азотистых оснований
друг с другом, разрывы цепей, отрыв пуриновых нуклеотидов и т.п. Такие изменения
быстро определяются специальными ферментами, пораженный участок удаляется
экзонуклеазами, заполняется ДНК-полимеразой β и сшивается ДНК-лигазой. В

делящейся клетке мутации могут также возникать во время синтеза ДНК. Поэтому в
клетках существует двойная система проверки точности репликации: одна
непосредственно

при

ДНК-полимеразной

реакции,

другая

–

анализ

уже

синтезированной ДНК.
Причины ошибок при синтезе ДНК

In vitro происходит 1 ошибка на 100 тыс. нукл. для средней ДНК-полимеразы.
Добавление аналогов нуклеотидов, например, бромдезоксиуридина - аналога
тимидина – это способ повышения количества ошибок как одно из средств борьбы со
СПИДом и раком. Аналоги одинаково вредны для всех клеток, однако в пораженных
вирусом клетках чаще проходит репликация.
1. Апуринизация. Каждая соматическая клетка теряет за
сутки около 10000 пуринов и пиримидинов. Разрывается Nгликозидная связь между пуриновым основанием и
дезоксирибозой. В ДНК образуются АП-сайты. Причины
апуринизации: изменение рН, ионизирующее излучение,
повышение температуры и т.д. Пиримидины тоже могут
отщепляться, но скорость этого процесса ниже.
2. Дезаминирование. Аденин превращается в гипоксантин, который образует две
водородные связи с цитозином. Гуанин превращается в ксантин, который образует
водородные связи с тимином. При дезаминировании цитозина образуется урацил.
Тимин не может быть дезаминирован (единственный в ДНК). Наличие тимина в ДНК
(вместо урацила) позволяет отличать дезаминированнный цитозин (т.е. урацил) от
законного урацила, если бы он был в ДНК. N-гликозилаза - фермент, который узнает
дезаминированное

основание,

разрывает

N-гликозидную

связь

и

удаляет

неправильное основание.
После этого АП-специфическая эндонуклеаза вносит одноцепочечный разрыв,
и фосфодиэстераза отщепляет от ДНК ту сахарофосфатную группу, к которой теперь

не присоединено основание. Появляется брешь размером в один нуклеотид, которую
заделывает ДНК-полимераза, а лигаза сшивает концы ДНК.
ДНК - двуцепочечна в отличие от РНК. Наличие второй цепи обеспечивает
исправление ошибок. Дезоксирибоза более устойчива, чем рибоза, к действию
щелочи, т.е. при рН > 8, ДНК устойчива, а РНК- нет.

3. Тиминовые димеры. Под действием ультрафиолетого света
происходит ковалентное сшивание рядом
стоящих пиримидинов. При сшивании
тиминов

образуется

циклобутановое

производное, блокирующее репликацию.
Фермент фотолиаза - узнает тиминовые
димеры и на свету или в темноте образует с

ними

комплекс. При освещении видимым светом происходит активация
фермента, циклобутановое кольцо разрывается, и вновь получаются два тимина.
Этот процесс называется фотореактивацией.
И дезаминированные основания, и тиминовые димеры, кроме того, могут
удаляться с помощью эксцизионной репарации. Специфические эндонуклеазы
производят одноцепочечные разрезы (инцизия). Затем происходит удаление
(эксцизия) нескольких нуклеотидов и заделывание бреши. У E. сoli заделыванием
бреши занимается ДНК-полимераза I. Лигаза сшивает цепь. Она же ликвидирует
одноцепочечные разрывы, возникающие при действии ионизирующей радиации.

У

E.coli

эксцизионная

репарация

осуществляется мультиферментным комплексом,
включающим белки uvrA, uvrB, uvrC (ultraviolet
repair), которые узнают поврежденный участок и
вносят 5'- и 3'- разрывы с разных сторон от него,
uvrD - хеликазу, которая отсоединяет вырезанный
олигомер - 12 нуклеотидов, используя энергию
АТФ.
У эукариот существует функциональный (но не структурный) аналог такого
мультиферментативного комплекса. Имеется 14 позиций, по которым ДНК
метилируется. Гуанин может быть метилирован (по кислороду в 6-ом положении) и в
такой форме будет связываться не только с цитозином, но и с тимином. Таким
образом, в два шага может произойти замена пары Г-Ц на А-Т. Фермент принимает
метильную группу на один из 12 цистеиновых остатков и при этом "гибнет".
3. Транскрипция – синтез РНК: субстраты, кофактор. РНК-полимераза.
Обратная транскрипция
Транскрипция (англ. transcription – переписывание) - это биосинтез всех видов
РНК по матрице ДНК, осуществляемый ферментом ДНК-зависимой РНКполимеразой. У прокариот синтез всех видов РНК осуществляется одним и тем же
ферментом. У эукариот - 3 ядерные РНК-полимеразы, митохондриальные РНКполимеразы, хлоропластные РНК-полимеразы. Субстратами для РНК-полимераз
служат рибонуклеозид-трифосфаты (активированные нуклеотиды). Весь процесс
транскрипции

осуществляется

актвированных нуклеотидов.

за

счет

энергии

макроэргических

связей

Биосинтез РНК происходит в участке ДНК, который называется транскриптом,
с одного края он ограничен промотором (начало), с другого – терминатором
(конец). Как в любом матричном биосинтезе в транскрипции выделяют 5
необходимых элементов:
• матрица – одна из цепей ДНК
• растущая цепь – РНК
• субстрат для синтеза – рибонуклеотиды (УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ)
• источник энергии – УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ
• ферменты – РНК-полимеразы.
Существует три основных типа РНК-полимераз: для синтеза пре-рРНК
(РНКполимераза I), для синтеза пре-мРНК (РНК-полимераза II), для синтеза претРНК и 5S-рРНК (РНК-полимераза III). В составе РНК-полимеразы E.coli выделяют
четыре субъединицы: две α-субъединицы, по одной β- и β’-субъединице. Имеется
также дополнительный белковый ζ-фактор Последний необходим только для
связывания с промотором и не участвует в удлинении цепи РНК. Строение РНКполимераз эукариот имеет много общего со структурой бактериального фермента:
они имеют по две больших субъединицы и несколько малых субъединиц.
Принципы транскрипции:

1. Комплементарность.
2.
Антипараллельность.
3. Униполярность.
4. Беззатравочность.
5. Асимметричность.

РНК синтезируется комплементарно и антипараллельно транскрибируемой
цепи ДНК. Рост цепи РНК идет только в направлении 5'

3'. Для начала синтеза

РНК фермент не нуждается в поли- или олигонуклеотидной затравке. Первый
нуклеотид в РНК всегда пурин в форме трифосфата.
РНК-полимераза Е.coli - белок с четвертичной структурой. Одновременно в
клетке присутствует около 7000 молекул РНК-полимеразы. Субъединичный состав
фермента: (2
фермент (2

- holo-фермент (полный фермент). Без -фактора это core-

)
)

. (сигма) -

фактор - сменный фактор
специфичности. Только holoфермент обладает высоким
сродством к специфической
последовательности нуклеотидов
– промотору. Как только произошла инициация транскрипции,

-фактор

отделяется. Стадии узнавания и связывания, а также инициации осуществляются
holo-ферментом. Элонгация и терминация осуществляются core-ферментом.
РНК-полимераза узнает промотор, покрывая 40-60 пар нуклеотидов - это ATбогатые участки ДНК в положениях "-10" и "-35". Примерно 5% промоторов у
прокариот имеют только участок "-10", однако хорошо узнаются РНК-полимеразой.
Такие

промоторы

представлены

палиндромными

последовательностями,

принимающими форму креста при суперспирализации кольцевых молекул ДНК.

Палиндромы

-

последовательности,
которые

читаются

одинаково
направо
налево.

слева
и

справа

Палиндромы

первого порядка имеют
одну ось симметрии,
второго - две, третьего - три.
Этапы транскрипции
Инициация. Промотор содержит стартовый сигнал транкрипции ТАТА-бокс –
определенную

последовательность

нуклеотидов

ДНК,

присоединяющий

инициирующий ТАТА-фактор. Этот ТАТА-фактор обеспечивает присоединение
РНК-полимеразы к той нити ДНК, которая будет использоваться в качестве шаблона
для транскрипции. Так как промотор ассиметричен, то он связывает РНК-полимеразу
только в одной ориентации, что определяет направление транскрипции от 5’-конца к
3’-концу (5’ → 3’). Другие факторы инициации раскручивают спираль ДНК перед
РНК-полимеразой. После синтеза затравочного фрагмента РНК длиной 8-10
рибонуклеотидов ζ-фактор отрывается от фермента.
Элонгация. Белковые факторы элонгации обеспечивают продвижение РНКполимеразы вдоль ДНК и расплетание нитей ДНК на протяжении примерно 17
нуклеотидных пар. РНК-полимераза продвигается со скоростью примерно 40-50
нуклеотидов в секунду в направлении 5’ → 3’. Используя одновременно в качестве
субстрата и источника энергии АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ.
Терминация. РНК-полимераза остановится, когда достигнет терминирующих
кодонов. С помощью белкового фактора терминации, так называемого ρ-фактора
(греч. ρ - "ро"), от матрицы ДНК отделяются фермент и синтезированная молекула
РНК, которая является первичным транскриптом, предшественником мРНК или
тРНК или рРНК.

1. Инициация - узнавание
и

прочное

фермента,

связывание
образование

первой фосфодиэфирной
связи

между

пурин-

трифосфатом (АТФ или
ГТФ)

и

следующим

нуклеотидом.
2.

Элонгация

-

последовательное
наращивание цепи РНК.
Скорость элонгации 40-50 нукл./сек.
3. Терминация - в терминаторе присутствует палиндром. В синтезируемой РНК
формируется шпилька. Шпилька меняет конформацию РНК-полимеразы и фермент
теряет сродство к ДНК.
Обратная транскрипция
Некоторые онкогенные РНК-содержащие вирусы животных имеют уникальный
фермент - РНК-зависимую ДНК-полимеразу - обратную транскриптазу и способны
встраивать генетическую информацию со своей вирусной РНК в ДНК генома клеткихозяина.
После того как вирус попадает в клетку-хозяина, этот фермент способен
катализировать синтез ДНК, комплементарной по отношению к вирусной РНК,
которая играет при этом роль матрицы. В результате образуется кДНК, которая
может в течение многих поколений оставаться в скрытом, т.е. неэкспрессируемом,
состоянии. При определенных условиях такие бездействующие вирусные гены могут
активироваться и вызывать репликацию вируса; при других же условиях они могут
способствовать превращению клеток в раковые. Открытие обратной транскриптазы
позволило по-новому сформулировать центральную догму молекулярной биологии.

Рис. Участие обратной транскриптазы в образовании к-ДНК на вирусной
одноцепочечной РНК-матрице в животной клетке
4. Процессинг РНК: посттранскрипционные превращения различных типов
РНК
Синтезированные молекулы РНК являются функционально неактивными и в
дальнейшем претерпевают ряд ферментативных превращений, которые называют

посттранскрипционным процессингом. У эукариот процессингу подвергаются все
виды пре-РНК, у прокариот – только предшественники рРНК и тРНК.
Процессинг предшественника рРНК. Предшественники рРНК являются
более крупными молекулами по сравнению со зрелыми рРНК.
У прокариот большая прерибосомная 30S-РНК расщепляется специфичными

нуклеазами с образованием 5S-рРНК, 16S-рРНК, и 23S-рРНК.
У эукариот большая прерибосомная 45S-РНК расщепляется специфичными
нуклеазами с образованием 5,8S-рРНК, 18S-рРНК, и 28S-рРНК.
рРНК как эукариотических, так и прокариотических клеток образуются из
более длинных молекул – предшественников, называемых прерибосомными РНК. У
прокариот 16S- и 23S-р-РНК образуются из одного длинного 30S-предшественника,
молекулярная

масса

которого

составляет

2×106.

приблизительно

Этот

предшественник метилируется по специфическим основаниям и расщепляется, давая
17S- и 25S-промежуточные РНК, которые затем процессируются путем отщепления
остатков с помощью нуклеаз, образуя характерные для прокариот 16S- и 23S-р-РНК.
5S-р-РНК образуется отдельно из 3-концевого участка 30S-предшественника.
Рис.

Посттранскрипционные

модификации

прерРНК

и

образование рибосом
1 - транскрипция пре-рРНК;
2 - связывание 45S- рРНК с белками
и 5S-рРНК;
3 - метилирование пре-рРНК и
расщепление

на

отдельные

фрагменты;
4 - дальнейшее укорочение рРНК и
формирование 40S- и 60S-субъединиц рибосом

У эукариот 18S- и 28S-р-РНК образуются в несколько этапов: из большой 45Sпрерибосомной РНК. Процессинг протекает в ядрышке. Сначала происходит
метилирование
метилированная

более

чем

45S-РНК

100

нуклеотидов

претерпевает

ряд

45S-предшественника.
ферментативных

Затем

расщеплений,

приводящих в конечном итоге к появлению 18S-, 28S- и 5,8S-р-РНК, характерных для
эукариотических рибосом. 5S-р-РНК синтезируется отдельно.
Процессинг предшественника тРНК. 1. Формирование на 3’-конце
последовательности Ц-Ц-А. Для этого у одних пре-тРНК с 3’-конца удаляются
лишние нуклеотиды до «обнажения» триплета Ц-Ц-А, у других идет присоединение
этой последовательности.
Формирование антикодоновой петли происходит путем сплайсинга и
удаления интрона в средней части пре-тРНК.
Модификация нуклеотидов путем дезаминирования, метилирования,
восстановления. Например, образование псевдоуридина и дигидроуридина.
тРНК также образуются из более длинных РНК-предшественников в
результате ферментативного удаления лишних нуклеотидов с 5- и 3-концов
молекулы. В ходе процессинга в предшественниках т-РНК происходят изменения
двоякого рода. Во-первых, к некоторым т-РНК присоединяется 3-концевая
тринуклеотидная последовательность -С-С-А (3-); в других т-РНК этот 3-концевой
тринуклеотид уже содержится в транскрипте. 3-концевой остаток А представляет
собой именно ту часть молекулы т-РНК, с которой ковалентно связывается
соответствующая ей аминокислота перед включением в растущую полипептидную
цепь на рибосоме. Во-вторых, ряд оснований в т-РНК специфическим образом
модифицируется:

одни

метилируются,

другие

дезаминируются,

третьи

восстанавливаются. Модифицированные основания располагаются во всех т-РНК в
определенных положениях.

Рис. Процессинг транскриптов тРНК:
1

-

удаляются

участки

полинуклеотидной цепи на 5'- и 3'концах молекулы пре-тРНК и интрон
в центральной области молекулы;
2

-

модифицируются

азотистые

основания, к 3-концу присоединяется
триплет ССА; 3 - в цитоплазму
выходят зрелые тРНК
Особенности транскрипции у эукариот
У эукариот процессы транскрипции и трансляции разобщены во времени и
пространстве (транскрипция - в ядре, трансляция - в цитоплазме). У эукариот
существуют специализированные РНК-полимеразы. В ядре выделяют 3 типа РНКполимераз:
 РНК-полимераза I - синтезирует rРНК (кроме 5S rРНК).
 РНК-полимераза II - синтезирует mРНК и некоторые sРНК.
 РНК-полимераза III - синтезирует tРНК, некоторые sРНК и 5SrРНК.
РНК-полимеразы различаются количеством субъединиц, их аминокислотным
составом, и зависимостью от катионов магния и марганца. Помимо ядерных РНКполимераз у эукариот есть еще РНК-полимеразы хлоропластов и митохондрий. Они
кодируются в ядре, а не в соответствующих органеллах. В органеллах образуются
свои тРНК, рРНК и рибосомные белки.
Процессинг (созревание) рРНК и тРНК у эукариот принципиально не
отличается от такового у прокариот. Процессинг мРНК сильно отличается и состоит
из нескольких этапов.
1. Кепирование 100% мРНК
2. Полиаденилирование ~95% мРНК

3.

Сплайсинг

~95%

мРНК.

Сплайсингу

подвергаются

только

полиаденилированные mРНК.
4. Редактирование. Показано лишь для нескольких мРНК.
Процессинг предшественника мРНК 1. Кэпирование (англ. cap - шапка) –
происходит еще во время транскрипции, состоит в том, что к 5’-трифосфату
концевого нуклеотида пре-мРНК присоединяется 5’-углерод N 7-метил-гуанозина.
«Кэп» необходим для защиты молекулы РНК от 5’-3’-экзонуклеаз.
2. При транскрипции зон ДНК, несущих информацию о белках, образуются
гетерогенные ядерные РНК, по размеру намного превосходящие мРНК. Дело в том,
что из-за мозаичной структуры генов эти гетерогенные РНК включают в себя
информативные (экзоны) и неинформативные (интроны) участки. При особом
процессе – сплайсинге (англ. splice – склеивать встык) происходит удаление интронов
и сохранение экзонов.
3.

Полиаденилирование

–

при

помощи

полиаденилат-полимеразы

с

использованием молекул АТФ происходит присоединение к 3’-концу 100-200
адениловых нуклеотидов, формирующих поли (А)-хвост.
Все

стадии

процессинга

мРНК

происходят

в

РНП-частицах

(рибонуклеопротеидных комплексах). По мере синтеза про-мРНК, она тут же
образует комплексы с ядерными белками - информоферами. И в ядерные, и в
цитоплазматические комплексы мРНК с белками (информосомы) придают РНК
необходимую конформацию и защищают. В составе информосом mРНК может жить
от нескольких минут до нескольких дней, не подвергаясь действию нуклеаз (мРНК
живут неделями в ооцитах, предшественниках яйцеклеток).
Полисома - комплекс мРНК с несколькими или многими рибосомами.

Кэпирование
надевание

-

"шапочки".

"Сар" представляет собой
метилированный

ГТФ,

присоединенный

в

необычной позиции 5'-5' и
две

метилированные

рибозы в первых двух нуклеотидах mРНК. По мере образования про-mРНК (еще до
30-ого нуклеотида), к 5'-концу, несущему пуринтрифосфат, присоединяется гуанин,
после чего происходит метилирование.
ГТФ + гуанинтрансфераза (Е)

Е~фГ + ф-ф

5'ф-ф-ф-Пур-ф-Х-ф-Y-ф-Z-...+E~фГ

Г5'-ф-ф-ф-5'-Пур-ф-Х-ф-Y-ф-Z...

(метилирование) Гm-ф-ф-ф-Пурm-ф-Хm-ф-Y-ф-Z-...
Назначение "Сар"
1. Защита 5'-конца мРНК от действия экзонуклеаз.
2. За счет узнавания "Сар"-связывающими белками происходит правильная
установка мРНК на рибосоме.
Полиаденилирование. Когда синтез про-мРНК завершен, то на расстоянии
примерно 20 нуклеотидов в
направлении к 3' - концу от
последовательности

5'-

AAУAA-3'

происходит

разрезание

специфической

эндонуклеазой и к новому 3'-концу присоединяется от 30 до 300 остатков АМФ
(безматричный синтез). Каждый вид мРНК имеет "поли-А хвост" определенной
длины. Он защищает 3'-конец от гидролиза, т.к. покрыт полиА-связывающими
белками. В значительной степени время жизни мРНК коррелирует с длиной полиА-

хвоста. мРНК ряда генов не полиаденилируется (например, гистоновых генов).
Полиаденилированные про-мРНК подвергаются сплайсингу.
Сплайсинг - вырезание копий интронов (некодирующих участков гена) из промРНК и сшивание копий экзонов (кодирующих участков гена) с образованием зрелой
мРНК.
Явление сплайсинга РНК (от англ. to splace - сшивать без узлов) открыл в 1978
г. Филипп Шарп (Массачусетский
технологический институт).
На долю интронов приходится в 5-7
раз больше нуклеотидных пар, чем на
долю экзонов. Количество экзонов в гене
больше, чем интронов.
Копии интронов гидролизуются до нуклеотидов. Сплайсинг показан для
большинства мРНК и некоторых тРНК. У простейших найден автосплайсинг рРНК.
Сплайсинг показан даже для архебактерий.
Существуют разные механизмы сплайсинга, его осуществляют ферментыматюразы. В некоторых случаях в процессе сплайсинга участвуют sРНК. В случае
автосплайсинга процесс происходит благодаря третичной структуре про-РНК.
В м-РНК 5' и 3' концы интрона очень консервативны: 5'(ГT-интрон-AГ)3'. При
сшивании копий экзонов соблюдается порядок их расположения в гене.

Альтернативный сплайсинг мРНК кальцитонинового гена у млекопитающих
Во всех клетках есть кальцитониновый ген, но в клетках щитовидной железы
он экспрессируется в виде гормона кальцитонина, а в клетках гипофиза нейропептида CGRP (пептида, имеющего отношение к гену кальцитонина). Ген один,
а белки получаются разные в результате сплайсинга мРНК и процессинга
полипептидов. В клетках других тканей этот ген не экспрессируется.
Сплайсинг осуществляется белковыми комплексами - сплайсосомами, в
которых помимо ферментов, вырезающих и сшивающих участки про-мРНК, имеются
белки, придающие про-мРНК нужную конформацию.

Автосплайсинг открыт Томасом Чеком
году.

Впервые

каталитической

было

показано,

активностью

обладают

(США) в 1982

что
не

только белки.
РНК-зимы - РНК с каталитической активностью.
Малые РНК (мяРНК) обнаружены в количестве 103-105 копий на
клетку. Поскольку в большинстве случаев эти РНК обогащены урацилом, они
называются U1, U2... Их размер от 100 до 300 нукл. Все они кодируются в ядре, но
работают как в ядре (small nuclear - SN), так и в цитоплазме (small cytoplasmic - SC).
Рибонуклеопротеидные комплексы в ядре участвуют в полиаденилированиии и
сплайсинге, РНП в цитоплазме входят в состав информосом. Малая РНК U4

присутствует в комплексах, участвующих в полиаденилировании. Если получить
антитела к белкам, связывающимся с U4, то не происходит полиаденилирования и
сплайсинга. При красной волчанке (аутоимунном заболевании) вырабатываются
антитела к белкам комплекса с U4.
5. Генетический код и его свойства. Значение тРНК в декодировании
генетической информации
Ген - это участок ДНК, кодирующий
одну

полипептидную

цепь

или

одну

молекулу тРНК, рРНК или мяРНК. Гены
тРНК, рРНК, мяРНК белки не кодируют.
Генетический код - это система записи
информации
расположения

о

последовательности

аминокислот

в белках с

помощью последовательности нуклеотидов в
ДНК. Поскольку ДНК непосредственного участия в синтезе белка не принимает, то
код записывается на языке РНК. В РНК вместо тимина входит урацил.
Свойства генетического кода
1. Триплетность. Каждая аминокислота кодируется последовательностью из 3-х
нуклеотидов.
2. Вырожденность. Все аминокислоты, за исключением метионина и триптофана,
кодируются более чем одним триплетом. Всего 61 триплет кодирует 20 аминокислот.
3. Однозначность. Каждый триплет кодирует лишь одну аминокислоту или является
терминатором трансляции.
4. Наличие межгенных знаков препинания. В конце каждого гена, кодирующего
полипептид, находится, по меньшей мере, один из 3-х терминирующих кодонов, или
стоп-сигналов: UAA, UAG, UGA. Они терминируют трансляцию. Условно к знакам

препинания относится инициирующий кодон AUG - первый после лидерной
последовательности, кодирует формилметионин (у прокариот).
5. Компактность, или отсутствие внутригенных знаков препинания.
Внутри гена каждый нуклеотид входит в состав значащего кодона.
6. Колинеарность – последовательность кодонов соответствует последовательности
аминокислот в кодируемом белке.
7. Неперекрываемость – триплеты не накладываются друг на друга, располагаясь
рядом.
8. Универсальность. Генетический код един для всех живущих на Земле существ.
Синтез белка в клетке состоит из двух этапов: рекогниции и собственно
синтеза полипептида на рибосоме. Ключевым субстратом рекогниции является
транспортная РНК.
Адапторная роль транспортных РНК. Транспортные РНК является
единственным

посредником

между

4-х

буквенной

последовательностью

нуклеиновых кислот и 20-ти буквенной последовательностью белков. Именно от
наличия того или иного антикодона в тРНК зависит, какая аминокислота включится
в белковую молекулу, т.к. ни рибосома, ни мРНК не узнают аминокислоту.
Присоединение аминокислоты к тРНК осуществляется ферментом аминоацилтРНКсинтетазой, имеющей специфичность одновременно к двум соединениям: какой-либо
аминокислоте и соответствующей ей тРНК. Так как существует около 60 различных
тРНК, то некоторым аминокислотам соответствует две или более тРНК.
Транспортные РНК, способные присоединять одну и ту же аминокислоту называют
изоакцепторными.

Структура транспортной РНК
Транспортные РНК (тРНК) - короткие молекулы (7090 нукл.), имеющие и вторичную, и третичную структуру.
Вторичная

структура

-

"клеверный

лист".

Последовательность CCA на 3'-конце одинакова для всех
тРНК. К концевому аденозину (А) присоединяется аминокислота. Наличие в тРНК
тимина (T), псевдоуридина( ) (в TC- петле ), и дигидроуридина (ДГУ) (в D-петле)
- минорных, т.е. редко встречающихся в РНК нуклеотидов, указывает на особенности
ее строения, необходимые для безошибочного узнавания
ферментами, для защиты от действия рибонуклеаз (поэтому
тРНК - долгоживущие, в отличие от мРНК).
Третичная структура в проекции на плоскость имеет
форму бумеранга. Существует разнообразие первичных
структур тРНК - 61+1 - по количеству кодонов (соответственно числу антикодонов
в тРНК) и формилметиониновая тРНК, у которой антикодон такой же, как у
метиониновой тРНК. Разнообразие третичных структур - 20 (по количеству
аминокислот).
Рекогниция - это подготовительный этап трансляции с образованием
ковалентной связи между тРНК и соответствующей аминокислотой. Состоит из двух
стадий: 1. Активирование аминокислоты. 2. Присоединение аминокислоты к
тРНК - аминоацилирование. Обе стадии рекогниции осуществляются ферментом

аминоацил-тРНК-синтетазой (APC-азой, кодазой). Существует 20 вариантов кодаз
(по числу аминокислот). У каждой кодазы 3 центра опознавания. Каждая АРС-аза
узнает третичную структуру тРНК.
Синтез белка у прокариот начинается с N – формилметионина.

1. Биосинтез белка (трансляция): основные этапы функционирования
белоксинтезирующей системы (инициация, элонгация, терминация)
Синтез полипептидов, происходит на рибосомах. Рибосомы - немембранные
самые мелкие клеточные органеллы. В клетке E.сoli присутствует около 103-5х103
рибосом. Линейные размеры прокариотической рибосомы 210 х 290 Å. У эукариот 220 х 320 Å. Выделяют четыре класса рибосом:
1. Прокариотические 70S.
2. Эукариотические 80S.
3. Рибосомы митохондрий (55S - у животных, 75S - у грибов).
4. Рибосомы хлоропластов (70S у высших растений).
Структура рибосом
S - коэффициент седиментации или константа Сведберга. Отражает
скорость осаждения молекул при центрифугировании в зависимости от конформации
и молекулярного веса.
Каждая рибосома состоит из 2-х субъединиц (большой и малой).

Прокариотическая рибосома

Эукариотическая рибосома

70S
50S
5S rРНК
23S rРНК

80S
30S

40S

5S rРНК
16S rРНК

5.8S rРНК

18S rРНК

28S rРНК

34
молекулы белков,

60S

21 белок

из них 31 разные

не менее 50

не менее 33 разных

разных белков

белков

рРНК выполняют не только функцию каркасов субъединиц рибосом, но и
принимают непосредственное участие в синтезе полипептидов.
23S рРНК входит в каталитический пептидилтрансферазный центр, 16S рРНК
необходима для установки на 30S субъединице инициирующего кодона мРНК, 5S
рРНК - для правильной ориентации аминоацил-тРНК на рибосоме. Все рРНК
обладают развитой вторичной структурой: около 70% нуклеотидов собрано в
шпильки. рРНК в значительной степени метилированы.
Каталитические центры рибосом.
Асп - центр специфического узнавания. Здесь
происходит взаимодействие кодон-антикодон.
Р-центр - пептидильный, донорный. Он
является донором формилметионина при
инициации, или пептидила при элонгации
трансляции.
А-центр - аминоацильный, акцепторный. Акцептирует формилметионин в
самом начале или пептидил при элонгации трансляции. К-центр - каталитический
(фермент пептидилтрансфераза).
Полирибосомы. По причине того, что продолжительность жизни матричной
РНК невелика, перед клеткой стоит задача использовать ее максимально эффективно,

т.е. получить максимальное количество «белковых копий». Для достижения этой
цели на каждой мРНК может располагаться не одна, а несколько рибосом, встающих
последовательно друг за другом и синтезирующих пептидные цепи. Такие
образования называются полирибосомы.
Этапы биосинтеза белка на рибосоме
После считывания информации с ДНК и переноса ее на матричную РНК
начинается синтез белков. Каждая зрелая мРНК несет информацию только об одной
полипептидной цепи. Если клетке необходимы другие белки, то необходимо
транскрибировать мРНК с иных участков ДНК. Биосинтез белков или трансляция
происходит на рибосомах, внутриклеточных белоксинтезирующих органеллах, и
включает
5 ключевых элементов:
• матрица – матричная РНК
• растущая цепь – полипептид
• субстрат для синтеза – 20 протеиногенных аминокислот
• источник энергии – ГТФ
• ферменты – рибосомальные белки и рРНК
Выделяют три основных стадии трансляции: инициация, элонгация, терминация.
Инициация. Для инициации необходимы мРНК, ГТФ, малая и большая
субъединицы рибосомы, три белковых фактора инициации (ИФ-1, ИФ-2, ИФ-3),
метионин и тРНК для метионина В начале этой стадии формируются два тройных
комплекса: первый – мРНК, малая субъединица, ИФ-3; второй – мет-тРНК, ИФ-2,
ГТФ. После их объединения и присоединения большой субъединицы начинается
стадия элонгации.
Элонгация. Для этой стадии необходимы все 20 аминокислот, тРНК для всех
аминокислот, белковые факторы элонгации, ГТФ. Элонгация представляет собой
циклический процесс, повторяющийся столько раз, сколько аминокислот необходимо

включить в полипептидную цепь. Удлинение цепи происходит со скоростью
примерно 20 аминокислот в секунду.
Терминация. Синтез белка будет продолжаться до тех пор, пока рибосома не
достигнет на мРНК особых терминирующих кодонов – стоп-кодонов УАА, УАГ,
УГА. Данные триплеты не кодируют ни одной из аминокислот, их также называют
нонсенс-кодоны. Кроме стоп-кодонов для окончания синтеза белка требуются ГТФ и
белковые факторы терминации, которые последовательно катализируют
1. Гидролитическое отщепление полипептида от конечной тРНК
2. Отделение от П-участка последней, уже пустой, тРНК,
3. Диссоциацию рибосомы.
Механизм трансляции
У прокариот перед каждым геном и соответственно в мРНК перед копией
каждого гена имеется лидерная
последовательность. Она может быть разного
размера (до 160 нукл.) и разной первичной
структуры,

но

обязательно

содержит

полипуриновую последовательность ШайнаДальгарно, которая комплементарна 3'-концевому участку 16S rРНК.
Комплементарными могут быть 3-9 нуклеотидов.
Назначение комплементарного взаимодействия 3'-концевого участка 16S rРНК
и последовательности Шайна-Дальгарно - правильная установка инициирующего
кодона AUG на малой субъединице рибосомы. Инициирующий кодон находится на
растоянии 3-10 нукл. от последовательности Шайна-Дальгарно.
К малой субъединице, на которой уже находится
мРНК, подходит формилметиониновая тРНК,
соединенная с формилметионином. В результате
образуется инициаторный комплекс: 30S

субъединица рибосомы + мРНК + формилметионовая тРНК-формилметионин.
Затем происходит ассоциация рибосомы. При этом изменяется конформация
16S rРНК и нарушается связь между ней и последовательностью Шайна-Дальгарно.
Аминоацильный конец формилметиониновой tРНК оказывается в Р-центре.
Второй кодон гена оказывается в Асп-центре.
Соответствующая

ему

аминоацил-tРНК

устанавливается таким образом, что ее аминоацильный
конец попадает в А-центр.
Пептидилтрансфераза отрывает формилметионин
в Р-центре и переносит его в А-центр. Образуется пептидная связь между
формилметионином и аминоацил-тРНК.
Рибосома претерпевает конформационные изменения и сдвигается на один
кодон. Формилметиониновая тРНК покидает рибосому. Второй кодон оказывается
напротив Р-центра. Сюда же переходит тРНК, несущая на хвосте дипептид. В Аспцентр попадает третий кодон, а в А-центр очередная аминоацил-тРНК.
Теперь в Р-центре отрывается дипептид, переносится в А-центр и соединяется
с третьей аминоацил-тРНК. Так продолжается до тех пор, пока в Асп-центр не
приходит терминирующий кодон. Полипептид отрывается в Р-центре, переносится в
А-центр и, т.к. присоединиться ему не к чему, он отваливается от рибосомы. Рибосома
диссоциирует и малая субъединица сканирует мРНК.

In vivo на каждой стадии (образования инициаторного комплекса, инициации,
элонгации и терминации) участвуют различные белковые факторы, которые
препятствуют посадке на рибосому деацилированных tРНК или запрещают посадку
формилметиониновой-тРНК в А-центр. На всех этапах принимают участие молекулы

ГТФ, которые дефосфорилируются. Смысл гидролиза ГТФ не в отдаче энергии, а в
свидетельстве того, что данный этап трансляции пройден.
2. Посттрансляционные изменения полипептидных цепей и образование
функционально-активных белков
Посттрансляционная модификация белков. Во время синтеза полипептидной
цепи или после его завершения - белок самопроизвольно принимает свою нативную
конформацию. Однако часто новообразованная полипептидная цепь не может
принять окончательную биологически активную конформацию, пока она не
подвергнется процессингу или ковалентной модификации. Изменения в ходе этих
процессов получили название посттрансляционной модификации. У различных
белков процессинг протекает по-разному.
1. Модификация N– конца и С – конца (удаление с N-конца метионина или даже
нескольких аминокислот специфичными аминопептидазами). В прокариотических
клетках все полипептиды начинаются с остатка N-формил-метилонина, а в
эукариотических- с остатка метионина. Однако формильная группа инициирующий
метионин, а часто и несколько следующих за ним аминокислотных остатков иногда
удаляются с помощью особых ферментов и, таким образом, не обнаруживаются в
окончательно сформированном белке. В некоторых белках после трансляции
ацетилируется аминогруппа N – концевого остатка, в других модификации
подвергается С - концевой остаток.
2. Удаление сигнальных последовательностей. Некоторые белки содержат на
N-конце дополнительную полипептидную последовательность из 15-30 остатков,
которая направляет этот белок к месту его назначения в клетке. Такие сигнальные
последовательности удаляются с помощью особых пептидаз.
3. Частичный протеолиз – удаление части пептидной цепи, как в случае с
инсулином или протеолитическими ферментами ЖКТ.
4. Образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина. Во
многих белках, предназначенных для выхода из эукариотической клетки, в процессе

формирования из нативной конформации появляются поперечные сшивки в
результате ферментативного образования дисульфидных мостиков между остатками
цистина; эти мостики соединяют друг с другом две полипептидные цепи или две
части одной цепи. Поперечные дисульфидные мостики помогают уберечь нативную
конформацию белковой молекулы от денатурации.
5. Присоединение химической группы к аминокислотным остаткам:
• фосфорной кислоты – фосфорилирование по сер, тре, тир используется при
регуляции активности ферментов или для связывания ионов кальция
• карбоксигруппы – при участии витамина К происходит γ-карбоксилирование
глутамата в составе протромбина, проконвертина, фактора Стюарта, Кристмаса, что
позволяет связать ионы кальция при инициации свертывания крови.
• метильной группы – метилирование аргинина и лизина в составе гистонов
используется для регуляции активности генома
• гидроксильной группы – образование гидроксипролина и гидроксилизина
необходимо для созревания молекул коллагена
• йода – в тиреоглобулине присоединение йода необходимо для образования
предшественников тиреоидных гормонов йодтиронинов.
• углеводных остатков – гликирование требуется при синтезе гликопротеинов
Фосфорилирование гидроксиаминокислот. В ряде белков гидроксильные
группы некоторых сериновых, треониновых и тирозиновых остатков подвергаются
ферментативному фосфорилированию с участием АТФ. Возникновение
фосфосериновых, фосфотреониновых и фосфотирозиновых остатков в этих белках
увеличивает их отрицательный заряд. В казеине, белке молока, содержится много
фосфосериновых остатков, функция которых состоит в связывании ионов Ca2+.
Поскольку и ионы Ca2+, и фосфат, а также аминокислоты необходимы грудным детям,
казеин молока представляет собой источник этих трех незаменимых питательных
веществ. Фосфорилирование гидроксильных групп определенных остатков серина
необходимо для активации некоторых ферментов, например, гликоген-фосфорилазы.
Фосфорилирование специфических остатков тирозина некоторых белков происходит
при онкогенезе.

Реакции карабоксилирования. К остаткам аспарагиновой и глутаминовой
кислот в ряде белков могут присоединяться дополнительные карбоксильные группы.
Например, белок системы свертывания крови протромбин содержит в своей N–
концевой области несколько остатков γ-карбоксиглутаминовой кислоты, которые
включаются в белок при помощи фермента, зависимого от витамина К.
Карбоксильные группы связывают ионы Ca2+, необходимые для запуска механизма
свертывания крови.
Метилирование групп. В ряде белков определенные остатки лизина
подвергаются ферментативному метилированию. Остатки монометил- и
диметиллизина обнаруживаются в некоторых мышечных белках и в цитохроме с. В
других белках метилированию подвергаются карбоксильные группы ряда остатков
глутаминовой кислоты, что приводит к нейтрализации их отрицательных зарядов.
Присоединение боковых углеводных цепей. Боковые углеводные цепи
гликопротеинов ковалентно присоединяются к полипептиду во время или после
синтеза последнего. В одних гликопротеинах боковая углеводная цепь прикрепляется
с помощью ферментов к остаткам аспарагиновой кислоты, в других - серина или
треонина. Многие белки, которые работают вне клетки, а также «смазочные»
протеогликаны, покрывающие слизистые оболочки, содержат боковые
олигосахаридные цепи.
6. Добавление простетических групп. В состав многих ферментов входят
обязательные для их активности ковалентно связанные с белком простетические
группы; они также присоединяются к полипептидной цепи после того, как та
покидает рибосому. Примерами таких простетических групп могут служить молекула
биотина, ковалентно связанная с ацетил-СоА-карбоксилазой и гемовая группа
цитохрома с.
Включение простетической группы:
• гема – при синтезе гемоглобина, миоглобина, цитохромов, каталазы
• витаминных коферментов – биотина, ФАД, пиридоксальфосфата и т.п.
7. Фолдинг – это процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную
пространственную структуру. Для обеспечения фолдинга используется группа

вспомогательных белков под названием шапероны (chaperon, франц. – спутник). Они
предотвращают взаимодействие новосинтезированных белков друг с другом,
изолируют гидрофобные участки белков от цитоплазмы, способствуют переходу
вторичной структуры в третичную. При нарушении функции шаперонов и
отсутствии фолдинга в клетке формируются белковые отложения – развивается
амилоидоз. Насчитывают около 15 вариантов амилоидоза.
8. Объединение протомеров в единый олигомерный белок, например,
гемоглобин, лактатдегидрогеназа.
9. Транспорт полипептидных цепей. Некоторые новообразованные белки
поступают просто в клеточный цитозоль, другие направляются к различным
клеточным органеллам, третьи секретируются из клетки, четвертые встраиваются в
ту или иную клеточную мембрану, где работают в качестве транспортных белков или
ферментов. Зрелый белок направляется в аппарат Гольджи, инкапсулируется и в виде
секреторного пузырька покидает клетку. Многие другие экспортируемые белки,
функционирующие вне клетки, - белки плазмы крови, полипептидные гормоны,
антитела, мукопротеины – могут поступать к месту своего назначения аналогичным
путем.
3. Регуляция экспрессии генов у прокариот и эукариот. Теория оперона
Регуляция транскрипции и трансляции у прокариот
Регуляция
биосинтеза
белка

у

прокариот

осуществляется на уровне
транскрипции мРНК. В
настоящее время принята теория
оперона,
сформулированная
Франсуа Жакобом и Жако Моно. В основе теории лежат следующие понятия:
 конституитивные ферменты – те, которые присутствуют в клетках всегда,
независимо от ее активности

 индуцибельные ферменты – те, которые синтезируются при появлении субстрата
 оперон – группа тесно связанных между собой генов (несколько структурных
генов и один ген-оператор), которые регулируют образование ферментов в
организме
 ген-регулятор – ген, регулирующий работу оперона, не входящий в его состав.
Лактозный оперон. При изучении E.coli было замечено, что активность одного
из ферментов катаболизма лактозы низка, если в среде имеется глюкоза. При
отсутствии же глюкозы и при наличии лактозы активность фермента резко
повышается. На основании этих наблюдений была предложена схема регуляции
оперона по механизму индукции. В отсутствие лактозы активный белок-репрессор
связывается с оператором и блокирует синтез мРНК, кодирующей ферменты
катаболизма лактозы. В результате эти ферменты не образуются.

Если глюкозы нет, и есть лактоза, то последняя связывается с белкомрепрессором и модифицирует его, не позволяя связаться с геном-оператором. Это
позволяет РНК-полимеразе считывать информацию, отвечающую за синтез
ферментов катаболизма лактозы, и синтезировать мРНК. Таким образом, лактоза
является индуктором транскрипции.
Схема негативной индукции Жакоба и Моно

Lac-оперон E. coli содержит 3 гена, отвечающие за образование белков,
участвующих в переносе в клетку дисахарида лактозы и в ее расщеплении.
Z - - галактозидаза (расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу).
Y - - галактозидпермеаза (переносит лактозу через мембрану клетки).
А - тиогалактозидтрансацетилаза (ацетилирует галактозу).
В отсутствие в клетке лактозы lac-оперон выключен. Активный белок репрессор, кодируемый в моноцистронном опероне, связан с оператором lac-оперона.
Поскольку оператор перекрывается с промотором, даже посадка РНК-полимеразы на
промотор невозможна. Как только некоторое количество лактозы попадает в клетку,
две молекулы субстрата (лактозы) взаимодействуют с белком - репрессором,
изменяют его конформацию, и он теряет сродство к оператору. Тут же начинается
транскрипция lac-оперона и трансляция образующейся мРНК; три синтезируемых
белка участвуют в утилизации лактозы. Когда вся лактоза переработана, очередная
порция репрессора, свободного от лактозы, выключает lac-оперон.

Триптофановый оперон. Функционирование триптофанового оперона
противоположно работе лактозного. В отличие от лактозного оперона, белокрепрессор синтезируется в неактивном состоянии и не может заблокировать
транскрипцию генов, кодирующих ферменты синтеза триптофана. Синтез
аминокислоты будет в клетке продолжаться до тех пор, пока в среде не появится
триптофан.

Триптофан соединяется с белком-репрессором и активирует его. Далее такой
активный комплекс присоединяется к гену-оператору и блокирует транскрипцию.
Таким образом, при наличии триптофана в среде, прекращается его внутриклеточный
синтез, экономятся ресурсы и энергия бактериальной клетки. В этом случае
триптофан является репрессором транскрипции. Регуляция осуществляется по
механизму репрессии.
Схема негативной репрессии. Оперон синтеза триптофана у E. сoli.
В

опероне

имеется

5

цистронов,

которые

кодируют

ферменты

последовательной цепи реакций синтеза триптофана. В норме оперон включен. Белок
- репрессор неактивен (в форме апо-репрессора), он не способен садиться на
оператор. Клетке нужно N молекул триптофана. N+1-ая молекула взаимодействует с
апо-репрессором. Он меняет конформацию, садится на оператор и синтез РНК
прекращается, белок репрессор "выключает" оперон.

Регуляция образования рибосомных РНК и белков рибосом E.сoli
Ежеминутно в E.сoli образуется около 500 рибосом (всего в клетке 10000-50000
рибосом). Имеется 7 оперонов, в которых закодированы rРНК (всего 3 разных rРНК
х 7оперонов = 21 ген). В формировании рибосом участвуют 52 различных белка, а

значит 52 гена, их кодирующих. В итоге, 73 гена должны работать координированно,
чтобы не было избытка белков или rРНК. Вначале образуется про-рРНК, которая
метилируется и процессируется (т.е. "созревает").
Количество рРНК регулируется количеством рибосомных оперонов, скоростью
их транскрипции и работой ферментов метилаз и эндонуклеаз.
Имеется 7 разных оперонов, в которых закодированы рибосомные белки. Регуляция
каждого из них осуществляется отдельно.

-оперон

регулируется

белком S4. Если в клетке имеется
свободная

16S

рРНК,

то

S4

связывется с ней (1). Если же 16S
rРНК не хватает, то он связывается
с мРНК, считывающейся с данного оперона (2). Причем связывается в районе лидера
и тем самым мешает трансляции. Осуществляется регуляция на уровне трансляции.

Оперон S10 регулируется белком L4. РНК-полимераза синтезирует первую
лидерную последовательность, длиной 140 нукл. Если 23S рРНК не хватает (1), то
белку L4 не с чем соединяться, и он взаимодействует с лидерной
последовательностью, придавая ей такую конформацию, которая не позволяет РНКполимеразе продолжать транскрипцию. В результате синтез мРНК обрывается на
первом же лидере (2). Так происходит регуляция на уровне транскрипции.

Регуляция транскрипции и трансляции у эукариот

Регуляция биосинтеза белка у эукариот - это более сложный процесс, так как
транскрипция и трансляция происходят в разных компартментах и обеспечиваются
большим количеством соответствующих структур. На уровне транскрипции
регуляторные механизмы у прокариот и эукариот имеют ряд общих черт. Рассмотрим
некоторые отличительные особенности. Существенное усложнение эукариотических
организмов повлекло за собой появление новых способов регуляции активности
матричных биосинтезов. Известно, что в клетках эукариот ДНК, соединенная с
белками (гистонами), упакована в нуклеосомы. В этом состоянии транскрипция
невозможна, и для экспрессии генов необходимо деблокирование транскриптона.
Следовательно, образование и разрушение нуклеосом является важным фактором
регуляции эукариотических генов.
Фосфорилирование гистонов. В результате действия белков гормонов
происходит опосредованное фосфорилирование ядерных белков – гистонов и
разрушение нуклеосом. Матрица при этом становится доступной для основных
факторов инициации транскрипции, и начинается синтез РНК. При прекращении
действия гормонов нуклеосомы восстанавливаются.
Ацетилирование и деацетилирование гистонов. Это важный фактор
регуляции генной активности. Оказалось, что фермент гистон-ацетилаза
ассоциирована с фактором ТАФ. Ацетилирование проходит по терминальному
остатку лизина в полипептидной цепи гистона. В результате ацетилирования
положительный заряд белка уменьшается, и сродство гистона к отрицательно
заряженной ДНК снижается. Это может привести к разрушению нуклеосом и
деблокированию транскриптона. Деацетилирование гистонов приводит к
противоположному эффекту. Специфические ацетилаза и деацетилаза
ассоциированы с белками инициации транскрипции.
Для клеток эукариот характерна амплификация генов и их перестройка. Оба
механизма обеспечивают резкое увеличение копий тех или иных белков,
необходимых для реализации клеточного метаболизма.
Амплификация – это увеличение количества генов, точнее многократное
копирование одного гена. Естественно, все полученные копии равнозначны и

одинаково активно обеспечивают транскрипцию. Например, противоопухолевый
препарат метотрексат препятствует работе дигидрофолатредуктазы, фермента,
необходимого для синтеза дезоксирибонуклеотидов. При этом в опухолевых
клеткахпроисходит амплификация гена этого фермента, что приводит к
многократномуувеличению синтеза дигидрофолатредуктазы и невосприимчивости
опухолевых клеток к метотрексату.
Перестройка генов. Нуклеотидные последовательности, кодирующие
белковую молекулу могут оказаться разделенными на отдельные сегменты, не
связанные между собой. Например, иммуноглобулины состоят из тяжелой и легкой
цепей, каждая из которых включает собственные вариабельную и константную части.
Существует множество вариантов как вариабельной, так и константной частей.
Генетическая информация об этих вариантах локализована подчас в разных
хромосомах. При дифференцировке В-лимфоцитов значительно удаленные сегменты
генетического материала переносятся и группируются рядом – происходит
генетическая рекомбинация.
Единицей транскрипции у эукариот является отдельный ген, а не оперон, как у
прокариот. Оператор, как таковой, отсутствует. Промотор есть, но он организован
иначе. На расстоянии -25 п.н. от +1 нукл. находится ТАТА-бокс. Его позиция
определяет точку инициации
транскрипции. А на
расстоянии -60-80 п.н.
находится

ЦААТ-бокс,

который не является абсолютно необходимым, но присутствует перед большинством
генов. Расстояние между ЦААТ и ТАТА большое и РНК-полимераза не способна
накрыть всю эту область. ЦААТ опознается своим белком, а ТАТА - своим.
Регуляторными элементами являются белки инициаторного комплекса,
описанные ранее, и особые нуклеотидные последовательности, способствующие
интенсификации транскрипции – энхансеры. Характерная особенность этих структур
заключается в том, что они влияют на скорость транскрипции независимо от
локализации в опероне. Белки, взаимодействующие с энхансерами, называются

энхансерными элементами, расположенными на расстоянии 1000-2000 пар оснований
от региона промотора. Эти белковые факторы способны воздействовать на
инициацию транскрипции благодаря образованию ДНК-петли, что приводит к
пространственному сближению энхансерных элементов и, например, белков ТАТА.
Энхансеры (англ. to enhance - усиливать) – участки ДНК в 10-20 пар оснований,
способные значительно усиливать экспрессию генов той же ДНК. В отличие от
промоторов они значительно удалены от транскрипционного участка и могут
располагаться от него в любом направлении (к 5’-концу или к 3’-концу). Сами
энхансеры не кодируют какие-либо белки, но способны связываться с регуляторными
белками.
Энхансеры

-

это

не

последовательности нуклеотидов.

непрерывные
Существуют

так

называемые модули - это отдельные части энхансеров.
Одинаковые модули могут

встречаться в разных

энхансерах. Для каждого энхансера набор модулей уникален.
Модули - это короткие последовательности, не более 2-х витков
спирали (20 п.н.), которые могут находиться перед, за и даже внутри гена. Таким
образом, М1+М2+М3+М4 - один энхансер, но он состоит из 4-х модулей. Все 4
модуля узнаются своими белками, а они, сидя на ДНК, взаимодействуют друг с
другом. Если в клетке присутствуют все соответствующие белки, то участку ДНК
придается определенная конформация и начинается синтез мРНК.
Сайленсеры (англ. silence - молчание) - последовательности ДНК,
ослабляющие транскрипцию генов при взаимодействии с определенными
регуляторными белками. При соответствующем наборе белков экспрессия отдельных
генов в клетке может быть подавлена.
Весьма существенным фактором регуляции транскрипции является процессинг
РНК. Образование зрелых мРНК зависит от скоростей кэпирования, образования
полиА, а также скорости сплайсинга. Для полицистронных мРНК определенное
регуляторное значение имеет альтернативный сплайсинг.

Процессинг мРНК – некоторые пре-мРНК подвергаются разным вариантам
сплайсинга (альтернативный сплайсинг) в результате чего образуются разные
мРНК,и соответственно, белки с разной функцией. Примером может служить
образование двух типов тяжелых цепей IgM в В-лимфоцитах, один из которых
удерживает IgM намембране, другой позволяет антителу нормально секретироваться
наружу.
Изменение стабильности мРНК – чем выше продолжительность жизни мРНК
в цитозоле клетки, тем больше соответствующего белка наработается. Например,
установлено, что при наличии пролактина в клетках молочной железы время полужизни мРНК белка казеина значительно увеличивается, а эстрадиол продлевает время
полужизни мРНК белка вителлогенина в десятки раз.
Регуляция образование рибосом у эукариот. Ядрышко - место образования
субъединиц рибосом, наблюдаемое в световой микроскоп. Одновременно в
эукариотическом ядре находятся сотни тысяч субъединиц рибосом. В ядре может
быть

несколько

ядрышек.

Кластер

генов

рРНК

называют

ядрышковым

организатором.
Гены рРНК присутствуют в количестве от 10 до 105 копий у разных видов (105
у амфибий). У
человека - 300 генов,
которых закодированы
рРНК. Все рибосомные
гены, кроме генов 5S
рибосомной РНК, сближены (т.е располагаются один за другим) и образуют
несколько кластеров. Сначала синтезируется про-рРНК, после созревания которой
образуются 28S, 18S и 5,8S рРНК.

в

Кроме белков инициаторного комплекса, на скорость транскрипции оказывают
существенное влияние ДНКсвязывающие белки. Из нескольких
семейств наиболее известны белки
типа: цинковые пальцы, спиральвиток-спираль

и

гомеодоменные

белки. Специфическое связывание
этих белков с ДНК происходит в
результате взаимодействия боковых
радикалов аминокислотных остатков
белка с основаниями ДНК.
Цинковые пальцы представляют собой серию повторяющихся доменов (от 2 - до
9), имеющих форму пальца. В центре координации каждого домена находится цинк.
В одних случаях цинк соединен с четырьмя остатками цистеина, в других – с двумя
цистеинами и двумя гистидинами.
Рис. Регуляция транскрипции у эукариот: 1 - регуляторные участки ДНК;регуляторные белки; 3 - белки-коактиваторы; 4 - РНК-полимеразный комплекс

Рис. Регуляция этапов реализации генетической информации в фенотипическую
Процесс реализации генетической информации регулируется на этапах: 1 транскрипции; 2 - посттранскрипционных модификаций; 3 - транспорта мРНК из ядра
в цитоплазму; 4 - продолжительности жизни мРНК; 5 - трансляции; 6 -

посттрансляционных превращений полипептидных цепей; 7 - продолжительности
жизни белка
На синтез белка также влияет скорость транспорта РНК в цитоплазму. В
цитоплазме мРНК, взаимодействуя с определенными белками, образует
информосому – своеобразное депо, из которого мРНК освобождается по мере
надобности для синтеза белка. Скорость освобождения мРНК также является
фактором регуляции белкового синтеза. Скорость синтеза белка напрямую зависит от
количества мРНК, которое определяется временем ее «полужизни» или
стабильностью in vivo. Таким образом, факторы, влияющие на стабильность мРНК,
являются регуляторами экспрессии генов и, как следствие, белкового синтеза. Одной
из структур, определяющих стабильность мРНК, является полиА –
последовательность на 3'-ОН-конце.
Таким образом, факторы, влияющие на регуляцию транскрипции и
экспрессию

генов:

амплификация

генов,

перегруппировка

генов,

белки

инициаторного комплекса, ДНК-связывающие белки, сплайсинг мРНК, стабильность
мРНК, транспорт мРНК в цитоплазму.
4. Ингибиторы матричных биосинтезов, применение в медицине
Существует множество ингибиторов транскрипции. Они действуют по разным
механизмам и на разных стадиях. Большинство из них - антибиотики.
Рифампицин - ингибитор инициации. Связывается с центром инициации holoРНК-полимеразы E. сoli. Стрептолидигин - ингибитор элонгации. Связывается с
центром элонгации core-РНК-полимеразы E. сoli.
Лекарственное ингибирование транскрипции
1. Гетероциклические соединения доксорубицин, дауномицин и актиномицин
D обладают способностью интеркалировать (встраиваться в молекулу ДНК) между

двумя соседними парами оснований Г-Ц. В результате возникает препятствие для
движения РНК-полимеразы («заедание молнии») и остановка транскрипции.
2. Рифампицин связывается с β-субъединицей РНК-полимеразы прокариот и
ингибирует ее. Благодаря такой избирательности действия рифампицин действует
только на бактерии и является препаратом для лечения туберкулеза.
3. α-Аманитин, октапептид, вещество бледной поганки (Amanita phalloides)
блокирует РНК-полимеразу II эукариот и предотвращает продукцию мРНК.
Лекарственная активация транскрипции
Активация транскрипции используется в клинике намного реже и заключается
в применении аналогов стероидных гормонов для достижения анаболического
эффекта в органе-мишени.
Лекарственная регуляция трансляции
1. Инактивация факторов инициации:
• интерферон активирует внутриклеточные протеинкиназы, которые, в свою
очередь, фосфорилируют белковый фактор инициации ИФ-2 и подавляют его
активность.
2. Нарушение кодон-антикодонового взаимодействия:
• стрептомицин присоединяется к малой субъединице и вызывает ошибку
считывания первого основания кодона.
3. Нарушение элонгации:
• тетрациклины блокируют А-центр рибосомы и лишают ее способности
связываться с аминоацил-тРНК
• левомицетин связывается с 50S-частицей рибосомы и ингибирует
пептидилтрансферазу
• эритромицин связывается с 50S-частицей рибосомы и ингибирует транслоказу
• пуромицин по структуре схож с тирозил-тРНК, входит в А-центр рибосомы и
участвует в пептидилтрансферазной реакции, образуя связь с имеющимся пептидом.

После этого комплекс пуромицин-пептид отделяется от рибосомы, что останавливает
синтез белка.
Таблица. Ингибиторы матричных биосинтезов, в том числе лекарства
Объект

Ингибитор

Механизм действия

Ингибиторы репликации и/или транскрипции
Человек и

Противоопухолевые

Интеркаляция в ДНК

животные

препараты

(дауномицин и др.), ингибиторы

(«антибиотики»)

ДНК-топоизомеразы II
(новобиоцин) и др.

Ингибиторы транскрипции
Бактерии

Рифамицины

Ингибиторы β-субъединицы РНКполимеразы

Человек

Токсин грибов α-

Ингибитор РНК-полимеразы II

аманитин
Ингибиторы трансляции
Бактерии

Антибиотики

В тексте

Бактерии, клетки Пуромицин — аналог Тир Преждевременная терминация
человека и

— тРНКтир

животных
Человек

Экзотоксин дифтерии

АДФ — рибозилирование и
ингибирование фактора
транслокации EF2

Человек и

Интерфероны —

Фосфорилирование и инактивация

животные

лекарства против

фактора инициации IF2,

генерализации вирусной

разрушение РНК, нарушение

инфекции

сплайсинга мРНК

Человек
животные

и Рицин (N-гликозидаза)

Удаление аденина и инактивация
28S рРНК

Ингибиторы транскрипции и/или репликации — это большая и очень важная
группа противоопухолевых препаратов, условно называемых антибиотиками. Среди
них имеются лекарства с разным механизмом действия.
1. Интеркаляторы (дауномицин, доксорубицин) встраиваются внутрь
молекулы ДНК между гуанином и цитозином противоположных цепей и тормозят
репликацию и транскрипцию и, следовательно, деление клеток. Аналогично
действует и актиномицин D, но он реже используется в онкологии из-за большой
токсичности.
2.

Ингибиторы

ДНК-топоизомеразы II

(новобиоцин, даунорубицин,

эпирубицин, идарубицин) ингибируют один из ферментов репликации, а также
индуцируют образование токсических гидроксильных радикалов.
3.

Азидотимидин

—

3’-аномальный

нуклеозид

с

измененной

2’-

дезоксирибозой после фосфорилирования до дНТФ включается в ДНК и
останавливает репликацию (удлинение цепи по 3’-углероду пентозы). Особенно
эффективен этот препарат для ингибирования кДНК вируса ВИЧ.
4. Аномальный нуклеозид цитарабин, превращаясь в организме в дНТФ,
ингибирует

ДНК-полимеразы.

Рассмотренные

противоопухолевые

препараты

тормозят размножение и злокачественных клеток, и в меньшей мере здоровых клеток,
так как в последних синтез ДНК и митозы проходят с меньшей скоростью. Так эти
неспецифические цитостатики проявляют свой побочный эффект. Кроме того, их
действие

на

опухолевые

клетки

происходит

быстрее

благодаря

большей

проницаемости мембран перерожденных раковых клеток.
Ингибиторы транскрипции рассмотрены в табл. Антибактериальные
рифамицины (против туберкулеза, гонореи и др.) ингибируют бактериальную РНКполимеразу.
Ингибиторы синтеза белка. Фрагмент дифтерийного токсина как фермент
катализирует АДФ-рибозилирование фактора элонгации EF2 в клетках зева и гортани
человека, чем его инактивирует и останавливает трансляцию на этапе элонгации, в
фазе транслокации, индуцируя характерную патологию. Белок клещевины рицин, как
N-гликозидаза, нарушает структуру 28S-рРНК, ингибирует синтез белка и поэтому

вызывает токсикоз вплоть до гибели человека. Существует несколько
интерферонов,относящихся к системе неспецифической резистентности организма.
Вирусы, некоторые бактериальные продукты и индуцируемые или медикаментозные
вещества (двухтяжевая РНК) провоцируют синтез интерферонов в клетках человека
и животных. Интерфероны — небольшие белки, часть из них — гликопротеины.
Как гормоны (цитокины) местного действия они тормозят инфицирование клеток
вирусами и даже могут ингибировать размножение бактерий. Интерфероны
специфичны в отношении клеток-хозяина, т.е. интерферон человека защищает только
клетки человека, но малоспецифичны по отношению к виду вируса. Интерфероны
синтезируются в лейкоцитах (α-), фибробластах (β-) и Т-лимфоцитах (γинтерфероны). Они имеют разнообразную активность: антивирусную (α- и β-),
антиопухолевую, антипролиферативную, радиопротекторную. γ-интерферон
представляет собой иммуномодулятор, способный влиять на активность Т-, Влимфоцитов и макрофагов в отношении синтеза антител и фагоцитоза.
Противовирусное, а возможно, и противоопухолевое действие интерферонов связано
со следующим. 1. В зараженных вирусом клетках они индуцируют синтез
протеинкиназы, которая фосфорилирует и инактивирует фактор инициации
трансляции IF2; в рибосомах зараженных клеток прекращается синтез и вирусных, и
клеточных белков (вирусы не имеют собственных рибосом); клетка погибает,
распространение вируса в организме прекращается. 2. Интерфероны индуцируют
синтез олигоаденилатсинтетазы, катализирующей образование 2’,5’–олигоА,
который, во-первых, нарушает созревание (сплайсинг) мРНК и, во-вторых,
активирует латентные РНКазы, разрушающие все РНК.
Ингибиторы трансляции у бактерий представлены в табл.
Таблица. Антибиотики — ингибиторы синтеза белка бактерий
Антибиотик

Мишень действия

Стрептомицин

Инициация трансляции

Тетрациклин

Элонгация, фаза 1

Эффективен против
Возбудителя туберкулеза
Бактерии Gr+, Gr– и
риккетсии Gr–

Амфениколы

Элонгация, фаза 2

(хлорамфеникол)

Бактерии Gr+, Gr– и
риккетсии Gr–

Макролиды

Элонгация, фаза 3

Бактерии Gr+

(эритромицин)
Таким образом, ингибиторы матричных биосинтезов вызывают: 1) гибель
бактерий и раковых клеток (это антибиотики); 2) гибель клеток, зараженных
вирусами (это интерфероны); 3) инфекционные болезни (это, например, экзотоксин
дифтерии); 4) отравления (это токсин гриба бледной поганки α-аманитин).

5.

Механизмы

генетической

изменчивости.

Полиморфизм

белков.

Наследственные болезни
В процессе эволюции биологических видов происходило увеличение размеров
и разнообразия их генома (ДНК или РНК) в результате сочетания рекомбинаций и
мутаций. Условно выделяют дихотомическую эволюцию, т.е. появление новых
генных локусов и генов в структуре ДНК (неравный кроссинговер, дупликации
генов), и филетическую эволюцию. Последняя — это мутации идентичных,
дуплицированных генов с возникновением новых генов. Такое сочетание двух
эволюционных процессов привело к тому, что у современной кишечной палочки
небольшой размер ДНК (3,8 х 106 нуклеотидных пар (н.п.) и молекулярная масса 2 х
109 Да) и общее количество белков и генов около 3000, а у человека,
соответственно,в ДНК (в гаплоидном наборе всех хромосом) 3,8 х 109 н.п., 2 х 1012
Да, а количество белков (не считая иммуноглобулинов) и их кодирующих генов —
около 35 000. При этом в процессе эволюции постоянно возрастало количество
служебныхпоследовательностей в ДНК, которые не кодируют белки, и эта доля
негенных участков у человека, вероятно, составляет около 90%.
Таблица. Молекулярные основы изменчивости
Изменчивость

Генотипическая

Модификационная

Молекулярный механизм Изменение первичной
структуры ДНК или

Изменение первичной
структуры мРНК и белка

геномной РНК
Уровень
изменчивости

процесса Рекомбинация в процессе

Ошибки процессов

кроссинговера, ошибки

транскрипции и

репликации,

трансляции под

нерепарируемые

действием экзогенных и

повреждения ДНК,

эндогенных факторов

мутации
Генотипическая гетерогенность. В результате того, что каждый ген у
человека имеется в двух копиях (аллелях), может подвергаться мутациям (замена,
делеция, вставка) и рекомбинациям, серьезно не затрагивающим функцию
кодируемого белка, то возникает полиморфизм генов, и, соответственно,
полиморфизм белков. Возникают целые семейства родственных белков, обладающих
схожими, но не одинаковыми свойствами и функцией.
Например, существует около 300 разных типов гемоглобина, часть из них
является необходимой на разных этапах онтогенеза: например, HbE –
эмбриональный, образуется в первые месяцы развития, HbF – фетальный, необходим
на более поздних сроках развития плода, HbA и HbA2 – гемоглобин взрослых.
Разнообразие обеспечивается разным набором глобиновых цепей: в гемоглобине E
присутствуют 2α и 2ε цепи, в HbF – 2α- и 2γ- цепи, в HbА – 2α- и 2β-цепи, в HbА2 –
2α- и 2δ-цепи.
Группы крови АВО зависят от строения особого углевода на мембране
эритроцитов. Лица с группой крови А0 на эритроците имеют олигосахарид с
присоединенным к нему N-ацетилгалактозамином, с группой крови В0 –
олигосахарид с галактозой, 00 – имеют только «чистый» олигосахарид. АВ – оба вида
сахаридов. Такие различия обусловлены разной специфичностью и активностью
фермента гликозилтрансферазы, способного модифицировать исходный
олигосахарид.

Белки главного комплекса гистосовместимости обеспечивают
трансплантационную несовместимость тканей. Они обладают чрезвычайно высоким
полиморфизмом и насчитывают несколько миллионов аллелей этих белков.
Благодаря такому разнообразию каждый человек обладает практически уникальным
набором аллелей.
Ферментопатии − это заболевания, развивающиеся в результате
наследственного дефицита некоторых ферментов или вследствие приобретенной их
недостаточности. Известно более 400 энзимопатий, связанных с нарушением обмена
углеводов, липидов, белков и аминокислот, азотистых оснований, порфиринов.
Энзимопатии могут приводить к нарушению важнейших метаболических путей,
блокированию синтеза жизненно важных метаболитов и продуктов, накоплению в
жидкостях и тканях организма субстратов и промежуточных продуктов реакций,
которые в ряде случаев оказывают токсическое действие на организм.
Примером врожденных нарушений метаболизма углеводов могут служить
гликогенозы и агликогенозы, характеризующиеся либо отложением в тканях
больших количеств гликогена, необычных его видов, либо нарушением синтеза
гликогена. Причиной гликогенозов служит дефицит или полное отсутствие
ферментов, катализирующих процесс распада гликогена. Агликогенозы возникают
при отсутствии ферментов синтеза гликогена.
В случае дефицита или отсутствия ряда лизосомных ферментов, принимающих
участие в обмене гликопротеинов, протеогликанов и гликолипидов, возникают
заболевания гликозидозы, мукополисахаридозы, гликолипидозы соответственно.
Они характеризуются накоплением в лизосомах почти всех тканей продуктов
неполного расщепления гетерополисахаридов и гликозаминогликанов. Общими
признаками разных форм таких заболеваний являются изменение скелета,
деформация суставов, поражение печени, селезенки, сердца, кровеносных сосудов,
задержка умственного и физического развития.

Схема возникновения наследственных болезней

Энзимопатии углеводного обмена

Наследственные нарушения
орнитинового цикла

1. Свободнорадикальное окисление: характеристика, значение в
норме и
патологии, пути образования активных форм кислорода.
Кислород

в

таблице

Менделеева имеет

порядковый номер – 8, заряд ядра – +8, общее
число электронов – 8, электронная формула
кислорода – 1s22s22p4. На 2р-подуровне атома
имеются

два

неспаренных

электрона,

т.е.

является

бирадикалом, обычное для кислорода окислительное число
равно -2. В процессе реакций восстановления кислорода
возникает ряд промежуточных метаболитов, которые
называются активными формами
кислорода (АФК). Они являются нестабильными молекулами и весьма
реакционноспособными соединениями. Кроме активных форм кислорода в
клетках могут образовываться активные формы азота и хлора – оксид азота
(NO*) и пероксинитрит (ONOO-), гипохлорная кислота (HOCl) и гипохлорит
(OCl-).

Активация кислорода происходит двумя различными механизмами:
1. Поглощение молекулой O2 достаточного количества энергии, чтобы
изменить спин одного из неспаренных электронов путем перехода из
триплетного в синглетное состояние:

2.Одноэлектронное
свободных

радикалов

восстановление
–

молекул

с

кислорода

с

образованием

неспаренными

электронами,

находящимися на внешней оболочке атома, обладающих очень высокой
реакционной способностью и повреждающим действием на клеточные
структуры.
При восстановлении
пероксида

водорода

гидроксил радикал,

образуется

обладающий

высокой

множество соединений,

энергией

и способный

включая

органические (белки, жирные

кислоты, нуклеиновые кислоты).

Однако

атаковать

из-за малой

продолжительности жизни он оказывает свое воздействие только в месте
возникновения.
В организме различают ферментативные и неферментативные пути
образования АФК.

Неферментативные пути образования АФК
Дыхательная

1.

митохондрий

цепь

является

основным источником АФК. Все
ее комплексы (особенно
Q)

коэнзим

способны

"терять"

электроны, которые
используются для образования АФК. Дополнительными индукторами
образования АФК являются гипоксия, ингибиторы дыхательных ферментов
или АТФ-синтазы, замедляющие скорость движения электронов и передачу
их на кислород в конце дыхательной цепи. Это приводит к «сбрасыванию»
электронов на кислород с образованием радикалов.
Микросомальное окисление с участием цитохромов Р450 и

2.
b5

синтезирует

некоторое

количество АФК. Это окисление
происходит

в

эндоплазматического

мембранах
ретикулума

всех тканей, кроме мышечной, и
используется

при

синтезе

и

метаболизме ряда веществ (желчных кислот, эйкозаноидов, холестерола и
т.п.), или для
окисления веществ при их обезвреживании. В одной из реакций происходит
спонтанная передача электрона на присоединившийся кислород и образуется
супероксид анион-радикал.

3.

Окисление гемоглобина

в

эритроцитах при участии гемового железа
с превращением гемоглобина в метгемоглобин.

4.
Спонтанная
двух

дисмутация

супероксид анион-радикалов с образованием синглетного кислорода и
пероксида водорода.

5.

Радиолиз воды. При действии ионизирующего излучения,

например, альфаизлучения, молекула
воды ионизируется, теряя электрон.
Высвобожденный

электрон

в

состоянии присоединиться к соседней
молекуле воды. Обе ионизированные
молекулы воды могут разлагаться на ионы H+ и HO– и на свободные
радикалы. Все образуемые частицы
быстро рекомбинируют друг с другом, получая и отдавая электроны, образуя
новые радикалы или ионы.

Ферментативные пути образования АФК
Некоторые ферменты при осуществлении реакции производят АФК
целенаправленно или спонтанно, выступая в роли прооксидантной
системы организма. Например, НАДФ-оксидаза, миелопероксидаза, NOсинтаза, а также
ксантиноксидаза,

моноаминоксидаза, оксидазы D- и L-аминокислот,
лизилоксидаза,

полиаминоксидазы,

циклоксигеназы,

липоксигеназы.

Образование свободных радикалов как главного продукта реакции
1. НАДФН-оксидаза

в

большом

количестве

локализуется

на

плазматической мембране моноцитов и гранулоцитов. Она представляет
собой мультикомпонентную систему, состоящую из цитозольных и
мембраносвязанных
стимуляции
быстрая

субъединиц.

фагоцитов

самосборка

При

происходит

цитозольных

и

мембранных компонентов в НАДФН-оксидазный комплекс.

Окисляя

НАДФН внутри клетки, НАДФНоксидаза одновременно связывает внеклеточный O2 и восстанавливает его до
супероксид анион-радикала, чем обеспечивает бактерицидный эффект при
фагоцитозе.

2. Миелопероксидаза – гемсодержащий фермент нейтрофилов, содержится
в азурофильных гранулах и секретируется из них при фагоцитозе. Также
фермент

содержится

в

слюне,

обеспечивая

ее

микробицидную

активность. Образованный в реакции гипохлорит-ион является сильным
окислителем, по агрессивности сопоставимым с ОН-радикалом. Он
реагирует с аминогруппами мембранных белков

бактерий с образованием хлораминов. Кроме этого, гипохлорит-ионы
способны генерировать гидроксил-радикалы в реакции с супероксид
анионом.
3. NO-синтаза
–
катализирующих

группа

НАДФН-зависимых

изоферментов,

сложную реакцию окисления аргинина с образованием оксида азота (NO).
Выделяют нейрональную, эндотелиальную и индуцируемую (в сердечнососудистой и иммунной системах)
формы фермента.
организме
функций,

Оксид азота в

выполняет
от

множество

регуляции

тонуса

сосудов до бактерицидного эффекта.
После формирования молекула NO
при

взаимодействии

с

супероксиданион-радикалом

может

превращаться в сильный окислитель
пероксинитрит-анион.

Образование
1.

АФК как

Моноаминооксидаза,

побочного продукта реакции
ФАД-

содержащий фермент, расположенный
на внешней мембране митохондрий, окисляет биогенные амины (гистамин,
серотонин, дофамин) в альдегиды. На эту реакцию расходуется до 2%
потребляемого кислорода, который превращается в H2O2.

2.

Оксидазы D-

и

L-аминокислот локализуются в пероксисомах

печени и почек, содержат флавиновые коферменты – ФАД
(оксидаза D-аминокислот) и ФМН (оксидаза L-аминокислот).
3.

Ксантиндегидрогеназа – фермент, содержащий в своем составе ФАД,
молибден и железо. Она принимает участие в конечных реакциях
катаболизма пуриновых нуклеотидов АМФ и ГМФ – превращает
гипоксантин и
ксантин

в

мочевую
кислоту.

В

аэробных
условиях
фермент
использует в качестве акцептора электронов НАД с образованием
НАДН. Однако в клетке может происходить превращение
фермента

в

О2-

зависимую
ксантиноксидазу. Превращение может запускаться разными механизмами,
включая

окисление

SH-групп

остатков

цистеина

в

ферменте

или

ограниченный протеолиз. Образуемая ксантиноксидазой H2O2 составляет
существенную долю в общей массе
АФК клетки.

4.

Лизилоксидаза, медь-содержащий белок, работает в межклеточной
среде

и

необходим

для

синтеза фибрилл коллагена.
Он окисляет остатки лизина

в белковой цепи коллагена до альдегидных групп (аллизин), и далее
самопроизвольная реакция между

аллизином и

лизином

обеспечивает ковалентное "сшивание" молекул коллагена между собой и
образование

прочных

нерастворимых

фибрилл

коллагена.

Пероксид

водорода является побочным продуктом процесса.

Образование
гидроперекисей жирных
кислот при биосинтезе
эйкозаноидов –
простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов.
1.

Липоксигеназы – железосодержащие ферменты, присоединяющие два

атома кислорода к полиненасыщенным жирным кислотам. Продуктом
реакции является гидропероксид жирной кислоты, который в дальнейшем
используется для синтеза лейкотриенов, важнейших регуляторов активности
лейкоцитов.
2.

Циклооксигеназы

кислотам

четыре

присоединяют

к

полиненасыщенным

жирным

атома

кислорода с
образованием
гидроперекиси – простагландина G (PgG), который далее идет
на образование других простагландинов, простациклинов,
тромбоксанов.

Свободно-радикальные процессы в норме имеют важное значение
для

обновления

состава

и

поддержании

функциональных

свойств

биомембран, энергетических процессов, клеточного деления, синтеза
биологически активных веществ, внутриклеточной сигнализации.
1.

Регуляция сосудистой системы. Одна из активных

молекул, оксид азота NO, участвует в физиологических реакциях
организма. Являясь нейромедиатором, он регулирует сосудистый
тонус, расслабляя гладкую мускулатуру сосудов, и также называется
эндотелиальный фактор релаксации сосудов. Также NO снижает
агрегацию тромбоцитов, адгезию нейтрофилов к эндотелию.
2.

Участие в реакциях воспаления. Супероксид анион-

радикал принимает участие в выработке хемотоксинов и в цитокинопосредованных реакциях. Вместе с указанным его взаимодействие с
оксидом азота NO приводит к двум важным следствиям: o снижение
концентрации NO и, таким образом, повышение адгезии нейтрофилов к
эндотелию в зоне поражения, o образование пероксинитрита OONO–,
являющегося агрессивной молекулой и повреждающего клеточные
белки.
3.

Ускорение

обновления

белковых

структур.

Также

окисление макромолекул является естественным и необходимым
элементом в самообновлении клеток. Окислительная модификация
аминокислот является одним из механизмов маркировки белка для
протеолиза. К тому же лизосомальные протеазы быстрее гидролизуют
окисленный и денатурированный белок, что сокращает срок жизни и
ускоряет самообновление клеточных структур.
4.

Регуляция вязкости и обновление клеточных мембран.

Перекисное окисление липидов поддерживает жидкостность мембран
на определенном уровне, усиливаясь, например, при накоплении
холестерина,
липидов

уплотняющего

являются

фосфолипидный

промежуточным

бислой.

продуктом

при

Перекиси
биосинтезе

эйкозаноидов, участвуют в регуляции мембранных ферментов. Таким
образом, реакции ПОЛ в организме играют роль не только
повреждающего, но и регулирующего фактора.
Регуляция внутриклеточного метаболизма. В малых

5.

количествах

АФК

усиливают

регенерацию,

дифференцировку,

пролиферацию клеток. Существует механизм передачи сигнала,
называемый АФК-зависимый сигналинг, этим образом АФК участвуют
в клеточном росте, их делении и апоптозе. Механизмы рецепции и
передачи

АФК-сигналов

описаны

пока

только

схематически.

Основными компонентами этих схем являются АФК-чувствительные
протеинкиназы и протеинфосфатазы, АФКчувствительные транскриптфакторы, белки теплового шока, редокс-регулируемые ионные каналы.
Антиоксидантные белки, изменяя степень окисления сигнальных
белков и ферментов, также участвуют во всех этих процессах.
Участие в реакциях иммунитета. Проявляя свойства

6.
радикала,

синтезируемый
фагоцитами

оксид

азота

может

NO

оказывать
цитотоксический

и

бактерицидный
эффект, хотя большую
роль в этом играет его
производное
– пероксинитрит (ONOO–).

Образование

NO

индуцибельной NO-синтазы в иммунных клетках играет

с

участием

роль в

образовании интерлейкинов и

других индукторов

воспаления. Свободнорадикальное окисление участвует в реакциях
специфического и неспецифического иммунитета. Ярким проявлением роли
свободных радикалов в иммунитете является фагоцитоз, осуществляемый
нейтрофилами, моноцитами, тканевыми макрофагами, купферовскими
клетками, остеокластами, клетками микроглии. Ведущую роль играет
генерация клетками кислородных радикалов (супероксид анион-радикал) и
оказываемый ими бактерицидный эффект.
В фагоцитах резко изменяется метаболизм, что получило название
"дыхательного" или "респираторного" взрыва. Потребление кислорода
клеткой возрастает в 20-40 раз. При этом 90% потребляемого клеткой
кислорода быстро превращается в супероксид анион-радикал под действием
мембранного фермента НАДФН-оксидазы и выделяется во внеклеточное
пространство

(цитотоксический

(бактерицидный эффект).

эффект)

или

внутрь

фаголизосомы

Большая часть супероксид анион-радикала вне

клетки спонтанно превращается в пероксид водорода. Другая часть
супероксида превращается в H2O2 при участии бактериальной или
межклеточной

СОД.

Одновременно,

дегрануляция

нейтрофила

сопровождается высвобождением еще одного фермента, миелопероксидазы,
в фагосому, который используя перекись водорода H2O2, образует
гипохлорную кислоту (HOCl) и гипохлорит-ион (ClO–). При наличии в среде
H2O2 и ионов Fe2+ может происходить реакция Фентона, присутствие H2O2 и
супероксида запускает реакцию Хабера-Вайса. Эти реакции сопровождаются
образованием чрезвычайно активного гидроксилрадикала. Кроме названных
АФК, фагоциты в состоянии атаковать бактерий и при помощи оксида азота.
Для постоянного образования непрерывно распадающихся АФК требуется
непрерывный приток НАДФН, ресинтез которого связан с окислением
глюкозы в пентозофосфатном пути.

Свободно-радикальные процессы при патологии. Гипоксия клеток
является распространенным явлением в жизнедеятельности организма как в
норме, так и в патологии. Ряд нарушений, таких как заболевания сердечнососудистой и бронхолегочной систем, тромбозы, разнообразные анемии
имеют в своем патогенезе состояние клеточной гипоксии. Установлено, что
недостаточность кислорода приводит к активации образования АФК и
свободнорадикального окисления.
Предложены несколько возможных механизмов этой активации:
1.

Конверсия

ксантиндегидрогеназы.

В

обычных

условиях

последние реакции катаболизма пуриновых нуклеотидов до мочевой кислоты
катализируются ксантиндегидрогеназой, которая использует в качестве
акцепторов электронов НАДН. В ишемизированной ткани происходит
частичный протеолиз ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу. Последняя в
качестве акцептора электронов использует молекулу кислорода и образует
H2O2. Учитывая факт, что при длительной гипоксии замедляются реакции
окислительного фосфорилирования и часть адениловых нуклеотидов
оказываются "лишними" и попадают в катаболизм, можно понять, что
количество образуемого H2O2 будет велико.
2.

Увеличение утечки с дыхательной цепи. При гипоксии утечка

электронов с дыхательных комплексов усиливается. Это объясняется
относительно невысоким сродством цитохромоксидазы (комплекс IV) к
кислороду.

Поэтому

при

снижении

концентрации

кислорода

цитохромоксидаза оказывается не может передать получаемые электроны на
молекулы кислорода. При этом на предыдущих дыхательных комплексах
электроны замедляют свой бег, и их "утечка" на кислород усиливается.
3.

Образование адренохрома. Данный механизм рассматривается,

как правило, в связи с развитием инфаркта миокарда. В этом случае болевой

синдром

сопровождается

выбросом

катехоламинов

–

адреналина

и

норадреналина. Окисление адреналина до адренохрома происходит в
результате внутримолекулярных перестроек молекулы адреналина путѐм
дегидрирования и циклизации с образованием промежуточных хинонов.
Этот процесс сопровождается одноэлектронным восстановлением кислорода
и связан с образованием супероксид анион-радикала. К тому же
нейтрализация других продуктов окисления адреналина и накопление
глутатионовых

конъюгантов

адреналина

и

адренохрома

истощают

антиоксидантные системы клеток и тканей.
4.

Активация нейтрофилов. На стадии необратимой ишемии и

инфаркта, когда ишемизированная ткань инфильтруется нейтрофилами, в
межклеточной среде появляются продукты клеточного распада. Развитие
реакций протеолиза и фосфолиполиза
поддерживает

погибающих

клеток

активацию приходящих фагоцитов и способствует

выделению ими супероксид анион-радикала.
5.

Деградация антиоксидантных систем.

При длительных

патологических процессах в ткани истощаются резервы неферментативных
антиоксидантов, активность антиоксидантных ферментов недостаточна для
противодействия

непрерывно

свободнорадикальные

процессы

поступающим
начинают

АФК.

нарастать

и

Поэтому
происходит

необратимое окисление HS-групп метаболических ферментов, глутатиона,
металлотионеинов, тиоредоксинов и пероксиредоксинов.

2. Перекисное окисление липидов (ПОЛ): субстраты, продукты ПОЛ,
стадии, механизмы повреждающего действия (перекисная гипотеза
гибели клеток)

«Окислительный стресс» - это состояние клеток, характеризующееся
избыточной продукцией эндогенных или накоплением экзогенных АФК на
фоне
недостаточной

активности

антиоксидантной системы организма.
Различные стимулы – ионизирующая
радиация, воспаление, промышленные
и бытовые токсины, гипо- и гипероксия
активируют

процессы

образования свободных
радикалов, которые мгновенно
инициируют

окисление веществ в

митохондриях, клеточной мембране,
мембранах ЭПР, повреждая ядерную и
митохондриальную ДНК, РНК,
белки,

фосфолипиды, гликозаминогликаны.

Свободнорадикальные

процессы

играют

роль

в

развитии

многих

заболеваний: рассеянный склероз, миодистрофия, болезнь Паркинсона,
болезнь Альцгеймера, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца и инфаркт
миокарда, женское бесплодие, хроническая обструктивная болезнь легких,
метаболический синдром.
Агрессивность
внутриклеточных

АФК

лежит

структур

и

в

основе

органелл.

деструкции
Перекисное

мембран,
окисление

жирнокислотных остатков фосфолипидов резко меняет свойства клеточных
мембран. Окисленные фосфолипиды формируют группы, т.н. кластеры,
образующие гидрофильные поры, что увеличивает проницаемость мембран и
ведет к потоку ионов Na+ и Са2+ внутрь клетки. Повышается микровязкость
мембран за счет снижения количества ненасыщенных фосфолипидов, в

результате интегральные белки оказываются как бы «вмороженными» в
более жесткую матрицу. Подвижность пептидной цепи, необходимая для
нормального

функционирования

ферментов,

рецепторов

и

каналообразующих белков, снижается. В результате функция белков
ингибируется, например, нарушается активность Са2+-АТФ-азы и Na+, K+АТФазы, ферментов дыхательной цепи и др.
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) снижает гидрофобность и
нарушает устойчивость мембран, изменяет работу мембрано-связанных
ферментов, повышает проницаемость мембран для ионов. Пищевые масла
при окислении прогоркают и приобретают неприятный запах. Основным
субстратом для свободно-радикальных реакций являются двойные связи
полиненасыщенных

жирных

полиненасыщенные

кислот.

жирные

кислоты находятся в составе
фосфолипидов и гликолипидов.
Большое

количество

фосфолипидов

с

полиненасыщенными жирными
кислотами также локализуется в
оболочке

липопротеинов

высокой, низкой и очень низкой
плотности.

В

результате

свободнорадикального
окисления

жирных

образуются

гидроперекиси

диеновые

кислот
и

конъюгаты

(первичные продукты), которые

В

клеточных

мембранах

очень нестабильны. При участии металлов переменной валентности они
быстро

метаболизируют во вторичные

диальдегиды)

и

и

(альдегиды

третичные (шиффовы основания) продукты ПОЛ.

ПОЛ включает в себя несколько стадий:
1. Инициация. 2. Развитие. 3. Разветвление. 4. Обрыв цепи.
В

момент

инициации

гидроксильный радикал атакует метиленовую группу,
расположенную между двойными связями, и выбивает электрон,
восстанавливающий
перестановка

гидроксил радикал до воды. Далее следует

двойной

связи, смещение радикальной группы и

взаимодействие ее с кислородом.
В

результате

липопероксильный

образуется
радикал.

Дальнейшее

взаимодействие

полученного

липоперекисного радикала со структурами соседних жирных кислот
приводит к его нейтрализации и появлению новых липоперекисных
радикалов, т.е. к развитию линейной цепной реакции с появлением новых
окисленных жирных кислот.
Кроме линейного развития, может происходить ветвление реакции за
счет получения гидроперекисью электронов от каких-либо металлов или при
воздействии

излучения.

Обрыв

цепной

реакции

происходит

при

взаимодействии радикалов друг с другом или в реакции с различными
антиоксидантами, например, витамином Е,

который отдает электроны, превращаясь при этом в стабильную окисленную
форму.
Первичными продуктами ПОЛ являются гидроперекиси жирных
кислот, они подвергаются дальнейшему распаду с образованием вторичных
продуктов

ПОЛ

диальдегидов,

–

различных

эпоксидов

и

спиртов,
других

кетонов,

соединений.

альдегидов

и

Наиболее

реакционноспособным из вторичных продуктов ПОЛ является малоновый
диальдегид. МДА способен реагировать с
NH2-группами

лизина

аминокислотами

белков,

фосфолипидов

и

или

N-концевыми

с

NH2-группами

гликозаминогликанов,

формируя поперечные и внутримолекулярные
мостики внутри молекулярных структур и
между молекулами с
образованием

шиффовых

оснований

(основания Шиффа).
Повреждение белков. В результате
окислительной атаки в белках появляются
поперечные сшивки внутри одной молекулы,
между разными белками, между белками и фосфолипидами.
этого активность ферментативных белков

Из-за

изменяется, возможности

структурных и сократительных белков
белки

падают,

каналообразующие

мембраны деформируются и

проницаемость мембран возрастает, жизнеспособность и функционирование
клетки уменьшаются. Продукты ПОЛ модифицируют остатки аминокислот,
фрагментирует пептидные цепи, приводя к сшивке белков, изменяет заряд
белка и его чувствительность к протеолизу.

В белках наиболее уязвимыми к повреждающему действию свободных
радикалов оказываются серосодержащие аминокислоты, остатки лизина,

триптофана и гистидина. Окислительное разрушение белка усиливается в
присутствии металлов, способных отдавать электроны, например, ионы Fe 2+.
Наличие металла позволяет локально образовывать гидроксил-радикал в
реакции Фентона и окислять аминокислотные остатки в непосредственной
близости.

В цистеине активные радикалы (АФК, хлорамины) способны

отрывать атом водорода от SH-группы, формируя тиольные радикалы и
дисульфидные сшивки между белками.
Образуемый миелопероксидазой гипохлорит-ион (OCl–) по силе
воздействия сопоставим с гидроксил-радикалом, атакует аминогруппы
остатков лизина в белках с образованием структур хлораминов. При этом
бактерицидный

эффект

гипохлоритиона

обусловлен

дальнейшим

отщеплением хлораминовой группы, окислением δуглеродного атома лизина
до альдегидной группы и появлением новой аминокислоты аллизина.
Аналогичным эффектом на лизин в белках обладают гидроксил-радикалы и
пероксинитрит-ион.

Повреждение нуклеиновых кислот. Наличие большого количества
катионных групп в нуклеиновых кислотах позволяет ионам железа,
имеющимся в клетке, связываться с ними и участвовать в реакции Фентона с
образованием гидроксильных радикалов. Свободные радикалы индуцируют в
живой клетке многочисленные повреждения РНК и ДНК: o с появлением
модифицированных и

неспаренных оснований, o вызывая одно- и

двунитевые разрывы между нуклеотидами цепи, o стимулируя разрывы
гликозидных связей между азотистым основанием и пентозой, o с
образованием сшивок между цистеином и тимином, o с возникновением
окисленных
образованию

пентозных

остатков. Окисление

8-гидроксигуанина,

оснований

5,8-дигидрокси–

тимидингликоля, к раскрытию цикла пуриновых оснований.

приводит
цитозина

к
и

3. Ферментативная и неферментативная антиоксидантная система
(АОС)
организма.
Для защиты от свободных радикалов клетками были выработаны
эффективные

механизмы

молекулярных

реакций

ликвидации

АФК,

называемые системой антиоксидантной защиты.

I. По локализации антиоксиданты можно разделить
• плазмы крови – аскорбиновая кислота, билирубин, мочевая кислота,
трансферрин, церулоплазмин, β-каротин
• мембранные – токоферол, убихинон, каротиноиды
• внутриклеточные

–

супероксиддисмутаза,

каталаза,

глутатионпероксидаза, глутатион-Sтрансфераза, глутатион, ферритин,
металлотионеины, пероксиредоксины, тиоредоксины.

II. По природе и действию:
Ферментативные

1.

Глутатионпероксидаза.

Супероксиддисмутаза.
4.

2.

Каталаза.

Глутатион-S-трансфераза.

3.
5.

Лактопероксидаза. 6.
Тиреопероксидаза.
Церулоплазмин.

7.

Пероксиредоксины.

8.

Неферментативные

1. Белки и пептиды: трансферрин, ферритин, металлотионеины,
тиоредоксины, глутатион, карнозин, ансерин.
2. Нутриенты: витамины – аскорбиновая кислота, токоферол,
каротиноиды – β-каротин, ликопин, биофлавоноиды – кверцетин,
ресвератрол, проантоцианиды, селен.
3. Метаболиты: билирубин, мочевая кислота, убихинон.

Ферментативная антиоксидантная система

Ферменты, ликвидирующие АФК
1.

Супероксиддисмутаза – фермент, представленный в цитозоле и

митохондриях, выполняет функции
антиоксидантного фермента, удаляя
агрессивный

супероксид

анион-

радикал и образуя при этом
более

устойчивый

водорода.

пероксид

У человека имеется три формы фермента: цитозольная и

внеклеточная формы, содержат металлы медь и цинк и митохондриальный
изофермент, включает марганец.
2.

Каталаза, гемсодержащий фермент,

присутствует в пероксисомах всех клеток

человека и обладает чрезвычайно высокой молекулярной активностью. В
эритроцитах она находится в цитозоле и защищает гемоглобин от окисления.
3.

Глутатионпероксидаза,
каталаза, является

как

и

гемсодержащим

ферментом и обезвреживает H2O2. Обладая в
1000

раз

большим

сродством

к

пероксиду

водорода, чем каталаза, она эффективна даже при
низких

его

концентрациях.

Особенностью

глутатионпероксидазы является
в

активном

центре

наличие

фермента

селеноцистеина, т.е. такого цистеина, в котором сера заменена на селен. В
качестве восстановителя для H2O2 фермент использует трипептид глутатион,
содержащий цистеин с его SH-группой. Окисленный в результате реакции
глутатион восстанавливается глутатионредуктазой.

Ферменты, использующие АФК
1.

Лактопероксидаза
гемсодержащий
гликопротеин,
который обнаруживается в молоке, слюне, слезной жидкости,
на слизистой оболочке

дыхательных путей. Ее
функцией является
использование H2O2 для
образования гипотиоцианата
(OSCN–), обладающего
бактериостатическим
действием.

Тиреопероксидаза

2.

(йодидпероксидаза) – фермент, участвующий в
образовании тиреоидных гормонов в белке тиреоглобулине в
щитовидной железе.
Пероксиредоксины

3.

–

антиоксидантные

ферменты,

контрол
ирующ
ие
уровень
цитокин
индуци
рованн
ых пероксидов,
участвующих
центре

в передаче клеточных сигналов. В активном

фермента

находятся SH-группы цистеина, которые окисляются до R-SOH состояния
пероксидным субстратом (например, липидной гидроперекисью).

4.

Церулоплазм
ин –

антиоксидантный
фермент плазмы крови,
содержит 6-8 ионов меди
(II) и окисляет ионы
до

Fe2+

Fe3+ без образования

гидроксилрадикала,

что

позволяет

железу связываться с белком трансферрином. Таким образом, церулоплазмин
обеспечивает равновесие между депонированием и использованием железа, а
применительно к СРО препятствует инициации свободнорадикальных
процессов
(реакция Фентона).

Неферментативная антиоксидантная система
Антиоксидантные белки
1.

Тиоредоксины – семейство небольших белков, содержащих остатки

цистеина

(-Цис-Гли-Про-

Цис-).

В

отношении антиоксидантной
защиты их функция сходна с
таковой

у

глутатиона

и частично с ней перекрывается.
С помощью HS-групп тиоредоксины выполняют функции: • восстановление
активности

некоторых ферментов (пероксиредоксины,

метионинсульфоксидредуктаза), • кофактор редуктаз, используемых при
синтезе дезоксирибонуклеотидов и при активации витамина К, •
восстановление дисульфидных связей в белках.

2.

Металлотионеины – небольшие, богатые цистеином (до 30% от

состава)

белки,

способные

связывать

ионы

металлов

переменной

валентности, такие как железо, цинк и медь, тяжелые металлы (например,
кадмий и ртуть). В результате действия этих белков металлы, способные
отдавать электроны, инактивируются.
3.

Другие белки проявляют антиоксидантную активность благодаря

способности связывать ионы железа и предотвращать реакцию Фентона.

Например, ионы Fe3+ в крови связываются с трансферрином, а внутри
клетки – с ферритином.

Небелковые антиоксиданты
Ряд низкомолекулярных веществ могут гасить свободнорадикальные
процессы, взаимодействуя с радикалами и переходя в радикальную, но менее
аткивную форму - токоферол (витамин Е) и каротиноиды (витамин А),
аскорбиновая кислота (витамин С), липоевая кислота и выступать в роли
ловушек свободных радикалов – это бензойная и мочевая кислоты,
билирубин, биофлавоноиды, одно- и многоатомные спирты, мелатонин,
эстрогены. Их химическая структура позволяет восстанавливать АФК.
Возникающие

при

этом

малоактивные

радикальные

формы

либо

взаимодействуют между собой, либо метаболизируют обычным образом,
либо нейтрализуются природными антиоксидантами.

4. «Программированная клеточная гибель»: биологическое значение,
классификация и сравнительная характеристика различных видов
гибели клеток

Классификация видов клеточной гибели. Номенклатурный комитет по
исследованию

гибели

клеток

по

совокупности

морфологических

и

биохимических изменений выделил четыре типичных вида клеточной смерти
- апоптоз, некроз, аутофагию и корнификацию (ороговение), а также восемь
атипичных видов (митотическую катастрофу, анойкис, экзитотоксичность,
валлеровское перерождение, параптоз, пироптоз, пиронекроз и энтоз).
Апоптоз

форма

-

самоликвидации

программируемой

имеет

ряд

клеточной

гибели.

морфо-функциональных

Процесс

характеристик,

приобретаемых клеткой за счет активации специфических метаболических
путей и молекулярных маркеров апоптоза.
Характерно прекращение деятельности клетки, сокращение псевдоподий,
уменьшение

объема

(кариорексис)
мембраны,

и

клетки

хроматина.

деполимеризуются

и

ядра

(пикноз),

Уплотняются

фрагментация

наружная

микротрубочки

и

ядра

цитозольные

цитоскелета,

актиновые

микрофиламенты связываются с мембраной, сокращаются - формируются
пузыревидные

выпячивания

(блеббинг).

Затем

-

фрагментация

на

окруженные мембраной апоптотические тельца без выхода содержимого
клетки в окружающую среду. Тельца поглощаются соседними клетками.
Физиологическая роль апоптоза:
1. Реализация морфогенеза в эмбриогенезе. Основное биологическое
назначение апоптоза - в процессе эмбрионального морфогенеза создавать
органы и ткани с эволюционно закрепленными конфигурациями и
размерами, поддерживая эти параметры в течение жизни.
2. Контроль клеточного гомеостаза и дифференцировки в онтогенезе.
Мониторинг внутренней среды клетки, в т.ч. клеточного ядра с его
содержимым; обеспечение правильного соотношения численности клеток
различных типов; селекция разновидностей клеток внутри популяции;
удаление

генетически

дефектных

клеток;

участие

в

клеточной

дифференцировке (эритропоэзе, созревании Т-лимфоцитов в тимусе,
кератинизации).
3. Участие в иммунных процессах. Реализация режимов толерантности,
цитотоксичности, клональной селекции, контроля численности популяции
лимфоцитов.
4. Контроль физиологической регенерации (обновления) клеток разных
тканей и органов и поддержании клеточного гомеостаза.
5. Реализация

программ

гормонзависимой

инволюции.

Отторжение

эндометрия во время менструального цикла, атрезия фолликулов
яичников, регрессия (обратное развитие) молочной железы после
прекращения лактации).
6. Участие в процессах старения. При старении интенсивность процессов
апоптоза нарастает. Генетический контроль над сменой интенсивности
пролиферации, дифференцировки и апоптоза на тканевом уровне,
постепенная убыль функционально активных клеток – механизмы
старения.
Некроз – развитие клеточного хаоса на фоне метаболической катастрофы,
вызванной тяжелыми внезапными повреждениями клетки. В развитии
некроза выделяют несколько стадий: паранекроза (стадия обратимых
изменений), некробиоза (необратимых), аутолиза (лизиса, разрушения). В
стадии паранекроза клетка временно теряет
способность

формировать

прижизненных

красителей,

гранулы
повышается

окрашиваемость цитоплазмы, ее вязкость и
кислотность,
коллоидов,

снижается

дисперсность

деполяризуется

ее

наружная

мембрана, нарушается клеточный метаболизм

и функции. При некробиозе хроматин конденсируется в крупные глыбки,
ядро уменьшается в объеме, становится сморщенным, плотным, интенсивно
базофильным - кариопикноз. Затем следует кариорексис (распад ядра на
фрагменты) и кариолизиз (полное разрушение остатков ядра). В цитоплазме
визуализируется набухание
митохондрий и деструкция мембран органелл, вакуолизация. Коагуляция
белков сменяется их колликвацией, спустя 6 ч от момента развития некроза
цитоплазма становиться гомогенной. Лизис клетки происходит в результате
действия своих же протеолитических ферментов – аутолиз. Содержимое
клетки поступает во внеклеточную среду, поглощается макрофагами и
нейтрофилами, развивается воспаление.
Некроз и апоптоз имеют ряд характерных особенностей. На схеме при
апоптозе указаны: 1) начало фрагментации хроматина и ядра, 2)
формирование апоптозных телец, 3) их фагоцитоз соседней клеткой. При
развитии

некроза:

4)

конденсация

хроматина

и

деградация

цитоплазматических структур, 5) мембраной.
Нет (или почти нет) поглощения фагоцитами. Пути реализации связаны с
активностью многочисленных белков Atg-семейства (autophagosome-related
proteins).
Индукторы

аутофагии

повреждѐнные

органеллы,

частично

денатурировавшие белки и их агрегаты, дефицит питательных веществ при
голодании, активные формы кислорода и свободные радикалы, токсины.
Выделяют

3

типа

аутофагии:

микроаутофагию,

макроаутофагию

и

шаперонзависимую аутофагию. При первой макромолекулы и обломки
клеточных мембран захватываются лизосомой. Таким путем клетка может
переваривать белки при нехватке энергии или строительного материала
(например, при голодании). Шаперонзависимый вариант аутофагии подобен,
но характеризуется направленным транспортом через лизосомальную

мембрану удаляемого белка после его комплексирования с шаперонами.
Индуцируется стрессом, участвуют цитозольные белки-шапероны семейства
hsc-70, вспомогательные белки и LAMP-2 (мембранный рецептор лизосомы
для связывания комплекса шаперона и белка, подлежащего транспорту в
лизосому). При макроаутофагии участок цитоплазмы (часто содержащий
какие-либо органоиды) окружается мембранным компартментом, похожим
на цистерну эндоплазматической сети. Такие двухмембранные органеллы,
окружающие

удаляемые

аутофагосомами.

органеллы

Аутофагосомы

и

соединяются

цитоплазму,
с

называют

лизосомами,

образуя

аутофаголизосомы, где содержимое аутофагосом переваривается. Реализация
одного из видов программируемой гибели контролируется самой клеткой на
молекулярном уровне.
Корнификация – вид гибели кератиноцитов эпидермиса. Характерны
изменения в мембране, аккумуляция липидов в F- и L-гранулах, затем
выделение гранул липидов (церамидов, холестерина и др.) во внеклеточное
пространство. Липиды заполняют межклеточные промежутки рогового слоя,
обеспечивая

его

барьерные

свойства.

Внутриклеточные

органеллы

разрушаются протеазами. Происходит аккумуляция элафина, кератиновых
промежуточных филаментов, лорикрина, инволюкрина, богатых пролином
белков. Между последними трансглутаминазы катализируют образование
межмолекулярных изопептидных связей. Филагрин собирает кератиновые
филаменты в плотные пучки, что способствует уплощению клетки,
характерному для корнеоцита рогового слоя. Ороговение способствует
формированию барьерных функций (предотвращение потери воды, защита от
микробных агентов, химических, механических воздействий).
Аноикис - форма гибели клетки, вызываемая утратой межклеточных
контактов. Молекулярные механизмы гибели клеток подобны таковым при
классическом апоптозе. В индукции участвуют гены семейства Bcl-2, jun-N,

PARP, RAF и эпителиальный фактор роста (EGRF). Аноикис предназначен
для поддержания определенного числа клеток в тканях эпителия. Его
нарушения,

устойчивость

к

аноикису может облегчать

образование

метастазов, поскольку позволяет клеткам выживать после открепления от
матрикса.
Митотическая катастрофа - это тип клеточной гибели в результате грубых
нарушений митоза, таких, как отставание хромосом в мета- и анафазе,
мультиполюсные

и

мультигрупповые

морфологическим

признаком

этой

мета-

формы

и

гибели

анафазы.

Ведущим

клетки

считается

образование одного или несколько микроядер, в которых отсутствуют
явления конденсации хроматина, что отличает ее от апоптоза. Ключевую
роль в развитии этого процесса играют гены chk1, chk2, atm, atr, p53, p21.
Валлеровская дегенерация - парциальный некроз нейрона, при котором
часть
(аксон) дегенерирует без распространения на тело клетки. Это понятие не
отражает программируемую клеточную гибель в буквальном смысле,
поскольку нейроны остаются живыми. Наблюдается в аксонах при
травматическом разрыве нервов и спинного мозга.
Экзитотоксичность

-

гибель

нейронов,

подвергшихся

действию

«возбуждающих» аминокислот (глутамата, аспартата), сопровождающаяся
открытием Ca2+ - каналов, активацией летальных сигнальных путей. Имеет
общие черты с апоптозом, некрозом. Критическим событием является
открытие митохондриальных пор.
Параптоз в отличие от апоптоза не может быть остановлен введением
ингибиторов каспаз или сверхэкспрессией проапоптотических белков bcl-2.
Может быть вызван экспрессией рецепторов инсулин-подобного фактора
роста I. Характерна интенсивная цитоплазматическая вакуолизация и
набухание митохондрий, но без других морфологических признаков некроза.

Пироптоз преимущественно характерен для моноцитов и
макрофагов, чаще сопровождает инфекционные процессы. Впервые
был описан как особая смерть макрофагов, вызваннная Shigella
typhimurium. Впоследствии было показано, что и другие бактериальные
и вирусные инфекционные агенты, а также синтетические аналоги
бактериального липопептида Pam3CSK4, натриевая соль мочевой
кислоты, a-токсин Staphylococcus aureus могут индуцировать развитие
пироптоза человеческих моноцитов. В развитии ключевую роль играет
снижение концентрации К+ в клетке. Другим ключевым фактором
является активация каспазы-1, избыточная продукция цитокинов. Это
ведет к перестройке цитоскелета, формированию выступов наружной
мембраны, к фрагментации ДНК и порообразованию. Есть признаки и
апоптоза, и некроза. Финал - осмотический лизис клетки. Выход IL-1β
(мощный провоспалительный цитокин и пироген), IL-18 и др. - важный
этап в развитии воспаления.
Пиронекроз как и пироптоз развивается через NLR (Nod-like receptors) и
ASC рецепторы в макрофагах, инфицированных бактериями, при высоком
соотношении бактерии/макрофаги. Однако не отмечено активации каспазы-1.
Энтоз - неапоптотический процесс клеточной гибели, при
котором одна клетка интернализируется внутри другой клетки. При
этом поглощенная клетка погибает в фагосоме, форма «клеточного
каннибализма».

5. Апоптоз: трансмембранные и внутриклеточные стимулы, стадии, роль
каспаз,
Ca2+ и Mg2+-зависимых эндонуклеаз, белка Р53 в развитии апоптоза
клетки

Каспазы - протеазы, реализующие программы клеточной гибели.
Это семейство

цистеиновых

аспартатспецифичных протеаз,
катализирующих гидролиз
пептидных связей, образованных
карбоксильными группами
аспарагиновой кислоты, что и
сформировало их название
(cysteinyl (С+) aspartate (asp +)
proteases (ases)
= Сaspases). В клетках находятся в виде зимогенов (проферментов) –
прокаспаз. Активация каспаз делает гибель клетки неизбежной. Это
реализуется за счѐт
частичного протеолиза прокаспаз (молекулярная масса 32-56 кДа), в составе
которых выделяют 3 домена: регуляторный N-концевой домен (продомен),
большую (17-21 кДа) и малую (10-13 кДа) субъединицы.
Активация происходит путѐм протеолитического процессинга: все три
домена расщепляются, отделяется продомен, а оставшиеся большая и малая
субъединицы ассоциируются в гетеродимер. Два гетеродимера в дальнейшем
формируют полноценную каспазу с двумя каталитическими участками тетрамер.
Каспазы делятся на инициаторные (А) и эффекторные (Б). Инициаторные
каспазы (8, 9, 10), принимая сигнал, активируются аутопротеолизом, а затем
активируют эффекторные каспазы (3, 6, 7) –
основные исполнители апоптоза. Каспаза-2
обладает двойной функцией.
Непосредственное участие в реализации
апоптоза принимают только 7 из 12 каспаз,

выявленных

у

человека.

Эффекторные каспазы, расщепляя

белки, принадлежащие самым различным семействам, выполняют
ряд функций, реализуя эффекторную фазу апоптоза. Одна из главных
функций -

прямое и опосредованное разрушение клеточных структур.

Гидролизу подвергаются ключевые структурные компоненты цитоскелета и
ядра, белки, вовлеченные в филаментную организацию – их расщепление
вызывает сморщивние и распад клетки. Например, гидролиз ламинов,
армирующих (укрепляющих) ядерную мембрану, ведет к конденсации
хроматина. Также разрушаются белковые факторы транскрипции; белки,
участвующие в репликации и репарации ДНК. Другой важной функцией
эффекторных каспаз является протеолиз ингибиторов апоптоза (например,
ингибитора фрагментации ДНК - DFF (англ. DNA fragmentation factor),
антиапоптозных белков семейства Bcl-2). На некоторые белки протеолиз
каспазами, наоборот, оказывает активирующее действие. Это белки,
регулирующие

ключевые

морфологические

изменения

при

апоптозе

(например, белки, участвующие в деполяризации F-актина - запускают
мембранный блеббинг, фактор фрагментации ДНК - CAD (англ. caspaseactivated DNase - «ДНКаза, активируемая каспазами»).
Также на белки, преобразующие или усиливающие сигнал (например,
участвующие

в

передаче

сигнала,

протеинкиназы).

Итак,

важной

биохимической особенностью апоптоза являются каспазные каскады,
которые позволяют усиливать и передавать инициирующий сигнал в клетке.
Процесс апоптоза состоит из ряда последовательных событий, которые
можно условно разделить на 3 фазы. Во время сигнальной фазы клетка
воспринимает

сигнал,

инициирующий

апоптоз.

Затем

активируются

эффекторные внутриклеточные механизмы гибели (эффекторная фаза), что
неизбежно приводит к деструктивной фазе (или фазе деградации), при
которой отмечают расщепление ДНК и другие необратимые изменения

биополимеров цитоплазмы и ядра клетки. События в клетке, происходящие в
деструктивную фазу визуализируются в виде характерных морфологических
признаков апоптоза. Деградационная фаза - три последовательных шага:
высвобождения (деполимеризуются микротрубочки цитоскелета, актиновые
микрофиламенты реорганизуются в связанные с мембраной периферийные
(кортикальные) кольцевые пучки, клетка приобретает округлую форму);
блеббинга (сокращение периферийных актиновых колец, клетка как бы
«кипит»); конденсации или фрагментации (клетка фрагментируется на
маленькие апоптотические тела, либо целиком конденсируется, округляясь и
уменьшаясь в размерах).
Инициация процесса осуществляется различными путями. Для большинства
клеток сигнальная фаза реализуется либо при участии рецепторов
клеточной

поверхности

(«рецепторов

смерти»),

либо

вследствие

повреждений
внутриклеточных структур (чаще всего митохондрий). Исходя из этого,
выделяют рецепторный (внешний) и митохондриальный (внутренний) пути
апоптоза.
В реализации сигнальной фазы внешнего пути ключевым моментом является
связывание лиганда - сигнальной молекулы со своим клеточным рецептором.
Рецепторы, воспринимающие сигнал апоптоза, т.н. «рецепторы смерти»,
относятся к суперсемейству TNF-рецепторов (англ. tumor necrosis factor
receptor или кратко TNF R — «рецептор фактора некроза опухолей»).
Известны два структурно гомологичных рецептора TNF-R1 (CD120a, р55) и
TNF-R1 (р75), а также CD95 (известный как Fas или Aро-1). Гомология
аминокислотной последовательности среди рецепторов семейства TNF
высока,

можно

выделить

внеклеточный,

трансмембранный

и

цитоплазматический домены. Это трансмембранные белки с наличием общей
последовательности из 80 аминокислот в цитоплазматическом домене.

Данная последовательность называется доменом смерти (англ. death domain
или кратко DD) и является необходимой для трансдукции сигнала апоптоза.
К дополнительным относятся рецепторы TRAILR, CARI, DR3 (англ. death
receptor3 - «рецептор смерти 3» или Apo-3, Wsl 1), DR4 и DR5.
В сигнальной фазе внешнего пути в результате связывания «лигандов
смерти» со своими специфическими рецепторами в клетке образуется особый
белковый комплекс - DISC (death-inducing signaling complex), инициирующий
развитие апоптоза.

Рис. Рецепторзависимый (внешний) сигнальный путь, формирование
DISC
Особыми трансдукторами сигнала являются адапторные белки, имеющие
как домен для связывания с лиганд-рецепторным комплексом, так и
эффекторный домен для связывания с прокаспазами. Так адаптерный белок
FADD связывается с активированными рецепторами в домене связывания

(через DD-DD-взаимодействие). При этом своим «эффекторным доменом
смерти» (death effector domain - DED) он участвует в связывании с
неактивными прокаспазой-8 или -10 (через DED-DEDвзаимодействие). В
результате

образуются

агрегаты,

например,

CD95L–CD95–

FADD–

прокаспаза-8, т.е. заканчивается сборка DISC, который в ассоциированном
виде

содержит

лиганд-рецептор-адаптор-прокаспазу.

Это

апоптосома

(апоптозный шаперон или «сигнальный комплекс, индуцирующий смерть».
После того, как прокаспаза-8 (или прокаспаза-10) становится частью
комплекса

DISC,

аутопротеолизом,
апоптосомах.

происходит
т.е.

Затем

ее

олигомеризация

инициаторные

сигнальная

фаза

прокаспазы
внешнего

с

последующим

активируются
пути

переходит

в
в

эффекторную фазу с активацией эффекторных прокаспаз-3 и -7.

Рис. 10. Особенности сигнальных фаз внутреннего и внешнего
путей.
Примечание: стрелки – активация, «плашки» - подавление

Инициация

апоптоза

происходит

вследствие

через

митохондриальный

пермеабилизации

либо

сигнальный
разрывов

путь

наружной

митохондриальной мембраны, что способствует выходу в цитоплазму ряда
апоптогенных факторов (цитохрома с, Smac, AIF, эндонуклеазы G и др.). В
частности, цитохром с, попав в цитозоль, связывается с адаптерным белком
APAF1 и прокаспазой-9, что приводит к образованию сигнального комплекса
(апоптосомы). Следовательно, в апоптосомы

внешнего

прокаспазы-8, -10, а внутреннего пути – прокаспаза-9.

пути

входят

Активированная

каспаза-9 затем расщепляет и активирует эффекторные каспазу-3 и -7.
Белковые факторы – регуляторы апоптоза. Белок р53 играет важную
роль в интеграции внешнего и внутреннего путей, он активируется при
повреждениях генетического аппарата. Его роль - удаление из пула
реплицирующихся клеток потенциально онкогенных. В норме белок р53
является фактором транскрипции, регулирующим активность ряда генов.
Результатом активации р53 является остановка клеточного цикла и
репликации ДНК, при сильном стрессовом сигнале — запуск апоптоза по
внешнему и внутреннему путям.

Процесс

высвобождения

апоптогенов

из

митохондрий

регулируют

представители семейства Bcl-2-подобных белков, для которых характерно
присутствие по крайней мере одного специфического BH-домена (Bcl-2 (В)
homology

(Н)

–

В-гомологичного).

Исходя

из

структурных

и

функциональных особенностей указанных белков, выделяют три их
подгруппы. В первую подгруппу входят белки Bcl-2, BCL-XL, Bcl-w, A1 и
Mcl-1, содержащие четыре BH-домена (BH1, BH2, BH3 и BH4) и
обладающие антиапоптотическими свойствами. Эти белки также содержат
трансмембранный участок, который позволяет им встраиваться во внешнюю
мембрану митохондрий. Представителей второй подгруппы (Вах, Bak и Bok)
отличает не только отсутствие BH4-домена, но и их проапоптотическая
активность. Третью подгруппу составляют проапоптотические белки Bik,
Bad, Bid, Bim, Bmf, HRK, Noxa и PUMA. Они содержат лишь один BH-домен
(BH3), с помощью которого взаимодействуют с другими белками семейства

Bcl-2. Эти молекулы чаще всего локализованы в цитоплазме, откуда в ответ
на действие индукторов апоптоза они могут перемещаться к митохондриям.
Интересно, что различные индукторы избирательно активируют те или иные
белки третьей подгруппы семейства Bcl-2. Например, Bim необходим для
апоптоза, вызываемого дефицитом факторов роста, тогда как при гибели
клеток вследствие необратимых повреждениях ДНК задействован белок
PUMA. Про- и антиапоптотические белки семейства Bcl-2 могут связываться
друг с другом, образуя сложную систему гомо- и гетеродимерных
комплексов. Соотношение про- и антиапоптотических Bcl-2 подобных белков
при

формировании

таких

комплексов

и

определяет

последующую

реализацию или ингибирование апоптоза в клетках.

Повреждения
ДНК

Удаление
ростовых
факторов
PUMA

Связывание
специфических
рецепторов

Bim

р53

Bad
Bax
Bcl-Xs

Bak
Bid
Bik
Box

Bcl-2
Bcl-Xl

Каспазы
(апоптотические протеазы)

Эндонуклеазы

АПОПТОЗ

Рис. Контроль биохимических сдвигов при индукции
апоптоза

6. Молекулярные механизмы клеточной гибели: внешний, внутренний и перфорингранзимный пути реализации клеточной гибели

Развитие апоптоза – это цепь детерминированных молекулярных событий.
Выделяют два основных пути апоптоза: внешний (путь, опосредованный
рецепторами смерти) и внутренний (митохондриальный) путь. Такое деление
условно, так как молекулы, участвующие в одном из этих путей, могут
влиять на другой. Кроме них существует специфический путь, который
реализует Т-клеточную цитотоксичность и перфорин-гранзим зависящую
гибель клеток. Основные пути апоптоза и механизм гранзима В, связанные с
активацией клеточных ферментов – каспаз, приводят, в конечном итоге, к
общей последовательности событий - эффекторной фазе апоптоза. Путь,
инициируемый гранзимом А, активирует параллельный, независимый от
каспаз, путь клеточной гибели через повреждение ДНК.

Рис. Пути развития апоптоза в клетке

При реализации апоптоза условно можно выделить четыре
стадии апоптоза: Инициация —> Программирование —> Реализация
программы —> Удаление погибшей клетки.

На 1 стадии инициации информационные сигналы рецептируются клеткой.
Инициирующие апоптоз стимулы могут быть трансмембранными или
внутриклеточными. Трансмембранные сигналы апоптоза: Положительные
сигналы генерируют запуск программы апоптоза. Так, связывание фактора
некроза опухолей (FasL) с его мембранным рецептором CD95 (Fas)
активирует программу смерти клетки. Отрицательные сигналы при их
отсутствие или снижении эффектов включается программа апоптоза.

Например, отсутствие или прекращение воздействия на клетку факторов
роста, цитокинов, регулирующих деление и созревание клетки, а также
гормонов,

контролирующих

жизнедеятельности

развитие

нейронов

клеток.

необходимо

Так,

для

постоянное

нормальной
наличие

нейротрофических факторов. Их устранение или снижение эффектов на
нервные клетки приводит к включению программы смерти нейрона.
Смешанные сигналы - комбинация воздействий сигналов 1 и 2 группы. Так,
апоптозу подвергаются лимфоциты, простимулированные митогеном, но не
проконтактировавшие с чужеродным АГ. Погибают и те лимфоциты, на
которые воздействовал АГ, но не получившие других сигналов, например,
митогенного или от HLA.
Внутриклеточные стимулы апоптоза: избыток Н+, свободные радикалы
липидов и других веществ, повышенная температура, внутриклеточные
вирусы и гормоны, реализующие свой эффект через ядерные рецепторы
(например, глюкокортикоиды).
На 2 стадии программирования специализированные белки реализуют
сигнал

к

апоптозу

путѐм

активации

исполнительной

программы

(эффекторами являются цистеиновые протеазы — каспазы и эндонуклеазы).
Выделяют два варианта реализации стадий программирования: 1) путь
прямой активации эффекторных каспаз и эндонуклеаз (минуя геном клетки)
и 2) путь опосредованной через геном клетки передачи сигнала на
эффекторные каспазы и эндонуклеазы.
Прямая передача сигнала осуществляется через адаптерные белки,
гранзимы и цитохром С. Прямая передача сигнала наблюдается обычно в
безъядерных клетках, например, в эритроцитах.
•

Адаптерные белки. В качестве адаптерного белка выступает,

например, каспаза-8. Так реализуют своѐ действие цитокины Т-лимфоцитов-

киллеров в отношении чужеродных клеток, фактор некроза опухолей и др.
лиганды CD95.
•

Гранзимы.

лимфоциты.

Эти

протеазы

Протеазы

выделяют

проникают

в

цитотоксические

клетки-мишени

Т-

через

цитоплазматические поры, предварительно сформированные перфоринами.
Гранзимы активируют каспазы аспартатспецифические

цистеиновые

протеазы

клетки-мишени,

подвергающейся апоптозу.
•

Цитохром С. Выделяясь из митохондрий, цитохром С вместе с

белком Apaf-1 и каспазой-9 формирует комплекс активации (апоптосому)
эффекторных каспаз. Каспаза-8 и каспаза-9 активируют эффекторные
каспазы (например, каспазу-3), которые участвуют в протеолизе белков.
Опосредованная
кодирующих

передача

промоторы

сигнала
апоптоза;

подразумевает:
репрессию

активацию

генов,

генов,

кодирующих

ингибиторы апоптоза. Белки-промоторы апоптоза (например, белки, синтез
которых контролируется генами Bad, Box, антионкогенами Rb или /Р53)
активируют эффекторные каспазы и эндонуклеазы. Белки-ингибиторы
апоптоза (например, продукты экспрессии антиапоптозных генов Bcl-2, BclXL) блокируют апоптоз (например, путѐм уменьшения проницаемости
мембран митохондрий, тем самым уменьшая вероятность выхода в цитозоль
одного из пусковых факторов апоптоза — цитохрома С).
Стадия 3 исполнительная, эффекторная состоит собственно в гибели
клетки, осуществляемой посредством активации протеолитического и
нуклеолитического каскадов. Непосредственными исполнителями процесса
гибели

клетки

являются:

эффекторные

каспазы

(подвергают

протеолитическому расщеплению различные белки, в т.ч. белки цитоскелета,
ядра, регуляторные белки и ферменты) и Ca2+, Mg2+ зависимые эндонуклеазы
(катализируют распад нуклеиновых кислот). В результате разрушения белков

и хроматина в процессе апоптоза клетка подвергается деструкции. В ней
формируются и от неѐ отпочковываются фрагменты, содержащие остатки
органелл, цитоплазмы, хроматина и цитолеммы - апоптозные тельца.
Деградационная 4
высвобождения

фаза

включает

деполимеризуются

-

три

последовательных

микротрубочки

цитоскелета,

шага:
-

реорганизуются актиновые микрофиламенты в связанные с мембраной
периферийные (кортикальные) кольцевые пучки, - клетка приобретает
округлую форму; 2. блеббинга - сокращение периферийных актиновых
колец, - клетка как бы «кипит»; 3. фрагментации - клетка фрагментируется на
маленькие апоптотические тела, - либо целиком конденсируется, округляясь
и

уменьшаясь

экспрессируются

в

размерах.

лиганды,

с

На

поверхности

которыми

апоптозных

взаимодействуют

телец

рецепторы

фагоцитирующих клеток. В нормальных клетках фосфолипиды распределены
асимметрично

между

внутренним

и

наружным

монослоями

цитоплазматической мембраны: аминофосфолипиды (фосфатидилсерин и
фосфатидилэтаноламин) отсутствуют в наружном монослое. Асимметрия
поддерживается

особым

АТФзависимым

ферментом,

переносящим

аминофосфолипиды снаружи внутрь. Апоптоз нарушает асимметрию
мембраны, на ее наружной поверхности появляются аминофосфолипиды, и
клетки-фагоциты узнают апоптозные клетки и апоптозные везикулы с
помощью специальных рецепторов, взаимодействующих с наружным
фосфатидилсерином. Апоптотические клетки и тельца экспонируют на
поверхности сигнальные и адгезивные молекулы, которые узнаются
соседними клетками или макрофагами и способствуют фагоцитозу фосфатидилсерин, лизофосфолипиды, витронектин, тромбоспондин и др.
Процессу фагоцитоза способствует также инактивация на поверхности
умирающих клеток молекул типа CD31, необходимых для распознавания не
подлежащих поглощению жизнеспособных клеток. Фагоциты быстро

1.

обнаруживают, поглощают и разрушают апоптозные тельца, поэтому
содержимое разрушенной клетки не попадает в межклеточное пространство и
при апоптозе отсутствует воспалительная реакция. Таким образом, каскад
апоптотической гибели включает:
 конденсацию хроматина, разрезание нитей хроматина эндонуклеазой
на равные отрезки около 180 пар нуклеотидов («лестница» на
электрофорезе), распад ядра на фрагменты (кариорексис)
 разрушение ядра
 вспучивание плазматической мембраны
 фрагментацию клетки с образованием апоптозных телец.

Перфорин-гранзимный путь. Цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) и
натуральные клетки-киллеры (natural killer, НК) содержат цитолитические
гранулы (секреторные лизосомы), в состав которых входит белок перфорин и
проферменты (зимогены) сериновых трипсиноподобных протеаз - гранзимов
(90%

содержимого

цитозольные

гранулы).

гранулы

(иммунологического

При

направляются

синапса)

и

распознавании
к

месту

высвобождают

клетки-мишени

клеточного
перфорин

контакта
-

белок,

образующий поры в мембране. Внутри гранул активированных ЦТЛ,

зимогены преобразуются в активные гранзимы А и В ключевым ферментом
их

активации

- лизосомальной цистеиновой протеазой

(дипептидил

пептидазой І, ДПП І или катепсином С). Гранзимы через образуемые
перфорином поры поступают в клетку-мишень.

Рис. Образование перфориновой поры и поступление
гранзимов в клетку
ЦТЛ при этом остаются неповрежденными, т.к. содержат цитозольные
ингибиторы гранзимов – серпины. Гранзим В – мощный активатор каспаз.
Активирует несколько прокаспаз, может расщеплять некоторые субстраты
каспаз, т.ч. ингибитор активации каспаз (ICAD). Гранзим А реализует иначе
свои проапоптотические стимулы – расщепляет субстраты каспаз, т.ч.
вызывая фрагментацию ДНК. Он участвует в регуляции пролиферации Влимфоцитов, расщепляет ряд белков межклеточного матрикса, облегчая
миграцию ЦТЛ и НК, индуцирует секрецию IL-6, IL-8 моноцитами.
Перфорин-гранзимный путь реализует иммунную киллерную функцию ЦТЛ
и НК, защищая организм человека от вирусов и развития опухолей.

7. Нарушения апоптоза и их роль в механизмах развития опухолевого
роста,
аутоиммунных заболеваний и дегенеративных процессов

При патологии апоптоз активируется в результате действия различных
повреждающих факторов, способных вызвать некроз, но действующих не
столь интенсивно. Индукторы апоптоза:
 стрессогенные факторы при гипертермии (белки теплового шока), при
гипоксии,

окислительном

стрессе

(активные

формы

кислорода,

свободные радикалы), при ионизирующем излучении (УФ-лучи и др.),
при воспалении (интерлейкины (IL1, IL-10, IL-12), глюкокортикоиды,
протеазы),
 цитостатики (цисплатин, доксорубицин, метотрексат, винкристин и др.),
 этанол, сульфиды, ионы кальция и др.,
 вирусы (некоторые штаммы аденовирусов, ретровирусов, ВИЧ).
Заболевания, характеризующиеся активацией

апоптоза:

нейродегенеративные состояния (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона,
боковой амниотрофический склероз), апластические и гипопластические
анемии, СПИД, ишемические повреждения кардиомиоцитов и нейронов
мозга, ишемические и токсические (т.ч. алкогольные) поражения печени.
Ряд факторов, наоборот, может ингибировать апоптотические процессы.
Ингибиторами апоптоза являются: грамотрицательные бактерии, вирусы
(аденовирусы штаммов Е1В19К, Е1В55К, бакуловирусы, вирус ЭпштейнБарра, герпес-вирусы, цитомегаловирусы, вирус коровьей оспы), эстрогены,
андрогены, нейтральные аминокислоты, ингибиторы протеаз, полисахариды,
производные

амантадина,

рилузол,

флупертин,

цинк,

стимуляторы

миелопоэза, ряд цитокинов. В частности, интерлейкины (IL-2, IL-3, IL-4, IL6, IL-8, IL-9), некоторые интерфероны, оксид азота.
Заболевания, характеризующиеся угнетением апоптоза:
нейропролифертивные состояния (шизофрения, аутизм), персистирующие
вирусные инфекции (например, цитомегаловирусная, герпетическая и пр.),
вирусные гепатиты В и С, заболевания почек (гломерулонефрит, люпуснефрит, IgA-нефропатия). Ряд солидных (рак молочной железы, простаты,
гастро-интестинальный рак) и гематогенных злокачественных опухолей

характеризуются угнетением апоптоза (например, в результате мутаций или
дефицита гена р53). Важна роль ослабления апоптоза в патогенезе
аутоиммунных заболеваний щит. железы
1. Опухоли: определение, классификация, признаки доброкачественных
и злокачественных опухолей. Теории онкогенеза

Онкогенез - процесс образования опухоли в организме.
Опухоль

-

это

результат

патологического

разрастания

клеток,

характеризующихся их бесконтрольным делением, ростом, атипической
структурой и особыми биологическими свойствами. Изучение процесса
канцерогенеза является ключевым моментом как для понимания природы
опухолей, так и для поиска новых и эффективных методов лечения
онкологических заболеваний. Опухоли гетерогенны по происхождению:
• эпителиальные
• из клеток соединительной ткани
• нейроэндокринные
• из клеток гемопоэтической системы
• из клеток иммунной системы
• множественного гистогенеза
Карциномы – опухоли из клеток экто- и энтодермы. Саркомы – из клеток
мезодермы Гемобластозы (лейкозы, лимфомы) – из клеток крови.
По

способности

к

распространению

в

организме,

биологическим

характеристикам, влияющим на прогноз, их подразделяют на две группы:
1. доброкачественные (локальные)
2. злокачественные (способные к разрастанию – инвазии,
перемещению в др. части тела, давая начала метастазам –
вторичным опухолям). В доброкачественных опухолях обмен
веществ

подобен

метаболизму

нормальной

ткани.

В

злокачественных

опухолях

наблюдается

перестройка

обмена

веществ.
Трансформация клеток

- это превращение нормальной клетки в

опухолевую. Опухолевые клетки часто не дифференцированы, по ряду
свойств они напоминают эмбриональные клетки и делятся неограниченно, у
них изменена клеточная мембрана и они не чувствительны к контактному
торможению. Цитоскелет у опухолевых клеток также изменен, часто
редуцирован, из-за чего они имеют более или менее округлую форму.
Опухолевые клетки могут содержать несколько ядер, не типичных по форме
и размерам. Доброкачественные опухоли растут относительно медленно и
состоят

из

дифференцированных

клеток.

Злокачественные

(малигнизирующие) опухоли способны к быстрому и инвазивному росту и к
метастазированию (образованию вторичных опухолей).
Биологическая классификация новообразований
Признаки
Доброкачественные
Злокачественные
Границы

четкие контуры,
инкапсулированы

нет капсулы, нет четких
границ с тканями

Рост

экспансивный

инфильтрирующий

Структура

высокодифференцирован.

анаплазия и атипизм

Митозы / рост

мало/ медленный

много/быстрый

Инвазия

не метастазируют

метастазируют

Интоксикация

нет

развитие кахексии

Особенности доброкачественных клеток:
1. слабо контролируемый рост;
2. отсутствие метастазирования;
3. экспансивный рост (отодвигание окружающих тканей без выраженной
их деструкции)

4. доброкачественные клетки делятся до максимального предела (~до 3050 делений), после чего они погибают.
Особенности злокачественных клеток:
1. неконтролируемое, бесконечное деление;
2. инвазивность - способность проникать в окружающие нормальные
ткани и вызывать деструкцию этих тканей;
3. метастазирование

(способность

перемещаться

из

первичной

«материнской» опухоли в органы и ткани, расположенные на
расстоянии и образовывать в них новые вторичные опухоли этой же
гистологической структуры).
Существует ряд теорий канцерогенеза:
•

мутационно-генетическая теория

•

вирусно-генетическая теория

•

теория дисгормонального канцерогенеза

•
физико-химическая
неоплазию)
•

теория

(ряд

факторов

инициирует

дис-онтогенетическая (нарушения внутриутробного периода,

хранимые клетками, дают толчок к их перерождению с возрастом)
•
теория четырех-стадийного канцерогенеза (последовательной
аккумуляции).
В основу каждой из этих теорий положено действие определенных факторов
риска или канцерогенов. Ведущие к малигнизации мутации накапливаются
при действии всех указанных факторов (дис-онтогенетических, вирусных,
дисгормональных, физико-химических).

2. Основные положения современной полиэтиологической теории
канцерогенеза

Согласно современной полиэтиологической теории канцерогенеза выделяют
четыре стадии развития онкологического заболевания.

І стадия -

инициации (стадия мутаций) - первичное воздействие

канцерогенного фактора на клетку приводит к следующим процессам:
• повреждению ДНК в соматической клетке
• активации онкогенов, ростовых факторов
• инактивации генов-супрессоров
• выключении генов, вызывающих апоптоз
• активизации генов, препятствующих апоптозу
• экспрессии

эмбриональных

изоферментов,

дающих

клетке

метаболические преимущества
Внутриклеточные сигнальные каскады устроены таким образом, что
нарушение лишь одного из их звеньев вызовет апоптоз клетки, а не еѐ
бесконтрольное

деление.

Поэтому

для

успешного

канцерогенеза

необходимы изменения многих звеньев, максимально имитирующие
влияние цитокинов и устраняющие возможность гибели клетки.

ІІ стадия – промоции (селекции - отбор мутировавших клеток). Для
осуществления опухолевой трансформации клетки необходимо повторное
воздействие на клетку канцерогенного фактора, способного вызвать
активизацию

промотора

изменѐнных

онкогенов.

Появление

несанкционированных сигналов является хотя и необходимым, но не
достаточным условием образования опухоли. На этом этапе наблюдаются
следующие процессы:
• Активация посредством активизации пролиферативных сигнальных
каскадов, прежде всего протеинкиназы С.

• Образование
ретровирусов.

опухолей

вследствие

воздействия

онкогенных

• Происходит преимущественное размножение опухолевых клеток,
поврежденных опухоль-инициирующими факторами.
• Качественно-количественные изменения в условиях переключения
генной активности приводят к формированию неопластического
фенотипа.
• Клетка обладает неограниченным пролиферативным потенциалом, не
отвечает на контролирующие сигналы организма.

ІІІ стадия – прогрессии (инвазии, селективного автономного роста
клеточных

клонов)

характеризуется

тем,

что

опухолевый

рост

продолжается при уклонении трансформированных клеток от дальнейшей
дифференцировки, идут процессы размножения малигнизированных клеток,
инвазии и метастазирования, ведущие к появлению злокачественной
опухоли. На этой стадии наблюдаются следующие события:
• Нарушение и прекращение дифференцировки из-за отсутствия
цитокинов, необходимых для специализации клеток (присутствие
цитокина

может

вызвать

нормализацию

и

продолжение

дифференцировки раковых клеток — процесс, обратный канцерогенезу).
• Созревание трансформированных клеток приостанавливается, они
накапливаются в результате непрерывной пролиферации и подавления
апоптоза.
• Формируется

опухоль

—

клон

клеток,

стволовая

линия

с

особенностями, не свойственными нормальным клеткам (нарушения
митоза, нестабильность генома, генные и хромосомные мутации)
• Происходит

нарушение

морфологических

(клеточный и тканевой атипизм).

характеристик

ткани

• Мембраны опухолевых
на
стимулы

клеток

не

способны реагировать

микроокружения (кровь, лимфа, межклеточная среда).
• Сформировавшийся опухолевый клон (стволовая линия) синтезирует
собственные цитокины, наращивает темпы деления, предотвращая
сокращение теломер, уклоняется от иммунного надзора организма и
обеспечивает интенсивное кровоснабжение.
• Появляется способность к миграции, продвижению в окружающие
ткани
(инфильтрация или инвазия, что стимулирует метастазирование)
IV стадия – метастазирование опухоли (лимфогенное, гематогенное,
тканевое). В организме человека постоянно образуются потенциальные
опухолевые клетки. Однако в силу своей антигенной гетерогенности они
быстро распознаются и разрушаются клетками иммунной системы.
Нормальное функционирование иммунной системы является основным
фактором защиты от опухолей. Иммунный механизм сопротивляемости
опухолям опосредован большим количеством специфических клеток (В- и Тлимфоциты, NK-клетки, моноциты,
полиморфноядерные лейкоциты) и гуморальных механизмов.
• В процессе опухолевой прогрессии клетки опухоли оказывают
выраженное антииммунное действие, что приводит к ускорению темпов
роста опухоли и появлению метастазов.
• Прорастая в кровеносные и лимфатические сосуды опухолевые клетки
разносятся по всему организму и, оседая в капиллярах различных
органов, формируют вторичные (метастатические) очаги опухолевого
роста.
• Мигрирующие клетки раздвигают эндотелиоциты новообразующихся
сосудов, проникая в эндотелиальные трубочки еще до начала синтеза
субстанций базальной мембраны и роста перицитов.

• В их плазмалемме появляются рецепторы для адгезии к эндотелию
сосудов в местах оптимальных по совместимости с тканевой средой
обитания.
• Клетки сохраняют при циркуляции способность к лизису базальной
мембраны капилляров, лизису стромы, а также к миграции и
размножению в новых условиях органа-мишени.

3.

Канцерогены: определение, свойства, классификация, гены-мишени

Онкогены и онкобелки: характеристика и роль в канцерогенезе

Канцерогены - это химические, физические и биологические факторы,
которые приводят к мутациям и запускают канцерогенез.
Различают следующие виды канцерогенов:
• физические (УФ, рентген, ионизирующее излучение),
• химические (курение (никотин), химические канцерогены, токсины),
• биологические (онковирусы),
• врожденные генетические дефекты и хроническое воспаление (редко).
Мишенями в механизме действия разных канцерогенов являются 4
семейства генов: 1. протоонкогены - регуляторы пролиферации и
дифференцировки клеток;
2. гены-супрессоры

опухолей

(антионкогены,

ингибирующие

пролиферацию клеток);
3. гены, участвующие в реализации апоптоза;
4. гены, отвечающие за процессы репарации ДНК.
В результате действия факторов риска активируются протоонкогены,
мутируют супрессорные гены, как следствие, изменяются клеточные
программы регуляции. Последнее обеспечивается путем стимуляции

экспрессии

ростовых

факторов,

их

рецепторов,

пострецепторных

трансдукторов сигналов роста, а также блокированием апоптоза и
нарушением контактного ингибирования пролиферации клеток.

Молекулярные основы опухолевой трансформации
В

ДНК

всех

нормальных

клеток

присутствуют

протоонкогены.

Протоонкоген – нормальный ген, кодирующий белок, регулирующий
нормальную пролиферацию клеток, и способный, в результате изменения
структуры превращаться в онкоген. Протоонкогены – онкогены в
неактивном состоянии, их активация - превращение в онкогены за счет
изменения структуры ДНК - мутаций происходит: в норме - в процессе
эмбриогенеза, при репаративной регенерации, при опухолевом росте.
Онкоген - это ген, экспрессия которого приводит к синтезу онкобелков белков с утраченной регуляторной функцией, что ведет к нарушению
регуляции пролиферации клеток, неконтролируемому делению и росту.
Изучена канцерогенная активность протоонкогенов группы ras (HRAS,
KRAS2). При различных онкозаболеваниях регистрируется значительное
повышение активности этих генов (рак поджелудочной железы, рак
мочевого пузыря). Например, раскрыт патогенез лимфомы, при которой
активация протоонкогена MYC происходит в случае его переноса в область
хромосом,

где

иммуноглобулинов.

содержатся

активно

транскрибируемые

гены

Рис. Основные онкогены, кодирующие различные онкопротеины

Выделяют следующие группы онкобелков по эффектам:
• гомологи факторов роста (онкогены sis, int-2, hst, int-r, k-fgt),
• гомологи их рецепторов (кодирующие онкогены: еrb В, met, ros),
рецепторы тирозинкиназного типа (кодированы: src, yes, abl);
• онкопротеины

-

трансдукторы

сигналов,

связанные

с

пострецепторной передачей сигнала - аналоги G-белков (Ras, Bcl-2),
серин-треониновые протеинкиназы (Raf, Mos);
• гомологи транскрипционных факторов - ядерные белки, передающие
сигналы роста на ДНК (продукты онкогенов: fos, jun, myb, erbA, myc).

Онкогены записывают трѐхбуквенным кодом из строчных латинских букв,
который обычно указывает: 1. объект, из которого данный онкоген был
выделен впервые (онкоген ras впервые идентифицирован в саркоме крысы,
rat sarcomas); 2. за кодом следует буква или цифpa, если существует
несколько генов в семействе: для обозначения вирусных онкогенов перед
названием вводят строчную букву v (virus - вирус) - v-onc; для клеточных
онкогенов, образующихся в трансформированных клетках при мутациях,
букву с (cell - клетка) - с-onc. Белковые продукты генов часто обозначают
так же, как гены, но с заглавной буквы. Так, ген ras кодирует белок Ras, ген
р53 - белок Р53.

Гены-кандидаты для онкологических заболеваний с различной
локализацией
опухоли

Регуляторы пролиферации, кодирующие онкопротеины, гомологичные
факторам роста. Рост и развитие клетки в нормальных и опухолевых
клетках начинаются с воздействия на рецепторы клетки факторов роста.

Факторы роста (ФР) - это многочисленная группа полипептидов из 40 – 50
аминокислот. Наиболее клинически значимые факторы роста:
• эпидермальный фактор роста (ЭФР, Epidermal Growth Factor, EGF),
• инсулиноподобные ИФР-1 и ИФР-2,
• ФР нервов (ФРН), интерлейкины (ИЛ-1, ИЛ-2),
• ФР фибробластов (FGF, продукт int-2онкогена)
• тромбоцитарный ФР (Platelet-Derived Growth Factor, PDGF, продукт sis),
• стимуляторы ангиогенеза: фактор роста эндотелия сосудов (Vascular
Еndothelial Growth Factor,VEGF).
К «антиростовым факторам», можно отнести:
• трансформирующий фактор некроза опухолей (ФНО или TNF),
• TGF- , интерфероны, которые, подавляют пролиферацию.
Общими функциями пептидных ростовых факторов в норме является
стимуляция
Передача

митоза,

дифференцировки,

пролиферации.

клетке пролиферативных сигналов от факторов роста

включает активацию циклинзависимых киназ. Запуск цикла клеточного
деления начинается с присоединения молекулы ФР к соответствующему
клеточному рецептору и реализации его сигнала подобно путям передачи
гормональных сигналов в клетки-мишени.
Механизмы действия ФР осуществляются 3 путями:
1. эндокринный - ФР секретируются в кровь и с током крови переносятся к
клеткам-мишеням разных органов
2. аутокринный - белки рецепторы ФР находятся в собственных клетках
3. паракринный - ФР действуют на соседние клетки, т.к собственные
клетки не имеют рецепторов
Взаимодействуя с поверхностными или внутриклеточными рецепторами, ФР
стимулируют

активность генов,

ответственных

за

биосинтез

белков, обеспечивающих рост и деление клеток. При взаимодействии

ФР с рецептором мембраны, являющимся тирозин-киназой, либо за счет
включения аденилатциклазного и фосфатидил-инозитольного каскадов
происходит фосфорилирование белков и активация транскрипционных
факторов, которые вызывают синтез новых мРНК и белков. Если ФР входит
в клетку, то в комплексе с внутриклеточным рецептором поступает в ядро,
активируя транскрипцию генов (протоонкогенов) кодирующих
регуляторные белки трансдукторы сигналов и транскрипционные факторы.
Если изменена структура протоонкогенов вследствие мутации, то
протоонкогены становятся онкогенами, увеличивая скорость синтеза ФР,
рецепторов к ним, что ведет к дисбалансу факторов роста и трансформации
нормальной клетки в опухолевую.

Рис. Формирование клеточного ответа на сигналы факторов роста: R
- рецепторы, Тир-Пк – тирозин-киназа, ПК – протеин-киназы, н/а –
неактивные, а - активные

Ряд факторов роста не способны проникать в клетку, они имеют рецепторы
тирозин-киназного

типа;

образовавшийся

комплекс

приводит

к

фосфорилированию клеточных белков (факторов транскрипции).
Другие факторы роста подобно гормонам реализуют свои пролиферативные
стимулы, используя систему внутриклеточных трансдукторов их сигнала (Gбелков, ras-белков, Raf I-связывающего белка, ферментов аденилатциклазы,
гуанилатциклазы или фосфолипазы С). Они индуцируют образование в
клетке

классических

вторичных

мессенджеров

(цАМФ,

цГМФ,

инозитолтрифосфата), с последующей активацией специфичных митогенактивируемых протеинкиназ (MAPkinases). МАР-зависимый сигнальный
каскад

реализует

путем

фосфорилирования

-

активацию

факторов

транскрипции (C-MYC, Jun, Fos, TGF-α, ErbA, Myb). Далее реализуются
эффекты при участии систем: циклин D-Cdk4,6; циклин Е-Cdk 2,
обеспечивающих переход и саму S-фазу цикла.
Липофильные факторы роста свободно проникают в цитоплазму, образуя
рецепторный комплекс ФР-R, проникают в ядро и непосредственно
активируют регуляторные зоны ДНК. Этот же механизм реализует ростстимулирующие сигналы стероидных гормонов - эстрогенов, прогестинов
при РМЖ, андрогенов при раке простаты, их влияние на синтез клеткой
факторов роста - запускают синтез белковых факторов, активирующих
пролиферацию (трансформирующего фактора роста альфа (TGF-alfa), ИФР1), подавляют синтез ингибирующих рост белков (TGF-beta)). В лечении
ряда опухолей антиэстрогены реализуют свои эффекты за счет ↓синтеза

TGF-α и ↓ экспрессии ИФР-1, и его рецепторов в эстроген-рецепторпозитивных клетках.
В нормальных клетках присутствуют также гены – антионкогены
(генысупрессоры), они кодируют белки, сдерживающие клеточный рост,
контролируют нормальную дифференцировку клеток (Р53, APC, Rb),
предотвращают развитие опухоли. В настоящее время установлено более 10
генов-супрессоров

опухолей,

кодирующих

регуляторные

белки,

ингибирующие аномальный рост и трансформацию клеток: rb1, Р53, Р15,
Р16, Р21 и др. Инактивация генов-супрессоров ведет к развитию некоторых
онкологических заболеваний.
Для ряда опухолей ключевым этапом в канцерогенезе являются мутации
геновсупрессоров, например, ретинобластомы (Rb), семейного полипоза
толстой кишки
(АРС-ген adenomatouspolyposiscoli), спорадического рака ободочной кишки.
Рост опухоли может быть связан не только с усилением пролиферации, но и
с уменьшением числа ее гибнущих клеток за счет подавления апоптоза.
Этими

эффектами

обладают

онкогены

семейства

bcl-2,

c-myс

и

мутировавший р53.
В норме антионкоген p53 кодирует ядерный белок, активизирующий, либо
подавляющий экспрессию ряда генов, регулируя прохождение клеточного
цикла через G1-фазу. Р53 функционирует в форме тетрамера и связывается с
регуляторными
участками ДНК. При повреждении ДНК Р53 предупреждает репликацию
такой поврежденной ДНК - обратимо удерживает клетки в этой фазе через
активацию транскрипции ингибитора циклин-зависимой протеинкиназы
WAF-1 для репарации ДНК. Ген Р53 кодирует ядерный фосфопротеин,
препятствующий вхождению клеток с повреждениями ДНК в S-фазу, пока
эти повреждения не будут устранены.

Рис. Роль антионкогенов и белка Р53
Если повреждение ДНК нерепарируемое, то Р53 активирует апоптоз
уничтожая поврежденную клетку, способную трансформироваться через
модулирование экспрессии bcl-2 и Вах (экспрессия антиапоптотического
гена bcl-2 снижается, аВах, запускающего апоптоз, - увеличивается).
Мутантный тип р53 наоборот ингибирует апоптоз подобно онкогену bcl-2.
Таким

образом,

многие

химические

соединения

или

физические

воздействия, а также вирусы могут вызывать мутации ДНК, не летальные
для клеток и провоцирующие экспрессию протоонкогенов или депрессию
антипротоонкогенов, что может приводить к трансформации нормальной
клетки в опухолевую.

4.

Последствия повреждения ДНК клетки канцерогенами

Рис. Последствия повреждения ДНК клеток канцерогенами
Генетические аспекты канцерогенеза. Мутационная теория канцерогенеза
рассматривает опухоли как генетические заболевания, патогенетическим
субстратом которых является повреждение генетического материала клетки
под воздействием внешних и внутренних канцерогенных факторов:
1.

соматические точечные мутации, хромосомные аберрации,

рекомбинации вызывающие превращение протоонкогенов в онкогены или
резко повышающие уровень их экспрессии;
2.

стойкое деметилирование ДНК при отсутствии повреждений

самих онкогенов, вызывающее гиперэкспрессию клеточных онкогенов и
опухолевую трансформацию. Следствием данных изменений ДНК является
нарушение механизмов контроля за пролиферацией и дифференцировкой
клеток, бесконтрольное деление клеток и возникновению опухоли.

Рис. Система репарации ошибок репликации ДНК

О нарушениях в работе ДНК-репарирующей системы свидетельствует
микросателлитная нестабильность опухоли.
Микросателлитные последовательности (МП) - короткие некодирующие
последовательности ДНК, которые повторяются в геноме много раз. В
опухолях, в отличие от нормальной ткани, МП варьируют по длине,
указывая на то, что опухолевые клетки либо теряют, либо приобретают
лишние нуклеотиды. Это явление может наблюдаться в том случае, если в
ходе репликации две нити ДНК скользят друг относительно друга. В

зависимости от направления скольжения новая нить ДНК будет короче или
длиннее

родительской.

В

результате

во

вновь

синтезированной

двухцепочечной ДНК появятся небольшие петли неспаренной ДНК, которые
в нормальных тканях устраняются репарирующей системой.
Клетка становится самодостаточной в генерации сигналов пролиферации;
нечувствительной к сигналам, подавляющим ее рост; способной ослабить
или избежать развитие апоптоза, стимулировать ангиогенез. Клетка является
генетически нестабильной, не подвергается клеточной дифференцировке,
характеризуется изменением морфологии и локомоции, что сопровождается
приобретением свойств к инвазии и метастазированию.

5.

Химический канцерогенез

Химические вещества – канцерогены делят на 3 группы.
1 категория - канцерогенные вещества и их производные;
2 категория

вероятно

-

канцерогенные

вещества

(акрилонитрил,

эпихлоргидрин, 1,4диоксан, гидрохлорид феназопирина);
3 категория - вещества неизвестной природы (из-за недостатка данных
невозможно классифицировать фторурацил, бензилхлорид, фенобарбитал,
сахарин).
Большинство химических
канцерогенов (ХКГ) поступают в
организм в виде
проканцерогенов,

а

метаболизируются

в

затем

организме непосредственно
в

токсические

соединения,

способные

взаимодействовать с ДHК, РHК, белками.

Биотрансформация

ксенобиотиков (канцерогенов и их производных) реализуется в две
фазы, в каждую из которых могут образовываться канцерогены из
соединений, являющихся проканцерогенами.
1.

Первый

этап

ферментами

детоксикация

эндоплазматического

(преконъюгация)
ретикулума

обеспечивается

(ЭПР),

в

т.ч.

микросомального окисления в системе цитохрома Р450. Реализуются
окислительные

реакции

карбоксилирования,

гидроксилирования,

фосфорилирования:
• окислительное гидроксилирование алканов и
боковых

радикалов

моноциклических

циклических

соединений

анилина,ацетанилида,

алкенов, алкильных
(биотрансформация

хлорсодержащих

циклов

-

пестицидов)
• окислительное N-, O-дезалкилирование
• восстановление нитро- и азосоединений
• восстановительное дегалогенирование
• свободно-радикальное

окисление

и

повреждение

биомолекул

(нуклеиновых кислот, белков, липидов)
2. Второй этап – коньюгирование модификатов, затем выведение
образованных глюкуронидов, сульфатов и пр. из организма.

Рис. Образование канцерогенов из ПАУ под влиянием ферментов
детоксикации ксенобиотиков
При заболеваниях печени нарушение процессов детоксикации может иметь
непосредственную угрозу, особенно при длительном и значительном
поступлении

ХКГ в организм. Особенности детоксикации и выведения

метаболитов ХКГ из организма делают мишенями по развитию рака ряд
органов, прежде всего печень, мочевой пузырь, легкие.

Химические канцерогены по структуре:
• полициклические

ароматические

углеводороды

(ПАУ)

и

гетероциклические соединения (бензапирен в дегте, саже, продуктах

неполного сгорания, в табачном дыме, копченостях, консервах) аккумулируется, вызывает развитие рака кожи и легких;
• ароматические амины - вещества, имеющие структуру дифенила, либо
нафталина (2-нафтиламин, 2-амино-1-нафтол - побочный продукт
производства красителей) - потенциальный канцероген рака мочевого
пузыря;
• амино-азосоединения

(азокрасители

натуральных

и

синтетических

тканей, в цветной печати, косметике, ранее - добавки к маргарину и
маслу) - способны вызывать развитие рака печени, мочевого пузыря;
• нитрозамины, нитрозосоединения (в производстве красителей, лекарств,
полимеров, пестицидов; нитрозамины синтезируются при запекании мяса,
рыбы) - индуцируют возникновение злокачественных опухолей лѐгких,
желудка, пищевода, печени и почек;
• афлотоксины - природные канцерогены растений и плесневых грибов
(афлотоксин Asрergillus flavus - продукт гниения злаковых культур и
орехов, вызывающий рак печени; антибиотики грибов);
• металлы (никель, хром, беррилий, кадмий, кобальт, мышьяк, свинец,
ртуть);
• волокнистые и неволокнистые силикаты (асбест).

Рис. Метилирование ДНК продуктами метилирования нитрозаминов

Рис. Метаболизм 2-нафтиламина
Химические канцерогены по механизму действия:
1. Канцерогены прямого действия (генотоксические) - соединения
Nнитрозоалкилмочевины,

азотистый

иприт,

диэпоксибутан,

β-

пропиолактон - имеют положительный заряд и высокую реакционную
способность, образуют стойкие связи с отрицательно заряженными
нуклеофильными группами молекул ДНК. При репликации нуклеотид,
связанный с остатком канцерогена, может быть неправильно считан ДНКполимеразой, что приводит к мутациям.
2. Канцерогены непрямого действия (негенотоксические, промоторного
типа) - пестициды, гормоны, волокнистые материалы, пр. воздействуют
в высоких дозах, длительно, беспрерывно.

Механизмы действия:
• промоция спонтанной инициации,
• митогенный эффект (активируют пролиферацию),
• оксидативный стресс,
• торможение апоптоза,
• нарушение межклеточных щелевых контактов.
Возможно участие в гентоксическом канцерогенезе производных эстрогенов
– катехолэстрогенов (2-, 4-гидроксиэстрадиола и 2-, 4-гидроксиэстрона).
Большинство канцерогенных химических соединений в окружающей среде
имеют антропогенное происхождение.

6.

Радиационный канцерогенез

Различают 3 вида излучений - лазерное, ультрафиолетовое, ионизирующее.

• гамма-лучи

ионизирующего

излучения

обладают

максимальной

проникающей способностью, беспрепятственно проходя через все тело.
• альфа- и бета-радиактивные изотопы имеют наибольшее поражающее
действие при попадании внутрь организма или на раневые и ожоговые
поверхности.
Механизм

действия

радиоактивных

излучений

–

способность

ионизировать и возбуждать атомы и молекулы облучаемых тканей.
Единицей измерения является рентген (р). Рентген - это доза гаммаизлучения, при которой в 1 см3 сухого воздуха при температуре 0° и
давлении 760 мм рт. ст. образуется 2,08 · 109 пар ионов, несущих одну
электростатическую единицу заряда.

Стадии действия радиации:
1.

Физическая стадия – изменения на субатомном и субмолекулярном

уровнях; поглощение энергии излучения, образование ионизированных и
возбужденных атомов и молекул.
2.

Физико-химическая стадия – субмолекулярный, молекулярный

уровни;

перераспределение

молекулами, образование

поглощенной

энергии

внутри

и

между

свободных радикалов (например, в результате

радиолиза воды образуются АФК.
3.

Химическая стадия (составляют тысячные и миллионные доли

секунд) - реакции между свободными радикалами и неактивированными
молекулами. Образуется широкий спектр молекул с измененной структурой
и функциональными свойствами. 4. Биологическая стадия (реализация от
секунд до нескольких лет) - функциональноморфологические нарушения в
клетках и физиологических системах, развитие поражений на всех уровнях
биологической организации, активация процессов репарации повреждений.

Механизмы действия радиации:
1. Прямое повреждающее действие - повреждение молекулы-мишени в
результате непосредственного взаимодействия с ней излучения.
• фотолиз воды
• денатурация белков
• повреждения
аз.оснований

ДНК

(мутации)

–

тиминовые

димеры,

удаление

• разрывы нити ДНК за счет разрушения фосфодиэфирных связей
• деполимеризация нуклеопротеидов, нуклеиновых кислот
• необратимые сшивки ДНК с белком
2. Непрямое повреждение молекулы-мишени - 70 - 90% повреждений
клеточных структур, ДНК АФК: ОН-, НО2, Н2О2 и продуктами ПОЛ.
• образование первичных радиотоксинов (продукты ПОЛ - перекиси,
гидроперекиси, эпоксиды, альдегиды, кетоны, хиноны и семихиноны)
• окислительная модификация белков
• нарушения обмена белков и нуклеиновых кислот
• инактивация РНК-азы за счет ионизации (радиолиза) воды
• нарушение синтеза и репарации ДНК и РНК (накопление мутаций)
• распад комплекса ДНК-гистоны
• повреждения ядерных мембран
• повышение мембранной проницаемости, поступление натрия, набухание
митохондриальных мембран
• нарушение окислительного фосфорилирования, дефицит АТФ
• повреждение

лизосомальных

мембран

лизосомальных протеолитических ферментов
• потеря микроэлементов, витаминов

Влияние радиации на клетки:

и

выход

в

цитозоль

1.
после

Репродуктивная гибель клетки. Во всех делящихся клетках сразу
облучения

временно

прекращается

митотическая

активность

("радиационный блок митозов"). Может наблюдаться задержка перехода из
фазы G1 в S и из фазы G2 в M. Вследствие нарушений репликации из-за
повреждений ДНК (двойные разрывы цепей и повреждения ДНКмембранного комплекса), клетка, войдя в митоз, погибает.
2.

Интерфазная гибель клетки. Более интенсивное облучение может

привести к гибели как неделящейся клетки, так и делящейся, но вне фазы
митоза. Морфологически характерно наличие хромосомных аберраций в
ана- или метафазе митоза. Механизм интерфазной гибели клеток путем
некроза и апоптоза, реализуемый преимущественно по внутриклеточному
сигнальному пути (митохондриальному).
3.

Нелетальные

повреждения

генома

клетки

-

возникновение

наследуемых мутаций и злокачественное перерождение соматических
клеток. Причины мутаций: дестабилизация структуры и репарации ДНК,
вызванная облучением. Облегчается внедрение онковирусов в геном клетки
или активации тех онковирусов, которые уже предсуществовали в геноме в
репрессированном состоянии. Следствием мутаций в зародышевых клетках,
мутации генофонда клеток половых желез могут стать дефекты развития у
потомства облученных родителей. Риск развития рака от средней
индивидуальной эффективной дозы облучения как от естественных, так и от
техногенных источников радиации в 100 раз ниже, чем от курения (при
выкуривании
20 сигарет в день).

7.

Вирусный канцерогенез

Онкогенные вирусы - это вирусы, содержащие онкогены (участки молекулы
ДНК, функционирование которых приводит к трансформации здоровой
клетки в опухолевую).
Онкогенные вирусы
классифицируются на:
• ДНК-содержащие
(вирус

герпеса,

вирус

папиломы,

вирус гепатита В,
вирус

ветряной

оспы, аденовирус)
• РНК-содержащие
ретровирусы «С» и
«В»,

вирус

саркомы
Рауса.

Функции онкогенных вирусов:
1.

50% из них кодируют биосинтез тирозиновой протеинкиназы, которая

ускоряет использование глюкозы в трансформированных клетках и поэтому
стимулирует трансформацию клеток;
2.

остальные 50% содержат информацию о различных функциональных

регуляторных активных белках (увеличивают синтез факторов роста
тромбоцитов, эпидермального фактора роста и их рецепторов).

Механизм действия онкогеновых вирусов:
ДНК- и РНК-вирусы частично или полностью встраиваются в геном клетки,
вызывают мутации протоонкогенов в онкогены → синтез онкобелков →

нарушение клеточного цикла → трансформация клетки → нарушение
функций клетки.

Онковирусы инициируют трансформацию протоонкогенов в онкогены и
обладают общими свойствами:
1. усиливают генетическую нестабильность клеток и пролиферацию;
2. повышают риск трансформации инфицированной клетки -

но для

развития неоплазии необходимы дополнительные факторы (клетка может
избежать, до момента перерождения имеет место продолжительный
латентный период, длящийся десятилетиями).
3. онковирусам (ретровирусам) не присущи исходно онкогены, но вирусы
получают их из генома тех клеток, в которых они обитают (гены хозяина
подвергаются мутациям и приобретают онкогенные свойства в вирусном
геноме)
4. онковирусы могут не содержать онкогенов, но случайно внедряясь в
геном человека, содержащего промоторы в регуляторных участках, могут
менять

экспрессию

соседних

хозяйских

генов

и

вызывать

трансформацию.

Молекулярные механизмы вирусной активации протоонкогенов при
опухолевой трансформации.
1.

Инсерционный мутагенез - вызван внедрением вирусных

генов в геном,

влиянием самих и их продуктов на экспрессию

клеточных генов. Ретровирусы могут быть носителями как вирусного
онкогена, так и энхансера, и промотора для протоонкогенов клетки.
Вирусная РНК содержит «длинные концевые повторы» (long termine
repeats, LTR по 10 - 80 нуклеотидов), смежные с концевыми 5- и 3-

последовательностями ДНК, что обеспечивает присоединение к
протоонкогену промотора или вставку в геном клетки энхансера.
2.

Активация при транслокации участка хромосомы с

протоонкогеном

в

локус

с

функционирующим

промотором.

Транслокации – это один из видов реаранжировки генов, которые
включают разрывы и воссоединение хромосом. Перемещение гена или
группы генов в другое место в пределах одной хромосомы или в
другую часто ведѐт к изменению экспрессии генов и нарушению их
функций. Так транслокация между 8 и 14 хромосомой приводит к
повышенной экспрессии cmyc при В-клеточной лимфоме.
3.

Активация путем амплификации (умножении копий)

протоонкогенов. В норме гены, обладающие небольшой активностью,
при увеличении числа их копий получают усиление суммарной
активности, что формирует избыточный ответ клетки и инициирует
трансформацию. Так ген c-myc амплифицирован 20-30-кратно в
нейробластомах, в линии лейкозных клеток, в карциноме прямой
кишки; cabl амплифицирован 10-кратно в клетках миелоидного
лейкоза; c-erbB - в 15-20 раз в клетках эпидермальной карциномы и
других солидных раках. Амплификация связана с неблагоприятным
прогнозом, химиорезистентностью (при лечении метотрексатом –
ингибитором дигидрофолатредуктазы (ДФР), выжившие клетки дают
клон с амплицикацией гена ДФР).
4.

Активация при точечных мутациях протоонкогенов -

замена, вставка, делеция кодона и различия в первичной структуре
по одной аминокислоте меняют функцию онкопротеина. Например,
ген с-h-ras, отличается от нормального гена одной аминокислотой, но
обусловливает снижение гуанозин-трифосфатазной активности в
клетке при раке мочевого пузыря.

8.

Особые свойства опухолевых клеток и механизм их приобретения

Канцерогенез возможен из двух источников: из нормальной клетки ткани,
ставшей прежде стволовой клеткой или из стволовой клетки ткани. В
составе клеток опухоли клетки неодинаковые:
• основную массу клеток составляют нераковые клетки: они быстро
делятся и после выполнения функций ткани сами погибают через
апоптоз; именно эти клетки - мишени для лекарств стандартной
химиотерапии;
• значительно меньшую часть составляют раковые стволовые клетки,
которые асимметричным делением копируют себя и генерируют
нераковые клетки в составе клеток рака.
• Раковые стволовые клетки делятся редко и медленно - это причина того,
что лекарства стандартной химиотерапии оказываются неэффективными
против раковых стволовых клеток
• Раковая стволовая клетка возникает из нормальной или стволовой
клетки ткани из-за дерепрессии в ней генов фетальных белков и
одновременно репрессии генов-супрессоров метилированием CpGдинуклеотидов промотора этих генов или мутаций в генах.
• Раковая клетка становится более живучей, чем нормальная клетка этого
же типа, она несѐт в себе ряд уловок, делающих еѐ неуязвимой и
способной к самостоятельному существованию в организме пациента.
• Эта дефектная клетка не просто клетка, а целый одноклеточный
организм – паразит

Молекулярно-генетические особенности опухолевой клетки:

1. Самодостаточность в отношении сигналов пролиферации, связанная с
аутопродукцией факторов роста, соответствующих рецепторов или
других компонентов сигнального промитотического каскада
2. Потеря

чувствительности

пролиферации,

к

сигналам,

обусловленная

сдерживающим

инактивацией

процесс

супрессорных

(антимитотических) белков.
3. Замедление

процессов

программируемой

клеточной

гибели,

опосредованное дисбалансом биохимической регуляции процессов
апоптоза.
4. Неограниченный
сопряжѐнный
реактивацией

репликативный потенциал клеток,
с

экспрессии

фермента

теломеразы,

и,

как

следствие,

отсутствием физиологического укорачивания теломер.
5. Стимуляция процессов ангиогенеза в опухоли, вызванная экспрессией
трансформированными клетками ангиогенных факторов и направленная
на

удовлетворение

повышенных

потребностей

в

оксигенации

быстроделящихся неопластических компонентов.
6. Способность к инвазии и метастазированию, ассоциированная с
продукцией опухолью гистолитических ферментов (протеаз), а также
факторов, угнетающих локальный иммунитет.
7. Геномная

нестабильность,

опосредованная

инактивацией

систем

репарации ДНК и нарушениями в молекулярном контроле клеточного
цикла.
8. Перестройка

стромальных

компонентов,

создающая

более

благоприятные условия для развития злокачественного клона.

9.

Биохимические изменения метаболизма в опухолевых клетках

В опухолевых клетках нарушен обмен всех веществ, который обеспечивает
им некоторые преимущества в сравнении с нормальными клетками:
неконтролируемый быстрый рост, метастазирование, что в свою очередь
требует большого количества АТФ. Характерна гипоксия. Однако, в
опухолевых клетках снижен биосинтез АТФ из-за малого содержания
митохондрий,

кровеносных

сосудов,

KoA-SH,

ТПФ

(вит

В 1)

и,

следовательно, медленно протекают процессы ЦТК и ЦТЭ.

Обмен углеводов в опухолевой клетке характеризуется:
1) усилением:
• гликолиза (аэробного и анаэробного)
• глюконеогенеза из аминокислот (за счет увеличения распада белков)
• синтеза лактата (эффект Варбурга), интенсификация цикла Кори –
синтез эндогенной глюкозы из лактата и аминокислот белков
• значительным увеличением сродства гексокиназы к глюкозе, поэтому
раковая клетка способна ассимилировать глюкозу, даже при очень низкой
концентрации в крови
• пентозофосфатного пути, поэтому в раковой клетке накапливаются
пентозофосфаты - субстраты для биосинтеза измененных ДНК.
2) ослаблением:
• биосинтеза гликогена, т.к. глюкоза для опухолевых клеток становится
основным энергетическим субстратом
• использования молочной кислоты для синтеза глюкозы, поэтому в
раковых клетках увеличивается содержание молочной кислоты (тест для
диагностики рака желудка).

Обмен липидов в опухолевой клетке практически не изменен, но
наблюдается:

• ускоренный метаболизм ТАГ, ФЛ и активация тканевого липолиза,
увеличение свободных жирных кислот
• дислипопротеинемия - дисбаланс синтеза жирных кислот и ТАГ
• активация ПОЛ
• дисбаланс антиоксидантной системы (повышение экспрессии СОД,
снижение активности глутатионтрансферазы, дефицит восстановленных
пиридиновых коферментов).

Обмен белков в опухолевой клетке характеризуется:
• уменьшением биосинтеза специфических белков клетки и увеличением
биосинтеза эмбриональных белков: α, β-фетопротеинов, канцероэмбрионального антигена и др. фетальных форм, факторов роста
• усилением распада собственных белков клетки и в дальнейшем кахексией
• деградацией белков и повышением в крови уровня аминокислот
• активацией

большого

числа

белков-ферментов:

теломеразы,

тирозинпротеинкиназы, лактатдегидрогеназы, гепаразы, катепсина В и
др.

Обмен нуклеиновых кислот в опухолевой клетке характеризуется:
• усилением биосинтеза азотистых оснований, ДНК, РНК, за счет
увеличения активности рибонуклеотидредуктазы, активности ДНКполимеразы и РНКполимеразы
• ослаблением катаболизма измененных нуклеиновых кислот и азотистых
оснований

за

счет

ингибирования

ферментов

распада:

инозинфосфорилазы, ксантиноксидазы, тимидинфосфорилазы, ДНКазы, РНК-азы,
• нарушением системы репарации ДНК

• нарушением обмена НК, перестройкой генетического материала в
опухолевой клетке.

Характерно системное влияние опухоли на организм при развитии раковой
кахексии. Метаболические основы - поглощение неоплазмой нуклеотидов и
их предшественников, аминокислот для синтеза своих НК и белков, а также
витаминов, глюкозы, жирных кислот в ущерб здоровым тканям. При этом
характерны нарушения эритро-, лимфо-, тромбопоэза и гемолиз; дисфункция
иммунокомпетентных клеток (дисбаланс между Т- и В-лимфоцитами);
активация факторов ангиогенеза, стимулирующих развитие сосудов, для
снабжения раковых клеток питательными веществами.
• Изменение

состава

и

структуры

гликопротеинов

и

гликосфинголипидов плазматической мембраны, еѐ проницаемости и
заряда
• Снижение синтеза и изменение структуры адгезивных молекул (Екадгерина), ослабление межклеточных связей
• Секреция

протеаз

(катепсин

L,

плазмин,

матриксные

металлопротеиназы, гепараза), коллагеназ и гликозидаз, которые
разрушают

коллаген,

белки,

гликозаминогликаны

межклеточного

матрикса и способствуют инвазии опухоли в соседние ткани и сосуды
(неоангиогенез)

Метастазирование – это перемещение опухолевых клеток из первичного
очага в другие ткани, где они дают начало вторичным опухолям. Причины
«отрыва» метастазирующих клеток и их перемещения:
1. в клетках происходит существенное изменение качественного и
количественного

состава

мембранных

белков,

ответственных

за

адгезивные свойства: уменьшение содержания кадгерина, катенина,
фибронектина,

ламинина

и

др.адгезивных

белков

способствует

ослаблению межклеточных связей, связей с цитоскелетом, базальными
мембранами, каллагеном и другими компонентами межклеточного
матрикса.
2. модифицированные

интегрины

помогают

инвазивным

клеткам

мигрировать через соединительную ткань и стенку капилляров в
кровеносное русло или лимфу.
3. происходит разрушение межклеточного матрикса и базальных мембран и
повышение проницаемости кровеносных сосудов, что обеспечивают
специфические ферменты метастазирующих клеток и фибробласты,
окружающие опухоль:
• коллагеназы (расщепляют коллаген межклеточного матрикса);
• гепараза (катализирует
мембраны);

гидролиз

гепарин-сульфата

базальной

• катепсин В (в злокачественных клетках встроен в плазматическую
мембрану и помогает им покинуть родительскую ткань, т.к.
активирует проколлагеназу, которая расщепляет коллаген IV типа);
• плазмин (расщепляет некоторые белки межклеточного матрикса
неколлагенового происхождения);
• семейство металлопротеаз (участвуют в разрушении различных
компонентов межклеточного матрикса).
После успешного прохождения через соединительную ткань органа
опухолевые клетки продвигаются к кровеносному сосуду, проталкиваются
между эпителиальными клетками, и выходят в кровоток. По крови они
транспортируются в комплексе с тромбоцитами к месту новой локализации,
где с помощью интегринов прикрепляются к базальной мембране в органахмишенях, т.е. только в «излюбленных» данной формой опухоли местах.

Например, рак простаты, как правило, дает метастазы в кости, рак молочной
железы и легкого – в мозг, рак прямой кишки – в печень.

10.

Принципы диагностики, лечения и профилактики

злокачественных новообразований

Для диагностики, клинической идентификации опухолей используют
индикаторы опухолевого процесса – онкомаркеры (ОМ).
Опухолевые маркеры - это химические соединения (белки, пептиды,
гормоны, ферменты, метаболиты), которые синтезируются только в
организме опухоле носителя в ответ на развитие рака, но должны
отсутствовать в нормальных клетках, так как являются продуктами
аномальной экспрессии генома раковой клетки. Их обнаруживают в крови
или других биологических жидкостях. Обычно это белки, которые
продуцируются опухолевой клеткой (группа 1) или синтезируются другими
клетками, взаимодействующими с опухолевыми (группа 2). К опухолевым
маркерам

группы

1

относятся

опухоль-ассоциированные

антигены,

секретируемые гормоны и ферменты. Биохимические опухолевые маркеры –
это вещества, образуемые опухолевыми клетками и секретируемые в
биологические жидкости, в которых они могут быть количественно
определены неинвазивными методами.
В настоящее время измерение уровня ОМ широко используется в
диагностике, лечении, при мониторинге состояния онкологических больных
и

доклинического

выявления

рецидивов.

Согласно

классификации ОМ делят на четыре основные группы:
1. плаценарные антигены (например, βХГЧ);
2. онкофетальные антигены (РЭА, АФП);

современной

3. антигены, ассоциированные с мембранами опухолевых клеток (СА 15-3,
СА 199, СА 125, СА 242, PSA);
4. метаболические маркеры (NSE, Cyfra 21-1, β2-МГ, ферменты)
Требования для онкомаркеров:
• специфичность для злокачественных процессов;
• чувствительность,
• определение на ранних стадиях болезни;
• корреляция с размером опухоли, стадией заболевания, прогнозом;
• короткий период полужизни,
• отражение эффективности лечения
Иммунологическая диагностика – обнаружение, определение содержания
эмбриональных онко-фетальных белков, которые в норме обнаруживаются в
эмбриональных тканях человека и крови в период внутриутробного
развития, но после рождения они исчезают или остаются в следовых
количествах. Однако, при опухолевой прогрессии эти белки начинают вновь
синтезироваться и секретируются в кровь. К ним относятся:
1)

Карцино-эмбриональный белок (КЭА) – одноцепочный

белок, гликопротеин, с молекулярной массой от 150 до 300 кД,
углеводная часть которого составляет от 45 до 57% молекулярной
массы, включает фруктозу, маннозу, галактозу и Nацетилглюкозамин.
2)

α-фетопротеин (α-ФП) - гликопротеин с М = 61-70 кД, его

углеводная часть составляет ~5% от общей массы белка. Используется
для диагностики рака печени.
3)

Плацентарные белки (хорионический гонадотропин (ХТГ).

Измерение уровня ХГТ спинно-мозговой жидкости используют для
диагностики метастаз в мозг и ЦНС.

Онкомерками (ОМ) могут служить и дифференцировочные антигены
(органо- или опухолеспецифические гликопротеины лимфоцитов), которые
определяются в крови с помощью моноклональных антител.
• Раково-эмбриональный антиген (РЭА) – вырабатывается в тканях
пищеварительного тракта эмбриона и плода – маркер при раке толстого
кишечника, РЛ, РМЖ, раке головы и шеи, злокачественных образованиях
соединительнотканного происхождения + белок острой фазы у больных с
аутоиммунными,

острыми

и

хроническими

воспалительными

заболеваниями.
• α-фетопротеин (АФП) – в норме АФП продуцируется в период гестации
в печени плода и желточном мешке - повышается в крови при развитии
рака печени, а также у больных с опухолями из зародышевого эпителия
(тератомы яичка или яичника и др.).
• Хорионический

гонадотропин

(ХГЧ),

свободная

β-субъединица

повышается при опухолях яичников и семенников, у больных раком
легких, на поздних стадиях при раке кишечника, при хорион-эпителиоме.
Антигены, ассоциированные с мембранами опухолевых клеток
• антиген СА15-3 для мониторинга лечения и диагностики рецидивов при
РМЖ, при
циррозе,

гепатите,

аутоиммунных

расстройствах,

доброкачественных заболеваниях яичников и молочной железы, на
поздних стадиях заболевания при карциноме яичников, шейки матки,
эндометрия
• антиген СА19-9 - в норме присутствует на мембране лейкоцитов для
адгезии лейкоцитов к эндотелию сосудов и выхода клетки к очагам
воспаления

-

гиперэкспрессия

при

метастазировании

рака

поджелудочной железы, желудка, толстой и прямой кишки, маркер
аденокарцином поджелудочной железы.

• антиген СА125 определяют перед процедурой ЭКО для выявления групп
риска по развитию РЯ.
• муциновый антиген CA242 –для диагностики и мониторинга РПЖ, рака
толстого кишечника.
• простата-специфичный антиген, общий и свободный (ПСА, свободный
ПСА, PSA) - практически не определяется у женщин, у мужчин
существенно

возрастает

в

злокачественных

и

доброкачественных

опухолях предстательной железы.

Гормональная диагностика
Гормоны и их рецепторы (эстрогены, андрогены и АКТГ, паратгормон,
кальцитонин, гормон роста, инсулин, глюкагон, катехоламины, серотонин)
являются онкомаркерами гормоно-продуцирующих органов. Гормоны как
опухолевые маркеры некоторых видов опухолей

Определение рецепторов гормонов в качестве онкомаркеров используют для
выявления рецидивов заболевания после хирургического вмешательства и
которым необходима химиотерапия.

Ферментативная неспецифическая диагностика
Для диагностики и контроля эффективности терапии онкозаболеваний
используют также некоторые ферменты:

•

нейроспецифическая енолаза – при раке легких

•

щелочная фосфатаза – при опухоли костной ткани

•

кислая фосфатаза – при раке предстательной железы

•

α-амилаза – при опухоли поджелудочной железы

Активным ОМ - ферментом является сериновая протеаза – активатор
плазмина, который способствует развитию опухолевого процесса.
• неспецифические онкомаркеры - белки острой фазы воспаления:
ферритин, церулоплазмин, гаптоглобин, С-реактивный белок; гемоглобин
и др.
• неспецифические

маркеры

цитотоксичности

химиопрепаратов

-

изоформы ЛДГ, креатинкиназы, активность глутатион-S-трансферазы
• неспецифические маркеры ранней диагностики, рецидива и контроля
лечения

–

активность

тимидинкиназы,

тимидинфосфорилазы

-

ферментов «запасного пути» синтеза дезокситимидилата – нуклеотида,
лимитирующего скорость синтеза ДНК

Рис. Схема «запасного пути» синтеза тимидилата

Молекулярно-генетические исследования в тканях - патоморфологические
исследования биопсийного материала, либо послеоперационного материала.
Иммуно-гистохимические

исследования

в

тканевых

микросрезах

парафиновых блоков с целью определения клинических маркеров, маркеров
прогноза, индивидуальной чувствительности к таргетной терапии. Для
диагностики определяют комплекс маркеров: CD 34 (сосудистый маркер),

Ki-67(показатель

пролиферации),

цитокератины,

Е-кадгерин,

α-

гладкомышечный актин, виментин.
Метаболические маркеры:
• нейрон-специфическая
клетках
нейроэктодермального

енолаза

происхождения,

(NSE)
нейронах

–

в

опухолевых

головного

мозга

и

периферической нервной ткани.
• цитокератины (Cyfra 21-1, TPA, TPS, UBC) – белки филаментов
цитоскелета эпителиальных клеток поступают в кровь в процессе некроза
опухолевых клеток, а также в S, G2 и М фазах нормального клеточного
цикла, поэтому их концентрация в сыворотке отражает скорость
обновления клеток.
• β2-микроглобулин (β2-МГ) - на поверхности различных эпителиальных
клеток, лимфоцитов, макрофагов – у пациентов с множественной
миеломой или неходжкинскими лимфомами; увеличение концентрации
маркера зависитот стадии заболевания, степени злокачественностии типа
клеток.

Лечение

онкологических

больных.

Химиотерапия

в

подавлении

опухолевого роста. Цитостатики

Можно подавить рост опухоли методами физио- или химиотерапии:
1. рентгеновское облучение благодаря мутагенному действию блокирует
размножение клеток
2. химиотерапия - подавление опухолевого роста с помощью цитостатиков
Недостатки методов:
1) низкая специфичность
2) побочные эффекты - повреждение нормальных клеток

А. Алкилирующие и интеркалирующие агенты. Первая группа веществ (A)
взаимодействует с молекулами ДНК, блокируя при этом процессы
транскрипции и репликации:
• химические соединения (циклофосфамид и неорганический комплекс
цисплатин),

образующие

ковалентные

связи

-

внутри-

и

межмолекулярные мостики в ДНК, приводя к изгибу двойной спирали
• интеркалирующие агенты - адриамицин, встраивающиеся между
плоскостями нуклеиновых оснований за счет нековалентных связей,
вызывая локальные изменения пространственной структуры ДНК
• антиметаболиты, встраивающиеся в ДНК и препятствующие репликации
Б. Антиметаболиты. Вторая группа цитостатиков (Б) подавляет синтез
предшественников ДНК:
• ингибиторы ферментов, избирательно блокирующие метаболические
пути, биосинтез нуклеотидов
• цитостатики - производные нуклеиновых оснований или нуклеотидов и
конкурентные ингибиторы ферментов
• цитостатики, действующие опосредованно, приобретая активность в
результате метаболической трансформации после введения в организм.
Например,

аналог

мононуклеотид

аденина

6-меркаптопурин

тиоинозинмонофосфат

[тИМФ

превращается
(tIMP)]

и

в
др.,

встраивается в ДНК, образуя поперечные связи, вызывая аномалии.
Другим

активным

метилтИМФ,

производным
ингибитор

6-меркаптопурина

является

S-

амидофосфорибозил-трансферазы.

Гидроксимочевина избирательно ингибирует рибонуклеотид-редуктазу.
Как ловушка свободных радикалов это соединение нейтрализует
тирозин-радикал, необходимый для функционирования редуктазы.

• цитостатики,

препятствующие

синтезу

тимина

на

стадии

дезоксимононуклеотида. Дезоксимононуклеотид, образующийся из 5фторурацила

или

соответствующего

нуклеозида,

ингибирует

тимидилатсинтазу, т.к. атом фтора в пиримидиновом цикле не
замещается на метильную группу. Кроме того, фтор содержащий аналог
встраивается

в

ДНК.

Для

тимидилат-синтазы

вспомогательным

ферментом является дигидрофолатредуктаза. Этот фермент принимает
участие в регенерации кофермента N5, N10-метилен-ТГФ (N5, N10methylene-ТНF): с потреблением
НАДФН он восстанавливает ДГФ (DHF) до ТГФ (THF). Аналог фолиевой
кислоты

метотрексат,

чрезвычайно

часто

применяющийся

эффективным

цитостатик,

конкурентным

является

ингибитором

дигидрофолатредуктазы. Действие цитостатика приводит к истощению
клеток относительно N5, N10-метилен-ТГФ и, следовательно, к остановке
синтеза ДНК.

Новые направления в лечении опухолей
• Антибиотики
• Гормон-зависимая терапия новообразований (например, с помощью
андрогенблокирующей терапии лечат рак простаты, рак молочной
железы часто подвергается регрессии при применении антагонистов
эстрогеновых рецепторов)
• Препараты, регулирующие концентрацию кальция
• Препараты, активирующие (ингибирующие) протеинкиназы и др.
ферменты
• Антиоксидантная терапия

• Фотодинамическая терапия – разрушение опухоли путем введения
веществ и их активации под воздействием лазера – цитотоксический
эффект путем повреждения мембран АФК, а не ДНК (нет мутаций)
• Направленная доставка лекарств в клетки-мишени
• Подавление ангиогенеза
• Генная терапия
Современные
молекулярно-генетические
онкозаболеваний

методы

в

лечении

Молекулярная или генная медицина - создание лекарств по генам-маркерам
и белкам-маркерам, позволяющие избирательно воздействовать только на
них и уничтожать их носителей, не давая побочных эффектов. Определив
ген-маркер болезни, можно определить, какой именно белок еѐ вызывает, и
создавать лекарство против этого белка или его гена. Новые лекарства и
средства на основе геновмаркеров и белков-маркеров конкретной болезни
станут прицельно атаковать только дефектные клетки, уничтожая их, и не
повреждая при этом здоровые клетки.
Таргетная терапия - использование таргетных препаратов для лечения.
Таргетные

препараты

-

новый

класс

препаратов

избирательного

воздействия на патогенетически обоснованные молекулярные мишени,
присущие, например, только опухолевым клеткам или очагам сосудистого
поражения. Это собственные белки организма, участвующие в процессах
канцерогенеза и определяющие способность опухоли к прогрессии и
метастазированию.
Молекулярные мишени таргетных препаратов в онкологии – селективные
маркерные биокомпоненты, содержащиеся в очаге поражения:
• рецепторы к эпидермальным факторам роста и факторам роста сосудов
(рецепторы ангиогенеза)

• белки, проводящие митогенные сигналы от рецепторов
• молекулы,

контролирующие

апоптоз

-

запуск

и

течение

запрограммированной смерти клеток.
Сайленсинг (от англ. silence - молчание) - новая перспективная таргетная
технология в генотерапии рака - «выключение» генов, отвечающих за рост и
деление раковых клеток, на основе механизма ингибирования экспрессии
гена на стадии трансляции с помощью малых интерферирующих РНК.

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Ранее, клонирование с использованием библиотек ДНК было
единственным способом изолировать ген или исследуемый фрагмент ДНК.
Этот подход и в настоящее время сохраняет свою актуальность при
полногеномном секвенировании, а также при работе с очень большими
генами. Гораздо более быструю и простую альтернативу для многих
приложений клонирования, в особенности для тех организмов, чьи полные
последовательности

геномов

секвенированы,

предлагает

метод

полимеразной цепной реакции (ПЦР) (polymerase chainreaction, PCR),
предложенный в 1983
г. сотрудником компании "Cetus" Кэри Муллисом, удостоенным за данное
изобретение Нобелевской премии по химии. В настоящее время, метод ПЦР
в той или иной его модификации является неотъемлемой частью любого
молекулярно-биологического исследования. В медицине ПЦР применяют
для диагностики инфекционных и наследственных заболеваний, при
диагностике рака и иммунных патологий. В криминалистике и судебной
медицине ПЦР используют для идентификации личности, определения
биологического родства индивидов и анализе образцов биологического
материала,

собранного

эпидемиологические

на

службы

месте
используют

преступления.
ПЦР

для

Санитарноконтроля

за

микробиологическим загрязнением окружающей среды

и продуктов

питания, а также для выявления генетически модифицированных продуктов
(ГМО). В научно-исследовательских лабораториях, ПЦР используют для
изучения нуклеиновых кислот и проведения манипуляций с ними. Благодаря
ПЦР стало возможным быстрое получение участков ДНК в чистом виде и
достаточном количестве. На основе ПЦР были созданы современные
технологии секвенирования нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) Внедрение
ПЦР в медицину открыло новое диагностическое направление - ДНКдиагностику.
В настоящее время существует множество модификаций ПЦР: ПЦР в
реальном времени, количественная ПЦР (quantitative, qPCR), мостиковая
ПЦР (bridge PCR, bPCR), эмульсионная (emulsion PCR, ePCR) и цифровая
капельная ПЦР (digital drop PCR, ddPCR). несмотря на большое
разнообразие отдельных подходов, в основе всех разновидностей метода
ПЦР

лежит

общий

принцип

способности

нуклеиновых

кислот

к

самокопированию (репликации). Поэтому рассмотрение биологических
основ и отличительных особенностей каждого из этих методов следует
начать с рассмотрения принципа классической ПЦР.
1.1 Классическая ПЦР
ПЦР может быть проведена целиком in vitro в бесклеточной
среде. С помощью этого метода заданную нуклеотидную последовательность
можно выборочно и быстро реплицировать в больших количествах из любого
образца ДНК. ПЦР основана на использовании ДНК-полимеразы для
копирования образца ДНК в повторяющихся циклах

репликации. ДНК-

полимеразу направляют к необходимой последовательности короткие ДНКпраймеры (затравки), представляющие собой короткие (18-24 нуклеотида)
искусственно синтезированные ДНК-олигонуклеотиды, которые добавляют в
реакционную смесь, где они гибридизуются с образцом ДНК в начале и в
конце необходимой последовательности. Эти праймеры предоставляют 3ʹ-

концы для ДНКполимеразы, с которых она начинает репликацию обеих
цепей. Последовательность самих праймеров необходимо подобрать таким
образом, чтобы они были комплементарны участкам ДНК, фланкирующим
(т.е. ограничивающим) необходимую последовательность. В настоящее
время задача по "дизайну" праймеров может быть решена с помощью
специальных компьютерных программ, предназначенных для анализа
биологических последовательностей, таких как, например, Primer3, Primer
Express и Vector NT. В последнее время, бурное развитие биоинформатики
предоставляет все больше возможностей для быстрого и
автоматизированного анализа последовательностей генов любого организма,
чей геном секвенирован и занесен в соответствующие биоинформационные
базы данных, такие как GenBank и NCBI. Синтез праймеров в настоящее
время также полностью автоматизирован и осуществляется с помощью
специальных приборов - синтезаторов ДНК. В настоящее время задача по
синтезу праймеров является рутинной и данная услуга предоставляется
многими коммерческими компаниями, действующими на рынке
биотехнологий: Синтол, Евроген, Invitrogen, Sigma Aldrich, Cell Signaling.
Поскольку праймеры должны быть комплементарны к участкам ДНК,
ограничивающим амплифицируемый фрагмент, ПЦР можно использовать
только для амплификации последовательности, начало и конец которой
известны. В ходе каждого цикла репликации две цепи двухцепочечной ДНК
разделяются и копируются независимо.
Каждый

цикл

ПЦР

включает

три

этапа

(Рис.

1).

Сначала

двухцепочечную ДНК ненадолго нагревают до 90-96°С, чтобы отделить
цепи друг от друга (плавление ДНК). Температура плавления каждого
образца ДНК индивидуальна и определяется соотношением G≡C и А=Т пар
в первичной структуре амплифицируемого фрагмента. Как известно, при
образовании Уотсон-Криковских пар между азотистыми основаниями,
между G и C формируется три водородные связи, тогда как пара А=Т
образована двумя водородными связями. Поэтому, чем выше содержание

G≡C пар в первичной структуре нуклеиновой кислоты, тем выше ее
температура плавления (Tm). Приблизительную температуру плавления
короткого

фрагмента

двухцепочечной

ДНК

можно

рассчитать

по

уравнению:
= 2( + ) + 4( + ) + , где
k - число, находящееся в интервале 0<k<5. Обычно принимают k = 4.

Рис. 1 Первый цикл ПЦР

После расхождения цепей ДНК охлаждают (примерно до 40-75°С) в
присутствии переизбытка праймеров, что позволяет им гибридизоваться с
комплементарными последовательностями на цепях ДНК. Затем смесь
инкубируется с ДНК-полимеразой и 4-мя видами dNTP, чтобы ДНК
синтезировалась, начиная с двух праймеров. Затем цикл начинается заново с
нагревания, чтобы отделить вновь синтезированные цепи ДНК друг от
друга. Поскольку процесс плавления ДНК требует использования высоких
температур,

данная

методика

требует

использовать

особые

виды

ДНКполимераз, способные выдерживать нагревание до 96°С. Большинство
известных ДНК-полимераз, как и других ферментов, при нагревании до
столь

высоких

температур

подвергаются

денатурации

и

теряют

биологическую активность. Поэтому для проведения ПЦР используют
специальные ДНКполимеразы, выделенные из термофильных бактерий,
которые устойчивы к действию гораздо более высоких температур, чем

эукариотические ДНКполимеразы. Это снимает необходимость добавления
новой порции фермента после каждого цикла ПЦР.
Долгое время для проведения ПЦР использовались отдельные
термостабильные ДНК полимеразы: Taq, Tth, Pwo, Pfu и др. В настоящее
время, для различных целей, в ПЦР используют смеси полимераз с
различными свойствами, включая искусственно полученные модификации
природных ферментов. Большинство используемых в настоящее время
ферментов получены на основе технологии рекомбинантных ДНК.
Taq-полимераза была выделена из термофильной эубактерии Thermus
aquaticus. Фермент представляет собой одну полипептидную цепь с
молекулярной массой 95 кДа. Данный фермент эффективно амплифицирует
фрагменты длиной 3000-5000 п. н. и обладает хорошо выраженной 5ʹ3ʹэкзонуклеазной активностью, но не проявляет корректирующей 3ʹ5ʹэкзонуклеазной

активности.

Получаемые

при

использовании

Taq-

полимеразы фрагменты ДНК, как правило, содержат выступающий 3ʹконцевой нуклеотид (чаще всего А), который нематрично присоединяется
ферментом. Это свойство Taq-полимеразы используют для эффективного
клонирования

продуктов

ПЦР

в

линеаризованные

векторы

с

3ʹ-

выступающим Т.
Tth-полимераза была выделена из термофильной эубактерии Thermus
thermophilus. Это также высокопроцессивный фермент, амплифицирующий
до 3000 п. н., имеющий молекулярную массу порядка 94 кДа, обладающий
хорошо выраженной 5ʹ-3ʹ-экзонуклеазной активностью, но не проявляющий
корректирующей 3ʹ-5ʹ-экзонуклеазной активности. Особенностью этой
полимеразы является наличие ревертазной активности. Данный фермент
обычно

используют

для

проведения

обратной

ПЦР

с

обратной

транскрипцией (RT-PCR).
Pwo-полимераза была выделена из гипертермофильной архебактерии
Pyrococcus woesei. Молекулярная масса фермента около 90 кДа. Это

процессивный фермент, обеспечивающий амплификацию до 3000 п. н., не
проявляющий 5ʹ-3ʹ-экзонуклеазной активности, но обладающий выраженной
3ʹ5ʹ-экзонуклеазной активностью.
Pfu-полимераза получена из Pyrococcus furiosus. Молекулярная масса
около

92

кДа.

Pfu-полимераза

характеризуется

сравнительной

процессивностью и эффективно амплифицирует фрагменты до 1000 п. н.
Фермент обладает 3ʹ-5ʹэкзонуклеазной активностью, наличие которой делает
его пригодным для тех вариантов ПЦР, в которых необходимо получение
продукта с высокой точностью синтеза (например, для последующего
секвенирования).

Рис. 2 Схема амплификации ДНК в течение трех циклов ПЦР

Помимо

ДНК-матрицы,

ДНК-полимеразы

и

праймеров,

необходимыми компонентами реакционной смеси являются dNTP 4-х типов
(dATP, dGTP, dCTP и dTTP), а также ионы Mg2+ (чаще всего в форме MgCl2).
После множества циклов амплификации образуется большое число,
обычно миллиарды копий исходной последовательности (Рис. 2).
В результате каждого цикла количество копий амплифицированного
фрагмента увеличивается как 2n. При этом относительная концентрация

целевых последовательностей многократно возрастает (показано желтым), в
то время как доля нецелевых участков прогрессивно уменьшается.
ПЦР крайне чувствительна и может зарегистрировать присутствие
единичной копии последовательности ДНК в образце, амплифицируя ее так,
что эту ДНК становится возможным увидеть с помощью, например,
окрашивания

бромистым

этидием

(интеркалирующего

агента,

встраивающегося между цепями двойной спирали ДНК и вызывающего ее
сверхспирализацию,

в

результате

чего

образовавшийся

комплекс

приобретает способность флуоресцировать в УФ-свете) после разделения
гель-электрофорезом.

Рис. 3 Получение геномных (А) и кДНК копий с помощью ПЦР

Существует несколько особенно важных областей применения ПЦР.
На сегодняшний день, это основной метод клонирования относительно
коротких фрагментов ДНК (менее 10 000 п. н.). Изначальной матрицей для
реакции может служить как ДНК, так и РНК, что позволяет с помощью ПЦР
получать как полногеномные копии, так и копии кДНК (Рис. 3). Удобство

метода состоит в том, что ген можно клонировать непосредственно с любого
фрагмента ДНК или РНК без необходимости первоначального создания
библиотек.
Другое применение ПЦР, связанное с ее особой чувствительностью,
это поиск патогенов инфекционных заболеваний на ранних стадиях. В этом
случае, в качестве праймеров используют короткие фрагменты ДНК,
комплементарные какой-либо из уникальных последовательностей генома
возбудителя. С помощью большого числа циклов ПЦР можно проверить
наличие или отсутствие даже единичных его копий в образце крови (Рис. 4).

Рис. 4 Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний.

ПЦР - самый чувствительный метод диагностики для многих
инфекций. В настоящее время он часто заменяет иммунологические методы
диагностики, такие как ИФА.
ПЦР широко применяется в судебной медицине и криминалистике.
Крайне высокая чувствительность этого метода позволяет работать с очень
маленькими образцами, такими как волосяная луковица от волоса,
мельчайшие следы крови или тканей, которые могут содержать фрагменты
лишь одной клетки. Используя ДНК, выделенную из таких образцов, можно
получать генетические "отпечатки пальцев" человека, от которого получен
образец. Геном каждого человека, за исключением монозиготных близнецов,

отличается по последовательности ДНК от генома любого другого человека.
ДНК, амплифицированная с помощью ПЦР с использованием определенных
праймеров будет различаться по последовательности у разных людей.
Используя набор праймеров, покрывающих известные высоковариабильные
участки генома человека, можно с помощью ПЦР получить различающиеся
генетические "отпечатки пальцев" для каждого человека. Обычно, в таком
анализе используют так называемые короткие тандемные повторы (short
tandem repeats, STRs), состоящие из таких последовательностей как
САСАСА... или GTGTGT..., и находящиеся в различных локусах в геноме
человека. Число повторов в каждом STR высоковариабильно в популяции, с
разбросом от 4 до 40 у разных индивидов. Из-за разнообразия в этих
последовательностях люди обычно наследуют разные варианты каждого
STR от матери и от отца; два неродственных человека, как правило, несут
разные пары последовательностей. После ПЦР с использованием праймеров,
ограничивающих локус, образуется пара полос амплифицированной ДНК от
каждого человека, одна из которых представляет материнский вариант STR,
а вторая - отцовский. Длина ПЦРпродукта и, соответственно, положение
полосы в геле после электрофореза будет зависеть от точного числа
повторов в локусе (Рис. 5).

Рис. 5 ПЦР-анализ одного STR-локуса

На Рис. 6 представлен пример анализа трех STR-локусов у трех
подозреваемых (А, Б и В), что приводит к образованию шести полос для
каждого человека после электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).
Несмотря на то, что у разных людей отдельные полосы могут совпадать,
общая картина уникальна для каждого человека. Четвертая дорожка геля (Г)
содержит продукты ПЦР проведенной с образцом ДНК, полученным из
биологического материала, собранного на месте преступления. Чем больше
локусов будет проанализировано, тем ниже будет вероятность ошибки из-за
совпадения числа повторов в отдельных локусах. Если исследовать
вариабельность 5-10 разных STR-локусов, то вероятность того, что у двух
случайных людей совпадут "отпечатки пальцев" будет примерно 1 на 10
млн.

Рис. 6 Анализ трех STR-локусов методом ПЦР

В рассмотренном случае, индивиды А и В могут быть исключены из
числа подозреваемых, а Б остается явным подозреваемым в совершении

преступления.

Аналогичный

подход

используется

при

определении

отцовства.
1.2 Оборудование и материалы для ПЦР
1.2.1 Типы ПЦР-амплификаторов
Приборы

для

проведения

ПЦР

(термоциклеры,

ДНК-

амплификаторы, ПЦР-амплификаторы) представляют собой устройства для
быстрого изменения температуры реакционной смеси по определенной
программе. Все современные амплификаторы можно разделить на модели с
возможностью

детекции

накопления

ДНК

в

процессе

реакции

(детектируюшие или real-time-амплификаторы) и без таковой (обычные
амплификаторы). Детектирующие амплификаторы, в сравнении с обычными
амплификаторами,

оснащены

дополнительной

оптической

насадкой,

позволяющей регистрировать флуоресценцию в закрытой реакционной
пробирке

(через

прозрачную

крышку

или

стенки

пробирки)

непосредственно во время реакции (Рис. 7).

Рис. 7. Примеры обычного (А) амплификатора С1000 Touch, BioRad (США) и
детектирующего амплификатора CFX96 Touch, BioRad (США)

1.2.2 Формат пробирок для проведения ПЦР
В настоящее время используют 4 стандартных формата отдельных или
стрипованных пробирок для ПЦР: 0,5 мл (0,6 мл), 0,2 мл, 0,025 мл
(384луночный формат) и 0,01 мл (1536-луночный формат), а также широкий

ассортимент нестандартных емкостей для проведения реакции. Пробирки по
0,5 мл и 0,2 мл бывают отдельными, скрепленными по 8 или 12 шт (в
"стрипах") и в виде 96-луночных планшетов. Форматы 0,025 мл и 0,01 мл
существуют только в виде 384-луночных или 1536-луночных планшетов.
Пробирки на 0,5 мл и 0,2 мл выпускают с различной толщиной стенок. На
толщину стенок

используемых

пробирок

следует

обращать особое

внимание, поскольку данный параметр существенно влияет на точность
расчета температуры реакционной смеси при использовании регулирования
температуры реакционной смеси по математической модели. Некоторые
амплификаторы позволяют учесть толщину стенок используемых пробирок
в формуле расчета.
1.2.3 "Горячий старт" (HotStart)
Несмотря на то, что оптимальная температура для действия
большинства используемых для ПЦР ДНК полимераз составляет 60-80°С,
большая часть из них сохраняет активность при комнатной температуре.
Поскольку компоненты реакции, как правило, смешивают при комнатной
температуре, в момент приготовления реакционной смеси праймеры могут
неспецифично отжигаться на всегда присутствующую в очищенной ДНК
одноцепочечную фракцию или же друг на друга и удлиняться ДНКполимеразой еще до начала ПЦР. В результате могут появляться
неспецифичные

фрагменты,

эффективно

амплифицируемые

в

ходе

последующей реакции. Для предотвращения такого эффекта существует
несколько подходов, обозначаемых как "горячий старт". 1.2.3.1 Добавление
одного из компонентов реакции при высокой температуре.
Наиболее

простым

необходимых

для

реакционной

смесью

способом

реакции

является

компонентов

высокой

добавление

только

температуры

(70

после
-

одного

из

достижения

95°С).

Такими

компонентами могут быть: ДНК-полимераза, Mg2+ (образуют растворимые
комплексы с dNTP и формируют субстрат для ДНК-полимеразы), dNTP или

праймеры. Данный подход удобен при небольшом числе реакций в одном
эксперименте. Минусом подхода является повышенная ошибка в количестве
отдельно добавляемого компонента.
1.2.3.2 Разделение барьером
Для достижения "горячего старта" можно отделить один из
необходимых для ПЦР компонентов барьером, исчезающим при высокой
температуре. Чаще всего такой барьер делается из парафина путем
разделения смеси на 2 отсека парафиновой пробкой, либо за счет помещения
одного из компонентов (Mg2+ или ДНК-полимеразы) внутрь парафиновых
шариков. Данный подход применим для масштабных экспериментов. К
минусам данной методики можно отнести сложность использования
автоматических дозирующих станций для приготовления реакций с
парафиновым барьером.
1.2.3.3 Ингибирование полимеразы антителами
При

температурах

ниже

50-60°С

можно

блокировать

работу

полимеразы путем ее связывания с антителами. Для этого используют монои поликлональные антитела (обычно мышиные) к ДНК-полимеразе. В
зависимости от качества антител используют смеси от 1:1 до 1:10 по
количеству молей фермента и антител, соответственно. ДНК-полимеразу
обычно хранят в заранее изготовленной смеси с антителами, используя эту
смесь для приготовления реакций. При нагревании реакционной смеси в
ходе первого цикла ПЦР антитела инактивируются и ДНК-полимераза
начинает действовать.
1.2.3.4 Использование химически модифицированной полимеразы
Ковалентное присоединение термо- или рН-лабильных химических
групп к некоторым аминокислотам ДНК-полимеразы обратимо ингибирует
еѐ активность. При 95°С во время первого цикла ПЦР такие химические
группы отделяются и фермент начинает работать. Для эффективной
активации фермента, как правило, необходима инкубация реакционной

смеси перед началом реакции при 95°С в течение 5-20 мин. 1.2.3.5
Использование ингибиторов ДНК-полимеразы
ДНК-полимеразу
модифицированными

можно

также

обратимо

олигонуклеотидами,

ингибировать

обладающими

высокой

константой связывания с ферментом и диссоциирующими из комплекса при
сравнительно высоких температурах.
1.3 ПЦР в реальном времени (Real-Time-PCR, qPCR, qRT-PCR)
Поскольку в ходе ПЦР происходит наработка определенного
участка ДНК, по окончании реакции можно зарегистрировать полученный
фрагмент при помощи ряда методов, наиболее популярным из которых
является метод электрофореза в геле с окрашиванием ДНК бромистым
этидием. Однако регистрация результата реакции по ее завершении не дает
информации

об

эффективности

процесса.

Поэтому

применение

классической ПЦР ограничено задачами, в которых достаточно получения
ответа по принципу "да
- нет".
В начале 1990-х гг. было предложено регистрировать накопление ДНК
непосредственно в ходе ПЦР с целью количественного определения
исходного числа ДНК-матриц, попавших в реакционную смесь. Для
регистрации процесса амплификации в режиме реального времени в
реакционную смесь добавляют флуоресцирующие и/или интеркалирующие
красители, такие как SYBRGreen, SYBRBlue или ROX, по интенсивности
флуоресценции которых можно судить об эффективности процесса
амплификации (Рис. 8). Использование оптической детекции также
исключает

необходимость

флуоресцентные

методы

стадии

электрофореза.

позволяют

избирательно

Кроме

того,

регистрировать

амплификацию лишь определенных фрагментов ДНК, что повышает
достоверность исследования.

Рис. 8.Детекция кинетики ПЦР в реальном времени с помощью флуоресцентных зондов.

Экспоненциальная стадия ПЦР описывается уравнением:
=

∗

(1)

где Pn - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу
n, P0 - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый
фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных
условиях E = 2, т.к. на каждом цикле ПЦР происходит удвоение количества
продукта.
Прологарифмировав обе части уравнения (1) получим:
= −(1/ log

) ∗ log

+ log

/ log

(2)

Назовем пороговым циклом (threshold cycle, Ct)) такой цикл n, на
котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции пороговая флуоресценция PCt = const. Для n=Ct уравнение 2 принимает вид:
= −(1/log ) ∗ log

+ log

/ log

(3)

Т.е. значение Сt прямо пропорционально логарифму количества
субстрата. Таким образом, ПЦР в реальном времени позволяет сравнивать
количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный
уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых
реакций.
Однако величина Сt может зависеть от многих случайных факторов,
например чувствительности детектора, качество фильтра. Поэтому точно

начальное количество интересующего продукта померить нельзя. Для
решения этой проблемы существуют методы нормировки. Измеряют
отношение количеств двух молекул в пробе. Нормализацию обычно
проводят по продуктам амплификации так называемых генов домашнего
хозяйства (housekeeping genes) уровень экспрессии которых в клетке всегда
примерно одинаков.
Вместе с тем, классическая ПЦР сохраняет свою актуальность в
методиках, требующих наработки фрагментов ДНК с целью их дальнейшего
использования (клонирования или секвенирования). В этих случаях,
присутствие интеркалирующих красителей может помешать последующим
процедурам.
1.3.1 Детекция амплификации ДНК в режиме реального времени
Все существующие режимы регистрации накопления продуктов ПЦР в
режиме реального времени основаны на измерении флуоресценции
реакционной смеси таким образом, чтобы интенсивность флуоресценции
была пропорциональна количеству наработанной в ходе реакции ДНК.
Способные к флуоресценции молекулы (флуорофоры) поглощают свет
одной длины волны и испускают свет в более длинноволновой части
спектра, что следует из основного постулата квантовой механики:
=

=ℎ,

где E - энергия фотона, h - постоянная Планка, λ - длина электромагнитной
волны, υ - частота электромагнитных колебаний, c - скорость света в
вакууме.
Длины

волн поглощения и испускания, а также количество

поглощенного и испущенного света являются характеристикой каждого
флуорофора и могут существенно различаться для разных соединений, что
делает возможным независимо детектировать в системе сигналы сразу от
нескольких флуорофоров.

Поглощение света флуорофором переводит электроны отдельных
атомов этого химического соединения на более высокие энергетические
уровни (возбужденное состояние). Электроны остаются в возбужденном
состоянии около 10-8 с, после чего флуорофор снова переходит в
стационарное состояние, испуская при этом фотон. Поскольку часть энергии
возбужденного электрона рассеивается в виде тепла, длина волны
испускаемого фотона всегда больше длины волны поглощенного фотона
(правило Стокса).
Таким образом, процесс флуоресценции состоит из многократно
повторяющихся циклов поглощения-испускания фотонов и, в конце концов,
приводит к разрушению флуорофора (фотообесцвечивание).
В настоящее время для визуализации результатов ПЦР в реальном
времени используется весьма широкий спектр флуорофоров, таких как
SYBR Green, SYBR Gold, SYBR Blue, Alexa Fluor 488/532/633, ROX, Cy3,
Cy5

и

т.д.

С

характеристиками

отдельных

флуорофоров

можно

ознакомиться в соответствующей справочной литературе. В большинстве
методик применяемых для детекции ПЦР в реальном времени используются
подходы, основанные на одновременном мечении праймеров или зондов
флуорофором

и

веществом,

способным

подавлять

флуоресценцию

(гасителем).
Существует несколько систем детекции амплификации ДНК в режиме
реального времени, которые принято подразделять на специфические и
неспецифические

к

определенной

последовательности

ДНК.

Неспецифические системы детекции проявляют любую образовавшуюся в
ходе реакции ДНК (включая и димеры праймеров), в то время как
специфические системы детекции позволяют достоверно регистрировать
накопление фрагмента ДНК строго определѐнной последовательности. В
свою очередь, неспецифические системы детекции можно разделить на

системы с использованием интеркалирующих красителей и системы с
мечением праймеров флуоресцентными красителями.
1.3.1.1 Неспецифические системы детекции
К неспецифическим системам детекции относятся

системы

с

использованием интеркалирующих красителей и системы с использованием
меченных праймеров с адаптерной последовательностью (амплифлюры).
1.3.1.1.1 Интеркалирующие красители
Использование

интеркалирующих

красителей

(интеркаляторов)

представляет собой наиболее дешевый и простой вариант окраски ДНК для
проведения ПЦР в реальном времени. Интеркалирующие красители - это
соединения, приобретающие способность флуоресцировать при встраивании
в двухцепочечную ДНК. В настоящее время существует множество
коммерчески доступных интеркаляторов: бромистый этидий, YOYO, SYBR
Green. наиболее часто встречающийся в молекулярно-биологической
лаборатории

интеркалятор

-

бромистый

этидий,

применяемый

для

окрашивания ДНК при электрофорезе. Однако он плохо подходит для
регистрации накопления ДНК в ходе реакции, поскольку негативно влияет
на эффективность ПЦР. Наиболее распространенным вариантом красителя
для ПЦР в реальном времени является SYBR Green I.
Несмотря на удобство в работе, метод использования интеркаляторов
обладает

существенным

красители

"проявляют"

недостатком,
накопление

поскольку

любой

ДНК,

интеркалирующие
включая

димеры

праймеров. Поэтому образование флуоресцентного сигнала в ходе реакции
не

позволяет

исследователю

быть

уверенным,

что

в

результате

амплификации наработан целевой фрагмент. Специфичность полученного
продукта реакции в данном случае можно попытаться оценить с помощью
анализа кривых плавления. Для этого, после окончания ПЦР пробирку
медленно нагревают от 40°С до 95°С (или наоборот охлаждают от 95°С до
40°С) и одновременно регистрируют изменение флуоресценции (Рис. 9).

Рис. 9 Кривая плавления продуктов ПЦР (сплошная линия). Прерывистой линией показан
график первой производной. Значения максимумов первых производных принимаются за
температуру плавления ампликонов.

Фрагменты ДНК различной длины и состава будут плавиться
(гибридизоваться) при разной температуре, что позволяет приблизительно
оценить состав реакционной смеси после ПЦР. Данный подход имеет
низкую разрешающую способность и обычно используется для различения
димеров праймеров и длинных продуктов ПЦР.
1.3.1.1.2 Меченные праймеры с адаптерной последовательностью
(амплифлюры)
Существует несколько вариантов использования адаптерных 5ʹконцевых последовательностей для регистрации накопления продукта ПЦР
с участием флуоресцентно меченного праймера. В наиболее простом
варианте, праймер несѐт дополнительную последовательность на 5ʹ-конце,
способную образовывать шпилечную структуру (Рис. 10).

Рис. 10 Схема работы праймеров "амплифлюр"
а - праймер содержит 5ʹ-адаптер с инвертированным повтором, по краям которого
расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. При температуре элонгации,

инвертированный повтор образует шпилечную структуру в которой флуорофор и
гаситель оказываются сближены. В ходе синтеза второй цеп ДНК, шпилечная структура
"разворачивается" и интенсивность флуоресценции возрастает. б - праймер содержит
меченный 5ʹ-адаптер, комплементарный дополнительному олигонуклеотиду с гасителем.
Синтез второй цепи "сталкивает" олигонуклеотид с гасителем.

Праймеры несут флуоресцентную метку (флуорофор) и гаситель
флуоресценции, расположенные так, что при образовании шпилечной
структуры

флуорофор

и

гаситель

оказываются

пространственно

сближенными. В растворе праймеры сохраняют структуру шпильки,
имеющую низкий уровень флуоресценции. В ходе реакции, шпилька
меченного

праймера

раскрывается

(поскольку

меченный

праймер

становится частью двухцепочечного продукта), что приводит к усилению
флуоресценции. Существует также вариант этого метода, при котором
гаситель

флуоресценции

находится

на

отдельном

нуклеотиде,

комплементарном 5ʹ-концевой адаптерной последовательности. В этом
случае, при встраивании праймера в ДНК гибридизация с гасящим
олигонуклеотидом оказывается невозможной.
1.3.1.2 Специфические системы детекции
Поскольку даже хорошо подобранная пара праймеров может давать
нежелательные продукты амплификации (например, димеры праймеров)
использование методик с регистрацией накопления только "нужных"
фрагментов ДНК является более надежным экспериментальным подходом.
Все специфические системы детекции продуктов ПЦР отличаются наличием
в реакционной смеси меченного олигонуклеотида (одного или нескольких),
неспособного
уникальной

выступать
части

в

качестве

амплифицируемой

затравки

и

комплементарного

последовательности.

Меченный

олигонуклеотид может быть прикреплен к праймеру или находиться в
растворе в свободной форме. К специфическим системам детекции
относятся праймеры-пробы ("скорпионы"), линейные разрушаемые пробы
(TaqMan), пробы с инвертированными концевыми повторами (ИКП)

(молекулярные "маячки", molecular beacons), а также системы меток,
работающих на основе метода FRET.
1.3.1.2.1 Праймеры-пробы ("скорпионы")
В основе данного методы лежит идея объединения праймера и
гибридизационной пробы в одну молекулу. Для этого к 5ʹ-концу праймера
прикрепляется адаптер со структурой типа "стебель-петля", в котором
петлевая часть адаптерной шпильки комплементарна внутренней части
образующегося фрагмента (Рис. 11). Эта структура практически полностью
повторяет праймеры типа "амплифлюр" с той лишь разницей, что адаптер
отделен от праймера блокатором синтеза второй цепи ДНК во избежание его
удвоения.

Рис. 11 Схема работы праймеров-скорпионов

Таким образом, после образования продукта реакции, петлевая часть
адаптерной последовательности может гибридизоваться на внутреннюю
часть фрагмента, что ведет к разобщению флуорофора и гасителя
флуоресценции и, как следствие, у усилению сигнала.
1.3.1.2.2 Линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
В данном подходе, олигонуклеотид, комплементарный продукту ПЦР,
метят флуорофором и гасителем флуоресценции. В отсутствии мишени
флуорофор и гаситель сближены и флуоресценция подавлена. При
накоплении соответствующего продукта реакции, проба гибридизуется на
ампликон, что ведет к ее разрушению за счет 5ʹ-экзонуклеазной активности
Taq-полимеразы (Рис. 12).

Рис. 12 Схема действия механизма TaqMan

При

этом

интенсивность

сигнала

нарастает

пропорционально

увеличению количества ампликонов. В данном подходе, принципиальным
моментом является использование ДНК-полимераз с хорошо выраженной
5ʹэкзонуклеазной активностью.
1.3.1.2.3 Пробы с инвертированными концевыми повторами (ИКП)
(молекулярные "маячки", molecular beacons)
В

данной

методике

флуорофор

и

гаситель

располагают

на

противоположных концах олигонуклеотида. Зонды, находящиеся в растворе
при температуре ниже 55-60°С образуют структуру типа "стебель-петля" с
очень низким уровнем флуоресценции. При гибридизации с ампликоном
зонд разворачивается, что ведет к увеличению уровня флуоресценции (Рис.
13).

Рис. 13 Схема работы молекулярных "маячков"

1.3.1.2.4 Метки, работающие на основе метода флуоресцентного
резонансного переноса энергии (fluorescent resonance energy transfer, FRET).
В данной методике используются 2 олигонуклеотидных зонда, каждый
из которых помечен своим флуорофором, один из которых имеет максимум

поглощения в более коротковолновой, а другой в более длинноволновой
части спектра. Метки подбираются таким образом, чтобы максимум эмиссии
флуорофора с более коротковолновым максимумом поглощения был близок
к максимуму поглощения второго флуорофора. Таким образом, один зонд
несет флуорофор-донор, а другой - флуорофор-акцептор флуоресценции.
Последовательность зондов задается таким образом, чтобы они могли
гибридизоваться с матричной ДНК в непосредственной близости друг от
друга. Гибридизация двух зондов с матрицей ведет к сближению
флуорофоров и к туннельному переносу энергии с донора на акцептор (Рис.
14). Детекцию продуктов амплификации ведут посредством регистрации
флуоресценции флуорофора-акцептора при длине волны возбуждения
флуорофора-донора. Данный подход наиболее широко используется при
анализе однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphisms,
SNPs).

Рис. 14 Детекция продуктов ПЦР методом FRET

1.3.2 Определение эффективности амплификации
Из уравнения (3) видно, что эффективность реакции можно рассчитать
как E=10-1/k, где k берется из уравнения прямой Ct = k·log P0 + b,
полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных.
При E=2 (максимально теоретически возможном значении) k ~ -3.32.

Значения k < -3.32 соответствуют более низкой эффективности
реакции. Желательно добиваться таких условий реакции, в которых
эффективность амплификации составляет, по меньшей мере, 1.7 - 1.8 (k не
больше -4 — -4.2).
С другой стороны, иногда k оказывается больше, чем -3.32, что
соответствует теоретически невозможной ситуации E > 2. Небольшое
превышение (-3.32 < k < -2.8) наблюдается относительно часто и может быть
отнесено на счет погрешности измерений. 1.3.3 Обработка данных ПЦР в
реальном времени
Методы обработки данных ПЦР в реальном времени основаны на
применении уравнения (3). Существует два основных метода обработки
данных ПЦР в реальном времени:
- Метод калибровочного графика.
- Прямое сравнение данных.
1.3.3.1 Метод калибровочного графика
Этот метод предполагает построение калибровочного графика в
координатах Ct - log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого
находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах.
1.3.3.2 Прямое сравнение данных
Из уравнения (3) следует, что при равной эффективности реакции E в
образцах 1 и 2, относительная концентрация субстрата (R) будет равна:
=

/

=

)=

(

∆

Проведем нормализацию этих результатов по данным амплификации с
контрольной последовательностью REF (соответствующей, например, гену
домашнего хозяйства). Пусть реакция REF в обоих образцах протекает с
эффективностью Eref. Тогда:
=

∆/

∆

(4)

Если эффективности "контрольной" и "опытной" реакций сходны, то можно
записать:
=

∆/

=

∆

∆

∆

(5)

Если обе реакции протекают со сходной эффективностью, близкой к 2,
уравнение упрощается до вида:
=

∆

∆

~ 2∆

∆

(6)

При проведении ОТ-ПЦР (RT-PCR) в реальном времени в качестве
REF можно использовать последовательность генов домашнего хозяйства,
однако нужно иметь в виду, что уровень экспрессии генов домашнего
хозяйства порой довольно значительно варьирует в разных тканях. Лучше
всего проводить нормализацию по усредненным данным амплификации
нескольких генов домашнего хозяйства.
1.4 Мостиковая ПЦР
В случаях, когда поставленные задачи требуют проведения
высокоэффективного секвенирования, 1536-ти луночного планшета (или
даже сотни таких планшетов) для ПЦР оказывается недостаточно. В таких
случаях требуются миллионы отдельных реакций, в каждой из которых
будет получен гомогенный продукт ПЦР.
Одним из методов, позволяющих решить данную задачу, является
мостиковая ПЦР (bridge PCR). Принцип данного метода заключается в
проведении ПЦР с праймерами, прикрепленными к твердой подложке,
наподобие предметного стекла. С пришитого к поверхности праймера
синтезируется фрагмент ДНК. После этапа денатурации, фрагмент снова
взаимодействует с праймером на поверхности, образую дугу (мостик) между
двумя точками на подложке (Рис. 15).

Рис. 15 Принцип действия мостиковой ПЦР

При повторных циклах ПЦР, из точки синтеза первого фрагмента
колония фрагментов ДНК будет быстро расти.
Технология мостиковой ПЦР используется для создания клональных
библиотек фрагментов ДНК в приборах компании Illumina.
1.5 Эмульсионная ПЦР (emulsion PCR, ePCR)
Эмульсионная

ПЦР

представляет

собой

распространенный

вариант клонирования фрагментов ДНК in vitro. Эта методика позволяет
амплифицировать ДНК на покрытых праймерами микросферах, так что
каждая микросфера оказывается "облеплена" фрагментами только одного
типа. Для этого создают библиотеку фрагментов ДНК с адаптерами по
концам, а затем смешивают полученные фрагменты с покрытыми
праймерами

микрофсерами,

свободным

праймером,

и

остальными

необходимыми для ПЦР компонентами в условиях мелкодисперсной водномасляной эмульсии так, чтобы в каждую микрокаплю воды попали в
среднем одна микросфера и один "стартовый" фрагмент ДНК. В ходе ПЦР,
праймеры на микросфере инициируют синтез фрагментов, начиная с
единственной

матрицы,

а

с

праймера,

находящегося

в

растворе,

достраивается вторая цепь. В итоге получают миллионы микросфер, каждая
из которых несет миллионы идентичных фрагментов ДНК (Рис. 16).

Рис. 16 Принцип действия эмульсионной ПЦР

Для

оценки

качества

библиотеки,

полученной

с

помощью

эмульсионной капельной ПЦР исходят из правила, что соотношение числа
"сработавших" микросфер к "несработавшим" должно быть примерно 30/70.
Оценить количество сработавших микросфер можно посредством измерения
флуоресценции несущих ДНК микросфер относительно несработавших. Для
этого применяется набор реагентов Ion Sphere Quality Control Kit (Life
Technologies, Thermo Fisher).
1.6 Цифровая капельная ПЦР (цПЦР, ddPCR)
Цифровая

полимеразная

цепная

реакция

(цПЦР)

это

-

технологически усовершенствованный метод традиционной полимеразной
цепной реакции (ПЦР). Принцип цифровой ПЦР заключается в том, что
реакционная смесь после добавления образца делится на десятки тысяч
микрообъемов, в каждом из которых проходит независимая ПЦР (Рис. 17).

Рис. 17 Принцип работы цифровой капельной ПЦР

Это

позволяет

идентифицировать

проводить

ПЦР-продукты,

амплификацию

молекул

полученные

каждой

с

ДНК

и

отдельной

ДНКматрицы, при этом не требуются использовать стандарты. Данный

метод незаменим для решения таких задач, как определение редких
последовательностей ДНК, например, соматических мутаций клеток
опухолей в парафинизированных гистологических срезах и биоптатах, даже
при низком количестве целевой ДНК, выявление наличия циркулирующих
опухолевых клеток в очень небольшом титре у пациентов, высокоточное
определение количества копий гена, анализ экспрессии генов и miRNA
единичных

клеток

в

неоднородных

популяциях,

оценка

качества

приготовления образцов для высокопроизводительного секвенирования
(секвенирования нового поколения, new generation sequencing, NGS) для
улучшения качества результатов сиквенса, выявление загрязнения даже
единичными бактериальными клетками или вирусными частицами.
Преимуществами цифровой ПЦР по сравнению с ПЦР в реальном
времени являются:
- прямое обнаружение редкого варианта мишени в сложном
окружении;
- исключительная чувствительность и точность даже при анализе
единичных молекул ДНК;
- отсутствие калибровочных кривых и отсутствие эффекта первых
циклов
ПЦР;
- низкая чувствительность к присутствию ингибиторов.
2. Методы секвенирования нуклеиновых кислот
2.1. Метод химической деградации (Максама-Гилберта)
Метод

определения

последовательности

нуклеотидов

нуклеиновых кислотах (НК), основанный на нуклеотид-специфической
химической деградации при обработке ДНК различными химическими
агентами был предложен в середине 70-х годов ХХ века исследователями
гарвардского университета (США) Алланом Максамом и Уолтером
Гилбертом. Данный метод был первым из подходов, предложенных для

в

анализа нуклеотидных последовательностей. На первом этапе образец ДНК,
обычно представляющий собой сравнительно короткий (100 - 1000 п.н.)
гомогенный фрагмент, полученный, например, вырезанием полосы из геля
после электрофоретического разделения образца ДНК, подвергнутого
фрагментации с помощью эндонуклеаз, с одного из концов метят
радиоактивной меткой. Затем образец разделяют на 4 части, после чего
каждую из частей обрабатывают своим реагентом, приводящим к гидролизу
ДНК по определенным основаниям (или по сочетаниям оснований).
Параметры каждой реакции подбирают таким образом, чтобы гидролиз
проходил не полностью, а лишь по некоторым позициям в каждой молекуле
ДНК (в среднем, желательно получить одну модификацию на отдельную
молекулу). В результате получают набор расщепленных фрагментов ДНК,
соответствующих по длине местам нахождения нуклеотидов данного типа
(Рис. 18).

Рис. 18 Принцип метода Максама-Гилберта

Расщепление одинаковых, помеченных с одного из концов, фрагментов ДНК по разным
позициям дает фрагменты разной длины, затем фрагменты могут быть разделены с
помощью электрофореза

Например, реакция определения положения гуанина выглядит так: при
помощи диметилсульфата проводят метилирование ДНК, в результате
которого гуанин метилируется по положению 3, а аденин - по положению 7.
Дальнейшая обработка соляной кислотой при 0°С приводит к выпадению из
цепи метиладенина (апуринизация по остаткам аденина). Такую ДНК с
"пустыми" остатками дезоксирибозы в позициях, где был аденин, можно
гидролизовать

при

нагревании

в

щелочи.

Гидролиз

в

случае

с

метилгуанином осуществляется при помощи пиперидина. Модификации по
пиримидиновым основаниям (C и Т) проводят с гидразином. Если реакцию
проводить в присутствии NaCl, модификация затронет только C. Гидролиз
обработанной гидразином ДНК проводят пиперидином.
После обработки, все четыре образца наносят на параллельные
дорожки денатурирующего полиакриламидного геля (ПААГ), и проводят
электрофорез таким образом, чтобы получить разделение фрагментов,
отличающихся на один нуклеотид. Далее с помощью рентгеновской пленки
получают

электрофореграмму,

последовательность

нуклеотидов,

по

которой

можно

исследуемого

восстановить

фрагмента

ДНК,

отсчитывая, в какой из 4-х дорожек оказался фрагмент, следующий за
самым

легким

продуктом,

т.е.

обладающим

наибольшей

электрофоретической подвижностью. Таким способом удается определить
последовательность до 200 нуклеотидов за одно прочтение.
В настоящее время метод Максама-Гилберта почти не используется в
виду сложности пробоподготовки и необходимости работы с вредными
реактивами. В основе большинства используемых на сегодняшний день
методов секвинирования ДНК лежит метод терминаторов (метод Сэнгера).
Тем

не

менее,

метод

Максама-Гилберта

имеет

ряд

неоспоримых

преимуществ, главными из которых являются его полная независимость от

вторичных

структур

и

отсутствие

необходимости

знания

участка

последовательности, интересующей исследователя ДНК. В связи с этим, до
последнего времени, метод Максама-Гилберта использовался в случаях,
когда фермент ДНКполимераза не мог пройти через вторичную структуру в
исследуемом образце ДНК, например через псевдоузел.

2.2 Метод Сэнгера (остановка синтеза ДНК ферментом на
дидезоксинуклеотидах (ddNTP))
В 1975 г Фредерик Сэнгер и Алан Кулзониз из лаборатории
молекулярной биологии Кембриджского университета (Великобритания)
предложили метод определения последовательности ДНК, основанный на
использовании ДНК-полимеразы и радиоактивно меченных нуклеотидов,
который получил название "плюс-минус" секвенирования. Впоследствии
метод

был

усовершенствован

посредством

использования

дидезоксинуклеозидтрифосфатов, встраивание которых в синтезируемую
цепочку ДНК приводит к остановке дальнейшего синтеза. Данный метод
получил название метода Сэнгера.
Основной идеей метода является использование модифицированных
нуклеотидов - дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP) (Рис. 19).
NH 2
N
N

O

O
( S)

HO

P
OH

O

P
OH

N

O

N

(R )

O

P
OH

O

O
(R )

H

H

OH

H

H

(R )

H

A

NH2

N
N

O

O
( S)

HO

P
OH

O

N

O

P
OH

N

(R )

O

P
OH

O

O
(S )

H

H

H

H

H

(R )

H

B

Рис. 19 Структурные формулы нуклеотидов, используемых для обычного синтеза (А) и
остановки синтеза ДНК (В)

В

отличие

от

обычного

субстрата

ДНК-полимеразы,

дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP), ddNTP не несут ОН-группы в
3ʹположении дезоксирибозы и вследствие этого не способны к
присоединению
ДНК-полимеразой

следующего

нуклеотида.

Фрагмент ДНК,

последовательность которого требуется определить, добавляется в реакцию
аналогичную ПЦР: реакционная смесь включает термостабильную
ДНКполимеразу, dNTP всех четырех типов и праймеры, выступающие в
качестве затравок для синтеза дочерних цепей ДНК.

Рис. 20 Принцип метода Сэнгера.
Удлинение цепи ДНК ферментом происходит до момента включения ddNTP. Разделение
полученных

фрагментов методом электрофореза в геле позволяет

последовательность нуклеотидов.

определить

Помимо этих компонентов, в реакционную смесь добавляются 4
соответствующих ddNTP (ddA, ddT, ddG и ddC) в концентрациях примерно в
20 раз меньше, чем dNTP. Каждый ddNTP помечен своим флуоресцентным
красителем, что позволяет производить анализ в одной пробирке. Ранее для
этой цели использовали изотопы P32, а реакцию проводили в 4-х отдельных
пробирках

для

каждого

азотистого

основания,

как

и

в

методе

МаксамаГилберта.
В ходе ферментативного синтеза ДНК, в каком-то из положений
случайным образом происходит включение в строящуюся цепь меченного
ddNTP вместо обычного dNTP, что приводит к остановке синтеза, так как
отсутствие 3ʹ-ОН группы блокирует образование фосфодиэфирной связи со
следующим нуклеотидом. Реакцию проводят в циклическом режиме (как
при ПЦР). Так как ddNTP составляют примерно 5% от dNTP, а мечение
включает 40-50 циклов, в конце такой линейной амплификации получается
набор одиночных цепей ДНК, отличающихся по длине и всегда
заканчивающихся меченным нуклеотидом (Рис. 20).
После мечения проводят разделение полученных одноцепочечных
фрагментов методом электрофореза в ПААГ. В настоящее время данный
процесс

полностью

автоматизирован.

Автоматические

секвенаторы

позволяют проводить электрофорез меченных фрагментов ДНК в тонком
капилляре, заполненном гелем (Рис. 21).

Рис. 21 Капиллярный автоматический секвенатор ABI 3130xl Applied Biosystems (США)

Детекция разделенных фрагментов происходит на дальнем конце
капилляра за счет регистрации флуоресценции терминальных ddNTP,

проходящих через детектор фрагментов ДНК. В зависимости от типа
терминального ddNTP прибор регистрирует флуоресценцию в той или иной
области спектра. Данные спектрограммы и прочтение нуклеотидной
последовательности отображаются на экране компьютера (Рис. 22).

Рис. 22 Спектрограмма, полученная в результате секвенирования по методу Сэнгера на
автоматическом секвенаторе

Анализ данных капиллярного секвенирования сводится к "прочтению"
последовательных

пиков

флуоресценции.

В

настоящее

время,

с

использованием современных автоматических секвенаторов, длина одного
прочтения по методу Сэнгера составляет 800-1000 нуклеотидов.
2.3 Метод гибридизации на твердой фазе
В

конце

1980-х

был

предложен

подход

к

определению

последовательностей ДНК, получивший название "секвенирование путем
гибридизации" (sequencing by hybridization, SBH) или секвенирования на
чипе. Метод основан на гибридизации меченных флуоресцентными метками
одноцепочечных фрагментов ДНК с синтетическими олигонуклеотидами
известной структуры и длины, которые точечно расположены на твердой
основе. При этом на подложке присутствуют все возможные варианты
последовательности олигонуклеотида заданной длины. Например, для
олигонуклеотида длиной в 8 оснований будут возможны 4 8=65 536
вариантов последовательностей. Условия гибридизации подбирают таким

образом, чтобы только полностью комплементарные фрагменты ДНК
взаимодействовали с олигонуклеотидом на подложке.

Рис. 23 Принцип метода секвенирования на чипе

После удаления несвязавшихся молекул ДНК можно зарегистрировать
сигнал флуоресценции в тех участках чипа, где находится олигонуклеотид,
комплементарная последовательность которого есть в секвенируемом
образце ДНК. Полученный гибридизационный паттерн можно использовать
для

восстановления

исходной

последовательности

путем

сборки

перекрывающихся участков сработавших проб (Рис. 23).
К сожалению, невозможно подобрать условия, при которых с
олигонуклеотидами

будут

гибридизоваться

только

полностью

комплементарные фрагменты. Всегда находятся GC-богатые участки,
которые будут гибридизоваться и при наличии одного или даже нескольких
неспаренных оснований. В связи с этим, метод SBH пока не нашел
широкого

практического

применения.

Тем

не

менее,

алгоритмы,

разработанные на основе SBH для сборки коротких прочтений в более
длинные

фрагменты,

стали

основой

для

последующих

алгоритмов

высокоскоростной сборки и выравнивания, используемых с технологиях
секвенирования нового поколения (new generation sequencing, NGS).
2.4 Секвенирование с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF
(Matrixassistedlaserdesorption/ionization-time-of-flight) (определение
нуклеотида по массе и заряду)
Масс-спектрометрия позволяет идентифицировать компоненты
гетерогенной смеси биомолекул по разнице их молекулярных масс. В
варианте MALDI-TOF, образец для анализа помещают на поглощающую
УФ-излучение подложку и подвергают воздействию короткого лазерного
импульса. Ионизированные молекулы летят в электрическом поле в
направлении детектора, причем время, за которое частица достигает
детектора обратно пропорционально отношению масса/заряд.
Для определения последовательности нуклеотидов ДНК методом
MALDI-TOF гомогенный фрагмент ДНК (или РНК) высушивают на
поверхности в среде 3-гидроксипиколиновой кислоты. ДНК обрабатывают
коротким импульсом УФ-лазера, в результате чего ионы ДНК переходят в
газовую фазу.

Рис. 24 Принцип секвенирования ДНК на основе метода MALDI-TOF

Заряженные молекулы ДНК в газовой фазе под действием высокого
напряжения ускоряются в электрическом поле и попадают на детектор.
Затем проводят повторный раунд расщепления и определения масс более
мелких фрагментов. На основании полученных данных может быть
вычислена

масса

анализируемой

молекулы

и

расшифрована

последовательность сравнительно короткого гомогенного фрагмента (Рис.
24).
В

настоящее

время,

метод

MALDI-TOF

не

используется

в

коммерческих вариантах секвенаторов.
2.5 Секвенирование лигированием (принцип комплементарности цепей
ДНК)
Современные методы секвенирования лигированием основаны на
использовании коллекции коротких (как правило от 8 до 10 оснований)
флуоресцентно-меченных с помощью четырех красителей вырожденных
олигонуклеотидов,

так,

что

каждому

флуорофору

соответствует

определенный нуклеотид (или два) в определенной позиции.
Сначала создают иммобилизованную на твердой фазе клональную
библиотеку
капельной

одноцепочечных
ПЦР).

фрагментов

Секвенирование

ДНК

начинают

(например
с

отжига

методом
праймера,

комплементарного адаптеру на одном из концов библиотеки ДНК. Затем к
библиотеке

добавляют

флуоресцентно-меченные

вырожденные

олигонуклеотиды и проводят реакцию лигирования, что приводит к
фиксированию олигонуклеотида на фрагменте в случае его полного
соответствия. Затем считывают флуоресценцию, определяя тем самым,
какой нуклеотид (или пара нуклеотидов) находится в определенной
позиции. Флуорофор удаляют и лигируют следующий олигонуклеотид
(всего проводят 10 - 15 последовательных лигирований). Затем проводят
"перезагрузку" праймера путем его отсоединения с прилигированными

меченными олигонуклеотидами и повторяют цикл с другим праймером со
сдвигом на одну букву (Рис. 25).

Рис. 25 Секвенирование методом лигирования

В настоящее время, данный принцип секвенирования реализуется в
коммерческих технологиях Prolonator (Dover/Harvard) и SOLiD (Life
Technologies Thermo Fisher Scientific).
2.6 Пиросеквенирование (регистрация акта присоединения нуклеотида по
образующемуся пирофосфату)

В

г.

1996

специалистами

Королевского

технологического

института в Стокгольме Мустафой Рональди и Полом Ниреном был
предложен подход к секвенированию ДНК, в основе которого лежит
принцип

регистрации

пирофосфата,

образующегося

в

результате

присоединения очередного нуклеотида ДНК-полимеразой. Для детекции
выделяющегося

в

процессе

образования

фосфодиэфирной

связи

пирофосфата используется каскад последовательных химических реакций,
заканчивающийся высвечиванием кванта света.
Вначале любым методом создают иммобилизованную на твердой фазе
клональную библиотеку одноцепочечных фрагментов ДНК (например,
методом мостиковой ПЦР). Предварительно, ко всем фрагментам ДНК
присоединяют адаптер, на который будет гибридизоваться праймер,
служащий затравкой для синтеза комплементарной цепи ДНК-полимеразой.
Дальнейшая реакция состоит из последовательных циклов, в процессе
которых, к закрепленной на твердой фазе ДНК по очереди добавляют dNTP
всех 4-х типов. В случае, если в данной ДНК-колонии на секвенируемой
цепи ДНК имеется комплементарный добавленному нуклеотид, в процессе
формирования

ДНК-полимеразой

фосфодиэфирной

связи

побочным

продуктом реакции будет пирофосфат. Он активирует каскад химических
реакций, в результате которых возникает световой сигнал, интенсивность
которого прямо пропорциональна числу включенных в цепь нуклеотидов.

Рис. 26 Принцип метода пиросеквенирования

Ферментативные

реакции

осуществляются

АТФ-сульфурилазой,

люциферазой и апиразой. Также в месте с ними в ячейке присутствуют
аденозинфосфосульфат (APS) и люциферин. Выделяющийся в ходе
образования очередной фосфодиэфирной связи пирофосфат вступает в
реакцию с APS, катализируемую АТФ-сульфурилазой, с образованием АТФ.
Образовавшийся АТФ является источником энергии для люциферазной
реакции окисления люциферина в оксилюциферин, в процессе которой
генерируются кванты света в видимой области спектра, в количестве,
пропорциональном количеству включенных в растущую цепь ДНК
нуклеотидов. Световой сигнал регистрируется ПЗС-матрицей (подобной
тем, которые используются в обычных цифровых фотоаппаратах) и
анализируется при помощи программного обеспечения, преобразующего так
называемую пирограмму в последовательность нуклеотидов (Рис. 26).
Не вовлеченные в синтез новой цепи нуклеотиды, а также АТФ
деградируются при помощи апиразы. После этого можно начинать
следующий цикл, т.е. добавлять другой тип нуклеотида. На принципе
пиросеквенирования основана коммерческая технология 454 Life Sciences
Roche.
2.7 Метод обратимых терминирующих нуклеотидов (регистрация каждого
присоединенного нуклеотида по отщепляемой метке)
Данная

концепция была предложена

Баласубрамяном и

Кленерманом на химическом факультете Кембриджского университета.
Также как и при пиросеквенировании, принцип метода состоит в регистрации
факта присоединения очередного нуклеотида, но не по побочным продуктам
реакции, а непосредственно по сигналу от присоединенного основания. При
этом должны выполняться два требования:

1) за один цикл реакции может быть добавлен только один
нуклеотид. Это легко обеспечить с использованием 3ʹ-блокированных
dNTP с возможностью снятия блока.
2) метка должна быть отщепляемой.
Сначала любым методом создают иммобилизованную на твердой фазе
клональную библиотеку одноцепочечных фрагментов ДНК (например,
методом мостиковой или эмульсионной ПЦР). Секвенирование начинают с
отжига праймера, комплементарного адаптеру на одном из концов
библиотеки

ДНК.

Затем

к

библиотеке

добавляют

четыре

типа

флуоресцентно меченых обратимых терминирующих dNTP (так называемых
RT-оснований). ДНК-полимераза присоединяет подходящий нуклеотид к
затравке и на этом синтез временно останавливается.

Рис. 27 Принцип секвенирования синтезом клональной библиотеки одноцепочечных
фрагментов ДНК на твердой фазе

Невключившиеся

нуклеотиды

смывают,

и

оптическая

система

считывает флуоресценцию каждой ДНК-колонии библиотеки. Каждая
колония высвечивает при этом кванты флуоресценции, соответствующие
включившемуся на данном этапе нуклеотиду. После этого флуорофор,
наряду с 3ʹ-концевым блокатором, химически удаляют из синтезированной
цепи, что позволяет повторить весь цикл сначала (Рис. 27).

В отличие от пиросеквенирования в данном подходе сигнал
флуоресценции можно регистрировать в течение длительного времени после
присоединения очередного нуклеотида, что позволяет производить анализ
очень большого количества ДНК-колоний.
На

данном

принципе

секвенирования

основаны

коммерческие

технологии компаний Illumina и Pacific Bioscience.
2.8 Полупроводниковое секвенирование (регистрация акта присоединения
нуклеотида по образующимся ионам водорода)
Полупроводниковое секвенирование - это метод определения
последовательности

ДНК,

основанный

на

детекции

ионов

водорода, выделяющихся в среду в ходе ферментативного синтеза ДНК.
Вначале, одним из стандартных методов создают иммобилизованную на
твердой фазе клональную библиотеку одноцепочечных фрагментов ДНК.
Важно, чтобы метод создания библиотеки позволял отделить каждую
колонию ДНК от других так, чтобы выравнивание рН в случае его
изменения в районе колонии происходило не слишком быстро. При
использовании эмульсионной ПЦР это обеспечивается закатыванием
микросфер в соответствующие им по размерам микрореакторы так, что в
реактор помещается только одна частица, а сообщаются реакторы только
одной поверхностью на проточном чипе. Секвенирование начинают с
отжига праймера, комплементарного адаптеру на одном из концов
библиотеки ДНК. Затем к микрореаторам, содержащим микросферы, по
очереди

добавляют

обычные

dNTP.

Если

добавленный

нуклеотид

оказывается комплементарным матрице, ДНК-полимераза встраивает его в
синтезируемую цепь. Реакция образования фосфодиэфирной связи приводит
к выделению пирофосфата и протона, вызывающего локальное изменение
рН раствора в микрореакторе, которое детектируется подключенным к
каждому микрореактору сенсором. Если нуклеотид не подходит, сигнал
отсутствует. После каждого добавленного в реакцию нуклеотида, прибор

выполняет

промывку

системы

буфером

для

очистки

от

остатков

невключившихся dNTP данного типа (Рис. 28).

Рис. 28 Полупроводниковое секвенирование

Как

и

в

случае

пиросеквенирования,

у

полопроводникового

секвенирования есть трудности с детекцией гомополимерных участков. В
случае протяженного мононуклеотида, например ТТТТТТТТ, сигнал теряет
дискретность и определить, сколько именно нуклеотидов присутствует в
последовательности становится затруднительно.
Важным отличием полупроводникового секвенирования от других
методов

является

отсутствие

оптического

детектора

сигнала,

что

значительно упрощает и удешевляет конструкцию прибора. Кроме того,
отсутствие необходимости оптической детекции снимает ограничение по
количеству микроцентров секвенирования, которые можно разместить на
чипе.
На

принципе

полупроводникового

секвенирования

основана

коммерческая технология IonTorrent, предоставляемая компанией Life
Technologies Thermo Fisher Scientific. Разработки в данном направлении
ведутся также компанией Roche.
2.9 Нанопоровое секвенирование

Еще одна оригинальная идея секвенирования была предложена
Касьяновичем в 1996 г. Принцип метода заключается в регистрации
изменений ионного тока, вызванного прохождением одноцепочечной ДНК
через нанопору в тонкой пленке под действием электрического поля (Рис.
29).

Рис. 29 Принцип нанопорового секвенирования.
Проходящая через пору молекула одноцепочечной ДНК или РНК меняет потенциал на
мембране.

Поры могут быть естественного биологического происхождения.
Например, можно использовать биологическую мембрану с какой-либо
порой. Также могут использоваться искусственные поры. Например, поры в
виде сенсора для фиксации изменения какой-либо характеристики:
туннельного тока, емкости, ионного тока или флуоресценции. При переходе
через пору, каждый тип азотистых оснований по-своему "закупоривает"
пору и влияет на ток.
В настоящее время данная технология реализована компанией Oxford
Nanopore (Великобритания) в устройствах MinION, GridION и PromethION
(Рис. 30).

Рис. 30 Приборы для нанопорового секвенирования: секвенаторы MinION (А), GridION
(Б) и PromethION

В настоящее время, технологии Nanopore позволяют осуществлять:
Прямое прочтение нуклеотидных последовательностей цепей

ДНК и РНК
-

Длина прочтения ограничена только длиной фрагмента.

-

Наблюдение за ходом секвенирования в реальном времени дает

возможность остановки процесса в любой момент при достаточном
накоплении данных, при очевидных ошибках пробоподготовки или других
сбоях в работе; интерпретацию сигналов (base calling) и анализ данных
можно проводить непосредственно в процессе секвенирования. Технология
обеспечивает

простой

алгоритм

сборки,

полученных

буквенных

последовательностей.
В секвенаторе MinION используется ячейка с 512 нанопоровыми
каналами, каждый из которых предназначен для анализа отдельной
молекулы нуклеиновой кислоты. В сумме прибор позволяет получить до 20
Гб информации о последовательности ДНК. Длина прочтения, ограничена
только длиной фрагмента нуклеиновой кислоты и составляет сотни тысяч
нуклеотидов. GridION, в отличие от MinION, состоит из пяти проточных
ячеек

с

нанопоровыми

каналами,

что

позволяет

проводить

пять

параллельных независимых экспериментов. Общий объѐм информации о
последовательности ДНК, полученный с помощью секвенатора GridION,
может

быть

до

100

Гб.

Методика

характеризуется

простой

пробоподготовкой и возможностью анализировать последовательности
любой

длины.

Секвенатор

высокопроизводительного

PromethION

секвенирования.

пердназначен

Прибор

включает

для
24

независимые ячейки, каждая из которых содержит 3000 каналов. При
анализе можно задействовать любое количество этих ячеек, в каждой из
которых будет проводиться отдельный эксперимент. Анализ результатов
происходит с помощью встроенного процессора.
2.10 Секвенирование генома человека
Создание автоматических секвенаторов настолько упростило и
удешевило процесс определения последовательности ДНК, что позволило к
середине 1980-х годов говорить о возможности определить полную
последовательность

генома

человека,

что

вылилось

в

крупнейшее

исследование под названием Human Genome Project (HGP) (Проект "Геном
человека").

Целью

проекта,

кроме

определения

последовательности

нуклеотидов, была также идентификация всех генов человека. Проект
стартовал в 1990 г. и финишировал в 2001 г. публикацией в журнале Nature.
Однако полный анализ полученных данных был завершен только в 2004 г.
Стоит отметить, что в 1998 г., параллельно с мировым научным
сообществом, секвенированием генома человека занялась компания Celera.
Полная последовательность нуклеотидов генома человека (3х109 п.н.) была
получена ее сотрудниками в течение 9 месяцев, т.е. в 20 раз быстрее, чем
участниками консорциума HGP. Получение столь быстрых результатов,
среди прочего, было связано с тем, что Celera стартовала на автоматических
секвенаторах

последнего

поколения,

сильно

выигрывавших

по

производительности. Кроме того, это позволило сотрудникам Celera не
прибегать к клонированию генома в искусственных бактериальных
хромосомах (bacterial artificial chromosomes, BAC), а сразу применить "метод
дробовика" для всего генома.

Основная сложность данной задачи состояла в том, что имевшиеся в
то время в распоряжении исследователей секвенаторы ДНК позволяли
секвенировать лишь несколько сотен нуклеотидов за одно прочтение.
Решение данной проблемы состояло в том, чтобы разбить геном на
фрагменты и секвенировать затем каждый фрагмент по отдельности.
Однако, главная проблема состояла также в том, как соединить
последовательности коротких фрагментов в правильном порядке, чтобы
получить сначала последовательности отдельных хромосом, а потом и весь
геном. Для решения этой задачи были применены две стратегии: шутгансеквенигование (shotgun) или метод "дробовика" и секвенирование по
принципу "клон за клоном" (cloneby-clone).
Метод "дробовика" состоял в том, чтобы разбить геном на небольшие
фрагменты, определить их нуклеотидную последовательность, а затем при
помощи

мощного

суперкомпьютера

восстановить

исходную

последовательность на основании перекрывающихся участков (Рис. 31).

Рис. 31 Принцип секвенирования методом "дробовика"

Однако, такой подход может быть успешно применѐн лишь для
секвенирования относительно небольших геномов. Данный метод показал
свою эффективность в 1995 г., когда был секвенирован геном бактерии

Haemophilus influenzae, первого организма, последовательность генома
которого была установлена. Недостатком метода является то, что сборка
генома может быть сильно осложнена повторяющимися нуклеотидными
последовательностями
(Рис. 32).

Рис. 32 Повторяющиеся участки затрудняют правильную сборку последовательности

У эукариот, в особенности у позвоночных, такие повторяющиеся
последовательности составляют довольно большую часть генома.
Данную проблему удалось преодолеть путем совмещения метода
"дробовика" с подходом "клон за клоном". Вначале была создана геномная
библиотека. Геном человека разбили на перекрывающиеся фрагменты
длиной 100-200 тыс. п.н. Затем эти фрагменты лигировали в искусственные
бактериальные хромосомы (bacterial artificial chromosomes, BAC), которые
внедрили в клетки E. coli. BAC похожи на бактериальные плазмиды, но, в
отличие от них, они могут включать гораздо большие фрагменты ДНК.
Бактерии

делились

и

копировали

BAC,

перекрывающихся клонированных фрагментов.

производя

коллекцию

Затем было найдено местоположение каждого из этих фрагментов в
геноме человека. Для этого была составлена рестрикционная карта каждого
из клонов (Рис. 33).

Рис. 33 Расположение индивидуальных клонов фрагментов генома, содержащихся в
BAC, на физической карте генома определяется при помощи их рестрикционных карт.

Знание расположения сайтов рестрикции в каждом из клонов
позволило определить их местоположение на рестрикционной карте генома
человека. Зная относительное расположение клонированных фрагментов,
исследователи выбрали из них около 30 000, разрезали на небольшие
фрагменты с помощью рестриктаз и секвенировали по методу "дробовика".
После этого стало возможным собрать последовательность всего генома,
соединяя

между

собой

последовательности

отдельных

клонов,

покрывающих всю длину генома.
3. Генная терапия
Генная терапия, в широком смысле, означает лечение путем
введения в ткани или клетки пациента смысловых последовательностей
ДНК. Первоначально генная терапия рассматривалась как возможность
исправления дефекта в гене с целью лечения моногенных наследственных

заболеваний (МНЗ). Предполагалось, что теоретически такая коррекция
будет возможной как на соматическом уровне, так и на уровне половых
клеток. Однако, многочисленные исследования в данной области показали,
что значительно проще исправлять не сам дефект в гене, а вести коррекцию
путем введения в организм пациента полноценно работающего гена.
Несмотря на значительные успехи генной инженерии, исследования по
генной терапии у человека осуществляются исключительно на соматических
клетках, в которых происходит экспрессия дефектного гена. Генная терапия
на уровне половых и зародышевых клеток человека, ввиду возможных
серьезных последствий для генофонда человечества, представляется на
современном этапе весьма проблематичной и малореальной. Разработанная
на сегодняшний день и применяемая на практике методология генной
терапии оказалась пригодной для лечения не только МНЗ, но и
онкозаболеваний, тяжелых вирусных инфекций, сердечно-сосудистых
заболеваний и др. Поэтому, на современном этапе, генную терапию можно
определить как лечение наследственных, онкологических, некоторых
вирусных и других заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с
целью направленного изменения генных дефектов либо придания клеткам
новых функций. Первые клинические испытания методов генной терапии
были предприняты 22 мая 1989 г. с целью генетического маркирования
опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы
прокариотическим геном neo. Первым МНЗ, в отношении которого были
применены методы генной терапии был наследственный иммунодифицит,
обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). К другим
МНЗ, в отношении которых уже имеются официально разрешенные
протоколы

и

начаты

клинические

испытания,

относятся

семейная

гиперхолестеролемия, гемофилии А и В, муковисцидоз, болезнь Гоше и
некоторые другие.
3.1 Типы генотерапевтических вмешательств и выбор клеток-мишеней

Генная терапия предполагает введение последовательностей ДНК
в клетки-мишени. Она проводится либо с целью коррекции наследственной
патологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо для придания
этим клеткам новых функций, способствующих устранению патологических
процессов. В первом случае в организм пациента вводят нормально
работающий гомолог дефектного гена. Второй подход применяют для
лечения онкологических и инфекционных заболеваний. В этих случаях
вводят гены, обладающие условным цитотоксическим эффектом или
способствующие

формированию

выраженного

иммунного

ответа.

Мишенями для таких генов могут служить пораженные ткани, иммунные
клетки,

специфическим образом

проникающие

в

эти

ткани,

либо

предварительно трансформированные in vitro другие клетки. В зависимости
от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия
может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно
в организме (in vivo). Клеточная терапия (ex vivo) предполагает выделение и
культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них
чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реинфузию их тому
же пациенту. В настоящее время, большинство допущенных к клиническим
испытаниям программ генной терапии используют подход ex vivo. Генная
терапия ex vivo включает следующие этапы (Рис. 34):
1) получение клеток от больного;
2) исправление генетического дефекта с помощью переноса
нужного гена в изолированные клетки;
3) отбор и наращивание генетически "исправленных" клеток; 4)
инфузия или трансплантация этих клеток пациенту;

Рис 34. Принцип генной терапии ex vivo

Использование собственных клеток пациента (аутологичных клеток)
гарантирует, что после инфузии или трансплантации у него не разовьется
иммунный ответ.
Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и
определенным

образом

упакованных

последовательностей

ДНК

в

специфические ткани больного (Рис. 35). При этом вводимые ДНК, как
правило, интегрируют с молекулами, обеспечивающими их адресную
доставку в клетки-мишени. В настоящее время этот подход опробирован
только для лечения муковисцидоза.

Рис. 35 Принцип генной терапии in vivo

Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo
представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых
вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения
пульмонологических заболеваний, таких как муковисцидоз, эмфизема, рак
легких, при которых объектами генетической модификации являются
специфические типы легочных клеток. Инъецируемые вакцины могут
использоваться для модификации различных типов клеток и представляют
собой наиболее универсальный способ доставки чужеродного генетического
материала в любые ткани.
Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный
анализ

тканеспецифической

идентификация

первичного

экспрессии

соответствующего

биохимического

дефекта,

гена,

исследование

структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового
продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. План
генотерапевтических вмешательств определяется также доступностью
клеток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в организме,
эффективностью

и

специфичностью

трансфекции

продолжительностью экспрессии введенного гена.

клеток

и

Наиболее перспективной представляется возможность генетической
модификации не самих дифференцированных клеток с наследственным
дефектом, а их предшественников - плюрипотентных стволовых клеток.
Определение типа клеток, подлежащих генетической модификации,
завершается оценкой результата переноса гена в системе in vitro и
проведением экспериментов на животных моделях. Апробацию процедуры
генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных
культурах экспрессирующих клеток больного либо на перевиваемых
культурах, полученных после предварительной трансформации первичных
культур. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной
системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой
генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом
клетки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и его
коррекции на биохимическом уровне.
Тем не менее, многие проблемы генной терапии не могут быть решены
на клеточном уровне. Важное значение имеет анализ влияния введенных
ДНК

на

межклеточные

взаимодействия,

определяющие

работу

соответствующих тканей и органов. Такие исследования могут быть
проведены только in vivo.
3.2 Методы генетической трансфекции в генной терапии
Решающим

условием

успешной

генной

терапии

является

обеспечение эффективной доставки, т.е. трансфекции (в широком смысле)
или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена
в клетки-мишени, обеспечение длительной персистенции его в этих клетках
и создание условий для полноценной экспрессии. Существуют следующие
основные подходы к трансфекции клеток:
1)
плазмиду;

трансфекция "чистой" ДНК, лигированной в соответствующую

2)

трансфекция комплексированной ДНК, т.е. - плазмидной ДНК,

находящейся в комплексе с солями, белками (например, трансферрином),
органическими полимерами (ДЭАЭ-декстраном, полилизином), липосомами
или частицами металлов (золото, вольфрам);
3)

трансдукция ДНК в составе вирусных частиц, предварительно

лишенных способности к репликации;
Условием

длительной

персистенции

чужеродной

ДНК

в

клеткахреципиентах является ее встраивание в геном клетки-хозяина.
Пребывание чужеродной ДНК в ядре клетки в свободном состоянии (в виде
эписом) неизбежно ведет к ее элиминации даже в неделящихся клетках и,
соответственно, к ее транзиторной (временной, обычно в течение
нескольких месяцев) экспрессии. Необходимой предпосылкой экспрессии
чужеродной ДНК является наличие соответствующих промоторов. В случае
наличия тканеспецифических промоторов можно добиться экспрессии
введенного гена только в определенных тканях и клетках. Методы доставки
чужеродных генов в клетки подразделяются на физические, химические и
биологические.
Реальная интеграция чужеродной ДНК в геном клетки-реципиента
может быть достигнута только с использованием ретровирусных и
аденоассоциированных векторов.
3.3 Коструирование векторных систем для трансфекции клеток человека
3.3.1 Основные векторные системы
Как правило, вводимый генетический материал представляет
собой полноразмерную последовательность кДНК определенного гена,
инсертированную в экспрессионный вектор и находящуюся под контролем
сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от многих
параметров, главным из которых является необходимый уровень экспрессии
в клетках-мишенях. Вектор часто содержит один из маркерных генов (neo,

β-Gal, ген люциферазы), присутствие которых в трансдуцированных клетках
может быть легко обнаружено. Существует 2 типа векторных конструкций:
1) на основе плазмидной ДНК;
2) на основе вирусов;
Плазмидные

конструкции

удобны

для

клонирования,

генно-

инженерных манипуляций, а также получения большого количества
рекомбинантной ДНК. Однако, бактериальные плазмиды, в отличие от
вирусных

конструкций,

не

способны

самостоятельно

проникать

в

эукариотические клетки. Для введения инсертированной в плазмиду
экзогенной ДНК в клетки человека необходимо перенести ее в подходящий
вирусный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение
через клеточные мембраны.
3.3.2 Физико-химические методы переноса чужеродной ДНК в клетки
эукариот
Чужеродная ДНК может спонтанно проникать в клетки эукариот
благодаря наличию в плазматической мембране белков, специфически
связывающих ДНК. Путем эндоцитоза чужеродная ДНК попадает в
цитоплазму

в

составе

эндосом

и

обычно

быстро

разрушается

лизосомальными ферментами. Только небольшая часть экзогенной ДНК
выходит из экзосом, попадает в ядро и если не разрушается эндогенными
нуклеазами, то может быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако,
случается достаточно редко. Исключение составляют скелетные мышцы, в
которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и низкой
пролиферативной активности введенная ДНК может долго (до 1 года)
сохраняться и даже экспрессироваться.
Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в ядро
клеткимишени может быть осуществлена путем микроиньекции, при
помощи электропорации, а также посредством перфорации клеточных
мембран

золотыми

или

вольфрамовыми

микрочастицами,

коньюгированными с чужеродными ДНК и разогнанными до высокой

скорости (метод бомбардировки). Эти методы доставки применимы главным
образом для клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь
метод бомбардировки с использованием специального "генного ружья",
который успешно применяется in vivo.
Для

повышения

эффективности

переноса

обычно

используют

соединения или группы соединений, взаимодействующие с ДНК с
образованием компактных структур, облегчающих проникновение ДНК в
клетки и защищающих ее от действия нуклеаз. Примерами таких способов
трансфекции являются система кальций-фосфорной коприципитации, а
также рецепторопосредованный транспорт, предусматривающий создание
трехкомпонентной конструкции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус.
В качестве лигандов используются специфические белки, такие как
трансферрин, эритропоэтин, асиалогликопротеин, коньюгированный с
альбумином

инсулин

и

некоторые

другие,

взаимодействующие

с

клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию генной конструкции
на специфических клетках (Рис. 36).

Рис. 36 Рецептор-опосредованный перенос гена

Лиганды

ковалентно

присоединяются

к

связывающим

компактизующим чужеродную ДНК катионным носителям (полилизин,
ДЭАЭдекстран). Важным компонентом системы является аденовирус,
выступающий

в

качестве

эффективного

фузогенного

агента,

обеспечивающего выход экзогенной ДНК из эндосом после попадания ее в
цитоплазму клеток-мишеней. Адресная доставка и защита от действия
лизосомальных

ферментов

обеспечивают

способность таких конструкций.

высокую

трансфекционную

и

Еще одной системой, основанной на сочетании физико-химического
подхода и использования вирусов, является конструкция, основанная на
использовании филаментного фага fd для трансфекции эпителиальных
клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фага, экспрессируются на его
поверхности. В один из них инсертируют последовательность, кодирующую
поли-L-лизин.

Полилизиновые

мотивы

в

составе

химерного

белка

связываются с плазмидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В
другой

ген

оболочки

фага

инсертируют

последовательность

ДНК,

кодирующую какойлибо агент, специфически связывающийся с апикальной
поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий конструкцию
внутрь клетки. Для этой цели могут использоваться гены патогенных
бактерий, поражающих кишечный эпителий, кодирующих белки интерналин
и инвазин, а также последовательности ДНК, кодирующие пептидные
фрагменты вариабельных доменов моноклональных антител.
Направленный перенос генов во многие типы клеток, содержащие
трансферриновые

рецепторы,

может

быть

осуществлен

при

комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в этом комплексе
аденовирусного вектора существенно облегчает прохождение ДНК через
эндосомы и попадание ее в ядро.
3.3.3 Липосомный метод трансфекции
Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от деградации
лизосомальными ферментами достигаются при использовании в качестве
векторов

липидных

везикул

(липосом),

обладающих

выраженными

фузогенными свойствами. Особенно перспективны в этом отношении
липосомы, полученные на основе катионных липидов, обеспечивающих
100% связывание ДНК в конденсированные нуклеолипидные частицы.
Положительный заряд на поверхности таких везикул обеспечивает их
эффективное

слияние

с

отрицательно

заряженными

клеточными

мембранами и прямое попадание чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя

эндосомы. Особенно эффективными являются комплексы, в которых
липосомы коньюгируют с мембранными антителами к определенным
белкам-мишеням
(иммунолипосомы)

или

с

белками-лигандами.

Эти

конструкции

обеспечивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клеткимишени.
3.3.4 Рекомбинантные вирусы
Эволюционно сложившаяся система эффективного проникновения
вирусов в клетки-мишени, а в случае ретровирусов и система интеграции в
клеточный геном позволяет использовать вирусы, как естественные векторы
чужеродной ДНК для клеток млекопитающих.
В

качестве

векторов

чаще

всего

применяют

следующие

рекомбинантные вирусы:
1) ретровирусы
2) аденовирусы
3) аденоассоциированные вирусы
4) вирус гепреса (HSV)
5) вирус ВИЧ (HIV)
6) вирус ветряной оспы
Ретровирусные векторы представляют собой генные конструкции на
основе

ретровирусов

(РНК-содержащих

вирусов),

особенно

часто

используемые для трансдукции ДНК ex vivo. Наиболее популярным
ретровирусным вектором является вирус мышиного лейкоза Molony
(MoMLV). По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают
уникальной способностью эффективно переносить чужеродные гены и
стабильно интегрировать их в геном делящихся соматических клеток. Для
безопасности ретровирусные последовательности модифицируют таким
образом, что в инфицированных ими клетках не производятся вирусные
белки. Это достигается за счет удаления или инактивации всех кодирующих
последовательностей

вируса.

Репликация

вирусных

векторов

может

происходить только в специальных "пакующих" клетках, в геном которых
встроены

все

гены,

кодирующие

вирусные

белки.

При

введении

ретровирусных векторов в эти клетки образуются вирионы, несущие
векторные РНК и способные лишь проникать в клетки-мишени, но не
размножаться в них. Недостатком данной системы, также как и других
векторных систем на основе вирусов, является возможность контаминации
производящей клеточной линии нормальным ретровирусом и получения на
его основе компетентного по репликации вируса. Для предотвращения этого
необходимо регулярное тестирование "пакующей" линии клеток. К другим
серьезным недостаткам ретровирусных векторов относятся:
1)
клетки;

их способность трансдуцировать только пролиферирующие

2)

способность индуцировать мутации при случайной интеграции в

геном;
3)

возможность спонтанной активации онкогена;

4)

небольшие размеры переносимой ДНК-вставки - до 8000 п.о.

5)

сравнительно низкий титр (106 - 107 на 1 мл) рекомбинантных

вирусных частиц, получаемых для трансдукции;
6)
необходимость
"пакующих"

конструирования

соответствующих

клонов клеток;
Аденовирусные

векторы

в

отличие

от

ретровирусов

активно

инфицируют неделящиеся клетки, обладают большей потенциальной
пакующей способностью (>8000 п.о.), имеют более высокий титр (10 11 на 1
мл), однако не обеспечивают встраивание чужеродной ДНК в геном клеткихозяина. Их использование перспективно для генокоррекции клеток верхних
дыхательных путей, легких, мозга, печени, мышц, кожи и др. Данный тип
векторов был использован

в

первых

клинических

испытаниях

по

генотерапии муковисцидоза, показавших их эффективность при доставке
аэрозольным способом. В аденовирусные векторы также инсерцируют

маркерные

гены

последующей

(neo,

CAT,

идентификации

конструирования

векторов

β-галактозидазный

ген

трансдуцированных

используют

дефектные

(β-Gal))
клеток.

по

для
Для

репликации

аденовирусы, которые получают путем вырезания из вирусной ДНК генов,
кодирующих белки E1a, E1b, а также регуляторный белок E4. Такая
конструкция

может

поддерживаться

только

в

присутствии

клетокпомошников (например, в культуре клеток почек человека). Удаление
большого числа аденовирусных генов из векторов часто сопровождается их
дестабилизацией, что является одним из главных их недостатков, так как в
ряде случаев остающиеся гены, трансдуцированные в клетки-мишени
способствуют формированию иммунного ответа.
Аденоассоциированные

вирусы

(AAV)

обладают

значительно

меньшей пакующей способностью (~5000 п.о.). Однако, в отличие от ранее
рассмотренных вирусов, они не обладают онкогенной активностью, не
патогенны, способны интегрироваться в геном, где преобладают в
латентном состоянии. Уникальной особенностью AAV является их
способность к стабильной неслучайной интеграции в один из районов
хромосомы 19. Специфичность интеграции вируса определяется наличием в
его геноме гена rep. близкородственные к AAV парвовирусы (H1, MVM,
LuIII) обладают еще меньшей пакующей способностью (~2000 п.о.) и не
обладают способностью к специфическому встраиванию. Однако, они также
рассматриваются как потенциальные векторы.
Вирус простого герпеса (HSV) - это крупный (152 тыс. п.о.)
ДНКсодержащий вирус, не интегрирующийся в геном при трансформации и
формирующий

эписомные

структуры

в

ядрах

клеток.

Уникальной

особенностью HSV является его выраженная тропность к клеткам нервной
ткани, в связи с чем представляется перспективным его использование для
терапии опухолей ЦНС, а также болезни

Паркинсона и других

нейродегенеративных заболеваний. Преимуществом HSV как вектора для

генной терапии состоит в его высокой пакующей способности (> 30 000
п.о.). Важным этапом в создании векторов на основе HSV является удаление
из его генома области ICP22, ответственной за синтез литических белков, и
индукция мутации 1814, вызывающей блок транскрипции вирусной ДНК. В
последнее время на основе HSV стали получать искусственные производные
вируса, так называемые "ампликон-продукты", лишенные практически всех
генов HSV, но способные к репликации.
Конструкции векторов, используемых для переноса экзогенных ДНК в
клетки человека, постоянно совершенствуются в зависимости от типа
клетокмишеней. Так, новый тип векторов, сконструированных на основе
псевдоаденовирусов, сочетает в себе все преимущества аденовирусных
векторов, но при этом собственные вирусные гены практически не
оказывают никакого повреждающего эффекта на трансформированные
клетки-мишени, так как содержат очень мало регуляторных элементов и
последовательностей,

ответственных

за

упаковку

и

репликацию

аденовируса. Кроме того, псевдоаденовирусные векторы с успехом
переносят чужеродные последовательности ДНК как в делящиеся, так и в
покоящиеся клетки. Изучаются также перспективы использования для
генной терапии других вирусных систем, таких как SV40, HIV (ВИЧ), вирус
ветряной оспы и др. В частности, представляются перспективными
эписомные (неинтегрирующиеся в геном реципиента) векторы, полученные
на основе очень крупного вируса
Эпштейна-Барра, который способен нести вставку размером от 60 до 330
тыс. п.о.
В последнее время, особое внимание уделяется созданию векторов на
базе искусственных хромосом млекопитающих (Mammalian Artificial
Chromosomes, MAC), которые могли бы достаточно автономно находиться в
ядре, сохраняя способность к репликации и экспрессии. Удобными

моделями для этого представляются циркулярные микрохромосомы раковых
клеток.
Особенно

привлекательной

в

отношении

генной

коррекции

представляется возможность замены всего мутантного гена или его
мутировавшей части (например, одного экзона) на его нормальный аналог,
что может быть достигнуто с помощью гомологической рекомбинации.
Такой подход может обеспечить не только продолжительную персистенцию
введенного гена, но и сохранение удовлетворительного уровня его
экспрессии. С этой целью, в конструкции, используемые для переноса ДНК,
включают агенты, повышающие частоту гомологичного спаривания,
например, ген бактериальной рекомбиназы. В таких условиях частота
гомологичной рекомбинации может быть достаточной для того, чтобы с
помощью ПЦР отобрать нужные клоны клеток.